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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
MÁRIO HENRIQUE GIRÃO FARIA
ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO DAS ALTERAÇÕES
MOLECULARES NOS TUMORES ASTROCÍTICOS:
VIAS TUMORIGÊNICAS E INDICADORES DE RESISTÊNCIA
FORTALEZA – CEARÁ – BRASIL
2005
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MÁRIO HENRIQUE GIRÃO FARIA
ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO DAS ALTERAÇÕES
MOLECULARES NOS TUMORES ASTROCÍTICOS:
VIAS TUMORIGÊNICAS E INDICADORES DE RESISTÊNCIA
Dissertação submetida à Coordenação do
Programa de Pós-Graduação em
Farmacologia do Departamento de Fisiologia
e Farmacologia da Universidade Federal do
Ceará como requisito parcial para obtenção
do título de Mestre em Farmacologia.
Orientador:
Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho
Co-Orientadora:
Profa. Dra. Silvia Helena Barem Rabenhorst
FORTALEZA – CEARÁ – BRASIL
2005
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3
F235e Faria, Mário Henrique Girão
Estudo imuno-histoquímico das alterações
moleculares nos tumores astrocíticos: vias tumorigênicas
e indicadores de resistência / Mário Henrique Girão
Faria. – Fortaleza, 2005.
188f. : il.
Orientador: Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho.
Co-Orientador: Dra. Silvia Helena Barem Rabenhorst.
Dissertação (Mestrado). Universidade Federal do
Ceará. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia.
1. Astrocitoma. 2. Marcadores moleculares. 3.
Tumorigênese. 4. Resistência tumoral. I. Título.
CDD 617.481
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MÁRIO HENRIQUE GIRÃO FARIA
ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO DAS ALTERAÇÕES
MOLECULARES NOS TUMORES ASTROCÍTICOS:
VIAS TUMORIGÊNICAS E INDICADORES DE RESISTÊNCIA
Dissertação submetida à Coordenação do
Programa de Pós-Graduação em Farmacologia do
Departamento de Fisiologia e Farmacologia da
Universidade Federal do Ceará como requisito
parcial para obtenção do título de Mestre em
Farmacologia.
Aprovada em 03 de junho de 2005.
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________________
Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho
Orientador
Professor Adjunto IV - Departamento de Fisiologia e Farmacologia
Universidade Federal do Ceará - UFC
__________________________________________________
Profa. Dra. Silvia Helena Barem Rabenhorst
Co-Orientador
Professor Adjunto IV - Departamento de Patologia e Medicina Legal
Universidade Federal do Ceará - UFC
__________________________________________________
Prof. Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro
Professor Adjunto IV - Departamento de Fisiologia e Farmacologia
Universidade Federal do Ceará - UFC
__________________________________________________
Profa. Dra. Leila Maria Cardão Chimelli
Professor Titular - Departamento de Patologia
Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ
5
Ao meu grande sonho, a NEUROCIRURGIA,
na intenção de que essa pesquisa configure
mais um passo em sua direção.
6
AGRADECIMENTOS
Aos PACIENTES portadores de neoplasias cerebrais, fontes do precioso material de
estudo, indivíduos que consistem no princípio e fim desta investigação.
Ao Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho, pela confiança a mim concedida,
além da amizade sincera e do incentivo constante.
A Profa. Dra. Silvia Helena Barem Rabenhorst, pela dedicação, pelo carinho e pelo
empenho na formatação e execução desta pesquisa, assim como na minha formação científica.
A Profa. Dra. Leila Maria Cardão Chimelli, pela honrosa participação na Banca
Examinadora.
Ao Prof. Dr. Ronaldo Albuquerque Ribeiro, pelo exemplo encorajador de
conciliação entre a pesquisa básica e a prática oncológica.
Ao Prof. Dr. Carlos Maurício de Castro Costa, pela influência exercida, mesmo que
indiretamente, sobre minha formação como pesquisador e admirador da neurociência.
A Profa. Dra. Régia Maria do Socorro Vidal do Patrocínio, pela inestimável
colaboração, pela amizade e pelos ensinamentos em neuropatologia.
Ao Acadêmico de Medicina Bronner Pamplona Augusto Gonçalves, pelo
devotamento no auxílio aos procedimentos experimentais e pela amizade fraterna.
7
Ao Prof. Dr. Fernando de Carvalho Gomes, pela atenção, pela paciência e pelo
empenho dispensados durante a avaliação dos dados deste ensaio.
Aos diretores e amigos do Laboratório BIOPSE
®
, pelo acesso irrestrito aos arquivos
histopatológicos e pelo apoio técnico na confecção das lâminas.
Aos Neurocirurgiões, aqui representados pelo Prof. Dr. José Arnaldo Motta de
Arruda, pela coleta dos tumores – muitas vezes o único recurso terapêutico e fonte
indissociável do material estudado.
Ao Departamento de Patologia e Medicina Legal - UFC, pelo assentimento no
fornecimento de tecidos-controle para os experimento, pelo custeio de parte do material de
consumo em histologia e pelo carinho sempre dispensado por parte de professores, residentes
e funcionários.
Aos amigos do Laboratório de Genética Molecular – LABGEM, pelo apoio, pelo
companheirismo e pelo incentivo nos momentos de insegurança.
Aos professores e pesquisadores do Laboratório de Oncologia Experimental –
LOE, pela introdução ao estudo do câncer e da prática laboratorial.
Ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, representado pelos eminentes
docentes e pelos estimados colegas discentes, pelo acolhimento e pela dedicação na formação
científica de seus pós-graduandos.
As funcionárias Silvia Maria Azevedo Lima, Aura Rhanes Farias Nogueira, Maria
Rosilene Matias Ferreira, Flávia Maria Martins Aguiar e Maria Teresa Rocha, pelos
incontáveis e prestimosos auxílios.
8
A Tânia Maria Galdino de Souza e Margareth Gonçalves Maia pela dedicação,
pelo esmero e pela prontidão no preparo dos cortes histológicos.
A BIOGEN
®
, representante da DakoCytomation
®
no Brasil, pelo apoio técnico e
pelo fornecimento de parte dos anticorpos.
Ao Conselho Nacional para o Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq,
pelo financiamento parcial desta pesquisa.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES, pelo
crédito a mim ofertado no Curso de Mestrado.
A minha Família, pela oportunidade de realizar meus estudos, mesmo transpondo
inúmeros obstáculos, e pela inspiração vocacional.
Ao amigo Marco Aurélio Rabenhorst Saliba, pela prontidão na assistência quanto ao
uso da língua inglesa.
A todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a concretização deste
trabalho, meus sinceros agradecimentos.
A DEUS, pelo dom da ciência, pela dádiva da habilidade médica, pela esperança nos
meus sonhos e pelo discernimento ofertado nas horas extenuantes.
9
“Houve um tempo em que se fazia ciência
a partir de quatro elementos:
água, terra, fogo e ar.
Naquele tempo não se sabia que é possível
fazer qualquer coisa com apenas dois:
vontade e imaginação.”
Martha Reis
10
RESUMO
O presente estudo objetivou avaliar a expressão de genes envolvidos no processo tumorigênico e nos
mecanismos de quimiorresistência dos tumores astrocíticos. Procedeu-se análise clínico-epidemiológica,
avaliação histopatológica e estudo imuno-histoquímico das proteínas Ki-67, c-Myc, GFAP, p53, p21
WAF1/CIP1
,
p27
KIP1
, Bcl-2, Bax, EGFR, erbB-2, p21
Ras
, MGMT, GSTπ, TS e TopoIIα pelo método da estreptoavidina-
biotina-peroxidase em 55 astrocitomas de diferentes gradações (OMS) (13 grau I, 14 grau II, 7 grau III e 21 grau
IV) e 05 amostras de tecido cerebral não-tumoral (grupo controle). A distribuição por idade, por sexo e pela
localização tumoral dos portadores dessas neoplasias reproduziu, de um modo geral, as tendências mundiais. Os
achados histopatológicos avaliados segundo critérios semiquantitativos confirmaram os parâmetros de
classificação dos astrocitomas estabelecidos pela OMS. A marcação para o antígeno Ki-67 aumentou conforme a
progressão dos tumores astrocíticos, sendo que sua detecção em mais de 8,0% das células tumorais distinguiu os
Astrocitomas Grau IV, índices entre 1,5 e 8,0% diferenciaram os Astrocitomas Grau III e valores abaixo de 1,5%
discriminaram os tumores de baixo grau (I e II). A expressão das proteínas TopoIIα e c-Myc (nuclear)
demonstraram associação com a proliferação celular nos astrocitomas, todavia de maneira não exclusiva. A
positividade citoplasmática para proteína c-Myc foi maior entre os tumores de alto grau (71,43%), com escores
de expressão máximos nos Astrocitomas Grau IV (LI médio=15,57; H médio=24,42). Em média, 76,9% das
células tumorais dos Astrocitomas Grau IV manifestaram moderada positividade para GFAP. A positividade e os
escores de marcação para as proteínas p53 e p27
KIP1
(nuclear e citoplasmática) demonstraram tendência de
aumento conforme a progressão dos tumores astrocíticos, enquanto a detecção do p21
WAF1/CIP1
mostrou
orientação oposta (exceto no grau IV). A porcentagem de tumores positivos para Bcl-2 e Bax aumentou
conforme a gradação dos astrocitomas, com positividade geral de 43,26% e 24,67%, respectivamente. Os escores
de marcação para Bcl-2 demonstraram propensão ao acréscimo segundo a evolução tumoral, enquanto os índices
para Bax foram semelhantes nas diversas graduações. A expressão da proteína erbB2 foi evidenciada apenas
entre os Astrocitomas Grau IV (positividade=14,28%), enquanto a superexpressão da proteína EGFR destacou-
se nos tumores astrocíticos dos graus I e IV, com respectivamente 46,15% e 61,90% de casos positivos. A
detecção da proteína p21
Ras
foi preponderante entre os Astrocitomas Grau II (positividade=37,71%), estando
ausente nos tumores de alto grau (III e IV). A superexpressão do EGFR e a mutação do p53 configuraram
eventos mutuamente exclusivos nos astrocitomas, assim como a superexpressão da proteína p21
Ras
e dos
receptores da família ErbB. Constatou-se elevada positividade para as enzimas GSTπ, TS e MGMT nos tumores
astrocíticos. Os índices de expressão da MGMT mostraram-se elevados e constantes entre as diferentes
categorias histológicas, incluindo os espécimes não-tumorais (LI médio=69,43). Os escores para GSTπ
demonstraram tendência à redução de acordo com evolução maligna dos astrocitomas, enquanto os índices para
TS atingiram níveis mais elevados entre os Astrocitomas Grau IV (H médio=63,33). A positividade para enzima
TopoIIα apresentou propensão ao aumento conforme a progressão dos tumores astrocíticos, ao passo que os
escores de marcação foram semelhantes nos astrocitomas dos graus II, III e IV (LI médio=27,71). Os resultados
obtidos pela corrente investigação apontaram o antígeno Ki-67 como o melhor marcador de proliferação celular
nos tumores astrocíticos. A mutação do p53 configurou evento inicial, relevante e potencialmente indicador de
progressão tumoral nos astrocitomas. A detecção do supressor tumoral p21
WAF1/CIP1
representou importante
recurso para a dedução da situação funcional do gene p53, enquanto a ativação funcional do p27
KIP1
não foi
comprometida pelo processo tumorigênico nos astrocitomas. A relação Bcl-2/Bax nos astrocitomas revelou a
crescente orientação à sobrevida celular conforme a evolução maligna desses tumores. A superexpressão da
proteína p21
Ras
destacou-se como um evento molecular típico do grau II e virtual indicador de não-progressão
tumoral. O acúmulo citoplasmático da proteína c-Myc configurou fenômeno inicial e significante na
tumorigênese dos astrocitomas, sendo reflexo direto da expressão nuclear do gene c-myc e da malignidade
tumoral. A análise conjunta dos marcadores moleculares investigados confirmou a mutação do gene p53 como a
principal via tumorigênica dos astrocitomas, ainda que a superexpressão do EGFR tenha sido a alteração
predominante nos tumores do grau IV e a expressão do gene c-myc tenha representado uma via molecular
distinta e alternativa às demais nas diferentes graduações tumorais. A marcante presença das enzimas MGMT,
GSTπ e TS configurou virtual indicação de quimiorresistência para diversos agentes antineoplásicos, enquanto a
elevada expressão da TopoIIα revelou esta enzima como potencial alvo terapêutico nos tumores astrocíticos.
Palavras-Chave
: astrocitoma; imuno-histoquímica; marcadores moleculares; tumorigênese; resistência tumoral.
11
ABSTRACT
The present study aimed to evaluate the expression of genes involved in the tumorigenic process and in the
chemoresistance mechanisms of the astrocytic tumors. A clinical and epidemiological analysis, histopathological
evaluation and immunohistochemical study of the proteins Ki-67, c-Myc, GFAP, p53, p21
WAF1/CIP1
, p27
KIP1
,
Bcl-2, Bax, EGFR, erbB-2, p21
Ras
, MGMT, GSTπ, TS and TopoIIα using streptoavidin-biotin-peroxidase
method were performed in 55 different graduations of astrocytomas (WHO) (13 grade I, 14 grade II, 7 grade III,
21 grade IV) and 05 samples of non-tumoral tissue (control group). The distribution by age, sex and tumoral
localization of astrocytomas patients in Fortaleza reproduced, in a general way, the worldwide trends. The
histopathological findings evaluated with semiquantitative criteria confirmed the classification parameters for
astrocytomas established by WHO. The stain for Ki-67 antigen increased as according to astrocytic tumors
progression; its detection in more than 8.0% of the tumoral cells distinguished Astrocytomas Grade IV, labeled
index between 1.5 and 8.0% differentiated Astrocytomas Grade III and values below 1.5% discriminated low-
grade tumors (I and II). The TopoIIα and c-Myc (nuclear) expression demonstrated association with cellular
proliferation in astrocytomas, however not in a exclusive way. The c-Myc protein cytoplasmic positive index
was bigger among high-grade tumors (71.43%), with maximum expression scores in Astrocytomas Grade IV (LI
mean=15.57; H mean=24.42). In general, 76.9% of the Astrocytomas Grade IV tumoral cells revealed moderate
positive index for GFAP. The positive index and expression scores for p53 and p27
KIP1
(nuclear and
cytoplasmic) proteins showed a tendency to increase with the astrocytic tumors progression, while the
p21
WAF1/CIP1
tumor suppressor detection demonstrated opposite orientation (except in grade IV). The percentage
of Bcl-2 and Bax positive tumors increased in accordance with histological grade of astrocytomas, with general
positive index of 43.26% and 24.67%, respectively. Bcl-2 staining scores demonstrated propensity to addition
according to tumoral evolution, while the scores for Bax was similar in all graduations. The erbB2 protein
expression was evidenced only between Astrocytomas Grade IV (positive index=14.28%), while the
overexpression of EGFR protein was distinguished in grade I and IV astrocytic tumors, with respectively 46.15%
and 61.90% of positive cases. p21
Ras
protein detection was preponderant in Astrocytomas Grade II (positive
index=37.71%), being absent in high-grade tumors (III and IV). The EGFR overexpression and p53 mutation
configured mutually exclusive events in astrocytomas tumorigenesis, as well as p21
Ras
protein and ErbB
receptors family overexpression. High positive index for enzymes MGMT, GSTπ and TS was evidenced in
astrocytic tumors. MGMT expression scores were high and constant among different histological categories,
including non-tumoral specimens (LI mean = 69.43). GSTπ scores demonstrated tendency to reduction in
accordance with malignant evolution of astrocytomas, while the values for TS reached higher levels on
Astrocytomas Grade IV (H mean=63.33). TopoIIα positive index demonstrated inclination to augment in
agreement with the progression of astrocytic tumors, whereas the staining scores had been similar in grade II, III
and IV astrocytomas (LI mean=27.71). The results obtained by current investigation indicated Ki-67 antigen as
the best cell proliferation marker. The p53 mutation configured an initial and relevant event in astrocytomas, as
well as potential indicative of tumor progression. p21
WAF1/CIP1
tumor suppressor detection represented important
resource for deduction of functional situation of p53 gene, while the p27
KIP1
functional activation was not
compromised by astrocytomas tumorigenic process. Astrocitomas Bcl-2/Bax ratio denoted increasing of cellular
survival orientation in accordance with malignant evolution of these tumors. p21
Ras
protein overexpression was
distinguished as a grade II typical molecular event and a virtual marker of tumor not-progression. c-Myc protein
cytoplasmic accumulation configured initial and significant phenomenon in astrocytomas tumorigenesis, being a
direct reflex of the nuclear expression of c-myc gene and the tumoral malignance. The combined analysis of the
investigated molecular markers confirmed p53 gene mutation as the main tumorigenic pathway of astrocytomas,
even though EGFR overexpression has been the predominant alteration in grade IV tumors and the c-myc gene
expression has represented a distinct and alternative molecular pathway to different tumor graduations. The
remarkable presence of MGMT, GSTπ and TS enzymes configured virtual indication of chemoresistance for
many antineoplastic agents, while the high expression of TopoIIα revealed this enzyme as a potential therapeutic
target in the astrocytic tumors.
Key Words
: astrocytoma; immunohistochemistry; molecular markers; tumorigenesis; tumoral resistance.
12
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 01
Representação esquemática do fluxo “normal” da informação
celular.
pág. 026
FIGURA 02
Representação esquemática da regulação do ciclo celular. pág. 028
FIGURA 03
Representação esquemática das vias apoptóticas mediadas pela
ativação do receptor CD95/FAS.
pág. 031
FIGURA 04
Distribuição percentual dos tumores primários do SNC
diagnosticados nos EUA no período de 1995 a 1999 segundo a
histopatologia (n=37.788).
pág. 035
FIGURA 05
Ilustração representativa da interação entre as células gliais
(astrócitos e oligodendrócitos) e os neurônios.
pág. 035
FIGURA 06
Histopatologia dos tumores astrocíticos (HE, 400X). pág. 040
FIGURA 07
Características histopatológicas dos Astrocitomas Grau IV
(Glioblastoma Multiforme).
pág. 041
FIGURA 08
Estudos tomográficos por Ressonância Magnética Nuclear (RMN)
representativos dos tumores astrocíticos.
pág. 042
FIGURA 09
Diagrama representativo das alterações genéticas envolvidas na
progressão maligna dos astrocitomas.
pág. 049
FIGURA 10
Expressão de GFAP detectada por imuno-histoquímica (400X). pág. 052
FIGURA 11
Representação simplificada da atuação das proteínas da família
bcl-2 na regulação da cascata apoptótica mitocondrial.
pág. 056
FIGURA 12
Representação esquemática dos subtipos e do mecanismo de
ativação dos receptores ErbB.
pág. 057
FIGURA 13
Modelo esquemático da atuação das proteínas Ras “normal” (A) e
mutante (B) na sinalização intracelular.
pág. 059
FIGURA 14
Estrutura, funções e ligantes da proteína c-Myc. pág. 061
FIGURA 15
Representação parcial e simplificada da atuação do c-myc nas vias
moleculares reguladoras do ciclo celular em organismos.
pág. 063
FIGURA 16
Vias apoptóticas mediadas pela proteína c-Myc. pág. 064
13
FIGURA 17
Modelo esquemático da regulação e do mecanismo de ação da
Glutationa-S-Transferase (GST).
pág. 066
FIGURA 18
Mecanismo de inibição da Timidilato Sintase pelo 5-Fluorouracil. pág. 068
FIGURA 19
Representação esquemática do mecanismo de ação da O
6
-
Metilguanosina-DNA-Metiltransferase (MGMT).
pág. 069
FIGURA 20
Representação do mecanismo de descompactação das fitas de
DNA catalisada pela enzima DNA Topoisomerase II (TopoII).
pág. 069
FIGURA 21
Modelo esquemático de uma árvore de decisão. pág. 073
FIGURA 22
Distribuição quantitativa dos casos (não-tumoral e astrocitomas)
selecionados para o estudo segundo a classificação histológica
(n=60).
pág. 086
FIGURA 23
Distribuição quantitativa dos casos (não-tumoral e astrocitomas)
selecionados para o estudo segundo a faixa etária dos pacientes
(n=60).
pág. 086
FIGURA 24
Distribuição percentual dos astrocitomas avaliados segundo o
sexo dos pacientes (n=55).
pág. 086
FIGURA 25
Distribuição percentual dos astrocitomas avaliados segundo a
localização tumoral (n=55).
pág. 087
FIGURA 26
Médias dos escores atribuídos aos parâmetros histopatológicos
segundo a classificação histológica dos casos avaliados.
pág. 088
FIGURA 27
Médias dos escores atribuídos à presença de células gigantes e de
gemistócitos segundo a classificação histológica dos casos
avaliados.
pág. 088
FIGURA 28
Árvore de decisão fornecida pelo método CART referente à
análise dos parâmetros histopatológicos de acordo com a
classificação histológica dos casos avaliados.
pág. 089
FIGURA 29
Expressão dos marcadores de proliferação celular Ki-67 [a, b, c,
d] e Topoisomerase IIα [e, f] detectada por imuno-histoquímica
(400X).
pág. 090
FIGURA 30
Expressão de c-Myc detectada por imuno-histoquímica (400X). pág. 091
FIGURA 31
Percentuais de positividade imuno-histoquímica para os
marcadores relacionados à proliferação celular Ki-67, TopoIIα e
c-Myc (nuclear) segundo a classificação histológica dos casos
avaliados.
pág. 091
14
FIGURA 32
Médias dos escores atribuídos aos parâmetros relacionados à
proliferação celular [índice mitótico, Ki-67 (LI), TopoIIα (LI), c-
Myc nuclear (LI)] segundo a classificação histológica dos casos
avaliados.
pág. 092
FIGURA 33
Árvore de decisão fornecida pelo método CART referente à
análise da expressão do antígeno Ki-67 detectada por imuno-
histoquímica de acordo com as diferentes gradações dos
astrocitomas avaliados.
pág. 093
FIGURA 34
Médias dos escores atribuídos à expressão de GFAP detectada por
imuno-histoquímica segundo a classificação histológica dos casos
avaliados.
pág. 093
FIGURA 35
Expressão dos supressores tumorais p53 [a, b], p21 [c] e p27 [d]
detectada por imuno-histoquímica (400X).
pág. 095
FIGURA 36
Percentuais de positividade imuno-histoquímica para os
supressores tumorais p53, p21 e p27 (nuclear) segundo a
classificação histológica dos casos avaliados.
pág. 095
FIGURA 37
Médias dos escores atribuídos à expressão dos supressores
tumorais [p53 (LI), p21 (LI) e p27 nuclear (LI)] detectada por
imuno-histoquímica segundo a classificação histológica dos casos
avaliados.
pág. 096
FIGURA 38
Distribuição percentual das diferentes gradações dos astrocitomas
segundo a relação entre a expressão imuno-histoquímica das
proteínas p53 e p21.
pág. 096
FIGURA 39
Percentuais de positividade imuno-histoquímica para o supressor
tumoral p27 (nuclear e citoplasmático) segundo a classificação
histológica dos casos avaliados.
pág. 097
FIGURA 40
Médias dos escores atribuídos à expressão de p27 nuclear (LI) e
citoplasmático (LI e H) detectada por imuno-histoquímica
segundo a classificação histológica dos casos avaliados.
pág. 097
FIGURA 41
Expressão dos supressores tumorais p53 [a], p21 [b] e p27 [c]
detectada por imuno-histoquímica (400X).
pág. 098
FIGURA 42
Expressão dos marcadores relacionados à apoptose Bax [a, b, c] e
Bcl-2 [d, e, f] detectada por imuno-histoquímica (400X).
pág. 099
FIGURA 43
Percentuais de positividade imuno-histoquímica para Bcl-2 e Bax
segundo a classificação histológica dos casos avaliados.
pág. 099
15
FIGURA 44
Médias dos escores atribuídos à expressão de Bcl-2 e Bax (LI e H)
detectada por imuno-histoquímica segundo a classificação
histológica dos casos avaliados.
pág. 100
FIGURA 45
Distribuição percentual das diferentes classificações histológicas
segundo a tendência à sobrevida estimada pelo balanço entre a
expressão de Bcl-2 e Bax detectada por imuno-histoquímica.
pág. 101
FIGURA 46
Expressão dos receptores de membrana EGFR [a, b, c] e ErbB2
[d] detectada por imuno-histoquímica.
pág. 102
FIGURA 47
Percentuais de positividade imuno-histoquímica para EGFR e
ErbB2 segundo a classificação histológica dos casos avaliados.
pág. 102
FIGURA 48
Médias dos escores atribuídos à expressão de EGFR (H) e ErbB2
(H) detectada por imuno-histoquímica segundo a classificação
histológica dos casos avaliados.
pág. 103
FIGURA 49
Distribuição percentual das diferentes gradações dos astrocitomas
segundo a situação funcional dos genes p53 e EGFR estimada
pela detecção imuno-histoquímica de suas respectivas proteínas.
pág. 104
FIGURA 50
Expressão de Ras detectada por imuno-histoquímica (400X). pág. 104
FIGURA 51
Percentual de positividade imuno-histoquímica para p21
ras
segundo a classificação histológica dos casos avaliados.
pág. 105
FIGURA 52
Médias dos escores atribuídos à expressão de Ras (LI e H)
detectada por imuno-histoquímica segundo a classificação
histológica dos casos avaliados.
pág. 106
FIGURA 53
Expressão de c-Myc detectada por imuno-histoquímica (400X). pág. 106
FIGURA 54
Percentuais de positividade imuno-histoquímica para o fator de
transcrição c-Myc (nuclear e citoplasmático) segundo a
classificação histológica dos casos avaliados.
pág. 107
FIGURA 55
Médias dos escores atribuídos à expressão de c-Myc detectada por
imuno-histoquímica segundo a classificação histológica dos casos
avaliados.
pág. 107
FIGURA 56
Percentuais de concordância (+/+ ou -/-) e concomitância (+/+)
entre as marcações nuclear e citoplasmática para c-Myc
detectadas por imuno-histoquímica segundo a classificação
histológica dos astrocitomas avaliados.
pág. 108
16
FIGURA 57
Distribuição percentual das diferentes gradações dos astrocitomas
segundo o principal evento tumorigênico (mutação do p53,
superexpressão do EGFR, expressão de c-Myc) estimado pela
detecção imuno-histoquímica das proteínas correlatas.
pág. 109
FIGURA 58
Expressão das enzimas relacionados à quimiorresistência GSTπ
[a, b], TS [c, d] e MGMT [e, f] detectada por imuno-histoquímica
(400X).
pág. 110
FIGURA 59
Percentuais de positividade imuno-histoquímica para as enzimas
MGMT, GSTπ, TopoIIα e TS segundo a classificação histológica
dos casos avaliados.
pág. 111
FIGURA 60
Médias dos escores atribuídos à expressão das enzimas
relacionadas à quimiorresistência [MGMT (LI), GSTπ (LI),
TopoIIα (LI) e TS (LI e H)] detectada por imuno-histoquímica
segundo a classificação histológica dos casos avaliados.
pág. 111
17
LISTA DE TABELAS
TABELA 01
Tumores de origem neuroepitelial - representação parcial (tumores
astrocíticos e correlatos) da classificação segundo a OMS
pág. 036
TABELA 02
Dados epidemiológicos referentes aos tumores astrocíticos
diagnosticados nos EUA no período de 1995 a 1999, distribuídos
de acordo com a graduação histológica da OMS
pág. 041
TABELA 03
Significado dos escores utilizados na análise dos parâmetros
histopatológicos
pág. 081
TABELA 04
Sítio(s) de expressão celular das diferentes proteínas estudadas pág. 081
TABELA 05
Valores referentes ao somatório dos escores atribuídos aos
parâmetros histopatológicos adotados como critérios para
graduação tumoral dos astrocitomas pela OMS (pleomorfismo
celular, atipia nuclear, índice mitótico, hiperplasia vascular e
necrose) segundo a classificação histológica dos casos avaliados
pág. 089
TABELA 06
Valores referentes aos escores atribuídos à expressão do antígeno
Ki-67 (LI) detectada por imuno-histoquímica segundo a
classificação histológica dos casos avaliados
pág. 093
TABELA 07
Índices de marcação imuno-histoquímica (LI) para o antígeno Ki-
67 nas diferentes gradações dos tumores astrocíticos (embebidos
em parafina) segundo diversas referências, incluindo o presente
estudo
pág. 095
TABELA 08
Percentuais de positividade imuno-histoquímica para p53 nas
diferentes gradações dos tumores astrocíticos segundo diversas
referências, incluindo o presente estudo
pág. 124
TABELA 09
Percentuais de mutação do gene p53 nas diferentes gradações dos
tumores astrocíticos segundo diversas referências, incluindo o
presente estudo
pág. 129
TABELA 10
Percentuais de positividade imuno-histoquímica para EGFR nas
diferentes gradações dos tumores astrocíticos segundo diversas
referências, incluindo o presente estudo
pág. 135
TABELA 11
Distribuição percentual dos Astrocitomas Grau IV (OMS) de
acordo com a situação funcional dos genes p53 e EGFR estimada
por imuno-histoquímica e/ou técnicas moleculares segundo
diversas referências, incluindo o presente estudo
pág. 140
18
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
o
C grau centígrado
a.C. antes de Cristo
ATP adenosina trifosfato
CART árvore de classificação e regressão
CDK quinase dependente de ciclina
DATASUS Departamento de Informação e Informática do Sistema Único de Saúde
Ministério da Saúde/Brasil
EUA Estados Unidos da América
ex. exemplo
g grama
GFAP proteína ácida glio-fibrilar
GSTπ glutationa-S-transferase subtipo pi
HE coloração pela hematoxilina-eosina
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
INCA Instituto Nacional do Câncer
kDa kilodalton
mg miligrama (10
-3
grama)
mL mililitro (10
-3
litro)
µL microlitro (10
-6
litro)
mm milímetro (10
-3
metro)
mM milimolar (10
-3
molar)
MGMT O
6
-metilguanosina-DNA-metiltransferase
OMS Organização Mundial da Saúde
pH potencial hidrogeniônico
RMN ressonância magnética nuclear
SNC sistema nervoso central
TopoIIα DNA Topoisomerase II subtipo alfa
TS timidilato sintase
X vezes (referindo-se ao aumento por microscopia óptica)
19
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................ pág. 023
1.1. CÂNCER ......................................................................................... pág. 023
1.1.1. Definições em Oncologia ................................................. pág. 024
1.1.2. Bases Moleculares do Câncer ........................................... pág. 025
1.2. TUMORES PRIMÁRIOS DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL pág. 031
1.2.1. Epidemiologia ................................................................... pág. 031
1.2.2. Etiologia ........................................................................... pág. 032
1.2.3. Classificação Histopatológica .......................................... pág. 033
1.3. ASTROCITOMAS .......................................................................... pág. 034
1.3.1.Classificação e Graduação dos Astrocitomas .................... pág. 036
1.3.2. Caracterização dos Astrocitomas ..................................... pág. 037
1.3.3. Aspectos Clínicos dos Astrocitomas ................................ pág. 043
1.3.4. Terapêutica dos Astrocitomas .......................................... pág. 044
1.4. ALTERAÇÕES GENÉTICAS NOS ASTROCITOMAS .............. pág. 045
1.5. MARCADORES MOLECULARES .............................................. pág. 049
1.5.1. Proliferação Celular .......................................................... pág. 050
1.5.2. Diferenciação Astrocítica ................................................. pág. 052
1.5.3. Supressores Tumorais ....................................................... pág. 053
1.5.4. Apoptose ........................................................................... pág. 054
1.5.5. Receptores da Família ErbB ............................................. pág. 055
1.5.6. Sinalização Intracelular .................................................... pág. 058
20
1.5.7. O Fator de Transcrição c-Myc .......................................... pág. 059
1.5.8. Enzimas relacionas à Quimiorresistência ......................... pág. 065
1.6. A BIOLOGIA MOLECULAR COMO FERRAMENTA
FARMACOLÓGICA ...................................................................... pág. 070
2. OBJETIVOS ................................................................................................. pág. 074
2.1. GERAL ........................................................................................... pág. 074
2.2. ESPECÍFICOS ................................................................................ pág. 074
3. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................ pág. 075
3.1. REAGENTES E SOLUÇÕES ........................................................ pág. 075
3.2. EQUIPAMENTOS ......................................................................... pág. 076
3.3. VIDRARIA ..................................................................................... pág. 077
3.4. PROGRAMAS COMPUTACIONAIS ........................................... pág. 077
3.5. OUTROS MATERIAIS .................................................................. pág. 077
3.6. CASUÍSTICA ................................................................................. pág. 078
3.7. PREPARO DAS LÂMINAS E DOS CORTES HISTOLÓGICOS pág. 079
3.8. IMUNO-HISTOQUÍMICA ............................................................ pág. 079
3.9. ANÁLISES HISTOPATOLÓGICA E IMUNO-HISTOQUÍMICA pág. 080
3.9.1. Análise Histopatológica ................................................... pág. 080
3.9.2. Análise Imuno-Histoquímica ........................................... pág. 080
3.10. ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................... pág. 082
4. RESULTADOS ............................................................................................ pág. 085
4.1. ANÁLISE CLÍNICO-EPIDEMIOLÓGICA ................................... pág. 085
4.2. ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA ................................................. pág. 087
4.3. ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA .......................................... pág. 090
21
4.3.1. Proliferação Celular .......................................................... pág. 090
4.3.2. Diferenciação Astrocítica ................................................. pág. 092
4.3.3. Supressores Tumorais ....................................................... pág. 094
4.3.4. Apoptose ........................................................................... pág. 098
4.3.5. Receptores da Família ErbB ............................................. pág. 101
4.3.6. Sinalização Intracelular .................................................... pág. 104
4.3.7. O Fator de Transcrição c-Myc .......................................... pág. 106
4.3.8. Vias Tumorigênicas .......................................................... pág. 108
4.3.9. Enzimas relacionadas à Quimiorresistência ..................... pág. 109
5. DISCUSSÃO ................................................................................................. pág. 112
5.1. ANÁLISE CLÍNICO-EPIDEMIOLÓGICA ................................... pág. 112
5.2. ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA .................................................. pág. 114
5.3. ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA ........................................... pág. 116
5.3.1. Proliferação Celular .......................................................... pág. 116
5.3.2. Diferenciação Astrocítica ................................................. pág. 123
5.3.3. Supressores Tumorais ....................................................... pág. 124
5.3.4. Apoptose ........................................................................... pág. 132
5.3.5. Receptores da Família ErbB ............................................. pág. 134
5.3.6. Sinalização Intracelular .................................................... pág. 140
5.3.7. O Fator de Transcrição c-Myc .......................................... pág. 142
5.3.8. Enzimas relacionadas à Quimiorresistência ..................... pág. 147
5.3.9. Potenciais Alvos Moleculares .......................................... pág. 154
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................... pág. 159
7. CONCLUSÕES ............................................................................................ pág. 162
8. LIMITAÇÕES & COMENTÁRIOS ......................................................... pág. 163
22
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................... pág. 164
10. ANEXOS ....................................................................................................... pág. 185
ANEXO I – APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA pág. 186
ANEXO II – ORÇAMENTO GERAL ................................................... pág. 187
ANEXO III – FONTES DE FINANCIAMENTO ................................. pág. 188
ANEXO IV – DADOS GERAIS ............................................................ pág. 189
23
1. INTRODUÇÃO
1.1. CÂNCER
Se examinares um enfermo que padeça com tumores em sua mama e verificares
que a intumescência alastra-se por sua mama; se puseres tua mão sobre sua mama,
por cima desses tumores, e os perceberes muito frios, não existindo febre naquele
lugar quando tua mão o tocar; se não apresentarem granulações, não formarem
fluidos, não gerarem secreções líquidas e forem salientes ao teu toque. Deverás
dizer-lhe a seu respeito: “Tens tumores! Uma doença com a qual não poderei lutar”.
Não há tratamento. (Breasted, 1980, p. 388).
Admite-se que o trecho acima, retirado do papiro egípcio de Edwin Smith (1.600
a.C.),
configure o primeiro relato histórico do câncer (do grego karkinos, caranguejo). Sua
conclusão diagnóstica revela o caráter sentencial, a impotência e o temor que esta doença viria
despertar pelos milênios subseqüentes.
Atualmente, mesmo após importantes avanços no entendimento das neoplasias, o
câncer representa a segunda principal causa de mortalidade por doença no mundo, sendo
diagnosticados cerca de 10 milhões de novos casos a cada ano (Schottenfeld & Beebe-
Dimmer, 2005). No Brasil, para o ano de 2005, estão previstos 467.440 novos casos de câncer
(Brasil/INCA, 2004), além de 585.000 internações hospitalares na rede pública e cerca de
130.000 mortes por neoplasias (Brasil/DATASUS, 2005).
24
1.1.1. Definições em Oncologia
Um ser humano adulto é composto de aproximadamente 10
15
células. Os processos
fisiológicos necessitam que muitas destas se dividam e/ou se diferenciem como condição para
a manutenção do funcionamento do organismo. A despeito da enorme produção de novas
células, os organismos mantêm rígido controle sobre a proliferação celular e, por outro lado,
sobre a morte programada das células (apoptose) através de complexos mecanismos
moleculares (Bertram, 2001).
Qualquer fator que altere esses mecanismos no sentido da promoção da proliferação
e/ou sobrevivência celulares pode desencadear a neoplasia, literalmente um crescimento novo.
De forma didática, tais fatores são categorizados em ambientais (químicos, físicos e
biológicos), genéticos (mutações, amplificações, deleções e rearranjos) e epigenéticos
(alterações da expressão gênica), interagindo mutuamente na promoção e progressão tumoral
(Cotran et al., 2000).
Considera-se ainda a palavra câncer como termo a ser empregado exclusivamente
para tumores malignos, ou seja, aqueles capazes de se implantarem de forma descontínua em
relação ao tumor primário (metastatização). Assim, o termo neoplasia referir-se-ia mais
apropriadamente, de modo mais abrangente, aos distúrbios da proliferação celular. A
expressão tumor é admitida como sinônimo para neoplasia.
Dessa forma, define-se a transformação neoplásica como um processo multicausal no
qual os controles normais da proliferação celular, da apoptose e da interação célula-célula são
perdidos (Louis & Cavenee, 1997).
25
1.1.2. Bases Moleculares do Câncer
A hipótese molecular do câncer caracteriza a lesão genética não-letal como o cerne
do processo tumorigênico. Usualmente, um conjunto de alterações moleculares em diferentes
níveis de regulação é o responsável pelo estabelecimento do câncer, de modo que uma
simples modificação numa célula normal raramente é suficiente para deflagrar o surgimento
da neoplasia. Os principais alvos dessas lesões correspondem a três classes de genes
reguladores normais: os oncogenes, os genes supressores tumorais e os genes reguladores da
apoptose (Cotran et al., 2000).
Os oncogenes derivam dos proto-oncogenes – os genes responsáveis pelo crescimento
e diferenciação celulares normais. A ativação desses genes, secundária a alterações genéticas
(deleção, mutação, amplificação, rearranjo cromossômico, inserção viral, entre outras),
promovem a expressão das chamadas oncoproteínas. Essas proteínas são semelhantes aos
produtos normais esperados dos proto-oncogenes, mas apresentam-se destituídas de
elementos regulatórios efetivos e não dependem da liberação de fatores de crescimento ou de
outros sinais externos para sua expressão (Hanahan & Weinberg, 2000).
Observando os elementos implicados no fluxo normal da informação celular
(Figura 01), podemos facilmente perceber as possíveis repercussões de versões protéicas
alteradas na indução da proliferação celular e na expressão diferencial protéica. A
superexpressão de fatores de crescimento, a superexpressão/hiperativação autônoma dos
receptores de fatores de crescimento, a hiperativação de proteínas transdutoras de sinal e a
ativação aberrante de fatores de transcrição são exemplos de alterações resultantes da
expressão de oncoproteínas e que acabam por sensibilizar o processo de ativação do
crescimento celular (Rabenhorst et al., 1994).
26
FIGURA 01 – Representação esquemática do fluxo “normal” da informação celular. (1) Ligação do fator
de crescimento ao seu receptor específico na membrana celular; (2) Ativação transitória e limitada do receptor
do fator de crescimento que, por sua vez, induz a (3) liberação de proteínas transdutoras de sinal na parte interna
da membrana citoplasmática; (4) Ativação de fatores de transcrição nucleares que podem levar à (5) expressão
de proteínas necessárias para o funcionamento celular e/ou à (6) replicação, com conseqüente divisão celular.
O resultado final de todos esses estímulos consiste na ativação das células quiescentes
(fase G0), promovendo a progressão das células através das diversas fases (G1, S, G2 e M) do
ciclo celular. Durante a fase G1 (de g
ap 1), a célula está responsiva a sinais inibitórios ou
ativadores do crescimento. Logo depois, segue-se à fase S (de s
ynthesis), onde ocorre a
replicação do DNA. Esta é imediatamente seguida pela fase G2 (de g
ap 2), na qual a
integridade do DNA é verificada. Por fim, a célula entra na fase M (de m
itosis), dando origem
a duas células filhas (Sandhu & Slingerland, 2000).
A entrada e o seguimento no ciclo celular, por sua vez, são regulados por famílias de
proteínas denominadas quinases dependentes de ciclinas (CDK, de cyclin-dependent kinase),
ciclinas
e inibidores das CDKs. As CDKs compõem-se de um grupo de proteíno-quinases do
tipo serina-treonina, nomeadas de 1 a 9, que são expressas de modo constitutivo na célula,
porém na forma inativa. Estas são ativadas através da ligação às ciclinas (A, B, C e D) que, ao
27
contrário das CDKs, são sintetizadas somente durante fases específicas do ciclo celular.
Enquanto as ciclinas estimulam as CDKs, seus inibidores as silenciam e, por conseguinte,
exercem efeito inibitório no controle do ciclo celular (Cotran et al., 2000).
Embora todas as fases do ciclo celular sejam cuidadosamente monitoradas (Figura 02),
a transição G1-S representa um importante marco regulatório, visto que aquelas células que
atravessam esse ponto de checagem estão definitivamente comprometidas com a progressão à
fase S. Após o recebimento dos sinais que promovem seu crescimento, ocorre síntese de
ciclinas do tipo D, que se ligam às CDK4 e CDK6 (início de G1). Um pouco depois ocorre a
síntese de ciclina E que, por sua vez, liga-se a CDK2. Os complexos ciclina D/CDK4 ou
CDK6 e ciclina E/CDK2 fosforilam a proteína do retinoblastoma (pRb). Trata-se de uma
reação crítica: a pRb não fosforilada retém os fatores de transcrição da família E2F, todavia
sua fosforilação promove a liberação desses fatores. As proteínas E2F ativam a transcrição de
vários genes cujos produtos são essenciais para a progressão das células através da fase S
(DNA-polimerases, dihidrofolato-redutase, timidilato sintase, entre outros) (Kamb, 1995).
A progressão S-G2 é facilitada pela ativação da CDK2 e CDK1 pela ciclina A. Os
alvos da fosforilação promovida pelos complexos ciclina A/CDK2 ou CDK6 não são
completamente conhecidos. No início da fase G2 surge a ciclina B que, ao formar complexos
com a CDK1, ajuda a progressão G2-M através da fosforilação de várias proteínas essenciais
para a mitose (Malumbres & Barbacid, 2001).
A atividade das CDKs é regulada por duas famílias de inibidores do ciclo celular: a
família INK4 (de inhibitor of CDK4), composta pelas proteínas p15
INK4b
, p16
INK4a
, p17
INK4c
e
p18
INK4d
, que inibem seletivamente os complexos ciclina D/CDK4 ou CDK6, e a família
CIP1/KIP1 (de CDK2 interacting protein 1/kinase inhibitory protein 1), composta pelas
proteínas p27
KIP1
, p57
KIP1
e p21
CIP1
, que inibem as CDKs de um modo geral. A proteína
28
p21
WAF1/CIP1
é codificada pelo gene WAF1 (de wild-type p53 activated fragment 1), sendo
produzida mediante ativação do fator de transcrição p53 (Sandhu & Slingerland, 2000).
FIGURA 02 – Representação esquemática da regulação do ciclo celular. Os complexos ciclina/CDK atuam
de forma específica quanto às fases do ciclo celular, conforme ilustrado pelas setas maiores (em tons de azul). O
principal evento da transição G1-S é representado pela fosforilação da pRb, com conseqüente liberação dos
fatores de transcrição E2F. A família CIP/KIP de inibidores de CDKs pode atuar em todas as fases do ciclo,
enquanto a família INK4 age somente na fase G1. A proteína p53 atua como ativadora transcricional da proteína
p21. Adaptado de Cotran et al. (2000).
A partir desses conceitos, torna-se fácil perceber que as alterações que promovem a
ativação das CDKs favorecem a proliferação celular. Sabidamente, muitos tipos de câncer
demonstram hiperexpressão dos genes das ciclinas ou mesmo das CDKs. Há também a
constatação da menor expressão ou ausência dos inibidores das CDKs contribuírem para a
instalação do processo neoplásico, visto que os sinais impeditivos da progressão do ciclo
celular estariam comprometidos. Por esta atividade, os genes dos inibidores de CDKs compõe
a classe dos supressores tumorais, às quais somam-se os genes p53 e Rb (MacLeod, 2000).
29
As vias inibitórias do crescimento são menos compreendidas do que aquelas
implicadas na sua promoção, sendo sugerido que estas seguiriam passos semelhantes às
cascatas mitogênicas (Figura 01). O estímulo proviria do ambiente extracelular, atuaria
através receptores de superfície celular específicos [como o receptor do fator de crescimento
tissular (TGF-β, de tissue growth factor,)], modulando a expressão de proteínas transdutoras
de sinal [como a neurofibromina (produto do gene NF-1)], que regulariam a expressão das
moléculas controladoras do ciclo celular, descritas anteriormente, coibindo a transcrição ou a
replicação do DNA (Malumbres & Barbacid, 2001).
A identificação de novos genes supressores tumorais, assim como o melhor
delineamento das funções de vários outros genes que atuam virtualmente como tal, tende a
aumentar quantitativa e qualitativamente o entendimento das complexas e intrincadas vias
inibitórias ativadas pelos supressores tumorais. A detecção de deleções cromossômicas, os
estudos de perda de heterozigose (LOH, de loss of heterozigozity) e a análise de mecanismos
de regulação pós-transcricional em células neoplásicas são exemplos de abordagens que
freqüentemente apontam potenciais genes supressores tumorais (MacLeod, 2000).
O conjunto das proteínas supressoras tumorais é responsável pela regulação rotineira
da atividade proliferativa. Por outro lado, situações onde estão presentes mecanismos
impeditivos da expressão ou da atuação dessas moléculas podem resultar no descontrole da
função proliferativa, desencadeando o processo neoplásico (Louro et al., 2002).
A ativação dos supressores tumorais ocorre frente à constatação de lesões no material
genético das células e objetiva a promoção dos sistemas de reparo. Caso os danos sejam
inexoráveis, são ativadas vias indutoras de morte celular programada – a apoptose. A
maquinaria bioquímica responsável pela apoptose depende de uma família de proteases
denominadas caspases. Estas são sintetizadas a partir de seus precursores inativos, ou
procaspases. Uma vez ativadas, as caspases clivam (e assim ativam) outras procaspases,
30
resultando na amplificação da cascata proteolítica. Este mecanismo, além de destrutivo e
autopropagado, é também irreversível (Alberts et al., 2002)
A ativação das caspases pode ser deflagrada não só através de estímulos intracelulares,
conforme já descrito, como também por incentivos extracelulares (Figura 03). Células
normais, como os linfócitos T killer, podem induzir a apoptose de células tumorais pela
produção de FAS (também conhecido por APO-1, de apoptosis inducing protein 1), um
ligante específico dos receptores CD95. A ligação FAS-CD95 ativa o receptor, que se acopla
à proteína FADD (de FAS-associated death domain), uma carreadora da procaspase
iniciadora tipo 8. Essa interação permite a liberação das procaspases que, após sofrerem auto-
ativação, desencadeiam a liberação de caspases executoras (Pelengaris et al., 2002).
A caspase-8 também pode ativar proteínas pró-apoptóticas (Bax, Bid, Bad, entre
outras) que promovem a formação de poros na membrana externa mitocondrial, denominada
fenômeno MOMP (de mitochondrial-outer-membrane permeabilization). Isto ativa a
liberação do citocromo c no citoplasma que, associado ao APAF1 (de apoptotic protease-
activating factor 1) e à procaspase-9, formam o chamado apoptosomo. Na presença de ATP, a
procaspase-9 é ativada, levando à liberação em cadeia de caspases executoras, incluindo a
caspase-3. A proteína anti-apoptótica Bcl-2 inibe o fenômeno MOMP, modulando a ativação
em série das caspases (Amarante-Mendes & Green, 1999).
A morte celular mediada por caspases difere da necrose em diversos aspectos,
principalmente por suas características morfológicas. Ao receber o sinal apoptótico, a célula
encolhe de tamanho, degrada sua cromatina e entra em colapso estrutural, mas sem ruptura
brusca da membrana, evitando o surgimento de edema e a ativação do processo inflamatório –
as principais peculiaridades do processo necrótico (Cotran et al., 2000).
31
FIGURA 03 – Representação esquemática das vias apoptóticas mediadas pela ativação do receptor
CD95/FAS. A liberação de caspases executoras pode se dar através de indução [a] direta, pela caspase-8
(procaspase-8 auto-ativada), ou [b] indireta, pelo surgimento do fenômeno MOMP, secundário a ativação de
proteínas pró-apoptóticas também pela caspase-8. Adaptado de Pelengaris et al. (2002).
1.2. TUMORES PRIMÁRIOS DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
1.2.1. Epidemiologia
Os tumores primários do Sistema Nervoso Central (SNC) correspondem a menos de
2% de todas as neoplasias humanas. A incidência anual desses tumores varia entre 4,9 a
16/100.000, sendo os maiores índices geralmente verificados em países desenvolvidos devido
a maior cobertura em saúde e tecnologia (neuroimagem de alta resolução), além de
organizados e confiáveis registros de câncer (Pekmezovic et al., 2002). No Brasil não existem
registros epidemiológicos específicos para os tumores originários do SNC. Os únicos dados
disponíveis dizem respeito ao município de São Paulo, onde se estima uma incidência de
5,4/100.000 para as mulheres e 6,7/100.000 para os homens a cada ano (Mirra et al., 2001).
32
Nos Estados Unidos da América (EUA), a prevalência dos tumores do SNC aproxima-
se de 130/100.000, sendo diagnosticados anualmente cerca de 40.000 novos casos de tumores
benignos (42,5%) e malignos (57,5%) do SNC. Os caucasianos representam o grupo étnico
mais freqüentemente afetado, em comparação aos descendentes de origem africana ou
asiática. Ainda nesse país, cerca de 13.000 mortes foram catalogadas no ano de 2002
decorrentes somente dos tumores malignos (CBTRUS, 2002).
A despeito da baixa incidência, os tumores primários do SNC representam os mais
freqüentes tumores sólidos da infância e a segunda causa de mortalidade por neoplasias nesta
faixa etária, ficando atrás somente das leucemias. Nos adultos, a sobrevida média após cinco
anos do diagnóstico de tumor maligno primário do SNC é de 32%, constituindo a terceira e
quarta causa de mortalidade por câncer entre homens e mulheres, respectivamente
(Schottenfeld & Beebe-Dimmer, 2005).
1.2.2. Etiologia
Apesar dos enormes esforços empreendidos na tentativa de se detectar correlações
epidemiológicas entre exposição ocupacional, dieta e hábitos de vida dos pacientes e o
surgimento de tumores do SNC, nenhum destes fatores demonstrou significância estatística. A
etiologia dos tumores originados no SNC ainda é pouco compreendida, à exceção do impacto
das síndromes neoplásicas hereditárias (Neurofibromatose, Li-Fraumeni, Turcot, entre outras)
(Greenberg et al., 1996).
Inúmeros trabalhos sugerem a possibilidade de substâncias químicas (formaldeído,
cloreto de vinil, solventes orgânicos), campos eletromagnéticos (telefones móveis, linhas de
transmissão), alimentos (conservantes nitrosos), traumatismos cranianos, tabagismo, drogas
33
(barbituratos) desencadearem a formação de tumores no SNC, entretanto todos estes carecem
de consistência epidemiológica e comprovação multicêntrica (Adams et al., 1998).
O único fator ambiental inequivocamente associado ao maior risco de
desenvolvimento de tumores do SNC consiste na exposição à radiação (radiografias,
radioterapia). Estudos experimentais apontam ainda alguns vírus como potenciais agentes
etiológicos, todavia não se observa aumento da incidência de tumores do SNC em populações
sabidamente mais expostas aos patógenos relacionados. Relata-se ainda que estados de
imunossupressão (síndrome da imunodeficiência adquirida, pós-transplantados) predisporiam
à manifestação de tumores próprios do SNC, contudo essa correlação só foi comprovada no
caso dos linfomas primários do SNC (Lantos et al., 2002).
1.2.3. Classificação Histopatológica
Os tumores primários do SNC exibem diversas apresentações histológicas e origens
citológicas, refletindo a complexidade tecidual e a variedade de tipos celulares características
do sistema nervoso. À multiplicidade morfológica dessas neoplasias acrescenta-se ainda a
diversidade de manifestações radiológicas e de comportamentos biológicos. Todos esses
fatores explicam as grandes dificuldades encontradas para a formatação de uma classificação
dos tumores do SNC com linguagem e aceitação universais (Kleihues & Cavenee, 2000).
O árduo trabalho na elaboração de critérios para classificação dos tumores primários
do SNC, iniciado ainda no século XIX por Virchow, culminou com a Classificação
Histológica dos Tumores do Sistema Nervoso Central, parte integrante da Classificação
Histológica Internacional dos Tumores, publicada em 1979 pela Organização Mundial da
34
Saúde (OMS). Este sistema adotou o princípio básico da tipificação histológica: as entidades
tumorais seriam definidas primariamente pela morfologia das células e pela sua disposição
tecidual (Zülch, 1979).
Os novos conhecimentos sobre a histogênese do sistema nervoso e a genética do
câncer, obtidos principalmente a partir do emprego de técnicas imuno-histoquímicas e/ou
moleculares, suscitaram revisões à classificação original nos anos de 1993, 1997 e 1999.
Assim, os grandes debates internacionais acerca da classificação da OMS resultaram no seu
aprimoramento e consolidaram sua adoção mundial (Kleihues & Cavenee, 2000).
1.3. ASTROCITOMAS
Os astrocitomas constituem o principal tipo histológico dentre os tumores primários do
SNC (Figura 04). O termo astrocitoma foi cunhado por Virchow (1863) para designar os
tumores compostos predominantemente por astrócitos atípicos (núcleos aumentados,
alongados ou hipercromáticos com citoplasmas escassos, poucos definidos), porém só foi
empregado definitivamente na classificação proposta por Bailey e Cushing, em 1926.
Os astrócitos fazem parte das células gliais (Figura 05) – elementos celulares
responsáveis pelo suporte tecidual, nutrição, equilíbrio iônico, metabolismo de
neurotransmissores e defesa imunológica dos neurônios. Estas células são representadas, além
dos astrócitos, pelos oligodendrócitos, pelos ependimócitos e pelas células da micróglia (Gray
et al., 2004).
35
FIGURA 04 – Distribuição percentual dos tumores primários do SNC diagnosticados nos EUA no período
de 1995 a 1999 segundo a histopatologia (n=37.788). Fonte: CBTRUS - Central Brain Tumor Registry of the
United States (2002).
Recentes evidências sugerem ainda que as células astrocíticas, nove vezes mais
numerosas que os neurônios, comunicam-se entre si através de sinais químicos, formando
uma rede independente e paralela à neuronal. Esta comunicação neurônio-glia influenciaria a
formação de sinapses e indicaria quais conexões neuronais se fortaleceriam ou
enfraqueceriam com o tempo – fatores determinantes na fisiologia do aprendizado e do
armazenamento da memória duradoura (Fields & Stevens-Grahan, 2002).
FIGURA 05 – Ilustração representativa da interação entre as células gliais (astrócitos e oligodendrócitos)
e os neurônios. Os astrócitos nutrem os neurônios, além de envolver e regular as sinapses. Os oligodendrócitos
produzem a mielina que recobre os axônios. Adaptado de Fields (2004).
36
1.3.1.Classificação e Graduação dos Astrocitomas
Na recente classificação histopatológica da OMS para os tumores próprios do SNC,
admite-se que as diversas apresentações histológicas dos astrocitomas possam ser divididas
em diferentes graus de malignidade, variando de I a IV (Tabela 01).
TABELA 01 – Tumores de origem neuroepitelial - representação parcial
(tumores astrocíticos e correlatos) da classificação segundo a OMS
TUMORES DE ORIGEM NEUROEPITELIAL
código ICD-O /
SNOMED
1
comportamento
biológico
2
Tumores Astrocíticos
GRAU I Astrocitoma Pilocítico 9421 1
Astrocitoma Difuso 9400 3
Astrocitoma Fibrilar 9420 3
Astrocitoma Protoplásmico 9410 3
GRAU II
Astrocitoma Gemistocítico 9411 3
GRAU III Astrocitoma Anaplásico 9401 3
Glioblastoma (Multiforme) 9440 3
Glioblastoma de Células Gigantes 9441 3
GRAU IV
Gliossarcoma 9442 3
Outras Variantes
Xantoastrocitoma Pleomórfico (Grau II ou III) 9424 3
Astrocitoma Subependimário de Células Gigantes (Grau I) 9384 1
Gliomas Mistos
Oligoastrocitoma (Grau II) 9382 3
Oligoastrocitoma Anaplásico (Grau III) 9382 3
Tumores Neuronais e Neuro-Gliais
Astrocitoma Infantil Desmoplásico (Grau I) 9412 1
1
Código adotado pela Classificação Internacional de Doenças para Oncologia (ICD-O) e pela Nomenclatura
Sistematizada em Medicina (SNOMED).
2
O comportamento biológico tumoral é qualificado em (0) benigno, (1)
malignidade baixa, limítrofe ou incerta, (2) lesões in situ e (3) maligno. Adaptado de Kleihues et al. (2002).
Essa graduação resulta do reconhecimento, através da análise histológica rotineira por
microscopia óptica, de indicadores de anaplasia (atipia nuclear, pleomorfismo, atividade
mitótica, hiperplasia endotelial e necrose) típicos de cada variante tumoral. Como regra geral,
o grau tumoral é baseado nas áreas de maior atipia, assumindo que esta população de células é
37
a que determina o curso da doença. Além de manifestar o comportamento biológico tumoral,
permitindo inferências prognósticas, o acúmulo de achados anaplásicos parece refletir a
progressão das alterações moleculares adquiridas durante o processo de transformação
neoplásica (Kleihues & Cavenee, 2000).
No esquema de graduação adotado pela OMS, a presença de atividade mitótica define
os tumores de alto grau (III e IV). A presença de necrose tumoral, acompanhada ou não por
hiperplasia endotelial, delimita o grau IV. A detecção unicamente de atipia citológica
(pleomorfismo celular e/ou atipia nuclear) estabelece o grau II. Os tumores do grau I
consistem em entidades distintas: além da ausência de anaplasia, tem sua gradação definida
ainda por parâmetros clínicos (idade do(a) paciente, localização tumoral, aspecto radiológico)
(Burger et al., 2002).
1.3.2. Caracterização dos Astrocitomas
ASTROCITOMAS GRAU I (OMS) – ASTROCITOMA PILOCÍTICO. São tumores de
crescimento lento, geralmente de origem cerebelar (>80%). Macroscopicamente, apresentam-
se como massas bem delimitadas, na maioria das vezes císticas, sem infiltração dos tecidos
subjacentes. Microscopicamente, são constituídos por células pilóides bipolares que se
organizam numa densa rede fibrilar, muitas vezes com microcistos de conteúdo mucinoso. A
distribuição radial do tecido tumoral ao redor de vasos sanguíneos origina o aspecto de
“pseudo-rosetas” perivasculares. A degeneração dos processos fibrilares resulta na deposição
de corpos eosinofílicos brilhantes, classicamente descritos como em “forma de salsicha” – as
fibras de Rosenthal, típicas desses tumores. Pode haver considerável pleomorfismo nuclear,
todavia este não está associado com fenômenos anaplásicos ou aumento de celularidade.
38
Mitoses são raras, comumente ausentes. A proliferação vascular pode ser extensa, contudo sua
presença não representa malignidade nesses tumores (Figura 06[b]) (Louis & Cavenee, 1997).
ASTROCITOMAS GRAU II (OMS). São neoplasias com alto grau de diferenciação
celular, baixo crescimento e potencial infiltrativo sobre estruturas contíguas. Podem ser
localizados em qualquer parte do SNC. Mostram-se como massas homogêneas, de bordos
mal-definidos, ocasionalmente com a formação de cistos. A histopatologia demonstra
aumento irregular da densidade celular com atipia nuclear e pleomorfismo proeminentes. Nas
áreas mais compactas, os processos citoplasmáticos formam uma rede fibrilar, de aspecto
microcístico. Usualmente, não são visualizadas figuras mitóticas. De acordo com o tipo
celular predominante, três variantes podem ser distinguidas: (1) Fibrilar, a mais freqüente,
com citoplasma escasso e núcleos hipercromáticos anômalos; (2) Gemistocítico, onde
predominam células de citoplasma abundante e eosinofílico, com núcleos excêntricos,
repousando sobre denso fundo fibrilar (denominadas por gemistócitos) e (3) Protoplásmico, a
mais rara, formada por pequenos astrócitos neoplásicos com discretos processos filamentosos
(Figura 06[c e d]) (Ironside et al., 2002).
ASTROCITOMAS GRAU III (OMS) – ASTROCITOMA ANAPLÁSICO. Apresentam-
se como tumores de contornos irregulares com tendência infiltrativa. Surgem em qualquer
local do SNC e demonstram rápido crescimento. Microscopicamente, observa-se aumento da
celularidade (multifocal ou difuso) associado a marcante pleomorfismo e atipia nuclear.
Detectam-se ainda células astrocíticas pouco diferenciadas e freqüentes figuras mitóticas.
Podem ocorrer pequenos focos de necrose e de proliferação endotelial, indicando potencial
progressão ao grau IV (Figura 06 [e]) (Vinters et al., 1998).
ASTROCITOMAS GRAU IV (OMS) – GLIOBLASTOMA MULTIFORME.
Representam os mais malignos neoplasmas de origem astrocítica. Podem se desenvolver a
partir de astrocitomas grau II ou III, quando são designados de “secundários”, ou surgirem de
39
novo, sem evidências de lesões precursoras, sendo denominados de “primários”. Localizam-se
preferencialmente nos hemisférios cerebrais, particularmente nas regiões fronto-temporal e
parietal. A despeito do rápido crescimento e do grande potencial infiltrativo, raramente
invadem o espaço subaracnóideo e, assim, dificilmente produzem metástases.
Histologicamente, demonstram grande heterogeneidade. O exuberante pleomorfismo celular
manifesta-se através de células bipolares, fusiformes, fasciculadas, pequenas (indiferenciadas)
ou gigantes, contendo inclusões lipídicas e granulações citoplasmáticas. Os núcleos são
comumente aberrantes, por vezes múltiplos. A presença de necrose (secundária ao insuficiente
suprimento sanguíneo tumoral) ocorre de duas formas distintas: em grandes áreas necróticas,
com focos hemorrágicos dispersos, ou em pequenas clareiras irregulares, múltiplas, rodeadas
por pequenas células tumorais fusiformes. Esta última, designada como necrose geográfica ou
em pseudopaliçada, configura achado típico dos glioblastomas. A proliferação microvascular
é outra marca histológica dos tumores do grau IV, aparecendo como tufos de aspecto
glomerulóide rodeando as áreas necróticas. Admite-se que a hiperplasia endotelial resulta de
estímulos neoangiogênicos sobre capilares pré-existentes e/ou do remodelamento vascular,
através da mobilização de pericitos e células musculares lisas. Podem ainda ocorrer focos de
metaplasia epitelial, exibindo rolhas queratínicas, bem como aglomerados de linfócitos
perivasculares. As duas variantes histológicas desses tumores são (1) o glioblastoma de
células gigantes, com o predomínio de células gigantes multinucleadas bizarras assentadas
sobre estroma rico em reticulina, e (2) o gliossarcoma, com áreas tumorais variando entre o
aspecto gliomatoso e o mesenquimal, manifestando diferenciação condróide, osteóide,
rabdóide, entre outras (Figuras 06[f] e 07) (Lantos et al., 2002).
OUTROS TIPOS HISTOLÓGICOS. O Xantoastrocitoma Pleomórfico é uma variante
rara, caracterizada pela presença de células pleomórficas com inclusões lipídicas, geralmente
envolvidas por fibras reticulínicas. O Astrocitoma Subependimário de Células Gigantes
40
constitui entidade benigna, derivada das lesões hamartomatosas associadas à esclerose
tuberosa, sendo caracterizada pela mistura de populações celulares heterogêneas sobre uma
matriz fibrilar. Os Tumores Mistos (oligo-astrocíticos) representam a “colisão” entre fenótipos
tumorais astrocíticos e oligodendrocíticos. Já o Astrocitoma Infantil Desmoplásico é formado
por um agregado de células pouco diferenciadas, com predomínio de astrócitos neoplásicos,
distribuído sobre abundante matriz conjuntiva (Taillibert et al., 2004).
FIGURA 06 – Histopatologia dos tumores astrocíticos (HE, 400X). [a] Caso n
o
. 0.3 - Córtex Cerebral Não-
Tumoral: observam-se corpos celulares de neurônios piramidais, de formato triangular (seta amarela); astrócitos
normais, com núcleos grandes, arredondados e mais “frouxos” (setas pretas); células da micróglia, de núcleos
densos, alongados e em forma de vírgula (seta vermelha) e oligodendrócitos, com núcleos redondos (menores
que os dos astrócitos), densos e circundados por um halo claro, resultado da tumefação artefatual típica desses
componentes gliais (seta azul). [b] Caso n
o
. 04 - Astrocitoma Pilocítico Cerebelar, grau II (OMS): percebe-se
proliferação de astrócitos discretamente atípicos sob densa matriz fibrilar, com áreas de degeneração
microcística, onde figuram fibras de Rosenthal (setas azuis). O tecido tumoral desenvolve-se entre o tecido
cerebelar não-tumoral, sendo visualizadas células de Purkinje (setas pretas). [c] Caso n
o
. 16 - Astrocitoma
Fibrilar, grau II (OMS): evidencia-se baixa celularidade, com núcleos ovais e hipercromáticos sob fundo fibrilar.
[d] Caso n
o
. 15 - Astrocitoma Gemistocítico, grau II (OMS): predominam células de citoplasma abundante e
eosinofílico, com núcleos excêntricos, repousando sobre compacta matriz fibrilar. [e] Caso n
o
. 30 - Astrocitoma
Anaplásico, grau III (OMS): nota-se moderada celularidade, composta por astrócitos atípicos, pleomórficos, com
núcleos irregulares e hipercromáticos. Há ainda discreta proliferação endotelial, raras mitoses e degeneração
microcística. [f] Caso n
o
. 54 - Glioblastoma Multiforme, grau IV (OMS): percebe-se marcante pleomorfismo
celular, com núcleos gigantes, hipercromáticos (por vezes múltiplos), sendo observadas figuras mitóticas,
proliferação micro-vascular e áreas de necrose. Para maiores detalhes sobre os casos, consultar Anexo IV.
41
FIGURA 07 – Características histopatológicas dos Astrocitomas Grau IV (Glioblastoma Multiforme). [a]
Visão Geral. Há significante aumento da celularidade, expressivo pleomorfismo celular, áreas de proliferação
endotelial e abundante necrose (Caso n
o
. 45, HE, 200X); [b] Área de necrose em pseudopaliçada (Caso n
o
. 53,
HE, 200X); [c] Proliferação endotelial de aspecto glomerulóide (Caso n
o
. 45, HE, 400X); [d] Células gigantes
multinucleadas (Caso n
o
. 35, HE, 1.000X). Para maiores detalhes sobre os casos, consultar Anexo IV.
Apesar das distinções entre os diferentes graus dos astrocitomas serem também
sugeridas por particularidades epidemiológicas (Tabela 02) e radiológicas (Figura 08), a
rotina diagnóstica histopatológica permanece extremamente laboriosa, sendo marcada pela
subjetividade e pela imprecisão.
TABELA 02 – Dados epidemiológicos referentes aos tumores astrocíticos diagnosticados nos
EUA no período de 1995 a 1999, distribuídos de acordo com a graduação histológica da OMS
Grau
Histológico
(OMS)
Percentual (%)
entre os tumores
primários do SNC
Percentual (%)
entre os
astrocitomas
Média de
idade ao
diagnóstico
Proporção
Masculino /
Feminino
Percentual médio
(%) de sobrevida
em 5 (cinco) anos
Incidência anual
(por 100.000
habitantes)
I
2,10 6,08 13 1,09 88,90 0,29
II
5,50 15,80 44 1,36 39,10 0,77
III
3,70 10,76 52 1,20 28,00 0,51
IV
23,00 67,36 65 1,26 2,90 3,24
TOTAL
34,30 100,00 43 1,26 32,00 4,81
Fonte: CBTRUS - Central Brain Tumor Registry of the United States (2002).
42
FIGURA 08 – Estudos tomográficos por Ressonância Magnética Nuclear (RMN) representativos dos
tumores astrocíticos. [a] Caso n
o
. 06 - Astrocitoma Pilocítico, grau I (OMS): corte sagital em T1 com contraste
paramagnético (gadolínio) demonstrando massa cística cerebelar isointensa com nodulações discretamente
captantes; há deslocamento anterior do tronco cerebral e hidrocefalia obstrutiva. [b] Caso n
o
. 24 - Astrocitoma
Fibrilar, grau II (OMS): corte axial em T1 revela lesão frontoinsular hipointensa à direita, mal-definida, com
componentes císticos; percebe-se deslocamento e compressão do lobo frontal direito. [c] Caso n
o
. 31 -
Astrocitoma Anaplásico, grau III (OMS): corte axial em T1 mostra massa fronto-parietal hipodensa, mal
delimitada; observa-se edema peritumoral com deslocamento da linha média. [d] Caso n
o
. 49 - Glioblastoma
Multiforme, grau IV (OMS): corte axial em T1 após contraste paramagnético (gadolínio) exibindo lesão frontal
bilateral (predomínio à direita), irregular, com captação de contraste (aspecto anelar multifocal); as áreas centrais
hipointensas correspondem à necrose. Para maiores detalhes sobre os casos, consultar Anexo IV.
43
1.3.3. Aspectos Clínicos dos Astrocitomas
Enquanto a duração da história clínica e as perspectivas de sobrevida estão mais
diretamente relacionadas ao comportamento biológico do tipo tumoral, os sintomas
determinados pelos astrocitomas dependem primariamente da localização dessas neoplasias
no SNC (Greenberg et al., 1996).
Os astrocitomas cerebelares geralmente cursam com ataxia, náuseas e disfunções dos
pares cranianos. Nos gliomas do nervo óptico podem ser observadas redução da acuidade
visual e irregularidades no campo visual. Neoplasias do tronco cerebral promovem déficits
relacionados aos nervos cranianos. O acometimento neoplásico hipotalâmico é tipicamente
associado a síndromes endócrinas (puberdade precoce, diabetes insipidus, entre outras),
desequilíbrio hidro-eletrolítico e desregulação autonômica (Lantos et al., 2002).
Entre os tumores supratentoriais, aqueles que se manifestam nos lobos frontais e/ou
parietais costumam ocasionar epilepsia, hemiparesia e transtornos de personalidade. Já os
temporais, além de crises convulsivas, favorecem o aparecimento de distúrbios da fala e da
linguagem. Qualquer uma dessas lesões que promova oclusão ou obstrução das vias de
drenagem do fluido cérebro-espinhal pode desencadear aumento da pressão intracraniana,
levando ao aparecimento de cefaléia, papiledema e vômitos (Adams et al., 1998).
1.3.4. Terapêutica dos Astrocitomas
A remoção cirúrgica, total ou parcial, continua sendo a principal abordagem
terapêutica contra os tumores do SNC. A máxima extirpação do tecido tumoral, o mais
precocemente possível, pode resultar em cura. Outros benefícios da terapia cirúrgica
44
consistem na possibilidade de definição precisa do diagnóstico histopatológico, na reversão
dos déficits neurológicos instalados e na minimização dos riscos de progressão tumoral.
Contudo, o potencial infiltrativo da maioria dos astrocitomas, bem como a capacidade de
migração local das células tumorais, pode tornar a intervenção cirúrgica inexeqüível ou
ineficaz. Além disso, a cirurgia pode agravar ou mesmo desencadear morbidades neurológicas
(Ellison et al., 2004).
A radioterapia é usualmente empregada no tratamento dos astrocitomas de alto grau
(III e IV), ao passo que seus benefícios no tratamento de tumores de baixo grau (I e II)
despertam controvérsia. Considerando os efeitos deletérios da radiação sobre tecidos sadios, a
prática atual restringe o uso da radiação focal somente para tumores de limites precisos,
utilizando em média 60 Grays como dose total (Zalutsky, 2004).
A quimioterapia tem demonstrado importante papel adjuvante no tratamento de
tumores astrocíticos de baixo grau em crianças (Castello et al., 1998). Todavia, agentes
quimioterápicos isoladamente ou associados à radioterapia não têm revelado aumentos
significativos na sobrevida dos pacientes. As principais drogas utilizadas em esquemas contra
os astrocitomas constam de nitrosuréias (ACNU; BCNU; CCNU), demais alquilantes
(procarbazina; temozolomida), alcalóides (vincristina), compostos platínicos (carboplatina;
cisplatina) e inibidores da Topoisomerase I (topotecano; irinotecano). A pouca eficácia da
quimioterapia no tratamento dos tumores do SNC tem sido apontada como resultado da baixa
penetração dos fármacos nos tecidos (causada pela seletividade da barreira hematencefálica e
pela coesão dos conjuntos celulares adjacentes aos tumores), bem como pela resistência
primária ou adquirida aos diferentes quimioterápicos (Stupp & Regg, 2003).
Há ainda uma significante proporção de pacientes portadores de astrocitomas de baixo
grau que são seguidos conservadoramente, sendo tratados unicamente com anticonvulsivantes
e acompanhados por neuro-radiologia.
45
Quanto aos tumores de alto grau reicidivantes, 20% dos pacientes são candidatos à
nova cirurgia. Novas radiações são limitadas pela toxicidade, mas os pacientes podem ser
conduzidos à radiocirurgia por esterotaxia (gamma knife, implantes radioativos) ou
braquiterapia intersticial (Nwokedi et al., 2002).
No Estado do Ceará, a abordagem cirúrgica prevalece ainda mais sobre a radioterapia
e a quimioterapia no tratamento dos tumores astrocíticos. O difícil acesso aos serviços
especializados, assim como aos métodos de neuroimagem, resultam em freqüente
retardamento diagnóstico. Por sua vez, este atraso corrobora para redução das possibilidades
quanto ao uso da radiação ou mesmo da ressecabilidade tumoral. Raros casos são designados
à quimioterapia devido ao insucesso e, por vezes, à indisponibilidade das drogas específicas
dos esquemas contra tumores do SNC. Recursos mais avançados, como radiocirurgia e
neuronavegação, são atualmente indisponíveis.
1.4. ALTERAÇÕES GENÉTICAS NOS ASTROCITOMAS
Os recentes avanços na área da biologia molecular apontam as distinções entre os
diferentes graus dos astrocitomas como reflexo de alterações genéticas específicas. Tais
eventos moleculares seriam responsáveis não só pela promoção, mas também pela progressão
tumoral em malignidade, conduzindo fenótipos de baixa gradação a categorias mais elevadas.
Os Astrocitomas Grau I exibem irregularidades genéticas distintas dos demais graus, o
que reforça a teoria de rara progressão para fenótipos mais malignos. Estudos citogenéticos
demonstram variação cariotípica de normal a aberrante, com ganho dos cromossomos 7, 8 e
22 e ganho ou deleção do cromossomo 19. Ocasionalmente, detectam-se perdas no
cromossomo 17q, incluindo a região codificadora do gene NF1. A neurofibromina, produto do
46
gene NF1, possui funções supressoras tumorais, fazendo crer que a desregulação desse gene
poderia assumir papel relevante na evolução para o astrocitoma pilocítico (Kleihues &
Cavenee, 2000).
A formação do Astrocitoma Grau II é associada a, pelo menos, três alterações:
inativação do gene supressor tumoral p53, perda do cromossomo 22q e ativação do fator de
crescimento derivado de plaqueta (PDGF, de platelet-derived growth factor) e/ou do seu
receptor (Torsten & Wiestler, 1997).
A alteração do p53 foi um dos primeiros eventos identificados na tumorigênese dos
astrocitomas, sendo considerada uma etapa inicial. O gene p53 (cromossomo 17p) codifica o
fator de transcrição homônimo que participa de inúmeros programas celulares, incluindo a
regulação do ciclo celular, a resposta aos danos ao DNA e a apoptose. Sua inativação,
usualmente por mutação de uma cópia e perda cromossômica do alelo restante, é descrita em
aproximadamente 60% de todos os tumores astrocíticos (Chosdol et al., 2002).
A perda do cromossomo 22q é detectada em 20-30% dos astrocitomas, sugerindo a
possível localização de um gene supressor tumoral neste cromossomo. Análises com
hibridação genômica comparativa (CGH, de c
omparative genomic hybridisation) destacam
outras alterações cromossômicas (ganho do 7q, amplificação do 8 e deleção do 6) como
potencialmente envolvidas no surgimento dos astrocitomas (Louis & Cavenee, 1997).
Dos vários fatores de crescimento expressos pelos astrocitomas, o PDGF é o mais
claramente implicado no processo tumorigênico, especialmente nos tumores do grau II. O
mecanismo de superexpressão do PDGF, bem como de seu receptor (PDGFR), ainda não foi
totalmente esclarecido, embora alguns tumores demonstrem amplificação do gene codificador
do PDGFR subtipo alfa. A expressão de PDGF também se correlaciona com a inativação do
p53 (Louis, 1997).
47
A transição para o Astrocitoma Grau III é vinculada à inativação de genes supressores
tumorais nos cromossomos 9p e 13q, bem como à amplificação do cromossomo 12q. Todas
essas alterações parecem convergir no sentido da não-expressão ou da ativação por
fosforilação proteína Rb (pRb), provocando a liberação de fatores de transcrição E2F
(promotores da transição G1-S) (Korshunov et al., 2002).
A perda do cromossomo 13q é observada em um terço dos astrocitomas, sendo o sítio
13q13 o local do gene codificador da pRb. A perda ou mutação dos genes supressores
tumorais p16 (CDKN2A) e p15 (CDKN2B) (localizados no cromossomo 9p21), bem como o
aumento da expressão ou amplificação do gene da CDK4 (situado no cromossomo 12q),
resultam no aumento da fosforilação da pRb (Figura 02).
Outro gene associado à progressão para o grau III consiste num suposto supressor
tumoral localizado no cromossomo 19q. A perda do cromossomo 19q parece ocorrer
exclusivamente em tumores gliais, sendo detectada em todos os graus dos astrocitomas,
especialmente no Astrocitoma Grau III (44%) (Chosdol et al., 2002).
Distintas vias moleculares podem caracterizar a progressão para o Glioblastoma: uma
comumente observada em pacientes jovens, a partir dos astrocitomas grau II ou III
(Astrocitoma Grau IV Secundário), e outra típica em pacientes idosos, sem história de
astrocitoma de baixo grau precedente, originada diretamente das células precursoras
(Astrocitoma Grau IV Primário). Todavia, a perda do cromossomo 10 é relatada como um
evento comum a todos os Astrocitomas Grau IV, sendo encontrada em 60-85% desses
tumores (Hilton & Melling, 2004).
O Astrocitoma Grau IV Secundário demonstra perda de heterozigose em grandes
regiões do cromossomo 10 (10p, 10q23 e 25-26). O gene supressor tumoral PTEN/MMAC1
(de phosphatase and tensin homology / mutated in multiple advanced cancer 1), situado no
cromossomo 10q23, também pode aparecer mutado nos tumores grau IV. O gene DCC (de
48
deleted in colon cancer), outro supressor tumoral localizado no cromossomo 18q21, está
ausente em 7% dos astrocitomas de baixo grau e em 53% dos glioblastomas, sugerindo sua
participação na gênese desses tumores. O gene DMBT1 (de deleted in malignant brain
tumours 1), situado no cromossomo 10q25-26, encontra-se deletado em 23-38% dos
astrocitomas grau IV secundários, sendo considerado mais um candidato a supressor tumoral
(Kleihues & Cavenee, 2000).
No Astrocitoma Grau IV Primário ocorre a amplificação do receptor do fator de
crescimento epidérmico (EGFR, de epidermal growth factor receptor) na maioria dos casos,
simultaneamente à perda do cromossomo 10. O EGFR consiste num receptor de membrana do
tipo tirosino-quinase envolvido no controle da proliferação celular (Louis et al., 2002).
Julga-se que menos de 10% dos glioblastomas primários exibam mutação do p53, não
sendo verificada concomitância entre esta e a superexpressão de EGFR. Tal fato indica que
esses eventos são mutuamente exclusivos, reiterando a diferença entre a progressão para os
tumores de novo e para os secundários, sendo nestes últimos tipicamente detectada a mutação
do p53. Entretanto, a atividade transcricional da proteína p53 nos astrocitomas grau IV
primários está algumas vezes abolida, visto a formação de complexos com a proteína MDM2
(de m
urine double minute clone 2). O gene MDM2, encontrado no cromossomo 12q13-14, é
descrito como superexpresso em 50% dos glioblastomas primários (Chosdol et al., 2002).
Ainda quanto à progressão para os tumores grau IV, a desregulação do gene CDKN2A
ocasiona a perda da expressão do supressor tumoral p16 o que, por sua vez, promove a
superexpressão/amplificação de CDKs e a ativação da pRb. A promoção destas vias é
observada em 36% dos astrocitomas grau IV primários, contrastando com 4% nos tumores
secundários. Outro subconjunto dos glioblastomas é formado por aqueles provenientes da
evolução de oligodendrogliomas e oligoastrocitomas, caracterizados pela perda dos
cromossomos 19q e 1p, além do 10 (Louis & Gusella, 1995).
49
Resumidamente, os astrocitomas malignos podem se originar através de diferentes
caminhos moleculares: a partir de astrocitomas de baixo grau, via inativação do p53; de novo,
no decurso da ativação do EGFR; de neoplasmas oligodendrogliais; ou ainda por direções até
então não definidas (Figura 09).
FIGURA 09 – Diagrama representativo das alterações genéticas envolvidas na progressão maligna dos
astrocitomas. Adaptado de Kleihues & Cavenee (2000).
1.5. MARCADORES MOLECULARES
Apesar das recentes descobertas sobre os eventos moleculares implicados na
tumorigênese dos astrocitomas, a análise histopatológica convencional permanece como o
melhor método diagnóstico e razoável indicador prognóstico para esses tumores. Tal fato
50
deve-se à ausência de correlação clínica direta entre as alterações genéticas detectadas e o
comportamento biológico dos tumores astrocíticos, especialmente na definição de conjecturas
prognósticas (Dietrich & Tribolet, 1997).
Um dos principais desafios da neuro-oncologia quanto ao estudo dos astrocitomas,
portanto, consiste na identificação de marcadores moleculares específicos, que efetivamente
caracterizem os diversos tipos de neoplasias, possibilitando o entendimento funcional das vias
tumorigênicas e fornecendo informações relevantes acerca do diagnóstico, da resposta
terapêutica e do prognóstico desses tumores (Grzybicki & Moore, 1999).
Neste contexto, marcadores de proliferação celular (Ki-67, Topoisomerase IIα, c-
Myc), diferenciação astrocítica (GFAP), supressores tumorais (p53, p21, p27), apoptose (Bax,
Bcl-2, c-Myc), receptores de membrana (EGFR, ErbB-2), transdutores de sinal (p21
ras
) e
enzimas relacionadas à quimiorresistência (O
6
-Metilguanosina-DNA-Metiltransferase,
Glutationa-S-Transferase π, Timidilato Sintase, Topoisomerase IIα) mostram-se como
potenciais ferramentas a serem utilizadas na investigação das modificações moleculares
resultantes do processo tumorigênico nos astrocitomas, demonstrando virtual valor
diagnóstico e prognóstico.
1.5.1. Proliferação Celular
A atividade proliferativa de um tecido, sadio ou tumoral, é resultado do balanço entre
a fração de células em duplicação, o tempo dispensado durante o ciclo celular e as perdas por
apoptose. A despeito da complexidade concernente ao crescimento celular, a medida do
potencial proliferativo das neoplasias tem demonstrado forte correlação com o grau de
malignidade, principalmente nos tumores sólidos (Brown & Gatter, 2002).
51
O progresso no reconhecimento dos mecanismos reguladores do ciclo celular
propiciou a descoberta de moléculas expressas diferencialmente em células proliferantes.
Dentre essas, destacam-se o antígeno Ki-67 e a enzima Topoisomerase IIα.
O antígeno Ki-67 é expresso durante todas as fases do ciclo celular (G1-S-G2-M).
Este consiste numa proteína nuclear do tipo não-histona, formada por cadeias polipeptídicas
com pesos moleculares variando entre 345 e 395kDa (Gerdes et al., 1991). O gene codificador
do antígeno Ki-67 foi localizado no cromossomo 10q25. A função dessa proteína permanece
desconhecida, embora sua estrutura sugira que sua expressão seja regulada por vias
proteolíticas (Fonatsch et al., 1991). Cattoretti et al., em 1992, padronizou a detecção imuno-
histoquímica do Ki-67 em tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina, utilizando
pela primeira vez o anticorpo monoclonal de camundongo designado MIB-1 (de Molecular
Immunology Borstel 1).
As topoisomerases, por sua vez, são enzimas que regulam as interconversões
topológicas do DNA através da quebra reversível da fita simples (tipo I) ou dupla (tipo II) do
DNA. A topoisomerase II revela-se essencial em vários processos celulares, incluindo a
replicação do DNA, a segregação dos cromossomos, a manutenção da estrutura cromossômica
e a prevenção do superenovelamento do DNA (Bakshi et al., 2001).
Recentemente, duas isoformas da topoisomerase II foram identificadas: a alfa (α) e a
beta (β), com 170 e 180kDa respectivamente. Apesar do alto grau de homologia, essas duas
variantes são diferentemente reguladas. A Topoisomerase IIα (subtipo predominante) é
descrita como expressa somente em células proliferantes, no intervalo entre o desfecho da
fase S e a conclusão da fase M. (Taniguchi et al., 1999).
52
1.5.2. Diferenciação Astrocítica
A proteína ácida glio-fibrilar (GFAP, de glial fibrillary acidic protein) participa da
constituição do citoesqueleto dos astrócitos, conferindo-lhes estabilidade estrutural e
mobilidade. Até o presente momento, a GFAP é considerada o marcador mais específico para
detecção de células de origem astrocítica (Figura 10) (Rutka et al., 1997).
Traumatismos no SNC, doenças neurodegenerativas, infecções, intoxicações químicas
e radiação podem induzir a proliferação astrocítica, elevando a expressão de GFAP. Tumores
mistos oligo-astrocíticos são distinguidos pela detecção diferencial da GFAP nos astrócitos
neoplásicos (Eng et al., 2000).
A marcação para GFAP tende a diminuir com a progressão maligna dos astrocitomas.
Nos glioblastomas, a extensão e o aspecto da imuno-expressão dessa proteína é altamente
variável. Células gigantes multinucleadas exibem marcação heterogênea. Células correlatas
aos astrócitos, como os gemistócitos, demonstram forte positividade, enquanto células
indiferenciadas mostram propensão à negatividade ou à fraca expressão de GFAP (Lantos et
al., 2002).
FIGURA 10 – Expressão de GFAP detectada por imuno-histoquímica (400X). [a] Caso n
o
. 0.5 - Córtex
Cerebral Não-Tumoral. [b] Caso n
o
. 40 – Astrocitoma Grau IV (OMS): percebe-se aumento da celularidade, com
atipia nuclear e pleomorfismo significantes; a expressão de GFAP é visualizada somente em cerca da metade dos
astrócitos neoplásicos. Para maiores detalhes sobre os casos, consultar Anexo IV.
53
1.5.3. Supressores Tumorais
O gene supressor tumoral p53 está localizado no cromossomo 17p13.1, sendo
constituído por onze exons. Seu produto protéico consiste numa nucleoproteína fosfatada de
53kDa, formada por três regiões distintas: a extremidade amino-terminal (exons 2, 3 e 4),
reguladora da ativação transcricional; a porção central (exons 4, 5, 6, 7 e 8), responsável pela
ligação ao DNA e a extremidade carboxi-terminal (exons 9, 10 e 11), importante na
oligomerização tetramérica e na fixação nuclear da estrutura protéica (Lane, 1992).
A proteína p53 atua basicamente como um fator de transcrição, ativando moléculas
reguladoras de diversos programas celulares incluindo o ciclo celular, a resposta ao dano ao
DNA, a apoptose, a diferenciação celular e a angiogênese. Na resposta às lesões genéticas,
por exemplo, a p53 pode induzir a expressão da proteína GADD-45 (de growth arrest and
DNA damage 45), que (1) promove a parada do ciclo celular na fase G2, provavelmente pela
associação com o complexo ciclina B/CDK1, (2) impede a replicação, através da formação de
complexos inibitórios com o PCNA (de proliferation cell nuclear antigen) e (3) desestabiliza
as interações DNA-histonas, permitindo assim o reparo ao DNA (Bertram, 2001).
A proteína p53 selvagem (wild-type, funcional) é discretamente expressa em todas as
células normais, tendo curta meia-vida (20 a 30min). Entretanto, sua versão mutante (inativa)
é altamente estável, provocando seu acúmulo celular e, dessa forma, tornando possível sua
detecção. Por esta razão, o método imuno-histoquímico tem sido proposto como uma forma
simples e rápida de investigação da mutação do gene p53 (Louis et al., 1993).
O principal alvo transcricional da p53 é representado pelo gene WAF1 (também
conhecido como CIP1, SDI1, mda-6 ou CDKN1A), localizado no cromossomo 6p21.1. Este,
por sua vez, codifica uma proteína fosfatada de 21kDa, que também exibe atividade
supressora tumoral, denominada p21
WAF1/CIP1
. A proteína p21 atua como reguladora negativa
54
do ciclo celular, inibindo a atividade das CDKs ativadoras da transição G1-S (Figura 02) e
controlando a síntese do DNA (fase S) através do bloqueio do PCNA (Ono et al., 1997).
A regulação direta da expressão do WAF1 pelo p53 implica que, na presença da
mutação do p53, os níveis de p21 estariam dramaticamente reduzidos ou totalmente ausentes.
Deste modo, a expressão do p21 refletiria o status funcional do gene p53 de modo simples e
adicional à constatação da existência da proteína p53 mutada.
Outra proteína supressora tumoral da família CIP/KIP corresponde à p27
KIP1
,
codificada pelo gene situado no cromossomo 12p13. A proteína p27 apresenta 42% de
homologia estrutural com a p21, o que justifica a similaridade na ação destas proteínas no
bloqueio da progressão do ciclo celular através da inibição dos complexos ciclina D/CDK4,
ciclina E/CDK2 e ciclina A/CDK2 (Lloyd et al., 1999)
Fato curioso é a detecção da proteína p27, de atuação eminentemente nuclear, no
compartimento citoplasmático de células neoplásicas. Recentes evidências sugerem que a
expressão oncogênica de PKB (de protein kinase B) provocaria a fosforilação da proteína p27,
resultando na sua redistribuição citoplasmática (Coqueret, 2003). A presença da p27 no
citoplasma desencadearia seu processo de degradação através de ubiquitinação seguida de
degradação por complexos proteossômicos. O seqüestro e a destruição da proteína p27
tornariam então possível a formação dos complexos ciclina/CDK, promovendo a ciclagem
celular (Bloom & Pagano, 2003).
1.5.4. Apoptose
A apoptose apresenta-se como o término de uma cascata de eventos moleculares
desencadeados por diversos estímulos, convergindo finalmente para a ativação de enzimas
55
proteolíticas (caspases) responsáveis pela morte celular. O processo de ativação das caspases,
embora ainda não completamente elucidado, é regulado predominantemente pela família de
proteínas bcl-2 (Cotran et al., 2000).
Os membros da família bcl-2 podem ser divididos em moléculas pró-apotóticas (Bax,
Bak, Bcl-x
S
, Bad, Bid, Bik, Hrk, Bim e Bok) e anti-apoptóticas (Bcl-2, Bcl-x
L
, Bcl-w, Bfl-1,
Brag-1, Mcl-1, A1, E1B19K, LMW5-HL e EBV BHRF1). O balanço relativo entre as
diferentes proteínas, refletindo a formação de homodímeros e heterodímeros (neutralização),
define a via de atuação sobre o mecanismo de morte celular programada (Zörnig et al., 2001).
A proteína Bax (de bcl-2 associated protein X) representa o protótipo das proteínas
pró-apoptóticas. Na presença de um sinal apoptótico, a Bax é translocada do citoplasma para a
as proximidades das mitocôndrias, onde sofre ativação e modificação conformacional,
aderindo à membrana mitocondrial externa. Pequenas unidades de proteínas Bax ativadas
tendem ao agrupamento, formando oligômeros que acabam por penetrar a membrana
mitocondrial externa. Essa integração possibilita a rápida liberação do citocromo c, um
potente ativador de caspases (Figura 11) (Antonsson & Martinou, 2000).
Por outro lado, a proteína Bcl-2 (de B
-cell lymphoma 2), codificada pelo gene
localizado no cromossomo 18q21, favorece a sobrevida celular. Esta impede o escape do
citocromo c, possivelmente pela formação de heterodímeros com moléculas pró-apoptóticas
como a proteína Bax (Amarante-Mendes & Green, 1999).
1.5.5. Receptores da Família ErbB
A resposta a diversos sinais extracelulares se inicia com a ativação de receptores
específicos na membrana citoplasmática. Os receptores com domínios tirosino-quinase
56
destacam-se como os mais numerosos receptores celulares ligados a enzimas, compreendendo
dezesseis famílias. Dentre estas, situa-se a família dos receptores ErbB (de erythroblastic
leukemia viral oncogene) (Alberts et al., 2002).
FIGURA 11 – Representação simplificada da atuação das proteínas da família bcl-2 na regulação da
cascata apoptótica mitocondrial. O sinal apoptótico ativa a caspase 8 e mobiliza a proteína Bax do citoplasma
para a mitocôndria. A caspase 8 cliva a proteína Bid, formando o tBid (fragmento C-teminal da Bid). O tBid
ativa a Bax, induzindo sua alteração conformacional e adesão à membrana externa mitocondrial. As proteínas
Bax ativadas oligomerizam-se e integralizam-se à membrana, possibilitando a liberação do citocromo c. A
ativação da Bax pode ser prevenida pela heterodimerização com a proteína Bcl-2. Adaptado de Desagher &
Martinou (2000).
Os receptores ErbB consistem em proteínas transmembranares com um domínio de
ligação extracelular e outro citoplasmático, onde se encontra a porção tirosino-quinase. Estes
podem ser formados a partir de quatro unidades monoméricas: ErbB-1, também conhecido
como HER1 (de h
omolog erythroblastic 1) ou EGFR (de epidermal growth factor receptor),
uma proteína de 170kDa codificada pelo gene localizado no cromossomo 7p12; ErbB-2
(HER2/neu), uma proteína com 185kDa codificada pelo gene situado no cromossomo 17q12-
21.32; ErbB-3 (HER3) e ErbB-4 (HER4) (Figura 12-I) (Arteaga, 2003).
57
A funcionalidade dos receptores ErbB se dá através da formação de homo ou
heterodímeros induzida pelo contato com fatores de crescimento específicos. Segue-se então
da ativação do domínio tirosino-quinase, que promove a auto-fosforilação da cadeia de
tirosina dos receptores. Uma vez fosforilados, os domínios citoplasmáticos dos receptores
recrutam e ativam proteínas de sinalização intracelular que irão atuar em múltiplas cascatas
regulatórias (Figura 12-II). As versões oncogênicas desses receptores resultam de sua
superexpressão ou estão associadas à dimerização e à ativação persistentes, mesmo na
ausência de ligantes, produzindo estado de estimulação contínua das vias mensageiras
celulares (Meldensohn & Baselga, 2000).
FIGURA 12 – Representação esquemática dos subtipos e do mecanismo de ativação dos receptores ErbB.
(I) Estrutura básica e ligantes específicos. (II) Mecanismo de ativação normal: [a] contato com o ligante, [b]
alteração conformacional - dimerização, [c] auto-fosforilação e [d] ligação e ativação de proteínas sinalizadoras.
Baseado em Arteaga (2003).
58
1.5.6. Sinalização Intracelular
As proteínas Ras (de rat sarcoma) foram inicialmente descritas como produto de
oncogenes virais, sendo identificados três subtipos: H-Ras (de Harvey), K-Ras (de Kirsten) e
N-ras (de neuroblastoma). A descoberta dos genes homólogos humanos nos cromossomos 11,
12 e 1, respectivamente, revelou a mutação desse conjunto como a anormalidade genética
mais freqüente em tumores humanos (Malumbres & Barbacid, 2003).
As proteínas Ras demonstram alto grau de homologia estrutural, apresentando 188
aminoácidos e peso molecular de 21kDa (daí p21
Ras
). Tais proteínas pertencem à grande
família das proteínas monoméricas ligadas ao GTP (de guanosine 5’-triphosphate), sendo
fundamentais na transdução intracitoplasmática de sinais (Shapiro, 2004).
Após contato com moléculas de ancoragem (como a SH2, de Src homology region 2)
recém-sensibilizadas pela estimulação dos receptores da membrana citoplasmática, as
proteínas Ras tornam-se ativas trocando o GDP (de guanosine 5’-diphosphate) pelo GTP. A
Ras ativada pode excitar inúmeros mensageiros, incluindo o Raf-1 (de Ras associated factor
1
). Este, por sua vez, sensibiliza a cascata de proliferação e diferenciação celular promovida
pela importante via MAPK (de mitogen-activated protein kinase). Duas classes de enzimas
regulam a atividade da Ras: (1) as GEFs (de g
uanine nucleotide exchange factors)
possibilitam sua ligação ao GTP e (2) as GAPs (de GTPase-activating protein) promovem a
hidrólise do GTP ligado à Ras, inativando-a (Figura 13-A) (Alberts et al., 2002).
As formas mutantes das proteínas Ras exibem alterações moleculares que as tornam
ativas, mesmo na ausência de estímulos extracelulares. Além disso, estas variantes também
podem demonstrar refratariedade à ação das GAPs, mantendo o GTP aprisionado e, assim,
prolongando seus períodos de ativação (Figura 13-B). A superexpressão das proteínas Ras,
59
por sua vez, ocasiona a maior sensibilização das vias transdutoras de sinal, tornando a
detecção dessas proteínas num importante indicador de malignidade (Marshall, 1999).
FIGURA 13 – Modelo esquemático da atuação das proteínas Ras “normal” (A) e mutante (B) na
sinalização intracelular. Adaptado de Cotran et al. (2000).
1.5.7. O Fator de Transcrição c-Myc
Em 1911, Peyton Rous evidenciou que um sarcoma típico de aves poderia ser
transmitido através de extratos tumorais não-celulares, sugerindo que vírus poderiam ser os
possíveis agentes etiológicos dessas neoplasias. Baseado nesse trabalho, Sheiness & Bishop
(1979), estudando um subgrupo de retrovírus causadores da mielocitomatose em aves,
identificaram o oncogene v-myc (de viral avian myelocytomatosis). Subseqüentemente, o
gene c-myc (de cell) foi identificado como o homólogo celular deste oncogene retroviral,
sendo sua superexpressão demonstrada em vários tumores humanos e animais (Dang, 1999).
O gene c-myc está localizado no locus 8q24.1, compreendendo três exons. Seus
produtos protéicos Myc-1 (67kDa) e Myc-2 (64kDa) consistem em fosfoproteínas nucleares
60
altamente conservadas, expressos em quantidades variáveis de acordo com o tecido avaliado.
Uma terceira isoforma da proteína c-Myc, denominada de Myc-S (do inglês short) ou Myc-3,
foi descrita recentemente (Spotts et al., 1997).
Logo depois da descoberta do gene c-Myc, dois outros genes relacionados foram
encontrados amplificados em cânceres humanos: o N-myc (nos neuroblastomas) e o L-myc
(nos carcinomas do pulmão, do inglês lung). Adicionalmente, dois novos genes foram
identificados, contudo somente em roedores: o B-myc e o S-myc. O conjunto desses genes é
denominado genericamente como família de oncogenes myc (Melkoumian et al., 2002).
A proteína c-Myc contém duas seqüências de localização nuclear (NLS) e domínios
estruturais que a caracterizam como um fator de transcrição. Os primeiros 143 aminoácidos
da porção N-terminal compreendem o domínio de transativação (TAD), que contém as
regiões chamadas Myc boxes (Mb) I e II. Estas últimas são intrinsecamente ligadas às
atividades biológicas exercidas pela c-Myc e altamente conservadas entre os membros da
família. A porção C-terminal contempla três importantes domínios: [1] a região básica (BR),
implicada no reconhecimento específico da seqüência do DNA, [2] a helix-loop-helix (HLH) e
[3] o z
ipper de leucina (LZ), estas últimas responsáveis pela formação de heterodímeros
específicos entre a c-Myc e seus ligantes (Figura 14) (Pelengaris et al., 2002).
Um dos ligantes reconhecido como essencial para a maioria das atividades biológicas
exercidas pela c-Myc é a proteína Max. Esta, quando dimerizada com a proteína c-Myc,
funciona como ativadora transcricional. Praticamente toda c-Myc celular está complexada
com a proteína Max que, ao contrário da c-Myc, é expressa constitutivamente. A Max
também interage com outras proteínas com domínios HLH-LZ, como as proteínas da família
Mad. O complexo Max/Mad forma-se do mesmo modo como o Myc/Max, entretanto atua
predominantemente como repressor transcricional (Baudino & Cleveland, 2001).
61
FIGURA 14 – Estrutura, funções e ligantes da proteína c-Myc. Os maiores domínios funcionais e os sítios de
fosforilação estão representados na estrutura protéica central nas cores azul e amarela, respectivamente. As
regiões responsáveis pelas atividades biológicas são indicadas acima da estrutura protéica e as envolvidas na
ligação com outras proteínas são enumeradas logo abaixo. A faixa azul descontínua indica os domínios
relacionados à repressão transcricional, ainda não completamente definidos. Exemplos de proteínas ligantes que
promovem a função da proteína c-Myc são mostradas na cor verde e as inibidoras na cor vermelha. BR, r
egião
b
ásica; HLH, helix-loop-helix; LZ, zipper de leucina; MbI, Myc Box I; MbII, Myc Box II; NLS, seqüência de
l
ocalização nuclear. Adaptado de Facchini & Penn (1998).
Várias pesquisas têm sido realizadas na tentativa de compreender o mecanismo dual
de transativação pelos complexos Myc/Max e Max/Mad. Recentes evidências sugerem que,
pelo menos em parte, Myc e Mad regulam a transcrição através do recrutamento de,
respectivamente, acetilases e desacetilases de histonas (Frank et al., 2001).
A expressão do c-myc, bem como de outros membros da família myc, é indispensável
durante o desenvolvimento embrionário normal. A atividade do c-myc em células normais é
regulada por sinais externos, como fatores de crescimento e componentes da matriz
extracelular, bem como por sinais internos, como a maquinaria de ativação do ciclo celular.
Células diferenciadas normalmente expressam baixos níveis de c-Myc, embora possam
potencialmente transcrever a proteína c-Myc quando estimuladas (Gardner et al., 2002).
62
Embora a ligação entre c-myc e câncer esteja bem estabelecida, tanto in vitro quanto in
vivo, os mecanismos moleculares que promovem a transformação maligna mediada pelo c-
myc não são completamente conhecidos. Muitos esforços têm se concentrado na identificação
dos programas genéticos induzidos pelo c-myc, através da identificação dos seus potenciais
alvos diretos e indiretos.
O impacto do c-myc no ciclo celular tem sido atribuído principalmente à promoção da
transição G1-S através da ativação do complexo ciclina/CDK, do incentivo à transcrição E2F-
dependente e do fomento ao crescimento celular (Beier et al., 2000).
Quanto à ativação das CDKs, especialmente do complexo ciclinaE/CDK2, a proteína
c-Myc atua em, pelo menos, três vias distintas: [1] inativação funcional do p27
KIP1
, através do
estímulo à sua degradação ou através do seu seqüestro pelo complexo ciclinaD2/CDK4, [2]
indução da cdc25A, uma fosfatase de CDKs e [3] ativação indireta da expressão de ciclina E.
Nesses processos, as CDKs ficam livres para fosforilar as proteínas da família Rb,
desencadeando a liberação dos fatores de transcrição E2F. Estes, por sua vez, ativam a
transcrição de mais ciclinas e de outros genes promotores do ciclo celular, incentivando
sobremaneira a progressão G1-S (Figura 15) (Amati et al., 1998).
Especula-se que o c-myc também poderia atuar em outras vias, desde a inibição da
transcrição de outros supressores tumorais até a cooperação com a oncoproteína transdutora
de sinal Ras, atuando de modo complementar e sinérgico na ativação das CDKs por estímulos
mitogênicos (Lutz et al., 2002).
A superexpressão de c-myc, mesmo que transitoriamente, parece também induzir
instabilidade cromossômica, caracterizada por amplificações, aneuploidias e poliploidias.
Outros estudos sugerem que a c-Myc induz a produção de radicais livres pelas mitocôndrias,
acarretando em danos ao DNA e, assim, irregularidades genômicas (Gardner et al., 2002).
63
FIGURA 15 – Representação parcial e simplificada da atuação do c-myc nas vias moleculares reguladoras
do ciclo celular em organismos superiores. A proteína c-Myc atua inativando os supressores tumorais (linhas
vermelhas), embora algumas vias ainda não tenham sido totalmente elucidadas (linhas descontínuas). O sinal de
interrogação (?) ilustra a participação de mediadores ainda não estabelecidos. A inibição do p15 promove a
“liberação” do complexo ciclinaD/CDK4, que atua seqüestrando o p27. A ausência do p27 torna o complexo
ciclinaE/CDK2 mais disponível, o que por sua vez promove a transição G1-S (linhas verdes). A disponibilidade
dos complexos ciclina/CDK promove a fosforilação das proteínas da família Rb, desencadeando a liberação de
E2F, que ativa a transcrição de mais ciclinas e de outros fatores transcricionais, dando impulso à ciclagem
celular. O c-myc também atua diretamente como fator de transcrição de ativadores do ciclo celular (linhas azuis),
como as ciclinas e a cdc25a, ou indiretamente, ativando outros elementos de transcrição (linhas cinzas).
Adaptado de Amati et al. (1998), Cotran et al. (2000) e Lutz et al. (2002).
A proteína c-Myc também apresenta importante papel na diferenciação celular.
Demonstrou-se que a baixa expressão de c-myc é acompanha de diferenciação precoce e
parada permanente da ciclagem celular. Por outro lado, a expressão ectópica de c-myc é
suficiente para bloquear os mecanismos de diferenciação celular (Canelles et al., 1997).
Historicamente, observa-se uma tendência em classificar o c-myc como um gene
responsável pela imortalização celular. Tal vocação é reforçada quando se percebe o c-myc
como o gene-chave na indução da atividade da telomerase, bem como na expressão de suas
subunidades catalíticas TERT (de t
elomerase reverse transcriptase) (Wang et al., 1998).
64
Paradoxalmente, evidenciou-se que, em certas circunstâncias, o c-myc poderia atuar
induzindo a apoptose. Muitos genes envolvidos na morte celular programada, como o p53,
p21 e Bax contém regiões responsivas a c-Myc em seus promotores. Entre as possíveis vias
pró-apoptóticas mediadas pelo c-myc destaca-se a ativação do p19
ARF
. Esta proteína
supressora tumoral atuaria reprimindo o MDM-2 (regulador negativo do p53), induzindo a
disponibilização da p53 e, assim, desencadeando a promoção dos mecanismos apoptóticos
(Figura 16) (Lutz et al., 2002).
FIGURA 16 – Vias apoptóticas mediadas pela proteína c-Myc. [a] Ativação da proteína Bax. [b] Ativação
indireta do supressor tumoral p53 via p19
ARF
. [c] Ligação ao receptor CD95/FAS. [d] Bloqueio da apoptose
mediada pela proteína c-Myc. A sinalização via receptor IGF-1 e/ou a ativação da proteína Ras promovem a
ativação da serina/treonina quinase PKB e, subseqüentemente, a fosforilação da proteína pró-apoptótica Bad. A
Bad fosforilada é “seqüestrada” e inativada pelas proteínas 14-3-3. Adaptado de Pelengaris et al. (2002).
O aumento da proliferação celular requer insumos energéticos e disponibilidade de
substratos específicos, resultando na necessidade do incremento no metabolismo celular. A
regulação do volume celular é diretamente relacionada ao ciclo celular, embora a base
molecular dessa modulação não seja completamente conhecida. Recentes pesquisas sugerem
65
que superexpressão de c-Myc resultaria no aumento da expressão de genes codificadores de
proteínas ribossomais que, por sua vez, contribuiriam para o crescimento celular. Além disso,
genes importantes para o metabolismo do DNA [como os que codificam a carmamoil-fosfato
sintase (CAD), a ornitina descarboxilase (ODC), a dihidrofolato redutase (DHFR) e a timidina
quinase (TK)] são igualmente apontados como alvos transcricionais da c-Myc (Dang, 1999).
A proteína c-Myc também é descrita como capaz de ativar os promotores de enzimas
glicolíticas frente aos sinais de hipóxia tecidual. Nos tumores, a vascularização escassa e o
alto perfil proliferativo resultam num status hipóxico (conhecido como efeito Warburg) capaz
de induzir a expressão do c-myc, que atua promovendo o reforço energético através da
glicólise (Gardner et al., 2002). Nessa perspectiva, cogita-se que a c-Myc possa atuar
adicionalmente na supressão de fatores anti-angiogênicos, como a trombospondina, ativando a
angiogênese na tentativa de contrapor a hipóxia e promover o suprimento metabólico exigido
pela neoplasia (Knies-Bamforth et al., 2004).
1.5.8. Enzimas relacionas à Quimiorresistência
Um dos cenários mais desafiadores da prática oncológica consiste no surgimento de
resistência à quimioterapia antineoplásica. Diversos fatores, pré-existentes ou secundários ao
processo neoplásico, parecem contribuir para esse fenômeno. Condições fisiológicas
(suprimento sanguíneo, pH e oxigenação tumoral) e biológicas (heterogeneidade celular e
fenótipo metastático) são implicadas como indutoras de refratariedade à terapêutica
antitumoral. Contudo, o termo quimiorresistência é tradicionalmente empregado em alusão a
mecanismos bioquímicos, onde moléculas específicas são diretamente relacionadas à
ineficácia de esquemas quimioterapêuticos (Ringborg & Platz, 1996).
66
Recentemente, algumas enzimas próprias do metabolismo celular normal foram
identificadas como promotoras de resistência a drogas antineoplásicas. Superexpressas nos
tecidos tumorais, ou mesmo em quantidades fisiológicas, essas enzimas parecem desencadear
sistemas de detoxificação, de restabelecimento de vias metabólicas e de reparo ao DNA
capazes de frustrar os mais variados regimes antineoplásicos (Nutt et al., 2000).
A conjugação de moléculas citotóxicas com a glutationa (tripeptídeo formado por
resíduos de glicina, glutamato e cisteína) representa um importante mecanismo de
detoxificação celular (fase II). Os conjugados resultantes mostram-se menos tóxicos e mais
hidrossolúveis, sendo geralmente excretados das células por transporte passivo. Pequenas
moléculas reagem espontaneamente com a glutationa, todavia as maiores necessitam da
interação com enzimas catalizadoras do tipo Glutationa-S-Transferase (GST) (Figura 17).
FIGURA 17 – Modelo esquemático da regulação e do mecanismo de ação da Glutationa-S-Transferase
(GST). A ativação de mensageiros intracelulares e de radicais livres como resposta aos agentes citotóxicos e/ou
seus metabólitos desencadeia a expressão de moléculas das famílias Fos e Jun. Estas formam heterodímeros que
atuam como fatores de transcrição das proteínas GST (α, µ, π ou τ). As enzimas GST operam adicionando
grupos GSH (glutationa) à estrutura dos agentes tóxicos e, assim, determinando sua exclusão da célula.
Adaptado de Bergelson et al. (1994).
67
As GSTs abrangem um grupo de quatro isoenzimas [α (alfa), µ (mu), π (pi) e τ (tau)]
divididas de acordo com a especificidade para diferentes substratos. Diversos carcinógenos,
agentes mutagênicos, quimioterápicos (exs.: alquilantes, antibióticos, podofilotoxinas),
metabólitos tóxicos e produtos reativos do oxigênio têm suas taxas de detoxificação celular
acentuadas pela ativação dessas enzimas (Wrensch et al., 2004). Assim, sugere-se que a
expressão diferencial das GSTs em células neoplásicas possa representar um importante
mecanismo de quimiorresistência tumoral (Mattern & Volm, 1992).
A enzima Timidilato Sintase (TS) exerce papel central na construção do DNA através
do fomento à síntese de nucleotídeos Timidina. Drogas que inibem a atividade dessa enzima,
como o 5-fluorouracil, provocam o bloqueio da replicação celular, demonstrando grande
aplicabilidade na terapêutica antineoplásica (Figura 18). Estudos clínicos revelam correlação
inversa entre a expressão de TS e a resposta aos seus agentes inibidores. Cogita-se que o
aumento da TS possa suplantar a ação dessas drogas, assegurando a síntese de nucleotídeos na
célula tumoral e, dessa forma, possibilitando sua proliferação (Peters et al., 2002).
A maioria das drogas antineoplásicas interage direta ou indiretamente com o DNA,
podendo atuar em vários sítios dessa molécula. A metilação da posição O
6
da guanina,
promovida por agentes alquilantes (ex.: nitrosuréias) e outros compostos genotóxicos, acarreta
interrupções na fita do DNA que, dependendo da quantidade e extensão, ativam mecanismos
apoptóticos. A enzima O
6
-Metilguanosina-DNA-Metiltransferase (MGMT) consiste numa
proteína de 22kDa reparadora do DNA, atuando através da remoção de grupamentos metil da
porção O
6
da guanina (Figura 19). A detecção de níveis elevados de MGMT indicaria
tendência à restauração eficiente do DNA e, portanto, insucesso na aplicação dessas
substâncias (Ueda et al., 2004).
68
FIGURA 18 – Mecanismo de inibição da Timidilato Sintase pelo 5-Fluorouracil. A enzima TS (timidilato
sintase) cataliza a conversão de dUMP (de d
eoxyurdine monophosphate) em timidilato (dTMP, de
d
eoxythymidine monophosphate), tendo o CH
2
THF [metileno(CH
2
-)tetrahidrofolato) como doador do
grupamento metil. O dTMP é metabolizado até o nucleotídeo timidina (dTTP, de d
eoxythymidine triphosphate),
fundamental para a síntese e reparo do DNA. O FdUMP (de f
luorodeoxyurdine monophosphate), metabólito
ativo do 5FU (5
-fluorouracil), acopla-se aos sítios ligantes do dUMP no homodímero TS-TS. A formação do
complexo ternário TS- CH
2
THF-FdUMP inibe a síntese de dTMP e induz a produção de moléculas tóxicas a
partir do FdUMP. O desequilíbrio na formação dos dNTPs (deoxinucleotídeos) e aumento de dUTP (de
d
eoxyurdine triphosphate) acarreta em danos ao DNA. A extensão das lesões ao DNA causadas pelo dUTP
depende também dos níveis da pirofosfatase dUTPase e da enzima UDG (de u
racil-DNA glycosylase). O dTMP
pode ser ainda conduzido à síntese de timidina por uma via acessória mediada pela enzima TK (de t
hymidine
k
inase). Adaptado de Longley et al. (2003).
A DNA Topoisomerase II (TopoII) consiste em alvo para muitos quimioterápicos,
como os compostos antracíclicos e as podofilotoxinas. Estes agentes estabilizam o complexo
de clivagem formado entre a TopoII e o DNA, resultando no aumento e/ou perpetuação das
rupturas no material genético (Figura 20). Nesse contexto, o estímulo à destruição celular
desencadeado pelas lesões estruturais no DNA mostra-se proporcional ao nível de TopoII,
sugerindo que a redução na quantidade dessa enzima poderia constituir um importante
mecanismo de quimiorresistência (Tanaka et al., 2001).
69
FIGURA 19 – Representação esquemática do mecanismo de ação da O
6
-Metilguanosina-DNA-
Metiltransferase (MGMT). A MGMT atua removendo grupamentos metil “anormais”, transferindo-os para o
radical sulfidrila da molécula de cisteína presente em seu sítio ativo. A enzima metilada perde a capacidade
catalítica, todavia atua como potente indutor para expressão de MGMT e de outras enzimas reparadoras do DNA
codificadas pelos genes ada (de a
lkylation damage). Adaptado de Komine et al. (2003).
FIGURA 20 – Representação do mecanismo de descompactação das fitas de DNA catalisada pela enzima
DNA Topoisomerase II (TopoII). (1) Estrutura dimérica da TopoII: A’ – domínio estrutural, B’ – domínio
ATPase; (2) Ligação covalente reversível ao segmento G (DNA fita dupla); (3) Captação do segmento T após
alteração conformacional dependente de ATP, seguida da quebra do segmento G; (4) Passagem do segmento T
por entre a abertura do segmento G; (5) Reparo da ruptura do segmento G e liberação do segmento T. Adaptado
de Alberts et al. (2002).
70
Esses mecanismos demonstram a necessidade não somente da busca por alvos
terapêuticos mais precisos, como também da identificação do espectro de resistência nas
diversas neoplasias humanas. Espera-se que a conjunção destes fatores permita a construção
de um perfil biomolecular para cada espécime tumoral, proporcionando a predição e o
desenvolvimento de tratamentos individualmente direcionados.
1.6. A BIOLOGIA MOLECULAR COMO FERRAMENTA FARMACOLÓGICA
A identificação das principais alterações moleculares envolvidas no processo
neoplásico desvenda a possibilidade da elaboração de estratégias terapêuticas dirigidas
especialmente para o bloqueio desses fenômenos. As terapias alvo-direcionadas prometem
significantes avanços no tratamento do câncer através do desenvolvimento de agentes mais
específicos, menos tóxicos, menos indutores de resistência e, portanto, mais efetivos.
Uma das novas abordagens consiste na inibição da expressão e/ou da atividade das
CDKs nas células tumorais, impedindo a progressão do ciclo celular e, assim, ativando
mecanismos apoptóticos. O Flavopididol, um inibidor sintético não-específico de CDKs,
aparece como um promissor exemplo dessa classe, já figurando em estudos clínicos (Shapiro,
2004). Outra alternativa seria a restauração ou a reintrodução dos inibidores naturais das
CDKs (genes supressores tumorais) quando estes estivessem mutados. A terapia genética com
o gene p53, introduzido através de vetores virais ou lisossomos catiônicos, têm demonstrado
sucesso no bloqueio da ciclagem celular e reativação da apoptose, melhorando a resposta de
algumas neoplasias (inclusive os astrocitomas) à quimioterapia convencional (Chang et al.,
2000).
71
Outro potencial alvo molecular é representado pelo conjunto de receptores de
superfície celular do tipo tirosino-quinase. Múltiplos agentes, compreendendo anticorpos
monoclonais, moléculas inibitórias e imunotoxinas, têm sido desenvolvidos na tentativa de
coibir os subtipos específicos desses receptores envolvidos na transformação e progressão
neoplásicas (Mendelsohn & Baselga, 2000). O Imatinib foi a primeira droga produzida a
partir desse conceito, atuando no bloqueio do domínio tirosino-quinase das proteínas abl-bcr
na leucemia mielóide crônica (Thiesing et al., 2000).
O impacto positivo do Trastuzumab (um anticorpo monoclonal recombinante
bloqueador do receptor ErbB2) no tratamento do câncer de mama avançado abriu caminho
para a geração dos agentes específicos contra os receptores da família ErbB (Cobleigh et al.,
1999). O Gefitinib, um inibidor seletivo do EGFR já em uso no carcinoma de pulmão
metastático, vem apresentando bons resultados experimentais na sensibilização de gliomas
malignos à radio e à quimioterapia (Stea et al., 2003). Novas preparações como o Erlotinib
(inibidor do domínio intracitoplasmático do EGFR), o Cetuximab (anticorpo monoclonal
contra a porção extracelular do EGFR) e o Canertinib (inibidor irreversível pan-ErbB)
encontram-se em adiantadas fases de diversos ensaios clínicos (Hamid, 2004).
Ainda com relação às vias de sinalização nas células tumorais, surge também a
possibilidade do bloqueio das moléculas transdutoras intracelulares. A inibição da enzima
farnesil-transferase tem se mostrado promissor artifício de inativação das proteínas Ras. A
farnesilação (adição pós-traducional de resíduos de 15 a 20 carbonos no domínio C-terminal)
promove a ativação e ancoragem à membrana citoplasmática desse grupo de proteínas,
tornando-as responsivas aos estímulos por parte dos receptores de membrana (Crul et al.,
2001). Nesse sentido, drogas que suprimem a atividade catalítica das enzimas farnesil-
transferases, como o Ionafarnib e o Tipifarnib, têm mostrado eficácia no tratamento de
tumores sólidos com mutação da proteína Ras (Sebti, 2003). Ensaios com portadores de
72
tumores astrocíticos não detectaram respostas objetivas à terapia com esses agentes, embora
alguns pacientes tenham demonstrado estabilização da doença (Delmas et al., 2002).
A inibição dos fatores implicados na angiogênese tumoral representa mais uma nova
tendência no tratamento do câncer. O reconhecimento de distúrbios moleculares e de
mecanismos fisiológicos ativadores dos fenômenos angiogênicos delimitou alvos terapêuticos
específicos, possibilitando a elaboração de diversas abordagens. Dentre as terapias anti-
angiogênicas atualmente em avaliação clínica, destacam-se os inibidores de proteases (ex.:
Velcade), os antagonistas dos fatores/receptores VEGF (de vascular endothelial growth
factor) (exs.: Bevacizumab, Semaxanib), os inibidores das integrinas (exs.: Talidomida,
Cilengitide), as toxinas endoteliais (ex.: Atrasentan), os inibidores das metaloproteinases
(exs.: Marimastat, Prinomastat), os supressores naturais da angiogênese (ex.: Angiostatina) e
os inibidores da ciclooxigenase-2 (ex.: Celecoxib) (Tremont-Lukats & Gilbert, 2003).
Outra vertente terapêutica aponta para o direcionamento do sistema imunológico no
sentido do reconhecimento e eliminação de células tumorais. Esta tarefa apresenta-se como
um grande desafio, visto os versáteis mecanismos de escape imunológico desenvolvido pelas
neoplasias. Todavia, a expressão diferencial de antígenos nas células cancerosas como
resultado de mutações ou alterações regulatórias nos proto-oncogenes tem possibilitado
consideráveis progressos (Mariani, 2003). As propostas imunoterápicas abrangem a
imunização passiva com anticorpos monoclonais (ex.: Rituximab), a imunização passiva com
células T ou natural killer ativadas, o uso de citocinas imunomoduladoras (ex.: IL-2), a
transfecção com os genes das citocinas (ex.: IL-12), a reversão da imunossupressão tumoral
(ex.: bloqueio do TGF-β2), bem como o uso de vacinas anti-câncer desenvolvidas a partir de
peptídeos tumorais ou com células dendríticas ativadas (Liu et al., 2003).
73
Uma das mais recentes promessas na terapia molecular do câncer é representada pelas
ferramentas de silenciamento genético pós-transcricional. Nestas, a inibição se dá através não
mais da proteína oncogênica, mas sim do seu transcrito (RNA mensageiro, RNAm). O
princípio da técnica consiste na introdução de moléculas de RNA complementar (RNA
antisense) ou pequenos fragmentos de RNA (RNA interference) em células neoplásicas.
Estes, por sua vez, reconhecem seqüências específicas de transcritos oncogênicos, formando
RNAs dupla-fita híbridos que são em seguida degradados por ribozimas (Hannon, 2002). A
constatação do livre acesso dos RNAs antisenso e de interferência através da barreira
hematencefálica desperta ainda mais o interesse nessa estratégia como uma potencial
abordagem contra tumores do SNC (Fan & Weiss, 2005).
Dessa forma, a conjunção entre o conhecimento dos distúrbios moleculares ativadores
do processo tumorigênico, a detecção dos mecanismos de quimiorresistência, o uso racional
da quimioterapia clássica e a aplicação das novas estratégias alvo-direcionadas sugere um
novo tempo na prática oncológica, onde a abordagem individualizada e molecularmente
guiada definirá a terapêutica antineoplásica.
74
2. OBJETIVOS
GERAL
Investigar a expressão de genes envolvidos no processo tumorigênico e nos
mecanismos de resistência dos tumores astrocíticos.
ESPECÍFICOS
Descrever alguns indicadores clínico-epidemiológicos (incidência anual, distribuição
por idade e sexo dos pacientes, localização tumoral) referentes aos astrocitomas
diagnosticados no município de Fortaleza;
Avaliar a influência dos achados histopatológicos na determinação do diagnóstico dos
tumores astrocíticos, especialmente aqueles que consistem em critérios de graduação;
Identificar alterações moleculares implicadas na tumorigênese dos astrocitomas;
Examinar a expressão de enzimas relacionadas a mecanismos de quimiorresistência
em tumores astrocíticos;
Correlacionar as alterações moleculares observadas à graduação histológica e aos
achados histopatológicos relativos aos tumores astrocíticos;
Estabelecer as possíveis vias tumorigênicas dos astrocitomas através da análise
combinada das alterações moleculares detectadas;
Identificar potenciais alvos terapêuticos baseados na expressão diferencial de
moléculas nos tumores astrocíticos;
Determinar o melhor indicador de proliferação celular para os tumores astrocíticos
dentre os marcadores estudados.
75
3. MATERIAL E MÉTODOS
REAGENTES E SOLUÇÕES
Anticorpos Primários:
- Anticorpo monoclonal anti-humano de camundongo para antígeno Ki-67 - clone
MIB-1 – diluição utilizada: 1:80 (Immunotech
®
, França)
- Anticorpo monoclonal anti-humano de camundongo para BCL2 - clone 124 –
diluição utilizada: 1:80 (DakoCytomation
®
, EUA)
- Anticorpo monoclonal anti-humano de camundongo para c-myc - clone 9E10.3 –
diluição utilizada: 1:100 (Labvision
®
, EUA)
- Anticorpo monoclonal anti-humano de camundongo para EGFR - clone H11 –
diluição utilizada: 1:100 (DakoCytomation
®
, EUA)
- Anticorpo monoclonal anti-humano de camundongo para GFAP (Proteína Ácida
Glio-Fibrilar) - clone 6F2 – diluição utilizada: 1:100 (DakoCytomation
®
, EUA)
- Anticorpo monoclonal anti-humano de camundongo para GSTπ (Glutationa-S-
Transferase π) - clone 353-10 – diluição utilizada: 1:50 (DakoCytomation
®
, EUA)
- Anticorpo monoclonal anti-humano de camundongo para MGMT (O
6
-
Metilguanina-DNA-Metiltransferase) - clone MT3.1 – diluição utilizada: 1:50
(DakoCytomation
®
, EUA)
- Anticorpo monoclonal anti-humano de camundongo para p21
ras
- clone NCC-
RAS-001 – diluição utilizada: 1:100 (DakoCytomation
®
, EUA)
- Anticorpo monoclonal anti-humano de camundongo para p21
WAF1/Cip1
- clone
4D10 – diluição utilizada: 1:50 (Novocastra
®
, Reino Unido)
- Anticorpo monoclonal anti-humano de camundongo para p27
kip1
- clone SX53G8
– diluição utilizada: 1:50 (DakoCytomation
®
, EUA)
- Anticorpo monoclonal anti-humano de camundongo para p53 - clone DO-7 –
diluição utilizada: 1:80 (DakoCytomation
®
, EUA)
- Anticorpo monoclonal anti-humano de camundongo para Timidilato Sintase -
clone TS106 – diluição utilizada: 1:80 (Chemicon
®
, EUA)
- Anticorpo monoclonal anti-humano de camundongo para Topoisomerase IIα -
clone Ki-S1 – diluição utilizada: 1:80 (DakoCytomation
®
, EUA)
76
- Anticorpo policlonal anti-humano de coelho para Bax – diluição utilizada: 1:400
(DakoCytomation
®
, EUA)
- Anticorpo policlonal anti-humano de coelho para oncoproteína erbB-2 – diluição
utilizada: 1:100 (DakoCytomation
®
, EUA)
Ácido Clorídrico 2% (Synth
®
, Brasil)
Albumina Bovina 5% (Sigma
®
, EUA)
Bálsamo do Canadá (QEL
®
, Brasil)
Eosina (Nuclear
®
, Brasil)
Etanol 95% (Synth
®
, Brasil)
Hematoxilina de Harrys 40% (Nuclear
®
, Brasil)
Kit de detecção LSAB+ System-HRP (DakoCytomation
®
, EUA)
Kit de revelação DAB+ líquido (DakoCytomation
®
, EUA)
Peróxido de Hidrogênio 3% (Dinâmica
®
, Brasil)
Silano 4% (Sigma
®
, EUA)
Tampão Citrato 10mM pH=6,0 (Sigma
®
, EUA)
TBS pH=7,6 (50mM Tris-HCl; 150mM NaCl) (Sigma
®
, EUA)
Xileno (Synth
®
, Brasil)
EQUIPAMENTOS
Balança de Precisão (Filizola
®
ID-1500, Brasil)
Banho-Maria (FANEM
®
, Brasil)
Câmara Úmida (Erviegas
®
, Brasil)
Câmera Fotográfica Digital 2200 (Nikon
®
, Japão)
Capela com Exaustor (Quimis
®
, Brasil)
Contador de Células Manual (Herka
®
, Alemanha)
Estufa 25-70
o
C (FANEM
®
, Brasil)
Forno de Microondas 700watts (Electrolux
®
, Brasil)
Geladeira (Electrolux
®
, Brasil)
Medidor de pH (Digimed
®
, Brasil)
Micropipetas 0,5-10µL; 20-200µL; 100-1000µL (Gilson
®
, EUA)
Microscópio Óptico 100-1000X (Nikon
®
, Japão)
77
Micrótomo (Quimis
®
, Brasil)
Pinça de Dissecção Anatômica 12cm (Webber Stainless
®
, Brasil)
Suporte de Lâminas para Histologia (Projecta
®
, Brasil)
VIDRARIA
Béquer 500mL (Pyrex
®
, Brasil)
Cubas para Histologia (Duralex
®
, Brasil)
Erlenmeyer 500mL (Pyrex
®
, Brasil)
Proveta 1000mL (Pyrex
®
, Brasil)
PROGRAMAS COMPUTACIONAIS
CART – Classification and Regression Trees 5.0 (Salford Systems
®
, EUA)
Microsoft Excel 2000 (Microsoft
®
, EUA)
Microsoft Word 2000 (Microsoft
®
, EUA)
SPSS – Statistical Package for Social Science 13.0 (SPSS
®
Inc., EUA)
OUTROS MATERIAIS
Caixas para Lâminas (Projecta
®
, Brasil)
Caneta Hidrofóbica (DakoCytomation
®
, EUA)
Etiquetas (Pimaco
®
, Brasil)
Lâminas para Microscopia (26,0x76,0x1,0mm
3
) (Bioglass
®
, Brasil)
Lamínulas (24,0x32,0mm
2
) (Bioglass
®
, Brasil)
Luvas de Procedimento (Blowtex
®
, Brasil)
Papel de Filtro (Ripax
®
, Brasil)
Termômetro (BD
®
, Brasil)
78
CASUÍSTICA
Realizou-se levantamento dos tumores astrocíticos humanos fixados em formalina
e incluídos em parafina provenientes do arquivo do Laboratório BIOPSE
®
- Biomédica,
Pesquisas e Serviços Ltda. (Fortaleza-Ceará-Brasil) referentes aos exames
histopatológicos rotineiros realizados no período entre 1999 e 2003, totalizando 354
(trezentos e cinqüenta e quatro) casos. Admitiram-se como critérios de inclusão a
existência de mais de uma amostra (bloco) para cada caso, o bom estado de conservação
dos blocos e a adequação da graduação histológica utilizada quando do diagnóstico em
relação à padronizada pela OMS (Kleihues et al., 2002). Dessa forma, 55 (cinqüenta e
cinco) astrocitomas foram selecionados: 13 (treze) grau I, 14 (catorze) grau II, 07 (sete)
grau III e 21 (vinte e um) grau IV, configurando uma amostragem não-probabilística.
Como parâmetro de normalidade, 05 (cinco) amostras de tecido cerebral não-
tumoral fixadas em formalina e incluídas em parafina foram obtidas do material de rotina
do Setor de Necropsia do Departamento de Patologia e Medicina Legal da Faculdade de
Medicina – UFC. Foram selecionados casos em que a causa imediata da morte e a doença
de base em nada remetessem a presença de neoplasia intra ou extracerebral.
A coleta das amostras foi autorizada pelos responsáveis de cada instituição, sendo
o Projeto de Pesquisa aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Complexo
Hospitalar da Universidade Federal do Ceará sob protocolo 32/04 (Anexo I), dentro das
normas que regulamentam a pesquisas em seres humanos segundo as Resoluções 196/96 e
251/97 do Conselho Nacional de Saúde – Ministério da Saúde/Brasil.
79
PREPARO DAS LÂMINAS E DOS CORTES HISTOLÓGICOS
As lâminas para microscopia foram limpas em acetona e tratadas com silano a 4%.
Seguiu-se manufatura de cortes histológicos a 5µm. Uma lâmina de cada bloco foi
destinada à coloração pela Hematoxilina/Eosina para reavaliação histopatológica e as
restantes para o estudo proteômico in situ (imuno-histoquímica).
IMUNO-HISTOQUÍMICA
No presente ensaio, foram estudadas as proteínas GFAP, TS, MGMT, GSTπ,
TopoIIα, Ki-67, c-Myc, p21
ras
, Bcl-2, Bax, p27
KIP1
, p21
WAF1/CIP1
, p53, EGFR e erbB-2.
Utilizou-se o método imuno-histoquímico da estreptoavidina-biotina-peroxidase, descrito
por Hsu et al. (1981) com modificações, conforme o procedimento a seguir:
1. Passagem das lâminas em estufa pré-aquecida a 70
o
C por 120 minutos;
2. Desparafinização e hidratação em gradiente xileno-álcool-água;
3. Recuperação antigênica em forno de microondas utilizando tampão
citrato 10mM pH=6,0 (± 99
o
C) por 15 minutos;
4. Incubação das lâminas com o anticorpo primário (diluição previamente
padronizada) na geladeira (± 4
o
C) por 16 horas;
5. Detecção pelo sistema LSAB+ conforme orientações do fabricante;
6. Revelação pelo sistema DAB+ conforme orientações do fabricante;
7. Contra-coloração com hematoxilina de Harrys a 40%;
8. Desidratação em gradiente água-álcool-xileno;
9. Montagem com lamínula e bálsamo do Canadá.
80
ANÁLISES HISTOPATOLÓGICA E IMUNO-HISTOQUÍMICA
As avaliações histopatológica e imuno-histoquímica foram realizadas por três
analistas experientes de forma independente. Os eventuais resultados conflitantes foram
revisados pelos mesmos, agora em conjunto, para definição consensual da análise.
Análise Histopatológica
Após a confirmação do diagnóstico histológico (variante e graduação, segundo
critérios da OMS), procedeu-se reavaliação geral das lâminas coradas pela
hematoxilina/eosina para análise de parâmetros histopatológico específicos (atipia nuclear,
pleomorfismo celular, hiperplasia endotelial, presença necrose, índice mitótico,
celularidade, presença de gemistócitos e existência de células gigantes). Foram atribuídos
escores de acordo com os achados qualitativos, conforme descrito na Tabela 03.
Análise Imuno-Histoquímica
Considerou-se marcação
a coloração distinta em marrom (castanho), em
contraposição ao azul/violeta da contra-coloração (hematoxilina), no(s) local(is)
previsto(s) para a detecção do antígeno estudado (Tabela 04).
A expressão dos marcadores foi quantificada através da contagem manual por
microscopia óptica de pelo menos 1.000 (mil) células astrocíticas, em diferentes campos
representativos, utilizando magnificação de 400X. Procedeu-se então o cálculo do índice
de marcação LI (de l
abelling index) (Landberg & Ross, 1993), segundo a fórmula:
LI (%) = (número de células imuno-positivas)/(número total de células contadas) X 100
81
TABELA 03 – Significado dos escores utilizados na análise dos parâmetros histopatológicos
PARÂMETRO ESCORE SIGNIFICADO
0
ausente
1
discreto(a)
2
moderado(a)
Atipia Nuclear*
Pleomorfismo Celular*
Hiperplasia Endotelial*
Necrose*
3
intenso(a)
0
ausência de figuras mitóticas
1
≤ 2 mitoses / campo
2
3 a 4 mitoses / campo
Índice Mitótico*
3
≥ 5 mitoses / campo
0
normal
1
baixa
2
moderada
Celularidade
3
alta
0
ausentes
1
poucos(as)
Gemistócitos
Células Gigantes
2
numerosos(as)
(*) critérios de graduação histopatológica dos astrocitomas segundo classificação da OMS.
TABELA 04 – Sítio(s) de expressão celular das diferentes proteínas estudadas
PROTEÍNA SÍTIO(S) DE EXPRESSÃO CELULAR
GFAP membrana citoplasmática e citoplasma
TS citoplasma
MGMT núcleo (citoplasma*)
GSTπ núcleo (citoplasma*)
TopoIIα núcleo
Ki-67 núcleo
c-Myc núcleo e citoplasma
p21
ras
citoplasma
Bcl-2 citoplasma
Bax citoplasma
p27
KIP1
núcleo e citoplasma
p21
WAF1/CIP1
núcleo
p53 núcleo
EGFR membrana citoplasmática e citoplasma
ErbB-2 membrana citoplasmática e citoplasma
(*) padrão de marcação pouco freqüente nos astrocitomas (Ali-Osman et al., 1997; Yuan et al., 2003).
82
Admitiu-se como critério de positividade a presença dos antígenos pesquisados
em no mínimo 5% das células analisadas (LI ≥ 5), exceto no caso do marcador Ki-67,
onde se considerou positiva a sua detecção para qualquer valor diferente de zero (LI > 0).
Para os marcadores expressos na membrana citoplasmática e/ou citoplasma foi
também realizada contagem semiquantitativa da mesma amostragem celular, levando-se
em consideração a intensidade de marcação. Foram atribuídos os valores 0 (ausente), 1+
(fraca), 2+ (moderada) e 3+ (intensa) de acordo com a intensidade observada. Tais valores
configuram índices aos quais foram multiplicados os valores percentuais (%) da fração
células que representam a respectiva categoria de intensidade, sendo calculado o H-Score
(McCarty et al., 1985):
H = (% 0) * 0 + (% 1+) * 1 + (% 2+) * 2 + (% 3+) * 3
O mesmo procedimento não foi aplicado à marcação nuclear devido a grande
variabilidade de intensidades de coloração promovida pela inconstância de volume e
formas nucleares (pleomorfismo nuclear) observadas em uma mesma amostra tumoral.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os escores referentes às análises histopatológica e imuno-histoquímica, bem
como os dados acerca da localização tumoral, da idade e do sexo dos pacientes, foram
tabulados utilizando-se o programa Microsoft Excel
2000 (Anexo IV).
Empregou-se o programa SPSS
13.0 para comparação dos dados através de
abordagens não-paramétricas (teste de Shapiro-Wilk, teste H de Kruskal-Wallis e teste U
83
de Mann-Whitney), sendo os resultados expressos como Média ± 2 E.P.M. (erro padrão da
média). Foram considerados significantes valores de p < 0,05.
Aplicou-se também a metodologia CART (Classification and Regression Trees)
de aprendizagem automática (inteligência artificial) para construção de árvores de
decisão com complexidade limitada através do programa CART 5.0 (Breiman et al.,
1984). Árvores de decisão (Figura 21) são estruturas que se assemelham a árvores
invertidas, nas quais as folhas representam as conclusões (diagnósticos), os nós expressam
as variáveis (sinais, sintomas, achados) e os ramos distinguem os valores assumidos pelas
variáveis. O primeiro nó é denominado raiz.
FIGURA 21: Modelo esquemático de uma árvore de decisão. A e B (retângulos): nós; V1, V2, V3 e V4
(traços): ramos; D1, D2 e D3 (círculos): folhas; Regras diagnósticas: A = V1 implica em D1, A = V2 e B =
V3 implicam em D2 e A = V2 e B = V4 implicam em D3.
O CART inicia sua abordagem gerando uma árvore de tamanho máximo a partir
dos dados descritos na casuística original. Assim, cada “caminho” que segue da raiz às
folhas representaria um único caso. Posteriormente, procede-se a poda dos ramos,
gerando árvores cada vez menores, até a escolha da melhor estratégia de decisão através
de múltiplos processos estatísticos (Carvalho-Gomes & Gascuel, 1994).
84
Quando a quantidade de casos disponíveis para a construção da árvore é
pequena, não possibilitando a divisão da amostra em um conjunto de aprendizagem e
outro conjunto teste, o CART emprega a validação cruzada. Este procedimento utiliza
sub-amostras disjuntas de mesmo tamanho para a formatação de sub-árvores, utilizando o
mesmo processo de desbaste. Dessa forma, estima-se o erro real contido nas sentenças de
decisão a partir da comparação entre as sub-árvores e a árvore principal, construída com a
totalidade dos dados. A associação entre a poda e a validação cruzada fornece uma árvore
de decisão de complexidade reduzida e com taxas de erro real satisfatórias.
85
4. RESULTADOS
4.1. ANÁLISE CLÍNICO-EPIDEMIOLÓGICA
O levantamento dos tumores astrocíticos registrados no Laboratório BIOPSE
®
(referência local para diagnóstico de neoplasias do SNC) no período de 1999 a 2003 permitiu
a estimativa da incidência anual média dos astrocitomas na cidade de Fortaleza em
3,08/100.000 habitantes, tendo como base de cálculo o conjunto populacional da capital
cearense corrigido para o ano de 2004 (IBGE, 2005).
Dentre os casos selecionados para o estudo (Figura 22), a maioria (35%) era
representada por Astrocitomas Grau IV (OMS), refletindo a maior incidência deste subtipo
histológico sobre os demais. A distribuição dos casos de acordo com a faixa etária dos
pacientes (Figura 23) demonstrou que 83,33% dos Astrocitomas Grau I acometeram pacientes
jovens (4 a 19 anos), 71,43% dos Astrocitomas Grau II ocorreram em indivíduos adultos (23 a
48 anos), 42,86% dos Astrocitomas Grau III manifestaram-se no terceiro decênio (22 a 28
anos), ao passo que 45% dos Astrocitomas Grau IV surgiram na sexta década de vida. Apesar
destas duas últimas gradações mostrarem predomínios específicos pelas faixas etárias
descritas, observou-se que a ocorrência do grau III prolongava-se até pacientes adultos e
idosos (40 a 71 anos) e o aparecimento do grau IV estendia-se desde crianças até idosos (5 a
81 anos).
A divisão por sexo dos pacientes portadores dos tumores astrocíticos avaliados (Figura 24)
indicou relação masculino/feminino de 1,89, sendo esta relação de 1,28 quando contabilizados todos
os pacientes detectados no levantamento geral (n=354). Quanto à localização tumoral (Figura 25),
prevaleceram os sítios frontal, cerebelar e parietal. A maior parte (75%) dos tumores Grau I estava
situada nos hemisférios cerebelares, enquanto cerca da metade (55%) dos tumores grau IV encontrava-
se nos lobos cerebrais frontais.
86
5
13
14
7
21
NÃO-TUMORAL
ASTROCITOMA GRAU I (OM S)
ASTROCITOMA GRAU II (OMS)
ASTROCITOMA GRAU III (OMS)
ASTROCITOMA GRAU IV (OM S)
FIGURA 22 – Distribuição quantitativa dos casos (não-tumoral e astrocitomas) selecionados para o estudo
segundo a classificação histológica (n=60).
2
1
2
4
6
11
2
3
4
3
11
3
11111
2
3
9
3
11
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
00-09 10-19' 20-29 30-39 40-49 50-59 60-69 70-79 80-89
faixa etária (anos)
número de casos
não-tumoral
GRAU I (OMS)
GRAU II (OMS)
GRAU III (OMS)
GRAU IV (OMS)
FIGURA 23 – Distribuição quantitativa dos casos (não-tumoral e astrocitomas) selecionados para o estudo
segundo a faixa etária dos pacientes (n=60).
67%
33%
MASCULINO
FEM ININO
FIGURA 24 – Distribuição percentual dos astrocitomas avaliados segundo o sexo dos pacientes (n=55).
87
FIGURA 25 – Distribuição percentual dos astrocitomas avaliados segundo a localização tumoral (n=33).
4.2. ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA
A reavaliação dos parâmetros histopatológicos nos astrocitomas (Figuras 26 e 27),
evidenciou significantes aumentos na celularidade, na atipia nuclear e na presença de necrose
conforme a progressão tumoral. A atividade mitótica e a detecção de células gigantes
acompanharam esta mesma tendência somente nos graus III e IV, enquanto a hiperplasia vascular
manifestou-se de forma significante unicamente nos Astrocitomas Grau IV. O pleomorfismo
celular e a existência de gemistócitos demonstraram propensão ao acréscimo, embora não-
significante, de acordo com a gradação tumoral. Nenhuma alteração quanto aos paradigmas
avaliados foi constatada nas amostras não-tumorais. A soma dos escores referentes apenas aos
critérios de graduação dos astrocitomas adotados pela OMS (Tabela 05) proporcionou clara
distinção entre as categorias histológicas.
A análise conjunta de todos os parâmetros histopatológicos pela metodologia CART
(Figura 28) indicou que a simples alteração na celularidade definiu a presença do tumor. O intenso
pleomorfismo celular determinou o grau IV. A associação entre níveis moderados ou intensos de
atipia nuclear e de atividade mitótica discriminou os tumores grau III. A conjunção entre atipia
nuclear moderada ou intensa com figuras mitóticas discretas ou ausentes e com a inexistência de
necrose diferenciou o grau II. Os tumores do grau I representaram a combinação entre a discrição
ou a ausência dos índices referentes à atipia nuclear, ao pleomorfismo celular e à ocorrência de
figuras mitóticas.
88
IVIIIIIInão-tumoral
GRAU (OMS)
3
2
1
0
escore
HIPERPLASIA ENDOTELIAL
NECROSE
ATIVIDADE MITÓTICA
ATIPIA NUCLEAR
PELOMORFISMO CELULAR
CELULARIDADE
FIGURA 26 – Médias dos escores atribuídos aos parâmetros histopatológicos segundo a classificação
histológica dos casos avaliados. (*) p<0,05 em relação ao grupo anterior (teste U de Mann-Whitney).
IVIIIIIInão-tumoral
GRAU (OMS)
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
-0,2
escore
GEMISTÓCITOS
CÉLULAS GIGANTES
FIGURA 27 – Médias dos escores atribuídos à presença de células gigantes e de gemistócitos segundo a
classificação histológica dos casos avaliados. (♦) p<0,01 em relação ao grupo anterior (teste U de Mann-
Whitney).
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
**
♦
♦
89
TABELA 05 – Valores referentes ao somatório dos escores atribuídos aos parâmetros
histopatológicos adotados como critérios para graduação tumoral dos astrocitomas pela
OMS (pleomorfismo celular, atipia nuclear, índice mitótico, hiperplasia vascular e necrose)
segundo a classificação histológica dos casos avaliados
Classificação Histológica Média do Total ± Desvio Padrão
não-tumoral 0
GRAU I
2,38 ± 1,98
♦
GRAU II
5,50 ± 1,50
♦
GRAU III
7,43 ± 0,97
♦
GRAU IV
13,05 ± 1,56
♦
(♦) p<0,01 em relação ao grupo anterior (teste U de Mann-Whitney).
FIGURA 28 – Árvore de decisão fornecida pelo método CART referente à análise dos parâmetros
histopatológicos de acordo com a classificação histológica dos casos avaliados. Custo relativo total: 0,192;
S (sensibilidade); E (especificidade).
90
4.3. ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA
4.3.1. Proliferação Celular
O padrão da marcação imuno-histoquímica para Ki-67 e Topoisomerase IIα, marcadores
clássicos de proliferação celular, está ilustrado na Figura 29. O potencial impacto do fator de
transcrição c-Myc nos eventos proliferativos (Figura 30) acarretou a inclusão dos dados referentes
à sua expressão nuclear (funcional) entre os indicadores de multiplicação celular, assim como os
escores relacionados ao índice mitótico verificado pela histopatologia.
A positividade para Ki-67, TopoIIα e c-Myc (Figura 31) demonstrou tendência de
aumento com a progressão maligna, estando ausente nos tecidos não-tumorais e apresentando
valores máximos nos astrocitomas de alto grau. A média dos escores atribuídos a esses
indicadores (Figura 32) revelou a significante marcação para c-Myc nos Astrocitomas Grau IV.
Observou-se ainda aumento gradual da expressão do Ki-67 conforme o índice mitótico e a
classificação histológica, não sendo o mesmo evidenciado quanto à detecção da TopoIIα.
FIGURA 29 – Expressão dos marcadores de proliferação celular Ki-67 [a, b, c, d] e Topoisomerase IIα [e,
f] detectada por imuno-histoquímica (400X). [a] Caso n
o
. 03 – Astrocitoma Grau I (OMS): marcação discreta;
[b] Caso n
o
. 17 – Astrocitoma Grau II (OMS): marcação moderada; [c] Caso n
o
. 35 – Astrocitoma Grau IV
(OMS): marcação intensa; [d] Caso n
o
. 0.5 – Córtex Cerebral Não-Tumoral: ausência de marcação nuclear,
todavia percebe-se background no citoplasma dos neurônios; [e] Caso n
o
. 31 – Astrocitoma Grau III (OMS):
marcação moderada; [f] Caso n
o
. 32 – Astrocitoma Grau III (OMS): marcação intensa. Para maiores detalhes
sobre os casos, consultar Anexo IV.
91
FIGURA 30 – Expressão de c-Myc detectada por imuno-histoquímica (400X). Caso n
o
. 36 – Astrocitoma
Grau IV (OMS): dentre as células tumorais positivas, destacam-se aquelas que exibem figuras mitóticas (setas).
Para maiores detalhes sobre o caso, consultar Anexo IV.
FIGURA 31 – Percentuais de positividade imuno-histoquímica para os marcadores relacionados à
proliferação celular Ki-67, TopoIIα e c-Myc (nuclear) segundo a classificação histológica dos casos
avaliados. (♦) p<0,01 em relação ao grupo anterior (teste U de Mann-Whitney).
♦
92
IVIIIIIInão-tumoral
GRAU (OMS)
60
50
40
30
20
10
0
-10
escore
C-MYC nuclear (LI)
TOPOISOMERASE II (LI)
KI-67 (LI)
ÍNDICE MITÓTICO
FIGURA 32 – Médias dos escores atribuídos aos parâmetros relacionados à proliferação celular [índice
mitótico, Ki-67 (LI), TopoIIα (LI), c-Myc nuclear (LI)] segundo a classificação histológica dos casos
avaliados. LI (de L
abelling Index); (♦) p<0,01 e (*) p<0,05 em relação ao grupo anterior (teste U de Mann-
Whitney).
Os valores médios referentes à expressão do antígeno Ki-67 nas classes histológicas
examinadas encontram-se na Tabela 06. A Figura 33 demonstra que os índices acima de 8,0%
distinguiram os tumores grau IV, ao passo que os escores entre 1,5 e 8,0% designaram os tumores do
grau III. Contagens abaixo de 1,5% compreenderam indiscriminadamente as demais categorias
histológicas analisadas.
4.3.2. Diferenciação Astrocítica
♠
O aspecto da marcação imuno-histoquímica para GFAP pôde ser visto na Figura 09. Em
média, 76,9% das células tumorais nos Astrocitomas Grau IV avaliados manifestaram positividade
para GFAP com intensidade moderada (2+), contrastando com os índices máximos (LI=100 e H=300)
verificados nos astrócitos das amostras não-tumorais (Figura 34).
♠
A expressão de GFAP foi avaliada somente nas amostras não-tumorais (controle) e nos Astrocitomas Grau IV,
notadamente os mais anaplásicos, objetivando confirmar a origem astrocítica e identificar o nível de
diferenciação desses tumores.
♦
♦
♦
♦
♦
*
*
93
TABELA 06 – Valores referentes aos escores atribuídos à expressão do antígeno Ki-67 (LI)
detectada por imuno-histoquímica segundo a classificação histológica dos casos avaliados
Classificação Histológica Média ± Desvio Padrão
não-tumoral 0
GRAU I
0,23 ± 0,60
♦
GRAU II
1,43 ± 2,20
♦
GRAU III
5,28 ± 4,50
♦
GRAU IV
19,8 ± 12,72
♦
LI (de Labelling Index); (♦) p<0,01 em relação ao grupo anterior (teste U de Mann-Whitney).
FIGURA 33 – Árvore de decisão fornecida pelo método CART referente à análise da expressão do
antígeno Ki-67 detectada por imuno-histoquímica de acordo com as diferentes gradações dos astrocitomas
avaliados. Custo relativo total: 0,595; S (sensibilidade); E (especificidade); LI (de L
abelling Index).
FIGURA 34 – Médias dos escores atribuídos à expressão de GFAP detectada por imuno-histoquímica
segundo a classificação histológica dos casos avaliados. LI (de L
abelling Index); H (de H-Score).
94
4.3.3. Supressores Tumorais
A detecção imuno-histoquímica das proteínas p53, p21 e p27 é retratada na Figura 35.
Não foi evidenciada a expressão destas moléculas em astrócitos não-tumorais. A positividade
(Figura 36) e a média dos escores (Figura 37) para p53 demonstraram discreta propensão ao
aumento com a evolução dos tumores astrocíticos. A porcentagem de casos positivos para p27
nuclear (funcional) apresentou significante ascensão conforme a progressão maligna, embora com
importante redução nos Astrocitomas Grau IV. Já os valores referentes à sua expressão
mantiveram a orientação de crescimento de acordo com a seqüência tumoral, com notável
marcação nos tumores grau IV: cerca de 40% dos casos exibiram positividade em mais de 70%
das células tumorais (LI > 70). As marcações para p53 e p27 (nuclear) correlacionaram-se de
forma significante com a classificação histológica (p<0,01; teste H de Kruskal-Wallis).
Por outro lado, os índices para p21 manifestaram tendência de redução com a sucessão
tumoral até a gradação III, contrastando com os significantes aumentos em positividade e em
expressão nos tumores do grau IV. A relação entre a expressão imuno-histoquímica dos
supressores tumorais p53 e p21 (alvo transcricional do p53) é apresentada na Figura 38, onde se
percebe pequena fração (16,36%) funcionalmente discordante [representada por p53(+)/p21(+)],
principalmente nos Astrocitomas Grau IV. A positividade para p53, p21 e p27 (nuclear) no
conjunto dos tumores astrocíticos estudados foi de 54,98%, 34,61% e 80,72%, respectivamente.
A marcação citoplasmática de p27 foi observada em 32,96% dos astrocitomas avaliados,
apresentando-se mais freqüentemente nos tumores de alto grau (III e IV) do que nos de baixo grau
(I e II) (Figura 39). A concomitância (+/+) entre a detecção nuclear e citoplasmática de p27
demonstrou inclinação semelhante, sendo de 42,86% nos tumores de alto grau e 22,22% nos de
baixo grau. Verificou-se sutil disposição ao acréscimo da expressão citoplasmática para p27
conforme a progressão tumoral (Figura 40).
95
FIGURA 35 – Expressão dos supressores tumorais p53 [a, b], p21 [c] e p27 [d] detectada por imuno-
histoquímica (400X). [a] Caso n
o
. 15 – Astrocitoma Grau II (OMS): marcação discreta; [b] Caso n
o
. 29 –
Astrocitoma Grau III (OMS): marcação intensa; [c] Caso n
o
. 52 – Astrocitoma Grau IV (OMS): marcação
intensa; [d] Caso n
o
. 17 – Astrocitoma Grau II (OMS): marcações nuclear e citoplasmática moderadas. Para
maiores detalhes sobre os casos, consultar Anexo IV.
IVIIIIIInão-tumoral
GRAU (OMS)
125
100
75
50
25
0
positividade (%)
P27 (nuclear)
P21
P53
FIGURA 36 – Percentuais de positividade imuno-histoquímica para os supressores tumorais p53, p21 e
p27 (nuclear) segundo a classificação histológica dos casos avaliados. (*) p<0,05 em relação ao grupo
anterior (teste U de Mann-Whitney).
*
*
*
*
96
IVIIIIIInão-tumoral
GRAU (OMS)
60
40
20
0
marcação
P27 nuclear (LI)
P21 (LI)
P53 (LI)
FIGURA 37 – Médias dos escores atribuídos à expressão dos supressores tumorais [p53 (LI), p21 (LI) e
p27 nuclear (LI)] detectada por imuno-histoquímica segundo a classificação histológica dos casos
avaliados. LI (de L
abelling Index); (*) p<0,05 em relação ao grupo anterior (teste U de Mann-Whitney).
23,07
0
28,57 28,57
15,38
30,77
30,77
7,14
28,57
42,86
21,43
57,14
14,28
4,76
38,09
0
10
20
30
40
50
60
p53(-)/p21(-) p53(+)/p21(-) p53(-)/p21(+) p53(+)/p21(+)
porcentagem dos casos (%)
GRAU I (OMS)
GRAU II (OMS)
GRAU III (OMS)
GRAU IV (OMS)
FIGURA 38 – Distribuição percentual das diferentes gradações dos astrocitomas segundo a relação entre
a expressão imuno-histoquímica das proteínas p53 e p21. (+) presença da expressão; (–) ausência da
expressão.
*
*
97
IVIIIIIInão-tumoral
GRAU (OMS)
120
100
80
60
40
20
0
positividade (%)
P27 citoplasmático
P27 nuclear
FIGURA 39 – Percentuais de positividade imuno-histoquímica para o supressor tumoral p27 (nuclear e
citoplasmático) segundo a classificação histológica dos casos avaliados. (*) p<0,05 em relação ao grupo
anterior (teste U de Mann-Whitney).
IVIIIIIInão-tumoral
GRAU (OMS)
80
60
40
20
0
-20
marcação
P27 citoplasmático (H)
P27 citoplasmático (LI)
P27 nuclear (LI)
FIGURA 40 – Médias dos escores atribuídos à expressão de p27 nuclear (LI) e citoplasmático (LI e H)
detectada por imuno-histoquímica segundo a classificação histológica dos casos avaliados. LI (de L
abelling
I
ndex); H (de H-Score); (*) p<0,05 em relação ao grupo anterior (teste U de Mann-Whitney).
*
*
*
*
98
Curiosamente, pôde se observar ainda a expressão de p21 e p27 na micróglia contígua
às células tumorais em aproximadamente 70% dos casos positivos para p53, notadamente nos
astrocitomas de alto grau (Figura 41).
FIGURA 41 – Expressão dos supressores tumorais p53 [a], p21 [b] e p27 [c] detectada por imuno-
histoquímica (400X). Caso n
o
. 01 – Astrocitoma Grau I (OMS): a marcação para p53 nos astrócitos tumorais é
acompanhada pela positividade para p21 e p27 nas células microgliais adjacentes (setas). Para maiores detalhes
sobre o caso, consultar Anexo IV.
4.3.4. Apoptose
Exemplos de reações imuno-histoquímicas para Bcl-2 e Bax estão ilustrados na Figura
42. O percentual de positividade (Figura 43) e a média dos escores (Figura 44) referentes à
marcação para a proteína Bcl-2 mostraram tendência ao acréscimo com a evolução tumoral.
Em relação à proteína Bax, evidenciou-se propensão ao aumento da positividade e à
constância nos níveis de sua expressão de acordo com a progressão maligna, exceto pela
redução desses índices observada nos Astrocitomas Grau II. A positividade para Bcl-2 e Bax
na totalidade dos tumores astrocíticos investigados foi de 43,26% e 24,67%, respectivamente.
Tais proteínas não foram evidenciadas entre as amostras não-tumorais pesquisadas.
99
FIGURA 42 – Expressão dos marcadores relacionados à apoptose Bax [a, b, c] e Bcl-2 [d, e, f] detectada
por imuno-histoquímica (400X). [a] Caso n
o
. 0.1 – Córtex Cerebral Não-Tumoral: ausência de marcação; [b]
Caso n
o
. 11 – Astrocitoma Grau I (OMS): marcação moderada; [c] Caso n
o
. 52 – Astrocitoma Grau IV (OMS):
marcação intensa; [d] Caso n
o
. 0.3 – Córtex Cerebral Não-Tumoral: ausência de marcação; [e] Caso n
o
. 29 –
Astrocitoma Grau III (OMS): marcação moderada; [f] Caso n
o
. 02 – Astrocitoma Grau I (OMS): marcação
intensa. Para maiores detalhes sobre os casos, consultar Anexo IV.
IVIIIIIInão-tumoral
GRAU (OMS)
100
80
60
40
20
0
positividade (%)
BAX
BCL-2
FIGURA 43 – Percentuais de positividade imuno-histoquímica para Bcl-2 e Bax segundo a classificação
histológica dos casos avaliados.
100
IVIIIIIInão-tumoral
GRAU (OMS)
50
40
30
20
10
0
-10
-20
marcação
BAX (H)
BAX (LI)
BCL2 (H)
BCL2 (LI)
FIGURA 44 – Médias dos escores atribuídos à expressão de Bcl-2 e Bax (LI e H) detectada por imuno-
histoquímica segundo a classificação histológica dos casos avaliados. LI (de L
abelling Index); H (de H-
Score).
As marcações para Bcl-2 (LI) e Bax (LI) manifestaram significante correlação com a
graduação dos astrocitomas (p<0,05; teste H de Kruskal-Wallis), sendo mais freqüente a
detecção destas moléculas nos tumores do grau IV do que nos tumores do grau I e II (p<0,05;
teste U de Mann-Whitney). A avaliação da tendência à sobrevida celular nos tumores
astrocíticos, calculada através do balanço entre Bcl-2 (estímulo anti-apoptótico) e Bax
(estímulo pró-apoptótico), revelou sua ampliação conforme a progressão tumoral (Figura 45).
101
0
30,77
50
57,14
61,9
0
10
20
30
40
50
60
70
sobrevida (relação bcl-2/bax)
porcentagem dos casos (%)
não-tumoral
GRAU I (OMS)
GRAU II (OMS)
GRAU III (OMS)
GRAU IV (OMS)
FIGURA 45 – Distribuição percentual das diferentes classificações histológicas segundo a tendência à
sobrevida estimada pelo balanço entre a expressão de Bcl-2 e Bax detectada por imuno-histoquímica.
4.3.5. Receptores da Família ErbB
Aspectos da marcação imuno-histoquímica para EGFR e ErbB2 nos astrocitomas
podem ser vistos na Figura 46. Não houve expressão destes receptores nos astrócitos não-
tumorais. A positividade para EGFR e ErbB2 no conjunto dos tumores estudados foi de
32,37% e 3,57%, respectivamente.
Os percentuais de positividade (Figura 47) e os valores médios do escore H (Figura
48) relativos ao EGFR foram significantes nos tumores astrocíticos dos graus I e IV. Apesar
dos Astrocitomas Grau IV terem demonstrado o maior índice de casos positivos para EGFR, a
média de expressão mostrou-se inferior à constatada nos tumores do grau I devido à menor
intensidade da marcação verificada. A proteína ErbB2 foi detectada somente em 14,28% dos
tumores do grau IV, apresentando média de 41,66% de células marcadas (LI médio ≅ 42) com
intensidade moderara (H médio ≅ 75).
102
FIGURA 46 – Expressão dos receptores de membrana EGFR [a, b, c] e ErbB2 [d] detectada por imuno-
histoquímica. [a e b] Caso n
o
. 43 – Astrocitoma Grau IV (OMS): (a) marcação intensa (400X), (b) detalhe
evidencia algumas células positivas exibindo figuras mitóticas (1.000X); [c] Caso n
o
. 13 – Astrocitoma Grau I
(OMS): marcação intensa, predominante em gemistócitos; [d] Caso n
o
. 49 – Astrocitoma Grau IV (OMS):
marcação moderada. Para maiores informações sobre os casos, consultar Anexo IV.
IVIIIIIInão-tumoral
GRAU (OMS)
100
80
60
40
20
0
positividade (%)
c-erbB2
EGFR
FIGURA 47 – Percentuais de positividade imuno-histoquímica para EGFR e ErbB2 segundo a
classificação histológica dos casos avaliados. (♦) p<0,01 em relação ao grupo anterior (teste U de Mann-
Whitney).
♦
♦
103
IVIIIIIInão-tumoral
GRAU (OMS)
150
100
50
0
-50
marcação
c-erbB2 (H)
EGFR (H)
FIGURA 48 – Médias dos escores atribuídos à expressão de EGFR (H) e ErbB2 (H) detectada por imuno-
histoquímica segundo a classificação histológica dos casos avaliados. H (de H
-Score); (♦) p<0,01 e (*)
p<0,05 em relação ao grupo anterior (teste U de Mann-Whitney).
Apoiando-se na expressão imuno-histoquímica das proteínas EGFR e p53/p21,
projetou-se o perfil funcional dos seus respectivos genes nos tumores astrocíticos pesquisados
(Figura 49). Nos Astrocitomas Graus I e II, a maior parte dos casos (38,46% e 50%,
respectivamente) não demonstrou indícios de alterações simultâneas nos genes EGFR e p53.
Todavia, considerável fração de tumores astrocíticos do grau I (30,77%) apresentou aumento
na expressão do gene EGFR associadas à normalidade no gene p53, ao passo que importante
porção dos tumores do grau II (28,57%) exibiu modificações no gene p53 na ausência de
desordens no gene EGFR. Este último panorama ilustrou a principal tendência verificada nos
tumores do grau III (71,43%). Quanto aos tumores do grau IV, observou-se maior freqüência
(42,86%) da superexpressão do gene EGFR em conjunção à inexistência da mutação do gene
p53. Cerca de 14,54% dos astrocitomas avaliados manifestaram a presença de alterações em
ambos os genes EGFR e p53.
♦
*
*
104
30,77
50
71,43
00
42,86
19,05
38,46
15,38 15,38
28,57
7,14
14,28
28,57
14,28
23,8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
EGFR(-)/p53wt EGFR(-)/p53mut EGFR(+)/p53wt EGFR(+)/p53mut
porcentagem dos casos (%)
GRAU I (OMS)
GRAU II (OMS)
GRAU III (OMS)
GRAU IV (OMS)
FIGURA 49 – Distribuição percentual das diferentes gradações dos astrocitomas segundo a situação
funcional dos genes p53 e EGFR estimada pela detecção imuno-histoquímica de suas respectivas
proteínas. wt* (selvagem, de w
ild-type); mut (mutado); + (presença da expressão); – (ausência da expressão).
* considerou-se o gene selvagem quando se constatava a ausência de expressão para p53 [p53(-)] ou a presença
da expressão para p53 associada à significativa positividade para p21 [p53(+)/p21(+)].
4.3.6. Sinalização Intracelular
A detecção imuno-histoquímica da proteína Ras é ilustrada na Figura 50. Percebeu-se
significante positividade para p21
Ras
nos Astrocitomas Grau II em relação às demais classes
histológicas (Figura 51), conquanto a média dos escores referente à expressão dessa proteína (Figura
52) tenha se destacado nos tumores do grau I (p<0,01; teste H de Kruskal-Wallis). A porcentagem de
casos positivos para a proteína Ras entre os tumores astrocíticos investigados foi de 10,90%, não
sendo observada marcação entre as amostras não-tumorais.
FIGURA 50 – Expressão de Ras detectada por imuno-histoquímica (400X). [a] Caso n
o
. 0.2 – Córtex
Cerebral Não-Tumoral: ausência de marcação; [b] Caso n
o
. 11 – Astrocitoma Grau I (OMS): marcação
moderada. Para maiores detalhes sobre os casos, consultar Anexo IV.
105
FIGURA 51 – Percentual de positividade imuno-histoquímica para p21
Ras
segundo a classificação
histológica dos casos avaliados. (*) p<0,05 em relação ao grupo anterior (teste U de Mann-Whitney).
IVIIIIIInão-tumoral
GRAU (OMS)
80
60
40
20
0
-20
marcação
p21RAS (H)
p21RAS (LI)
FIGURA 52 – Médias dos escores atribuídos à expressão de Ras (LI e H) detectada por imuno-
histoquímica segundo a classificação histológica dos casos avaliados. H (de H
-Score); LI (de Labelling
I
ndex).
*
*
106
4.3.7. O Fator de Transcrição c-Myc
A Figura 53 retrata diferentes padrões de marcação imuno-histoquímica para a
proteína c-Myc. O percentual de positividade (Figura 54) e o valor médio dos escores (Figura
55) referentes à expressão nuclear de c-Myc apresentaram tendência ao aumento com a
sucessão tumoral dos astrocitomas.
Quanto à detecção citoplasmática de c-Myc, observou-se maior número de casos
positivos entre os tumores astrocíticos de alto grau (III e IV) do que entre os de baixo grau (I e
II). Semelhante diferenciação foi constatada de modo significante através dos valores
relativos às médias do escore H, com maiores índices para os tumores de alto grau em relação
aos de baixo grau. Já em relação à porcentagem de células positivas (escore LI), evidenciou-
se significante marcação a partir dos tumores do grau I, mantendo-se constante até a discreta
ampliação registrada nos tumores do grau IV.
FIGURA 53 – Expressão de c-Myc detectada por imuno-histoquímica (400X). [a] Caso n
o
. 0.2 – Córtex
Cerebral Não-Tumoral: ausência de marcação; [b] Caso n
o
. 14 – Astrocitoma Grau II (OMS): marcação
citoplasmática moderada, predominante em gemistócitos; [c] Caso n
o
. 28 – Astrocitoma Grau III (OMS):
marcações citoplasmática (detalhe superior) e nuclear (detalhe inferior) moderadas. Para maiores informações
sobre os casos, consultar Anexo IV.
107
IVIIIIIInão-tumoral
GRAU
(
OMS
)
100
80
60
40
20
0
positividade (%)
C-MYC citoplasmático
C-MYC nuclear
FIGURA 54 – Percentuais de positividade imuno-histoquímica para o fator de transcrição c-Myc (nuclear
e citoplasmático) segundo a classificação histológica dos casos avaliados.
IVIIIIIInão-tumoral
GRAU (OMS)
50
40
30
20
10
0
-10
marcação
C-MYC citoplasmático (H)
C-MYC citoplasmático (LI)
C-MYC nuclear
FIGURA 55 – Médias dos escores atribuídos à expressão de c-Myc detectada por imuno-histoquímica
segundo a classificação histológica dos casos avaliados. LI (de L
abelling Index); H (de H-Score); (*) p<0,05
em relação ao grupo anterior (teste U de Mann-Whitney).
*
*
*
108
A concordância entre as expressões nuclear e citoplasmática para c-Myc mostrou-se
similar nas diferentes gradações dos tumores astrocíticos (em média 65,45%), enquanto a
concomitância demonstrou considerável acréscimo conforme a progressão maligna (Figura
56). A positividade geral para c-Myc dentre os astrocitomas avaliados foi de 50,27% e
54,12% para os sítios nuclear e citoplasmático, respectivamente. Não ocorreu positividade
entre os exemplares não-tumorais averiguados.
52,84
0
64,28
21,42
57,14
42,85
66,66
65,45
36,36
76,19
0
10
20
30
40
50
60
70
80
concordância (+/+ ou -/-) concomitância (+/+)
porcentagem dos casos (%
)
GRAU I (OMS)
GRAU II (OMS)
GRAU III (OMS)
GRAU IV (OMS)
GERAL (GRAUS I a IV)
FIGURA 56 – Percentuais de concordância (+/+ ou -/-) e concomitância (+/+) entre as marcações nuclear e
citoplasmática para c-Myc detectadas por imuno-histoquímica segundo a classificação histológica dos
astrocitomas avaliados.
4.3.8. Vias Tumorigênicas
A constatação da maior freqüência de alterações na expressão dos genes p53, EGFR e
c-myc nos tumores astrocíticos, bem como as evidências do impacto dessas variações na
graduação tumoral, suscitou a subdivisão simplificada dos astrocitomas avaliados
considerando-se agora a alteração molecular preponderante (quantitativa e qualitativamente)
em cada caso. O resultado destas inferências encontra-se representado na Figura 57.
109
Nos Astrocitomas Grau I constataram-se semelhantes índices entre os tumores que
exibiram a mutação do p53 e a superexpressão do EGFR como principal desordem molecular.
Nos Astrocitomas Graus II e III observou-se predomínio da mutação do p53, especialmente
nesta última gradação, logo seguida pela expressão do c-myc. Nos Astrocitomas Grau IV,
prevaleceu a superexpressão do EGFR, sucedida pela mutação do p53 e pela expressão do c-
myc, respectivamente.
30,46
28,57
7,14
0
28,57
23,8
15,38
30,77
21,43
54,14
57,14
9,52
0
10
20
30
40
50
60
p53 EGFR c-myc
porcentagem dos casos (%)
GRAU I (OMS)
GRAU II (OMS)
GRAU III (OMS)
GRAU IV (OMS)
FIGURA 57 – Distribuição percentual das diferentes gradações dos astrocitomas segundo o principal
evento tumorigênico (mutação do p53, superexpressão do EGFR, expressão de c-Myc) estimado pela
detecção imuno-histoquímica das proteínas correlatas.
4.3.9. Enzimas relacionadas à Quimiorresistência
Exemplos da detecção imuno-histoquímica para TopoIIα, MGMT, GSTπ e TS podem
ser vistos nas Figuras 29 [e, f] e 58. Os percentuais de positividade e os escores médios de
expressão dessas enzimas nas diferentes classificações histológicas são mostrados nas Figuras
59 e 60, respectivamente.
A presença da MGMT foi evidenciada em todos os espécimes avaliados (tumorais e
não-tumorais), ocorrendo predominantemente no núcleo das células astrocíticas. Os índices
110
médios de marcação para essa enzima foram elevados (LI médio = 69,43), demonstrando
aparente nivelamento entre as distintas categorias histológicas pesquisadas.
A GSTπ foi detectada basicamente entre os astrocitomas, com elevada positividade
(média de 92,44%) nas diferentes gradações tumorais, ao passo que os escores de expressão
(LI) para essa enzima apresentaram tendência à redução conforme a progressão maligna.
Quanto à TopoIIα, constatou-se tendência à ampliação das porcentagens de amostras
positivas de acordo com a evolução tumoral dos astrocitomas (média de 62,02%), enquanto os
índices de marcação revelaram-se similares nas diversas graduações (LI médio = 22,93).
Já a TS manifestou-se preponderantemente nos tumores astrocíticos, com semelhantes
valores de positividade (média de 79,16%) e escores de expressão (LI médio = 23,95;
H médio = 38,20) nas diferentes gradações. Os Astrocitomas Grau IV configuraram exceção,
visto que exibiram significante aumento do índice médio de marcação (LI médio = 63,33),
mesmo diante da redução no percentual de casos positivos para essa enzima.
FIGURA 58 – Expressão das enzimas relacionados à quimiorresistência GSTπ [a, b], TS [c, d] e MGMT
[e, f] detectada por imuno-histoquímica (400X). [a, c, e] Caso n
o
. 0.4 – Córtex Cerebral Não-Tumoral:
ausência de marcação para GSTπ e TS, porém intensa marcação das células astrocíticas para MGMT; [b] Caso
n
o
. 06 – Astrocitoma Grau I (OMS): marcação intensa; [d] Caso n
o
. 30 – Astrocitoma Grau III (OMS): marcação
moderada; [f] Caso n
o
. 33 – Astrocitoma Grau III (OMS): marcação intensa. Para maiores detalhes sobre os
casos, consultar Anexo IV.
111
FIGURA 59 – Percentuais de positividade imuno-histoquímica para as enzimas MGMT, GSTπ, TopoIIα e
TS segundo a classificação histológica dos casos avaliados. (♦) p<0,01 em relação ao grupo anterior (teste U
de Mann-Whitney).
FIGURA 60 – Médias dos escores atribuídos à expressão das enzimas relacionadas à quimiorresistência
[MGMT (LI), GSTπ (LI), TopoIIα (LI) e TS (LI e H)] detectada por imuno-histoquímica segundo a
classificação histológica dos casos avaliados. LI (de L
abelling Index) H (de H-Score); (*) p<0,05 em relação ao
grupo anterior (teste U de Mann-Whitney).
*
*
*
*
*
♦ ♦
112
5. DISCUSSÃO
O presente estudo analisou o perfil clínico-epidemiológico, histopatológico e imuno-
histoquímico de 55 (cinqüenta e cinco) tumores astrocíticos e de 05 (cinco) exemplares de
tecido cerebral não-tumoral (grupo controle), todos procedentes de material de arquivo fixado
em formalina e incluído em parafina. A proposta de avaliação proteômica in situ de 15
(quinze) marcadores relacionados a diferentes funções celulares em uma mesma amostragem
de astrocitomas apresenta-se, até este momento, sem paralelo na literatura mundial.
5.1. ANÁLISE CLÍNICO-EPIDEMIOLÓGICA
A incidência anual dos astrocitomas evidenciada na cidade de Fortaleza (3,08/100.000
habitantes) mostrou-se semelhante às observadas em regiões subdesenvolvidas (2,86/100.000)
(Kleihues & Cavenee, 2000) e inferior às verificadas em áreas mais desenvolvidas, como o
município de São Paulo (4,15/100.000) (Mirra et al., 2001) e os EUA (4,81/100.000)
(CBTRUS, 2002). Conforme indicado, essa diferença parece remeter somente a razões sócio-
econômicas, visto que não se detectam fatores etiológicos específicos para o surgimento de
tumores astrocíticos entre os diferentes povos/territórios mundiais (Lantos et al., 2002).
Acredita-se que as dificuldades enfrentadas pelos pacientes no acesso aos serviços de saúde
pública (profissionais especializados, recursos de imagem, oportunidade cirúrgica)
contribuam para o atraso no diagnóstico e/ou na conduta terapêutica, resultando na ausência
de perspectiva cirúrgica ou mesmo no óbito dos portadores dessas e de outras neoplasias
primárias do SNC.
113
Embora seja pouco provável, não se pode descartar a possibilidade de sub-notificação
dos casos de astrocitomas em Fortaleza, já que a referência do material histológico para o
Laboratório BIOPSE
não ocorre de forma invariável. Além disso, a carência de abordagens
terapêuticas pós-cirúrgicas por vezes desestimula os pacientes a se certificarem do diagnóstico
histopatológico (fonte dos dados). Esse panorama reforça a necessidade da implementação de
um serviço oficial confiável para o registro dos tumores primários do SNC diagnosticados no
Brasil, objetivando o reconhecimento endêmico e o planejamento de estratégias eficientes
para o seguimento clínico-cirúrgico dessas neoplasias.
A distribuição etária dos pacientes da amostra avaliada (n=55) refletiu de modo
fidedigno as peculiaridades descritas nos estudos epidemiológicos multicêntricos, com o
predomínio dos astrocitomas de baixo grau (I e II) entre os indivíduos mais jovens e dos
astrocitomas de alto grau (III e IV) entre os mais idosos (Louis, 1997). A classificação por
sexo entre os casos da amostragem revelou a preponderância do gênero masculino, todavia a
relação masculino/feminino observada no levantamento geral (1,28) retratou melhor a
propensão mundial (1,02) (Kleihues & Cavenee, 2000).
A localização dos tumores astrocíticos estudados também reproduziu os achados
internacionais, com predominância dos tumores grau I na região infratentorial e dos tumores
grau II, III e IV em sítios supratentoriais (Ironside et al., 2002). Apesar dos Astrocitomas
Grau IV serem descritos mais freqüentemente (31%) nos lobos temporais (Kleihues &
Cavenee, 2000), cerca da metade dos tumores dessa gradação pertencentes à amostra
encontrava-se nos lobos frontais. A despeito do reduzido tamanho amostral, parece razoável
supor que a maior porção do tecido cerebral corresponda ao principal local para o surgimento
de tumores tipicamente supratentoriais (Burger et al., 2002). Outra explicação advém da
possível extensão de grandes massas tumorais sobre os lobos frontais, caracterizando-as no
momento cirúrgico como presentes nestas projeções encefálicas.
114
5.2. ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA
A reavaliação dos parâmetros histopatológicos nos astrocitomas pesquisados indicou
que a alteração da celularidade define a presença de neoplasia; a atipia nuclear caracteriza os
tumores do grau II, enquanto sua associação à atividade mitótica distingue os tumores do grau
III; a presença de hiperplasia endotelial e/ou necrose diferencia os tumores do grau IV em
relação ao grau III; discretas alterações histológicas discriminam os tumores do grau I. Esses
achados coincidem integralmente com os critérios estabelecidos pela OMS para graduação
dos tumores astrocíticos (Kleihues et al., 2002), confirmando o diagnóstico original e
reiterando a aplicabilidade e a reprodutibilidade dos mesmos.
Ressalta-se, no entanto, que tais resultados foram obtidos através não da usual análise
qualitativa de achados histológicos, mas da atribuição de escores semiquantitativos propostos
pelo presente estudo (Tabela 03) de acordo com os paradigmas preconizados pela OMS para a
classificação dos astrocitomas. Tanto as variações individuais como o somatório das
pontuações demonstraram valor preditivo em relação à gradação tumoral. Dessa forma,
percebe-se a adequação desta estratégia como auxiliar na determinação do grau dos tumores
astrocíticos, tendo os valores médios da soma dos escores analisados (Tabela 05) como
principal referência para a classificação dessas neoplasias.
Outro importante instrumento para distinção da graduação dos astrocitomas revelado
pela corrente investigação surgiu com a aplicação da metodologia CART (Figura 28). Além
da combinação dos parâmetros já descritos, a árvore de decisão referente à análise
histopatológica dos tumores astrocíticos apontou o pleomorfismo celular intenso como
“marca registrada” do grau IV. De fato, poucos neoplasmas humanos demonstram tamanha
heterogeneidade em sua composição celular como os Astrocitomas Grau IV (Ellison et al.,
2004). Nestes tumores, transições entre áreas com diferenciação astrocítica discernível e
115
regiões altamente anaplásicas mostram-se freqüentes e, por vezes, ocorrem de forma abrupta.
Essas variações súbitas parecem indicar o aparecimento de novos fenótipos tumorais
desencadeados pela aquisição de alterações genéticas diversas (Louis, 1997).
A necessidade da precisão na classificação dos astrocitomas provém da imprescindível
padronização do diagnóstico desses tumores, uma vez que este persiste como o único
indicador de condutas terapêuticas específicas e agrega valor prognóstico quanto à sobrevida
dos pacientes (Jaros et al., 1992). Dessa forma, acredita-se que o uso dos escores/médias e da
árvore de decisão para gradação dos tumores astrocíticos apresentados neste estudo
configurem artifícios aplicáveis na prática diagnóstica como auxiliares na determinação do
grau histológico dos astrocitomas, especialmente os de difícil categorização.
Embora não figurem entre os critérios de graduação tumoral da OMS, a presença de
células gigantes multinucleadas e a detecção de gemistócitos entre os tipos celulares dos
tumores astrocíticos são apontadas como indicadores de malignidade (Gray et al., 2004). Nos
astrocitomas investigados, células gigantes foram evidenciadas somente nos tumores de alto
grau (III e IV), manifestando-se em associação à elevada celularidade e ao expressivo
pleomorfismo celular. Diversos autores consideram esses elementos celulares como
conseqüentes a alterações regressivas (indiferenciação) e sugerem sua correlação com pior
prognóstico clínico (Louis & Cavenee, 1997). Já os gemistócitos foram encontrados desde os
astrocitomas de baixo grau (I e II), todavia com maior representação entre os tumores de alto
grau, assim como relatado na literatura. Esses componentes celulares, por sua vez, são
descritos como resultantes possivelmente da degeneração de astrócitos neoplásicos,
conquanto sua origem permaneça incerta (Taillibert et al., 2004). Tumores astrocíticos de
baixo grau onde são demonstrados gemistócitos exibem tendência à rápida progressão para
subtipos mais malignos (Vinters et al., 1998). Apesar disso, não se constata correlação direta
entre a proporção de gemistócitos e o prognóstico dos pacientes (Yang et al., 2003).
116
5.3. ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA
5.3.1. Proliferação Celular
A proliferação celular descontrolada é a principal característica do processo
neoplásico. O conceito do aumento de malignidade conforme o incremento do índice
proliferativo tumoral é intuitivamente admitido como regra (Grzybicki & Moore, 1999). Nos
últimos anos, a medida do perfil proliferativo dos astrocitomas, assim como seu possível
impacto diagnóstico/prognóstico nos tumores, tem sido alvo de intensas pesquisas, utilizando
variadas metodologias (Stemmer-Rachamimov & Louis, 1997).
O mais simples e antigo método de averiguação de células proliferantes consiste na
observação de figuras mitóticas nos tecidos avaliados. As transformações estruturais
desencadeadas pela mitose, como a condensação da cromatina recém-duplicada (final da
prófase), a centralização celular das cromátides (metáfase), a separação dos cromossomos
pelo fuso mitótico (anáfase) e o início da distinção entre as duas novas células (telófase), são
eventos facilmente visualizados por microscopia óptica simples (Cotran et al., 2000).
Contudo, o fenômeno mitótico representa apenas o último passo (fase M) do complexo
mecanismo proliferativo representado pelo ciclo celular (G1-S-G2-M).
A necessidade da detecção das células proliferativas, independentemente da presença
de indícios morfológicos, levou à busca por elementos expressos exclusivamente no período
de ciclagem celular. Nesse sentido, surge o antígeno Ki-67, uma proteína nuclear presente em
todas as fases do ciclo celular (Gerdes et al., 1991). A elaboração do anticorpo monoclonal
MIB-1 para a análise imuno-histoquímica do Ki-67 transformou-o no mais utilizado marcador
de proliferação celular na rotina histopatológica devido à sua aplicabilidade em tecidos
fixados em formalina e incluídos em parafina (Cattoretti et al., 1992).
117
O presente estudo demonstrou o aumento gradual da expressão do antígeno Ki-67 de
acordo com a progressão maligna e o índice mitótico dos tumores astrocíticos avaliados
(Figura 32). Além disso, os escores médios do índice da marcação (LI) para Ki-67 revelaram
significante distinção entre as diferentes gradações dos astrocitomas (Tabela 06). Essas
tendências mostram-se em concordância com a maioria dos estudos anteriores (Tabela 07),
apesar da oscilação observada entre os valores estabelecidos para cada grupo histopatológico.
TABELA 07 – Índices de marcação imuno-histoquímica (LI) para o antígeno Ki-67
nas diferentes gradações dos tumores astrocíticos (incluídos em parafina)
segundo diversas referências, incluindo o presente estudo
Grau I (OMS) Grau II (OMS) Grau III (OMS) Grau IV (OMS)
Referência AC
n
MD ± DP
n
MD ± DP
n
MD ± DP
n
MD ± DP
Raghavan et al. (1990) *
MIB-1
1:50
- - 26
0,50 ±
0,54
26
4,10 ±
2,80
38
6,40 ±
3,34
Jaros et al. (1992) *
♦
MIB-1
1:50
- - 06 1,10 13 8,30 20 13,40
Karamitopoulou et al. (1994)
MIB-1
1:50
- - 24
2,03 ±
2,03
26
12,80 ±
6,29
09
14,57 ±
6,57
Onda et al. (1994)
MIB-1
1:50
- - 23
4,20 ±
4,10
22
7,30 ±
7,20
30
13,90 ±
13,50
Wakimoto et al. (1996) *
♦
MIB-1
1:50
- - 19
3,80 ±
2,70
25
18,40 ±
9,70
28
31,60 ±
12,90
Kordek et al. (1996) *
poAb
1:50
08 0,80 09 1,90 09 6,30 30 9,80
Khalid et al. (1997) *
MIB-1
1:100
09
1,20 ±
1,60
24
1,80 ±
3,20
20
13,50 ±
11,20
33
15,70 ±
15,40
Eneström et al. (1998) *
♦
MIB-1
1:50
- - 06
7,60 ±
2,30
09
13,30 ±
3,90
07
24,30 ±
6,60
Giannini et al. (1999) *
♦
MIB-1
1:100
131 1,10 45 2,30 50 6,00 45 9,1
Ralte et al. (2001) *
♦
MIB-1
1:50
08
0,44 ±
0,76
30
3,73 ±
3,70
11
9,65 ±
7,22
15
10,33 ±
7,98
Neder et al. (2004) *
♦
MoAb
1:200
- - 11
2,35 ±
3,00
05
6,44 ±
2,70
31
12,28 ±
8,20
Faria (2005) *
MIB-1
1:80
13
0,23 ±
0,60
14
1,43 ±
2,20
07
5,28 ±
4,50
21
19,80 ±
12,70
LI (de Labelling Index); AC (anticorpo e diluição); n (número de casos); MD (média); DP (desvio padrão);
* (associação estatística com a gradação histológica);
♦
(associação estatística com a sobrevida).
118
Mesmo com relativa limitação no número de casos estudados, percebe-se que os
índices de marcação para Ki-67 obtidos pela atual investigação exibiram valores similares aos
de grandes séries, como a reportada por Giannini et al. (1999).
As evidentes variações quantitativas para semelhantes gradações tumorais, observadas
entre os diferentes estudos, podem ser justificadas por uma simples e desconcertante razão: a
determinação imuno-histoquímica de antígenos em tumores astrocíticos fixados em formalina
e incluídos em parafina, especialmente aqueles relacionados à atividade proliferativa, não é
fácil! Os desafios começam no processamento rotineiro do material, onde a inadequação dos
métodos de fixação e diafanização tecidual pode ocasionar deterioração protéica, destituindo
o tecido do antígeno a ser pesquisado (Shi et al., 2001). Durante a reação imuno-histoquímica,
fatores como a adequação dos cortes histológicos, as condições de recuperação antigênica, a
titulação do anticorpo primário, o tempo de detecção, a técnica de revelação, a intensidade da
contra-coloração, entre outros são determinantes para a qualidade final da imuno-marcação
(Taylor et al., 1994). Já na etapa de visualização microscópica, a escolha dos campos
tumorais para a avaliação (geralmente os astrocitomas apresentam áreas heterogêneas, com
importantes distinções entre as populações celulares), o número de células avaliadas e a
experiência do examinador podem influenciar a quantificação das células imuno-reativas
(Coons & Johnson, 1993).
∗
Considerando as limitações da metodologia imuno-histoquímica “manual”, sistemas
automáticos de coloração e métodos computacionais para contagem de células positivas têm
sido propostos como solução para a padronização universal desta importante ferramenta de
estudo. Entretanto, o custo desses equipamentos e a necessidade de pessoal especialmente
treinado para aplicação dos mesmos têm dificultado, até o presente momento, a utilização
dessas estratégias na rotina diagnóstica em patologia e na prática laboratorial (Sallinen, 1999).
∗
As fontes de variação do método imuno-histoquímico enumeradas são extensíveis a todos os marcadores.
119
Por outro lado, as melhorias qualitativas dos reagentes (anticorpos monoclonais,
sistemas de detecção mais sensíveis) e a formatação de diretrizes técnicas internacionais (ex.:
Herceptest
®
) representam avanços simples e práticos em direção à aquisição de uniformidade
entre os estudos imuno-histoquímicos multicêntricos. O impacto desses fatores já pode ser
notado através da maior regularidade observada entre os resultados obtidos pelas pesquisas
publicadas mais recentemente.
A despeito da variabilidade dos dados, grande parte dos investigadores aponta nítida
correlação entre o nível de marcação para Ki-67 e o grau histológico dos tumores astrocíticos
(Tabela 07), confirmando a importância da proliferação celular na determinação do fenótipo
maligno tumoral. Nessa direção, o presente trabalho reporta ainda o estabelecimento de
“valores de corte” da marcação (LI) para o antígeno Ki-67 nos tumores astrocíticos de acordo
com a graduação tumoral, através da metodologia CART (Figura 33). Escores acima de 8%
distinguiram os Astrocitomas Grau IV (sensibilidade: 0,90; especificidade: 0,97), índices
entre 1,5% e 8% diferenciaram os Astrocitomas Grau III (sensibilidade: 0,85; especificidade:
0,86) e valores abaixo de 1,5% discriminaram os astrocitomas de baixo grau (I e II)
(sensibilidade: 0,81; especificidade: 0,96).
A estipulação de tais valores não possui correspondente entre as referências atuais.
Apesar disso, comparando-se esses resultados aos percentuais médios de marcação para Ki-67
em tumores astrocíticos, conforme já descritos (Tabela 07) e resumidos por Lantos et al.
(2002) [≅ 0% no grau I; < 4% no grau II; 5-10% no grau III; 15-20% no grau IV], percebe-se
que os “pontos de corte” descrevem valores inferiores aos reportados pelas médias.
Considera-se que este fato se deva a propensão do método do CART em privilegiar a
especificidade sobre a sensibilidade, ou seja, em não atribuir diagnóstico àquele que
realmente não o representa. Essa tendência termina por promover o “descarte” daqueles
tumores com índice proliferativo excessivamente divergente da maioria dos casos de sua
120
graduação histológica. Nesse sentido, deduz-se que astrocitomas genotipicamente mais
malignos (elevados índices proliferativos), possivelmente inclinados à progressão neoplásica,
são os responsáveis pela superioridade dos escores médios de marcação para o antígeno Ki-67
quando considerados os valores esperados para os tumores da mesma graduação
histopatológica, porém demonstrando a “típica” malignidade deste grau.
Dessa forma, admite-se que os escores médios (Tabela 06) e a árvore de decisão
(Figura 33) estabelecidos a partir da marcação para Ki-67 nos astrocitomas pesquisados
configurem ferramentas adicionais no apoio à determinação da gradação histopatológica
dessas neoplasias, especialmente para os tumores de alto grau.
Muitos relatos sugerem o antígeno Ki-67 como indicador de prognóstico nos tumores
astrocíticos (Shiffer et al., 1988; Montine et al., 1994; Wakimoto et al., 1996; Hoshi et al.,
1997; McKeever et al., 1998; Eneström et al., 1998; Giannini et al., 1999; Pollack et al.,
2002). Jaros et al. (1992) descreve escores acima de 5% (LI > 5) como preditivos de menor
sobrevida. Ralte et al. (2001) encontrou correlação inversa entre os valores da expressão do
Ki-67 e o tempo de recorrência tumoral. Não obstante, diversos estudos contradizem esses
achados (Ito et al., 1994; Ellison et al., 1995a; Karkavelas et al., 1995; Kaluza et al., 1997;
Hilton et al., 1998). De fato, ainda não existem evidências conclusivas sobre o impacto da
detecção do Ki-67 como fator prognóstico independente nos astrocitomas.
Acontecimento intrigante ocorreu com a visualização de pigmentação castanha,
compatível com a coloração do cromógeno imuno-histoquímico diaminobenzidina (DAB), no
citoplasma de alguns neurônios dos tecidos cerebrais não-tumorais pesquisados quanto à
presença do antígeno Ki-67 (Figura 29 [d]). Apesar de não se conhecer a real função da
proteína Ki-67, sabe-se que esta atua no processo proliferativo através de mecanismos
exclusivamente nucleares (Fonatsch et al., 1991). Além disso, os neurônios corticais cerebrais
não possuem atividade proliferativa, visto se tratarem de células altamente especializadas e,
121
portanto, maximamente diferenciadas (Fuchs et al., 2004). A constatação de semelhante
coloração nas lâminas coradas com HE, nas mesmas áreas descritas, conduziu à conclusão de
que tal achado tratava-se de background, ou seja, de uma “marcação” artefatual. Atribui-se tal
fenômeno a substâncias pré-existentes nessas células, possivelmente a lipofuscina (pigmento
amarelado resultante da degeneração de organelas celulares neuronais) ou até mesmo a
melanina (pigmento escuro presente no citoplasma de neurônios da substância negra
mesencéfalica) (Gray & Woulfe, 2005).
A detecção da enzima DNA Topoisomerase IIα, descrita como expressa
diferencialmente durante o intervalo S-G2-M do ciclo celular, tem sido apontada como uma
alternativa para a determinação da atividade proliferativa nos tumores astrocíticos (Bredel et
al., 2002c). A presente investigação constatou crescente positividade para TopoIIα de acordo
com a progressão dos astrocitomas (22,22% no grau I; 60,00% no grau II; 71,43% no grau III;
94,44% no grau IV) (Figura 31). Todavia, as médias dos índices de marcação (LI) para
TopoIIα não exibiram o mesmo comportamento (4,33; 31,60; 18,28; 29,22) (Figura 32), bem
como não demonstraram correlação com a expressão do antígeno Ki-67.
Estes resultados contrastam com os obtidos por Holden & Townsend (1999), que
observaram índices de marcação (LI) para TopoIIα crescentes de acordo com a gradação dos
tumores astrocíticos (2,1; 4,0; 17,3; 39,5). Já Taniguchi et al. (1999) evidenciaram diferenças
nos escores de marcação (LI) para TopoIIα somente entre astrocitomas de baixo e alto grau
(4,07 nos graus I e II; 11,97 no grau III; 13,84 no grau IV). Ambas as pesquisas relatam ainda
significante correlação entre as marcações para Ki-67 e TopoIIα, apesar dos maiores índices
verificados para este último marcador.
Entretanto, como explicar a maior expressão da TopoIIα em relação ao Ki-67 se esta
enzima encontrar-se-ia expressa em um período menor do ciclo celular? Através da análise
122
por citometria de fluxo, Taniguchi et al. (1999) perceberam que a detecção de TopoIIα nos
astrocitomas ocorria também em células nas fases G0 e G1. O referido trabalho atribui tal
achado à possível persistência desta enzima após sua atuação no processo replicativo e a
prováveis alterações qualitativas em sua expressão, decorrentes da transformação maligna.
Sendo assim, julga-se estar descaracterizada a expressão desta enzima como exclusiva durante
o processo de multiplicação celular, descartando sua aplicação como marcador específico do
status proliferativo. Além disso, recentes evidências apontam a participação das DNA
Topoisomerases II, incluindo o subtipo alfa, nos mecanismos reparadores do DNA de células
em repouso (G0) (Adachi et al., 2004; Walker et al., 2004).
Transpondo esses conhecimentos para o conjunto de dados apresentados pelo presente
estudo, admite-se que a crescente positividade para TopoIIα observada conforme a progressão
tumoral dos astrocitomas avaliados represente o impacto do grau de malignidade sobre a
proliferação celular e o dano ao DNA. A superioridade nos índices de marcação para TopoIIα
em relação ao Ki-67 em todas as gradações reforça a convicção sobre a atuação desta enzima
em outros mecanismos além da multiplicação celular. Contudo, a progressiva redução da
diferença entre os valores médios da marcação para TopoIIα e Ki-67 nos tumores astrocíticos
(a partir do grau II) sugere a falência do processo de reparo com a evolução neoplásica.
Apesar do potencial envolvimento do fator de transcrição c-Myc no mecanismo
proliferativo (Figuras 14 e 30), poucas referências versam sobre esta correlação nos tumores
astrocíticos. Nesse sentido, a atual investigação analisou a marcação nuclear (funcional) para
c-Myc nos astrocitomas da amostra, tendo observado propensão ao aumento do número de
casos positivos (15,38%; 42,86%; 57,14%; 85,71%) e dos índices de marcação (LI) (5,46;
10,42; 10,00; 30,04) conforme a progressão tumoral (Figuras 31 e 32).
Tais resultados confirmam a tendência de aumento da expressão de c-Myc de acordo
com o grau de malignidade dos astrocitomas, notadamente nos tumores do grau IV
(Engelhard
123
et al., 1989). Semelhante inclinação foi demonstrada por Orian et al. (1992) (positividade de 5%
no grau II; 33% no grau III; 76% no grau IV), embora os percentuais mostrem-se inferiores aos
aqui reportados, possivelmente pela maior sensibilidade do método imuno-histoquímico na
atualidade.
Dessa forma, parece razoável indicar a contribuição da proteína c-Myc para o processo de
multiplicação celular nos tumores astrocíticos. Entretanto, a persistente superioridade nos índices
de expressão nuclear de c-Myc em relação aos valores encontrados para o antígeno Ki-67, bem
como a grande variabilidade individual de sua marcação, remetem ao provável envolvimento
dessa proteína em outros eventos neoplásicos ativos nos astrocitomas.
Resumidamente, os dados apresentados pelo presente estudo corroboram com o conceito
da participação da enzima DNA Topoisomerase IIα e da proteína c-Myc nos mecanismos de
proliferação celular dos astrocitomas. Todavia, o potencial comprometimento dessas proteínas em
outras demandas celulares inviabiliza o uso de suas expressões como indicadores específicos da
multiplicação celular nesses tumores. Por outro lado, a expressão do antígeno Ki-67 demonstrou
significante aumento conforme a progressão dos tumores astrocíticos e confirmou-se como
preditiva da gradação tumoral.
5.3.2. Diferenciação Astrocítica
Na presente investigação, a predominante expressão da Proteína Ácida Glio-Fibrilar
observada em todos os Glioblastomas Multiformes avaliados reiterou a origem astrocítica dos
mesmos, excluindo a possibilidade da evolução desses tumores a partir de precursores
oligodendrogliais (Louis et al., 2002). A marcação média para GFAP nos Astrocitomas Grau IV
ocorreu em, aproximadamente, 77% dos astrócitos tumorais (LI = 76,90 ± 11,88) de forma
moderada (H = 155,57 ± 35,68) (Figura 34). Tendo como referência a detecção da GFAP nos
astrócitos dos tecidos não-tumorais (LI = 100 e H = 300), reitera-se a concepção de que a
quantidade e a intensidade da marcação para GFAP são inversamente proporcionais à extensão da
124
anaplasia (Lantos et al., 2002). Apesar da evidente correlação com a malignidade tumoral,
Wilhelmsson et al. (2003) destaca que a baixa expressão de GFAP não contribui para o
desenvolvimento neoplásico, estando implicada unicamente na representação do estado de
diferenciação das células tumorais.
Supressores Tumorais
O presente estudo constatou discreta tendência ao acréscimo do número de casos positivos
quanto à expressão da proteína p53 conforme a progressão dos tumores astrocíticos,
demonstrando semelhantes valores aos reportados pelos trabalhos anteriores, compilados na
Tabela 08. O índice médio de marcação (LI) também apresentou propensão ao aumento de acordo
com a gradação dos astrocitomas (7,69; 9,64; 15,28; 22,95) (Figura 37), a despeito da
regularidade dos escores médios recentemente publicados por Nayak et al. (2001) entre os
tumores dos graus II, III e IV (0; 9,89; 8,15; 8,13).
TABELA 08 – Percentuais de positividade imuno-histoquímica para p53
nas diferentes gradações dos tumores astrocíticos segundo
diversas referências, incluindo o presente estudo
Grau I (OMS) Grau II (OMS) Grau III (OMS) Grau IV (OMS) GERAL
Referência
n % n % n % n % n %
Jaros et al. (1992) *
♦
04 0 06 17,00 13 38,00 20 65,00 43 44,00
Louis et al. (1993)
- - 08 37,50 12 58,33 14 50,00 24 50,00
Lang et al. (1994)
07 71,00 08 63,00 16 64,51 - - 31 64,51
Kordek et al. (1996)
08 0 09 44,40 09 33,30 30 53,30 56 41,00
Ono et al. (1997) * - - 15 40,00 20 40,00 13 38,00 48 39,58
Khalid et al. (1998)
- - - - - - 57 52,63 57 52,63
Kirla et al. (2000)
- - - - 25 44,00 52 46,00 77 45,45
Xu et al. (2001)
- - - - - - - - 41 68,30
Pardo et al. (2004)
♦
- - - - - - - - 74 48,00
Nayak et al. (2004)
15 0 38 52,63 29 48,27 70 50 152 45,39
Faria (2005) *
13 46,15 14 50,00 07 57,14 21 66,66 55 54,98
n (número de casos); % (porcentagem); * (associação estatística com a gradação histológica);
♦
(associação estatística com a sobrevida).
125
Os altos valores e a semelhança entre as freqüências de marcação para p53
observadas nas diferentes gradações dos tumores astrocíticos confirmam a mutação do gene
p53 como um evento inicial e relevante na formação dessas neoplasias (Louis et al., 1993).
Acredita-se que a proliferação clonal das células mutadas para p53 conforme a progressão
tumoral ampliaria a porcentagem de células imuno-positivas (Dietrich & Tribolet, 1997),
tornando os aumentos dos índices de marcação (LI) aqui apresentados mais prováveis do que
a constância descrita por Nayak et al. (2001).
Dentre as investigações expostas (Tabela 08), destacam-se os conflitantes resultados
acerca da expressão da proteína p53 nos Astrocitomas Grau I. Os dados da atual pesquisa
corroboram com os achados de Lang et al. (1994), que descreveram a detecção imuno-
histoquímica da p53 nos tumores do grau I, embora em maior porcentagem de casos. Essa
mesma tendência é ratificada por grande parte dos estudos que utilizaram métodos
moleculares (mais sensíveis e específicos) para detecção de alterações no gene p53,
comprovando a participação da mutação deste gene na tumorigênese dos Astrocitomas
Pilocíticos (Tabela 09). Considera-se que o êxito na demonstração in situ da proteína p53 nos
tumores astrocíticos do grau I reportado por Lang et al. (1994) e pelo corrente trabalho tenha
sido ocasionado pela alta performance técnica obtida através da otimização máxima do
método imuno-histoquímico utilizado. Todavia, futuros estudos deverão esclarecer de modo
definitivo o impacto do gene p53 nos Astrocitomas Grau I através de grandes séries tumorais
examinadas a partir de abordagens moleculares específicas.
Inúmeras pesquisas relatam ainda a detecção da proteína p53 em tumores astrocíticos
como fator prognóstico. Jaros et al. (1992) e Pardo et al. (2004) referem-se à proteína p53
com indicadora de maior progressão maligna, menor período livre de doença após a cirurgia e
menor sobrevida. Por outro lado, Birner et al. (2002) associaram a detecção da proteína p53 à
maior sensibilidade dos tumores do grau IV à radioterapia e à quimioterapia adjuvantes.
126
Poucas referências na literatura exploram o papel do gene supressor tumoral WAF1
(codificador da proteína p21
WAF1/CIP1
) no processo neoplásico dos astrocitomas, visto sua
mutação ser descrita como um evento raro entre esses tumores (Ono et al., 1997). Contudo, o
fato do WAF1 ser o principal alvo transcricional do gene p53 abre a perspectiva do melhor
entendimento funcional dessa via inibidora do ciclo celular a partir do estudo da expressão
dos produtos protéicos desses genes (Coqueret, 2003).
A análise da expressão da proteína p21 nos tumores astrocíticos pesquisados revelou
propensão ao decréscimo do percentual de casos positivos (38,46%; 28,57%; 14,28%;
57,14%) e dos valores médios de marcação (LI) (10,38; 12,14; 5,71; 24,79) segundo a
evolução tumoral, a despeito dos notáveis aumentos desses índices nos Astrocitomas Grau IV
(Figuras 36 e 37). Khalid et al. (1998) e Kirla et al. (2000), estudando a expressão do p21 nos
Glioblastomas, descreveram percentuais de positividade de 57% e 48%, respectivamente. Ono
et al. (1997) verificou semelhante inclinação nos índices médios (LI) conforme a graduação
tumoral, apesar dessa redução ter sido extensível aos tumores do grau IV (22,2 no grau II,
14,0 no grau III; 10,2 no grau IV).
A avaliação preliminar desses achados conduz à idéia da menor expressão do p21 de
acordo com a progressão maligna dos tumores astrocíticos, apesar do intrigante acréscimo de
sua expressão nos Astrocitomas Grau IV. Todavia, convém examinar tais resultados em
associação aos dados encontrados quanto à detecção da proteína p53 (Figura 38).
Considerando a incapacidade da proteína p53 mutada em ativar a expressão da
proteína p21 e a detecção desta última como evidência da funcionalidade da p53, observou-se
que, entre as diferentes gradações tumorais, semelhantes porcentagens não demonstraram
alteração da via supressora tumoral p53/p21 {grupos A [p53(-)/p21(-)] e C [p53(-)/p21(+)]},
exceto pelos tumores do grau III no grupo C e os do grau IV principalmente no grupo A. Por
outro lado, crescentes porcentagens dos astrocitomas apresentaram alteração da via p53/p21
127
conforme a progressão tumoral {grupo B [p53(+)/p21(-)]}, apesar do menor índice verificado
nos tumores do grau IV. Diferentes parcelas dos astrocitomas exibiram ativação
funcionalmente conflitante da via p53/p21 {grupo D [p53(+)/p21(+)]}, destacadamente os
tumores do grau IV.
O grupo B representa os casos onde certamente ocorreu alteração do gene p53. A
crescente marcação corrobora com os achados prévios de acréscimo da mutação do p53
conforme a gradação tumoral, sugeridos pelo aumento da expressão da proteína p53. A menor
fração de tumores do grau III no grupo C reforça o grande impacto da mutação do p53 nessa
categoria tumoral. Ainda no grupo B, percebeu-se menor porcentagem de tumores do grau IV,
apesar da tendência de aumento frente à notória expressão da p53 nesta gradação (Figura 37).
Acredita-se que este conflito seja explicado pela detecção, na realidade, da proteína p53
selvagem em uma parcela dos Astrocitomas Grau IV. Esta expressão ocorreria pela ativação
desse supressor tumoral provocada por outra(s) alteração(ões) genética(s) presente(s) nos
tumores grau IV, levando ao acúmulo de notável quantidade da proteína p53 funcional, capaz
de persistir em quantidades detectáveis nos tecidos (Xu et al., 2001). Tal parcela seria
representada provavelmente pelos tumores do grau IV encontrados no grupo D, onde a
evidência da detecção da p53 selvagem é reforçada pela positividade para p21. Ono et al.
(1997) relatam que os astrocitomas que acumulam a proteína p53 na ausência de mutação do
gene p53 tendem a expressar p21 de modo mais intenso em relação aos que acumulam p53
mutada ou não acumulam p53. Assim, propõe-se que o expressivo acréscimo médio na
expressão da proteína p21 constatado nos Glioblastomas seja reflexo, pelo menos em parte, da
superexpressão de p53 selvagem em uma porção desses tumores.
Outra possibilidade para a redução dos percentuais referentes aos Astrocitomas Grau
IV no grupo B concomitante ao acréscimo no grupo D seria a superexpressão da proteína
MDM2 (inativadora a proteína p53 selvagem), resultando em pouca ou nenhuma expressão de
128
p21 apesar do acúmulo de p53. Todavia, estudos anteriores tornam essa alternativa mais
remota visto que, além da detecção da amplificação do gene MDM2 ter sido verificada em
apenas 10% dos glioblastomas estudados, nenhum desses casos positivo teria sido detectado
entre os tumores com imuno-expressão para a proteína p53 associada à mutação do gene p53
(Rubio et al., 1993).
Admite-se que os casos descritos no grupo D, incluindo os astrocitomas dos graus I e
II, poderiam ainda indicar a expressão de p21 por vias independentes da induzida pelo p53.
Essa possibilidade fundamenta-se na observação da expressão de p21 em células nocauteadas
para o gene p53, desencadeada por agentes citotóxicos, mitógenos, indutores de diferenciação
entre outros (Jiang et al., 1994; Johnson et al., 1994; Michieli et al., 1994; Steinman et al.,
1994). Nos astrocitomas, esse fenômeno já foi evidenciado tanto em linhagens celulares in
vitro (Jung et al., 1995) como em material procedente de biópsias (Ono et al., 1997). A(s)
outra(s) alteração(ões) genética(s) proposta(s) para os tumores do grau IV parece(m) remeter
a mecanismos completamente distintos da via p53/p21, visto a ausência de justificativa (até
este momento) para os mínimos índices atingidos por esta gradação no grupo A.
A inferência do status funcional do gene p53 a partir da expressão imuno-
histoquímica das proteínas p53 e p21 demonstra correlação com a detecção da mutação do
p53 por técnicas moleculares específicas, embora não as prescinda (Ono et al., 1997). O uso
dessa estratégia pelo presente estudo permitiu a dedução de índices para mutação do gene p53
que acompanharam a tendência da maior parte das referências (acréscimo conforme a
progressão dos astrocitomas, exceto pelo decréscimo nos tumores do grau IV), apesar da
grande variabilidade entre os valores apontados pelas diferentes investigações (Tabela 09).
Com grande homologia estrutural e funcional ao p21, destaca-se ainda o supressor
tumoral p27. Alterações quantitativas da proteína p27
KIP1
são freqüentemente descritas em
tumores humanos, apesar de mutações e deleções do gene p27 serem raramente observadas
129
(Lloyd et al., 1999). Recentes evidências indicam que tais alterações seriam reguladas por
mecanismos exclusivamente pós-transcricionais, como a degradação protéica mediada por
ubiquitinas, e influenciariam diretamente o comportamento biológico tumoral (Bloom &
Pagano, 2003).
TABELA 09 – Percentuais de mutação do gene p53 nas diferentes gradações dos
tumores astrocíticos segundo diversas referências, incluindo o presente estudo
Graus I e II (OMS) Grau III (OMS) Grau IV (OMS)
Referência Método
n % n % n %
Mashiyama et al. (1991)
SSCP 06 0 03 66,66 10 10,00
Fults et al. (1992)
SSCP 06 0 14 37,71 25 28,00
Louis et al. (1993)
SSCP+Seq 08 37,50 12 33,33 14 28,57
Wu et al. (1993)
SSCP 09 0 06 16,60 38 12,15
Chozick et al. (1994)
SSCP 15 0 07 14,28 19 31,57
Lang et al. (1994)
SSCP+Seq 07 e 08 14,00 e 25,00 16 18,75 - -
Rasheed et al. (1994)
SSCP 36 8,30 11 54,54 51 17,3
Patt et al. (1996)
SSCP 07 e 18 14,30 e 5,06 04 25,00 13 0
p53/p21 26,66 25,00 30,76
Ono et al. (1997)
SSCP+Seq
15
26,66
20
25,00
13
23,07
Hwang et al. (1999)
SSCP+Seq 05 0 13 23,07 05 20
Hayes et al. (1999)
SSCP 20 53,00 - - - -
Kato et al. (2000)
Seq - - 14 64,30 27 25,90
Faria (2005) p53/p21 13 e 14 30,77 e 42,86 07 57,14 21 38,09
n (número de casos); % (porcentagem); SSCP (de single-strand conformation polymorphism);
Seq (sequenciamento); p53/p21 (estimativa segundo a relação entre a expressão de p53 e de p21).
Poucos estudos referem-se à expressão do p27 nos astrocitomas. Piva et al. (1997) e
Mizumatsu et al. (1999) relatam correlação inversa entre a graduação dos tumores astrocíticos
e os índices médios da marcação nuclear (LI) para p27 [(44,40 no grau II; 5,86 no grau III;
2,10 no grau IV) e (64,0; 54,9; 48,00; 40,20), respectivamente]. Por outro lado, Alleyne et al.
(1999) e Zagzag et al. (2003) não evidenciaram qualquer relação entre a o grau de
malignidade dos astrocitomas e a imuno-expressão de p27.
130
No entanto, a presente investigação revelou crescente positividade para p27 (nuclear)
nos astrocitomas conforme a evolução tumoral, exceto pela relativa redução nos tumores do
grau IV (53,84%; 92,86%; 100,00%; 76,19%) (Figura 39). Quantos aos escores médios da
marcação nuclear (LI) para p27, demonstrou-se discreta propensão ao acréscimo de acordo
com a graduação dos tumores astrocíticos (20,00; 30,21; 38,28; 42,38) (Figura 40). A maior
média verificada nos Astrocitomas Grau IV, apesar da menor positividade, remete à
expressiva marcação (LI > 70) constatada em cerca de 40% dos tumores desta graduação.
A despeito das notáveis divergências entre os estudos, os dados aqui reportados
indicam que a expressão nuclear de p27 nos astrocitomas ocorre proporcionalmente ao grau
tumoral, refletindo a ativação funcional do gene p27 como supressor do processo neoplásico.
Dentre os Astrocitomas Grau IV, entretanto, significante porcentagem dos casos não
expressou p27, demonstrando mais uma vez a heterogeneidade deste grupo. Sugere-se que
nesses tumores estejam ativadas vias de degradação da proteína p27, já que não foram
evidenciados níveis elevados de p27 citoplasmático (dados discutidos a seguir) e a mutação
do gene p27 é comprovadamente incomum entre os tumores humanos. Dessa forma, percebe-
se que as alterações na expressão nuclear da proteína p27 apenas refletem a malignidade
tumoral, não demonstrado impacto na tumorigênese dos astrocitomas.
A maioria dos trabalhos que avaliam a expressão de p27 nas neoplasias humanas
desconsidera a detecção dessa proteína no citoplasma celular, referindo-se a esta como
desprovida de significado funcional (Zagzag et al., 2003). Todavia, novos estudos revelam
que a proteína p27 recém-transcrita pode ser impedida de entrar no núcleo através da
fosforilação mediada pela proteíno-quinase B (PKB ou Akt), ativada oncogenicamente.
Assim, o acúmulo citoplasmático de p27 representaria o bloqueio da sua função como
supressora tumoral (nuclear), fomentando a progressão neoplásica (Blain & Massagué, 2002).
131
O presente estudo configura a primeira análise da expressão citoplasmática da
proteína p27 em tumores astrocíticos. Os resultados indicaram maior positividade
citoplasmática para p27 entre os astrocitomas de alto grau (42,86%) em relação aos de baixo
grau (23,07%) (Figura 39), sendo a concomitância entre as marcações nuclear e
citoplasmática para p27 mais evidente nos tumores de alto grau (42,86%). O aumento paralelo
entre as marcações nuclear e citoplasmática para p27 conforme a progressão dos tumores
astrocíticos, associado à maior concomitância de positividade nos tumores de alto grau,
sugere que a expressão citoplasmática de p27 nos astrocitomas reflete a superexpressão
nuclear dessa proteína, pelo menos parcialmente.
Contudo, os valores médios para os índices de marcação citoplasmática de p27 nos
tumores astrocíticos foram modestos, embora com discreta propensão ao acréscimo de acordo
com a gradação tumoral [H (2,69; 5,85; 5,14; 7,00) e LI (2,69; 3,71; 4,00; 6,42)] (Figura 40).
Esses baixos escores de marcação citoplasmática para p27 indicam que (1) ou o bloqueio
citoplasmático da proteína p27 ocorre em pequena quantidade ou (2) verifica-se eficiente
degradação protéica da p27 após seu bloqueio no citoplasma celular. De qualquer forma, a
apresentação citoplasmática da proteína p27 não parece ser relevante para o processo
tumorigênico dos astrocitomas.
Apesar das evidências aqui reportadas serem contrárias à participação do p27 na
promoção dos tumores astrocíticos, Mizumatsu et al. (1999) e Kirla et al. (2003) descrevem a
baixa expressão de p27 como indicadora de pior prognóstico. Chen et al. (1996) expõem a
transfecção do gene p27 funcional em gliomas como promissor método de inibição da
proliferação celular, enquanto Park et al. (2004) apontam melhores resultados com o uso do
gene p27 mutado. Outras análises, por sua vez, retratam o p27 como indutor de resistência
tumoral (Hochhauser, 1997). Lloyd et al. (1999) relatam ainda o potencial envolvimento do
p27 em diversos mecanismos como a diferenciação celular, a apoptose, a interação/adesão
132
celular e a inflamação. Dessa forma, novas pesquisas serão necessárias para o estabelecimento
do verdadeiro papel deste supressor tumoral na progressão dos astrocitomas.
Ainda quanto aos supressores tumorais, percebeu-se freqüente marcação para p21 e
p27 entre as células microgliais presentes no tecido astrocítico tumoral quando este mostrava
positividade para p53 (Figura 41), especialmente em tumores de alto grau. A expressão de
supressores tumorais em células da micróglia já havia sido descrita após episódios de injúria
traumática (Saito et al., 2000) e mesmo nas regiões peritumorais dos astrocitomas (Korshunov
et al., 2002). Todavia, pela primeira vez se estabelece a correlação entre essas marcações e a
presença de uma alteração molecular específica no tecido tumoral. Apesar da autonomia
intercelular quanto ao controle direto dos mecanismos proliferativos, sugere-se que de alguma
forma a micróglia possa reagir a presença de desordens moleculares nas células tumorais.
Futuros estudos deverão esclarecer esse fenômeno, bem como avaliar seu possível impacto no
comportamento biológico dos tumores astrocíticos.
Apoptose
Na presente investigação, tanto a porcentagem de casos positivos (23,07%; 35,71%;
42,86%; 71,43%) como os índices médios de marcação [LI (4,30; 6,57; 8,71; 16,85) e H
(10,84; 14,42; 18,85; 27,85)] para a proteína anti-apoptótica Bcl-2 demonstraram tendência de
aumento segundo a graduação dos astrocitomas (Figuras 43 e 44). Fels et al. (2000)
detectaram propensão similar quanto à positividade para Bcl-2 nos tumores astrocíticos de
alto grau (48% no grau III; 51% no grau IV), ao passo que Ellison et al. (1995b) descreveram
inclinação oposta (44% no grau II; 42% no grau III; 28% no grau IV). Entretanto, Strik et al.
(1999) e Kraus et al. (2001) confirmaram recentemente a tendência de maior positividade
entre os Astrocitomas Grau IV (94,60% e 60,25%, respectivamente). Não foram encontrados
estudos que apresentassem escores de marcação comparáveis aos aqui relatados.
133
Com relação à expressão da proteína pró-apoptótica Bax, mostrou-se
inclinação ao acréscimo na positividade (15,38%; 7,14%; 28,57%; 47,62%) e relativa
constância entre as médias de marcação [LI (5,00; 0,57; 9,28; 9,38) e H (11,53; 0,57;
17,14; 11,66)] conforme evolução dos tumores astrocíticos, excetuando-se a redução
verificada em todos os valores referentes aos Astrocitomas Grau II (Figuras 43 e 44). Os
escassos estudos acerca da expressão imuno-histoquímica de Bax nos tumores astrocíticos
relatam apenas a alta freqüência da detecção de Bax nos Glioblastomas [98% (Krajewski
et al., 1997), 78% (Strik et al., 1999), 94% (Cartron et al., 2003)].
A despeito da ausência de significância estatística verificada entre os índices
de marcação (LI e H) para Bcl-2 e Bax na análise seqüencial (teste U) das diferentes
gradações dos astrocitomas, o exame do conjunto dos valores (teste H) relativos à fração
de células positivas (LI) para essas proteínas demonstrou significante correlação com o
grau histopatológico. Tal distinção foi reforçada pela significante superioridade dos
escores para Bcl-2 e Bax nos tumores do grau IV em relação aos tumores do grau I e II
(teste U).
Frente ao exposto, evidencia-se o aumento paralelo na detecção das proteínas
Bax e Bcl-2 conforme a gradação dos astrocitomas (notadamente entre os de baixo e alto
grau), sugerindo a co-regulação entre a expressão dessas proteínas durante a progressão
tumoral (Martin et al., 2001). Quanto a intrigante redução da marcação para Bax nos
tumores do grau II, admite-se que particularidades referentes à histogênese dessa classe
tumoral possam provocar variações na expressão de moléculas relacionadas à apoptose
(Hara et al., 1997). Todavia, essas variações podem ser mais bem compreendidas quando
avaliadas frente ao balanço entre as tendências pró- e anti-apoptótica (Zörnig et al., 2001).
Assim, através da comparação quantitativa entre os índices de marcação (LI)
das proteínas Bcl-2 (anti-apoptótica) e Bax (pró-apoptótica), foi demonstrada crescente
134
orientação à sobrevida celular conforme a progressão dos tumores astrocíticos (Figura 45).
Acredita-se que essa diminuição gradual do estímulo apoptótico, associada ao aumento
progressivo do incentivo proliferativo antes relatado, resulta na promoção cada vez maior
das células mais anaplásicas (mais alteradas geneticamente), contribuindo para a evolução
do fenótipo maligno dos astrocitomas (Yu et al., 2000). Apesar disso, nenhuma correlação
prognóstica categórica foi detectada a partir da expressão das proteínas Bcl-2 e Bax nos
tumores astrocíticos até este momento (Hara et al., 1997; Rieger et al., 1998; Strik et al.,
1999; Fels et al., 2000).
5.3.5. Receptores da Família ErbB
A expressão aberrante da glicoproteína EGFR tem sido associada à tumorigênese e à
progressão maligna nos astrocitomas (Libermann et al., 1985; Ekstrand et al., 1991). A
amplificação do gene EGFR é apontada como a principal desordem responsável pela sua
superexpressão nesses tumores, notadamente nos glioblastomas (Huncharek & Kupelnick,
2000). Outra possível alteração consiste no rearranjo do gene EGFR, provocando sua ativação
constitucional. O rearranjo mais observado resulta na variante denominada EGFRvIII
(também designada por ∆EGFR ou de2-7EGFR), caracterizada pela deleção dos exons 2-7 no
RNAm, correspondentes aos nucleotídeos 275-1075 (codificadores dos aminoácidos 6-273)
(Shinojima et al., 2003). Waha et al. (1996) descreve ainda o aumento da expressão do EGFR
na ausência de alterações gênicas como um achado freqüente entre os tumores astrocíticos.
A significante expressão de EGFR verificada nos Astrocitomas Grau IV pesquisados
(LI médio = 19,28 ± 17,97; H médio = 25,71 ± 27,44) reforça as evidências da participação
desse receptor nos mecanismos tumorigênicos atuantes nesta gradação, conforme
documentado pela maioria dos trabalhos anteriores (Tabela 10). Recentes estudos indicam que
a superexpressão de EGFR ocorre mais freqüentemente entre os Glioblastomas Primários, ou
135
seja, aqueles que se originam diretamente de células precursoras astrocíticas e acometem
predominantemente pacientes idosos (Louis, 1997). Contudo, nenhuma correlação entre a
idade dos pacientes e a marcação para EGFR foi verificada nos casos aqui reportados.
TABELA 10 – Percentuais de positividade imuno-histoquímica para EGFR
nas diferentes gradações dos tumores astrocíticos segundo
diversas referências, incluindo o presente estudo
Grau I (OMS) Grau II (OMS) Grau III (OMS) Grau IV (OMS) GERAL
Referência
n % n % n % n % n %
Jaros et al. (1992)
♦
04 0 06 33,00 13 85,00 20 95,00 43 74,42
Orian et al. (1992)
- - 20 95,00 21 48,00 21 86,00 62 77,42
Agosti et al. (1992) * 10 0 15 0 15 0 63 67,00 103 40,77
Kordek et al. (1995)
08 0 09 11,10 09 22,20 30 33,30 56 23,21
Hwang et al. (1997)
- - 12 67,00 13 92,30 08 100,00 33 85,00
Simmons et al. (2001)
♦
- - - - - - 110 35,45 110 35,45
Shinojima et al. (2003)
♦
- - - - - - 87 46,00 87 46,00
Faria (2005) *
13 46,15 14 21,43 07 0 21 61,09 55 32,37
n (número de casos); % (porcentagem); * (associação estatística com a gradação histológica);
♦
(associação estatística com a sobrevida);
A ausência da expressão de EGFR entre os Astrocitomas Grau III avaliados contrastou
com os elevados índices de positividade relatados pela maior parte das pesquisas (Tabela 10).
Embora não se possa excluir a possibilidade da sub-representação dessa categoria pela atual
investigação, visto a pequena amostragem analisada (n = 07), esse resultado pode ser
justificado pela pequena ocorrência de alterações moleculares no gene EGFR descritas nos
tumores do grau III (Bredel et al., 1999). Já a discreta detecção de EGFR observada nos
Astrocitomas Grau II examinados (LI médio = 3,92 ± 7,88; H médio = 5,35 ± 10,82)
corrobora com a maioria das referências, sendo apontada como decorrente do simples
acréscimo da expressão de EGFR, sem a influência de desordens moleculares específicas
(Jaros et al., 1992) (Figura 47, Figura 48 e Tabela 10).
136
Apesar das evidentes discrepâncias entre os dados obtidos pelas várias investigações
quanto à positividade para EGFR nas diferentes gradações dos tumores astrocíticos, os poucos
trabalhos que avaliaram a presença desse receptor nos Astrocitomas Grau I são unânimes em
reportar a ausência da expressão de EGFR nesta gradação (Tabela 10). Análises moleculares
permitiram também a confirmação da inexistência de amplificação e/ou rearranjo do gene
EGFR nesses tumores (Huncharek & Kupelnick, 2000). No entanto, o presente estudo revelou
significante marcação para EGFR entre os tumores astrocíticos do grau I (LI médio = 27,30 ±
32,63; H médio = 60,00 ± 69,88).
Poder-se-ia alegar a ocorrência de marcação artefatual (background). Todavia, (1)
outros estudos apontam o método imuno-histoquímico como uma técnica sensível para a
documentação da presença da proteína EGFR (Schober et al., 1995); (2) inúmeras referências
demonstram a aplicabilidade e a especificidade do clone H11 (anticorpo monoclonal anti-
EGFR utilizado) na detecção da proteína EGFR em tecidos fixados em formalina e incluídos
em parafina (Agosti et al., 1992); (3) outros tumores do grau I, bem como de outras
gradações, mostraram-se negativos para a expressão de EGFR; (4) os índices de marcação não
foram discretos ou duvidosos, muitas vezes superando os vistos nos tumores do grau IV.
Dessa forma, admite-se que a marcação evidenciada nos Astrocitomas Grau I
corresponda, de fato, à superexpressão da proteína EGFR, ainda que esse aumento de
expressão ocorra na ausência de desordens moleculares específicas (Jaros et al., 1992; Waha
et al., 1996). Assim, propõe-se a superexpressão de EGFR como mais um potencial evento
tumorigênico presente nessa gradação, estimulando novas pesquisas quanto ao seu mecanismo
de ativação e possível impacto prognóstico.
Várias investigações apontam a superexpressão/amplificação do EGFR nos tumores
astrocíticos como relacionada ao pior prognóstico clínico, embora a maioria tenha falhado em
demonstrar o EGFR como um fator preditivo independentemente da graduação histológica
137
desses tumores (Jaros et al., 1992; Schober et al., 1995; Waha et al., 1996; Shinojima et al.,
2003). Uma exceção consiste no trabalho de Hiesiger et al. (1993), que reporta a
superexpressão de EGFR nos Astrocitomas Grau IV como indicadora per si de
comportamento clínico agressivo e resistência terapêutica.
A superexpressão da glicoproteína (c-)erbB2, por sua vez, é freqüentemente observada
nos cânceres de mama, bem como numa grande variedade de tumores gastrintestinais e
geniturinários (Ross et al., 1999). Nestas neoplasias, o aumento quantitativo dessa unidade
receptora de sinais extracelulares favorece a formação de homodímeros (erbB2-erbB2) e/ou
de heterodímeros (ex.: EGFR-erbB2), resultando na maior sensibilidade e responsividade aos
estímulos mitogênicos (Espinosa et al., 2003).
Mesmo diante da rara ocorrência de amplificações no gene HER2/neu nos tumores
astrocíticos (Haapasalo et al., 1996), alguns trabalhos descrevem o simples acréscimo de
erbB2 como um potencial evento tumorigênico dos astrocitomas (Schwechheimer et al., 1994;
Hwang et al., 1997). Além disso, outras referências sugerem a provável associação entre a
expressão de EGFR e de erbB2 no processo neoplásico desses tumores (Menard et al., 2004).
A atual investigação constatou a expressão de erbB2 somente nos Astrocitomas Grau
IV pesquisados (positividade de 14,28%; LI médio = 5,95 ± 16,85; H médio = 10,71 ± 30,83),
correspondendo a 3,57% de positividade entre todos os tumores astrocíticos avaliados.
Haapasalo et al. (1996) também observaram discreta marcação para erbB2 nos astrocitomas
(3,90%), em parte devido à ausência da sua expressão nos tumores de baixo grau (I e II).
Koka et al. (2003) perceberam a expressão diferencial de erbB2 entre os Glioblastomas
(15,40%), sendo esta mesma disposição comprovada posteriormente por Potti et al. (2004).
Dessa forma, confirma-se a discreta participação do receptor erbB2 na tumorigênese dos
astrocitomas, notadamente nos tumores do grau IV.
138
Dos 03 (três) Astrocitomas Grau IV positivos para erbB2, 02 (dois) também
apresentavam marcação para EGFR (Anexo IV), ratificando a tendência de co-expressão entre
esses receptores (Hwang et al., 1997). A superexpressão de erbB2 exclusivamente entre os
tumores do grau IV denota ainda a contribuição dessa alteração molecular para o
estabelecimento de fenótipos mais malignos, possivelmente através do sinergismo com a
freqüente expressão de EGFR nesta gradação (Menard et al., 2004). Esse fato corrobora com
a atribuição de pior prognóstico aos tumores astrocíticos que expressam erbB2, conforme
apontado por Koka et al. (2003) e Potti et al. (2004).
As consideráveis evidências acerca do envolvimento do EGFR e do supressor tumoral
p53 no estabelecimento e progressão dos astrocitomas suscitaram a análise conjunta desses
genes nos tumores avaliados. Através da imuno-expressão de EGFR e de p53/p21, foi
deduzida a situação funcional dos genes EGFR e p53 nas diferentes gradações dos tumores
astrocíticos (Figura 49). O percentual de casos que não apresentaram alterações em ambos os
genes [EGFR(-)/p53wt] diminuiu de acordo com a progressão tumoral, confirmando a
crescente aquisição dessas desordens genotípicas conforme a evolução maligna dos
astrocitomas (Louis et al., 2002). O número de casos que exibiram somente mutação do p53
[EGFR(-)/p53mut] aumentou consoante a graduação histológica, exceto pela relativa redução
observada nos Astrocitomas Grau IV. Essa mesma propensão já havia sido apontada na
apreciação individual do p53 (Figura 38 – grupo B), sendo atribuída à propagação da mutação
do p53 segundo a sucessão tumoral e à provável participação de outras alterações genéticas
nos tumores do grau IV. Entre essas ‘outras’ alterações, julga-se figurar a superexpressão do
EGFR, visto a significante porcentagem de casos do grau IV (42,86%) que demonstraram
exclusivamente essa desordem [EGFR(+)/p53wt]. Parte dos Astrocitomas Grau I
manifestaram semelhante panorama (30,77%), reiterando o grande impacto da expressão de
EGFR nesta graduação. Excetuando-se os tumores do grau III, a simultaneidade entre as
139
alterações moleculares [EGFR(+)/p53mut] ocorreu em proporções similares nas diferentes
gradações dos tumores astrocíticos (média de 14,54%), reafirmando os achados de Kordek et
al. (1995). O pequeno percentual de concomitância entre a superexpressão de EGFR e a
mutação de p53 caracterizou ainda a tendência de mútua exclusividade entre esses eventos
moleculares, assim como reportado por Watanabe et al. (1996) e Yoon et al. (2001).
Tal distinção entre as alterações moleculares nos genes EGFR e p53 fomenta ainda a
diferenciação dos Astrocitomas Grau IV nos subtipos Primário (ou de novo) e Secundário (ou
progressivo). Kleihues & Ohgaki (1999) referem-se aos Glioblastomas Primários como
derivados diretamente de células precursoras astrocíticas, com breve evolução clínica, sendo
mais comuns em pacientes idosos e apresentando unicamente a superexpressão do EGFR
[EGFR(+)/p53wt]. Já os Glioblastomas Secundários são descritos como provenientes de
astrocitomas dos graus II ou III, com lenta progressão clínica, surgindo em pacientes jovens e
demonstrando somente a mutação do p53 [EGFR(-)/p53mut] (Figura 08).
A despeito da ausência dos parâmetros clínicos dos portadores dos tumores
astrocíticos aqui analisados, bem como de qualquer relação entre a expressão de EGFR ou
p53/p21 e a faixa etária dos mesmos, sugere-se que os 42,86% dos tumores do grau IV que
revelaram apenas a superexpressão do EGFR correspondam a Glioblastomas Primários,
enquanto os 23,80% que manifestaram unicamente a mutação do p53 representem
Glioblastomas Secundários. Essa inferência ganha suporte frente às semelhantes distribuições
registradas pelos trabalhos anteriores, em sua maioria correlacionadas também ao seguimento
clínico dos pacientes (Tabela 11).
Apesar da coerente distinção entre os fenótipos Primário e Secundário a partir do
genótipo EGFR versus p53, recentes evidências destacam a similaridade entre essas variantes
quanto ao comportamento biológico tumoral (Simmons et al., 2001; Sarkar et al., 2004). Por
140
conseguinte, outras alterações moleculares devem ser investigadas na tentativa de melhor
contextualizar a marcante heterogeneidade clínica característica dos Astrocitomas Grau IV.
TABELA 11 – Distribuição percentual dos Astrocitomas Grau IV (OMS) de acordo com
a situação funcional dos genes p53 e EGFR estimada por imuno-histoquímica e/ou
técnicas moleculares segundo diversas referências, incluindo o presente estudo
Astrocitoma Grau IV (OMS)
Referência n
EGFR(-)/p53wt EGFR(+)/p53wt
(primário*)
EGFR(-)/p53mut
(secundário*)
EGFR(+)/p53mut
Hayashi et al. (1997)
70 30,00 % 40,00 % 30,00 % 0 %
Watanabe et al. (1997)
19 16,00 % 47,00 % 21,00 % 16,00 %
Newcomb et al. (1998)
80 29,00 % 18,00 % 36,00 % 18,00 %
Simmons et al. (2001)
46 48,00 % 22,00 % 26,00 % 4,00 %
Sarkar et al. (2004)
58 14,00 % 38,00 % 34,00 % 14,00 %
Faria (2005) 21 14,28 % 42,86 % 23,80 % 19,05 %
n (número de casos); – (ausência da expressão); + (presença da expressão); wt (selvagem); mut (mutado).
* classificação baseada somente no perfil genotípico (Kleihues & Ohgaki, 1999)
5.3.6. Sinalização Intracelular
As proteínas H-, K- e N-Ras, denominadas conjuntamente por p21
Ras
, desempenham
papel central nos mecanismos de sinalização que regulam o crescimento, a diferenciação, a
proliferação e a sobrevida celulares (Sebti, 2003). Os eventos tumorigênicos podem ativar
diretamente as vias reguladas pela p21
Ras
através de mutações nos genes ras ou de sua
superexpressão protéica. Somente neste último caso se consegue revelar a presença da p21
Ras
pelo método imuno-histoquímico, visto que as versões normal (níveis fisiológicos) e mutada
dessas proteínas geralmente são expressas em quantidades não-detectáveis (Marshall, 1999).
A atual investigação demonstrou a expressão da proteína p21
Ras
predominantemente
entre os Astrocitomas Grau II (positividade de 37,71%; LI médio = 2,71 ± 4,02; H médio =
4,92 ± 7,79). A expressiva marcação de um único caso do grau I (positividade de 7,69%)
141
resultou em escores médios relativamente mais elevados nesta gradação (LI = 6,15 ± 22,18; H
= 20 ± 72,11). Nenhum tumor astrocítico de alto grau (III e IV) da amostra avaliada
apresentou marcação para p21
Ras
(Figuras 51 e 52).
Em análises anteriores, Arvanitis et al. (1991) observaram positividade para p21
Ras
em 35,71% dos Astrocitomas Grau II e em 75% dos tumores astrocíticos de alto grau. Orian
et al. (1992) confirmaram a tendência de maior detecção da proteína p21
Ras
entre os
astrocitomas de alto grau (57%), embora não tenham evidenciado casos positivos entre os
tumores do grau II. Dentre os estudos prévios, não há referência à expressão de p21
Ras
em
Astrocitomas Grau I nem descrição de índices de marcação metodologicamente comparáveis
aos aqui apresentados.
A despeito das discrepâncias entre os resultados, grande parte das pesquisas confirma
a ausência da imuno-expressão de p21
Ras
nos astrocitomas de alto grau e associam este fato à
freqüente superexpressão dos receptores do tipo tirosino-quinase (ex.: EGFR, PDGFR) nesses
tumores (Bos, 1989; Tuzi et al., 1991; Guha et al., 1997). Acredita-se que a hiperativação
desses receptores, mesmo repercutindo sobre quantidades fisiológicas de p21
Ras
, seria
suficiente para a maior promoção das cascatas intracelulares, tornando a expressão
oncogênica de p21
Ras
“dispensável” (Guha et al., 1997).
Essa hipótese também pode ser estendida aos Astrocitomas Grau I avaliados, já que
os casos dessa graduação foram predominantemente negativos para p21
Ras
e demonstraram
significante positividade para EGFR. Contudo, não se pode excluir a possibilidade da
ausência da superexpressão de p21
Ras
como uma característica independente nos tumores do
grau I, desde que o único caso positivo para p21
Ras
nessa gradação também apresentava
considerável expressão de EGFR (Anexo IV).
A detecção de p21
Ras
concomitante à inexistência da expressão de EGFR nos
Astrocitomas Grau II avaliados reforça ainda mais a tendência antes reportada. A marcação
142
para p21
Ras
quase que exclusivamente entre os tumores do grau II também demonstra que a
superexpressão de p21
Ras
ocorre de modo diferencial nesta gradação. Além disso, a ausência
da expressão de p21
Ras
entre os astrocitomas de alto grau sugere que os Astrocitomas do Grau
II portadores de alterações na expressão de p21
Ras
não progridem para fenótipos mais
malignos, tornando a marcação para p21
Ras
num virtual indicador de melhor prognóstico.
Não obstante, Bian et al. (2000) relataram não ter observado qualquer relação entre a
expressão de p21
Ras
com a gradação ou o prognóstico dos tumores astrocíticos, propondo que
tais associações seriam facultadas às mutações dos genes ras. Todavia, Gomori et al. (1999) e
Woods et al. (2002) ressaltam que os tumores astrocíticos, contrariamente a maioria das
neoplasias humanas, raramente apresentam mutações nos genes ras.
5.3.7. O Fator de Transcrição c-Myc
A contribuição da proteína c-Myc nuclear (funcional) para o processo de proliferação
celular nos astrocitomas foi discutida anteriormente. Conforme relatado, a superioridade dos
índices de marcação nuclear para c-Myc em relação aos valores obtidos para o antígeno Ki-67
(admitido como marcador padrão de proliferação celular), assim como a notável variabilidade
destes escores, indicou a provável participação da proteína c-Myc em outros fenômenos
neoplásicos atuantes nesses tumores.
Apesar das intensas pesquisas, os mecanismos pelos quais a desregulação da expressão
do gene c-myc promove a tumorigênese não estão completamente elucidados. Dentre os
possíveis eventos coordenados pela expressão oncogênica do c-myc, destacam-se o
incremento do metabolismo celular (Dang, 1999), a indução de instabilidade cromossômica
(Gardner et al., 2002), o bloqueio da diferenciação celular (Canelles et al., 1997), a regulação
da apoptose (Lutz et al., 2002) e a promoção da imortalidade celular (Wang et al., 1998). Os
altos índices de c-Myc nuclear entre os tumores astrocíticos do grau IV sugerem ainda o
143
envolvimento dessa proteína na ativação da angiogênese (Knies-Bamforth et al., 2004),
fenômeno responsável pela marcante proliferação endotelial observada nessa gradação
(Kleihues & Cavenee, 2000). Futuros estudos especialmente orientados para a investigação
das diferentes funções da proteína c-Myc deverão identificar os programas celulares ativados
por esta proteína e o real impacto dessas alterações nos tumores astrocíticos.
A maioria dos trabalhos que avaliaram a expressão de c-Myc nas neoplasias humanas
desprezou a detecção dessa proteína no citoplasma celular, referindo-se a esta como
desprovida de significado funcional (Orian et al., 1992) ou até mesmo como marcação
inespecífica, resultante de fixação histológica inadequada (Williams et al., 1990). No entanto,
alguns estudos observaram o acréscimo da expressão citoplasmática de c-Myc conforme a
progressão maligna nos carcinomas gástrico (Yamamoto et al., 1987), do cólon (Royds et al.,
1992) e do ovário (Sasano et al., 1992). Já Satoh et al. (1992) e Bai et al. (1994) reportaram
inclinação oposta quanto aos carcinomas oral e endometrial, respectivamente. Royds et al.
(1992) comprovaram ainda que a proteína c-Myc citoplasmática encontrava-se associada a
grupamentos ribossômicos, sugerindo que o acúmulo dessa proteína no citoplasma resultaria
de possíveis alterações pós-transcricionais.
Recentes evidências apontam a distribuição protéica celular como resultado de
complexos e refinados mecanismos de transporte núcleo-citoplasmático, consistindo em: (1)
reconhecimento da proteína por receptores de “importação” ou “exportação”; (2) ancoragem
do complexo receptor-proteína aos poros da membrana nuclear; (3) deslocamento do
complexo através da membrana nuclear; (4) liberação do receptor e (5) reciclagem dos fatores
de transporte (Alberts et al., 2002). Dessa forma, percebe-se que a desregulação dessas etapas
pode ocasionar a localização anômala e, conseqüentemente, a alteração funcional de grande
variedade de proteínas. Fabbro & Henderson (2003) confirmam o processo neoplásico como
144
potencial indutor de modificações nesses mecanismos, provocando a acumulação/disfunção
de proteínas responsáveis por importantes fenômenos celulares.
Frente a esta realidade, o presente estudo procedeu a primeira avaliação da marcação
citoplasmática do c-Myc em tumores astrocíticos, tendo evidenciado maior positividade entre
os tumores de alto grau (71,43%) em relação aos tumores do grau I (30,77%) e II (42,86%)
(Figura 54). Por outro lado, os escores médios de marcação foram semelhantes, exceto pela
disposição de aumento verificada nos astrocitomas do grau IV [LI (8,69; 8,92; 9,57; 15,57) e
H (14,61; 13,42; 16,57; 24,42)] (Figura 55). Esses dados indicam o acúmulo citoplasmático
da proteína c-Myc como um evento inicial e relevante na tumorigênese dos astrocitomas,
notadamente nos tumores do grau IV.
A expressiva e constante concordância entre as marcações nuclear e citoplasmática
para c-Myc nos tumores astrocíticos (em média 65,45%) sugerem ainda que a presença desta
proteína no citoplasma reflete diretamente seus níveis nucleares de expressão. Já o
crescimento da concomitância entre essas marcações caracteriza o surgimento de c-Myc no
citoplasma como diretamente proporcional à evolução maligna dos astrocitomas. Não
obstante, a relativa diminuição da concomitância nos Glioblastomas demonstra eventuais
divergências entre a localização citoplasmática e nuclear da proteína c-Myc nesses tumores,
reforçando ainda mais a heterogeneidade dessa gradação (Figura 56).
Diante desses achados e dos conhecimentos atuais, propõe-se a hipótese do
aprisionamento citoplasmático de c-Myc nos tumores astrocíticos como uma tentativa de
bloqueio das funções oncogênicas dessa proteína. Admite-se que, objetivando reduzir o
impacto da expressão aberrante do gene c-myc, mecanismos de transporte núcleo-
citoplasmático reduziriam progressivamente a captação da proteína c-Myc recém-transcrita ou
até mesmo promoveriam sua expulsão após a entrada no núcleo. A potencialização deste
fenômeno com a progressão tumoral ocasionaria, por vezes, a retenção total de c-Myc no
145
citoplasma, justificando as consideráveis discordâncias entre as marcações nuclear e
citoplasmática observadas nos tumores Astrocitomas Grau IV.
A necessidade de comprovação desta hipótese suscitará novas investigações,
promovendo a identificação dos elementos regulatórios envolvidos no mecanismo de
transporte núcleo-citoplasmático e colaborando para o entendimento das múltiplas vias
moduladas pela proteína c-Myc da tumorigênese dos astrocitomas. Para tanto, julga-se
também fundamental o estudo dos ligantes específicos do fator de transcrição c-Myc (ex.:
Max), bem como dos estímulos responsáveis pela expressão dessa enigmática proteína.
5.3.8. Vias Tumorigênicas
O fenômeno tumorigênico consiste num complexo processo no qual células tornam-se
imortais, proliferantes, invasoras e moduladoras dos seus ambientes (Louis, 1997). Uma única
alteração molecular dificilmente é responsável pela totalidade do evento neoplásico, sendo
este habitualmente resultante de uma série de distúrbios genéticos em diversos níveis da
regulação celular (Cavenee & White, 1995).
Todavia, a alteração de alguns genes com papel central em múltiplos canais
regulatórios revela o potencial impacto de uma simples desordem molecular para o
desenvolvimento do câncer. Nesse contexto, admite-se que as principais alterações genéticas
desencadeadoras da transformação maligna são aquelas que conferem as maiores “vantagens”
à célula-matriz, estimulando sua proliferação e sobrevida. Percebe-se ainda que tais desordens
acabam sendo amplamente perpetuadas para as células subseqüentes (expansão clonal),
assegurando sua presença na maioria das células formadoras do tumor primário (Nowell,
1976; Breivik, 2005).
Dessa forma, através da simples comparação quantitativa e qualitativa entre os escores
referentes aos marcadores que mais se destacaram nos tumores astrocíticos (p53/p21, EGFR e
146
c-Myc), pôde-se inferir a principal alteração molecular em cada caso investigado,
determinando as principais vias tumorigênicas ativadas nas diferentes gradações dos
astrocitomas (Figura 57).
A mutação do gene supressor tumoral p53 destacou-se em todas as graduações dos
tumores astrocíticos (especialmente nos Astrocitomas Grau III), figurando como a principal
alteração tumorigênica dentre os astrocitomas estudados. A manifestação dessa desordem
genética desde os tumores do grau I, associada à sua manifestação em consideráveis índices
nas gradações subseqüentes, confirma a mutação do p53 como um evento inicial, relevante e
potencial indicador da progressão tumoral nos astrocitomas.
Já a superexpressão do EGFR notabilizou-se apenas entre os tumores astrocíticos dos
graus I e IV, caracterizando esta alteração molecular como distintiva dessas gradações e não
relacionada à sucessão tumoral nos astrocitomas. O amplo predomínio da via EGFR nos
Astrocitomas Grau IV reafirma a importante contribuição das desordens deste gene para o
estabelecimento dos Glioblastomas. Por outro lado, a constatação da expressão de EGFR nos
Astrocitomas Grau I desvenda um inédito subconjunto genético nessa graduação,
acrescentando um novo elemento para a melhor compreensão da tumorigênese e da eventual
evolução maligna desses tumores.
Outra novidade consistiu na demonstração da expressão do gene c-myc (nuclear e/ou
citoplasmática) como capaz de explicar o processo tumorigênico dos astrocitomas quando da
ausência ou discreta participação das alterações nos genes p53 ou EGFR. O impacto do c-myc
na transformação maligna dos astrocitomas mostrou-se crescente conforme a graduação
tumoral, exceto pela modesta influência verificada nos Astrocitomas Grau IV.
Huang et al. (2000) já haviam constatado o aumento da expressão do c-myc (RNAm)
nos Astrocitomas Grau II, sugerindo o envolvimento deste gene na patogênese dos tumores
astrocíticos de baixo grau. Jensen et al. (2003), por sua vez, demonstraram que a
147
superexpressão do gene c-myc em precursores astrogliais de camundongos era suficiente para
deflagrar o fenômeno neoplásico, originando tumores astrocíticos de fenótipo maligno (alto
grau). Deste modo, fortalece-se o conceito do gene c-myc como responsável por uma
importante e distinta via molecular na tumorigênese dos astrocitomas, atuando de modo
alternativo àquelas encabeçadas pelos genes p53 e EGFR.
5.3.8. Enzimas relacionadas à Quimiorresistência
Apesar dos recentes avanços na quimioterapia dos gliomas, a expectativa de sobrevida
para a maioria dos pacientes permanece inalterada. Grande parte do insucesso na terapia
adjuvante desses tumores é atribuída às variações na sensibilidade tumoral desencadeadas por
desordens genéticas inerentes à formação e/ou à progressão dessas neoplasias, caracterizando
o fenômeno denominado quimiorresistência primária (Kitange et al., 2001).
Vários estudos moleculares têm demonstrado a participação de enzimas reguladoras
do metabolismo celular nos mecanismos de quimiorresistência dos astrocitomas, assim como
o sucesso de estratégias terapêuticas delineadas segundo o perfil bioquímico de cada tumor
(Nagane et al., 1999; Nutt et al., 2000; Tanaka et al., 2000). Não obstante, a detecção imuno-
histoquímica dessas enzimas desponta como uma alternativa prática para o screening dos
mecanismos de resistência tumoral, constituindo promissora ferramenta para a escolha de
agentes antineoplásicos efetivos e, principalmente, para a exclusão das drogas virtualmente
ineficientes (Mattern & Volm, 1992).
Neste sentido, a corrente investigação apresenta a imuno-expressão de algumas
enzimas associadas à quimiorresistência (MGMT, GSTπ, TopoIIα e TS) nos tumores
astrocíticos, configurando um dos primeiros relatos semiquantitativos acerca da detecção in
situ dessas proteínas em astrocitomas de diferentes graduações histológicas (Figuras 59 e 60).
148
A enzima O
6
-Metilguanosina-DNA-Metiltransferase (MGMT) atua na reparação de
eventuais lesões no DNA através da remoção de grupamentos alquil nocivamente transferidos
para a posição O
6
da guanosina (Margison et al., 2003). Inúmeras pesquisas têm comprovado
a associação entre o acréscimo na expressão da MGMT em células neoplásicas e a resistência
tumoral aos agentes alquilantes, com destaque para as nitrosuréias, a procarbazina e a
temozolomida - importantes drogas utilizadas na terapia dos astrocitomas (Gerson, 2002).
No presente ensaio, constatou-se a expressão da MGMT em astrócitos de todos os
casos examinados, com elevados e semelhantes escores médios de marcação (LI) entre os
espécimes tumorais (68,07; 72,50; 63,14; 73,10) e não-tumorais (75,00).
A detecção da MGMT na totalidade das amostras avaliadas revela a ativação dessa
enzima como um fenômeno assíduo na linhagem astrocítica. Anteriormente, Citron et al.
(1995) havia reportado a detecção dessa enzima em 100% dos tecidos cerebrais sadios,
enquanto Yuan et al. (2003) relataram semelhante tendência em relação aos astrocitomas
(94,28%). Em contraste, Ohe et al. (2003) e Sun et al. (2004) descreveram menor positividade
para MGMT entre os tumores astrocíticos: 73,50% e 50,84%, respectivamente.
Já os consideráveis índices médios de marcação (LI) para MGMT demonstram a
eminente presença dessa enzima nos casos pesquisados, ao passo que a semelhança entre os
escores nas diferentes classes histológicas denota a não-associação da expressão dessa enzima
com a sucessão de eventos neoplásicos nos astrocitomas. Esses achados contrapõem-se aos de
Yuan et al. (2003), que observaram o decréscimo dos valores médios de marcação para
MGMT conforme a progressão dos tumores astrocíticos (69,28 no grau II; 44,44 no grau III e
19,36 no grau IV), bem como aos de Silber et al. (1993), que evidenciaram o aumento da
quantidade e da distribuição dessa enzima na maioria dos tumores cerebrais quando
comparadas aos tecidos não-tumorais adjacentes.
149
As notórias discrepâncias entre os dados supracitados refletem sobretudo a relativa
escassez de estudos imuno-histoquímicos para a enzima MGMT nos astrocitomas, visto que a
maior parte dos trabalhos nesse campo remete a investigações moleculares. Dentre estas,
sobressaem-se pesquisas acerca da hipermetilação da região promotora do gene MGMT,
fenômeno responsável pelo impedimento da sua expressão (silenciamento epigenético).
A compilação dos trabalhos acerca da metilação do gene MGMT mostra que, em
média, 43,16% (297/688) dos tumores astrocíticos exibem essa alteração (Esteller et al., 2001;
Nakamura et al., 2001; Komine et al., 2003; Balaña et al., 2003; Blan et al., 2004; Hegi et al.,
2005; Watanabe et al., 2005). Todavia, cerca de 97% desses tumores também manifestam o
status não-metilado (Blan et al., 2004). Estas evidências demonstram que a transformação
neoplásica configura importante estímulo para a metilação desse gene, induzindo o bloqueio
da expressão da MGMT nos astrocitomas. Tal desordem, contudo, ocorre de forma
heterogênea entre as células neoplásicas, o que acaba assegurando a presença da referida
enzima na maioria dos tumores astrocíticos. Essa tendência pôde ser comprovada através da
marcante positividade para MGMT verificada entre os espécimes tumorais do corrente estudo.
Além disso, o relato de semelhantes índices de metilação nos astrocitomas dos graus II e IV
(48%) (Nakamura et al., 2001) reforça a similaridade entre a expressão da MGMT nas
diferentes graduações desses tumores, disposição também registrada pela atual investigação.
Nakamura et al. (2001) descreveram ainda intrigante correlação entre a ocorrência da
metilação no gene MGMT e a maior freqüência de mutações no gene p53 em tumores
astrocíticos [especialmente transições guanina:citosina → adenina:timina localizadas nos
sítios CpG (de cytosine-phosphate-guanine)]. Apesar do desconhecimento acerca de seu
significado funcional, esta tendência pode justificar a discreta redução no escore médio de
marcação para MGMT observada nos Astrocitomas Grau III da presente análise, uma vez que
essa categoria histológica apresenta o maior índice de mutação do gene p53 (Figura 57).
150
Conforme esperado, o fenômeno da metilação do MGMT nos tumores astrocíticos é
reconhecido como indicador de melhor resposta aos agentes alquilantes por grande parte dos
trabalhos, sendo ainda apontado como preditor independente de maior sobrevida (Balaña et
al., 2003; Kamiryo et al., 2004; Hegi et al., 2005). Blan et al. (2004), por sua vez, não
identificaram qualquer relação entre o silenciamento epigenético do MGMT e a resposta
terapêutica/sobrevida geral dos portadores de Glioblastomas. Já Komine et al. (2003) e
Watanabe et al. (2005) reportam a metilação desse gene como indicativa de pior prognóstico
clínico e de menor resposta às nitrosuréias tanto em astrocitomas de baixo quanto de alto
grau. Dessa forma, percebe-se que o impacto prognóstico do bloqueio epigenético do MGMT
permanece incerto, sendo necessário maiores investigações.
Mesmo diante de tantas divergências, admite-se que a significante expressão da
enzima MGMT verificada nos tumores astrocíticos possa conferir notável resistência aos
quimioterápicos indutores de danos ao DNA, o que em parte suportaria o freqüente insucesso
dos agentes alquilantes no tratamento dessas neoplasias. Esta refratariedade à quimioterapia
manifestar-se-ia como uma condição inerente às células astrocitárias, estando aparentemente
dissociada das alterações tumorigênicas sucedidas nos astrocitomas.
Outro importante mecanismo de quimiorresistência é representado pela família de
enzimas Glutationa-S-Transferases (GSTs), que atua favorecendo a detoxificação celular
mediada pela glutationa reduzida (GSH). Recentes estudos apontam o aumento da expressão
das GSTs nos gliomas, especialmente da variante pi (GSTπ), como potencial responsável pela
resistência desses tumores à cisplatina (Nagane et al., 1995), à nimustina (ACNU), à
tenoposida (VM26) (von Bossanyi et al., 1997) e à carmustina (BCNU) (Nutt et al., 2000).
O presente trabalho evidenciou discreta expressão da GSTπ em células astrocíticas dos
espécimes não-tumorais examinados (LI médio ≅ 0,40), com nítido predomínio da marcação
nuclear, à semelhança do reportado por Hara et al. (1990) e Grant & Ironside (1995).
151
Já as amostras tumorais manifestaram elevada positividade nuclear para GSTπ desde
os Astrocitomas Grau I, apresentando tendência à ampliação do percentual de casos positivos
de acordo com a evolução histológica (76,92%; 92,86%; 100,00%; 100,00%). Por outro lado,
constatou-se propensão ao declínio dos índices médios de marcação (LI) para essa enzima
conforme a progressão dos tumores astrocíticos avaliados (59,80; 61,46; 55,00; 46,71). Esses
achados reproduzem os de von Bossanyi et al. (1997), que observaram considerável expressão
da GSTπ nos astrocitomas, notadamente entre os tumores do grau II. Grant & Ironside (1990)
mencionaram ainda correlação inversa entre a imuno-detecção dessa enzima e o grau de
anaplasia tumoral, o que poderia fundamentar a redução nos escores médios de expressão (LI)
da GSTπ verificada nos astrocitomas de alto grau (III e IV).
Em conjunto, tais dados sugerem a ativação da expressão da enzima GSTπ como um
fenômeno peculiar, inicial, vigoroso e freqüente na tumorigênese dos astrocitomas, ainda que
passível de interrupções frente à aquisição de fenótipos mais anaplásicos. Nesse contexto,
infere-se que a expressão diferencial dessa enzima nos tumores astrocíticos resulte em grande
incentivo à detoxificação celular promovida pela glutationa, justificando (pelo menos
parcialmente) a habitual resistência dos astrocitomas às drogas antineoplásicas sabidamente
depuradas pela GSH, como os agentes alquilantes, os antibióticos e as podofilotoxinas.
A maioria dos ensaios reportam ainda o acréscimo na expressão da GSTπ nos tumores
astrocíticos como indicador de agressividade clínica e forte preditor de menor sobrevida (Ali-
Osman et al., 1997; Yoshii et al., 2001), embora algumas pesquisas não tenham encontrado
qualquer valor prognóstico atribuível à marcação para essa enzima (Anda et al., 2003).
Outra enzima potencialmente implicada na quimiorresistência tumoral consiste na
Timidilato Sintase (TS), que catalisa a única via intracelular responsável pela síntese do
Timidilato - uma das etapas limitantes na síntese do DNA. Inúmeros estudos sugerem que
aumentos significativos na expressão dessa enzima em células neoplásicas poderiam superar
152
os efeitos de seus agentes inibidores, configurando o mecanismo básico da refratariedade
terapêutica (Peters et al., 2002). Dentre os quimioterápicos que bloqueiam a TS, destacam-se
os consagrados antagonistas dos sítios da pirimidina [5-fluorouracil (5FU); capecitabina] e as
novas drogas inibidoras dos sítios do folato [ZD1694 (Raltitrexed); LY231514 (Pemetrexed);
AG337 (Nolatrexed); ZD9331 e AG331] (van Triest et al., 2000).
A atual pesquisa constatou tênue expressão de TS em astrócitos das amostras não-
tumorais avaliadas (H médio ≅ 0,60), ao passo que nos astrocitomas investigados (n = 24)
*
foi
evidenciada considerável positividade para essa enzima, com semelhantes percentuais entre as
diferentes gradações (83,33%; 83,33%; 83,33%; 66,66%). Os escores médios de marcação
para TS demonstraram a mesma orientação, exceto pelos maiores índices verificados nos
tumores do grau IV [LI (24,16; 21,66; 18,33; 31,66) e H (35,00; 38,33; 32,00; 63,33)]. Esses
dados corroboram com os relatados por Boon et al. (2004), que verificaram a ativação
diferencial do gene da TS nos tumores astrocíticos, bem como ratificam a maior imuno-
detecção dessa enzima nos astrocitomas de alto grau (particularmente nos Glioblastomas),
conforme apontado por Bardot et al. (1994).
Assim, percebe-se a superexpressão da TS como um evento distintivo e comum no
processo tumorigênico dos astrocitomas, ocorrendo com grande intensidade desde os tumores
de baixo grau e atingindo proeminentes valores entre os Astrocitomas Grau IV. Nesta
perspectiva, denota-se intrínseca capacidade de resistência dos tumores astrocíticos aos
agentes antineoplásicos inibidores da TS, o que em parte explicaria a baixa eficiência de
drogas como o 5FU no tratamento dessas neoplasias (Cvitkovic et al., 1993; Stewart et al.,
1995; Cascino et al., 1996; Shapiro et al., 1999). Até o momento, não existem relatos quanto
ao valor prognóstico da imuno-detecção dessa enzima nos astrocitomas.
*
A detecção imuno-histoquímica da enzima TS foi realizada somente em vinte e quatro amostras tumorais (seis
de cada graduação tumoral) devido à limitada quantidade disponível do anticorpo monoclonal TS106.
153
Ao contrário das demais enzimas analisadas, a presença da DNA Topoisomerase II
(TopoII) constitui situação favorável para a ação de diversos agentes antineoplásicos, de
modo que a redução da sua expressão em células tumorais é que determina o fenômeno de
quimiorresistência. Essa enzima atua rompendo e religando a dupla fita do DNA - manobras
essenciais para a funcionalidade do material genético, conquanto potencialmente letais se
desprovidas de minuciosa regulação (Wilstermann & Osheroff, 2003). Drogas que favorecem
a formação dos complexos de clivagem DNA-TopoII transformam essa enzima numa virtual
toxina celular, capaz de fragmentar de forma irreparável o genoma e, assim, desencadear
mecanismos de morte celular. Algumas dessas substâncias são conhecidas como “venenos” da
TopoII, sendo representadas pelos(as) compostos antracíclicos, epipodofilotoxinas, acridinas,
antracenodionas, antibióticos e elipticinas (Kufe et al., 2003).
Os resultados obtidos pela presente investigação acerca da detecção da enzima DNA
Topoisomerase II subtipo alfa (TopoIIα) foram comentados anteriormente na seção 5.3.1
(Proliferação Celular; pág. 99). De acordo com o exposto, percebeu-se crescente positividade
para TopoIIα conforme a progressão dos tumores astrocíticos, com elevados e semelhantes
índices médios de marcação (LI) para os tumores dos grau II, III e IV. Estes achados
demonstram a expressão diferencial dessa enzima nos astrocitomas, especialmente a partir do
grau II, indicando a potencial susceptibilidade dessas neoplasias aos quimioterápicos que
promovem a ativação das enzimas TopoII.
A despeito dessas evidências, o impacto prognóstico da expressão da TopoIIα nos
tumores astrocíticos continua indefinido. Grande parte dos estudos aponta a elevada marcação
para essa enzima como indicativa de menor sobrevida (Tanigushi et al., 1999; Korkolopoulou
et al., 2001; Bredel et al., 2002a; Ho et al., 2003), vocação provavelmente conseqüente à
participação da TopoIIα no mecanismo de proliferação celular e, por conseguinte, no
estabelecimento de fenótipos mais malignos. Entretanto, Bredel et al. (2002b) constataram
154
maior sobrevida entre os portadores de Glioblastomas que apresentavam altos índices de
detecção para essa enzima, enquanto nos gliomas ópticos da infância (astrocitomas de baixo
grau) nenhuma associação entre a presença da TopoIIα e o comportamento clínico desses
tumores foi observada (Bredel et al. 2002c).
5.3.9. Potenciais Alvos Moleculares
O reconhecimento de determinadas alterações moleculares como essenciais para o
estabelecimento e/ou progressão do câncer constitui o ponto de partida para a caracterização
dessas desordens como possíveis alvos terapêuticos. Idealmente, um alvo molecular deve
configurar aspecto distintivo e estratégico para o processo neoplásico, sendo ainda regulado
de modo diferente entre células tumorais e tecidos sadios (Huang & Oliff, 2001).
Nessa perspectiva, os dados apresentados pela atual análise fundamentam a indicação
dos genes/proteínas p53, Bcl-2, EGFR, c-Myc, MGMT, GSTπ e TopoIIα como potenciais
alvos moleculares nos tumores astrocíticos.
A confirmação da mutação do gene p53 como a principal desordem molecular nos
astrocitomas incentiva a pesquisa por artifícios capazes de restaurar a função desse gene nos
referidos tumores. Utilizando técnicas de reposição do gene supressor tumoral p53 através de
vetores virais (terapia genética), Tsuchiya (2000) observou maior radiossensibilidade entre as
linhagens de Astrocitomas Grau IV tratadas, enquanto Geoerger et al. (2004) demonstraram
indução da apoptose e redução do crescimento tumoral respectivamente em culturas primárias
e modelos de transplantes heterólogos de Glioblastomas transfectados com o gene p53.
Já a constatação do aumento na expressão da proteína anti-apoptótica Bcl-2 conforme
a progressão dos tumores astrocíticos, resultando em crescente tendência à sobrevida celular,
abre espaço para abordagens que promovam o bloqueio transcricional dessa proteína e, assim,
estimulem o mecanismo apoptótico. Zhu et al. (2003) reportaram considerável inibição do
155
crescimento tumoral, completa perda do potencial tumorigênico e significante incremento da
sensibilidade à cisplatina em culturas de astrocitomas malignos humanos tratadas com
oligonucleotídeos antisense para Bcl-2. Jiang et al. (2003) obtiveram semelhantes resultados
com o uso de oligonucleotídeos antisense para Bcl-2/Bcl-x
L
(bi-específicos) nas linhagens de
Glioblastomas U87 e NS008.
A consolidação da superexpressão do EGFR como a alteração molecular predominante
nos Astrocitomas Grau IV (especialmente dos Primários), bem como as novas evidências
acerca da sua participação na tumorigênese dos Astrocitomas Grau I, desvenda a perspectiva
do emprego das modernas táticas anti-EGFR no tratamento dessas neoplasias. Dentre estas,
Kuan et al. (2001) ressaltam os inibidores protéicos, os anticorpos monoclonais “desarmados”
ou complexados (ligados a agentes citotóxicos, imunotoxinas ou radioisótopos) e os
imunizantes ativos (peptídeos imunogênicos, células dendríticas) como possíveis estratégias
para o tratamento dos tumores astrocíticos. Comprovando essa disposição, Stea et al. (2003)
verificaram significante efeito radiossensibilizador e indutor da apoptose em células de
Glioblastoma (linhagem U251) com o uso do Gefitinib, um bloqueador do domínio tirosino-
quinase do EGFR. Zhang et al. (2004) e Fan & Weiss (2005) documentaram ainda o potencial
terapêutico da tecnologia RNA interference no impedimento da expressão, respectivamente,
do EGFR e da variante EGFRvIII em astrocitomas malignos.
O estabelecimento da ativação do gene c-myc como uma via tumorigênica alternativa
àquelas deflagradas pela mutação do p53 e pela superexpressão do EGFR nos tumores
astrocíticos fomenta o interesse por terapêuticas capazes de bloquear a expressão desse gene.
Baker et al. (2002) reportaram um caso de Astrocitoma Grau III recorrente que obteve
remissão parcial com a aplicação do Fenilbutirato, uma droga da categoria dos modificadores
da resposta biológica que atua inibindo as cascatas mediadas pela c-Myc. Hosoi et al. (1998)
relataram o agente citostático Rapamicina como um eficiente bloqueador da transcrição do
156
gene c-myc em células tumorais humanas, incluindo as provenientes de gliomas. No âmbito
das terapias moleculares, Broaddus et al. (1997) descreveram excelentes resultados com a
utilização de oligonucleotídeos antisense para c-myc no tratamento de gliomas malignos, ao
passo que Chen et al. (1995) apontaram a transfecção de tumores cerebrais humanos com
adenovírus contendo o gene MAD (antagonista do c-myc) como uma estratégia promissora.
A evidência de elevada expressão da enzima MGMT entre os astrocitomas manifesta a
eminente refratariedade desses tumores aos quimioterápicos alquilantes. Todavia, a ação da
MGMT pode ser bloqueada através da utilização de fármacos como a O
6
-benzilguanina (BG),
resultando em potencial reversão da resistência aos agentes alquiladores (Gerson, 2002).
Kanzawa et al. (2003) documentaram a quimiossensibilização da linhagem de Glioblastoma
T98G à temozolomida após o tratamento com a BG. Bobola et al. (2005), estudando 11
(onze) linhagens de gliomas pediátricos, observaram que a administração de BG reduz a dose
letal (LD10) da carmustina (BCNU) e da temozolomida em, respectivamente, 2,6 e 26 vezes,
bem como diminui a dose tóxica desses agentes em 3,3 e 138 vezes, respectivamente. A
utilização clínica da BG vem sendo encorajada por recentes estudos de fase I/II, que mostram
a inexistência de toxicidade aparente dessa droga quando utilizada em protocolos adjuvantes
para gliomas malignos humanos (Friedman et al., 1998).
O grande incentivo à detoxificação celular nos astrocitomas, depreendido a partir da
marcante presença da enzima GSTπ, configura outro virtual mecanismo de quimiorresistência
atuante nesses tumores. Não obstante, diferentes estratégias terapêuticas têm sido propostas
com o objetivo de revogar essa condição. Allalunis-Turner et al. (1991) evidenciaram a
sensibilização à carmustina e à mostarda nitrogenada em culturas primárias de gliomas
malignos após a incubação com a Butionina Sulfoximina, um aminoácido sintético que
restringe a atividade das enzimas GST pela inibição da síntese da glutationa (molécula efetora
da detoxificação). Brandt & Ali-Osman (1997) identificaram a Cisplatina como um agente
157
supressor reversível da expressão de GSTπ na linhagem de Glioblastoma MGR3, operando de
maneira dose-dependente. Já Geroni et al. (2002) relataram o potencial uso da Brostalicina
(PNU-166196), um novo agente alquilante da classe dos ligantes do sulco menor do DNA (ou
MGBs, de minor groove binders) que exibe intrigante acréscimo da sua atividade citotóxica
conforme a ampliação dos níveis celulares das GSTs e da glutationa reduzida (GSH).
Em contraste, a demonstração do aumento na expressão da enzima TopoIIα nos
astrocitomas estimula a utilização dos fármacos que interferem na atuação dessa enzima em
esquemas terapêuticos para os referidos tumores. Os “venenos” da TopoII atuam promovendo
a formação dos complexos de clivagem covalentes DNA-TopoII, sendo representados por
agentes intercaladores [Epipodofilotoxinas (exs.: etoposida, tenoposida)] e não-intercaladores
[Antraciclinas (exs.: doxorrubicina, daunorrubicina); Acridinas (ex.: amsacrina); Antibióticos
(ex.: actinomicina); Antracenodionas (ex.: mitoxantrona) e Elipticinas (ex.: hidroxielipticina)]
(Kufe et al., 2003). A Topo II também é alvo para uma segunda categoria de drogas
conhecidas como “inibidores catalíticos”, que impedem a enzima de realizar suas funções
fisiológicas através da intromissão na sua ligação com o DNA (exs.: aclarrubicina, suramina),
da estabilização dos complexos de clivagem não-covalentes DNA-TopoII (exs.: merbarona,
ICRF-187) ou da inibição do sítio ATPásico enzimático (ex.: novobiocina) (Larsen et al.,
2003). Beauchesne et al. (1999) obtiveram resultados satisfatórios utilizando a radioterapia
associada à quimioterapia com a Etoposida no tratamento de gliomas malignos primários,
referindo índices de resposta e sobrevida semelhantes aos alcançados com a terapia clássica
(radioterapia + nitrosuréias). Enquanto isso, Ali-Osman et al. (1993) e Vassal et al. (2003)
constataram a eficácia dos inibidores da TopoII no tratamento dos Glioblastomas em
linhagens celulares e modelos de transplante heterólogos, respectivamente.
158
Diante do exposto, percebe-se que a identificação de alvos moleculares em células
tumorais configura importante ferramenta para o desenvolvimento de novas drogas anticâncer
e estratégias terapêuticas, além de elucidar os eventos tumorigênicos e de possibilitar o uso
mais racional dos agentes antineoplásicos atualmente disponíveis. Nesse contexto, destaca-se
ainda a potencialidade da combinação de múltiplas abordagens farmacológicas e genéticas na
tentativa de modular os variados componentes envolvidos nas diversas cascatas de sinalização
celular ativadas nas neoplasias humanas (Bunz et al., 2001).
159
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
A incidência anual dos tumores astrocíticos na cidade de Fortaleza mostrou-se
semelhante às observadas em regiões subdesenvolvidas;
A distribuição por idade, por sexo e pela localização tumoral dos portadores de
astrocitomas em Fortaleza reproduziu, de um modo geral, as tendências mundiais;
A utilização dos escores semiquantitativos e da árvore de decisão CART referentes
aos parâmetros histopatológicos dos tumores astrocíticos configurou estratégia prática
e auxiliar para a graduação tumoral segundo os critérios estabelecidos pela OMS;
A presença de células gigantes multinucleadas e/ou de gemistócitos nos astrocitomas
confirmou-se como indicadora de fenótipos tumorais mais malignos;
A marcação para o antígeno Ki-67 em mais de 8,0% das células tumorais distinguiu os
Astrocitomas Grau IV, índices entre 1,5 e 8,0% diferenciaram os Astrocitomas Grau
III e valores abaixo de 1,5% discriminaram os tumores de baixo grau (I e II);
As proteínas TopoIIα e c-Myc (nuclear) demonstraram associação com proliferação
celular nos tumores astrocíticos, todavia de maneira não exclusiva;
A marcação da proteína p53 foi evidenciada em todas as graduações tumorais,
especialmente no grau III;
A expressão do supressor tumoral WAF1 (p21) demonstrou correlação inversa com a
graduação dos tumores astrocíticos (exceto no grau IV), configurando ainda
importante recurso para a inferência da situação funcional do gene p53;
A marcante presença da proteína p21
WAF1/CIP1
entre os Glioblastomas indicou a
superexpressão da proteína p53 selvagem e a participação de outras desordens
moleculares distintas da via p53/p21 em parte dos tumores dessa gradação;
160
A expressão nuclear do p27
KIP1
manifestou-se proporcionalmente à malignidade
tumoral, revelando a ativação funcional desse supressor como insuficiente para a
contenção do processo tumorigênico dos astrocitomas;
A expressão citoplasmática do p27
KIP1
foi modesta entre os tumores astrocíticos,
ocorrendo como reflexo de sua expressão nuclear e, portanto, não demonstrando
impacto na tumorigênese dessas neoplasias;
O predomínio da proteína anti-apoptótica Bcl-2 sobre a proteína pró-apoptótica Bax
consolidou-se com a progressão dos astrocitomas;
A expressão da proteína erbB2 ocorreu somente em alguns tumores do grau IV;
A superexpressão da proteína EGFR figurou entre as principais alterações moleculares
dos tumores astrocíticos dos graus I e IV;
A superexpressão do EGFR e a mutação do p53 configuraram eventos mutuamente
exclusivos no processo tumorigênico dos astrocitomas;
A expressão da proteína p21
Ras
foi evidenciada principalmente entre os Astrocitomas
Grau II, não ocorrendo nos tumores astrocíticos de alto grau;
A superexpressão da proteína p21
Ras
e dos receptores da família erbB demonstraram
tendência à exclusividade recíproca entre os tumores astrocíticos;
O acúmulo citoplasmático da proteína c-Myc apresentou-se como um fenômeno
inicial e significante na tumorigênese dos astrocitomas, sendo reflexo direto da
expressão nuclear do gene c-Myc e da malignidade tumoral;
As discordâncias entre as marcações nuclear e citoplasmática para c-Myc,
principalmente entre os Astrocitomas Grau IV, suscitaram a elaboração da hipótese do
aprisionamento citoplasmático da c-Myc, a qual admite o bloqueio da captação nuclear
da proteína c-Myc recém-transcrita no citoplasma como uma tentativa de redução da
sua funcionalidade como fator de transcrição;
161
A análise conjunta dos marcadores moleculares investigados confirmou a mutação do
gene p53 como a principal via tumorigênica dos astrocitomas, ainda que a
superexpressão do EGFR tenha sido a alteração predominante nos tumores do grau IV
e a expressão do gene c-myc tenha configurado uma via molecular distinta em relação
às demais nas diferentes graduações tumorais.
A elevada expressão da enzima MGMT manifestou-se como condição inerente às
células astrocíticas (tumorais e não-tumorais), fundamentando a habitual
quimiorresistência dos astrocitomas aos compostos alquilantes;
A ativação da enzima GSTπ representou fenômeno peculiar, inicial, intenso e
freqüente na tumorigênese dos astrocitomas, indicando o potencial incremento à
detoxificação celular de agentes antineoplásicos nesses tumores;
A superexpressão da enzima TS constituiu evento distintivo, primário, comum e
relevante entre os tumores astrocíticos, notadamente nos Glioblastomas, sugerindo a
intrínseca capacidade de resistência desses tumores aos inibidores dessa enzima;
A considerável expressão da enzima TopoIIα entre os astrocitomas demonstrou a
potencial susceptibilidade dessas neoplasias às drogas ativadoras dessa enzima;
Os genes/produtos protéicos p53, Bcl-2, EGFR, c-Myc, MGMT, GSTπ e TopoIIα
foram identificados como potenciais alvos moleculares nos tumores astrocíticos.
162
7. CONCLUSÕES
O antígeno Ki-67 notabilizou-se como o melhor marcador de proliferação celular nos
tumores astrocíticos, sendo sua expressão preditora da graduação histopatológica
dessas neoplasias;
A mutação do gene supressor tumoral p53 configurou evento inicial, relevante e
indicador de progressão nos tumores astrocíticos;
Os astrocitomas não demonstraram alterações na via de ativação do gene supressor
tumoral p27
KIP1
;
Houve crescente orientação à sobrevida celular (perfil anti-apoptótico) conforme a
evolução maligna dos tumores astrocíticos;
A superexpressão da proteína erbB2 representou fenômeno incomum na tumorigênese
dos astrocitomas;
A superexpressão da proteína p21
Ras
configurou evento molecular típico dos
Astrocitomas Grau II, sendo ainda indicadora de não-progressão tumoral;
A ativação do gene c-myc representou uma via tumorigênica distinta e alternativa
àquelas encabeçadas pela mutação do p53 e pela superexpressão do EGFR nos
tumores astrocíticos;
As enzimas indutoras de quimiorresistência MGMT, GSTπ e TS mostraram-se
altamente expressas nos tumores astrocíticos;
A enzima TopoIIα apresentou-se como promissor alvo terapêutico nos astrocitomas.
163
8. LIMITAÇÕES & COMENTÁRIOS
A quantidade de amostras tumorais investigadas pelo presente estudo foi relativamente
pequena, especialmente no grupo dos Astrocitomas Grau III (n = 07), devido ao
limitado número de casos que se enquadraram nos critérios de inclusão estabelecidos
(existência de múltiplos blocos, bom estado de conservação e diagnóstico histológico
segundo os parâmetros da OMS) e à restrita quantidade de reagentes para as reações
imuno-histoquímicas;
As informações clínicas referentes aos portadores dos tumores astrocíticos examinados
pela corrente investigação não foram apresentadas em detalhes visto as dificuldades
enfrentadas para a obtenção dos prontuários (pacientes de diversos hospitais), a
freqüente ocorrência de registros médicos incompletos e o baixo índice de seguimento
clínico pós-cirúrgico;
A análise de possíveis correlações prognósticas e a confirmação dos mecanismos de
quimiorresistência tumoral, sugeridas pelos marcadores moleculares avaliados no
presente ensaio, foram impossibilitadas devido à ausência dos parâmetros clínicos
(sobrevida, tempo livre de doença, recidivas, exposição/resposta à quimioterapia e/ou
à radioterapia) antes comentada;
A melhor definição de alguns eventos moleculares mencionados pela atual pesquisa
foi dificultada pela limitação do método imuno-histoquímico em identificar alterações
genéticas específicas, demonstrando a necessidade da complementação deste estudo
através de abordagens moleculares.
164
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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185
10. ANEXOS
186
ANEXO I
APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
187
ANEXO II
ORÇAMENTO GERAL
MATERIAL DE CONSUMO ORIGEM QUANTIDADE
VALOR
(US$)
Anticorpo monoclonal anti-humano de camundongo
para antígeno Ki-67 - clone MIB-1 Immunotech
®
1,0mL 468.00
Anticorpo policlonal anti-humano de coelho para
oncoproteína c-erbB-2 DakoCytomation
®
0,2mL 344.00
Anticorpo monoclonal anti-humano de camundongo
para c-myc - clone 9E10.3 Labvision
®
1,0mL 500.00
Anticorpo monoclonal anti-humano de camundongo
para EGFR - clone H11 DakoCytomation
®
1,0mL 756.00
Anticorpo monoclonal anti-humano de camundongo
para BCL2 - clone 124 DakoCytomation
®
1,0mL 418.00
Anticorpo policlonal anti-humano de coelho para Bax DakoCytomation
®
1,0mL 396.00
Anticorpo monoclonal anti-humano de camundongo
para p53 - clone DO-7 DakoCytomation
®
1,0mL 364.00
Anticorpo monoclonal anti-humano de camundongo
para p27kip1 - clone SX53G8 DakoCytomation
®
1,0mL 496.00
Anticorpo monoclonal anti-humano de camundongo
para p21WAF1/Cip1 - clone 4D10 Novocastra
®
1,0mL 364.00
Anticorpo monoclonal anti-humano de camundongo
para p21ras - clone NCC-RAS-001 DakoCytomation
®
1,0mL 404.00
Anticorpo monoclonal anti-humano de camundongo
para Timidilato Sintase - clone TS106 Chemicon
®
0,2mL 680.00
Anticorpo monoclonal anti-humano de camundongo
para MGMT - clone MT3.1 DakoCytomation
®
1,0mL 426.00
Anticorpo monoclonal anti-humano de camundongo
para Topoisomerase IIa - clone Ki-S1 DakoCytomation
®
1,0mL 488.00
Anticorpo monoclonal anti-humano de camundongo
para GSTpi - clone 353-10 DakoCytomation
®
1,0mL 436.00
Anticorpo monoclonal anti-humano de camundongo
para GFAP - clone 6F2 DakoCytomation
®
1,0mL 340.00
Kit Dako LSAB+, peroxidase-universal DakoCytomation
®
2 904.00
Kit DAB+ líquido DakoCytomation
®
1 122.00
Caneta para Imuno-Histoquímica DakoCytomation
®
2 160.00
Ácido Cítrico Sigma
®
1,0Kg 8.00
Tris Sigma
®
1,0Kg 216.00
Cloreto de Sódio Synth
®
2,0Kg 6.00
Álcool Etílico 95% Synth
®
50,0L 140.00
Xileno Dinâmica
®
50,0L 204.00
Ácido Clorídrico Synth
®
1,0L 6.00
Acetona Dinâmica
®
5,0L 39.00
Silano Sigma
®
200,0mL 413.80
Peróxido de Hidrogênio 30vol Dinâmica
®
5,0L 33.00
Albumina Bovina (BSA) Sigma
®
100,0g 871.00
Hematoxilina Nuclear
®
30,0g 174.00
Lâminas Bioglass
®
1500 58.50
Lamínulas 24X32mm Perfecta
®
1500 46.80
Bálsamo do Canadá QEL
®
300,0mL 28.80
Gastos Gerais 400.00
TOTAL 10,710.90
188
ANEXO III
FONTES DE FINANCIAMENTO
FONTE DE FINANCIAMENTO VALOR (US$)
Laboratório de Genética Molecular – LABGEM / UFC 3,870.80
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq
(Processo no. 470424/01-0)
3,188.00
DakoCytomation
®
, Inc. / BIOGEN
®
1,714.00
Recursos Pessoais 1,233.00
Departamento de Patologia e Medicina Legal / UFC 705.10
TOTAL 10,710.90
189
ANEXO IV
TABELA GERAL
ANE XO IV
ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO DAS ALTERAÇÕES MOLECULARES NOS ASTROCITOMAS: VIAS TUMORIGÊNICAS, ALVOS TERAPÊUTICOS E INDICADORES DE RESISTÊNCIA
DADOS GERAI S
c- my c n ucl ea r
Idade Sexo Local Variante (OMS) Celularidade Pleomorfismo Celular Atipia Nuclear Índice Mítótico Necros e Hiperplasia Endotelial TOTAL Células Gigantes Gemistócitos Observações 0(%) 1(%) 2(%) 3(%) HLIpadrão 0(%)1(%)2( %) 3(%) HLIpadrão LI padrão LI padr ã o LI pa dr ã o LI padrão LI padrão 0(%) 1(%) 2(%)3(%) HLIpadrão 0(%) 1(%) 2(%) 3(%) HLIpadrão 0(%) 1(%) 2(%) 3(%) HLIpad rão 0( %) 1(%) 2(%) 3(%) HLIpadrão LI padrão 0(%) 1(%)2(%) 3(%) HLIpadrão LI padrão LI p a dr ã o 0 (%) 1(% ) 2( % ) 3( % ) HLIpadrão 0(%)1(%) 2(%)3(%) HLIpadrão
0.1
A82/03 não-tum oral 48 mas culino 0 0 0 0 0 0 0 0 0 FEBR E HEM ORRÁGIC A 00 100 0 0 0 00 75D 00 0 0 100000 00 10 0 0 0 0 00 100000 00 10 0 0 0 0 00 0 0000 00 0 0 100000 00 100000 00
0.2
A38/03 não-tum oral 14 mas culino 0 0 0 0 0 0 0 0 0 SEPSE 00 98200 20difuso 75 D 1 D* 00 0100000 00 100 0 0 0 00 100000 00 100 0 0 0 00 0 0000 00 0 0 100000 00 100000 00
0.3
A1 20/03 não-tum oral 55 femi nino 00 0000000HIC
00
100 0 0 0
00 75
D
00 0 0
100000
00
100 0 0 0
00
100000
00
100 0 0 0
00 0
0000
00 0 0
100000
00
100000
00
0.4
A1 28/03 não-tum oral 15 femi nino 0 0 0 0 0 0 0 0 0 FEBR E HEM ORRÁGIC A
00
100 0 0 0
00 75
D
1
D*
00 0
100000
00
100 0 0 0
00
100000
00
100 0 0 0
00 0
0000
00 0 0
100000
00
100000
00
0.5
A89/03 não-tum oral 57 feminino 0 0 0 0 0 0 0 0 0 PNE UM ONI A
00
99100
10
difuso
75
D
00 0 0
100000
00
100 0 0 0
00
100000
00
100 0 0 0
00 0
0000
00 0 0
100000
00
100000
00
1
2469899 I 10 mas culino PILOCÍTICO 2 1 1 0 0 0 2 0 1 70 25 5 0
35 30
focal
65
D
70
D
2
dif us o
02
multifocal 87 3 2 8
31 13
mu l t i f oc al 10 0 0 0 0
00
97300
33
focal 97 3 0 0
33
foca l
40
multifocal* 90 10 0 0
10 10
multifoc al
045
difuso 100 0 0 0
00
100000
00
2
2167700 I 19 mas culino
PILOCÍTICO 2 0 0 0 0 0 0 0 0 100 0 0 0 00 45D 75 D 1 di f us o 1 dif us o 0 98200 22di f u so 10 0 0 0 0 00 75 0 5 20 70 25 di f u s o 100 0 0 0 00 45difuso* 90 10 0 0 10 10 difuso 015multifocal 100 0 0 0 00 100000 00
3
1534600 I 34 feminino P ILOCÍTICO 1 0 0 0 0 0 0 0 0 95500 55difuso 85 D 65 D* 02di f us o 15 difuso100000 00 10 0 0 0 0 00 95500 55di fus o 98 2 0 0 22 foca l 0 * 100000 00 35fo cal 10 multifocal 100 0 0 0 00 100000 00
4
2409902 I 6 ma sculino CEREBELO PILOCÍTICO 1 0 0 0 0 1 1 0 0 90 10 0 0 10 10 difuso 55 D 00 0 0 86680 22 1 4 focal 100 0 0 0 00 97300 33m ultifocal 100 0 0 0 00 0 100000 00 0 5focal5551525110 45 difuso 100 0 0 0 00
5
4077199 I 17 feminino VENTR ÍC ULO PIL OCÍT ICO 2 1 1 0 0 0 2 0 0 65 15 2 0 0 55 35 difuso 50 D 65 D* 25 multifocal 00100000 00 10 0 0 0 0 00 80 0 0 20 60 20 multif ocal 100 0 0 0 00 40difuso 85 15 0 0 15 15 difuso 15 difuso 5 focal100000 00 100000 00
6
1708702 I 4 feminino CEREBE LO PILOCÍTICO 2 0 1 1 1 3 6 0 0 CALCIFICAÇÃO 35 15 40 10 10 65 difuso 80 D 83 D 2 dif us o 0010000000 100 0 0 0 00 100000 00 100 0 0 0 00 25multifocal* 100 0 0 0 00 0 0 100000 00 100000 00
7
848903 I 16 mas culino CEREBELO PILOCÍTICO 1 1 1 1 0 2 5 0 0 95 D 60 D 00 4focal98110 32focal 100 0 0 0 00 100000 00 100 0 0 0 00 0 100000 00 0 0 4 0 10 30 20 130 60 difuso 100 0 0 0 00
8
942403 I 4 fe minino SU PRA-SE LAR PILOC ÍTICO 2 1 0 0 0 1 2 0 0 85 D 0003 0 30 30 10 12 0 7 0 di f u so 10 0 0 0 0 00 100000 00 10 0 0 0 0 00 0 100000 00 0 0 200602018 0 80 difuso 100 0 0 0 00
9
1301103 I 14 mas culino CEREBELO PILOCÍTICO 2 0 1 0 0 2 3 0 0 65 D 0050multifocal 100 0 0 0 00 100 0 0 0 00 100000 00 10 0 0 0 0 00 0 100000 00 30focal 0 100000 00 100000 00
10
2227603 I 3 ma sculino PILOCÍTICO 1 0 1 0 0 1 2 0 0 60 MF 15 D 0098200 22di fu so 10 0 0 0 0 00 100000 00 10 0 0 0 0 00 0 100000 00 20mult ifocal 0 100000 00 100000 00
11
2376603 I fe minino P IL OC ÍT IC O 2 0 0 0 0 0 0 0 1 O LI GODE ND RÓ CIT O 20 MF 40 D 0090 10 0 0 10 1 0 difuso 20 10 20 70 260 80 difuso100000 00 75 0 5 20 70 25 difuso 25 difuso100000 00 0 20di f u s o 5 5 10 15 20 100 45 difuso 100 0 0 0 00
12
34204 I 42 mascu lino CEREBELO P ILOCÍTICO 1 1 1 0 0 1 3 0 0 90 D 55 D* 8 di f us o 00100000 00 10 0 0 0 0 00 100000 00 10 0 0 0 0 00 45difuso100000 00 0 0 20 30 40 10 14 0 80 difuso 100 0 0 0 00
13
4908003 I 13 feminino CEREBE LO PILOCÍTICO 2 1 1 0 2 1 5 0 1 90 D 70 D 1 di f us o 00100000 00 100 0 0 0 00 100000 00 65 5 20 10 75 3 5 difuso 40 multifocal 100 0 0 0 00 35multifocal 0 55 5 5 35 120 45 difuso 100 0 0 0 00
14
1661602 II 56 mascu lino CEREBE LO F IBRI LAR 2 1 2 0 0 0 3 0 0 50 20 30 0 80 50 difuso 55 D 52 D 50 di f us o 2 mu ltifocal 5 multifocal 97 2 1 0 43di fu so 10 0 0 0 0 00 97300 33di f u s o 100 0 0 0 00 30difuso*100000 00 0 25multifocal 100 0 0 0 00 100000 00
15
2092802 II 34 fe minino GEMISTOCÍTICO 2 2 2 0 0 1 5 0 2 GEMISTOCÍTICO 85 D 086dif us o 040di f us o 7 0 0 5 25 85 30 di fus o 10 0 0 0 0 00 96040 84mu ltifocal 100 0 0 0 00 45difuso*100000 00 0 25difuso855100 25 15 difuso 100 0 0 0 00
16
3182500 II 23 mascu lino TEMPORAL FIBRILAR 1 2 3 1 0 1 7 0 0 70 D 55 D 74 dif us o 2 m ultifocal 15 difuso97300 33di fu so 9 2 4 2 2 14 8 mu ltifocal 98 0 0 2 62mu ltifocal 100 0 0 0 00 35difuso*100000 00 0 18difuso 100 0 0 0 00 100000 00
17
3072200 II 36 mascu lino PA RI ET AL FI B RI LAR 3 2 3 0 1 1 7 0 0 OLI GODE ND RÓ CIT O 65 5 20 10 75 35 difuso 55 D 60 D 8 di f us o 7 di f us o 0 100000 00 100 0 0 0 00 70 5 5 20 75 30 multif ocal 100 0 0 0 00 40difuso* 801010 0 30 20 difuso 035d i fu s o 8 0 10 10 0 30 20 mu ltifocal 100 0 0 0 00
18
2831200 II 47 mascu lino FRONTAL FI BRILAR 2 2 2 0 0 0 4 0 0 80 0 20 0
40 20
difuso
65
D
65
D*
00 0
92800
88
mu l t i f oc al 10 0 0 0 0
00
90028
28 10
di f u s o 9 2 8 0 0
88
difuso
35
difuso*100000
00 0 0
80 20 0 0
20 20
multifoc al 1 00 0 0 0
00
19
2678800 II 4 ma sculino CE REBE LO FI BRILAR 2 2 2 1 0 2 7 0 0 CALC IFICAÇÃO 10 0 0 0 0
00 75
D
65
MF*
11
multifocal
5
multifocal
0
100000
00
100 0 0 0
00
855100
25 15
multifoc al 100 0 0 0
00 45
difuso* 751010 5
45 25
difuso
00
100000
00
100000
00
20
2303500 II 2 ma sculino FI BRILAR 2 2 1 1 0 0 4 0 0 80 10 10 0
30 20
difuso
65
D
75
D
1
foca l
0
*
25
dif us o 90 10 0 0
10 10
di f u s o 100 0 0 0
00
92026
22 8
di f u s o 100 0 0 0
00 55
difuso*93700
77
difuso
00
100000
00
100000
00
21
2160800 II 37 fe minino FRONTAL FIBRILAR 2 1 1 2 0 0 4 0 0 OLIGODENDRÓCITO 95 5 0 0
55
difuso
65
D
50
MF*
03
multifocal
30
multifocal 70 30 0 0
30 30
di f u s o 100 0 0 0
00
805150
35 20
multifoc al 100 0 0 0
00 15
difuso*100000
00 15
difuso
0
100000
00
100000
00
22
4634201 II 33 mascu lino
VENTR ÍCULO FIBRILAR 3 2 3 0 1 2 8 0 0 OLIGODENDRÓCITO 90 MF 60 D 85 di f us o 0 * 2 difuso100000 00 10 0 0 0 0 00 100000 00 10 0 0 0 0 00 30difuso100000 00 0 0 100000 00 100000 00
23
2129502 II 67 mascu lino F IBRI LAR 2 2 2 0 0 0 4 0 1 60 D 45 MF* 01di f us o 8 4 14 2 0 18 1 6 di f u s o 90 3 2 5 22 1 0 focal100000 00 10 0 0 0 0 00 10multifocal* 100 0 0 0 00 0 5difuso 100 0 0 0 00 100000 00
24
392103 II 23 fe minino TÊMPORO-P ARIETAL FI BRILAR 2 2 3 0 0 1 6 0 0 80 D 60 D 00100000 00 95 5 0 0 55difuso100000 00 100 0 0 0 00 25difuso*100000 00 20multifocal 1 difuso 100 0 0 0 00 100000 00
25
1193403 II 48 mascu lino F IBRI LAR 2 2 3 0 0 1 6 0 0 85 D 72 D 1 mu ltifocal 025difuso100000 00 100 0 0 0 00 100000 00 10 0 0 0 0 00 28difuso*100000 00 80difuso 10 difuso 100 0 0 0 00 100000 00
26
855203 II 43 mascu lino F I BRI LA R 2 2 2 1 0 1 6 0 0 O LI GODE ND RÓ CIT O 90 D 65 D 00100000 00 95 2 1 2 10 5 focal100000 00 100 0 0 0 00 0 * 100000 00 55focal 0 100000 00 100000 00
27
2030402 II 28 fe minino FI BRI LAR 3 2 2 1 0 1 6 0 0 75 D 75 D 1 multifocal 3 di f us o 7 5 20 5 0 30 2 5 di f u s o 9 0 5 2 3 18 1 0 multifocal 100 0 0 0 00 10 0 0 0 0 00 30 * 100000 00 0 16difuso 100 0 0 0 00 100000 00
28
2246702 III 71 mas culino TEMPO RAL AN APLÁSIC O 3 2 2 2 1 2 9 1 0 65 10 15 10 70 35 difuso 32 D 35 D* 6 dif uso 3 foca l* 15 di f us o 90 10 0 0 10 10 di fu so 10 0 0 0 0 00 9253011 8 di f u s o 100 0 0 0 00 5difuso*100000 00 0 2difuso 100 0 0 0 00 100000 00
29
3821099 III 56 mas culino PARI ETAL ANAPLÁ SICO 2 2 3 0 1 1 7 0 1 90820 12 10 difuso 70 D 55 D* 3 di f us o 15 dif us o 0 100000 00 100 0 0 0 00 8555530 15 di f u s o 100 0 0 0 00 60difuso*95500 55difuso 060difuso 100 0 0 0 00 100000 00
30
3344400 III 40 mas culino FRONTAL ANAPLÁ SICO 3 2 3 1 1 1 8 0 1 65 5 2 0 10 75 35 difuso 40 D 50 D* 1 dif us o 5 mu ltifocal 0 9501414 5 m u l ti f oc al 10 0 0 0 0 00 96040 84di fus o 10 0 0 0 0 00 25difuso*9253011 8 difuso 015difuso 100 0 0 0 00 100000 00
31
0285601 III 62 feminino P ARI ETAL ANAPLÁ SICO 3 2 3 2 0 0 7 0 0 75 20 5 0 30 25 difuso 65 D 55 MF* 9 dif us o 3 multifocal 5 multifocal 95 5 0 0 55di f u s o 100 0 0 0 00 96040 84difuso 55 10 25 10 90 4 5 difuso 60 difuso 85 10 5 0 20 15 difuso 00100000 00 100000 00
32
0620201 III 28 feminino FRONTA L ANAPLÁSICO 2 1 3 2 0 0 6 0 0 100 0 0 0 00 70D 55 D 84 dif us o 3 dif us o* 10 difuso95500 55di f u s o 100 0 0 0 00 70 5 5 20 75 30 di fus o 10 0 0 0 0 00 40difuso*100000 00 0 10difuso 100 0 0 0 00 100000 00
33
4108599 III 22 mas culino ANAPLÁ SICO 3 2 3 2 1 0 8 1 0 95500 55difuso 85 D 60 D 8 di f us o 2 multifocal 40 focal98200 22di fu so 10 0 0 0 0 00 100000 00 10 0 0 0 0 00 25difuso100000 00 0 18difuso 100 0 0 0 00 100000 00
34
4014103 III 27 mas culino ANAPLÁ SICO 3 2 3 2 0 0 7 1 2 80 D 75 D 17 dif us o 6 multifocal 0 6 0 10 20 10 80 40 focal 100 0 0 0 00 100000 00 80 10 10 0 30 2 0 difuso 53 difuso*100000 00 40focal 2 difuso 100 0 0 0 00 100000 00
35
1983302 IV 5 fe minino GLIO BLASTO MA 3 3 3 1 1 1 9 2 2 20 40 2 0 0 87 60 mu l t i f oc al 20 20 40 2 0 16 0 80 difuso 60 D* 15 D 6 di f us o 9 di f us o 15 difuso100000 00 10 0 0 0 0 00 9073013 10 di fu so 10 0 0 0 0 00 45difuso 85 10 5 0 20 15 difuso 03multifocal 80 10 10 0 30 20 difuso 100 0 0 0 00
36
0900301 IV 57 ma sculino P ARI E TA L GL IO BL AS TO M A 3 3 3 3 2 1 12 1 1 OLI GODE ND RÓ CIT O 10 20 1 0 60 220 90 difuso 65 D 35 D 17 dif us o 0 4 0 20 40 0 10 0 6 0 m u l ti f oc al 10 0 0 0 0 00 2 0 40 10 30 15 0 80 focal 85 10 5 0 20 15 multifocal 0 100000 00 0 10fo cal 7 0 30 0 0 30 30 difuso 100 0 0 0 00
37
0448901 IV 43 femi nino TEMPO RA L G LIO BLASTO MA 3 3 3 3 3 2 1 4 1 2 HEMOSSI DERIN A 50 10 10 30 120 50 multif ocal 1 00 0 0 0 00 52MF 55 D 16 dif us o 10 dif us o 5 difuso95500 55di fu so 10 0 0 0 0 00 9253011 8 mu ltifocal 100 0 0 0 00 35multifocal* 80 15 5 0 25 20 multifocal 010difuso 100 0 0 0 00 100000 00
38
0407001 IV 62 ma sculino GLIO BLASTO MA 3 3 3 3 3 1 1 3 1 1 20 20 40 20
160 80
difuso
60
D
015
dif us o
0
100000
00
100 0 0 0
00
95500
55
di f u s o 100 0 0 0
00 0
* 100000
00 50
multifocal
7
difuso 100 0 0 0
00
100000
00
39
1733201 IV 32 ma sculino GLIOBLASTOMA 3 3 3 2 3 1 12 2 1 5 15 50 30
205 95
difuso 40 20 30 10
110 60
difuso
85
D
50
D*
10
dif us o
45
dif us o
25
multifocal 85 15 0 0
15 15
di f u s o 100 0 0 0
00
100000
00
80 10 10 0
30 20
multifocal
15
difuso*100000
00 0 55
di f u s o 6 0 30 10 0
50 40
difuso 100 0 0 0
00
40
4302401 IV 50 ma sculino GLIO BLASTO MA 3 3 3 3 1 2 1 2 2 0 REICI DIVA 20 20 30 30
170 80
di f u s o 90 10 0 0
10 10
difuso
80
D
55
D
50
dif us o
30
dif us o
15
difuso98020
42
mu l t i f oc al 10 0 0 0 0
00
92800
88
multifoc al 85 15 0 0
15 15
multifocal
10
difuso100000
00 0 70
difuso 100 0 0 0
00
100000
00
41
4427401 IV fe minino GLIO BLASTO MA 3 3 3 2 2 2 12 2 0 20 30 20 30
160 80
multifoc al
15
D
80
D*
1
dif us o
12
dif us o
30
difuso90820
12 10
di f u s o 100 0 0 0
00
40 25 20 15
110 60
di f u s o 100 0 0 0
00 25
difuso*93520
97
difuso
10
difuso
0
70 30 0 0
30 30
difuso 100 0 0 0
00
42
4470201 IV 34 ma sculino
FRONTA L GLIOBLASTOMA 3 3 3 2 1 2 11 2 2 10 20 10 6 0 220 90 difuso 100 0 0 0 00 90D* 10 MF* 17 multifocal 26 dif us o 45 dif us o 7 0 20 10 0 40 3 0 di f u s o 10 0 0 0 0 00 75 15 5 5 40 25 focal 100 0 0 0 00 10difuso*95500 55difuso 040focal10000000 100000 00
43
2129402 IV 54 ma sculino
GLIO BLASTO MA 3 3 3 3 3 2 14 1 1 40 5 5 50 165 60 mu l ti f oc al 60 5 1 0 2 5 10 0 40 difuso 85 D 65 D 14 dif us o 12 di f us o 25 multifocal 30 20 40 10 130 7 0 mul t i f oc al 10 0 0 0 0 00 100000 00 90 7 3 0 13 1 0 fo cal 10 multifocal* 100 0 0 0 00 0 5m ul t i f o c a l 5 5 10 15 20 10 0 45 difuso 100 0 0 0 00
44
540403 IV 81 feminino FRONTA L GLIOBLASTOMA 3 3 3 3 1 3 13 0 1 10 40 40 10 150 90 difuso 90 D 70 D 25 di f us o 24 dif us o 40 difuso100000 00 100 0 0 0 00 85 15 0 0 15 15 di f u s o 100 0 0 0 00 95difuso*92800 88difuso 50 difuso 30 difuso 75 20 5 0 30 25 d i fu so 70 15 1 0 5 50 30 multifoc al
45
578603 IV 72 feminino G LIOBL ASTOM A 3 3 3 3 1 3 1 3 1 1 30 30 20 20 130 70 difuso 70 D* 65 D 55 dif us o 17 multifocal 30 di f us o 8 0 5 5 10 45 20 di fu so 10 0 0 0 0 00 7 5 10 15 0 40 25 difuso 75 20 5 0 30 2 5 difuso 80 difuso* 90 10 0 0 10 10 difuso 30 multifocal 40 di f u s o 4 5 40 15 0 70 55 focal100000 00
46
664303 IV 44 mas culino FRONTAL GLIOBLASTOMA 3 3 3 3 3 3 15 1 1 20 30 30 20 150 80 difuso 50 D* 045mu ltifocal 45 dif us o 25 difuso95500 55di f u s o 10 0 0 0 0 00 7 0 20 10 0 40 30 di fuso 80 10 10 0 30 2 0 difuso 90 difuso*100000 00 10foca l 55 multifocal 85 15 0 0 15 15 difuso 100 0 0 0 00
47
1189603 IV 62 femi nino PARI ETAL GLIO BLASTO MA 3 3 3 3 3 3 1 5 1 1 20 30 40 10 140 80 difuso 90 D 66 D 040multifocal 85 5 10 0 25 1 5 di fus o 100 0 0 0 00 100000 00 85 15 0 0 15 1 5 multifocal 0 * 100000 00 10focal 3 multifocal 75 20 5 0 30 25 difuso 100 0 0 0 00
48
1190803 IV 43 ma sculino G LIO BLASTO MA 3 3 3 3 1 3 1 3 2 0 20 20 30 30 170 80 difuso 40 MF 50 F 27 multifocal 9 multifocal 5 multifocal 65 20 10 5 55 3 5 m u l ti f oc al 10 0 0 0 0 00 100000 00 98 2 0 0 22difuso 0 * 100000 00 40difuso 4 multifocal 60 30 10 0 50 40 difuso 100 0 0 0 00
49
2439303 IV 55 ma sculino FRONTAL GLIOBLASTOMA 3 2 3 1 3 3 12 1 1 20 10 30 40 190 80 difuso 65 D* 55 D 45 dif us o 11 dif uso 85 difuso100000 00 100 0 0 0 00 90 10 0 0 10 10 di f u s o 100 0 0 0 00 98difuso* 80 20 0 0 20 20 difuso 60 difuso 0 10000000 30 30 20 2 0 130 70 multifocal
50
3343503 IV 53 ma sculino P ARIETAL GL IOBLAST OMA 3 3 3 3 3 3 1 5 1 0 CALCIFIC AÇÃO 20 3 0 20 30 160 80 difuso 75 MF 70 D 20 mu ltifocal 13 dif us o 6 dif us o 8 5 10 5 0 20 1 5 di fus o 100 0 0 0 00 97300 33di fu so 10 0 0 0 0 00 15multifocal* 100 0 0 0 00 75difuso 3 focal 702010 0 40 30 difuso 100 0 0 0 00
51
4224203 IV 50 ma sculino TÊMPORO-PARIETAL GLIOBLASTOMA 3 3 3 3 2 3 14 2 2 10 40 20 30 170 90 difuso 85 D 55 D 60 dif us o 18 dif us o 40 dif us o 8 5 10 5 0 20 15 di fus o 10 0 0 0 0 00 7 0 15 10 5 50 30 di fuso 70 20 10 0 40 3 0 difuso 95 difuso* 80 20 0 0 20 20 difuso 025multifocal 100 0 0 0 00 100000 00
52
4307303 IV 51 femi nino GLIOBL ASTOM A 3 3 3 3 3 3 1 5 1 1 20 30 20 30 160 80 difuso 75 D 75 D 70 multifocal 28 di f us o 55 difuso93520 97di fu so 10 0 0 0 0 00 85 10 5 0 20 15 difuso 70 25 5 0 35 30 multifocal 90 difuso* 70 30 0 0 30 30 difuso 80 difuso 12 multifocal 85 15 0 0 15 15 d i f u s o 75 10 1 0 5 45 25 multifocal
53
4384403 IV 65 ma sculino FRONTAL GLIOBLASTOMA 3 3 3 3 3 3 15 1 1 30 40 20 10 110 70 difuso 85 D 25 D 5 multifocal 5 di f us o 0 100000 00 100 0 0 0 00 100000 00 85 15 0 0 15 1 5 multifocal 2 difuso*100000 00 60multifocal 0 6 5 20 15 0 50 35 difuso 100 0 0 0 00
54
4760003 IV 55 ma sculino O CCIP ITAL GL IOBLAST OMA 3 3 3 2 3 2 1 3 1 1 REICIDIVA 30 4 5 20 5 100 70 difuso 70 D 25 D* 30 dif us o 40 dif us o 75 difuso92800 88di fu so 10 0 0 0 0 00 7501015 65 25 di fu so 10 0 0 0 0 00 95difuso*100000 00 0 55difuso 100 0 0 0 00 100000 00
55
201104 IV 55 mas culino OC CIP ITAL G LIO BLASTO MA 2 3 3 2 2 2 1 2 1 0 REICI DIVA 40 20 10 30 130 60 difuso 90 D 60 D 30 fo ca l 30 fo ca l* 70 dif us o 8 5 10 5 0 20 15 di fus o 100 0 0 0 00 95500 55di fu so 10 0 0 0 0 00 80difuso*100000 00 45difuso 55 focal10000000 100000 00
p21 p53 E GFR c-erb-B2bcl-2 bax p27 nuclear p27 citoplasmático
HISTOPATOLOGIA
IMU NO - HIS T OQ U ÍM I CA
GFAP TdS MGMT GSTpi TOPO K i-67 c-myc citopl asmáti co ras
N
Ú
MER
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