ads:
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
ESTUDO FARMACOLÓGICO DA FRAÇÃO HEXÂNICA DE
Lonchocarpus sericeus (Poir.) Kunth E SEUS CONSTITUINTES
QUÍMICOS, LONCHOCARPINA E DERRICINA
JUVENIA BEZERRA FONTENELE
Tese submetida à Coordenação do
curso de Pós-Graduação em
Farmacologia, do Departamento de
Fisiologia e Farmacologia da
Faculdade de Medicina da
Universidade Federal do Ceará, como
requisito parcial para a obtenção do
grau de Doutor em Farmacologia
Orientadora: Profa. Dra. Glauce
Socorro de Barros Viana
Fortaleza-CE
2004
ads:
F 763 e Fontenele, Juvenia Bezerra
Estudo farmacológico da fração hexânica de Lonchocarpus
sericeus (Poir.) Kunth e seus constituintes químicos,
lonchocarpina e derricina / Juvenia Bezerra Fontenele.
–
Fortaleza, 2004.
262f.: il.
Orientador: Profa. Dra. Glauce Socorro de Barros Viana
Tese (Doutorado). Universidade Federal do Ceará.
Faculdade de Medicina.
1. Plantas medicinais – efeito de drogas. 2. Medição d
a
dor. 3. Analgesia. 4. Inflamação. 5. Antiinflamatórios. 6.
Inibidores da agregação de plaquetas. I. Viana, Glauce
Socorro de Barros (orient.). II. Título.
CDD 615.783
ii
Esta tese encontra-se a disposição dos interessados na Biblioteca da
Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará.
A citação de qualquer trecho desta tese é permitida desde que cumpra as
normas da ética científica.
_____________________________________________
Juvenia Bezerra Fontenele
Tese aprovada, com louvor, em 01 de outubro de 2004
_____________________________________________
Profa. Dra. Glauce Socorro Barros Viana (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará
_____________________________________________
Profa. Dra. Ana Maria Sampaio Assreuy
Universidade Estadual do Ceará
_____________________________________________
Prof. Dr. Antônio José Lapa
Universidade Federal de São Paulo
_____________________________________________
Prof. Dr. Vietla Satyanarayna Rao
Universidade Federal do Ceará
_____________________________________________
Prof. Dr. Pedro Jorge Caldas Magalhães
Universidade Federal do Ceará
ads:
iii
“Mas há um pássaro que vence um avião
por quem Picasso explodiu seu coração
pra que o céu ficasse azul
pra que o planeta fosse um
e a Humanidade encontrasse a mãe”
Lisieux Costa e Fausto Nilo
(“Lua do Leblon”)
iv
À minha mãe
Maria Bezerra,
Exemplo de amor, bondade e retidão
Ao Hélder,
“Minha alma de sonhar-te anda perdida,
meus olhos andam cegos de te ver,
não és sequer a razão do meu viver,
porque tu és já toda minha vida...”
Aos amados
Lucas, Beatriz e Sofia,
Simplesmente por existirem
v
AGRADECIMENTOS
À Professora Doutora Glauce Socorro de Barros Viana, uma apaixonada pela
experimentação que, à sua maneira, tem conduzido com sabedoria e paciência
minha íngreme caminhada pela ciência;
Ao Professor Doutor Edilberto Rocha Silveira pela imprescindível e inestimável
colaboração;
Ao Professor Doutor Vietla Satyanarayna Rao pela cessão dos aparelhos de seu
laboratório, pela amizade e apoio no decorrer do curso de Pós-graduação, além de
ter aceitado compor a banca examinadora deste trabalho;
Aos Professores Doutores Antônio José Lapa, Pedro Jorge Caldas Magalhães e
Ana Maria Sampaio Assreuy por aceitarem fazer parte da banca examinadora
desta tese de doutorado;
Ao Professor Doutor Manoel Odorico de Moraes pela cessão do seu laboratório
para realização dos experimentos de citotoxicidade;
À Luzia Kalyne Almeida Moreira Leal, Maria Vilani Rodrigues Bastos e Flávia
Almeida Santos, amigas incondicionais, sempre presentes, por tudo;
À Jacqueline Viana pela dedicação e imprescindível auxílio técnico, além da
amizade;
Carinhosamente à amiga Lusivânia Carlos Moura pela inestimável contribuição
nos experimentos de migração de neutrófilos;
À Professora Doutora Letícia Veras Costa Lotufo pela indispensável contribuição
nos experimentos de citotoxicidade, além da amizade;
À Joana Barbosa Carvalho por sua disponibilidade e amizade verdadeira;
A todos os que fazem o Laboratório de Produtos Naturais pelo convívio amigável e
colaboração, em especial a Regilane Matos e Laura Paiva por sacrificarem seu
tempo tão curto para me ajudarem em alguns experimentos, o meu muitíssimo
obrigada;
vi
Aos alunos do Departamento de Química Orgânica e Inorgânica da UFC: Richeyla
Kelly Cardoso de Assis e Francisco das Chagas Martins de Sousa pela obtenção
da fração e isolamento das chalconas a partir da Lonchocarpus sericeus;
Aos diletos amigos do curso de Pós-graduação e do Laboratório de
Neurofarmacologia em especial à Augusta Drago, Geanne Matos, Osmar Del Rio,
Antônio Nava, Bruno A. Pereira e Kamyla S. Fonseca;
Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia Marta Célia de
Freitas, Rejane Teixeira, Sílvia Maria de Lima e Aura Rhanes Yida pela
eficiência em desempenharem funções, que embora indiretas, foram essenciais para
a conclusão deste trabalho;
Aos funcionários do biotério e àqueles que prestam serviço neste departamento em
particular a Rosilene Ferreira (Rose), Fernando R. Teixeira, Íris Ferreira e
Francisco Nunes o meu cordial agradecimento;
A Jânia Teixeira pela atenção e doação desinteressada de seus conhecimentos;
A todos os que compõem o Laboratório Central do Hospital Universitário Walter
Cantídio pela colaboração nos experimentos os quais se utilizou sangue humano;
À Fundação Cearense de Amparo à Pesquisa (FUNCAP), pelo apoio financeiro;
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.
vii
ÍNDICE
Lista de abreviaturas
................................................................................... xvi
Lista de figuras
................................................................................... xx
Lista de tabelas
................................................................................... xxiv
Resumo
................................................................................... xxvii
Abstract
................................................................................... xxviii
1 INTRODUÇÃO 2
1.1 Plantas Medicinais 2
1.1.1 Histórico e Generalidades 2
1.1.2 Biodiversidade da flora brasileira 8
1.1.3 Incentivos governamentais e institucionais 9
1.1.4 Mercado e consumo de medicamentos 10
1.1.5 Instituições brasileiras e a pesquisa de plantas no Brasil 12
1.2 Lonchocarpus sericeus (Poir.) Kunth 13
1.2.1 Sinonímia 19
1.2.2 Nomes populares 20
1.2.3 Distribuição geográfica 20
1.2.4 Habitat 23
1.2.5 Usos 24
1.2.6 Química e Farmacologia de Lonchocarpus spp. 24
1.3 Flavonóides 26
1.3.1 Farmacologia dos flavonóides 29
viii
1.3.2 Chalconas 40
1.3.2.1 Farmacologia das chalconas 42
2 OBJETIVOS 48
2.1 Geral 48
2.1 Específicos 48
3 MATERIAL 51
3.1 Material botânico 51
3.2 Fração hexânica de Lonchocarpus sericeus (Poir.) Kunth e seus
constituintes 51
3.3 Animais 51
3.4 Sangue humano 52
3.5 Reagentes e Drogas 52
3.6 Composição de soluções, corantes e tampões 54
3.7 Material permanente e equipamentos utilizados 55
4 MÉTODOS 58
4.1 QUÍMICOS 58
4.1.1 Obtenção da fração hexânica das cascas das raízes de
Lonchocarpus sericeus (Poir.) Kunth 58
4.1.1.1 Tratamento cromatográfico do extrato hexânico das
cascas das raízes de Lonchocarpus sericeus (LSCR-H) 58
ix
4.1.2 Obtenção das chalconas lonchocarpina e derricina a partir da
Fração hexânica de Lonchocarpus sericeus 59
4.2 TOXICOLÓGICOS 65
4.2.1 Avaliação da toxicidade aguda e efeitos comportamentais da
fração hexânica de Lonchocarpus sericeus em camundongos 65
4.2.2 Avaliação da citotoxicidade da fração hexânica de
Lonchocarpus sericeus, lonchocarpina e derricina 65
4.2.2.1 Determinação do potencial antimitótico da fração
hexânica de Lonchocarpus sericeus, lonchocarpina e
derricina em ovos do ouriço-do-mar Lytechinus variegatus 65
4.2.2.2 Inibição da proliferação de células tumorais in vitro
pela fração hexânica de Lonchocarpus sericeus,
lonchocarpina e derricina 66
4.2.2.3 Avaliação do potencial hemolítico da fração hexânica
de Lonchocarpus sericeus, lonchocarpina e derricina em
eritrócitos de camundongos 68
4.2.2.4 Determinação da atividade antimicrobiana da fração
hexânica de Lonchocarpus sericeus, lonchocarpina e
derricina 69
4.3 FARMACOLÓGICOS 70
4.3.2 Atividade antiinflamatória 70
4.3.2.1 Edema de pata induzido por dextrano em ratos 70
4.3.2.2 Edema de pata induzido por bradicinina em ratos 71
4.3.2.3 Edema de pata induzido por levedura de cerveja em
ratos 71
x
4.3.2.4 Edema de pata induzido por carragenina em ratos 71
4.3.2.5 Edema de pata induzido por formalina em
camundongos 72
4.3.2.6 Migração de neutrófilos induzida por carragenina ou
N-Formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP) na cavidade
peritoneal de ratos 73
4.3.2.7 Granuloma induzido por pellet de algodão em ratos 73
4.3.2.8 Colite induzida por ácido acético em ratos 74
4.3.3 Atividade analgésica 75
4.3.3.1 Teste das contorções abdominais induzidas pelo
ácido acético em camundongos 75
4.3.3.2 Teste das contorções abdominais induzidas pela
acetilcolina em camundongos 76
4.3.3.3 Teste da formalina em camundongos 76
4.3.3.4 Teste da placa quente em camundongos 77
4.3.4 Atividade sobre o Sistema Nervoso Central 78
4.3.4.1 Teste do campo aberto em camundongos 78
4.3.4.2 Teste do rota-rod em camundongos 78
4.3.4.3 Tempo de sono induzido por barbitúrico em
camundongos
79
4.3.5 Atividade antiagregante plaquetária 80
4.3.5.1 Colheita do sangue 80
4.3.5.2 Obtenção do plasma humano rico em plaquetas 80
4.3.5.3 Estudo da agregação plaquetária in vitro em plasma
humano rico em plaquetas 80
xi
4.3.5.4 Inibição da agregação plaquetária induzida in vitro
p
or diferentes agonistas em plasma humano rico em
plaquetas 81
4.3.6 Determinação do número de plaquetas em sangue total de
camundongos, após a administração oral ou intraperitoneal da
fração hexânica de Lonchocarpus sericeus 82
4.3.7 Determinação do efeito da fração hexânica de Lonchocarpus
sericeus sobre o tempo de protrombina em plasma humano 82
4.4 ESTATÍTICOS 83
5 RESULTADOS 85
5.1 Obtenção da fração hexânica das cascas das raízes de Lonchocarpus
sericeus (Poir.) Kunth e suas chalconas lonchocarpina e derricina 85
5.2 Efeitos comportamentais e toxicidade aguda da fração hexânica de
Lonchocarpus sericeus em camundongos 86
5.3 Atividade citotóxica in vitro da fração hexânica de Lonchocarpus
sericeus, lonchocarpina e derricina 87
5.3.1 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus,
lonchocarpina e derricina sobre o desenvolvimento embrionário de
ovos de ouriço-do-mar Lytechinus variegatus 87
5.3.2 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus,
lonchocarpina e derricina sobre a proliferação de células tumorais in
vitro
87
5.3.3 Efeito hemolítico da fração hexânica de Lonchocarpus
sericeus, lonchocarpina e derricina em eritrócitos de camundongos 92
5.3.4 Efeito antimicrobiano da fração hexânica de Lonchocarpus
sericeus, lonchocarpina e derricina 92
xii
5.4 Atividade antiinflamatória 92
5.4.1 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus sobre o
edema de pata induzido por dextrano em ratos 92
5.4.2 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus sobre o
edema de pata induzido por bradicinina em ratos 93
5.4.3 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus sobre o
edema de pata induzido por levedura de cerveja em ratos 93
5.4.4 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus so
b
re o
edema de pata induzido por carragenina em ratos
a) Avaliação do envolvimento da inibição da ciclooxigenase no
efeito antiedematogênico da fração hexânica de Lonchocarpus
sericeus no modelo de edema de pata induzido pela carragenina
b) Avaliação do papel do sistema óxido nítrico no efeito
antiedematogênico da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus
no modelo de edema de pata induzido pela carragenina
c) Avaliação do envolvimento da inibição da fosfodiesterase no
efeito antiedematogênico da fração hexânica de Lonchocarpus
sericeus no modelo de edema de pata induzido pela carragenina
96
99
102
102
5.4.5 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus sobre o
edema de pata induzido por formalina em camundongos 102
5.4.6 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus sobre a
migração de neutrófilos induzida por carragenina na cavidade
peritoneal de ratos 105
5.4.7 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus sobre a
migração de neutrófilos induzida por N-Formil-metionil-leucil-
fenilalanina na cavidade peritoneal de ratos 108
5.4.8 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus sobre o
xiii
granuloma induzido por pellet de algodão em ratos 108
5.4.9 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus sobre a
colite induzida por ácido acético em ratos 110
5.5 Atividade analgésica 112
5.5.1 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus nas
contorções abdominais induzidas pelo ácido acético em
camundongos
a) Estudo sobre o envolvimento do TNF- na antinocicepção da
fração hexânica de Lonchocarpus sericeus
b) Avaliação do papel da fosfodiesterase na antinocicepção da
fração hexânica de Lonchocarpus sericeus
112
112
117
5.5.2 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus nas
contorções abdominais induzidas pela acetilcolina em camundongos 117
5.5.3 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus no teste
da formalina em camundongos
a) Estudo do papel do sistema opióide na antinocicepção da fração
hexânica de Lonchocarpus sericeus
b) Estudo sobre o envolvimento do óxido nítrico na antinocicepção
da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus
c) Avaliação do papel dos receptores
1
e
2
adrenérgicos na
antinocicepção da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus
117
122
126
126
5.5.4 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus no teste
da placa quente em camundongos 129
5.6 Atividade sobre o Sistema Nervoso Central 132
xiv
5.6.1 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus no teste
do campo aberto em camundongos 132
5.6.2 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus no teste
do rota-rod em camundongos 132
5.6.3 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus no tempo
de sono induzido por barbitúrico em camundongos 132
5.7 Atividade antiagregante plaquetária 135
5.7.1 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus,
lonchocarpina e derricina na agregação plaquetária induzida in vitro
por vários agonistas em PRP humano
135
COLÁGENO 135
TROMBINA 135
DIFOSFATO DE ADENOSINA
a) Avaliação do papel do sistema óxido nítrico no efeito
inibitório da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus,
lonchocarpina e derricina sobre a agregação plaquetária
induzida in vitro pelo difosfato de adenosina em plasma
humano rico em plaquetas
b) Estudo do papel da fosfodiesterase no efeito inibitório da
fração hexânica de Lonchocarpus sericeus, lonchocarpina e
derricina sobre a agregação plaquetária induzida in vitro
pelo difosfato de adenosina em PRP humano
138
138
142
ÁCIDO ARAQUIDÔNICO
a) Estudo sobre o envolvimento da inibição da
142
xv
ciclooxigenase no efeito antiagregante plaquetário da
fração hexânica de Lonchocarpus sericeus, lonchocarpina
e derricina sobre a agregação induzida in vitro pelo ácido
araquidônico em plasma humano rico em plaquetas
142
ADRENALINA 145
5.7.2 Efeito da administração sistêmica da fração hexânica de
Lonchocarpus sericeus sobre o número de plaquetas em sangue
total de camundongos 145
5.7.3 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus,
lonchocarpina e derricina sobre o tempo de protrombina em plasma
humano 149
6 DISCUSSÃO 152
7 CONCLUSÕES 196
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 201
xvi
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS UTILIZADAS NESTE TRABALHO
AAS Ácido acetilsalicílico
AA Ácido araquidônico
ACh Acetilcolina
ADP Difosfato de adenosina
ADR Adrenalina
AIDS Síndrome da imunodeficiência adquirida
AMPc Monofosfato de adenosina cíclico
ANOVA Análise de variância
AOM Azoximetano
BHE Barreira hemato-encefálica
BM Banho-maria
BK Bradicinina
C
Grau centígrado
CAM Moléculas de adesão celular
CB citocalasina B
CCD Cromatografia em camada delgada
CEM Células de leucemia linfocítica de origem humana
CIPRO Ciproeptadina
Cg Carragenina
CLONI Clonidina
cm Centímetro
cols. Colaboradores
COL Colágeno
CONT Controle
COX Ciclooxigenase
C5a Quinto componente do sistema complemento
DL
50
Dose letal 50%
DMSO Dimetil sulfóxido
DRC Derricina
xvii
DX Dextrano
EDTA Ácido etileno-diamino-tretracético
EGCG Epigalocatequina-3-galato
E.P.M. Erro padrão da média
ERO Espécies reativas de oxigênio
FDA Food and Drug Administration
FDE Fosfodiesterase
FENIL Fenilefrina
FL Fosfolipase
FLS Fração hexânica das cascas da raiz de Lonchocarpus sericeus
fMLP Formil-metil-leucil-fenilalanina
g Grama
GM-CSF Fator estimulador de colônia de granulócito e macrófago
GMPc Mofosfato de guanosina cíclico
GRO Oncogene relacionado ao crescimento
h Hora
HDL Lipoproteínas de alta densidade
HIV Vírus da imunodeficiência humana
HPLC Cromatografia líquida de alta performance
HTAB Brometo de hexadeciltrimetilamônio
H
2
O
2
Peróxido de hidrogênio
ICAM Molécula de adesão intercelular
IFN Interferon
IL Interleucina
INDO Indometacina
IOIM Ioimbina
i.p. Intraperitoneal
i.r. Intra-retal
KB Células tumorais epidermóides humanas
Kg Kilograma
LC Levedura de cerveja
xviii
LCC Lonchocarpina
LDL Lipoproteínas de baixa densidade
L-NAME N
G
-nitro-L-arginina-metil-éster
L-NMMA N
G
-monometil-L-arginina
LOX Lipoxigenase
LPS Lipopolissacarídeo
LSCR-H
Extrato hexânico das cascas das raízes de Lonchocarpus
sericeus
LT Leucotrieno
MDA Malonildialdeído
MDR Multirresistência a drogas
min Minuto
MIP Proteína inflamatória derivada de macrófago
mL Mililitro
MNCF Fator quimiotático para neutrófilos derivado de macrófagos
MORF Morfina
MPO Mieloperoxidase
MTT Brometo de 3-(4’,5’-dimetiltiazol-2’-il)-2,5-difeniltetrazólio
NADP Nicotinamida adenina dinucleotídio fosfato
NAL Naloxona
NF-kB fator nuclear kappa B
nm Nanômetro
n
o
Número
OMS Organização Mundial de Saúde
NO Óxido nítrico
NOSc Óxido nítrico sintase constitutiva
NOSi Óxido nítrico sintase induzível
NOSn Óxido nítrico sintase neuronal
PAF Fator de ativação plaquetária
PECAM Molécula de adesão célula endotelial-plaqueta
PG(s) Prostaglandina(s)
xix
PMN Polimorfonucleares
PRAZ Prazosin
PRP Plasma humano rico em plaquetas
PPP Plasma pobre em plaquetas
PTX Pentoxifilina
RMN Ressonância magnética nuclear
rpm Rotações por minuto
s.c. Subcutânea
SDF Fator derivado de células estromais
seg Segundo
SNC Sistema nervoso central
TALI Talidomida
TF Fator tissular
TGF Fator de crescimento tumoral
TNBS Ácido trinitrobenzenosulfônico
TNF-
Fator de necrose tumoral alfa
TP Tempo de protrombina
TPA Acetato de tetradecanoilforbol
TRB Trombina
TX Tromboxano
UFC Universidade Federal do Ceará
VCAM Molécula de adesão vascular
v.o. Via oral
vWF Fator de von Willebrand
g
Micrograma
l
Microlitro
% Percentagem
5-HT Serotonina
xx
LISTA DE FIGURAS
FIGURAS
PÁGINA
Figura 1A – Foto de um espécimen de Lonchocarpus sericeus (a).
Destaque para frutos (b) e inflorescências (c) 17
Figura 1B – Lonchocarpus sericeus: a) ramo com inflorescência,
b) flor, c) cálice, d) estandarte, e) asas, f) quilha, g)
androceu, h) gineceu 18
Figura 2 – Núcleo fundamental dos flavonóides 27
Figura 3 – Núcleo fundamental das chalconas 41
Figura 4 – Representação esquemática da obtenção das
chalconas lonchocarpina (LCC) e derricina (DRC) a
partir da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus
(FLS) 60
Figura 5 – Estrutura Química da Lonchocarpina (a) e Derricina
(b) 62
Figura 6 – Fases da embriogênese de ovos de ouriço-do-mar
Lythechinus variegatus
67
Figura 7 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus
(símbolos fechados) e derricina (símbolos abertos) na
clivagem de ovos de ouriço-do-mar Lytechinus
variegatus
88
Figura 8 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus
(), derricina () e lonchocarpina () sobre o
crescimento de células de leucemia linfocítica de
origem humana (CEM) 90
Figura 9 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus
sobre o edema de pata induzido por levedura de
cerveja (LC) em ratos
97
xxi
Figura 10 – Efeito da administração oral da fração hexânica de
Lonchocarpus sericeus no edema de pata induzido
por carragenina (Cg) em ratos 98
Figura 11 – Efeito da administração intraperitoneal da fração
hexânica de Lonchocarpus sericeus no edema de pata
induzido por carragenina (Cg) em ratos 100
Figura 12 – Avaliação do papel da fosfodiesterase no efeito
antiedematogênico da fração hexânica de
Lonchocarpus sericeus sobre o edema de pata
induzido por carragenina (Cg) em ratos 104
Figura 13 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus
na migração de leucócitos induzida por carragenina
em ratos 107
Figura 14 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus
na migração de leucócitos induzida por N-Formil-
metionil-leucil-fenilalanina (fMLP) em ratos 109
Figura 15 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus
sobre a atividade da mieloperoxidase na colite
induzida pelo ácido acético em ratos 114
Figura 16 – Efeito da administração oral da fração hexânica de
Lonchocarpus sericeus na resposta nociceptiva
induzida por ácido acético em camundongos 115
Figura 17 – Efeito da administração subcutânea da fração
hexânica de Lonchocarpus sericeus na resposta
nociceptiva induzida por ácido acético em
camundongos 116
Figura 18 – Efeito da talidomida na antinocicepção da fração
hexânica de Lonchocarpus sericeus no teste das
contorções abdominais induzidas pelo ácido acético
em camundongos
119
xxii
Figura 19 – Efeito da pentoxifilina na antinocicepção da fração
hexânica de Lonchocarpus sericeus no teste das
contorções abdominais induzidas pelo ácido acético
em camundongos 120
Figura 20 – Efeito da administração oral da fração hexânica de
Lonchocarpus sericeus na nocicepção induzida pela
formalina em camundongos 123
Figura 21 – Efeito da administração intraperitoneal da fração
hexânica de Lonchocarpus sericeus na nocicepção
induzida pela formalina em camundongos 124
Figura 22 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus,
lonchocarpina e derricina na agregação plaquetária
induzida in vitro pelo colágeno em plasma humano
rico em plaquetas (PRP) 137
Figura 23 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus,
lonchocarpina e derricina na agregação plaquetária
induzida in vitro pela trombina em plasma humano
rico em plaquetas 139
Figura 24 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus,
lonchocarpina e derricina na agregação plaquetária
induzida in vitro pelo difosfato de adenosina (ADP)
em plasma humano rico em plaquetas 140
Figura 25 – Avaliação do papel da fosfodiesterase no efeito
inibitório da fração hexânica de Lonchocarpus
sericeus, lonchocarpina e derricina na agregação
plaquetária induzida in vitro pelo ADP em plasma
humano rico em plaquetas 143
Figura 26 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus,
lonchocarpina e derricina na agregação plaquetária
induzida in vitro pelo ácido araquidônico em plasma
humano rico em plaquetas 144
xxiii
Figura 27 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus,
lonchocarpina e derricina na agregação plaquetária
induzida in vitro pela adrenalina em plasma humano
rico em plaquetas 147
xxiv
LISTA DE TABELAS
TABELAS
PÁGINA
Tabela 1 – Classes de flavonóides e algumas características
conhecidas 28
Tabela 2 – Tratamento cromatográfico do extrato hexânico
obtido das cascas das raízes de Lonchocarpus
sericeus
59
Tabela 3 – Correlação Heteronuclear
1
H-
13
C (HMQC e HMBC)
da Lonchocarpina 63
Tabela 4 – Correlação Heteronuclear
1
H-
13
C (HMQC e HMBC)
da Derricina 64
Tabela 5 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus,
lonchocarpina e derricina sobre o desenvolvimento
embrionário de ovos de ouriço-do-mar Lytechinus
variegatus
89
Tabela 6 – Efeito inibitório da fração hexânica de Lonchocarpus
sericeus, lonchocarpina e derricina sobre o
crescimento de células de leucemia linfocítica de
origem humana (CEM) 91
Tabela 7 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus
sobre o edema de pata induzido por dextrano em
ratos 94
Tabela 8 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus
sobre o edema de pata induzido por bradicinina em
ratos 95
Tabela 9 – Avaliação do papel da ciclooxigenase no efeito
antiedematogênico da fração hexânica de
Lonchocarpus sericeus sobre o edema de pata
induzido por carragenina em ratos 101
xxv
Tabela 10 – Avaliação do papel do sistema óxido nítrico no efeito
antiedematogênico da fração hexânica de
Lonchocarpus sericeus sobre o edema de pata
induzido por carragenina em ratos 103
Tabela 11 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus
sobre o edema de pata induzido por formalina em
camundongos 106
Tabela 12 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus
sobre o granuloma induzido por pellet de algodão em
ratos 111
Tabela 13 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus
sobre a colite induzida por ácido acético em ratos 113
Tabela 14 – Efeito da co-administração da talidomida e da fração
hexânica de Lonchocarpus sericeus nas contorções
abdominais induzidas pelo ácido acético em
camundongos 118
Tabela 15 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus
nas contorções abdominais induzidas pela
acetilcolina em camundongos 121
Tabela 16 – Avaliação da participação do sistema opióide no
efeito antinociceptivo da fração hexânica de
Lonchocarpus sericeus na nocicepção induzida pela
formalina em camundongos 125
Tabela 17 – Avaliação do papel do óxido nítrico no efeito
antinociceptivo da fração hexânica de Lonchocarpus
sericeus na nocicepção induzida pela formalina em
camundongos 127
Tabela 18 –
Avaliação do papel dos receptores
1
adrenérgicos
no efeito antinociceptivo da fração hexânica de
Lonchocarpus sericeus na nocicepção induzida pela
xxvi
formalina em camundongos
128
Tabela 19 –
Avaliação do papel dos receptores
2
adrenérgicos
no efeito antinociceptivo da fração hexânica de
Lonchocarpus sericeus na nocicepção induzida pela
formalina em camundongos
130
Tabela 20 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus
no teste da placa quente em camundongos 131
Tabela 21 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus
no teste do campo aberto em camundongos
133
Tabela 22 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus
no teste do rota-rod em camundongos 134
Tabela 23 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus
sobre o tempo de sono induzido por barbitúrico em
camundongos 136
Tabela 24 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus,
lonchocarpina e derricina sobre a inibição produzida
pela L-Arginina na agregação plaquetária induzida in
vitro
p
elo difosfato de adenosina em plasma humano
rico em plaquetas 141
Tabela 25 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus,
lonchocarpina e derricina sobre a inibição produzida
p
elo ácido acetilsalicílico (AAS) na agregação
plaquetária induzida in vitro pelo ácido araquidônico
em plasma humano rico em plaquetas 146
Tabela 26 – Efeito da administração sistêmica da fração hexânica
de Lonchocarpus sericeus sobre o n
o
de plaquetas em
sangue total de camundongos 148
Tabela 27 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus,
lonchocarpina e derricina sobre o tempo de
protrombina in vitro em plasma humano 150
xxvii
RESUMO
O gênero Lonchocarpus é bastante conhecido e amplamente estudado, porém não
há registros na literatura científica dos usos farmacológicos da espécie
Lonchocarpus sericeus (Poir.) Kunth, (Leguminosae Papilionaceae). Estudos
químicos demonstraram que a fração hexânica das cascas das raízes de L. sericeus
(FLS) é rica nas chalconas: lonchocarpina (LCC) e derricina (DRC). O objetivo
deste trabalho foi investigar os efeitos tóxicos e as ações farmacológicas da FLS e
de sua chalconas LCC e DRC. A DL
50
para FLS em camundongos foi de 781,5
mg/kg por v.o. e 446,2 mg/kg, por via i.p. A FLS e a DRC mostraram efeito
inibitório concentração-dependente sobre o desenvolvimento embrionário de ovos
de ouriço-do-mar Lytechinus variegatus. A FLS, LCC e DRC apresentaram ainda
atividade citotóxica sobre células de leucemia linfocítica de origem humana. A FLS,
administrada por via sistêmica, apresentou atividade antiedematogênica nos
modelos de edema de pata induzidos por carragenina (Cg) e levedura de cerveja,
mas não sobre aqueles induzidos por dextrano ou bradicinina. O efeito da FLS no
edema por Cg não foi modificado pela associação com a indometacina ou L-
NAME, mostrando que a mesma parece não interferir com a via da COX ou do
sistema NO. Entretanto, este efeito da FLS foi potencializado pela pentoxifilina
(PTX) evidenciando uma possível inibição da FDE e/ou da síntese de citocinas
inflamatórias como o TNF-. Apesar de ter inibido significativamente a migração
de neutrófilos na cavidade peritoneal de ratos induzida por Cg, a FLS apresentou
um efeito inibitório bem maior sobre àquela induzida por fMLP, demonstrando que
a mesma além de bloquear a síntese e/ou liberação de mediadores inflamatórios
como PGs, LTs e citocinas, pode também bloquear uma das etapas da migração ou
ainda, inibir alguma das molécula de adesão envolvidas neste processo. A FLS
também reduziu o dano tissular induzido por ácido acético em ratos, evidenciado
através de seu efeito inibitório sobre a atividade da MPO. Entretanto, a mesma não
foi capaz de suprimir a formação do tecido de granulação, induzida por pellet de
algodão, onde as PGs desempenham um papel essencial. A atividade antinociceptiva
da FLS também foi observada em modelos experimentais de dor como teste das
contorções abdominais induzidas pelo ácido acético e teste da formalina, em
camundongos. Todavia, a FLS não modificou a resposta nociceptiva ao estímulo
térmico no teste da placa quente. Este efeito antinociceptivo da FLS independe do
sistema opióide e da via do NO, e também não envolve a participação do
componente adrénergico, porém além de outros mecanismos, a inibição da FDE
e/ou da síntese de citocinas como TNF- parecem exercer um papel importante na
antinocicepção da FLS. A atividade antiagregante plaquetára da FLS, LCC e DRC
também foi estudada e os resultados demonstraram que as mesmas possuem efeito
inibitório da agregação in vitro em plasma humano rico em plaquetas, frente aos
agonistas ADP, colágeno, trombina, ácido araquidônico e adrenalina. O efeito
antiagregante plaquetário da FLS, LCC e DRC foi potencializado pela PTX, um
inibidor da fosfodiesterase de AMPc, mas não pela L-arginina ou pelo ácido
acetilsalicílico. Desta forma, a FLS possui atividade citotóxica, antiinflamatória,
analgésica e antiagregante plaquetária. Estes efeitos parecem ser mediados pelas
chalconas LCC e DRC, presentes na FLS.
xxviii
ABSTRACT
The Lonchocarpus genus is well known and much studied though there is no record
on scientific publications about the pharmacological properties of the species
Lonchocarpus sericeus (Poir.) Kunth, (Leguminosae Papilionaceae). Chemical
research determined that the hexanic fraction from root bark of L. sericeus (FLS) is
rich in two chalcones: lonchocarpin (LCC) and dericin (DRC). This work’s purpose
was to investigate the toxical effects and the pharmacological actions of FLS and its
chalcones LCC e DRC. The LD
50
of FLS in mice was 781,5 mg/kg, p.o. and 446,2
mg/kg, i.p. FLS and DRC showed concentration-dependent inhibition on the
development of the sea urchin Lytechinus variegatus eggs. Additionaly, FLS, LCC
and DRC showed cytotoxic activity on human lymphocytic leukemia cells.
Sistemically administered FLS demonstrated anti-edematogenic activity on
carragenan (Cg)- and yeast-induced rat paw edema models, but did not show any
effect on dextran- or bradikinin-induced rat paw edema models. The FLS effect on
Cg model was not modified by treatment with indomethacin or L-NAME what
implies that it seems not to affect COX or NO pathways. Notwithstanding, this FLS
effect was indeed potentiated by pentoxifylline (PTX) suggesting a possible
phosphodiesterase (PDE) or TNF- like cytokines inhibition. Even though FLS
significantly inhibited the Cg-induced neutrophil migration on peritoneal cavity of
rats, it showed a even stronger inhibitory effect upon fMLP-induced neutrophil
migration on peritoneal cavity. This demonstrates that FLS, besides blocking the
synthesis or liberation of inflammation mediators such as PG, LT and cytokines can
also block one of the migration steps or maybe some of the adhesion molecules
involved. FLS also reduced tissue damage induced by acetic acid in rats,
demonstrated by its ability to inhibit myeloperoxidase (MPO) activity. However,
FLS was not capable of blocking cotton pellet induced granulation tissue formation,
which is dependet on PG. FLS antinociceptive activity was observed in
experimental pain models, such as the acetic acid-induced abdominal contractions
and formalin test, both in mice. Nevertheless, FLS did not modify nociceptive
response to thermic stimuli in the hot plate model. FLS antinociceptive effect does
not depend on opioid or NO release, and equally is independent from adrenergic
activity, though it seems to involve PDE and/or TNF- and other cytokines
inhibition. Anti-platelet activity of FLS, LCC and DRC was also studied and all of
them showed in vitro platelet aggregation inhibition in platelet-rich human plasma,
upon ADP, collagen, thrombin, arachidonic acid or adrenalin agonist addition. FLS,
LCC and DRC anti-platelet effect was potentiated by PTX, a PDE inhibitor, but not
by L-arginine or aspirin. In conclusion, FLS possess cytotoxic, anti-inflammatory,
analgesic and anti-platelet activities. These effects seem to be mediated by the
chalcones LCC e DRC, present in FLS.
1
Introdução
2
1 INTRODUÇÃO
1.1 Plantas Medicinais
1.1.1 Histórico e Generalidades
Os vegetais fazem parte da vida do homem desde seus primórdios como
fonte de alimentos, de materiais para o vestuário, habitação, utilidades domésticas,
defesa e ataque, na produção de meios de transporte, como utensílios para
manifestações artísticas, culturais e religiosas e ainda como meio restaurador da
saúde. A simples observação das variações sazonais mostradas pelas plantas
certamente deslumbrou os primeiros observadores da natureza que, provavelmente
viam nos vegetais, grande sabedoria em antecipar as estações do ano.
O efeito causado por algumas plantas inadvertidamente ingeridas também
contribuiu para elevar as plantas à categoria de entidades divinas. Plantas com
propriedades alucinógenas foram rapidamente incluídas em rituais religiosos, e a
elas foram atribuídas propriedades mágicas de colocar os homens em contato direto
com os deuses. O conhecimento de plantas alucinógenas pelos ameríndios que as
empregavam em seus ritos pagãos, bem como das propriedades afrodisíacas de
diversas poções preparadas a partir de distintas espécies vegetais, acompanha o
homem há muitos milênios.
Nas origens da história, a noção das plantas terapêuticas e tóxicas passou a
ser objeto de grande interesse. Até hoje, arqueólogos têm encontrado em túmulos
pré-históricos, partes de plantas tidas como medicinais. No ano de 1975, no atual
território do Iraque, foi descoberto um esqueleto humano de quase 60.000 anos de
idade, junto ao qual foi encontrado petrificado pequena quantidade de pólen
concentrado de achilea e jacinto, plantas estas utilizadas até hoje pelos camponeses
daquela região (OTTE, 1994).
Inúmeros documentos importantes que marcaram a evolução histórica das
plantas são citados até hoje (PELT, 1993; OTTE, 1994; MIGUEL & MIGUEL,
2004) como: (1) A “Tabuinha sumeriana”, que possui registro desde o terceiro
3
milênio antes de nossa era, descoberta nas ruínas da cidade de Nip-pur sendo
considerado “O mais antigo tratado de medicina” do mundo; (2) Os fragmentos do
Papyrus Ebers, considerado o primeiro tratado de medicina egípcia, datado do
século XVI a.C., o qual já relatava substâncias sedativas extraídas de Ephedra e o
uso habitual do salgueiro e da acácia; (3) Os manuscritos de um clássico da
literatura botânica da Idade Média, denominado de “Matéria médica”, de autoria do
médico árabe Mohamed Al-Ghafiqi (Córdoba, século XII); (4) O tratado médico
denominado “El libro de medicina interna del emperador Amarillo”, escrito no ano
2000 a.C. pelo Imperador Amarillo em Huang Ti (China), que registra a utilização
de óleos aromáticos no tratamento de diversas enfermidades; (5) Os escritos
religiosos do século XII que referiam à indicação de Santa Hildegarda sobre a ação
cicatrizante das flores de bétula; (6) “A teoria das assinaturas”, criada pelo
botânico inglês Robert B. Turner, no século XVII que relacionava as partes das
plantas e sua utilização em algumas doenças; (7) Registros do século XVIII que
apresentam a descoberta da casca da quina e permitem a extração da quinina
utilizado no tratamento da malária; (8) Em 1829, Leroux isolava pela primeira vez,
das cascas do salgueiro, uma substância denominada salicina, que anos depois, na
Alemanha, serviria de precursor na síntese química do ácido salicílico.
Posteriormente, em 1889, Felix Hoffman da companhia farmacêutica alemã Bayer,
produzia o ácido acetilsalicílico, analgésico de uso universal (GEREZ, 1993); (9) O
trabalho do médico grego Hipócrates (460-377 a.C.) que dentre tantos legados
descreveu centenas de medicamentos incluindo os de origem vegetal; (10) Os
escritos de Claudius Galeno (130-200 d.C.), também médico grego, que apresentou
numerosas drogas de origem natural, combinadas com diversas formulações e seus
respectivos métodos de manipulação.
Existem relatos na literatura que há aproximadamente 3000 a.C., os antigos
povos orientais, em particular os chineses, já faziam uso de plantas e outros
métodos terapêuticos naturais no tratamento de diversas moléstias (CHANG &
BUT, 1986-1987; WAGNER & FARNSWORTH, 1990).
A Ginkgo biloba é uma planta medicinal que atrai até hoje o interesse de
diversas áreas das ciências. É a única representante viva do seu gênero, cuja origem
4
remonta ao Paleozóico Superior (cerca de 250 milhões de anos). Seu emprego,
principalmente em doenças respiratórias na medicina popular chinesa, já era
descrito em 2800 a.C. e tem evoluído com o passar dos anos. Um exemplo desta
evolução pode ser ilustrado com o isolamento dos terpenos polioxigenados
ginkgolídeos A, B, C e M. Estes compostos apresentam importantes propriedades
antitrombóticas, sendo caracterizados como antagonistas dos receptores do fator de
ativação plaquetária (PAF). Este fosfolipídeo endógeno atua como potente
mediador celular e é capaz de regular uma gama de respostas biológicas, como
broncoconstrição, hiperreatividade pulmonar e hipotensão, além de ter sido descrito
como o mais potente indutor da agregação plaquetária (GODFROID & BRAQUET,
1986).
Além dos terpenos, outras classes químicas de produtos naturais apresentam
importantes propriedades biológicas. Um exemplo importante é o gossipol, derivado
fenólico presente no óleo da semente de algodão (Gossypium sp., Malvacea) que foi
amplamente empregado na China como contraceptivo masculino. Esta propriedade
do gossipol foi confirmada em 1980, sendo sugerido que o mesmo atua como
inibidor reversível da espermatogênese (COMBS, 1997). Recentemente, foram
atribuídas ao gossipol propriedades antivirais, particularmente contra herpes genital,
devido à sua capacidade de estimular a biossíntese de interferons (BARREIRO &
FRAGA, 2001a).
Além dos povos orientais, os ocidentais também tiveram grande importância
na descoberta de substâncias bioativas de origem vegetal. Um estudo das plantas ou
seus respectivos fármacos, incluídos nas farmacopéias ocidentais, revelou que as
mesmas vêm sendo utilizadas desde as eras Greco-romanas. Dentre estas, podemos
citar a Cinchona sp., da qual derivam os alcalóides quinina, com propriedade
antimalárica, e quinidina com propriedade antiarrítmica; as diferentes espécies de
Digitalis, que possuem os glicosídeos digoxina e digitoxina, que apesar de
apresentarem índice terapêutico reduzido são empregados até hoje como
cardiotônicos, em virtude de não ter sido identificado um substituto mais seguro e
com as mesmas propriedades terapêuticas. Esses glicosídeos são considerados o
“decano” dos produtos naturais de origem vegetal com aplicações terapêuticas
5
(FRAGA & BARREIRO, 1996). Há ainda componentes de plantas de grande valor
terapêutico, como os alcalóides vinblastina e vincristina de Catharanthus roseus,
com propriedades antineoplásicas, utilizadas principalmente na leucemia infantil
(McCORMACK, 1990).
A etnofarmacologia pode servir como estratégia para investigação de plantas
medicinais. Esse tipo de abordagem consiste em combinar informações adquiridas
junto às comunidades locais que fazem uso da flora medicinal, com estudos
químicos e farmacológicos realizados em laboratórios especializados. Existe uma
grande correlação entre o uso tradicional de um extrato bruto e a aplicação clínica
de um composto puro proveniente do mesmo. Dentre 117 drogas botânicas
revisadas por FARNSWORTH e cols. (1985), 86 substâncias (73,5%) possuíam o
mesmo ou um uso relacionado com aqueles das plantas de origem. Uma descoberta
importante baseada na etnofarmacologia foi a da artemisinina, um sesquiterpeno de
Artemisia annua com marcante atividade terapêutica contra a malária (Plasmodium
vivax) e contra cepas de P. falciparum resistentes a cloroquina (LIU et al., 1992).
Outras substâncias descobertas com base em seu uso popular foram a quinina, um
alcalóide de Cinchona sp, também com atividade antimalárica; e os
antiinflamatórios curcuminóides de Curcuma longa, inibidores das enzimas
lipoxigenase (LOX) e ciclooxigenase (COX) (HUANG et al., 1991) e
seqüestradores de radicais livres (RUBY et al., 1998). A galantamina, originalmente
isolada de espécies de Galanthus e usada pela população local dos Balcãs para
fraqueza muscular, mostrou-se um inibidor competitivo e reversível da
acetilcolinesterase. Após a produção em larga escala da galantamina através de sua
extração a partir de Narcissus spp, estudos clínicos foram conduzidos com sucesso,
e hoje este composto é usado em toda Europa, para o tratamento sintomático de
pacientes nos primeiros estágios da doença de Alzheimer (HOUGHTON, 2002).
Nos últimos anos, vários constituintes químicos de origem vegetal foram
identificados, dentre estes podemos citar a 10-hidróxi-camptotecina, um alcalóide
de Camptotheca acuminata com atividade antineoplásica (BLASKO & CORDELL,
1988); os elagitaninos geraniin e galoilgeraniin, isolados de Spondias monbin Jacq.
com propriedades antivirais contra coxsackie B
2
e herpes simples tipo 1
6
(CORTHOUT et al., 1991) e o taxol, um diterpenóide de Taxus brevifolia, com
atividade antitumoral (CHABNER, 1991; CORRÊA, 1995).
Mais recentemente, pesquisadores da Universidade Federal do Rio de Janeiro
(UFRJ) identificaram e demonstraram que o ácido pomólico, um triterpeno
purificado do Chrysobalanus icaco, conhecido como abajeru, não apenas destrói
linhagens de células tumorais de várias origens, mas também linhagens tumorais
que expressam o fenômeno de multirresistência a drogas (MDR). Em virtude destes
resultados, uma patente da atividade anti-MDR do ácido pomólico foi depositada no
Tratado Internacional de Patentes, com cobertura para 122 países. Experimentos
demonstraram que o ácido pomólico é capaz de eliminar com eficiência linhagens
de células tumorais de várias origens como células de pulmão, laringe, intestino,
mama, sistema nervoso e pele, além de leucemias. Mas o que chamou mais atenção
foi o fato deste triterpeno ser capaz de matar linhagens MDR, que superexpressam a
glicoproteína P (Ppg) e a proteína associada a multirresistência na ausência de
moduladores destas proteínas (ALVES-DE-PAULO et al., 2000; FERNANDES et
al., 2003). Portanto, a utilização do ácido pomólico para o tratamento de tumores
com o fenótipo MDR dispensaria o uso de moduladores, evitando assim os efeitos
tóxicos de terapias combinadas.
As plantas são uma fonte importante de produtos naturais biologicamente
ativos, muitos dos quais se constituem em modelos para a síntese de um grande
número de fármacos. Pesquisadores da área de produtos naturais mostram-se
impressionados pelo fato desses produtos revelarem uma gama quase que
inacreditável de diversidade em termos de estrutura e de propriedades físico-
químicas e biológicas (GUERRA & NODARI, 2000). A espetacular diversidade
molecular de padrões estruturais que se encontram nas distintas classes de produtos
naturais, como flavonóides, isoflavonóides, lignanas, neolignanas, glicosídeos,
cumarinas, cromonas, isocromonas, quinonas, alcalóides, entre outras, representa
fonte inesgotável de modelos originais de arquitetura enantiopura, como assinalava
Pasteur em 1860: “...tous les produits des laboratoires sont à l’image
superposable... au contraire tous les produits essentiels a la vie sont
dyssimétriques...” (BARREIRO & FRAGA, 2001b).
7
Um exemplo histórico e marcante da importância dos produtos naturais como
fonte para a obtenção de substâncias sintéticas foi a descoberta do ácido
acetilsalicílico (AAS) a partir da salicina, um glicosídeo natural de Salix sp.,
derivado do ácido salicílico e encontrado no salgueiro (Salicaceae) (TAINER &
FERRIS, 1969). O AAS é um fármaco centenário com importantes propriedades
farmacoterapêuticas, empregado até hoje como analgésico, inclusive para uso
pediátrico. Outro exemplo histórico é ilustrado pelos trabalhos de Russell E. Marker
sobre a síntese de hormônios esteróides a partir de saponinas isoladas de cactus do
altiplano mexicano conhecido como cabeza de negro (Dioscorea macrostachya),
que contém diosgenina (MARKER, 1947). Este trabalho foi de capital importância
para o desenvolvimento de esteróides e contribuiu significativamente para a
descoberta subseqüente da pílula contraceptiva feminina (DJERASSI, 1970;
CRABBÉ, 1979).
Os derivados 4-hidróxi-cumarínicos, descobertos durante a investigação de
uma doença hemorrágica no gado alimentado com trevo-de-cheiro-amarelo
fermentado (Melilotus officinalis), levaram à descoberta da ação anticoagulante do
dicumarol, pela indústria farmacêutica Abbott & Lilly em 1945. Esse foi o primeiro
fármaco com essa ação por via oral e constituiu o modelo para o desenvolvimento
de uma classe de anticoagulantes com o núcleo básico da 4-hidróxi-cumarina, do
qual derivam importantes fármacos como a varfarina, entre outros (MAJERUS et
al., 1996).
A quinina, um dos principais componentes da casca de Cinchona officinalis,
que desde há muito tempo era conhecida pelos ameríndios como antitérmico, foi o
composto-protótipo para descoberta de derivados antimalariais como a cloroquina e
a mefloquina. Da mesma forma, a morfina, poderosa substância hipnoanalgésica,
obtida de Papaver somniferum, foi o protótipo natural dos derivados 4-
fenilpiperidínicos, importante classe de analgésicos centrais a que pertence a
meperidina (BARREIRO & FRAGA, 2001b; SCHENKEL et al., 2000).
O etoposídeo, um derivado glicopiranosídico com propriedades anticâncer,
particularmente útil para o tratamento de tumores de próstata e carcinomas
pulmonares foi obtido por simples modificação estrutural da podofilotoxina, isolada
8
de Podophyllum peltatum, que antes apresentava modestas propriedades
carcinostáticas (CHEN et al., 1984).
1.1.2 Biodiversidade da flora brasileira
A magnitude da biodiversidade brasileira não é conhecida com precisão tal a
sua complexidade, estimando-se a existência de mais de dois milhões de espécies
distintas de plantas, animais e microorganismos. O Brasil é o país com maior
diversidade genética vegetal do mundo, contando com mais de 55.000 espécies
catalogadas de um total estimado entre 350.000 e 550.000. Mais da metade dessas
espécies encontra-se nas florestas tropicais, cuja área corresponde a apenas 7% da
superfície da terra (SOEJARTO, 1996).
Só a floresta tropical amazônica brasileira abriga 17% da biodiversidade do
país. Já a floresta atlântica contém aproximadamente 35% das Angiospermas do
mundo, e mais de 8% das Pteridófitas (SUFFREDINI et al., 2004).
O maior número de espécies encontra-se nas regiões equatoriais da América
do Sul, da África e da Ásia e o máximo de diversidade global encontra-se na flora
da Colômbia, Equador e Peru. Em todo o território dos Estados Unidos e Canadá, a
magnitude da diversidade genética vegetal nativa limita-se a 700 espécies.
Apenas 8% das espécies vegetais da flora brasileira foi estudada em busca de
compostos bioativos e 1100 espécies foram avaliadas em suas propriedades
medicinais. Destas, 590 plantas foram registradas no Ministério da Saúde para
comercialização (GUERRA & NODARI, 2000).
Até o ano de 2015, entre 4 e 8% de todas as espécies vivas presentes nas
florestas tropicais podem desaparecer. A América do Sul detém 52% destas
florestas e somente na década de 80, o Brasil respondeu por 28% das perdas das
florestas tropicais e por 14% dos outros tipos de florestas. As principais causas da
perda da diversidade genética têm sido associadas à destruição e à fragmentação dos
ecossistemas e aos estresses ambientais como a poluição e as mudanças climáticas
globais (BAUR & SCHMID, 1996). Entretanto, a exploração de plantas de uso
medicinal da flora nativa através da extração direta nos ecossistemas tropicais tem
9
levado a reduções drásticas das populações naturais dessas espécies, seja pelo
processo predatório de exploração, seja pelo desconhecimento dos mecanismos de
perpetuação das mesmas.
Um aspecto menos discutido na questão da devastação das florestas tropicais
refere-se à perda do conhecimento, acumulado por milênios, sobre o uso medicinal
tradicional das plantas destas florestas pelas populações a elas associadas. Esta
devastação provoca a migração destas comunidades, normalmente para centros
urbanos, provocando o rompimento do fluxo de conhecimento adquirido e
acumulado ao longo do tempo.
1.1.3 Incentivos governamentais e institucionais
Apesar do Brasil possuir uma das mais ricas e diversificadas floras do
mundo, sua tecnologia em fabricação de medicamentos, ainda depende em grande
escala, de matérias-primas farmacêuticas do exterior. No entanto, alguns programas
governamentais vêm sendo desenvolvidos no sentido de promover a investigação
científica das potenciais propriedades terapêuticas de espécies vegetais utilizadas
pela população, visando um futuro desenvolvimento de medicamentos ou
preparações que sirvam de suporte ao estabelecimento de uma terapêutica
alternativa e complementar. Embora as drogas sintéticas continuem maioria na
farmácia caseira, os medicamentos à base de plantas – os fitoterápicos – ganham um
espaço cada vez maior nas prateleiras.
A Organização Mundial de Saúde (OMS) preconiza que no ano de 2020 a
população mundial chegará a 7,5 bilhões de pessoas e que destas cerca de 75%
viverão em países em desenvolvimento, os quais consomem hoje menos de 15% do
mercado total de medicamentos. Estas observações indicam que, no futuro, esta
população deverá depender mais ainda das plantas medicinais.
Por conseguinte, a OMS visando diminuir o número de excluídos dos
sistemas governamentais de saúde, recomenda aos órgãos responsáveis pela saúde
pública de cada país, que: a) procedam levantamentos regionais das plantas usadas
na medicina popular tradicional e identifique-as botanicamente; b) estimulem e
10
recomendem o uso daquelas que tiverem comprovadas sua eficácia e segurança
terapêuticas; c) desaconselhem o emprego das práticas da medicina popular
consideradas inúteis ou prejudiciais; d) desenvolvam programas que permitam
cultivar e utilizar as plantas selecionadas na forma de preparações dotadas de
eficácia, segurança e qualidade (LORENZI & MATOS, 2002).
Paralelamente, o Ministério da Saúde do Brasil estipulou Diretrizes e
Prioridades de Investigação em Saúde (Portaria n
o
212, de 11/09/81) incluindo as
plantas medicinais. Em 1988, a Comissão Nacional Interministerial de
Planejamento e Coordenação (CIPLAN) implantou a fitoterapia como prática oficial
de medicina e orientou as Comissões Interinstitucionais de Saúde a buscarem a
inclusão da mesma nos serviços primários de saúde através do Sistema Único de
Saúde (SUS) (MIGUEL & MIGUEL, 2004).
A exemplo da China, que possui uma medicina tradicional milenar calcada
no uso de plantas medicinais, que serve aos cuidados primários de saúde, podemos
entender que a utilização de todos os recursos apropriados e disponíveis, incluindo a
medicina tradicional, constitui alternativa ao tratamento das enfermidades. Desta
forma, podemos concluir que os produtos de origem natural podem ser tão
eficientes quanto àqueles produzidos a partir da síntese química.
1.1.4 Mercado e consumo de medicamentos
Segundo a OMS, 80% da população mundial não possui acesso ao
atendimento primário à saúde, por encontrar-se longe dos centros de saúde ou por
não possuir poder aquisitivo que permita tal atendimento (GOTTLIEB & KAPLAN,
1993).
O consumo mundial de medicamentos em 1990 ultrapassou 173 bilhões de
dólares. Porém, a participação da América Latina, da qual o Brasil como país
membro possui significativa representação, foi de cerca de 8,5 bilhões de dólares,
ou seja, menos que 5% do consumo mundial (JORQUERA, 1993). Mais alarmante
é o fato de que no ano de 1980, o consumo de medicamentos pela América Latina
gerou cerca de 6,4 bilhões de dólares, o equivalente a 8% do consumo total
11
mundial. A análise destes dados demonstra que nos últimos 15 anos o consumo de
medicamentos nos países em desenvolvimento, incluindo os da América Latina,
esta decrescendo muito em relação ao consumo mundial.
Apesar do baixo consumo per capita de medicamentos pela América Latina,
o percentual gasto em intervenções cirúrgicas e procedimentos ambulatoriais em
saúde, pelos governos, situa-se entre 25 a 50%, acima daqueles gastos pelos países
desenvolvidos. Tais diferenças reafirmam a falta de recursos para compra e
distribuição de medicamentos à população e a falta de investimentos em políticas de
saúde pública por parte do setor público.
Nos últimos anos, nosso país passou por grandes mudanças no plano
econômico, o que gerou severos danos aos programas sociais de saúde. Por
conseguinte, a descontinuidade destes programas tem causado um impacto negativo
sobre o consumo e mercado de medicamentos, levando a população a tentar
minimizar estes problemas através do uso de terapias alternativas, de plantas usadas
na medicina popular e da automedicação tradicional.
Segundo JORQUERA (1993), cerca de 50% da população da América Latina
tem pouco ou nenhum acesso aos medicamentos, e grande parte destes usam uma
ou outra forma de plantas medicinais nos cuidados com a saúde.
As plantas são utilizadas em quase todo mundo como matéria-prima, na
forma de extratos, óleos essenciais e substâncias químicas puras ou semi-sintéticas.
O Brasil exporta cerca de 7 milhões de dólares anuais em extratos como os de
alcaçuz, aloe, bardana, arnica, catuaba, ipepacuanha e quina. Porém, importa a
quase totalidade de produtos naturais de alto valor unitário para o uso da indústria
farmacêutica e de cosméticos (DIAS & SHARAPIN, 1995).
No Brasil, 20% da população é responsável por 63% do consumo de
medicamentos disponíveis, o restante encontra nos produtos de origem natural,
especialmente as plantas medicinais, a única fonte de recursos terapêuticos (DI
STASI, 1996). Esta alternativa é utilizada tanto dentro de um contexto cultural, na
medicina popular, quanto na forma de fitoterápicos.
Os fitoterápicos têm sido, no caso do Brasil e de muitos países, o suporte da
indústria farmacêutica genuinamente nacional de pequeno e médio porte. Segundo
12
um estudo realizado pela OMS, o mercado mundial de todos os medicamentos no
mundo é de cerca de US$ 480 bilhões. Já o mercado de fitomedicamentos está na
ordem de US$ 20 bilhões anuais, com cerca de US$ 400 milhões no Brasil, e vem
apresentando taxas de crescimento internas da ordem de 15%, contra apenas 4% dos
medicamentos sintéticos (RODRIGUES, 2004). No Canadá, as vendas crescem
15% ao ano, enquanto nos Estados Unidos esse número chega a 20%. No Brasil,
estima-se que 25% dos US$ 8 bilhões de faturamento, em 1996, da indústria
farmacêutica nacional tenham sido originados de medicamentos derivados de
plantas.
Dois fatores podem explicar esse crescimento. O primeiro é o desejo de
encontrar uma alternativa aos medicamentos sintéticos, em geral muito caros e
carregados de efeitos colaterais. O segundo, e o mais importante é o respaldo cada
vez mais sólido que a ciência está oferecendo às drogas a base de plantas. A partir
da constatação de que muitas vezes a sabedoria popular de fato tem fundamento,
diversos pesquisadores deixaram de lado o preconceito e partiram para a pesquisa
sobre o poder medicinal das plantas.
1.1.5 Instituições brasileiras e a pesquisa de plantas no Brasil
No Brasil, há vários laboratórios e universidades empenhadas na tarefa de
pesquisar e validar o uso de plantas medicinais, como é o caso da Universidade
Estadual de Campinas (Unicamp), que comprovou a eficácia da Artemisia contra a
malária; a Universidade Federal do Rio Grande do Sul, que tem estudado diversas
plantas contra o câncer; a Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz), que há três anos
abriga o Laboratório de Química de Produtos Naturais, com o objetivo de desvendar
as propriedades medicinais de várias plantas; a Universidade Federal de São Paulo
(Escola Paulista de Medicina), que conduziu o primeiro estudo clínico do país sobre
a eficácia da Myrcia uniflora e Bauhinia fortificata (pata-de-vaca) no tratamento do
diabetes tipo II (RUSSO et al., 1990); a Universidade Federal do Rio de Janeiro que
isolou o ácido pomólico e demonstrou que o mesmo destrói linhagens de células
tumorais de várias origens, assim como também células tumorais que expressam o
13
fenômeno MDR (ALVES-DE-PAULO et al., 2000; FERNANDES et al., 2003); e a
própria Universidade Federal do Ceará, onde o Departamento de Fisiologia e
Farmacologia, em parceria com o Departamento de Química Orgânica e Inorgânica
têm dado grande impulso no sentido de validar o uso popular de diversas plantas,
especialmente as do Nordeste.
As potencialidades de uso das plantas medicinais encontram-se longe de
estarem esgotadas. A tarefa de desenvolver, a partir de plantas medicinais, produtos
com constância de composição e propriedades terapêuticas reprodutíveis, como se
exige dos demais medicamentos, ainda é muito complexa. A transformação de uma
planta medicinal em um medicamento é, portanto, uma tarefa que apresenta
problemas diferenciados daqueles que caracterizam a busca de protótipos para
novos fármacos. Desta forma, é necessário um esforço conjunto entre botânicos,
químicos, fisiologistas, toxicologistas e farmacologistas, para validar o uso empírico
de produtos vegetais pela população e livrar os países em desenvolvimento da
dependência externa.
Além destas prerrogativas, faz-se necessário buscar urgentemente novas
parcerias entre governo, indústrias e universidades, no sentido de encontrar
alternativas de investimento para os programas de saúde pública, tanto na geração
de recursos direcionados à produção, bem como à pesquisa e formação de recursos
humanos especializados, para atuarem junto às comunidades a fim de proporcionar
a melhoria da qualidade de vida do nosso povo.
1.2 Lonchocarpus sericeus (Poir.) Kunth
Lonchocarpus sericeus (Poir.) Kunth é uma angiosperma dicotiledônea da
subclasse Archichlamydeae que pertence à ordem Rosales e à família Leguminosae
papilionaceae ou Fabaceae (EVANS, 2002a).
A família Leguminosae é a segunda maior família de plantas floríferas,
possuindo cerca de 600 gêneros e 12.000 espécies. Esta família é dividida em três
subfamílias: Mimosoideae, Caesalpinoideae e Papilionaceae, contendo
respectivamente cerca de 40, 133 e 377 gêneros (EVANS, 2002a). Sua distribuição
14
é bastante ampla nas zonas tropicais e subtropicais, estendendo-se ainda às regiões
temperadas. Contudo, sua maior diversidade encontra-se nos trópicos americanos e
africanos (MARTINS DE SOUSA, 2003).
O gênero Lonchocarpus é bastante conhecido e amplamente estudado, sendo
que das 150 espécies existentes, 24 são nativas do Brasil e o estudo químico de
cerca de 34 espécies estão registrados na literatura (ADERBAL et al., 2000;
MARTINS DE SOUSA, 2003). Dentre estas, além da L. sericeus podemos citar a L.
araripensis, L. campestris, L. capassus, L. chiricanus, L. cyanescens, L. eriocalyx,
L. guatemalensis, L. latifolius, L. neuroscapha, L. oaxacensis, L. urucu, L. utilis, L.
xuul, etc.
A descrição botânica de Lonchocarpus sericeus (Poir.) Kunth, segundo
AZEVEDO-TOZZI (1989) segue transcrita textualmente:
“Árvore vistosa, ereta, de altura variada, desde 2 m até raramente
30 m e então até 1 m de DAP, geralmente entre 10 e 15 m de altura e DAP
de 15 – 30 cm, com tronco reto, casca amarelo-acinzentada, ligeiramente
rugosa, mas não fissurada, lenticelada e fuste ca. 1,5 – 2 m, copa ampla,
densa, espalhada, fornecendo sombreamento abundante, com ramos
subdecumbentes, ficando aproximadamente horizontais, de onde saem às
inflorescências verticais e eretas; ramos ferrugíneo-pubescentes ou
tomentosos a glabrescentes, marrom-esverdeados, com numerosas
lenticelas brancas destacadas sobre o fundo escuro; estípulas ovais,
pequenas, ferrugíneo-pilosas, ca. 3 mm compr., caducas. Folhas 7 ou 9 –
folioladas, raramente 5 ou 11 – folioladas; pecíolo estriado, denso-
pubescente, de 3 – 4 cm de compr.; ráquis canaliculada, com o sulco mais
largo na inserção dos peciólulos, gradativamente menos pubescente, de 4,5
– 9 cm compr., com o comprimento dos segmentos intermediários ca. 2 – 3
cm e do terminal de 1 – 7 mm; peciólulo estriado, ferrugíneo-pubescente,
de 3 – 6 mm compr.; folíolos muitas vezes assimétricos, suborbiculares,
oblongos, oblongo-ovais a elíptico-obovais, ápice obtuso ou arredondado e
abruptamente e curto-acuminado (acúmem menor que 4 mm compr.), base
15
geralmente oblíqua-arrendondada, coriáceos ou cartáceos, face superior
com nervação e margem destacadas ou levemente imersas, pubérula a
glabra, pouco lustrosa ou opaca, verde-escura, face inferior com nervação
e margem proeminentes, ferrugíneo-tomentosa, principalmente sobre as
nervuras, a glabrescente, de 4 – 13 cm x 3 – 6,5 cm.
Pseudo-rácemo axilar, solitário, densifloro, geralmente menor que
a folha, ereto, situado na axila das folhas apicais do ramo; eixo de 1
a
.
ordem lenhoso, estriado, ferrugíneo velutino-pubescente, glabro nas
infrutescências, de 5 –15 cm compr.; eixos de 2
a
. ordem próximos, denso
ferrugíneo-pubescente, a maioria com duas flores, raramente três flores,
de 2 – 3 mm compr.; brácteas geralmente ovais, pubescentes e caducas;
pedicelo denso ferrugíneo-pubescente, curto, de 2 – 4 mm compr.,
bractéolas oval-orbiculares, pubescentes, de até 2 mm compr.,
persistentes; cálice cupuliforme, subtruncado, com lacínios pouco
desenvolvidos, aparentemente sinuoso, densamente tomentoso a velutino-
pubescente, com tricomas ferrugíneos, de 4 – 5 mm compr., no material
herborizado marrom-mostarda e na planta viva marrom esverdeado a
amarelo, com tonalidade ligeiramente púrpura, como o pedicelo e as
bractéolas; hipanto pouco desenvolvido; corola de 1,2 – 1,6 cm compr.,
rosada, arroxeada a púrpura, com tonalidades lilás ou vinosa sombreada,
muito sedosa e brilhante na face externa e na interna rosa-avermelhada
mais opaca, e estandarte com mancha verde-amarelada na região centro-
basal da face interna; estandarte suborbicular, emarginado no ápice,
truncado e biauriculado (aurículas pequenas) na base que termina em
unguícula curta, com apêndices calosos basais, densamente seríceo, com
tricomas prateados, na face externa; asas aderentes à quilha oblongo-
obovais, oblíquas, ápice obtuso, auriculadas na parte vexilar, levemente
seríceas, terminando em unguícula de ca. 3 mm compr.; quilha subfalcada,
denso serícea na metade superior e ao longo da margem inferior; estames
amarelados na planta viva, com esparsos pêlos retos, canescentes, finos,
na parte apical dos filetes, com abertura basal calosa; ovário séssil, e
16
engrossado na base, canescente-tomentoso, no geral 7 – ovulado; estilete
arqueado, piloso apenas na base.
Fruto verde, densamente revestido por indumento ferruginoso,
marrom quando maduro, espessado na região das sementes e com
constrições, entre elas, de grau variado, desde pouco constrito até muito,
principalmente na margem carenal, formando ístimos de 4 – 5 mm e
artículos oblongos-ovais, semi-elípticos, oblongos a suborbiculares, de 4,5
– 5 cm compr., estipitado (estipe de 0,5 – 2 cm compr., densamente
tomentosa), base atenuada a cuneada, ápice assimétrico-truncado a
arrendondado, margem vexilar espessada na região em frente as sementes
(espessura de 4 – 5 mm), no fruto imaturo parecendo uma ala sub-lenhosa,
margem carenal compressa, formando uma sub-ala lenhosa e nerviforme
de 1 – 2 mm de largura, coriáceo a lenhoso, duro recoberto por tomentoso
ferruginoso, às vezes sub-rufescente a glabro, com 1 – 3 (– 5) sementes, de
4,5 – 5,5 cm compr. Nos frutos monospermos, de 11 – 12,5 cm nos
bispermos, ca. 15 cm compr. Nos trispermos e assim por diante e largura
de 2,6 – 3 cm, dos quais ca. 0,5 cm correspondente à espessura do fruto.
Infrutescência geralmente com poucos frutos desenvolvidos. Sementes
arredondadas a oblongo-reniformes, marrom-escuras com hilo branco e
testa coriácea.” (Figura 1A e 1B).
A frutificação de L. sericeus no Brasil verifica-se geralmente em maio-junho.
No entanto, no nordeste brasileiro ocorre em setembro-outubro e no Pará em abril.
Na América Central, a frutificação ocorre em julho, na Guiné em setembro e em
julho e novembro na Colômbia. Nas Antilhas, o material frutífero foi observado em
junho, julho, outubro, fevereiro e março (AZEVEDO-TOZZI, 1989).
Segundo AZEVEDO-TOZZI (1989), o período de floração ocorre de outubro
a fevereiro. No entanto, no Pará inicia-se no mês de setembro. Na Colômbia foi
coletado material florido de junho a agosto e na América Central em março. Nas
Antilhas a espécie parece florescer durante todo ano, com exceção de setembro e
dezembro.
17
Figura 1A – Foto de um espécimen de Lonchocarpus sericeus (a).
Destaque para frutos (b) e inflorescências (c).
a
b c
18
Figura 1B – Lonchocarpus sericeus: a) ramo com inflorescência, b) flor, c)
cálice, d) estandarte, e) asas, f) quilha, g) androceu, h) gineceu (Azevedo –
Tozzi, 1989).
a
b
c
d
e
f
g
h
2 mm
2 cm
19
A L. sericeus é uma espécie caducifólia com flores muito vistosas e
perfumadas (na América e África), sendo freqüentemente visitadas por insetos,
especialmente abelhas. Esta árvore é uma das essências mais preciosas do Senegal.
Sua madeira tem grã-fina, é dura, susceptível de belo polimento e é muito
empregada na ebanisteria (PIO CORRÊA, 1974).
Na Colômbia, a madeira de L. sericeus é usada para construção, e suas cascas
são usadas como remédio purgativo em Guiné, na África.
1.2.1 Sinonímia
Segundo AZEVEDO-TOZZI (1989), a sinonímia de Lonchocarpus sericeus
(Poir.) Kunth é a seguinte:
Robinia sericea Poiret
Robinia violacea Beauvois
Dalbergia domingensis Turp. ex Persoon
Lonchocarpus macrophyllus Kunth
Lonchocarpus turpinii Kunth
Lonchocarpus domingensis (Turp. ex Pers.) DC.
Lonchocarpus formosianus DC.
Lonchocarpus pyxidarius DC.
Dalbergia macrophylla Sprengel
Lonchocarpus tomentosos Tulasne
Lonchocarpus sericeus var. glabrescens Bentham, Journ. Linn.
Lonchocarpus sericeus var. bracteolis parvis Bentham
Lonchocarpus sericeus var. jamaicensis Grisebach
Lonchocarpus lucidus Pittier
20
Lonchocarpus cruentus Lundell
Derris sericea (Poir.) Ducke.
1.2.2 Nomes populares
No sertão nordestino a espécie é conhecida por ingazeiro (DUCKE, 1953) e
em Fortaleza, no Ceará, por ingá ou ingá-bravo (FERNANDES, 1964; MARTINS
DE SOUSA, 2003). Ainda no Ceará, a espécie é chamada de ingá-de-bucha, ingá-
im, ingá-pena-de-buchas, ingareira-piaba e guará-timbó. Também nominado
vulgarmente de cabelouro (Bahia), imburana, muxiba ou muxibeira (Maranhão),
ingá-hi (Espírito Santo), ingarana (Piauí), piaca (Pernambuco) e priaca (Paraíba)
(AZEVEDO-TOZZI, 1989). Outras denominações como carrapato, embira-de-
carrapato, imbira-de-sapo, tamboril (PIO CORRÊA, 1974), angelim, cabelouro-da-
caatinga e timbó, também são usadas no Brasil.
Na Colômbia é conhecida comumente por guarapato ou guamucho, na
Venezuela por mojomo, na Rebública Dominicana por anón-del-rio, em Tobago por
dogwood e na Guiné por biafada, buchomalé, canainé e mandinga. No Panamá é
conhecida por malvecino (STANDLEY, 1928). É também conhecida por linguana,
em Cabo Verde; duckwa, na Costa do Ouro e palo amarillo, no México (PIO
CORRÊA, 1974).
1.2.3 Distribuição geográfica
No Brasil, a Lonchocarpus sericeus (Poir.) Kunth é encontrada nas seguintes
regiões:
CENTRO-OESTE
Goiás
Mato Grosso
21
NORDESTE
Alagoas
Bahia
Ceará
Maranhão
Paraíba
Pernambuco
Piauí
NORTE
Pará
SUDESTE
Espírito Santo
Rio de Janeiro
O padrão de distribuição de L. sericeus mostra algumas peculiaridades que
devem ser mencionadas. Em primeiro lugar, a espécie não é encontrada no Estado
do Amazonas, o que provavelmente indica que a rota migratória da espécie deve ter
sido através da Venezuela e Guianas, uma vez que a espécie também não é
encontrada no oeste da América do Sul. Na África tropical, a espécie mostra uma
distribuição completamente disjunta, enquanto na Venezuela sua distribuição é rara
(AZEVEDO-TOZZI, 1989).
22
Sua distribuição em outros países e continentes parece ser a seguinte
(INTERNATIONAL LEGUME DATABASE & INFORMATION SERVICE, 2004):
ÁFRICA:
Angola
Benin
Camarão
Guiné Equatorial
Gabão
Gâmbia
Gana
Guiné
Guiné Bissau
Costa do Marfim
Libéria
Nigéria
São Tomé e Príncipe
Senegal
Serra Leoa
África do Sul
Togo
Zaire
AMÉRICA CENTRAL:
México (Central, Norte e Sudeste)
Panamá
23
AMÉRICA DO SUL:
Brasil
Colombia
ÁSIA:
Índia
AUSTRÁLIA:
Papua Nova Guiné
CARIBE:
Cuba
Granada
Guadalupe
Jamaica
Martinica
Trinidade e Tobago
OCEANO PACÍFICO:
Fiji
1.2.4 Habitat
L. sericeus é encontrada com freqüência à margem de cursos d’agua, onde
deve apresentar uma freqüência mediana ou alta. Ocorre em formações florestais,
24
como mata de galeria, mata costeira, mata virgem e alta, mata secundária, mata de
várzea ou de terra firme, floresta estacional semidecidual. Coletada também em
estepe arbórea aberta, carnaubal, restinga debastada, caatinga, capoeira e savana.
Citada em mata seca e sertão nordestino (DUCKE, 1953) e baixadas pantanosas da
Amazônia (DUCKE 1925; 1949). Parece interessante mencionar que as árvores
mais altas (20 – 30 m de altura) devem ser provavelmente mais velhas e foram
localizadas em matas virgens altas e fechadas no Pará, Venezuela e Costa Rica.
1.2.5 Usos
Culinária
Medicina
Fabrico de móveis
Ambiental
Agricultura (Inseticidas)
1.2.6 Química e Farmacologia de Lonchocarpus spp.
Estudos químicos realizados com algumas espécies do gênero Lonchocarpus
demonstram a presença de alcalóides (ELBEIN et al., 1984; MAGALHÃES et al.,
2002), rotenóides (FANG & CASIDA, 1999a; PEREIRA et al., 2000; CABIZZA et
al., 2004), flavonóides (HOTON-DORGE, 1963; OGBEIDE & PARVEZ, 1991;
FANG & CASIDA, 1999b; ALAVEZ-SOLANO et al., 2000; BORGES-ARGAEZ
et al., 2000; MAGALHÃES et al., 2000), inclusive chalconas (DE MELLO et al.,
1974; GONÇALVES DE LIMA et al., 1975; LUPI et al., 1977; MESIA-VELA et
al., 2001; BORGES-ARGAEZ et al., 2002), estilbenos, auronas, triterpenos entre
outros metabólitos (IOSET et al., 2001), em diversas partes da planta.
Segundo estudos realizados na UFC, a L. sericeus contém os seguintes
flavonóides (chalconas): Derricina, Lonchocarpina, 2,3-Diidrolonchocarpina e
Isolonchocarpina, sendo que as duas primeiras chalconas são seus constituintes
majoritários (MARTINS DE SOUSA, 2003).
25
Dentre as plantas do gênero Lonchocarpus, algumas vêm sendo estudadas e
têm demonstrado propriedades farmacológicas variadas. As chalconas isoladas de
Lonchocarpus neuroscapha demonstraram atividade antimicrobiana e
antineoplásica (DE MELLO et al., 1974; GONÇALVES DE LIMA et al., 1975).
Compostos isolados de L. chiricanus e L. oaxacensis apresentaram efeito
antifúngico contra Cladosporium cucumerinum e Postia placenta, respectivamente
(ALAVEZ-SOLANO et al., 2000; IOSET et al., 2001). A L. urucu, assim como a L.
chiricanus também apresentaram atividade larvicida contra o Aedes aegypt,
mosquito transmissor da febre amarela (IOSET et al., 2001; GUSMÃO et al.,
2002).
Foi demonstrado que a ingestão diária de rotenona, derivada de algumas
espécies de Lonchocarpus, eleva significativamente o nível de enzimas da fase II,
glutationa S-transferase e quinona redutase no fígado e cólon de ratas F344 com
adenocarcinoma colônico induzido por azoximetano (AOM) (YOSHITANI et al.,
2001). Neste mesmo trabalho, a rotenona também inibiu significativamente a
formação de focos aberrantes das criptas induzida pelo AOM. Já os rotenóides
sumatrol e vilosinol isolados de L. aff. fluvialis exibiram significante atividade
citotóxica contra células tumorais epidermóides humanas (KB) (BLATT et al.,
2002).
IWU E ANYANWU (1982), após uma pesquisa detalhada sobre as plantas
antiartríticas usadas por uma tribo da Nigéria resolveram estudá-las e demonstraram
que uma delas, a L. cyanescens reduz o edema de pata induzido pela carragenina, a
diarréia induzida pelo ácido araquidônico (AA) e pelo óleo de rícino e ainda
melhora todos os sintomas e sinais associados com a poliartrite induzida por
adjuvante em ratos.
Apesar do gênero Lonchocarpus ser rico em alcalóides, flavonóides,
inclusive chalconas, não foi encontrado na literatura especializada, nenhum trabalho
que mostre que a L. sericeus tenha sido estudada farmacologicamente. Na literatura
científica, consta apenas que um alcalóide isolado da mesma (2,5-Dihidroximetil-
3,4-dihidroxipirrolidina) é capaz de inibir o processamento de glicoproteínas
(ELBEIN et al., 1984).
26
1.3 Flavonóides
Os flavonóides, assim como outros metabólitos secundários, são produzidos
pelas plantas a partir dos metabólitos primários através de rotas biossintéticas
diversas e freqüentemente desconhecidas, às custas de energia. Esses pigmentos
representam um dos grupos fenólicos mais importantes e diversificados entre os
produtos de origem natural. Essa classe de compostos é amplamente distribuída no
reino vegetal, principalmente entre os vegetais superiores, sobretudo em partes
aéreas: folhas, flores e frutos. São raros em algas, briófitas, fungos e pteridófitas.
Todavia, estão presentes em abundância em angiospermas, apresentando neste
grupo grande diversidade estrutural (ZUANAZZI, 2000).
O núcleo fundamental dos flavonóides, dois anéis aromáticos conectados por
uma cadeia de três átomos de carbono (C
6
– C
3
– C
6
), resulta de rotas biossintéticas
distintas: a do ácido chiquímico e a do acetato, via ácido malônico. A primeira
origina fenilalanina, o precursor do ácido cinâmico, responsável por um dos anéis
aromáticos (anel B) e a ponte de três carbonos, e a segunda resulta no outro anel
aromático (anel A) do núcleo fundamental dos flavonóides (DOS SANTOS, 2000)
(Figura 2). Os flavonóides de origem natural apresentam-se freqüentemente
oxigenados e um grande número ocorre conjugado com açúcares (heterósides), ou
sob a forma dos respectivos compostos aglicônicos livres.
Na tabela 1 encontram-se as principais classes de flavonóides e um resumo
de suas propriedades e características mais importantes.
Nas plantas, diversas funções são atribuídas aos flavonóides. Entre elas
podemos citar: a) proteção dos vegetais contra os raios UV e visível, além de
proteção contra insetos, fungos, vírus e bactérias; b) atraentes de animais com
finalidade de polinização; c) antioxidantes; d) controle da ação de hormônios
vegetais; e) agentes alelopáticos; e f) inibição de enzimas (HARBORNE &
WILLIAMS, 2000; ZUANAZZI, 2000).
27
O
O
A
B
C
5
6
7
8
3
2
2'
3'
4'
5'
6'
Figura 2 – Núcleo fundamental dos flavonóides.
28
Tabela 1 – Classes de flavonóides e algumas características conhecidas
Classes N
o
aproximado de
estruturas conhecidas
Características
Flavonas, flavonóis e seus
O-heterósides
1660 Copigmentação em flores;
p
rotetores contra raios UV
nas folhas
C-heterósides 303 –
Antocianos 256 Pigmentação do vermelho
até o azul
Chalconas 197 Pigmentação amarela
Auronas 29 Pigmentação amarela
Di-hidro-flavonóis 110 Estão presentes com
freqüência em tecidos de
madeiras
Flavanonas 319 Podem apresentar sabor
amargo
Di-hidro-chalconas 71 Podem apresentar sabor
amargo
Flavanas,
leucoantocianidinas e
proantocianidinas
309 Substâncias adstringentes
com propriedades tanantes
Isoflavonóides 630 Propriedades estrogênicas
e/ou antifúngicas
Biflavonóides 134 Propriedades antifúngicas
e antivirais
Neoflavonóides 70 –
Outras estruturas 100 –
(ZUANAZZI, 2000).
29
O interesse econômico despertado pelos flavonóides é decorrente de suas
diferentes propriedades como:
Cores produzidas por esses pigmentos;
Processo de tanagem do couro;
Fermentação do chá-da-índia;
Manufatura do cacau;
Suas contribuições em nutrição e sabor dos alimentos; e
Importância farmacológica.
São conhecidos mais de 8000 flavonóides, sendo que o número de novas
estruturas identificadas praticamente dobrou nos últimos vinte anos (PIETTA,
2000).
Os flavonóides e derivados constituem uma das mais importantes classes de
compostos biologicamente ativos, sendo por vezes denominados “bioflavonóides”,
por apresentarem um largo espectro de atividade biológica, além da multiplicidade
de ações observadas em alguns membros do grupo.
Dentre os flavonóides mais conhecidos estão a rutina, a quercetina e os
bioflavonóides cítricos (hesperetina, hesperidina, diosmina e naringina). A rutina e a
hesperidina são denominadas vitamina P ou fatores de permeabilidade, e são usadas
há muitos anos para o tratamento de diversos estados que se caracterizam por
hemorragia e excessiva fragilidade capilar (TYLER et al., 1979; KUKLINSKI,
2000; EVANS, 2002b).
1.3.1 Farmacologia dos flavonóides
O emprego dos flavonóides na terapêutica é vasto e ainda empírico, uma vez
que sua prática de uso é mais antiga que o desenvolvimento das análises
farmacológicas modernas. Os flavonóides podem afetar a função de diversos
sistemas enzimáticos envolvidos em respostas metabólicas, imunes e na geração de
processos inflamatórios.
30
Dentre as enzimas podemos citar a óxido nítrico sintase (NOS) (CHEN et al.,
2000; SRIVASTAVA et al., 2000); lipoxigenase (LOX) (FERRANDIZ &
ALCARAZ, 1991; MANTHEY, 2000); ciclooxigenase (COX) (LIANG et al.,
1999; CHEN et al., 2000; MANTHEY, 2000), proteína quinase C (MIDDLETON,
1998; MANTHEY, 2000), tirosina quinase (MIDDLETON, 1998);
fosfatidilinositol-3-quinase (MATTER et al., 1992); fosfolipase (FLP) A
2
(MIDDLETON, 1998; MANTHEY, 2000); aldose redutase (VARMA &
KINOSHITA, 1976; TAWATA et al., 1992); mieloperoxidase (MPO) (CRESPO et
al., 1999); xantina oxidase (COS et al., 1998; RUSSO et al., 2000); NADH oxidase
(HODNICK et al., 1994); NADPH diaforase (TAMURA et al., 1994); Ca
2+
ATPase
(FEWTRELL & CAOMPERTS, 1977) e Fosfodiesterase (FDE) (MANTHEY,
2000).
Embora alguns autores sugiram que os flavonóides possam causar efeitos
maléficos (ROSS, 2000; MIRANDA et al., 2000), em geral são considerados como
benéficos.
Muitas pesquisas têm demonstrado que vários flavonóides podem agir como
antiinflamatórios em diversos modelos de inflamação. A diosmina, em modelo de
colite induzida por ácido trinitrobenzenosulfônico (TNBS) em ratos, além de
reduzir os níveis da MPO também diminui a produção de malonildialdeído (MDA)
e inibe a síntese de LTB
4
(CRESPO et al., 1999). Neste mesmo trabalho, a
hesperidina, outro flavonóide também reduziu os níveis de MPO, prevenindo a
inflamação do cólon.
Os flavonóides presentes nas folhas e flores de Tanacetum parthenium e T.
vulgare foram testados farmacologicamente e muitos deles inibiram o metabolismo
do AA através da inibição das enzimas LOX e COX, sendo que as flavonas foram
bem menos ativas que os flavonóis correspondentes na inibição destas enzimas
(WILLIAMS et al., 1999).
Além do efeito antiinflamatório demonstrado pelo extrato do rizoma de
Sambucus ebulus, rico em flavonóides, o mesmo também apresentou efeito
antinociceptivo no teste da formalina e tail flick em ratos (AHMADIANI et al.,
1998). Usando os mesmos modelos e o modelo de edema de pata induzido por
31
formalina, AHMADIANI e cols. (2000) demonstraram ainda que o extrato dos
frutos de Elaeagnus angustifolia, também rico em flavonóides, mostrou-se efetivo
como antiinflamatório e analgésico.
A Ipomoea pes-caprae é uma planta medicinal usada no tratamento de
muitas doenças, incluindo processos inflamatórios e algésicos. DE SOUZA e cols.
(2000) demonstraram que o extrato etanólico e duas frações obtidas das partes
aéreas desta planta exibiram considerável atividade antonociceptiva em modelos
clássicos de dor em camundongos. A análise fitoquímica preliminar do extrato e
suas frações sugeriu a presença de flavonóides dentre outros compostos.
Algumas espécies de Hypericum são popularmente usadas no sul do Brasil,
para o alívio de cólicas, inflamações na boca e faringe e angina. Estudos
demonstraram que o extrato lipofílico de Hypericum caprifoliatum possui atividade
antidepressiva no teste do nado forçado, assim como um efeito antinociceptivo no
teste da placa quente (VIANA et al., 1999; DAUDT et al., 2000). O H.
caprifoliatum, além de outras espécies também mostrou um efeito inibitório in vitro
da atividade da monoamino oxidase (GNERRE et al., 2001). Além disso, seu
extrato metanólico, rico em flavonóides, exibiu uma potente atividade
antinociveptiva no teste da placa quente (VIANA et al., 2003a).
Flavonóides como a gossipina, epicatequina, morina e rutina também
apresentam significante atividade analgésica (HARBORNE & WILLIAMS, 2000).
Nos últimos anos, o interesse pelos flavonóides tem crescido bastante devido ao seu
amplo espectro de atividade farmacológica. Na realidade, estes compostos têm sido
descritos por muitos estudos, como antialérgicos, antivirais, antitumorais,
antiplaquetários, vasodilatadores e antioxidantes.
A atividade antioxidante dos flavonóides pode estar relacionada à sua
habilidade em inibir enzimas envolvidas na produção de radicais livres, em atuar
como varredores destes radicais e em agir como quelantes de íons. Outro possível
mecanismo para este efeito dos flavonóides seria sua ação estabilizadora de
membranas, através da diminuição da fluidez das mesmas (ARORA et al., 2000).
A capacidade dos flavonóides de agirem como antioxidantes in vitro tem sido
assunto de diversos estudos nos últimos anos, e uma importante relação estrutura-
32
atividade foi bem estabelecida. DAS E PEREIRA (1990) demonstraram que uma
dupla ligação entre os carbonos C
2
e C
3
, assim como um grupamento carbonila no
C
4
são importantes características para a potência da ação antioxidante dos
flavonóides.
A Buteína e outras 3,4-dihidroxichalconas são mais ativas que suas análogas
flavonas devido a sua maior capacidade em deslocar elétrons (DZIEDZIC &
HUDSON, 1983). Da mesma forma as isoflavonas são bem mais potentes que as
flavonas devido aos efeitos estabilizadores dos grupamentos 4-carbonil e 5-hidroxil
presentes nas mesmas.
SHAHIDI e cols. (1991) demonstraram que os O-hidroxiflavonóides são
excelentes quelantes de metais. Estudos com a planta Scutellaria baicalensis
analisaram o perfil antioxidante dos três principais flavonóides contidos no extrato
de suas raízes: wogolina (5,7-dihidroxi-8-metoxiflavona), baicaleína (5,6,7-
trihidroxiflavona) e seu 7-glicuronídeo, a baicalina. Este último mostrou a maior
atividade antioxidante dos três, devido à presença do grupamento glicuronídeo no
C
7
de sua estrutura (GABRIELSKA et al., 1997).
MIYASE e cols. (1999a) identificaram na planta Lespedeza homoloba
(Leguminosae), oito novos compostos fenólicos. Dentre estes, três demonstraram
possuir potente atividade antioxidante in vitro em homogenatos de cérebro de ratos.
Em uma análise posterior usando também o modelo de peroxidação lipídica em
homogenato de cérebro de ratos, MIYASE e col. (1999b) testeram quinze novos
isoflavonóides e concluíram que aqueles compostos que possuíam um grupamento
catecol apresentavam maior atividade antioxidante, que aqueles que não possuíam.
A eficácia antioxidante in vivo dos flavonóides é ainda pouco documentada
(PIETTA, 2000; RUSSO et al., 2000). No entanto, os mesmos fazem parte de nossa
dieta em quantidades consideráveis, pois estão presentes em frutas, flores, chás,
vinhos, grãos, raízes, tronco, casca de árvores e etc. A média calculada para o
consumo de flavonóides é de 25,9 mg/dia, sendo que as maiores fontes destes
compostos são o chá, a cebola e a maçã (HARBORNE & WILLIAMS, 2000).
Apesar disto, pouco se sabe sobre a absorção, distribuição, metabolismo e excreção
destes compostos no organismo humano (MIDDLETON, 1998).
33
Alguns trabalhos têm documentado os benefícios de uma dieta rica em frutas,
vegetais, azeite de oliva, vinho e chás, para as doenças cardiovasculares
(GIUGLIANO, 2000). Em muitos países o elevado consumo de gorduras saturadas
está fortemente relacionado com a alta mortalidade por doenças coronarianas. No
entanto, este não é o caso de algumas regiões da França, onde a taxa de mortalidade
por doenças coronarianas é aproximadamente 50% menor que aquelas de outros
países da Europa e dos Estados Unidos (HARBORNE & WILLIAMS, 2000;
ROSENKRANZ et al., 2002). Este fenômeno chamado French paradox pode ser
explicado pelo consumo regular de vinho na dieta, particularmente de vinho tinto,
visto que estudos epidemiológicos mostram que este consumo reduz o índice de
mortalidade e morbidade por doenças cardíacas coronarianas (DAS et al., 1999;
ROSENKRANZ et al., 2002).
O vinho tem feito parte da cultura humana por aproximadamente 6000 anos,
sendo utilizado com funções sócio-religiosas e dietéticas. Sua produção ocorre em
praticamente todos os continentes, e sua composição depende basicamente das
técnicas enológicas e origem das uvas empregadas, e ainda de fatores climáticos
(SOLAES et al., 1997a). Além do álcool, cujo consumo regular e moderado pode
reduzir a mortalidade por doenças coronarianas através do aumento do colesterol
HDL e da inibição da agregação plaquetária (REHM et al., 2003), o vinho contém
ainda uma série de polifenóis com propriedades biológicas benéficas. Dentre estes
compostos encontram-se os ácidos fenólicos, como os ácidos cinâmico, p-cumárico,
cafêico, gentísico, ferúlico e vanílico; os trihidroxi-estilbenos, como a polidatina e o
resveratrol e os flavonóides como a catequina, epicatequina e quercetina (SOLAES
et al., 1997b).
Os efeitos benéficos dos componentes do vinho tinto têm sido demonstrados
em muitos sistemas experimentais, abrangendo desde estudos in vitro (LDL
humano, lipossomos, macrófagos, cultura de células) até investigações em
voluntários humanos sadios. Estes compostos, especialmente a catequina,
quercetina e resveratrol, promovem a produção de óxido nítrico (NO) pelo endotélio
vascular, inibem a síntese de tromboxano (TX) em plaquetas e leucotrieno (LT) em
neutrófilos, modulam a síntese e secreção de lipoproteínas in vitro e in vivo, e
34
impedem o crescimento tumoral, inibindo a carcinogênese em diferentes modelos
experimentais (SOLAES et al., 1997a). Os mecanismos envolvidos nestes efeitos
incluem inibição da FLA
2
e COX, inibição da FDE com aumento nas concentrações
de nucleotídeos cíclicos e inibição de várias quinases envolvidas em mecanismos de
sinalização celular.
Apesar do vinho ser uma excelente fonte de compostos fenólicos,
especialmente de flavonóides que possuem vários efeitos benéficos para o
organismo humano, é bom lembrar que o mesmo contém álcool, e que o uso crônico
deste último em elevada quantidade está associado com lesões hepáticas,
neurotoxicidade, hipertensão, cardiomiopatias, alterações da resposta imune e
aumento do risco de surgimento de câncer (AROOR & SHUKLA, 2004).
Outro exemplo dos benefícios da ingestão diária de flavonóides está na dieta
adotada pelos povos Mediterrâneos, onde o azeite de oliva é um dos maiores
componentes.
Existem estudos que relatam os benefícios do azeite puro de oliva em
patologias como câncer, especialmente de mama, estômago, cólon, endométrio e
ovário, patologias gastrointestinais como úlceras pépticas, colelitíase e motilidade
gástrica. O óleo de oliva diminui ainda o risco de artrite reumatóide e melhora a sua
evolução. Em indivíduos com diabetes melitus, o azeite de oliva aumenta a
sensibilidade à insulina, diminui a pressão sangüínea e reduz os níveis das
lipoproteínas aterogênicas (ZAMORA et al., 2004).
Estudos recentes demonstraram que o azeite de oliva extravirgem contém em
abundância compostos fenólicos antioxidantes como fenóis simples (hidroxitirosol,
tirosol), flavonóides, secoiridóides aldeídicos e lignanas (acetoxipinoresinol,
pinoresinol). Todas estas substâncias fenólicas são potentes inibidores do ataque de
espécies reativas de oxigênio (ERO). Existem evidências que as ERO estão
envolvidas na etiologia de neoplasias ligadas à gordura como o câncer de mama e
colorretal (OWEN et al., 2000). Este estudo, usando uma metodologia mais acurada
de cromatografia líquida de alta performance (HPLC) para quantificação de ERO,
demonstrou que os compostos fenólicos antioxidantes presentes no azeite de oliva
extravirgem são potentes inibidores da geração de radicais livres pela matriz fecal.
35
Estes achados indicam que o estudo da inter-relação entre ERO e antioxidantes da
dieta é uma área muito promissora para elucidação dos mecanismos envolvidos na
carcinogênese colorretal e para futuras estratégias de prevenção deste tipo de
câncer.
Segundo pesquisadores da Universidade do Estado de Michigan, o consumo
regular de cerejas, ricas em antioxidantes, tem o potencial de reduzir o risco de
doenças cardiovasculares e doenças crônicas como artrite e gota. Os mesmos
afirmam ainda que seu consumo diário tem o potencial de reduzir a dor relacionada
com a inflamação, artrite e gota (AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, 1999).
WANG e cols. (1999) demonstraram que a cianidina, um flavonóide presente
nas cerejas, possui uma significante atividade inibitória das enzimas COX-1 e
COX-2 com concentração inibitória 50% (IC
50
) de 90 e 60 M respectivamente,
quando comparadas a IC
50
de 1050 M para aspirina em ambos os testes. A inibição
preferencial deste flavonóide pela COX-2 pode ser útil para pacientes em uso
crônico de drogas antiinflamatórias não-esteroidais cujos efeitos adversos são
atribuídos em grande parte à inibição da COX-1.
A natureza tem sido uma fonte contínua de moléculas farmacologicamente
ativas e as plantas medicinais têm sido usadas por incontáveis gerações. Apesar
disso, surpreendentemente poucas plantas têm demonstrado atividade neuroativa.
Existem evidências experimentais de que a kava e os extratos de Ginkgo biloba
possuem atividade neuroprotetora (OYAMA et al., 1994; ASSEMI, 2001;
BASTIANETTO & QUIRION, 2002). No entanto, têm sido descritos vários efeitos
adversos para a kava e Ginkgo biloba (MASHOUR et al., 1998; MESEGUER et al.,
2002).
Evidências substanciais sugerem que o acúmulo de peptídeos derivados de
beta-amilóide e em menor extensão radicais livres, podem contribuir para etiologia
e progressão da doença de Alzheimer. BASTIANETTO e cols. (2000)
demonstraram que o extrato de Ginkgo biloba, rico em flavonóides e terpenos,
bloqueia completamente os eventos induzidos pela beta-amilóide como acumulação
de ERO e apoptose em cultura de células de hipocampo.
36
O perfil antioxidante dos flavonóides provavelmente é a base para a suas
atividades neuroprotetoras cerebrais. Sua biodisponibilidade e particularmente sua
presença no cérebro in vivo parece ter um papel importante na expressão da sua
capacidade neuroprotetora. É sabido que transformações metabólicas como
glicuronidação, metilação e outras reações são a regra, e uma pequena quantidade
de flavonóides livres como agliconas estão presentes no sangue (AZUMA et al.,
2002; OLIVEIRA et al., 2002). Entretanto, as barreiras cerebrais parecem ser um
obstáculo adicional para a penetração dos flavonóides no cérebro.
A quercetina é a molécula mais representativa do grupo dos flavonóides e
está presente em vegetais e frutas, com consumo diário de cerca de 25 mg/dia na
dieta humana (DAJAS et al., 2003). COSTA e cols. (2001) demonstraram que a
quercetina atravessa pobremente a barreira hemato-encefálica (BHE). Em um
estudo posterior DAJAS e cols. (2002) demonstraram que a mistura da quercetina
com a lecitina gera uma preparação lipossômica que aumenta a possibilidade deste
flavonóide de atravessar a BHE. Por conseguinte, o complexo quercetina/lecitina,
diminuiu o volume da lesão isquêmica em 56%, mostrando que esta mistura
atravessa eficazmente a BHE. Esta diminuição no volume da lesão foi similar
àquela obtida com o uso de bloqueadores de canal de cálcio (O’NEILL et al., 2001).
Dentre as poucas investigações do efeito de flavonóides no cérebro in vivo,
SHUTENKO e cols. (1999) caracterizaram mudanças nos níveis de NO em um
modelo de isquemia global com reperfusão, na presença de quercetina. Estas
mudanças foram atribuídas à ação deste flavonóide como varredor de radicais
livres. Também foi descrito o efeito benéfico da quercetina no choque endotóxico,
explicado pela inibição da lipoperoxidação, através do aumento da atividade da
glutationa peroxidase (ABDEL-GAWAD & CALIFA, 2001).
A capacidade dos flavonóides de inibirem a ação de diversas enzimas pode
ativar mecanismos sinalizadores de sobrevivência, exercendo um efeito antioxidante
indireto em adição a um efeito direto de varredor de ERO. É importante mencionar
ainda que os flavonóides também exercem seus efeitos ao nível de glia e vasos
cerebrais. Ao nível de microvasculatura, a atividade antioxidante e antiinflamatória
37
pode ser adicionada à vasodilatação, melhorando o fluxo sangüíneo e o processo
isquêmico (DAJAS et al., 2003).
Há ainda estudos que mostram que os flavonóides são usados como
ansiolíticos e antidepressivos (WOLFMAN et al., 1994; VIOLA et al., 1995;
BUTTERWECK et al., 2000).
Muitas outras atividades farmacológicas são descritas para os flavonóides,
dentre estas estão a anticancerígena. Embora muitos estudos confirmem que
concentrações significativas de flavonóides estejam presentes em vegetais como
cebola, couve galega, brócolis e feijões; em frutas como maçã e tomate; e em
bebidas como vinho e chás, não existem estudos conclusivos que mostrem o
potencial anticancerígeno destes constituintes alimentares. Contudo, três estudos
foram feitos com flavonóides presentes na dieta, no tratamento de cânceres
humanos.
O primeiro estudo mostrou que a genisteína, um flavonóide com atividade
estrogênica, presente nos grãos de soja, é capaz de bloquear a ação do fator
transcricional conhecido como fator ligante de CCAAT, neutralizando-o antes que o
início da leitura seja ativado, dessa forma a mesma faz com que a célula
cancerígena definhe, feneça e morra (COGHLAN, 1998). A genisteína não produz
efeitos danosos sobre células normais. Portanto, este flavonóide, comumente
consumido na dieta, é capaz de estabilizar o crescimento de células cancerígenas,
assim como parar o processo angiogênico.
Os outros dois estudos foram feitos com flavonóides, especialmente as
catequinas (flavan-3-ois), presentes em concentrações elevadas no chá. Cânceres
humanos necessitam de enzimas proteolíticas, como a uroquinase, para invadir
células e formar metástases. A inibição da uroquinase pela epigalocatequina-3-
galato (EGCG) em camundongos, diminui o tamanho do tumor e pode levá-lo até
mesmo a remissão completa. A EGCG age ligando-se a uroquinase, bloqueando a
histidina 57 e a serina 195 no seu sítio catalítico (JANKUN et al., 1997).
O segundo estudo feito com a EGCG mostrou que a mesma é capaz de
suprimir a angiogênese, um processo-chave requerido para o crescimento de novos
vasos sanguíneos necessários para alimentar o tumor, fazendo com que o mesmo
38
cresça e se metastise (CAO & CAO, 1999). Portanto, a EGCG pode ser um
importante constituinte da dieta agindo como preventivo para o crescimento de
muitos tipos de câncer no homem.
Os flavonóides são capazes de agir através de vários mecanismos sobre os
componentes sangüíneos, como plaquetas, lipoproteínas de baixa densidade (LDL)
e músculo liso. As plaquetas são participantes chave na aterogênese e como
mediadores pró-inflamatórios, visto que o TXA
2
, o PAF e a serotonina (5-HT) são
produzidos pelas mesmas. Os Flavonóides podem inibir a agregação, a adesão e a
secreção plaquetária (HARBORNE & WILLIAMS, 2000).
Outros flavonóides com atividade antiplaquetária incluem a isobavachalcona
e a neobavaisoflavona isoladas das folhas de Psoralea corylifolia (Leguminosae)
(TSAI et al., 1996). Ambos inibem a agregação plaquetária induzida por AA e PAF.
A luteolina, flavonóide isolado de Gentiana arisanensis, é um potente
antiagregante plaquetário, inibindo a agregação induzida por AA, PAF, colágeno
(COL) e trombina (TRB). A luteolina também inibe as contrações induzidas por
Ca
2+
e noradrenalina, além de relaxar as contrações sustentadas, induzidas por esta
última e por K
+
, em aorta isolada de ratos (LIN et al., 1997a).
Foi demonstrado que flavonóis como kaempferol, quercetina e miricetina
inibem a atividade da adenosina deaminase em células de aorta (MELZIG, 1996).
Com este resultado o autor sugere que muitas ações farmacológicas dos flavonóides
podem ser mediadas através da amplificação do efeito da adenosina endógena, via
receptores de adenosina, visto que a adenosina deaminase é responsável pela
inativação da adenosina. Muitos flavonóides como a miricetina e a gossipetina, são
ainda potentes inibidores da modificação oxidadativa das LDL pelos macrófagos
(HARBORNE & WILLIAMS, 2000).
Além da atividade antiespasmolítica em aorta de ratos, os flavonóides
também são conhecidos pelos seus benefícios como relaxantes da musculatura lisa
do trato respiratório e do trato gastrointestinal. Quatro flavonóis isolados de
Artemisia abrotanum (Labiatae), mostraram um efeito relaxante dose-dependente
das contrações induzidas pelo carbacol em traquéia isolada de cobaias
(BERGENDORFF & STERNER, 1995). Similarmente, a rutina e o 3-glicosídio da
39
quercetina, isolados de Conzya filaginoides (Compositae), inibiram de forma
concentração-dependente as contrações espontâneas em íleo de ratos (MATA et al.,
1997). A rutina ainda é conhecida por induzir relaxamento da musculatura lisa em
várias outras preparações in vitro, como cólon de cobaias e duodeno de ratos
(MATA et al., 1997).
Diversos flavonóides têm sido referidos como agentes hepatoprotetores. O
extrato metanólico das folhas de Combretum quadrangulare, rico em flavonas
apresentou significante atividade hepatoprotetora na morte celular induzida por D-
galactosamina/TNF- em cultura de hepatócitos de camundongos (BANSKOTA et
al., 2000). Os flavonóides isolados de Apocynum venetum também mostraram
potente atividade hepatoprotetora, inibindo a morte celular induzida por TNF-
(XIONG et al., 2000).
A propriedade antiviral dos flavonóides tem sido reconhecida por
aproximadamente 40 anos, mas somente nos últimos anos com o surgimento de
novos vírus, algumas modificações estruturais foram desenvolvidas para melhorar a
atividade e perfil farmacocinético destes compostos, além de tentar eliminar ou
diminuir sua toxicidade e mutagenicidade quando as mesmas existem (SELWAY,
1986). Alguns derivados flavônicos como as chalconas e flavonas, podem
apresentar atividade antiviral, inibindo seletivamente diferentes sorotipos de
rinovírus (BAUER et al., 1981).
Recentemente, muitos flavonóides tiveram suas atividades avaliadas contra o
vírus da imunodeficiência humana (HIV), o agente causador da síndrome da
imunodeficiência adquirida (AIDS), e alguns destes flavonóides parecem ter
atividade inibitória direta sobre este vírus. Este parece ser o caso da baicalina, uma
flavona isolada de Scutellaria baicalensis (LI et al., 1997). Outros flavonóides são
inibidores das enzimas responsáveis pela replicação viral. Por exemplo, as
biflavonas robustaflavona e hinokiflavona são ativos contra transcriptase reversa do
HIV-1 (LIN et al., 1997b). Já a quercetina, isolada da Acer okamatoanum é
inibidora da integrase do HIV-l (KIM et al., 1998).
Além da atividade antiviral, diversos flavonóides podem apresentar atividade
antimicrobiana. Por exemplo, a quercitrina, isolada de Euphorbia hirta
40
(Euphorbiaceae) e a cirsimarina, isolada de Microtea debilis (Phytolaccaceae) são
usadas para tratar vários tipos de infecções bacterianas, especialmente diarréias
infecciosas (HARBORNE & WILLIAMS, 2000). Além destas, o flavonóide 5, 7,
2’, 6’-tetrahidroxi-6-prenil-8-lavandulil-4’-metoxiflavanona inibe completamente o
crescimento de Staphylococcus aureus com concentrações inibitórias entre 1,56 e
6,25 g.mL
(IINUMA et al., 1994). Esta flavona é particularmente ativa contra
cepas de S. aureus resistentes a antibióticos, podendo ser útil no tratamento de
pacientes hospitalizados durante longos períodos, onde a infecção por este patógeno
é comum.
Um número substancial de novos antibióticos introduzidos no mercado é
obtido de fonte natural ou semi-sintética. Foi relatado que entre os anos de 1983 e
1994, de 93 novos agentes antibacterianos submetidos à análise pelo Food and
Drug Administration (FDA), 6 eram de origem natural (teicoplanina, muripocina,
miokamicina, carumonam, isepamicina e RV-11), 45 eram produtos semi-sintéticos
modelados a partir de compostos naturais, e 7 antivirais eram compostos sintéticos
baseados em estruturas de produtos naturais (CRAGG et al., 1997).
O screening antibacteriano sistemático de extratos de plantas, representa um
esforço contínuo na busca de novos compostos com potencial atividade contra
bactérias multirresistentes. Também têm sido relatados flavonóides com atividade
antifúngica. Três diprenilisoflavonas, 6,8-diprenilgenisteína, 6,3’-diprenilgenisteína
e a derrisisoflavona isoladas de Derris scandens (Leguminosae), se mostraram
ativas contra o patógeno humano, Trichophyton mentagrophytes TIMM1189
(SEKINE et al., 1999).
1.3.2 Chalconas
O termo chalcona é utilizado para caracterizar uma família de compostos que
possuem como núcleo fundamental o 1,3-diarilpropano, modificado pela presença
de uma ligação olefínica, de um grupamento cetona e/ou de um grupamento
hidroxila (Figura 3).
41
O
A
B
6'
4'
2'
5
3
'
Figura 3 – Núcleo fundamental das chalconas.
42
As chalconas são compostos precursores da via de biossíntese dos
flavonóides. Uma característica importante neste grupo é a pigmentação amarela
apresentada pelos mesmos, que passa a vermelha em meio alcalino. Essas
substâncias têm um papel importante em sistemas ecológicos em função das cores
que produzem nos vegetais, e são encontradas em diferentes órgãos, sobretudo nas
flores. As cores estão implicadas especialmente na polinização como atraentes de
insetos e/ou pássaros.
As chalconas apresentam uma grande variedade de atividades biológicas,
sendo as mais comuns edulcorantes ou protetores contra a luz e calor.
1.3.2.1 Farmacologia das chalconas
Além do papel sobre sistemas ecológicos e das atividades biológicas, as
chalconas têm despertado grande interesse farmacológico. Nos últimos anos, têm
sido documentadas as atividades: antiinflamatória, antinociceptiva, antitumoral,
antimicrobiana e antioxidante para várias chalconas e seus derivados sintéticos.
Dentre as várias chalconas com atividade antiinflamatória e antinociceptiva
podemos citar as chalconas presentes na fração isolada de Miracrodruon urundeuva
(VIANA et al., 2003b), a 3,4-diclorochalcona, com potente efeito na dor
inflamatória (CORREA et al., 2001), as chalconas derivadas de 2’-hidroxi e 2’,5’-
dihidroxichalcona que exibiram efeito antiinflamatório através da inibição da
liberação de beta-glicuronidase e lisozima a partir de neutrófilos estimulados com
formil-metil-leucil-fenilalanina/citocalasina B (fMLP/CB), e uma forte atividade
inibitória sobre a degranulação de mastócitos e formação de NO a partir de células
microgliais murinas estimuladas com lipopolissacarídeo (LPS) (HSIEH et al.,
2000), e ainda as chalconas dimetilamino-chalcona e 3,4,5-trimetoxi-4’-
fluorochalcona, que exercem seus efeitos aniinflamatórios através da inibição da
NOS indutível (NOSi) (ROJAS et al., 2002; ROJAS et al., 2003).
Foi demonstrado que a 4-dimetilamino-3’,4’-dimetoxichalcona, além de
apresentar efeito inibitório sobre o edema de pata induzido por carragenina, também
inibiu a migração e a liberação de fator de necrose tumoral alfa (TNF-) e
43
eicosanóides em bolsa de ar subcutânea estimulada com zimosan em camundongos
(HERENCIA et al., 2001).
A inibição da expressão de moléculas de adesão celular (CAM), incluindo as
intercelular CAM-1 (ICAM-1), vascular CAM-1 (VCAM-1), e E-selectina, é um
passo importante no controle de diversos processos inflamatórios. Estas proteínas de
adesão celular são induzidas por várias citocinas inflamatórias como TNF-, IL-1 e
LPS bacteriano. O processo de indução acontece primariamente ao nível
transcricional, onde o fator nuclear kappa B (NF-kB) tem o papel principal.
MADAN e cols. (2000) demonstraram que a 2’-hidroxichalcona inibe a adesão de
neutrófilos periféricos à monocamadas de células endoteliais através da inibição da
expressão da ICAM-1, VCAM-1 e E-selectina. A 2’-hidroxichalcona também inibe
a indução dos níveis basais de transcrição de ICAM-1, VCAM-1 e E-selectina pelo
TNF-, e ainda a ativação do NF-kB, principal fator transcricional envolvido na
expressão de CAM.
Muitos trabalhos têm demonstrado a atividade antimicrobiana das chalconas.
Dentre estas podemos citar a retrochalcona licochalcona C, com atividade
antibacteriana contra Staphylococcus aureus com concentração inibitória mínima de
6,25 g.mL
1
(HARAGUCHI et al., 1998). Essa chalcona estrogênica possui
atividade antitumoral e antiapoptótica, através da modulação da proteína bcl-2
(RAFI et al., 2000).
Existem muitos exemplos de flavonóides com atividade antifúngica, não só
contra patógenos humanos, mas também contra aqueles que parasitam plantas. É o
caso de duas chalconas: 2’-4’-dihidroxi-6’-metoxi-3’-5’-dimetilchalcona e a 2’-4’-
dihidroxi-6’-metoxi-5’-metilchalcona, presentes nas folhas de Myrica cerrata que
são inibidoras do crescimento de Cladosporium cucumerinum (GAFNER et al.,
1996).
Existem relatos de que algumas chalconas podem apresentar atividade
antiprotozoária. Os protozoários do gênero Trypanosoma causam um grande
espectro de doenças em hospedeiros humanos. O Trypanosoma brucei brucei,
transmitido pela mosca tsetse, causa uma doença responsável por um importante
problema de ordem econômica em algumas partes da África. Algumas chalconas
44
ativas in vitro e in vivo contra Plasmodium falciparum, também foram testadas no
crescimento de formas sangüíneas do T. b. brucei em cultura de células e em
modelo murino de tripanossomíase, para investigar sua habilidade em inibir a
tripanopaina-TB, a principal cisteína proteinase do T. b. brucei (TROEBERG et al.,
2000). Os resultados deste trabalho demonstraram que muitas chalconas inibiram o
crescimento in vitro e in vivo do T. b. brucei, sugerindo que as mesmas são
promissores agentes quimioterápicos antitripanossomíase.
Dos frutos de Neoraputia magnifica var. magnifica, foram isoladas duas
novas chalconas, e várias chalconas de estrutura já conhecida. Todas essas
substâncias foram testadas e mostraram-se ativas como inibidores da enzima
glicossomal gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase do Trypanosoma cruzi, agente
causador da doença de Chagas (TOMAZELA et al., 2000).
Muitos modelos são utilizados para pesquisa de agentes antitumorais
citotóxicos. Da mesma forma, existem muitas plantas da medicina popular usadas
para tal finalidade. Nos últimos anos, vários constituintes ativos destas plantas
foram isolados e identificados.
Dentre os flavonóides, as chalconas têm sido relatadas como compostos
atraentes com propriedades quimioprotetoras e antitumorais. As chalconas 4,2’,6’-
trihidroxi-4’-metoxidihidrochalcona, 2’,6’-dihidroxi-4’-metoxidihidro-chalcona, e
2’,4’-diacetoxichalcona, isoladas das partes aéreas de Ononis natrix ssp.
ramosissima (Leguminosae), apresentam moderada atividade citotóxica contra P-
388 (leucemia murina), A-549 (carcinoma de pulmão de não-pequenas células
humano) e HT-29 (câncer de colon humano). Entretanto, o composto mais potente,
a 2’,6’-diacetoxi-4,4’-dimetoxidihidrochalcona, mostrou atividade seletiva pela
linhagem de células P-388 (BARRERO et al., 1997).
A chalcona 3,4,3’,4’,5’-pentametoxichalcona é um potente agente citotóxico
que atua ligando-se à tubulina, impedindo a montagem dos microtúbulos
(LAWRENCE et al., 2000). A chalcona pedicina (2’,5’-dihidroxi-3’,4’,6’-
trimetoxichalcona) isolada das folhas de Fissistigma languinosum (Annonaceae),
também age ao nível de tubulina, interrompendo a montagem destas subunidades
em microtúbulos (ALIAS et al., 1995). Nesta mesma planta foram descobertas duas
45
novas chalconas condensadas, fissistina e isofissistina, citotóxicas contra células KB
(ALIAS et al., 1995).
Com base em sua descoberta de que a licochalcona A isolada de Xin-jiang
licorice possui atividade antiinflamatória e antitumorigênica, SHIBATA (1994)
sintetisou e estudou a atividade antitumoral in vitro e in vivo de 40 chalconas
derivadas da licochalcona A. Os resultados obtidos demonstraram que muitos destes
compostos possuem uma grande potência em inibir a tumorigênese. Dentre estes
estão a 3’-metil-3-hidroxichalcona e a 4’-metil-3-hidroxichalcona, que além de
inibir a fosforilação de fosfolipídeos promovida pelo acetato de tetradecanoilforbol
(TPA) em células HeLa in vitro e o crescimento de tumores em pele de
camundongos iniciados com dimetilbenz[a]-antraceno e promovidos por TPA,
também apresentam uma marcante atividade inibitória sobre a proliferação de
células HGC-27 (câncer gástrico humano).
Evidências epidemiológicas sugerem claramente uma relação inversa entre a
ingestão de flavonóides e risco cardiovascular. LEBEAU e cols. (2000)
demonstraram que vários flavonóides possuem forte atividade antioxidante e que
dentre estes as chalconas apresentam melhor atividade, com doses efetivas (ED
50
)
menores que as da vitamina E e da quercetina. As chalconas encontradas no lúpulo
também apresentam atividade inibitória sobre a oxidação de LDL humanas. Este
efeito é bem maior que aquele apresentado pela vitamina E e pela genisteína
(MIRANDA et al., 2000).
Há ainda chalconas com atividade antiplaquetária. TAWATA e cols. (1992)
demonstraram a ação antiagregante plaquetária da isoliquiritigenina, uma inibidora
da aldose redutase, purificada de Glycyrrhizae radix (licorice). Este agente inibe a
agregação de plaquetas in vitro, não só pela inibição da atividade da COX como
também da LOX ou peroxidase em plaquetas. A isoliquiritigenina também
apresenta ação antiplaquetária in vivo.
Com base nestes dados e considerando a ausência de estudos farmacológicos
sobre a espécie Lonchocarpus sericeus (Poir.) Kunth, e sabendo que a fração
hexânica de suas raízes é rica em flavonóides, particularmente chalconas, e que as
mesmas, de uma forma geral, apresentam uma grande variedade de efeitos
46
farmacológicos, resolvemos investigar suas ações farmacológicas, visto que esta
planta é rica em flavonóides, particularmente nas chalconas lonchocarpina e
derricina.
47
Objetivos
48
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
O presente trabalho tem como objetivo geral estudar os efeitos
farmacológicos da fração hexânica das cascas das raízes de Lonchocarpus sericeus
(Poir.) Kunth, assim como das chalconas lonchocarpina e derricina, seus principais
constituintes.
2.2 Específicos
Como objetivos específicos procuramos:
Obter e purificar a fração hexânica a partir das cascas das raízes de
Lonchocarpus sericeus (Poir.) Kunth (FLS) e isolar as chalconas
lonchocarpina (LCC) e derricina (DRC) a partir desta fração, etapa
realizada no Departamento de Química Orgânica e Inorgânica da UFC;
Determinar a toxicidade aguda e os efeitos comportamentais da FLS em
camundongos;
Verificar a ocorrência de atividade citotóxica da FLS, e das chalconas
LCC e DRC, utilizando os ensaios de desenvolvimento embrionário de
ovos de ouriço-do-mar, inibição da proliferação de células tumorais in
vitro, atividade hemolítica em eritrócitos de camundongos e atividade
antimicrobiana;
Avaliar do ponto de vista farmacológico os efeitos da FLS em diversos
modelos de inflamação como edema de pata, peritonite, colite e
granuloma induzidos em ratos;
Estudar a atividade analgésica da FLS em diversos modelos de
nocicepção tais como teste das contorções abdominais, teste da formalina
e teste da placa quente em camundongos;
49
Determinar o efeito sedativo da FLS no teste do campo aberto, rota-rod
e tempo de sono induzido por barbitúrico;
Verificar a atividade antiagregante plaquetária da FLS e de suas
chalconas LCC e DRC;
Determinar o efeito da administração sistêmica da FLS sobre o número
de plaquetas em sangue total de camundongos;
Avaliar o efeito da FLS, e das chalconas LCC e DRC sobre o tempo de
protrombina in vitro em plasma humano;
E delinear, quando possível, os mecanismos de ação envolvidos nos
efeitos observados com a FLS e com as chalconas LCC e DRC.
50
Material
51
3 MATERIAL
3.1 Material botânico
Amostras das raízes, folhas e frutos de Lonchocarpus sericeus (Poir.) Kunth
foram coletadas no mês de agosto de 1998, as margens da BR 222, na cidade de
Caucaia, estado do Ceará da região nordeste do Brasil e a identificação botânica foi
realizada pelo professor doutor Edson de Paula Nunes do Departamento de Biologia
da UFC, cuja exsicata de número 31.018 está depositada no Herbário Prisco Bezerra
do departamento supracitado.
3.2 Fração hexânica de Lonchocarpus sericeus (Poir.) Kunth e seus
constituintes
A obtenção da fração hexânica a partir das cascas das raízes de Lonchcarpus
sericeus (FLS) e a purificação das chalconas lonchocarpina (LCC) e derricina
(DRC) foram realizadas pelo grupo de pesquisas em Química Orgânica e Inorgânica
da UFC, coordenado pelo professor doutor Edilberto Rocha Silveira.
3.3 Animais
Camundongos albinos (Mus musculus), variedade Swiss-Webster, adultos, de
ambos os sexos, pesando entre 20 e 30 g e ratos albinos (Rattus norvegicus),
variedade Wistar, adultos, de ambos os sexos, pesando de 150 a 220 g, oriundos do
Biotério Central da UFC, foram mantidos em caixas plásticas, no Biotério do
Departamento de Fisiologia e Farmacologia, a temperatura de aproximadamente
26C, com ciclo claro/escuro de 12 horas, recebendo ração padrão (Purina Chow) e
água ad libitum. Os experimentos foram conduzidos de acordo com as normas
estabelecidas pelo COBEA (COLÉGIO BRASILEIRO DE EXPERIMENTAÇÃO
ANIMAL, 2004).
52
3.4 Sangue humano
Amostras de sangue foram obtidas de voluntários saudáveis do Departamento
de Fisiologia e Farmacologia e do Laboratório Central do Hospital Universitário
Walter Cantídio da Faculdade de Medicina da UFC. Os voluntários relataram não
estar fazendo uso de drogas que pudessem prejudicar o estudo.
3.5 Reagentes e Drogas
As drogas e reagentes utilizados foram de grau analítico e encontram-se
abaixo relacionados com suas respectivas procedências:
PRODUTO ORIGEM
- Ácido acético Grupo Química, Brasil
- Ácido acetilsalicílico (AAS) CEME, Brasil
- Ácido araquidônico Helena Laboratories, USA
- Ácido clorídrico Merck, Alemanha
- Ácido sulfúrico Reagen, Brasil
- Adrenalina Sigma, USA
- Albumina sérica bovina Sigma, USA
- Bradicinina Sigma, USA
- Brometo de hexadeciltrimetilamônio Sigma, USA
- Carbonato de sódio Grupo Química, Brasil
- Carragenina ()
Sigma, USA
- Cefalotina Cecom, Brasil
- Cetoconazol (Nizoral)
Janssen-Cilag Farmacêutica, Brasil
- Ciproeptadina Sigma, USA
- Cloreto de potássio Reagen, Brasil
- Cloreto de sódio Reagen, Brasil
- Colágeno Helena Laboratories, USA
53
- Corante Panótico Laborclin, Brasil
- Cremophor EL Sigma, USA
- Dexametasona (Decadron)
Promode Química Farmacêutica,
Brasil
- Dextrano (PM 17.200) Sigma, USA
- -Diasidina
Sigma, USA
- Difosfato de adenosina (ADP) Sigma, USA
- Éter etílico Vetec, Brasil
- Formalina Synth, Brasil
- Fosfato de potássio dibásico Reagen, Brasil
- Fosfato de potássio monobásico Reagen, Brasil
- Fosfato de sódio dibásico Reagen, Brasil
- Fosfato de sódio monobásico Reagen, Brasil
- Gentamicina Cecom, Brasil
- Heparina 5.000 UI Roche, Brasil
- Hidróxido de sódio Reagen, Brasil
- Indometacina Sigma, USA
- Kit para determinação do tempo de
protrombina (Replastin e CaCl
2
)
Labtest, Brasil
- L-arginina Sigma, USA
- Levedura de cerveja (Yeast Tipo II) Sigma, USA
- L-NAME (N-nitro-L-arginina-metil-ester)
Sigma, USA
- Meio de cultura RPMI 1640 Cultilab, Brasil
- Metanol Synth, Brasil
- MTT (brometo de 3-(4’,5’-dimetiltiazol-2’-
il)-2,5-difeniltetrazólio) Sigma, USA
- Naloxona Sigma, USA
- N-Formil-metionil-leucil-fenilalanina
(fMLP) Sigma, USA
- Nitrogênio Líquido CENAUREMN – UFC, Brasil
- Pentoxifilina (Trental) Aventis, Brasil
54
- Peróxido de hidrogênio Synth, Brasil
- Soro fetal bovino Cultilab, Brasil
- Sulfato de morfina (Dimorf)
Cristália, Brasil
- Talidomida CEME, Brasil
- Triton X-100 Sigma, USA
- Trombina Helena Laboratories, USA
- Tween 80 Sigma, USA
3.6 Composição de soluções, corantes e tampões
Corante de Turk
- Ácido acético glacial 15 mL
- Violeta de genciana a 2 % 2 mL
- Água destilada q.s.p. 500 mL
Solução salina
- Cloreto de sódio 0,9 g
- Água destilada q.s.p. 100 mL
Solução salina para hemólise
- Cloreto de sódio 0,85 g
- Cloreto de cálcio 10 mM
- Água destilada q.s.p. 100 mL
Solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4
- Cloreto de sódio 8 g
- Cloreto de potássio 0,2 g
55
- Fosfato de sódio dibásico 1,15 g
- Fosfato de sódio monobásico 0,2 g
- Água deionizada q.s.p. 1000 mL
Solução para homogeneizar o cólon onde será determinada a atividade
da enzima mieloperoxidase (MPO)
- Brometo de hexadeciltrimetilamônio (HTAB) 5 g
- Fosfato de potássio dibásico 8,71 g
- Fosfato de potássio monobásico 6,81 g
- Água destilada q.s.p. 1000 mL
Solução para determinação da atividade da enzima MPO
- -diasidina
0,167 g
- Peróxido de hidrogênio 1,67 mL
- Fosfato de potássio dibásico 8,71 g
- Fosfato de potássio monobásico 6,81 g
- Água destilada q.s.p. 1000 mL
3.7 Material permanente e equipamentos utilizados
- Agitador de tubos Mod. 251 – Fanem, Brasil
- Agregômetro e registrador Mod. 450 – Chrono-log Co., USA
- Autoclave Soc. Fabbe Ltda., Brasil
- Balança analítica Mod. ADA 210/L – Adam Equipment
Ltda., United Kingdom
- Banho-Maria com agitador Mod. G76 – New Brunswick Scient., USA
- Centrífuga Mod. 215 – Fanem, Brasil
- Centrífuga refrigerada Mod. 5500 DR – Cientec, Brasil
- Contador manual de células GEMMY Ind. Corp., Taiwan
56
- Cronômetros Technos, Brasil
- Estufa de secagem e esterilização Mod. 315 SE – Fanem, Brasil
- Espectrofotômetro
Mod. DU
640 B – Beckman, USA
- Homogeneizador de tecidos Mod. Polytron PT10-35-9500 – Kinematica
AG Littau, Suiça
- Material cirúrgico -
- Microscópio óptico Mod. YS2 T – Nikon, Japão
- Placa quente Mod. DS37-Ugo Basile, Itália
- pHmetro Mod. B 374 – Micronal, Brasil
- Pipetas automáticas Várias marcas
- Pletismógrafo Mod. 7150 – Ugo Basile, Itália
- Rota-rod Mod. 7650 – Ugo Basile, Itália
- Sonicador Mod.MS 200 – Thornton Inpec Eletrônica
Ltda., Brasil
- Vidraria -
57
Métodos
58
4 MÉTODOS
4.1 QUÍMICOS
4.1.1 Obtenção da fração hexânica das cascas das raízes de Lonchocarpus
sericeus (Poir.) Kunth
A fração hexânica obtida a partir das cascas das raízes de Lonchocarpus
sericeus (FLS) foi preparada pelo grupo de pesquisa do Depto. de Química
Orgânica e Inorgânica da UFC, orientado pelo professor doutor Edilberto Rocha
Silveira, de acordo com as seguintes etapas:
separação das cascas das raízes;
secagem das cascas à temperatura ambiente;
trituração mecânica das cascas das raízes (1 kg);
extração exaustiva com hexano à temperatura ambiente;
concentração do extrato hexânico através da destilação do solvente sob
pressão reduzida, fornecendo 24,6 g de um líquido viscoso amarelo
denominado LSCR-H.
4.1.1.1 Tratamento cromatográfico do extrato hexânico das cascas das raízes
de Lonchocarpus sericeus (LSCR-H)
Uma alíquota do LSCR-H (20,6 g) foi pulverizada em gral de porcelana,
adsorvida em 40 g de gel de sílica e devidamente acondicionada sobre 60 g de gel
sílica em coluna cromatográfica de 500 mL. Na eluição foram utilizados os
seguintes solventes: hexano, hexano/clorofórmio 1:1 e clorofórmio. Os resultados
obtidos estão dispostos na tabela abaixo (Tabela 2).
59
Tabela 2 – Tratamento cromatográfico do extrato hexânico obtido das
cascas das raízes de Lonchocarpus sericeus
Eluente Peso (g) Denominação
Hexano 4,8 LSCRH-H
Hexano/Clorofórmio 1:1 14,8 LSCRH-HC
Clorofórmio 0,1 LSCRH-C
Total 19,7
(MARTINS DE SOUSA, 2003).
Neste trabalho, das três frações obtidas a partir do LSCR-H, estudamos a
fração hexânica das cascas das raízes de L. sericeus, denominada pelo grupo de
química como LSCRH-H e por nós como FLS, durante o restante do texto desta
tese.
4.1.2 Obtenção das chalconas lonchocarpina e derricina a partir da fração
hexânica de Lonchocarpus sericeus
As chalconas, lonchocarpina (LCC) e derricina (DRC) foram isoladas e
identificadas a partir da fração hexânica de L. sericeus (FLS), segundo o método
descrito por MARTINS DE SOUSA (2003) (Figura 4). A FLS (4,8 g), obtida como
descrito em 4.1.1.1, foi pulverizada em gral de porcelana, adsorvida em 4,5 g de
sílica e acondicionada em 57 g de gel de sílica em coluna de 250 mL. As frações (1
– 7) foram eluídas com hexano, (8 – 12) com hexano/Clorofórmio (CHCl
3
) 1:1, (13
– 15) com hexano/CHCl
3
70%, (16 – 19) com CHCl
3
, (20 – 24) com acetato de etila
(AcOEt) e (25 – 26) com metanol (MeOH). Após monitoramento em
cromatografias em camada delgadas (CCD) foi possível o agrupamento das frações
60
60
Figura 4 – Representação esquemática da obtenção das chalconas
lonchocarpina (LCC) e derricina (DRC) a partir da fração hexânica de
Lonchocarpus sericeus (FLS).
LSCR-H
LSCRH-CH LSCRH-C
LS-3
LS-4
LS-1
(
LCC
)
Sucessivas
cromatografias
Sucessivas
cromatografias
Coluna
cromatográfica
Extração com Hexano
Evaporação do solvente
CASCAS DAS RAÍZES DE Lonchocarpus sericeus
LSCRH-H
(FLS)
LS-2
(
DRC
)
61
61
com o mesmo perfil cromatográfico. A fração obtida (12 – 17, FLS) (1,81 g) foi
então pulverizada em gral de porcelana, adsorvida em 30 g de gel de sílica e
acondicionada numa coluna cromatográfica. As frações (1 – 5) foram eluídas com
éter de petróleo (EP)/AcOEt 5%, (21 – 24) com EP/AcOEt 10%, (25 – 40)
EP/AcOEt 1:1, (41 – 43) com AcOEt e 44 com MeOH. Após monitoramento em
CCD, foi possível o agrupamento das frações com mesmo perfil cromatográfico. A
fração (10 – 11, 12 – 17, FLS) (814 mg), mostrou-se uniforme na cromatoplaca,
onde após evaporação do solvente, em condições ambiente, houve a formação de
cristais alaranjados. Denominou-se esta fração de LS-1 (lonchocarpina ou [2”,2”-
Dimetildiidropirano (5”,6” : 3’,4’)-2’-hidroxichalcona]).
A fração (21 – 24, FLS) (670 mg), após análise em CCD, foi transferida para
um erlenmeyer de 50 mL e diluída em 12 mL de etanol à quente. Após completa
dissolução do material deixou-se esfriar em condições ambiente, onde após
aproximadamente 1 h, houve formação de cristais amarelados que foram separados
da água-mãe. A fração constituída pelos cristais, quando analisada por CCD,
mostou-se pura e foi denominada de LS-2 (derricina ou [3’-(3,3-Dimetilalil)-2’-
hidroxi-4’-metoxichalcona]).
As estruturas mostradas na Figura 5 foram sugeridas após extensiva análise
de ressonância magnética nuclear (RMN), incluindo técnicas uni e bidimensionais
(COSY, HMBC e HMBQ).
A correlação heteronuclear dos espectros de RMN
1
H (500 MHz) e
13
C-BB
(125 MHz) para LCC e DRC são mostrados nas Tabelas 3 e 4.
A FLC, a LCC e a DRC foram suspensas em Cremophor EL (crel)
(concentração máxima de 5%) ou Tween 80 (concentração máxima de 2%) e usadas
nos testes farmacológicos. O veículo referente a cada experimento foi usado como
controle.
62
62
O
OH
MeO
Derricin
(b)
O
O
OH
Lonchocarpin
(a)
Figura 5 – Estrutura Química da Lonchocarpina (a) e Derricina (b).
Lonchocarpina Derricina
(a) (b)
63
63
Tabela 3 – Correlação Heteronuclear
1
H-
13
C (HMQC e HMBC) da
Lonchocarpina
1
H-
13
C – HMQC –
1
J
CH
1
H-
13
C – HMBC –
n
J
CH
(n 2)
C
C H
2
J
CH
3
J
CH
1
134,9 -
H- H-
2
128,5 7,62 (m) H-3
H-; H-4
3
129,0 7,40 (m) - -
4
130,7 7,40 (m) - -
5
129,0 7,40 (m) - -
6
128,5 7,62 (m) H-5
H-; H-4
120,7 7,54 (d, J = 15,5 Hz)
H-
-
144,1 7,85 (d, J = 15,5 Hz)
H-
-
C=O
192,0 -
H- H-; H-6
1
114,1 - -
O-H
fen.
; H-5
2
161,1 - O-H
fen.
-
3
109,5 -
-
O-H
fen.
; H-5′ e H-3′
4
159,9 -
H-5 H-4; H-6′
5
108,4 6,37 (d, J = 8,9 Hz) - -
6
130,6 7,70 (d, J = 8,9 Hz) -
H-
2
77,9 -
CH
2
-H; H-3 H-4
3
128,1 5,57 (d, J = 10 Hz) - CH
2
-H
4
115,9 6,74 (d, J = 10 Hz) - CH
2
-H
CH
3
28,4 1,45 (s) - -
2-OH
- 13,67 - -
(MARTINS DE SOUSA, 2003).
64
64
Tabela 4 – Correlação Heteronuclear
1
H-
13
C (HMQC e HMBC) da
Derricina
1
H-
13
C – HMQC –
1
J
CH
1
H-
13
C – HMBC –
n
J
CH
(n 2)
C
C H
2
J
CH
3
J
CH
1
135,0 -
H- H-; H-3; H-5
2
128,5 7,60 (m) H-3
H-; H-4
3
129,0 7,40 (m) H-4 -
4
130,5 7,40 (m) - H-2; H-6
5
129,0 7,40 (m) H-4 -
6
128,5 7,60 (m) H-5
H-; H-4
120,7 7,56 (d, J = 15,5 Hz)
H-
-
144,1 7,85 (d, J = 15,5 Hz) - H-2; H-6
C=O
192,3 -
H- H-; H-6
1
114,7 -
H-6 O-H
fen.
; H-5
2
163,1 - O-H
fen.
H-6
3
117,7 -
H-1
O-H
fen.
4
163,4 -
H-5 H-1; -OCH
3
5
102,2 6,47 (d, J = 9 Hz) - -
6
129,3 7,70 (d, J = 9 Hz) - -
1
21,8 3,38 (d, J = 7,1 Hz)
H-2
-
2
122,2 5,23 (t)
H-1
2 (CH
2
-H)
3
131,8 - 2 (CH
2
-H)
H-1
CH
3
25,8 1,79 (s) -
H-2
CH
3
17,9 1,68 (s) -
H-2
4-OCH
3
55,8 3,9 (s) - -
2-OH
- 13,41 - -
(MARTINS DE SOUSA, 2003).
65
65
4.2 TOXICOLÓGICOS
4.2.1 Avaliação da toxicidade aguda e efeitos comportamentais da fração
hexânica de Lonchocarpus sericeus em camundongos
Foram utilizados camundongos Swiss, fêmeas (20 – 30g), escolhidos ao
acaso, separados em grupos de 10 animais e mantidos previamente em jejum por 12
horas. A FLS foi administrada por via oral (v.o.), nas doses de 300, 400, 600, 700,
750, 800, 1000, ou 1500 mg/kg, e por via intraperitoneal (i.p.), nas doses de 300,
400, 600, 800 ou 1000 mg/kg, num volume de 10 mL/kg de peso. O grupo controle
recebeu volume equivalente de veículo (crel 5%). Todos os grupos foram
observados durante 120 minutos após administração da FLS, e em intervalos
previamente estabelecidos durante 72 horas.
Os animais foram observados quanto às alterações comportamentais,
alterações nos padrões fisiológicos de evacuação e micção e quanto ao número de
mortes ocorridas no período de 72 h. A Dose Letal para 50% dos animais (DL
50
) foi
calculada segundo o método do probito (MILLER & TAINTER, 1944).
4.2.2 Avaliação da citotoxicidade da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus,
lonchocarpina e derricina
4.2.2.1 Determinação do potencial antimitótico da fração hexânica de
Lonchocarpus sericeus, lonchocarpina e derricina em ovos do ouriço-do-mar
Lytechinus variegatus
A espécie de ouriço-do-mar Lytechinus variegatus (Filo Echinodermata,
Classe Echinoidea e Subclasse Euechinoidea) (RUPERT & BARNES, 1996), foi
selecionada para a utilização em testes de toxicidade por ser facilmente mantida em
laboratório, apresentar-se fértil o ano todo, e por possuir ovos pouco pigmentados,
viabilizando assim, a execução de ensaios com seus gametas. Os óvulos apresentam
uma coloração alaranjada enquanto que os espermatozóides apresentam-se
66
66
esbranquiçados. A membrana de fecundação dos ovos é facilmente visualizada ao
microscópio, assim como as várias fases da embriogênese (Figura 6). O uso deste
modelo permite avaliar o efeito inibitório em diferentes níveis do processo mitótico,
instigando inclusive sobre o mecanismo de ação das substâncias (JIMENEZ et al.,
2003).
Para o procedimento experimental, os espécimens de Lytechinus variegatus
foram coletados na praia do Pecém, na costa leste do estado do Ceará. A eliminação
dos gametas foi induzida pela injeção de 3 mL de KCl 0,5 M na cavidade celômica
dos animais. Após a eliminação, os óvulos foram lavados por três vezes, em uma
proveta com água do mar filtrada, para remoção da camada gelatinosa. Os
espermatozóides concentrados foram mantidos em baixa temperatura até o
momento do uso. Após a última lavagem, os óvulos foram ressuspendidos em 50
mL de água do mar filtrada e a fecundação realizada pela adição de 1 mL da
suspensão de espermatozóide (0,01 mL da suspensão concentrada + 2,49 mL de
água do mar filtrada) à 100 mL da suspensão de óvulos. Após cerca de 2 min, a
fecundação foi confirmada pela presença da membrana vitelínica, através da
observação de uma amostra das células ao microscópio. Um mililitro da suspensão
de ovos foi distribuído numa multiplaca com 24 cavidades, contendo a FLS, LCC
ou DRC e incubados num volume final de 2 mL, mantidos à temperatura ambiente
(26 2C) sob agitação constante (modificado de MALPEZZI et al., 1994). A FLS,
LCC e DRC foram testadas nas concentrações finais de 1 a 100 g.mL
. Nos
intervalos correspondentes às fases da primeira e terceira divisão e de blástula,
alíquotas de 0,2 mL foram fixadas em formol 10%, e foram contados cem ovos em
cada amostra para obtenção da porcentagem de células normais.
4.2.2.2 Inibição da proliferação de células tumorais in vitro pela fração
hexânica de Lonchocarpus sericeus, lonchocarpina e derricina
A atividade citotóxica da FLS, LCC e DRC foi avaliada em células de
leucemia linfocítica de origem humana (CEM), usando o ensaio do MTT
67
67
Figura 6 – Fases da embriogênese de ovos de ouriço-do-mar Lythechinus
variegatus.
Em A, óvulo não fecundado; em B, ovo fecundado, podendo-se
visualizar a membrana de fecundação; em C, estágio de duas células; em D, estágio
de quatro células; em E, estágio de oito células; e em F, estágio de blástula,
podendo-se observar a blastocele.
A B
C
D E
F
100
m
68
68
(brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio) (MOSMANN, 1983).
Este ensaio, utilizado para determinar citotoxicidade, proliferação e ativação
celular, é baseado na análise colorimétrica que quantifica indiretamente as células
viáveis, através da conversão de um sal de cor amarela, o MTT a formazan, de
coloração púrpura, pela atividade da enzima succinil-desidrogenase presente nas
mitocôndrias ativas das células vivas.
A linhagem celular CEM utilizada para a avaliação da citotoxidade da FLS,
LCC e DRC foi cultivada em frascos plásticos para cultura (75 cm
2
, volume de 250
mL) em meio de cultura RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino e
1% de antibióticos. As células foram incubadas em estufa a 37C sob atmosfera de
5% de CO
2
, tendo sido observado o crescimento celular em um microscópio de
inversão a cada 24 h. Quando necessário, as células eram repicadas em novo meio
de cultura, em concentrações de 0,5 – 1,0 x 10
6
cels.mL
(BUTLER & DAWSON,
1992). As células foram plaqueadas em multiplacas de 96 poços numa densidade de
0,3 x 10
6
cels.mL
ou 1x 10
6
cels.mL
, para células em suspensão ou aderidas,
respectivamente. A FLS, LCC e DRC (10 – 100 g.mL
) foram incubadas
juntamente com a suspensão de células, por 24 h. A seguir, as placas foram
centrifugadas (1000 rpm/5 min), o sobrenadante descartado e cada poço recebeu
200 l da solução de MTT (0,5 mg.mL
). As placas foram incubadas novamente
por mais 3 h, ao fim das quais as mesmas foram novamente centrifugadas, o
sobrenadante desprezado e o precipitado resuspendido em 150 l de dimetil
sulfóxido (DMSO). Para quantificação do sal reduzido nas células viáveis, as
absorbâncias foram lidas com o auxílio de espectrofotômetro de placa a um
comprimento de onda de 550 nm.
4.2.2.3 Avaliação do potencial hemolítico da fração hexânica de Lonchocarpus
sericeus, lonchocarpina e derricina em eritrócitos de camundongos
Este procedimento, modificado de BERLINCK e cols. (1996), permite
avaliar o potencial das substâncias em análise, de causar danos à membrana celular,
através da formação de poros ou de sua ruptura total.
69
69
O sangue utilizado no teste foi coletado de camundongos Swiss (25 - 30 g),
através do plexo orbital e diluído em 30 volumes de solução de NaCl 0,85%
contendo CaCl
2
10 mM. Os eritrócitos foram lavados 2 vezes em solução salina por
centrifugação (5000 rpm/3 min) para redução da contaminação plasmática e
resuspendidos em solução salina para se obter uma suspensão de eritrócitos a 2%.
Para realização deste experimento foram utilizadas multiplacas com 96 poços, onde
cada poço da primeira fileira recebeu 100 l da solução salina (controle). Na
segunda fileira, os poços receberam 50 l da solução salina e 50 l do veículo (crel
0,1%). Aos poços da terceira fileira, foram adicionados 50 l da FLS, LCC e DRC e
diluídos à metade com solução salina. Essa mesma diluição serial foi feita da quarta
até a décima primeira fileira, de modo que as substâncias em análise foram testadas
nas concentrações de 0,5 – 250 g.mL
. Os poços da última fileira receberam 50 l
de triton X-100 a 0,2% (controle positivo). Em seguida, 50 l da suspensão de
eritrócitos 2% foram plaqueados em todos os poços. Após incubação de 30 min, sob
leve agitação, a temperatura ambiente (26 2C), as amostras foram centrifugadas
(5000 rpm/3 min) e o sobrenadante transferido para outra placa para proceder-se à
medida da absorbância em espectrofotômetro a 540 nm.
4.2.2.4 Determinação da atividade antimicrobiana da fração hexânica de
Lonchocarpus sericeus, lonchocarpina e derricina
O estudo da atividade antimicrobiana da FLS, LCC e DRC foi realizado
segundo o ensaio de difusão em agar Mueller Hinton (BAUER et al., 1996),
utilizando os microorganismos Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Candida
albicans. Em resumo, os microorganismos foram ressuspendidos em água estéril
seguindo a escala de 0,5 MacFarland (10
8
Unidades Formadoras de Colônia/mL) e
sedimentados em agar. Vinte e cinco microlitros das soluções de FLS, LCC e DRC
(1,25 –5 g.l
) foram aplicados em poços perfurados (diâmetro 6 mm) no agar
sedimentado e após 18 h de incubação a 37
o
C, as inibições das zonas de
crescimento foram medidas. A gentamicina (10 g/disco) e a cefalotina (30
70
70
g/disco) foram utilizadas como agentes antibacterianos padrões contra E. coli e S.
aureus respectivamente. O cetoconazol (nizoral) (10 g/25 l) foi usado como
antifúngico padrão contra C. albicans.
4.3 FARMACOLÓGICOS
4.3.2 Atividade antiinflamatória
4.3.2.1 Edema de pata induzido por dextrano em ratos
O modelo de edema de pata induzido por dextrano (DX) foi realizado
segundo o método descrito por PARRATT E WEST (1958). Foram utilizados ratos
Wistar, fêmeas (150 - 200 g), escolhidos aleatoriamente e divididos em grupos de 6
animais cada. As patas direitas traseiras foram marcadas ao nível da borda póstero-
proximal da proeminência do calcanhar e seus volumes (mL) foram medidos por
meio de pletismógrafo (V
I
).
Os animais foram tratados por via i.p. com a FLS (100 e 200 mg/kg) ou, por
v.o. com ciproeptadina como controle positivo (10 mg/kg), num volume de 10
mL/kg de peso. O grupo controle recebeu crel 5%, em volume correspondente aos
demais grupos. Sessenta minutos após o tratamento por v.o. ou trinta minutos após
o tratamento i.p., os animais receberam uma injeção intraplantar de 0,1 mL de uma
solução de DX a 1,5% p/v. O volume das patas direitas foi medido antes da injeção
do agente inflamatório (V
I
) e nos períodos de ½, 1, 2, 3 e 4 horas após a injeção
(V
F
). O volume do edema (V
E
), decorrente de uma reação inflamatória aguda, foi
determinado, para todos os grupos, pela diferença entre o volume final (V
F
) e
volume inicial (V
I
) das patas, nos períodos de tempo pré-determinados.
V
E
= V
F
V
I
71
71
4.3.2.2 Edema de pata induzido por bradicinina em ratos
O edema de pata foi induzido em ratos Wistar fêmeas, divididos em grupos
de 7 animais cada, pela injeção intraplantar de bradicinina (BK), segundo CAMPOS
E CALIXTO (1995). Inicialmente, os animais tiveram suas patas direitas traseiras
medidas em um pletismógrafo, como descrito em 4.2.1. Os mesmos foram pré-
tratados com captopril (5 mg/kg, s.c.), sessenta minutos antes da injeção de BK (5
nmol/pata), para prevenir a ação das cininases. O tratamento dos animais foi então
realizado utilizando-se a FLS por v.o. (100 e 200 mg/kg) ou por via i.p. (200
mg/kg), num volume correspondente a 10 mL/kg de peso, sessenta ou trinta minutos
antes da injeção de BK, respectivamente. O grupo controle recebeu crel 5%
(veículo), em volume correspondente aos demais grupos. O volume das patas foi
medido nos intervalos de 10, 20, 30, 60 e 120 min após a injeção de BK. O volume
do edema (V
E
) foi calculado como referido anteriormente.
4.3.2.3 Edema de pata induzido por levedura de cerveja em ratos
Ratos Wistar fêmeas, divididos em grupos de 8 animais cada, foram tratados
com a FLS (200 mg/kg) por v.o. ou i.p., sessenta ou trinta min antes da indução do
edema induzido por levedura de cerveja (LC) 2,5% p/v (0,1 mL/pata) (HORE et al.,
1996). O controle recebeu crel 5% (veículo) num volume correspondente a 10
mL/kg de peso. O volume das patas foi medido antes e nos intervalos de ½, 1, 2, 3,
4 e 24 h após a injeção de LC. O volume do edema (V
E
) foi determinado como
descrito anteriormente.
4.3.2.4 Edema de pata induzido por carragenina em ratos
O modelo de edema de pata induzido por carragenina (Cg) foi realizado
segundo o método de WINTER e cols. (1962). Para tanto, foram utilizados ratos
Wistar fêmeas (150 - 200 g), escolhidos aleatoriamente. Suas patas direitas traseiras
72
72
foram estendidas e introduzidas, em pletismógrafo, até a borda póstero-proximal da
proeminência do calcanhar. O volume (mL) de líquido deslocado (V
I
), foi registrado
em um monitor digital.
Os animais foram tratados com a FLS por v.o. (100 e 200 mg/kg) ou por via
i.p. (50, 100 e 200 mg/kg), num volume de 10 mL/kg de peso. O grupo controle
recebeu veículo (Crel 5%) em volume equivalente. A indometacina (INDO 2
mg/kg, v.o.) foi utilizada como droga antiinflamatória padrão. Sessenta minutos
após o tratamento oral ou trinta minutos após o tratamento i.p., os animais
receberam uma injeção intraplantar de 0,1 mL de uma solução de Cg 1% p/v. O
volume das patas foi medido nos intervalos de 1, 2, 3, 4 e 24 h após a injeção de Cg.
O edema (V
E
) foi determinado pela fórmula referida anteriormente.
Sabe-se que a indometacina é uma droga antiinflamatória não esteroidal
clássica que exerce seus efeitos através da inbição da COX. Baseado nesta
afirmativa, esta droga foi administrada (INDO 1 mg/kg, v.o.) simultaneamente com
a FLS (20 mg/kg, i.p.), para avaliarmos uma possível potencialização do efeito
desta última no edema induzido por Cg.
Para avaliar o papel do sistema NO no efeito antiinflamatório da FLS, o N
-
nitro-L-arginina-metil-ester (L-NAME), um inibidor da NOS, foi administrado (5
mg/kg, i.p.) simultaneamente com a FLS (20 mg/kg, i.p.), trinta min antes da
injeção intraplantar de Cg.
O efeito da pentoxifilina (PTX 10 mg/kg, i.p.), um conhecido inibidor não-
específico da FDE, sobre a atividade antiedematogênica da FLS (20 mg/kg, i.p.) foi
determinado pela administração simultânea de ambas, trinta min antes da injeção
intraplantar da Cg.
4.3.2.5 Edema de pata induzido por formalina em camundongos
Camundongos Swiss (20 – 30 g), distribuídos em grupos de 10 animais cada,
foram tratados com a FLS por via i.p. nas doses de 100 e 200 mg/kg, trinta minutos
antes da injeção intraplantar de 20 l de formalina 5% v/v, nas patas direitas
traseiras (DAMAS & LIÉGEOIS, 1999). O controle recebeu veículo (crel 5%) em
73
73
volume equivalente aos demais grupos (10 mL/kg). O edema foi medido nos
intervalos de ½, 1, 2, 3, 4, e 24 h, e calculado como referido acima.
4.3.2.6 Migração de neutrófilos induzida por carragenina ou N-Formil-
metionil-leucil-fenilalanina na cavidade peritoneal de ratos
Ratos Wistar (170 – 220 g), escolhidos aleatoriamente, foram divididos em
seis grupos de 6 a 10 animais cada. O grupo I foi tratado com veículo (crel 2%), v.o.
(controle), o grupo II não recebeu tratamento, os grupos III, IV e V receberam FLS
(100, 200 e 400 mg/kg, v.o. respectivamente) e o grupo VI recebeu dexametasona
(DEXA 1 mg/kg), por via subcutânea (s.c.). Os tratamentos dos grupos I, III, IV e V
foram feitos 60 min, e do grupo VI, 120 min antes da injeção intraperitoneal (i.p.)
de 1 mL de Cg (300 g/animal) ou fMLP (10 nM/animal). O grupo II recebeu uma
injeção de salina por via i.p. Quatro horas após a injeção do agente flogístico foi
avaliada a migração de neutrófilos. Os animais foram sacrificados por deslocamento
cervical e logo em seguida suas cavidades peritoneais foram lavadas com 10 mL de
solução salina tamponada com fosfato (PBS) heparinizada a 0,1% contendo
albumina sérica bovina (3%) a 1%. Após leve massagem no abdômen, foram
coletados 6 mL do exsudato. As contagens total e diferencial das células foram
executadas baseadas no método de SOUZA E FERREIRA (1985). Para a contagem
total dos leucócitos, foram retirados 20 l de exsudato e acrescidos de 380 l de
corante de Turk. Para a contagem diferencial, o exsudato foi centrifugado a 1000
rpm durante 5 minutos. O sobrenadante foi desprezado e o sedimento foi
ressuspendido em 200 l de albumina bovina a 3% e distribuido em lâminas. Após
serem coradas com o corante panótico rápido, foi feita a contagem diferencial das
células. Os resultados foram expressos em número de células por mililitro (mL).
4.3.2.7 Granuloma induzido por pellet de algodão em ratos
Para a indução do granuloma por pellet de algodão em ratos, foi utilizado o
método descrito por D’ARCY e cols. (1960), com modificações mínimas. Foram
74
74
utilizados grupos de 8 animais cada. No dia anterior ao experimento, os animais
tiveram seus dorsos depilados e após cerca de 24 h os mesmos foram tratados com
FLS (50 mg/kg, i.p. e 25 mg/kg, v.o.) e veículo (crel 5%, 10 mL/kg). A
dexametasona (0,01 mg/kg, s.c.) foi usada como antiinflamatório padrão. Após 120
min do tratamento por via s.c., 60 min do tratamento por v.o. ou 30 min do
tratamento i.p., os animais foram anestesiados com éter e foi realizada uma incisão
centro-longitudinal no dorso, onde foram implantados dois pellets de algodão
estéreis (50 1 mg/cada), um de cada lado da incisão. Os animais continuaram
sendo tratados uma vez ao dia, ao longo de 7 dias, ao final dos quais foram
sacrificados após anestesia com éter. Os pellets foram então dissecados juntamente
com os granulomas e tomados os pesos úmidos e posteriormente os pesos secos,
após secagem dos mesmos por 2 h, em estufa a 60C. Cada animal teve também
dissecado e pesado seu timo e suas adrenais direita e esquerda.
4.3.2.8 Colite induzida por ácido acético em ratos
Para o modelo de colite induzida pelo ácido acético utilizou-se o método
descrito por KRAWISZ e cols. (1984), ligeiramente modificado. Foram utilizados
ratos Wistar (220 – 250 g), distribuídos aleatoriamente em grupos de 6 animais
cada. Um dia antes e durante o experimento, os animais foram mantidos em jejum
com livre acesso a uma solução de glicose 0,5% p/v. Durante os dois primeiros dias
os animais foram tratados com a FLS 100 mg/kg, por via intra-retal (i.r.) ou por via
oral nas doses de 100 ou 200 mg/kg, duas vezes ao dia. No terceiro dia, os animais
receberam tratamento apenas pela manhã. O grupo controle recebeu veículo (tween
2%) em volume equivalente aos demais grupos (10 mL/kg). Após duas horas do
último tratamento, a colite foi induzida por ácido acético 4%, 2 mL por animal, por
via i.r., através de um cateter de 0,3 mm introduzido até 8 cm no ânus. Vinte quatro
horas após a indução da colite, os animais foram sacrificados por deslocamento
cervical e 8 cm do cólon foi retirado, aberto, lavado com salina gelada e pesado
(peso úmido). Procedeu-se então a avaliação macroscópica para atribuição de
escores de acordo com MASCOLO e cols. (1995).
75
75
A atividade da mieloperoxidase (MPO) foi medida segundo BRADLEY e
cols. (1982). Resumidamente, 300 mg da mucosa retirada do cólon foi pesada e
congelada em nitrogênio líquido e homogeneizada com brometo de
hexadeciltrimetilamônio 0,5% (HTAB) em 6 mL de tampão fosfato de potássio (50
mM, pH 6,0), em gelo, usando-se um homogeneizador polytron. O homogenato foi
sonicado durante 10 seg e então congelado. Este processo foi repetido por três vezes
e o mesmo foi centrifugado a 40.000 g por 15 min a 4C. Uma alíquota de 100 l
do sobrenadante foi adicionada à -diasidina (0,167 mg.mL
) em 2,9 mL de
tampão fosfato de potássio (50 mM, pH 6,0) contendo peróxido de hidrogênio
(0,0005%) e a leitura foi feita imediatamente (T
0
) e após 5 min (T
5
) em
espectrofotômetro a 460 nm. Uma unidade de atividade da MPO é definida como
sendo capaz de degradar 1 mol de peróxido/min a 37C. Os resultados foram
expressos como U/min/g de tecido.
4.3.3 Atividade analgésica
4.3.3.1 Teste das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético em
camundongos
Para o modelo das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético 0,6%
foi utilizado o método originalmente descrito por VANDER E MARGOLIN (1956)
para ratos, e modificado por KOSTER e cols. (1959) para camundongos. Foram
utilizados camundongos Swiss, fêmeas (20 – 30 g), escolhidos aleatoriamente e
reunidos em grupos de 12 a 20 animais. A solução de ácido acético a 0,6% (v/v) foi
administrada por via intraperitoneal (i.p.) num volume de 10 mL/kg de peso. O
número de contorções abdominais apresentado pelos animais foi registrado durante
20 min, sendo a contagem iniciada 10 min após a injeção do ácido. Sessenta ou
trinta minutos antes da avaliação, os animais foram tratados com FLS por v.o., nas
doses de 200 e 400 mg/kg ou por via s.c., nas doses de 50, 100 e 200 mg/kg.
A talidomida (TALI 5 mg/kg, v.o.), droga inibidora da síntese de TNF-, foi
utilizada conjuntamente com a FLS (25 mg/kg, s.c. ou 200 mg/kg, v.o.), para se
76
76
avaliar uma possível potencialização do efeito antinociceptivo da FLS no teste das
contorções abdominais induzidas pelo ácido acético.
O efeito da pentoxifilina (PTX 5 mg/kg, s.c.) sobre a atividade
antinociceptiva da FLS (100 mg/kg, v.o.) foi determinado pela administração de
ambas, 30 e 60 min respectivamente, antes da injeção intraperitoneal de ácido
acético.
4.3.3.2 Teste das contorções abdominais induzidas pela acetilcolina em
camundongos
Foram utilizados camundongos Swiss, fêmeas (20 – 30 g), escolhidos ao
acaso e distribuídos em 4 grupos de 20 a 22 animais cada. A solução de acetilcolina
(ACh, 10 mg/kg) foi administrada por via i.p., num volume de 10 mL/kg de peso. O
número de contorções abdominais apresentado pelos animais foi registrado durante
10 min, a partir do surgimento da primeira contorção (FERREIRA, 1972). Os
animais foram tratados com FLS (100 e 200 mg/kg, s.c.) ou INDO (2 mg/kg, v.o.),
30 ou 60 min respectivamente, antes da injeção intraperitoneal de ACh. O grupo
controle recebeu veículo (crel 2%) em volume correspondente aos demais grupos
(10 mL/kg).
4.3.3.3 Teste da formalina em camundongos
Na nocicepção química induzida segundo o método descrito por
HUNSKAAR e cols. (1985), o tempo gasto em segundos pelo animal lambendo a
pata, é registrado durante os períodos de 0 – 5 min (fase inicial) e 20 – 25 min (fase
tardia) após a injeção intraplantar de formalina (20 l de uma solução a 1%, v/v), na
pata traseira direita do animal. Em camundongos, esse teste deve ser realizado à
temperatura ambiente de 22 – 23
o
C ou 26 – 28
o
C e na ausência de fatores
estressantes incluindo sons, odores e alta luminosidade, como medida para evitar
modificações na resposta comportamental (TJOLSEN et al., 1992).
77
77
Foram utilizados camundongos Swiss, machos (20 – 30 g), escolhidos ao
acaso e tratados com a FLS por v.o. (100, 200 e 400 mg/kg) ou por via i.p. (50, 100
e 200 mg/kg), 60 ou 30 min respectivamente antes da injeção intraplantar de
formalina.
O efeito da naloxona (NAL), um conhecido antagonista opióide, sobre a
atividade antinociceptiva da FLS, foi determinado pela administração da NAL (2
mg/kg, s.c.), 15 min antes do tratamento com a FLS (100 e 200 mg/kg, i.p.), ou
morfina (MORF 7 mg/kg, i.p.), sendo que estas últimas foram administradas 30 min
antes da injeção de formalina.
Para avaliar um possível envolvimento do NO na antinocicepção induzida
pela FLS, a L-arginina (L-ARG 600 mg/kg, i.p.), um substrato para síntese do NO,
foi administrada 5 min antes da FLS (100 e 200 mg/kg, i.p.) ou N
-nitro-L-arginina-
metil-ester (L-NAME 75 mg/kg, i.p.), administrados 30 ou 15 min antes da injeção
intraplantar de formalina. Os demais grupos receberam L-ARG (600 mg/kg, i.p.) ou
L-NAME (75 mg/kg, i.p.), 20 ou 15 min respectivamente, antes da formalina.
O papel dos receptores adrenérgicos na antinocicepção induzida pela FLS
também foi determinado. Para avaliar o papel dos receptores
1
, os animais foram
pré-tratados com prazosin (PRAZ 1 mg/kg, v.o.), 30 min antes da FLS (200 mg/kg,
i.p.) ou fenilefrina (FENIL 12 mg/kg, i.p.), administrados 30 min antes da indução
da dor pela formalina. Os demais grupos receberam PRAZ (1 mg/kg, v.o.) ou
FENIL (12 mg/kg, i.p.), 60 ou 30 min respectivamente antes da formalina. Já no
estudo do papel dos receptores
2
, os animais foram pré-tratados com a ioimbina
(IOIM 600 g/kg, i.p.), 30 min antes da FLS (200 mg/kg, i.p.) ou clonidina (CLONI
62 g/kg, i.p.), administrados 30 min antes da injeção de formalina. Os demais
grupos receberam IOIM (600 g/kg, i.p.) ou CLONI (62 g/kg, i.p.) administrados
30 min antes da formalina.
4.3.3.4 Teste da placa quente em camundongos
O método de EDDY E LEIMBACH (1953) foi utilizado para avaliar a
eficácia da FLS contra a nocicepção térmica e de ação central. Camundongos Swiss
78
78
(20 – 25 g), que exibiram respostas características ao estímulo térmico (55 0,5
o
C)
na placa quente, como lamber as patas posteriores e/ou saltar sobre a placa, em
cerca de 20 segundos foram selecionados para o teste.
O tempo de reação foi registrado antes (0 min) e após 30, 60 e 90 min da
administração da FLS 200 e 400 mg/kg, v.o. e 200 mg/kg, i.p., MORF 7 mg/kg, s.c.
e crel 5% (controle). Um tempo de 45 segundos foi considerado como tempo
máximo de reação para prevenir danos às patas dos animais.
4.3.4 Atividade sobre o Sistema Nervoso Central
4.3.4.1 Teste do campo aberto em camundongos
A atividade motora espontânea da FLS foi avaliada na tentativa de verificar
uma possível atividade sedativa/depressora do Sistema Nervoso Central (SNC).
Foram utilizados camundongos Swiss, machos (20 – 30 g), escolhidos ao
acaso e tratados com a FLS via i.p. (200 mg/kg) ou por v.o. (200 e 400 mg/kg), 30
ou 60 min antes do início do teste. O controle recebeu veículo (crel 2%) em volume
correspondente (10 mL/kg).
A atividade motora dos animais foi avaliada por meio de um campo aberto,
confeccionado em acrílico (paredes transparentes, chão preto e dimensões de 30 x
30 x 15 cm). A movimentação espontânea dos animais (n
o
de cruzamentos, com as
quatro patas, entre as divisões do campo), o n
o
de comportamentos de autolimpeza
(grooming) e de levantar (rearing) foram registrados num período de 5 min após o
início do teste (SIEGEL, 1946; ARCHER, 1973). Este teste permite avaliar a
atividade estimulante ou depressora de um composto, podendo ainda indicar
atividades mais específicas como a ansiolítica.
4.3.4.2 Teste do rota-rod em camundongos
Camundongos Swiss, fêmeas (25 –30 g), foram pré-selecionados pela
colocação em um aparelho de rota-rod de 25 cm de diâmetro, subdividido em seis
79
79
compartimentos, colocada a 25 cm de altura e girando a 12 rotações por minutos.
Os animais que permaneceram no aparelho em período até 2 min foram
selecionados e divididos em grupos de 8 animais cada. Os mesmos foram tratados
com FLS por v.o. (400 mg/kg) ou por via i.p. (200 mg/kg) 60 ou 30 min antes da
colocação dos mesmos no rota-rod. O tempo de permanência (por 1 min) dos
animais na barra giratória foi registrado em segundos, com três reconduções, no
máximo, à barra. Este teste permite avaliar se as substâncias testadas promovem
incoordenação motora dos animais, por sedação e/ou relaxamento muscular
(DUNHAM & MIYA, 1957).
4.3.4.3 Tempo de sono induzido por barbitúrico em camundongos
Camundongos Swiss, fêmeas (25 – 30 g) foram divididos em grupos de 15
animais cada, e tratados com veículo (crel 2%, 10 mL/kg), FLS (50, 100 e 200
mg/kg, i.p.) e clorpromazina (5 mg/kg, i.p.), 30 min e FLS (200 mg/kg, v.o.), 60
min antes da injeção do agente indutor do sono, o pentobarbital sódico (40 mg/kg,
i.p.) (DANDIYA & COLLUMBINE, 1959). A latência para a perda (tempo de
indução do sono) do reflexo postural (reflexo de endireitamento) e duração do
mesmo (tempo de recuperação), após a injenção do barbitúrico foi registrado por,
no máximo, 3 h consecutivas à injeção do mesmo (CARLINI et al., 1986). Drogas
depressoras do SNC, em geral, reduzem a latência e/ou aumentam a duração do
sono induzido.
O tempo de sono foi calculado para cada animal da seguinte forma:
Onde:
T
0
= tempo registrado no início do sono
T
1
= tempo no qual o animal despertou
Tempo de sono = T
1
T
0
80
80
4.3.5 Atividade antiagregante plaquetária
4.3.5.1 Colheita do sangue
O sangue foi obtido de voluntários aparentemente saudáveis, não fumantes,
em jejum de 12 h, que relataram não ter feito uso de medicamentos há pelo menos
15 dias antes da colheita.
Amostras de sangue humano foram obtidas através de punção venosa da veia
antecubital dos voluntários. Tubos descartáveis siliconizados comumente utilizados
em laboratórios de análises clínicas, contendo citrato de sódio (0,129 M; pH 7,5),
foram utilizados para colheita do sangue na proporção de 1:10.
Os testes com este material foram realizados em um período de até 3 h após a
colheita da amostra.
4.3.5.2 Obtenção do plasma humano rico em plaquetas
O plasma humano rico em plaquetas (PRP) foi obtido através da separação,
após centrifugação das amostras de sangue humano a 1000 rpm por 5 min à
temperatura ambiente. O plasma pobre em plaquetas (PPP) foi separado em seguida,
após a centrifugação do restante da amostra a 3000 rpm durante 15 min à
temperatura ambiente.
O número de plaquetas no pool de PRP foi contado segundo o método de
BRECHER E CRONKITE (1950), através de câmara de Newbauer e microscópio
ótico e ajustado, sempre que necessário, para cerca de 260.000 plaquetas/mm
3
,
utilizando-se o PPP.
4.3.5.3 Estudo da agregação plaquetária in vitro em plasma humano rico em
plaquetas
Para estudar a agregação plaquetária, foi utilizado o método descrito por
BORN E CROSS (1963). A agregação foi estudada a 37
o
C em 450 l de PRP em
81
81
um agregômetro acoplado a um registrador, sendo medida através da agitação
constante de um bastão magnético (1200 rpm) colocado nos tubos do agregômetro
contendo PRP, após a adição do agente agregante. A turvação do PRP, devido à
presença das plaquetas em suspensão, representa 0% de transmissão luminosa, pois
não permite a passagem do feixe de luz. À medida que as plaquetas se agregam, há
um aumento da transmitância, que é representada pela deflexão na linha vertical da
curva e medida espectrofotometricamente através da passagem da luz pela
suspensão das plaquetas e registrada em forma de curva que expressa a quantidade e
velocidade de agregação. O PPP representa 100% de transmissão luminosa.
4.3.5.4 Inibição da agregação plaquetária induzida in vitro por diferentes
agonistas em plasma humano rico em plaquetas
Os efeitos da FLS, lonchocarpina (LCC) e derricina (DRC) sobre a
agregação plaquetária foram estudados utilizando os seguintes agentes agregantes:
ácido araquidônico (AA), adrenalina (ADR), colágeno (COL), difosfato de
adenosina (ADP) e trombina (TRB).
A FLS, LCC e DRC foram incubadas em doses crescentes com 450 l do
pool de PRP, 5 minutos antes da adição de cada agonista. A altura das curvas foi
medida, em milímetros (mm), da linha de base onde teve início (0% de
transmitância) até o ponto máximo (100% de transmitância). As curvas de
agregação dos controles foram obtidas através da adição dos agonistas ao PRP pré-
incubado com o veículo utilizado no respectivo teste, como descrito acima.
A inibição da agregação plaquetária foi avaliada através da comparação da
altura de cada uma das curvas referentes as diferentes concentrações da FLS, LCC e
DRC com o valor médio da altura das curvas dos controles.
As soluções dos agregantes plaquetários foram empregadas nas seguintes
concentrações finais no meio de reação: AA 30 M, ADP 20 M, ADR 30 M,
COL 42,6 g/mL e TRB 0,16 U/mL.
Para avaliar os mecanismos de ação envolvidos no possível efeito
antiagregante plaquetário da FLS, LCC e DRC, foram usados antagonistas como a
82
82
aspirina (AAS 20 M) no caso do agonista AA e L-arginina (L-ARG 9,7 g/l) ou
pentoxifilina (PTX 377 g/mL) no caso do agente agregante ADP. Os antagonistas
foram incubados (8 min antes do agonista) só e conjuntamente com a FLS, LCC e
DRC (incubadas após 3 min da adição dos antagonistas), para se avaliar uma
possível potencialização dos seus efeitos.
4.3.6 Determinação do número de plaquetas em sangue total de camundongos,
após a administração oral ou intraperitoneal da fração hexânica de
Lonchocarpus sericeus
Foram utilizados camundongos Swiss, fêmeas (25 – 30 g), escolhidos
aleatoriamente e divididos em grupos de 6 a 12 animais cada. Os mesmos foram
tratados uma única vez, com FLS na dose de 200 mg/kg, administrada por v.o. ou
por via i.p., em volume de 10 mL/kg. O grupo controle recebeu veículo (crel 2%)
em volume equivalente. Sessenta min após o tratamento com a FLS (200 mg/kg,
v.o. ou i.p.), amostras de sangue foram colhidas, por punção do plexo orbicular, sob
leve anestesia com éter, utilizando um tubo capilar e depositadas em tubos contendo
EDTA (ácido etileno-diamino-tetracético) 1 mg/mL (9:1, v/v), como anticoagulante.
As plaquetas foram então contadas utilizando microscópio ótico comum, de acordo
com o método de Rees – Ecker (PLATT, 1972). Após 24 h, o sangue dos animais
foi novamente colhido e as plaquetas contadas, como descrito acima.
4.3.7 Determinação do efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus
sobre o tempo de protrombina em plasma humano
O sangue foi obtido de no mínimo três indivíduos por experimento, sadios,
não fumantes, que relataram não serem portadores de doenças hepáticas ou, se do
sexo feminino, não fazerem uso de contraceptivos orais e não estarem grávidas.
O sangue foi colhido como descrito em 4.3.5.1, centrifugado a 3000 rpm por
10 min e preparado um pool deste plasma citratado. O sangue obtido de punção
venosa traumática, hemolisado, com presença de bolhas ou com aspiração de
83
83
líquido tissular foi desprezado. Os testes com o pool de plasma foram realizados em
um período máximo de 4 h após a colheita da amostra.
Concentrações crescentes de FLS, LCC ou DRC (0,67 e 3,33 g/l) foram
incubadas com 100 l de plasma em banho-maria (BM) a 37
o
C, em tubos de ensaio,
por 5 min. Em seguida 100 l do replastin (tromboplastina liofilizada extraída de
cérebro desidratado de coelhos) foram acrescentados à mistura e incubados por mais
5 min em BM a 37
o
C, e 100 l de CaCl
2
25 mM (previamente aquecidos) foram
adicionados e a contagem do tempo iniciada imediatamente. Ao final de 9
segundos, o tubo foi removido do BM e inclinado constantemente em intervalos
menores que 1 segundo até a observação da formação de um coágulo. O tempo
gasto para a formação do mesmo foi registrado em segundos. No grupo controle foi
utilizado o veículo de diluição das substâncias (crel 2%). A heparina (0,001 U/l)
foi utilizada como anticoagulante padrão.
4.4 ESTATÍSTICOS
Os resultados obtidos foram expressos como média erro padrão da média
(E.P.M.), com exceção dos escores atribuídos às lesões do cólon, no experimento de
colite induzida pelo ácido acético, e da DL
50
, que foram expressos como mediana.
Para comparações múltiplas foi utilizada a análise de variância (ANOVA), seguida
do teste de Student-Newman-Keuls para os dados paramétricos e Kruskall-Wallis
seguido do teste de Dunnett para os dados não paramétricos. Níveis de
probabilidade inferiores a 5% foram considerados indicativos de significância. Os
programas estatísticos empregados para as análises foram o GraphPad Instat
(1993) e o GraphPad Prism versão 3.00 for Windows (1999), USA. Os dados
foram apresentados em tabelas, figuras ou gráficos.
84
84
Resultados
85
85
5 RESULTADOS
5.1 Obtenção da fração hexânica das cascas das raízes de Lonchocarpus
sericeus (Poir.) Kunth e suas chalconas lonchocarpina e derricina
A obtenção da fração hexânica das cascas da raiz de Lonchocarpus sericeus
(FLS), da lonchocarpina (LCC) e derricina (DRC) foi realizada conforme descrito
em 4.1.1 e 4.1.2, respectivamente. As cascas das raízes de L. sericeus (1 kg) foram
extraídas com hexano, fornecendo um extrato bruto denominado de extrato
hexânico das cascas das raízes de L. sericeus (LSCR-H) (24,6 g; rendimento
2,4%). A partir da eluição de uma alíquota deste extrato (20,6 g), foram obtidas as
frações hexânica (FLS ou LSCRH-H) (4,8 g; rendimento 23,3%),
hexânica/clorofórmica (LSCRH-HC) (14,8 g; rendimento 71,8%) e clorofórmica
(LSCRH-C) (0,1 g; rendimento 0,48%). A análise da FLS, em RMN
1
H e
13
C,
revelou a presença de duas substâncias majoritárias: as chalconas preniladas LCC e
DRC, com as seguintes constantes físico-químicas:
Lonchocarpina (LCC):
Fórmula molecular: C
20
H
18
O
3
Massa molecular (g/mol): 306
Ponto de fusão: 106,4 – 108,9 C
Aspecto: cristais de cor laranja
Solubilidade: clorofórmio
Derricina (DRC):
Fórmula molecular: C
21
H
22
O
3
Massa molecular (g/mol): 322
Ponto de fusão: 94,9 –96,7 C
86
86
Aspecto: cristais de cor amarela
Solubilidade: clorofórmio
5.2 Efeitos comportamentais e toxicidade aguda da fração hexânica de
Lonchocarpus sericeus em camundongos
A toxidade aguda da FLS e seus efeitos em camundongos foram
determinados, nas doses de 300, 400, 600, 700, 750, 800, 1000 e 1500 mg/kg, por
v.o. e 300, 400, 600, 800 e 1000 mg/kg, por via i.p., seguindo o procedimento
descrito em 4.2.1. A dose letal para 50% dos animais (DL
50
) para a FLS
administrada por via oral foi de 781,5 mg/kg (597,7 – 960,0 mg/kg), e por via
intraperitoneal foi de 446,2 mg/kg (369,6 – 522,7 mg/kg).
Após a administração intraperitoneal da FLS, a dose de 300 mg/kg foi à
única que não provocou morte dos animais, contudo já foram observadas uma
diminuição da atividade exploratória e uma leve depressão respiratória. Nas doses
de 400 e 600 mg/kg, i.p., a FLS causou em alguns animais contorções abdominais,
piloereção, depressão respiratória, redução na capacidade urinária e na defecação,
diminuição da atividade locomotora e morte. Com as doses de 800 e 1000 mg/kg,
i.p., os principais efeitos observados, além dos supracitados, foram ausência de
micção e defecação, ataxia, paralisia do trem posterior e morte de praticamente
todos os animais.
Com relação à administração oral da FLS nas doses de 300 e 400 mg/kg, não
foram observadas alterações no comportamento dos animais, nem mortes. Nas
doses de 600, 700 e 750 mg/kg, v.o., a FLS produziu depressão respiratória,
diminuição da atividade exploratória e uma leve alteração da marcha dos animais.
Nas doses de 800, 1000 e 1500 mg/kg, observou-se depressão respiratória,
diminuição da atividade exploratória e redução na capacidade urinária e na
defecação em quase todos os animais. Dois animais apresentaram convulsões e em
mais dois foram observadas ataxia e paralisia do trem posterior.
O grupo controle, tratado com veículo (crel 5%) por v.o. ou i.p., não
apresentou alterações comportamentais, nem mortes.
87
87
5.3. Atividade citotóxica in vitro da Fração hexânica de Lonchocarpus sericeus,
lonchocarpina e derricina
5.3.1 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus, lonchocarpina e
derricina sobre o desenvolvimento embrionário de ovos de ouriço-do-mar
Lytechinus variegatus
A Figura 7 mostra que a FLS e a DRC exibiram um efeito inibitório
concentração-dependente sobre o desenvolvimento embrionário dos ovos de ouriço-
do-mar Lytechinus variegatus.
A FLS apresentou elevado potencial antimitótico com CI
50
de 30,4; 12,6 e
23,2 g/mL para os estágios de 1
a
e 3
a
divisão e de blástula, respectivamente. A
DRC comportou-se de modo semelhante, apresentando uma alta inibição do
desenvolvimento dos ovos na 1
a
e 3
a
divisão e blástula; com CI
50
de 51,2; 41,8 e
76,2 g/mL, respectivamente. A FLS apresentou-se cerca de 2,7 vezes mais ativa
que a DRC. Contrariamente, a LCC não modificou a divisão dos ovos, mesmo na
maior concentração utilizada (100 g./mL) (Tabela 5).
5.3.2 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus, lonchocarpina e
derricina sobre a proliferação de células tumorais in vitro
A Figura 8 evidencia o potencial citotóxico da FLS, LCC e DRC sobre
células de leucemia linfocítica de origem humana (CEM).
A FLS, LCC e DRC apresentaram elevada citotoxicidade sobre o
crescimento de células CEM, com CI
50
de 17,6; 10,4 e 13,0 g/mL, respectivamente
(Tabela 6). Neste ensaio, a FLS foi mais ativa que as suas chalconas LCC e DRC,
visto que aboliu completamente o crescimento das células CEM na concentração de
25 g/mL. A inibição máxima do crescimento celular para as chalconas LCC e
DRC, na maior concentração testada (100 g/mL), foi de 77,1 8,1 e 96,0 3,6 %,
respectivamente (Tabela 6).
88
88
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
0
20
40
60
80
100
Log da concentração( g/mL)
% de Inibição da Clivagem
Figura 7 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus (símbolos
fechados) e derricina (símbolos abertos) na clivagem de ovos de ouriço-
do-mar Lytechinus variegatus.
Os dados representam média E.P.M. de 6
experimentos para 1
a
() e 3
a
() clivagem e blástula (). A curva foi obtida por
regressão não-linear. Para o controle negativo foi utilizado o veículo das substâncias
testadas (crel 0,1% no máximo).
89
89
Tabela 5 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus,
lonchocarpina e derricina sobre o desenvolvimento embrionário de ovos
de ouriço-do-mar Lytechinus variegatus
Grupo
CI
50
(
g/mL)
(n) 1
a
divisão 3
a
divisão Blástula
FLS
(6)
30,4 (26,2 – 35,3)
12,6 (11,3 – 14,1) 23,2 (20,8 – 25,9)
LCC
(6)
-
- -
DRC
(6)
51,2 (42,1 – 62,3) 41,8 (36,1 – 48,4) 76,2 (66,4 – 87,5)
Os dados representam os valores de CI
50
e seus respectivos intervalos de confiança (IC
95%), obtidos por regressão não-linear, para a 1
a
e 3
a
divisão e para o estágio de blástula.
A LCC não mostrou efeito. O n
o
de experimentos (n) é dado em parênteses.
90
90
-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
0
20
40
60
80
100
120
Log da concentração ( g/mL)
% de Inibição do
crescimento celular (CEM )
Figura 8 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus (
),
derricina (
) e lonchocarpina () sobre o crescimento de células de
leucemia linfocítica de origem humana (CEM).
A análise foi feita pelo
método do MTT após 24 h da incubação. Os dados representam média E.P.M. de
6 experimentos. As curvas foram obtidas por regressão não-linear. Para o controle
negativo foi utilizado o veículo das substâncias testadas (crel 0,1% no máximo).
91
91
Tabela 6 – Efeito inibitório da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus,
lonchocarpina e derricina sobre o crescimento de células de leucemia
linfocítica de origem humana (CEM)
Grupo
(n)
CI
50
(
g/mL)
Inibição máxima (%)
FLS
(6)
17,6 (13,7 – 22,6)
98,7 1,3
LCC
(6)
10,4 (5,6 – 19,1)
77,1 8,1*
DRC
(6)
13,0 (12,0 – 14,0)
96,0 3,6
Os dados representam os valores de CI
50
e seus respectivos intervalos de confiança (IC
95%), obtidos por regressão não-linear, e o efeito inibitório máximo observado com a
concentração de 50 g/mL para todas as substâncias testadas. O n
o
de experimentos (n) é
dado em parênteses. ANOVA e Student-Newman-Keuls,* p < 0,05.
92
92
5.3.3 Efeito hemolítico da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus,
lonchocarpina e derricina em eritrócitos de camundongos
O efeito hemolítico da FLS, LCC e DRC foi avaliado, em doses crescentes
(0,5 – 250 g/mL), em hemácias de camundongos. Não foi observada nenhuma
atividade lítica (0% de hemólise) com a FLS, LCC ou com a DRC, mesmo na maior
concentração testada (250 g/mL). Contudo, o Triton X-100 0,2% (controle
positivo) causou 100% de hemólise.
5.3.4 Efeito antimicrobiano da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus,
lonchocarpina e derricina
Doses crescentes de FLS, LCC e DRC (1,25 – 5 g/l) foram testadas sobre
o crescimento de bactérias gram-positivas (Staphylococcus aureus), gram-negativas
(Escherichia coli) ou fungos (Candida albicans) sem, contudo exibirem efeito
antimicrobiano sobre estes patógenos.
5.4. Atividade antiinflamatória
5.4.1 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus sobre o edema de
pata induzido por dextrano em ratos
Os resultados obtidos com a FLS sobre o edema de pata induzido por
dextrano (DX) em ratos encontram-se apresentados na Tabela 7.
A FLS (100 e 200 mg/kg, i.p.) não apresentou nenhuma diferença
significativa no volume médio do edema (2,05 0,11; 2,09 0,16; 1,83 0,16;
1,68 0,13; 1,48 0,13 mL e 1,42 0,20; 1,85 0,14; 1,65 0,14; 1,51 0,15;
1,24 0,18 mL, respectivamente) em relação ao grupo controle, nos períodos de ½,
1, 2, 3 e 4 h (1,76 0,14; 2,03 0,15; 1,92 0,09; 1,95 0,14 e 1,68 0,10 mL,
respectivamente), após a administração do DX. A ciproeptadina (CIPRO 10 mg/kg,
v.o.), utilizada como droga inibidora padrão, promoveu uma redução significativa
93
93
(P<0,001) do volume médio do edema em todos os períodos observados (0,54
0,09; 0,51 0,07; 0,62 0,09; 0,65 0,13 e 0,73 0,12 mL), correspondendo a
inibições de 69, 75, 68, 67 e 57 %, respectivamente quando comparada ao grupo
controle nos períodos de ½, 1, 2, 3 e 4 h após a injeção de DX.
5.4.2 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus sobre o edema de
pata induzido por bradicinina em ratos
A Tabela 8 mostra os resultados obtidos com a FLS no edema de pata
induzido por bradicinina (BK) em ratos.
Não foi observada diferença significativa do edema nos grupos tratados com
FLS (100 e 200 mg/kg) por via oral (0,80 0,05; 0,79 0,06; 0,73 0,05; 0,71
0,05; 0,59 0,04 mL e 0,59 0,05; 0,63 0,05; 0,62 0,07; 0,57 0,07; 0,48
0,08 mL respectivamente), quando comparados ao grupo controle, nos períodos de
tempo de 10, 20, 30, 60 e 120 min (0,67 0,06; 0,74 0,09; 0,73 0,09; 0,68
0,09; 0,55 0,09 mL), após a administração de BK. Da mesma forma, a FLS (200
mg/kg) administrada por via intraperitoneal também não mostrou inibição
significativa do edema quando comparado ao controle, com exceção do primeiro
período de tempo (10 min) observado (0,51 0,03; 0,53 0,04; 0,51 0,04; 0,48
0,03; 0,35 0,04 mL), o que correspondeu a uma inibição de 24%.
5.4.3 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus sobre o edema de
pata induzido por levedura de cerveja em ratos
A Figura 9
mostra o efeito da administração oral e intraperitoneal da fração
hexânica de Lonchocarpus sericeus (FLS) no edema de pata induzido por levedura
de cerveja (LC) em ratos.
94
94
Tabela 7 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus sobre o edema de pata induzido por dextrano em
ratos
Grupo
Volume do edema (mL)
(n) ½ h 1 h 2 h 3 h 4 h
CONT
(6)
1,76 0,14 2,03 0,15 1,92 0,09 1,95 0,14 1,68 0,10
FLS 100 mg/kg, i.p.
(6)
2,05 0,11 2,09 0,16 1,83 0,16 1,68 0,13 1,48 0,13
FLS 200 mg/kg, i.p.
(6)
1,42 0,20 1,85 0,14 1,65 0,14 1,51 0,15 1,24 0,18
CIPRO 10 mg/kg, v.o.
(6)
0,54 0,09*
(69,3%)
0,51 0,07*
(74,9%)
0,62 0,09*
(67,7%)
0,65 0,13*
(66,7%)
0,73 0,12*
(56,5%)
A fração hexânica de Lonchocarpus sericeus (FLS) e o crel 5% (veículo – CONT) foram administrados por via i.p., 30 min antes da injeção
intraplantar de dextrano (DX 0,1 mL) 1,5% p/v, enquanto a ciproeptadina (CIPRO), foi administrada por v.o., 60 min antes do estímulo
inflamatório. Os valores representam média E.P.M. do volume do edema nos períodos de ½, 1, 2, 3 e 4 horas após a injeção de DX. O
percentual de inibição do edema em relação ao controle a cada período é dado em parênteses. O n
o
de animais (n) é dado em parênteses logo
abaixo dos grupos experimentais. ANOVA e Student-Newman-Keuls, *p < 0,001, comparado ao controle.
95
95
Tabela 8 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus sobre o edema de pata induzido por bradicinina em
ratos
Grupo
Volume do edema (mL)
(n) 10 min 20 min 30 min 60 min 120 min
CONT
(7)
0,67 0,06 0,74 0,09 0,73 0,09 0,68 0,09 0,55 0,09
FLS 100 mg/kg, v.o.
(7)
0,80 0,05 0,79 0,06 0,73 0,05 0,71 0,05 0,59 0,04
FLS 200 mg/kg, v.o.
(7)
0,59 0,05 0,63 0,05 0,62 0,07 0,57 0,07 0,48 0,08
FLS 200 mg/kg, i.p.
(7)
0,51 0,03*
(23,9 %)
0,53 0,04 0,51 0,04 0,48 0,03 0,35 0,04
A fração hexânica de Lonchocarpus sericeus (FLS) e o CONT (crel 5%) foram administrados 60 (v.o.) ou 30 min (i.p.) antes da injeção
intraplantar (0,1 mL) de bradicinina (BK) 5 nmol. Os valores representam média E.P.M. do volume do edema nos períodos de 10, 20, 30, 60 e
120 min após a injeção do estímulo inflamatório. O percentual de inibição do edema em relação ao controle é dado em parênteses. O n
o
de
animais (n) é dado logo abaixo dos grupos experimentais. ANOVA e Student-Newman-Keuls, *p < 0,05, comparado ao controle.
96
96
A FLS na dose de 200 mg/kg, i.p, reduziu significativamente (p < 0,05) o
volume do edema da primeira à quarta hora (0,60 0,10; 0,69 0,09; 0,88 0,10;
0,55 0,09 mL) quando comparado ao controle (1,04 0,09; 1,34 0,14; 1,52
0,14; 1,35 0,17 mL). Entretanto, a FLS na mesma dose por via oral, inibiu
significantemente (p < 0,05) o edema por LC apenas na segunda e quarta horas
(0,98 0,13 e 0,92 0,11 mL, respectivamente).
5.4.4 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus sobre o edema de
pata induzido por carragenina em ratos
Os resultados obtidos pela administração oral da fração hexânica de
Lonchocarpus sericeus (FLS) no edema de pata induzido por carragenina (Cg) em
ratos, encontram-se ilustrados na Figura 10.
O volume do edema (mL) foi reduzido significativamente (p < 0,05) pela
FLS 200 mg/kg, v.o., na segunda, terceira e quarta horas (0,88 0,12; 1,32 0,20;
1,47 0,13), quando comparado ao controle (1,52 0,15; 2,12 0,15; 2,12 0,15),
correspondendo a inibições de 42, 38 e 31% respectivamente. No entanto, a FLS na
dose de 100 mg/kg, v.o. reduziu o edema de forma significativa (p < 0,01) apenas
na segunda e terceira horas (1,02 0,12 e 1,48 0,17 mL), quando comparado ao
controle, com inibições correspondendo a 33 e 30% respectivamente. A INDO (2
mg/kg, v.o.), droga antiinflamatória padrão, também inibiu significativamente (p <
0,001) o edema na segunda, terceira e quarta horas (0,62 0,07; 0,72 0,09; 0,81
0,11 mL), quando comparada ao controle, com inibições que correspondem a 59, 66
e 62% respectivamente.
Na Figura 11 estão representados os resultados obtidos pela administração
i.p. da FLS no edema de pata induzido por Cg em ratos.
97
97
0
0,5
1
1,5
2
01234 24
Tempo (h)
Volume do edema (mL)
CONT
FLS 200, vo
FLS 200, ip
Figura 9 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus sobre o
edema de pata induzido por levedura de cerveja (LC) em ratos.
A fração
hexânica de Lonchocarpus sericeus (FLS 200 mg/kg, v.o. ou 200 mg/kg, i.p) foi
administrada 60 ou 30 min, respectivamente antes da injeção intraplantar de LC
(2,5%). Os valores representam média ± E.P.M. do volume do edema (8
animais/grupo), medido nos períodos de 1, 2, 3, 4 e 24 h, após a injeção de LC.
ANOVA e Student-Newman-Keuls, * p < 0,05, comparado ao controle.
*
*
*
*
*
*
98
98
0
0,5
1
1,5
2
2,5
01234 24
Tempo (h)
Volume do edema (mL)
CONT
FLS 100, vo
FLS 200, vo
INDO 2, vo
Figura 10 – Efeito da administração oral da fração hexânica de
Lonchocarpus sericeus no edema de pata induzido por carragenina (Cg)
em ratos.
A fração hexânica de Lonchocarpus sericeus (FLS 100 e 200 mg/kg,
v.o.), a indometacina (INDO 2 mg/kg, v.o.) e o controle (CONT – crel 5%) foram
administrados 60 min antes da injeção intraplantar de Cg 1% (0,1 mL) na pata
traseira direita do animal. Os valores representam média E.P.M. do volume do
edema (mL) de 8 a 10 animais por grupo, medido após 1, 2, 3, 4 e 24 h da injeção
de Cg. ANOVA e Student-Newman-Kuels, a: p < 0,05; b: p < 0,01; c: p < 0,001 vs
controle.
a
b
b
b
b
c
c
c
99
99
A FLS na dose de 200 mg/kg, i.p., inibiu significativamente (p < 0,001) o
edema induzido por Cg em todos os períodos de tempo observados (0,29 0,06;
0,32 0,07; 0,41 0,07; 0,71 0,16; 0,29 0,05 mL), quando comparado ao
controle (0,76 0,06; 1,20 0,17; 1,58 0,20; 1,89 0,19; 0,74 0,06 mL). Na
dose de 100 mg/kg, i.p.; a FLS inibiu de forma significativa (p < 0,01) o volume do
edema da segunda a vigésima quarta hora (0,62 0,07; 0,68 0,07; 0,80 0,08;
0,32 0,03 mL), em relação ao controle. Na menor dose (50 mg/kg, i.p.), a FLS
inibiu significativamente (p < 0,01) o edema da terceira a vigésima quarta hora
(1,05 0,17; 1,29 0,20; 0,47 0,04 mL), com inibições de 34, 32 e 37%
respectivamente. A INDO (2 mg/kg, v.o.), usada como controle positivo, também
reduziu significativamente (p < 0,05) o volume do edema da segunda à vigésima
quarta hora (0,75 0,09; 0,91 0,11; 0,93 0,10; 0,53 0,05 mL), correspondendo
a inibições de 38, 42, 51 e 28%, em relação ao controle.
a) Avaliação do envolvimento da inibição da ciclooxigenase no efeito
antiedematogênico da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus no modelo de
edema de pata induzido pela carragenina
Na Tabela 9 está representado o efeito da associação da INDO e FLS no
edema induzido por Cg.
A INDO (1 mg/kg, v.o.) associada a FLS (20 mg/kg, i.p.) (0,82 0,08; 1,18
0,11; 1,43 0,14; 1,43 0,14; 0,60 0,06 mL) não foi capaz de potencializar o
efeito inibitório da FLS quando administrada sozinha, em nenhum dos períodos de
tempo observados (0,83 0,07; 1,27 0,13; 1,75 0,17; 2,05 0,17; 0,81
0,09
mL).
100
100
0
0,5
1
1,5
2
2,5
01234 24
Tempo (h)
Volume do edema (mL)
CONT
FLS 50, ip
FLS 100, ip
FLS 200, ip
INDO 2, vo
Figura 11 – Efeito da administração intraperitoneal da fração hexânica
de Lonchocarpus sericeus no edema de pata induzido por carragenina
(Cg) em ratos.
A fração hexânica de Lonchocarpus sericeus (FLS 50, 100 e 200
mg/kg, i.p.), CONT (crel 5%) e INDO (2 mg/kg, v.o.) foram administrados 30 min
ou 60 min antes da injeção intraplantar de Cg 1% (0,1 mL) na pata traseira direita
do animal. Os valores representam média E.P.M. do volume do edema (mL) de 12
animais/grupo, medido após 1, 2, 3, 4 e 24 h da injeção de Cg. ANOVA e Student-
Newman-Kuels, a: p < 0,05; b: p < 0,01; c: p < 0,001 vs controle.
b
a
c
c
c
c
c
b
b
b
b
c
c b
c
c
101
101
Tabela 9 – Avaliação do papel da ciclooxigenase no efeito antiedematogênico da fração hexânica de Lonchocarpus
sericeus sobre o edema de pata induzido por carragenina em ratos
Grupo
Volume do edema (mL)
(n) 1 h 2 h 3 h 4 h 24 h
CONT
(8)
0,96 0,08 2,90 0,22 3,16 0,20 3,14 0,20 1,16 0,10
FLS 20 mg/kg, i.p.
(8)
0,83 0,07 1,27 0,13
a
(56,2 %)
1,75 0,17
a
(44,6 %)
2,05 0,17
a
(34,7 %)
0,81 0,09
a
(30,2 %)
INDO 1 mg/kg, v.o.
(8)
0,60 0,06
a
(37,5 %)
0,97 0,11
a
(66,6 %)
1,65 0,26
a
(47,8 %)
2,04 0,28
a
(35,0 %)
1,02 0,08
FLS 20 mg/kg, i.p.
+
INDO 1 mg/kg, v.o.
(8)
0,82 0,08
1,18 0,11
a
(59,3 %)
1,43 0,14
a
(54,7 %)
1,43 0,14
a
(54,4 %)
0,60 0,06
a,b
(48,3 %)
A fração hexânica de Lonchocarpus sericeus (FLS) e o crel 1% (CONT) foram administrados 30 min e a indometacina
(INDO) 60 min antes da injeção intraplantar de carragenina (Cg – 0,1 mL) 1% p/v. No grupo FLS + INDO, a FLS foi
administrada 30 min após a administração da INDO, a qual foi administrada 60 min antes da Cg. Os valores representam
média E.P.M. do volume do edema nos períodos de 1, 2, 3, 4 e 24 h após a injeção do estímulo inflamatório. O percentual
de inibição do edema em relação ao controle a cada período é dado em parênteses. O n
o
de animais (n) é dado logo abaixo
dos grupos experimentais. ANOVA e Student-Newman-Keuls, a, b: p < 0,05, comparado ao controle e a INDO
respectivamente.
102
102
b) Avaliação do papel do sistema óxido nítrico no efeito antiedematogênico da
fração hexânica de Lonchocarpus sericeus no modelo de edema de pata
induzido pela carragenina
O L-NAME (5 mg/kg, i.p) administrado em associação com a FLS (20
mg/kg, i.p.) (0,68 0,07; 1,28 0,14; 2,21 0,16; 2,60 0,18; 0,87 0,07 mL),
não promoveu potencialização do efeito inibitório da FLS, quando administrada
sozinha e na mesma dose, (0,75 0,07; 1,51 0,12; 2,14 0,14; 2,53 0,184; 0,85
0,13 mL), nos períodos de tempo pré-estabelecidos. Estes resultados encontram-se
apresentados na Tabela 10.
c) Avaliação do envolvimento da inibição da fosfodiesterase no efeito
antiedematogênico da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus no modelo de
edema de pata induzido pela carragenina
A FLS (20 mg/kg, i.p.) (0,83 0,05; 1,08 0,10; 1,30 0,11 mL) teve seu
efeito potencializado significativamente (p < 0,01) pela PTX (10 mg/kg, i.p.) na
segunda, terceira e quarta horas, quando as mesmas foram co-administradas (0,48
0,04; 0,53 0,10; 0,80 0,06 mL). Na Figura 12 estão ilustrados os resultados
desta associação.
5.4.5 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus sobre o edema de
pata induzido por formalina em camundongos
Na Tabela 11 estão apresentados os resultados obtidos com a FLS na reação
inflamatória induzida por formalina em camundongos.
A administração por via i.p. de 100 mg/kg da FLS não resultou em alteração
significativa do edema por formalina, em nenhum dos períodos de tempo
registrados (½, 1, 2, 3, 4, e 24 h ) (0,24 0,013; 0,30 0,014; 0,29 0,016;
103
103
Tabela 10 – Avaliação do papel do sistema óxido nítrico no efeito antiedematogênico da fração hexânica de
Lonchocarpus sericeus sobre o edema de pata induzido por carragenina em ratos
Grupo
Volume do edema (mL)
(n) 1 h 2 h 3 h 4 h 24 h
CONT
(8)
1,07 0,11 1,99 0,15 2,43 0,14 2,50 0,13 0,91 0,08
FLS 20 mg/kg, i.p.
(8)
0,75 0,07*
(29,9 %)
1,51 0,12 2,14 0,14 2,53 0,18 0,85 0,13
L-NAME 5 mg/kg, i.p.
(8)
0,78 0,09*
(27,1 %)
1,57 0,21 2,25 0,28 2,70 0,28 0,87 0,08
FLS 20 mg/kg, i.p.
+
L-NAME 5 mg/kg, i.p.
(8)
0,68 0,07*
(36,4 %)
1,28 0,14*
(36,7 %)
2,21 0,16
2,60 0,18
0,87 0,07
A fração hexânica de Lonchocarpus sericeus (FLS), o L-NAME e o crel 1% (CONT) foram administrados 30 min antes da injeção intraplantar
de carragenina (Cg – 0,1 mL) 1 % p/v. No grupo FLS + L-NAME, ambas as substâncias foram administradas simultaneamente 30 min antes da
Cg. Os valores representam média E.P.M. do volume do edema nos períodos de 1, 2, 3, 4 e 24 h após a injeção do estímulo inflamatório. O
percentual de inibição do edema em relação ao controle a cada período é dado em parênteses. O n
o
de animais (n) é dado logo abaixo dos grupos
experimentais. ANOVA e Student-Newman-Keuls, *p < 0,05, comparado ao controle.
104
104
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
01234 24
Tempo (h)
Volume do edema (mL)
CONT
FLS 20, ip
PTX 10, ip
FLS + PTX, ip
Figura 12 – Avaliação do papel da fosfodiesterase no efeito
antiedematogênico da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus sobre o
edema de pata induzido por carragenina (Cg) em ratos.
A FLS (20 mg/kg,
i.p.), PTX (10 mg/kg, i.p.) e CONT (crel 5%) foram administrados 30 min antes da
injeção intraplantar de Cg 1% (0,1 mL) na pata traseira direita do animal. No grupo
FLS + PTX (20 + 10 mg/kg, i.p., respectivamente), as mesmas foram administradas
simultaneamente, 30 min antes da injeção de Cg. Os valores representam média
E.P.M. do volume do edema (8 animais/grupo), medido em mL após 1, 2, 3, 4 e 24
h da injeção de Cg. ANOVA e Student-Newman-Kuels, a,b,c: p < 0,01 vs CONT,
FLS e PTX, respectivamente.
a,b,c
a
a
a,b,c
a,b,c
a,c
105
105
0,27 0,016; 0,25 0,025; 0,28 0,022 mL) em relação ao controle (0,24 0,017;
0,30 0,017; 0,30 0,015; 0,29 0,016; 0,27 0,016; 0,27 0,027 mL).
Entretanto, na dose de 200 mg/kg, i.p., a FLS promoveu uma redução significativa
(P < 0,05) do volume médio do edema em todos os períodos de tempo observados,
com exceção da vigésima quarta hora (0,15 0,19; 0,22 0,010; 0,23 0,013; 0,19
0,007; 0,19 0,007 mL), correspondendo a inibições de 38; 27; 23; 35 e 30%
respectivamente, quando comparados ao controle.
5.4.6 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus sobre a migração de
neutrófilos induzida por carragenina na cavidade peritoneal de ratos
A Figura 13 mostra os resultados obtidos com a FLS sobre a migração de
neutrófilos induzida por Cg na cavidade peritoneal de ratos.
No grupo controle (crel 2%, v.o.), o n
o
médio de leucócitos totais (x 10
6
células/mL) encontrados na cavidade peritoneal, 4 h após a injeção de Cg (300 g),
foi de 5,0 0,20; enquanto o n
o
médio de neutrófilos (x 10
6
células/mL) foi de 3,0
0,16. Entretanto, no grupo de animais que não recebeu Cg, o n
o
de leucócitos totais
foi de 1,1 0,14; enquanto que para neutrófilos foi de 0,6 0,07. A FLS (200 e 400
mg/kg, v.o.) causou uma redução no n
o
de leucócitos (2,5 0,16 e 3,3 0,18) e no
n
o
de neutrófilos (1,4 0,08 e 1,8 0,09) correspondendo a inibições significativas
(p < 0,001) de 50 e 34% respectivamente para leucócitos, e de 53 e 40% (p < 0,001)
respectivamente para neutrófilos, comparadas ao grupo controle. A DEXA (1
mg/kg, s.c.), usada como controle positivo, reduziu de forma significativa o n
o
de
leucócitos totais (1,3 0,06; p < 0,001) assim como o de neutrófilos (0,7 0,03; p <
0,001), no foco inflamatório, correspondendo a inibições de 74 e 77%
respectivamente, em relação ao grupo controle.
106
106
Tabela 11 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus sobre o edema de pata induzido por formalina em
camundongos
Grupo
Volume do edema (mL)
(n) ½ h 1 h 2 h 3 h 4 h 24 h
CONT
(10)
0,24 0,017 0,30 0,017 0,30 0,015 0,29 0,016 0,27 0,016 0,27 0,027
FLS 100 mg/kg, i.p.
(10)
0,24 0,013 0,30 0,014 0,29 0,016 0,27 0,016 0,25 0,025 0,29 0,022
FLS 200 mg/kg, i.p.
(10)
0,15 0,019*
(37,5 %)
0,22 0,010*
(26,7 %)
0,23 0,013*
(23,3 %)
0,19 0,007*
(34,5 %)
0,20 0,007*
(29,6 %)
0,24 0,016
A fração hexânica de Lonchocarpus sericeus (FLS) e o crel 1 % (CONT) foram administrados por via i.p., 30 min antes da injeção intraplantar de
formalina (20 l) 5 % v/v. Os valores representam média E.P.M. do volume do edema nos períodos de ½, 1, 2, 3, 4 e 24 h após a injeção do
estímulo inflamatório. O percentual de inibição do edema em relação ao controle a cada período é dado em parênteses. O n
o
de animais (n) é
dado logo abaixo dos grupos experimentais. ANOVA e Student-Newman-Keuls, *p < 0,05, comparado ao controle.
107
107
0
1
2
3
4
5
6
CONT FLS 200 vo FLS 400 vo DEXA 1 sc
N
o
de células x 10
6
/mL
Leucócitos
Neutrófilos
Figura 13 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus na
migração de leucócitos induzida por carragenina em ratos.
A fração
hexânica de Lonchocarpus sericeus (FLS 200 e 400 mg/kg, v.o.) e o CONT (Crel
2%) foram administrados 60 min, e a dexametasona (DEXA 1 mg/kg, s.c.) foi
administrada 120 min antes da injeção de 1 mL de carragenina (Cg 300 g/animal,
i.p.). Os valores representam média ± E.P.M. do número de leucócitos e neutrófilos
na cavidade peritoneal de 8 ratos por grupo, 4 h após a administração da Cg.
ANOVA e Student-Newman-Keuls, * p < 0,001 comparado ao controle.
*
*
*
*
*
*
CONT
200 400 1
FLS
(mg/kg)
DEXA
(mg/kg)
108
108
5.4.7 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus sobre a migração de
neutrófilos induzida por N-Formil-metionil-leucil-fenilalanina na cavidade
peritoneal de ratos
Os resultados obtidos com a FLS sobre a migração de neutrófilos induzida
por fMLP, 4 h após sua administração, na cavidade peritoneal de ratos encontram-se
representados na Figura 14.
O grupo de animais que não recebeu fMLP apresentou um n
o
médio de
leucócitos totais (x 10
6
células/mL) e neutrófilos (x 10
6
células/mL) de 1,4 0,12 e
0,6 0,06 respectivamente. Por outro lado, no grupo controle (crel 2%, v.o.) o n
o
de
leucócitos totais, encontrados na cavidade peritoneal injetada com fMLP (10 nM),
foi de 2,8 0,18, enquanto o n
o
médio de neutrófilos foi de 1,5 0,11. A FLS (100
e 200 mg/kg, v.o.) reduziu o n
o
de leucócitos (0,9 0,11 e 1,82 0,13) e o n
o
de
neutrófilos (0,5 0,07 e 0,9 0,07) correspondendo a inibições significativas de 51
e 64% (p < 0,01) respectivamente para leucócitos totais, e de 49 e 64% (p < 0,01)
respectivamente para neutrófilos, quando comparadas ao grupo controle. A menor
dose de FLS (50 mg/kg, v.o.) reduziu de forma significativa apenas o n
o
total de
leucócitos (2,1 0,28; p < 0,05), representando 25% de inibição em relação ao
controle. A DEXA (1 mg/kg, s.c.), usada como controle positivo, reduziu de forma
significativa (p < 0,001) o número de leucócitos em 57% (1,2 0,13) e número de
neutrófilos em 60% (0,6 0,07), em relação ao grupo controle (Figura 14).
5.4.8 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus sobre o granuloma
induzido por pellet de algodão em ratos
A Tabela 12 mostra os resultados obtidos com a FLS no modelo de
granuloma induzido por pellet de algodão em ratos.
109
109
0
1
2
3
4
CONT FLS 100 vo FLS 200 vo DEXA 1 sc
N
o
de células x 10
6
/mL
Leucócitos
Neutrófilos
Figura 14 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus na
migração de leucócitos induzida por N-formil-metionil-leucil-fenilalanina
(fMLP) em ratos.
A fração hexânica de Lonchocarpus sericeus (FLS 100 e 200
mg/kg, v.o.) e o CONT (Crel 2 %) foram administrados 60 min, e a dexametasona
(DEXA 1 mg/kg) 120 min antes da injeção de 1 mL de fMLP (10 nM/animal, i.p.).
Os valores representam média ± E.P.M. do número de leucócitos e neutrófilos na
cavidade peritoneal de 10 ratos por grupo, 4 h após a administração do estímulo
inflamatório. ANOVA e Student-Newman-Kuels, * p < 0,01; ** p < 0,001
comparado ao controle.
*
*
**
**
*
*
CONT
100 200 1
FLS
(mg/kg)
DEXA
(mg/kg)
110
110
O tratamento dos animais com a FLS (25 mg/kg, v.o. e 50 mg/kg, i.p.) não
resultou em diminuição significativa do peso úmido (1055,0 64,77 e 943,7
39,93 mg respectivamente) e peso seco (714,0 50,80 e 585,4 33,27 mg
respectivamente) dos granulomas formados, quando comparados ao controle (peso
úmido: 1101,0 56,03 e peso seco: 683,2 42,24 mg respectivamente), após sete
dias de implantação dos pellets de algodão. Da mesma forma, a FLS (25 mg/kg, v.o.
e 50 mg/kg, i.p.) também foi incapaz de modificar de maneira significativa, o peso
das glândulas adrenais (31,3 1,17 e 28,5 1,41 mg respectivamente) e do timo
(317,9 16,94 e 342,3 31,63 mg respectivamente), quando os mesmos foram
comparados com os do grupo controle (adrenais: 28,7 1,29 e timo: 393,6 8,87
mg respectivamente). A DEXA (0,01 mg/kg, s.c.), usada como antiinflamatório
padrão reduziu de forma significativa o peso úmido (872,8 44,64 mg; p < 0,05),
mas não o peso seco (563,1 35,20 mg) dos granulomas quando comparada ao
controle. A mesma ainda foi capaz de modificar de forma significativa (p < 0,001) o
peso das glândulas adrenais (21,7 0,94 mg) e do timo (225,9 16,18 mg), quando
os mesmos foram comparados aos pesos dos controles.
5.4.9 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus sobre a colite
induzida por ácido acético em ratos
Os resultados obtidos com a FLS no modelo de colite induzida pelo ácido
acético em ratos estão ilustrados na Tabela 13 e Figura 15.
A FLS administrada por via intra-retal (i.r.), na dose de 100 mg/kg, não
modificou a média de escores atribuídos às lesões do cólon (8,5; 1,0 – 16,0), o peso
úmido do cólon (574,6 55,78 mg) e a atividade da MPO (1,94 0,24 U/min/g),
quando comparada ao controle (12,5; 7,0 – 15,0; 628,1 43,78 mg; 2,72 0,27
U/min/g). Contudo, quando administrada por v.o., a FLS (200 mg/kg) modificou
significativamente (p < 0,01) a média de escores macroscópicos (4,0; 2,0 – 9,0) e a
atividade da MPO (0,74 0,19 U/min/g), porém não modificou o peso úmido do
111
111
Tabela 12 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus sobre o granuloma induzido por pellet de algodão em
ratos
Grupo Granuloma (mg) Adrenais (mg) Timo (mg)
Peso Úmido Peso Seco
CONT
1101,0 56,03
(16)
683,2 42,24
(16)
28,7 1,29
(16)
393,6 8,87
(8)
FLS 25 mg/kg, v.o.
1055,0 64,77
(16)
714,0 50,80
(16)
31,3 1,17
(16)
317,9 16,94
(8)
FLS 50 mg/kg, i.p.
943,7 39,93
(16)
585,4 33,27
(16)
28,5 1,41
(16)
342,3 31,63
(8)
DEXA 0,01 mg/kg, s.c.
872,8 44,64*
(16)
563,1 35,20
(16)
21,7 0,94**
(16)
225,9 16,18**
(8)
Os animais foram tratados por via s.c. com dexametasona (DEXA 0,01 mg/kg) e por v.o. ou i.p. com fração hexânica de Lonchocarpus sericeus
(FLS 25 e 50 mg/kg), 120, 60 ou 30 min antes da implantação dos pellets de algodão, e continuaram sendo tratados por sete dias. Após este
período os animais foram sacrificados e tiveram dissecados e pesados os granulomas, as adrenais e os timos. Os valores representam média
E.P.M. do peso em mg dos granulomas úmidos e secos, das glândulas adrenais e timos. O n
o
de estruturas pesadas é dado em parênteses.
ANOVA e Student-Newman-Keuls, *p < 0,05; **p < 0,001 comparado ao controle.
112
112
cólon (664,9 27,67 mg), quando comparada ao controle. Ainda a FLS, na dose de
100 mg/kg, v.o., não foi capaz de modificar significativamente nenhum dos
parâmetros citados acima (8,5; 5,0 – 15,0; 623,2 61,12 mg; 2,48 0,47 U/min/g),
quando os mesmos foram comparados aos do controle.
5.5 Atividade analgésica
5.5.1 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus nas contorções
abdominais induzidas pelo ácido acético em camundongos
A administração oral da FLS (200 e 400 mg/kg) reduziu significativamente
(p < 0,001) e de forma dose-dependente, a resposta nociceptiva induzida pelo ácido
acético (31,1 2,95 e 12,1 2,97 contorções/ 20 min), em relação ao controle (50,0
2,37 contorções/ 20 min), correspondendo a inibições de 38 e 76% (Figura 16).
A FLS, nas doses de 50, 100 e 200 mg/kg, administrada subcutaneamente
reduziu de maneira significativa (p < 0,01) o n
o
de contorções abdominais (25,8
5,67; 21,8 4,50 e 20,3 3,89 contorções/ 20 min), quando comparada ao grupo
controle (46,9 2,75 contorções/ 20 min), correspondendo a inibições de 45; 54 e
57% respectivamente (Figura 17).
a) Estudo sobre o envolvimento do TNF- na antinocicepção da fração
hexânica de Lonchocarpus sericeus
A talidomida (TALI 5 mg/kg, v.o.) apresentou uma inibição não significativa do n
o
de contorções abdominais registradas durante 20 min (29,5 4,34) quando
comparada ao controle (43,0 2,86). A mesma não foi capaz de modificar de forma
significativa o efeito da FLS na dose de 25 mg/kg, s.c., quando as duas foram
administradas em associação (33,3 4,98 contorções/ 20 min) quando comparadas
a FLS sozinha (36,9 4,91 contorções/ 20 min) (Tabela 14).
113
113
Tabela 13 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus sobre a colite induzida por ácido acético em ratos
Grupo
(n)
Atividade da MPO
(U/min/g)
Peso úmido do cólon
(mg)
Escores macroscópicos
das lesões do cólon
CONT
(10)
2,72 0,27 628,1 43,78
12,5 (7,0 – 15,0)
FLS 100 mg/kg, i.r.
(8)
1,94 0,24 574,6 55,78
8,5 (1,0 – 16,0)
FLS 100 mg/kg, v.o.
(8)
2,48 0,47 623,2 61,12
8,5 (5,0 – 15,0)
FLS 200 mg/kg, v.o.
(8)
0,74 0,19* 664,9 27,67
4,0 (2,0 – 9,0)*
Durante os dois primeiros dias os animais foram tratados com a fração hexânica de Lonchocarpus sericeus (FLS 100 mg/kg, por via i.r.) ou (100
e 200 mg/kg, v.o.), duas vezes ao dia. No terceiro dia, os animais receberam tratamento apenas pela manhã e após duas horas, a colite foi
induzida por via i.r. com ácido acético 4%. Após vinte quatro horas os animais foram sacrificados e procedeu-se a avaliação macroscópica das
lesões do cólon, a pesagem da mucosa e a dosagem da MPO. O n
o
de animais (n) é dado em parênteses. Com exceção dos escores, que são
apresentados como mediana (min – máx), os outros parâmetros foram expressos como média E.P.M. ANOVA e Student-Newman-Keuls, *p <
0,001 comparado ao controle da atividade da MPO e do peso úmido do cólon. Para os escores foi utilizado o Kruskall-Wallis seguido do teste de
Dunnett, *p < 0,01 comparado ao controle.
114
114
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
CONT FLS 100, ir FLS 100, vo FLS 200, vo
MPO (U/min/g de tecido)
Figura 15 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus sobre a
atividade da mieloperoxidase na colite induzida pelo ácido acético em
ratos.
Durante os dois primeiros dias os animais (n = 8 a 10/grupo) foram tratados
com a fração hexânica de Lonchocarpus sericeus (FLS) 100 mg/kg, por via intra-
retal (i.r.) ou 100 e 200 mg/kg, v.o., duas vezes ao dia. No terceiro dia, os animais
receberam tratamento apenas pela manhã e após duas horas, a colite foi induzida
por ácido acético 4% (via i.r.). Após vinte quatro horas, os animais foram
sacrificados e a atividade da MPO (U/min/g) foi avaliada. Os resultados
representam média E.P.M da atividade da MPO. ANOVA e Student-Newman-
Keuls, *p < 0,01 comparado ao controle.
*
CONT
100, i.r.
100, v.o. 200, v.o.
FLS
(mg/kg)
115
115
0
20
40
60
CONT FLS 200, vo FLS 400, vo
N
o
de contorções/ 20 min
Figura 16 – Efeito da administração oral da fração hexânica de
Lonchocarpus sericeus na resposta nociceptiva induzida por ácido acético
em camundongos.
A fração hexânica de Lonchocarpus sericeus (FLS 200 e 400
mg/kg, v.o.) e o CONT (crel 2%) foram administrados 60 min antes da injeção
intraperitoneal de ácido acético 0,6%. Os valores representam média E.P.M. do
número de contorções abdominais apresentado pelos animais (15/grupo),
registrados durante 20 min, iniciando 10 min após a injeção do ácido acético.
ANOVA e Student-Newman-Keuls, *p < 0,001 comparado ao controle.
*
*
CONT
200 400
FLS
(mg/kg)
116
116
0
20
40
60
CONT FLS 50, sc FLS 100, sc FLS 200, sc
N
o
de contorções/ 20 min
Figura 17 – Efeito da administração subcutânea da fração hexânica de
Lonchocarpus sericeus na resposta nociceptiva induzida por ácido acético
em camundongos.
A fração hexânica de Lonchocarpus sericeus (FLS 50, 100 e
200 mg/kg, s.c.) e o CONT (crel 2%) foram administrados 30 min antes da injeção
intraperitoneal de ácido acético 0,6%. Os valores representam média E.P.M. do
número de contorções abdominais apresentado pelos animais (12/grupo),
registrados durante 20 min, iniciando 10 min após a injeção do ácido acético.
ANOVA e Student-Newman-Keuls, *p < 0,01 comparado ao controle.
*
*
*
CONT
50 100 200
FLS
(mg/kg)
117
117
Entretanto, a FLS (200 mg/kg, v.o.) associada à TALI (5 mg/kg, v.o.) teve seu
efeito potencializado de forma significativa (14,9 2,96 contorções/ 20 min; p <
0,01), quando comparada a FLS, na mesma dose, administrada sozinha (33,4 4,28
contorções/ 20 min). Estes resultados estão apresentados na Tabela 14 e Figura 18.
b) Avaliação do papel da fosfodiesterase na antinocicepção da fração hexânica
de Lonchocarpus sericeus
Ainda utilizando o teste das contorções abdominais induzidas pelo ácido
acético, a Figura 19 mostra que a FLS (100 mg/kg, v.o.) associada à PTX (5 mg/kg,
s.c.) teve seu efeito antinociceptivo potencializado significativamente (18,9 2,42
contorções/ 20 min; p < 0,001) quando comparada a FLS administrada sozinha, na
mesma dose (36,3 3,48 contorções/ 20 min).
5.5.2 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus nas contorções
abdominais induzidas pela acetilcolina em camundongos
A Tabela 15 mostra que a administração subcutânea da FLS (100 e 200
mg/kg) não foi capaz de modificar significativamente o n
o
de contorções
abdominais induzidas pela ACh (3,55 0,69 e 4,30 0,76 contorções) quando
comparada ao grupo controle (4,65 0,72 contorções). No entanto, a INDO (2
mg/kg, v.o.) reduziu de forma significativa (p < 0,001) a resposta dolorosa induzida
pela ACh em 94% (0,30 0,13 contorções), em relação ao controle.
5.5.3 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus no teste da formalina
em camundongos
Na Figura 20 está ilustrado o efeito da administração oral da FLS na
nocicepção induzida pela formalina em camundongos. A FLS, nas doses de 200 e
400 mg/kg, v.o., causou inibições significativas de 45 e 60% respectivamente (p <
118
118
Tabela 14 – Efeito da co-administração da talidomida e da fração
hexânica de Lonchocarpus sericeus nas contorções abdominais induzidas
pelo ácido acético em camundongos
Grupo
(n)
N
o
de Contorções % de Inibição
CONT
(20)
43,0 2,86
-
FLS 25 mg/kg, s.c.
(14)
36,9 4,91
14,0
FLS 200 mg/kg, v.o.
(18)
33,4 4,28
22,1
TALI 5 mg/kg, v.o.
(20)
29,5 4,34
31,2
FLS 25 mg/kg, s.c.
+
TALI 5 mg/kg, v.o.
(14)
33,3 4,98
22,4
FLS 200 mg/kg, v.o.
+
TALI 5 mg/kg, v.o.
(18)
14,9 2,96
a,b,c
65,3
A fração hexânica de Lonchocarpus sericeus (FLS 200 mg/kg), talidomida (TALI) ou
CONT (crel 2%) foram administrados oralmente 60 min, e a FLS (25 mg/kg) foi
administrada por via s.c., 30 min antes da injeção de ácido acético (0,6%, i.p.). Os valores
representam média E.P.M. do n
o
de contorções registrado por 20 min, 10 min após a
injeção de ácido acético. O n
o
de animais (n) é dado em parênteses. ANOVA e Student-
Newman-Keuls, a, b, c: p < 0,01; versus CONT, TALI e FLS (200 mg/kg, v.o.)
respectivamente.
119
119
0
10
20
30
40
50
N
o
de contorções/ 20 min
Figura 18 – Efeito da talidomida na antinocicepção da fração hexânica de
Lonchocarpus sericeus no teste das contorções abdominais induzidas pelo
ácido acético em camundongos.
A talidomida (TALI 5 mg/kg, v.o.) e a fração
hexânica de Lonchocarpus sericeus (FLS 200 mg/kg, v.o.) foram administradas 60
min antes da injeção de ácido acético (0,6 %, i.p.). Os valores representam média
E.P.M. do n
o
de contorções apresentado pelos animais (14 a 20/grupo), registrado
durante um período de 20 min, iniciando 10 min após a injeção do ácido acético.
ANOVA e Student-Newman-Keuls, a, b, c: p< 0,01 comparado ao controle, FLS
(200 mg/kg, v.o.) e TALI (5 mg/kg, v.o.), respectivamente.
5 200 200
FLS
(mg/kg)
TALI
(5 mg/kg)
TALI
(mg/kg)
CONT
a,b,c
120
120
0
10
20
30
40
50
60
CONT PTX 5, sc FLS 100, vo PTX 5 + FLS
100, vo
N
o
de contorções/ 20 min
Figura 19 – Efeito da pentoxifilina na antinocicepção da fração hexânica
de Lonchocarpus sericeus no teste das contorções abdominais induzidas
pelo ácido acético em camundongos.
A fração hexânica de Lonchocarpus
sericeus (FLS 100 mg/kg, v.o.) ou a pentoxifilina (PTX 5 mg/kg, s.c.) foram
administradas 60 ou 30 min antes da injeção de ácido acético (0,6%, i.p.). Os
valores representam média E.P.M. do n
o
de contorções apresentado pelos animais
(15/grupo), registrados durante um período de 20 min, iniciando 10 min após a
injeção do ácido acético. ANOVA e Student-Newman-Keuls, a, b, c: p< 0,001
comparado ao controle, FLS (100 mg/kg, v.o.) e PTX (5 mg/kg, s.c.),
respectivamente.
a
,
b
,
c
5
100
100
FLS
(mg/kg)
PTX
(5 mg/kg)
PTX
(mg/kg)
CONT
121
121
Tabela 15 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus nas
contorções abdominais induzidas pela acetilcolina em camundongos
Grupo
(n)
N
o
de Contorções % de Inibição
CONT
(20)
4,65 0,72
-
FLS 100 mg/kg, s.c.
(20)
3,55 0,69
-
FLS 200 mg/kg, s.c.
(20)
4,30 0,76
-
INDO 2 mg/kg, v.o.
(20)
0,30 0,13*
93,5
A fração hexânica de Lonchocarpus sericeus (FLS) e o CONT (crel 2%) foram
administrados por via s.c. e a indometacina (INDO) foi administrada por v.o., 30 e 60 min
respectivamente, antes da injeção de ACh (10 mg/kg, i.p.). Os valores representam média
S.E.M. do n
o
de contorções registrado por 10 min, após o surgimento da primeira
contorção. O n
o
de animais (n) é dado em parênteses. ANOVA e Student-Newman-Keuls,
*p < 0,001 comparado ao controle.
122
122
0,01) no tempo que o animal passou lambendo a pata, na segunda fase do teste (20 –
25 min) (10,4 1,52 e 7,6 1,61 seg) quando comparada ao controle (18,9 3,45
seg). Apenas a maior dose da FLS (400 mg/kg, v.o.) foi capaz de reduzir de forma
significativa (p < 0,01) o tempo de reação do animal ao estímulo químico, na
primeira fase do teste (0 – 5 min) (42,9 4,81 seg) em relação ao controle (64,7
4,00 seg), correspondendo a uma inibição de 34%.
Na Figura 21 está representado o efeito da administração por via i.p. da FLS
na nocicepção induzida pela formalina em camundongos. A FLS, na dose de 200
mg/kg, i.p., inibiu de maneira significativa (p < 0,001) o tempo que o animal passou
lambendo a pata, na primeira fase do teste (39,3 2,76 seg), quando comparada ao
controle (61,4 2,50 seg). Na segunda fase do teste, a FLS nas doses de 100 e 200
mg/kg, i.p., causou inibições significativas (p < 0,01) de 62 e 94% (10,7 2,65 e
1,7 0,56 seg), em relação ao grupo controle (28,1 3,88 seg).
a) Estudo do papel do sistema opióide na antinocicepção da fração hexânica de
Lonchocarpus sericeus
O pré-tratamento com a naloxona (NAL 2 mg/kg, s.c.) não reverteu o efeito
antinociceptivo da FLS (100 e 200 mg/kg, i.p.) na segunda fase do teste da
formalina (8,9 1,93 e 1,1 0,50 seg respectivamente) quando comparada a FLS
(100 e 200 mg/kg, i.p.) administrada sozinha (9,8 3,12 e 1,7 0,90 seg
respectivamente). Entretanto, a NAL, na mesma dose e via de administração,
promoveu uma reversão significativa (p < 0,05) do efeito antinociceptivo da MORF
(7 mg/kg, i.p.) nas duas fases do teste. Estes resultados encontram-se representados
na Tabela 16.
123
123
Figura 20 – Efeito da administração oral da fração hexânica de
Lonchocarpus sericeus na nocicepção induzida pela formalina em
camundongos.
A fração hexânica de Lonchocarpus sericeus (FLS 200 e 400
mg/kg, v.o.) e o CONT (crel 2%) foram administrados 60 min antes da injeção
intraplantar de formalina 1% (20 L). Os resultados representam média E.P.M. do
tempo gasto pelos animais (18/grupo) lambendo a pata, registrado nos períodos de 0
– 5 min (1
a
fase) e 20 – 25 min (2
a
fase), após a injeção de formalina. ANOVA e
Student-Newman-Keuls, * p< 0,05 e ** p< 0,01 comparado ao controle.
0
20
40
60
80
Tempo gasto lambendo a pata
(seg)
1a fase
2a fase
CONT
200
400
FLS
(mg/kg)
*
**
**
124
124
Figura 21 – Efeito da administração intraperitoneal da fração hexânica
de Lonchocarpus sericeus na nocicepção induzida pela formalina em
camundongos.
A fração hexânica de Lonchocarpus sericeus (FLS 100 e 200
mg/kg, i.p.) e o CONT (crel 2%) foram administrados 30 min antes da injeção
intraplantar de formalina 1% (20 L). Os resultados representam média E.P.M. do
tempo gasto pelos animais (24 a 36/grupo) lambendo a pata, registrado nos períodos
de 0 – 5 min (1
a
fase) e 20 – 25 min (2
a
fase), após a injeção de formalina. ANOVA
e Student-Newman-Keuls, * p< 0,01 e ** p< 0,001 comparado ao controle.
0
20
40
60
80
Tempo gasto lambendo a pata
(seg)
1a fase
2a fase
CONT
100
200
FLS
(mg/kg)
**
**
*
125
125
Tabela 16 – Avaliação da participação do sistema opióide no efeito
antinociceptivo da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus na
nocicepção induzida pela formalina em camundongos
Grupo Tempo (seg) % de Inibição
(n) 1
a
fase 2
a
fase 1
a
fase 2
a
fase
CONT
(12)
63,5 3,44 27,2 4,89
-
-
FLS 100 mg/kg, i.p.
(12)
60,0 4,69 9,8 3,12
a
- 64,0
FLS 200 mg/kg, i.p.
(12)
40,4 3,92
a
1,7 0,90
a
36,4 93,8
MORF 7 mg/kg, i.p.
(12)
43,5 3,17
a
12,1 2,71
a
31,5 55,5
NAL 2 mg/kg, s.c.
(12)
67,7 3,86 27,4 4,22
- -
FLS 100 mg/kg, i.p.
+
NAL 2 mg/kg, s.c.
(12)
49,6 4,01
a
8,9 1,93
a
21,9
67,3
FLS 200 mg/kg, i.p.
+
NAL 2 mg/kg, s.c.
(12)
41,1 4,42
a
1,1 0,50
a
35,3
96,0
MORF 7 mg/kg, i.p.
+
NAL 2 mg/kg, s.c.
(12)
66,3 3,74
b
23,0 3,72
b
-
-
A fração hexânica de Lonchocarpus sericeus (FLS), a morfina (MORF) e o CONT (crel
2%) foram administrados 30 min antes da injeção intraplantar de formalina 1% (20 l). A
naloxona (NAL) foi administrada 15 min antes do tratamento com a FLS ou MORF. Os
resultados representam média E.P.M. do tempo gasto pelo animal lambendo a pata,
registrado nos períodos de 0 – 5 min (1
a
fase) e 20 – 25 min (2
a
fase), após a injeção de
formalina. O n
o
de animais (n) é dado em parênteses. ANOVA e Student-Newman-Keuls, a
e b: p < 0,05 versus CONT e MORF respectivamente.
126
126
b) Estudo sobre o envolvimento do óxido nítrico na antinocicepção da fração
hexânica de Lonchocarpus sericeus
Na Tabela 17 estão representados os resultados obtidos com o pré-
tratamento intraperitoneal com a L-arginina (L-ARG) sobre a antinocicepção
induzida pela FLS. A L-ARG (600 mg/kg, i.p.) não reverteu o efeito da FLS (100 e
200 mg/kg, i.p.), na segunda fase do teste da formalina (17,2 3,89 e 0 0 seg,
respectivamente) quando comparada ao efeito da FLS sozinha (12,7 1,43 e 0 0
seg, respectivamente). A FLS, na dose de 200 mg/kg, i.p., também não teve seu
efeito revertido pela L-ARG (600 mg/kg, i.p.) na primeira fase (47,8 8,51 seg)
quando comparada a FLS sem o pré-tratamento com a L-ARG (47,7 6,23 seg).
Contudo, o L-NAME (75 mg/kg, i.p.) teve seu efeito revertido significativamente (p
< 0,05) pela L-ARG (1
a
fase: 67,3 5,37 seg e 2
a
fase: 20,5 2,79 seg), quando
comparado ao L-NAME sem pré-tratamento (1
a
fase: 54,8 3,33 seg e 2
a
fase: 8,5
2,00 seg).
c) Avaliação do papel dos receptores
1
e
2
adrenérgicos na antinocicepção da
fração hexânica de Lonchocarpus sericeus
O efeito do pré-tratamento dos animais com o prazosin (PRAZ), um
antagonista dos receptores
1
adrenérgicos, sobre a antinocicepção induzida pela
FLS no teste da formalina está representado na Tabela 18. A FLS (200 mg/kg, i.p.)
não teve seu efeito modificado pelo PRAZ (1 mg/kg, v.o.) (1
a
fase: 29,4 4,55 seg
e 2
a
fase: 0,3 0,19 seg) quando comparada a FLS administrada sozinha (1
a
fase:
39,5 4,59 seg e 2
a
fase: 2,3 0,79 seg). Entretanto, o pré-tratamento com o PRAZ
(1 mg/kg, v.o.) reverteu de forma significativa (p < 0,05), o efeito da fenilefrina
(FENIL 12 mg/kg, i.p.) (1
a
fase: 48,4 4,65 seg e 2
a
fase: 29,7 4,04 seg), quando
comparado ao efeito desta última administrada sozinha (1
a
fase: 30,2 4,88 seg e 2
a
fase: 1,2 0,27 seg).
127
127
Tabela 17 - Avaliação do papel do óxido nítrico no efeito antinociceptivo
da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus na nocicepção induzida pela
formalina em camundongos
Grupo Tempo (seg) % de Inibição
(n) 1
a
fase 2
a
fase 1
a
fase 2
a
fase
CONT
(18)
70,7 3,72 26,8 3,03
- -
FLS 100 mg/kg, i.p.
(18)
63,1 3,77 12,7 1,43
a
- 52,6
FLS 200 mg/kg, i.p.
(6)
47,7 6,23
a
0
a
32,5 100
L-NAME 75 mg/kg, i.p.
(18)
54,8 3,33
a
8,5 2,00
a
22,5 68,3
L-ARG 600 mg/kg, i.p.
(18)
61,5 3,34 29,1 3,20
- -
FLS 100 mg/kg, i.p.
+
L-ARG 600 mg/kg, i.p.
(12)
61,3 3,89
17,2 3,89
a
-
35,8
FLS 200 mg/kg, i.p.
+
L-ARG 600 mg/kg, i.p.
(6)
47,8 8,51
a
0
a
32,4
100
L-NAME 75 mg/kg, i.p.
+
L-ARG 600 mg/kg, i.p.
(18)
67,3 5,37
20,5 2,79
b
-
-
A fração hexânica de Lonchocarpus sericeus (FLS) e o CONT (crel 2%) foram
administrados 30 min, e o L-NAME (75 mg/kg, i.p.) 15 min antes da injeção intraplantar
de 20 l de formalina 1% v/v. A L-arginina (L-ARG 600 mg/kg, i.p.) foi administrada 5
min antes do tratamento com L-NAME ou FLS. Os valores representam média E.P.M.
do tempo gasto pelo animal lambendo a pata, registrado nos períodos de 0 – 5 min (1
a
fase)
e 20 – 25 min (2
a
fase) após a injeção de formalina. O n
o
de animais (n) é dado em
parênteses. ANOVA e Student-Newman-Keuls, a e b: p < 0,05 vs CONT e L-NAME
respectivamente.
128
128
Tabela 18 - Avaliação do papel dos receptores
1
adrenérgicos no efeito
antinociceptivo da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus na
nocicepção induzida pela formalina em camundongos
Grupo Tempo (seg) % de Inibição
(n) 1
a
fase 2
a
fase 1
a
fase 2
a
fase
CONT
(12)
59,3 3,40 26,0 4,51
- -
FLS 200 mg/kg, i.p.
(12)
39,5 4,59
a
2,3 0,79
a
33,4 91,2
FENIL 12 mg/kg, i.p.
(12)
30,2 4,88
a
1,2 0,27
a
49,1 95,4
PRAZ 1 mg/kg, v.o.
(12)
52,6 3,48
23,8 3,28
- -
FLS 200 mg/kg, i.p.
+
PRAZ 1 mg/kg, v.o.
(12)
29,4 4,55
a
0,3 0,19
a
50,4
98,8
FENIL 12 mg/kg, i.p.
+
PRAZ 1 mg/kg, v.o.
(12)
48,4 4,65
b
29,7 4,04
b
-
-
A fração hexânica de Lonchocarpus sericeus (FLS 200 mg/kg, i.p.), a fenilefrina (FENIL
12 mg/kg, i.p.) e o CONT (crel 2%) foram administrados 30 min antes da injeção
intraplantar de 20 l de formalina 1% v/v. O prazosin (PRAZ 1 mg/kg, v.o.) foi
administrado 30 min antes do tratamento com FENIL ou FLS. Os valores representam
média E.P.M. do tempo gasto pelo animal lambendo a pata, registrado nos períodos de 0
– 5 min (1
a
fase) e 20 – 25 min (2
a
fase) após a injeção de formalina. O n
o
de animais (n) é
dado em parênteses. ANOVA e Student-Newman-Keuls, a e b: p < 0,05 versus CONT e
FENIL respectivamente.
129
129
Na Tabela 19 encontram-se representados os resultados obtidos com o pré-
tratamento dos animais com a ioimbina (IOIM), um antagonista dos receptores
2
adrenérgicos, sobre a antinocicepção induzida pela FLS no teste da formalina. A
IOIM (600 g/kg, i.p.) não foi capaz de reverter o efeito antinociceptivo da FLS
(200 mg/kg, i.p.) no teste da formalina (1
a
fase: 38,6 3,43 seg e 2
a
fase: 1,1 0,34
seg), quando comparada à administração, sem pré-tratamento, da FLS na mesma
dose e via de administração (1
a
fase: 39,5 4,19 seg e 2
a
fase: 1,1 0,34 seg). A
IOIM (600 g/kg, i.p.) reverteu de maneira significativa (p < 0,01), o efeito da
clonidina (CLONI 62 g/kg, i.p.) (1
a
fase: 53,4 4,59 seg e 2
a
fase: 22,3 3,65
seg), quando comparada ao efeito da CLONI sozinha (1
a
fase: 32,3 3,01 seg e 2
a
fase: 1,6 0,50 seg).
5.5.4 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus no teste da placa
quente em camundongos
A FLS (200 mg/kg, i.p.) não modificou o tempo de reação à placa quente (55
0,5
o
C) em nenhum dos intervalos de tempo pré-estabelecidos, quando comparada
ao controle (Tabela 20). A administração oral da FLS (200 e 400 mg/kg) também
se mostrou ineficaz em modificar o tempo de reação dos animais ao estímulo
térmico. Entretanto, a morfina (7 mg/kg, s.c.) promoveu um aumento significativo
no tempo de reação nos intervalos de 30 (p < 0,001) e 60 min (p < 0,05) após sua
administração (30,3 4,14 e 25,3 4,38 seg respectivamente), quando comparada
ao controle (14,4 1,10 e 14,1 1,36 seg respectivamente).
130
130
Tabela 19 - Avaliação do papel dos receptores
2
adrenérgicos no efeito
antinociceptivo da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus na
nocicepção induzida pela formalina em camundongos
Grupo Tempo (seg) % de Inibição
(n) 1
a
fase 2
a
fase 1
a
fase 2
a
fase
CONT
(12)
60,5 4,44 28,8 3,76
- -
FLS 200 mg/kg, i.p.
(12)
39,5 4,19
a
1,1 0,34
a
34,7 96,2
CLONI 62 g/kg, i.p.
(12)
32,3 3,01
a
1,6 0,50
a
46,6 94,4
IOIM 600 g/kg, i.p.
(12)
49,0 5,78
27,0 3,94
- -
FLS 200 mg/kg, i.p.
+
IOIM 600 g /kg, i.p.
(12)
38,6 3,43
a
0,5 0,25
a
36,2
98,3
CLONI 62 g/kg, i.p.
+
IOIM 600 g /kg, v.o.
(12)
53,4 4,59
b
22,3 3,65
b
-
-
A fração hexânica de Lonchocarpus sericeus (FLS 200 mg/kg, i.p.), a clonidina (CLONI
62 g/kg, i.p.) e o CONT (crel 2%) foram administrados 30 min antes da injeção
intraplantar de 20 l de formalina 1% v/v. A ioimbina (IOIM 600 g /kg, i.p.) foi
administrada 15 min antes do tratamento com CLONI ou FLS. Os valores representam
média E.P.M. do tempo gasto pelo animal lambendo a pata, registrado nos períodos de 0
– 5 min (1
a
fase) e 20 – 25 min (2
a
fase) após a injeção de formalina. O n
o
de animais (n) é
dado em parênteses. ANOVA e Student-Newman-Keuls, a e b: p < 0,01 vs CONT e
CLONI respectivamente.
131
131
Tabela 20 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus no teste
da placa quente em camundongos
Grupo
Tempo de Reação (seg)
(n) 0 min 30 min 60 min 90 min
CONT
(10)
15,0 0,86 14,4 1,10 14,1 1,36 14,0 1,54
FLS 200 mg/kg, v.o.
(10)
17,3 1,10 16,6 1,86 13,4 1,96 13,3 1,81
FLS 400 mg/kg, v.o.
(10)
14,9 1,47 14,3 1,85 16,6 2,38 19,7 2,72
FLS 200 mg/kg, i.p.
(10)
17,8 0,71 17,3 1,69 18,9 3,15 15,1 0,91
MORF 7 mg/kg, s.c.
(10)
15,8 1,37 30,3 4,14** 25,2 4,38* 14,8 2,17
A fração hexânica de Lonchocarpus sericeus (FLS), morfina (MORF) e CONT (crel 2%)
foram administrados no tempo zero do teste (0 min). Os valores representam média
E.P.M. do tempo de reação (em segundos), que consiste dos animais saltarem ou lamberem
as patas traseiras após a colocação na placa quente (55 0,5ºC), registrado antes (0 min) e
30, 60 e 90 min após o tratamento com as drogas. O n
o
de animais (n) é dado em
parênteses. ANOVA e Student-Newman-Keuls, *p < 0,05, **p < 0,001 comparado ao
controle.
132
132
5.6 Atividade sobre o Sistema Nervoso Central
5.6.1 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus no teste do campo
aberto em camundongos
A Tabela 21 mostra o efeito da FLS sobre a atividade motora espontânea em
camundongos, no teste do campo aberto.
A FLS (200 mg/kg, i.p. e 400mg/kg v.o.) não modificou de forma
significativa (p > 0,05) o n
o
de cruzamentos (47,6 3,21 e 41,9 1,96), o grooming
(30,9 2,51 e 26,3 3,13) ou o rearing (1,8 0,49 e 2,1 0,35), quando
comparada ao controle (47,6 4,07; 28,3 4,46; 3,3 0,62, respectivamente).
5.6.2 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus no teste do rota-rod
em camundongos
A FLS não modificou de forma significativa (p > 0,05) o tempo de
permanência dos animais no aparelho de rota-rod (Tabela 22). A FLS, nas doses de
200 mg/kg, i.p. e 400 mg/kg, v.o., mostrou um tempo de permanência no rota-rod
de 58,1 0,74 e 56,1 1,16 seg, com um n
o
médio de reconduções de 0,63 0,26 e
1,0 0,33 respectivamente. O tempo registrado para o grupo controle foi de 58,4
1,22 seg com média de reconduções de 0,63 0,32.
5.6.3 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus no tempo de sono
induzido por barbitúrico em camundongos
A administração da FLS, na dose de 200 mg/kg, i.p. ou v.o., reduziu de
forma significativa (p < 0,05) a latência do sono de 344,0 29,5 (controle) para
260,5 22,5 ou 226,6 13,2 respectivamente (Tabela 23). A clorpromazina (5
mg/kg, i.p.), usada como padrão, também reduziu significativamente, a latência do
sono para 243,5 27,2 seg.
133
133
Tabela 21 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus no teste
do campo aberto em camundongos
Grupo
(n)
N
o
de cruzamentos Grooming Rearing
CONT
(8)
47,6 4,07 28,3 4,46 3,2 0,62
FLS 200 mg/kg, i.p.
(8)
47,6 3,21 30,9 2,51 1,8 0,49
FLS 400 mg/kg, v.o.
(8)
41,9 1,96 26,3 3,13 2,1 0,35
A fração hexânica de Lonchocarpus sericeus (FLS) e o crel 2% (CONT) foram
administrados por via i.p. (200 mg/kg) ou por v.o. (400 mg/kg), 30 ou 60 min antes dos
animais serem colocados no campo aberto. Os valores representam média S.E.M. do n
o
de cruzamentos, grooming e rearing registrado por 5 min, após o início do teste. O n
o
de
animais (n) é dado em parênteses. ANOVA e Student-Newman-Keuls.
134
134
Tabela 22 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus no teste
do rota-rod em camundongos
Grupo
(n)
Tempo de permanência
(seg)
N
o
de reconduções
CONT
(8)
58,4 1,22 0,63 0,32
FLS 200 mg/kg, i.p.
(8)
58,1 0,74 0,63 0,26
FLS 400 mg/kg, v.o.
(8)
56,1 1,16 1,0 0,33
A fração hexânica de Lonchocarpus sericeus (FLS) e o crel 2% (CONT) foram
administrados por via i.p. (200 mg/kg) ou por v.o. (400 mg/kg), 30 ou 60 min antes dos
animais serem colocados no rota-rod. Os valores representam média S.E.M. do tempo de
permanência na barra giratória do aparato e do n
o
de reconduções à barra, registrados por
60 seg. O n
o
de animais (n) é dado em parênteses. ANOVA e Student-Newman-Keuls.
135
135
Na mesma dose, a FLS (200 mg/kg, i.p. ou v.o.) prolongou o tempo de sono
de 1838,0 166,9 seg (controle) para 5293,0 487,1 e 4061,0 592,9 seg
respectivamente. As doses de 50 e 100 mg/kg, i.p. da FLS também mostraram uma
potencialização significativa (p < 0,05) do tempo de sono barbitúrico (3599,0
247,8 e 3481,0 401,8 seg) em relação ao controle. Da mesma forma, a
clorpromazina também aumentou significativamente (p < 0,001) o tempo de sono
para 7380,0 438,5 seg, quando comparada ao controle (Tabela 23).
5.7 Atividade antiagregante plaquetária
5.7.1 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus, lonchocarpina e
derricina na agregação plaquetária induzida in vitro por vários agonistas em
plasma humano rico em plaquetas
COLÁGENO
A FLS, LCC e DRC inibiram significativamente (p < 0,001) a agregação
plaquetária induzida pelo COL em PRP humano, correspondendo a inibições de 37
(61,4 5,27 mm) e 50% (48,8 3,44 mm) para a FLS (0,2 e 0,4 g/l); 20 (77,6
2,45 mm) e 25% (72,8 3,43 mm) para a LCC (0,2 e 0,4 g/l); 19 (78,1 2,73
mm) e 28% (70,2 2,56 mm) para a DRC (0,2 e 0,4 g/l); quando comparadas ao
controle (96,9 2,60 mm) (Figura 22).
TROMBINA
A Figura 23 mostra que a FLS (0,2 e 0,4 g/l) causou uma inibição
significativa (p < 0,001) da agregação induzida pela TRB (69,0 1,84 e 49,9 2,08
mm respectivamente) de 31 e 50% em relação ao controle (99,6 2,38 mm). A
LCC (0,2 e 0,4 g/l) e a DRC (0,2 e 0,4 g/l) também causaram redução na
agregação induzida pela TRB, com inibições de 18 (81,8 2,52 mm) e 36% (64,0
136
136
Tabela 23 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus sobre o
tempo de sono induzido por barbitúrico em camundongos
Tempo de sono (seg) Grupo
(n)
Latência Duração
Controle (veículo)
(15)
344,0 29,5 1838,0 166,9
FLS 50 mg/kg, i.p.
(15)
280,7 16,4 3599,0 247,8*
FLS 100 mg/kg, i.p.
(15)
299,1 14,3 3481,0 401,8**
FLS 200 mg/kg, i.p.
(15)
260,5 22,5* 5293,0 487,1***
FLS 200 mg/kg, v.o.
(15)
226,6 13,2** 4061,0 592,9**
Clorpromazina 5 mg/kg, i.p.
(15)
243,5 27,2* 7380,0 438,5***
A fração hexânica de Lonchocarpus sericeus (FLS) e o crel 2% (CONT) foram
administrados por via i.p. (50, 100 e 200 mg/kg) ou por v.o. (200 mg/kg), 30 ou 60 min
antes da administração do pentobarbital (40 mg/kg, i.p.). Os valores representam média
S.E.M. da latência e duração do tempo de sono (seg), registrados no máximo por 3 h. O n
o
de animais (n) é dado em parênteses. ANOVA e Student-Newman-Keuls, * p < 0,05, ** p
< 0,01 e *** p < 0,001 comparado ao controle.
137
137
0
20
40
60
80
100
120
CONT FLS
10 - 10
ul
FLS
10 - 20
ul
LCC
10 ul
LCC
20 ul
DRC
10 ul
DRC
20 ul
Transmissão luminosa (mm)
Figura 22 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus,
lonchocarpina e derricina na agregação plaquetária induzida in vitro pelo
colágeno em plasma humano rico em plaquetas (PRP).
O PRP foi incubado
por 5 min com FLS, LCC, DRC (0,2 e 0,4 g/l) ou crel 2% (CONT) e a agregação
foi induzida pelo COL (42,6 g/mL). Os resultados representam média E.P.M. da
altura (mm) das curvas de agregação (n = 5 a 10) que representam a transmissão
luminosa que atravessa o PRP. ANOVA e Student-Newman-Keuls, * p < 0,001
comparado ao controle.
*
*
*
*
*
*
CONT
0,2
0,4
0,2
0,4
0,2
0,4
DRC
(g/l)
LCC
(g/l)
FLS
(g/l)
138
138
3,16 mm) para a LCC e 22 (77,8 3,95 mm) e 45% (55,0 1,88 mm) para a DRC
quando comparadas ao grupo controle.
DIFOSFATO DE ADENOSINA
A FLS (0,2 e 0,4 g/l) reduziu de forma significativa (p < 0,001) a
agregação plaquetária induzida por ADP, fornecendo uma transmissão luminosa
média de 59,2 3,84 e 43,5 2,68 mm, quando comparada ao controle (97,7 2,91
mm), correspondendo a inibições de 39 e 56% (Figura 24).
A LCC (0,2 e 0,4 g/l) e a DRC (0,2 e 0,4 g/l) também reduziram de
forma significativa (p < 0,001) a agregação induzida por ADP, com inibições de 32
(66,5 1,41 mm) e 45% (54,2 2,49 mm) respectivamente para LCC e de 34 (64,2
6,67 mm) e 49% (49,7 1,61 mm) respectivamente para DRC, quando
comparadas ao controle (Figura 24).
a) Avaliação do papel do sistema óxido nítrico no efeito inibitório da fração
hexânica de Lonchocarpus sericeus, lonchocarpina e derricina sobre a
agregação plaquetária induzida in vitro pelo difosfato de adenosina em plasma
humano rico em plaquetas
As respostas inibitórias da FLS (0,2 g/l) (57,8 3,09 mm), LCC (0,2
g/l) (66,8 2,56 mm) e DRC (0,2 g/l) (55,8 3,82 mm) na agregação
plaquetária induzida pelo ADP, não foram modificadas pela pré-incubação com a L-
ARG (9,7 g/l), quando comparadas às respostas das mesmas na ausência da L-
ARG (68,0 3,19; 71,0 2,35 e 70,0 1,08 mm) (Tabela 24).
139
139
0
20
40
60
80
100
120
CONT FLS 10
- 10 ul
FLS 10
- 20 ul
LCC 10
ul
LCC 20
ul
DRC
10 ul
DRC
20 ul
Transmissão luminosa (mm)
Figura 23 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus,
lonchocarpina e derricina na agregação plaquetária induzida in vitro pela
trombina em plasma humano rico em plaquetas.
O PRP foi incubado por 5
min com FLS, LCC, DRC (0,2 e 0,4 g/l) e crel 2% (CONT) e a agregação foi
induzida pela TRB (0,16 U/mL). Os resultados representam média E.P.M. da
altura (mm) das curvas de agregação (n = 6 a 8) que representam a transmissão
luminosa que atravessa o PRP. ANOVA e Student-Newman-Keuls, * p < 0,001
comparado ao controle.
*
*
*
*
*
*
CONT
0,2
0,4
0,2
0,4
0,2
0,4
DRC
(g/l)
LCC
(g/l)
FLS
(g/l)
140
140
0
20
40
60
80
100
120
CONT FLS 5 -
20 ul
FLS 5 -
40 ul
LCC
10 ul
LCC
20 ul
DRC
10 ul
DRC
20 ul
Transmissão luminosa (mm)
Figura 24 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus,
lonchocarpina e derricina na agregação plaquetária induzida in vitro pelo
difosfato de adenosina (ADP) em plasma humano rico em plaquetas.
O
PRP foi incubado por 5 min com FLS, LCC, DRC (0,2 e 0,4 g/l) e crel 2%
(CONT) e a agregação foi induzida pelo ADP (20 M). Os resultados representam
média E.P.M. da altura (mm) das curvas de agregação (n = 6) que representam a
transmissão luminosa que atravessa o PRP. ANOVA e Student-Newman-Keuls, * p
< 0,001 comparado ao controle.
*
*
*
*
*
*
CONT
0,2
0,4
0,2
0,4
0,2
0,4
DRC
(g/l)
LCC
(g/l)
FLS
(g/l)
141
141
Tabela 24 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus,
lonchocarpina e derricina sobre a inibição produzida pela L-Arginina na
agregação plaquetária induzida in vitro pelo difosfato de adenosina
(ADP) em plasma humano rico em plaquetas
Grupo
(n)
Transmissão luminosa
(mm)
% de Inibição
CONT
(7)
92,6 3,85
-
L-ARG 9,7 g/l
(8)
77,9 4,58
a
15,8
FLS 0,2 g/l
(5)
68,0 3,19
a
26,6
LCC 0,2 g/l
(4)
71,0 2,35
a
23,3
DRC 0,2 g/l
(4)
70,0 1,08
a
24,4
L-ARG 9,7 g/l
+
FLS 0,2 g/l
(4)
57,8 3,09
a
37,6
L-ARG 9,7 g/l
+
LCC 0,2 g/l
(4)
66,8 2,56
a
27,9
L-ARG 9,7 g/l
+
DRC 0,2 g/l
(4)
55,8 3,82
a
39,7
O PRP foi incubado por 8 min com L-ARG (9,7 g/l), ou por 5 min com FLS, LCC ou
DRC (0,2 g/l) e a agregação foi induzida com ADP (20 M). Nos testes realizados com
L-ARG na presença de FLS, LCC ou DRC, as mesmas foram acrescentadas após 3 min da
incubação do PRP com a L-ARG e após mais 5 min adicionou-se o agonista. O controle foi
obtido da mesma forma, com os veículos da L-ARG (salina) e da FLS, LCC e DRC (Crel
2%). Os resultados representam média E.P.M. da altura (mm) das curvas de agregação
que representam a transmissão luminosa que atravessa o PRP. ANOVA e Student-
Newman-Keuls, a: p < 0,01 comparado ao controle.
142
142
b) Estudo do papel da fosfodiesterase no efeito inibitório da fração hexânica de
Lonchocarpus sericeus, lonchocarpina e derricina sobre a agregação
plaquetária induzida in vitro pelo difosfato de adenosina em PRP humano
Ainda na agregação induzida pelo ADP, a FLS (0,1 g/l), LCC (0,2 g/l)
e DRC (0,2 g/l) associadas à PTX (0,4 g/l), tiveram sua atividade
antiagregante plaquetária aumentada (33,4 0,63; 53,4 3,22 e 47,7 4,59 mm),
em relação as mesmas na ausência da PTX (67,3 3,07; 72,3 3,22 e 74,5 3,65
mm) (Figura 25).
ÁCIDO ARAQUIDÔNICO
A Figura 26 mostra que a FLS (0,4 g/l) promoveu uma inibição
significativa (p < 0,001) de 20% (80,8 3,91 mm), da agregação induzida pelo AA
em relação ao controle (100,3 3,26 mm). A LCC (0,2 e 0,4 g/l) e a DRC (0,2 e
0,4 g/l) também promoveram inibições de 24 (76,2 3,46 mm) e 36% (64,0
3,18 mm) para LCC e 34 (66,6 2,99 mm) e 53% (46,8 1,83 mm) para DRC
quando comparadas ao grupo controle.
a) Estudo sobre o envolvimento da inibição da ciclooxigenase no efeito
antiagregante plaquetário da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus,
lonchocarpina e derricina sobre a agregação induzida in vitro pelo ácido
araquidônico em plasma humano rico em plaquetas
Na Tabela 25 encontram-se apresentados os efeitos da pré-incubação do
AAS, no efeito antiagregante plaquetário da FLS, LCC e DRC.
O efeito inibitório da FLS (0,2 g/l) (79,8 2,13 mm), LCC (0,2 g/l)
(70,4 2,62 mm) e DRC (0,2 g/l) (67,6 5,25 mm) na agregação induzida pelo
AA, não foi modificado pela pré-incubação com o AAS (20 M), quando
143
143
0
20
40
60
80
100
CONT PX FLS10
- 5 ul
PX +
FLS10
- 5 ul
LCC
10 - 10
ul
PX +
LCC
10 - 10
ul
DRC
10 ul
PX +
DRC
10 ul
Transmissão luminosa (mm)
Figura 25 – Avaliação do papel da fosfodiesterase no efeito inibitório da
fração hexânica de Lonchocarpus sericeus, lonchocarpina e derricina na
agregação plaquetária induzida in vitro pelo ADP em plasma humano
rico em plaquetas.
O PRP foi incubado por 8 min com PTX (0,4 g/l), ou por 5
min com FLS (0,1 g/l), LCC ou DRC (0,2 g/l) e a agregação foi induzida pelo
ADP (20 M). Nos testes realizados com PTX na presença de FLS, LCC ou DRC,
as mesmas foram acrescentadas após 3 min da incubação do PRP com a PTX e após
mais 5 min adicionou-se o agonista. O controle foi obtido da mesma forma, com os
veículos da PTX (salina) e da FLS, LCC e DRC (crel 2%). Os resultados
representam média E.P.M. da altura (mm) das curvas de agregação (n = 6 a 10)
que representam a transmissão luminosa que atravessa o PRP. ANOVA e Student-
Newman-Keuls, a: p < 0,01 vs CONT; b: p < 0,001 vs FLS; c: p < 0,01 vs LCC; d: p
< 0,001 vs DRC.
a,c
a,b
a
a
a
a,
d
CONT 0,4 0,1 0,2 0,2 0,1 0,2 0,2
PTX FLS LCC DRC
PTX PTX PTX
(
g/
l)
144
144
0
20
40
60
80
100
120
CONT FLS 10
- 10 ul
FLS 10
- 20 ul
LCC
10 ul
LCC
20 ul
DRC
10 ul
DRC
20 ul
Transmissão luminosa (mm)
Figura 26 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus,
lonchocarpina e derricina na agregação plaquetária induzida in vitro pelo
ácido araquidônico em plasma humano rico em plaquetas.
O PRP foi
incubado por 5 min com FLS, LCC, DRC (0,2 e 0,4 g/l) e crel 2% (CONT) e a
agregação foi induzida pelo AA (30 M). Os resultados representam média
E.P.M. da altura (mm) das curvas de agregação (n = 5 a 7) que representam a
transmissão luminosa que atravessa o PRP. ANOVA e Student-Newman-Keuls, * p
< 0,001 comparado ao controle.
*
*
*
*
*
CONT
0,2
0,4
0,2
0,4
0,2
0,4
DRC
(g/l)
LCC
(g/l)
FLS
(g/l)
145
145
comparado ao efeito das mesmas incubadas na ausência do AAS (79,6 2,82; 70,6
3,17 e 70,6 3,37 mm).
ADRENALINA
A agregação plaquetária induzida por ADR, apresentou uma trasmissão
luminosa média de 93,0 1,56 mm, sendo reduzida significativamente (p < 0,001)
na presença da FLS (0,2 e 0,4 g/l) para 42,0 6,59 e 15,8 1,30 mm,
correspondendo a inibições de 55 e 83% respectivamente. Da mesma forma, a LCC
(0,1 e 0,2 g/l) e a DRC (0,1 e 0,2 g/l) também inibiram significativamente (p <
0,001) a agregação plaquetária induzida pela ADR, resultando em transmissão
luminosa média de 71,7 2,14 e 55,0 1,00 mm, para LCC e 66,3 3,12 e 52,5
1,52 mm, para DRC, quando comparadas ao grupo controle (Figura 27).
5.7.2 Efeito da administração sistêmica da fração hexânica de Lonchocarpus
sericeus sobre o número de plaquetas em sangue total de camundongos
A Tabela 26 mostra o efeito da administração sistêmica da FLS sobre o
número de plaquetas em sangue total de camundongos. Após 1 ou 24 h da
administração da FLS (200 mg/kg, v.o.), não houve diferença significativa no
número de plaquetas (689.500 51.110 e 664.700 46.580/mm
3
respectivamente),
em relação ao controle (675.800 61.090 e 613.800 77.270/mm
3
respectivamente). A FLS, nas doses de 100 e 200 mg/kg administrada por via i.p.,
também não causou uma redução significativa no número de plaquetas após 1 h
(773.700 32.500 e 692.000 45.680/mm
3
respectivamente) e 24 h (512.300
57.320 e 584.800 26.900/mm
3
respectivamente) de sua administração quando
comparada ao controle.
146
146
Tabela 25 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus,
lonchocarpina e derricina sobre a inibição produzida pelo ácido
acetilsalicílico (AAS) na agregação plaquetária induzida in vitro pelo
ácido araquidônico em plasma humano rico em plaquetas
Grupo
(n)
Transmissão luminosa
(mm)
% de Inibição
CONT
(5)
96,0 0,84
-
AAS 20 M
(5)
90,8 3,99
5,4
FLS 0,2 g/l
(5)
79,6 2,82
a
17,1
LCC 0,2 g/l
(5)
70,6 3,17
a
26,4
DRC 0,2 g/l
(5)
70,6 3,37
a
26,4
AAS 20 M
+
FLS 0,2 g/l
(5)
79,8 2,13
a
16,8
AAS 20 M
+
LCC 0,2 g/l
(5)
70,4 2,62
a
26,6
AAS 20 M
+
DRC 0,2 g/l
(5)
67,6 5,25
a
29,6
O PRP foi incubado por 8 min com AAS 20 M ou por 5 min com FLS, LCC ou DRC (0,2
g/l) e a agregação foi induzida pelo AA (30 M). Nos testes realizados com AAS na
presença de FLS, LCC ou DRC, as mesmas foram acrescentadas após 3 min da incubação
do PRP com a L-ARG e após mais 5 min adicionou-se o agonista. O controle foi obtido da
mesma forma, com os veículos do AAS e da FLS, LCC e DRC (crel 2%). Os resultados
representam média E.P.M. da altura (mm) das curvas de agregação que representam a
transmissão luminosa que atravessa o PRP. ANOVA e Student-Newman-Keuls, a: p < 0,01
comparado ao controle.
147
147
0
20
40
60
80
100
CONT FLS 5 -
20 ul
FLS 5 -
40 ul
LCC
10 - 10
ul
LCC
10 - 20
ul
DRC
10 - 10
ul
DRC
10 - 20
ul
Transmissão luminosa (mm)
Figura 27 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus,
lonchocarpina e derricina na agregação plaquetária induzida in vitro pela
adrenalina em plasma humano rico em plaquetas.
O PRP foi incubado por 5
min com FLS, LCC, DRC (0,2 e 0,4 g/l) e crel 2% (CONT) e a agregação foi
induzida pela ADR (30 M). Os resultados representam média E.P.M. da altura
(mm) das curvas de agregação (n = 6 a 9) que representam a transmissão luminosa
que atravessa o PRP. ANOVA e Student-Newman-Keuls, * p < 0,001 comparado
ao controle.
*
*
*
*
*
*
CONT
0,2
0,4
0,2
0,4
0,2
0,4
DRC
(g/l)
LCC
(g/l)
FLS
(g/l)
148
148
Tabela 26 – Efeito da administração sistêmica da fração hexânica de
Lonchocarpus sericeus sobre o número de plaquetas em sangue total de
camundongos
Grupo
N
o
de plaquetas x 10
3
/mm
3
(n) 1 h 24 h
CONT
(6)
675,8 61,10 613,8 77,27
FLS 100 mg/kg, i.p.
(6)
773,7 32,50 512,3 57,32
FLS 200 mg/kg, i.p.
(6)
692,0 45,68 584,8 26,90
FLS 200 mg/kg, v.o.
(6)
689,5 51,11 664,7 46,58
O CONT (crel 2%) e a FLS foram administrados por via i.p. (100 e 200 mg/kg) ou v.o.
(200 mg/kg), 1 h antes da primeira contagem de plaquetas. A segunda contagem foi
realizada após 24 h da administração da FLS ou crel 2%. Os resultados representam média
E.P.M. do n
o
de plaquetas x 10
3
/mm
3
. O número de animais (n) é dado em parênteses.
ANOVA e Student-Newman-Keuls.
149
149
5.7.3 Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus, lonchocarpina e
derricina sobre o tempo de protrombina em plasma humano
Os resultados obtidos com a FLS, LCC e DRC sobre o tempo de protrombina
in vitro em plasma humano, encontram-se registrados na Tabela 27.
A FLS, LCC e DRC, nas concentrações de 0,7 e 3,3 g/l, não modificaram
o tempo de protrombina em plasma humano (FLS: 17,9 0,26 e 20,1 0,83 seg;
LCC: 18,0 0,31 e 19,1 0,46 seg; DRC: 17,9 0,26 e 18,9 0,74 seg
respectivamente) quando comparadas ao controle (19,0 0,76 seg). Contudo, a
heparina (0,001 U/l), um anticoagulante padrão, promoveu um aumento de 75% (p
< 0,01) no tempo de protrombina (33,3 0,99 seg), em relação ao grupo controle.
150
150
Tabela 27 – Efeito da fração hexânica de Lonchocarpus sericeus,
lonchocarpina e derricina sobre o tempo de protrombina in vitro em
plasma humano
Grupo
(n)
Tempo de protrombina
(seg)
CONT
(7)
19,0 0,76
FLS 0,7 g/l
(7)
17,9 0,26
FLS 3,3 g/l
(7)
20,1 0,83
LCC 0,7 g/l
(7)
18,0 0,31
LCC 3,3 g/l
(7)
19,1 0,46
DRC 0,7 g/l
(7)
17,9 0,26
DRC 3,3 g/l
(7)
18,9 0,74
HEP 0,001 U/l
(7)
33,3 0,99*
CONT, FLS, LCC, DRC e heparina (HEP) foram adicionados ao plasma e incubados em
BM a 37
o
C durante 5 min antes da adição do replastin. Decorridos 5 min, o tempo de
reação (seg) para o surgimento do coágulo foi registrado após a adição e incubação por 9
seg, do CaCl
2
ao meio. O número de repetições (n) é dado em parênteses. ANOVA e
Student-Newman-Keuls, * p < 0,01 comparado ao controle.
151
151
Discussão
152
152
6 DISCUSSÃO
A pesquisa de plantas medicinais como estratégia alternativa na procura de
novos agentes terapêuticos tem se tornado uma ferramenta bastante útil nos países
em desenvolvimento visto que, a população mais carente destes países depende
essencialmente das plantas para o cuidado primário da saúde.
De acordo com dados do Ministério da Ciência e Tecnologia,
aproximadamente 70% da diversidade biológica da Terra encontra-se em 12 países.
Dentre eles destacam-se os que abrangem a região Amazônica, como Brasil,
Colômbia e Equador. Estima-se que de 10 a 20% de todas as espécies do planeta
estejam no Brasil e esse percentual chega a 35%, quando falamos de espécies
vegetais. Além da Amazônia, que é o maior repositório de plantas medicinais
conhecidas ou potencialmente utilizáveis, um bom número destas espécies também
é encontrado em outras regiões do Brasil, inclusive no nordeste (MATOS, 1982).
Os produtos de origem natural deram uma contribuição decisiva para o
desenvolvimento da terapêutica moderna. De todos os fármacos vendidos
atualmente nos EUA, 25% são obtidos através de plantas. E mais, dos vinte
remédios mais vendidos em 1998, dez vieram de produtos naturais e 40% dos
medicamentos disponíveis no mundo são obtidos direta ou indiretamente de plantas
e animais.
Juntos, estes fatos têm motivado a indústria farmacêutica local e mundial, a
investir na pesquisa de novos medicamentos obtidos de plantas, no Brasil. Além
disto, as universidades brasileiras em parceria com orgãos governamentais,
baseados principalmente na pesquisa bibliográfica e indicação popular, têm
validado o uso de diversas plantas medicinais, demonstrando que é possível investir
em pesquisa no Brasil e que nossa biodiversidade poderá resultar em atividades
econômicas lucrativas e ainda em desenvolvimento científico.
Segundo BRITO (1994), toxicidade aguda é o efeito nefasto que se produz
dentro de um curto período de tempo, e que resulta da administração de uma única
dose ou de várias doses de uma substância em um período de 24 horas. Sua
determinação é uma avaliação estimativa e preliminar das propriedades tóxicas de
153
153
uma droga, fornecendo informações acerca dos riscos para a saúde, resultantes de
uma exposição de curta duração pela via ou vias escolhidas.
A administração por via intraperitoneal de doses não letais da fração
hexânica de Lonchocarpus sericeus (FLS < 300 mg/kg), mostrou uma leve
depressão respiratória e diminuição da atividade exploratória dos animais. Com
relação à administração oral de doses não letais da FLS (< 500 mg/kg), não foram
observadas alterações no comportamento dos animais. Considerando as vias de
administração testadas, a DL
50
da FLS, determinada em camundongos, foi menor
por via intraperitoneal (446,2 mg/kg) que por via oral (781,5 mg/kg), indicando que
a sua absorção por esta última via é menos eficiente. Portanto, a FLS manifestou
maior toxicidade aguda após a administração intraperitoneal.
O interesse em desenvolver novos modelos celulares para o acesso à
toxicidade vem aumentando nos últimos anos por serem mais econômicos, rápidos e
fornecerem resultados mais facilmente quantificáveis e com maior
reprodutibilidade. Vários destes modelos têm sido utilizados para determinação da
citotoxicidade in vitro e muitos têm se mostrado eficazes na descoberta de novos
agentes antitumorais (CRAGG & NEWMAN, 2000).
Além da toxicidade in vivo, o presente estudo também avaliou a
citotoxicidade da FLS, LCC e DRC utilizando ovos de ouriço-do-mar Lytechinus
variegatus e células de leucemia linfocítica de origem humana (CEM).
Os resultados mostraram que a FLS e a DRC são tóxicas para o
desenvolvimento dos ovos de ouriço-do-mar Lytechinus variegatus, inibindo os
estágios de 1
a
e 3
a
divisão e blástula, sendo que a FLS mostrou-se cerca de 2,7 vezes
mais ativa que a DRC. A LCC foi desprovida de atividade neste modelo de
citotoxicidade (CUNHA et al., 2003).
O ensaio com os ovos de ouriço-do-mar é um modelo alternativo de um
sistema celular que dispensa qualquer tipo de meio de cultura especial ou
aparelhagem sofisticada. Este modelo é amplamente utilizado no estudo de drogas
com efeitos citotóxicos, teratogênicos e antineoplásicos (JACOBS & WILSON,
1986). Assim como as células tumorais, os ovos de ouriço dividem-se rapidamente
e apresentam uma sensibilidade seletiva a certos tipos de drogas, além de uma série
154
154
de peculiaridades no seu ciclo de desenvolvimento, o que o torna bastante
elucidativo no estudo de drogas com potencial antitumoral (JIMENEZ, 2004). Um
exemplo disto é o fato do ciclo celular destas células ser bastante abreviado. O
mesmo é destituído da fase G
1
que antecede a síntese (S), e a fase G
2
que a sucede,
encontra-se bastante reduzida. Desta forma, drogas que atuam na fase G
1
não
apresentam atividade neste bioensaio (JACOBS & WILSON, 1986).
No bioensaio com ovos de ouriço, a inibição da divisão celular pode estar
relacionada a vários eventos, como síntese de ácidos nucléicos (DNA e RNA),
síntese protéica e polimerização de microtúbulos, e estes processos podem, muitas
vezes, ser analisados individualmente.
A inibição da 1
a
clivagem neste tipo celular está relacionada à síntese de
DNA e/ou de proteínas ou à polimerização de microtúbulos, uma vez que a síntese
de RNA é muito lenta ou praticamente ausente após a fertilização (GROSS et al.,
1964). Neste estágio, o rápido aumento na taxa de síntese protéica é devido
principalmente ao recrutamento de RNAm, proveniente do gameta feminino, pelos
polissomos (BRANDHORST, 1985). Entretanto, quando uma substância bloqueia a
montagem dos microtúbulos, manchas claras que correspondem à duplicação
nuclear podem ser observadas no citoplasma. Este processo parece não ser afetado
pela FLS ou pela DRC, pois as células tratadas com os mesmos apresentaram
citoplasma homogêneo. Desta forma, a FLS e a DRC podem estar influenciando a
síntese de DNA e/ou proteínas através da inibição da 1
a
clivagem no
desenvolvimento dos ovos de ouriço.
Para verificar se a FLS e a DRC exercem seus efeitos citotóxicos através de
danos às membranas celulares, os mesmos foram testados quanto ao seu potencial
em lisar hemácias de camundongos. A FLS e a DRC não demonstraram qualquer
atividade lítica, sugerindo que seu mecanismo de ação citotóxico não está
relacionado a danos membranares.
A FLS, LCC e DRC apresentaram elevada citotoxicidade sobre o
crescimento de células CEM. Repetindo o que foi observado anteriormente no
ensaio antimitótico com ovos de ouriço-do-mar, a FLS também se mostrou cerca de
quatro vezes mais ativa que as chalconas LCC e DRC (CUNHA et al., 2003).
155
155
De acordo com alguns autores, a presença de substituintes metoxílicos
modifica a citotoxicidade dos flavonóides (AGULLO et al., 1996; DUCKI et al.,
1998; MIDDLETON et al., 2000). DUCKI e cols. (1998) mostraram que a adição
de um grupo metoxil à estrutura de uma chalcona isolada de Scutellaria barbata
(Labiatae) aumenta em muito, sua habilidade em inibir o crescimento celular. No
nosso estudo, a DRC mostrou-se mais ativa que a LCC, provavelmente devido à
presença de um grupamento metoxil em sua estrutura.
Os resultados observados nos experimentos de citotoxicidade são
corroborados com aqueles em mamíferos, cuja administração oral e intraperitoneal
da FLS promoveu sinais de alta toxicidade, além de mortes.
A atividade antibacteriana de uma substância não está diretamente
relacionada com suas propriedades tóxicas, todavia tem sido proposto que
flavonóides e polifenóis relacionados podem ser usados contra patógenos humanos,
especialmente fungos, devido a sua capacidade em proteger plantas que os contém,
contra a invasão de microorganismos (HARBONE & WILLIAMS, 2000). Desta
forma, investigou-se uma possível atividade antimicrobiana in vitro da FLS, LCC e
DRC, utilizando-se três microorganismos: Staphylococcus aureus (bactéria gram-
positiva), Escherichia coli (bactéria gram-negativa) e Candida albicans (fungo).
Nas doses testadas, a FLS, LCC e DRC não exibiram efeito antimicrobiano
sobre nenhum dos patógenos utilizados. Estes dados são corroborados pelos dados
obtidos por DE MELLO e cols. (1974), que demonstraram que chalconas preniladas
isoladas de Lonchocarpus neuroschapa apresentaram uma potente atividade
inibitória sobre bactérias gram positivas, enquanto a DRC e a LCC mostraram-se
inativas contra estes microorganismos.
A relativa toxicidade da FLS merece estudos posteriores, com vista a
esclarecer melhor possíveis ações inseticida, anti-helmíntica e anticancerígena desta
fração.
A inflamação é uma resposta estereotipada e complexa do organismo, ao
dano de suas células e tecidos vascularizados, com atuação de numerosos
mediadores de origem plasmática e celular, e efeitos biológicos inter-relacionados
(KEHRER, 1993).
156
156
Existem duas categorias de fatores capazes de induzir dano às células ou
tecidos – endógenos e exógenos. Os fatores endógenos incluem reações
imunopatológicas e algumas desordens neurológicas e genéticas. Os fatores
exógenos podem ser divididos em:
Mecânicos (danos traumáticos);
Físicos (temperaturas extremas, radiações ionizantes, microondas);
Químicos (agentes cáusticos, venenos, compostos genotóxicos e
proteotóxicos);
Nutritivos (deficiência em oxigênio, vitaminas e nutrientes básicos);
Biológicos (vírus, microorganismos, parasitas protozoários e
metazoários) (STVRTINOVÁ et al., 1995a).
Os sinais e sintomas básicos da inflamação – eritema, edema, calor, dor e
perda da função – são conhecidos desde a era Greco-romana.
A reação inflamatória pode apresentar três fases distintas: fase aguda, fase
crônica e fase de resolução. A primeira fase tem curta duração e compreende as
seguintes etapas: 1) dilatação dos pequenos vasos adjacentes à área da lesão
tecidual, tornando o fluxo sangüíneo mais lento através destes; 2) aumento da
permeabilidade vascular e formação de exsudato fluido, contendo pequenas
proteínas plasmáticas; 3) formação de exsudato celular por migração de leucócitos,
especialmente neutrófilos, para o foco inflamatório (MACKAY et al., 1985). A
segunda fase ou fase crônica é caracterizada pelo surgimento de infiltrado de células
mononucleares composto por macrófagos e linfócitos. Estas células realizam a
fagocitose de agentes lesivos, matam bactérias, degradam tecidos necrosados e
antígenos estranhos e remodelam tecidos (BEVILACQUA et al., 1994;
STVRTINOVÁ et al., 1995b). Após algumas poucas semanas, a arquitetura tecidual
normal é restaurada na fase de resolução. Coágulos sangüíneos são removidos
através de fibrinólise e quando não é possível retornar a forma original do tecido, a
cicatrização resulta do preenchimento com fibroblastos, colágeno e células
endoteliais.
157
157
A atividade antiinflamatória da FLS foi avaliada através de reconhecidos
modelos de inflamação como edema de pata induzido por formalina em
camundongos, edema de pata induzido por dextrano, bradicinina, levedura de
cerveja, carragenina em ratos; migração de leucócitos para cavidade peritoneal de
ratos induzida por carragenina ou fMLP; granuloma induzido por pellet de algodão
e colite induzida por acido acético em ratos.
O edema de pata induzido por dextrano é um modelo vantajoso para detectar
efeito antiedematogênico em substâncias úteis no tratamento da urticária (KAPLAN
& BEAVEN, 1976), edema pulmonar e outros tipos de reações anafiláticas (GOTH
& JONHSON, 1975; BEAVEN, 1978).
A reação inflamatória induzida pelo dextrano, na pata do rato, envolve
degranulação de mastócitos, resultando principalmente na liberação de histamina e
serotonina (5-HT), as quais contribuem para o aumento da permeabilidade vascular
e extravasamento de fluido (PARRATT & WEST, 1958; JORI et al., 1961).
Diferente do que ocorre no edema induzido por carragenina, que causa um
progressivo acúmulo de exsudato rico em proteínas e neutrófilos (LO et al., 1982),
o dextrano provoca um rápido extravasamento de fluido com poucas proteínas e
leucócitos.
A FLS (100 e 200 mg/kg, i.p.) não modificou a resposta inflamatória
induzida pelo dextrano em ratos. Contrariamente, a ciproeptadina, um antagonista
dos receptores H
1
e 5-HT
2
reduziu o edema, de modo significativo, em todos os
períodos de tempo avaliados.
A morfina e as drogas antiinflamatórias, de um modo geral, não inibem o
edema por dextrano, contudo a efedrina, epinefrina, clorpromazina, agentes anti-
histamínicos e doses anestésicas de pentobarbital bloqueiam a formação deste
edema (STUCKI & THOMPSON, 1958). Segundo COURVOISIER E DUCROT
(1955), a inibição deste edema ocorre de várias formas: (i) efeito direto sobre a
inibição da permeabilidade tissular ou da dinâmica de fluidos; (ii) antagonismo
específico de agentes responsáveis diretamente pelo edema e, (iii) através da
interrupção de processos nervosos ou humorais que levam a formação de agentes
edematogênicos.
158
158
A ausência de atividade da FLS no edema induzido por dextrano, indica que
esta provavelmente não possui ação vasoativa direta, propriedade antagonista
específica ou alguma ação que interrompa processos neuro-humorais.
A bradicinina (BK) é um nonapeptídeo produzido pelas calicreínas
plasmáticas e/ou tissulares a partir do cininogênio de alto e baixo peso molecular,
em resposta a estímulos fisiopatológicos como trauma tissular, inflamação, anoxia e
baixo pH (DRAY & PERKINS, 1993).
Baseado em estudos in vitro e in vivo, utilizando agonistas e antagonistas
seletivos, quatro subtipos de receptores para BK (B
1
, B
2
, B
3
, B
4
) foram propostos,
no entanto os mais aceitos e melhor caracterizados são os receptores B
1
e B
2
(KHASAR et al., 1995a). O subtipo B
2
é o receptor predominante e
constitutivamente expresso na maioria dos tecidos e células, e medeia muitas
funções fisiológicas da BK. Contrariamente, os receptores B
1
têm normalmente uma
expressão muito limitada e parecem ser o subtipo predominante no músculo liso
vascular. Entretanto, sua expressão pode ser induzida por processos inflamatórios
ou por infecção bacteriana (STEWART, 2004).
As ações biológicas da BK são extremamente diversas. Dependendo do tipo
celular, a BK pode ativar diversos sistemas de segundos mensageiros, além de
contrair músculo liso em muitos órgãos, especialmente útero, intestinos e vênulas, e
diminuir a pressão arterial através do relaxamento das arteríolas. Este relaxamento
ocorre porque no endotélio arteriolar, os receptores de BK estão ligados à enzima
NO sintase, produzindo NO. Este se difunde para a musculatura lisa, ativando a
guanilil ciclase com produção de GMPc resultando no relaxamento das arteríolas.
A BK tem sido implicada em muitos processos fisiopatológicos,
particularmente nas reações inflamatórias, onde possui o papel de iniciador da
cascata de mediadores inflamatórios, estimulando a produção e liberação de
prostanóides (PGE
2
e PGI
2
) a partir de muitos tipos celulares e neurônios
simpáticos, e de citocinas (IL-1) e TNF- a partir de macrófagos (STEWART,
2004; DRAY & PERKINS, 1993).
A FLS, administrada por via sistêmica, não modificou a resposta inflamatória
induzida pela BK, na pata de ratos, o que indica que a mesma parece não agir ao
159
159
nível de receptores B
1
e B
2
ou não ser capaz de antagonizar diretamente os efeitos
da BK.
A levedura de cerveja (LC) injetada na pata de ratos causa edema e
hiperalgesia (RANDALL & SELITTO, 1957; WINTER & FLATAKER, 1965;
RACKHAM & FORD-HUTCHINSON, 1983). Estudos farmacológicos com
inibidores da COX sugerem que estas respostas da LC são mediadas por produtos
derivados do metabolismo do AA (DAVIES et al., 1984). HAWORTH E CAREY
(1986) demonstraram que a LC injetada na pata de ratos gera produtos da COX e
LOX em associação temporal com o desenvolvimento da hiperalgesia.
Segundo OPAS e cols. (1987), a liberação dos metabólitos do AA ocorre em
dois picos. O primeiro acontece aos 5 min após a injeção de LC e coincide com o
início do desenvolvimento do edema. Nesta fase, os metabólitos liberados são
exclusivamente produtos gerados pela LOX como LTC
4
, LTD
4
e 5-HETE. A
quantidade destes metabólitos e o volume do edema são máximos aos 15 min. O
segundo pico ocorre na 4
a
h e coincide com a hiperalgesia máxima produzida pela
LC na pata de ratos. Nesta fase, são encontradas quantidades elevadas de produtos
da LOX (LTB
4
e 5-HETE) e COX (TXB
2
e PGE
2
).
Outros mediadores como histamina, 5-HT, substância P, BK, dopamina, -
metil-para-tirosina e noradrenalina também modulam a reação inflamatória induzida
por LC (OPAS et al., 1987; HORE et al., 1996, HORE et al., 1997).
A administração da FLS, por via i.p., promoveu uma inibição do edema por
LC logo na 1
a
h e manteve-se até a 4
a
h. Este comportamento da FLS pode indicar
que a mesma, além de inibir a liberação de PGs, também inibe a liberação de
leucotrienos (LTs), visto que estes últimos estão associados com o desenvolvimento
inicial do edema por LC (RACKHAM & FORD-HUTCHINSON, 1983). O efeito
da FLS, administrada por v.o., não mostrou o mesmo padrão de comportamento,
inibindo apenas a 2
a
e 4
a
h, indicando que a mesma provavelmente não possui uma
boa absorção por esta via.
A carragenina (Cg) é considerada um agente flogístico de escolha para a
avaliar drogas antiinflamatórias por depender inteiramente de um estímulo local,
não produzir efeitos sistêmicos, não apresentar potencial antigênico, possuir um
160
160
elevado grau de reprodutibilidade e sua ação inflamatória poder ser inibida por
antiinflamatórios esteroidais e não esteroidais (WINTER et al., 1962).
O edema induzido por Cg na pata posterior de ratos é um teste adequado para
avaliar drogas antiinflamatórias e tem sido utilizado comumente para pesquisar
efeito antiedematogênico em produtos de origem natural (WINTER et al., 1962;
DELLA LOGGIA et al., 1986; VILLAR et al., 1987; FERRANDIZ & ALCARAZ,
1991). Além disto, este modelo demonstra proporcionalidade entre a dose testada
em laboratório e a dose clínica (OTTERNESS & GAUS, 1988).
WILLOUGHBY e cols. (1969) sugeriram uma possível participação do
sistema complemento como um mecanismo indutor do processo inflamatório agudo.
Paralelamente, WILLIS (1969a e b) demonstrou que muitos mediadores como
histamina, 5-HT, cininas e PGs parecem estar envolvidos no edema de pata
induzido por Cg. Estes achados foram corroborados por DI ROSA e cols. (1971)
que investigaram a atuação do sistema complemento e reavaliaram o papel destes
mediadores no edema de pata induzido por Cg na pata de ratos. Os resultados deste
estudo demonstraram que a resposta vascular aguda induzida por Cg envolve três
etapas distintas: a primeira fase cursa com liberação simultânea de histamina e 5-
HT, nas concentrações em que cada amina exerce seu efeito máximo na
permeabilidade vascular e ocorre nos 90 min iniciais; a segunda fase, que ocorre
entre 90 e 150 min, é mediada pela liberação de cininas, como a BK, e a fase final,
que ocorre a partir de 150 min, é decorrente da presença de PGs no exsudato. A
ação destes mediadores é dependente da presença do sistema complemento que
exerce seus efeitos do início ao final da reação inflamatória.
A FLS, administrada por via i.p., reduziu significativamente o volume do
edema induzido por Cg em todos os períodos de tempo avaliados. Já por via oral, a
FLS, na maior dose administrada, reduziu o edema apenas na 2
a
, 3
a
e 4
a
h após a
injeção de Cg, tempo esse onde a liberação de cininas e PGs, assim como o
infiltrado neutrofílico já é bastante expressivo. A indometacina (INDO), como era
esperado, também inibiu significativamente o edema a partir da 2
a
h após a injeção
deste agente flogístico.
161
161
A ação antiinflamatória da FLS, no modelo de edema por Cg, parece ser
dependente da inibição da síntese e/ou liberação de cininas e PGs e/ou da redução
do infiltrado neutrofílico no foco inflamatório.
Partindo das evidências de que a FLS pode exercer seus efeitos através da
inibição da COX e/ou liberação de PGs, resolvemos então investigar uma possível
potenciação deste efeito da FLS pela INDO, no edema de pata promovido por Cg
em ratos. Entretanto, a INDO associada à FLS não foi capaz de potencializar o
efeito deste última, em nenhum dos períodos de tempo observados.
O óxido nítrico (NO) é um gás, sintetizado a partir do aminoácido L-arginina
e do oxigênio molecular, que estimula a vasodilatação por ligar-se a guanilil ciclase
solúvel, ativando a síntese de GMPc (MONCADA et al., 1991).
O NO é liberado a partir de células endoteliais in vitro, em resposta a uma
grande variedade de substâncias como BK, histamina e 5-HT (PALMER et al.,
1987; LUSCHER et al., 1990; IALENTI et al., 1992). O NO é formado também por
macrófagos ativados por LPS ou citocinas (AMBER et al., 1991). Adicionalmente,
agentes flogísticos como a Cg e mediadores inflamatórios como o LTB
4
, também
induzem a síntese e liberação de NO a partir de leucócitos polimorfonucleares
(PMN) (RIMELE et al., 1988; McCALL et al., 1989; STURM et al., 1989).
IALENTI e cols. (1992) estudaram o efeito da L-arginina e de inibidores da
NO sintase (NOS) como L-NAME e N
G
-monometil-L-arginina (L-NMMA) sobre o
aumento da permeabilidade vascular e edema induzido por Cg na pata de ratos.
Estes autores demonstraram que os antagonistas L-NAME e L-NMMA inibiram o
aumento da permeabilidade vascular e a formação do edema. A L-arginina
promoveu um aumento de ambas as respostas inflamatórias, e ainda foi capaz de
reverter os efeitos do L-NAME e L-NMMA.
Para demonstrar o papel da NOS induzível (NOSi) no edema por Cg, a
dexametasona, um inibidor desta enzima foi utilizada. Neste trabalho, IALENTI e
cols. (1992) demonstraram que a L-arginina, que potencializa as primeiras fases
deste edema, não modifica o efeito da dexametasona na última fase. Desta forma, o
NO endógeno parece ser liberado no local da inflamação aguda e parece modular a
formação do edema. O NO pode ser predominantemente gerado pela NOS
162
162
constitutiva (NOSc) ou NOSi, dependendo do tipo de reação inflamatória ou do
tempo decorrido para que a mesma ocorra.
Estes achados foram corroborados por SALVEMINI e cols. (1996a) que
apontam o NO como um importante mediador do edema produzido por Cg, e
sugerem que durante sua produção a NOSc atua nas etapas iniciais, de
desenvolvimento do edema, e a NOSi está envolvida na última etapa, de
manutenção da reação inflamatória.
O NO além de suas ações como vasodilatador e sua habilidade em aumentar
a permeabilidade vascular e o edema durante uma resposta inflamatória, ainda é
capaz de aumentar a produção de PGs pró-inflamatórias, através da ativação da
COX-1(constitutiva) e COX-2 (induzível), in vitro e in vivo (SALVEMINI et al.,
1993; SAUTEBIN et al., 1995; SALVEMINI et al., 1995).
A COX-2 foi apontada por SIEBERT e cols. (1994) como sendo a enzima
responsável pela elevada produção de PGs observada na última etapa do edema de
pata por Cg, em ratos. Além das PGs, a produção do ânion superóxido (O
2
),
peroxinitrito (ONOO
) e NO, também foi demonstrada neste modelo de inflamação
(SALVEMINI et al., 1996b). POSADAS e cols. (2004) também observaram níveis
elevados de NO e PGE
2
, além da indução de NOSi e COX-2 no edema de pata
induzido por Cg em camundongos.
Foi demonstrado que inibidores da enzima NOSi são capazes de
potencializar o efeito de antiinflamatórios não-esteroidais no edema de pata por Cg
(AL-MAJED et al., 2003). Além disto, diversas chalconas e seus derivados inibem
a expressão da NOSi e a produção de nitrito in vivo e in vitro (HERENCIA et al.,
2001; ROJAS et al., 2002; ROJAS et al., 2003). Assim sendo, resolvemos avaliar o
papel do sistema NO sobre o efeito apresentado pela FLS na inflamação aguda
induzida por Cg na pata posterior de ratos. A co-administração do L-NAME, um
inibidor da NOS, não potencializou o efeito da FLS, mostrando que o efeito
antiinflamatório deste último neste modelo de edema, parece ser independente do
bloqueio de enzimas ou das ações do NO.
A Pentoxifilina (PTX) (oxpentifilina) é um derivado dimetilxantínico, com
atividade por via oral, largamente utilizado no tratamento de desordens vasculares
163
163
periféricas, cerebrovasculares e um grande número de outras condições que
envolvem a microcirculação regional comprometida (TJON et al., 2001;
HARTMANN & TSUDA, 1988; WARD & CLISSOLD, 1987), que exerce seus
efeitos fisiológicos e farmacológicos através de vários mecanismos como
translocação de cálcio extracelular, redução dos níveis de TNF- devido a inibição
da fosfodiesterase (FDE), aumento dos níveis de AMPc e GMPc e bloqueio dos
receptores de adenosina (MICHETTI et al., 2003; CUNHA et al., 2000).
A PTX é um agente hemorreológico, que atua primariamente através do
aumento da deformabilidade de células sanguíneas vermelhas, pela redução da
viscosidade do plasma e dos níveis de fibrinogênio e pela redução da agregação de
plaquetas e formação de trombos. (SIDOROVA et al., 1991; DE LA CRUZ et al.,
1993; WARD & CLISSOLD, 1987). Além destas ações, a PTX possui propriedades
venodilatadora (GROSSMANN et al., 1998) e antioxidante (McDONALD, 1991), e
ainda previne a aderência de leucócitos a capilares e vênulas (SEIFFGE et al.,
1995).
CARNEIRO-FILHO e cols. (2001) demonstraram a atividade
antiinflamatória da PTX no modelo de edema de pata e na migração de neutrófilos
induzidos pelas toxinas A e B do Clostridium difficile. A PTX também possui
atividade antiinflamatória no edema de pata por Cg (CHEN et al., 1994; ABDEL-
SALAM et al., 2003), na artrite por adjuvante completo de Freund (SILVA et al.,
2000) e na resposta inflamatória cutânea produzida por luz ultravioleta (LOWITT,
2001). Na pancreatite experimental induzida por ceruleína em ratos, a PTX reduz o
edema e a inflamação pancreática (GOMEZ-CAMBRONERO et al., 2000).
No edema de pata induzido por Cg, o pré-tratamento com a PTX reduz o
edema da 1
a
a 4
a
h (ABDEL-SALAM et al., 2003). Entretanto, após o
estabelecimento do edema, a PTX reduz o edema apenas na 1
a
e 2
a
. Neste mesmo
estudo, foi demonstrado que a PTX praticamente não modifica o efeito
antiinflamatório da indometacina, mas potencializa o efeito da dexametasona e do
celecoxib (inibidor seletivo da COX-2). ABDEL-SALAM e cols. (2003)
demonstraram ainda o efeito antiinflamatório da administração tópica da PTX na
pata de ratos.
164
164
A PTX inibe a produção de algumas citocinas como TNF-, interferon gama
(IFN-), IL-1 IL-6, IL-12 (MARCINKIEWICK et al., 2000; VAN CREVEL et
al., 2000; VISSER et al., 2000; STOSIC-GRUJICIC et al., 2001), sendo que o
TNF- é um importante mediator inflamatório (WOOLF et al., 1997), e sua
inibição é considerada o provável mecanismo antiinflamatório desta droga
(MICHETTI et al., 2003, TONG et al., 2004; THAKURDAS et al., 2004).
Em estômago de ratos, a PTX diminui o dano à mucosa (SANTUCCI et al.,
1994) e a marginação de neutrófilos (SANTUCCI et al., 1995) induzida pela
indometacina e acelera a cicatrização de úlceras (SHIMIZU et al., 2000).
Nos últimos anos, o interesse pela PTX tem sido renovado devido ao seu uso
potencial na fibrose hepática (DESMOULIERE et al., 1997), na hipertensão portal
(ELEFTHERIADES et al., 1998) e na cardiomiopatia dilatada idiopática (SLIWA
et al., 1998).
No nosso trabalho, também foi avaliado o efeito da co-administração da PTX
e da FLS, no edema de pata induzido por Cg em ratos. O efeito antiedematogênico
da FLS foi potencializado na 2
a
, 3
a
e 4
a
h, mostrando que a mesma pode exercer seu
efeito na inflamação, através da inibição da FDE ou da síntese e/ou liberação de
citocinas inflamatórias como o TNF-.
A injeção intraplantar de formalina induz uma resposta comportamental
bifásica dolorosa, na qual a 1
a
fase é mediada pela ativação direta de neurônios
nociceptores com liberação de substância P e BK e a 2
a
fase é, em parte, dependente
da resposta inflamatória do tecido à injúria (HUNSKAAR & HOLE, 1987;
ABBOTT et al., 1995; HONG & ABBOTT, 1995). Além de estimular neurônios
nociceptores, a injeção de formalina induz edema e aumento da permeabilidade
vascular. A resposta inflamatória e os mediadores envolvidos dependem da
concentração de formalina utilizada (DAMAS & LIÉGEOIS, 1999).
Baixas concentrações de formalina (1,75%) induzem um edema imediato
associado a um acúmulo progressivo de proteínas na pata de ratos, que parece ser
dependente principalmente da estimulação de neurônios aferentes primários e
reflexos axônicos (WHEELER-ACETO & COWAN, 1991). Esta reação
inflamatória é reduzida por capsaicina, xilocaína, antagonistas de receptores de NK
1
165
165
(receptores de taquicininas) e agonistas de receptores -opióides (HONG &
ABBOTT, 1995; DAMAS & LIÉGEOIS, 1999), e é potencializada por inibidores
de peptidases responsáveis pela metabolização da substância P e inativação do
peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (MENTLEIN & ROOS, 1996).
Antagonista de histamina, 5-HT, BK ou inibidores da COX
1
, não têm nenhuma
influência nas mudanças vasculares promovidas por baixas doses de formalina
(DAMAS & LIÉGEOIS, 1999, DAMAS et al., 1998).
Concentrações mais elevadas de formalina (5%) induzem um edema de
maior extensão, que cursa com duas fases durante a primeira hora. A 1
a
fase dura
cerca de 20 minutos e a 2
a
fase se inicia 40 minutos após a injeção de formalina.
Ambas as fases apresentam um componente neurogênico, visto que o pré e pós-
tratamento com capsaicina e antagonistas dos receptores de NK
1
reduzem a reação
inflamatória. Diferentemente do que ocorre com baixas doses de formalina, a
metisergida, mepiramina e a indometacina inibem as mudanças vasculares
induzidas por altas doses de formalina (DAMAS & LIÉGEOIS, 1999).
Agonistas dos receptores
2
adrenérgicos como a clonidina e guanfancina
também inibem o edema induzido por formalina em ratos. A ioimbina reverte o
efeito antiinflamatório de ambos os agonistas, mas o prazosin não bloqueia o efeito
da clonidina neste modelo (KULKARNI et al., 1986).
Desta forma, as mudanças vasculares induzidas por baixas doses de
formalina na pata de ratos, dependem unicamente de uma reação inflamatória
neurogênica, e em doses mais elevadas de formalina, essas mudanças são mediadas
por neuropeptídeos, prostanóides e aminas provenientes de mastócitos. A BK,
apesar de ter um papel importante na estimulação de neurônios aferentes
nociceptores, não exerce nenhuma influência no desenvolvimento do edema e
extravasamento plasmático.
Em camundongos, o edema induzido por formalina é inibido por diferentes
antagonistas dos receptores B
2
de BK (CORREA & CALIXTO, 1993; CORREA et
al., 1996; DE CAMPOS et al., 1996), entretanto a reação inflamatória induzida por
formalina é similar em ratos normais e em animais deficientes de cininogênio e não
é reduzida pelos antagonistas B
2
.
166
166
Na reação inflamatória por formalina em camundongos, a FLS demonstrou
atividade antiinflamatória significante, apenas com a maior dose administrada.
Além disto, esta ação da FLS mostrou ser de curta duração, visto que a mesma não
se manteve até a 24
a
h após a administração de formalina.
Os modelos que utilizam a carragenina como agente flogístico são
considerados como aqueles que melhor indicam a atividade antiinflamatória de
compostos para o uso na clínica (OTTERNESS & GAUS, 1988). Tendo como base
o efeito inibitório da FLS sobre o edema de pata induzido por carragenina,
resolvemos investigar seus efeitos sobre a migração de leucócitos PMN induzida
por carragenina na cavidade peritoneal de ratos. À semelhança da dexametasona, a
FLS, administrada por via oral, mostrou-se eficaz em inibir o acúmulo de
neutrófilos na cavidade peritoneal de ratos induzido pela carragenina.
A resposta inflamatória celular é um dos mecanismos pelos quais o
organismo se defende de agentes lesivos e repara o tecido danificado. Muitas
células envolvidas nesta resposta chegam ao foco inflamatório provenientes do
sangue, como é o caso dos PMN (neutrófilos, eosinófilos, basófilos) e das células
mononucleares (monócitos e linfócitos), enquanto outras já estão presentes nos
tecidos, como as células endoteliais, células mononucleares residentes (macrófagos
teciduais e linfócitos), mastócitos e etc.
Os monócitos sangüíneos são células jovens que já possuem atividade
migratória, quimiotática, pinocítica e fagocítica. Após migrarem para os tecidos, os
monócitos sofrem diferenciação para tornarem-se macrófagos tissulares
multifuncionais, que podem ser divididos em normais e inflamatórios. Os normais
incluem os macrófagos do tecido conectivo (histiócitos), fígado (células de
Kupffer), pulmão (macrófagos alveolares), linfonodos (livres e fixos), baço (livres e
fixos), medula óssea (fixos), fluido seroso (macrófagos pleurais e peritoneais), pele
(histiócitos, células de Langerhans) e de outros tecidos. Os macrófagos
inflamatórios estão presentes em diversos exsudatos e podem ser caracterizados por
vários marcadores específicos, como por exemplo, atividade de peroxidase.
Os macrófagos são fagócitos mononucleares responsáveis por numerosos
processos homeostáticos, imunológicos e inflamatórios. Devido a sua vasta
167
167
distribuição tissular, estas células constituem a defesa imediata contra elementos
estranhos mesmo antes da chegada dos leucócitos.
Os mastócitos e basófilos possuem um papel central nas reações alérgicas
imediatas e inflamatórias. Estas células contêm grânulos citoplasmáticos, cuja
degranulação pode ser induzida por substâncias químicas (toxinas, venenos e
proteases), mediadores endógenos (proteases teciduais, proteínas catiônicas
derivadas de eosinófilos e neutrófilos), mecanismos imunes dependentes ou não de
IgE e destruição física (altas temperaturas, trauma mecânico, radiações ionizantes,
etc.).
Existem dois tipos de mediadores inflamatórios (anafiláticos) nos mastócitos
e basófilos: os pré-formados, estocados nos grânulos e secretados após ativação
celular, que incluem aminas como a histamina, os proteoglicanos (heparina, sulfato
de condroitina) e várias proteases neutras; e os mediadores recém-formados,
geralmente ausentes em mastócitos em repouso, mas tipicamente produzidos
durante a ativação mediada por IgE e consistem de metabólitos do ácido
araquidônico e citocinas. Estes mediadores agem sobre a vasculatura, músculo liso,
tecido conectivo, glândulas mucosas e células inflamatórias (STVRTINOVÁ et al.,
1995c). Os mastócitos repousam no tecido conectivo e usualmente não circulam na
corrente sangüínea, já os basófilos constituem os menores granulócitos circulantes.
O aumento no número de mastócitos e basófilos e conseqüentemente de suas
secreções no sítio inflamatório, pode acelerar a eliminação da causa da injúria
tissular ou, paradoxalmente, pode levar a uma resposta inflamatória crônica.
Portanto, a manipulação da adesão de mastócitos e basófilos pode ser uma estratégia
importante no controle da cronificação da resposta inflamatória e alérgica.
Os eosinófilos são leucócitos completamente diferenciados, que se
encontram predominantemente em tecidos submucosos e são recrutados para sítios
de reações imunes específicas. Como os outros granulócitos, os eosinófilos também
são polimorfonucleados. Seu citoplasma contém grânulos grandes elipsóides
(específicos ou secundários) com núcleo cristalino denso, grânulos primários
(grandes ou médios, densos e esféricos sem núcleo cristalino), e pequenos grânulos
168
168
(pequenos e densos) microgrânulos (estruturas vesículo-tubulares) que funcionam
como unidades estruturais da célula (TELLES-FILHO, 2004).
Os grânulos específicos são a principal característica de identificação dos
eosinófilos e contêm várias proteínas catiônicas: proteína básica maior, proteína
catiônica eosinofílica, proteína X eosinofílica, neurotoxina derivada de eosinófilos e
peroxidase eosinofílica, que exercem uma grande variedade de efeitos biológicos
sobre os micróbios e células dos hospedeiros. Estas proteínas também contribuem
para a disfunção e dano causado pelos eosinófilos, em doenças inflamatórias e
alérgicas (STVRTINOVÁ et al., 1995d).
Os eosinófilos também são capazes de elaborar citocinas, que incluem
aquelas com potencial autócrino de fatores de crescimento (GM-CSF, IL-3 e IL-5) e
aquelas com papel na resposta inflamatória aguda e crônica (IL-1, IL-6, IL-8,
TNF-, TGF- e TGF-). Os eosinófilos também participam das reações de
hipersensibilidade, especialmente aquelas mediadas pelo LTC
4
e PAF. Além da
liberação aguda de proteínas, citocinas e mediadores inflamatórios lipídicos, os
eosinófilos também contribuem para a inflamação crônica, incluindo o
desenvolvimento de fibrose.
Os neutrófilos representam 50 a 60% dos leucócitos totais circulantes e
constituem as células de defesa mais importantes contra agentes infecciosos ou
substâncias estranhas ao hospedeiro (MALECH & GALLIN, 1987, SECCO et al.,
2004). Uma vez iniciada a resposta inflamatória, os neutrófilos são as primeiras
células a serem recrutadas para o sítio inflamatório. Seus alvos incluem bactérias,
fungos, protozoários, vírus, células infectadas por vírus e células tumorais. Seu
citoplasma contém três tipos de grânulos: primários ou azurófilos, secundários ou
específicos e pequenos grânulos de estocagem, e um núcleo lobulado com
cromatina densa sem nucléolo.
Os grânulos dos neutrófilos contêm substâncias antimicrobianas e
citotóxicas, proteinases neutras, hidrolases ácidas e receptores citoplasmáticos
membranares. Dentre os constituintes dos grânulos azurófilos, encontra-se a
mieloperoxidase (MPO), que é uma enzima crítica na conversão de peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
) a ácido hipocloroso. Juntos, MPO e H
2
O
2
mais cofator formam o
169
169
sistema MPO, que é o mecanismo citotóxico e microbicida mais efetivo dos
leucócitos (STVRTINOVÁ et al., 1995e).
A função dos grânulos neutrofílicos não é apenas de produzir enzimas para
degradação de substratos hidrolíticos, mas também matar bactérias fagocitadas e,
através da secreção de seus conteúdos, regular vários processos fisiológicos e
patológicos, incluindo inflamação.
Além de enzimas, dois tipos de radicais livres são produzidos pelos
neutrófilos. O primeiro tipo é representado por intermediários reativos de oxigênio
que são formados nos neutrófilos pela NADPH oxidase, enzima do burst
respiratório, enquanto o segundo tipo inclui intermediários reativos de nitrogênio,
cujo membro principal é o NO.
Embora os neutrófilos sejam essenciais para defesa do hospedeiro, estes
também estão implicados na patologia de muitas condições inflamatórias onde há
dano tissular como artrite reumatóide, glomerulonefrite, vasculite imune e doença
inflamatória intestinal (SECCO et al., 2004). Em condições normais, os neutrófilos
podem migrar para o sítio infeccioso sem causar dano tissular. Entretanto, este dano
pode ocorrer através de mecanismos independentes. Estes incluem ativação
prematura durante a migração, liberação extracelular de produtos tóxicos durante a
destruição de alguns micróbios, remoção de células infectadas ou danificadas e
restos celulares como primeiro passo na remodelação ou falha na finalização da
resposta inflamatória aguda.
O processo de migração dos PMN envolve diversos eventos que seguem
basicamente os seguintes passos: rolling (deslizamento) dos leucócitos pela parede
dos vasos, através de interações de baixa afinidade entre leucócitos e células
endoteliais; ativação dos leucócitos por ação de agentes quimiotáticos ou integrinas;
adesão de alta afinidade devido à mudança conformacional do leucócito por ação de
integrinas; e transmigração para o espaço extravascular (MACKAY & IMHOF,
1993, ALBELDA et al., 1994; PENBERTHY et al., 1997). A migração de
neutrófilos durante a resposta inflamatória resulta principalmente da liberação de
fatores quimiotáticos por células residentes (BURKE-GAFFNEY & HELLEWELL,
1996; ZHANG et al., 2001).
170
170
Diversos fatores quimiotáticos para neutrófilos, tais como TNF-, PAF,
quinto componente do sistema complemento (C5a), LTB
4
, e uma grande variedade
de quimiocinas, incluindo IL-8, GRO- e SDF-1 e fator quimiotático para
neutrófilos derivado de macrófagos (MNCF), além de fragmentos da parede de
bactérias e peptídeos sintéticos (fMLP), têm sido descritos na literatura (CUNHA &
FERREIRA, 1986; MUNDER & COLDITZ, 1993; RIBEIRO et al., 1997; BINDER
et al., 1999; DROST & MAcNEE, 2002; SZEKANECZ et al., 2003). Por outro
lado, a produção de fatores quimiotáticos ocorre concomitantemente com a
liberação de mediadores antiinflamatórios como IL-10, IL-4 e lipoxina, que
modulam negativamente o recrutamento de neutrófilos (POULIOT & SERHAN,
1999; LEE et al., 2002). Estudos recentes também têm demonstrado que o NO inibe
a migração de neutrófilos (IALENTI et al., 2000; PAUL-CLARK, et al., 2001;
SECCO et al., 2004).
As células endoteliais desempenham um papel importante na regulação da
migração de PMN. Estas células, quando expostas a mediadores inflamatórios como
IL-1, TNF-, PAF, LTB
4
e C5a, tornam-se mais aderentes para neutrófilos.
Acredita-se que esse fenômeno seja decorrente de interações específicas entre
moléculas de adesão presentes nos leucócitos e nas superfícies das células
endoteliais (BEVILACQUA et al., 1994). Estas moléculas podem ser divididas em
três classes principais: selectinas, integrinas e alguns membros da superfamília das
imunoglobulinas.
A família das selectinas é composta por três membros: L-selectina, E-
selectina e P-selectina. Dentre estas se destacam a L-selectina, que é
constitutivamente expressa por todos os leucócitos e desaparece dos mesmos assim
que se inicia a adesão firme destes ao endotélio, e a E-selectina (ELAM-1), que é
expressa exclusivamente pelas células endoteliais após ativação por citocinas
(BEVILACQUA et al., 1994).
As integrinas são glicoproteínas transmembranares expressas particularmente
por leucócitos e formadas por duas cadeias moleculares e .
Dentre as imunoglobulinas, as mais importantes são a ICAM-1 (molécula de
adesão intercelular-1), ICAM-2 e PECAM-1 (molécula de adesão célula endotelial-
171
171
plaqueta-1). Ambas ICAM-1 e ICAM-2 são expressas pelas células endoteliais,
enquanto PECAM-1 foi identificada em neutrófilos, monócitos, plaquetas e, em
grande quantidade, nas células endoteliais (BEVILACQUA, 1993; BEVILACQUA
et al., 1994; PENBERTHY et al., 1997).
As moléculas de adesão participam da interação leucócito-célula endotelial
da seguinte forma: o rolling inicial dos leucócitos sobre o endotélio vascular é
mediado pelas selectinas, este evento é seguido pela (1) ativação das integrinas
2
após a exposição dos leucócitos às citocinas e mediadores pró-inflamatórios, (2)
aderência dos leucócitos via integrinas
2
ao ligante vascular endotelial (ICAM-1),
(3) extravasamento dos leucócitos para os tecidos através das tight junctions das
células endoteliais mediado pela PECAM-1 e (4) migração perivascular através da
matrix extracelular via integrina
1
(RADI et al., 2001; WANG & DOERSCHUK,
2002).
O efeito da FLS sobre a migração de leucócitos PMN induzida por fMLP,
também foi avaliado. Nesse modelo, a FLS, assim como a dexametasona, também
mostrou efeito inibitório sobre o acúmulo de neutrófilos na cavidade peritoneal de
ratos. Alguns autores sugerem que a migração de neutrófilos induzida por fMLP é
mediada por produtos da lipoxigenase (LOX) (BHATTACHERJEE &
PATTERSON, 1990). Contudo, RIBEIRO e cols. (1997) demonstraram que os
metabólitos do ácido araquidônico provavelmente não estão envolvidos na migração
de neutrófilos induzida pelo fMLP, visto que inibidores da COX e da LOX não
apresentaram efeito inibitório sobre este processo. Estes autores ainda sugerem que
a migração de neutrófilos induzida por fMLP parece estar relacionada à formação
de um gradiente haptotático, que é definido como sendo um gradiente produzido em
resposta a uma substância atrativa ligada a um substrato localizado na superfície das
células endoteliais e/ou à matriz extracelular.
Outros trabalhos têm demonstrado que o fMLP além de induzir o burst
respiratório também ativa a fosfolipase D (FLP D) (KESSELS et al., 1991; WANG
et al., 2002; PACLET et al., 2004), induz a fosforilação de resíduos de tirosina de
proteínas e a translocação do fator de ribosilação de ADP e das proteínas Rho A
(WANG et al., 2002), ativa a FLP C específica para fosfatidil inositol, com
172
172
consequente produção de trifostato de inositol e diacilglicerol (ISHII et al., 2002), e
ativa algumas isoformas de proteína quinase C, através de sua ligação à receptores
FPR (formyl peptide receptor) para fMLP (PACLET et al., 2004; SUN et al., 2004).
O mecanismo pelo qual a dexametasona (DEXA) inibe o recrutamento de
neutrófilos ou PMN para o sítio inflamatório ainda não está completamente
esclarecido. Por muitos anos pensou-se que os glicocorticóides inibiam a migração
de PMN através do bloqueio da adesão de neutrófilos ao endotélio (MICHEL &
WHORTON, 1951; MOON & TERSHAKOVIC, 1953; ALLISON et al., 1955).
Entretanto, com o advento de novas técnicas para o estudo da migração de células,
KATORI e cols. (1990) demonstraram que a DEXA não inibe o rolling nem a
adesão de neutrófilos ao endotélio, induzidos in vivo por LTB
4
, mas inibe a
penetração dos neutrófilos através das junções das células endoteliais. Mais tarde,
ODA E KATORI (1992), usando um sistema de vídeo mais moderno,
demonstraram que além do rolling e da adesão firme dos PMN, induzidos por fMLP
ou LTB
4
, a DEXA também era incapaz de inibir a penetração e a passagem dos
PMN entre as células endoteliais após 30 min da aplicação do estímulo. Entretanto,
60 e 90 min após aplicação do estímulo, o número de PMN era significantemente
suprimido em relação ao controle, sugerindo que neste tempo estas células não eram
capazes de penetrar a membrana basal. Os autores sugeriram que esta incapacidade
de penetração era devido ao fato da DEXA inibir provavelmente a síntese e/ou
liberação de proteinases dos grânulos dos PMN, enzimas estas normalmente
responsáveis pela degradação da membrana basal.
Usando técnicas de microscopia intravital, MANCUSO e cols. (1995)
mostraram que a DEXA também não modifica o rolling nem o número de células
aderidas ao endotélio, induzidos por fMLP ou substância P. Contudo,
aproximadamente 65% dos neutrófilos aderidos retornam a corrente sangüínea e os
que permanecem no processo de diapedese exibem um longo período de latência
antes da transmigração. Nos animais imunizados com soro anti-lipocortina-1, o
processo de diapedese ocorre em períodos de tempo similares nos grupos controle e
tratados com DEXA, enquanto que nos animais pré-tratados com soro não-imune,
ocorre um significante aumento neste período de tempo. Além disto, nos animais
173
173
tratados com DEXA, os níveis de lipocortina-1 encontram-se bastante elevados.
Estas observações indicam que a inibição do processo de transmigração pela DEXA
pode ser mediada pela lipocortina endógena.
Há ainda vários trabalhos que mostram que a DEXA inibe a migração de
PMN induzida in vitro por LPS, através da inibição da liberação de potentes
citocinas pró-inflamatórias, tais como IL-8 e MIP (proteína inflamatória derivada de
macrófago) (ZENTAY et al., 1999; IRAKAM et al., 2002).
Sabe-se ainda que a DEXA é um potente inibidor da síntese de citocinas ao
nível transcricional, pós-transcricional e translacional (ALMAWI et al., 1996). Em
muitos modelos utilizando mamíferos, os glicocorticóides inibem a transcrição de
genes de muitas citocinas inflamatórias, incluindo TNF-, IL-1 e IL-8 (MONICK
et al., 1994; MALAZDREWICH et al., 2004), além de citocinas imunológicas
como IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-12 e IFN-, entre outras (ALMAWI et al., 1996).
A migração de neutrófilos em cavidade peritoneal de ratos induzida por
fMLP, não depende de células residentes para produzir quimiotaxia, pois o mesmo é
considerado um estímulo direto, enquanto que àquela mediada por Cg, se dá por um
mecanismo indireto, via liberação de fatores quimiotáticos para neutrófilos por
células residentes.
A ação antiinflamatória da FLS parece ser dependente não apenas do
bloqueio da síntese de PGs e LTs, como também da síntese e liberação de
mediadores inflamatórios como a IL-1, IL-8, MIP, TNF-, LTB
4
e C5a, ou de uma
possível inibição de uma das etapas envolvidas na migração de neutrófilos ou até
mesmo do bloqueio de alguma molécula de adesão envolvida neste processo, visto
que a FLS foi cerca de duas vezes mais eficaz em inibir a migração induzida pelo
fMLP, do que àquela induzida por Cg.
A inflamação crônica é um processo complexo, que ocorre quando a resposta
inflamatória aguda é insuficiente para eliminar os agentes pró-inflamatórios. A
inflamação crônica induz a proliferação de fribroblastos, infiltração de neutrófilos e
exsudação (GEPDIREMEN et al., 2004).
O pellet de algodão quando introduzido no tecido conectivo dos animais
experimentais provoca uma resposta inflamatória aguda transitória, que é seguida
174
174
por uma intensa acumulação de macrófagos e formação de granuloma (BOROS,
1978). Por sua vez, a formação do granuloma é acompanhada pela síntese de PGE
2
,
PGF
2a
e TXA
2
. A PGE
2
liberada pelas células endoteliais, células da musculatura
lisa e pelos macrófagos, é um potente vasodilatador que aumenta a permeabilidade
da membrana e promove a quimiotaxia de células inflamatórias, enquanto que a
PGF
2a
promove a hiperplasia e a hipervascularização no sítio inflamatório. Já o
TXA
2
liberado das plaquetas, induz agregação plaquetária e vasoconstrição.
O modelo de granuloma induzido por pellet de algodão é um modelo típico
de reação inflamatória crônica estabelecida e que serve como teste subcrônico e
crônico para avaliar drogas antiartríticas (PANTHONG et al., 2004). Este modelo
tem sido empregado para avaliar componentes transudativos e proliferativos da
inflamação crônica, visto que o fluido absorvido pelo pellet de algodão influencia o
peso úmido do granuloma, enquanto que o peso seco correlaciona-se com a
quantidade de tecido granulomatoso formado.
Muitas drogas antiinflamatórias não-esteroidais como a aspirina, exercem
apenas uma discreta inibição na formação do granuloma sem, contudo influenciar o
peso do timo ou o ganho de peso dos animais experimentais. Contrariamente, as
drogas esteroidais mostram elevada redução no peso do granuloma e do timo, assim
como no ganho de peso corporal (SWINGLE & SHIDEMAN, 1972).
Para avaliar o efeito da FLS na inflamação crônica, foi utilizado o modelo de
granuloma induzido por pellet de algodão. Durante o processo de reparo, ocorre a
proliferação de macrófagos, neutrófilos, fibroblastos e a multiplicação de vasos
sangüíneos de pequeno calibre, os quais servem de base para formação da massa
vascularizada que forma o tecido de granulação (SWINGLE, 1974;
BHATTACHARYA et al., 1992).
A administração sistêmica da FLS, durante sete dias, não promoveu redução
do peso úmido ou do peso seco dos granulomas, nem modificou o peso do timo e
das glândulas adrenais. A DEXA, usada como droga padrão, reduziu o peso úmido
dos granulomas e o peso das glândulas adrenais e timo dos ratos. Desta forma, a
FLS, pelo menos nas doses utilizadas, parece não interferir com o metabolismo do
ácido araquidônico nem inibir a atividade dos macrófagos ou a formação de fibrose.
175
175
A doença inflamatória intestinal que inclui a doença de Crohn e a colite
ulcerativa, compreende um grupo de desordens multifatoriais de etiologia
desconhecida. A colite ulcerativa (CoU), descrita por WILKS E MOXON (1875), é
uma inflamação difusa e recorrente do cólon e reto, que afeta predominantemente a
mucosa colônica e pode acometer pessoas de ambos os sexos e de todas as idades,
com maior incidência até os 50 anos. Sua etiologia é pouco compreendida e, embora
tenha sido assunto de muita investigação científica, seu tratamento ainda é empírico
e as opções terapêuticas disponíveis visam apenas à remissão dos sintomas
(ELSON, 1996; BOZKURT et al., 2003). Os antiinflamatórios específicos como a
sulfassalazina, o ácido 5-amino-2-hidroxibenzóico (5-ASA), os corticosteróides,
antibióticos e imunossupressores, além de psicoterapia, hidratação venosa e, às
vezes, transfusão sangüínea, dependendo dos sintomas são, de uma forma geral, os
tratamentos disponíveis para CoU (RODRIGUES, 1999).
Diversos mediadores inflamatórios como citocinas, eicosanóides, aminas
vasoativas e espécies reativas de oxigênio (ERO), possuem um papel central no
desenvolvimento e persistência da CoU (SEO et al., 1995; LOGUERCIO et al.,
1996; CARTY et al., 2000, NOSÁL’OVÁ et al., 2000). A principal fonte de ERO
na mucosa inflamada são os neutrófilos ativados, capazes de produzir ânion
superóxido (O
2
) e uma cascata de várias espécies reativas que pode culminar com
produção de peróxido e radicais hidroxílicos extremamente reativos (BAKER &
CAMPBELL, 1991).
A necessidade de esclarecer a etiologia e a etiopatogenia e desenvolver
métodos terapêuticos adequados para CoU, fez surgir vários modelos experimentais
de colite. Um destes modelos, a CoU induzida por ácido acético em ratos
(MAcPHERSON E PFEIFER, 1978), tem demonstrado boa reprodutibilidade e
lesões similares àquelas da CoU humana, e tem se mostrado muito útil na busca de
novas substâncias para o tratamento da doença inflamatória intestinal (NOA et al.,
2000; RODRIGUES et al., 2002).
A infiltração neutrofílica na lâmina própria é uma característica comum da
CoU e, provavelmente, contribui para a inespecificidade desta doença e para o
aumento da atividade da MPO colônica (NOSÁL’OVÁ et al., 2000). Esta enzima é
176
176
liberada dos grânulos de estocagem dos neutrófilos após a ativação dos mesmos e
cataliza a formação de inúmeras espécies reativas. Portanto, a redução da atividade
da MPO pode ser interpretada como sendo uma manifestação da atividade
antiinflamatória de determinada substância (PAIVA et al., 2004).
Diversas pesquisas com substâncias obtidas de plantas têm sido conduzidas
no sentido de encontrar, no mínimo, uma terapia complementar para o tratamento
da CoU (SÁNCHEZ DE MEDINA, et al., 1996; GOTTELAND et al., 1997;
GÁLVEZ et al., 1997; OCETE et al., 1998; CRUZ et al., 1998; RODRIGUES et
al., 2002; PAIVA et al., 2004).
A FLS, administrada por via oral, mas não por via intra-retal, reduziu
significativamente o dano tissular induzido por ácido acético em ratos, evidenciado
através de seus efeitos inibitórios sobre os escores macroscópicos e atividade da
MPO. Entretanto, o peso úmido do cólon não foi modificado pela FLS. O peso
úmido do cólon inflamado é considerado um indicativo seguro da severidade e
extensão da resposta inflamatória (RACHMILEWITZ et al., 1989).
Conjuntamente, os resultados obtidos na inflamação demonstram que a FLS
pode ter um potencial terapêutico como antiinflamatória, administrada sozinha ou
em combinação com agentes como a PTX, que aumentam sua eficácia
antiinflamatória.
Considerando a atividade antiinflamatória apresentada pela FLS em diversos
modelos de inflamação, resolvemos investigar seu efeito em diferentes testes de
nocicepção como o das contorções abdominais pelo ácido acético ou pela
acetilcolina (ACh), teste da formalina e o teste da placa quente, em camundongos.
A utilização de diferentes estímulos nociceptivos é útil na avaliação de uma droga,
pois produz no animal a percepção do fenômeno doloroso com diferentes
características, revelando assim, a verdadeira natureza antinociceptiva da substância
em questão.
O ácido acético induz dor indiretamente, produzindo uma reação inflamatória
aguda na área peritoneal (NORTHOVER, 1963; GYIRES & KNOLL, 1975). Um
aumento nos níveis de PGE
2
e PGF
2a
no fluido peritoneal é evidenciado, após a
aplicação do ácido acético (DERAET et al., 1976; DERAET et al., 1980). Além das
177
177
PGs, outros componentes inflamatórios como o envolvimento do sistema simpático
podem ser responsáveis pelas contorções induzidas pela administração
intraperitoneal do ácido acético (DUARTE et al., 1988). Um aumento da
permeabilidade vascular, nos vasos sanguíneos peritoneais no momento da primeira
contorção, também foi evidenciado (GYIRES & TORMA, 1984).
A nocicepção induzida pelo ácido acético foi eficazmente prevenida pela
FLS, administrada por via oral ou subcutânea (FONTENELE et al., 2001). Embora
a inibição das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético represente uma
antinocicepção periférica (WEI et al., 1986), este modelo não possui especificidade,
visto que uma diversidade de drogas como antidepressivos tricíclicos
(TAKAHASHI & PAZ, 1987), anti-histamínicos (YEH, 1986) e anti-hipertensivos
(PETTIBONE & MULLER, 1989) podem inibir as contorções induzidas pelo ácido
acético, sugerindo uma antinocicepção questionável.
A redução da inflamação pelo uso de fármacos antiinflamatórios também
resulta em alívio da dor. Além disso, a maioria dos analgésicos não-opióides
(aspirina e outros) também exerce efeito antiinflamatório e, portanto, estas drogas
são adequadas para o tratamento de condições inflamatórias agudas e crônicas
(PAYAN & KATZUNG, 1995).
Uma grande variedade de mediadores químicos, que atuam em neurônios
nociceptores, é produzida por células não neuronais durante a inflamação. A
descarga desses neurônios é controlada pela atividade de canais iônicos da
membrana. Esses mediadores podem ser classificados em dois tipos: agentes
ativadores diretos e agentes hiperalgésicos ou sensibilizadores de nociceptores
(MONCADA et al., 1978). Parece pouco provável que a sensibilização de
nociceptores não seja um fator importante nas muitas formas de dor inflamatória.
Portanto, a inflamação aguda ou crônica pode ser considerada como modelo de
nocicepção, visto que muitos mediadores inflamatórios podem gerar impulsos
nociceptivos (STEEN et al., 1996; BESSON, 1997).
Foi estabelecido que a BK e a 5-HT são capazes de excitar nociceptores
assim como sensibilizá-los a outros estímulos (FERREIRA et al., 1993), e que a 5-
HT pode ainda aumentar pronunciadamente a resposta nociceptiva induzida pela
178
178
BK (LANG et al., 1990; RUEFF & DRAY, 1993). A BK também estimula a
liberação de TNF- e IL-1, a partir de macrófagos (TIFFANY & BURCH, 1989).
As PGs, embora ineficazes na ativação de nociceptores, podem promover a
sensibilização dos mesmos a muitos outros estímulos, inclusive à BK (SCHAIBLE
& SCHMIDT, 1988). Essa ação das PGs parece ser importante no desenvolvimento
da hiperalgesia periférica (RANG et al., 1991). Os LTs também parecem
desempenhar um papel na sensibilização dos nociceptores. O LTB
4
, assim como
outros LTs, não atuam diretamente sobre neurônios sensoriais, mas exercem seus
efeitos através da liberação de um hidroxiácido bioativo, o
dihidroxieicosatetraenóico (DiHETE), de leucócitos polimorfonucleares (LEVINE
et al., 1986). Em tecidos inflamados, o LTD
4
produz uma rápida interação na
expressão de genes em células como macrófagos e basófilos, que estimulam a
síntese e liberação de eicosanóides (CROOK et al., 1989). Além disso, o LTD
4
parece ser capaz de induzir a liberação de substância P (BLOOMQUIST &
KREAM, 1987), um neuropeptídeo abundante em nociceptores polinodais-C. A
substância P, assim como outros neuropeptídeos, possue um papel importante na
ativação da inflamação neurogênica (STEEN et al., 1996). Além disso, evidências
recentes apontam a contribuição de citocinas, inclusive TNF-, na geração e
manutenção da hiperalgesia que acompanha a dor neuropática (JUNGLER &
SORKIN, 2000). A grande diversidade e a interação de todos estes compostos torna
o tratamento farmacológico da dor bastante complexo.
Duas vias diferentes foram identificadas na hiperalgesia. O TNF-, liberado
por estímulos inflamatórios, induz a liberação de IL-1 e IL-6, que por sua vez
estimulam a produção de produtos da cicloxigenase e, induz a liberação de IL-8,
que estimula a produção de simpatomiméticos, como a dopamina, noradrenalina e
adrenalina (CUNHA et al., 1992). Portanto, a inibição da síntese e liberação de
TNF- parece ser um passo limitante no processo da hiperalgesia.
A talidomida (TALI) foi sintetizada em 1954 pela companhia farmacêutica
CIBA e era prescrita como sedativo, tranqüilizante e antiemético para enjôos da
gravidez (FRANKS et al., 2004). Embora tenha sido uma droga bastante popular
como sedativo no mundo inteiro, a mesma nunca foi aprovada pelo FDA devido à
179
179
neurite irreversível produzida como um dos potenciais efeitos colaterais da TALI
(MELLIN & KATZENSTEIN, 1962; KELSEY, 1988).
Os primeiros relatos de que a TALI produzia anormalidades dos membros e
outros defeitos congênitos, foram feitos por mulheres que usaram a droga, até
mesmo em uma única dose, durante a gestação (MELLIN & KATZENSTEIN,
1962). Estima-se que cerca de 10.000 crianças no mundo inteiro nasceram com
malformações devido ao uso desta droga, e por este motivo a mesma foi retirada do
mercado Europeu e Canadense, em 1961 e 1962, respectivamente (LENZ, 1988).
Em 1965, a TALI resurgiu como uma droga efetiva no tratamento do eritema
nodoso da lepra, tendo sido aprovada para este fim, pelo FDA, em 1988 (FRANKS
et al., 2004).
A TALI é uma molécula racêmica, consistindo dos enanciomeros S() e R()
que se interconvertem em condições fisiológicas. A forma S() inibe a liberação de
TNF- a partir de células sangüíneas mononucleares (WNENDT et al., 1996),
enquanto a forma R() parece agir como sedativo (FREDERICKSON et al., 1977).
O mecanismo responsável pelas propriedades imunomodulatórias,
antiinflamatórias e antiangiogênicas da TALI ainda não foi completamente
elucidado. Contudo, a modulação da enzima COX-2, de citocinas como TNF-,
interferon (IFN-), IL-10 e IL-12 e possivelmente do NF-kB parecem estar
envolvidas nestas ações da TALI (FUJITA et al., 2001; KEIFER et al., 2001;
MAJUMDAR et al., 2002; VIANA et al., 2002; FRANKS et al., 2004). A TALI
inibe seletivamente a produção de TNF- através do aumento da degradação do
RNAm do TNF- (SAMPAIO et al., 1991; MOREIRA et al., 1993).
Vários trabalhos têm demonstrado que a TALI é capaz de inibir a dor em
alguns modelos de nocicepção (VALE & RIBEIRO, 1996; RIBEIRO et al., 2000),
possui atividade inibitória sobre os efeitos pró-inflamatórios da enterotoxina
secretada pelo Vibrio cholerae na pata de ratos (VIANA et al., 2002), assim como a
infiltração neutrofílica induzida, em ratos, pelas toxinas A (enterotoxina) e B
(citotoxina) produzidas pelo Clostridium difficile (CARNEIRO-FILHO et al.,
2001).
180
180
A associação da TALI e FLS, não foi capaz de modificar o efeito
antinociceptivo da FLS quando a mesma foi administrada por via subcutânea, na
nocicepção induzida pelo ácido acético. Entretanto, a associação da TALI à FLS por
via oral, mostrou uma potencialização do efeito antinociceptivo desta última,
sugerindo que neste modelo, o efeito da FLS parece estar relacionado, pelo menos
em parte, à inibição da síntese de TNF- (FONTENELE et al., 2001).
Diferente da TALI, a PTX é um inibidor não-seletivo da síntese de TNF-
que reduz sua liberação através da inibição da transcrição do gene do TNF-, além
de regular a liberação de outras citonicas pró-inflamatórias como a IL-1, a IL-6 e a
IL-8 (VIANA et al., 2002; MALAZDREWICH et al., 2004; VAJJA et al., 2004). A
PTX, que é um inibidor não-seletivo da enzima FDE, também inibe a síntese de
TNF- através do aumento dos níveis de AMPc (WARD & CLISSOLD, 1987;
BRITO et al., 2001). Além disso, esta droga altera a quimiotaxia de neutrófilos,
reduz a produção de superóxido, atenua a injúria tecidual, estimula a produção da
citocina antiinflamatória IL-10 e reduz o aumento da permeabilidade vascular
induzida por LPS (WARD & CLISSOLD, 1987; SULLIVAN et al., 1988;
STANDIFORD et al., 1995; IRIE et al., 2001).
Utilizando ainda o teste das contorções abdominais induzidas pelo ácido
acético, a associação da FLS à PTX também foi avaliada, mostrando que houve uma
potencialização do efeito da FLS por este inibidor da FDE e da síntese de TNF-.
Estes dados corroboram os anteriores e demonstram que, pelo menos em parte, a
atividade antinociceptiva da FLS parece ser mediada pela inibição da síntese e/ou
liberação de TNF-, ou ainda pela inibição da FDE, com conseqüente aumento dos
níveis de AMPc.
A reação dolorosa seguida à injeção intraperitoneal de diferentes irritantes
pode ser devido à liberação de substâncias endógenas, ao estímulo direto de
nociceptores peritoneais ou a substâncias que sensibilizam as terminações nervosas
dolorosas (GYIRES & TORMA, 1984). Substâncias que produzem um período de
latência curto para o aparecimento da primeira contorção, parecem agir por um
mecanismo direto de excitação da dor, enquanto que um longo período de latência
181
181
pode ser conseqüência de um mecanismo indireto de reação à dor (COLLIER et al.,
1968).
A ACh, além de possuir um curto período de latência para dor, induz a
liberação de PGs, evidenciada pelos altos níveis de MDA no fluido peritoneal. De
acordo com FERREIRA (1972), as PGs são capazes de sensibilizar as terminações
dolorosas a estímulos químicos, térmicos e mecânicos. Contudo, diferente do que
ocorre com o ácido acético, a ACh não influencia a permeabilidade vascular dos
vasos peritoneais (GYIRES & TORMA, 1984).
As drogas que inibem a síntese de PGs, antagonistas dos receptores 5-HT
(metisergida, dolasetron, etc.), derivados pirimidínicos (rimazólio) e a morfina,
inibem efetivamente as contorções abdominais induzidas pela ACh, em
camundongos (MOSER, 1995; FUJIYOSHI et al., 1990; GYIRES et al., 1985).
A administração sistêmica da FLS não modificou significativamente a
resposta dolorosa induzida pela ACh. Contudo, a INDO, conhecido inibidor da
síntese de PGs, bloqueou quase completamente as contorções abdominais induzidas
por este estímulo.
O teste da formalina é um modelo de dor aguda e tônica, sendo considerado
um dos mais válidos modelos para se estudar dor clínica. Além disso, foi
demonstrado que a dor periférica mediada pela injeção intraplantar de formalina,
pode ser análoga à dor pós-operatória humana (ABBOTT & FRANKLIN, 1986;
TJOLSEN et al., 1992).
Um aspecto importante do teste da formalina em roedores, consiste no fato
de que estes animais mostram uma resposta comportamental bifásica que envolve
mecanismos distintos (HUNSKAAR & HOLE, 1987). A primeira fase,
caracterizada como uma dor neurogênica, tem início imediatamente após a injeção
de formalina, dura de 3 a 5 min e provavelmente representa um efeito irritante
direto da formalina sobre as fibras C sensoriais. Subseqüentemente, ocorre um
período de 10 a 15 min, no qual os animais exibem comportamento pouco sugestivo
de nocicepção. A segunda fase, decorrente do desenvolvimento de um processo
inflamatório, se inicia 10 a 20 min após a injeção de formalina e dura de 20 a 40
min, e parece envolver o recrutamento de células inflamatórias pelos neurônios
182
182
aferentes primários adjacentes (HUNSKAAR et al., 1985; McCARSON &
GOLDSTEIN, 1990).
Evidências experimentais indicam que a substância P e BK participam da
primeira fase do teste da formalina, enquanto a histamina, 5-HT, PGs e BK estão
envolvidas na segunda fase (HALEY et al., 1989; SHIBATA et al., 1989;
CORREA & CALIXTO, 1993). Além desses mediadores, foi demonstrado que
aminoácidos excitatórios, como o L-glutamato e L-aspartato, também
desempenham um papel no desenvolvimento da sensibilização central e nocicepção
persistente associadas à injeção de formalina (CODERRE & MELZACK, 1992).
Drogas de ação central como os narcóticos, são capazes de inibir ambas as
fases do teste da formalina, enquanto drogas de ação periférica como os
antiinflamatórios não esteroidais e os corticosteróides, inibem o comportamento
nociceptivo apenas na segunda fase do teste (HUNSKAAR & HOLE, 1987;
ROSLAND et al., 1990).
A FLS, administrada por via oral ou intraperitoneal, exibiu um efeito
antinociceptivo em ambas as fases do teste da formalina. Contudo, sua atividade
antinociceptiva parece não envolver a ativação de receptores opióides, visto que a
naloxona, um conhecido antagonista opióide, não mostrou influência sobre a ação
antinociceptiva da FLS, mas foi capaz de abolir o efeito antinociceptivo da morfina
(FONTENELE et al., 2001).
Existem evidências de que o óxido nítrico (NO) pode exercer efeito
nociceptivo (HUGHES et al., 1990) e antinociceptivo (KAWABATA et al., 1992,
ROCHA et al., 2002) em modelos experimentais de dor. Alguns autores têm
sugerido, que o NO desempenha um papel importante na sensibilização central e na
persistência da nocicepção, seguida à injúria tecidual induzida pela formalina
(MOORE et al., 1991; CODERRE & YASHPAL, 1994; SHIBUTA et al., 1996).
Além disso, estudos feitos com cães e humanos demonstraram que o NO é também
um mediador nociceptivo nestas espécies (PELLIGINO et al., 1996; KINDGEN-
MILLES & ARNDT, 1996).
Estudos recentes (OKUDA et al., 2001) demonstraram que a formalina
injetada na pata de ratos leva a um aumento bifásico dos níveis extracelulares de
183
183
nitrito/nitrato, em dialisados da medula espinhal, que cursa conjuntamente com a
resposta comportamental também bifásica do teste da formalina. Neste trabalho, os
autores ainda demonstram que o L-NAME, administrado por via intratecal, reduz a
liberação de nitrito/nitrato e a nocicepção (flinching, mas não licking/biting) durante
a segunda fase do teste.
Outros estudos também demonstraram que a injeção intratecal de L-NAME
resulta em significante redução da resposta comportamental de licking, induzida por
baixas doses de formalina (SAKURADA et al., 2001).
Níveis elevados de glutamato, durante a primeira fase do teste da formalina,
também foram observados (OKUDA et al., 2001; WATANABE et al., 2003). Estes
autores sugerem ainda que a liberação de nitrito/nitrato pode ser mediada pelo
aumento dos níveis de glutamato. O pré-tratamento com L-NAME também inibe a
liberação de glutamato após a injeção de formalina.
Há também evidências de que o NO é um intermediário importante nas
funções dos receptores de NMDA na medula espinhal (HALEY et al., 1990). Esta
observação foi posteriormente confirmada por estudos que mostraram que a
administração intratecal de agonistas de receptores de NMDA induz a liberação de
glutamato e citrulina, um aminoácido co-produzido na síntese de NO e que a
inibição da NOS bloqueia a liberação de glutamato, ao nível espinhal, induzido pela
ativação dos receptores de NMDA (SORKIN, 1993). Outros trabalhos
demonstraram que a sensibilização central e a hiperalgesia induzidas pela ativação
dos receptores de NMDA envolvem a produção de NO (MELLER et al., 1992).
Foi demonstrado que a associação da morfina ao L-NAME no teste da
formalina, resulta no aumento da inibição da resposta nociceptiva em ambas as
fases do teste, sugerindo que a combinação de drogas pode ser promissora no
tratamento da dor aguda e persistente (WATANABE et al., 2003).
Outras pesquisas têm relatado ainda que o NO pode estimular a atividade da
COX (MITCHELL et al., 1993; SALVEMINI et al., 1993). As PGs são importantes
mediadores inflamatórios liberados durante a segunda fase do teste da formalina,
através da ativação da COX (SHIBATA et al., 1989). ALEY e cols. (1998) também
demonstraram que o NO facilita a hiperalgesia dependente de monofosfato de
184
184
adenosina cíclico (AMPc), produzida pelas PGs. Mais recentemente foi evidenciada
a existência de uma interação importante entre os sistemas NO e COX, no teste da
formalina (DUDHGAONKAR et al., 2004). Neste trabalho, os autores utilizaram o
rofecoxib (inibidor seletivo da COX-2) e a aminoguanidina (inibidor seletivo da
NOSi) e mostraram que a co-administração oral destas drogas produz um efeito
antinociceptivo sinérgico na nocicepção induzida pela formalina em camundongos.
Tendo como base as evidências experimentais descritas, passamos a
investigar um possível envolvimento do NO na antinocicepção exercida pela FLS
no teste da formalina, em camundongos. A L-arginina não promoveu reversão do
efeito da FLS em nenhuma das fases do teste, sugerindo que o sistema NO parece
não ter um papel importante na antinocicepção da FLS (FONTENELE et al., 2001).
Estes achados estão de acordo com aqueles obtidos no edema de pata induzido pela
Cg, onde o L-NAME não exerceu nenhuma influência no efeito antiedematogênico
da FLS.
Além da via do NO, da COX, e da participação das citocinas, o componente
simpático também tem sido referido por diversos autores, ao longo dos anos, como
participante nos mecanismos modulatórios da dor (CODERRE et al., 1984;
NAKAMURA & FERREIRA, 1987; TASKER et al., 1992; BERNARD et al.,
1995; KHASAR et al., 1995b; SAWYNOK et al., 1995; HONG & ABBOTT, 1996;
TSURUOKA et al.,1998; SHANNON & LUTZ, 2000; XU et al., 2000).
TASKER e cols. (1992) demonstraram que os agonistas
1
adrenérgicos
fenilefrina (FENIL) e metoxamina, administrados por via sistêmica, produziram
significante antinocicepção dose-dependente no teste da formalina em ratos. O
efeito destes agonistas foi completamente antagonizado pelo prazosin (PRAZ), um
antagonista dos receptores
1
adrenérgicos. Neste mesmo trabalho, os autores
mostraram que o ST-91, um agonista seletivo dos receptores
2
adrenérgicos,
também causou antinocicepção no teste da formalina e este efeito foi parcialmente
revertido pelo antagonista
2
adrenérgico idazoxan.
HONG E ABBOTT (1996) relataram que a dor induzida pela noradrenalina e
-metil-5-hidroxitriptamina (-metil-5-HT), na pata de ratos, é antagonizada pela
injeção intraplantar de PRAZ e do antagonista adrenérgico não-seletivo
185
185
fentolamina, mas não pelo timolol, um antagonista adrenérgico. Contrariamente,
os autores demonstraram que a fentolamina e o PRAZ, administrados por via
intraplantar, antes da injeção de formalina atenuam a resposta comportamental
nociceptiva, na segunda fase do teste.
Segundo SHANNON E LUTZ (2000), a moxonidina, um agonista dos
receptores imidazolínicos I
1
/
2
adrenérgicos produz uma intensa antinocicepção no
teste da formalina em ratos. Neste teste sua eficácia foi equivalente à da clonidina
(CLONI) e morfina, embora sua potência tenha sido dez vezes menor que a da
CLONI. A ioimbina (IOIM), um antagonista dos receptores
2
adrenérgicos que
não se liga aos receptores imidazolínicos (PILETZ et al., 1996), antagonizou o
efeito analgésico da moxonidina mostrando que os receptores
2
adrenérgicos
possuem um papel importante na analgesia desta droga no teste da formalina.
Diante das evidências experimentais, que mostram a importância dos
receptores adrenérgicos na dor, em vários modelos de nocicepção em animais
(TSURUOKA et al., 1998; MENDES et al., 2000; SHANNON & LUTZ, 2000;
ÖNAL & SOYKAN, 2001), assim como no homem (RAJA et al., 1991;
McMAHON, 1991; TREEDE et al., 1992), resolvemos avaliar o papel do
componente simpático na antinocicepção induzida pela FLS no teste da formalina.
O pré-tratamento dos animais com o PRAZ não foi capaz de modificar o
efeito antinociceptivo da FLS em ambas as fases do teste da formalina, em
camundongos. Entretando, o mesmo bloqueou completamente a resposta
antinociceptiva da FENIL. A IOIM, apesar de reverter completamente a
antinocicepção induzida pela CLONI, não teve nenhum efeito na antinocicepção
induzida pela FLS. Estes dados mostram que, pelo menos neste modelo de dor, as
ações da FLS parecem não ser mediadas pelo sistema adrenérgico.
O teste da placa quente, assim como o tail-flick e o das contorções
abdominais, são baseados em estímulos fásicos de alta intensidade e suas respostas
nociceptivas não são duradouras. Ao contrário do tail-flick, que avalia a ocorrência
de uma resposta reflexa de integração medular, a resposta à placa quente é
decorrente de uma resposta operante de integração central. Com o intuito de
avaliarmos um possível efeito antinociceptivo da FLS sobre o SNC, utilizamos o
186
186
teste da placa quente, uma vez que o mesmo é bastante conhecido por ser sensível a
drogas que agem ao nível supraespinhal (YASKSH & RUDY, 1977).
A FLS não elevou o limiar de sensibilidade de camundongos ao estímulo
térmico (FONTENELE et al., 2001). Contudo, a morfina, usada como controle
positivo, apresentou um nítido efeito analgésico, aos 30 e 60 min após sua
administração.
A dor relacionada aos testes comportamentais utilizados para avaliar agentes
potencialmente antinociceptivos pode apresentar limitações. Ainda não está claro
que extensão de sedação ou alterações nas funções motoras pode influenciar o
resultado destes testes. ROSLAND e cols.(1990) sugere que a sedação pode reduzir
respostas motoras coordenadas, como o ato de lamber a pata. Além disso, algumas
drogas como os agonistas da adenosina, que inibem a atividade locomotora, são
capazes de mostrar efeito antinociceptivo em alguns testes (KARLSTEN et al.,
1992).
No presente estudo, a FLS não alterou o desempenho dos animais no teste do
rota-rod, nem a atividade motora e exploratória no teste do campo aberto. Contudo,
a FLS apresentou um efeito potencializador sobre a latência e sobre a duração do
tempo de sono induzido por pentobarbital. Drogas depressoras do SNC, em geral,
comportam-se desta mesma forma, entretanto drogas cuja metabolização ocorre no
fígado também podem alterar os parâmetros registrados no tempo de sono
barbitúrico, como conseqüência de uma interação farmacocinética.
Além de participarem primariamente da coagulação sanguínea e dos
fenômenos trombóticos, as plaquetas também são importantes na inflamação e em
processos alérgicos como a asma brônquica. Vários mediadores envolvidos no
processo inflamatório, também são responsáveis por alguns dos mecanismos da
agregação plaquetária. Desta forma, tendo como base a pesquisa de novos fármacos
antitrombóticos que resultaram no isolamento de muitos constituintes de plantas
com atividade antiplaquetária, e frente à atividade antiinflamatória apresentada pela
FLS, resolvemos investigar seu potencial como droga antitrombótica, assim como o
de suas chalconas lonchocarpina (LCC) e derricina (DRC), na agregação plaquetária
induzida in vitro em PRP humano por diferentes agonistas, além de avaliar seus
187
187
efeitos sobre o tempo de protrombina determinado em plasma humano e sobre o
número de plaquetas circulantes no sangue total de camundongos.
As plaquetas são discos biconvexos com dimensões variando entre 2 – 4 m
por 0,5 m, geradas pela fragmentação do citoplasma dos megacariócitos na medula
óssea, que circulam normalmente na corrente sangüínea. Estas células são os
segundos corpúsculos mais numerosos no sangue humano e normalmente circulam
em número de 150 – 450 x 10
9
/L. Estas células anucleadas possuem um tempo de
vida usualmente de 7 a 10 dias, sendo retiradas da circulação pelo sistema retículo-
endotelial ou através de sua incorporação a tampões hemostáticos (BRÜNE et al.,
1991; GEORGE, 2000). In vivo, as plaquetas atuam principalmente na manutenção
da circulação normal do sangue, preservando a integridade vascular e controlando a
hemorragia após a injúria (RUGGERI, 1994).
As plaquetas são multifuncionais e estão envolvidas em muitos processos
fisiopatológicos como hemostasia e trombose, retração do coágulo, constrição e
reparo dos vasos, inflamação incluindo promoção da aterosclerose, defesa do
hospedeiro, metástase e crescimento tumoral. Quando os vasos sangüíneos são
agregidos ou lesados, as plaquetas rapidamente respondem com uma série de
respostas funcionais que incluem adesão, mudança de forma, reações de secreção,
agregação, exposição da superfície pró-coagulante, formação de micropartículas e
retração do coágulo (RAND et al., 2003; HARRISON, 2005). Todas estas respostas
das plaquetas levam a formação do tampão hemostático que oclui o sítio da lesão e
previne a perda sangüínea.
No presente estudo, a FLS, a LCC e a DRC inibiram de forma concentração-
dependente a agregação plaquetária induzida in vitro, em PRP humano, pelos
agonista difosfato de adenosina (ADP), adrenalina (ADR), trombina (TRB),
colágeno (COL) e ácido araquidônico (AA).
Os principais agentes que ativam as plaquetas in vivo são o COL, o ADP, o
TXA
2
e a TRB além de agonistas fracos como a 5-HT e a ADR. As plaquetas
possuem receptores para todos estes agentes agregantes, assim como para o
fibrinogênio e para o fator de von Willebrand (vWF). A ativação é aumentada pela
síntese e liberação de TXA
2
, secreção de ADP e 5-HT dos grânulos densos das
188
188
plaquetas, e exposição da superfície pró-coagulante que promove a geração de TRB,
o mais potente agonista plaquetário. A secreção do conteúdo dos grânulos alfa
também é induzida e a P-selectina, uma proteína transmembrana, aparece na
superfície das plaquetas. Todos estes agentes agregantes atuam sinergicamente
(WARE et al., 1987; RAND et al., 2003). Visto que as plaquetas são muito
sensíveis e respondem rapidamente a estes agentes, sua atividade requer rigoroso
controle, o que envolve a ação de inibidores endógenos como a prostaciclina (PGI
2
)
e o óxido nítrico (NO) (RADOMSKI & MONCADA, 1993; BOS et al., 2004).
Na matrix extracelular do subendotélio da parede vascular lesada, as
plaquetas aderem ao vWF, COL e fribonectina. A interação do complexo
glicoproteína (GP) Ib/IX/V e vWF sob condições de alta força de cisalhamento
(high shear) é inicialmente transiente, mas torna-se irreversível quando o vWF liga-
se também a GPIIb/IIIa, na superficie das plaquetas. Os receptores do COL incluem
a GPIa/IIa, que possue um papel crítico na adesão, e a GPVI, cuja função na
ativação plaquetária é a formação e liberação de TXA
2
e a secreção do conteúdo dos
granulos alfa e densos das plaquetas. Como as plaquetas possuem receptores para
TXA
2
e ADP, após o dano vascular as mesmas são estimuladas a mudar sua forma,
emitir pseudópodos e formar agregados ao redor das plaquetas já aderidas (TSUJI et
al., 1999).
A agregação plaquetária requer a mudança conformacional da GPIIb/IIIa na
superfície das plaquetas para que esta integrina sirva como receptor para o
fibrinogênio e, em algumas condições, para o vWF, e ocorre quando as plaquetas
adquirem a forma esférica. A ligação de moléculas de fibrinogênio com os
receptores GPIIb/IIIa forma pontes entre plaquetas ativadas adjacentes
possibilitando a agregação. A ativação da GPIIb/IIIa é essencial para a agregação
plaquetária e depende do aumento da concentração de Ca
intracelular (DU &
GINSBERG, 1997; HERMAN, 1998).
Quando as plaquetas são estimuladas por agonistas como COL e TRB, que
induzem a secreção do conteúdo dos seus grânulos, fosfolipídeos pró-coagulantes
membranares como a fosfatidilserina, são trazidos até a superfície das plaquetas.
Micropartículas com propriedades pró-coagulantes também são formadas. A
189
189
exposição da fosfatidilserina acelera as reações de tenase e protrombinase da via da
coagulação, resultando na geração de TRB. A TRB age através da clivagem
proteolítica dos receptores ativados por proteases (PAR1) na superfície das
plaquetas, o que resulta em ativação da GPIIb/IIIa, formação de TXA
2
e secreção do
conteúdo dos grânulos das plaquetas (LANDIS et al., 2001; RAND et al., 2003). A
TRB também converte fibrinogênio em fibrina, que é formada ao redor e sobre a
massa de plaquetas agregadas, conferindo estabilidade ao tampão hemostático ou
trombo.
A formação de TXA
2
nas plaquetas ocorre quando o ácido araquidônico
(AA) é liberado, em resposta a vários estímulos fisiológicos e patológicos, a partir
dos fosfolipídeos da membrana, pela FLP A
2
ou diacilglicerol lipase (BOS et al.,
2004). Tanto o AA endógeno, liberado de plaquetas ativadas por outros agonistas,
quanto aquele adicionado às plaquetas, é metabolizado por duas vias. Uma delas
compreende a ação da enzima 12-LOX sobre o AA, com formação de 12-
hidroperoxi-ácido eicosatetranóico (12-HPETE), que é rapidamente convertido em
12-hidroxi-ácido eicosatetranóico (12-HETE). Estes dois compostos são agentes
quimiotáticos para PMN. A outra via, que resulta na formação de TXA
2
, envolve a
atuação das enzimas COX e tromboxano sintase (TXS). Inicialmente, o AA é
convertido no precursor PGG
2
, o qual é posteriormente convertido no prostanóide
PGH
2
. Ambas as reações são catalizadas pela COX, que consiste de duas isoformas
COX-1 e COX-2. A isoforma COX-1, que é constitutivamente expressa tem um
papel central na regulação de importantes funções fisiológicas, como agregação
plaquetária e função renal, enquanto a COX-2 que é induzível, possue um papel
central na inflamação (BOS et al., 2004). A seguir, a TXS promove a conversão do
intermediário instável PGH
2
em TXA
2
(BRÜNE et al., 1991). Além de ser um
potente vasoconstritor e broncoconstritor (MONCADA & VANE, 1978), o TXA
2
também é um importante mediador da reação de secreção e agregação plaquetária.
Trata-se de um composto bastante instável, que rapidamente se transforma em
TXB
2
, seu metabólito biologicamente inativo.
Estudos farmacológicos sugerem a presença de, no mínino, dois subtipos de
receptores do TXA
2
nas plaquetas: TP e TP, contudo a isoforma parece ser
190
190
bem mais abundante que a isoforma . Enquanto um deles é responsável pela
agregação e secreção, o outro responde pela alteração da forma das plaquetas e
aumento majoritário de Ca
citoplasmático (TAKAHARA et al., 1990, HABIB et
al., 1999; BOS et al., 2004).
Drogas como o ácido acetilsalicílico (AAS) que inibem a COX e a
conseqüente formação de TXA
2
, previnem a agregação plaquetária induzida por
agentes como ADP, AA, COL e TRB (HAMBERG et al., 1975; RAND et al.,
2003). Embora a FLS, a LCC e a DRC tenham inibido a agregação plaquetária
induzida in vitro por estes agentes, as mesmas quando associadas ao AAS não
modificaram significativamente o efeito inibitório desta droga nos experimentos
conduzidos na presença do agonista AA, sugerindo que a FLS, a LCC e a DRC
podem estar agindo em algum passo anterior à inibição da COX.
Quando expostos à injúria na parede vascular, diversos tipos de COL,
constituintes da região subendotelial, têm um papel importante na ativação de
plaquetas, evento que inicia o processo de reparo da lesão (CLEMETSON, 1999).
Vários receptores têm sido descritos para este agonista dentre eles estão a GPIa/IIa e
a GPVI, cujas funções já foram descritas acima.
O ADP, comparado ao COL ou a TRB, é um agonista fraco que é liberado
dos grânulos densos de plaquetas ativadas por si mesmo ou por outros agonistas
(PURI & COLMAN, 1997). Em PRP citratado, este agonista pode induzir in vitro
dois tipos de agregação: primária (incompleta e reversível), em baixas
concentrações (0,1 a 0,5 M) e secundária (irreversível), em concentrações elevadas
que variam de 2 a 5 M (RAND et al., 2003). Esta agregação secundária depende
da formação de TXA
2
, e drogas como o AAS a inibem.
A ativação plaquetária por ADP resulta em alteração da forma, agregação,
produção de TXA
2
e secreção dos grânulos. Além disso, o ADP induz a inibição da
adenilil ciclase, previamente estimulada por PGI
2
e PGE
1
, a mobilização de Ca
de
seus estoques no citoplasma, além do rápido influxo de Ca
(CUSACK &
HOURANI, 2000).
A adrenalina (ADR) apesar de ser considerada um agonista fraco, é um
importante indutor de ativação plaquetária, cuja principal função é sensibilizar as
191
191
plaquetas a outros agonistas. Em concentrações fisiológicas, a ADR é capaz de
aumentar tanto a agregação plaquetária dependente de alta força de cisalhamento
(high shear) mediada pelo vWF, como a interação plaqueta-plaqueta e plaqueta-
COL. Portanto, um papel importante da ADR na regulação da formação de trombos
sob condições de fluxo sangüíneo arterial é presumível (HJEMDAHL et al., 1994).
Níveis elevados desta catecolamina pelo fumo ou estresse, podem revestir-se de
importância fisiopatológica na ativação plaquetária (HJEMDAHL et al., 1991).
Como o COL e a TBR, a ADR também libera das plaquetas o AA, que é
metabolizado pela COX e TXS para produzir o TXA
2
. Este agente pró-agregante
aumenta os níveis de Ca
intracelular levando a exposição do receptor GPIIb/IIIa e
a liberação de ADP, 5-HT, fator plaquetário 4 e vários fatores de crescimento a
partir dos grânulos densos e/ou alfa das plaquetas (HERMAN, 1998).
Da mesma forma que o ADP, a ADR induz dois eventos independentes de
ativação plaquetária: a hidrólise de fosfatidilinositol (via FLP C, com mobilização
de Ca
citoplasmático, formação de TXA
2
e resultante agregação) e redução dos
níveis de AMPc (através da inibição de adenilil ciclase previamente estimulada por
PGI
2
ou PGE
1
). Todos os efeitos da ADR, ou seja, agregação ou potencialização da
agregação induzida por outros agonistas e inibição da adenilil ciclase, são mediados
através da ativação de receptores
2
adrenérgicos presentes nas plaquetas (YUN-
CHOI et al., 2000). Os receptores adrenérgicos das plaquetas humanas são
exclusivamente do subtipo
2A
(MUSTONEN et al., 2000) e antagonistas
adrenérgicos como a ioimbina e fentolamina inibem estas ações da ADR. As
plaquetas humanas também possuem receptores adrenérgicos do tipo
2
, que ao
contrário dos receptores
2
adrenérgicos, são acoplados a estimulação da adenilil
ciclase e respondem pela inibição da função plaquetária (HJEMDAHL et al., 1991).
A liberação de NO, a partir da L-arginina (L-ARG), pelo endotélio vascular,
constitui um poderoso mecanismo de inibição da adesão, agregação e desagregação
de plaquetas in vivo e in vitro (RADOMSKI & MONCADA, 1993), além de
aumentar a expressão do receptor de fibrinogênio (GPIIb/IIIa) ativado
(MICHELSON et al., 1996). Esta molécula atua como um potente inibidor da
agregação plaquetária em resposta a vários agonistas, via ativação da guanilil
192
192
ciclase solúvel, que leva ao aumento dos níveis intracelulares de GMPc (ANFOSSI
et al., 1999).
O aminoácido L-ARG, por ação da NO sintase (NOS), fornece o átomo de
nitrogênio guanidino terminal necessário para a síntese de NO. Até o momento, três
isoformas da NOS foram identificadas: a NOSn (neuronal), NOSe (endotelial) e a
NOSi (induzível) (FORSTERMANN & KLEINERT, 1995). A NOSn é uma
isoforma constitutiva, dependente de Ca
/Calmodulina que libera NO por curto
período de tempo, em resposta a estimulação de receptor. A NOSi é encontrada em
macrófagos e PMN ativados e sua ativação independe de Ca
. Uma vez expressa, a
mesma sintetiza NO por períodos de tempo prolongados (MONCADA & HIGGS,
1991). Ambas as enzimas são inibidas in vivo e in vitro por análogos da L-ARG,
como o L-NAME e L-NMMA. Alguns estudos demonstraram a presença de
isoformas de NOSe induzível e constitutiva em plaquetas humanas (MEHTA et al.,
1995; SASE & MICHEL, 1995; CHEN & MEHTA, 1996).
Em indivíduos saudáveis, a infusão sistêmica de L-ARG produz inibição da
agregação plaquetária (BODE-BOGER et al., 1994), enquanto a infusão de L-
NMMA resulta em aumento da resposta das plaquetas à vários agonistas
(BODZENTA-LUKASZYLE et al., 1994). Contudo, tais estudos não permitem a
separação dos efeitos do NO derivado do endotélio ou daquele sintetizado pelas
plaquetas.
Diversos trabalhos demonstram que a agregação de plaquetas humanas
induzida in vitro em resposta ao COL, ADP e outros agonistas, é inibida, via
aumento de GMPc, pela pré-incubação com L-ARG e aumentada pela pré-
incubação com L-NAME e L-NMMA, sugerindo o envolvimento do NO derivado
de plaquetas no controle da função plaquetária (RADOMSKI et al., 1990;
MARIETTA et al., 1997; ANFOSSI et al., 1999; YOSHIMOTO et al., 1999).
O efeito da associação da L-ARG com a FLS, LCC ou DRC foi estudado in
vitro, em PRP humano, na agregação plaquetária induzida por ADP. O efeito
inibitório da FLS, LCC ou DRC não foi modificado de forma significativa pela L-
ARG, evidenciando que estas substâncias possivelmente não atuam através da
ativação da guanilil ciclase e aumento dos níveis de GMPc.
193
193
Além do GMPc, outro importante nucleotídeo cíclico, o AMPc, modula a
função plaquetária. Uma elevação nos níveis de nucleotídeos cíclicos (AMPc e
GMPc), pela ativação da adenilil ou guanilil ciclase ou pela inibição da
fosfodiesterase (FDE), constitui a via inibitória mais potente para regular a ativação
plaquetária, visto que ambos inibem a adesão e agregação induzida por diferentes
agonistas, assim como a secreção do conteúdo dos grânulos das plaquetas
(RADOMSKI et al., 1987; LIAO et al., 1998). Segundo HERSTRUP e cols (1994),
ambos AMPc e GMPc estão envolvidos em respostas plaquetárias como agregação,
secreção de ATP, fosforilação de proteínas, mobilização de Ca
intracelular e
ativação da GPIIb/IIIa. Os níveis de nucleotídeos cíclicos são mantidos pelo
balanço entre a taxa de síntese pela adenilil ou guanilil ciclase ou pela taxa de
hidrólise pela FDE de nucleotídeos cíclicos.
A pentoxifilina (PTX), é uma metilxantina, usada no tratamento de doenças
vasculares periféricas. Este efeito benéfico da PTX parece ser exercido através da
inibição da agregação e desagregação plaquetária in vitro e in vivo (NENCI et al.,
1981; SIDOROVA et al., 1991; DE LA CRUZ et al., 1993). Um aumento nos
níveis de AMPc nas plaquetas (via inibição da FDE) e um aumento na síntese de
PGI
2
pelo endotélio vascular parecem ser os mecanismos pelos quais a PTX
promove a inibição da agregação plaquetária (BERKENBOOM et al., 1991). A
associação da PTX à FLS, LCC e DRC aumentou significantemente o efeito
inibitório das mesmas sobre agregação induzida por ADP, sugerindo que a FLS,
LCC e DRC podem estar exercendo seus efeitos através da inibição da FDE e
aumento dos níveis de AMPc e/ou GMPc. Recentemente, inibidores específicos
para as isoformas de FDE têm sido desenvolvidos para uso terapêutico (OHBA et
al., 2001). Visto que os dados do presente trabalho mostram que a FLS, LCC e
DRC inibem a agregação plaquetária, provavelmente através de mecanismos que
envolvem a inibição da FDE e aumento nos níveis de AMPc e GMPc, ou ainda pela
inibição da formação de TXA
2
, é possível que após estudos posteriores estas
substâncias possam ser utilizadas profilaticamente ou terapeuticamente em
desordens tromboembólicas.
194
194
A produção de fibrina por meio das vias extrínseca e comum da coagulação
requer tromboplastina tecidual (fator tissular, TF) e fator VII, além de fator X, fator
V, protrombina e fibrinogênio. Estas vias são avaliadas quantitativamente pelo
tempo de protrombina (TP), no qual o plasma é recalcificado na presença de
excesso de TF. Este teste não requer ativação de contato e independe da via
intrínseca e dos fatores envolvidos na mesma. Uma vez que o TF contém
fosfolipídeos que agem como “substitutos plaquetários”, o teste não é afetado pelo
número de plaquetas. Dos cinco fatores de coagulação cuja atividade influencia o
TP: V, VII, X, II e fibrinogênio, três fatores são dependentes de vitamina K e
podem estar diminuídos quando o paciente faz uso de drogas cumarínicas. Dessa
forma, o TP é o melhor teste para avaliar a eficiência da anticoagulação oral. O TP
nomalmente está prolongado quando a quantidade de qualquer destes fatores cai
abaixo de 10% do normal, sendo mais sensível à deficiência dos fatores VII e X que
as deficiências de protrombina e fibrinogênio. Várias técnicas modificadas e
tromboplastinas têm sido utilizadas para aumentar a utilidade do TP na
monitorização da anticoagulação oral. A expressão do TP como uma porcentagem
não é recomendada, uma vez que há grande variação nas curvas de diluição
utilizadas. A utilização do INR (International Normalized Ratio) é recomendada.
(RODGERS & BITHELL, 1998).
O presente trabalho também avaliou o efeito da FLS, LCC e DRC no TP, in
vitro, em plasma humano. Entretanto, nenhuma das três substâncias foi capaz de
modificar o TP. Da mesma forma, a FLS, LCC e DRC administradas por via
sistêmica, também não modificaram o número de plaquetas circulantes, em sangue
total de camundongos.
195
195
Conclusões
196
196
7 CONCLUSÕES
A investigação realizada com a fração hexânica de Lonchocarpus sericeus
(FLS) e suas chalconas lonchocarpina (LCC) e derricina (DRC), nos permite
concluir que:
A administração aguda da FLS pelas vias oral e intraperitoneal em
camundongos, mostrou sinais de toxicidade elevada, além de mortes;
A FLS e a DRC, mas não a LCC, são citotóxicas para o
desenvolvimento dos ovos de ouriço-do-mar Lytechinus variegatus,
possivelmente pelo bloqueio da síntese de DNA e/ou de proteínas;
A FLS, LCC e DRC mostraram elevada citotoxicidade sobre o
crescimento de células de leucemia linfocítica de origem humana;
A FLS, LCC e DRC não apresentaram atividade antimicrobiana
contra Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Candida albicans;
A administração sistêmica da FLS não mostrou atividade no edema
de pata induzido por dextrano, o que nos permite concluir que a
mesma parece não agir como antagonista específico de receptores
histaminérgicos e/ou serotoninérgicos, não interromper processos
neuro-humorais, e também não possuir ação vasoativa direta;
A administração sistêmica da FLS também não mostrou atividade no
edema de pata induzido por bradicinina, indicando que a mesma
provavelmente não age ao nível de receptores B
1
e B
2
ou ainda, não é
capaz de antagonizar diretamente os efeitos da bradicinina;
197
197
A administração da FLS, por via i.p., promoveu uma inibição do
edema por levedura de cerveja logo na primeira hora, o que
evidencia uma possível inibição da síntese e/ou liberação de LTs
pois estes últimos estão intimamente associados ao desenvolvimento
inicial deste tipo de edema;
A atividade inibitória da FLS, sobre o edema de pata induzido por
carragenina, parece ser independente da inibição da COX e/ou
liberação de PGs, ou ainda do bloqueio das ações do NO ou de suas
enzimas geradoras. Contudo, esta atividade da FLS parece ser
exercida através da inibição da fosfodiesterase (FDE) e/ou da síntese
e liberação de citocinas inflamatórias como o TNF-, uma vez que o
efeito antiedematogênico da FLS, neste modelo, foi potencializado
pela pentoxifilina, um inibidor da síntese de TNF-;
O bloqueio da migração de neutrófilos pela FLS, parece ser
multimediado e pode envolver a inibição da síntese e/ou liberação de
mediadores inflamatórios como PGs, LTs e citocinas ou, uma
possível inibição de uma das etapas da migração de neutrófilos ou
ainda, o bloqueio de alguma das molécula de adesão envolvidas
neste processo;
Apesar da atividade antiinflamatória demonstrada pela FLS, a
mesma, nas doses testadas, não foi capaz de inibir a formação do
tecido de granulação, induzida por irritante físico, onde as PGs
desempenham um papel essencial;
198
198
A FLS também manifestou sua atividade antiinflamatória através da
redução do dano tissular induzido por ácido acético em ratos,
evidenciado através de seu efeito inibitório sobre a atividade da
MPO;
A FLS inibiu de forma significativa e dose-dependente a nocicepção
em diversos modelos experimentais de dor em camundongos, sem
contudo modificar a resposta nociceptiva ao estímulo térmico no
teste da placa quente;
O mecanismo de ação analgésica da FLS provavelmente não envolve
a participação de receptores opióides, do sistema NO ou do
componente adrenérgico. Entretanto, além de outros mecanismos, a
inibição da FDE e/ou a inibição da síntese de citocinas como o TNF-
parecem desempenhar um papel importante no mecanismo de
antinocicepção da FLS;
A FLS não altera o desempenho dos animais no teste do rota-rod,
nem a atividade motora e exploratória no teste do campo aberto;
A FLS parece possuir propriedade sedativa ou interagir
farmacocineticamente com o pentobarbital, visto que sua
administração sistêmica potencializa o tempo de sono induzido por
este barbitúrico;
A FLS, LCC e DRC inibem de forma significativa e concentração-
dependente, a agregação plaquetária induzida in vitro por ADP,
TRB, COL, AA e ADR, em PRP humano. Provavelmente, a FLS,
LCC e DRC atuam em alguma etapa do processo de ativação
plaquetária, comum a todos estes agentes agregantes;
199
199
Como a FLS, LCC e DRC não alteraram a resposta das plaquetas à
L-ARG ou ao AAS, suas ações parecem não ser exercidas via
ativação da guanilil ciclase e conseqüente aumento dos níveis
citoplasmáticos de GMPc ou, através da inibição da COX,
respectivamente;
Visto que o efeito inibitório da FLS, LCC e DRC, na agregação
plaquetária induzida por ADP, foi potencializado pela PTX, seu
mecanismo de ação parece envolver provavelmente a inibição da
FDE com conseqüente aumento nos níveis de AMPc;
A FLS, LCC e DRC, administradas por via sistêmica, não
modificam o número de plaquetas circulantes, em sangue total de
camundongos, nem o tempo de protrombina em plasma humano;
Os dados obtidos no presente trabalho demonstram que a FLS possui
atividade citotóxica, antiinflamatória, analgésica e antiagregante
plaquetária. Estes efeitos parecem ser mediados, em grande parte,
pelas chalconas LCC e DRC presentes na FLS.
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