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ANA LÚCIA VAZQUEZ VILLA
Produção e aplicação de peptídeos de
hidrolisado de penas de frango na cosmética
capilar
OUTUBRO 2008
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II
ANA LÚCIA VAZQUEZ VILLA
Produção e aplicação de peptídeos de hidrolisado de penas de
frango na cosmética capilar
Tese de Doutorado apresentada ao programa de
Pós-graduação em ciências (Microbiologia),
Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como
parte dos requisitos necessários a obtenção do
título de Doutor em Ciências Biológicas
(Microbiologia).
Orientadoras: Alane Beatriz Vermelho
Elisabete Pereira dos Santos
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE MICROBIOLOGIA PROF PAULO DE GÓES
RIO DE JANEIRO
OUTUBRO 2008
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III
Produção e aplicação de peptídeos de hidrolisado de penas de
frango na cosmética capilar
ANA LÚCIA VAZQUEZ VILLA
Orientadoras: Alane Beatriz Vermelho
Elisabete Pereira dos Santos
Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências
Biológicas (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof Paulo de Góes,
Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (Microbiologia).
Aprovada por:
Presidente, Profa. Dra Alane Beatriz Vermelho / UFRJ
Profa. Dra Mônica Freiman de Souza Ramos / UFRJ
Prof. Dr. Robson Roney Bernardo / Universidade Estácio de Sá
Profa. Dr. Ulysses Casado Lins / UFRJ
Prof. Dra. Rosalie Reed Rodrigues Coelho / UFRJ
Rio de Janeiro
Outubro/2008
IV
FICHA CATALOGRÁFICA
Villa, Ana Lúcia Vazquez
Produção e aplicação de peptídeos de hidrolisado de penas de frango na
cosmética capilar / Ana Lúcia Vazquez Villa– Rio de Janeiro, 2008
X, 119
Tese [Doutorado em Ciências (Microbiologia)]
Universidade Federal do Rio de Janeiro / Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de
Góes, 2008.
Orientadoras: Alane Beatriz Vermelho e Elisabete Pereira dos Santos
Referências bibliográficas:f 101-118
1. Queratina 2. Cabelo 3. Penas de frango 4. Queratinase 5. Peptídeos 6.
Cosméticos I. Vermelho Alane. II. UFRJ, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de
Góes, Doutorado em Ciências (Microbiologia). III. Produção e aplicação de
peptídeos de hidrolisado de penas de frango na cosmética capilar.
V
“QUEM PASSA EM NOSSA VIDA NÃO PASSA POR ACASO, DEIXA UM POUCO DE SI
E LEVA UM POUCO DE NÓS...”
Dedico esta tese à minha família,
especialmente ao meu marido.
VI
Agradecimentos
Primeiramente a Deus, pois sem Ele, nada disso seria possível.
Ao meu marido, José de Souza Villa, pelo carinho, apoio, compreensão e pela
força de me fazer seguir em frente.
Às Prof
as
Alane e Elisabete minhas orientadoras, por propiciar o meu
desenvolvimento científico, profissional e pessoal. Obrigada pelo carinho, força e
paciência de vocês.
À Prof
a
Marta Helena e seus alunos de iniciação e pós graduação, pelo incentivo,
pela força, pela energia positiva e pelo carinho. Obrigada!!
Ao Prof Ulysses e seus colaboradores do laboratório de microscopia eletrônica do
IMPPG, pela ajuda prestada em parte desta tese, com as imagens de microscopia
eletrônica das hastes capilares.
Às meninas do laboratório, em especial, Ana Maria, Sabrina, Ana Cristina e
Edilma, sem esquecer o 5° elemento, Alice (filha de Edilma), que me ajudaram, com sua
sabedoria e com seu apoio, desde o início deste trabalho. Muito obrigada meninas, vocês
são demais!!
Não posso esquecer das que vieram depois: Bárbara, Thalita, Ana Carolina, Ingrid,
Fabíola e a transloucada da Denise, pelo apoio técnico, emocional e pela alegria de
vocês. Sem isso não chegaria aqui. Adoro vocês todas, de coração!
À minha amiga Izabel, de Bariri, que conheci no curso de pós graduação em
Gestão da Cosmetologia, em São Paulo, por acreditar em nosso trabalho e no futuro
torná-lo realidade. Obrigada, amiga!
À minha aluna Márcia, que ajudou muito na realização de parte desta tese.
À CAPES pelo financiamento do Projeto e a Universidade Estácio de Sá, pelo
amadurecimento do saber.
Muito obrigado a todos que participaram direta ou indiretamente deste trabalho.
VII
Produção e aplicação de peptídeos de hidrolisado de penas de frango na
cosmética capilar
Tese de Doutorado de Ana Lúcia Vazquez Villa
Oritentadoras: Prof
as
Dras. Alane Beatriz Vermelho e Elisabete Pereira dos Santos
Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes – Centro de Ciências da Saúde
UFRJ – Rio de Janeiro - Brasil
Resumo
As fibras capilares são constituídas principalmente por queratina em α - hélice
formando um polímero contendo cadeias polipeptídicas arranjadas em paralelo, ligadas
por ligações do tipo hidrogênio, salina e pontes dissulfeto entre os aminoácidos cisteína
(cistina). Esta estrutura confere resistência a agentes físicos e a degradação química e
enzimática. O córtex é a massa principal da fibra capilar. Revestindo esta estrutura se
encontra uma camada protetora de células queratinizadas denominada cutícula. A maioria
dos produtos cosméticos com a finalidade de melhorar a hidratação, a emoliência ou a
restauração das fibras capilares danificadas apresenta em sua formulação algum
hidrolisado de proteína, animal ou vegetal.
Este trabalho tem como objetivo a obtenção e a aplicação de hidrolisados de penas
de frango. Os peptídeos de queratina foram obtidos por hidrólise enzimática através de
queratinases. Para obtenção dos hidrolisados de queratina utilizou-se o Bacillus subtilis
cepa AMR. Os microrganismos cresceram em meio de penas - PBS pH 8,0 (1 % de
penas) suplementado com 0,01% de extrato de levedura, durante 5 dias a 28°C com
agitação. Os sobrenadantes dos meios de cultura foram coletados por centrifugação e
ultrafiltrados em um sistema AMICON usando nano-membranas (Millipore – YC05), a fim
de obter peptídeos de 0.5 e 1 kDa. Proteínas, peptidases e peptídeos foram analisados,
respectivamente, por análises em SDS-PAGE, zimografias e HPTLC. Preparações
comerciais dos hidrolisados de queratina foram usados como padrões comparativos.
Peptídeos com massa molecular ≤ a 500 Dalton foram incorporados em duas bases
cosméticas: um xampu suave e um creme rinse com enxágüe, ambos contendo 10% dos
peptídeos. Estes produtos foram aplicados em mechas de cabelos virgem e quimicamente
tratados, previamente lavados e desengordurados com xampu de lauril éter sulfato de
sódio 2%. As mechas foram submetidas ao tratamento com o xampu suave e creme rinse,
durante 5 semanas, aplicados em intervalos de 24 hs e a secagem natural e com calor
seguida de placa térmica de 180°C, com a finalidade de avaliar o grau de hidratação das
fibras capilares. Os ensaios de medição de hidratação foram realizados em aparelho
CORNEOMETHER, a cada 7 dias. A Análise de Variância ANOVA foi utilizada para
avaliar estatisticamente o teor final de hidratação na estrutura capilar. Avaliação sensorial
e microscopia eletrônica de varredura também foram utilizadas para avaliar a melhora na
hidratação capilar.
Nossos resultados mostraram que o processo de ultrafiltração concentrou os
peptídeos de queratina. Análise por HPTLC mostrou um perfil similar entre os hidrolisados
enzimáticos e os comerciais. As enzimas e proteínas foram analisadas por zimografia e
SDS-PAGE, respectivamente, e as peptidases apresentaram atividade com o substrato
gelatina e queratina. Com relação à medição de hidratação, avaliação sensorial e
microscopia eletrônica, nossos resultados mostraram um aumento significativo na
hidratação, principalmente com o uso do calor, que possivelmente facilitou a entrada ou a
aderência dos peptídeos ao fio e também a preferência das avaliadoras, e a microscopia
mostrou presença de material orgânico na superfície capilar, sugerindo uma melhora na
restauração capilar.
VIII
Production and application of peptides of chicken feather keratin in the
hair care cosmetic
Abstract
The hair fibers are constituted mainly by keratin in α - helix forming a polymer
containing polypeptide chains arranged in parallel, linked by hydrogen, salt and disulfide
bonds (cystine). This structure confers resistance to physical agents, chemical and
enzymatic degradation. The cortex is the main material component of the hair fiber.
Covering all the structure a protective layer of keratinized cells called cuticle is found. The
majority of the cosmetic products with the purpose to improve the hydration, the smooth or
the restoration of damaged hair fibers present in its formulation some animal or vegetal
protein hydrolysate.
This work has as objective the production and the application of hydrolysates of
chicken feathers. The keratin peptides were obtained by enzymatic hydrolysis through
keratinases. For production of the hydrolysates a Bacillus subtilis strain AMR was used.
The microorganism grown on feather - PBS medium, pH 8.0 (1% feathers) supplemented
with 0,01% of yeast extract, during 5 days, 28°C with agitation. The supernatants of culture
media were collected by centrifugation and ultrafiltered in an AMICON system using nano–
membranes (Millipore – YC05) in order to obtain peptides of 0.5 and 1 kDa. The Proteins,
peptidases and peptides were analyzed using SDS-PAGE, zymograns and HPTLC
respectively. Commercial preparations of keratin hydrolysates were used as comparative
standard.
Peptides with a molecular mass ≤ to 500 Dalton were incorporated into two
cosmetic bases: one mild shampoo and a cream rinse with rinses, both containing 10% of
the peptides. These products had been applied in chemically treat and virgin hair,
previously washed and taken away the fat with shampoo of laureth sodium sulfate 2%.
Hairs had been submitted to the treatment with mild shampoo and cream rinse, during 5
weeks, applied in the hair at 24 hs intervals and the naturally dryed and drying with
followed heat of thermal plate of 180°C, with the purpose to evaluate the degree of
conditioning of hair fibers. The assays of measurement of hydration had been carried
through in device CORNEOMETHER, to each 7 days. The Analysis of Variance ANOVA
was used to statistical evaluation of the final hydration of the hair structure. Sensorial
evaluation and electronic microscopy of sweepings had been also used to evaluate the
improvement in the hair conditioning.
Our results showed that the ultrafiltration process concentrated the keratin peptides
bases on protein measurement. The HPTLC analysis showed a similar profile between the
enzymatic hydrolysate and the commercial samples. The enzymes and proteins retained
on AMICON membranes were analyzed by zymography and SDS-PAGE respectively and
the peptidases present activity with substrate gelatin and keratin. With regard to the
measurement of hydration, sensorial evaluation and with electronic microscopy, our results
had shown a significant increase in the hydration, mainly with the use of the heat, that
possibly facilitated to the entrance or the tack of the peptides to the wire and also the
preference of the hairdressers, and the microscopy showed a presence of organic material
in the hair surface, suggesting an improvement in the restoration of the hair.
IX
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
IF = filamentos intermediários
kDa ou Da= kiloDalton ou Dalton
KAP ou IFAP = filamentos associados às proteínas
nm = nanômetro
CMC = complexo de membrana celular
- NH = amino
- CO = carboxila
PMSF = fluoreto de fenilmetanosulfonil
DFP = diisopropilfluorofosfato
EGTA = ácido etilenoglico-bis-(β-amino-etil éter) N, N’ -tetracético
EDTA = ácido etileno-diamino tetracético
rpm = rotações por minuto
KCl = cloreto de potássio
PBS = tampão fosfato
SDS-PAGE = sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel eletrophoresis
V = volts
DMSO = dimetilsulfóxido
HPTLC = high performance thin layer chromatography
MALDI-TOF = matrix assisted laser desorption/ionization – time of flight
TFA = ácido trifluoroacético
ACN = acetonitrila
UV = ultravioleta
COLIPA = The European Cosmetic Toiletry and Perfumery Association
GRAS = Generally recognized as safe
X
ÍNDICE
Introdução..................................................................................................... 15
1. Queratinas................................................................................................ 15
1.1. Conformação.................................................................................... 16
1.1.1. α - Queratina.............................................................................
17
1.1.2. β - Queratina.............................................................................
18
2. Fibra capilar: estrutura.............................................................................. 18
2.1. Cutícula e CMC................................................................................ 20
2.2. Córtex............................................................................................... 23
2.3. Medula............................................................................................. 27
3. Filamentos Intermediários de Queratina ................................................. 27
4. Tipos de cabelos humanos...................................................................... 36
4.1. Composição de aminoácidos do cabelo.......................................... 39
5. Estrutura das penas de frango................................................................. 40
5.1. Composição de aminoácidos das penas......................................... 45
6. Enzimas proteolíticas: peptidases............................................................ 46
6.1. Queratinases................................................................................... 51
7. Aplicações de queratinases e hidrolisados de queratina em cosméticos 55
Objetivos...................................................................................................... 58
Materiais e métodos.................................................................................... 60
1. Preparo das penas de frango................................................................... 60
2. Microrganismo e condições de cultura.................................................... 60
3. Obtenção dos hidrolisados de queratina.................................................. 61
4. Análise dos hidrolisados de queratina..................................................... 61
4.1. Gel de Eletroforese (SDS-PAGE).................................................... 61
4.2. Zimografias com gelatina e queratina.............................................. 62
4.3. Cromatografia em camada fina – HPTLC........................................ 62
4.4. Espectrometria de Massa (MALDI-TOF).......................................... 63
5. Proposta de uma formulação cosmética contendo hidrolisado de
queratina......................................................................................................
64
5.1. Aplicação e avaliação cosmética..................................................... 66
XI
6. Microscopia eletrônica de varredura........................................................ 69
Resultados................................................................................................... 71
1. Microrganismo e condições de cultivo..................................................... 71
2. Análise dos peptídeos de queratina........................................................ 72
2.1. Análise do hidrolisado bruto por MALDI-TOF................................. 72
2.2. Cromatografia em camada fina – HPTLC........................................ 73
2.3. Gel de eletroforese e Zimografia com gelatina e queratina............. 75
3. Formulação e aplicação cosmética.......................................................... 79
4. Microscopia eletrônica de varredura........................................................ 84
Discussão..................................................................................................... 88
Conclusão..................................................................................................... 99
Referências bibliográficas............................................................................ 101
XII
LISTA DE TABELAS
N° Pág.
1. Nomenclatura revisada das queratinas humanas incluindo as
queratinas do cabelo humano tipo I e II .............................................
33
2. Sequências características das KAPs humanas ................................ 36
3. Distribuição dos diferentes tipos de cabelos nos países .................... 37
4. Composição dos aminoácidos do cabelo ........................................... 40
5. Composição química das penas......................................................... 45
6. Composição de aminoácidos de pena................................................ 46
7. Teor de hidratação obtido por cada tipo de cabelo em unidades
arbitrárias ............................................................................................
79
XIII
LISTA DE FIGURAS
N° Pág.
1. Duas unidades de cisteína, formando a cistina .................................... 16
2.
Estrutura em hélice da α - queratina (40-70 KDa) ................................
17
3.
Estrutura pregueada da β - queratina (11 – 14,5 KDa) .........................
18
4. Estrutura geral da fibra do cabelo mostrando os microcomponentes.... 19
5. Esquema dos componentes do cabelo em microscopia de varredura.. 20
6. Imagem de microscopia de varredura mostrando a fibra capilar .......... 22
7. Imagem de um polimorfismo observado na organização das
macrofibrilas...........................................................................................
23
8. A. Microscopia de transmissão de cortes transversais do cabelo ........ 25
B. Os diferentes níveis de ondulamento ............................................... 25
9. Estrutura da fibra de queratina em diferentes aumentos....................... 26
10. Micrografia eletrônica mostrando a medula........................................... 27
11. Esquema comparativo dos elementos do citoesqueleto........................ 29
12.
Domínios da α - queratina.....................................................................
31
13. Classificação dos filamentos intermediários e sua estrutura ............... 32
14. A. Representação esquemática da expressão das queratinas de
cabelo e epiteliais presentes no folículo capilar ....................................
35
B. Representação da fibra capilar formada com a distribuição do tipo
de queratinas em sua estrutura ............................................................
35
15. Distribuição dos oito tipos de cabelo da nova divisão dentro de seis
diferentes populações............................................................................
38
16. Estrutura química da queratina.............................................................. 39
17. Diferentes tipos de penas de frango ..................................................... 41
18. Morfologia de uma pena de contorno.................................................... 42
19. Componentes da pena.......................................................................... 42
20.
Pontes de hidrogênio formadas na estrutura β - pregueada ...............
43
21.
Arranjo dos filamentos de β - queratina.................................................
44
22. Classificação das peptidases quanto ao local de clivagem na proteína 47
XIV
23. Degradação da queratina pelo mecanismo enzimático......................... 54
24. Fluxograma da metodologia empregada .............................................. 68
25. Meio de cultivo de B. subtilis AMR ....................................................... 71
26. Espectro de massa do sobrenadante de cultura do B. subtilis AMR
em meio de penas após 120 h de cultivo .............................................
72
27. Espectro de massa dos hidrolisados de queratina da preparação
comercial 1............................................................................................
73
28. HPTLC dos hidrolisados de queratina de penas por degradação
microbiana ............................................................................................
74
29. SDS-PAGE dos hidrolisados de queratina comercial e filtrado em
AMICON.................................................................................................
76
30. SDS-PAGE do material retido e filtrado pela membrana de 1 KDa
pelo processo de ultrafiltração em AMICON ........................................
77
31. Zimografia com gelatina e queratina do sobrenadante de Bacillus
subtilis em penas ..................................................................................
77
32. Zimograma de gelatina do material retido e filtrado pela membrana de
1KDa (A) e de queratina (B) .................................................................
78
33. Avaliação da hidratação para as mechas secas sem calor
(temperatura ambiente) ........................................................................
80
34. Avaliação da hidratação para as mechas secas com calor e placa
térmica ..................................................................................................
81
35. Gráfico dos resultados da análise sensorial para o grupo de mechas
secas sem calor (temperatura ambiente) .............................................
83
36. Gráfico dos resultados da análise sensorial para o grupo de mechas
secas com calor e placa térmica ..........................................................
83
37. Microscopia eletrônica de uma fibra capilar da amostra 0 ................... 84
38. Imagem de uma fibra capilar de cabelo alisado e com tintura
(amostra A) ...........................................................................................
85
39. Imagem de uma fibra capilar de cabelo descolorido (amostra B) ......... 86
40. Imagem de uma fibra capilar de cabelo tingido (amostra C) ............... 87
15
INTRODUÇÃO
1. QUERATINAS
As queratinas são proteínas estruturais fibrosas e insolúveis que fazem parte
do tecido epidérmico e seus apêndices, sendo a principal constituinte de penas, lã,
escamas, cabelos, pele, cascos e unhas (VIGNARDET et al., 2001, GUPTA &
RAMNANI, 2006). Apresentam estabilidade mecânica e não são degradadas por
peptidases como a papaína, pepsina e tripsina (IGNATOVA et al.,1999). A
estrutura estável e rígida e a baixa solubilidade deve-se à presença de alto teor de
unidades de cistina formando pontes dissulfeto intra- e inter-cadeia (Figura 1). A
formação destas pontes ocorre pela oxidação dos grupos SH de duas moléculas
do aminoácido cisteína, que podem tomar parte de cadeias polipeptídicas
adjacentes (SCHROOYEN et al., 2001).
As pontes dissulfeto são também responsáveis pela resistência geral das
queratinas as temperaturas elevadas. Além dessas pontes também há a presença
de ligações tipo hidrogênio, interações hidrofóbicas e iônicas, dentre outras
interações, que resultam na estabilização da molécula. Devido à grande
quantidade de pontes dissulfeto e de aminoácidos hidrofóbicos, as queratinas são
insolúveis em solventes polares, como a água, assim como em solventes apolares
(SCHROOYEN et al., 2001).
16
Fig 1. Duas unidades de cisteína, formando a cistina (SCHROOYEN et al., 2001).
.
1.1. CONFORMAÇÃO
Quanto à conformação estrutural, as queratinas podem ser classificadas em
α-queratina e β-queratina e podem ser classificadas em macias e duras
dependendo do seu teor de cistina. O termo queratina ”dura” tem sido usado para
descrever as proteínas do cabelo e lã, por exemplo, e possui um teor de cistina
maior, enquanto o termo queratina “macia” é usada para denominar as proteínas
fibrosas da epiderme como a citoqueratina (VIGNARDET et al., 2001; GUPTA &
RAMNANI, 2006). Estas possuem um teor de cisteína de 3% e de glicina de 12%,
cisteína
cistina
17
enquanto as do tipo duro, presentes nos cabelos e unhas, possuem um teor mais
alto de cisteína (7,6%) e mais baixo de glicina (FRASER, MACRAE & ROGER,
1972; YU et al., 2002).
1.1.1. α-Queratina
Na α-queratina predominam segmentos em α-hélice, formando uma
estrutura bastante rígida (VIGNARDET et al., 2001). Pertencem à superfamília dos
filamentos intermediários e são encontradas em cabelos, unhas, pêlos, lã e pele
(figura 2). Os filamentos de citoqueratina compõem o citoesqueleto de células
epiteliais. Cada tipo de epitélio sempre expressa uma combinação específica de
queratina do tipo I e II. Outras proteínas fibrosas como, por exemplo, colágeno,
fibroína da seda, actina e miosina, desempenham um papel estrutural em tecidos
e em células animais (YAMADA, WIRTZ & COULOMBE, 2002).
Fig. 2 Estrutura em hélice da α- queratina (40-70kDa) (YAMADA, WIRTZ &
COULOMBE, 2002).
18
1.1.2. β-Queratina
A β-queratina possui a queratina na conformação β- pregueada (Gupta &
Ramnani, 2006) e são encontradas em repteis e aves (penas, garras, bicos e
escamas). As interações entre os filamentos determinam as propriedades
estruturais e mecânicas dos polímeros de queratina (YAMADA, WIRTZ &
COULOMBE, 2002, BRUSH, 1996). A figura 3 mostra a conformação da β-
queratina.
Fig.3: Estrutura pregueada da β- queratina (11-14,5 kDa) (YAMADA, WIRTZ &
COULOMBE, 2002).
2. FIBRA CAPILAR: ESTRUTURA
Basicamente a fibra capilar é composta por uma cutícula que é a camada
mais externa e o córtex. As células corticais são formadas por macrofibrilas e
material intermacrofibrilar. As macrofibrilas consistem em microfibrilas e pela
matriz intermicrofibrilar. As microfibrilas são os filamentos intermediários
denominados IF, IFP ou ainda KP (“keratin protein“). A matriz intermicrofibrilar é
19
formada pelas proteínas associadas aos filamentos denominadas IFAP ou KAP. A
matriz, também contém algum conteúdo de núcleo e membrana. O pigmento
(melanina) é formada pelos melanócitos que estão no córtex. Em cabelos grossos
existem cavidades cheias de ar feitas por tipos especiais de células que forma a
medula central. A figura 4 mostra as distribuições dos microcomponentes na fibra
e a figura 5 representa as principais estruturas da fibra capilar (MOLL &
LANGBEIN, 2008).
Fig. 4: Estrutura geral da fibra do cabelo mostrando os microcomponentes (MOLL
& LANGBEIN, 2008).
20
Fig. 5: Esquema dos componentes do cabelo em microscopia de varredura
mostrando a fibra capilar, cutícula, córtex e medula (A) e um esquema gráfico
mostrando a fibra capilar em um corte longitudinal e transversal com seus
componentes (B) (MOLL & LANGBEIN, 2008).
2.1. CUTÍCULA E CMC
A cutícula é formada por 6 a 10 camadas de células em forma de lâminas
(escamas). Devido ao modo como as células se sobrepõem, somente 1/6 das
A
B
21
mesmas ficam expostas na superfície do cabelo. Sua principal função é formar
uma barreira protetora, contra as agressões naturais externas e agentes químicos.
A cutícula corresponde a 10% do peso da fibra capilar (FEUGHELMAN, 2002).
Cada célula cuticular possui 4 camadas com diferentes conteúdos de
pontes dissulfeto e ligações polipeptídicas (figura 6): 1- a epicutícula é a mais
externa com aproximadamente 5 nm com uma membrana resistente hidrofóbica.
Esta membrana contém proteínas (80%), lipídeos (5%) e é quimicamente
resistente aos álcalis, ácidos, enzimas, agentes redutores e oxidantes; 2- Logo
abaixo da epicutícula está uma camada rica em cistina (aproximadamente 30%) e
quimicamente resistente e hidrofóbica, denominada camada A; 3- Abaixo desta
camada se encontra a exocutícula, esta representa dois terços da estrutura da
cutícula, também é rica cistina (15%); 4- Por último vem a endocutícula que é
composta por proteínas que não são queratinas, com elevado teor de aminoácidos
ácidos e básicos, e baixa concentração de cistina (3%). Esta constituição lhe
confere um caráter hidrofílico. Devido à constituição química, a epicutícula, a
camada A e a exocutícula atuam com uma barreira à difusão de moléculas com
alto peso molecular. Enquanto a exocutícula é altamente reticulada por pontes
dissulfeto da cistina, a endocutícula não apresenta reticulações e é facilmente
degradada por enzimas Os remanescentes celulares como núcleo, mitocôndria,
membranas lipídios e outras organelas correspondem a 50% da endocutícula
(SCANAVEZ et.al, 2004).
Entre as células cuticulares e ligando as células cuticulares às corticais,
encontra-se o complexo da membrana celular (CMC), este é formado por três
camadas: duas camadas β formadas por lipoproteínas e uma camada δ, composta
22
por proteínas diferentes da queratina. O complexo de membrana celular (CMC)
corresponde a 2% da fibra e une a células cuticulares com as corticais. Os lipídeos
estruturais do complexo de membrana celular associados as proteínas não só
participam da coesão como também constituem uma barreira contra certos
procedimentos químicos e físicos. (DAWBER ,1996; SCANAVEZ et al, 2004)
Fig. 6: Imagem de microscopia de varredura mostrando a fibra capilar longitudinal
(A), e um corte transversal da fibra (B), microscopia eletrônica de transmissão (C),
mostrando a estrutura da cutícula: EPI (epicutícula), a (camada a), Exo
(exocutícula) e Endo, (endocutícula). CM representa a membrana celular.
Baseado em POPESCU & HÖCKER, 2007.
C
C
A
B
23
2.2. CÓRTEX
O córtex (88% da fibra) pode ser formado por três tipos de células corticais
em forma de feixes: orto-, para- e mais raramente meso- córtex. A figura 7 mostra
uma micrografia eletrônica de queratinas da lã do carneiro da raça merino, onde
padrões bem definidos dos arranjos orto-cortical e para-cortical são observados
(FRASER & PARRY, 2003).
Fig. 7: Imagem de um polimorfismo observado na organização das macrofibrilas.
A- Micrografia eletrônica de um corte transversal do para- córtex da lã merino,
corado com tetróxido de ósmio. B- Corte transversal do orto-córtex. Retirado de
FRASER & PARRY, 2003. Foto: cortesia do Professor Rogers..
No orto-cótex se observa menos matriz e os filamentos estão empacotados
em volta de um núcleo. À medida que aumentam a curvatura fica mais difícil
distingui-los, indicando uma inclinação da fibra em curvas que aumentam a
A
B
24
curvatura. É interessante observar que os diferentes tipos de células corticais têm
uma distribuição característica de acordo com o tipo de cabelo. Cabelos
ondulados são caracterizados por possuírem as macrofibrilas orto-corticais e
meso-corticais entrelaçadas em volta das macrofibrilas para-corticais (Fig. 8 A, b) .
Aumentando o grau do ondulamento, nos cabelos crespos desaparece o meso-
córtex, predominando as células orto- corticais (A, c). No cabelo liso os três tipos
de macrofibrilas assumem a conformação reta, sendo as células meso-corticais
predominantes (THIBAUT et al., 2007).
Uma célula cortical contém aproximadamente 5-8 macrofibrilas com um
diâmento de 300 nm. Fragmentos citoplasmáticos e de núcleo dos queratinócitos
compõem a matriz intermacrofibrilar. Cada macrofibrila contém 500-600
microfibrilas. Proteínas associadas à queratina (KAP) fazem a matriz
intermicrofibrilar. A figura 9 mostra o esquema da fibra com os tipos de células
corticais (POPESCU & HÖCKER, 2007).
25
Fig. 8: A- Microscopia de transmissão de cortes transversais do cabelo mostrando
as diferentes células do córtex: orto- (o); meso-(M) e para- córtex (P) em cabelos
lisos (a), ondulados (b) e crespo (c). Retirado de THIBAUT et al., 2007.
Fig. 8: B- Os diferentes níveis de ondulamento: liso (a), ondulado (b e c) e crespo
(d-f). Retirado de THIBAUT et al., 2007.
A
B
26
Fig. 9: Estrutura da fibra de queratina em diferentes aumentos. Baseado em
POPESCU & HÖCKER, 2007.
Os cabelos apresentam coloração, onde a cor natural dos cabelos é devido
aos grânulos de pigmentos, denominados melanina, que podem variar do preto ao
marrom (eumelanina) e do amarelo ao vermelho (feomelanina). Os pigmentos de
melanina são biopolímeros sintetizados pelo organismo de mamíferos a partir da
tirosina que sofre uma sucessão de oxidações sob o controle da tirosinase,
transformando-se em diidroxifenilalanina (DOPA) e dopaquinona, e em seguida
após várias reações produz benzotiazina e 5,6 dihidroxiindol. Os monômeros
polimerizam e produzem feo- e eumelanina (PEYREFITTE, MARTINI & CHIVOT,
1998).
27
2.3. MEDULA
A medula é encontrada apenas em alguns tipos de fibra e forma na fibra um
núcleo com células cheias de ar (Figura 10) (SCANAVEZ, 2001)
Fig. 10: Micrografia eletrônica mostrando a medula. As setas mostram a
membrana de pouca densidade que envolve a medula separando-a das células
corticais (SCANAVEZ, 2001).
3. FILAMENTOS INTERMEDIÁRIOS DE QUERATINA
As queratinas são filamentos intermediários (IF) que formam proteínas que
fornecem suporte mecânico e outras funções as células. Representam um grupo
de aproximadamente 54 proteínas diferentes expressas em diferentes tecidos
epiteliais e a massa molecular delas variando de 40-70 kDa. As queratinas são
encontradas na natureza, nos núcleos e citoplasma de diferentes células
28
eucarióticas incluindo células epiteliais, neuronais e gliais. Entretanto elas são
também as principais proteínas estruturais do cabelo, pele e penas além de outras
estruturas epidérmicas. Devido às dificuldades nos processos de extração das
queratinas em amostras biológicas, sua seqüência, homologia e modificações pós-
traducionais são menos estudadas do que outras proteínas (PLOWMAN, 2007). O
termo queratina inclui a classe de filamentos intermediários (IF) e também as
proteínas que são associadas a estes filamentos denominadas KAP. Pelo menos
5 tipos de IFs são conhecidos. O tipo I acídico e o tipo II básico são encontrados
nas fibras de lã, cabelo e unhas (α-queratina) e nos filamentos de compostos das
citoqueratinas das células epiteliais. Dentre esses, 10 queratinas são especificas
para tecidos epiteliais duros (cabelo, unhas e lã) e 20 queratinas são denominadas
citoqueratinas e são geralmente encontradas nas células epiteliais. Cada tipo de
epitélio expressa uma combinação característica do tipo I e tipo II (CHANG &
GOLDMAN, 2004).
Os filamentos intemediários são uma classe de filamentos intracelulares
que tem de 8-10 nm de diâmetro e são constituintes do citoesqueleto, de
tamanhos intermediários entre os microtúbulos e os microfilamentos como os de
actina (Figura 11). Organizam-se como uma estrutura tridimensional nas células.
Cada tipo de filamento é feito de diferentes subunidades que pertencem a seis
classes (I, II, III, IV, V e VI) (CHANG & GOLDMAN, 2004).
.
29
Fig. 11: Esquema comparativo dos elementos do citoesqueleto. A.
Microtúbulo; B. Filamento de actina e C. Filamento intermediário. O esquema do
filamento intermediário (dir.) e o aspecto na microscopia eletrônica (esq.) (CHANG
& GOLDMAN, 2004).
Estes filamentos intermediários (IF) associam-se na taxa de 1:1 formando
heterodímeros que montam os microfilamentos. O processo de dimerização é feito
30
pelo entrelaçamento de duas cadeias polipeptídicas. Os dímeros de queratina
associam-se antiparalelamente para formar tetrâmeros estáveis chamados
protofilamentos, dois destes se entrelaçam para formar protofibrilas, e quatro
protofibrilas formam um filamento. A queratina das microfibrilas tem uma
organização lateral. O número de cadeias de queratina em corte transversal é de
aproximadamente 32, que é o valor encontrado para filamentos intermediários de
outros tipos de células. As microfibrilas consistem de 7-8 protofilamentos únicos
ou pareados. A subunidade do protofilamento tem a estrutura das 4 cadeias ou 8
protofilamentos contém, conseqüentemente, 48 ou 32 cadeias de queratina
(AHMADI & SPEAKMAN, 1978) (Figura 12).
O tipo III ocorre em células de origem mesenquimal, em células cardíacas e
esqueléticas, gliais e astrócitos e células neuronais. O tipo IV ocorre somente em
células neuronais e o tipo V é encontrado no envelope nuclear de células de
mamíferos (lamininas) (CHANG & GOLDMAN, 2004). A Figura 13 mostra os
diferentes tipos encontrados.
31
Fig.12: Domínios da α-queratina. a- Os tipos I e II de α-queratina possuem um
domínio longo central os dois domínios curtos terminais. Os números dos
aminoácidos estão indicados na figura. Asterisco representa domínios com
tamanho variável. b- O domínio central é formado pelo entrelaçamento de duas
cadeias em α hélice da queratina que voa se associando até formar as protofibrilas
e depois os filamentos (A,B,C,D,E,F). Baseado em STEINERT & PARRY; 1985;
COHLBERG, 1993.
b)
32
Fig. 13: Classificação dos filamentos intermediários e sua estrutura:
Filamentos intermediários de queratina (IF), classificados em 5 tipos baseado na
sua seqüência e distribuição nos tecidos. O filamento é interrompido por
seqüências curtas repetidas: L1, L12 e L2, resultando em dois segmentos dentro
do domínio; 1A e 1B constituem a espiral 1 e, 2A e 2B a espiral 2. A estrutura e a
seqüência do domínio central longo são altamente conservadas nos filamentos de
vertebrados, exceto pelas lamininas nucleares. Baseado em CHANG &
GOLDMAN, 2004.
33
A tabela 1 mostra os tipos de filamentos de queratina humana, com a nova
nomenclatura adotada (a nomenclatura antiga também é mostrada) incluindo os
tipo I e II do cabelo e a Figura 14 mostra a distribuição destes filamentos na
estrutura do cabelo (PLOWMAN, 2007; POPESCU & HÖCKER, 2007).
Tabela 1: Nomenclatura revisada das queratinas humanas incluindo as
queratinas do cabelo humano tipo I e tipo II ..
Abreviações: K (“keratin”); H (“Hair”); a (“acidic”) and b (“basic”) (SCHWEIZER ET
AL., 2006, GU & COULOMBE, 2007).
34
As proteínas associadas às queratinas (KAP) e os filamentos formam a fibra
de queratina. Estas proteínas de matriz pertencem às três famílias que são
basicamente designadas como: 1 - as que têm alto conteúdo de enxofre (high –
sulfur- HS), 2 - as que têm “ultra- alto” conteúdo de enxofre (ultrahigh - UHS) e 3 -
as que são ricas em glicina-tirosina (high-glycine-tyrosine - HGT) (PARRY et al.,
2006).
As com alto conteúdo de enxofre são encontradas predominantemente no
córtex (KAP 1, 2, 3, 13, 15 e 23) e algumas são encontradas na cutícula (KAP 13 e
23) e na matriz (KAP 11 e 13). As que apresentam conteúdo ultra alto (KAP 4, 5,
9, 10, 12 e 17) e as que apresentam conteúdo alto de glicina e tirosina (KAP 6–8 e
19–21) igualmente ocorrem no córtex (KAP6, 7, 19, 20 e 21), na cutícula (KAP 19)
e na matriz (KAP 8) (PARRY et al., 2006). A tabela 2 apresenta as seqüências
características destas proteínas em humanos.
35
Fig. 14: a- Representação esquemática da expressão das queratinas de
cabelo e epiteliais presentes no folículo capilar. As queratinas são indicadas
de acordo com a nova nomenclatura (com exceção da bainha da raiz externa
(ORS)) (SCHWEIZER et al., 2006). Cada um dos futuros compartimentos
foliculares (cl, camada associada); IRS (bainha da raiz interna) com camada
Henle; camada Huxley; cutícula (cu) ; e o compartimento formador do cabelo
com a medula; córtex e cutícula, que surge da matriz germinativa (Gm) na base
do bulbo. b - Representação da fibra capilar formada com a distribuição do
tipo de queratinas em sua estrutura. (MOLL et al., 2008)
a
36
Tabela 2: Seqüências características das KAPs humanas.
Abreviações: HS (proteínas com alto conteúdo de enxofre); UHS (proteínas com
“ultra-alto” conteúdo de enxofre); HGT (proteínas ricas em glicina-tirosina),
Seqüências A, cys-cys-X-pro-X; A1, cys-cys-gln-pro-X; A2, cys-cys-arg-pro-X; B,
cys-cys-X-ser/thr-ser/thr. Retirado de PARRY et al.,2006.
4. TIPOS DE CABELOS HUMANOS
Até há pouco tempo o cabelo humano era classificado como cabelos
étnicos em apenas três tipos: Africano, Asiático e Europeu. Estes tipos, entretanto,
não cobriam a grande e complexa variedade de tipos de cabelos (McMICHAEL
2003; BERNARD, 2003; LOUSSOUARN et al, 2007). Recentemente foi criada
37
uma nova classificação de acordo com critérios específicos levando em conta a
forma do cabelo humano empregando apenas 4 índices: diâmetro da curva (CD),
índice de ondulação (i), número de torções (t) e número de ondas (w). Este
método fornece uma classificação mundial em categorias bem definidas e com
grande utilidade para a ciência cosmética (LOUSSOUARN et al, 2007; DE LA
METTRIE et al., 2007). Com base nestas análises e cálculos estatísticos, foi
possível classificar os cabelos humanos em 8 tipos principais sem nenhuma
referência com a origem étnica dos cabelos. A tabela 3 mostra a porcentagem de
distribuição dos tipos de cabelos em diferentes países e a figura 15, as relações
dos principais tipos da nova classificação dentro da classificação étnica antiga,
demonstrando a variedade dos novos tipos dentro de cada cabelo étnico
(LOUSSOUARN et al., 2007).
Tabela 3. Distribuição dos diferentes tipos de cabelo nos países. Retirado de DE
LA METTRIE et al., 2007.
38
Fig. 15: Distribuição dos oito tipos de cabelo da nova divisão dentro de seis
diferentes populações. Retirado de LOUSSOUARN et al.,2007.
39
4.1. COMPOSIÇÃO DE AMINOÁCIDOS DO CABELO
O cabelo é formado por queratina, que é uma proteína fibrosa insolúvel e de
alto peso molecular. É composto por uma sequência de 18 aminoácidos
interligados por ligações tipo hidrogênio, eletrostática e dissulfeto (figura 16). Os
aminoácidos mais encontrados são a cistina (enxofre), serina, ácido glutâmico,
arginina e glicina. A estrutura helicoidal (α) da cadeia é estabilizada por
numerosos aceptores de hidrogênio, que se formam entre os agrupamentos -NH e
-CO de aminoácidos vizinhos (PEYREFITTE, MARTINI & CHIVOT, 1998;
WOODRUF, 2002). A tabela 4 mostra a composição básica de aminoácidos do
cabelo.
Fig. 16: Estrutura química da queratina mostrando ligações peptídicas, cistinas e
eletrostática (SYED, AYOUB & KUHAJDA, 1998).
40
Tabela 4: Composição dos aminoácidos do cabelo (*Aminoácidos sulfurados).
Baseado em BUTLER, 2000.
5. ESTRUTURA DAS PENAS DE FRANGO
As penas são estruturas altamente ordenadas e hierarquicamente
ramificadas, apresentando três níveis de ramificação (de raque a barba, de barba
a bárbula, de bárbula a cílios). As penas podem se desenvolver dentro de uma
variedade de formas, incluindo penugem, penas de contorno, ou penas de vôo,
como mostrado na figura17 (YU et al.,2002).
Aminoácido mol% Aminoácido mol%
Alanina 5,6 Lisina 2,9
Arginina 7,0 Ornitina 0,2
Acido aspártico 7,0 Fenilalanina 2,0
Cistina*, cisteína * 12,3 Prolina 7,2
Metionina* - Serina 10,2
Acido glutâmico 12,9 Treonina 6,7
Histamina 0,8 Tirosina 2,0
Isoleucina 3,2 Valina 6,2
Leucina 8,0 Glicina 6,0
41
Fig.17: Diferentes tipos de penas de frango (YU et al., 2002).
As penas de contorno dão formato à ave e variam muito em relação ao
tamanho. Uma característica comum a todas as penas de contorno é um vexilo
plano, em cada lado do eixo (figura 18). O eixo de todos os tipos de penas é
composto por cálamo e raque. O cálamo é a parte do eixo dentro do folículo da
pena; o restante do eixo é a raque. O cálamo tem uma abertura em cada
extremidade, o umbigo inferior que contém as papilas dérmicas, e o umbigo
superior. Duas partes da pena surgem da margem do umbigo superior, a pena
principal e a pena posterior ou secundária, que é menor, como mostrado na figura
19 (GETTY, 1981).
As barbas são estruturas que se projetam para fora e distalmente de cada
lado da raque e delas partem as bárbulas. Das bárbulas projetam-se as
barbicelas, em cuja ponta se encontram os cílios, estruturas semelhantes a
ganchos que se prendem a sulcos presentes nas bárbulas proximais (KNOX,
42
1980). A pena principal possui uma parte plumácea e uma penácea (GETTY,
1981), cuja diferença consiste na presença de cílios na parte penácea (figura 18).
Bárbulas, barbas, cálamo e raque são completamente queratinizados e formados
de β-queratina (ALIBARDI & SAWYER, 2006).
Fig. 18: Morfologia de uma pena de contorno (GETTY, 1981).
Fig. 19: Componentes da pena. Retirado de GETTY, 1981.
43
A principal proteína encontrada nas penas é a β-queratina (11-14,5 kDa).
Na estrutura da β-queratina há a presença de segmentos com conformação em α-
hélice e β- pregueada estabelecidas por pontes de dissulfeto e ligações de
hidrogênio (figura 20), sendo a folha β-pregueada mais importante (BRUSH,1996).
Fig. 20: Ligações tipo hidrogênio formadas na estrutura β- pregueada
(BRUSH,1996)
Os monômeros de β-queratina têm sempre a mesma forma, mas seu
tamanho é variável. Esta diferença de tamanho dos monômeros é tecido-
específica (este peptídeo está presente em outras estruturas epiteliais das aves,
não apenas nas penas, mas em escamas, garras ou bico) e produzida por um
tripeptídeo inserido na cadeia que é encontrado repetidamente (os três
aminoácidos são glicina, glicina e o terceiro pode ser prolina, leucina ou tirosina).
(BRUSH, 1996; FRASER & PARRY, 1996). Os microfilamentos são formados pela
associação linear dos monômeros, que se dá espontaneamente quando os
monômeros são convertidos do estado inativo para o estado associativo. Os
44
microfilamentos formam o filamento, dobrando-se quatro vezes em seu eixo. Os
filamentos são as unidades estruturais. A figura 21 mostra o arranjo da fibra e sua
reação com anticorpos antiqueratina. As fibras são formadas pela associação
linear dos filamentos, altamente orientados no espaço. A matriz interfibra é
formada pela parte globular do monômero. Todos os monômeros de queratina de
penas têm a mesma configuração: a parte central β-pregueada. As pontes
dissulfeto participam da formação do filamento e na sua estabilização. Além disso,
o alto teor de pontes dissulfeto favorece a insolubilidade (BRUSH, 1996). A figura
21 (b,c), mostra uma seção longitudinal e transversal, respectivamente, de
bárbulas de pena embrionária tratada com anticorpo anti-β-queratina marcado
com fluorescência, revelando os filamentos de queratina (ALIBARDI & SAWYER,
2006).
Fig. 21: A - Arranjo dos filamentos de β-queratina. B Seção longitudinal e C –
seção transversal de bárbula de pena embrionária após reação com anticorpo
anti-β-queratina, mostrando os filamentos de queratina. Barra de escala de 10 µm
(FRASER & PARRY, 1996; ALIBARDI & SAWYER, 2006).
A B C
45
Quando reduzidas sob condições alcalinas, as penas produzem peptídeos
S-carboximetilados com 10,6 kDa (BRUSH, 1996; ALIBARDI & SAWYER, 2006).
Todas as penas e suas partes possuem misturas heterogêneas desse peptídeo.
As partes morfológicas das penas possuem composição de enxofre e aminoácidos
diferentes (HARRAP & WOODS, 1967), mas a composição da mesma parte de
diferentes penas (de contorno, plumagem ou de vôo) é a mesma em uma mesma
espécie (KNOX, 1980). Estas diferenças estão confinadas aos mesmos
aminoácidos: alanina, cistina, glicina, isoleucina, prolina e tirosina (HARRAP &
WOODS, 1964).
5.1. COMPOSIÇÃO DE AMINOÁCIDOS DA PENAS
A composição química e de aminoácidos da pena são mostradas nas
tabelas 5 e 6, respectivamente.
Tabela 5: Composição química das penas em g.kg
-1
(DALEV, 1994, 1997, 2000).
Componente Concentração em g.kg
-1
Proteína (queratina) 894,0
Lipídeos 14,1
Água 49,5
Ca 3,5
P 1,3
Na 4,0
Cl 8,0
46
Tabela 6: Composição de aminoácidos de pena em g.kg
-1
(DALEV, 1994, 1997,
2000).
6. ENZIMAS PROTEOLÍTICAS: PEPTIDASES
As peptidases (proteases ou proteinases) são enzimas proteolíticas que
catalisam a hidrólise de ligações peptídicas. O nome peptidase é o termo
recomendado pelo sistema MEROPS, um banco de dados criado para dar suporte
à classificação destas enzimas (www.merops.acd.uk). Segundo o Comitê de
Nomenclatura Enzimática (EC) da União Internacional de Bioquímica e Biologia
Molecular, as peptidases pertencem à classe 3 (hidrolases) e sub-classe 3.4
(peptídeo-hidrolases ou peptidases). As peptidases podem ser classificadas como
exopetidases (EC 3.4.11-19), quando clivam aminoácidos terminais, e
endopeptidases (EC 3.4.21-99), quando hidrolisam ligações peptídicas no interior
Aminoácido g.kg
-1
Aminoácido g.kg
-1
Alanina 56,6 Lisina 22,5
Arginina 66,4 Ornitina 0,2
cisteína * 46,1 Prolina 90,8
Acido glutâmico 102,5 Treonina 48,4
Histidina 14,4 Tirosina 24,1
Isoleucina 49,3 Valina 76,1
Leucina 84,3 Serina 114,4
Glicina 76,7 Fenilalanina 52,2
47
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A
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da cadeia polipeptídica. As exopeptidases podem ainda ser classificadas de
acordo com a sua atuação na região N- ou C- terminal da proteína. Aquelas que
atuam na região N-terminal podem liberar um único aminoácido (aminopeptidase),
um dipeptídeo (dipeptidil-peptidases) ou um tripeptídeo (tripeptidil-peptidases). Já
as carboxipeptidases clivam um aminoácido ou um dipeptídeo (peptidil-
dipeptidase). Algumas exopeptidases hidrolisam dipeptídeos, e outras removem
unidades de aminoácidos substituídos, ciclizados ou ligados por ligação
isopeptídica, neste último caso, denominadas ômega peptidases (RAWLINGS et
al, 2008). As reações catalisadas pelas peptidases estão esquematizadas na
figura 22 (VERMELHO et al., 2008a).
Fig. 22: Classificação das peptidases quanto ao local de clivagem na proteína
(VERMELHO et al., 2008a).
Tipo de reação catalisada
Exopeptidases
Endopeptidases
N-terminal
C-terminal
48
As peptidases são também classificadas segundo o sítio catalítico, de
acordo com os grupos químicos presentes no centro ativo. Atualmente são
descritos seis tipos catalíticos: cisteína, treonina, glutâmico, aspártico, e serina
peptidases, em função da presença destes aminoácidos no centro ativo da
molécula protéica, e metalopeptidase quando um ou dois íons metálicos estão
envolvidos no mecanismo catalítico (BON & VERMELHO, 2004; VERMELHO et al,
2008a). A maioria das metalopeptidases possui zinco no sítio ativo, podendo
também ocorrer cobalto ou níquel. Algumas peptidases não têm seus mecanismos
de ação suficientemente elucidados e são classificadas no subgrupo EC. 3.4.99
segundo o Comitê de Nomenclatura Enzimática (VERMELHO et al., 2008a).
O avanço dos estudos de química de proteínas, como a cristalografia,
estudos comparativos da seqüência primária, dos aminoácidos do centro ativo
assim como da estrutura tridimensional das peptidases, permitiram a elaboração
de novos critérios para a sua classificação e para os estudos das relações
filogenéticas. Estes estudos foram iniciados por RAWLINGS & BARRET (1993),
que estabeleceram linhas evolutivas baseadas na comparação das seqüências
dos domínios importantes para a atividade.
Desta forma, cada peptidase é designada como uma espécie, e, cada
espécie recebe um nome, como tripsina por exemplo. Cada espécie de peptidase
pode ser detectada em muitos organismos, com pequenas variações esperadas,
neste caso estas são espécies variantes da primeira encontrada. Espécies
protéicas com seqüências com semelhança estatisticamente relevante foram,
então, alocadas em famílias. A família é um grupo de peptidases baseada na
homologia da seqüência e uma família pode conter uma única peptidase se
49
nenhuma peptidase homóloga for conhecida. Cada família é representada pela
letra que representa seu tipo catalítico e por um número. Por sua vez, as famílias
que aparentam ter um ancestral comum, ou por causa da estrutura quaternária ou
devido a resíduos no sítio ativo, foram agrupadas em clãs (RAWLINGS et al.,
2008). Foi sugerido que a classificação em famílias e clãs fosse usada como uma
extensão da classificação de acordo com o sítio catalítico das peptidases.
Baseado nesta classificação hierárquica apoiada na estrutura da proteína, foi
criado em 1996 o banco de dados MEROPS (RAWLINGS et al., 2008). O
MEROPS também disponibiliza informações sobre inibidores não protéicos e
classifica hierarquicamente os inibidores protéicos em espécies, famílias e clãs
baseado em sua estrutura química, além de fornecer outras informações sobre as
peptidases, como a especificidade de substrato, quais inibidores atuam sobre elas,
função biológica, relevância farmacêutica e biotecnológica. Um clã contém todas
as peptidases que derivam de uma única origem evolutiva. Cada clã apresenta
uma ou mais famílias e é identificado por duas letras, sendo a primeira
representando o sítio catalítico das famílias incluídas no clã: A para aspártico
peptidase, C para cisteína peptidase, M para metalopeptidase, S para serina
peptidase, T para treonina peptidase e U para glutâmico peptidase. A letra P é
atribuída aos clãs que possuem famílias de mais de um tipo catalítico. Alguns clãs
são divididos em subclãs quando existe a evidência de divergência evolutiva
dentro do clã. O mesmo pode acontecer com as famílias. Por exemplo, a espécie
subtilisina Carlsberg, uma peptidase produzida por Bacillus licheniformis
Carlsberg, é classificada como S08.001; ela pertence à subfamília S8A
(denominada subfamília da subtilisina), que pertence à família S8 (família da
50
subtilisina), uma família de serina peptidases inibidas por PMSF e DFP e algumas
vezes por EGTA e EDTA, uma vez que alguns membros desta família são
estabilizados por cálcio. Esta família está incluída no clã SB. Neste clã também se
encontra a família S5, a família da sedolisina, uma serina-peptidase produzida por
Pseudomonas spp. (www.merops.acd.uk).
As peptidases têm grande importância biológica, médica e biotecnológica, e
constituem um produto com alto valor agregado, podendo participar de diversos
processos industriais, como na indústria de detergentes, alimentícia, farmacêutica,
têxtil, entre outras. As peptidases correspondem a aproximadamente 60% do total
de enzimas no mercado mundial e cerca de 40% das peptidases comercializadas
são de origem microbiana. Destas, destacam-se as peptidases alcalinas
produzidas por bactérias do gênero Bacillus, cujas aplicações têm aumentado
acentuadamente devido à capacidade de produção destes microrganismos e a
alta atividade catalítica das peptidases por eles produzidas (JOO & CHANG,
2006). O interesse nas peptidases de origem microbiana de forma geral deve-se
ao fato de que as peptidases de plantas e animais não atendem à demanda
mundial, além da facilidade de manipulação genética, grande diversidade
bioquímica encontrada, o curto tempo de geração, controle da produção em todas
as fases, processo de produção mais barato, processo de extração mais simples,
otimização das condições de crescimento e produção regional independente, uma
vez que determinadas plantas só crescem em condições climáticas específicas
(GUPTA et al., 2002; RAWLINGS et al., 2008; VERMELHO et al., 2008a).
51
6.1. QUERATINASES
As queratinases (EC 3.4.21/24/99.11) são peptidases que têm como
substrato um grupo de proteínas fibrosas e insolúveis denominadas de queratinas,
e estas peptidases são produzidas por bactérias e fungos. Estas enzimas são em
sua maioria endopeptidases, embora tenham sido descritas exopeptidases em
Keratinomyces ajelloi e Trichophyton gallinae (RUFFLIN et al., 1979;
WAWRZKIEWICZ, LOBARZEWSKI & WOLSKY, 1987; RAO et al., 1998). Vários
tipos catalíticos de queratinases têm sido descritos em microrganismos,
principalmente queratinases do tipo serina e metalopeptidases (BRESSOLIER et
al., 1999; BROUTA et al., 2002; GUPTA & RAMNANI, 2006; KOJIMA et al., 2007;
VERMELHO et al, 2008b). Em Candida albicans foi detectada uma aspártico
endopeptidase com atividade queratinolítica (HATTORI et al., 1984).
Para a hidrólise das ligações peptídicas da queratina é necessária a
clivagem prévia das pontes dissulfeto da molécula. Há dois mecanismos propostos
para a clivagem destas pontes, um observado por KUNERT (1992) no qual a
clivagem de pontes dissulfeto é realizada por sulfitólise, e o outro por YAMAMURA
et al., (2002) onde essa clivagem é feita por uma dissulfeto redutase.
Os fungos dermatófitos crescem sobre meio com cistina (duas unidades de
cisteína ligadas por uma ponte dissulfeto) livre ou combinada. Eles metabolizam
intensamente esta substância, excretando para o meio o excesso de enxofre na
forma de sulfatos e/ou sulfito. O sulfito reage com a cistina em solução neutra ou
alcalina, clivando em cisteína e S-sulfocisteína, segundo a reação:
52
Cys-SS-Cys + HSO
3
–
→ Cys –SSO
3
–
+ Cys-SH
A hipótese foi apoiada por experimentos que revelaram a presença de
produtos de sulfitólise no meio de cultura. KUNERT (1992) avaliou o efeito das
peptidases do dermatófito Microsporum gypseum sobre a queratina e outros
substratos protéicos, como a soro albumina bovina (que possui 17 pontes
dissulfeto), insolubilizada por ligações cruzadas e caseína (que não tem cistina),
na presença de sulfito e outros agentes redutores. Ele observou que houve a
estimulação da proteólise na presença dos agentes redutores, em especial o
sulfito. Esta estimulação foi detectável quando a peptidase e o agente redutor
atuaram juntos. Com o substrato caseína não houve estimulação da hidrólise
pelas peptidases do dermatófito. A sulfitólise das pontes dissulfeto também
aumentou a atividade de tripsina e pronase sobre substratos queratinosos. Os
resultados obtidos por KUNERT (1992) apóiam sua hipótese sobre a degradação
da queratina pela excreção de sulfito antes do ataque das peptidases do fungo.
YAMAMURA et al., (2002) isolaram uma bactéria, Stenetrophomonas sp.
cepa D-1, capaz de degradar queratina. Eles observaram a produção de duas
proteínas extracelulares: uma com atividade proteolítica e outra capaz de reduzir
pontes dissulfeto. A purificação e caracterização destas proteínas mostraram que
a primeira se tratava de uma peptidase pertencente à classe das serina
peptidases e a segunda é uma dissulfeto redutase. Estas enzimas, quando
53
testadas individualmente, não mostraram quase nenhuma atividade queratinolítica.
Entretanto, depois que as duas enzimas foram misturadas, a atividade
queratinolítica aumentou mais de 50 vezes. Estes resultados demonstraram que
as duas enzimas atuaram cooperativamente para degradar a queratina, resultando
no aumento da atividade hidrolítica e revelando um novo mecanismo de
degradação desta proteína, onde uma dissulfeto redutase ataca as pontes
dissulfeto da queratina primeiro, produzindo uma proteína passível de degradação
por uma peptidase, como mostra o esquema e a figura 23:
Dissulfeto
Redutase Peptidase
K-S-S-K K-SH Peptídeos/ aminoácidos
(queratina nativa) (queratina reduzida) (produtos)
54
K-S-S-K Peptídeos/ aminoácidos
Fig. 23: Degradação da queratina pelo mecanismo enzimático. 1- Queratina
nativa; 2- Redução das pontes dissulfeto pela enzima dissulfeto redutase; 2-
Peptidases degradam monômeros de queratina em peptídeos e aminoácidos
K - SH
55
7. APLICAÇÕES DE QUERATINASES E HIDROLISADOS DE QUERATINA
EM COSMÉTICOS
O mercado mundial de enzimas é da ordem de quatro bilhões de dólares,
sendo 2.2 bilhões de dólares o mercado de enzimas industriais (técnicas, para a
indústria de alimentos e ração animal). Dados levantados pelo Ministério de
Ciência e Tecnologia confirmam a defasagem do Brasil nesta área, prevalecendo
no país o uso da catálise em detrimento da biocatálise. Assim, avaliou-se o
mercado externo brasileiro, no ano de 2005, em 147,2 milhões de dólares sendo
que 86% correspondem às importações, indicando desvantagem tecnológica e
estratégica em termos de produção e uso destes catalisadores no país. As
peptidases representam 60% das vendas mundiais de enzimas, sendo 40% de
origem microbiana. Os processos biocatalisados por peptidases são menos
poluentes. As características destes processos industriais e a biodegradabilidade
apresentada pelos seus efluentes atendem às exigências das normas ISO 9000 e
ISO 14001, que estabelecem padrões para a qualidade de produtos e norteiam as
características dos processos de produção, dando ênfase ao menor consumo
energético, ao baixo impacto ambiental e à maior qualidade dos produtos. Neste
contexto é importante ressaltar que o processamento enzimático de matérias
primas resulta em produtos de maior valor agregado, pela sua qualidade e por ser
produzido por tecnologias limpas. Ainda neste contexto o uso de queratinases
para hidrólise de queratina humana, de penas ou de outra origem é de ter a
vantagem de eliminar um dos riscos dos materiais biológicos que são a
contaminação pelos prions das encefalopatias. As queratinases têm a propriedade
56
de degradar esta proteína infectante e isto tem sido reportado em artigos
científicos nos últimos anos (BRANDELLI, 2008; YOSHIOKA et al, 2007;
MÜLLER-HELLWIG et al, 2006; VERMELHO et al, 2008b).
Segundo BRENDA (2006), as enzimas são utilizadas há muitos anos na área
médica, especialmente pela Dermatologia, com inúmeras finalidades, como o preparo
da superfície cutânea lesada para receber enxertos cirúrgicos, na limpeza de lesões
infectadas com a remoção de tecidos danificados ou necrosados e como auxiliar na
remoção de manchas (CAYLE, 1963).
São inúmeras as aplicações das enzimas, em especial as proteases, em
Cosmetologia (D’AUDIFRET E ROBERTET, 1978; SANTOS, 2001), incluindo a estética
dermatológica e a preparação dos denominados “cosmecêuticos” ou
“dermocosméticos”, produtos destinados a corrigir pequenas desordens cutâneas, como
auxiliar no tratamento da acne e da caspa, e ainda no combate ao envelhecimento
cutâneo, para amaciamento da pele (peeling), depilatórios, alisantes ou onduladores,
tinturas capilares, dentifrícios, de clareadores cutâneos e de ação antimicrobiana
(desodorantes e conservantes) (TANAKA, 1983; TSUTSUMI, 1988; SMITH, 1997;
LODS et al., 2000)
Há também outros usos diferentes para as queratinases, como na eliminação de
queratina em acne ou psoriase (VIGNARDET et al., 2001), na eliminação de calo
humano, como vem sendo estudado através do uso de duas serina-peptidases
produzidas por Kryptococcus sedentarius (LONGSHAW et al., 2002). As queratinases
também podem ser aplicadas em pomadas médicas e veterinárias e na produção de
aminoácidos essenciais ou peptídeos a partir de moléculas de alto peso molecular.
57
A queratina do cabelo e da unha é denominada de queratina dura pelo seu alto
teor de cistina, um aminoácido rico em enxofre. A queratina da pele é denominada de
queratina mole ou suave (contém 1% de enxofre). A degradação da queratina dura do
pêlo, por enzimas é possível com a utilização de cistina, glutation e bissulfito redutase,
queratinase e papaína (PROTOPAPA et al. 1999; TRAVERSA, 2003)
A biodegradação de penas de frango por microrganismos que possuem atividade
queratinolítica representa um método alternativo para melhorar o valor nutricional das
rações para frangos. Além de não promover perda de determinados aminoácidos,
aumenta o valor nutricional através da própria biomassa microbiana visto que os
métodos utilizados, como decocção, promovem a perda de aminoácidos essenciais. Os
avanços na tecnologia das enzimas microbianas, no caso queratinases, oferecem
consideráveis oportunidades de baixo custo para a bioconversão de penas descartadas
como poluente à uma proteína melhorada em termos nutricionais para ração animal
(ONIFADE et al, 1998).
Estudos recentes apontam que hidrolisados de penas são um produto
potencialmente útil como fertilizante e de liberação lenta de nitrogênio, uma vez que
penas têm cerca de 15% de nitrogênio (ICHIDA et al, 2001).
As queratinases podem também ser usadas não apenas na indústria de couro e
avícola mas também para o tratamento de resíduos queratinolíticos animais, como
cascos, chifres, pêlos, uma vez que durante a decomposição não controlada da
queratina, principalmente por bactérias anaeróbias, é liberada uma grande quantidade
de sulfeto de hidrogênio e amônia (SINGH, 2002).
58
OBJETIVOS
Na indústria de insumos para uso em cosméticos há um potencial muito
grande de utilização do mecanismo químico para obtenção de hidrolisados de
queratina, sendo incomum o uso de microorganismos catalisadores de queratina
para a obtenção destes hidrolisados. Esta tese visa à obtenção e a aplicação de
peptídeos de hidrolisados de queratina de penas de frango em formulações
cosméticas, através de enzimas microbianas, com o objetivo de reconstrução
capilar. Para atingir esta meta os seguintes objetivos foram estabelecidos:
• Obter os hidrolisados de queratina de pena de frango usando Bacillus
subtilis AMR.
• Analisar os hidrolisados de queratina:
Espectrometria de massa (MALDI TOF): detectar a presença de
peptídeos no sobrenadante de cultura após hidrólise enzimática,
Gel de eletroforese (SDS PAGE): verificar a presença ou ausência
de proteínas no sobrenadante de cultura antes e após ultrafiltração e
de amostras comerciais,
Cromatografia em camada fina de alta resolução (HPTLC): avaliar as
frações de aminoácidos ou peptídeos obtidos após hidrólise
enzimática e ultrafiltração e de uma amostra comercial,
Zimografia em gelatina e queratina: verificar se os hidrolisados, antes
e após a ultrafiltração, apresentam ou não atividade enzimática.
59
• Testar diferentes bases cosméticas para incorporação dos hidrolisados
microbianos de queratina, avaliando a homogeneidade e a solubilidade
destes hidrolisados em bases cosméticas em xampu, emulsão e gel.
• Verificar o efeito da aplicação de xampus e emulsões com hidrolisados de
queratina de penas de frango na restauração capilar através de medição de
hidratação, análise sensorial e microscopia eletrônica.
60
MATERIAIS E MÉTODOS
1. PREPARO DAS PENAS DE FRANGO
As penas utilizadas no meio de cultura foram penas de frango brancas
lavadas com detergente em água corrente, secas a 60°C e delipidadas em Becker
de 4 litros com 1/3 do volume do mesmo em penas com 1L da solução de
clorofórmio: metanol 1;1 (v/v) (WARZKIEWICZ et al, 1987). Em seguida as penas
foram removidas e secas overnight a 60°C. As penas foram adicionadas inteiras
no meio de cultura como principal fonte de carbono e nitrogênio.
2. MICRORGANISMO E CONDIÇÕES DE CULTURA
Para obtenção dos hidrolisados de queratina utilizou-se o Bacillus subtilis
cepa AMR, isolado de resíduos agro-industriais da indústria avícola RICA,
atualmente depositado na coleção de cultura da Fundação Oswaldo Cruz com o
número de registro 1266. Este microrganismo foi escolhido devido a sua intensa
atividade queratinolítica para penas de frango.
O microrganismo foi cultivado em 250 ml de meio extrato de levedura
(extrato de levedura 0,5%, peptona 0,5%, KCl 2,0% e sacarose 2,0%) por 2 dias a
28°C sob agitação constante (300 rpm) para obter massa celular, lavados com
salina (2x 3000 rpm/20min) para remoção dos componentes do meio, antes de
serem inoculados no meio contendo penas a 1%. Em seguida as células foram
transferidas para 1 litro de meio PBS pH 8,0 (NaH
2
PO
4
0,06M e K
2
HPO
4
0,04M)
61
com 1% de penas de frango e suplementado com 0,01% de extrato de levedura. A
amostra foi cultivada neste meio durante 5 dias a 28°C sob agitação de 300 rpm
(MAZOTTO, 2008)
3. OBTENÇÃO DOS HIDROLISADOS DE QUERATINA
Ao término da fermentação do microrganismo no meio contendo penas
como principal fonte de carbono e nitrogênio, o hidrolisado foi obtido por
centrifugação a 4.000 rpm por 20 minutos e, em seguida clarificado por filtração
esterilizante (MAZOTTO, 2008). Para se obter uma preparação contendo apenas
os peptídeos na faixa de 500 e 1000 Dalton, o sobrenadante foi submetido a
ultrafiltração, usando o sistema AMICON, com o objetivo de separar os peptídeos
de até 500 e 1000 Dalton através de membranas de celulose regenerada Millipore
(YC 05) de 500 e 1000 NMWL (Nominal Molecular Weight Limit), respectivamente.
4. ANÁLISE DOS HIDROLISADOS DE QUERATINA
4.1. GEL DE ELETROFORESE (SDS-PAGE)
Esta análise foi realizada nas frações de hidrolisados obtidas antes e após
a ultrafiltraçào e nas amostras comerciais de hidrolisados proteicos denominadas
como 1 e 2, sendo a primeira obtida de cascos e pêlos de porco e a segunda de
queratina de penas de frango. As soluções obtidas foram diluídas em tampão de
amostra, aquecidas a 100°C por 5 minutos para desnaturação das proteínas e, em
62
seguida aplicados em gel de poliacrilamida. As análises em SDS-PAGE foram
realizadas segundo o método de LAEMMLI (1970), com gel de poliacrilamida a
12,5 e 15%. A corrida foi realizada em 2 horas/ 180 V/ 4
o
C. Os seguintes padrões
de massa molecular foram utilizados: fosforilase b (94 kDa), soro albumina bovina
(67 kDa), ovoalbumina (43 kDa), anidrase carbônica (30 kDa), inibidor de tripsina
de soja (20,1 kDa) e α-lactoalbumina (14,4 kDa) (Sigma) e a coloração do gel foi
por coomassie blue ou prata.
4.2. ZIMOGRAFIAS COM GELATINA E QUERATINA
Esta análise foi feita nas preparações dos hidrolisados obtidos antes e após
a ultrafiltração. As zimografias foram preparadas segundo metodologia descrita
por HEUSSEN & DOWDLE (1980), porém utilizando gelatina (Merck) e queratina
extraída de penas de frango com DMSO (LOPES et al, 2008) como substratos
incorporados a malha de poliacrilaminda a 12,5%. A coloração utilizada foi por
Coomasie Blue e/ou coloração por prata. Utilizou-se um padrão de massa
molecular como controle.
4.3. CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA – HPTLC
A cromatografia em camada fina de alta resolução (HPTLC) foi utilizada
para avaliar o perfil cromatográfico do hidrolisado de penas de frango após a
ultrafiltração em membranas de AMICON de 500 e 1000 Da. Foram utilizados
63
placas de vidro de HPTLC (Merck). Os solventes utilizados para a fase móvel
foram: butanol / acetona / ácido acético glacial / água (5:5:1:3,7v/v/v/v/) (BRENNE
& NIEDEWIESER, 1967; adaptado de KANAKI & RAJANI, 2005) Como revelador
foi empregado a ninhidrina / butanol e acetona (3,75 g de ninhidrina, 25 mL de
butanol e 25 mL de acetona). Na placa de HPTLC foram aplicadas 10 µL das
amostras separadas do sobrenadante com membrana de 500 e 1000 Da e da
amostra comercial 2. Como controle foi utilizado uma solução de aminoácido
glicina (1 mg/ml), um aminoácido presente em alta concentração nas penas, 76,6
g/kg (DALEV, 2000).
4.4. ESPECTROMETRIA DE MASSA (MALDI-TOF)
Foram feitas análises em espectrometria de massa (MALDI-TOF - Matrix
assisted laser desorption/ionisation – Time of flight) das amostras após a hidrólise
de penas pelas peptidases do B.subtilis AMR e também para uma preparação
comercial, denominada preparação comercial 1 (diluída 100x). O sobrenadante
contendo 4,99 mg/ml de proteínas dosadas pelo método de LOWRY (1951), foi
parcialmente purificada em ponteira do tipo ZipTip C
18
. O ZipTip C
18
foi equilibrado
com uma solução de acetonitrila (ACN) 100% seguida pela lavagem com ácido
trifluoroacético (TFA) 0,1%. Após este processo, os peptídeos foram fixados na
resina do ZipTip C
18
, lavados com TFA 0,1% para remoção de sais, fosfatos e/ou
DMSO que causam ruído na leitura. A eluição foi feita com 0,1% de TFA em ACN
50%. As amostras purificadas foram incorporadas as matrizes de ácido α-ciano-4-
hidroxicinâmico (5µg/mL em TFA 0,1% em ACN 50%) 1:1. A mistura foi então
64
aplicada na placa para análise por espectrometria de massa (MALDI-TOF)
(MAZOTTO, 2008).
5. PROPOSTA DE UMA FORMULAÇÃO COSMÉTICA CONTENDO
HIDROLISADO DE QUERATINA .
Os peptídeos de massa molecular menor que 500 Da obtidos através da
ultrafiltração em AMICON (membrana 500 NMWL), foram incorporados em duas
bases cosméticas comumente utilizadas no mercado: um xampu suave e um
creme rinse com enxágüe, ambas contendo 10% do material filtrado através de
membrana de AMICON de 500 NMWL.
Após uma busca aos fornecedores de hidrolisados de proteínas verificou-se
que a massa molecular destes hidrolisados seriam, de aproximadamente, 1000
Da. Logo, a escolha pelo peptídeo de massa molecular de 500 Da foi em função
deste não existir no mercado e também, devido sua pequena massa, possibilitar
uma melhora na restauração capilar.
As formulações utilizadas neste trabalho são básicas, ou seja, comumente
comercializados, a fim de se evitar a influência dos componentes presentes na
formulação nos resultados do nosso aditivo.
65
Fórmula 1: Xampu suave
Componentes % (p/p) Função
Lauril éter sulfato sódio.......................... 30
Detergente
Decil poliglicosídeo................................. 5
Detergente, sobreengordurante
Lauril poliglicosídeo................................ 5
Detergente, sobreengordurante
Surfax ácido........................................... 3
Anfótero, espumante
Dietanolamida de ácido graxo de côco.. 4
Sobreengordurante
Phenova.................................................. 0,5
Conservante
Germal 115............................................. 0,2
Conservante
Peptídeos de queratina.......................... 10
Aditivo
Unistab 569............................................. 0,2
Neutralizante de odor
Essência de erva-doce........................... 0,5
Perfume
Água destilada q.s.p............................... 100
Veículo
Procedimento: Aquecer o Germal (80ºC) para a sua dissolução em água destilada.
Após a dissolução do Germal, os demais componentes foram adicionados a
solução. Os poliglicosídeos foram aquecidos para incorporação a solução anterior.
A homogeneização foi feita lentamente para evitar formação de espuma. Finalizar
adicionando o hidrolisado microbiano de penas, o Unistab 569 e a essência.
completar o volume final, homogeneizando.
Fórmula 2: Creme rinse com enxágüe
Componentes % (p/p) Função
Fase oleosa
Álcool cetoestearílico....................... 5
Espessante fase oleosa
Phenova .......................................... 0,5
Conservante
Cloreto de cetiltrimetilamonio........... 0,5
Agente antiestático
66
Fase aquosa
Germal 115....................................... 0,2
Conservante
Essência erva-doce.......................... 0,5
Perfume
Peptídeos de queratina.................... 10
Aditivo
Água destilada q.s.p......................... 100
Veículo
Procedimento: Todos os componentes da fase oleosa foram aquecidos (75°C)
juntos e homogeneizados até completa dissolução. Em outro recipiente o germal
foi dissolvido sob aquecimento a 80ºC. Após atingir as temperaturas, a fase oleosa
foi acrescida a fase aquosa, sob agitação, até emulsionar. A solução obtida foi
colocada em banho frio, homogeneizada e acrescida das demais substâncias da
fase aquosa.
5.1. APLICAÇÃO E AVALIAÇÃO COSMÉTICA
Os produtos cosméticos formulados foram aplicados em mechas de cabelos
virgem e quimicamente tratados (obtidos do Salão Eva’s Hair Cabeleireiros Ltda.),
previamente lavados e desengordurados. Antes da realização dos ensaios todas
as mechas foram devidamente lavadas com xampu de lauril éter sulfato de sódio
2%, e enxaguadas com água destilada. Esse procedimento visou eliminar
quaisquer materiais adsorvidos ao fio, evitando-se interferência no ensaio (KON,
1998).
As mechas foram separadas em 5 grupos diferentes. Estes são compostos
por mechas de cabelos virgens, tingidos, tingidos com alisamento, tingido com
luzes (descoloração) e totalmente descolorados. Cada grupo continha quatro
mechas, sendo duas com os peptídeos de queratina a 10% e duas mechas
67
controles. O período do ensaio, para avaliação do grau de hidratação das fibras
capilares, foi de 5 semanas. As mechas foram submetidas ao tratamento com o
xampu suave e creme rinse, com e sem o peptídeo de queratina, e a secagem
com calor seguida de placa térmica de 180°C e a temperatura ambiente
(naturalmente), em dias alternados e as medições de hidratação foram semanais.
Os ensaios de medição de hidratação foram realizados em aparelho
CORNEOMETHER marca CM 825,
que tem como função avaliar a quantidade de
água evaporada através da pele por variação de campo. O método está baseado
na grande variabilidade do vapor da constante dielétrica da água a qual é
registrada automaticamente no aparelho. O valor medido é dado em Unidade
Arbitrária de Hidratação (UA). Foram realizados em paralelo, no mesmo grupo de
mechas, ensaios controle com as bases cosméticas sem os peptídeos de
hidrolisado de pena de frango. As formulações foram manipuladas no Laboratório
de Farmacotécnica da Universidade Estácio de Sá – Campus Rebouças. Abaixo
está ilustrado o fluxograma da metodologia utilizada para o processo de
tratamento e medição da hidratação (figura 24).
68
Fig. 24: Fluxograma da metodologia empregada.
Foi realizado um teste para avaliação sensorial das mechas para verificar o
grau de brilho e emoliência. O mesmo foi realizado pelas funcionárias do salão de
Eva’s Hair Cabeleireiros Ltda, as quais participaram do processo de separação e
tratamento químico das mechas.
As avaliadoras (total de 20 pessoas) analisaram as mechas (ponto zero)
com as de controle e as mechas testes, onde a avaliação foi realizada através de
um questionário simples abordando os parâmetros brilho, emoliência e maciez. A
avaliação foi cega, pois as avaliadoras não sabiam qual formulação estava sendo
usada. Antes de ser feito o teste as avaliadoras passaram por um processo de
higienização das mãos, para retirada de qualquer produto engordurante que
Cabelo limpo
Lauril éter sulfato sódio
Xampu e creme controle
Xampu e creme com 10%
peptídeos
Secagem
natural
Secagem
natural
Secagem com calor e
placa térmica
Secagem com calor e
placa térmica
Medição da hidratação
Aparelho corneomether CM 825
69
pudesse interferir na análise, sendo respondido, através de um questionário
simples, qual grupo apresentava maior ou menor grau de brilho, emoliência e
maciez (VILLA et al, 2008).
6. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
Os fios de cabelo antes e após aplicação dos produtos contendo peptídeos
de 500 Da, foram microfotografados em microscópio eletrônico de varredura
(MEV), para avaliar sua fisiologia. A microscopia da haste do pêlo é essencial para
o diagnóstico de muitas anormalidades, particularmente doença fúngica e
distúrbios congênitos e hereditários da haste do pêlo, para avaliar o desgaste do
pêlo, e para esclarecer a causa da queda de cabelos (DAWBER, 1996, BERKER,
2002). A microscopia eletrônica de varredura é muito diversa nos seus modos de
operação e fornece riqueza de informação a respeito da arquitetura de superfície
(DAWBER, 1996). A técnica também possibilita determinar a forma de um
material, o tamanho das partículas que o compõem e seu arranjo (ANDREAZZI,
2001).
Foram retirados de cada amostra analisada três pedaços de fios, escolhidos
aleatoriamente, e montados numa placa, sobre fita de carbono. As amostras foram
classificadas como: amostra A (cabelo alisado + tintura), amostra B (cabelo
descolorido), amostra C (cabelo tingido), amostra O (cabelo virgem – sem tratamento
químico), onde 0 (zero) equivale ao ponto zero, C equivale a amostra submetida ao
calor (placa térmica 180°C) e S equivale a amostra sem calor (secagem a temperatura
70
ambiente). As amostras de hastes capilares foram colocados em chips com fita adesiva
apropriada, recobertas com ouro e observadas em microscópio de varredura JEOL JSM
5310 em 10 kV. Foi fotografada, com aumento de 1000x e 3500x, uma imagem de cada
pedaço de fio de cabelo de cada uma das condições.
As amostras submetidas à avaliação de hidratação pelo aparelho
“corneomether” foram analisadas por microscopia eletrônica, para avaliar a
estrutura da fibra capilar antes e após a aplicação dos produtos contendo os
hidrolisados de peptídeos, como delimitação das escamas cuticulares e presença
de material orgânico, na restauração capilar.
O ensaio para análise física dos fios de cabelo por microscopia eletrônica de
varredura foi realizado em cooperação com o prof. Ulysses Lins da Microscopia
eletrônica, do Instituto de Microbiologia prof Paulo de Góes - IMPPG.
71
RESULTADOS
1. MICRORGANISMO E CONDIÇÕES DE CULTIVO
A figura 25 apresenta o meio de cultivo do microrganismo mostrando a
degradação das penas de frango (90-95% de degradação) nas condições
descritas na metodologia.
Fig. 25: Meio de cultivo de B. subtilis AMR, mostrando antes (A) e após cinco dias
de cultivo (B). Observar a quase completa degradação das penas (90-95%).
A B
72
2. ANÁLISE DOS PEPTÍDEOS DE QUERATINA
2.1. ANÁLISE DO HIDROLISADO BRUTO POR MALDI TOF
O sobrenadante analisado em MALDI-TOF, revelou fragmentos com massa
molecular de 800-1100 Dalton no sobrenadante bruto das culturas (Figura 26). O
perfil de pequenos fragmentos peptídicos observado no sobrenadante de cultura
do microrganismo foi também observado na preparação comercial 1 (Figura 27).
Fig. 26: Espectro de massa do sobrenadante de cultura do B. subtilis AMR em
meio de penas após 120h de cultivo, mostrando os peptídeos derivados da
queratina da pena.
799.0 1439.4 2079.8 2720.2 3360.6
Mass
(
m/z
)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In t e n s it y
Voyager Spec #1= > AdvBC(32,0.5,0. 1)= > NR(2.00)= > BC= > NR(2.00)[BP = 1080. 9, 190]
1079.9217
819.8509
814.4206
826.8543
1065.8939
832.8707
1049.6936
1505.9552
1171.5758
946.9434
1758.9659
1040.7560
1495.1083
2151.2563
1788.0340
1025.1377
1423.2869
2595.2921
2147.3449
2372.7889
2847.6118
3069.7440
3313.8333
3557.76
3
869.4881
73
Fig. 27: Espectro de massa dos hidrolisados de queratina da preparação
comercial 1.
Como observado, os espectros de massa da amostra comercial 1 e do
sobrenadante de cultura do microrganismo apresentam uma composição
diferente, provavelmente apresentando na amostra comercial 1 uma estrutura
diferente de nosso insumo em sua composição.
2.2. CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA - HPTLC
A figura 28 mostra os peptídeos e aminoácidos e os compara com uma
preparação comercial de queratina de penas hidrolisada denominado preparação
comercial 2, através de HPTLC (high performance thin layer chromatography) e
revelado com ninhidrina.
799.0 1639.4 2479.8 3320.2 4160.6 5001.0
Mass
(
m/z
)
0
1185.
5
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In t e n s it y
Voyager Spec #1= > Ad vBC(32,0.5,0.1)=> NR(2. 00)=> BC= >NR(2. 00)= > BC= > NR(2.00)=> BC[BP = 903. 7, 1186]
903.73
881.05
897.69
913.61
918.34
924.66
932.47
939.58
1147.65
947.90
1060.84
867.26
1087.50
1131.11
1471.96
1399.30
3465.33
74
Fig. 28: HPTLC dos hidrolisados de queratina de penas por degradação
microbiana. 1- controle de glicina; 2-peptídeos recolhidos pela membrana de 1000
Da; 3- peptídeos recolhidos pela membrana de 500 Da; 4- preparação comercial 2.
O ensaio realizado por HPTLC mostrou que a queratina de penas
hidrolisadas pelo B. subtilis AMR tem um padrão de polaridade dos aminoácidos e
peptídeos semelhante ao da preparação comercial usada. Observa-se também
que a preparação comercial 2 possui, em adição, macromoléculas de massa
molecular maior. Comparativamente, nosso procedimento parece ser melhor, por
ter apenas peptídeos de baixa massa molecular, o que confere a possibilidade de
uma melhor adesão e penetração na fibra capilar.
75
2.3. GEL DE ELETROFORESE E ZIMOGRAFIA COM GELATINA E
QUERATINA
Durante a ultrafiltração ficaram retidas nas membranas basicamente
proteínas com massa molecular acima do seu limite de exclusão, incluídos as
enzimas e moléculas de queratina solubilizadas, porém não hidrolisadas (com
peso molecular de aproximadamente 10 kDa). A figura 29 mostra uma
comparação entre os perfis eletroforéticos dos hidrolisados de queratina das
amostras comerciais 1 e 2, e dos filtrados em AMICON de 1 e 0,5 KDa. Pode-se
observar que nas amostras comerciais há a presença de material protéico de alta
massa molecular (amostra comercial 1) e ainda frações de proteínas de penas de
frango não hidrolizada na amostra comercial 2, e, em contrapartida, em nosso
hidrolisado não se observa presença de material proteico, confirmando que a
ultrafiltração foi capaz de reter proteínas de alta massa molecular.
A análise por gel de eletroforese (SDS-PAGE) tanto do retido pela
membrana como dos peptídeos menores que seu limite de exclusão (filtrado)
(Figura 30) mostrou a presença de proteínas apenas no retido pela membrana, um
resultado esperado, uma vez que peptídeos e aminoácidos estão fora do limite de
detecção da técnica, o mesmo é válido para a zimografia.
O sobrenadante de cultura além de conter os peptídeos oriundos da
hidrólise das penas, apresentava também as queratinases e peptidases
secretadas pelo Bacillus subtilis AMR. A figura 31 mostra dois zimogramas com
gelatina e queratina do sobrenadante de cultura bruto concentrado 20X em
membrana de diálise, overnight, contra polietilenoglicol. A figura 32 A representa
76
uma zimografia em gelatina, no qual apresentou atividade enzimática no material
retido e ausência desta no filtrado, confirmando, novamente, a eficácia na
separação de macromoléculas por ultrafiltração, e a figura 32 B representa um
zimograma em queratina de material retido em membrana de AMICON de 10, 1 e
0,5 KDa, mostrando que após a ultrafiltração ainda se observa atividade
queratinolítica, porém com uma atividade um pouco menor do que no
sobrenadante de penas após hidrólise microbiana.
A
BCD
Fig. 29: SDS-PAGE dos hidrolisados de queratina: comercial 2 (A), comercial 1 (B),
filtrado AMICON 1 KDa
(
C
)
e 0,5 KDa
(
D
)
. Colora
ç
ão: nitrato de
p
rata.
77
Fig. 30: SDS-PAGE do material retido e filtrado pela membrana de 1 KDa pelo
processo de ultrafiltração em AMICON. Coloração: nitrato de prata. Os n° indicam
a massa molecular do padrão.
Fig. 31: Zimografia com gelatina e queratina do sobrenadante de Bacillus subtilis
em penas demonstrando a presença de enzimas proteolíticas e queratinolíticas.
Os n° indicam a massa molecular do padrão.
78
Fig. 32: Zimograma de gelatina do material retido e filtrado pela membrana de 1K
Da (A) e de queratina do material retido em membrana de 10, 1 e 0,5 KDa (B) em
AMICON. Coloração: coomassie blue. Os n° indicam a massa molecular do
padrão.
A zimografia, tanto em gelatina quanto em queratina, mostrou que houve
perda de atividade do sobrenadante de cultura durante o processo de
ultrafiltração, quando comparado com a zimografia do sobrenadante antes da
ultrafiltração. O SDS-PAGE e a zimografia mostraram a completa ausência de
proteínas na fração peptídica confirmando que não houve contaminação do
hidrolisado com proteínas e enzimas proteolíticas respectivamente. Pode-se
verificar que no filtrado obtido após filtração em AMICON, usando-se a membrana
de 500 Dalton, não se observou proteínas, ficando as mesmas todas retidas na
membrana.
A
B
79
3. APLICAÇÃO E AVALIAÇÃO COSMÉTICA
Após as aplicações dos produtos nos diferentes tipos de mechas,
observaram-se os graus de hidratação a seguir (tabela 7):
Tabela 7: Teor de hidratação obtido por cada tipo de cabelo em unidades
arbitrárias (UA).
A – mecha ponto zero (lavada somente com lauril sulfato de sódio) e seca sem
calor (naturalmente); B – mecha lavada com xampu e condicionador de peptídeos
hidrolisados de proteínas 10% e seca com calor e placa térmica (180°C); C -
mecha lavada com xampu e condicionador de peptídeos hidrolisados de proteínas
10%, e seca sem calor (naturalmente); D – mecha controle (lavada com xampu e
condicionador controle) seca com calor e placa térmica (180°C); E - mecha
controle (lavada com xampu e condicionador controle) seca sem calor
(naturalmente).
Tipos de tratamento
(médias obtidas ao final de 5 semanas em UA)
Grupo de Mechas
A B C D E
1 – Virgem 7,363 8,236 8,108 7,454 7,836
2- Tingido 7,181 8,145 8,126 7,017 7,654
3 – Tingido com
luzes 7,09 7,781 7,526 7,017 7,29
4 – Tingido com
alisamento 6,454 7,761 6,563 7,09 6,399
5 – Totalmente
descolorado 7,181 7,672 7,563 7,036 7,326
80
As figuras 33 e 34 representam as médias dos resultados da avaliação de
hidratação do grupo de mechas secas sem calor (figura 33) e com calor e placa
térmica (figura 34) descrita na tabela 7. Para ambas as situações foram feitas
comparações entre a hidratação das mechas controle, ponto zero e com peptídeo
hidrolisado de proteína 10%.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Hidratação (UA)
Virgem Tingido Tingido com
luzes
Tingido com
alisamento
Totalmente
descolorado
Tipo de cabelo
A
C
E
Fig. 33: Avaliação da hidratação para as mechas secas sem calor (temperatura
ambiente). Tipo de tratamento: A – Ponto zero; C – Mecha tratada com peptídeo;
E – Mecha controle
81
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Hidratação (UA)
Virgem Tingido Tingido com
luzes
Tingido com
alisamento
Totalmente
descolorado
Tipo de cabelo
A
B
D
Fig. 34: Avaliação da hidratação para as mechas secas com calor e placa térmica.
Tipo de tratamento: A – Ponto zero; B – Mecha tratada com peptídeo; D – Mecha
controle
A partir da análise de variância ANOVA foi possível observar que as
comparações entre mechas do ponto zero (mecha A) com as mechas controle
com calor e placa térmica (mecha D) e sem calor (secas naturalmente -
temperatura ambiente – mecha E) não apresentaram resultados significativos ao
nível de 5%, na hidratação capilar. Também não apresentaram resultados
significativos na hidratação as mechas tratadas com o peptídeo hidrolisado de
proteína e secagem sem calor (naturalmente – mecha C). Porém as mechas que
utilizaram o peptídeo hidrolisado de proteína 10% e secagem com calor e placa
térmica (mecha B), tiveram uma hidratação significativa ao nível de 5%. Isto
confirma de forma mais clara e consistente os resultados obtidos anteriormente
através do método das médias.
82
Portanto, pode-se observar que o aquecimento foi um fator que influenciou
na melhora da hidratação, possivelmente facilitando a aderência destes peptídeos
de hidrolisado protéico nas fibras capilares, e ao mesmo tempo, pode-se observar
que a base utilizada (amostra controle) não interferiu na hidratação.
A avaliação sensorial realizada para verificar qual das mechas (com
peptídeos de hidrolisado de penas de frango a 10% e controle) apresentava maior
brilho e emoliência, deram resultados distintos de acordo com o tipo de secagem
realizada. Para o grupo de mechas secas sem calor (naturalmente - temperatura
ambiente) foi observado que o maior percentual de preferência das avaliadoras
(65%) foi pelas mechas que haviam sido tratadas com os peptídeos de
hidrolisados de penas de frango a 10%. Um menor grupo das avaliadoras (35%)
não foi capaz de optar por qual dos grupos apresentava maior brilho e emoliência
(Figura 35). Em contrapartida, para o grupo de mechas secas com calor e placa
térmica foi observado que o maior percentual de preferência das avaliadoras
(90%) foi pelas mechas que haviam sido tratadas com o peptídeo de hidrolisado
de penas de frango a 10% e um menor (10%) não foi capaz de optar por qual dos
grupos apresentava maior brilho e emoliência (Figura 36). Estes resultados foram
fundamentais para avaliar o quanto o uso do peptídeo de hidrolisado de penas de
frango interferiu na estrutura capilar tornando-a mais sedosa e brilhosa,
corroborando com os resultados obtidos na avaliação de hidratação.
83
Avaliação Sensorial
Aspectos: brilho e maciez
65%
0%
35%
Hidrolisado de Peptídeo a10% Controle Não Diferenciaram as Mechas
Fig. 35: Gráfico dos resultados da análise sensorial para o grupo de mechas secas sem
calor
Fig. 36: Gráfico dos resultados da análise sensorial para o grupo de mechas secas com
calor
Avaliação Sensorial
Aspectos: brilho e maciez
90%
0%
10%
Hidrolisado de Peptídeo a10% Controle Não Diferenciaram as Mechas
84
4. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
A Figura 37 mostra-nos uma imagem da fibra capilar da amostra O, onde é
possível verificar a sobreposição e a delimitação das células cuticulares de
superfície (DAWBER E NESTE, 1996).
As figuras 38 a 40 mostram as imagens das hastes capilares antes e após a
aplicação dos produtos, submetidas a secagem natural e ao calor. É possível
verificar presença de escamas cuticulares danificadas, com as bordas levantadas
e rompidas, como também a presença de ranhuras, característico de dano capilar.
Nas amostras submetidas ao calor foi possível verificar a presença de
material orgânico aderido às escamas cuticulares e a restauração de algumas
partes desta estrutura.
As setas indicam as características descritas.
Fig. 37: Microscopia eletrônica de uma fibra capilar da amostra O. A seta indica as escamas
cuticulares
85
Fig. 38: Imagem de uma fibra capilar de cabelo alisado e com tintura (amostra A). 1. Sem
tratamento (ponto zero), 2. Após tratamento e secagem com calor, 3. Após tratamento e
secagem sem calor (naturalmente).
1
2
3
86
Fig. 39: Imagem de uma fibra capilar de cabelo descolorido (amostra B). 1. Sem tratamento
(ponto zero), 2. Após tratamento e secagem com calor, 3. Após tratamento e secagem sem
calor (naturalmente).
1
2
3
87
Fig. 40: Imagem de uma fibra capilar de cabelo tingido (amostra C), 1. Sem tratamento
(ponto zero), 2. Após tratamento e secagem com calor, 3. Após tratamento e secagem sem
calor (naturalmente).
3
2
1
88
DISCUSSÃO
Os peptídeos são amplamente usados em xampus e condicionadores,
contribuindo para o brilho da estrutura e proteção capilar. Um dos fatores
fundamentais que estão envolvidos na interação do cabelo e aminoácidos em uma
solução aquosa: a difusão e carga elétrica das moléculas. Devido ao seu pequeno
tamanho e sua hidrofobicidade, a difusão é considerada o principal método de
penetração dos aminoácidos. Mas devido à hidrofobicidade natural do cabelo
humano (camada lipídica que envolve a cutícula) é formada uma barreira natural.
Por isso os cabelos danificados têm uma afinidade muito mais alta para os
aminoácidos do que os cabelos normais. Além disso, o número de grupos iônicos
nos cabelos danificados também contribui para esta maior afinidade (OSHIMURA,
2008).
Os aminoácidos ácidos são aqueles que possuem um grupo carboxila
adicional e os básicos são aqueles que possuem um grupo amino adicional. Esta
classificação é útil para o entendimento da natureza da interação destas
moléculas com o cabelo. O aminoácido arginina por exemplo é um aminoácido
básico porque possui um grupo guanidina. A constante de dissociação ácida do
grupo guanidina é 9,04. Deste modo o grupo apresenta uma carga catiônica em
pH abaixo de 9. Portanto a arginina tem uma forte afinidade pelo cabelo em pH na
faixa 4-9. Os aminoácidos neutros e acídicos apresentam uma carga negativa ou
neutra na faixa do pH 3-7 e devido a isso eles quase não são captados pelo
cabelo em soluções aquosas. Entretanto em cosméticos, novos fatores são
89
introduzidos nesta interação e mesmo aminoácidos neutros e acídicos são
introduzidos no cabelo (OSHIMURA, 2008).
Existem basicamente alguns tipos de danos prejudiciais ao cabelo, tais
como: queda, ruptura das cadeias cistínicas provocadas por certos produtos
químicos (alisamento e ondulação, tinturas permanentes e descoloração), fatores
ambientais (radiação UV) e tratamento mecânico de escovação e secador, tendo
como consequência uma desestabilidade molecular, podendo destruir as
propriedades físicas do cabelo, tornando-os mais porosos e menos resistentes
(LERSCH E MACZKIEWITZ, 2003).
A radiação ultravioleta (UV) provoca uma foto-oxidação protéica que pode
levar a clivagem das ligações dissulfeto, que são ligações cruzadas de proteínas,
e quebrando a ligação tioéster, resultando no desprendimento dos lipídeos de
superfície. Estas reações levam a deteriorização das propriedades dos cabelos,
notadamente percebida pelos consumidores na forma de baixa maleabilidade,
fragilidade e secura, perda de brilho, e em casos extremos perda de resistência
(quebra da haste capilar) (RODDICK-LANZILOTTA et al, 2006).
Descolorir ou tratar os cabelos com produtos para permanente faz diminuir
a quantidade de cistina da fibra capilar. Descolorações drásticas levam também a
perda de tirosina e metionina (SCANAVEZ, 2001). O uso de produtos com
hidrolisados de queratina pode minimizar essa perda e melhorar as características
do cabelo. Cabelos desgastados por agentes mecânicos, radiação UV e agentes
químicos perdem aminoácidos e estudos demonstraram que preferencialmente
lisina histidina, cistina, metionina e triptofano são os mais perdidos (O’TOOLE et
al, 2007).
90
Verificou-se melhora na fibra capilar com a utilização de nosso peptídeo de
massa molecular menor que 500 Da, apresentando melhora no brilho e maciez,
através dos testes de hidratação, sensorial e microscopia eletrônica, e, ao mesmo
tempo, comprovou, através dos ensaios de SDS-PAGE e HPTLC, que são de
baixa massa molecular.
Obteve-se aumento significativo na hidratação, principalmente com o uso
do calor, que possivelmente facilitou a entrada ou a aderência dos peptídeos ao fio
e isto ficou comprovado com a preferência das avaliadoras, e com a microscopia
eletrônica, onde visualizou-se a presença de material orgânico na superfície
capilar, sugerindo uma melhora na sua restauração.
Os peptídeos e aminoácidos podem ser também incorporados em
colorações. Os agentes de coloração são divididos em três categorias principais:
permanentes, semi- permanente ou direta e temporária. Corantes permanentes
são geralmente oxidativos e podem conter peróxido de hidrogênio como agente
oxidante. Estes agentes danificam o cabelo. Na coloração semi-permanente ou
direta as moléculas do corante são aplicadas nos cabelos e duram de 6-12
lavagens. E nas temporárias há a sobreposição do pigmento na fibra capilar. Estes
tipos de colorações não contêm peróxidos. Novas estratégias têm sido
desenvolvidas nos últimos anos inclusive para diminuir os danos e aumentar a
durabilidade das colorações, incluindo-se metodologias que empregam anticorpos
anti-queratina e peptídeos específicos. Com a proteína de queratina um novo
método tem sido usado em colorações como a KENJI et al, (JP09-003100 1997) e
de IGARASHI et al.(2007), (U.S. Patent No. 5.597.386) que descrevem uma
coloração que em sua composição há um anticorpo anti-queratina que se liga
91
covalentemente ao pigmento ou corante. O anticorpo se liga ao cabelo
aumentando a coloração da fibra. Em outra estratégia o agente cosmético é ligado
diretamente a proteína ou aos hidrolisados de proteínas. A patente No 5.192.332
(LANG et al, 1993) descreve uma coloração temporária que contém proteína
animal ou vegetal ou hidrolisada que contém resíduos da molécula corante
enxertada na cadeia da proteína. A proteína serve como um agente condicionador.
Hidrolisado de proteína do leite, trigo, da soja são alguns tipos de proteínas
que são utilizados em cosméticos para os cabelos, atuando na estrutura capilar
dando-lhes resistência. Muitos processos químicos como tintura, alisamento,
relaxamento e descoloração, entre outros, danificam a estrutura capilar tornando-a
porosa, seca, sem brilho e sem maciez, modificando a textura e a penteabilidade
dos cabelos. Embora muito usados na cosmética, poucos trabalhos científicos
relatam a importância dos hidrolisados de queratina e mesmo de outras proteínas
na cosmética capilar (TOMITA et al, 1994 U.S. Patent No. 5.314.873). Há
inúmeras patentes depositadas abordando peptídeos, obtidos após hidrolise
química de proteínas com a soja, trigo, etc. Não há, portanto, nenhuma patente
sobre a hidrólise enzimática de proteínas como a queratina de pena de frango ou
mesmo de cabelo humano, exceto a que foi desenvolvida pelo nosso grupo com
hidrolisados enzimáticos de penas de frango (em anexo o protocolo PCT/ BR
2008/000180) e no qual apresentou um bom rendimento. Também não há
trabalhos científicos publicados com hidrolisados de queratina obtidos
enzimaticamente, demonstrando a originalidade do processo desenvolvido em
nosso laboratório.
92
E além disso, os ensaios de SDS PAGE, zimografia e HPTLC, confirmaram
que a ultrafiltração por AMICON reteve as moléculas de alto peso molecular,
inclusive as enzimas, e que somente os peptídeos de baixo peso molecular foram
utilizados nos testes em mechas de cabelo. Trabalhos científicos, entretanto,
descrevem as ações de queratinases na queratina tanto de penas como de
cabelos humanos e outras estruturas epidérmicas, mas com os objetivos voltados
para a área de compostagem e reaproveitamento de resíduos agroindustriais
(BRANDELLI, 2008).
O comitê “Scientific committee on consumer products” (SCCP), publicou,
durante a 4
th
plenária, ocorrida em 21 de junho de 2005 um artigo intitulado
“Opinion on amino acids obtained by hydrolysis of human hair”. Nesta opinião, o
comitê concluiu que o risco no presente momento, do uso de produtos para
aplicação tópica de aminoácidos obtidos pela hidrólise química do cabelo
humanos ou de penas de frango nas condições descritas (hidrolise ácida com HCl
20%/ 6 horas) seria negligenciável. O anexo II do diretivo cosmético 76/768/EEC
que é a lista de substâncias que não podem fazer parte de produtos cosméticos
proíbe o uso de células, tecidos ou produtos de origem humana em produtos
comercializados nos Estados Unidos. Estes materiais estão listados na entrada
416 do anexo. São proibidos devido ao seu risco potencial de transmitir doenças
degenerativas do sistema nervoso como a doença de Creutzfeldt-Jakob, a
encefalopatia espongiforme humana, causada por um príon e também pelo risco
de contaminação com doenças virais. Esta proibição exclui materiais derivados de
cabelo humano nos produtos cosméticos. O COLIPA (“The European Cosmetic
Toiletry and Perfumery Association”) requereu esta modificação com o objetivo de
93
permitir o uso de alguns materiais derivados do cabelo humano produzidos com
segurança. A modificação proposta (entrada 416) foi como descrevemos no item
abaixo:
“Cells, tissues or products of human origin. However, amino acids obtained by
hydrolysis of human hair may be used provided that the following method has been
used and certified by the producer: - Hydrolysis with HCl (> 20% throughout the
whole process) for at least 6 hours at 100°C.”
Neste contexto, nosso peptídeo de hidrolisado de pena de frango apresenta
algumas vantagens, como por exemplo, a não utilização de solventes, visto que
todo nosso processo é microbiano e o meio de obtenção destes hidrolisados é um
tampão. Vale ressaltar, também, que o microrganismo utilizado é seguro (GRAS –
Generally Recognized As Safe) e que o processo não produz efluentes tóxicos e
tem alto valor agregado, apresentando, assim, uma série de vantagens em relação
aos similares comerciais, tais como: coloração clara, veículo não químico (tampão)
e pureza (massa molecular baixa).
Para o mercado de cosméticos os aminoácidos e peptídeos são geralmente
fornecidos na forma de pó e usados em produtos para pele como umectantes
(arginina, lisina e acido glutâmico) e em produtos para cabelo com o objetivo de
melhorar a aparência e as propriedades físicas (como por exemplo prolina e
cisteina). Em nosso trabalho obtivemos estes hidrolisados na forma líquida, porém
com uma coloração mais clara em relação as amostras comerciais 1 e 2, que se
apresentavam na forma líquida e escura. Isto pode ocasionar modificações no
aspecto do produto final ou até mesmo na sua estabilidade ou pode provocar
alguma incompatibilidade com outros componentes da fórmula, visto que este tipo
94
de hidrolisado protéico é obtido quimicamente. A incorporação de peptídeos,
obtidos pela hidrólise da queratina da lã, em soluções aquosas ou em lipossomas
podem aumentar a elasticidade e a umidade da pele, bem como pode aumentar a
estabilidade em uma formulação cosmética (BARBA et al., 2008).
O brilho está relacionado com a forma em que as cutículas se encontram,
pois quanto mais coesa elas estiverem, ou seja, uma sobreposta a outra, maior
será o brilho. Uma vez que a cutícula já não está mais aderida em seu lugar, as
escamas começam a se desprender e a se levantar da superfície da estrutura
capilar, tornando o cabelo danificado. Quanto mais danificado o cabelo estiver
menor é o brilho. O brilho está diretamente relacionado com um cabelo saudável,
pois quanto maior for o brilho mais saudável será o cabelo e isso é muito buscado
pelo consumidor (SCHUELLER E ROMANOWSKY, 2002).
O método de medição utilizado tem como função verificar o grau de
hidratação da superfície cutânea e como a avaliação foi feita para verificar o grau
de hidratação da haste capilar, pode ter ocorrido alguma interferência nos
resultados, uma vez que, a estrutura capilar apresenta algumas diferenças em
relação à pele como, por exemplo, um menor grau hídrico (PEYREFITTE,
MARTINI & CHIVOT 1998).
Observou-se que o grupo de mechas tratadas com preparação controle não
apresentou hidratação significativa como às tratadas com peptídeo hidrolisado de
proteínas de pena de frango a 10%. A média de hidratação obtida pelo grupo de
mechas tratadas com a formulação controle durante as duas avaliações (secagem
com calor e naturalmente) foi inferior à do grupo tratado com o peptídeo
95
hidrolisado a 10%. Inclusive as mechas que foram submetidas ao calor obtiveram
menor grau de hidratação do que as que secaram naturalmente em temperatura
ambiente. Esse dado confirma que a base utilizada na formulação não interferiu na
hidratação (VILLA et al, 2008). Desta forma, torna-se claro a importância dos
componentes peptídicos (queratina hidrolisada) na estrutura capilar,
proporcionando um grau maior de hidratação. Isso se dá devido à função que
esses componentes têm em proteger, enriquecer ou reparar as fibras do cabelo
tornado-as mais hidratadas, pois os fragmentos de aminoácidos e de polipeptídios
das proteínas hidrolisadas que são compostos de um agrupamento de aminoácido
e apresenta peso molecular baixo, parecem se ligar a queratina do cabelo,
restaurando a estrutura protéica danificada (PAOLA et al, 1999).
Em relação as patentes temos como exemplo o depósito WO2008/029064
(THOREL, 2008) sobre os extratos de soja e/ ou trigo para combater alterações
celulares, incluindo no cabelo, devido as radiações UVA e UVB. A mesma
proteção pode ser obtida com peptídeos sintéticos (BECK et al, 2008, WO
2008/073368). A patente publicada (CHUNG et al., 2007), WO2007049905, relata
o efeito de peptídeos em aumentar o crescimento de cabelo e melhorar o
ondulado de cabelos, onde em nosso trabalho foi possível verificar uma melhora
no aspecto da mecha ondulada tratada quimicamente. O peptídeo estável e com
grande poder de penetração possui aminoácidos específicos com a seqüência da
tirosina humana β4 (Tβ4). HUANG et al (2005, 2006) descreve a produção de
peptídeos sintéticos em condicionadores para cabelo, pele, unhas e colorações;
(WO2005.025505, WO2006/028503). Outras patentes usam os peptídeos em
condicionadores (FAHNESTOCK et al, 2008, em WO2008/057463).
96
O’TOOLE et al., (2007) em WO200051556, descreve uma composição de
cosmético capilar contendo quatro ou mais aminoácidos ente eles histidina,
metionina, tirosina, triptofano e cisteína. Substâncias que formam filmes protetores
e incluem em sua composição proteínas animais vegetais hidrolisadas
(PUCHALSKI et al., 1983, U.S. Patent No 4,416,873; EL MENSHAWY et al.,1984,
U.S. Patent No. 4.482.537) proteínas da seda (PHILIPPE et al., 2001, US patent
No.6.280,747) e peptídeos de queratina de cabelo humano como cicatrizantes
(VAN DYKE et al., 2001, U.S. Patent n° 6.270.791).
Através dos resultados obtidos foi observado que o cabelo virgem por estar
com sua cutícula intacta obteve um grau maior de hidratação, uma vez que
permite que o produto permaneça em sua estrutura. Já em relação aos cabelos
tratados quimicamente foi observado que o teor de absorção é maior quanto
menor for o grau de agressão em sua estrutura capilar (EXPÓSITO, 1995).
A microscopia da haste do pêlo é essencial para o diagnóstico de muitas
anormalidades, particularmente doença fúngica e distúrbios congênitos e
hereditários da haste do pêlo, para avaliar o desgaste do pêlo, e para esclarecer a
causa da queda de cabelos (DAWBER, 1996, BERKER, 2002).
A microscopia óptica é limitada em resolução e tem uma profundidade
estreita de foco. A microscopia eletrônica de varredura é capaz de uma resolução
muito alta (até 2 nm em materiais biológicos) e possui um foco em profundidade
de imagem que é maior do que a espessura normal do espécime
(aproximadamente 100 nm) (DAWBER, 1996), sendo uma técnica muito utilizada
atualmente para análise de fibras capilares (ANDREAZZI, 2001).
97
A microscopia eletrônica de varredura possibilita determinar a forma de um
material, o tamanho das partículas que o compõem e seu arranjo (ANDREAZZI,
2001), onde com esta técnica foi possível verificar, nas hastes capilares
analisadas, a presença de material orgânico, bem como a delimitação das bordas
contrastadas, confirmando com isso o que foi observado nas determinações de
hidratação e nos testes de sensorial aplicado às mechas.
Também, tem aumentando o uso de aminoácidos em produtos
antienvelhecimento. Em 2004, 20 toneladas de aminoácidos foram usados na
indústria de cosmético e até 2010 há uma previsão de 46 toneladas. No
tratamento da pele, aminoácidos especificamente escolhidos, purificados como a
serina, treonina, alanina e ácido piroglutâmico já são ingredientes populares por
serem ingredientes-chave do fator natural de hidratação (NMF); embora serem
poucos lipofílicos, tendem a permanecer na superfície do estrato córneo e a agir
apenas como moléculas ligadas à água. Normalmente estes aminoácidos e
peptídeos são obtidos por hidrólise de proteínas como colágeno animal, proteínas
do leite, da seda e queratina humana do cabelo. Entretanto o uso de enzimas para
hidrólise de proteínas, com peptidases é uma opção ainda não explorada no
mercado dos cosméticos (LINTNER, 2008).
As queratinases e outras peptidases têm adquirido grande importância
biotecnológica devido a suas aplicações industriais crescentes. Atualmente são
utilizadas pela indústria farmacêutica, em medicamentos e cosméticos, pela
indústria de detergentes, de alimentos e indústria coureira como depilantes
Também são utilizadas para tratamento de tecidos na indústria têxtil e em
processo de biorremediação e compostagem (BRANDELLI, 2008; VERMELHO et
98
al, 2008b). A patente US n° 4,232,123 (BRAEUMER ET AL, 1980) descreve a
obtenção de peptídeos obtidos com enzimas proteolíticas comerciais, mas usando
também, em conjunto, o método químico. Caracterizamos, com isso, uma
vantagem em nosso processo de obtenção destes hidrolisados ou peptídeos, que
foram obtidos exclusivamente pelo método enzimático.
99
CONCLUSÃO
I. Neste trabalho elaborou-se um processo biotecnológico que foi patenteado
para a obtenção de hidrolisados de queratina com metodologia enzimática. A
matéria prima utilizada, as penas de frango, que são abundantes no Brasil e o
descarte deste resíduo (800 mil toneladas previstas para 2008) constituem um
problema para a indústria avícola. Foi possível verificar neste trabalho que
houve uma degradação de aproximadamente 95% das penas, sendo este
uma ferramenta útil para o descarte de penas das avícolas e com um possível
potencial de obtenção de insumos para uso cosmético, além de ser um
processo vantajoso, por evitar a contaminação do meio ambiente por produtos
químicos.
II. A utilização da ultrafiltração permitiu separar os peptídeos (baixa massa
molecular) da enzima (alta massa molecular) e outras macromoléculas
presentes no meio, tornando-se um insumo cosmético possível de ser
incorporado em bases cosméticas. Esta separação foi comprovada pelos géis
de eletroforese e zimogramas.
III. Pode-se observar também que nosso insumo apresentou um perfil
cromatográfico, em HPTLC, muito semelhante ao insumo comercial, provando
que é possível obter estes produtos de maneira menos tóxica. Além disso,
nosso insumo apresenta uma enorme vantagem em relação a estes insumos
comercializados no mercado, que é a característica de possuir uma coloração
clara. Estas preparações comerciais apresentaram, além dos peptídeos,
100
contaminantes protéicos, de alta massa molecular, enquanto nosso insumo
somente moléculas de baixa massa molecular.
IV. A incorporação dos peptídeos menores que 500 Da em uma base xampu e
creme rinse, e sua posterior aplicação em mechas de cabelo, utilizando
métodos de secagem sem calor (temperatura ambiente) e com calor (placa
térmica), possibilitou verificar que o aquecimento foi um fator que pode ter
influenciado no grau de hidratação, pois como observado nos resultados, o
cabelo tratado com hidrolisado de peptídeos de proteína de pena de frango
10% e seco com calor e placa térmica (180° C), proporcionou um aumento
significativo na hidratação em relação às mechas submetidas a secagem em
temperatura ambiente (sem calor).
V. Em relação ao teste de avaliação sensorial, percebeu-se que o parâmetro de
brilho e emoliência foi melhor nas mechas tratadas com os peptídeos, nos
cabelos secos com calor e placa térmica (180° C), quando comparado aos
demais. A base utilizada não influenciou nos resultados.
VI. A microscopia eletrônica nos permitiu avaliar a estrutura de uma haste capilar
sem tratamento químico, bem como antes e após a aplicação do xampu e do
creme rinse contendo peptídeos de 500 Da, utilizando temperatura ambiente e
secagem por placa térmica (180°C).
VII. Portanto, concluiu-se que nosso hidrolisado de peptídeo de até 500 Da, por
ter como diferencial sua baixa massa molecular, provavelmente é o fator que
permite sua fácil e rápida penetração nos fios quando utilizado calor,
fornecendo um grau maior de hidratação, brilho e maciez aos mesmos, além
de não ter interferido na coloração das bases utilizadas neste trabalho.
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