ads:
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DE TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
AVALIAÇÃO DE VARIÁVEIS OPERACIONAIS E
APLICAÇÃO DE ENFOQUE HÍBRIDO NA MODELAGEM DO
PROCESSO DE PRODUÇÃO DE PENICILINA G ACILASE
POR Bacillus megaterium
Fábio Cristiano Tonin
São Carlos – SP
2005
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DE TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
AVALIAÇÃO DE VARIÁVEIS OPERACIONAIS E
APLICAÇÃO DE ENFOQUE HÍBRIDO NA MODELAGEM DO
PROCESSO DE PRODUÇÃO DE PENICILINA G ACILASE
POR Bacillus megaterium
Fábio Cristiano Tonin
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Engenharia
Química da Universidade Federal de São
Carlos como parte dos requisitos necessários
à obtenção do título de Mestre em
Engenharia Química, área de concentração
em Pesquisa e Desenvolvimento de
Processos Químicos.
Orientador:
Prof. Dr. Antonio José Gonçalves da Cruz
São Carlos – SP
2005
ads:
Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da
Biblioteca Comunitária da UFSCar
T665av
Tonin, Fábio Cristiano.
Avaliação de variáveis operacionais e aplicação de
enfoque híbrido na modelagem do processo de produção de
penicilina G acilase por Bacillus megaterium / Fábio
Cristiano Tonin. -- São Carlos : UFSCar, 2005.
85 p.
Dissertação (Mestrado) -- Universidade Federal de São
Carlos, 2005.
1. Engenharia bioquímica. 2. Automação. 3.
Simulação. 4. Redes neurais. 5. Penicilina G acilase –
fermentação. I. Título.
CDD: 660.63 (20
a
)
Dedicação especial
Aos meus pais
José Carlos e Maria de Fátima
& meu irmão, Erick
Por estarem presentes na minha vida.
Agradecimentos
A Deus por dar-me fé e forças para enfrentar os desafios do dia-a-dia.
Ao professor Antonio José Gonçalves da Cruz pela orientação, dedicação, apoio e
amizade ao decorrer destes anos o qual tornou possível a conclusão deste trabalho.
Aos professores do Departamento de Engenharia Química que direta ou indiretamente
contribuíram para minha formação e elaboração deste trabalho, em especial aos professores
Roberto de Campos Giordano e Rosineide Gomes da Silva.
Aos amigos Edson, Vanessa, Gilson, Charles e Marcelo do departamento de
Engenharia Química pela amizade, disposição e orientação, pois com palavras sábias sempre
mostraram um norte a ser seguido.
A todos os companheiros, colegas e amigos de departamento, que de uma forma ou de
outra colaboraram para a realização dessa dissertação, fosse com palavras de descontração,
amizade ou mesmo de orientação.
Aos meus familiares que sempre mostraram carinho e amor por eu estar realizando este trabalho.
Aos meus amigos de São Carlos, Aline, Fernanda, Adriano, Haron, Pereira, Lúcio,
Breno, Francisco, Camila, Simone, Stella, Thais, e aos de Rio Claro, Andres, Leandro,
Fernando, Daniel, Fábio, Ronald, que me ajudaram a fortalecer meu trabalho com um simples
bate-papo ou alguma brincadeira nas horas mais complicadas.
A minha companheira e mais que amiga Fernanda que com gestos e palavras de amor,
carinho e incentivo sempre mostrou o caminho que eu deveria seguir.
Ao CNPq e FAPESP pelo auxílio financeiro e ao DEQ/UFSCar pela disposição dos
equipamentos e materiais dos laboratórios para a realização deste trabalho.
A todos meu muito obrigado, pois fico feliz em saber que vocês acreditam em mim.
Resumo
Este trabalho teve por objetivo estudar a influência de condições operacionais,
particularmente a concentração de oxigênio dissolvido, na produção da penicilina G acilase
(PGA) em cultivos empregando bactéria Bacillus megaterium em biorreator tipo tanque
agitado e aerado. A importância desta variável reside no fato que tanto sua falta como seu
excesso pode prejudicar a produção da enzima.
A análise dos dados experimentais permitiu identificar a melhor condição
experimental: experimento realizado com controle de oxigênio dissolvido em 10% da
saturação. Em relação à composição dos meios, esta não se mostrou significativa. A
substituição do ácido fenilacético pelo acetato de potássio, bem como a redução de dezoito
para sete aminoácidos não teve efeito sobre as concentrações de células e de enzima obtidas.
A operação do cultivo em batelada alimentada e o controle de pH não se mostraram efetivos
para melhorar a produção da enzima.
Propôs-se modelo híbrido combinando equação de balanço com redes neurais
artificiais para inferir a concentração celular ao longo do processo. O modelo proposto foi
capaz de inferir com boa precisão a concentração celular nos ensaios de treinamento e obteve
boas previsões nos ensaios de validação para alguns testes realizados.
Abstract
In the present work it was studied the influence of operational conditions particularly
dissolved oxygen concentration in the penicillin G acylase (PGA) production. The
experiments were carried out in aerated and agitated bioreactor employing bacteria Bacillus
megaterium. The production of PGA is sensitive to dissolved oxygen concentration during its
cultivation. As much its lack as its excess can be reduces PGA production.
As regarding dissolved oxygen concentration the experiments realized in 10% of its
saturation showed the better results. The media composition was not significantly influence
on enzyme production. The use of potassium acetate instead of phenyl acetic acid as well as
the reduction of eighteen for seven amino acids did not have effect on the cells’ and enzyme
concentrations obtained.
It was proposed an hybrid model combining mass balance equation with artificial
neural network to infer the cellular concentration during the process. The proposed model
showed good results to modeling cellular concentration in both training and validate data sets.
Lista de Figuras
Figura 2.1: Ilustração em 3D da estrutura da PGA obtida por difração de raio-X. 20
Figura 2.2: Hidrólise enzimática da PG. 21
Figura 2.3: Representação de um neurônio humano. 31
Figura 2.4: Resultado do treinamento para a rede de inferência com dados filtrados.
(A) ensaio I, (B) ensaio II e (C) ensaio III. 36
Figura 2.5: Resultado da validação para a rede de inferência da fase exponencial.
(A) ensaio IV, (B) ensaio V e (C) ensaio VI. 37
Figura 3.1: Procedimento experimental de produção de PGA por Bacillus
megaterium. 43
Figura 3.2: Preparo dos criotubos com Bacillus megaterium. 46
Figura 3.3: Esquema do aparato experimental ilustrando equipamentos. 47
Figura 4.1: Valores experimentais da concentração celular dos cultivos 1 a 6. 54
Figura 4.2: Valores experimentais da atividade enzimática dos cultivos 1 a 6. 55
Figura 4.3: Concentração de oxigênio dissolvido para os ensaios de 1 a 6. 56
Figura 4.4: Fração molar de CO
2
da saída do biorreator para os ensaios 1 a 6. 56
Figura 4.5: Valores de agitação dos ensaios 1 a 6 realizados 57
Figura 4.6: Valores experimentais da concentração celular dos cultivos 7 a 13. 58
Figura 4.7: Valores experimentais da atividade enzimática dos ensaios 7 a 13. 59
Figura 4.8: Concentração de oxigênio dissolvido para os ensaios de 7 a 13. 59
Figura 4.9: Fração molar de CO
2
da saída do biorreator para os ensaios 7 a 13. 60
Figura 4.10: Valores de agitação dos ensaios 7 a 13 realizados. 60
Figura 4.11: Modelo neural híbrido. 63
Figura 4.12: Esquema ilustrativo da estrutura de rede neural utilizada. 64
Figura 4.13: Treinamento da rede neural com 15 neurônios na camada oculta e
500 apresentações. (A) Ensaio 1, (B) Ensaio 2, (C) Ensaio 3 e (D) Ensaio 6. 66
Figura 4.14: Concentração celular dos ensaios prevista pelo modelo híbrido.
(A) Ensaio 1, (B) Ensaio 2, (C) Ensaio 3 e (D) Ensaio 6. 67
Figura 4.15: Resultados de validação apresentados pela Rede Neural previamente
treinada com 15 nco e 500 apresentações para os ensaios 4 e 5. (A) Ensaio 4 e
(B) Ensaio 5. 68
Figura 4.16: Concentração celular dos ensaios prevista pelo modelo híbrido na etapa
de validação. (A) Ensaio 4 e (B) Ensaio 5. 68
Figura 4.17: Treinamento da rede neural com 15 neurônios na camada oculta e
500 apresentações. (A) Ensaio 8, (B) Ensaio 9, (C) Ensaio 11, (D) Ensaio 12 e
(E) Ensaio 13. 69
Figura 4.18: Concentração celular dos ensaios prevista pelo modelo híbrido.
(A) Ensaio 8, (B) Ensaio 9, (C) Ensaio 11, (D) Ensaio 12 e (E) Ensaio 13. 70
Figura 4.19: Resultados de validação apresentados pela Rede Neural previamente
treinada com 15 nco e 500 apresentações para os ensaios 7 e 10. (A) Ensaio 7 e
(B) Ensaio 10. 71
Figura 4.20: Concentração celular dos ensaios prevista pelo modelo híbrido na etapa
de validação. (A) Ensaio 7 e (B) Ensaio 10. 71
Figura 4.21: Variação do erro em função do número de apresentações para o número
de neurônios na camada oculta (aa
total
, com os ensaios 1, 2 e 3 usados no treinamento). 72
Figura 4.22: Variação do erro em função do número de apresentações para o número
de neurônios na camada oculta (aa
pref
, com os ensaios 8, 9, 11 e 12 usados no
treinamento). 72
Figura 4.23: Treinamento da rede neural com 15 neurônios na camada oculta e
200 apresentações. (A) Ensaio 1, (B) Ensaio 2 e (C) Ensaio 3. 73
Figura 4.24: Concentração celular dos ensaios prevista pelo modelo híbrido.
(A) Ensaio 1, (B) Ensaio 2 e (C) Ensaio 3. 74
Figura 4.25: Resultados de validação apresentados pela Rede Neural previamente
treinada com 15 nco e 200 apresentações. (A) Ensaio 4 e (B) Ensaio 5. 75
Figura 4.26: Concentração celular dos ensaios prevista pelo modelo híbrido na etapa
de validação. (A) Ensaio 4 e (B) Ensaio 5. 75
Figura 4.27: Treinamento da rede neural com 15 neurônios na camada oculta e
200 apresentações. (A) Ensaio 8, (B) Ensaio 9, (C) Ensaio 11 e (D) Ensaio 12. 76
Figura 4.28: Concentração celular dos ensaios prevista pelo modelo híbrido. (A)
Ensaio 8, (B) Ensaio 9, (C) Ensaio 11 e (D) Ensaio 12. 77
Figura 4.29: Resultados de validação apresentados pela Rede Neural previamente
treinada com 15 nco e 200. (A) Ensaio 7, (B) Ensaio 10 e (C) Ensaio 13. 78
Figura 4.30: Concentração celular dos ensaios prevista pelo modelo híbrido na etapa
de validação. (A) Ensaio 7, (B) Ensaio 10 e (C) Ensaio 13. 79
Lista de Tabelas
Tabela 2.1: Algumas empresas que utilizam PGA imobilizada e seus respectivos
microrganismos produtores. 21
Tabela 3.1: Composição do meio sólido empregado para preservação e manutenção do
Bacillus megaterium. 41
Tabela 3.2: Solução contendo aminoácidos livres. 41
Tabela 3.3: Solução contendo aminoácidos preferenciais. 42
Tabela 3.4: Composição dos meios de produção em shaker e biorreator (aa
total
). 42
Tabela 3.5: Composição dos meios de produção em shaker e biorreator (aa
pref
). 42
Tabela 4.1: Condições experimentais comuns mantidas nos ensaios realizados. 52
Tabela 4.2: Condições experimentais adotadas nos ensaios realizados em biorreator 53
Tabela 4.3: Resultados obtidos em shaker durante a realização dos ensaios de 1 a 13. 53
Tabela 4.4: Concentração celular inicial, atividade enzimática máxima no respectivo
tempo, atividade enzimática específica e velocidade específica máxima de crescimento
celular calculados nos ensaios realizados. 61
Nomenclatura
aa: Aminoácidos
aa
pref
Solução de aminoácidos preferenciais + soro de queijo + solução de sais +FAK
aa
total
: Solução de aminoácidos livres + soro de queijo + solução de sais + AFA
AE
*
: Atividade enzimática específica (UI/g)
AFA: Ácido fenilacético
6-APA: Ácido 6-aminopenicilânico
CHE: Caseína hidrolisada enzimaticamente
CLP: Controlador lógico programável
C
P
: Concentração de enzima (UI/L)
C
Pmáx
: Concentração de enzima máxima (UI/L)
C
X
: Concentração celular (g/L)
Cx
0
: Concentração celular inicial (g/L)
FAK: Fenil acetato de potássio
K
6-APA
: Constante de inibição não competitiva para 6-APA (mM)
K
AFA
: Constante de inibição competitiva para AFA (mM)
K
i
: Constante de Monod do substrato i (g/L)
K
M
: Constante de Michaelis-Menten para PG (mM)
K
S
: Constante de inibição competitiva para PG (mM)
MLP: Multilayer perceptron
MP: Meio de produção
nco: Número de neurônios na camada oculta
OD: Concentração de oxigênio dissolvido (% Sat.)
P: Concentração de produto (UI/L)
PDAB: p-dimetilaminobenzaldeído
PG: Penicilina G
PGA: Penicilina G Acilase
PMC: Perceptrons de múltiplas camadas
RNA: Rede neural artificial
S
i
: Concentração do substrato i (g/L)
UI: Unidade internacional de atividade
V
max
: Taxa de reação máxima
YCO
2
Fração molar de gás carbônico (%)
Y
X/P
: Fator de rendimento celular em relação ao produto (g
células
/g
produto
)
Y
X/Si
: Fator de rendimento celular em relação ao substrato i (g
células
/g
substrato i
)
Letras Gregas
δ: Somatório do erro
µ: Velocidade específica de crescimento celular (h
-1
)
µ
máx
: Velocidade máxima específica de crescimento celular (h
-1
)
Sumário
Capítulo 1 _______ Introdução
1 Introdução 16
Capítulo 2 Revisão Bibliográfica
2 Revisão Bibliográfica 18
2.1 Introdução sobre as Penicilinas 18
2.2 Penicilina G Acilase 20
2.3 Bacillus megaterium 22
2.4 Penicilina G Acilase Produzida por Bacillus megaterium 22
2.5 Requerimento Nutricional do Bacillus megaterium 26
2.6 Oxigênio Dissolvido e seu Fator de Importância 27
2.7 Modelagem Matemática para o Crescimento Celular 28
2.8 Redes Neurais Artificiais 29
2.8.1 Introdução 29
2.8.2 Redes Neurais e o Sistema Nervoso Humano 30
2.8.3 Modelos de Redes Neurais 32
2.8.4 Perceptron Múltiplas camadas e Backpropagation 33
2.8.5 Modelagem Híbrida 34
2.8.6 Redes de Inferência da Concentração Celular 35
Capítulo 3 Materiais, Equipamentos e Métodos
3 Materiais, Equipamentos e Métodos 38
3.1 Materiais e Equipamentos 38
3.1.1 Microrganismo e outros materiais experimentais 38
3.1.2 Equipamentos 38
3.2 Meios de Cultivo 40
3.2.1 Meio de Esporulação 40
3.2.2 Procedimento Experimental para Germinação e Inóculo 41
3.2.3 Produção da Enzima em Shaker e Biorreator 42
3.2.4 Produção da Enzima em Biorreator Agitado e Aerado 43
3.3 Análise das Amostras para Acompanhamento da Produção 43
3.3.1 Análise da Concentração Celular 44
3.3.2 Determinação da Concentração da Enzima (Atividade Enzimática) 44
3.3.2.1 Método espectrofotométrico PDAB 44
3.3.3 Preparo dos Criotubos 45
3.4 Descrição da Instrumentação do Biorreator Convencional e do Sistema de
Aquisição de Dados 46
3.4.1 Descrição do Sistema de Controle de Oxigênio Dissolvido 48
3.4.2 Descrição do Sistema de Controle de pH 48
3.4.3 Descrição do Sistema de Controle de Temperatura 49
3.4.4 Descrição do Sistema de Controle de Formação de Espuma 49
3.4.5 Descrição do Sistema de Controle de Vazão do Meio Suplementar 49
3.4.6 Medidor de Vazão 50
3.4.7 Analisador dos Gases de Saída 50
3.4.8 O Controlador Lógico Programável (CLP) 50
3.4.8.1 O Sistema Supervisório 51
Capítulo 4 Resultados e Discussão
4 Resultados e Discussão 52
4.1 Análise dos Dados Experimentais 52
4.2 Simulação Empregando Modelo Híbrido 63
Capítulo 5 Considerações Finais
5 Conclusões 80
5.1 Sugestões para Trabalhos Futuros 81
Capítulo 6 Referências Bibliográficas
6 Referências Bibliográficas 82
1 Introdução 16
1 Introdução
O uso de antibióticos no tratamento de infecções causadas por microrganismo
difundiu-se principalmente durante a Segunda Guerra Mundial. Foi nesta época que se iniciou
a produção da penicilina. Esta era realizada em frascos, empregando meio sólido. Desde a
descoberta do composto − por Alexander Fleming em 1929 − até sua ampla utilização,
acelerada pela ocorrência do conflito mundial, cerca de duas décadas se passaram. A partir
dos anos cinqüenta, estudos empregando culturas submersas em tanques agitados e aerados
tiveram início nos Estados Unidos.
A descoberta do antibiótico e sua aplicação no tratamento de doenças em seres
humanos inauguraram um novo capítulo na ciência, denominado de biotecnologia. Desde
então, uma ampla variedade de compostos bioquímicos com atividade antimicrobiana vem
sendo descoberta. A partir da identificação e caracterização do núcleo 6-aminopenicilânico
(6-APA) da molécula de penicilina tornou possível a obtenção de novos compostos a partir
deste. Surgiram as chamadas penicilinas semi-sintéticas, obtidas através da modificação da
cadeia lateral da molécula de penicilina.
No Brasil, a produção de antibióticos é gerenciada por empresas estrangeiras ou
transnacionais que detêm a tecnologia neste campo. Empresas nacionais necessitam importar
insumos para sua produção. Dessa forma, tornam-se imprescindíveis estudos neste campo,
principalmente sobre a produção dos antibióticos semi-sintéticos. Na produção de ampicilina
e amoxicilina, por exemplo, existe a necessidade do precursor 6-APA obtido da reação de
hidrólise da penicilina G. Tradicionalmente o precursor é obtido via hidrólise química. Outra
forma de obter o precursor é via enzimática, empregando a enzima penicilina G acilase
(PGA). A ligação do núcleo 6-APA obtido com a respectiva cadeia lateral, para obtenção da
ampicilina (ou amoxicilina), é hoje majoritariamente realizada via rota química. Contudo,
1 Introdução 17
estudos vêm sendo realizados com objetivo de realizar esta síntese via enzimática, utilizando
a mesma enzima, PGA (chamada rota verde de produção).
O Laboratório de Engenharia Bioquímica do Departamento de Engenharia Química da
Universidade Federal de São Carlos (LEB/DEQ/UFSCar) realiza em estreita colaboração com
o Laboratório de Automação e Desenvolvimento de Bioprocessos (LaDABio) estudos na
produção, caracterização, purificação e imobilização da enzima PGA obtida a partir de
cultivos submersos empregando o microrganismo Bacillus megaterium. A partir de 2005, a
produção de PGA por Xanthomonas sp. também vem sendo objeto de investigação pelo grupo
de pesquisa. Em parceria com o Departamento de Genética e Fisiologia do DEQ/UFSCar
estudos na clonagem do gene produtor de PGA e sua expressão em Escherichia coli estão
sendo estudados.
A produção da enzima pelo microrganismo B. megaterium é complexa e as condições
operacionais para otimização do processo ainda não estão totalmente elucidadas. Poucos
relatos são encontrados na literatura utilizando este microrganismo na obtenção da enzima
PGA. Dessa forma, estudos focando este tópico são necessários.
Este trabalho teve por objetivo estudar a influência de condições operacionais na
produção da enzima em cultivos em biorreator tipo tanque agitado e aerado, particularmente o
oxigênio dissolvido. Esta variável é de grande importância, uma vez que tanto sua falta como
seu excesso pode prejudicar a produção da enzima (De LEÓN et al., 2003; HOJO, 1997;
VISNARDI, 1997).
A partir dos resultados experimentais obtidos, propôs-se modelar o crescimento
celular do processo de produção da enzima por Bacillus megaterium através de enfoque
híbrido, combinando equação de balanço de massa com rede neural artificial.
2 Revisão Bibliográfica 18
2 Revisão Bibliográfica
2.1 Introdução sobre as Penicilinas
A penicilina foi descoberta em Londres, em 1929, por sir Alexander Fleming. Mais
tarde a descoberta revolucionaria o tratamento de infecções causadas por bactérias
patogênicas, além de induzir a descoberta de novos compostos de atividade farmacológica
produzida através de bioprocessos (SWARTZ, 1985). Essa descoberta trouxe para a
biotecnologia um novo produto comercial, de uso terapêutico, além dos tradicionais alimentos
e bebidas já existentes na época. Dessa forma, iniciou-se uma revolução no tratamento de
infecções bacterianas, que serviu de modelo para o surgimento de numerosos compostos
produzidos por via fermentativa. Neste contexto, a palavra fermentação não se refere á
cultivos anaeróbios, mas sim ao cultivo em geral de microrganismos em meio sólido ou
líquido, quer sejam aeróbios ou anaeróbios (SILVA, 2003).
O início da produção industrial da penicilina ocorreu nos Estados Unidos, em 1941,
treze anos após sua descoberta, durante a Segunda Guerra Mundial. Naquela época o cultivo
era realizado empregando meio sólido atingindo uma produção de 10 a 20 unidades
Oxford/ml (equivalente a 0,006-0,012 mg de benzil penicilina, sal de sódio/ml)
(SWARTZ, 1985).
As penicilinas podem ser divididas em três grupos: as biossintéticas, as semi-sintéticas
e as sintéticas.
As penicilinas biossintéticas podem ser obtidas diretamente por caldos de cultura de
bioprocessos, com diferentes estruturas. As mais conhecidas são as penicilinas G e V, pois
possuem maior interesse clínico. Suas cadeias laterais diferem por causa da diferença
estrutural do radical em que está ligada na cadeia lateral ao ácido 6-aminopenicilânico
(6-APA) (SWARTZ, 1985).
2 Revisão Bibliográfica 19
Segundo Hersbach et al. (1984), todas as penicilinas semi-sintéticas são compostas
pelo ácido 6-aminopenicilânico (6-APA) e podem ser obtidas pela modificação da cadeia
lateral das penicilinas biossintéticas por via química ou enzimática. Um exemplo é a
utilização da penicilina amido hidrolase para obtenção do núcleo 6-APA a partir da penicilina
(HOJO, 1997).
As penicilinas semi-sintéticas, originadas a partir da modificação da cadeia lateral da
molécula de penicilina, vêm sendo obtidas industrialmente pela “Rota Química”, a qual
emprega solventes caros e tóxicos. Esta forma de produção pode gerar problemas ambientais
havendo a necessidade de tratar os resíduos gerados.
Desde 1994 o Laboratório de Engenharia Bioquímica do Departamento de Engenharia
Química da UFSCar realiza estudos relativos à produção da enzima penicilina G acilase
(PGA) empregando o microrganismo Bacillus megaterium. Vários estudos vêm sendo
conduzidos focando a produção, purificação e imobilização da enzima. Paralelamente, estudos
utilizando PGA imobilizada estão sendo realizados com o objetivo de produzir antibióticos
semi-sintéticos (exemplo ampicilina), via “rota verde”. Esta rota possui como atrativos o uso
de substâncias mais baratas e pouco nocivas ao meio ambiente. Embora os rendimentos nesta
rota ainda sejam menores que aqueles obtidos via rota química, grandes avanços vem sendo
obtidos.
PGA pode ser produzida por leveduras, bolores e bactérias com diferentes pesos
moleculares e afinidades pelos substratos. De todos os possíveis e conhecidos microrganismos
produtores desta enzima o Bacillus megaterium é um dos poucos que a produz
extracelularmente. Essa característica torna particularmente interessante o estudo do processo
de produção desta enzima utilizando este microrganismo, pois do ponto de vista econômico os
procedimentos de purificação tornam-se mais simples (SOUZA, 2003).
2 Revisão Bibliográfica 20
No Brasil, a produção de antibióticos é feita principalmente por empresas
transnacionais que importam insumos. PGA é a segunda enzima mais imobilizada em todo
mundo, atrás apenas da glicose isomerase, e o país não possui ainda tecnologia de produção,
purificação ou imobilização da mesma (SOUZA, 2003).
Assim, estudos de processos envolvendo a produção de PGA são plenamente
justificados, buscando independência tecnológica.
2.2 Penicilina G Acilase
Oficialmente a enzima penicilina G acilase (PGA) é conhecida como penicilina amido
hidrolase, (E.C. 3.5.1.11), e tem sido empregada para obtenção do 6-APA e do ácido
fenilacético (AFA) a partir de penicilina G (PG) empregando a enzima imobilizada por várias
empresas no mundo (SAVIDGE, 1984). A Figura 2.1 apresenta uma ilustração da enzima
PGA.
Figura 2.1: Ilustração em 3D da estrutura da PGA obtida por difração de raio-X
Fonte: RESEARCH... <http://www.rcsb.org/pdb/>, 15 maio 2005.
Segundo dados de Illanes et al. (1994), mais de 60% de 6-APA eram produzidos
enzimaticamente correspondendo algo em torno de 5500 ton/ano em todo mundo.
2 Revisão Bibliográfica 21
PGA pode também ser utilizada na síntese de antibióticos semi-sintéticos β-lactâmicos
através da denominada “rota verde” (VIEIRA, 2003).
Dentre os vários microrganismos capazes de produzir a PGA encontram-se o Bacillus
megaterium e a Escherichia coli. A principal diferença entre eles está ligada ao fato de que o
primeiro produz a enzima extracelular, enquanto o segundo, o faz intracelular, havendo a
necessidade de romper as células para posterior obtenção da PGA. Encontram-se muitos
artigos envolvendo E. coli, ao passo que para B. megaterium a literatura é mais escassa. Alia-
se o fato de que muitas informações são mantidas em sigilo por grandes empresas
(ILLANES et al., 1994).
A Tabela 2.1 mostra algumas empresas que utilizam a PGA obtida de diferentes
microrganismos na forma imobilizada.
Tabela 2.1: Algumas empresas que utilizam PGA imobilizada e seus respectivos
microrganismos produtores (SAVIDGE, 1984).
Empresa Microrganismo Tipo de Enzima
BAYER
Escherichia coli
Intracelular
KYOWA HAKKO
Kluyvera citrofila
Intracelular
PFIZER
Proteus rettgeri
Intracelular
SQUIBB
Bacillus megaterium
Extracelular
A Figura 2.2 apresenta a equação da reação de hidrólise da PG catalisada pela enzima
PGA obtendo o 6-APA e o AFA.
C H
2
C O
N
H
N
O
S
C H
3
C H
3
C O O H
PGA
+
H
2
O
N
N
H
2
O
S
C H
3
C H
3
C O O H
+
C H
2
C O O H
6-APA AFA
PG
Figura 2.2: Hidrólise enzimática da PG (SILVA, 2003).
2 Revisão Bibliográfica 22
2.3 Bacillus megaterium
Bacillus megaterium é um microrganismo aeróbio que se encontra em forma cilíndrica
e unida em pequenas cadeias, proveniente do solo, podendo ser encontrado também em água
marinha, alimentos desidratados, peixes, entre outros. Suas dimensões variam de acordo com
o meio de cultura, mas em ágar nutriente, seu diâmetro é de aproximadamente 1,5 µm, ao
passo que em meios com carboidratos possam assumir cerca de 3,0 µm. Seus esporos podem
ser de formas ovalada de peras ou alongada (HOJO, 1997).
Murao et al. (1964) mostram que a temperatura ótima de crescimento do
B. megaterium está entre 28º e 35ºC, enquanto que em temperaturas que excedem 45ºC não
ocorre crescimento. O pH ótimo de cultivo está em torno de 7,0 a 8,5. Em pH menor ou igual
a 5 não foi verificado crescimento do microrganismo. Ele pode produzir amônia e formar
ácidos, ao passo que não gera gases em meios contendo amido, glicose, frutose, galactose,
maltose e sacarose. Tem forte capacidade para reduzir nitrato a nitrito. Digere a caseína e se
reproduz em meios sem fatores de crescimento, com apenas nitratos ou sais de amônio e
glicose como fonte de carbono e nitrogênio.
B. megaterium é importante economicamente, pois é o maior produtor de
vitamina B
12
, além de poder produzir penicilinas acilase e amilase, antibióticos, entre outros
produtos (VARY, 1994).
2.4 Penicilina G Acilase Produzida por Bacillus megaterium
Trabalhos clássicos relacionados com produção de PGA empregando B. megaterium
foram realizados por Acevedo e Cooney (1973), Gentina et al. (1997), Illanes et al. (1994).
Os meios utilizados e as condições ótimas na produção de PGA diferem e dependem
do microrganismo produtor. Industrialmente, o que se procura é o condicionamento do
microrganismo de forma a aumentar a produtividade da enzima, de acordo com o meio e
2 Revisão Bibliográfica 23
condições de fermentação. A formulação correta do meio de cultura é fundamental para a
obtenção de um rendimento maior, fazendo com que a composição dos meios de
fermentações industriais não seja usualmente encontrada devido ao seu valor comercial
(SILVA, 2003).
Usa-se a definição de unidade internacional de atividade (UI) para determinar qual é a
quantidade de enzima necessária para converter 1 µmol de 6-APA a partir de benzil penicilina
por minuto em tampão borato a pH 8,7 e 37ºC (SAVIDGE e COLE, 1975).
Vários meios de cultura para produção de PGA via B. megaterium, são encontrados na
literatura. Alguns autores propõem meios a base de caseína hidrolisada enzimaticamente
(CHE) (SAVIDGE e COLE, 1975; CHIANG e BENNETT, 1967; HOJO, 1997). Outros
utilizam meios complexos preparados a partir de solução de aminoácidos (aa) e/ou vários sais
(ACEVEDO e COONEY, 1973; ILLANES et al., 1994; SOUZA, 2003).
Para a produção da enzima PGA, faz-se necessário o uso de um indutor, como o ácido
fenilacético (AFA). Segundo Acevedo e Cooney (1973), este ácido estimula o crescimento e
induz a produção quando presente em baixas concentrações, e inibe a síntese de enzima e o
crescimento quando presente em altas concentrações.
Illanes et al. (1994) relatam o efeito da glicose na produção da enzima bem como a
influência do AFA, tanto em meio complexo como em meio definido. Os resultados, em
termos da produção de PGA e produtividade, sugerem meio complexo sem adição de glicose,
que a priori reprime a síntese de enzima em meios complexos, mas não em meios definidos.
Empregando meio semelhante ao de Illanes et al. (1994), Gentina et al. (1997),
verificaram o efeito de várias fontes de nitrogênio complexas na síntese e excreção de PGA
por B. megaterium, tendo como melhor substrato a CHE, pelo fato de haver maior conteúdo
de aa livres em comparação com as outras fontes utilizadas.
2 Revisão Bibliográfica 24
O primeiro trabalho, na linha de pesquisa de produção da PGA por B. megaterium no
Laboratório de Engenharia Bioquímica do Departamento de Engenharia Química da UFSCar,
foi o de Hojo (1997). O autor estudou a influência da composição do meio de cultura na
produção da enzima. O meio otimizado foi empregado em experimentos onde se constatou
que a produção da enzima era dependente das condições operacionais, como concentração de
oxigênio dissolvido, pH e adição de Ácido Fenil Acético (AFA), denominado indutor.
O uso do planejamento composto central foi utilizado para correlacionar a atividade
enzimática com as variáveis estudadas. Através da análise canônica da superfície de resposta
foi possível obter condições experimentais onde a atividade da enzima atingiu 250 UI/L de
caldo. Este valor foi da mesma ordem de grandeza daqueles obtidos por Illanes et al. (1994).
Nestes experimentos, o oxigênio dissolvido foi controlado em 10 e 20% de saturação nas
fases de crescimento e produção, respectivamente (HOJO, 1997).
O uso do soro de queijo como fonte de carbono para produzir PGA foi objeto de
estudo de Berazaín (1997). O autor concluiu que o uso deste composto reduz o custo da
produção de PGA, pois o mesmo é obtido em grandes quantidades como subproduto do
processo de produção de queijos (atualmente com baixíssimo ou nenhum valor comercial).
Embora novas aplicações venham sendo estudadas e propostas para este subproduto
(na produção de bebidas lácteas, por exemplo) o volume a ser descartado ainda é muito
grande. Nos estudos realizados por Berazaín (1997), o emprego do soro de queijo como
matéria-prima no processo de produção de PGA proporcionou atingir uma produção de
180 UI/L de PGA.
Visnardi (1997) observou a influência de oxigênio dissolvido no processo de produção
de PGA. Valores altos (acima de 40% do valor de saturação) e baixos (menores de 5%) de
oxigênio dissolvido não favoreceram a produção de PGA. Em relação a esta variável o autor
2 Revisão Bibliográfica 25
conclui que deve existir um perfil ótimo a ser seguido durante o cultivo de forma a maximizar
a produção.
Pinotti (1999) estudou a utilização de lactose e glicose como fontes de carbono e CHE
como fonte de nitrogênio na produção da enzima PGA. Testou também a troca de glicose por
soro de queijo no meio de produção. A autora verificou que a produção de PGA é dependente
da fonte de nitrogênio e carbono, atingindo maiores concentrações de enzima (138 UI/L)
quando se utilizou caseína hidrolisada com Alcalase
®
e soro de queijo como fontes de
carbono e nitrogênio. Para produção da enzima, o soro de queijo fornece nutrientes que se
mostram importantes.
Estudos sobre os requerimentos nutricionais do Bacillus megaterium na produção de
PGA foram realizados por Souza (2003). Para otimizar os meios de cultivo, estudou-se a
influência de diferentes concentrações de aminoácidos (aa) no meio de cultura em frascos
agitados. Os resultados mostraram que nenhum dos aa, quando omitidos individualmente, era
essencial ao crescimento e à produção da enzima. Além disso, concentrações iniciais acima de
10,0 g/L de aminoácidos inibiam sua síntese. Com o teste da influência dos diferentes
componentes do soro de queijo na produção de PGA por B. megaterium, também em frascos
agitados, verificou-se que a substituição do soro de queijo pelos aa livres que compõem suas
proteínas, não favorece a síntese de enzima, mesmo que permita o crescimento celular. Em
ensaios em biorreator de 5 L, em batelada alimentada com oito aa preferenciais (a solução
completa continha dezoito aa), atingiu-se 263 UI/L de atividade enzimática. O estudo da
influência do oxigênio dissolvido mostrou, em um experimento, que a redução de 20 para 5 %
de saturação após 12 horas de cultivo, resultou em uma produção de enzima de 330 UI/L.
Silva (2003) realizou experimentos de produção de PGA por Bacillus megaterium
ATCC 14945 em reator convencional, utilizando sistema de aquisição de dados, com
monitoramento em tempo real de variáveis como fração molar de oxigênio e dióxido de
2 Revisão Bibliográfica 26
carbono nos gases de saída, pH e oxigênio dissolvido. A partir dos resultados experimentais
foram propostos três modelos cinéticos não-estruturados do processo, utilizando um ou mais
substrato(s) limitante(s). Devido à complexidade do processo, Silva (2003) utilizou também a
técnica das redes neurais na modelagem do processo. Estudos envolvendo a identificação de
estado e o tratamento de sinais utilizando redes neurais foram realizados. Nos experimentos
em biorreator de bancada atingiu-se valores de atividade enzimática em torno de 200 UI/L.
Nucci (2003) estudou a influência do pH na produção da enzima e implementou um
algoritmo baseado na teoria da lógica nebulosa, Fuzzy, com o objetivo de identificar em
“tempo real” (on-line) o momento de máxima concentração da enzima durante os
experimentos. Em biorreator de bancada (5 litros de volume útil) realizaram-se experimentos
com aquisição de dados e controle do processo por controlador lógico programável e sistema
supervisório. Os cultivos atingiram uma máxima concentração de 203 UI/L. Em experimentos
em que não houve controle de pH, originaram melhores resultados, em comparação aos que
tiveram controle, devido ao aumento na concentração da enzima.
2.5 Requerimento Nutricional do Bacillus megaterium
Os nutrientes são as substâncias químicas necessárias ao crescimento dos seres vivos.
Eles estão divididos em duas frentes, de acordo com Souza (2003):
Fins energéticos: transformação da fonte de carbono em CO
2
ou em outras
substâncias;
Fins biossintéticos: anabolismo resultando em biossíntese de novo material celular.
Além disso, os microrganismos precisam de uma série de elementos químicos,
combinados ou não, que podem ser:
2 Revisão Bibliográfica 27
Macronutrientes: C, H, O, N, P, S, K, Mg;
Micronutrientes (traços metálicos): Co, Cu, Zn, Mo.
Os microrganismos requerem exigências nutricionais que são reveladas pela própria
composição elementar da célula. Uma célula bacteriana é composta de 70% de água e 30% de
matéria química, principalmente de proteína. Infelizmente, não se encontram dados para
B. megaterium. Para E. coli, que através de modificação genética pode ser um microrganismo
produtor de PGA, sua composição é C, H, O, N, S, P, K, Mg, Fe, Ca, Mn e traços de Zn, Co,
Cu e Mo (MICROBIOLOGY, 2005).
2.6 Oxigênio Dissolvido e sua Importância
Segundo Souza (2003), medir a quantidade de oxigênio no meio de cultivo com
B. megaterium é uma forma de avaliar o desempenho do biorreator, e também uma importante
variável para a otimização do processo fermentativo.
Como o oxigênio é um gás parcialmente solúvel no meio de cultura, torna este
componente um importante substrato em fermentações aeróbias, sendo muitas vezes
denominado de substrato limitante.
Shuler e Kargi (1992) descrevem que o oxigênio é um importante fator de crescimento
para os cultivos aeróbios.
Vojtisek e Slekak (1975) apud Shewale e Sivaraman (1989) relatam que altos valores
da concentração de oxigênio no meio de cultivo com E. coli podem conduzir a um efeito
repressivo na produção de PGA.
Vaz et al. (1978) apud Shewale e Sivaraman (1989) verificaram que manter o oxigênio
dissolvido no processo em baixas concentrações, ou seja, em torno de 5% do valor de
saturação, é um dos principais fatores que contribuem para a produção de PGA em larga
escala.
2 Revisão Bibliográfica 28
2.7 Modelagem Matemática para o Crescimento Celular
Silva (2003) propõe três abordagens para modelar o processo de crescimento do
B. megaterium, levando em conta a presença de um ou mais substrato(s) limitante(s).
Na primeira proposta, tomou-se o AFA como apenas um substrato limitante, acrescido
à concentração de aminoácidos totais.
Na segunda proposta, os aminoácidos totais e o AFA foram separados, como dois
substratos limitantes.
Por último, os aminoácidos mais rapidamente consumidos, os aminoácidos mais
lentamente consumidos e o AFA foram três substratos limitantes.
Pela cinética de crescimento de Monod, para múltiplos substratos, na forma aditiva,
foi proposto um crescimento celular e um consumo de substrato. Isso se deve ao fato do
crescimento continuar mesmo quando o AFA ou algum grupo de aminoácidos se esgote, que
não poderia ocorrer se a cinética multiplicativa fosse adotada as equações (2.1), (2.2) e (2.3):
º
max
1
nS
ii
X
X
i
ii
S
dC
C
dt K S
µ
=
⎛⎞
⋅
=⋅
⎜⎟
+
⎝⎠
∑
(Eq. 2.1)
max
/
1
iii
X
XSi i i
dS S
C
dt Y K S
µ
⎛⎞
⋅
=− ⋅ ⋅
⎜⎟
+
⎝⎠
(Eq. 2.2)
º
max
1
/
1
nS
ii
X
i
XP i i
S
dP
C
dt Y K S
µ
=
⎛⎞
⋅
=⋅ ⋅
⎜⎟
+
⎝⎠
∑
(Eq. 2.3)
onde, C
X
: concentração celular (g/L), S
i
: concentração do substrato i (g/L), P: concentração de
produto (UI/L),
µ
máx
: velocidade máxima específica de crescimento celular nos substratos
(h
-1
), K
i
: constante de Monod do substrato i (g/L), Y
X/Si
: fator de rendimento celular em
relação ao substrato i (g
células
/g
substrato i
), Y
X/P
: fator de rendimento celular em relação ao
produto (g
células
/g
produto
).
2 Revisão Bibliográfica 29
Embora os modelos propostos descrevessem qualitativamente o processo durante a
fase de batelada, nos experimentos em batelada alimentada os modelos não foram capazes de
descrever adequadamente o processo.
2.8 Redes Neurais Artificiais
2.8.1 Introdução
Redes neurais artificiais são modelos computacionais fundamentados na estrutura e no
comportamento dos neurônios cerebrais (SILVA et al., 2000). Eles podem reconhecer
padrões, base de dados e “aprender” comportamentos dinâmicos complexos de sistemas
físicos. O significado de rede neural artificial (RNA) relaciona-se com pesquisas no campo da
Inteligência Artificial, onde originou estudos para entender e modelar o comportamento do
cérebro humano (SILVA, 2003).
Os primeiros estudos formativos de redes neurais datam da década de quarenta. Em
artigo publicado por Warren S. McCulloch e Walter H. Pitts, 1943, sugeriam a construção de
uma máquina baseada ou inspirada no cérebro humano, mostrando que um neurônio podia ser
modelado por uma função degrau para realizar uma função lógica (LAU, 1990).
Em 1949, Donald Olding Hebb postulou a primeira regra de aprendizagem auto-
organizada. Anos depois, em 1958, Frank Rosenblatt propôs o perceptron como primeiro
modelo para aprendizagem supervisionada. Mais estudos e modelos decorreram-se com o
passar dos anos, e no início dos anos setenta Paul J. Werbos desenvolveu o algoritmo
Backpropagation, porém este foi ignorado por alguns anos (HAYKIN, 2002).
Tempos depois, na década de oitenta, as pesquisas receberam um forte impulso com a
descrição e popularização deste algoritmo publicado em Rumelhart et al. (1986). Assim, esse
algoritmo se tornou uma ferramenta muito importante para treinamento de redes com
múltiplas camadas para desempenho de uma vasta aplicação em tarefas.
2 Revisão Bibliográfica 30
2.8.2 Redes Neurais e o Sistema Nervoso Humano
O cérebro humano pode ser considerado uma das mais avançadas máquinas de
processamento, devido sua estrutura e capacidade de processamento e armazenamento de
dados. Todas as funções e movimentos do corpo humano estão ligados a pequenas células,
chamadas neurônios. Em cada ser humano existem aproximadamente 10 bilhões de neurônios
(INTRODUÇÃO, 2005).
Neurônios estão ligados uns com os outros por meio de sinapses, formando uma
extensa rede, chamada rede neural. As sinapses por sua vez, transmitem estímulos através de
diferentes concentrações de Na
+
(sódio) e K
+
(potássio) por todo o corpo humano. Essas
conexões geram uma fantástica rede com alta capacidade de processamento e armazenamento
de informações e dados.
Os principais componentes dos neurônios são:
• Dendritos que tem por função receber os estímulos transmitidos pelos outros
neurônios;
• Corpo de neurônio, também chamado de soma, responsável por coletar e combinar
informações vindas de outros neurônios;
• E finalmente o axônio, que é constituído de uma fibra tubular que pode alcançar até
alguns metros, e é responsável por transmitir os estímulos para outras células.
Pela Figura 2.3 pode-se verificar a estrutura de um neurônio.
2 Revisão Bibliográfica 31
Figura 2.3: Representação de um neurônio humano
Fonte: INTRODUÇÃO... <http://www.din.uem.br/ia/neurais/> 15 maio 2005.
Todo o sistema nervoso é formado por um conjunto complexo de neurônios. Neles a
comunicação é realizada através de impulsos, quando recebido, o neurônio o processa, e
passado um limite de ação, dispara um segundo impulso que produz uma substância
neurotransmissora o qual flui do corpo celular para o axônio (que por sua vez pode ou não
estar conectado a um dendrito de outra célula). O neurônio que transmite o pulso pode
controlar a freqüência de pulsos aumentando ou diminuindo a polaridade na membrana pós
sináptica. Eles têm um papel essencial na determinação do funcionamento, comportamento e
do raciocínio do ser humano.
Ao contrário das redes neurais artificiais, redes neurais naturais não transmitem sinais
negativos, sua ativação é medida pela freqüência com que emite pulsos, freqüência esta
composta por pulsos contínuos e positivos. As redes naturais não são uniformes como as redes
artificiais, e apresentam uniformidade apenas em alguns pontos do organismo. Seus pulsos
não são síncronos ou assíncronos, devido ao fato de não serem contínuos, o que a difere de
redes artificiais.
2 Revisão Bibliográfica 32
2.8.3 Modelos de Redes Neurais
Estrutura e algoritmos de aprendizagem são as maneiras pelas quais se podem
classificar uma Rede Neural Artificial (RNA). As conexões entre os neurônios e sua natureza
determinam à estrutura da RNA. O ajuste dos pesos e o treinamento da RNA são realizados
pelo algoritmo de aprendizagem (SILVA, 2003).
Quanto a estrutura, RNAs podem ser separadas em pelo menos dois tipos: redes
feedforward e redes recorrentes. Em feedforward os neurônios são agrupados em camadas e
seu fluxo de informações entre uma camada e outra é unidirecional, a partir da entrada,
passando pela camada(s) oculta(s) e chegando a saída, sendo seus neurônios ligados entre as
camadas e não dentro de uma mesma camada. Seu treinamento pode convergir mais
rapidamente que em outras redes. Ao passo que em redes recorrentes as conexões permitem o
fluxo de informação em ambos os sentidos para um mesmo par de unidades (SILVA, 2003).
A fase de treinamento precisa produzir uma RNA que tanto seja estável quanto
convergente. Para isso, é necessário um grupo de dados padrões de entrada e saída conhecidos
e seus respectivos ajustes dos parâmetros. Geralmente, para treinar a rede neural há
necessidade de se ajustar os fatores pesos até que o padrão de saída possa ser reproduzido,
sendo este calculado a partir da base de dados na entrada (BAUGHMAN e LIU, 1995).
Para o treinamento, existem dois tipos de aprendizagens: supervisionado ou não
supervisionado. Quando os pesos são ajustados de acordo com a diferença entre a saída
desejada com a obtida pela rede, esse tipo de algoritmo de aprendizagem é chamado de
supervisionado. Esse algoritmo é o mais comumente encontrado na engenharia química, e
utilizado neste trabalho, é o algoritmo backpropagation ou retropropagação. Já o algoritmo
não supervisionado não necessita de saída desejada conhecida, onde a própria RNA realiza
automaticamente um mapa com dados de entrada apresentados para prever o conjunto de
2 Revisão Bibliográfica 33
saída. Essas redes possuem mais aplicações em tarefas de classificação e agrupamento de
dados.
2.8.4 Perceptron Múltiplas Camadas e Backpropagation
Segundo Haykin (2002), um perceptron é a forma mais simples de uma rede neural
usada para a classificação de padrões. De forma simples, ele está composto de um único
neurônio com pesos ajustáveis.
Tradicionalmente, a rede é composta de um conjunto de unidades sensoriais dividida
em camada de entrada, uma ou mais camadas ocultas e uma camada de saída. As redes
neurais que recebem o sinal de entrada propagando-se para frente através da rede, camada por
camada, são chamadas de multilayer perceptron (MLP) ou perceptrons de múltiplas camadas
(PMC). A informação segue um fluxo unidirecional, onde a camada de entrada tem um papel
importante de distribuição destes dados (HAYKIN, 2002).
Os PMC têm sido aplicados para resolver diversos problemas complicados,
especialmente em engenharia, mostrando-se muito eficientes, através do seu treinamento de
forma supervisionada com um algoritmo de atualização de pesos muito popularmente
conhecido como error backpropagation ou retropropagação do erro (BAUGHMAN e LIU,
1995). Na literatura é muito comum encontrar o termo algoritmo de retropropagação e seu
processo de aprendizagem é conhecido como aprendizagem por retropropagação.
Em redes mais simples, utiliza-se o algoritmo de Levenberg-Marquardt e, para as mais
robustas, o da retropropagação. Ambos são algoritmos de otimização de mesmas
características que buscam reduzir a minimização dos erros entre valores calculados com os
desejados (SILVA, 2003).
Durante o treinamento, a RNA processa os padrões de conjunto de dados de entrada na
seguinte forma: primeiramente aplica-se um padrão de entrada a rede e permite-se que sua
2 Revisão Bibliográfica 34
atividade passe diretamente para camada de saída, também chamado de passo para frente.
Como inicialmente esse resultado é errado, então a rede compara este padrão com um
desejado para aqueles dados, resultando em um erro para cada neurônio na camada de saída.
O somatório do erro (δ) é retropropagado, fazendo o chamado passo de retropropagação,
determinando a mudança dos pesos anteriormente utilizados (CAUDIL, 1991).
O cálculo do δ para cada neurônio do PMC requer o conhecimento da função de
ativação associada aquele neurônio. A mais comum utilizada para realizar o ajuste dos δ da
rede é a Soma dos Quadrados dos Erros, porém a mais amplamente utilizada é a função
sigmoidal, representada na equação (2.4):
x
e1
1
xf
−
+
=)(
(Eq. 2.4)
2.8.5 Modelagem Híbrida
Dois tipos de abordagens podem ser empregados neste tipo de modelagem chamados
de black box ou caixa-preta e gray box ou caixa-cinza.
Na abordagem caixa-preta, o desenvolvimento deste modelo está relacionado com
observações do comportamento de seus dados de entrada e saída, sem importar sua
preocupação fenomenológica. Este método é vantajoso quando nenhum conhecimento do
processo está disponível. Sua vantagem está relacionada com a geração de um modelo
matemático de um sistema sem o conhecimento dos fenômenos que estão acontecendo no
processo. Quando se utiliza esse processo, fica inviável realizar extrapolações. Encontram-se
na literatura alguns trabalhos relacionados: Psichogios e Ungar (1992), Van Can et al. (1997),
Silva et al. (2000).
Já na abordagem caixa-cinza, também denominada modelagem híbrida, objeto de
estudo deste trabalho, há combinação de equações de conservação que trazem certo
conhecimento do processo a ser modelado, com uma ou mais redes neurais, ajudando como
2 Revisão Bibliográfica 35
estimadoras de parâmetros ou variáveis não conhecidas. Para este caso, a rede pode ser
treinada para prever parâmetros do modelo fenomenológico ou substituir equações deste, por
exemplo, velocidade de reação, taxa de crescimento celular, entre outras. Alguns trabalhos
podem ser encontrados neste enfoque como Azevedo et al. (1997), Galvanauskas et al. (2004),
Komives e Parker (2003), Psichogios e Ungar (1992), Silva et al. (2000), Thompson e Kramer
(1994), Van Can et al. (1997).
2.8.6 Redes de Inferência da Concentração Celular
Em Silva (2003) encontram-se estudos sobre inferência da concentração celular de
Bacillus megaterium durante o cultivo para a produção de PGA. Em sua tese de doutorado
Silva utilizou uma única rede neural feedforward com algoritmo de Levenberg-Marquardt
realizado em Matlab® 5.2, para inferência da concentração celular.
Foram utilizados, inicialmente, dados ruidosos para treinamento da rede, tendo como
variáveis de entrada tempo, YCO
2
e velocidade de agitação em tempos atuais, e,
posteriormente, dados filtrados. Para a filtragem dos dados na entrada, foi utilizado filtro
média móvel, o qual encontra-se descrito em Silva (2003).
A partir da análise de erro quadrado médio pelo número de neurônios, constatou-se
que os menores erros na etapa de validação foram obtidos quando se utilizou 10 neurônios na
camada oculta (nco).
Os resultados de treinamento e validação obtidos por Silva (2003) com 10 neurônios
na camada oculta (nco) são apresentados nas Figuras 2.4 e 2.5, respectivamente. A rede
aprendeu bem a dinâmica do processo na etapa de treinamento na fase de crescimento
exponencial. No início da fase estacionária a rede não consegue inferir quantitativamente a
concentração celular. Após certo tempo, esta volta a inferir de maneira razoável o valor da
concentração celular.
2 Revisão Bibliográfica 36
Pela Figura 2.4, nota-se que a rede inferiu razoavelmente até o término da fase
exponencial, descolando um pouco no final.
(A)
(B)
(C)
Figura 2.4: Resultado do treinamento para a rede de inferência com dados filtrados. (A) ensaio I,
(B) ensaio II e (C) ensaio III (SILVA, 2003).
Não é de se estranhar à dificuldade da rede em inferir a concentração celular ao final
do cultivo. Quando a rede de identificação de fases indicar o fim do crescimento exponencial,
qualquer processo industrial deve ser interrompido. Desta forma, é plenamente satisfatório
que a rede seja precisa na inferência apenas até o final do crescimento, como é o caso
apresentado.
Uma vez que não é preciso uma rede de inferência de concentração celular ao longo de
todo cultivo, resolveu-se utilizar somente a fase de crescimento (obtida a partir da rede de
identificação de fases) para o treinamento e validação da rede. Na validação há algum desvio
0 10203040
0
1
2
3
4
5
6
0 10203040
0
1
2
3
4
5
6
0 10203040
0
1
2
3
4
5
6
0 10203040
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Conc. celular (g/L)
Rede Inferência
Tempo (horas)
Spline
Experimental
Classificação (0,1 e 2)
0 10203040
0
1
2
3
4
5
0 10203040
0
1
2
3
4
5
0 10203040
0
1
2
3
4
5
0 10203040
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Rede inferência
Conc. celular (g/L)
Tempo (horas)
Spline
Experimental
Classificação (0,1 e 2)
0 1020304050
0
1
2
3
4
5
6
0 1020304050
0
1
2
3
4
5
6
0 1020304050
0
1
2
3
4
5
6
0 1020304050
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Tempo (horas)
Rede inferência
Conc. celular (g/L)
Spline
Experimental
Classificação (0,1 e 2)
2 Revisão Bibliográfica 37
sistemático, principalmente no final da fase exponencial, mas, de forma geral, a inferência
mostra-se de boa qualidade. Os resultados da validação são mostrados na Figura 2.5.
(A)
(B)
(C)
Figura 2.5: Resultado da validação para a rede de inferência da fase exponencial.
(A) ensaio IV, (B) ensaio V e (C) ensaio VI (SILVA, 2003).
2 4 6 8 10 12 14
0
1
2
3
4
5
6
2 4 6 8 10 12 14
0
1
2
3
4
5
6
Conc. celular (g/L)
Tempo (horas)
Spline
Rede inferência
Experimental
2468101214
0
1
2
3
4
5
6
2 4 6 8 10 12 14
0
1
2
3
4
5
6
Conc. celular (g/L)
Tempo (horas)
Spline
Rede inferência
Experimental
2468101214
0
1
2
3
4
5
2 4 6 8 10 12 14
0
1
2
3
4
5
Conc. celular (g/L)
Tempo (horas)
Spline
Rede inferência
Experimental
3 Materiais, Equipamentos e Métodos 38
3 Materiais, Equipamentos e Métodos
Este item apresenta os principais materiais e métodos utilizados durante a execução da
parte experimental desta dissertação.
3.1 Materiais e Equipamentos
3.1.1 Microrganismo e Outros Materiais Experimentais
O microrganismo utilizado para a produção de PGA foi o Bacillus megaterium ATCC
14945, cedido pela Fundação Tropical de Campinas, SP, com suspensão de esporos contendo
aproximadamente 10
8
esporos/mL e mantida em criotubos com glicerol 20% a –50
o
C.
Soro de queijo (Sigma), ácido fenilacético (Carlo Erba), aminoácidos (Ajinomoto),
fenil acetato de potássio (Prodotti), e Penicilina G (Paraquímica) são alguns materiais
experimentais utilizados, uma vez que os demais reagentes utilizados eram de grau analítico.
3.1.2 Equipamentos
Vários equipamentos de uso geral em um laboratório bioquímico foram utilizados
durante a realização deste trabalho. São eles:
•
Câmara Asséptica
Nas etapas de manipulação de microrganismos e do material em contato direto com os
mesmos, utilizou-se a câmara asséptica de fluxo laminar da marca Veco (Campinas, SP,
Brasil), contendo bico de Bunsen e lâmpada germicida Ultra Violeta (UV).
• Autoclaves
Empregada para esterilização dos meios de cultura, soluções e suspensões de várias
naturezas, e todo material que esteve em contato com o microrganismo (vidrarias, biorreator e
3 Materiais, Equipamentos e Métodos 39
demais utensílios de usos diversos envolvidos na realização dos ensaios). As autoclaves são
da marca Fabbe Primar Industrial (São Paulo, SP, Brasil), e todo material foi esterilizado a
120 °C por 15 minutos.
•
Câmara Incubadora Rotativa Climatizada (Shaker)
As etapas de crescimento do microrganismo (germinação e inóculo) foram realizadas
em frascos agitados (erlenmeyers) em câmara incubadora rotativa climatizada
(New Brunswick Scientific Co., Inc., Edison, NJ, EUA).
•
Centrífuga Refrigerada
Para separar as células do sobrenadante nas amostras coletadas durante os ensaios,
como parte do procedimento para determinação da atividade celular e massa seca, foi
utilizada a centrífuga refrigerada da marca Eppendorf (modelo 5403, Netherler-Hinz GMBH-
Hamburg), com capacidade para seis tubos.
•
Estufas
Para secagem de vidrarias utilizou-se estufa da marca Fanem (São Paulo, SP, Brasil) a
60
o
C. Para esterilização de alguns utensílios foi utilizada estufa de circulação mecânica
também da marca Fanem a 100
o
C.
•
Reator Tipo Tanque Agitado e Aerado (Biorreator)
Para fermentações em escala de laboratório foi utilizado um reator tipo tanque agitado
e aerado da marca Bioflo II-C, New Brunswick Scientific Co., Inc., Edison, NJ, EUA com
capacidade para 5 litros (acoplado a um sistema de aquisição de dados e analisador de gases
de saída, CO
2
e O
2
).
3 Materiais, Equipamentos e Métodos 40
• Outros Equipamentos
− Balança Analítica marca Mettler modelo PB 3002
− Balança de precisão marca Kern modelo 410
− Ultrafreezer marca Forma Scientific
− pHmetro marca Orion modelo 420 A
− Espectrofotômetro marca Pharmacia Biotech modelo Ultraspec 2000
− Banho termostático marca Brookfield modelo EX − 200
− Banho termostático marca Neslab modelo RTE − 111
− Bomba de vácuo marca Fabbe modelo 341
− Reator de vidro com camisa de água
− Agitador mecânico marca Fisatom modelo 710
− Vidrarias em geral
3.2 Meios de Cultivo
A enzima PGA foi produzida em shaker e em biorreator, seguindo-se os
procedimentos e composições de meios:
3.2.1 Meio de Esporulação
A composição do meio sólido para o cultivo e preservação da linhagem em tubos
inclinados ("slants") e frascos de Roux é descrita na Tabela 3.1. O microrganismo foi
repicado dentro de tubos de ensaio, deixados em câmara rotativa por sete dias a 30
o
C, sendo
retirado do tubo por meio de uma solução salina 0,9% p/v e transferido para o frasco de
produção do inóculo. Uma outra forma de armazenamento do microrganismo foi em criotubos
(esporos mantidos em solução de glicerol 20%) estocados em ultrafreezer a –50ºC.
3 Materiais, Equipamentos e Métodos 41
Tabela 3.1: Composição do meio sólido empregado para preservação e
manutenção do B. megaterium (SOUZA, 2003).
Nutriente Concentração (g/L)
Agar 20,0
Extrato de carne 3,0
Glicose 1,5
Peptona 5,0
3.2.2 Procedimento Experimental para Germinação e Inóculo
O meio de germinação e inóculo foram incubados em shaker por 24 horas, a 300 rpm
e 30 ºC (frascos de Erlenmeyer de 500 mL). O inóculo representa 10% do volume total do
meio de fermentação para produção de enzima.
Nos ensaios 01 a 06 foi utilizado meio contendo solução de 18 aminoácidos livres com
concentração de 10 g/L, soro de queijo a 19,6 g/L e sais minerais a 0,5 g/L.
E nos ensaios 07 a 13 foi utilizado meio composto por solução de 7 aminoácidos
preferenciais com concentração de 10 g/L, soro de queijo a 19,6 g/L e sais minerais a 0,5 g/L,
uma vez que, estudos realizados por Silva (2003) e Souza (2003), podem-se verificar em
experimentos anteriores que estes compostos eram os mais rapidamente consumidos,
mostrando que Bacillus megaterium possuía certa “afinidade” a estes aminoácidos enfocados
neste conjunto de cultivos.
As Tabelas 3.2 e 3.3 mostram as composições dos meios compostos por aminoácidos
livres e aminoácidos preferenciais, respectivamente.
Tabela 3.2: Solução contendo aminoácidos livres.
Aminoácido Símbolo Peso Molecular Concentração (g/L)
Alanina Ala 89,09 0,29
Arginina Arg 174,20 0,41
Ácido aspártico Asp 133,1 0,68
Cistina Cst 240,3 0,03
Ácido glutâmico Glu 147,13 1,17
Glicina Gly 75,07 0,11
Histidina HCl His 191,7 0,25
Leucina Leu 131,2 1,05
Isoleucina Ile 131,2 0,52
3 Materiais, Equipamentos e Métodos 42
Lisina HCl Lys 182,6 0,76
DL-metionina Met 149,21 0,62
Fenilalanina Phe 165,2 0,61
Prolina Pro 115,13 1,07
Serina Ser 105,1 0,62
Treonina Thr 119,1 0,48
Tirosina Tyr 181,19 0,49
Triptofano Trp 204,2 0,15
Valina Val 117,1 0,69
Tabela 3.3: Solução contendo aminoácidos preferenciais.
Aminoácido Símbolo Peso Molecular Concentração (g/L)
Alanina Ala 89,09 0,72
Arginina Arg 174,20 0,95
Ácido aspártico Asp 133,1 2,31
Ácido glutâmico Glu 147,13 3,98
Lisina HCl Lys 182,6 0,95
Serina Ser 105,1 0,81
Treonina Thr 119,1 0,28
3.2.3 Produção da Enzima em Shaker e Biorreator
A produção da enzima em shaker foi realizada em meio de cultura com a adição do
inóculo e mantido por pelo menos 24 horas a 300 rpm e 30
o
C, em paralelo com biorreator.
As Tabelas 3.4 e 3.5 mostram a composição e concentrações dos meios utilizados
chamados de
aa
total
e aa
pref
, respectivamente, nas etapas de reações.
Tabela 3.4: Composição dos meios de produção em shaker e biorreator (
aa
total
).
Nutriente Concentração (g/L)
Solução de aminoácidos livres (Vide Tabela 3.2) 10,0
Soro de queijo 19,6
Solução de sais 0,5
Ácido fenilacético – AFA 2,7
Tabela 3.5: Composição dos meios de produção em shaker e biorreator (aa
pref
).
Nutriente Concentração (g/L)
Solução de aminoácidos preferenciais (Ver tabela 3.3) 10,0
Soro de queijo 19,6
Solução de sais 0,5
Fenil acetato de potássio – FAK 3,45
3 Materiais, Equipamentos e Métodos 43
3.2.4 Produção da Enzima em Biorreator Agitado e Aerado
Os procedimentos utilizados até a obtenção do inóculo são os mesmos descritos para
os ensaios em câmara rotativa. Após esterilização do reator, o meio de produção foi
adicionado ao seu interior, utilizando-se 10% em volume de inóculo por volume de meio de
produção. A concentração de oxigênio dissolvido, a vazão de ar e a agitação variaram entre
um ensaio e outro. A temperatura foi controlada a 30
o
C, a aeração mantida em 2,0 L/min
(21 °C e 1 atm) e o biorreator operado por um período de 24h, aproximadamente.
A composição do meio foi a mesma para a produção em shaker e está descrita na Tabela 3.4.
A Figura 3.1 apresenta esquema ilustrativo do procedimento experimental de produção
de PGA por B. megaterium.
Figura 3.1: Procedimento experimental de produção de PGA por B. megaterium
(SOUZA, 2003).
3.3 Análise das Amostras para Acompanhamento da Produção
A análise das amostras para acompanhamento da produção iniciou-se pela separação
do microrganismo do meio de cultura. A separação foi realizada por centrifugação ou
filtração. A centrifugação procedeu-se a 4
o
C a 11000⋅rpm por 20 minutos. O sobrenadante foi
utilizado para análises das atividades enzimáticas.
3 Materiais, Equipamentos e Métodos 44
3.3.1 Análise da Concentração Celular
Para os experimentos de 1 a 6, a análise da concentração celular foi feita pela pesagem
da massa seca. Antes de fazer a filtração ou centrifugação, o tubo de centrífuga ou a
membrana do filtro foram previamente secos a 60
o
C por 24h, colocados em dessecador e
posteriormente pesados. Filtrou-se ou centrifugou-se uma alíquota de 10 mL da amostra.
Após filtração ou centrifugação o sobrenadante era utilizado para análises e as membranas ou
tubos eram novamente secos a 60
o
C por 24h e pesados. Pela diferença de massa determinou-
se a concentração celular. Nos meios com presença de CaCO
3
retirou-se o carbonato de cálcio
lavando-se o filtro ou o tubo de ensaio contendo as células, já sem o meio de cultura, com um
volume de 20 mL de solução de ácido acético 5%.
Quanto aos outros experimentos, a análise da concentração celular (C
x
) foi realizada
empregando método espectrofotométrico (λ = 600 nm, amostra diluída 20 vezes em solução
salina 0,8%). A equação (3.1) apresenta a curva de calibração empregada:
() ( )
diluiçãoAbsLgC
X
⋅⋅=
600
3,0/ (Eq. 3.1)
3.3.2 Determinação da Concentração da Enzima (Atividade Enzimática)
3.3.2.1 Método Espectrofotométrico PDAB
Este método determina a concentração da enzima (C
P
) ou atividade enzimática da
penicilina G acilase utilizando p-dimetilaminobenzaldeído (PDAB). O ácido
6-aminopenicilânico (6-APA) produzido na reação de hidrólise da penicilina G que reage com
o PDAB, gerando um produto colorido que foi acompanhado em espectrofotômetro em
comprimento de onda de 415 nm. A leitura relaciona-se à concentração de 6-APA por meio
de uma curva de calibração obtida com soluções padrões de 6-APA na faixa de
200-1000 µg/ml (BALASINGHAM et al., 1972).
3 Materiais, Equipamentos e Métodos 45
Procedimento: Em um reator aquecido por meio de uma camisa de água, ajustado para
37
o
C, coloca-se 4 ml de PG 5% (p/v) em tampão fosfato 20mM pH 8,0 e espera-se estabilizar
a temperatura, após a adição de 2 ml da solução de enzima sob agitação. Tomam-se alíquotas
em diferentes tempos de reação, colocadas em cubetas preparadas com reagente PDAB
(mistura de 0,5 ml de PDAB 0,5% (p/v) em metanol, 2,0 ml de ácido acético 20% (v/v) e
1,0 ml de solução de hidróxido de sódio 0,05M) deixando-se reagir por 2,5 minutos.
Pelas alíquotas obtidas em diferentes tempos como descrito acima, estes foram
dispostos em um gráfico e realizou-se um ajuste linear dos pontos obtidos. A partir da
tangente desta reta, calculou-se a atividade enzimática em UI/L.
3.3.3 Preparo dos Criotubos
Dentre os métodos mais usuais de preservação de microrganismo, o de congelamento
a baixas temperaturas torna-se mais vantajoso em relação aos demais, por preservar a cultura
por longos períodos. O preparo dos criotubos com Bacillus megaterium ATCC 14945 passa
por várias etapas descritas a seguir (Figura 3.2):
– primeiro a linhagem é repicada em tubos inclinados com meio sólido, mantidos por sete dias
a 30
o
C.
– após este período, os esporos são suspensos em 5ml de solução salina 0,9% e repassados aos
frascos de Roux, previamente preparados com meio sólido de esporulação, mantidos por sete
dias a 30
o
C.
– decorrido os sete dias, é adicionada aos frascos contendo o meio esporulado uma solução
crioprotetora estéril (glicerol 20% v/v), precedida de uma vigorosa agitação e raspagem dos
esporos.
– as suspensões de esporos de todos os frascos são transferidas para um erlenmeyer
previamente esterilizado.
3 Materiais, Equipamentos e Métodos 46
– Retira-se uma alíquota para contagem dos esporos em câmara de Neubauer e finalmente
utilizar-se-á os criotubos para acondicionar os volumes de suspensão de esporos referentes à
concentração desejada.
– Os criotubos são armazenados em ultrafreezer a –50ºC.
Figura 3.2: Preparo dos criotubos com Bacillus megaterium (SILVA, 2003).
3.4 Descrição da Instrumentação do Biorreator Convencional e do Sistema de Aquisição
de Dados
O sistema de aquisição de dados implementado no Laboratório de Fermentações do
DEQ – UFSCar é composto por um Controlador Lógico Programável (CLP – GE Fanuc, série
90-30), Sistema Supervisório (InduSoft, versão 3.0) operado em microcomputador tipo PC. O
CLP tem suas entradas e saídas conectadas ao biorreator tipo tanque agitado e aerado (Bioflo
II-C, News Brunswick Scientific Co., Inc., Edson, NJ, EUA). O biorreator convencional é
utilizado nos experimentos em batelada e batelada alimentada. A comunicação entre o CLP e
o Sistema Supervisório é realizada via protocolo TCP/IP. Um esquema do aparato
experimental juntamente com o sistema de aquisição de dados é apresentado na Figura 3.3.
Toda a instrumentação foi baseada nas normas da "American National Standard".
3 Materiais, Equipamentos e Métodos 47
Figura 3.3: Esquema do aparato experimental ilustrando equipamentos (SILVA, 2003).
Esta configuração permite o desenvolvimento de rotinas de controle e monitoração
que utilizam o protocolo ODBC de comunicação de dados para acessar os diferentes
computadores/processadores em tempo real.
Na arquitetura do sistema de controle/aquisição de dados, toda a comunicação entre o
Controlador Lógico Programável e o Sistema Supervisório é realizada através de uma rede
local Intranet. Com este sistema obtém-se maior velocidade de transferência dos dados; a rede
Intranet está no momento conectada a um "Hub" de 10 Mbps.
No Servidor Windows NT está instalado a nova versão do Sistema Supervisório,
InduSoft Studio 3.0. Uma das principais vantagens desta versão encontra-se na facilidade de
troca de dados entre os microcomputadores e o CLP via rede.
Os seguintes equipamentos fazem parte da instrumentação utilizada no biorreator:
•
Eletrodo de pH, tipo 465-90 (Mettler Toledo, NJ, EUA) conectado ao Medidor e
Transmissor de pH, modelo TH-41 (Digimed);
•
Eletrodo de oxigênio dissolvido, tipo 12/320T (Mettler Toledo) conectado ao
Medidor e Transmissor de Oxigênio Dissolvido, O
2
4500 (Mettler Toledo);
3 Materiais, Equipamentos e Métodos 48
• Bombas peristálticas BVP (Ismatec, Zürich, Suiça) para adição de meio suplementar,
ácido e/ou base;
•
Fluxômetro de massa, modelo 33116-20, 0 a 5 L/min (21◦C, 1 atm), Cole Parmer®
(Venon Hills) para monitoração da vazão de ar no sistema;
•
Transdutor de pressão (modelo 560, T&S Equipamentos) para monitorar a
sobrepressão no interior do biorreator;
•
Sensor de temperatura (Pt-100), inserido em um poço dentro do reator;
•
Analisadores de oxigênio (modelo 755, Rosemount Analytical) e dióxido de carbono
(modelo 880A, Rosemount Analytical) acoplados para análise dos gases de saída do
biorreator. Os analisadores são calibrados com gases padrões (N
2
99,99% e CO
2
5,0%/95%N
2
).
O CLP lê periodicamente todas as suas entradas e, em seguida, fornece os valores para
o Sistema Supervisório.
3.4.1 Descrição do Sistema de Controle de Oxigênio Dissolvido
O oxigênio dissolvido foi controlado na faixa de 5 a 95% (± 1%) da saturação. É
medido através de um eletrodo imerso no interior do biorreator e o controle é realizado
através de controlador PID, que atua sobre a velocidade de agitação, mantendo-se constante a
vazão de alimentação de ar.
3.4.2 Descrição do Sistema de Controle de pH
O pH foi controlado na faixa de 2,00 a 12,00 (± 0,01). Utiliza-se um sensor
amperométrico imerso no meio de cultura, o qual é conectado a um transmissor. Emprega-se
um controlador PID (Proporcional, Integral e Derivativo) no acionamento de duas bombas
3 Materiais, Equipamentos e Métodos 49
peristálticas para a adição do ácido ou base, dependendo do pH do meio e do "set-point"
determinado por função lógica programável.
3.4.3 Descrição do Sistema de Controle de Temperatura
A temperatura do meio de cultura pode ser selecionada na faixa de 20 a 60
o
C
(± 0,1
o
C) e controlada por um microprocessador baseado em controlador PID. A temperatura
média é medida por um sensor RTD ("Resistence Temperature Sensor"), imerso no biorreator.
Quando a temperatura do sistema está abaixo do "set-point", o controlador atua abrindo uma
válvula solenóide e ligando o aquecedor. O sistema dispõe ainda de um dispositivo de
proteção que impede que o aquecedor entre em funcionamento na ausência da vazão do fluido
de refrigeração (falta de água).
3.4.4 Descrição do Sistema de Controle de Formação de Espuma
A formação de espuma durante o bioprocesso é controlada pela adição de
antiespumante. O sensor colocado na parte superior do Bioflo II-C detecta a formação de
espuma. A este sensor está conectado um controlador “on-off”, que aciona uma bomba
peristáltica que adiciona antiespumante ao sistema.
3.4.5 Descrição do Sistema de Controle de Vazão do Meio Suplementar
Uma bomba peristáltica está incorporada ao sistema para a realização de experimentos
em batelada alimentada. Um controlador está conectado a esta bomba e é manipulado por
função lógica programável. A vazão máxima que se pode operar com este sistema é de
10ml/min.
3 Materiais, Equipamentos e Métodos 50
3.4.6 Medidor de Vazão
Também incorporado ao aparato experimental, há um fluxômetro de massa para
monitorar a vazão de ar empregada durante o experimento.
3.4.7 Analisador dos Gases de Saída
• Dióxido de Carbono (CO
2
)
Um analisador infravermelho está incorporado ao sistema para dióxido de carbono,
conectado ao controlador lógico programável, que é acessado por função lógica programável
para aquisição de dados.
• Oxigênio (O
2
)
Também está conectado ao sistema um analisador paramagnético de oxigênio
(Rosemount Analytical Model 755) que está conectado ao CLP e é acessado por função lógica
programável para a aquisição dos dados.
3.4.8 O Controlador Lógico Programável (CLP)
O CLP é um controlador industrial da GE Fanuc Automation série 90-30. Sua CPU
apresenta como características: um módulo de programação de controlador do tipo PID;
programação estruturada; palavras de 16 bits; endereçamento indireto e uma grande variedade
de funções para o processamento de operações complexas. Outras características são: 32MB
de RAM, módulos de posicionamento de eixos, módulo de execução Booleana de alta
velocidade (0,2 ms/KB), módulos de co-processamento programável nas linguagens
BASIC
TM
e "C", módulos de comunicação analógicos de entrada (até 1024) e de saída
(até 626) e digitais (até 1024 cada). A Figura 3.3 mostra o CLP com todos os módulos
acoplados.
3 Materiais, Equipamentos e Métodos 51
3.4.8.1 O Sistema Supervisório
O sistema supervisório é formado por um microcomputador com processador K6-2 de
450 Mhz, 128 MB RAM e por "software" de supervisão da InduSoft.
O InduSoft é um "software" para desenvolvimento de interfaces homem-máquina,
estações de supervisão local de processos industriais e estações de concentradoras de dados
em processos distribuídos. É baseado em um microcomputador interligado a um processo ou
máquina através de um controlador lógico programável (CLP) ou outro sistema de aquisição
de dados. A interface gráfica do sistema e a utilização de planilhas para configuração geram
um ambiente simples e de rápida assimilação. Abaixo seguem as características do sistema:
− Configuração em tempo real durante a aplicação;
− Suporte em tempo real do "mouse" com linha de "status" definida pelo usuário;
− Recursos de indexação de vetores e criação de classes na configuração;
− Sistema de segurança embutido, tanto para cópia de engenharia como de "Run-Time";
− Dois editores gráficos internos, um de "bitmap" e outro orientado a objeto;
− Funções matemáticas;
− Comunicação de dados sempre em blocos, otimizando a utilização do canal serial;
− A arquitetura permite o desenvolvimento de novos módulos em linguagem C ou qualquer
outra linguagem que suporte arquivos
DLL para serem conectados ao sistema.
O sistema InduSoft é voltado para aplicações em Supervisão e Controle de Processos,
onde se utiliza uma arquitetura distribuída baseada em CLP's e microcomputadores e flexível
para conexão com qualquer tipo de CLP, fazendo com que o microcomputador seja utilizado
como estação de supervisão local do processo. Cruz (2000) usou este sistema para a produção
de cefalosporina, executando as funções de monitoramento do sistema, controle de situações
de alarme, geração de gráficos e histórico das variáveis de processo e interface para a entrada
de comandos do operador.
4 Resultados e Discussão 52
4 Resultados e Discussão
4.1 Análise dos Dados Experimentais
Foram realizados dois conjuntos de experimentos em biorreator. A composição dos
meios utilizados, chamados de
aa
total
e aa
pref
, encontra-se descrita na Tabela 3.4 (Item 3.2.3).
Os experimentos foram realizados em diferentes condições operacionais, as quais estão
descritas na Tabela 4.1.
Tabela 4.1: Condições experimentais comuns mantidas nos ensaios realizados.
Ensaios em batelada (1, 3, 4, 7 a 13)
Aeração, L/min (21ºC e 1 atm) 2,0
Temperatura (ºC) 30
Volume (L) 4,0 de meio e 0,5 de inóculo
Ensaios em batelada alimentada (2, 5 e 6)
Aeração, L/min (21ºC e 1 atm) 2,0
Temperatura (ºC) 30
Volume inicial (L) 3,5 (ensaio 6)
4,0 (ensaios 2 e 5)
0,5 de inóculo
Ensaio 2
5 h de cultivo
Suplementação: aa 1,76 mL/min (10 g/L)
Ensaio 5
5h de cultivo
aa (10g/L)e soro de queijo
Início da suplementação
e
Meio suplementar
Ensaio 6
5h de cultivo
aa. total (40g/L) + AFA e soro de queijo
Com o meio
aa
total
(solução de aminoácidos livres + soro de queijo + solução de sais +
AFA) foram realizados seis ensaios em biorreator (denominados ensaios 1 a 6). Empregando
o meio
aa
pref
(solução de aminoácidos preferenciais + soro de queijo + solução de sais +
FAK) foram realizados sete ensaios (denominados ensaios 7 a 13).
Na Tabela 4.2 encontram-se as condições experimentais relativas a cada experimento
realizado em biorreator. Ressalta-se que no ensaio 6 foi utilizada concentração de
aminoácidos (aa) quatro vezes maior que nos demais ensaios, 40 g/L, o que resultou em um
crescimento celular elevado e uma baixa atividade enzimática, quando comparado aos demais
experimentos (vide Figuras 4.1 e 4.3, respectivamente).
4 Resultados e Discussão 53
Tabela 4.2: Condições experimentais adotadas nos ensaios realizados em biorreator.
Ensaio Meio de
Cultura
Duração
(horas)
Condições operacionais
1
aa
total
37 Batelada; controle de OD em 20%
2
aa
total
38 Batelada alimentada; controle de OD em 20%
3
aa
total
44 Batelada; controle de OD em 20% e pH em 8,0
4
aa
total
43 Batelada; controle de OD em 20%
5
aa
total
40 Batelada alimentada; controle de OD em 15%
6
aa
total
30 Batelada alimentada; controle de OD em 20%
7
aa
pref
24 Batelada; controle de OD em 20%
8
aa
pref
22 Batelada; controle de agitação em 350 rpm
9
aa
pref
20 Batelada; controle de agitação em 300 rpm
10
aa
pref
24 Batelada; controle de agitação em 300 rpm
11
aa
pref
24 Batelada; controle de agitação em 300 rpm
12
aa
pref
33 Batelada; controle de OD em 10%
13
aa
pref
24 Batelada; controle de OD em 15%
Para efeito comparativo, paralelamente a todos os ensaios realizados em biorreator
foram conduzidos ensaios em shaker. A Tabela 4.3 mostra os dados obtidos nestes
experimentos.
Tabela 4.3: Resultados obtidos em shaker durante a realização dos ensaios de 1 a 13 em
biorreator.
Ensaio Tempo (h) Concentração Celular (g/L) Atividade Enzimática (UI/L)
0 0,4 -
10 2,6 42
24 3,5 171
1
37 4,0 179
24 4,3 188
2
38 4,1 210
0 0,2 -
24 3,3 193
3
36 3,2 201
0 0,2 -
20 3,7 121
4
43 4,6 150
0 0,28 -
24 3,37 90
5
40 3,6 115
0 0,4 -
6
24 4,41 52
0 0,4 -
7
22 3,9 150
0 0,3 -
8
24 3,3 139
4 Resultados e Discussão 54
0 0,33 -
12 1,7 55
9
24 2,7 147
0 0,5 -
12 2,5 97
10
24 3,5 171
0 0,6 -
12 3,0 96
11
24 4,7 200
0 0,46 -
12 2,5 187
12
24 3,2 371
0 0,5 -
12 2,4 183
24 2,9 285
13
36 2,8 283
Para facilitar a apresentação e análise dos experimentos, estes serão apresentados em
dois grupos: experimentos de 1 a 6 (empregaram solução de aminoácidos totais + AFA,
aa
total
) e experimentos de 7 a 13 (empregaram solução de aminoácidos preferenciais + FAK,
aa
pref
). A Figura 4.1 apresenta as concentrações celulares dos ensaios de 1 a 6.
0 5 10 15 20 25 30
0
2
4
6
8
10
12
Concentração Celular (g/L)
tempo (h)
Ensaio 01
Ensaio 02
Ensaio 03
Ensaio 04
Ensaio 05
Ensaio 06
Figura 4.1: Valores experimentais da concentração celular dos cultivos 1 a 6.
Observando a Figura 4.1, verifica-se que no experimento 6 a concentração celular
obtida foi cerca de duas vezes maior que a média dos demais experimentos. Este fato é
4 Resultados e Discussão 55
atribuído à maior concentração de aminoácidos do meio suplementar empregado neste
experimento (40 g/L). O experimento 5 apresenta uma velocidade de crescimento celular um
pouco menor que os demais experimentos, fato que é explicado pela condição operacional
utilizada neste experimento: controle do oxigênio dissolvido em 15% da saturação; os demais
foram controlados em 20% da saturação.
A Figura 4.2 apresenta os gráficos da concentração de enzima obtida nos
experimentos de 1 a 6.
0 5 10 15 20 25 30
0
25
50
75
100
125
150
175
200
Atividade Enzimática (UI/L)
tempo (h)
Ensaio 01
Ensaio 02
Ensaio 03
Ensaio 04
Ensaio 05
Ensaio 06
Figura 4.2: Valores experimentais da atividade enzimática dos cultivos 1 a 6.
Comparando os valores das concentrações de enzima obtidas nos experimentos 1 a 6,
Figura 4.2, nota-se que os menores valores foram obtidos nos ensaios 5 (atribuído a
problemas na linhagem durante a etapa de preparo de inóculo) e 6 (atribuído a alta
concentração de substrato empregado). A diminuição da concentração de enzima após
12 horas no experimento 3 é atribuída ao controle de pH utilizado neste experimento. A
adição de solução de HCl 5M para manter o pH em 8,0 pode ter sido responsável pela
desnaturação da enzima no meio reacional. Nos experimentos 1, 2 e 4 a concentração de PGA
alcançou valores da ordem de 170 UI/L.
4 Resultados e Discussão 56
As Figuras 4.3 e 4.4 ilustram, respectivamente, as concentrações de oxigênio
dissolvido e frações molares de dióxido de carbono dos experimentos 1 a 6.
0 5 10 15 20 25 30
0
20
40
60
80
100
Oxigênio Dissolvido (% Sat.)
tempo (h)
Ensaio 01
Ensaio 02
Ensaio 03
Ensaio 04
Ensaio 05
Ensaio 06
Figura 4.3: Concentração de oxigênio dissolvido para os ensaios de 1 a 6.
0 5 10 15 20 25 30
0
1
2
3
4
YCO
2
(%)
tempo (h)
Ensaio 01
Ensaio 02
Ensaio 03
Ensaio 04
Ensaio 05
Ensaio 06
Figura 4.4: Fração molar de CO
2
da saída do biorreator para os ensaios 1 a 6.
4 Resultados e Discussão 57
Na Figura 4.4 observa-se que o experimento 6 apresenta o maior valor da
concentração de dióxido de carbono nos gases de exaustão, fato coerente com a massa celular
obtida neste cultivo. Para os demais ensaios, existe uma concordância ao longo do tempo
entre esta variável e a concentração celular.
A Figura 4.5 mostra o gráfico da velocidade de agitação para os experimentos 1 a 6.
Nesta figura é possível constatar que para o ensaio que atingiu a maior concentração celular
(ensaio 6) a velocidade de agitação também atingiu um maior valor, coerente com o fato de
neste ensaio ser necessário manter uma maior taxa de transferência de oxigênio.
0 5 10 15 20 25 30
0
100
200
300
400
500
600
Agitação (rpm)
tempo (h)
Ensaio 01
Ensaio 02
Ensaio 03
Ensaio 04
Ensaio 05
Ensaio 06
Figura 4.5: Valores de agitação dos ensaios 1 a 6 realizados.
A Figura 4.6 apresenta os valores das concentrações celulares dos experimentos de
7 a 13.
4 Resultados e Discussão 58
0 5 10 15 20 25 30
0
1
2
3
4
5
Concentração Celular (g/L)
tempo (h)
Ensaio 07
Ensaio 08
Ensaio 09
Ensaio 10
Ensaio 11
Ensaio 12
Ensaio 13
Figura 4.6: Valores experimentais da concentração celular dos cultivos 7 a 13.
A partir da análise da Figura 4.6, observa-se que os experimentos 9, 10 e 11 têm a
velocidade de crescimento limitada pela concentração de oxigênio dissolvido utilizada (estes
experimentos foram realizados a velocidade de agitação constante, 300 rpm). Nos
experimentos 12 e 13, realizados com controle de oxigênio dissolvido em 10% e 15% da
saturação, respectivamente, também apresentam um atraso no crescimento celular nas
primeiras horas de cultivo. Nos ensaios 7 e 8 não houve limitação no crescimento celular por
esta variável.
A Figura 4.7 apresenta os valores da concentração de enzima obtidos nos ensaios
7 a 13.
4 Resultados e Discussão 59
0 5 10 15 20 25 30
0
25
50
75
100
125
150
175
200
Atividade Enzimática (UI/L)
tempo (h)
Ensaio 07
Ensaio 08
Ensaio 09
Ensaio 10
Ensaio 11
Ensaio 12
Ensaio 13
Figura 4.7: Valores experimentais da atividade enzimática dos ensaios 7 a 13.
A limitação do oxigênio dissolvido ocasionada pela realização do cultivo a 300 rpm
(ensaios 9, 10 e 11) resultou nos menores valores da concentração de enzima nestes
experimentos (Figura 4.7). Nos demais experimentos a concentração de enzima atingiu
valores da ordem de 180-200 UI/L.
As Figuras 4.8 e 4.9 ilustram, respectivamente, as concentrações de oxigênio
dissolvido e fração molar de dióxido de carbono dos experimentos 7 a 13.
0 5 10 15 20 25 30
0
20
40
60
80
100
Oxigênio Dissolvido (% Sat.)
tempo (h)
Ensaio 07
Ensaio 08
Ensaio 09
Ensaio 10
Ensaio 11
Ensaio 12
Ensaio 13
Figura 4.8: Concentração de oxigênio dissolvido para os ensaios de 7 a 13.
4 Resultados e Discussão 60
0 5 10 15 20 25 30
0
1
2
3
4
YCO
2
(%)
tempo (h)
Ensaio 07
Ensaio 08
Ensaio 09
Ensaio 10
Ensaio 11
Ensaio 12
Ensaio 13
Figura 4.9: Fração molar de CO
2
da saída do biorreator para os ensaios 7 a 13.
A Figura 4.10 ilustra o gráfico da velocidade de agitação para os experimentos 7 a 13.
0 5 10 15 20 25 30
0
100
200
300
400
500
600
Agitação (rpm)
tempo (h)
Ensaio 07
Ensaio 08
Ensaio 09
Ensaio 10
Ensaio 11
Ensaio 12
Ensaio 13
Figura 4.10: Valores de agitação dos ensaios 7 a 13 realizados.
4 Resultados e Discussão 61
Com o objetivo de realizar um estudo mais detalhado acerca dos experimentos
realizados, alguns parâmetros foram calculados. A Tabela 4.4 apresenta os valores
experimentais destes parâmetros: concentração celular inicial (Cx
0
), atividade enzimática
máxima no respectivo tempo (C
Pmáx
/ t), atividade enzimática específica (AE
*
) e velocidade
específica máxima de crescimento celular (µ
máx
) para os treze experimentos realizados.
Tabela 4.4: Concentração celular inicial, concentração de enzima máxima no
respectivo tempo, atividade enzimática específica e velocidade específica
máxima de crescimento celular calculados nos ensaios realizados.
Ensaio Cx
0
(g/L) C
Pmáx
(UI/L) / t (h) AE
*
(UI PGA/g C
x
)
µ
máx
(h
-1
)
01
0,28 175 / 13 39,0 0,36
02
0,35 191 / 16 53,5 0,31
03
0,30 200 / 12 42,0 0,38
04
0,32 180 / 20 40,0 0,36
05
0,30 110 / 16 29,7 0,29
06
0,31 98 / 12 12,0 0,37
07
0,30 167 / 12 41,7 0,27
08
0,48 187 / 12 57,1 0,20
09
0,40 120 / 16 42,0 0,20
10
0,33 140 / 16 40,0 0,20
11
0,24 126 / 22 33,2 0,21
12
0,23 200 / 18 69,0 0,35
13
0,15 186 / 16 54,7 0,33
()
célulagenzimaUI
C
C
AE
X
P
máx
−−= /
*
A partir da análise dos valores de atividade enzimática específica (AE
*
) apresentados
na Tabela 4.4, verificou-se que os experimentos realizados com controle de oxigênio
dissolvido em 20% da saturação (ensaios 1, 2, 3, 4, 7) apresentaram valores semelhantes
(~40 UI PGA/g-célula). Embora o experimento 6 fosse realizado na mesma condição
operacional quanto ao controle de oxigênio dissolvido no meio de cultivo (20% da saturação),
neste experimento foi utilizada na corrente de suplementação concentração de substrato
(aminoácidos) quatro vezes maior que nos demais. Apesar da alta concentração celular obtida
neste experimento (Figura 4.1), houve uma baixa produção de enzima (Figura 4.2), que pode
4 Resultados e Discussão 62
ser atribuída a uma inibição na formação do produto pelo substrato (vide experimento 6
realizado em shaker na Tabela 4.3).
A utilização de ácido fenil acético (AFA) ou fenil acetato de potássio (FAK) de meio
reacional não resultou efeito significativo na concentração de enzima obtida nos cultivos
como ilustram os valores da AE
*
(Tabela 4.4) para os experimentos 3 e 7, ambos realizados
nas mesmas condições operacionais.
Nos experimentos 8 a 11 verificaram-se os menores valores da velocidade específica
máxima de crescimento celular em relação aos demais experimentos. Este fato é atribuído à
limitação pelo oxigênio, uma vez que estes experimentos foram realizados em condições
(agitação constante) onde a velocidade de transferência de massa se igualava ao consumo pelo
microrganismo atingindo 0% da saturação durante boa parte do cultivo (vide Figura 4.8).
Nestes experimentos, a velocidade de transferência de oxigênio igualou-se à velocidade de
consumo de oxigênio.
Os experimentos 5 e 13 foram realizados controlando a concentração de oxigênio
dissolvido em 15% da saturação. Estes deveriam apresentar resultados semelhantes, uma vez
que a utilização dos meios contendo aa
total
e aa
pref
não produziu efeito na concentração celular
e de enzima (Figuras 4.1, 4.2 e 4.6 e 4.7, respectivamente). A menor atividade enzimática
específica obtida no ensaio 5 pode ser atribuída a problemas na linhagem durante a etapa de
preparo de inóculo. O experimento realizado em shaker em condições padrões (conduzidos
em todos os experimentos) também apresentou uma concentração de enzima com valores
abaixo dos observados normalmente (vide Tabela 4.3). Conforme já verificado anteriormente
pelo grupo de pesquisa, esta linhagem de microrganismo pode se desenvolver em dois tipos
de colônia: uma mais produtiva e outra menos (PINOTTI et al., 2000b), o que pode justificar
a baixa atividade enzimática deste experimento (ensaio 5).
4 Resultados e Discussão 63
O experimento conduzido com concentração de oxigênio dissolvido em 10% da
saturação (ensaio 12) foi o que atingiu a maior atividade específica (69 UI PGA/g-célula)
sendo, portanto, a melhor condição operacional.
4.2 Simulação empregando Modelo Híbrido
A Figura 4.11 apresenta uma ilustração do modelo híbrido empregado neste trabalho.
Figura 4.11: Modelo neural híbrido. A rede estima o termo cinético do processo (velocidade
específica de crescimento celular) a partir de variáveis adquiridas em tempo real, usado como
entrada para a equação de balanço (adaptado de PSICHOGIOS e UNGAR, 1992).
A rede neural empregada foi uma Rede Feedforward com uma camada oculta
utilizando treinamento supervisionado (algoritmo de atualização de pesos Backpropagation).
Foram escolhidas três variáveis como entrada para a rede: tempo (h), YCO
2
(%), velocidade
de agitação (rpm). Como variável de saída a rede previa a velocidade específica de
crescimento celular: µ (h
-1
). A Figura 4.12 ilustra um esquema da estrutura de rede neural
utilizada.
Rede Neural
Equação de
Balanço
µ
k
Cx
k+1
Cx
k
tempo
k
YCO
2 k
Vel. Agitação
k
4 Resultados e Discussão 64
Figura 4.12: Esquema ilustrativo da estrutura de rede neural utilizada.
A equação de balanço (Equação 4.1) é integrada utilizando algoritmo de Runge-Kutta,
4ª ordem (MATHEWS e FINK, 1999).
X
X
C
dt
dC
⋅=
µ
(Eq. 4.1)
Como os valores da velocidade específica de crescimento celular (µ) não estão
disponíveis experimentalmente, fez necessário estimá-los a partir dos valores experimentais
da concentração celular (amostras retiradas periodicamente do biorreator, 2 em 2 horas).
Como as variáveis de entrada da rede neural possuem uma freqüência de amostragem maior
em relação à variável amostrada (para treinamento da rede empregou-se 6 minutos) houve a
necessidade de gerar dados de concentração celular. Para isso foi empregado um polinômio
interpolador Spline (PRESS et al., 1986). A partir da interpolação foi possível gerar a mesma
quantidade de pontos para concentração celular e assim, empregando a Equação (4.2)
obtiveram-se os valores de µ.
•
•
•
YCO
2
(%)
Agitação (rpm)
tempo (h)
µ
k
(h
-1
)
Entrada
Oculta
Saída
k
k-1
k-2
k
k-1
k-2
k
k-1
k-2
bias
1
bias
1
4 Resultados e Discussão 65
dt
dC
C
1
X
X
⋅=
µ
(Eq. 4.2)
Todos os programas foram implementados em MatLab
®
(versão 6.0 Release 12).
Vários testes foram realizados. A rede neural foi treinada empregando as variáveis de
entrada no tempo atual para prever µ, e também foram utilizados tempos passados para estas
variáveis, uma vez que fazendo uso apenas dos tempos atuais, os resultados não foram
satisfatórios. O número de neurônios na camada oculta (nco) também foi avaliado (analisou-
se 7, 10, 12 e 15). São apresentados os melhores resultados obtidos, ou seja, para entrada da
rede empregaram-se valores das variáveis nos tempo atuais e dois tempos passados. Optou-se
por se utilizar 15 nco e 500 apresentações, uma vez que este apresentou o menor valor do erro
0,0054, frente a 0,0075 para 12 nco, 0,0097 para 10 nco e 0,0122 para 7 nco. Valores
superiores a 15 nco, superestimaram os resultados da RNA.
Na etapa de treinamento da rede, os experimentos foram divididos em dois conjuntos
de dados. No primeiro foram agrupados os experimentos de 1 a 6, chamados de
aa
total
, e aa
pref
para o segundo conjunto, composto pelos experimentos de 7 a 13.
A Figura 4.13 apresenta os gráficos de velocidade específica de crescimento celular, µ,
gerados após o treinamento da rede neural versus µ “experimental” (empregou-se os ensaios
1, 2, 3 e 6, respectivamente na etapa de treinamento, por apresentarem as condições extremas
obtidas). Foram utilizadas 500 apresentações da base de dados durante a fase de treinamento.
Pode-se verificar que a rede neural conseguiu realizar um treinamento muito satisfatório no
intervalo de dados avaliado.
4 Resultados e Discussão 66
(A)
(B)
(C)
(D)
Figura 4.13: Treinamento da rede neural com 15 neurônios na camada oculta e
500 apresentações. (A) Ensaio 1, (B) Ensaio 2, (C) Ensaio 3 e (D) Ensaio 6.
A Figura 4.14 apresenta os valores das concentrações celulares fornecida pelo modelo
híbrido após a etapa de treinamento da rede neural.
4 Resultados e Discussão 67
(A)
(B)
(C)
(D)
Figura 4.14: Concentração celular dos ensaios prevista pelo modelo híbrido.
(A) Ensaio 1, (B) Ensaio 2, (C) Ensaio 3 e (D) Ensaio 6.
A partir dos resultados obtidos na Figura 4.14 pode-se afirmar que o modelo híbrido
foi capaz de inferir com boa acuidade a concentração celular nos experimentos utilizados
durante a fase de treinamento.
Na etapa seguinte, avaliou-se a capacidade do modelo em predizer o perfil da
concentração celular nos experimentos não utilizados (etapa de validação). A Figura 4.15
apresenta as simulações da velocidade de crescimento celular obtida nos experimentos 4 e 5.
4 Resultados e Discussão 68
(A)
(B)
Figura 4.15: Resultados de validação apresentados pela Rede Neural previamente treinada
com 15 nco e 500 apresentações para os ensaios 4 e 5. (A) Ensaio 4 e (B) Ensaio 5.
Apesar dos resultados satisfatórios obtidos pelo treinamento para os ensaios 1, 2, 3 e 6,
pode-se verificar que a rede neural não conseguiu acompanhar a curva de µ experimental do
experimento 5 utilizado na etapa de validação.
A simulação da concentração celular pelo modelo híbrido é apresentada na Figura 4.16
para etapa de validação.
(A)
(B)
Figura 4.16: Concentração celular dos ensaios prevista pelo modelo híbrido na etapa de
validação. (A) Ensaio 4 e (B) Ensaio 5.
Observa-se que para o ensaio 4, o modelo forneceu uma estimativa da concentração
celular acima do valor experimental a partir de cinco hora de cultivo. Já para o experimento 5,
o modelo previu satisfatoriamente os valores da concentração celular.
4 Resultados e Discussão 69
A Figura 4.17 apresenta os gráficos de µ obtidos após o treinamento da rede neural
versus µ “experimental” para o segundo grupo de ensaios (8, 9, 11, 12 e 13). Foram utilizadas
500 apresentações da base de dados durante a fase de treinamento.
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
Figura 4.17: Treinamento da rede neural com 15 neurônios na camada oculta e
500 apresentações. (A) Ensaio 8, (B) Ensaio 9, (C) Ensaio 11, (D) Ensaio 12 e
(E) Ensaio 13.
4 Resultados e Discussão 70
Observa-se pela Figura 4.17, que após 500 apresentações dos dados à rede neural, foi
capaz de realizar uma boa previsão dos valores de µ para os ensaios de treinamento.
A Figura 4.18 apresenta os valores da concentração celular obtidas pelo modelo
híbrido (etapa de treinamento).
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
Figura 4.18: Concentração celular dos ensaios prevista pelo modelo híbrido.
(A) Ensaio 8, (B) Ensaio 9, (C) Ensaio 11, (D) Ensaio 12 e (E) Ensaio 13.
4 Resultados e Discussão 71
Para todos os experimentos que compunham a base de dados empregada no
treinamento o modelo híbrido forneceu boa previsão da concentração celular ao longo dos
experimentos.
Nas Figuras 4.19 e 4.20 são apresentados os ensaios de validação realizados
(simulação para os ensaios 7 e 10).
(A)
(B)
Figura 4.19: Resultados de validação apresentados pela Rede Neural previamente treinada
com 15 nco e 500 apresentações para os ensaios 7 e 10. (A) Ensaio 7 e (B) Ensaio 10.
(A)
(B)
Figura 4.20: Concentração celular dos ensaios prevista pelo modelo híbrido na etapa de
validação. (A) Ensaio 7 e (B) Ensaio 10.
Embora no ensaio 7 o modelo híbrido não tenha fornecido uma boa previsão da
concentração celular, na simulação do ensaio 10 houve uma boa concordância entre os valores
simulados e os obtidos experimentalmente.
4 Resultados e Discussão 72
Em outro teste avaliaram-se como variáveis de entrada da rede neural o tempo, a
fração molar de CO
2
, a velocidade de agitação e a derivada da fração molar de CO
2
. Para
estes dados, utilizaram-se essas variáveis no tempo atual e dois tempos atrasados.
Avaliou-se o número de neurônios empregado na camada oculta empregando 7, 10, 12
e 15 neurônios. As Figuras 4.21 e 4.22 mostram os resultados obtidos.
0 100 200 300 400 500
0.0000
0.0002
0.0004
0.0006
0.0008
0.0010
Erro X Apresentações (aa
total
)
Erro
Apresentações
nco7
nco10
nco12
nco15
Figura 4.21: Variação do erro em função do número de apresentações para o número de
neurônios na camada oculta (
aa
total
, com os ensaios 1, 2 e 3 usados no treinamento).
0 100 200 300 400 500
0.0000
0.0002
0.0004
0.0006
0.0008
0.0010
Erro X Apresentações (aa
pref
)
Erro
Apresentações
nco7
nco10
nco12
nco15
Figura 4.22: Variação do erro em função do número de apresentações para o número de
neurônios na camada oculta (
aa
pref
, com os ensaios 8, 9, 11 e 12 usados no treinamento).
4 Resultados e Discussão 73
Pelas Figuras 4.21 e 4.22, verifica-se que a melhor configuração de RNA emprega 15
neurônios na camada oculta. Além disso, 200 apresentações seria um número suficiente de
apresentações da base de dados durante a etapa de treinamento.
A Figura 4.23 apresenta os gráficos de µ gerado após o treinamento da rede neural
com µ “experimental” (empregaram-se os ensaios 1, 2, e 3, na etapa de treinamento). Foram
utilizadas 200 apresentações da base de dados durante a fase de treinamento. Pode-se verificar
que a rede neural conseguiu realizar um treinamento satisfatório. Optou-se por excluir o
cultivo 6 durante o treinamento do conjunto
aa
total
, visto que este poderia superestimar os
dados da concentração celular (maior concentração celular obtida).
(A)
(B)
(C)
Figura 4.23: Treinamento da rede neural com 15 neurônios na camada oculta e
200 apresentações. (A) Ensaio 1, (B) Ensaio 2 e (C) Ensaio 3.
4 Resultados e Discussão 74
A Figura 4.24 apresenta os valores da concentração celular obtidas pelo modelo
híbrido durante etapa de treinamento.
(A)
(B)
(C)
Figura 4.24: Concentração celular dos ensaios prevista pelo modelo híbrido.
(A) Ensaio 1, (B) Ensaio 2 e (C) Ensaio 3.
Assim, pode-se verificar que o modelo produziu resultados satisfatórios durante a
etapa de treinamento.
Pela Figura 4.25, pode-se notar o comportamento da curva de µ durante os teste para
validação para os experimentos 4 e 5.
4 Resultados e Discussão 75
(A)
(B)
Figura 4.25: Resultados de validação apresentados pela Rede Neural previamente treinada
com 15 nco e 200 apresentações. (A) Ensaio 4 e (B) Ensaio 5.
Ao analisarmos a Figura 4.25 para o ensaio 5 (B), verifica-se um comportamento
muito irregular para µ simulado, se comparado aos dados de µ experimental, mostrando que
este experimento não foi possível identificar construir dados sejam compatíveis aos
experimentais. No ensaio 4, a curva de simulação mostrou um certo acompanhamento durante
um determinado período.
A Figura 4.26 apresenta a simulação do modelo híbrido para os experimentos de
validação.
(A)
(B)
Figura 4.26: Concentração celular dos ensaios prevista pelo modelo híbrido na etapa de
validação. (A) Ensaio 4 e (B) Ensaio 5.
A Figura 4.27 apresenta os gráficos de µ gerado após o treinamento da rede neural
com µ “experimental” (empregou-se os ensaios 8, 9, 11 e 12, respectivamente). Foram
4 Resultados e Discussão 76
utilizadas 200 apresentações da base de dados durante a fase de treinamento. Pode-se verificar
que a rede neural conseguiu realizar um treinamento satisfatório, com relação aos dados
apresentados.
(A)
(B)
(C)
(D)
Figura 4.27: Treinamento da rede neural com 15 neurônios na camada oculta e
200 apresentações. (A) Ensaio 8, (B) Ensaio 9, (C) Ensaio 11 e (D) Ensaio 12.
A seguir, seguem os respectivos gráficos da concentração celular para os experimentos
utilizados no treinamento na Figura 4.28 para o conjunto
aa
pref
.
4 Resultados e Discussão 77
(A)
(B)
(C)
(D)
Figura 4.28: Concentração celular dos ensaios prevista pelo modelo híbrido.
(A) Ensaio 8, (B) Ensaio 9, (C) Ensaio 11 e (D) Ensaio 12.
Novamente, nota-se que o modelo acompanhou muito bem as curvas de concentração
celular para a etapa de treinamento.
Dessa forma, faz-se necessário realizar a etapa de validação, como pode ser
visualizado nas Figuras 4.29 e 4.30, para verificar se foi possível o modelo híbrido, para os
experimentos de 6 a 13, ajustar dados fora da etapa de treinamento realizar um bom
acompanhamento dos dados simulados com os experimentais.
4 Resultados e Discussão 78
(A)
(B)
(C)
Figura 4.29: Resultados de validação apresentados pela Rede Neural previamente treinada
com 15 nco e 200. (A) Ensaio 7, (B) Ensaio 10 e (C) Ensaio 13.
4 Resultados e Discussão 79
(A)
(B)
(C)
Figura 4.30: Concentração celular dos ensaios prevista pelo modelo híbrido na etapa de
validação. (A) Ensaio 7, (B) Ensaio 10 e (C) Ensaio 13.
A partir dos dados apresentados pela rede neural previamente treinada, pode-se
concluir que a inclusão da variável derivada da fração molar de CO
2
como informação de
entrada para rede neural não resultou em melhores resultados (Figuras 4.30 e 4.26).
5 Conclusões 80
5 Conclusões
Estudos sobre produção da enzima Penicilina G Acilase por Bacillus megaterium estão
inseridos em contexto de grande importância. O Laboratório de Engenharia Bioquímica do
Departamento de Engenharia Química da UFSCar vem realizando estudos empregando esta
bactéria e alguns resultados importantes já foram alcançados, como a substituição do meio de
cultivo – caseína hidrolisada enzimaticamente por aminoácidos livres, proporcionando
aumento da concentração de enzima durante o processo. Paralelamente, desenvolveram-se
modelos matemáticos (fenomenológico e empírico) para o processo além de estudos
empregando lógica nebulosa (Fuzzy) para inferir o momento de finalizar o cultivo. Contudo,
existe ainda a necessidade de realizar investigações buscando identificar perfil ótimo com
relação à concentração de oxigênio dissolvido (OD) durante o cultivo e também a proposição
de um modelo que represente melhor o processo.
A partir da análise dos resultados dos experimentos para produção de PGA por
Bacillus megaterium realizados em diferentes condições operacionais observou-se que a
maior atividade enzimática específica foi atingida quando a concentração de oxigênio
dissolvido foi mantida em 10% da saturação durante todo o cultivo. Os dados obtidos neste
trabalho indicaram que existe um ponto ótimo em relação a esta variável. Se por um lado altos
valores da concentração oxigênio dissolvido (20% da saturação) favorecem o crescimento
celular por outro reprimem a produção da enzima. No outro extremo, baixos valores da
concentração de oxigênio dissolvido (5% da saturação) limitam o crescimento celular
prejudicando também a produção da enzima. Este resultado está de acordo com o verificado
por De León et al. (2003) empregando E. coli modificada para produção de PGA. Dessa
forma, para o microrganismo empregado, Bacillus megaterium, e para o meio utilizado há
também um compromisso entre concentração de oxigênio dissolvido no meio de cultivo e a
produção da enzima.
5 Conclusões 81
Em relação à redução do número de aminoácidos no meio reacional de 18 para 7,
mantendo a concentração final de 10,0 g/L e mantendo os preferencialmente consumidos, não
resultou em diferenças significativas na concentração final de enzima produzida. Houve,
contudo, uma simplificação do meio de cultivo empregado. O controle de pH também não se
mostrou eficaz.
A aplicação do enfoque híbrido na determinação da concentração celular através de
dados obtidos em tempo real forneceu resultados satisfatórios. Na etapa de treinamento o
modelo foi capaz de aprender, através da parte empírica, rede neural, as relações entre as
variáveis de entrada e saída, utilizando a equação de balanço para estimar a concentração
celular.
5.1 Sugestões para Trabalhos Futuros
Sugere-se realizar estudos para buscar um valor ótimo para produção de penicilina G
acilase por Bacillus megaterium entre 5 e 10% de saturação da concentração de oxigênio
dissolvido.
Em relação à modelagem empregando redes neurais, sugere-se alisar os dados da
variável de fração molar de CO
2
e calcular a derivada em intervalos de tempo maiores (a cada
10, 20 ou 30 minutos), utilizando esta informação como entrada para a rede neural em
substituição ao tempo de cultivo.
6 Referências Bibliográficas 82
6 Referências Bibliográficas
ACEVEDO, F.; COONEY, C. L. Penicillin amidase production by Bacillus megaterium.
Biotechnology and Bioengineering, v. 15, p.493-503, 1973.
ARMIGER, W. B.
Instrumentation for monitoring and controlling bioreactors. Malvern,
PA, USA: BioChem Technology Inc., 2000.
AZEVEDO, S. F.; DAHM, B.; OLIVEIRA, F. R. Hybrid Modeling of Biochemical
Processes: a comparison with the conventional approach.
Computers Chemical
Engineering, v. 21, p.S751-S756, 1997.
BAILEY, J. E.; OLLIS, D. F.
Biochemical engineering fundamentals. New York, USA:
McGraw-Hill Book Company, 1986.
BALASINGHAM, K. et al. The isolation and kinetics of penicillin amidase from Escherichia
coli.
Biochimica ET Biophysica Acta, p.250-256, 1972.
BAUGHMAN, D. R.; LIU, Y. A.
Neural networks in bioprocessing and chemical
engineering. London, UK: Academic Press, Inc., 1995.
BERAZAÍN, J. G. H. Q.
Estudo sobre a utilização do soro de queijo na produção de
penicilina G acilase por Bacillus megaterium ATCC 14945. 1997. 97f. Dissertação
(Mestrado em Engenharia Química) – Universidade Federal de São Carlos, São Carlos. 1997.
BERAZAÍN, J.G.H.Q.; HOJO, O.; HOKKA, C. O. Utilization of cheese whey for the
production of penicillin G acylase from Bacillus megaterium ATCC 14945. In: EUROPEAN
SYMPOSIUM ON BIOCHEMICAL ENGINEERING SCIENCE (ESBES-2). 2., September
16-19, 1998.
Proceedings ... Portugal: ESBES, 1998. p.72-77.
BULL, D. N.
Instrumentation for fermentation process control. Upper Montclair, NJ,
USA: Satori Corporation, 2000.
CAUDIL, M. Neural network training tips and techniques.
Al Expert, v. 6, n.1, p.56-61,
1991.
CHIANG, C.; BENNETT, R. E. Purification and properties of penicillin amidase from
Bacillus megaterium.
Journal of Bacteriology, v.93, n.1, p.302-308, 1967.
CRUZ, A. J. G.
Estudo de produção de cefalosporina C com acompanhamento em linha
de variáveis do processo.
2000. 236f. Tese (Doutorado em Engenharia Química) –
Universidade Federal de São Carlos, São Carlos. 2000.
DEMUTH, H.; BEALE, M.
Neural network toolbox for use with Matlab
®
. Natick, USA:
The MathWorks, Inc., 2000.
De LEÓN, A. et al. Effects of dissolved oxygen tension on the production of recombinant
penicillin acylase in Escherichia coli.
Enzyme and Microbial Technology, v. 33, p.689-697,
2003.
GALVANAUSKAS, V.; SIMUTIS, R.; LÜBBERT, A. Hybrid process models for process
optimization, monitoring and control.
Bioprocess Biosyst. Eng., v. 26, p.393-400, 2004.
GENTINA, J. C.; ACEVEDO, F.; VILLAGRA, M. P. Short communication: effect of
complex nitrogen sources on the production of penicillin acylase by Bacillus megaterium.
World Journal of Microbiology & Biotechnology, v.13, p.127-128, 1997.
HAYKIN, S.
Redes neurais: princípios e prática. 2.ed. Tradução Engel, P. M. Porto Alegre,
Brasil: Bookman, 2001.
6 Referências Bibliográficas 83
HERBACH, G. J. M.; Van Der BEEK, C. P.; Van DIJCK, P. W. M. The penicillins:
properties, biosynthesis and fermentation. In: VANDAME, E. J.
Biotechnology of Industrial
Antibiotics. New York, USA: Marcel Dekker, v. 22, p.45-140, 1984.
HOJO, O.
Estudo sobre a produção de penicilina G acilase por Bacillus megaterium
ATCC 14945. 1997. 123f. Tese (Doutorado em Engenharia Química) – Universidade Federal
de São Carlos, São Carlos. 1997.
ILLANES, A. et al. Production of penicillin acylase from Bacillus megaterium in complex
and defined media.
Process Biochemistry, v.29, p.263-270, 1994.
INTRODUÇÃO a Redes Neurais. Departamento de Informática da Universidade Estadual de
Maringá. Disponível em: <http://www.din.uem.br/ia/neurais/>. Acesso em: 15 maio. 2005.
KOMIVES, C.; PARKER, R. S. Bioreactor state estimation and control.
Current Opinion in
Biotechnology, v.14, p.468-474, 2003.
LAU, C. G. Y. Neural network, theory and modeling.
Proceedings of the IEEE, v.78, n.9,
p.1411-1413, 1990.
MATHEWS, J. H.; FINK, K. D.
Numerical recipes using matlab. 3.ed. London, UK:
Prentice-Hall, 1999.
MICROBIOLOGY and Bacteriology: the world of microbes. Disponível em:
<http://www.bact.wisc.edu/Microtextbook/>. Acesso em: 15 maio. 2005.
MURAO, S.; SAKAGUCHI, K.; KONO, K.
Process for preparing 6-aminopenicilanic acid
by Bacillus megaterium. U.S. Patent 3,144,395, 1964.
NUCCI, E. R.
Aplicação da lógica Fuzzy na produção de penicilina G acilase em cultivos
de Bacillus megaterium. 2003. 157f. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química) –
Universidade Federal de São Carlos, São Carlos. 2003.
PINOTTI, L. M.
Estudo da produção, purificação e imobilização de penicilina G acilase
de Bacillus megaterium ATCC 14945. 1999. 103f. Dissertação (Mestrado em Engenharia
Química) – Universidade Federal de São Carlos, São Carlos. 1999.
PINOTTI, L. M. et al. Study of different media for production of penicillin G acylase for
Bacillus megaterium ATCC 14945.
Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 84-6,
p.655-663, 2000a.
PINOTTI, L. M. et al. Produção de penicilina G acilase por B. megaterium ATCC 14945:
seleção de microrganismo padrão para inóculo. In: SIMPÓSIO NACIONAL DE
FERMENTAÇÕES, (SINAFERM-13). 13., Teresópolis, Brasil, 2000.
Anais.... Teresópolis:
SINAFERM, 2000b. p.1-6.
PINOTTI, L. M.
Produção e purificação de penicilina G acilase. 2003. 270f. Tese
(Doutorado em Engenharia Química) – Universidade Federal de São Carlos, São Carlos.
2003.
PRESS, W. H. et al.
Numerical recipes: the art of scientific computing. Cambridge, UK:
Cambridge University Press, 1986.
PSICHOGIOS, D. C.; UNGAR, L. H. A hybrid neural network: first principles approach to
process modeling.
AIChE Journal, v. 38, no. 10, p.1499-1511, 1992.
RESEARCH Collaboratory for Structural Bioinformations: Protein Data Bank. Disponível
em: <http://www.rcsb.org/pdb/>. Acesso em: 15 maio. 2005.
6 Referências Bibliográficas 84
RUMELHART, D. E.; McCLELLAND, J. L. and Research Group. Parallel Distributed
Processing: Explorations in the Microstructure of Cognition. Cambridge, UK: MIT Press,
v. I, 1986.
SAVIDGE, T. A.; COLE, M. Penicillin acylase (bacterial).
Methods in Enzymology, v.43,
p.705-721, 1975.
SAVIDGE, T.A. Enzymatic conversions used in the production of penicillins and
cephalosporins. In: VANDAME, E. J.
Biotechnology of Industrial Antibiotics. New York,
USA: Ed. Marcel Dekker, v. 22, p.171-224, 1984.
SHEWALE, J. W.; SIVARAMAN, H. Penicillin Acylase: enzyme production and its
application in the manufacture of 6-APA.
Process Biochemistry, p.146-154, 1989.
SHULER, M. L.; KARGI, F.
Bioprocess engineering: basic concepts. New Jersey, USA:
Prentice Hall International Series in the Physical and Chemical Engineering Sciences, 1992.
SILVA, R. G. et al. A hybrid feedforward neural network model for the cephalosporin C
production process.
Brazilian Journal of Chemical Engineering, v.17, n.04-07, p.587-597,
2000.
SILVA, R. G.
Inferência de variáveis do processo de produção de penicilina G acilase
por Bacillus megaterium ATCC 14945. 2003. 266f. Tese (Doutorado em Engenharia
Química) – Universidade Federal de São Carlos, São Carlos. 2003.
SOUZA, V. R.
Requerimentos nutricionais da produção de penicilina G acilase por
Bacillus megaterium ATCC 14945. 2003. 121f. Dissertação (Mestrado em Engenharia
Química) – Universidade Federal de São Carlos, São Carlos. 2003.
SWARTZ, R. W. Penicillins. In: MOO-YOUNG, M.
Comprehensive biotechnology.
Oxford, UK: Pergamon Press, 1985. v.3, p.7-47.
SZENTIRMAI, A. Production of penicillin acylase.
Applied Microbiology, v.12, p.185-187,
1964.
THOMPSON, M. L.; KRAMER, M. A. Modeling chemical processes using prior knowledge
and neural networks.
AIChE Journal, v.40, n.8, p.1328-1340, 1994.
VANDAME, E. J.
Biotechnology of Industrial Antibiotics. New York, USA: Ed. Marcel
Dekker, v. 22, 1984.
Van CAN, H. J. L. et al. An efficient model development strategy for bioprocesses based on
neural networks in macroscopic balances.
Biotechnology and Bioengineering, v.54, n.64,
p.551-566, 1997.
VARY, P. S. Prime time for Bacillus megaterium.
Microbiology, v.140, p. 1001-1013, 1994.
VAZ, R.; CARLOS, E.; YOKOYA, F. Rev. Lationoam. Ing. Quim., v.8, n.79, 1978. In:
SHEWALE, J. G.; SIVARAMAN, H.; Enzyme production and its application in the
manufacture of 6-APA.
Process Biochemistry, 1989.
VIEIRA, M. F.
Separação de ampicilina produzida enzimaticamente por reação entre
éster metílico de fenilglicina e ácido 6-aminopenicilânico.
2003. Tese (Doutorado em
Engenharia Química) – Universidade Federal de São Carlos, São Carlos. 2004.
VISNARDI, C.
Estudo de alguns aspectos do processo de produção da penicilina G
acilase por Bacillus megaterium ATCC 14945. 1997. 59f. Dissertação (Mestrado em
Engenharia Química) – Universidade Federal de São Carlos. 1997.
6 Referências Bibliográficas 85
VOJTISEK, V.; SLEZAK, J. Folia microbiológica., v.20, 1975. In: SHEWALE, J. G.;
SIVARAMAN, H.; Enzyme production and its application in the manufacture of 6-APA.
Process Biochemistry, 1989.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
