( PDF ) Avaliação diferencial de fatores fisiológicos e cinéticos em cultivos de linhagens de células selvagem e recombinante de drosophila melanogaster S2

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA

Avaliação Diferencial de Fatores Fisiológicos e Cinéticos

em Cultivos de Linhagens de Células Selvagem e Recombinante

de Drosophila melanogaster S2

Clóvis Sacardo da Silva

Orientador: Prof. Dr. Cláudio Alberto Torres Suazo

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Engenharia Química da

Universidade Federal de São Carlos como

parte dos requisitos necessários à obtenção

do título de mestre em Engenharia Química,

área de concentração em Pesquisa e

Desenvolvimento de Processos Químicos.

SÃO CARLOS –SP

2006

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Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da

Biblioteca Comunitária da UFSCar

S586ad

Silva, Clóvis Sacardo da.

Avaliação diferencial de fatores fisiológicos e cinéticos

em cultivos de linhagens de células selvagem e

recombinante de Drosophila melanogaster S2 / Clóvis

Sacardo da Silva. -- São Carlos : UFSCar, 2006.

109 p.

Dissertação (Mestrado) -- Universidade Federal de São

Carlos, 2005.

1. Engenharia bioquímica. 2. Drosophila melanogaster. 3.

Aminoácidos. 4. Apoptose. 5. Velocidade específica de

respiração. I. Título.

CDD: 660.63 (20

)

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AGRADECIMENTOS

Ao Professor Dr. Cláudio Alberto Torres Suazo pela orientação, durante esses dois

anos de trabalho.

À doutoranda Kamilla Swiech pela valorosa colaboração e apoio durante a realização

desta pesquisa.

À equipe do Laboratório de Imunologia Viral do Instituto Butantan (SP) por

possibilitar o desenvolvimento do trabalho com infraestrutura e fornecimento de material para

pesquisa.

Ao Amadeus pela importante ajuda prestada, atenção e paciência, à Sheila, Rodrigo

Bettega e Álvaro, pelo companheirismo e amizade, e a todos os demais amigos do laboratório

Latecc, Patrícia, Marina, Marcelo, Mabel, Douglas, Luiz Cláudio.

Agradeço por tudo e a todos que me ajudaram de alguma forma neste trabalho.

À CNPq pela bolsa concedida e à FAPESP pelo auxílio financeiro.

SUMÁRIO

Lista de Figuras

Lista de Tabelas

NOMENCLATURA

viii

LISTA DE SÍMBOLO

RESUMO

ABSTRACT

1. INTRODUÇÃO

1.1 Objetivo 2

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. Desenvolvimento da vacina anti-rábica 3

2.2. Sistemas de expressão de proteínas recombinantes 4

2.3. Características da célula de inseto Drosophila melanogaster Schneider S2 6

2.4. Meio de cultivo para células de inseto 8

2.5. Cultivo celular 12

2.6. O estado fisiológico da célula 15

2.5.1. Morte celular 16

2.5.2. Necrose e apoptose 16

2.7. Consumo de nutrientes das células de insetos 19

2.8. Acúmulo de subprodutos no cultivo de células de inseto 20

2.9. Oxigênio no cultivo 21

2.4. Comentários gerais

3. MATERIAIS E METODOS

3.1. Materiais 26

3.1.1. Células utilizadas 25

3.1.2. Meio de cultura 26

3.1.3. Corantes para determinar viabilidade celular 26

3.1.4. Solução tampão salina

3.1.5. Equipamentos

3.1.5.1. Câmara asséptica

3.1.5.2. Microscópio 28

3.1.5.3. Autoclave 28

3.1.5.4. Frasco Schott modificado 28

3.1.5.5. Câmara de incubação rotatória 29

3.2. Procedimento experimental para o cultivo de células 29

3.3. Avaliação de métodos para análise de viabilidade 31

3.3.1. Determinação da concentração e viabilidade celular 31

3.3.2. Quantificação de apoptose e viabilidade celular usando corantes

fluorescentes

3.4. Avaliação da influencia do inóculo no crescimento das células S2 32

3.5. Métodos analíticos 35

3.5.1. Concentração de glicose e aminoácidos 35

3.5.2. Medida da transferência de oxigênio 36

3.5.3. Método para determinação Q

3.5.4. Variação do oxigênio durante o cultivo das células S2 em frasco Schott 38

3.6. Programação e estratégia experimental seguida nesta pesquisa 39

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Definição de uma metodologia para quantificação viabilidade das células S2 41

4.2. Consumo de nutrientes e viabilidade celular 45

4.3. Análise da influência do inóculo no crescimento das células S2 e rS2 54

4.4. Análise do planejamento fatorial 57

4.5. Análise da oxigenação do meio no crescimento celular 59

4.5.1. Transferência de oxigênio no frasco Schott 59

4.5.2. Características de respiração das células S2 e rS2 61

4.5.3. Estudo da velocidade específica de respiração celular (Q

) das células

rS2 em Schott de 100 mL

5. CONCLUSÕES

6. SUGESTÕES

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

APÊNDICE

Lista de Figuras

Figura 2.1. O crescimento da célula de inseto Sf-9 em vários meios livres de soro

(SFM) e meio suplementado com soro fetal bovino (FBS). Figura adaptada da

INVITROGEN (2003).

Figura 2.2. Esquema do frasco spinner para cultivo de células de inseto.

Figura 2.3. Esquema geral da diferença entre apoptose e necrose em células animais

(BioAgengy, 2004).

Figura 3.1. Representação esquemática do frasco Schott modificado para realização

de cultivo envolvendo células de inseto S2.

Figura 3.2. Representação esquemática do procedimento seguido nos experimentos

de cultivos das células inseto.

Figura 3.3. Exemplo de gráfico para determinação da produtividade máxima de

células.

Figura 3.4. Variação da concentração de O

dissolvido com tempo durante a

utilização do método dinâmico para determinar Q

Figura 3.5. Esquema do sistema experimental utilizado para a determinação da queda

do oxigênio no frasco Schott. (1) Entrada de ar; (2) Saída de gás; (3) Frasco

Schott modificado.

Figura 4.1. Resultados dos experimentos E1-S2 e E2-rS2 utilizando as células S2 e

rS2, respectivamente, para comparação de porcentagem das células viáveis

totais entre o método de exclusão corante azul de Trypan e método de

fluorescência.

Figura 4.2. Evolução da viabilidade celular no experimento E1-S2.

Figura 4.3. Evolução da viabilidade celular no experimento E2-rS2.

Figura 4.4. Identificação de várias populações de células em microscópio de

fluorescência durante o cultivo de células S2 e rS2. a) Células viáveis não

apoptóticas (VNA). b) Células necróticas (Nec). c) Células livres de

cromatina (CF). d) Células viáveis apoptóticas (VA). e) Células não viáveis

apoptóticas (NVA).

Figura 4.5. Resultados de crescimento celular no cultivo das células S2 e rS2 nos

experimentos E3-S2 e E4-rS2.

Figura 4.6. Evolução da viabilidade celular no experimento E3-S2 monitorada com o

método da fluorescência.

Figura 4.7. Evolução da viabilidade celular no experimento E4 -rS2 monitorada com

o método da fluorescência.

Figura 4.8. Consumo de aminoácidos no cultivo das células S2 no experimento E3-

S2 em frasco Schott de 100 mL a 28°C e 100 rpm.

Figura 4.9. Consumo de aminoácidos no cultivo das células rS2 no experimento E4-

rS2 em frasco Schott de 100 mL a 28°C e 100 rpm.

Figura 4.10. Porcentagem do consumo de aminoácido das células de inseto S2 e rS2

após 216 h de cultivo nos experimentos E3-S2 e E4-rS2.

Figura 4.11. Consumo de aminoácidos correlacionado com a porcentagem de células

S2 apoptóticas no experimento E3-S2.

Figura 4.12. Consumo de aminoácidos correlacionado com a porcentagem de células

rS2 apoptóticas no experimento E4-rS2.

iii

Figura 4.13. Consumo de glicose durante os experimentos E5-rS2 e E6-S2 com as

células rS2 e S2, respectivamente, cultivadas em frasco Schott de 100 mL,

com meio Sf-900 II em correlação com a viabilidade e a concentração celular.

Figura 4.14. Consumo de glicose e glutamina durante os experimentos E5-rS2 e E6-

S2 das células rS2 e S2, respectivamente, cultivadas em frasco Schott de 100

mL com meio Sf-900 II correlacionado com a porcentagem de células

apoptóticas no cultivo das células rS2 e S2.

Figura 4.15. Resultados do crescimento das células rS2 em experimentos realizados

com diferentes concentrações de inóculo (C

ino

) e idades inóculo (I

ino

) em

frasco Schott de 100 mL, agitação 100 rpm e meio Sf-900 II.

Figura 4.16. Efeitos padronizados dos experimentos do planejamento fatorial de 2

considerando a resposta das variáveis: (A) Velocidade específica máxima de

crescimento (µ

max

);

B) Concentração máxima de células (C

max

) e C)

Produtividade de célula (P

max

Figura 4.17. Variação da concentração do oxigênio dissolvido no frasco Schott de

250ml com volume de trabalho de 50 mL, durante a utilização do método

dinâmico oxigenando água a: a) 1 vvm, b) 2 vvm, c) 3 vvm e o meio Sf-900

II a: 1 vvm.

Figura 4.18. Resultados do crescimento e viabilidade celular das células S2 e rS2 nos

experimentos realizados com diferentes vazões de ar com vazão de ar 1 vvm

para oxigenação superficial do frasco Schott de 250 mL, com agitação orbital

de 100 rpm e temperatura de 28°C.

Figura 4.19. Consumo de glicose nos cultivos das células S2 e rS2 com diferentes

vazões de ar com vazão de ar 1 vvm para oxigenação superficial do frasco

Schott de 250 mL, com agitação orbital de 100 rpm e temperatura de 28°C.

Figura 4.20. Consumo de glutamina nos cultivos das células S2 e rS2 com diferentes

vazões de ar com vazão de ar 1 vvm para oxigenação superficial do frasco

Schott de 250 mL, com agitação orbital de 100 rpm e temperatura de 28°C.

Figura 4.21. Curvas de crescimento celular e variação de oxigênio dissolvido nos

experimentos E7-rS2 e E8-S2 com as células rS2 e S2, com vazão de ar 1

vvm para oxigenação superficial do frasco Schott de 250 mL, agitação orbital

de 100 rpm e temperatura de 28°C.

Figura 4.22. Curva de crescimento celular e variação de oxigênio dissolvido no

experimento E9-S2 com as células S2 no frasco Schott de 250 mL, com

agitação orbital de 100 rpm e temperatura de 28°C.

Figura 4.23. Estado morfológico das células S2 no E9-S2 em sistema com excesso de

oxigênio (120%) inicial: A) 48 h e C) 118 h. E sistema sem oxigenação no

E4-rS2: B) 48 h e D) 118 h de cultivo.

Figura 4.24. Curvas de Q

em função do tempo dos experimentos E7-rS2, E8-S2 e

E9-S2 com as células S2 e rS2 utilizando vazão de ar 1 vvm para oxigenação

superficial no frasco Schott de 250 mL, agitação orbital de 100 rpm e

temperatura de 28°C.

Figura 4.25. Curvas de Q

e crescimento celular das células High Five

(Tn-5) e

Sf-9, ambas as células cultivadas em meio Sf-900 II, biorreator Applikon,

com volume de trabalho de 1,4 L em função do tempo de cultivo celular.

Gráfico adaptado dos estudos realizados por RHIEL et al. (1997).

Figura 4.26. Variação Q

com a concentração de oxigênio dissolvido (C

)

das

células S2 e rS2 em experimentos com vazão de ar 1 vvm para oxigenação

superficial em frasco Schott de 250 mL, com agitação orbital de 100rpm e

temperatura de 28°C.

Figura 4.27. Resultados do experimento E11-rS2, com vazão de ar 1 vvm para

oxigenação superficial do frasco Schott de 100 mL, com volume de trabalho

de 20 mL, meio Sf-900 II, temperatura de 28°C e agitação orbital de 100 rpm.

Figura 4.28. Variação Q

com a concentração de oxigênio dissolvido (C

) das

células rS2 no experimento E11-rS2, com vazão de ar 1 vvm para oxigenação

superficial do frasco Schott de 100 mL, com volume de trabalho de 20 mL,

meio Sf-900 II, temperatura de 28°C e agitação orbital de 100 rpm.

Figura 4.29. Variação de pH, agitação, viabilidade e crescimento celular das células

rS2 cultivadas em meio Sf-900 II no biorreator Applikon, com volume de

trabalho de 0,75 L em função do tempo de cultivo celular. Gráfico adaptado

dos estudos realizados por SWIECH (2005).

Figura 4.30. Variação de Q

das células rS2 e oxigênio dissolvido em função do

tempo de cultivo celular do experimento realizado por SWIECH (2005) e o

experimento E11-rS2 e E7-rS2.

Figura 4.31. Resultados do crescimento e viabilidade celular das células rS2 nos

experimentos realizados com diferentes agitações (90, 100 e 120 rpm)

utilizando o frasco Schott de 100 mL, meio Sf-900 II, temperatura de 28°C e

com volume de trabalho de 20 mL.

Lista de Tabelas

Tabela 2.1. Lista das nove linhagens de células de inseto investigado com potencial para

sistema de expressão de proteínas recombinante.

Tabela 2.2.

Proteína recombinantes expressa por células de Drosophila melanogaster.

Tabela 2.3. Meios suplementados com soro fetal bovino (FBS) para cultura de inseto.

Tabela 2.4. Meios livres de soro (SFM) comercialmente disponíveis para cultura de

células de inseto.

Tabela 2.5. As vantagens e desvantagens do uso de SFM (CARTWRIGHT, 1994).

Tabela 2.6. Vantagens e desvantagens para os métodos de cultura em monocamada e

suspensão.

Tabela 2.7. Indução de apoptose em condições de cultura de células animais.

Tabela 2.8. Características dos experimentos no biorreator para investigar o efeito da

oscilação da concentração do oxigênio dissolvido (RHEIL & MURHAMMER,

1995).

Tabela 3.1 Concentração de componentes identificados em trabalhos que utilizaram o

meio Sf-900 II.

Tabela 3.2. Composição da solução tampão salina.

Tabela 3.3. Ensaios realizados e suas principais características.

Tabela 4.1. Resultados dos experimentos de cultivo com células rS2 em meio Sf-900 II

variando a concentração e idade do inóculo.

Tabela 4.2. Valores de k

a, para diversas vazões de ar no espaço gasoso de um frasco

Schott de 250 mL.

vii

Tabela 4.3. Característica dos experimentos realizados para monitoramento do oxigênio

dissolvido no caldo de cultivo no frasco Schott de 250 mL.

Tabela 4.4. Resultados obtidos nos experimentos utilizando as células S2 e rS2 realizados

com vazão de ar de 1vvm no espaço gasoso do frasco Schott de 250 mL, em

relação µ

max

e concentração máxima de células.

Tabela 4.5. Características dos experimentos utilizando frasco Schott de 100 mL, para

monitoramento do oxigênio dissolvido e influência da rotação.

Tabela 4.6. Valores de Q

no início e final da fase de crescimento exponencial das

células rS2 na presença do eletrodo de oxigênio dissolvido para diferentes

volumes de trabalho.

Tabela 4.7. Resultados obtidos nos experimentos utilizando as células rS2 utilizando

frasco Schott de 100 mL e diferentes condições de agitação, em relação µ

max

concentração máxima de células.

viii

NOMENCLATURA

Ala Alanina

Asp Aspartato

Arg Arginina

Bm-5 Célula Bombxy mory linhagem 5

BVDV Bovine Viral Diarrhea Vírus (Vírus da Diarréia Viral Bovina)

Cys Cisteína

EMEA Agência européia para o desenvolvimento de produtos medicinal

FBS Soro fetal bovino

FDA Agência americana de gerenciamento de alimentos e medicamentos

Gly Glicina

Glu Glutamato

His Histidina

Leu Leucina

Lys Lisina

Ile Isoleucina

Met Metionina

Phe Fenilalanina

Pro Prolina

rADN ADN (ácido desoxirribonucléico) recombinante

rS2 Células recombinante Schneider linhagem 2

Ser Serina

SVEB Sistema vetor de expressão baculovirus

S2 Células Drosophila melanogaster Schneider linhagem 2

SFM Meio livre de soro

Sf-9 Célula Spodoptera frugiperda linhagem 9

Tn Célula Trichoplusia ni

Thr Treonina

Tyr Tirosina

Val Valina

LISTA DE SÍMBOLO

abrev. nome unidade

máx

Velocidade específica de crescimento celular máxima h

-1

máx

Produtividade máxima células/mL.h

Concentração de saturação de oxigênio mmol/mL

Velocidade específica de respiração mmol/célula.h

Velocidade específica de crescimento h

-1

Coeficiente volumétrico de transferência de O

OD Oxigênio dissolvido mmol/L

Concentração de oxigênio dissolvido mmol/L

ino

Idade do inóculo h

ino

Concentração de célula do inóculo células/mL

max

Concentração máxima de célula células/mL

Viab. Viabilidade celular %

t Tempo de cultivo h

Resumo

Nos últimos 10 anos a célula de inseto Drosophila melanogaster Schneider S2 tem se

destacado nos estudos de proteínas recombinantes. Entretanto, encontra-se na literatura pouco

estudo dos parâmetros relacionado ao uso da célula de inseto Drosophila melanogaster em

bioprocessos. O presente trabalho foram avaliados fatores fisiológicos importantes no do

cultivo das células de inseto Drosophila melanogaster S2 (S2) e recombinante S2 (rS2)

através de cultivos em frasco Schott e meio livre de soro a 28°C. Realizaram-se experimentos

nos quais foi acompanhada a viabilidade celular das células de insetos pelos métodos de

exclusão de corante azul de Tripan e de corantes fluorescentes. Ambos os métodos utilizados

nos experimentos para acompanhar a viabilidade do cultivo das células S2 e rS2 se mostraram

confiáveis para identificação da porcentagem de células viáveis. Os estudos demonstraram que

o crescimento das células S2 e rS2 não foram limitados pelo consumo total de aminoácidos e

glicose.

Nos experimentos utilizando as células rS2 para verificar a influência da idade e

concentração do inóculo, verificou-se que ambos os parâmetros não tem influência na

velocidade específica de crescimento máxima.

Foram realizados experimentos em frasco Schott de 250 mL com volume de trabalho

de 50 mL, nos quais foram monitoradas as concentrações de oxigênio dissolvido (OD) nos

caldos de cultivo das células S2 e rS2. Os resultados demonstraram que o cultivo atingiu a fase

estacionária com nível muito baixo de oxigênio dissolvido. Sendo este um fator limitante do

crescimento das células. A velocidade específica de respiração celular (Q

) demonstrou um

decréscimo acentuado na fase exponencial de crescimento exceto para fase estacionária. O

excesso de oxigênio na fase inicial do cultivo foi prejudicial para o crescimento das células.

Entretanto, nos experimentos realizados em frasco Schott de 100 mL com volume de trabalho

de 20 mL, Q

das células rS2 apresentou-se 10 a 15 vezes menor que realizados no frasco

Schott de 250 mL.

Os experimentos realizados em frasco Schott de 100mL com diferentes agitações

demonstraram que para baixa agitação, a transferência de oxigênio deve ser um fator limitante

no crescimento celular. A viabilidade celular para todos os experimentos realizados em

diferentes agitações se manteve entre 95 e 99% de células viáveis, indicando que as células

estavam em bom estado fisiológico.

ABSTRACT

In the last 10 years the insect cell Drosophila melanogaster Schneider S2 has been

increasingly used for studies of proteins recombinants. However, there is a lack of studies that

involved parameters related to the use of the insect cell Drosophila melanogaster in

bioprocess. The aim of this work was to study the factors physiologies important in the

cultures of the insect cells Drosophila melanogaster S2 (S2) and recombinant S2 (rS2),

through cultures in Schott flask, serum free medium at 28°C. There were performed

experiments with the purpose of monitoring the viability cellular of insect cells by the methods

of exclusion of Trypan blue and of fluorescent dyes. Both methods used in the experiments to

monitor the viability of the cultures of the cells S2 and rS2 were shown reliable for the

identification of the percentage of viable cells. The studies revealed that growth of S2 and rS2

cells was not limited by the total consumption of amino acids and glucose.

In the experiments utilizing the rS2 cells to verify the influence of the age of the

inoculum and concentration of the inoculum, it was verified that both parameters did not have

influence in the growth specific rate.

Experiments done in Schott flask of 250 mL with a working of 50 mL, in which were

monitored the concentration of dissolved oxygen (DO) in the broths of cultivation of the cells

S2 and rS2. The results demonstrated that the cultivation reaches the stationary phase with

very low level of dissolved oxygen, whit DO being a limiting factor of the growth of the cells.

The specific oxygen consumption rate (Q

) demonstrates an accentuated decrease in the

exponential phase of growth, except for stationary phase. The excess of oxygen in the initial

phase of the cultivation was harmful to the growth of the cells. However, in the experiments

done in Schott flask 100 mL with a working volume of 20 mL, Q

of the cells rS2, revealed

10 to 15 times smaller than these performed in the Schott flask of 250 mL.

The experiments done in Schott flask of 100 mL with different agitations demonstrated

that for low agitation the transfer of oxygen should be a limiting factor in the cellular growth.

The cellular viability for all of the experiments performed in different agitations stayed

between 95 and 99% of viable cells indicating that the cells were in good physiologic state.

Introdução -1-

1. INTRODUÇÃO

O desenvolvimento rápido da biotecnologia durante os últimos 20 anos se deve

principalmente aos avanços conseguidos em engenharia genética. Vários sistemas de

expressão têm sido desenvolvidos em bactérias, leveduras, células de plantas e células animais

para uso na produção de proteínas de grande interesse para a humanidade. A seleção de um

sistema ótimo de expressão é muito importante para obter alto rendimento na produção da

proteína com alto grau de pureza e baixo custo de produção. Porém, a escolha do sistema de

expressão está baseada na funcionalidade da proteína expressa, pois muitas proteínas requerem

modificações pós-traducionais como a glicosilação, por exemplo, fundamentais para a correta

atividade biológica.

A utilização de células animais para expressão de biomoléculas vem sendo cada vez

mais escolhida pelas indústrias farmacêuticas, devido à qualidade das proteínas obtidas com

esse tipo de células. Comercialmente, as proteínas provenientes de células recombinantes

animais devem ocupar 10% do mercado mundial de produtos farmacêuticos, tornando-se um

setor de multi-bilhão de dólares na biotecnologia (AL-RUBEAI, 2004).

Nos últimos 10 anos a célula de inseto de Drosophila melanogaster tem sido

destaque na expressão e estudos de proteínas recombinantes, incluindo moléculas de adesão de

células (BELLOSTA et al., 1994), antígenos virais (BRIGHTY et al., 1991; BRIGHTY &

ROSENBERG, 1994; DEML et al., 1999), oncogenes (GETLER et al., 1995), anticorpos

(KIRKPATRICK et al., 1995), receptores (JOHANSON et al., 1995; TOTA et al., 1995) e

fatores de transcrição (COUREY & TJIAN, 1998). Na maioria dos casos, as proteínas testadas

foram processadas confiadamente e biologicamente ativas. Entretanto, há pouca informação

disponível sobre parâmetros cinéticos relacionados ao uso da célula de inseto Drosophila

melanogaster em bioprocessos, gerando a necessidade de uma adaptação e aperfeiçoamento de

Introdução -2-

conhecimentos concernentes à engenharia de bioprocessos para satisfazer esta nova demanda

tecnológica.

Porém, é importante levar em consideração que qualquer estratégia de investigação

ou de desenvolvimento de bioprocessos envolve formulação de meio de cultura, otimização

das condições operacionais e estudos de aumento de escala, exigindo o conhecimento de

alguns parâmetros como a velocidade específica de crescimento celular, de respiração, de

consumo ou produção de metabólitos chaves, que permitem comparar entre si diferentes

bioprocessos, mesmo que conduzidos de formas diferentes (NEVES et al., 2001).

Neste contexto, uma interação entre o Laboratório de Tecnologia de Cultivo Celular

(LATECC) do Departamento de Engenharia Química da UFSCar e o Laboratório de

Imunologia Viral do Instituto Butantan vem sendo realizada com o objetivo de desenvolver o

bioprocesso do cultivo de células de inseto Drosophila melanogaster Schneider S2 para

produção de vacina anti-rábica em larga escala. O trabalho consiste na modificação genética e

seleção das células de inseto recombinante S2 (rS2) pelo Instituto Butantan e comparação

fisiológica de ambas células de inseto S2 e rS2 pelo LATECC, pois as células não

recombinantes normalmente apresentam características de crescimento celular diferentes em

relação às células recombinantes, devido à modificação genética (KEITH et al., 1999).

1.1. Objetivo

O presente trabalho teve como objetivo estudar parâmetros fisiológicos do cultivo das

células de inseto Drosophila melanogaster S2 e rS2 como velocidade específica de

crescimento celular, consumo de nutrientes (glicose e aminoácidos), velocidade específica de

respiração e viabilidade celular, através de cultivos em frasco Schott e meio livre de soro,

visando à obtenção de dados importantes para o desenvolvimento do bioprocesso.

Revisão Bibliográfica - 3 -

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. Desenvolvimento da vacina anti-rábica

O vírus da raiva causa uma forma fatal de encefalomielite, que constantemente

produz vítimas tanto em seres humanos como em animais domésticos e selvagens. A maioria

das vacinas de raiva humana é produzida de cultivo de tecido infectado. Podemos destacar

cultivos em células diplóides humanas (CDH) e células VERO, cujas vacinas podem ser

admitas para uso profilático sem preocupações de efeitos colaterais com os que tinham sido

associados o vacinas de produzida em cérebro de camundongo. As vacinas da raiva humana

são usadas normalmente como um agente terapêutico pós-exposição das pessoas mordida por

animal raivoso, mas países em desenvolvimento não são auto-suficientes na produção de

vacinas da raiva para uso humano. Além disso, o processo da produção da vacina da raiva

inclui passos perigosos em controlar quantias grandes de materiais infecciosos (COSTA et al.

2000).

No entanto, com desenvolvimento da engenharia genética está sendo possível o

desenvolvimento de vacinas recombinante preparadas a partir da glicoproteína do vírus da

raiva. A glicoproteína do vírus da raiva é antígeno de superfície, responsável pela formação de

anticorpos neutralizantes (COLL, 1995).

Vários sistemas têm sido estudados para expressão da glicoproteína do vírus da raiva

tais como bactérias, leveduras e células eucariontes. A proteína expressa pelo sistema de

bactéria (Escherichia coli) não protegeram os ratos nos teste realizados em laboratório, divido

a falta da glicosilação não realizado pelas as bactérias (YELVERTON et al., 1983).

O sistema com levedura (Saccharomyces cerevisiae) nem toda forma de glicoproteína

do vírus da raiva pode ser produzida. SAKAMOTO et al. (1998) investigaram duas formas de

glicoproteína do vírus raiva (designadas como yGI e yGII, peso molecular 66 e 56 kDa).

Revisão Bibliográfica - 4 -

Ambas formas yGI e yGII foram produzidas, mas somente yGII induziu imunidade protetora

em porcos da guiné. Além disso, a forma yGII foi produzida em baixa quantidade 30-40

ng/mL.

A produção da glicoproteína do vírus da raiva em células eucariontes tem se

demonstrado eficiente imunogenicamente e antigenicamente. GUPTA et al. (2005) utilizando

células de mamífero MDBK (Madin Darby bovine kidney), demonstraram que as células

expressam a forma solúvel da glicoproteína do vírus da raiva.

O estudo em células eucariontes tem a vantagem de que não há nenhuma manipulação

vírus vivo, assim o antígeno da glicoproteína do vírus da raiva pode ser produzido sem risco

de infecção para humano ou animais. Além disso, a proteína da recombinante é expressa

continuamente no sobrenadante da cultura de células que pode ser purificado usando

cromatografia de afinidade sem contaminantes celulares.

2.2. Sistemas de expressão de proteínas recombinantes

Nas últimas duas décadas inúmeros sistemas de expressão de proteínas recombinantes

altamente eficiente têm sido desenvolvidos com base na utilização de bactérias, leveduras,

células de mamíferos e insetos.

O sistema de expressão de proteínas recombinantes com bactéria mais comum é

Escherichia coli, devido a sua simplicidade para manipulação e custo do meio de cultivo mais

barato. Entretanto, Escherichia coli não tem sido satisfatoriamente aprovado para a produção

de proteínas grandes e complexas, como enzimas, antígenos virais e anticorpos monoclonais.

Isto é porque, muitas proteínas produzidas em células passam por umas inúmeras

modificações químicas pós-traducionais, como glicosilação, fosforilação, carboxilação,

amidação, acetilação e formação de ligações de enxofre (BANEYX, 1999; CARTWRIGHT,

Revisão Bibliográfica - 5 -

1994). Leveduras como Pichia pastoris e Sacharomyses cerevisiae são organismos mais

complexos que a Escherichia coli e executam algumas modificações pós-traducionais tal

como glicosilação, mas os processos com levedura costumam ser mais complexos que os

microbianos (CEREGHINO & CREGG, 1999). No entanto, as células de mamíferos tais como

CHO e BHK efetuam modificações pós-traducionais semelhantes às das células humanas, mas

a manutenção dessas células em cultura tem custo mais elevado, exigindo cuidados rigorosos

em relação à contaminação (GOOSEN, 1993).

Por outro lado, as células de inseto são capazes de promover os vários tipos de

modificações pós-traducionais já mencionados. A glicosilação (adição de açucares a cadeia

protéica) uma das mais importantes é basicamente similar à realizada por células de

mamíferos, pois esta modificação permite a correta atividade da proteína.

A célula de inseto em conjunto com o sistema vetor de expressão baculovirus

(SVEB) tem sido alvo de inúmeros estudos tanto na produção de bioinseticidas quanto na

produção de proteínas recombinantes de interesse industrial. No entanto, SANDERSON et al.

(1999) lista algumas dificuldades com o SVEB como a produção de proteases, não secreção de

produto, lise da célula e incompleta glicosilação.

KEITH et al. (1999) destacam em seu trabalho nove linhagens (Tabela 2.1) de células

de inseto com potencial para o sistema de produção de proteína recombinante que podem ser

obtidas comercialmente. Eles detiveram seus estudos em apenas cinco linhagens (Bm-5, High-

Five, IPLB-LdFB, IZD-MB-0503, Sf-21), com destaque para linhagem de célula High-Five

cultivada em meio IPL-41 suplementado com 10% de soro fetal bovino que atingiu uma

concentração final da proteína (GM-CSF, Granulocyte–macrophage colony-stimulating

factor) desejada de 22,8 mg/L em cultura em suspensão e 46 mg/L em cultura estática.

Revisão Bibliográfica - 6 -

Tabela 2.1. Lista das nove linhagens de células de inseto investigadas com potencial

para sistema de expressão de proteínas recombinantes.

Linhagem de células Espécies

Bm-5

Bombyx mori

Bm-N4

Bombyx mori

Hihg-Five

Trichoplusia ni

IAL-PiE

Plodia interpuntella

IPLB-HvE6

Heliothis virencens

IPLB-LdFB

Lymantria dispar

IZD-MB-0503

Mamestra Brassicae

Schneider´s line 2

Drosophila melanogaster

Sf-21

Spodoptera frugiperda

2.3. Características da célula de inseto Drosophila melanogaster Schneider S2

As células de inseto Drosophila melanogaster Schneider-2 (S2) são derivadas de uma

cultura primária de estágio tardio (20-24 horas) de embriões de Drosophila melanogaster

(SCHNEIDER, 1972 apud INVITROGEN, 2003), e têm sido usadas progressivamente para

expressão de proteínas heterólogas.

Umas das características é a estabilidade da célula S2 transfectada, que pode ter

também a estabilidade pela co-transfecção de expressão de dois plasmídeos. Um aspecto único

das células de inseto S2 é a possibilidade de completar perto de 1000 cópias de células

transfectadas em um evento de transfecção–seleção. Portanto, um longo período de

amplificação plasmídica e seleção de células clones não são requeridos (DEML et al., 1999).

No referente à expressão de proteína as células de Drosophila apresentam uma clara vantagem

sobre as células de mamíferos, já que estas requerem meses de seleção para conseguir um alto

número de cópias de gene alvo e altos níveis de produção de proteína.

Revisão Bibliográfica - 7 -

IVEY-HOYLE (1991) relata em seu trabalho a versatilidade e conveniência da

flexibilidade das células de Drosophila, tendo como destaque o crescimento em suspensão

para alta densidade celular (1 a 2 x 10

células/mL). A Tabela 2.2 mostra algumas proteínas que

foram expressas de maneira satisfatória em células de Drosophila melanogaster.

Outra característica importante é que as células Schneider S2 podem tanto ser

cultivadas em meio suplementado com soro fetal bovino (FBS – fetal bovine serum) como

serem adaptadas para cultivo em meio livre de soro (SFM – serum free medium) (ARANTES,

2004).

Tabela 2.2. Proteínas recombinantes expressadas por células de Drosophila

melanogaster.

Proteínas

Concentração

(mg/L)

Referência

Glicoproteína envelope recombinante

(gp 120)

1 –35 IVEY-HOYLE (1991)

Antígeno de superfície do vírus da

hepatite B (HbsAg)

1,8 – 4,75 DEML et al. (1999)

Proteína citosólica anexina XIIb (Anx

XIIb)

1,6

BENTING et al. (2000)

Forma truncada da proteína VIP36 0,5

BENTING et al. (2000)

Proteína menin humana 1

VALLE et al. (2001)

Proteína verde fluorescente (GFP) -

CHA et al. (2003)

Interleucina humana 2 (HIL-2) 2,3

CHA et al. (2003)

Revisão Bibliográfica - 8 -

2.4. Meio de cultivo para células de inseto

Através da história da cultura de células de inseto, melhoramentos no projeto de

meios de cultura têm levado ao aumento da produtividade das células na produção de vírus e

proteínas recombinantes. Inicialmente, meios contendo FBS mostraram-se particularmente

benéfico para a cultura de células de inseto. Contudo, devido às dificuldades apresentadas nas

operações de purificação do produto e o conseqüente aumento no custo do processo, meios de

cultivos não contendo soro foram desenvolvidos, os quais têm apresentado bom desempenho

na produção de proteínas (CHAN et al., 1998). Além da dificuldade que o soro apresenta no

momento da purificação do produto (SILVA, 2004), HENSLER et al. (1994) e CRUZ et al.

(1998) ressaltam a preocupação com possíveis agentes contaminantes no soro, por exemplo: a

presença do Vírus da Diarréia Viral Bovina (BVDV - Bovine Viral Diarrhea Vírus) no FBS

pode interferir na produção de vacina animal e processos de produção com uso de soro podem

ter uma variabilidade na composição de lote para lote, uma vez que o soro representa uma

mistura indefinida componente.

As necessidades nutricionais das células de inseto, como as de outras células animais,

são extremamente complexas. Isto tem levado ao desenvolvimento de vários meios de cultura,

desde o primeiro sucesso com o meio Grace’s no cultivo de tecidos de célula de inseto. A

composição do meio Grace foi baseada na hemolinfa de inseto a 5% (w/w). Contudo foi

verificado que a hemolinfa de inseto poderia ser substituída por soro fetal bovino como fonte

de vitaminas, fatores de crescimento e outros componentes não definidos.

Pelo fato de ser mais fácil de obter grandes quantidades de FBS sob condições

controladas, este foi o suplemento escolhido. Meios de cultura para o cultivo de células de

inseto passaram a ser suplementados com 4 a 20% de FBS (MARANGA et al., 2002). Na

Tabela 2.3 estão listados os principais meios desenvolvidos suplementados com FBS.

Revisão Bibliográfica - 9 -

Tabela 2.3. Meios suplementados com FBS para cultura de células de inseto.

Meios Formulação

Grace’s Insect Medium

Mistura nutritiva de aminoácidos, vitaminas, carboidratos,

suplementos orgânicos, inorgânicos e sais.

Grace’s Insect Medium –

Vaughn’s Modified

Original Grace’s Insect Medium com aumento na

concentração de cloreto de potássio e um correspondente

decréscimo na concentração de cloreto de cálcio.

Hink’s TNM-FH Insect

Medium

Original do meio Grace’s suplementada com lactalbumina

hidrolisada (LAH) e extrato de levedura (yeastolate)

TC-100 Insect Medium

Meio de cultivo de menor complexidade, não contém

hemolinfa de inseto e albumina.

Schneider’s Drosophila

Suplementado com L-Glutamina. Este meio é geralmente

suplementado com soro (5-10% FBS).

Quando componentes de origem humana ou animal são adicionados ao meio de

cultura, há um risco potencial de transferência de vírus como Encefalopatia Espongiforme

Bovina precursor da doença da “Vaca Louca” (BSE - Bovine Spongiform Encephalopathy)

que causa a degeneração cerebral. Recentemente agências reguladoras, como o FDA (Food

and Drug Administration) ou EMEA (Europe Agency for the Evaluation of Medicinal

Products), estão banindo o uso de soro, e assim, o SFM tem se tornado o padrão preferido na

fase de desenvolvimento de processos (VAN DER POL & TRAMPER, 1998; MARANGA et

al., 2002).

No entanto, o desenvolvimento bem sucedido do meio livre de soro para cultivo de

células de inseto como demonstra a Figura 2.1, tem resultado em várias formulações de meios

comercialmente disponíveis não requerendo adição de soro para cultivo das células inseto Sf-

Revisão Bibliográfica - 10 -

0246810

100

120

140

GIBCO SF-900 II SFM

JRH EXCELL 400SFM

JRH EXCELL 401SFM

SIGMA SFM

WHITTAKER SFM

GRACES+10% FBS

Concentração Celular (células/mL (x10

))

Dias de Cultivo

Figura 2.1. O crescimento da célula de inseto Sf-9 em vários meios livres de soro

(SFM) e meio suplementado com soro fetal bovino (FBS). Figura adaptada da

INVITROGEN (2003).

Na Tabela 2.4 estão listados alguns meios disponíveis comercialmente para cultura

células de inseto e para tecnologia de rADN. Deve-se ressaltar que há inúmeros meios livres

de soro (SFM) no mercado.

Tabela 2.4. Meios livres de soro (SFM) comercialmente disponíveis para cultura de

células de inseto.

Meios Composição Aplicação Célula de inseto

Sf-900 II

Livre de

proteína e soro

Usado para sistema de vetor de

expressão baculovirus (SVEB)

para cultivo em monocamada ou

suspensão.

Sf-9, Sf-21, Tn-368,

adaptado para S2.

EX-CELL™ 420

L-Glutamina,

Pluronic-F68 e

glicose.

Sistema de suspensão ou

monocamada.

Sf-9 e Sf-21

Schneider S2

(Drosophila)

Drosophila-SFM

Livre de

proteína e soro

Sistema de suspensão ou

monocamada.

Drosophila (D.Mel-

2, Schneider S2)

Insectgro™

Livre de

proteína e soro

Crescimento de Drosophila S2

Schneider S2

(Drosophila)

Revisão Bibliográfica - 11 -

Os problemas com o uso do SFM surgem do não conhecimento total das necessidades

nutricionais das células, sendo impossível preverem todos os componentes necessários em um

meio quimicamente definido. Outros inconvenientes incluem a perda do efeito de proteção

exercido pelo soro contra forças de cisalhamento e o longo tempo de adaptação para alguns

tipos de célula. Além disso, as condições de crescimento da célula tornam-se mais críticas na

ausência de soro (ex: menores variações no valor do pH do meio são toleradas pelas células)

(CARTWRIGHT, 1994). A Tabela 2.5 resume as vantagens e desvantagens do uso de SFM no

cultivo de células animais.

O esgotamento de nutrientes no meio de cultura tem sido apontado como a principal

limitação em relação ao crescimento e à formação do produto em culturas de células de inseto

(WU et al., 1998; ZHANG et al., 1998; DOVERSKOG et al., 1997). Para atingir o objetivo de

altas densidades de células e maiores produtividades na expressão de proteínas, várias

estratégias têm sido utilizadas, entre elas, o melhoramento do meio de cultura, operação da

cultura em batelada alimentada e cultura em perfusão (CARON et al., 1994; BÉDARD et al.,

1997; ELIAS et al., 2000).

Tabela 2.5. As vantagens e desvantagens do uso de SFM em cultivos de células

animais (CARTWRIGHT, 1994).

Vantagens Desvantagens

- Sem riscos de contaminação viral;

- Composição do meio constante;

- Garantia de suprimento de nutrientes;

- Ambiente nutricional definido;

- Maior facilidade de purificação de produto.

- Cada tipo de célula pode requerer um meio

diferente;

- Pode ocorrer dificuldade em adaptação das

células;

- Perda dos efeitos positivos do soro.

Revisão Bibliográfica - 12 -

Além das altas densidades de células, deve haver a preocupação com a produtividade

do sistema. Uma importante característica do sistema célula de inseto é que a produtividade

específica (isto é, produção por célula) diminui com o aumento da densidade celular. É o

chamado “efeito da densidade celular”. Alguns autores sugerem como causas desse efeito à

limitação de nutrientes, a exaustão do precursor ou o acúmulo de componentes tóxicos no

meio (CARON et al., 1994; TATICEK & SHULER, 1997).

Como estratégia para reverter parcial ou totalmente o “efeito da densidade celular”

pode ser realizada a completa renovação do meio de cultura gasto com meio fresco

(AGATHOS, 1996; HENSLER & AGATHOS, 1994) ou simultânea renovação do meio e

suplementação de nutrientes (AGATHOS, 1996; REVEUNY et al., 1993).

2.5. Cultivo celular

São várias técnicas para o cultivo de células animais como cultura em monocamada,

suspensão e aderidas a partículas (microcarregadores) (RIZZO et al., 1983).

As culturas em monocamadas são culturas onde as células aderem a uma superfície

sólida e usa-se meio de cultura líquido. Para células de inseto S2 este tipo de cultivo é

realizado normalmente em frascos T. Células em suspensão podem sobreviver e proliferar sem

a necessidade de estarem aderidas a um substrato. Culturas em suspensão é o método preferido

para aumento de escala por ser mais fácil e de menor custo, requer menos espaço, o

crescimento celular pode ser monitorado e os parâmetros ambientais podem ser controlados

mais facilmente (FRESHNEY, 1994).

Células de inseto não são geralmente dependentes de ancoramento (adesão a um

substrato), elas se adaptam facilmente a condições de cultura em suspensão. Para o cultivo de

Revisão Bibliográfica - 13 -

células de inseto em suspensão são utilizados normalmente frascos Schott, spinners e

biorreatores (DREWS et al. 1995; KAMEN et al., 1996). O frasco spinner possui uma haste

rotatória ligada a tampa do recipiente. Além disso, há a presença de braços laterais para a

adição de células, troca de meio ou de gás (Figura 2.2) (DOYLE, 1998).

Figura 2.2. Esquema do frasco spinner para cultivo de células de inseto.

Cada forma de cultivo de células animais tem fatores que a tornam vantajosa ou

desvantajosa em relação à outra. A Tabela 2.6 lista os mais importantes fatores de cada forma

de cultivo.

Os biorreatores utilizados em cultura de células animais normalmente são os

operados em batelada, batelada alimentada e de perfusão. O processo de perfusão é empregado

há muito tempo no cultivo de células animais. São ensaios contínuos onde as células são

constantemente nutridas com meio fresco.

Células de inseto S2 crescem bem tanto em cultivos em monocamada (frascos T)

como em suspensão (frascos Erlenmeyers, Schotts, spinners e biorreatores)

(SONDERGAARD, 1996; VALLE et al., 2001; ARANTES, 2004; CHA et al., 2005).

Revisão Bibliográfica - 14 -

Tabela 2.6. Vantagens e desvantagens para os métodos de cultura em monocamada e

suspensão.

Vantagens Desvantagens

Cultura em

Monocamada

(aderidas)

- Manutenção fácil e de baixo custo;

- Permite uma fácil inspeção visual com o

uso do microscópio invertido;

- Facilidade na troca de meio de cultivo;

- A razão meio/célula é mudada mais

facilmente durante um experimento.

- Manipulação mecânica

(passagens) pode diminuir a

viabilidade;

- Requer múltiplos frascos para

expressão em larga escala;

- A densidade de células é

limitada devido à monocamada.

Isto pode limitar a

produtividade de proteína por

unidade de volume de cultura

celular.

Cultura em

Suspensão

- Facilita o aumento de escala de expressão

de proteínas;

- Requer menos espaço;

- Mais alta densidade de células. Isto pode

aumentar a produtividade volumétrica de

cultura celular;

- Maior oxigenação e manipulação mínima

podem aumentar a viabilidade. As

viabilidades são normalmente maiores que

98%;

- Células S2 não requerem adaptação e

prontamente passam de culturas aderidas à

suspensão e vice-versa.

- Requer spinners, incubadoras.

O start up pode ser de maior

custo;

- Requer diariamente a

contagem de células e

determinação da viabilidade

para seguir padrões de

crescimento;

- Pode ser difícil manter a

esterilidade.

Fonte: Adaptado de Growth and Maintenance of Insect Cells Lines. Insect Cell Lines –

Invitrogen Life Technologies (2002).

SONDERGAARD (1996), trabalhando com as células Drosophila melanogaster

linhagem S2 analisou o crescimento da célula em alta densidade (5,7 x 10

células/mL) em

cultivos em batelada e em batelada alimentada. Usando meio Schneider’s suplementado com

10% FBS, os autores obtiveram um rendimento de 1,7 x 10

células/mL, operando o biorreator

em batelada alimentada, enquanto que no cultivo em batelada o rendimento foi de 8,3 x 10

células/mL. Estudos realizados por VALLE et al. (2001) com as células Drosophila

Revisão Bibliográfica - 15 -

melanogaster recombinante S2 para produção da proteína menin humana usando um

biorreator de 10 L operando em batelada alimentada obtiveram uma concentração celular final

de 1,2 x 10

células/mL. O alto rendimento obtido com as células de inseto S2 e rS2

demonstra a viabilidade desse processo em biorreatores.

2.6. O estado fisiológico da célula

O termo estado fisiológico é quantificado por um vetor composto de várias variáveis

de processo que fornecem informações significativas sobre o estado celular. Estas variáveis

podem ser selecionadas entre diferentes classes, incluindo velocidades metabólicas

específicas, razões entre velocidades metabólicas e outras.

A eficiência do bioprocesso é fortemente influenciada por mudanças no estado

celular, o qual deve ser monitorado, interpretado e, se possível, propriamente manipulado. O

monitoramento e controle da fisiologia celular são considerados as questões mais desafiantes

da engenharia de processo moderna. (KONSTANTINOV, 1996).

O ponto central do processo da otimização é o estudo das interações entre células e os

componentes químicos, bioquímicos e físicos do ambiente da cultura, e o impacto destes

fatores na produtividade da proteína, na proliferação e morte das células. Entretanto a

determinação do total de células e sua viabilidade estão entre as mais importantes medidas

durante ambas as fases, de crescimento e de produção, em cultivos com células de inseto

(AGATHOS, 1996).

Revisão Bibliográfica - 16 -

2.6.1. Morte celular

Previamente, como com a maioria das áreas de pesquisa biológica, o termo necrose

foi usado constantemente por cientistas da cultura de células para designar morte celular.

Entretanto, pesquisas demonstram que muitas das linhagens de células de mamífero e

linhagens de células de inseto, que são usadas na produção de proteínas recombinantes em

escala industrial submetem-se realmente à morte programada (apoptose) no ambiente do

biorreator (AL-RUBEAI & SINGH, 1998; COWGER et al., 1998; MENESES-ACOSTA et

al., 2001). Fatores como a consumo total dos nutrientes chaves (aminoácidos, glicose, soro,

oxigênio), e o uso de sistemas baseado em vírus para expressão da proteína e de agentes

citostáticos foram identificados como potenciais indutores de apoptose em culturas industriais,

limitando assim a duração da cultura e a produtividade (SINGH et al., 1994; SIMPSON et al.,

1997; GOSWAMI et al., 1998; SIMPSON et al., 1998).

2.6.2. Necrose e apoptose

A morte das células é um processo fisiológico normal, totalmente regulado. A morte

é patológica ou "acidental" quando a célula é impedida de manter seus processos vitais por

lesões físicas ou químicas causadas por fatores externos, como temperatura, traumas, produtos

tóxicos e falta de oxigênio. As lesões podem ter ainda origem biológica, como nas infecções

por bactérias ou vírus. Esse tipo de morte celular é chamado de necrose.

A necrose é claramente visível por microscopia eletrônica: a célula incha e as

organelas do citoplasma, em particular as mitocôndrias, são danificadas, mas o núcleo não

sofre alterações significativas. Tais lesões impedem o controle do equilíbrio interno: a água e

alguns íons (em especial sódio e cálcio), normalmente bombeados para fora, fluem livremente

Revisão Bibliográfica - 17 -

para dentro da célula, que incha e se rompe. A ruptura libera no tecido vizinho o conteúdo

celular, rico em proteases e substâncias danosas (ABASTADO, 1996).

O termo apoptose foi criado para descrever somente as mudanças morfológicas que

ocorrem durante a morte celular. Durante a apoptose as células encolhem drasticamente, a

membrana plasmática e o retículo endoplasmático formam vacúolos, a cromatina é

condensada ao longo da membrana nuclear, depois forma esferas em formas crescentes.

Subseqüentemente a célula é fragmentada em estruturas membranosas compactas chamadas de

corpos apoptóticos. Como já foi mencionado no item 2.6.1, inúmeras são as causas

relacionadas às células apoptóticas no biorreator. SINGH et al. (1996) lista em seu trabalho as

principais causas que induzem apoptose em culturas de células e seus níveis de importância

(Tabela 2.7).

Tabela 2.7. Fatores indutores de apoptose em cultivo de células animais (SINGH et

al., 1996).

Tipos de estresses Nível de apoptose

Esgotamento do soro Muito Alto

Esgotamento de glicose Muito Alto

Esgotamento da glutamina Muito Alto

Oxigênio baixo Muito Alto

Oxigênio alto Alto

Nível moderado de estresse hidrodinâmico Moderado

Alto nível de estresse hidrodinâmico Nenhum

Alta concentração de amônia Baixo

Revisão Bibliográfica - 18 -

A Figura 2.2 demonstra a diferença entre os dois processos: necrose e apoptose. A

expressão de vários genes tem sido associada à indução de morte celular em bioprocesso com

células animais. Há um grande interesse em definir quais são os genes que bloqueiam e os que

ativam a morte celular programada. A relação entre estes genes e as principais vias de

sinalização celular envolvidas neste processo tem como finalidade futuras aplicações práticas

nos cultivos de células animais e também na terapia de doenças como tumores malignos.

Em relação à célula de Drosophila melanogaster foram identificados alguns genes

que podem causar apoptose:

• Gene reaper (rpr):

controla a morte celular programada apoptótica. Experimentos

demonstraram que o gene rpr é transcrito no início da morte das células sendo, portanto,

necessário neste processo (WHITE et al., 1995; ABRAMS, 1999).

• Gene hid (Head Involution Defective

= Defeito da involução da cabeça): este gene é

expresso no embrião e durante o desenvolvimento do olho de Drosophila e parece ser um

regulador positivo de morte celular (ABRAMS, 1999).

Entretanto, para cultivo de células de inseto as pesquisas estão focadas em determinar

os fatores chaves que possam estar associados ao aparecimento de apoptose no biorreator sem

estar relacionado ao gene.

Revisão Bibliográfica - 19 -

Figura 2.2. Esquema geral da diferença entre apoptose e necrose em células animais

(BioAgency, 2004).

2.7. Consumo de nutrientes por células de insetos

O conhecimento do metabolismo da célula de inseto é vital para desenvolvimento de

novos meio de cultura e produção de proteínas recombinantes. STAVROULAKIS et al.

(1991) estudando culturas de células de inseto Bm-5 em meio IPL-41 suplementado com 10%

de soro fetal bovino concluíram que os açúcares, incluindo glicose, frutose e sacarose

juntamente com o aminoácido glutamina são consumidos pelas células.

BÉDARD et al. (1993) trabalhando com as linhagens de células Sf-9 e BTI-EAA

verificaram que estas linhagens utilizam maltose e frutose, mas não sacarose. A glicose,

frutose e maltose são usadas como fontes de carbono (REUVENY et al., 1992 apud

Revisão Bibliográfica - 20 -

IKONOMOU et al., 2003) e a frutose é consumida somente depois da exaustão da glicose

(BÉDARD et al., 1993). Entretanto, o carboidrato que é considerado mais importante para o

crescimento da célula de inseto Sf-9 é a glicose (BÉDARD et al., 1997; DREWS et al., 1995;

MENDONÇA et al., 1999). Glicose foi identificada como sendo a fonte de energia e fonte de

carbono preferida (DREWS et al., 1995).

No estudo realizado por IKONOMOU et al. (2004) com a linhagem de inseto High-

Five

verificou-se que a queda de viabilidade coincide com a exaustão da glicose. Entretanto,

em alguns trabalhos observou-se que o excesso de glicose reduz o rendimento celular e

acúmulo de subprodutos, tais como alanina (MENDONÇA et al., 1999; IKONOMOU et al.,

2004).

Aminoácidos como glutamina, glutamato, aspartato, serina, arginina, asparagina e

metionina são usados para produção de energia (DREWS et al., 1995). A maioria destes

aminoácidos não é sintetizada por células de inseto. A suplementação dos aminoácidos

metionina e tirosina foram usadas para retardar a morte celular em cultura de células de inseto,

verificando-se que suplementação de glutamina no meio de cultivo pode afetar a velocidade de

crescimento de células de inseto Sf-9 (MENDONÇA et al., 1999).

2.8. Acúmulo de subprodutos no cultivo de células de inseto

A cultura de células de inseto em larga escala é afetada por vários fatores chaves que

incluem o fluxo contínuo no biorreator, resistência à transferência de massa no transporte de

nutrientes, parâmetros biofísicos e biológicos que controlam o crescimento das células.

As células alteram o ambiente do meio de cultura pela remoção de nutrientes e adição

de produtos e subprodutos, que são produtos liberados do metabolismo como o lactato e a

amônia que são tóxicos para as células (VAN DER POL & TRAMPER, 1998).

Revisão Bibliográfica - 21 -

Os acúmulos destas moléculas juntamente com o esgotamento de nutrientes causam a

paralisação do crescimento e o declínio da viabilidade celular (CARTWRIGHT, 1994).

Contudo, em culturas de células de inseto não ocorre acúmulo significante de amônia e lactato

durante a fase de crescimento (BÉDARD et al., 1993; RADFORD et al., 1997; RHIEL et al.,

1997; MENDONÇA et al., 1999).

STAVROULAKIS et al. (1991) estudando a produção de amônia durante o cultivo

das células de inseto Bm-5 observaram que a mesma foi consumida no meio de cultura

acompanhada de um acúmulo de acido úrico sugerindo que a amônia é convertida para ácido

úrico. Contudo, um estudo realizado por DONALDSON et al. (1999) demonstrou o efeito

negativo da amônia na produção da proteína SEAP (secreted alkaline phosphatase) pela célula

Trichoplusia ni.

Os subprodutos podem estar relacionados à adição de nutrientes requeridos pelas

células. Esta adição pode ter efeito negativo na densidade celular, pois o metabolismo do

inseto resulta na formação de subprodutos que podem ter um efeito inibidor na atividade

metabólica da célula. STAVROULAKIS et al. (1991) observaram que o excesso de glutamina

no meio de cultivo resultou em uma baixa densidade celular, devido provavelmente ao alto

nível de lactato encontrado no meio.

2.9. Oxigênio no cultivo

O oxigênio é considerado essencial na cultura de célula animal e, portanto, deve ser

considerado como um nutriente do meio de cultura. O controle da concentração de oxigênio

dissolvido (OD) assegura que o crescimento célula não seja limitado pelo oxigênio e que a

Revisão Bibliográfica - 22 -

formação de radicais livres, especialmente prejudiciais para células animais, é evitada

(KAMEN et al., 1995; AGATHOS, 1996; SCHMID, 1996).

JIAO et al. (1997) trabalharam com células de insetos da linhagem Sf-21 em frasco

spinner modificado com 500 mL de volume de trabalho para estimar on line a taxa de

respiração. Realizaram dois testes, em experimento em batelada com diferentes concentrações

de oxigênio dissolvido (OD), a 10% e 50% de saturação de ar. Na concentração 10% de OD o

oxigênio mostrou-se um fator limitante para cultivo da célula Sf-21, pois a máxima

concentração celular foi de apenas 1,80 x 10

células/mL e a velocidade máxima de consumo

de oxigênio de 0,289 mmol/L.h em 108 h. Com 50% de OD a densidade celular foi de 7 x 10

células/mL e a velocidade máxima de consumo de oxigênio alcançada de 0,593 mmol/L.h em

132 h. Os autores do trabalho ainda enfatizam a importância da velocidade de consumo de

oxigênio para a determinação do estado fisiológico da Sf-21.

RHEIL e MURHAMMER (1995), buscando um melhor entendimento do efeito da

concentração de OD no metabolismo das células de inseto, investigaram efeitos da oscilação

da concentração de OD no metabolismo da célula de inseto. O trabalho foi desenvolvido

utilizando a célula de Spodoptera frugiperda IPLB-Sf-21-AE e biorreator com capacidade 3 L

(operando com volume de 1,4 L). As características dos ensaios estão resumidas na Tabela

2.8. Os ensaios consistiram em ciclos de 30 min a 15% de saturação de ar, seguido de 30 min

de anoxia. Para uma condição constante de oxigênio dissolvido (Tabela 2.8 e ensaio G9) a

velocidade específica de crescimento celular foi de 0,022 h

-1

, enquanto que para uma condição

de oscilação de oxigênio dissolvido (Tabela 2.8 e ensaio G10) ocorreu uma redução

significativa na velocidade específica de crescimento celular de 0,0098 h

-1

. Os resultados

demonstraram claramente que a célula exposta a esta oscilação de concentração de OD com

Revisão Bibliográfica - 23 -

período de anoxia e concentração de oxigênio dissolvido insuficiente afeta significativamente

o metabolismo da célula e conseqüentemente o crescimento celular.

Tabela 2.8. Características dos experimentos no biorreator para investigar o efeito da

oscilação da concentração do oxigênio dissolvido (RHEIL & MURHAMMER,

1995).

Número do ensaio Características do ensaio

G9 OD constante a 15%

G10 OD oscilando entre 15% e 0% desde 32 h até o fim do ensaio; fluxo

descontínuo de nitrogênio a 0% de OD, período de anoxia

“aparentemente”.

G11 OD oscilando entre 15% e 0% desde 56 h para 131 h; OD constante a

15% desde 131 h até o fim do ensaio; fluxo descontínuo de nitrogênio a

0% de OD, período de anoxia “Verdadeiro”.

G15 OD oscilando entre 15% e 0% desde 53 h para 115 h; OD constante a

15% desde 115 h até o fim do ensaio; fluxo descontínuo de nitrogênio a

0% de OD, período de anoxia “Verdadeiro”.

GOTOH et al. (2002) analisaram a dependência da velocidade específica de consumo

de oxigênio (Q

) das células de inseto Sf-9. Para regiões de alta concentração de OD os

valores de Q

se mantêm constantes, mas os valores decrescem rapidamente com o

decréscimo de OD na região de baixa concentração. Geralmente a variação de Q

com a

concentração de oxigênio dissolvido é descrita com uma cinética do tipo Monod ilustrada na

Equação 2.1.,

2max2

(2.1)

Revisão Bibliográfica - 24 -

onde Q

O2max

é velocidade específica máxima de consumo de oxigênio, K

é a constante de

saturação e

é concentração de oxigênio dissolvido. Os ensaios demonstraram que a

concentração OD crítico para células Sf-9 foi de 2,5% da saturação e sua constante de

saturação

foi 2,0 µM com velocidade específica máxima de respiração Q

O2max

de 0,62

µmol/10

células.h.

As velocidades específicas de consumo de oxigênio (

) para as células de inseto

são similares as células de mamíferos, variando de 0,08 a 0,48 mmolO

/10

célula.h para

células as de inseto comparadas com as células de mamífero que varia de 0,023 a 0,54

mmolO

/10

célula.h (SCHIMD, 1996; RUFFIEUX et al., 1998).

Entretanto, alguns fatores como densidade do inóculo e temperatura podem

influenciar na velocidade específica de consumo de oxigênio. GOTOH

et al. (2004)

demonstraram que a densidade celular do inóculo não provoca mudança significativa na

velocidade de consumo de oxigênio das células de inseto Sf-9, mas a diminuição da

temperatura provoca um decréscimo na velocidade específica máxima de consumo de

oxigênio e na constante de saturação.

2.10. Comentários gerais

Os vários tópicos abordados nesta revisão bibliográfica proporcionaram uma idéia

dos vários fatores que podem influenciar no cultivo das células de inseto.

Apesar do grande número de pesquisas realizadas com células de inseto, a maioria

está relacionada aos cultivos das células de insetos de

Bombyx mori, Spodoptera frugiperda e

Trichoplusia ni.

No que diz a respeito ao cultivo utilizando células de inseto de Drosophila

melanogaster

, poucos trabalhos foram realizados, dentre os quais se podem destacar os

Revisão Bibliográfica - 25 -

trabalhos de SONDERGAARD (1996) e VALLE et al. (2001). Ambos os trabalhos analisaram

apenas a viabilidade do cultivo das células S2 e rS2 em biorreator sem definir parâmetros

fisiológicos como consumo de nutrientes e velocidade específica de respiração celular, os

quais são fundamentais para desenvolvimento do bioprocesso.

Neste contexto, o presente trabalho foi realizado com as células de inseto S2 e rS2 a

fim de se avaliar as possíveis mudanças ocorridas no metabolismo das células devido à

modificação genética realizada nas células e determinar parâmetros que permitam o

desenvolvimento deste bioprocesso.

Materiais e Métodos - 26 -

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Materiais

3.1.1. Células utilizadas

Foram utilizadas duas linhagens de célula

de Drosophila melanogaster, a linhagem

selvagem

Drosophila melanogaster Schneider-S2 (SCHNEIDER, 1972) e a linhagem

recombinante

Drosophila melanogaster Schneider-rS2 GPV (Glicoproteína do vírus da raiva

rabies vírus glycoprotein) ambas as linhagens foram cedidas pelo Laboratório de

Imunologia Viral do Instituto Butantan de São Paulo.

3.1.2. Meio de cultura

O meio de cultura utilizado em todos os experimentos foi o meio comercial livre de

soro Sf-900 II SFM da Gibco. Na Tabela 3.1 estão representadas as concentrações de alguns

componentes identificados em trabalhos que utilizaram o meio Sf-900 II, uma vez que a

composição deste meio não é disponibilizada pelo fabricante.

3.1.3. Corantes para determinar viabilidade celular

Foi utilizada uma solução aquosa de 0,4% azul de Tripan (Trypan Blue) (Sigma T-

6146), como corante para método de exclusão de corante para acompanhar a viabilidade

celular durante os cultivos.

Também foram utilizados os corantes fluorescentes: Brometo de Etídio (C

Br)

e Laranja de Acridina (C

ClN

.1/2ZnCl

), da marca Sigma, na análise de células

apoptóticas pelo método da fluorescência .

Materiais e Métodos - 27 -

Tabela 3.1 Concentração de componentes identificados em trabalhos que utilizaram o

meio Sf-900 II.

Componentes Concentração (g/L) Referência

Carboidratos

Glicose 9,73-10,0

RHIEL

et al. (1997); ARANTES et al. (2004)

Trealose 1,00 MARQUES (2005)

Aminoácidos

Glutamina 2,18 RHIEL et al. (1997)

Asparagina 1,65 RHIEL et al. (1997)

Glutamato 1,66 ARANTES (2004)

Serina 0,89 ARANTES (2004)

Glicina 1,00 ARANTES (2004)

Histidina 0,61 ARANTES (2004)

Arginina 0,60 ARANTES (2004)

Treonina 0,18 ARANTES (2004)

Alanina 0,45 ARANTES (2004)

Prolina 0,55 ARANTES (2004)

Tirosina 0,23 ARANTES (2004)

Valina 0,62 ARANTES (2004)

Metionina 0,82 ARANTES (2004)

Cisteína 0,031 ARANTES (2004)

Isoleucina 0,53 ARANTES (2004)

Leucina 0,34 ARANTES (2004)

Fenilalanina 0,85 ARANTES (2004)

Lisina 0,59 ARANTES (2004)

3.1.4. Solução tampão salina

A solução tampão (pH 7,4) da marca Cultilab, apresentando a composição para 1 L

que está representada na Tabela 3.2. A solução foi utilizada para diluir a concentração celular

da amostra retirada do cultivo com a finalidade de fazer a contagem de células.

Tabela 3.2. Composição da solução tampão salina.

Composto Quantidade(g)

NaCl 80,0

KCl 2,0

HPO

11,5

2,0

Materiais e Métodos - 28 -

3.1.5. Equipamentos

3.1.5.1. Câmara asséptica

Foi utilizado câmara asséptica de fluxo laminar Sterilgard III, classe II da Baker

Company (USA), contendo lâmpada germicida UV, em todas as etapas nas quais eram

manipuladas as células.

3.1.5.2. Microscópio

Para a contagem de células e determinação da viabilidade por exclusão de corante foi

utilizado o microscópio de campo invertido da marca Olympus modelo CK3.

O microscópio óptico Olympus BX 50 (campo direto), acoplado a uma câmera de

vídeo SONY CCD-Iris DXC–107A com placa de aquisição de imagens vídeo modelo Blaster,

foi utilizado para obter imagens da cultura para quantificar células necróticas e apoptóticas

através do método de fluorescência.

3.1.5.3. Autoclave

As vidrarias e demais utensílios envolvidos na realização dos cultivos de células

foram esterilizados em autoclaves da marca FABBE LTDA, por 25 minutos a 121°C.

3.1.5.4. Frasco Schott modificado

Um frasco do tipo Schott de 250 mL (vide Figura 3.1) foi modificado para a

realização dos experimentos de cultivos envolvendo células de inseto S2. A modificação foi

feita na tampa do frasco Schott, onde foi incorporado um eletrodo de oxigênio dissolvido

Materiais e Métodos - 29 -

autoclavável, para monitoramento da concentração de oxigênio no meio de cultivo e uma

entrada de ar e saída de gás com filtros acoplados para evitar contaminação do cultivo.

Eletrodo

Filtros de ar

Entrada de ar

Saída de gás

50 mL de meio de cultura

Figura 3.1. Representação esquemática do frasco Schott modificado para realização

de cultivo envolvendo as células de inseto S2.

3.1.5.5. Câmara de incubação rotatória

Foi utilizado em todas as etapas de cultivos o no incubador rotatório (shaker) marca

Superohm. Um suporte foi acoplado na parte interna do equipamento com capacidade para 8

frascos T de 25 cm

, uma vez que os frascos T de cultura não devem ser agitados e, no

entanto, devem ter sua temperatura controlada.

3.2. Procedimento experimental para o cultivo de células

O seguinte procedimento foi seguido nos cultivos com células de inseto S2.

Materiais e Métodos - 30 -

Descongelamento

do criotubo

Cultivo do frasco T

na incubadora a 28°C,

por 72h

Transferência

Inóculo: Cultivo em

frasco Schott incubado

em shaker a 100rpm

e 28°C, por 72

Experimentos: Cultivos em

frascos Schotts em

shaker a 100rpm e 28°C

Centrifugação

das células

Inóculo

Figura 3.2. Representação esquemática do procedimento seguido nos experimentos

de cultivos das células inseto S2.

As células estocadas em nitrogênio líquido (–196ºC) foram ativadas e, depois de

recuperar sua atividade normal, foram inoculadas em 5 mL de meio Sf-900 II em frasco T de

25 mL de capacidade. O meio de cultura (normalmente conservado em geladeira,

aproximadamente 4

°C) usado nos cultivos foi levado à temperatura ambiente (25°C) antes do

uso.

As células foram colocadas para incubação em frasco T à temperatura de 28ºC sem

agitação. Depois de incubadas durante 3 dias para que pudessem recuperar completamente sua

atividade normal, a seguir as células foram centrifugadas e ressuspendidas em meio novo e

em seguida foram transferidas para frasco Schott de 100 mL contendo 15 mL de meio Sf-900

II para o preparo do inóculo. O frasco Schott foi colocado para incubação no Shaker a

temperatura de 28ºC e rotação de 100 rpm. Após 72 horas um volume de meio contendo

células suficientes foi transferido para inocular o frasco Schott do experimento com uma

concentração inicial entre 4 x 10

a 5,5 x 10

células/mL. A seguir, foram retiradas

diariamente amostras de 0,1 mL, através de micropipetas para fazer as determinações da

concentração celular através de método de contagem por exclusão de corante.

Materiais e Métodos - 31 -

3.3. Avaliação de métodos para análise de viabilidade

3.3.1. Determinação da concentração e viabilidade celular

As contagens de células foram realizadas pelo através do método de exclusão de

corante azul de Tripan (Trypan Blue Sigma) (FRESHNEY, 1994). Neste método as

concentrações de células viáveis e não viáveis foram determinadas pela contagem em câmara

de Neubauer. Era retirada alíquota de 0,1 mL de cada frasco Schott, a qual era diluída com 0,9

mL de solução tampão salina, totalizando 1 mL de amostra diluída. Em seguida retirava-se 90

µL da amostra diluída e acrescentavam-se 10 µL de uma solução etílica 0,4% de azul de

Tripan, completando um volume 100

µL. Com ajuda de uma micropipeta colocava-se uma

alíquota de 10

µL da amostra corada na câmara de Neubauer. A contagem era realizada em

microscópio OLYMPUS CK3, utilizando a objetiva de 10x.

A concentração total das células era dada pela somatória do número de células não

coradas (viáveis) mais o número de células coradas (não viáveis) e multiplicado pelo fator de

diluição (Equação 3.1).

Cálculo:

Concentração total de células:

10)( ××+ Dnn

= células/mL

(3.1)

Concentração de células viáveis:

10×× Dn

= células viáveis/mL

(3.2)

Porcentagem de células viáveis:

100×

= % células viáveis

(3.3)

Materiais e Métodos - 32 -

Onde: n

= número total de células viáveis

= número total de células não viáveis

D = fator de diluição para células S2: D = 10/9

3.3.2. Quantificação de apoptose e viabilidade celular usando corantes

fluorescentes

A distribuição das células necróticas e apoptóticas na cultura foi determinada com

base no protocolo utilizado por MERCILLE

et al. (1994).

Uma amostra de célula em suspensão era misturada com corantes fluorescentes que

aderem ao ADN (Ácido Desoxirribonucléico) e examinada em microscópio fluorescente para

visualizar a contagem de células com organização anômala da cromatina.

Uma solução da mistura de corante de 100

µg/mL de laranja de acridina (AO) e 100

µg/mL brometo de etídio (EB) era preparada com em solução tampão salina livre de Ca

. Um volume de 4 µL de esta mistura de corante foi adicionado a uma amostra de 100 µL

de suspensão de células contendo 5 x 10

a 5 x 10

células/mL.

Após adição da solução do corante a amostra, a câmara de Neubauer foi preparada e

examinada no microscópio BX50 Olympus (Melville, NY) com uma objetiva de 40x de

magnificação e a combinação de filtros: faixa de excitação 470-490 nm; emissão de 515 nm.

O laranja de acridina atravessa a membrana das células viáveis e não viáveis. O

corante reage com a cromatina, formando um composto esverdeado.

O brometo de etídio somente atravessa a membrana das células não viáveis (não pode

atravessar a membrana intacta da célula viável). Este, interagindo com a cromatina, gerando

um composto laranja-vermelho.

Materiais e Métodos - 33 -

Foram contadas, no mínimo 200 células por amostra, registrando o número de células

de cada amostra seguindo a classificação do estado celular utilizada originalmente por

MERCILLE

et al. (1994):

(i)

VNA: células viáveis com núcleo não apoptótico;

(ii)

VA: células viáveis com núcleo apoptótico;

(iii)

NEC: células necróticas, células não viáveis com núcleo normal;

(iv)

NVA: células não viáveis com núcleo apoptótico;

(v)

CF: células livres de cromatina.

A porcentagem de cada estado celular em relação ao total de células foi obtida da

seguinte maneira, similarmente para os outros quatro estados celulares:

%VNA = (VNA/(VNA + VA + NEC + NVA + CF))

× 100

(3.4)

3.4. Avaliação da influência do inóculo no crescimento das células S2

Para os experimentos onde foram avaliados os efeitos do inóculo no cultivo das

células de inseto S2 foi utilizado um planejamento fatorial 2

(4 experimentos + 2 pontos

centrais) objetivando as quantificações dos efeitos das variáveis independentes concentração

do inóculo e idade do inóculo na variável dependente velocidade especifica máxima de

crescimento celular (

max.)

Os níveis das variáveis independentes foram de 2,5 x 10

e 7,5 x

células/mL para a concentração de inóculo e 48 e 96 horas para a idade do inóculo.

Os resultados obtidos de concentração celular em função do tempo nos experimentos

foram analisados através de softwares Origin 5.0 e Statistic 5.0, podendo assim traçar os

gráficos dos resultados obtidos.

Materiais e Métodos - 34 -

A partir dos gráficos foi possível determinar:

−

Velocidade específica máxima de crescimento celular:

máx

− Produtividade máxima em células: P

máx

Para a determinação da velocidade específica máxima de crescimento celular

podemos considerar-se a seguinte equação:

(3.5)

onde:

é a velocidade específica de crescimento celular; X é a concentração de células e t é

tempo de cultivo.

Na região exponencial de crescimento da célula tem-se que:

máx

cte

(3.6)

Integrando a equação anterior na fase exponencial,

(

)

imáxi

ttXX

−

lnln

(3.7)

onde o índice i indica o início da fase exponencial e o valor de

máx

é o coeficiente angular do

gráfico lnX versus t.

A produtividade máxima de células de uma cultura é uma medida do número de

células produzidas por volume de cultura e por unidade de tempo que permite avaliar o

desempenho de um bioprocesso (SCHMIDELL et al., 2001). Essa produtividade pode ser

determinada traçando uma linha a partir da origem, tangenciando o gráfico da concentração de

células versus tempo, no ponto de maior inclinação, como indicado na Figura 3.3.

Materiais e Métodos - 35 -

Xmáx

tempo

Figura 3.3. Exemplo de gráfico para determinação da produtividade máxima de

células.

Essa produtividade máxima em células pode ser determinada através da equação:

XiX

máx

−

(3.8)

onde:

é a concentração de células no tempo t, C

é a concentração de células inicial e t

tempo de cultivo para se atingir a concentração de célula

3.5. Métodos analíticos

3.5.1. Concentração de glicose e aminoácidos

As concentrações de glicose e glutamina no sobrenadante do cultivo foram realizadas

enzimaticamente usando o YSI

Biochemical Analyzer modelo 2700 (Yellow Spring

Instruments). As concentrações de aminoácidos foram determinadas pelo sistema Pico-tag

usando uma coluna de água de fase reversa HPLC marca Waters.

Materiais e Métodos - 36 -

3.5.2. Medida da transferência de oxigênio

Para determinação do k

a (coeficiente volumétrico de transferência de O

) foi

utilizado o método dinâmico descrito por SCHMIDELL

et al. (2001).

O método consiste em inicialmente borbulhar nitrogênio no líquido, a fim de eliminar

todo o O

dissolvido, até que o eletrodo indique o valor zero.

A seguir, inicia-se a aeração e a agitação do meio líquido, nas condições em que se

pretende obter o valor de

a, passando-se então a registrar o sinal do eletrodo. O sinal sai do

valor zero e aumenta até atingir a saturação.

Nessas condições a Equação 3.9 do balanço da concentração de oxigênio dissolvido,

pode ser integrada, conhecendo-se condição inicial (

t = 0; C = 0), pois é possível separar as

variáveis:

)( CCak

−⋅=

(3.9)

Integrando, obtém-se:

tak

⋅=













−

(3.10)

onde o C

concentração de saturação O

dissolvido no líquido e o valor de k

a é o coeficiente

angular do gráfico













− CC

versus t.

Materiais e Métodos - 37 -

3.5.3. Método para determinação Q

As determinações das velocidades específicas de respiração (Q

) foram feitas pelo

método dinâmico. Com o eletrodo de oxigênio dissolvido imerso no meio de cultivo com

células, num dado instante (t

) interrompeu-se a alimentação de ar no frasco Schott, com o

intuito de anular a transferência de oxigênio. Neste instante foi desligada agitação do shaker, a

fim de reduzir ao máximo a transferência de O

na superfície do líquido. A resposta do

eletrodo era quase imediata, sendo o processo representado pela Figura 3.4 que segue:

Temp

Conc. Oxig ê nio Dissolvido

Figura 3.4. Variação da concentração de O

dissolvido com tempo durante a

utilização do método dinâmico para determinar

Como se observa na Figura 3.4, depois da interrupção da agitação a concentração de

oxigênio dissolvido inicial (

) começa a diminuir. Ao se atingir um certo valor C

(instante

), foi retomada a agitação e a aeração, nas condições que estavam sendo praticadas,

observando-se então, o aumento da concentração de O

dissolvido até atingir novamente o

valor inicial (

Materiais e Métodos - 38 -

O procedimento demorava um tempo relativamente curto variando entre 1 a 1,5

minuto. Supondo que neste intervalo de tempo não haja mudança no sistema (concentração

celular (

X), metabólitos e substratos permanecem constantes), e o valor de Q

seja mantido

constante, a equação de balanço de oxigênio simplificava-se a:

−=

(3.9)

Devido às hipóteses assumidas, o produto

X deve ser constante durante este

intervalo de tempo, permitindo a integração da Equação 3.8, obtendo-se:

)(

020

ttXQCC

−

(3.10)

A Equação 3.10 prevê que a partir do instante

(C = C

) deve ocorrer uma variação

linear de

C com o tempo, obtendo-se uma reta cujo coeficiente angular é igual a (-Q

X),

permitindo, assim, a determinação do valor de

(SCHMIDELL et al., 2001).

3.5.4. Variação do oxigênio durante o cultivo das células S2 em frasco Schott

A concentração de oxigênio dissolvido no caldo de cultivo contido no frasco Schott

de 250mL e 100mL foi determinada

indiretamente, através da leitura dos sinais emitidos pelo

eletrodo galvânico (modelo M.1016.500) e eletrodo polarográfico (modelo: 405-M3-S7/60),

marca Meteller Tolledo, respectivamente, conforme esquematizado na Figura 3.5. Durante

todo o experimento era registrada a queda do oxigênio em relação ao tempo.

Materiais e Métodos - 39 -

T=28ºC

100 rpm

Bomba

Shaker

Analisador de OD

Figura 3.5. Esquema do sistema experimental utilizado para a determinação da queda

do oxigênio no frasco Schott. (1) Entrada de ar; (2) Saída de gás; (3) Frasco

Schott modificado.

Durante o cultivo de células em frasco Schott, efetua-se a transferência de oxigênio

da fase gasosa para a fase líquida, enquanto que, simultaneamente, a célula consome o

oxigênio dissolvido. Assim sendo, o balanço de oxigênio no meio líquido é representado pela

equação que segue:

()

XQCCak

OSL 2

−−⋅=

(3.11)

A Equação 3.11 indica que a variação da concentração de oxigênio dissolvido no

líquido (

dC/dt) é o resultado da diferença entre as quantidades de O

que se consegue dissolver

a.(C

- C) e a de oxigênio consumido pelas células Q

3.6. Programação e estratégia experimental seguida nesta pesquisa

Para facilitar a compreensão e a justificativa do trabalho experimental realizados

nesta pesquisa são listados os 19 experimentos realizados e as respectivas características dos

Materiais e Métodos - 40 -

mesmos. Nas Tabelas A1 a A19 do apêndice A encontram-se os valores das principais

variáveis, ao longo dos cultivos.

Tabela 3.3. Experimentos realizados nesta pesquisa e suas principais características.

Experimento

Célula

utilizada

Frasco Schott

(mL)

Volume de

trabalho(mL)

Principal objetivo

E1-S2 S2 100 20

Análise da metodologia para

quantificar a viabilidade celular.

E2-rS2 rS2 100 20

Análise da metodologia para

quantificar a viabilidade celular.

E3-S2 S2 100 20

Análise do consumo de

aminoácidos, como substratos

limitantes.

E4-rS2 rS2 100 20

Análise do consumo de

aminoácidos, como substratos

limitantes.

E5-S2 S2 100 20

Análise do consumo de glicose e

glutamina, como substratos

limitantes.

E6-rS2 rS2 100 20

Análise do consumo de glicose e

glutamina, como substratos

limitantes.

E 1 a E6 rS2 100 20

Análise da influência da idade e

concentração do inóculo no

crescimento celular.

E7-rS2 rS2 250 50

Avaliação das características de

respiração das células rS2

E8-S2 S2 250 50

Avaliação das características de

respiração das células S2

E9-S2 S2 250 50

Análise do excesso de oxigênio

(hiperoxia)

E10-S2 rS2 250 50

Analise do crescimento celular

sem oxigenação superficial.

E 11-rS2 a

E14-rs2

rS2 100 20

Análise da influencia da

agitação no oxigênio dissolvido

e no crescimento celular.

Resultados e Discussão - 41 -

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Definição de metodologia para quantificação da viabilidade das células S2

Devido à inexistência de uma metodologia consolidada para quantificar a viabilidade

de células de inseto optou-se neste trabalho por fazer uma análise comparativa dos dois

métodos mais comumente utilizados no âmbito de tecnologia de cultivo de célula animal,

quais sejam, o método de exclusão do corante azul de Tripan (FRESHNEY, 1994) e o método

que utiliza corantes fluorescentes para discriminação de células apoptóticas e necróticas

(MERCILLE

et al., 1994). Inicialmente foram realizados experimentos utilizando as células

de inseto S2 (E1-S2) e as células de inseto rS2 (E2-rS2). Ambos os experimentos em Schotts

de 100 mL contendo um volume de trabalho de 20 mL de meio de cultura Sf-900 II,

concentração inicial de células de 5 x 10

células/mL, a temperatura de 28°C e 100 rpm de

rotação, com o objetivo de comparar a porcentagem de células viáveis identificadas pelo

método de exclusão de corante e o método de corantes fluorescentes. Os resultados obtidos

nos experimentos encontram-se na Figura 4.1.

Como pode ser observado na Figura 4.1 ambos os métodos, exclusão de corante e

fluorescência, mostraram-se capazes de prever a porcentagem de células viáveis nos

experimentos E1-S2 e E2-rS2. Entretanto, no E1-S2 pode-se observar que o método

fluorescente apresentou uma tendência em antecipar a queda da viabilidade celular, pois o

método é capaz de identificar as células apoptóticas. O corante fluorescente evidencia mais

rapidamente a perda de viabilidade pela célula que o método de exclusão de azul de Tripan

(MENESES-ACOSTA

et al. 2001). Na Figura 4.1 pode se observar uma concentração

máxima de célula de 2,55 x 10

células/mL no E1-S2, superior à concentração celular máxima

Resultados e Discussão - 42 -

de 1,64 x 10

células/mL do E2-rS2, evidenciando que a modificação genética realizada nas

células S2 alterou o crescimento celular da mesma.

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264

0,0

5,0x10

1,0x10

1,5x10

2,0x10

2,5x10

3,0x10

3,5x10

4,0x10

Tempo(h)

Concentração celular (células/mL)

Concentração Celular

E1-S2 - conc. celular

E2-rS2 - conc. celular

100

Viabilidade (%)

Viabilidade Celular

E1-S2 - Azul de Trypan

E1-S2 - Fluorescência

E2- rS2 - Azul de Trypan

E2- rS2 - Fluorescência

Figura 4.1. Resultados dos experimentos E1-S2 e E2-rS2 utilizando as células S2 e

rS2, respectivamente, para comparação de porcentagem das células viáveis

totais entre o método de exclusão corante azul de Tripan e método de

fluorescência.

A evolução da porcentagem da viabilidade celular seguindo os critérios de

MERCILLE

et al. (1994) identificado pelo método de florescência nos experimentos E1-S2 e

E2-rS2 está demonstrada nas Figuras 4.2 e 4.3. As células não viáveis apoptóticas

representaram uma baixa porcentagem durante o cultivo (0,4%), e no final (0,3%) do

experimento E1-S2 (Figura 4.2), entretanto, este tipo de célula não foi observado no

experimento E2-rS2 com a célula recombinante, como pode ser observado na Figura 4.3.

As células livres de cromatina aparecem no início do cultivo do experimento E1-S2,

entretanto o experimento E2-rS2 não apresentou este tipo de célula no início do cultivo

Resultados e Discussão - 43 -

(Figura 4.3). O fato do experimento E1-S2 apresentar 3,6% de células livres de cromatina no

início do cultivo pode ser atribuído à presença de células necróticas provenientes do inóculo

(MERCILLE

et al., 1994), uma vez que esta porcentagem diminui durante o cultivo chegando

a 0%, como pode ser observado na Figura 4.2.

Os experimentos E1-S2 e E2–rS2 não apresentaram índices elevados de células

viáveis apoptóticas, 5,6% para o E1-S2 e 6,5% para o E2-rS2, respectivamente, como pode ser

observado nas Figuras 4.2 e 4.3.

0 50 100 150 200 250

100

Células viáveis não apoptóticas

Células apoptóticas

Células não viáveis apoptóticas

Células necróticas

Células livre de cromatina

% de células S2

Tempo(h)

Figura 4.2. Evolução da viabilidade celular no experimento E1-S2.

Resultados e Discussão - 44 -

0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300

100

% de células rS2

Tempo(h)

Células viáveis não apoptóticas

Células viaveis apoptóticas

Células necróticas

Figura 4.3. Evolução da viabilidade celular no experimento E2-rS2.

As características observadas nas células de inseto S2 e rS2 utilizando o método de

fluorescência apresentaram-se semelhantes entre si e similares às observadas em trabalhos

com as células de hibridoma e células de inseto da linhagem Sf-9 (MERCILLE

et al., 1994;

MENESES-ACOSTA

et al., 2001). As células viáveis apresentaram coloração esverdeada

devido à reação do corante de laranja de acridina com a cromatina (Figura 4.4 (a)). As células

necróticas apresentaram a cromatina condensada com a coloração vermelha alaranjada devido

à interação do brometo de etídio com a cromatina da célula (Figura 4.4 (b)).

Os núcleos apoptóticos das células S2 e rS2 apresentaram forma fragmentada e cor

amarela (Figura 4.4 (1d, 2d, 3d)). Estas características morfológicas já foram observadas por

COWGER

et al. (1999) e MENESES-ACOSTA et al. (2001) nas células de inseto da

linhagem Sf-9.

Resultados e Discussão - 45 -

a) b)

1d) 2d) 3d)

VNA

VA VA VA

Figura 4.4. Identificação de várias populações de células em microscópio de

fluorescência durante o cultivo de células S2 e rS2. a) Células viáveis não

apoptóticas (VNA). b) Células necróticas (Nec). c) Células livres de cromatina

(CF). d) Células viáveis apoptóticas (VA). e) Células não viáveis apoptóticas

(NVA).

4.2. Consumo de nutrientes e viabilidade celular

Com intuito de analisar o consumo de nutrientes chaves como aminoácidos e glicose

no cultivo e comparar o metabolismo das células de inseto S2 e rS2, foram realizados os

experimentos E3-S2, E4-rS2, E5-rS2 e E6-S2 em frasco Schott de 100 mL contendo um

volume de trabalho de 20 mL de meio de cultura Sf-900 II a temperatura de 28° C e 100 rpm

de rotação. A viabilidade celular em ambos os experimentos foi acompanhada pelo método de

Resultados e Discussão - 46 -

exclusão de corante e de corante fluorescente. No entanto, devido ao baixo volume de trabalho

(20 mL) optou-se em realizar nos experimentos E3-S2 e E4-rS2 análise dos consumos de

aminoácidos e os experimentos E5-rS2 e E6-S2, análises dos consumos de glutamina e

glicose, pois a soma dos volumes das amostras (950

L) retiradas num único experimento para

análises de aminoácidos, glicose e viabilidade celular, poderia interferir nas características do

experimento durante os cultivos a ser realizados.

As curvas de crescimento e viabilidade celular dos experimentos E3-S2 e E4-rS2

estão apresentadas na Figuras 4.5 e as curvas da evolução da viabilidade estão na Figura 4.6

para o E3-S2 e na Figura 4.7 para o E4-rS2. Para ambos os experimentos observam-se o

mesmo comportamento em relação à viabilidade celular, tal como descrito no item 4.1

(Figuras 4.1, 4.2 e 4.3).

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 288

0,0

5,0x10

1,0x10

1,5x10

2,0x10

2,5x10

3,0x10

3,5x10

4,0x10

Concentração Celular (células/mL)

Tempo(h)

Concentração Celular

E3-S2 - conc. células

E4-rS2 - conc. células

100

Viabilidade (%)

Viabilidade Celular

E3-S2 - Azul de Trypan

E3-S2 - Fluorescência

E4-rS2 - Azul de Trypan

E4-rS2 - Fluorescência

Figura 4.5. Resultados de crescimento celular no cultivo das células S2 e rS2 nos

experimentos E3-S2 e E4-rS2.

Resultados e Discussão - 47 -

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

100

Células necróticas

Células livre de cromatina

% de células S2

Tempo (h)

Células viáveis não apoptóticas

Células viáveis apoptóticas

Células não viaveis apoptóticas

Figura 4.6. Evolução da viabilidade celular no experimento E3-S2 monitorada com o

método da fluorescência.

0 50 100 150 200 250 300

100

% de células rS2

Tempo (h)

Células viaveis não apoptóticas

Células viáveis apoptoticas

Células necróticas

Figura 4.7. Evolução da viabilidade celular no experimento E4-rS2 monitorada com o

método da fluorescência.

Resultados e Discussão - 48 -

As Figuras 4.8 e 4.9 mostram os perfis de consumo e produção de aminoácidos em

ambos os experimentos E3-S2 e E4-rS2. Os aminoácidos mais consumidos em ambas culturas

foram cisteína, serina, prolina e histidina. No experimento E3-S2 (Figura 4.8), os aminoácidos

serina, prolina e cisteína foram consumidos completamente, entretanto, apenas o aminoácido

prolina teve consumo por completo pelas células rS2 no experimento E4-rS2 (Figura 4.9).

Analisando o perfil de aminoácidos em ambos os experimentos E3-S2 e E4–rS2

(Figuras 4.8 e 4.9) pode-se observar uma alta de produção de alanina. De acordo com

BHATIA

et al. (1997), a produção de alanina é alta em culturas de células de inseto que

apresentam uma alta concentração inicial de glicose. Como neste trabalho os cultivos foram

realizados com o meio Sf-900 II que possui uma alta concentração de glicose (

≅ 10 g/L), a

concentração de alanina alcançada com 168 h no experimento E3-S2 foi de 4,01 g/L e para o

experimento E4-rS2 de 2,62 g/L.

Asp Glu Ser Gly His Arg Thr Ala Pro Tyr Val Met Cys Ile Leu Phe Lys

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

Concentração (g/L)

0 h

95,8 h

119,7 h

167,0 h

215,5 h

Figura 4.8. Consumo de aminoácidos no cultivo das células S2 no experimento E3-S2

em frasco Schott de 100 mL a 28°C e 100 rpm.

Resultados e Discussão - 49 -

Asp Glu Ser Gly His Arg Thr Ala Pro Tyr Val Met Cys Ile Leu Phe Lys

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Concentração (g/L)

0 h

92,0 h

168,8 h

214,5 h

260,8 h

Figura 4.9. Consumo de aminoácidos no cultivo das células rS2 no experimento E4-

rS2 em frasco Schott de 100 mL a 28°C e 100 rpm.

Por outro lado, observa-se o consumo alanina com 215,5 h e 260,8 h nos experimentos

E3-S2 e E4-rS2, respectivamente. Tal observação pode indicar o consumo deste aminoácido como

fonte de carbono na reposição de piruvato, intermediário da glicólise, o que também foi observado

nos estudos de BÉDARD

et al. (1993) e ARANTES (2004).

Na Figura 4.10 pode-se observar as diferenças nos metabolismos dos aminoácidos

nas culturas das células S2 e rS2, considerando consumo de aminoácidos pelas células após

215,5 h de cultivo. Os aminoácidos que se apresentaram com maior diferença no consumo

entre as células S2 e rS2 foram: glutamato 68,9% para as células S2 e 14,5% para as células

rS2, valina 54,6% para as células S2 e 13,8% para as células rS2, isoleucina 80,4% para as

células S2 e 24,5% para as células rS2. Estas diferenças de consumo de aminoácidos entre as

células podem estar relacionadas a modificações genéticas, contudo, ainda não foi possível

obter informações sobre as mudanças ocorridas na rota metabólica quando comparadas às

células S2 e rS2.

Resultados e Discussão - 50 -

AspGlu Ser Gly His Arg Thr Pro Tyr Val MetCys Ile Leu Phe Lys

100

Consumo (%)

E3-S2

E4-rS2

Figura 4.10. Porcentagem do consumo de aminoácido das células de inseto S2 e rS2

após 215,5 h de cultivo nos experimentos E3-S2 e E4-rS2.

Estudos indicam que a exaustão de aminoácidos é uma das causas do aparecimento

das células apoptóticas no cultivo de células animais (SIMPSON

et al., 1996, SINGH et al.,

1996, MERCILLE

et al., 1994). Nas Figuras 4.11 e 4.12 estão relacionados os aminoácidos

mais consumidos (consumo acima de 80%), para os experimentos E3-S2 e E4-rS2. No

experimento E3-S2 as primeiras células apoptóticas apareceram com 96 h de cultivo,

coincidindo com o esgotamento total de prolina no caldo de cultivo. A concentração de células

apoptóticas alcançou o seu valor máximo de 5,4% com 215,5 horas, quando os aminoácidos

serina e cisteína foram totalmente esgotados pelas células S2 (Figura 4.11). No experimento

E4-rS2 as células apoptóticas apareceram após 120 horas de cultivo. A concentração de

células apoptóticas atingiu seu máximo valor (11%) com 236 horas de cultivo, verificando-se

um consumo próximo do total dos aminoácidos prolina e serina pelas células rS2 no E4-rS2

(Figura 4.12).

Resultados e Discussão - 51 -

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

Células viáveis apoptóticas

Aminoácido serina

Aminoácido prolina

Aminoácido histidina

Aminoácido leucina

Aminoácido glutamina

Tempo(h)

Concentração de aminoácido (g/L)

% de Células apoptóticas

Figura 4.11. Consumo de aminoácidos correlacionado com a porcentagem de células

S2 apoptóticas no experimento E3-S2.

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 288

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

Tempo (h)

Concentração de aminoácido (g/L)

Aminoácido glutamina

Aminoácido serina

Aminoácido prolina

% de Células apoptóticas

Células viáveis apoptóticas

Figura 4.12. Consumo de aminoácidos correlacionado com a porcentagem de células

rS2 apoptóticas no experimento E4-rS2.

Resultados e Discussão - 52 -

O consumo de glutamina também foi analisado em ambos os experimentos E3-S2 e

E4-rS2, uma vez que estudos realizados por MENESES-ACOSTA

et al. (2001) com as células

Sf-9 demonstram que o esgotamento da glutamina do caldo de cultivo está associado à

apoptose. Entretanto, observa-se nas Figuras 4.11 e 4.12 que a glutamina não foi totalmente

consumida nos experimentos E3-S2 e E4-rS2.

A Figura 4.13 apresenta os resultados obtidos nos experimentos E5-rS2 e E6-S2, de

consumo de glicose em relação à viabilidade celular. Como pode se observar, a queda da

viabilidade celular coincidiu com o esgotamento da glicose.

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 288 312 336 360 384

0,0

5,0x10

1,0x10

1,5x10

2,0x10

2,5x10

3,0x10

3,5x10

Tempo (h)

Concentração de células (células/mL)

E5-rS2-conc. celular

E6-S2-conc. celular

100

E5-rS2-Azul de Tripan

E5-rS2-Fluorescência

E6-S2-Azul de Tripan

E6-S2-Fluorescência

Viabilidade (%)

Concentração de glicose (g/L)

E5-rS2-conc. glicose

E6-S2-conc. glicose

Figura 4.13. Consumo de glicose durante os experimentos E5-rS2 e E6-S2 com as

células rS2 e S2, respectivamente, cultivadas em frasco Schott de 100 mL, com

meio Sf-900 II em correlação com a viabilidade e a concentração celular.

O aparecimento de células apoptóticas para ambos os experimentos com 94 h de

cultivo não está relacionado com os esgotamentos de glicose ou glutamina, uma vez que

Resultados e Discussão - 53 -

ambos os nutrientes se encontram em alta concentração no experimento E5-rS2, 9,17 g/L e

1,82 g/L respectivamente, e no experimento E6-S2, 9,02 g/L e 1,74 g/L, respectivamente,

como pode ser observado na Figura 4.14. O fato das células

de Drosophila melanogaster

apresentarem células apoptóticas com 94 horas de cultivo pode estar relacionado ao processo

de morte natural das células, uma vez que a porcentagem de células apoptóticas não

apresentou um índice muito alto durante os experimentos.

Na Figura 4.14 pode-se observar o aumento das células apoptóticas após o

esgotamento da glicose. Tal constatação foi também observada nos estudos realizados por

MENESES-ACOSTA et

al. (2001) com a linhagem de células Sf-9 em meio TNM-FH

suplementado com 10% v/v de soro fetal bovino, observando um aumento na porcentagem de

células apoptóticas, quando há esgotamento da glicose do meio de cultura.

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 288 312 336 360

Tempo(h)

% células apoptóticas

E5-rS2 Células apóptoticas

E6-S2 Células apóptoticas

Concentração (g/L)

E5-rS2- conc. glicose

E5-rS2- conc. glutamina

E6-S2- conc. glutamina

E6-S2- conc. glicose

Figura 4.14. Consumo de glicose e glutamina durante os experimentos E5-rS2 e E6-

S2 das células rS2 e S2, respectivamente, cultivadas em frasco Schott de 100

mL com meio Sf-900 II correlacionado com a porcentagem de células

apoptóticas no cultivo das células rS2 e S2.

Resultados e Discussão - 54 -

4.3. Análise da influência do inóculo no crescimento das células S2 e rS2

Os fatores principais que asseguram crescimento adequado em um determinado meio

de cultura dependem do estado quantitativo e qualitativo do inóculo usado. Pode-se esperar

que a fase de crescimento das células no inóculo, assim como a concentração celular possa

influenciar significativamente o crescimento celular da nova cultura (KIOUKIA

et al., 1995).

A exigência de uma concentração mínima de célula no inóculo pode ser explicada, por

exemplo, pela existência de metabolitos que promovem o crescimento junto com o inóculo

(TATICEK

et al., 2001).

Desta maneira foram realizados ensaios para verificar a influência da idade (I

ino

,) e

concentração do inóculo (C

ino

) no crescimento das células rS2. As curvas de crescimento

obtidas para experimentos estão apresentadas na Figura 4.15. As viabilidades de todos os

experimentos os ficaram entre 90 e 100%. Levando em conta a duração da fase lag, os

experimentos 3 e 4 (C

ino

= 2,5 x 10

células/mL e I

ino

= 96 h; C

ino

= 2,5 x 10

células/mL e I

ino

= 48 h, respectivamente) ambos com 2,5 x 10

células/mL no inóculo apresentaram uma

tendência em apresentar uma fase lag maior. A idade do inóculo parece não ter nenhum efeito

na duração de fase lag. Esta tendência da fase lag mais prolongada para o inóculo de 2,5 x 10

células/mL está de acordo com outros estudos da literatura que recomendam inocular células

de inseto em densidades de pelo menos 5,0 x 10

células/mL para evitar atrasos significativos

no crescimento (CLEM, 1992; MILLER

et al., 1986; SUMMERS & SMITH, 1987).

TATICEK

et al. (2001) cultivando células de Sf-21 em meio Ex-CELL 400-SFM em frasco

spinner mostraram que uma concentração de inóculo abaixo de 3,0 x 10

células/mL resultou

em uma fase lag prolongada.

As culturas que alcançaram maiores concentrações de células e produtividade foram

às iniciadas com uma concentração de inóculo de 7,5 x 10

células/mL e idade 48 horas. Na

Resultados e Discussão - 55 -

Figura 4.15 e Tabela 4.1 pode ser visto que para inóculo de baixa idade, a cultura teve

características de crescimento semelhantes, não sendo este influenciado pela concentração de

inóculo. Por outro lado, aumentando da idade do inóculo, as células estavam limitadas pela

alta concentração inicial de células. Esta situação pode ser explicada pelo fato de que em

inóculo novo (48 horas), as células estavam possivelmente na fase inicial ou média de

crescimento exponencial. Com uma idade de inóculo de 96 horas, as células estavam perto do

fim da fase exponencial, sendo mais sensível a altas concentrações de células.

TATICEK

et al. (2001) estudando a cultura de células Sf-21 em meio Ex-CELL 400

SFM em frascos spinner a 150 rpm, observaram que a concentração de inóculo de 5,0 x 10

células/mL foi a que rendeu valores maiores na velocidade específica de crescimento,

concentração de célula máxima e produtividade de célula. No mesmo estudo, utilizando

células Tn 5B-1-4, a maior velocidade específica máxima de crescimento foi obtida com um

inóculo de cerca de 2,4 x 10

células/mL, enquanto a produtividade máxima em célula ocorreu

com aproximadamente 5,0 x 10

células/mL. KIOUKIA et al. (1995) trabalhando com a

linhagem de inseto Sf-9 demonstram que para o inóculo proveniente da fase estacionária, a

velocidade específica de crescimento foi insatisfatória em relação ao inóculo derivado da fase

inicial e final da exponencial. Quando o efeito da concentração do inóculo foi examinado, os

resultados obtidos mostraram que, baixas concentrações de inóculo, resultaram em períodos

maiores da fase lag em relação ao inóculo com alta concentração de células.

Resultados e Discussão - 56 -

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 288

0,0

2,0x10

4,0x10

6,0x10

8,0x10

1,0x10

1,2x10

1,4x10

E1 - C

ino

=7,5x10

células/mL I

ino

=48h

E2 - C

ino

=7,5x10

células/mL I

ino

=96h

E3 - C

ino

=2,5x10

células/mL I

ino

=48h

E4 - C

ino

=2,5x10

células/mL I

ino

=96h

E5 - C

ino

=5,0x10

células/mL I

ino

=72h

E6 - C

ino

=5,0x10

células/mL I

ino

=72h

Tempo(h)

Concentração celular(células/mL)

100

Viabilidade(%)

Figura 4.15. Resultados do crescimento das células rS2 em experimentos realizados

com diferentes concentrações de inóculo (C

ino

) e idades inóculo (I

ino

) em frasco

Schott de 100 mL, agitação 100 rpm e meio Sf-900 II.

Tabela 4.1. Resultados dos experimentos de cultivo com as células rS2 em meio de

cultivo Sf-900 II variando a concentração e idade do inóculo.

Experimento Descrição

max

-1

)

max

(células/mL)

Produtividade

máxima em

células, P

máx

(células/mL.h)

E1 C

ino

= 7,5 x 10

, I

ino

= 48 0,0485 1,35 x 10

1,44 x 10

E2 C

ino

= 7,5 x 10

, I

ino

= 96 0,0341 1,19 x1 0

1,03 x 10

E3 C

ino

= 2,5 x 10

, I

ino

= 48 0,0418 1,22 x 10

1,02 x 10

E4 C

ino

= 2,5 x 10

, I

ino

= 96 0,0490 1,15 x 10

1,13 x 10

E5 C

ino

= 5,0 x 10

, I

ino

= 72 0,0347 1,33 x 10

1,16 x 10

E6 C

ino

= 5,0 x 10

, I

ino

= 72 0,0380 1,05 x 10

9,91 x 10

Resultados e Discussão - 57 -

4.4. Análise do planejamento fatorial

A influência da concentração do inóculo e idade do inóculo como variáveis

independentes foi analisada com relação à velocidade específica máxima de crescimento

(

max

), concentração máxima de células (C

max

) e máxima produtividade em células (P

max

)

estabelecendo um planejamento fatorial 2

com dois pontos centrais.

Fazendo uma análise estatística dos valores obtidos para

max

e C

max

utilizando o

Software Stastic 5.0, como pode ser visto nas Figuras 4.16 A e B, o efeito do inóculo segundo

a classificação das variáveis concentração e idade do inóculo, a interação destas duas variáveis

não teve resultado expressivo em

max

e em C

max

. Na Figura 4.16 C, pode ser visto que a

variável idade do inóculo teve um efeito significativo na produtividade máxima em células.

A variável idade do inóculo (I

ino

) não tem nenhum efeito significativo na velocidade

específica máxima de crescimento e na concentração máxima de células. DOVERSKOG

et al.

(2000) mostraram que a variação da concentração do inóculo de 3,0 a 10,0 x 10

células/mL

na cultura das células Sf-9 em meio Sf-900 II não teve nenhum efeito na avaliação do

max

Resultados e Discussão - 58 -

-,605156

-,689205

-1,81547

p=,05

ino

e I

ino

0,0

0,5

1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0

Estimativa do efeito

–

Velocidade específica máxima de crescimento (

máx

)

-,314007

,5931235

-,802461

p=,05

ino

e I

ino

-0,5

0,0

0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0

Estimativa do efeito - Concentração máxima de células (C

máx

)

,8899712

3,610149

-4,69822

p=,05

ino

e I

ino

0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5

Estimativa do efeito -Produtividade de célula, P

max

Figuras 4.16. Efeitos padronizados dos experimentos do planejamento fatorial de 2

considerando a resposta das variáveis: (A) Velocidade específica máxima de

crescimento (

max

);

B) Concentração máxima de células (C

max

) e C)

Produtividade de célula (P

max

Resultados e Discussão - 59 -

4.5. Análise da oxigenação do meio no crescimento celular

Os resultados dos experimentos realizados para avaliar o consumo de nutrientes

(aminoácidos e glicose) demonstraram que as curvas de crescimento das células S2 e rS2

entram na fase de desaceleração de crescimento com altos níveis de nutrientes solúveis no

meio de cultivo Sf-900 II. O fato de o crescimento celular desacelerar pode estar relacionado à

escassez de oxigênio no meio de cultivo celular, pois uma concentração de oxigênio dissolvido

não limitante pode ser decisiva para um ótimo crescimento e produção da proteína.

4.5.1. Transferência de oxigênio no frasco Schott

Esse ensaio teve como objetivo determinar o coeficiente volumétrico de transferência

de oxigênio (

a) no frasco Schott de 250 mL com volume de trabalho de 50 mL de líquido

(água e o meio Sf-900 II) , em condições de cultivo 100 rpm e temperatura de 28°C.

Para determinação do

a foi utilizado o frasco Schott com a tampa modificada como

descrito no item 3.1.5.4 (Figura 3.1) e o método dinâmico (item 3.6.2). A alimentação de ar no

espaço gasoso do frasco Schott foi realizada através de bomba peristáltica (Ismatec, modelo

BVP) possibilitando trabalhar com várias vazões de ar. A Figura 4.17 mostra a variação do

oxigênio dissolvido com diversas vazões de ar.

Resultados e Discussão - 60 -

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

100

água (1VVM)

água (2VVM)

água (3VVM)

meio SF900II-SFM (1VVM)

(%)

Tempo(mim)

Figura 4.17. Variação da concentração do oxigênio dissolvido em frasco Schott de 250

mL com volume de trabalho de 50 mL, durante a utilização do método

dinâmico oxigenando água a: a) 1 vvm, b) 2 vvm, c) 3 vvm e o meio Sf-900 II

a: 1 vvm.

Na Tabela 4.2 estão apresentados os valores obtidos de

a para o sistema composto

por água e para o composto por meio Sf-900 ІІ. Podemos verificar que as diferenças entre os

valores de

a não se apresentaram muito significativas, mesmo sabendo que no meio de

cultivo estão incorporados nutrientes que poderiam dificultar a transferência de oxigênio.

Tabela 4.2. Valores de

a, para diversas vazões de ar no espaço gasoso de um frasco

Schott de 250 mL.

Líquido Vazão de ar (vvm)

a (s

)

Água 3

1,72 x 10

-3

Água 2

1,08 x 10

-3

Água 1

7,73 x 10

-4

Meio Sf-900 ІІ 1

7,38 x 10

-4

Resultados e Discussão - 61 -

4.5.2. Características de respiração das células S2 e rS2

Para os estudos das características da respiração das células S2 e rS2 foram realizados

experimentos cujas características estão apresentadas na Tabela 4.3.

Todos os experimentos foram realizados em frasco Schott de 250 mL com volume de

trabalho de 50 mL de meio Sf-900 II com uma agitação de 100 rpm a temperatura de 28°C.

Tabela 4.3. Características dos experimentos realizados para monitoramento da

concentração do oxigênio dissolvido no meio de cultivo em frasco Schott de

250mL.

Ensaio Células Características

E7 rS2 Meio inicialmente com 100% de oxigênio dissolvido, com vazão de ar

1vvm para oxigenação superficial.

E8 S2 Meio inicialmente com 100% de oxigênio dissolvido, com vazão de ar

1vvm para oxigenação superficial.

E9 S2 Meio inicialmente com 100% de oxigênio dissolvido, após a inoculação

foi bombeada em conjunto uma vazão de ar de 0,95 vvm e 0,05 vvm de

oxigênio puro. Etapas realizadas durante o experimento: A) diminuição

na vazão de oxigênio puro na entrada de 0,05 para 0,04 vvm B)

fechamento da entrada do oxigênio puro e diminuição na vazão de ar

para 0,5 vvm C) diminuição na vazão de ar para 0,25 vvm D)

fechamento da alimentação de ar pela bomba.

E10 rS2 Sem oxigenação superficial

Na Figura 4.18 pode se observar às curvas de crescimento e viabilidade celulares dos

ensaios E7-rS2, E8-S2, E9-S2 e E10-rS2. A viabilidade celular nos experimentos manteve-se

entre 99 e 97% durante 187 horas de cultivo, independentemente das características dos

experimentos como definidas na Tabela 4.3. Como se pode ser observar na Figura 4.18, a

queda da viabilidade celular ocorre após 187 horas de cultivo no ensaio E7-S2. Este fato está

relacionado ao esgotamento da glicose do caldo de cultivo como se observa na Figura 4.19.

Resultados e Discussão - 62 -

Para os experimentos E8-S2 e E9-rS2 observa-se o mesmo comportamento em relação à queda

da viabilidade celular ocorrendo após o esgotamento total da glicose (Figura 4.18 e Figura

4.19).

Os consumos de glicose e glutamina para ambos os experimentos E7-rS2, E8-S2 e

E9-S2 tiveram os mesmo comportamentos já observados nos experimentos E5-rS2 e E6-S2 no

item 4.2 (Figura 4.19 e 4.20).

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 288 312 336

0,0

5,0x10

1,0x10

1,5x10

2,0x10

2,5x10

3,0x10

3,5x10

4,0x10

4,5x10

Tempo (h)

Concentração celular (células/mL)

100

E9-S2 (OD

inicial

=120%)

E10-rS2 ("Sem entrada de Ar")

Viabilidade (%)

E7-rS2 (OD

inicial

=100%)

E8-S2 (OD

inicial

=100%)

Figura 4.18. Resultados do crescimento e das viabilidades celular das células S2 e rS2

nos experimentos realizados com vazão de ar 1 vvm para oxigenação

superficial do frasco Schott de 250 mL, com agitação orbital de 100 rpm e

temperatura de 28°C.

Resultados e Discussão - 63 -

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 288 312 336

Tempo(h)

Concentração de glicose(g/L)

E7-rS2 (OD

inicial

=100%)

E8-S2 (OD

inicial

=100%)

E9-S2 (OD

inicial

=120%)

E10-rS2 ("Sem entrada de Ar")

Figura 4.19. Consumo de glicose nos cultivos das células S2 e rS2, com vazão de ar

de 1 vvm para oxigenação superficial do frasco Schott de 250 mL, com

agitação orbital de 100 rpm e temperatura de 28°C.

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 288 312

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

2,4

E7-rS2 (OD

inicial

=100%)

E8-S2 (OD

inicial

=100%)

E9-S2 (OD

inicial

=120%)

Concentração de glutamina (g/L)

Tempo (h)

Figura 4.20. Consumo de glutamina nos cultivos das células S2 e rS2 com vazão de

ar de 1 vvm para oxigenação superficial do frasco Schott de 250 mL, com

agitação orbital de 100 rpm e temperatura de 28°C.

Resultados e Discussão - 64 -

Nos experimentos E7-rS2 e E8-S2, os inícios das desacelerações dos crescimentos

coincidem com o nível muito baixo de oxigênio no caldo de cultivo. No experimento E7-rS2 a

concentração de oxigênio dissolvido atinge 6% da saturação (0,013 mmol/L), enquanto que no

experimento E8-S2 atinge 2% da saturação (0,004 mmol/L) (Figura 4.21). Estudos de

GOTOH

et al. (2004) realizados com linhagem de células Sf-9 demonstram que a

concentração crítica de oxigênio dissolvido está em torno de 2,5% no meio de cultivo.

Entretanto os experimentos E7-rS2 e E8-S2 onde o oxigênio aparentemente foi o fator

limitante para crescimento celular, a viabilidade manteve-se alta, entre 99 e 95%, somente

ocorrendo queda da viabilidade após 194 horas para o experimento E7-rS2 e 186,5 horas para

o experimento E8-S2 devido ao esgotamento da glicose no meio de cultivo (Figura 4.21, 4.18

e 4.19). Esta alta tolerância à falta de oxigênio nas células S2 e rS2 pode estar relacionada com

a resistência da

Drosophila melanogaster a anoxia. Os mecanismos de tolerância desse inseto

à escassez de oxigênio ainda não estão bem definidos. Estudo recente tem demonstrado que na

fase embrionária, a

Drosophila melanogaster tem um mecanismo natural de proteção das

células diante do estresse causado por anoxia (CHEN

et al., 2002; CHEN et al., 2003).

Entretanto, RHEIL & MURHAMMER (1995) demonstraram que anoxia (falta de

oxigênio) em qualquer momento do cultivo das células Sf-9 influencia o crescimento celular.

Este fato causa a desaceleração do crescimento e a diferenças no

max

e na concentração

máxima de células como demonstrado na Tabela 4.4 e Figura 4.21.

Resultados e Discussão - 65 -

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264

0,0

5,0x10

-2

1,0x10

-1

1,5x10

-1

2,0x10

-1

2,5x10

-1

Oxigênio Dissolvido

E7-rS2 (OD

inicial

=100%)

E8-S2 (OD

inicial

=100%)

(mmol/L)

Tempo (h)

0,0

5,0x10

1,0x10

1,5x10

2,0x10

2,5x10

3,0x10

Concentração celular (células/mL)

Concentração celular

E7-rS2 (OD

inicial

=100%)

E8-S2

(

inicial

=100%

)

Figura 4.21. Curvas de crescimento celular e variação de oxigênio dissolvido nos

experimentos E7-rS2 e E8-S2 com as células rS2 e S2, com vazão de ar de 1

vvm para oxigenação superficial do frasco Schott de 250 mL, agitação orbital

de 100 rpm e temperatura de 28°C.

No entanto o excesso de oxigênio dissolvido (hiperoxia) no início do experimento

E9-S2 também afetou o crescimento celular como pode ser observado na Figura 4.22. Devido

ao efeito negativo da alta concentração de oxigênio dissolvido no meio de cultivo na célula S2

como pode se observar na Figura 4.23.(A), optou-se em fazer a oxigenação superficial em

etapas como descrito na Tabela 4.3. O fato de diminuir o fornecimento de ar enriquecido de

oxigênio fez com que as células crescessem até 232 horas atingindo uma concentração de 1,86

x 10

células/mL. Na observação no microscópio com o método de fluorescência foi verificado

que as características externas das células foram afetadas no início do experimento quando o

meio estava com uma concentração de oxigênio dissolvido de 120% ao ser comparado com

experimento em que o meio não foi oxigenado (E10-rS2, Figura 4.23.(B)). A recuperação das

Resultados e Discussão - 66 -

células ocorreu somente após 70 horas, depois da interrupção da entrada de ar enriquecido

com oxigênio (Figura 4.23.(C)).

A exposição à hiperoxia causou um efeito negativo muito forte no crescimento

celular como está demonstrado na Tabela 4.4. Estudos recentes realizados por HETZ &

BRADLEY (2005) demonstram a existência de mecanismos que regulam a concentração de

oxigênio no tecido da mosca

Drosophila melanogaster, pois a concentração de oxigênio em

condições atmosféricas normais tem efeito tóxico para este inseto, este fato pode estar

relacionado com o decréscimo acentuado da velocidade específica de respiração celular no

início dos experimentos onde há uma concentração de oxigênio acima de 60% de oxigênio

dissolvido.

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 288 312

0,0

5,0x10

-2

1,0x10

-1

1,5x10

-1

2,0x10

-1

2,5x10

-1

3,0x10

-1

Concentração celular (células/mL)

Oxigênio Dissolvido

E9-S2 (OD

inicial

=120%)

(mmol/L)

Tempo (h)

0,0

5,0x10

1,0x10

1,5x10

2,0x10

2,5x10

3,0x10

Concentração Celular

E9-S2 (OD

inicial

=120%)

Figura 4.22. Curva de crescimento celular e variação de oxigênio dissolvido no

experimento E9-S2 com as células S2 no frasco Schott de 250 mL, com

agitação orbital de 100 rpm e temperatura de 28°C.

Resultados e Discussão - 67 -

Tabela 4.4. Resultados obtidos nos experimentos utilizando as células S2 e rS2

realizados com vazão de ar 1 vvm para oxigenação superficial do frasco Schott

de 250 mL, em relação à

max

e concentração máxima de células.

Ensaios Células

max

-1

)

Concentração máxima de células

(células/mL)

E7 rS2 0,0534 1,65 x1 0

E8 S2 0,0431 2,59 x 10

E9 S2 0,0337 1,86 x 10

E10 rS2 0,0323 1,06 x 10

48h 48h

118h

)

E9-S2

E10-rS2

Figura 4.23. Estado morfológico das células S2 no E9-S2 em cultivo com excesso de

oxigênio (120%) inicial: A) 48 h e C) 118 h e cultivo sem oxigenação no E4-

rS2: B) 48 h e D) 118 h de cultivo.

Na Figura 4.24 observa-se o decréscimo da velocidade específica de respiração

celular (

) das células S2 e rS2 durante a fase de crescimento exponencial. No experimento

E7-rS2 o decréscimo da velocidade específica de respiração celular (

) das células rS2 foi

de 6,08 x 10

-9

para 1,22 x 10

-10

mmol/célula.h. O decréscimo da velocidade específica da

respiração celular (

) das células S2 no experimento E8-S2 foi de 4,82 x 10

-9

para 1,17 x 10

mmol/célula.h e para o experimento E9-S2 foi de 7,69 x1 0

-9

para 1,22 x 10

-10

Resultados e Discussão - 68 -

mmol/célula.h. Estudos realizados por RHIEL

et al. (1997) com as células High Five

(Tn-5)

e Sf-9 ambas cultivadas em meio Sf-900 II com o oxigênio dissolvido controlado a 50% da

saturação do ar, identificaram aproximadamente o mesmo formato no perfil da velocidade

específica de respiração celular na fase de crescimento exponencial. Os pesquisadores

verificaram um decréscimo da velocidade específica de respiração celular (

) na fase de

crescimento exponencial para a as células High Five

(Tn-5) de aproximadamente 5,40 x 10

-9

para 2,88 x 10

-9

mmol/célula.h (Figura 4.25). Para as células Sf-9 o decréscimo da velocidade

específica de respiração celular (

) na fase de crescimento exponencial foi

aproximadamente de 1,8 x 10

-9

para 0,72 x 10

-9

mmol/célula.h (Figura 4.25).

Entretanto, podemos notar que este decréscimo da velocidade específica de respiração

celular (

) na fase de crescimento exponencial foi mais acentuado para as células S2 e rS2

em relação às células High Five

(Tn-5) e Sf-9.

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 288

0,0

1,0x10

-9

2,0x10

-9

3,0x10

-9

4,0x10

-9

5,0x10

-9

6,0x10

-9

7,0x10

-9

8,0x10

-9

E7-rS2 (OD

inicial

=100%)

E8-S2 (OD

inicial

=100%)

E9-S2 (OD

inicial

=120%)

(mmol/célula.h)

Tempo(h)

Figura 4.24. Variação de

nos experimentos E7-rS2, E8-S2 e E9-S2 com as

células S2 e rS2 utilizando vazão de ar de 1 vvm para oxigenação superficial do

frasco Schott de 250 mL, agitação orbital de 100 rpm e temperatura de 28° C.

Resultados e Discussão - 69 -

0 50 100 150 200 250 300

0,0

1,0x10

-9

2,0x10

-9

3,0x10

-9

4,0x10

-9

5,0x10

-9

6,0x10

-9

7,0x10

-9

Concentração de célula viável (células/mL)

Respiração celular (Q

)

Tn-5 em Sf900 II

Sf-9 em Sf900 II

(mmol/célula.h)

Tempo(h)

Concentração de célula viável

Tn-5 em Sf900 II

Sf-9 em Sf900 II

Figura 4.25. Variação de

e crescimento celular das células High Five

(Tn-5) e

Sf-9, ambas as células cultivadas em meio Sf-900 II, biorreator Applikon, com

volume de trabalho de 1,4 L em função do tempo de cultivo celular. Gráfico

adaptado dos estudos realizados por RHIEL

et al. (1997).

Geralmente o oxigênio dissolvido no meio de cultivo é dependente da velocidade

específica de consumo de oxigênio. Esta é descrita em estudos realizados com as células Sf-9

como sendo do tipo Monod (Equação 4.1) (GOTOH

et al., 2002; GOTOH et al., 2004),

mostrada a seguir:

2max2

(4.1)

onde,

O2max

é velocidade específica máxima de consumo de oxigênio e K

é a constante de

saturação.

Contudo, pode-se observar na Figura 4.26 que experimento E7-rS2 e E8-S2 não

apresentam o perfil descrito pelo modelo do tipo Monod em relação à velocidade específica de

respiração celular (

). O ensaio E9-S2 mesmo sendo mais oxigenado não apresentou um

perfil do tipo Monod.

Resultados e Discussão - 70 -

Nos experimentos E7-rS2 e E8-S2 os perfis da velocidade específica de respiração

celular (

) apresentaram uma queda acentuada até próximo de 60% (0,132 mmol/L) de

oxigênio dissolvido e uma faixa aproximadamente constante, 60% (0,132 mmol/L) e 20%

(0,044 mmol/L) de oxigênio dissolvido isto pode ser observado na Figura 4.26. O resultado do

experimento E9-S2 demonstra que o perfil da velocidade específica de respiração celular

(

) é aproximadamente constante após o crescimento exponencial celular, independente da

faixa de oxigênio dissolvido registrada no caldo do cultivo neste experimento (E9-S2).

Os resultados obtidos nos experimentos E7-rS2, E8-S2 e E9-S2 demonstram que um

estudo mais minucioso da velocidade específica de respiração celular (

) deve ser realizado

em um sistema onde se permita um controle mais rigoroso do oxigênio dissolvido no caldo de

cultivo para podermos obter um modelo da velocidade específica de respiração celular (

)

em função da concentração de oxigênio dissolvido.

0,0

5,0x10

-2

1,0x10

-1

1,5x10

-1

2,0x10

-1

2,5x10

-1

3,0x10

-1

0,0

1,0x10

-9

2,0x10

-9

3,0x10

-9

4,0x10

-9

5,0x10

-9

6,0x10

-9

7,0x10

-9

8,0x10

-9

E7-rS2(OD

inicial

=100%)

E8-S2 (OD

inicial

=100%)

E9-S2 (OD

inicial

=120%)

(mmol/célula.h)

(mmol/L)

Figura 4.26. Variação de

com a concentração de oxigênio dissolvido (C

) das

células S2 e rS2 nos experimentos E7-rS2, E8-S2 e E9-S2 com vazão de ar de 1

vvm para oxigenação superficial no frasco Schott de 250 mL, meio Sf-900 II,

com agitação orbital de 100 rpm e temperatura de 28°C.

Resultados e Discussão - 71 -

4.5.3. Estudo da velocidade específica de respiração celular (Q

) das células

rS2 em Schott de 100 mL

Com intuito de estudar mais a fundo as características de respiração da célula rS2

foram realizados experimentos adicionais em frasco Schott com oxigenação superficial. No

entanto, não foi mais possível à utilização do eletrodo galvânico para as medidas do oxigênio

dissolvido, devido à quebra do mesmo. Então se optou por um eletrodo polarográfico,

contudo, não foi possível realizar os experimentos no frasco Schott de 250 mL em razão do

comprimento do eletrodo polarográfico ser menor que do eletrodo galvânico. Como as tampas

dos frascos Schott são padronizadas independente do volume (100 mL, 250 mL, 500 mL e

1000 mL), fez-se uso nos novos experimentos do frasco Schott de 100 mL com volume de

trabalho 20 mL de meio Sf-900 II, a temperatura de 28°C no cultivo de células rS2. As

principais características dos experimentos realizados estão apresentadas na Tabela 4.5.

Tabela 4.5. Características dos experimentos adicionais com a célula rS2 utilizando

frasco Schott de 100 mL, com volume de trabalho de 20 mL, meio Sf-900 II,

temperatura de 28°C e oxigenação superficial.

Experimentos Características Objetivos

E11-rS2 Vazão de ar 1 vvm,

agitação orbital de

100rpm, com eletrodo.

Monitorar oxigênio dissolvido,

velocidade específica de respiração

celular (

) e influência do eletrodo no

cultivo.

E12-rS2 Sem eletrodo, agitação

orbital de 100 rpm e sem

oxigenação superficial.

Avaliar a influência da agitação no

crescimento celular.

E13-rS2

Sem eletrodo, agitação

orbital de 90 rpm e sem

oxigenação superficial.

Avaliar a influência da agitação no Q

no crescimento celular.

E14-rS2

Sem eletrodo, agitação

orbital de 120 rpm e sem

oxigenação superficial.

Avaliar a influência da agitação no Q

no crescimento celular.

Resultados e Discussão - 72 -

Inicialmente foram realizados experimentos com o intuito de analisar a velocidade

específica de respiração celular das células rS2 cultivadas no frasco Schott de 100 mL. No

entanto, os experimentos apresentaram um baixo crescimento celular no início, então se optou

por interromper os cultivos. A primeira hipótese era que o inóculo provinha de um frasco

Schott em estoque com 18 passagens, com isso às células estariam perdendo a sua capacidade

de crescimento. A segunda hipótese foi que a presença do eletrodo estaria influenciando o

crescimento celular, pois houve uma diminuição no volume de trabalho de 50 mL para 20 mL

e no diâmetro interno do frasco Schott, aproximadamente passou de 5,9 para 4,5 cm, no

entanto, se manteve o diâmetro do eletrodo, isto poderia estar causando cisalhamento em

níveis prejudiciais as células.

Diante destas hipóteses optou-se em descongelar um novo criotubo de células rS2,

para que não houvesse problema com o número de passagens e realizar experimentos com o

objetivo de avaliar a influência do eletrodo e da agitação no crescimento celular.

Pode se notar na Figura 4.27 os resultados obtidos no experimento E11-rS2, cujo

inóculo foi realizado com células provindas de um frasco Schott estoque de uma passagem. A

Figura 4.27 demonstra que a concentração de oxigênio dissolvido para os experimentos E11-

rS2 manteve se em níveis altos, entre 0,18 mmol/L (82%) a 0,04 mmol/L (20%) durante a fase

de crescimento exponencial. Assim sendo, a concentração de oxigênio dissolvido não foi um

fator que poderia estar limitando o crescimento das células.

A curva da velocidade específica de respiração celular (

) em relação ao tempo de

cultivo (Figura 4.27) e em relação à concentração de oxigênio dissolvido no meio de cultivo

(Figura 4.28) apresentaram formatos semelhantes à queda do experimento anterior realizado

no frasco Schott de 250 mL com eletrodo galvânico (Figura 4.24 e 4.26). Entretanto, a ordem

de grandeza da velocidade específica de respiração celular (Q

) foi 15 vezes menor em

Resultados e Discussão - 73 -

relação ao experimento (E7-rS2) realizado no frasco Schott de 250 mL. Comparando o

experimento E11-rS2 com o experimento E7-rS2 do item anterior (Figura 4.24), percebe-se

que após 2 horas do início do cultivo o experimento E11-rS2 apresentou uma velocidade

específica de respiração celular (

) aproximadamente igual a 3,85 x 10

-10

mmol/célula.h e o

experimento E7-rS2 realizado no frasco Schott de 250 mL apresentou uma velocidade

específica de respiração celular (

) aproximadamente igual a 6,08 x 10

-9

mmol/célula.h.

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 288 312

0,0

5,0x10

1,0x10

1,5x10

2,0x10

2,5x10

(mmol/L)

Concentração e Viabilidade celular

Concentração celular

Concentração celular (células/mL)

Tempo (h)

0,0

5,0x10

-2

1,0x10

-1

1,5x10

-1

2,0x10

-1

2,5x10

-1

Oxigênio Dissolvido e Q

Concentração de oxigênio dissolvido

100

Viabilidade celular

Viabilidade (%)

0,0

5,0x10

-11

1,0x10

-10

1,5x10

-10

2,0x10

-10

2,5x10

-10

3,0x10

-10

3,5x10

-10

4,0x10

-10

(mmol/célula.h)

Figura 4.27. Resultados do experimento E11-rS2, com vazão de ar de 1 vvm para

oxigenação superficial do frasco Schott de 100 mL, com volume de trabalho de

20 mL, meio Sf-900 II, temperatura de 28°C e agitação orbital de 100 rpm.

Resultados e Discussão - 74 -

0,0

5,0x10

-2

1,0x10

-1

1,5x10

-1

2,0x10

-1

0,0

1,0x10

-10

2,0x10

-10

3,0x10

-10

4,0x10

-10

(mmol/célula.h)

(mmol/L)

Figura 4.28. Variação

com a concentração de oxigênio dissolvido (C

) das

células rS2 no experimento E11-rS2, com vazão de ar de 1 vvm para

oxigenação superficial do frasco Schott de 100 mL, com volume de trabalho de

20 mL, meio Sf-900 II, temperatura de 28°C e agitação orbital de 100 rpm.

Estudos realizados por SWIECH (2005) com a linhagem recombinante das células de

Drosophila melanogaster Schneider S2 utilizando um biorreator Applikon com volume de

trabalho de 0,75 L, cultivadas em meio Sf-900 II com oxigênio dissolvido variando de 58 a

50% da saturação do ar na fase exponencial e com agitação crescente, demonstram que a

viabilidade celular não foi afetada com o aumento da agitação (Figura 4.29). No entanto, como

o volume de trabalho no biorreator é de 15 e 37,5 vezes maior que nos frascos Schott de 250

mL e 100 mL respectivamente, a interferência do eletrodo na velocidade específica de

respiração celular foi menor que nos frascos Schott, com isso a velocidade específica de

respiração celular inicial foi muito superior às obtidas nos frascos Schott (Figura 4.30). Por

outro lado, apresentou o mesmo formato de decréscimo da velocidade específica de respiração

celular durante a fase de crescimento exponencial (Figura 4.30). Na Tabela 4.6 estão

representados os valores de velocidades específicas de respiração celular e velocidades

Resultados e Discussão - 75 -

específicas máximas de crescimento celular referentes aos experimentos E11-rS2, E7-rS2 e o

trabalho de SWIECH (2005).

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240

0,0

5,0x10

1,0x10

1,5x10

2,0x10

Viabilidade (%)

Concentração celular (célula/mL)

Tempo (h)

Concentração

6,2

6,4

6,6

6,8

7,0

7,2

100

110

120

130

140

150

160

Agitação (rpm)

rpm

100

Viabilidade

Figura 4.29. Variação de pH, agitação, viabilidade e crescimento celular das células

rS2 cultivadas em meio Sf-900 II no biorreator Applikon, com volume de

trabalho de 0,75 L em função do tempo de cultivo celular. Gráfico adaptado dos

estudos realizados por SWIECH (2005).

Tabela 4.6. Valores de

no início e final da fase de crescimento exponencial das

células rS2 na presença de eletrodo de oxigênio dissolvido para diferentes

volumes de trabalho.

Experimento

Volume de

trabalho (mL)

inicial

(mmol/célula.h)

final

(mmol/célula.h)

max

-1

)

E7-rS2(*) 50 6,08 x 10

-9

0,122 x 10

-9

0,053

E11-rS2(**) 20 0,39 x 10

-9

0,043 x 10

-9

0,032

SWIECH (2005) 750 22,9 x 10

-9

4,71 x 10

-9

0,051

(*) com eletrodo galvânico.

(**) com eletrodo polarográfico.

Resultados e Discussão - 76 -

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 288 312

0,0

5,0x10

-9

1,0x10

-8

1,5x10

-8

2,0x10

-8

2,5x10

-8

Exp. realizado por SWIECH (2005)

E11-rS2

E7-rS2

(mmol/célula.h)

Tempo (h)

0,0

5,0x10

-2

1,0x10

-1

1,5x10

-1

2,0x10

-1

2,5x10

-1

Exp. realizado por SWIECH (2005)

E11-rS2

E7-rS2

(mmol/L)

Figura 4.30. Variação de

das células rS2 e oxigênio dissolvido em função do

tempo no experimento realizado por SWIECH (2005) e o experimento E11-rS2

e E7-rS2.

Como os resultados iniciais dos experimentos não foram satisfatórios e havendo a

hipótese da interferência do eletrodo no crescimento celular, optou-se em realizar

paralelamente experimentos com diferentes agitações como demonstrado na Tabela 4.5 com

objetivo de avaliar o estresse por cisalhamento das células rS2 durante o cultivo.

Neste conjunto de experimentos com diferentes agitações, realizados paralelamente

com experimento E11-rS2, pode-se observar (Figura 4.31) que durante a fase exponencial a

viabilidade celular se manteve alta, entre 95 e 99% independente da agitação utilizada. Para o

Resultados e Discussão - 77 -

experimento E13-rS2 na qual agitação foi de 90 rpm observa-se na Figura 4.31 e Tabela 4.6

que a velocidade específica máxima de crescimento celular (

máx

) e a concentração máxima de

células foram inferiores aos demais experimentos. Segundo estudos realizados por CRUZ

al.

(1998) com as células Sf-9, cultivadas em frasco Wheaton com volume de trabalho de 125

mL, meio Sf-900 II e uma agitação orbital de 80 a 250 rpm. O fato das células apresentarem

uma baixa velocidade específica máxima de crescimento celular para baixa agitação (80 rpm)

pode ser atribuído à baixa transferência de oxigênio e alta concentração de gás carbônico no

meio de cultivo. No entanto, o experimento (E13-rS2) manteve-se com a viabilidade alta, entre

95 e 99%, durante 408 horas (17dias) de cultivo. Como a velocidade específica máxima de

crescimento celular foi baixa em relação aos outros experimentos (E11-rS2, E12-rS2 e E14-

rS2) provavelmente o experimento E13-rS2 deve ter atingido a fase estacionária com um nível

de concentração de nutrientes solúveis ainda altos no meio de cultivo, assim permitindo a

longa duração do experimento E13-rS2.

No experimento E14-rS2 com agitação orbital de 120 rpm observa-se na Figura 4.31

e Tabela 4.6 que a velocidade específica máxima de crescimento celular foi superior aos

demais experimentos realizados paralelamente, este fato deve estar relacionado a uma melhor

transferência de oxigênio para o meio de cultivo devido à agitação (120 rpm). A viabilidade

celular monitorada pelo método de exclusão de corante azul de Tripan não apresentou nenhum

indicativo de que as células estariam sofrendo algum tipo estresse por cisalhamento, também

não foi observado no microscópio fragmento de células no caldo de cultivo que seria um

indicativo de cisalhamento ou lise de células. Entretanto, pode-se observar na Figura 4.31 uma

menor duração com 308 horas (12,8 dias), provavelmente devido ao esgotamento de algum

nutriente importante (glicose) do meio de cultivo.

Resultados e Discussão - 78 -

Nos experimentos E11-rS2 (com eletrodo) e E12-rS2 (sem eletrodo) observa-se que

as velocidades específicas de crescimento celular foram praticamente iguais (Tabela 4.7). No

entanto, as concentrações máximas de células foram diferentes, logo se observa uma menor

duração do cultivo E11-rS2 (289 horas) em relação aos demais experimentos. Este fato deve

estar relacionado ao esgotamento de nutriente (glicose) no meio de cultivo, pois não foi

observada uma queda na viabilidade ou fragmentos de células que pudesse indicar

cisalhamento devido à presença do eletrodo.

O experimento E12-rS2 apresenta o mesmo crescimento celular do experimento E10-

rS2 realizado (Figura 4.18 e Tabela 4.4) no frasco Schott de 250 mL com agitação de 100 rpm.

Indicando provavelmente assim, uma limitação por uma baixa concentração de oxigênio

dissolvido no meio de cultivo no final da fase exponencial.

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

0,00

2,50x10

5,00x10

7,50x10

1,00x10

1,25x10

1,50x10

1,75x10

2,00x10

2,25x10

2,50x10

E13-rS2 (90rpm)

E14-rS2(120rpm)

Tempo (h)

Concentração celular (células/mL)

E11-rS2 (100rpm e eletrodo)

E12-rS2 (100rpm)

100

Viabilidade (%)

Figura 4.31. Resultados do crescimento e viabilidade celular das células rS2 nos

experimentos realizados com diferentes agitações (90, 100 e 120 rpm)

utilizando o frasco Schott de 100 mL, meio Sf-900 II, temperatura de 28°C e

com volume de trabalho de 20 mL.

Resultados e Discussão - 79 -

Tabela 4.7. Resultados obtidos nos experimentos com células rS2 utilizando frasco

Schott de 100 mL e diferentes condições de agitação, em relação a

max

concentração máxima de células.

Experimentos Características

max

-1

)

Concentração máxima de

células (células/mL)

E11-rS2

Vazão de ar 1 vvm para oxigenação

superficial, agitação orbital de 100 rpm,

com eletrodo.

0,032 1,33 x 10

E12-rS2

Sem eletrodo, agitação orbital de 100 rpm

e sem oxigenação superficial.

0,031 1,05 x 10

E13-rS2

Sem eletrodo, agitação orbital de 90 rpm e

sem oxigenação superficial.

0,024 0,87 x 10

E14-rS2

Sem eletrodo, agitação orbital de 120 rpm

e sem oxigenação superficial.

0,040

1,29 x 10

O conjunto de experimentos realizado demonstra que a concentração de oxigênio

dissolvido no meio de cultivo foi um fator limitante para o crescimento celular das células rS2.

No entanto, outro fator não identificado deve estar limitando o crescimento celular das células

rS2, pois os cultivos apresentam uma fase estacionária longa entre 140 e 240 horas com

viabilidade celular alta, entre 95 e 99%. No entanto, a hipótese de cisalhamento das células e

que seria a mais provável, não foi possível ser confirmada pelo método de exclusão do corante

azul de Tripan. Logo a utilização de outro método como o que utiliza o substrato azocaseína

para detecção de protease celular, proveniente do cisalhamento de células poderia ser

empregado para identificar o efeito do cisalhamento celular durante no crescimento celular e o

estresse celular.

Conclusões - 80 -

5. CONCLUSÕES

Como conclusões relevantes da pesquisa realizada pode-se dizer que:

Na tentativa de definir uma metodologia para quantificar a viabilidade celular das

células de insetos, ambos os métodos utilizados nos experimentos para acompanhar a

viabilidade do cultivo das células S2 e rS2, o de exclusão de corante azul de Tripan e o de

corantes fluorescentes, se mostraram rápidos, simples e confiáveis para identificação da

porcentagem de células viáveis. Entretanto, à diferença do método de exclusão de corante, o

método de corantes fluorescentes é capaz de identificar apoptose, logo, pode identificar com

antecedência fatores adversos ao crescimento das células, como hipoxia ou esgotamento de

algum nutriente que possa limitar a longevidade da cultura da célula de inseto.

O estudo do consumo de aminoácidos e glicose pelas células S2 e rS2 mostrou

que estes nutrientes não estão relacionados à desaceleração do seu crescimento, pois se

encontram em altas concentrações no meio de cultivo Sf-900 II ainda na fase estacionária.

Sendo assim, a falta de oxigênio pode ser considerada a causa mais provável dessa

desaceleração.

Nos experimentos realizados para verificar a influência da idade e concentração

do inóculo, verificou-se que ambos os parâmetros não tem influência na velocidade específica

de crescimento (

). A influência ocorre na fase lag do crescimento celular; quanto menor a

concentração do inóculo mais prolongada é a fase lag do cultivo. Em função disso, a idade do

inóculo apresentou efeitos substanciais apenas na produtividade máxima das células rS2.

Os experimentos onde foi monitorada a concentração de oxigênio dissolvido no

meio de cultivo das células S2 e rS2 demonstraram que o cultivo atinge a fase estacionária

com nível muito baixo de oxigênio, sendo o fator limitante do crescimento das células. O

Conclusões - 81 -

excesso de oxigênio na fase inicial do cultivo também foi prejudicial para o crescimento das

células.

Os resultados dos experimentos com medidas da velocidade específica de

respiração celular (

) demonstram que este parâmetro, para as células S2 e rS2, apresenta

decréscimo acentuado durante a fase exponencial de crescimento celular.

A velocidade específica de respiração celular (Q

) obtida em cultivo realizado

em frasco Schott de 100 mL apresentou-se 15 vezes menor que em cultivos realizados no

frasco Schott de 250 mL evidenciando uma interferência do eletrodo no cultivo das células.

Os experimentos de cultivo realizados em diferentes agitações (90, 100 e 120

rpm) demonstraram que para baixa agitação a transferência de oxigênio é um fator limitante

no crescimento celular. A viabilidade celular para todos os experimentos realizados em

diferentes agitações se manteve alta, entre 95 e 99% de células viáveis indicando que as

células aparentemente estão em bom estado fisiológico.

Sugestões - 82 -

6. SUGESTÕES

Para os futuros trabalhos que venham a ser desenvolvidos sobre o estudo da fisiologia

celular do cultivo das células S2 e rS2 são propostas as seguintes sugestões:

Reavaliar a concentração de células apoptóticas após 96 horas de cultivo das

células S2 e rS2, utilizando outros métodos de identificação de células apoptóticas como o de

citometria de fluxo.

Estudar o consumo de outros componentes como carboidratos (trealose, frutose,

maltose) e a produção de lactato, amônia e da proteína recombinante. No quais podem ser

limitantes para o crescimento das células das células rS2.

Avaliar o efeito do cisalhamento celular nos cultivos em frasco Schott de 100 mL

e 250 mL, com a presença do eletrodo e sem a presença do eletrodo, através do método de

espectroscopia utilizando o substrato azocaseína, para identificar protease provindas das

células lisadas.

Determinar um modelo para velocidade específica de respiração celular (Q

) em

função da concentração de oxigênio (

) para concentração deste, entre 0 e 50%.

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Apêndice - 96 -

APÊNDICE

Valores experimentais referentes aos experimentos realizados

Apêndice - 97 -

Tabela A1 - Valores dos dados experimentais obtidos no experimento E1-S2 utilizando as

células S2 cultivadas em frasco Schott de 100 mL, meio Sf-900 II, agitação orbital de 100

rpm, temperatura de 28°C e com volume de trabalho de 20 mL.

Tempo

(h)

Concentração celular

(*10

células/mL)

Viabilidade celular

Método azul de Tripan

(%)

Viabilidade celular

Método fluorescência

(%)

0,0 0,46 95,6 95,6

27,5 0,85 96,0 93,3

50,0 3,95 96,3 94,2

74,5 10,20 96,8 94,8

99,0 12,70 97,2 97,8

120,3 21,50 98,9 95,6

143,7 25,50 97,0 96,6

167,7 25,40 97,3 93,8

195,5 25,40 95,7 90,7

220,0 19,50 82,9 85,2

Tabela A2 - Valores dos dados experimentais obtidos no experimento E1-S2 utilizando o

método de corantes fluorescentes.

Tempo

(h)

VNA (*)

(%)

NVA

(%)

NEC

(%)

0,0 95,7 0,0 0,0 0,7 3,6

27,5 93,3 1,7 0,0 5,0 0,0

50,0 94,2 2,1 0,0 3,7 0,0

74,5 94,8 0,3 0,0 4,9 0,0

99,0 97,8 0,9 0,0 1,3 0,0

120,3 95,3 2,0 0,4 2,0 0,0

143,7 96,2 3,0 0,4 0,4 0,0

167,7 93,8 5,6 0,0 0,6 0,0

195,5 90,7 5,0 0,0 4,3 0,0

220,0 85,3 5,3 0,3 9,1 0,0

(*) Símbolo definido em materiais e método.

Apêndice - 98 -

Tabela A3 - Valores dos dados experimentais obtidos no experimento E2-rS2 utilizando as

células S2 cultivadas em frasco Schott de 100 mL, meio Sf-900 II, agitação 100 rpm,

temperatura de 28°C e com volume de trabalho de 20 mL.

Tempo

(h)

Concentração Celular

(*10

células/mL)

Viabilidade Celular

Método azul de Tripan

(%)

Viabilidade Celular

Método fluorescência

(%)

0,0 0,34 98 98,3

23,5 0,70 94,8 96,5

47,8 3,98 97,2 95,9

68,8 10,00 95,2 97,0

96,8 16,20 96,6 97,9

121,0 16,30 96,8 98,1

144,5 16,30 97,4 100

167,5 16,10 96,5 95,4

186,3 15,00 90,6 93,2

210,7 16,40 90,9 89,8

236,5 14,40 80,6 75,9

Tabela A4 - Valores dos dados experimentais obtidos no experimento E2-rS2 utilizando o

método de corantes fluorescentes.

Tempo

(h)

VNA

(%)

NEC

(%)

0,0 96,3 0,0 3,7

23,5 96,5 0,0 3,5

47,8 95,9 0,0 4,1

68,8 97,0 0,0 3,0

96,8 97,9 0,0 2,1

121,0 98,1 0,0 1,9

144,5 100 0,0 0,0

167,5 95,4 2,6 2,0

186,3 93,2 2,9 3,9

210,7 89,8 4,5 4,5

236,5 75,9 6,5 18,0

Apêndice - 99 -

Tabela A5 - Valores dos dados experimentais obtidos no experimento E3-S2 utilizando as

células S2 cultivadas em frasco Schott de 100 mL, meio Sf-900 II, agitação orbital de 100

rpm, temperatura de 28°C e com volume de trabalho de 20 mL.

Tempo

(h)

Concentração Celular

(*10

células/mL)

Viabilidade Celular

Método azul de Tripan

(%)

Viabilidade Celular

Método fluorescência

(%)

0,0 0,47 95,2 95,6

24,5 0,90 95,0 96,5

47,0 4,21 94,2 94,0

70,5 9,19 96,8 97,3

95,8 12,7 98,8 98,1

119,7 21,6 95,4 96,9

143,0 23,9 97,2 96,7

167,0 23,5 97,2 94,1

191,5 24,3 96,4 93,8

215,5 20,3 85,0 87,8

Tabela A6 - Valores dos dados experimentais obtidos no experimento E3-S2 utilizando o

método de corantes fluorescentes.

Tempo

(h)

VNA

(%)

NVA

(%)

NEC

(%)

0,0 95,6 0,0 0,0 0,7 3,7

24,5 96,5 0,6 0,3 1,5 1,1

47,0 94,0 0,2 0,2 4,4 1,2

70,5 97,2 0,0 0,2 2,6 0,0

95,8 98,1 1,0 0,0 0,7 0,2

119,7 96,9 2,8 0,0 0,3 0,0

143,0 96,7 2,7 0,0 0,0 0,6

167,0 94,1 5,1 0,0 0,8 0,0

191,5 93,8 3,8 0,2 1,7 0,5

215,5 87,8 5,4 0,5 6,3 0,0

Apêndice - 100 -

Tabela A7 - Valores dos dados experimentais do consumo e produção de aminoácidos obtidos

no experimento E3-S2 utilizando as células S2 cultivadas em frasco Schott de 100 mL, meio

Sf-900 II, agitação orbital de 100 rpm, temperatura de 28°C e com volume de trabalho de 20

mL.

Tempo (h)

Aminoácido (g/L)

0 95,8 119,7 167 215,5

Asp 1,415 1,110 1,330 0,836 0,909

Glu 1,769 1,190 0,875 0,503 0,550

Ser 0,727 0,130 0,086 0,041 0,005

Gly 0,621 0,483 0,431 0,398 0,384

His 0,699 0,169 0,129 0,127 0,106

Arg 0,825 0,830 0,754 0,681 0,650

Thr 0,263 0,231 0,171 0,119 0,113

Ala 1,262 3,130 3,620 4,012 2,660

Pro 0,386 0,001 0,000 0,000 0,002

Tyr 0,216 0,187 0,162 0,126 0,111

Val 0,609 0,548 0,443 0,315 0,276

Met 0,862 0,898 0,830 0,778 0,768

Cys 0,024 0,009 0,000 0,000 0,000

Ile 0,804 0,551 0,409 0,210 0,157

Leu 0,301 0,168 0,102 0,029 0,017

Phe 0,848 0,904 0,830 0,770 0,755

Lys 0,635 0,622 0,546 0,493 0,456

Apêndice - 101 -

Tabela A8 - Valores dos dados experimentais obtidos no experimento E4-rS2 utilizando as

células rS2 cultivadas em frasco Schott de 100 mL, meio Sf-900 II, agitação orbital de 100

rpm, temperatura de 28°C e com volume de trabalho de 20 mL.

Tempo

(h)

Concentração Celular

(*10

células/mL)

Viabilidade Celular

Método azul de Tripan

(%)

Viabilidade Celular

Método fluorescência

(%)

0,0 0,53 96,2 96,3

22,0 1,34 94,0 95,7

46,0 6,12 94,8 97,5

73,8 12,8 97,5 98,3

92,0 14,5 97,6 98,4

121,0 14,6 96,0 97,7

144,2 14,3 95,9 96,8

168,8 14,4 97,4 95,2

191,8 14,4 91,3 92,4

214,5 14,2 90,1 87,3

236,3 14,9 89,3 83,0

260,8 14,3 72,5 68,8

Tabela A9 - Valores dos dados experimentais obtidos no experimento E4-rS2 utilizando o

método de corantes fluorescentes.

Tempo

(h)

VNA

(%)

NEC

(%)

0,0 96,3 0,0 3,7

22,0 95,7 0,0 4,3

46,0 97,5 0,0 2,5

73,8 98,3 0,0 1,7

92,0 98,4 0,0 1,6

121,0 97,7 0,0 2,3

144,2 96,8 0,0 3,2

168,8 95,2 4,8 0,0

191,8 92,4 3,5 4,1

214,5 87,3 6,1 6,6

236,3 83,0 11,0 6,0

260,8 68,8 8,6 21,6

Apêndice - 102 -

Tabela A10 - Valores dos dados experimentais do consumo e produção de aminoácidos

obtidos no experimento E4-rS2 utilizando as células S2 cultivadas em frasco Schott de 100

mL, meio Sf-900 II, agitação orbital de 100 rpm, temperatura de 28°C e com volume de

trabalho de 20 mL.

Tempo (h)

Aminoácido (g/L)

0 92 168,8 214,5 260,8

Glu 1,769 1,420 1,160 1,196 0,891

Ser 0,727 1,780 1,300 1,477 1,440

Gly 0,621 0,524 0,054 0,038 0,035

His 0,699 0,397 0,408 0,397 0,435

Arg 0,825 0,699 0,142 0,129 0,139

Thr 0,263 0,795 0,712 0,727 0,713

Ala 1,262 0,227 0,177 0,169 0,181

Pro 0,386 1,800 2,620 2,584 2,280

Tyr 0,216 0,292 0,002 0,013 0,010

Val 0,609 0,215 0,168 0,169 0,143

Met 0,862 0,600 0,520 0,524 0,525

Cys 0,025 0,860 0,800 0,829 0,826

Ile 0,804 0,019 0,011 0,012 0,013

Leu 0,301 0,785 0,639 0,607 0,594

Phe 0,848 0,274 0,181 0,164 0,147

Lys 0,635 0,833 0,809 0,841 0,836

Apêndice - 103 -

Tabela A11-Valores dos dados experimentais obtidos no experimento E5-rS2 utilizando as

células rS2 cultivadas em frasco Schott de 100 mL, meio Sf-900 II, agitação orbital de 100

rpm, temperatura 28°C e com volume de trabalho de 20 mL.

Tempo

(h)

Glutamina

(g/L)

Glicose

(g/L)

(*10

células/mL)

Viab.

(%)

VNA

(%)

Nec

(%)

0,0 2,26 10,70 0,38 100 98,1 0,0 1,9

19,5 2,27 10,50 0,74 99,6 98,2 0,0 1,8

43,0 2,00 10,50 1,46 96,2 98,2 0,0 1,8

68,0 1,91 10,00 2,43 97,3 97,2 0,0 2,8

94,5 1,82 9,17 4,58 95,9 97,4 1,9 0,7

111,8 1,64 8,97 7,36 97,8 96,3 1,8 1,9

140,0 1,22 7,06 9,21 97,1 94,4 3,9 2,2

172,0 1,37 5,54 9,66 98,6 95,3 2,5 1,7

192,0 1,14 4,33 9,05 97,9 95,4 3,3 1,3

216,0 0,90 3,54 9,21 97,9 96,4 1,9 1,7

235,5 1,00 2,12 8,69 97,6 97,0 1,9 1,1

260,0 1,02 1,53 8,77 98,7 96,1 2,2 1,7

283,8 1,02 0,51 9,30 97,0 95,4 2,8 1,8

308,8 0,76 0,06 8,55 95,7 93,8 1,9 4,3

334,0 0,60 0,03 9,32 76,0 70,8 6,5 22,7

Tabela A12-Valores dos dados experimentais obtidos no experimento E6-S2 utilizando as

células rS2 cultivadas em frasco Schott de 100 mL, meio Sf-900 II, agitação orbital de 100

rpm, temperatura de 28°C e com volume de trabalho de 20 mL.

Tempo

(h)

Glutamina

(g/L)

Glicose

(g/L)

(*10

células/mL)

Viab.

(%)

VNA

(%)

Nec

(%)

0,0 2,16 10,60 0,47 97,0 96,3 0,0 3,7

20,0 2,04 10,30 0,85 99,2 97,3 0,0 2,7

44,5 2,03 10,00 1,38 98,9 98,0 0,0 2,0

67,8 1,90 9,82 3,10 98,8 98,9 0,0 1,1

95,0 1,74 9,02 4,80 99,8 97,3 1,9 0,8

116,0 1,63 8,48 10,00 97,0 94,2 3,4 2,4

140,0 1,09 5,39 11,00 99,4 96,5 1,3 2,2

172,5 1,00 4,49 11,10 99,5 97,2 2,2 0,6

192,5 1,00 3,09 12,10 97,7 96,2 1,9 1,9

216,5 0,85 2,53 11,80 99,3 96,3 2,2 1,5

236,0 0,99 0,59 11,60 98,7 97,8 1,1 1,1

260,0 0,69 0,32 12,20 98,9 97,6 1,4 1,0

284,0 1,00 0,06 13,40 98,6 98,5 0,8 0,7

303,5 0,65 0,06 13,60 96,0 95,5 2,5 2,0

333,5 0,62 0,02 12,00 83,6 85,5 7,0 7,5

Apêndice - 104 -

Tabela A13-Valores dos dados experimentais obtidos nos experimentos com planejamento

fatorial utilizando as células rS2 cultivadas em frasco Schott de 100 mL, meio Sf-900 II,

agitação orbital de 100 rpm, temperatura de 28°C com volume de trabalho de 20 mL.

Tabela A

E1 E2

Tempo

(h)

(*10

células/mL)

Viab.

(%)

Tempo

(h)

(*10

células/mL)

Viab.

(%)

0,0 0,62 99,6 0,0 0,78 99,1

21,5 2,41 96,3 24,0 1,34 96,6

46,0 5,80 96,0 44,7 5,16 97,6

77,0 11,70 96,9 68,0 7,29 98,5

96,0 10,90 98,7 92,0 7,50 96,7

118,0 11,60 97,5 115,3 10,10 95,4

144,0 11,00 97,6 146,5 9,87 97,4

168,0 12,10 97,9 163,5 10,80 97,8

192,0 13,30 94,4 192,0 10,40 96,4

216,0 10,90 94,0 216,0 11,90 97,7

240,0 13,50 95,3 240,0 10,90 95,7

264,0 11,90 94,9 264,0 10,70 96,9

Tabela B

E3 E4

Tempo

(h)

(*10

células/mL)

Viab.

(%)

Tempo

(h)

(*10

células/mL)

Viab.

(%)

0,0 0,58 97,2 0,0 0,22 98,8

21,0 1,08 96,2 21,7 0,38 98,1

44,5 2,26 94,8 46,0 1,27 97,3

67,7 6,23 97,5 77,0 4,92 93,9

91,3 9,05 95,3 96,0 10,20 95,3

115,0 13,30 99,0 118,0 9,35 97,6

144,0 11,20 97,8 144,0 11,00 97,4

166,5 11,50 97,1 168,0 9,80 99,4

185,0 10,60 95,2 192,0 11,0 97,5

216,0 12,90 97,5 216,0 11,80 93,2

240,0 10,80 97,4 240,0 10,80 97,2

264,0 11,30 93,9 264,0 12,20 94,8

Apêndice - 105 -

Tabela C

E5 E6

Tempo

(h)

(*10

células/mL)

Viab.

(%)

Tempo

(h)

(*10

células/mL)

Viab.

(%)

0,0 0,50 97,6 0,0 0,27 99,5

18,0 1,26 97,4 23,5 0,47 95,6

46,5 4,4 95,0 48,0 1,24 91,2

67,0 6,6 98,1 72,5 5,13 97,9

89,7 9,38 98,4 95,3 11,00 97,9

112,0 10,50 95,7 120,0 11,00 98,8

144,0 10,20 96,8 144,0 10,10 95,3

168,0 8,10 98,5 168,0 11,50 91,3

192,0 9,98 98,4 - - -

216,0 9,46 97,9 - - -

240,0 10,20 96,6 - - -

264,0 10,70 95,61 - - -

Tabela A14 -Valores dos dados experimentais obtidos no experimento E7-rS2 utilizando as

células rS2 cultivadas em frasco Schott de 250 mL, meio Sf-900 II, agitação orbital de 100

rpm, temperatura de 28°C e com volume de trabalho de 50 mL.

(h)

(*10

células/mL)

Viab.

(%)

(h)

(*10

-9

mmol/célula.h)

(mmol/L)

(*10

-9

mmol/célula.h)

0,0 0,51 99,5 2,0 6,08 0,20 6,08

24,0 1,11 98,2 24,0 4,67 0,18 4,67

36,0 2,12 99,5 36,0 2,04 0,16 2,04

47,0 3,52 98,0 47,0 1,09 0,13 1,09

52,0 4,18 97,5 52,0 0,83 0,11 0,83

65,5 8,48 96,6 65,5 0,38 0,08 0,39

81,0 12,40 97,0 68,8 0,20 0,04 0,21

94,0 12,60 96,7 72,0 0,18 0,04 0,18

118,5 13,70 98,8 78,5 0,12 0,02 0,12

143,0 13,80 98,0 90,0 0,00 0,00 0,00

167,5 13,30 94,0 - - - -

194,0 13,90 94,8 - - - -

219,0 16,50 81,5 - - - -

238,5 13,10 83,3 - - - -

Apêndice - 106 -

Tabela A15 - Valores dos dados experimentais obtidos no experimento E8-S2 utilizando as

células S2 cultivadas em frasco Schott de 250 mL, meio Sf-900 II, agitação de 100 rpm,

temperatura de 28°C e com volume de trabalho de 50 mL.

(h)

(*10

células/mL)

Viab.

(%)

(h)

(*10

-9

mmol/célula.h)

(mmol/L)

(*10

-9

mmol/célula.h)

0,0 0,59 99,4 1,5 4,82 0,19 4,82

24,0 2,12 98,3 13,0 1,49 0,17 1,49

38,0 4,82 99,0 18,0 1,17 0,15 1,17

50,0 8,22 99,5 24,0 1,06 0,14 1,06

71,5 13,40 99,2 36,0 0,46 0,11 0,46

93,0 16,00 97,2 38,0 0,41 0,10 0,41

111,5 21,50 98,0 42,0 0,28 0,09 0,28

134,0 25,90 97,3 44,0 0,26 0,07 0,26

158,0 22,50 96,5 48,0 0,14 0,06 0,14

186,5 21,20 98,0 50,0 0,17 0,06 0,17

213,5 21,30 66,6 57,0 0,12 0,04 0,12

239,0 13,60 49,5 71,5 0,10 0,01 0,10

- - - 84,0 0,00 0,00 0,00

Tabela A16 - Valores dos dados experimentais obtidos no experimento E9-S2 utilizando as

células S2 cultivadas em frasco Schott de 250 mL, meio Sf-900 II, agitação orbital de 100

rpm, temperatura de 28°C e com volume de trabalho de 50 mL.

(h)

(*10

células/mL)

Viab.

(%)

(h)

(*10

-9

mmol/célula.h)

(mmol/L)

(*10

-9

mmol/célula.h)

0,0 0,47 99,1 0,0 7,69 0,26 7,69

16,5 0,58 99,8 16,5 6,14 0,26 6,14

27,5 0,85 99,5 27,5 4,02 0,23 4,02

39,5 1,19 99,6 39,5 3,09 0,26 3,09

48,0 1,62 97,0 48,0 2,00 0,26 2,00

65,0 2,73 98,5 65,0 0,94 0,24 0,94

72,0 4,05 98,6 72,0 0,50 0,21 0,50

88,5 5,48 98,5 88,5 0,32 0,20 0,32

96,0 6,75 98,1 96,0 0,29 0,19 0,29

118,0 10,30 99,0 118,0 0,18 0,18 0,18

138,0 12,20 99,5 138,0 0,12 0,16 0,12

161,5 14,10 98,7 161,5 0,10 0,13 0,10

185,5 16,80 97,5 185,5 0,08 0,11 0,08

211,5 17,60 98,7 211,5 0,04 0,09 0,04

232,5 18,60 96,9 232,5 0,01 - -

262,0 16,70 92,0 262,0 0,01 - -

281,0 11,40 66,4 - - - -

Apêndice - 107 -

Tabela A17 - Valores dos dados experimentais obtidos nos experimentos, E7-rS2, E8-S2 e E9-

S2 utilizando as células S2 e rS2 cultivadas em frasco Schott de 250 mL, meio Sf-900 II,

agitação orbital de 100 rpm, temperatura de 28°C e com volume de trabalho de 50 mL.

E7-rS2 E8-S2 E9-S2

(h)

(mmol/L)

(h)

(mmol/L)

(h)

(mmol/L)

0,0 0,220 0,0 0,220 0,0 0,264

2,0 0,202 1,0 0,198 2,5 0,264

21,0 0,180 2,5 0,194 16,5 0,264

26,0 0,176 13,0 0,165 27,5 0,231

29,0 0,172 18,0 0,158 39,0 0,255

33,0 0,167 17,0 0,154 48,0 0,238

35,0 0,163 20,0 0,150 65,0 0,216

36,0 0,158 24,0 0,143 72,0 0,216

36,0 0,163 27,5 0,136 88,5 0,216

38,0 0,158 36,0 0,110 94,5 0,194

40,0 0,154 37,0 0,106 96,0 0,194

42,0 0,150 39,0 0,097 118,0 0,185

44,0 0,143 40,0 0,092 136,0 0,158

45,0 0,140 42,0 0,086 138,0 0,158

46,0 0,136 43,0 0,079 161,5 0,125

48,5 0,131 43,5 0,075 185,5 0,110

51,5 0,106 44,0 0,070 185,5 0,132

53,0 0,123 45,5 0,066 211,5 0,092

53,5 0,110 46,5 0,062 232,0 0,154

58,0 0,101 48,0 0,057 262,0 0,220

59,0 0,097 49,5 0,053 281,0 0,220

62,0 0,092 50,0 0,066 - -

63,0 0,088 50,5 0,055 - -

64,3 0,084 52,5 0,044 - -

64,7 0,079 54,0 0,040 - -

65,1 0,077 57,0 0,035 - -

66,0 0,079 58,0 0,031 - -

66,8 0,070 60,0 0,026 - -

67,0 0,066 70,0 0,004 - -

67,3 0,062 72,0 0,018 - -

67,4 0,057 93,0 0,000 - -

68,2 0,053 93,0 0,013 - -

68,3 0,048 111,5 0,000 - -

69,3 0,040 111,5 0,020 - -

74,5 0,031 134,0 0,000 - -

75,3 0,026 134,0 0,000 - -

76,5 0,022 158,0 0,000 - -

79,5 0,017 158,0 0,013 - -

81,0 0,013 186,5 0,000 - -

81,0 0,026 213,5 0,000 - -

Apêndice - 108 -

92,0 0,000 213,5 0,048 - -

94,0 0,000 213,5 0,070 - -

118,5 0,022 239,0 0,128 - -

118,5 0,057 - - - -

143,0 0,042 - - - -

143,0 0,057 - - - -

167,0 0,046 - - - -

167,0 0,057 - - - -

194,0 0,066 - - - -

194,0 0,081 - - - -

219,0 0,092 - - - -

219,0 0,101 - - - -

238,5 0,114 - - - -

Tabela A18 - Valores dos dados experimentais obtidos no experimento E11-rS2 utilizando as

células rS2 cultivadas em frasco Schott de 100 mL, meio Sf-900 II, agitação orbital de 100

rpm, temperatura de 28°C e com volume de trabalho de 20 mL.

(h)

(*10

cell/mL)

Viab.

(%)

(h)

(*10

-10

mmol/célula.h)

(mmol/L)

(*10

-10

mmol/célula.h)

(h)

(mmol/L)

0,0 0,44 100 2,0 3,85 0,211 3,85 0,0 0,220

23,0 1,03 99,6 23,0 1,43 0,191 1,43 2,0 0,211

48,0 1,44 97,5 48,0 1,26 0,183 1,26 23,0 0,191

71,0 3,05 100 71,0 0,60 0,163 0,60 48,0 0,183

95,0 6,41 99,8 95,0 0,46 0,117 0,46 71,0 0,163

119,0 10,00 99,8 119,0 0,43 0,079 0,43 73,0 0,176

143,0 13,10 99,0 143,0 0,35 0,058 0,35 95,0 0,117

167,0 13,30 97,5 167,0 0,38 - - 97,0 0,128

191,0 13,50 95,4 191,0 0,48 - - 119,0 0,079

215,0 13,20 95,8 215,0 0,46 - - 121,0 0,099

242,0 13,70 95,1 242,0 0,42 - - 143,0 0,058

265,0 11,70 86,0 265,0 0,30 - - 167,0 0,059

289,0 11,60 78,3 289,0 0,32 - - 191,0 0,072

- - - - - - - 215,0 0,073

- - - - - - - 242,0 0,090

- - - - - - - 265,0 0,114

- - - - - - - 289,0 0,136

Apêndice - 109 -

Tabela A19 - Valores dos dados experimentais obtidos nos experimentos E12-rS2 (100 rpm),

E13-rS2 (90 rpm) e E14-rS2 (120 rpm) utilizando a célula rS2 cultivada em frasco Schott de

100 mL, meio Sf-900 II, diferente agitação orbital (100 rpm, 90 rpm, 120 rpm), temperatura de

28°C e com volume de trabalho de 20 mL.

Experimento E12-rS2 Experimento E13-rS2 Experimento E14-rS2

(h)

(*10

células/mL)

Viab.

(%)

(h)

(*10

células/mL)

Viab.

(%)

(h)

(*10

células/mL)

Viab.

(%)

0 0,44 100 0,0 0,44 100 0,0 0,47 99,5

23 1,03 99,7 23,5 0,67 99,6 20,0 1,12 98,0

48 2,17 98,3 47,5 1,06 98,9 44,0 3,04 98,1

71 4,70 99,2 72,0 2,15 98,6 67,0 6,67 98,9

95 8,06 99,7 96,0 4,48 97,3 90,7 10,60 98,6

119 10,50 99,7 120,0 6,26 98,7 114,8 12,90 98,9

143 9,77 98,4 144,0 6,95 99,7 138,5 11,15 99,2

167 10,40 99,1 169,0 8,18 99,1 164,5 11,20 99,5

191 10,60 99,0 192,0 7,11 99,3 192,8 12,70 98,9

215 10,60 99,8 216,0 8,65 98,5 210,0 10,45 98,9

241 10,60 99,2 240,0 8,85 99,1 235,1 11,30 99,4

265,5 10,70 99,2 264,0 8,76 97,0 259,3 12,00 97,7

288 10,10 98,1 288,3 8,59 97,7 283,3 11,50 96,5

312 10,90 98,5 312,3 8,37 97,7 308,1 9,04 85,7

335 9,49 98,8 336,0 8,09 98,7 330,0 6,41 83,6

359 10,90 98,5 359,4 8,81 98,0 - - -

383,5 10,60 93,5 383,8 9,04 96,2 - - -

407 9,90 90,4 407,8 8,20 96,5 - - -

432 9,90 79,8 432,6 7,16 84,1 - - -

- - - 456,0 7,83 50,0 - - -

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