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Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
Faculdade de Biociências
Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
GUSTAVO PIMENTEL DUTRA
ESTUDO ASSOCIATIVO ENTRE A ESQUIZOFRENIA E O
POLIMORFISMO G22A NO GENE DA ADENOSINA DEAMINASE (ADA)
Porto Alegre/2008
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2
GUSTAVO PIMENTEL DUTRA
(Farmacêutico-Bioquímico)
ESTUDO ASSOCIATIVO ENTRE A ESQUIZOFRENIA E O
POLIMORFISMO G22A NO GENE DA ADENOSINA DEAMINASE (ADA)
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Biologia Celular e
Molecular, da Faculdade de Biociências, da
Pontifícia Universidade Católica do Rio
Grande do Sul, como requisito parcial para
a obtenção do grau de Mestre em Biologia
Celular e Molecular, sob a orientação do
Dr. Maurício Reis Bogo e a co-orientação
do Dr. Diogo Rizzato Lara.
Porto Alegre (RS)
Maio de 2008
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3
PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA
DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E
MOLECULAR
ESTUDO ASSOCIATIVO ENTRE A ESQUIZOFRENIA E O
POLIMORFISMO G22A NO GENE DA ADENOSINA DEAMINASE (ADA)
GUSTAVO PIMENTEL DUTRA
ORIENTADOR: MAURÍCIO REIS BOGO
CO-ORIENTADOR: DIOGO LARA
Porto Alegre (RS)
Maio de 2008
4
AGRADECIMENTOS
Aos Doutores Diogo Rizzato Lara e Maurício
Reis Bogo pela qualificada e presente orientação
desta dissertação.
Aos demais professores e funcionários da
Faculdade de Biociências da PUCRS.
A todos os colegas do Centro de Biologia
Genômica e Molecular pela ajuda oferecida para
desenvolver este projeto.
A Josiane Brandinelli e a Doutora
Jacquelini Piccolli pela contribuição no
desenvolvimento das técnicas e cálculos
estatísticos.
E aos meus Pais pela força,
incentivo, compreensão e sacrifício
despendidos em mais essa etapa da
minha vida.
5
SUMÁRIO
1 REFERENCIAL TEÓRICO..............................................................9
1.1 Esquizofrenia..........................................................................9
1.1.1 História.............................................................................9
1.1.2 Características................................................................10
1.1.3 Epidemiologia..................................................................11
1.1.4 Etiologia..........................................................................12
1.1.4.1 Bases Biológicas.....................................................13
1.1.4.2 Neurodesenvolvimento.............................................13
1.1.4.3 Genética.................................................................15
1.1.4.4 Fatores de risco psicossociais..................................16
1.1.5 Tratamento......................................................................17
1.2 Hipótese Purinérgica..............................................................18
1.2.1 Alopurinol e a Esquizofrenia.............................................21
1.2.2 A adenosina no Neurodesenvolvimento..............................24
1.2.3 Adenosina Deaminase......................................................27
1.3 Outros genes estudados na Esquizofrenia................................29
1.4 OBJETIVOS..........................................................................30
2 ARTIGO CIENTÍFICO...................................................................31
6
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS...........................................................42
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................44
ANEXOS........................................................................................54
7
ESTUDO ASSOCIATIVO ENTRE A ESQUIZOFRENIA E O
POLIMORFISMO G22A NO GENE DA ADENOSINA DEAMINASE (ADA)
Pós-graduando: Gustavo Pimentel Dutra
Orientador: Prof. Doutor Maurício Reis Bogo
1
Co-Orientador: Prof. Doutor Diogo Rizzato Lara
1
1
Faculdade de Biociência da PUCRS
RESUMO
O sistema purinérgico, especialmente a adenosina, pode
desempenhar um papel na patofisiologia da esquizofrenia. A ativação
dos receptores de adenosina A1 inibe a liberação de vários
neurotransmissores como o glutamato, a dopamina, a serotonina e a
acetilcolina, e diminui a atividade neuronal pela hiperpolarização pós-
sináptica. A adenosina (ADA) participa no metabolismo da adenosina
convertendo-a em inosina. O polimorfismo funcional mais freqüente da
ADA (22 G→A) (ADA1 *2) exibe 20-30% menos atividade enzimática em
indivíduos com o genótipo G/A do que em indivíduos com o genótipo
G/G. Esse polimorfismo foi avaliado em 152 pacientes esquizofrênicos
e 111 controles saudáveis. Nós observamos uma diminuição
significativa na freqüência do alelo de baixa atividade ADA1 *2 em
pacientes esquizofrênicos (7 – 4,6%) em relação aos controles (13 –
17%, p= 0,032, OR= 2,6). Esses resultados sugerem que o alelo ADA1
*2 associado à baixa atividade da ADA, e conseqüentemente a altos
níveis de adenosina, é menos freqüente entre os pacientes
esquizofrênicos.
8
ABSTRACT
The purinergic system, especially adenosine, can play a role in the
pathophysiology of schizophrenia. Activation of adenosine A1R inhibits the
release of several neurotransmitters, such as glutamate, dopamine, serotonin
and acetylcholine, and decreases neuronal activity by pos-synaptic
hyperpolarization. Adenosine deaminase (ADA) paticipates in purine
metabolism by converting adenosine into inosine. The most frequent
functional polymorphism of ADA (22 G→A) (ADA1 *2) exhibits 20-30%
lower enzymatic activity in individuals with the G/A genotype than
individuals with the G/G genotype. We evaluated this polymorphism in 152
schizophrenic patients and 111 healthy controls. We observed a significant
decrease in frequency of the low-activity ADA1 *2 allele in schizophrenic
patients (7 – 4.6%) relative to controls (13 – 11.7%, p= 0.032, OR=2.6).
These results suggest that ADA1 *2 allele associated with low ADA activity,
and putatively with higher adenosine levels, is less frequent among
schizophrenic patients.
9
1 REFERENCIAL TEÓRICO
1.1 Esquizofrenia
A esquizofrenia pode ser vista como um dos principais transtornos
psiquiátricos, considerando-se a gravidade de suas manifestações
clínicas, a complexidade do tratamento e, sobretudo o impacto causado
às famílias, à sociedade e aos próprios pacientes.
1.1.1 História
A definição atual da esquizofrenia deriva das observações
clínicas do francês Benedict A. Morel (1809-1873), do alemão Emil
Kraepelin (1856-1926) e do suíço Eugen Bleuler (1857-1939). Morel
chamou de démense précose (demência precoce) a deterioração mental
ocorrida na adolescência. A principal contribuição de Kraepelin foi
diferenciar a demência precoce de Morel da psicose maníaco-depresiva
(atualmente chamada de transtorno bipolar), principalmente com
relação ao curso, sendo o da primeira deteriorante e o da segunda
10
remitente. Contudo, foi dos trabalhos de Bleuler que se originou o
termo esquizofrenia (do grego skhízô = divisão, cisma, fenda e phrenós
= inteligência, pensamento, alma) utilizado para indicar a presença de
uma cisão entre o pensamento, emoção e comportamento nos
pacientes afetados
1,2 e 3
.
1.1.2 Características
Os indivíduos com esquizofrenia demonstram ampla gama de
sintomas graves e incomuns. Na área cognitiva eles podem: a) ter
crenças bizarras sobre quem eles são e o que está acontecendo com
eles (delírios); b) apresentar um déficit sério em seu funcionamento
intelectual e suas habilidades de comunicar-se (déficit cognitivo); c) ter
alterações de sensopercepção, como ouvir, sentir, cheirar e ver coisas
que os indivíduos normais não percebem (alucinações); d) ser
incapazes de filtrar estimulações irrelevantes e assim sentir-se
inundado com estímulos (sobrecarga sensorial). Em relação ao plano
afetivo, suas respostas emocionais podem ser não-moduladas ou
grosseiramente inapropriadas para a situação. Somaticamente os
pacientes podem ficar hiperestimulados durante a fase aguda do
transtorno mas apresentam estimulação normal ou baixa durante a fase
crônica. Os sintomas motores podem variar de imobilidade prolongada
à hiperatividade e agitação e em alguns casos podem demonstrar
caretas e movimentos de dedos ou mão repetitivos ou estereotipados
4
e 6
.
11
As pessoas com esquizofrenia frequentemente passam por três
fases: a fase prodrômica, na qual o transtorno se desenvolve; a fase
ativa, na qual os sintomas são mais pronunciados e a fase residual, na
qual os sintomas estão diminuídos
4
.
Cinco tipos de esquizofrenia foram identificados: desorganizado,
paranóide, indiferenciado, catatônico e residual. Em relação ao valor
prático na resposta ao tratamento, o tipo paranóide responde melhor do
que os tipos desorganizado e catatônico. No entanto, há alguma dúvida
quanto a se eles são de fato tipos diferentes com causas diferentes
4
.
Uma distinção foi feita entre os sintomas positivos (ex.,
alucinações, delírios, transtorno de pensamento) e sintomas negativos
(ex., humor não modulado, pobreza de fala, apatia). Os sintomas
negativos são observados com mais freqüência em homens do que em
mulheres e são mais estáveis do que os sintomas positivos
4 e 7
.
1.1.3 Epidemiologia
A esquizofrenia afeta entre 0,5 e 1,5% da população adulta
mundial. A incidência é comparável em todas as sociedades, estando
na faixa de 0,5 a 5 em cada 10.000 pessoas por ano
1
. Em estudo
recente, que revisou publicações desde 1965 até 2002 de 46 países,
concluiu-se que apesar de existir variações substanciais entre diversos
locais, foi encontrada uma prevalência de esquizofrenia de 4 a 7 por
1,000
5
. Além disso, países em desenvolvimento têm uma baixa
prevalência. Em relação à localização rural e urbana, a incidência de
esquizofrenia na população urbana é mais alta. Nestes estudos também
12
foi comparada a prevalência desta doença entre os imigrantes e os
nativos, sendo que foi encontrada uma maior prevalência entre os
imigrantes
5 e 8
.
McGrath et al. (2005) não encontraram diferença significativa na
prevalência da esquizofrenia entre homens e mulheres (F
1,72
=0.68 e
p=0.41)
5
. Habitualmente, a esquizofrenia se manifesta durante a
adolescência ou início da idade adulta (15-35 anos), com um pico de
incidência mais precoce em homens, primeira admissão hospitalar em
média aos 25 anos, do que em mulheres, que em média são internadas
pela primeira vez aos 30 anos
6 e 9
.
1.1.4 Etiologia
Apesar da exata origem não estar concluída, as evidências
indicam que a esquizofrenia é um severo transtorno do funcionamento
cerebral. As atuais evidências relativas às causas da esquizofrenia são
um mosaico: a única coisa clara é a constituição multifatorial da
esquizofrenia. Isso inclui mudanças na química cerebral, alterações
estruturais e ambientais. A origem viral e traumas encefálicos não
estão descartados
10
.
A busca da identificação dos fatores etiológicos envolve o estudo
das bases biológicas, pesquisas genéticas e de neuroimagem e
conhecimento dos fatores psicossociais.
13
1.1.4.1 Bases biológicas
Vários neurotransmissores têm sido investigados e relacionados à
esquizofrenia, dentre eles a dopamina, a serotonina a noradrenalina e
o ácido γ-amino-butírico (GABA).
A hipótese dopaminérgica evoluiu, em primeiro lugar, da
observação de que drogas que elevam os níveis de dopamina, por
exemplo, anfetamina e cocaína, podem causar psicose paranóide quase
indistinta da esquizofrenia paranóide. Em segundo lugar, todos os anti-
psicóticos capazes de tratar os sintomas psicóticos positivos são
bloqueadores dopaminérgicos, particularmente dos receptores D2
localizados na via dopaminérgica mesolímbica, que se projeta da área
tegmental ventral do mesencéfalo para o nucleus accumbens
6
.
A serotonina despertou grande interesse desde que se observou
que os antipsicóticos atípicos (ex., clozapina e risperidona) têm
potentes atividades serotoninérgicas. Especificamente, um
antagonismo no receptor de serotonina tipo 2 tem sido relacionado à
redução de sintomas, principalmente negativos, e prevenção contra o
desenvolvimento de transtornos dos movimentos relacionados ao
antagonismo D2
1
.
1.1.4.2 Neurodesenvolvimento
Esta hipótese é baseada na demonstração de distúrbios de
comportamento e cognitivos na infância e adolescência que são
eventualmente diagnosticados em esquizofrênicos
11
. A ausência de
14
marcadas mudanças neurodegenerativas em cérebros de
esquizofrênicos junto com evidencias sugestivas de mal-
desenvolvimento cortical são consistentes com esta hipótese.
De acordo com esta hipótese, a etiologia da esquizofrenia pode
envolver processos patológicos os quais iniciam in útero ou perinatal e
continuam até o cérebro se aproximar de seu estado anatômico adulto
resultando numa extensiva perda neuronal e poda sináptica durante o
inicio e final da adolescência. Propõe-se que essas anormalidades no
neurodesenvolvimento levam a ativação de circuitos neurais
patológicos durante a adolescência ou inicio da fase adulta, talvez
devido a estresse severo, desencadeando sintomas positivos,
negativos ou ambos. O surgimento de evidências de mal-
desenvolvimento cortical na esquizofrenia e o desenvolvimento de
vários modelos animais, os quais são baseados em lesões neonatais
que produzem anormalidades comportamentais ou sensibilidade
alterada a drogas dopaminérgicas somente em animais adolescentes e
adultos
12
, tem feito uma ligação entre o mal-desenvolvimento e a
esquizofrenia mais sustentável.
Um achado consistente na esquizofrenia é o aumento ventricular
cerebral
13
. Um grande número de estudos com tomografia
computadorizada e ressonância magnética indica aumento ventricular
lateral e terceiro e uma dilatação das fissuras corticais e sulcos.
Gêmeos monozigóticos (MZ) afetados com esquizofrenia possuem
grandes ventrículos quando comparados com gêmeos não afetados.
Estas descobertas não são específicas para a esquizofrenia, porém,
15
elas também são encontradas na mesma extensão em maníaco-
depressivos.
1.1.4.3 Genética
A esquizofrenia possui um modo complexo de herança e
variabilidade de expressão. Pesquisas com adoção, gêmeos e estudos
de famílias por volta de 1960 estabeleceram que a vulnerabilidade para
o desenvolvimento de esquizofrenia é em grande parte genético. O que
é herdado é um aumento do risco de vir a desenvolver esquizofrenia ao
invés de um gene ou genes que predizem a ocorrência da
esquizofrenia. Assim, cerca de 50% de gêmeos monozigotos (MZ) são
concordantes para esquizofrenia comparados com menos de 20% dos
gêmeos dizigotos (DZ), usando psicose como fenótipo. Desta forma fica
claro que o ambiente bem como os fatores genéticos são importantes
no desenvolvimento desta desordem
14
.
A alta taxa de discordância entre gêmeos MZ indica que o que é
herdado é uma predisposição, mas não uma certeza de
desenvolvimento da esquizofrenia. Parentes em primeiro grau
apresentam uma chance de desenvolver esquizofrenia de cerca de 10%
se um parente ou um irmão (ã) tem esquizofrenia e 45 a 50% para um
filho (a) de dois pais esquizofrênicos. Em segundo e terceiro grau a
chance cai para 3,3% e 2,4%, respectivamente. Além disso, estudos de
adoção mostram uma prevalência de 9,4% em filhos adotados de pais
esquizofrênicos e uma prevalência de 1,2% em adotados controle
14
.
16
A distribuição da esquizofrenia nas famílias indica uma herança
complexa já que o risco para parentes diminui acentuadamente
conforme a distancia de parentesco. Estudos de extensas genealogias
com esquizofrenias de diversas origens têm descartado a hipótese de
um único gene dominante como causa da doença na maioria dos casos.
Entretanto, pode haver uma pequena proporção de casos os quais um
gene, agindo sozinho ou com outros múltiplos genes de pequena ação
e fatores ambientais, que leva a vulnerabilidade de desenvolvimento da
esquizofrenia. É provável que efeitos aditivos de vários genes de efeito
modesto, chamado de herança oligogênica, ou muitos genes de efeito
pequeno, chamado de herança poligênica, sejam a base para a
vulnerabilidade
15
.
1.1.4.4 Fatores de risco psicossociais
Processos sociais potencialmente desorganizadores, tais como
rápida urbanização e industrialização assim como mudanças
econômicas e sociais profundas, parecem estar ligados ao maior risco
de desenvolvimento de esquizofrenia, principalmente ao momento de
início e severidade da doença. Outros possíveis fatores de risco são os
microssociais, tais como processos familiares
1
e uso de substâncias
psicoativas, como a maconha
16
.
17
1.1.5 Tratamento
O tratamento que oferece melhores resultados baseia-se na
utilização de medicamentos associados a medidas psicossociais como,
por exemplo, psicoterapia, terapia ocupacional e grupos terapêuticos.
No entanto, o uso de antipsicóticos é parcialmente eficaz, mas
indispensável no tratamento em todas as fases da esquizofrenia, tanto
na aguda quanto no período de manutenção, apesar de não ser
curativa.
O tratamento da esquizofrenia com os antipsicóticos convencionais
melhora o quadro de 60% a 80% dos pacientes. Entretanto, um
percentual expressivo destes pacientes, 20% a 40%, não respondem a
estes antipsicóticos, mesmo em doses elevadas sendo considerados
um “grupo de pacientes ‘resistentes’ à terapia neuroléptica que
apresenta alta taxa de morbimortalidade, além de elevado custo social
e familiar”
17
.
Como os modelos clássicos para a esquizofrenia parecem ter
chegado ao seu limite do ponto de vista terapêutico, o estudo de novos
modelos também deve contribuir para a compreensão da doença e para
o desenvolvimento de tratamentos mais eficientes. É provável que os
conhecimentos das alterações genéticas relacionadas à esquizofrenia
possam nortear tratamentos mais eficazes em relação aos sintomas e
ao curso da doença.
18
1.2 Hipótese Purinérgica
Vários modelos têm sido propostos para explicar as bases
neurobiológicas da esquizofrenia. Estes modelos relacionam-se com os
sistemas dopaminérgico, glutamatérgico, serotoninérgico, colinérgico
ou GABAérgico
18
.
O sistema purinérgico usualmente relaciona-se aos nucleotídeos
da adenina ATP, ADP e AMP e ao nucleosídeo adenosina, o qual
possui vários papéis a parte do metabolismo energético. Os
nucleotídeos da guanina e o nucleosídeo guanosina também são
considerados parte deste sistema
18
.
O papel do ATP como um neurotransmissor excitatório, central e
periférico, é atualmente bem documentado
19
. ATP é armazenado no
botão pré-sináptico e liberado para exercer sua ação nos chamados
receptores P2, os quais são classificados como ionotrópicos (P2X) e
metabotrópicos (P2Y). Os receptores ionotrópicos mediam o fluxo de
Ca
2+
, Na
+
e K
+
, enquanto que os receptores metabotrópicos, via
proteínas G, ativam segundo mensageiros. Após o ATP ser liberado das
vesículas na fenda sináptica, ecto-nucleotidases tais como as ecto-
NTPDases a as ecto-5’-nucleotidases promovem a hidrólise do
nucleotídeo até adenosina (Fig. 1)
20
. A adenosina ativa o receptor
chamado P1, os quais são classificados como A1, A2a, A2b e A3
19 e 21
.
Os receptores A1 são amplamente distribuídos no CNS e tem-se
demonstrado que diminuem a excitabilidade neuronal e inibem a
atividade sináptica e a liberação de vários neurotransmissores, tais
como dopamina, glutamato, serotonina, noradrenalina e acetilcolina. Os
19
receptores A2a estão concentrados em áreas ricas em dopamina,
modulando a atividade dopaminérgica. Estes receptores estão
presentes também no hipocampo e córtex cerebral. Receptores A2b
não são bem caracterizados, mas tem sido sugerida sua interação com
mediadores inflamatórios, como a interleucina-6. Similarmente, os
receptores A3 também têm sido relacionados à inflamação,
especialmente nos pulmões, mas ainda não estão bem caracterizados
também. A cafeína e a teofilina são os antagonistas clássicos não
seletivos A1-A2 de adenosina
22
.
Fig. 1. Sistema purinérgico e fontes de adenosina extracelular (Fonte: DR Lara et
al. 2006).
20
Em relação à dopamina, o modelo de esquizofrenia é baseado na
ação correlacionada dos antagonistas dos receptores D2
23
. Entretanto,
os receptores de dopamina não parecem ser primariamente afetados na
esquizofrenia. Neste contexto, Ferré e colegas
24
têm caracterizado
interações diretas entre os receptores A2a/D2 e A1/D1 os quais levam
a mudança na afinidade dos receptores dopaminérgicos na sua união
com proteínas G. Por exemplo, o agonista A2a CGS 21680 reduz a
afinidade do receptor D2 por agonistas de dopamina e inibe o aumento
da atividade motora produzida pelos agonistas D2. Desta forma, é
razoável sugerir que a alteração do metabolismo purinérgico,
resultando numa concentração reduzida de adenosina extracelular,
pode levar a um estado hiperdopaminérgico, ambos pelo aumento da
sensibilidade do receptor e possivelmente pela redução da inibição
mediada pelo receptor A1
25
. De fato, o aumento da liberação de
dopamina foi demonstrado na esquizofrenia
26 e 27
.
O glutamato, principal neurotransmissor excitatório no SNC, age
nos receptores ionotrópicos (NMDA, AMPA e kainato) e metobotrópico
(mGlu)
28 e 29
. Além dos bem documentados papéis em vários
processos fisiológicos, tais como aprendizagem e memória, a
hiperativação do sistema glutamatérgico leva a excitotoxicidade
28
. Em
relação à esquizofrenia, antagonistas dos receptores MNDA
(fenciclidina, ketamina e MK-801) são hábeis para reproduzir sintomas
positivos, negativos e cognitivos
28 e 29
. Além disso, antagonistas de
NMDA também estimulam a liberação de glutamato, o qual levaria a
superestimulação de outros subtipos de receptores de glutamato
30
. A
adenosina tem sido bem caracterizada como um modulador endógeno
21
da atividade glutamatérgica. Adenosina inibe a liberação de glutamato
e também a ação pós-sináptica dos neurotransmissores excitatórios a
partir da hiperpolarização neuronal via receptores A1
54
. Também, a
ativação de receptores A1 pode inibir a função dos receptores MNDA
independentemente de sua habilidade de hiperpolarizar neurônios
31 e
61
.
Comportamentalmente, estudos pré-clínicos mostram que
análogos da adenosina são anticonvulsivantes, ansiolíticos,
sedativos
19
, antiagressivos
36
, além de antipsicóticos
24
.
Sendo assim, recentemente foi proposto um modelo purinérgico
onde a atividade adenosinérgica estaria deficiente na esquizofrenia e
haveria uma possível relação entre a esquizofrenia e o papel da
adenosina
18, 37 e 38
.
1.2.1 O Alopurinol e a Esquizofrenia
Alopurinol é uma droga conhecida, inibidora da enzima xantina
oxidase, usada rotineiramente no tratamento de hiperuricemia e gota.
Entretanto, estudos prévios e observações clínicas têm sugerido seu
potencial de uso no tratamento de epilepsia refratária
39
, mania
40
e
comportamento agressivo em pacientes com desordens neurológicas
41
e demência
42
. Estudos recentes têm demonstrado que o alopurinol
pode ter um importante papel como adjuvante no tratamento da
esquizofrenia. Brunstein e colegas (2005)
43
demonstraram em seu
estudo, com pacientes moderadamente refratários, que o alopurinol foi
22
bem tolerado e produziu melhora significativa (mais de 20%) na Escala
da Síndrome Positiva e Negativa (PANSS), particularmente para
sintomas positivos quando administrado como adjuvante.
Concordantemente, Akhondzadeh e colegas (2005)
44
demonstraram
que a combinação de alopurinol com o antipsicótico haloperidol,
mostrou significante superioridade quando comparado com o
tratamento somente com haloperidol para os sintomas positivos,
sintomas psicopatológicos gerais bem como para a Escala da Síndrome
Positiva e Negativa (PANSS) total.
O primeiro relato de tratamento de sintomas psiquiátricos com
alopurinol foi em pacientes neurológicos com comportamento agressivo
refratário
41
. A razão foi que a síndrome de Lesch-Nyhan, que é uma
doença neurológica inata da recuperação do déficit de purinas, leva a
um aumento da degradação de purinas, sendo associado com um
severo comportamento agressivo e retardo mental. Já que o alopurinol
inibe a enzima xantina oxidase, que é o último passo na degradação da
purina para ácido úrico, a recuperação de purina seria aumentada e
produziria um efeito anti-agressivo. No caso da esquizofrenia, um
déficit na atividade da adenosina foi proposta como contribuinte da
patofisiologia da esquizofrenia
18 e 45
, e o aumento da atividade da
adenosina tem sido sugerido como um alvo para intervenção
terapêutica
24
. A adenosina é um neuromodulador do sistema purinégico
com ações principalmente inibitórias no sistema nervoso central
19
através de receptores A1 amplamente espalhados e receptores
mesolímbicos estriatal A2A, os quais são co-localizados com
23
receptores D2
24
. Agonista dos receptores A1 e A2A têm um claro perfil
antipisicótico em modelos dopaminérgicos e glutamatérgicos
24,46 e 47
.
Neste contexto, alopurinol é utilizado para aumentar a
disponibilidade de purinas pela inibição da enzima xantina oxidase, a
qual converte hipoxantina e xantina em ácido úrico. O acúmulo de
hipoxantina e xantina podem favorecer a enzima hipoxantina-guanina
fosforibosiltransferase (HGPRT), que é responsável pela recuperação
de purina
48
, possibilitando um aumento nos níveis do neuromodulador
adenosina
39,41 e 49
(Fig. 2).
Fig. 2. Representação esquemática do metabolismo de purina do ATP ao ácido
úrico (Fonte: DR Lara et al. 2006).
Os resultados destes estudos sugerem que alguns aspectos da
esquizofrenia podem ser coerentes com um déficit na atividade
adenosinérgica e alterações no sistema purinérgico, dando sustentação
à hipótese purinérgica.
24
1.2.2 A Adenosina no Neurodesenvolvimento
De acordo com a hipótese do neurodesenvolvimento da
esquizofrenia, uma alteração do desenvolvimento normal do cérebro
particularmente na segunda metade da gestação para talvez o primeiro
ano de vida pode levar a modificações traduzidas em alterações
comportamentais e neuropsicológicas que se tornam mais evidentes na
adolescência
49
. Vários mecanismos têm sido sugeridos como hipóxia e
infecções virais
51
. Estudos de neuroimagem têm mostrado,
repetidamente, ventriculomegalia e redução do volume cerebral já no
primeiro episódio psicótico
10,13 e 52
.
Todo dano levando a um aumento do turn-over do ATP como
hipóxia, infecções e trauma eventualmente aumentam os níveis de
adenosina extracelular
53 e 54
. Estudos prévios têm demonstrado que o
aumento dos níveis de adenosina durante o início do desenvolvimento
cerebral pode ter conseqüências importantes. Turner e colegas (2002)
demonstraram que a administração de agonistas A1R no início do
período pós-natal leva ao aumento ventricular e alterações na massa
cinzenta e branca. A alteração histopatológica mais proeminente foi a
diminuição do número e do volume dos axônios, o qual é acompanhado
de uma redução de ~50% na densidade de A1R
55
. Esta foi a primeira
evidência do efeito da neurotoxicidade da adenosina in vivo no cérebro
imaturo, a qual contrasta com o seu papel neuroprotetor no cérebro
maduro
38
. De grande importância, camundongos sem A1R foram
totalmente protegidos contra o aumento no volume ventricular e
25
anormalidades na massa branca resultantes da hipóxia durante o início
do período pós-natal
56
. Camundongos heterozigotos para A1R
submetidos à hipóxia neonatal, apresentaram alterações intermediárias
quando comparados a camundongos do tipo selvagem. Além disso,
camundongos sem adenosina deaminase, uma enzima envolvida na
degradação da adenosina, tiveram os níveis de adenosina aumentados
oito vezes e o tamanho dos ventrículos duas vezes
56
. Estes resultados
sugerem, fortemente, que em cérebros imaturos, a ação da adenosina
sob os A1R é suficiente e necessária para neurotoxicidade induzida por
hipóxia. O efeito tóxico pré ou peri-natal da adenosina poderia ser
ativado por alguma situação levando a um desequilíbrio energético,
quebra do ATP e conseqüente liberação de adenosina
38
.
Interessantemente, a neurotoxicidade da adenosina em cérebros
imaturos afeta principalmente axônios, o que está de acordo com os
achados na esquizofrenia sobre a aumentada densidade neuronal e
reduzida arborização
57
.
Evidências recentes sugerem que, no mínimo em casos
selecionados, há um aumento na perda cerebral em pacientes
esquizofrênicos
52, 58 e 59
. Como a perda é de neuropilos inibitórios com
a neurotoxicidade da adenosina no início do desenvolvimento cerebral,
isto poderia resultar uma predominância relativa da atividade
excitatória do glutamato. A reduzida atividade da adenosina, mediada
por A1R, pode aumentar a vulnerabilidade cerebral ao dano na
maturidade pela alteração entre o balanço protetor da adenosina e as
ações excitotóxicas do glutamato
60
. Isto é sustentado pelo bem
documentado papel da adenosina como um agente endógeno
26
neuroprotetor demonstrado pelas lesões causadas pelos antagonistas
do A1R
53 e 61
e a aumentada suscetibilidade de camundongos sem A1R
à hipóxia em cérebro maduro. Também, camundongos sem A1R
demonstraram desmielinização, injúria axonal e desfecho neurológico
ruim em modelos animais de inflamação cerebral
62
. Assim, o modelo
da adenosina sugere um mecanismo bioquímico único que é compatível
com o modelo proposto “two-hit” por Shenton et al., (2001): interrupção
no início do desenvolvimento cerebral (primeiro “hit” – neurotoxicidade
mediada pela adenosina levando a diminuição na densidade dos A1R) e
“poda” sináptica aberrante ou aumentada neurodegeneração durante a
última maturação cerebral (segundo “hit” – reflexo da neuromodulação
deficiente em adenosina nas sinapses maduras)
52
.
A transição do papel neurotóxico para neuroprotetor da adenosina
e a ontogenia da função inibitória da adenosina ainda não foi bem
caracterizada durante o período da infância para a maioridade.
Contudo, crianças parecem ser menos suscetíveis aos efeitos
estimuladores da cafeína do que adultos
63
. Em ratos, a cafeína
estimula a atividade locomotora em adultos, mas não em jovens
64
. A
mudança na resposta a xantinas pode estar relacionada ao aumento na
densidade de ambos receptores A1 e A2a até quatro semanas de idade
65, 66 e 67
, que é equivalente ao início da puberdade em humanos. Já os
efeitos da cafeína em baixas doses são atribuídos principalmente ao
bloqueio dos receptores A2a e sua interação com os receptores D2
68
.
Esta interação pode contribuir para o aparecimento dos sintomas
psicóticos no final da adolescência e início da maioridade. Ao todo,
esses achados podem correlacionar o início dos sintomas da
27
esquizofrenia no final da adolescência e início da maioridade quando a
ação inibitória da adenosina se torna mais importante
38
.
1.2.3 Adenosina Deaminase (ADA)
A enzima adenosina deaminase (ADA) tem sido objeto de
considerável interesse devido ao seu papel na manutenção dos níveis
de adenosina, intra e extracelular, catalisando sua deaminação à
inosina. Além de sua localização intracelular clássica, a ADA também
está presente como uma ecto-enzima (Ecto-ADA) na superfície de
muitos tipos celulares incluindo linfócitos e neurônios
69
. Na superfície
neuronal a ADA está ligada aos receptores de adenosina A1 (A1R), que
podem ser importantes na regulação local da neurotransmissão de
adenosina no SNC
70
.
O gene da ADA foi identificado no braço longo do cromossomo 20
71
. Por meio de estudos de dosagem e pelo estudo de um paciente com
deleção intersticial 20q, o gene da ADA foi encontrado mais
precisamente na região da banda 20q13.11
72 e 73
. O produto do gene
ADA1 consiste de 363 aminoácidos e há um alto grau de conservação
na seqüência de aminoácidos entre as espécies
74 e 75
. O produto de 41
kDa do gene ADA1 pode ser facilmente estudado em eritrócitos.
Hischhorn et al. (1994) encontraram que uma substituição Asp8Asn é
responsável por um polimorfismo genético. De fato, a substituição de
um Asn neutro por um Asp aniônico é consistente com a menor
migração eletroforética anodal das bandas de proteína correspondentes
ao fenótipo da chamada ADA2
76
. Entretanto, atualmente este
28
polimorfismo é frequentemente referido como ADA1*2, ou seja, essa é
uma aloenzima polimórfica da ADA1
77
. Em publicação recente Zavialov
e Engström (2005) caracterizaram ADA2 como uma isoenzima da ADA1
pertencente a uma nova família de fatores de crescimento com
atividade adenosina deaminase (ADGF – ADA-related growth factors)
78
.
Mais de 30 variantes alélicas da ADA são atualmente listadas no
banco de dados Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM)
(accession nº 608958). Entretanto, muitas destas variantes
representam alelos não funcionais. O alelo mais freqüente, que é
assintomático em portadores heterozigotos, é resultante da transição
de G para A no nucleotídeo 22 do exon 1 (22G→A)
79
. As seguintes
freqüências genotípicas ocorrem em uma população caucasiana
saudável: G/G, 88-92%; G/A, 8-12%; e A/A, < 1%
80 e 81
. Foi
demonstrado que indivíduos com o genótipo G/A exibem uma atividade
enzimática 20 – 30% menor, em eritrócitos e leucócitos, do que
indivíduos com o genótipo G/G
82
. Foi sugerido que a baixa atividade
da ADA neste polimorfismo, e o conseqüente aumento nos níveis de
adenosina extracelular, possa estar associada a doenças como
imunodeficiência combinada (ADA-SCID)
83
, asma atópica
78
, aborto
espontâneo recorrente
84
, autismo
81
, depressão
85
e retardo mental
leve
77
.
29
1.3 Outros genes estudados na esquizofrenia
A pesquisa de lócus cromossômicos e genes associados com a
esquizofrenia é bastante complexa, já que se trata de uma doença
poligênica ou oligogênica em que a influência de um único gene na
susceptibilidade da doença é relativamente pequena
86
. Atualmente,
análises de ligação envolvendo a pesquisa de regiões cromossômicas
específicas implicadas na suscetibilidade à esquizofrenia têm sido
confusas pela dificuldade de reprodução dos resultados assim como a
obtenção freqüente de resultados contraditórios. Porém, algumas
descobertas têm revelado grande consistência a respeito de suposta
suscetibilidade de determinados lócus. Em uma classificação baseada
numa varredura genômica, Lewis e colegas (2003)
87
concluíram que os
dados favoreciam a ligação da região 2q e também sustentavam a
evidência de suscetibilidade dos lócus nas seguintes regiões: 5q, 3p,
11q, 6p, 1q, 8p, 22q, 20q e 14p. Essas descobertas levaram ao
mapeamento de várias regiões ligadas e a identificação de genes
específicos os quais conferem risco ao desenvolvimento de
esquizofrenia. Vários desses genes são estudados atualmente como:
neuroregulina 1 (NRG1 - 8p21-22p), regulador da sinalização da
proteína-G 4 (RGS4 – 1q21-22q), dysbindin (DTNBP1 – 6p22.3),
catecol-o-metiltransferase (COMT – 22q11), prolina dehidrogenase
(PODH – 22q11) e disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1 – 1q42)
86
.
30
1.4 OBJETIVOS
A partir de amostras de DNA, foi investigada a possível associação
entre o polimorfismo G22A na seqüência de DNA no gene que codifica
a enzima adenosina deaminase e a esquizofrenia.
31
2 ARTIGO CIENTÍFICO
Artigo científico submetido à revista Schizophrenia Research.
Lower Frequency of the adenosine deaminase
polymorphism (ADA1 *2) in Schizophrenic Patients.
Dutra G
a
, Ottoni G
b
, Lara DR
a
, Bogo MR
a,*
a
Faculdade de Biociências da PUCRS, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil.
b
Departamento de Bioquímica da UFRGS, Porto Alegre, Rio Grande do Sul,
Brasil.
32
Abstract
The purinergic system, especially adenosine, can play a role in the
pathophysiology of schizophrenia. Activation of adenosine A1R inhibits the
release of several neurotransmitters, such as glutamate, dopamine, serotonin
and acetylcholine, and decreases neuronal activity by pos-synaptic
hyperpolarization. Adenosine deaminase (ADA) paticipates in purine
metabolism by converting adenosine into inosine. The most frequent
functional polymorphism of ADA (22 G→A) (ADA1 *2) exhibits 20-30%
lower enzymatic activity in individuals with the G/A genotype than
individuals with the G/G genotype. We evaluated this polymorphism in 152
schizophrenic patients and 111 healthy controls. We observed a significant
decrease in frequency of the low-activity ADA1 *2 allele in schizophrenic
patients (7 – 4.6%) relative to controls (13 – 11.7%, p= 0.032, OR=2.6).
These results suggest that ADA1 *2 allele associated with low ADA activity,
and putatively with higher adenosine levels, is less frequent among
schizophrenic patients.
Key words: polymorphism, adenosine, adenosine deaminase, schizophrenia.
*Corresponding author: Faculdade de Biociências, Pontifícia Universidade Católica do Rio
Grande do Sul . Av. Ipiranga 6610, Partenon, CEP. 90.610-000, Porto Alegre, RS, Brazil
E-mail addres: [email protected]
33
1 Introduction
Schizophrenia is a severe psychiatric illness and its pathophysiology
remains puzzling. Many neurochemical hypotheses have been suggested
related to dopaminergic, serotonergic, GABAergic, cholinergic and
glutamatergic neurotransmission systems. We have proposed that the
purinergic system, specifically a deficit in adenosinergic activity, can play a
role in schizophrenia, especially because this system modulates most
neurotransmitter systems (Lara and Souza, 2000, Lara et al, 2006)
The purinergic system comprises two main effectors, namely the
neuromodulator adenosine acting on A1, A2a, A2b and A3 receptors
(Fredholm et al. 2005), and the nucleotide ATP, acting on purinergic P2X and
P2Y receptors (Ralevick and Burnstock, 1998). After ATP is released in the
synaptic cleft from vesicles, ecto-nucleotidases promote nucleotide hydrolysis
down to adenosine (Zimmermann, 1996). Activation of adenosine A1R
inhibits the release of several neurotransmitters, such as glutamate, dopamine,
serotonin and acetylcholine, and decreases neuronal activity by post-synaptic
hyperpolarization (Dunwiddie and Masino, 2001). These neuromodulatory
actions under physiological conditions can be separated from homeostatic
roles under stressful or pathophysiological conditions (Cunha, 2001), when
adenosine formed from intracellular ATP breakdown is released and
attenuates excitotoxicity by glutamate. Due to the above mentioned,
adenosine is considered an endogenous anticonvulsant and neuroprotective
agent. Accordingly, pre-clinical studies show that administration of A1R
agonists exerts anticonvulsant, neuroprotective, anxiolytic, sedative
(Dunwiddie and Masino, 2001; Ralevic and Burnstock, 1998), anti-aggressive
(Ushijima et al., 1984), as well as antipsychotic-like actions (Ferre, 1997;
Kafka and Cobertt, 1996; Sills et al., 1999). On the other hand, Turner et al.
(2002b) have shown that administration of an A1R agonist in the early
postnatal periods leads to ventricular enlargement and diffuse gray and white
matter alterations. The most prominent histopathological alteration was
decreased axonal number and volume, which is accompanied by ~50%
reduction in A1R. This was the first evidence for an in vivo neurotoxic effect
34
of adenosine in the immature brain, which contrasts with its neuroprotective
role in the mature brain.
A2aR and D2R are co-localized in GABAergic striatopallidal neurons
and form functional heteromeric complexes, with opposing actions via
coupling with G proteins (Ferre, 1997; Hillion et al., 2002). Activation of
A2aR decreases the affinity for D2 receptor antagonists (Ferre, 1997) and
A2aR knockout mice present increased aggressiveness, anxiety and
hypoalgesia (Ledent et al., 1997) and reduced behavioral effects with
amphetamine and cocaine administration (Chen et al., 2000).
Adenosine Deaminase (ADA) participates in purine metabolism by
converting either adenosine or 2’-deoxyadenosine into inosine or 2’-
deoxyinosine, respectively. Further metabolization of these deaminated
nucleosides leads to hypoxantine, which can be either transformed into uric
acid by xanthine oxidase or salvaged into mononucleotides by hypoxanthine-
guanine phosphoribosyl-transferase (Mills et al., 1976). Beside its classical
intracellular localization, ADA is an ectoenzyme (Ecto-ADA) on the surface
of many cell types, including lymphocytes and neurons (Franco et al, 1996)
where it behaves as a cell adhesion molecule with an important role in the
regulation of neuronal growth and plasticity processes. The most frequent
functional polymorphism of ADA is caused by a G-to-A transition at
nucleotide 22 (coding DNA 22G→ A). This transition leads to the substitution
of asparagine for aspartic acid at codon 8 (protein Asp8Asn) of the ADA
protein (Hirschhorn et al., 1994). Individuals with the G/A genotype exhibit
20-30% lower enzymatic activity in erythrocytes and leucocytes than
individuals with the G/G genotype (Battistuzzi et al., 1981). This
polymorphism has been associated to autism (Bottini et al., 2001) and mild
mental retardation (Saccucci et al., 2006). In both studies, a high frequency
of the low-activity genotype ADA-Asn 8 (ADA-8Asn) (ADA1 *2) of
adenosine deaminase was found. This genotype was also associated with the
duration and intensity of deep sleep in healthy subjects (Retéy et al, 2005),
reinforcing the functional consequences of this polymorphism on adenosine-
mediated neuromodulation. The following genotype frequencies are expected
to occur in a healthy Caucasian population: G/G, 88-92%; G/A, 8-12%; A/A,
<1% (Persico et al., 2000; Retéy et al, 2005).
35
In this paper, we evaluated the ADA polymorphism 22 G→A (ADA1
*2) in schizophrenic patients and healthy controls.
2 Subjects and Methods
The study protocol and all experimental procedures were approved by
the national ethic committee in research on human subjects. All subjects
received a full explanation and written description of the procedures. The
investigators concluded that all subjects understood the procedures, and
written informed consent was obtained. We determined diagnoses by using
best-estimate procedures incorporating the Structured Clinical Interview for
DSM-IV Axis I Disorders (SCID-I).
Genomic DNA was extracted from 300 µL blood samples using the
“Perfect gDNA Blood Mini” (Ependorf) or “Wizard
®
Genomic Purification
Kit” (Promega). The genotypes of the ADA 22G→A were analyzed in 100 ng
of DNA with allele-specific PCR. HotStarTaq DNA polymerase (Qiagen) and
allele-specific primers were used. ADA primers were as follows: forward-G,
5’ –CCC AGA CGC CCG CCT TCG-3’; forward-A, 5’ –CCC AGA CGC CCG
CCT TCA- 3’; reverse, 5’ –GAA CTC GCC TGC AGG AGC C- 3’ (annealing
temperature, 62 ºC; 1,5 nM MgCl
2
; 1 x Q-solution) (adapted of Rétey et al.
2005). The amplification product of 152 pb was visualized with Gel Red in
U.V. illumination. Genoptype frequency was compared between cases and
controls, and the statistical significance of the associations was tested using
the chi-square test. Odds ratio with 95% confidence intervals were also
calculated to estimate the strength of the association between adenosine
deaminase genotype and schizophrenia and its statistical significance.
3 Results
The schizophrenic group consisted of 152 patients (108 males) with
mean age of 36.7 ± 10.8 years old. The control group of healthy individuals
consisted of 111 members (40 males) with mean age of 44.4 ± 15.5 years old.
Table 1 shows the distribution of ADA genotypes in schizophrenic
patients and healthy individuals. In the group of healthy individuals there was
36
a higher frequency of the ADA1 *2 polymorphism than in the schizophrenic
group (P=0.032, odds ratio 2.7; IC 95% 1.1-7.1).
4 Discussion
The frequency of ADA1 *2 allele in the control group was similar to
the values reported by others researchers (Spencer et al., 1968; Persico et al.,
2000, Rétey et al., 2005). Our results showed that ADA1 *2 variant was less
frequent in schizophrenic patients (GG 95.4% and GA 4.6%) than in the
general population (GG 88.3% and GA 11.7%). To our knowledge there is no
report on the association between ADA polymorphism and schizophrenia.
However, serum adenosine deaminase activity was found increased in
schizophrenic patients under pharmacological treatment (Brunstein et al,
2007), but it remains to be established if this increase in related to the
phenotype or due to medication.
Several indirect findings are suggestive of adenosine dysfunction in
schizophrenia (Lara et al. 2006). The psychostimulants caffeine and
theophylline are the closest pharmacological models for adenosine
hypofunction in humans since they are non-selective antagonists of A1R and
A2aR and their biological effects are attributed to the mechanism of action
(Fredholm et al., 1999). In contrast to the intermittent and relatively weak
blockade of adenosine receptors produced by low-dose caffeine intake
normally observed in humans, schizophrenia patients would have a
persistently decreased adenosinergic and, consequently, increased
dopaminergic and glutamatergic activity. Theophylline and caffeine are able
to decrease P50 sensory gating in normal volunteers, mimicking the findings
in schizophrenic patients (Ghisolfi et al, 2002, 2006) and caffeine exacerbates
symptoms of schizophrenia (Ferré, 1997). Moreover, psychostimulant effects
of caffeine are blocked by D2 receptor antagonists (Ferré, 1997; Powell et al.,
2001). Regarding the glutamatergic system, NMDA receptor antagonists
(phencyclidine, ketamine and MK-801) are able to produce the positive,
negative and cognitive symptoms of schizophrenia (Olney and Farber, 1995;
Krystal et al., 2002) possibly related to increased glutamate release. In
37
animals models of schizophrenia, A1 and A2aR agonists have been repeatedly
shown to prevent behavioral as well as neurophysiological (EEG and prepulse
inhibition) alterations induced by NMDA antagonists (Browne and Welch,
1982; Kafka and Corbett, 1996; Popoli et al., 1997; Rimondini et al., 1997;
Sills et al., 1999), indicating a potential antipsychotic effect in humans.
The polymorphism of ADA protein that changes its electrophoretic
mobility has been known since 1968, and its molecular basis (G22A,
Asp8Asn) since 1994 (Hirschhorn, 1994). It has been hypothesized that the
differences in enzymatic activity between ADA genotypes could result in
differences in immune reactivity (Bottini et al., 1981). Stubbs et al. (1982)
reported decreased ADA serum activity in 18 children with autism compared
to a group of 19 normal controls, 16 individuals with cerebral palsy and 17
individuals with intellectual impairment (F-test 0.02 when compared with
other group). A significantly increased frequency of *2 allele was observed in
a study with 118 Italian autistic children compared with 126 healthy controls
(by genoptype Asp/Asn P<0.0001; by allele Asn frequency P<0.00001)
(Bottini et al., 2001). However, Zoruglu et al. (2004) measured activities of
erythrocyte free radical scavenging enzymes, including ADA, in 27 children
with autism and 26 sex- and age-matched controls and found no differences in
ADA activity between the two groups (P = 0.52). In contrast to the previous
genetic studies, a recent study found no significant increase in the frequency
of the ADA *2 allele in cases from North America (controls: 7.2%; cases:
4.8%) (Hettinger et al., 2007). Thus, the role of ADA in autism remains
controversial. The low-activity ADA-8Asn polymorphism has been associated
with mild mental retardation showing genotype frequency with P < 0.05 and
odds ratio 2.16 (Saccucci et al., 2006). These are relevant since cognitive
problems and autistic symptoms are part of schizophrenia syndrome. Previous
studies indicate a direct role of adenosine in human sleep homeostasis
(Basheer et al, 2004), with ADA*2 variant was associated with better sleep.
Individuals with the G/A genotype (n = 13) reported fewer awakenings at
night than individuals with the G/G genotype (n = 106). Moreover,
individuals with G/A genotype showed almost twice the amount of deep,
stage-4 sleep and roughly 30 min more slow-wave sleep within the 8-h sleep
period when compared with the G/G genotype. This suggests that the ADA
38
22G→A polymorphism modulates not only the duration of slow-wave sleep
but also the intensity of sleep (Rétey et al., 2005). Unmedicated
schizophrenic patients had longer sleep onset latency, slept less and had
lower sleep efficiency (Nishino et al., 1998; Keshavan et al., 1998). These
results are in accordance with a proposal of reduced adenosine activity in
schizophrenia. The lower frequency of the ADA1 *2 allele in schizophrenics
suggests that this allele may be protective against a hypoadenosinergic state.
In conclusion, our data suggest, for the first time, that the ADA1 *2
allele associated with low ADA activity, and putatively with higher adenosine
levels, is less frequent among schizophrenic patients. This finding is in line
with the hypothesis of lower adenosinergic activity in schizophrenia, but
replication with independent and larger samples is needed.
Acknowledgement
This study was supported with grants from CNPq (National Counsel of
Technological and Scientific Development).
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41
Table 1. ADA G22A (ADA1 *2) Genotype distributions in healthy controls
and individuals with schizophrenia.
Healthy Schizophrenic
Genotype Controls Patients
GG 98 (88.3%) 145 (95.4%)
GA 13 (11.7%) * 7 (4.6%)
AA 0 0
Total 111 152
* P = 0.032
Odds Ratio: 2.7 (95% confidence interval: 1.1-7.1)
42
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Como a esquizofrenia apresenta uma base genética importante, é
necessário investigar a influência de polimorfismos em genes que
possam estar relacionados com o risco para desenvolver este
transtorno.
Alterações no sistema purinérgico, principalmente nos níveis de
adenosina, podem levar a um desequilíbrio de outros sistemas
modulados por ele (dopaminérgico, glutamatérgico, etc) bem como à
toxicidade mediada por adenosina. Estudos prévios sugerem que o
aumento dos níveis de adenosina, no início do desenvolvimento
cerebral, pode ser neurotóxico resultando em uma diminuição na
densidade de receptores A1 afetando o desenvolvimento e a
plasticidade neuronal. Além disso, estudos têm demonstrado que
agonistas dos receptores A1 produzem ventriculomegalia, uma
característica comum encontrada em pacientes esquizofrênicos em
estudos de neuroimagem. Por ouro lado, no cérebro maduro, níveis
elevados de adenosina desempenham uma função neuroprotetora
através de uma atividade neuromoduladora inibitória de outros
43
neurotransmissores. Sendo assim, fica implícita a importância do bom
funcionamento do sistema purinérgico tanto na fase de
desenvolvimento neural como no cérebro maduro onde os níveis de
adenosina terão papéis ambíguos.
A enzima adenosina deaminase é uma das responsáveis pela
manutenção dos níveis de adenosina extracelular. Portanto, um
polimorfismo funcional onde há a substituição da Asparagina pelo Ácido
Aspártico na posição 8 da proteína que leva a uma diminuição da
atividade catalítica em torno de 20-30%, provavelmente interfere nos
níveis de adenosina extracelular. De fato, esse polimorfismo já foi
associado a vários distúrbios como o autismo (aumenta o risco),
retardo mental leve (aumenta o risco) e qualidade do sono (melhora o
sono) entre outros.
No caso da esquizofrenia este polimorfismo parece estar
associado de forma diferente, ou seja, a baixa freqüência desse alelo
entre os pacientes contribui para o estabelecimento de um quadro de
hipofunção adenosinérgica. Sendo assim, a baixa freqüência do alelo
ADA-Asn8 entre os esquizofrênicos sugere que este alelo possa ser
protetor contra um estado hipoadenosinérgico.
Para concluir, os dados sugerem, pela primeira vez, que o alelo
polimórfico ADA1 *2 associado com a baixa atividade, e
consequentemente a altos níveis de adenosina, é menos freqüente
entre os pacientes esquizofrênicos. Estes dados corroboram com a
hipótese de baixa atividade adenosinérgica na esquizofrenia, mas a
replicação independente e o aumento do número de amostras é
necessário.
44
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54
ANEXOS
55
ANEXO 1. Exemplo da visualização da eletroforese em gel de agarose
2% dos genótipos homozigotos resultantes da PCR alelo específica
(visualização com Brometo de Etídio e luz ultravioleta)
MA MG 1A 1G Mpb 2A 2G 3A 3G
152 pb
Genótipos encontrados:
1> GG
2> GG
3> GG
56
ANEXO 2. Exemplo da visualização da eletroforese em gel de agarose
2% dos genótipos heterozigotos resultantes da PCR alelo específica
(visualização com Gel Red e luz ultravioleta).
MA MG 4A 4G 5A 5G
Genótipos encontrados:
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