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Universidade Federal de São Carlos
Centro de Ciências Exatas e Tecnológicas
Programa de Pós Graduação em Engenharia Química
Avaliação de fontes de carbono e condições de indução na
expressão de canacistatina em Escherichia coli BL21 (DE3)
Carolina Bellão
Orientador: Prof. Dr. Alberto Colli Badino Jr.
São Carlos – SP
2006
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Universidade Federal de São Carlos
Centro de Ciências Exatas e Tecnológicas
Programa de Pós Graduação em Engenharia Química
Avaliação de fontes de carbono e condições de indução na
expressão de canacistatina em Escherichia coli BL21 (DE3)
Carolina Bellão
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa
de Pós-graduação em Engenharia Química da
Universidade Federal de São Carlos como parte
dos requisitos necessários à obtenção do título de
Mestre em Engenharia Química, área de
concentração Pesquisa e Desenvolvimento de
Processos Químicos.
Orientador: Prof. Dr. Alberto Colli Badino Jr.
São Carlos – SP
2006
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Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da
Biblioteca Comunitária da UFSCar
B433af
Bellão, Carolina.
Avaliação de fontes de carbono e condições de indução
na expressão de canacistatina em Escherichia coli BL21
(DE3) / Carolina Bellão. -- São Carlos : UFSCar, 2006.
76 p.
Dissertação (Mestrado) -- Universidade Federal de São
Carlos, 2006.
1. Biotecnologia. 2. Canacistatina. 3. Escherichia coli. 4.
Expressão heteróloga. 5. Fontes de carbono. 6. Engenharia
genética. I. Título.
CDD: 660.6 (20
a
)
À minha mãe Angélica
Ao meu namorado Júlio
E aos meus irmãos Marta e Bruno
AGRADECIMENTOS
Aos professores Dr. Alberto Colli Badino Junior e Dr. Flávio Henrique da Silva pela
orientação neste trabalho.
À minha mãe e ao meu namorado pela paciência nos momentos difíceis.
Aos colegas do Laboratório de Engenharia Bioquímica do DEQ/UFSCar: Luciana,
Sheila, Marcel, Célia, Juliana, Daniela e Álvaro pelo companheirismo.
Aos colegas do Laboratório de Biologia Molecular do DGE/UFSCar: Cássia, Rosseli,
Viviane, Andréia, Mylene e Carol pela ajuda e pela companhia.
Ao técnico Amadeus que esteve sempre disposto a ajudar.
Às amigas Erida, Mônica, Karina e Rafa pela amizade e convivência.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq pela
bolsa concedida.
Enfim, a todos que contribuíram para o desenvolvimento deste trabalho.
Sumário
Lista de Figuras ...........................................................................................................................i
Lista de Tabelas.........................................................................................................................iv
Nomenclatura..............................................................................................................................v
Resumo......................................................................................................................................vi
Abstract.....................................................................................................................................vii
1. Introdução...............................................................................................................................1
2. Revisão Bibliográfica .............................................................................................................3
2.1. Fungicidas e biofungicidas..............................................................................................3
2.2. Inibidores de proteases ....................................................................................................4
2.3. Tecnologia do DNA recombinante..................................................................................9
2.4. Expressão de proteínas heterólogas ..............................................................................14
2.5. Condições de cultivo .....................................................................................................19
2.5.1. Ácido acético.......................................................................................................21
2.5.2. Obtenção de alta concentração celular ................................................................23
2.5.3. Síntese de proteína heteróloga.............................................................................25
3. Materiais e Métodos .............................................................................................................29
3.1. Microrganismo ..............................................................................................................29
3.2. Meios de Cultura ...........................................................................................................29
3.2.1. Meio de cultura de reativação .............................................................................29
3.2.2. Meios de cultura de inóculo ...............................................................................29
3.2.3. Meios de cultura de produção..............................................................................30
3.3. Indutores........................................................................................................................30
3.4. Métodos Analíticos........................................................................................................30
3.4.1. Determinação da concentração celular................................................................30
3.4.2. Determinação das concentrações de substratos...................................................31
3.4.3. Determinação da concentração de carboidratos totais.........................................31
3.4.4. Determinação da concentração de nitrogênio......................................................31
3.4.5. Avaliação da expressão de canacistatina.............................................................32
3.4.6. Purificação da canacistatina ................................................................................32
3.4.7. Determinação da concetração de canacistatina ...................................................33
3.5. Metodologia Experimental ...........................................................................................33
3.5.1. Cultivos em mesa incubadora rotativa ................................................................34
3.5.1.1. Etapa 1: Avaliação de diferentes fontes de carbono no crescimento de
E.coli BL21(DE3) ....................................................................................................................35
3.5.1.2. Etapa 2: Expressão de canacistatina em caldos de fermentação com
diferentes substratos – Avaliações do momento e tempo de indução ......................................36
3.5.1.3. Etapa 3: Avaliação da indução por lactose.............................................37
3.5.1.4. Etapa 4: Avaliação quantitativa da expressão de canacistatina..............38
3.5.2. Cultivos em biorreator airlift de bancada ...........................................................39
4. Resultados e Discussão ........................................................................................................42
4.1. Cultivos em mesa incubadora rotativa ..........................................................................42
4.1.1. Etapa 1: Avaliação de diferentes fontes de carbono no crescimento de E.coli
BL21(DE3) ..............................................................................................................................42
4.1.2. Etapa 2: Expressão de canacistatina em caldos de fermentação com diferentes
substratos – Avaliações do momento e tempo de indução.......................................................45
4.1.3. Etapa 3: Avaliação da indução por lactose..........................................................49
4.1.4. Etapa 4: Avaliação quantitativa da expressão de canacistatina...........................53
4.2. Cultivos em biorreator airlift ........................................................................................55
4.2.1. Etapa 1: Avaliação do crescimento celular..........................................................55
4.2.2. Etapa 2: Expressão de canacistatina ....................................................................56
5. Conclusões ...........................................................................................................................59
6. Sugestões ..............................................................................................................................61
Referências Bibliográficas .......................................................................................................62
Apêndice A ..............................................................................................................................69
Apêndice B ..............................................................................................................................73
i
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1.
Tecnologia do DNA recombinante: o DNA recombinante é
formado e inserido na célula hospedeira
11
Figura 2.2.
Mecanismo proposto para a transformação de E. coli com
uma molécula de DNA exógeno
14
Figura 2.3.
Esquema de funcionamento do operon lac. 18
Figura 3.1.
Procedimento experimental utilizado nos cultivos em mesa
incubadora rotativa
34
Figura 3.2.
Procedimento experimental utilizado nos cultivos em
biorreator airlift
40
Figura 4.1.
Curva de crescimento celular do cultivo padrão (C0_1) 42
Figura 4.2.
Curva de crescimento celular 43
Figura 4.3.
Curva de consumo de substrato 43
Figura 4.4.
Análise da expressão da canacistatina com 0,4 mM de IPTG
sob várias condições de cultivo. SDS-PAGE mostrando em
M, marcador de massa molecular e nas demais canaletas as
amostras oriundas das induções nas diferentes condições. A
seta indica a banda de aproximadamente 13 kDa relativa à
canacistatina recombinante.
48
Figura 4.5.
Gel comparativo da expressão da canacistatina com 0,4 mM
de IPTG para as diferentes fontes de carbono utilizadas. SDS-
PAGE mostrando em M, marcador de massa molecular e nas
demais canaletas as amostras oriundas das induções nas
diferentes condições. A seta indica a banda de
aproximadamente 13 kDa relativa à canacistatina
recombinante.
49
ii
Figura 4.6.
Análise da expressão da canacistatina com 0,4 mM de lactose
sob várias condições de cultivo. SDS-PAGE mostrando em
M, marcador de massa molecular e nas demais canaletas as
amostras oriundas das induções nas diferentes condições. A
seta indica a banda de aproximadamente 13 kDa relativa à
canacistatina recombinante.
50
Figura 4.7.
Atividades da galactosideo permease e β-galactosidase no
metabolismo da lactose em E. coli.
51
Figura 4.8.
Análise da expressão da canacistatina, induzido com 4 mM e
40 mM de lactose. SDS-PAGE mostrando em M, marcador
de massa molecular e nas demais canaletas as amostras
oriundas das induções nas diferentes condições. A seta indica
a banda de aproximadamente 13 kDa relativa à canacistatina
recombinante.
52
Figura 4.9.
Curva de crescimento celular para o cultivo realizado no
biorreator airlift
55
Figura 4.10.
Curva de consumo de substrato e de oxigênio dissolvido no
cultivo A! realizado no biorreator airlift
56
Figura A.1.
Relação entre a concentração celular e a densidade ótica para
o cultivo padrão (C0_1)
69
Figura A.2.
Relação entre a concentração celular e a densidade ótica para
o cultivo utilizando glicerol (C1_1)
69
Figura A.3.
Relação entre a concentração celular e a densidade ótica para
o cultivo utilizando glicose (C1_2)
70
Figura A.4.
Relação entre a concentração celular e a densidade ótica para
o cultivo utilizando frutose (C1_3)
70
Figura A.5.
Relação entre a concentração celular e a densidade ótica para
o cultivo utilizando frutose + glicose (C1_4)
70
Figura A.6.
Relação entre a concentração celular e a densidade ótica para
o cultivo utilizando galactose (C1_5)
71
Figura A.7.
Relação entre a concentração celular e a densidade ótica para
o cultivo utilizando lactose (C1_6)
71
Figura A.8.
Relação entre a concentração celular e a densidade ótica para
o cultivo utilizando sacarose (C1_7)
71
iii
Figura A.9.
Relação entre a concentração celular e a densidade ótica para
o cultivo no Airlift
72
Figura B.1.
Curva para determinação da velocidade específica máxima de
crescimento celular (µ
máx
) para o cultivo padrão (C0_1)
73
Figura B.2.
Curva para determinação dos parâmetros cinéticos de
crescimento (µ
máx
e Y
X/S
) para o cultivo utilizando glicerol
(C1_1)
73
Figura B.3.
Curva para determinação dos parâmetros cinéticos de
crescimento (µ
máx
e Y
X/S
) para o cultivo utilizando glicose
(C1_2)
74
Figura B.4.
Curva para determinação dos parâmetros cinéticos de
crescimento (µ
máx
e Y
X/S
) para o cultivo utilizando frutose
(C1_3)
74
Figura B.5.
Curva para determinação dos parâmetros cinéticos de
crescimento (µ
máx
e Y
X/S
) para o cultivo utilizando frutose +
glicose (C1_4)
74
Figura B.6.
Curva para determinação da velocidade específica máxima de
crescimento celular (µ
máx
) para o cultivo utilizando galactose
(C1_5)
75
Figura B.7.
Curva para determinação dos parâmetros cinéticos de
crescimento (µ
máx
e Y
X/S
) para o cultivo utilizando lactose
(C1_6)
75
Figura B.8.
Curva para determinação da velocidade específica máxima de
crescimento celular (µ
máx
) para o cultivo utilizando sacarose
(C1_7)
75
Figura B.9.
Curva para determinação dos parâmetros cinéticos de
crescimento (µ
máx
e Y
X/S
) para o cultivo no Airlift
76
iv
LISTA DE TABELAS
Tabela 3.1.
Cultivos realizados para obtenção de parâmetros relacionados com o
crescimento celular
35
Tabela 3.2
Condições experimentais empregadas nos cultivos realizados para
avaliação qualitativa da expressão de canacistatina com 0,4 mM de
IPTG
37
Tabela 3.3.
Condições experimentais empregadas nos cultivos induzidos com
lactose
38
Tabela 3.4.
Condições experimentais empregadas nos cultivos realizados no
biorreator
41
Tabela 4.1.
Equações de Cx em função de DO obtidas nos cultivos 44
Tabela 4.2.
Parâmetros de crescimento celular de E. coli em diferentes fontes de
carbono
45
Tabela 4.3.
Concentração de canacistatina obtida para diferentes fontes de
carbono
53
Tabela 4.4.
Massa de canacistatina produzida por custo de matéria prima (meio
de cultura)
54
Tabela 4.5.
Concentração de canacistatina obtida no cultivo realizado em
biorreator airlift
57
Tabela 4.6.
Produção especifica de canacistatina obtida nos cultivos realizados
em biorreator airlift
57
v
NOMENCLATURA
CC = canacistatina
IPTG = isopropiltio-β-d-galactosídeo, análogo de lactose sintético
CAP = proteína ativadora de genes por catabólitos
LB = meio de cultura Luria Bertani
Cs = concentração de substrato
Cx = concentração celular
µ
máx
= velocidade especifica máxima de crescimento celular
Y
X/S
= coeficiente de rendimento de substrato a células
Cs
0
= concentração de substrato inicial
Cx
0
= concentração celular inicial
DO = densidade ótica
C
N
= concentração de nitrogênio
V
HCL
= volume de ácido clorídrico
C
HCL
= concentração de ácido clorídrico
C
C
= concentração de canacistatina
OD = oxigênio dissolvido
P
Cc/x
= produção especifica de canacistatina
vi
RESUMO
A canacistatina (CC) é um inibidor competitivo e reversível de proteases, que bloqueia
a atividade proteolítica de enzimas de insetos, fungos e nematóides, prejudicando assim o
crescimento, desenvolvimento e reprodução destes organismos patogênicos. É produzida em
quantidades limitadas pela cana-de-açúcar, inviabilizando sua extração e purificação para
produção de produtos comerciais, sendo a tecnologia de DNA recombinante uma alternativa
para o aumento da sua produção. Atualmente, a CC é produzida no laboratório de Biologia
Molecular do Departamento de Genética e Evolução da UFSCar (LBM-DGE/UFSCar) por de
E. coli BL21(DE3) em mesa incubadora rotativa utilizando o meio de cultura comercial
(Circlegrow
®
) de alto custo. Com a finalidade de se produzir CC em maior escala, o presente
trabalho teve como objetivo o estudo da expressão de CC em E. coli BL21(DE3), avaliando-
se diferentes fontes de carbono, tipo de indutor e momento de indução, em mesa incubadora
rotativa no sentido de se avaliar a expressão, bem como comprovar as novas condições de
expressão em biorreator airlift de 6 L de capacidade útil. Nos ensaios em mesa incubadora
rotativa foram obtidos crescimentos celulares semelhantes quando se utilizou glicerol, glicose,
frutose e frutose + glicose, e baixo crescimento celular quando se utilizou galactose. Foi
observada uma alta expressão quando se utilizou galactose como fonte de carbono e IPTG 0,4
mM como indutor. Quando foi utilizada lactose como indutor em concentrações de 4 e 40
mM, observou-se expressão de CC apenas nos cultivos com galactose como fonte de carbono.
Foram obtidas produções volumétricas (mg/L) no máximo de 61% da concentração de CC
obtida no cultivo padrão, com exceção dos cultivos com galactose induzidos com 0,4 mM de
IPTG e 4 mM de lactose, e produção específica (mg
CC
/g
célula
) com valores superiores a 75%
do obtido no cultivo padrão. Quanto aos cultivos em biorreator airlift, expressão de CC foi
superior à do cultivo realizado em mesa incubadora rotativa utilizando glicose como fonte de
carbono, em torno de 80% da produção obtida no cultivo padrão após 1 hora de indução,
alcançando 90% na segunda hora. Em termos de produção específica, nesse cultivo obteve-se
79,9 mg
CC
/g
célula
após 2 horas de indução, cerca de 25% superior ao cultivo padrão.
vii
ABSTRACT
Canecystatin (CC) is a competitive and reversible protease inhibitor which blocks the
proteolytic enzymes activities of insets, fungus e nematodes, prejudicing thus the growth,
development and reproduction from these pathogenics organisms. CC is produced by
sugarcane, but with limited production, difficulting extraction and purification for production
of commercials products, so recombinant DNA technology is one alternative for increase of
CC production. Nowadays, CC is produced in the Molecular Biology Laboratory of the
Department of Genetic and Evolution of UFSCar (LBM-DGE/UFSCar) from E. coli
BL21(DE3) in shaker, utilizing a high cost commercial culture medium (Circlegrow
®
). With
the purpose of produce CC in higher scale, the aim of present work was the study the CC
expression in E. coli BL21(DE3), evaluating different carbon source, kind of inductor and
induction moment in shaker, as well as confirming the expression conditions in airlift
bioreactor of 6 L working volume. In the experiments carried out in shaker were obtained
similar cellular growth when utilized glycerol, glucose, fructose e fructose + glucose, and low
cellular growth when utilized galactose. It was observed high expression when galactose was
utilized as carbon source and IPTG 0,4 mM as inductor. When lactose at 4 e 40 mM was
utilized as inductor, CC expression occurred only in the culture containing galactose as
carbon source. Volumetric production (in mg/L) of CC up to 61% those from standard culture
was obtained, with exception the culture that utilized galactose induced with 0,4 mM of IPTG
and 4 mM of lactose, and specific production (mg
CC
/g
cells
) greater 75% from standard culture.
With respect of cultures in airlift bioreactor, CC expression was superior to expression culture
carried out in shaker utilizing glucose with carbon source, approximately 80% of CC
concentration obtained in the standard culture after 1 hour of induction and achieving more
than 90% in the second hour of induction. In terms of specific production, in this culture was
obtained 79,9 mg
CC
/g
cell
, value approximately 25% superior to the standard culture.
Introdução
1
1. INTRODUÇÃO
As plantas possuem vários mecanismos de defesa contra o ataque de agentes
biológicos e de estresses do ambiente, tais como liberação de produtos químicos voláteis que
atraem predadores e parasitas eliminando os insetos herbívoros, chamada de defesa indireta; e
a defesa direta, que é a liberação de produtos que atuam como veneno expulsando o inimigo
ou freando seu crescimento (Keller e Baldwin, 2001).
Os mecanismos de defesa das plantas incluem dois principais eventos: respostas
localizadas e sistêmicas. As respostas localizadas ocorrem dentro dos tecidos que estão
próximos aos organismos invasores, e ocorre uma oxidação rápida com troca iônica entre H
+
e
K
+
, fortalecendo a parede celular. As respostas sistêmicas são desencadeadas em resposta a
estímulos (Joshi et al., 1998), que envolve reações da planta ligadas à ativação de genes de
defesa para reação de hipersensibilidade (causa rápida morte das células no local de infecção,
o que impede a expansão do patógeno), resistência sistêmica adquirida e produção de lignina,
enzimas hidrolíticas e fitoalexinas (componentes antimicrobianos de baixo peso molecular
sintetizados quando as plantas são expostas a microrganismos, que atacam a parede celular do
patógeno) (Rizzardi et al., 2003).
Plantas superiores possuem lipoxigenases, enzimas que produzem hidroperóxidos de
ácidos graxos, precursores da síntese do ácido jasmônico. O ácido jasmônico possui atividade
de fitorregulação e está envolvido em processos de desenvolvimento, bem como na resposta
da planta a insetos e patógenos, induzindo a síntese de genes que expressam inibidores de
proteases (Silva et al., 2004). Os inibidores de proteases também participam no mecanismo de
defesa contra muitos insetos herbívoros, que regulam as atividades proteolíticas endógenas
em órgãos e inibem atividades catalíticas ou enzimas proteolíticas em nematóides, insetos e
fungos (Soares-Costa et al., 2002).
Muitas doenças que ocorrem em plantas são causadas por fungos patogênicos,
resultando em perdas de produção e qualidade. A cana de açúcar que tem um papel
importante na economia brasileira muitas vezes tem a sua produtividade limitada por estas
doenças. Atualmente, o combate ao ataque patogênico mais aplicado é o uso de fungicidas e
pesticidas que aumentam os custos e os problemas ambientais (Soares-Costa et al., 2002).
Uma estratégia para combater o ataque patogênico sem prejudicar o meio ambiente é o uso de
proteínas inibidoras de proteases, que bloqueiam a atividade proteolítica em insetos, fungos e
nematóides, prejudicando assim o seu crescimento, desenvolvimento e reprodução. A cana de
açúcar possui proteínas inibidoras de proteases, chamadas de canacistatinas, em seus tecidos,
Introdução
2
mas a sua produção é limitada, inviabilizando a extração e purificação para produção de
produtos comerciais, e uma alternativa para o aumento da produção é através da tecnologia de
DNA recombinante.
Microrganismos geneticamente modificados são utilizados industrialmente para a
produção de hormônios, antibióticos, enzimas e proteínas em geral. Na produção de
moléculas heterólogas, tanto a etapa de desenvolvimento da cepa que carrega o gene de
interesse como a etapa de desenvolvimento de processo de produção são importantes, e neste
sentido o estudo das condições de cultivo em reator é importante para a viabilidade do
processo (Rossi, 2001).
Muitas proteínas heterólogas são produzidas por microrganismos recombinantes,
sendo a Escherichia coli o mais utilizado nestes processos, devido ao vasto conhecimento
acumulado sobre o mesmo.
Atualmente, a canacistatina é produzida no laboratório de Biologia Molecular do
Departamento de Genética e Evolução da UFSCar (LBM-DGE/UFSCar) a partir de E. coli
BL21(DE3), sendo sua potente atividade antifúngica comprovada contra o fungo Trichoderma
reesei (Soares-Costa et al., 2002). A produção vem sendo realizada mesa incubadora rotativa
utilizando o meio de cultura comercial Circlegrow
®
, à concentração de 40 g/L e indução com
IPTG (isopropiltio-β-d-galactosídeo). Tal meio de cultura apresenta alto custo e é conhecido
por aumentar a replicação de plasmídeos em culturas de E. coli utilizando duas fontes de
carbono.
No entanto, para testes subseqüentes de aplicação da canacistatina como biofungicida
em maior escala, há a necessidade do aumento da produção, o que significa o emprego de
biorreatores, a utilização de meios de cultura eficientes e de baixo custo, e a definição das
melhores condições de indução, avaliando-se o tipo de indutor, e os melhores momento e
período de indução.
Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo o estudo da expressão de
canacistatina em E. coli BL21(DE3), avaliando-se diferentes fontes de carbono no
crescimento celular e na expressão de canacistatina, estudando o tipo de indutor (IPTG ou
lactose) e o estudo do momento e tempo de indução, em mesa incubadora rotativa no sentido
de se melhorar a expressão, bem como validar as novas condições de expressão em biorreator
airlift de bancada de 6 L de capacidade útil.
Revisão Bibliográfica
3
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Fungicidas e Biofungicidas
Atualmente, o combate aos ataques patogênicos em plantas é realizado através do uso
de fungicidas, pesticidas e herbicidas que fazem parte de um grupo de substâncias químicas
muito resistentes à degradação por processos bioquímicos, por isso são muito estáveis e de
longa vida, além de serem tóxicos e bioacumulativos nos tecidos de animais e humanos,
causando prejuízos ambientais, doenças graves e perdas da biodiversidade
(www.jornalcana.com.br, 23/08/2004).
Alguns herbicidas influenciam a severidade de doenças, induzindo ou inibindo a
síntese de fitoalexinas. Herbicidas do grupo químico difeniléteres geram espécies reativas de
oxigênio, as quais mediam a ativação de genes de defesa responsáveis pela síntese de
fitoalexinas. O uso de subdoses de glifosfato ocasiona efeito contrário, diminuindo a produção
de fitoalexinas. Os impactos negativos com o uso de herbicidas podem ser minimizados com
o uso de bioherbicidas (Rizzardi et al., 2003).
Os agrotóxicos que merecem mais atenção são os organoclorados que contaminam a
água subterrânea trazendo enormes problemas ambientais (www.jornalcana.com.br,
23/08/2004).
Além da poluição ambiental e dos alimentos, os agrotóxicos têm um elevado custo.
Por estes motivos, cientistas estão desenvolvendo produtos biológicos de baixo custo e que
diminuem a contaminação do ambiente e dos alimentos e a intoxicação dos produtores rurais
(www.jornalcana.com.br, 27/11/2003).
No Brasil, o controle biológico de pragas já é utilizado desde da década de 20, quando
o Instituto Biológico combateu a broca do café com a utilização da vespinha de Uganda. Hoje
o Brasil tem importantes programas de controle biológico, em destaque está o controle
microbiano que utiliza bactérias, fungos, vírus e nematóides no combate a pragas e doenças
que atacam culturas de importância econômica, como a cana de açúcar. A cigarrinha é a
principal praga da cana de açúcar, pois causa redução de até 60 % de peso da cana e
principalmente de teor de sacarose, provocando perdas na produção de açúcar e de álcool.
Bons resultados têm sido obtidos no combate à cigarrinha da cana de açúcar com o fungo
Metharizium anisopliae. Em pelo menos 160 hectares de cana de açúcar do estado de São
Paulo já está sendo realizado o controle biológico da cigarrinha, obtendo uma redução
significativa na aplicação de produtos químicos. No período de 2002/2003, o custo médio de
Revisão Bibliográfica
4
tratamento utilizando produtos químicos foi de R$ 160,00/ha, enquanto que utilizando
controle biológico, o custo caiu para R$ 40,00/ha, que foi uma redução bastante significativa
(www.biologico.sp.gov.br, mar/abr-2004).
Cientistas paranaenses estão estudando o genoma de uma bactéria que é capaz de
produzir amônia a partir do nitrogênio, substituindo os fertilizantes nitrogenados, permitindo
uma enorme economia para os agricultores, além de não contaminar a atmosfera e o lençol
freático (www.jornalcana.com.br, 23/08/2004).
Pesquisadores do Laboratório de Controle Microbiano do Setor de Entomologia da
Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz desenvolveram três bioinseticidas para o
combate das pragas (Metarril, Boveril e Trichodermil). O Metarril e o Boveril são formulados
com isolados de fungos que ocorrem na natureza, atuam por contato, infectando insetos e
ácaros. Agem nas culturas de morangos, citros, cana de açúcar, hortaliças, seringueiras e
floricultura. O Trichodermil é um fungo eficaz contra outros fungos específicos que causam
doenças na agricultura, ele atua como antagonista, evitando a ocorrência de outros fungos em
determinada região, age contra doenças do solo, principalmente no tratamento de grãos e
sementes (www.jornalcana.com.br, 27/11/2003).
O ICIDCA (Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de
Azúcar) desenvolveu um produto biológico, o Gluticid, produzido a partir de cepas de
Pseudomonas sp., constituídos por metabólitos ativos suportados em sulfato de amônio, que
se mostra efetivo no controle fitosanitário.
Estão sendo realizados estudos no combate ao gorgulho aquático (Orysophagus
oryzae), inseto que ataca culturas de arroz, através da engenharia genética. Com a introdução,
no genoma do arroz, de um gene que codifica uma proteína que destrói o trato digestivo do
inseto, serão obtidas plantas mais resistentes (www.cib.gov.br, 11/03/2004).
Estudos realizados com proteína inibidora da protease cisteínica da cana de açúcar
chamada de canacistatina comprovaram que esta é capaz de desenvolver safras de cana de
açúcar mais resistentes ao ataque patogênico, o que pode reduzir o uso de produtos químicos
na agricultura, diminuindo o custo e os problemas com o ambiente, além de fornecer
alimentos mais saudáveis (Soares-Costa et al., 2002).
2.2. Inibidores de Proteases
As proteases, enzimas proteolíticas, são agrupadas em 4 grupos de acordo com os
resíduos de aminoácidos nos sítios ativos, o pH ótimo de atividade, similaridades na
Revisão Bibliográfica
5
seqüência de aminoácidos, similaridade para inibidores. São classificadas em proteases
serínica, cisteínica, aspártica e metalo (Oliveira et al., 2003).
Proteases cisteínicas são enzimas encontradas em todos os organismos, incluindo
vírus, bactérias, animais e plantas. Elas são sintetizadas como pré-pro-enzimas e são
caracterizadas por compreender os resíduos de cisteína, histidina e asparagina. A estrutura é
caracteriza por pelo menos três pontes de dissulfeto (Hellberg et al., 2002).
Hellberg et al. (2002) expressaram uma protease cisteínica da Entamoeba histolytica,
que causa a patogenicidade da ameba, em E. coli BL21 e testaram vários inibidores. Os
reagentes que inibem proteases serínica, aspártica e metalo não influenciaram a atividade da
protease cisteínica da Entamoeba histolytica recombinante. No entanto, todos os inibidores de
proteases cisteínicas testados reduziram ou bloquearam completamente a atividade enzimática
da protease.
Em mamíferos, há um grupo de proteases cisteínicas conhecidas como catepsinas que
são importantes em muitos processos fisiológicos e para regular estes processos há um grande
número de inibidores endógenos destas proteases (Oliva et al., 2004).
Os inibidores são responsáveis por vários processos regulatórios, tais como, respostas
imunológicas, regulação de câncer e contra invasão de parasitas (Oliva et al., 2004).
Os inibidores de proteases cisteínica e serínica estão distribuídos nos tecidos das
plantas, protegendo-as contra o ataque patogênico e servindo como proteína de reserva em
algumas sementes. São inibidores competitivos e reversíveis que bloqueiam a atividade
proteolítica em insetos, fungos e nematóides, prejudicando assim o crescimento,
desenvolvimento e reprodução destes patogênicos (Soares-Costa et al., 2002). Os inibidores
de proteases cisteínicas, conhecidos como cistatinas, foram primeiramente identificadas em
animais (Peng et al., 2004) e podem proteger as células de proteólises endógenas e exógenas
inapropriadas e/ou estar envolvido no mecanismo de controle responsável pela inativação
protéica intra e extracelular. As cistatinas possuem, também, utilidade em aplicações
medicinais como no tratamento de inflamações, distrofia muscular, doenças hereditárias,
tumores malignos, entre outros (Turk e Bode, 1991).
A cistatina é composta por uma superfamília apresentando similaridades na seqüência
de aminoácidos e funções, sua atividade é explicada pela presença de três pontos de contato
com a protease alvo: dois pontos de contato correspondem ao “loop hairpin” formado entre as
conformações β antiparalelas, o primeiro “loop” contém o motivo conservado QXVXG
encontrado em todos os membros da superfamília, enquanto que o segundo “loop”, menos
conservado, pode apresentar um triptofano próximo à região C-terminal; o terceiro ponto de
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contato é um resíduo conservado de glicina, localizado na extremidade N-terminal, é um
ponto de contato fechado com o resíduo catalítico da enzima, mas em uma conformação que
tem uma ponte peptídica invulnerável ao ataque proteolítico (Margis et al., 1998).
Os inibidores de proteases cisteínicas são ricos em serina e glicina, pobre em histidina,
cisteína e metionina, e não possuem triptofano (Joshi et al., 1998).
Quase todas as cistatinas conhecidas inibem a atividade da papaína e outras proteases
cisteínicas e podem ser intra e extracelulares (Ojima et al., 1997). Ojima et al. (1997)
encontraram cistatina extracelular em cenouras e até o momento desta publicação não havia
relatos de cistatina extracelular em plantas.
Os inibidores de proteases cisteínicas e serínicas possuem várias características de
inibição competitiva e reversível similares, mas acredita-se que os mecanismos de interação
sejam diferentes (Abrahamson et al., 1987).
A superfamília da cistatina está dividida em três famílias, baseado em suas seqüências
homólogas, na presença e posição de pontes de dissulfetos e massa molar da proteína. A
primeira família é das estefinas, que é composta de proteínas de baixo peso molecular
(aproximadamente 11 kDa) e que não contém pontes de dissulfeto e carboidratos; a segunda,
das cistatinas, agrupa proteínas com 120-122 aminoácidos, contém resíduos cisteínicos
conservados formando duas pontes de dissulfeto próximo à região C-terminal (ligações
covalentes de proteínas e grupos dissulfeto de resíduos de cisteína ajudam a proteger a
proteína de uma desnaturação) e podem ser glicosiladas e/ou fosforiladas; a terceira família,
dos kininogênios, se caracteriza por ser formada por glicoproteínas de alto peso molecular
(60-120 kDa) e com três domínios repetidos similares aos da família da cistatina (Margis et
al., 1998).
As cistatinas de plantas apresentam diferenças estruturais em relação a cistatina
animal, o que justifica uma nova família, a fitocistatina, que foi originalmente encontrada em
sementes de arroz e milho. A classificação das cistatinas de plantas como uma família
independente é suportada por alguns pontos principais: a existência de uma seqüência
consenso típica; o agrupamento em uma classe estatisticamente distinta das cistatinas e
estefinas e a diversidade genômica entre diferentes membros de cistinas de plantas,
caracterizado não só pelo tamanho e posição dos introns, mas também pela multiplicação de
exons e fusão com exons distintos não relatado funcionalmente (Margis et al., 1998). As
fitocistatinas possuem uma seqüência conservada na região N-terminal da α-hélice, que
também as diferenciam da cistatina animal (Shyu et al., 2004). As fitocistatinas são proteínas
termo-estáveis (Peng et al., 2004) que não possui pontes de dissulfeto, igualmente ao grupo
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das estefinas, e contém uma seqüência conservada L-A-R-[FY]-A-[VI]-X3-N na região N-
terminal (primeiro resíduo de aminoácido), são também semelhantes as cistatinas por
incluírem o motivo QXVXG. As fitocistatinas não possuem resíduos cisteínicos com exceção
da cistatina de papaia. As fitocistatinas possuem várias funções biológicas: funções
fisiológicas de regulação das atividades de proteases endógenas em sementes durante a
maturação, participação na inibição como elemento importante na defesa contra ataque por
insetos e nematóides, utilizadas em processos alimentícios para inibição de autólises e
amaciamento de carnes (Peng et al., 2004) e várias aplicações biotecnológicas (Oliveira et al.,
2003) e também como modulador de morte celular programada (Reis e Margis, 2001). A
atividade inibitória das fitocistatinas é devido ao fato de estas possuírem resíduos de glicina
na região N-terminal.
Abrahamson et al. (1987) observaram que o resíduo de glicina é conservado em todas
as cistatinas, indicando que a ponte de glicil pode ser um sítio reativo inibitório das cistatinas.
Ritonja et al. (1989) caracterizaram a cathelina, um inibidor de catepsina L de
leucócito de porco e não foi encontrado o resíduo de glicina 9 encontrado em todas as
cistatinas como importante na atividade inibitória, também não foi encontrado a seqüência
conservada QXVXG. Estas regiões conservadas são importantes para a interação da cistatina
com as proteases cisteínas da família da papaína, como não estão presentes na cathelina esta
interação deve ser diferente. Por estas razões, sugerem que as cistatinas sejam divididas em 4
famílias.
Abe et al. (1988) estudaram a orizacistatina (cistatina do arroz) e observaram que a
orizacistatina sem a região N-terminal incluindo o resíduo de glicina e com 231 aminoácidos
inibiu a atividade de protease em papaia tão bem quanto a orizacistatina nativa, indicando que
em orizacistatina, a glicina não é necessária para atividade inibitória.
Margis et al. (1998) observaram que a cistatina da cenoura diverge de outras
fitocistatinas pela presença de um segmento adicional que pode corresponder ao segundo
domínio hélice encontrado na cistatina do ovo e em todos os membros da família da cistatina
animal.
Reis et al. (2001) identificaram 25 possíveis fitocistatinas da cana-de-açúcar e através
de uma análise filogenética agruparam as fitocistatinas em 4 grupos: i) contendo o consenso
N-terminal, ii) contendo o consenso N-terminal e mais uma extensão C-terminal (último
resíduo de aminoácido), iii) destituído do consenso N-terminal e iv) destituído do consenso N-
terminal e do motivo conservado QXVXG encontrado em todos os membros da superfamília
e indispensável para a atividade inibidora das cistatinas. Observaram que a cana de açúcar
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possui fitocistatinas com características novas e com expressão diferencial não só encontradas
em sementes, mas também em outros órgãos e tecidos (Reis e Margis, 2001).
Soares-Costa et al. (2002) observaram que a canacistatina, nome dado para a cistatina
da cana de açúcar tem uma estrutura secundária similar à da orizacistatina I do arroz.
Shyu et al. (2004) expressaram a cistatina de gergelim em E. coli BL21 e testaram a
sua atividade de inibição em proteases de papaia e obtiveram um coeficiente de inibição (Ki)
de 7,89.10
-8
M para a cistatina na forma nativa e 2,77.10
-8
M para a cistatina recombinante,
mostrando que esta possui uma atividade de inibição efetiva.
Gruden et al. (1998) verificaram que quando o besouro Leptinotarsa decemlineata,
principal praga das culturas de batata, ingere inibidores de proteases tem o seu crescimento
alterado, isto ocorre porque o inibidor induz a expressão de uma atividade proteolítica
específica no intestino do inseto, mas inibidores de proteases extraídos da batata não inibiram
a atividade da protease cisteínica no besouro. Quando o inseto é alimentado com trans-epoxi
succinil-L-leucilamido-(4-guanidino)-butano, um inibidor de baixo peso molecular de
proteases cisteínicas, tem mostrado retardo no crescimento e aumento na mortalidade da larva
do besouro e baixa fecundidade nas espécies adultas. Construção de plantas transgênicas
produzindo inibidores de proteases suscetíveis pode ser uma alternativa de proteção das
lavouras contra o besouro Leptinotarsa decemlineata.
O tabaco Nicotiana alata produz vários inibidores de proteases serínicas, um inibidor
de chimotripsina e quatros inibidores de tripsina. Heath et al. (1997) testaram estes inibidores
no intestino da lagarta Helicoverpa punctigera e do grilo Teleogryllus commodus, pestes que
causam perdas em lavouras na Austrália, e observaram substancial inibição das proteases
destes insetos. Teleogryllus commodus quando alimentado com uma dieta artificial contendo
0,33% m/v de inibidor de protease de Nicotiana alata e 3% m/v de caseína teve um peso
médio reduzido de 67%. Helicoverpa punctigera também teve seu crescimento reduzido em
54% quando alimentados com uma dieta contendo 0,26% m/v de inibidor. Foi observado que
utilizando dietas artificiais houve retardo no crescimento, causado pela diminuição da
atividade proteolítica nos intestinos dos insetos, mas não teve diferenças significativas em
relação à mortalidade, já quando utiliza tabacos transgênicos contendo inibidores da
Nicotiana alata houve aumento na mortalidade. Inibidores de proteases serínicas de outras
plantas contêm 1 ou 2 domínios de inibição, enquanto que a Nicotiana alata contem 5 ou 6.
Isto fornece atividade inibitória contra muitas proteases em intestino de pestes específicas,
podendo aumentar a resistência a insetos em plantas de Nicotiana alata transgênica.
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Joshi et al. (1998) extraíram proteína inibidora de protease da semente de milheto e
testaram a atividade antifúngica em quatro cepas de Trichoderma reesei, quatro de
Aspergillus flavus e duas de Fusarium monoliforme. Observaram que uma das cepas de
Trichoderma reesei foi inibida com 2 µg/mL de proteína, as outras cepas de Trichoderma
reesei e todas de Fusarium monoliforme foram inibidas com 10-20 µg/mL de proteína, já o
fungo Aspergillus flavus não foi inibido com menos de 40 µg/mL. A atividade antifúngica
pode ser devido a hidrolases, como chitinases e glucanases que são responsáveis pela
degradação da parede celular dos fungos.
Soares-Costa et al. (2002) testaram a atividade inibitória da canacistatina no fungo
Trichoderma reesei e observaram que uma concentração de 50 µg/mL de canacistatina foi
capaz de inibir o crescimento do fungo e com concentrações entre 100 e 200 µg/mL o
crescimento foi totalmente inibido.
2.3. Tecnologia do DNA recombinante
A tecnologia do DNA recombinante começou a ser desenvolvida no final dos anos 70
e foi um grande progresso para o entendimento e combate de doenças. A oportunidade de
introduzir um novo DNA em células hospedeiras criou um microrganismo industrial capaz de
produzir proteínas de alto valor (Bailey e Ollis, 1986). Através desta técnica pode-se realizar
diagnóstico pré-natal de doenças genéticas, a produção de larga escala de potentes agentes
farmacêuticos, o sequenciamento do genoma humano, a introdução de novos traços em
bactérias, plantas e animais para industria e agricultura, terapia gênica (Lehninger et al.,
1993).
Em 1975 o primeiro anticorpo monoclonal foi produzido. No ano de 1977 um gene
humano foi expresso em bactéria e um gene da insulina de rato foi clonado, no ano seguinte,
insulina humana e hormônio de crescimento foram produzidos e DNA bacteriano foi inserido
em cromossomo de levedura. A insulina humana recombinante foi aprovada pelo FDA em
1982 e o hormônio de crescimento recombinante foi aprovado em 1985. Em 1986 α-
interferon e a primeira vacina recombinante para hepatite B foram aprovadas. O fator VIII foi
aprovado em 1992 e β-interferon um ano mais tarde. Com estas descobertas, a tecnologia do
DNA recombinante foi ganhando espaço e grande importância (Demain, 2001). O instituto
Butantan é capaz de produzir 50 milhões de doses por ano de vacina recombinante contra
hepatite B.
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Como conseqüência do desenvolvimento desta tecnologia é atualmente possível
realizar investigação de paternidade e o diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas através
da análise de DNA (Lehninger et al., 1993). Uma outra conseqüência da utilização desta
técnica é a possibilidade de utilizar plantas para a produção de substâncias farmacêuticas.
Estão sendo obtidos resultados positivos por meio de modificações genéticas de plantas para a
produção de compostos de interesse medicinal, tais como: a hirudina, um poderoso
anticoagulante e a vitamina C (www.cib.org.br, 11/08/2003).
A técnica central da metodologia do DNA recombinante é a clonagem molecular, a
qual consiste no isolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas. A clonagem
molecular compreende pelo menos dois estágios importantes. Primeiro, o fragmento do DNA
de interesse chamado de inserto é ligado a uma outra molécula de DNA chamada de vetor de
clonagem para formar o que se chama de DNA recombinante. Segundo, a molécula do DNA
recombinante é introduzida numa célula hospedeira compatível, num processo chamado de
transformação. A célula hospedeira que adquiriu a molécula do DNA recombinante é agora
chamada de transformante ou célula transformada (Bailey e Ollis, 1986).
No entanto, a transformação não acontece em todas as células, só certas linhagens são
transformáveis, chamadas de células competentes. As células competentes possuem alta
capacidade de inserir o DNA na célula do que as células não competentes. A competência
pode depender do estado fisiológico da célula. E. coli normalmente não são competentes, mas
sua importância para a genética microbiana tem levado ao desenvolvimento de procedimentos
empíricos para induzir sua competência. Este procedimento envolve tratamento da E. coli
com altas concentrações de íons cálcio com manipulação da temperatura, que alteram a
permeabilidade da parede celular permitindo a entrada do DNA exógeno através da
membrana celular (Shuler e Kargi, 1992). A permeabilidade da membrana celular também é
alterada com a adição de manganês no meio (Bailey e Ollis, 1986).
Somente algumas células terão o plasmídeo com o gene de interesse, por isso é
necessária a realização de um método para selecionar estas células. O gene de interesse
freqüentemente confere resistência a antibióticos. Portanto, antibióticos são acrescentados ao
meio de cultura para selecionar somente as linhagens que portam os plasmídeos
recombinantes. (Lehninger et al., 1993).
O inserto é obtido através do uso de endonucleases de restrição, que reconhece e corta
seqüências de nucleotídeos específicos dentro do DNA deixando extremidades de fitas
simples de DNA permitindo a ligação do inserto no vetor. As enzimas de restrição mais
largamente utilizada na tecnologia do DNA recombinante são as do tipo II que são proteínas
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11
simples, não requer ATP e clivam o DNA dentro do seu sítio de reconhecimento (Lehninger
et al., 1993). A utilidade das enzimas de restrição na tecnologia do DNA recombinante vem
de sua especificidade em clivar DNA em sítios particulares. Estas enzimas reconhecem sítios
de 6 ou 4 nucleotídeos, e estes fragmentos são suficientemente longos para conter informação
genética e suficientemente pequenos para permitir uma manipulação física e bioquímica
conveniente in vitro (Bailey e Ollis, 1986).
Após a clivagem do DNA os fragmentos se ligam ao vetor através da enzima DNA
ligase, esta enzima catalisa a ligação fosfodiéster entre o grupo OH livre na extremidade 3’ de
uma das cadeias de DNA e um grupo fosfato na extremidade 5’ da outra cadeia. Em E. coli o
fosfato deve ser ativado utilizando NAD+ como cofator (alguns organismos utilizam ATP),
para fornecer a energia química requerida. (Lehninger et al., 1993). A Figura 2.1 esquematiza
a tecnologia do DNA recombinante.
Figura 2.1: Tecnologia do DNA recombinante: o DNA recombinante é formado e
inserido na célula hospedeira
Há três tipos de vetores de clonagem utilizados na metodologia do DNA
recombinante, que são comumente utilizados em E. coli, plasmídeos, bacteriófagos e
cosmídeos. Os plasmídeos são pequenas moléculas de DNA circular que replica
separadamente do cromossomo do hospedeiro, têm a vantagem de ter pelo menos um gene
que confere resistência a antibiótico, permitindo que em um meio contendo antibiótico, só as
células transformadas cresçam. Quando o segmento de DNA é maior, pode ser clonado
utilizando bacteriófago λ como vetor, permite a clonagem de DNA acima de 23 kb e seu
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“design” assegura que todas as partículas viáveis do fago irão conter o fragmento de DNA de
interesse. Os cosmídeos são plasmídeos recombinantes que combinam características tanto
dos plasmídeos quanto do bacteriófago λ, são utilizados quando o fragmento de DNA é muito
grande (45 kb) (Lehninger et al., 1993).
A escolha do hospedeiro é baseada na habilidade de propagação da proteína de
interesse em grande extensão. O hospedeiro deverá sintetizar a proteína de interesse com o
mesmo molde de glicosilação, fosforilação e acetilação encontrado quando a proteína é
isolada na sua forma nativa (Glick, 1995).
E. coli é o microrganismo mais utilizado e competente para transformação com DNA
exógeno, por várias razões, por possuir métodos precisos e rápidos para modificação de seu
genoma, rápido crescimento, facilidade de cultivo, facilidade de redução de protease,
facilidade de evitar incorporação de aminoácidos análogos, facilidade de alterar o número de
cópias, facilidade de formação de pontes de dissulfeto intracelulares, facilidade de crescer em
altas densidades celulares, acumulação de proteína heteróloga acima de 50% de sua massa
celular, sobrevivência em diferentes condições ambientais, não necessita de um meio de
cultura caro, desempenho reprodutível, alto rendimento em produto, entre outras (Demain,
2001). Mas, nem todo gene pode ser expresso eficientemente neste organismo devido às
características estruturais única e sutis da seqüência gênica, estabilidade e eficiência
translacional do mRNA, a facilidade de enovelamento da proteína, degradação da proteína por
proteases do hospedeiro, diferenças de códons entre o gene de interesse e da E. coli nativa, e a
toxidade potencial da proteína para o hospedeiro. As principais desvantagens da E. coli como
sistema de expressão inclui a incapacidade de fazer modificações pós-translacionais
encontradas em proteínas eucariotas, a falta de mecanismo de secreção da proteína para o
meio de cultura e limitada capacidade de formar pontes dissulfeto (Makrides, 1996).
Todavia, muitas proteínas recombinantes têm sido produzidas com sucesso utilizando
E. coli (Choi e Lee, 2004), tais como: interferons, interleucinas, hormônio de crescimento e
insulina (Lee, 1996).
Um vetor de clonagem utilizado em E. coli deve ter as seguintes propriedades:
habilidade para replicar na célula hospedeira, habilidade para acomodar insertos de vários
tamanhos sem danificar as funções de replicação, facilidade de inserção na célula hospedeira
depois de manipulação in vitro, conter marcador de seleção para selecionar rapidamente e
positivamente as células que contém o vetor, conter só um sítio para uma ou mais
endonucleases de restrição. Os vetores mais utilizados para clonagem de DNA em E. coli são
plasmídeos e bacteriófagos, quando os insertos são fragmentos grandes de genoma eucariótico
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é preferível o uso do bacteriófago como vetor. Um plasmídeo bastante popular é o pBR322,
inclui um único sítio para enzima de restrição, possui genes resistentes à tetraciclina e
ampicilina e uma origem de replicação (Bailey e Ollis, 1986). Os vetores bastante utilizados
para expressão de proteínas heterólogas em E. coli são os da série pET (“plasmid for
expression by T7 RNA polimerase”), estes requerem um hospedeiro que possa produzir a
RNA polimerase do bacteriófago T7 sob o controle induzível do promotor lacUV5. Sob a
jusante do promotor altamente específico T7 e um sitio de ligação do ribossomo. Estes vetores
são mantidos por conferir resistência a antibióticos (ampicilina ou kanamicina) e a expressão
do gene é iniciada por adição de IPTG (0,1 a 1 mM). Muitas proteínas overexpressadas em
vetores pET são encontrados em corpos de inclusão (Hoffman et al., 1995).
Embora muitas proteínas sejam expressas em forma insolúvel, biologicamente inativa
em corpos de inclusão, sendo sua recuperação complicada e de custo elevado, muitas técnicas
estão sendo desenvolvidas para que proteínas recombinantes em E. coli estejam em forma
solúvel e/ou secretadas (Lee, 1996). A formação de corpos de inclusão continua sendo uma
barreira para expressão gênica no citosol. Os corpos de inclusão oferecem muitas vantagens,
mas que acabam sendo pequenas, considerando a difícil tarefa de enovelar as proteínas
agregadas, a incerteza de que a proteína enovelada retém a atividade biológica, e a redução do
rendimento da proteína enovelada e purificada (Makrides, 1996). Makrides (1996) analisou 81
proteínas que formam ou não corpos de inclusão em E. coli e concluiu que 6 parâmetros são
correlacionados com a formação de corpos de inclusão: carga média, fração de resíduo “turn
forming”, fração de cisteína, fração de prolina, hidrofilicidade e o número total de resíduos.
Muitos experimentos têm sido realizados para minimizar a formação de corpos de
inclusão e melhorar o enovelamento das proteínas. Estes incluem o crescimento de culturas
bacterianas a baixas temperaturas, a seleção de diferentes linhagens, a substituição de
aminoácidos, a co-produção de chaperonas, a utilização de tioredoxina como proteína de
fusão, crescimento e indução sob stress osmótico na presença de sorbitol e glicil betaína,
adição de açúcares não metabolizados no meio de crescimento, alteração do pH do meio e a
utilização de linhagens deficientes em tioredoxina redutase (Makrides, 1996).
Há uma grande variedade de organismos e células utilizados como hospedeiro na
expressão de genes, incluindo diferentes microrganismos, assim como também células
animais, de plantas e insetos (Glick, 1995).
Um microrganismo bastante utilizado como hospedeiro para DNA recombinante é a
bactéria gram-positiva Bacillus subtilis, por ser um microrganismo não patogênico, não
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parasita e por secretar alguns dos produtos expressados. Muitas proteínas mamíferas são
expressas em Bacillus subtilis incluindo insulina e interferons (Bailey e Ollis, 1986).
A levedura Saccharomyces cerevisie é, também, bastante utilizada para expressão de
proteínas por ser capaz de expressar diretamente alguns genes eucarióticos e procarióticos. A
levedura realiza algumas modificações pós-translacionais típicas de eucariotos e pode secretar
algumas proteínas no meio (Bailey e Ollis, 1986).
A Figura 2.2 mostra um mecanismo molecular proposto para esta transformação de E.
coli.
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Zona de adesão
Plasmídeo
Bicamada lipídica
(interna)
Bicamada lipídica
(externa)
Fosfolipídeos
Íon de cálcio
Camada peptido
glucan
DNA genômico Célula
Bacteriana
Figura 2.2: Mecanismo proposto para a transformação de E. coli com uma molécula de
DNA exógeno
2.4. Expressão de proteínas heterólogas
A escolha de um sistema de expressão para a produção de altos níveis de proteína
recombinante depende de muitos fatores, tais como: características de crescimento celular,
níveis de expressão, expressão intracelular e extracelular, modificações translacionais e
atividade biológica da proteína de interesse, assim como questões regulatórias na produção de
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proteínas terapêuticas. A seleção de um sistema de expressão particular requer uma análise de
custo em termos de processo, projeto e outras considerações econômicas (Makrides, 1996).
A introdução e expressão de DNA exógeno no hospedeiro fazem com que ocorram
mudanças no metabolismo do organismo que pode prejudicar o funcionamento do
metabolismo normal dos organismos. As mudanças no metabolismo ocorrem como
conseqüência da carga metabólica, recursos da célula hospedeira (ATP, GTP, aminoácidos)
necessários para manter e expressar DNA exógeno. A carga metabólica aumenta com o
aumento do número de cópias de plasmídeos, pois uma certa quantidade de energia é
necessária para manter o plasmídeo dentro da célula (Glick, 1995).
A magnitude da carga metabólica causada pela produção de proteínas heterólogas
depende da extensão que a proteína é produzida, do número de cópias de plasmídeos, do
tamanho do vetor de clonagem, do estado metabólico da célula, da composição do meio de
crescimento e da concentração de oxigênio dissolvido (Glick, 1995).
A imposição de uma carga metabólica por introdução de DNA exógeno pode causar
muitas mudanças na fisiologia e funcionamento do hospedeiro. A mudança mais observada é
a diminuição da velocidade específica de crescimento e que se não houver antibióticos de
seleção no meio, os plasmídeos serão perdidos (Glick, 1995). Isto é mais bem observado em
cultivos contínuos, se a manutenção de plasmídeos de alta cópia é instável (Flickinger e
Rouse, 1993). Uma simples estratégia para diminuir a carga metabólica no hospedeiro é a
utilização de baixo número de cópias de plasmídeos (Glick, 1995). O número de cópias dos
plasmídeos é determinado pela origem de replicação (Makrides, 1996).
Glick (1995) observou que a velocidade específica de crescimento celular e a
expressão da proteína β-lactamase em E. coli HB101 diminuíram com o aumento do número
de cópias de plasmídeos.
Muitos sistemas de expressão (instrumentos genéticos que possibilitam a síntese de
proteínas de interesse biotecnológico em célula hospedeira) estão sob o controle de um
promotor (seqüência de DNA onde a RNA polimerase se liga levando ao início da
transcrição) e um repressor (proteína que se liga à seqüência operadora de um gene e bloqueia
a sua transcrição), permitindo que o cultivo aconteça em duas fases: crescimento celular e
síntese da proteína heteróloga (Gombert e Kilikian, 1998). Altos níveis de expressão são
alcançados através do uso de promotores fortes e reguláveis (Glick, 1995).
O sistema mais utilizado para a expressão de proteínas heterólogas é o que utiliza E.
coli como célula hospedeira, devido à facilidade e baixo custo de se cultivar E. coli e pela
reprodutibilidade e abundância de proteína que se produz. A expressão de proteínas e a
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clonagem de genes são controladas por um dado promotor. O promotor é posicionado
aproximadamente 10 a 100 pb a montante do sítio de ligação do ribossomo e está sob o
controle de um gene regulatório, que pode estar presente no vetor ou integrado ao
cromossomo do hospedeiro (Makrides, 1996).
Promotores de E. coli consistem de uma seqüência hexanucleotídica localizada
aproximadamente 35 pb a montante do início da transcrição (região – 35) separado por
pequeno espaço de outro hexanucleotídeo (região –10) (Makrides, 1996).
Há muitos promotores disponíveis para a expressão gênica em E. coli, incluindo
pequenos derivados de bactérias gram positivas e bacteriófagos. Um promotor útil exibe
muitas características: é forte, possui baixos níveis de expressão basal, é facilmente
transferido para outras linhagens, e a indução é simples e efetiva (Makrides, 1996).
Um promotor para ser utilizado em E. coli deve ter certas características para tornar
apropriada a síntese de altos níveis de proteína. Primeiro, deve ser forte, resultando em um
acúmulo de 10 a 30% ou mais do total da proteína celular; segundo, deve exibir um nível
mínimo de atividade transcricional basal. Expressão gênica em larga escala preferencialmente
emprega cultivos com alta densidade celular e mínima atividade do promotor, seguindo da
indução e desrepressão do promotor. A regulação do promotor é essencial para sínteses de
proteínas que podem ser prejudiciais para a célula hospedeira (Makrides, 1996).
Sistemas de expressão incompletamente reprimidos podem causar instabilidade do
plasmídeo, diminuição da velocidade de crescimento celular e perda da produção de proteína
recombinante (Makrides, 1996).
Uma terceira característica importante do promotor é que seja induzido de uma
maneira simples e de baixo custo. Os promotores largamente utilizados para a produção de
proteína recombinante utilizam indução térmica ou química (Makrides, 1996).
Kaprálek et al. (1991) observaram que a temperatura de cultivo influencia a
velocidade específica de expressão do gene: a 30 ºC a expressão do gene foi praticamente
bloqueada, a 37 ºC o gene foi expresso com uma diminuição na velocidade específica de
crescimento e a 42 ºC houve uma diminuição na expressão e o crescimento celular parou.
Em resumo, um eficiente vetor de expressão em procariotos deve conter um promotor
forte e regulado, um sítio Shine Dalgarno (SD) posicionado 9 pb a 5’ do início do códon de
translação e é complementar a 3’ do 16S rRNA e um eficiente terminador de transcrição
posicionado a 3’ do gene da seqüência codificadora. Em adição, os vetores requerem uma
origem de replicação, um marcador de seleção, e um gene que facilita a regulação estringente
da atividade do promotor (Makrides, 1996).
Revisão Bibliográfica
1
7
A expressão de proteínas pode ser indutível ou constitutiva. O sistema de expressão
indutível é o mais utilizado e em E. coli o mais utilizado é o operon lac. Neste sistema, o
DNA de interesse é clonado em fago ou plasmídeo contendo o lac I (repressor, que quando
ligado impede a ligação da RNA polimerase e a transcrição), lac P (promotor), lac Y
(envolvido com o transporte de lactose) e lac Z (gene estrutural transcrito para o mRNA da β-
galactosidase, catalisa a quebra de lactose em glicose e galactose). A indução da transcrição é
obtida pela adição de lactose ou de IPTG (isopropiltio-β-d-galactosídeo, um análogo de
lactose sintético e não degradável), o qual se associa ao repressor, inibindo-o, deixando o
promotor livre para a interação da RNA polimerase e conseqüente transcrição do gene
(Nascimento et al., 2003). Apesar de o IPTG possuir alto custo e toxicidade, há poucos
trabalhos publicados que utiliza lactose como indutor, provavelmente pela dificuldade em
estabelecer condições ideais de cultivo, já que a lactose serve como indutor e fonte de carbono
(Gombert e Kilikian, 1998). O operon lac só é transcrito quando no meio há lactose e
ausência de glicose, a enzima β-galactosidase converte a lactose em galactose e glicose, que é
então utilizada como fonte de energia. Quando E. coli cresce rapidamente em um meio
contendo glicose, há a inibição da formação de AMP cíclico, que influencia a atividade do
promotor no operon lac, cuja indução é bloqueada ou moderada quando o nível de AMP
cíclico está baixo (Bailey e Ollis, 1986). Em bactérias, o AMP cíclico se liga ao CAP
(proteína ativadora de genes por catabólitos); somente o complexo CAP-AMP é capaz de
estimular a transcrição e se ligar a determinados promotores, CAP estimula a transcrição do
operon lac por possuir uma região de ligação a RNA polimerase quando está ligado ao DNA.
A Figura 2.3 mostra o funcionamento do operon lac.
Revisão Bibliográfica
18
Figura 2.3: Esquema de funcionamento do operon lac.
Um dos mais poderosos e amplamente utilizados sistemas de expressão em E. coli
utiliza o promotor do fago T7. A atividade deste sistema depende da unidade de transcrição
que fornece a T7 RNA polimerase, que a repressão é essencial para evitar o enfraquecimento
do promotor T7 (Makrides, 1996).
Gombert et al. (1998) utilizaram lactose como indutor da proteína troponina C em E.
coli e mostraram que a lactose possui vantagens por ser mais barata, menos tóxica e não
requerer uma fonte de carbono extra. A indução foi realizada em 3 pulsos com o objetivo de
evitar eventuais efeitos de inibição, devido à alta concentração residual no meio.
O processo de degradação do mRNA fornece um importante ponto de controle da
expressão gênica em praticamente todos os organismos. Muitas diferentes RNAses participam
da degradação do mRNA em E. coli, incluindo endonucleases, e 3’ exonucleases, nenhuma 5’
exonuclease foi identificada em procariotos. Alguns autores sugerem que a expressão gênica
pode ser aumentada quando se utilizam hospedeiros que são deficientes em RNAses
(Makrides, 1996).
E. coli BL21 são deficientes na protease lon e na protease de membrana ompT que
pode degradar proteínas durante a purificação. A proteína de interesse deve ser mais estável
nestas linhagens do que em hospedeiros que contêm estas proteases (Novagen, 2003).
Quando a proteína de interesse está localizada no citoplasma da E. coli, é muito
provável que esta sofra degradação por causa do grande número de proteases localizadas no
Revisão Bibliográfica
19
citoplasma, além da dificuldade de purificar a proteína de interesse das proteínas
intracelulares. O periplasma oferece muitas vantagens para proteínas heterólogas em contraste
com o citoplasma, o periplasma contém só 4% da proteína celular total, assim a proteína de
interesse fica concentrada e a purificação é consideravelmente mais fácil. O ambiente
oxidativo do periplasma facilita o enovelamento correto das proteínas e a degradação é
menor. Quando as proteínas heterólogas são secretadas no meio, as vantagens aumentam, mas
infelizmente E. coli secreta poucas proteínas e a manipulação de vários caminhos de
transporte para facilitar a secreção é uma árdua tarefa (Makrides, 1996).
Atualmente há uma larga variedade de proteínas de fusão utilizadas em pesquisas
biológicas. Proteínas de fusão têm utilidade na produção, detecção e purificação de proteínas
recombinantes. Fusões específicas podem aumentar o enovelamento, solubilidade, resistência
a proteólises e secreção de proteínas recombinantes no meio de cultura, aumentando o
rendimento da proteína de interesse (Makrides, 1996).
Proteólise é um seletivo e altamente regulado processo que tem um importante papel
em fisiologia celular. E. coli contém um grande número de proteases que estão localizadas no
citoplasma, periplasma e nas membranas internas e externas e que podem degradar as
proteínas heterólogas. Há muitas estratégias para minimizar proteólises de proteínas
recombinantes em E. coli, tais como: transporte da proteína para o meio de cultura, utilização
de linhagens hospedeiras proteases deficientes, crescimento das células hospedeiras a baixas
temperaturas, construção de proteínas de fusão no N- e/ou C- terminal, fusão “tandem” de
múltiplas cópias do gene alvo, co-expressão de chaperonas, substituição de um resíduo de
aminoácido específico para eliminar o sítio de clivagem da protease, modificação da
hidrofobicidade da proteína alvo e otimização das condições de fermentação (Makrides,
1996).
2.5. Condições de cultivo
Muitos estudos estão sendo realizados para aumentar a produtividade de proteínas
recombinantes utilizando bactérias como hospedeiro, tais como: manutenção de alta dosagem
de gene, redução de toxidade, aumento da estabilidade proteolítica da proteína, composição de
meio de cultura, entre outros (Vila et al., 1997).
Para a síntese de produtos heterólogos, algumas variáveis importantes das condições
de fermentação devem ser otimizadas, tais como: condições de crescimento, métodos de
Revisão Bibliográfica
20
indução, inibição mínima por metabólitos, além da obtenção de sistemas genéticos bem
adequados (Rossi, 2001).
Níveis de expressão gênica em E. coli dependem das características bioquímicas da
proteína recombinante, mecanismo de indução da expressão, linhagens do hospedeiro e
condições de cultivo (Lee et al., 1997).
Para otimizar a produção da proteína recombinante é essencial entender a relação entre
a fisiologia microbiana, sistema hospedeiro/vetor e a expressão gênica durante a fermentação;
também é importante o entendimento da relação entre tempo de indução e o estado
metabólico do hospedeiro durante o ciclo de fermentação. A otimização do processo
freqüentemente envolve melhorias nas condições de fermentação, como composição do meio
de cultura, condições de crescimento, método de indução e minimização de inibição por
metabólito (Lee et al., 1997).
A composição do meio de crescimento celular deve ser cuidadosamente formulada e
monitorada, porque pode ter efeitos metabólicos significativos tanto nas células quanto na
produção da proteína. A composição de nutrientes e a definição de variáveis de fermentação
tais como temperatura, pH e outros parâmetros podem afetar a atividade proteolítica, secreção
e os níveis de produção. A suplementação do meio de cultura com glicina aumenta a liberação
da proteína do periplasma para o meio de cultura sem causar significativa lise celular,
similarmente, crescimento celular sob stress osmótico na presença de sorbitol e glicil betaína
aumenta mais de 400 vezes a produção de proteína solúvel e ativa (Makrides, 1996).
A utilização de um meio de cultura definido resulta em condições de cultivo
reprodutíveis e é preferível ao meio de cultura complexo quando o controle da velocidade
específica de crescimento é desejável, porque o nutriente limitante é conhecido e pode-se
alcançar crescimento celular balanceado (Yee e Blanch, 1993). Yee e Blanch (1993)
desenvolveram um meio de cultura definido para o cultivo de E. coli X90 recombinante e
obtiveram uma velocidade específica máxima de crescimento de 0,87 h
-1
e um rendimento de
biomassa em glicose de 0,42 g/g.
Flickinger e Rouse (1993) sugerem que é possível limitar o crescimento celular
enquanto mantém a síntese do produto, fornecendo substrato a uma velocidade mínima
necessária para a manutenção celular e síntese do produto, mas a síntese de proteína em
bactéria diminui quando a velocidade de crescimento se aproxima de zero por causa do
controle de síntese de rRNA.
Revisão Bibliográfica
21
2.5.1. Ácido acético
Excreção e acúmulo de ácidos orgânicos é um problema no cultivo de muitas
linhagens bacterianas. Dentre uma variedade de metabólitos, o ácido acético tem provado ser
o principal componente responsável pela redução do desempenho do processo. Ele inibe o
crescimento celular quando acumulado acima de certa concentração (Konstantinov et al.,
1990).
Konstantinov et al. (1990) estudaram o processo em batelada alimentada para a
produção de fenilalanina em E. coli AT2471 e observaram que quando a concentração de
ácido acético no meio de cultura foi alta, foi detectada também uma baixa concentração de
etanol, principalmente durante o período de crescimento celular.
O acetato é o principal produto das vias fermentativas de E. coli, mas é um inibidor de
crescimento e de síntese de produtos heterólogos, alguns autores citam que a formação de
acetato é maior em meio de cultivo complexo do que em definido. Em meios de cultura
complexos o microrganismo consome os nutrientes (aminoácidos e vitaminas presentes no
extrato de levedura ou triptona) para biossíntese e glicose (fonte de carbono e energia) para
obtenção de energia, utilizando as vias fermentativas como forma de regulação do fluxo de
nutrientes. Uma maior concentração de extrato de levedura pode acarretar uma maior
concentração de subprodutos no meio de cultura, como, por exemplo, o ácido acético (Rossi,
2001).
Kleist et al. (2003) observaram que quando a concentração de acetato no meio está
acima de 5 g/L há uma redução na velocidade de crescimento e no rendimento em biomassa.
Konstantinov et al. (1990) observaram que o crescimento celular parou quando a
concentração de ácido acético no meio estava em torno de 15 g/L e quando a concentração de
ácido estava em 2 g/L, não houve inibição do crescimento.
O acetato é produzido quando E. coli está crescendo sob condições anaeróbicas ou
quando há limitação por oxigênio, mas em culturas onde há excesso de glicose no meio,
acetato pode ser produzido sob condições aeróbicas (Lee, 1996). Lee (1996) relata que não há
produção de acetato quando se utiliza glicerol como fonte de carbono e energia. Korz et al.
(1995) estudaram a utilização de glicose e glicerol como fontes de carbono e energia em
cultivos com E. coli e a produção de acetato não foi observada quando se utilizou glicerol
como fonte de carbono e energia devido à baixa velocidade de crescimento.
A concentração de glicose, oxigênio dissolvido e velocidade específica de crescimento
são fatores chaves para a formação de ácido acético que podem ser controlados empregando
Revisão Bibliográfica
22
processos em batelada alimentada, que são utilizados para alcançar altas concentrações
celulares, controlando a velocidade específica de crescimento, evitando redução de oxigênio
dissolvido e formação de produtos fermentativos (Suárez e Kilikian, 2000).
Konstantinov et al. (1990) concluíram que a deficiência de oxigênio é um fator
importante na excreção de ácido acético. A deficiência de oxigênio irá forçar a glicose a ir
para o caminho fermentativo e o ácido acético é formado quando o fluxo de carbono excede a
capacidade do caminho oxidativo.
A concentração de ácido acético mínima que inibe o crescimento de E. coli depende da
cepa utilizada e das condições de cultivo e o valor da velocidade específica de crescimento em
que ocorre a formação de ácido acético é chamada de velocidade específica de crescimento
crítica. Para processos contínuos este valor está entre 0,3 h
-1
e 0,72 h
-1
e para processos em
batelada entre 0,05 h
-1
a 0,4 h
-1
(Suárez e Kilikian, 2000).
Gombert et al. (1997) observaram que para E. coli BL21 (DE3) pLysS a concentração
crítica de ácido acético para não haver inibição foi de 0,9 g/L.
Suárez et al. (2000) produziram troponina C em E. coli BL21 e observaram que para
velocidades específicas de crescimento maiores que 0,30 h
-1
, a velocidade de acúmulo de
ácido acético aumentou bastante e a concentração de ácido acético que inibe o crescimento foi
alcançada rapidamente. Para µ abaixo de 0,2 h
-1
, houve uma redução de 17 % no rendimento
de biomassa em glicose. Com estes resultados os autores concluíram que E. coli BL21 deve
ser cultivada com velocidade específica de crescimento entre 0,2 e 0,3 h
-1
para obter alto
rendimento de biomassa com moderado acúmulo de ácido acético.
Durante o crescimento aeróbio ou anaeróbio em presença de excesso de fonte de
carbono ocorrem eventos fisiológicos que levam ao acúmulo de ácido pirúvico, responsável
pela formação de substâncias ácidas prejudiciais à célula, como o acetato (Aristidou et al.,
1995).
Estudos têm mostrado que ácidos de cadeias curtas podem reprimir a síntese de
macromoléculas, incluindo DNA, RNA, proteínas, lipídios e peptidoglicano (Aristidou et al.,
1994)
Aristidou et al. (1995) introduziram o gene alsS de Bacillus subtilis que codifica a
enzima acetolactate em E. coli e observaram uma redução na produção de acetato e um
aumento na produção da proteína recombinante. Esta enzima é capaz de catalisar a conversão
do piruvato em espécies não ácidas e menos prejudiciais ao crescimento celular, como a
acetonina (Aristidou et al., 1994).
Revisão Bibliográfica
23
O crescimento de E. coli é inibido quando os seguintes nutrientes estão presentes
acima de certas concentrações (g/L): glicose (50), amônia (3), ferro (1,15), magnésio (8,7),
fósforo (10) e zinco (0,038) (Lee, 1996).
Muitas técnicas de engenharia têm sido aplicadas para diminuir a excreção e acúmulo
de ácido acético, incluindo diálises, método que remove fisicamente o ácido acético do meio
de cultura, mas não é apropriado para aplicação industrial devido ao alto custo e dificuldades
práticas em realizar este processo. Outra técnica é estabilizar o oxigênio dissolvido por
controle do suprimento de oxigênio (DO-stat) e a terceira técnica é baseada na combinação do
DO-Stat com uma política de alimentação correta de glicose (Konstantinov et al., 1990).
2.5.2. Obtenção de alta concentração celular
Altas concentrações celulares em cultivos de E. coli recombinante são necessárias para
melhorar a produtividade de produtos heterólogos quando a expressão do gene alvo é
controlada por um promotor repressor (lac, trp, λ
PL
) permitindo que o cultivo ocorra em duas
fases: crescimento celular e expressão gênica (Gombert e Kilikian, 1997). Isto ajuda a manter
a estabilidade dos plasmídeos e evita uma instabilidade estrutural por causa da redução da
pressão seletiva durante a fase de crescimento (Curless et al., 1990). Estes promotores podem
ser ativados com mudanças no meio de cultura tal como, adição de indutor, esgotamento de
repressor ou mudanças de temperatura.
As vantagens dos cultivos com alta densidade celular são: reatores de volume
reduzido, menos esforço nos processos de “upstream” e “dowstream”, produtividades
volumétricas altas, facilidade de separação celular e melhora do rendimento na recuperação
do produto, reduzida perda de água e menor custo para a produção (Riesenberg et al., 1991).
Porém, culturas com alta densidade celular possuem muitas desvantagens, incluindo
limitada disponibilidade de oxigênio dissolvido, níveis de dióxido de carbono que podem
diminuir a velocidade de crescimento e produzir acetato, redução da eficiência de mistura da
fermentação e geração de calor (Makrides, 1996).
Korz et al. (1995) obtiveram uma alta concentração celular em cultivos de E. coli em
batelada alimentada quando se utilizou glicerol como fonte de carbono devido à alta
concentração de glicerol na solução de alimentação. Quando se utilizou glicose, a
concentração de glicose na solução de alimentação não pode ser aumentada devido à
solubilidade limitada da glicose.
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24
Além da obtenção de alta concentração celular, a técnica de batelada alimentada pode
ser aplicada para produção de proteínas recombinantes, ou seja, durante o processo em
batelada alimentada pode ser mantida a velocidade específica constante permitindo a
investigação dos efeitos da velocidade de crescimento na interação vetor-hospedeiro em E.
coli (Korz et al., 1995).
Altos níveis de expressão de proteínas em culturas bacterianas com altas
concentrações celulares são obtidos quando se estabelece um estado de crescimento
balanceado e exponencial. Crescimento balanceado é obtido quando nutrientes são supridos
em quantidades ótimas acima da concentração limite e abaixo da concentração tóxica
(MacDonald e Neway, 1990).
A concentração celular no final da fase de crescimento depende das condições de
cultivo, tais como composição do meio, tipo e concentração da fonte de carbono e
concentração de oxigênio dissolvido (Kilikian et al., 2000).
A glicose, uma fonte de carbono de fácil assimilação, é um repressor catabólito na
biossíntese de antibióticos como penicilina, mitocina, bacitracina e streptomicina. Aumento
da produção de penicilina é alcançado quando se utiliza glicose mais uma fonte de carbono de
metabolismo lento, como a lactose. O processo ocorre em duas fases, a primeira, crescimento
celular, onde é consumido glicose e a segunda é a fase de produção do antibiótico com
consumo de lactose. Uma outra alternativa é a adição lenta de glicose no meio (batelada
alimentada) (Bailey e Ollis, 1986).
A glicose também leva a excreção de substâncias ácidas, como o acetato, que são
prejudiciais ao crescimento celular e a produção de produtos heterólogos (Aristidou et al.,
1995).
E. coli consome preferencialmente glicose do que lactose e, como a lactose induz a
produção de β-galactosidase, em um meio contendo glicose não haverá a produção desta
enzima. Crescimento celular rápido em glicose inibe a produção de AMP cíclico, que
influencia a atividade do promotor operon lac (Bailey e Ollis, 1986).
Gombert et al. (1997) obtiveram alta concentração celular (92 g/L) com alta
produtividade (3,7 g/L.h) na produção de troponina C em E. coli BL21 recombinante através
de cultivo em batelada alimentada em biorreator. A velocidade de crescimento foi mantida
abaixo de 0,30 h
-1
para evitar o efeito Crabtree (inibição por excesso de glicose e alta
velocidade de crescimento) e a concentração de oxigênio foi mantida numa saturação acima
de 30% para evitar o efeito Pasteur (aumento da atividade fermentativa de E. coli por
limitação de oxigênio).
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Fass et al. (1989) cultivaram E. coli em batelada alimentada e obtiveram uma
concentração celular de 45 g/L através de um sistema de ar enriquecido com oxigênio e
mantendo uma velocidade específica de crescimento de 0,55 h
-1
. Este resultado foi três vezes
maior do que o obtido com ar comprimido. Concluíram que sobe condições que asseguram
não limitação por oxigênio, não há inibição por acetato, apesar da alta concentração de glicose
no início do crescimento exponencial.
Embora o melhoramento do meio de cultura favoreça o alcance de altas concentrações
celulares e rendimento de proteínas recombinantes, a produção de ácido acético é também
maior em meios complexos do que definidos (Suárez et al., 1998).
Suárez et al. (1998) testaram um meio de cultura com diferentes concentrações de
extrato de levedura na expressão de troponina C por E. coli BL21 e observaram que a
concentração de extrato de levedura não afeta o crescimento celular ou a cinética em níveis
significativos, mas afeta a concentração de ácido acético no meio, sugerindo que um meio de
cultura sem extrato de levedura é a melhor opção para obter altas concentrações celulares e
expressão de proteína recombinante mantendo a concentração de ácido acético baixa.
2.5.3. Síntese de proteína heteróloga
A quantidade de proteína alvo é manipulada através do tempo de indução, da
disponibilidade do indutor e do controle da velocidade específica de crescimento antes da
indução (Kilikian et al., 2000).
O tipo de indutor, disponibilidade da fonte de carbono e a velocidade específica de
crescimento no início da indução influencia no conteúdo de proteína celular e na velocidade
específica de produção de proteína heteróloga. Em alguns casos alta velocidade específica de
crescimento (µ) ajuda a indução, em outros casos baixo µ ajuda a indução e em alguns casos a
indução independe de µ (Kilikian et al., 2000).
Freqüentemente, quando a expressão da proteína é induzida em um estágio antes da
fase exponencial de crescimento se obtém uma alta produtividade específica (concentração de
proteína por concentração celular por tempo de cultivo), mas resulta em produção volumétrica
(concentração de proteína por tempo de cultivo) insatisfatória devido à baixa concentração
celular no final do cultivo (Lee et al., 1997).
Lee et al. (1997) obtiveram maior produtividade específica na expressão de TGF-α-
PE40 quando utilizaram glicerol como fonte de carbono ao invés de glicose. Observaram
também que a utilização de diferentes quantidades de extrato de levedura no meio causou
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2
6
diferenças na concentração celular final e na produtividade de proteína, sugerindo que a
concentração de extrato de levedura no meio de produção foi fator limitante para alta
concentração celular e expressão de TGF-α-PE40 sob condições fermentativas.
MacDonald et al. (1990) expressaram interleucina-2 humana em E. coli K-12 e
induziram a diferentes densidades celulares e observaram que quando a cultura foi induzida a
densidades celulares mais baixas, houve uma maior produção de interleucin-2.
Riesenberg et al. (1991) observaram que a velocidade de expressão de produtos
recombinantes em E. coli é mais alta a velocidades de crescimentos baixas, como foi provado
na produção de α-interferon-1.
Para alcançar tanto alta concentração celular e alta expressão do produto, estratégias
de cultivos de E. coli a velocidades de crescimento reduzidas são necessárias, isto é, abaixo
do valor crítico para geração de bioprodutos e ótimo para a expressão do produto. A
velocidade de crescimento apropriada depende da linhagem e das condições de cultivo
(Riesenberg et al., 1991).
A indução da expressão de genes exógenos pode ser desencadeada por diferentes
mecanismos, tais como mudança da temperatura de cultivo ou adição de um indutor
específico e, dependendo do promotor utilizado, resulta em diminuição das atividades
celulares, fenômeno conhecido como “metabolic burden” (Kilikian et al., 2000).
Condições de estresse da célula (“metabolic burden”) podem ser desfavorecidas por
mudanças na composição do meio de cultivo, como a suplementação de aminoácidos durante
a fase de crescimento (no caso de cepas auxotróficas, que são incapazes de sintetizar um ou
mais fatores nutricionais de crescimento) e na fase de síntese de produtos heterólogos (Rossi,
2001).
Kilikian et al. (2000) testaram IPTG (isopropiltio-β-d-galactosídeo) e lactose como
indutor para a expressão da proteína troponina C e observaram um rendimento em biomassa
(Y
X/S
) três vezes maior quando se utiliza lactose como indutor ao invés de IPTG, significando
um efeito tóxico do IPTG no metabolismo celular, ou seja, a carga metabólica é mais
pronunciada quando se utiliza IPTG do que lactose. A carga metabólica é maior quando se
têm altos valores de velocidades específicas de produção, que foi observado quando utiliza
IPTG.
Kaprálek et al. (1991) testaram diferentes fontes de carbono e indutores na produção
de prochimosina de bezerro em E. coli HB101 e observaram que utilizando glicerol como
fonte de carbono e IPTG como indutor houve uma diminuição na velocidade específica de
crescimento de 0,81 h
-1
para 0,45 h
-1
após a indução e que depois de 4 h de indução 100 % das
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2
7
células com diâmetro médio de 1µm continham prochimosina. Observaram também que em
meio complexo contendo triptona e extrato de levedura não houve diferença no crescimento
para diferentes fontes de carbono (lactose, glicose e glicerol).
Vila et al. (1997) expressaram β-galactosidase em E. coli MC1061 em batelada e
observaram que a síntese da proteína foi máxima em uma fase intermediária de crescimento,
diminuindo no início da fase estacionária, mas recuperando progressivamente. Já a produção
de biomassa permanece constante em toda a fase estacionária.
Lim et al. (1998) expressaram γ-interferon em E. coli controlado pelo promotor P
L
,
termosensível induzido à 42ºC, e induziram a diferentes fases de crescimento. Observaram
que é necessário que a velocidade específica de crescimento após indução seja maior que um
valor crítico para se obter alta produção de γ-interferon e que foi maior quando a indução foi
realizada antes da fase exponencial de crescimento. Houve uma redução na velocidade
específica de crescimento após a indução, o que é explicado pelo fato de que altas
temperaturas causam danos a células.
Curless et al. (1990) investigaram diferentes vazões específicas de diluição (D) na
produção de α-interferon em E. coli K-12 sob o controle de um promotor termosensível e
observaram uma aumento de quatro vezes na expressão quando se aumentou D de 0,025 h
-1
a
0,200 h
-1
, concluindo que a expressão depende da velocidade específica de crescimento antes
da indução. Obtiveram um rendimento máximo após 3 h de indução.
Marcadores de seleção são importantes. Quando um gene no plasmídeo é resistente a
antibióticos pode-se selecionar rapidamente e positivamente as células que contêm o
plasmídeo com a adição de antibióticos no meio de cultura. Estes marcadores facilitam
pesquisas, pois rapidamente são identificadas colônias que contêm o vetor e minimiza
competições com plasmídeos livres na célula que podem ter surgido durante o crescimento
celular (Bailey e Ollis, 1986).
Em cultivos nas quais a concentração de oxigênio dissolvido é reduzida rapidamente,
o número de cópias de plasmídeos dentro das células diminui cerca de 1 %, mesmo que no
meio de cultura haja antibióticos. Em cultivos em grandes escalas é difícil manter altos e
uniformes níveis de oxigênio dissolvido e quando isto ocorre, o plasmídeo introduzido pode
se tornar instável e se perder da célula recombinante, reduzindo desta maneira o rendimento
da proteína de interesse. Esta consideração é importante quando o cultivo é realizado a
grandes volumes e não se consegue uma boa mistura, ou quando em cultivos contínuos, onde
as células selvagens irão predominar (Glick, 1995).
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Lim et al. (1998) observaram que durante a batelada alimentada, os plasmídeos se
tornam instáveis e desta maneira é necessário obter alta concentração celular antes da perda
dos plasmídeos para obter altos níveis de expressão, e isto foi alcançado com uma
alimentação exponencial antes da indução.
Spiegeleer et al. (2004) cultivaram E. coli MG1655 em meio Luria Bertani (10 g/L de
triptona, 5 g/L de extrato de levedura e 5 g/L de NaCl) e observaram que dependendo da
origem da triptona deste meio há diferenças na sensibilidade do stress oxidativo da célula.
Este stress oxidativo em culturas bacterianas é causado quando a conversão de oxigênio em
água na respiração celular é incompleta, e cerca de 1% do oxigênio utilizado é liberado não
como água, mas como espécies reativas de oxigênio, tais como peróxido de hidrogênio
(H
2
O
2
), o radical superóxido (O
2
-
), o radical hidroxil (OH
-
) e O
2
. Concentrações baixas destas
espécies reativas de oxigênio têm uma função fisiológica, concentrações altas, que são
originadas pelo stress oxidativo são perigosas. O stress pode causar danos subletais às células
e células danificadas podem ser sensíveis a condições que não afetam células não danificadas
(Spiegeleer et al., 2004).
Uma alternativa para aumentar a produtividade e o rendimento de produção de
proteínas heterólogas inclui a adição de metabólitos e nutrientes no meio, principalmente
durante a fase de expressão (Ramírez e Bentley, 1993).
Ramírez et al. (1993) testaram diferentes aminoácidos no meio de cultura para a
expressão de cloranfenicol-acetil-transferase em E. coli RR1 e JM105. Primeiramente a
fenilalanina, pois a cloranfenicol-acetil-transferase é rica em fenilalanina, sugerindo o uso
deste aminoácido como precursor. Os autores observaram que as adições de IPTG e
fenilalanina em níveis intermediários aumentam a produção de cloranfenicol-acetil-
transferase e, que a adição de fenilalanina em culturas não induzidas não causa alteração na
velocidade específica de crescimento celular, ao contrário de culturas induzidas, nas quais o
crescimento é aumentado com a adição de fenilalanina. Observaram também, que a atividade
enzimática pode ser estabilizada com a adição de fenilalanina em níveis intermediários e
concluíram que a adição de um precursor intermediário pode aumentar de 2 a 6 vezes o
rendimento em produto recombinante.
Materiais e Métodos
29
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Microrganismo
Foi utilizada a linhagem de E. coli BL21 (DE3), disponível no laboratório de Biologia
Molecular do DGE/UFSCar, mantida em glicerol 10% m/v e cloreto de cálcio 0,1M a –80 ºC
e transformada com o plasmídeo pET28a contendo o gene da canacistatina (pET28canecys).
3.2. Meios de cultura
No ensaio denominado “padrão” foi utilizado como meio de cultura de reativação o
meio LB (Luria Bertani) descrito por Spiegeleer et al. (2004) e como meios de inóculo e de
produção, o meio comercial Circlegrow
®
à concentração de 40 g/L. Tal meio de cultura é
atualmente utilizado no DGE/UFSCar no bioprocesso de expressão de canacistatina.
Alternativamente aos meios utilizados no cultivo padrão foi utilizado meio de cultura
descrito por Kaprálek et al. (1991), variando-se a fonte de carbono e ajustando o pH em 7,0.
3.2.1. Meio de cultura de reativação
O meio de cultura de reativação LB proposto por Spiegeleer et al., 2004 teve a
seguinte composição:
Componente Concentração (g/L)
Triptona 10,0
Extrato de levedura 5,0
NaCl 5,0
Kanamicina 25 µg/mL
3.2.2. Meios de cultura de inóculo
Os meios de cultura de inóculo tiveram a seguinte composição:
Componente Concentração (g/L)
Fonte de carbono 10,0
Materiais e Métodos
30
Triptona 10,0
Extrato de levedura 2,0
Na
2
HPO
4
.12H
2
O 28,6
KH
2
PO
4
2,7
Kanamicina 25 µg/mL
3.2.3. Meios de cultura de produção
Os meios de cultura de produção empregados tiveram a seguinte composição:
Componente Concentração (g/L)
Fonte de carbono 5,0
Triptona 10,0
Extrato de levedura 2,0
Na
2
HPO
4
.12H
2
O 28,6
KH
2
PO
4
2,7
Kanamicina 25 µg/mL
Como fontes de carbono e energia foram avaliadas glicerol e os carboidratos glicose,
frutose, galactose, lactose, sacarose e sacarose invertida (frutose + glicose).
3.3. Indutores
Como indutores da expressão da canacistatina foram avaliados IPTG (isopropiltio-β-
D-galactosídeo) à concentração de 0,4 mM (Soares-Costa et al., 2002) e lactose nas
concentrações de 0,4 mM, 4 mM e 40 mM.
3.4. Métodos analíticos
3.4.1. Determinação da concentração celular
A concentração celular foi determinada pelo método da massa seca por centrifugação a
11000 rpm e 4ºC por 15 min de um volume conhecido de amostra, lavagem e filtração do
precipitado e determinação da massa de células por secagem em estufa a 60 ºC por 20 h.
Materiais e Métodos
31
3.4.2. Determinação das concentrações de substratos
As concentrações de glicerol, glicose, lactose, sacarose, frutose, galactose foram
determinadas por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), utilizando-se coluna
Shodex KS-802 (Lonpak, divisão da Millipore) e água Milli-Q como eluente. O equipamento
foi operado à 80ºC com uma vazão de 1 mL/min. As concentrações de substrato foram
determinadas a partir de curvas de calibração obtidas com soluções com concentrações
inferiores a 1 g/L de substrato. Os picos foram detectados utilizando-se um medidor de índice
de refração das substâncias modelo W410 da Waters.
3.4.3. Determinação da concentração de carboidratos totais
Os carboidratos totais foram determinados pelo método fenol-sulfúrico (Dubois et al.,
1956). Este método consiste na adição de fenol e ácido sulfúrico concentrado que resultam
numa coloração alaranjada na presença de carboidratos.
Transferiu-se 1 mL de amostra para tubos de ensaio, seguido de adição de 1 mL de
fenol 5% m/V e 5 mL de ácido sulfúrico concentrado. Os tubos foram deixados em repouso
por 10 minutos e depois colocados em banho com aquecimento a 30ºC por 15 minutos. A
absorbância foi lida em 488 nm e a curva de calibração foi obtida com solução de lactose em
água com concentrações variando de 10 a 160 mg.L
-1
.
3.4.4. Determinação da concentração de nitrogênio
A concentração de nitrogênio foi determinada pelo método de Kjeldahl, seguindo-se
procedimento descrito no boletim técnico da Micronal, 1985. Nestes ensaios foram utilizadas
uma unidade digestora (B-435) e uma unidade de destilação (Büchi, modelo 323).
Inicialmente, as amostras foram digeridas, adicionaram-se 5 mL de amostras, 25 mL de ácido
sulfúrico concentrado e 2 g de catalisador misto (preparado com uma parte de CuSO
4
e três
partes de K
2
SO
4
) nos tubos de digestão. Em seguida, esta mistura de coloração marrom escuro
foi colocada para ser digerida até que atingisse uma tonalidade verde claro. Em seguida as
amostras eram destiladas.
Para a destilação das amostras foram preparadas soluções de ácido bórico 2 % e NaOH
32 %. Erlenmeyers contendo 100 mL de ácido bórico 2 % e 3 gotas de indicador misto cada
foram, juntamente com os tubos contendo as amostras já digeridas, devidamente posicionadas
Materiais e Métodos
32
na unidade de destilação. 30 mL de água destilada e solução de NaOH foram adicionados ao
tubo até que estes atingissem novamente a coloração marrom escuro. A partir daí, as amostras
foram destiladas por um período de seis minutos. Posteriormente, o destilado coletado no
Erlenmeyer foi então, submetido á titulação.
O conteúdo dos Erlenmeyers foi titulado com HCL padronizado na concentração de
aproximadamente 0,1 N. A concentração de nitrogênio contida nas amostras foi determinada
utilizando a equação descrita abaixo.
()
amostra
HCLHCL
N
V
CV
LgC
14
/
⋅
⋅
=
Equação 3.1
3.4.5. Avaliação da expressão de canacistatina
A expressão da proteína recombinante foi avaliada por eletroforese em gel do tipo
SDS-PAGE (Laemmli, 1970).
3.4.6. Purificação da canacistatina
O método utilizado para a purificação da canacistatina foi o de cromatografia por
afinidade. Vários dos vetores da série pET possuem uma seqüência de aminoácidos que
codifica uma “cauda” de 6 histidinas (His-tag) que é utilizada como parceira de fusão. As
proteínas a serem expressas são clonadas em fusão com o His-tag e podem ser purificadas em
coluna de níquel, o qual apresenta afinidade pelas histidinas. Na maioria dos casos, as
histidinas não interferem na estrutura ou função da proteína purificada.
Foi utilizada uma coluna que contém uma resina de níquel ácido nitrilotriacético (Ni-
NTA Superflow) adquirida da empresa Quiagen. O caldo de fermentação foi centrifugado e o
sobrenadante descartado. O precipitado foi resuspendido em tampão de lise (NaCl 100mM;
Tris HCl 10mM; NaH
2
PO
4
50mM, pH 8,0), sonicado e centrifugado. O sobrenadante foi
passado na coluna Ni-NTA previamente equilibrada com 25mL de tampão de lise. A proteína
foi eluida utilizando o mesmo tampão contendo concentrações crescentes de imidazol (10
mM, 25 mM, 50 mM e 500 mM), pois o imidazol possui afinidade pelo níquel e compete com
as histidinas, liberando a proteína recombinante ligada à resina. A eluição dos tampões na
coluna foi realizada em duas frações de 5mL cada, com exceção do eluente com concentração
de 500 mM que foi passado três vezes. Os eluentes de concentrações 10, 25 e 50 mM foram
Materiais e Métodos
33
descartados, por não apresentarem a proteína totalmente pura. A concentração de proteína
purificada foi determinada nos eluentes de 500 mM.
3.4.7. Determinação da concentração de canacistatina
Após purificação, a concentração de canacistatina foi determinada pelo método
químico proposto por Bradford (1976), que se baseia na interação entre o corante “Comassie
Brillant Blue” G 250 e macromoléculas de proteínas que contêm aminoácidos de cadeias
laterais básicas ou aromáticas e leitura de absorbância no comprimento de onda de 595 nm.
Preparação do reativo:
1. Dissolver 100 mg de “Comassie Brillant Blue” G 250 em 50 mL de etanol 95 %
m/v sob vigorosa agitação;
2. Adicionar 100 mL de ácido fosfórico 85 % m/v em balão volumétrico e completar
com água destilada até 1L;
3. Agitar por 1h;
4. Filtrar a solução em sistema Millipore com papel de filtro Wathman 113.
Com o reativo preparado, a análise foi realizada adicionando-se 5 mL do reativo e 100
µL de amostra. Após 20 minutos à temperatura ambiente, leu-se a absorbância. A leitura
“zero” do espectrofotômetro foi ajustada adicionando 2,5 mL do reativo e 100 µL de água.
A curva de calibração foi realizada através de uma solução mãe de albumina bovina na
concentração de 800 mg/L.
3.5. Metodologia experimental
Foram realizados cultivos descontínuos, primeiramente em mesa incubadora rotativa
da NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC Co., modelo G-25 e posteriormente, os melhores
resultados foram repetidos em um biorreator airlift de volume útil de 6 L, provido de sistemas
de controle de temperatura, pH e medida de concentração de O
2
dissolvido, disponível no
laboratório de Engenharia Bioquímica do DEQ/UFSCar, com o objetivo de observar o
desempenho dos cultivos em condições de não limitação por oxigênio.
Materiais e Métodos
34
3.5.1. Cultivos em mesa incubadora rotativa
Inicialmente, foi adicionado 1 µL de uma suspensão de plasmídeo pET28canecys em
200 µL de suspensão de E. coli BL21 (DE3) competentes mantidas em glicerol 10 % m/v e
cloreto de cálcio 0,1M, sendo a mistura mantida em banho térmico a 42 ºC por 90 s para a
transformação. Um volume de 800 µL de meio LB foi transferido para esta mistura e a mesma
foi mantida a 37 ºC por 1 h. Transferiu-se, 200 µL para uma placa de Petri contendo 20 mL de
meio LB sólido (com presença de ágar) e 20 µL de kanamicina (antibiótico de seleção)
previamente preparada. A placa foi mantida à 37 ºC “overnight” (≈ 16 h). Colônias desta
placa foram transferidas para uma outra placa contendo o mesmo meio de cultura e incubada
“overnight” a 37 ºC. Com alça de platina, foram transferidas células de uma das colônias
formadas para 50 mL de meio de reativação em frasco Erlenmeyer de 250 mL. Este frasco foi
deixado em mesa incubadora rotativa a 37 ºC e 250 rpm por 10 h. Transferiram-se 0,5 mL da
suspensão para frascos Erlenmeyer de 500 mL contendo 50 mL de meio de inóculo, os quais
foram incubados em mesa incubadora rotativa a 37 ºC e 250 rpm por 6 h. Foram inoculados,
então, 5 mL da suspensão em frascos Erlenmeyer de 500 mL contendo 50 mL de meio de
produção e incubados a 37 ºC e 250 rpm. A Figura 3.1 ilustra o procedimento experimental
utilizado.
Figura 3.1: Procedimento experimental utilizado nos cultivos em mesa incubadora rotativa
O trabalho foi dividido em quatro etapas experimentais, descritas a seguir.
Materiais e Métodos
35
3.5.1.1. Etapa 1: Avaliação de diferentes fontes de carbono no crescimento da E.
coli BL21 (DE3)
Nessa etapa foi avaliado o crescimento celular de E. coli BL21 (DE3) em meio de
cultura principal proposto por Kaprálek et al. (1991) utilizando 5 g/L de diferentes fontes de
carbono e energia, a saber, glicerol, glicose, frutose, galactose, lactose, sacarose e sacarose
invertida (glicose + frutose). Tal como descrito no item anterior (3.5.1), foram inoculados
vários Erlenmeyers de 500 mL, contendo 50 mL de meio de cultura principal, com 5 mL de
suspensão de inóculo. A cada 1 hora de cultivo, um frasco considerado como uma amostra era
retirado da mesa incubadora rotativa, sendo analisadas as concentrações de substrato (C
S
) e de
células (C
X
). A partir dos valores de C
S
e C
X
, foram calculados os parâmetros velocidade
específica máxima de crescimento celular (µ
máx
) e o coeficiente de rendimento de substrato a
células (Y
X/S
) de acordo com as equações 3.2 e 3.3. Obteve-se também, relações entre as
concentrações celulares (C
X
) e as densidades óticas (DO) à 600 nm para cada substrato
utilizado.
()
0
0
ln tt
Cx
Cx
máx
−⋅=
µ
Equação 3.2
()
CsCsYCxCx
SX
−⋅+=
0/0
Equação 3.3
Nesta etapa foram realizados no total oito cultivos, incluindo o cultivo padrão, onde o
meio utilizado foi o meio comercial Circlegrow
®
. Estes cultivos estão apresentados na Tabela
3.1 juntamente com seus códigos e substratos utilizados.
Tabela 3.1: Cultivos realizados para obtenção de parâmetros relacionados com o crescimento
celular
Cultivo Substrato
C0_1 Circlegrow
®
C1_1 Glicerol
C1_2 Glicose
C1_3 Frutose
C1_4 Frutose + Glicose
C1_5 Galactose
C1_6 Lactose
C1_7 Sacarose
Materiais e Métodos
3
6
3.5.1.2. Etapa 2: Expressão de canacistatina em caldos de fermentação com
diferentes substratos – Avaliações do momento e tempo de indução
Após a avaliação do crescimento celular nos diferentes substratos estudados,
procedeu-se a avaliação qualitativa da expressão de canacistatina.
Com base nas curvas de crescimento celular nos diferentes substratos e conhecendo-se
as equações que relacionam as densidades óticas (DO) dos caldos de fermentação a 600 nm,
com as concentrações celulares (em g/L), os cultivos realizados na etapa 1 foram repetidos,
sendo a expressão da canacistatina induzida com a adição de IPTG, perfazendo nos caldos
uma concentração de indutor de 0,4 mM tal como proposto por Soares-Costa et al. (2002). As
induções foram realizadas em diferentes momentos dos cultivos; no início (I1), intermédio
(I2) e final (I3) das etapas de crescimento celular.
Após as induções, as expressões qualitativas de canacistatina foram avaliadas após
períodos de 1, 2, 3 e 4 horas, respectivamente.
Como os crescimentos celulares foram diferentes nos diferentes meios de cultura
estudados e, sabendo-se que a canacistatina é uma proteína intracelular, as expressões de
canacistatina foram avaliadas qualitativamente em termos volumétricos e específicos.
Nesta etapa do trabalho foram realizados 21 cultivos, incluindo os cultivos utilizando
Circlegrow
®
como fonte de carbono, sendo os mesmos induzidos com IPTG nos três
momentos de indução (I1, I2 e I3). A Tabela 3.2 apresenta as condições experimentais
empregadas nesta etapa.
Materiais e Métodos
3
7
Tabela 3.2: Condições experimentais empregadas nos cultivos realizados para avaliação
qualitativa da expressão de canacistatina com 0,4 mM de IPTG
Cultivo Substrato momento indução
C0_2 Circlegrow
®
I1
C0_3 Circlegrow
®
I2
C0_4 Circlegrow
®
I3
C2_1 Glicerol I1
C2_2 Glicose I1
C2_3 Frutose I1
C2_4 Frutose + Glicose I1
C2_5 Galactose I1
C2_6 Lactose I1
C2_7 Glicerol I2
C2_8 Glicose I2
C2_9 Frutose I2
C2_10 Frutose + Glicose I2
C2_11 Galactose I2
C2_12 Lactose I2
C2_13 Glicerol I3
C2_14 Glicose I3
C2_15 Frutose I3
C2_16 Frutose + Glicose I3
C2_17 Galactose I3
C2_18 Lactose I3
3.5.1.3. Etapa 3: Avaliação da indução por lactose
Frente aos resultados de indução da expressão de canacistatina com IPTG e com a
finalidade de se reduzir o custo da expressão e a toxicidade, foram realizados ensaios de
indução com lactose.
Como os cultivos contendo glicerol, glicose, frutose + glicose e galactose foram os
que forneceram melhores resultados em relação à expressão de canacistatina, estes foram
induzidos com lactose na concentração de 0,4 mM. Com a finalidade de avaliar a
concentração do indutor (lactose) na expressão de canacistatina, os cultivos contendo glicerol,
glicose e galactose foram induzidos com lactose também nas concentrações de 4 mM e 40
mM.
Nessa etapa do trabalho foram realizados 18 cultivos que estão apresentados na Tabela
3.3.
Materiais e Métodos
38
Tabela 3.3: Condições experimentais empregadas nos cultivos induzidos com lactose
Cultivo Substrato momento indução conc. indutor
C3_1 Glicerol I1 0,4 mM
C3_2 Glicose I1 0,4 mM
C3_3 Frutose + Glicose I1 0,4 mM
C3_4 Galactose I1 0,4 mM
C3_5 Glicerol I2 0,4 mM
C3_6 Glicose I2 0,4 mM
C3_7 Frutose + Glicose I2 0,4 mM
C3_8 Galactose I2 0,4 mM
C3_9 Glicerol I3 0,4 mM
C3_10 Glicose I3 0,4 mM
C3_11 Frutose + Glicose I3 0,4 mM
C3_12 Galactose I3 0,4 mM
C3_13 Glicerol I1 4 mM
C3_14 Glicerol I1 40 mM
C3_15 Glicose I1 4 mM
C3_16 Glicose I1 40 mM
C3_17 Galactose I1 4 mM
C3_18 Galactose I1 40 mM
3.5.1.4. Etapa 4: Avaliação quantitativa da expressão de canacistatina
Pelo fato do objetivo deste trabalho ser o estudo da expressão de canacistatina, torna-
se muito importante quantificar esta expressão. Foram, então, realizados cultivos para
avaliação quantitativa da expressão de canacistatina.
Os cultivos que forneceram os melhores resultados qualitativos da expressão de
canacistatina foram repetidos para obtenção da concentração de canacistatina (C
cc
em g/L) no
caldo de fermentação, a saber, os cultivos C2_1, C2_2, C2_3, C2_5, C3_17 e C3_18, e para
fins de comparação foi repetido o cultivo padrão C0_2, com meio comercial Circlegrow
®
.
Foram realizados nesta etapa mais dois cultivos, um contendo soro de queijo
hidrolisado com uma concentração de 10 g/L de açúcares redutores (C4_1), subproduto
normalmente descartado pela indústria de leite, que contém entre 4,5 e 5 % m/v de lactose
(Siso, 1996), e um outro cultivo utilizando soro hidrolisado simulado, contendo 5 g/L de
galactose e 5 g/L de glicose (C4_2), respectivamente. Como descrito no item 3.5.1, foram
inoculados 5 Erlenmeyers de 500 mL, contendo 50 mL de meio de cultura principal, com 5
mL de suspensão de inóculo. Os cultivos foram induzidos no momento I1 (no início da fase
de crescimento) e após 1 h de indução o conteúdo dos frascos foi centrifugado. Como a
Materiais e Métodos
39
proteína é intracelular, o sobrenadante foi descartado e o precipitado foi congelado para
posterior análise quantitativa da proteína.
Para análise da quantidade de proteína no caldo de fermentação, o precipitado foi
resuspendido e sonicado, seguindo de purificação em coluna de afinidade como descrito no
item 3.4.6. Após a purificação, a concentração da proteína foi determinada pelo método de
Bradford (1976).
3.5.2. Cultivos em biorreator airlift de bancada
Com o objetivo de observar o desempenho dos cultivos em maior escala e em
condições de não limitação por oxigênio, os melhores resultados obtidos em termos de
concentração de canacistatina no caldo de fermentação foram repetidos em biorreator airlift
de bancada de 6 L de volume útil, disponível no laboratório de Engenharia Bioquímica do
DEQ/UFSCar, provido de sistemas de controle de temperatura e pH e medida de concentração
de O
2
dissolvido.
Inicialmente, foi adicionado 1 µL de uma suspensão de plasmídeo pET28canecys em
200 µL de suspensão de E. coli BL21 (DE3) competentes mantidas em glicerol 10 % m/v e
cloreto de cálcio 0,1M, sendo a mistura mantida em banho térmico a 42 ºC por 90 s para a
transformação. Um volume de 800 µL de meio LB foi transferido para esta mistura e mantido
a 37 ºC por 1 h. Transferiu-se 200 µL para uma placa de Petri contendo 20 mL de meio LB
sólido (com presença de ágar) e 20 µL de kanamicina (antibiótico de seleção) previamente
preparada. A placa foi mantida à 37 ºC “overnight” (≈ 16 h). Colônias desta placa foram
transferidas para uma outra placa contendo o mesmo meio de cultura e incubada “overnight” a
37 ºC. Com alça de platina transferiram-se células de uma das colônias formadas para 50 mL
de meio de reativação em frasco Erlenmeyer de 250 mL. Este frasco foi deixado em mesa
incubadora rotativa a 37 ºC e 250 rpm por 10 h. Transferiram-se 0,5 mL da suspensão para
frascos Erlenmeyer de 500 mL contendo 50 mL de meio de inóculo, os quais foram incubados
em mesa incubadora rotativa a 37 ºC e 250 rpm por 6 h. Foram inoculados, então, 600 mL da
suspensão no biorreator airlift contendo 5,4 L de meio de cultura de produção (10 % v/v).
Em todos os cultivos a temperatura foi mantida em 37 ºC, o pH em 7,0 e a vazão
específica de aeração em 3 vvm. A Figura 3.2 ilustra o procedimento experimental utilizado.
Materiais e Métodos
40
Figura 3.2: Procedimento experimental utilizado nos cultivos em biorreator airlift de bancada
No primeiro cultivo em biorreator airlift, foi avaliado o crescimento celular de E. coli
BL21 (DE3) utilizando o meio de cultura principal proposto por Kaprálek et al. (1991)
contendo 5g/L de glicose como fonte de carbono e energia. Tal cultivo foi denominado A1.
Tal como descrito no item anterior (3.5.2), foram inoculados 600 mL da suspensão no
biorreator Airlift contendo 5,4 L de meio de cultura de produção. A cada 1 hora de cultivo, foi
retirada uma amostra de 20 mL, sendo analisadas as concentrações de glicose (C
S
) e de
células (C
X
). Foram medidos, também, valores de DO e de oxigênio dissolvido. A partir dos
valores de C
S
e C
X
, foram calculados parâmetros relacionados com o crescimento celular,
como a velocidade específica máxima de crescimento celular (µ
máx
) e o coeficiente de
rendimento de substrato a células (Y
X/S
) de acordo com as equações 3.2 e 3.3. Obteve-se
também, relações entre a concentração celular (C
X
) e a densidade ótica (DO) à 600 nm.
Após avaliar o crescimento celular de E. coli BL21 (DE3) no biorreator airlift em meio
contendo glicose procedeu-se à avaliação quantitativa da expressão de canacistatina.
Nesta etapa foram realizados três cultivos cuja indução foi realizada no momento I1
(no início da fase de crescimento). Após a indução foram retirados 250 mL de amostra a cada
1 h ao longo de 3 h, para avaliação quantitativa da expressão de canacistatina. A concentração
de canacistatina no caldo foi determinada como descrito nos itens 3.4.6 e 3.4.7. Nos primeiros
dois cultivos foram utilizados glicerol e glicose como fonte de carbono e energia, sendo a
indução realizada com 0,4 mM de IPTG. No último cultivo, com base nos resultados obtidos
Materiais e Métodos
41
em mesa incubadora rotativa, utilizou-se galactose como fonte de carbono, sendo a indução
realizada com 40 mM de lactose, metabolizada também como fonte de carbono.
A Tabela 3.4 ilustra as condições experimentais empregadas nos cultivos realizados no
biorreator Airlift de bancada.
Tabela 3.4. Condições experimentais empregadas nos cultivos realizados no biorreator
Cultivo Substrato Indutor momento indução conc. indutor
A1 Glicose - - -
A2 Glicose IPTG I1 0,4 mM
A3 Glicerol IPTG I1 0,4 mM
A4 Galactose Lactose I1 40 mM
Resultados e Discussão
42
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Cultivos em mesa incubadora rotativa
4.1.1. Etapa 1: Avaliação de diferentes fontes de carbono no crescimento de E.
coli BL21 (DE3)
Inicialmente, foi realizado um cultivo padrão com o meio de cultura comercial
Circlegrow
®
(C0_1) para avaliar o crescimento celular. Este meio de cultura tem uma
composição desconhecida, logo não foi possível obter a curva de consumo de substrato. No
entanto, a partir da análise de carboidratos totais (Dubois et al., 1956) obteve-se o valor de
4,55 g/L Foi analisada, também, a quantidade de nitrogênio total neste meio pelo método
tradicional de Kjedahl (Micronal, 1995) e obteve-se um total de aproximadamente 4 g/L, que
é aproximadamente 3 vezes superior à quantidade de nitrogênio no meio utilizado nos demais
cultivos. O crescimento celular deste cultivo foi relativamente alto comparado com os dos
cultivos subseqüentes, alcançando-se uma concentração celular de 3,27 g/L após 12 h de
cultivo. A Figura 4.1 ilustra o crescimento celular obtido no cultivo C0_1.
02468101214
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
C
x
(g/l)
Tempo (h)
Figura 4.1: Curva de crescimento celular do cultivo padrão (C0_1)
Resultados e Discussão
43
Os cultivos C1_1 a C1_7 foram conduzidos de forma idêntica e tiveram como objetivo
avaliar o crescimento celular com a utilização de diferentes fontes de carbono e energia. Os
cultivos tiveram duração de 12 h, com exceção do cultivo C1_7 que teve duração de 6 h.
As Figuras 4.2 e 4.3 ilustram os perfis de crescimento celular e de consumo de
substrato, respectivamente para as diferentes fontes de carbono estudadas.
0 2 4 6 8 10 12 14
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
C
x
(g/l)
Tempo (h)
Cx
glicerol
(C1_1) Cx
glicose
(C1_2) Cx
frutose
(C1_3)
Cx
frutose+glicose
(C1_4) Cx
galactose
C1_5) Cx
lactose
(C1_6) Cx
sacarose
(C1_7)
Figura 4.2: Curva de crescimento celular
0 2 4 6 8 10 12 14
0
1
2
3
4
5
6
7
C
s
(g/L)
Tempo (h)
Cs
glicerol
(C1_1) Cs
glicose
(C1_2) Cs
frutose
(C1_3) Cs
glicose(frut.+glic.)
(C1_4)
Cs
frutose(frut.+glic.)
(C1_4) Cs
galactose
(C1_5) Cs
lactose
(C1_6) Cs
sacarose
(C1_7)
Figura 4.3: Curva de consumo de substrato
Resultados e Discussão
44
Pela Figura 4.2 pode-se observar que houve crescimento celular em todos os cultivos
realizados. Observaram-se crescimentos semelhantes quando se utilizou glicerol (C1_1),
glicose (C1_2), frutose (C1_3) e frutose + glicose (C1_4), com consumos similares de
substrato. Quando galactose foi utilizada como fonte de carbono (cultivo C1_5), o
crescimento foi o menor de todos e não houve consumo desse substrato, como observado na
Figura 4.3. Provavelmente, aminoácidos livres e peptídeos presentes na triptona e no extrato
de levedura, que também contém uma pequena quantidade de carboidratos, foram utilizados
como fontes de carbono e de nitrogênio. Quando se utilizou sacarose como fonte de carbono
(cultivo C1_7), observou-se que também não houve consumo desta fonte de carbono, embora
tenha havido crescimento celular. Isto se deve ao fato de E. coli não sintetizar invertase.
Quando foi utilizada lactose (C1_6), o crescimento foi lento, devido à necessidade das células
sintetizarem β-galactosidase para hidrolisar esse dissacarídeo e, com isso, disponibilizar a
glicose mais lentamente no caldo fermentativo para ser metabolizada, já que a galactose não é
consumida por este microrganismo. Foi também realizado um cultivo isento de fonte de
carbono e foi observado um crescimento celular maior do que o observado no cultivo
contendo galactose (C1_5), o que sugere que esta fonte de carbono inibe o crescimento celular
de E. coli.
Foram obtidos, também, relações entre as concentrações celulares (C
X
) e as densidades
óticas (DO) a 600 nm. Os gráficos de C
X
em função da DO para os diversos cultivos estão
ilustrados nas Figuras A.1 a A.8 do Apêndice A e na Tabela 4.1 são apresentadas as equações
de reta que relacionam C
X
com DO para os diversos meios de cultura utilizados.
Tabela 4.1: Equações de C
X
em função de DO obtidas nos cultivos
Cultivo Fonte de carbono Equação R
2
C0_1 Circlegrow
®
C
X
= 0,707DO 0,977
C1_1 Glicerol C
X
= 0,501DO 0,982
C1_2 Glicose C
X
= 0,517DO 0,994
C1_3 Frutose C
X
= 0,547DO 0,981
C1_4 Frutose + Glicose C
X
= 0,580DO 0,983
C1_5 Galactose C
X
= 0,392DO 0,991
C1_6 Lactose C
X
= 0,590DO 0,991
C1_7 Sacarose C
X
= 0,163DO 0,996
A Tabela 4.2 apresenta os valores de velocidade específica máxima de crescimento
celular (µ
máx
) e do coeficiente de rendimento de substrato a células (Y
X/S
) obtidos nos
Resultados e Discussão
45
cultivos. No Apêndice B encontram-se os gráficos a partir dos quais pôde-se determinar os
valores de µ
máx
e Y
X/S
dos cultivos (Figuras B.1 a B.8).
Tabela 4.2: Parâmetros de crescimento celular de E. coli em diferentes fontes de carbono
Cultivo
Fonte de carbono
µ
máx
(h
-1
) Y
X/S
(g/g)
C1_1
Glicerol
0,498 0,429
C1_2
Glicose
0,668 0,514
C1_3
Frutose
0,709 0,607
C1_4
Frutose + Glicose
0,472 0,608
C1_5
Galactose
0,352 -
C1_6
Lactose
0,313 0,757
C1_7
Sacarose
0,543 -
Quanto ao coeficiente de rendimento de substrato a células (Y
X/S
), fica evidente a
superioridade do ensaio realizado com lactose (0,757 g/g). No entanto, parece que nesse caso
o microrganismo utilizou parte da fonte de nitrogênio como fonte de carbono e energia. Nota-
se, também, que os crescimentos celulares em termos de consumo de substrato foram
similares.
Foi observado também um crescimento celular quase linear nos cultivos realizados
com glicerol e sacarose. Isto deve ter ocorrido, provavelmente, pela limitação por falta de
oxigênio freqüentemente observada em cultivos em mesa incubadora rotativa.
Em linhas gerais, pode-se notar que houve crescimento celular satisfatório em todos os
substratos utilizados, ficando a escolha do mesmo a ser definida pelo custo da matéria prima
e, principalmente pela quantidade expressada da proteína de interesse.
4.1.2. Etapa 2: Expressão de canacistatina em caldos de fermentação com
diferentes substratos – Avaliações do momento e tempo de indução
Após a etapa de avaliação do crescimento celular, procedeu-se a etapa de avaliação
comparativa da expressão de canacistatina nos diferentes substratos utilizados. Cabe salientar
que após a indução houve uma diminuição significativa na velocidade de crescimento celular
em todos os cultivos realizados. Frente aos resultados de crescimento celular da etapa anterior
e com a finalidade de se avaliar a relação entre momento de indução e expressão de
canacistatina, houve a indução da expressão com IPTG em 3 momentos ao longo do cultivo; a
primeira no início da fase de crescimento (I1), a segunda no meio da fase de crescimento (I2)
e uma última indução no final da fase de crescimento ou no início da fase estacionária (I3).
Estabeleceu-se 4 h como tempo (ou período) máximo de indução, sendo retiradas amostras de
Resultados e Discussão
4
6
1 em 1 h e analisadas em gel tipo SDS-PAGE. Com o objetivo de se comparar as expressões
com base na mesma quantidade de células, utilizou-se a seguinte metodologia: após as
retiradas de amostras, foram lidas as densidades óticas (DO) e, a partir da estimativa da
concentração celular (C
X
) pelas relações entre C
X
e DO (Tabela 4.1), foram utilizados
volumes diferentes de caldo, de tal modo a se ter uma massa constante e igual de células de
0,0003 g (0,3 mg). Esses volumes foram aplicados no gel e as expressões qualitativas em
termos de intensidade da banda foram avaliadas. Esses resultados com base na mesma massa
celular tiveram como objetivo verificar e comparar as produções específicas, ou seja,
quantidade expressada de canacistatina com base na mesma quantidade de células. Outro
procedimento similar, utilizando agora volume constante de 1mL de caldo, nos diferentes
momentos de indução teve como objetivo verificar e comparar as produções volumétricas, ou
seja, quantidade expressada de canacistatina por volume de caldo.
Para fins comparativos em termos de expressão de canacistatina, os géis obtidos estão
ilustrados na Figura 4.4. Para facilitar o entendimento da Figura 4.4, a primeira letra que
define o código da amostra indica o substrato utilizado no cultivo (CG = Circlegrow
®
, G =
glicerol, GL = glicose, F = frutose, FG = frutose +glicose, GA = galactose e L = lactose). O
primeiro número indica o momento da indução; (1) início da fase de crescimento celular (após
1 h de cultivo para os cultivos C0_2, C1_1, C1_2, C1_3 e C1_4, e após 2 h para os cultivos
C1_5 e C1_6), (2) meio da fase de crescimento (3 h para os cultivos C0_3, C1_1, C1_2, C1_3
e C1_4, 4 h para o cultivo C1_5 e 7 h para o cultivo C1_6) e (3) início da fase estacionária (6
h para todos os cultivos, exceto para o C1_6 cujo momento de indução foi igual a 12 h). O
segundo número indica o tempo de indução, que variou de 1 a 4 h após o momento de
indução. Por fim, as letras M ou V indica se a avaliação foi à massa de células constante ou
com volume de caldo constante que define massas diferentes de acordo com a concentração
celular no momento da amostragem.
Pode-se observar através dos resultados da eletroforese, que houve expressão de
canacistatina em todas as condições de cultivo pesquisadas, obtendo-se uma maior expressão
nos cultivos realizados com galactose (C2_5, C2_11 e C2_17) que foram qualitativamente
semelhantes aos cultivos C0_2, C0_3 e C0_4 (cultivos padrão).
Em todos os ensaios realizados observa-se uma maior expressão de canacistatina
quando a indução foi realizada no início da fase de crescimento (C2_1, C2_2, C2_3, C2_4 e
C2_6), resultados que corroboram com informações relatadas por Lee et al. (1997), que
afirmam que a indução antes da fase exponencial de crescimento celular gera altos valores de
produção específica (massa de canacistatina por unidade de massa celular em mg
cc
/g
x
) de
Resultados e Discussão
4
7
proteínas heterólogas. Já a indução em cultivos em fase adiantada de crescimento celular gera
maior produção volumétrica (concentração de proteína em mg
cc
/L), pois a concentração
celular é maior, no entanto, a produção específica é baixa.
Quando se utilizou galactose como fonte de carbono (C2_5), foi observado um
comportamento diferente. A expressão de canacistatina foi crescente em relação ao momento
de indução. Estes resultados estão de acordo com as informações relatadas por Riesenberg et
al. (1991), que observaram que velocidades de expressão de produtos recombinantes em E.
coli são mais altas a velocidades de crescimento baixas.
Pode-se observar, também, que não houve aumento significativo das expressões de
canacistatina após 1 h de indução, o que sugere que 1 h de indução seja suficiente para se
obter boa expressão desta proteína. No entanto, deve-se considerar que após 4 h de indução,
mesmo que o crescimento seja prejudicado pelo indutor, a produção volumétrica é maior uma
vez que se tem mais células no caldo fermentativo.
Resultados e Discussão
48
Figura 4.4: Análise da expressão da canacistatina com 0,4 mM de IPTG sob várias condições
de cultivo. SDS-PAGE mostrando em M, marcador de massa molecular e nas demais
canaletas as amostras oriundas das induções nas diferentes condições. A seta indica a banda
de aproximadamente 13 kDa relativa à canacistatina recombinante.
Para melhor classificar os substratos e condições de indução empregadas em relação à
expressão qualitativa de canacistatina, é apresentado na Figura 4.5 um resumo dos resultados
Resultados e Discussão
49
das expressões ilustradas na Figura 4.4, onde foi aplicado no gel as amostras cujo cultivos
foram induzidos no período I1 com 1 h de indução para as diferentes fontes de carbono e
energia utilizadas.
Figura 4.5: Gel comparativo da expressão da canacistatina com 0,4 mM de IPTG para as
diferentes fontes de carbono utilizadas. SDS-PAGE mostrando em M, marcador de massa
molecular e nas demais canaletas as amostras oriundas das induções nas diferentes condições.
A seta indica a banda de aproximadamente 13 kDa relativa à canacistatina recombinante.
Observando-se a intensidade das bandas geradas na Figura 4.5, os ensaios em que se
obtiveram as melhores expressões em canacistatina podem ser classificados na seguinte
ordem: glicose > frutose > galactose > glicerol >frutose + glicose > lactose. É importante
observar que qualitativamente, a expressão em meio de cultura Circlegrow
foi similar às
expressões nos meios de cultura utilizando glicose, frutose, galactose e glicerol.
4.1.3. Etapa 3: Avaliação da indução por lactose
Frente aos resultados de indução da expressão com IPTG e com a finalidade de reduzir
o custo da expressão e a toxicidade do indutor, foram realizados ensaios de indução com
lactose.
Como os cultivos contendo glicerol, glicose, frutose + glicose e galactose foram os
que forneceram melhores resultados qualitativos em relação à expressão de canacistatina,
estes foram induzidos com lactose na mesma concentração utilizada de IPTG (0,4 mM). O
tempo de indução foi de 1 h. Os géis obtidos nesta etapa estão ilustrados na Figura 4.6.
Resultados e Discussão
50
Figura 4.6: Análise da expressão da canacistatina com 0,4 mM de lactose sob várias
condições de cultivo. SDS-PAGE mostrando em M, marcador de massa molecular e nas
demais canaletas as amostras oriundas das induções nas diferentes condições. A seta indica a
banda de aproximadamente 13 kDa relativa à canacistatina recombinante.
Pode-se observar baixas expressões de canacistatina para todas as fontes de carbono,
exceto quando se utilizou galactose (C3_4, C3_8 e C3_12). Isto pode ser explicado pelo fato
da lactose servir simultaneamente como indutor e como fonte de carbono, havendo a
necessidade, portanto, de se induzir com uma concentração mais alta de lactose ou por um
período de indução maior.
Nesse caso, o fato do cultivo contendo galactose ter resultado em uma boa expressão
de canacistatina pode ser explicado com base na Figura 4.7 (Lehninger et al., 1993). A lactose
entra na célula por intermédio de uma permease (galactosídio permease). Dentro da célula a
β-galactosidase catalisa duas reações: a quebra da lactose em glicose e galactose, e a
conversão de lactose em alolactose, que é o verdadeiro indutor do operon lac. Provavelmente,
quando se tem galactose no meio de cultura, a reação intermediária de conversão da lactose
em alolactose é favorecida, havendo uma maior expressão de canacistatina. A presença do
produto final das reações paralelas pode inibir as conversões dos substratos havendo um
consumo mais lento desses. No caso os substratos são a lactose (reação 1) e a alolactose
(reação 3).
Resultados e Discussão
51
Figura 4.7: Atividades da galactosídio permease e β-galactosidase no metabolismo da
lactose em E. coli
Foram, então realizados cultivos com lactose (como indutor) à concentração de 4 mM
(C3_13, C3_15 e C3_17) e de 40 mM (C3_14, C3_16 e C3_18) com um período de indução
de 5 h, retirando amostras a cada hora para serem analisadas em gel. Esses resultados estão
ilustrados na Figura 4.8.
Resultados e Discussão
52
Figura 4.8: Análise da expressão da canacistatina, induzido com 4 mM e 40 mM de lactose.
SDS-PAGE mostrando em M, marcador de massa molecular e nas demais canaletas as
amostras oriundas das induções nas diferentes condições. A seta indica a banda de
aproximadamente 13 kDa relativa à canacistatina recombinante.
Pode-se observar na Figura 4.8 que não houve expressão significativa nos cultivos
contendo glicose e glicerol, mesmo quando se aumenta a concentração de indutor (lactose) e o
tempo de indução. Já quando se utilizou galactose como fonte de carbono pode-se observar
um aumento na expressão de canacistatina quando induzido com concentrações maiores de
lactose.
Estes resultados mostram que é possível induzir a expressão de canacistatina com
lactose, um indutor não tóxico e de baixo custo. Foi observado no cultivo contendo galactose
como fonte de carbono, expressões semelhantes quando induzido com IPTG ou lactose,
porém há a necessidade de estudos mais aprofundados, para melhor entendimento do
mecanismo de indução.
Resultados e Discussão
53
4.1.4. Etapa 4: Avaliação quantitativa da expressão de canacistatina
Após a etapa de avaliação qualitativa da expressão de canacistatina, procedeu-se a
etapa de avaliação quantitativa da expressão. Os cultivos que forneceram os melhores
resultados qualitativos da expressão de canacistatina foram repetidos para obtenção da
concentração de canacistatina no caldo de fermentação. Foram, portanto, realizados
novamente os cultivos C2_1, C2_2, C2_3, C2_5, C3_17 e C3_18, e para fins de comparação
foi repetido o cultivo padrão C0_2 contendo o meio comercial Circlegrow
®
.
Foram, também realizados cultivos contendo soro de queijo hidrolisado e soro
hidrolisado simulado (C4_1 e C4_2).
Como descrito no item 3.5.1, foram inoculados 5 Erlenmeyers de 500 mL, contendo
50 mL de meio de cultura principal, com 5 mL de suspensão de inóculo. Os cultivos foram
induzidos no momento I1, isto é, após 1 h de cultivo para os ensaios C0_2, C2_1, C2_2,
C3_3, C4_1 e C4_2 e após 2 h para os ensaios C2_5 e C3_17 e C3_18. Após 1 h de indução o
conteúdo dos frascos foi centrifugado, o sobrenadante foi descartado e o precipitado utilizado
para a determinação da concentração de proteína, já que esta é intracelular. O precipitado foi
resuspendido e sonicado para a liberação da proteína para o meio externo. Depois que amostra
foi sonicada, ela foi centrifugada e o sobrenadante foi passado na coluna de afinidade para a
purificação conforme descrito no item 3.4.6. A concentração da canacistatina purificada foi
determinada pelo método de Bradford (1976).
A Tabela 4.3 mostra a concentração de canacistatina obtida para todos os cultivos
realizados, bem como a concentração celular (C
x
) e a produção específica (P
Cc/x
em mg de
canacistatina / g de células).
Tabela 4.3: Concentração de canacistatina obtida para diferentes fontes de carbono
Cultivo Fonte de carbono Indutor C
C
(mg/L) C
X
(g/L) P
Cc/x
(mg/g)
C0_2 Circlegrow
®
0,4 mM de IPTG 50,8 0,79 64,3
C2_1 Glicerol 0,4 mM de IPTG 33,1 0,62 53,4
C2_2 Glicose 0,4 mM de IPTG 32,0 0,62 51,3
C2_3 Frutose 0,4 mM de IPTG 32,2 0,65 49,8
C2_5 Galactose 0,4 mM de IPTG 16,0 0,35 45,1
C3_17 Galactose 4 mM de lactose 14,0 0,20 70,2
C3_18 Galactose 40 mM de lactose 28,1 0,20 140,7
C4_1 Soro hidrolisado 0,4 mM de IPTG 23,8 0,20 119,0
C4_2 Soro hidr. simulado 0,4 mM de IPTG 42,5 0,82 51,8
Resultados e Discussão
54
Em termos de produção volumétrica, com exceção dos cultivos C2_5, C3_17 e C4_1,
foram obtidos resultados bastante semelhantes para todos os cultivos, que foi de
aproximadamente 61 % da concentração de canacistatina obtida no cultivo padrão com o meio
comercial Circlegrow
®
. No entanto, deve-se observar a maior concentração celular obtida
neste cultivo.
Com relação à produção específica desses cultivos (C2_1, C2_2, C2_3, C2_5 e C4_2),
os resultados foram ainda melhores, obtendo-se valores superiores a 75 % daquele obtido no
cultivo padrão Os cultivos C3_17, C3_18 e C4_1 superaram a produção específica do cultivo
padrão em 10 %, 120 % e 85 % respectivamente.
Pode-se perceber uma baixa produção volumétrica quando se utilizou soro de queijo
hidrolisado, mas com uma alta produção específica. Este ensaio pode ser melhorado
utilizando permeado de soro de queijo, que contém somente lactose e sais (sem lipídios e
outras proteínas que podem interferir na indução da canacistatina). Foi observado em uma
análise em HPLC. um resíduo de lactose, ou seja, o que evidencia que o soro não estava
totalmente hidrolisado. Siso (1996) relata que uma das desvantagens da hidrólise enzimática
da lactose é que às vezes ocorre a polimerização da galactose ou lactose formando
oligossacarídeos, sendo difícil obter mais que 75 % de hidrólise. Além do mais, a β-
galactosidase pode ser inibida por lactose.
Estes resultados mostram a possibilidade de expressar a canacistatina em meios de
cultura menos dispendiosos como os que utilizam glicerol e glicose como fontes de carbono e
energia, que são matérias primas de baixo custo em relação a outros substratos. Além do mais,
a utilização de meios de cultura de composição conhecida permite a otimização do tipo e das
condições de cultivo em biorreatores.
A Tabela 4.4 mostra a massa de canacistatina obtida por custo de matéria prima total
empregada (mg
cc
/R$
mp
), para os cultivos induzidos com 0,4 mM de IPTG (C0_2, C2_1, C2_2,
C2_3 e C2_5).
Tabela 4.4: Massa de canacistatina produzida por custo de matéria prima (meio de cultura)
Cultivo Fonte de carbono C
C
(mg/L) mg
cc
/R$
mp
C0_2 Circlegrow
®
50,8 1,22
C2_1 Glicerol 33,1 9,11
C2_2 Glicose 32,0 8,93
C2_3 Frutose 32,2 8,03
C2_5 Galactose 16,0 1,90
Resultados e Discussão
55
4.2. Cultivos em biorreator airlift
4.2.1. Etapa 1: Avaliação do crescimento celular
Com o objetivo de observar o desempenho dos cultivos em condições de não limitação
por oxigênio, foi realizado um cultivo contendo glicose como fonte de carbono e energia em
um biorreator airlift de bancada de 6 L, provido de sistemas de controle de temperatura e pH e
medida de concentração de O
2
dissolvido, disponível no laboratório de Engenharia
Bioquímica do DEQ/UFSCar.
Nesta etapa foi avaliado o crescimento celular de E. coli ao longo de um cultivo que
teve duração de 7 h. A Figura 4.9 ilustra o perfil de crescimento celular e na Figura 4.10 estão
apresentados os perfis de consumo de substrato e de oxigênio dissolvido (OD).
0123456789
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
C
x
(g/l)
Tempo (h)
Figura 4.9: Curva de crescimento celular para o cultivo realizado no biorreator airlift
Resultados e Discussão
5
6
2345678910
0
2
4
6
8
10
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Cs
C
S
(g/L)
Tempo (h)
OD (%)
OD
Figura 4.10: Curva de consumo de substrato e de oxigênio dissolvido no cultivo A1 realizado
no biorreator airlif
Pela Figura 4.9 pode-se observar que houve um crescimento celular bastante
semelhante ao cultivo realizado em mesa incubadora rotativa quando utilizado o mesmo meio
de cultura, o que mostra que não houve limitação por falta de oxigênio. Foi obtido uma
velocidade específica máxima de crescimento celular (µ
máx
) de 0,683 h
-1
, o que não diferiu
muito do valor obtido no cultivo em mesa incubadora rotativa (0,668 h
-1
).
Quanto ao substrato, este foi quase totalmente consumido em aproximadamente 7 h de
cultivo, como observado na Figura 4.10. No cultivo em mesa incubadora rotativa este tempo
foi de 10 h. O coeficiente de rendimento de substrato a células (Y
X/S
) obtido neste cultivo foi
de 0,439 g/g. No Apêndice B encontram-se os gráficos a partir dos quais pôde-se determinar
os valores de µ
máx
e Y
X/S
deste cultivo (Figura B.9).
Obtiveram-se também, relações entre a concentração celular (C
X
) e a densidade ótica
(DO) à 600 nm. O gráfico de C
X
em função da DO deste cultivo está ilustrado na Figura A.9
do Apêndice A.
Pode-se observar também pela Figura 4.10 que houve um rápido consumo de oxigênio
dissolvido neste cultivo, caindo a concentração de OD para aproximadamente em 20 % em 3
h de cultivo, permanecendo entre 20 e 30 % até o final do cultivo.
4.2.2. Etapa 2: Expressão de canacistatina
Com a finalidade de aumentar a produção de canacistatina, procedeu-se a etapa de
expressão de canacistatina em biorreator airlift de bancada. Os melhores resultados obtidos
Resultados e Discussão
5
7
em termos de concentração de canacistatina no caldo de fermentação e produção específica
em mesa incubadora rotativa foram repetidos em biorreator.
Foram realizados três cultivos cuja indução foi realizada no momento I1 (após 1 h de
cultivo para os cultivos A2 e A3 e após 2 h para o cultivo A4). Após a indução foram
retirados 250 mL de amostra a cada 1 h durante 3 h de cultivo, para avaliação quantitativa da
expressão de canacistatina. As Tabelas 4.5 e 4.6 mostram os resultados obtidos de
concentração de canacistatina e produção específica para os três cultivos realizados.
Tabela 4.5: Concentração de canacistatina obtida no cultivo realizado em biorreator airlift
Cultivo Fonte de carbono Indutor Tempo de indução C
C
(mg/L)
1 h 40,1
2 h 47,3
A2 Glicose 0,4 mM de IPTG
3 h 42,9
1 h 26,6
2 h 35,5
A3 Glicerol 0,4 mM de IPTG
3 h 29,1
1 h 17,9
2 h 26,2
A4 Galactose 40 mM de lactose
3 h 41,0
Tabela 4.6: Produção específica de canacistatina obtida nos cultivos realizados em biorreator
airlift
Cultivo Fonte de carbono Tempo de indução C
X
(g/l) P (mg/g)
1 h 0,587
68,3
2 h 0,592
79,9
A2 Glicose
3 h 0,591
72,6
1 h 0,797
33,4
2 h 0,801
44,3
A3 Glicerol
3 h 0,799
36,4
1 h 0,246
72,8
2 h 0,337
77,8
A4 Galactose
3 h 0,46
89,1
Observa-se pelos dados da Tabela 4.5 que o cultivo A2 foi superior ao realizado em
mesa incubadora rotativa utilizando o mesmo meio de cultura, chegando-se ao valor de 80 %
da concentração de canacistatina obtida no cultivo padrão (meio de cultura Circlegrow
®
)
depois de 1 h de indução, chegando a mais de 90 % na segunda hora de indução. Já nos
cultivos A3 e A4 a indução foi um pouco mais lenta em relação ao cultivo realizado em mesa
incubadora rotativa, para mesma fonte carbono, obtendo-se depois de 2 h de indução
Resultados e Discussão
58
aproximadamente a mesma concentração de canacistatina obtida depois de 1 h de indução em
mesa incubadora rotativa.
Em relação às produções específicas, a Tabela 4.6 apresenta os resultados obtidos. Nos
cultivos A3 e A4 foram obtidos resultados inferiores aos obtidos em mesa incubadora
rotativa. No cultivo A2 foi superior até mesmo ao cultivo padrão após 2 horas de indução
(79,9 mg/g).
Os resultados inferiores observados nos cultivos A3 e A4 devem-se ao fato que estes
tiveram um crescimento celular mais rápido em relação aos cultivos em mesa incubadora
rotativa para o mesmo meio de cultura, o que estão de acordo com as informações relatadas
por Riesenberg et al. (1991), que observaram que velocidades de expressão de produtos
recombinantes em E. coli são mais altas a velocidades de crescimento baixas.
Conclusões
59
5. CONCLUSÕES
Quanto à avaliação do crescimento celular, exceto quando utilizadas galactose e
sacarose houve crescimento celular com consumo das respectivas fontes de carbono. Nos
cultivos com galactose e sacarose os peptídeos, aminoácidos e carboidratos presentes no
extrato de levedura e na triptona foram utilizados como fonte de carbono.
A utilização de glicose como fonte de carbono forneceu uma expressão de
canacistatina alta, indicando que não houve inibição ou repressão da produção da proteína
heteróloga por catabólitos do crescimento celular, observado em algumas condições quando
se utiliza glicose como fonte de carbono.
Independente da fonte de carbono utilizada, o tempo de indução não afetou a
expressão, sendo esta mantida constante durante os períodos avaliados (1 a 4 h).
Confirmando informações prévias de literatura, as maiores expressões foram obtidas
em condições de baixo crescimento celular.
A expressão com galactose como fonte de carbono e IPTG como indutor apresentou os
melhores resultados qualitativos, na mesma intensidade de expressão observada no cultivo
padrão utilizando meio de cultura comercial Circlegrow
®
, devido ao baixo e lento
crescimento.
A expressão em meio de cultivo com lactose como indutor foi detectada apenas na
presença de galactose, o que mostra que essa fonte de carbono tem papel importante nesse
processo de expressão.
Nos ensaios quantitativos em mesa incubadora rotativa obteve-se uma produção
volumétrica de no máximo 61 % da concentração de canacistatina obtida no cultivo padrão, a
exceção dos cultivos contendo galactose induzido com 0,4 mM de IPTG e 4 mM de lactose
(C2_5 e C3_17). Obteve-se, ainda, produção específica com valores superiores a 75 %
daquele obtido no cultivo padrão, cultivos contendo glicerol, glicose, frutose e galactose
induzidos com 0,4 mM de IPTG (C2_1, C2_2, C2_3 e C2_5). Os cultivos contendo galactose
e induzido com 4 mM e 40 mM de lactose (C3_17 e C3_18) superaram a produção específica
do cultivo padrão em 10 % e 120 %, respectivamente.
O crescimento celular do cultivo A1 realizado em biorreator airlift foi bastante
semelhante ao cultivo realizado em mesa incubadora rotativa quando utilizado o mesmo meio
de cultura, concluindo-se que não houve limitação por falta de oxigênio nos cultivos
realizados em mesa incubadora rotativa.
Conclusões
60
No ensaio A2 realizado no biorreator airlift obteve-se um valor de concentração de
canacistatina superior ao àquele obtido em mesa incubadora rotativa utilizando o mesmo meio
de cultura, chegando-se ao valor de 80 % da concentração de canacistatina obtida no cultivo
padrão (meio de cultura Circlegrow
®
) depois de 1 h de indução, chegando-se a mais de 90 %
na segunda hora de indução. Já nos cultivos A3 e A4 a indução foi um pouco mais lenta em
relação ao cultivo realizado em mesa incubadora rotativa, para mesma fonte de carbono,
obtendo-se depois de 2 h de indução aproximadamente a mesma concentração de
canacistatina obtida depois de 1 h de indução em mesa incubadora rotativa.
A metodologia analítica proposta utilizada para a avaliação qualitativa de canacistatina
possibilitou a avaliação de uma grande quantidade de resultados, permitindo a avaliação de
diferentes fontes de carbono e condições de indução para a otimização da expressão de
canacistatina.
Os resultados mostraram que as diferentes fontes de carbono estudadas foram capazes
de induzir a expressão da canacistatina, sendo possível o estabelecimento de meios de cultura
menos dispendiosos, como os que utilizam glicerol e glicose como fontes de carbono, que são
matérias primas de baixo custo em relação a outros substratos.
Sugestões
61
6. SUGESTÕES
Para continuidade do trabalho, sugere-se as seguintes etapas de desenvolvimento:
- realização de cultivos em batelada utilizando meios de cultura contendo glicose e glicerol
em maiores concentrações e avaliar a expressão de canacistatina em estágios mais avançados
induzindo com IPTG 0,4 mM.
- realização de cultivos em batelada alimentada utilizando meios de cultura contendo glicose
ou glicerol em diferentes condições de operação, que definem diferentes velocidades de
crescimento celular, com indução com IPTG 0,4 mM.
- avaliar a influência da concentração de ácido acético nos cultivos e verificar a relação com a
expressão de canacistatina.
Referências Bibliográficas
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(61) www.jornalcana.com.br
Apêndice
69
APÊNDICE A
As Figuras A.1 a A.9 relacionam as concentrações celulares (Cx) com as densidades
óticas (DO) para os diversos cultivos realizados.
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
C
x
(g/L)
DO à 600 nm
Cx = 0,707 DO
Figura A.1: Relação entre a concentração celular e a densidade ótica para o cultivo padrão
(C0_1)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Cx = 0,501 DO
C
x
(g/L)
DO à 600 nm
Figura A.2: Relação entre a concentração celular e a densidade ótica para o cultivo utilizando
glicerol (C1_1)
Apêndice
70
-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Cx = 0,517 DO
DO à 600 nm
C
x
(g/L)
Figura A.3: Relação entre a concentração celular e a densidade ótica para o cultivo utilizando
glicose (C1_2)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
C
x
(g/L)
DO à 600 nm
Cx = 0,547 DO
Figura A.4: Relação entre a concentração celular e a densidade ótica para o cultivo utilizando
frutose (C1_3)
-0,20,00,20,40,60,81,01,21,41,61,8
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Cx = 0,580 DO
C
x
(g/L)
DO à 600 nm
Figura A.5: Relação entre a concentração celular e a densidade ótica para o cultivo utilizando
frutose + glicose (C1_4)
Apêndice
71
-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
0,0
0,2
0,4
0,6
C
x
(g/L)
DO à 600 nm
Cx = 0,392 DO
Figura A.6: Relação entre a concentração celular e a densidade ótica para o cultivo utilizando
galactose (C1_5)
-0,20,00,20,40,60,81,01,21,41,61,8
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Cx = 0,590 DO
C
x
(g/L)
DO à 600 nm
Figura A.7: Relação entre a concentração celular e a densidade ótica para o cultivo utilizando
lactose (C1_6)
012345678
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
C
x
(g/L)
DO à 600 nm
Cx = 0,163 DO
Figura A.8: Relação entre a concentração celular e a densidade ótica para o cultivo utilizando
sacarose (C1_7)
Apêndice
72
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Cx = 0,554 DO
C
x
(g/L)
DO à 600 nm
Figura A.9: Relação entre a concentração celular e a densidade ótica para o cultivo no Airlift
Apêndice
73
APÊNDICE B
As Figuras B.1 a B.9 ilustram os gráficos a partir dos quais pôde-se determinar os
valores dos parâmetros cinéticos de crescimento (µ
máx
e Y
X/S
) para os diferentes cultivos.
012345
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
Ln(Cx)
Tempo (h)
µ
máx.
= 0,296h
-1
Figura B.1: Curva para determinação da velocidade específica máxima de crescimento celular
(µ
máx
) para o cultivo padrão (C0_1)
0123456
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
µ
máx.
= 0,498h
-1
Tempo (h)
Ln(Cx)
012
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
C
x
(g/L)
Cs
0
- Cs
Yx/s = 0,429 g/g
Figura B.2: Curva para determinação dos parâmetros cinéticos de crescimento (µ
máx
e Y
X/S
)
para o cultivo utilizando glicerol (C1_1)
Apêndice
74
01234
-2,2
-2,0
-1,8
-1,6
-1,4
-1,2
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0,2
µ
máx.
= 0,668 h
-1
Tempo (h)
Ln(Cx)
012
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
C
x
(g/L)
Cs
0
- Cs
Yx/s = 0,514 g/g
Figura B.3: Curva para determinação dos parâmetros cinéticos de crescimento (µ
máx
e Y
X/S
)
para o cultivo utilizando glicose (C1_2)
0123
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
µ
máx.
= 0,709 h
-1
Ln(Cx)
Tempo (h)
0,0 0,5 1,0 1,5
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
C
x
(g/L)
Cs
0
- Cs
Yx/s = 0,607 g/g
Figura B.4: Curva para determinação dos parâmetros cinéticos de crescimento (µ
máx
e Y
X/S
)
para o cultivo utilizando frutose (C1_3)
01234
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
Ln(Cx)
Tempo (h)
µ
máx.
= 0,472 h
-1
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
C
x
(g/L)
Cs
0
- Cs
Yx/s = 0,608 g/g
Figura B.5: Curva para determinação dos parâmetros cinéticos de crescimento (µ
máx
e Y
X/S
)
para o cultivo utilizando frutose + glicose (C1_4)
Apêndice
75
0123456
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
µ
máx.
= 0,352 h
-1
Ln(Cx)
Tempo (h)
Figura B.6: Curva para determinação da velocidade específica máxima de crescimento celular
(µ
máx
) para o cultivo utilizando galactose (C1_5)
0123456
-3,5
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
µ
máx.
= 0,313 h
-1
Ln(Cx)
Tempo (h)
-0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
C
x
(g/L)
Cs
0
- Cs
Yx/s = 0,757 g/g
Figura B.7: Curva para determinação dos parâmetros cinéticos de crescimento (µ
máx
e Y
X/S
)
para o cultivo utilizando lactose (C1_6)
123
-1,6
-1,4
-1,2
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
µ
máx.
= 0,543 h
-1
Ln(Cx)
Tempo (h)
Figura B.8: Curva para determinação da velocidade específica máxima de crescimento celular
(µ
máx
) para o cultivo utilizando sacarose (C1_7)
Apêndice
7
6
0123
-2,0
-1,8
-1,6
-1,4
-1,2
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
µ
máx.
= 0,683h
-1
Tempo (h)
Ln(Cx)
0123
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
C
x
(g/L)
Cs
0
- Cs
Yx/s = 0,439 g/g
Figura B.9: Curva para determinação dos parâmetros cinéticos de crescimento (µ
máx
e Y
X/S
)
para o cultivo no Airlift
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