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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
JULIO CESAR ROSA E SILVA
Avaliação de marcadores de proliferação celular e apoptose em
tecido endometrial eutópico e ectópico em modelo experimental de
endometriose em coelhas
RIBEIRÃO PRETO
2007
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JULIO CESAR ROSA E SILVA
Avaliação de marcadores de proliferação celular e apoptose em
tecido endometrial eutópico e ectópico em modelo experimental de
endometriose em coelhas
Tese de doutorado apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de
São Paulo para obtenção do título de Doutor em
Medicina.
Área de concentração: Tocoginecologia
Orientador: Prof. Dr. Antonio Alberto Nogueira
RIBEIRÃO PRETO
2007
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Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio
convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.
Rosa e Silva, Julio Cesar. Avaliação de marcadores de proliferação
celular e apoptose em tecido endometrial eutópico e ectópico em modelo
experimental de endometriose em coelhas. Ribeirão Preto, 2007.
61p. : il. ; 29,7cm
Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto/USP – Área de concentração: Tocoginecologia.
Orientador: Nogueira, Antonio Alberto
1. Proliferação celular. 2. Apoptose. 3. Endometriose.
4. Homeostase tecidual. 5. Coelha.
DEDICO ESSE TRABALHO:
Ao meu pai, JAYRO, que sempre foi um grande exemplo de cientista e professor para mim
(no verdadeiro sentido destas palavras), e que com muita dedicação, construiu uma família
exemplar da qual muito me orgulho.
À minha mãe, LILIAN, que muita falta nos faz e que com muito amor e serenidade sempre
nos mostrou o melhor caminho da vida a seguir, da honestidade e do amor. Agradeço a ela
tudo o que sou hoje.
À minha esposa, ANA CAROLINA, que se transformou no principal motivo da minha vida,
e que sempre esteve ao meu lado durante toda minha trajetória profissional e pessoal nestes
últimos 9 anos.
Ao meu filho, MATHEUS, que desde os seus primeiros dias de vida intra-uterina já se tornou
o ser mais amado deste mundo.
À minha família, que sempre esteve presente em todos os momentos da minha vida.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Antônio Alberto Nogueira, meu orientador, meu professor e responsável por este
trabalho e por grande parte da minha formação profissional e pessoal. Exemplo profissional e
pessoal a ser seguido.
Ao Prof. Dr. Sérgio Britto Garcia, pela grande contribuição neste trabalho e pela grande
amizade que nos aproximou desde o início da minha vida nesta instituição.
Ao Prof. Dr. Francisco José Cândido dos Reis, que contribuiu enormemente para este
trabalho, e também na minha formação profissional, do qual muito me orgulho.
Ao Prof. Dr. Rui Alberto Ferriani, pelos ensinamentos, pelo exemplo que é e deve ser seguido
como professor, pesquisador e como pessoa, e principalmente pelas oportunidades abertas.
Ao Prof. Dr. Omero Benedicto Poli Neto, pela amizade e grande colaboração neste e em todos
os nos nossos projetos de pesquisa em conjunto.
Ao Prof. Dr. Antonio Pellicer Martinez, pela oportunidade do conhecimento de um novo
serviço e pelos ensinamentos.
Ao Setor de Reprodução Humana deste Departamento, pelos inúmeros ensinamentos e pelas
oportunidades proporcionadas ao meu crescimento acadêmico e profissional, em especial aos
Professores Rui Alberto Ferriani, Rosana Maria dos Reis, Marcos Felipe Silva de Sá, Marcos
Dias de Moura e Maria Matheus de Sala.
Ao Setor de Vídeo-endoscopia Ginecológica deste Departamento, pelo convívio marcante,
pela amizade, pelos constantes ensinamentos e pela contribuição neste trabalho, Professores
Antônio Alberto Nogueira, Francisco José Cândido dos Reis, Omero Benedicto Poli Neto,
Médico Assistente Hermes de Freitas Barbosa, Pós-graduandas Debora Machado, Mary
Lourdes Montenegro, Liana Gomide, Adriana Peterson, Paula de Souza.
A todos os professores e médicos assistentes deste e de outros Departamentos que muito
contribuíram para a minha formação profissional.
Às Sras. Ilza, Taísa e Rosane, que sempre presentes, contribuíram e seguem contribuindo de
maneira decisiva para o desenvolvimento de toda a pós-graduação deste Departamento e pela
amizade sempre presente.
À todos os funcionários do Setor de Cirurgia Experimental deste hospital, pela ajuda durante a
execução deste trabalho.
Às Sras. Rose e Aline pela ajuda e grande disponibilidade no preparo do material para análise
histológica.
Aos funcionários do laboratório de Ginecologia e Obstetrícia, Albina, Auxiliadora, Cidinha,
Marilda, Cristina, Sandra e Roberta, pela amizade dispensada a mim.
À todos funcionários do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto, pela disponibilidade em ajudar quando necessário.
Ao amigo Hermes, pela amizade e grande colaboração profissional no Setor de Video-
endoscopia Ginecológica deste Departamento.
Aos demais amigos pós-graduandos e médicos assistentes deste departamento, pela amizade e
companheirismo durante estes anos todos, em especial para Adriana Peterson, Alberto Trapp,
Ângela Cury, Alessandra Marcolin, Carolina Sales, Cláudia Baraldi, Conrado Coutinho,
Daniel Tiezzi, Daniela Michelazzo, Davidson Alvarenga, Débora Machado, Elaine Moisés,
Fernanda Rodovalho, Flávia Aguiar, Francisco Magário, Joaquim Sarmento, Laura Santana,
Liana Gomide, Luiz Manetta, Maria Rita Bagio, Mariana Kefalás, Mary Lourdes Montenegro,
Patrícia Reis, Paula Andrea Navarro, Paula de Souza, Rodrigo Ferreira, Stael Porto.
À minha esposa, Ana Carolina, pelo amor vivido em todos estes anos e pelos próximos que
seguramente virão.
Ao meu filho, Matheus, por existir, pois somente assim consolidei em meu coração o exato
significado da palavra AMOR.
À toda minha família, Jayro, Lisete, Fernando, Lucilene, Craig, Jairo Jr., Ana Julieta, Liana,
Jarson, Ana Rita, Leandra, Eduardo, Thiago, Guilherme, Mariana, Ana Carolina, Leonardo,
Pedro, Felipe, Letícia, Lívia, Nathália pela presença constante e decisiva durante toda minha
vida, nos bons e principalmente nos maus momentos.
À minha nova família, Marcos Felipe, Marina, Guilherme, Andréa, Leonardo e Fernanda
pelos grandes momentos vividos juntos e pela amizade criada nestes anos de convívio.
Ao meu tio César, pela presença sempre marcante desde a minha infância, pelos momentos
juntos e pelo amor sempre dedicado a todos nós. Um grande exemplo como cientista e
professor.
A todos os que contribuíram, direta ou indiretamente, para realização desse trabalho.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS EXTRAS ............................................................................................ix
LISTA DE TABELAS.............................................................................................................. x
LISTA DE ABREVIATURAS................................................................................................xi
RESUMO.................................................................................................................................xii
ABSTRACT ............................................................................................................................xv
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................................18
2 JUSTIFICATIVA................................................................................................................ 24
3 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 26
4 ARTIGO............................................................................................................................... 28
4.1 Introdução........................................................................................................................... 29
4.2 Material e Métodos............................................................................................................. 32
4.3 Resultados...........................................................................................................................35
4.4 Discussão............................................................................................................................36
4.5 Referências Bibliográficas.................................................................................................. 41
4.6 Tabelas................................................................................................................................ 46
4.7 Figuras ................................................................................................................................ 50
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................51
6. ANEXOS ............................................................................................................................. 55
Figuras extras
Aprovação do Comitê de Ética em experimentação animal da FMRP
Artigo publicado do mestrado
ix
LISTA DE FIGURAS EXTRAS
Figura 1E – ...............................................................................................................................56
Figura 2E – ...............................................................................................................................56
Figura 3E – ...............................................................................................................................57
Figura 4E –...............................................................................................................................57
Figura 5E -................................................................................................................................58
Figura 6E -................................................................................................................................58
Figura 7E -................................................................................................................................59
Figura 8E -................................................................................................................................59
Figura 9E -................................................................................................................................60
Figura 10E -..............................................................................................................................60
Figura 11E -..............................................................................................................................61
Figura 12E -..............................................................................................................................61
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 .................................................................................................................................... 46
Tabela 2 .................................................................................................................................... 47
Tabela 3 .................................................................................................................................... 48
Tabela 4 .................................................................................................................................... 49
xi
LISTA DE ABREVIATURAS
PCNA: Antígeno nuclear celular proliferativo
IPC: Índice de proliferação celular
IA: Índice de apoptose
IHT: Índice de homeostase tecidual
MMP: Metaloprotease
TIMP: Inibidor tecidual de metaloprotease
VEGF: Fator de crescimento endotelial vascular
DNA: Ácido desóxi-rubonucléico
TNF: Fator de necrose tumoral
HE: Hematoxilina-eosina
TGF: Fator de crescimento tumoral
EGF: Fator de crescimento epidermal
CPI: Cell Proliferation Index
AI: Apoptotic Index
HTI: Homeostatic Tissue Index
xii
Resumo
xiii
RESUMO
Rosa e Silva, J.C. Avaliação de marcadores de proliferação celular e apoptose em tecido
endometrial eutópico e ectópico em modelo experimental de endometriose em coelhas.
2007. Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São
Paulo, Ribeirão Preto, 2007.
Objetivo: Caracterizar o padrão de homeostase (proliferação celular e apoptose) de tecido
endometrial eutópico e ectópico de coelhas submetidas à indução de lesões de endometriose
por modelo experimental já conhecido, quatro e oito semanas após o procedimento de
implantação endometrial.
Material e Métodos: Estudo experimental animal sendo utilizado 20 coelhas adultas Nova
Zelândia, fêmeas e virgens, submetidas à laparotomia para indução da lesão de endometriose,
através da ressecção de um corno uterino e fixação no peritônio pélvico de fragmento de
5mm. As coelhas foram divididas em dois grupos de 10 animais, sendo os animais do grupo
1, sacrificados após 4 semanas da indução da lesão endometrial ectópica e os do grupo 2 após
8 semanas. A lesão foi excisada para análise histológica juntamente com o corno uterino
contralateral, comprovando a presença de tecido endometrial glandular e estromal. Reações de
imunohistoquímica foram realizadas, no tecido endometrial eutópico e ectópico, para
proliferação celular através do PCNA e para apoptose através do fas, na glândula e estroma,
sendo obtido o índice de proliferação celular (IPC) e de apoptose (IA) através do número de
células marcadas por 1000 contadas, e o índice de homeostase tecidual através do coeficiente
entre o IPC e IA.
Resultados: Observou-se maior índice de proliferação no tecido ectópico, tanto glandular
como estromal, quando comparado com o endométrio eutópico, com 4 e 8 semanas após a
xiv
indução da lesão. Contudo, quando as lesões ectópicas foram comparadas entre si, com 4 e 8
semanas, não foi observada diferença significativa. Quando comparamos o índice de
apoptose, observamos que não houve diferença entre o tecido ectópico e o eutópico, tanto
glandular como estromal nas lesões induzidas e analisadas com 4 semanas, porém no tecido
glandular das lesões analisadas com 8 semanas houve diferença significativa entre a lesão
ectópica e o tecido endometrial eutópico 0,0819 ± 0,0213 e 0,0995 ± 0,01336,
respectivamente (p=0,04). A homeostase tecidual foi calculada e observou-se uma tendência
destes tecidos a proliferação, sempre com índices de homeostase tecidual (IPC/IA) acima de
1.
Conclusão: As lesões ectópicas parecem ter uma proliferação celular maior que o endométrio
eutópico levando a uma tendência ao crescimento tecidual descontrolado nas lesões de
endometriose induzidas.
Palavras-chave: endometriose experimental, proliferação celular, apoptose, homeostase
tecidual, coelha
xv
Abstract
xvi
ABSTRACT
Rosa e Silva, J.C. Evaluation of cell proliferation and apoptosis markers on eutopic and
ectopic endometrium in a rabbit experimental model. Thesis (Doctoral) – Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2007.
Objective: To characterize the pattern of tissue homeostasis (cell proliferation and apoptosis)
of eutopic and ectopic endometrium in rabbits four and eight weeks after endometrium
implantation for induction of endometriotic lesions by experimental standardized method.
Material and methods: Animal experimental study with 20 female, virgins and adult New
Zeland rabbits, submitted to laparotomy for endometriosis induction by resection of one
uterine horn, isolation of the correspondent endometrium and fixation of a 5mm tissue
segment to the pelvic peritoneum. The animals were divided in two groups of 10, group 1 was
sacrificed after 4 weeks of endometriosis induction and group 2 eight weeks after the
procedure. The lesion was excised for later histological analysis together with the opposite
uterine horn, just to verify the presence of endometrial gland and stroma.
Immunohistochemistry reactions were performed in order to study cell proliferation (by
PCNA technique) and apoptosis (by fas technique) in the eutopic and ectopic endometrium,
and a Cell Proliferation Index (CPI) and an Apoptotic Index (AI) were calculated based on
these findings, considering the number of marked cells per 1000 counted cells. The
Homeostatic Tissue Index (HTI) was considered to be the relation between CPI and AI
(CPI/AI). Gland and stroma were analyzed separately.
Results: There was an increase in the CPI of the ectopic tissue, considering gland and stroma,
after four and eight weeks of endometriosis induction when comparing to the eutopic one.
However, when comparing the ectopic lesions, there was no difference between four and eight
xvii
weeks of induction. Analyzing the only the AI, there was no difference between the eutopic
and the ectopic endometrium with four weeks, nevertheless there was a significant difference
in the glandular tissue of the lesions with eight weeks when comparing eutopic and ectopic
tissues (0.0819 ± 0.0213 e 0.0995 ± 0.01336, respectively (p=0,04)). Based on HTI there was
a tendency to cell proliferation on these tissues, always with and HTI (CPI/AI) higher than 1.
Conclusions: Ectopic lesions seem to have a higher cell proliferation than the eutopic
endometrium, tending to present an uncontrolled tissue growth in the endometriotic inducted
lesions.
Key words: Experimental endometriosis, cell proliferation, apoptosis, tissue homeostasis,
rabbit
1. Introdução
19
A etiopatogenia da endometriose continua controversa e várias são as teorias
atuais para explicá-la, embora nenhuma delas o faça completamente quando isolada. A mais
aceita é a teoria de Sampson que aponta a presença de células endometriais viáveis no fluxo
menstrual retrógrado como causador das lesões (Sampson, 1927), porém praticamente 90%
das mulheres têm trompas pérvias (Halme et al, 1984) e apresentam fluxo retrógrado e, no
entanto, a maioria não apresenta endometriose. Há também a teoria da metaplasia celômica
(Suginami, 1991), e, mais recentemente, a teoria imunológica (Chung et al, 2002; Braun et al,
2002; Witz et al, 2002 e Nogueira & Abrão, 2000). Hoje se acredita na confluência destas
teorias para a verdadeira explicação da etiopatogenia da endometriose, haveria realmente um
fluxo menstrual retrógrado associado a uma predisposição imunológica no micro-ambiente
peritonial que facilitaria o implante de células endometriais viáveis e com potencial para
implantação.
Alguns fatores que justificariam a predisposição de algumas pacientes à formação
de implantes de endometriose estariam relacionadas com alterações no micro-ambiente
peritonial. Já é descrito por alguns autores o provável mecanismo de invasão do tecido
endometrial descamado no peritônio abdominal. A adesão entre o tecido endometrial e o
peritônio ocorreria por meio das integrinas, que são receptores heterodiméricos trans-
membrana de adesão celular (Witz et al, 2002). O peritônio ao qual está aderido o fragmento
de endométrio teria sua matriz extracelular invadida. Acredita-se que esta invasão ocorra
devido a um desequilíbrio entre enzimas de degradação de componentes da matriz
extracelular e seus reguladores. As metaloproteases (MMPs) são enzimas zinco-dependentes
como as colagenases, gelatinases e as enzimas estromais, que tem expressão mutagênica, com
capacidade de promover a remodelação da matriz extracelular quando associados a seus
inibidores (TIMPs- tissue inhibitors of metalloproteases). Vários estudos têm observado um
aumento na quantidade de algumas MMPs e redução de TIMPs produzidos pelo endométrio
20
eutópico e ectópico de paciente com endometriose em comparação com o endométrio de
pacientes sem a doença, o que justificaria uma maior capacidade invasora deste tecido no
fluxo menstrual retrógrado (Chung et al, 2002). Após a invasão peritonial a viabilidade do
foco endometriótico seria mantida pela neo-formação vascular local desenvolvida sob
estímulo de substâncias angiogênicas como o VEGF (Fator de crescimento endotelial
vascular). O VEGF seria produzido e secretado no fluido peritonial por macrófagos ali
presentes, e teria capacidade de promover crescimento endotelial, aumento da permeabilidade
vascular e modulação da secreção de enzimas proteolíticas relacionadas a angiogênese
(Nogueira & Abrão, 2000). Há estudos descrevendo a presença de VEGF aumentado no
fluido peritonial e no soro de pacientes com endometriose (Oliveira et al, 2005).
A “Homeostase Tecidual” é dada por um equilíbrio entre células em proliferação
e células em processo de degradação (morte celular programada - apoptose). Acredita-se que
nestas pacientes haveria alterações nesta homeostase tecidual dada por uma maior viabilidade
das células endometriais descamadas secundárias a um aumento na capacidade de proliferação
tecidual e pela diminuição dos processos de apoptose. A apoptose é um processo de morte
celular programada que acontece após estímulo específico, no qual há condensação da
cromatina e fragmentação do DNA, do núcleo e da célula em si, com posterior fagocitose por
macrófagos. A apoptose é controlada pela proporção de BCL2 e BAX, duas proteínas
intracelulares, sendo que a BCL2 tem função de bloquear a apoptose, aumentando a sobrevida
da célula e a BAX tem função contra-reguladora, acelerando o processo de apoptose
(Nogueira & Abrão, 2000). No endométrio, a proteína BCL-2 tem sua máxima expressão
durante a fase proliferativa, gradualmente diminuindo até a fase secretora, quando
praticamente não é encontrada, coincidindo com o aumento da incidência de apoptose nessa
fase do ciclo menstrual.
21
Tem sido observado um aumento de macrófagos BCL2+ em tecido endometrial
ectópico analisado por imunohistoquímica, sugerindo maior "resistência" do tecido (Nogueira
& Abrão, 2000). Além disso, também tem sido descrita uma redução do número de
macrófagos e de células apoptóticas no endométrio eutópico de pacientes com endometriose
quando comparado com endométrio de pacientes sem a doença, podendo justificar um
aumento na viabilidade deste tecido para implantação futura (Braun et al, 2002).
Mc Laren et al mediram as proteínas BCL-2 e BAX em tecido endometrial e em
macrófagos de líquido peritoneal de pacientes com endometriose e concluíram que, em tecido
endometrial eutópico ou ectópico, a expressão do BCL-2 acompanha o ciclo menstrual, com
aumento na fase proliferativa e declínio até níveis não mensuráveis na segunda metade da fase
secretora, enquanto a expressão do BAX não se altera, independente da fase do ciclo ou tecido
endometrial eutópico ou ectópico. Adicionalmente, macrófagos expressando a proteína BCL-
2 estavam presentes em número significativamente maior em pacientes com endometriose e
apresentavam variação cíclica, com declínio de seu número até próximo de valores
encontrados em pacientes sem endometriose, na fase secretora. Nas pacientes sem
endometriose, não houve variação cíclica destes macrófagos. Em relação aos macrófagos que
expressavam proteína BAX, um número expressivamente maior deles foi encontrado em
pacientes sem endometriose, porém em ambos os grupos, sem alterações com a fase do ciclo.
O estudo imunohistoquímico revelou população de macrófagos BCL-2 positivo e BAX
negativo presentes apenas em tecido ectópico endometrial (presentes em todas as fases do
ciclo, sem descrição de variações quantitativas de acordo com a fase do ciclo). Especula-se
que a expressão da proteína BCL-2 com a ausência da proteína BAX poderia conferir a estas
células maior resistência a estímulos apoptóticos, aumentando a expectativa de vida destas
células, ou seja, a viabilidade deste tecido. Os autores postularam ainda que, apesar de ser
reconhecido que a ativação de macrófagos freqüentemente resulte em apoptose, a maior
22
quantidade de macrófagos BCL-2 positivos em pacientes com endometriose pode resultar em
maior número de células que sobrevivam ao processo de ativação e, portanto, ser um dos
mecanismos pelo qual se observa maior quantidade de macrófagos ativados no líquido
peritoneal de pacientes com endometriose (Mc Laren et al, 1997).
A apoptose pode ser regulada através da ativação de sinais chamados sinais de
morte (“death signals”), que aumentam a expressão de proteína p53 e ativam receptores de
membrana como as proteínas do sistema fas-fas ligante. O receptor fas, também chamado
CD95, é uma proteína de membrana que pertence à família TNF, que está expressa em uma
grande variedade de tipos celulares. Seu ligante, fasL, também é uma proteína de membrana,
mais restrita a linfócitos T. A interação destas proteínas desencadeia mecanismos
intracelulares que culminam com o processo de apoptose através do estímulo da enzima
caspase-8 (Nagara, 1997).
Alguns marcadores de proliferação celular estão sendo implicados na gênese da
endometriose. O PCNA (proliferative cell nuclear antigen) é avaliado através de estudo
imunohistoquímico e está sendo bastante estudado em neoplasias, estando relacionado a
neoplasias mais indiferenciadas. Fujishita et al., em 1999, avaliando o PCNA em
endometriose mostrou maior expressão do PCNA entre lesões vermelhas, quando comparadas
a lesões brancas e negras (Fujishita et al, 1999).
A complexidade na fisiopatologia da endometriose e a heterogeneidade da doença
levaram ao desenvolvimento de alguns modelos experimentais. O achado de endometriose
espontânea em 25% de animais primatas não humanos (D'Hooghe et al, 1991) com histologia
e localização semelhantes às encontradas em humanos (Cornillie et al, 1985; Clement, 1990;
Cornillie, 1990; Vernon & Wilson, 1985), levou à utilização destes animais como modelo
experimental, porém sua utilização vem sendo progressivamente reduzida devido às
dificuldades éticas e pela heterogeneidade das lesões. A utilização de coelhas passa a ser uma
23
boa opção de modelo experimental, pois se caracteriza pelo desenvolvimento de lesões
homogêneas, geralmente massas sólidas hemorrágicas, facilmente obtidas através de
autotransplante de fragmentos endometriais ou abertura e exposição da cavidade endometrial
(Manyak et al, 1990; Hahn et al, 1986; Rosa e Silva et al, 2004). Além disso, a escolha da
coelha como animal para experimentação se deve ao baixo índice de infecção, sem
necessidade de utilização de antibióticos (Schor et al, 1999) e pela ausência de ciclo estral, o
que dispensa a necessidade de programação dos procedimentos de acordo com a fase do ciclo
do animal.
Em modelo experimental desenvolvido em nosso serviço por Rosa e Silva em
2004, o desenvolvimento das lesões após o implante do tecido endometrial foi de 100% após
quatro e oito semanas, com presença de estroma e glândulas à histologia (Rosa e Silva et al,
2004), fato também relatado em outros estudos experimentais (Schor et al, 1999; Schenken &
Asch, 1980). Os implantes eram bem vascularizados e bem delimitados, com incremento
substancial de tamanho após oito semanas da fixação ao peritônio quando comparado com as
lesões de quatro semanas. Esta facilidade de implantação do tecido endometrial ectópico
traduz a alta eficácia deste modelo experimental para desenvolvimento da endometriose. A
utilização deste tecido para avaliação de marcadores de proliferação tecidual e apoptose pode
ser extremamente útil para identificar o padrão de comportamento destas lesões, elucidando
alguns pontos na etiopatogenia da endometriose. A verdadeira correlação destes focos de
tecido endometrial implantado na parede abdominal das coelhas com a endometriose humana
não é conhecida, por isso estudos comparativos são necessários para que os resultados destes
experimentos possam ser extrapolados para humanos.
24
2. Justificativa
25
Sendo a endometriose uma doença de grande importância clínica e com tantos
pontos obscuros em sua etiopatogenia, o desenvolvimento de modelos experimentais passa a
ter papel fundamental na descoberta de características e padrões de comportamento da doença
e para o desenvolvimento de novas opções terapêuticas, permitindo o teste de novas
medicações. Com base em estudos anteriores que sugerem haver alterações na capacidade de
proliferação e apoptose do tecido endometrial em pacientes com endometriose, o que
justificaria a maior viabilidade do tecido e o desenvolvimento dos focos de lesão peritonial,
este estudo propõe a avaliação da homeostase destes tecidos através de marcadores de
multiplicação celular e apoptose.
26
3. Objetivos
27
Objetivos gerais:
Caracterizar o padrão de homeostase (proliferação celular e apoptose) de tecido
endometrial eutópico e ectópico de coelhas submetidas à indução de lesões de endometriose
por modelo experimental já conhecido, quatro e oito semanas após o procedimento de
implantação endometrial.
A avaliação das lesões em dois tempos tem a finalidade de verificar se existe
modificação tecidual ao longo da evolução das lesões assim como se existe crescimento das
mesmas.
Objetivos específicos:
Avaliar marcadores de proliferação celular e apoptose em tecido endometrial
eutópico e ectópico de coelhas após quatro e oito semanas de implantação das lesões:
• índice de proliferação celular através da marcação do PCNA (proliferative cell
nuclear antigen).
• Índice de apoptose através da marcação do anticorpo fas.
• Índice de Homeostase tecidual, caracterizado pelo coeficiente entre o índice de
proliferação celular e apoptótico.
28
4. Artigo
29
4.1 Introdução
A etiopatogenia da endometriose continua controversa e várias são as teorias
atuais para explicá-la, embora nenhuma delas o faça completamente quando isolada. A mais
aceita é a teoria de Sampson que aponta a presença de células endometriais viáveis no fluxo
menstrual retrógrado como causador das lesões (Sampson, 1927), porém praticamente 90%
das mulheres têm trompas pérvias (Halme et al, 1984) e apresentam fluxo retrógrado e, no
entanto, a maioria não apresenta endometriose. Há também a teoria da metaplasia celômica
(Suginami, 1991), e, mais recentemente, a teoria imunológica (Chung et al, 2002; Braun et al,
2002; Witz et al, 2002 e Nogueira & Abrão, 2000). Hoje se acredita na confluência destas
teorias para a verdadeira explicação da etiopatogenia da endometriose, haveria realmente um
fluxo menstrual retrógrado associado a uma predisposição imunológica no micro-ambiente
peritonial que facilitaria o implante de células endometriais viáveis e com potencial para
implantação.
A “Homeostase Tecidual” é dada por um equilíbrio entre células em proliferação
e células em processo de degradação (morte celular programada - apoptose). Acredita-se que
nestas pacientes haveriam alterações nesta homeostase tecidual dada por uma maior
viabilidade das células endometriais descamadas secundárias a um aumento na capacidade de
proliferação tecidual e pela diminuição dos processos de apoptose.
A apoptose pode ser regulada através da ativação de sinais chamados sinais de
morte (“death signals”)., que aumentam a expressão de proteína p53 e ativam receptores de
membrana como as proteínas do sistema fas-fas ligante. O receptor fas, também chamado
CD95, é uma proteína de membrana que pertence à família TNF, que está expressa em uma
grande variedade de tipos celulares. Seu ligante, fasL, também é uma proteína de membrana,
mais restrita a linfócitos T. A interação destas proteínas desencadeia mecanismos
30
intracelulares que culminam com o processo de apoptose através do estímulo da enzima
caspase-8 (Nagara, 1997).
Alguns marcadores de proliferação celular estão sendo implicados na gênese da
endometriose. O PCNA (proliferative cell nuclear antigen) é avaliado através de estudo
imunohistoquímico e está sendo bastante estudado em neoplasias, estando relacionado a
neoplasias mais indiferenciadas. Estudos avaliando o PCNA em endometriose ainda são
escassos, mas um estudo de Fujishita, em 1999, mostrou maior expressão do PCNA entre
lesões vermelhas, quando comparadas a lesões brancas e negras (Fujishita et al, 1999).
A complexidade na fisiopatologia da endometriose e a heterogeneidade da doença
levaram ao desenvolvimento de alguns modelos experimentais. A utilização de coelhas passa
a ser uma boa opção de modelo experimental, pois se caracteriza pelo desenvolvimento de
lesões homogêneas, geralmente massas sólidas hemorrágicas, facilmente obtidas através de
autotransplante de fragmentos endometriais ou abertura e exposição da cavidade endometrial
(Manyak et al, 1990; Hahn et al, 1986; Rosa e Silva et al, 2004). Além disso, a escolha da
coelha como animal para experimentação se deve ao baixo índice de infecção, sem
necessidade de utilização de antibióticos (Schor et al, 1999) e pela ausência de ciclo estral, o
que dispensa a necessidade de programação dos procedimentos de acordo com a fase do ciclo
do animal.
Em modelo experimental desenvolvido em nosso serviço por Rosa e Silva em
2004, o desenvolvimento das lesões após o implante do tecido endometrial foi de 100% após
quatro e oito semanas, com presença de estroma e glândulas à histologia (Rosa e Silva et al,
2004), fato também relatado em outros estudos experimentais (Schor et al, 1999; Schenken &
Asch, 1980). Os implantes eram bem vascularizados e bem delimitados, com incremento
substancial de tamanho após oito semanas da fixação ao peritônio quando comparado com as
lesões de quatro semanas. Esta facilidade de implantação do tecido endometrial ectópico
31
traduz a alta eficácia deste modelo experimental para desenvolvimento da endometriose. A
utilização deste tecido para avaliação de marcadores de proliferação tecidual e apoptose pode
ser extremamente útil para identificar o padrão de comportamento destas lesões, elucidando
alguns pontos na etiopatogenia da endometriose. A verdadeira correlação destes focos de
tecido endometrial implantado na parede das coelhas com a endometriose humana não é
conhecida, por isso estudos comparativos são necessários para que os resultados destes
experimentos possam ser extrapolados para humanos.
Este estudo tem por objetivo caracterizar o padrão de homeostase (proliferação
celular e apoptose) de tecido endometrial eutópico e ectópico de coelhas submetidas à indução
de lesões de endometriose por modelo experimental já conhecido, quatro e oito semanas após
o procedimento de implantação endometrial. A avaliação das lesões em dois tempos tem a
finalidade de verificar se existe modificação tecidual ao longo da evolução das lesões assim
como existe crescimento das mesmas.
32
4.2 Material e Métodos
1. Animais: o estudo foi realizado no setor de cirurgia experimental do Hospital das
Clínicas de Ribeirão Preto e no Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, laboratório de Oncopatologia.
Foram utilizadas 20 coelhas adultas Nova Zelândia, fêmeas, virgens do biotério da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto. As coelhas foram mantidas em gaiolas apropriadas
sob controle de temperatura, umidade e luminosidade do ambiente por três dias antes da
indução das lesões cirurgicamente e alimentadas com água e ração ad libitum. Todas foram
submetidas à laparotomia para indução da lesão de endometriose, após anestesia geral
endovenosa com 3ml de tionembutal associado a 1ml de xilestasina. O procedimento foi
realizado com todos os cuidados de anti-sepsia e sempre pelo mesmo pesquisador.
2. Técnica de indução das lesões de endometriose: a abertura da cavidade pélvica
foi realizada com incisão longitudinal mediana de aproximadamente 2cm, a 2 cm do púbis do
animal. Posteriormente foi ressecado cerca de 4 cm do corno uterino direito seguido de seu
fechamento. A porção uterina ressecada foi imersa em soro fisiológico 0,9% a 4°C por cerca
de 2 minutos e então incisada longitudinalmente, sendo retirado um fragmento de 5 x 5mm.
Este fragmento de tecido endometrial foi suturado ao peritônio próximo ao trato reprodutivo
da coelha utilizando-se o fio Vicryl 6.0 com a face endometrial livre voltada para a cavidade
abdominal, com posterior fechamento da incisão cirúrgica abdominal. Nenhuma
suplementação hormonal foi administrada antes ou após a laparotomia.
3. Obtenção das lesões para análise histológica: as coelhas foram divididas em dois
grupos de 10 animais, sendo os animais do grupo 1, sacrificados após 4 semanas da indução
da lesão endometrial ectópica e os do grupo 2 após 8 semanas. A lesão foi excisada para
análise histológica juntamente com o corno uterino esquerdo (contralateral) (Figuras 1E e 2E).
Os tecidos retirados foram fixados em formol 10%, processados para inclusão em parafina e
33
corados por hematoxilina e eosina (HE) para análise histológica comprovando a presença de
tecido endometrial glandular e estromal (Figura 3E e 4E).
4. Técnicas de imunohistoquímica: as reações de imunohistoquímica foram
realizadas nos cortes histológicos com 4 a 5µm através de reação antígeno-anticorpo seguida
de revelação da reação com marcador visível ao microscópio. As lâminas desparafinadas e
hidratadas foram recuperadas antigenicamente através de incubação em panela a vapor em
meio tamponado por 40 minutos. Após resfriamento do material, as peroxidases teciduais
endógenas foram removidas pela adição de peróxido de hidrogênio e ligações inespecíficas do
anticorpo primário foram evitadas por adição de soro de cavalo. As lâminas foram então
incubadas com anticorpo primário por 12 horas em câmara úmida. Em seguida, houve a
incubação com anticorpo secundário e, por último, a etapa avidina-biotina. A reação foi
identificada após a revelação por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc., USA) por cinco
minutos e contra coloração com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lâminas.
5. Quantificação da proliferação celular: na avaliação do PCNA, que apresenta
marcação nuclear, utilizamos método quantitativo, com contagem de células marcadas pela
imunohistoquímica em 1000 células contadas na lâmina, procurando contar células nos quatro
quadrantes de cada lâmina. Com base neste cálculo, obtivemos o Índice de Proliferação
Celular (IPC): número de células marcadas para o PCNA em 1000 células contadas, tanto no
tecido glandular como estromal, que foram analisadas separadamente (Figuras 5E, 6E, 7E e
8E).
6. Quantificação da apoptose: na avaliação do fas, que apresenta marcação
citoplasmática, utilizamos o mesmo método quantitativo e obtivemos o Índice de apoptose
(IA) tanto glandular como estromal (Figuras 9E, 10E, 11E e 12E).
7. Índice de Homeostase tecidual: caracterizado pelo coeficiente entre o índice de
proliferação celular e apoptótico.
34
8. Análise estatística: foi realizada através da utilização do software GraphPad
Prism® 2.01 32 Bit Executable (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA), utilizando-
se Teste t pareado e considerando-se nível de significância de 5%.
Todas as lâminas foram analisadas por dois patologistas com experiência em
imunohistoquímica, sem identificação do tipo de tecido analisado.
O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Experimentação Animal da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo.
35
4.3 Resultados
Observou-se maior índice de proliferação no tecido ectópico, tanto glandular como
estromal, quando comparado com o endométrio eutópico, com 4 e 8 semanas após a indução
da lesão (Tabela 1). Contudo, quando as lesões ectópicas foram comparadas entre si, com 4 e
8 semanas, não foi observada diferença significativa (Tabela 2).
Quando comparamos o índice de apoptose, observamos que não houve diferença entre o
tecido ectópico e o eutópico, tanto glandular como estromal nas lesões induzidas e analisadas
com 4 semanas (Tabela 3), porém no tecido glandular das lesões analisadas com 8 semanas
houve diferença significativa entre a lesão ectópica e o tecido endometrial eutópico 0,0819 ±
0,0213 e 0,0995 ± 0,0133, respectivamente (p=0,002) (Tabela 3). Ao compararmos os índices
apoptóticos das lesões ectópicas de 4 e 8 semanas, observamos que tanto no tecido glandular
como estromal houve mais apoptose no grupo de lesões analisadas com 4 semanas (Tabela 2).
A homeostase tecidual foi calculada e observou-se uma tendência destes tecidos a
proliferação, sempre com índices de homeostase tecidual (IPC/IA) acima de 1. A análise
comparativa entre os tecidos mostrou que o tecido ectópico tem uma tendência maior a
proliferação que o tecido eutópico, tanto estromal quanto glandular (Tabela 4). Contudo a
comparação entre a homeostase tecidual da glândula entre 4 e 8 semanas não mostrou-se
diferente significativamente (Tabela 2), ao contrário, no estroma houve diferença entre as
lesões analisadas com 4 e 8 semanas (Tabela 2).
36
4.4 Discussão
Os padrões de proliferação celular e apoptose no endométrio eutópico de pacientes
normais sofrem variações ao longo do ciclo. A proliferação do tecido glandular da camada
funcional do endométrio tem um padrão cíclico, com proliferação máxima na fase
proliferativa tardia, com decréscimo importante ao longo da fase secretora, até praticamente
ausente na fase menstrual. O tecido estromal, ao contrário, apresenta dois picos de
proliferação celular, um na fase proliferativa e outro na fase pré-menstrual. Este mesmo
padrão é mantido em mulheres com endometriose, tanto no tecido glandular quanto estromal,
quando consideramos o tecido endometrial eutópico (Li et al, 1993; Wingfield et al, 1995;
Jurgensen et al, 1996; Nisolle & Donnez, 1997; Beliard et al, 2004). Entretanto, os focos
ectópicos de tecido parecem perder esta ciclicidade (Jones et al, 1995; Nisolle et al, 1997;
Scotti et al, 2000; Beliard et al, 2004). No desenvolvimento deste modelo experimental em
coelhas, um dos fatores considerados foi a ausência de ciclo estral nestes animais, o que
facilitaria a padronização da técnica, permitindo que o procedimento fosse realizado em
qualquer época e mantendo uma característica de similaridade com o tecido endometrial
ectópico.
A teoria de Sampson do fluxo menstrual retrógrado justifica a presença do tecido
endometrial na cavidade pélvica (Sampson, 1927). Entretanto, cerca de 90% das mulheres têm
trompas pérvias (Halme et al, 1984) e apresentam fluxo menstrual retrógrado, sem no entanto
desenvolverem endometriose. Complementando a etiopatogenia da doença, inúmeros estudos
vêm demonstrando uma maior viabilidade deste tecido refluído naquelas pacientes portadoras
da doença. Gebel et al, verificaram que existe uma diminuição da susceptibilidade à apoptose
espontânea no endométrio eutópico de pacientes com endometriose (Gebel et al, 1998), dados
estes que foram corroborados por Meresman et al, em 2000 (Meresman et al, 2000). Além
disso, a capacidade de proliferação celular também se encontra aumentada no endométrio
37
eutópico de pacientes com endometriose quando comparado a pacientes do grupo controle,
em parte secundário à diminuição das concentrações de TGF beta, um regulador de
proliferação e diferenciação das células endometriais. Nas células de linhagem epitelial o TGF
beta mantém a homeostase tecidual limitando seu crescimento através da supressão de fatores
de crescimento promotores de transcrição, como o cMyc, um proto-oncongene, que no tecido
endometrial das pacientes com endometriose encontra-se aumentado (Johnson et al, 2005).
Este aumento na proliferação celular e redução de apoptose descrito para o
endométrio eutópico de pacientes com endometriose se mantêm no comportamento do tecido
ectópico, inclusive de maneira mais proeminente. Como já mencionado, as lesões perdem sua
ciclicidade (Jones et al, 1995; Nisolle et al, 1997; Scotti et al, 2000; Beliard et al, 2004) e
mantém índices de proliferação celular aumentado (Li et al, 1993). Em nosso estudo
verificamos um aumento da capacidade proliferativa do tecido implantado quando o
comparamos ao tecido eutópico, independente do tempo de duração do implante, mostrando
um padrão de comportamento semelhante ao das lesões endometrióticas humanas. Estas
alterações foram verificadas tanto para o componente glandular quanto estromal do tecido
ectópico.
Como a origem do implante é a mesma do tecido eutópico, acreditamos que a
exposição do tecido implantado ao micro-ambiente peritoneal promoveu alterações locais que
culminaram com o desbalanço na homeostase tecidual. Na composição do fluido peritoneal
humano encontramos a presença de substâncias inflamatórias, mesmo em situações normais,
livre de doença, apesar de níveis menos elevados que no fluido peritoneal de pacientes com
endometriose (Kats et al, 2002; Akoum et al, in press).
Em pacientes com endometriose já é bem documentada a presença aumentada de
substâncias inflamatórias e fatores de crescimento no fluido peritoneal (Kats et al, 2002;
38
Akoum et al, in press), bem como o aumento da concentração de macrófagos peritoneais, com
aumento da atividade dos fagócitos mononucleares (Oral & Arici, 1997). Este efeito foi
demonstrado através de medidas de biossíntese de citocinas, metabolismo oxidativo e funções
de citotoxicidade (Zeller et al, 1987; Braun DP et al, 1992; Taketani et al, 1992 e Braun DP et
at, 1996). Braun et al, utilizando cultivo de células endometriais de pacientes com e sem
endometriose, acrescentando fluido peritoneal autólogo ou heterólogo entre os grupos,
verificaram que em pacientes com endometriose o acréscimo de fluido peritoneal autólogo
promovia aumento da proliferação celular, enquanto que o fluido de pacientes férteis
controles produzia redução na proliferação. Em contrapartida em cultura de células
endometriais de pacientes férteis normais, independente do fluido acrescentado, não houve
variação do índice de proliferação celular. Portanto, o aumento da capacidade de proliferação
do tecido em pacientes com endometriose está relacionado não só a alterações específicas do
endométrio, mas também à mudanças no micro-ambiente peritoneal (Braun et al, 2002).
Com o intuito de verificar o impacto de diversos mediadores inflamatórios
secretados por macrófagos sobre a proliferação celular em cultivo de células estromais de
endométrio humano, Hammond et al verificaram a existência de uma resposta pró-
proliferativa dose-dependente destas células in vitro. Diversos fatores foram testados, como o
fator de crescimento epidermal (EGF), o fator de crescimento tumoral alfa (TGF-α), o fator de
crescimento tumoral beta (TGF-β) e o fator de crescimento de fibroblastos (Hammond et al,
1993). A presença de uma maior população de macrófagos ativados na cavidade pélvica de
pacientes com endometriose promove o aumento de secreção destes mediadores,
provavelmente tendo papel importante na etiopatogenia de doença.
Em relação à apoptose, neste estudo, não foi observada diferença entre os tecidos
eutópicos e ectópicos nos implantes de 4 semanas, tanto para estroma como para o tecido
glandular. Em contrapartida, após 8 semanas de implante o tecido glandular apresentou maior
39
índice de apoptose quando comparado ao endométrio eutópico. Este achado talvez possa ser
explicado pelo maior tempo de exposição do tecido implantado ao fluido peritoneal, o que
promoveu mudança na homeostase do tecido. Em consonância com o que ocorre no tecido
ectópico das lesões de endometriose a apoptose espontânea passa a estar supressa (Gebel et al,
1998; Meresman et al, 2000; Szymanowski et al, 2006). O tecido estromal não sofreu
modificações em relação aos índices de apoptose após 8 semanas.
De qualquer maneira, no cômputo geral, o índice de homeostase tecidual (IPC/IA)
apresentou uma tendência dos implantes à proliferação celular, com IHT maiores que 1 em
ambos os componentes histológicos: glândula e estroma.
A teoria inflamatória, uma das teorias para a etiopatogenia da endometriose, propõe
que um ambiente peritoneal pró-inflamatório propiciaria o implante do tecido menstrual
refluído no peritônio pélvico (Chung et al, 2002). Em compensação, a própria presença do
implante poderia promover uma agressão local com conseqüente recrutamento de macrófagos
pélvicos (Oral & Arici, 1997) e ativação de fibroblastos peritoneais (Buckley et al, 2001), os
quais levam a secreção de substâncias inflamatórias, gerando assim um círculo vicioso . Este
estudo vem de encontro à estas dúvidas, os dados aqui verificados indicam que realmente
existe um papel ambiental promovendo uma mudança no comportamento do tecido
endometrial e permitindo a formação das lesões de endometriose. Todavia, não podemos
afirmar que esta transformação se deva à presença de substâncias inflamatórias no fluido
peritoneal, visto que este não foi o objetivo deste estudo e portanto seu desenho não nos
permite tirar tal conclusão.
A boa reprodutibilidade e eficácia do modelo experimental proposto em coelhas já
havia sido confirmada em estudos anteriores (Schor et al, 1999; Rosa e Silva et al, 2004),
embora o comportamento histológico das lesões não houvesse sido estudado. Aqui foi
40
possível caracterizar o padrão de proliferação celular e apoptose do tecido implantado e
verificar que o comportamento das lesões em termos de homeostase tecidual é semelhante
àquele encontrado no tecido eutópico e ectópico de portadoras de endometriose. Portanto, este
modelo experimental de endometriose reproduz satisfatoriamente a endometriose humana e
pode ser utilizado para testes terapêuticos com diferentes classes de droga, com resultados
bastante compatíveis com a realidade clínica.
41
4.5 Referências
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46
4.6 Tabelas
Tabela 1. Índice de Proliferação Celular nas diferentes estruturas histológicas após 4 e 8
semanas:
IPC
Ectópico
Média ± SD
Eutópico
Média ± SD
p
Glândula 4 sem 0.2505 ± 0.0452 0.1830 ± 0.0450 0.001
Estroma 4 sem 0.2026 ± 0.0553 0.1443 ± 0.0379 0.001
Glândula 8 sem 0.2210 ± 0.0368 0.1696 ± 0.0334 0.0003
Estroma 8 sem 0.2010 ± 0.0359 0.1632 ± 0.0320 0.0002
IPC= Índice de Proliferação Celular
47
Tabela 2. Comparação entre IPC, IA e IHT nas diferentes estruturas histológicas após 4 e 8
semanas:
4 semanas
Média ± SD
8 semanas
Média ± SD
p
IPC Glândula 0.2505 ± 0.0452 0.2210 ± 0.0368 0.127
IPC Estroma 0.2026 ± 0.0553 0.2010 ± 0.0359 0.939
IA Glândula 0.1182 ± 0.0379 0.0819 ± 0.0213 0.049
IA Estroma 0.1291 ± 0.0356 0.0921 ± 0.0184 0.0049
IHT Glândula 2.311 ± 0.826 2.935 ± 1.141 0.184
IHT Estroma 1.681 ± 0.608 2.328 ± 0.855 0.0159
IPC= Índice de proliferação celular; IA= Índice de apoptose; Índice de homeostase tecidual
48
Tabela 3. Índice de Apoptose nas diferentes estruturas histológicas após 4 e 8 semanas:
IA
Ectópico
Média ± SD
Eutópico
Média ± SD
p
Glândula 4 sem 0.1182 ± 0.0379 0.1132 ± 0.0162 0.589
Estroma 4 sem 0.1291 ± 0.0356 0.1272 ± 0.0374 0.707
Glândula 8 sem 0.0819 ± 0.0213 0.0995 ± 0.0133 0.002
Estroma 8 sem 0.0921 ± 0.0184 0.0959 ± 0.0156 0.393
IA= Índice de Apoptose
49
Tabela 4. Índice de Homeostase Tecidual (IPC/IA) nas diferentes estruturas histológicas após
4 e 8 semanas:
IHT
Ectópico
Média ± SD
Eutópico
Média ± SD
p
Glândula 4 sem 2.311 ± 0.826 1.659 ± 0.534 0.0043
Estroma 4 sem 1.681 ± 0.608 1.262 ± 0.569 0.0181
Glândula 8 sem 2.935 ± 1.141 1.749 ± 0.486 0.0027
Estroma 8 sem 2.328 ± 0.855 1.750 ± 0.500 0.0029
IHT= Índice de Homeostase Tecidual (IPC/IA)
50
4.7 Figuras
Figura 1. Marcação pelo PCNA em endométrio ectópico
Figura 2. Marcação pelo fas em endométrio ectópica
51
5. Referências Bibliográficas
52
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Este trabalho foi elaborado de acordo com: Universidade de São Paulo. Sistema Integrado
de Bibliotecas. Grupo Diteses. Diretrizes para apresentação de dissertações e teses da
USP: documento eletrônico e impresso / Vânia M. B. de Oliveira Funaro, coord. [et al.].
São Paulo: SIBi-USP, 2004.
As referências bibliográficas foram normatizadas de acordo com: International Committee
of Medical Journals Editors (Vancouver Style). Updated Oct 2001:
http://www.icmje.org/index.html.
55
6. Anexos
56
Figuras extras
Figura 1E. Lesão macroscópica após 4 semanas da indução:
Figura 2E. Lesão macroscópica após 8 semanas da indução:
57
Figura 3E. Lesão microscópica após 4 semanas da indução:
Figura 4E. Lesão microscópica após 8 semanas da indução:
58
Figura 5E. Marcação pelo PCNA em lesão ectópica com 4 semanas de evolução:
Figura 1 e 6E. Marcação pelo PCNA em lesão ectópica com 8 semanas de evolução:
59
Figura 7E. Controle positivo da marcação pelo PCNA:
Figura 8E. Controle negativo da marcação pelo PCNA:
60
Figura 2 e 9E. Marcação pelo fas em lesão ectópica com 4 semanas de evolução:
Figura 10E. Marcação pelo fas em lesão ectópica com 8 semanas de evolução:
61
Figura 11E. Controle positivo da marcação pelo fas:
Figura 12E. Controle negativo da marcação pelo fas:
715
RBGO - v. 26, nº 9, 2004
Trabalhos Originais
26 (9): 715-719, 2004
RBGO
Modelo Experimental para Endometriose em Coelhas com
Seguimento Evolutivo das Lesões
Experimental Endometriosis Model in Rabbits with Follow-up of the Lesions
Julio César Rosa e Silva
1
, Ana Carolina Japur de Sá Rosa e Silva
1
, Pedro Soler Coltro
1
,
Sérgio Britto Garcia
2
, Francisco Cândido dos Reis
1
, Antônio Alberto Nogueira
1
1
Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto - USP
2
Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto - USP
Correspondência:
Antônio Alberto Nogueira
Departamento de Ginecologia e Obstetrícia
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade
de São Paulo
Av. Bandeirantes, 3900 – Campus da USP
14049-900 – Ribeirão Preto – SP
Introdução
A endometriose é, atualmente, uma das doen-
ças ginecológicas mais estudadas. Sua incidên-
cia é variável de acordo com a população analisa-
RESUMO
Objetivos: desenvolvimento de modelo experimental de endometriose em coelhas avaliando
a evolução temporal da doença macro e microscopicamente.
Métodos: foram utilizadas 30 coelhas nas quais induziu-se lesão de endometriose por fixação
de fragmento do corno uterino no peritônio da parede pélvica. Após 4 ou 8 semanas
verificou-se a viabilidade da lesão por laparoscopia. Foi documentado o aspecto visual
endoscópico e feita avaliação anatomopatológica. Os grupos foram comparados quanto à
presença de lesão visual à laparoscopia, seu maior diâmetro, presença de aderências e
histologia da mesma. Na análise estatística foram utilizados os testes t de Student e de Mann-
Whitney, com significância estatística de 5%.
Resultados: em todos os casos foi identificada a presença de lesão visual à laparoscopia
após 4 semanas, sendo 64% císticas, e em 80% dos casos após 8 semanas, 66% císticas. As
aderências estavam presentes em 71% das coelhas após 4 semanas (sendo ausentes nos
implantes) e em 80% das coelhas após 8 semanas (13% nos implantes). O diâmetro das lesões
após 8 semanas de implante foi maior que após 4 semanas (p<0,0001). A análise histológica
mostrou 100% de tecido endometrial (glândula e estroma) em atividade nos 2 grupos.
Conclusão: a utilização desse modelo experimental de endometriose em coelhas mostrou
ser possível reproduzir a doença nesse animal, sendo viável e de fácil execução. Permitiu
documentar as características e a progressão dos implantes, o crescimento e o desenvolvimento
histopatológico. Embora com mesmo aspecto histológico, as lesões após oito semanas foram
maiores que após 4 semanas da implantação.
PALAVRAS-CHAVE: Endometriose. Endometriose: modelo experimental. Laparoscopia.
da, desde 2 a 7,5% em pacientes assintomáticas
submetidas à laqueadura tubária
1,2
até 50% nas
pacientes com dor pélvica associada à infertilida-
de
3
. Caracteriza-se pela presença de tecido
endometrial, seja ele glandular ou estromal, fora
da cavidade uterina
4
. As lesões de endometriose
podem ter aspectos variáveis, podendo ser classi-
ficadas em típicas e atípicas. As lesões típicas são
as negras e as atípicas as vesiculares, brancas,
vermelhas e marrons. Alguns autores defendem
a teoria de que estas seriam manifestações
evolutivas de doença progressiva
5,6
.
A etiopatogenia da endometriose continua
controversa e várias são as teorias atuais para
explicá-la, embora nenhuma delas o faça comple-
tamente quando isolada. A mais aceita é a teoria
716
RBGO - v. 26, nº 9, 2004
de Sampson
4
, que aponta a presença de células
endometriais viáveis no fluxo menstrual retrógra-
do como causador das lesões. No entanto, pratica-
mente 90% das mulheres têm trompas pérvias e
apresentam fluxo menstrual retrógrado
7
e a maio-
ria não apresentará endometriose. Há também a
teoria da metaplasia celômica
8
e, mais recente-
mente, a teoria imunológica
9-11
. Hoje se acredita
na confluência destas teorias para a explicação da
etiopatogenia da endometriose. Haveria realmen-
te fluxo menstrual retrógrado associado a predispo-
sição imunológica no microambiente peritoneal
que facilitaria o implante de células endometriais
viáveis e com potencial para implantação.
A complexidade na sua fisiopatologia e a
heterogeneidade da doença em humanos faz da
endometriose uma das doenças mais estudadas
da atualidade. Para facilitar estes estudos alguns
modelos experimentais vêm sendo propostos. O
achado de endometriose espontânea em 25% de
animais primatas não humanos
12
com histologia
e localização semelhantes às encontradas em
humanos
3,13-15
levou à utilização destes animais
como modelo experimental, porém sua utilização
vem sendo progressivamente reduzida devido às
dificuldades éticas e pela heterogeneidade das le-
sões. As ratas seriam modelos experimentais bem
mais acessíveis com lesões homogêneas e mane-
jo fácil
16
,
mas o pequeno porte do animal dificulta
a abordagem cirúrgica com material laparoscópi-
co. Assim, a utilização de coelhas passa a ser boa
opção de modelo experimental, pois apresenta bai-
xo índice de infecção, sem necessidade, portanto,
de utilização de antibióticos
17
. O porte do animal
facilita o acesso por vídeo-laparoscopia se compa-
rado com ratas, e a ausência de ciclo estral dis-
pensa a necessidade de programação dos procedi-
mentos de acordo com a fase do ciclo do animal.
Além disso, apresentam lesões homogêneas, ge-
ralmente massas sólidas hemorrágicas, facilmen-
te obtidas por meio de autotransplante de fragmen-
tos endometriais ou abertura e exposição da cavi-
dade endometrial
18
. A opção pela técnica cirúrgi-
ca de colocação do implante na parede abdominal
foi feita pela necessidade de visualização fácil da
lesão à laparoscopia.
A padronização e validação de técnica facil-
mente reprodutível tornam-se extremamente im-
portantes para o desenvolvimento deste tipo de
pesquisa, permitindo simular novas propostas
diagnósticas e terapêuticas para a abordagem des-
ta doença. Não encontramos na literatura nenhu-
ma descrição de modelo experimental para endo-
metriose em coelhas com seguimento evolutivo
das lesões utilizando-se da técnica laparoscópica
e acreditamos ser este um modelo prático, que
permitiria caracterizar e documentar as lesões
induzidas com baixas taxas de aderências pélvicas
por ser método pouco invasivo. A proposta deste
estudo é de produzir lesões endometrióticas com
o emprego de laparotomia e realizar o seguimento
evolutivo da lesão por videolaparoscopia e estudo
histológico comparativo das lesões com quatro e
oito semanas após o implante.
Materiais e Métodos
Trata-se de estudo experimental realizado
no setor de cirurgia experimental do Hospital das
Clínicas do Departamento de Cirurgia e Anatomia
e no Departamento de Patologia da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São
Paulo. Foram utilizadas 30 coelhas adultas Nova
Zelândia, fêmeas, virgens, com peso aproximado
de 2,5 kg. As coelhas foram mantidas em gaiolas
apropriadas sob controle de temperatura, umida-
de e luminosidade do ambiente por três dias an-
tes da indução cirúrgica das lesões, alimentadas
com água e ração ad libitum. As coelhas eram pe-
sadas no dia do procedimento inicial.
Todas foram submetidas a laparotomia para
indução da lesão de endometriose, após anestesia
geral endovenosa com 3 mL de tionembutal as-
sociado a 1 mL de xilestasina. Procedeu-se à
tricotomia da parede abdominal dos animais, se-
guida dos cuidados de anti-sepsia. As luvas de
látex foram lavadas com soro fisiológico 0,9%
exaustivamente para redução da formação de
aderências e o mesmo pesquisador realizou to-
dos os procedimentos.
A abertura da cavidade pélvica foi realizada
com incisão longitudinal mediana de aproxima-
damente 2 cm, iniciando 2 cm cranialmente ao
púbis do animal. Posteriormente foi ressecado
segmento de cerca de 4 cm do corno uterino direi-
to, seguido de seu fechamento. A porção uterina
ressecada foi imersa em soro fisiológico 0,9% a
4ºC por cerca de 2 minutos e então incisada lon-
gitudinalmente, sendo retirado fragmento de 5 por
5 mm. Este fragmento de tecido endometrial foi
suturado ao peritônio próximo ao trato reprodutivo
da coelha, utilizando-se fio Vicryl 6.0, com a face
endometrial livre voltada para a cavidade abdomi-
nal, com posterior fechamento da incisão cirúrgi-
ca abdominal. Nenhuma suplementação hormonal
foi administrada antes ou após a laparotomia.
As coelhas foram divididas em dois grupos,
sendo o primeiro denominado grupo 8 semanas,
constituído de 15 animais, que foram submetidos
a laparoscopia diagnóstica para pesquisa de lesões
de endometriose, documentação da lesão por meio
de vídeo e medida da lesão após oito semanas de
sua indução. O outro grupo, chamado grupo 4 se-
manas, também composto de 15 animais, foi sub-
metido aos mesmos procedimentos porém somen-
te após quatro semanas de seguimento. A
EndometrioseSilva et al
717
RBGO - v. 26, nº 9, 2004
laparoscopia foi realizada utilizando-se óptica de
6 mm e 30° e trocarte de 7 mm. Após incisão lon-
gitudinal na pele e tecido subcutâneo de 7,0 mm,
sobre a linha mediana e 6,0 cm abaixo do esterno,
foi introduzido de maneira direta um trocarte de 7
mm. Procedeu-se à insuflação de gás CO
2
com flu-
xo constante de um litro por minuto e pressão
máxima de aproximadamente 3 mmHg e realiza-
da a inspeção da cavidade abdômino-pélvica, com
registro das imagens por meio de vídeo super VHS.
Após a inspeção pélvica, identificação e documen-
tação da lesão, as coelhas foram sacrificadas e a
lesão foi excisada para análise histológica. Os te-
cidos retirados foram fixados em formol 10%, pro-
cessados para inclusão em parafina e corados por
hematoxilina e eosina (HE).
Os grupos foram analisados quanto ao peso
médio das coelhas, ganho de peso total ao longo do
seguimento e tempo cirúrgico da laparotomia du-
rante indução da lesão endometriótica para
homogeneização das amostras e padronização para
posterior comparação. A análise estatística utili-
zou o programa GraphPad Prism
2.01 32 Bit
Executable (GraphPad Software Inc., San Diego,
CA, EUA), utilizando-se o teste estatístico t de
Student para as variáveis peso e tempo de cirur-
gia, que seguiram padrão de distribuição normal
sem diferença à análise de variância. O teste de
Mann-Whitney foi empregado para a comparação
do ganho de peso ao longo de seguimento, pois esta
variável não apresentou distribuição gaussiana.
Os grupos foram então comparados quanto ao as-
pecto visual da lesão e tamanho da mesma; para
esta comparação foi utilizado o teste de Mann-
Whitney, apesar da distribuição normal, já que os
grupos apresentavam variâncias diferentes. Con-
siderou-se o nível de significância de 5%.
Este estudo foi aprovado pela Comissão de
Ética em Experimentação Animal da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São
Paulo.
Resultados
Os grupos apresentaram-se homogêneos
quanto ao peso no início do experimento e ganho
de peso ao longo do seguimento. O peso inicial foi
de 2493,0±231,4 g no grupo 8 semanas e de
2453,0±269,6 g no grupo 4 semanas, com p=0,66, e
o ganho de peso foi de 440,0±284,9 g e de
293,3±301,1 g para os grupos 8 e 4 semanas, res-
pectivamente (p=0,18). O tempo cirúrgico médio da
realização da laparotomia para indução da endo-
metriose, no grupo 8 semanas, foi de 18,6 minutos
e no grupo 4 semanas, de 16,0 minutos (p=0,02).
Na comparação entre os achados cirúrgicos
da videolaparoscopia verificamos que a lesão foi
visualizada em 80% das coelhas do grupo 8 sema-
nas e em 100% do grupo 4 semanas, embora após
o sacrifício do animal e exploração do peritônio via
aberta tenham sido encontradas lesões em todos
os animais, de ambos os grupos. Das lesões visí-
veis na laparoscopia, 66% foram caracterizadas
como de aspecto cístico no grupo 8 semanas, se-
melhante ao achado do grupo 4 semanas, em que
este aspecto foi descrito em 64% das lesões.
As aderências estavam presentes em 71%
das coelhas após 4 semanas, porém em locais dis-
tintos dos implantes endometriais, e em 80% das
coelhas após 8 semanas, sendo 13% no local dos
implantes.
Na avaliação da medida das lesões encon-
tramos diferença significante entre os dois gru-
pos, sendo maiores as lesões após 8 semanas de
seguimento. A média do maior diâmetro das le-
sões do grupo 8 semanas foi de 1,82±0,73 cm (va-
riando de 0,7 a 3,5 cm) e do grupo 4 semanas, de
0,96±0,17 cm (variando de 0,7 a 1,3 cm) (p<0,0001)
(Figura 1).
A análise histológica mostrou que todas as
amostras eram compostas de tecido endometrial
(glândula e estroma) em atividade nos dois gru-
pos, com características morfológicas similares
entre eles. As lesões caracterizaram-se por cistos
de paredes finas localizados sobre a musculatura
estriada da parede abdominal, projetando-se para
a cavidade abdominal. A parede destes cistos era
formada por camada delgada de tecido conjuntivo,
rica em células e revestida por epitélio pavimen-
toso simples. O estroma era rico em fibroblastos e
apresentava alguns macrófagos e eosinófilos, além
de grande quantidade de glândulas endometriais
típicas. Portanto, o tecido da lesão de endometrio-
se não sofreu alterações em sua composição e
arquitetura ao longo do tempo, porém apresentou
aumento de suas dimensões.
Figura 1 - Distribuição dos diâmetros das lesões das coelhas de acordo com o período
de avaliação.
EndometrioseSilva et al
718
RBGO - v. 26, nº 9, 2004
Abstract
Purpose: development of a new experimental model of
endometriosis induction in rabbits evaluating its temporal
evolution both macro-and microscopically.
Methods: thirty female rabbits were submitted to
endometriosis induction through the fixation of a piece of
the left uterine horn to the abdominal peritoneum. After four
or eight weeks the viability of the lesions was verified by
laparoscopy. The lesions were observed endoscopically. The
implants were measured and histological analyses were
made. The groups were compared for the presence of
endometriotic lesion on laparoscopy, presence of adhesions,
implant size and histological aspects. For statistical analyses
we utilized Student’s t and Mann-Whitney’s tests, with a
statistical significance of 5%.
Results: endometriotic lesions were identified in all cases
submitted to laparoscopy after 4 weeks of induction, 64% of
them cystic, and in 80% of the rabbits after eight weeks, 66%
of which cystic. The adhesions were present in 71% of the
rabbits after 4 weeks (none in the implants) and in 80% of
the rabbits after 8 weeks (13% in the implants). The lesions
were significantly larger after 8 weeks (p<0,0001). The
histological analyses showed 100% of endometrial tissue in
both groups.
Conclusion: this experimental model showed that it is possible
to simulate endometriosis in rabbits with a viable and simple
technique, also allowing to record the characteristics and
development of the implants macro-and microscopically.
Discussão
O desenvolvimento das lesões após o implan-
te do tecido endometrial ocorreu em todos os ani-
mais, com presença de estroma e glândulas à
histologia, fato também relatado em outros estu-
dos experimentais. Schor et al.
17
e Schenken e
Asch
19
descrevem inclusive os implantes como
bem vascularizados e bem delimitados, com in-
cremento substancial de tamanho após sete se-
manas da fixação ao peritônio. Esta facilidade de
implantação do tecido endometrial ectópico traduz
a alta eficácia deste modelo experimental para
desenvolvimento da endometriose, o que talvez
permitisse realização do estudo com menor nú-
mero de animais, apesar de que a demonstração
da evolução significativa no diâmetro da lesão não
teria sido possível com casuística menor.
A avaliação videolaparoscópica da lesão, por
ser menos invasiva que a laparotomia, possibilita
a avaliação e documentação seriada do aspecto
macroscópico das lesões e a demonstração de sua
evolução temporal. Esta evolução é bastante evi-
dente em nosso estudo, no qual houve incremen-
to significativo no maior diâmetro da lesão entre
a 4
a
e a 8
a
semana após o implante do tecido
endometrial. A progressão do tecido endometrial
ectópico sugere viabilidade do implante e prová-
vel evolução da doença, e a predominância do as-
pecto cístico das lesões caracteriza atividade
secretora destes focos. Não houve, porém, mudan-
ça nas características histológicas do tecido
endometrial ectópico quando analisado 4 e 8 se-
manas após o implante, sem mudança na cor ou
aspecto visual das lesões à macroscopia e sem
alterações no padrão de distribuição glandular ou
estromal à microscopia. Esses dados são concor-
dantes com os da literatura, que não fazem men-
ção a nenhuma mudança na histologia dos im-
plantes e, sim, crescimento das lesões medidas
pelo maior diâmetro ou pelo volume.
Um quinto das lesões endometrióticas en-
contradas após a abertura da cavidade abdominal
das coelhas do grupo 8 semanas não haviam sido
vistas durante a laparoscopia, pois encontravam-
se aderidas a estruturas adjacentes. A visualização
a céu aberto e a lise destas aderências permiti-
ram identificação de todas as lesões.
O peso das coelhas não diferiu entre os gru-
pos, mostrando, provavelmente, que foram
mantidas sob mesmas condições de alimentação,
luz e temperatura, não havendo, portanto, inter-
ferências das condições ambientais no tamanho
das lesões entre eles.
As primeiras coelhas submetidas à indução
de lesão de endometriose foram as do grupo 8 se-
manas, o que talvez justifique o maior tempo ci-
rúrgico encontrado nos procedimentos deste gru-
po em relação ao grupo 4 semanas; não acredita-
mos, porém, que isto possa ter influenciado na
evolução dos implantes.
A utilização dos modelos experimentais para
testes terapêuticos com drogas já existentes no
mercado, como o danazol, os agonistas do GnRH e
inibidores da aromatase, e com novas substâncias
ainda em fase de experimentação já vem sendo
empregada por alguns autores, com sucesso
20-25
.
A verdadeira equivalência destes focos de tecido
endometrial implantado na parede de ratas e
coelhas com a endometriose humana não é co-
nhecida, por isso estudos comparativos são neces-
sários para que os resultados destes experimen-
tos possam ser extrapolados para humanos.
Com base nos achados deste estudo concluí-
mos que este modelo experimental mostrou-se
eficaz no desenvolvimento de focos de endométrio
ectópico na parede abdominal de coelhas, man-
tendo características evolutivas que sugerem pro-
gressão da lesão ao longo do tempo e viabilidade
do tecido implantado. A possibilidade de realiza-
ção de laparoscopias ou microlaparoscopias seria-
das permite a avaliação macroscópica do aspecto
evolutivo da lesão, registro das imagens e coleta
de material para exame histológico quando neces-
sário, de maneira minimamente invasiva.
EndometrioseSilva et al
719
RBGO - v. 26, nº 9, 2004
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Although the histological aspects were similar, the lesions
after eight weeks were larger than after four, making their
manipulation easier.
KEYWORDS: Endometriosis. Endometriosis: experimental
model. Laparoscopy.
Recebido em: 16/8/04
Aceito com modificações em: 16/9/04
EndometrioseSilva et al
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