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Micheli Evangelista de Souza
Avaliação da microbiota intestinal de indivíduos que
sofreram acidente ocupacional com materiais biológicos
que realizaram profilaxia anti-retroviral
Botucatu –SP
2007
Dissertação apresentada ao programa de Pós-
Graduação em Doenças Tropicais e diagnóstico por
imagem da Faculdade de Medicina de Botucatu,
Universidade Estadual Paulista, Unesp, para obtenção
do título de Mestre.
Orientador: Prof. Adjunto Paulo Câmara Marques
Pereira
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Micheli Evangelista de Souza
Avaliação da microbiota intestinal de indivíduos que
sofreram acidente ocupacional com materiais biológicos
que realizaram profilaxia anti-retroviral
Botucatu –SP
2007
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Dedicatória ii
A Deus
Todo Poderoso, pela sua fidelidade nos momentos de angústia, ou indecisão, que se
fez presente em todas as etapas deste projeto, me fortalecendo tornando possível a
realização deste sonho. Muito obrigado por tudo.
À Edinilson Bochio, meu esposo, pela paciência nas horas a fio em que fiquei na
frente do computador. E além desta paciência, quero agradecê-lo principalmente
pelo compartilhamento do entusiasmo, pela motivação e pelo constante apoio que
sempre me dá. "Você é maravilhoso, meu querido, e é a fonte de inspiração de tudo
o que faço. Com a sua alegria e todo o apoio que me dá eu sei que amanhã será
sempre melhor do que hoje, não importa o que aconteça".
Aos meus pais, com muita dedicação e amor, me deram a educação sem a qual
eu não teria chegado a lugar algum. "Vocês dois são o meu grande orgulho e eu
quero que tudo o que eu faça em toda a minha vida sejam provas de que o pouco
que vocês acham que fizeram por mim, na verdade foi muito mais do que qualquer
filho no mundo poderia querer. Vocês me deram simplesmente tudo e vão estar
eternamente em tudo o que eu fizer".
Ao Cristiano Evangelista de Souza, meu irmão querido e companheiro em todos
os momentos da minha vida, saiba que todo este carinho foi muito importante
mesmo na distância, para realização deste sonho.
Agradecimentos iii
Agradecimentos
Ao Prof. Adjunto Paulo Câmara Marques Pereira, do Departamento de
Doenças Tropicais e Diagnóstico por Imagem da Faculdade de Medicina de
Botucatu/Unesp pela orientação valiosa e pelos ensinamentos importantes para o
amadurecimento profissional durante a realização deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Carlos Magno Castelo Branco Fortaleza, do Departamento de
Doençcas Tropicais e Diagnóstico por Imagem da Faculdade de Medicina de
Botucatu/ Unesp pela colaboração na análise estatística do trabalho.
Aos responsáveis pelo Laboratório de Doenças Tropicais da Faculdade
de Medicina de Botucatu/ Unesp, Carlos Roberto Gonçalves Lima e Sueli
Aparecida Calvin, pelo espaço e apoio durante a realização do trabalho.
Aos Médicos Residentes em Doenças Tropicais do Departamento de
Doenças Tropicais e Diagnóstico por Imagem da Faculdade de Medicina de
Botucatu/Unesp pela colaboração na triagem dos pacientes.
À Amiga pós-graduanda Juliana Geraix do Departamento de Doenças
Tropicais da Faculdade de Medicina de Botuca/Unesp,pela valiosa colaboração para
execução desse trabalho e pela amizade sincera.
Às aprimorandas e pós-graduanda do laboratório de Doenças Tropicais
da Faculdade de Medicina de Botucatu/ Unesp, pela contribuição na realização
deste projeto.
Agradecimentos iv
Áo Erasmo Benício Santos de Moraes Trindade, pela colaboração na
análise copromicrobiológica e sugestões valiosas.
Aos funcionários da enfermaria de Moléstias Infecciosa do Hospital das
Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu pela colaboração na realização
desse trabalho e pela amizade.
À Fundação de Apoio a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo
apoio financeiro para realização desse projeto.
Aos indivíduos participantes-colaboradores, por terem tornado possível a
realização desse trabalho.
Às amigas Ana Paula Alves Pereira e Elizabeth Fernandes Buzinaro pela
amizade sincera em todos os momentos e pela contribuição na realização desse
sonho.
Ao Amigo Neilson Cassimiro pela valiosa colaboração e amizade sincera.
As Nutricionistas do Hospital Estadual Bauru pelo apoio moral e conselhos
sinceros.
Resumo v
Souza. ME. Avaliação da microbiota intestinal de indivíduos que sofreram acidente
ocupacional com materiais biológicos que realizaram profilaxia anti-retroviral.
Botucatu, 2007.88p. Dissertação (Mestrado)-Faculdade de Medicina de Botucatu,
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”.
Resumo
A microbiota intestinal normal embora bastante estável pode se alterar em
condições patológicas, modificações na composição da dieta, presença de distúrbios
gastrointestinais e/ou ingestão de drogas. A associação de infecção com a utilização
de medicamentos dificulta a interpretação da participação desses fatores na
microbiota intestinal. O objetivo do presente estudo foi avaliar a microbiota intestinal
de indivíduos que sofreram acidente ocupacional com materiais biológicos e
receberam anti-retrovirais. Foram estudados 23 indivíduos adultos com idade entre
18-45 anos, sendo 13 doadores de sangue, grupo controle (GC) e 10 que sofreram
acidente ocupacional com material biológico e realizaram profilaxia anti-retroviral.
Foram avaliados a microbiota intestinal, medidas antropométricas, exames
laboratoriais (hemograma, função renal, hepática, lipidograma, glicemia, proteínas
totais e frações) pré, após a medicação e 30 dias após o término da medicação. A
zidovudina mais a lamivudina foi utilizada em 70% dos indivíduos associado ao
nelfinavir, 20% ao efavirenz e 10% ao ritonavir. Náuseas, vômitos e diarréia
estiveram presentes em 80% no segundo momento do estudo. Sobrepeso em 70%,
desnutrição e eutrofia em 10%, dos indivíduos sem alteração durante o estudo. As
enzimas AST, ALT, Gama-GT e triglicérides, LDL-colesterol se elevaram no segundo
momento e se normalizaram 30
dias após término da medicação. Foi observada
Resumo vi
redução significativa dos três gêneros de bactérias anaeróbias avaliadas
Lactobacillus , Bifidobacterium e Bacteróides em relação ao grupo controle nos três
momentos. O uso de anti-retrovirais provocou impacto significativo na microbiota
intestinal dos indivíduos normais em uso de anti-retrovirais, não sendo recuperada
30 dias após o término da medicação.
Palavras chaves: Microbiota intestinal, Anti-retroviral, Acidente ocupacional, Estado
nutricional, HIV-1.
Abstract vii
Souza, M.E. Evaluation of the intestinal microbiota from individuals injured by
biological materials in occupational accident, submitted to antiretroviral prophylaxis.
Dissertation (Master Science). Botucatu, 2007. 87p. School of Medicine of the
Paulista State University. Botucatu, São Paulo, Brazil.
ABSTRACT
Pathological conditions, changes in diet composition, presence of gastrointestinal
disorders and/or ingestion of drugs may alter the normal intestinal microbiota,
regardless of its sufficient steadiness. The association of infection with the use of
medicine makes the interpretation of the participation of these factors in intestinal
microbiota difficult. The objective of the present study was to evaluate the intestinal
microbiota from individuals injured by biological materials in occupational accident,
submitted to antiretroviral prophylaxis. 23 adult individuals with ages between 18-45
years old were studied, being 13 blood donors (control group – CG) and 10
individuals injured by biological materials in occupational accident, submitted to anti-
retroviral prophylaxis. Intestinal microbiota, anthropometric measures and
biochemical examinations (blood count, renal and hepatic functions, glucose and
lipids blood levels, total proteins and fractions) were evaluated before, right after and
30 days after the end of medication. Zidovudine plus lamivudine were used in 70% of
the individuals associated to nelfinavir, 20% to efavirenz and 10% to ritonavir.
Nausea, vomiting and diarrhea were present in 80% of the individuals at the second
part of the study. Overweight was noticed in 70% and malnutrition and eutrophia
were noticed in 10% of the individuals without alterations during the study. AST, ALT,
Gamma-GT and triglycerides and LDL-cholesterol enzymes were increased at the
second part and normalized 30 days after the end of medication. Significant
Abstract viii
reduction of the three genera of anaerobic bacteria – Lactobacillus, Bifidobacterium
and Bacteroides – evaluated was observed in relation to the control group at the
three moments. The use of antiretrovirals caused significant impact in the intestinal
microbiota of the normal individuals, without recovery 30 days after the end of
medication.
Keywords: Intestinal microbiota, antiretroviral agents, occupational accidents,
nutritional status, HIV-1.
Sumário ix
SUMÁRIO
Páginas
1. Introdução 12
1.1. Microbiota Intestinal 12
1.2. Fatores que alteram a microbiota intestinal 13
1.3. Exposição Ocupacional 19
1.4. Tipos de exposições 19
1.5. Risco do virus da imunodeficiência humana 20
1.6. Indicação de anti-retrovirais _____________________________________21
1.7. Acompanhamento Sorológico do Profissional de Saúde_______________26
2. Objetivos 27
2.1. Objetivo geral 27
2.2. Objetivos específicos 27
3. Casuística e Métodos 28
3.1. Casuística 28
3.2. Métodos 29
3.2.1. Critérios de inclusão e exclusão 29
3.2.2. Distribuição dos grupos 29
3.2.3. Delineamento do estudo 30
3.2.4. Avaliação Nutricional 31
3.2.5. Investigação laboratorial 33
3.2.6. Avaliação da microbiota intestinal 34
3.2.7. Análise estátistica 38
3.2.8. Ética 38
4. Resultados 39
4.1. Caracterização da casuística quanto ao sexo 39
4.2. Caracterização da casuística quanto a idade 40
4.3. Caracterização da casuística quanto tabagismo e etilismo 41
4.4. Caracterização da casuística quanto a profissão 42
4.5. Caracterização da casuística quanto tipo de exposição ocupacional_____ 43
4.6. Caracterização da casuística quanto ao material exposto_____________ 44
4.7. Caracterização da casuística quanto a profilaxia anti- retroviral_________ 45
4.8. Caracterização da casuística quanto as manifestações clínicas do trato
gastrointestinal 46
4.9. Avaliação do estado nutricional _________________________________47
4.10. Avaliação Laboratorial _____49
4.11 Caracterização dos indivíduos de acordo com a análise de ingestão de
alimentos____________________________________________________ 54
4.12 Avaliação da Microbiota intestinal 55
5 Discussão 62
6 Considerações finais 70
7 Referências bibliográficas 71
8 ANEXOS 81
9 APENDICES 84
Lista de Tabelas x
Lista de Tabelas Pagínas
Tabela 1 –Distribuição dos indivíduos que sofreram acidente ocupacional a materiais
biológicos com indicação de profilaxia anti-retroviral (G1), segundo etilismo e
tabagismo 41
Tabela 2 – Média e desvio padrão(x±s)dos grupos ( GC versus G1) nos três
momentos do estudo (M1,M2,M3) quanto à avaliação antropométrica com os
valores de IMC, CMB e porcentagem de gordura considerando nível de
significância(p<0,05) 47
Tabela 3 – Média e desvio padrão (x±s) do grupo (G1) nos três momentos do
estudo (M1,M2,M3) quanto aos valores séricos de proteínas totais, albumina,
globulina e glicemia considerando nível de significância(p>0,05) 49
Tabela 4 – Média e desvio padrão (x±s) do grupo (G1) nos três momentos do
estudo (M1,M2,M3) quanto aos valores séricos de colesterol total e frações, HDL e
LDL colesterol e triglicérides considerando nível de significância(p>0,05) 50
Tabela 5 – Média e desvio padrão (x±s) do grupo (G1) nos três momentos do
estudo (M1,M2,M3) quanto aos valores séricos de AST, ALT e Gama-GT
considerando nível de significância(p>0,05) 51
Tabela 6 – Média e desvio padrão (x±s) do grupo (G1) nos três momentos do
estudo (M1,M2,M3) quanto aos valores séricos de uréia e creatinina considerando
nível de significância(p>0,05) 52
Tabela 7 – Média e desvio padrão (x±s) do grupo (G1) nos três momentos do
estudo (M1,M2,M3) quanto aos valores séricos de hematócrito e hemoglobina
considerando nível de significância (p>0,05) 53
Tabela 8 – Média e desvio padrão (x±s)do grupo G1 quanto a ingestão alimentar
de macronutrientes (carboídratos, proteínas, lipídios e fibras)______________54
Lista de Tabelas xi
Tabela 9 – Média e desvio padrão(x±s)do logarítmica da contagem de Lactobacillus
dos grupos (GC versus G1) entre os três momentos do estudo (M1,M2,M3)
considerando nível de significância(p<0,05) 56
Tabela 10 – Média e desvio padrão(x±s)do logarítmica da contagagem de
Bifidobacterium dos grupos (GC versus G1) nos três momentos do estudo
(M1,M2,M3) considerando nível de significância(p<0,05) 58
Tabela 11 – Média e desvio padrão(x±s) logarítmica da contagagem de
Bacteróides dos grupos (GC versus G1) nos três momentos do estudo (M1,M2,M3)
considerando nível de significância(p<0,05) 60
Introdução 12
1 INTRODUÇÃO
1.1 Microbiota Intestinal
O trato gastrointestinal possui enorme variedade de bactérias aeróbias e
anaeróbias que interagem entre si em complexo ecosistema
(1)
.
As bactérias são encontradas em todo trato gastrointestinal, porém tem
distribuição heterogênea. No estômago e no intestino delgado o ambiente é
desfavorável para a colonização e proliferação bacteriana, que é reduzida por
ação bactericida do suco gástrico, da bile e da secreção pancreática, como pelo
intenso peristaltismo do delgado. O íleo é um sítio de transição bacteriológica,
entre a escassa população bacteriana do jejuno e a densa flora do cólon. No
cólon as bactérias encontram condições favoráveis para a sua proliferação devido
à ausência de secreções intestinais, peristaltismo lento e abundante suprimento
nutricional. A população microbiana do cólon alcança 10
10
a 10
12
microorganismo
por grama de conteúdo lúminal, e supera em número o total das células
eucarióticas presentes no corpo humano
(2)
.
O cólon apresenta flora extremamente rica, com aproximadamente 400-
500 espécies de microorganismos e de bactérias aeróbias e anaeróbias,
destacando-se em ordem decrescente: bacteróides, bifidobactérias, clostrídeos,
peptoestreptococos, fusobactérias, lactobacilos, enterobactérias, enterococos,
eubactérias, bactérias metanogênicas e sulforedutoras. Essa diversidade é
causada provavelmente, pela motilidade intestinal e pelo potencial mais baixo de
oxi-redução
(3)
.
Introdução 13
Segundo Macfarlane et al
(4)
a concentração de Bacteróides,
Bifidobaterium e Lactobacillus, são bem elevados no intestino grosso, conforme
ilustrado no quadro abaixo:
Quadro 1- Concentração de bactérias no intestino grosso humano
Bactérias Concentração (Log 10/g de fezes)
Média Variação
Bacteróides 11,3 9,2- 13,5
Bifidobactérias 10,2 4,9 –
13,4
Lactobacilos 9,6 3,6 –
12,5
Logo após o nascimento, o intestino, previamente estéril do lactente,
começa a ser colonizado pelas bactérias da mãe e do meio ambiente. Durante os
primeiros dias de vida, Escherichia coli, Clostridium e Estreptococos colonizam o
trato gastrointestinal e com a amamentação surgem as bifidobactérias e os
lactobacilos. Logo em seguida, aparecem os bacteróides, eubactérias e
peptococos
(5)
. O recém nascido desenvolve uma coleção heterogênea de
bactérias no trato gastrointestinal, sob a influência de fatores relacionados ao
hospedeiro, as bactérias e outros fatores externos, como o uso de medicamentos,
a alimentação e as condições de higiene/ contaminação ambiental. Há uma
seleção da flora com persistência de algumas populações bacterianas e
eliminação de outras, a flora infantil evolui para flora adulta normal a partir do
segundo ano de vida, mas o tempo depende da dieta da criança
(6)
. O papel da
microbiota intestinal na saúde e na doença é, cada vez mais reconhecido e há
Introdução 14
evidências que a microbiota intestinal podem ter resultados benéficos e
patogênicos para o hospedeiro Gibson e Roberfroid
(7)
, geralmente, dividem as
bactérias fecais humanas em 3 grupos, aquelas que podem exercer efeito nocivo
ou benéficos sobre o hospedeiro, ou ambos. Efeitos benéficos promotores da
saúde poderiam ser provenientes de poupar energia advinda da fermentação de
carboídratos da alimentação e proteínas que alcançam o cólon, síntese de
vitaminas principalmente do grupo B e K, produção de ácidos graxos de cadeia
curta (AGCC), como produtos metabólicos finais, que podem exercer efeitos
antipatogênicos, ao diminuir o pH do lúmen intestinal, facilitando assim a
absorção de água pelo cólon
(6,8)
produção de compostos antimicrobianos
(9)
,
aumento das funções da barreira intestinal ao competir com patógenos por
receptores de adesão da mucosa intestinal, competir por nutrientes e estimular a
imunidade do hospedeiro
(10)
.
Entre os efeitos patogênicos para a saúde do hospedeiro destaca-se o
super crescimento microbiano, seguindo desequilíbrio da microecologia
gastrointestinal devido ao uso de antibióticos orais, choque ou outras condições
de infecções oportunistas, pela passagem da bactéria através da barreira mucosa
para os nódulos linfáticos mesentéricos e outros lugares intestinais (conhecido
como translocação bacteriana), principalmente em hospedeiros
imunocomprometidos ou com traumas
(10,11).
Introdução 15
Quadro 2 - Principais funções atribuídas à microbiota intestinal
(12)
Função Mecanismo
Antibacteriana Competição por sítios de adesão
Competição por nutrientes
Produção de um ambiente fisiologicamente restritivo
Produção de substâncias antimicrobianas
Estímulo para o sistema imune
Imunomoduladora Desenvolvimento de tolerância imunológica
Salvamento energético
Nutrição dos colonócitos
Conversão do colesterol em coprastanol
Nutricional/metabólica
Conversão de bilirrubina em urobilina
Inativação da tripsina
Síntese da vitamina K
1.2 Fatores que alteram a Microbiota Intestinal
Embora a microflora gastrointestinal seja relativamente estável durantea
vida do indivíduo
(12)
, alguns fatores como doenças e determinados medicamentos
podem afetar este equilíbrio
(13)
.
Esse ecossistema pode ser influenciado pela dieta, localização geográfica,
cirurgias do trato gastrointestinal e, principalmente durante o uso de antibiótico.
Dentre os principais fatores que influênciam a colonização bacteriana do trato
gastrointestinal destaca-se os fatores genéticos, alimentares, estado nutricional e
agentes antimicrobianos, descritos a seguir.
Em relação aos fatores genéticos, o controle da colonização estaria
relacionado à disponibilidade e qualidade dos sítios de adesão da mucosa intestinal,
Introdução 16
visto que a permanência das bactérias no intestino depende de ligação a um sítio de
adesão e quando isto não ocorre é eliminada pelo peristaltismo. Existe uma
especificidade na ligação da bactéria com um receptor de mucosa, o que seleciona a
colonização do hospedeiro. Possivelmente o padrão destes locais de adesão são
geneticamente determinados, além disso o hospedeiro pode ainda regular a
população bacteriana através do sistema imune
(14)
. Recentemente, foi demonstrada
a capacidade de interação entre as bactérias e as células do hospedeiro, em que a
microbiota modificou a expressão ou a atividade dos sítios de adesão das células da
mucosa, através de mediadores moleculares
(15,16)
.
Outro fator importante na alteração da microbiota intestinal é o dietético, a
relação entre a nutrição e a microbiota intestinal começa na amamentação ao seio
com um predomínio de bifidobactérias, havendo pequena quantidade de espécies
bacteriana potencialmente patogênica.
Em contraste, as crianças em uso de fórmulas artificiais desenvolvem
microbiota mais diversa, composta não só de bifidobactérias, como também de
bacteróides, enterobactérias, enterococos e Clostridium sp
(17,18)
.
A dieta pode afetar a sobrevivência e o metabolismo das bactérias, nesse
sentido a dieta induz mudanças na microbiota e/ou no seu metabolismo por dois
mecanismos importantes como: presença de componentes dietéticos não digeridos
utilizados como fonte energética e o estado nutricional do hospedeiro, influenciando
a quantidade e tipo de substâncias secretoras pelo intestino
(19)
.
O efeito mais espetacular da dieta sobre a microbiota intestinal se obtém
através do uso de substratos específicos a certos gêneros de bactérias como os
frutooligossacarídeos são adicionados a dieta para aumentar a concentração de
bifidobactérias e uma diminuição correspondente de bacteróides
(19)
.
Introdução 17
A fibra alimentar presente na dieta do indivíduo, definida como:
carboidratos não digeríveis mais lignina, presentes nos vegetais que têm ação
fisiológica ao ser humano
(20)
, pode alterar de forma direta a flora bacteriana e a
regulação dos seus metabólitos e de forma indireta com mudanças físicas no
sistema digestório
(21)
, contribuindo, portanto na população bacteriana intestinal
quanto aos aspectos quantitativos e qualitativos
(21)
.
A participação de componentes dietéticos, com ação positiva na microbiota
intestinal, estimulou a indústria alimentícia a desenvolver produtos que contenham
na sua composição determinadas bactérias, esses alimentos foram denominados
probióticos, que por definição são alimentos que contêm bactérias, comuns no trato
gastrointestinal, resistentes à ação dos sucos digestivos e com ação benéfica ao
hospedeiro, que contribuem por alterar a microbiota intestinal quanto a sua
composição ou atividade metabólica, ou modulação da resposta imune
(3)
.
Outro fator importante é o estado nutricional que reflete o equilíbrio entre a
ingestão balanceada de alimentos e o consumo de energia necessário para manter
as funções diárias do organismo; sempre que um fator interfere em qualquer etapa
desse equilíbrio, os riscos de desnutrição tornam-se iminentes provocando um
desequilíbrio da microbiota intestinal normal
(22,23)
Gorbach & Goldin
(24)
, descreveram que indivíduos com desnutrição protéico
energética (DPE) de grau moderado a grave, pode apresentar alterações da
fisiologia do sistema do trato gastrointestinal, com redução de secreção (gástrica,
biliar, pancreática e intestinal) e da motilidade, contribuindo para o crescimento
exagerado de microorganismo anaeróbios no trato gastrointestinal superior,
prejudicando a absorção de carboidratos, lipídeos, vitamina B
12
e proteínas.
Introdução 18
A desnutrição pode interferir diretamente na absorção gastrointestinal dos
medicamentos, ocasionando alterações da absorção de nutrientes provocadas por
certos medicamentos que podem ser de origem primária ou secundária. Primária:
efeitos diretos do princípio ativo sobre a mucosa intestinal ou sobre os processos
intralumiais que determinam a absorção dos nutrientes; secundários ocasionado
pela desnutrição, embora existam poucos estudos sobre a participação da
desnutrição sobre a absorção de medicamentos
(26)
.
Em relação ao uso de antimicrobianos, podem ocorrer alterações no padrão
de colonização intestinal. O principal efeito observado inclui a supressão relevante
das bactérias anaeróbias, com exceção do Clostridium sp que permanece em níveis
detectáveis. A influência de uso de antimicrobianos no padrão da microbiota
intestinal é transitório, mas pode persistir por algum período após o término do uso.
(27,28)
A redução da população bacteriana intestinal pode trazer entre outras,
conseqüências imunológicas. A administração de antibiótico pode influenciar a
microflora colônica e essa influência depende da concentração da droga no lúmen
intestinal e de seu espectro de ação
(29,30,31)
.
Monreal et al
(1)
observaram em estudo recente que paciente com infecção
de vias aéreas em uso de amoxicilina revelaram redução significativa da quantidade
de Lactobacillus e Bibidobacterium. Também foi observado que após 30 dias do
término do tratamento esses microorganismos retornaram ao normal
(1)
.
A prevalência de diarréia pós-antibióticos varia de 5-8% em crianças e de 5
a 25% em adultos, e é dependente da definição da diarréia, dos agentes
antimicrobianos e de fatores do hospedeiro. Virtualmente qualquer agente
antimicrobiano pode causar diarréia e colite pseudomembranosa, mas a ampicilina,
a amoxicilina-clavulanato, as cefaslospoinas e a clindamicina são freqüentemente,
Introdução 19
mais responsáveis pela diarréia. Acredita-se que seu mecanismo esteja relacionado
às alterações na microbiota intestinal e a colonização por flora resistente a
antibióticos, inclusive Clostridium difficile. Tendo por base esta suposição, os
probióticos são amplamente usados para prevenir e tratar a diarréia associada ao
uso de antibióticos
(32)
.
Um estudo com pacientes infectados pelo vírus da imunodeficiência
humana (HIV+) em uso de anti-retrovirais revelou importante redução das bactérias
benéficas Lactobacillus e Bifidobacterium com recuperação após o uso de pré e pró-
bióticos. Não foi possível identificar qual fator alterou mais a estabilidade da
microbiota intestinal, se o uso de drogas ou a presença de infecção
(3)
. Embora
existam poucos trabalhos sobre a possível interação entre a infecção do HIV/aids e
as drogas anti-retrovirais na microbiota intestinal, não há relatos da ação isolada do
uso de drogas anti-retrovirais na ausência de infecção ou doença.
1.3 Exposição Ocupacional
As exposições ocupacionais a materiais biológicos (MB) tem representado
sério risco aos profissionais da área da saúde, no seu local de trabalho, sendo que
os acidentes envolvendo sangue e outros fluídos orgânicos correspondem às
exposições mais freqüentes.
(33)
.
Os ferimentos com agulhas e material perfuro-cortante, em geral, são
considerados extremamente perigosos por serem potencialmente capazes de
transmitir mais de 20 tipos de patógenos diferentes
(34)
, sendo o vírus da
Imunodeficiência Humana (HIV), da hepatite B e da hepatite C os agentes
infecciosos mais comumentes envolvidos
(35)
.
Introdução 20
1.4 Tipos de Exposições
As exposições que podem trazer riscos de transmissão ocupacional do HIV e
dos vírus das hepatites B (HBV) e C (HCV) são definidas como:
Exposições percutâneas – lesões provocadas por instrumentos perfurantes e
cortantes (p ex. agulhas, bisturi, vidrarias);
Exposições em mucosas – p ex. quando há respingos na face envolvendo
olho, nariz, boca ou genitália;
Exposição cutânea (pele não-íntegra) – p.ex. contato com pele com dermatite
ou feridas abertas;
Mordeduras humanas – consideradas como exposição de risco quando
envolverem a presença de sangue, devendo ser avaliadas tanto para o indivíduo
que provocou a lesão quanto aquele que tenha sido exposto
(31)
.
1.5 Risco de Transmissão do Vírus da Imunodeficiência Humana
O risco ocupacional após exposições a materiais biológicos já foi bem
demonstrado em grandes estudos. Ele é variável e depende do tipo de acidente e de
outros fatores envolvidos, tais como a gravidade, tamanho da lesão, presença e
volume de sangue envolvido, além das condições clínicas do paciente-fonte e
seguimento adequado pós exposição
(36) .
O risco de aquisição do HIV pós-exposição ocupacional percutânea com
sangue contaminado é de aproximadamente 0,3% (IC 95% = 0,2 – 0,5%)
de 0.09%
(IC 95% = 0.006 – 0.5%). O risco após exposição envolvendo pele não íntegra, não
é precisamente quantificado, estimando-se que ele seja inferior ao risco das
exposições em mucosas
(37)
Introdução 21
1.6 Indicação de anti-retrovirais
A indicação do uso de anti-retrovirais deve ser baseada em uma avaliação
criteriosa do risco de transmissão do HIV em função do tipo de acidente ocorrido e a
toxicidade dessas medicações: exceto sobre a zidovudina (AZT). Existem poucos
dados disponíveis sobre a toxicidade das medicações anti-retrovirais em indivíduos
não infectados pelo HIV
(37)
.
O profissional de saúde deve ser informado que o conhecimento sobre a
eficácia e a toxicidade das medicações anti-retrovirais é limitado. A zidovudina
mostrou benefício em estudos humanos. A toxicidade em pessoas não infectadas
pelo HIV é limitada ao AZT e pouco conhecida em relação às outras drogas que
podem ser opção do profissional
(37)
.
Segundo Manual de recomendações do Ministério da Saúde
(37)
, os critérios
de gravidade na avaliação do acidente são dependentes do volume de sangue e da
quantidade de vírus presentes (Anexo1).
A indicação da quimioprofilaxia deverá ser iniciada o mais rápido possível,
idealmente dentro de 1 a 2 horas após o acidente. Estudos em animais sugerem que
a quimioprofilaxia não é eficaz quando iniciada de 24-36 horas após o acidente. O
inicio após largos intervalos de tempo (1ou 2 semanas) pode ser considerado
somente para exposição com elevado risco de transmissão do HIV. A duração da
quimioprofilaxia é de 4 semanas
(37)
.
Uso combinado de AZT com lamivudina (3TC) é recomendado na maioria das
situações com indicação de uso de quimioprofilaxia. O uso do indinavir ou nelfinavir
deve ser reservado para acidentes graves e situações em que haja possibilidade de
resistência viral (paciente-fonte)
Introdução 22
Os esquemas preferênciais estabelecidos pelo Ministério da Saúde
(37)
são:
Quimioprofilaxia básica = AZT + 3TC
Indicado em exposições com risco conhecido de transmissão pelo HIV.
Quimioprofilaxia Expandida = AZT+ 3TC + IP (indinavir ou nelfinavir)
Indicada em exposições com risco elevado de transmissão pelo HIV
A quimioprofilaxia apresenta potencial toxicidade, e seu uso não é justificado
em exposições com risco desprezível de transmissão pelo HIV. Além disso, o fato da
inexistência de evidências suficientes de benefício, o uso de exquemas expandidos,
não são recomendados para todos os tipos de exposições.
Medicamentos anti-retrovirais diferentes do esquema padrão podem estar
indicados quando há suspeita de exposição a cepas virais resistentes
(38)
. Para
quimioprofilaxia ocupacional, a profilaxia com dois inibidores da transcriptase reversa
análogos de nucleosídeos, com ou sem inibidor da protease, durante quatro
semanas pode ser consideradas em situações específicas nas quais haja risco de
infecção incluindo o uso do efavirenz para outros esquemas
(37)
Atualmente existem medicamentos anti-retrovirais potencialmente úteis embora
nem todos indicados para quimioprofilaxia, com atuações em diferentes fases do
ciclo de replicação viral do HIV incluindo :
Zidovudina – A zidovudina(3’-azido-2,3-dideoxitimidina; AZT ou ADV) é
análogo do nucleosídeo tiamina e está disponível nas formulações oral e
parenteral. Sua formulação oral é bem absorvida com uma biodisponibilidade de
63%
(42,43)
. Embora sua meia-vida plasmática seja de apenas uma hora e dez
minutos, a meia vida da forma trisfosfata intracelular biologicamente ativa é de 3-
4 horas, permitindo uma dosagem de duas vezes ao dia
(40)
.
Introdução 23
A zidovudina é metabolizada primariamente no fígado por glucoronidação,
formando um composto inativo, e 90% da dose absorvida é excretada na urina. A
dose atual de zidovudina para adultos é de 300mg por via oral a cada 12 horas.
Os efeitos adversos são vistos mais comumentes em pacientes com a doença
em estado avançado
(40)
.
Sua toxicidade mais grave é a supressão da medula óssea
(41)
. Entre as
reações adversas menos graves, porém mais comuns, inclue-se dor de cabeça,
insônia, mialgia, fadiga, pigmentação das unhas, náusea e dispepsia. As
elevações discretas nos níveis séricos das enzimas hepáticas também podem
ser vistas, embora normalmente ocorram com a administração concomitante com
outras drogas potencialmente mielossupressivas
(42,43)
.
Lamivudina
A lamivudina (β-enantiomero de 2’,3’ tiacitidina; 3TC) é um análogo do
nucleosídeo citosínico é bem absorvido por via oral, com uma biodisponibilidade
de 86%. A sua meia vida no soro é de 2,5 horas e a meia vida intracelular de sua
forma trifosfatada biologicamente ativa é de 11 a 14 horas
(44)
. Aproximadamente
70% da dose é excretada inalteradamente na urina e a dosagem de lamivudina
deve ser ajustada em pacientes com problemas renais. A dose para adultos é de
150mg por via oral a cada 12 horas ou de 300mg por via oral uma vez ao dia
(40)
.
A lamivudina é normalmente bem tolerada em adultos,
(45)
seus efeitos
adversos mais freqüentes são dores de cabeça, tontura, fadiga e mal-estar
(46,47)
.
Possui grandes vantagens por ser potente contra o HIV, bem tolerado, sem
efeitos de alimentos, pode ser tomado uma vez ao dia, co-formulado com AZT
(Biovir), também apresenta atividade contra o vírus da hepatite B, melhora a
Introdução 24
sensibilidade ao AZT entre outros, retarda o acúmulo de análogos de timidina
(TAM) e pode reverter em partes seus efeitos.
(48)
.
Efavirenz
O efavirenz é bem absorvido por via oral e sua biodisponibilidade
aumenta se for tomado com alimentos, deve ser ingerido de estomago vazio
porque o aumento das concentrações quando ingerido com alimento pode elevar a
freqüência de vários efeitos adversos. Uma refeição rica em gorduras e/ou calorias
aumenta a concentração máxima em 40% à 80%, de modo que alguns
especialistas preconizam evitar a ingestão especialmente nas 2-3 primeiras
semanas a fim de reduzir os efeitos tóxicos no sistema nervoso central (SNC). A
dose para adultos é de 600mg, uma vez ao dia
(40)
, geralmente associado a dois
nucleosídeos, tomados à noite para reduzir os efeitos tóxicos do SNC. Pode ser
ingerido com alimentos após a resolução dos efeitos adversos centrais, sua meia
vida é de 36 a 100 horas, 14% a 34% são excretados na urina como metabólitos
glicoronídeos e 16-61% nas fezes
(39)
.
O próprio efavirenz é tão indutor quanto inibidor enzimático do citocromo
P-450 e pode alterar significativamente o metabolismo hepático de várias drogas
(40)
. Os efeitos adversos mais freqüentes são queixas relacionadas ao sistema
nervoso incluindo delírios, tontura, distúrbios do sono e dor de cabeça, esses
efeitos quase sempre diminuem com a continuidade da terapia. Elevações no
colesterol total de 10% a 20% bem como aumentos ocasionais na transaminase
hepátca também foram observados no tratamento com efavirenz
(40)
.
Introdução 25
Ritonavir
O ritonavir é bem absorvido por via oral e possui biodisponibilidade de
aproximadamente 70%, apresenta alta ligação protéica no plasma superior a 98% e
sua meia vida é de 3 a 5 horas
(51,52).
Outras drogas podem alterar o metabolismo do
ritonavir aumentando seus níveis plasmáticos. A dose usual de ritonavir para adultos
é de 600mg por via oral a cada 12 horas, embora doses mais baixas possam ser
usadas em combinação com alguns outros inibidores da protease. O ritonavir deve
ser armazenado em geladeira e ao abrigo da luz
(41)
.
As reações adversas ao ritonavir incluíram distúrbios gastrointestinais como
náusea, vômito ou diarréia em até 52% dos pacientes e menos freqüentes são
anorexia e dor abdominal, fraqueza, parestesias periférica e perioral, alterações de
paladar e dor de cabeça
(52,53)
. A maioria dos pacientes sofre alguma elevação nos
níveis de colesterol 30-40% e triglicérides 200 a 300% e muitos outros desenvolvem
níveis elevados de creatina fosfoquinase e de transaminases
(52,53)
.
Nelfinavir
O nelfinavir tem uma boa disponibilidade e absorção de 70–80% é ótima
quando administrada com alimentos
(54)
. Sua ligação é altamente protéica no plasma
superior a 98% e sua meia vida é de 3,5 a 5 horas, é excretada principalmente pela
CYP3A4. Apenas1%
a 2% são recuperados na urina, até 90% são encontrados nas
fezes, principalmente como metábolito hidroxilado, que é tão ativo como o nelfinavir
contra o HIV
(41)
.
A dose de nelfinavir para adultos é de 1250mg por via oral a cada 12
horas
(41)
. O nelfinavir tem como vantagem ampla experiência e é bem tolerado na
gestação, e como desvantagem, menor potência comparado a muitos outros
Introdução 26
esquemas, necessidade ingerir grande quantidade de comprimidos e com alimentos
ricos em gordura, levando a um alto índice de diarréia
(40)
Estudo com 1500 paciente em uso de nelfinavir mostraram como o principal
efeito adverso a diarréia em cerca de 10% a 30%, ou fezes amolecidas. Os demais
efeitos adversos de classe: lipodistrofia, aumento dos níveis de triglicerídeos e/ou
colesterol, hiperglicemia com resistência a insulina e diabetes tipo 2, osteoporose e
possível aumento do sangramento na hemofilia
(40)
.
1.6 Acompanhamento Sorológico do Profissional de Saúde
O profissional de saúde deverá ser acompanhado pelo período de seis
meses após o acidente com material infectado pelo HIV
(37)
.
Em acidentes em que a quimioprofilaxia anti-retroviral foi iniciada, o
acompanhamento clínico deverá ser realizado semanalmente para avaliação de
sinais de intolerância medicamentosa. Além disso, exames laboratoriais
(hemograma completo, transaminases, prova de função renal) deveram ser
realizados para avaliação dos efeitos adversos. Esses exames deveram ser
colhidos no momento do acidente e para o seguimento, na segunda semana da
profilaxia
(37)
.
Os efeitos colaterais da utilização das medicações anti-retrovirais são
freqüentes, mas usualmente leves e transitórios. Mesmo os efeitos colaterais mais
graves, geralmente se resolvem com a suspensão da medicação
(37)
.
Por fim, os acidentes ocupacionais são frequentes e muitas vezes
necessitam de quimioprofilaxia, particularmente os anti-retrovirais. Há necessidade
de se conhecer melhor as possíveis interações dessas drogas na microbiota
intestinal e assim contribuir para o melhor seguimento desses indivíduos.
Objetivo 27
2 OBJETIVOS
O presente trabalho tem com objetivos:
2.1 Objetivo geral
Avaliar a microbiota intestinal de indivíduos que sofreram acidente ocupacional a
materiais biológicos que realizaram profilaxia anti-retroviral.
2.2 Objetivos específicos
Caracterização dos grupos quanto aos seguintes aspectos:
Avaliação do estado nutricional segundo a antropometria e ingestão
alimentar;
Exames laboratoriais;
Avaliar a microbiota intestinal dos indivíduos em diferentes momentos do estudo.
Casuísticas e Métodos 28
3. CASUÍSTICA E MÉTODOS
3.1. Casuística
O presente trabalho foi desenvolvido no período de março de 2005 a
agosto de 2006, com participação de 23 indivíduos, sendo 10 que sofreram
acidente ocupacional com materiais biológicos que realizaram profilaxia anti-
retroviral por 28 dias, três do sexo masculino e sete feminino e 13 indivíduos
doadores de sangue do Hemocentro do Hospital das Clínicas da Faculdade de
Medicina de Botucatu seis do sexo masculino, sete feminino.
Os indivíduos participantes desse estudo foram informados em detalhes
quanto aos procedimentos a que seriam submetidos e assinaram documento de
anuência de sua participação e concordância da realização do mesmo, conforme
a resolução nº196/96, sobre“ Pesquisa envolvendo seres humanos”, do Conselho
de Saúde do Ministério de Saúde (Apêndice 2).
Casuísticas e Métodos 29
3.2 Métodos
3.2.1 Critérios de inclusão e exclusão
A Critérios de inclusão
Foram incluídos todos os pacientes que sofreram acidente ocupacional com
materiais biológicos que realizaram profilaxia anti-retroviral por 28 dias, atendidos no
Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu- Unesp.
B Critérios de exclusão
Foram excluídos:
Menores de 18 anos
Gestantes e lactantes
Indivíduos em uso prévio de antimicrobianos nos últimos 30 dias
Indivíduos que interromperam a profilaxia
3.2.2 Distribuição dos grupos
Foram constituídos dois grupos de estudo:
Grupo Controle (GC): Constituído por treze indivíduos doadores de sangue do
Hemocentro do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu-
UNESP de ambos os sexos.
Grupo 1 (G1): Constituído por dez indivíduos que sofreram acidente
ocupacional com materiais biológicos que realizaram profilaxia anti-retroviral de
ambos os sexos atendidos no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de
Botucatu- UNESP.
Casuísticas e Métodos 30
3.2.3 Delineamento do estudo
O presente estudo foi dividido em três momentos;
G1
M1 M2 M3
Momento 1 (M1): Foram realizadas avaliações nutricionais, laboratoriais, e da
microbiota intestinal, nos dois grupos;
Momento 2 (M2): Foram realizadas avaliações nutricionais,laboratoriais e da
microbiota intestinal no grupo G1, no último dia da profilaxia anti-retroviral;
Momento 3 (M3): Foram realizadas avaliações nutricionais,laboratoriais e da
microbiota intestinal, um mês após o término da profilaxia anti-retroviral;
No grupo controle foi realizada avaliação antropométrica e avaliação da
microbiota intestinal no primeiro momento.
No último dia
da profilaxia
30 dias após o
término da
profilaxia
Antes ou até
dois dias após
o início da
profilaxia
Casuísticas e Métodos 31
3.2.4 Avaliação Nutricional
Avaliação nutricional foi realizada pela própria pesquisadora nos indivíduos do
grupo G1, através da aplicação de protocolo específico (Apêndice 1) contendo
aspectos de identificação dos indivíduos, avaliação clínica, interrogatório alimentar
incluindo as variáveis de atividade física, variáveis epidemiológicas sobre tabagismo
e etilismo. Foi também realizado avaliação dietética através de inquérito alimentar de
24 horas e freqüência alimentar, avaliação antropométrica, laboratorial e da
microbiota intestinal. No grupo controle foi realizada apenas antropometria.
(Apêndice 1).
A Avaliação Antropométrica
A avaliação antropométrica envolveu a mensuração do peso, estatura,
circunferência do braço, dobras cutâneas do bíceps, tríceps, subescapular e supra-
ilíaca e cálculos do índice de massa corporal e circunferência muscular do braço.
• Peso (P) – kg: Foi obtido com a ultilização de balança antropométrica, tipo
plataforma com precisão de 0.1Kg, com indivíduo descalço e com mínimo de
vestimenta
(54,55)
.
Estatura (E) – m : Foi determinada por meio de uma escala fixada na balança
antropométrica, com precisão de 0.5cm
(54,55)
.
Índice de massa corporal (IMC) - kg/m
2
:
calculado a partir da relação peso
(kg) e estatura ao quadrado(m
2
) através da fórmula: IMC = P / E
2 (54,55)
.
Circunferência do braço (CB) – cm : aferida no ponto médio do braço não
dominante, em extensão, no ponto eqüidistante entre o acrômio e o olécrano,
utilizando-se de fita milimetrada de celulose inextensível
(54,55)
.
Casuísticas e Métodos 32
Circunferência muscular do braço (CMB) -cm: calculada a partir da
fórmula: CMB = CB – (0,314 x DCT)
(56)
.
Para a aferição das dobras cutâneas foi utilizado adipômetro apropriado
(LANGE CALIPER – Cambridge Scientific, USA), com pressão constante de
10g/mm
2
, na superfície de contato. Cada dobra foi aferida em três medidas e
utilizado o valor médio dos dois valores mais próximos.
(57)
.
Dobra cutânea triciptal (DCT) – mm: foi aferida no ponto médio do braço, da
mesma forma procedida para circunferência do braço (CB), sobre o tríceps fazendo
o pregueamento da pele e do tecido subcutâneo paralelamente ao eixo longitudinal
do braço
(54,55,58) .
Dobra cutânea biciptal (DCB) – mm: obtida com o procedimento para DCT,
sendo sobre o músculo bíceps
(54,55,58)
.
Dobra cutânea subescapular(DCSE) – mm: obtida no ponto localizado a um
centímetro abaixo do ângulo da escápula, no mesmo lado da medida da DCB,
observando-se as linhas de força naturais da pele
(59)
Dobra cutânea supra-íliaca (DCSI) – mm: aferida a um centímetro acima da
crista ilíaca, no mesmo lado da medida da DCT, medindo-se a dobra da pele e
tecido subcutâneo, paralelamente ao eixo do abdome
(54,55,58)
.
Aferidas as dobras cutâneas anteriores, obteve-se a somatória dessas (ΣP),
para cálculo da porcentagem de gordura corpórea (%G) mediante a aplicação da
fórmula cujo o valor de referência é de 15-25% para mulheres e 15-18% para
homens
(59).
A classificação do estado nutricional foi realizada através do índice de massa
corporal (IMC), segundo a recomendação da Organização Mundial de Saúde
(60)
(anexo 3)
Casuísticas e Métodos 33
B Investigação Dietética
Para obtenção da ingestão alimentar foi aplicado o método recordatório de 24
horas, associado a um questionário específico sobre a ingestão dos grandes grupos
de alimentos
(54)
. (Apêndice 1)
A partir dos dados otidos do registro, as medidas caseiras foram convertidas
em pesos de porções ou de alimentos para cálculo de calorias totais, carboídratos,
proteínas, lipídeos e fibras. Esses cálculos foram obtidos mediante uso de "software"
Diet Pró da Faculdade Federal de Viçosa.
3.2.5 Investigação laboratorial
Para a análise bioquímica dos indivíduos, foram coletadas amostras de
sangue periférico, após jejum de oito a doze horas.
A avaliação bioquímica constou de indicadores de função renal: uréia e
creatinina, enzimas hepáticas: aspartato aminotransferase (AST), alanina
aminotrasferase (ALT),Gama-GT (gama-glutamiltransferase) perfil lípidico: colesterol
total e frações HDL (Lipoproteínas de alta densidade) e LDL (Lipoproteínas de baixa
densidade), triglicérides, glicemia, proteínas totais e frações e hemograma
considerando os valores de referência (Anexo 4) . Essas determinações foram
realizadas em analizador automático DADE BEHRING, modelo RxL DIMENSION
®
,
em serviço de rotina do Laboratório de Análises Clínicas do Hospital das Clínicas da
Faculdade de Medicina de Botucatu.
Casuísticas e Métodos 34
3.2.6 Avaliação da Microbiota Bacteriana Intestinal
A avaliação microbiológica da microbiota intestinal foi realizada pela
pesquisadora utilizando o método adaptado de Sutter et al
(61)
.
A avaliação foi realizada no Laboratório de Pesquisa na Área de Doenças
Tropicais do Departamento de Doenças Tropicais e Diagnóstico por Imagem da
Faculdade de Medicina de Botucatu–UNESP seguindo os seguintes passos e sendo
esclarecido aos indivíduos quanto aos procedimentos da coleta do material a ser
analisado.
No momento da anamnese os indivíduos do G1 foram orientados que
deveriam trazer três amostras de fezes, sendo que a primeira deveria ser coletada
na próxima evacuação após a consulta, a segunda coletada no último dia do
tratamento com os anti-retrovirais e a terceira um mês após o término da profilaxia.
Foram agendadas as datas de retornos aos indivíduos à medida que eram
incluídos no estudo. Para evitar esquecimentos 24 horas antes das datas das
coletas era realizado um contato pelo telefone para adesão ao estudo.
1º Etapa. Transporte do Material para análise (fezes) - para o transporte das
fezes utilizou-se o meio líquido TIOGLICOLATO
®
(Figura 1), contendo nutrientes
adequados para bactérias aeróbias e anaeróbias e anaeróbias facultativas. Foi
entregue a cada indivíduo um frasco contendo oito ml dessa solução e um frasco de
coleta estérel (Figura 2 )
Casuísticas e Métodos 35
2º Etapa: Diluição da amostra de fezes – Foi utilizado um grama de fezes
pesado em balança analítica –SCIENTECH SA120, que foi colocado em tubo de
ensaio, contendo nove ml de Stuart Transport Medium
®
(oxoid). Este meio contém
indicador de azul de Metileno, que indica a presença de oxigênio, indispensável para
os procedimentos.
A amostra foi homogeneizada em vortex até a dissolução total do material (figura 3).
Em seguida, foram realizadas dissoluções subseqüentes de 10
2
até 10
8
(figura 4),
com meios seletivos conforme demonstrado no quadro 3 e na (figura 5).
Figura 1
-
Meio de
transporte e frasco
estéril
Figura 2
-
Frasco contendo fezes e
meio de transporte
Figura 4 -Tubos contendo meio de
Stuart para diluição de 10
2
à
10
8
Figura 3 – diluição da amostra em
agitador vortex
Casuísticas e Métodos 36
Quadro 3 – Diluição e meio de cultura seletivo de microorganismos
Meio de Cultura Fezes (Diluição) Microorganismos
Kanamycin-vancomycin blood agar 10
4
10
6
10
7
10
8
Bacteróides
Bifidobacterium medium 10
4
10
6
10
7
10
8
Bifidobactérias
Lactobacillus selective 10
2
10
4
10
5
10
6
Lactobacilos
3º Etapa : Plaqueamento nos meios de cultura – Para realização do
plaqueamento das amostras estudadas foram utilizados bastões de vidro em “L”,
individual para cada diluição e meio de cultura, evitando contaminação (figura 6).
Figura 5 - Placas com dos meios específicos:
Lactobacillus, Bifidobaterium e Bacteróides
Figura 6
-
Pl
aqueamento dos meios
Casuísticas e Métodos 37
4º Etapa: Acondicionamento das placas em ambiente de anaerobiose –
Terminado o plaqueamento as placas foram acondicionadas em jarras de
anaerobiose (Figura 7) e com gerador de anaerobiose ANAEROBAC que foram
colocados em estufa a 37ºC, pelo período de 48 horas.
5º Etapa: Leitura das Unidades Formadoras de Colônias (UFC) - Após o
período de incubação, foi realizada a contagem nas placas das unidades formadoras
de colônias em contador de colônia (Figura 8).
Figura 7- Jarra de anaerobiose contendo
gerador de anaerobiose em estufa à 37º C
Figura 8
-
Contagem das unidades formadoras
de colônia em contador de colônia
Casuísticas e Métodos 38
3.2.7 Análise estatística
Foi realizada análise estatística pareada nos três momentos do estudo para o
grupo 1. Para as contagens de Bacteroides, Bifidobacterium e Lactobacillus foram
calculados média e desvio padrão com a transformação logarítima dos dados e
média na escala original
Para a comparação entre os grupos GC (M0) e G1 em cada momento foram
utilizados o teste t para duas amostras independentes (usando logarítimo de
contagem) com o cálculo das estatísticas t e p e/ou não pareados. Em todas as
análises efetuadas, as estatísticas calculadas foram consideradas significativas
quando p ≤ 0,05 (p é a probabilidade de erroneamente concluir pela significância).
Foi utilizado para análise o programa SPSS versão 14.0.
3.2.9 Ética
O presente estudo foi submetido à avaliação do Comitê de Ética em
Pesquisa da Faculdade de Medicina de Botucatu-UNESP, recebendo parecer
favorável em setembro de 2004.
Resultados 39
RESULTADOS
4.1 Caracterização da casuística quanto ao Sexo.
A distribuição dos indivíduos quanto ao sexo nos grupos GC e G1 encontra-
se na figura 9.
.
46,1
53,8
30
70
0
10
20
30
40
50
60
70
%
GC G1
Grupos
Masculino
Feminino
GC: Grupo Controle – Indivíduos doadores de sangue
G1: indivíduos que sofreram acidente ocupacional com materiais biológicos que realizaram de profilaxia anti-retroviral
Figura 9 - Distribuição dos 23 indivíduos dos grupos GC e G1 quanto ao sexo
Foi observado maior porcentagem do sexo feminino em ambos os grupos,
sendo 53,8% no GC e 70% no G1.
Resultados 40
4.2 Caracterização da casuística quanto à faixa etária em anos.
A distribuição dos indivíduos de ambos os grupos GC e G1 em relação à
idade em anos encontra-se na figura 10
60
40
54
46
0
10
20
30
40
50
60
%
GC G1
Grupos
18-40 anos
40-45 anos
GC: Grupo Controle – Indivíduos doadores de sangue.
G1: indivíduos que sofreram acidente ocupacional com materiais biológicos que realizaram de profilaxia anti-retroviral
Figura 10 – Distribuição dos 23 indivíduos dos grupos GC e G1 quanto à idade
em anos.
Foi observado maior porcentagem de indivíduos com idade entre 18-40 anos
em ambos os grupos.
Resultados 41
4.3 Caracterização da casuística quanto ao hábito de fumar (tabagismo) e
hábito de beber (etilismo).
A distribuição dos indivíduos do G1 em relação ao etilismo e tabagismo encontra-
se na tabela1.
Tabela 1 – Distribuição dos 10 indivíduos do G1, segundo hábito de fumar e
beber. Botucatu-SP, 2006.
Variáveis
Presença
Etilismo social
n º (%)
Tabagismo
nº (%)
Sim 03 (30) 05 (50)
Não 07 (70) 05 (50)
Total 10 (100) 23 100
nº: número de indivíduos
Foi observado que 50% dos indivíduos do grupo G1 tinham o hábito de fumar
e 30% o hábito de beber socialmente.
Resultados 42
4.4 Caracterização da casuística quanto à profissão.
A distribuição dos indivíduos do grupo G1 em relação à profissão encontra-
se na figura 11.
60
20
10
10
0
10
20
30
40
50
60
%
grupo 1
Técnicos e Auxiliares de
enfermagem
Auxiliares de limpeza
Médicos residentes
Alunos de medicina
G1: indivíduos que sofreram acidente ocupacional com materiais biológicos que realizaram de profilaxia anti-retroviral
Figura 11 - Distribuição dos 10 indivíduos do G1 quanto à profissão.
Foi observado que 60% dos indivíduos eram auxiliares e técnicos de
enfermagem, 20% auxiliares de limpeza e 10% alunos de medicina e médico
residente.
Resultados 43
4.5 Caracterização da casuística quanto ao tipo de exposição ocupacional.
A distribuição dos indivíduos do grupo G1 em relação ao tipo de exposição
ocupacional encontra-se na figura 12.
80
10
10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
%
G1
Indivíduos
percutânea
mucosa
cutânea
G1: indivíduos que sofreram acidente ocupacional com materiais biológicos que realizaram de profilaxia anti-retroviral
Figura 12 - Distribuição dos 10 indivíduos do G1 quanto ao tipo de exposição
ocupacional.
Foi observado que 80% dos indivíduos tiveram exposição ocupacional
percutânea e 20% exposição de mucosa e cutânea.
Resultados 44
4.6 Caracterização da casuística quanto ao tipo de material exposto
A distribuição dos indivíduos do grupo G1 em relação ao tipo de material
exposto encontra-se na figura 13.
60
20
10
10
0
10
20
30
40
50
60
%
G1
indivíduos
agulha com lúmen
agulha de sutura
agulha de HGT
capilar de diálise
G1: indivíduos que sofreram acidente ocupacional com materiais biológicos que realizaram de profilaxia anti-retroviral
Figura 13 – Distribuição dos 10 indivíduos do G1 quanto ao tipo de acidente
ocupacional.
Foi observado que 60% dos indivíduos tiveram acidente com agulha com lúmen,
20% agulha de sutura, 10% agulha hemoglico-teste (HGT) e capilar de diálise.
Resultados 45
4.7 Caracterização da casuística quanto à profilaxia anti-retroviral utilizada.
A distribuição dos indivíduos do G1 e o tipo de profilaxia anti-retroviral
encontra-se na figura 14.
70
10
20
0
10
20
30
40
50
60
70
%
G1
indivíduos
AZT+3TC- nelfinavir
AZT+3TC- ritonavir
AZT+3TC- efavirenz
G1: indivíduos que sofreram acidente ocupacional com materiais biológico que realizaram profilaxia anti-retroviral
3TC: Lamivudina
AZT: zidovudina
Figura 14 - Distribuição dos 10 indivíduos do G1 quanto a profilaxia anti-
retroviral utilizada.
Foi observado que todos os indivíduos do G1 receberam AZT + 3TC sendo
que 70% associado ao nelfinavir, 20% associado ao efavirenz e 10% associado ao
ritonavir.
Resultados 46
4.8 Caracterização da casuística quanto às manifestações clínicas do trato
gastrointestinal
.
A distribuição dos indivíduos do grupo G1 quanto às manifestações clínicas
do trato gastrointestinal encontra-se na figura 15.
0 0
0
50
40
40
0
20
10
0
10
20
30
40
50
%
M1 M2 M3
momentos
diarréia
náusea
vômito
G1: Grupo de paciente que sofreram acidente ocupacional com materiais biológico que realizaram profilaxia anti-retroviral
M1: até dois dias após o inicio da profilaxia anti-retroviral
M2: no último dia da profilaxia anti-retroviral
M3: 30 dias após o término da profilaxia anti-retroviral
Figura 15 – Distribuição dos 10 indivíduos do G1 quanto aos tipos de
manifestações clínicas do trato gastrointestinal nos três momentos.
Foi observado que os indivíduos do G1 apresentaram 40% de náusea e
vômitos e 50% de diarréia no momento M2. No M3 apenas 20% de naúseas e 10%
de vômitos.
Resultados 47
4.9 Avaliação Nutricional
4.9.1 Caracterização da casuística quanto á avaliação antropometrica
A distribuição dos indivíduos do GC e G1 nos três momentos quanto à
avaliação antropométrica em relação ao índice de massa corporal (IMC),
circunferência muscular do braço (CMB) e porcentagem de gordura encontra-se na
tabela 2
Tabela 2-Média e desvio padrão (x ± s) do GC versus G1 nos três momentos
(M1, M2 e M3) da avaliação antropométrica quanto aos valores de IMC, CMB e
porcentagem de gordura considerando nível de significância (p<0,05).
Momentos
variáveis
M1
GC
(x± s)
M1
G1
(x± s)
M2
G1
(x± s)
M3
G1
(x± s)
IMC (kg/m
2)
25,95 3,71 25,95 3,71 26,16 4,10 25.8 4,09
CMB (cm)
25,82 3,50 25,82 7,85 23,28 3,57 23,18 3,74
% gordura (∑D)
32,06 5,71 32,06 5,71 32,64 6,75 31,74 6,58
(x± s) média e desvio padrão
G1: indivíduos que sofreram acidente ocupacional com materiais biológicos que realizaram de profilaxia anti-retroviral
GC : indivíduos doadores de sangue
M1 : até dois dias após o inicio da profilaxia
M2: no último dia da profilaxia
M3: 30 dias após o término da profilaxia
IMC: Índice de Massa Corporal
CMB: Circunferência muscular do braço
% gordura = soma tória das dobras cutâneas triceps, bíceps, subscapular e supra-ilíaca.
Hipótese Estatística Comentário
Interação entre os grupos
(G1 e GC)
p > 0,05 Perfis similares
Diferença entre os momentos (M1,M2,M3) p > 0,05 M1=M2=M3
Foi observado que não houve diferença estatística na avaliação antropométrica
quanto às médias do índice de massa corporal (IMC), porcentagem de gordura e
Resultados 48
circunferência muscular do braço (CMB) nos grupos GC e G1 nos três momentos
M1,M2 e M3.
4.9.2 Caracterização da casuística quanto ao estado nutricional.
A distribuição dos indivíduos de ambos os grupos GC e G1 em relação ao estado
nutricional conforme classificação do índice de massa corpórea (IMC) encontra-se
na figura 16
(52)
.
7,8
69,2
23
10
10
70
10 10
70
10
20
60
0
10
20
30
40
50
60
70
%
GC-M1 G1-M1 G1-M2 G1-M3
grupos e momentos
desnutrição
eutrofia
sobrepeso
obeso
GC: Grupo controle-indivíduos doadores de sangue
G1: Grupo de paciente que sofreram acidente ocupacional com materiais biológicos que realizaram profilaxia anti-retroviral
M1: até dois dias após o inicio da profilaxia anti-retroviral
M2: no último dia da profilaxia anti-retroviral
M3: 30 dias após o término da profilaxia anti-retroviral
Figura 16 – Distribuição dos 23 indivíduos do G1 quanto ao diagnóstico
nutricional de ambos os grupos GC e G1 nos três momentos (M1, M2 e M3).
Foi observado no grupo GC maior porcentagem indivíduos eutróficos e no
grupo G1 maior porcentagem de sobrepeso nos três momentos M1,M2 e M3. Foi
observado também no G1 100% de sedentarismo nos três momentos do estudo.
Resultados 49
4.10 Avaliação Laboratorial
4.10.1 A avaliação dos indivíduos quanto aos valores séricos de proteínas totais e
frações e glicemia do grupo G1 nos três momentos (M1,M2 e M3) encontra-se
descrita na tabela 3.
Tabela 3 – Média e desvio padrão (x± s) do grupo G1 nos momentos (M1, M2 e
M3) quanto aos valores séricos de proteínas totais, albumina , globulina e
glicemia de jejum considerando nível de significância (p>0,05).
Momentos
Níveis séricos
M1
(x± s)
M2
(x± s)
M3
(x± s)
Proteínas totais (g/dL) 7,57 ± 0,447 7,47 ± 0,628 7,36 ± 0,522
Albumina (g/dL) 4,42 ± 0,492 4,36 ± 0,47 4,26 ± 0,35
Globulina (g/dL) 3,14 ± 0,312 3,17 ± 0,519 3,18 ± 0,488
Glicemia(mg/dL) 86 ± 16,68 88,25 ± 6,77 87,11 ± 18,44
(x± s) média e desvio padrão
G1: indivíduos que sofreram acidente ocupacional com materiais biológicos que realizaram de profilaxia anti-retroviral
M1 : até dois dias após o inicio da profilaxia
M2: no último dia da profilaxia
M3: 30 dias após o término da medicação
Hipótese Estatística Comentário
Diferença entre os momentos
(M1,M2,M3) do G1.
p> 0,05 M1=M2=M3
Resultados 50
Foi observado que os níveis séricos de proteínas totais, albumina, globulina e
glicemia não mostrou diferença estatística nos três momentos (M1, M2 e M3) do
estudo.
4.10.2 Avaliação do perfil lipídico
Caracterização dos indivíduos quanto aos níveis séricos de colesterol total e
frações (HDL colesterol e LDL colesterol) e triglicérides do G1 nos três momentos
(M1, M2 e M3) encontra-se na tabela 4.
Tabela 4 - Média e desvio padrão (x± s) do grupo G1 entre os três momentos
(M1, M2 e M3) quanto à avaliação sérica de colesterol total e frações, HDL e
LDL colesterol e triglicérides, considerando nível de significância (p <0,05).
Momentos
Níveis séricos
M1
(x± s)
M2
(x± s)
M3
(x± s)
Colesterol total (mg/dL) 179,22 ± 28,11 209,33 ± 63,76 187,33 ± 33,17
HDL colesterol (mg/dL) 51,37 ± 10.32 49.89
± 22.30 47,78 ± 12,57
LDL colesterol (mg/dL) 98.55 ± 20,59 130,11 ± 47,65 112,82 ± 34,01
Triglicérides (mg/dL) 143,48 ± 64,48 146,22 ± 103,69 135,67
± 58.83
(x± s) média e desvio padrão
G1: indivíduos que sofreram acidente ocupacional com materiais biológicos que realizaram de profilaxia anti-retroviral
M1 : até dois dias após o inicio da profilaxia
M2: no último dia da profilaxia
M3: 30 dias após o término da medicação
Hipótese Estatística Comentário
Colesterol total M1=M2
M2=M3
M3=M1
p> 0,05
p> 0,05
p> 0,05
M1=M2=M3
HDL colesterol M1=M2
M2=M3
M3=M1
p> 0,05
p> 0,05
p> 0,05
M1=M2=M3
LDL Colesterol M1=M2
M2=M3
M3=M1
P< 0,05
p> 0,05
p> 0,05
M1<M2
Resultados 51
Triglicérides M1=M2
M2=M3
M3=M1
p> 0,05
p< 0,05
p> 0,05
M2 >M3
Foi observado diferença estatística apenas nos valores de LDL–colesterol
entre o M1 e M2. Os triglicérides também apresentaram diferença estatística entre o
M2 e M3.
4.10.3 Avaliação das enzimas hepática
A caracterização da avaliação das enzimas hepáticas quanto aos níveis
séricos de AST, ALT e Gama-GT dos indivíduos do G1 entre os três momentos (M1,
M2 e M3) encontra-se na Tabela 5.
Tabela 5-Média e desvio padrão (x± s) do grupo G1 nos momentos (M1, M2 e
M3) quanto à avaliação sérica de AST , ALT e Gama GT, considerando nível de
significância (p <0,05).
Momentos
Níveis séricos
M1
(x± s)
M2
(x± s)
M3
(x± s)
AST/TGP (u/L) 34,10 ± 7.73 43,89 ± 21.84 26,60 ± 9,02
ALT/TGO (u/L) 23,10 ± 4,43 25,56
± 25,56 21,40 ± 5,17
Gama-GT (u/L) 37,00 ± 27,37 66,00
± 48,75 29,70
± 18,25
(x± s) média e desvio padrão
G1: indivíduos que sofreram acidente ocupacional com materiais biológicos que realizaram de profilaxia anti-retroviral
M1 : até dois dias após o inicio da profilaxia
M2: no último dia da profilaxia
M3: 30 dias após o termino da medicação
Hipótese Estatística Comentário
AST/TGP M1=M2
M2=M3
M1=M3
p> 0,05
p< 0,05
p< 0,05
M2>M3
M3<M1
ALT/TGO M1=M2
M2=M3
M1=M3
p> 0,05
p< 0,05
p> 0,05
M2>M3
Gama-GT M1=M2 p> 0,05
Resultados 52
M2=M3
M1=M3
p< 0,05
p> 0,05
M2>M3
Foi observado diferença estatística nas três enzimas entre os momentos M2 e
M3 e somente a AST mostrou diferença estatística entre M3 e M1.
4.10.4 Avaliação da Função Renal
A caracterização dos indivíduos quanto a avaliação da função renal dos níveis
séricos de uréia e creatinina do grupo G1 nos três momentos (M1, M2 e M3)
encontra-se na tabela 6.
Tabela 6- Média e desvio padrão (x± s) do grupo G1 nos momentos (M1, M2 e
M3) quanto à avaliação dos níveis séricos de uréia e creatinina considerando
nível de significância (p<0,05).
Momentos
Níveis séricos
M1
(x± s)
M2
(x± s)
M3
(x± s)
Uréia (mg/dL) 24,38 ± 8,70 22,13 ± 5,54 22,50 ± 5,99
Creatinina (mg/dL) 0,756
± 0,181 0,791 ± 0,157 0,772
± 0,174
(x± s) média e desvio padrão
G1: indivíduos que sofreram acidente ocupacional com materiais biológicos que realizaram de profilaxia anti-retroviral
M1 : até dois dias após o inÍcio da profilaxia
M2: no último dia da profilaxia
M3: 30 dias após o término da medicação
Hipótese Estatística Comentário
Diferença entre os
momentos(M1,M2 e M3)
do G1
p> 0,05 M1=M2=M3
Resultados 53
Foi observado que não houve diferença estatística quanto aos níveis séricos
de uréia e creatinina do G1 nos três momentos (M1, M2 e M3) .
4.10.5 Avaliação Hematológica
A caracterização da avaliação hematológica dos indivíduos do grupo G1 nos
três momentos (M1, M2 e M3) foi obtida através dos valores séricos de hemoglobina
e hematócrito encontra-se na Tabela 7.
Tabela 7 - Média e desvio padrão (x± s) do grupo G1 nos momentos (M1, M2 e
M3) quanto aos valores séricos de hematócrito e hemoglobina considerando
nível de significância p<0,05.
Momentos
Níveis séricos
M1
(x± s)
M2
(x± s)
M3
(x± s)
Hematócrito (%) 42,21 ± 5,35 41,45 ± 4,12 41,35 ± 4,45
Hemoglobina (g/dL) 14,30
± 1,63 13,94 ± 1,62 14,17 ± 0,172
(x± s) média e desvio padrão
G1: indivíduos que sofreram acidente ocupacional com materiais biológicos que realizaram de profilaxia anti-retroviral
M1 : até dois dias após o início da profilaxia
M2: no último dia da profilaxia
M3: 30 dias após o término da medicação
Hipótese Estatística Comentário
Diferença entre os
momen
tos (M1, M2 e M3)
do G1
p> 0,05 M1=M2=M3
Resultados 54
Foi observado que não houve diferença estatística quanto aos níveis séricos
de hematócrito e hemoglobina do G1 nos três momentos (M1, M2 e M3).
4.11 Caracterização dos indivíduos de acordo com a análise da ingestão de
alimentos
A caracterização dos indivíduos do G1 nos três momentos quanto à ingestão
dos macronutrientes,carboidratos, lipídios,proteínas e fibras encontra-se na tabela 8.
Tabela 8-Média e desvio padrão (x± s) do grupo G1 quanto á ingestão dos
macronutrientes carboidratos, lipídios e proteínas em porcentagem e fibras em
gramas, considerando nível de significância p< 0,05.
Momentos
Nutrientes
M1
(x± s)
M2
(x± s)
M3
x± s)
Carboidratos (%) 45 44,5 47
Lipídios (%) 36 35,5 34
Proteínas (%) 19 20 19
Fibras (g) 10 11 12
(x± s) média e desvio padrão
G1: indivíduos que sofreram acidente ocupacional com materiais biológicos que realizaram de profilaxia anti-retroviral
M1 : até dois dias após o início da profilaxia
M2: no último dia da profilaxia
M3: 30 dias após o término da medicação
Hipótese Estatística Comentário
Resultados 55
Diferença entre os
momentos (M1, M2 e M3)
do G1
p> 0,05 M1=M2=M3
A média da análise do recordatório alimentar do grupo G1 entre os três
momentos (M1, M2 e M3) demonstrou ingestão reduzida de carboidratos e fibras e
ingestão excessiva de lipídios e proteínas, sem alteração da alimentação durante o
estudo.
4.12 Avaliação da Microbiota Intestinal
4.12.1 Avaliação da microbiota intestinal de Lactobacillus
A avaliação da microbiota intestinal dos indivíduos do grupo G1 nos três
momentos (M1 M2 e M3) e grupo controle quanto a contagem de Lactobacillus em
escala logarítmica encontra-se na figura 17 e a análise estatística na tabela 9.
6,6
7,6
9,57
6,9
0
2
4
6
8
10
12
M1(GC) M1(G1) M2(G1) M3(G1)
grupos
log/g
M1(GC)
M1(G1)
M2(G1)
M3(G1)
GC: Grupo controle-indivíduos doadores de sangue
G1: indivíduos que sofreram acidente ocupacional com materiais biológicos que realizaram de profilaxia anti-retroviral
M1: até dois dias após o inicio da profilaxia anti-retroviral
M2: no ultimo dia da profilaxia anti-retroviral
M3: 30 dias após o término da profilaxia
Log/g/fezes: contagem logarítima por grama de fezes
Resultados 56
Figura 17 - Média logarítmica da contagem de UFC/g de fezes de Lactobacillus
nos grupos G1 e GC.
Tabela 9- Média e desvio padrão (x ± s) do logarítmica da contagem de
Lactobacillus no grupos GC versus G1 nos três momentos (M1,M2 e M3)
considerando nível de significância (p<0,05).
Momentos
Grupos
M1
GC
(x± s)
M1
G1
(x± s)
M2
G1
(x± s)
M3
G1
(x± s)
Lactobacillus
(log/g)
9,57 ± 0,85 7,6± 0,371
6,96 ± 0,89 6,60
±
43
(x± s) média e desvio padrão
GC: Grupo controle-indivíduos doadores de sangue
G1: indivíduos que sofreram acidente ocupacional com materiais biológicos que realizaram de profilaxia anti-retroviral
M1 : até dois dias após o inicio da profilaxia
M2: no último dia da profilaxia
M3: 30 dias após o termino da medicação
Hipótese Estatística Comentário
Interação entre os grupos (GC e G1)
entre os momentos. GC >G1-M1
GC >G1-M2
GC >G1- M3
p<0,05
p<0,05
p<0,05
GC>M1
GC>M2
GC>M3
Diferença do G1 entre os momentos (M1, M2
e M3)
M1= M2
M2= M3
M3= M1
p<0,05
p>0,05
p<0,05
M1>M2
M2=M3
M1>M3
Resultados 57
Foi observado diferença estatística na avaliação da microbiota bacteriana de
Lactobacillus dos grupos GC versus G1 nos três momentos e na avaliação do G1
entre os três momentos (M1, M2 e M3) mostrou diferença estatística quando
comparado M1 - M2 e M1 - M3.
4.12.2 Avaliação da microbiota intestinal de Bifidobacterium
A avaliação da microbiota intestinal dos indivíduos dos grupo GC versus G1
nos três momentos (M1,M2 e M3) quanto a contagem de Bifidobacterium em escala
logarítmica encontra-se na figura 18 e a análise estatística nas tabela 10.
8,14
10,55
9
8,37
0
2
4
6
8
10
12
M1(GC) M1(G1) M2(G1) M3(G1)
momentos
log/g fezes
M1(GC)
M1(G1)
M2(G1)
M3(G1)
GC: Grupo controle-indivíduos doadores de sangue
G1: indivíduos que sofreram acidente ocupacional com materiais biológicos que realizaram de profilaxia anti-retroviral
M1: até dois dias após o inicio da profilaxia anti-retroviral
M2: no ultimo dia da profilaxia anti-retroviral
M3: 30 dias após o término da profilaxia
Log/g fezes: contagem logarítmica por grama de fezes
Resultados 58
Figura 18 - Média de Logarítmica da Contagem de unidade formadora de
colônia por grama de fezes(UFC/g de fezes) de Bifidobacterium nos grupos GC
e G1.
Tabela 10 - Média e desvio padrão (x ± s) do logarítmica da contagem de
Bifidobactérium no grupos GC versus G1 nos três momentos (M1,M2 e M3)
considerando nível de significância (p<0,05).
Momentos
Grupos
M1
GC
(x± s)
M1
G1
(x± s)
M2
G1
(x± s)
M3
G1
(x± s)
Bifidobacterium(log/g)
10,55 ± 0,93
9,0 ± 0,809 8,37 ± 1,39 8,14 ± 1,39
(x± s) média e desvio padrão
M1 : até dois dias após o inicio da profilaxia
M2: no último dia da profilaxia
M3: 30 dias após o termino da medicação
Hipótese Estatística Comentário
Interação entre os grupos (GC e G1) entre
os momentos. GC >M1
GC >M2
GC >M3
p< 0,05
p< 0,05
p< 0,05
GC >M1
GC> M2
GC >M3
Diferença entre os momentos
(M1, M2 M3) M1= M2
M2= M3
M3= M1
p< 0,05
p< 0,05
p< 0,05
M1=M2
M2=M3
M1>M3
Resultados 59
Foi observado diferença estatística na avaliação da microbiota intestinal de
Bifidobacterium no GC versus o G1 nos três momentos e na avaliação do G1 houve
diferença estatística apenas quando comparado M1 e M3.
4.12.3 Avaliação da microbiota intestinal de Bacteróides
A caracterização da microbiota intestinal quanto à avaliação da contagem em
log/g de fezes de Bacteróides nos grupos GC e G1 nos três momentos (M1, M2 e
M3) conforme descrito na figura 19 e análise estatística nas tabelas 11.
11,68
8,96
9,34
8,06
0
2
4
6
8
10
12
M1(GC) M1(G1) M2(G1) M3(G1)
grupos e momentos
média log/g de fezes
M1(GC)
M1(G1)
M2(G1)
M3(G1)
GC: grupo controle doadores de sangue
G1: indivíduos que sofreram acidente ocupacional com materiais biológicos que realizaram de profilaxia anti-retroviral
M1 : até dois dias após o inicio da profilaxia
M2: no último dia da profilaxia
M3: 30 dias após o termino da medicação
Log/g fezes:Contagem logarítmica por grama de fezes
Resultados 60
Figura 19- Média logarítmica da contagem de UFC/g de fezes de Bacteróides
nos grupos GC e G1.
Tabela 11-Média e desvio padrão (x ± s) do logarítimo da contagem de
Bacteroides no grupos GC versus G1 nos três momentos (M1, M2 e M3)
considerando nível de significância (p<0,05).
Momentos
Grupos
M1
GC
(x± s)
M1
G1
(x± s)
M2
G1
(x± s)
M3
G1
(x± s)
Bacteroides
(log/g)
11,68 ± 0,459
9,33
± 0,68 8,06
± 2,93
8,96
± 0,66
(x± s) média e desvio padrão
M1 : até dois dias após o inicio da profilaxia
M2: no último dia da profilaxia
M3: 30 dias após o termino da medicação
Hipótese Estatística Comentário
Interação entre os grupos (GC e G1)
entre os momentos. GC >M1
GC >M2
GC >M3
p< 0,05
p< 0,05
p< 0,05
GC >M1
GC> M2
GC> M3
Diferença entre os momentos
(M1, M2 M3) M1= M2
M2= M3
M3= M1
p>0,05
p>0,05
p>0,05
M1=M2
M2=M3
M3=M1
Resultados 61
Foi observado diferença estatística na avaliação da microbiota intestinal de
Bacteroides no GC versus o G1 nos três momentos já na avaliação do G1 não
mostrou diferença estatística .
4.12.4
Caracterização da microbiota intestinal em Log/g de fezes de
Lactobacillus , Bifidobacterium e Bacteroides do G1 nos três momentos (M1,
M2 e M3) encontra-se na figura 20.
9,57
6,6
11,68
8,96
7,6
6,96
9,33
8,06
8,14
10,55
9,0
8,37
0
2
4
6
8
10
12
14
M0(GC) M1(G1) M2(G1) M3(G1)
grupos
log/g fezes
0
2
4
6
8
10
12
Lactobacillus
Bacteróides
Bifidobaterium
(x± s) média e desvio padrão
M1 : até dois dias após o inicio da profilaxia
M2: no último dia da profilaxia
M3: 30 dias após o termino da medicação
Log/g fezes: contagem logarítmica por grama de fezes
Figura 20 – Distribuição de Lactobacillus, Bifidobacterium e Bacteróides
quanto à média logarítmica da contagem de UFC/g de fezes do grupo G1.
Resultados 62
Quando comparamos os três gêneros Lactobacillus, Bifidobacterium e
Bacteróides, nos três momentos do G1 com GC observou-se diferença estatística
em todos os momentos de todos os gêneros de bactérias, já quando comparados
apenas o G1 entre os momentos houve diferença apenas nos gêneros de
Lactobacillus nos Bifidobacterium.
Discussão 62
5. DISCUSSÃO
O trato gastrointestinal é um sistema altamente complexo que têm
despertado interesse de muitos pesquisadores principalmente associado à presença
de infecções
(1,3,8,12)
.
Entretanto, apesar dos vários estudos neste campo pouco se sabe das
possíveis alterações deste órgão na ausência de doença e a participação de drogas
como os anti-retrovirais, utilizada nos indivíduos que sofreram acidentes
ocupacionais a materiais biológicos contaminados de pacientes infectados pelo
HIV/aids.
Neste sentido o presente estudo teve por objetivo, investigar as alterações
na composição da microbiota intestinal de indivíduos normais com indicação de
terapia anti-retroviral por 28 dias. Sendo assim foram determinados três gêneros de
bactérias anaeróbias frequentemente encontradas e de grande importância para a
manutenção da saúde tais como Lactobacillus, Bifidobacterium e Bacteróides
(61)
.
Segundo Brandt et al, vários fatores podem influenciar a colonização da
microbiota intestinal tais como genética, idade, sistema imune, alimentação, estado
nutricional, e uso de antimicrobianos
(62)
.
As alterações da microbiota intestinal relacionadas à idade são observadas
com maior intensidade ao nascimento, quando a mesma se estabelece e o sistema
gastrointestinal se coloniza com os microorganismos que estão presentes nos
alimentos, e no contato com o meio ambiente
(63,64,65)
. Já os indivíduos adultos
normalmente apresentam a microbiota intestinal qualitativamente e
quantitativamente estável
(9,13,66,67)
.
Discussão 63
A faixa etária dos indivíduos do presente estudo ficou entre 18 e 45 anos ,
período que segundo a literatura
(9)
, não há alterações significativas da microbiota
intestinal. Sendo assim as alterações observadas não devem ter interferido nos
resultados encontrados
(9)
.
Em relação ao sexo, houve maior porcentagem do feminino em ambos os
grupos. Nesse sentido, Bertazzoni-Minelli
(67)
et al, revelam que desordens hormonais
esteróides também podem influenciar a microbiota intestinal, na qual amostras de
fezes de mulheres após a menopausa demonstraram maior quantidade de fungos,
Clostridium e Lactobacillus, do que as amostras colhidas de mulheres em idade fértil.
No presente estudo apesar do predomínio do sexo feminino a paticipação de apenas
mulheres mulheres em idade fértil e a homogeneidade entre os grupos não deve ter
influênciado na microbiota intestinal.
A dieta também pode contribuir para modificações na microbiota intestinal
segundo alguns autores
(9,3,68)
estando relacionada aos hábitos culturais, estilo de
vida e principalmente ao nível sócio-econômico. Edwards
(68)
descreve que a dieta
pode afetar a sobrevivência e o metabolismo das bactérias através de componentes
dietéticos não digeridos e tipo de substância secretada pelo intestino. No presente
estudo a dieta não demonstrou modificação durante o experimento com a utilização
dos anti-retrovirais.
Em relação à avaliação da ingestão alimentar tanto qualitativa quanto
quantitativa realizada no presente estudo através do recordatório alimentar de vinte
quatro horas, observou-se ingestão excessiva de lipídios e proteínas e baixa
ingestão de fibras, que não se modificaram nos diferentes momentos. Sabe-se que a
ingestão de carboidratos não digeríveis na dieta e a utilização de fibras pode alterar
de forma direta e indireta a microbiota intestinal e a regulação de seus metabólitos. A
Discussão 64
baixa ingestão de fibras e carboidratos observada no presente estudo, não deve ter
contribuído para as modificação da microbiota intestinal.
Em relação à avaliação do estado nutricional, a “American Dietetic
Association”
(69),
destaca a importância dessa avaliação para identificar desnutrição
ou risco nutricional, os quais talvez possam interferir na composição da microbiota
intestinal.
No presente estudo foi realizada avaliação do percentual de gordura
corporal, como indicador do estado nutricional importante para a avaliação da
composição da massa corporal, segundo os critérios propostos por Durnin et al.
(59) .
Sendo Assim, o grupo de indivíduos que recebeu anti-retrovirais, apresentou
percentual de gordura acima do intervalo de referência, consequência associada a
alta ingestão alimentar de gorduras e sedentarismo. Os indivíduos, apresentaram
predomínio de sobrepeso no grupo que recebeu profilaxia anti-retroviral (G1) e
eutrofia no grupo de doadores de sangue (GC), portanto esses fatores não devem
estar associados às modificações da microbiota intestinal.
Esses dados refletem as condições brasileiras da população atual, que
segundo dados do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE), mostraram
prevalência de excesso de peso na população adulta brasileira, sendo que este
problema alcança grandes expressões em todas as regiões do país e em todas as
classes de rendimentos
(70)
.
Outros fatores avaliados foram o etilismo e o tabagismo e sua possível
influência na microbiota intestinal. Alguns estudos
(71,72)
relatam que o alcoolismo
crônico pode provocar alterações detectáveis na população microbiana que coloniza
a orofaringe. No presente estudo foi observado pequena porcentagem de etilista
social o que não deve ter influenciado na microbiota intestinal. Por outro lado, não
Discussão 65
existem estudos acerca da interação entre o tabagismo e a microbiota intestinal, fato
esse que esteve presente na metade dos indivíduos estudados.
Outro aspecto estudado foi o tipo de acidente ocupacional. Houve maior
prevalência de acidentes percutâneos,pelo uso de agulha utilizada na coleta de
sangue e administração de medicamentos, por auxiliares e técnicos de
enfermagem os quais estão mais expostos à contaminação de materiais
biológicos assim como em outros estudos com profissionais da saúde que
sofreram acidentes ocupacionais
(73,74).
Em relação ao tipo de anti-retroviral utilizado, a combinação do AZT+ 3TC
fez parte de todos os esquemas, segundo a recomendação do Ministério da Saúde
por ter eficácia comprovada e boa tolerância digestiva
(75)
.
Os inibidores da protease foram utilizados na maioria dos indivíduos sendo
que o nelfinavir, foi o mais indicado, por ser bem tolerado, embora esteja associado
à presença de diarréia.
(40)
No presente estudo, metade dos indivíduos apresentou diarréia no segundo
momento, o que deve ter sido ocasionado pelo uso do Nelfinavir, o que concorda
com os dados da literatura
(39)
, a normalização desses sintomas ocorreu após 30 dias
do término da profilaxia.
A presença de efeitos adversos associada ao uso de anti-retrovirais tem
sido relatada em mais de 50% dos profissionais acidentados, sendo que um terço
aproximadamente interrompe o uso desses medicamentos pela presença desses
sintomas. Essas manifestações em geral são inespecíficas, leves e autolimitadas.
As alterações gastrointestinais e laboratoriais usualmente são discretas, transitórias
e pouco freqüentes
(37)
.
Discussão 66
No presente estudo, observou-se que os efeitos adversos provocados pela
quimioprofilaxia no trato gastrointestinal foram náuseas, vômitos e diarréias, durante
o uso de anti-retrovirais, os quais não diferiram dos relatos da literatura
(37)
.
Vários estudos sugerem que o acompanhamento laboratorial do
profissional acidentado deverá avaliar possíveis alterações hepáticas e/ou do perfil
lipídico
(37)
. No presente estudo foram encontradas elevações nos níveis séricos das
transaminases, AST, ALT e Gama-GT bem como nos triglicérides e LDL- colesterol.
Houve normalização desses valores trinta dias após o término da quimioprofilaxia,
conforme descrito na literatura
(37)
. Os demais exames laboratoriais não sofreram
alterações.
Fatores exógenos, tais como os agentes antimicrobianos, são capazes de
induzir mudanças rápidas e profundas na microbiota intestinal, segundo Monreal et
al
(1)
Nesse sentido Sullivan et al
(76)
descreveram que a extensão dessas
mudanças na microbiota intestinal depende não apenas do espectro de ação do
agente antimicrobiano mas do seu grau de absorção, via de administração e
possível inativação enzimática e/ou capacidade de ligação aos líquidos corporais e
material intestinal
(76)
Nos últimos anos vários pesquisadores
(1,3,26)
vem estudando o efeito dos
antimicrobianos na microbiota intestinal e seu desequilíbrio, em indivíduos com
infecções associadas, dificultando a identificação real da ação dessas drogas no
organismo sem doença. O presente estudo foi realizado para se conhecer melhor a
participação dos anti-retrovirais na ausência de doença, e o possível impacto na
redução das bactérias anaeróbias. O uso dessas drogas mostrou efeito importante
na modificação da microbiota durante todo o estudo. A alteração observada no início
Discussão 67
da profilaxia se deve ao fato de que a análise das fezes ocorreu até dois dias do
inicio da profilaxia revelando a precoce mudança na composição da microbiota.
Portanto, as alterações provocadas na microbiota intestinal foram
importantes e não se recuperaram após trinta dias do término da medicação.
Monreal et al
(1)
avaliaram indivíduos com infecção de vias aéreas que
receberam tratamento com amoxacilina por sete dias e observaram redução
significativa das bactérias anaeróbias Lactobacillus e Bifidobactérium, e aumento de
bacteróides no período do tratamento, com normalização da composição da
microbiota após 30 dias do término do tratamento com esse antibiótico
(1)
.
Em outro estudo, Lode et al
(77)
, avaliaram doze indivíduos normais que
receberam amoxacilina e ácido clavulânico por sete dias e observaram redução
significativa na microbiota anaeróbica do número de bifidobactérias, lactobacilos e
clostrídios enquanto o número de bacteróides não foi alterado. Observaram também
que a microbiota intestinal se normalizou após 35 dias da administração de
medicamentos
(77)
.
Em estudo com anti-retrovirais, Trindade et al
(3)
avaliaram indivíduos
infetados pelo HIV/aids em uso de terapia anti-retroviral potente, e identificaram
também redução das bactérias anaeróbias Bacteroides, Lactobacillus e
Bifdobacterium. Esse estudo não permitiu avaliar a participação das drogas de
forma isolada e sua relação com a microbiota intestinal devido a presença da doença
e a suplementação de pré e pro- bióticos durante o estudo
(3)
.
Embora existam estudos
(1,77)
sobre infecção e uso de antimicrobianos e
alterações na microbiota intestinal, a participação da ação dos anti-retrovirais na
ausência de infecção, ainda não tem sido relatada.
Discussão 68
Os lactobacilos e as bifidobactérias são encontrados em grandes
quantidades na microbiota intestinal anaeróbia. Esses microorganismos contribuem
para a manutenção da resistência à colonização, pela produção de ácidos acéticos e
lácticos, que diminuem o pH intestinal, impedindo o crescimento excessivo de outros
microrganismos, potencialmente patogênicos, que têm seu crescimento limitado pela
acidez intestinal. Além dessas substâncias, outras com ação antimicrobianas são
produzidas
(78)
.
Os Lactobacillus e Bifidobacterium são frequentemente utilizados em
produtos alimentares conhecidos por probióticos, que possuem efeitos importantes
sobre o sistema imune. Entre esses efeitos, podem ser citados o estímulo da função
fagocitária e o controle do balanço entre citocinas pró-inflamatórias e anti-
inflamatórias
(79)
No presente estudo a redução das bactérias anaeróbias Bacteroides,
Bifidobacterium e Lactobacillus nos indivíduos em uso de anti-retrovirais nos três
momentos, foi importante durante todo o estudo. Os Lactobacillus e Bifidobacterium,
mantiveram-se reduzidos após 30 dias do término da profilaxia, revelando a
importância de se estudar melhor essas variáveis para possíveis intervenções. Cabe
salientar que outros estudos com antibióticos e infecções que não HIV/aids tem
mostrado que ocorre normalização da microbiota até 30 dias após o tratamento o
que não foi observado no presente estudo.
A diminuição destes microorganismos pode representar diversos prejuízos
para o hospedeiro, sendo o principal deles a diminuição à resistência e à
colonização. Várias medidas terapêuticas e alimentares podem ser utilizadas pela
equipe de saúde no sentido de minimizar a influência nociva dos medicamentos
sobre o ecossistema gastrointestinal do paciente.
Discussão 69
Por fim, novos estudos devem ser realizados e associados à intervenção
nutricional, no sentido se de aprofundar os conhecimentos da interação entre droga
e microbiota intestinal, e assim propor medidas para reduzir esse desequilíbrio, o
qual pode ser extremamente prejudicial aos indivíduos.
Considerações Finais 70
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
As váriáveis idade, sexo, alimentação e o estado nutricional não
interferiram significativamente sobre a microbiota intestinal dos índivíduos.
A avaliação do estado nutricional dos indivíduos, quanto à composição
corporal (índice de massa corporal, porcentagem de gordura e circunferência
muscular do braço), não mostraram diferenças entre os grupos e os momentos
analisados, porém foi possível observar maior número de indivíduos com
sobrepeso no grupo de indivíduos que sofreram acidente ocupacional com
indicação de profilaxia anti-retroviral.
Os exames laboratoriais de proteínas totais e frações, glicemia, uréia,
creatinina, colesterol total, HDL-colesterol, hematócrito e hemoglobina não
apresentaram diferença entre os momentos avaliados. Entretanto as enzimas
hepáticas AST, ALT, GGT e LDL-colesterol e triglicérides apresentaram diferença
entre os momentos, principalmente no M2. No entanto acredita-se que esses
resultaram não influenciaram as alterações da microbiota intestinal.
Os anti-retrovirais apresentaram impacto importante na microbiota intestinal e
já no primeiro momento pode-se identificar alterações na microbiota que se
intensificaram durante a profilaxia e que não se normalizaram após o término do
uso dos anti-retrovirais.
Referências Bibliográficas 71
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Anexos 81
Anexo - 01
Anexos 82
Anexo-2
Classificação do estado nutricional segundo o índice de massa corporal
(IMC –kg/m
2
)
(61)
.
Índice de Massa Corporal (kg/m
2
) Classificação
≤ 16 Desnutrição grau I (leve)
16 – 16,9 Desnutrição grau II (moderada)
17,0 – 18,49 Desnutrição grau I (leve)
18,5 – 24,9 Eutrofia
25,0 –29,9 Pré – obeso
30,0 –34,9 Obesidade grau I
35,0 –39,9 Obesidade grau II
≥ 40 Obesidade grau III
Anexos 83
Anexo 3
Caracterização dos métodos laboratoriais utilizados e seus valores de
referência.
Exame Método Valor de referência
Uréia Colorimétrico enzimático Homens 19-42mg/dl
mulheres 15-37mg/dl
Creatinina Colorimétrico Homens 0.8 - 1.5 mg/dl
mulheres 0.7 –1.2mg/dl
AST Cinético- UV Homens 21 – 75 u/l
Mulheres 14 – 36 u/l
GAMA GT Cinético – UV Homens 15 – 73
Mulheres 13 - 43
ALT Cinético- UV Homens 21 –75u/l
Mulheres 9 – 52u/l
Colesterol total Colorimétrico enzimático desejável < 200mg/dl
LDL Colorimétrico enzimático Desejável <130mg/dl
HDL Colorimétrico enzimático 40-60mg/dl
Triglicérides Colorimétrico enzimático Desejável < 150mg/dl
Glicose Colorimétrico enzimático Desejável < 100 mg/dl
Proteínas totais Colorimétrico 6,3 – 8,2g/dl
Albumina Colorimétrico 3,5 – 5,0 g/dl
Apêndice 84
Apêndice 1
Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho”
Faculdade de Medicina de Botucatu
Departamento de Doenças Tropicais e Diagnóstico por Imagem
Protocolo de Avaliação
1. Identificação
Nome___________________________________________________
Estado Civil_________________Sexo____________Cor__________
Data de Nascimento__/___/____ idade______________________
Escolaridade___________________ Profissão__________________
Endereço____________________________nº__________________
Compelmento_________________________Bairro_______________
Procedência________________________Naturalidade____________
Telefone_________________________________________________
2.Dados Sócio-econômicos
Moradia ( ) madeira ( ) alvenaria ( )própria ( )alugada ( )financiada
Localidade( )urbana ( )rural
Saneamento básico sim ( ) não( )
Número de pessoas que residem na casa___quantas trabalham______
Renda Mensal_______
3.Avaliação Clínica
Tipo de acidente:___________________________data_____________
Material acidentado__________________________________________
Medicação indicada__________________________________________
Fez uso de antibióticos nos últmos 30 dias________________________
4. Interrogatório Nutricional Complementar
Consulta M1 M2 M3
Alergia alimentar
Hábito intestinal
Ingestão hídrica
Náuseas
Vômitos
Tabagismo
Etilismo
Atividade física
Apêndice 85
5. Inquérito Alimentar
Alimento Quantidade
Frequência Alimentar
Diário semanal mensal
Carne
bovina
Carne de
frango
Carne de
porco
Ovo
Leite e
derivados
Pão
Leguminosa
Cereais
Verdura e
legumes
Doces em
geral
Refrigerantes
Café
Embutidos/
industrializados
7. Recordatório Alimentar
Refeição Momento alimento Medida
Desjejum Local
Hora
Colação Local
Hora
Almoço Local
Hora
Lanche Local
Hora
Jantar Local
Hora
Ceia Local
Hora
Apêndice 86
8. Avaliação Antropométrica
Consulta M1 M2 M3
Peso usual
Peso atual
Estatura
IMC(Kg/m
2
)
CB(cm)
CMB(cm)
PCT(mm)
PCB(mm)
PCSE(mm)
PCSI(mm)
∑ dobras
% gordura
Diagnóstico
Nutricional
9. Exames Laboratoriais
Consulta M1 M2 M3
Hemoglobina
Hematócrito
Linfócitos
Colesterol total
LDL-colesterol
HDL- colesterol
Triglicérides
Glicemia de jejum
AST
ALT
Gama GT
Uréia
Creatinina
Proteínas totais e
frações
Albumina
Globulina
Apêndice 87
10. Avaliação da Microbiota Intestinal
M1
Bactéria 10
2
10
4
10
5
10
6
Lactobacillus
Bactéria 10
4
10
6
10
7
10
8
Bifidobacterium
Bactéria 10
4
10
6
10
7
10
8
Bacteróides
M2
Bactéria 10
2
10
4
10
5
10
6
Lactobacillus
Bactéria 10
4
10
6
10
7
10
8
Bifidobacterium
Bactéria 10
4
10
6
10
7
10
8
Bacteróides
M3
Bactéria 10
2
10
4
10
5
10
6
Lactobacillus
Bactéria 10
4
10
6
10
7
10
8
Bifidobacterium
Bactéria 10
4
10
6
10
7
10
8
Bacteróides
Apêndice 88
Apêndice 2
Termo de Consentimento livre e esclarecimento
Eu______________________________________________________________
Recebi pessoalmente as informações do protocolo de pesquisa:
“Avaliação da microbiota intestinal de indivíduos que sofreram acidente
ocupacional a materiais biológicos com indicação de profilaxia anti-retroviral”.
Fui devidamente informado sobre os objetivos e procedimentos envolvidos
no estudo(entrevista, exames laboratoriais contendo 5ml de sangue,
antropometria e avaliação da microbiota intestinal através da solicitação da
amostras de fezes em três momentos: 1º:momento até o segundo dia da
medicação, 2º momento: no último dia da profilaxia anti-retriviral e 3
momento: um mês após o término da profilaxia anti-retroviral. Com o
resultados obtidos será possível oferecer orientações relativas a alimentação,
como forma de melhorar a quantidade de germes que trazem benefícios à
saúde.
Garantia de acesso as informações dos procedimentos e benefícios
relacionados a pesquisa: liberdade para retirar seu consentimento a qualquer
momento e deixar de participar do estudo, sem prejuízos, sigilo e privacidade.
Este termo de consentimento foi elaborado de acordo com a resolução
196/196 do Conselho Nacional de Saúde- Ministério da Saúde, sobre pesquisa
envolvendo seres humanos.
_____________________ ___________________________________
Assinatura do Paciente Pesquisadora: Micheli Evangelista de Souza
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