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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUISTA FILHO”
FACULDADE DE MEDICINA
MARIA CRISTINA SANTOS HAANWINCKEL
Avaliação da atividade de macrófagos e produção de anticorpos
em camundongos geneticamente selecionados e infectados com a
Leptospira sorovar Pomona
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação
em Doenças Tropicais da Faculdade de
Medicina de Botucatu, da Universidade Estadual
Paulista - UNESP para obtenção do título de
Doutor em Doenças Tropicais.
Orientador:Prof. Dr. Silvio Luis de Oliveira
Botucatu
2007
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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO
DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
Haanwinckel, Maria Cristina Santos.
Avaliação da atividade de macrófagos e produção de anticorpos em
camundongos geneticamente selecionados e infectados com a
Leptospira sorovar Pomona / Maria Cristina Santos Haanwinckel. –
Botucatu : [s.n.], 2007.
Tese (doutorado) – Faculd
ade de Medicina de Botucatu,
Universidade Estadual Paulista, 2007.
Orientador: Silvio Luis de Oliveira
Assunto CAPES: 40101096
1. Leptospirose - Aspectos imunológicos - Estudos experimentais
CDD 616.931
Palavras chave: Aspectos imunológicos; Camundongos Biozzi;
Infecção experimental; Leptospira sorovar pomona; Macrófagos
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ii
Esse trabalho foi realizado nos laboratórios do
Departamento de Microbiologia e Imunologia do
Instituto de Biociências e no Laboratório de
Zoonoses do Departamento de Higiene Veterinária
e Saúde Pública da Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia do Campus da UNESP de
Botucatu, com auxílio financeiro do Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico-CNPq –Processo n.140026/02-9.
iii
DEDICATÓRIA
Ao meu pai Elysio,
Por valiosos anos de ensinamentos de vida, de conceitos baseados na mais
pura retidão de comportamento, de atitudes de força, mas, sobretudo de
solidariedade com o próximo.
À minha mãe Ruth (In memorian)
A mais forte de todas as mulheres que conheci, pois nunca permitiu que as
adversidades fossem barreiras para suas conquistas, exemplo de honestidade,
perseverança e vontade de crescer sempre, sem nunca deixar de amparar
àqueles que dela dependiam.
Aos meus irmãos Fátima, Auxiliadora, Paulo, Eduardo e Carolina, e a todos os
meus sobrinhos por todos os momentos que possibilitaram a certeza de que
podemos contar uns com outros.
A Jorge que embora esteja à distância de um oceano, está a um passo, em
sentimento e apoio.
iv
Nos caminhos que ninguém percorreu arisca
teu passo. Nos pensamentos que ninguém
cogitou, arrisca tua cabeça.
Anônimo
v
AGRADECIMENTOS
Ao Prof
o
Dr Sílvio Luis de Oliveira, que com sua orientação colaborou de forma
fundamental para que fosse possível a realização desse trabalho.
Ao Prof
o
Dr Hélio Langoni por ceder as instalações de seus laboratórios para que
fosse possível realizar parte desse trabalho, e a seus residentes Rodrigo, André,
Juliana e Mônica pelo valioso auxílio.
A Prof
a
. Dr
a
Jane Megid por todos os anos de auxílio durante o meu percurso como
residente e pós-graduanda.
Ao Prof
o
Dr Silvio Arruda Vasconcellos e a Bióloga Zenaíde Maria de Moraes por
cederem as cepas de leptospiras utilizadas nesse trabalho.
Aos professores do Departamento de Microbiologia e Imunologia, pela atenção
desprendida e disponibilidade para ensinar.
A todos os funcionários do Departamento de Microbiologia e Imunologia, em
especial a Maria de Lourdes Alves e Luís Alquati., Sônia Faraldo e Leonice Garcia,
por toda ajuda prestada, e por todas as vezes que necessitei de conselhos.
Ao residente da patologia humana Marcelo Padovani de Toledo Moraes pelo auxílio
na leitura das laminas de hematoxilina-eosina.
Aos meus colegas pós-graduandos, Fabiane, Juliana, João Gustavo, Ricardo,
Gladston, por todas as vezes que precisei de auxílio ou nos momentos de
descontração.
vi
Aos meus amigos Carla, André, Bianca, Fábio, Wellington, Cristina Crespo, Gustavo,
Déborah, Érica, Guilherme e Linda por todas as inúmeras vezes que precisei e
estavam presentes, mesmo que apenas em pensamento.
Ao conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo
apoio financeiro, sobretudo pela confiança a mim depositada em momentos que
foram decisivos para que meu trabalho se concretizasse.
vii
LISTA DE ABREVIATURAS
BCG- Bacilo Calmette Guérin
ConA - Concavalina A
ELISA- ensaio imuno-enzimático (Enzyme-Linked Imunosorbent Assay)
GM-CSF- fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos
HE- eritrócitos humanos
H
IV-A
– camundongos bons (H=High) produtores de anticorpo-Seleção IV-A
Ig- imunoglobulina
L
IV-A
camundongos maus (L=low) produtores de anticorpos-Seleção IV-A
LPS– lipopolissacaride
H
2
O
2
– peróxido de hidrogênio
IFN-γ
γγ
γ interferon-gama
IL -interleucina
MCCC –meio completo para cultura de células
MHC –complexo principal de histocompatibilidade
NK –células natural Killer
NO –óxido nítrico
O
-
2
–ânion superóxido
OONO
-
–peroxinitrito
PBS –solução salina tamponada com fosfatos (Phosphate Buffer Saline)
PMA –Phorbol myristate acetate
SE –eritrócito de carneiro
TNF-α
αα
α –fator de necrose tumoral alfa
Th1 –linfócito T auxiliar tipo 1
viii
LISTA DE FIGURAS
Figuras 1A e 1B. Recuperação de leptospiras em rins (A) e fígado (B) de
camundongos das linhagens High (H) e Low (L), submetidos à inoculação de 2x 10
7
Leptospira interrogans sorovar pomona em períodos de tempo determinados................
37
Figura 2. Títulos de anticorpos detectados pelo teste de aglutinação microscópica
frente ao antígeno de Leptospira interrogans sorovar pomona, em camundongos High
e Low, inoculados com 2x10
7
leptospiras/ml....................................................................
39
Figuras 3A, 3B, 3C, 3D. Produção de peróxido de hidrogênio por macrófagos
peritoneais de camundongos H e L da seleção IV-A infectados com L. interrogans
sorovar pomona e animais controle não infectados...........................................................
42
Figuras 4A, 4B, 4C, 4D. Produção de peróxido de hidrogênio por macrófagos
esplênicos de camundongos H e L da seleção IV-A infectados com L. interrogans
sorovar pomona e animais controle não infectados...........................................................
44
Figuras 5A, 5B, 5C, 5D. Produção de peróxido de hidrogênio por macrófagos
pulmonares de camundongos H e L da seleção IV-A infectados com L. interrogans
sorovar pomona e animais controle não infectados...........................................................
47
Figuras 6A, 6B. Produção de óxido nítrico por macrófagos peritoneais de
camundongos H e L da seleção IV-A infectados com L. interrogans sorovar pomona e
animais controle não infectados........................................................................................
49
Figuras 7A, 7B. Produção de óxido nítrico por macrófagos esplênicos de
camundongos H e L da seleção IV-A infectados com L. interrogans sorovar pomona e
animais controle não infectados........................................................................................
51
Figuras 8A, 8B. Produção de óxido nítrico por macrófagos pulmonares de
camundongos H e L da seleção IV-A infectados com L. interrogans sorovar pomona e
animais controle não infectados........................................................................................
53
Figura 9A, 9B, 9C, 9D. Níveis de TNF-α detectados em soros (A) e homogenato de
baço (B), fígado (C) e pulmão (D) de camundongos High e Low inoculados com
Leptospira sorovar pomona, e grupo controle não infectado............................................
56
Figura 10. Valores séricos de uréia (mg/dl) em média ±desvio padrão em cinco
animais por grupo..............................................................................................................
58
Figura 11. Valores séricos de creatinina (mg/dl) em média ±desvio padrão em cinco
animais por grupo.............................................................................................................
58
ix
Figura 12. Fotomicrografia de rins de camundongo infectado com L.interrogans
sorovar pomona. Coloração pela imunoperoxidase indireta.............................................
61
Figura 13. Fotomicrografia de rins de camundongo controle negativo. Coloração pela
imunoperoxidase indireta..................................................................................................
61
Figura 14. Fotomicrografia de tecido renal de camundongo L
IV-A
infectado. Técnica
de Hematoxilina Eosina....................................................................................................
64
Figura 15. Fotomicrografia de tecido renal de camundongo linhagem H
IV-A
sadio.
Técnica de Hematoxilina Eosina.......................................................................................
64
x
SUMÁRIO
R
ESUMO
..................................................................................................................... xii
A
BSTRACT
..................................................................................................................
xiii
1
I
NTRODUÇÃO
..........................................................................................................
1
2
O
BJETIVOS
..............................................................................................................
21
2.1 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL……………….………………………….
3. M
ATERIAL E
M
ÉTODOS
..........................................................................................
21
24
3.1 A
NIMAIS
.........................................................................................................................
24
3.1.1 Camundongos..............................................................................................................
24
3.1.2 Hamsters......................................................................................................................
24
3.2 I
NÓCULO
.........................................................................................................................
25
3.3
S
ACRIFÍCIO DOS
A
NIMAIS
..............................................................................................
25
3.4 M
EIOS DE
C
ULTURA
.......................................................................................................
26
3.4.1 Meio Semi-Sólido de Fletcher....................................................................................
26
3.4.2 Meio liquido de EMJH...............................................................................................
26
3.5
R
ECUPERAÇÃO DE
L
EPTOSPIRAS EM
M
EIO DE
C
ULTIVO
..............................................
27
3.6
T
ÉCNICA DE
S
OROAGLUTINAÇÃO
.................................................................................
27
3.7
A
TIVIDADE DE
M
ACRÓFAGOS
.......................................................................................
27
3.7.1 Determinação de intermediários reativos do oxigênio (H
2
O
2
)...................................
28
3.7.2 Determinação de intermediários reativos do nitrogênio (NO)...................................
29
3.8
E
NSAIO BIOLÓGICO PARA DETERMINAÇÃO DE
TNF-α..................................................
29
3.9
DOSAGEM
DE
URÉIA
E
CREATININA....................................................................
31
3.10
TÉCNICA DE IMUNOHISTOQUÍMICA (IMUNOPEROXIDASE) PARA
DETERMINAÇÃO DE ANTÍGENOS DE LEPTOSPIRA................................................
31
3.10.1- Obtenção do anticorpo primário..............................................................................
31
3.10.2 Controle de Especificidade.......................................................................................
32
3.11
T
ÉCNICA HISTOLÓGICA DE
H
EMATOXILINA
-E
OSINA
..................................................
33
3.12
A
NÁLISE
E
STATÍSTICA
...............................................................................................
34
xi
4.
R
ESULTADOS
.........................................................................................................
36
4.1
R
ECUPERAÇÃO DE
L
EPTOSPIRAS
V
IÁVEIS
.....................................................................
36
4.2
P
RODUÇÃO DE ANTICORPOS ANTI
-L
EPTOSPIRA INTERROGANS SOROVAR POMONA
......
38
4.3
A
TIVIDADE DE
M
ACRÓFAGOS
........................................................................................
40
4.3.1 Determinação da produção de Intermediários Reativos do Oxigênio
(H
2
o
2
)...........................................................................................................................
40
4.3.2 Determinação da produção de intermediários reativos do nitrogênio (NO)...............
48
4.4
P
RODUÇÃO DE
F
ATOR DE
N
ECROSE
T
UMORAL
-α
(TNF-α)...........................................
54
4.5
V
ALORES SÉRICOS DE URÉIA E CREATININA EM CAMUNDONGOS
H
IGH E
L
OW
.............
57
4.6 IDENTIFICAÇÃO DE ANTÍGENOS LEPTOSPIRICOS EM TECIDO RENAL DE
CAMUNDONGOS INFECTADOS PELA TÉCNICA DE
IMUNOHISTOQUÍMICA........
59
4.7
H
ISTOPATOLOGIA
(H
EMATOXILINA
-E
OSINA
)................................................................
63
5.
D
ISCUSSÃO
.......................................................................................................................
66
6.
C
ONCLUSÕES
....................................................................................................................
85
7.
R
EFERÊNCIAS
...................................................................................................................
87
xii
RESUMO
O presente estudo teve por objetivo principal avaliar a atividade de macrófagos e
produção de anticorpos frente à infecção experimental pela Leptospira interrogans sorovar
Pomona em camundongos selecionados geneticamente para boa (H) ou má (L) resposta
imune humoral. Para avaliar a atividade macrofágica foram utilizados ensaios para
determinação de produtos intermediários do oxigênio e nitrogênio. Também foram
investigados a produção de fator de necrose tumoral (TNF-α), anticorpos específicos,
recuperação da leptospira nos rins e fígado, lesões histológicas através da técnica de
hematoxilina-eosina e determinação de antígenos leptospiricos nos tecidos através da
técnica de imunohistoquímica. Os resultados mostram que a linhagem L
IV-A
apresentou
menor recuperação do microrganismo nos compartimentos analisados. Entretanto, a
linhagem H
IV-A
a partir do 14° dia de infecção apresentou total contenção , embora a L
IV-A
ainda tenha recuperado bactérias no fígado no 21° dia. A resposta imune contra o sorovar
Pomona nessas linhagens se caracterizou com produção elevada de anticorpos
principalmente em períodos mais tardios do processo infeccioso. A produção de
intermediários reativos do oxigênio e nitrogênio também auxiliou na eliminação do sorovar
Pomona nas duas linhagens, sendo a produção de H
2
O
2
importante fator nas linhagens H
IV-
A
e NO nas linhagens L
IV-A
, principalmente nos períodos mais tardios pós-inoculação, o
mesmo ocorrendo em relação ao TNF-α. Lesões renais mais intensas ocorreram em
períodos em que houve maior numero de leptospiras isoladas em meio de cultivo.
Entretanto, na linhagem L
IV-A
houve persistência de alterações teciduais mesmo em
períodos em que não houve recuperação de leptospiras. A técnica de imunohistoquímica
apresentou-se um pouco mais sensível em relação ao cultivo na detecção das leptospiras.
Entretanto, ambas foram bons parâmetros de identificação do agente nessas linhagens. Os
resultados sugerem que essas linhagens podem representar modelo importante para
investigação da patogenia e resposta imune de animais contra os variados sorovares da
leptospira.
Palavras-chave: Aspectos imunológicos; Camundongos Biozzi; Infecção experimental;
Leptospira interrogans sorovar Pomona; Macrófagos.
xiii
ABSTRACT
The aim of the present study was to evaluate the role of macrophage activity and antibody
production in experimental infection with Leptospira Pomona in mice genetically selected
for high (H) or low (L) humoral immune response. To evaluate macrophage activity,
reactive oxygen and nitrogen intermediates were determined. Also, the production of tumor
necrosis factor (TNF-) and the recovery of Leptospira-specific antibodies in the kidneys
and liver were assessed; histological lesions were analyzed using the hematoxylin-eosin
technique, and Leptospira antigens in tissues were determined by immunohistochemistry.
Results showed that recovery of microorganisms from the analyzed organs was lower in
L
IV-A
mice. However, H
IV-A
animals showed total restraint since the 14
th
day after infection,
whereas L
IV-A
mice
still had bacteria in the liver at the 21
st
post-infection day. Immune
response against Pomona serovar in those lineages was characterized as high production of
antibodies, mainly in late periods of the infectious process. The production of reactive
oxygen and nitrogen intermediates also contributed to the elimination of Leptospira
Pomona in all two lineages; H
2
O
2
production was an important factor in H
IV-A
mice, as well
as NO production in the L
IV-A
animals, mainly at the latest post-inoculation periods. The
same occurred regarding TNF- productionSevere renal lesions were observed at periods
in which larger numbers of leptospires were isolated using the culture technique. Tissue
alterations persisted in L
IV-A
mice, even at periods in which leptospires were not recovered.
Immunohistochemistry showed to be more sensitive than culturing. However, both
techniques were appropriate for the agent identification in the studied lineages. Results
suggest that such lineages could represent an important model to investigate pathogenesis
and immune response against the varied serovars of leptospires.
KEY WORDS: immunological tests, Biozzi mice, experimental infection, Leptospira
interrogans serovar Pomona, macrophages.
Para escrever só existem duas regras. Ter algo
a dizer e a coragem de dizê-lo.
Oscar Wilde
Introdução
IntroduçãoIntrodução
Introdução
1
1. INTRODUÇÃO
A leptospirose é uma zoonose de ampla distribuição geográfica, que acomete animais e o
homem, causada por espiroquetas do gênero Leptospira. A doença foi descrita pela primeira vez
em 1880 no Cairo por Larrey, contudo foi Weil em 1886 que descreveu minuciosamente a
doença, sendo denominada posteriormente de “Doença de Weil”.
A partir de 1950 se intensificaram no Brasil, trabalhos sobre esta importante zoonose,
como trabalhos de Santa Rosa principalmente em medicina veterinária
1
.
O Gênero Leptospira compreendem atualmente treze geno-espécies representadas pela
Leptospira interrogans, L. inadai, L borgpetersenii, L. kirschneri, L. noguchii, L. santarosai, L.
parva, L. weilii, L. fainei, L. alexanderi, L. meyeri, L. wolbachii e L. biflexa. Contudo ainda não
foram totalmente reconhecidas pelos subcomitês de classificação taxonômica para Leptospira
2,3,4
.
Através das características aglutinogênicas da Leptospira interrogans já foram
identificados mais de 200 sorovares distribuídos em 23 sorogrupos
5
. Padrões biomoleculares
relacionados a testes de DNA, RNA ribossômico e a reação em cadeia da polimerase (PCR) têm
confirmado a diversidade genômica dos sorogrupos
6,7
.
As leptospiras são microrganismos helicoidais, aeróbios obrigatórios, flexíveis e móveis,
medindo usualmente de 6-20µm de comprimento e cerca de 1µm de diâmetro e visíveis em
microscopia óptica quando coradas, como também em microscópio de campo escuro ou de
contraste de fase. Utilizam ácidos graxos, vitaminas B1 e B12 e álcoois como fonte de energia.
As bactérias crescem bem em condições ótimas de pH entre 7,2 a 7,6, temperaturas entre 28 a
30°, com crescimento médio em sete dias, embora não seja indicado descarte do material com
menos de oito semanas
8
.
2
A sobrevivência das leptospiras depende de condições de temperatura, umidade e pH.
Estes agentes são sensíveis a desinfetantes comuns, permanecem apenas por 30 minutos em solo
seco. Entretanto, podem permanecer 180 dias em solo úmido, sobrevivem em água estagnada por
longos períodos de tempo, sendo esta, veículo constante de transmissão
8
.
Os principais reservatórios são roedores, que podem eliminar e disseminar o agente por
vários anos. Outros reservatórios importantes incluem caninos, bovinos, caprinos, ovinos, suínos
e animais silvestres
8
.
A transmissão pode ocorrer de forma direta através do sangue, urina, tecidos e órgãos de
animais infectados, ou por via indireta, através do contato com solo, alimentos e água
contaminados com a urina dos animais portadores, constituindo a principal fonte de
contaminação. A penetração do agente ocorre na pele lesada ou íntegra. Após um período de
incubação que varia entre quatro a dez dias, o agente é encontrado no sangue. Nesse período
denominado leptospiremia, ocorre febre, depressão, dores articulares e posteriormente icterícia,
hemoglobinúria e falha renal
8
.
A leptospirose é importante causa de abortos, natimortos e falhas reprodutivas
principalmente em bovinos e suínos, sendo que o aumento da prevalência em seres humanos
resulta de sua proximidade com animais infectados ou fontes de infecção
9
. A letalidade da
leptospirose varia de acordo com a região geográfica, sorovar predominante, presença
concomitante de outras enfermidades, estado imunológico do hospedeiro e quantidade de
leptospiras circulantes
10
, sendo o diagnóstico baseado na investigação clinica, epidemiológica e
provas laboratoriais
11, 12
.
Santa Rosa et al
13
examinaram 808 amostras de soros humanos em sete regiões do estado
do Amazonas com o objetivo de avaliar a prevalência da leptospirose sendo os títulos acima de
1:100 considerados positivos. Do total de soros examinados, cerca de 135 (16,7%) foram
3
reagentes, com a seguinte distribuição dos sorovares: 45 (33,3%) Panama, 23 (17%) para
Grippotyphosa, 19 (14%) Bataviae e 12 (8,8%) Wolffi, sendo as amostras restantes constituídas
de outras cepas. Em relação à profissão dos indivíduos, a maioria era constituída por militares e
indivíduos do sexo masculino. Tal fato se explica por estes indivíduos estarem mais expostos a
condições ambientais que propiciam a permanência do agente. Os jovens entre 15 e 30 anos
foram os mais acometidos, o que de acordo com outros autores comprova que a leptospirose é
doença de adultos jovens. As populações das sete regiões amazônicas analisadas estão sujeitas a
infecções diversas inclusive leptospirose devido às condições sanitárias precárias e presença de
água em condições propícias (temperatura e estagnação) para o desenvolvimento do agente.
A leptospirose apresenta certa adaptação a hospedeiros, sendo considerada em muitos
casos espécie específica. Sorovares como Pomona são adaptados a suínos e bovinos, enquanto
Hardjo ocorre mais freqüentemente em bovinos. Em cães o principal agente é a L. Canicola,
entretanto, ocasionalmente infecta bovinos, lobos e cervos. Em bovinos as epizootias se difundem
rapidamente caracterizando-se por alta taxa de morbidade. Em epizootias de curso lento a taxa de
infecção inaparente varia de um rebanho a outro. Em eqüinos, a ocorrência também esta
relacionada com incidência do sorovar predominante bem como adaptabilidade ao hospedeiro.
Nos EUA são comuns infecções por. Pomona e na Europa pelos sorovares Hardjo, Pomona e
Icterohaemorrhagiae
14
.
Os mecanismos de patogenicidade, defesa do hospedeiro e imunidade protetora da
Leptospira ainda permanece pouco conhecido, casos de morte em seres humanos podem alcançar
valores de até 25% e o conhecimento a cerca dos mecanismos de defesa do hospedeiro pode
auxiliar no tratamento mais efetivo e prevenção da doença
15
.
A patogenicidade dos sorovares da Leptospira estão relacionados à adaptabilidade do
agente ao hospedeiro, envolvendo mecanismos intrínsecos que permitem sua penetração,
4
multiplicação e permanência nos tecidos. Toxinas como a esfigomielinase produzida pelo sorovar
Pomona, exibem fatores de patogenicidade que acarretam alterações histopatológicas e estimulam
a presença de infiltrados inflamatórios
4
. Alterações celulares decorrentes da presença da
Leptospira em tecidos de eleição do agente como rins e fígado, podem ser visualizadas através da
prova de Hematoxilina-Eosina. Nos rins, os túbulos distais e proximais podem se apresentar
dilatados em presença de edema intersticial proeminente, sobretudo na junção córtex-medula.
Presença de nefrite geralmente está associada a infiltrados inflamatórios que incluem linfócitos,
células plasmáticas, células mononucleares e neutrófilos
16
.
Soros provenientes de pacientes humanos apresentando falha renal demonstraram
variados graus de supressão na resposta proliferativa de células mononucleares do sangue
periférico em resposta a variados sorovares
17.18
.
Os hamsters e as cobaias são os animais de laboratório mais indicados para o isolamento e
estudos a cerca de infecções por leptospiras
19, 20,21,22,23
. Entretanto, outros modelos experimentais
vêm sendo investigados quanto ao comportamento dessa enfermidade, entre eles o camundongo.
Estes animais geralmente manifestam sinais clínicos e apresentam leptospiremia por um período
de dois a três dias pós-infecção, e em alguns casos insuficiência renal no sétimo dia de
inoculação. Entretanto, tais alterações são dependentes do sorovar infectante
24
.
Em hamsters as lesões geralmente se apresentam nos rins como degeneração hialina,
marcada hiperemia e nefrite intersticial aguda
25,19
Modelos murinos têm sido utilizados para avaliar e definir perfis de função renal em
presença de lesões teciduais, sendo a análise de creatinina considerada o método mais utilizado
para este propósito, embora os valores possam variar conforme a metodologia empregada
26
. Em
camundongos apresentando quadro caracterizado por falha renal, proveniente de processos
vasculares isquêmicos, podem ser detectados níveis elevados de creatinina (1.52 ± 0.30 mg/dl),
5
retornando a índices considerados basais (0.55 ±0.03) após término do processo isquêmico
27
.
Níveis de uréia também podem se encontrar elevados em processos que envolvam déficit de
excreção de metabólitos por mecanismos de excreção renal ineficiente. Entretanto níveis séricos
de uréia elevados (102.4 ± 13) podem não ser indicativo de falha renal aguda, visto que outros
processos podem estar envolvidos no aumento sangüíneo desses metabólitos do nitrogênio
28
.
Quadros de insuficiência renal aguda ou crônica em camundongos, devido à formação de
cistos renais
29
, nefropatias decorrentes da presença de citocina IL-4 associada à Ig-A nefropática
30
e devido à intoxicação experimental por veneno de cobra
31
podem resultar em níveis elevados
de uréia e creatinina, cujos valores podem estar quatro vezes acima de parâmetros considerados
normais. Em animais que apresentaram falha renal com níveis de uréia em torno de 40-80mg/dL,
a filtração glomerular foi reduzida em 46%. Entretanto, este percentual não interferiu na
recuperação da função renal após a retirada do estímulo. Apesar de alterações teciduais e
funcionais, os níveis de creatinina se encontravam normais
32
.
O diagnóstico da leptospirose animal deve estar relacionado com os aspectos clínicos e
epidemiológicos, juntamente com os resultados de provas laboratoriais. Enquanto as provas
laboratoriais podem auxiliar o clinico a avaliar o quadro, emitir prognóstico sobre a evolução da
doença, e analisar a eficiência da terapia instituída, a confirmação da doença baseia-se na
detecção do agente ou de anticorpos específicos produzidos pelo hospedeiro contra o
microrganismo invasor
11,12
. A aglutinação microscópica com antígenos vivos é o procedimento
mais utilizado na rotina diagnóstica, para detecção de anticorpos em animais e no homem.
Alguns autores
33
,
34
avaliaram testes como a hibridização do ácido nucléico, imunofluorescência
e cultivo na identificação de L. Hardjo em urina de bovinos, e observaram que o cultivo
apresentou resultados inferiores quando comparado às outras técnicas, este fato pode estar
6
relacionado à necessidade de agentes viáveis na amostra analisada em quantidades suficientes
para se obter material para o isolamento mesmo após diluições, que são necessárias para diminuir
a ocorrência de microrganismos oportunistas.
Técnica que alia a anatomia, imunologia e bioquímica, a imunohistoquímica tornou-se
recurso diagnóstico para a identificação de antígenos. Empregando anticorpos específicos e
marcadores enzimáticos ou substâncias fluorescentes
35
, apresenta-se como uma técnica
essencialmente qualitativa, pois seu objetivo é o encontro do antígeno nos tecidos e células
36
.
Métodos imunoistoquímicos empregando conjugados com peroxidase com objetivo de localizar
topograficamente leptospiras em impressões de tecidos ou cortes histológicos bem como em
esfregaços provenientes de cultivos, têm sido bastante utilizados tanto em pesquisas a campo
como em estudos experimentais, demonstrando resultados bastante satisfatórios
37,38,39
. Dentre as
diversas enzimas que podem ser utilizadas nos conjugados, a peroxidase parece ser a mais
eficiente, devido ao seu baixo peso molecular, que permite sua penetração na célula sem maiores
danos como também a estabilidade dos complexos imune formados. Essas preparações podem ser
armazenadas por diversos meses a uma temperatura de 4°C ou por tempo indefinido quando em
congelamento sem perda de sua atividade. Não há necessidade de microscópio de luz ultravioleta
para o exame e as estruturas podem ser facilmente identificadas e fotografadas, em microscopia
comum ou eletrônica
40,41,42
.
Ellis et al
43
trabalhando com amostras de tecidos renais suínos, verificaram que das 18
amostras renais positivas para o cultivo, 17 (94,4%) foram positivas também para a
imunoperoxidase em cortes e 4 (22,2%) nas impressões. A baixa positividade nesta última foi
justificada pela distribuição ao acaso das leptospiras nos túbulos, o que dificulta em alguns casos
a visualização em tecidos fixados que concentram poucas leptospiras. Além disso, os tecidos
7
tendem a se apresentar de forma íntegra quando processados em cortes. Todas as amostras
provenientes de animais controle negativos não infectados, bem como amostras pré-absorvidas
com leptospiras não reagiram à prova imunohistoquímica. Alves et al
1
detectaram através da
peroxidase, leptospiras em cortes de tecidos renais com 100% de positividade em animais
experimentalmente infectados. Em algumas espécies animais e no ser humano, a aplicação desta
técnica em tecidos fixados em formol e incluídos em parafina, pode ser um importante
instrumento para o diagnóstico da leptospirose, em biópsias ou materiais de necropsia submetidos
rotineiramente à histopatologia
43,44
.
Scanziani et al
45
, comparando a imunoperoxidase e o cultivo na detecção de leptospiras
em rins de suínos na fase crônica da enfermidade verificaram que a sensibilidade e especificidade
na imunohistoquímica foi de 78% e 100% respectivamente, sendo tais resultados superiores ao
cultivo. Os autores relacionaram a redução da sensibilidade da técnica a uma maior eliminação
das leptospiras nos tecidos, que pode ter influenciado no isolamento em meios de cultivo.
A presença de anticorpos aglutinantes em animais infectados, nem sempre está associada
ao isolamento do agente em meios de cultivo, devido a menor sensibilidade do meio de cultivo ou
mesmo à quantidades insuficientes de microrganismos para o isolamento
46
.
A proteção contra infecção leptospírica envolve diferentes fatores, como anticorpos
específicos e sistema complemento. Os anticorpos parecem ser os responsáveis pela eliminação
do agente nos primeiros momentos pós-infecção, quando a doença progride da fase septicêmica
para a fase tóxica tecidual
47
. As imunoglobulinas do tipo IgM são inicialmente sintetizadas entre
24 à 72hs pós-infecção, sendo produzida a seguir IgG que possibilita a remoção das leptospiras
circulantes através da opsonização, no entanto o agente pode persistir nos rins e trato
reprodutivo
48,49
.
8
Mecanismos de resistência ao hospedeiro e capacidade de sobrevivência da Leptospira
são ainda pouco conhecidos
5
. A presença de lesões teciduais e gravidade do quadro clínico têm
sido relacionados à formação de complexos imunes estimulando a via clássica do complemento
50
.
Adler & Faine
51
infectaram experimentalmente camundongos Balb/c com leptospiras do sorovar
Pomona avaliando resistência ou suscetibilidade em presença de ciclofosfamida, um potente
imunossupressor. Todos as camundongos tratados apresentaram manifestações clínicas e lesões
compatíveis com o quadro infeccioso, sendo que as leptospiras foram isoladas dos animais em
todos os períodos analisados. Em animais infectados que não receberam droga imunossupressora,
foram encontradas leptospiras até o terceiro dia pós-inoculação. Os autores sugerem que células
formadoras de anticorpos estejam presentes na circulação, 24 a 48 horas após infecção. Mesmo
com altas doses de inóculo contendo leptospiras patogênicas a opsonização das bactérias
circulantes, evita que haja tempo suficiente para que ocorram maiores danos aos tecidos,
impedindo desta forma, a adaptação do agente em órgãos de eleição como rins e fígado. Animais
que obtiveram resposta imune prévia, por imunidade pós-infecção natural ou experimental,
apresentam maior capacidade de recuperação que animais com primo infecção
52
.
Animais que sobrevivem a infecção natural apresentam fagócitos que retiram
gradualmente as leptospiras dos tecidos e fluídos como em áreas hemorrágicas e áreas onde há
reação inflamatória ou recuperação. Entretanto, algumas leptospiras patogênicas podem escapar
da fagocitose, mesmo em presença de resposta imune específica
24
.
Antígenos do envelope bacteriano parecem ser o principal alvo do sistema anticorpo-
complemento. O anticorpo associado ao complemento resultou na presença de infiltrados
inflamatórios, linfocitose e degranulação de neutrófilos em tecidos de hamsters infectados
51, 53
. O
sistema complemento foi ineficiente em estimular células fagocitárias, quando esse não se
9
encontrava associado ao soro imune-específico frente a alguns tipos de sorovares patogênicos de
leptospiras
54,55
.
Diversos trabalhos priorizam a participação da resposta humoral na leptospirose.
Entretanto, é necessário avaliar a presença do sistema imune celular e fagocitário, com ênfase na
participação de macrófagos, células T e citocinas na eliminação do agente em tecidos e fluidos. A
atividade macrofágica parece ser eficiente contra vários antígenos leptospíricos, demonstrando
alta capacidade de fagocitose em diferentes tecidos de camundongos imunizados e não
imunizados. Em relação à resposta imune inata é importante destacar trabalhos que demonstraram
que ativação de macrófagos por lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) foi dependente da presença
dos receptores TolL-like 2 e linfócitos CD4
56
Em células hepáticas de camundongos inoculados com LPS de Leptospira Hebdomalis e
Copenhageni, foram observadas necrose do tipo multifocal, congestão e trombose presente em
sinusoídes, sendo estas alterações associadas à presença de macrófagos e complexos imune. O
fenômeno de lesão celular aparece em outros órgãos como pele, pulmão e trato digestivo. A
miocardite tem relação direta com o processo inflamatório em presença de histiócitos, linfócitos e
plasmócitos
57,58
. O agravamento das lesões também pode estar associado à presença de
metabólitos reativos do nitrogênio como oxido nítrico (NO)
59
.
Banfi et al
47
, avaliando o comportamento de cepas virulentas PB-3 (Copenhageni) e
saprófita Isola sacra I, observaram que houve inibição do agente em meios de cultivo e
fagocitose com formação de vacúolos quando anticorpos homólogos (IgG) estavam associados à
presença de macrófagos após 60 minutos de incubação. Antígenos lipopolissacarídeos parecem
estar associados à ativação de macrófagos e neutrófilos polimorfonucleares em presença de
anticorpos específicos
60,61,62
.
10
A presença de peptidoglicano (PG) da Leptospira parece exercer importante efeito
biológico na ativação do complemento, ativação de células mononucleares, e adesão de células
endoteliais, essas últimas envolvidas em alterações vasculares que ocorrem no início da
infecção
63
. Estudos de Cinco et al,
64
avaliando a atividade bactericida e fagocitária de
macrófagos em cobaias experimentalmente infectadas, observaram que essa atividade parece ser
ineficiente nas primeiras horas pós-infecção. Os autores observaram em microscopia eletrônica
que 30% da Leptospira Isola sacra I e PB-3 (sorovar Copenhageni), se localizavam no interior de
macrófagos, sem alteração estrutural do microrganismo. Os autores sugerem que mecanismos de
controle mediados por células mononucleares podem ser ineficientes em infecções por
leptospiras, principalmente no início da infecção, fato que pode estar associado à capacidade de
escape do metabolismo oxidativo de macrófagos.
Trabalhos de Cheville et al
65
,
utilizando suínos experimentalmente infectados com o
sorovar Pomona, bem com em trabalhos referindo-se a modelos murinos e ao homem
58
, sugerem
que as leptospiras podem sofrer alteração estrutural quando no interior de macrófagos. Alguns
autores
57,66
estudando a resposta de macrófagos a antígenos de parede da Leptospira Hebdomadis
e Copenhageni em camundongos Balb/C infectados experimentalmente, observaram que em
concentrações variadas do antígeno, macrófagos ativados se apresentavam em grande número no
fígado, baço e linfonodos. Essa atividade pode estar presente, mesmo na ausência do soro imune
e complemento, embora seja menos efetiva. Trabalhos de Tu et al
67
, referem que nas primeiras 24
horas pós-exposição de macrófagos às leptospiras patogênicas não ocorre fagocitose eficiente.
Entretanto, aproximadamente 95% de macrófagos continham leptospiras quando soro hiperimune
estava presente. Desta forma, a resistência de camundongos às leptospiras não se deve apenas a
fagocitose, visto que esta só é eficiente na presença de anticorpos opsonizantes.
11
Células fagocitárias como macrófagos e leucócitos polimorfonucleares, respondem com
“burst oxidativo” a patógenos como Toxoplasma gondii, Trypanossoma cruzi, Leishmania spp,
Candida spp e Micobactérias. O burst é caracterizado por aumento no oxigênio, sendo este
reduzido a anion superóxido (O
2
-
) utilizando nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida
(NADH) ou Nicotinamida adenina dinucleotídeo-P (NADPH) como doadores de elétrons. O
ânion superóxido (O
2
-
)
é convertido a peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) sob ação da enzima
superóxido dismutase (SOD). Segundo Los et al
68
produtos resultantes do “burst oxidativo”
podem destruir células fagocitadas em meio intra e extracelular, induzir a expressão de citocinas
e moléculas de adesão, entre outras funções. Os autores sugerem que a atividade microbicida esta
associada à presença e liberação de peróxido de hidrogênio. Entretanto, outros metabólitos
podem estar associados aos mecanismos de controle oxidativos como oxigênio, ânion superóxido
e radicais hidroxila.
A atividade dependente de oxidação realizada por macrófagos pode ser estimulada em
presença de estímulos como PMA, Zymosan, ConA, ésteres de ácidos graxos e citocinas como
IFN-γ, TNF-α e GM-CSF e assim, determinadas por ensaios in vitro. Métodos colorimétricos
para detecção de reativos do oxigênio e nitrogênio são de menor custo quando comparados às
técnicas que utilizam fluorescência, sendo que grandes números de amostras podem ser avaliados
simultaneamente
69
.
Macrófagos peritoneais possuem alta capacidade de gerar o “burst oxidativo” mesmo na
ausência de citocinas
70
. Aumento nos níveis de H
2
O
2
em presença de IFN-γ natural e
recombinante resultam em elevada atividade bactericida por macrófagos peritoneais e alveolares
de seres humanos e camundongos em presença de Toxoplasma gondii
71
, Leishmania major
72
,
Coccidiodis imminits
73
, Trypanossoma cruzi
74,75
e Salmonella typhimurium
76
assim como em
12
presença de IFN-γ e TNF-α associados a PMA
77
. Efeitos decorrentes da associação dessas
citocinas parecem ser aditivos, pois não há interferência nem inibição quando ambas estão
presentes na modulação da resposta imune, ocorrendo sinergismo de ação destas citocinas.
Formas amastigotas (intracelulares) e promastigotas (extracelulares) da Leishmania
donovani, parecem ser susceptíveis a presença de intermediários do oxigênio. Entretanto, parece
que a atividade microbicida desses metabólitos só permanece por períodos longos (dias) quando
estimulados por citocinas. A presença de catalase,um inibidor do metabolismo do oxigênio,
acarreta perda parcial da atividade microbicida de macrófagos
78
.
Alguns autores referem que IFN-γ parece ser mais ativo que o IFN-β na ativação de
células fagocitárias
79
. Buchmüller-Rovillerr & Mauël
80
, referem que macrófagos de
camundongos suscetíveis a infecções por agentes como Leishmania, possuem baixa atividade
microbicida apresentando déficit na oxidação de glicose resultando em níveis reduzidos de
metabólitos reativos do oxigênio. Entretanto, presença de LPS e citocinas auxiliaram na atividade
bactericida, sendo que o “burst oxidativo” sozinho é incapaz de eliminar ou controlar a difusão
do agente. Macrófagos de camundongos previamente imunizados com T. cruzi parecem liberar
maior quantidade de H
2
O
2
em presença de PMA, quando em contato com tripanossomas
inativados
81
. Os resultados são similares a outros estudos que avaliaram ativação fagocitária e
fungicida de macrófagos alveolares frente ao Paracoccidioidis brasiliensis sendo observada
produção de reativos do oxigênio por até 16 semanas em linhagens de camundongos resistentes à
infecção
82
.
Estudos relataram que macrófagos são capazes de produzir valores acima de 8 nM de
H
2
O
2
durante cinco minutos em meio extracelular, capacidade produtiva similar à produzida por
13
células polimorfonucleares. Alterações na produção de H
2
O
2
em tecidos ou fluidos, podem ser
resultantes de diferenças na resposta imune aos diferentes tecidos
83
Murgia et al
84
verificaram a sensibilidade “in vitro” de leptospiras patogênicas e
saprófitas contra mecanismos bactericidas dependentes de oxigênio. Leptospiras saprófitas (L.
Patoc 1) e patogênicas (L. Hardjo) foram sensíveis ao H
2
O
2
em presença ou ausência de
mieloperoxidase (MPO). Outras leptospiras como L. Icterohaemorrhagiae, L. Copenhageni e L.
Autralis também apresentaram sensibilidade em presença de produtos intermediários do oxigênio.
Intermediários do nitrogênio como oxido nítrico, nitrato e ácido nitroso produzidos por
macrófagos sob variados estímulos possuem elevada atividade microbicida, auxiliando no
controle de infecções por mecanismos oxidativos
85
. O Oxido nítrico (NO) é um radical instável
livre, possuindo atividade pleiotrópica intracelular, atuando no relaxamento do endotélio, como
neuro modulador. Em mecanismos de defesa do sistema imune, são produzidos por células
endonteliais, trombócitos, macrófagos, monócitos vasculares e cardíacos, hepatócitos etc
86
.
Macrófagos metabolizam L-arginina para produção de NO, nitrato (NO
3
) e L-citrulina.
Altos níveis de NO estão relacionados à elevada atividade de macrófagos em meio de cultivo.
Dosagens elevadas destes intermediários do nitrogênio podem inibir citocinas como IL-3, no qual
a relação inibição de IL-3 e produção de IFN-γ é importante na citotoxidade de macrófagos
contra parasitas intracelulares como Leishmania
87
. Parasitas como Mycobacterium bovis e
Leishmania spp são controlados por mecanismos dependentes de L-arginina, estimulando
produção de intermediários do nitrogênio, cujos efeitos incluem perda intracelular de ferro
afetando microrganismos que dependem deste metal para realizar sua multiplicação. Parasitas de
multiplicação extracelular como Schistosoma mansoni também são controlados por mecanismos
14
dependentes de L-arginina, sendo que o NO possui meia vida curta sendo rapidamente oxidado a
NO
2
-
(nitrito) e NO
3
-
(nitrato), permanecendo no sobrenadante de cultivos celulares
88
.
O NO parece apresentar efeitos sinérgicos quando associado ao IFN-γ ou peróxido de
hidrogênio, resultando em destruição da molécula de DNA do parasita. A molécula de NO, por
ser de pequena dimensão e lipofílica possui boa capacidade de interagir com alguns
microrganismos e provocar sua destruição
59
.
Culturas de células renais de camundongos quando incubados com proteínas da
membrana externa (LipL32) de leptospiras patogênicas, podem estimular até nove vezes mais
intermediários do nitrogênio em relação às células normais. Esse extrato proteíco parece
estimular a produção de TNF-α por monócitos. Os túbulos proximais são um dos principais
locais de produção de oxido nítrico, participando nos eventos pró-inflamatórios presentes nos
tecidos renais
89
.
A produção de macrófagos pode ser suprimida em presença de NO como mecanismo de
controle dessas células, restringindo também a expressão de linfócitos T em presença de citocinas
como IFN-γ, enquanto que, efeitos imunossupressores associados ao H
2
O
2
são expressos durante
proliferação de células B
90
.
As citocinas são mediadores protéicos que participam de mecanismos de interação entre o
sistema imune específico e inespecífico, ativação de outras citocinas, expressão de enzimas,
efeitos citostáticos e citolíticos e remodelação da matriz extracelular entre outras funções
91,92,93,94
. Estudos demonstram que bactérias patogênicas como a Borrelia burgdorferi podem
estimular a produção de interleucina (IL-1). A presença desta citocina, entretanto, pode ser uma
das causas de lesões artríticas em bovinos e no ser humano que apresentam artrite por Doença de
15
Lyme. Em ambos os casos, com o agente vivo ou inativado pelo calor, foi possível observar
grande liberação de IL-1 por macrófagos
95
.
Em hospedeiros imunossuprimidos e infectados pelo Mycobacterium avium a presença de
TNF-α e IL-6 parece estar associada à inibição do crescimento intracelular e redução do
parasitismo em macrófagos
96
Tabel et al
97
avaliando a presença de Trypanossoma spp em camundongos Balb/c e
C57BL/6 observaram maior resistência dos camundongos C57BL/6 frente a antígenos, e
relacionaram esse fato a níveis mais elevados de IL-4, IFN-γ e IL-10 em plasma e sobrenadante
de células esplênicas, embora o grau de parasitemia fosse o mesmo nas duas linhagens.
Isogai et al,
98
utilizando camundongos experimentalmente inoculados com
lipopolissacarídeo (LPS) da Leptospira sorovar Hebdomadis, verificaram que o estímulo
antigênico aumentou a produção e expressão de marcadores específicos de superfície CD5, CD8,
além de elevadas concentrações séricas de IL1-α, IL-6 e TNF-α. Níveis séricos de TNF-α
permaneceram elevados (14336±6133 pg/mL) nas primeiras horas . O LPS foi capaz de induzir
principalmente, a apoptose de células linfóides esplênicas.
Estudos sobre a infecção por Leptospira em seres humanos, indicam que células
mononucleares do sangue periférico parecem exibir perfil de citocinas do tipo Th1, com maior
produção de citocinas IL-2, IL-6 e TNF-α, além de níveis elevados de IFN-γ induzidos
principalmente pelo LPS bacteriano
99
Algumas citocinas da classe TNF são sintetizadas por linhagens de células como
macrófagos, astrócitos, células da microglia, células de Kupffer e linfócitos. Sua síntese é
induzida por produtos bacterianos como endotoxinas, além de antígenos virais e fúngicos. O TNF
pode atuar em conjunto ao IFN-γ na atividade citolítica e citotóxica, sendo que sua identificação
16
pode ser realizada através de ensaios biológicos. Os ensaios biológicos são testes baseados na
proliferação de células em presença de citocinas como TNF-α, provenientes de soros ou
suspensões celulares e incluem metodologias como a contagem direta ou métodos indiretos como
os radioativos ou coloração através do vermelho neutro
100
. Embora esses testes não sejam
efetivamente específicos, pois outras citocinas podem reagir de forma cruzada, em geral são
muito sensíveis, sendo técnicas de fácil manipulação e baixo custo
91
. Alguns trabalhos avaliando
a presença de citocinas como TNF-α e IL-6 através de bioensaios observaram a ausência do
TNF-α em cultivo celular, indicando que esse fato pode estar relacionado à produção de TNF
inativo ou devido à rápida metabolização desse peptídeo pelas células
101
.Entretanto, em outros
estudos na análise da liberação de TNF-α, em macrófagos hepáticos de cobaias infectados com a
Leptospira sorovar Icterohaemorrhagiae verificou-se que houve alta produção de desta citocina
(>75 pg/ml) quando comparados aos controles
102
.
A integridade do hospedeiro quando exposto a determinados antígenos está relacionada à
capacidade em estimular ou não o sistema imune de forma eficiente. Com o objetivo de avaliar
experimentalmente tal comportamento, animais de laboratório geneticamente selecionados para a
boa ou má resposta imune vêm sendo utilizados para o estudo de várias infecções por parasitas de
multiplicação intra e extracelular.
Linhagens de camundongos geneticamente selecionadas foram inicialmente desenvolvidas
por Biozzi et al
103
, para o estudo da caracterização dos mecanismos reguladores dos fenômenos
que participam da resposta imunológica. Este modelo foi obtido através da seleção genética
bidirecional de camundongos bons (H) e maus respondedores (L) para produção de anticorpos
contra antígenos naturais complexos por período de 15 a 20 gerações até que máxima divergência
na resposta imune humoral fosse obtida. A seleção modificou a resposta não apenas do antígeno
17
selecionador, também a outros não correlacionados
104
. A alta ou a baixa capacidade de resposta
resulta do efeito aditivo de alelos localizados em vários loci independentes (controle poligênico),
acumulados progressivamente nos animais H e L durante o processo seletivo. Essas linhagens
homozigotas representam fenótipos extremos encontrados em populações naturais heterogêneas.
Estima-se que entre sete a 10 loci contribuem para as diferenças na resposta de anticorpos entre
as linhagens H e L. Essas linhagens sob o ponto de vista genético são mais complexas
imunologicamente que linhagens isogênicas, que diferem apenas em um alelo
104
.
A partir de colônias de camundongos albinos outbread, foram descritas cinco seleções. As
seleções I e II foram desenvolvidas no laboratório de imunogenética do Instituto Curie de Paris
em resposta a estímulos antigênicos provenientes de eritrócitos heterólogos (carneiro e pombo).
As seleções III e IV foram desenvolvidas na Seção de Imunologia do Instituto Biológico de São
Paulo de acordo com resposta secundária aos antígenos flagelar e somático, respectivamente, de
duas espécies de Salmonella antigenicamente distintas, Salmonella typhimurium e Salmonella
oraniemburg. A seleção V foi desenvolvida no Departamento de Microbiologia e Imunologia da
Escola Paulista de Medicina segundo resposta secundária às proteínas albumina bovina (BSA) e
gamaglobulina de coelho (RGG). Os parâmetros imunogenéticos obtidos nas seleções de I a V
foram muito semelhantes, apesar das diferentes populações iniciais, natureza dos antígenos e
processos de imunização. As linhagens diferiram em características imunológicas importantes, e
em seu efeito multiespecífico
105
. Na análise deste efeito multiespecífico foram escolhidos grupos
de imunógenos antigenicamente distintos, mas de natureza semelhante àqueles empregados nos
vários processos seletivos, ou seja, eritrócitos heterólogos, bactérias, proteínas heterólogas e
conjugados haptênicos. Este efeito foi mais amplo nas seleções I, II e III, ou seja, a diferença
entre o comportamento das linhagens H e L foi semelhante à obtida com os antígenos de seleção.
18
Entretanto foi restrito nas linhagens IV e V. Destacando-se os animais H
IV
e L
IV
que não
diferiram na resposta a eritrócitos de carneiro (SE) e eritrócitos humanos (HE)
106
.
Isso sugere que os acasalamentos seletivos baseados na resposta secundária ao antígeno
somático de Salmonella não afetaram a resposta aos eritrócitos heterólogos e, portanto os alelos
de efeito “bom” ou “mau” respondedor estão distribuídos aleatoriamente nas linhagens.
Para demonstrar essa hipótese, procedeu-se o acasalamento seletivo de bons e maus
respondedores para SE e HE a partir de segregantes F2 da seleção IV por várias gerações. Esse
processo seletivo deu origem à seleção IV-A e quando o limite de seleção para SE e HE foi
atingido, as linhagens H
IV-A
e L
IV-A
não se diferenciaram mais quanto à resposta ao antígeno
somático de Salmonella.
107
.
Apesar das diferentes populações originais e pressões ambientais distintas a que foram
submetidas às seleções I e IV-A, foi verificada notável semelhança entre os parâmetros genéticos
das seleções, nas quais eritrócitos heterólogos foram os antígenos selecionadores. A seleção IV-A
passou a apresentar um efeito multiespecífico muito superior aos da seleção IV, da qual se
originou, e muito próximo ao da seleção I, excetuando-se a resposta a antígenos somáticos de
Salmonella, em que as linhagens H
IV-A
e L
IV-A
apresentaram produção de anticorpos idêntica.
Alguns estudos foram realizados para verificar se a expressão dos genes acumulados no processo
seletivo induziu modificações na atividade de outras células além de linfócitos B.
Alguns trabalhos sugerem que não houve diferenças ao nível de resposta celular a
enxertos de pele
108
, reação de enxerto versus hospedeiro
109
e resposta proliferativa de linfócitos
ativados in vitro por mitógenos
110,111
. Entretanto, quando a ativação de linfócitos T é dependente
de apresentação de antígenos por macrófagos, a resposta da linhagem H tem se mostrado mais
elevada, tanto na seleção I como na IV-A
112,113
. Na Seleção I, o burst respiratório, avaliado pela
produção de ânion superóxido ou de peróxido de hidrogênio, mostrou-se mais elevado na
19
linhagem H. Apenas a produção de IL-1 mostrou-se semelhante nas duas linhagens
104
. A
atividade catabólica de macrófagos parece ser mais elevada em linhagens L das seleções I, II e
IV-A em relação às linhagens H
114,115,116
, sugerindo que este rápido metabolismo possa impedir
que macrófagos exibam determinantes antigênicos de forma adequada, resultando em resposta
imune humoral menos eficiente
117
.
Algumas infecções têm sido estudadas utilizando modelos experimentais H e L, com
ênfase na resistência das linhagens H em infecções extracelulares como, por exemplo,
Trypanossoma cruzi
118,104
e Klebsiella pneumoniae
119
, ou maior resistência das linhagens L
contra patógenos intracelulares como Yersinia pestis, Leishmania tropica
115
. Alguns autores
referem que a maior resistência de camundongos L a alguns tipos de infecções pode estar
relacionado ao aumento na produção de TNF-α, nem sempre estando associada a aumento na
atividade de macrófagos
104
.
Diversos trabalhos priorizam a participação da resposta humoral na leptospirose. Contudo
é necessário analisar a participação de células T e macrófagos, sobretudo na eliminação do agente
em tecidos e fluidos bem como, na patogênese das lesões presentes em órgãos e tecidos. Alguns
trabalhos referentes à análise de mecanismos envolvidos na patogênese e resposta imune a
leptospirose, vêm sendo aplicados a diferentes modelos experimentais. No presente estudo foram
utilizadas linhagens de camundongos geneticamente selecionados para a produção quantitativa de
anticorpos, visto que estes apresentam diferentes fenótipos na expressão de células B, bem como
modificações na atividade metabólica de macrófagos. Embora o mecanismo de defesa na
leptospirose seja principalmente mediado por anticorpos, a participação de macrófagos é
determinante no processo de resistência do hospedeiro, tornando-se interessante analisar seus
20
mecanismos de ativação nas linhagens geneticamente selecionadas, as quais representam
fenótipos extremos encontrados em uma população naturalmente heterogênea.
O mais importante na vida não é a
situação onde estamos, mas a
direção para a qual nos movemos.
O. W. Holmes
Objetivos
21
2. OBJETIVOS
Esse trabalho teve por objetivo principal, avaliar o estado de ativação de
macrófagos, produção de anticorpos e o curso da infecção experimental com a Leptospira
sorovar Pomona em camundongos geneticamente selecionados para a boa ou má resposta
de anticorpos (seleção IV-A).
2.1 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Durante os procedimentos experimentais foram avaliados os seguintes parâmetros:
1. Recuperação do sorovar Pomona, a partir de rins, fígado e pulmão das linhagens
selecionadas.
2. Detecção de anticorpos específicos em camundongos da seleção IV-A após
infecção por Leptospira sorovar Pomona.
3. Determinação da atividade de macrófagos peritoneais, esplênicos e pulmonares,
através da dosagem de intermediários reativos do oxigênio (H
2
O
2
) e nitrogênio (NO) em
animais infectados e controles.
4. Pesquisa da citocina TNF-α em soros e homogenatos de células esplênicas,
pulmonares e hepáticas em animais infectados e controles.
5. Avaliação da função renal através da análise dos níveis séricos de uréia e
creatinina nas linhagens de camundongos infectados e controles.
6. Identificação de leptospiras em tecidos renais provenientes de camundongos da
seleção IV-A infectados experimentalmente com o sorovar Pomona pela técnica
imunohistoquímica (imunoperoxidase).
22
7. Analise histopatológica de alterações celulares em tecidos renais de camundongos
da seleção IV-A infectados com a Leptospira sorovar Pomona.
Nossas vidas são tecidas pelo
mesmo fio de nossos
sonhos.
Willian Shakespeare
Material e Métodos
Material e MétodosMaterial e Métodos
Material e Métodos
24
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 ANIMAIS
3.1.1 Camundongos
Foram utilizados camundongos machos das linhagens High e Low da seleção IV-A
com quatro a oito semanas de idade (desenvolvidos no Departamento de Imunologia do
Instituto Biológico de São Paulo) e mantidos no Departamento de Microbiologia e
Imunologia do Instituto de Biociências-IB- UNESP/Botucatu. Os animais foram
distribuídos em grupos constituídos de animais infectados com o sorovar Pomona, sendo 36
animais pertencentes à linhagem IV-A para a boa resposta humoral (H
IV-A
) e 36 animais
pertencentes à linhagem IV-A para a má resposta humoral (L
IV-A
). Controles negativos não
infectados foram constituídos por 24 animais pertencentes às linhagens para boa (CH
IV-A
) e
má (CL
IV-A
) resposta humoral.
3.1.2 Hamsters
Os hamsters de ambos os sexos (Mesocriterus auratus), obtidos do biotério central
na UNESP de Botucatu foram utilizados com o objetivo de manter a virulência das cepas
de leptospiras utilizadas como inócuo nos camundongos para a boa (High) ou má (Low)
resposta humoral.
Os animais foram inoculados com o sorovar Pomona e após a fase agônica ou a
aparecimento dos sintomas clínicos, os animais foram mortos através de dose excessiva de
pentobarbital sódico a 27 mg/kg de peso. Após, os rins e fígado e foram cultivados através
25
da técnica de pipeta Pasteur, sendo o meio de cultivo observado por um período de até oito
semanas com o objetivo de monitorar o crescimento das leptospiras que seriam utilizadas
como inoculo.
3.2 INÓCULO
Na infecção experimental em camundongos, foi utilizada cepa de Leptospira
interrogans sorovar Pomona identificada pela prova de absorção de aglutininas
11,120
, e
quantificada segundo técnica de Faine
121
utilizando câmara hemocitométrica de Petroff-
Hauser, estipulando valores em torno de 2x10
7
leptospiras /ml. Cada animal do grupo de
animais infectados recebeu cerca de 1mL do inócuo por via intraperitoneal. As amostras
foram gentilmente cedidas pelo Prof. Dr. Silvio Arruda Vasconcellos do laboratório de
Zoonoses Bacterianas do Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Animal da
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo (USP), São
Paulo, SP
3.3. SACRIFÍCIO DOS ANIMAIS
Antes do sacrifício, os camundongos foram submetidos à anestesia por inalação leve
de éter e em seguida, foi realizada sangria parcial com obtenção do sangue através de
punção pelo plexo orbital. A utilização de barbitúricos como método anestésico não poderia
ser utilizada nestes animais, devido à composição química do anestésico, que interferiria
com os resultados obtidos nos testes para avaliar os níveis de uréia
122,123
. Seis animais de
cada grupo foram sacrificados de forma cronológica nos dias 4, 7, 14, 21, 28 e 35 pós-
inoculação por deslocamento cervical. Após, foram realizadas lavagens peritoneais para
26
obtenção de exsuldato celular contendo macrófagos. Baço, rins, fígado e pulmões foram
retirados e utilizados nos testes de recuperação de Leptospiras, atividade macrofágica,
detecção de TNF-α por ensaio biológico e técnicas histológicas de Hematoxilina-Eosina e
Imunohistoquímica.
O projeto foi aprovado pelo comitê de ética experimental da Faculdade de Medicina
de Botucatu (Protocolo-383/2004).
3.4 MEIOS DE CULTURA
3.4.1 Meio Semi-Sólido de Fletcher
Utilizado no preparo de inóculos e recuperação bacteriana, o meio foi preparado de
acordo com as normas do laboratório fabricante (DIFCO Laboratories) e submetido a testes
de esterilidade e crescimento
11
.
3.4.2 Meio liquido de EMJH
Este meio foi utilizado para repique ou passagem de cultivos de Leptospira que se
desenvolveram em meio de Fletcher, com a finalidade de obtenção de meio que
possibilitasse a contagem de leptospiras para se obter a concentração necessária à
inoculação dos camundongos.
Os meios foram gentilmente cedidos pelo Prof. Dr. Hélio Langoni do Departamento
de Higiene Veterinária e Saúde Publica da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
da Universidade Estadual Paulista, UNESP, Botucatu, SP.
27
3.5. RECUPERAÇÃO DE LEPTOSPIRAS EM MEIO DE CULTIVO
Com o objetivo de avaliar o grau de infecção pela Leptospira, fragmentos de rins,
fígado e pulmões dos animais infectados foram submetidos ao cultivo e isolamento através
de técnica de diluições seriadas, segundo trabalhos de Santa Rosa
11
e Passos et al
120
, sendo
os controles representados por animais sadios.
3.6. TÉCNICA DE SOROAGLUTINAÇÃO
A pesquisa de anticorpos anti-Leptospira interrogans sorovar Pomona foi realizada
através da técnica de aglutinação microscópica em lâmina segundo técnica de Faine
(1982)
121
em soros obtidos dos camundongos controle e infectados.
3.7. ATIVIDADE DE MACRÓFAGOS
Após o sacrifício, os animais foram mantidos em câmara asséptica de fluxo laminar
e fixados em decúbito dorsal em suporte de dissecção. A parede abdominal foi exposta,
rebatendo-se a pele da região. A seguir 5 + 5ml de PBS (solução tampão fosfato pH 7,2)
gelado foram injetados com o auxilio de seringa na porção mediana superior do abdômen.
Posteriormente, a cavidade abdominal foi massageada e retirado liquido peritoneal com a
seringa. Este procedimento foi repetido três vezes. Após, amostras do baço e pulmões
foram retirados e maceradas a seguir adicionando-se PBS para obtenção de suspensões. A
suspensão abdominal e dos órgãos foram armazenadas em tubos de plástico, mantidos em
banho de gelo e centrifugados ao final da colheita por 10 minutos a 1500g. Após a
centrifugação, a suspensão celular foi ressuspendida em meio completo para cultura de
células (MCCC). De cada suspensão peritoneal foram retiradas alíquotas de 50 µl que
28
foram acrescidos de uma solução contendo 0,45 mL de vermelho neutro a 0,02% e
incubadas a 37
o
C durante 10 minutos para posterior contagem. Os macrófagos foram
identificados pela incorporação do corante, contados em câmara de Neubauer e a
concentração celular ajustada para 2x10
6
macrófagos/ mL de MCCC. Volumes de 0,1 mL
da suspensão foram distribuídos em microplacas de cultura de fundo chato (Corning) para
cultivo celular. Após período de incubação de 2 horas a 37°C em tensão de 5% de CO
2
, as
células não aderentes foram retiradas por lavagem da placa com meio de RPMI 1640.
3.7.1 Determinação de intermediários reativos do oxigênio (H
2
O
2
)
A produção de peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) foi determinada pelo método descrito
por Pick e Keisari (1980)
69
e adaptado por Pick e Misel (1981)
124
. Os macrófagos obtidos
conforme descrição no item 3.7 foram incubados por 24 horas a 37
o
C em tensão de 5% de
CO
2,
na presença ou ausência de 250UI/mL de INF-γ recombinante (Genzyme). Após este
período, os sobrenadantes das culturas foram coletados para dosagem de óxido nítrico (NO)
e as células aderentes foram ressuspensas ao volume original (0,1mL) em solução de
vermelho fenol contendo: 140 nM NaCL; 10 nM de tampão fosfato, pH 7; 5,5 nM de
dextrose; 0,56 nM de vermelho fenol; 0,01 mg/mL de peroxidase raiz forte tipo II, e na
presença ou ausência de estímulo acrescentando-se 1 µg de Phorbol myristate acetato PMA
(Sigma Chemical Co. USA) e incubados por uma hora a 37
0
C em câmara úmida e escura.
Após este período, a reação foi interrompida pela adição de 0,01mL de NaOH 1N. A
absorbância foi determinada em microleitor automático de ELISA (ensaio imuno-
enzimático- Enzyme-Linked Imunosorbent Assay), com filtro de 620nm. Os resultados
29
foram expressos em nanomols (nmoles) de H
2
O
2
/2,0x10
5
células, a partir de curva padrão
estabelecida em cada ensaio. Sendo que os ensaios foram realizados em quadruplicata.
3.7.2 Determinação de intermediários reativos do nitrogênio (NO)
O óxido nítrico (NO) se decompõe em nitritos (NO
2
-
) e nitratos (NO
3
-
) em meio de
cultura. A produção de NO
2
-
pelo cultivo de macrófagos, foi avaliada pelo método
colorimétrico baseado na reação de Griess. Aos sobrenadantes, foram adicionados 100 µL
do reagente de Griess, que contém n-(1-naftil – etil – enediamina) (NEED – Sigma
Chemical Co., St. Louis, Mo) diluído 0,1% em água destilada, e sulfanilamida (Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO) diluída a 1% em ácido fosfórico (H
3
PO
4
) 5%. Os reagentes
NEED e sulfanilamida foram misturados em volumes iguais no mesmo momento da reação.
Os ensaios foram realizados em quadruplicata. Em seguida, as amostras foram lidas em
microleitor de ELISA com comprimento de onda de 540nm contra um branco constituído
por reagente de Griess, os resultados foram expressos em micromoles (umoles) de NO por
2x10
5
células, comparando-se a densidade óptica (DO) à curva padrão de concentração
conhecida de NO
2
_
variando de 200 a 0,39 nM. Sendo a produção de NO analisada pela
adição ou não de estimulos
125
.
3.8 ENSAIO BIOLÓGICO PARA DETERMINAÇÃO DE TNF-α
αα
α
Linhagem tumoral de fibroblastos murinos denominada L929 que é sensível ao
TNF-α, foi utilizada no ensaio biológico para detecção dessa citocina. As células foram
cultivadas em meio completo para cultura de células (MCCC) e mantidas por repiques
semanais, em frascos de plástico, em estufa a 37°C com atmosfera constante de 5% de CO
2.
30
O meio de cultura de manutenção das células foi desprezado e substituído por uma solução
de ATV (tripsina 0,2% e verseno 0,02%) para promover o deslocamento das células da
parede da garrafa. Em seguida, o ATV foi desprezado, e as células foram lavadas e
ressuspensas em meio de RPMI completo. Após a contagem das células em câmara de
Neubauer, a suspensão foi ajustada para a concentração de 5.0 x 10
5
células/mL. Volumes
de 100 µL dessa suspensão foram distribuídos em microplacas de 96 orifícios para cultura
de células (Costar, Cambridge, Mass, USA). Após incubação de 24 horas a 37°C em
atmosfera constante de 5% de Co
2
, o meio contido nos orifícios foi desprezado e
substituído por 100µL de meio de RPMI completo contendo Actinomicina D na
concentração de 1µg/mL.
Foram realizados ensaios de citotoxidade, através de soro, e homogenatos de células
esplênicas, hepáticas e pulmonares. Os sobrenadantes foram adicionados em volumes de
100µL de células L929 tratadas com Actinomicina D por 3 horas. As culturas foram feitas
em triplicata. Em três orifícios foi adicionado apenas meio de RPMI completo (cultura
controle). Após incubação a 37°C em atmosfera constante de CO
2
por 18 horas, os
sobrenadantes foram desprezados, e 100µL de suspensão cristal violeta (o,2% em 20% de
etanol) foram adicionados aos orifícios por 15 minutos para fixação e coloração das células.
Em seguida, a placa foi lavada em água por imersão para remoção do excesso de corante, e
100µL de lourinil sulfato de sódio (SDS) a 1% de água destilada foram colocados em cada
orifício, para solubilização das células. A leitura das densidades ópticas (DO) em cada
orifício foi realizada a 490nm em espectofotômetro automático de ELISA, modelo
Multiskan (MD
5000
, Dynatec Laboratories Inc., Chantilly, Va). A quantidade de TNF-α nos
sobrenadantes da cultura de macrófagos foi calculada sobre curva padrão realizada com
31
TNF-α recombinante murino (R & D Systems- Minneapolis, MN, USA) empregado nas
concentrações de 40 a 4000 U/ml.
3.9. DOSAGEM DE URÉIA E CREATININA
Amostras de soro de camundongos infectados e controle foram utilizados para a
pesquisa de níveis séricos de uréia e creatinina através de sistema automatizado VITROS
950 (Sigma), sendo os valores estabelecidos em mg/dl.
3.10 TÉCNICA DE IMUNOHISTOQUÍMICA (IMUNOPEROXIDASE) PARA
DETERMINAÇÃO DE ANTÍGENOS DE LEPTOSPIRA
Os fragmentos de tecido renal dos camundongos foram colhidos e adicionados em
solução de formalina tamponada a 10%, sendo a seguir incluídos em parafina e cortados em
micrótomo a 6µ de diâmetro, e mantidos em estufa a 30° C por 30 minutos para distensão
dos cortes. Os materiais foram submetidos à reação de imunoperoxidase segundo técnica
modificada de Ellis et al
43
, para a pesquisa de antígenos leptospiricos do sorogrupo
Pomona. A leitura das lâminas foi realizada em microscópio óptico (Leika) com ocular de
10X e objetiva de 40X e 100X (imersão) e condensador de campo claro.
3.10.1- Obtenção do anticorpo primário
Os soros hiperimunes preparados com o objetivo de produzir o anticorpo primário a
ser utilizado na técnica de imunoperoxidase foram preparados em coelhos jovens
(Orictolagus cuniculus) através de aplicações seriadas por via intravenosa, na veia marginal
da orelha, de culturas vivas de Leptospira Pomona puras. Este material foi gentilmente
32
cedido pela Dra. Jane Megid, do laboratório de Imunologia do Departamento de Higiene
Veterinária e Saúde Pública da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu.,
UNESP.
3.10.2 Controle de Especificidade
Na avaliação da especificidade, três áreas das lâminas destinadas aos cortes foram
demarcadas com extensão aproximada de 0,5 centímetro quadrado com o auxílio de caneta
para marcação imunohistoquímica Dakopen (DAKO Laboratories). Na primeira área
demarcada foi adicionado o anticorpo primário, na segunda o anticorpo pré-absorvido com
as leptospiras formalizadas e na terceira área omitiu-se o anticorpo primário, conforme
adaptado de Taylor
38
e Ellis et al
43
.
Absorção em Tecido Renal
O anticorpo foi mantido pré-incubado em suspensão de tecido renal de hamsters
sadios, para que as imunoglobulinas fossem conjugadas de forma inespecífica aos
determinantes antigênicos presentes no tecido renal, permanecendo livre o anticorpo anti-
leptospira sorovar Pomona para a reação antígeno-anticorpo possibilitando a visualização
da reação positiva.
Absorção com Leptospiras
Para o teste de absorção foram adicionados 0,5 mL de culturas vivas de leptospiras
em meio estéril de EMJH, e observado quanto ao crescimento, viabilidade e mobilidade.
33
Quando o número de leptospiras se encontrava em torno de 10
8
por mililitro, foram
formalizadas a 0,2% sob agitação magnética e incubadas a 37°C por 20 minutos. Após, o
material foi centrifugado a 10.000 rpm por 20 minutos descartando-se o sobrenadante Ao
sedimento formado foi adicionado suspensão renal de hamsters em volume igual ao meio
de cultivo original, sendo acondicionado sob refrigeração e utilizado até 15 dias após o
preparo. No momento do uso, o material foi incubado a 37° por 60 minutos, com o
anticorpo primário na diluição de 1:80 e a seguir centrifugado a 10.000 rpm por 20
minutos, o sobrenadante foi utilizado no teste de especificidade, caracterizando o controle
negativo do teste
43, 126
.
Omissão do anticorpo primário
Durante o processamento da técnica imunohistoquímica o anticorpo primário foi
substituído por uma solução de TRIS-PBS, como parte do procedimento de controle da
especificidade, conforme também utilizado por Taylor
38
e Ellis et al
43
.
3.11 TÉCNICA HISTOLÓGICA DE HEMATOXILINA-EOSINA
Os fragmentos dos rins colhidos foram fixados em solução de formalina tamponada
a 10% , incluídos em blocos de parafina, cortados a 7µ de espessura e a seguir corados pela
técnica de hematoxilina e eosina, segundo Behmer et al
127
. A leitura das lâminas foi
realizada em microscópio óptico com ocular de 10X e objetiva de 40X e 100X (imersão) e
condensador de campo claro
34
3.12. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para a comparação de títulos sorológicos obtidos pelos camundongos High e Low
(bons e maus respondedores seleção IV-A), quando inoculados com amostra patogênica de
Leptospira interrogans sorovar Pomona, utilizou-se à análise não paramétrica ANOVA,
Kruskal-Wallis para amostras independentes. Para comparação de médias de variâncias da
produção de H
2
O
2
, NO, citocinas e uréia e creatinina utilizou-se o teste de variância, com
médias repetidas e teste T Student-Newman-Keuls de comparações múltiplas
128
. Para
comparação das técnicas de cultivo e imunohistoquímica utilizou-se a análise de
concordância Kappa e teste de proporções
128
. O nível de significância para todos os testes
foi de 5%.
Faça o necessário, depois o
possível e, de repente, você estará
fazendo o impossível.
São Francisco de Assis
Resultados
36
4. RESULTADOS
4.1 RECUPERAÇÃO DE LEPTOSPIRAS VIÁVEIS
Os resultados expressos na Figuras 1A e 1B indicam que a recuperação bacteriana no
fígado e rins ocorreu a partir do quarto dia pós-inoculação nas duas linhagens, com picos no
7° dia pós-inoculação nos camundongos da linhagem H
IV-A
e no 7° e 14° dias de infecção
na linhagem L
IV-A
. Após o 21° dia os valores apresentaram-se em declínio. Na linhagem
Low foi possível isolar o agente por um período mais prolongado em relação as linhagem
High, possibilitando o isolamento de leptospiras no fígado desses camundongos até o 21°
dia pós-inoculação. Não houve identificação ou o isolamento de leptospiras nos pulmões
em nenhuma das linhagens durante os períodos analisados. Os níveis de recuperação do
fígado e rins dos camundongos da linhagem High foram superiores aos da linhagem Low
até o 14° dia.
37
0
10
20
30
40
50
60
70
80
4 7 14 21 28 35
%
R
e
c
u
p
e
r
a
ç
ã
o
Dias
High
Low
Figuras 1A e 1B. Recuperação de leptospiras em rins (A) e fígado (B) de camundongos das linhagens High
(H) e Low (L), submetidos à inoculação de 2x 10
7
Leptospira interrogans sorovar Pomona nos períodos pós-
infecção.
A
B
38
4.2 PRODUÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-LEPTOSPIRA INTERROGANS
SOROVAR POMONA
Os grupos de camundongos geneticamente selecionados para a boa ou má resposta
de produção de anticorpos, High e Low, foram inoculados com 1mL de amostra de cultivo
em meio de EMJH contendo 2 x 10
7
leptospiras do sorovar Pomona. Em seguida, os soros
foram coletados no 4, 7, 14, 21, 28, 35 dias pós-inoculação, sendo que os mesmos foram
testados pela prova de microaglutinação para a presença de anticorpos contra o sorovar
Pomona além de outros 24 sorovares descritos a seguir: Australis, Bratislava, Autumnalis,
Butembo, Castellonis, Bataviae, Canicola, Whitcombi, Cynopteri, Grippotyphosa,
Hebdomadis, Copenhageni, Icterohaemrrhagiae, Javanica, Panama, From, Pyrogenes,
Hardjo, Wolffi, Shermani, Tarassovi, Andamana, Patoc e Sentot. Este procedimento foi
utilizado para evitar que camundongos previamente infectados ou portadores de outro
sorovar que não o Pomona fizessem parte do grupo Os títulos de anticorpos produzidos
pelos camundongos após inoculação com a amostra de Leptospira interrogans sorovar
Pomona foram expressos em títulos sorológicos que podem ser visualizados na figura 2.
A análise destes resultados revela que não houve diferença estatística significativa
entre as linhagens geneticamente selecionadas High
IV-A
e Low
IV-A
, embora tenham sido
detectados níveis de anticorpos mais elevados na linhagem H
IV-A
quando comparada a
linhagem L
IV-A
, principalmente entre o sétimo e o vigésimo primeiro dias pós-inoculação.
A partir do vigésimo oitavo dia houve uma acentuada elevação dos títulos, sendo que neste
período, níveis séricos de anticorpos aglutinantes se comportaram de forma semelhante
entre as duas linhagens.
39
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
4 7 14 21 28 35
dias pós inoculação
Títulos
HIGH
LOW
Figura 2. Títulos de anticorpos detectados pelo teste de aglutinação microscópica frente ao antígeno de
Leptospira interrogans sorovar Pomona, em camundongos High e Low, inoculados com 2x10
7
leptospiras/mL.
40
4.3 ATIVIDADE DE MACRÓFAGOS
4.3.1 Determinação de Intermediários Reativos do Oxigênio (H
2
o
2
)
a. Produção de H
2
O
2
por macrófagos peritoneais
As células dos animais H
IV-A
infectados quando cultivadas sem estímulo,
apresentaram produção elevada de H
2
O
2
no sétimo, décimo quarto, vigésimo primeiro e
trigésimo quinto dia de infecção, sendo que apenas no 14° dia esta produção foi
estatisticamente significante em relação aos controles.
Quando comparamos esta linhagem com a L
IV-A
também infectada sem estímulos,
observamos que houve produção elevada nas linhagens H
IV-A
aos sete, 14 e 21 dias, sendo
que apenas no 14° dia foram observados valores significativos. A produção de H
2
O
2
nas
linhagens L
IV-A
manteve-se em níveis basais durante o experimento (Figura 3A). Não houve
diferença significativa entre os controles não infectados e sem estímulos nas linhagens H
IV-
A
e L
IV-A.
Com o objetivo de verificar se macrófagos peritoneais apresentavam capacidade
em produzir H
2
O
2
, estes animais foram submetidos a estímulos com IFN-γ e/ou PMA.
Na figura 3C observamos a produção de H
2
O
2
por macrófagos das linhagens H
IV-A
e
L
IV-A
estimulados com IFN-γ. Os animais H
IV-A
controles, produziram maior concentração
de H
2
O
2
que os controles L
IV-A
. Entretanto, este aparente aumento não foi significante,
provavelmente devido a grande variabilidade dos dados individuais.
A linhagem H
IV-A
apresentou inibição na produção de H
2
O
2
no 4° dia de infecção,
sendo que foi estatisticamente significante em relação à linhagem L
IV-A,
entretanto, houve
recuperação da produção durante o experimento, decrescendo novamente apenas no 35°
41
dia. No 14° dia a concentração de H
2
O
2
foi estatisticamente significante em relação aos L
IV-
A
, que novamente apresentou produção basal deste metabólito.
Na figura 3B observa-se que o tratamento de macrófagos peritoneais com PMA, não
afetou significativamente a produção de H
2
O
2
nos animais controle, entretanto, ambas
linhagens H
IV-A
e L
IV-A
infectadas, apresentaram grande produção deste metabólito no 7° e
28° dias de infecção em relação aos controles. Comparando a produção de H
2
O
2
entre as
linhagens, observamos diferenças significantes no 14° (H >L) e 21° (L>H) dias de infecção.
O estímulo em conjunto de IFN-γ. e PMA, elevou a produção de H
2
O
2
dos animais
controles e infectados em ambas as linhagens, entretanto diferenças significativas também
foram observados no 14° (H>L) e 21° (L>H) dias de infecção (Figura 3D).
42
Figuras 3A, 3B, 3C, 3D. Produção de peróxido de hidrogênio por macrófagos peritoneais de camundongos H e L da
seleção IV-A no período pós-infecção com L. interrogans sorovar Pomona e animais controle não infectados.
Macrófagos cultivados na ausência de interferon-gama sem estímulo (A) ou estimulados com PMA (B) ou cultivados
na presença de IFN-γ, sem estimulo (C), ou estimulados com PMA (D).
Teste de Student-Newman-Keuls de comparações múltiplas (p
<
0.05).
# indica diferença significativa de animais infectados em relação ao respectivo grupo controle.
+ indica diferença estatística interlinhagens (H x L) em cada período.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
Co
n
tr
ol
e
4
7
14
21
28
35
dias
nmoles H
2
O
2
/ 2 x 10
5
células
High
Low
+
+
#
A
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
Contro
l
e
4
7
1
4
2
1
28
35
dias
nmoles H
2
O
2
/ 2 x 10
5
células
High
Low
#
#
#
#
+
+
#
B
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
Co
n
tr
ol
e
4
7
14
21
28
35
dias
nmoles H
2
O
2
/ 2 x 10
5
células
High
Low
+
#
+
#
C
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
Co
n
tr
ol
e
4
7
14
21
28
35
dias
nmoles H
2
O
2
/ 2 x 10
5
células
High
Low
+
+
D
43
b. Produção de H
2
O
2
por macrófagos esplênicos
A produção de intermediários reativos do oxigênio por macrófagos esplênicos das
linhagens H
IV-A
e L
IV-A
sem estímulos, manteve-se praticamente inalterada durante todo o
experimento, sendo que apenas no 14° dia e 35° dia ambas as linhagens apresentaram maior
produção de H
2
O
2
em comparação com seus respectivos controles. A produção de H
2
O
2
entre as linhagens também apresentou diferenças significativas nesses períodos, com a
linhagem H
IV-A
apresentando maior produção no 14 ° dia e na linhagem L
IV-A
no 35° dias
(Figura 4A).
O tratamento com IFN-γ não afetou a produção dos animais controles, aumentando
levemente a concentração dos infectados no inicio da infecção com picos de produção aos
21 dias na linhagem H
IV-A
e no 35° dia na linhagem L
IV-A
, que também apresentaram
diferenças interlinhagens nesses períodos com H > L no 21° dia e L > H no 35° (Figura
4C).
A produção de H
2
O
2
por macrófagos estimulados com PMA não sofreu grandes
alterações. Produção significante só foi observada no 14° e 35° dias entre as linhagens
infectadas e respectivos controles. Sendo que as diferenças interlinhagens também foram
observadas no mesmo período com a linhagem L
IV-A
apresentando maior concentração no
14° dia e a H
IV-A
no 35° dia (Figura 4B). Com o estimulo adicional de IFN-γ e PMA houve
diferença interlinhagens com L>H no 14° dia (Figura 4D).
44
Figuras 4A, 4B, 4C, 4D. Produção de peróxido de hidrogênio por macrófagos esplênicos de camundongos H e L da
seleção IV-A no período pós-infecção com L. interrogans sorovar Pomona e animais controle não infectados.
Macrófagos cultivados na ausência de interferon-gama sem estímulo (A) ou estimulados com PMA (B) ou cultivados
na presença de IFN-γ, sem estimulo (C), ou estimulados com PMA (D).
Teste de Student-Newman-Keuls de comparações múltiplas (p
<
0.05).
# indica diferença significativa de animais infectados em relação ao respectivo grupo controle.
+ indica diferença estatística interlinhagens (H x L) em cada período.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
Co
n
tr
ol
e
4
7
14
21
28
35
dias
nmoles de H
2
O
2
2 x 10
5
células
High
Low
#
#
#
+
+
#
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
Contr
ol
e
4
7
14
21
28
35
dias
nmoles H
2
O
2
/ 2 x 10
5
células
High
Low
+
#
#
#
+
#
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
Co
n
tr
ol
e
4
7
14
21
28
35
dias
nmoles de 2 x 105 células
High
Low
#
+
#
#
#
+
A B
C
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
Co
n
tr
ol
e
4
7
14
21
28
35
dias
nmoles H
2
O
2
/ 2 x 10
5
células
High
Low
#
#
#
#
+
D
45
c.Produção de H
2
O
2
por macrófagos pulmonares
Produção elevada e significativa de H
2
O
2
por macrófagos pulmonares só foi
observada aos 14 dias nas linhagens L
IV-A
e no 35° dia nas duas linhagens em relação aos
seus respectivos controles. Diferença significante interlinhagens só foi observada no 14°
dia com a linhagem L
IV-A
produzindo maior concentração que a linhagem H
IV-A
, sendo que
esta praticamente não produziu H
2
O
2
neste e no 21 ° e 28° períodos analisados (Figura 5A).
O tratamento das células com IFN-γ não afetou a produção de H
2
O
2
dos animais
controles, entretanto aumentou a síntese desse matabólito na linhagem H
IV-A
infectada no
4°, 7°, 14°, 21° e 35° dias, sendo que o mesmo foi observado nos animais da linhagem L
IV-
A
nos períodos de 7°, 14° e 35° de infecção. Diferenças significativas entre as linhagens
foram observadas no 14° dia de infecção com as linhagens L
IV-A
produzindo maior
concentração de H
2
O
2
que os animais da linhagem H
IV-A
(Figura 5C).
O tratamento com PMA não elevou a produção de H
2
O
2
dos animais H
IV-A
infectados em relação aos controles nos períodos de 4, 7, 14 e 28 dias, não afetando
também os animais L
IV-A
no 4°, 7° e 28° dias de infecção. Entretanto aumento significativo
dos infectados em relação aos controles foi observado no 14°, 21° e 35° dias na linhagem
L
IV-A
e aos 21 e 35 dias na linhagem H
IV-A
. Diferença significativa foi observada apenas no
14° dia com a linhagem L
IV-A
produzindo mais H
2
O
2
que os animais H
IV-A
(Figura 5B).
A produção de H
2
O
2
por macrófagos pulmonares dos animais controles não foi
afetada pelo tratamento conjunto com IFN-γ e PMA. Entretanto os animais infectados H
IV-A
apresentaram maior produção que o grupo controle no 4°, 7°, 14°, 21° e 35° dias, e os
animais L
IV-A
no 4°, 7°, 14° e 35° dias de infecção.
46
Diferenças interlinhagens foram observadas no 4°, 7° e 14° dias, com a linhagem
L
IV-A
produzindo mais H
2
O
2
que linhagens H
IV-A
, sendo que esta produziu no 21° dia mais
H
2
O
2
que a linhagem L
IV-A
que praticamente apresentou inibição na produção desse
metabólito (Figura 5D).
47
Figuras 5A, 5B, 5C, 5D. Produção de peróxido de hidrogênio por macrófagos pulmonares de camundongos H
e L da seleção IV-A no período pós-infecção com L. interrogans sorovar Pomona e animais controle não
infectados. Macrófagos cultivados na ausência de interferon-gama sem estímulo (A) ou estimulados com PMA
(B) ou cultivados na presença de IFN-γ, sem estimulo (C), ou estimulados com PMA (D).
Teste de Student-Newman-Keuls de comparações múltiplas (p
<
0.05).
# indica diferença significativa de animais infectados em relação ao respectivo grupo controle.
+ indica diferença estatística interlinhagens (H x L) em cada período.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
Controle
4
7
14
21
28
35
dias
nmoles de 2 x 10
5
células
High
Low
+
#
#
#
A
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
Co
n
tr
ol
e
4
7
14
21
28
35
dias
nmoles H
2
O
2
/ 2 x 10
5
células
High
Low
#
#
#
#
#
+
B
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
Contro
l
e
4
7
1
4
21
28
35
dias
nmoles H
2
O
2
/ 2 x 10
5
células
High
Low
#
#
#
#
#
#
#
#
+
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
Controle
4
7
14
2
1
2
8
3
5
dias
nmoles H
2
O
2
2 x 10
5
células
High
Low
+
#
#
# #
#
#
#
#
#
+
+
+
D C
48
4.3.2 Determinação da produção de intermediários reativos do nitrogênio (NO)
a. Produção de NO por macrófagos peritoneais
A produção de NO das linhagens H
IV-A
e L
IV-A
controles basicamente foi a mesma.
Durante a infecção, o mesmo foi observado até o 14° dia na linhagem L
IV-A
que apresentou
aumento significativo em relação aos controles do 21° ao 35° dias. A linhagem H
IV-A
apresentou valores significativos apenas no 35° em relação aos controles. Diferenças
interlinhagens só foram obtidas no 21° dia com a linhagem L
IV-A
produzindo mais NO que
as linhagens H
IV-A
(Figura 6A).
O tratamento de macrófagos peritoneais com IFN-γ não modificou o perfil de
resposta das linhagens controles. Entretanto, a produção de NO nos grupos infectados
apresentou-se elevado em ambas as linhagens no decorrer do experimento, apresentando
valores significantes aos 4°, 14°, 21°, 28° e 35° dias em relação aos seus controles, exceto
no 28° dia para os animais H
IV-A
. Nenhuma diferença interlinhagens foi observada após o
tratamento com IFN-γ (Figura 6B).
49
Figuras 6A, 6B. Produção de óxido nítrico por macrófagos peritoneais de camundongos H e L da seleção
IV-A no período pós-infecção com L. interrogans sorovar Pomona e animais controle não infectados.
Os macrófagos foram cultivados sem estímulo (A) ou estimulados com interferon-gama (B).
Teste de Student-Newman-Keuls de comparações múltiplas (p
<
0.05).
# indica diferença significativa de animais infectados em relação ao respectivo grupo controle.
+ indica diferença estatística interlinhagens (H x L) em cada período.
0
5
10
15
20
25
30
35
Controle 4 7 14 21 28 35
dias
umoles NO / 2 x 10
5
células
High
Low
+
#
#
#
#
0
5
10
15
20
25
30
35
Controle 4 7 14 21 28 35
dias
umoles NO / 2 x 10
5
células
High
Low
#
# # #
#
#
#
#
#
#
A
B
50
b. Produção de NO por macrófagos esplênicos
A produção de NO por macrófagos esplênicos das linhagens controles H
IV-A
e L
IV-A
não apresentou diferenças significantes. Entre os grupos infectados observamos inibição de
resposta nos L
IV-A
em relação aos controles no 28° dia. Entretanto, no 14° e 35° dias a
produção de NO foi significativamente maior. Diferença interlinhagens só foi obtida no 35°
dia com a linhagem H
IV-A
produzindo mais NO que a linhagem L
IV-A
(Figura 7A).
O tratamento de macrófagos esplênicos com IFN-γ aumentou levemente a
concentração de NO nos grupos controles, mas sem nenhuma diferença significante entre as
linhagens. O mesmo perfil de resposta foi obtido entre os infectados no 4° dia com visível
inibição aos 14, 21 e 28 dias de infecção. Aumento significativo foi observado no 7° e 35°
dias nas linhagens H
IV-A
e L
IV-A
em relação aos seus respectivos controles (Figura 7B).
51
Figuras 7A, 7B. Produção de óxido nítrico por macrófagos esplênicos de camundongos H e L da seleção
IV-A no período pós-infecção com L. interrogans sorovar Pomona e animais controle não infectados.
Os macrófagos foram cultivados sem estímulo (A) ou estimulados com interferon-gama (B).
Teste de Student-Newman-Keuls de comparações múltiplas (p
<
0.05).
# indica diferença significativa de animais infectados em relação ao respectivo grupo controle.
+ indica diferença estatística interlinhagens (H x L) em cada período.
0
5
10
15
20
25
30
35
Controle 4 7 14 21 28 35
dias
umol de NO / 2 x 10
5
células
High
Low
#
#
#
#
#
+
A
0
5
10
15
20
25
30
35
Controle 4 7 14 21 28 35
dias
umol NO / 2 x 10
5
células
High
Low
#
#
#
#
#
#
#
#
B
52
c. Produção de NO por macrófagos pulmonares
A produção de NO por macrófagos pulmonares foi muito baixa nos animais H
IV-A
e
L
IV-A
controles. Durante a infecção o mesmo foi observado até o 35° dia, onde ambas as
linhagens passaram a produzir NO em concentrações extremamente elevadas em relação
aos seus respectivos controles. Nesse período, a linhagem L
IV-A
produziu níveis
significativamente maiores que a linhagem H
IV-A
(Figura 8A). O tratamento com IFN-γ não
modificou o perfil de resposta das linhagens e novamente apenas no 35° dia, ambas as
linhagens H
IV-A
e L
IV-A
apresentaram produção significante em relação a seus respectivos
controles. Entretanto, após o tratamento com IFN-γ não observamos diferença
interlinhagens nesse período (Figura 8B).
53
Figuras 8A, 8B. Produção de óxido nítrico por macrófagos pulmonares de camundongos H e L da
seleção IV-A no período pós-infecção com L. interrogans sorovar Pomona e animais controle não
infectados.
Os macrófagos foram cultivados sem estímulo (A) ou estimulados com interferon-gama (B).
Teste de Student-Newman-Keuls de comparações múltiplas (p
<
0.05).
# indica diferença significativa de animais infectados em relação ao respectivo grupo controle.
+ indica diferença estatística interlinhagens (H x L) em cada período.
0
5
10
15
20
25
30
35
Controle 4 7 14 21 28 35
dias
umol NO / 2 x 10
5
células
High
Low
#
#
+
A
0
5
10
15
20
25
30
35
Controle 4 7 14 21 28 35
dias
umoles NO / 2 x10
5
células
High
Low
#
#
B
54
4.4 PRODUÇÃO DE FATOR DE NECROSE TUMORAL-α (TNF-α).
a. Detecção de TNF-α
αα
α obtida em soros de camundongos H
IV-A
e L
IV-A
A produção de TNF-α por animais controle das linhagens H
IV-A
e L
IV-A
não
apresentou diferenças significantes. O grupo de camundongos H
IV-A
infectados não
apresentou diferenças em relação ao grupo controle, sendo que no 14° houve presença de
inibição na produção desse metabólito. A linhagem L
IV-A
infectada apresentou maior
produção de TNF-α aos 7, 21 e 35 dias de infecção, com diferenças inter-linhagens apenas
no 21° dia com a linhagem L
IV-A
produzindo mais TNF-α que a linhagem H
IV-A
(Figura
9A).
b. Produção de TNF-α
αα
α por células esplênicas, hepáticas e pulmonares de
camundongos H
IV-A
e L
IV-A
A produção de TNF-α por células esplênicas não apresentou diferença significativa
entre animais controle das duas linhagens H
IV-A
e L
IV-A
. A linhagem H
IV-A
produziu mais
TNF-α em relação aos controles no 4°, 28° e 35° dias de infecção, enquanto as linhagens
L
IV-A
apenas no 28° dia. Diferenças significativas interlinhagens foram observadas no 4° e
35° dias de infecção com a linhagem H
IV-A
produzindo mais TNF-α que a linhagem L
IV-A
(Figura 9B).
A produção de TNF-α por células hepáticas foi mais elevada que a observada em
outros órgãos analisados. Entretanto, nesse compartimento, não observamos diferenças na
produção dessa citocina entre os animais controles H
IV-A
e L
IV-A.
Os animais H
IV-A
55
apresentaram inibição em relação aos controles no 7° e 14° dias, recuperando-se nos
períodos subseqüentes com produção elevada no 21°, 28° e 35° dias.
A linhagem L
IV-A
infectada apresentou produção maior que o grupo controle no 7°,
21° e 28° dias, e diferença inter-linhagens ocorreu apenas no 35° com a linhagem H
IV-A
produzindo mais TNF-α que a L
IV-A
(Figura 9C).
A produção de TNF-α por células pulmonares obtidas do pulmão entre as linhagens
H
IV-A
e L
IV-A
controles, não apresentou diferenças significativas.
A linhagem L
IV-A
infectada apresentou níveis basais na produção dessa citocinas,
enquanto a linhagem H
IV-A
apresentou maior produção no 4° e 35° dias, sendo que no 4° dia
esta produção foi estatisticamente significante quando comparada a produção da linhagem
L
IV-A
(Figura 9D).
56
Figura 9A, 9B, 9C, 9D. Concentração de TNF-α detectados em soros (A) e homogenato de baço (B), fígado
(C) e pulmão (D) de camundongos High e Low inoculados com Leptospira sorovar Pomona, e grupo controle
não infectado.
Teste de Student-Newman-Keuls de comparações múltiplas (p
<
0.05).
# indica diferença significativa de animais infectados em relação ao respectivo grupo controle.
+ indica diferença estatística interlinhagens (H x L) em cada período.
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
50000
Con
t
r
ole
4
7
14
21
2
8
3
5
dias
pg/mL
High
Low
#
#
#
+
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
50000
controle
4
7
1
4
21
28
35
dias
pg/mL
High
Low
+
#
#
#
#
+
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
50000
controle
4
7
1
4
21
28
35
dias
pg / mL
High
Low
#
##
#
#
#
#
#
+
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
50000
p
g
/
m
L
dias
High
Low
+
#
#
A
B
C D
57
4.5 VALORES SÉRICOS DE URÉIA E CREATININA EM CAMUNDONGOS
HIGH E LOW
Os resultados apresentados na figura 10 demonstram que houve discreta elevação
nos níveis de uréia, principalmente após o 14° dia pós-inoculação nas linhagens H
Iv-A
e a
partir do 21° dia nas linhagens L
IV-A
, em seguida apresentando-se em discreto declínio. Os
dados apresentados na figura 10 sugerem que houve diferença significativa entre os níveis
de uréia apresentados intralinhagens (grupo infectado x controle), sendo tais resultados
observados nas duas linhagens e em todos os períodos analisados. Em relação aos valores
interlinhagens (H
IV-A
x L
IV-A
), foi observada variância significativa no sétimo e vigésimo
primeiro dias pós-inoculação, no qual, foram encontrados níveis mais elevados de uréia nas
linhagens L
IV-A
em relação às linhagens H
Iv-A
. Houve um pequeno declínio nos níveis de
uréia no vigésimo oitavo dia pós-inoculação que se manteve até o trigésimo quinto dia.
Em animais controles não infectados os valores de uréia permaneceram normais em
todos os períodos analisados, com média de 26ug/dl ± 4.
Conforme observado na figura 11, valores séricos de creatinina apresentados pelos
animais infectados bem como por animais controle negativos não infectados, apresentou-se
em níveis de normalidade (0.18 a 0, 3mg/dl.) nas duas linhagens analisadas.
58
0
10
20
30
40
50
60
70
Con
tr
ol
e
4
7
1
4
21
28
35
Dias
uréia mg/dl
High
Low
#
#
#
#
#
#
#
+
+
#
#
Figura 10. Concentração de uréia (mg/dl) em média ±desvio padrão em seis animais por grupo.
High Animais do grupo High pós-infetados com 1ml de Leptospira Pomona, Low, animais do grupo Low
infectados com 1 ml de Leptospira Pomona.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
C
on
tro
le
4
7
14
21
2
8
3
5
dias
creatinina mg/dl
High
Low
Figura 11. Concentração de creatinina (mg/dl) em média ±desvio padrão em seis animais por grupo.
High; animais do grupo High infetados com 1ml de Leptospira Pomona, Low; animais do grupo Low
infectados com 1 ml de Leptospira Pomona.
Teste de Student-Newman-Keuls de comparações múltiplas (p
<
0.05).
# indica diferença significativa de animais infectados em relação ao respectivo grupo controle.
+ indica diferença estatística interlinhagens (H x L) em cada período.
59
4.6 IDENTIFICAÇÃO DE ANTÍGENOS LEPTOSPIRICOS EM TECIDO RENAL
DE CAMUNDONGOS INFECTADOS PELA TÉCNICA DE
IMUNOHISTOQUÍMICA
Nos cortes histológicos a presença da leptospira foi detectada em todos os aumentos
observados ao microscópio óptico, formando massas de aglomerados filiformes de
coloração amarronzada, destacados do fundo azul, corado pela hematoxilina e visíveis
principalmente no lúmem e em algumas áreas na periferia dos túbulos (Figura 12). As
bactérias foram observadas também próximas a vasos sangüíneos e interstícios, sendo
raramente encontrados dispersas nos tecidos. Em muitas áreas observadas o agente se
encontrava fragmentado. Ocasionalmente foram vistos próximos a glomérulos, formando
cadeias periféricas de coloração variando de marrom claro a escuro relacionada à maior
concentração de leptospiras ou antígenos presentes. Tais granulações foram vistas em pelo
menos quatro regiões por campo microscópico observado em aumentos de 40X e 100X.
Houve variação na intensidade de coloração principalmente a partir do 14° dia pós-
inoculação, com menor intensidade de coloração em lâminas que apresentavam número
reduzido de antígenos leptospiricos. Na maioria das lâminas o agente se apresentava
comumente formando pequenos fragmentos de aspecto arredondado, corados em marrom
claro e distribuídos pelos tecidos principalmente nos espaços intercelulares.
Nos tecidos dos camundongos controle negativos não foi observada nenhuma
alteração ou presença de antígeno (Figura 13).
Com relação às linhagens é preciso destacar que o antígeno foi identificado nos
tecidos renais entre o 4° e o 21° dias pós-inoculação em ambas as linhagens analisadas.
60
Entre o 4° e o 14° dias pós-inoculação os tecidos se caracterizam por apresentar boa
intensidade de coloração (++). Entre o 4° e 7° períodos pós-inoculação observou-se maior
número de amostras positivas nos animais da linhagem H
IV-A
em relação à linhagem L
IV-A
havendo diferença estatística significativa apenas no 4° dia pós-inoculação
(Tabela 1). A
partir do 21° dia, as amostras analisadas apresentaram decréscimo no numero de
positividade e na intensidade de coloração (+), onde as leptospiras se encontravam em
menor número e de forma dispersa em alguns tecidos analisados. Entretanto, animais da
linhagem L
IV-A
passaram a apresentar maior número de positivos em relação à linhagem
H
IV-A.
A partir do 28° dia pós-inoculação não foi possível observar antígenos nos tecidos
renais de nenhuma das linhagens analisadas.
Conforme podemos analisar pelos resultados apresentados na tabela 1, o teste de
imunoperoxidase foi mais sensível em detectar as leptospiras nos tecidos renais de ambas
linhagens analisadas, quando comparado ao cultivo, onde só foi possível recuperar as
leptospiras nos tecidos renais das linhagens até o 14° dias pós-inoculação.
Em relação à concordância de resultados entre as duas técnicas foi observado que na
linhagem H
IV-A
houve boa concordância entre as técnicas de identificação apenas no 14° dia
pós-inoculação, o mesmo ocorrendo com os resultados comparativos obtidos com a
linhagem L
IV-A
no 7° dia pós-inoculação. Foram encontrados resultados idênticos para as
linhagens H
IV-A
no 4° e 7° períodos pós-inoculação. Em outros períodos as concordâncias
entre resultados foram consideradas moderadas ou fracas sendo que foi utilizado método
estatístico Kappa para analisar estes parâmetros.
61
Figura 12. Fotomicrografia de rins de camundongo infectado com L.interrogans sorovar Pomona.
Observar a presença de antígenos de forma dispersas ou no lúmen dos túbulos (setas). Coloração pela
imunoperoxidase indireta. Aumento 40x. Microscópio Leika.
Figura 13. Fotomicrografia de rins de camundongo controle negativo. Coloração pela imunoperoxidase
indireta. Aumento 100x. Microscópio Leika.
62
Tabela 1. Comparação de resultados entre as técnicas de visualização bacteriana e imunoperoxidase indireta
em cortes frente ao cultivo bacteriano em Camundongos H
IV-A
e L
IV-A
infectados com o sorovar pomona.
Resultados expressos em número de animais positivos por período. (18), total de animais por período com
teste realizado em triplicata. Teste para proporções.
(
*
)
Diferenças significativas inter-linhagens (HxL)
p< 0,05.
Imunoperoxidase Cultivo
Dias
High
(18)
Low
(18)
High
(18)
Low
(18)
4
12* 6*
9* 3*
7
12 9
9 6
14
9 9
6 3
21
3 6
- -
28
- -
- -
35
- -
- -
63
4.7 HISTOPATOLOGIA (HEMATOXILINA-EOSINA)
A intensidade e o grau de alterações celulares observadas nos tecidos dos camundongos
infectados com o sorovar Pomona através da coloração de Hematoxilina e Eosina, se caracterizaram
por processo degenerativo a partir do quarto dia pós-inoculação, estendendo-se até o vigésimo
oitavo dia de infecção, mesmo em presença de resultados negativos no isolamento em meio de
cultivo, variando, entretanto, em diferenças de intensidade de lesões presentes. No quarto dia pós-
inoculação foram observadas algumas áreas de degeneração hidrópica (hiperhidratação celular) com
células aumentadas e vácuolos ciroplasmáticos em presença de infiltrados inflamatórios, sobretudo
polimorfonucleares principalmente próximos a vasos sanguíneos (figura 14). Alguns glomérulos
apresentaram hipercelularidade e os túbulos encontravam-se edemaciados. Entre o quarto e o
décimo quarto dia, foi observada com mais intensidade nefrite intersticial caracterizada por
acúmulo de células mononucleares, presença de congestão com vasodilatação, acompanhada de
hiperplasia de túbulos. A severidade das lesões foi progressiva até o décimo quarto dia, havendo a
partir deste período declínio de alterações inflamatórias e do grau de degeneração celular.
Entre o quarto e o sétimo dia pós-inoculação as alterações inflamatórias aparentemente
foram mais freqüentes nos animais das linhagens H
IV-A
quando comparados aos animais L
IV-A
.
Entretanto, nos animais maus respondedores a presença de lesões se estendeu até o vigésimo oitavo
dia comparados aos animais bons respondedores, quando as lesões foram observadas até o vigésimo
primeiro dia pós-inoculação. Nenhum camundongo controle negativo apresentou quaisquer
alterações histopatológicas (Figura 15).
64
Figura 14. Fotomicrografia de tecido renal de camundongo L
IV-A
infectado. Presença de congestão, edema e
alguns infiltrados inflamatórios (setas). Técnica de Hematoxilina Eosina (H&E), aumento (100X).
Figura 15. Fotomicrografia de tecido renal de camundongo linhagem H
IV-A
sadio. Os túbulos e glomérulo
(seta) se apresentam com sua morfologia normal. Técnica de Hematoxilina Eosina (H&E), aumento (40X).
Começai por admirar o que Deus
nos mostra e não terás tempo de
procurar o que Ele nos oculta.
Alexandre Dumas
Discussão
DiscussãoDiscussão
Discussão
66
5. DISCUSSÃO
Nesse trabalho, avaliamos a resistência a infecção pela Leptospira Pomona, em
linhagens H
IV-A
e L
IV-A,
analisando o crescimento bacteriano em vários órgãos e a
imunidade inata e adaptativa.
A leptospirose constitui-se em uma enfermidade bifásica, tendo início em uma fase
aguda, após a penetração da leptospira pelas membranas mucosas ou pele integra e a seguir,
multiplicando-se ativamente e resultando em leptospiremia, com posterior migração para
órgãos de eleição, ocorrendo o desenvolvimento da fase imune, com presença de anticorpos
circulantes e opsonizadores.
O modelo murino não é considerado padrão na infecção experimental com os
variados sorovares da leptospira, pois geralmente não apresenta desenvolvimento clinico da
enfermidade. Os quadros de resistência destes animais aos sorovares da Leptospira estão
provavelmente relacionados a mecanismos de formação de resposta imune, sobretudo do
tipo humoral com os mecanismos imuno-mediados desenvolvendo-se de forma precoce,
impossibilitando que variados sorovares se adaptem aos tecidos, dificultando dessa forma
sua permanência no hospedeiro
24,51
. Entretanto, linhagens de camundongos selecionadas
quanto à diferenciação na resposta humoral podem apresentar graus variados de resposta
antigênica frente a antígenos de multiplicação intracelular e/ou extracelular, em decorrência
de variações genéticas quanto à produção de imunoglobulinas e atividade macrofágica.
Diferenças na resposta imune apresentada por estas linhagens pode auxiliar na avaliação
quanto aos mecanismos de patogenicidade e posterior resistência do hospedeiro frente aos
antígenos leptospiricos.
67
Em trabalho anteriormente realizado, Marinho
129
analisou a resposta imune por
Leptospira sorovar Icterohaemorrhagiae nessas linhagens, quando foram analisados
parâmetros como recuperação bacteriana, produção de anticorpos, atividade macrofágica,
produção de citocinas e analise histopatológica. Os camundongos L
IV-A
apresentaram-se
mais resistentes à infecção com total eliminação do parasita a partir do 14° dia de infecção
no fígado e rins, enquanto animais H
IV-A
apresentaram recuperação nesses órgãos até o 35°
dia.
No presente trabalho, a recuperação da Leptospira interrogans sorovar Pomona, a
partir de fragmentos de rins e fígado em camundongos das linhagens H
IV-A
e L
IV-A
inoculados com amostra patogênica de L. Pomona, ocorreu de forma praticamente similar
entre as duas linhagens selecionadas até o 14° dia pós-inoculação, quando a linhagem L
IV-A
apresentou maior contenção do processo infeccioso que a H
IV-A
. Entretanto, a linhagem H
IV-
A
apresentou total contenção do processo nos dois órgãos analisados após este período,
sendo que ainda obtivemos animais L
IV-A
com leptospiras no fígado até o 21° dia. Esses
resultados podem estar relacionados ao metabolismo mais intenso presente nos macrófagos
de animais maus respondedores em relação aos bons respondedores, dificultando a
apresentação de determinantes antigênicos aos anticorpos específicos pelos macrófagos nos
animais da linhagem L
IV-A
.
Embora os camundongos L
IV-A
tenham conseguido controlar a infecção de forma
mais eficiente, a persistência de recuperação bacteriana no fígado pode ter sido ocasionada
por incapacidade de algum isotipo de anticorpos circulantes em conter a adaptação da
leptospira nesse órgão como referem alguns trabalhos
24
, sugerindo que anticorpos são
capazes de retirar as leptospiras circulantes, mas algumas bactérias podem permanecer
68
viáveis nos parênquimas hepático e renal mantendo a viabilidade do agente nestes e em
outros tecidos.
A maior recuperação de leptospiras em tecidos da linhagem H
IV-A
quando comparado a
linhagem L
IV-A
no inicio do processo infeccioso apresenta dados concordantes com
trabalhos de Gheorghiu et al
130
, estudando a resistência ao Mycobacterium bovis (BCG) em
camundongos L e H da seleção I. Os autores observaram que esse efeito ocorre de forma
mais rápida na linhagem H em relação a L nas duas primeiras semanas pós-infecção. A
partir desse momento, a contagem de unidades formadoras de colônias decresceu
rapidamente e 12 semanas após, foi encontrado maior número de bactérias viáveis nos
maus respondedores quando comparados aos bons respondedores. Esta cinética sugere que
na fase inicial a multiplicação do BCG foi muito mais rápida na linhagem H. Os autores
sugerem mecanismos associados à falhas no metabolismo de macrófagos dos animais bons
respondedores para explicar esta alta recuperação inicial. Entretanto a eliminação posterior
do agente denota alta capacidade opsonizante e formação de anticorpos específicos.
As diferenças nos índices de recuperação da Leptospira sorovar Pomona na seleção
IV-A em relação a outros sorovares observados em outros estudos, pode estar relacionado a
mecanismos de controle na produção de anticorpos e reposta celular diferenciada, com
déficits na produção de metabólitos oxidativos de macrófagos
64
, mas, sobretudo, associado
a fatores de adaptabilidade do agente infeccioso, uma vez que os sorovares apresentam
diferenças na sua virulência em relação a alguns hospedeiros, ou seja, são espécie
adaptados
4, 99,
.
131
Os valores decrescentes de recuperação coincidem com os períodos em que houve
aumento da produção de imunoglobulinas detectáveis na prova de soroaglutinação
69
microscópica, demonstrando correlação positiva entre esses dois parâmetros, uma vez que
os títulos de anticorpos elevaram-se ao mesmo tempo em que houve decréscimo no
potencial de recuperação de leptospiras a partir de rins e fígado e são concordantes com
outros estudos
132
.
Alguns trabalhos referem que existem diferenças significativas quanto à infecção de
camundongos por alguns sorovares como Pomona, Ballum, Balcanica e Hardjo. Altos
níveis de anticorpos contra o sorovar Pomona podem indicar adaptação deste sorovar ao
hospedeiro mas, não indicam que são hospedeiros de manutenção. Entretanto, as leptospiras
podem ser detectadas, de forma persistente, nos tecidos do hospedeiro mesmo que níveis
altos de anticorpos sejam detectados como observado no presente estudo, e em outros
trabalhos
131
.
Quanto à produção de anticorpos contra L. Pomona nas linhagens H
IV-A
e L
IV-A,
não
houve diferenças significativas, apesar dos animais H
IV-A
produzirem mais anticorpos entre
os períodos de 7 a 21 dias. No 35° dia ambas linhagens produziram altos títulos de
anticorpos.
Durante o presente estudo, o agente infeccioso foi recuperado nos primeiros dias pós-
inoculação. Embora essa recuperação tenha sido observada no início do processo
infeccioso, a formação de anticorpos circulantes provavelmente reduziu drasticamente a
possibilidade de difusão do agente nos tecidos, auxiliando na eliminação do agente após o
21° dia nas duas linhagens, como resultado, dificultando o isolamento da leptospira em
períodos mais tardios pós-inoculação, fato também observado por Adler & Faine,
51,52
Esses resultados são parcialmente discordantes de Marinho et al
132
que analisaram a
produção de anticorpos das linhagens da seleção IV-A contra L. Icterohaemorrhagiae. A
70
linhagem H
IV-A
produziu resposta estatisticamente significante em relação à linhagem L
IV-A,
mantendo o efeito multiespecífico normalmente observado nessas linhagens. Quando os
títulos de anticorpos contra L. Icterohamorrhagiae apresentavam-se baixos, observou-se
maior recuperação no meio da infecção. Porém, quando houve um aumento da produção de
anticorpos observou-se queda da recuperação das leptospiras, demonstrando que o nível de
anticorpos produzidos colaborou em parte como fator limitante da infecção.
Mouton et al
119
investigando a resistência inata a Klebsiella pneumoniae, não
observaram nenhuma diferença entre as linhagens da seleção I, quando quantidades
crescentes dessa bactéria, inativadas pelo calor, foram administradas aos animais H e L dez
dias antes da inoculação intravenosa letal. Os resultados demonstraram que a dose de
vacinação requerida para a proteção é 1000 vezes menor nos camundongos H em relação
aos L. O nível de anticorpos produzidos também foi fator limitante para a resistência, pois a
transferência passiva do soro imune induziu proteção completa.
Durante o processo infeccioso a formação de células fagocitárias e anticorpos
opsonizantes são importantes no controle da enfermidade, dificultando a permanência e
adaptação das leptospiras no hospedeiro. No presente estudo foi observado que a formação
de anticorpos aglutinantes ocorreu de forma aparentemente semelhante entre as duas
linhagens, embora tenham sido observados valores discretamente mais elevados entre os
animais da linhagem High em relação a Low, indicando resposta imune multiespecífica,
característica observada nas linhagens para boa resposta imune humoral. Aumento em
níveis de anticorpos aglutinantes juntamente com a diminuição do percentual de
recuperação das leptospiras em órgãos podem ser fatores correlatos, pois a presença de
imunoglobulinas reduz a capacidade das leptospiras em permanecer de forma viável em
71
tecidos e órgãos. Em alguns trabalhos não foi possível fazer esta associação
46
, por
dificuldades encontradas na tentativa de isolamento em meio de cultivo. Entretanto são
concordantes com autores
47
que descreveram a presença de anticorpos IgG contra L.
Copenhageni e saprófita isola sacra I associados à presença de macrófagos, houve redução
no potencial de recuperação das leptospiras. Resultados semelhantes foram observados por
Costa et al
48
e Sitprija et al
50
no controle da infecção por leptospiras em tecidos renais e
hepáticos.
Embora a resposta imune humoral seja o mecanismo mais importante contra
infecções por leptospiras, o sistema imune celular e fagocitário, ainda é pouco conhecido.
Portanto, parece ser importante avaliar suas implicações no controle da infecção, visto que
uma resposta imune inata, parece ser fator primordial para o inicio de uma resposta imune
adaptativa. Macrófagos conseguem fagocitar leptospiras apatogênicas sem presença de
anticorpos específicos, enquanto as amostras patogênicas necessitam de opsonização para
que ocorra fagocitose por essas células. Entretanto, outros estudos sugerem que atividade
opsonizante não é fator primordial na fagocitose das leptospiras por macrófagos, pois
mesmo sem a presença de anticorpos opsonizantes foi possível observar leptospiras dentro
de vacúolos
133
.
As leptospiras patogênicas podem permanecer no interior de macrófagos sem
alteração de sua morfologia. As bactérias saprófitas por sua vez não possuem capacidade de
permanecerem viáveis no interior de macrófagos. As leptospiras virulentas também
apresentam adaptação diferenciada aos tecidos e células de órgãos de eleição como rins,
fígado e pulmão.
134
.
72
Os macrófagos são reconhecidos como células essenciais do sistema imune,
podendo aumentar ou suprimir reações imunológicas. Várias mudanças na estrutura e
função, envolvendo eventos endógenos e secretórios têm sido observados durante a
ativação dessas células. Os dois principais mecanismos pelos quais os macrófagos podem
ser ativados são: em conseqüência de sua interação com o microrganismo e seus produtos,
como endotoxinas e componentes da parede celular
135
ou por citocinas produzidas por
linfócitos CD4
+
como IFN-γ e TNF-α
71,77
.
Uma das alterações metabólicas que ocorrem quando o macrófago é ativado, é o
aumento da atividade microbicida, fagocítica e citotóxica
136
. Macrófagos ativados possuem
propriedades microbicidas por ação de enzimas lisossômicas, liberação de citocinas como
TNF-α e produtos reativos do nitrogênio e oxigênio
86
A produção de intermediários do oxigênio e nitrogênio por macrófagos ocorre
durante a fagocitose de bactérias, fungos e protozoários sendo que, neste estudo a atividade
macrofágica nas linhagens L
IV-A
e H
IV-A
inoculadas com amostras patogênicas de
Leptospira interrogans sorovar Pomona, foi analisada através da dosagem de produtos
reativos do oxigênio (H
2
O
2
) e nitrogênio (NO).
A produção de H
2
O
2
por macrófagos dessas duas linhagens foi avaliada em
compartimentos como peritônio, baço e pulmão. Animais controles, não infectados e não
submetidos a estímulos não apresentaram diferenças na produção desse metabólito.
Linhagens infectadas sem estímulo demonstraram produção endógena de H
2
O
2
, sendo o
padrão de resposta diferente nos compartimentos analisados. A linhagem L
IV-A
apresentou
durante todo o experimento níveis basais de H
2
O
2
em células peritoneais e esplênicas,
enquanto, no pulmão foi observada inibição em ambas linhagens, com apenas a linhagem
73
L
IV-A
apresentando-se significante no 14° dia em relação a H
IV-A
. Sob estimulo adicional de
IFN-γ e PMA, as linhagens apresentaram aumento significativo, que se modificou em
relação ao órgão e períodos analisados. O estimulo com IFN-γ e PMA teve por objetivo
verificar o comportamento das células quanto à produção de H
2
O
2
, sendo a produção
endógena mais abordada.
Nesse estudo observamos que a produção endógena de H
2
O
2
na linhagem H
IV-A
em
células peritoneais e esplênicas pode ter auxiliado na contenção do processo infeccioso,
visto que, maior produção desse metabólito foi observado em concentrações
estatisticamente significantes em relação a L
IV-A
nesses compartimentos no 14° dia com
total recuperação após esse período. Apesar da linhagem L
IV-A
apresentar produção basal
desse metabólito na maioria dos períodos analisados, esses, apresentaram-se aumentados
em relação aos controles no 14° e 35° dias no baço e no 28° e 35° dias no peritônio, quando
esta linhagem também apresentou total resistência ao processo infeccioso.
Mecanismos microbicidas ativados por macrófagos em presença de citocinas
também incluem a presença de oxido nítrico (NO). Macrófagos, monócitos, e linfócitos
produzem grande quantidade de NO durante reações imunológicas e choque séptico. As
células fagocitárias podem produzir quantidades suficientes de NO para destruir ou inibir o
crescimento de inúmeros patógenos de multiplicação intra ou extracelulares.
Macrófagos peritoneais, esplênicos e pulmonares de animais controles não
infectados e sem estimulo por IFN-γ produziram concentrações idênticas desse metabólito.
Em relação aos controles observamos a linhagem H
IV-A
infectada sem estimulo produzindo
mais NO que seus respectivos controles no 35° dia no peritônio e pulmão, e no 14° dia e
35° dia no baço, com as linhagens L
IV-A
infectadas apresentando produção endógena em
74
relação aos controles no 21°, 28° e 35° dias no peritônio, 14° e 35° dias no baço e 35° dia
no pulmão.
Diferenças interlinhagens entre os animais apenas infectados foram observadas em
L
IV-A
, produzindo mais NO que H
IV-A
no peritônio no 14° dia, 21° e 28° dias e no pulmão
no 35° dia, sendo que na linhagem H
IV-A
esta diferença só foi observada no 35° dia (H
IV-A
>
L
IV-A
) em macrófagos esplênicos.
Relacionando esses resultados com os obtidos com a recuperação bacteriana, a
produção de NO colaborou na contenção do processo infeccioso em períodos mais tardios
da infecção (a partir do 14° dia) sendo que na linhagem L
IV-A
a produção desse metabólito
por células esplênicas apresentou maior contribuição. Marangoni et al
133
refere que a
produção de NO também parece ser importante na contenção do processo infeccioso gerado
em presença da leptospira, sendo que níveis aumentados deste metabólico podem
permanecer de horas a dias pós-infecção.
Marinho
129
analisou a produção de NO nas linhagens da seleção IV-A contra a
infecção por Leptospira Icterohaemorrhagiae, observando aumento significativo na
produção desse metabólito em relação aos controles no 2° dia apenas na linhagem L
IV-A
.
Entretanto, células que receberam tratamento com IFN-γ apresentaram níveis elevados de
produção em todos os períodos analisados e em ambas linhagens. Esse efeito também foi
observado no presente estudo com a infecção por L. Pomona. O tratamento com IFN-γ e /ou
PMA sobre a produção de H
2
O
2
e IFN-γ na produção de NO demonstrou que em alguns
compartimentos e períodos analisados a L. Pomona funcionou como “sinalizador” para que
esta célula produzisse esse metabólito.
75
Alguns trabalhos
137
, utilizando camundongos Knockout para avaliar a produção de
H
2
O
2
e NO em infecções por Rhodococcus equi, demonstraram em experimento “in vitro”
que camundongos deficientes em quaisquer das duas vias de ativação macrofágica foram
susceptíveis à infecção, sendo que, nem o superóxido, nem o NO sozinhos foram
suficientes para eliminar o agente. A combinação de ambos os radicais para formar
peroxinitrito resultou em efeito sinérgico, com rápida e eficiente morte do patógeno por
macrófagos ativados, principalmente sob estímulo de IFN-γ.
O peroxinitrito tem demonstrado possuir maior toxicidade que o NO para
Escherichia coli
138
, Salmonella Typhimurium
139
, Mycoplasma pulmonis
140
e Candida
albicans
141
. Nesses modelos experimentais ambos os radicais de oxigênio e nitrogênio são
necessários para mediar o efeito microbicida máximo. Em outros sistemas experimentais,
entretanto, o NO parece ser mais tóxico que o peroxinitrito, como observado na Leishmania
major
142
, Giardia lamblia
143
e Cryptococcus neoformans
144
.
A produção de NO necessita da presença de IFN-γ, o qual apresenta papel
importante como fator de ativação de macrófagos e como sinal primário para a transcrição
da enzima óxido nítrico sintetase (NOS). Na imunidade inata, os sinais para a ativação dos
macrófagos podem ser proveniente do patógeno e das células NK, que são fonte de IFN-γ,
ou a ativação pode ser conferida por linfócitos T na imunidade mediada por células
145
.
Produção de fator de necrose tumoral (TNF-α), como parâmetro da atividade
macrofágica, também foi avaliada no presente experimento.
Os níveis de TNF-α no soro da linhagem L
IV-A
infectada foram mais elevados aos
sete, 21 e 35 dias, com diferenças significativas inter-linhagens apenas no 21° dia. A
produção de TNF-α obtida por células esplênicas apresentou diferenças significativas entre
76
as duas linhagens e seus respectivos controles, sendo que a linhagem H
IV-A
produziu mais
TNF-α que a linhagem L
IV-A
no 4° e 35° dias pós-inoculação, o mesmo foi observado na
análise da produção dessa citocina em células do pulmão.
Em células hepáticas a produção de TNF-α na linhagem H
IV-A
apresentou inibição
no início da infecção, elevando a produção nos períodos subseqüentes. Já a linhagem L
IV-A
apresentou maior produção em relação aos controles no 7°, 21° e 28° dias, sendo que
diferenças interlinhagens ocorreram apenas no 35° dia (H
IV-A
> L
IV-A
).
Esses resultados demonstram que o TNF-α foi coadjuvante na contenção do
processo infeccioso em ambas linhagens, sendo que a análise na produção dessa citocina na
linhagem H
IV-A
em células hepáticas evidencia a importância dessa citocina na contenção
do processo infeccioso. Estes dados são concordantes com Marangoni et al,
102
que analisou
a produção desta citocina por macrófagos hepáticos relacionando esta produção com a
presença do LPS da Leptospira interrogans sorovar Icterohaemorrhagiae.
Marinho
129
analisando a produção de TNF-α das linhagens H
IV-A
e L
IV-A
contra
Leptospira Icterohaemorrhagiae, observou a produção elevada na linhagem L
IV-A
no início
da infecção e até o 14° dia este nível manteve-se estável. Após esse período, ocorreu
inibição da produção de TNF-α, justamente no momento em que não se recuperou mais
leptospiras. O mesmo foi observado para a linhagem H
IV-A
. Cinco et al
146
observaram níveis
elevados de TNF-α em pacientes com leptospirose e correlacionaram a sua produção ao
estímulo produzido em decorrência da presença de peptideoglicano da leptospira.
Em outro estudo, a expressão do mRNA para TNF-α foi analisada em soros de
hamsters infectados com cepas patogênicas de Leptospira interrogans sorovar
Icterohaemorrhragiae, através do PCR, sendo esta citocina observada já nas primeiras 24
77
horas pós-inoculação e conjuntamente com o aparecimento posterior de IFN-γ parece
exercer efeitos sobre o controle da infecção bem como sobre o agravamento das lesões
147
.
Substâncias tóxicas, patógenos ou produtos de seu catabolismo podem ocasionar
alterações em tecidos renais, resultando em perda de função renal permanente ou
temporária. Dentre os parâmetros para avaliar a filtração glomerular podemos analisar
níveis séricos de uréia e creatinina que podem se encontrar aumentados em alguns tipos de
disfunção renal.
Aumento em valores séricos de uréia estavam presentes nas duas linhagens
analisadas, sendo ligeiramente mais elevado na linhagem má respondedora (Low) em
relação à linhagem para a boa resposta (High), esse fato pode estar relacionado a menor
capacidade de produção de anticorpos específicos desta linhagem nos primeiros períodos
pós-infecção. Falhas na capacidade de opsonização no início da infecção, podem ter
favorecido adaptação inicial dos antígenos nos tecidos comprometendo a função renal.
Apesar de níveis aumentados de uréia durante os períodos em que os animais foram
analisados, nenhuma alteração clínica como irritabilidade, tremores, lordoses e flexões
anormais de cabeça ou lesões teciduais irreversíveis foi observada. Alterações neurológicas
em decorrência de níveis elevados de uréia, podem ocorrer por incapacidade dos rins em
excretar esses metabólitos
45
. Entretanto, nesse trabalho alterações teciduais provenientes da
presença do antígeno e células inflamatórias se encontravam de forma moderada em quase
todos os períodos analisados, o que justifica os níveis considerados leves de uréia
encontrados nas duas linhagens.
Alguns autores
32
descrevem que em animais apresentando insuficiência renal,
níveis de uréia séricos foram considerados leves (40 a 80mg/dl), com perda de função renal
78
em torno de 46%. Entretanto, essa disfunção não interferiu com a filtração glomerular
mesmo em presença de estímulo irritante. Este fato que também pôde ser observado no
presente trabalho visto que os animais não apresentavam alterações clínicas e, sobretudo
pelos níveis moderados de uréia encontrados, que podem ser indicativos de prognóstico
positivo em relação à reestruturação tecidual.
Embora camundongos da linhagem Low tenham conseguido controlar o agente
infeccioso sobretudo no inicio da infecção, os níveis de uréia que podem ser considerados
parâmetros de avaliação da função renal, se encontraram mais elevados nessa linhagem em
alguns períodos analisados. Esses fatos podem indicar que mecanismos independentes da
presença do antígeno tecidual podem influenciar na persistência de lesões teciduais, como a
presença de citocinas ou outros mediadores imunológicos e inflamatórios
30
. Outros
trabalhos
57,58
também associaram a histopatologia da leptospirose com a presença de
agregação de infiltrados inflamatórios, sobretudo no córtex tubular renal.
Níveis normais de creatinina encontrados nas linhagens analisadas como também
descrito por alguns autores
32
, parece indicar que efeitos da bactéria e suas toxinas
associadas à reação inflamatória local, não afetaram a função renal de forma irreversível,
determinando essas linhagens como animais potencialmente resistentes aos mecanismos de
patogenicidade da Leptospira Pomona, uma vez que a permanência do agente infeccioso
nos tecidos renais provavelmente foi controlada inicialmente por mecanismos dependentes
de macrófagos e seus produtos metabólitos.
Ausência de níveis séricos detectáveis de creatinina, não exclui a possibilidade de
lesões renais provenientes de fatores irritantes como toxinas bacterianas, agentes químicos
e imunes complexos formados em decorrência de processo inflamatório
26
, uma vez que no
79
presente estudo foram encontradas alterações celulares nos tecidos renais mesmo na
ausência de creatinina sérica.
Como em outros estudos
148
os valores de uréia e creatinina encontrados indicam
que houve azotemia do tipo pré-renal, por fatores sistêmicos em presença do agente,
revelando que os animais foram capazes de controlar o processo infeccioso, pois os tecidos
renais demonstraram boa recuperação nos períodos finais da infecção.
A utilização dos níveis séricos de uréia e creatinina podem ser bons parâmetros para
avaliação da função renal e, sobretudo em relação ao prognóstico das lesões presentes.
A avaliação da presença de antígenos teciduais através de provas que utilizam
enzimas como marcadores pode ser útil na investigação de mecanismos de patogenicidade
presentes em alguns microrganismos.
Nos cortes histológicos avaliados pela técnica de imunoperoxidase, a forma de
apresentação das leptospiras, a coloração e sua disposição nos tecidos, foram semelhantes
às encontradas por Alves et al
1
e Scanziani et al
45
. A menor intensidade de coloração
apresentada em algumas amostras analisadas pode estar relacionada à distribuição ao acaso
das leptospiras nos tecidos fixados como também observada por Taylor
38
e Ellis et al
43
ou a
mecanismos de resistência das linhagens que possibilitaram a redução dos antígenos nos
tecidos renais, reduzindo dessa forma a intensidade de coloração principalmente a partir do
14° dia pós-inoculação.
A disposição das leptospiras de forma dispersa nos tecidos, formando fragmentos ou
isoladas, foram também relatados por alguns autores
38,43,1,45
, que consideraram amostras
positivas mesmo quando o agente se encontrava fragmentado. Entretanto são discordantes
de outros trabalhos
149,150,151,152
que referem a visualização do antígeno claramente nos
80
tecidos, isoladamente com sua morfologia típica formando corpos alongados de coloração
marrom, observados em microscopia de luz clara.
A visualização e disposição das leptospiras observadas nos cortes renais, mesmo
quando não foi possível caracterizar o antígeno na sua forma íntegra, denota positividade
em virtude da presença de coloração dada pelo cromógeno diaminobenzidina, indicativo de
reação antígeno-anticorpo marcado com a peroxidase conforme também relatado por outros
autores
38,43, 45
.
O anticorpo primário produzido contra os determinantes antigênicos do sorovar
Pomona identificou através da imunohistoquímica, o agente nos tecidos, demonstrando
altos níveis de especificidade (100%) em cortes formalizados e emblocados em parafina,
achados esses também observados em outros estudos
153, 43, 1
. A especificidade da técnica
imunohistoquímica utilizando a peroxidase foi confirmada através da não coloração dos
cortes e impressões pela Diamino-benzidina (DAB), em conseqüência da omissão do
anticorpo primário, absorção do mesmo com leptospiras formalizadas, como também pela
ausência de reação nos controles negativos. Resultados também verificados por outros
autores
149,38,43,1
. utilizando pelo menos um dos métodos presentes nesse trabalho.
Quando comparamos resultados de recuperação com a identificação do antígeno em
tecido através da imunoperoxidase, observamos que a sensibilidade do teste
imunoistoquímico foi estatisticamente significante apenas no 4° dia pós-inoculação em
relação às duas linhagens. Entretanto houve boa concordância em alguns períodos
analisados como os observados na linhagem H
IV-A
no 14° período pós-inoculação e na
linhagem L
IV-A
no 7° período. Analisando-se os resultados obtidos parece ter havido maior
eficiência da técnica imunohistoquímica em detectar as leptospiras em tecidos renais, fato
81
que pode estar relacionado a dificuldades inerentes ao isolamento, como sensibilidade das
leptospiras quando em meio de cultivo, ou quantidades ineficientes do agente que
impossibilitaram seu isolamento. Fator que pôde ser observado em alguns estudos
34
,
analisando técnicas imunológicas e o cultivo na identificação da L. Hardjo, e outros
trabalhos
45
comparando a imunohistoquímica com o cultivo na identificação da leptospira
em tecidos renais suínos.
Apesar de camundongos da linhagem H
IV-A
terem apresentado maior número de
amostras positivas nos tecidos renais até o 14° período pós-inoculação, essa linhagem
conseguiu eliminar as leptospiras com maior eficiência e rapidez em relação as linhagem
L
IV-A
. Tal fato pode estar associado à presença de complexos imunes, e posterior formação
de anticorpos circulantes nas linhagem para boa resposta, como descrito em estudos
51
utilizando camundongos imunossuprimidos.
Menor número de amostras positivas nos fragmentos de tecidos renais associado a
níveis de recuperação microbiológica também inferiores dos camundongos L
IV-A
em relação
à linhagem H
IV-A
nos primeiros períodos pós-inoculação, sugere que mecanismos
relacionados ao metabolismo acelerado de macrófagos nessa linhagem L
IV-A
tenha
favorecido a eliminação inicial mais eficiente da Leptospira. Por outro lado pode também
indicar que este rápido metabolismo possa impedir que macrófagos exibam determinantes
antigênicos de forma adequada, resultando em resposta imune humoral menos eficiente,
pelo menos no início do processo infeccioso e são concordantes com outros estudos
114,115,116,117
. Entretanto, esses resultados parecem ser discordantes de trabalhos
111
que
referem não haver similaridades entre a atividade de macrófagos e aumento da atividade
imune humoral nas seleções III e IV.
82
Cerca de 5 a 10% das infecções causadas pela leptospira afeta diferentes órgãos
como fígado, rins e pulmão. Nos casos em que a doença se apresenta na sua forma mais
grave caracterizada como Doença de Weil, ocorre icterícia, lesões severas em órgãos
resultando em insuficiência renal e hepática, sendo a nefrite tubular e lesão mais
comumente encontrada
154
.
As alterações nos tecidos renais em decorrência da presença do antígeno
leptospírico, associado a fatores inflamatórios com presença de linfócitos, macrófagos,
monócitos, células plasmáticas, entre outros, auxilia no controle da infecção, mas também,
favorece graus variáveis de lesão celular, que pode resultar em danos irreversíveis à função
do órgão se o estimulo antigênico persistir por longos períodos
18,22,154
.
A leptospira pode estar presente no sítio de infecção, independente da presença de
resposta humoral ou celular. Constituintes da parede externa bacteriana como
lipopolisacárides, glicolipídeos e lipoproteínas, são fatores determinantes da virulência, e
estão associados à permanência do agente nos tecidos renais. Kemers e Szeky
155
sugerem
que embora possam estar aparentemente saudáveis, os camundongos são susceptíveis a
colonização de alguns tipos de leptospiras, sendo a capacidade de provocar lesões em
tecidos dependente de fatores ligados a adaptação de microrganismos aos tecidos do
hospedeiro.
As alterações degenerativas apresentadas pelos animais infectados foram
concordantes com outros estudos,
19,25
que referem proliferação de células inflamatórias
principalmente nos períodos inicias de infecção. Alterações em presença do sorovar podem
estar associadas a mecanismos de toxicidade provenientes dos antígenos bacterianos como
LPS, glicoliproteínas, que podem estimular células imunomediadas como leucócitos
83
mononucleares no início da infecção, e sistema complemento e células responsáveis pelo
resposta imune humoral nos períodos mais avançados da enfermidade.
A intensidade de lesões inflamatórias presentes nos animais H
Iv-A
coincide com a
dificuldade inicial desses animais em processar e eliminar o agente infeccioso mais
rapidamente em relação as linhagens L
IV-A
, pois a presença da leptospira e infiltrados
inflamatórios no tecidos pode contribuir para o agravamento das lesões, fato também
observado por Chen
30
.
De uma forma geral, o estudo da infecção pela Leptospira Pomona nas linhagens
demonstrou que a produção de anticorpos e a atividade macrofágica são importantes na
contenção do processo infeccioso que variaram de acordo com o compartimento e os
períodos analisados respectivamente. Os resultados comparados a trabalhos com outros
sorovares demonstraram diferenças parciais de um caráter imunológico geneticamente
selecionado, por um agente externo e não específico.
A caridade é a capacidade de
defender o que sabemos ser
indispensável.
Chesterton
Conclusões
85
6. CONCLUSÕES
1. Camundongos H e L da seleção IV-A foram eficientes em controlar o processo
infeccioso.
2. Valores decrescentes nas taxas de recuperação da Leptospira coincidiram com
níveis elevados de anticorpos apresentados entre as linhagens, demonstrando que
houve associação entre a produção de anticorpos e a contenção do processo
infeccioso.
3. A produção de H
2
O
2
, NO e TNF-α por macrófagos de animais infectados
demonstrou a ativação destas células durante a infecção e se associou com a
contenção do processo infeccioso.
4. Níveis séricos de uréia embora tendo sido considerados próximos de valores
normais, justifica as lesões apresentadas principalmente no início do processo
infeccioso, sendo que a dosagem desse metabólito pode ser utilizada na avaliação de
lesões em decorrência de processos tóxicos e/ou infecciosos. A ausência de níveis
séricos de creatinina, não indica necessariamente a ausência de lesões severas nos
tecidos, fato comprovado pela presença de amostras em que foi observado processo
inflamatório.
5. Níveis mais elevados de uréia presentes na linhagem L
IV-A
coincidiram com a
persistência de lesões em relação à linhagem H
IV-A,
indicando que mecanismos
independentes da presença do antígeno podem favorecer a persistência de lesões.
86
6. A presença de leptospiras em cortes renais foi confirmada pela técnica
imunohistoquímica, sendo que essa foi mais sensível que o cultivo principalmente
no início do processo infeccioso.
7. Camundongos da linhagem para a boa (H
IV-A
) ou má (L
IV-A
) resposta a anticorpos,
podem ser úteis na investigação de mecanismos relacionados à resistência do
hospedeiro à leptospirose.
Não poderá ser mestre na escrita e
leitura sem ter sido antes aluno.
Marco Aurélio
Referências
87
7. REFERÊNCIAS
1
1. Alves V A F, Yasuda P H, Yamashiro E H, Santos R T M, Yamamoto L V, Brito T.
An immunohiostochemic assay to localize Leptospires in tissue specimes. Rev Inst
Med Trop São Paulo 1986; 28:170-173.
2. Lee S H K A, Kim Y G, Park I W, Seang M J, Lee I J. Identification and partial
characterization of a novel hemolysin from Leptospira interrogans sorovar lai.
Gene 2000; 254: 19-28.
3. Plank R, Dean D. Overview of the epidemiology, microbiology and pathogenesis of
Leptospira spp. in humans. Microbiol Infec 2000; 2: 1265-1276.
4. Levett P N. Leptospirosis. Clin Microbiol Vet 2001; 14: 296-326.
5. Bharti A R J E, Nally J N, Ricaldi M A, Matthias M M, Diaz M A Levett P N, et al.
Leptospirosis: a zoonotic disease of global importance. Lancet Infect Dis 2003; 3:
757-771.
6. Souza D. Leptospirose humana-Infecção em habitantes do vale do Rio Aricanduva,
município de São Paulo, 1984-5. Rev Esc Enferm USP 1988; 22: 159-168.
7. Merien F, Baranton G, Perolat P. Invasion of vero cells and induction of apoptosis
in macrophages by pathogenic Leptospira interrogans are correlated with virulence.
Infect Immun 1997; 65: 729-738.
8. Lomar A V. Leptospiroses. In: VERONESI R, editor. Tratado de Infectologia. São
Paulo: Atheneu, 1996, p. 987-1003.
1
International Committee of Medical Journal Editors. Requisitos uniformes para manuscritos
apresentados a periódicos biomédicos. Rev Saúde Publica USP 1999; 33:6-15.
88
9. Nagy G. Comparative pathogenicity study of Leptospira interrogans serovar
pomona strains. Acta Vet Hung 1993; 41:315-324.
10. Heath E S, Johnson R. Leptospirosis. J Am Vet Med Assoc. 1994; 205: 1518-1523.
11. Santa Rosa C A. Diagnóstico Laboratorial das Leptospiroses. Rev Microbiol 1970;
1: 97-109.
12. Michna S W, Campbell R S F. Leptospirosis in pigs: Epidemiology, Microbiology
and Pathology. Vet Rec 1969; 84: 135-138.
13. Santa Rosa C A, Lacaz C S, Machado P A, Yanaguita R M, Castrillon A L,
Ferraroni J J, Fonseca O J. Leptospirose no Estado do Amazonas: Inquérito
sorológico. Rev Inst Med Trop São Paulo 1980; 22: 265-268.
14. Acha P N, Szyfres B E. Bacteriosis. In: OPAS-OMS editors. Zoonosis y
Enfermidades tranmissibles communes al hombre y aos animals. Washington-DC.
Pub. Cient. n. 503, 1993.
15. Smythe, L D. Leptospirosis workwise. Wkly Epidemiol Rec 1999; 76: 109-116.
16. Brito T. On the pathogensis of the hapatic and renal lesions in leptospirosis. Rev Int
Med Trop 1968; 10: 1001-1003.
17. Kunori T, Fehrman I, Ringdén O, Moller E.. In vitro characterization of
immunological responsiveness of uremic patients. Nephon 1980; 26: 234-239.
18. Yamashiro-Kanashiro E H, Bernard G, Sato M N, Seguro A C, Duarte A J S.
Cellular immune response analysis of patients with leptospirosis. Am J Trop Med
Hyg. 1991; 45: 138-145.
89
19. Alves J A, Vasconcellos S A, Camargo C R A, Macedo N A. de, Morais Z M de, et
al. Influência da estimulação inespecífica com o BCG sobre a susceptibilidade do
hamster à infecção experimental por Leptospira interrogans sorovar pomona. Braz J
Vet Res Anim Sci 1992; 29: 193-199.
20. Ferguson K L C, Ramge J C, Sanger V L. Experimental bovine leptospirosis. Am J
Vet Res 1957; 18: 43-49.
21. Sanger V L, Hamdy A H, Fizette W H, Bohl E H, Ferguson L C. Leptospira
pomona infection in hamsters. Cornell Vet 1961; 51: 489-498.
22. Abdu M T F, Sleight S D. Pathology of experimental Leptospira pomona infection
in hamsters. Cornell Vet 1965; 55: 74-86.
23. Badiola J, Thierman A B, Cheville N F. Pathologic features of leptospirosis in
hamsters caused by Leptospira interrogans serovar hardjo and szwajizak. Am J Vet
Res 1983; 44: 91-99.
24. Faine S, Phil D. Reticuloendothelial phagocytocis of virulent leptospiras. Am J Vet
Res 1964; 25: 830-835.
25. De B N, Chatterjee A, Bidyanta J, Deb S K, Sen G P. Studies on leptospiral
abortion in cattle. Indian J Anim Health 1983; 22: 143-145.
26. Dunn S R, Qi Z, Bottinger E P, Breyer M D, Sharma K. Utility of endogenous
creatinine clearance as a measure of renal function in mice. Kidney Int 2004; 65:
1959-1967.
27. Burne-Tuney M J, Kofler J, Yokota N, Weisfeldt M, Traystman R J, Rabb H. Acute
renal failure after whole body ischemia is characterized by inflammation and T cell-
mediated injury. Am J Physiol Renal Physiol 2003; 285: f 87-f 94.
90
28. Melnikov V Y, Faubel S, Siegmund B, Lucia M S, Ljubanovic D, Edelstein C L.
Neutrophil-independent mechanisms of caspase-1-and IL-8- mediated ischemic
acute tubular necrosis in mice. J Clin Invest 2002; 110: 1083-1091.
29. Masunaga T, Hirabayashi M, Takahira R, Imai E, Kawanishi G. Renal anemia in
polycystic kidney disease mouse. J Vet Med Sci 1991; 53: 621-627.
30. Chen A. Interleukin-1 receptor antagonist modulates the progression of a
spontaneously ocorring IgA nephropathy in mice. Am J Kid Dis. 1997; 30: 693-702.
31. Ponraj D, Gopalakrishnakone P. Renal lesions in rhabdomyolysis caused by
Pseudechis australis snake mytoxin. Kid Int 1997; 51: 1956-1969.
32. Ormrod D, Miller T. Experimental uremia. Nephron 1980; 26: 249-254.
33. Pinto A A, Santa Rosa C A, Sadatsune T, Fkeury G C. Comparative study between
complement fixation and microscopic agglutination tests for leptospiral diagnosis.
Rev Int Med Trop São Paulo 1974; 16: 28-31.
34. Bolin M, Zuerner R L, Trueba G. Comparation of three techiques to detect
Leptospira interrogans serovar hardjo type Hardjo-bovis in bovine urine. Am J Vet
Res 1989; 50: 1001-1003.
35. Maestrone G. The use in improved fluorescent antibody procedure in the
demonstration of Leptospira in animal tissues. Can J Comp Med Vet Sci 1963; 27:
109-112.
36. Filho, G B, Barbosa. A J A, Miranda, D. Métodos de estudo em patologia. In:
Bongliolo, L, editor. Patologia geral. Rio de Janeiro: Guanabara Kogan, 1993: p.26.
91
37. Tripathy D N, Hanson L E. Immunoperoxidase staining of leptospires. Appl
Microbiol 1974; 27: 268-269.
38. Taylor C R. Immunoperoxidase techniques: Practical and theoretical aspects. Arch
Pathol Lab Med 1978; 102: 113-121.
39. Gangadhar N L, Rejasekhar M. A modified silver impregnation staining for
leptospires. Ind Vet J 1998; 75: 349-351.
40. Avrameas S. Immunoenzyme techniques: enzymes markers for the localization of
antigens and antibodies. Int Vet Cytol 1970; 2: 349-385.
41. Kurstak E. The immunoperoxidase technique localization of visual antigens in cells.
Methods Virol 1971; 5: 423-444.
42. Petts V, Roitt J M. Peroxidase conjugates for demonstration of tissue antibodies:
Evolution of the technique. Clin Exp Immunol 1971; 9: 407-418.
43. Ellis T M., Robertson G M., Huston L, Kirby M. Detection of leptospires in tissue
using an immunoperoxidase staining procedure. Aust Vet J 1983; 68: 364-367.
44. Alves V A F, Vianna M R, Yasuda P H, Brito T. Detection of Leptospiral antigen in
the human liver and kidney using an immunoperoxidase staining procedure. J
Pathol 1987; 151: 123-131.
45. Scanziani E, Luini M, Fabbi M, Pizzocaro P. Comparation between specific
immunoperoxidase staining and bacteriological culture in the diagnosis of renal
leptospirosis of pigs. Res Vet Sci 1991; 50: 229-232.
46. Songer J G, Chilelli C J, Reed R E, Trautman R J. Leptospirosis in rodents from an
arid enviroment. Am J Vet Res 1983; 44: 1973-1977.
92
47. Banfi E, Cinco M, Bellini M. Soranzo M S. The role antibodies and serum
complement in the interaction between macrophages and leptospires. J. Gen Micro
1982; 128: 813-816.
48. Costa A V, Silva I V, Miranda Filho G, Silva V V, Caldas E M, Brito E, et al.
Estudo imunológico da leptospirose. Rev Inst Adolfo Lutz 1981; 41: 93-100.
49. Alt D P, Bolin C. Preliminary evaluation of antimicrobial agents for treatment of
Leptospira interrogans serovar pomona infection in hamsters and swine. Am J Vet
Res 1996; 57: 59-62.
50. Sitprija V, Pipatanagul V, Mertowidjojo K, Boonpucknavig V, Boonpuknavig S.
Pathogenesis of renal diseases in leptosirosis: Clinical and experimental studies.
Kidney Inter 1980; 17: 827-836.
51. Adler B, Faine S. Susceptibility of mice treat with cyclophosphamide to lethal
infection with Leptospira interrogans serovar pomona. Infect Immun 1976; 14:
703-708.
52. Adler B, Faine S. Serological and protective-antibody response of rabbits to
leptospiral antigens. J Med Micro 1978; 11: .401-409.
53. Ingh T S G A M, Hartman E G. Pathology of acute Leptospira interrogans sorotype
Icterohaemorrhagiae infection in the syrian hamsters. Vet Micro 1986; 12: 367-376.
54. Johnson R C, Haaris V G. Antileptosiral activity of serum. II. Leptospiral virulence
factor. J Bact 1967; 93: 513-519.
55. Cinco M, Banfi E. Activation of complement by leptospires and its bactericidal
activy. Zbl Bakt Hyg I Abt Orig A 1983; 254: 261-265.
93
56. Wertts et al. Leptospiral lipopolysaccharide activates cells through a TLR2-
dependent mechanism. Nature Immunol 2001; 2:346-352.
57. Isogai E, Isogai H, Fujii N, Oguma K. Macrophage activation by leptospiral
lipopolysaccharide. Zbl Bakt 1990; 273: 200-208.
58. Faine, S, editors. Pathogenesis, Virulence and Immunity, In: Leptospira and
Leptospirosis. Boca-Raton/Florida : CRC-Press, 1994, 353 pgs.
59. MacMicking J, Xie Q, Nathan C. Nitric oxide and macrophage function. Annu. Rev
Immunol 1997; 15: 323-350.
60. Macgrath H, et al. Phagocytosis of virulent and avirulent leptospires by guinea-pig
and human polymorphonuclear leukocytes in vitro. Pathol 1984; 16: 243-249.
61. Farrely H E, Adler B, Faine S. Opsonic monoclonal antibodies against
lipopolysaccharide antigens of Leptospira interrogans serovar hardjo. J Med
Microbiol 1987;23: 1-7.
62. Takase H, Yanagawa R. Opsonic effect of monoclonal antibodies against
Leptospira interrogans serovar copenhageni. Vet Microb 1988; 16: 167-180.
63. Cinco M, Perticarai S, Presani G, Dobrina A, Liut F. Biological activity of a
peptideoglycan extracted from Leptospira interrogans: in vitro studies J Gen
Microbiol 1993; 139: 2959-2964.
64. Cinco M, Banfi E, Soranzo M R. Studies on the interaction between macrophages
and leptospiras. J Gen Microbiol 1981; 124: 409-413.
94
65. Cheville N F, Hurin R, Cutlip R. Ultrastructure of renal lesions in pigs with acute
Leptospirosis caused by Leptospira pomona. Vet Pathol 1980; 17: 338-351.
66. Isogai E, Kitagawa H, Isogai H, Kurebayashi Y, Ito N. Phagocytosis as a defense
mechanism against infection with leptospires. Zlb Bakt Hyg A 1986; 261: 65-74.
67. Tu V, Adler B, Faine S. The role of macrophages in the protection of mice against
leptospires: in vitro an in vivo studies. Pathology 1982; 14: 463-468.
68. Los M, Droge W, kirstin S, Baeuerle P A, Osthoff-Schulza K. Hydrogen peroxide
as a potent activator of T lymphocyte functions. Eur J Immunol 1995; 25: 159-165.
69. Pick E, Keisari Y. A simple colorimetric method for the measurement of hydrogen
peroxide produced by cells in culture. J Immu Meth 1980; 38: 161-170.
70. Phillips W A & Hamilton J A. Phorbol eter-estimulated superoxide production by
murine bone marrow-derived macrophages requires preexposure to cytokines. J
Immunol 1989; 142: 2445-2449.
71. Nathan C F, Michael M, Wiebe E, Rubin B Y. Identification of interferon-γ as the
lymphokine that activates human macrophage oxidative metabolism and
antimicrobial activity. J Exp Med 1983; 158: 670-689.
72. Nacy C A, Fortier A H, Meltzer M S, Buchmeier N A, Schreiber R D. Macrophage
activation to kill Leishmania major: Activation of macrophages for intracellular
destruction of amastigotes can be induced by both recombinant interferon-γ and
non-interferon lymphokines. J Immunol 1985; 135: 3505-3511.
73. Beaman L. Fungical activation of murine macrophages by recombinant gamma
interferon. Infect Immun 1987; 55: 2951-2955.
95
74. Reed S G, Nathan C F, Rodricks P, Shaorebeck K, Conlon P J, Grabstein, K H.
Recombinant granulocyte.macrophage colony-stimulating factor activates
macrophages to inhibit Trypanosoma cruzi and release hydrogen peroxide. J Exp
Med 1987; 166: 1734-1746.
75. Wirth J J, Kierszembaum F, Sonnenfeld G, Zlotnik A. Enhancing effects of gamma
interferon on phagocytic cell association with and killing of Trypanosoma cruzi.
Infect Immun 1985; 49: 61-66.
76. Kagaya K, Watanabe K, Fukazawa Y. Capacity of recombinant gamma interferon to
activate macrophages for Salmonella-killing activity. Infect Immun 1989; 57: 609-
615.
77. Hoffman M, Weinberg J B. Tumor necrosis factor-α induces increased hydrogen
peroxide production and Fc receptor expression, but not increased la antigen
expression by peritoneal macrophages. J Leuk Biol 1987; 42: 704-707.
78. Haidaris C G, Bonventre P F A. A role for oxygen-dependent mechanisms in killing
of Leishmania donovani tissue forms by activated macrophage. J Immunol 1982;
129: 850-855.
79. Pace J L, Russell S W, Schreiber R D, Altmann A, Katz D H.. Macrophage
activation: Priming activity from a T-cell hybridoma is attributable to interferon-γ.
Proc Natl Acad Sci USA 1983; 80: 3782-3786.
80. Buchmuller-Rouiller Y, Mauel J. Correlation between enhanced oxidative
metabolism and leishmanicidal activity in activated macrophages from healer and
nonhealer mouse strains. J Immunol 1986; 136: 3884-3890.
96
81. Nathan C, Nogueira N, Juangbhanich C, Ellis J, Conh Z. Activation of macrophages
in vivo and in vitro: Correlation between hydrogen peroxide release and killing of
Trypanosoma cruzi. J Exp Med 1979; 149: 1056-1068.
82. Cano L E, Singer-Vermes L M, Vaz C A C, Russo M, Cáliz V L G. Pulmonary
paracoccidioidomycosis in resistant and susceptible mice: Relationship among
progression of infection, bronchoalveolar cell activation, cellular immune response
and specific isotype patterns. Infect Immun 1995; 63: 1777-1783.
83. Nathan C F, Root R K. Hydrogen peroxide release from mouse peritoneal
macrophages. J Exp Med 1977; 146: 1648-1662.
84. Murgia R, Garcia R, Cinco M. Leptospires are killed in vitro by both oxygen-
dependent and - independent reactions. Infect Immun 2002; 70: 7172-7175.
85. Chan J, Xing Y, Magliozzo R S, Bloom B R. Killing of virulent Mycobacterium
tuberculosis by reactive nitrogen intermediates produced by activated murine
macrophages. J Exp Med 1992; 175: 1111-1122.
86. Adams H R. Physiologic, pathophysiologic, and therapeutic implications for
endogenous nitric oxide. J Ame Vet Med Assoc 1996; 209: 1297-1302.
87. Marcinkiewicz J, Chain B M. Differential regulation of cytokine production by
nitric oxide. Immunol. 1993; 80: 146-150.
88. Park J, Rikihisa Y. L-arginine-dependent killng of intracellular Ehrlichia risticii by
macrophages treated with gamma interferon. Infect Immun 1992; 60: 3504-3508.
89. Yang C T, Wu M S, Pan M J, Hsieh W J, Vandewalle A, Huang C C. The
Leptospira outer membrane protein LipL32 induces tubulointerstitial nephritis-
97
mediated gene expression in mouse proximal tubule cells. J Am Soc Nephrol 2002;
13: 2037-2045.
90. Albina J E, Abate J A, Henry Jr W L. Nitric oxide production is required for murine
resident peritoneal macrophages to supress mitogen-stimulated t cell proliferation. J
Immunol 1991; 147: 144-148.
91. Whicher J T, Evans S W. Cytokines in tissues. Clic Chem 1990; 36-7: 1269-1281.
92. Wagner R, Myres R R S. Schwann cells produce tumor necrosis factor alpha:
Expresion in injured and non-injured nerves. NeuroSci 1996; 73: 625-629.
93. Bienvenu J A D, Monneret G, Gutowki M CL, Fabien N. Cytokine assay in human
sera and tissues. Toxic 1998; 129: 55-61.
94. Forséni M, Melhus A, Ryan A F, Bagger-Sjöbäck D, Hultcrantz M. Detection and
localization of interleukin-6 in the rat middle ear during experimental acute otitis
media, using mRNA in situ hybridization and immunohistochemistry. Int J Pediatr
Otorhinolaryngol. 2001; 57: 115-121.
95. Kenefick K B, Lederer J A, Schell R F, Czuprynski C J. Borrelia burgdorferi
stimulates release of Interleukin-1 activity from bovine peripherical monocytes.
Infect Immun 1992; 6:3630-3634.
96. Champsi J, Young L S, Bermudez L E. Production of TNF-α and TNF-β, and
expression of receptors for TNF-α and IL-6 murine Mycobacterium avium
infection. Immunol. 1995; 84: 549-554.
97. Tabel H, Kaushik R S, Uzonna J E. Suscetibily and resistance to Trypanosoma
congolensis infections. Microb Infect 2000; 2: 1619-1629.
98
98. Isogai E, Isogai H, Kubota T, Fujii N, Hayashi S, Indoh T, et al. Apoptosis of
lymphocytes in mice administer Lipopolyssacharide from Leptospira interrogans. J
Vet Med B 1998; 45: 529-537.
99. Klimpel G R, Mathias M A, Vinetz J M. Leptospira interrogans activation of
human peripheral blood mononuclear cells. Preferential Expansion of TCR yδ
+
T
cells vs TCRαβ
+
T cells. J Immunol 2003; 171: 1447-1455.
100. Mosmann T R, Fong T A T. Specific assays for cytokines production by T
cells. J Immunol Methods 1989; 116: 151-158.
101. Gogusev J, Augusti M, Chrétien Y, Droz D. Interleukin-6 TNFα production
in human renal cell carcinoma. Kidney Int 1993; 44: 585-592.
102. Marangoni A, Aldini R, Sambri V, Giacani L, Di Leo K, Cevenini R.
Production de tumor factor α by Treponema pallidum, Borrelia burgdorferi, s.l, and
Leptospira interrogans in islated rat Kupffer cells. FEMS Immunol Med Microbiol
2004; 40: 187-191.
103. Biozzi G., Stiffel C. Mouton D., Bouthillier Y., Decreusefond C..
Cytodynamics of the immune response in the two lines of mice genetically selected
for “high” and “low” antibody synthesis. J Exp Med 1972; 135: 1071-1094.
104. Dockrell H M, Taverne J, Lelchuk R, Depledge P, Brown I N, Playfair J H.
Macrophage functions in Biozzi mice. Immunol. 1985; 55: 501-509.
105. Biozzi G, Mouton G, Sant`Anna O A, Passos H C, Gennari M, Reis M H, et al.
Genetics of immunoresponsiveness to natural antigens in the mouse. Curr Trop
Microbiol Immunol 1979; 85: 31-38.
99
106. Santa’anna O A, Ibañes O M, Ferreira V C A, Gennari M, Mouton D. Inverse
modification of antibody responsiveness to RGG in lines of mice selected for high
or low responses to somatic antigen of Salmonella. Immunogenetics 1983; 18: 359.
107. Cabrera W H, Ibanez O M, Iliveira, S L, Sant´Anna O A, Siqueira M, Mouton D,
Biozzi G. Evidence for distinct polygenic regulation of antibody responses to some
unrelated antigens in lines of mice selected for high or low antibody responses to
somatic antigen of Salmonella. Immunogenetics 1982; 16: 583-592.
108. Liacopoulos-Briot M, Mouton D, Lambert F, Decreusefond C, Stiffel C, Biozzi G.
Comparation of skin allogratt rejection and citotoxic antibody production in two
lines of mice genetically selected for high and low antibody synthesis.
Transplatantion 1972; 14: 590-595.
109. Byfield P E, Howard J G. Equivalent graft-versus-host reactivity of spleen cells
from two lines of mice genetically selected for high and low humoral antibody
formation. Transplantation 1972; 14: 133-135.
110. Liacopoulos-Briot, Mouton M, Stiffel C, Lambert F, Decreusefond C, Bouthillier
Y, Biozzi G. Rësponse à la phytohëmagglutinine des lymphocytes des deux lignëes
de souris gënëtiquement sëlectionnëes pour unes forte et une faible synthèse
d’anticorps. Ann Immunol 1974; 125c: 393-404.
111. Ferreira V, Gennari M, Reis M H, Siqueira M, Stiffel C, Mouton D, et al.
Potentialities of immunocompetent cells in high and low antibody production lines
of mice obtained by selective breedings for responsiveness to flagelar or somatic
antigens of Salmonella. J Immunogenetics 1985; 12: 309-319.
112. Courdec J, Bouthillier Y, Mevel J C, Mouton. Evaluation of T helper function in
lines of mice selected for high or low antibody production: Quantitative inhibition
100
of immune response by anti-L
3
T
4
monoclonal antibody. Immun Lett 1989-90; 23:
21-26.
113. Cabrera, W. H. Mecanismos regulatórios de resposta humoral de camundongos
bons e maus respondedores obtidos por seleção genética bidirecional. (tese) São
Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo; 1993
114. Adorini L, Doria G. Defective antigen presentation by macrophages from mice
genetically selected for low antibody response. Eur J Immunol 1981; 11: 984-989.
115. Biozzi G, Mouton D, Stiffel C, Bouthillier Y. A major role of the macrophage in
quantitative genetic regulation of immunoresponsiveness and antiinfectious
immunity. Adv Immunol 1984; 36: 189-233.
116. Gennari M, Boutothillier Y, Ibanez O M, Ferreira V C, Mevel J C, Reis M H, et al.
Effect of silica on the genetic regulation of antibody responsiveness. Ann Inst
Pasteur Immunol 1987; 138: 359-370.
117. Ibanez O M, Mouton D, Oliveira S L, Ribeiro Filho O G, Piatti R M, Sant´Anna O
A, et al. Polygenic control of quantitative antibody responsiveness: restrictions of
the multispecific effect related to the selection antigen. Immunogenetics 1988; 28:
6-12.
118. Kierszembaum F, Howard J G. Mechanisms of resistance against experimental
Trypanosoma cruzi infection: The importance of antibodies and antibody-forming
capacity in the Biozzi high and low responder mice. J Immunol 1976; 116: 1208-
1211.
119. Mouton D, Parant M, Meyel J C, Parant F. Dose-dependent efficacy of vaccination
against K pneumoniae in high and low antibody responder lines of mice. Immunol
Lett 1987; 14: 335-339.
101
120. Passos E C, Vasconcellos S A; Ito F O, Yasuda P H, Nürmberger Jr R. Isolamento
de Leptospiras a partir do tecido renal de hamsters experimentalmente infectados
com L. interrogans sorotipo pomona: Emprego das técnicas de Pipeta Pasteur e das
diluições seriadas em meio de cultura de Fletcher tratado com 5-fluor-uracil ou
sulfato de neomicina. Rev Fac Med Vet Zootec Univ São Paulo 1988; 25: 221-235.
121. Faine, S. Guidelines for the control of leptospirosis. Geneva: WHO, 1982, p.82-83.
122. Collins, V J. Princípios de Anestesiologia. Rio de Janeiro 2° Ed, Guanabara
Coogan, 1978, 1194 pg.
123. Thurmon W J, Tranquilli J B, Benson G J. Veterinary Anesthesia. Third Edition:
Maryland, USA: Lippincott-Willians & Wilkins editors, 1996, 928 pgs.
124. Pick A, Misel A. A rapid microassay of the measurements of superoxide and
hydrogen peroxide production by macrophages in culture using automatic enzyme
immunoassay reader. J Immunol 1981; 46: 2111-2126.
125. Green L C, Tannenbaun S R. Nitrate syntesis in the germ free and convectional
rat. Science 1981; 212: 56-58.
126. Schalm O W, Jain, N C, Carrol, E J. Hematologic techinics. In: Veterinary
Hematology. Philadelphia: Lea Febiger 1986. p.21-86.
127. Behmer O A, Tolosa, E M C, Freitas Neto, A G. Manual de técnicas para
histologia normal e patológica. São Paulo: EDART, 1976. 158p.
128. Zar J H. Bioestatistical analysis. 3. Ed. Upper Saddle River. Prentice Hall, 1996,
718p.
102
129. Marinho M. Resposta imune à infecção por Leptospira interrogans sorovar
icterohaemorrhagiae em linhagens de camundongos geneticamente selecionados.
(tese) Botucatu: Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista; 2000.
130. Gheorghiu M, Mouton D, Lecoeur H, Lagranderie M, Mevel J C, Biozzi G.
Resistance of high and low antibody responder lines of mice to the growth of a
virulent (BCG) and virulent (H37Rv) strains of mycobacteria. Clin Exp Immunol
1985; 59: 177-184.
131. Hathaway, S. C, Blackmore, R. B, Marshall, R. B. Leptospirosis and the
maintenance host: a laboratory mouse model. Res Vet Sci 1983; 24: 82-89.
132. Marinho M, Langoni H, Oliveira S L, Carreira R, Perri S H V, Luvizoto M C.
Resposta humoral, recuperação bacteriana e lesões histológicas em camundongos
em geneticamente selecionados para bons e maus respondedores de anticorpos e
balb/c, frente à infecção por Leptospira interrogans sorovar icterohaemorrhagiae.
Pesq Vet Bras 2003; 23: 5-12.
133. Marangoni A, Accardo S, Aldini, R, Guardigli M, Cavrini F, Sambri V,
Montagnani M, Roda A, Cavenini R. Production of reactive oxygen species and
expression of inducible nitric oxide synthase in rat isolated Kupffer cells stimulated
by Leptospira interrogans and Borrelia burgdorferi. World J Gastroenterol 2006;
12: 3077-3081.
134. Liu Y, Zheng W, Mao L Li Y, Yan J. Pathogenesis of leptospirosis: interactions of
Leptospira interrogans with in vitro cultured mammalian cells. Med Microbiol
Immunol 2007; 196: 233-239.
135. Moonis M., Ahmad I., Bochhowot B.W. Macrophages in host defence: an
overview. Int J Biochem Biophys 1992; 29: 89-98.
103
136. Rabinovitch, M. Macrophage spreading in vitro. In: Mononuclear phagocytes,
characteristics, physiology & function. Oxford: FURTH, R.V editors 1975, p.161-
170.
137. Darrah P A, Hondalus M K, Chen Q, Ischiropoulos H, Mosser D M. Cooperation
between reactive oxygen and nitrogen intermediates in killing of Rodococcus equi
by activated macrophages. Infect Immun 2000; 68: 3587-3593.
138. Brunelli L, Crow J P, Beckman, J S. The comparative toxicity of nitric oxide and
peroxynitrite to Escherichia coli. Arch Biochem Biophys 1995; 316: 724-730.
139. De Groote M A, Fang F C. Noinhibitions: antimicrobial properties of nitric oxide.
Clin Infect Dis 1995; 21, suppl.2: 5162-5165.
140. Hickman-Davis J, Gibbs-Erwin J, Lindsey J R, Matalon S. Surfactant protein A
mediates mycoplasmacidal activity of alveolar macrophages by production of
peroxynitrite. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 4953-4958.
141. Vasquez-Torres A, Jones-Carson J, Balish E. Peroxynitrite contributes to the
candidacidal activity of nitric oxide producing macrophages. Infect Immun 1996;
21: 11-17
.
142. Assreuy J F, Cunha F Q, Epperlein M, Noronha-Dutra A, O’donell, C A, Liew Y.
Production of nitric oxide end superoxid by activated macrophages and killing of
Leishmania major. Eur J Immunol 1994; 24: 672-676.
143. Fernandes P D, Assreuy J. Role of nitric and superoxide in Giardia lamblia
killing. Braz J Med Biol Res 1997; 30: 93-99.
104
144. Tohyama M, Kanakami K, Futenma M, Saito A. Enhancing effect of oxygen
radical scavengers on murine macrophage anticryptococcal activity throught
production of nitric oxide. Clin Exp Immunol 1996; 103: 436-441.
145. Abbas A K, Lichtman A H, Pober J S. Citocinas. In: Imunologia celular e
molecular. Philadephia: Sauders; 2002: 11: 235-269
146. Cinco M, Vecile E, Murgia R, Dobrina P, Dobrina A. A Leptospira interrogans
and Leptospira peptidoglycans induce the release of tumor necrosis factor alpha
from human monocytes. FEMS (Fed. Europ Microbiol Soc) Microbiol Lett. 1996;
138: 211-214.
147. Vernel-Pauillac F, Merien F. Proinflammatory and immunomodulatory cytokine
mRNA time course profiles in hamsters infected with avirulent variant of
Leptospira interrogans. Infect Immun 2006; 74: 4172-4179.
148. Nally J E, et al. Alveolar Septal Deposition of Immunoglobulin and Complement
Parallels Pulmonary Hemorrhage in a Guinea Pig Model of Severe Pulmonary
Leptospirosis. Am J Pathol 2004, 163: 1115-1127.
149. Sternberger L A, Hardy P H Jr., Circulis J J, Meyer HG. The unlabeled antibody
enzyme method of immunohistochemistry. J. Histochem Cytochem 1970; 18: 315-
333.
150. Scanziani E, Sironi G, Mandeli G. Immunoperoxidase studies on Leptospiral
nephritis of swine. Vet Pathol 1989; 26: 442-444.
151. Zamora J, Riedemann S, Cabezas X, Vega S. Comparación de cuatro técnicas
microscópicas para el diagnóstico de leptospirosis en roedores silvestres en el area
rural de Valdivia, Chile. Rev Lationoam Microbiol 1995; 37: 267-272.
105
152. Zamora J, Riedemann S, Cabezas X, Lovera P. Leptospirosis de roedores
silvestres en el área rural de Valdivia. Pesquisa de Leptospira interrogans mediante
inmunofluorencencia e inmunoperoxidase. Arch Med Vet 1995; 24:115-118.
153. Wachstein M, Meisel E. Demonstration of peroxidase activity in tissue sections. J
Histochem Cytochem 1964; 12: 538-544.
154. Chih-Wei Y, Mai-Szu W, Mig-Jeng P. Leptospirosis renal diseases. Nephrol Dial
Transplant 2001; 16: 73-77.
155. Kemers F, Szeky A. Leptospira sejro infection of albino mice in Hungary
(Erradication of Leptospires from the infected mouse stocks). Zlb Med Reike B Bd
1966; 13: 591-600.
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