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iii
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E GENOTÍPICA DE
Escherichia coli PRODUTORA DE TOXINA SHIGA (STEC)
ISOLADAS DE BOVINOS DE CORTE DO ESTADO DO PARANÁ
JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL
Fevereiro de 2008
Tese apresentada à Faculdade de Ciências
Agrárias e Veterinárias, UNESP, Campus de
Jaboticabal, como parte das exigências para a
obtenção do Título de Doutora em Medicina
Veterinária – Área de Concentração em Medicina
Veterinária Preventiva.
Caroline Peters Pigatto
Orientador: Prof. Dr. Rubén Pablo Schocken-Iturrino
Co-orientadores: Profa. Dra. Cyntia Maria Telles Fadel-Picheth
Prof. Dr. José Moacir Marin
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iv
Pigatto, Caroline Peters
P628c
Caracterização fenotipica e genotípica de Escherichia coli
produtora de toxina shiga (STEC) isoladas de bovinos de corte do
estado do Paraná / Caroline Peters Pigatto – Jaboticabal, 2008
xiv, 84 f. ; 28 cm
Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de
Ciências Agrárias e Veterinárias, 2008
Orientador: Rubén Pablo Schocken-Iturrino
Banca examinadora: Luiz Augusto do Amaral, Helio José
Montassier, Alessandra Aparecida Medeiros, Elaine Cristina Pereira
De Martinis
Bibliografia
1. Escherichia coli. 2. toxina Shiga. 3. STEC. 4.stx I. Título. II.
Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias.
CDU 619:616.98:636.2
Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço
Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal.
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v
DADOS CURRICULARES DO AUTOR
CAROLINE PETERS PIGATTO – Nascida a 30 de janeiro de 1977 em
Curitiba/Pr. Concluiu o segundo grau no Colégio Marista Santa Maria, em 1994. Iniciou
o curso de Medicina Veterinária em 1996, na Pontifícia Universidade Católica do Paraná
– PUC/Pr, concluído em fevereiro de 2001. Durante o curso realizou trabalhos com
microbiologia e monitoria na disciplina de Microbiologia Veterinária. Em março de 2002
iniciou o curso de Mestrado em Ciências Veterinárias com ênfase em Microbiologia na
Universidade Federal do Paraná – UFPR, concluído em fevereiro de 2004. Em março
de 2004, iniciou o curso de Doutorado em Medicina Veterinária Preventiva na
Universidade Estadual Paulista – UNESP/Campus Jaboticabal, concluído em fevereiro
de 2008.
vi
Quando iniciamos a vida, cada um de nós recebe um bloco de mármore e as
ferramentas necessárias para converter este bloco em escultura.
Podemos arrastá-lo intacto a vida toda, podemos reduzi-lo a cascalho, ou
podemos dar-lhe uma forma gloriosa.
Eis aqui um teste para verificar se sua missão na Terra está cumprida.
Responda rápido: você está vivo?
Se a resposta é SIM, então ainda falta muita coisa a fazer.
Richard Bach
vii
Dedico este trabalho as pessoas que são a base da minha vida!
Aos meus avós Irineu e Delorme,
aos meus pais Carmen e Ernani
e a minha irmã Mariane.
viii
AGRADECIMENTOS
Chegar ao fim deste estudo me mostrou como é importante o trabalho em
equipe! Por isso agradeço:
A Deus que está sempre ao meu lado me iluminando.
Aos meus avós Irineu e Delorme Peters, fonte inspiradora e grande exemplo de
vida. Agradeço sempre a Deus por ter colocado em meu caminho pessoas tão
maravilhosas como vocês!
A minha mãe e melhor amiga Carmen Sueli Pigatto, que sempre me
proporcionou uma vida estruturada e muito feliz e para quem sempre recorro para
contar alegrias e frustrações. Sua capacidade criativa e sua inteligência são, para mim,
estímulos constantes para seguir em frente. Sem seu apoio certamente não chegaria
até aqui.
Ao meu pai Ernani Pigatto, que desde a infância me propiciou uma perfeita
formação educacional. Graças ao seu esforço e dedicação, eu tive subsídios para
terminar um trabalho como este.
A minha querida irmã Mariane Pigatto, que me ensinou a compartilhar. Com seu
jeito carinhoso e meigo tornou minha vida mais alegre. Conte sempre comigo!
Ao meu esposo Andrigo Barboza De Nardi que com seu entusiasmo e com seu
amor traz a minha vida muita felicidade. Sua ajuda e apoio foram fundamentais.
Ao meu amigo e orientador Prof. Ruben Pablo Schocken-Iturrino seu jeito alegre
e amigo de ensinar e aconselhar transforma árduas tarefas em atividades agradáveis!
Que nossa amizade perdure para sempre!
A minha querida mestra e amiga Profa Cyntia M. T. Fadel-Picheth tenho seu
entusiasmo e sua capacidade profissional como exemplo. Seu apoio e seus
ensinamentos foram fundamentais para o meu crescimento científico. Espero, um dia,
ser uma profissional tão competente quanto você!
A pesquisadora Kinue Irino (Instituto Adolfo Lutz), referência nacional em
Escherichia coli. Obrigada pelos seus ensinamentos e apoio!!
Ao Prof. José Moacir Marin pela ajuda e apoio.
ix
Aos meus queridos amigos do laboratório de Microbiologia da UNESP; Silvina
Berchielli, Tammy P. Chioda, Gisela Garcia, Adriana Ragazani, Juliano Vittori, Edna
Testa, Gislaine Barbosa, César Martins, Érica Oliveira e Kátia Trovó. Eu adorei os
estudos em conjunto e as nossas saídas para comer espetinho! Este período ficará
sempre na minha memória!
As minhas amigas do laboratório de Bacteriologia e Biologia Molecular da UFPR;
Sônia S.S. Farah, Cibelle Dalagassa, Mônica Surek, Lauriane Faveri, Octaviana e
Fabiana De Toni, pela ajuda direta no experimento e pela amizade que ficará para
sempre guardada em meu coração!
As minhas queridas irmãzinhas e companheiras de república Thatiana Motheo,
Marcy Lancya Pereira, Virginia Tessarine e Sofia Borin. É muito bom chegar em casa e
sentir a alegria transmitidas por vocês, sentar na mesa para jantar e compartilhar
histórias e experiências. Sentirei muitas saudades. Quero, mesmo de longe,
acompanhar a caminhada de cada uma, saber se estão bem e saber das grandes
realizações que certamente ocorrerão!!
A minha cachorrinha Neguinha, companheira da graduação ao doutorado!
E a todos aqueles que direta ou indiretamente auxiliaram durante esta jornada.
Muito Obrigada!!
x
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS ......................................................................................................xiii
LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................... xiv
RESUMO........................................................................................................................ xv
ABSTRACT ................................................................................................................... xvi
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................1
2. REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................3
2.1 Fatores de Virulência de STEC............................................................................5
2.2 Reservatório da STEC ..........................................................................................9
2.3 Incidência de Infecções por STEC em Humanos.............................................10
2.4 Manifestações Clínicas ......................................................................................13
2.5 Formas de Transmissão de STEC.....................................................................14
2.6 Métodos Diagnósticos para Detecção de STEC ..............................................16
3. OBJETIVO..................................................................................................................21
4. MATERIAL E MÉTODOS...........................................................................................22
4.1. Amostras ............................................................................................................22
4.2. Determinação dos Sorotipos de STEC ............................................................22
4.3. Detecção da Expressão da Toxina Shiga Através de Imunoensaio..............23
4.4. Caracterização Genotípica das STEC ..............................................................23
4.4.1. PCR – Multiplex.............................................................................................23
4.4.2. Detecção dos Produtos de PCR....................................................................25
4.4.3. Ensaios de PCR-RFLP..................................................................................25
4.5. Sequenciamento de DNA ..................................................................................27
4.5.1. Amplificação dos Genes do Tipo stx
2
por PCR ............................................27
4.5.2. Purificação do Produto de PCR ....................................................................27
4.5.3. Reação de Sequenciamento .........................................................................27
4.6. Perfil de Susceptibilidade a Agentes Antimicrobianos..................................28
4.7. Viabilidade de isolados de STEC em queijo minas frescal............................29
4.7.1. Determinação de coliformes totais e coliformes termotolerantes no leite
pasteurizado............................................................................................................29
4.7.2. Isolados de STEC utilizados para inoculação no leite...................................29
4.7.3. Processo de Produção do Queijo Tipo Minas Frescal...................................29
4.7.4. Detecção de STEC a partir do queijo elaborado. ..........................................30
5. RESULTADOS...........................................................................................................31
5.1. Sorologia ............................................................................................................31
5.2. Expressão da Toxina Shiga ..............................................................................33
5.3. Caracterização Genotípica das STEC ..............................................................34
5.4. Subtipagem do Gene stx
2
.................................................................................37
5.5. Sequenciamento de Cepas de STEC................................................................42
5.6. Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos......................................................43
5.7. Viabilidade de cepas STEC em Queijo Minas Frescal ....................................44
5.7.1. Determinação de coliformes totais e coliformes termotolerantes no leite
pasteurizado............................................................................................................44
xi
5.7.2. Detecção de STEC a partir do queijo elaborado ...........................................45
6. DISCUSSÃO ..............................................................................................................46
7. CONCLUSÕES ..........................................................................................................53
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS .......................................................................................54
9. REFERÊNCIAS.........................................................................................................56
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
AE - “attaching and effacing”
CDC – Centro de Controle e Prevenção de Doenças dos Estados Unidos
CH – colite hemorrágica
CT-SMAC – ágar MacConkey sorbitol com cefixima e telurito
DAEC – E. coli de aderência difusa
EAEC – E. coli enteroagregativa
EIEC - E. coli enteroinvasiva
EPEC - E. coli enteropatogênica
ETEC - E. coli enterotoxigênica
FDA – “Food and Drug Administration – Estados Unidos”
HELA – células epiteliais de carcinoma do colo do útero humano
OMS – Organização Mundial da Saúde
pb – pares de base
PCR – reação em cadeia da polimerase
PCR-RFLP – polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição
pmol - picomol
PTT – púrpura trombocitopênica trombótica
SHU – síndrome hemolítica urêmica
SLT – “Shiga-like toxin”
SMAC – ágar MacConkey sorbitol
STEC - E. coli produtora de toxina Shiga
Stx – toxina Shiga
Stx1 – toxina Shiga 1
Stx2 – toxina Shiga 2
VERO – células de rim de macaco verde africano
IAL – Instituto Adolfo Lutz
µL – microlitro
xiii
LISTA DE TABELAS
1.
Iniciadores utilizados na PCR multiplex para amplificação dos genes stx
1
, stx
2
,
eae, ehxA
e saa.......................................................................................................24
2. Perfil de restrição de variantes stx
2
obtido com as enzimas HincII e AccI, segundo
DE BAETS et al.,(2004)..........................................................................................26
3. Perfil de restrição de variantes stx
2
obtido com as enzimas PvuI e HaeIII, segundo
DE BAETS et al.,(2004)..........................................................................................26
4.
Sorotipos de STEC identificados e suas respectivas freqüências em fezes de
bovinos provenientes do Estado do Paraná............................................................32
5.
Total de amostras com as características do ensaio VTEC-RPLA e da PCR
Multiplex provenientes de fezes de bovinos oriundos do Estado do Paraná..........33
6.
Expressão da toxina Shiga e presença de genes de virulência nas STEC
estudadas, isoladas de fezes de bovinos de corte provenientes do Estado do
Paraná.....................................................................................................................34
7. Freqüência de subtipos de stx
2
identificados nas amostras de STEC isoladas de
fezes de bovinos provenientes do Estado do Paraná.............................................38
8.
Antibiograma das STEC isoladas de fezes de bovinos provenientes do Estado do
Paraná.....................................................................................................................43
.
xiv
LISTA DE FIGURAS
1.
Estrutura do tipo A:B da toxina Shiga de Escherichia coli.........................................6
2.
Perfis genotípicos identificados nas Cepas de STEC isoladas de fezes de bovinos
provenientes do Estado do Paraná..........................................................................37
3. Representação em gel de agarose (2%) contendo produtos de PCR para detecção
do gene stx
2
(amplificação de 1400pb) com o iniciador OLI (DE BAETS et al.
2004)........................................................................................................................39
4.
PCR-RFLP do gene stx
2
mostrando perfil compatível com stx
2OX3a/O111
e stx
2
........40
5.
PCR-RFLP do gene stx
2
mostrando perfil compatível com stx
2
e stx
2vha
.................41
6. Teste de sensibilidade da amostra CP11 de STEC a antimicrobianos. Observar
halos de inibição em torno dos discos.....................................................................44
xv
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E GENOTÍPICA DE Escherichia coli
PRODUTORA DE TOXINA SHIGA (STEC) ISOLADAS DE BOVINOS DE
CORTE DO ESTADO DO PARANÁ.
RESUMO - Escherichia coli produtoras de toxina Shiga (STEC) são reconhecidas
como agentes causadores de infecções em humanos em todo o mundo. O principal
reservatório é o bovino. Neste trabalho, cepas de STEC previamente isoladas de fezes
bovinas foram caracterizadas usando PCR multiplex para determinar os genes de
virulência (stx
1
, stx
2
, ehxA, eaeA e saa), soroaglutinação passiva reversa em látex
(RPLA-VTEC screen) para avaliar a expressão da toxina Shiga, PCR-RFLP e
sequenciamento para obter os subtipos e a variabilidade dos genes stx
2
,
respectivamente. Foram determinados também os sorotipos, o perfil de sensibilidade e
a viabilidade das cepas de STEC em queijo minas frescal. A freqüência de STEC nas
amostras de fezes bovinas foi de 37%. Foram encontrados trinta e quatro sorotipos de
STEC sendo os mais freqüentes o ONT:H7 (10%), O22:H8, O22:H16 e ONT:H21 (7%
cada). Onze sorotipos encontrados não tinham sido associados com STEC até o
momento. A maioria das STEC (96%) foi susceptível a todos os antimicrobianos
testados. A produção de toxina Shiga determinada pelo ensaio RPLA foi de 89%. Os
marcadores de virulência foram encontrados em 11 diferentes combinações, a mais
freqüente foi stx
2
(27%), stx
1
stx
2
e stx
1
stx
2
ehxA saa (16% cada). Foram detectados 8
subtipos de stx
2
: stx
2OX3a/O111
; stx
2
; stx
2c
; stx
2(vha)
; stx
2(vhb)
; stx
2OX3b
; stx
2vnb/vhc
e stx
2O48
.
Os genes que apresentaram maior freqüência foram: stx
2
e stx
2c
. As seqüências
parciais obtidas sugerem a presença de elevada variabilidade nos genes do tipo stx
2
nas STEC analisadas. A viabilidade de STEC não-O157 em queijo minas revelou que
diferentes cepas de STEC podem ser detectadas nos queijos após 10 dias de
armazenamento sob refrigeração. Os dados encontrados neste trabalho sugerem
isolados com alto potencial de patogenicidade oferecendo risco de desencadear graves
infecções à população.
Palavras-chave: Escherichia coli; toxina Shiga, STEC, stx.
xvi
FENOTYPIC AND GENOTYPIC CHARACTERISTICS OF SHIGA TOXIN-PRODUCING
Escherichia coli STRAINS (STEC) ISOLATED FROM BEEF CATTLE OF PARANÁ
STATE-BRAZIL.
ABSTRACT - Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) is recognize
worldwide as an organism capable to cause human diseases. Cattle are the main
source of STEC. In this research, STEC strains previously isolated were analyzed using
multiplex-PCR for virulence genes, the RPLA assay to detect the Shiga toxin production
and serotyping. PCR-RFLP and nucleotide sequence were analyzed to detect stx
2
genes subtypes and their variability. Moreover tests for antimicrobial susceptibility and
the vialbility of STEC in Minas Frescal cheese were done. The frequency of cattle
shedding STEC was 37%. Thirty-four serotypes of STEC were found, the most frequent
being ONT:H7 (10%), O22:H8, O22:H16 and ONT:H21 (7% each). Eleven serotypes
had not been associate with STEC until the moment. Most of the strains (96%) were
susceptible to all antimicrobial agents tested. Production of Shiga toxin by the RPLA
assay was detected in most (89%) of the STEC strains. The frequency of virulence
markers were found in 11 diferent combinations: stx
2
(27%), stx
1
stx
2
e stx
1
stx
2
ehxA
saa (16% each). Eigth stx
2
subtypes were detect (stx
2OX3a/O111
; stx
2
; stx
2c
; stx
2(vha)
;
stx
2(vhb)
; stx
2OX3b
; stx
2vnb/vhc
; stx
2O48
) and the most frequent were: stx
2
; stx
2c
. The partial
sequences of stx
2
genes suggested a high variability of stx
2
types in the STEC analyzed.
The STEC viability in cheese could be detected after 10 days of storage under
refrigeration. The results found in this work suggest strains with high potential of
pathogenicity offering risk to lead serious infections to the population.
Key-words: Escherichia coli; STEC, Shiga toxin, stx
1
1. INTRODUÇÃO
As bactérias da espécie Escherichia coli são bastonetes Gram negativos que
fazem parte da microbiota intestinal dos mamíferos. Algumas cepas estão associadas a
patologias intestinais e extraintestinais. As linhagens de E. coli patogênicas causadoras
de infecções entéricas no ser humano e nos animais envolvem seis categorias: E. coli
enteropatogênicas (EPEC), E. coli enteroinvasora (EIEC), E. coli enterotoxigênica
(ETEC), E. coli enteroagregativa (EAEC), E. coli de aderência difusa (DAEC) e E. coli
produtora de toxina Shiga (STEC). Dentre estas categorias, as STEC destacam-se
devido ao seu potencial zoonótico emergente (KONEMAN et al.,2001).
Desde o primeiro relato de surto causado por STEC em 1982, esta linhagem foi
associada a um amplo espectro de doenças no ser humano, variando de diarréia
branda a complicações graves como a síndrome hemolítica urêmica (SHU) (NATARO
& KAPER, 1998).
As STEC são reconhecidas como um importante grupo de patógenos
emergentes e tornaram-se um grande desafio à saúde pública, pois possuem um alto
grau de infectividade para os seres humanos, mesmo em baixo número no alimento
ingerido (10 UFC) são capazes de provocar infecção. O aumento gradativo da
ocorrência de surtos alimentares causados por STEC em todo o mundo tem mostrado
a importância da obtenção de informações sobre a epidemiologia dessa bactéria e de
seus reservatórios. Neste sentido, o principal reservatório de STEC são os bovinos,
que as elimina por meio das fezes. Estas bactérias de maneira direta ou indireta podem
atingir a cadeia alimentar dos seres humanos causando graves doenças (WHO, 1998).
Embora se enfatize o estudo da Escherichia coli O157:H7, mais de 200 sorotipos
não-O157 já foram associados com infecções entéricas. No entanto a freqüência,
geralmente, é subestimada pela inexistência de métodos eficazes de isolamento. As
dificuldades ocorrem devido ao baixo número de microrganismos por grama de fezes,
bem como pela presença de microbiota competitiva. Em alguns países da Europa,
América Latina e na Austrália, a maioria dos casos de colite hemorrágica e síndrome
2
hemolítica urêmica são causados por STEC não-O157 sendo estabelecida assim a
importância de métodos específicos de detecção e caracterização destas cepas
igualmente toxigênicas (WHO, 1998).
A emergência deste patógeno gerou grande preocupação mundial, pelo número
de pessoas afetadas e por distintos veículos de transmissão identificados (ressaltando
produtos de origem animal), o que levou a Organização Mundial de Saúde (OMS) a
promover medidas de controle e prevenção. No Brasil são poucas as informações
disponíveis sobre o assunto, embora sejam reconhecidos casos esporádicos de diarréia
provocados pela STEC que ocorrem com mais freqüência em crianças. Ainda estudos
relacionados ao reservatório apontam uma predominância de STEC não-O157 no
rebanho bovino brasileiro (PATON & PATON, 1998).
Devido à escassez de dados nacionais a respeito deste patógeno, surgiu a
proposta deste trabalho. O conhecimento sobre a epidemiologia da STEC contribuirá
para o controle da disseminação deste agente, diminuindo os riscos de infecção ao ser
humano.
3
2. REVISÃO DE LITERATURA
A Escherichia coli é um bastonete Gram negativo da família Enterobacteriaceae
que faz parte da microbiota intestinal do ser humano e dos animais. Mas existem cepas
patogênicas associadas a uma grande variedade de infecções intestinais e
extraintestinais (NATARO & KAPER, 1998).
Este microrganismo, isolado de fezes de neonatos foi descrito primeiramente em
1885, pelo bacteriologista alemão Theodore Escherich como “Bacterium coli comune”.
Muitos estudos sobre o metabolismo e os processos bioquímicos dessa bactéria foram
conduzidos e tornaram-se a base para o estudo das enterobactérias em geral e da
Escherichia coli em particular (GYLES, 1994).
Até 1950, este microrganismo foi considerado como habitante não patogênico
do trato entérico do ser humano e dos animais de sangue quente (WASTENSON,
2001). A tipagem sorológica tem sido amplamente utilizada para caracterizar a
Escherichia coli. Porém, uma vez que os fatores de virulência estão mais diretamente
associados com a patogenicidade do que os antígenos de superfície, apenas a
sorologia não é adequada para caracterizar cepas de E. coli como patogênicas
(FORBES et al., 2002). A identificação das cepas patogênicas de E. coli baseia-se,
sobretudo na presença de genes de virulência associados a cada categoria do
enteropatógeno e utiliza-se, principalmente métodos moleculares (NATARO & KAPER,
1998).
As principais categorias diarreogênicas de E. coli são: enteropatogênica (EPEC),
enterotoxigênica (ETEC), enteroinvasora (EIEC), enteroagregativa (EAEC), aderência
difusa (DAEC) e produtora de toxina Shiga (STEC). Linhagens pertencentes a cada
categoria utilizam diferentes estratégias para provocar infecção, conseqüência da
versatilidade de seu genoma que é conferida principalmente por duas configurações
genéticas: plasmídeos de virulência e ilhas de patogenicidade, além da presença de
bacteriófagos (PATON & PATON, 1998). Dentre o grupo das diarreogênicas destaca-se
a E. coli produtora de toxina Shiga (STEC), capaz de causar desde diarréia não
4
complicada a colite hemorrágica (CH), e doenças potencialmente fatais como síndrome
hemolítica urêmica (SHU) (NATARO & KAPER, 1998).
O primeiro relato sobre E. coli produtora de toxina Shiga foi feito por
KONOWALCHUCK et al.,(1977) analisando cepas isoladas de pacientes com diarréia.
Estes autores verificaram o efeito citotóxico irreversível da toxina Shiga em células Vero
(células de rim de macaco verde africano). A toxina identificada foi denominada de
verotoxina, nomenclatura utilizada até hoje por alguns pesquisadores.
Após, estudos realizados nos Estados Unidos por O’BRIEN et al., (1982),
identificaram entre cepas de E. coli pertencentes a sorogrupos considerados EPEC, a
produção de uma citotoxina letal para células Hela (células epiteliais de carcinoma do
colo do útero humano), cujo efeito era neutralizável por antisoros contra a toxina da
Shigella dysenteriae tipo1, denominando-a, então, de Shiga-like toxin (SLT).
RILEY et.al., (1983), ao investigar dois surtos de colite hemorrágica e SHU
veiculados por hambúrguer mal cozido nos Estados Unidos, confirmaram a STEC como
um patógeno humano. Estes pesquisadores isolaram um sorotipo até então raro de E.
coli, o O157:H7. O quadro foi caracterizado por dores abdominais severas, diarréia
aquosa inicial seguida de diarréia hemorrágica.
Em 1983, O’BRIEN e colaboradores relataram que E. coli do sorotipo O157:H7
produzia toxina similar a produzida pela Shigella dysentariae tipo 1. No Canadá,
JOHNSON e colaboradores em 1983 relataram que E. coli O157:H7 isolada de
pacientes com colite hemorrágica produziam uma citotoxina ativa em células Vero.
Hoje, a denominação STEC é utilizada para se referir a um grupo de Escherichia
coli que apresenta como característica comum a produção de toxina Shiga. Além da
Escherichia coli O157:H7, outros sorotipos de STEC, conhecidos como STEC não-
O157, também provocam doenças em seres humanos e são predominantes em vários
países (BEUTIN et al.,1993; BOERLIN et al.,1999; FEY et al., 2000; VAZ et al., 2004).
A STEC é similar a outras E. coli em termos de propriedades bioquímicas,
gerando dificuldades no diagnóstico em laboratórios de rotina. Apenas fatores de
virulência como a produção de toxina Shiga, permite distinguir a STEC dos demais
isolados de E. coli (TSCHÄPE & FRUTH, 2001).
5
2.1 Fatores de Virulência de STEC
O mecanismo de patogenicidade das STEC é complexo e envolve vários fatores
de virulência. A produção da toxina Shiga é característica comum a todas as STEC
(PATON & PATON, 1998).
- Toxinas Shiga (Stx)
As STEC são diferenciadas de outras Escherichia coli pela produção de um ou
dois tipos de potentes toxinas denominadas toxinas Shiga, cujo mecanismo de ação
envolve a inibição da síntese protéica nas células alvo (PATON & PATON, 1998).
O gene stx, que codifica a toxina, está localizado no genoma de bacteriófagos
integrando-se ao cromossomo da célula hospedeira (GOBIUS et al.,2003). A presença
desses genes em bacteriófagos propicia não somente a capacidade de disseminação
entre diferentes cepas, mas também possibilita a presença das duas toxinas em uma
mesma bactéria. Portanto, as STEC podem apresentar um ou mais genes stx (FÜRST
et al., 2000).
A existência de mais de um tipo de toxina Stx foi verificada quando o antisoro
anti-Stx não neutralizou a citotoxicidade da toxina produzida por uma cepa de STEC
(PATON & PATON, 1998). As toxinas Stx são geneticamente relacionadas e
apresentam atividades biológicas similares, mas são distintas antigenicamente. A
família das toxinas Stx produzidas pela E. coli possui dois grupos: Stx1 e Stx2. STEC
pode produzir Stx1, Stx2 ou ambas as toxinas. Stx1 diverge da Stx2 na seqüência de
aminoácidos da subunidade B alterando, desta forma, a afinidade pelo receptor celular
(MELTON-CELSA & O’BRIEN, 1998). As características da família das toxinas Shiga
estão resumidas a seguir:
- A estrutura da proteína é constituída de um polipeptídio A e cinco polipeptídios B;
- O receptor na célula eucariótica é o glicolipídeo Gb
3
ou Gb
4
(Stx2e);
- O modo de ação consiste na inibição da síntese protéica em célula eucariótica;
- Citotóxica para células Vero, HeLa e células endoteliais;
6
- Stx1 e Stx2 não apresentam reação cruzada;
- Os aminoácidos idênticos entre Stx1 e Stx2 são de aproximadamente 55%;
- Stx2 é mais tóxica para as células endoteliais microvascular renal humana do que a
Stx1 (MELTON-CELSA & O’BRIEN, 1998).
FIGURA 1 – Estrutura do tipo A:B da toxina Shiga de Escherichia coli. (Fonte:
www.textbookofbacteriology.net/proteintoxins.html)
As toxinas Stx1 e Stx2 possuem a estrutura 1A:5B (Figura 1). O polipeptídio B
forma um pentâmero que é responsável pela adesão ao receptor glicolipídico,
globotriosilceramida de células eucarióticas. A subunidade A é internalizada e clivada
pela tripsina gerando as porções A1 (28kDa) e A2 (4kDa). O polipeptídio A1 inibe a
síntese protéica celular. O peptídeo A2 é requerido para ligar a porção A1 ao B
pentâmero que se liga ao receptor (MELTON-CELSA & O’BRIEN, 1998).
O grupo Stx2 é altamente heterogêneo, com diversas variantes já descritas
(NAKAO et al.,2002). Além de Stx2 clássica existem variantes como Stx2c, Stx2vha,
Stx2vhb, Stx2vhc, Stx2Ox3b, Stx2O111, Stx2O48, Stx2O118, Stx2OX393, Stx2OX392,
Stx2e e Stx2ev (BASTIAN et al.,1998; DE BAETS et at.,2004). Existem variantes que
apresentam alta similaridade (aproximadamente 96% na seqüência de aminoácidos da
subunidade B e de 99 a 100% na subunidade A) com Stx2 como Stx2c, Stx2vha,
Stx2vhb e Stx2Ox393. Já em variantes como Stx2O111, Stx2Ox392, a similaridade é de
B
A
7
aproximadamente 86% para a subunidade B e 95% para a subunidade A (BASTIAN et
al.,1998; PIÉRARD et al.,1998; NAKAO et al.,2002).
A susceptibilidade celular à toxina Shiga é determinada pela presença de
receptores para a toxina na superfície da célula. Nos seres humanos esses receptores
estão presentes principalmente nas células epiteliais do intestino, nas células do
endotélio vascular e nas células do epitélio renal (O’BRIEN & HOLMES, 1987). As
conseqüências de uma infecção por STEC, são claramente diferentes ente os seres
humanos e os bovinos, por falta de patogenicidade neste último. Assim, sugere-se que
os bovinos são insensíveis à ação da toxina Shiga ou que estas toxinas têm atividade
diferenciada entre estes dois hospedeiros (SMITH et al.,2002). PRUIMBOOM-BREES et
al.(2002), sugerem que a falta de receptores vasculares para a toxina Shiga, explicaria
o fato dos bovinos serem portadores sadios de STEC.
O sequenciamento dos genes stx, stx
1
e stx
2
que codificam, respectivamente, as
toxinas Shiga produzidas por Shigella dysenteriae do tipo 1, e Stx1 e Stx2 de STEC,
permitiu elucidar e comparar as estruturas desses genes e a seqüência de aminoácidos
dessas proteínas. Substituições de nucleotídeos encontradas nas seqüências de stx
1
e
stx
2
em algumas STEC levaram a descrição de formas variantes destes genes. Na
literatura, diferentes designações são utilizadas para os mesmos genes causando,
muitas vezes, confusão. No grupo das toxinas Stx1 poucas variantes foram descritas,
destacando-se Stx1c (PATON et al.,1993a.; PATON et al.,1995; BASTIAN et al.,1998;
ZHANG et al.,2002; BÜRK et al., 2003).
- Intimina
Foi relatada uma relação direta entre a presença do gene eae e a capacidade da
STEC em causar doenças graves nos seres humanos. O gene eae codifica uma
proteína externa de membrana, denominada Intimina. Esta proteína é um fator de
virulência mediador no ataque ao enterócito, produzindo uma lesão intestinal do tipo
“attaching and effacing” (AE); “attaching” que indica íntima adesão ao enterócito e,
8
“effacing”, desaparecimento das microvilosidades da borda em escova do epitélio
intestinal (WILLSHAW et al.,1994, CHINA et al.,1996).
- Enterohemolisina
Outro fator de virulência produzido pela STEC é a enterohemolisina, codificada
pelo gene hly (FAGAN et al.,1999). Sua produção está, geralmente, associada ao
plasmídeo pO157, mas os genes da enterohemolisina também podem ser encontrados
em outros plasmídeos de alta massa molecular presentes na STEC (BRÜNDER et al.,
1999).
A enterohemolisina é uma proteína monomérica que se insere na membrana
plasmática das células eucarióticas e forma poros (SCHMIDT et al.,1999). O provável
papel da enterohemolisina na patogênese da colite hemorrágica e da síndrome
hemolítica urêmica ainda é incerto. Uma alternativa seria que a hemoglobina liberada
pela ação da enterohemolisina provê uma fonte de ferro que favoreça a multiplicação da
STEC no intestino (LAW & KELLY, 1995).
- Adesina Saa (STEC autoagglutination adhesin)
A adesina Saa foi identificada pela primeira vez por Paton e colaboradores em
2001, na STEC O113:H21 isolada de um surto de SHU. Essa cepa não possui a ilha de
patogenicidade LEE que contém o gene eae. Existem evidências que o gene saa, que
codifica esta adesina, esteja associado com o gene que codifica enterohemolisina
(PATON et al.,2001). O gene saa foi localizado em um megaplasmídeo, cuja eliminação
resultou na redução da capacidade de aderência da bactéria ao intestino do hospedeiro
(JENKINS et al.,2003).
O gene saa foi detectado, além do sorotipo O113:H21, em outras cepas STEC
isoladas de casos esporádicos de SHU, o que sugere que Saa possa ser um fator de
virulência em STEC LEE-negativa isoladas de humanos (PATON & PATON, 2002).
9
JENKINS et al.,(2003), relatam uma íntima relação entre Saa e a adesão da STEC no
intestino de bovinos.
2.2 Reservatório da STEC
O bovino é o principal reservatório de STEC, eliminando-as pelas fezes as quais,
de maneira direta ou indireta, atingem a cadeia alimentar dos seres humanos podendo
causar doença (BEUTIN et al.,1995). As taxas de colonização de STEC em rebanhos
bovinos são variadas, podendo chegar a 60%, mas as taxas típicas variam entre 10 a
40% (NATARO & KAPER, 1998; PIGATTO, 2004; FARAH et al.,2007).
A STEC é comumente isolada em animais sadios, mas pode estar associada a
episódios iniciais de diarréia em animais jovens seguida por colonização assintomática
(NATARO & KAPER, 1998). Ao estudar a presença do receptor de Stx
(globotriosilceramida) nos bovinos, não foi observada sua presença no intestino, mas
apenas no cérebro e no rim. Este dado explica o não desenvolvimento de doença
entérica nestes animais (BREES et al.,2000).
Pesquisas procuram esclarecer o mecanismo de infecção natural do bovino por
STEC, bem como a eliminação fecal do microrganismo (WHO, 1998). REIMANN et
al.,(1998) verificaram que o período de eliminação da STEC nas fezes dos bovinos
pode variar entre 8 a 46 dias. Utilizando a inoculação experimental, destacou-se o
caráter assintomático dos animais. A recuperação da STEC ocorre a partir do conteúdo
intestinal e linfonodos mesentéricos não havendo disseminação para outros órgãos. O
experimento mostrou ainda que a primo infecção não previne a reinfecção (CRAY et
al.,1995).
SHERE et al.,(1998) citaram que um animal pode ser reinfectado pelo mesmo
isolado de STEC, indicando uma baixa proteção imunitária. Assim, episódios
recorrentes com alta prevalência de STEC no rebanho podem indicar exposição dos
animais a alguma fonte deste agente. Portanto, se os fatores que diminuem a
resistência à colonização fossem identificados e eliminados, poderia diminuir
10
substancialmente, a exposição dos seres humanos a este patógeno emergente
(BESSER et al.,1997). Alguns fatores contribuem para a presença e disseminação das
STEC no rebanho, tais como, práticas de manejo, dieta, estresse, densidade
populacional, região geográfica e sazonalidade (KUDVA et al.,1996; DARGATZ et
al.,1997).
A STEC está presente no intestino tanto no gado de corte como no gado leiteiro
e a excreção é mais comum em períodos quentes. A prevalência é maior em animais
jovens e o agente pode permanecer viável no meio ambiente por até dois anos
(HANCOCK et al.,1998).
A dieta alimentar do animal está diretamente relacionada à excreção de STEC,
principalmente no rebanho confinado. A influência da dieta está na habilidade da
Escherichia coli em desenvolver resistência ao pH ácido, aumentando o risco de
doenças de origem alimentar no ser humano. Normalmente a acidez estomacal é uma
barreira efetiva à infecção dos patógenos alimentares. Porém a adaptação que a STEC
sofreu no rúmen do bovino a torna capaz de sobreviver a este mecanismo de defesa
(CRAY et al.,1995).
Os hospedeiros naturais, além dos bovinos, são animais silvestres e domésticos
incluindo os ovinos, caprinos, suínos, felinos e cães (GRIFFIN & TAUXE, 1991; BEUTIN
et al.,1993). BEUTIN et al.,(1993) obtiveram indícios de que aves podem servir de
reservatório para STEC, já que este patógeno é capaz de colonizar o ceco de galinhas,
sendo eliminado pelas fezes.
2.3 Incidência de Infecções por STEC em Humanos
Estima-se que, nos EUA, a STEC cause pelo menos 10.000 a 20.000 episódios
por ano e cerca de 200 a 500 óbitos que ocorrem mais comumente em crianças e
jovens (BROTAM et al.,1995). Segundo KENSH & ACHECON, 2002 este agente já foi
considerado causa mais freqüente de insuficiência renal aguda em crianças nos EUA.
STEC, de um modo geral, tem sido encontrada em 75% dos episódios de síndrome
11
hemolítica urêmica na Europa, América do Norte, Canadá e América Latina,
especialmente na Argentina (LOPEZ et al.,1998).
Em países como Alemanha, Noruega, Suíça e Áustria os casos de diarréia por
STEC excederam a 2%, enquanto que em países como a Itália foi menor que 1%. Nos
casos relatados o sorogrupo O157 representou menos que um terço das STEC
isoladas. Os casos de síndrome hemolítica urêmica (SHU), por exigir hospitalização,
são identificados com mais facilidade, sendo a SHU considerada um bom indicador da
freqüência de infecções por STEC. Os países com maior incidência de SHU no
continente Europeu são Alemanha com 19 casos para cada 100.000 crianças até 15
anos, seguida pela Holanda, Suíça e Bélgica com 1,5 para 100.000. Os países do Sul
da Europa possuem uma menor incidência de SHU nessa faixa etária sugerindo uma
menor freqüência de infecção por STEC (CAPRIOLI & TOZZI, 1998).
No Canadá, infecções por STEC são monitoradas desde 1990. Entre 1993 e
1995, 93% dos casos de infecções provocadas por STEC foram causadas pelo
sorogrupo O157, mas vem ocorrendo um declínio da incidência em razão das
atividades de controle implementadas, como boas práticas de fabricação dos alimentos
e análise laboratorial.. O maior surto de infecção por STEC ocorreu no Canadá, foi
notificado em 1991 entre os esquimós com 521 casos, sendo 22 casos de SHU e duas
mortes (SPIKA et al.,1998).
Em Michigan, nos EUA, foi realizado estudo das STEC isoladas entre 2000 e
2005. Foram avaliados mais de 389 pacientes com STEC, 62% destes eram brancos e
aproximadamente metade eram mulheres. A doença ocorreu em menos de 27% das
pessoas com 10 anos de idade, 19% com 11 a 18 anos e 17% em pessoas com 19 a 23
anos de idade. Embora a freqüência em pessoas maiores de 65 anos tenha sido menor
(9%), esta faixa etária é hospitalizada com maior freqüência que os menores de 18
anos, com diarréia sanguinolenta ou SHU. Cerca de 12 pacientes apresentaram SHU e
dois estavam infectados com sorotipos não-O157: O103:H2 e O76:H7. Sete dos 12
pacientes com SHU estavam associados com cepas stx
2
apenas (MANNING et
al.,2007).
12
No Japão, entre 1991 a 1995, ocorreram 29 surtos provocados por Escherichia
coli O157:H7. Quatro destes surtos ocorreram em jardins de infância, seis ocorreram
em escolas primárias e 19 ocorreram entre familiares (MICHINO et al.,1998).
Na Argentina, nos últimos 30 anos, a incidência de SHU em crianças de até
quatro anos foi a maior do planeta. Casos de SHU neste país parecem ser 7 a 10 vezes
mais altos do que se relata em outras áreas do mundo. Em grupo de crianças com SHU
e com diarréia, 57% apresentaram infecções por STEC. Em crianças com diarréia
sanguinolenta a percentagem de STEC foi de 38,9% e crianças com diarréia aquosa o
agente foi detectado em 21% dos casos. Apenas 3% dos casos de síndrome hemolítica
urêmica (SHU) e 3% dos casos de diarréia foram relacionados com o sorotipo O157:H7
demonstrando a importância da STEC não pertencentes ao sorotipo O157:H7. O
consumo de carne bovina na Argentina é considerado o maior do mundo
(60Kg/habitante/ano). Neste país a carne bovina é a proteína de origem animal mais
barata. As crianças iniciam o consumo de carne muito cedo, 20% aos cinco meses de
idade e 80% delas consomem carne três vezes por semana. Além disso, 80% da carne
consumida no país não passa por inspeção adequada. Estes dados justificam a alta
incidência de infecções por STEC na Argentina (LOPEZ et al.,1998).
No Brasil, estudos realizados em São Paulo e no Paraná utilizando fezes de
crianças com diarréia apontam freqüência de STEC de aproximadamente 1%. Surtos
associados à STEC ainda não foram confirmados no país (GUTH et al., 2002; TONI et
al., 2004), porém existem relatos de alta prevalência de STEC em bovinos saudáveis
(CERQUEIRA et al.,1999; PIGATTO,2004; IRINO et al.,2005; FARAH et al.,2007). Além
disso, PANETO et al. (2007), ao estudar 50 queijos elaborados com leite não
pasteurizado obtidos em supermercados da região centro oeste do Brasil, encontrou
Escherichia coli em 96% e, destas, 6% pertenciam ao grupo produtor de toxina Shiga.
Estes dados sugerem que este alimento pode servir como veículo de transmissão de
STEC.
No Brasil, não há dados sistemáticos que possam indicar a situação da síndrome
entre nós. No Estado de São Paulo, um estudo vem sendo conduzido pelo Centro de
Vigilância Epidemiológica (CVE) para determinar a situação dessa síndrome no Estado
13
e para estabelecer um ponto de partida para a introdução do sistema de vigilância da
bactéria e da SHU. Mais informações sobre a epidemiologia desse patógeno no Brasil
são necessárias para obter mais subsídios para a adoção de medidas de controle e
diminuição do risco de infecção ao ser humano.
2.4 Manifestações Clínicas
A variedade de agravos à saúde provocados pela infecção por STEC inclui
diarréia aquosa, colite hemorrágica, púrpura trombocitopênica trombótica (PTT) e
síndrome hemolítica urêmica (SHU) (NATARO & KAPER, 1998).
Os sintomas da colite hemorrágica iniciam com uma fase prodrômica que
consiste em cólicas abdominais intensas seguidas por um ou dois dias de diarréia
aquosa abundante, que progride para sanguinolenta, com presença de coágulos, não
acompanhada de leucócitos nas fezes, em pacientes sem febre. A doença, geralmente,
é autolimitada, durando em média oito dias (RILEY et al.,1983, FDA, 1999). Estas
características a distinguem da disenteria clássica causada por Shigella sp. ou
Escherichia coli enteroinvasiva, que são caracterizadas por febre alta, toxemia, fezes
com pouco sangue e muco contendo muitos leucócitos (GUAN et al.,2002).
A infecção por STEC, em alguns pacientes, progride para síndrome hemolítica
urêmica que, embora acometa pessoas de todas as idades, afeta principalmente
crianças, sendo neste grupo a mais importante causa de falência renal (NATARO &
KAPER, 1998). A síndrome é caracterizada por um início súbito de anemia hemolítica,
trombocitopenia e falência renal aguda (KARMALI et al.,1983). Cinco a 10% dos
pacientes com diarréia por STEC podem desenvolver SHU, podendo resultar em perda
permanente das funções renais (GRIFFIN & TAUXE, 1991). Dentre os pacientes com
SHU, 3 a 5% morrem (MEAD & GRIFFIN, 1998), cerca de 30% dos que se recuperam
podem apresentar lesões permanentes como insuficiência renal crônica, hipertensão e
deficiência neurológica (TARR, 1995).
A púrpura trombocitopênica trombótica é muito semelhante à SHU em suas
características clínico-patológicas. Porém, sinais neurológicos resultantes de coágulos
14
sanguíneos no cérebro e febre são mais evidentes na PTT, sendo mais comum em
adultos que em crianças (KARMALI, 1989). Alguns indivíduos infectados com STEC
podem permanecer assintomáticos, apesar da presença, em grande quantidade, tanto
de microrganismos quanto de toxina nas fezes (BRIAN et al.,1992).
A infectividade da STEC é marcada pela característica de que apenas algumas
células são necessárias para causar doença em seres humanos (GRIFFIN & TAUXE,
1991). A dose infectante é de apenas 10 bactérias, que não precisam multiplicar-se no
alimento, sendo a contaminação original já suficiente para causar doença
(WAHLSTRÖM, 2001). O regulamento do Serviço de Inspeção de Segurança Alimentar
dos EUA declara que a presença de uma unidade formadora de colônia de E. coli
O157:H7 em 25g constitui uma carne bovina de risco à saúde pública (JOHNSON et
al.,1998).
Mesmo com várias pesquisas sendo desenvolvidas, não existe tratamento efetivo
disponível para infecções causadas por STEC. O uso de antibióticos em pacientes com
STEC não é indicado, pois aumenta o risco de desenvolvimento de SHU. A
administração de antibiótico pode estimular a produção de toxina Shiga e a torna mais
disponível à absorção agravando o quadro clínico (ZHANG et al.,2000; TARR et
al.,2005).
2.5 Formas de Transmissão de STEC
O consumo de alimentos contaminados direta ou indiretamente por fezes bovinas
é a principal via de transmissão da STEC. Nos EUA, desde 1982, mais de 100 surtos
foram notificados, em 52% destes a via de transmissão foi alimento de origem animal,
16% foi a transmissão pessoa a pessoa, 14% por meio de alimentos de origem vegetal
e frutas e 12% pela água (WHO, 1998).
A maioria dos surtos ocasionados por STEC está associado ao consumo de
alimentos de origem bovina crus ou mal cozidos (MENG et al.,1998). No entanto outros
alimentos como derivados de leite cru ou inadequadamente pasteurizado, frutas,
15
vegetais, produtos secos ou fermentados, estão relacionados a doenças causadas por
STEC. A veiculação também foi relatada por alface, brotos de rabanete, alfafa e feijão,
salada com molho de maionese, salada de ervilha, molho de frutos do mar, suco de
maçã não pasteurizado, batata, rosbife, salame, carne seca e atum cru fatiado (PATON
& PATON, 1998; FUKUSHIMA et al., 1999; SAFARIKOVA & SAFARIK, 2001; HUSSEIN
& SAKUMA, 2005).
A contaminação de carcaças bovinas no processo de abate com fezes de
animais portadores associado ao consumo de produtos e subprodutos cárneos, sem
apropriado processamento térmico, permite a manutenção do microrganismo no interior
da carne (HART et al.,1997).
No Reino Unido foi confirmado pela primeira vez o leite não pasteurizado como
fonte de E.coli O157 (CHAPMAN et al.,1993). Posteriormente muitos relatos indicaram
a associação entre consumo de leite não pasteurizado e a colite hemorrágica ou a SHU
(KIRK et al.,1997). A habilidade das STEC em invadir células epiteliais da glândula
mamária dos bovinos, pode ser um mecanismo importante na sua patogênese. Esta
situação nos apresenta uma rota em que o leite cru pode potencialmente ser
contaminado, servindo de fonte de contaminação para equipamentos e fonte de
infecção para trabalhadores (MATTHEWS et al.,1997). Mesmo o leite tratado pode ser
contaminado, se a pasteurização for inadequada ou ocorrer contaminação pós-
pasteurização. Surtos e casos esporádicos foram relatados após o consumo de queijo
(CDC, 2000) e iogurte (MORGAN et al,1993) contaminados com STEC. Além disso,
animais que saem do período de produção de leite são abatidos para o aproveitamento
de sua carne e, esta situação também representa importante risco à saúde (FAITH et
al.,1996).
Segundo a Food and Drug Administration (FDA), dos EUA, órgão que
regulamenta os padrões sanitários de alimentos e a utilização de medicamentos no
país, os alimentos com pH inferior a 4,6 são considerados de menor risco na
transmissão de patógenos de origem alimentar. Contudo, surtos recentes envolvendo
STEC têm revelado que esse organismo pode manter-se viável em alimentos com baixo
pH, como suco de maçã (pH entre 3,7 a 3,9) (RIBEIRO et al.,1999).
16
2.6 Métodos Diagnósticos para Detecção de STEC
O principal impasse na identificação e caracterização da STEC é a
predominância da Escherichia coli comensal na microbiota fecal da amostra a ser
analisada. Os pontos importantes a serem estabelecidos são: detectar a STEC,
presente em menor quantidade na amostra, e isolar, identificar e caracterizar o isolado.
Além disso, a análise deve ser rápida e eficiente para auxiliar a identificação do
reservatório, do surto e para iniciar rapidamente o tratamento de suporte ao paciente
(BETTELHEIM & BEUTIN, 2003).
Vários métodos para detecção de STEC vem sendo desenvolvidos. Os métodos
microbiológicos tradicionais, além de demorados, são inadequados para a detecção de
pequeno número de microrganismo-alvo em presença da microbiota interferente
abundante (VIEGAS, 1996). Assim, a detecção de STEC deve ser baseada na pesquisa
das toxinas Shiga ou dos genes que as codificam (WHO, 1998).
- Ensaio de Citotoxicidade em Cultura Celular
O ensaio de citotoxicidade em cultura celular deve ser realizado com células
Vero, que são mais sensíveis às toxinas Shiga. Esse método é utilizado como triagem e
pode ser aplicado a filtrados de fezes, extratos de cultivos microbianos e colônias
isoladas. O ensaio de citotoxicidade é muito sensível, mas não é específico como os
métodos moleculares. Assim a positividade desta metodologia deve ser confirmada por
um método mais específico como, por exemplo, a neutralização com anticorpos
monoclonais ou policlonais específicos (WHO, 1998). Este ensaio é bastante sensível,
porém demorado e trabalhoso e necessita de cultivo celular que o torna pouco prático
para os laboratórios de rotina (BETTELHEIM & BEUTIN, 2003).
17
- Ensaios Imunológicos
Vários métodos imunológicos como ensaios imunoenzimáticos para detecção de
STEC foram desenvolvidos. Diferente da cultura celular, muitos ensaios imunológicos
estão disponíveis comercialmente em “kits” prontos para uso, o que é uma vantagem
para a rotina laboratorial, mas apresentam custo elevado (BETTELHEIM & BEUTIN,
2003).
O sistema de separação imunomagnética é um tipo de ensaio imunológico e
baseia-se em duas ações principais: a captura da célula alvo por ligação imunológica
utilizando imunoglobulinas específicas para detecção do sorotipo, ligadas a
microesferas magnéticas e a posterior precipitação e separação por ação de forças
magnéticas. Essas duas etapas levam à separação específica de células bacterianas
permitindo a posterior concentração e purificação do microrganismo-alvo (LIU & LI,
2002). Apesar da grande eficiência este método está disponível para poucos
sorogrupos de Escherichia coli (O157, O111 e O26) (DE BOER & HEUVELINK, 2002).
- Ágar MacConkey Sorbitol (SMAC)
O Ágar MacConkey Sorbitol (SMAC) é o meio comumente utilizado para
detecção de STEC do sorotipo O157:H7 (CHAPAMN et al.,1991; CUBBON, 1996). O
SMAC diferencia do Ágar MacConkey tradicional devido a substituição da lactose pelo
sorbitol. O sorotipo O157:H7 não fermenta o sorbitol e este é identificado por meio de
colônias transparentes no SMAC após 24h de incubação, enquanto a maioria das
outras E. coli fermenta o sorbitol (DUFFY et al.,2001).
A inclusão do carboidrato ramnose e do antibiótico cefixime no SMAC,
denominado CR-SMAC, auxilia a inibição de outros organismos que também não
fermentam o sorbitol. Além disso, o cefixime inibe Proteus spp (CHAPMAN et al.,1991).
Outra modificação realizada no SMAC inclui além do cefixime o telurito de potássio,
criando o meio CT-SMAC (FUKUSHIMA & GOMYODA,1999). Este inibe a multiplicação
18
de outras Escherichia coli, permitindo a multiplicação apenas do sorotipo O157:H7
(ZADIK et al.,1993).
- Ensaio Sorológico
Diferentes antígenos podem ser encontrados na superfície bacteriana. Os três
antígenos fundamentais para os ensaios sorológicos são O, K e H (ORSKOV &
ORSKOV, 1984; MENG et al.,2001). Os antígenos somáticos “O”, termoestáveis, são
relacionados com polissacarídeos da membrana externa; antígenos flagelares “H”,
termolábeis, são relacionados com proteínas dos flagelos e os antígenos capsulares
“K”, são relacionados com polissacarídeos capsulares (ACHA & SZYFRES, 2001;
MENG et al.,2001).
Embora mais de 400 sorotipos de E. coli produzam a toxina Shiga,
aproximadamente 200 foram descritos como causa de infecções enterohemorrágicas,
no ser humano. O sorotipo O157:H7 é o predominante entre as STEC nos Estados
Unidos e o mais frequentemente associado a surtos de origem alimentar nesse país
(VOLD et al.,1998). A habilidade para distinguir estes isolados sorologicamente é
importante para esclarecer quais tipos de E. coli podem causar diarréia ou outras
doenças.
Embora a tipagem sorológica seja amplamente utilizada e existam associações
entre sorotipos e virulência, esta técnica isoladamente não é adequada para
caracterizar estirpes de E. coli como patogênicas (FORBES et al.,2002). Uma vez que
as amostras diarreogênicas apresentam, em geral, as mesmas características
bioquímicas do restante da espécie, seu isolamento e identificação baseiam-se,
sobretudo na presença de fatores de virulência associados a cada categoria,
detectáveis principalmente através de métodos moleculares (NATARO & KAPER,
1998).
19
- Técnicas Moleculares para diagnósticos de STEC
Métodos baseados na análise de DNA como a Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR) são utilizados com sucesso no diagnóstico da STEC. Regiões específicas dos
genes stx são selecionadas e oligonucleotídeos complementares são utilizados para
amplificar fragmentos dos genes (BETTELHEIM & BEUTIN, 2003). Uma variedade de
sistemas são utilizados por diferentes laboratórios, sendo que 14 foram comparados
(BASTIAN et al.,1998) e a medida que aumenta o número de variantes das toxinas, a
variedade e o número de sistemas de PCR também aumentam (BETTELHEIM &
BEUTIN, 2003).
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é um dos principais métodos
moleculares utilizados para detecção de STEC (PARK et al.,1999). Esta técnica
apresenta como vantagens a especificidade e sensibilidade bem como a rapidez na sua
execução (PATON & PATON, 1998). Por outro lado apresenta como desvantagem a
presença de inibidores da reação presentes na própria amostra e a facilidade de
contaminação durante o processo (BRIAN et al.,1992). Além disso, a seqüência a ser
escolhida para o iniciador (“primer”) deve conter uma região bastante conservada para
que não ocorra a diminuição na eficiência do anelamento (PATON & PATON, 1998).
Variações da PCR como PCR multiplex, PCR em Tempo Real também são utilizados. A
maioria destas técnicas é usada para determinar a presença de STEC na amostra sem
a necessidade do isolamento do microrganismo (BETTELHEIM & BEUTIN, 2003).
Os métodos para a tipagem de gene stx baseados em análise de ácidos
nucléicos incluem, principalmente, os ensaios com endonucleases de restrição. As
análises estão fundamentadas no uso de enzimas produzidas por bactérias e
denominadas endonucleases de restrição. Estas enzimas cortam o DNA em seqüências
específicas compostas por quatro a seis pares de base. Após o tratamento com estas
enzimas, ocorre a formação de fragmentos, cujos tamanhos são determinados via
eletroforese. A separação dos fragmentos é obtida por eletroforese em gel de agarose,
e a visualização é realizada por coloração do gel com brometo de etídio. A diferença
(polimorfismo) no tamanho dos fragmentos de DNA gerados pelo tratamento com
20
endonucleases de restrição é denominada “polimorfismo no comprimento de
fragmentos de restrição”ou RFLP. Esta técnica pode ser aplicada em estudos
epidemiológicos e permite a identificação de subtipos de Stx (KONEMANN et al.,2001).
Existem ainda técnicas que, além de identificar os subtipos já descritos, propiciam a
detecção de novas variantes como é o caso do sequenciamento.
O sequenciamento é um processo molecular que determina a seqüência real de
nucleotídeos num fragmento de DNA. Existem vários métodos disponíveis, e cada um
apresenta vantagens e desvantagens. Um dos mais utilizado é o chamado “método
didesoxi” conhecido também como de “terminadores de cadeia” descritos por Sanger. O
sequenciamento permite comparações entre seqüências e permite a detecção de novas
variantes Stx1 e Stx2 (MICKLOS et al.,2005).
21
3. OBJETIVO
Objetivo Geral
Caracterizar fenotipica e genotipicamente isolados de Escherichia coli produtora
de toxina Shiga (STEC) oriundos de fezes de bovinos de corte do Estado do Paraná.
Objetivos Específicos
- Detectar os principais fatores de virulência (genes stx, eae, hlyA e saa),
- Determinar os sorotipos de STEC isolados,
- Determinar o perfil de resistência a diferentes agentes antimicrobianos,
- Determinar a viabilidade da STEC em 10 dias no queijo Minas Frescal,
- Determinar a seqüência genética parcial da toxina Stx2 produzida pela STEC.
22
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Amostras
Isolados de STEC previamente obtidos por PIGATTO (2004) foram selecionados
a partir de 563 colônias de Escherichia coli isoladas de culturas de 193 amostras de
fezes bovinas coletadas em matadouro frigorífico situado na região metropolitana de
Curitiba, Paraná.
Nesse estudo anterior, as amostras fecais foram colhidas com swab retal no
período de dezembro de 2002 a novembro de 2003. O transporte das amostras foi
realizado em meio Cary-Blair, a cultura em Ágar MacConkey-Sorbitol (SMAC) foi
incubada a 37ºC por 24 horas. Foram selecionadas em média 10 colônias sorbitol
positivo e negativo que foram inoculadas nos meios EPM (Escola Paulista de Medicina)
e MILI (motilidade, indol e lisina). Colônias com características de Escherichia coli foram
inoculadas em Ágar TSA (OXOID) e estocadas a temperatura ambiente.
As colônias foram avaliadas quanto a capacidade de produzir toxina Shiga,
através do ensaio de citotoxicidade em células Vero segundo KARMALI et al.,(1985) e
quanto à presença dos genes stx através da reação em cadeia da polimerase (PCR)
segundo LIN et al.,(1993).
4.2. Determinação dos Sorotipos de STEC
A caracterização antigênica das STEC foi realizada no Instituto Adolfo Lutz (São
Paulo) utilizando os antisoros somáticos (O1-O181) e flagelares (H1-H56) preparados
com cepas de referência obtidas junto ao “International Reference Centre for
Escherichia / Klebsiella”, Copenhagen, Dinamarca. A sorotipagem foi realizada de
acordo com EWING, (1986).
23
4.3. Detecção da Expressão da Toxina Shiga Através de Imunoensaio
A expressão de Stx nas STEC foi avaliada utilizando o kit comercial VTEC-RPLA
(Denka-Seiken, Japan). O VTEC-Screen detecta Stx1 e Stx2 em culturas mistas e
isolados de Escherichia coli por aglutinação passiva reversa. Este ensaio foi realizado
segundo instruções do fabricante. Foram realizadas diluições até 1:16 e títulos
inferiores a 1:4 foram considerados negativos. A cepa STEC O157:H7 EDL 933 foi
utilizada como controle positivo e Escherichia coli ATCC 25922 como controle negativo
para a produção de toxina Shiga.
4.4. Caracterização Genotípica das STEC
4.4.1. PCR – Multiplex
O DNA foi extraído pelo método da fervura segundo OLSVICK & STROCKBINE
(1993). A caracterização genotípica das STEC foi realizada quanto à presença ou
ausência dos genes stx
1
, stx
2
, ehxA, eae e saa de acordo com PATON & PATON
(2002). A seqüência dos iniciadores está descrita na TABELA 2.
24
TABELA 1 – Iniciadores utilizados na PCR multiplex para amplificação dos genes stx
1
,
stx
2
, eae, ehxA e saa..
Iniciador Seqüência (5’-3’) Tamanho do
Amplicon
saa F
CCTCACATCTTCTGCAAATACC
119pb
saa R
GTTGTCCTGCAGATTTTACCATCCAATGGACATG
stx
1
F
ATAAATCGCCATTCGTTGACTAC 180pb
stx
1
R
AGAACGCCCACTGAGATCATC
stx
2
F
GGCACTGTCTGAAACTGCTCC 255pb
stx
2
R
TCGCCAGTTATCTGACATTCTG
eaeA F
GACCCGGCACAAGCATAAGC 384pb
eaeA R
CCACCTGCAGCAACAAGAGG
ehxA F
GCATCATCAAGCGTACGTTCC 534pb
ehxA R
AATGAGCCAAGCTGGTTAAGCT
* Fonte PATON & PATON (1998, 2002).
As reações foram realizadas em volume final de 25µL, contendo 3µL de DNA;
0,25µL de Taq DNA Polimerase (Invitrogen 5U/µL); 2,5 µL de tampão 10X para Taq
(Invitrogen); 0,75µL de MgCl
2
50mM; 2µL da mistura dos iniciadores (300nM cada);
1,0µL de dNTP (Eppendorf) 5mM. O programa utilizado foi o seguinte: 1 ciclo a 94ºC
durante 4 minutos; 35 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 64ºC por 30 segundos e 72ºC
por 1 minuto; seguido de 1 ciclo de 72ºC por 5 minutos. A amplificação das amostras foi
realizada em termociclador Mastercycler Gradient (Eppendorf). Foram utilizadas STEC
O157:H7 EDL933 como controle positivo e Escherichia coli ATCC 25922 como controle
negativo.
25
4.4.2. Detecção dos Produtos de PCR
Para a detecção dos produtos de PCR foi realizada eletroforese em gel de
agarose (BIO RAD) a 2% em TBE (Tris 89mM, ácido bórico 89mM, EDTA 2mM)
(AUSUBEL et al.,1999). As corridas eletroforéticas foram realizadas em sistema de
eletroforese horizontal, a 36V durante 3 horas. Os géis de agarose foram corados em
solução de brometo de etídio 0,5µg/mL, visualizados em transiluminador ultravioleta
(Ultralum) e as imagens registradas com câmera digital Sony W7.
4.4.3. Ensaios de PCR-RFLP
A técnica de PCR-RFLP (Reação em Cadeia da Polimerase - Polimorfismo no
Comprimento de Fragmentos de Restrição) foi utilizada para identificar as variantes
genéticas de stx
2
. No ensaio de PCR-RFLP fragmentos dos genes stx
2
foram tratados
com endonucleases de restrição gerando produtos que permitem caracterizar alelos de
stx
2
, como descritos em DE BAETS et al.,(2004).
Para a subtipagem das variantes, foi realizado inicialmente um ensaio de PCR
para amplificação dos genes do tipo stx
2
. Foram utilizados na reação 25µL da mistura
contendo 10µL de DNA, uma unidade de Taq DNA platinum (Invitrogen), 2,5µL de
tampão de Taq 10X, 0,75µL de MgCl
2
50mM, 1,0µL de dNTP 5mM e 1,0µL dos
iniciadores oli320b (5’GGTCACTGGTTCGAATCCAGTAC3’) e oli321
(5’GGGATCCTGAATTGTGACACAGATTACACTTGTTAC3’) a 25pmol/µL. A reação de
amplificação foi realizada em termociclador Mastercycler Gradient – Eppendorf,
utilizando o seguinte programa: 1 ciclo a 94ºC durante 50 segundos; 35 ciclos a 94ºC
durante 1 minuto, 55ºC por 1 minuto, 72ºC por 1 minuto; seguidos de 1 ciclo de 72ºC
por 5 minutos. A presença dos produtos de amplificação foi verificada através de
eletroforese em gel de agarose a 1% (DE BAETS et al.,2004).
A digestão do DNA com as enzimas de restrição foi realizada em volume final de
20µL, utilizando 10µL do produto de PCR e uma unidade das enzimas HincII, AccI, PvuI
e HaeIII (Fermentas) em tampão fornecido pelo fabricante. A reação foi incubada por 12
26
horas a 37ºC. Os fragmentos gerados foram separados por eletroforese em gel de
agarose a 2,5%, a 30V durante 4 horas. A interpretação do padrão de bandas gerada
foi feita como indicado nas TABELAS 3 e 4.
TABELA 2 –
Perfil de restrição de variantes stx
2
obtido com as enzimas HincII e
AccI, segundo DE BAETS et al.,(2004).
TABELA 3 –
Perfil de restrição de variantes stx
2
obtido com as enzimas PvuI e
HaeIII, segundo DE BAETS et al.,(2004).
27
4.5. Sequenciamento de DNA
4.5.1. Amplificação dos Genes do Tipo stx
2
por PCR
A amplificação dos genes tipo stx
2
foi realizada utilizando os iniciadores
propostos por DE BAETS et al.,(2004) (item 4.4.3) gerando fragmentos de
aproximadamente 1400pb contendo todo o operon stx
2
.
4.5.2. Purificação do Produto de PCR
Antes de proceder a reação de sequenciamento, os produtos de PCR foram
tratados com as enzimas EXO I (Exonuclease I marca USB -10U/µL) e SAP (Shrimp
Alkaline Phosphatase marca USB - 1U/µL) para eliminar restos de iniciadores e dNTP.
Dez microlitros do produto de PCR foram adicionados de 1µL de EXO e 0,5µL de SAP e
incubados durante uma hora a 37ºC e 20 minutos a 80ºC.
4.5.3. Reação de Sequenciamento
O sequenciamento de DNA foi realizado pelo método de terminação de cadeia
utilizando dideoxirribonucleotídeos fluorescentes (SANGER et al.,1977 modificado). A
reação foi realizada em volume final de 10µL contendo 5pmol do iniciador específico,
6µL do produto de PCR purificado e 3µL do reagente de sequenciamento DYEnamic ET
Sequence Premix Terminator (DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit,
Amershan Biosciences). O programa utilizado para a reação de sequenciamento foi: 30
ciclos de 96ºC por 30 segundos, 55ºC com as seqüências oli320b
(5’GGTCACTGGTTCGAATCCAGTAC3’) ou oli321
(5’GGGATCCTGAATTGTGACACAGATTACACTTGTTAC3’) (DE BAETS et al.,2004).
Os iniciadores stx
2
F, stx
2
R (PATON & PATON,1998b) e linF, linR (LIN et al.,1993)
28
também foram utilizados para o sequenciamento. O produto da reação de
sequenciamento foi tratado com isopropanol (60µL) e água Milli Q (30µL),
homogeneizado e então mantido a temperatura ambiente durante 30 minutos e
centrifugado a 14.000rpm durante 25minutos. O sobrenadante foi cuidadosamente
removido e o precipitado foi lavado por duas vezes com 250µL de etanol 70%
(preparado na hora), seco e aplicado no Seqüenciador Automático de DNA modelo ABI
Prism 377 DNA Sequencer da Applied Biosystems. As seqüências foram analisadas
com os programas Bio Edit Sequence Alignment Editor (HALL,1999), BLASTN
(ALTSHUL et al.,1997) e CLUSTAL X (JEANMOUGIN et al., 1998).
4.6. Perfil de Susceptibilidade a Agentes Antimicrobianos
O perfil de susceptibilidade a antimicrobianos foi determinado utilizando a técnica
de disco difusão segundo as recomendações do NCCLS (National Committee for
Clinical Laboratories Standars 2000). As cepas de STEC foram cultivadas em meio TSA
durante 18 horas em estufa bacteriológica a 37ºC. Três a cinco colônias foram
suspensas em solução salina estéril a 0,85% até atingir uma turvação equivalente ao
tubo 0,5 na escala de Mac Farland (aproximadamente 10
8
microrganismos/mL). A
suspensão foi inoculada em placas de ágar Muller-Hinton, com o auxílio de swab estéril,
por toda a superfície do meio, para a obtenção de crescimento bacteriano confluente.
Discos impregnados com os antimicrobianos selecionados (marca CECON) foram
depositados nas placas com o auxílio de uma pinça estéril. Os seguintes
antimicrobianos foram testados: Ácido Nalidíxico (NAL) 30 µg, Ampicilina (AMP) 10µg,
Cefalotina (CFL) 30 µg, Ciprofloxacina (CIP) 5µg, Cloranfenicol (CLO) 30µg,
Estreptomicina (EST) 10µg, Gentamicina (GEN) 10µg, Imipenem (IPM) 10 µg,
Nitrofurantoína (NIT) 300 µg, Sulfazotrim (SUT) 25 µg, Tetraciclina (TET) 30µg,. As
placas foram incubadas a 37ºC por 16 a 20 horas. Após o período de incubação, o
diâmetro dos halos de inibição foi medido e os resultados foram interpretados de acordo
com as normas do NCCLS.
29
4.7. Viabilidade de isolados de STEC em queijo minas frescal.
4.7.1. Determinação de coliformes totais e coliformes termotolerantes no
Leite Pasteurizado.
As análises para determinação de coliformes totais e termotolerantes no leite
pasteurizado utilizado como matéria prima foram realizadas seguindo a metodologia do
Compêndio de Métodos para Exames Microbiológicos de Alimentos da Associação
Americana de Saúde Pública (VANDERZANT & SPLITTSTOESSER; 1992).
4.7.2. Isolados de STEC utilizados para inoculação no leite.
Dezesseis cepas de STEC não-O157, previamente isoladas de fezes de
bovinos adultos aparentemente saudáveis (PIGATTO, 2004), carreando genes do tipo
stx
2
, foram utilizadas, separadamente, para contaminar alíquotas de leite usadas na
produção de queijo Minas Frescal. As cepas de STEC foram semeadas em ágar
MacConkey e incubadas a 37ºC por 24 horas e colônias isoladas foram suspensas em
solução salina fisiológica estéril até atingir turvação equivalente ao tubo 0,5 da escala
de MacFarland o que corresponde a aproximadamente 10
8
UFC/mL. As suspensões
preparadas com cada uma das cepas isoladamente foram utilizadas para contaminar
alíquotas de leite distintas que foram então empregadas na fabricação de queijos. Cada
amostra de leite foi contaminada com um isolado diferente de STEC.
4.7.3. Processo de Produção do Queijo Tipo Minas Frescal
Para o processamento do queijo tipo Minas Frescal foram utilizados os seguintes
produtos: leite tipo “A” pasteurizado pelo processo HTST (“High Temperature, Short
Time”, 75°C por 20 segundos), proveniente da Granja Leiteira da FCAV - Unesp -
30
Campus de Jaboticabal, coalho HA-LA BIOTEC (Christian-Hansen) 1:20000, obtido por
fermentação, contendo 100% quimosina tipo A, CaCl
2
a 50% (Base Química) e formas
plásticas estéreis.
As alíquotas do leite foram aquecidas a 35°C e adicionadas 10mL de uma das
suspensões de STEC, 25mL de solução de CaCl
2
a 50% e do coalho comercial, na
proporção indicada pelo fabricante. A mistura foi homogeneizada e então mantida em
repouso por aproximadamente 40 minutos até a formação do coágulo. Após este
período foi retirado o soro presente e a salga realizada com NaCl diluído a 2%. Os
queijos foram acondicionados em embalagens plásticas estéreis e armazenados sob
refrigeração a 4°C por um período de 10 dias (BRASIL, 1997). Os queijos foram
preparados em duplicata a partir de novas alíquotas de leite e suspensões de STEC.
4.7.4. Detecção de STEC a partir do queijo elaborado.
Para verificar a viabilidade das cepas de STEC, alíquotas de 25g de cada queijo
foram colhidas após o 1º, 2º, 4º, 6º e 10º dias da fabricação e cultivadas em 225mL de
água peptonada durante 24 horas a 37ºC. Após este período 0,1mL de cada cultura foi
semeado em ágar MacConkey e incubado por 24 horas a 37ºC. O crescimento foi
utilizado para a extração do DNA segundo OLSVICK & STROCKBINE (1993). A
detecção de STEC foi realizada utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR)
tendo como alvo o gene stx
2
. A reação foi realizada segundo CHINA et al.,(1996),
utilizando os iniciadores stx
2
F 3’TGGGTTTTTCTTCGGTATC5’ e stx
2
R
5’GACATTCTGGTTGACTCTCTT3’ que amplificam um fragmento de 807pb dos genes
stx
2
. Como controles positivo e negativo foram utilizados a STEC O157:H7 EDL 933 e
Escherichia coli ATCC 25922, respectivamente.
31
5. RESULTADOS
Do total de 190 amostras de fezes do reservatório bovino analisadas, 70 (37%)
foram positivas para STEC. A maioria das STEC isoladas eram sorbitol positivo. As
amostras de três animais apresentaram mais de uma estirpe de STEC. Estas estirpes
pertencem a diferentes sorotipos e carreiam marcadores de virulência distintos,
produzindo assim um total de 74 STEC.
5.1. Sorologia
As STEC foram classificadas em 34 diferentes sorotipos de acordo com a
reação sorológica (TABELA 5). Do total de amostras testadas nenhuma apresentou
positividade para o sorogrupo O157. Os sorotipos mais freqüentes foram ONT:H7
(10%), O22:H8, O22:H16 (7%) e ONT:H21 (7%). Em cinco amostras não foi possível à
identificação sorológica com os soros disponíveis.
Importante ressaltar, que os sorotipos O10:H42, O17:H41, O41:H2, O98:H41,
O113:H12, O117:H8, O124:H11, O159:H21, O175:H21, O179:H8, O181:H4 e ONT:H8
até então, não tinham sido descritos na literatura em associação com STEC. Por sua
vez, os sorotipos O22:H8, O113:H21, O174:H21, ONT:H- e OR:H10 encontrados neste
trabalho já foram associados a casos graves da síndrome hemolítica urêmica.
32
TABELA 4 –
Sorotipos de STEC identificados e suas respectivas freqüências em
fezes de bovinos provenientes do Estado do Paraná.
33
*Os sorotipos em negrito ainda não foram descritos na literatura associados à STEC.
** Os sorotipos em negrito e sublinhados estão associados a casos graves de síndrome
hemolítica urêmica (http://www.microbionet.com.au/vtectable.htm). NT: não tipável e R:
rugosa.
5.2. Expressão da Toxina Shiga
Sessenta e cinco (89%) cepas de STEC reagiram positivamente no ensaio
VTEC-RPLA (TABELA 6). Três cepas foram identificadas como produtora de toxina
Stx1 pelo ensaio VTEC-RPLA e foram detectadas na PCR multiplex contendo o gene
stx
2
. Além disso, nove STEC que apresentaram resultado negativo no ensaio VTEC-
RPLA foram positivas na PCR multiplex para stx
1
e stx
1
, stx
2
ou stx
1
.
TABELA 5 –
Total de amostras com as características do ensaio VTEC-RPLA e da
PCR Multiplex provenientes de fezes de bovinos oriundos do Estado
do Paraná.
NR: não reagente
34
5.3. Caracterização Genotípica das STEC
Os marcadores de virulência foram encontrados em 11 diferentes combinações,
o mais freqüente foi stx
2
(27%), stx
1
stx
2
e stx
1
stx
2
ehxA saa (16% cada). O gene eae foi
encontrado em somente uma cepa e em associação com stx
1
e ehxA.
O gene saa foi encontrado em apenas 28 cepas (38%). O gene ehxA foi
encontrado em 32 cepas (44%) e 22 destas apresentaram positividade para o gene saa,
indicando uma significativa associação (P<0,05) entre estes genes de origem plasmidial
(TABELA 7 e FIGURA 1).
TABELA 6 –
Expressão da toxina Shiga e presença de genes de virulência nas
STEC estudadas, isoladas de fezes de bovinos de corte provenientes
do Estado do Paraná.
Isolados VTEC-RPLA (Título) PCR-Multiplex
CP-10 Stx2 (1:16)
stx
2
saa
CP-11 Stx2 (1:8)
stx
2
CP-13 Stx2 (1:16)
stx
2
CP-14 Stx1 (1:16)
stx
1
ehxA saa
CP-16 Stx2 (1:16)
stx
2
saa
CP-17 Stx2 (1:16)
stx
2
CP-18 NR
stx
1
stx
2
CP-21 Stx2 (1:8)
stx
2
CP-22 Stx1 Stx2 (1:16)
stx
1
stx
2
ehxA saa
CP-24 Stx2 (1:16)
stx
2
ehxA
CP-26 Stx1 Stx2 (1:16)
stx
1
stx
2
ehxA saa
CP-27 NR
stx
1
stx
2
CP-28 Stx1 Stx2 (1:16/1:8)
stx
1
stx
2
ehxA saa
CP-29 Stx2 (1:16)
stx
2
CP-31 Stx2 (1:16)
stx
2
CP-32 Stx2 (1:8)
stx
2
CP-33 Stx2 (1:16)
stx
2
ehxA saa
35
CP-33a Stx1 Stx2 (1:16)
stx
1
stx
2
ehxA
CP-37 Stx1 Stx2 (1:16/1:4)
stx
1
stx
2
ehxA
CP-39 Stx1 (1:16)
stx
1
stx
2
CP-41 Stx1 (1:8)
stx
1
ehxA saa
CP-42 Stx2 (1:16)
stx
2
ehxA saa
CP-43 Stx2 (1:16)
stx
2
ehxA saa
CP-44 Stx1 Stx2 (1:16)
stx
1
stx
2
CP-44a Stx1 Stx2 (1:16/1:8)
stx
1
stx
2
ehxA
CP-46 Stx2 (1:16)
stx
2
ehxA saa
CP-47 Stx2 (1:8)
stx
2
saa
CP-50 Stx1 (1:16)
stx
1
stx
2
CP-50a Stx1 Stx2 (1:16)
stx
1
stx
2
CP-52 Stx1 Stx2 (1:16)
stx
1
stx
2
ehxA saa
CP-53 Stx2 (1:16)
stx
2
saa
CP-54 Stx2 (1:16)
stx
2
CP-61 Stx1 Stx2 (1:16)
stx
1
stx
2
ehxA
CP-66 Stx2 (1:8)
stx
2
CP-67 Stx1 Stx2 (1:16)
stx
1
stx
2
ehxA saa
CP-68 Stx1 Stx2 (1:16)
stx
1
stx
2
ehxA saa
CP-69 Stx1 Stx2 (1:16)
stx
1
stx
2
CP-70 Stx2 (1:16)
stx
2
CP-72 Stx1 Stx2 (1:16)
stx
1
stx
2
ehxA
CP-74 Stx1 Stx2 (1:16/1:8)
stx
1
stx
2
CP-75 Stx1 Stx2 (1:16/1:8)
stx
1
stx
2
ehxA saa
CP-77 Stx1 Stx2 (1:16)
stx
1
stx
2
saa
CP-78 Stx1 Stx2 (1:16/1:8)
stx
1
stx
2
ehxA saa
CP-86 NR
stx
1
stx
2
saa
CP-87 Stx1 Stx2 (1:16)
stx
1
stx
2
ehxA
CP-88 Stx1 Stx2 (1:16)
stx
1
stx
2
ehxA saa
CP-90 Stx1 (1:16)
stx
1
eaeA
ehxA
36
CP-103 Stx1 Stx2 (1:16)
stx
1
stx
2
CP-104 Stx1 (1:16)
stx
1
ehxA saa
CP-105 Stx1 Stx2 (1:16)
stx
1
stx
2
ehxA
CP-112 Stx1 Stx2 (1:16)
stx
1
stx
2
ehxA saa
CP-113 Stx1 Stx2 (1:16)
stx
1
stx
2
ehxA saa
CP-114 Stx2 (1:16)
stx
2
ehxA saa
CP-116 Stx2 (1:4)
stx
2
CP-119 Stx2 (1:16)
stx
2
CP-122 NR
stx
2
ehxA saa
CP-123 NR
stx
1
stx
2
CP-124 Stx2 (1:16)
stx
2
CP-137 Stx1 Stx2 (1:16)
stx
1
stx
2
saa
CP-151 Stx2 (1:16)
stx
2
CP-152 Stx2 (1:16)
stx
2
CP-158 NR
stx
1
CP-162 Stx1 Stx2 (1:16)
stx
1
stx
2
ehxA
CP-163 NR
stx
1
CP-168 Stx2 (1:8)
stx
2
CP-169 Stx1 Stx2 (1:16)
stx
1
stx
2
CP-170 Stx1 (1:16)
stx
1
stx
2
CP-172 Stx2 (1:16)
stx
2
CP-173 Stx1 (1:4)
stx
1
CP-174 NR
stx
2
CP-175 Stx2 (1:16)
stx
2
CP-176 NR
stx
1
ehxA saa
CP-178 Stx2 (1:16)
stx
2
CP-179 Stx1 Stx2 (1:16)
stx
1
stx
2
ehxA saa
NR : não reagente
37
3
4
20
4
1 1
11
1
11
7
8
3
0
5
10
15
20
25
stx1
stx2
s
aa
s
t
x
2
stx1
eh
x
A
s
a
a
s
tx1
stx2
s
t
x
1
eae
A e
hx
A
s
t
x
1 s
t
x
2 e
h
x
A
s
a
a
s
t
x
2
e
hx
A
s
t
x
1
s
t
x
2
s
t
x
2
eh
x
A
saa
s
t
x
1
stx2
ehx
A
s
t
x
1 s
t
x
2
s
aa
Perfil Genotípico
Número de Amostras
FIGURA 2 – Perfis genotípicos identificados nas Cepas de STEC isoladas de fezes de
bovinos provenientes do Estado do Paraná.
5.4. Subtipagem do Gene stx
2
A pesquisa de variantes de stx
2
foi realizada por PCR-RFLP segundo DE BAETS
et al. (2004). A combinação das enzimas PVUII, HaeIII, HincII e AccI utilizadas nesta
metodologia permitiu descriminar oito padrões de stx
2
.
Do total de 74 STEC isoladas, 66 apresentaram o gene stx
2
. Dezesseis STEC
confirmadas pela PCR multiplex não amplificaram com os iniciadores OLI
recomendados por DE BAETS et al. (2004), o que não permitiu determinar o alelo
presente nestas amostras. Três estirpes testadas provavelmente apresentam mais de
dois genes o que não permitiu sua determinação por meio deste ensaio. Além disso,
oito amostras não apresentaram o padrão estipulado por este sistema. Foram
detectados oito subtipos nas demais cepas: stx
2OX3a/O111
; stx
2
; stx
2c
; stx
2(vha)
; stx
2(vhb)
;
38
stx
2OX3b
; stx
2vnb/vhc
e stx
2O48
. Os genes que apresentaram maior freqüência foram: stx
2
;
stx
2c
. Os resultados obtidos estão indicados na TABELA 8, FIGURAS 2, 3 e 4.
TABELA 7 –
Freqüência de subtipos de stx
2
identificados nas amostras de STEC
isoladas de fezes de bovinos provenientes do Estado do Paraná.
39
FIGURA 3 – Representação em gel de agarose (2%) contendo produtos de PCR para
detecção do gene stx
2
(amplificação de 1400pb) com o iniciador OLI (DE BAETS et al.
2004). Linha 1 - marcador de massa molecular Low Mass (Fermentas). Linhas 2,3,5,6,7
e 8 - amostras CP11, CP13, CP21, CP29, CP32, CP54 contendo gene stx
2
. Linha 4 -
marcador de massa molecular de 2kb (Fermentas).
1 2 3 4 5 6 7 8
1200pb
40
FIGURA 4 – PCR-RFLP do gene stx
2
mostrando perfil compatível com stx
2OX3a/O111
e
stx
2
. Linha 1 - perfil de stx
2OX3a/O111
digerido com a enzima HincII. Linha 2 - perfil de
stx
2OX3a/O111
digerido com AccI. Linha 3 - perfil de stx
2OX3a/O111
digerido com PVU I. Linha
4 - perfil de stx
2OX3a/O111
digerido com HaeIII. Linha 5 - perfil de stx
2
digerido com HincII.
Linha 6 - perfil de stx
2
digerido com AccI. Linha 7 - perfil de stx
2
digerido com PVU I.
Linha 8 - marcador de Massa Molecular 2 Kb (Invitrogem).
2.000 pb
1.650 pb
1.000 pb
850 pb
650 pb
500 pb
400 pb
300 pb
200 pb
100 pb
1 2 3 4 5 6 7 8
41
FIGURA 5 – PCR-RFLP do gene stx
2
mostrando perfil compatível com stx
2
e stx
2vha
.
Linha 1 - marcador de Massa Molecular 1 Kb (Invitrogem). Linha 2 - perfil de stx
2
digerido com a enzima HaeIII. Linha 3 - perfil de stx
2vha
digerido com HincII. Linha 4 -
perfil de stx
2vha
digerido com AccI. Linha 5 - perfil de stx
2vha
digerido com PVU I. Linha 6
- perfil de stx
2vha
digerido com HaeII.
2.000 pb
1.650 pb
1.000 pb
850 pb
650 pb
500 pb
400 pb
300 pb
200 pb
100 pb
1 2 3 4 5 6
42
5.5. Sequenciamento de Cepas de STEC
As seqüências obtidas foram agrupadas utilizando o programa Clustal W, que
realiza o alinhamento das mesmas indicando as regiões que são similares e as regiões
contíguas reunidas. Para todas as estirpes analisadas dois “contigs” (fragmentos de
DNA) foram obtidos, um deles referente à região 5’ do operon e que continha a
seqüência de nucleotídeos do promotor e início do gene stx
2
A, e outro que continha o
final do gene stx
2
A e o gene stx
2
B completo. Não foi possível completar o
sequenciamento dos genes stx
2
A com os iniciadores disponíveis. Por essa razão apenas
os fragmentos que continham o gene stx
2
B completo (que segundo a literatura é o que
apresenta maior variação) e o final do gene stx
2
A foram utilizados para dar
prosseguimento a este estudo. Esses fragmentos (Query) foram submetidos ao
GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) utilizando o programa BLASTN e as seqüências
do banco de dados (Sbjct) que apresentaram maior similaridade com os genes
presentes nas STEC analisadas estão indicadas no ANEXO I.
As seqüências parciais obtidas sugerem a presença dos seguintes genes do tipo
stx
2
das estirpes analisadas:
STEC 1: gene stx
2
;
STEC 2: variante de stx
2
designado pVTEC16;
STEC 6: variante stx
2d
ativável pelo muco intestinal;
STEC 10: variante descrita em STEC sorotipo O48:H21;
STEC 11, variante descrita em STEC sorotipo ONT:H11 e
STEC 12: variante descrita na STEC EBC289.
Importante ressaltar que a seqüência da variante stx
2d
ativável pelo muco
intestinal, até então, não tinha sido relatada no Brasil.
43
5.6. Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos
A maioria das STEC (96%) foi susceptível a todos os antimicrobianos testados.
Três cepas apresentaram resposta intermediária à tetraciclina (TABELA 8 e FIGURA 6).
TABELA 8 –
Antibiograma das STEC isoladas de fezes de bovinos provenientes do
Estado do Paraná.
44
FIGURA 6 –
Teste de sensibilidade da amostra CP11 de STEC a antimicrobianos.
Observar halos de inibição em torno dos discos.
5.7. Viabilidade de cepas STEC em Queijo Minas Frescal
5.7.1. Determinação de coliformes totais e coliformes termotolerantes no
leite pasteurizado.
As análises microbiológicas realizadas no leite pasteurizado utilizado como
matéria prima, antes da inoculação de STEC, revelaram ausência de coliformes
termotolerantes. Os resultados obtidos indicam que o leite pasteurizado utilizado como
matéria prima se enquadrou dentro dos padrões legais, considerando os padrões
microbiológicos estabelecidos pelos órgãos oficiais – Agência Nacional de Vigilância
Sanitária, Resolução RDC n° 12, de 02 de janeiro de 2001 (Brasil, 2001).
45
5.7.2. Detecção de STEC a partir do queijo elaborado.
A viabilidade, em queijo minas, de cepas de STEC não–O157 contendo
diferentes genes de virulência foi analisada. Neste trabalho a viabilidade de STEC não-
O157 em queijo minas foi avaliada até o 10º dia, devido ao prazo de validade do
produto estabelecido pela legislação ser de 10 dias. Os resultados mostraram que as
diferentes cepas de STEC foram detectadas nos queijos após 1, 2, 4, 6 e 10 dias de
armazenamento sob refrigeração.
A sobrevivência das estirpes foi confirmada através do cultivo de alíquotas de
queijo em água peptonada seguido de subcultivo em ágar MacConkey, meio de onde
foram retiradas as colônias para a extração de DNA e a realização de PCR. Foi
observado que todas as 16 diferentes cepas permaneceram viáveis no queijo Minas
mesmo após 10 dias de conservação a 4°C. Isto confirma que cepas não-O157 são
capazes de sobreviver em queijo mantido em condições adequadas de
armazenamento.
46
6. DISCUSSÃO
A importância dos bovinos como fonte direta e indireta de contaminação dos
seres humanos com E. coli STEC é inquestionável. Embora sua presença possa ser
minimizada através da implantação de elevados padrões de higiene, na prática é muito
difícil erradicá-las do ambiente devido à colonização assintomática dos animais, da
capacidade de sobreviver por longos períodos nas fezes bovinas, no pasto e na água
(CAPRIOLI, 2005).
Procedimentos diagnósticos que permitam discriminar estirpes patogênicas de E.
coli devem ser adotados para evitar riscos à saúde da população e para que sejam
adotadas medidas preventivas e terapêuticas (TSCHÄPE e FRUTH, 2001). Neste
trabalho foram avaliadas características genotípicas e fenotípicas de STEC em bovinos
de corte, avaliando seu risco à saúde pública.
A elevada freqüência (37%) de STEC foi semelhante ao encontrado no Rio de
Janeiro (CERQUEIRA et al.,1999), porém mais elevada do que a encontrada no estado
de São Paulo (IRINO et al., 2005). Dois estudos conduzidos no sul do Brasil e
relataram uma alta freqüência de STEC no Rio Grande do Sul (49%) e no Paraná
(59%) (MOREIRA et al.,2003; FARAH et al.,2007).
As STEC, neste trabalho, foram classificadas em 34 sorotipos distintos, os mais
freqüentes foram ONT:H7 (10%), O22:H8, O22:H16 (7%) e ONT:H21 (7%). Os
sorotipos ONT:H7 e O22:H8 foram predominantes em outros estudos realizados no
Paraná, mas não em outros estados (CERQUEIRA et al.,1999 e FARAH et al.,2007).
Estes dados sugerem uma distribuição heterogênea dos sorotipos de STEC nas
diferentes regiões do país. Além disso, segundo informações obtidas da “VTEC table”
(http://www.microbionet.com.au/vtectable.htm), foram encontrados neste trabalho
sorotipos (O10:H42, O17:H41, O41:H2, O98:H41, O113:H12, O117:H8, O124:H11,
O159:H21, O175:H21, O179:H8, O181:H4 e ONT:H8) que até então não tinham sido
descritos em associação com a STEC. Ressaltando a evolução e a adaptação destes
patógenos.
47
Por outro lado, os sorotipos O22:H8, O113:H21, O174:H21, ONT:H- e OR:H10
encontrados neste trabalho já foram associados a casos graves da síndrome hemolítica
urêmica (“VTEC table” - http://www.microbionet.com.au/vtectable.htm). Este dado
concorda com um recente estudo feito em água utilizada para consumo humano na
Índia onde foram isoladas diversas estirpes de E. coli patogênicas, sendo o grupo da
STEC o mais frequentemente encontrado. Os sorogrupos de STEC obtidos no referido
trabalho também já foram descritos como causadores de enfermidades graves
(RAMTEKE & TEWARI, 2007). No Brasil, foram isolados sorogrupos potencialmente
patogênicos de STEC em queijo elaborado com leite cru contendo tanto gene stx
1
como
stx
2
(PANETO et al.,2007). Estes dados sugerem que diversos sorogrupos patogênicos
não só foram isolados em alimentos como também na água de consumo humano, por
isso é necessário criar um sistema de monitoramento, como medida preventiva, tanto
para alimentos como para água de consumo da população.
No antibiograma, a grande maioria dos isolados (96%) apresentou sensibilidade
aos antimicrobianos testados. Este resultado contrasta com o nível de resistência
encontrado em STEC isoladas de bovinos de outras regiões do Brasil e outros países
(SCHROEDER et al.,2002; MORA et al., 2005; STELLA, 2006). Provavelmente o baixo
nível de resistência pode estar relacionado com o modo de criação extensivo destes
animais. A diferença na taxa de resistência encontradas nos diferentes trabalhos e nas
diferentes regiões pode representar uma variação na forma de utilização dos
antimicrobianos, seja na forma profilática, contínua ou terapêutica. Segundo
WEGENER et al. (1999) o princípio para evitar o desenvolvimento de resistência dos
animais aos antibióticos envolve controlar os níveis de infecção dos rebanhos e o uso
prudente dos antibióticos. Embora os isolados deste estudo tenham apresentado
elevada sensibilidade antimicrobiana das E. coli STEC, sugere-se uma monitoração
contínua do perfil de resistência destes agentes no rebanho bovino.
Os fatores de virulência em E. coli STEC foram encontrados em 11 diferentes
combinações (FIGURA 2), os mais freqüentes foram stx
2
(27%), stx
1
stx
2
e stx
1
stx
2
ehxA saa (16% cada). A elevada freqüência do gene stx
2
(89%) sugere um alto
potencial de risco à saúde humana, pois o stx
2
está relacionado com uma maior
48
virulência. O gene eae foi encontrado em somente uma cepa em associação com stx
1
e
ehxA. A presença do stx
2
mais eae está associado com casos mais severos da doença
nos humanos (BOERLIN et al.,1999; BEUTIN et al.,2004). Embora certos sorotipos de
STEC eae – negativo também possam causar doença severa, este resultado sugere
que a baixa prevalência do genótipo stx
2
eae pode estar relacionada com a ocorrência
rara da síndrome hemolítica urêmica no Brasil (GUTH et al., 2002). O gene saa foi
encontrado em 28 (38%) cepas, sugerindo que outros tipos de adesina podem estar
envolvidos no mecanismo de adesão destas cepas. O gene ehxA foi encontrado em 32
(44%) cepas, 22 destas cepas foram positivas também para o gene saa, indicando uma
importante associação entre estes genes de origem plasmidial (BRÜNDER et al.,1999;
PATON et al.,2001).
Muitas destas cepas pertencem ao mesmo sorotipo e carreiam diferentes genes
de virulência, indicando uma diversidade genética e bioquímica dos isolados que
podem diferir com relação à habilidade do agente em causar doença. Apenas a
sorologia não é suficiente para definir o potencial de causar doença da cepa. Os genes
de virulência podem ser identificados servindo de base para análises epidemiológicas
para melhor avaliar o risco que a STEC representa aos seres humanos. Portanto a
análise molecular é, atualmente, uma ferramenta epidemiológica importantíssima na
detecção e caracterização destas estirpes e devem ser amplamente utilizadas em
suspeitas de surtos e casos isolados.
Resultados divergentes entre o kit VTEC-RPLA e a PCR multiplex foram
observados na TABELA 5. Sessenta e cinco (89%) isolados reagiram positivamente no
kit. Três destes isolados identificados como produtores de Stx1 foram positivos para o
gene stx
1
e stx
2
pela técnica de PCR Multiplex. Oito STEC identificadas como negativas
para VTEC-RPLA carreavam os genes stx
1
mais stx
2
, stx
2
ou stx
1
. Estas discrepâncias
podem ser devido ao baixo nível de expressão dos genes stx em algumas cepas ou
devido à presença de variantes Stx que não são reconhecidas pelos anticorpos
presentes no kit.
Nos últimos anos, devido à disponibilidade das técnicas de biologia molecular,
muito conhecimento tem sido obtido sobre os mecanismos de virulência bacteriana e a
49
patôgenese das infecções. O sequenciamento de genes stx revelou a presença de
substituições de nucleotídeos nos genes stx
1
e stx
2
em diversas estirpes, levando à
descrição de diversos alelos ou formas variantes desses genes (PATON & PATON,
1998; NAKAO et al., 2002).
Estudos realizados em cultura de células têm mostrado que tais genes diferem
em relação à citotoxicidade, e estudos epidemiológicos mostram que enquanto alguns
deles são encontrados em estirpes de STEC isoladas de pacientes com diarréia outros
são associadas com estirpes que provocam quadros mais graves de doença como
colite hemorrágica e SHU (FRIEDRICH et al., 2002). Do ponto de vista de saúde
pública, esta identificação é importante para avaliar a severidade do caso, pois algumas
variantes são mais perigosas que outras.
Embora tenha sido descrito que o gene stx
2
está associado com estirpes mais
virulentas, nem todos os seus variantes apresentam o mesmo risco para o
desenvolvimento de formas graves de doença, sendo alguns são isolados de casos de
diarréia branda. Dessa forma, a subtipagem dos genes stx
2
tem sido empregada com a
finalidade de se avaliar o potencial de virulência de STEC e o risco para o
desenvolvimento de complicações graves.
A diversidade de variantes é maior para Stx2, em número e variabilidade nas
características. Essas variantes diferem entre si na seqüência de nucleotídeos,
características antigênicas e toxicidade (MAINIL & DAUBE, 2005). A pesquisa das
variantes de stx
2
foi realizada por PCR-RFLP e foram encontrados oito subtipos:
stx
2OX3a/O111
; stx
2
; stx
2c
; stx
2(vha)
; stx
2(vhb)
; stx
2OX3b
; stx
2vnb/vhc
e stx
2O48
. Dentre este grupo
existem subtipos com grande potencial patogênico como o stx
2c
. A presença de stx
2c
e
stx
2
foi encontrada, principalmente nos casos de colite hemorrágica e SHU (EKLUND et
al., 2002). A falta de uniformidade, na literatura, para a classificação de algumas
variantes é uma dificuldade nas análises, pois nomenclaturas diferentes têm sido
utilizadas para a classificação de algumas variantes.
No presente trabalho seis estirpes de STEC previamente isoladas e detectadas
como stx
2
foram analisadas por sequenciamento de DNA para verificar a presença de
formas variantes. Ambas as fitas de DNA foram seqüenciadas, mas não foi possível
50
concluir o sequenciamento do gene stx
2
A. Novos iniciadores devem ser preparados
com essa finalidade. Por essa razão e pelo fato de que o gene stxB é o que parece
apresentar maior variabilidade, optou-se por comparar apenas os fragmentos de 589
nucleotídeos que contém o gene stx
2
B inteiro e parte do gene stx
2
A com o banco de
dados de seqüências de DNA GenBank. Observou-se alta similaridade, mas não
identidade, em 5 dos 6 fragmentos comparados com as seqüências do gene stx
2
dispostas no GenBank. Isto pode sugerir a presença de variantes que apresentam
distribuição regional.
Em quatro estirpes (2, 6, 10 e 12 – ANEXO I) foram detectadas variantes de stx
2
:
variantes encontrados nas estirpes VTEC 16 e EBC 289, descritos recentemente por
DE BAETS et al., (2004) cujo potencial de virulência ainda não é conhecido; variante
detectado na estirpe O48:H21 descrito por PATON et al (1995), que apresenta atividade
citotóxica em células Vero e o variante stx
2d
(GOBIUS et al, 2003). Este último não deve
ser confundido com o variante stx
2d
que é isolado de estirpes associadas com diarréia.
Pelo contrário, o variante stx
2d
ativável pelo muco apresenta elevado potencial de
virulência, tendo a atividade citotóxica ativada no intestino (GOBIUS et al., 2003).
Nossos resultados sugerem que três das seis estirpes de STEC analisadas
apresentam alto potencial de virulência e indicam a presença de elevada variabilidade
entre os genes stx
2
de STEC, mas estudos com maior número de estirpes devem ser
realizados para confirmar este achado.
Embora a incidência de infecção em humanos por STEC seja, relativamente
baixa, a severidade dos sintomas e a freqüência de seqüelas renais, neurológicas e a
morte de pessoas são motivos de grande preocupação. Alimentos como o queijo Minas
Frescal são amplamente consumidos no Brasil, mas podem tornar-se vias de
transmissão de STEC ao ser humano (PANETO et al.,2007). No Brasil, o queijo tipo
Minas Frescal é amplamente consumido pela população devido, principalmente, a
facilidade do preparo e ao baixo custo. Este queijo possui elevado teor de umidade, por
esta razão é altamente perecível. A contaminação de queijos tipo Minas Frescal por
coliformes termotolerantes acima dos padrões estabelecidos foi observada em vários
trabalhos (PERESI et al., 2001; FERNANDEZ et al., 2005), mostrando a vulnerabilidade
51
desse tipo de alimento à proliferação de patógenos. Considerando a elevada freqüência
de STEC em bovinos de diversas regiões do Brasil e que essas bactérias podem entrar
em contato com o leite durante a ordenha, existe a possibilidade de contaminação de
queijos com essas bactérias, o que tem sido demonstrado mesmo em países com
melhores padrões higiênico-sanitários (RAMSARAN et al., 1998; VERNOZY-ROZAND
et al., 2005).
Neste trabalho a viabilidade de STEC não O-157 em queijo minas foi avaliada
até o 10º dia, devido ao prazo de validade do produto estabelecido pela legislação ser
de 10 dias. Os resultados mostraram que as diferentes cepas de STEC foram
detectadas nos queijos após 1, 2, 4, 6 e 10 dias de armazenamento sob refrigeração. A
viabilidade das estirpes foi confirmada através do cultivo de alíquotas de queijo em
água peptonada seguido de subcultivo em ágar MacConkey, meio de onde foram
retiradas as colônias para a extração de DNA e a realização de PCR. Foi observado
que todas as diferentes cepas permaneceram viáveis no queijo Minas mesmo após 10
dias de conservação a 4°C. Isto confirma que estirpes não-O157 são capazes de
sobreviver em queijo mantido em condições adequadas de armazenamento e que,
portanto, podem ser veiculadas aos seres humanos dessa forma.
Muitos casos de infecção por STEC foram atribuídos ao consumo de produtos
lácteos contaminados (NATARO & KAPER, 1998). Surtos e casos esporádicos de
infecções causadas após o consumo de queijo contaminado com STEC foram relatados
em diversos países (CDC, 2000; CURNOW, 1994). Até o momento não existem relatos
de surtos causados por STEC no Brasil. Porém a freqüência elevada dessas bactérias
em bovinos (PIGATTO, 2004; FARAH et al.,2007) indica alto potencial para a
contaminação da carne e leite. Além disso, em estudo envolvendo águas de descarte
de abatedouros e águas de rios, foram encontrados alta freqüência de STEC sugerindo
uma significativa distribuição deste agente no ambiente e, portanto, um importante
problema de saúde pública (LOUKIADIS et al., 2006).
A doença é de suma importância, do ponto de vista epidemiológico, sendo
necessária a adoção de métodos de prevenção. Portanto, este trabalho mostra a
presença de STEC associadas com doenças humanas em bovinos, indicando que estes
52
animais podem representar uma fonte de infecção humana e que o manejo apropriado
dos animais ajuda na prevenção de infecções.
53
7. CONCLUSÕES
- Os resultados sugerem a presença de elevada variabilidade genética dos isolados
estudados.
- Foram encontrados 34 sorotipos de STEC. Destes 11 não tinham sido, até então
associados com STEC e cinco foram associados a casos graves da infecção.
- O perfil de virulência mais prevalente foi stx
2
(27%) que é o mais patogênico.
- Os subtipos mais freqüentes foram stx
2
e a variante stx
2c
, ambos com elevado
potencial de patogenicidade.
- A presença da variante stx
2d
ativável pelo muco intestinal foi relatada pela primeira vez
no Brasil e sugere alto potencial de virulência nas estirpes que as contém.
- Existe uma elevada susceptibilidade dos isolados de STEC aos antimicrobianos
testados.
- As STEC avaliadas foram capazes de sobreviver em queijo mantido em condições
adequadas de armazenamento por até 10 dias.
54
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS
As graves conseqüências que uma infecção por STEC pode desencadear no ser
humano são bem conhecidas. Este trabalho ressalta a presença de isolados de STEC,
associados à doença no ser humano, em fezes de bovinos no estado do Paraná.
Como os bovinos representam importante reservatório, a adoção de um sistema
de monitoramento e de prevenção prático e eficiente é fundamental para evitar
episódios de infecção na população. E, quais seriam as alternativas de prevenção e
monitoramento mais viáveis neste caso?
Para atingirmos metas de prevenção é necessário integrar toda a cadeia
produtiva. O trabalho deve iniciar com um adequado manejo dos animais, evitando
indivíduos positivos no rebanho, desinfetando instalações, fornecendo água de boa
qualidade, armazenando os alimentos dos animais em locais apropriados e o adequado
destino dos dejetos. Estas medidas, além de beneficiar a produção, também evita a
contaminação do ambiente.
Além de um bom manejo, outro fator importante é a educação em saúde e a
transmissão de conhecimento para trabalhadores rurais e manipuladores de alimentos.
Aos trabalhadores rurais fornecer noções de higiene pessoal, manutenção de roupas
limpas, lavagem das mãos, como manejar o rebanho satisfatoriamente, armazenar os
alimentos, eliminar dejetos e outros. Aos manipuladores de alimentos noções de higiene
pessoal, além de, como manipular adequadamente a matéria prima, como processar e
armazenar este alimento até chegar às mãos do consumidor. A educação e informação
facilitam a adoção das boas práticas de fabricação para obtenção de um alimento
seguro.
Outro aspecto fundamental é a notificação de casos suspeitos às autoridades
sanitárias. O episódio deve ser notificado para que investigações epidemiológicas
sejam desencadeadas estabelecendo prováveis causas e associações com alimentos.
Neste mesmo contexto, a atuação da inspeção por parte do Ministério da Agricultura, é
fundamental para obtermos alimentos de boa qualidade. Alimentos produzidos
clandestinamente comprometem medidas de controle do agente.
55
Portanto, levar informação aos trabalhadores, trabalhar adequadamente com os
animais, boas práticas na indústria de alimentos e uma inspeção efetiva por parte das
autoridades sanitárias propiciarão a criação e manutenção de programas de prevenção
efetivos, diminuindo o risco do agente à população.
56
9. REFERÊNCIAS
ACHA, P. N.; SZYFRES, B. Zoonosis e enfermidades transmisibles comunes al hombre
y a los annimais. Bacterioses y micosis. Publicacion Científica y Técnica,
Washington, v. 1, n. 580, p. 398, 2001.
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MILLER, W.; LIPMAN, D. J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of
protein database search programs. Nucleic Acids Research, Washington, v. 25, n. 1,
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76
ANEXO I
1.
Alinhamento e comparação da seqüência de nucleotídeos da cepa STEC 1 com
a região stx correspondente do Banco de Genes.
Accession
Description
Max
score
Total
score
Query
coverage
E
value
Max
ident
AF525041.1
Escherichia coli O157:H- strain
550/98 Shiga toxin 2 subunit A
(stxA2) and Shiga toxin 2 subunit
B (stxB2) genes, complete cds
1058 1058 100% 0.0 99%
gb|AF525041.1| Escherichia coli O157:H- strain 550/98 Shiga toxin 2 subunit A (stxA2)
and Shiga toxin 2 subunit B (stxB2) genes.
Tamanho (length) = 1422
Escore = 1058 bits (1172)
Identidade = 588/589 (99%), Gaps = 0/589 (0%)
Strand = Plus/Plus
Query 1 TGGACCTCACTCTGAACTGGGGGCGAATCAGCAATGTGCTTCCGGAGTATCGGGGAGAGG 60
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 678 TGGACCTCACTCTGAACTGGGGGCGAATCAGCAATGTGCTTCCGGAGTATCGGGGAGAGG 737
Query 61 ATGGTGTCAGAGTGGGGAGAATATCCTTTAATAATATATCAGCGATACTGGGTACTGTGG 120
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 738 ATGGTGTCAGAGTGGGGAGAATATCCTTTAATAATATATCAGCGATACTGGGTACTGTGG 797
Query 121 CCGTTATACTGAATTGCCATCATCAGGGGGCGCGTTCTGTTCGCGCCGTGAATGAAGAGA 180
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 798 CCGTTATACTGAATTGCCATCATCAGGGGGCGCGTTCTGTTCGCGCCGTGAATGAAGAGA 857
Query 181 GTCAACCAGAATGTCAGATAACTGGCGACAGGCCCGTTATAAAAATAAACAATACATTAT 240
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 858 GTCAACCAGAATGTCAGATAACTGGCGACAGGCCCGTTATAAAAATAAACAATACATTAT 917
Query 241 GGGAAAGTAATACAGCTGCAGCGTTTCTGAACAGAAAGTCACAGTTTTTATATACAACGG 300
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 918 GGGAAAGTAATACAGCTGCAGCGTTTCTGAACAGAAAGTCACAGTTTTTATATACAACGG 977
Query 301 GTAAATTAAGGAGTTAAGTATGAAGAAGATGTTTATGGCGGTTTTATTTGCATTAGTTTC 360
|||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 978 GTAAATAAAGGAGTTAAGTATGAAGAAGATGTTTATGGCGGTTTTATTTGCATTAGTTTC 1037
77
Query 361 TGTTAATGCAATGGCGGCGGATTGTGCTAAAGGTAAAATTGAGTTTTCCAAGTATAATGA 420
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1038 TGTTAATGCAATGGCGGCGGATTGTGCTAAAGGTAAAATTGAGTTTTCCAAGTATAATGA 1097
Query 421 GGATGACACATTTACAGTGAAGGTTGACGGGAAAGAATACTGGACCAGTCGCTGGAATCT 480
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1098 GGATGACACATTTACAGTGAAGGTTGACGGGAAAGAATACTGGACCAGTCGCTGGAATCT 1157
Query 481 GCAACCGTTACTGCAAAGTGCTCAGTTGACAGGAATGACTGTCACAATCAAATCCAGTAC 540
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1158 GCAACCGTTACTGCAAAGTGCTCAGTTGACAGGAATGACTGTCACAATCAAATCCAGTAC 1217
Query 541 CTGTGAATCAGGCTCCGGATTTGCTGAAGTGCAGTTTAATAATGACTGA 589
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1218 CTGTGAATCAGGCTCCGGATTTGCTGAAGTGCAGTTTAATAATGACTGA 1266
2.
Alinhamento e comparação da seqüência de nucleotídeos da cepa STEC 2 com a
região stx correspondente do Banco de Genes.
Accession
Description
Max
score
Total
score
Query
coverage
E
value
Max
ident
AY443053.1
Escherichia coli clone pVTEC16
verocytotoxin 2 variant A subunit
and verocytotoxin 2 variant B
subunit genes, complete cds
1056 1056 100% 0.0 99%
Escore = 1056 bits (1170)
Identidade = 587/589 (99%), Gaps = 0/589 (0%)
Strand = Plus/Plus
Query 1 TGGACCTCACTCTGAACTGGGGGCGAATCAGCAATGTGCTTCCGGAGTATCGGGGAGAGG 60
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 775 TGGACCTCACTCTGAACTGGGGGCGAATCAGCAATGTGCTTCCGGAGTATCGGGGAGAGG 834
Query 61 ATGGTGTCAGAGTGGGGAGAATATCCTTTAATAATATATCAGCGATACTGGGTACTGTGG 120
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 835 ATGGTGTCAGAGTGGGGAGAATATCCTTTAATAATATATCAGCGATACTGGGTACTGTGG 894
Query 121 CCGTTATACTGAATTGCCATCATCAGGGGGCGCGCTCTGTTCGCGCCGTGAATGAAGAGA 180
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 895 CCGTTATACTGAATTGCCATCATCAGGGGGCGCGCTCTGTTCGCGCCGTGAATGAAGAGA 954
Query 181 GTCAACCAGAATGTCAGATAACTGGCGACAGGCCCGTTATAAAAATAAACAATACATTAT 240
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 955 GTCAACCAGAATGTCAGATAACTGGCGACAGGCCCGTTATAAAAATAAACAATACATTAT 1014
78
Query 241 GGGAAAGTAATACAGCAGCAGCGTTTCTGAACAGAAAGTCACAGTTTTTATATACAACGG 300
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1015 GGGAAAGTAATACAGCAGCAGCGTTTCTGAACAGAAAGTCACAGTTTTTATATACAACGG 1074
Query 301 GTAAATAAAGGAGTTAAGTATGAAGAAGATGTTTATGGCGGTTTTATTTGCATTAGTTTC 360
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1075 GTAAATAAAGGAGTTAAGTATGAAGAAGATGTTTATGGCGGTTTTATTTGCATTAGTTTC 1134
Query 361 TGTTAATGCAATGGCGGCGGATTGTGCTAAAGGTAAAATTGAGTTTTCCAAGTATAATGA 420
|||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1135 TGTTAATGCAATGGCGGCGGATTGTGCTAAAGSTAAAATTGAGTTTTCCAAGTATAATGA 1194
Query 421 GGATGACACATTTACAGTGAAGGTTGACGGGAAAGAATACTGGACCAGTCGCTGGAATCT 480
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1195 GGATGACACATTTACAGTGAAGGTTGACGGGAAAGAATACTGGACCAGTCGCTGGAATCT 1254
Query 481 GCAACCGTTACTGCAAAGTGCTCAGCTGACAGGAATGACTGTCACAATCAAATCCAGTAC 540
||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1255 GCAACCGTTACTGCAAAGTGCTCAGTTGACAGGAATGACTGTCACAATCAAATCCAGTAC 1314
Query 541 CTGTGAATCAGGCTCCGGATTTGCTGAAGTGCAGTTTAATAATGACTGA 589
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1315 CTGTGAATCAGGCTCCGGATTTGCTGAAGTGCAGTTTAATAATGACTGA 1363
3.
Alinhamento e comparação da seqüência de nucleotídeos da cepa STEC 6 com a
região stx correspondente do Banco de Genes.
Accession
Description
Max
score
Total
score
Query
coverage
E
value
Max
ident
AF500191.1
Escherichia coli isolate EC1871a
serotype ONT:H11 variant Shiga
toxin type 2 A subunit (stx2dA) and
variant Shiga toxin type 2 B subunit
(stx2dB) genes, complete cds
1063 1063 100% 0.0 100%
gb|AF500191.1| Escherichia coli isolate EC1871a serotype ONT:H11 variant Shiga
toxin type 2 A subunit (stx2dA) and variant Shiga toxin type 2 B subunit (stx2dB) genes.
Tamanho (length) = 1444
Escore = 1063 bits (1178)
Identidade = 589/589 (100%), Gaps = 0/589 (0%)
Strand = Plus/Plus
79
Query 1 TGGACCTCACTCTGAACTGGGGGCGAATCAGCAATGTGCTTCCGGAGTATCGGGGAGAGG 60
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 820 TGGACCTCACTCTGAACTGGGGGCGAATCAGCAATGTGCTTCCGGAGTATCGGGGAGAGG 879
Query 61 ATGGTGTCAGAGTGGGGAGAATATCCTTTAATAATATATCGGCGATACTGGGTACTGTGG 120
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 880 ATGGTGTCAGAGTGGGGAGAATATCCTTTAATAATATATCGGCGATACTGGGTACTGTGG 939
Query 121 CCGTTATACTGAATTGTCATCATCAGGGGGCGCGTTCTGTTCGCGCCGTGAATGAAGATA 180
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 940 CCGTTATACTGAATTGTCATCATCAGGGGGCGCGTTCTGTTCGCGCCGTGAATGAAGATA 999
Query 181 GTCAACCAGAATGTCAGATAACTGGCGACAGGCCCGTTATAAAAATAAACAATACATTAT 240
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1000 GTCAACCAGAATGTCAGATAACTGGCGACAGGCCCGTTATAAAAATAAACAATACATTAT 1059
Query 241 GGGAAAGTAATACAGCAGCAGCGTTTCTGAACAGAAAATCACAGTCTTTATATACAACGG 300
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1060 GGGAAAGTAATACAGCAGCAGCGTTTCTGAACAGAAAATCACAGTCTTTATATACAACGG 1119
Query 301 GTGAATAAAGGAGTTAAGTATGAAGAAGATGTTTATGGCGGTTTTATTTGCATTAGTTTC 360
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1120 GTGAATAAAGGAGTTAAGTATGAAGAAGATGTTTATGGCGGTTTTATTTGCATTAGTTTC 1179
Query 361 TGTTAATGCAATGGCGGCGGATTGCGCTAAAGGTAAAATTGAGTTTTCCAAGTATAATGA 420
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1180 TGTTAATGCAATGGCGGCGGATTGCGCTAAAGGTAAAATTGAGTTTTCCAAGTATAATGA 1239
Query 421 GAATGATACATTCACAGTAAAAGTGGCCGGGAAAGAATACTGGACCAGTCGCTGGAATCT 480
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1240 GAATGATACATTCACAGTAAAAGTGGCCGGGAAAGAATACTGGACCAGTCGCTGGAATCT 1299
Query 481 GCAACCGTTACTGCAAAGTGCTCAGCTGACAGGAATGACTGTCACAATCAAATCCAGTAC 540
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1300 GCAACCGTTACTGCAAAGTGCTCAGCTGACAGGAATGACTGTCACAATCAAATCCAGTAC 1359
Query 541 CTGTGAATCAGGCTCCGGATTTGCTGAAGTGCAGTTTAATAATGACTGA 589
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1360 CTGTGAATCAGGCTCCGGATTTGCTGAAGTGCAGTTTAATAATGACTGA 1408
4.
Alinhamento e comparação da seqüência de nucleotídeos da cepa STEC 10 com a
região stx correspondente do Banco de Genes.
Accession
Description
Max
score
Total
score
Query
coverage
E
value
Max
ident
Z37725.1
E.coli gene for shiga-
like toxin
type II A and B subunits
1036 1036 100% 0.0 98%
emb|Z37725.1|ECSHGIIAB E.coli gene for shiga-like toxin type II A and B subunits
80
Tamanho (length) = 1461
Escore = 1036 bits (1148)
Identidade = 583/589 (98%), Gaps = 0/589 (0%)
Strand = Plus/Plus
Query 1 TGGACCTCACTCTGAACTGGGGGCGAATCAGCAATGTGCTTCCGGAGTATCGGGGAGAGG 60
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 828 TGGACCTCACTCTGAACTGGGGGCGAATCAGCAATGTGCTTCCGGAGTATCGGGGAGAGG 887
Query 61 ATGGTGTCAGAGTGGGGAGAATATCCTTTAATAATATATCGGCGATACTGGGCACTGTGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||| |||||||
Sbjct 888 ATGGTGTCAGAGTGGGGAGAATATCCTTTAATAATATATCAGCGATACTGGGTACTGTGG 947
Query 121 CCGTTATACTGAATTGTCATCATCAGGGGGCGCGTTCTGTTCGCGCCGTGAATGAAGAGA 180
|||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 948 CCGTTATACTGAATTGCCATCATCAGGGGGCGCGTTCTGTTCGCGCCGTGAATGAAGAGA 1007
Query 181 GTCAACCAGAATGTCAGATAACTGGCGACAGGCCCGTTATAAAAATAAACAATACATTAT 240
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1008 GTCAACCAGAATGTCAGATAACTGGCGACAGGCCCGTTATAAAAATAAACAATACATTAT 067
Query 241 GGGAAAGTAATACAGCTGCAGCGTTTCTGAACAGAAAGTCACAGTTTTTATATACAACGG 300
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1068 GGGAAAGTAATACAGCTGCAGCGTTTCTGAACAGAAAGTCACAGTTTTTATATACAACGG 1127
Query 301 GTAAATAAAGGAGTTAAGTATGAAGAAGATGTTTATGGCGGTTTTATTTGCATTAGTTTC 360
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1128 GTAAATAAAGGAGTTAAGTATGAAGAAGATGTTTATGGCGGTTTTATTTGCATTAGTTTC 1187
Query 361 TGTCAATGCAATGGCGGCGGATTGCGCTAAAGGTAAAATTGAGTTTTCCAAGTATAATGA 420
||| |||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1188 TGTTAATGCAATGGCGGCGGATTGTGCTAAAGGTAAAATTGAGTTTTCCAAGTATAATGA 1247
Query 421 GGATGACACATTTACAGTGAAGGTTGACGGGAAAGAATACTGGACCAGTCGCTGGAATCT 480
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1248 GGATGACACATTTACAGTGAAGGTTGACGGGAAAGAATACTGGACCAGTCGCTGGAATCT 1307
Query 481 GCAACCGTTACTGCAAAGTGCTCAGCTGACAGGAATGACTGTCACAATCAAATCCAGTAC 540
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1308 GCAACCGTTACTGCAAAGTGCTCAGCTGACAGGAATGACTGTCACAATCAAATCCAGTAC 1367
Query 541 CTGTGAATCAGGCTCCGGATTTGCTGAAGTGCAGTTTAATAATGAATGA 589
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||
Sbjct 1368 CTGTGAATCAGGCTCCGGATTTGCTGAAGTGCAGTTTAATAATGACTGA 1416
81
5.
Alinhamento e comparação da seqüência de nucleotídeos da cepa STEC 11 com
a região stx correspondente do Banco de Genes.
Accession
Description
Max
score
Total
score
Query
coverage
E
value
Max
ident
EF079674.1
Escherichia coli O157:H7 strain
GZ-021210 Shiga toxin 2 subunit A
and Shiga toxin 2 subunit B genes,
complete cds
1032 1032 100% 0.0 98%
AB168110.1
Escherichia coli O157:H7 q, stx2A,
stx2B genes for antiterminator Q
protein, Shiga toxin 2 A subunit,
Shiga toxin 2 B subunit, complete
cds, strain:Thai-12
1032 1032 100% 0.0 98%
AF500191.1
Escherichia coli isolate EC1871a
serotype ONT:H11 variant Shiga
toxin type 2 A subunit (stx2dA) and
variant Shiga toxin type 2 B subunit
(stx2dB) genes, complete cds
1032 1032 100% 0.0 98%
AF500189.1
Escherichia coli isolate EC1720a
serotype O174:H21 variant Shiga
toxin type 2 A subunit (stx2dA) and
variant Shiga toxin type 2 B subunit
(stx2dB) genes, complete cds
1032 1032 100% 0.0 98%
gb|EF079674.1| Escherichia coli O157:H7 strain GZ-021210 Shiga toxin 2 subunit A
and Shiga toxin 2 subunit B genes, complete cds
Tamanho (length) = 1241
Escore = 1032 bits (1144)
Identidade = 581/589 (98%), Gaps = 0/589 (0%)
Strand = Plus/Plus
82
Query 1 TGGACCTCACTCTGAACTGGGGGCGAATCAGCAATGTGCTTCCGGAGTATCGGGGAGAGG 60
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 653 TGGACCTCACTCTGAACTGGGGGCGAATCAGCAATGTGCTTCCGGAGTATCGGGGAGAGG 712
Query 61 ATGGTGTCAGAGTGGGGAGAATATCCTTTAATAATATATCGGCGATACTGGGCACTGTGG 120
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 713 ATGGTGTCAGAGTGGGGAGAATATCCTTTAATAATATATCGGCGATACTGGGCACTGTGG 772
Query 121 CCGTTATACTGAATTGTCATCATCAGGGGGCGCGTTCTGTTCGCGCCGTGAATGAAGATA 180
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 773 CCGTTATACTGAATTGTCATCATCAGGGGGCGCGTTCTGTTCGCGCCGTGAATGAAGATA 832
Query 181 GTCAACCAGAATGTCAGATAACTGGCGACAGGCCCGTTATAAAAATAAACAATACATTAT 240
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 833 GTCAACCAGAATGTCAGATAACTGGCGACAGGCCCGTTATAAAAATAAACAATACATTAT 892
Query 241 GGGAAAGTAATACAGCTGCAGCGTTTCTGAACAGAAAGTCACAGTCTTTATATACAACGG 300
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||
Sbjct 893 GGGAAAGTAATACAGCTGCAGCGTTTCTGAACAGAAAGTCACAGTTTTTATATACAACGG 952
Query 301 GTGAATAAAGGAGTTAAGTATGAAGAAGATGTTTATGGCGGTTTTATTTGCATTAGTTTC 360
|| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 953 GTAAATAAAGGAGTTAAGTATGAAGAAGATGTTTATGGCGGTTTTATTTGCATTAGTTTC 1012
Query 361 TGTTAATGCAATGGCGGCGGATTGCGCTAAAGGTAAAATTGAGTTTTCCAAGTATAATGA 420
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1013 TGTTAATGCAATGGCGGCGGATTGCGCTAAAGGTAAAATTGAGTTTTCCAAGTATAATGA 1072
Query 421 GAATGATACATTCACAGTAAAAGTGGACGGGAAAGAATACTGGACCAGTCGCTGGAATCT 480
|||||||||||||||||||||||||| ||| ||||| |||||||||||||||||||||||
Sbjct 1073 GAATGATACATTCACAGTAAAAGTGGCCGGAAAAGAGTACTGGACCAGTCGCTGGAATCT 1132
Query 481 GCAACCGTTACTGCAAAGTGCTCAGTTNACAGGAATGACNGTCACAATCAAATCCAGTAC 540
||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||| ||||||||||||||||||||
Sbjct 1133 GCAACCGTTACTGCAAAGTGCTCAGTTGACAGGAATGACTGTCACAATCAAATCCAGTAC 1192
Query 541 CTGTGNATCAGGCTCCGGATTTGCTGAAGTGCAGTTTAATAATGACTGA 589
||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1193 CTGTGAATCAGGCTCCGGATTTGCTGAAGTGCAGTTTAATAATGACTGA 1241
83
6.
Alinhamento e comparação da seqüência de nucleotídeos da cepa STEC 12 com a
região stx correspondente do Banco de Genes.
Accession
Description
Max
score
Total
score
Query
coverage
E
value
Max
ident
AY443049.1
Escherichia coli isolate EBC289
verocytotoxin 2 variant A subunit
and verocytotoxin 2 variant B
subunit genes, complete cds
1027 1027 100% 0.0 98%
gb|AY443049.1| Escherichia coli isolate EBC289 verocytotoxin 2 variant A subunit and
verocytotoxin 2 variant B subunit genes.
Tamanho (length) = 1241
Escore = 1027 bits (1138)
Identidade = 581/589 (98%), Gaps = 0/589 (0%)
Strand = Plus/Plus
Query 1 TGGACCTCACTCTGAACTGGGGGCGAATCAGCAATGTGCTTCCGGAGTATCGGGGAGAGG 60
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 653 TGGACCTCACTCTGAACTGGGGGCGAATCAGCAATGTGCTTCCGGAGTATCGGGGAGAGG 712
Query 61 ATGGTGTCAGAGTGGGGAGAATATCCTTTAATAATATATCAGCGATACTGGGTACTGTGG 120
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 713 ATGGTGTCAGAGTGGGGAGAATATCCTTTAATAATATATCAGCGATACTGGGTACTGTGG 772
Query 121 CCGTTATACTGAATTGCCATCATCAGGGGGCGCGTTCTGTTCGCGCCGTGAATGAAGATA 180
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 773 CCGTTATACTGAATTGCCATCATCAGGGGGCGCGTTCTGTTCGCGCCGTGAATGAAGATA 832
Query 181 GTCAACCAGAATGTCAGATAACTGGCGACAGGCTCGTTATAAAAATAAACAATACATTAT 240
||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 833 GTCAACCAGAATGTCAGATAACTGGCGACAGGCCCGTTATAAAAATAAACAATACATTAT 892
Query 241 GGGAAAGTAATACAGCAGCAGCGTTTCTGAACAGAAAGTCACAGTTTTTATATACCACGG 300
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||
Sbjct 893 GGGAAAGTAATACAGCAGCAGCGTTTCTGAACAGAAAGTCACAGTTTTTATATACAACGG 952
Query 301 GTAAATAAAGGAGTTTAGTATGAAGAAGATGTTTATGGCGGTTTTATTTGCATTAGTTTC 360
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Sbjct 953 GTAAATAAAGGAGTTAAGTATGAAGAAGATGTTTATGGCGGTTTTATTTGCATTAGTTTC 1012
Query 361 TGTTAATGCAATGGCGGCGGATTGCGCTAAAGGTAAAATTGAGTTTTCCAAGTATAATGA 420
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1013 TGTTAATGCAATGGCGGCGGATTGCGCTAAAGGTAAAATTGAGTTTTCCAAGTATAATGA 1072
84
Query 421 GAATGATACATTCACAGTAAAAGTGTCCGGGAAAGAATACTGGACCAGTCGCTGGAATCT 480
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Sbjct 1073 GAATGATACATTCACAGTAAAAGTGGCCGGGAAAGAATACTGGACCAGTCGCTGGAATCT 1132
Query 481 GCAACCGTTACTGCAAAGTGCTCAGTTGACAGGAATTGCTGTCACGATCAAATCCAGTAC 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||| ||||||||||||||
Sbjct 1133 GCAACCGTTACTGCAAAGTGCTCAGTTGACAGGAATGACTGTCACAATCAAATCCAGTAC 1192
Query 541 CTGTGAATCAGGCTCCGGATTTGCTGAAGTGCAGTTTAATAATGAATGA 589
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||
Sbjct 1193 CTGTGAATCAGGCTCCGGATTTGCTGAAGTGCAGTTTAATAATGACTGA 1241
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