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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CAMPUS DE JABOTICABAL
ESTUDO FENOTÍPICO E GENOTÍPICO DA PRODUÇÃO DE
BIOFILMES POR ESTIRPES DE Staphylococcus aureus
ISOLADAS DOS CASOS DE MASTITE SUBCLÍNICA
BOVINA
POLIANA DE CASTRO MELO
Médica Veterinária
JABOTICABAL – SP – BRASIL
2008
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CAMPUS DE JABOTICABAL
ESTUDO FENOTÍPICO E GENOTÍPICO DA PRODUÇÃO DE
BIOFILMES POR ESTIRPES DE Staphylococcus aureus
ISOLADAS DOS CASOS DE MASTITE SUBCLÍNICA
BOVINA
POLIANA DE CASTRO MELO
Orientador: Prof. Dr. Antônio Nader Filho
Dissertação apresentada à Faculdade de
Ciências Agrárias e Veterinárias do Campus
de Jaboticabal–UNESP, como parte das
exigências para obtenção do Título de
Mestre em Medicina Veterinária - Medicina
Veterinária Preventiva.
JABOTICABAL – SP – BRASIL
FEVEREIRO – 2008
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Melo, Poliana de Castro
M528e
Estudo fenotípico e genotípico da produção de biofilmes por
estirpes de Staphylococcus aureus isoladas de casos de mastite
subclínica bovina / Poliana de Castro Melo. – – Jaboticabal, 2008
xvi, 101 f. : il. ; 28 cm
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista,
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2008
Orientador: Antônio Nader Filho
Banca examinadora: Luiz Augusto do Amaral, Elisabeth
Loshchagin Pizzolitto
Bibliografia
1. Biofilmes. 2. Mastite bovina. 3. Staphylococcus aureus. I.
Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias.
CDU 619:618.19-002:636.2
Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação –
Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal.
email: [email protected]
DADOS CURRICULARES DA AUTORA
POLIANA DE CASTRO MELO – nascida em Uberlândia – Minas Gerais, em
20 de abril de 1981, é Médica Veterinária, formada em Julho de 2004, pela
Universidade Federal de Uberlândia (UFU), Uberlândia-MG. Durante a graduação
fez estágios em diversas áreas, e o estágio supervisionado na área de Medicina
Veterinária Preventiva na Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) e na
Universidade Estadual Paulista (UNESP) – Câmpus de Botucatu. Foi representante
de turma durante três anos e meio, participou do diretório acadêmico como membro
efetivo e de projetos de iniciação científica na área de Microbiologia e projetos de
extensão. Fez estágio na Universidade Estadual Paulista (UNESP) Câmpus de
Jaboticabal-SP após o término da graduação. Em março de 2006 ingressou no
programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária (Medicina Veterinária
Preventiva), da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP, Câmpus de
Jaboticabal-SP, onde desenvolveu o projeto de pesquisa como bolsista do CNPq, e
auxílio financeiro de pesquisa da FAPESP, além de outros trabalhos na mesma
área. Em setembro de 2005 iniciou o curso de Especialização em Processamento e
Controle de Qualidade em Carne, Leite e Ovos da Universidade Federal de Lavras
(UFLA) com o término do mesmo em setembro de 2006. Em outubro de 2007 foi
selecionada para o Curso de Doutorado na mesma área e instituição que realiza o
Mestrado.
MENSAGEM
Nunca espere algo que não deseja,
E nunca deseje algo que não espera.
Quando você espera algo que não quer,
Está atraindo o indesejado,
E quando deseja algo que não espera,
Está dissipando a valiosa força mental.
Por outro lado, quando você está na constante,
Expectativa de algo que deseja persistentemente,
Sua habilidade para atrair se torna irresistível.
A mente é um ímã e atrai o que quer que corresponda
Ao seu estado dominante.
Dr. Raymond Holiwell, em Working with the Law:
Eleven Truth Principles for Successful Living.
ii
DEDICO
Aos meus pais Nilza e Luiz, ao meu irmão Rodrigo,
Ao meu avô Geraldo,
Aos meus tios (as) Leninha, Lázaro, Alice e César,
Aos meus primos William, Wellington e Lucas,
As minhas primas Fávia e Bruna,
E as todos meus Familiares,
Pelo apoio, carinho, compreensão,
Força e exemplo de Fé essencial,
Que me ajudaram nesta caminhada
Longe de casa, mas presente nos meus,
Pensamentos.
Ao meu noivo Rafael pelo companheirismo,
Pelo amor, pela espera, pelo apoio e por estar sempre,
Do meu lado.
Aos queridos cães companheiros: Danger, Dolly, Dot e Donna.
iii
AGRADECIMENTOS
Á Deus, pela força nos momentos difíceis, pelas alegrias nas conquistas
alcançadas, e pela presença constante na minha vida. “Se tiveres de atravessar a
água, estarei contigo. E os rios não te submergirão; se caminhares pelo fogo, não
te queimarás, e a chama não te consumirá. Pois eu sou o Senhor, teu Deus...Dou
o Egito por teu resgate, Porque és precioso aos meus olhos, porque eu te aprecio
e te amo.” Isaías 43, 2-4.
Ao meu orientador Prof. Dr. Antônio Nader Filho, pela confiança em mim e
no meu trabalho, pela amizade, e por sua orientação nestes anos de trabalho.
Aos Profs. Drs. Luiz Augusto do Amaral e Oswaldo Durival Rossi Junior,
pela amizade e auxílio durante a realização deste trabalho.
Aos demais professores do Departamento de Medicina Veterinária
Preventiva e Reprodução Animal, pelo agradável convívio e pelos ensinamentos
ministrados.
Á Profa. Dra. Elisabeth Loshchagin Pizzolitto (UNESP – Araraquara), por
sua indispensável e importante colaboração e sua amizade.
Ao Dr. Luiz Francisco Zafalon, pela amizade e colaboração na realização
deste trabalho cedendo, gentilmente, as estirpes de Staphylococcus aureus de
seu projeto para novos estudos.
iv
Á todos os funcionários do Departamento de Medicina Veterinária
Preventiva e Reprodução Animal, em especial Liliana Biondi Naka (Lila) e
Waldemar Dibelli Jr. (Diba), pela amizade, pelo carinho, pela ajuda e
ensinamentos importantes para a realização desta pesquisa.
Á minha família, em especial, a minha mãe, por me proporcionar esta
oportunidade de estar aqui em Jaboticabal e poder cursar a pós-graduação, pelo
seu carinho e amor.
Ao meu padrinho Carlos e sua esposa Médica Veterinária Teresa Cristina
pelo apoio e carinho desde minha graduação.
Ao meu noivo Rafael pela confiança, companheirismo, pelos dias do meu
lado e também nos meus pensamentos enquanto estivemos longe.
Ao amigo Osvaldo, pela amizade, consideração e carinho durante estes
anos de caminhada.
Ás minhas amigas (os) de Uberlândia, em especial as amigas Lívia, Flávia,
Bruna, Cláudia, Larissa, Daniela e Ana Luíza que apesar da distância estiveram
sempre por perto e no meu coração.
A Profa. Ms. Sueli de Uberlândia pela amizade, carinho e apoio.
Aos Prof. Dra. Denise e Prof. Dr. Paulo do laboratório de Microbiologia da
Universidade Federal de Uberlândia pela amizade e apoio desde minha
graduação.
v
A todos os amigos do Cesec Uberlândia, em especial José Eustáquio,
Mara, Jussara, Neir, Eurípia, Orestes, Maria Antônia, Rúbia, Maria Eleusa, Maria
Helena, Elza, Cida, Cristina, Maria Joana, Osmar, Eleutério, Maricele, Renízia,
Cida, Fátima, Marise, Lúcia e a todos os outros pelo constante apoio, e confiança
em mim.
As amigas de República, Dáphine, Gerusa, Sabrina, Anita, Maira, Paula,
Roberta, Maristela, Pollyanna, pela amizade, e pelas alegrias que passamos
juntas.
Aos amigos de Jaboticabal, Raphaella, Luciano, Sandrinha, Lívia, Najara,
Jú Rossi, Jú Costa, Bruna, Fábio, Susy, Viviane, Tuti (Hinig Isa), Thaís, Natacha,
Ana Lígia, Karina, Raquel, Mônica, Tatiane, Raquel, Natália, Claúdia, Aracele, Ana
Paula, Ana Claúdia, Jean, Natália (argentina), Michele, Fernanda, Flávia, Gilson,
Bruno, Fernanda, Elaine, Lú, Karla, Guido, Luís Guilherme, Leilane, Juliana,
Simara, Wanderson e Joice, a todos os amigos do GOU (grupo de oração
universitário), a todos os amigos do Grupo Mãe Rainha, aos Padres Paulo e
Marcelo da Igreja Santa Tereza e a todos outros que não citei aqui, mas estão
guardados no meu coração.
Aos amigos irmãos Luciano, Vivi e Susy, pelo companheirismo não só no
laboratório, mas pela amizade presente em todos os momentos.
As amigas Vandréa, Graciele e Guta, pela amizade que perdura mesmo com
a distância.
vi
A todos os colegas do Departamento de Biologia, Laboratório de
Genética de Bactérias, pela ajuda na realização desta pesquisa e também pela
amizade.
Ao CNPq, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior,
pela bolsa concedida durante o Mestrado.
A FIOCRUZ, pelas cepas (ATCC) gentilmente cedidas para a realização
deste trabalho.
A FAPESP, Fundação de Apoio a Pesquisa do Estado de São Paulo, pelo
auxílio financeiro concedido para a realização deste trabalho.
A todos que me ajudaram a vencer mais uma batalha, em especial a aqueles
que duvidaram e essa dúvida só fez aumentar a minha persistência e força de
vontade.
Muito Obrigado a todos vocês, amigos (as), parentes, professores, colegas,
pois vocês contribuíram de alguma forma para a vitória de mais uma luta.
“FELICIDADE: É ter a oportunidade de viver intensamente todos os
momentos de uma existência. É olhar para trás e ver que está valendo a
pena. É acreditar que tudo que acontece é para o meu bem e para me fazer
cada dia mais feliz. A minha felicidade é feita das coisas simples e de
pessoas maravilhosas.”
Eduardo Botelho, Minutos de Felicidade.
vii
SUMÁRIO
Assunto Página
LISTA DE TABELAS................................................................... xi
LISTA DE ABREVIATURAS........................................................ xiii
LISTA DE ILUSTRAÇÕES............................................................ xiv
RESUMO...................................................................................... xv
ABSTRACT..................................................................................
1. INTRODUÇÃO.........................................................................
2. REVISÃO DE LITERATURA...................................................
2.1 A Mastite na Bovinocultura Leiteira...................................
2.1.2 California Mastitis Test ...................................................
2.1.3 Mastite X Tratamento......................................................
2.2 Staphylococcus spp e Staphylococcus aureus…………….
2.3 Biofilmes..............................................................................
2.3.1 Conceito...........................................................................
2.3.2 Composição dos Biofilmes...............................................
2.3.3 Teorias da Formação de Biofilmes..................................
2.4 Aderência Bacteriana.........................................................
2.4.1 Fatores que influenciam a adesão bacteriana.................
2.4.2 Mecanismo de adesão dos Staphylococcus aureus.........
2.5 Constituição da Matriz de Exopolissacarídeos..................... 15
2.6 Fase de variação................................................................
2.7 Resistência dos microrganismos nos biofilmes aos
componentes do sistema imune..............................................
2.8 Resistência dos microrganismos nos biofilmes aos
agentes antimicrobianos..........................................................
2.9 Pesquisas de avaliação da produção de biofilmes..............
viii
18
19
22
1
3
3
4
4
6
8
8
9
8
10
12
14
18
xvi
3. OBJETIVOS............................................................................
4. MATERIAL E MÉTODOS........................................................
4.1 Obtenção das amostras de leite.........................................
4.1.1 Propriedade A..................................................................
4.1.2 Características da propriedade rural e do rebanho.........
4.1.3 Propriedade B..................................................................
4.1.4 Características da propriedade rural e do rebanho.........
4.2 Seleção dos animais..........................................................
4.3
Propriedades A e B............................................................
4.3.1 CMT.................................................................................
4.3.2 Amostras de leite dos quartos mamários para
isolamento bacteriológico........................................................
4.3.3 Isolamento e Identificação das estirpes de
Staphylococcus aureus...........................................................
4.3.4 Teste da Coagulase livre em Tubo................................
4.3.5 Teste da Catalase..........................................................
4.3.6 Preparação Caldo MRVP..............................................
4.3.6.1 Reativo de Barrit.........................................................
4.3.6.2 Teste para Verificar a Produção da Acetoína a partir
da glicose (Voges-proskauer)..................................................
4.3.7 Teste da utilização aeróbia dos carboidratos (Maltose e
Trealose)................................................................................
4.4 Extração do DNA..............................................................
4.5 Amplificação de fragmento de DNA cromossomal para
identificação de estirpes de Staphylococcus aureus...............
4.6 Caracterização Fenotípica.................................................
4.6.1 Teste do Agar Vermelho Congo.....................................
ix
24
25
25
25
25
25
25
26
26
26
27
27
28
28
29
29
29
30
30
31
32
32
4.6.2 Produção de biofilmes “In vitro"........................................
4.7 Caracterização Genotípica................................................
4.7.1 Amplificação de DNA cromossomal pela reação em
cadeia da polimerase (PCR) para identificação dos genes
icaA e icaD..............................................................................
4.8 Teste de sensibilidade das estirpes de S. aureus aos
antimicrobianos.......................................................................
4.9 Análise Estatística.............................................................
5. RESULTADOS..........................................................................
6. DISCUSSÃO.............................................................................
6.1 Produção de “Slime” no Agar Vermelho Congo................
6.2 Quantificação da Produção de Biofilmes pelo Teste de
Aderência em Placas...............................................................
6.3 Presença dos genes icaA e icaD.......................................
6.4 Resistência dos S. aureus aos
antimicrobianos.......................................................................
6.5. Avaliação da concordância, sensibilidade,
especificidade, e valores preditivos positivos e negativos
entre os testes de diagnóstico.................................................
7. CONCLUSÕES..........................................................................
7.1 CONSIDERAÇÕES FINAIS.................................................
8. REFERÊNCIAS..........................................................................
APÊNDICE.....................................................................................
x
33
34
35
36
34
45
46
47
49
45
52
56
59
76
37
58
LISTA DE TABELAS
Tabelas Página
1. Distribuição das estirpes de S. aureus identificadas por testes
bioquímicos, pela técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR),
em duas propriedades no estado de São Paulo, no período de 2001 a
2006.........................................................................................................
2. Resultados do estudo fenotípico e genotípico das estirpes de S.
aureus para produção de slime, isoladas de amostras de leite,
oriundas de casos de mastite subclínica bovina, no período de 2001 a
2006.........................................................................................................
3. Sensibilidade e resistência das estirpes de S. aureus frente aos
antimicrobianos, isoladas de amostras de leite, de vacas com mastite
subclínica, em duas propriedades no estado de São Paulo, no período
de 2001 a 2006........................................................................................
4. Distribuição dos resultados das provas fenotípicas e genotípica das
estirpes de S. aureus, isoladas de amostras de leite, oriundas de
vacas com mastite subclínica, em duas propriedades, no estado de
São Paulo, no período de 2001 a 2006...................................................
5. Resultados da análise estatística das provas fenotípicas e genotípica
das estirpes de S. aureus, para a produção de biofilmes, isoladas de
amostras de leite, oriundas de casos de mastite subclínica bovina, em
duas propriedades, no estado de São Paulo, no período de 2001 à
2006..........................................................................................................
xi
37
38
39
41
43
6. Resultados da análise estatística das provas fenotípicas das estirpes
de S. aureus, para a produção de biofilmes, isoladas de amostras de
leite, oriundas de casos de mastite subclínica bovina, em duas
propriedades, no período de 2001 à 2006.......................................
xii
44
LISTA DE ABREVIATURAS
Palavras / Termos Abreviatura
Agar Vermelho Congo.............................................................
Brain Heart Infusion ………………………………………………
California Mastitis Test.............................................................
Colônias produtoras de slime...................................................
Colônias não produtoras de slime............................................
Contagem de Células Somáticas.............................................
Especificidade...........................................................................
Exopolissacarídeo....................................................................
Kappa.......................................................................................
Significância.............................................................................
Reação em Cadeia da Polimerase..........................................
Sensibilidade............................................................................
Staphylococcus aureus............................................................
Trypticase Soy Broth................................................................
Valor Preditivo Positivo............................................................
Valor Preditivo Negativo...........................................................
xiii
CRA
BHI
CMT
SP
NSP
CCS
E
EPS
K
p
PCR
S
S. aureus
TSB
VPP
VPN
17
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figuras Página
Figura 1: Representação esquemática das interações envolvidas na
adesão bacteriana a um substrato sólido..............................................
Figura 2: Colônias negras e rugosas no Agar Vermelho Congo,
estirpes de S. aureus produtoras de Slime...........................................
Figura 3: Colônias vermelhas e lisas no Agar Vermelho Congo,
estirpes de S. aureus não produtoras de Slime....................................
Figura 4: Teste de aderência em microplacas. Poços A1 e A2: ATCC
12228, S. aureus não produtores de biofilmes. Poços A3 e A4: ATCC
25923, S. aureus produtores de biofilmes, cepas coradas com Cristal
Violeta (1%). Visualização de estirpes positivas (Coloração evidente)
e Negativas (Coloração ausente ou Fraca)...........................................
12
xiv
32
32
33
18
ESTUDO FENOTÍPICO E GENOTÍPICO DA PRODUÇÃO DE BIOFILMES POR
ESTIRPES DE Staphylococcus aureus ISOLADAS DOS CASOS DE MASTITE
SUBCLÍNICA BOVINA.
RESUMO - Estudou-se 94 estirpes de Staphylococcus aureus obtidas do leite de
vacas com mastite subclínica em duas propriedades rurais no estado de São Paulo.
Essas estirpes foram caracterizadas fenotipicamente quanto a produção de biofilmes
pelos testes do agar vermelho congo e pelo teste de aderência em microplacas e
também foram genotipicamente identificadas pela presença dos genes icaA e icaD
responsáveis pela produção do polissacarídeo de adesão intercelular. Além disso, todas
as estirpes foram também submetidas ao teste de sensibilidade aos antimicrobianos.
Os resultados obtidos revelaram que 85% das estirpes produziram biofilmes “in vitro”
para o teste do agar vermelho congo. No teste de aderência em placas foi verificado
que 98,9% das estirpes produziram biofilme, devido a forte aderência nas placas de
polietileno. A presença dos genes icaA e icaD foi encontrada em 95,7% das estirpes de
S. aureus. No antibiograma foi observado que sete estirpes foram resistentes aos
seguintes antimicrobianos: cloranfenicol, clindamicina, eritromicina, gentamicina,
oxacilina e penicilinaG, sendo que as maiores resistências ocorreram frente a
gentamicina (2,2%) e a penicilina G (6,6%). Na avaliação dos testes fenotípicos com os
genotípicos o teste de aderência em microplacas foi o mais sensível (100%), sendo
indicado para identificar estirpes produtoras de biofilmes. Todos os testes, com exceção
do antibiograma, foram estatisticamente significativos (p<0,05).
Palavras-chaves: biofilmes, genes icaAD, mastite bovina, Staphylococcus aureus.
xv
19
PHENOTYPIC AND GENOTYPIC STUDIES OF BIOFILMS PRODUCTION BY
Staphylococcus aureus STRAINS ISOLATED FROM BOVINE SUBCLINICAL
MASTITIS
ABSTRACT – 94 Staphylococcus aureus strains obtained from milk samples of
cows suffering from subclinical mastitis in dairy herd, in two properties, in the state of
São Paulo were evaluated. These strains were characterized by the in vitro slime
production on the Congo red agar, biofilm formation and by the presence of icaA and
icaD genes which are responsible for the intercellular adhesion. All strains were too
subjected to in vitro susceptibility to 12 different antibiotics. The results revealed that
85% of isolates tested produced slime on the Congo red agar and 98,9% of the isolates
produced biofilm in vitro by the adherence in sterile 96-well “U” bottom polystyrene
tissue culture plates. 95,7% of isolates possessed the icaA and icaD genes. The results
of in vitro antibiotic susceptibility assay to 12 different antibiotics revealed that seven
isolates were resistance to follow antibiotics: clorphenicol, clindamicin, erythromycin,
gentamicin, oxacillin and penicillin, the higher resistance occurred to penicillin (6,6%)
and gentamicin (2,2%). In the study of phenotypic tests compared with genotypic test,
the 96-well polystyrene tissue culture plates assay was the most sensitivity (100%) and
is recommended with genotypic test for the investigation biofilm formation in S. aureus.
All the tests, exception of antibiotic susceptibility assay were statistically significant
(p<005).
Keywords: biofilms, bovine mastitis, icaAD genes, Staphylococcus aureus.
xvi
1
1. INTRODUÇÃO
Staphylococcus aureus são importantes agentes etiológicos que causam
infecções intramamárias em ruminantes e estão associados a várias formas de mastite
clínica e subclínica no rebanho leiteiro. Estima-se uma perda muito grande na pecuária
com a mastite bovina, além do que a virulência dos S. aureus na mastite depende da
produção de exotoxinas, proteínas de superfície e polissacarídeos extracelulares
contendo várias camadas.
As adesões dos S. aureus ao epitélio da glândula mamária são consideradas o
primeiro ponto crítico na patogenia da mastite sendo que a maioria das estirpes dos S.
aureus que causam mastite são circundadas por uma camada espessa (“slime”), que
ajuda na aderência e colonização dos microrganismos no epitélio da glândula mamária
(BASELGA et al., 1993; AGUILAR et al., 2001). A habilidade dos S. aureus aderirem à
superfície do epitélio tem sido associada à produção de biofilmes, composto de
multicamadas de células embebidas em uma matriz.
Os biofilmes são agregados de microrganismos embebidos em uma matriz
polimérica e aderidos a uma superfície sólida, formando uma estrutura porosa e
altamente hidratada contendo exopolissacarídeos e pequenos canais, abertos por entre
microcolônias. Este tipo de organização é extremamente vantajosa a todas as espécies
de microrganismos por fornecer proteção contra adversidades como desidratação,
colonização por bacteriófagos e resistência a antimicrobianos.
Os biofilmes podem ser benéficos, como para produção de vinagre e tratamento
de resíduos, assim como podem ser maléficos no que concerne à corrosão de metais
nos quais o biofilme está localizado ou quando biofilmes formados por bactérias
deterioradoras ou patogênicas podem gerar perdas para a indústria e tornar o produto
veiculador de doenças.
Algumas estirpes produtoras de biofilmes têm uma significante capacidade de
colonização quando comparadas com as estirpes não produtoras e variantes.
(BASELGA et al., 1993). Os biofilmes formados por S. aureus isolados de mastite estão
associados à redução da susceptibilidade a antimicrobianos, fato este atribuído a baixa
2
difusão de antimicrobianos na matriz e a baixa atividade metabólica das bactérias
dentro dos biofilmes.
Os biofilmes são também considerados exopolissacarídeos, com uma matriz
espessa, conhecida como “slime” rodeados de multicamadas de células sendo que a
produção dessa matriz está sobre um controle poligênico (JEFFERSON, 2004). A
cápsula é uma camada polissacarídea que protege as bactérias contra a fagocitose e
outras defesas do organismo e para fagocitar uma bactéria possuidora de envoltório
capsular é necessário que o organismo tenha anticorpos específicos contra os
polissacarídeos capsulares.
Tem sido estudada a utilização de antígenos capsulares de S. aureus como
vacina devido ao fato desses antígenos reforçarem a habilidade dos fagócitos
responderem a essas infecções (SORDELLI et al., 2000). Algumas evidências sugerem
que a capacidade genética dos S. aureus para produção de biofilmes tem aumentado a
habilidade destes microrganismos em iniciar e causar infecções intramamárias
persistentes, além de proteger as bactérias contra a fagocitose.
Além da habilidade dos S. aureus produzirem biofilmes ser um dos fatores de
virulência para a mastite, os biofilmes também são uns dos problemas em relação ao
tratamento das infecções por permitir que microrganismos fiquem protegidos da ação
de antimicrobianos e da fagocitose pelo sistema imune, o que torna a mastite subclínica
persistente. Devido à ausência de pesquisas relacionadas a presença de S. aureus
produtores de biofilmes em casos de mastite subclínica no Brasil hipotetizou-se a
realização deste trabalho.
3
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 A Mastite na Bovinocultura Leiteira
A mastite, inflamação da glândula mamária pode ser classificada em duas
formas: clínica e subclínica. A mastite subclínica apresenta prevalência muito maior que
a forma clínica e caracteriza-se por alterações na composição do leite, tais como
aumento no número de células somáticas e dos teores de cloro e sódio, além da
diminuição nos teores de caseína, lactose e gordura (FONSECA & SANTOS, 2000).
A preocupação com a mastite se justifica, pois se estima no rebanho brasileiro a
prevalência de 20 a 38% desta doença o que representaria perda da produção entre 12
a 15%, sendo assim a causa de perda econômica mais significativa na indústria leiteira.
Devem ser computados gastos com medicamentos, leite descartado, serviços
veterinários, descarte prematuro dos animais e a diminuição do valor comercial dos
animais (FONSECA & SANTOS, 2000; REIS et al., 2005). O centro nacional de controle
da mastite nos Estados Unidos (NMC) estimou em 2002 uma perda monetária de
aproximadamente US$ 2 bilhões (USDA, 2002 citado por VASUDEVAN et al, 2003).
Embora muitos patógenos bacterianos, como algumas bactérias do grupo
coliformes, possam estar relacionados ao ambiente que os animais vivem, existem
aqueles altamente associados à glândula mamária e a pele do teto, como os S. aureus
que emergiram como um dos microrganismos mais prevalentes na maior parte do
mundo (TOLLERSRUD et al., 2000).
O diagnóstico da mastite clínica é realizado a partir da observação das
alterações no leite e da presença de sinais da inflamação como a presença de dor,
edema no úbere e modificação das características da secreção do leite. No entanto, a
mastite subclínica pode ser melhor caracterizada pelo aumento da contagem de células
somáticas (CCS), devido ao influxo de leucócitos, uma vez que tanto o úbere quanto o
leite estarão aparentemente normais. O exame bacteriológico do leite, obtido em um
único quarto ou em todos os quartos mamários é o procedimento para estabelecer se o
úbere está infectado. Em surtos de mastite clínica no rebanho, ou em casos individuais,
4
o isolamento dos agentes etiológicos é o método de diagnóstico de eleição, sendo útil,
no monitoramento dos mesmos (BRITO et al., 2002).
2.1.2 California Mastitis Test
O método mais utilizado para auxiliar o diagnóstico da mastite subclínica é o
“California Mastitis Test” (CMT), desenvolvido por Schalm e Noorlander (1957). Este
teste estima o número de células somáticas no leite, sendo que, as principais vantagens
deste método podem ser atribuídas a elevada concordância com o exame
bacteriológico, o reduzido número de resultados falso-negativos além de ser um método
de fácil aplicação e baixo custo. (FAGLIARI et al., 1990; BRITO et al., 2002).
A interpretação do CMT baseia-se na observação visual da mistura do leite com
o reagente. A reação se processa entre o reagente e o material genético das células
somáticas presentes no leite, formando um gel cuja concentração é proporcional ao
número de células somáticas. O resultado do CMT é dado como negativo, suspeito,
fracamente positivo e fortemente positivo (BRITO et al., 2002).
2.1.3 Mastite X Tratamento
Estudos epidemiológicos revelaram que no tratamento com agentes
antimicrobianos a cura bacteriológica pode alcançar 80% dos casos, dependendo da
idade, número de parições, período de lactação, contagem de células somáticas e
outros fatores (WILSON et al., 1999). O tratamento no período seco atingiu resultados
de cura bacteriológica de 90 - 100% (OWENS et al., 2001), e em contraste as vacas em
lactação que foram tratadas obtiveram cura bacteriológica de 0-52%. O tratamento de
vacas mais velhas com alta contagem de células somáticas obteve menos sucesso que
o tratamento de vacas jovens com altas contagens de células somáticas além de ser
baixa eficiência dependendo dos patógenos presentes (DELUYKER et al., 1999;
SHEPHARD et al., 2000). Por exemplo, os Staphylococcus aureus foram refratários ao
tratamento (WILSON et al., 1999) e para infecções por: Streptococcus dysgalactiae,
5
Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis e Escherichia coli as taxas de cura
variaram de 33 -100%. (HILLERTON & KLIEM, 2002; WILSON et al, 1999).
Estudos epidemiológicos sugeriram que 40% dos casos de mastite foram
recorrentes após o fim do tratamento. (HILLERTON & KLIEM, 2002). A probabilidade da
mastite clínica reaparecer no mesmo quarto, no mês seguinte, é de 4,8 vezes maior se
a primeira terapia não for terminada com sucesso. (HOUBEN et al., 1993). Se a
primeira infecção ocorreu na lactação anterior, o risco de infecções recorrentes é baixo.
Em geral, a terapia utilizada para mastite é o uso de antimicrobianos para
combater a infecção latente. Vários relatos de testes de susceptibilidade confirmaram
que na última década patógenos isolados de casos de mastite têm permanecido
susceptíveis aos agentes antimicrobianos (ERSKINE et al., 2002; ROSSITO et al.,
2002), entretanto, o sucesso da terapia da mastite, desaponta em muitos casos, não
melhorando a saúde do úbere, e as contagens de células somáticas aumentam ou, se
diminuem começam a aumentar em um curto espaço de tempo.
Considerando a baixa eficiência da terapia, relacionada à resistência intrínseca
dos microrganismos e não a resistência adquirida, por patógenos comuns, e nenhuma
mudança na farmacocinética e na formulação dos agentes antimicrobianos, outros
fatores têm sido identificados por proteger patógenos do ataque de agentes
antimicrobianos. Uma das hipóteses mais convincentes para explicar a resistência à
terapia é a habilidade dos estafilococos tão bem quanto os outros microrganismos se
multiplicarem e formarem biofilmes em tecidos infectados, desenvolvendo assim uma
resistência inata à maioria dos agentes antimicrobianos (MELCHIOR et al., 2005).
A aderência de patógenos na mastite foi investigada “in vitro” e “in vivo”
(AGUILAR et al., 2001; ALMEIDA et al., 1999; HENSEN et al., 2000). Exames
microscópicos de S. aureus em tecido mamário com infecções agudas e crônicas
mostraram a permanência das bactérias agrupadas dentro dos alvéolos e ductos
lactíferos em associação com células epiteliais e invadidos por tecido intersticial. Estes
agrupamentos de bactérias apareceram aproximadamente 24 horas após a exposição
via intramamária ao patógeno.
6
2.2 Staphylococcus spp e Staphylococcus aureus
O leite é um ótimo meio para o desenvolvimento de microrganismos e entre os
agentes etiológicos causadores de mastite, destacam-se os de origem contagiosa e os
ambientais. Segundo Mendonça et al. (1999), apesar da grande variedade de agentes
infecciosos isolados a partir da glândula mamária, existem alguns que são
predominantes, como é o caso dos estafilococos e estreptococos.
O gênero Staphylococcus compreende diversas espécies e subespécies, que se
encontram amplamente distribuídas na natureza, sendo principalmente isolados na pele
e membranas mucosas de aves e mamíferos (KLOOS & BANNERMAN,1999). Desde a
sua proposição em 1884 por Rosenbach, o gênero Staphylococcus tem sido
classificado na família Micrococcaceae. Foi somente na última década, com o avanço
da biologia molecular, estudos genéticos, perfis de ácidos graxos, composição da
parede celular e principalmente, estudos com RNA ribossômico 16S que o gênero
Staphylococcus foi incluído numa nova família: Staphylococcaceae (GARRITY e HOLT,
2001). Atualmente já são 40 espécies descritas no gênero (BANNERMAN, 2003;
EUZÉBY, 2007), a maioria coagulase-negativo, caracterizando-se a exclusividade da
síntese desta enzima aos S. aureus, S. schleiferi subsps. coagulans, S. intermedius, S.
hyicus e S. delphini (BANNERMAN, 2003).
Os estafilococos são cocos Gram-positivos, imóveis, anaeróbios facultativos,
apresentando metabolismo fermentativo com produção de ácido e não de gás, não
fotossintético, não esporulado, catalase-positivos e capazes de se multiplicarem em
meio contendo 10% de cloreto de sódio. São microrganismos mesófilos, com
temperatura de desenvolvimento de 7 a 48º C, com ótima de 37º C e pH na faixa de 4,0
a 10,0, com ótimo de 6,0 a 7,0. (KLOOS & BANNERMAN, 1999).
No gênero Staphylococcus, o S. aureus sempre foi a espécie mais importante
relacionada com uma série de infecções e intoxicações no ser humano e nos animais.
Vários fatores de virulência são responsáveis pelos sinais clínicos e gravidade das
infecções causadas por S. aureus. Esses fatores incluem as hemolisinas α, β, γ, δ, a
leucocidina e um grupo de superantígenos tóxicos pirogênicos. (BANNERMAN, 2003).
7
S. aureus destacam-se como microrganismos causadores de mastites
contagiosas de maior importância, maior ocorrência nos rebanhos mundiais, e de
tratamento mais difícil devido à elevada resistência aos antimicrobianos. As infecções
intramamárias causadas por S. aureus apresentam implicações importantes em saúde
pública, tendo em vista que as toxinas podem ser excretadas no leite e permanecer
estáveis nos produtos oferecidos ao consumo. O risco à saúde humana está associado
ao consumo de leite dos rebanhos infectados, uma vez que a maioria dos casos de
mastite diagnosticados é de mastite subclínica. (FAGUNDES e OLIVEIRA, 2004).
MOTA et al. (2004) verificaram uma freqüência de 59,27% de amostras de leite
positivas ao CMT e 81,63% positivas ao exame microbiológico, destacando-se como
microrganismos prevalentes os Staphylococcus spp (52,16%) em propriedades no
estado de Pernambuco.
FERREIRA, (2004), encontrou 77 estirpes de S. aureus isoladas de amostras de
leite, procedentes de 40 vacas da raça holandesa, que apresentaram mastite
subclínica, em uma propriedade rural no estado de São Paulo. Encontrou também 4
padrões distintos de S. aureus resistentes aos agentes antimicrobianos e 9 padrões de
ribotipos diferentes em uma mesma propriedade, mostrando assim a heterogeneidade
genética dos S. aureus nas mastites bovinas.
ALMEIDA et al. (2005), em propriedades na região do sul de Minas Gerais
analisaram amostras de leite provenientes de 96 rebanhos, sendo que as maiores
freqüências de isolamentos foram de S. aureus (64,55%) seguido do Streptococcus
agalactiae (52%).
COSTA et al. (2005), verificaram a ocorrência de microrganismos em quartos
mamários negativos ao CMT e ao exame de Tamis, evidenciando a ocorrência de
45,1% de quartos mamários portadores, sendo considerado portadores os quartos que
foram positivos ao exame microbiológico e negativos ao CMT. Foram estudadas 87.039
glândulas de 148 propriedades leiteiras no estado de Minas Gerais e São Paulo, sendo
que 8,1% dos isolados foram Staphylococcus sp (55% foram coagulase negativo).
8
PEREIRA et al. (2007), avaliaram a ocorrência de mastite subclínica em 31
rebanhos no Sul do estado de Minas Gerais verificando que, entre as 2.368 vacas
submetidas ao CMT os principais patógenos isolados foram: Staphylococcus
coagulase-positivos (35,57%), Streptococcus agalactiae (21,33%), Staphylococcus
coagulase-negativos (7,37%), Corynebacterium sp (15,53%) e outros (20,2%).
2.3 Biofilmes
2.3.1 Conceito
Os biofilmes são constituídos de bactérias, as quais estão aderidas a qualquer
superfície, que por sua vez são envolvidas por uma matriz de polímeros orgânicos, ou
seja, são depósitos onde os microrganismos estão fortemente aderidos a uma
superfície por meio de filamentos de natureza protéica ou polissacarídica, denominados
glicocálice (COSTERTON et al., 1999).
2.3.2 Composição dos Biofilmes
A matriz de polímeros extracelulares de natureza polissacarídica ou protéica,
conhecida como glicocálice, expõe-se exteriormente à membrana externa das células
gram-negativas e ao peptideoglicano das células gram-positivas. A matriz é sintetizada
por polimerases, constituindo-se em uma estrutura composta de diversas fibras de
polissacarídeo ou proteínas globulares, e em seu estado hidratado contém cerca de
98% a 99% de água, protegendo as células da desidratação, já que podem reter água
em quantidades muito maiores que sua massa e se desidratam lentamente
(FIGUEIREDO, 2000).
A adesão superficial dos microrganismos forma o glicocálice, que sobrevive a
ambientes hostis, de modo a bloquear e reter os nutrientes necessários para o
crescimento dos biofilmes, além de oferecer proteção às células planctônicas contra
agentes antimicrobianos (TORTORA et al., 2000).
9
Os biofilmes contêm partículas de proteínas, lipídeos, fosfolipídeos, carboidratos,
sais minerais e vitaminas, que formam uma espécie de crosta, debaixo das quais os
microrganismos continuam a se multiplicar, seja em cultivo puro ou em associação com
outros microrganismos. Sendo assim, nos biofilmes os microrganismos estão mais
resistentes à ação de agentes físicos e químicos como os utilizados nos procedimentos
de higienização (RICHARD et al., 2003; MARQUES, 2005).
A água é o principal componente dos biofilmes, tornando-o hidrofílico (HOIBY et
al., 2001). Os canais abertos de água circulam entre as estruturas nos biofilmes
permitindo a aquisição e troca de genes por transferência horizontal (WUERTZ et al.,
2004).
2.3.3 Teorias da Formação de Biofilmes
Existem várias teorias para a formação de biofilmes e a primeira delas foi
descrita por Marshall et al. (1971), a qual relata que a adesão em superfícies é um
processo que ocorre em duas etapas. Na primeira etapa, o processo é ainda reversível,
pois os microrganismos estão fracamente aderidos à superfície por meio de forças de
Van der Walls e atração eletrostática, o que promove uma fácil remoção das células
bacterianas. Na segunda etapa, o processo é irreversível, depende do tempo de
aderência e envolve adesão física das células com as superfícies por meio de material
extracelular de natureza polissacarídica ou protéica produzida pelas bactérias,
denominado glicocálice, que suporta a adesão de biofilmes.
Uma segunda teoria sugere a existência de cinco etapas diferenciadas que
podem ser citadas na seguinte ordem: condicionamento da superfície pela adsorção de
material orgânico; transporte de células e nutrientes para o sítio de aderência; processo
de adesão bacteriana, por atração eletrostática, ainda reversível; multiplicação celular e
colonização e adesão irreversível. (DUDDRIDGE & PRITCHARD, 1983 citado por
MARQUES, 2005).
Uma terceira teoria proposta por Dormans et al. (1991) citado por Zotolla (1997),
indica a formação dos biofilmes em três etapas que seria a fixação das bactérias
10
seguida pela consolidação das bactérias nas superfícies e, por último, a colonização e a
multiplicação das bactérias nas superfícies. Na etapa de consolidação ocorre a
produção de material extracelular que facilita a fixação dos microrganismos.
2.4 Aderência Bacteriana
Quando as distâncias de separação entre as células bacterianas e as superfícies
a serem colonizadas forem maiores que 50ηm somente as forças atrativas de Van der
Waals atuam na adesão das bactérias aos substratos. Essa distância é relativamente
grande para a oposição de forças e o reconhecimento de componentes específicos de
superfície. A uma distância de 10 e 20ηm, ocorrem interações em virtude da repulsão
eletrostática, força que se opõe às forças de Van der Waals. Nessa etapa a adesão
pode ser reversível, porém altera-se com o tempo para pouco reversível ou
essencialmente irreversível, em razão do rearranjo da superfície da célula, o que leva
as interações de curta distância. Para isso, o filme de água precisa ser removido da
interface superfície/bactéria, pois o maior papel da hidrofobicidade e dos componentes
de superfície hidrofóbica na adesão bacteriana, provavelmente, é em razão do efeito
desidratante nesse filme de água, o que possibilita a ocorrência de interações
específicas de curta distância (FIGURA 1).
A uma distância menor que 1,5ηm, em que a barreira de energia potencial já foi
superada, interações específicas podem ocorrer. Essas interações podem levar a uma
ligação essencialmente irreversível. A interação específica é uma interação
microscópica, como a interação entre um componente da superfície da célula e o
substrato ocorre a uma distância extremamente curta e permite ligações específicas
iônicas, pontes de hidrogênio e outras ligações químicas. A interação não-específica é
definida como aquela que ocorre em virtude da propriedade de superfície microscópica
total, como as cargas ou a energia livre de superfície, sendo que essas interações
podem atuar à consideráveis distâncias do substrato (BUSSCHER & WEERKAMP,
1987).
11
Foi proposto recentemente um valor calculado com base na força de Van der
Waals, em que uma longa distância seria > 50ηm, enquanto que a curta seria menor
que 1,5ηm (MARQUES, 2005).
Após o contato inicial com a superfície, os microrganismos iniciam a produção de
fibras finas, que podem ser vistas por microscopia eletrônica. Essas fibras se tornam
mais grossas com o tempo, levando a formação das matrizes dos biofilmes, e dentro
das matrizes, outras substâncias orgânicas e inorgânicas e material particulado podem
existir juntamente com microrganismos. A produção de exopolissacarídeo (EPS)
aumenta com as adesões das bactérias às superfícies, caso as células dos biofilmes
sejam reinoculadas no meio como células planctônicas, haverá redução na produção de
EPS (KUMAR & ANAND, 1998).
12
2.4.1 Fatores que influenciam a adesão bacteriana
Vários fatores podem influenciar a adesão dos microrganismos às superfícies
como fase de multiplicação da célula, o tipo e as propriedades dos materiais, a
presença de matéria orgânica, o pH e a temperatura do meio que envolve os
microrganismos. (POMPERMAYER & GAYLARDE, 2000).
As células bacterianas possuem cargas negativas em potencial de hidrogênio
(pH) em torno de 3, sendo que as bactérias gram-positivas tem uma carga negativa que
é originária dos ácidos teicóicos e teiurônicos da parede e dos polipeptídeos do
glicocálice, e nas bactérias gram-negativas essa carga negativa é originária dos
lipopolissacarídeos e proteínas da membrana externa em conjunto com os polímeros do
13
glicocálice. Estudos recentes sugerem que a baixa multiplicação das células dentro dos
biofilmes é causada em resposta ao stress iniciado pela multiplicação das mesmas
dentro dos biofilmes sendo que células bacterianas sob inanição, que não estão
utilizando os nutrientes nos biofilmes, causam queda na sua multiplicação. Na fase
exponencial a multiplicação dos microrganismos ou a sua paralisação são
acompanhadas pelo aumento na resistência aos antimicrobianos (MARQUES, 2005).
Tanto as bactérias quanto os substratos adquirem cargas superficiais
(geralmente negativas) como resultado da adsorção de íons e, ou a ionização de
superfície. Quando as bactérias se aproximam dos substratos interações começam a se
desenvolver através da formação de substâncias exopoliméricas que formam uma
ponte entre os microrganismos e os substratos, embora a produção destas substâncias
extracelulares não dependa das mesmas interações eletrostáticas (ZOTTOLA &
SASAHARA, 1994; FIGUEIREDO, 2000).
A composição dos biofilmes é heterogênea, devido à presença do grande
número de variados microrganismos com várias propriedades fisiológicas e metabólicas
como resposta ao pH e requerimentos nutricionais ocorrendo dentro da matriz
polimérica, além do que, a distribuição destes microrganismos dentro dos biofilmes não
é uniforme podendo ocorrer interdependência entre as espécies o que contribui para o
aumento da resistência a agentes antimicrobianos, e a multiplicação dos
microrganismos na matriz é intercalado por canais de água altamente permeáveis.
(MORTON et al., 1998; MARQUES, 2005).
Em ambientes naturais, as células microbianas necessitam adaptar-se a
alterações no meio vizinho enquanto que as células dentro dos biofilmes não
necessitam desta adaptação, pois as matrizes dos biofilmes proporcionam a troca de
nutrientes orgânicos. Muitos polímeros das matrizes são de natureza aniônica, assim
podem se ligar aos cátions e proporcionar a reserva destes nutrientes, o que faz com
que as matrizes funcionem como reserva de energia e carbono. Devido à proximidade
das células microbianas nas matrizes dos biofilmes, a competividade por nutrientes
disponíveis é muito grande, por isso, os agentes microbianos que entram nas matrizes
acabam destruindo as células vizinhas (SUTHERLAND, 2001; MARQUES, 2005).
14
As estruturas das comunidades dos biofilmes variam com a localização, a
natureza dos microrganismos e a disponibilidade dos nutrientes. As células colonizadas
produzem polissacarídeo extracelular e migram até as superfícies dos biofilmes
lentamente formando juntas pequenos agrupamentos, estruturas em forma de
cogumelo, e canais cheios de água são formados entre estas pequenas colônias,
constituindo sistema circulatório primitivo, distribuindo nutrientes e removendo produtos
desnecessários para as comunidades de células nas microcolônias (SUTHERLAND,
2001; MARQUES, 2005; CLUTTERBUCK et al., 2007).
Colonizadores primários são os microrganismos que aderem primeiro à
superfície, favorecendo a adesão de espécies compatíveis. A presença dos
colonizadores primários inibe, mas não impede a aderência de outras bactérias, e
modifica as características da superfície aderida pela sua multiplicação, contribuindo
para a adesão de bactérias secundárias, detritos orgânicos, minerais e outros (BEECH
& SUNNER, 2004).
2.4.2 Mecanismo de adesão dos Staphylococcus aureus
Staphylococcus sp em especial o Staphylococcus aureus, produzem uma ampla
variedade de exoproteínas que contribuem para sua capacidade de colonizarem e de
causarem doenças em hospedeiros mamíferos e aves. Quase todas as estirpes
secretam enzimas e citotoxinas, as quais incluem hemolisinas (alfa, beta, gama e delta),
nucleases, proteases, lípases, hialuronidases e colagenase. A principal função destas
proteínas é converter os tecidos locais do hospedeiro em nutrientes necessários a sua
multiplicação, sendo que algumas estirpes produzem uma ou mais exoproteínas
adicionais, as quais incluem a toxina da síndrome do choque tóxico, as enterotoxinas
estafilocócicas (SE), as toxinas esfoliativas e a leucocidina (DINGES et al., 2000).
Staphylococcus aureus produzem duas proteínas associadas com a parede
celular que se ligam a fibronectina (Fn) e são chamadas de FnBPA e FnBPB. Os
mutantes de S. aureus que não possuíam o gene fnbA ou fnbB foram efetivos em aderir
a superfície, porém o duplo mutante para fnbA e fnbB foi deficiente na adesão e se um
15
dos dois tipos de genes for fornecido por plasmídeos, então a adesão é restaurada
(DALTON & MARCH, 1998; CUCARELLA et al., 2001).
A proliferação das células para aderir e formar biofilme é mediada pela produção
do polissacarídeo intercelular adesina (PIA) ou poly-N-succinil-β-1,6-glucosamina, a
síntese é codificada pelo gene produto do locus ica do operon icaABCD e os genes e
produtos do locus ica foram demonstrados fundamentais para a formação de biofilmes
e virulência dos microrganismos e são regulados em resposta a fatores ambientais,
como glicose, anaerobiose, alta osmolaridade e temperatura, limitação de etanol e ferro
(O’ TOOLE et al., 2000; STANLEY & LAZAZZERA, 2004 citado por MARQUES, 2005).
O polissacarídeo capsular adesina PS/A é responsável pela adesão primária à
superfície celular e sua síntese é controlada pelo lócus ica, em seguida multicamadas
de células são formadas devido a produção do polissacarídeo intercelular adesina (PIA)
também controlado pelo lócus icaADBC. Foi demonstrado que os genes icaA e icaD
tem importante papel na formação dos biofilmes por S. aureus e S. epidermidis
(ARCIOLA et al., 2001; VASUDEVAN et al., 2003).
O quorum-sensing dos S. aureus é um sistema de comunicação bacteriana sobre
a densidade de células presentes nos biofilmes, e o locus responsável é o locus agr que
consiste em 4 genes (agrA, agrC, agrD, agrB), sendo que este locus é ativado durante a
transição da fase de multiplicação exponencial para a fase estacionária por um
mecanismo autorregulatório que envolve um peptídeo modificado que sinaliza a
densidade celular (VOUNG et al., 2000; JEFFERSON, 2004).
2.5 Constituição da Matriz de Exopolissacarídeos
Os polissacarídeos bacterianos têm sido objetos de estudo principalmente por
suas propriedades, como as interações parasito-hospedeiro, como determinante
imunológico ou por sua capacidade adesiva e representam 65% do material extracelular
(CHRISTENSEN, 1989; citado por BERNADI, 2005).
Os polissacarídeos podem ser classificados de acordo com sua fonte,
biossíntese, estruturas, propriedades físicas (características de adsorção, solubilidade,
16
trocas iônicas, viscosidade, formação de gel e interação polímero-polímero) ou
biológicas.
Os componentes extracelulares e de superfície celular mais comum são a
glicose, galactose, manose, fucose, ramnose, glicosamina, galactosamina, ácido
glicurônico e galacturônico, proteínas, ácidos nucléicos e lipídeos (CHRISTENSEN,
1989; citado por BERNADI, 2005).
Muitas moléculas têm sido identificadas com o envolvimento direto do processo
de adesão célula a célula e é possível colocá-las em dois maiores grupos: carboidratos
poliméricos e proteínas poliméricas e, bioquimicamente, a adesina polissacarídica
extracelular tem função essencial na aderência inicial e na adesão intercelular
(formação dos biofilmes) (MORALES et al., 2004; ZHANG et al., 1998).
Há vários outros polissacarídeos que compõe o “slime”, mas um polissacarídeo
específico de alto peso molecular que tem a mesma função da cápsula bacteriana e
intervém a aderência inicial das bactérias nas superfícies dos polímeros é chamado de
polissacarídeo capsular/adesina (PS/A) (ARCIOLA et al., 2001; GOTZ, 2002) e é
descrito como componente da superfície celular e da camada do biofilme protegendo as
bactérias das defesas do hospedeiro e da fagocitose e está envolvido no primeiro passo
da adesão primária, acompanhada da proliferação das células em agrupamentos de
multicamadas (ARCIOLA et al., 2001; FARBER et al., 1990; GERKE et al., 1998;
HANDKE et al., 2004). Hoje, o PS/A é conhecido como PNAG (poli-succinil-
glicosamina) e estudos o descrevem como um forte candidato na produção de vacina
contra doenças estafilocócicas (BALDASSARI et al., 1996; HANDKE et al., 2004).
Em um segundo passo, há a formação de grandes grupos celulares que são
associados com a produção do polissacarídeo intercelular/adesina chamado de PIA que
é um homopolímero linear de até 130 resíduos de b-1,6-glicosamina N-acetilado (15% a
20% diacetilados) composto por duas frações polissacarídicas: polissacarídeo I (>80%)
e polissacarídeo II (< 20%) estruturalmente relacionado ao polissacarídeo I com baixa
quantidade de resíduos não N-acetilados D-glicosamina, fosfato e éster ligado a
sucsunato, sendo aniônico (MORALES et al., 2004). O PIA é localizado na superfície
celular mediado por produtos do gene cromossômico ica (intercelular adhesion) que
17
corresponde a quatro genes de adesão intercelular, icaA, icaD, icaB e icaC, e um gene
regulador, icaR organizados em uma estrutura operon envolvidos na produção deste
polissacarídeo e codificam quatro proteínas que são necessárias para a síntese do PIA
que são, icaA, icaD, icaB e icaC (ARCIOLA et al., 2001; CAFISO et al., 2004; CONLON
et al., 2002; FITZGERALD et al., 2005;JOHANNES et al., 2001 GERKE et al., 1998;
GOTZ, 2002).
O PIA é envolvido no acúmulo celular dos Staphylococcus sp nas superfícies, na
hemaglutinação e também age na adesão intercelular em vidro e outras superfícies
hidrofílicas e é distinto do PS/A. Também é descrito que o PS/A e o PIA dividem em sua
constituição um mesmo arranjo de b-1-6-glicosamina diferindo em um substituinte
primário no grupo amino e tamanho molecular, mostrando que ambos são produzidos
de proteínas codificadas no locus ica. A síntese do polissacarídeo capsular-PS/A é
mediada por um operon ica que uma vez ativado, um polissacarídeo de adesão
intercelular-PIA é sintetizado (ARCIOLA et al., 2001).
O gene icaA representa atividade catalítica N-acetilglicosaminatranferase e que
sozinha tem baixa atividade transferase mas, quando é co-expressa com o gene icaD
apresenta atividade total sintetizando resíduos longos de 10-20 oligômeros de b 1,6-N-
acetil glicosamina (DOBINSKY et al., 2002; GALDBART et al., 2000; GOTZ, 2002).
Longos oligômeros de até 130 resíduos são formados na presença do gene icaC, e o
gene icaB está presente principalmente no sobrenadante das culturas e codifica uma
proteína que catalisa reações de diacetilação durante a biossíntese do PIA e é
secretado quando da necessidade de icaC que sintetiza longos oligômeros, sendo que
o gene ica C não tem atividade bem definida, mas deve estar envolvida no transporte
transmembrana por ser uma proteína integrante da membrana, não tendo atividade
essencial para a síntese do PIA (DOBINSKY et al. , 2002; GOTZ, 2002).
18
2.6. Fase de variação
O fenômeno fase de variação, colônias de S. aureus produtoras de “slime” foram
capazes de após novo cultivo no Agar Vermelho Congo (CRA) não produzirem mais
“slime” e colônias não produtoras se tornaram produtoras, foi primeiramente descrito
por Baselga et al. (1993) referindo-se aos S. aureus isolados de casos de mastite. No
referido trabalho foi descrito as diferenças entre estirpes produtoras de “slime” (SP) e
não produtoras de “slime” (NSP), que se multiplicaram no Agar Vermelho Congo. Com
repetidos sub-cultivos foi possível converter estirpes não produtoras de “slime” em
estirpes produtoras de “slime” e vice-versa.
Pesquisas feitas por Conlon et al. (2004) demonstraram que a fase de variação
está sob regulação do locus icaADBC e ocorre quando esses genes são inativados ou
tem baixa regulação na expressão gênica, sendo que, esta fase de variação representa
um importante mecanismo que facilita a saída das células livres dos biofilmes. Essa
saída das células dos biofilmes resultou na ativação da expressão do gene por meio de
adesão, toxinas e rápida multiplicação, e esse estágio é frequentemente acompanhado
por recorrência da infecção.
2.7 Resistência dos microrganismos nos biofilmes aos componentes do sistema
imune
Os exopolímeros formados nos biofilmes protegem as bactérias de componentes
do sistema imune. “Slime” extracelular produzido por S. epidermidis protegeu células da
atividade fagocitária de macrófagos e contra opsoninas assim como a espécies reativas
ao oxigênio em leucócitos polimorfonucleares (YASUDA et al., 1994).
Uma baixa atividade bactericida dos neutrófilos foi observada contra estirpes de
S. aureus produtoras de “slime”. (BARRIO et al., 2000).
19
2.8 Resistência dos microrganismos nos biofilmes aos agentes antimicrobianos
A farmacodinâmica e a farmacocinética dos agentes antimicrobianos usados na
terapia da mastite têm sido discutidos em relação a aparente resistência da terapia. A
aplicação parenteral de antimicrobianos depende de muitos fatores na passagem dos
agentes do sangue para o leite tais como: soro proteína ligante, lipossolubilidade e
valores de pKa. Além de proteínas do leite ligantes, a inativação por íons quelantes (Ca
e Mg) no leite influencia a terapia antimicrobiana (DU PREEZ, 2000).
A composição da terapia determina se níveis efetivos ou não efetivos de
antimicrobianos no tecido mamário são alcançados na administração intramamária.
Além disso, a distribuição do agente antimicrobiano no tecido mamário pode ser
impedida por mudanças patológicas como, por exemplo, necrose e isquemia, não
permitindo que o antimicrobiano chegue ao local de atuação (SHOSHANI et al, 2000).
S. aureus, intracelular em leucócitos polimorfonucleares (PMF), mostrou longos
períodos de replicação tornando-se menos susceptível aos antimicrobianos, que
exercem limitados efeitos bactericidas em microrganismos que não estão se dividindo,
como as penicilinas e cefalosporinas (YANCEY et al., 1991).
A hipótese que infecções mamárias são associadas com a formação de biofilmes
é também realçada pela falha na sensibilidade aos antimicrobianos. Em uma célula
primária epitelial mamária os testes para sensibilidade de neomicina, neomicina com
penicilina, neomicina com tetraciclina, neomicina com bacitracina, e tetraciclina com
bacitracina foram mais sensíveis para células não aderentes de S. aureus que para
células aderentes (HENSEN, 2000). Um estudo comparativo com 11 antimicrobianos,
calculado de acordo com a concentração-dependente de ação contra biofilmes imaturos
(6h) e biofilmes maduros (18h) formados pela multiplicação dos S. aureus em caldo ou
em leite mostrou que em geral, antimicrobianos tiveram um melhor efeito em biofilmes
imaturos e também naqueles que se multiplicaram no leite, que em biofilmes maturos e
também naqueles que multiplicaram em caldo (AMORENA et al., 1999). Esse
experimento também mostrou que a gentamicina e a eritromicina foram os
antimicrobianos menos efetivos contra Staphylococcus aureus nos biofilmes.
20
Estudos “in vitro” demonstraram que as bactérias nos biofilmes tornaram-se de
10-1000 vezes mais resistentes aos efeitos dos agentes antimicrobianos quando
comparadas com as células livres das mesmas estirpes (AMORENA et al., 1999;
OLSON et al., 2002; CONLEY et al., 2003). Os mecanismos responsáveis pela
resistência dos microrganimos nos biofilmes aos agentes antimicrobianos são: demora
na penetração de agentes antimicrobianos através das matrizes dos biofilmes, taxa de
multiplicação alterada de organismos nos biofilmes, mudanças fisiológicas com o
crescimento dos biofilmes incluindo as células persistentes.
A matriz de exopolisacarídeo funciona como barreira aos agentes
antimicrobianos (STEWART, 1996).
ANDERL et al, (2000) mostraram que a ampicilina não foi capaz de penetrar nos
biofilmes formado por Klebsiella pneumoniae e alguns mutantes deficientes de β-
lactamase multiplicaram em biofilmes e foram resistentes a ampicilina. Uma correlação
positiva entre a espessura dos biofilmes e sua resistência a antimicrobianos foi
observada (AMORENA et al., 1999; MONZON et al., 2001, 2002).
Uma baixa taxa de multiplicação das bactérias foi observada (COSTERTON, et
al.1999), e esse fenômeno aconteceu por uma baixa susceptibilidade das bactérias em
biofilmes submetidos a agentes antimicrobianos, a qual é exigida para a multiplicação
dos microrganismos, devido ao efeito bactericida dos antimicrobianos. Por exemplo,
penicilinas e cefalosporinas praticamente não têm efeito em células que não estão se
multiplicando, e o efeito bactericida é proporcional à multiplicação das células
bacterianas. Várias classes de antimicrobianos incluindo aminoglicosídeos e
fluorquinolonas, no entanto, podem destruir células em não divisão, mas são mais
eficientes em células que se dividem rapidamente.
A penetração de antimicrobianos e as baixas taxas de replicações bacterianas
não explicam inteiramente a resistência dos biofilmes a um dos mais importantes
grupos dos agentes antimicrobianos, as fluorquinolonas, compostos esses que
atravessaram o biofilme bacteriano e foram capazes de destruirem células em não
divisão (BROOUN et al., 2000), no entanto, depois de 3-4 horas de multiplicação
bacteriana, uma maior concentração de agentes antimicrobianos não aumentou o efeito
21
bactericida. Este experimento mostrou que uma pequena fração de células persistentes
podem permanecer após a administração das fluorquinolonas e sugeriu-se que estas
células persistentes eram células que tinham o mecanismo de morte celular inativado
(LEWIS, 2000).
As células persistentes foram responsáveis pela sobrevivência das populações
bacterianas, e as mudanças fisiológicas adaptativas nas células persistentes foram
vistas como a chave para a extraordinária propriedade de sobrevivência dos biofilmes
(LEWIS, 2001). As bactérias removidas dos biofilmes foram tão sensíveis quanto as
células livres primárias (ANDERL et al., 2003).
Estudos evidenciaram que os antimicrobianos não foram somente menos
efetivos nos biofilmes, mas também estimularam a formação dos mesmos. Para três
classes de antimicrobianos, incluindo as tetraciclinas, quinopristina e eritromicina a
expressão dos genes ica foram estimuladas, e a indução desses genes por
antimicrobianos promoveu a aderência das bactérias as superfícies biológicas e
estimulou a formação de biofilmes. Concentrações mínimas de antimicrobianos podem
influenciar na expressão de fatores de virulência importantes como a adesão de
moléculas e produção de toxinas (RACHID et al. 2000).
Uma das formas de se melhorar as taxas de curas bacteriológicas é estender a
duração da terapia (SOL et al., 2000). O tratamento das infecções por S. aureus por 3-4
dias resultou em 29% de cura bacteriológica, enquanto que o tratamento por 5 dias
resultou em 42% de cura (PYORALA, 1998). A extensão da terapia de 3-6 dias
melhorou as taxas de cura da infecção por S. uberis de 60% para 70-80%
respectivamente (HILLERTON & KLIEM 2002).
A dinâmica das formações dos biofilmes e da saída dos microrganismos para a
formação de novos biofilmes pode explicar a natureza de infecções pelo mesmo, e a
necessidade de extensão da terapia a fim que quebrar o ciclo de formação dos
biofilmes (MELCHIOR et al., 2005).
22
2.9 Pesquisas de avaliação da produção de biofilmes
A capacidade dos S. aureus em formarem biofilmes “in vivo” é considerada o
maior fator de virulência na patogenia da mastite. Foi realizado um estudo que avaliou a
capacidade de formação de biofilmes “in vitro” e a presença do locus ica e genes icaA e
icaD em 35 estirpes de S. aureus oriundos de casos de mastite, sendo que 32 (91,4%)
destas estirpes produziram “slime” no Agar Vermelho Congo, enquanto que apenas 24
(68,57%) produziram biofilmes “in vitro”. Entretanto, todas as 35 (100%) estirpes foram
positivas para os genes icaA e icaD, esse estudo mostrou uma alta prevalência dos
genes icaA e icaD em S. aureus isolados de mastite, sendo recomendado a
combinação dos testes genotípicos e fenotípicos para a investigação de biofilmes
(VASUDEVAN et al., 2003).
BERNADI, (2005), avaliou estirpes hospitalares de Staphylococcus coagulase
negativos isoladas de cateteres quanto a habilidade da produção de biofilmes sobre
superfícies abióticas (cateter esterilizado), antibiograma e a presença de genes icaAD.
Foram analisadas 27 estirpes Staphylococcus coagulase-negativos (10 Staphylococcus
epidermidis, 4 S. haemolyticus, 2 S. hominis, 2 S. lugdunensis, 1 S. saprophyticus, 1 S.
schleiferi, 2 S. xylosus e 4 S. warneri). Os genes icaAD foram detectados em dez
estirpes S.epidermidis. A habilidade de formar slime foi testada em placas contendo
ágar vermelho Congo, no qual foram observadas colônias negras em 10 estirpes de S
epidermidis, 4 de S. haemolyticus, 4 de S. warneri, 2 de S. xylosus e 1 de S.
chromogenes. A aderência dos Staphylococcus coagulase-negativos ao poliestireno foi
observada em 19 estirpes, incluindo: 10 de S. epidermidis, 3 de S. haemolyticus, 3 de
S. warneri, 2 de S. xylosus, 1 de S. chromogenes.
O antibiograma mostrou que 100%
Staphylococcus coagulase-negativos eram sensíveis a vancomicina e 88,88%
resistentes a pencilina.
A detecção de slime, e a habilidade de aderir e formar biofilmes foi observada na
maioria das estirpes de Staphylococcus coagulase-negativos sugerindo elevada
ocorrência de estirpes com potencial patogênico em ambiente hospitalar. As mesmas
estirpes que produziram slime foram resistentes a oxacilina e formaram biofilmes, eram
23
também resistentes a mais de seis antimicrobianos. A presença dos genes de adesão
intercelular (icaAD) foi detectada na maioria das estirpes de Staphylococcus coagulase-
negativos, exceção para S. saprophyticus e S. scheleiferi, sugerindo que estas estirpes
não tem homologia com S. epidermidis.
Estirpes de S. aureus foram investigadas quanto a presença do locus ica e sobre
sua influência na formação de biofilmes. A produção de biofilmes “in vitro” pelo teste
aderência em placas ocorreu em 78% das estirpes positivas para o gene icaA e de 59%
para o gene icaD, e a deleção do ica locus resultou na perda da habilidade de formar
biofilmes. Outros experimentos revelaram que a presença do icaA em muitas espécies
de Staphylococcus, está correlacionado com a adesão célula-célula e o potencial de
formar biofilmes está relacionado a este gene. (CRAMTON et al, 1999).
Estudou-se a presença dos genes icaA e icaD em uma coleção de 91 estirpes de
estafilococos (68 S. epidermidis e 23 S. aureus) de infecções associada a catéteres
venosos e em 10 estirpes de pele e mucosa de voluntários sadios. A habilidade de
formar “slime” foi testada no agar vermelho congo. Para o S. epidermidis 49% das
estirpes foram positivas para a formação de “slime” e para a presença dos genes icaA e
icaD e para o S. aureus 61% das estirpes foram positivas para produção de “slime” e a
presença dos genes icaA e icaD. (ARCIOLA et al., 2001).
24
3. OBJETIVOS
3.1 GERAL:
Verificar a capacidade produtora de biofilmes por estirpes de Staphylococcus
aureus isoladas de amostras de leite oriundas de casos de mastite subclínica bovina.
3.2 ESPECÍFICOS:
Confirmar as estirpes de S. aureus isoladas pelo método de reação em
cadeia da polimerase (PCR).
Avaliar as produções de “slime” através da morfologia dos S. aureus
apresentada no Agar Vermelho Congo (CRA).
Determinar a habilidade dos S. aureus produzirem biofilmes "in vitro" pelo
método de aderência em microplacas.
Identificar os genes icaA e icaD responsáveis pela produção do
polissacarídeo de adesão intercelular (PIA) utilizando a Reação em Cadeia da
Polimerase (PCR).
Avaliar o perfil de sensibilidade e resistência das estirpes de S. aureus frente
aos antimicrobianos.
Avaliar a concordância, sensibilidade, especificidade, valores preditivos
positivo e negativo entre os testes fenotípicos (Agar Vermelho Congo, Teste
de aderência em placas e perfil de sensibilidade e resistência dos S. aureus
frente aos antimicrobianos) e o teste genotípico (presença dos genes icaAD)
e também avaliar os parâmetros citados acima entre o teste de aderência em
placas e a morfologia no Agar vermelho congo.
25
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Obtenção das amostras de leite
4.1.1 Propriedade A
4.1.2 Características da propriedade rural e do rebanho
Foram colhidas amostras de leite oriundas de 40 vacas aparentemente sadias,
porém reagentes ao Califórnia Mastistis Test em uma propriedade rural produtora de
leite tipo C situada no município de Colina/SP. Este rebanho era constituído por vacas
mestiças 7/8 holandesas, variedade preta e branca, ordenhadas mecanicamente uma
vez ao dia, sendo adotado o sistema de “balde ao pé”, cuja produção global média
situou-se em torno de 400 litros diários.
4.1.3 Propriedade B
4.1.4 Características da propriedade rural e do rebanho
Foram colhidas amostras de leite oriundas de 80 vacas aparentemente sadias,
porém reagentes ao CMT, em uma propriedade rural produtora de leite tipo B
pertencentes ao Centro de Bovinos de Leite do Instituto de Zootecnia de Nova Odessa,
Estado de São Paulo, órgão da Agência Paulista de Tecnologia do Agronegócio. O
rebanho leiteiro era constituído por vacas P.O., holandesas e pardo-suíças, cuja
produção global média situava-se em torno de 1200 litros diários cuja ordenha era
efetuada mecanicamente em sistema de circuito fechado, sendo realizada duas vezes
ao dia.
26
4.2 Seleção dos animais
Em ambas as propriedades todas as vacas lactantes aparentemente sadias
foram submetidas mensalmente à prova do California Mastitis Test (CMT). Investigou-
se também a presença de animais com quadro clínico de mastite, sendo
desconsideradas as vacas que apresentavam reações positivas ao CMT nos primeiros
10 dias de lactação e nos 30 dias anteriores à secagem. Foram colhidas, de acordo
com as normas de assepsia propostas por Harmon et al (1990), amostras de leite dos
animais reagentes ao CMT e dos que apresentassem sinais evidentes da presença de
mastite clínica.
4.3 Propriedades A e B
4.3.1
Realização da prova do “Califórnia Mastitis Test” (CMT)
Após a lavagem dos tetos com água corrente e secagem com papel toalha foram
desprezados os três primeiros jatos de leite, em seguida, colhidos cerca de dois
mililitros em uma bandeja plástica apropriada contendo quatro compartimentos
circulares distintos. Depois do escoamento do excesso de leite efetuado por inclinação
da bandeja, adicionava-se igual quantidade do reagente, tendo-se o cuidado de evitar a
formação de espuma. A homogeneização foi efetuada com movimentos circulares e
uniformes, durante 10 a 15 segundos, quando se realizavam as leituras e a
interpretação da prova. Assim foram consideradas positivas as misturas (leite +
reagente) que apresentavam evidente formação de gel viscoso, acompanhadas ou não
pela coloração violeta, e negativas as misturas que permaneceram inalteradas, ou seja,
sem a clara evidenciação de viscosidade (SCHALM E NOORLANDER, 1957).
27
4.3.2 Amostras de leite dos quartos mamários para isolamento bacteriológico
As amostras foram colhidas de acordo com os procedimentos recomendados
pelo National Mastitis Council (HARMON, 1990). Após a limpeza do óstio papilar com
álcool etílico 70% (v/v) utilizou-se tubos de ensaio esterilizados para acondicionar
amostras individuais de 2 a 5 mL de leite, em duplicatas, de cada quarto mamário,
antes do início da ordenha. Os tubos contendo as amostras foram colocados em caixa
de material isotérmico contendo cubos de gelo e levados ao laboratório de Análises de
Alimentos e Água do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução
Animal - UNESP – Jaboticabal-SP, e Laboratório do Centro de Pesquisas do Instituto de
Zootecnia do Estado de São Paulo na cidade de Nova Odessa-SP para isolamento e
identificação bacteriana.
4.3.3 Isolamento e Identificação das estirpes de Staphylococcus aureus.
As estirpes de Staphylococcus aureus foram isoladas seguindo o procedimento
indicado abaixo, sendo que na presente pesquisa estas estirpes já tinham sido
previamente isoladas de acordo com a metodologia descrita abaixo.
Foram semeados dez microlitros das amostras de leite de cada quarto mamário
sobre a superfície do Agar Sangue de carneiro a 5% (Oxoid, Hampshire, Inglaterra), em
placas de Petri, em duplicatas e depois as placas foram incubadas à 37ºC durante 24 a
48 horas. Após a incubação colônias sugestivas de microrganismos do gênero
Staphylococcus foram submetidas à coloração pelo método de Gram.
As colônias classificadas como cocos Gram-positivos foram submetidas às
provas da catalase e coagulase lenta com plasma de coelho (MAC FADDIN, 1976;
APHA, 2001). As estirpes catalase e coagulase positivas foram submetidas à prova
para verificação da produção de acetoína (caldo MRVP - Oxoid, Hampshire, Inglaterra)
para a diferenciação entre Staphylococcus aureus, Staphylococcus hyicus,
Staphylococcus delphini e Staphylococcus intermedius.
28
As estirpes produtoras de acetoína foram testadas quanto à utilização ou não da
maltose e trealose (MAC FADDIN, 1976; MURRAY et al., 1999; APHA, 2001), para a
diferenciação entre Staphylococcus aureus e Staphylococcus schleiferi subespécie
coagulans. As estirpes que se mostraram positivas a essas provas foram classificadas
como Staphylococcus aureus (HOLT et al., 1994).
4.3.4 Teste da Coagulase livre em Tubo
Em tubos de vidro estéreis (13x100), foram depositados 0,5 mL de plasma de
coelho, diluídos 1:5. Adicionou-se também 0,5 mL de cultura pura de estirpe de
S.aureus após 24 horas de cultivo em caldo BHI. Os tubos foram inclinados,
suavemente, sem agitar e incubados a 37ºC em banho-maria.
Foram analisados quanto à formação do coágulo com 1 hora após incubação em
banho-maria. E a cada uma hora logo após a primeira hora até completar 4 horas.
Foram consideradas estirpes positivas aquelas que coagularam o plasma, formando um
coágulo visível. (MAC FADDIN, 1976).
4.3.5 Teste da Catalase
Com uma alça de semeadura flambada retirou-se uma colônia pura de cultivo de
S. aureus (24hs cultivo). Logo após, foi feito um esfregaço em uma lâmina de vidro
limpa. Adicionou-se uma gota de água oxigenada (H
2
O
2
) a 3% sobre o esfregaço na
lâmina. As estirpes que apresentaram imediato borbulhamento (liberação de gás) foram
consideradas positivas (MAC FADDIN, 1976).
29
4.3.6 Preparação Caldo MRVP
O meio desidratado foi adicionado à água destilada na proporção de 17 gramas
por litro e a mistura homogeneizada até a completa dissolução. A seguir o caldo foi
distribuído em tubos (10X100mm) na quantidade de 2,5mL e estes esterilizados a 121º
C por 15 minutos. Os tubos foram mantidos à 4ºC até o momento do uso.
4.3.6.1 Reativo de Barrit (MAC FADDIN, 1976).
Solução de alfa-naftol 5%
Alfa-naftol (5,0 gramas) e álcool etílico absoluto (100mL). Dissolveu-se o alfa-
naftol no álcool etílico e armazenou-se em um frasco escuro na geladeira a 4ºC.
Solução de hidróxido de Potássio 40% q.s.p
Foram dissolvidas 40 gramas de hidróxido de potássio em 100mL (q.s.p) de água
destilada e a solução foi armazenada em frasco escuro sob refrigeração.
4.3.6.2 Teste para Verificar a Produção da Acetoína a partir da glicose (Voges-
proskauer)
As estirpes de estafilococos foram inoculadas em tubos contendo caldo de
cultivo MRVP e incubadas à 28º C por 48 horas. Após a incubação adicionou-se uma
solução de alfa-naftol a 5% e 0,2 mL de solução de hidróxido de potássio a 40% (reativo
de Barrit) em cada tubo. Após agitação foi feita a leitura, e foram considerados positivos
os tubos que estiveram com a coloração vermelha em até 15 minutos (MAC FADDIN,
1976).
30
4.3.7 Teste da utilização aeróbia dos carboidratos (Maltose e Trealose)
As estirpes produtoras de acetoína foram testadas quanto à utilização da maltose
e trealose (Vetec, Rio de Janeiro), para a diferenciação entre Staphylococcus aureus e
Staphylococcus schleiferi subespécie coagulans.
Estes testes foram realizados em Caldo Vermelho de Fenol (Oxoid, Hampshire,
Inglaterra), suplementado com 1% do respectivo carboidrato (o carboidrato foi
adicionado no meio após ter sido filtrado em membrana de diâmetro 0,45µ poro). Foi
inoculado o microrganismo a ser testado no meio suplementado com o carboidrato
específico e incubado em estufa bacteriológica a 35-37º C por até 24 horas. Leitura:
Prova positiva: multiplicação do microrganismo com viragem do pH do meio de cultura
(vermelho para amarelo). Prova negativa: multiplicação do microrganismo sem
alteração de cor. (MAC FADDIN, 1976; MURRAY et al., 1999; APHA, 2001).
4.4 Extração do DNA
A extração do DNA bacteriano foi realizada no Laboratório de Epidemiologia
Molecular no departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução Animal
(UNESP) utilizando o Kit GFX Genomic Blood (Amersham Biosciences) que contém
uma solução de lise, solução de extração, solução de lavagem e colunas de GFX de
purificação, além de ter sido feito um pré-tratamento com lisozima. Colônias de
S.aureus foram retiradas com uma alça de semeadura do agar sangue e inoculadas à
37º C por 18 horas, em 1,5 mL caldo cérebro coração (BHI) em tubos tipo ependorfes
com volume de 2,0mL.
Os ependorfes contendo as colônias inoculadas no BHI foram centrifugados por
30 segundos a 14.000 rotações por minuto (rpm). O sobrenadante foi desprezado.
Adicionou-se 40µL de tampão lisozima (agitou-se em vortex até o total desprendimento
do pellet). Foi adicionado 10µL de lisozima e agitado em vortex. O tubo ficou 15 minutos
em temperatura ambiente, foi então adicionado 10µL de Proteinase K e agitado em
vortex. Os tubos foram incubados a 55º C por 15 minutos. Então foram adicionados 5µL
31
de RNAse e agitados, permaneceram 15 minutos em temperatura ambiente. Foram
adicionados 500µL da solução de extração, agitados e permaneceram 10 minutos em
temperatura ambiente sendo agitados ocasionalmente. Toda mistura foi transferida para
coluna GFX encaixada em um microtubo. Foram então centrifugadas a 8000rpm por 1
minuto. O líquido do tubo foi descartado e colocou-se novamente 500µL da solução de
extração na coluna (Centrifugou-se a 8000rpm por 1 minuto). O líquido foi descartado e
depositado no tubo.
Após o procedimento citado acima foi então adicionado 500µL da solução de
lavagem na coluna GFX. Centrifugou-se a velocidade máxima de 12 a 16000rpm por 3
minutos. O líquido foi descartado do tubo e transferido a coluna para um novo tubo de
1,5mL. Adicionou-se 200µL de tampão TE pré-aquecido a 70º C na coluna encaixada
no novo tubo e deixou-se por 1 minuto em temperatura ambiente. Centrifugou-se a
8000rpm por 1 minuto. O microtubo coletor foi mantido a -20º C até o momento do uso
(BRAOIOS, 2005).
4.5 Amplificação de fragmento de DNA cromossomal para identificação de
estirpes de Staphylococcus aureus.
De acordo com o protocolo descrito por Martineau et al., 1998, as reações
tiveram volume final de 20µL, com 20mM Tris-HCL pH-80; 50mM KCL; 2,5mM MgCl
2
;
0,2mM de cada dNTP; 0,4µM de cada oligonucleotídeo iniciador (Invitrogen, Brasil)
Sa442-1 (5' - AAT CTT TGT CGG TAC ACG ATA TTC TTC ACG-3') e Sa442-2 (5'-
CGT AAT GAG ATT TCA GTA GAT AAT ACA ACA -3'), e 0,5U de Taq polimerase
(Invitrogen, Brasil) em amplificação do tipo host- start. As misturas de PCR foram
submetidas à desnaturação, por 3 minutos, a 94ºC e posteriormente, a 30 ciclos de 1
segundo, a 95ºC, para desnaturação à 30 segundos, a 55ºC, para anelamento e
extensão dos oligonucleotídeos. Dez microlitros do produto amplificado foram
visualizados após eletroforese em gel de agarose em concentração de 2% corado com
brometo de etídio. Marcador de tamanho de 100 bp foi utilizado como padrão de peso
molecular.
32
4.6 Caracterização Fenotípica
4.6.1 Teste do Ágar Vermelho Congo
A produção de biofilmes pelas estirpes de S. aureus foi determinada pelo cultivo
no Ágar Vermelho Congo (CRA) {0,8g de corante vermelho congo [Sigma] para 1 Lt de
Brain Heart Infusion Agar (BHI) [sigma] e 50 gramas de sacarose [sigma]}. (FREEMAN
et al, 1989). Para tanto as placas de Agar Vermelho Congo foram inoculadas e
incubadas à 37ºC por 24 horas, seguido por uma incubação à temperatura ambiente
por 48 horas. A produção de colônias rugosas e pretas foi utilizada para diferenciar de
estirpes não produtoras de biofilmes, as quais apresentaram colônias lisas e vermelhas.
Foram utilizadas também as cepas de S. aureus (ATCC 25923) e (ATCC 12228), para
fins de controle positivo e negativo respectivamente.
FIG.2
: Colônias negras e rugosas no Agar
Vermelho Congo, estirpes de S. aureus
produtoras de Slime.
FIG.3
: Colônias vermelhas e lisas no Agar
Vermelho Congo, estirpes de S. aureus
não produtoras de Slime.
33
4.6.2 Produção de biofilmes “In vitro"
A capacidade de produção de biofilmes "in vitro" foi determinada de acordo com
o método citado por Cucarella et al., 2001, com pequenas modificações. As estirpes de
S. aureus foram cultivadas individualmente, por uma noite, no TSB a 37ºC e diluídas
1:200 no TSB contendo 0,25% de glicose. 200µL de células em suspensão foram
inoculadas em microplacas de poliestireno estéreis com 96 poços em fundo "U" e
incubou-se por 24 horas à 37ºC sem agitação. Os poços foram lavados 3 vezes com
200µL de Tampão Fosfato Salina (PBS), estéril (PBS, pH-7,4) secos à 60º C por 1 hora
logo após foram corados com 1% de solução cristal violeta por 1 minuto.
Os poços foram lavados três vezes com água destilada e secos à temperatura
ambiente. A absorbância foi determinada à 492nm (Thermoplate reader). Poços não
inoculados contendo TSB com glicose serviram como branco. Cada estirpe para
produção de biofilme foi testada em duplicada e o teste foi repetido 3 vezes, foram
consideradas produtoras de biofilmes estirpes com absorbância medidas maior que 0,1
(MACK et al, 2000). As cepas controles utilizadas foram ATCC 12228 (negativa) e
ATCC 25923 (positiva).
ATCC 25923 Controle Positivo
ATCC 12228 Controle Negativo
ATCC 25923 Controle Positivo
ATCC 12228 Controle Negativo
FIG.4
:
Teste de aderência em microplacas. Poços A1 e A2:
ATCC 12228
, S. aureus não
produtores de biofilmes. Poços A3 e A4: ATCC 25923, S. aureus produtores de biofilmes,
cepas coradas com Cristal Violeta (1%). Visualização de estirpes positivas (Coloração
evidente) e Negativas (Coloração ausente ou Fraca).
34
4.7 Caracterização Genotípica
4.7.1 Amplificação de DNA cromossomal pela reação em cadeia da polimerase
(PCR) para identificação dos genes icaA e icaD.
Os oligonucleotídeos iniciadores para a amplificação do icaA e icaD genes foram
descritos do Gen Bank seqüência do ica locus (CRAMTON et al, 1999). 20µL de
reação final consistiu em 2.5mM MgCl
2
, 200µM de cada nucleotídio, 1µM de cada
oligonucleotídeo iniciador, 1.25U de Taq polimerase e 100ng de DNA molde. Trinta
ciclos de amplificação que consistiram na desnaturação a 92ºC por 45 segundos,
anelamento a 49ºC por 45 segundos, alongamento a 72ºC por 1 minuto, com uma
extensão final de 72ºC por 7 minutos em um termociclador (Mastercycler gradient,
Eppendorf). A presença e tamanho da amplificação dos produtos foram confirmados por
eletroforese em 2% de gel de agarose corado com brometo de etídio. Foi utilizado um
marcador de tamanho 100pb (Invitrogen, Brasil). As cepas controles utilizadas foram
ATCC 12228 (negativa) e ATCC 25923 (positiva).
Seqüência do fragmento de oligonucleotídeo iniciador (Invitrogen, Brasil):
icaA
Forward: 5’ – TCTCTTGCAGGAGCAATCAA - 3’
Reverse: 5’ - TCAGGCACTAACATCCAGCA - 3’
Tamanho do produto: 188pb
icaD
Forward: 5’ – ATGGTCAAGCCCAGACAGAG – 3’
Reverse: 5’ – CGTGTTTTCAACATTTAATGCAA – 3’
Tamanho do produto: 198pb
35
4.8 Teste de sensibilidade das estirpes de S. aureus aos antimicrobianos
As estirpes de S. aureus foram submetidas ao teste de sensibilidade “in vitro” a
partir da técnica de difusão em disco (BAUER et al., 1966). Desse modo, foram
utilizados multidiscos de antimicrobianos para microrganismos gram positivos
(Laborclin), os quais consistiam em unidades plásticas às quais estavam aderidos 12
discos de papel com diâmetro de 6 mm, impregnados com princípios ativos para uso
em antibiograma por difusão em agar (placas de 140mm de diâmetro), contendo o agar
Müller–Hinton (NCCLS, 2000).
As placas e as unidades com os multidiscos foram retiradas da geladeira para
adquirirem a temperatura ambiente cerca de 30 minutos antes da execução da prova.
As colônias foram retiradas do agar sangue com alça de semeadura devidamente
flambada e inoculadas em caldo cérebro-coração por 12 horas a 37º C em estufa
bacteriológica para multiplicação. Comparou-se o grau de turvamento dos tubos com o
grau 0,5 da escala Mac Farland. Um suabe estéril foi colocado dentro do tubo contendo
o caldo cérebro coração, retirou-se o excesso comprimindo-o na parede do tubo. Em
seguida semeou-se com suabe no agar Müller_Hinton em todas as direções da placa
abrangendo toda a superfície e após 15 minutos com auxílio de uma pinça flambada
colocou-se a unidade de multidiscos sobre a superfície do agar do meio inoculado.
A placa foi incubada invertida em estufa bacteriológica a 35º C por 18 horas
para avaliação dos resultados. Com a ajuda de uma régua mediu-se o diâmetro dos
halos inibitórios de cada disco e foi consultada uma tabela apropriada para determinar
se o S. aureus foi sensível ou resistente aos antimicrobianos testados. Os
antimicrobianos presentes no multidiscos e testados foram: cefepime (30µg),
ciprofloxaxin (5µg), cloranfenicol (30µg), clindamicina (2µg), eritromicina (15µg),
gentamicina (10µg), oxacilina (1µg), penicilina G (10 Un), rifampicina (30µg), sulfazotrin
(25µg), tetraciclina (30µg), vancomicina (30µg), sendo que foi utilizado o ATCC 29213
como controle.
36
4.9 Análise Estatística
Foi efetuado estudo estatístico, utilizando-se o teste do Qui-quadrado, para
avaliar se houve significância entre os testes, o coeficiente de Kappa, que determinou
se houve uma boa concordância entre os testes, a porcentagem de sensibilidade e
especificidade entre os testes, e o valor preditivo positivo (VPP) e negativo (VPN). Estes
testes foram realizados pelo programa de computador SAS (2002) e pelo programa de
computador TestDiag (Cálculos estatísticos básicos para testes diagnósticos) (GODOY
et al., 1999) no Departamento de Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista
(UNESP), Campus de Jaboticabal-SP.
Segue-se no quadro abaixo a fórmula utilizada pelo programa TestDiag (GODOY
et al., 1999).
a
Verdadeiro Positivo
b
Falso Positivo
c
Falso Negativo
d
Verdadeiro Negativo
Positivo
Positivo
Negativo
Negativo
Sensibilidade: a / (a + c)
Especificidade: d / (b + d)
VPP: a / (a + b)
VPN: d / (c + d)
Kappa: (Po
–
Pe) / 1
–
Pe
Po: Frequência observada
Pe: Frequência esperada
Resultado Kappa: (<0,20=pobre; 0,21-
0,40=fraca; 0,41-0,60=moderada; 0,61-
0,80=boa; >0,80=muito boa).
37
5. RESULTADOS
Foram identificadas 263 estirpes de S. aureus pelos testes bioquímicos, sendo que
a amplificação do DNA cromossômico para identificação dos S. aureus não foi observada
em 50 estirpes de S. aureus. Para a realização dos estudos fenotípicos e genotípicos
utilizados na avaliação da capacidade produtora de biofilmes das estirpes de S. aureus
investigadas foram testadas 94 estirpes (44%) de 213 estirpes de S. aureus positivas na
reação de PCR. Não houve nenhum caso clínico de mastite, nos rebanhos estudados, no
período da presente pesquisa.
A tabela 1 revela a distribuição das estirpes de S. aureus identificadas pelos testes
bioquímicos e pela reação de PCR.
Tabela 1 – Distribuição das estirpes de S. aureus identificadas por testes
bioquímicos e pela técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) em duas
propriedades no estado de São Paulo, no período de 2001 a 2006.
Estirpes de Staphylococcus aureus
Teste
Identificação
Confirmadas
%
Não confirmadas
%
Bioquímica
263 / (263)
100
0 / (263)
0
PCR
213 / (263)
80,1
50 / (263)
19,9
38
A tabela 2 evidencia a produção de “slime” no Agar Vermelho Congo (CRA), sendo
as estirpes que apresentavam colônias negras 80 (85%) foram consideradas como sendo
produtoras de biofilmes e as estirpes que mostravam colônias vermelhas 14 (15%),
caracterizadas como não produtoras de biofilmes.
A avaliação quantitativa da produção de “slime” por estirpes de S. aureus mostrou
que 93 (98,9%) das estirpes se aderiram fortemente, e 1 (1,1%) não aderiu a placa de
poliestireno. (Tabela 2).
Os dados da tabela 2 mostram que 90 (95,7%) das estirpes apresentaram os
genes icaA e icaD, enquanto que 4 (4,3%) das estirpes não apresentaram os genes icaA
e icaD.
Tabela 2 – Resultados do estudo fenotípico e genotípico das estirpes de S. aureus
para produção de slime, isoladas de amostras de leite, oriundas de casos de
mastite subclínica bovina, no período de 2001 a 2006.
Estirpes de S. aureus
Testes Diagnósticos
Positivas % Negativas %
Agar Vermelho Congo
(CRA)
80 / (94)
85
14 / (94)
15
Teste de Aderência em
Microplacas
93 / (94)
98,9
1 / (94)
1,1
Detecção dos genes
icaA e icaD
90 / (94)
95,7
4 / (94)
4,3
39
Tabela 3 – Sensibilidade e Resistência das estirpes de S. aureus frente aos
antimicrobianos, isoladas de amostras de leite, de vacas com mastite subclínica,
em duas propriedades no estado de São Paulo, no período de 2001 a 2006.
Estirpes de Staphylococcus aureus
isoladas de amostras de leite
ANTIMICROBIANOS
Sensíveis
% Resistentes %
Cefepime
94 / (94)
100
0 / (94)
0
Ciprofloxacin
94 / (94)
100
0 / (94)
0
Cloranfenicol
93 / (94)
98,9
1 / (94)
1,1
Clindamicina
93 / (94)
98,9
1 / (94)
1,1
Eritromicina
93 / (94)
98,9
1 / (94)
1,1
Gentamicina
92 / (94)
97,8
2 / (94)
2,2
Oxacilina
93 / (94)
98,9
1 / (94)
1,1
Penicilina G
88 / (94)
93,4
6 / (94)
6,6
Rifampicina
94 / (94)
100
0 / (94)
0
Sulfazotrin
94 / (94)
100
0 / (94)
0
Tetraciclina
94 / (94)
100
0 / (94)
0
Vancomicina
94 / (94)
100
0 / (94)
0
40
Na tabela 3 pôde-se observar a distribuição das estirpes de S. aureus sensíveis e
resistentes aos antimicrobianos, isoladas de amostras de leite, oriundas de casos de
mastite subclínica bovina. Verifica-se que ocorreram estirpes resistentes a mais de um
princípio ativo sendo que, a maior resistência ocorreu frente à penicilina G 6 (6,6%) e a
gentamicina 2 (2,2%). Observa-se também a presença de uma estirpe multi-resistente
(resistentes a seis antimicrobianos). Ressalta-se ainda, a presença de uma estirpe
resistente ao cloranfenicol, antimicrobiano proibido para uso na produção animal.
Na tabela 4, verifica-se que 75 (79,7%) das estirpes obtiveram as seguintes
características: produção de colônias negras, forte aderência, presença dos genes icaA
e icaD, e sensibilidade aos antimicrobianos. Cinco (5,4%) estirpes apresentaram as
seguintes características: produção de colônias negras, forte aderência, presença dos
genes icaA e icaD, e resistência aos antimicrobianos. Já para as estirpes que
produziram colônias vermelhas, 7 (7,5%) apresentaram características de forte
aderência, presença dos genes icaA e icaD e sensibilidade aos antimicrobianos.
Apenas uma estirpe apresentou características de não produção de biofilmes
associadas em conjunto. Para as estirpes que produziram colônias vermelhas, 3 (3,1%)
não possuíam os genes icaA e icaD de modo a concordar com este teste, mas não
concordaram com o teste de aderência em placas, sendo assim estas estirpes foram
consideradas não produtoras de biofilmes devido a ausência dos genes icaAD. Três
(3,2%) estirpes que produziram colônias vermelhas possuíam ambos os genes,
apresentaram aderência no teste de microplacas sendo que 2 (2,1%) foram resistentes
aos antimicrobianos e uma (1,1%) foi sensível aos antimicrobianos testados.
41
Tabela 4 – Distribuição dos resultados das provas fenotípicas e genotípica das estirpes de S. aureus,
isoladas de amostras de leite, de vacas com mastite subclínica, em duas propriedades, no estado de São
Paulo, no período de 2001 a 2006.
Morfologia no Agar
Vermelho Congo
Aderência
em placas
Presença
do gene
icaA
Presença
do gene
icaD
Antimicrobianos
Estirpes de
S. aureus
Total
%
Negra
Forte
aderência
Positivo
Positivo
Sensível
75 /(94)
79,7
Negra
Forte
aderência
Positivo
Positivo
Resistente
5 /(94)
5,4
Vermelha
Fraca
aderência
Positivo
Positivo
Sensível
1 /(94)
1,1
Vermelha
Negativa
Negativo
Negativo
Sensível
1 /(94)
1,1
Vermelha
Forte
aderência
Positivo
Positivo
Sensível
7 /(94)
7,5
Vermelha
Vermelha
Forte
aderência
Forte
aderência
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
Sensível
Resistente
3 /(94)
2 /(94)
3,1
2,1
TOTAL
-
-
-
-
-
94 /(94)
100
42
Os dados da tabela 5 mostram que a análise estatística entre os testes CRA e da
presença dos genes evidenciou significância, porém com uma concordância moderada
(K=0,41). A sensibilidade, ou seja, a capacidade do teste detectar estirpes positivas foi
de 88,9%, enquanto que a especificidade, ou seja, a capacidade do teste detectar
estirpes negativas foi de 100%. Isso demonstra que o teste CRA é um teste muito
específico, mas de baixa sensibilidade e valor preditivo negativo, o qual foi de 28,6%
isso significa que as estirpes verdadeiramente negativas entre as que foram detectadas
negativas são de 28,6%.
Verifica-se também que o teste de aderência em microplacas apresentou uma
concordância fraca (K=0,39) com a presença dos genes icaA e icaD. Porém,
evidenciou-se uma sensibilidade de 100% e VPP de 96,8% e VPN de 100%. Apesar de
a especificidade ter sido baixa no valor de 25% esse teste mostrou ser até o momento o
melhor teste para o diagnóstico de estirpes produtoras de biofilmes devido a sua alta
sensibilidade. As análises também foram estatisticamente significativas (p<0,05)
(Tabela 5).
Quando comparado com o padrão ouro (presença dos genes) o teste de
sensibilidade a antimicrobianos não foi estatisticamente significativo (p>0,05). A
concordância foi pobre, porém a especificidade do teste foi de 100%. (Tabela 5).
43
Tabela 5 – Resultados da análise estatística das provas fenotípicas e genotípica
das estirpes de S. aureus, para a produção de biofilmes, isoladas de amostras de
leite, oriundas de casos de mastite subclínica bovina, em duas propriedades, no
estado de São Paulo, no período de 2001 à 2006.
Legenda: Valores de Kappa (< 0,20= pobre; 0,21-0,40=fraca; 0,41-0,60=moderada; 0,61-
0,80=boa; >0,80= muito boa). p: Significância, (VPP: valor preditivo positivo; VPN: valor
preditivo negativo).
Testes utilizados para avaliar a produção de
Biofilmes por estirpes de S. aureus
Resultados da
Análise Estatística
CRA/Genes
icaAD
Aderência
Microplacas/
Genes icaAD
Sensibilidade
Antimicrobianos
Genes
icaAD
Kappa
0,41
0,39
0,01
Sensibilidade
88,9%
100%
7,8%
Especificidade
100%
25%
100%
VPP
100%
96,4%
100%
VPN
p
28,6%
< 0,05
100%
<0,05
4,6%
>0,05
44
Na tabela 6 verifica-se que quando o teste CRA foi comparado com o teste de
aderência em microplacas, a concordância avaliada foi pobre (K=0,12). A sensibilidade
encontrada foi de 86% e a especificidade foi de 100%. As análises estatísticas foram
significativas (p<0,05). Apesar de ter aumentado a especificidade quando os dois testes
foram utilizados juntos, a sensibilidade diminuiu e o VPN foi de 7,1% ou seja, a
capacidade de se detectar estirpes verdadeiramente negativas entre as que foram
negativas foi baixa, devido ao número encontrado de estirpes falso-negativas.
Tabela 6 – Resultados da análise estatística das provas fenotípicas das estirpes
de S. aureus, para a produção de biofilmes, isoladas de amostras de leite,
oriundas de casos de mastite subclínica bovina, em duas propriedades, no
período de 2001 à 2006.
Legenda: Valores de Kappa (< 0,20= pobre; 0,21-0,40=fraca; 0,41-0,60=moderada; 0,61-
0,80=boa; >0,80= muito boa). p: Significância, (VPP: valor preditivo positivo; VPN: valor
preditivo negativo).
Testes utilizados para avaliar a produção de
Biofilmes por estirpes de S. aureus
Resultados da Análise
Estatística
CRA/ Aderência em microplacas
Kappa
0,12
Sensibilidade
86%
Especificidade
100%
VPP
100%
VPN
p
7,1%
<0,05
45
6. DISCUSSÃO
6.1 Produção de “Slime” no Agar Vermelho Congo
A análise dos dados inseridos na Tabela 2 mostrou que a produção de biofilmes
no Agar Vermelho Congo, com a produção de colônias negras foi de 85% por estirpes
de S. aureus oriundas de amostras de leite colhidas de casos de mastite subclínica
bovina.
VASUDEVAN et al. (2003), estudaram a importância dos biofilmes na mastite e
encontraram 91,4% das estirpes de S. aureus produtoras de biofilmes no agar vermelho
congo, valor esse que o presente estudo se aproxima. Foram observados também que
algumas estirpes de S. aureus produziram colônias negras no período de 48 horas, e
após 72 horas de cultivo nenhuma estirpe de S.aureus teve capacidade de produzir
biofilmes, o que também foi constatado neste estudo. BASELGA et al. (1993), FOX et
al. (2005), OLIVEIRA et al. (2006), estudaram a formação de biofilmes em estirpes de
S. aureus isoladas de mastite e verificaram a ocorrência de 12%, 41%, e 37,5%,
respectivamente, de estirpes produtoras de biofilmes no agar vermelho congo, sendo
que no estudo feito por Baselga et al. (1993), não foram avaliadas a presença dos
genes icaA e icaD.
ARCIOLA et al. (2001), identificaram 61% das estirpes de S. aureus produtoras
de biofilmes no agar vermelho congo de infecções associadas a catéteres em humanos.
BERNADI, (2005) estudou a produção de biofilmes em estirpes de
Staphyococcus coagulase negativa isoladas de catéteres venosos e encontraram
77,78% das estirpes produtoras de “slime”, sendo que 4 estirpes que foram negativas
para produção de biofilmes possuíam os genes icaA e icaD.
FREEMAN et al. (1989) propuseram o ágar Vermelho Congo, como método
alternativo para detectar a produção de slime em Staphylococcus coagulase negativa.
Utilizou o ágar Vermelho Congo e a produção de “slime” foi detectada em 77,78% das
cepas de Staphylococcus coagulase-negativos. Este meio de cultura permite verificar
as modificações fenotípicas das colônias dos Staphylococcus coagulase-negativos, as
46
quais são categorizadas pelas cores negra e vermelha, sendo que as colônias
produtoras de slime apresentam cor negra e as não produtoras cor vermelha.
A virulência dos S. aureus está associada com sua capacidade de produzir
toxinas, fatores extracelulares, adesão e formação de biofilmes nas superfícies dos
hospedeiros e ainda resistirem à fagocitose (TAKEUCHI et al, 2001). A capacidade dos
S. aureus produzirem biofilmes ajuda a bactéria a sobreviver em ambientes hostis
dentro do hospedeiro, e esse é um fator responsável por infecções crônicas e ou
persistentes (COSTERTON et al., 1999).
Vários estudos mostraram que a formação de biofilmes por S. aureus e S.
epidermidis causam infecções associadas a cateteres hospitalares, infecções
nosocomiais e os biofilmes estiveram associados à presença dos genes icaA e icaD
(ARCIOLA et al., 2001; BERNADI, 2005). Entretanto, a prevalência dos genes ica, e seu
papel na formação de biofilmes por S. aureus isolados de casos de mastite bovina
ainda não haviam sido investigados no Brasil, isso demonstra a importância dos
resultados encontrados no presente estudo associando-se os biofilmes como fatores de
virulência na mastite.
6.2 Quantificação da Produção de Biofilmes pelo Teste de Aderência em Placas
A análise da produção de biofilmes pela aderência em placas (Tabela 2)
demonstrou que, 98,9% das estirpes se aderiram à placa e foram consideradas
produtoras de biofilmes. VASUDEVAN et al. (2003), encontraram 68,57% das estirpes
produtoras de biofilmes pela aderência em placas, mas no estudo genotípico 100% das
estirpes possuíam os genes icaA e icaD, mostrando que neste estudo o teste de
aderência não apresentou uma boa concordância com teste genotípico.
No presente estudo a porcentagem genotípica foi 95,7% das estirpes de S.
aureus que possuíam os genes icaA e icaD. A porcentagem para aderência em placas
(fenotípica) foi de 98,9%, demonstrando uma boa correlação entre os resultados do
teste genotípico e fenotípico.
47
FOX et al. (2005), estudaram estirpes de S. aureus isoladas de leite, pele do teto,
e insufladores e detectaram uma produção de biofilmes “in vitro” em 41%, 24,7% e
14,7% das estirpes isoladas do leite, pele do teto e dos insufladores, respectivamente.
Neste estudo não foi correlacionado a produção de biofilme com a presença dos genes
icaAD.
CRAMTON et al. (1999), AMMENDOLIA, et al. (1999), encontraram 100%, e
88,9%, respectivamente, de produção de biofilmes pelas estirpes de S. aureus isoladas
de diferentes infecções humanas, com a presença dos genes icaA e icaD, e esses
valores foram semelhantes ao encontrado neste estudo.
BERNADI, (2005), encontrou 100% das estirpes de Staphylococcus coagulase
negativa produtoras de biofilmes quanto à sua aderência em placas e 77% destas
estirpes estavam correlacionadas com a presença dos genes icaAD.
OLIVEIRA et al. (2006), estudaram a produção de biofilmes por estirpes de S.
aureus e S. epidermidis isolados de casos de mastite e encontraram pelo teste de
aderência em placas 18,7% de estirpes de S. aureus produtoras de biofilmes, mas não
identificaram a presença dos genes icaAD de grande importância para testar a validade
do teste.
STEPANOVIC et al. (2000) notaram que o teste de aderência em placas é um
dos métodos usados com maior freqüência para quantificar a formação dos biofilmes
produzidos pelos Staphylococcus sp, além de funcionar como um indicador de
patogenicidade dos microrganimos.
6.3 Presença dos genes icaA e icaD
No presente estudo, a presença dos genes icaA e icaD responsáveis pela
síntese do slime foi investigada em 2 cepas de referência ATCC 25923 e ATCC12228 e
em 94 estirpes de S. aureus isoladas de amostras de leite oriundas de bovinos com
mastite subclínica. Verificou-se que 95,7% das estirpes de S. aureus possuíam os
genes icaA e icaD (Tabela 2).
48
VASUDEVAN et al. (2003), estudaram estirpes de S. aureus isoladas de
amostras de leite oriundas de bovinos com mastite subclínica e encontraram 100% das
estirpes com os genes icaA e icaD, inclusive as estirpes que apresentaram fase de
variação no agar vermelho congo produzindo colônias vermelhas, e concluíram que a
presença do lócus ica em todos os S. aureus isolados de casos de mastite confirmam o
potencial desse gene como fator de virulência na patogenia da mastite de ruminantes.
CRAMTON et al. (1999), ARCIOLA et al. (2001), encontraram 61%, e 100%
respectivamente, das estirpes de S. aureus estudadas de infecções em humanos, com
os genes icaA e icaD, sendo que o valor encontrado por Arciola et al. (2001) foi
aproximado ao encontrado no presente estudo, além disso, os autores citados acima
também ressaltaram a importância do gene ica como fator de virulência para o S.
aureus.
BERNADI, (2005), estudou a importância dos biofilmes e sua ligação com o gene
ica nos Staphylococcus coagulase negativa oriundos de cateteres venosos, e
encontraram 88,8% das estirpes com gene icaA e 92,5% com gene icaD, demonstrando
também a importância do gene ica no estafilococos e sua patogenicidade em infecções
clínicas.
MACK et al. (2000), ARCIOLA et al. (2002) demonstraram que a segunda fase
da formação dos biofilmes requer a adesina polissacarídica intercelular (PIA), um
homopolímero parcialmente desacetilado com resíduo N-acetilglicosamina ligado pela
ponte 1-6 beta-glicosideo, o qual é produzido pelo locus do gene ica.
ZIEBUHR et al. (1997), HEILMANN & PETERS (2000) relataram que após a
aderência inicial a uma superfície, a bactéria prolifera e acumula-se agrupada em
multicamadas. A formação de multicamadas requer a aderência intercelular, realizada
por uma adesina polissacarídica intercelular (PIA-polysaccharide intercellular adhesin).
De acordo com Mack et al. (1996) PIA representa uma única estrutura polissacarídica.
HEILMANN et al. (1997) relataram que os genes (icaABC) que intervem o
agrupamento celular e a síntese do PIA foram clonados e seqüenciados. Mais tarde, o
gene icaD localizado entre icaA e icaB, também foi identificado. O gene icaA carreia a
N-acetilglicosaminatransferase, e sozinha exibe baixa atividade de transferase. A co
49
expressão de icaA junto com icaD aumenta a atividade e síntese dos oligômeros N-
acetilglicosamina.
ARCIOLA et al. (2002) mostraram que técnicas moleculares para identificação
dos genes ica, que codificam a síntese do slime, representa uma ferramenta muito
importante para uma identificação acurada de cepas virulentas formadoras de slime.
6.4 Resistência dos S. aureus aos antimicrobianos
No presente estudo, avaliou-se a sensibilidade e resistência “in vitro” dos S.
aureus frente a 12 agentes antimicrobianos segundo a técnica de difusão em disco
(BAUER et al., 1966). Foi observado um padrão de resistência envolvendo os seguintes
antimicrobianos: cloranfenicol, clindamicina, eritromicina, gentamicina, oxacilina e
penicilina G. Verificou-se também que uma estirpe (1,1%) foi multi-resistente (resistente
a seis antimicrobianos), e seis estirpes (6,6%) foram resistentes aos antimicrobianos
citados acima sendo que a maior resistência ocorreu frente à penicilina G (6,6%) e a
gentamicina (2,2%). Ressalta-se também a presença de uma estirpe (1,1%) resistente
ao cloranfenicol, antimicrobiano proibido para uso na produção animal (Tabela 3).
Apesar da porcentagem de estirpes resistentes aos antimicrobianos na presente
pesquisa ter sido baixa, deve-se levar em consideração a presença das mesmas e de
uma estirpe multi-resistente. Além do mais, esta técnica avaliou apenas a eficiência do
antimicrobiano na célula livre e não nos biofilmes.
Devido à impossibilidade da técnica de difusão em disco avaliar a eficiência dos
antimicrobianos nos S. aureus em biofilmes, Amorena et al. (1999) estudaram uma
técnica que possibilitou avaliarem a sensibilidade e resistência dos antimicrobianos em
biofilmes. O estudo envolveu 11 antimicrobianos e 4 estirpes de S. aureus produtoras
de “slime”. Foi utilizado um ensaio em placas de poliestireno, avaliando 2 etapas dos
biofilmes uma com 6 horas de formação (biofilmes jovem), outra com 48 horas de
formação (biofilmes velhos). Utilizaram também dois meios de cultivo um com TSB
(caldo) e outro com leite. Três concentrações de antimicrobianos foram testadas (4
vezes a concentração do disco; 100mg/L e 500mg/L), A ATP bioluminescência foi
50
utilizada para determinar a viabilidade das células bacterianas após 24 horas de
exposição aos antimicrobianos. Vários antimicrobianos foram viáveis quando se utilizou
altas taxas de concentração (≥ 100mg/L) em biofilmes jovens (6horas de formação).
Maiores taxas de eficiência dos antimicrobianos foram maiores em biofilmes
formados no leite que no TSB. Fosfomicina e cefuroxim seguidos da rifampicina,
cefazolin, novobiocina, vancomicina, penicilina, ciprofloxacina, e tobramicina afetaram
as células dos biofilmes sobre no mínimo uma das condições testadas. Gentamicina e
eritromicina não afetaram significantemente as células dos biofilmes, sendo sem efeito
sob células dos biofilmes. Sendo que o cefuroxim não é comumente utilizado em
tratamento devido ao não conhecimento da sua taxa de toxicidade em muitas espécies.
A ciprofloxacina teve uma menor eficiência nos biofilmes quando comparada com
cefalosporina e rifampicina. Muitos estudos mostraram que as quinolonas (ex.
ciprofloxacina) tiveram uma alta eficiência considerando que ela atingiu 14 vezes a
concentração no soro sanguíneo, sendo esta, uma vantagem para ser utilizada em
tratamentos de infecções crônicas em humanos e em mastites em ruminantes
(tratamento no período seco, evitando resíduos antimicrobianos no leite), e quando
associada à rifampicina apresenta maior sucesso no tratamento.
No trabalho de Amorena et al. (1999), a cefalosporina e rifampicina
apresentaram ser bons antimicrobianos para bactérias em biofilmes, e a vancomicina é
um potente inibidor da síntese de peptideoglicano, que é mais usada em casos de S.
aureus multi-resistente (MRSA) (NIETO et al., 1971 citado por AMORENA et al., 1999).
A vancomicina foi significante para matar bactérias em biofilmes, mas em biofilmes
(48horas) na concentração (4 vezes MBC) foi ineficiente. Isso pode ter ocorrido devido
à inibição dos efeitos de glicopeptídeos nas matrizes dos biofilmes ou a baixa
susceptibilidade das bactérias nos biofilmes. Pode-se utilizar antimicrobianos com
efeitos sinérgicos como a rifampicina e a novobiocina. Uma analogia semelhante que foi
descrita é a utilização da penicilina com a novobiocina na terapia da mastite
(TARDÁGUILA et al., 1997; citado por AMORENA et al., 1999).
BERNADI, (2005), avaliou estirpes hospitalares de Staphylococcus coagulase
negativa isoladas de cateteres quanto a habilidade da produção de biofilmes sobre
51
superfícies abióticas (cateter esterilizado), antibiograma e a presença de genes icaAD.
O antibiograma mostrou que 100% Staphylococcus coagulase-negativos eram
sensíveis a vancomicina e 88,88% resistentes a penicilina.
FERREIRA, (2004), estudou a variabilidade fenotípica e genotípica de 77
estirpes de S. aureus isoladas de casos de mastite subclínica bovina. As estirpes foram
submetidas à PCR-ribotipagem e suas sensibilidades “in vitro” a 12 antimicrobianos. Os
resultados obtidos revelaram diferentes padrões de resistência, sendo que a lincomicina
foi predominante (24,7%). As 58 (75,3%) das estirpes restantes foram sensíveis aos
antimicrobianos testados. Além do que entre as 19 estirpes resistentes aos
antimicrobianos, 14 (73,5%) foram agrupadas em 3 padrões de ribotipagem e destas 13
(92,9%) apresentaram resistência a eritromicina e lincomicina, isoladamente ou em
associação.
PACHECO et al. (2007), estudaram a susceptibilidade aos antimicrobianos de
710 estirpes de S. aureus isolados de amostras de leite, oriundos de mastite subclínica
de diferentes regiões no estado de Minas Gerais, no período de 1997-2006. Foi
utilizada a técnica de difusão em disco e no período de 1996-2002, houve uma variação
na susceptibilidade do S. aureus frente aos antimicrobianos, principalmente aos beta-
lactâmicos (penicilina, ampicilina e cloxacilina), os quais apresentaram menores
desempenhos durante o período. A enrofloxacina (97,66%), gentamicina (94,66%) e
norfloxacina (93,12%) apresentaram-se como os de maior eficiência “in vitro”. A
resistência a outros antimicrobianos como a penicilina (75,13%), ampicilina (63,01%), e
polimixina-B (59,06%), foi observada durante todo o período.
Outros agentes como, trimetropim-sulfonamidas, foram eficientes durante quase
todo período, mas houve uma diminuição no percentual de estirpes susceptíveis entre
os anos de 2000 a 2004. Este estudo permitiu monitorar o aparecimento de mutantes
resistentes e a baixa eficiência dos tratamentos por mastites causadas por S. aureus.
Estudos “in vitro” demonstraram que as bactérias nos biofilmes tornaram-se de
10-1000 vezes mais resistentes aos efeitos dos agentes antimicrobianos quando
comparado com a célula livre da mesma estirpe (AMORENA et al., 1999; OLSON et al.,
2002; CONLEY et al., 2003). Os mecanismos responsáveis pela resistência das
52
bactérias nos biofilmes aos agentes antimicrobianos são: demora na penetração de
agentes antimicrobianos através das matrizes dos biofilmes, taxa de crescimento
alterado de organismos nos biofilmes, mudanças fisiológicas com o crescimento dos
biofilmes incluindo células persistentes.
Sabendo-se que animais portadores podem constituir fonte de infecção
permanente no rebanho, assim podendo permitir a persistência do S. aureus durante
todas as fases de lactação (ROBERSON et al., 1998; citado por FERREIRA, 2004), faz-
se necessário o tratamento dos animais doentes. A este respeito sabe-se que
diferentemente dos casos clínicos que são tratados no momento do diagnóstico, a
mastite subclínica tem sido preferencialmente tratada no período seco, ocasião que
existe maior probabilidade de sucesso na adoção de medidas terapêuticas (MALLARD
et al., 1998); uma das formas de se melhorar as taxas de curas bacteriológicas é
estender a duração da terapia (SOL et al., 2000).
Segundo Ferreira (2004), o grande número de ribotipos e padrões de resistência
a antimicrobianos observados em apenas uma propriedade demonstraram uma grande
heterogeneidade genética em populações naturais de S. aureus, o que deve ser levado
em conta em programas de controle da mastite bovina.
No presente estudo, a presença de estirpes de S. aureus produtoras de biofilmes
é mais um fator que deve ser avaliado com cautela, principalmente, quando se refere ao
tratamento a fim de se evitar que novas estirpes formem biofilmes e troquem genes de
resistência aos antimicrobianos, prevenindo assim infecções persistentes.
6.5. Avaliação do grau de concordância, sensibilidade, especificidade, acurácia e
valores preditivos positivos e negativos entre os testes de diagnóstico.
No presente estudo foi investigado o grau de concordância (coeficiente de
Kappa), sensibilidade, especificidade, acurácia e valores preditivos positivos (VPP) e
negativos (VPN) existentes entre o teste do Agar vermelho congo (morfologia das
colônias) e a presença dos genes icaA e icaD. Encontraram-se os seguintes valores:
grau de concordância moderado, com acurácia de 89,4%, sensibilidade: 88,9%,
53
especificidade: 100%, VPP: 100%, VPN: 28,6%. Estes valores significam que o teste do
Agar vermelho congo identificou 100% das estirpes negativas e 28,6% foi a
possibilidade das estirpes negativas serem verdadeiramente negativas, e dentre as
88,9% de estirpes positivas a possibilidade de elas serem realmente positivas foi de
100%. A análise estatística para os testes genotípico e fenotípicos foi significativa
(p<0,05). Devido ao número de estirpes falso-negativas o valor preditivo negativo foi
baixo e isso diminui também a sensibilidade, quanto a especificidade verificou-se que
este teste é muito específico, porém apresenta um baixo VPN, ou seja a capacidade de
se detectar estirpes verdadeiramente negativas é baixo (Tabela 5).
Os mesmos parâmetros citados acima foram analisados para o teste de
aderência em placas e a presença dos genes icaA e icaD. E os seguintes valores foram
encontrados: As estirpes positivas detectadas foram 100%, e as estirpes negativas
foram 25%; quanto a possibilidade das estirpes positivas serem realmente positivas foi
de 96,8%, e a possibilidade das estirpes negativas serem realmente negativas foi de
100%. O grau de concordância encontrado foi fraco, o valor do Kappa foi de 0,39,
porém a acurácia foi de 96,8% com kappa variando até 1,07, além deste teste ser muito
sensível e apresentar altos valores preditivo positivos e negativos. A análise estatística
foi significante (p<0,05) (Tabela 5).
O teste de aderência em microplacas é o mais indicado para detecção de
biofilmes “in vitro”, para as estirpes positivas, sendo então recomendado para análises
de rotina em estirpes de S. aureus isoladas de amostras de leite, por apresentar alta
sensibilidade, sendo recomendável em testes de diagnóstico utilizar os testes que forem
muito sensíveis. Esse teste também apresentou uma melhor correlação com a presença
dos genes icaAD (padrão ouro), na detecção do polissacarídeo intercelular que é o
principal componente do biofilme; este teste também é de fácil realização e permite
realizar a análise de 47 estirpes de uma vez o que viabiliza o custo do mesmo.
ARCIOLA et al. (2006), compararam os testes do Agar vemelho congo (CRA) e
de aderência em microplacas (MtP) com a presença dos genes icaA e icaD em estirpes
de Staphylococcus epidermidis isolados de implantes médicos. E encontraram 57% das
estirpes com os genes icaA e icaD, dessas 3 foram negativas no CRA. Pelo método
54
MtP verificaram que 66% das estirpes foram produtoras de biofilmes, sendo que dessas
16% positivas foram negativas para a presença dos genes e desses 16%, 10% das
estirpes foram classificadas com produtoras fracas de biofilmes (fraca aderência). A
melhor concordância com a presença dos genes ocorreu com o teste CRA. Outro fato
relatado no trabalho foi que não ocorreu a ausência dos genes expressadas no CRA
(fase de variação) o que foi relatado para estirpes de S. aureus em outros trabalhos.
Na presente pesquisa o teste que apresentou melhor sensibilidade foi o teste de
aderência em microplacas. O teste CRA apresentou muitos resultados falso-negativos,
provavelmente devido à fase de variação que já foi relatada em trabalhos com estirpes
de S. aureus e na presente pesquisa também, diferentemente das estirpes de S.
epidermidis que em outros trabalhos tiveram bons resultados no CRA.
Outra análise que foi feita na presente pesquisa foi a avaliação dos parâmetros
citados acima entre o antibiograma e a presença dos genes icaA e icaD . Foram
encontrados os seguintes resultados: Sensibilidade: 7,8%, Especificidade: 100%, VPP:
100%, VPN: 4,6% e o grau concordância foi pobre, sendo o valor do K: zero e acurácia
de 11,7% (Tabela 5). Estes resultados que foram encontrados podem ter sido devido ao
teste de antibiograma por difusão em disco não detectar a sensibilidade e resistência
dos microrganismos em biofilmes, detectando apenas para a célula bacteriana livre.
Este teste foi bom para detectar estirpes verdadeiramente resistentes entre as estirpes
resistentes, pois a especificidade e o VPP encontrado foram de 100%. Mas, ao se
avaliar as estirpes sensíveis não se pode inferir que, quando as estirpes estiverem
agrupadas em biofilmes elas vão apresentar esse mesmo padrão de sensibilidade.
Todos os testes, com exceção do antibiograma, foram estatisticamente
significantes com o valor de p<0,05. Não foi encontrado nenhum trabalho de pesquisa
que avaliou os parâmetros discutidos acima, ressaltando-se assim a importância de
avaliar tais parâmetros quando se compara métodos de diagnóstico, o que possibilita
uma maior credibilidade nos mesmos.
Os dados inseridos na Tabela 6 revelaram que quando os testes fenotípicos
(CRA e teste de aderência em microplacas) foram testados quanto a sensibilidade,
especificidade, concordância e significância, foram encontrados os seguintes
55
resultados: A sensibilidade foi de 86%, e a especificidade foi de 100%, mas a
concordância entre os testes foi pobre e com acurácia de 86%. Esta comparação entre
os dois testes demonstrou que não é necessária a utilização dos dois testes fenotípicos
para o diagnóstico, pois apesar de aumentar a especificidade em relação ao teste de
aderência em microplacas, o valor preditivo negativo que foi de 7,1% ou seja, a
capacidade de detecção de estirpes verdadeiramente negativas entre as negativas foi
baixa.
A utilização dos dois testes poderia aumentar o custo do diagnóstico, sendo que
o teste de aderência em microplacas quando utilizado sozinho apresentou uma boa
sensibilidade, já quando os dois testes foram utilizados juntos a sensibilidade diminuiu.
O valor de (p<0,05), mostrou que a análise foi estatisticamente significativa.
56
7. CONCLUSÕES
Confirmou-se pela técnica de PCR a presença de 213 (80,10%) estirpes de S.
aureus de um total de 263 estirpes identificadas pelos testes bioquímicos.
Na avaliação da produção de slime por estirpes de S. aureus em Agar vermelho
congo verificou-se a presença de estirpes produtoras de slime que foi de 85%.
A avaliação quantitativa da produção de biofilmes realizada pelo teste de
aderência em microplacas evidenciou que 98,9% das estirpes de S. aureus se aderiram
às placas de poliestireno.
O estudo genotípico verificou a presença dos genes icaA e icaD, em 95,15% das
estirpes de S. aureus estudadas.
Observou-se um padrão de resistência envolvendo os seguintes antimicrobianos:
cloranfenicol, clindamicina, eritromicina, gentamicina, oxacilina e penicilina G, sendo
que a maior resistência ocorreu frente à penicilina G e a gentamicina.
O teste de aderência em microplacas foi o que apresentou a maior sensibilidade
(100%) e VPP (96,4%) e VPN (100%) para a detecção da produção de biofilmes
quando comparado com a presença dos genes icaA e icaD.
O teste do Agar Vermelho Congo (CRA) foi o que apresentou maior
especificidade (100%) quando comparado com a presença dos genes icaA e icaD.
O Kappa para o teste de aderência em placas foi fraco e para o teste CRA foi
moderado.
57
É desnecessária a utilização simultânea de ambos os testes fenotípicos na
detecção de estirpes produtoras de biofilmes, pois quando os testes de aderência em
microplacas e CRA foram comparados em conjunto a sensibilidade foi de 86%, a
especificidade foi de 100%, o VPP foi de 100% mas o VPN foi de 7,1% e a
concordância foi pobre.
A grande maioria dos isolados de S. aureus do leite bovino oriundos de quartos
com mastite subclínica foi capaz de produzir biofilmes e apresentaram os genes icaA e
icaD.
Considerando a presença dos genes icaA e icaD como fundamentais para a
produção de biofilmes e o teste de aderência em placas por apresentar alta
sensibilidade e alto valor preditivo positivo é o teste mais indicado para verificar a
capacidade de produção de biofilmes de isolados de S. aureus do leite bovino oriundos
de quartos com mastite bovina.
58
7.1 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Considerando-se a capacidade de estirpes de Staphylococcus aureus formarem
biofilmes e aderirem a diversas superfícies, principalmente de equipamentos e
instalações no ambiente de ordenha ressalta-se a importância da sanitização e higiene
adequada destes equipamentos para a eliminação desses agentes.
Sabendo-se que o processo de infecção da glândula mamária por estirpes de S.
aureus ocorre via ascendente pelo canal do teto e tendo em vista a capacidade dos
mesmos se aderir e formarem biofilmes permanecendo nos alvéolos evidencia-se a
importância do pré e pós-dipping na profilaxia da mastite.
O manejo profilático é o caminho adequado para prevenir a infecção e evitar a
formação de biofilmes e consequentemente à alta resistência dos microrganismos, já
que essa resistência dificulta o tratamento das mastites e pode aumentar os casos de
infecções subclínicas.
Sendo assim justifica-se a importância de novos estudos para o conhecimento
dos agentes formadores de biofilmes e seus mecanismos de adesão de forma a
fornecer subsídios para a profilaxia da mastite bovina.
59
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76
APÊNDICE
77
Tabela 2.1 – Produção de slime no Agar Vermelho Congo, entre as estirpes de Staphylococcus
aureus isoladas de amostras de leite oriundas de bovinos com mastite subclínica, na propriedade
A, no período de 2001 a 2002
,
município de Colina-Sp.
Variação da cor em Agar Vermelho Congo em estirpes de Staphylococcus aureus
Estirpes Negra (produtora de slime)
Positivas.
Vermelha (não produtora de slime)
Negativas.
ATCC 12228
Controle
negativo
-
vermelha
ATCC 25923
Controle
positivo
negra
-
11 negra -
14 negra -
17 - vermelha
19 negra -
54 negra -
57 negra -
58 negra -
60 negra -
65 negra -
70 negra -
74 negra -
75 - vermelha
79 - vermelha
80 negra -
86 negra -
87 - vermelha
94 negra -
97 negra -
98 negra -
101 negra -
106 negra -
113 negra -
114 negra -
78
Variação da cor em Agar Vermelho Congo em estirpes de Staphylococcus aureus
Estirpes Negra (produtora de slime)
Positivas.
Vermelha (não produtora de slime)
Negativas.
129 vermelha
130 vermelha
131 negra -
135 negra -
137 negra -
139 negra -
143 negra -
144 negra -
145 negra -
148 negra -
152 negra -
153 negra -
157 negra -
158 negra -
159 negra -
160 negra -
162 negra -
165 negra -
169 negra -
171 negra -
172 negra -
173 negra -
176 negra -
177 negra -
182 negra -
183 negra -
184 negra -
185 negra -
186 - vermelha
188 - vermelha
189 negra -
192 negra -
192 negra -
194 negra -
79
Variação da cor em Agar Vermelho Congo em estirpes de Staphylococcus aureus
Estirpes Negra (produtora de slime)
Positivas.
Vermelha (não produtora de slime)
Negativas.
197 negra -
198 negra -
199 negra -
200 negra -
201 negra -
205 negra -
TOTAL
55
8
% 87,30 12,7
80
Tabela 2.2 – Produção de slime no Agar Vermelho Congo, entre as estirpes de Staphylococcus
aureus isoladas de amostras de leite oriundas de bovinos com mastite subclínica, na propriedade
B, no período de 2005 a 2006, município de Nova Odessa - SP.
Variação da cor em Agar Vermelho Congo em estirpes de Staphylococcus aureus
Estirpes Negra (produtora de slime)
Positivas.
Vermelha (não produtora de slime)
Negativas.
ATCC 12228
Controle
negativo
-
vermelha
ATCC 25923
Controle
positivo
negra
-
208 negra -
209 - vermelha
210 negra -
211 - vermelha
213 - vermelha
215 negra -
217 negra -
219 negra -
220 negra -
221 negra -
222 negra -
223 negra -
224 negra -
225 negra -
226 negra -
227 negra -
228 negra -
230 negra -
231 negra -
234 negra -
237 - vermelha
238 - vermelha
240 - vermelha
241 negra -
81
Variação da cor em Agar Vermelho Congo em estirpes de Staphylococcus aureus
Estirpes Negra (produtora de slime)
Positivas.
Vermelha (não produtora de slime)
Negativas.
259 negra -
260 negra -
261 negra -
262 negra -
263 negra -
264 negra -
265 negra -
TOTAL
25
6
% 80,6 19,4
82
Tabela 2.3 - Densidade óptica das reações de aderência entre as estirpes de S. aureus isoladas de
amostras de leite oriundas de bovinos com mastite subclínica na propriedade A, no período de
2001 a 2002, município de Colina-Sp.
Densidade óptica do teste de aderência em placas de poliestireno (492nm)
Estirpes de
Staphylococcus
aureus
Fracamente aderente
(0,120 a 0,240nm)
Fortemente aderente
(>= 0,240nm)
Negativas
(<=0,1nm)
ATCC 12228 - - 0,031
ATCC 25923 - 2,31 -
11 - 1,16 -
14 - 0,69 -
17 0,23 - -
19 - 0,37 -
54 - 0,66 -
57 - 0,87 -
58 - 0,63 -
60 - 0,63 -
65 - 0,50 -
70 - 0,71 -
74 - 0,64 -
75 - - 0,052
79 - 0,274 -
80 - 0,44 -
86 - 0,84 -
87 - 1,6 -
94 - 0,45 -
97 - 0,37 -
98 - 0,56 -
101 - 0,67 -
106 - 0,38 -
113 - 0,75 -
114 - 0,76 -
129 - 0,60 -
130 - 0,30 -
131 - 0,72 -
135 - 0,54 -
137 - 0,62 -
139 - 0,65 -
143 - 0,92 -
144 - 0,50 -
145 - 1,0 -
148 - 0,79 -
152 - 0,54 -
153 - 0,63 -
157 - 0,43 -
158 - 0,69 -
159 - 0,83 -
160 - 0,64 -
83
Densidade óptica do teste de aderência em placas de poliestireno (492nm)
Estirpes de
Staphylococcus
aureus
Fracamente aderente
(0,120 a 0,240nm)
Fortemente aderente
(>= 0,240nm)
Negativas
(<=0,1nm)
162 - 0,67 -
165 - 0,73 -
169 - 0,69 -
171 - 0,37 -
172 - 0,56 -
173 - 0,60 -
176 - 1,14 -
177 - 0,89 -
182 - 1,17 -
183 - 1,39 -
184 - 1,38 -
185 - 0,60 -
186 - 0,60 -
188 - 0,50 -
189 - 0,81 -
192 - 0,83 -
193 - 1,20 -
194 - 0,71 -
197 - 1,16 -
198 - 1,22 -
199 - 1,35 -
200 - 1,15 -
201 - 1,26 -
205 - 1,18
TOTAL 1 61 1
% 1,6 96,8 1,6
84
Tabela 2.4 - Densidade óptica das reações de aderência entre as estirpes de S. aureus isoladas de
amostras de leite oriundas de bovinos com mastite subclínica na propriedade B, no período de
2005 a 2006, município de Nova Odessa - SP.
Densidade óptica do teste de aderência em placas de poliestireno
(492nm)
Estirpes de
Staphylococcus
aureus
Fracamente aderente
(0,120 a 0,240nm)
Fortemente aderente
(>= 0,240nm)
Negativas
(<=0,1nm)
ATCC 12228 - - 0,031
ATCC 25923 - 2,31 -
208 - 0,84 -
209 - 0,32 -
210 - 0,48 -
211 - 2,11 -
213 - 1,43 -
215 - 1,38 -
217 - 0,79 -
219 - 1,37 -
220 - 0,71 -
221 - 0,90 -
222 - 1,61 -
223 - 0,61 -
224 - 0,71 -
225 - 1,09 -
226 - 2,15 -
227 - 1,08 -
228 - 1,12 -
230 - 2,08 -
231 - 1,13 -
234 - 1,66 -
237 - 1,97 -
238 - 0,49
240 - 0,54 -
241 - 1,40 -
259 - 1,21 -
260 - 1,15 -
261 - 1,38 -
262 - 1,0 -
263 - 0,97 -
264 - 1,56 -
265 - 1,58 -
TOTAL 0 31 0
% 0 100 0
85
Tabela 2.5 - Presença dos genes icaA e icaD entres as estirpes de S. aureus isoladas de amostras
de leite oriundas de bovinos com mastite subclínica na propriedade A, no período de 2001 a 2002,
município de Colina –Sp.
Presença dos genes de virulência
Estirpes de Staphylococcus
aureus
icaA icaD
ATCC 12228 NEGATIVO NEGATIVO
ATCC 25923 POSITIVO POSITIVO
11
POSITIVO POSITIVO
14
POSITIVO POSITIVO
17
POSITIVO POSITIVO
19
POSITIVO POSITIVO
54
POSITIVO POSITIVO
57
POSITIVO POSITIVO
58
POSITIVO POSITIVO
60
POSITIVO POSITIVO
65
POSITIVO POSITIVO
70
POSITIVO POSITIVO
74
POSITIVO POSITIVO
75 NEGATIVO NEGATIVO
79
POSITIVO POSITIVO
80
POSITIVO POSITIVO
86
POSITIVO POSITIVO
87 NEGATIVO NEGATIVO
94
POSITIVO POSITIVO
97
POSITIVO POSITIVO
98
POSITIVO POSITIVO
101
POSITIVO POSITIVO
106
POSITIVO POSITIVO
113
POSITIVO POSITIVO
114
POSITIVO POSITIVO
129
POSITIVO POSITIVO
130
POSITIVO POSITIVO
131
POSITIVO POSITIVO
135
POSITIVO POSITIVO
137
POSITIVO POSITIVO
139
POSITIVO POSITIVO
143
POSITIVO POSITIVO
144
POSITIVO POSITIVO
145
POSITIVO POSITIVO
148
POSITIVO POSITIVO
152
POSITIVO POSITIVO
153
POSITIVO POSITIVO
157
POSITIVO POSITIVO
158
POSITIVO POSITIVO
159
POSITIVO POSITIVO
160
POSITIVO POSITIVO
162
POSITIVO POSITIVO
165
POSITIVO POSITIVO
169
POSITIVO POSITIVO
171
POSITIVO POSITIVO
86
Presença dos genes de virulência
Estirpes de Staphylococcus
aureus
icaA icaD
172
POSITIVO POSITIVO
173
POSITIVO POSITIVO
176
POSITIVO POSITIVO
177
POSITIVO POSITIVO
182
POSITIVO POSITIVO
183
POSITIVO POSITIVO
184
POSITIVO POSITIVO
185
POSITIVO POSITIVO
186
POSITIVO POSITIVO
188
POSITIVO POSITIVO
189
POSITIVO POSITIVO
192
POSITIVO POSITIVO
193
POSITIVO POSITIVO
194
POSITIVO POSITIVO
197
POSITIVO POSITIVO
198
POSITIVO POSITIVO
199
POSITIVO POSITIVO
200
POSITIVO POSITIVO
201
POSITIVO POSITIVO
205
POSITIVO POSITIVO
TOTAL Positivos 61 61
% 96,8 96,8
87
Tabela 2.6 - Presença dos genes icaA e icaD entres as estirpes de S. aureus isoladas de amostras
de leite oriundas de bovinos com mastite subclínica na propriedade B, no período de 2005 a 2006,
município de Nova Odessa - SP.
Presença dos genes de virulência
Estirpes de Staphylococcus
aureus
icaA icaD
ATCC 12228 NEGATIVO NEGATIVO
ATCC 25923 POSITIVO POSITIVO
208
POSITIVO POSITIVO
209
POSITIVO POSITIVO
210
POSITIVO POSITIVO
211 NEGATIVO NEGATIVO
213
POSITIVO POSITIVO
215
POSITIVO POSITIVO
217
POSITIVO POSITIVO
219
POSITIVO POSITIVO
220
POSITIVO POSITIVO
221
POSITIVO POSITIVO
222
POSITIVO POSITIVO
223
POSITIVO POSITIVO
224
POSITIVO POSITIVO
225
POSITIVO POSITIVO
226
POSITIVO POSITIVO
227
POSITIVO POSITIVO
228
POSITIVO POSITIVO
230
POSITIVO POSITIVO
231
POSITIVO POSITIVO
234
POSITIVO POSITIVO
237
POSITIVO POSITIVO
238
POSITIVO POSITIVO
240 NEGATIVO NEGATIVO
241
POSITIVO POSITIVO
259
POSITIVO POSITIVO
260
POSITIVO POSITIVO
261
POSITIVO POSITIVO
262
POSITIVO POSITIVO
263
POSITIVO POSITIVO
264
POSITIVO POSITIVO
265
POSITIVO POSITIVO
TOTAL Positivos 29 29
% 93,5 93,5
88
Tabela 3.1 - Sensibilidade e Resistência de estirpes de S. aureus frente aos antimicrobianos,
isoladas de amostras de leite oriundas de bovinos, com mastite subclínica, na propriedade A no
período de 2001 a 2002, município de Colina-Sp.
ANTIMICROBIANOS
ESTIRPES
CPM
CIP CLO CLI ERI GEN OXA
PEN
RIF SUT TET VAN
11 SENS
SENS
SENS
SENS
SENS
SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
14 SENS
SENS
SENS
SENS
INT
RES
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
17 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
19 SENS
SENS
SENS
SENS
SENS
SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
54 SENS
SENS
SENS
SENS
SENS
SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
57 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
58 SENS
SENS
SENS
SENS
SENS
SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
60 SENS
SENS
SENS
SENS
SENS
SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
65 SENS
SENS
SENS
SENS
SENS
SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
70 SENS
SENS
SENS
SENS
SENS
SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
74 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
75 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
79 SENS
SENS
SENS
INT INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
80 SENS
SENS
SENS
SENS
SENS
SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
86 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
87 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
94 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
97 SENS
SENS
SENS
SENS
SENS
SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
98 SENS
INT SENS
SENS
SENS
SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
101 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
106 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
113 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
114 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
129 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
130 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
131 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
135 SENS
SENS
SENS
SENS
SENS
SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
137 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
139 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
143 SENS
SENS
SENS
SENS
SENS
SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
144 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
145 SENS
INT SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
INT SEN
SEN
148 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
89
ANTIMICROBIANOS
ESTIRPES
CPM
CIP CLO CLI ERI GEN OXA
PEN
RIF SUT TET VAN
152 SENS
SENS
SENS
SENS
SENS
SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
153 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
157 SENS
INT SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
158 SENS
INT SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
159 SENS
INT SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
160 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
162 SENS
SENS
SENS
INT INT INT SEN SEN
SEN
SEN
INT SEN
165 SENS
INT SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
169 SENS
INT SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
171 SENS
INT SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
172 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
173 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
176 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
177 SENS
SENS
SENS
INT INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
182 SENS
SENS
SENS
INT INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
183 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
184 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
185 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
186 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
188 SENS
SENS
SENS
INT INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
189 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
192 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
193 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
194 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
197 SENS
SENS
SENS
INT INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
198 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
199 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
200 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
201 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
205 SENS
INT SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
ATCC 25 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
SEN
SEN
SEN
ATCC 12 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS
SEN SEN
SEN
INT SEN
SEN
Legenda: CPM: Cefepime; CIP: Ciprofloxaxina; CLI: Clindamicina; CLO: Cloranfenicol; ERI: Eritromicina;
GEN: Gentamicina; OXA: Oxacilina; PEN: Penicilina; RIF: Rifampicina; SUT: Sulfazotrin; TET:
Tetraciclina; VAN: Vancomicina. SENS: Sensível; INT: Intermediário; RES: Resistente.
90
Tabela 3.2 - Sensibilidade e Resistência de estirpes de S. aureus frente aos antimicrobianos,
isoladas de amostras de leite oriundas de bovinos, com mastite subclínica, na propriedade B no
período de 2005 a 2006, município de Nova Odessa - SP.
ANTIMICROBIANOS
ESTIRPES
CPM
CIP CLO CLI ERI GEN OXA PEN RIF SUT TET VAN
208 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS SEN
SEN SEN SEN SEN SEN
209 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS SEN
SEN SEN SEN SEN SEN
210 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS SEN
SEN SEN SEN SEN SEN
211 SENS
INT SENS
SENS
INT SENS SEN
SEN SEN SEN SEN SEN
213 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS SEN
SEN SEN SEN SEN SEN
215 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS SEN
RES
SEN SEN SEN SEN
217 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS SEN
RES
SEN SEN SEN SEN
219 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS SEN
RES
SEN SEN SEN SEN
220 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS SEN
SEN SEN SEN SEN SEN
221 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS SEN
SEN SEN SEN SEN SEN
222 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS SEN
SEN SEN SEN SEN SEN
223 SENS
INT SENS
SENS
INT SENS SEN
SEN SEN SEN SEN SEN
224 SENS
SENS
SENS
INT INT SENS SEN
SEN SEN SEN SEN SEN
225 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS SEN
SEN SEN SEN SEN SEN
226 SENS
SENS
RES RES RES RES RES RES
SEN SEN SEN SEN
227 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS SEN
SEN SEN SEN SEN SEN
228 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS SEN
SEN SEN SEN SEN SEN
230 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS SEN
SEN SEN SEN SEN SEN
231 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS SEN
SEN SEN SEN INT SEN
234 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS SEN
SEN SEN SEN INT SEN
237 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS SEN
RES
SEN SEN INT SEN
238 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS SEN
RES
SEN SEN INT SEN
240 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS SEN
SEN SEN SEN INT SEN
241 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS SEN
SEN SEN SEN INT SEN
259 SENS
SENS
SENS
INT INT SENS SEN
SEN SEN SEN INT SEN
260 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS SEN
SEN SEN SEN INT SEN
261 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS SEN
SEN SEN SEN INT SEN
262 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS SEN
SEN SEN SEN INT SEN
263 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS SEN
SEN SEN SEN INT SEN
264 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS SEN
SEN SEN SEN INT SEN
265 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS SEN
SEN SEN SEN SEN SEN
ATCC 25 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS SEN
SEN SEN SEN SEN SEN
ATCC12 SENS
SENS
SENS
SENS
INT SENS SEN SEN SEN INT SEN SEN
91
Legenda: CPM: Cefepime; CIP: Ciprofloxaxina; CLI: Clindamicina; CLO: Cloranfenicol; ERI: Eritromicina;
GEN: Gentamicina; OXA: Oxacilina; PEN: Penicilina; RIF: Rifampicina; SUT: Sulfazotrin; TET:
Tetraciclina; VAN: Vancomicina. SENS: Sensível; INT: Intermediário; RES: Resistente.
92
Tabela 4.1 - Distribuição entre os resultados obtidos após estudo fenotípico e genotípico das
estirpes de S. aureus isoladas de amostras de leite oriundas de bovinos com mastite subclínica,
na propriedade A no período de 2001 a 2002, município de Colina – Sp.
Estirpes de
Staphylococcus
aureus
Teste do
Agar
Vermelho
Congo
Teste de
Aderência
em Placas
Presença do
gene icaA
Presença do
gene icaD
Antimicrobianos
ATCC 12228 Vermelho Negativa Negativo Negativo
Sensível
ATCC 25923 Negra Forte
aderência
Positivo Positivo
Sensível
11
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
14 Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Resistente
17 Vermelho Fraca
aderência
Positivo Positivo Sensível
19
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
54
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
57
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
58
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
60
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
65
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
70
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
74
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
75 Vermelho Negativo Negativo Negativo
Sensível
79 Vermelho
Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
80
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
86
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
87 Vermelho
Forte
aderência
Negativo Negativo
Sensível
93
Estirpes de
Staphylococcus
aureus
Teste do
Agar
Vermelho
Congo
Teste de
Aderência
em Placas
Presença do
gene icaA
Presença do
gene icaD
Antimicrobianos
94
Negra
Forte
aderência
Positivo
Positivo
Sensível
97
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
98
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
101
Negra
Forte
aderência
Positivo
Positivo
Sensível
106
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
113
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
114
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
129 Vermelho
Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
130 Vermelho
Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
131
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
135
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
137
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
139
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
143
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
144
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
145
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
148
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
152
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
94
Estirpes de
Staphylococcus
aureus
Teste do
Agar
Vermelho
Congo
Teste de
Aderência
em Placas
Presença do
gene icaA
Presença do
gene icaD
Antimicrobianos
153
Negra
Forte
aderência
Positivo
Positivo
Sensível
157
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
158
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
159
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
160
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
162
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
165
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
169
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
171
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
172
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
173
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
176
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
177
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
182
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
183
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
184
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
185
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
186 Vermelha
Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
95
Estirpes de
Staphylococcus
aureus
Teste do
Agar
Vermelho
Congo
Teste de
Aderência
em Placas
Presença do
gene icaA
Presença do
gene icaD
Antimicrobianos
188
Vermelha
Forte
aderência
Positivo
Positivo
Sensível
189
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
192
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
193
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
194
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
197
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
198
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
199
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
200
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
201
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
205
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
Total Estirpes
Produtoras de
Biofilme
55 (63)
62 (63)
61 (63)
61 (63)
-
% 87,30 98,4 96,8 96,8
-
96
Tabela 4.2 - Distribuição entre os resultados obtidos após estudo fenotípico e genotípico das
estirpes de S. aureus isoladas de amostras de leite oriundas de bovinos com mastite subclínica,
na propriedade B no período de 2005 a 2006, município de Nova Odessa – Sp
Estirpes de
Staphylococcus
aureus
Teste do
Agar
Vermelho
Congo
Teste de
Aderência em
Placas
Presença do
gene icaA
Presença do
gene icaD
Antimicrobianos
208
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
209 Vermelha
Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
210
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
211 Vermelha
Forte
aderência
Negativo Negativo
Sensível
213 Vermelha
Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
215
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo
Resistente
217
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo
Resistente
219
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo
Resistente
220
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
221
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
222
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
223
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
224
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
225
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
226 Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Resistente * (6)
227
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
228
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
230
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
231
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
234
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
237 Vermelha
Forte
aderência
Positivo Positivo
Resistente
97
Estirpes de
Staphylococcus
aureus
Teste do
Agar
Vermelho
Congo
Teste de
Aderência em
Placas
Presença do
gene icaA
Presença do
gene icaD
Antimicrobianos
238
Vermelha
Forte
aderência
Positivo
Positivo
Resistente
240 Vermelha
Forte
aderência
Negativo Negativo
Sensível
241
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
259
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
260
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
261
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
262
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
263
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
264
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
265
Negra Forte
aderência
Positivo Positivo Sensível
Total Estirpes
Produtoras de
Biofilme
25 (31)
31 (31)
29 (31)
29 (31)
-
% 80,64 100 93,5 93,5
-
*Resistente a seis antimicrobianos: estirpe multi-resistente.
98
Tabela 5.1 – Análise estatística entre a presença dos genes icaA e icaD e a
morfologia no Agar Vermelho Congo das estirpes de S. aureus, isoladas de
amostras de leite, oriundas de casos de mastite subclínica bovina, no período de
2001 a 2006.
Estirpes de
Staphylococcus
aureus
Genes icaA e icaD (padrão ouro)
Morfologia do
Agar Vermelho
Congo (CRA)
Positivo
Negativo
Total
%
Positivo
80
0
80
85,10
Negativo
10
4
14
14,90
Total
90
4
94
100
99
Tabela 5.2 – Análise estatística entre a presença dos genes icaA e icaD e o teste
de aderência em placas das estirpes de S. aureus, isoladas de amostras de leite,
oriundas de casos de mastite subclínica bovina, no período de 2001 a 2006.
Estirpes de
Staphylococcus
aureus
Genes icaA e icaD (padrão ouro)
Teste de
aderência em
microplacas
(492nm)
Positivo
Negativo
Total
%
Positivo
90
3
93
98,9
Negativo
0
1
1
1,1
Total
90
4
94
100
100
Tabela 5.3 – Análise estatística entre a presença dos genes icaA e icaD e o teste
de sensibilidade das estirpes de S. aureus frente aos antimicrobianos, isoladas de
amostras de leite, oriundas de casos de mastite subclínica bovina, no período de
2001 a 2006.
Estirpes de
Staphylococcus
aureus
Genes icaA e icaD (padrão ouro)
Teste
sensibilidade
aos
antimicrobianos
Positivo
Negativo
Total
%
Positivo
(resistentes)
7
0
7
7,4
Negativo
(sensíveis)
83
4
87
92,6
Total
90
4
94
100
101
Tabela 6.1 - Análise estatística entre o teste de aderência em microplacas e a
morfologia do agar vermelho congo das estirpes de S. aureus, isoladas de
amostras de leite, oriundas de casos de mastite subclínica bovina, no período de
2001 a 2006.
Estirpes de
Staphylococcus
aureus
Teste de aderência em microplacas (492nm) (padrão ouro)
Morfologia no
agar vermelho
congo (CRA)
Positivo
Negativo
Total
%
Positivo
80
0
80
85,1
Negativo
13
1
14
14,9
Total
93
1
94
100
102
Composição do Kit GFX Genomic Blood (Amersham Biosciences) para extração
de DNA bacteriano.
COMPOSIÇÃO DO KIT GFX GENOMIC BLOOD (Amersham Biosciences)
Solução de Lise: 10Mm KHCO
3
; 155mM HH
4
CL; 0,1mM EDTA
Solução de Extração: tampão contendo agente caotrópico e detergente.
Solução de Lavagem: Tampão Tris-EDTA.
Colunas GFX: Colunas MicroSpin
TM
contendo uma matriz de fibra de vidro.
Tubos: microtubos com capacidade para 2mL
REAGENTES NÃO FORNECIDOS PELO KIT:
RNAse A (Invitrogen): 20mg/mL
Tampão TE: 10mM Tris-HCl 1mM EDTA, pH 8.0
Lisozima (Invitrogen): 10mg/mL em 10mM Tris-HCl, pH 8.0
Tampão Lisozima: 0,1 M NaCl 10mM Tris pH 8.0, 1mM EDTA, 5% Triton X-100.
Proteinase K: (Invitrogen): 20mg/mL em 10mM Tris-HCl pH 8.0
103
Preparo do Agar Vermelho Congo
Ágar Vermelho Congo (Freeman et al., 1989):
Ágar de cerebro-coração-BHI (Biolab)..........................................................37,0g
Sacarose (Sigma)..........................................................................................50,0g
Corante vermelho Congo (Sigma)...................................................................0,8g
Água destilada............................................................................................1000,0mL
pH 7,3 ± 0,2 a 25°C
Ao meio esterilizado e resfriado a 55°C foi acrescentando assepticamente solução
aquosa do corante vermelho Congo e sacarose.
Preparo da Solução de Tampão Fosfato Salina (PBS), pH 7,4:
NaCl...............................................................................................................8g
KCl................................................................................................................0,20g
Na
2
HPO
4
12H
2
O...........................................................................................2.89g
KH
2
PO
4
.........................................................................................................0,20g
Água destilada..............................................................................................1Litro
Os ingredientes citados acima foram dissolvidos na água destilada, logo então o pH foi
medido para verificar se estava no grau correto, depois o meio foi autoclavado a 121º C
por 15 minutos e assim foi mantido a temperatura ambiente (25º/30ºC) até o momento
do uso.
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