( PDF ) Adição de aminoácidos e insulina ao meio crioprotetor seminal de garanhões da raça Mangalarga Marchador

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY

RIBEIRO – UENF

BRUNO FAGUNDES

ADIÇÃO DE AMINOÁCIDOS E INSULINA AO MEIO CRIOPROTETOR

SEMINAL DE GARANHÕES DA RAÇA MANGALARGA MARCHADOR

Campos dos Goytacazes – RJ

2008

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BRUNO FAGUNDES

ADIÇÃO DE AMINOÁCIDOS E INSULINA AO MEIO CRIOPROTETOR

SEMINAL DE GARANHÕES DA RAÇA MANGALARGA MARCHADOR

Tese apresentada ao Centro de

Ciências e Tecnologias

Agropecuárias da Universidade

Estadual do Norte Fluminense

Darcy Ribeiro, como requisito

parcial para obtenção do grau de

Doutor em Produção Animal na

Área de Concentração de

Biotecnologia da Reprodução

ORIENTADOR: Prof. José Frederico Straggiotti Silva

Campos dos Goytacazes – RJ

2008

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BRUNO FAGUNDES

ADIÇÃO DE AMINOÁCIDOS E INSULINA AO MEIO CRIOPROTETOR

SEMINAL DE GARANHÕES DA RAÇA MANGALARGA MARCHADOR

Tese apresentada ao Centro de Ciências e

Tecnologias Agropecuárias da Universidade

Estadual do Norte Fluminense Darcy

Ribeiro, como requisito parcial das

exigências para obtenção do grau de Doutor

em Produção Animal, na Área de

Concentração de Biotecnologia da

Reprodução

Aprovada em 04 de março de 2008

BANCA EXAMINADORA

_____________________________________________________________

Prof

Isabel Candia

Nunes da Cunha (Doutora, Medicina Veterinária) - UENF

_____________________________________________________________

Prof. Cláudio Andres Retamal Martines (Doutor, Biociências e Biotecnologia) -

UENF

_____________________________________________________________

Prof. Deiler Sampaio Costa (Doutor, Ciência Animal) – UFMS

_____________________________________________________________

Prof. José Frederico Straggiotti Silva (Ph.D, Medicina Veterinária) – UENF

(Orientador)

Ao meu filho, Matheus, pela compreensão

de que o papai precisa trabalhar.

DEDICO

AGRADECIMENTOS

A Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF) e ao Centro de

Ciências e Tecnologias Agropecuárias (CCTA), pelo oferecimento deste curso e pela

concessão de bolsa de estudo;

À comissão de pós-graduação em produção animal, pelas ações empregadas

visando um melhor conceito do curso, pela simplificação de formulários burocráticos

e divulgação de informações essenciais ao pós-graduando de forma moderna e

prática, às secretárias Etiene e Jovana pela paciência e disponibilidade em resolver

qualquer tipo de problema;

Aos amigos, Adriana, Alemão, Alessa, Alexandre, Amanda, Ana Bárbara, Ana

Paula, André, Ângela, Antônio, Argemiro, Bethânia, Beth, Bianca, Boquinha, Bruna,

Bruno, Cacau, Cadum, Cambaíba, Camila, Carlinhos, Carla, Carol, Cris, Daniel,

Daniele, David, Dona Janete, Edinho, Edmundo, Elton, Estevão, Fabio, Face,

Fausto, Francimara, Francisco, Ginnie, Giulliano, Hugo, Ieda, Isaac, Isabel, Israel,

João Paulo, Jhonny, Jorge, José Antônio, José Renato, Josias, Juca, Juliana, Kellen,

Lara, Léo, Lério, Letícia, Lineu, Lívia, Lúcio, Luciano, Márcia, Marcos, Marcus,

Marília, Marina, Marinho, Mario Jorge, Marcela, Marcele, Marcelo, Mariane, Matheus,

Orélo, Orlando, Paulinho, Priscila, Queijinho, Rafael, Raquel, Reinaldo, Renata,

Ricardo, Roberto, Rose, Saulo, Sérgio, Thiago, Tiaguinho, Thomaz, Tobá, Vânia,

Vidal, Vitor, Vitinho, Viviane, Xaropinho, Zé e os demais não recordados neste

instante por todos os momentos compartilhados;

iii

Aos amigos, Guilherme Valente de Souza, Maurício Fraga van Tilburg,

Marcus Antônio Pessanha Barreto e Vinicius Motta Ferreira pelas colaborações

prestadas ao trabalho apresentado e também pelos momentos compartilhados;

Ao Laboratório de Química e Funções de Proteínas e Peptídeos (LQFPP), em

especial à Prof

. Olga Tavares Lima e à doutoranda Viviane pela atenção e

disponibilidade de equipamentos para execução de parte deste trabalho;

Ao Prof. Aldo Shimoya pela extrema dedicação empregada não somente nas

análises estatísticas, mas também pelas dicas de formatação do trabalho aqui

apresentado. Tenho certeza de que iremos desenvolver outros trabalhos em

parceria;

Ao Haras LUGAVI, em especial ao proprietário, Sr. Washinton pela gentileza

em disponibilizar animais e espaço físico para execução de diversos trabalhos na

área de reprodução eqüina no qual este se inclui;

Ao meu orientador, Prof. Dr. José Frederico Straggiotti Silva, modelo de

integridade humana e profissional nesta instituição, por estar ao meu lado durante

toda minha jornada acadêmica acompanhando e participando de momentos felizes e

conturbados;

Aos demais membros da banca examinadora pela contribuição ao presente

trabalho, em especial ao membro externo Prof. Dr. Deiler Sampaio Costa pela

disponibilidade em enfrentar a longa distância entre Campo Grande-MS e Campos

dos Goytacazes-RJ, o que me faz valorizar ainda mais a sua participação;

À minha esposa pelo amor e dedicação;

Aos meus pais pelo exemplo no qual procuro me espelhar;

Aos demais parentes que mesmo a distância transmite uma força positiva que

sempre me faz crescer;

Àqueles que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste

trabalho;

A Deus, pela finalização de mais uma etapa em minha vida e por sempre

estar comigo para superar as dificuldades encontradas.

“Eu tenho uma história repleta de

falhas e fracassos. E é exatamente

por isso que sou um sucesso”

(Michael Jordan, melhor jogador de

basquete de todos os tempos).

BIOGRAFIA

BRUNO FAGUNDES, filho de Darlis Fagundes de Resende e Vania Lúcia

Fagundes, nasceu em 4 de março de 1978, na cidade de Teresópolis – RJ.

Em março de 1996, iniciou o curso de Medicina Veterinária na Universidade

Estadual do Norte Fluminense (UENF), em Campos dos Goytacazes – RJ, onde se

formou em março de 2001.

Foi selecionado em março de 2001 para o Curso de Pós-Graduação em

Produção Animal, em nível de Mestrado, na área de Biotecnologia da Reprodução,

da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, em Campos dos

Goytacazes – RJ, concluindo o curso em março de 2003.

Também em março de 2003, deu início ao Curso de Pós-Graduação em

Produção Animal, em nível de Doutorado, na área de Biotecnologia da Reprodução,

da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, em Campos dos

Goytacazes – RJ, submetendo-se à defesa de tese para conclusão do curso em 4 de

março de 2008.

RESUMO

FAGUNDES,BRUNO, Msc., Universidade Estadual do Norte Fluminense – Darcy

Ribeiro. Março de 2008. Adição de aminoácidos e insulina ao meio crioprotetor

seminal de garanhões da raça Mangalarga Marchador. Professor Orientador: José

Frederico Straggiotti Silva. Professor conselheiro: Isabel Candia Nunes da Cunha.

Neste trabalho foi verificado o efeito da adição de: 0,1U/mL, 1U/mL e 10U/mL

de insulina (Experimento 1) e de 40mM de alanina; 40mM de glicina; 60 mM de

glutamina; 7mM de alanina + 7mM de glicina + 20mM de glutamina; 40mM de

alanina + 40mM de glicina + 60mM de glutamina (Experimento 2) ao diluente de

congelamento de sêmen de garanhões da raça Mangalarga Marchador através da

análise computadorizada das características da motilidade espermática (CASA),

funcionalidade da membrana plasmática através de teste hiposmótico e integridade

de membrana acrossomal externa através do teste FITC-PSA. Os resultados do

experimento 1 mostraram que o tratamento que utilizou 10U/mL de insulina reduziu

os parâmetros de motilidade e cinemática espermática, enquanto que os demais

tratamentos não diferiram estatisticamente do diluente controle. Os resultados do

experimento 2 mostraram que o tratamento que utilizou 40mM de alanina + 40mM

de glicina + 60mM de glutamina foi o que apresentou a pior qualidade seminal em

todos os testes realizados. Os melhores valores apresentados na motilidade total e

progressiva, velocidade do trajeto (VAP), velocidade progressiva (VSL) e velocidade

curvilinear (VCL) foram apresentados pelo tratamento controle, 40mM de alanina,

40mM de glicina e 7mM de alanina + 7mM de glicina + 20mM de glutamina.

Contudo, apesar de não ter ocorrido uma melhora nos parâmetros de motilidade

espermática em relação ao tratamento controle, todos estes tratamentos foram

superiores ao tratamento controle na análise de integridade de membrana

acrossomal.

Palavras-chave: Aminoácido, congelamento, insulina, mangalarga marchador,

sêmen.

vii

ABSTRACT

This work verified the effect of the addition of: 0.1 U / mL, 1U/mL and 10U/mL insulin

(Experiment 1) and 40mM of alanine, 40mM of glycine, 60mM glutamine; 7mM of

alanine + 7mM of glycine + 20mM glutamine; 40mM, alanine, glycine 40mM + +

60mM glutamine (Experiment 2) to the Mangalarga breed frozen semen extender

using Compute-assisted assessment of sperm motility (CASA), functionality of

plasma membrane using hypoosmotic swelling testing (HOST,) acrossomal

membrane integrity using FITC-PSA probe. Results of experiment 1 showed that the

treatment which used 10U/mL insulin reduce the parameters of kinematics and

sperm motility while other treatments did not differ statistically from control extender.

According to results of experiment 2 the treatment that used 40mM of alanine +

40mM glycine + 60 mM glutamine showed the worst seminal quality in all trials. The

best values in total and progressive motility, average-path velocity (VAP), straigh-line

velocity (VSL) and curvilinear velocity (VCL) were presented by control, 40mM of

alanine, 40mM of glycine, 7mM of alanine + 7mM of glycine + 20mM glutamine.

Although aminoacids treatments didn’t improve the parameters of motility sperm in

compare to control, all of these treatments were higher than control treatment in

analyses of acrossomal membrane integrity.

Keywords: Seminal plasma, spermatozoa, freezing, thawing, equine

viii

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO.............................................................................................. 11

2 REVISÃO DE LITERATURA...................................................................... 13

2.1 Criopreservação de sêmen eqüino.............................................................. 13

2.2 Membrana plasmática do espermatozóide................................................. 17

2.3 Regulação da insulina no metabolismo espermático................................ 19

2.4 Utilização de aminoácidos para crioproteção............................................. 22

2.5 Proteção espermática pela ação do plasma seminal................................. 23

2.6 Análise computadorizada da motilidade espermática................................26

3. MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................... 28

3.1 Delineamento experimental.......................................................................... 28

3.2 Animais........................................................................................................... 28

3.3 Obtenção do sêmen....................................................................................... 29

3.4 Processamento para congelamento............................................................ 29

3.4.1 Experimento 1............................................................................................. 30

3.4.2 Experimento 2............................................................................................. 30

3.4.2.1 Determinação da composição em aminoácidos................................... 30

3.5 Avaliação da funcionalidade da membrana espermática através do

teste hiposmótico................................................................................................ 31

3.6 Avaliação da integridade acrossomal......................................................... 31

3.7 Descongelamento.......................................................................................... 32

3.8 Análise computadorizada dos parâmetros da motilidade espermática... 32

3.9 Análise Estatística........................................................................................ 34

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................. 35

5. CONCLUSÕES............................................................................................. 56

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................... 57

7. ANEXOS......................................................................................................... 67

1. INTRODUÇÃO

O enorme interesse na utilização de sêmen eqüino congelado é bem

conhecido. Porém, dentre as restrições que limitam a sua utilização comercial, os

parâmetros espermáticos de fertilidade pós-descongelamento abaixo do necessário,

tais como motilidade e funcionalidade de membrana plasmática são os principais

fatores responsáveis. Este fato leva a um menor potencial fertilizante do sêmen

congelado, o que gera a necessidade de reduzir o intervalo entre a ovulação e a

inseminação, resultando em maiores custos com sincronização do cio e controle

folicular da égua.

A utilização rotineira de indutores da ovulação na reprodução eqüina é um

fator que contribui para a utilização do sêmen congelado, pois permite que a

inseminação seja efetuada no momento de maior possibilidade de ocorrer a

ovulação. Um outro fator que colabora para o uso do sêmen congelado é a

inseminação artificial através de histeroscopia, através da qual pode-se utilizar

apenas um por cento da dose inseminante convencional (MORRIS et al., 2003), isto

se deve ao local de deposição do sêmen ser mais próximo à tuba ipsilateral ao

ovário em que deve ocorrer a ovulação. Deste modo, se a fertilidade do sêmen

congelado do garanhão for comprovada, o seu uso pode substituir o sêmen resfriado

na maioria dos programas de inseminação artificial, já que permite o armazenamento

por um período indeterminado, tornando possível a obtenção de prenhez na

ausência do garanhão. Este fato corresponde a uma das grandes vantagens do uso

do sêmen congelado no melhoramento e na difusão da genética nas raças atuais.

O crescente uso de sêmen congelado eqüino se deve aos avanços na

pesquisa desta técnica. A descoberta de novos crioprotetores que apresentam

menor toxicidade do que o glicerol melhorou a congelabilidade de sêmen de

garanhões, inclusive os da raça Mangalarga Marchador.

O aprimoramento desta técnica consiste em elevar não só a fertilidade, mas

também a proteção do espermatozóide no trato reprodutivo da égua tornando-o apto

para a fertilização no momento correto. Para que ocorra uma concepção bem

sucedida, o espermatozóide fertilizante deve ter membranas funcionais

competentes, organelas e o genoma haplóide intactos.

A insulina é um hormônio polipeptídico que atua no metabolismo de açúcares,

lipídeos e proteínas regulando diversas funções celulares vitais. Recentemente

AQUILA et al. (2005) demonstraram que espermatozóides humanos são capazes de

expressar e secretar insulina, o que sugere uma regulação autócrina do seu

metabolismo. A função de capturar aminoácidos para síntese protéica também é

controlada pela insulina (CUNNINGHAM, 1997), o que leva a suspeitar de algum

efeito benéfico indireto à criopreservação celular. Isto se deve à comprovação do

efeito crioprotetor de alguns aminoácidos, tais como a alanina, glicina e glutamina

sobre espermatozóides de diversas espécies (SANCHEZ-PARTIDA et al., 1992;

RENARD et al., 1996; TRIMECHE et al.,1999: KUNDU et al., 2001; HE e WOODS

2003, 2004a e 2004b).

Este trabalho foi dividido em dois experimentos, onde o primeiro objetivo foi

verificar o efeito da adição de insulina em concentrações de 0,1UI/mL, 1UI/mL e

10UI/mL ao diluente de congelamento que vem sendo utilizado com sucesso no

congelamento de sêmen de garanhões da raça Mangalarga Marchador contendo

glicerol e dimetilformamida. No segundo experimento o objetivo foi verificar o efeito

crioprotetor através da adição de alanina, glicina e glutamina em concentrações pré-

determinadas através de consulta literária em ovinos sendo adaptada para o diluente

de congelamento eqüino. O efeito da adição destes aminoácidos foi verificado

separadamente e através de duas associações entre eles; reduzindo a concentração

estipulada e associando estas concentrações pré-determinadas.

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Criopreservação de sêmen eqüino

Protocolos de criopreservação de espermatozóides eqüinos não estão

padronizados e o sucesso desta técnica varia substancialmente. Em geral, as taxas

de sucesso são mais baixas do que nas demais espécies domésticas. Um dos pré-

requisitos para a eficácia da preservação do sêmen do garanhão é a alta qualidade

inicial (SAMPER e MORRIS, 1998).

Existe uma grande diferença na congelabilidade do sêmen eqüino entre

garanhões e entre ejaculados de um mesmo garanhão (PICKETT e AMANN, 1993;

KLUG, 1992). Estima-se que 25% a 30% dos garanhões produzem sêmen com boa

congelabilidade, 30% a 50% dos garanhões produzem sêmen com moderada

congelabilidade e 25% a 40% dos garanhões produzem sêmen com reduzida

congelabilidade. Além disso, alguns ejaculados do mesmo garanhão podem

apresentar diferenças na habilidade de resistir ao congelamento (PICKETT e

AMANN, 1993). Sabe-se que esta diferença também ocorre entre raças, sendo que

a grande maioria dos garanhões da raça Mangalarga Marchador é classificada como

maus congeladores quando se utiliza apenas o glicerol como crioprotetor, pois

apresentam motilidade menor do que 30% (GOMES et al. 2002). ALVARENGA et al.

(1996) compararam a congelabilidade do sêmen de garanhões da raça Mangalarga

Marchador com garanhões de raça de salto (Hanoveriano, Holsteiner e Trackenner)

e garanhões da raça Quarto de Milha, sendo que os da raça Mangalarga Marchador

foram os que apresentaram os piores resultados.

DROBINSKI et al. (1995) verificaram que espermatozóides congelados se

ligam com uma menor intensidade às células do epitélio do oviduto do que os

espermatozóides in natura, sendo isto um aspecto positivo, porém eles têm uma

menor habilidade em se ligarem à zona pelúcida do que os mantidos à temperatura

ambiente. Esta ligação reduzida entre o espermatozóide e o epitélio do oviduto e

com a zona pelúcida é conseqüência da crioinjúria, causada possivelmente pelos

danos estruturais nos receptores da membrana espermática ou pelo acoplamento

incompleto destes receptores. Isto pode explicar o fato da inseminação artificial com

sêmen congelado eqüino não ser, no momento, uma metodologia confiável com

relação a bons índices de prenhez, porém apresenta possibilidades de uma

utilização mais intensa (KLUG et al., 1992; SAMPER e MORRIS, 1998) com o

aprimoramento dos protocolos de criopreservação baseado na diminuição da

crioinjúria espermática (WOELDERS, 1997).

Os espermatozóides à temperatura corporal apresentam seu metabolismo

máximo, e os produtos do seu metabolismo (ácido lático e/ou CO

) podem aumentar

a acidez do sêmen, causando danos celulares permanentes, resultando em lesões

na membrana e, em geral, da própria célula. Todo este processo irá causar a morte

dos espermatozóides dentro de 12 a 24 horas (BAUMGARTL 1980 citado por

BARRETO, 2002).

O grande desafio das células no processo de congelamento e

descongelamento não é a capacidade de resistir à temperatura de armazenamento

de –196°C, mas o de suportar as mudanças ocorridas durante a zona intermediária

de temperatura (-15°C a -60°C), pela qual irão passar duas vezes, primeiro durante

o congelamento e depois durante o descongelamento (MAZUR, 1984). Quando uma

solução com crioprotetor alcança uma temperatura entre -5°C a -15°C começa a

formação de cristais de gelo no diluente, que resulta no aumento da concentração

de solutos no fluido remanescente fora do espermatozóide. Esta alta concentração

de solutos faz com que a água se mova de dentro do espermatozóide para o meio

extracelular, permitindo que este se desidrate (MAZUR, 1984). A curva de

congelamento mais utilizada é a de -60°C/min (curva rápida), obtida quando se

coloca palhetas horizontalmente a 3-5 cm acima do nível de nitrogênio líquido

(PICKETT e AMANN 1993).

Segundo GRAHAM (1996), a congelabilidade ruim dos espermatozóides de

alguns garanhões pode ser melhorada pela alteração de alguma(s) etapa(s) do

“protocolo principal” de criopreservação.

A avaliação de crioprotetores alternativos ao glicerol para preservação de

espermatozóide eqüino tornou-se uma área de extensa investigação nos últimos

anos. As amidas são componentes de menor peso molecular do que o glicerol e

deve penetrar a membrana plasmática mais rapidamente (SQUIRES 2005).

VIDAMENT et al. (2002) reportaram que a combinação de dimetilformamida com

glicerol foi mais efetiva do que o uso destes crioprotetores separadamente.

SQUIRES et al. (2004) demonstraram que a metilformamida, dimetilformamida ou o

etilenoglicol a 0,9M foram tão eficazes quanto o glicerol na proteção ao

espermatozóide eqüino. HENRY et al. (2002) concluíram que o etilenoglicol é uma

alternativa de crioprotetor de sêmen eqüino, podendo ser utilizado sozinho ou

associado ao glicerol, assim como a acetamida associada à trealose e metilcelulose

também correspondem à uma alternativa eficaz de crioproteção. MEDEIROS et al.

(2002) constataram que a dimetilformamida e a metilformamida melhoraram a

congelabilidade do sêmen eqüino, enquanto GOMES et al. (2002) constataram este

mesmo resultado em estudo utilizando garanhões da raça Mangalarga Marchador.

A maioria dos crioprotetores penetrantes, tais como o glicerol, etilenoglicol e

amidas, funciona como solvente e como soluto. O glicerol altera a pressão osmótica

do diluidor e do espermatozóide. Crioprotetores solúveis, como o glicerol, funcionam

como solvente com ponto de congelamento inferior ao da água e permitem a

formação de canais de diluidor descongelados, nos quais residem os

espermatozóides (revisado por COTTORELLO e HENRY 2002). O glicerol é nocivo

ao espermatozóide mesmo na ausência do congelamento. Os efeitos tóxicos

causados pelo glicerol incluem estresse osmótico, mudanças na organização, fluidez

e permeabilidade da membrana celular, assim como mudanças na sua composição

lipídica (WATSON 1995).

Os diluentes de congelamento devem conter algum tipo de lipídio ou

lipoproteína para proteger o espermatozóide dos danos causados pelo choque

térmico, geralmente este componente é obtido na gema de ovo. Pelo menos um

crioprotetor penetrante deve ser incluído no diluente, porém na maioria das

formulações utiliza-se o glicerol associado a um açúcar (crioprotetor não penetrante).

Outros componentes podem incluir EDTA, detergente, tampão e antibióticos. O

EDTA liga-se aos íons cálcio impedindo que o cálcio extracelular penetre no

espermatozóide e danifique a célula durante o choque térmico. Os detergentes

solubilizam os lipídeos da gema de ovo e as lipoproteínas, intensificando as

interações entre estes componentes e a membrana plasmática do espermatozóide.

Os tampões ajudam a manter o pH neutro enquanto que os antibióticos controlam o

crescimento microbiano (revisado por COTTORELLO e HENRY 2002).

MELO et al. (2007) observaram que é possível realizar o congelamento de

sêmen eqüino resfriado por 24 horas sem perda da sua qualidade. KATILA et al.

(2001) revisaram as diferentes técnicas disponíveis para determinar a qualidade do

sêmen eqüino após o descongelamento e concluíram que os melhores parâmetros

são a motilidade e a viabilidade espermática. BRINSKO et al. (2005) mostraram que

a suplementação nutricional de ácido docosahexaenoico (DHA – docosahexaenoic

acid) melhorou as motilidades total e progressiva de espermatozóides de garanhões

que apresentavam baixos valores destes parâmetros.

Métodos de congelamento de espermatozóide, composição de diluentes

necessária para preservar a integridade e a funcionalidade do sêmen, o momento da

inseminação, o local da inseminação e a dose inseminante ideal são fatores que

contribuem na variabilidade da taxa de prenhez com sêmen congelado

(COLENBRANDER et al. 2003).

Segundo SQUIRES (2005), é improvável que a adição de um único

ingrediente ao meio de congelamento possa melhorar drasticamente a motilidade e

a fertilidade pós-descongelamento. Contudo, parece razoável que a adição de

antioxidantes, aminoácidos e, talvez, o uso de crioprotetores alternativos possa

melhorar a congelabilidade do sêmen de alguns garanhões.

O sucesso na criopreservação do espermatozóide eqüino depende de

interações entre diluente, crioprotetor e curvas de resfriamento e reaquecimento,

visando minimizar danos causados por choque térmico, formação de cristais de gelo

e desidratação celular (JASKO, 1994).

2.2 Membrana plasmática do espermatozóide

A membrana plasmática não é apenas a borda da célula espermática, mas

parece ser uma estrutura extremamente dinâmica (FRESCH e GADELLA 2000). Ela

é heterogênea e consiste em cinco domínios específicos: pré-equatorial

(acrossoma), segmento equatorial, pós-equatorial (região basal), região da peça

intermediária e a cauda. As diferenças nestas regiões estão relacionadas às suas

diferentes funções (LADHA, 1998).

Na espermatogênese, o volume celular da espermátide reduz a 25% do seu

volume original devido à perda do citoplasma que contém grande parte de RNA e

organelas, tais como complexo de Golgi, retículo endoplasmático, lisossomos e

peroxissomos que passam a formar o corpo residual (FRESCH e GADELLA 2000).

Durante a passagem do espermatozóide pelo epidídimo ocorre liberação,

modificação e adsorção de proteínas e lipídeos em sua membrana plasmática.

Apesar de algumas proteínas adsorvidas neste trajeto estarem envolvidas na ligação

entre o espermatozóide e o ovócito, as funções destas alterações na membrana do

espermatozóide ainda não estão completamente esclarecidas. Na maioria das

espécies mamíferas as células espermáticas estão completamente maduras ao

alcançarem o final da cauda do epidídimo (EDDY e O`BRIAN, 1994).

Estas mudanças na membrana plasmática espermática que incluem a

integração e desintegração de proteínas, integração de lipídeos, alteração no grau

de saturação de ácidos graxos e, no caso de garanhões, a perda de colesterol que

resulta na diminuição marcante na taxa de colesterol/fosfolipídios (GADELLA et al.

2001) ocorrem não apenas antes da ejaculação, mas também após este ato durante

seu trajeto no trato reprodutivo feminino. Mudanças fisiológicas na membrana

plasmática após a ejaculação estão associadas com a aquisição da capacidade

fecundante da célula espermática que resulta em uma hipermotilidade celular. Tal

evento é denominado capacitação espermática.

Em garanhões, o plasma seminal pode bloquear o efluxo de colesterol da

membrana plasmática espermática pela formação de vesículas ricas em colesterol

originárias da próstata denominadas prostassomas (MINELLI et al. 1998). ZAHN et

al. (2002) estudaram o efeito da incorporação de colesterol à membrana do

espermatozóide eqüino pós-descongelamento e verificaram que apesar de ter sido

comprovada a maior integridade de membrana no grupo que incorporou o colesterol

(avaliação por sondas fluorescentes -Iodeto de propídeo/ Diacetato de

carboxifluoresceína) e menor reação acrossômica (avaliação pelo teste FITC-PNA

associado com iodeto de propídeo), apenas 25% das éguas inseminadas com

sêmen que incorporou colesterol tornaram-se prenhas enquanto que 75% das éguas

inseminadas com sêmen sem incorporação de colesterol emprenharam.

Para que ocorra uma concepção bem sucedida, o espermatozóide fertilizante

deve ter membranas funcionais competentes, organelas e o genoma haplóide

intactos (SILVA e GADELLA, 2006). Quando são utilizadas tecnologias reprodutivas

assistidas, como a inseminação artificial, as etapas do processamento podem gerar

danos ao DNA, membranas e organelas dos espermatozóides (SILVA e GADELLA,

2006). Deste modo, se a membrana plasmática do espermatozóide não estiver

funcionalmente intacta, o espermatozóide torna-se deteriorado, sendo incapaz de

fertilizar “in vivo”. (AURICH 2005; SILVA e GADELLA, 2006).

Estas lesões à membrana plasmática do espermatozóide resultam em perda

irreversível das suas funções (AURICH, 2005). Devido ao alto teor de ácidos graxos

insaturados na membrana plasmática, espermatozóides de mamíferos são sensíveis

ao estresse oxidativo. Enquanto uma peroxidação suave parece promover a

capacitação do espermatozóide, uma peroxidação excessiva vai lesionar a

membrana espermática resultando em perda da motilidade e da fertilidade (AITKEN.

1994). Desta maneira, a avaliação da funcionalidade da membrana plasmática do

espermatozóide é um método de extrema importância a ser utilizado em programas

de inseminação artificial.

Na avaliação da funcionalidade da membrana plasmática do espermatozóide

pelo teste hiposmótico ocorre um influxo de água no espermatozóide

bioquimicamente ativo, resultando em um aumento esférico no volume celular da

cauda espermática, o que leva a mesma a se enrolar (revisado por COTTORELLO e

HENRY, 2002).

A membrana plasmática envolve toda a célula espermática, mantendo juntos

as suas organelas e seus componentes intracelulares e por sua característica

semipermeável mantém o gradiente químico de íons e outros componentes solúveis.

Proteínas específicas da membrana plasmática facilitam o transporte de glicose e

frutose do meio extracelular para dentro do espermatozóide (ANGULO et al.1998).

Estes transportadores são substratos de fonte de energia indispensáveis, já que no

espermatozóide maduro cerca de 90% do ATP é produzido por glicólise

(anaeróbico), indicando a importância destes monossacarídeos como substratos

para produção de ATP (MUKAI e OKUNO, 2004; MARIN et al.,2003).

2.3 Regulação da insulina no metabolismo espermático

A insulina é um hormônio polipeptídico essencial para o metabolismo normal

e regulação do crescimento mediante ligação com seu respectivo receptor

transmembrana ou com receptores de IGFs (fator de crescimento semelhante à

insulina) na superfície da célula alvo, sendo que a ligação entre peptídeo e receptor

homólogo tem afinidade de 100 a 1000 vezes maior que com peptídeos heterólogos

(DUPONT et al., 2001). Ela tem efeitos importantes no metabolismo de carboidratos,

gorduras e proteínas. No metabolismo de carboidratos, a insulina tem duas ações

principais: aumento da taxa de captação de glicose nas células do fígado, músculo e

do tecido adiposo e estímulo da glicogênese. No metabolismo dos lipídeos, a

insulina estimula a lipogênese no fígado e no tecido adiposo. Enquanto que no

metabolismo das proteínas, a insulina estimula a captação de aminoácidos no fígado

e nos músculos e a incorporação de aminoácidos em proteína (RANDALL et al.

(2000).

A síntese de insulina se inicia no citoplasma com a tradução de uma

seqüência hidrofóbica de aminoácidos chamada seqüência sinal. Esta seqüência é

reconhecida pela partícula reconhecedora do sinal que interrompe a sua síntese no

citoplasma, fazendo com que o complexo formado pelo ribossomo, RNAm e

seqüência sinal associada à esta partícula seja encaminhado à superfície da

membrana do retículo endoplasmático rugoso. Após a associação entre uma

proteína ancorada na membrana do retículo com a partícula reconhecedora do sinal

e após a associação entre a seqüência sinal à superfície interna da proteína

translocon, a síntese protéica se reinicia no lúmen do retículo formando, desta

maneira, um polipeptídeo linear chamado pré-pró-insulina. Em seguida ocorre a

remoção da seqüência sinal pela ação de uma peptidade para formar a pró-insulina

(DE ROBERTIS e HIB, 2006). A pró-insulina é espiralada, e os fragmentos finais são

unidos por pontes dissulfeto. A pró-insulina é transferida para o aparelho de Golgi,

onde é posteriormente processada e armazenada dentro de grânulos

citoplasmáticos. O principal fator de liberação da secreção de insulina é a

concentração de glicose. (CUNNINGHAM, 1997)

Existe uma grande semelhança entre as insulinas humana, suína, bovina e

eqüina, sendo que a diferença estrutural ocorre entre um a três aminoácidos em

suas cadeias. Esta diferença não afeta a eficácia da insulina entre espécies, sendo

comum a utilização de insulina heteróloga no tratamento padrão para o diabetes

mellitus (MURRAY et al. 2002).

HICKS et al. (1972) observaram que a concentração de insulina no plasma

seminal humano é quase que três vezes maior do que no sangue, o que sugere

alguma função seminal. Neste mesmo trabalho foi evidenciada a influência definitiva

da insulina no metabolismo glicolítico do espermatozóide humano e no aumento da

atividade da piruvato desidrogenase. KREMER (1965) (revisado por HICKS et al.

1972) observou que quando se utiliza glicose ou piruvato como substrato, a adição

de insulina produz um aumento significativo na motilidade de espermatozóides

humanos, o que não ocorreu quando se utilizou frutose.

AITKEN et al. (1994) relataram que hormônios, citosinas e fatores de

crescimento presentes no plasma seminal afetam a motilidade espermática e a

fertilização.

AQUILA et al. (2005) mostraram que espermatozóides humanos são capazes

de expressar e secretar insulina. A insulina secretada pelo espermatozóide sugere

uma regulação autócrina do metabolismo da glicose, a qual é provida ao

espermatozóide pelo plasma seminal, pelo fluido do trato reprodutivo da fêmea in

vivo (KOCH, 1980 citado por AQUILA et al., 2005) ou pelo meio de cultura in vitro

(TRAVIS et al., 2004). A capacidade autônoma do espermatozóide em secretar

insulina sugere que ela pode promover o recrutamento de substrato energético

através de um sistema autócrino de acordo com a necessidade metabólica do

espermatozóide. Isto ocorre independentemente pela regulação sistêmica e pode

representar um mecanismo protetor que preserva a capacidade fertilizante de algum

efeito deletério produzido por longa restrição calórica ou por alterações que ocorrem

na homeostase energética em nível sistêmico (ANDÒ e AQUILA, 2005). BACCETTI

et al. (2002) mostraram que em homens afetados por diabetes dependente de

insulina os espermatozóides apresentam vários defeitos estruturais e menor

motilidade.

MACPHERSON et al. (2002) compararam as concentrações de IGF-1

presentes no plasma seminal eqüino e observaram que em garanhões sexualmente

ativos, a motilidade espermática total foi maior nos garanhões com altas

concentrações de IGF-1 do que nos que apresentavam baixas concentrações deste

fator de crescimento, assim como as taxas de prenhez também foram superiores em

cavalos com altas concentrações de IGF-1 no plasma seminal, que é sugestivo do

efeito da IGF-1 na função espermática.

Sabe-se que a insulina exerce um papel central na regulação da função das

gônadas, porém a sua importância na fertilidade masculina não está completamente

elucidada. NAKAYAMA et al. (1999) reportaram que tanto a insulina quanto a IGF-1

e IGF-2 favorecem a diferenciação das espermatogônias para espermatócitos

primários por ligação com receptores de IGF-1. A membrana plasmática do

espermatozóide e o acrossoma são alvos citológicos para a insulina (SILVESTRONI

et al., 1992 citado por AQUILA et al., 2005).

VAN TILBURG (2006) verificou a ação da insulina em diversas concentrações

(0,003 U/mL, 0,03 U/mL, 0,3 U/mL e 3 U/mL) em espermatozóides de ovinos,

constatando uma proteção à integridade de acrossoma e uma pequena melhora na

motilidade após o teste de termo-resistência lento após o descongelamento, sendo

que a maior diferença estatística ocorreu favoravelmente aos tratamentos que

utilizaram insulina ao sêmen resfriado após 24 a 96 horas.

No metabolismo protéico, a insulina promove a captura de aminoácidos pela

maioria dos tecidos, promovendo a síntese de proteínas e inibindo a sua degradação

(CUNNINGHAM, 1997).

Segundo ABDELMONEIN et al., (1998), a insulina pode melhorar a

sobrevivência espermática após o congelamento, pois estimula a síntese de DNA,

RNA, proteínas, e de lipídeos, além de aumentar as funções intracelulares e da

membrana plasmática. Neste trabalho foi verificado o efeito da insulina transferrina

selênio (ITS) na motilidade e integridade de membrana de espermatozóides de

chimpanzé após o congelamento. Nas concentrações de 1 e 10 µg/ml de ITS

ocorreu diminuição da velocidade e da motilidade progressiva, o que pode ter

gerado uma pequena citotoxidade. Porém, na concentração de 100 µg/ml de ITS

protegeu o espermatozóide durante o estresse térmico decorrente do congelamento

e descongelamento.

2.4 Utilização de aminoácidos para crioproteção.

Sabe-se que uma grande variedade de plantas acumula o aminoácido prolina

em resposta a baixas temperaturas, e alguns aminoácidos protegem vários tipos de

células animais contra hipotermia. Estes aminoácidos previnem danos à estrutura

celular durante o estresse causado pelo congelamento (revisado por TRIMECHE et

al.,1999). Fibroblastos de hamsters chineses foram congelados e descongelados

para verificar a ação crioprotetora de certos aminoácidos, sendo comprovada a

eficácia da glutamina e da prolina promovendo a melhor proteção na concentração

de 10 a 40mM (KRUUV e GLOFCHESKI, 1992). KUNDU et al. (2001)

criopreservaram espermatozóides caprinos utilizando aminoácidos com diferentes

concentrações em um meio definido (sem gema de ovo ou leite) sem a adição de

qualquer outro crioprotetor, obtendo uma crioproteção máxima com a l-alanina na

concentração de 135mM. Porém, a glutamina, prolina e a glicina também obtiveram

êxito nas concentrações de 100mM, 130mM e 150mM, respectivamente, enquanto

que l-arginina, l-lisina e l-histidina ofereceram pouca ou nenhuma crioproteção. Na

mesma publicação, KUNDU et al. (2001) demonstraram que a associação destes

aminoácidos com glicerol e glicerol com dimetilsulfóxido (DMSO) conferem um

melhor resultado, porém, em uma concentração menor tanto na associação com o

glicerol (Alanina: 40mM, Prolina: 20mM, Glicina 40mM e Glutamina 70mM) quanto

com o glicerol e DMSO (Alanina: 40mM, Prolina: 20 mM, Glicina 40mM e Glutamina

60mM). A associação de aminoácido com glicerol e DMSO gerou os melhores

resultados deste trabalho com uma elevada eficácia crioprotetora obtida. Deste

modo, os autores sugerem que esta mistura de crioprotetores possa ser benéfica

para a criopreservação de sêmen de várias espécies.

HE e WOODS (2003) verificaram a concentração de 75mM para alanina ou

de 50mM de glicina usando 5% de DMSO para obter a melhor motilidade pós-

descongelamento de espermatozóides do peixe “baixo listrado” (Morone saxatilis). A

glicina tem sido usada com sucesso como crioprotetor não-penetrante para

criopreservar espermatozóides, e aumentar a motilidade pós-descongelamento

(KUNDU et al., 2001; HE e WOODS 2003). HE e WOODS (2004) observaram que a

glicina protege a mitocôndria e seu conteúdo de ATP, mas não protege a integridade

da membrana plasmática espermática no pós-descongelamento. Este mecanismo de

ação da glicina é desconhecido. KHLIFAOUI et al. (2005) verificaram que a adição

de 50mM de glutamina mais 2,5% de glicerol aumentou a motilidade espermática de

garanhões quando comparado a outros diluentes de congelamento contendo apenas

glicerol.

Apesar de ter sido verificado o efeito crioprotetor sobre espermatozóides em

diversas espécies (SANCHEZ-PARTIDA et al., 1992; RENARD et al., 1996;

TRIMECHE et al.,1999: KUNDU et al., 2001; HE e WOODS 2003, 2004a e 2004b),

os mecanismos de crioproteção espermática por aminoácido, assim como a função

de aminoácidos livres na fisiologia do espermatozóide ainda não foram esclarecidos.

KUNDU et al., 2001 especularam ser possível que os aminoácidos possam interagir

eletrostaticamente com grupos fosfato de fosfolipídeos na membrana plasmática do

espermatozóide, deste modo, formando uma camada na superfície espermática.

Todavia, tem sido descrito a toxicidade de altas concentrações de

aminoácidos durante o processo de congelamento e descongelamento para

espermatozóides de carneiros (SANCHEZ-PARTIDA et al., 1992), jumentos

(TRIMECHE et al.,1996), cavalos (TRIMECHE et al.,1999) e de humanos (RENARD

et al., 1996). Alguns autores explicam a toxidade da alta concentração de

aminoácidos pelo efeito osmótico (KRUUV et al., 1988; TRIMECHE et al.,1999;

FAHY et al., 1990), porém, a hipótese de toxicidade bioquímica não pode ser

descartada (TRIMECHE et al.,1996), podendo, também, ambas hipóteses atuarem

em conjunto (FAHY et al., 1990).

2.5 Proteção espermática pela ação do plasma seminal

É bem conhecido que o plasma seminal exerce muitas funções sobre o

metabolismo e fertilidade espermática: ativação de espermatozóides imóveis, ação

bactericida, neutralização de metabólitos espermáticos, nutrição do espermatozóide

ejaculado na fêmea e proteção do epitélio e do espermatozóide contra acrosina por

inibidores de proteinase (PESCH et al. 2006).

A composição do plasma seminal, que contém moléculas inorgânicas,

aminoácidos, peptídeos e proteínas de alta massa molecular, varia de acordo com

as espécies, com os intervalos entre ejaculações e com a saúde do animal (CATT,

1997). Apesar dos efeitos osmóticos benéficos de diluentes, a diluição do sêmen

também remove proteínas adsorvidas, antioxidantes naturais, e outros componentes

benéficos presentes no plasma seminal requeridos para manutenção da integridade

de membrana e para a ação do espermatozóide (CATT, 1997). A remoção destes

componentes pela diluição pode também criar diferenças de cargas entre

espermatozóides, resultando em aglutinação “cabeça com cabeça”, um problema

que pode ser reduzido pela adição de proteínas, como por exemplo, a albumina

sérica bovina (BSA), ou plasma seminal ao meio (MAXWELL e JOHNSON 1999). O

plasma seminal pode não conter fatores extremamente essenciais para a

fecundação, mas as secreções podem proporcionar condições para a motilidade,

sobrevivência e transporte dos espermatozóides, tanto no trato reprodutivo

masculino, quanto no feminino (EWING e CHANG,1986).

O plasma seminal tem sido descrito como um fator importante na

manutenção da motilidade espermática em bovinos (BAAS et al., 1983) e ovinos

(GRAHAN et al., 1994), promovendo viabilidade espermática (ASHWORTH, 1994;

MAXWELL, 1997) e aumentando a resistência do espermatozóide ao choque

térmico (PURSEL et al.,1973; BERGER, 1985).

Os diversos estudos que analisaram a função do plasma seminal na

fertilidade do espermatozóide são contraditórios. Em camundongos e coelhos, a

fertilidade melhorou após a adição de componentes do plasma seminal (GAUR e

TALWAR citado por MAXWELL e JOHNSON, 1999), assim como em ratos (CURRY

e ATHERTHON, 1990). Após a remoção das glândulas acessórias, ocorreram

mudanças na composição do plasma seminal que prejudicaram a fertilidade em

ratos (PURSEL e JOHNSON, 1975), hamsters (CHOW e PANG, 1986 ) e

camundongo (PANG e CHOW, 1979). Por outro lado, alguns estudos mostraram a

redução da fertilidade após exposição do espermatozóide ao plasma seminal em

bovinos, caprinos, ovinos (DOTT e HARRISON, 1979), suínos (IWAMOTO et al.,

1992) e em humanos (IWAMOTO e GAGNON, 1988). Variações na presença,

ausência ou na concentração crítica de certos componentes, possivelmente

proteínas, no plasma seminal devem ser a causa da variabilidade desses efeitos na

fertilidade do espermatozóide. No entanto, o fato da maior parte do plasma seminal

não acompanhar o espermatozóide durante a sua ascensão ao local da fertilização

no trato reprodutivo feminino, sugere que a sua remoção é necessária para a

aquisição da capacidade fertilizante, e deve ser um fator importante no processo de

capacitação.

Os fatores presentes no plasma seminal ligados às células espermáticas

responsáveis pela modulação da capacitação para que esta ocorra somente próxima

ao local em que ocorre a fertilização são, possivelmente, proteínas da família das

espermadesinas ligadas à heparina, as quais têm sido descritas por alguns

pesquisadores (CALVETE, 1996). A adição de plasma seminal à suspensão de

espermatozóides previamente capacitados parece decapacitar as células, porque

reduz a sua capacidade de fertilizar ovócitos “in vivo” (CHANG, 1957, citado por

MAXWELL e JOHNSON, 1999). A adsorção de grande quantidade de proteínas do

plasma seminal em espermatozóides suínos tem sido confirmada por METZ et al.

(1990), e mudanças no espermatozóide de touro, carneiro e varrão, devido a

interações com proteínas do plasma seminal também têm sido descritas. BARRIOS

et al. (2000) observaram que a aquisição de proteínas do plasma seminal reverte o

efeito prejudicial do choque térmico sobre a membrana espermática de carneiro.

MORTIMER e MAXWELL (2004) observaram que a alteração do meio após o

descongelamento de sêmen ovino para um meio que contenha 20% de plasma

seminal diminui a capacitação espermática.

Vários estudos sugerem que o plasma seminal contém fatores que podem

influenciar a fertilidade nos machos. Alguns fatores têm sido isolados, tais como

íons, proteínas e lipídeos. Dentre estes, as proteínas são os principais alvos de

estudos. A presença, ausência ou a concentração de proteína no plasma seminal

são responsáveis pelos efeitos deste fluido na fertilidade espermática (HENAULT e

KILLIAN, 1996).

Proteínas do plasma seminal são ativas na proteção e eliminação do

espermatozóide no útero. A inclusão de plasma seminal ou de proteínas específicas

do plasma seminal em doses de inseminação artificial pode ser importante para o

transporte normal e eliminação do espermatozóide quando as éguas são

inseminadas mais do que uma vez, onde a segunda dose inseminante atuará em

um meio uterino inflamado (TROEDSSON et al. 2006).

Os constituintes do plasma seminal que interagem com o espermatozóide,

uma vez depositado sobre as células, são difíceis de retirar, mesmo através de

lavagem (MANN et al., 1981). Além disso, sob certas circunstâncias, a presença do

plasma seminal aumenta a resistência dos espermatozóides ao choque térmico e a

sua capacidade de sobreviver após congelamento e descongelamento (PURSEL e

JONHSON, 1975). A remoção das proteínas acrossomais, que ocorre tipicamente no

espermatozóide bovino após choque térmico, foi acentuadamente reduzida no

congelamento do espermatozóide realizado na presença de plasma seminal

(CHURCH e GRAVES, 1976). O espermatozóide congelado de carneiro também

aumenta a sua penetração no muco cervical, aumentando a porcentagem de

ovelhas prenhes após inseminação cervical na presença de plasma seminal. A

interação de proteínas do plasma seminal com o espermatozóide deve influenciar na

sua capacidade fertilizante e na proteção da membrana espermática de choques

térmicos (BARRIOS, 2000).

FAGUNDES (2003) constatou que a adição de proteínas acima de 10 kDa do

plasma seminal autólogo dez vezes concentradas tiveram um efeito benéfico não só

à motilidade do espermatozóide eqüino congelado mas também à sua integridade de

membrana acrossomal.

O sêmen congelado provoca uma forte resposta de polimorfonucleares,

devido à alta concentração espermática e devido à falta de plasma seminal, isso

deve apressar a remoção dos espermatozóides congelados. Uma supressão do

influxo de polimorfonucleares pelo plasma seminal deve proteger temporariamente

os espermatozóides da fagocitose (TROEDSSON et al., 1999).

2.6 Análise computadorizada da motilidade espermática

A padronização e o maior detalhamento das avaliações de motilidade pelo

computador é uma ferramenta importante na pesquisa científica, já que aumenta a

confiabilidade dos dados e a capacidade de determinar o tipo de movimento e a

velocidade do espermatozóide em um determinado trajeto. Parâmetros da análise

computadorizada da motilidade espermática (CASA) tais como velocidade curvilinear

(VCL), velocidade média do trajeto (VAP), velocidade em linha reta (VSL) e medidas

de retidão do trajeto do espermatozóide (linearidade (LIN) e retidão (STR)) foram

usados para detectar efeitos sutis de agentes toxicológicos em espermatozóides de

roedores (PERREAULT e CANCEL, 2001). Esses parâmetros também foram

utilizados para caracterizar espermatozóides de ratos com motilidade hiperativada, o

que é um indicativo de capacitação espermática (CANCEL et al., 2000). A transição

de motilidade progressiva para motilidade hiperativada foi caracterizada em ratos

pelo aumento na VCL e VAP com um decréscimo correspondente na VSL, STR e

LIN (PERREAULT e CANCEL, 2001; CANCEL et al., 2000). RATHI et al. (2001)

postularam que a amplitude lateral da cabeça (ALH) e a VCL aumentam em

espermatozóides eqüinos hiperativados em meio contendo agentes capacitantes,

tais como: bicarbonato e Ca

ionóforo. Estes autores concluíram que

espermatozóides eqüinos hiperativados apresentam VCL ≥180 e ALH ≥12.

Foi observado que apenas espermatozóides que apresentam boa motilidade

progressiva e alto deslocamento lateral da cabeça são capazes de penetrar no muco

cervical de ovinos (revisado por MORTIMER e MAXWELL, 2004).

KATHIRAVAN et al. (2008) observaram uma diferença altamente significativa

entre touros nos parâmetros de CASA analisados, sendo esta diferença a maior

fonte de variação destas medidas e segundo esses autores existe uma correlação

positiva dos parâmetros de motilidade espermática analisados por CASA com a taxa

de penetração em zona pelúcida de ovócitos de hamster. As correlações positivas

altamente significativas entre motilidade progressiva e os parâmetros de velocidade

indicam que o espermatozóide com um trajeto linear progressivo e reto vai percorrer

uma distância maior em um curto espaço de tempo. Ocorreu uma correlação

fortemente negativa neste mesmo estudo entre retidão e linearidade com amplitude

lateral de cabeça, já que estes parâmetros são parecidos e medem a partida da

linha de conduta e o trajeto da célula em uma linha reta. A retidão e a linearidade

quase não tiveram correlação com a fertilidade. A Linearidade (LIN) é um parâmetro

variável na análise entre diluentes (ARRUDA et al. 2003), porém, JANUSKAUSKAS

et al. (2003) também não encontraram correlação de LIN com fertilidade.

A velocidade do trajeto (VAP) e a velocidade progressiva (VSL) possuem uma

forte correlação positiva com a fertilidade (KATHIRAVAN et al. 2008; SUKCHAROEN

et al. 1998) podendo, desta maneira, ser utilizada para se estimar a fertilidade de

amostras seminais.

MORTIMER (1997) reportou que o aumento na viscosidade do diluente

resulta em uma diminuição da amplitude da onda flagelar. Geralmente a amplitude

lateral de cabeça (ALH) elevada não é desejável porque afeta a progressão celular,

deste modo valores mais elevados de ALH denotam uma menor qualidade da

amostra seminal (ARRUDA et al. 2003).

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Delineamento experimental

O delineamento experimental utilizado foi o de blocos ao acaso. Os

tratamentos, número de coletas e de garanhões estão descritos abaixo.

Inicialmente, foram realizadas cinco coletas de sêmen de cada garanhão com

intervalo de 2 dias, a fim de eliminar células espermáticas armazenadas por um

longo período. Em seguida, foram coletados três ejaculados de cada animal para a

realização de cada experimento (itens 3.4.1 e 3.4.2).

3.2 Animais

Foram utilizados cinco garanhões em idade reprodutiva da raça Mangalarga

Marchador provenientes do Haras LUGAVI, localizado às margens da BR 101 no

município de Campos dos Goytacazes – RJ, distando dez quilômetros do laboratório

de reprodução e melhoramento genético animal na UENF, local onde foi realizado o

congelamento do sêmen.

3.3 Obtenção do sêmen.

O sêmen foi obtido com o auxílio de uma vagina artificial modelo Hannover,

sendo ajustada a temperatura a uma variação entre 42°C e 45°C, de acordo com a

libido do animal e a pressão interna da vagina que foi ajustada de acordo com o

tamanho do pênis do garanhão. As coletas foram realizadas utilizando-se uma égua

em cio como manequim para estimular o garanhão a realizar a monta.

3.4 Processamento para congelamento

Após a obtenção do sêmen, a porção gelatinosa, proveniente das vesículas

seminais foi removida ao ficar retida no filtro de coleta. Para análise da concentração

espermática, uma amostra do sêmen foi diluída em uma proporção de 1:200 de

solução formol citrato, preparada com 2,94g de Citrato de Sódio em 100 mL de água

destilada, onde foi removido 4 mL desta solução e adicionado 4 mL de Formaldeído

(Merck). O restante do ejaculado foi diluído em meio de resfriamento contendo 10 g

de leite desnatado Molico (Nestlé) e 0,4g de AGROVET



(Novartis) diluídos em 100

mL de água destilada q.s.p (Souza et al. 2001) em uma proporção de uma parte de

sêmen para duas de diluente, sendo mantido à uma temperatura de

aproximadamente 15°C em uma caixa térmica para o transporte do sêmen (Max-

sêmen).

No laboratório, a concentração espermática foi determinada com auxílio de

uma câmara de Newbauer e em seguida o sêmen foi centrifugado no meio de

resfriamento a 600 G, durante 10 minutos, à temperatura ambiente. Foi mantido no

tubo para congelamento cerca de 10 a 20% do diluente de resfriamento com o

plasma seminal para resuspender com o diluente de congelamento.

O diluente de congelamento utilizado foi o proposto por VIDAMENT et.al.

(2002) com modificações contendo 50 mL de lactose 11%; 25 mL de glicose-EDTA

(12g de glicose; 0,240g de carbonato de sódio; 0,740g de EDTA; 0,750 g de Citrato

de sódio 2 H

O; 0,8 g de AGROVET



(Novartis); 200 mL de água destilada q.s.p); 20

mL de gema de ovo in natura; 3 mL de glicerol; 2 mL de dimetilformamida; 0,5 mL de

Equex



- Farmacia, Orvus et paste. Todos os demais reagentes descritos acima

foram obtidos pela empresa VETEC



3.4.1 Experimento 1

Foi avaliada a adição de insulina (Iolin® mista bovina e suína altamente

purificada com concentração de 100 U/mL) ao diluente de congelamento da

seguinte maneira: Tratamento 1 (T1), controle; Tratamento 2 (T2), 0,1U/mL;

Tratamento 3 (T3), 1U/mL; Tratamento 4 (T4), 10U/mL. Foram avaliados os

parâmetros de motilidade e cinemática espermática utilizando o programa Ceros

versão 10.8 da Hamilton Thorn Research (HTM-CEROS), de funcionalidade de

membrana plasmática pelo teste hiposmótico (DELL’AQUA JÚNIOR, 2000) e de

integridade acrossomal pelo teste FITC-PSA (item 3.6).

Foi feita a resuspensão do sedimento de espermatozóides acrescentando-se

o diluente de congelamento de acordo com os tratamentos, de forma a se obter uma

concentração de 100 X 10

células/mL.

O envase do sêmen foi feito em palhetas de 0,5 mL previamente identificadas,

sendo em seguida vedadas com álcool polivinílico. As palhetas ficaram em repouso

por 20 minutos à temperatura de ±4 °C e em seguida foram colocadas no vapor de

nitrogênio líquido (N

), ficando a 4 cm acima do nível deste criogênio por 10 minutos,

para, posteriormente, serem imersas no mesmo para armazenamento.

3.4.2 Experimento 2

Foi avaliada a adição de aminoácidos (obtidos pela Sigma-Aldrich) ao diluente

de congelamento da seguinte maneira: Tratamento 1, controle; Tratamento 2, 40mM

de l-alanina; Tratamento 3, 40mM de l-glicina; Tratamento 4, 60mM de l-glutamina;

Tratamento 5, 7mM de l-alanina + 7mM de l-glicina + 20mM de l-glutamina e

Tratamento 6, 40mM de l-alanina + 40mM de l-glicina + 60mM de l-glutamina. Os

parâmetros analisados e o método de processamento do sêmen para congelamento

são o mesmo descrito no experimento 1.

3.4.2.1 Determinação da composição em aminoácidos

A determinação da composição em aminoácidos foi realizada no Laboratório

de Química e Funções de Proteínas e Peptídeos da Universidade Estadual do Norte

Fluminense.

Inicialmente foi realizada uma diluição de dez vezes do diluente controle e de

duzentas vezes do diluente do tratamento 5. Uma amostra de 20µL de cada diluente

previamente diluído foi aplicada em coluna de troca iônica (Amino-Na) utilizando o

analisador de aminoácidos “Shimadzu High-Performance Liquid Chromatograph

(HPLC) – Amino Acids Analysis System”. Após fracionamento os aminoácidos

sofreram uma derivatização pós-coluna, ou seja, reagiram com OPA (o-

phthalaldehyde) para a formação de um composto fluorescente. Foi utilizado um

comprimento de onda de 348nm na excitação de 450nm na emissão.

3.5 Avaliação da funcionalidade da membrana espermática através do teste

hiposmótico

A integridade funcional da membrana espermática foi avaliada através do

choque hiposmótico utilizando a técnica desenvolvida por DELL’AQUA JÚNIOR

(2000) modificada. Em um tubo foi adicionado 190µl de água bidestilada a 38°C e 10

µl do sêmen descongelado. A amostra foi incubada por 5 minutos em banho-maria a

38°C. Em seguida foi colocada uma gota sobre a lâmina recobrindo-a com uma

lamínula para análise em microscópio de contraste de fase com aumento de 400X.

Foram contadas 200 células espermáticas, considerando-se as células com

membrana funcional aquelas que apresentaram a cauda enrolada e não funcionais

aquelas que permaneceram com a cauda esticada.

3.6 Avaliação da integridade acrossomal

A integridade do acrossoma foi avaliada utilizando a fluoresceina isotiocianato

conjugada com a lectina Pisum sativum aglutinina (FITC-PSA), a qual se liga a

glicoconjugados da matriz acrossomal (BEDFORD et al. 2000) em associação com o

Iodeto de Propídeo (corante nuclear).

Após a análise da funcionalidade da membrana, motilidade e cinemática

espermática, o sêmen descongelado foi submetido à centrifugação a 200 G por 2

minutos para remoção do diluente de congelamento e adição de PBS. Em seguida,

foram preparados esfregaços das amostras que foram secas à temperatura

ambiente e mergulhadas em metanol resfriado a – 10ºC no congelador por 30

segundos e novamente secas à temperatura ambiente. Foi colocado sobre cada

lâmina 60 a 90µL de FITC-PSA sob proteção de luminosidade e em seguida foram

cobertas com um pedaço de transparência para retroprojeção e incubadas por 20

minutos. Em seguida foi adicionado 60 a 90µL de iodeto de propídio em cada

lâmina e novamente ela foi coberta com um filme de poliéster e incubada por 10

minutos. Foi removido o filme de poliéster para que as lâminas fossem lavadas com

PBS e cobertas com lamínula para serem observadas em microscopia de

fluorescência com aumento de 1000X. Foram contadas 200 células por lâmina e

classificadas como acrossoma integro (verde uniforme), parcialmente reagido

(“balloon” ou danificado) e reagido (vermelho). O comprimento de onda utilizado na

observação foi de 540nm. Todos os reagentes utilizados foram obtidos pela Sigma-

Aldrich.

3.7 Descongelamento:

As palhetas foram descongeladas a 37º C por 30 segundos.

3.8 Análise computadorizada dos parâmetros da motilidade espermática

Os parâmetros da motilidade espermática analisados foram:

Motilidade total (Total Motility,%);

Corresponde à taxa de células móveis em relação à concentração total

de células analisadas.

Motilidade progressiva (Progressive Motility,%);

São utilizados os seguintes parâmetros para classificação da

velocidade de uma célula móvel: MVV (Medium VAP Cut Off), LVV

(Low VAP Cut Off) e LVS (Low VSL Cut Off). Células rápidas

apresentam VAP>MVV, de velocidade média quando LVV<VAP<MVV

e lentas quando VAP<LVV e/ou VSL<LVS. A célula é definida com

motilidade progressiva se a retidão for maior do que o limite inferior

para índice retilíneo (Threshold Straightness) e a velocidade do trajeto

(VAP) for maior do que o corte de velocidade média do trajeto (MVV).

Velocidade média do trajeto (VAP, Path velocity, µm/s);

É a velocidade média ininterrupta do caminho da célula. Representa a

distância total ao longo do trajeto médio para cada espermatozóide

dividido pelo tempo utilizado.

Velocidade progressiva (em linha reta) (VSL, Progressive velocity, µm/s);

É a velocidade média percorrida em linha reta entre o início e o fim do

trajeto.

Velocidade curvilinear (VCL, Track speed, µm/s);

É a velocidade média de cada ponto atual do trajeto seguido por cada

célula. É definida pela distância total entre cada posição do centro de

brilho do espermatozóide durante a aquisição da imagem, dividida pelo

tempo gasto.

Amplitude do deslocamento lateral de cabeça (ALH, Lateral amplitude, µm);

Corresponde a largura média da oscilação da cabeça do

espermatozóide de acordo com o seu movimento.

Freqüência de batimentos (BCF, Beat cross frequency, Hz);

É a freqüência que a cabeça do espermatozóide se move para cima e

para baixo durante um trajeto.

Retidão (STR, Straightness, %)

É o valor médio da proporção entre VSL/VAP. Determina a partida da

linha de conduta da célula de uma linha reta.

Linearidade (LIN, Linearity, %)

É o valor médio da proporção entre VSL/VCL. Determina a partida do

trajeto da célula em uma linha reta.

Estes parâmetros foram determinados através de uma avaliação

computadorizada utilizando o programa Ceros versão 10.8 da Hamilton Thorne

Research (HTM-CEROS, 1999), sendo que tais definições foram obtidas no seu

manual de operação de onde podem obter maiores detalhes. Os parâmetros de

ajuste (set up) do aparelho são os seguintes: Número de imagens adquiridas

(Frames Acquired) – 30; Taxa de aquisição das imagens (Frame rate) – 60Hz;

Contraste mínimo (Minimum Contrast) - 80; Tamanho mínimo da célula (Minimum

Cell Size) - 3 pixels; Contraste para células imóveis (Non-motile Cell Contrast) – 30;

Limite inferior para índice retilíneo (Threshold Straightness) – 70%; Referência de

VAP de células lentas (Low VAP Cut-Off) - 5,0 µm/s; Referência de VAP de células

médias (Medium VAP Cut-Off) - 25,0 µm/s; Referência de VSL para células lentas

(Low VSL Cut-Off) - 11,0 µm/s; Tamanho de cabeça parada (Non-Motile Head Size)

- 6 pixels; Intensidade da cabeça parada (Non-Motile Head Intensity) – 160; Limites

de tamanho estático (Static Size Limits) – 0,32 a 2,50; Limites de intensidade

estática (Static Intensity Limits) – 0,10 a 1,12; Limites de alongamento estático

(Static Elongation Limits) – 12 a 90; Opção não marcada para contar células lentas

como motilidade (Count Slow as Motile).

Uma câmara de contagem de 20 µL (Hamilton Thorne Research) pré-

aquecida pela placa de platina aquecedora (±37

C) foi utilizada para observação da

amostra seminal através do microscópio óptico com um aumento de 100X acoplado

ao computador. A intensidade da fonte de luz foi ajustada para que as imagens dos

espermatozóides fossem capturadas e digitalizadas para análise pelo programa.

Foram escolhidos quatro campos que apresentavam melhor motilidade aparente na

amostra para submissão à análise, sendo a média destes valores anotada e salva

pelo programa para análise estatística.

O programa Ceros analisa cada trajeto espermático separadamente. Isto se

deve à sua indicação da posição média do brilho da cabeça do espermatozóide, ou

seja, o centro de brilho para cada imagem captada. Após cada avaliação realizada

pelo programa foi realizado um controle de qualidade de cada análise para

comprovar a marcação de todas as células através da tecla Playback.

3.9 Análise Estatística

Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e os tratamentos

comparados pelo teste F. As médias dos tratamentos foram comparadas pelo teste

de Tukey em nível de 5% de probabilidade. As análises estatísticas foram realizadas

utilizando o programa computacional Genes (CRUZ, 2006). Foi determinado o efeito

dos tratamentos, dos garanhões e das coletas de sêmen.

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os valores relativos à variação no pH e osmolaridade (mOsm) entre os

diluentes utilizados nos experimentos 1 e 2 estão apresentados na tabela 1.

Tabela 1: Valores de pH e osmolaridade dos diluentes utilizados.

Tratamento pH Osmolaridade sem

crioprotetor (mOsm)

Osmolaridade com

crioprotetor (mOsm)

Controle 6,45 358 1254

Insulina 1 UI/mL 6,47 373 1301

Insulina 10 UI/mL 6,48 371 1276

Insulina 100 UI/mL 6,52 375 1193

Alanina (40mM) 6,49 428 1351

Glicina (40mM) 6,5 414 1305

Glutamina (60mM) 6,47 447 1364

7mM de Alanina e Glicina e 20

mM de Glutamina

6,5 413 1296

40mM de Alanina e Glicina e 60

mM de Glutamina

6,44 581 1767

De acordo com os dados da tabela 1 não houve variação significativa no pH

entre os diluentes (variou de 6,44 a 6,52), o que se deve ao uso de tampão na

formulação do diluente. Contudo, a maior variação na osmolaridade ocorreu entre o

tratamento com 40mM de Alanina e de Glicina e 60 mM de Glutamina com os

demais tratamentos. O aumento da pressão osmótica ao se adicionar os

crioprotetores penetrantes está de acordo com a revisão realizada por

COTTORELLO e HENRY (2002), sendo que este efeito é uma das causas de

toxicidade ao espermatozóide que foi verificada por Watson (1995) mesmo na

ausência do congelamento. O diluente que apresentou os maiores valores de

osmolaridade (40mM de Alanina e Glicina e 60 mM de Glutamina) foi o que resultou

na menor qualidade seminal após o descongelamento, conforme mostrado nas

tabelas do experimento 2.

Figura 1: Análise de aminoácidos: (A) padrão de 1nM, (B) diluente controle

(tratamento 1), (C) diluente tratamento controle comparado com

tratamento 5 do experimento 1 (em vermelho)

Na figura 1A observa-se os padrões de aminoácidos na concentração de

1nM/mL utilizados para análise e comparação com o diluente controle (Figura 1B). A

figura 1C mostra uma comparação gráfica entre o diluente controle e o tratamento 5

(20mM de glutamina, 7mM de alanina e glicina), onde o maior pico mostrado nesta

figura (após aproximadamente 7,5 minutos de corrida) corresponde à glutamina que

neste caso está associada à treonina e os picos seguintes correspondem à glicina

(após aproximadamente 12,5 minutos) e alanina (após aproximadamente 13,5

minutos). A tabela 2 mostra a concentração dos aminoácidos analisados pelo

analisador “Shimadzu High-Performance Liquid Chromatograph (HPLC) – Amino

Acids Analysis System” no diluente controle, o qual utiliza 20% de gema de ovo.

Tabela 2. Composição de aminoácidos encontrados no diluente MARTIN et.al.

(1979) modificado.

Aminoácidos Concentração (mM)

Ácido aspártico 0,0981

Glutamina+Treonina

0,4614

Serina 0,2486

Ácido Glutâmico 0,1655

Prolina 0,1545

Glicina 0,0635

Alanina 0,1052

Valina 0,1557

Metionina 0,0435

Isoleucina 0,1534

Leucina 0,1917

Tirosina 0,0686

Fenilalanina 0,1288

Histidina 0,3131

Lisina 0,1900

Arginina 0,1661

EXPERIMENTO 1: Adição de insulina ao diluente crioprotetor eqüino

O resumo da análise de variância das variáveis motilidade, funcionalidade de

membrana através do teste hiposmótico (HIPO), integridade acrossomal e das

variáveis de cinemática espermática obtido dos dados dos tratamentos deste

experimento são mostrados nos anexos A e B. Pelo teste F houve diferença

estatística (P<0,01) entre os tratamentos na análise de motilidade total e motilidade

progressiva, enquanto que os tratamentos não se diferiram na análise de integridade

funcional de membrana plasmática pelo teste hiposmótico e nem na integridade

acrossomal pelo teste FITC-PSA. De acordo com estas análises, a adição de

insulina afetou apenas os parâmetros de motilidade. Também ocorreu uma diferença

estatística entre os tratamentos na análise de freqüência de batimentos (BCF)

(P<0,01) e na análise de amplitude lateral de cabeça (ALH) (P<0,05), sendo

semelhante o efeito dos tratamentos nos demais parâmetros cinemáticos analisados.

Deste modo, a adição de insulina afetou apenas os parâmetros ALH e BCF de

cinemática espermática.

O resumo da análise de variância das variáveis motilidade, funcionalidade de

membrana através do teste hiposmótico (HIPO), integridade acrossomal e das

variáveis de cinemática espermática obtido dos dados dos garanhões do

experimento 1 estão apresentados nos anexos C e D, enquanto que nos anexos E e

F estão os resumos destas mesmas variáveis obtido dos dados das coletas neste

experimento. Pelo teste F houve diferença estatística entre os garanhões (P<0,01)

na análise de motilidade total, motilidade progressiva, integridade funcional de

membrana plasmática pelo teste hiposmótico, integridade acrossomal pelo teste

FICT-PSA para íntegros e lesados e para semilesados (P<0,05), além de todos os

parâmetros cinemáticos analisados (P<0,01).

Com exceção do grupo com membrana acrossomal semilesada (PSA-SL) houve

diferença estatística (P<0,01) entre as coletas dos garanhões na análise de

motilidade total, motilidade progressiva, integridade funcional de membrana

plasmática pelo teste hiposmótico e integridade acrossomal pelo teste FITC-PSA.

Do mesmo modo ocorreram diferenças entre as coletas na análise de velocidade do

trajeto (VAP), velocidade progressiva (VSL), velocidade curvilinear (VCL), amplitude

lateral de cabeça (ALH) e freqüência de batimentos (BCF) (P<0,01) e na análise de

retidão (STR) e linearidade (LIN) (P<0,05), de acordo com os anexos E e F.

Os valores relacionados às médias das variáveis de motilidade, funcionalidade

de membrana pelo teste hiposmótico (HIPO), Integridade da membrana acrossomal

pelo teste do FITC-PSA e das variáveis de cinemática espermática obtidas dos

dados dos tratamentos no experimento 1 encontram-se apresentados nas tabelas 3

e 4.

Tabela 3. Médias das variáveis motilidade total (MOT), motilidade progressiva

(PROG), teste hiposmótico (HIPO), Integridade da membrana acrossomal pelo teste

do FITC-PSA: íntegros (PSA-I), semilesados (PSA-SL) e lesados (PSA-L), obtidas

dos dados dos tratamentos no experimento 1(adição de insulina) verificados

imediatamente após o descongelamento.

Tratamentos

MOT PROG HIPO

Controle 31,6 ± 18,0 a 19,8 ± 12,0 a 30,1 ± 11,2 a

0,1U/mL 32,5 ± 17,9 a 20,8 ± 12,3 a 31,4 ± 12,9 a

1 U/mL 31,6 ± 18,5 a 20,8 ± 13,3 a 30,9 ± 13,9 a

10 U/mL 24,5 ± 15,9 b 15,7 ± 10,5 b 32,2 ± 13,8 a

Média geral 30,0 19,3 31,2

Tratamentos

PSA-I PSA-SL PSA-L

Controle 68,2 ± 15,5 a 6,0 ± 3,7 a 25,8 ± 14,1 a

0,1U/mL 71,7 ± 15,2 a 4,9 ± 2,9 a 23,4 ± 14,4 a

1 U/mL 71,6 ± 17,1 a 5,0 ± 3,0 a 23,4 ± 17,1 a

10 U/mL 73,3 ± 14,6 a 5,4 ± 3,7 a 21,3 ± 12,8 a

Média geral 71,2 5,3 23,5

Médias seguidas pela mesma letra nas colunas não diferem entre si pelo teste de

Tukey em 5% de probabilidade.

Verifica-se na tabela 3 que os tratamentos controle, 0,1U/mL e 1 U/mL não

diferiram em relação à motilidade total e progressiva e nem com relação a

funcionalidade de membrana plasmática e integridade de membrana acrossomal.

Apesar de a insulina aumentar o transporte de glicose para dentro da célula

espermática, como descrito por HICKS et al., (1972) e AQUILA et al., (2005), com

isso proporcionar uma disponibilidade maior de energia promovendo a síntese de

proteínas e lipídeos e por aumentar as funções intracelulares e da membrana

plasmática, os resultados da adição de insulina neste experimento não

demonstraram melhora na motilidade espermática. VAN TILBURG (2006) também

não observou melhora na motilidade total e progressiva na análise imediata após o

descongelamento de sêmen ovino, porém nossos resultados são contraditórios

pelo

fato de que um dos tratamentos (10U/mL) apresentou valores de motilidade total e

progressiva estatisticamente inferiores e não houve melhora na funcionalidade de

membrana e integridade acrossomal, enquanto que no trabalho com ovinos não

ocorreu perda de motilidade em nenhum dos tratamentos e houve uma melhora na

integridade acrossomal com a adição de insulina. Isto pode ser explicado pelo fato

das concentrações de insulina utilizadas também terem sido diferentes, onde a

variação na concentração no trabalho com ovinos foi de 0,003 a 3 U/mL, enquanto

que neste trabalho esta variação foi de 0,1 a 10 U/mL e o tratamento que diferiu

negativamente foi justamente o de maior concentração empregada. Outra

justificativa pode estar na metodologia de congelamento, pois em ovinos não se

retira parte do plasma seminal, como ocorre em eqüinos, e este componente seminal

tem efeito direto na proteção espermática (PESCH et al. 2006; TROEDSSON et al.

2006; BARRIOS et al. 2000; CATT, 1997; MAXWELL e JOHNSON 1999), inclusive

na proteção contra o choque térmico (PURSEL et al.,1973; BERGER, 1985), o que

justifica os menores valores de motilidade pós-descongelamento encontrados neste

trabalho em comparação ao trabalho com ovinos. Possivelmente a associação da

insulina com proteínas do plasma seminal possa ter elevado esta proteção ao

espermatozóide ovino, o que não ocorreu neste trabalho devido à remoção de

grande parte do plasma seminal.

É importante ressaltar que a insulina atua no metabolismo na ativação e

inibição de vias metabólicas que desencadeiam eventos que necessitam de certo

tempo para apresentar resultados. Deste modo, estes resultados na análise imediata

após o descongelamento podem ter ocorrido pelo curto tempo para ativação das

vias metabólicas envolvidas pela insulina.

Tabela 4. Médias das variáveis de cinemática espermática: velocidade do trajeto

(VAP), velocidade progressiva (VSL), velocidade curvilínea (VCL),

amplitude lateral de cabeça (ALH), freqüência de batimentos (BCF),

retidão (STR) e linearidade (LIN), obtidas dos dados dos tratamentos no

experimento 1 (adição de insulina) verificados imediatamente após o

descongelamento.

Tratamentos

VAP VSL VCL

Controle 55,9 ± 11,1 a 44,3 ± 9,4 a 92,0 ± 27,5 a

0,1U/mL 55,8 ± 11,9 a 45,0 ± 10,5 a 96,9 ± 18,9 a

1 U/mL 55,0 ± 11,5 a 43,7 ± 10,0 a 95,9 ± 20,3 a

10 U/mL 52,0 ± 12,3 a 42,2 ± 11,0 a 92,4 ± 19,7 a

Média geral 54,7 43,8 94,3

Tratamentos

ALH BCF STR LIN

Controle 5,2 ± 0,6 a 22,3 ± 6,4 b 78,3 ± 3,6 a 45,2 ± 3,7 a

0,1U/mL 5,1 ± 0,7 a 23,2 ± 6,7 ab 79,3 ± 3,2 a 46,7 ± 4,4 a

1 U/mL 5,0 ± 0,9 ab 23,3 ± 7,9 ab 78,9 ± 4,0 a 46,5 ± 4,3 a

10 U/mL 4,8 ± 1,0 b 25,4 ± 7,0 a 80,0 ± 6,0 a 45,7 ± 5,3 a

Média geral 5,0 23,6 79,1 46,0

Médias seguidas pela mesma letra nas colunas não diferem entre si pelo teste de

Tukey em 5% de probabilidade.

Observa-se que o tratamento que utilizou 10 U/mL de insulina além de

apresentar resultados inferiores de motilidade total e progressiva também

apresentou menor amplitude lateral de cabeça do que os tratamentos controle e 0,1

U/mL e maior freqüência de batimentos do que o tratamento controle, como mostra

a tabela 4. Este menor valor de ALH corrobora com a revisão de MORTIMER e

MAXWELL (2004) de que a penetração no muco cervical estaria prejudicada por

estes espermatozóides que também não apresentaram boa motilidade. Apesar de

ter apresentado um baixo valor de ALH, as características de velocidade (VAP, VCL

e VSL) deste tratamento não se mostraram superiores aos demais tratamentos.

Deste modo, isto mostra que apesar da ALH elevada não ser desejável por afetar a

progressão celular e com isso denotar uma menor qualidade da amostra seminal

(ARRUDA et al. 2003), uma ALH baixa não caracteriza uma boa qualidade da

amostra seminal de acordo com os resultados.

Os valores relacionados às médias entre as variáveis de motilidade,

funcionalidade de membrana pelo teste hiposmótico (HIPO), Integridade da

membrana acrossomal pelo teste do FITC-PSA e das variáveis de cinemática

espermática obtidas dos dados dos garanhões no experimento 1 encontram-se

apresentados nas tabelas 5 e 6.

Tabela 5. Médias das variáveis motilidade total (MOT), motilidade progressiva

(PROG), teste hiposmótico (HIPO), Integridade da membrana

acrossomal pelo teste do FITC-PSA: íntegros (PSA-I), semilesados

(PSA-SL) e lesados (PSA-L), obtidas dos dados dos garanhões no

experimento 1 (adição de insulina) verificados imediatamente após o

descongelamento.

Garanhões MOT PROG HIPO

1 38,4 ± 16,3 a 25,5 ± 10,5 a 38,3 ± 12,2 a

2 43,7 ± 15,9 a 27,9 ± 12,5 a 33,8 ± 9,1 a

3 19,7 ± 8,9 b 12,9 ± 6,7 b 22,8 ± 8,7 b

4 36,1 ± 13,4 a 22,6 ± 8,6 a 36,8 ± 12,3 a

5 12,4 ± 10,2b 7,3 ± 7,1 b 24,2 ± 13,4 b

Média geral 30,0 19,3 31,2

Garanhões PSA-I PSA-SL PSA-L

1 83,1 ± 7,4 a 3,9 ± 2,8 b 12,9 ± 6,4 b

2 77,1 ± 13,8 a 4,8 ± 3,2 ab 18,1 ± 13,1 b

3 58,0 ± 9,3 b 6,2 ± 2,9a 35,9 ± 8,4 a

4 77,2 ± 7,6 a 5,8 ± 3,4 ab 17,0 ± 6,0 b

5 60,8 ± 18,5 b 5,8 ± 3,8 ab 33,4 ± 18,2 a

Média geral 71,2 5,3 23,5

Médias seguidas pela mesma letra nas colunas não diferem entre si pelo teste de

Tukey em 5% de probabilidade.

Tabela 6. Médias das variáveis de cinemática espermática: velocidade do trajeto

(VAP), velocidade progressiva (VSL), velocidade curvilínea (VCL),

amplitude lateral de cabeça (ALH), freqüência de batimentos (BCF),

retidão (STR) e linearidade (LIN), obtidas dos dados dos garanhões no

experimento 1 (adição de insulina) verificados imediatamente após o

descongelamento.

Garanhões VAP VSL VCL

1 66,5 ± 9,3 a 53,1 ± 8,3 a 111,4 ± 17,2 a

2 54,4 ± 10,5 b 45,2 ± 9,6b 93,0 ± 19,1 b

3 51,1 ± 9,4 b 41,4 ± 8,6 bc 89,0 ± 15,6 b

4 49,4 ± 9,3 b 39,0 ± 8,4 c 84,4 ± 14,6 b

5 52,0 ± 11,7 b 40,3 ± 9,5 c 93,9 ± 29,7 b

Média geral 54,7 43,8 94,3

Garanhões ALH BCF STR LIN

1 5,5 ± 0,7 a 22,8 ± 8,9 b 79,0 ± 5,0 bc 47,6 ± 4,2 a

2 4,6 ± 0,3 b 28,8 ± 7,0 a 82,1 ± 2,9 a 47,3 ± 4,0 a

3 4,9 ± 0,5 b 21,3 ± 4,8 b 79,8 ± 2,8 ab 46,7 ± 3,1 a

4 4,7 ± 0,6 b 22,3 ± 5,9 b 78,0 ± 4,4 bc 46,8 ± 4,2 a

5 5,4 ± 1,3 a 22,5 ± 5,6 b 76,9 ± 4,4 c 41,8 ± 4,1 b

Média geral 5,0 23,6 79,1 46,0

Médias seguidas pela mesma letra nas colunas não diferem entre si pelo

teste de Tukey em 5% de probabilidade.

Observa-se que os garanhões 3 e 5 apresentaram menor motilidade total e

progressiva, além de mostrar menor funcionalidade de membrana plasmática e

menor integridade acrossomal (tabela 5). Na análise das variáveis de cinemática o

garanhão 1 apresentou maior velocidade de trajeto (VAP), velocidade progressiva

(VSL) e velocidade curvilinear (VCL) do que os demais garanhões e o garanhão 2

apresentou maior VSL do que os garanhões 4 e 5. A amplitude lateral de cabeça foi

maior nos espermatozóides dos garanhões 1 e 5, enquanto que a freqüência de

batimentos foi maior nos espermatozóides do garanhão 2. O garanhão 2 também

apresentou maior retidão espermática do que os garanhões 1, 4 e 5, enquanto que o

garanhão 3 apresentou maior retidão espermática do que o garanhão 5. O garanhão

5 também apresentou a menor linearidade do que os demais garanhões, de acordo

com o teste Tukey (P<0,05) (tabela 6). Estes resultados estão de acordo com

PICKETT e AMANN (1993) e KLUG (1992), já que verificaram a grande diferença na

congelabilidade de sêmen entre garanhões e com GOMES et al.(2002) na raça

Mangalarga Marchador. Esta variação individual também ocorre em outras espécies

(KATIVARAN et al. 2008). É valido ressaltar que não foi realizado nenhum estudo

prévio de congelabilidade entre os garanhões utilizados, sendo que a péssima

congelabilidade do sêmen dos garanhões 3 e 5 influenciou negativamente na média

geral de cada parâmetro analisado pelos tratamentos nas tabelas 3 e 4.

Os valores das médias das variáveis de motilidade, funcionalidade de membrana

pelo teste hiposmótico (HIPO), Integridade da membrana acrossomal pelo teste do

FITC-PSA e das variáveis de cinemática espermática obtidas dos dados de coletas

no experimento 1 encontram-se apresentados nas tabelas 7 e 8.

Tabela 7. Médias das variáveis motilidade total (MOT), motilidade progressiva

(PROG), teste hiposmótico (HIPO), Integridade da membrana

acrossomal pelo teste do FITC-PSA: íntegros (PSA-I), semilesados

(PSA-SL) e lesados (PSA-L), obtidas dos dados das coletas no

experimento 1 (adição de insulina) verificados imediatamente após o

descongelamento.

Coletas MOT PROG HIPO

1 35,0 ± 15,6 a 22,7 ± 10,5 a 37,8 ± 11,0 a

2 32,6 ± 20,3 a 21,0 ± 14,4 a 30,1 ± 13,3 b

3 22,6 ± 14,7 b 14,0 ± 9,3 b 25,6 ± 11,3 b

Média geral

30,0 19,3 31,2

Coletas PSA-I PSA-SL PSA-L

1 73,7 ± 12,7 a 4,9 ± 3,2 a 21,4 ± 11,5 b

2 73,5 ± 14,0 a 5,0 ± 3,6 a 21,5 ± 12,7 b

3 66,5 ± 18,6 b 6,0 ± 3,1 a 27,5 ± 18,3 a

Média geral

71,2 5,3 23,5

Médias seguidas pela mesma letra nas colunas não diferem entre si pelo teste de

Tukey em 5% de probabilidade.

Tabela 8. Médias das variáveis de cinemática espermática: velocidade do trajeto

(VAP), velocidade progressiva (VSL), velocidade curvilínea (VCL),

amplitude lateral de cabeça (ALH), freqüência de batimentos (BCF),

retidão (STR) e linearidade (LIN), obtidas das coletas no experimento 1

(adição de insulina) verificados imediatamente após o descongelamento.

Coletas VAP VSL VCL

1 61,3 ± 10,7 a 49,5 ± 9,4 a 105,7 ± 24,3 a

2 54,8 ± 9,4 b 43,9 ± 8,3 b 92,6 ± 18,3 b

3 48,0 ± 11,0 c 37,9 ± 9,4 c 84,6 ± 17,0 c

Média geral 54,7 43,8 94,3

Coletas ALH BCF STR LIN

1 5,3 ± 0,8 a 27,1 ± 6,8 a 80,1 ± 4,5 a 46,0 ± 3,7 ab

2 4,9 ± 0,7 b 22,3 ± 7,6 b 79,2 ± 4,5 ab 47,1 ± 5,2 a

3 4,9 ± 1,0 b 21,2 ± 5,2 b 78,1 ± 3,8 b 45,0 ± 4,1 b

Média geral 5,0 23,6 79,1 46,0

Médias seguidas pela mesma letra nas colunas não diferem entre si pelo teste de

Tukey em 5% de probabilidade.

Na tabela 7 observa-se que a coleta 1 dos garanhões apresentou maior

funcionalidade de membrana plasmática, enquanto que a coleta 3 apresentou menor

motilidade total e progressiva, além de mostrar menor integridade de membrana

acrossomal. Esta coleta também apresentou menor VAP, VSL e VCL do que as

demais. A coleta 1 apresentou os maiores valores de VAP, VSL, VCL, ALH e BCF

em relação às demais coletas. A coleta 3 também apresentou menor retidão do que

a coleta 1 e menor linearidade do que a coleta 2 (tabela 8).

Esta grande diferença na congelabilidade do sêmen eqüino entre as coletas

de cada garanhão corrobora com PICKETT e AMANN (1993) e KLUG (1992).

EXPERIMENTO 2: Adição de aminoácidos ao diluente crioprotetor de sêmen eqüino

O resumo da análise de variância das variáveis motilidade, funcionalidade de

membrana através do teste hiposmótico (HIPO), integridade acrossomal e das

variáveis de cinemática espermática obtido dos dados dos tratamentos do

experimento 2 estão apresentados nos anexos G e H. Foi verificada a diferença

estatística pelo teste F (P<0,01) entre os tratamentos que adicionaram aminoácidos

na análise de motilidade total, motilidade progressiva, integridade funcional de

membrana plasmática pelo teste hiposmótico e integridade acrossomal pelo teste

FITC-PSA, com exceção do grupo que apresentou lesão parcial na membrana

acrossomal (PSA-SL) e entre todos os tratamentos na análise de todos os

parâmetros de cinemática analisados.

O resumo da análise de variância das variáveis motilidade, funcionalidade de

membrana através do teste hiposmótico (HIPO), integridade acrossomal e das

variáveis de cinemática espermática obtido dos dados dos garanhões do

experimento 2 está apresentado nos anexos I e J, enquanto que os anexos K e L

apresentam o resumo destas mesmas variáveis obtido dos dados das coletas neste

experimento. Ocorreu diferença estatística (P<0,01) entre os garanhões na análise

de motilidade total, motilidade progressiva, integridade funcional de membrana

plasmática pelo teste hiposmótico e integridade acrossomal pelo teste FITC-PSA e

em todos os parâmetros cinemáticos analisados. A influência do garanhão sobre as

características espermáticas também foram descritas por PICKETT e AMANN (1993)

e KLUG (1992) e por GOMES et al.(2002) na raça Mangalarga Marchador.

As coletas dos garanhões diferiram (P<0,01) na análise de motilidade total,

motilidade progressiva, integridade funcional de membrana plasmática pelo teste

hiposmótico e integridade acrossomal pelo teste FITC-PSA e na análise de

velocidade do trajeto (VAP), velocidade progressiva (VSL) e velocidade curvilinear

(VCL). Também houve diferença (P<0,05) entre as coletas na análise de amplitude

lateral de cabeça (ALH), sendo que a análise entre as coletas de freqüência de

batimentos (BCF), retidão (STR) e linearidade (LIN) não se diferiram. A diferença

entre ejaculados de um mesmo garanhão sobre as características espermáticas

também foi descrita por PICKETT e AMANN (1993) e KLUG (1992).

Os valores das médias das variáveis de motilidade, funcionalidade de membrana

pelo teste hiposmótico (HIPO), Integridade da membrana acrossomal pelo teste do

FITC-PSA e das variáveis de cinemática espermática, obtidas dos dados dos

tratamentos no experimento 2 estão apresentados nas tabelas 9 e 10.

Tabela 9. Médias das variáveis motilidade total (MOT), motilidade progressiva

(PROG), teste hiposmótico (HIPO), Integridade da membrana

acrossomal pelo teste do FITC-PSA: íntegros (PSA-I), semilesados

(PSA-SL) e lesados (PSA-L), obtidas dos dados dos tratamentos:

Controle; 40mM de Alanina (40mM Ala); 40mM de Glicina (40mM Gli);

60mM de Glutamina (60mM Glut); 7mM de Alanina e Glicina e 20mM de

Glutamina (7AlaGli20Glut); 40 mM de Alanina e Glicina e 60 mM de

Glutamina(40AlaGli60Glut) no experimento 2 (adição de aminoácidos)

verificados imediatamente após o descongelamento.

Tratamentos MOT PROG HIPO

Controle 31,6 ± 18,0 ab 19,8 ± 12,0 a 30,1 ± 11,2 a

40mM Ala 32,5 ± 16,6 a 17,8 ± 10,8 ab 29,5 ± 10,4 a

40mM Gli 31,9 ± 16,7 a 18,2 ± 11,2 ab 31,3 ± 11,0 a

60mM Glut 26,0 ± 16,3 b 13,9 ± 11,1 b 26,2 ± 12,5 a

7AlaGli20Glut 34,8 ± 21,1 a 20,2 ± 14,4 a 28,8 ± 11,2 a

40AlaGli60Glut

7,4 ± 7,5 c 2,8 ± 3,8 c 18,6 ± 10,6 b

Média geral 27,4 15,5 27,4

Tratamentos PSA-I PSA-SL PSA-L

Controle 68,2 ± 15,5 d 6,0 ± 3,7 a 25,8 ± 14,1 a

40mM Ala 78,6 ± 13,6 a 5,7 ± 4,7 a 15,7 ± 10,7 d

40mM Gli 74,7 ± 19,6 abc 6,1 ± 7,4 a 19,2 ± 14,8 bcd

60mM Glut 73,3 ± 14,9 bc 6,7 ± 5,8 a 20,0 ± 11,6 bc

7AlaGli20Glut 76,8 ± 17,5 ab 6,3 ± 6,6 a 16,7 ± 13,6 cd

40AlaGli60Glut

69,6 ± 19,0 cd 7,2 ± 8,8 a 23,1 ± 13,7 ab

Média geral 73,5 6,3 20,1

Médias seguidas pela mesma letra nas colunas não diferem entre si pelo teste de

Tukey em 5% de probabilidade.

Tabela 10. Médias das variáveis de cinemática espermática: velocidade do trajeto

(VAP), velocidade progressiva (VSL), velocidade curvilínea (VCL),

amplitude lateral de cabeça (ALH), freqüência de batimentos (BCF),

retidão (STR) e linearidade (LIN), obtidas dos dados dos tratamentos:

Controle; 40mM de Alanina (40mM Ala); 40mM de Glicina (40mM Gli);

60mM de Glutamina (60mM Glut); 7mM de Alanina e Glicina e 20mM de

Glutamina (7AlaGli20Glut); 40 mM de Alanina e Glicina e 60 mM de

Glutamina(40AlaGli60Glut) no experimento 2 (adição de aminoácidos)

verificados imediatamente após o descongelamento.

Tratamentos VAP VSL VCL

Controle 55,9 ± 11,1 a 44,3 ± 9,4 a 92,0 ± 27,5 a

40mM Ala 52,6 ± 7,9 a 40,4± 7,2 a 92,3 ± 12,8 a

40mM Gli 53,2 ± 11,4 a 41,2 ± 9,9 a 92,1 ± 18,0 a

60mM Glut 47,2 ± 12,1 b 35,2 ± 10,1 b 83,6 ± 21,5 a

7AlaGli20Glut 52,9 ± 10,3 a 40,8 ± 8,4 a 93,6 ± 17,2 a

40AlaGli60Glut

39,6 ± 12,9 c 28,1 ± 11,5 c 67,8 ± 23,0 b

Média geral 50,2 38,3 86,9

Tratamentos ALH BCF STR LIN

Controle 5,2 ± 0,6 a 22,3 ± 6,4 a 78,3 ± 3,6 a 45,2 ± 3,7 a

40mM Ala 5,4 ± 0,7 a 20,1 ± 6,8 a 76,2 ± 4,6 a 44,7 ± 3,9 a

40mM Gli 5,4 ± 0,8 a 19,6 ± 6,3 a 76,6 ± 4,6 a 45,2 ± 4,2 a

60mM Glut 4,8 ± 1,5 a 20,2 ± 7,3 a 74,0 ± 4,4 a 43,0 ± 4,2 ab

7AlaGli20Glut 5,3 ± 0,7 a 21,1 ± 6,2 a 76,4 ± 4,7 a 44,6 ± 4,1 a

40AlaGli60Glut

4,0 ± 1,8 b 15,8 ± 6,3 b 67,6 ± 16,2 b 40,1 ± 10,8 b

Média geral 5,0 19,9 74,9 43,8

Médias seguidas pela mesma letra nas colunas não diferem entre si pelo teste de

Tukey em 5% de probabilidade.

De acordo com a tabela 9, os tratamentos que utilizaram 40mM de alanina

(40mM Ala), 40mM de glicina (40mM Gli) e 20mM de Glutamina + 7mM de alanina +

7mM de glicina (7AlaGli20Glut) apresentaram motilidade total superior aos

tratamentos que utilizaram 60 mM de glutamina (60mM Glut) e 60 mM de glutamina

+ 40mM de alanina + 40mM de glicina (40AlaGli60Glut). O tratamento controle e o

tratamento 60mM Glut apresentaram motilidade total superior ao tratamento

40AlaGli60Glut. A motilidade progressiva dos tratamentos controle e 7AlaGli20Glut

foram superiores ao tratamento 60mM Glut e 40AlaGli60Glut, sendo que este

apresentou-se com os piores valores entre os demais tratamentos na motilidade

progressiva e na funcionalidade de membrana plasmática pelo teste hiposmótico, de

acordo com o teste Tukey (P<0,05). Este fato pode ter ocorrido devido à elevada

osmolaridade encontrada no meio deste tratamento (Tabela 1), o que corrobora com

os achados de TRIMECHE et al. (1999) em cavalos, de SANCHEZ-PARTIDA et al.,

(1992) em carneiros, TRIMECHE et al.,(1996) em jumentos e RENARD et al., (1996)

em humanos, sem descartar a hipótese de toxidade bioquímica (TRIMECHE et

al.,1996). Foi observado que, nestas concentrações utilizadas, nenhum tratamento

com aminoácidos melhorou a motilidade em relação ao controle. Este fato diverge

dos resultados de KHLIFAOUI et al. (2005) que adicionaram 50mM de glutamina e

2,5% de glicerol, observando melhora na motilidade pós-descongelamento de

espermatozóides eqüinos. Neste experimento a concentração de glutamina foi

superior (60mM) e, além disso, foi adicionado um outro tipo de crioprotetor (2% de

dimetilformamida) além do glicerol estar em uma concentração superior à utilizada

por KHLIFAOUI et al. (2005). Este fato gerou um ligeiro aumento da osmolaridade do

meio 60mM Glut em relação ao controle (Tabela 1), que pode ter contribuído para os

menores valores de motilidade apresentados em relação ao tratamento controle. Os

resultados deste trabalho também contradizem os estudos em carneiros (KUNDU et

al., 2001) e em peixes (HE E WOODS 2003), o que também pode se justificar pelas

diferenças na metodologia de congelamento e necessidades nutricionais e

crioprotetoras específicas entre estas espécies, como por exemplo o uso de DMSO

nestes trabalhos, enquanto que no apresentado foi utilizado a dimetilformamida. O

fato de utilizar a associação de glicerol com dimetilformamida ocorreu devido aos

resultados de MEDEIROS et al. (2002), VIDAMENT et al. (2002) e GOMES et al.

(2002), sendo constatada esta verificação em um pré-experimento com os

garanhões da raça Mangalarga Marchador utilizados neste experimento. A adição de

aminoácidos aumentou ligeiramente a osmolaridade do meio e talvez se ocorresse

uma redução proporcional da concentração de glicerol e dimetilformamida baseados

na osmolaridade final do meio possivelmente obteria um êxito maior na motilidade

destes espermatozóides analisados. O tratamento 40mM Ala apresentou maior

integridade acrossomal do que os tratamentos controle, 60mM Glut e

40AlaGli60Glut, enquanto que os tratamentos 40mM Gli, 40mM Glut e 7AlaGli20Glut

apresentaram maior integridade acrossomal do que os tratamentos controle e

40AlaGli60Glut (tabela 21). O fato do tratamento 40AlaGli60Glut não ter superado o

tratamento controle se justifica pelo possível estresse osmótico e/ou bioquímico

discutido previamente. HE e WOODS (2004) observaram que a glicina protege a

mitocôndria e seu conteúdo de ATP, mas não protege a integridade da membrana

plasmática espermática no pós-descongelamento. Apesar de não ter tido melhora na

funcionalidade da membrana plasmática, os tratamentos que utilizaram 40mM de

glicina, além dos tratamentos 40mM Ala e 7AlaGli20Glut apresentarem maior

integridade acrossomal (tabela 2), o que indica um efeito protetor destes

aminoácidos nestas concentrações utilizadas. O tratamento 40AlaGli60Glut

apresentou a menor velocidade do trajeto (VAP), velocidade progressiva (VSL),

velocidade curvilinear (VCL), amplitude lateral da cabeça (ALH), freqüência de

batimentos (BCF) e retidão (STR) em relação aos demais tratamentos, enquanto que

o tratamento 60mM Glut apresentou VAP e VSL maior do que o tratamento

40AlaGli60Glut, porém menor do que os tratamentos controle, 40mM Ala, 40mM Gli

e 7AlaGli20Glut que mostraram os maiores resultados nestes parâmetros

analisados. Os tratamentos controle, 40mM Ala, 40mM Gli e 7AlaGli20Glut também

apresentaram maiores valores de linearidade do que o tratamento 40AlaGli60Glut

(Tabela 10). Estes dados de cinemática espermática mostram que o menor valor de

ALH apresentado pelo tratamento 40AlaGli60Glut corrobora com a revisão de

MORTIMER e MAXWELL (2004) de que a penetração no muco cervical estaria

prejudicada por estes espermatozóides que também não apresentaram boa

motilidade. Mas apesar de ter apresentado um baixo valor de ALH, as características

de velocidade (VAP, VCL e VSL) deste tratamento também se mostraram inferiores

aos demais tratamentos. Deste modo, isto mostra que apesar da ALH elevada não

ser desejável por afetar a progressão celular e com isso denotar uma menor

qualidade da amostra seminal (ARRUDA et al. 2003), uma ALH baixa não

caracteriza uma boa qualidade da amostra seminal, de acordo com os resultados, o

que corrobora com o experimento 1.

As tabelas 11 e 12 apresentam as médias das variáveis de motilidade,

funcionalidade de membrana pelo teste hiposmótico (HIPO), Integridade da

membrana acrossomal pelo teste do FITC-PSA e das variáveis de cinemática

espermática, obtidas dos dados dos garanhões no experimento 2.

Tabela 11. Médias das variáveis motilidade total (MOT), motilidade progressiva

(PROG), teste hiposmótico (HIPO), Integridade da membrana

acrossomal pelo teste do FITC-PSA: íntegros (PSA-I), semilesados

(PSA-SL) e lesados (PSA-L), obtidas dos dados dos garanhões no

experimento 2 (adição de aminoácidos) verificados imediatamente após

o descongelamento.

Garanhões MOT PROG HIPO

1 39,0 ± 20,1 a 22,7 ± 13,2 a 30,6 ± 12,9 a

2 39,5 ± 16,4 a 24,0 ± 12,7 a 28,7 ± 9,2 a

3 15,0 ± 9,2 c 8,3 ± 5,6 b 21,4 ± 7,8 b

4 31,2 ± 15,3 b 16,3 ± 10,5 a 32,9 ± 13,1 a

5 12,1 ± 11,2 c 6,0 ± 6,3 b 23,4 ± 11,5 b

Média geral 27,4 15,5 27,4

Garanhões PSA-I PSA-SL PSA-L

1 85,9 ± 9,0 a 3,9 ± 3,3 b 10,2 ± 7,3 b

2 80,6 ± 10,5 a 5,9 ± 4,4 b 13,6 ± 8,2 b

3 63,1 ± 9,9 b 6,1 ± 3,7 b 30,7 ± 8,1 a

4 80,9 ± 7,5 a 5,4 ± 3,5 b 13,8 ± 5,5 b

5 57,3 ± 22,2 b 10,3 ± 11,2 a 32,2 ± 16,2 a

Média geral 73,5 6,3 20,1

Médias seguidas pela mesma letra nas colunas não diferem entre si pelo teste de

Tukey em 5% de probabilidade.

Tabela 12. Médias das variáveis de cinemática espermática: velocidade do trajeto

(VAP), velocidade progressiva (VSL), velocidade curvilínea (VCL),

amplitude lateral de cabeça (ALH), freqüência de batimentos (BCF),

retidão (STR) e linearidade (LIN), obtidas dos dados dos garanhões no

experimento 2 (adição de aminoácidos) verificados imediatamente após

o descongelamento.

Garanhões VAP VSL VCL

1 61,1 ± 11,6 a 46,9 ± 9,9 a 102,5 ± 24,3 a

2 50,6 ± 9,7 b 40,5 ± 9,6 b 88,2 ± 17,6b

3 46,4 ± 9,2 bc 35,3 ± 8,6 cd 83,0 ± 15,8 bc

4 49,0 ± 9,2 b 36,6 ± 9,2 bc 84,7 ± 14,6 bc

5 44,0 ± 13,6 c 32,3 ± 10,9 d 76,2 ± 28,0 c

Média geral 50,2 38,3 86,9

Garanhões ALH BCF STR LIN

1 5,5 ± 0,9 a 18,7 ± 6,2 b 76,3 ± 3,4 ab 46,2 ± 3,4 a

2 4,8 ± 0,5 b 25,8 ± 6,5 a 78,8 ± 5,2 a 45,2 ± 4,5ab

3 5,1 ± 1,1 ab 18,6 ± 4,5 b 74,9 ± 4,9 b 43,1 ± 3,9 bc

4 5,0 ± 1,1 ab 18,6 ± 4,8 b 74,1 ± 5,5bc 44,0 ± 4,9 ab

5 4,6 ± 1,9 b 17,7 ± 8,0 b 70,3 ± 15,0 c 40,5 ± 9,5 c

Média geral 5,0 19,9 74,9 43,8

Médias seguidas pela mesma letra nas colunas não diferem entre si pelo teste de

Tukey em 5% de probabilidade.

Os garanhões 1 e 2 apresentaram os maiores valores de motilidade total pós-

descongelamento, sendo que o garanhão 4 foi superior aos garanhões 3 e 5 neste

parâmetro analisado. A motilidade progressiva, a funcionalidade de membrana pelo

teste hiposmótico e a integridade acrossomal foram superiores nos

descongelamentos do sêmen dos garanhões 1, 2 e 4 em relação aos dos garanhões

3 e 5 (tabela 11). Estes dados corroboram com PICKETT e AMANN (1993) e KLUG

(1992) que estimaram a congelabilidade dos garanhões em grupos de boa,

moderada e baixa congelabilidade. Os maiores valores de VAP, VSL e VCL foram

obtidos na análise pós-descongelamento do sêmen do garanhão 1, porém os

garanhões 2 e 4 apresentaram valores de VAP e VSL superiores ao do garanhão 5 e

o garanhão 2 apresentou VCL maior do que o garanhão 5. A ALH do garanhão 1 foi

superior aos garanhões 2 e 5, enquanto o BCF do garanhão 2 foi superior aos

demais garanhões. A retidão dos espermatozóides do garanhão 2 foi superior aos

dos garanhões 3, 4 e 5, enquanto que a retidão dos espermatozóides dos garanhões

1 e 3 foram superiores ao dos garanhão 5. A linearidade dos espermatozóides do

garanhão 1 foi maior do que a dos espermatozóides do garanhão 3 e 5, enquanto

que a linearidade dos espermatozóides dos garanhões 2 e 4 foram superiores à dos

espermatozóides do garanhão 5 (tabela 12). Esta enorme variação nos parâmetros

espermáticos que ocorreu entre os garanhões está de acordo com os dados de

PICKETT e AMANN (1993) e KLUG (1992).

As tabelas 13 e 14 apresentam as médias das variáveis de motilidade,

funcionalidade de membrana pelo teste hiposmótico (HIPO), Integridade da

membrana acrossomal pelo teste do FITC-PSA e das variáveis de cinemática

espermática, obtidas dos dados de coletas no experimento 2.

Tabela 13. Médias das variáveis motilidade total (MOT), motilidade progressiva

(PROG), teste hiposmótico (HIPO), Integridade da membrana

acrossomal pelo teste do FITC-PSA: íntegros (PSA-I), semilesados

(PSA-SL) e lesados (PSA-L), obtidas dos dados das coletas no

experimento 2 (adição de aminoácidos) verificados imediatamente após

o descongelamento.

Coletas MOT PROG HIPO

1 32,1 ± 17,7 a 18,0 ± 11,5 a 32,5 ± 12,0 a

2 27,3 ± 21,2 b 15,9 ± 14,7 a 25,7 ± 10,8 b

3 22,7 ± 16,5 c 12,4 ± 10,3 b 24,0 ± 11,1 b

Média geral

27,4 15,5 27,4

Coletas PSA-I PSA-SL PSA-L

1 77,4 ± 11,3 a 4,9 ± 4,0 b 17,8 ± 9,6 b

2 76,1 ± 13,4 a 5,5 ± 3,7 b 18,4 ± 11,9 b

3 67,1 ± 22,6 b 8,7 ± 9,2 a 24,1 ± 17,2 a

Média geral

73,5 6,3 20,1

Médias seguidas pela mesma letra nas colunas não diferem entre si pelo teste de

Tukey em 5% de probabilidade.

Tabela 14. Médias das variáveis de cinemática espermática: velocidade do trajeto

(VAP), velocidade progressiva (VSL), velocidade curvilínea (VCL),

amplitude lateral de cabeça (ALH), freqüência de batimentos (BCF),

retidão (STR) e linearidade (LIN), obtidas dos dados das coletas no

experimento 2 (adição de aminoácidos) verificados imediatamente após

o descongelamento.

Coletas VAP VSL VCL

1 54,15 ± 11,3 a 40,9 ± 10,5 a 92,9 ± 23,5 a

2 47,9 ± 9,7 b 36,4 ± 8,5 b 82,5 ± 17,7 b

3 48,6 ± 14,4 b 37,7 ± 12,7 b 85,2 ± 24,2 b

Média geral 50,2 38,3 86,9

Coletas ALH BCF STR LIN

1 5,1 ± 1,0 a 20,3 ± 7,1 a 74,9 ± 5,2 a 43,4 ± 4,5 a

2 4,8 ± 1,0 b 18,9 ± 6,7 a 75,1 ± 5,1 a 44,2 ± 4,2 a

3 5,1 ± 1,5 ab 20,5 ± 6,5 a 74,6 ± 12,7 a 43,8 ± 8,3 a

Média geral 5,0 19,9 74,9 43,8

Médias seguidas pela mesma letra nas colunas não diferem entre si pelo teste de

Tukey em 5% de probabilidade.

Na tabela 13 observa-se que a coleta 1 do sêmen dos garanhões apresentou

os melhores resultados de motilidade total, sendo que a coleta 2 foi superior à coleta

3. A coleta 3 apresentou resultados inferiores de motilidade progressiva e

integridade acrossomal às demais coletas e a coleta 1 apresentou melhor

funcionalidade de membrana pelo teste hiposmótico de acordo com o teste tukey

(P<0,05). Os valores de VAP, VSL e VCL também foram superiores na coleta 1,

enquanto que a ALH foi maior na coleta 1, em relação à coleta 2 (tabela 14). A

variação nos parâmetros espermáticos que ocorreu entre as coletas dos garanhões

está de acordo com os dados de PICKETT e AMANN (1993) e KLUG (1992).

5. CONCLUSÕES

O experimento 1 apresentou as seguintes conclusões:

1. A adição de 10 U/mL insulina reduziu os parâmetros de motilidade e cinemática

espermática, enquanto que os demais tratamentos não diferiram estatisticamente do

diluente controle na análise imediata após o descongelamento;

2. Apenas o baixo valor de amplitude lateral de cabeça (ALH) não caracteriza uma

boa qualidade da amostra seminal.

O experimento 2 apresentou as seguintes conclusões:

1. No meio crioprotetor seminal utilizando 3% de Glicerol e 2% de Dimetilformamida,

a adição de aminoácidos não melhorou os parâmetros de motilidade e cinemática

espermática em garanhões da raça Mangalarga Marchador, sendo que a adição de

60mM de glutamina + 40mM de glicina + 40mM de alanina afetou negativamente

estes valores;

2. A adição de 60mM de glutamina + 40mM de glicina e 40mM de alanina diminuiu a

funcionalidade de membrana plasmática;

3. A adição de 60mM de glutamina ou 40mM de glicina ou 40mM de alanina ou 20

mM de glutamina + 7mM de glicina + 7 mM de alanina aumentou a proteção da

membrana acrossomal dos espermatozóides de garanhões da raça Mangalarga

Marchador;

4. Apenas o baixo valor de amplitude lateral de cabeça (ALH) não caracteriza uma

boa qualidade da amostra seminal.

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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7. ANEXOS

ANEXO A

Resumo da análise de variância das variáveis motilidade total (MOT), motilidade

progressiva (PROG), teste hiposmótico (HIPO), Integridade da membrana

acrossomal pelo teste do FITC-PSA: íntegros (PSA-I), semilesados (PSA-SL) e

lesados (PSA-L), obtidos dos dados dos tratamentos no experimento 1.

Fonte de QM

Variação GL MOT PROG HIPO

Blocos 44 980,116919 468,658586 388,539268

Tratamentos

3 630,548148** 263,516667** 35,916204

Resíduo 132 86,445875 37,978788 95,537416

CV (%) 30,9 32,0 31,4

Fonte de QM

Variação GL PSA-I PSA-SL PSA-L

Blocos 44 710,111616 17,006818 647,210227

Tratamentos

3 204,716667

10,805093

147,797685

Resíduo 132 88,171212 9,056986 72,415109

CV (%) 13,2 56,5 36,3

**, ns

Significativo em 1% e não-significativo, respectivamente, pelo teste F.

ANEXO B

Resumo da análise de variância das variáveis de cinemática espermática:

velocidade do trajeto (VAP), velocidade progressiva (VSL), velocidade curvilínea

(VCL), amplitude lateral de cabeça (ALH), freqüência de batimentos (BCF), retidão

(STR) e linearidade (LIN), obtidos dos dados dos tratamentos no experimento 1.

Fonte de QM

Variação GL VAP VSL VCL

Blocos 44 356,163359 255,441636 1003,865795

Tratamentos

3 148,565537

63,315630

268,916204

Resíduo 132 63,286295 53,845781 304,163136

CV (%) 14,5 16,8 18,5

Fonte de QM

Variação GL ALH BCF STR LIN

Blocos 44 1,574818 112,780033 32,516919 38,313636

Tratamentos

3 1,446278** 77,156222* 22,940741

21,962963

Resíduo 132 0,378020 28,223305 13,929377 13,697811

CV (%) 12,3 22,6 4,7 8,0

**, *, ns

Significativo em 1%, 5% e não-significativo, respectivamente, pelo teste F.

ANEXO C

Resumo da análise de variância das variáveis motilidade total (MOT), motilidade

progressiva (PROG), teste hiposmótico (HIPO), Integridade da membrana

acrossomal pelo teste do FITC-PSA: íntegros (PSA-I), semilesados (PSA-SL) e

lesados (PSA-L), obtidos dos dados dos garanhões no experimento 1.

Fonte de QM

Variação GL MOT PROG HIPO

Blocos 35 281,966984 130,477937 201,980437

Garanhões 4 6385,355556** 2783,105556** 1877,522222**

Resíduo 140 150,124127 76,611270 108,821508

CV (%) 40,8 45,4 33,5

Fonte de QM

Variação GL PSA-I PSA-SL PSA-L

Blocos 35 143,327460 11,286786 106,761071

Garanhões 4 4472,297222** 30,484722* 3914,215278**

Resíduo 140 147,085794 10,423294 136,328135

CV (%) 17,0 60,6 49,8

**, *

Significativo em 1% e 5% de probabilidade, respectivamente, pelo teste F.

ANEXO D

Resumo da análise de variância das variáveis de cinemática espermática:

velocidade do trajeto (VAP), velocidade progressiva (VSL), velocidade curvilínea

(VCL), amplitude lateral de cabeça (ALH), freqüência de batimentos (BCF), retidão

(STR) e linearidade (LIN), obtidos dos dados dos garanhões no experimento 1.

Fonte de QM

Variação GL VAP VSL VCL

Blocos 35 233,688551 190,748857 695,877986

Tratamentos

4 1683,358472** 1172,535083** 3784,600417**

Resíduo 140 68,272444 51,219084 325,944616

CV (%) 15,1 16,3 19,1

Fonte de QM

Variação GL ALH BCF STR LIN

Blocos 35 0,613757 72,218127 24,326984 21,571429

Tratamentos

4 6,074667** 320,781472**

137,755556**

206,102778**

Resíduo 140 0,555352 36,489329 13,826984 14,145635

CV (%) 14,8 25,6 4,7 8,2

Significativo em 1% de probabilidade pelo teste F.

ANEXO E

Resumo da análise de variância das variáveis motilidade total (MOT), motilidade

progressiva (PROG), teste hiposmótico (HIPO), Integridade da membrana

acrossomal pelo teste do FITC-PSA: íntegros (PSA-I), semilesados (PSA-SL) e

lesados (PSA-L), obtidos dos dados das coletas no experimento 1.

Fonte de QM

Variação GL MOT PROG HIPO

Blocos 59 538,762335 233,006685 210,967491

Coletas 2 2607,538889** 1262,022222** 2268,309722**

Resíduo 118 164,623635 86,044821 108,734864

CV (%) 42,7 48,2 33,5

Fonte de QM

Variação GL PSA-I PSA-SL PSA-L

Blocos 59 389,982957 8,967302 336,699506

Coletas 2 1013,538889** 22,629167

729,204167**

Resíduo 118 156,454143 11,880580 145,387783

CV (%) 17,6 64,7 51,4

**, ns

Significativo em 1% e não-significativo, respectivamente, pelo teste F.

ANEXO F

Resumo da análise de variância das variáveis de cinemática espermática:

velocidade do trajeto (VAP), velocidade progressiva (VSL), velocidade curvilínea

(VCL), amplitude lateral de cabeça (ALH), freqüência de batimentos (BCF), retidão

(STR) e linearidade (LIN), obtidos dos dados das coletas no experimento 1.

Fonte de QM

Variação GL VAP VSL VCL

Blocos 59 165,045909 117,265571 569,936229

Coletas 2 2659,420222** 2032,665167** 6830,565167**

Resíduo 118 79,780731 64,008669 320,669574

CV (%) 16,3 18,3 19,0

Fonte de QM

Variação GL ALH BCF STR LIN

Blocos 59 0,955867 49,263838 24,094539 26,595480

Coletas 2 2,875167** 583,366722**

67,272222*

66,350000*

Resíduo 118 0,520195 41,067514 15,102731 15,745480

CV (%) 14,4 27,2 4,9 8,6

**, *

Significativo em 1% e 5% de probabilidade, respectivamente, pelo teste F.

ANEXO G

Resumo da análise de variância das variáveis motilidade total (MOT), motilidade

progressiva (PROG), teste hiposmótico (HIPO), Integridade da membrana

acrossomal pelo teste do FITC-PSA: íntegros (PSA-I), semilesados (PSA-SL) e

lesados (PSA-L), obtidos dos dados dos tratamentos no experimento 2.

Fonte de QM

Variação GL MOT PROG HIPO

Blocos 44 1169,554714 471,724242 317,240530

Tratamentos

5 4690,039259** 1942,737778** 976,041667**

Resíduo 220 94,986229 52,007475 86,109470

CV (%) 35,6 46,6 33,8

Fonte de QM

Variação GL PSA-I PSA-SL PSA-L

Blocos 44 1345,139394 124,238552 827,777441

Tratamentos

5 726,940000** 13,817037

654,654815**

Resíduo 220 70,573333 24,121582 43,112391

CV (%) 11,4 77,5 32,7

**, ns

Significativo em 1% e não-significativo, respectivamente, pelo teste F.

ANEXO H

Resumo da análise de variância das variáveis de cinemática espermática:

velocidade do trajeto (VAP), velocidade progressiva (VSL), velocidade curvilínea

(VCL), amplitude lateral de cabeça (ALH), freqüência de batimentos (BCF), retidão

(STR) e linearidade (LIN), obtidos dos dados dos tratamentos no experimento2.

Fonte de QM

Variação GL VAP VSL VCL

Blocos 44 373,613153 244,727379 905,096638

Tratamentos

5 1587,335593** 1521,684622** 4524,864215**

Resíduo 220 72,274123 59,892850 326,816775

CV (%) 16,9 20,1 20,8

Fonte de QM

Variação GL ALH BCF STR LIN

Blocos 44 1,894845 101,581894 68,696128 39,173906

Tratamentos 5 13,76741**

217,67384**

654,56370** 176,39704**

Resíduo 220 1,140536 31,147587 57,831886 31,647037

CV (%) 21,4 28,1 10,2 12,8

Significativo em 1% pelo teste F.

ANEXO I

Resumo da análise de variância das variáveis motilidade total (MOT), motilidade

progressiva (PROG), teste hiposmótico (HIPO), Integridade da membrana

acrossomal pelo teste do FITC-PSA: íntegros (PSA-I), semilesados (PSA-SL) e

lesados (PSA-L), obtidos dos dados dos garanhões no experimento 2.

Fonte de QM

Variação GL MOT PROG HIPO

Blocos 53 856,595737 250,437736 218,486321

Garanhões 4 9181,703704** 3621,050000** 1275,451389**

Resíduo 212 132,033892 66,763208 99,534408

CV (%) 42,0 52,8 36,4

Fonte de QM

Variação GL PSA-I PSA-SL PSA-L

Blocos 53 231,240881 40,081691 137,166177

Garanhões 4 8467,125926** 309,411111** 5942,246296**

Resíduo 212 151,993850 35,284696 85,572711

CV (%) 16,8 93,7 46,1

Significativo em 1% de probabilidade pelo teste F.

ANEXO J

Resumo da análise de variância das variáveis de cinemática espermática:

velocidade do trajeto (VAP), velocidade progressiva (VSL), velocidade curvilínea

(VCL), amplitude lateral de cabeça (ALH), freqüência de batimentos (BCF), retidão

(STR) e linearidade (LIN), obtidos dos dados dos garanhões no experimento 2.

Fonte de QM

Variação GL VAP VSL VCL

Blocos 53 251,675542 211,882541 783,855995

Garanhões 4 2343,606537** 1710,617648** 5132,564222**

Resíduo 212 82,843084 63,587780 340,913392

CV (%) 18,1 20,8 21,2

Fonte de QM

Variação GL ALH BCF STR LIN

Blocos 53 2,174570 41,765390 96,144584 45,471419

Garanhões 4 6,81867**

594,632315** 525,046296** 260,690741**

Resíduo 212 1,229251 36,878994 55,767051 28,845458

CV (%) 22,2 30,6 10,0 12,3

Significativo em 1% de probabilidade pelo teste F.

ANEXO K

Resumo da análise de variância das variáveis motilidade total (MOT), motilidade

progressiva (PROG), teste hiposmótico (HIPO), Integridade da membrana

acrossomal pelo teste do FITC-PSA: íntegros (PSA-I), semilesados (PSA-SL) e

lesados (PSA-L), obtidos dos dados das coletas no experimento 2.

Fonte de QM

Variação GL MOT PROG HIPO

Blocos 89 760,736787 316,979775 202,964888

Coletas 2 1979,337037** 714,711111** 1808,819444**

Resíduo 178 135,636663 68,935830 90,457085

CV (%) 42,6 53,7 34,7

Fonte de QM

Variação GL PSA-I PSA-SL PSA-L

Blocos 89 483,082022 38,745277 339,433042

Coletas 2 2800,900000** 381,159259** 1076,381481**

Resíduo 178 167,139700 37,256638 94,482605

CV (%) 17,6 96,3 48,4

Significativo em 1% de probabilidade pelo teste F.

ANEXO L

Resumo da análise de variância das variáveis de cinemática espermática:

velocidade do trajeto (VAP), velocidade progressiva (VSL), velocidade curvilínea

(VCL), amplitude lateral de cabeça (ALH), freqüência de batimentos (BCF), retidão

(STR) e linearidade (LIN), obtidos dos dados das coletas no experimento 2.

Fonte de QM

Variação GL VAP VSL VCL

Blocos 89 265,358094 220,803835 803,762364

Coletas 2 1084,939593** 487,051444** 2631,044148**

Resíduo 178 81,804574 61,388823 323,322051

CV (%) 18,0 20,4 20,7

Fonte de QM

Variação GL ALH BCF STR LIN

Blocos 89 2,498744 71,078296 109,915314 46,913691

Coletas 2 3,315148* 70,419000

4,670370

14,581481

Resíduo 178

0,978144 33,391210 51,835164 30,132043

CV (%) 19,8 29,1 9,6 12,5

**, *, ns

Significativo em 1%, 5% e não-significativo, respectivamente, pelo teste F.

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