( PDF ) Avaliação da citoxicidade induzida por produtos cosméticos e tensoativos pelo método de quantificação de proteínas totais em células 3T3

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AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE INDUZIDA POR PRODUTOS COSMÉTICOS

PELO MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS EM CÉLULAS 3T3

Clarice Lima do Canto Abreu

Mestrado Acadêmico

Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária

Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde

Fundação Oswaldo Cruz

Orientadora: Isabella Fernandes Delgado

Rio de Janeiro

2008

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AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE INDUZIDA POR PRODUTOS COSMÉTICOS

PELO MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS EM CÉLULAS 3T3

Clarice Lima do Canto Abreu

Dissertação submetida à Comissão Examinadora composta pelo corpo docente do

Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária do Instituto Nacional de Controle de

Qualidade em Saúde da Fundação Oswaldo Cruz e por professores convidados de outras

Instituições, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre.

Aprovado:

___________________________________________________________(INCQS/FIOCRUZ)

Prof

. Dr

. Ana Cristina Martins de Almeida Nogueira

___________________________________________________________(INCQS/FIOCRUZ)

Prof

. Dr

. Rosaura de Faria Presgrave

___________________________________________________________(UFF)

Prof

. Dr

. Rita Leal Paixão

___________________________________________________________(INCQS/FIOCRUZ)

Orientador: Prof

. Dra. Isabella Fernandes Delgado

Rio de Janeiro

2008

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iii

Abreu, Clarice Lima do Canto

Avaliação da citotoxicidade induzida por produtos cosméticos pelo método de Quantificação

de Proteínas Totais em células 3T3/Clarice Lima do Canto Abreu. Rio de Janeiro:

INCQS/FIOCRUZ, 2008.

xiii, 104 p., il., tab.

Dissertação (Mestrado) – Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Nacional de Controle de

Qualidade em Saúde, Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária, Rio de Janeiro,

2008. Orientador: Isabella Fernandes Delgado

1. Quantificação de Proteínas Totais 2. Métodos alternativos 3. Teste de citotoxicidade 4.

Irritação ocular 5.Produtos cosméticos

Evaluation of cytotoxicity inducted by cosmetics products utilizing Total Protein

Quantification Method with 3T3 cell lineage.

Dedico este trabalho aos animais, que doaram suas vidas ao conhecimento científico.

Dedico aos meus pais, presentes em todos os momentos de minha vida.

Dedico aos meus familiares e amigos, que me apoiaram durante a confecção deste trabalho.

“Human truths, however valuable they seem, are always open to challenge, revision, to

refinement, to refutation, to repeal. Only the question is eternal.”

(Andre Geurard)

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus, que iluminou e guiou meus passos, em sua infinita sabedoria.

Agradeço aos meus pais Gláucia Lima do Canto Abreu e Jair do Canto Abreu Jr, por serem

meus eternos companheiros de jornada, meus eternos anjos da guarda. Obrigada por estarem

ao meu lado nos momentos mais importantes de minha vida!

Ao meu marido Marko Olavi Suomela, pelo companheirismo, carinho e compreensão;

A minha orientadora, Dra. Isabella Fernandes Delgado, sem a qual, jamais teria chegado até

aqui. Isabella, serei eternamente grata pelo apoio, incentivo, paciência e carinho de sempre;

Aos meus queridos amigos de laboratório Anna Guimarães, Ana Cristina (Tininha), Isis,

Letícia e Daniel Machado pela colaboração na confecção deste trabalho;

Ao amigo Rodrigo Costa, pela inestimável ajuda durante a realização deste estudo e por

dividir comigo, seus resultados in vitro;

Aos queridos amigos Octávio e Rosaura Presgrave e Eloísa Alves, por compartilharem seus

profundos conhecimentos e resultados de seus estudos sobre irritação in vivo;

Ao colega Wlamir Moura pela grande ajuda na parte estatística do projeto;

Aos meus queridos amigos, Cristiane Caldeira, Ludmila Bergstein e João Carlos (Profeta),

pelo incentivo e apoio;

A toda equipe do Departamento de Farmacologia e Toxicologia e do Departamento de

Imunologia do INCQS que, de alguma forma, contribuíram para a realização deste estudo;

A Coordenação de Pós Graduação do INCQS, pela organização do curso de Mestrado

Acadêmico em Vigilância Sanitária;

A Capes (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pela colaboração

financeira para a realização deste projeto.

vii

RESUMO

A sociedade científica mundial vem sofrendo pressão para que seja efetuada a

substituição de ensaios in vivo por ensaios in vitro, sendo o teste de irritação ocular de Draize

um dos testes in vivo mais fortemente combatidos pelos setores ativistas que lutam pela

promoção e preservação do bem estar animal. Como a substituição do teste de Draize por

metodologia alternativa se mostrou tarefa mais difícil do que se imaginava inicialmente,

sobretudo devido ao grande número de desfechos que esta metodologia quantifica, as agências

internacionais de validação de metodologia alternativas adotaram como conduta a busca por

uma bateria de ensaios in vitro que possam servir de triagem para avaliação do potencial

irritante ocular de produtos e ingredientes. Neste caso, o uso de animais só é recomendado,

quando os resultados obtidos in vitro sugerem um baixo potencial irritante. Neste contexto, o

presente estudo objetivou avaliar o grau de preditibilidade do método de Quantificação de

Proteínas Totais (QPT) na avaliação do potencial citotóxico de tensoativos (N=6) e produtos

cosméticos acabados (xampus e condicionadores, N=19). Todos os produtos avaliados no

presente estudo foram previamente analisados quanto ao seu potencial irritante pela

metodologia in vivo. O teste in vitro foi realizado utilizando linhagem celular proveniente de

fibroblasto de embrião de camundongo (3T3) e o corante Azul Brilhante de Coomassie R-250.

A avaliação do coeficiente de variação do teste de QPT em células 3T3 mostrou um valor de CV%

global de 30,00%. Para a comparação entre os resultados in vivo (MEM) e in vitro (IC

)

utilizamos o coeficiente de correlação de Pearson. Obtivemos o valor de -0,420 (p=0,022)

para a correlação entre os métodos. A análise entre os valores de IC

e MEM das diferentes

estruturas oculares mostrou uma melhor correlação do método in vitro com lesões ocorridas

na conjuntiva, do que na íris e córnea. Além disso, observou-se valores de correlação de melhor

calibre para tensoativos do que para produtos acabados. Para a avaliação da preditibilidade do teste

in vitro em relação ao teste in vivo, estabeleceu-se um ponto de corte (cut-off) para a

diferenciação de substância irritantes (IC

<1,000 mg/ml) de não-irritantes (IC

>1,000

mg/ml) no teste in vitro. Assim, nas condições experimentais do presente estudo, a precisão do

ensaio foi de 80%, a sensibilidade de 94% e a especificidade de 43%. Com base nos

resultados obtidos, podemos concluir que o método de QPT, utilizando o corante Azul

Brilhante de Coomasssie R-250 e linhagem celular 3T3, apresenta melhor capacidade de

predizer o potencial irritante de produtos isolados (tensoativos), do que de produtos acabados

(xampus e condicionadores). Embora o valor de CV% global seja considerado adequado, segundo a

OMS, para ensaios conduzidos com linhagens celulares, a comparação de nossos resultados com dados

da literatura demonstra que a utilização de células SIRC é mais vantajosa em termos de precisão inter-

ensaio. Também em termos de sensibilidade, especificidade e precisão observamos resultados mais

promissores quando da utilização de células SIRC. Concluímos ainda, que o teste proposto tem

maior capacidade em predizer o efeito irritante ocorrido na conjuntiva do que nas outras

estruturas oculares (íris e conjuntiva). Por fim, vale ressaltar que o método apresenta alto grau

de sensibilidade e grau moderado de especificidade e sua utilização pode ser útil como teste

adicional à bateria de ensaios com aplicação na avaliação de toxicidade induzida por produtos

sujeitos à ação da Vigilância Sanitária.

viii

ABSTRACT

The world scientific community is under pressure to find effective ways to substitute in vivo

by in vitro tests. The Draize Eye Test is one of the most disapproved in vivo tests by the

animal welfare activists. Since the substitution of the Draize Eye Test by an alternative

method turned out to be a more difficult issue than it was first thought, mainly due to the great

number of endpoints that this assay is able to quantify, the international validation agencies

for alternative methods adopted, as a conduct, the search for a set of in vitro assays, which

might work as a screening for the evaluation of the ocular irritant potential of products and

ingredients. The use of animals would only be recommended if the results obtained with the in

vitro screening tests indicate a low irritant potential for a determined substance. In this

context, the main goal of the present study was to evaluate the degree of predictability of the

Total Protein Quantification Methodology (QPT) in the evaluation of the citotoxic potential of

surfactants (n=6) as well as in cosmetics (shampoos and hair conditioners, n=19). All the

evaluated products in this study were previously analyzed in vivo, regarding their irritant

potential. The in vitro test was performed using a cellular lineage derived from embryo mouse

fibroblast (3T3) and the dye Blue Brilhant of Coomassie – R 250. The evaluation of the test

variation coefficient (CV%) in 3T3 cells demonstrated a global CV% of 30%. In order to

compare the in vivo (MMS) results with the ones obtained in vitro (IC

), we applied the

Pearson´s coefficient of correlation. The value obtained for the correlation between the two

methods was –0.420 (p=0.022). The analysis of the IC

and MMS values of the different

ocular structures showed a better correlation of the in vitro method with the injuries on the

conjunctive, than with the damage found on the iris or cornea in vivo. Furthermore, an

enhanced correlation of the in vitro versus in vivo method was observed for surfactants, when

compared to whole products. In order to evaluate the predictability of the in vitro test in regard

to the in vivo method a cut-off point was established, where substances with values of IC

mg/ml were determined as irritant and substances with levels of IC

higher then 1mg/ml were

considered as non-irritant. Hence, under the experimental conditions of the present study, the

assay accuracy was of 80%, the sensibility was 94% and the specificity was of 43%. Based on

the results obtained we conclude that the QPT method, using Dye Blue Brilliant of Comassie

R-250 and the cellular lineage 3T3, shows a better ability to predict the irritant potential of

isolated products (surfactants) than of entire products. Even though the global CV% value

found with our in vitro method, according to WHO, is considered suitable for assays

performed with cell lines, the comparison of our results with the published data shows that the

SIRC cell line is more interesting once considering inter-assay accuracy. We also conclude

that the proposed assay has a better capacity to predict the irritant effect on the conjunctive

than on the other ocular structures. At last, it is worth pointing out that this method shows a

high sensibility degree and moderate level of specificity, and the application of the QPT assay

may be useful to add the screening set assays for the evaluation of toxicity induced by

products under the scope of Sanitary Surveillance.

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

3T3 - Células de embrião de camundongo

ABIHPEC -Associação Brasileira da Indústria de Higiene Pessoal, Perfumaria e Cosméticos.

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária

ATTC - American Type Tissue Collection.

BCOP – Opacidade e Permeabilidade de Córnea Bovina

BSS.CMF – Solução salina balanceada livre de cálcio e magnésio

CBB.R250 – Corante Azul Brilhante de Coomassie

CPSC - Consumer Product Safety Commission

CSHHIB - Chemical Safety and Hazard Investigation Board

CV% – Coeficiente de variação

DFT – Departamento de Farmacologia e Toxicologia

– Dose letal 50

D.O – Densidade óptica

ECVAM – European Centre for Validation of Alternative Methods

EEC –Economic European Community

e.g – exempli gratia (por exemplo)

ELISA –Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

EPA - Environmental Protection Agency. Agência de Proteção Ambiental

ESAC - Scientif Advisory Commitee

FDA - Food and Drug Administration

FIOCRUZ - Fundação Oswaldo Cruz

FRAME – Fund for Replacement of Animals in Medical Experiments

GH – Geneticamente modificado

HET-CAM – Teste em Membrana Cório-Alantóide de Ovo Embrionado de Galinha

– Concentração inibitória50

ICCVAM - Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods

IL – Irritante Leve

IM – Irritante moderado

IMáx – Irritante máximo

IS – Irritante severo

ICH - International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration

of Pharmaceuticals for Human Use

ILAR – Institute for Laboratory Animal Research

INCQS – Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde

IRE – Isolated Rabbit Eye

JaCVAM - Japanese Center for the Validation of Alternative Methods

K-S – Teste estatístico Kolmogorov-Smirnov

LACENS - Laboratórios centrais de Saúde Pública

LDH – Enzima Lactato Desidrogenase

LLNA - Local Lymph Node Assay

L929 – Linhagem celular proveniente de fibroblasto de camundongos

MEM – Média dos escores máximos

MTT – Ensaio de captação do corante Tetrazoliun (atividade metabólica mitocondrial)

NI – Não irritante

NRU – Neutral Red Uptake – Ensaio de captação do corante Vermelho Neutro

OSHA: Occupational Safety and Health Administration

OECD: Organization for Economic Co-operation and Development

PBS – solução tampão

POP – Procedimento operacional padrão

QPT – Ensaio de Quantificação de Proteínas Totais

q.s.p – Quantidade suficiente para

RBC – Red Blood Cell Test

REBLAS - Laboratórios da Rede Brasileira de Laboratórios Analíticos em Saúde

RSPA: Research and Special Programs Administration.

SFB – Soro fetal bovino

SINITOX –

Sistema Nacional de Informações Tóxico-Farmacológicas

SIRC – linhagem celular proveniente de córnea de coelho

ToBI – Teste de Inibição da Ligação da Toxina

WHO – World Health Organization

VSQ – Vaccine and Sera Quality –

ZEBET - Centre for Documentation and Evaluation of Alternatives to Animal Experiments

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Lista dos produtos avaliados: uso, classificação in vivo, fabricante,

marca e composição 33

Tabela 2 - Classificação in vivo dos produtos acabados 49

Tabela 3 - Relação dose-resposta entre os escores (MEM) obtidos in vivo

e a concentração de tensoativos aplicados nos olhos dos animais 50

Tabela 4 - Categorização do potencial irritante ocular dos tensoativos avaliados 52

Tabela 5 - ICs

média dos produtos/tensoativos 54

Tabela 6 - Comparação dos resultados in vivo e in vitro obtidos com

tensoativos 56

Tabela 7 - Precisão inter-ensaio do teste in vitro 57

Tabela 8 - Valores utilizados para o cálculo dos coeficientes de correlação de

Pearson: médias aritméticas das ICs

, valor global de MEM e das estruturas

oculares (MEM de córnea, íris e conjuntiva) 64

Tabela 9 - Coeficientes de correlação de Pearson relacionando os valores

de IC

com os escores das estruturas oculares dos ensaios in vivo 65

Tabela 10 - Comparação entre as classificações obtidas no ensaio in vivo

e o valor médio de IC

in vitro 67

Tabela 11 - Tabela de Contingência. 68

Tabela 12: Casos registrados de intoxicação humana por agente tóxico 71

Tabela 13: Avaliação comparativa dos CV% globais do método

de QPT com diferentes linhagens celulares. 81

Tabela 14: Avaliação comparativa da preditibilidade do método de QPT

com diferentes linhagens celulares 82

Tabela15: Avaliação comparativa dos valores de IC

obtidos com

tensoativos no presente estudo em comparação com modelos descritos

na literatura 85

xii

Tabela 16: Comparação dos valores de coeficiente de correlação de

Pearson em diferentes ensaios de citotoxicidade 86

xiii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Cartazes da campanha de Henry Spira contra a realização do

teste de Draize para a avaliação da segurança de produtos cosméticos 06

Figura 2 - Exemplo de bateria de métodos alternativos propostos para

avaliação da irritação ocular 09

Figura 3 - Ilustração divulgada pelo FDA no ano de 1933 13

Figura 4 - Publicações da década de 1930 com registros dos agravos à saúde

induzidos por produtos de uso comum, tais como medicamentos, alimentos e

cosméticos 14

Figura 5 - John H. Draize, farmacologista do FDA que desenvolveu o teste de

irritação ocular de Draize em 1944 15

Figura 6 - Células 3T3 27

Figura 7 - Esquema resumido do procedimento do ensaio in vitro 43

Figura 8 - Esquema da aplicação das amostras diluídas na placa de 96 poços 44

Figura 9 - Distribuição normal dos valores de MEM Global (in vivo) 60

Figura 10 - Distribuição normal dos valores de média aritmética da IC

Figura 11

- Distribuição normal dos valores de MEM de córnea 61

Figura 12 - Distribuição normal dos valores de MEM de íris 61

Figura 13 - Distribuição normal dos valores de MEM de conjuntiva 62

Figura 14: Estratégia para teste de irritação ocular de novas substâncias

químicas de acordo com procedimentos de países membros da Comunidade

Européia. 78

xiv

LISTA DE QUADROS

Quadro 1: Exemplos de metodologias alternativas validadas/aceitas para fins

regulatórios na Europa. 03

Quadro 2: Legislações internacionais e a preconização do teste de irritação

ocular de Draize. 16

Quadro 3: Prazos estimados - segundo a Directiva 2003/15/EEC - para a

proibição definitiva do uso de animais na avaliação de alguns desfechos

toxicológicos comumente investigados pela indústria de cosméticos 18

Quadro 4: Principais testes alternativos usados na avaliação da toxicidade

ocular 20

Quadro 5: Registro do FDA: reclamações de consumidores quanto a reações

adversas provocadas por produtos cosméticos nos EUA, entre 1987 e 1995 73

SUMÁRIO

Resumo iv

Abstract v

Lista de Siglas e abreviaturas vi

Lista de Tabelas. ix

Lista de Figuras xi

Lista de Quadros xii

I.INTRODUÇÃO

1.1 Considerações Gerais 01

1.2 Príncipio dos 3R´s 04

1.3 Exemplos de aplicações da regra dos 3R’s no controle da qualidade

de produtos sujeitos à Vigilância Sanitária 07

1.4 Da origem do Teste de Draize à proibição do uso de animais no

processo de avaliação de segurança de produtos cosméticos 09

1.5 Métodos alternativos ao Teste de irritação ocular de Draize 18

1.6 Ensaios de citotoxicidade 23

1.7 Ensaio da Quantificação de Proteínas Totais (QPT) 24

1.7.1 Células 3T3 26

1.8 Justificativa. 28

II OBJETIVOS 30

III MATERIAIS E MÉTODOS 31

3.1 Produtos acabados e tensoativos 31

3.2 Ensaio in vitro

3.2.1 Linhagem celular 37

3.2.2 Soluções 37

3.2.3 Equipamentos 39

3.2.4 Descongelamento celular 41

3.2.5 Procedimento 41

xvi

3.3 Ensaio in vivo 45

3.4 Análise Estatística 45

IV. RESULTADOS 48

4.1 Resultados in vivo 48

4.1.1 Produtos infantis 48

4.1.2 Produtos da linha adulta 48

4.1.3 Tensoativos 49

4.2 Resultados in vitro 53

4.2.1 Precisão Inter.- ensaio 56

4.3 Comparação entre os ensaios in vivo e in vitro 58

4.3.1 Coeficiente de correlação de Pearson 59

4.3.2 Grau de preditibilidade do ensaio in vitro 66

V.DISCUSSÃO 69

5.1 Toxicologia de Produtos Cosméticos 69

5.2 Avaliação integrada: combinação de testes in vitro e in vivo na

avaliação do potencial irritante ocular 75

5.3 Uso de métodos alternativos na avaliação do potencial irritante de

cosméticos 79

5.4 Confronto com dados da literatura 80

VI. Conclusões 90

VII. Referências Bibliográficas 92

I. INTRODUÇÃO

_______________________________________________

1.1 Considerações Gerais

A pressão política exercida por setores ativistas que lutam em defesa dos direitos

dos animais tem gerado grande impacto na pesquisa científica, sobretudo na área

biomédica. Neste contexto, pode-se dizer que diversos setores da indústria, e.g.

cosméticos, imunobiológicos, fármacos entre outros, assim como órgãos governamentais

de regulamentação e controle da qualidade de produtos, estão sob crescente pressão para -

sempre que possível - substituir a experimentação animal por metodologias alternativas.

Embora a comunidade científica, em sua maioria, concorde com o fato de que

metodologias in vitro podem representar uma opção promissora para a pesquisa na área

biomédica e que em algum ponto do futuro, essas alternativas podem vir a substituir um

número considerável de métodos in vivo hoje preconizados em compêndios oficiais (e.g.

métodos farmacopeicos), há de se considerar que o processo de desenvolvimento e

validação de novos métodos alternativos é laborioso e requer grande investimento de

tempo, dinheiro e pessoal capacitado. Assim alguns países, percebendo a complexidade de

tal processo, se organizaram e criaram centros de pesquisa e fomento para o

desenvolvimento e validação de metodologias alternativas ao uso de animais, como é o

caso do European Centre for Validation of Alternative Methods (ECVAM) em Ispra na

Itália, o Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods

(ICCVAM) nos EUA, o Japanese Center for the Validation of Alternative Methods

(JaCVAM) no Japão, o Fund for Replacement of Animal Medical Experiments (FRAME)

na Inglaterra e o Centre for Documentation and Evaluation of Alternatives to Animal

Experiments (ZEBET) na Alemanha, entre outros. Dentre os principais objetivos destes

centros de estudos, destacam-se: i. o desenvolvimento de novos métodos alternativos em

consonância com o princípio dos 3Rs, ii. o estabelecimento da base de dados sobre

métodos alternativos ao uso de animais, iii. o fomento de projetos de pesquisa

relacionados aos métodos alternativos e a cooperações com outras agências de fomento

nacionais e internacionais e centros de validação, iv. a coordenação de estudos inter-

laboratoriais de validação; e por fim, v. a promoção de fóruns de discussão sobre métodos

alternativos ao uso de animais.

Como resultado deste esforço mundial no desenvolvimento/validação de

metodologias alternativas, existe hoje um número considerável de ensaios validados e

aceitos para fins regulatórios (Quadro 1). Tais métodos são aplicáveis ao controle da

qualidade de produtos sujeitos à ação da Vigilância Sanitária e - via de regra - apresentam

boa especificidade, sensibilidade e precisão. Além disso, são considerados vantajosos

quando comparados aos ensaios in vivo que pretendem substituir. Dentre as principais

vantagens quando consideramos tais metodologias alternativas, podemos citar:

1. Questões éticas

: embora a utilização de animais em experimentos científicos

ocorra há milhares de anos (RAYMUNDO & GOLDIM, 2002) e sejam

inegáveis os benefícios alcançados para o desenvolvimento da ciência e de

novas tecnologias, principalmente na área da saúde, é necessário o

comprometimento do meio científico pela busca, sempre que possível, de

modelos alternativos.

2. Maior rapidez de resposta

: ensaios alternativos apresentam - em sua grande

maioria - menor duração que ensaios in vivo.

3. Maior precisão de resultados

: muitos ensaios in vivo apresentam desfechos

subjetivos, que muitas vezes dependem de um treinamento criterioso dos

técnicos envolvidos na análise final dos resultados (e.g. análise qualitativa de

alterações da pele ou olho após aplicação de um determinado produto). Estes

desfechos podem ser hoje substituídos por ensaios automatizados e cuja análise

final é objetiva (e.g. quantificação de citocinas por ELISA ou estabelecimento

da IC

- concentração inibitória 50% - em testes de citotoxicidade).

Quadro 1: Exemplos de metodologias alternativas validadas/aceitas para fins regulatórios

na Europa.

*: The European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare

Fonte: ECVAM

Teste Desfechos Avaliados Modelo Usado

Ensaio a ser

substituído

Validação

Aceito para fins

regulatórios

Teste de Irritação

Dérmica

Potencial irritante de

produtos acabados ou

ingredientes

Modelos de pele reconstituída

(EPISKIN®, EPIDERM®). Análise

através de citotoxicidade (redução de

MTT)e/ou liberação de IL.

Teste de

irritação

dérmica em

coelhos

2007 Não

Teste de Pirogênio

in vitro (LAL)

Pirogênicidade

mediada por

endotoxinas de

origem bacteriana

(Gran-neg.)

Ensaio gel-clot – gelificação de

amebócito sanguíneos de carangueijo

Limullus

Teste e

Pirogênio em

coelhos

1985

Sim. Farmacopéia

(Americana)

Teste de Pirogênio

in vitro

Pirogenicidade -

pirogênios em geral

Quantificação de IL-1 ou IL-6 em sangue

total humano fresco ou criopreservado,

ou quantificação de IL-6 em linhagem

celular Mono-Mac 6 ou em células

monocíticas isoladas de sangue humano

periférico

Teste de

pirogênios em

coelhos

2006 Não

Ensaio do

Linfonodo Local

Murino

Potencial

sensibilizante de

xenobióticos

Quantificação de 3H-timidina nos

linfonodos auriculares de camundongos

tratados com substância teste

Teste de

maximização e

Buehler em

cobaias

2000

2002 (OECD test

guideline 429)

Ensaio de

Fototoxicidade

(3T3-NRU)

Potencial fototóxico

de ingredientes de

produtos

preconizados para

pele humana

(exposição a luz

solar)

Utilização de linhagem celular 3T3 e

corante Vermelho Neutro

Teste de

Fototoxicidade

in vivo (cobaias)

1998

2002 (Directiva

67/548/EEC;

Draft OECD test

guideline 432

Teste de Potência

do componente

tetânico

Potencia do

componente tetânico

presente em vacinas

de uso humano como

DTP, DT, dT e DTP

acelular e no soro

anti-tetânico

Teste in vitro de inibição de ligação da

toxina (ToBI)

Teste de

potência em

camundongos

2000

2003,

EDQM*/Farmaco

péia Européia

4. Menor custo

: apesar dos altos custos envolvidos no processo de

desenvolvimento/validação de uma nova metodologia, pode-se dizer que, uma

vez validadas, as metodologias alternativas apresentam um custo menor do que

aquelas relacionadas à manutenção de animais e infra-estrutura de biotérios. O

cumprimento das normas internacionais de bioterismo exige cuidados especiais

com o ambiente (controle de temperatura, umidade, luminosidade, troca de ar

etc.), com os animais (freqüência de trocas, limpeza de caixas e gaiolas etc.)

bem como o treinamento e atualização dos técnicos que manipulam esses

animais (NATIONAL RESEARCH COUNCIL, 2003), o que eleva muito o

custo destes ensaios.

5. Maior facilidade de disseminação para outros laboratórios de saúde

pública, e.g. laboratórios centrais de Saúde Pública (LACENS), Laboratórios

da Rede Brasileira de Laboratórios Analíticos em Saúde (REBLAS) e

universidades, pois eliminam a necessidade de infra-estrutura para a criação e

manutenção de animais de experimentação.

1.2 O Princípio dos 3R’s

Em 1959, Willian Russel e Rex Burch apresentaram à comunidade científica o

livro Principles of Humane Experimental Technique, definindo os 3R’s, cuja sigla

representa “refinament”, “reduction” e “replacement”, que significam respectivamente:

(1) refinamento

: a modificação de algum procedimento operacional com animais,

objetivando minimizar a dor e/ou o estresse. A experiência da dor e do estresse tem, como

resultado, mudanças psicológicas que interferem nos resultados obtidos. Sendo assim, o

interesse dos cientistas é assegurar que as condições ambientais para os animais sejam as

melhores possíveis; (2) redução: um menor número de animais sendo utilizado para obter

a mesma qualidade de informação, ou maximização da informação obtida, utilizando-se

mesmo número de animais utilizados no teste clássico; e (3) substituição

, dos testes in vivo

por testes in vitro (HENDRIKESEN et al., 1994; PRESGRAVE, 2002; CORRADO, 2007;

ANVISA, 2003).

Apesar da pouca atenção da comunidade científica durante a década de 1960 à

regra dos 3R`s, este conceito evoluiu como uma tendência mundial durante os anos

seguintes, iniciando uma forte pressão quanto a implicações éticas para a não utilização de

animais em pesquisas científicas e a mobilização de várias entidades e órgãos regulatórios

no árduo trabalho da validação de métodos alternativos na área biomédica.

Nas décadas de 1970 e 1980 a discussão sobre o uso de animais em pesquisa

científica tornou-se mais abrangente e madura. Estas décadas viveram a discussão de

temas, tais como: meios para reduzir tanto o número de animais de laboratório utilizados

por experimento, quanto o número de experimentos realizados; otimização das condições

que promovessem um maior bem-estar de animais em experimentação; desenvolvimento

de métodos de refinamento das técnicas convencionais, além de, sempre que possível, a

tentativa de substituir modelos in vivo por modelos in vitro.

Em 1975, o filósofo australiano Peter Singer lançou o livro intitulado Animal

Liberation (SINGER, 1975), despertando o movimento de proteção aos animais e

apontando o teste de irritação ocular de Draize (teste preditivo para a determinação da

irritabilidade oftálmica induzida por drogas, cosméticos e substâncias químicas descrito

por John Draize e colaboradores - DRAIZE et al., 1944), como um importante alvo de

combate para os ativistas (WILHELMUS, 2001; CORRADO, 2007). A partir de então, o

teste de Draize gerou muitos protestos, principalmente contra a indústria de cosméticos,

que o utilizava em grande escala. Uma grande campanha deflagrada por ativistas dos

direitos civis contra a indústria de cosméticos REVLON culminou com a publicação dos

seguintes anúncios no jornal The New York Times: “Cego pela beleza” e “Quantos coelhos

a REVLON cega em nome da beleza?” (Figura 1). Após estes protestos a REVLON

providenciou fundos para pesquisas em métodos alternativos ao uso de animais. Outras

companhias, como AVON e Bristol-Myers, seguiram o mesmo caminho e colaboram no

fomento as pesquisas afins (RAYMUNDO & GOLDIM, 2002)

Apesar da década de 1970 ter sido de amadurecimento, como dito anteriormente,

no que se refere à discussão de questões éticas em experimentação animal, a primeira

publicação oficial sobre a aplicação dos 3R´s só surgiu em meados de 1980, quando foi

criada na Europa a Directiva 86/906/EEC que descreve as leis que regem a proteção de

animais usados em experimentação científica (ROWAN, 1997).

Figura 1: Cartazes da campanha de Henry Spira contra a realização do teste de Draize para

a avaliação da segurança de produtos cosméticos publicada pelo The New York Times na

década de 1980.

Fonte: http://pages.cthome.net/pageone/commdesign.html (Acessado em 20/Fevereiro/2008)

Assim, pode-se dizer que foi somente nos anos 1980 que o interesse pela busca de

novas metodologias alternativas à utilização de animais na pesquisa científica se

consolidou. Novas legislações passaram a aderir ao conceito dos 3R´s e as pesquisas em

métodos alternativos aumentaram consideravelmente (ROWAN & ANDRUTIS, 1990;

PAIXÃO, 2001). Como resultado deste processo, pôde-se observar em alguns países uma

diminuição significativa do número de animais utilizados em pesquisa científica. Na

Alemanha, por exemplo, após a fundação do ZEBET em 1989, o número de animais de

laboratório utilizados anualmente diminuiu de 2,7 milhões em 1989 para 1,6 milhões em

1999 (SPIELMANN, 2002). Uma análise mais detalhada destes números revela que esta

diminuição foi devida - predominantemente - à redução do número de animais usados em

pesquisas relacionadas ao desenvolvimento de novos fármacos. Neste setor, a redução foi

de mais de 50%, i.e. de 1,4 para 0,6 milhões de animais/ano, no mesmo período de tempo

compreendido entre 1989 e 1999. Tecnologias modernas, como e.g. técnicas físico-

químicas, cultura de células, tecidos e órgãos - aliadas ao investimento financeiro da

indústria farmacêutica - permitiram a concepção de modelos mais adequados de triagem

(tanto no estabelecimento do perfil toxicológico como na avaliação de eficácia) das

moléculas candidatas ao desenvolvimento de novos fármacos. Além disso, a utilização de

ferramentas de informática, bases de dados contendo informações sobre matérias-primas, a

harmonização de diretrizes internacionais através do ICH (International Conference on

Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human

Use) contribuíram enormemente para a elaboração de bancos de informações e tornaram

possível a eliminação da duplicidade desnecessária de trabalho com animais.

Apesar de notarmos um aumento na utilização de animais na pesquisa básica a

partir do ano 2000 (e.g. desenvolvimento de animais geneticamente modificados –GM),

percebemos, a partir da mesma época, uma diminuição do número de animais utilizados

em pesquisa aplicada (e.g. análises toxicológicas), em decorrência principalmente de

benefícios oferecidos pelo governo às indústrias para a implementação da filosofia dos 3

R´s (HUDSON, 2007).

1.3 Exemplos de aplicações da regra dos 3R’s no controle da qualidade de

produtos sujeitos à Vigilância Sanitária

Além de tentar validar novos métodos, cabe a comunidade científica o bom senso

de excluir de seus compêndios oficiais metodologias obsoletas, que pouco contribuam no

fornecimento de dados relevantes para a ciência e que utilizem um grande número de

animais ou provoquem dor, angústia ou sofrimento aos mesmos. Um exemplo desta

conduta é a exclusão do método de dose letal 50% (DL

) em 2001, da Directiva

67/548/EEC e das guidelines da OECD.

Alguns métodos alternativos recentemente validados podem substituir por

completo o uso de animais (e.g. modelos de pele reconstituída para avaliação da

irritabilidade dérmica induzida por xenobióticos e testes in vitro para detecção da presença

de contaminantes pirogênicos em imunobiológicos, fármacos, parenterais de grande

volume etc). Em outras situações, a substituição plena ainda não é possível. No entanto, é

importante destacar que toda pesquisa na área de métodos alternativos é válida e

recomendada pelas agências de validação internacionais, havendo diversos exemplos de

estudos que geraram importantes contribuições em termos de refinamento das técnicas

e/ou redução do número de animais por desfecho toxicológico avaliado (ALVES &

COLLI, 2006).

Para alguns desfechos, embora permaneça a situação de utilização de animais de

laboratório, alcançou-se importante grau de refinamento na técnica previamente

preconizado. Como exemplo podemos citar o ensaio do linfonodo local murino (LLNA, da

sigla em inglês Local Lymph Node Assay), que é realizado em camundongos e se baseia na

resposta imune celular (i.e. na ativação e proliferação específica de linfócitos) que é

característica da fase de indução (1

fase) do processo de hipersensibilidade dérmica. Das

vantagens deste teste em relação aos seus precursores, listam-se: i. o parâmetro final

analisado é quantitativo (incorporação de

H-timidina), ii. o teste se passa na fase de

indução, e por isso tem a duração de 5 dias, enquanto os ensaios anteriores duravam em

média 35 dias, iii. características referentes a natureza da substância, tal como cor, não

interferem com desfecho do teste, iv. o número de animais utilizados por substância-teste é

cerca de 50% menor do que nos testes mais antigos, e por fim, v. os animais são poupados

da dor e do desconforto decorrentes das reações de fase 2 (processo inflamatório)

(BASKETEER et al., 2007; BASKETEER & KIMBER, 2007).

Um outro bom exemplo da aplicação da regra dos 3R´s no laboratório de controle

da qualidade é o uso dos métodos in vitro para avaliação da potência de imunobiológicos

de uso humano. A potência dos componentes diftérico e tetânico, presentes em vacinas

como DTP, DT, dT e DTP acelular, por exemplo, é determinada a partir de um teste de

duas etapas (imunização e soroneutralização) que utiliza cobaias e/ou camundongos. A

etapa de soroneutralização é a que envolve maior número de animais, cerca de 80 a 90%

do total utilizado no ensaio. Alguns métodos alternativos foram propostos a fim de

substituir os animais utilizados na etapa de soroneutralização. Destaca-se, neste contexto,

o recém validado teste de inibição de ligação da toxina (ToBI) realizado in vitro

(ESAC/ECVAM, 2000). Assim, mesmo que permanecendo a necessidade de animais na

etapa de imunização, a implementação de ensaios in vitro para avaliação da

soroneutralização permite uma redução significativa do número de animais utilizados (i.e.

cerca de 70 animais por lote de cada produto analisado).

Nas circunstâncias em que o teste em animais não possa ser substituído por um

único método alternativo (o que parece hoje ser a situação para o teste de irritação ocular

de Draize), o desenvolvimento de esquema de avaliação que envolva uma bateria de testes

deve ser levado em consideração, podendo também ser desenvolvido um sistema

hierárquico no qual os animais somente sejam utilizados para a confirmação da ausência

de toxicidade, reduzindo ao máximo o risco desses animais sofrerem quaisquer efeitos

tóxicos (Figura 2). Desta forma, é de enorme relevância a busca por novas metodologias

que possam compor tal esquema de avaliação.

Figura 2: Exemplo de bateria de métodos alternativos propostos

para avaliação da irritação ocular.

Bateria de Métodos Alternativos

(e.g. HET-CAM, BCOP, citotoxicidade)

Positivo Negativo

in vivo

Positivo

Negativo

1.4 Da origem do Teste de Draize à proibição do uso de animais no processo

de avaliação de segurança de produtos cosméticos

Até meados do século XX, mesmo em países europeus e nos Estados Unidos, não

era incomum a comercialização de uma diversidade de produtos que, além de não serem

testados quanto a sua eficácia, colocavam em risco a saúde de seus consumidores. A

necessidade de um maior controle por parte das agências regulatórias internacionais foi

tornando-se evidente, conforme denúncias sobre agravos à saúde associados à utilização

de determinados produtos foram tornando-se públicas. Foi exatamente neste contexto que

surgiu, em meados da década de 1940, o teste de irritação ocular de Draize (DRAIZE et

al., 1944).

Seguem abaixo alguns exemplos de marcos históricos relacionados à utilização

inadequada de produtos que ganharam o mercado sem antes terem sido devidamente

avaliados sob o ponto de vista toxicológico, deixando assim vítimas, como veremos a

seguir:

Elixir de Sulfanilamida:

O primeiro, ou pelo menos um dos primeiros registros, sobre o surgimento de

efeitos adversos associados ao consumo de medicamentos ocorreu no final da década de

1930, mais especificamente em 1937, em um episódio que ficou conhecido como a

Tragédia do Elixir de Sulfanilamida. O Elixir de Sulfanilamida foi considerado à época

um promissor agente anti-infeccioso, tendo sido desenvolvido principalmente para uso

pediátrico, no combate às infecções de garganta. Após a ingestão do Elixir, observou-se o

aparecimento de manifestações clínicas típicas dos quadros de falência renal aguda que,

como se sabe hoje, se deu devido ao alto teor de dietilenoglicol contido em sua formulação

(solução de sulfanilamida em uma mistura aquosa contendo 72% de dietilenoglicol). Os

sintomas incluíam náuseas, vertigens, oligúria e anorexia e levaram à morte de cerca de

105 norte-americanos, a maioria crianças. Dentre as vítimas do Elixir de Sulfanilamida,

destaca-se a morte do farmacêutico responsável pela formulação, que ao perceber a

dimensão da tragédia, suicidou-se ainda em 1937 (BALLENTINE, 1981).

Este trágico episódio fez com que já no ano seguinte, as autoridades americanas

competentes publicassem a primeira Lei Federal voltada para a garantia de segurança de

Alimentos, Medicamentos e Cosméticos (Food, Drug and Cosmetics Act, 1938).

Radithor

Preconizado como terapia fortificante, o Radithor era comercializado pela Bailey

Radium Laboratories de New Jersey na década de 1930. O fabricante - na tentativa de

provar a eficácia do produto em questão - garantia que em cada frasco de Radithor



havia

pelo menos 1 microcurie de Ra-226 e/ou Ra-228. Como parte da campanha publicitária, o

laboratório Bailey Radium usava frases de impacto do tipo: “terapaia absolutamente

segura, em todos os aspectos”, e desafiava o público, oferecendo U$1.000,00 a qualquer

indivíduo capaz de provar que o produto contivesse quantidade menor de Radio do que a

anunciada.

Pelo menos uma morte foi comprovadamente relacionada à terapia a base de Ra,

entre 100 indivíduos acometidos pelos efeitos adversos desta terapia, que incluíam queda

generalizada de pêlos e dentes, enfraquecimento ósseo, insuficiência renal e da medula

óssea, entre outros sintomas (MACKLIS, 1990).

Talidomida

Foi desenvolvida pela indústria alemã Chemie Grünenthal e introduzida no

mercado europeu em meados da década de 1950 como um potente e seguro medicamento

sedativo/hipnótico, com o nome comercial de Contergan



. A talidomida foi lançada

através de um marketing agressivo. Um dos motes da campanha da nova droga era: “tão

segura, que seria impossível alguém ter êxito em tentativas de suicídio com a talidomida”.

De fato, sob o ponto de vista de sua toxicidade aguda, a talidomida não representa risco

importante. No entanto, como se observou poucos anos após o início de sua

comercialização, a talidomida apresenta potente ação teratogênica, induzindo

malformações específicas, tais como focomelia e amelia quando ingerida entre a 6

e a 7

semana de gravidez. O aumento da incidência destas graves malformações, até aquele

momento bastante raras, e que chamam à atenção logo ao nascimento, possibilitou o

pronto estabelecimento da relação causal entre a ingestão na talidomida no primeiro

trimestre de gestação e o nascimento de crianças malformadas. Na Alemanha e na

Austrália constatou-se de forma independente, que as mães de crianças com estas

anomalias apresentavam em comum o fato de terem feito uso da talidomida no primeiro

trimestre de gravidez. Assim, em 1961, o Contergan



foi retirada do mercado. Estima-se

que ao redor do mundo a talidomida tenha feito cerca de 10.000 vítimas (TRUETA, 1962).

A lista de produtos, cuja comercialização levou a severos danos à saúde da

população em geral, não era restrita aos medicamentos. Produtos cosméticos foram

igualmente responsáveis pelo surgimento de sérios efeitos adversos, como veremos a

seguir:

Linha de cosméticos Lash Lure

Cosméticos da linha Lash Lure

eram aplicados em salões de beleza da época e se

apresentavam como corantes permanentes para cílios e sobrancelhas. Continham em sua

formulação parafenileno de amina, substância com alto potencial dermo-sensibilizante,

que causou severa alteração - geralmente bilateral - de córnea em mulheres que fizeram

uso destes produtos semanas após tê-los aplicado. Estima-se que os produtos da Linha

Lash Lure

tenham deixado pelo menos 12 mulheres cegas e causado a morte de uma

pessoa na década de 1930 nos EUA (WILHELMUS, 2001). O FDA divulgou o caso, com

cartazes como o ilustrado na Figura 3, alertando a população para o risco associado ao uso

do produto.

Figura 3: Ilustração divulgada pelo FDA no ano de 1933.

O cartaz descreve o mote da campanha do Lash Lure: “Irradie personalidade”, e afirma “esta

é a versão do fabricante para os efeitos de seu produto” (com a foto de uma das vítimas do Lash

Lure, uma mulher de 38 anos de Ohio, EUA, horas antes fazer uso do produto). À direita:

“Totalmente cega: este foi o verdadeiro efeito de Lash Lure, em pelo menos um dos casos”

(com a foto da mesma mulher com severa alteração bilateral de córnea, semanas após ter

utilizado o produto).

Fonte:

http://www.fda.gov/oc/history/historyoffda/section2.html (acessado em

28/Fevereiro/2008).

A lista de princípios ativos tóxicos presentes em produtos para higiene pessoal e

embelezamento era significativa. Há registros da comercialização de produtos como o

Berry’s Freck



uma pomada a base de mercúrio, o Anti-Mole



, um creme anti-sinais

contendo 5% de ácido nítrico acrescido a 25% de ácido acético glacial, tônicos capilares

como Dr. Denni’s



e Dewsberry



a base de cloreto de cobre e hidrato de cloro, ou ainda,

xampus contendo em suas formulações substâncias hoje sabidamente carcinogênicas como

o tetracloreto de carbono (ILAR, 2004; RIORDAN, 2004; COSTA, 2006).

No final da década de 1930 eram tantos os casos de agravos à saúde e óbitos

induzidos por produtos de uso comum nos EUA, que coleções conhecidas como “The

American Chamber of Horrors: the truth about food and drugs”, organizada pela FDA –

“Food and Drug Administration”, e o best-seller americano “100.000.000 Guinea pigs:

dangers in everyday foods, drugs, and cosmetics” (Figura 4) foram publicadas com a

finalidade de alertar a opinião pública para tal fato (Calver, 1936). Estes registros

culminaram na publicação, do “The Federal Food, Drug, and Cosmetic Act”, uma

importante lei que pela primeira vez na história regulamentou os produtos cosméticos e

trouxe inovações para o campo de medicamentos, como por exemplo, a exigência de

comprovação de eficácia/segurança de novos produtos numa etapa prévia a

comercialização.

Figura 4: Publicações da década de 1930 com registros dos agravos à saúde

induzidos por produtos de uso comum, tais como medicamentos, alimentos e

cosméticos.

Fonte: http://www.fda.gov/oc/history/slideshow/Slide_158.html

(acessado em

28/Fevereiro/2008)

Como mencionado anteriormente, o teste de irritação ocular de Draize surgiu

exatamente neste momento de crise do sistema de saúde pública americano, como fruto da

necessidade detectada pelos órgãos regulatórios competentes de se controlar

adequadamente aspectos relacionados à segurança de produtos cosméticos, antes mesmo,

destes ganharem o mercado consumidor (KURIAN,

1998). O teste foi desenvolvido em

1944 pelo farmacologista John H. Draize (Figura 5) do FDA e seus colaboradores, com o

propósito de se avaliar o potencial tóxico de produtos que pudessem vir a entrar em

contato com o olho humano.

O teste de irritação ocular de Draize foi preconizado durante muito tempo como

procedimento padrão universal para avaliação da irritação ocular e o potencial de risco de

substâncias químicas manufaturadas em vários tipos de indústrias (e.g. cosméticos,

fármacos, produtos de uso agrícola e domissanitários, entre outros), como mostra o

Quadro 2. Ao longo dos anos, desde sua criação, o teste sofreu diversas alterações.

Algumas versões modificadas do teste foram apresentadas pela comunidade científica

(DRAIZE et al., 1944; DRAIZE, 1959; KAY & CALANDRA, 1962; DASTON &

FREEBERG, 1991; CHAMBERS et al., 1993 e CHAN & HAYES, 1994) e diversos

protocolos foram objeto de discussão em fóruns técnico-científicos no mundo todo

(WILHELMUS, 2001).

Figura 5: John H. Draize, farmacologista do FDA que desenvolveu o

teste de irritação ocular de Draize em 1944.

Fonte: Wilhelmus 2001

Quadro 2: Legislações internacionais e a preconização do teste de irritação

ocular de Draize.

Legislação/ano da

primeira versão

Agência regulatória Produto

Federal Insecticide,

Fungicide and Rodenticide

Act / 1947 e Federal

Environmental Pesticide

Control Act / 1972

EPA

Pesticidas

Federal Hazardous

Substances Act /1964 e

Toxic Substances Control

Act / 1977

EPA

Químicos de uso agrícola e

industrial

Occupational Safety and

Health Act / 1970

OSHA

Produtos que oferecem risco

ocupacional

Consumer Product Safety

Act / 1972

CPSC

Produtos de uso doméstico

Hazardous Materials

Transportation Act / 1974

RSPA

Químicos transportados

comercialmente

Clean Air Act Amendment/

1990

CSHHIB

♣

Produtos que oferecem risco

ambiental

OECD Guidelines for

testing of chemicals / 2002

OECD

♣♣

Substâncias químicas em

geral

EPA: Environmental Protection Agency.

OSHA: Occupational Safety and Health Administration.

CPSC: Consumer Product Safety Commission

RSPA: Reasearch and Special Programs Administration

♣

: CSHHIB: Chemical Safety and Hazard Investigation Board

♣♣

:OECD: Organisation for Economic Co-operation and Development

Hoje, apesar das duras críticas e de existirem controvérsias quanto à validade de

seus resultados, o teste de irritação ocular de Draize permanece preconizado em diretrizes

internacionais para avaliação de segurança de substâncias químicas (OECD, 2002) e é o

único teste aceito pela entidade regulatória brasileira, i.e. ANVISA, para a avaliação do

efeito irritante ocular de produtos sujeitos à ação da Vigilância Sanitária.

Na questão específica do controle da qualidade de cosméticos, esta situação gera

um importante impasse, que dificulta enormemente a exportação de nossos produtos para

outros países. Isto porque, enquanto o Brasil exige a comprovação de segurança de

cosméticos através de testes in vivo, a Europa já proíbe desde 2004 a comercialização de

produtos acabados testados em animais e estabelece novos prazos de proibição do uso de

animais na avaliação de segurança de ingredientes isolados (e.g. tensoativos) utilizados

em cosméticos em países membros da Comunidade Econômica Européia (DIRECTIVA

2003/15/EEC), conforme demonstrado no Quadro 3.

Quadro 3: Prazos estimados - segundo a Directiva 2003/15/EEC - para a proibição

definitiva do uso de animais na avaliação de alguns desfechos toxicológicos comumente

investigados pela indústria de cosméticos.

Prazos estimados

Desfechos

toxicológicos

Proibição

definitiva do

uso de

animais

Proibição

definitiva da

comercialização

de produtos

testados por

ensaio in vivo

Validação

final de

ensaios

alternativos

ao uso de

animais

Substituição

plena do uso

de animais na

CEE

Corrosividade

cutânea

2009 2009 Já validado B40 Anexo V

Directiva

67/548/EEC, e

TG430 e TG

431 da OECD

Efeitos tóxicos

induzidos pela UV:

fototoxicidade aguda

2009 2009 Já validado B41 Anexo V

Directiva

67/548/EEC, e

TG432 da

OECD

Absorção/penetração

Dérmica

2009 2009 Já validado

(2005)

TG428 da

OECD

Irritação Dérmica

2009 2009 Já validado

(2007)

2008

Irritação Ocular

2009 2009 2008 2009

Fonte: Commission Staff Working Document

(Commission of the European Communities), Brussels, 2004

1.5 Métodos alternativos ao Teste de irritação ocular de Draize

Embora o teste de irritação ocular de Draize cause grande desconforto e sofrimento

aos animais e tenha sido, por esta razão, um dos primeiros testes usados para fins

regulatórios pelo qual se procurou abordagens alternativas (PRESGRAVE, 2002), ele

permanece na condição de ensaio cujas alternativas ainda não foram plenamente validadas

(Quadro 3). Muitos métodos válidos vêm sendo pesquisados (Quadro 4), entre eles: 1.

HET-CAM - membrana cório-alantóide de ovo embrionado de galinha (LUPKE et al.,

1985); 2. células 3T3 com NRU - captação de vermelho neutro (VIAN et al., 1995) e

MTT – captação de MTT ou ensaio da atividade metabólica mitocondrial (CHIBA et al.,

1999); 3. RBC - red blood cell assay (PAPE et al., 1999); 4. BCOP - opacidade e

permeabilidade de córnea de bovinos (BURDICK et al., 2002); 5. ICE - olho de galinha

isolado (BURTON et al., 1981); e 6. IRE - olho de coelho isolado (De TORRES et al.,

1997).

Através deste conjunto de métodos in vitro agrupam-se informações que oferecem

subsídios para garantir a segurança do produto ao nível ocular. Como há mais de um

mecanismo indutor de irritação ocular, apenas um ensaio in vitro não é suficiente para uma

completa avaliação. O ideal é obtermos dados relacionados à vascularização (e.g. HET-

CAM), opacidade/permeabilização (e.g. BCOP) e citotoxicidade (e.g. MTT, RBC).

É importante ressaltar que vários destes testes vêem sendo utilizados na avaliação

do risco irritativo de ingredientes isolados. Entretanto, como nenhum deles está

plenamente validado até o presente momento, os modelos citados acima só podem ser

contemplados como modelos experimentais de “triagem”, ou seja, de caráter preliminar.

Quadro 4: Principais testes alternativos usados na avaliação da toxicidade ocular.

BCOP – Opacidade e permeabilidade de Córnea Bovina.

ÓRGÃO

ISOLADO

ICE – Olho Isolado de Galinha – Avalia edema corneal, opacidade

corneal e retenção de fluoresceína.

NRU – mede a atividade de retenção do corante vermelho neutro

pelos lisossomos de células viáveis ( e.g. SIRC e 3T3).

MTT – avalia a metabolização de sais de tetrazolium por mitocôndrias de células

viáveis ( e.g. SIRC e 3T3).

AGAROSE DIFFUSION METHOD – realizado em células L929 e avalia a

morte celular.

FLUORESCEIN LEAKAGE - realizado em células MDCK (rins de cão) e avalia

injúrias causadas às junções celulares.

CULTURA DE

CÉLULAS

EPIOCULAR – epitélio ocular humano reconstituído – avalia a viabilidade celular,

liberação de mediadores inflamatórios e permeabilidade celular.

HET-CAM – teste realizado em membrana cório-alantóide de ovo embrionado de

galinha. Avalia danos na membrana cório-alantóide.

OVO

EMBRIONADO

CAM – TBS – OVO DE GALINHA – método quantitativo com corante Azul de Tripan.

Avalia danos na membrana cório-alantóide. Hiperemia, Hemorragia e Coagulação.

SANGUE DE

MAMÍFEROS

RBC – teste de hemólise – utiliza amostras de sangue bovino.Avalia danos causados à

membrana citoplasmática em combinação com danos às proteínas celulares

(desnaturação).

A seguir, serão apresentadas breves informações sobre os ensaios mais

freqüentemente utilizados para a avaliação in vitro da toxicidade ocular (e.g. na avaliação

do potencial irritante de xampus, sabonetes líquidos e outros produtos de higiene pessoal,

além da avaliação de ingredientes isolados).

HET-CAM (membrana corio-alantóide de ovo embrionado de galinha

)

O objetivo do ensaio HET-CAM é avaliar semi-quantitativamente o potencial

irritante de um produto (produtos solúveis, emulsões, géis e óleos), sobre a membrana

cório-alantóide de ovo embrionado de galinha, no décimo dia de incubação. O ensaio é

baseado na observação dos efeitos irritantes durante 5 minutos após a aplicação do

produto, puro ou diluído, sobre a membrana cório-alantóide. A avaliação final é feita a

partir de uma escala que considera cada fenômeno observado (hiperemia, hemorragia e

coagulação) em função do seu tempo de aparecimento (LIEBSCH & SPIELMANN,

2002).

O método apresenta praticidade de execução, demonstra boa sensibilidade e não

requer recursos financeiros altos (LUEPKE, 1985).

Porém, como desvantagem, o método

não apresenta boa predição do potencial irritante ocular para produtos opacos ou coloridos,

pois dificulta a visualização dos efeitos hemodinâmicos ocorridos na membrana cório-

alantóide (VINARDELL & MITJANS, 2006)

RBC - Red Blood Cell System

Este ensaio permite quantificar os efeitos adversos de ingredientes isolados e de

produtos acabados sobre a membrana plasmática das hemácias e a conseqüente liberação

da hemoglobina (hemólise) e ainda, o índice de desnaturação da hemoglobina, avaliado

através de sua forma oxidada, ambos quantificados por espectrofotometria. A relação entre

a hemólise e oxidação da hemoglobina fornece um parâmetro de caracterização dos efeitos

dessas substâncias in vitro (ALVES, 2003).

O teste RBC vem se mostrando bastante útil na avaliação do potencial irritante de

tensoativos, gerando resultados confiáveis e reprodutíveis em estudos intra e inter

laboratoriais (PAPE et al., 1999; MEHLING et al., 2007)

BCOP (Opacidade e Permeabilidade de córnea bovina)

O objetivo do ensaio é avaliar quantitativamente o potencial irritante de um

produto ou de uma substância química após aplicação sobre a córnea isolada de bezerro. O

ensaio é baseado na medida da opacidade e da permeabilidade da córnea após o contato

com o produto-teste.

A medida da opacificação da córnea é realizada com o auxílio de um opacitômetro,

aparelho que determina a transmissão do fluxo luminoso através da córnea a ser avaliada e

fixando um valor numérico de opacidade. Já a medida da permeabilidade da córnea é

realizada em função do tempo de contato do produto com o olho, após adição de

fluoresceína. A densidade óptica é medida em 490nm. Obtém-se uma escala que considera

os fenômenos observados (ANVISA, 2003)

O teste é rápido, apresenta boa predição do grau de irritação ocular de uma grande

variedade de substâncias e se mostra como uma alternativa confiável ao método in vivo

(teste de irritação ocular de Draize) (PRICE & ANDREWS, 1985).

Citotoxicidade pela difusão em gel de agarose

Indicado para emulsões e géis com fase contínua aquosa. Aplica-se os produtos à

superfície de um gel de agarose em contato com células de tecido conjuntivo de

camundongo da linhagem NCTC – clone L929 (ATCC CCL1) onde, a citotoxicidade é

avaliada com a ajuda de um corante vital, o MTT ou o NRU, observando-se o diâmetro

médio do halo de lise celular revelado pela coloração. O halo reflete a citotoxicidade de

um produto testado e a sua capacidade em se difundir no gel de agarose (ANVISA, 2003).

Citotoxicidade pelo método MTT

Utiliza-se cultura de células, como e.g. a SIRC (linhagem celular derivada da

córnea do coelho) ou outras, adicionadas do corante vital MTT [ou 3-(4,5 dimethyl

thiazole-2yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide]. Este método mede a atividade

mitocondrial das células viáveis em metabolizar sais de tetrazolium. O parâmetro final de

avaliação é o estabelecimento da IC

(i.e. a concentração da substância-teste que inibe

50% do crescimento celular). Não aplicável a produtos insolúveis em água (ANVISA,

2003).

Citotoxicidade pela método NRU

Assim como no método de citotoxicidade com MTT, neste ensaio utiliza-se cultura

de células adicionada de um corante vital, i.e. o NR (ou seja, o corante vermelho neutro).

O método mede a atividade de retenção do corante pelos lisossomas das células viáveis. A

captação do NR pelas células viáveis é quantificada por espectrofotometria, através de um

leitor automático de microplacas. O parâmetro final de avaliação também é o

estabelecimento da IC

(i.e. concentração da substância-teste que inibe 50% do

crescimento celular). Este método é empregado para todo tipo de formulação, exceto

aquelas que possuam propriedades fixadoras, como as formulações alcoólicas (ANVISA,

2003), pois a avaliação da acurácia de álcoois, ácidos fortes e substâncias alcalinas fica

dificultada (TANI et al., 1999).

1.6 Ensaios de citotoxicidade

Os ensaios de citotoxicidade têm sido os métodos in vitro mais estudados como

possíveis alternativas ao teste de irritação ocular de Draize (VIAN et al., 1995; GUILLOT,

1992; RENZI et al., 1993; EUN & SUH, 2000; LAGARTO et al., 2005).

Sabe-se que linhagens celulares quando mantidas em cultura dividem-se e

multiplicam-se continuamente. A base dos ensaios de citotoxicidade está exatamente na

avaliação da interferência induzida por agentes químicos (e.g. tensoativos) nos processos

metabólicos celulares e na investigação a respeito da maneira em que esses processos

podem vir a intervir no crescimento/multiplicação celular, ou até mesmo culminar na

morte celular, reduzindo, assim o número de células viáveis se comparado com culturas

controles não-tratadas. Estes ensaios tendem a simplificar os eventos quantificados,

contudo, por serem métodos simples, de baixo custo e reprodutíveis são extensamente

empregados em processos de triagem

(FRESHNEY, 1994).

Os testes realizados para a medição da viabilidade celular e integridade da

membrana citoplasmática (como o NRU, o MTT, o teste de liberação de enzimas

citoplasmáticas como a lactato desidrogenase (LDH) ou RBC) têm apresentado uma boa

correlação com o potencial de irritação ocular in vivo

(YANG & ACOSTA, 1994; EUN &

SUH., 2000, VIAN et al., 1995; SPIELMANN, 1996; RENZI et al., 1993; GEURTSEN,

1998, DICKSON, 1993; COSTA, 2006; DEBBASCH et al, 2005; HARBELL et al.,

1997). Dentre os desfechos que fornecem informações sobre diferentes funções celulares,

aqueles que utilizam estimativas quantitativas sobre funções metabólicas (como e.g. o

NRU e MTT) são os mais usados. Apesar destes ensaios apresentarem vantagens como

precisão e serem sujeitos a automação, eles são extremamente dependentes de possíveis

alterações fisiológicas celulares, como alterações nas atividades lisossomal (NRU) e

mitocondrial (MTT). Estes parâmetros são dependentes das condições da cultura celular,

que podem ser modificados por aspectos como densidade celular e secreção celular.

Conseqüentemente, somente células crescendo em condições similares podem ser

comparadas por estes métodos (MARGIS & BOROJEVICH, 1989).

1.7 Ensaio da Quantificação de Proteínas Totais (QPT)

A metodologia do teste de quantificação de proteínas totais foi descrita em 1986

por Knox e colaboradores. Desde aquela época até os dias de hoje, a metodologia vem

sendo refinada e modificada para a utilização de placa com 96 orifícios (CLOTHIER,

1995), além da utilização de esquema de lavagem automatizado de microplacas,

conferindo uma maior rapidez e praticidade durante o ensaio (COSTA, 2006).

O método avalia a taxa de crescimento celular através da determinação

colorimétrica da quantificação de proteínas totais contidas em cultura celular (SHOPSIS &

ENG, 1985 E VIAN et al., 1995). Assim, o ensaio tem como desfecho final a avaliação do

efeito de uma determinada substância sobre o crescimento/proliferação celular, ou seja, o

grau de inibição do crescimento celular provocado pela substância em questão fornece um

indicativo de sua toxicidade (KNOX et al., 1986; CLOTHIER, 1995).

Apesar de apresentar algumas limitações (i. quantifica as células indiretamente, ou

seja, de forma relativa à quantidade de proteínas totais e ii. os resultados obtidos são

dependentes do tipo celular utilizado (EUN & SUH, 2000); este teste é considerado

rápido, sensível, reprodutível, possui simplicidade de execução, custo relativamente baixo,

requer reagentes com baixa toxicidade, é sujeito a automação e não é tão dependente das

modificações fisiológicas celulares como os ensaios de viabilidade através da avaliação do

metabolismo celular (SHOPSIS, 1985; KNOX et al., 1986; MARGIS & BOROJEVICH,

1989).

Este método baseia-se na adsorção, eluição e medição de densidade ótica (D.O.) do

corante Azul Brilhante de Coomassie (CBB-R250) que cora as proteínas celulares. Há

uma relação linear entre o teor de proteínas totais dosadas e o número de células existente

na cultura. Os tensoativos existentes na composição dos xampus e condicionadores

apresentam ação citolítica sobre a cultura celular. A quantificação do teor de proteínas

totais,é realizada após a lavagem das placas e a fixação das células que permaneceram

vivas e aderidas após o contato com a substância-teste. Esta metodologia apresenta ainda a

vantagem da possibilidade de se estocar as placas para um processamento posterior, além

da possibilidade da realização de repetições do ensaio utilizando as mesmas microplacas.

Assim sendo, o método indireto pode ser usado nas mais diversas metodologias,

onde a quantificação celular é requerida (MARGIS & BOROJEVICH, 1989)

. Portanto, é

possível utilizá-lo na avaliação da citotoxicidade de compostos, avaliando diferentes

doses, produtos e tratamentos aos quais a monocamada celular for submetida. Além disso,

o método possibilita o uso de microplacas de 96 cavidades, permitindo a avaliação

simultânea de um maior número de diluições e a utilização de lavadores e leitores

automáticos de microplacas, agilizando o processo metodológico (SHOPSIS, 1985;

RENZI et al., 1993). Por todas as razões citadas acima, este foi o método de escolha para o

presente estudo.

1.7.1 Células 3T3

As células 3T3 (Figura 6) são provenientes de uma linhagem celular estabelecida

em 1962 por dois cientistas - George Todaro e Howard Green - do Departamento de

Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade de Nova York. Todaro e Green

obtiveram as células 3T3 de tecido de embrião de camundongo suíço albino (TODARO &

GREEN, 1963).A designação “3T3” se refere ao fato de que esta linhagem celular cresceu

originalmente em uma concentração de 3 x 10

células por cm² (primeiro “3”), com um

intervalo de transferência (“T”) de 3 dias (segundo “3”).

Na década de 1950, Dulbelco e Vogt publicaram importantes artigos (GREEN,

2006) demonstrando que fibroblastos recentemente retirados de animais e cultivados por

curtos períodos de tempo poderiam ser transformados pela infecção por poliomavírus.

Porém, o pesquisador Howerd Green

na tentativa de reprodução dos resultados obtidos por

Dulbelco e Vogt, encontrou dificuldades na utilização de culturas primárias ou secundárias

de fibroblastos, pelo fato de serem estas, culturas bastante heterogênias, o que dificultava a

reprodutibilidade do ensaio. Dessa forma, ficava clara a necessidade do desenvolvimento

de culturas celulares mais homogêneas, pois somente uma linhagem celular imortalizada

(estabelecida) capaz de realizar propagação indefinida se prestaria de forma adequada à

reprodutibilidade destes ensaios (GREEN, 2006).

Figura 6: Células 3T3

Fonte: www.answers.com/topic/3t3-cells

- acessado em 07/03/2008

Muitas linhagens celulares foram testadas, porém nenhuma apresentava as

características desejadas (GREEN, 2006). Assim, como mencionado anteriormente, na

década de 1960, George Todaro e Howard Green iniciaram seus trabalhos cultivando

fibroblasto embrionado de camundongo, com o objetivo de estabelecer uma linhagem

celular imortalizada que atendesse adequadamente às necessidades da pesquisa de

transformação celular ocasionada pelo poliomavírus. Assim, percebeu-se que

diferentemente da linhagem celular proveniente de fibroblastos humanos, a linhagem

celular de fibroblastos proveniente de embrião de camundongo possui uma maior

capacidade de se manter estável, mesmo em um alto número de passagens (TODARO &

GREEN, 1963)

A 3T3 foi escolhida para o presente estudo por apresentar facilidade de obtenção,

manutenção e manipulação, além do fato de que esta possui a capacidade de se manter

estável mesmo após muitas passagens, o que facilita o trabalho, nos fornecendo resultados

mais confiáveis. Além disso, esta linhagem celular é largamente utilizada em outros

ensaios de avaliação da citotoxicidade (GEURTSEN, et al., 1998; SPILEMANN, et al.,

1996; DICKSON, 1996; WILLSHAW

et al., 1994; COSTA, 2006; VIAN et al., 1995;

KNOX et al., 1986; CLOTHIER et al., 1988; CLOTHIER et al., 1992; CLOTHIER et al.,

2006 ) induzida por produtos e ingredientes de cosméticos (e.g. MTT e NRU),

o que

permite a comparação dos resultados obtidos no presente estudo com os descritos na

literatura.

1.8 Justificativa

O ensaio de QPT apresenta características importantes, como rapidez, simplicidade

de execução, baixo custo, alto grau de automação; além de não ser tão dependente das

modificações fisiológicas celulares como outros ensaios de viabilidade através da

avaliação do metabolismo celular (MARGIS & BOROJEVICH, 1989; KNOX et al., 1986;

SHOPSIS & ENG, 1985). Vale ressaltar que o método proposto requer reagentes de baixa

toxicidade, e.g. o corante azul brilhante de comassie, que é sabidamente menos tóxico que

os corantes NR e MTT. Além disso, resultados recentes obtidos pelo nosso grupo

demonstraram que o ensaio de QPT em células SIRC apresenta resultados promissores,

quando comparados aos resultados obtidos pelo teste de irritação ocular de Draize

(COSTA, 2006).

Acreditamos ser importante avaliar de forma consistente a aplicabilidade do ensaio

de QPT em outra linhagem celular (3T3), investigando o potencial deste ensaio como

método in vitro para a avaliação do potencial irritante ocular de produtos sujeitos a ação da

Vigilância Sanitária. Os estudos existentes sobre o ensaio proposto, utilizando a mesma

linhagem celular (3T3) e o mesmo corante (azul brilhante de Coomassie) (e.g VIAN et al.,

1995; CLOTHIER et al., 1988; CLOTHIER et al., 2006) avaliam somente ingredientes

isolados (i.e. tensoativos). Pretendemos, com nossa investigação, avaliar tensoativos e

produtos acabados (i.e. xampus e condicionadores), onde se concentram as análises

realizadas pelo Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS).

Assim, o presente trabalho se propõe a contribuir com uma maior compreensão da

aplicabilidade deste método de citotoxicidade, utilizando nova linhagen celular, através da

quantificação de proteínas celulares totais na avaliação do potencial de irritação ocular de

tensoativos, xampus e condicionadores, como mais uma possível alternativa ao teste de

irritação ocular de Draize.

II. OBJETIVOS

______________________________________________________

Objetivo Geral:

Avaliar os efeitos citotóxicos produzidos por tensoativos e produtos acabados

(xampus e condicionadores) pelo ensaio QPT utilizando o corante Azul Brilhante de

Comassie R-250 em células 3T3; comparando os resultados obtidos nesse ensaio com

aqueles obtidos no teste de irritação ocular de Draize

Objetivos Específicos:

• Avaliar a correlação existente entre achados macroscópicos em cada uma das

estruturas oculares (córnea, íris e conjuntiva) estudadas no teste de irritação ocular

de Draize e os resultados obtidos no ensaio QPT.

• Estabelecer um ponto de corte (cut-off) para a diferenciação de substâncias

irritantes e não-irritantes e avaliar parâmetros como precisão, sensibilidade e

especificidade do ensaio proposto em comparação com o teste de irritação ocular

de Draize.

• Comparar os resultados finais do ensaio de QPT em células 3T3 com resultados

previamente obtidos em nosso laboratório com células SIRC, correlacionando-os

com os dados obtidos in vivo pelo teste de irritação ocular de Draize (banco de

dados do Departamento de Farmacologia e Toxicologia – DFT do INCQS).

III. MATERIAIS E MÉTODOS

_____________________________________________________

3.1 Produtos acabados e tensoativos

Os produtos acabados e tensoativos do presente estudo foram selecionados de

modo a atender a dois critérios: i. produtos previamente analisados no teste in vivo

, e ii.

contemplar todas as cinco categorias de classificações possíveis (i.e. NI: Não Irritante,

IL: Irritante Leve, IM: Irritante Moderado, IS: Irritante Severo e IMax: Irritante

Máximo) no teste de Draize (Tabela 1).

Foram avaliados tensoativos, xampus e condicionadores, de uso adulto e infantil,

de marcas e formulações idênticas aos produtos testados anteriormente pela equipe do

DFT no ensaio in vivo e no teste in vitro utilizando células SIRC (COSTA, 2006).

Os xampus infantis (N = 6), xampus de uso adulto (N = 6), condicionadores de uso

infantil (N = 5) e condicionadores de uso adulto (N = 2) foram adquiridos em

estabelecimentos comercias no município do Rio de Janeiro no ano de 2006.

Cabe ressaltar que todo o procedimento in vivo havia sido conduzido previamente

pela equipe do Departamento de Farmacologia e Toxicologia (DFT) do INCQS. Assim,

os resultados do teste de irritação ocular de Draize provêm de um banco de dados em

software Microsoft Excel pertencente ao DFT.

Com relação aos fabricantes, podemos dizer que foram avaliados produtos

acabados de 12 diferentes laboratórios, que receberam códigos conforme descrito na

Tabela 1. No caso dos F1, F2, F3 e F4 avaliamos mais de uma marca produzida pelo

mesmo fabricante. Assim, nossos produtos foram codificados, de modo a expressar o

código do fabricante (F1 a F12) e a marca (M1, M2, M3 e M4).

Alguns exemplos que seguem abaixo ilustram o procedimento adotado para criar

os códigos do presente estudo:

F1M1: O produto é proveniente do fabricante 1, sendo da marca 1 (a primeira

marca testada proveniente do fabricante 1);

F1M2: O produto é proveniente do fabricante 1, sendo da marca 2 (a segunda

marca testada proveniente do mesmo fabricante 1);

F4M2: O produto é proveniente do fabricante 4, sendo da marca 2 (a segunda

marca testada proveniente do mesmo fabricante 4);

F4M4: O produto é proveniente do fabricante 4, sendo da marca 4 (a quarta marca

testada proveniente do mesmo fabricante 4).

Tabela 1: Lista dos produtos avaliados: uso, classificação in vivo, fabricante, marca e

composição.

N° Produto Classifi-

cação

in vivo

Lote Fabricante Código

Final

Composição

Xampu

Infantil

10099

F1M1

Aqua, PEG-150, pentaerythril

tetrastearate, dissodium laureth

sulfosuccinate, laurete sulfate,

sodium lauroyl sarcosinate, sodium

cocoamphoacetate, PEG-80

sorbitan laurate, avena sativa,

kernel extract, parfu, dazolidynil,

urea, iodopropynyl

butylcarebamate, citric

acid,tetrasodium EDTA

Xampu

Infantil

MI B304 F2

F2M1

Água, lauril éter sulfato de sódio,

lauril-éter-8 sulfato de sódio, lauril

éter sulfato de magnésio, lauril

éter-8 sulfato de magnésio,

oleiléter sufato de magnésio,

cocoanfodiacetato dissódico,

palmato de glicerila hidrogenado

etoxilado (200 OE), cocato de

glicerila etoxilado (30 OE) CI

14700, CI 14005, metilparabeno

sódico, DMDM hidrontoína,

cocoato, de glicerila etoxilado (7

OE), poliquatérni-10,

ricinoleamido, olamida,

sufoccinato dissódico edeato

dissódico, fragrância, hexileno

glicol, ácido tartárico

Xampu

Infantil

0437

B01

F3M1

Água, cocoamidopropil betaína,

PEG-80, laurat de sorbitano,

tridecil éter sulfato de sódio,

distearato de PEG-150, fragrância,

poliquatérnio 10,ácido cítrico,

EDTA tetrassódico, quatérnio 15,

corante amarelo DeC

n°10(cl47005) e corante laranja

DeC n° 4(cl 15510)

Xampu

Infantil

50703

F4M1

Lauril sulfato de sódio/lauriléter

sulfossuccinato dissódico,

cocoamidopropilabeaína,

laurilglicosídio, cocoamida DEA,

cocoato de glicerina PEG-7, edeato

dissódico, benzofenona-4,

fenoxietanol/metil etil propil e

butil parabenos, CL 16185,

tretolamina, cloreto de sódio,

extrato de calêndula, extrato de

aloe Vera, água deionizada.

[Continuação da Tabela 1]

N° Produto

Classifi-

cação

in vivo

Lote Fabricante

Marca/

Código

Final

Composição

Xampu

Infantil

MI 60403 F4

F4M2

Edetato dissódico, benzofenona-

4,2-bromo-2-2nitropropano-1, 3-

diol, metilparabeno,lauriléter

sulfato de sódio/lauril

sulfossuccinato dissódico,

cocoamidopropilbetaína, lauril

glicosídio,cocoamida DEA,

fragrância, propilparabeno,

cocoanato de glicerina PEG-7, Cl

16255, trietanolamina, cloreto de

sódio, água deionizada, pró milk

Xampu

infantil

SI 3/10B F5

F5M1

Água, lauril sulfato de sódio, lauret

sulfosuccnato dosódico,

cocoamidopropil betaína, DEA

cocamida, dioleato de PEG –120

Metilglucosa, perfume, cloruro de

sódio, EDTA tetrasódico,

trietanolamina, poloxámero

124,formaldeído.

Metilcloroisotiazolinona, amarillo

ácido 23 (CL 19140)

Cond.

Infantil

N I

10008

8032

F3M2

Cloreto de distearildimônio, álcool

estearílico, laurato deorbitano

PEG-80, hidroetilcelulose, álcool

benzílico, EDTA tetrassódico,

fragrância, ácido cítrico, corante

amarelo DeC n°10 ( cl 47005),

corante laranja DeC n°4

(cl015510) e água

Cond.

Infant.

NI 60502 F4

F4M3

Detato dissódico, cloreto de

estrealcônio,

propilenoglicol,metilparabeno,

propilparabeno,álcool

cetoestearílico, cetearet 20, éter

dicaprílico, trietanolamina, CI

19140 CI 16255, fragrância, água

deionizada, pró-milk

Cond.

Infantil

NI 60101 F4

F4M4

Metilparabeno,

propilparabeno,álcool

cetostearílico, cetearet-20,éter

dicaprílico, edeato dissódico,

cloreto estearalonio, trietolamina,

CI 74160,

ciclometicona/dimeticona,extrato

de aloe Vera, extrato de

calêndula,fragrância e água

deionizada

Cond.

Infant.

0602

F6M1

Álcool cetoestearílico, cloreto de

cetiltrimetilamônio,

cocoamidopropil betaína,

dimeticona,mistura de

isotiazolonas, extrato de calêndula,

ácido cítrico, fragrância, CI 42090,

água

[Continuação da Tabela 1]

N°

Produt

Classifi-

cação

in vivo

Lote Fabricante

Código

Final

Composição

Cond.

Infant.

10047

F1M2

EDTA tetrassódico, ácido

cítrico,anidro, álcool ceto

estearílico etoxilado, diazolidinil

uréia e iodopropinil

butilcarbamato, metosulfato de

betrimônio e álcool cetoestearílico,

MÊS-acetomida, extrato natural de

aveia, dimeticonol, essência e água

desmineralizada.

Xampu

Adulto

61442

59804

F7M1

Água, lauril éter sulfato de amônio,

lauril sulfato de amônio, cloreto de

sódio, cocamida MEA, perfume,

citrato de sódio, EDTA dissódico,

ácido cítrico, poliquatérnio-10,

pantenol, éter pantenil etílico,

xilenosulfonato de amônio,

metilcloroisotiazolina,

metilisotiazolina

Xampu

Adulto

50548

F8M1

Água, lauril éter sulfato de sódio,

cocoamidopropilbetaína,

aquilpoliglicosídeo, alcanolamida

do ácido graxo de coco,

poliquatérnio 55, EDTA

tetrassódico, quatérnio 70, mistura

de extratos hidrogicólicos de

acerola,maracujá, guaraná e uva

associados com lipoproteínas de

amêndoas, aminometilpropanol,

cloreto de sódio, mistura e

iotiazolonas, associação de

cocoisotionato de sódio com ácido

esteárico, álcool cetoestearílico,

carbômero, cloreto de guar

hidroxipropiltrimônio.

Xampu

Adutlto

MI 186/3 F9

F9M1

Água desmineralizada, lauril éter

sulfato de sódio,

cocoamidopropilbetaína, lauril éter

sulfossuccinato de sódio, base

perolizante, pragrancia, extrato de

jaborandi, goma Agar

quaternizada, proteína de trigo

hidrolizada, metilparabeno,

propilparabeno, edetato dissódico,

benzotriazol sulfonodo, ácido

lático, isotiazolinas e corante.

Xampu

Adulto

03392

0s2p

F10

F10M1

Água, lauril éter sulfato de sódio,

c-12-13 sulfato de sódio,

diestearato de glicol,

cocoamidopropil betaína, cloreto

de sódio, perfume, carbomer,

EDTA dissódico, goma

guarquaternizada,formaldeído,

dimeticonol, metoxicinamato de

octila, hidroxipropil polisiloxano

de proteína de trigo hidrolizada,

ácido cítrico/hidróxido de sódio

[Continuação da Tabela 1]

N° Produto

Classifi-

cação

in vivo

Lote Fabricante

Código

Final

Composição

Xampu

Adulto

0437

B01

F11

F11M1

Lauril sulfato de sódio,

cocoamidopropil betaína,

cocoamido DEA, glicol

distearato,cloreto guar

hidroxipropiltrimonium, hidroxietil

uréia, dissodium EDTA,

methylchloroisothiazoline/methilis

othiazoline, coffea arábica/ethyl

methoxycinnamate/ethylhexyl

triazone/isodecyl

neopentanoate/ciclodextrin., ácido

cítrico, cloreto de sódio

Xampu

Adulto

36040

F12

F12M1

Água, lauril sulfato de sódio,

EDTA tetrasódio, cocoamido

propil betaína,extratos de flores e

frutas (jasmim, girassol...),Lauril

DEA, metilparabeno,

propilparabeno, cloreto de sódio,

ácido

cítrico,metilclorothiazollione,metili

sothiazoline,Cl 15985.

Cond

Adulto

B582

927

F7M2

Água, álcool cetearílico, cloreto de

cetrimônio, álcool, perfume,

pantenol, formaldeído, dimeticona,

acetato de tocoferila, lactato de

cetila, ácido cítrico, álcool cetílico

Cond.

Adulto

bC10

F2M2

Água, álcool cetílico, PEG-180,

hidroxietilcelulose,

estearamidopropil dimetilamina,

tridecet-12,dicloridrato de

clorexidina, lanolina,

amodimeticona, 2-oleamido-1,3-

actadecanodiol, cloreto de

cetrimônio, ésteres cetílicos,

metilparabeno, ácido cítrico, amido

de batata modificado, copoliol,

laurimeticona, fragrância

Todos os tensoativos testados (N = 6) eram da marca Sigma



. Foram avaliados os

seguintes tensoativos: Lauril Sulfato de Sódio, Triton X, Tween 20, Cloreto de

Benzalcônio, Brometo de Cetildimetiletilamônio e Lauril Éter Sulfato de Sódio.

3.2 Ensaio in vitro

3.2.1 Linhagem Celular

Linhagens 3T3 obtidas da “American Type Tissue Collection” (ATCC) mantidas

no Setor de Cultura de Células (SCC) do Laboratório de Vacinas Virais do Departamento

de Imunologia (DI) do INCQS.

3.2.2 Soluções

PBS 0,01 M pH = 7,2 (solução de lavagem):

Solução A

NaHPO

.2H

O - 35,61 g

Água Deionizada q.s.p - 1000 ml

Solução B

NaH

O 27,6g

Água Deionizada q.s.p 1000 ml

Homogeneizar 36ml da solução A + 14ml da solução B, completando o volume de 100ml

com água deionizada. Ajustar para pH = 7,2 e levar até 1000 ml com água deionizada,

estocar a 4° C.

PBS 0,01 M/ 4% Formol (fixador):

Formaldeído 40 % 100ml

PBS 0,01 M q.s.p 1000ml

Estocar a 4° C

SDS 1% (Eluente):

Dodecilsulfato de Sódio 10g

Água Deionizada q.s.p 1000ml

Estocar a temperatura ambiente

Azul Brilhante de Comassie 0,2% (corante):

Azul Brilhante de Comassie R-250 0,2g

Ácido Acético Glacial 10ml

Metanol 40ml

Água Deionizada q.s.p. 100ml

Filtrar e estocar a temperatura ambiente e ao abrigo da luz

Solução de Tripsina 0,05% e EDTA 0,02%

Tripsina 1: 250 0,5g

EDTA 0,2g

NaCl 8,0g

KCl 0,4g

Dextrose 1,0g

NaHCO

0,58g

Água deionizada q.s.p. 1000ml

Esterilizar por filtração em membrana de 0,22µm e estocar a -20° C

Solução de Bicarbonato de Sódio 7,5%:

Bicarbonato de Sódio 7,5g

Água Deionizada q.s.p. 100ml

Esterilizar por filtração em membrana de 0,22µm e estocar a 4° C

Solução de Penicilina 10.000 UI e Estreptomicina 10 mg/ml

Penicilina G Potássica 1.000.000 UI

Sulfato de Estreptomicina 1g

Água deionizada q.s.p 100 ml

Esterilizar por filtração em membrana de 0,22 µm e estocar a – 20° C

Solução de Glutamina 3%:

L- Glutamina 3,0g

Água Deionizada q.s.p. 100ml

Esterilizar por filtração em membrana de 0,22µm e estocar a -20° C

Solução salina balanceada livre de cálcio e magnésio (BSS.CMF): (estoque)

Solução A

- 20 vezes concentrada

Meio de Cultura DMEM 1 X

Meio base - 134,7 g

O deionizada q.s.p 5 L

Este modo de preparo é específico para reagente Sigma, código D-7777.

Estocar a 4° C

Meio DMEM 1 X suplementado para manutenção da linhagem celular 3T3 em estufa

com atmosfera de 3,5 % de CO

Soro fetal bovino – SFB (Cultilab lote 1210) 10% - 100 ml

Solução de Glutamina 3 % - 15 ml

HEPES - 20Mm

NaCO

- 26mM

Completar o volume para 1000 ml q.s.p de meio DMEM 1X e estocar a 4° C

DMEM 1 X suplementado para diluição dos produtos testados no ensaio de

citotoxicidade

SFB (Cultilab lote 1210) - 50 ml

Solução de Bicarbonato de Sódio 7,5 % 30 ml

Solução de Glutamina 3% 15 ml

Completar o volume para 1000 ml q.s.p de meio DMEM 1 X

Estocar a 4 ° C.

3.2.3 Equipamentos:

• Balança Digital Metler Pe 3600

• Banho Maria Fanen Modelo 10210

• Câmara de Fluxo Laminar marca VECO

• Microscópio invertido Olimpus modelo IM

• Capela química de exaustão marca BNF

• Estufa de CO

para cultura celular marca REVCO

• Pipetador automático Pipet Aid Drummond modelo serial 72834

• Placa agitadora Analiton modelo 704

• Potenciômetro Analion modelo PM 608

• Sistema de criopreservação Cryometal modelo DS – 34

• Bomba a vácuo/pressão

• Sistema de purificação de água Milli –Q Millipore

• Autoclave da marca Lutz Ferrando

• Sistema de filtração a vácuo Nalgene volume de 500 ml

• Leitor de Elisa Elx 800 Bio-Tec (filtro de 595 nm)

• Lavador automático de microplacas Elx 50 Step Washer Bio – Tek

• Agitador de tubos Vortex

• Micropipetas para volumes de 5 - 40 µL, 50 - 200 µL, e 500 – 2500 µL

• Micropipeta Multicanal 40 – 200 µL

• Cronômetro

3.2.4. Descongelamento Celular

As células 3T3 foram retiradas do reservatório de nitrogênio a -196°C e

descongeladas rapidamente em banho-maria. Foram transferidas em câmara de fluxo

laminar para garrafa de cultura contendo aproximadamente 9 ml de meio DMEM

suplementado para manutenção e crescimento celular em estufa de CO

. O repique foi

realizado no momento em que era observada uma monocamada confluente.

3.2.5 Procedimento

A metodologia foi realizada com base no estudo proposto por Costa, 2006 e

Clothier, 1995 conforme demonstrado nas Figuras 7 e 8. As células 3T3 foram semeadas

em microplacas de 96 cavidades (excetuando-se as extremidades) em um volume de

100µL na concentração de 1,0 x10

em meio DMEM (10% SFB) suplementado para

manutenção e crescimento celular e mantidas por 24 horas em estufa a 36,5°C com 3,5%

de CO

. Posteriormente, o meio foi trocado por 100µL de diluições pré-estabelecidas das

amostras em meio DMEM (5% de SFB). Após 24 horas de incubação, todo o conteúdo de

meio existente nas microplacas foi descartado e as mesmas foram então lavadas com

solução tampão PBS 0,01M e lavadas em lavador automático de microplacas em quatro

ciclos de lavagem. Posteriormente, a solução tampão foi descartada e foi adicionado às

cavidades da microplaca (em cabine de segurança química) 100µL de solução fixadora

PBS 0,01M/formol 4%, procedendo-se a incubação das mesmas por 15 minutos. O fixador

foi descartado e as microplacas foram secas em temperatura ambiente. Depois de secas, foi

adicionado às cavidades da microplaca 50µL de solução corante CBB-R250 0,2% p/v,

incubando-se por 30 minutos ao abrigo da luz em temperatura ambiente.

O corante foi descartado após esse intervalo de tempo e as microplacas foram

submersas imediatamente em recipiente plástico contendo água destilada e logo após,

lavadas manualmente por três vezes, procedendo-se a troca do recipiente com água a cada

lavagem. As microplacas foram colocadas em agitador automático (ainda com água

destilada no interior de suas cavidades) por 20 minutos a 500rpm, seguido de uma última

lavagem manual com água destilada. As microplacas foram secas em temperatura

ambiente. Depois de secas, o corante foi eluído com a adição de 100µL de SDS 1% em

cada cavidade da microplaca. A substância eluente foi mantida overnight ao abrigo da luz

e a densidade óptica (D.O) foi medida em leitor de Elisa a 595 nm.

Uma curva inicial foi obtida com oito concentrações de cada produto diluído em

meio de cultura (100; 10; 1; 0,1; 0,01; 0,001; 0,0001, 0,00001 mg/ml). A partir daí, uma

segunda curva com uma faixa mais estreita de oito concentrações foi realizada a partir da

primeira curva. A concentração em que se obteve, nesta segunda curva, a redução de 50%

na absorbância quando comparado às células não-tratadas (controle) foi considerado a

concentração de efeito tóxico (i.e. a IC

ou concentração inibitória 50%). O valor de IC

para cada produto foi calculada pela média de três ensaios independentes.

Plaqueamento

D issociação do Cultivo Ce lular

Tratam ento da s célula s com

am ostras diluídas

Fixação

PBS/Formol 4% 15 min.

Incubação por 24 horas a

36,5°C 3,5% CO2

Diluição das amostras

Incubação por 24 horas a

36,5°C 3,5% CO2

Coloração

CBB-R250 0,2%

30 min

Eluição

SDS 1%

(overnight)

Leitura da D.O

595 nm

Lavagem automática

Lavagem Manual

Figura 7: Esquema resumido do procedimento do ensaio in vitro.

Vazio

Diluições da amostra

Controle

Branco

Amostra [-]Amostra[+]

Figura 8: Esquema da aplicação das amostras diluídas na placa de96 poços

3.3 Ensaio in vivo

Conforme mencionado anteriormente, foram utilizados dados provenientes do

banco de dados do DFT/INCQS. O ensaio in vivo foi realizado segundo o POP n°

65.333.004 do INCQS/FIOCRUZ, cujo objetivo é a detecção e avaliação do potencial de

irritabilidade para o homem de qualquer substância ou produto acabado que possa vir a

entrar em contato com os olhos (Anexo 1).

3.4 Análise Estatística

Para estabelecer a precisão inter-ensaio foi realizado o cálculo do coeficiente de

variação (CV%) segundo Bland & Altaman (BLAND & ALTMAN, 2008). Através dos

resultados obtidos nos três ensaios independentes realizados em cada uma das 25 amostras

de produtos acabados/tensoativos. O CV% foi calculado dividindo-se o desvio padrão (DP)

de cada amostra por sua respectiva média aritmética e multiplicando-se por 100.

Para o cálculo do coeficiente de variação global (CV% overall), procedemos

segundo Bland (BLAND, 2006). Primeiramente, dividimos a média das variâncias

encontradas entre os três ensaios independentes de cada amostra pelo quadrado da média

das ICs

50.

CV = DP

* 100

Média arit. IC

=Média das Variância

(Média das IC

)

Posteriormente calculamos a média dos valores de CV

. A partir deste valor calculamos a

raiz quadrada e multiplicamos por 100.

A distribuição normal dos dados, tanto dos valores das ICs

do teste in vitro quanto

das MEM do teste in vivo, foi aferida pelo teste Kolmogorov-Smirnov (K-S), através do

programa estatístico SPSS

12.0

Uma vez demonstrada a distribuição normal dos dados in vivo e in vitro, a

correlação existente entre os resultados foi calculada, através do coeficiente de correlação

de Pearson, utilizando para este fim, o software MINITAB 10.5 (MINITAB Statistical

Software

, Minitab Inc. PA, USA, 1995)

CV% global = √

√√

√Média CV

* 100

Para calcular o grau de preditibilidade do ensaio in vitro foi montada uma tabela de

contingência, calculando-se a sensibilidade, especificidade e precisão dos testes in vitro

com relação ao teste in vivo:

NI: Não irritante I: Irritante

Onde:

1) Sensibilidade é a capacidade de uma metodologia in vitro detectar os produtos

positivos (irritante) = d/c+d

2) Especificidade é a capacidade de uma metodologia in vitro detectar produtos

negativos (Não irritantes) = a/a+b

3) Precisão é a capacidade de uma metodologia in vitro fornecer os mesmos

resultados que o teste in vivo = a+d/a+b+c+d

In vitro

NI I

a b

In vivo

c d

IV RESULTADOS

_______________________________________________________

4.1 Resultados in vivo

Todos os produtos foram testados quanto ao seu potencial de irritação utilizando

modelos in vivo e in vitro. A Tabela 2 demonstra a distribuição dos produtos acabados tanto

pela sua classificação de uso (infantil ou adulto; condicionador ou xampu) quanto pela

classificação do seu potencial irritante ocular segundo o teste de Draize (in vivo).

4.1.1 Produtos infantis

Foram avaliados 11 produtos de uso infantil (Tabela 2), sendo que destes 05 (46%)

foram considerados como não irritantes no teste in vivo, 02 como irritantes leves (18%), 03

como irritantes moderados (27%) e 01 como irritante severo (9%).

Dentre os 11 produtos infantis avaliados, 06 eram xampus e 05 eram

condicionadores. Os condicionadores apresentam menor potencial irritante; dentre os 05

condicionadores infantis analisados, 04 foram não irritantes e 01 classificado como irritante

leve. Já a análise dos dados relacionados aos xampus infantis mostra somente 01 produto

não irritante e 01 irritante leve. Cabe destacar a observação de 04 xampus, que apesar da

designação como infantil, foram classificados como irritantes moderados (N=3) e severo

(N=1).

4.1.2 Produtos da linha adulta

Com relação à linha adulta, foi avaliado um total de 08 produtos, sendo 02

condicionadores e 06 xampus. Chama atenção o fato de que destes produtos, somente 01

(13%) recebeu classificação não irritante; 01 foi classificado como irritante leve (13%), 04

(50%) como irritantes moderados e 02 (24%) como irritantes severos.

Os 02 condicionadores foram classificados como não irritante (N = 1) e irritante

leve (N = 1), sugerindo assim, que a exemplo dos produtos infantis, também para linha

adulta observa-se um menor potencial irritante ocular por parte dos condicionadores. Cabe

ainda ressaltar, que todos os xampus adultos foram irritantes ao olho do coelho: 04

moderados e 02 severos. Nenhum dos produtos estudados recebeu a classificação de

irritante máximo.

Tabela 2: Classificação in vivo dos produtos acabados.

in vivo

NI IL IM IS IMax

Infantil 5 (46%) 2 (18%) 3 (27%) 1 (9%) 0

Xampus 1 1 3 1 0

Condicionadores

4 1 0 0 0

Adulto 1 (13%) 1 (13%) 4 (50%) 2 (24%) 0

Xampus 0 0 4 2 0

Condicionadores

1 1 0 0 0

Total 6 (32%) 3 (16%) 7 (36%) 3 (16%) 0

NI: Não Irritante; IL: Irritante leve; IM: Irritante Moderado; IS: Irritante Severo; IMax: Irritante Máximo.

Fonte: dados gentilmente cedidos pelo DFT/INCQS.

4.1.3 Tensoativos

A maioria dos tensoativos foi avaliada in vivo em diferentes concentrações (banco

de dados DFT/INCQS). A relação dose-resposta e o potencial irritante ocular de cada

tensoativo estudado estão demonstrados na Tabela 3.

Tabela 3: Relação dose-resposta entre as Médias dos Escores Máximos (MEM)

obtidos in vivo e a concentração de tensoativos aplicados nos olhos dos animais.

Concentração aplicada nos olhos dos coelhos (%)

100 30 16 10 8 4 1 0,5

Tween 20

(não-iônico)

2,0

(NI)

- - - - - - -

Lauril Éter a 27%

(aniônico)

- 26,8

(IM)

- 3,2

(IL)

- - - -

Lauril Sulfato de

Sódio (aniônico)

- 56,0

(IS)

38,8

(IS)

15,6

(IM)

15,6

(IM)

5,6

(IL)

- -

Triton X

(não-iônico)

- 59,8

(IMax)

- - - - 2,8

(IL)

1,6

(NI)

Cloreto de

Benzalcônio

(catiônico)

- - - - - - 46,4

(IS)

6,0

(IM)

Brometo de cetil-

dimetiletilamônio

(catiônico)

- - - - - - - 8,4

(IM)

Valores: Escores obtidos no ensaio de irritação ocular de Draize (MEM).

(): Classificação final obtida no ensaio de irritação ocular de Draize.

Fonte: Dados gentilmente cedidos pelo DFT/INCQS.

Os dados compilados na Tabela 3 demonstram que todos os tensoativos

apresentaram potencial irritante ocular, com exceção do tween 20, um tensoativo não-

iônico, que mesmo quando testado puro, foi classificado como não irritante.

Os tensoativos aniônicos, i.e. lauril éter a 27% e lauril sulfato de sódio,

apresentaram potencial irritante moderado (MEM = 26,8) e severo (MEM = 56,0),

respectivamente, na maior concentração testada (30%). Assim, pode-se dizer que o lauril

sulfato de sódio foi discretamente mais irritante para os olhos dos coelhos que o lauril éter a

27% (Tabelas 3 e 4).

O triton X induziu lesões graves nos olhos dos animais aqui avaliados. Este

tensoativo recebeu classificação compatível com “irritante máximo”, quando aplicado nos

olhos dos coelhos na concentração de 30%, demonstrando assim, que apesar de pertencer à

classe de tensoativos não-iônicos (que via de regra é considerada uma classe que

compreende ingredientes com baixo potencial irritante), é mais irritante para os olhos que

os tensoativos aniônicos lauril éter a 27% e lauril sulfato de sódio (Tabelas 3 e 4).

Os tensoativos que demonstraram os maiores potenciais irritantes neste estudo

foram os catiônicos cloreto de benzalcônio e brometo de cetildimetiletilamônio. Estes

ingredientes, mesmo quando avaliados em concentrações muito baixas (e.g. 0,5%),

induziram lesões oculares compatíveis com a classificação de “irritante moderado” (Tabela

3).

A Tabela 4 busca categorizar os tensoativos estudados de acordo com seu potencial

irritante ocular, usando como base a análise da relação dose resposta obtida in vivo.

Tabela 4: Categorização do potencial irritante ocular dos tensoativos avaliados.

Tensoativo Natureza

tensoativo

Resultado

in vivo

[conc. teste]

classificação

Potencial

irritante

in vivo

Tween 20

Não-ionico

[100%]

Lauril Éter 27%

Aniônico

[30%],[10%]

IM IL

Lauril Sulfato de Sódio

Aniônico [30%],[16%],[10%],[8%],[4%]

IS IS IM IM IL

Triton X

Não-iônico

[30%], [1%],[0,5%]

IMáx, IL NI

+++

Cloreto de Benzalcônio

Catiônico

[1%],[0,5%]

IS IM

++++

Brometo de

Cetildimetiletilamônio

Catiônico

[0,5%]

++++

Assim, se considerarmos a classificação do teste de Draize em função da relação

dose-resposta observada nos animais estudados, podemos ordenar os tensoativos de acordo

com o seu potencial irritante ocular in vivo; onde [tween 20] < [lauril éter a 27%] < [lauril

sulfato de sódio] = [triton x] < [cloreto de benzalcônio = brometo de cetildimetilamônio],

conforme demonstra a Tabela 4.

4.2 Resultados in vitro

As médias das ICs

de cada um dos 19 produtos acabados e dos 06 tensoativos

foram obtidas a partir de três ensaios in vitro realizados independentemente e que são

demonstradas na Tabela 5.

O pH dos produtos acabados variou entre 3,76 e 7,25 (tabela5).

A Tabela 5 mostra ainda os valores das regressões lineares das curvas obtidas em

cada um dos três ensaios independentes realizados para cada um dos 25

produtos/tensoativos. Os valores das regressões lineares variaram entre 0,746 e 1,000.

O valores médios de IC

aqui obtidos variaram entre 0,004 e 3,771mg/mL. O maior

valor (representa teoricamente um produto com baixo potencial irritante) foi atribuído ao

produto F3M2, um condicionador classificado in vivo como não irritante, enquanto que os

menores valores de IC

observados foram atribuídos a tensoativos com forte potencial

irritante (Tabela 5).

Tabela 5: ICs

média dos produtos/tensoativos avaliados.

Produtos in vivo pH

IC 50

∗

Regressão linear

∗

Média

(1°) (2°) (3°) R

(1°) R

(2°) R

(3°) (mg/mL)

6,31 3,002 1,102 3,321

0,962 0,864 0,943

2,475

F2M1

6,8 1,103 0,713 0,836

0,933 0,895 0,993

0,884

F3M1

7,25 1,371 1,096 1,368

0,891 0,935 0,860

1,278

F4M1

6,55 1,127 0,715 0,840

0,975 0,986 0,961

0,894

F4 F1M2

7,01 0,539 0,389 0,263

0,974 0,972 0,939

0,397

F5M1

6,71 0,513 0,836 0,643

0,934 0,921 0,882

0,664

F3M2

4,23 2,725 2,752 5,837

0,908 0,938 0,919

3,771

F4M3

4,26 0,628 0,728 0,459

0,857 0,958 0,967

0,605

F4M4

3,76 0,379 0,306 0,300

0,991 0,968 0,901

0,328

F6M1

3,82 0,575 0,562 0,466

0,994 0,986 0,841

0,534

F1M2

3,98 0,664 0,666 0,643

0,852 0,882 0,911

0,657

F7M1

5,6 0,633 0,310 0,330

0,997 0,968 0,760

0,424

F8M1

5,81 0,888 0,729 0,917

0,961 0,912 0,971

0,844

F9M1

4,84 0,164 0,225 0,095

0,929 0,811 0,746

0,161

F10M1

6,17 0,453 1,051 0,555

0,935 0,993 0,978

0,686

F11M1

5 0,692 0,673 0,624

0,869 0,979 0,905

0,663

F12M1

6,92 1,012 0,478 1,403

0,921 0,952 0,960

0,964

F7M2

4,09 0,863 0,507 0,853

0,952 0,843 0,934

0,741

F2M2

4,67 2,432 1,829 3,369

0,916 0,994 0,970

2,543

Lauril Sulf. de Sódio ++

0,0597 0,0637 0,0615

1,000 0,961 0,989

0,062

Triton X +++

0,0024 0,0078 0,0063

0,999 0,931 0,916

0,005

Tween 20 -

0,3990 0,4072 0,3740

0,999 0,985 0,825

0,393

Cloreto de Benzalcônio

++++

0,0072 0,0097 0,0040

0,897 0,975 0,961

0,007

Br. de Cetilmetiletilam

++++

0,0041 0,0045 0,0030

0,929 0,995 0,986

0,004

Lauril Éter +

0,2763 0,2650 0,2900

0,903 0,896 0,900

0,277

∗Valores de ICs50 e Regressão linear (R

) obtidos em cada um dos três

ensaios independentes (1

), (2

) e (3

Na Tabela 6 podemos observar os valores médios de IC

obtidos somente para os

tensoativos aqui estudados. Os menores valores de IC

deste estudo foram observados para

os dois tensoativos catiônicos avaliados, i.e. o cloreto de benzalcônio (IC

= 0,007mg/mL)

e o brometo de cetildimetiletilamônio (IC

= 0,004mg/mL) e para o triton X (IC

0,005mg/mL). As ICs

médias destes tensoativos foram cerca de 10 vezes menores que

aquela observada para o lauril sulfato de sódio (IC

= 0,062 mg/mL) e aproximadamente

50 vezes menores que a IC

obtida para o lauril éter a 27% (IC

= 0,277mg/mL). O maior

valor de IC

obtido entre os tensoativos, foi observado para o tween 20 (IC

= 0,393

mg/mL), o único tensoativo classificado como não irritante in vivo neste estudo.

Em uma análise semelhante àquela realizada para o teste de Draize, podemos

ordenar os tensoativos de acordo com o seu potencial irritante in vitro; onde [tween 20] <

[lauril éter a 27%] < [lauril sulfato de sódio] < [triton x = cloreto de benzalcônio = brometo

de cetildimetiletilamônio]. Assim, podemos afirmar com base nos dados compilados na

Tabela 6, que os resultados obtidos in vitro são compatíveis com o potencial irritante dos

tensoativos estabelecidos in vivo.

Tabela 6: Comparação dos resultados in vivo e in vitro obtidos com tensoativos.

Tensoativo Natureza do

tensoativo

Potencial

irritante

in vivo

Resultado

in vitro

Média IC

(mg/mL)

Potencial

irritante

in vitro

Tween 20

Não-ionico

0,393 +

Lauril Éter 27%

Aniônico

0,277 +

Lauril Sulfato de Sódio

Aniônico

0,062

Triton x

Não-iônico

+++

0,005

+++

Cloreto de Benzalcônio

Catiônico

++++

0,007

+++

Brometo de

Cetildimetiletilamônio

Catiônico

++++

0,004

+++

4.2.1 Precisão inter-ensaio

Para estabelecer a precisão inter-ensaio

do método proposto, calculamos o

coeficiente de variação, conforme protocolo preconizado pela OMS para validação de

ensaios biológicos (WHO/VSQ/97.02). Os coeficientes de variação (CV%) de cada uma

das amostras ensaiadas neste estudo foram calculados de acordo com metodologia descrita

no capítulo 3.6 de “Materiais e Métodos” e estão demonstrados na Tabela 7.

Precisão inter-ensaio

(também conhecida como precisão intermediária): é medida através do coeficiente de

variação, obtido pela análise de múltiplas determinações de uma (ou várias) amostra(s), ensaiada(s) em série

de experimentos independentes, conduzidos por um mesmo laboratório.

Tabela 7: Precisão inter-ensaio do teste in vitro.

Produtos

in vivo

(1°)

IC50

(2°)

(3°)

Média

aritmética

CV%

F1M1

3,002 1,102 3,321 2,475 1,200 48,47

F2M1

1,103 0,713 0,836 0,884 0,199 22,55

F3M1

1,371 1,096 1,368 1,278 0,158 12,36

F4M1

1,127 0,715 0,840 0,894 0,211 23,63

F4M2

0,539 0,389 0,263 0,397 0,138 34,80

F5M1

0,513 0,836 0,643 0,664 0,163 24,48

F3M2

2,725 2,752 5,837 3,771 1,789 47,44

F4M3

0,628 0,728 0,459 0,605 0,136 22,47

F4M4

0,379 0,306 0,300 0,328 0,044 13,40

F6M1

0,575 0,562 0,466 0,534 0,060 11,15

F1M2

0,664 0,666 0,643 0,657 0,013 1,94

F7M1

0,633 0,310 0,330 0,424 0,181 42,69

F8M1

0,888 0,729 0,917 0,844 0,101 11,98

F9M1

0,164 0,225 0,095 0,161 0,065 40,40

F10M1

0,453 1,051 0,555 0,686 0,320 46,63

F11M1

0,692 0,673 0,624 0,663 0,035 5,29

F12M1

1,012 1,403 0,478 0,964 0,276 28,68

F7M2

0,863 0,507 0,853 0,741 0,203 27,36

F2M2

2,432 1,829 3,369 2,543 0,776 30,52

Lauril Sulfato de Sódio

0,0597 0,0637 0,0615 0,062 0,002 3,23

Triton X

+++

0,0024 0,0078 0,0063 0,005 0,003 46,45

Tween 20

0,3990 0,4072 0,3740 0,393 0,017 4,40

Clor. de Benzalcônio

++++

0,0072 0,0097 0,0040 0,007 0,003 40,81

Br. de Cetiletildimetilamônio

++++

0,0041 0,0045 0,0030 0,004 0,001 19,42

Lauril Éter 27%

0,2763 0,2650 0,2900 0,277 0,013 4,52

CV% Global

30,00

Dentre os 25 produtos acabados/tensoativos ensaiados, nenhum apresentou

coeficiente de variação maior que 50%. O coeficiente de variação global do estudo foi

estabelecido como sendo de 30,00 (Tabela 7).

Os produtos acabados apresentaram os coeficientes de variação com valores

compreendidos entre 1,94% (F1M2) e 48,47% (F1M1). Esta grande variação entre os

produtos, no que tange os valores de CV%, também foi observada para os tensoativos.

Observamos entre os tensoativos avaliados, amostras com valores de CV% bastante

satisfatórios, como e.g o lauril sulfato de sódio (CV%: 3,23%), o tween 20 (CV%: 4,40) e o

lauril éter (CV%: 4,52) e outros com valores acima de 20%, como nos casos do triton x

(CV%:46,45) e o cloreto de benzalcônio (CV%: 40,81%).

4.3 Comparação entre os ensaios in vivo e in vitro

Os resultados do presente estudo foram comparados (in vivo versus in vitro) através

da análise do coeficiente de correlação de Pearson existente entre os escores (MEM)

obtidos no teste de Draize e os valores médios de IC

obtidos in vitro. Além disso, com o

intuito de avaliar o grau de preditibilidade do ensaio in vitro em relação ao teste de Draize,

estabelecemos um ponto de corte (cut-off) para diferenciação de substâncias irritantes

daquelas não-irritantes (no teste in vitro) e calculamos parâmetros como precisão,

sensibilidade, especificidade.

4.3.1 Coeficiente de correlação de Pearson

Para avaliar a correlação entre os valores de MEM (média dos escores máximos)

obtidos no ensaio in vivo e os valores médios de IC

obtidos no presente estudo realizamos

o cálculo do coeficiente de correlação de Pearson. Tal análise estatística se aplica à

investigação da correlação existente entre médias de grupos que apresentam valores

paramétricos (CANN, 2003; OSBORNE, 2005; MALONEY, 2003; FILHO et al., 2005),

i.e. obedecem a uma distribuição normal, como é o caso dos resultados in vitro e in vivo

encontrados pelo presente estudo.

As distribuições normais dos dados (KS teste >0,05) estão demonstradas para os

valores de MEM global na Figura 9, para os valores médios de IC

do teste in vitro na

Figura 10, assim como para os valores de MEM de córnea (Figura 11), para os valores de

MEM de íris (Figura 12) e para os valores de MEM de conjuntiva (Figura 13).

Figura 9: Distribuição normal dos valores de MEM Global (in vivo).

Figura 10: Distribuição normal dos valores de média aritmética da IC

Figura 11: Distribuição normal dos valores de MEM de

córnea.

Figura 12: Distribuição normal dos valores de MEM de íris.

Figura 13: Distribuição normal dos valores de MEM de conjuntiva.

Para a análise dos coeficientes de correlação de Pearson (Tabelas 8 e 9),

confrontamos os valores de MEM com os valores de IC

de todos os produtos testados

neste estudo (produtos acabados/tensoativos, N=25); somente dos produtos acabados

(N=19) e posteriormente, somente dos tensoativos (N=6). Tais cálculos foram realizados

com a intenção de se observar a correlação existente entre a citotoxicidade e o grau de lesão

induzido no olho por cada categoria de amostra ensaiada.

Em uma segunda etapa, confrontamos os valores de MEM específicos para cada

estrutura ocular separadamente (córnea, íris e conjuntiva) com os valores das médias

aritméticas das ICs

de todos os produtos acabados/tensoativos (N=25), somente dos

produtos acabados (N=19) e posteriormente, somente dos tensoativos (N=6), para que

pudéssemos relacionar o potencial citotóxico das amostras testados com as lesões ocorridas

em cada uma das estruturas oculares (Tabela 9).

No caso dos tensoativos, para efeito de cálculo do coeficiente de correlação de

Pearson entre os resultados in vitro e in vivo (onde diferentes doses foram testadas no teste

de Draize) utilizamos como critério o uso dos valores de MEM obtidos com a maior dose

de tensoativo avaliada in vivo, como mostra a Tabela 8.

Tabela 8: Valores utilizados para o cálculo dos coeficientes de correlação de Pearson:

médias aritiméticas das ICs

, valor global de MEM (olho como um todo) e das estruturas

oculares (MEM de córnea, íris e conjuntiva).

Produtos

vivo

MEM

Global

Média

Aritimética

(mg/ml)

MEM

Córnea

MEM

íris

MEM

conjuntiva

F1M1

1,6 2,475 0,0 1,0 1,6

F2M1

25,4 0,884 16,0 1,0 8,4

F3M1

4,8 1,278 0,0 0,0 4,8

F4M1

36,8 0,894 20,0 4,0 12,8

F4M2

28,6 0,397 16,0 1,0 11,6

F5M1

41,0 0,664 28,0 3,0 10,8

F3M2

0,8 3,771 0,0 0,0 0,8

F4M3

1,2 0,605 0,0 0,0 1,2

F4M4

0,8 0,328 0,0 0,0 0,8

F6M1

3,6 0,534 0,0 0,0 3,6

F1M2

0,4 0,657 0,0 0,0 0,4

F7M1

52,2 0,424 36,0 5,0 13,2

F8M1

29,4 0,844 16,0 5,0 8,8

F9M1

13,0 0,161 6,0 1,0 6,4

F10M1

52,2 0,686 36,0 3,0 12,8

F11M1

32,0 0,663 18,0 4,0 11,6

F12M1

23,4 0,964 10,0 3,0 10,4

F7M2

3,4 0,741 0,0 1,0 2,4

F2M2

2,4 2,543 0,0 0,0 2,4

Lauril Sulf. de Sód. (30%)

56,0 0,062 23,20 3,2 12,4

Triton X (30%)

Imáx

59,8 0,005 40,0 5,0 11,2

Tween 20 (100%)

2,0 0,393 0,0 0,0 2,0

Clor. Benzalcônio (1%)

46,4 0,007 30,4 4,0 13,2

Brom. cetildimetil. (0,5%)

8,4 0,004 0,8 0,0 7,6

Lauril Éter a 27% (30%)

26,8 0,277 18 2,0 7,6

Os coeficientes de correlação de Pearson entre os valores médios de IC

do teste in

vitro e os escores das três estruturas oculares (córnea, íris e conjuntiva) e escore global do

teste de Draize encontram-se descritos na Tabela 9.

Tabela 9: Coeficientes de correlação de Pearson relacionando os valores

de IC

com os escores das estruturas oculares dos ensaios in vivo.

(grau de confiança: 99%).

N=25 (todos os produtos) Correlação de Pearson

Córnea -0,397 ( p= 0,050)

Íris -0,313 ( p= 0,128)

Conjuntiva -0,455 ( p=0,035)

Escore total (MEM) -0,420 (p=0,022)

N=19 (produtos acabados)

Córnea -0,359 (p=0,131)

Íris -0,289 (p=0,230)

Conjuntiva -0,413 (p=0,079)

Escore total (MEM) -0,381 (p=0,108)

N= 6 (tensoativos)

Córnea -0,531 ( p=0,278 )

Íris -0, 550 (p=0,258)

Conjuntiva -0,824 (p =0,044)

Escore total (MEM) -0,611 (p=0,197)

Quando consideramos todos os produtos acabados/tensoativos avaliados (N=25),

obtivemos um valor de coeficiente de correlação de Pearson de -0,420 (p=0,022). Este

coeficiente, juntamente com os coeficientes de correlação estabelecidos a partir da

comparação de escores da conjuntiva vs. IC

(-0,455, p=0,035) e da córnea vs. IC

0,397, p = 0,050) foram estatisticamente significativos (Tabela 9).

Quando consideramos somente produtos acabados (N=19, Tabela 9), observamos

coeficientes de correlação de menor calibre, e sem significância estatística, tanto para o

escore total como para as estruturas oculares analisadas individualmente.

Já a análise dos resultados obtidos com tensoativos mostra valores de coeficiente de

correlação de maior calibre que aqueles obtidos para produtos acabados, porém devido ao

pequeno número de tensoativos analisados (N=6), não se obteve significância estatística

(Tabela 9). Uma exceção foi observada para o coeficiente de correlação estabelecido entre

os escores da conjuntiva vs. IC

. Este foi o coeficiente de maior calibre observado neste

estudo (-0,824, p=0,044).

É importante destacar que em todos os casos avaliados (produtos acabados +

tensoativos, somente produtos acabados e somente tensoativos), os achados observados na

conjuntiva, dentre as estruturas oculares analisadas, foram os que melhor se

correlacionaram com o efeito citotóxico in vivo.

4.3.2 Grau de preditibilidade do ensaio in vitro

A classificação dos produtos de acordo com a graduação das lesões obtidas nos

testes in vivo, juntamente com as médias de IC

dos experimentos in vitro, encontra-se na

Tabela 10.

Para avaliar o grau de preditibilidade do teste in vitro em relação ao teste de Draize,

estabelecemos um ponto de corte (cut-off) para diferenciação de substâncias irritantes

daquelas não-irritantes no teste in vitro. Consideramos o valor de IC

= 1,00mg/mL como

um possível ponto de corte para a diferenciação de produtos acabados irritantes

(IC

<1,00mg/mL) de não-irritantes (IC

>1,00mg/mL). Calculamos, assim, parâmetros

como precisão, sensibilidade, especificidade conforme descrito no capítulo 3.6 de

“Materiais e Métodos” e de acordo com a Tabela 11.

Tabela 10: Comparação entre as classificações obtidas no ensaio in vivo e o valor

médio de IC

in vitro.

Classificação

Produtos in vivo

(MEM)

in vitro

(IC

mg/mL)

Final

(in vivo)

Final

♣

(in vitro)

F1M1

F3M2

F4M3

F4M4

F1M2

F2M2

Tween 20

1,6

0,8

1,2

0,8

0,4

2,4

2,0

2,475

3,771

0,605

0,328

0,658

2,543

0,393

F3M1

F6M1

F7M2

4,8

3,6

3,4

1,278

0,534

0,741

F12M1

F2M1

F4M1

F4M2

F7M1

F8M1

F9M1

Brom. Cetildim. (0,5%)

Lauril Éter (30%)

23,4

25,4

36,8

28,6

52,2

29,4

13,0

8,4

26,8

0,964

0,884

0,894

0,397

0,424

0,844

0,161

0,004

0,277

F5M1

F10M1

F11M1

Clor. Benzalcôn. (1%)

41,0

52,2

32,0

46,4

0,664

0,686

0,663

0,007

Lauril Sulf. Sód. (30%) 56,0 0,062 SI I

Triton X (30%)

59,8

0,005

IMáx

♣: Ponto de corte: IC

=1,0mg/mL

Usando o valor de 1,000mg/ml como ponto de corte, obtivemos 5 resultados discordantes

entre os testes in vivo e in vitro, sendo4 falsos positivos (F4M3, F4M4, F1M2 e tensoativo

tween 20) e 1 resultado falso negativo (F3M1).

Tabela 11: Tabela de Contingência.

Assim, a precisão do ensaio foi de 80%, a sensibilidade foi de 94% e a

especificidade foi de 43%.

in vitro

NI I

NI A = 3 B = 4

in vivo

I C = 1 D= 17

V. DISCUSSÃO

______________________________________________

5.1 Toxicologia de produtos cosméticos

Segundo dados da ABIHPEC (Associação Brasileira da Indústria de Higiene

Pessoal, Perfumaria e Cosméticos), um dos setores da indústria brasileira que apresentou

maior crescimento nos últimos anos foi o da indústria de produtos cosméticos, com um

crescimento médio deflacionado composto de 10,9% na ultima década, contra 2,8% da

indústria em geral (ABIHPEC, 2008).

Uma variedade de fatores tem contribuído para o enorme crescimento deste

segmento da indústria nos últimos anos. Entre eles destacam-se a participação crescente da

mulher brasileira no mercado de trabalho, a utilização de tecnologia de ponta e o

conseqüente aumento da produtividade (favorecendo assim os preços praticados pelo setor,

que têm aumentos menores do que os índices de preços da economia em geral), os

lançamentos constantes de novos produtos atendendo cada vez mais às necessidades do

mercado e, por fim, o aumento da expectativa de vida, o que traz a necessidade de

conservar uma impressão de juventude.

O aumento de vendas de produtos cosméticos e de higiene pessoal deve ser

atentamente acompanhado pelos setores regulatórios competentes, uma vez que o

entusiasmo no crescimento de vendas pode induzir o surgimento de novas empresas, que

devem, todavia, atender a um criterioso grau de exigência quanto à comprovação da

segurança de seus produtos. Ao contrário da situação de exposição humana a fármacos,

onde em dadas circunstâncias pode-se ponderar sobre a relação risco-benefício, no caso

particular de produtos cosméticos, não se pode admitir o surgimento de quaisquer efeitos

danosos em conseqüência deste tipo de exposição.

No Brasil, dados levantados pelo Sistema Nacional de Informações Tóxico-

Farmacológicas (SINITOX) apontam para uma baixa incidência de intoxicações

decorrentes da exposição a produtos cosméticos, i.e. 808 casos, ou 0,96% do total de casos

de intoxicação humana notificados nos Centros de Informação e Assistência Toxicológica

no âmbito nacional, durante o ano de 2005, conforme mostra a Tabela 12 (SINITOX,

2005). Não há neste site dados disponíveis sobre a natureza dos produtos cosméticos que

levaram aos registros junto aos Centros de Informação e Assistência Toxicológica e nem

sobre a severidade dos sintomas apresentados, embora nenhum óbito tenha sido associado

ao uso de cosméticos durante o período estudado. Ainda segundo o SINITOX, as regiões

em que mais observa-se casos de agravos à saúde em decorrência ao uso de produtos

cosméticos são as regiões sul, com 330 casos e a região sudeste, com 315 em 2005. Na

região sul, por exemplo, a incidência de reações adversas induzidas por cosméticos foi

superior ao número de casos de intoxicação alimentar (42 casos notificados em 2005).

Tabela 12: Casos registrados de intoxicação humana por agente tóxico (Brasil,

2005).

Total

n° %

Agente

Medicamentos 21926 25,96

Agrotóxicos agrícolas 5577 6,60

Agrotóxicos domésticos 2590 3,07

Produtos veterinários 877 1,04

Raticidas 3213 3,80

Domissanitários 6506 7,70

Cosméticos 808 0,96

Produtos químicos industriais 4631 5,48

Metais 720 0,85

Drogas de abuso 2942 3,48

Plantas 1765 2,09

Alimentos 833 0,99

Animais peçonhentos/Serpentes 4944 5,85

Animais peçonhentos/ Aranhas 4661 5,52

Animais peçonhentos/Escorpiões 8208 9,72

Outros animais peçonhentos 5834 6,,91

Animais não peçonhentos 5146 6,09

Desconhecido 2005 2,37

Outros 1270 1,50

Total 84456 100

Fonte: http://www.fiocruz.br/sinitox

O baixo grau de severidade de efeitos adversos induzidos por determinados

produtos, assim como a percepção do risco por parte do consumidor, podem ser

importantes aspectos no que diz respeito a possíveis sub-notificações de casos de

intoxicações por cosméticos em nosso país, sobretudo se levarmos em consideração dados

do mercado norte-americano (CORBETT et al., 1999). Segundo estes autores, os casos de

intoxicações humanas em decorrência da exposição a cosméticos e produtos de higiene

pessoal representaram a terceira principal causa de registros (8,5%, ou cerca de 170 mil

casos) aos centros de controle de intoxicação nos EUA no ano de 1995, sendo menos

freqüente somente do que os casos de intoxicações por produtos domissanitários e

medicamentos (analgésicos). Estes mesmos autores relatam que os efeitos adversos

observados nos casos registrados com cosméticos são de baixa gravidade e que em menos

de 10% dos casos foi necessário tratamento em unidades hospitalares.

Outro dado interessante sobre a incidência de reações adversas induzidas por

produtos cosméticos pode ser observado através de registros dos casos de reclamações

feitas ao FDA por consumidores norte-americanos. Tais registros são feitos por classes de

produtos comercializadas neste país. O Quadro 5 mostra dados do FDA sobre a incidência

de reações adversas (e.g. irritações de pele e mucosas, dermatites, dor/desconforto, efeitos

sobre o sistema respiratório etc) induzidas por produtos cosméticos entre os anos de 1987 a

1995 nos EUA, relacionando-os com a natureza dos produtos. Cremes para cuidados da

pele e tinturas de cabelo foram os produtos que levaram ao maior número de reações

adversas. Xampus foram responsáveis pela indução de cerca de 80 tipos distintos de

reações e aparecem como a terceira maior causa de reclamações, juntamente com produto

para as unhas.

Quadro 5: Registro do FDA: reclamações de consumidores quanto a reações adversas

provocadas por produtos cosméticos nos EUA, entre 1987 e 1995.

Número de reações adversas observadas Natureza do produto

262 Produtos para o cuidado da pele (cremes de

uso diário e noturno, cremes anti-rugas,

cremes para clareamento da pele, hidratantes,

soluções para limpeza da pele etc).

111 Tinturas de cabelo.

70-89 Xampus e produtos para unhas.

50-69 Fixadores para cabelos cacheados, produtos

para os olhos, condicionadores de cabelo.

30-49 Bronzeadores, desodorantes, depiladores,

alisantes de cabelo.

20-29 Fragrâncias, dentifrícios e outros produtos

para higiene bucal, batons e tônicos

capilares.

10-19 Sabonetes, produtos para o banho e produtos

infantis.

≦ 10

Descolorantes de cabelo, produtos para o

barbear.

Fonte: CORBETT et al., 1999.

N= 1305 casos

No Brasil, o artigo 50 do Decreto no 79.094 de 05 de janeiro de 1977 dispõe sobre

produtos de higiene e cosméticos para uso infantil e é claro quanto à proibição de xampus

infantis com potencial irritante ocular:

“... Xampus destinados à limpeza do cabelo e do couro cabeludo das crianças por

ação tensoativa ou absorção sobre sujidades podem ser apresentados em formas e veículos

apropriados, mas sem ser irritantes ao couro cabeludo e aos olhos da criança, devem ser

facilmente removíveis após a sua aplicação e o pH deve estar compreendido entre os limites

de 7,0 (sete vírgula zero) e 8,5 (oito vírgula cinco)...”

É importante destacar, que tal legislação é a única existente em nosso país que trata

da segurança dos produtos cosméticos em questão, e a mesma impõe limites quanto ao pH

somente para a classe de xampus infantis. Sendo assim, não existem parâmetros para a

faixa aceitável de pH para as outras categorias avaliadas, i.e. os condicionadores da linha

infantil e os xampus e condicionadores de uso adulto. Vale ainda ressaltar que, todos os

produtos contemplados no presente estudo foram avaliados quanto ao seu pH e que cerca de

65% dos xampus infantis encontravam-se fora da faixa preconizada pela legislação

brasileira (DECRETO n° 79.094,1977).

Outro dado que evidencia a discrepância entre a Lei em vigor e a situação real dos

produtos comercializados no município do Rio de Janeiro é o fato de cerca de 70% dos

produtos acabados aqui avaliados (incluindo a maioria dos xampus da linha infantil)

induzirem algum grau de irritação ocular pelo teste de Draize, o único teste oficialmente

aceito para avaliação da irritabilidade ocular pela autoridade regulatória nacional.

A análise comparativa entre o potencial irritante ocular de xampus e

condicionadores demonstra que, tanto para a linha adulta como para a linha de produtos

recomendados para o público infantil, são os xampus os produtos que apresentam o maior

potencial irritante. Todos os xampus da linha adulta foram considerados insatisfatórios no

teste de Draize; 04 deles receberam a classificação de irritantes moderados e 02 irritantes

severos. A situação é ainda mais crítica se considerarmos os produtos da linha infantil.

Dentre os 06 xampus infantis aqui estudados, somente 01 foi aprovado no teste de Draize,

embora seu pH estivesse fora da faixa preconizada por Lei. Sendo assim, todos os xampus

infantis foram considerados impróprios para comercialização e consumo, embora tenham

sido adquiridos comercialmente. Tal fato demonstra a necessidade de intensificação de

ações fiscalizadoras, exigindo o pleno cumprimento da Lei por parte de algumas indústrias

de cosméticos.

5.2 Avaliação integrada: combinação de testes in vitro e in vivo na avaliação do

potencial irritante ocular

Poucos foram os testes de segurança que até hoje sofreram tão grande pressão pela

sua abolição como o teste de irritação ocular de Draize. Dentre as razões que contribuíram

para este cenário, podemos citar:

i. O teste de Draize é um teste fácil de ser compreendido pela população em

geral; enquanto que o grau de dor/desconforto ao qual os animais são

submetidos durante o teste é difícil de ser explicado pelo meio científico

(sobretudo antes do teste passar por um certo grau de refinamento, que

eliminou a avaliação de substâncias corrosivas com pH < 2,0 e > 11,5);

ii. O teste de Draize sempre teve grande aplicação pela indústria de

cosméticos e a opinião pública tem se mostrado pouco tolerante no que diz

respeito à avaliação de segurança desta classe de produtos;

iii. A existência de questionamentos sobre o poder preditivo do teste de

Draize e sua real relação com o potencial irritante ocular em humanos.

Somado aos aspectos levantados acima, vale ressaltar o fato da comunidade

científica ter, inicialmente, acreditado que a substituição do teste de Draize fosse uma tarefa

mais simples do que de fato ela se revelou ser.

Desde o início da década de 1980, inúmeros testes alternativos ao teste de Draize

foram sugeridos pela comunidade científica mundial (VIAN et al., 1995; CLOTHIER et al.,

1988; CLOTHIER, 1995; CLOTHIER et al., 2006; KNOX et al., 1986; RIDDEL et al.,

1986; HOCKLEY & BAXTER, 1986.; LUEPKE & KEMPER, 1986.; LUEPKE, 1986;

PAPE et al., 1999; BURDICK et al., 2002.; BURTON et al., 1981; DE TORRES et al.,

1997.; PRICE & ANDREWS, 1985; TANI et al., 1999.; GUILLOT, 1992; RENZI et al.,

1993; EUN & SUH, 2000; LAGARTO et al., 2005; YANG & ACOSTA, 1994.;

SPIELMANN,1996; MARGIS & BOROJEVICH, 1989), porém alguns fatores dificultaram

sua plena validação. O primeiro destes fatores diz respeito à complexidade das estruturas

oculares. Para muitas das alternativas estudadas não se tem observado suficiente

concordância entre os mecanismos que realmente influenciam o processo de irritação

ocular e o desfecho proposto. Além disso, não há pleno conhecimento científico da biologia

envolvida no processo de irritação ocular e, em humanos, os dados sobre o potencial

irritante ocular de ingredientes e produtos são escassos (SPIELMANN & GOLDBERG,

1999).

Como a variedade de ensaios alternativos ao teste de Draize até hoje propostos não

substitui plenamente o uso de animais, a comunidade científica e órgãos regulatórios de

alguns países (e.g. a agência regulatória alemã, o EPA e a OECD) vêm sugerindo uma

estratégia integrada de avaliação, que compreenda a realização de ensaios in vitro, e em

alguns casos, a aplicação do ensaio in vivo conforme descrito por Spielmann & Goldberg,

1999 (Figura 14).

Neste tipo de abordagem, os dados físico-químicos, a análise quanto à

estrutura/atividade da substância química em questão e resultados obtidos a partir de

ensaios in vitro e in vivo são levados em consideração para a avaliação do potencial

irritante de novas substâncias químicas. Com esta abordagem integrada, substâncias

classificadas como “perigosas para os olhos: causadoras de lesão severa ocular” (i.e. com

base na análise de resultados obtidos nas etapas preliminares, incluindo medida de pH,

avaliação de dados relacionados ao potencial irritante cutâneo, considerações sobre

estrutura/atividade e a realização de testes in vitro) não são testadas em animais. Somente

as substâncias que apresentam resultados negativos na bateria de ensaios in vitro (até o

passo 4 da Figura 14) são submetidas ao ensaio in vivo, mesmo assim tomando como

precaução a utilização inicial de somente 01 coelho no teste de irritação ocular. Tal

abordagem já é utilizada em diversos países membros da comunidade européia, porém

segundo normas e diretrizes dos países membros, já não pode ser aplicada a produtos

cosméticos, uma vez que a Europa já proíbe desde 2004 a comercialização de produtos

cosméticos testados em animais e estabelece como novo prazo o ano de 2009 para a

proibição definitiva do uso de animais na avaliação de segurança de ingredientes isolados

(e.g. tensoativos) utilizados em cosméticos (DIRECTIVA 2003/15/EEC).

Figura 14: Estratégia para teste de irritação ocular de novas substâncias químicas de acordo

com procedimentos de países membros da Comunidade Européia.

Fonte: De Silva et al, 1997

1° Passo

Mensuaração do pH

Avaliação da irritação

cutânea

Considerações sobre

estrutura/atividade

Testes alternativos

2° Passo

3° Passo

4° Passo

Teste de irritação ocular de Draize com 1 animal

5° Passo

Teste de irritação ocular de Draize com 3 animais

6° Passo

Nenhuma indicação de risco

Não é irritante, de acordo com critérios estabelecidos pela Comunidade Européia

Não é irritante ou é irritante reversível ocular

Irritante moderado e reversível ocular

R 36

Irrit

ante severo/corrosivo

Nenhum outro teste solicitado

Não é irritante ocular importante

Irritante severo/corrosivo ocular

Teste de irritação ocular de Draize não recomendado

Irritante severo/corrosivo ocular

Teste de irritação ocular de Draize não recomendado

Positivo no teste

de corrosividade cutânea

Teste de irritação ocular de Draize não recomendado

pH ›11,5 ou ‹ 2

Teste de irritação ocular de Draize não recomendado

R 36

R 41

R 34

R35

R 41

Não é corrosivo ocular

[continuação da Figura 14]

Onde:

R36 – Produtos classificados como irritantes oculares moderados in vivo

R41 – Produtos classificados como irritantes severos/corrosivos oculares in vivo

R35 – Produtos classificados como corrosivos cutâneos in vivo

R34 - Produtos classificados como irritantes severos cutâneos in vivo

5.3 Uso de métodos alternativos na avaliação do potencial irritante de

cosméticos

Diante do aumento no consumo de produtos cosméticos e devido às questões éticas

relacionadas à diminuição do número de animais em pesquisa científica, sobretudo no

controle da qualidade desta classe de produtos, os laboratórios brasileiros oficiais que

controlam a qualidade de produtos sujeitos à Vigilância Sanitária devem estar

particularmente atentos ao desenvolvimento, implantação e validação de metodologias

alternativas. Uma das etapas do processo de validação consiste em estimar a variação intra-

laboratorial do ensaio em questão, avaliando, inclusive, a variação dos resultados obtidos

em diferentes ensaios por um mesmo analista e entre analistas diferentes.

No presente estudo observou-se um elevado valor de coeficiente de variação para

alguns produtos acabados e também para alguns tensoativos. No entanto, este parece não

ser de fato, um aspecto limitante para o ensaio proposto, já que de acordo com a OMS

(WHO/VSQ/97.02), ensaios biológicos apresentam - via de regra - uma variação entre 5 e

20%, se considerarmos ensaios de ligação (e.g. imunoensaios) ou ainda, superiores a 50%

quando consideramos ensaios realizados com linhagens celulares (e.g. ensaios de

citotoxicidade) e/ou modelos animais (e.g. ensaios de toxicidade, pirogênio etc). Além

disso, o fato do coeficiente de variação global do ensaio (30,00%) se encontrar dentro do

limite preconizado para ensaios biológicos conduzidos com células, segundo protocolo de

validação de bioensaios da OMS, parece ser mais um indício de que o elevado coeficiente

de variação de alguns poucos produtos não deva ser um fator limitante do ensaio proposto.

Em outro estudo realizado por nosso laboratório (COSTA, 2006), em que avaliamos

através do método de QPT em células SIRC o potencial citotóxico somente de xampus

(N=20) e tensoativos (N=5) foi encontrado um valor de CV% global de 16,82 (Tabela 13).

Percebemos, desta forma, que os coeficientes de variação globais dos estudos diferem,

sendo os dados de Costa, 2006 mais satisfatórios em termos de precisão inter-ensaio.

Para avaliar se a maior variabilidade encontrada no presente estudo se deveu à

escolha da linhagem celular (e descartar a possibilidade de ser uma interferência da

utilização de produtos de diferentes naturezas, e.g. o uso de condicionadores no presente

estudo) recalculamos os CV%s globais com base nos valores obtidos com 17 amostras (12

xampus e 5 tensoativos), as únicas amostras que foram ensaiadas tanto no presente estudo

como por Costa, 2006. Concluímos, assim, que os coeficientes de variação globais do

método diferem quando utilizamos linhagens celulares distintas, e que os resultados dos

ensaios conduzidos com células SIRC (CV% global: 18,43%) são mais satisfatórios em

termos de precisão inter-ensaio do que os obtidos com as mesmas 17 amostras usando

células 3T3 (CV% global: 31,00%). Também em termos do grau de preditibilidade do

ensaio, nos parece que a utilização de células SIRC se mostra mais vantajosa, como

veremos no item 5.3.1.

Tabela 13: Avaliação comparativa dos CV% globais do método de QPT com

diferentes linhagens celulares.

N Linhagem

celular

CV% Global

Presente estudo 25 3T3 30,00

17* 3T3 31,00

Costa, 2006 25 SIRC 16,82

17* SIRC 18,43

* Número de produtos/tensoativos usados em ambos os estudos.

5.3.1 Grau de preditibilidade do método proposto

Para a avaliação do grau de preditibilidade do teste in vitro em relação ao teste in

vivo foi necessário o estabelecimento de um ponto de corte (cut-off) que possibilitasse a

diferenciação de substâncias irritantes daquelas não-irritantes no teste in vitro. Após análise

dos resultados obtidos in vitro e a avaliação destes, tendo como base os resultados obtidos

in vivo, optamos pelo ponto de corte de 1,00mg/mL. Assim, amostras com

<1,00mg/mL foram consideradas como irritantes in vitro, enquanto aquelas com

>1,00mg/mL como não-irritantes.

Usando este valor como ponto de corte, obtivemos 5 resultados discordantes entre o

teste in vitro e o teste in vivo, sendo 4 falsos positivos e 1 falso negativo, enfatizando uma

maior fragilidade da célula 3T3 em relação a outras linhagens celulares (e.g SIRC), como

mostram o resultados de sensibilidade, especificidade e precisão (Tabela 14).

Tabela 14: Avaliação comparativa da preditibilidade do método de QPT com

diferentes linhagens celulares.

N Sensibilidade Especificidade

Precisão

Costa, 2006

(SIRC)

25 100% 83% 96%

Presente estudo

(3T3)

25 94% 43% 80%

A análise dos dados nos permitiu ainda concluir, que há uma melhor capacidade do

método proposto em detectar produtos classificados como irritantes na metodologia in vivo

(sensibilidade) do que aqueles classificados como não-irritantes (especificidade). A

precisão do método foi de 96%, quando realizado com células SIRC e de 80% no presente

estudo (Tabela 14).

Alguns erros de estimação que ocorrem na maioria dos ensaios de citotoxicidade

parecem estar relacionados com a classe química das substâncias-teste. Substâncias que

apresentam pH extremo, i.e. sabidamente irritantes in vivo, podem apresentar resultados

subestimados in vitro. Por outro lado, substâncias com baixo potencial irritante in vivo, em

alguns casos, podem apresentar resultados superestimados in vitro, devido ao fato dos

parâmetros de medição serem mais sensíveis nos testes de citotoxicidade (SEIFREID,

1986; BENOIT et al., 1987; GUILLOT, 1992; COSTA, 2006). Neste contexto, possíveis

influências de componentes presentes no meio de cultura e outras características de

exposição devem ser levadas em consideração:

i. Enquanto no teste in vivo, o olho dispõe de alguma proteção em relação ao

contato com a substância irritante, como o extrato córneo e a produção de

lágrimas, no ensaio in vitro, a cultura celular é exposta diretamente à

substância teste (HERZINGER et al., 1994);

ii. Alguns ingredientes do meio de cultura, como soro fetal bovino, glicose e

algumas proteínas podem exercer efeito protetor nas células, já que tais

substâncias do meio podem inativar algum produto testado (Costa 2006).

Substâncias teste podem vir a sofrer interação com compostos do meio de

cultura e assim, o efeito de substâncias ácidas ou alcalinas pode ser

mascarado pela solução tampão presente no meio para incubação celular

(HERZINGER et al., 1994). Por outro lado, proteínas do meio podem

desnaturar e gerar uma toxicidade não presente in vivo (COSTA, 2006).

Algumas substâncias testadas, como, por exemplo, alguns tensoativos,

interagem com proteínas do soro fetal bovino (HERZINGER et al., 1994),

fazendo com que o efeito tóxico dessas substâncias possa vir a ser

mascarado in vitro;

iii. Adicionalmente, deve-se levar em consideração o fato das diferentes

solubilidades apresentadas pelas diversas substâncias-teste nos meios de

cultura, que também podem ser causa de resultados discordantes entre o

teste in vitro e o teste in vivo (SEIFREID 1986; BENOIT et al., 1987;

GUILLOT, 1992; COSTA, 2006).

5.3.2 Confronto com dados da literatura

Existem diversos artigos na literatura científica que dizem respeito à investigação da

aplicabilidade de testes de citotoxicidade para avaliação de produtos com potencial irritante

ocular. Muitos deles utilizaram como corantes o MTT e/ou o vermelho neutro (NR) e foram

realizados em células SIRC e 3T3 (DE ANGELIS et al, 1986; VIAN et al, 1995;

CLOTHIER et al, 1988; CLOTHIER, 1995; CLOTHIER et al, 2006; KNOX et al, 1986;

RIDDEL et al, 1986; GUILLOT, 1992; RENZI et al, 1993; EUN & SUH, 2000; YANG &

ACOSTA, 1994; SPIELMANN et al,1996; MARGIS & BOROJEVICH, 1989;

BORENFREUND & PUERNER, 1985; DICKSON et al, 1993; HOCKLEY & BAXTER,

1986; PASTERNAK & MILLER, 1995; ROUGUET et al, 1992; SHOPSIS & ENG, 1992;

TANI et al, 1999). Estudos utilizando a metodologia de QPT são um pouco mais escassos

(KNOX et al., 1986; RIDDEL et al., 1986; CLOTHIER et al., 1988; CLOTHIER, 1995;

CLOTHIER et al., 2006., VIAN et al., 1995 e COSTA, 2006).

Desde sua criação até os dias de hoje, a metodologia de QPT vem sofrendo algumas

modificações, como por exemplo, a adaptação do teste com placas de 24 poços (KNOX et

al., 1986; RIDDEL et al., 1986; CLOTHIER et al., 1988) para a utilização de placas com

96 poços (VIAN et al., 1995; CLOTHIER, 1995; CLOTHIER et al., 2006; COSTA, 2006).

Em 1995, houve a publicação do protocolo n°15 do INVITOX - FRAME (CLOTHIER,

1995), afirmando que o corante utilizado no teste de QPT (Azul de Kenacid) poderia ser

substituído pelo corante Azul Brilhante de Comassie R-250, sem nenhum tipo de prejuízo à

técnica. Desta forma, o método pode ser realizado tanto com o corante Azul de Kenacid

(KNOX et al, 1986; RIDDEL et al, 1986; CLOTHIER et al, 1988; CLOTHIER, 1995;

CLOTHIER et al, 2006) quanto com o corante Azul Brilhante de Coomassie R-250 (VIAN

et al., 1995; Costa, 2006), como mostra a Tabela 15.

A Tabela 15 nos mostra ainda que os resultados do presente estudo são muito

semelhantes aos encontrados por outros autores, que utilizaram o mesmo método em

estudos conduzidos com células 3T3, ou mesmo com outras linhagens celulares, e que a

utilização deste método permite diferenciar tensoativos quanto ao seu potencial irritante.

Tabela 15: Avaliação comparativa dos valores de IC

obtidos com tensoativos no presente

estudo em comparação com modelos descritos na literatura.

# Corante Azul de Kenacid, *Corante Azul Brilhante de Coomassie R-250

BCL-D1: fibroblasto humano

No entanto, na grande maioria das vezes, os estudos que buscam investigar a

aplicabilidade de testes de citotoxicidade utilizam somente ingredientes isolados (como e.g.

tensoativos), não sendo contemplados neste tipo de estudo os produtos acabados (WOLF et

al, 2001). Muitos produtos acabados apresentam em sua formulação um conjunto de

tensoativos (2 a 4 tensoativos diferentes como e.g. catiônicos, aniônicos, anfotéricos e não-

iônicos), e esta mistura de ingredientes dificulta a predição do potencial irritante. Esta é

uma provável explicação para o baixo coeficiente de correlação de Pearson observado em

nosso estudo entre os testes in vitro e in vivo, quando consideramos apenas produtos

acabados (0,381), conforme demonstrado na Tabela 16

(mg/ml)

3T3 SIRC BCL-D1

Tensoativos

*Presente

estudo

#Riddel, et

al., 1986

#Clothier

et al., 1988

*Clothier

et al., 2006

*Vian et

al., 1995

*Costa,

2006

#Knox et al.,

1986

Tween 20 0,393 _ 0,263 0,262 0,344 1,208 _

Lauril Éter 0,277 _ _ 0,114 _ _ _

Lauril Sulfato de

Sódio

0,062

0,100

0,090

0,072

0,080

0,040

0,084

Triton X

0,006

0,014

0,003

0,030

Cloreto de

Benzalcônio

0,007 _ 0,007 0,007 0,006 0,004 0,002

Brometo de

Cetildimetiletilamônio

0,004 _ _ 0,002 _ 0,003 --

Tabela 16: Comparação dos valores de coeficiente de correlação de Pearson em diferentes

ensaios de citotoxicidade.

*Tensoativos

# Produtos acabados (xampus e condicionadores)

Com relação aos tensoativos, apesar do valor de coeficiente de correlação de

Pearson ter se apresentado de melhor calibre (e.g. -0,611, p = 0,197), tal valor não

apresenta significância estatística. Devemos ressaltar o fato de que o número reduzido de

amostras provavelmente influenciou a significância estatística (N=6).

No que se refere às estruturas oculares, podemos observar que as ICs

dos testes in

vitro se correlacionam melhor com as lesões ocorridas na conjuntiva do que na íris e

córnea. Este dado se confirma na análise de todos as amostras avaliadas conjuntamente,

SIRC 3T3 L929

NRU -0,59 (N=20)* -0,580 (N=20)* -0,57 (N=20)*

MTT -0,59 (N=20)* -0,620 (N=20)* -

Vian et al., 1995

QPT -0,56 (N=20)* -0,480 (N=19)* -0,55 (N=20)*

NRU -0,816 (N=35)* - -

Ohono et al., 1999

MTT - - --

Tani et al., 1999 NRU -0,787 (N=30)* - -

Costa, 2006 QPT -0,62 (N=21)*# - -

Presente Estudo QPT -

-0,611 (N=6)*

-0,381 (N=19)#

-0,420 (N=25)*#

sendo tal correlação estatisticamente significativa na análise de produtos acabados +

tensoativos, e somente tensoativos.

A face anterior do olho é recoberta pela córnea e pela conjuntiva. A córnea é a

estrutura ocular mais exposta, e assim, é a estrutura mais susceptível à exposição química e

conseqüente lesão ocular. Injúria corneal em testes com animais, após a exposição a

substâncias fortemente irritantes/corrosivas, demonstra ser responsável por 73% do escore

total de toxicidade ocular (ESAC/ECVAM, 2007). Por essa razão, modelos in vitro, que

analisam possíveis lesões ocorridas na córnea apresentam melhor correlação com o teste de

irritação ocular de Draize (sobretudo para substâncias com forte potencial irritante) e vêm

sendo o principal foco dos estudos para o desenvolvimento de metodologias alternativas ao

teste de irritação ocular de Draize.

Existem, neste contexto, dois métodos alternativos ao teste de irritação ocular de

Draize em vias de receber a validação oficial para a avaliação de segurança de produtos

cosméticos isolados, são eles: o BCOP (teste que avalia opacidade e permeabilidade

corneal utilizando córnea isolada de bovino) e o ICE (teste que avalia opacidade e

permeabilidade corneal, além da retenção de fluoresceína, utilizando córnea isolada de

galinha). Tais métodos demonstram uma excelente correlação com o teste de irritação

ocular de Draize (BURDICK et al, 2002.; BURTON et al, 1981). Cabe ressaltar que tanto o

BCOP como o ICE foram recentemente validados (2007) como métodos integrantes de uma

bateria de ensaios de triagem para a detecção de substâncias não cosméticas (agrotóxicos,

pesticidas etc.) classificadas como irritantes severos/corrosivos oculares (ESAC/ECVAM,

2007).

Além da córnea, a íris é outra estrutura ocular investigada na avaliação da resposta a

substâncias químicas no teste de irritação ocular de Draize. Existe concordância no meio

científico de que, em geral, a avaliação in vitro de lesões ocorridas na íris não se faz

necessária, já que a resposta desta estrutura ocular ocorre somente após uma significante

disrupção da barreira ocular anterior da córnea (BAGLEY et al., 2006; ALTOX, 2007).

A conjuntiva é a terceira estrutura ocular investigada na avaliação da resposta a

substâncias químicas no teste de irritação ocular de Draize. As lesões ocorridas na

conjuntiva são responsáveis por apenas cerca de 18% do escore total de toxicidade ocular

observado no teste de Draize (ALTOX, 2007). Por isso, testes alternativos que apresentam

como desfecho final a medição de alterações vasculares, i.e. mais correlacionáveis à injuria

de conjuntiva (e.g. HET-CAM), tendem a superestimar os resultados obtidos in vivo

(CORRADO, 2007). Este parece ser também o caso do teste de citotoxicidade pelo método

de QPT. Podemos dizer que a dificuldade em correlacionar a metodologia in vitro com a

metodologia in vivo, assim como a baixa especificidade do método em questão, parece

residir no fato de que o teste proposto demonstrou maior correlação com o efeito tóxico

ocorrido na conjuntiva, que por sua vez, é a estrutura ocular que recebe o menor peso

durante a análise do teste de irritação ocular in vivo (alterações de íris e córnea recebem

peso 5, enquanto conjuntiva recebe peso 2, conforme etapa 1 do anexo 1).

Apesar de receber um menor peso no teste in vivo, a possibilidade de dano à

conjuntiva não deve ser negligenciada. Lesões nesta estrutura ocular podem até ser

consideradas de menor relevância em se tratando de produtos com potencial irritante

moderado a severo, porém, a avaliação das lesões ocorridas na conjuntiva, são úteis na

avaliação de efeitos mais leves, especialmente os ocasionados por produtos aplicados no

olho propriamente dito e ao redor do mesmo (ALTOX, 2007). Cabe ressaltar que a

avaliação da conjuntiva representa grande importância em termos de sistema vascular e

imunológico, e que possíveis alterações nesta estrutura são importantes na resposta

inflamatória relacionada ao processo de toxicidade ocular (ALTOX, 2007).

Assim, cada vez mais se torna clara a idéia de que uma metodologia substitutiva in

vitro não deve ser utilizada isoladamente para a avaliação da irritação ocular, e sim através

de um conjunto de outras metodologias alternativas, com capacidade de detecção de

diferentes desfechos.

5.4 Considerações finais

De acordo com o publicado na 7

Emenda da Diretiva 76/768/CEE (2000), países

membros da União Européia se comprometem a “abolir o uso de animais de forma

definitiva e permanente no controle toxicológico de produtos cosméticos acabados”. E

complementam: “A comissão se esforçará em obter o reconhecimento recíproco dos

resultados de validação dos estudos in vivo/in vitro”. Cabe ao profissional envolvido em

questões como essa, o bom senso na utilização de abordagens alternativas, evitando sempre

que possível o sofrimento e a morte desnecessárias dos animais e contribuindo para o

desenvolvimento de pesquisa científica de melhor qualidade.

Neste contexto se inseriu o presente trabalho, buscando por alternativas que

integram o modelo combinado de avaliação do potencial irritante ocular, ampliando o

elenco de alternativas e aprimorando nosso conhecimento a respeito de vantagens,

limitações e peculiaridades dos modelos propostos.

VI. CONCLUSÕES

_________________________________________________________________________

A análise dos resultados obtidos no presente estudo nos permite concluir, que:

i. Cerca de 70% dos produtos acabados aqui avaliados induziram

algum grau de irritação ocular no teste de Draize. Como este é o

único teste preconizado pela autoridade regulatória nacional para

a avaliação da irritação ocular, e mediante a legislação vigente,

que proíbe a comercialização de xampus da linha infantil com

potencial irritante, concluímos que há uma evidente discrepância

entre a Lei em vigor e a situação real dos produtos acabados aqui

avaliados. Nossos dados demonstram a necessidade de

intensificação de ações fiscalizadoras, especificamente nesta are

de atuação da Vigilância Sanitária;

ii. A avaliação do coeficiente de variação do teste de QPT

conduzido com células 3T3 mostrou um valor de CV% global de

30,00%. Embora este valor seja considerado adequado, segundo

a OMS, para ensaios conduzidos com linhagens celulares, a

comparação de nossos resultados demonstra que a utilização de

células SIRC (CV% global 16,82%) é mais vantajosa em termos

de precisão inter-ensaio;

iii. Também em termos de sensibilidade, especificidade e precisão

observamos resultados mais promissores quando da utilização de

células SIRC (Costa, 2006). Ainda em relação ao grau de

preditibilidade do método de QPT, pode-se concluir que há uma

melhor capacidade em detectar produtos classificados in vivo

como irritantes (sensibilidade = 94%) do que aqueles

classificados in vivo como não irritantes (especificidade = 43%).

Nas condições experimentais do presente estudo, a precisão do

método foi estabelecida em 80%;

iv. A avaliação de tensoativos pelo método de QPT nos mostrou

que este teste é capaz de diferenciar tensoativos quanto ao seu

potencial irritante. Os valores de IC

obtidos nesta etapa do

estudo foram muito semelhantes aos encontrados na literatura

internacional, demonstrando que, pelo menos para ingredientes

isolados, o método apresenta pouca variabilidade inter-

laboratorial;

v. A análise dos valores de correlação de Pearson entre os

resultados obtidos in vivo e in vitro mostrou que o método de

QPT em células 3T3 tende a apresentar valores de correlação de

melhor calibre para tensoativos do que para produtos acabados.

O fato de xampus e condicionadores serem constituídos, via de

regra, por uma mistura de ingredientes é uma provável razão

para a baixa correlação observada entre os testes para esta classe

de produtos;

vi. No que tange a análise das estruturas oculares, concluímos que

os valores obtidos in vitro (IC

) se correlacionam melhor com

as lesões ocorridas na conjuntiva do que na íris e córnea. Esta

característica foi observada tanto quando analisamos dados de

tensoativos, como quando consideramos produtos acabados.

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_________________________________________________________________________

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101

ANEXO

___________________________________________

Teste in vivo:

Serão utilizados dados provenientes do banco de dados do DFT/INCQS. Os ensaios

in vivo foram realizados segundo o POP n° 65.333.004 do INCQS/FIOCRUZ

, cujo

objetivo é a detecção e avaliação do potencial de irritabilidade para o homem de qualquer

substância ou produto acabado que possa vir a entrar em contato com os olhos.

O teste de Draize permite cinco classificações dos produtos quanto ao seu

potencial irritante ocular, são elas: não irritantes (NI), irritante leve (IL),

irritante moderado (IM), irritante severo (IS) e irritante máximo (IMax).

1) Animais: Coelhos albinos, machos ou fêmeas da raça Nova Zelândia, hígidos e com

peso corpóreo acima de 2,0 Kg. Foram utilizados 5 animais por amostra/substância-

teste

2) Acondicionamento: Os animais foram mantidos em gaiolas individuais em

condições controladas de temperatura (20 +/- 2°C) e umidade relativa doa ar (30 –

70%) e ciclo claro/escuro constante (12 horas cada). Os animais receberam ração e

água ad libidum.

3) Preparo dos animais: Ambos globos oculares de cada animal foram examinados 24

horas antes do início do ensaio. Os animais que apresentaram injúrias na conjuntiva

e globo ocular foram descartados.

4) Aplicação: Instilou-se 0,1 mL do produto no saco conjuntival inferior e, em seguida

massageou-se gentilmente durante 30 segundos. As substâncias ou produtos

fortemente ácidos ou alcalinos (pH menor que 2,0 e maior que 11,5) não foram

testados, pois são reconhecidamente corrosivos.

5) Leitura: Foram realizadas leituras, por três analistas, nos períodos de 24h, 48h, 72h

e 7 dias, para a observação das alterações e graduação das lesões (Quadro 1)

6) Avaliação dos resultados: Foi dividida em etapa I e etapa II

ETAPA I:

1) Determinação da quantificação da lesão ocular

102

Este cálculo deve ser realizado para cada animal com base nas leituras de 24, 48, 72 horas

e 7 dias, conforme a graduação das lesões, segundo a equação abaixo e registrando-se os

valores na ficha de soma das leituras para, em seguida, calcular a média aritmética de cada

tempo de leitura

Lxt = [(AxB) x 5 + (Cx5) + [(D+E+F) x 2]. Onde:

Lxt – Leitura de um animal em um intervalo de tempo (t)

A – densidade da opacidade

B – área da opacidade

C – irite

D – hiperemia

E – quimose

F – secreção

2) Seleção da maior média aritmética entre as médias de 24, 48, 72 horas (ME

24h

48h

, ME

72h

)

Seleciona-se a média de valor máximo (ME max), e posteriormente calcula-se a faixa de

confiança de acordo com a seguinte equação: FC=MEmax+/-5, onde:

Fc – faixa de confiança

MEMAX – média aritmética de maior valor entre os tempos de 24h, 48h e 72h.

Uma vez selecionada a ME max verifica-se se pelo menos dois valores de Lxt encontram-se

dentro da Fc. Se tais valores forem encontrados, deve-se considerar o MEmax e utilizar a

tabela 2, referente à classificação prévia do produto.

103

Tabela 2: classificação prévia do potencial de irritabilidade de um produto

Classe Faixa/Escores Classificação

I 0,0 a 14,9 Produto não –irritante (NI)

II 15,0 a 24,9 Produto levemente irritante (IL)

III 25 a 49,9 Produto irritante moderado (IM)

IV 50,0 a 79,9 Produto irritante severo (IS)

V 80,0 a 110,0 Produto Irritante Máximo (IMax)

ETAPA II – Classificação final do potencial de irritabilidade ocular

Esta etapa foi utilizada para confirmar ou alterar a classificação da amostra ou substância-

teste encontrada da etapa I. Para tal, fez-se uso da Tabela 3, referente à classificação final

do produto.

Tabela3: Classificação final do potencial de irritabilidade ocular de um produto

* M = Média; h = horas; d = dias; L = leitura

Classificação Confirmação da classificação inicial

Não irritante (classe I) M24h < 2.4 – classe I; se M24> 2.4 ir para classe II

Irritante leve (classe II) (1) M48h </= 2.4, classe II; se M48h> 2.4, ir para o item (2)

(2) M72h</=2.4, classe II; se M72h > 2.4, ir para classe III

Irritante moderado (classe

III)

(1) M7d</= 20, ir para o item (2); se M7d > 20, ir para classe IV

(2) L7d </= 10 em pelo menos 3 animais, classe III; se L7d>30 em pelo menos 1

animal, classe IV

Irritante severo (classe IV) (1) M7d</= 40, ir para i item (2); se M7d > 40, ir para a classe V

(2) L7d </= 30 em pelo menos 3 animais, classe IV; se L7d > 60 em pelo menos

um animal, classe V

Irritante máximo (classe v) (1) M7d > 40, ir para item (2)

(2) L7d > 60 em pelo menos 1 animal, classe V

104

Graduação

Estrutura Alteração 0 1 2 3 4

Quanto à

densidade

Nenhuma

área

afetada

Área difusa ou

disseminada,

ligeira perda de

brilho

Áreas translúcidas

facilmente

discerníveis,

detalhamento da

íris ligeiramente

dificultado.

Área opalascente,

nenhum

detalhamento

visível da íris.

Opaca.

Íris invisível

Córnea

Quanto à área

afetada

Sem

opacidade

¼ (ou menos),

mas nunca zero

Entre ¼ e ½ da

córnea

Entre ½ e ¾

Entre ¾ e área

total

Íris Irite Íris normal Raias com

congestão,

edema,

congestão

circuncorneal,

íris ainda

reativa à luz

Nenhuma reação à

luz, hemorragias,

destruição de

tecido

X X

Conjuntiva Hiperemia Vasos

normais

Vasos injetados

acima do

normal

Congestão difusa,

vasos visualizados

com muita

dificuldade.

Congestão difusa.

Não visualização

de vasos

Quimose Ausência

de edema

Leve edema Edema moderado

com eversão

parcial das

pálpebras

Edema severo com

pálpebras cobrindo

metade do olho

Edema severo

com eversão

de pálpebras

podendo haver

fechamento

total do olho

Secreção Ausência

de secreção

Quantidade

pequena de

secreção

Umedecimento de

pálpebras e pêlos

adjacentes

Umedecimento

severo de área ao

redor do olho

105

106

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