( PDF ) Sexagem fetal a partir de plasma materno

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

Flávia Cappello Donabela

“Sexagem fetal a partir de plasma materno”

Ribeirão Preto

2008

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Flávia Cappello Donabela

“Sexagem fetal a partir de plasma materno”

“Fetal sexing in maternal plasma”

Dissertação apresentada ao Departamento de

Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina

de Ribeirão Preto como pré-requisito para obtenção

do Título de Mestre em Biologia da Reprodução.

Área de Concentração: Ginecologia e Obstetrícia

Orientadora: Profa. Dra. Ester Silveira Ramos

Ribeirão Preto

2008

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Donabela, Flávia Cappello.

Sexagem Fetal a partir de plasma materno / Flávia Cappello Donabela;

Orientadora Profa Dra Ester Silveira Ramos. Ribeirão Preto, 2008.

98p. il.; 30cm

Dissertação (Mestrado – Programa de Pós-graduação em Biologia da

Reprodução), Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São

Paulo.

Orientadora: Ramos, Ester Silveira

Título em inglês: Fetal sexing in maternal plasma

1- Sexagem fetal, 2- TSPY, 3 – DNA livre fetal.

Folha de aprovação

Flávia Cappello Donabela

Sexagem fetal a partir de plasma materno.

Dissertação apresentada à Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto da Universidade

de São Paulo para obtenção do Título de

Mestre.

Área de Concentração: Ginecologia e

Obstetrícia

Aprovada em ____/____/_____

Banca examinadora

Prof.Dr.________________________________________________

Instituição_________________Assinatura_____________________

Prof.Dr.________________________________________________

Instituição_________________Assinatura_____________________

Prof.Dr.________________________________________________

Instituição_________________Assinatura_____________________

Dedico àqueles que sem eles eu não estaria

aqui:

meus pais ,Antonismar e Romana

meu irmão, Mazinho

Aqueles que mesmo longe nunca estiveram tão

perto:

meus avôs: Amadeu e Valdemar

minhas avós: Adélia, Aurora e Ercília

E ao meu grande amigo e marido Neto

AGRADEÇO

Primeiramente a DEUS,

DEUS, DEUS,

DEUS, pois Ele é tudo.

Aos meus pais por serem quem são e terem me ensinado tudo de mais

bonito e precioso que eu poderia aprender: o respeito, a verdade, a

sinceridade e a educação. Ao meu irmão Mazinho que apesar das

brigas sempre torceu e acreditou em mim. Obrigada por existirem, por

serem sempre tudo na minha vida, me apoiarem e acreditarem sempre

que eu conseguiria vencer, amo vocês!!!

Ao meu amigo, irmão, companheiro, confidente, professor e marido,

Neto obrigada por estar ao meu lado sendo meu porto seguro de

confiança, carinho, atenção e otimismo, em todos os momentos, eu te

amo!!!

À Profa. Dra. Ester Silveira Ramos, pela paciência, carinho,

ensinamentos, conselhos e orientação. Muito obrigada!!!

Ao Prof. Dr. Rui Alberto Ferriani pela amizade, carinho, confiança e

ensinamentos.

Ao Prof. Dr. Raysildo Barbosa Lôbo e à Profa. Dra. Lucia Regina

Martelli pela convivência e ensinamentos.

Aos membros da banca que me ajudaram nesta “reta final” agradeço a

atenção.

Aos demais professores do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia

da FMRP-USP pelos ensinamentos e carinho demonstrado durante o

mestrado.

Aos amigos do Bloco C do Departamento de Genética da FMRP-USP

pela convivência e ajuda no desenvolvimento do trabalho, tornando

agradável o ambiente de trabalho.

As “florzinhas” Fernanda, Lisandra, Francielle, Adriane, Juliana

Meola, Luciana, Jaqueline, Hélida, Mariana, Christina, Cristiana,

Juliana e Rita que foram minhas amigas, irmãs, “mãezinhas”,

companheiras e me ajudaram em todos os momentos difíceis e de

descontração.

A minha querida amiga e irmã Paulinha pela paciência, pelas

caronas, e pelas bolachinhas na hora do cafezinho acompanhadas de

muitas conversas e risadas.

Aos meninos Murilo, Marquinhos, Álvaro e Jair pela amizade,

sugestões, conselhos e ajuda.

Ao Athos e ao Marcelo pelos conselhos, pelas conversas, pela amizade e

carinho.

Aos técnicos do Bloco C, Marli A. V. Galerani, Reginaldo A. Vila,

Sílvio A. dos Santos, Luís A. F. Bezerra e Sebastião Paulo F. Bezerra,

pelos ensinamentos, ajuda e fundamental colaboração para a

realização deste trabalho.

À Dona Júlia pelo carinho, à Dona Elizete e à Adriana pela

convivência agradável e pelos chazinhos nas horas de estresse.

Ao Jefferson pelas análises estatísticas e pela paciência.

Às secretárias da pós-graduação do Departamento de Ginecologia e

Obstetrícia da FMRP-USP, Ilza Mazzocato por sua atenção “materna”

e pelo carinho e amizade e à Taísa Abade pela ajuda e paciência.

Obrigada por tudo!!!

Aos demais funcionários do Departamento de Ginecologia e

Obstertícia da FMRP-USP que colaboraram direta ou idiretamente

para a realização deste trabalho.

Às funcionárias e amigas do Laboratório de Reprodução: Sandra,

Auxiliadora, Albina, Roberta, Cristina, Cidinha e Marilda, pessoas

importantes que agradeço a ajuda, atenção e força para conseguir

realizar deste trabalho.

A todas as pacientes, pois sem elas eu não teria conseguido chegar até

aqui. Muito obrigada!!!!

A todos os amigos da pós-grduação da Ginecologia e Obstetrícia, em

especial Carol Sales, Elisa, Lauriane, Liana, Luciana Abreu,

Alessandra Vireque, Conrado, Janaina, Mali, Ionara pela força, apoio,

companheirismo nestes anos.

Aos funcionários do Serviço de Arquivo Médico (SAME) e do Arquivo

Semi-ativo (ASA) pelo auxílio no levantamento dos prontuários das

pacientes.

Aos meus amigos de Rio Pardo, em especial Maria Rosângela, que

apesar da distância sempre torceram por mim e me ajudaram com

palavras de afeto.

Aos meus amigos de Ribeirão em especial aos meus “compadres”

Natália e Alison, e seus filhos Mateus e “meu bonequinho” Henry; e

também os casais: Fernanda e Richard, e Claudinha e César obrigada

por estarem ao meu lado e serem meus amigos!!!

As minhas amigas Regina e Rosângela pela ajuda, conversas,

conselhos e apoio em todas as horas, obrigada!!!!

A minha família de sangue: Letícia, Leticinha e Lenita, e minha

família de coração: Tia Rosana, Tio Carvalhaes, Guilherme, Henrique,

Lígia e Léo que sempre me apoiaram e torceram por mim.

A minha “nova” família: Dona Ilza, Sr. Carlinhos, Cristina,

Emerson,”Vó” Nena, “Vô” Alcides, a todos os tios, tias, primos e ao

“meu anjinho Raul” obrigada pelas palavras doces sempre que precisei

e por me acolherem com tanto amor.

A todos que participaram de uma forma ou de outra na realização

deste trabalho, contribuindo para o meu crescimento profissional e

pessoal.

Apoio Financeiro:

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP),

bolsa mestrado processo n° 05/52365-6, e projeto regular de pesquisa

processo n° 2005/00616-5;

Fundação de Amparo ao Ensino, Pesquisa e Assistência do HCFMRP-

USP (FAEPA);

Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico (CNPq)

(processo n° 408856/2006-8).

“A razão comanda meus atos, mas o

amor comanda minha vida...”

(Ghandi)

SUMÁRIO

SUMÁRIOSUMÁRIO

SUMÁRIO

I – INTRODUÇÃO..............................................................................................23

I.1. A importância do diagnóstico pré-natal.....................................................24

I.2. Célula fetal em circulação materna...........................................................25

I.2.1. Permanência de células fetais na circulação materna...........................26

I.3. DNA livre fetal em circulação materna......................................................27

I.3.1. Clearance...............................................................................................28

I.4. Aplicações da detecção de DNA fetal através de sangue materno..........29

I.4.1. Hiperplasia Adrenal Congênita...............................................................30

I.4.2. Pré-eclâmpsia.........................................................................................31

I.5. Sexagem fetal através de sequências Y-específicas................................32

I.5.1. Gene TSPY............................................................................................34

II – OBJETIVOS...................................................................................................38

III - CASUÍSTICA, METODOLOGIA..............................................................40

III.1. Pacientes.................................................................................................41

III.2. Material e métodos..................................................................................42

III.2.1. Análise molecular.................................................................................42

III.2.2. Extração de DNA de amostras de sangue...........................................42

III.2.3. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)............................................43

III.2.4. Análise estatística.................................................................................46

IV – RESULTADOS............................................................................................51

V – DISCUSSÃO..................................................................................................65

VI – CONCLUSÃO...............................................................................................72

VII – BIBLIOGRAFIA.......................................................................................74

ANEXOS...............................................................................................................91

Anexo 1- aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos do

HCFMRP-USP.................................................................................................92

APÊNDICES.......................................................................................................93

Apêndice A – Termo de consentimento Livre e Esclarecido...........................94

Apêndice B – Questionário..............................................................................95

Apêndice C – Tabela 12..................................................................................96

Apêndice D – Tabela 13..................................................................................97

Apêndice E – Tabela 14..................................................................................98

RESUMO

RESUMORESUMO

RESUMO

DONABELA, F.C.Sexagem fetal a partir de plasma materno. 2008. 98f. Disertação

(Mestrado) – Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto,

2008.

A determinação do sexo fetal a partir do plasma materno vem sendo muito

pesquisada devido a estudos que provaram a superioridade prática da detecção de

DNA livre fetal em relação às preparações de células fetais isoladas em sangue

materno. Há relato da permanecência das células fetais na circulação materna por

até 27 anos após o parto, enquanto o DNA livre fetal desaparece em

aproximadamente 48 horas após o nascimento. Por se tratar de técnica não invasiva

para o feto, representa maior vantagem sobre outros métodos de diagnóstico pré-

natal como a amniocentese e a biópsia de vilosidade coriônica. Os objetivos deste

trabalho foram: (1) Sexagem fetal a partir de plasma materno por meio do gene

TSPY (Tests-Specific Protein, Y-encoded), utilizando a Reação em Cadeia da

Polimerase; (2) Verificar a especificidade e sensibilidade da sexagem fetal com o

gene TSPY correlacionando com o sexo fenotípico fetal verificado pela

ultrassonografia e/ou pelo exame físico do recém-nascido; (3) Correlacionar a

sensibilidade da sexagem com a idade gestacional e com o sexo fenotípico. Foram

selecionadas 102 gestantes (idade gestacional entre duas e 40 semanas). Após a

coleta do sangue periférico e da separação do plasma, realizou-se a extração de

DNA e utilizou-se a técnica de Nested-Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para

amplificação de seqüência do gene TSPY. Foi utilizada seqüência do gene da β-

globina como controle. Foram detectadas 40 (39,21%) gestações com resultados

positivos para o cromossomo Y e 62 (60,78%) negativos. Em 67 casos, onde foi

possível comparar os resultados do exame com sexo fetal através da

ultrassonografia ou exame físico do recém-nascido, 36 (59,21%) casos resultaram

em positivos para TSPY, 29 (38,16%) resultaram em negativos e dois (2,63%)

resultados foram falso-negativos. Através da análise estatística (tabela de matriz de

confusão), foi encontrada uma confiabilidade positiva de 88,89% e confiabilidade

negativa de 100%, para gestações com menos de sete semanas e confiabilidade

positiva de 100% e confiabilidade negativa de 100% para gestações com mais de

sete semanas. Esses resultados confirmam a boa sensibilidade e especificidade do

método, o qual poderia ser utilizado na rotina médica para auxiliar nos casos onde a

sexagem fetal é necessária para tratamento fetal e/ou diminuição da ansiedade

materna. No presente estudo foi escolhido, o gene TSPY, envolvendo sexagem fetal

a partir de sangue periférico em humanos, e foi possível detectar o sexo fetal a partir

da 2ª semana de gestação. Portanto, o diagnóstico do sexo fetal a partir da 2ª

semana de gestação pela técnica de Nested PCR apresentou 88,9% de

sensibilidade e 100% de especificidade.

ABSTRACT

ABSTRACTABSTRACT

ABSTRACT

DONABELA, F.C. Fetal sexing in maternal plasma. 2007.98 p. Dissertation (Master's

degree) - University of Medicine, University of São Paulo, Ribeirão Preto, 2008

The determination of fetal sex from maternal plasma has been very searched

because of studies that proved the superiority practice of detection of free fetal DNA

in relation to the preparations of isolated fetal cells in maternal blood. There are

reports of persist of fetal cells in maternal circulation for up to 27 years after the birth,

while the free fetal DNA disappears within 48 hours after birth. This is noninvasive

technique to the fetus, represents major advantage over other methods of prenatal

diagnosis such as amniocentesis and chorionic villus biopsy. The objectives of this

work were: (1) fetal sexing from maternal blood through gene TSPY (Tests-Specific

Protein, Y-encoded), using the Chain Reaction in the polymerase, (2) To assess the

specificity and sensitivity of fetal sexing correlating with the gene TSPY with the

phenotypic fetal sex verified by ultrasound and / or physical examination of the

newborn, (3) correlate with the sensitivity of sexing gestational age and with the

phenotypic sex. We selected 102 pregnant (gestational age between two and 40

weeks). After collecting the peripheral blood and the separation of the plasma, was

held on extraction of DNA and used to the technique of Nested Chain Reaction in the

polymerase (PCR) to amplify the sequence of the gene TSPY. Was used sequence

of the β-globin gene as a control. We detected 40 (39.21%) pregnancies with positive

results for the Y chromosome in 62 (60.78%) were negative. In 67 cases where it

was possible to compare the results of the examination with fetal gender by

ultrasound or physical examination of the newborn, 36 (59.21%) cases resulted in

positive for TSPY, 29 (38.16%) resulted in negative and two (2.63%) were false-

negative results. Through statistical analysis (table the matrix of confusion) was

seeking a reliability of 88.89% positive and negative reliability of 100% for

pregnancies with less than seven weeks and reliability of 100% positive and negative

reliability of 100% for pregnancies with more than seven weeks. These results

confirm the good sensitivity and specificity of the method, which could be used in

routine medical to assist in cases where fetal sexing is necessary for fetal treatment

and / or reduction of maternal anxiety. In the present study was chosen the gene

TSPY involving fetal sexing from peripheral blood in humans, and it was possible to

detect the fetal sex on the 2 nd week of pregnancy. Therefore, the diagnosis of fetal

sex on the 2 nd week of pregnancy by the technique of Nested PCR showed 88.9%

sensitivity and 100% specificity.

Lista de figuras

Lista de figurasLista de figuras

Lista de figuras

Figura 1 – Representação esquemática do cromossomo Y humano mostrando o

mapeamento de alguns dos genes

Figura 2 – Esquema do cromossomo Y humano mostrando a localização do gene

TSPY

Figura 3 – Esquema dos resultados da Nested PCR para o gene TSPY

Figura 4 – Foto do resultado da eletroforese em gel de agarose 2% da Nested PCR

para o gene TSPY

Figura 5 - Foto do resultado da eletroforese em gel de agarose 2% da PCR para o

gene da β-globina

Lista de Tabelas

Lista de TabelasLista de Tabelas

Lista de Tabelas

Tabela 1 – Seqüências dos primers internos (TSPY SENSE1 e TSPY ANTI-

SENSE1) e externos (TSPY SENSE2 e TSPY ANTI-SENSE2) do gene TSPY, e

seqüências dos primers do gene da β-globina

Tabela 2 - Tabela da matriz de confusão utilizada para a realização da análise

estatística

Tabela 3 - Resultados da amplificação dos genes TSPY e β-globina, comparado com

o resultado da ultrassonografia pré-natal e/ou exame físico do recém-nascido em

gestações de feto único apresentando a idade gestacional, o número de filhos

anteriores e o sexo destas crianças/fetos.

Tabela 4 - Resultados da amplificação dos genes TSPY e β-globina, comparado com

o resultado da ultrassonografia pré-natal e/ou exame físico do recém-nascido em

gestações múltiplas apresentando a idade gestacional, o número de filhos anteriores

e o sexo destas crianças/fetos.

Tabela 5 - Resultados parciais da amplificação dos genes TSPY e β-globina, em

gestações que resultaram em aborto apresentando a idade gestacional, o número de

filhos anteriores e o sexo destas crianças/fetos.

Tabela 6 - Resultados da amplificação dos genes TSPY e β-globina, em gestações

para as quais ainda não há a confirmação do sexo fenotipico do recém-nascido

apresentando a idade gestacional, o número de filhos anteriores e o sexo destas

crianças/fetos.

Tabela 7 – Resultados da amplificação dos genes TSPY e β-globina, em gestações

com menos de sete semanas de gestação com sexo fenotípico confirmado

apresentando a idade gestacional, o número de filhos anteriores e o sexo destas

crianças/fetos.

Tabela 8 - Resultados da amplificação dos genes TSPY e β-globina, em gestações

com idade gestacional maior ou igual a sete semanas de gestação com sexo

fenotípico confirmado apresentando a idade gestacional, o número de filhos

anteriores e o sexo destas crianças/fetos.

Tabela 9: Análise estatística mostrando a sensibilidade, especificidade, falso positivo

e falso negativo geral (76 casos confirmados sexo) e das subdivisões (31 casos com

menos de sete semanas e 34 casos com mais de sete semanas)

Tabela 10: Análise estatística mostrando a sensibilidade, especificidade, valor

predito positivo e valor predito negativo do sexo masculino e feminino

Tabela 11: Autores, métodos de sexagem utilizados, sequências Y-específicas,

número de pacientes, idade gestacional em semanas e índice de acerto dos

trabalhos utilizados como referências

Tabela 12: Análise estatística do grupo total de pacientes confirmados os resultados

através de ultrassonografia e/ou exame físico do recém-nascido

Tabela 13: Análise estatística do grupo de pacientes com idade gestacional menor

que sete semanas de gestação.

Tabela 14: Análise estatística do grupo de pacientes com idade gestacional maior

que sete semanas de gestação

Lista de abreviaturas

Lista de abreviaturasLista de abreviaturas

Lista de abreviaturas

AMGY – do inglês Amelogenin Y gene

BD – do inglês Beckton-Dickinson

CONEP - Comitê Nacional de Ética em Pesquisa

DNA - ácido deseoxiribonucleico

dNTP - desoxinucleotídeo trifosfato

DYS-14 – região Y específica

EDTA – ácido etilenodiaminotetraacético

FIV – Fertilização in vitro

HAC – Hiperplasia Adrenal Congênita

HCFMRP- Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto

ICSI – Injeção Intra Citoplasmática de Espermatozóide

IGs – idades gestacionais

MgCl2 – cloreto de magnésio

NaCl – cloreto de sódio

NAP – do inglês nucleosome assembly protein

pb – pares de bases

PCR – do inglês Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da

Polimerase)

PPT – do inglês Plasma Preparation Tube

RA – reprodução assistida

RNA – ácido ribonucléico

rpm – rotações por minuto

SRY – do ingles Sex-Determining Region of the Y chromosome

TSPY – do inglês Testis-especfic Protein, Y-encoded

US - ultrassonografia

USP - Universidade de São Paulo

Yp – braço curto do cromossomo Y

Yq – braço longo do cromossomo Y

ZFY – do inglês Azoospermia Factor

Lista de símbolos

Lista de símbolosLista de símbolos

Lista de símbolos

C – graus Celsius

mmHg – milímetro de mercúrio

µg – micrograma

mg – miligrama

µL – microlitro

mL – mililitro

M – molar

mM – milimolar

% - porcentagem

U - unidade

I – INTRODUÇÃO

I.1.A importância do diagnóstico pré-natal

Toda gestante possui um risco de apresentar um feto com uma anomalia,

inclusive cromossômica. Estas anomalias podem ocorrer devido a erros na formação

dos gametas ou mesmo no desenvolvimento embrionário, podendo ser de origem

exclusivamente genética ou estarem sujeitas a fatores ambientais (Dennery, 2007).

O diagnóstico precoce de algumas alterações permite a prevenção de determinadas

doenças e/ou o tratamento das mesmas, o que torna os exames pré-natais

essenciais (Thapar et al., 2007). Devido a isso deve sempre verificar a idade

materna, realizar a ultrassonografia morfológica fetal e os testes bioquímicos em

sangue materno (Cícero et al., 2003).

A observação de determinados fenótipos no feto e a suspeita de anomalias

cromossômicas levam à indicação de exames invasivos tais como a amniocentese

ou a biópsia de vilosidade coriônica, ambos com risco de perda fetal (Stewart, 2004).

Segundo Seeds (2004) o risco fetal devido à amniocentese encontra-se entre 0,5 e

1%. Em outro estudo, Cavallotti et al. (2004) encontraram uma incidência de perdas

de 1% para biópsia de vilosidade coriônica e 1,7% para amniocentese.

Visando anular tais riscos de morte fetal, diversas pesquisas têm buscado a

utilização de novas tecnologias para o diagnóstico pré-natal (Levi et al., 2003). A

descoberta de DNA fetal em circulação materna abriu um novo horizonte para

investigação de técnicas não invasivas de diagnóstico pré - natal (Gerovassili et al.,

2007).

A definição do sexo fetal pode ser muito útil para diagnóstico de doenças

genéticas ligadas ao cromossomo X como, por exemplo, a distrofia muscular de

Duchenne. A detecção precoce do sexo fetal pode ajudar especialmente em relação

à ansiedade dos pais que apresentam o risco de transmitir essas doenças ligadas ao

X. Assim, a possibilidade de sexagem do feto durante as primeiras semanas de

gestação, e este sendo do sexo feminino, pode ser de grande utilidade. Do mesmo

modo, o exame pode ser uma ferramenta valiosa para reprodução assistida em

clínicas que realizam sexagem embrionária quando existe um risco de herdar uma

doença ligada ao X (Martinhago et al., 2006).

Recentemente, alguns investigadores demonstraram ser possível a detecção

de RNA fetal, além de DNA, em plasma materno (Lo, 2005; Chiu et al., 2006; Chiu,

2007). Esta descoberta pode representar um grande avanço para o estudo da

expressão gênica fetal relacionada à diferentes fases da vida intra-uterina, ou seja, o

estudo de certos tipos de genes que são expressos e silenciados de acordo com a

idade gestacional (Martinhago et al., 2006).

I.2. Célula fetal em circulação materna

Bianchi (2004) afirmou que as complicações na gestação pelas técnicas

tradicionais, como a amniocentese e a biópsia de vilosidade coriônica, podem ser

evitadas pela utilização de células fetais intactas e DNA livre fetal que circulam na

corrente sangüínea da gestante. Como alternativa a tais metodologias, amostras de

células fetais têm sido intensamente pesquisadas nas últimas décadas através de

técnicas não invasivas (Walknowska et al., 1969).

Desde o século XIX, quando se observou pela primeira vez a presença de

células fetais em parênquima pulmonar materno associada à eclâmpsia (Schmorl,

1893), a detecção das mesmas em sangue periférico materno permanece como

objeto de intensas pesquisas. Vários estudos foram desenvolvidos com o objetivo de

comprovar a passagem de trofoblastos, eritrócitos e leucócitos fetais para a

circulação materna (Mueller et al., 1990).

Em 1989, Lo et al. demonstraram a presença dessas células fetais na

circulação materna por meio de técnica de amplificação de seqüências específicas

do material genético, uma metodologia de biologia molecular conhecida como

Reação em Cadeia de Polimerase (PCR). Porém, o isolamento de células fetais da

circulação materna é tecnicamente bastante complexo, sendo ainda hoje pouco

realizado (Bianchi, 1998).

As células fetais aparecem na circulação materna precocemente no primeiro

trimestre e continuam presentes através da gestação (Thomas et al., 1995). Durante

a gravidez, essa concentração aumenta gradualmente, acentuando-se antes do

nascimento (Rijnders et al., 2003), podendo ser utilizadas para o diagnóstico pré-

natal precoce de aneuploidias e doenças genéticas (Thomas et al., 1995).

I.2.1. Permanência de células fetais na circulação materna

As células fetais nucleadas podem estar presentes no sangue materno numa

proporção igual ou inferior a 1:100.000 células maternas (Lo et al., 1998).

Atualmente o diagnóstico pré-natal não invasivo pelo isolamento e pela análise

genética destas células vem procurando evidenciar a persistência destas células

fetais na circulação materna, através de amostras de sangue de mulheres com

gestações anteriores. O DNA nuclear, amplificado por PCR para seqüências de

cromossomo Y em mulheres, longo tempo após uma gravidez do sexo masculino, foi

considerado como uma evidência de células fetais masculinas persistentes. Há

relatos da presença de DNA de células de feto masculino em sangue de mulher que

teve seu último filho 27 anos antes do estudo (Bianchi et al., 1996).

I.3. DNA livre fetal em circulação materna

Estudos que demonstraram a existência de DNA tumoral livre (cell-free) no

plasma de pacientes (Chen et al., 1996), levaram à pesquisa de DNA fetal no

plasma de mulheres grávidas realizada primeiramente por Lo et al. (1997). A análise

quantitativa do DNA fetal presente no plasma demonstrou que este pode compor até

3-4% do DNA total, devido a isso existe uma superioridade do DNA fetal em relação

às células fetais que estão presentes numa proporção muito pequena no sangue

materno (Lo et al., 1998). A detecção de células fetais na circulação materna tem

mostrado implicações em doenças autoimunes e seu potencial como fonte de célula-

tronco para as mães. No entanto, a metodologia disponível para pesquisar estas

células é cara e complexa, devido à permanência de células fetais na circulação

materna após a gravidez e sua escassez (Ramos, 2006).

Rijnders et al (2003) sugerem que o DNA livre fetal de uma gravidez anterior

não pode ser detectado em soro materno, mesmo usando uma técnica altamente

sensível. A partir destes resultados, outros estudos evidenciaram a superioridade

prática do DNA fetal plasmático em relação às preparações de células fetais

isoladas do sangue materno. Além disso, o isolamento do DNA fetal a partir do

plasma materno é relativamente fácil, barato e permite o processamento simultâneo

de muitas amostras (Blazer et al., 2004; Ramos, 2006).

A maior parte dos grupos de pesquisa utiliza, como marcador de DNA fetal,

seqüências do cromossomo Y em grávidas de fetos masculinos. Outros alvos estão

sendo pesquisados, dentre eles o genótipo Rh(D) (Lo et al., 1998), a α-talassemia

(Chiu et al., 2002), a acondroplasia (Saito et al., 2000), e até mesmo a síndrome de

Down (Lo et al., 1999).

Métodos mais recentes utilizam equipamentos de detecção em tempo real

(real-time PCR), possibilitando com isso menor risco de contaminação e a obtenção

de níveis mais altos de sensibilidade (Bischoff et al., 2002; Bianchi, 2004). A

utilização dessas técnicas como diagnóstico pré-natal não invasivo está crescendo,

mas ainda é tratada com cuidado (Boon et al., 2007).

Quantificações anormais de amostras de DNA de células fetais livres

correlacionam-se com um elevado número de alterações da placenta. Segundo

Bianchi (2004) a implantação de DNA fetal como marcador pode ser incrementada

por pesquisas de polimorfismos, marcadores epigenéticos ou de RNAm.

I.3.1. Clearance

Do mesmo modo que é crescente a quantidade de DNA livre fetal no plasma

materno durante a evolução da gravidez, este decresce logo após o nascimento.

Segundo Kolialexi et al., (2004) foi encontrada uma taxa de apoptose de 12,5% (9,2-

14,7%) entre a 37 e 38 semanas de gestação. Trinta minutos após o parto, a taxa

era de 25,1% (16,8-28,5%), em 12 horas de 12,5% (10,9-14,1%), em 24 horas de

6,1% (4,8-7,1%), e em 48 horas de 2,3% (1,3-3,0%). As células fetais sofrem

apoptose no plasma materno em até 48 horas após o nascimento. A apoptose

explica em parte o desaparecimento do DNA livre fetal da circulação materna logo

após o nascimento, porque é uma reação rápida terminada dentro de 2-3 horas.

Estes achados confirmam que o DNA livre fetal no plasma materno é um instrumento

adequado para o diagnóstico pré - natal não invasivo.

I.4. Aplicações da detecção de DNA livre fetal através de sangue materno

A natureza não invasiva desta técnica, recentemente muito pesquisada,

representa a maior vantagem sobre os métodos convencionais de diagnóstico pré-

natal. Além da utilização do DNA livre fetal para a sexagem do embrião e/ou feto,

muitas doenças genéticas causadas por mutações que resultam em diferenças sutis

entre as seqüências de DNA materno e fetal, como a acondroplasia, a doença de

Huntington, a fibrose cística e a presença de Hemoglobina E, também poderiam ser

diagnosticadas, significando a detecção ou exclusão do alelo mutante paterno no

plasma materno (Ding et al., 2004). Em outras doenças, nas quais a quantidade de

DNA fetal na circulação materna é elevada, a quantificação do mesmo pode ser um

dos primeiros indícios de que algo está errado na gestação (Bianchi et al., 2004;

Zhong et al., 2001).

I.4.1. A Hiperplasia Adrenal Congênita

De origem genética, com padrão de herança autossômico recessivo, a

Hiperplasia Adrenal Congênita (HAC) é causada pela deficiência total ou parcial de

enzimas envolvidas na via metabólica do colesterol e na síntese de corticóides pela

glândula adrenal (ou supra-renal) (New et al., 1989)(Figura 1). O defeito mais

comum na HAC é a deficiência da enzima 21-hidroxilase, embora qualquer uma das

várias etapas enzimáticas possa ser defeituosa (Friães et al., 2003).

Tradicionalmente é classificada em duas formas clínicas: clássica, que inclui

os subgrupos perdedora de sal e virilizante simples; e não clássica, que inclui os

subgrupos sintomática e assintomática (ou críptica). A forma virilizante simples

caracteriza-se por graus variados de virilização pré-natal da genitália externa no

sexo feminino e virilização pós-natal em ambos os sexos, com aumento do clitóris ou

pênis, pubarca precoce e avanço da idade óssea com prejuízo na estatura final. A

forma perdedora de sal, além da hiperprodução androgênica da forma anterior,

apresenta deficiência mais severa na produção de aldosterona levando à

desidratação com hiponatremia e hiperpotassemia nos primeiros 30 dias de vida

que, se não tratada, resulta em choque e óbito

(Miller e Levine, 1987). Numa época

posterior da infância, em ambos os sexos, há um rápido crescimento e maturação

esquelética acelerada (New et al., 1989).

Em casos de risco da HAC acometer o feto da gestação atual, pode-se aplicar

a terapia pré-natal com corticóides que poderia diminuir a masculinização dos fetos

femininos. Com o objetivo de minimizar os efeitos colaterais, tem sido preconizada a

interrupção da terapia no caso de fetos masculinos (afetados ou normais) e de

femininos normais. Neste caso, é necessária a sexagem no início da gravidez, a

qual, normalmente, é realizada por métodos invasivos (Bartha et al., 2003).

I.4.2. Pré-eclâmpsia

A pré-eclâmpsia caracterizada por um aumento na pressão arterial e

proteinúria após 20 semanas de gravidez. Suas potenciais complicações, tais como

eclâmpsia, representam um dos mais sérios problemas de saúde materna e fetais

(Bischoff et al., 2005).

No Brasil, as síndromes hipertensivas gestacionais associadas, contribuem

com 20 a 30% das causas de mortes maternas. Na América Latina e no Caribe elas

representam a maior causa de óbito materno (Khan et al., 2006). As síndromes

hipertensivas gestacionais, hipertensão gestacional e a pré-eclâmpsia/eclâmpsia,

contribuem significantemente para a mortalidade e a morbidade neonatais e

natimortos (ACOG, 1996).

Lo et al. (1997) constataram um aumento de DNA fetal circulando na mulher

com pré-eclâmpsia quando comparado com o grupo controle. Zhong et al. (2001)

observaram que o aumento nos níveis de DNA fetal e materno circulante

correspondia ao grau de severidade da doença, podendo o nível de DNA fetal

circulante servir como sinalizador do prognóstico da gravidade do quadro clínico.

I.5. Sexagem fetal através de sequências Y-específicas

Segundo Lo (2000), vários autores têm se voltado para tentativas de sexagem

embrionária e fetal não invasivas através de sangue materno utilizando PCR e

amplificação de seqüências Y-específicas. O cromossomo Y, na maioria das

espécies, é o menor do genoma com aproximadamente 1% do conteúdo do genoma

humano (60 x 10

pb), sendo constituído por três tipos de DNA com propriedades

distintas.

O primeiro grupo é composto pelo DNA das regiões pseudo-autossômicas

localizadas nos extremos dos braços curto (Yp) e longo (Yq) do cromossomo Y (Liu

et al., 2002; Willard, 2003). Os genes das regiões pseudo-autossômicas apresentam

um padrão de herança semelhante ao dos cromossomos autossômicos (Burgoyne,

1982; Simmler et al., 1985). Nas regiões pseudo-autossômicas terminais durante a

meiose masculina, pode ocorrer o crossing-over. Uma troca obrigatória em PAR1

(região pseudo-autossômica 1),em Xp/Yp, região pseudo-autossômica de 2,6 Mb,

criando um macho-específico com a recombinação “hot domain”, com uma taxa de

recombinação aproximadamente 20 vezes superior que a média do genoma.(Royer

et al., 1986; Page et al., 1987; Rappold, 1993; May et al., 2002). A região pseudo-

autossômica 2 (PAR2) é utilizada para explorar as características e as relações

internas da epigenética e os circuitos envolvidos neste fenômeno (D’Esposito et al.,

1996; Heard, 2005).

O segundo é formado por seqüências repetitivas de DNA satélite, sem função

aparente, cobrindo 50% a 70% de Yq, estando sua maior parte na heterocromatina

(Georges et al., 1995; Ma et al., 1996; Kappes et al., 1997). As seqüências

repetitivas de DNA satélite são utilizadas na medicina forense, pois os padrões

estabelecidos entre estas permitem a aplicação destes marcadores em teste de

paternidade (Lesing et al., 2005).

O terceiro é formado por genes específicos do cromossomo Y, localizado no

limite proximal da região pseudoautossômica de Yp indo até o centrômero e deste

até a região heterocromática de Yq (Figura 2) (Haqq e Donahoe, 1998; Liu et al.,

2002; Willard, 2003). Na maioria das vezes para a sexagem são utilizadas

seqüências altamente repetitivas ou os genes SRY (Sex-Determining Region of the

Y chromosome), AMGY (Amelogenin Y Gene) e ZFY (Azoospermia Factor)

(Levinson et al., 1992, Rijnders et al., 2004, Malcov et al., 2004).

O gene SRY foi descoberto através da análise de pequenos fragmentos do

cromossomo Y que tinham sido translocados para o cromossomo X em genomas de

homens XX e no hermafroditismo verdadeiro (Sinclair et al., 1990).

Apesar de ser um gene de cópia única, tradicionalmente o gene SRY tem sido

mais utilizado para a sexagem fetal pelo plasma materno por se tratar de um Fator

Determinante de Testículo mais importante mapeado no cromossomo Y (Poulat et

al., 1997; Maron et al.,2007; Liu et al.,2007).

Dados obtidos por Martinhago, et al. (2006) utilizando a região Y específica

DSY 14, coincidem com os relatos da literatura que mostram que a precisão da

técnica, PCR em tempo-real, é superior a 97% quando a análise é realizada a partir

da sétima semana de gravidez. A razão para não detectar o cromossomo Y em

alguns casos estudados por estes autores não é clara. Neste mesmo estudo,

detectou-se o sexo fetal com cinco e seis semanas de gravidez, com uma ampla

margem de confiança e a subseqüente quantificação de DNA masculino no plasma

materno.

Sabe-se que a concentração de DNA fetal no sangue materno aumenta com a

idade gestacional (Lo et al., 1998), e, portanto, quanto maior a idade gestacional,

mais fácil a sexagem fetal.

Figura 1: Representação esquemática do cromossomo Y humano mostrando o

mapeamento de alguns dos genes (modificado de Malcov et al., 2004).

I.5.1. Gene TSPY

O TSPY (Testis-especfic Protein, Y-encoded) é um dos genes Y-específicos

(Arnemann et al., 1991; Affara et al., 1996) e, na espécie humana, é repetitivo com

cerca de 30 a 60 cópias por cromossomo Y (Arnemann et al., 1987; Jakubiczka et

al., 1993; Manz et al., 1993). TSPY é parte de uma família de genes repetitivos

heterogêneos descrita na parte proximal do Yp humano, com 20-40 cópias

estimadas de seqüências relacionadas. As cópias adicionais foram mapeadas no

braço longo do cromossomo Y (Yq11.23) (Ratti et al., 2000) (Figura 3). Este gene é

quase que exclusivamente expresso em espermatogônia e mais raramente em

espermatócitos primários, sugerindo um papel do produto do gene na

espermatogênese (Schnieders et al., 1996); atuando, de fato, como um dos

principais fatores de fertilidade do homem (Vogt, 1997).

Os genes da família de TSPY são organizados em clusters ao longo do

cromossomo Y de várias espécies de mamíferos (Vogel e Schmidtke, 1998), e

diversos estudos evidenciaram a existência de homólogos desse gene em várias

espécies, dentre elas estão as bovinas, eqüinas e humanas (Jakubiczka et al., 1993;

Schempp et al., 1995; Vogel et al., 1997).

O transcrito principal, denominado TSPY-S, previamente TSPYmajor, é

expresso exclusivamente no testículo e a proteína localiza-se, predominatemente,

na espermatogônia, e em menor grau, no espermatócito primário (Schnieders et al.,

1996). A proteína TSPY é um membro de uma superfamília, que inclui os fatores

ativadores do processo de replicação SET e NAP, assim como as proteínas ligantes

de ciclina B (Lardone et al., 2007).

O TSPY é um gene candidato para o locus do gonadoblastoma no

cromossomo Y (GBY), que predisporia as gônadas disgenéticas de pacientes com

distúrbios da determinação e da diferenciação sexuais ao desenvolvimento do

gonadoblastoma (Page, 1997). O gene é expresso em níveis elevados no

gonadoblastoma, indicando sua possível função oncogênica neste tipo de tumor das

células germinativas (Oram et al., 2006).

Estudos demonstraram que o gene TSPY está expresso abundantemente em

outros tumores gonadais como os seminomas, concomitantemente a marcadores

tumorais já estabelecidos na literatura (fosfatase alcalina semelhante à placentária,

c-KIT e OCT4) e a marcadores proliferativos (Ki-67 e ciclina B1). A expressão

ectópica de TSPY em cultura de células promove a regulação positiva de genes pró-

crescimento, incluindo genes freqüentemente amplificados em células germinativas

de tumores testiculares. O TSPY, em combinação com outros marcadores, pode ser

um marcador importante para o diagnóstico e a classificação destes tumores, bem

como para confirmar seu papel na patogenia de tumores gonadais (Li et al., 2007).

O gene TSPY o qual está presente na forma de múltiplas cópias no genoma

masculino, também foi utilizado para detecção do cromossomo Y em pequenas

amostras de DNA em substituição ao gene SRY (cópia única) em pesquisas com

blastocisto único humano (Kenneth et al., 2000), para a sexagem fetal em sangue de

bovinos (Lemos, 2004) e em pesquisas com a síndrome de Turner,(Bartmann et al.,

2004).

Figura 2: Esquema do cromossomo Y humano mostrando a localização do gene

TSPY (modificado de Mysid, 2007).

A sexagem fetal vem sendo descrita por muitos autores de diferentes países,

com resultados relativamente precisos (Costa et al.,2001; Boon et al.,2007). Para

sexagem fetal pelo plasma materno, diversos marcadores moleculares têm sido

utilizados dentre eles pode-se destacar: o gene SRY e a região Y específica DYS-

14.

No presente estudo foi escolhido, pela primeira vez na literatura envolvendo

sexagem fetal a partir de sangue periférico em humanos, o gene TSPY, pois se trata

de um gene Y-específico de múltiplas cópias o que permite, após a reação de PCR,

melhor visualização do sinal em gel de agarose, em contraste com o SRY que

possui cópia única na espécie humana (Kenneth et al., 2000, Bartmann et al., 2004).

II – OBJETIVOS

1. Sexagem fetal a partir de plasma materno por meio do gene TSPY,

utilizando a Reação em Cadeia da Polimerase;

2. Verificar a especificidade e sensibilidade da sexagem fetal com o gene

TSPY correlacionando com o sexo fenotípico fetal verificado pela ultrassonografia

e/ou pelo exame físico do recém-nascido;

3. Correlacionar a sensibilidade da sexagem com a idade gestacional e

com o sexo fenotípico.

III - CASUÍSTICA E

METODOLOGIA

III.1. Pacientes

Foram incluídas, para as pesquisas transversal e longitudinal, mulheres

grávidas, hígidas, em diferentes idades gestacionais (IG) e excluídas mulheres não

grávidas ou sem os requisitos de inclusão. Dados adicionais sobre as pacientes

foram coletados através de entrevista e revisão dos prontuários médicos.

Como controles foram incluídos duas pacientes grávidas de feto masculino

confirmado, um homem normal com fertilidade comprovada, uma paciente grávida

de feto feminino sem gravidez prévia e uma mulher normal nulípara.

As pacientes foram atendidas pelos médicos do Departamento de Ginecologia

e Obstetrícia do HCFMRP-USP. O sexo fetal foi confirmado através de

ultrassonografia e o dos recém-nascidos pelo exame físico. Nos casos em que as

crianças não nasceram no serviço, foram solicitados aos pais os resultados da

Declaração de Nascidos Vivos, onde constava o sexo observado pelo médico

responsável.

Foi explicado para os casais que se tratava de técnica em fase experimental

de implantação e, como tal, sujeita a erros. Os resultados foram comunicados às

pacientes que o desejaram durante o pré-natal.

O trabalho foi iniciado após aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa em

Seres Humanos do HCFMRP-USP, Processo HCRP n°6147/2005 (Anexo 1) e da

Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP) do Ministério da Saúde. Antes

da coleta do exame, as pacientes assinaram o termo de consentimento livre e

esclarecido (Apêndice A), e responderam a um questionário informativo (Apêndice

B), durante consulta no Departamento de Ginecologia e Obstetrícia do HCFMRP-

USP.

III.2. Material e Métodos

III.2.1. Análise Molecular

III.2.2. Extração de DNA de amostras de sangue

Foram coletadas, após a assinatura do termo de consentimento livre e

esclarecido, amostras de sangue materno por punção venosa em tubos PPT

(Plasma Preparation Tube) da marca Beckton-Dickinson (BD) e K3 EDTA da marca

Vacutainer. Esse material foi imediatamente centrifugado e separado em tubos de

1,5µl no Laboratório de Reprodução Humana do Departamento de Ginecologia e

Obstetrícia HCFMRP-USP e levado refrigerado para o Laboratório de Epigenética e

Reprodução da FMPR – USP, onde foi realizada a análise genética.

O DNA foi extraído em duplicata seguindo o protocolo do Kit Qiagen:

QIAamp® Blood Mini Kit da Qiagen (Chattlesworth, CA, EUA): utilizando 20 µl de

enzima protease, 200 µl de amostra de plasma, 200 µl de buffer AL, mistura no

pulso-vortex por 15 segundos, incuba a 56ºC por 10 minutos, adiciona 200 µl de

etanol absoluto, mistura no pulso-vortex por 15 segundos, aplica a mistura na coluna

montada do kit, cetrifuga por 1 minuto a 8000 rpm, despreza o filtrado trocando de

tubo, adiciona 500 µl de buffer AW1, centrifuga por 1 minuto a 8000 rpm, descarta o

filtrado trocando o tubo, adiciona 500 µl da buffer AW2 centrifuga por 3 minutos a

14000 rpm, adiciona 200 µl e buffer AE, incuba à temperatura ambiente por 5

minutos, centrifuga por 1 minuto a 8000 rpm e armazena o produto da extração em

tubo de 1,5 µl.

III.2.3. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

Foram pesquisados os genes Tests-Specific Protein, Y-encoded (TSPY) e da

β-globina, utilizado para verificar a presença de DNA na reação por estar presente

no genoma de ambos os sexos, mapeados nos cromossomos Y e 11,

respectivamente.

Foi realizada Nested PCR para o gene TSPY (uma primeira PCR, que

amplificava um segmento maior, e uma segunda PCR onde os primers eram

mapeados internamente à seqüência amplificada na primeira PCR), e uma PCR

simples para o gene controle (Figura 4). As reações de amplificação foram

realizadas em aparelho termociclador modelo Stratagene® - Robo Cycler 40,

seguindo os protocolos da referida empresa e de Innis et al. (1990), em tubos de

200µL. A primeira reação foi constituída de volume de 10µL, contendo 7,02µL de

água miliQ, 1,0µL de solução tampão (constituída de 20mM Tris-HCl, 0,1mM EDTA,

1mMDTT, 50% glicerol, estabilizadores), 0,3µL de MgCl

, 0,2µL de dNTP (bases

púricas e pirimídicas diluídas em água ultra pura), 0,2µL de cada um dos primers

externos (SENSE1 e ANTI-SENSE1) (Tabela 1), 0,08µL de Taq Polimerase e 1µL de

DNA. A segunda reação foi constituída de um volume de 10µL, contendo 6,42µL de

água, 1,0µL de solução tampão (constituída de 20mM Tris-HCl, 0,1mM EDTA,

1mMDTT, 50% glicerol, estabilizadores), 0,3µL de MgCl

, 0,2µL de dNTP, 0,5µL de

cada um dos primers internos (SENSE2 e ANTI-SENSE2) (Tabela 1), 0,08µL de Taq

Polimerase e 1µL do resultado da primeira reação. Em todas as reações foi incluído

um controle negativo de amplificação contendo todos os reagentes e substituindo o

DNA por água ultrapura.

Os produtos das amplificações foram aplicados em géis de agarose a 2%,

contendo 8µL de brometo de etídio. A eletroforese foi realizada utilizando tampão

Tris-Borato-EDTA a 1%. Após a eletroforese, os fragmentos foram visualizados e

fotografados sob luz ultravioleta e as fotos, digitalizadas.

Foram consideradas positivas para o sexo masculino as amostras que

apresentaram fragmento de tamanho 236pb, correspondente à seqüência do gene

TSPY estudada e amostras negativas para TSPY (feminina) as que não

apresentaram o fragmento correspondente à seqüência do gene TSPY, mas que

apresentaram a amplificação de fragmento de 619pb, correspondente à seqüência

do gene da β-globina, a qual indica a presença de DNA na reação.

A análise molecular foi realizada pelo menos três vezes (triplicata) para cada

uma das coletas do estudo, utilizando em todas elas três controles positivos (dois de

DNA extraído de duas pacientes grávidas de 40 semanas de feto masculino e um de

DNA extraído de plasma masculino), dois controles negativos (um de DNA extraído

de paciente grávida de feto feminino e outro de DNA extraído de plasma feminino),

além de um controle negativo (sem DNA) para a reação.

1-Primers externos;

2-Primers internos.

Figura 3: Esquema dos resultados da Nested PCR para o gene TSPY

Tabela 1: Seqüências dos primers internos (TSPY SENSE1 e TSPY ANTI-SENSE1)

e externos (TSPY SENSE2 e TSPY ANTI-SENSE2) do gene TSPY, e seqüências

dos primers do gene da β-globina

Gene

Seqüência dos

primers

5’

3’

TSPY SENSE1

GTGGAAGAAGAGAAGCATCC

TSPY ANTI-SENSE1 GAGTGGAATGAGAAGCCCTG

TSPY SENSE2 CTGACGAAGATGAAGTCATGC

TSPY ANT-SENSE2 AGTCCCCTGACGTCTCTGTT

β –GLOBINA SENSE

β -GLOBINA ANTI-SENSE

CCTGAGAGCTTGCTAGTGATT

TAGTCCCACTGTGGACTACTT

III.2.4. Análise estatística

A matriz de confusão apresenta uma medida efetiva do modelo de

classificação, mostrando classificações corretas versus classificações preditas para

cada classe, num conjunto de exemplos (Monard, Baranauskas, 2003).

Numa matriz de confusão com apenas duas classes, denominadas como

classe observada e classe predita, elas podem ser rotuladas como, positiva e

negativa. Na classe observada foram utilizados métodos diagnósticos consagrados

como a ultrassonografia e o exame físico do recém-nascido. Na classe predita foi

considerado o método de diagnóstico em teste, ou seja, a sexagem fetal.

Foram construídas duas matrizes de confusão considerando as pacientes

com menos de sete semanas de gestação e com mais de setes semanas (tabela 2).

Os valores observados dentro da tabela de confusão são denominados como:

1- Verdadeiro Positivo (TP): número de exemplos positivos classificados

corretamente;

2- Verdadeiro Negativo (TN): número de exemplos negativos classificados

corretamente;

3- Falso Positivo (FP): número de exemplos positivos classificados

erroneamente pela classe predita;

4- Falso Negativo (FN): número de exemplos negativos classificados

erroneamente pela classe predita;

5- Total Preditos Positivos (l): total de exemplos classificados como positivos

pela classe predita;

6- Total Preditos Negativos (

): total de exemplos classificados como

negativos pela classe predita;

7- Total Observados Positivos (r): total de exemplos classificados como

positivos pela classe observada;

8- Total Observados Negativos (

): total de exemplos classificados como

negativos pela classe observada;

9- Total (n): número total e exemplos.

Na matriz de confusão podem ser calculadas taxas de erros (Monard,

Baranauskas, 2003), que avaliam a capacidade preditiva do método diagnóstico, a

sexagem fetal:

1- Taxa de Erro para Falso Negativo (

FNErr

=)(

): mensura a

porcentagem do erro falso negativo, em relação à classe observada positiva;

2- Taxa de Erro para Falso Positivo (

PErr

=)(

): mensura a porcentagem

do erro falso positivo, em relação à classe observada negativa;

3- Taxa de Erro Total (

FNFP

totalErr

=)(

): mensura a porcentagem de ambos

os erros em relação ao número total de exemplos.

Várias medidas podem ser derivadas a partir da matriz de confusão (Weiss,

Kulikowski, 1991; Piatetsky-Shapiro, 1991), capazes de descrever o comportamento

da classe predita em relação à classe observada:

1- Confiabilidade Positiva (

=Pr

): relaciona a capacidade do método

diagnóstico classificar como verdadeiros positivos em relação ao total de

preditos positivos. Uma alta confiabilidade positiva indica que o resultado

positivo para TSPY resultará alta probabilidade do feto ser do sexo masculino;

2- Confiabilidade Negativa (

Nrel

): relaciona a capacidade do método

diagnóstico classificar como verdadeiros negativos em relação ao total de

preditos negativos. Uma alta confiabilidade negativa indica que o resultado

negativo para TSPY resultará alta probabilidade do feto ser do sexo feminino;

3- Suporte (

Sup =

): quantifica a incidência de verdadeiros positivos em

relação ao número total de exemplos. Valores de suporte próximos a 50%

indicam bom desempenho do método diagnóstico, dado que, são esperados

numa amostra, metade de fetos de sexo masculino e outra metade de sexo

feminino;

Sensibilidade (

Sens

): mensura a porcentagem de verdadeiros

positivos em relação à classe observada positiva. O método diagnóstico será

considerado sensível quando o TSPY positivo estiver relacionado ao feto do

sexo masculino

;

5- Especificidade (

Stec

): mensura a porcentagem de verdadeiros

negativos em relação à classe observada negativa. O método diagnóstico será

considerado específico quando o TSPY negativo estiver relacionado ao feto do

sexo feminino;

6- Precisão Total (

TNTP

Tacc

): mensura a porcentagem de verdadeiros

positivos e verdadeiros negativos. O método diagnóstico será considerado

preciso quando classificar corretamente o sexo fetal;

7- Novidade (

Nov

−=

): a novidade é definida verificando se verdadeiros

positivos são independentes do total de preditos positivos e o total de

observados positivos. Quanto mais o valor observado diferir do esperado

maior a probabilidade de existir uma associação verdadeira e inesperada entre

o total preditos positivos e o total observados positivos. A novidade é um valor

que varia no intervalo Nov=[-25%;+25%]. Valores próximos a +25% indicam

forte associação entre total preditos positivos e total observados positivos, ou

seja, existem poucos fatores inesperados que fariam com que o TSPY positivo

fosse para o feto do sexo feminino. Valores próximos a -25% indicam forte

associação entre total preditos positivos e total observados negativos, ou seja,

existem muitos fatores inesperados que fariam com que o TSPY positivo fosse

para o feto do sexo feminino.

8- Satisfação (

FNn

Sat

−=

): indica o aumento relativo na precisão entre as

regras se total preditos positivos então “verdade” e se total preditos positivos

então total observados negativos. Altos valores de satisfação indicam que o

método diagnóstico classifica como positivo quando realmente é observado

um feto do sexo masculino.

Tabela 2: Tabela da matriz de confusão utilizada para a realização da análise

estatística

Classe Observada

(US_EF)

Classe Predita (TSPY)

Total

Positivo Negativo

Masculino (Positivo)

Feminino (Negativo)

Total

Medida Sigla Fórmula Resultado

Verdadeiro Positivo TP

Verdadeiro Negativo TN

Falso Positivo FP

Falso Negativo FN

Total Preditos

Positivos

Total Preditos

Negativos

lt(traço)

Total Observados

Positivos

Total Observados

Negativos

rt(traço)

Total N

Taxa de Erro para FN

Err(FN) FN/(TP+FN)

Taxa de Erro para FP

Err(FP) FP/(FP+TN)

Taxa de Erro Total Err(total) (FP+FN)/n

Confiabilidade

Positiva

Prel TP/(TP+FP)

Confiabilidade

Negativa

Nrel TN/(TN+FN)

Suporte Sup TP/n

Sensibilidade Sens TP/(TP+FN)

Especificidade Spec TN/(TN+FP)

Precisão Total Tacc (TP+TN)/n

Novidade Nov (TP/N)-(l*r)/(n^2)

Satisfação Sat 1-(n*FN)/(l*rt)

IV – RESULTADOS

De 132 mulheres entrevistadas para a pesquisa, 102 pacientes aceitaram

participar do projeto. O trabalho foi realizado de forma transversal (apenas um

exame/paciente) em 94 gestantes de idades gestacionais (IGs) diferentes (entre

duas e 40 semanas) e em oito gestantes de forma longitudinal (seguimento com

exames realizados em diferentes IGs da mesma paciente). Destas 102 pacientes, 63

eram de gestação natural, sendo deste grupo as gestantes que aceitaram coleta

longitudinal, e 39 gestantes do programa de fertilização in vitro (FIV) e injeção intra-

citoplasmática de espermatozóide (ICSI) do laboratório de Reprodução Humana do

Departamento de Ginecologia e Obstetrícia HCFMRP-USP.

Foi observado um melhor desempenho na reação de PCR ao utilizar a

amostra de DNA conservado a -20°C por pelo menos 24hs após a finalização da

técnica de extração, quando comparado com o uso deste DNA logo após a

finalização da técnica de extração

Na figura 4 é apresentado um gel de agarose corado com brometo de etídio

onde pode ser visualizado fragmentos de comprimento de 236pb, correspondente à

seqüência do gene TSPY sendo o resultado do exame considerado positivo para o

sexo masculino, e amostras que não apresentaram o fragmento, portanto

consideradas como negativas para presença do gene TSPY e, conseqüentemente ,

de fetos femininos. Na figura 4 foi apresentado outro gel onde pode ser visualizada a

banda correspondente a seqüência correspondente ao gene da β-globina, a qual

indica a presença de DNA na reação (controle da amplificação).

M B P 1 2 3 4 5

Figura 4: Foto do resultado da eletroforese em gel de agarose 2% da

Nested PCR para o gene TSPY. (M) Marcador de 100bp; (B) branco;

(P) Controle de DNA extraído de plasma de um homem normal; (1)

DNA extraído de plasma de gestante de feto masculino; (2) DNA

extraído de plasma de gestante de feto masculino; (3) DNA extraído de

plasma de gestante de feto feminino; (4) DNA extraído de plasma de

gestante de feto masculino; (5) DNA extraído de plasma de gestante de

feto feminino.

M B P 1 2 3

Figura 5: Foto do resultado da eletroforese em gel de agarose 2% da

PCR para o gene da β-globina. (M) Marcador de 100bp; (B) branco; (P)

Controle de DNA extraído de plasma de um homem normal; (1) DNA

extraído de plasma de gestante de feto masculino; (2) DNA extraído de

plasma de gestante de feto masculino; (3) DNA extraído de plasma de

gestante de feto feminino.

Através da análise das amostras submetidas à Nested PCR, foram detectadas

40 (39,2%) gestações com resultados positivos para o cromossomo Y e 62 (60,8%)

negativos. Em 102 pacientes tivemos 67 casos onde foi possível comparar os

resultados do exame com sexo fetal através da ultrassonografia ou exame físico do

recém-nascido, 36 (59,2%) resultaram em positivos para TSPY, 29 (38,2%)

resultaram em negativos e dois (2,6%) resultados foram falso-negativos. Nas tabelas

3, 4, 5, 6, 7 foram subdivididos os resultados relativos às 102 pacientes.

Na tabela 3 são apresentados os resultados de 54 das pacientes de feto único

com idades gestacionais variáveis (de duas a 40 semanas) provenientes de

gestação natural (38) e reprodução assistida (16); os quais foram confirmados por

exame físico do recém-nascido ou ultrassonografia. Observaram-se dois resultados

falso-negativos, sendo um deles de duas semanas pós-transferência do embrião

(ICSI), e outro com cinco semanas (gestação natural).

Na tabela 4 são apresentadas onze pacientes gestantes de fetos múltiplos,

cujo sexo foi confirmado também por exame físico do recém-nascido ou

ultrassonografia.

Onze gestações resultaram em aborto, em idades gestacionais variadas, e,

nesses casos, o sexo fetal de dois casos em que o resultado positivo para o gene

TSPY foi confirmado através de exames anátomo-patológico fetal ou

ultrassonografia, apresentados na tabela 5.

Em 26 pacientes apresentadas na tabela 6 os fenótipos não foram

confirmados, alguns devido à perda de contato com a paciente (14 casos) e outros

devido à gestação em andamento até o momento (12 casos).

Na tabela 7 mostra 31 casos com menos de sete semanas de gestação cujo

sexo foi confirmado por exame físico do recém-nascido ou ultrassonografia. A

análise estatística dos casos onde mostrou que a confiabilidade positiva foi de

88,89%, a confiabilidade negativa foi de 100%, o suporte de 48,48%, especificidade

88,24%, precisão 93,04% e novidade de 22,04% para gestações com menos de sete

semanas (Tabela 13 em apêndice).

Na tabela 8 são apresentados 34 pacientes com idade gestacional maior ou

igual a sete semanas de gestação cujo sexo fenotípico foi confirmado por exame

físico do recém-nascido ou ultrassonografia. A análise estatística dos casos onde

mostrou que a confiabilidade positiva foi de 100% com mais de sete semanas o que

mostra que e a confiabilidade positiva foi de 100%, a confiabilidade negativa foi de

100%, o suporte de 50%, especificidade 100%, precisão 100% e novidade de 25%

para gestações com idade gestacional maior ou igual a sete semanas (Tabela 14 em

apêndice)

Em nenhum dos casos em que foi possível a confirmação do sexo fetal e/ou

do recém-nascido foi encontrado resultado falso-positivo, o que demonstra boa

especificidade da técnica.

Dos oito casos que foram realizados o estudo longitudinal, três apresentaram

resultados positivos para TSPY e quatro apresentaram resultados negativos para

TSPY desde a primeira coleta, e estes resultados não se modificaram com a

evolução da gestação.

Tabela 3: Resultados da amplificação dos genes TSPY e β-globina, comparado com

o resultado da ultrassonografia pré-natal e/ou exame físico do recém-nascido em

gestações de feto único apresentando a idade gestacional, o número de filhos

anteriores e o sexo destas crianças/fetos.

Caso

Nº

banco

DNA

TSPY

Β-

globina

US/Ex.

físico

Falso

neg

Tipo de

gestação

I.G.

(semanas)

Nº e sexo

filhos

1 350 - + F FIV 6

2 353 - + F ICSI 5 2F 1M

3 355 - + F FIV 7

4 358 - + F ICSI 2

5 361 - + F ICSI 6

6 362 - + F FIV 5

7 364 + + M ICSI 6

8 379 + + M FIV 2

9 380 - + F FIV 2

10 385 + + M NAT 17

11 395 + + M NAT 40 4F 1M 1A

12 396 + + M NAT 40 1F 1M

13 397 + + M NAT 10

14 398 + + M NAT 20 1F 1M 1A

15 399 + + M NAT 13 1F 1M

16 403 - + F NAT 30

17 404 - + F ICSI 2 1A

18 457 - + M * ICSI 2

19 459 + + M ICSI 2

20 463 - + F NAT 13

21 464 - + F NAT 8

22 465 - + F ICSI 2

23 466 + + M ICSI 4

24 467 - + F NAT 31

25 469 + + M NAT 10 3F 2M

26 470 + + M NAT 13 1F 1M

27 471 + + M NAT 25

28 605 - + F NAT 15

29 606 - + F NAT 11

30 607 - + F NAT 10 1F

31 643 - + F NAT 10;16;18 1F 1A

32 648 - + F NAT 7 1M

33 650 - + F NAT 13 1A

34 654 + + M NAT 6;11;20

35 664 - + F NAT 20

36 665 - + F FIV 2 1A

37 666 - + F NAT 17

Caso

Nº

banco

DNA

TSPY

Β-

globina

US/Ex.

físico

Falso

neg

Tipo de

gestação

I.G.

(semanas)

Nº e sexo

filhos

38 669 - + F ICSI 2 1A

39 663 - + F NAT 9

40 671 - + F NAT 4,12,20 1F 1A

41 712 + + M NAT 17

42 714 - + F NAT 16 2F 3M

43 715 + + M NAT 14

44 716 + + M NAT 14,26

45 717 + + M NAT 21 1M 1A

46 718 + + M NAT 9

47 722 - + F NAT 16 1A

48 723 + + M NAT 10,16

49 748 + + M NAT 6

50 752 + + M NAT 6

51 766 - + F NAT 16,29

52 835 - + M * NAT 5

53 836 - + F NAT 4,12

54 882 - + F NAT 11,2 1A

(DNA) número do registro do DNA; (-) Negativo; (+) Positivo; (F) Feminino; (M)

Masculino; (A) Aborto; (*) Falso negativo; (I.G.) Idade Gestacional em semanas;

(FIV) Fertilização in vitro; (ICSI) Injeção Intra Citoplasmática de Espermatozóide;

(NAT) Natural; em negrito estão destacados os casos falsos negativos

Tabela 4: Resultados da amplificação dos genes TSPY e β-globina, comparado com

o resultado da ultrassonografia pré-natal e/ou exame físico do recém-nascido em

gestações múltiplas apresentando a idade gestacional, o número de filhos anteriores

e o sexo destas crianças/fetos.

Caso

Nº no

banco

DNA

TSPY

β-

globina

US/

Ex.

físico

Falso

Negativo

Tipo de

gestação

I.G.

(semanas)

Número e

sexo de

filhos

1 351 + + M/M/F

FIV 6

2 352 + + M/F ICSI 5 1A

3 354 + + M/F FIV 2 1A

4 359 + + M/M FIV 2

5 360 + + M/F/F

FIV 6

6 363 + + M/M ICSI 5

7 377 + + M/M ICSI 2 2A

8 458 + + M/M FIV 2

9 460 + + M/M NAT 21 1M

10 642 - + F/F ICSI 2

11 668 + + F/M FIV 2

(DNA) número do registro do DNA; (-) Negativo; (+) Positivo; (F) Feminino; (M)

Masculino; (A) Aborto; (*) Falso negativo; (I.G.) Idade Gestacional em semanas;

(FIV) Fertilização in vitro; (ICSI) Injeção Intra Citoplasmática de Espermatozóide;

(NAT) Natural

Tabela 5: Resultados parciais da amplificação dos genes TSPY e β-globina, em

gestações que resultaram em aborto apresentando a idade gestacional, o número de

filhos anteriores e o sexo destas crianças/fetos.

Caso

Nº

banco

DNA

TSPY

β -

globina

US/

Ex.

físico

Falso

Negativo

Tipo de

gestação

I.G.

(semanas)

Número e

sexo de

filhos

1 356 - + A ICSI 2

2 357 - + A MIV 2 1A

3 378 - + A ICSI 4

4 462 - + A ICSI 6

5 641 - + A FIV 2 1A

6 660 - + A NAT 3

7 667 - + A FIV 2 1F

8 670 - + A ICSI 2

9 662 - + A ICSI 2 3A

10 713 + + A NAT 9

11 749 + + A NAT 16

(DNA) número do registro do DNA; (-) Negativo; (+) Positivo; (A) Aborto; (I.G.) Idade

Gestacional em semanas; (FIV) Fertilização in vitro; (ICSI) Injeção Intra

Citoplasmática de Espermatozóide; (NAT) Natural; em negrito estão destacados os

casos falsos negativos

Tabela 6: Resultados da amplificação dos genes TSPY e β-globina, em

gestações para as quais ainda não há a confirmação do sexo fenotipico do recém-

nascido apresentando a idade gestacional, o número de filhos anteriores e o sexo

destas crianças/fetos.

Caso

Nº

banco

DNA

TSPY

β -

globina

US/

Ex.

físico

Falso

Negativo

Tipo de

gestação

I.G.

(semanas)

Número e

sexo de

filhos

1 461 - + NAT 11 1F

2 468 - + NAT 31 2F 1M 1A

3 649 - + NAT 11 1F

4 719 + + NAT 6

5 750 + + NAT 11 2F 1M 1A

6 751 - + ICSI 2

7 88 - + NAT 7

8 764 - + FIV 6

9 765 - + FIV 6

10 817 - + NAT 10

11 820 - + NAT 12

12 821 - + NAT 13 1M

13 822 - + NAT 12 1M

14 823 - + NAT 13 1M

15 827 - + FIV 4 1A

16 828 + + NAT 12

17 829 - + NAT 13

18 830 + + NAT 13 2F 2M

19 831 - + NAT 7

20 832 + + NAT 7

21 833 - + NAT 7

22 834 + + ICSI 6

23 837 - + NAT 6

24 883 - + NAT 7

25 966 - + NAT 10

26 967 - + NAT 7

(DNA) número do registro do DNA; (-) Negativo; (+) Positivo; (M) Masculino; (F)

Feminino; (A) Aborto; (I.G.) Idade Gestacional em semanas; (FIV) Fertilização in

vitro; (ICSI) Injeção Intra Citoplasmática de Espermatozóide; (NAT) Natural.

Tabela 7: Resultados da amplificação dos genes TSPY e β-globina, em gestações

com menos de sete semanas de gestação com sexo fenotípico confirmado

apresentando a idade gestacional, o número de filhos anteriores e o sexo destas

crianças/fetos.

Caso

Nº no

banco

DNA

TSPY

β-

globina

US/

Ex.

físico

Falso

Negativo

Tipo de

gestação

I.G.

(semanas)

Número e

sexo de

filhos

1 350 - + F FIV 6

2 353 - + F ICSI 5

3 358 - + F ICSI 2

4 361 - + F ICSI 6

5 362 - + F FIV 5

6 364 + + M ICSI 6

7 379 + + M FIV 2

8 380 - + F FIV 2

9 404 - + F ICSI 2

10 457 - + M * ICSI 2

11 459 + + M ICSI 2

12 465 - + F ICSI 2 1A

13 466 + + M ICSI 4

14 654 + + M NAT 6;11;20

15 665 - + F FIV 2

16 669 - + F ICSI 2 1A

17 671 - + F NAT 4,12,20 1F 1A

18 748 + + M NAT 6

19 752 + + M NAT 6

20 835 - + M * NAT 5

21 836 - + F NAT 4,12

22 351 + + M/M/F

FIV 6

23 352 + + M/F ICSI 5

24 354 + + M/F FIV 2 1A

25 359 + + M/M FIV 2

26 360 + + M/F/F

FIV 6

27 363 + + M/M ICSI 5

28 377 + + M/M ICSI 2 2A

29 458 + + M/M FIV 2

30 642 - + F/F ICSI 2

31 668 + + F/M FIV 2

(DNA) número do registro do DNA; (-) Negativo; (+) Positivo; (F) Feminino; (M)

Masculino; (A) Aborto; (I.G.) Idade Gestacional em semanas; (FIV) Fertilização in

vitro; (ICSI) Injeção Intra Citoplasmática de Espermatozóide; (NAT) Natural; em

negrito estão destacados os casos falsos negativos

Tabela 8: Resultados da amplificação dos genes TSPY e β-globina, em gestações

com idade gestacional maior ou igual a sete semanas de gestação com sexo

fenotípico confirmado apresentando a idade gestacional, o número de filhos

anteriores e o sexo destas crianças/fetos.

Caso

Nº no

banco

DNA

TSPY

β-

globina

US/

Ex.

físico

Falso

Negativo

Tipo de

gestação

I.G.

(semanas)

Número e

sexo de

filhos

1 355 - + F FIV 7

2 385 + + M NAT 17

3 395 + + M NAT 40

4 396 + + M NAT 40

5 397 + + M NAT 10

6 398 + + M NAT 20

7 399 + + M NAT 13

8 403 - + F NAT 30

9 463 - + F NAT 13

10 464 - + F NAT 8

11 467 - + F NAT 31

12 469 + + M NAT 10 3F 2M

13 470 + + M NAT 13

14 471 + + M NAT 25

15 605 - + F NAT 15

16 606 - + F NAT 11

17 607 - + F NAT 10 1F 1M

18 643 - + F NAT 10;16;18 1F 1A

19 648 - + F NAT 7 1M

20 650 - + F NAT 13 1A

21 664 - + F NAT 20

22 666 - + F NAT 17

23 663 - + F NAT 9

24 712 + + M NAT 17

25 714 - + F NAT 16

26 715 + + M NAT 14

27 716 + + M NAT 14,26

28 717 + + M NAT 21 1M 1A

29 718 + + M NAT 9

30 722 - + F NAT 16 1A

31 723 + + M NAT 10,16

32 766 - + F NAT 16,29

33 882 - + F NAT 11,15 1A

34 460 + + M/M NAT 21 1M

(DNA) número do registro do DNA; (-) Negativo; (+) Positivo; (F) Feminino; (M)

Masculino; (A) Aborto; (I.G.) Idade Gestacional em semanas; (FIV) Fertilização in

vitro; (ICSI) Injeção Intra Citoplasmática de Espermatozóide; (NAT) Natural.

Tabela 9: Análise estatística mostrando a sensibilidade, especificidade, falso positivo

e falso negativo geral (76 casos confirmados o sexo) e das subdivisões (31 casos

com menos de sete semanas e 34 casos com idade gestacional maior ou igual a

sete semanas)

IG Sensibilidade

Especificidade

Falso Positivo

Falso Negativo

IG menor

que 7

semanas 88,20% 100% 0 6,10%

IG maior ou

igual a 7

semanas 100% 100% 0 0

Geral

93,70% 100% 0 3,70%

(IG) Idade Gestacional em semanas; (Geral) total de pacientes confirmado o sexo

através de ultrassonografia e/ou exame físico do recém-nascido

Tabela 10: Análise estatística mostrando a sensibilidade, especificidade, valor

predito positivo e valor predito negativo do sexo masculino e feminino

Sexo Sensibilidade Especificidade

Valor Predito

Positivo

Valor Predito

Negativo

Masculino 93,7% 100% 36 31

Feminino - - - -

(-) por se tratar de um exame onde se pesquisa a presença do cromossomo Y este

não é um exame para detecção de fetos/crianças do sexo feminino, este último é

deduzido por exclusão do sexo masculino.

V - DISCUSSÃO

A descoberta da presença de DNA livre fetal no plasma materno de gestantes

trouxe uma grande evolução nas técnicas de diagnóstico pré-natal não invasivo para

o feto (Lo et al., 1997; Lo e Chiu, 2007). Existem alguns estudos mostrando a

sensibilidade e especificidade do método de determinação do sexo fetal pelo plasma

materno (Lo et al., 1998; Johnson, et al., 2004).

O método de PCR por ser relativamente simples, rápido, relativamente barato

e de grande sensibilidade, que deriva da amplificação exponencial de um fragmento

de DNA ao longo dos ciclos da reação, trouxe grandes contribuições à pesquisa. A

grande sensibilidade da PCR permite detectar pequenas quantidades de DNA fetal

presente no plasma materno. Conforme a evolução da gravidez aumenta a

quantidade de DNA fetal no plasma materno que provém de diferentes tipos de

células fetais (Lo et al.,1998). Por não ser possível separar o DNA fetal do DNA

materno igualmente presente no plasma, mas em maiores quantidades, o

diagnóstico do genótipo fetal só é possível quando este apresentar seqüência de

bases diferentes do materno. No caso da sexagem fetal, o filho difere da mãe em

relação à presença do cromossomo Y (Zhong, et al., 2000).

Neste trabalho foi possível detectar o sexo fetal a partir da 2ª semana de

gestação, embora outros estudos descritos estabelecessem a 5ª e 7ª semana como

o tempo mínimo para a determinação do sexo fetal, devido a uma melhor

confiabilidade dos resultados.

Segundo relatos da literatura trata-se de técnica sujeita a variações, parte

destas derivadas dos métodos de coleta e preparo do DNA (Chiu et al., 2001), da

escolha dos primers de PCR, da metodologia de PCR propriamente dita e da idade

gestacional (Jhonson et al., 2004).

Apesar da sensibilidade e especificidade da PCR em tempo real já ter sido

demonstrada em outros trabalhos (Alberry et al., 2007; Boon et al., 2007; Martinhago

et al. 2007), com a utilização da Nested PCR foi atingida sensibilidade e

especificidade que permitem sua utilização em rotina hospitalar, com um custo

relativamente reduzido. Isso pode contribuir para a implantação desta metodologia

no Sistema Único de Saúde (SUS).

Na maioria dos trabalhos realizados foram encontrados resultados falso-

negativos variando entre 2 a 5% (Sezikawa et al. 2001; Rijnders et al., 2003;

Martinhago et al., 2007; Alberry et al., 2007; Boon et al., 2007). No presente trabalho

falso-negativos também foram encontrados numa proporção de 2,63%. No entanto,

deve ser lembrado que nos dois casos onde isto ocorreu, as coletadas de plasma

foram realizadas com IGs precoces (2 e 5 semanas de gestação) enquanto que nos

outros trabalhos citados anteriormente estes resultados foram detectados em

amostras coletadas em idades gestacionais mais avançadas mostrando uma maior

sensibilidade do teste utilizando seqüência do gene TSPY em relação a outros

marcadores.

Sezikawa et al. (2001) avaliaram 302 gestantes com idade gestacional entre 7

e 16 semanas, utilizando a seqüência genômica DYS-14. Foi encontrado índice de

acerto para o sexo masculino de 97,2% (139 de 143 gestantes). O motivo pelo qual

não se detectou o fragmento do cromossomo Y no plasma das quatro gestantes que

apresentaram resultado falso-negativo não foi esclarecido pelos autores.

Foi avaliado por Rijnders et al. (2003) a presença do gene SRY em 72

gestantes no primeiro trimestre utilizando PCR em tempo real. Em dois casos com

cinco semanas de gestação obtiveram 50% de acerto no sexo fetal, e em quatro

casos com IGs acima de sete semanas obtiveram 100% de acerto.

Jhonson, et al. (2004) avaliaram 20 gestantes de IGs entre 10 e 20

semanas,em cinco laboratórios diferentes através do método de PCR em tempo real

utilizando o gene SRY e obtiveram uma especificidade do método entre 31% a 97%.

Foi pesquisada por Alberry et al. (2007) a região Y específica DYS-14 em 15

gestantes de 11 semanas através do método da PCR em tempo real e obtiveram

100% de sensibilidade e especificidade.

Boon et al. (2007) utilizaram o SRY para sexagem fetal em 58 mulheres

grávidas com média da IG de 11,2 semanas (+-3,3 semanas) através da PCR em

tempo real, obtendo 18 resultados positivos e 25 negativos para SRY com 100% de

sensibilidade e 97,7% de especificidade.

Foram avaliadas por Martinhago et al. (2007) 52 gestantes a partir da 5ª

semana de gestação com 92,6% de acerto em relação ao sexo fetal, utilizando como

marcador o DYS-14.

Outro fato é que muitas gestantes que participaram deste estudo

engravidaram por meio de fertilização in vitro (FIV) o qual confere maior precisão na

determinação da idade gestacional. Além disso, sabe-se que as pacientes que

engravidam naturalmente ou por FIV apresentam a mesma concentração de DNA

fetal circulante no plasma (Pan et al., 2005).

Entre os casos em que não houve concordância do resultado do exame com

o sexo fetal, o plasma havia sido coletado com idade gestacional precoce (2ª e 5ª

semanas), o que nos leva a crer que a quantidade de DNA fetal circulante no sangue

materno, nesses dois casos era insuficiente para a detecção. Também deve ser

lembrado que a paciente com IG de duas semanas fazia parte do grupo de

pacientes da Reprodução Assistida, mas a de cinco semanas, do grupo de gestação

concebida naturalmente, caso em que poderia haver erro na IG, a qual poderia ser

menor que a referida.

Tabela 11: Autores, métodos de sexagem utilizados, sequências Y-específicas,

número de pacientes, idade gestacional em semanas e índice de acerto dos

trabalhos utilizados como referências

Referência

Método

utilizado

Material

utilizado

Sequência

Y-específica

Nº

amostras

(semanas)

Índice de

acerto

Sezikawa et

al., 2001

PCR tempo

real

Plasma

DYS-14

302 7 a 16 97,20%

Rijnders et al.,

2003

PCR tempo

real

Plasma

SRY

1º

trimestre

50% a

100%

Jhonson et al.,

2004

PCR tempo

real

Plasma

SRY

20 10 a 20

31% a

97%

Alberry et al.,

2007

PCR tempo

real

Plasma

DYS-14

15 11 100%

Boon et al.,

2007

PCR tempo

real

Plasma

SRY

58 11 97,70%

Martinhago et

al., 2007

PCR tempo

real

Plasma

DYS-14

52 5 92,60%

Presente

trabalho

Nested

PCR

Plasma

TSPY

102 2 a 40 97,01%

Foram encontradas dificuldades na adesão das pacientes ao estudo

longitudinal, pois o sangue deveria ser coletado em diferentes fases da gravidez, o

que nem sempre era possível devido à necessidade de retornos freqüentes ao

serviço.

Outra questão foi à quantidade de pacientes da Reprodução Assistida que foi

relativamente pequena em relação às gestações naturais, devido à quantidade de

transferência de embriões que resultaram em gestações, pois quando não se

obtinha um resultado positivo de gravidez, as pacientes que haviam concordado em

participar da pesquisa acabavam sendo excluídas da mesma.

Embora não se tenha o resultado final do sexo fenotípico de todos os

fetos/recém-nascidos, a especificidade do método foi a desejada, o que demonstra a

falta de contaminação por DNA de gestações anteriores de fetos do sexo masculino.

A sexagem fetal em plasma materno pôde ser realizada tanto em primigestas como

em multíparas tendo sendo precisa em IGs diferentes.

De acordo com a análise estatística tivemos Confiabilidade Positiva de

88,89%, nos casos de menos de sete semanas, e 100% nos casos com mais de

sete semanas o que indicou que o resultado positivo para TSPY resultou em alta

probabilidade de o feto ser do sexo masculino. A Confiabilidade Negativa de 100%

em todas as IGs indicou que o resultado negativo para TSPY resultou em alta

probabilidade do feto ser do sexo feminino. O Suporte de 48,48% e 50% indicaram

um bom desempenho do método diagnóstico, dado que eram esperados, numa

amostra, metade de fetos de sexo masculino e outra metade de sexo feminino. A

Sensibilidade de 100% em ambos os grupos de IGs indicou que o método

diagnóstico foi considerado sensível quando o TSPY positivo estivesse relacionado

ao feto do sexo masculino. A Especificidade de 88,24% e 100% indicou que o

método diagnóstico foi considerado específico quando o TSPY negativo estava

relacionado ao feto do sexo feminino. A Precisão Total de 93,94% e 100%

mensurava a porcentagem de verdadeiros positivos e verdadeiros negativos.

Portanto, o método diagnóstico foi considerado preciso quando classificou

corretamente o sexo fetal. A Novidade de 22,04% e 25% mostrou que valores

próximos a +25% indicam que existem poucos fatores inesperados que fariam com

que o TSPY positivo fosse para o feto do sexo feminino. A Satisfação de 100%

indicou que o método diagnóstico classificou como positivo quando realmente era

observado um feto do sexo masculino. Portanto, o diagnóstico do sexo fetal a partir

da 2ª semana de gestação pela técnica de Nested PCR apresentou sensibilidade de

88,9% e especificidade de 100%.

A sexagem fetal precoce pode auxiliar principalmente na ansiedade dos pais

que estão sob um risco genético reprodutivo, e também pode ser muito útil para o

manejo das doenças genéticas ligadas ao cromossomo X. Podendo-se confirmar o

sexo fetal precocemente não há a necessidade da realização de exames invasivos e

mais tardios (coleta de vilosidade coriônica ou líquido amniótico).

Na recorrência da hiperplasia adrenal congênita, a sexagem fetal precoce

seria de grande utilidade devido ao esquema terapêutico profilático logo no inicio da

gestação para prevenir a possível virilização dos fetos femininos afetados. Em fetos

do sexo masculino, como não há necessidade de tratamento intra-útero, a parada

precoce da medicação evitaria efeitos colaterais para a gestante (Rijnders et al.,

2004).

Com a utilização de metodologias ainda mais rápidas e sensíveis, como a

PCR em tempo real, devem-se obter índices de acerto ainda maiores, inclusive em

fases precoces da gravidez. No entanto, a utilização da Nested PCR permite que,

mesmo centros sem grandes recursos possam implantar a técnica, aumentando a

abrangência da população que pode ser beneficiada pela mesma. Além disso, os

resultados das pesquisas em curso no momento permitirão sem dúvida, no futuro

próximo, a descoberta de novos marcadores e a utilização da técnica de diagnóstico

pré-natal em plasma materno para várias doenças.

VI – CONCLUSÃO

A sexagem fetal a partir de plasma materno utilizando a PCR para

amplificação do gene TSPY se mostrou eficaz e de boa qualidade;

A especificidade da sexagem fetal pelo gene TSPY comparado com o

fenótipo do feto foi de 100%;

A sensibilidade da sexagem fetal com o gene TSPY foi de 88,9% abaixo de

sete semanas e de 100% para as com idade gestacional igual ou superior a sete

semanas de gestação.

VII – BIBLIOGRAFIA

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ANEXOS

Anexo 1- aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa em

Seres Humanos do HCFMRP-USP

APÊNDICES

Apêndice A – Termo de consentimento Livre e Esclarecido

HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA

DE RIBEIRÃO PRETO DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

CEP. 14048-900

RIBEIRÃO PRETO - S.P.

B R A S I L

CAMPUS UNIVERSITÁRIO - MONTE ALEGRE

FONE: 602-1000 - FAX (016) 633-1144

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

1. NOME DA PESQUISA: “Sexagem Fetal a partir de Sangue Materno”

2. PESQUISADORES RESPONSÁVEIS: Flavia C. Donabela

Profa. Dra. Ester S. Ramos

3. PROMOTOR DA PESQUISA: Hospital das Clínicas da FMRP-USP

4. ESCLARECIMENTOS: O diagnóstico pré-natal é muito importante para o seguimento da gravidez.

Algumas doenças podem ser tratadas com o bebê ainda dentro do útero da mãe e outras logo após o

nascimento. Algumas doenças comuns em certas famílias são conhecidas como de causa genética e

podem afetar apenas bebês do sexo masculino ou feminino Nesta pesquisa, através dos resultados de

alguns exames que não afetam a saúde do bebê, poderemos conhecer o sexo de seu filho ou filha e se

saberá que grávidas precisarão de tratamento. Além disso, poderá ser dada depois uma melhor

orientação para você e seus parentes. O estudo não trará nenhuma despesa para você. Você pode

auxiliar neste trabalho através de um pouco de sangue (colhidos como qualquer exame de rotina).

Todo esse material será usado para estudar a constituição genética do seu nenê através do DNA (mas

não será utilizado para outros fins, que não esta pesquisa, sem um novo consentimento).

5. Informações adicionais: você receberá resposta a qualquer pergunta ou esclarecimento de qualquer

dúvida a respeito dos procedimentos, riscos, benefícios e de outras situações relacionadas com a

pesquisa. Você tem a liberdade de retirar o seu consentimento e de deixar de participar do estudo, a

qualquer momento, sem que isso traga prejuízo à continuidade do seu tratamento. A segurança de que

não será identificada e que será mantido o caráter confidencial da informação relacionada à sua

privacidade. O compromisso de que será prestada informação atualizada durante o estudo, ainda que

esta possa afetar a sua vontade de continuar dele participando. O compromisso de que você será

devidamente acompanhada e assistida durante todo o período de sua participação no projeto, bem

como de que será garantida a continuidade do seu tratamento, após a conclusão dos trabalhos da

pesquisa.

Eu______________________________________________________________RG

_______________, abaixo assinado, concordo com as condições que me foram apresentadas e que,

livremente, manifesto a minha vontade em participar do projeto de pesquisa “Sexagem Fetal a partir

de Sangue Materno”

Ribeirão Preto, ____de _____________de _____

______________________________ ________________________________

Assinatura dos pesquisadores Assinatura da paciente

Apêndice B – Questionário

Ficha de Paciente

Nome:___________________________________________

Reg. HC:_________________________Data:____________

Nasc. Paciente:________________Nasc. Marido:_________

Endereço:_________________________________________

Telefone:_____________________

Tipo Sanguíneo:________________

G___P___A___C___

Filhos:____Idade e sexo:_____________________________

Datas dos abortos:___________

Pré-eclâmpsia/eclâmpsia ou hipertensão?____Quando:_____

Historia na família?__________________________________

Tentativas de R.A.__________________________________

Gestação atual

Natural___Hiperovulação___FIV___ICSI___Outras________

Data T.E.________________

D.U.M.__________________

Idade Gestacional (US)______________________________

OBS.:

Apêndice C – Tabela

Tabela 12: Análise estatística do grupo total de pacientes confirmados os resultados

através de ultrassonografia e/ou exame físico do recém-nascido

Classe Observada

(US_EF)

Classe Predita (TSPY)

Total

Positivo Negativo

Masculino (Positivo) 36 2 38

Feminino (Negativo) 0 29 29

Total 36 31 67

Medida Sigla Fórmula Resultado

Verdadeiro Positivo TP 36

Verdadeiro Negativo TN 29

Falso Positivo FP 2

Falso Negativo FN 0

Total Preditos

Positivos

l 36

Total Preditos

Negativos

lt(traço) 31

Total Observados

Positivos

r 38

Total Observados

Negativos

rt(traço) 29

Total n 67

Taxa de Erro para FN

Err(FN) FN/(TP+FN) 0,00%

Taxa de Erro para FP

Err(FP) FP/(FP+TN) 6,45%

Taxa de Erro Total Err(total) (FP+FN)/n 2,99%

Confiabilidade

Positiva

Prel TP/(TP+FP) 94,74%

Confiabilidade

Negativa

Nrel TN/(TN+FN) 100,00%

Suporte Sup TP/n 53,73%

Sensibilidade Sens TP/(TP+FN) 100,00%

Especificidade Spec TN/(TN+FP) 93,55%

Precisão Total Tacc (TP+TN)/n 97,01%

Cobertura Cov (TP+FP)/n 56,72%

Novidade Nov (TP/N)-(l*r)/(n^2) 23,26%

Satisfação Sat 1-(n*FN)/(l*rt) 100,00%

Apêndice D – Tabela

Tabela 13: Análise estatística do grupo de pacientes com idade gestacional menor

que sete semanas de gestação.

Classe Observada

(US_EF)

Classe Predita (TSPY)

Total

Positivo Negativo

Masculino (Positivo) 16 2 18

Feminino (Negativo) 0 15 15

Total 16 17 33

Medida Sigla Fórmula Resultado

Verdadeiro Positivo TP 16

Verdadeiro Negativo TN 15

Falso Positivo FP 2

Falso Negativo FN 0

Total Preditos

Positivos

l 16

Total Preditos

Negativos

lt(traço) 17

Total Observados

Positivos

r 18

Total Observados

Negativos

rt(traço) 15

Total n 33

Taxa de Erro para FN

Err(FN) FN/(TP+FN) 0,00%

Taxa de Erro para FP

Err(FP) FP/(FP+TN) 11,76%

Taxa de Erro Total Err(total) (FP+FN)/n 6,06%

Confiabilidade

Positiva

Prel TP/(TP+FP) 88,89%

Confiabilidade

Negativa

Nrel TN/(TN+FN) 100,00%

Suporte Sup TP/n 48,48%

Sensibilidade Sens TP/(TP+FN) 100,00%

Especificidade Spec TN/(TN+FP) 88,24%

Precisão Total Tacc (TP+TN)/n 93,94%

Cobertura Cov (TP+FP)/n 54,55%

Novidade Nov (TP/N)-(l*r)/(n^2) 22,04%

Satisfação Sat 1-(n*FN)/(l*rt) 100,00%

Apêndice E – Tabela

Tabela 14: Análise estatística do grupo de pacientes com idade gestacional maior

que sete semanas de gestação.

Classe Observada

(US_EF)

Classe Predita (TSPY)

Total

Positivo Negativo

Masculino (Positivo) 17 0 17

Feminino (Negativo) 0 17 17

Total 17 17 34

Medida Sigla Fórmula Resultado

Verdadeiro Positivo TP 17

Verdadeiro Negativo TN 17

Falso Positivo FP 0

Falso Negativo FN 0

Total Preditos

Positivos

l 17

Total Preditos

Negativos

lt(traço) 17

Total Observados

Positivos

r 17

Total Observados

Negativos

rt(traço) 17

Total n 34

Taxa de Erro para FN

Err(FN) FN/(TP+FN) 0,00%

Taxa de Erro para FP

Err(FP) FP/(FP+TN) 0,00%

Taxa de Erro Total Err(total) (FP+FN)/n 0,00%

Confiabilidade

Positiva

Prel TP/(TP+FP) 100,00%

Confiabilidade

Negativa

Nrel TN/(TN+FN) 100,00%

Suporte Sup TP/n 50,00%

Sensibilidade Sens TP/(TP+FN) 100,00%

Especificidade Spec TN/(TN+FP) 100,00%

Precisão Total Tacc (TP+TN)/n 100,00%

Cobertura Cov (TP+FP)/n 50,00%

Novidade Nov (TP/N)-(l*r)/(n^2) 25,00%

Satisfação Sat 1-(n*FN)/(l*rt) 100,00%

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