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Estudo in vitro dos efeitos do estrogênio
em células tireoideas
.
.
Michel Alexandre Villani Gantus
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências
Morfológicas, da Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Orientadores:
Prof. Luiz Eurico Nasciutti
Profa. Ana Maria Blanco Martinez
Rio de Janeiro,
Setembro 2008
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ii
Michel Alexandre Villani Gantus
Estudo in vitro dos efeitos do estrogênio em células
tireoideas: Papel do TGF-β1.
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Morfológicas, Universidade
Federal do Rio de Janeiro, como requisito para
obtenção do título de Doutor em Ciências Morfológicas
Orientadores:
Luiz Eurico Nasciutti
Ana Maria Blanco Martinez
Rio de Janeiro,
2008
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iii
Ficha Catalográfica
Gantus, Michel Alexandre Villani.
Estudo in vitro dos efeitos do estrogênio em células tireoideas:
Papel do TGF-β1 / Michel Alexandre Villani Gantus – 2008.
82f.
Tese de Doutorado em Ciências Morfológicas – Universidade
Federal do Rio de Janeiro, Programa de Pós-Graduação em
Ciências Morfológicas, Rio de Janeiro, 2008.
Orientadores: Luiz Eurico Nasciutti
Ana Maria Blanco Martinez
1. Glândula Tireóide. 2. Interação Epitélio-Estroma. 3. Ciências
Morfológicas – Teses.
I. Nasciutti, Luiz Eurico. II. Martinez, Ana Maria Blanco. III.
Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas,
Universidade Federal do Rio de Janeiro. IV. Estudo in vitro dos
efeitos do estrogênio em células tireoideas: Papel do TGF-β1.
iv
Michel Alexandre Villani Gantus
Estudo in vitro dos efeitos do estrogênio em células
tireoideas: Papel do TGF-β1.
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Morfológicas, Universidade
Federal do Rio de Janeiro, como requisito para
obtenção do título de Doutor em Ciências Morfológicas
Aprovada em 26/10/2008
___________________________________________________
Prof. Dr. Marcia Cury El-Cheikh - UFRJ
___________________________________________________
Prof. Dr. Thereza Christina Barja Fidalgo - UERJ
__________________________________________________
Dr. Patricia Machado Rodrigues e Silva Martins - Fiocruz
v
Sumário:
Sumário .............................................................................................................. v
Resumo ............................................................................................................. ix
Abstract .............................................................................................................. x
Lista de Ilustrações .......................................................................................... xi
Lista de Abreviaturas ..................................................................................... xiv
1. Introdução ................................................................................................... 02
1.1. Morfologia da Tireóide ............................................................................... 03
1.2. Fisiologia da Tireóide ................................................................................. 08
1.3. Patologias da Tireóide ............................................................................... 12
1.4. Efeitos do Estrogênio na Tireóide .............................................................. 15
1.5. Efeitos do TGF-β1 na Tireóide ................................................................... 18
1.6. Linhagens Celulares Tireoideas ................................................................ 23
2. Objetivo Geral ............................................................................................. 24
2.1. Objetivos Específicos ................................................................................. 24
3. Material e Métodos ...................................................................................... 28
3.1. Cultura de células estromais TS7 ............................................................. 28
3.2. Cultura de células foliculares PC Cl3 ........................................................ 28
3.3. Co-cultura de células TS7/PC Cl3 ............................................................. 28
3.4. Tratamento das células estromais tireóideas ............................................ 29
3.5. Análise por RT-PCR .................................................................................. 29
3.5.1. Extração de RNA .................................................................................... 29
3.5.2. Quantificação do RNA total extraído ....................................................... 30
3.5.3. Gel de Agarose ....................................................................................... 30
3.5.3. Transcrição reversa ................................................................................ 31
3.5.3. Reação em cadeia de polimerase .......................................................... 32
3.6. Imunocitoquímica ....................................................................................... 33
3.7. Western blotting ......................................................................................... 34
vi
3.8. Elisa ........................................................................................................... 35
3.9. Ensaio de MTT ........................................................................................... 36
3.10. Captação de iodo radioativo .................................................................... 36
3.11. Análise Estatística .................................................................................... 37
4. Resultados ................................................................................................... 38
4.1. Organização das culturas celulares ........................................................... 38
4.2. Expressão do receptor de estrogênio (ERα) ............................................. 38
4.3. Distribuição imunocitoquímica dos receptores de TGF-β1 ........................ 41
4.4.Dosagem do TGF-b1 secretado pelas células estromais TS7 tratadas com
E2 ...................................................................................................................... 41
4.5. Efeito do estrogênio sobre a expressão de TGF-β1 e TGFRII nas células
estromais TS7 ................................................................................................... 44
4.6. Efeito do E2 sobre a via de sinalização do TGF-b1 (Smad2-p) nas células
estromais TS7 ................................................................................................... 44
4.7. Efeito do E2 sobre a distribuição de TGFRI e TGFRII nas células estromais
TS7 e foliculares PC Cl3 ................................................................................... 47
4.8. Efeito do E2 e do TGF-β1 sobre a viabilidade das células estromais TS7 e
foliculares PC Cl3, cultivadas isoladamente ou em co-cultura ......................... 50
4.9. Efeito do E2 e do TGF-β1 sobre a captação de iodeto nas células estromais
TS7 e foliculares PC Cl3, cultivadas isoladamente e em co-cultura .................. 53
5. Discussão .................................................................................................... 57
6. Conclusões .................................................................................................. 65
7. Referências .................................................................................................. 66
vii
Agradecimentos:
Eu gostaria de agradecer e muito a todos que de alguma forma me
ajudaram a realizar essa tese, não só aqueles que colaboraram efetivamente na
sua realização, mas também todos que me apoiaram durante as diversidades
encontradas.
☺ A minha família, meus pais, minha irmã e minha namorada, por todo o
apoio emocional, sendo pacientes e me incentivando quando pressentiam um
desânimo durante o desenvolvimento da tese.
Aos meus orientadores, Ana Martinez, Luiz Eurico e Leandro, que me
auxiliaram durante toda a minha formação acadêmica, e principalmente, quando
decidi mudar de projeto apoiaram minha decisão e confiaram em mim.
Aos amigos do laboratório, ou melhor, da faculdade, uma vez que todos me
ajudaram mesmo aqueles que não convivem diariamente comigo no mesmo
laboratório. Afinal de contas você não precisa saber fazer tudo, mas sim
conhecer quem sabe.
viii
“Para que a mudança dure entre as criaturas racionais,
essa mudança deve ser para melhor. E, desse modo,
as civilizações, os povos evoluem para um melhor
entendimento e um lugar melhor.”
Drizzit Do’Urden
ix
Resumo
GANTUS, Michel Alexandre Villani.
Estudo in vitro dos efeitos do estrogênio em
células tireoideas: Papel do TGF-β1. Rio de Janeiro, 2008. Tese de Doutorado -
Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas, Universidade Federal
do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2008.
A prevalência de doenças da tireóide em mulheres sugere um efeito do
estrogênio (E2) sobre o crescimento e a função da tireóide. Nosso laboratório
isolou e caracterizou uma linhagem de células estromais da tireóide, as células
TS7, que mostraram ser capazes de sintetizar componentes da membrana basal
e de expressar TGF-β1. Células foliculares FRTL-5 da tireóide em co-cultivo com
as células TS7 tiveram sua capacidade de captar iodeto reduzida, sugerindo o
envolvimento do estroma na regulação da função da tireóide. Neste estudo,
nossa proposta foi que os efeitos do E2 nas células foliculares da tireóide podem
estar relacionados com a síntese e secreção de TGF-β1 pelas células estromais
(ação parácrina). Investigamos, in vitro, o efeito do E2 na síntese e sinalização
do TGF-β1 nas células estromais TS7 e na linhagem de células foliculares PC
Cl3 da tireóide. Inicialmente, verificamos que apenas as células TS7 expressam
o receptor α de E2 (ERα). Em seguida, observamos que os receptores TGFRI e
TGFRII estão distribuídos nas células TS7 e PC Cl3. As células TS7 tratadas
com E2 aumentaram tanto a síntese quanto a secreção de TGF-β1, bem como a
ativação da sua cascata de sinalização via Smad2 fosforilada, porém o E2 não
modificou a expressão de TGFRII. Nas células PC Cl3 o TGF-β1 reduziu a
captação de iodeto, contudo em co-cultura com as células TS7, o E2 junto com o
TGF-β1 aumentou esta captação. Esses resultados sugerem que o E2 poderia
modular a atividade do TGF-β1 nas células estromais da tireóide, embora não
esteja clara sua relação com a sinalização do TGF-β1 e com as funções das
células foliculares.
x
Abstract
GANTUS, Michel Alexandre Villani.
Estudo in vitro dos efeitos do estrogênio em
células tireoideas: Papel do TGF-β1. Rio de Janeiro, 2008. Tese de Doutorado -
Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas, Universidade Federal
do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2008.
The prevalence of thyroid disease on women suggests that estrogen (E2) might
be involved on thyroid growth and function. TS7 thyroid stromal cells, previously
isolated and characterized in our laboratory, showed the ability to synthesize
basement membrane components and to express TGF-β1. In FRTL5 cells, a
follicular thyroid cell line, it was observed a decrease of iodide uptake when
cultivated on TS7 cells substrate, suggesting the involvement of the stroma in
thyroid function. Our proposition is that the effects of E2 on follicular thyroid cells
could be related to TGF-β1 synthesis and secretion by stromal cells (paracrine
action). In this study, we have investigated the in vitro effect of E2 on TGF-β1
synthesis and its signaling pathway in TS7 cells and in a follicular cell line, PC
Cl3. First, we prove that only TS7 cells express the estrogen receptor α (ERα).
Further, we observed that both TS7 and PC Cl3 cells respond to TGF-β1 via its
receptors TGFRI and TGFRII. The E2 treatment of TS7 cells induces both
synthesis and secretion of TGF-β1, as well as Smad2 phosphorylation signaling
pathway although TGFRII synthesis was not modified. In PC Cl3 cells, TGF-β1
decrease iodide uptake, however in co-cultured E2 plus TGF-β1 thre was an
increase in iodide uptake. These results indicate that E2 could be able to
modulate TGF-β1 activity on thyroid stromal cells, but the relationship with TGF-
β1 signaling and the follicular cell function is not clear.
xi
Lista de Figuras:
Figura 1: Localização e estrutura macroscópica da tireóide. Página 4.
Figura 2: Esquema da estrutura microscópica dos folículos tireoideanos. Página
6.
Figura 3: Corte histológico da tireóide mostrando os folículos formados por
células foliculares e parafoliculares. Página 6.
Figura 4: Esquema da síntese de hormônios nas células foliculares da Tireóide.
Página 8.
Figura 5: Esquema da via de sinalização do estrogênio. Página 13.
Figura 6: Esquema da via de sinalização do TGF-β mediada por Smads. Página
17.
Figura 7: Fotomicrografias de contraste de fase das células estromais TS7 (A) e
foliculares PC Cl3 (B) de tireóide de rato, cultivadas isoladamente e em co-
cultura (C). Página 32.
Figura 8: RT-PCR para ERα sintetizado pela linhagem PC Cl3 de células
foliculares e pela linhagem TS7 de células estromais. Página 33.
Figura 9: Imunodistribuição de TGFRI (A, C) e TGFRII (B, D) nas células
estromais TS7 (A, B) e foliculares PCCL3 (C, D). Página 35.
xii
Figura 10: Dosagem por ELISA do TGF-β1 secretado na forma total e na forma
ativada pelas células TS7 tratadas 24 horas com estrogênio (E2) 10
-8
M. Página
36.
Figura 11: RT-PCR para TGF-β1 secretado pelas células estromais TS7
tratadas com E2 por 48 horas. Página 36.
Figura 12: RT-PCR para TGFRII secretado pelas células estromais TS7
tratadas com E2 por 48 horas. Página 37.
Figura 13: Western Blotting para Smad2-p nas células estromais TS7 tratadas
por 48 horas com E2 10
-8
M. Página 37.
Figura 14: Imunodistribuição do TGFRI nas células estromais TS7 (A, B) e
foliculares PC Cl3 (C, D), cultivadas na ausência (A, C) ou na presença de E2
10
-8
M (B, D) por 48 horas. Página 39.
Figura 15: Imunodistribuição do TGFRII nas células estromais TS7 (A, B) e
foliculares PC Cl3 (C, D), cultivadas na ausência (A, C) ou na presença de E2
10-8M (B, D) por 48 horas. Página 40.
Figura 16: Ensaio de viabilidade das células estromais TS7 pela técnica do
MTT. Página 41.
Figura 17: Ensaio de viabilidade das células foliculares PC Cl3 pela técnica do
MTT. Página 41.
Figura 18: Ensaio de viabilidade das células foliculares PCCL3 cultivadas na
presença de meio condicionado das células estromais TS7, pela técnica do
MTT. Página 42.
xiii
Figura 19: Ensaio de viabilidade da co-cultura de células estromais TS7 e
foliculares PCCL3 pela técnica do MTT. Página 42.
Figura 20: Ensaio de captação de Iodo 125 pelas células estromais TS7. Página
44.
Figura 21: Ensaio de captação e efluxo de Iodo 125 pelas células foliculares PC
Cl3. Página 45.
Figura 22: Ensaio de captação e efluxo de Iodo 125 na co-cultura das células
estromais TS7 e foliculares PC Cl3. Página 46.
xiv
Lista de Abreviações:
BSS - solução salina balanceada
cDNA - DNA complementar
DEPC - dietil-pirocarboneto
DIT - diiodotirosila
E2 - 17β-estradiol
EGF - fator de crescimento epidérmico
ERα - receptor α de estrogênio
ERβ - receptor β de estrogênio
ERE - elementos responsivos ao estrogênio
FRTL - linhagem de células foliculares da tireóide
FRTL-5 - linhagem de células foliculares da tireóide
FSH - hormônio folículo estimulante
HBSS - Hans Balanced Saline Solution
HRP - anticorpo conjugado a peroxidase
HT - hormônios tireóideos
IGF-I - fator de crescimento insulina-like I
IGF-II - fator de crescimento insulina-like II
LH - hormônio luteinizante
MAPK - proteína cinase ativada por mitógeno
MCF-7 – Linhagem de células de cancer de mama
MEC - matriz extracelular
MIT – monoiodotirosila
MTT - sal tetrazolium
NIS - co-transportador Na
+
/I
-
simporter
PC Cl3 - linhagem de células foliculares da tireóide
PFA - paraformaldeído a 4%
PI3-K - fosfatidilinositol 3 cinase
T3 - triiodotironina
T4 - tetraiodotironina ou tiroxina
xv
TG - tireoglobulina
TGB - proteína ligadora de T4
TGF-α - fator de crescimento transformante α
TGF-β - fator de crescimento transformante β
TGFRI - receptor do tipo I de TGF-β
TGFRII - receptor do tipo II de TGF-β
TGFRIII - receptor do tipo III de TGF-β
TPO - tireoperoxidase
TS7 - Linhagem de células estromais da tireóide
TS7/PC Cl3 – Co-cultura das linhagens TS7 e PC Cl3
TSH - hormônio estimulador da tireóide ou hormônio tireotrófico
TSHr - receptor de TSH
TPS - tampão fosfato 0,1M pH 7,45
TTBS - TPS com tween 0,1%
2
1. Introdução:
Em todos os organismos multicelulares, a sobrevivência depende de uma
elaborada rede de comunicação intercelular que coordena o crescimento, a
diferenciação e o metabolismo de diversas células nos diferentes tecidos. O
principal sistema responsável por esses tipos de interações é o sistema
endócrino, ao liberar hormônios na corrente sanguínea. A diversidade e a
complexidade do sistema endócrino são muito extensas, com mecanismos
extremamente finos e variados que controlam desde a síntese, liberação,
ativação, transporte e metabolismo hormonal. A estrutura do sistema endócrino
é de grande importância para o funcionamento adequado dessas funções
(Gartner e Hiatt, 1999).
As glândulas endócrinas se organizam em cordões celulares e/ou folículos
e podem também constituir células endócrinas isoladas, como é o caso das
encontradas nas mucosas do aparelho digestório e do aparelho respiratório. As
glândulas endócrinas são ricamente vascularizadas, sendo seu produto de
secreção liberado tanto no tecido conjuntivo subjacente, quanto nos leitos
capilares existentes. Dentre as principais glândulas endócrinas podemos citar a
hipófise, a tireóide, as paratireóides, as glândulas adrenais e as ilhotas de
Langerhans do pâncreas (Gartner e Hiatt, 1999).
3
O foco desse estudo está na glândula tireóide, que é responsável pela
secreção dos hormônios triiodotironina (T3) e tetraiodotironina ou tiroxina (T4) no
organismo. O aumento da tireóide recebe o nome de bócio e pode acontecer no
hipertireoidismo, no hipotireoidismo ou em pessoas que vieram de regiões onde
a ingestão de iodo na dieta é baixa, constituindo o bócio endêmico. No início da
década de 50, constatou-se que cerca de 20% da população brasileira sofria de
bócio. O então Presidente da República Juscelino Kubitschek assinou o Decreto
nº 39.814, de 17 de Agosto de 1956, que tornava obrigatória a iodação do sal de
cozinha. Em 20 anos essa prevalência caiu para 14,1% e no último censo em
1996 a prevalência caiu para 1% (Programa Nacional de Controle dos Distúrbios
por Deficiência de lodo). Entretanto, ao se analisar a população que ainda
desenvolve o bócio verificou-se uma incidência três vezes maior em mulheres
(Wang e Crapo, 1997). Essa diferença entre os sexos na incidência de
patologias tireoideanas é observada mundialmente, e sugere que o crescimento
da tireóide pode ser influenciado por hormônios sexuais femininos,
particularmente o estrogênio (Marugo e cols., 1991).
1.1. Morfologia da Tireóide
A tireóide é a primeira glândula endócrina a se desenvolver no embrião.
Sua formação inicia-se por volta do vigésimo quarto dia após a fertilização do
óvulo, a partir de um espessamento do endoderma mediano que provém do
assoalho da faringe primitiva. Este espessamento forma uma saliência que é o
4
primórdio da tireóide. O primórdio da tireóide consiste em uma massa de células
endodérmicas que mais tarde será invadida pelo mesênquima vascular
adjacente. Estas células se diferenciam em agregados de células epiteliais que à
medida que a síntese de colóide se inicia, provocam uma organização em torno
de uma luz preenchida pelo mesmo. Durante a décima primeira semana, com o
aparecimento do colóide nestas estruturas, estas passam a ser chamadas de
folículos tireoideanos; e a partir deste momento em diante já podem ser
demonstradas atividades de captação de iodeto e síntese dos hormônios
tireóideos (Larsen e cols., 1998; Moore e Persaud, 2004). À medida que o
embrião cresce e a língua se desenvolve, a tireóide que está se formando desce
para a região do pescoço, passando ventralmente ao osso hióide e às
cartilagens da laringe em desenvolvimento (Moore e Persaud, 2004). Por um
curto período de tempo, a tireóide fica conectada à língua, por um tubo estreito,
chamado ducto tireoglosso. Durante o desenvolvimento, a tireóide se divide em
dois lobos, o direito e o esquerdo, ligados por um istmo situado na região
anterior ao segundo e terceiro anéis da traquéia. A glândula tireóide é coberta
por uma cápsula dupla de tecido conjuntivo frouxo que envia septos para o
parênquima. Estes septos se tornam gradativamente mais delgados conforme
alcançam os folículos, que são separados entre si principalmente por fibras
reticulares. Por volta da sétima semana do desenvolvimento embrionário, a
glândula tireóide assume sua forma e localização definitiva imediatamente
abaixo da laringe e anteriormente à traquéia (Figura 1), sendo inervada por
5
fibras provenientes do sistema nervoso autônomo. Nesta mesma ocasião o
ducto tireoglosso degenera e desaparece.
Figura 1: Localização e estrutura macroscópica da tireóide
(http://www.indatir.org.br/a_tiroide.htm).
A tireóide é formada por diversos tipos celulares, destacando-se as células
foliculares, as parafoliculares e as estromais. A tireóide apresenta uma
organização histológica folicular. Os folículos tireoideanos são revestidos por um
epitélio simples de natureza cubóide, possuindo no seu interior um material
amorfo denominado colóide. As células foliculares tireoideanas se apóiam sobre
uma lâmina basal e exibem todas as características de células que
simultaneamente sintetizam, secretam, absorvem e digerem proteínas; têm sua
6
polaridade secretora direcionada para o lúmen dos folículos e apresentam dois
domínios característicos: o apical e o basolateral. A polaridade do folículo é
importante para a captação de iodeto e a estrutura do folículo (Figura 2) é
importante para a síntese dos hormônios tireoideanos. A superfície apical das
células possui microvilos que aumentam a área de contato com o colóide e uma
extensa rede de capilares interfoliculares fornece às células um abundante
suprimento sanguíneo (Ericson e cols., 1992). As células foliculares possuem
um retículo endoplasmático rugoso e um complexo de Golgi bastante
desenvolvidos, favorecendo a síntese e o empacotamento de proteínas,
principalmente a tireoglobulina, que são transportadas para o lúmen folicular,
constituindo o principal componente do colóide (Figura 3). Numerosos corpos
lisossomais elétrondensos estão presentes no citoplasma, sendo importantes na
secreção dos hormônios tireoideanos (Takasu e cols., 1992).
As células parafoliculares ou células C estão presentes no epitélio folicular,
porém sem alcançar o lúmen do folículo (Figuras 2, 3). A característica mais
marcante dessas células é a presença de numerosos grânulos de secreção
contendo o hormônio calcitonina, cujo efeito principal é estimular a síntese de
matriz óssea, reduzindo assim a calcemia (Hazard, 1977).
O estroma tireoideo é escasso e concentrado ao redor dos folículos, vasos
sanguíneos e vasos linfáticos (Figura 2, 3). As principais células da tireóide são
fibroblastos, macrófagos, linfócitos, plasmócitos e mastócitos, sendo os
7
fibroblastos responsáveis pela maior parte da síntese e deposição de elementos
da matrix extracelular (Gartner e Hiatt, 1997). Os fibroblastos presentes nos
tecidos são derivados de células tronco mesenquimais e apresentam-se com
uma grande diversidade fenotípica. São células capazes de realizarem um
“cross-talk” com componentes do sistema imunológico, de participarem de
doenças inflamatórias e autoimunes, como por exemplo na doença de Gravis.
(Komuro, 1990 e Smith e cols., 1997).
Figura 2: Esquema da estrutura microscópica dos folículos tireoideanos
(medical-dictionary.thefreedictionary.com/thyroid+glands).
8
Figura 3: Corte histológico da tireóide mostrando os folículos formados por
células foliculares e parafoliculares (Junqueira e Carneiro, 2004).
1.2. Fisiologia da Tireóide
Os principais hormônios produzidos pela tireóide são a triiodotironina (T3) e
a tetraiodotironina ou tiroxina (T4). Estes hormônios têm importância
fundamental no desenvolvimento dos organismos, além de exercer um
importante papel no equilíbrio metabólico. A formação destes hormônios envolve
etapas coordenadas e distintas como: síntese de tireoglobulina e liberação para
o colóide, captação de iodeto para dentro das células foliculares, oxidação do
iodeto, iodação dos radicais tirosila da tireoglobulina, armazenamento da
tireoglobulina iodada, endocitose e degradação da tireoglobulina iodada e a
formação de T3 e T4 (Guyton e Hall, 2002).
Células
Foliculares
Células
Estromais
Células
Parafoliculares
9
A primeira etapa na formação dos hormônios tireóideos consiste na síntese
do componente peptídico dos hormônios tireoideanos, a tireoglobulina. Esta
proteína é transportada do complexo de Golgi para a membrana apical da célula
numa vesícula junto com uma outra proteína, a tireoperoxidase, que é ativada
com a mudança de pH no lúmen do folículo. Enquanto isso, a célula folicular
capta iodeto do sangue por um co-transportador denominado Na
+
/I
-
simporter
(NIS), uma glicopreoteína de membrana plasmática, responsável por concentrar
o iodeto (Guyton e Hall, 2002). O iodeto passa para o lúmen do folículo por um
outro transportador denominado pendrina. Na superfície folicular ocorre a
oxidação dos radicais tirosila da tireoglobulina catalisada pela tireoperoxidase,
que é, em seguida, armazenada no colóide. Em resposta ao estímulo secretório,
a tireoglobulina iodada é endocitada e a vesícula de endocitose formada se
funde com vesículas lisossomais que vão hidrolisar a tireoglobulina quebrando-a
em monoiodotirosila (MIT) e diiodotirosila (DIT). Essas moléculas se combinam
formando assim T3 (MIT+DIT) e T4 (DIT+DIT), que serão liberados na corrente
sanguínea e irão exercer suas funções no organismo (ver Mauchamp e cols.,
1998) (Figura 4).
10
Figura 4: Esquema da síntese de hormônios nas células foliculares da Tireóide
(Kierszenbaum, 2002).
O principal regulador da secreção da glândula tireóide é o TSH (hormônio
estimulador da tireóide ou hormônio tireotrófico), que é produzido pelas células
tireotróficas adenohipofisárias (Gartner e Hiatt, 1999). Quando o TSH produzido
na adenohipófise interage com seus receptores das membranas foliculares, ele
desencadeia uma série de alterações que resulta na ativação e no crescimento
glandular. O receptor do TSH é uma proteína que faz parte da família de
receptores acoplados à proteína G (Birnbaumer e cols., 1989). O receptor é
composto de um segmento extracelular que se liga ao TSH, um segmento
transmembrana e ainda um segmento intracelular que está ligado às proteínas
11
sinalizadoras (Vassart e Dumont, 1992). Ghinea e cols. (2002) relataram que o
domínio extracelular do receptor do TSH se liga a fibronectina sendo modulado
por esta proteína da matriz extracelular. Em humanos, a sinalização intracelular
pelo TSH ocorre via ativação adenilato-ciclase/AMPc e também pela ativação da
fosfolipase C/fosfatidilinositol, no entanto, em ratos ocorre somente à via
adenilato-ciclase/AMPc (Laurent e cols., 1987). Desta forma, o TSH é capaz de
estimular a captação de iodeto, a síntese da tireoperoxidase e da tireoglobulina,
e promover a reabsorção do colóide, modulando a secreção dos hormônios
tireóideos (Chazenbalk e cols., 1987; Kaminsky e cols., 1994; Carvalho e cols.,
1996; Larsen e cols., 1998).
Além do TSH, a glândula tireóide possui a capacidade de auto-regular a
sua função de acordo com a concentração de iodo disponível (Pisarevi, 1985).
Sabe-se que doses crescentes de iodeto levam inicialmente a um aumento da
formação de hormônios tireóideos, entretanto tratamentos duradouros diminuem
a síntese hormonal. Este fato pode ser explicado por um bloqueio relativo da
organificação do iodo, o efeito Wolff-Chaikoff em conseqüência dos altos níveis
de iodo dentro das células foliculares (Larsen e cols., 1998).
As funções da glândula tireóide também podem estar sujeitas à influência
de fatores de crescimento ou citocinas. Os fatores de crescimento são
polipeptídeos que podem interagir com receptores específicos de membrana,
sendo capazes de gerar uma sinalização intracelular, que irá regular a
12
proliferação, função e diferenciação das células. Dentre estes fatores, podemos
destacar o fator de crescimento insulina-like I e II (IGF-I e IGF-II), o fator de
crescimento epidérmico (EGF), o fator de crescimento transformante alfa (TGF-
α) e o fator de crescimento transformante beta (TGF-β). Esses fatores podem
ser sintetizados tanto pelas células foliculares como pelas células estromais
atuando de forma autócrina e parácrina na tireóide, modulando o efeito exercido
pelo TSH. A grande maioria desses fatores é capaz de gerar uma sinalização
intracelular de ativação de tirosinas-quinases, como é o caso dos IGFs, do EGF
e do TGF-β. O TGF-β possui 3 tipos de receptores (TGFRI, TGFRII e TGFRIII);
os dois primeiros são serina-treonina-quinases e o terceiro é responsável pela
apresentação do ligante aos receptores de sinalização. O estímulo provocado
pelo TGFRI leva a cadeia de fosforilação das Smad2 e Smad3 (Miyazono e
cols., 2000). Nos tireócitos, o TGF-β inibe a proliferação celular atuando como
antagonista de fatores de crescimento como EGF, PGDF e FGF, parando o ciclo
celular na fase G1 (Cirafici e cols., 1992).
1.3. Patologias da Tireóide
Uma patologia típica da tireóide é o bócio, que é o nome dado para o
aumento da glândula, que pode estar ou não relacionado com alterações nas
concentrações de hormônios tireóideos (HT). Existem diferentes tipos de bócio:
o bócio endêmico, causado por deficiência de iodo, o bócio hereditário e o bócio
esporádico. Com relação aos aspectos morfológicos os bócios podem ser
13
multinodulares, nodulares ou difusos, e em termos funcionais eles podem ser
tóxicos ou atóxicos (Derwahl e Studer, 2000, 2001).
O bócio endêmico ocorre em certas áreas com deficiência de iodo na
alimentação, a deficiência promove a redução da formação dos HT mantendo
assim o estímulo proliferativo gerado pelo TSH. O bócio atóxico ocorre sem que
exista deficiência de iodo, porém a secreção de hormônios tireóideos é normal,
já no bócio tóxico a secreção de hormônios está diminuída. O bócio difuso
ocorre quando toda a glândula esta aumentada, o nodular quando apenas uma
região da glândula está aumentada e o multinodular quando várias regiões estão
aumentadas. Alguns bócios são causados por alterações nas etapas de
formação dos hormônios (defeitos enzimáticos) tais como: deficiência do
mecanismo de seqüestro de iodeto, deficiência da peroxidase, de tireoglobulina
ou deficiência da enzima geradora de H
2
O
2
(Derwahl e Studer, 2000, 2001).
A formação de um bócio pode acontecer devido a ações diretas na hipófise,
como: a redução da síntese dos hormônios tireoideanos, ou por um fator
promotor do crescimento tireoideano, ou ainda evitando a morte celular
desbalanceando a homeostase da glândula, ou também por vias indiretas que
promovam o aumento dos níveis de TSH (Derwahl e Studer, 2001)
No bócio atóxico, quando as células foliculares da tireóide retomam à
normalidade surge um balanço entre a proliferação e a morte celular.
14
Primeiramente, a proliferação diminui e em seguida surgem indícios de apoptose
dessas células (Riesco e cols., 1998). O tamanho do bócio é inversamente
proporcional à sensibilidade do nódulo as vias apoptóticas e essa sensibilidade é
regulada pela atividade proteossomica das células (Mezosi e cols., 2002). Mais
recentemente, Mutuku e colaboradores em 2002 verificaram que também ocorre
necrose durante o processo de involução do bócio, porém a necrose está
relacionada ao status oxidativo das células enquanto a apoptose com a
normalização da regulação de iodo.
Todas as formas de doenças tireoideanas como, bócio atóxico, doença de
Graves, tireoidites de Hashimoto e neoplasias tireoideanas são mais comuns em
mulheres do que em homens (Rallison e cols., 1991). Essa diferença entre os
sexos e na incidência de patologias tireoideanas é observada mundialmente, e
sugere que o crescimento da tireóide pode ser influenciado por hormônios
sexuais femininos, particularmente o estrogênio (Marugo e cols., 1991). Entre as
mulheres, os grupos de alto risco são as adolescentes, as grávidas e mulheres
que estão na fase de lactação. Apesar do conhecimento da prevalência da
doença nas mulheres, pouco se sabe sobre como isso influencia o fator de risco
para a doença. Alguns trabalhos sugerem que o uso de contraceptivos orais
poderia estar contribuindo para um aumento do risco de se desenvolver câncer
de tireóide (Preston-Martin e cols., 1987, Ron e cols., 1987), entretanto trabalhos
endêmicos não foram capazes de confirmar essa associação (McTiernan e cols.,
1984 e Rossing e cols., 1998).
15
1.4. Efeitos do Estrogênio na Tireóide
Os estrogênios são hormônios esteróides produzidos predominantemente
nos ovários. Sob regulação do LH (hormônio luteinizante), o colesterol é
transformado em androstenediona nas células da camada granulosa, sendo
transferida para as células da camada da teca, onde sob a influência do FSH
(hormônio folículo estimulante), é transformada em estradiol e liberada na
circulação para atuar nos tecidos alvos. O estrogênio regula a proliferação,
diferenciação, mobilidade e apoptose em diferentes tipos celulares (ver em
Couse e Korach, 1999). O principal e mais potente estrogênio é o 17-β-Estradiol
(E2) (Abeles e cols., 1992 e Lehninger e cols.,1993). Os efeitos do estrogênio
são mediados através dos seus receptores α e β (ERα e ERβ). O mecanismo
clássico de ação dos ERs envolve a interação do estrogênio com seu receptor,
formando dímeros de complexo estrogênio-receptor que são translocados para o
núcleo e se ligam a elementos responsivos ao estrogênio (EREs), localizados na
região promotora dos genes alvos (Nilsson e cols., 2001), sendo que apenas
1/3 desses genes não seguem a via de ativação das EREs (O’Lone e cols.,
2004). O estrogênio também pode regular a expressão de certos genes ligando-
se indiretamente ao DNA através da modulação de outros fatores transcricionais
das células (Figura 5). Nas vias genômicas do estrogênio independentes de
EREs, os receptores se ligam ao DNA no núcleo e são ativados por fosforilação
de cascatas de sinalização pertencentes a outros hormônios (Björnströrm e
Sjöberg, 2005).
16
Figura 5: Esquema da via de sinalização do estrogênio
(http://www.life.uiuc.edu/shapiro/Shap03.jpg)
A maioria das ações do estrogênio é feita através da modulação da
expressão gênica, porém alguns efeitos imediatos podem ocorrer indicando a
presença de mecanismos independentes da síntese de RNA e proteínas.
Acredita-se que essas ações não genômicas são mediadas por receptores de
membrana do estrogênio. Em 2004, Rizandi e colaboradores observaram que
esses receptores de membrana existem como dímeros funcionais quando
ativados pelo E2. Os REs na membrana plasmática desencadeiam cascatas de
sinalização via proteína quinases, tais como MAPK, IP3-K e Shc kinases
17
(Björnströrm e Sjöberg, 2005). Essas vias promovem diversas respostas
celulares; as MAPK tem sido observadas como vias proliferativas (Manole e
cols., 2001; Santen e cols 2002) e as 3 vias juntas como múltiplas vias paralelas
anti-apoptóticas (Alexaki e cols., 2006). Fernando e Wimalasena (2004)
descobriram que a ação anti-apoptótica do estrogênio acontece pela inativação
de BAD após a ativação da via IP3 kinase e ERK, proteína da cascata de MAPK
e Shc kinase. Outro ponto sobre as vias de sinalização não genômicas do E2 é
que as MAPK fosforilam o próprio RE, modulando assim a sua própria atividade
(Björnströrm e Sjöberg, 2005).
O estrogênio possui duas funções reguladoras nas concentrações de T3 e
T4. Em uma, o estrogênio aumenta as concentrações da proteína ligadora de T4
(TGB) no sangue devido à redução do clearence de TGB no fígado. Logo, a
quantidade de T4 livre no sangue diminui estimulando assim a proliferação dos
tireócitos (Ain e cols.,1987). Na segunda, o estrogênio aumenta os níveis de
diodinase hepática que converte T4 em T3, levando a uma redução ainda maior
no nível de T4 disponível (Lisboa e cols., 2001).
O estrogênio também é capaz de induzir proliferação e reduzir expressão
do transportador sódio/iodeto simporter (NIS) em tireócitos isolados em cultura,
a linhagem de células FRTL-5 (Furlanetto e cols., 1999). Por outro lado, em
ratos ovarectomizados, o estrogênio induziu proliferação e aumentou a síntese
de tireoperoxidase e a captação de iodeto (Lima e cols., 2006). Este dado
18
controverso pode ser explicado pelo fato de que, embora a expressão de NIS
seja reduzida, o aumento da glândula possa ter acarretado o aumento da
captação de iodeto.
Em 1989, Money e cols. verificaram que o tecido tireóideo humano
apresenta receptores de estrogênio e progesterona. Banu e cols., (2001, 2002a,
2002b) verificaram que o estrogênio só é capaz de induzir a proliferação de
tireócitos via TSH em fêmeas, e que nos machos esse efeito seria causado pela
testosterona. Além disso, foi observado que os hormônios sexuais podem
modular a expressão dos seus receptores na tireóide e com isso influenciar
diretamente o crescimento e proliferação das células foliculares (Banu e cols.
2002c). Em células MCF-7 de cancer de mama, foi demonstrado que o TGF-β1
foi capaz de inibir a transcrição de ERα, sugerindo a existência de um “cross-
talk” entre as vias de sinalização dos receptores de estrogênio e do TGF-β1
(Stoica e cols., 1997).
1.5. Efeitos do TGF-β
ββ
β1 na Tireóide
O fator de crescimento transformante β (TGF-β) tem sido relacionado a
diferentes funções celulares, por exemplo, atua como forte inibidor do
crescimento de células epiteliais (Kerbel, 1992; Ewan e cols., 2005) e no
aumento da diferenciação e sobrevivência de células (Hölting e cols., 1994; ver
em Akhurst e Derynk, 2001, Nicolussi e cols., 2006). O controle das funções do
19
TGF-β depende do equilíbrio entre sinais de estímulo e de inibição, os quais
muitas vezes estão interligados. Estudos com animais knock-out para TGF-β
demonstraram que este fator de crescimento atua também na regulação de
processos inflamatórios e no reparo tecidual (Kaminska e cols., 2005).
O principal integrante da superfamília do TGF-β é o TGF-β1, que é um
inibidor potente do crescimento e da síntese de DNA em células epiteliais,
bloqueando o ciclo celular, inibindo o mecanismo de ação das ciclinas e suas
quinases reguladoras (Ewen e cols., 1993, Geng e Weinberg,1993). Cirafici e
colaboradores em 1992 mostraram que o TGF-β1 possui a capacidade de inibir
a proliferação de células normais de tireóide, interrompendo o ciclo celular na
fase G
1
. Entretanto, linhagens transformadas de células tireóideas conseguem,
em cultura, resistir ao efeito inibitório do crescimento exercido pelo TGF-β1
(Coppa e cols., 1997). O TGF-β1 exerce suas funções de regular a proliferação
celular, a mobilidade celular, diferenciação e síntese de matriz extracelular
através de diferentes vias de sinalização (Piek e cols., 1999). O TGF-β1 é
sintetizado e secretado em uma forma pró-ativa, sendo posteriormente ativado
pela proteína “furin convertase” no complexo de Golgi. Muitas células são
capazes de secretar a forma inativa do TGF-β1, entretanto essa forma não é
reconhecida pelos receptores de TGF-β1 na superfície celular (Dubois e cols.,
1995).
20
Na tireóide o TGF-β1 inibe a proliferação de células da tireoideas, ação
oposta a do TSH e outros fatores de crescimento autócrinos (Ariga e cols.,
2000). Estas características indicam que o TGF-β1 possui um papel importante
para a manutenção da homeostase da tireóide (Bidey e cols., 1999). Sabe-se
que o TGF-β1 em tireócitos também inibe a expressão de alguns genes como: o
gene do transportador simporter Na
+
/I
-
(NIS), da tireoglobulina (Tg), da
tireoperoxidase (TPO) e do receptor de TSH (TSHr) (Colletta e cols., 1989,
Taton e cols., 1993, Kawaguchi e cols., 1997 e Franzén e cols.,1999). Além
disso, o TGF-β1 inibe a função do TSH na regulação do metabolismo do iodo
(Tsushima e cols., 1988) e na foliculogênese (Pellerin e cols., 1999).
Ensaios de afinidade revelaram que o TGF-β1 pode se ligar a diferentes
receptores dentre os quais os mais encontrados são os dos tipos I, II e III. Os
receptores dos tipos I e II (TGFRI e TGFRII) são serina/treoninas quinases e são
responsáveis pela translocação do sinal para a célula, enquanto o tipo III
(TGFRIII) é responsável por apresentar o ligante para os receptores de
sinalização (Lopes-Casillas e cols., 1993). Cada receptor é formado por
homodímeros de TGFRI ou TGFRII que ao serem ativados formam complexos
heterotetrâmicos, onde o TGFRII se autofosforila e depois fosforila o receptor
TGFRI (Massagué e Wotton, 2000; Moustakas, 2002). Ao ser ativado o TGFRI
transmite o sinal para o meio intracelular através de fosforilação de outras
proteínas chamadas Smads (Massagué, 1998). Existem 8 isoformas de Smads
1-8, divididas em 3 classes distintas. As Smads 1, 2, 3, 5 e 8 são as reguladoras
21
de receptor ou R-Smads, sendo fosforiladas pelos receptores de TGF-β. A
Smad4 é demoninada como Co-Smad por se ligar as R-Smads fosforiladas e
promover a translocação do complexo para o núcleo. Por fim, as Smads 6 e 7
regulam negativamente a ação do TGF-β por competirem com as R-Smads pela
ligação com a Co-Smad, sendo denominadas I-Smads (Figura 6). As I-Smads
também podem se ligar a outra família de proteínas, Smurfs, inativando os
receptores de TGF-β (Miyazono e cols., 1993; Hill, 1999; Moustakas, 2002,
Derynck e Zang, 2003, Shi e Massagué, 2003; Nicolussi e cols., 2006). A Smad4
também pode interagir com o complexo EREs formados por ERα ligado ao DNA,
reprimindo a ação gênica do E2; por outro lado, a Smad4 não é capaz de
interagir com os complexos EREs formados por ERβ (Wu e cols., 2003 e Ewan e
cols., 2005).
22
Figura 6: Esquema da via de sinalização mediada por Smads do TGF-β
(researchblogs.duke.edu/jas83).
Os receptores de TGF-β1 também influenciam outras vias de sinalização,
tais como: MAPKs (Grände e cols, 2002 e Mincione e cols., 2003), PI3-Ks (Bakin
e cols., 2000), as mesmas vias que também podem ser ativadas pelo estrogênio.
Em células da tireóide, o TGF-β1 foi capaz de inibir a proliferação (Tsushima e
cols., 1988) e reduzir a captação de iodeto (Colleta e cols., 1989; Pang e cols.,
1992), bem como a expressão de NIS na linhagem de células foliculares da
tireóide PC Cl3 (Costamagna e cols., 2004).
23
Em conjunto com a matriz extracelular (MEC), o TGF-β1 influencia
processos de reparação tecidual, como a cicatrização, sendo provável que atue
no “turnover” da MEC. Ignotz e Massagué (1986) mostraram que o TGF-β1
aumenta o acúmulo de fibronectina e colágeno em diferentes tipos celulares,
pelo aumento de suas sínteses (Ignotz e cols., 1987). É cada vez mais evidente
que os fatores de crescimento, as citocinas e a MEC se associam gerando sinais
que podem influenciar diversas funções celulares sendo que o TGF-β1 está
envolvido em muitos desses processos (Garbi e cols., 1990).
1.6. Linhagens Celulares Tireoideas
As células FRTL-5 e PC Cl3 são clones provenientes da linhagem
imortalizada de células tireoidéias FRTL, originadas a partir de uma cultura
primária de células da tireóide de ratos mantidas em meio de cultura com baixas
concentrações de soro fetal e suplementado com seis hormônios/fatores de
crescimento (insulina, transferrina, TSH, hidrocortisona, somatostatina e glicil-L-
histidil-L-lisina acetato), sendo purificadas por isolamentos de colônias
sucessivas. Estas células (FRTL) mantém um alto grau de diferenciação
evidenciado pela secreção de tireoglobulina e pelo aumento da concentração de
iodeto em mais de 100 vezes no meio de cultura (Ambesi-Impiombato e cols.,
1980). Em 1987, Fusco e cols., transfectaram estas células com alguns
24
retrovírus e conseguiram transformá-las em células independentes do TSH para
o seu crescimento, originando assim a linhagem celular FRTL-5 após uma
transfecção e as PC Cl3 após duas transfecções. Uma outra característica das
células FRTL é a secreção de condroitin sulfato e heparan sultafo para o meio
de cultura modulada pelo TSH, através do aumento de AMPc (Shishiba e cols.,
1988). Esta característica também é preservada nas células FRTL-5 já que
esses dados foram confirmados por Alves (2005). As funções de captar iodeto e
a síntese de tireoglobulina também estão preservadas nas células PC Cl3 (Lima
e cols., 2006) indicando não haver muitas diferenças entre estas linhagens
celulares.
As células estromais TS7 estabelecidas recentemente em nosso laboratório
por Alves (2005), são células alongadas com formato fibroblastóide que
expressam α-actina de músculo liso e vimentina, e sintetizam uma elaborada
rede de componentes de matriz extracelular como: laminina, fibronectina,
colágeno do tipo IV, heparan e condroitin sulfato. Experimentos de co-cultura
dessas células estromais TS7 com as células FRTL-5 mostraram aumento da
atividade proliferativa e diminuição da captação de iodeto das células FRTL-5,
sugerindo um papel importante do estroma na modulação da atividade
tireoideana.
Embora diferentes linhagens celulares tireóideas guardem características
morfológicas e funcionais bastante semelhantes às células in vivo, o estudo da
25
atividade destas linhagens celulares isoladas não mimetiza adequadamente o
microambiente glandular. Neste sentido, uma melhor compreensão destas
funções pode ser obtida, por exemplo, a partir da análise das interações
celulares entre células foliculares (PC Cl3) e células estromais (TS7) em
sistemas de co-cultura. Considerando os dados da literatura, estas interações
celulares envolvem mecanismos que interferem na proliferação celular e na
síntese hormonal, podendo ser intermediadas por uma via de sinalização que
utiliza TGF-β1 (Hölting e cols., 1994). Como o estroma e o epitélio cooperam na
formação da lâmina basal, mudanças no estroma podem alterar a lâmina basal e
consequentemente alterar a função das células epiteliais (Lin e Bissel, 1993).
Por outro lado, sabe-se também que o estrogênio tem um papel relevante sobre
essas funções glandulares, o que levanta a questão de uma possível relação
entre a ação desses dois sinalizadores na atividade normal da tireóide.
26
2. Objetivo Geral:
Avaliar in vitro os efeitos do estrogênio (E2) em células tireoideanas, e
correlacionar esses efeitos com as vias de sinalização do TGF-β1.
2.1. Objetivos Específicos:
• Analisar a expressão do receptor α de estrogênio (ERα) em cultura
de linhagens de células estromais (TS7) e foliculares (PC Cl3) de
tireóide.
• Analisar a expressão e distribuição do TGFRII nas linhagens de
células TS7 e PC Cl3.
• Analisar o efeito do 17β-estradiol sobre a expressão de TGFβ-1 e
TGFRII nas linhagens de células TS7 e PC Cl3.
• Quantificar a secreção de TGFβ-1 nas linhagens de células TS7 e
PC Cl3 tratadas com 17β-estradiol.
• Analisar o efeito do 17β-estradiol na via de sinalização de TGFβ-1
nas linhagens de células TS7 e PC Cl3.
27
• Analisar o efeito do 17β-estradiol na viabilidade das linhagens de
células TS7 e PC Cl3.
• Analisar o efeito do meio condicionado das células TS7 tratadas
com 17β-estradiol sobre a viabilidade e a captação de iodeto das
células PC Cl3.
• Analisar em modelos de co-cultura de células TS7/ PC Cl3 o efeito
do 17β-estradiol na viabilidade e na atividade celular.
• Quantificar a secreção de TGFβ-1 pelas co-culturas de células
TS7/ PC Cl3 tratadas com 17β-estradiol.
28
3. Material e Métodos
3.1. Obtenção e manutenção de células estromais tireóideas TS7
As células TS7, originadas de ratos machos, foram obtidas por Alves e
cols. (2005) e foram mantidas em estufa, à 37
o
C, em uma atmosfera de 5% de
CO
2
e em meio de cultura DMEM, com 5% de soro fetal bovino. A evolução
destas culturas celulares foi acompanhada por microscopia de contraste de fase
e o meio foi trocado a cada 48h.
3.2. Manutenção das células PC Cl3
As células PC Cl3, originadas de ratas fêmeas, foram mantidas em estufa à
37
o
C com atmosfera de 5% de CO
2
e em meio de cultura F12 suplementado
com TSH 1mU/mL e insulina 10µg/mL, transferrina 5µg/mL e 5% de soro fetal
bovino. A evolução destas culturas celulares foi acompanhada por microscopia
de contraste de fase e o meio foi trocado a cada 48h.
3.3. Co-culturas de células TS7/PC Cl3
As células TS7 e PC Cl3 (TS7/PC Cl3) foram cultivadas simultaneamente
em meio de cultura DMEM/F12 suplementado com TSH 1mU/mL e insulina
10µg/mL, transferrina 5µg/mL e 5% de soro fetal bovino, sua evolução foi
29
acompanhada por microscopia de contraste de fase e o meio foi trocado a cada
48h.
3.4. Tratamento das células estromais tireóideas TS7
As células TS7 foram cultivadas em meio DMEM com 5% de soro fetal
bovino até atingirem a semi-confluência, quando foram tratadas por 48h com
17β-estradiol (E2) diluído em 0,1% de etanol em três concentrações diferentes:
10
-9
M, 10
-8
M e 10
-7
M em meio de cultura livre de soro fetal. Todas as células
foram incubadas a 37
o
C e atmosfera de 5% de CO
2
em estufa.
3.5. Análise por RT-PCR
3.5.1. Extração de RNA
Para a extração do RNA das células estromais (TS7) e foliculares (PC
Cl3) tireóideas, foi utilizado o 1mL de reagente Trizol® (GibcoBRL, NY, EUA) por
garrafa de cultura de 25cm
3
. Aos lisados celulares foram adicionados 0,2 mL de
clorofórmio, para a separação do RNA total. Após a centrifugação (10000 rpm,
4
o
C, 15 minutos) é possível observar uma fase superior aquosa, transparente e
uma fase inferior mais densa e rosada. A fase aquosa foi transferida para um
novo tubo, onde foram adicionados 0,5 mL de isopropanol, para a precipitação
do RNA total. Após centrifugação (10000 rpm, 4
o
C por 10 minutos), o
30
sobrenadante foi descartado e 1mL de etanol 75% foi adicionado para lavagem
do precipitado remanescente. O etanol foi descartado por evaporação e o
precipitado ressuspendido em água tratada com dietil-pirocarboneto (DEPC)
(Sigma, MO, EUA). O RNA total foi extraído e armazenado no freezer a –20
o
C.
3.5.2. Quantificação do RNA total extraído
Os RNAs totais extraídos foram diluídos em água tratada com DEPC na
proporção de 1:500. As absorbâncias das amostras foram medidas nos
comprimentos de onda de 260 e 280 nm em espectrofotômetro (Hitachi, U
3000). Através de cálculos [absorbância a 260 nm x fator de diluição x 40] / 1000
foi determinada a quantidade de RNA total de cada amostra em µg/µL. Para a
verificação da pureza do RNA extraído, calculamos: absorbância a razão entre
as absorbâncias de 280nm / 260nm. O resultado encontrado deveria variar entre
1,5 e 2 indicando que as amostras estavam dentro dos padrões de pureza.
3.5.3. Gel de agarose
Depois da quantificação dos RNAs, as amostras foram submetidas à
eletroforese em gel de agarose (1% de agarose + Tampão contendo Tris 40mM
e EDTA 1 mM – TAE + 0,01% brometo de etídeo (intercalante de ácido nucléico)
para a verificação da integridade das amostras, através da observação das
31
bandas correspondentes aos RNA ribossomais 28S e 18S. A visualização das
bandas foi possível através da utilização de transiluminador UV (Bio Rad).
3.5.4. Transcrição reversa
Na síntese de fitas simples de DNA complementar (cDNA) a partir do
RNA total purificado, foram utilizados 2µg de RNA, 50 µM de oligonucleotídeo dT
(Pharmacia Biotech, NJ, EUA), transcriptase reversa (Superscript Rnase H-
Reverse Transcriptase, Gibco-BRL, NY, EUA), tampão 5x first strand [250mM
Tris-HCL (pH 8,3), 375mM KCl, 15mM MgCl
2
], 100mM DTT (Gibco-BRL, NY,
EUA), 10 unidades RNAsin (Gibco-BRL, NY, EUA) (inibidor de Rnase) e 10µM
dNTP (Gibco-BRL, NY, EUA) (coquetel de nucleotídeos). O RNA total purificado
foi incubado a 70
o
C por 10 minutos, na presença de H
2
O DEPC e
oligonucleotídeo dT, para reconhecimento e ligação à cauda poli A dos RNA
mensageiros. Em seguida, adicionou-se ao tubo o restante dos reagentes e
incubou-se à 42
o
C por 1 hora. Terminado o tempo de incubação, a mistura é
submetida à 90
o
C por 5 minutos para a inativação de enzima transcriptase
reversa (RT). Foi adicionado ao tubo 15µL de acetato de amônia 7,5 M, pH 8,0 e
120µL de etanol 100% e colocou-se em freezer –20
o
C overnight para
precipitação do cDNA. A seguir, as amostras foram submetidas à centrifugação
(12000 rpm, por 30 min, à 4
o
C) para precipitação do cDNA. O sobrenadante foi
descartado e acrescentou-se 50µl de etanol 75% ao precipitado. O etanol foi
32
todo retirado, o cDNA foi ressuspenso em 11µl de água MilliQ e armazenado em
freezer –20
o
C.
3.5.5. Reação em Cadeia de polimerase (PCR)
Após a obtenção do RNA de fita única (cDNA), através da etapa de
transcrição reversa, foi realizada a amplificação do fragmento de cDNA
correspondente ao RNA mensageiro em estudo, utilizando-se oligonucleotídeos
sense e antisense para uma região específica do Transforming Growth Factor –
β1 (TGF-β1) [forward (sense: 5’-CTG TAA AAA CTA AGG CTC GC-3’) e reverse
(antisense: 5’-CGT CAA AAG AÇA GCC ACT CA-3’)]; receptor do TGF-β1
(TGFRII) [forward (sense: 5’-CGC TTT GCT GAG GTC TAT AAG GC-3’) e
reverse (antisense: 5’-GAT ATT GGA GCT CTT GAG GTC CCT-3’)]; receptor de
estrogênio α (ERα) [forward (sense: 5’-AAT TCT GAC AAT CGA CGC CAG-3’) e
reverse (antisense: 5’-GTG CTT CAA CAT TCT CCC TCC TC-3’)]; receptor de
estrogênio β (ERβ) [forward (sense: 5’-AAA GCC AAG AGA AAC GGT GGG
CAT-3’) e reverse (antisense: 5’-GCC AAT CAT GTG CAC VAG TTC CTT-3’)] .
Para a amplificação dos fragmentos desejados, do gene do TGF-β1, tampão
10X [200mM Tris-HCl (ph 8,4) e 500mM KCl) (Gibco-BRL, NY, EUA), 1,5mM de
MgCl
2
(Gibco-BRL, NY, EUA), 10µM dNTP (Gibco-BRL, NY, EUA) e 3 unidades
da enzima Taq polimerase (Gibco-BRL, NY, EUA). A reação de PCR foi utilizada
sob as seguintes condições: 94
o
C por 4 min; seguida de 35 ciclos com
seqüência: 95
o
C por 30 seg, 57
o
C por 45 seg e 72
o
C por 45 seg; 72
o
por 7 min;
33
4
o
Cpor 4 min. Como controle interno dos experimentos utiliza-se, a amplificação
por PCR de um gene constitutivo, o gene do GAPDH (sense: 5’ctg aga atg gga
aac ttg tc- 3’; antisense: 5’gtc act gtt aaa gtt gga gg- 3’). Em seguida, a
densidade das bandas foram medidas com o programa Scion Image.
3.6. Imunocitoquímica
As células foram cultivadas em estufa a 37
o
C e atmosfera de 5% de CO
2
,
sobre lamínulas de vidro, em placas de 24 poços, até atingirem a semi-
confluência; foram depois fixadas com 4% de paraformaldeído (PFA) em tampão
fosfato 0,1M pH 7,45 (TPS) por 30 minutos, sendo depois lavadas 3 vezes em
TPS. Em seguida, incubadas com cloreto de amônia 50nM por 15 minutos e
depois com gelatina 0,2% + saponina 0,05% em TPS por 30 minutos e com o
anticorpo primário “overnight” em câmara úmida a 4°C. Os anticorpos primários
utilizados foram: Monoclonal Anti-α-Actina de Músculo Liso clone 1A4 (Sigma),
Policlonal Anti-Rat TGFRI (Santa Cruz Biotechnology), Policlonal Anti-Rat
TGFRII clone L-21 (Santa Cruz Biotechnology). No dia seguinte, as células
foram lavadas 3 vezes com a solução de gelatina 0,2% + saponina 0,05% em
TPS por 10 minutos e depois incubadas com o anticorpo secundário conjugado
a fluoreceína (Alexia Fluor® 488) ou rodamina (Alexia Fluor® 546) por 2 horas.
Após esse tempo repetem-se as 3 lavagens de 10 minutos com gelatina 0,2% +
saponina 0,05% em TPS e por fim as lamínulas foram lavadas com água
destilada e incubadas 5 minutos com DAPI para marcação nuclear, sendo bem
34
lavadas com água destilada para serem montadas em lâminas com o meio de
montagem n-propilgalato, quando então foram levadas para a observação no
microscópio óptico de fluorescência.
3.7. Western blotting
As células foram cultivadas em garrafas de cultura de 25cm
3
até atingirem
a semiconfluência, quando foram tratadas com E2 10
-8
M por 48 horas. Após o
tratamento, as proteínas celulares foram extraídas em tampão de lise (tampão
fosfato + 2mM EDTA pH 7.0 + 2mM β-mercaptoetanol + 1mM Benzamidina). Em
seguida as proteínas das amostras foram dosadas pelo método de Bradford
(Bradford, 1976). No dia seguinte, as amostras foram fervidas e depois aplicadas
no gel de poliacrilamida a 12 %. Após a corrida, o gel foi retirado e as proteínas
transferidas para uma membrana de PVDF previamente ativada por metanol por
em 30 segundos, sendo depois lavada em água e ambientada em tampão de
transferência. A transferência foi feita em uma cuba da Bio-Rad no tempo de
1hora a 90-95V com amperagem constante. A membrana foi bloqueada com
albumina 10% em TBS com tween 0,1% (TTBS) por 1 hora, e incubada com
anticorpo primário (Policlonal Anti-Rabbit Phospho-Smad (Ser 465/467), Cell
Signaling Technology) em TTBS por 1 hora. Após a incubação, lava-se a
membrana com TTBS 3 vezes por 5 minutos e incuba-se com o anticorpo
secundário conjugado a peroxidase (HRP) em TTBS por 1 hora, que foi revelado
35
com o kit ECL Plus por 5 minutos na câmara escura, e por fim foi revelado em
em filme fotográfico e a densidade das bandas foram medidas com o programa
Scion Image.
3.8. ELISA
Os níveis de TGFβ-1 secretados pelas células estromais TS7 foram
medidos pela técnica de ELISA. Neste ensaio usamos o anticorpo monoclonal
anti-TGFβ-1 (R&D Systems, UK) para captura e o anticorpo policlonal biotinilado
de galinha anti-humano (R&D Systems, UK) como anticorpo de detecção. Este
ensaio mede apenas o TGFβ-1 ativo na amostra. Para medir o TGFβ-1 total
presente nos meios condicionados, o TGFβ-1 biologicamente latente foi ativado
por um tratamento ácido com HCl 1N, por 10 minutos. Após este tempo o HCl foi
neutralizado com igual volume de NaOH 1N. As análises de ELISA foram feitas
em placas de 96 poços de acordo com instruções do fabricante do kit (R&D
Systems, UK cat nº DY240). O TGFβ-1 humano recombinante foi usado como
padrão numa curva que variava de 0,032-2,000 pg/ml.
36
3.9. Ensaio de MTT
Para o ensaio de viabilidade celular, as células foram cultivadas por 24,
48 e 72 horas em placas de 96 poços (4x10
3
células / poço) em meio sem soro
fetal bovino. O meio de cultura das células foi descartado e as células foram
lavadas com BSS (solução salina balanceada). O ensaio de MTT é baseado na
conversão do sal tetrazolium (3-(4,5-dimetihylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxy-
methoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) em formazam que é solúvel
em meio de cultura e é medido diretamente a 570nm. Foram adicionados 100µL
de MTT (0,5mg / ml) em cada poço. A placa foi coberta com papel alumínio e
permaneceu por 3-4 horas na estufa a 37°C. Em segui da, o MTT foi retirado e
foram acrescentados 100µL de DMSO. A placa foi lida em espectrofotômetro em
comprimento de onda de 570 nm.
3.10. Captação de Iodo radioativo
As células PC Cl3 foram cultivadas em placas de 24 poços com meio F12
suplementado com TSH 1mU/mL e insulina 10µg/mL e transferrina 5µg/mL até
atingirem a semi-confluência quando foram tratadas por 48 horas com
estrogênio nas concentração de 10
-9
M, 10
-8
M, 10
-7
M. Enquanto as co-culturas,
foram cultivadas em meio de cultura DMEM/F12 suplementado com TSH
1mU/mL e insulina 10µg/mL, transferrina 5µg/mL e 5% de soro fetal bovino. Em
37
seguida, as células foram lavadas com HBSS (Hans Balanced Saline Solution) e
depois incubadas com aproximadamente 150.000 cpms de iodo radioativo por
poço durante 45 minutos. O sobrenadante foi recolhido e depois adicionado mais
500µL de HBSS, o qual foi recolhido após 3 minutos, este processo foi repetido
até 15 minutos depois, sendo em seguida as células permeabilizadas com
DMSO. As amostras foram então encaminhadas para o leitor de radiação gama
onde foi medida a quantidade de I
125
liberado pelas células.
3.11. Análide Estatística
As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o Programa
GraphPad Prism 4.0. Os dados obtidos a partir da densitometria das bandas
tanto dos RT-PCRs quanto do western blotting, como os dados do ELISA e da
captação de iodeto foram analisados pelo teste de variância oneway ANOVA,
seguido pela análise de Colunas de Tukey. Para a análise da viabilidade celular
e do efluxo de iodo foi utilizado o teste de variância twoway ANOVA, seguido
também pela análise de colunas de Tukey.
38
4. Resultados:
4.1. Organização das culturas celulares.
Pela microscopia de contraste de fase podemos observar a morfologia
geral das células estromais TS7, que adquirem a forma estrelada com
prolongamentos semelhantes àqueles observados em fibroblastos em cultura
(Figura 7A). As células PC Cl3, por sua vez, são menores que as células
estromais TS7, apresentam formato esférico e apresentam-se agregadas (Figura
7B). Em co-cultura as células estromais TS7 se organizam ao redor de
pequenos aglomerados de células foliculares PC Cl3, formando estruturas
bidimensionais que lembram os folículos presentes na glândula in vivo (Figura
7C).
4.2. Expressão do receptor de estrogênio (ERα
αα
α).
A expressão do RNA mensageiro do receptor de estrogênio α (ERα) foi
analisada por RT-PCR nas células estromais TS7 e nas células foliculares PC
Cl3 (Figura 8A), seguida pela análise da densitometria das bandas (Figura 8B).
Nas células TS7 podemos observar a expressão o receptor ERα, enquanto que
as células PCCL3 não o expressam.
Figura 7: Fotomicrografias de
contraste de fase das células
estromais TS7 (A) e foliculares
PC Cl3 (B) de tireóide de rato,
cultivadas isoladamente e em co-
cultura (C). Observe que as células
TS7 possuem um formato alongado
do tipo fibroblastóide, enquanto que
as células PC Cl3 assumem uma
conformação mais arredondada.
Quando co-cultivadas, as células
PC Cl3 formam pequenos
aglomerados circundados pelas
células TS7 (em amarelo),
lembrando a organização folicular
observada na glândula in vivo.
Barras = 50µm.
A
C
B
39
Figura 8: RT-PCR para ERα
αα
α sintetizado pela linhagem PC Cl3 de células
foliculares e pela linhagem TS7 de células estromais. (A) RT-PCR para ERα,
padrão de peso molecular (PM), células PC Cl3 (PC Cl3), células TS7 (TS7), extrato de
útero usado como controle positivo (Útero), controle negativo sem transcriptase reversa
(RT-), controle negativo sem cDNA (C-). (B) Densitometria. Observe que as células
estromais TS7 expressam o receptor ERα, enquanto que as células foliculares PCCL3
não expressam.
**
p < 0,01,
***
p < 0,001 em relação aos controles negativos.
GAPDH
ERα
αα
α
PM PC Cl3 TS7 Útero RT-
C-
A
PC Cl3 TS7 Útero RT - C -
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
ER
α
α
α
α
/GAPDH
B
**
***
40
41
4.3. Distribuição imunocitoquímica dos receptores de TGF-β
ββ
β1.
A imunodistribuição dos receptores TGFRI e TGFRII foi granular e
observada na região do núcleo e da superfície celular em ambos os tipos
celulares. As células TS7 e PC Cl3 apresentaram uma reatividade mais intensa
para o TGFRII (Figura 9B, 9D), enquanto que a imunomarcação para o TGFRI
(Figura 9A, 9C) foi menos intensa, porém mais concentrada nas células PC Cl3.
4.4. Dosagem do TGF-β
ββ
β1 secretado pelas células estromais TS7
tratadas com E2.
Utilizando a técnica de ELISA, realizamos a dosagem do TGF-β1 secretado
para o meio de cultura pelas células estromais TS7, tratadas com E2 10
-8
M por
24 horas. Os resultados mostraram que o E2, nesta concentração, foi capaz de
aumentar a secreção da forma pró-ativa do TGF-β1, porém não foi capaz de
aumentar a quantidade de TGF-β1 ativado (Figura 10).
Figura 9: Imunodistribuição de TGFRI (A, C) e TGFRII (B, D) nas células
estromais TS7 (A, B) e foliculares PCCL3 (C, D). Observe que a imunomarcação é
granular e distribuída na região do núcleo e da superfície celular em ambos os tipos
celulares. Notar que as células TS7 e PC Cl3 possuem uma reatividade mais intensa
para o TGFRII, enquanto que a imunomarcação para o TGFRI é menos intensa e
mais observada nas células PC Cl3. (E, F) controle negativo. Coloração nuclear com
DAPI. Barras = 50 µm.
A
C
B
D
42
E
F
Figura 10: Dosagem por ELISA do TGF-β
ββ
β1 secretado na
forma total e na forma ativada pelas células TS7 tratadas
24 horas com estrogênio (E2) 10
-8
M. Notar que, embora haja
um aumento da secreção de TGF-β1 total, a quantidade ativa
do fator não sofre alteração.
**
p < 0,01.
43
Secretado Total Secretado Ativo
0.000
0.025
0.050
0.075
0.100
0.125
V
E2
[TGF-
β
β
β
β
1] ng/mL
**
44
4.5. Efeito do estrogênio sobre a expressão de TGF-β
ββ
β1 e TGFRII nas
células estromais TS7.
O efeito do E2 na expressão de TGF-β1 foi avaliado por RT-PCR nas
células TS7 tratadas por 48 horas com concentrações crescentes de E2 (10
-9
M,
10
-8
M, 10
-7
M). Os resultados obtidos mostraram que essas concentrações de E2
foram capazes de estimular de forma direta a síntese de TGF-β1, como
confirmado pela análise estatística (Figura 11). A ação do estrogênio sobre o
TGFRII também foi analisada por RT-PCR e os resultados mostraram que, não
houve modificação da síntese deste receptor nas células estimuladas por essas
concentrações de E2 (Figura 12).
4.6. Efeito do E2 sobre a via de sinalização do TGF-β
ββ
β1 (Smad2-p) nas
células estromais TS7.
A fosforilação de Smad2 (Smad2-p) compreende uma via secundária de
ação do TGF-β1 e foi analisada por western blotting (Figura 13A). Nestes
experimentos verificamos que o E2 na concentração de 10
-8
M foi capaz de
aumentar a fosforilação de Smad2 nas células estromais TS7, conforme
demonstrado na análise da densitometria das bandas (Figura 13B).
***
Figura 11: RT-PCR para TGF-β
ββ
β1 sintetizado pelas células estromais TS7 tratadas
com E2 por 48 horas. (A) RT-PCR para TGF-β1. Padrão de peso molecular (PM), células
sem tratamento (V), E2 10
-9
M (E2 10
-9
M), E2 10
-8
M (E2 10
-8
M), E2 10
-7
M (E2 10
-7
M),
controle negativo sem transcriptase reversa (RT-), controle negativo sem cDNA (C-). (B)
Densitometria. Observe que o E2 é capaz de estimular de forma concentração dependente
a síntese de TGF-β1.
**
p < 0,01,
***
p < 0,001.
GAPDH
TGF-β
ββ
β1
V E2 10
-9
M E2 10
-8
M E2 10
-7
M
0
1
2
3
4
5
TGF-
β
β
β
β
1/GAPDH
P
M
V
E
2
1
0
-
9
M
E
2
1
0
-
8
M
E
2
1
0
-
7
M
R
T
-
C
-
A B
***
***
**
Figura 12: RT-PCR para TGFRII sintetizado pelas células estromais TS7 tratadas
com E2 por 48 horas. (A) RT-PCR para TGFRII. Padrão de peso molecular (PM),
células sem tratamento (V), E2 10
-9
M (E2 10
-9
M), E2 10
-8
M (E2 10
-8
M), E2 10
-7
M (E2
10
-7
M), controle negativo sem transcriptase reversa (RT-), controle negativo sem cDNA
(C-). (B) Densitometria. Observe que essas concentrações de E2 não alteram a síntese
de TGFRII.
GAPDH
TGFRII
P
M
V
E
2
1
0
-
9
M
E
2
1
0
-
8
M
E
2
1
0
-
7
M
R
T
-
C
-
V E2 10
-9
M E2 10
-8
M E2 10
-7
M
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
TGFRII/GADPH
A B
45
Figura 13: Western Blotting para Smad2-p nas células
estromais TS7 tratadas por 48 horas com E2 10
-8
M. (A) Western
blotting para Smad2-p. Células não tratadas (V), células tratadas
(E2), células tratadas 1 hora com TGF-β1 como controle positivo
(TGF-β1). (B) Densitometria. Observe que o E2 10
-8
M induziu um
aumento na fosforilação de Smad2, embora este aumento tenha
sido menor que o induzido diretamente pelo TGF-β1.
**
p < 0,01,
***
p < 0,001.
V
E2 10
-8
M
TGF-β1
Smad2-P
α-tubulina
A
46
V E2 TGF-
β
ββ
β
1
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
Smad2-p/
α
α
α
α
-Tubulina
B
***
**
**
47
4.7. Efeito do E2 sobre a distribuição de TGFRI e TGFRII nas células
estromais TS7 e foliculares PC Cl3.
A distribuição de TGFRI (Figura 14) e TGFRII (Figura 15) foi analisada por
imunocitoquímica após o tratamento com E2 10
-8
M por 48 horas, tanto nas
células estromais TS7 quanto nas células foliculares PC Cl3. Embora tenha
havido uma discreta redução da imunomarcação do TGFRI apenas nas células
PC Cl3, não houve alteração no seu padrão de distribuição (Figura 14C, 14D).
No caso do TGFRII, houve uma leve redução da imunoreatividade apenas nas
células TS7 (Figura 15A, 15B), não havendo modificação relevante da sua
distribuição em ambas as células.
Figura 14: Imunodistribuição do TGFRI nas células estromais TS7 (A, B) e
foliculares PC Cl3 (C, D), cultivadas na ausência (A, C) ou na presença de E2 10
-8
M
(B, D) por 48 horas. Observe que este tratamento induz apenas uma discreta diminuição
da imunomarcação nas células PC Cl3. Coloração nuclear com DAPI. Barras = 50µm.
A B
C D
48
Figura 15: Imunodistribuição do TGFRII nas células estromais TS7 (A, B) e
foliculares PC Cl3 (C, D), cultivadas na ausência (A, C) ou na presença de E2
10
-8
M (B, D) por 48 horas. Notar que o tratamento reduz levemente a
imunoreatividade nas células TS7, porém sem alterar a sua distribuição. Coloração
nuclear com DAPI. Barras = 50µm.
A B
C D
49
50
4.8. Efeito do E2 e do TGF-β
ββ
β1 sobre a viabilidade das células estromais
TS7 e foliculares PC Cl3, cultivadas isoladamente e em co-cultura.
A viabilidade das células estromais TS7 e foliculares PC Cl3 tratadas com
E2 10
-8
M e com TGF-β1 foi analisada pela técnica de MTT. Nestes
experimentos, não observamos nenhum efeito do E2 e do TGF-β1 na viabilidade
das células TS7 (Figura 16) e PC Cl3 (Figura 17). A fim de verificar se algum
material secretado pelas células TS7 poderia influenciar na viabilidade das
células PC Cl3, estas foram cultivadas na presença de meio condicionado de
células TS7 tratadas com E2 por 48 horas. Nestas condições de cultivo,
novamente não observamos alterações na viabilidade das células PC Cl3
(Figura 18). Quando as células PC Cl3 e TS7 foram co-cultivadas, houve um
pequeno aumento na viabilidade celular, embora não tenha havido nenhuma
diferença entre os tratamentos realizados (Figura 19).
Figura 16: Ensaio de viabilidade das células estromais TS7 pela técnica do
MTT. Células sem tratamento (Veículo), células tratadas com E2 10
-8
M (E2),
tratadas com 10 µg/mL de TGF-β1 (TGF-β1), meio de cultivo com SFB usado
como controle positivo (SFB). Observe que nem o E2 nem o TGF-β1 são capazes
de influenciar a viabilidade das células TS7.
0 24 48 72
0
50
100
150
200
Veículo
E2
TGF-β1
Tempo (horas)
% Células Viáveis
Figura 17: Ensaio de viabilidade das células foliculares PC Cl3 pela técnica do
MTT. Células sem tratamento (Veículo), células tratadas com E2 10
-8
M (E2), tratadas
com 10 µg/mL de TGF-β1 (TGF-β1), meio de cultivo com SFB usado como controle
positivo (SFB). Notar que nem o E2 nem o TGF-β1 são capazes de influenciar a
viabilidade das células PC Cl3.
0 24 48 72
0
50
100
150
200
TGF-β1
E2
Veículo
Tempo (horas)
% Células Viáveis
51
Figura 18: Ensaio de viabilidade das células foliculares PCCL3 cultivadas na
presença de meio condicionado das células estromais TS7, pela técnica do MTT .
Células não tratadas (Veículo), células tratadas com E2 10
-8
M(E2), com 10 µg/mL de
TGF-β1 (TGF-β1), meio de cultivo das células PC Cl3 (F12 + SFB), meio de cultivo das
células estromais TS7 (DMEM + SFB), meio condicionado das células TS7 sem
tratamento (DMEM + V 48h), meio condicionado das células TS7 tratadas com E2 por 48
horas (DMEM + E2 48h). Observe que o meio condicionado das células TS7 tratadas ou
não com E2 por 48 horas não foi capaz de modificar a viabilidade das células PC Cl3.
0 24 48 72
0
50
100
150
200
Veículo
E2
TGF-β1
Meio Condicionado das Células TS7
Meio Condicionado das Células TS7 tratadas
com E2
Tempo (horas)
% Células Viáveis
Figura 19: Ensaio de viabilidade da co-cultura de células estromais TS7 e foliculares
PC Cl3 pela técnica do MTT. Células sem tratamento (Veículo), tratadas com E2 10
-8
M
(E2), com 10 µg/mL de TGF-β1 (TGF-β1), meio de cultivo com SFB (DMEM/F12 + SFB).
Observe que, nestas condições de co-cultivo, há um pequeno aumento na viabilidade das
células PC Cl3 e TS7, embora tanto o E2 quanto o TGF-β1 não tenham influenciado este
comportamento.
0 24 48 72
0
50
100
150
200
Veículo
E2
TGF-β1
Tempo (horas)
% Células Viáveis
52
53
53
4.9. Efeito do E2 e do TGFβ
ββ
β-1 sobre a captação de iodeto nas células
estromais TS7 e foliculares PC Cl3, cultivadas isoladamente e em co-
cultura.
Nestes experimentos de captação de iodo radioativo nas linhagens
celulares estromal e folicular, observamos que as células TS7 não conseguiram
captar nenhum isótopo de iodo (Figura 20). Como esperado, as células PC Cl3
captaram iodo, embora nenhum tratamento tenha modificado esta atividade. No
entanto, quando comparados entre si, o E2 induziu uma maior captação de
iodeto do que o TGF-β1 (Figura 21A). A análise do efluxo de iodo nas células
PC Cl3 não demonstrou nenhuma diferença entre os tratamentos efetuados
(Figura 21B). Na co-cultura, as células PC Cl3 captaram menos iodo, embora o
tratamento conjugado E2 + TGF-β1 tenha estimulado a captação, quando
comparado aos tratamentos isolados (Figura 22A). Não houve nenhuma
alteração na velocidade de efluxo de Iodo 125 entre os grupos (Figura 22B).
0
100
200
300
400
500
600
Veículo
E2
TGF-β1
E2 + TGF-β1
KClO
4
% Captação de Iodeto
Figura 20: Ensaio de captação de Iodo 125 pelas células estromais TS7.
Células sem tratamento (Veículo), tratadas por 48 horas com E2 10
-8
M (E2), com
10 µg/mL TGF-β1 (TGF-β1), com E2 10
-8
M + 10 µg/mL de TGF-β1 (E2 + TGF-
β1) e com um inibidor do transportador NIS (KClO
4
). Observa-se que não existe
alteração na captação de Iodo 125 entre os grupos.
54
0 3 6 9 12 15
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
Veículo
E2 10
-9
M
E2 10
-8
M
E2 10
-7
M
TGF-β1
Tempo (minutos)
CPMs
0
100
200
300
400
500
600
Veículo
E2
TGF-β1
E2 + TGF-β1
KClO
4
% Captação de Iodeto
* * *
* *
Figura 21: Ensaio de captação e efluxo de Iodo 125 pelas células foliculares PC Cl3.
(A) Captação de Iodo das células não tratadas (V), tratadas por 48 horas com E2 10
-8
M
(E2), com 10 µg/mL de TGF-β1 (TGF-β1), com E2 10
-8
M + 10 µg/mL de TGF-β1 (E2 +
TGF-β1) e com um inibidor do transportador NIS (KClO
4
). (B) Efluxo de Iodo das células
não tratadas (Veículo), tratadas com E2 10
-9
M (E2 10
-9
M), com E2 10
-8
M (E2 10
-8
M), com
E2 10
-7
M (E2 10
-7
M), com 10 µg/mL de TGF-β1 (TGF-β1). Observe que todos os grupos
captaram iodo, e quando comparados entre si, o E2 induz uma maior captação do que o
TGF-β1. Não houve nenhuma alteração na velocidade de efluxo de Iodo 125 entre os
grupos.
**
p < 0,01,
***
p < 0,001 em relação a todos os grupos.
A
B
55
Figura 22: Ensaio de captação e efluxo de Iodo 125 na co-cultura das células
estromais TS7 e foliculares PC Cl3. (A) Captação de Iodo das células não tratadas
(V), tratadas por 48 horas com E2 10
-8
M (E2), com 10 µg/mL de TGF-β1 (TGF-β1),
com E2 10
-8
M + 10 µg/mL de TGF-β1 (E2 + TGF-β1) e com um inibidor do
transportador NIS (KClO
4
). (B) Efluxo de Iodo das células não tratadas (V), tratadas
com E2 10
-9
M (E2 10
-9
M), com E2 10
-8
M (E2 10
-8
M), com E2 10
-7
M (E2 10
-7
M), com
10 µg/mL de TGF-β1 (TGF-β1). Observe que nestas condições de cultivo as células
PC Cl3 captam menos iodo, embora o tratamento com E2 + TGF-β1 tem um efeito
estimulador da captação quando comparado aos tratamentos isolados. Não houve
nenhuma alteração na velocidade de efluxo de Iodo 125 entre os grupos.
*
p < 0,05,
***
p < 0,001 em relação a todos os grupos.
3
6
9
12
15
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Veículo
E2 10
-9
M
E2 10
-8
M
E2 10
-7
M
TGF-β1
Tempo (minutos)
CPMs
0
100
200
300
400
500
600
Veículo
E2
TGF-β1
E2 + TGF-β1
KClO4
% Captação de Iodeto
* * *
*
*
A
B
56
57
5. Discussão:
A prevalência três vezes maior de doenças da tireóide em mulheres do que
em homens tem sido determinante para a especulação sobre o efeito do
estrogênio sobre essa glândula (Wang e Crapo, 1997; Marugo e cols., 1991;
Rallison e cols., 1991). Considerando que o estrogênio é capaz de modular a
atividade da tireóide, como por exemplo, estimular o crescimento glandular,
muitos estudos têm focalizado sua atividade proliferativa em tumores tireóideos,
os quais são formados principalmente por células foliculares (Manole e cols.,
2001; Santen e cols., 2002; Doganay e cols., 2005). Recentemente, Bléchet e
cols. (2007) verificaram que hiperplasias de células parafoliculares ocorrem
preferencialmente em homens do que em mulheres, sugerindo que diferentes
tipos de hiperplasias respondem a diferentes estímulos de hormônios sexuais.
Entretanto, esses trabalhos verificaram a ação dos hormônios sexuais apenas
em um tipo celular, enquanto que a glândula possui três populações distintas: o
estroma, as células foliculares e as células parafoliculares. Diante deste fato e
com o intuito de melhor compreender o microambiente glandular, nosso
laboratório isolou pela primeira vez uma população de células estromais de
tireóide de rato, denominadas células TS7 (Alves, 2005), cujas interações com
diferentes linhagens de células foliculares estão sendo avaliadas em modelos de
co-cultura.
58
Nesta tese demonstramos que as células estromais TS7 expressaram o
ERα, e que o E2 foi capaz de induzir a expressão de TGF-β1 e ativação da via
de sinalização intracelular Smad2. Também verificamos que os receptores
TGFRI e TGFRII do TGF-β1 estavam presentes nas células estromais TS7 e nas
foliculares PC Cl3, inclusive sendo detectados pela primeira vez no núcleo
dessas células. Além disto, observamos nas co-culturas que a captação de
iodeto estava diminuída e que o tratamento conjugado de E2 mais TGF-β1
melhorava esta atividade.
Haslam e Woodward (2003) fizeram uma revisão sobre a ação do E2 na
interação de células estromais e foliculares de glândulas mamárias, um tecido
que sofre forte influência da ação hormonal que, assim como a tireóide, depende
de interações estroma - epitélio para realizar corretamente sua função. Nesta
revisão ficou evidenciado que a resposta da glândula tanto ao estrogênio quanto
a progesterona deve ser indireta, através de ações parácrinas, uma vez que as
células proliferativas não são positivas para o receptor alfa de estrogênio (Zang
e cols., 2002). Na tireóide, há relatos na literatura sobre a expressão apenas de
ERβ pelas células foliculares e parafoliculares (Taylor e Al-Azzawi, 2000;
Kawabata e cols., 2003; Bléchet e cols., 2007). Por outro lado, nossos
resultados revelaram a presença do RNA mensageiro para ERα apenas nas
células estromais TS7 e confirmaram que as células foliculares PC Cl3 não
expressavam este receptor. A presença de ERα na linhagem estromal TS7
sugere que o E2 possa induzir nestas células a produção de algum outro fator, o
59
qual não seria induzido pelo sinal gerado pelo ERβ, interferindo assim de forma
parácrina na atividade das células foliculares PC Cl3.
Em 2003, Soares e cols. constataram que os receptores de E2 ativados
possuem a capacidade de induzir a síntese e secreção de TGF-β em linhagem
estabelecida a partir de câncer de mama, as células MCF-7. Devido à
capacidade do TGF-β de inibir a proliferação, migração e invasão de linhagens
de carcinomas foliculares e papilíferos da tireóide (Höltng e cols., 1994),
indagamos se o E2 poderia induzir a síntese de TGF-β nas células estromais
que, por sua vez, atuaria nas células foliculares regulando suas atividades
proliferativa e secretora. Esta hipótese ganhou mais força quando verificamos a
presença dos receptores de TGF-β (TGFRI, TGFRII) nas células TS7 e PC Cl3,
e também pelo efeito indutor do E2 sobre a secreção de TGF-β1. Todavia,
observamos que o estímulo com E2 não modificou os níveis de RNA mensageiro
de TGFRII nas células TS7, um dado curioso uma vez que o TGF-β1 regula a
transcrição dos seus receptores, mas foi suficiente para induzir um aumento da
via Smad2 de sinalização do TGF-β1. O aumento na secreção apenas da forma
inativa de TGF-β1 induzido pelo E2 após 24 horas pode ser justificado pelo fato
deste fator ficar armazenado na MEC sendo posteriormente ativado e liberado
(Dallas e cols., 2005; Chen e cols., 2007; ver Wells e Discher 2008), por isso
aumentamos a partir deste momento o tratamento para 48 horas. Em células
MCF-7, foram observados um efeito inibidor do TGF-β1 sobre a expressão do
60
RNA mensageiro do ER (Stoica e cols., 1997), e que Smad4 atuava como co-
repressor do ERα (Wu e cols., 2003).
Nossos resultados mostraram que os níveis de receptores de TGF-β1 não
foram alterados durante o tratamento com E2, mas a sinalização intracelular
estava aumentada. Cogitamos então da possibilidade de uma reorganização da
disposição do TGFRI e TGFRII após o tratamento com E2, que poderia
amplificar o sinal intracelular. Apesar do E2 não ter sido capaz de promover esta
reorganização, observamos pela primeira vez, a presença de TGFRI e TGFRII
no núcleo das células. Embora tenhamos observado que estes mesmos
resultados se repetiram em vários experimentos, que as imagens das
imunofluorescências analisadas por microscopia confocal confirmaram a
marcação na região nuclear e que, os controles negativos com peptídeos
inibidores dos anticorpos primários indicaram uma marcação nuclear, este
resultado é de difícil interpretação à luz da literatura, devendo ser ainda
efetivamente confirmado por experimentos de fracionamento celular e de
western blot. No entanto, podemos sugerir a existência de outro mecanismo de
ação do TGF-β1, que não envolva a interação classicamente conhecida com
receptores na membrana celular, e sim com receptores nucleares.
Além do seu papel na regulação de citocinas, tanto o E2 quanto o TGF-β1
possuem papel importante na proliferação celular da tireóide. Diferentes estudos
mostraram que o E2 estimula a proliferação de diversas linhagens celulares da
61
tireóide como: células foliculares WRO e células tumorais ARO de tireóide
humana (Vivacqua e cols., 2006), células foliculares FRTL-5 de tireóide de rato
(Furnaletto e cols., 1999), células MCF-7 ERα positivas (Ewan e cols., 2005).
Por sua vez, o TGF-β1 inibe a proliferação de células de tireóide de porco
(Tsushima e cols., 1988), células FRTL-5 (Morris e cols., 1988) e células MCF-7
ERα positivas (Ewan e cols., 2005). Em nossos resultados, não observamos
alterações na viabilidade das células TS7 e PC Cl3 tratadas com E2 e/ou TGF-
β1, sugerindo que estes fatores não influenciam a proliferação dessas células.
Uma outra explicação para essa diferença de resultados é o fato de tanto as
células FRTL-5 quanto as PC Cl3 apresentarem um alto grau de variabilidade
clonal, proporcionando resultados controversos entre vários grupos de
pesquisadores (Kimura e cols., 2001). Também é importante ressaltar que o
papel do E2 na viabilidade de células da tireóide ainda não está completamente
esclarecido, pois apesar de estudos in vitro mostrarem aumento da proliferação,
um acompanhamento por um ano do tratamento com reposição de E2 em
mulheres na pós-menopausa com bócio endêmico, não revelou nenhuma
alteração tanto no volume da glândula quanto nos nódulos (Ceresini e cols.,
2008). Um dado importante quanto à viabilidade celular foi o aumento desta
quando as células foram cultivadas em sistema de co-cultura, indicando que a
interação entre o estroma e o epitélio é crucial para a proliferação desses tipos
celulares.
62
Uma outra característica típica das células foliculares da tireóide consiste
na captação de iodeto para a síntese dos hormônios tireóideos promovida pelo
NIS (Carrasco, 1993). Neste aspecto, ao revisar a literatura nota-se uma
primeira ligação direta entre o E2 e o TGF-β1, pois ambos conseguem inibir a
expressão de NIS nas células FRTL-5 (Furnaletto e cols., 1999; Pekary e cols.,
1997) e PC Cl3 (Costamagna e cols., 2004). Essa regulação promovida pelo E2
está associada com a redução dos níveis de iodeto que, por auto-regulação,
estimula a proliferação das células FRTL-5 (Becks e cols., 1988). Contudo,
nossos resultados apenas sugerem que a atividade de TGF-β1 possa inibir a
captação de iodeto pelas células PC Cl3, uma vez que não encontramos
diferença significativa na captação destas células quando tratadas com E2.
Também reforçamos esta hipótese pelo acompanhamento do efluxo de iodo, já
que esta linhagem não possui a capacidade de organificá-lo. Podemos, portanto,
afirmar que a alteração encontrada realmente ocorreu no sentido do influxo. Por
outro lado, ao analisarmos os resultados da captação de iodeto nas co-culturas
de células TS7 e PC Cl3, observamos que a simples presença das células TS7
inibiu a captação de iodeto pelas células PC Cl3. Contudo, observou-se que o
tratamento com E2 e TGF-β1 proporcionou um aumento do influxo de iodo nas
células PC Cl3, mostrando mais uma vez a importância do estroma na regulação
da secreção hormonal das células foliculares e da comunicação entre as vias de
sinalização do E2 e do TGF-β1.
63
Embora o E2 tenha induzido a síntese e secreção de TGF-β1 e ativação da
via de sinalização de Smad nas células TS7, não houve alteração induzida pelo
E2 na captação de iodeto pelas células PC Cl3. Este fato pode ter ocorrido
porque células tumorais podem se tornar não responsivas ao E2. Estudos com
células MCF-7 de câncer de mama (Schiff e cols., 2003; Osborne e cols., 2005)
injetadas em camundongos que foram posteriormente tratados por períodos
curtos de tempo com tamoxifeno, um antagonista do E2, mostraram uma
diminuição da proliferação celular. Quando submetidos ao mesmo tratamento,
porém por longos períodos de tempo, estas células se tornaram resistentes ao
tamoxifeno. Os autores verificaram que existia um “crosstalk” entre receptores
de estrogênio e de fatores de crescimento, que poderia justificar esses
resultados. Por outro lado, este efeito poderia também ser explicado por
inativação e/ou depleção de receptores de TGF-β1 (Heldin e cols., 1997; Heldin
e cols., 1999), por inativação e/ou depleção de Smads em estudos com
carcinomas de tireóide (Massagué, 1998), e/ou simplesmente pela redução da
razão TGFRII / TGFRI observada em estudos utilizando carcinomas de mama
(Kalkhoven e cols., 1995). Recentemente, Buck e cols. (2008) demonstraram in
vitro que a capacidade do tamoxifeno de diminuir a proliferação das células
MCF-7 estava relacionada com o aumento dos níveis de mRNA para TGF-β2 e
TGFRII, indicando, mais uma vez, uma importante interação entre o E2 e o TGF-
β2 no controle das atividades celulares.
64
Em resumo, nossos estudos mostraram que o E2 possui um forte papel
indutor da ativação de TGF-β1 na linhagem de células estromais TS7 da
tireóide, e que o TGF-β1 pode estar envolvido com um efeito indireto do E2
sobre a atividade das células foliculares PC Cl3. Muito recentemente, Suenaga e
cols. (2008) verificaram que o resveratrol, uma substância análoga ao E2, induz
a secreção de TGF-β2 e a fosforilação de Smad3 na linhagem tumoral A549 de
células epiteliais de pulmão. Esses resultados fortalecem ainda mais a idéia de
que o E2 e a família do TGF-β estão interligados em diferentes sistemas,
contribuindo para a manutenção e regulação das funções celulares.
65
6. Conclusões:
Em resumo, nossos resultados mostraram que o E2 foi capaz de induzir a
secreção e a atividade do TGF-β1, via Smad2, nas células estromais TS7. No
entanto, nem o E2 nem o TGF-β1 modularam a viabilidade das células TS7 e PC
Cl3. Além disso, o TGF-β1 reduziu a captação de iodeto pelas células foliculares
PC Cl3, mas em modelo de co-cultura com as células estromais TS7, esta
atividade foi estimulada pelo tratamento conjunto de E2 e TGF-β1. Podemos
então concluir que o E2 e o TGF-β1, de forma isolada ou em associação, direta
ou indiretamente, e em conjunto com outros fatores como o TSH, devem
participar da regulação da função tireoideana, abrindo questões para outros
estudos envolvendo estes fatores e as interações entre células estromais e
células foliculares.
66
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