( PDF ) Centros rombencefálicos de processamento auditivo do sagüi (Callithrix jacchus): uma análise citoarquitetônica e neuroquímica

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTROS ROMBENCEFÁLICOS DE PROCESSAMENTO AUDITIVO DO

SAGÜI (Callithrix jacchus): UMA ANÁLISE CITOARQUITETÔNICA E

NEUROQUÍMICA

NATAL-RN

2008

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FRANCIMAR ARAÚJO DOS SANTOS

CENTROS ROMBENCEFÁLICOS DE PROCESSAMENTO AUDITIVO DO

SAGÜI (Callithrix jacchus): UMA ANÁLISE CITOARQUITETÔNICA E

NEUROQUÍMICA

Dissertação de Mestrado submetida

ao Programa de Pós-graduação em

Psicobiologia da Universidade

Federal do Rio Grande do Norte

como pré-requisito para a obtenção

do título de Mestre.

Orientadora: Profa. Miriam Stela M. O. Costa.

NATAL-RN

2008

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Título: “Centros rombencefálicos de processamento auditivo do sagüi (Callithrix jacchus):

uma análise citoarquitetônica e neuroquímica”.

Autora: Francimar Araújo dos Santos

Data da Defesa: 26/09/2008

Banca Examinadora:

Profª Dra. Miriam Stela Maris de Oliveira Costa – UFRN - Orientadora

Prof. Dr. Ricado Luiz Smith - UNIFESP

Prof. Dr. John Fontenele Araújo - UFRN

No olhar de um irmão

Vejo a mão do Mestre

No viver, no morrer

Vejo a mão do Mestre

Na poesia, na canção

No pulsar do coração

Vejo a mão de Deus

Sinto a mão de Deus

Na emoção que estou sentindo

Eu vejo a mão de Deus

Em saber que estão me ouvindo

Eu vejo a mão de Deus,

Vejo a mão de Deus

O sol nasceu, o sol se pôs

Fica a mão do Mestre

O ano vem, o ano vai

Fica a mão do Mestre

Sobre nós a proteger

Sobre todos posso ver

Vejo a mão de Deus

Sinto a mão de Deus

Na emoção que estou sentindo

Eu vejo a mão de Deus

Em saber que estão me ouvindo

Eu vejo a mão de Deus,

Vejo a mão de Deus

A Mão do Mestre (Josué Teodoro)

AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar, quero agradecer ao Senhor Jesus por ter me capacitado a

iniciar e a concluir esse mestrado, assim como por ter cuidado de mim e ter reservado pessoas

especiais para cooperarem com minha vida.

Aos meus pais: Norma Araújo dos Santos e Francisco dos Santos, aos meus

irmãos: Francilene Araújo dos Santos e Francisco dos Santos Júnior e a minha doce sobrinha:

Ana Luísa dos Santos Lorenzato, assim como a toda a minha família, espalhada por este

grande País, que mesmo sem compreender muito bem o valor dessa conquista cooperaram e

me incentivaram a continuar lutando para obter mais essa vitória! Essa vitória também é de

vocês. Sem vocês eu jamais teria chegado até aqui.

Aos amigos de fé, irmãos camaradas: Lígia e Carlos Quintans, Rubenita e

Robinson Lima, Mari e Luís Carlos Souza e Raquel Justino pelo amor, orações, incentivo e

carinho. Vocês são luz no meu caminho, manifestação do cuidado de Deus em minha vida.

Obrigada.

A minha querida orientadora Dra. Miriam Stela Maris de Oliveira Costa pela

incansável dedicação e paciência. Seu cuidado, amor e dedicação aos alunos me fizeram

conhecer uma verdadeira doutora na arte de ensinar. Através de seus conhecimentos e

entusiasmo me ensinou a construir e lutar pelos meus sonhos. Obrigada por acreditar e

investir na minha vida! Seu exemplo de caráter, seriedade e dedicação refletem a esperança

que tenho na educação desse país e despertou em mim o desejo pela docência.

A Márcia Albuquerque e Sebastião Franco por terem me incentivado, cada

um a seu modo, desde a graduação, a me dedicar à pesquisa e expor os meus conceitos e

ideais.

Prof. Dr. Jeferson de Sousa Cavalcante pelo interesse e cooperação

indispensáveis para confecção desse trabalho.

Aos amigos e companheiros do Labneuro: Regina Celi Oliveira, Renata

Duarte, Rovena Engelberth, Ruthnaldo Melo, Twyla Barros, Talyta Albuquerque, Expedito

Nascimento Jr, Raíssa Rodrigues, Leandro Freitas, Ana Carla Nunes, André Pontes, Rayane

Nascmento, Janaina Borda e Kátia Gouveia pela alegria, exemplo de determinação e amor a

neurociências. Com vocês aprendi que é possível o crescimento genuíno através do

compartilhamento do conhecimento de muitos.

A minha querida amiga Patrícia Cavalcanti Rocha e sua família por me

adotarem e terem me incentivado e apoiado nessa jornada.

A Janaina Ferreira e Dinaide Marinho por sonharem junto comigo e não me

deixarem desistir desse ideal, mesmo quando nossos caminhos se separaram.

A Rosângela Machado, Wani Gurgel e Carmem Rejane pelos conselhos e

exemplo profissional que tem me ajudado a escolher a estrada correta a trilhar.

Aos meus pacientes que me ensinaram a perseverar dia-a-dia e a sorrir diante

das mais genuínas adversidades (-a própria vida)!

Ao saudoso Iram (em memória) pelas palavras sábias, abraço sincero e amor

que dedicou a minha vida. Você realmente foi usado por Deus para reciclar (transformar)

vidas como a minha.

A todos os professores de Graduação do Curso de Fonoaudiologia da UnP e

do Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia da UFRN, os quais contribuíram

fundamentalmente para minha formação acadêmica.

Ao Departamento de Morfologia na pessoa de chefe, Celcimar, assim como

seus demais funcionários pelo suporte, infra-estrutura e manutenção do laboratório de

neuranatomia.

Aos funcionários do Núcleo de Primatologia da UFRN, pelo cuidado com os

animais e apoio a esse estudo.

Ao IBAMA, pela liberação da licença para realização deste trabalho.

Ao CNPq pelo apoio financeiro.

RESUMO

O sistema auditivo compreende uma série de estações que se estendem desde a orelha externa

até o córtex cerebral. Em mamíferos o sistema auditivo central subcortical é formado

essencialmente por núcleos cocleares, complexo olivar superior, colículo inferior e corpo

geniculado medial. Neste estudo, os centros rombencefálicos, compreendendo o complexo

nuclear coclear e o complexo olivar superior foram avaliados com relação a sua

citoarquitetura e conteúdo neuroquímico de corpos celulares e terminais axônicos, através das

técnicas de coloração de Nissl e imuno-histoquímica para proteína nuclear neurônio específica

(NeuN), glutamato (Glu), descaboxilase de ácido glutâmico (GAD), encefalina (ENK),

serotonina (5-HT), colina acetiltransferase (ChAT) e proteínas ligantes de cálcio – calbindina

(CB), cal-retinina (CR) e parvalbumina (PV). Foi utilizado como animal experimental o sagüi

(Callithrix jacchus), um pequeno primata nativo da Mata Atlântica do Nordeste Brasileiro.

Como resultados, foi evidenciado que o complexo nuclear coclear é composto pelos núcleos

cocleares antero-ventral, póstero-ventral e dorsal, e o complexo olivar superior pelos núcleos

olivares superiores lateral e medial e o núcleo do corpo trapezóide. Em todos os núcleos, de

ambos os complexos, foram encontrados de forma variável corpos celulares, fibras e terminais

imunorreativos a Glu, GAD, ChAT, CB, CR, PV, corpos celulares e terminais imunoreativos

a ENK, além de fibras e terminais imunorreativos a 5-HT em diferentes densidades. Os dados

obtidos são discutidos dentro de um contexto comparativo e funcional e representam uma

importante contribuição ao conhecimento das vias auditivas centrais no sagüi, e por extensão

em primatas.

Palavras chave: Callithrix jacchus, citoarquitetura, imuno-histoquímica, complexo nuclear

coclear, complexo olivar superior.

ABSTRACT

The auditory system is composed by a set of relays from the outer ear to the cerebral cortex.

In mammals, the central auditory system is composed by cochlear nuclei, superior olivary

complex, inferior colliculus and medial geniculate body. In this study, the auditory

rombencephalic centers, the cochlear nuclear complex and the superior olivary complex were

evaluated from the cytoarchitecture and neurochemical aspects, thorough Nissl staining and

immunohistochemical techniques to reveal specific neuron nuclear protein (NeuN), glutamate

(Glu), glutamic acid decarboxilase (GAD), enkephalin (ENK), serotonin (5-HT), choline

acetyltransferase (ChAT) and calcium-binding proteins – calbindin (CB), calretinin (CR), and

parvalbumin (PV).

The common marmoset (Callithrix jacchus), a little native primate of the Brazilian atlantic

forest was used as an experimental animal. As results, it was noted that the cochlear nuclear

complex is composed by anteroventral, posteroventral and dorsal nuclei, and the superior

olivary complex is constituted by the lateral and medial superior olivary nuclei and the

trapezoid body nucleus. Glu, GAD, ENK, ChAT, CB, CR, PV- immunoreactive cells, fibers

and terminals besides besides only 5-HT terminals were found unhomogeneously in all

nuclei, of both complex. The emerging data are discussed in a comparative and functional

context, and represent an important contribution to knowledge of the central auditory

pathways in the common marmoset, and then in primates.

Key words: Callithrix jacchus, cytoarchitecture, immunohistochemistry, cochlear nuclear

complex, superior olivary complex.

LISTA DE ABREVIATURAS

5-HT - Serotonina

ACh - Acetilcolina

CB - Calbindina

ChAT - Colina acetiltransferase

CNVA - Núcleo coclear ventral anterior

COS - Complexo olivar superior

CR – Cal-retinina

ENK - Encefalina

GABA - Ácido gama-amino-butírico

GAD - Descarboxilase do ácido glutâmico

Glu - Glutamato

NC – Complexo Núclear coclear

NCD - Núcleo coclear dorsal

NCV - Núcleo coclear ventral

NCVP - Núcleo coclear ventral posterior

NT - Núcleo do corpo trapezóide

OSL - Núcleo olivar superior lateral

OSM - Núcleo olivar superior medial

PLC - Proteínas ligantes de cálcio

PV - Parvalbumina

LISTA DE FIGURAS E TABELAS

Figura 1 (pág. 17): Visão geral do sistema auditivo periférico.

Figura 2 (pág. 24): Via Auditiva.

Figura 3 (pág. 27): O Sagüi.

Figura 4 (pág. 31): Cérebros de sagüi.

Figura 5 (pág. 32): Fotomicrografia de secções de Nissl representando secções

aproxidamente no nível rostral (A e D), médio (B e E) e caudal (C e F) para o complexo

olivar superior (A, B e C) e núcleos cocleares (D, E e F) do sagüi.

Figura 6 (pág. 39): Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do complexo

nuclear coclear do sagüi em níveis rostral, médio e caudal, mostrando a citoarquitetura pelo

método de Nissl (A, B e C) e NeuN (D, E e F). NCAV, núcleo coclear ântero-ventral; NCPV,

núcleo coclear póstero-ventral; NCD, núcleo coclear dorsal.

Figura 7 (pág. 40): Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do NCD do sagüi

em níveis rostral, médio e caudal, mostrando a citoarquitetura pelo método de Nissl (A, B e

C) e NeuN (D, E e F). Observe a camada molecular na periferia do NCD.

Figura 8 (pág. 41): Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do complexo

nuclear coclear do sagüi em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a

distribuição de imunorreatividade para Glu em corpos celulares, fibras e terminais em todos

os núcleos.

Figura 9 (pág.42): Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do complexo

nuclear coclear do sagüi em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a

distribuição de imunorreatividade para GAD em pericários, fibras e terminais em todos os

núcleos.

Figura 10 (pág. 43): Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do complexo

nuclear coclear do sagüi em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a

distribuição de imunorreatividade para ENK em pericários e terminais em NCAV e NCPV e

predomínio de terminais em NCD.

Figura 11 (pág. 44): Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do complexo

nuclear coclear do sagüi em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a

distribuição de imunorreatividade para 5-HT em terminais e fibras em todos os núcleos.

Figura 12 (pág. 45): Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do complexo

nuclear coclear do sagüi em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a

distribuição de imunorreatividade para ChAT em pericários no NCAV, fibras e terminais no

NCV e corpos celulares, fibras e terminais no NCD.

Figura 13 (pág. 46): Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do complexo

nuclear coclear do sagüi em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a

distribuição de imunorreatividade para CB em corpos celulares, fibras e terminais em todos os

núcleos.

Figura 14 (pág. 47): Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do complexo

nuclear coclear do sagüi em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a

distribuição de imunorreatividade para CR em pericários, fibras e terminais em todos os

núcleos.

Figura 15 (pág. 48): Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do complexo

nuclear coclear do sagüi em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a

distribuição de imunorreatividade para PV em corpos celulares, fibras e terminais em todos os

núcleos.

Figura 16 (pág. 49 e 50): Esquema ilustrando a distribuição de imunorreatividade em

pericários (pontos pretos) e neuróglia (tons de cinza de acordo com a densidade) para Glu,

GAD, ENK, 5-HT, ChAT, CB, CR e PV nos núcleos do complexo nuclear coclear em três

níveis de secção (rostral, médio e caudal).

Figura 17 (pág. 54): Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do através do

complexo olivar superior do sagüi em níveis rostral (A e D), médio (B e E) e caudal (C e F),

mostrando a citoarquitetura pelo método de Nissl (A, B e C) e NeuN (D, E e F).

Figura 18 (pág. 55): Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do COS do sagüi

em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a distribuição da imunorreatividade

para Glu em pericários, fibras e terminais em todos os núcleos.

Figura 19 (pág. 56): Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do COS do sagüi

em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a distribuição da imunorreatividade

para GAD em pericários, fibras e terminais em todos os núcleos.

Figura 20 (pág. 57): Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do COS do sagüi

em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a distribuição da imunorreatividade

para ENK em pericários e terminais no CT rostral e todo OSM e apenas terminais no OSL.

Figura 21 (pág. 58): Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do COS do sagüi

em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a distribuição da imunorreatividade

para 5-HT em terminais e fibras em todos os núcleos.

Figura 22 (pág. 59): Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do COS do sagüi

em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a distribuição da imunorreatividade

para ChAT em pericários, fibras e terminais no CT e OSM médio e caudal. Pericários e densa

neurópila no OSL.

Figura 23 (pág. 60): Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do COS do sagüi

em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a distribuição da imunorreatividade

para CB em pericários, fibras e terminais em todos os núcleos.

Figura 24 (pág. 61): Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do COS do sagüi

em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a distribuição da imunorreatividade

para CR em pericários, fibras e terminais em todos os núcleos.

Figura 25 (pág. 62): Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do COS do sagüi

em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a distribuição da imunorreatividade

para PV em pericários, fibras e terminais em todos os núcleos.

Figura 26 (pág. 63 e 64): Esquema ilustrando a distribuição de imunorreatividade em

pericários (pontos pretos) e neuróglia (tons de cinza de acordo com a densidade) para Glu,

GAD, ENK, 5-HT, ChAT, CB, CR e PV nos núcleos do complexo olivar superior em três

níveis de secção (rostral, médio e caudal).

Tabela 1 (pág. 34): Número de cortes para cada núcleo auditivo rombencefálico.

Tabela 2 (pág. 35): Lista de substâncias e diluições utilizadas no experimento.

Tabela 3 (pág. 65): Resumo da caracterização neuroquímica dos centros auditivos do sagüi.

SUMÁRIO

Página

1. INTRODUÇÃO

A Audição e o sistema auditivo 14

O sistema auditivo periférico 15

O sistema auditivo central 17

Os núcleos cocleares – primeira estação da via auditiva central 18

O complexo olivar superior – fundamental na localização sonora 19

O colículo inferior – principal estação auditiva do tronco encefálico 20

O corpo geniculado medial – relé talâmico 21

Áreas auditivas corticais 22

Propriedades do sistema auditivo 23

Neuroquímica – aliada na delimitação anatômica e funcionalidade neuronal 25

O Sagüi (Callithrix jacchus) 26

2. JUSTIFICATIVA

3. OBJETIVOS

4. METODOLOGIA

5. RESULTADOS

6. DISCUSSÃO

7. CONCLUSÃO

8. CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS

9. REFERÊNCIAS

1. INTRODUÇÃO

A audição e o Sistema Auditivo

A grande maioria dos seres vivos é capaz de interagir entre os indivíduos

e com o meio ambiente por meio de alguma forma de comunicação. A participação do som é

evidente nesse processo, quando se observa comportamentos, tais como o sofisticado canto de

acasalamento de alguns pássaros (Snowdon, 2007). Ao longo do processo seletivo, a

possibilidade de detecção à distância dos estímulos provenientes do meio externo tornou-se

uma grande vantagem adaptativa, pois permitiu aos animais localizar e identificar presas,

predadores, obstáculos, como também os animais da mesma espécie, favorecendo o processo

de reprodução. Isso foi conseguido através do desenvolvimento da capacidade auditiva,

conseqüência do desenvolvimento de órgãos auditivos sofisticados e de grande sensibilidade,

capazes de detectar as menores vibrações sonoras do meio, transmitidas através do ar ou da

água, permitindo ao animal uma maior percepção do meio ambiente ao seu redor até mesmo

durante o sono (Motta, 2005; Snowdon, 2007).

Dessa forma, a audição se destaca como uma das mais importantes

modalidades sensoriais para muitos animais e principalmente para o ser humano. Através dela

o indivíduo adquire uma maior socialização e desenvolve sua singularidade, pois ela favorece

a aquisição da linguagem e a conseqüente integração do homem ao mundo sonoro (Lent,

2004; Gazzaniga e Heatherton, 2005; Silveira e Vaucher, 2006; Snowdon, 2007). Atualmente

já se tem desenvolvido equipamentos sofisticados e de alta sensibilidade e tecnologia, como

os aparelhos de amplificação sonora individual e mesmo os implantes cocleares e de tronco

cerebral, mas, nenhum destes instumentos foi suficientemente capaz de substituir o sistema

auditvo funcionalmente por completo, mesmo que associados a terapias fonoaudiológicas.

Do ponto de vista anátomo-funcional, em mamíferos o sistema auditivo

divide-se em sistema auditivo periférico e sistema auditivo central. A porção periférica

estende-se do pavilhão auricular até o nervo vestíbulo-coclear (VIII par craniano). O sistema

auditivo central compreende estruturas e vias situadas no tronco encefálico, tálamo e córtex

cerebral, onde sucessivamente os impulsos traduzidos por informações auditivas são

decodificados e transformados em informações compreensíveis ao indivíduo (Russo e Santos,

1994; Schoeny e Talbott, 1999; Hudspeth, 2000a; Santos e Branco Barreiro, 2005; Pereira,

2005; Glendnning, 2005; Tortora, 2007).

A porção periférica do sistema auditivo é responsável pela detecção e

transmissão dos estímulos sonoros até a porção central, a qual atua na transmissão dos

impulsos nervosos, discriminação, localização e reconhecimento do som, associados à

compreensão, atenção seletiva e memória auditiva, formando, assim, em conjunto as vias de

processamento do som (Machado 2003; Friedland, 2006).

O sistema auditivo periférico

A porção periférica do sistema auditivo é formada pela orelha, a qual

didaticamente é dividida em orelha externa, orelha média e orelha interna. A orelha tem

origem a partir dos três folhetos embrionários. A orelha interna desenvolve-se a partir de um

espessamento do ectoderma que cobre as laterais da cabeça do embrião. A orelha média

origina-se do endoderma da primeira bolsa faríngica, que forma os ossículos, e do

mesoderma, que forma os músculos neles inseridos. A orelha externa desenvolve-se à custa de

proliferação do mesênquima das regiões dorsais do primeiro e segundo arcos branquiais e do

ectoderma, que forma a pele que o reveste por fora (Northern e Downs, 2002; Tortora, 2007).

A orelha externa está parcialmente incluída no osso temporal e é

composta por pavilhão auricular, concha e meato acústico externo. O pavilhão auricular

consiste de uma prega cutânea da face lateral da cabeça, com um esqueleto de cartilagem

elástica, de forma afunilada, com saliências e depressões. É o pavilhão auricular o responsável

por coletar a energia sonora e afunilá-la em direção ao meato acústico externo, que é um tubo

curvo, medindo cerca de 2,5 cm em humanos, situado no osso temporal, estendendo-se do

pavilhão auricular até a membrana timpânica, ou tímpano. A membrana timpânica estabelece

a separação entre a orelha externa e a orelha média. É uma membrana delgada e

semitransparente, côncava, e levemente em forma de cone, cujo ápice está voltado para a

orelha média. É pela vibração dessa membrana que ocorre a passagem da energia mecânica

sonora, capaz de movimentar os ossículos da orelha média (Russo e Santos, 1994; Wright,

1995; Hudspeth, 2000a; b; Machado 2003; Lent, 2004).

A orelha média, também denominada de cavidade timpânica, é um

espaço cheio de ar, revestido por epitélio, localizado dentro da porção petrosa do osso

temporal. É separada da orelha externa pela membrana do tímpano e da orelha interna por

delgado tabique ósseo, que contém duas aberturas cobertas por membrana: a janela oval e a

janela redonda. Contém três ossículos, o martelo, a bigorna e o estribo, interconectados por

articulações sinoviais. O martelo é aderido à superfície interna da membrana do tímpano pelo

manúbrio e através da cabeça se articula com o corpo da bigorna. A bigorna se articula com a

cabeça do estribo e a base deste se ajusta à janela oval. Imediatamente abaixo da janela oval,

situa-se outra abertura, a janela redonda, que é fechada por uma membrana, chamada

membrana timpânica secundária. Além dos ligamentos, dois pequenos músculos esqueléticos

se prendem aos ossículos. O músculo tensor do tímpano, inervado pelo ramo mandibular do

nervo trigêmeo (V) limita o movimento e aumenta a tensão sobre a membrana do tímpano,

para impedir lesão da orelha interna por sons muito intensos. O músculo estapédio, que é

inervado pelo nervo facial (VII), amortece as grandes vibrações do estribo, produzidas por

sons de grande intensidade, protegendo a janela oval, diminuindo também a sensibilidade

auditiva. A parede anterior da orelha média contém uma abertura que tem continuidade com

um canal formado por osso e cartilagem hialina: é a tuba faringotimpânica, que conecta a

orelha média com a nasofaringe, tendo por finalidade equalizar a pressão atmosférica dos dois

lados da membrana do tímpano. Quando as pressões estão equilibradas a membrana timpânica

vibra livremente à medida que as ondas sonoras a atingem. Quando a pressão não está

equalizada podem ocorrer dores intensas, zumbido, surdez e mesmo vertigem (Wright, 1995;

Hudspeth, 2000a; b; Lent, 2004; Tortora, 2007).

A energia das ondas sonoras ao alcançar a membrana timpânica é

transmitida através dos ossículos do ouvido para a escala vestibular (janela oval) pela base do

estribo. A membrana que cobre a janela redonda na base da escala timpânica acomoda as

alterações da pressão hidrostática. A ação tipo êmbolo do estribo transmite a energia das

ondas sonoras para a perilinfa na escala vestibular. A energia transmitida para a perilinfa

produz ondas progressivas na membrana basilar, que se move da base da cóclea para o seu

ápice. O deslocamento da membrana basilar em resposta aos estímulos auditivos provoca

inclinação das células ciliadas em contato com a membrana tectória. O deslocamento máximo

da membrana basal a diferentes distâncias da janela oval pode ser correlacionado com

freqüências específicas do som. Altas freqüências são percebidas na base e baixas freqüências

no ápice. Quando a membrana basilar vibra, em conseqüência da energia mecânica provocada

pela vibração dos ossículos da orelha média, a membrana tectória não vibra no mesmo

intervalo de tempo, resultando numa deformação dos cílios a cada nova onda vibratória. Esse

deslocamento periódico provoca alteração iônica no interior dos cílios, causando alteração na

polarização da célula ciliar. Como há diferença entre as alturas dos cílios, o movimento na

direção dos mais altos resulta na despolarização, e na direção dos cílios menores resulta na

hiperpolarização. A despolarização por sua vez abre os canais de cálcio e produz a liberação

do transmissor na sinapse com os prolongamentos periféricos (equivalentes a dendritos) das

células bipolares do gânglio espiral, desencadeando potenciais pós-sinápticos excitatórios. A

informação codificada será então conduzida através do nervo coclear, formado pelos

prolongamentos centrais (equivalentes a axônios) das mesmas células, para o tronco

encefálico para, através de estações sucessivas, chegarem ao córtex cerebral auditivo (Brugge

e Geisler, 1978; Nelly, 1989; Dallos, 1992; Hudspeth, 2000a; b; Lent, 2004).

A figura 1 ilustra o sistema auditivo periférico:

Figura 1. Visão geral do sistema auditivo periférico (modificado de

Netter, 1987).

O sistema auditivo central

As fibras do nervo coclear, o qual emerge de toda extensão da cóclea,

formando uma espécie de leque espiral convergente, emerge pelo meato acústico interno,

direcionando-se para o encéfalo, dando início ao sistema auditivo central. Este contém várias

estações sinápticas e vias em segmentos do encéfalo tais como a ponte, o mesencéfalo e o

tálamo, antes de atingir o córtex cerebral. No trajeto da via auditiva se observam vários

cruzamentos através de decussações e comissuras (Brodal, 1993; Brugge e Geisler, 1978;

Russo e Santos, 1994; Wright, 1995; Bonaldi et al., 1997; Brust, 2000; Hudspeth, 2000a;

Machado, 2003; Lent, 2004). Em cada uma das estações sinápticas ocorre a transmissão do

sinal, que é passível de ser modulado a partir de outras aferências sensoriais e influências

descendentes de níveis superiores que a elas chegam. Ao longo das vias também se formam

circuitos-base de reflexos desencadeados por estímulos sonoros, alguns dos quais com efeito

protetor (Brodal, 1993; Bonaldi et al., 1997).

Os núcleos cocleares – Primeira estação central da via auditiva

As fibras do nervo coclear, que têm como principal neurotransmissor o

glutamato, penetram pelo sulco bulbopontino, atingindo de cada lado os núcleos cocleares

situados na porção caudal da ponte, lateralmente às fibras do pedúnculo cerebelar inferior

(Brugge e Geisler, 1978; Baran e Musiek, 2001; Snell, 2003). Esta é a primeira estação

sináptica da via auditiva. De cada lado, os núcleos cocleares são em número de dois: o dorsal

e o ventral, este subdividido em ântero-ventral e póstero-ventral (Bellis, 1996; Parent, 1996;

Schoeny e Talbott, 1999; Snell, 2003). Ao penetrarem na ponte, as fibras do nervo coclear

bifurcam-se em seqüência ordenada e são distribuídas a ambos os núcleos cocleares, dorsal e

ventral, o ramo ascendente terminando no núcleo coclear antero-ventral e o descendente nos

núcleos cocleares póstero-ventral e dorsal. Além disso, cada um dos dois núcleos cocleares é

tonotopicamente organizado, de tal modo que em todos eles, neurônios que respondem às

freqüências mais altas (agudas) são localizados dorsalmente e os que respondem às

freqüências mais baixas (graves) progressivamente mais ventralmente (Brodal, 1993; Bellis,

1996; Martin, 1998; Hudspeth, 2000a; Machado, 2003). O núcleo coclear dorsal emite fibras

que cruzam o plano mediano pelas estrias acústicas dorsal e intermédia e ascendem pelo

lemnisco lateral até o colículo inferior contralateral. Já os neurônios de ambas as divisões do

núcleo coclear ventral projetam-se para o complexo olivar superior do mesmo lado e do lado

oposto, o cruzamento se dando pela estria acústica intermédia e estria acústica ventral (ou

corpo trapezóide), considerando-se as conexões recíprocas entre os complexos olivares

superiores entre si (Brodal, 1993; Bellis, 1996; Parent, 1996; Martin, 1998; Snell, 2003).

Em mamíferos roedores o núcleo coclear dorsal é estratificado,

apresentando uma camada molecular superficial, caracterizada pelo seu conteúdo em zinco

(Féres e Cairasco, 2003), e quatro camadas celulares mais profundas. Os principais neurônios

de projeção são as células fusiformes, orientadas radialmente, lembrando a organização das

células de Purkinje no córtex do cerebelo. Contém também as células tentaculares (Brodal,

1993; Hudspeth, 2000a; Machado, 2003). Já o núcleo coclear ventral contém

predominantemente as células estreladas e as células em arbusto (Hudspeth, 2000a) e a

marcação pelo íon zinco é restrita à periferia do subnúcleo (Féres e Cairasco, 2003).

É importante destacar que há evidências de correlação entre a morfologia

do neurônio e sua resposta funcional, sendo esta importante para a manutenção da tonotopia

coclear, codificação de intensidade, resolução temporal e codificação de tons complexos

(Brodal, 1993; Aquino e Araújo, 2002).

Os axônios dos diversos tipos celulares presentes nos núcleos cocleares

projetam-se para diversos outros núcleos em níveis mais rostrais do tronco encefálico. Do

núcleo coclear antero-ventral emerge o maior volume de fibras para o lado oposto, formando

o corpo trapezóide (ou estria acústica ventral), que se estende do nível da ponte até os três

núcleos do complexo olivar superior (lateral, medial e o núcleo do corpo trapezóide). Axônios

de neurônios do núcleo coclear dorsal ao saírem formam a estria acústica dorsal e ascendem

pelo lemnisco lateral contralateral (Hudspeth, 2000a).

O complexo olivar superior – Fundamental na localização sonora

O complexo olivar superior é constituído por três divisões anatômicas, as

quais são: núcleo olivar superior medial, núcleo olivar superior lateral e o núcleo do corpo

trapezóide (Martin, 1998). As três porções do complexo olivar superior emitem fibras

ascendentes tanto ipso quanto contralaterais, contribuindo para formar o lemnisco lateral. Este

ascende pelo tronco encefálico até atingir o mesencéfalo, terminando no colículo inferior.

Circundando o complexo olivar superior, pequenos grupamentos neuronais constituem os

núcleos periolivares (Martin, 1998; Malmierca e Merchán, 2004), de onde têm origem as

fibras eferentes que formam o fascículo olivococlear (Guinan, Jr, 2006). O fascículo

olivococlear tem dois componentes: um componente medial, de espessas fibras mielinizadas,

que termina primariamente nas células ciliadas externas, predominantemente para o lado

contralateral, e um componente lateral, de fibras amielínicas, que se projeta para as células

ciliadas internas, predominantemente ipsolaterais. Esta é uma via através da qual o sistema

nervoso central pode influenciar sua própria entrada sensorial (Parent, 1996; Breuel et al.,

2001; Aquino e Araújo, 2002; Guinan, Jr, 2006).

O lemnisco lateral, a principal via auditiva ascendente no tronco

encefálico contém fibras ipso e contralaterais e ascende na parte lateral do tegmento,

terminando no colículo inferior do mesencéfalo. Imersos entre as fibras do lemnisco lateral

estão os núcleos do lemnisco lateral, os quais recebem e contribuem com fibras para o feixe

principal (Bellis, 1996; Parent, 1996). As informações que chegam a cada núcleo do lemnisco

lateral são predominantemente contralaterais (Bellis, 1996; Aquino e Araújo, 2002; Machado,

2003).

Em sendo a primeira estação a receber impulsos provenientes de ambas

as orelhas, o complexo olivar superior desempenha um papel na localização da fonte sonora

(Bellis, 1996; Waxman, 1996; Bonaldi et al., 1997; Brust, 2000; Northern e Downs, 2002;

Machado 2003).

O colículo inferior – Principal estação auditiva do tronco encefálico

O colículo inferior é um núcleo par situado na parte caudal do teto

mesencefálico. Pode ser dividido em três partes: (1) o núcleo central, uma massa celular

ovóide e de estrutura laminar, formado por duas subdivisões: uma dorsomedial, menor,

composta de células grandes, e uma ventrolateral, maior, de células pequenas a médias, com

um arranjo laminar; (2) o núcleo pericentral, uma fina camada celular dorsal; e (3) o núcleo

externo, que circunda o núcleo central, lateral e ventralmente (Brodal, 1993; Parent, 1996). O

colículo inferior funciona como o principal núcleo relé do sistema auditivo no tronco

encefálico, transmitindo sinais recebidos do lemnisco lateral para o corpo geniculado medial.

Fibras auditivas ascendentes no lemnisco lateral projetam-se para as divisões dorsomedial e

ventrolateral do núcleo central do colículo inferior. Fibras que penetram na divisão

ventrolateral cursam ao longo do comprimento de cada lâmina seguindo sua curvatura e, à

medida em que atravessam estas lâminas, estabelecem contatos sinápticos com neurônios

coliculares. A divisão dorsomedial do núcleo central recebe conexões comissurais da região

correspondente do colículo inferior oposto e projeções bilaterais do córtex auditivo. O núcleo

pericentral também recebe entradas bilaterais do córtex auditivo e projeções ascendentes do

núcleo dorsal do lemnisco lateral. Células do núcleo pericentral projetam fibras para dentro do

núcleo central, as quais cursam em paralelo às suas lâminas (Parent, 1996; Okoyama et al.,

2006).

A maioria das células do colículo inferior responde à estimulação

biauricular, e muitas células codificam a localização do som com padrões de descarga espaço-

temporal (Champoux et al., 2007). Uma localização tonotópica definida está presente dentro

dos núcleos central e pericentral do colículo inferior. Neurônios no núcleo central do colículo

inferior são arranjados em um padrão laminar que representam diferentes faixas de

freqüência. A representação da freqüência no núcleo central reflete a representação

proporcional de freqüências ao longo de partes da cóclea, em que baixas freqüências são

percebidas no ápice e altas freqüências na base (Parent, 1996).

No núcleo pericentral também se evidencia uma organização tonotópica,

com altas freqüências localizadas externamente e baixas freqüências próximo às margens do

núcleo central. A maioria das células desta divisão recebe apenas uma entrada monoauricular

contralateral e provavelmente estão relacionadas à atenção auditiva direta. Já o núcleo externo

provavelmente não é um núcleo relé auditivo como o núcleo central do colículo inferior,

estando relacionado primariamente com reflexos auditivos (Parent, 1996).

Fibras eferentes do núcleo central do colículo inferior projetam-se através

do braço do colículo inferior para a parte laminada ventral do corpo geniculado medial.

Células na divisão dorsal do núcleo central e no núcleo pericentral enviam fibras para a parte

dorsal do corpo geniculado medial. Assim, a divisão dorsal do núcleo central e o núcleo

pericentral do colículo inferior, os quais recebem fibras do córtex auditivo, finalmente enviam

sinais de volta para o córtex auditivo secundário. Células da parte ventral do corpo geniculado

medial projetam-se tonotopicamente, através da radiação auditiva, sobre o córtex auditivo

primário (Parent, 1996; Machado, 2003; Okoyama et al., 2006).

Estudos eletrofisiológicos destacam a importância do complexo olivar

superior e a via até os colículos inferiores no mecanismo de fala na presença de ruído, logo a

integridade dessas estruturas, bem como de sua via é essencial para uma comunicação

adequada (Okoyama et al., 2006; Schochat et al., 2006).

O corpo geniculado medial – Relé talâmico

O corpo, núcleo ou complexo geniculado medial no encéfalo de primata

situa-se no tálamo posterior, fazendo saliência na superfície ventral, medialmente ao corpo

geniculado lateral e dorsalmente ao pedúnculo cerebral. Esta massa nuclear laminada, o

núcleo relé talâmico auditivo, recebe fibras do colículo inferior e dá origem à radiação

auditiva. Diferentemente dos núcleos relés auditivos do tronco encefálico, não há conexões

comissurais entre os corpos geniculados mediais (Bellis, 1996; Parent, 1996).

O núcleo geniculado medial consiste de três principais subdivisões com

citoarquitetura e conexões distintas, referidas como medial, dorsal e ventral (Parent, 1996; De

la Mothe et al., 2006). O núcleo ventral, considerado o principal, estende-se através de toda

extensão rostrocaudal do corpo geniculado medial e é limitado medialmente pelo braço do

colículo inferior. Tem uma organização laminar distinta, sendo as células de tamanho e forma

relativamente constantes, com dendritos em tufo. A laminação produzida pelos dendritos de

células em tufo e fibras do braço do colículo inferior, toma a forma de espirais ou bainhas

verticais curvas. Fibras aferentes do colículo inferior, chegando pelo braço do colículo

inferior, entram em lâminas particulares e permanecem continuamente associadas com as

mesmas camadas. O mapeamento fisiológico da divisão ventral do corpo geniculado medial

revela que as lâminas celulares apresentam organização tonotópica, em que as altas

freqüências são representadas medialmente, e baixas freqüências lateralmente. Neurônios na

divisão ventral do corpo geniculado medial dão origem à radiação auditiva, que termina no

córtex auditivo primário, onde há uma representação espacial de freqüências tonais. O córtex

auditivo primário dá origem a fibras córtico-talâmicas que terminam na divisão ventral do

corpo geniculado medial. Ambas as conexões genículo-corticais e córtico-geniculadas são

sempre ipsolaterais (Parent, 1996).

Os demais componentes do núcleo geniculado medial são multimodais,

recebendo entradas somatossensoriais e visuais, além das projeções auditivas. A divisão

dorsal do corpo geniculado medial contém vários núcleos, entre os quais os núcleos

suprageniculado e dorsal. O núcleo dorsal, proeminente em níveis caudais do corpo

geniculado medial, recebe projeções de uma área tegmental lateral, estendendo-se das

camadas profundas do colículo superior para a área adjacente ao lemnisco lateral. A divisão

medial, magnocelular, do corpo geniculado medial, recebe entradas do colículo inferior, do

tegmento lateral e da medula espinhal. Porções não laminadas do corpo geniculado medial

enviam fibras ipsolateralmente para uma faixa cortical que circunda a área auditiva primária

(Parent, 1996; Hudspeth, 2000a).

Áreas auditivas corticais

Em humanos, a principal projeção do corpo geniculado medial, originada

essencialmente da divisão ventral, é para o giro temporal transverso anterior (giro de Heschl,

área 41 de Brodman, A1), através da radiação auditiva ou trato genículo-temporal. Este giro

cortical está localizado no assoalho do sulco lateral e é caracterizado por ter uma

representação tonotópica, em que tons altos são processados medial e caudalmente e tons

baixos são representados lateral e anteriormente (Bellis, 1996; Parent, 1996; Hudspeth, 2000a;

b; Teixeira, 2005).

O córtex auditivo primário possui a capacidade de discriminar

freqüências e intensidades sonoras, além de possuir um padrão temporal e envolvimento na

localização sonora (Teixeira, 2005). De forma geral, as estruturas envolvidas no mecanismo

auditivo central interferem tanto nos sinais verbais, quanto nos não-verbais, logo estão

intimamente envolvidos com funções mais elevadas, como a linguagem e a aprendizagem

(Bevilaqua e Formigoni, 1997). Outras áreas corticais que contribuem para o processamento

da informação auditiva são as áreas associativas secundárias e terciárias. As áreas terciárias

incluem áreas que podem ter a capacidade de responder a estímulos auditivos, mas também a

outros estímulos sensitivos não auditivos. Isso inclui a área de Broca, o lobo da insula e a área

de Wernicke (Aquino e Araújo, 2002; Lent, 2004). Pode-se ainda relatar a existência de

conexão com o lobo frontal, porção postero-inferior, área pré-frontal e lobo parietal, porção

inferior. O corpo caloso, que conecta as duas metades do cérebro, contém fibras que conectam

as áreas auditivas dos dois hemisférios, permitindo dessa forma o cruzamento das

informações sonoras (Bellis, 1996; Baran e Musiek, 2001).

Propriedades do Sistema Auditivo

O processamento auditivo envolve não apenas a percepção do som, mas

também a capacidade de identificar, localizar, analisar, manter a atenção, memorizar e

recuperar esse estímulo (Katz e Wilde, 1999; Silveira et al., 2004).

Pode-se enumerar quatro características específicas do sistema auditivo:

(a) representação cortical bilateral; (b) capacidade de localização da fonte sonora; (c)

representação tonotópica e (d) controle eferente descendente para ajuste dos receptores

(Bhatnagar, 2004; Cramer, 2005).

A representação auditiva bilateral é decorrente dos cruzamentos de

informações auditivas devido às interconexões ascendentes nos níveis dos núcleos cocleares,

lemnisco lateral e colículo inferior. O córtex auditivo primário em cada hemisfério cerebral

recebe impulsos provenientes de ambas as orelhas, embora o impulso principal para o córtex

auditivo primário provém do receptor contralateral, com um menor número de projeções do

ipsolateral. Esta característica possibilita que lesões em qualquer ponto da via auditiva central

não resulte em surdez completa no ouvido oposto, mas cause apenas uma perda auditiva leve

ou mesmo nenhuma alteração. Porém, se a ablação ou lesão bilateral envolver o córtex

auditivo primário ou o córtex de associação resultará em grande perda de discriminação

auditiva e da percepção da fala (Bonaldi et al., 1997; Bhatnagar, 2004).

A localização da fonte sonora ocorre devido à diferença de tempo de

chegada do estímulo sonoro em cada orelha, já que a orelha mais próxima da fonte sonora

recebe a informação primeiro. O mecanismo de localização sonora começa no nível do núcleo

olivar superior. É este o núcleo o primeiro a receber projeções cruzadas e não cruzadas dos

dois receptores auditivos e usa as diferenças de tempo e intensidade para determinar a

localização exata e a direção da fonte sonora (Brust, 2000; Bhatnagar, 2004).

A representação tonotópica, iniciada no nível coclear, é mantida em toda

a via auditiva central. Vale salientar que mesmo no nível mais elevado, ou seja, no córtex

auditivo, apenas um neurônio responde melhor a determinadas freqüências sonoras (Brugge e

Geisler, 1978; Waxman. 1996; Read et al., 2002; Bhatnagar, 2004).

Em paralelo às projeções ascendentes para o córtex auditivo, conexões

descendentes partem de diferentes camadas do córtex auditivo primário e fazem

retransmissões sinápticas para as estações imediatamente caudais situadas no tálamo, tronco

encefálico (colículo inferior e núcleo olivar superior), até atingirem as células ciliadas

cocleares através do feixe olivococlear (Bellis, 1996; Bonaldi et al., 1997; Breuel et al., 2001).

Também foi descrita uma projeção da rafe para as células ciliadas cocleares (Kim et al.,

2003). Estas projeções não apenas tornam o sinal acústico mais definido, para melhorar a

proporção sinal-ruído, como também melhoram os indícios para a localização do som, e

contribuem para a qualidade do som percebido, por supressão dos sinais concorrentes, assim

como ajudam a proteger as células ciliadas cocleares de estímulos muito intensos (Waxman,

1996; Kim et al., 2003; Bhatnagar, 2004; Friedland, 2006).

Fig. 2. Esquema da via auditiva (modificado de Netter, 1987). Destaque

enfatizando os núcleos auditivos rombencefálicos.

Neuroquímica – aliada na delimitação anatômica e funcionalidade

dos centros neurais

A comunicação neuronal depende da capacidade do neurônio em

responder a uma determinada estimulação. A estimulação pode ser capaz de tornar o neurônio

eletricamente excitado e, consequentemente, apto para transmitir sinais para outros neurônios.

Dessa forma são gerados potenciais de ação, que fazem com que os neurônios liberem

neurotransmissores, os quais são substâncias químicas capazes de inibir ou estimular a ação

de um outro neurônio. Esses neurotransmissores são liberados na fenda sináptica e se unem a

um receptor específico no neurônio seguinte, chamado então, neurônio pós-sináptico. São os

neurotransmissores que ajudam a regular os mecanismos encefálicos que controlam a

cognição, a linguagem, a fala, audição, o humor, bem como a atenção, a memória, a

personalidade, a motivação e os ajustes fisiológicos do encéfalo (Kolb e Whishaw, 2002;

Bhatnagar, 2004; Von Bohlen und Halbach e Dermietzel, 2006).

Os receptores são moléculas de proteínas especializadas que quando

unidos aos respectivos neurotransmissores facilitam a abertura dos canais iônicos e,

modificando o potencial de membrana naquele ponto, afetam a probabilidade da descarga

neuronal. Quando um neurotransmissor se une com o receptor e provoca despolarização na

membrana pós-sináptica é considerado excitatório, uma vez que aumenta a probabilidade

desse receptor descarregar. No entanto, quando a união deste neurotransmissor com o receptor

provoca hiperpolarização no neurônio pós-sináptico é considerado inibitório, já que torna

menos provável a descarga do neurônio receptor (Kolb e Whishaw, 2002; Gazzaniga e

Heatherton, 2005).

Até a década de 70 acreditava-se que cada neurônio utilizava um único

neurotransmissor. Atualmente acredita-se que há na maioria das sinapses, um

neurotransmissor principal, que ativa diretamente um canal iônico. Outros neurotransmissores

co-localizados funcionariam, em geral, como moduladores da atividade do neurotransmissor

primário, facilitando ou inibindo sua ação (Burt 1995; Lent, 2004). Muitos

neurotransmissores têm mais de um receptor e podem ter efeitos variados em diferentes

sinapses no sistema nervoso (Kolb e Whishaw, 2002; Lent, 2004; Gazzaniga e Heatherton,

2005).

A maioria dos neurotransmissores situa-se em três categorias:

aminoácidos, aminas e peptídeos. Os neurotransmissores aminoácidos e aminas são pequenas

moléculas orgânicas com pelo menos um átomo de nitrogênio, armazenadas e liberadas em

vesículas sinápticas. Sua síntese ocorre no terminal axonal a partir de precursores metabólicos

ali presentes. As enzimas envolvidas na síntese de tais neurotransmissores são produzidas no

soma (corpo celular do neurônio) e transportadas até o terminal axonal e, neste local,

rapidamente dirigem a síntese desses mediadores químicos. Uma vez sintetizados, os

neurotransmissores aminoácidos e aminas são levados para as vesículas sinápticas que

liberam seus conteúdos por exocitose. Os neurotransmissores peptídeos, por sua vez,

constituem-se de grandes moléculas armazenadas e liberadas em grânulos secretores. A

síntese dos neurotransmissores peptídicos ocorre no retículo endoplasmático rugoso do soma.

Após serem sintetizados, são clivados no complexo de Golgi, transformando-se em

neurotransmissores ativos, que são secretados em grânulos secretores e transportados até o

terminal axonal (transporte anterógrado) para serem liberados na fenda sináptica (Burt, 1995).

Os vários centros que compõem o sistema auditivo podem ser

identificados através de técnicas imuno-histoquímicas, por uma variedade de

neurotransmissores, tais como acetilcolina (Ach), ácido gama-amino-butírico (GABA),

glutamato (Glu), serotonina (5-HT), encefalina (ENK) e outras substâncias neuroativas, como

as proteínas ligantes de cálcio, calbindina (CB), cal-retinina (CR) e parvalbumin a (PV).

O sagüi (Callithrix jacchus)

Por serem filogeneticamente as espécies mais próximas de humanos,

primatas não humanos são modelos lógicos para estudo dos processamentos cerebrais

relevantes à condição humana, por exemplo, com relação à fala e, por extensão, à audição.

Por essa razão, o modelo animal escolhido foi o sagüi (Callithrix jacchus), um pequeno

primata do Novo Mundo, nativo das florestas equatoriais do Brasil, mais encontrado em

regiões de Mata Atlântica, existindo em abundância no Rio Grande do Norte. Trata-se de um

animal de pequeno porte, medindo em média 20 cm de comprimento de corpo e cerca de 25

cm de cauda e peso corporal de menos de 500 g quando adultos. Uma marca característica da

espécie é a presença de tufos de pêlos longos e brancos ao redor das orelha e a cauda não

preênsil marcada com anéis de pêlos brancos e pretos. São animais de hábitos diurnos

(Menezes et al., 1993; 1994; 1997; Azevedo et al., 1997). No ambiente natural dispendem 25

a 30% do tempo em atividades de forrageio, alimentando-se de insetos, aranhas, pequenos

vertebrados, ovos de pássaros e exsudatos de árvores. Entretanto, são facilmente adaptáveis à

vida em cativeiro, sendo de fácil manuseio e alimentando-se de frutas, legumes, cereais e

eventualmente proteínas animais (Epple, 1970). Atingem a maturidade sexual em torno dos

14 meses. Sua alta capacidade reprodutiva – 2 partos gemelares por ano – mesmo em

cativeiro, o exclui da lista de espécies em extinção. A expectativa de vida no campo é de cerca

de 10 anos, podendo atingir os 16 anos no cativeiro. Embora oriundo das florestas tropicais do

Nordeste Brasileiro, o sagüi é atualmente encontrado em colônias de diversas partes do

mundo para onde foi levado, sendo utilizado como modelo para estudo nas mais diversas

áreas (Rylands, 1996).

Por ser um animal de repertório vocal bem desenvolvido, o sagüi

representa um bom modelo para estudos também do sistema auditivo.

O Núcleo de Primatologia da UFRN, coordenado e mantido pelo

Departamento de Fisiologia, é responsável há vários anos pela manutenção e reprodução em

cativeiro do sagüi (Registro IBAMA no. 1/24/92/0039-0). Desde a criação do Núcleo de

Primatologia, muitos trabalhos foram produzidos na UFRN, nas áreas de comportamento

social, sexual e reprodutivo, ritmos biológicos e neuranatomia, dando suporte ao Programa de

pós-graduação em Psicobiologia. Os estudos neuranatômicos iniciados a partir de 1992 com a

instalação do Laboratório de Neuranatomia foram inicialmente voltados para a elucidação das

bases circadianas dos ritmos biológicos e sistemas visuais (ver, por exemplo, Costa e Britto,

1997; Costa et al., 1998; 1999; Cavalcante et al., 2002; 2005; 2008; Pinato et al., 2007). Este

trabalho representa o início da expansão das linhas pesquisas na direção de estudar o sistema

auditivo, tendo o sagüi como modelo experimental.

Fig. 3. O Sagüi

2. JUSTIFICATIVA

O sistema auditivo tem muitas funções, sendo uma das mais importantes

a análise de vocalizações de co-específicos. Em humanos, a capacidade de ouvir a fala é vital

para a sobrevivência, tanto do indivíduo como da espécie. Sendo as espécies mais próximas

de humanos, primatas não humanos são modelos naturais para estudo dos processamentos

cerebrais relevantes à condição humana, particularmente com relação à fala. Assim, justifica-

se esse estudo no sagüi, um primata caracterizado por apresentar um rico repertório vocal.

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo geral

Este estudo tem como objetivo descrever, baseado na citoarquitetura, as

estações subcorticais que compõem a via auditiva do sagüi, bem como caracterizar os

principais neurotransmissores e substâncias neuroativas presentes nestes centros neurais,

iniciando-se pelas estações rombencefálicas.

3.2. Objetivos específicos

3.2.1. Caracterizar a citoarquitetura e a neuroquímica dos núcleos

cocleares;

3.2.2. Caracterizar a citoarquitetura e a neuroquímica do complexo olivar

superior.

4. METODOLOGIA

SUJEITOS:

Foram utilizados 2 (dois) sagüis adultos jovens (com idade variando entre

18 a 60 meses) saudáveis provenientes do Núcleo de Primatologia de Universidade Federal do

Rio Grande do Norte (registro IBAMA n° 1/24/92/0039-00). Todos os esforços foram feitos

para minimizar o número de animais e o seu sofrimento, seguindo estritamente as normas

estabelecidas pelo National Research Council of the National Academy publicadas no livro

“Guidelines for the Care and use of Mammals in Neuroscience and Behavioral Research”.

Uma versão em formato PDF está disponível gratuitamente no site da Sociedade de

Neurociências e Comportamento (SBNEC): http://www.sbnec.gov.br/links.

Secções rombencefálicas utilizadas em outros projetos e armazenadas no

laboratório foram utilizadas para complementar nossa análise.

PROCEDIMENTOS:

Para investigar os centros rombencefálicos de processamento auditivo do

sagüi, os animais foram submetidos aos procedimentos de perfusão, remoção do encéfalo,

microtomia, colorações e reações imuno-histoquímicas da área de interesse, ou seja, o tronco

encefálico.

Perfusão

Os animais foram anestesiados com tiopental sódico (Thiopentax,

Cristália), na dose de 400 mg por quilograma de peso corporal por via intraperitonial.

Atestada a anestesia, os animais foram submetidos à perfusão transcardíaca, de acordo com o

seguinte protocolo:

O animal é colocado em decúbito dorsal, imobilizado sobre uma grade de

metal em capela de exaustão. A grade é inclinada num ângulo de aproximadamente 45 graus,

mantendo o animal com a cabeça inclinada para baixo para favorecer a fixação do sistema

nervoso central. Com o auxílio de uma pinça de Allis prende-se o processo xifóide,

tracionando-o para cima, seccionando-se a pele e partes moles, contornando as bordas

inferiores do gradil costal. A incisão é prolongada para cima, pelas paredes laterais do tórax, o

músculo diafragma é desinserido, expondo-se o coração dentro da cavidade torácica. Uma

agulha conectada a uma bomba peristáltica de perfusão (Cole Parmer) é introduzida no

ventrículo esquerdo através do ápice do coração, na direção da aorta ascendente, e em

seguida, é realizada uma pequena incisão no átrio direito. Logo em seguida liga-se a bomba,

promovendo-se a impulsão de 300 ml de solução salina a 0,9% em tampão fosfato 0,1M, pH

7,4 com heparina (Parinex 5000 UI/ml, Hipolabor, 2 ml/1000ml de solução salina), a um

fluxo de 100 ml por minuto, com o objetivo de lavar o sistema circulatório. Em seguida são

impulsionados 700 ml de solução fixadora (paraformaldeído a 4% em tampão fosfato 0,1M,

pH 7,4), a primeira metade à velocidade de 90 ml/min e a outra metade à velocidade de 25

ml/min aproximadamente, devendo todo o fluxo de soluções durar em torno de 30 minutos.

Remoção do Encéfalo

Passadas pelo menos duas horas após perfusão, o encéfalo foi removido

da cavidade craniana através da secção de tecidos moles e osteotomia dos ossos da calota

craniana. O encéfalo foi armazenado em solução de sacarose a 30% em tampão fosfato 0,1M,

pH 7,4, a 4°C, até a realização da microtomia com trocas de solução a cada dois dias, caso

ultrapassasse o intervalo de 48h.

Cada encéfalo foi então seccionado em três blocos, através de 2 secções,

uma imediatamente anterior ao quiasma óptico, e o outro no nível da junção ponto-

mesencefálica.

Fig. 4. Encéfalo de sagüi em vista lateral (A), superior (B) e inferior (C).

As marcações em vermelho indicam os locais de secção do encéfalo em

blocos. (Blocos: 1, 2 e 3).

Fig. 5: Fotomicrografia de secções de Nissl representando secções aproxidamente no nível

rostral (A e D), médio (B e E) e caudal (C e F) para o complexo olivar superior (A, B e C) e

núcleos cocleares (D, E e F) do sagüi. Adaptado de Stephan et al, 1980. NC (núcleo coclear),

Cb (cerebelo), CI (colículo inferior), CS (colículo superior), COS (complexo olivar superior),

H (hipocampo).

Cb Cb

CI CI

COS

Microtomia

Os blocos encefálicos foram congelados por gelo seco e seccionados em

micrótomo de deslizamento (Leica SM 2000R), obtendo-se secções coronais de 20 µm, as

quais foram coletadas seriadamente em 10 (dez) compartimentos com tampão fosfato 0,1M,

pH 7,4. Cada compartimento continha um corte de cada seqüência de 10 (dez), de modo que a

distância entre uma secção e a seguinte no mesmo compartimento era de aproximadamente

200 µm. As secções foram conservadas em solução anticongelante, a -20°C, até a realização

dos processamentos subseqüentes.

Coloração citoarquitetônica

Uma das séries de cada encéfalo foi utilizada para coloração pelo método

de Nissl, utilizando o corante thionina. Esta técnica tem como finalidade delimitar os

grupamentos neuronais.

Imuno-histoquímica

Do encéfalo de cada animal restaram 9 séries, as quais foram submetidas

para imuno-histoquímica para identificar as seguintes substâncias neuroativas: NeuN (Mullen

et al, 1992; Kumar e Buckmaster, 2007) , Glu, GAD, ENK, 5-HT, ChAT e as proteínas

ligantes de cálcio CB, CR e PV.

Os anticorpos utilizados nesse estudo são os mesmos utilizados em

outros trabalhos nesse laboratório, e por não apresentarem reações cruzadas e serem

previamente testados, dispensam a necessidade de experimento controle.

O procedimento imuno-histoquímico foi realizado com os cortes

mergulhados em solução, submetidos a seguinte seqüência de eventos, de acordo com o

protocolo descrito abaixo:

1. 4 lavagens, durante 10 minutos cada, em solução de tampão fosfato

0,1 M, pH 7,4, em agitador orbital.

2. Anticorpo primário diluído em Triton X-100 a 0,4% (ver tabela 1),

acrescido de soro normal do animal em que foi obtido o anticorpo

secundário, durante 18 a 24 horas, à temperatura ambiente, em rotor.

3. 3 três lavagens em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4, de 10 minutos cada.

4. Anticorpo secundário diluído em Triton X-100 a 0,4%, durante 90

minutos, à temperatura ambiente, em rotor.

5. 3 lavagens em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4, de 10 minutos cada.

6. Complexo avidina-biotina-peroxidade (Kit ABC elite, Vector) a uma

diluição 1:100 em Triton X-100 a 0,4% contendo NaCl. Os cortes

ficam nesta solução durante 90 minutos, à temperatura ambiente, sob

agitação lenta, em rotor.

7. 4 lavagens em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4, de 10 minutos cada.

8. Na reação final os cortes são colocados em um meio contendo H

0,03% como substrato para peroxidase e a 3,3’, 4,4’-

tetrahidrocloreto-diaminobenzidina (DAB-Sigma), como cromógeno.

9. 4 lavagens em solução tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4, de 10 minutos

cada.

10. Motangem dos cortes em lâminas de vidro previamente gelatinizadas

e secagem à temperatura ambiente.

11. Intensificação pelo ósmio: Após a secagem, as lâminas são

mergulhadas rapidamente em solução de tetróxido de ósmio a 0,05%

para intensificação da reação, seguindo-se a desidratação e

diafanização dos cortes seguido da montagem das lamínulas, estando

prontas para serem examinadas ao microscópio óptico.

Análise dos resultados

As secções montadas em lâminas foram analisadas através de

microscópio óptico (Olympus BX41) em campo claro. As imagens digitais foram obtidas

através de uma câmera de vídeo (Nikon DXM1200) acoplada ao microscópio.

O programa Adobe Photoshop 7.0 foi utilizado para correções mínimas de brilho e contraste.

Os cortes foram organizados em três níveis de secção, sendo

selecionados aqueles que melhor representassem o nível rostral, médio e caudal em cada área

de estudo.

Tabela 1: Número de cortes para cada núcleo auditivo rombencefálico:

Núcleos cocleares Complexo olivar superior

13 08

Tabela 2. Lista de substâncias e diluições utilizadas no experimento

Antígeno Anticorpo Primário

(diluição)

Anticorpo

Secundário

(diluição)

Soro Normal

(diluição)

NeuN

Camundongo

[1:500µl]

Jumento

[1:1000µl]

Jumento

[1:50 µl]

Glu

Camundongo

[1:1000µl]

Jumento

[1:1000µl]

Jumento

[1:50 µl]

GAD

Camundongo

[1:5000µl]

Jumento

[1:1000µl]

Jumento

[1:50µl]

ENK

Camundongo

[1:1000µl]

Coelho

[1:1000µl]

Coelho

[1:50 µl]

5-HT

Coelho

[1:5000µl]

Cabra

[1:1000µl]

Cabra

[1:50 µl]

ChAT

Camundongo

[1:500µl]

Jumento

[1:1000µl]

Jumento

[1:50 µl]

Camundongo

[1:5000µl]

Jumento

[1:1000µl]

Jumento

[1:50 µl]

Coelho

[1:5000µl]

Cabra

[1:1000µl]

Cabra

[1:50 µl]

Camundongo

[1:5000µl]

Jumento

[1:1000µl]

Jumento

[1:50 µl]

5. RESULTADOS

Neste estudo foram analisadas as estações rombencefálicas da via

auditiva do sagüi: os núcleos cocleares (NC) e o complexo olivar superior (COS). Ambos os

centros foram analisados em três níveis – rostral, médio e caudal. De cada um dos complexos

nucleares serão descritas em sequência a citoarquitetura (Técnica de Nissl e imuno-

histoquímica para NeuN) e a caracterização imuno-histoquímica para Glu, GAD, ENK, 5-HT,

ChAT, CB, CR e PV.

5.1. Complexo nuclear coclear (NC)

Citoarquitetura

Em secções frontais do encéfalo do sagüi coradas pelo método de Nissl

ou imunocoradas para NeuN, os núcleos cocleares foram visualizados como uma

proeminência no contorno lateral da parte caudal da ponte, nas imediações do sulco bulbo-

pontino. Citoarquitetonicamente foi possível delimitar 3 núcleos analisando-se os níveis

rostral, médio e caudal. Rostralmente, o núcleo coclear ântero-ventral (NCAV) é o primeiro a

aparecer (Fig. 6 A e D), mas, devido a sua extensão e ângulo de secção, esse subnúcleo ainda

pode ser visualizado no nível médio, dorsalmente ao núcleo coclear póstero-ventral (NCPV),

onde também se visualiza a parte inicial do núcleo coclear dorsal (NCD), dorsalmente ao

NCAV (Fig. 6 B e E). No nível caudal, apenas o NCD é visualizado (Fig. 6 C e F). Neste

nível o NCD exibe uma camada externa pobre em células (Fig. 7).

Caracterização neuroquímica

Glutamato (Glu)

Corpos celulares, fibras e terminais imunorreativos a Glu foram

visualizados no NC do sagüi no nível rostral (NCAV, fig. 8 A e D), médio (NCAV, NCPV e

NCD, fig. 8 B e E) e caudal (NCD, fig. 8 C e F), com aparente menor densidade neste último.

Ver representação gráfica na figura 16.

Descarboxilase do ácido glutâmico GAD

O padrão de expressão imuno-histoquímica de GAD contribuiu para

delimitar as duas divisões do NCV (NCAV e NCPV) e o NCD, correlacionando-se com a

delimitação encontrada com a técnica de Nissl e NeuN nos três níveis de secção. No nível

rostral corpos celulares, fibras e terminais imunorreativos a GAD foram visualizadas no

NCAV (Fig. 9 A e D). No nível médio foi detectada a presença maciça de terminações

nervosas e de poucas fibras e corpos celulares imunomarcadas no NCPV (Fig. 9 B e E). No

nível caudal corpos celulares, fibras e terminações imunocoradas para GAD foram vistas no

NCD (Fig 9 C e F). Ver representação gráfica na figura 16.

Encefalina (ENK)

A imunorreatividade a ENK também foi útil para delimitar os núcleos

cocleares, tendo-se encontrado uma presença maciça de corpos celulares imunorreativos a

ENK e menor quantidade de terminais em NCAV (fig. 10 A e D) e NCPV (Fig. 10 B e E), o

inverso ocorrendo com o NCD, no qual predominam e terminações nervosas imunorreativas a

ENK (Fig. 10 C e F). Ver representação gráfica na figura 16.

Serotonina (5-HT)

Todos os núcleos do NC do sagüi apresentaram imunorreatividade a 5-

HT em fibras e terminais em todos os níveis de secção (Fig 11 A-F). Entretanto esta

distribuição não foi homogênea, verificando-se uma maior concentração no NCD e no

contorno lateral do NCAV (Fig 11 A-F). Ver representação gráfica na figura 16.

Colina acetil transferase (ChAT)

Rostralmente foram visualizadas pericários imunorreativas a ChAT no

NCAV. No nível médio, foi detectada a presença de fibras e terminais imunorreativos a ChAT

no NCAV, NCPV e corpos celulares, fibras e terminais imunomarcados no NCD. No nível

caudal, onde é visualizado apenas o NCD, verificou-se pericários, fibras e terminais

imunomarcados a ChAT (Fig. 12 A-F). Ver representação gráfica na figura 16.

Proteínas ligantes de cálcio (PLC)

Calbindina (CB)

Imunorreatividade a CB foi encontrada nos núcleos cocleares em grande

quantidade de pericários, fibras e terminais, contribuindo para delimitação dos núcleos

NCAV, NCPV, NCD, tendo sua distribuição aparentemente uniforme no sentido rostrocaudal

(Fig 13 A-F). Ver representação gráfica na figura 16.

Cal-retinina (CR)

Corpos celulares, fibras e terminais fortemente imunorreativos a CR

foram encontrados em todas as subdivisões do NC. O NCAV apresentou uma concentração

maior de fibras imunorreativas a CR do que o NCPV, e este apresentou uma concentração de

fibras imunorreativas maior que o NCD (Fig 14 A-F). Ver representação gráfica na figura 16.

Parvalbumina (PV)

A imunorreatividade a PV em pericários, fibras e terminais foi notada de

forma densa nos NC e com distribuição relativamente uniforme em todo os níveis no sentido

rostrocaudal, contribuindo para delimitar os núcleos NCAV (Fig. 15 A-D), NCPV (Fig. 15 B

e E) e NCD (Fig. 15 C-F). A presença de fibras imunorreativas foi maior no NCAV,

decrescendo no sentido rostro-caudal, de modo que o NCD apresentou a menor concentração

(Fig. 15 C e F). Ver representação gráfica na figura 16.

Figura 6. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do

complexo nuclear coclear do sagüi em níveis rostral, médio e caudal, mostrando a

citoarquitetura pelo método de Nissl (A, B e C) e NeuN (D, E e F). NCAV, núcleo coclear

ântero-ventral; NCPV, núcleo coclear póstero-ventral; NCD, núcleo coclear dorsal, Barra: A,

B e C: 1000 µm e D, E e F: 700µm.

NCAV

NCPV

NCD

NCAV

NCPV

NCD

NISSL NeuN

Figura 7. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do NCD

do sagüi em níveis rostral, médio e caudal, mostrando a citoarquitetura pelo método de Nissl

(A, B e C) e NeuN (D, E e F). Observe a camada molecular na periferia do NCD. Barra:

290µm.

NISSL NeuN

NCD

Figura 8. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do

complexo nuclear coclear do sagüi em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a

distribuição de imunorreatividade para Glu em corpos celulares, fibras e terminais em todos

os núcleos. D: ampliação do retângulo em A, E: ampliação do retângulo em B, F: ampliação

do retângulo em C. Barra: A, B e C: 700 µm e D, E e F: 40µm.

Glu

Figura 9. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do

complexo nuclear coclear do sagüi em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a

distribuição de imunorreatividade para GAD em pericários, fibras e terminais em todos os

núcleos. D: ampliação do retângulo em A, E: ampliação do retângulo em B, F: ampliação do

retângulo em C. Barra: A, B e C: 700 µm e D, E e F: 40µm.

GAD

Figura 10. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do

complexo nuclear coclear do sagüi em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a

distribuição de imunorreatividade para ENK em pericários e terminais em NCAV e NCPV e

predomínio de terminais em NCD. D: ampliação do retângulo em A, E: ampliação do

retângulo em B, F: ampliação do retângulo em C. Barra: A, B e C: 700 µm e D, E e F: 40µm.

ENK

Figura 11. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do

complexo nuclear coclear do sagüi em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a

distribuição de imunorreatividade para 5-HT em terminais e fibras em todos os núcleos. D:

ampliação do retângulo em A, E: ampliação do retângulo em B, F: ampliação do retângulo em

C. Barra: A, B e C: 700 µm e D, E e F: 40µm.

Figura 12. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do

complexo nuclear coclear do sagüi em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a

distribuição de imunorreatividade para ChAT em pericários no NCAV, fibras e terminais no

NCV e corpos celulares, fibras e terminais no NCD. D: ampliação do retângulo em A, E:

ampliação do retângulo em B, F: ampliação do retângulo em C. Barra: A, B e C: 700 µm e D,

E e F: 40µm.

CHAT

Figura 13. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do

complexo nuclear coclear do sagüi em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a

distribuição de imunorreatividade para CB em corpos celulares, fibras e terminais em todos os

núcleos. D: ampliação do retângulo em A, E: ampliação do retângulo em B, F: ampliação do

retângulo em C. Barra: A, B e C: 700 µm e D, E e F: 40µm.

Figura 14. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do

complexo nuclear coclear do sagüi em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a

distribuição de imunorreatividade para CR em pericários, fibras e terminais em todos os

núcleos. D: ampliação do retângulo em A, E: ampliação do retângulo em B, F: ampliação do

retângulo em C. Barra: A, B e C: 700 µm e D, E e F: 40µm.

Figura 15. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do

complexo nuclear coclear do sagüi em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a

distribuição de imunorreatividade para PV em corpos celulares, fibras e terminais em todos os

núcleos. D: ampliação do retângulo em A, E: ampliação do retângulo em B, F: ampliação do

retângulo em C. Barra: A, B e C: 700 µm e D, E e F: 40µm.

Rostral Médio Caudal

ChAT

ENK

5-HT

GAD

Glu

Nissl

NCVA

NCD

NCVA

Rostral Médio Caudal

ChAT

ENK

5-HT

GAD

Glu

ChAT

ENK

5-HT

GAD

Glu

Nissl

NCVA

NCD

NCVA

Nissl

NCVA

NCD

NCVA

Figura 16.

Figura 16. Esquema ilustrando a distribuição de imunorreatividade em

pericários (pontos pretos) e neuróglia (tons de cinza de acordo com a densidade) para Glu,

GAD, ENK, 5-HT, ChAT, CB, CR e PV nos núcleos do complexo nuclear coclear em três

níveis de secção (rostral, médio e caudal). Cb, cerebelo.

Rostral Médio Caudal

5.2. Complexo olivar superior (COS)

Citoarquitetura

A técnica de Nissl, em combinação com a imuno-histoquímica para

NeuN foi útil para delimitar os núcleos do complexo olivar superior (COS) do sagüi,

distinguindo-se três núcleos característicos: olivar superior lateral (OSL), olivar superior

medial (OSM) e o núcleo do corpo trapezóide (CT). Em nosso material, o OSM destaca-se

pela forte afinidade tintorial das suas células, sendo identificado como um conjunto de

neurônios densamente compactados em formato aproximado de uma fita vertical ligeiramente

curva, de concavidade lateral (Fig. 17 B, C, E e F). Nos níveis médio e caudal, o OSM é

ladeado pelo CT, medialmente, e o OSL, lateralmente. O CT pode ser reconhecido como o

menor núcleo em secção coronal, porém de maior extensão rostrocaudal, sendo o primeiro a

ser visualizado em nível pontino rostral, lateralmente à pirâmide (Fig. 17 A e D). O OSL é o

que apresenta maior área seccional em secção coronal, tendo os seus neurônios arranjados de

maneira esparsa, em comparação ao OSM. O OSL assume formato ligeiramente oval,

podendo ser dividido grosseiramente em uma porção dorsal, com os neurônios arranjados

mais compactamente e uma porção ventral, de neurônios mais esparsos (Fig 17 B, C, E e F).

Ver representação gráfica na figura 26.

Caracterização neuroquímica

Glutamato (Glu)

Pericários, fibras e terminais imunorreativos a Glu estavam presentes nos

três núcleos do COS do sagüi, contribuindo para a delimitação de todos eles (Fig 18). Ver

representação gráfica na figura 26.

Descarboxilase do ácido glutâmico (GAD)

Corpos celulares, fibras e terminais imunorreativos a GAD foram

evidenciados nos três núcleos – CT, OSM e OSL – com aparente maior densidade nos dois

primeiros (Fig. 19). Ver representação gráfica na figura 26.

Encefalina (ENK)

Foi evidenciada imunorreatividade a ENK nos 3 núcleos do COS, em

pericários e terminais no nível rostral do CT e em todos os níveis do OSM. Apenas terminais

foram vistos no OSL e nos nível médio e caudal do CT (Fig. 20). Ver representação gráfica na

figura 26.

Serotonina (5-HT)

Fibras e terminais imunorreativos a 5-HT foram evidenciados nos três

núcleos (OSL, OSM e CT) nos três níveis de secção. No OSL a imunorreatividade a 5-HT

aparentava ser mais densa na porção dorsal, principalmente em nível rostral. O OSM é

discretamente mais marcado em nível rostral e o CT mostrou-se bem marcado em todos os

níveis (Fig. 21). Alguns pericários imunorreativos a 5-HT foram vistos nas vizinhanças do

CT, provalvelmente representando neurônios deslocados do grupo serotoninérgico da

formação reticular pontina (Fig 21). Ver representação gráfica na figura 26.

Colina acetil-transferase (ChAT)

Foram visualizados nos três níveis de secção a presença de corpos

celulares, fibras e terminais imunorreativos a ChAT no CT (Fig. 22 A1, B4 e C7) e nos níveis

médio e caudal no OSM (Fig. 22 B3 e C6). Presença de pericários e densa neurópila foi

observada no OSL com maior densidade na porção dorsal (Fig. 22 B2 e C5). Ver

representação gráfica na figura 26.

Proteínas Ligantes de cálcio (PLC)

Calbindina (CB)

Corpos celulares, fibras e terminais imunorreativos a CB foram

evidenciados nos três níveis de secção dos núcleos do COS, contribuindo para sua delimitação

(Fig. 23). Ver representação gráfica na figura 26.

Cal-retinina (CR)

Observou-se abundante imuno-marcação para CR em pericários, fibras e

terminais nos três níveis de secção, embora a imunorreatividade em pericários seja mais

intensa no nível caudal, tanto no CT, como no OSM, como na periferia do OSL (Fig. 24). Ver

representação gráfica na figura 26.

Parvalbumina (PV)

Corpos celulares, fibras e terminais densamente imunorreativos a PV

foram evidenciados nos três níveis de secção dos núcleos do COS (Fig. 25). Ver

representação gráfica na figura 26.

Figura 17. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do

através do complexo olivar superior do sagüi em níveis rostral (A e D), médio (B e E) e

caudal (C e F), mostrando a citoarquitetura pelo método de Nissl (A, B e C) e NeuN (D, E e

F). OSL, núcleo olivar superior lateral, OSM, núcleo olivar superior medial, CT, núcleo do

corpo trapezóide. Barra: A, B e C: 1000 µm; D, E, F: 700 µm).

NISSL

NeuN

OSM

OSL

OSM

OSL

Figura 18. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do COS

do sagüi em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a distribuição da

imunorreatividade para Glu em pericários, fibras e terminais em todos os núcleos. À direita de

cada figura, ampliações das áreas dos retângulos de acordo com a numeração correspondente.

Barra: A, B e C: 700 µm; 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7: 60 µm.

Glu

OSL

OSM

OSL

OSM

GAD

OSL

OSM

OSL

OSM

GAD

OSL

OSM

OSL

OSM

GAD

OSL

OSM

OSL

OSM

OSL

OSM

OSL

OSM

Figura 19. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do COS

do sagüi em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a distribuição da

imunorreatividade para GAD em pericários, fibras e terminais em todos os núcleos. À direita

de cada figura, ampliações das áreas dos retângulos de acordo com a numeração

correspondente. Barra: A, B e C: 700 µm; 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7: 60 µm.

ENK

OSL

OSM

OSL

OSM

ENK

OSL

OSM

OSL

OSM

ENK

OSL

OSM

OSL

OSM

OSL

OSM

OSL

OSM

Figura 20. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do

COS do sagüi em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a distribuição da

imunorreatividade para ENK em pericários e terminais no CT rostral e todo OSM e apenas

terminais no OSL. À direita de cada figura, ampliações das áreas dos retângulos de acordo

com a numeração correspondente. Barra: A, B e C: 700 µm; 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7: 60 µm.

5-HT

OSL

OSM

OSL

OSM

5-HT

OSL

OSM

OSL

OSM

Figura 21. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do COS

do sagüi em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a distribuição da

imunorreatividade para 5-HT em terminais e fibras em todos os núcleos. À direita de cada

figura, ampliações das áreas dos retângulos de acordo com a numeração correspondente.

Barra: A, B e C: 700 µm; 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7: 60 µm.

CHAT

OSL

OSM

OSL

OSM

CHAT

OSL

OSM

OSL

OSM

CHAT

OSL

OSM

OSL

OSM

OSL

OSM

OSL

OSM

OSL

OSM

OSL

OSM

CCC

Figura 22. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do COS

do sagüi em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a distribuição da

imunorreatividade para ChAT em pericários, fibras e terminais no CT e OSM médio e caudal.

Pericários e densa neurópila no OSL. À direita de cada figura, ampliações das áreas dos

retângulos de acordo com a numeração correspondente. Barra: A, B e C: 700 µm; 1, 2, 3, 4, 5,

6 e 7: 60 µm.

OSL

OSM

OSL

OSM

OSL

OSM

OSL

OSM

OSL

OSM

OSL

OSM

OSL

OSM

OSL

OSM

OSL

OSM

Figura 23. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do COS do sagüi

em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a distribuição da imunorreatividade

para CB em pericários, fibras e terminais em todos os núcleos. À direita de cada figura,

ampliações das áreas dos retângulos de acordo com a numeração correspondente. Barra: A, B

e C: 700 µm; 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7: 60 µm.

OSL

OSM

OSL

OSM

OSL

OSM

OSL

OSM

OSL

OSM

OSL

OSM

OSL

OSM

OSL

OSM

OSL

OSM

OSL

OSM

Figura 24. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do COS

do sagüi em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a distribuição da

imunorreatividade para CR em pericários, fibras e terminais em todos os núcleos. À direita de

cada figura, ampliações das áreas dos retângulos de acordo com a numeração correspondente.

Barra: A, B e C: 700 µm; 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7: 60 µm.

OSL

OSM

OSL

OSM

OSL

OSM

OSL

OSM

OSL

OSM

OSL

OSM

OSL

OSM

OSL

OSM

OSL

OSM

Figura 25. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do COS

do sagüi em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a distribuição da

imunorreatividade para PV em pericários, fibras e terminais em todos os núcleos. À direita de

cada figura, ampliações das áreas dos retângulos de acordo com a numeração correspondente.

Barra: A, B e C: 700 µm; 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7: 60 µm.

Nissl

ENK

5-HT

ChAT

R R

Rostral Médio Caudal

GAD

Glu

CT CT

OSL

OSM

Nissl

ENK

5-HT

ChAT

R R

Rostral Médio Caudal

GAD

Glu

CT CT

OSL

OSM

Figura 26.

Figura 26. Esquema ilustrando a distribuição de imunorreatividade em

pericários (pontos pretos) e neuróglia (tons de cinza de acordo com a densidade) para Glu,

GAD, ENK, 5-HT, ChAT, CB, CR e PV nos núcleos do complexo olivar superior em três

níveis de secção (rostral, médio e caudal). p, pirâmide; R, núcleos da rafe.

Rostral Médio Caudal

Tabela 3. Resumo da caracterização neuroquímica dos centros auditivos

do sagüi:

Substância NC COS

GLU C/F/T C/F/T

GAD C/F/T C/F/T

ENK C/T C/T

5-HT F/T F/T

ChAT C/F/T C/F/T

CB C/F/T C/F/T

CR C/F/T C/F/T

PV C/F/T C/F/T

C, Corpo celular; F, Fibras; T, Terminais.

6. DISCUSSÃO

Neste trabalho analisamos os centros auditivos rombencefálicos do sagüi

(Callithrix jacchus)

, em bases citoarquitetônica e neuroquímica. Discutiremos nossos

resultados, à luz de dados da literatura, dentro de uma perspectiva funcional.

Um estudo citoarquitetônico nessa espécie já foi realizado por Aitkin e

Park (1993) e Stephan et al. (1980), com técnica de Nissl, mas além disso, nós introduzimos a

imuno-histoquímica para uma proteína nuclear neurônio-específica, denominada NeuN. Esta

técnica tem-se revelado um excelente marcador para a maioria dos neurônios maduros e

diferenciados, oferecendo um melhor contraste para delimitação dos grupamentos nucleares,

uma vez que não marca células da glia (Mullen et al, 1992; Kumar e Buckmaster, 2007).

Citoarquitetura

A técnica de Nissl e a imuno-histoquímica para NeuN forneceram uma

excelente ferramenta para delimitar os núcleos do complexo nuclear coclear e do complexo

olivar superior no sagüi.

Em nosso estudo, o NC foi evidenciado como um aglomerado de núcleos

formando uma saliência lateral nas proximidades do sulco bulbo-pontino, subdividindo-se em

dois núcleos: o NCV, com suas subdivisões NCAV e NCPV, e o NCD. Estes resultados estão

de acordo com descrições citoarquitetônicas prévias, baseadas em técnica de Nissl nessa

espécie (Aitkin e Park, 1993; Stephan et al, 1980) e corresponde ao padrão geral de

mamíferos. As três principais subdivisões acima descritas são baseadas nas características

citoarquitetônicas e ramificações da porção coclear do nervo vestíbulo-coclear, em que um

ramo ascendente projeta-se para o NCAV e o ramo descendente bifurca-se terminando no

NCPV e NCD, conforme descrito em estudos pioneiros no gato (Osen, 1969; Brawer et al,

1974; Cant e Morest, 1979; Tolbert e Morest, 1982; Rouiller et al, 1986; Ryugo e Rouiller,

1988; Leake e Snyder, 1989). Entre os mamíferos encontra-se pequenas variações

interespecíficas na localização e orientação espacial, presumivelmente secundárias a

diferenças na forma do tronco encefálico (ver Malmierca e Merchán, 2004).

O NCD é descrito como um aglomerado celular estratificado em 3

camadas – molecular, piramidal ou de células fusiformes e de células polimórficas – em

mamíferos não primatas como o gato (Osen, 1969; Brawer et al, 1974; Brodal, 1993), rato

(Féres e Cairasco, 2003; Malmierca e Merchán, 2004; Paxinos e Watson, 2007), camundongo

(Browner e Baruch, 1982;

Webster e Trune, 1982; Franklin e Paxinos, 2008), e em marsupiais

(Aitkin, 1995; 1996). Entretanto, há relatos de que o NCD e as regiões de células granulares

associadas sofrem alterações filogenéticas pronunciadas, perdendo o característico padrão

laminar em primatas não humanos e humanos (Moore e Osen, 1979; Moore, 1980; Heiman-

Patterson e Strominger, 1985). Num estudo citoarquitetônico, ultra-estrutural e imuno-

histoquímico para CB e receptores de Glu foi evidenciada a persistência de uma camada

molecular no NCD de macaco Rhesus (Rubio et al, 2008). Nossos dados no sagüi mostram a

presença de um padrão similar no nível caudal do NCD, sugerindo que os primatas mantêm

um resquício da organização básica de mamíferos.

O NC é a primeira estação obrigatória para as fibras da porção coclear do

nervo vestíbulo-coclear e inicia todas as vias auditivas ascendentes no encéfalo. Além disso, o

NCD recebe também informações não auditivas, incluindo entradas somatossensoriais dos

núcleos do funículo dorsal (Itoh et al, 1987; Wright e Ryugo, 1996; Kanold e Young, 2001) e

núcleos trigeminais (Itoh et al, 1987). O quadro de conexões do NCD sugere que ele

desempenha um papel na orientação da cabeça em direção à fonte sonora de interesse a partir

da integração da informação auditiva e multissensorial (May, 2000; Ryugo et al, 2003; Shore,

2005).

No COS do sagüi identificamos 3 núcleos: OSL, OSM e CT, com o OSM

no formato de uma fita vertical ligeiramente curva, de concavidade lateral, destacando-se pela

forte afinidade tintorial das suas células, ladeado nos níveis médio e caudal, pelo CT,

medialmente, e o OSL, lateralmente. Estes resultados estão de acordo com descrições

citoarquitetônicas prévias, baseadas em técnica de Nissl, nessa espécie (Aitkin e Park, 1993;

Stephan et al, 1980).

A anatomia topográfica do COS mostra uma grande variabilidade entre

as espécies, mas em mamíferos não primatas compreende três núcleos mais consistentemente

identificados: olivar superior lateral, olivar superior medial e do corpo trapezóide, além de

vários menores grupamentos neuronais, que os circundam, os núcleos periolivares (Malmierca

e Merchán, 2004; Paxinos e Watson, 2007). Além da variabilidade anatômica, a nomenclatura

para os núcleos desse complexo também não é constante. Por exemplo, o núcleo do corpo

trapezóide, como é chamado no presente estudo, é assim identificado em sagüi (Stephan et al,

1980), humano (Brodal, 1993; Martin, 1998), gato (Brodal, 1993) rato (Paxinos e Watson,

2007) e camundongo (Franklin e Paxinos, 2008), mas outras vezes é denominado núcleo

medial do corpo trapezóide em sagüi (Aitkin e Park, 1993), humano (Bazwinsky et al, 2003),

rato (Kuleska et al, 2002; Malmierca e Merchán, 2004) e marsupiais australianos (Aitkin,

1996), para citar exemplos.

Neste trabalho no sagüi, concordando com Aitkin e Park (1993) e

Stephan et al (1980), identificamos os três núcleos que formam o complexo, e optamos por

denominar o núcleo medial do corpo trapezóide como núcleo do corpo trapezóide (CT),

seguindo Stephan et al (1980). As técnicas utilizadas neste trabalho não permitiram distinguir

os núcleos periolivares.

Em mamíferos não primatas, é relativamente constante a descrição do

COS como sendo constituído pelos OSL, OSM e CT, sendo o OSL o de maior área seccional

com o característico formato de S, como em rato (Kuleska et al, 2002; Malmierca e Merchán,

2004; Paxinos e Watson, 2007), camundongo (Franklin e Paxinos, 2008). Entretanto, os dados

disponíveis para o COS de primatas não humanos e humanos são controversos.

Com relação a primatas não humanos, num estudo pioneiro, comparativo

entre 10 espécies, foi mostrado que o COS como um todo mantém seu tamanho relativo,

variando o tamanho dos seus componentes – OSL, OSM e CT (Moore e Moore, 1971). De

acordo com este estudo o CT de pró-símios e macacos exibe a citologia típica de mamíferos,

enquanto em gibão e chimpanzé as células do CT, em vez de formarem um núcleo compacto,

são esparsas entre as fibras do corpo trapezóide (Moore e Moore, 1971). Os resultados em

sagüi (Stephan et al, 1980; Aitkin e Park, 1993; presente estudo) estão de acordo com esse

padrão.

Embora o núcleo do corpo trapezóide (ou medial do corpo trapezóide)

seja considerado como estando presente no tronco encefálico de humanos (Richter et al, 1983;

Brodal, 1993; Martin, 1998), isto está em desacordo com vários outros estudos (Strominger e

Hurwitz, 1976; Moore e Moore, 1987; Paxinos e Wang, 1995; Moore et al, 1999; Moore,

2000; Bazwinsky et al, 2003; Kuleska, 2007; 2008). Estes autores descrevem no tronco

encefálico de humanos o MSO, o LSO e vários grupos celulares periolivares.

Estudos experimentais e clínicos fornecem evidência de que o COS

desempenha um papel essencial no processamento da informação auditiva no plano

horizontal, integrando a informação proveniente das duas orelhas, a qual é conduzida até ele a

partir de projeções originadas de ambos os núcleos cocleares. O COS transforma informação

mono-auricular em informação de intensidade e tempo bi-auricular. Além de estar envolvido

na localização espacial dos sons, o COS também participa da decodificação das características

temporais de sons complexos, reflexos acústicos, da composição da via ascendente e da

modulação dos núcleos cocleares e cóclea através da origem do sistema eferente olivo-coclear

(Oliver, 2000; Thompson e Schofield 2000; Tolin, 2003; Guinan, Jr, 2006).

Caracterização Neuroquímica

Glutamato (Glu)

Em nosso estudo, corpos celulares, fibras e terminais contendo Glu foram

visualizados em todos os núcleos do NC, com aparente menor densidade no NCD, e também

nos três núcleos do COS do sagüi, contribuindo para a delimitação de todos eles.

Não há relato em sagüi, mas a presença de receptores de Glu foi

identificada no NC de macaco Rhesus (Rubio et al, 2008). Além disso, a presença de

terminais glutamatérgicos no NC foi detectada por imuno-histoquímica e outras técnicas in

vivo e in vitro, em várias outras espécies, principalmente roedores. Ao mesmo tempo, esses

estudos apontam que o Glu atua como o neurotransmissor principal das fibras do nervo

coclear, sendo daí provenientes os terminais glutamatérgicos evidenciados no NC (Klinke e

Oertel, 1977; Bobbin e Thompson, 1978). Um estudo em cobaias revelou que após ablação

coclear ocorre diminuição na concentração de Glu em ambas as porções do NCV, a principal

área receptora das terminações nervosas do VIII par craniano -porção coclear, não ocorrendo

nas porções mais superficiais do NCD (Wenthold e Gulley, 1977), o qual recebe menor

inervação das fibras do gânglio espiral (Brodal, 1993). Vários outros estudos, utilizando

técnicas anatômicas, eletrofisiológicas ou farmacológicas, se seguiram corroborando esse

dado, em rato (Godfrey et al, 1978; 2000), gato (Čanžek e Reubi, 1980), cobaia (Altschuler et

al, 1981; Hackney et al, 1996; Suneja et al, 2000), camundongo (Wickesberg e Oertel, 1989) e

chinchila (Morest et al 1997; Godfrey et al, 2005; 2008). Glu pode também atuar como

neurotransmissor excitatório de células granulares em cobaia (Manis, 1989; Osen et al, 1995;

Manis e Molitor, 1996) e rato (Waller et al, 1996; Manis e Molitor, 1996; Rubio e Juiz, 1998)

e de aferências sensoriais gerais para o núcleo coclear em rato (Wright e Riugo, 1996; Rubio e

Juiz, 1998). Glu também foi identificado como neurotransmissor de neurônios de projeção

dos núcleos cocleares para o COS em cobaia (Helfert et al, 1992; Suneja et al, 1995; Schwartz

e Eager 1999).

O Glu, juntamente com o aspartato, é o neurotransmissor excitatório mais

abundante no sistema nervoso central, para o qual se reconhece um papel durante o

desenvolvimento, atuando na migração e maturação dos neurônios, além de atuar na

eliminação, estabelecimento e refinamento de conexões sinápticas (Von Bohlen und Halbach

e Dermietzel, 2006; Nakamichi e Yoneda, 2002). Particularmente nos centros auditivos do

tronco encefálico isso ocorre por ativação programada de receptores glutamatérgicos (Caicedo

e Eybalin, 1999).

A teoria de que o Glu seria o neutrotransmissor excitatório predominante

na vida auditiva central é aceita por inúmeros autores, bem como a teoria de que a homeostase

é dependente do equilíbrio entre os neurônios glutamatérgicos e GABAérgicos (Azevedo e

Figueredo, 2005). Essa pode ser a base da fisiopatologia das doenças do ouvido, como por

exemplo, o zumbido, para o qual a teoria mais aceita é da excitotoxicidade pelo Glu. De

acordo com essa teoria, a liberação excessiva de Glu nas vias auditivas centrais e periféricas

gera uma excessiva excitação do sistema. Essa excitabilidade geraria a ruptura dos neurônios

auditivos primários devido à entrada excessiva de cálcio nas células (Azevedo e Figueredo,

2005; Von Bohlen und Halbach e Dermietzel, 2006). Há que se levar em conta a

interatividade entre os neurotransmissores Glu, GABA e as proteínas ligantes de cálcio na via

auditiva, uma vez que existe um nível ótimo de estimulação para a homeostasia auditiva. A

ocorrência de excitotoxidade no NC acabaria por interferir em toda via auditiva ascendente,

prejudicando a função auditiva, já que a informação auditiva já chegaria alterada nos demais

níveis ascendentes, que por sua vez também a processariam inadequadamente.

GABA

O ácido gama-amino-butírico (GABA) é formado a partir do glutamato

pela ação da enzima descarboxilase do ácido glutâmico (GAD) (Von Bohlen und Halbach e

Dermietzel, 2006). Neste trabalho, usamos a imunorreatividade a GAD como marcador para a

presença de GABA nos centros auditivos rombencefálicos.

De acordo com nossos resultados, GABA está presente em corpos

celulares, fibras e terminais de todas as três divisões do NC e em todas as três divisões do

COS, contribuindo com as técnicas citoarquitetônicas utilizadas para delimitar os núcleos

desses complexos auditivos no sagüi.

Não há relato de estudos de GABA nos centros auditivos do sagüi, mas a

distribuição deste aminoácido também foi investigada com imuno-histoquímica para GABA

ou GAD em outras espécies, inclusive outra espécie primata, o babuíno (Papio anubis), no

qual os resultados são similares. Concordando também com os nossos resultados, pericários

imunorreativos a GAD foram detectados apenas nas camadas superficiais granular e

molecular, enquanto terminais foram encontrados em todas as subdivisões do NC de cobaia

(Kolston et al, 1992; Juiz et al, 1996) e rato (Moore e Moore, 1987; Godfrey et al, 2000). Em

gerbil encontra-se no NC um padrão em que tanto terminais como pericários positivos para

GAD apresentam maior densidade nas camadas superficiais do NCD e em menor densidade e

quantidade no NCV, onde são esparsos em todo núcleo (Roberts e Ribak, 2004). Um padrão

diferente foi descrito em duas espécies de morcegos (Rhinolophus rouxi e Pteronotus

parnellii), nos quais corpos celulares imunomarcadas para GAD foram visualizadas nos NC,

com exceção da porção dorsal, não laminada do NCD (Vater et al, 1992). Isto indica a

existência de diferenças locais na entrada inibitória relacionada com a conectividade e com a

organização tonotópica da via auditiva em mamíferos.

No COS de cobaia, imunorreatividade a GABA foi descrita como se

expressando em terminais em todos os núcleos e na maioria dos neurônios do OSL e dos

núcleos ventral e lateral do corpo trapezóide (Helfert et al, 1989; 1992). De forma similar, no

gerbil a mais alta concentração de pericários e terminais imunorreativos foi encontrada no CT

(ventral e lateral), havendo no OSL grande número de somas imunorreativos numa neurópila

escassa (Roberts e Ribak, 2004).

Um estudo em rato dá conta de que a imunorreatividade a GAD reduz

com o progredir da idade nos centros auditivos do tronco encefálico, com exceção dos NC,

onde a densidade é relativamente constante em todas as faixas de idade estudadas (Raza et al,

1994). Pesquisas recentes indicam que os circuitos inibitórios desempenham um importante

papel na percepção de intensidade, discriminação auditiva, zumbido e hiperacusia (Knobel e

Sanchez, 2005). Dessa forma, a presença de GABA nos centros auditivos é essencial para o

seu bom funcionamento, uma vez que esse é o principal neurotransmissor inibitório do

sistema nervoso (Von Bohlen und Halbach e Dermietzel, 2006). Uma série de estudos em

animais sugere que há um decréscimo relacionado com a idade da inibição glicinérgica e

GABAérgica ao longo de todo sistema nervoso auditivo central, que pode contribuir para o

aparecimento dos defeitos auditivos decorrentes do envelhecimento (Caspary et al 2008).

Encefalina (ENK)

Em nosso estudo no sagüi, ENK foi detectada no NC predominando em

pericários nos NCAV e NCPV e em terminações no NCD. Também foi encontrada

imunorreatividade a ENK nos 3 núcleos do COS, em pericários e terminais no nível rostral do

CT e em todos os níveis do OSM. Apenas terminais foram vistos no OSL e nos nível médio e

caudal do CT.

Não há relatos da distribuição de ENK nos núcleos auditivos nesta

espécie. Num estudo imuno-histoquímico no macaco (Macaca fuscata), também não há

referência à presença de ENK nos núcleos auditivos do tronco encefálaico (Ibuki et al, 1989).

No gato foram descritas apenas esparsas fibras no OSM (Belda et al, 2003).

No rato há vários estudos. Num estudo pioneiro nessa espécie, corpos

celulares associados com baixas densidades de terminais foram descritos no NCD (Uhl et al,

1979). Posteriormente, um estudo com hibridização in situ mostrou pericários expressando

RNAm para pré-pró-encefalina em neurônios pontinos, especificamente no núcleo ventral do

corpo trapezóide (Hoffman et al, 1993). Num estudo imuno-histoquímico também em ratos,

pré-tratados com colchicina, foram evidenciados corpos celulares marcados nas camadas

profundas do NCD e pequenos pericários na região marginal do NCV, além de um campo

terminal moderado no NCD e de baixa densidade no NCV. No COS corpos celulares e

terminais foram vistos no núcleo ventral do corpo trapezóide e no centro e no contorno lateral

do OSL (Aguilar et al, 2004).

O potencial envolvimento da ENK na modulação do processamento

auditivo ao nível do receptor coclear foi destacado num estudo pioneiro em cobaia e gato, no

qual foram evidenciadas terminações encefalinérgicas nas células ciliadas internas (Fex e

Altschuler, 1981). Estes autores sugeriram que a ENK poderia estar envolvida no sistema

olivo-coclear. Desde então, outros estudos implicaram a ENK no sistema olivococlear, como

um modulador da atividade coclear (Robertson e Mulders, 2000). Esta idéia é fortalecida pelo

fato de se encontrar pericários marcados para ENK no núcleo do corpo trapezóide no rato

(Aguilar et al, 2004) e no sagüi (presente estudo). Além disso, a injeção intra-cérebro-

ventricular em coelhos provoca encurtamento do tempo de latência entre os picos de

potenciais evocados nos centros auditivos, enquanto naloxane, um antagonista, tem efeito

contrário (Gregorowicz et al, 1990).

Num estudo de desenvolvimento no rato, foi mostrado que corpos

celulares imunorreativos a ENK são encontrados apenas no 12º. dia pós-natal, aumentando

progressivamente com a idade até o 21º. dia, quando os níveis adultos são alcançados,

sugerindo um papel da ENK no processo de maturação neuronal (Kungel e Friauf, 1995).

Serotonina (5-HT)

Em nosso estudo no sagüi evidenciamos a presença de fibras e terminais

serotoninérgicos, embora com densidades variáveis, em todos os núcleos do CN e todos do

COS, em todos os níveis de secção. A presença de pericários imunorreativos a 5-HT nas

vizinhanças do CT no sagüi, como visto no presente estudo, pode significar neurônios

deslocados do grupo serotoninérgico da formação reticular pontina (Cavalcante, 2001),

embora seja relatada a presença de neurônios 5-HT no OSL de camundongo neonatal

(Thompson, 2006). A distribuição de terminais serotoninérgicos é também encontrada no

complexo nuclear coclear e complexo olivar superior do rato, por imuno-histoquímica

(Thompson et al, 1994; Klepper e Herbert, 1991) e por cromatografia líquida (HPLC)

(Cransac et al, 1995). Um estudo de dupla marcação imuno-histoquímica para 5-HT e

peroxidase da raiz forte conjugada a aglutinina do germe do trigo/ (WGA-HRP) em cobaia

revelou a presença de terminais imunorreativos a 5-HT em todos os núcleos do NC, mais

proeminente nas camadas superficiais do NCD e área anterior do NCAV. De acordo com esse

estudo, a origem dessa inervação provém na maior parte do núcleo dorsal da rafe, mas

também do mediano e de toda extensão dos núcleos da rafe (Thompson et al, 1995).

Resultados semelhantes foram também encontrados no pró-símio galago (Otolemur garnettii)

(Thompson e Thompson, 1995). O padrão de projeção da inervação serotoninérgica no NC e

sua origem foi também estudado no gato oferecendo resultados semelhantes (Thompson e

Thompson, 2001). Também concordando com nossos resultados, no camundongo, no NC o

NCD é o mais densamente inervado por terminais serotoninérgicos e no COS todos os

núcleos são ricamente inervados por 5-HT, mas o núcleo medial do corpo trapezóide recebe

fibras esparsas (Thompson e Hurley, 2004). No morcego mexicano, fibras 5-HT são

encontradas mais densamente nas regiões periolivares, além do que a porção lateral do OSL e

dorsal do OSM contêm mais fibras 5-HT, em comparação a outras partes dos mesmos

núcleos, sugerindo que qualquer efeito modulatório de 5-HT no morcego pode ser freqüência-

específico, considerando que a porção lateral de OSL e dorsal do OSM contêm os corpos

celulares de neurônios que têm relativamente baixas freqüências (Guinan et al, 1972). É

possível que essa mesma relação seja encontrada no sagüi.

Nossos resultados em conjunto com os obtidos da literatura suportam

achados comportamentais e neurofisiológicos que indicam que o sistema serotoninérgico

modula a atividade de neurônios das estações auditivas rombencefálicas. Um estudo de dupla

marcação em rato mostrou a aposição de terminais serotoninérgicos em neurônios do OSL

que se projetam para a cóclea, constituindo o fascículo olivo-coclear (Woods e Azeredo

1999). Outros alvos potenciais desta modulação podem incluir os neurônios de projeção para

o colículo inferior e interneurônios, porém estudos adicionais são necessários para identificar

quais tipos celulares dentro do COS são alvos pós-sinápticos da 5-HT. É provável que a

atividade das entradas 5-HT esteja correlacionada com o nível de atenção e alerta (Jacobs e

Azmitia 1992). Por exemplo, estudos em humanos com técnicas de eletroencefalografia e

magnetoencefalografia, mostraram que deficiência dietética aguda de triptófano, um precursor

da 5-HT, compromete a atenção involuntária auditiva (Ahveninen et al, 2002; 2003). A

presença de inervação serotoninérgica nos centros auditivos subcorticais indicam que esse

processo pode começar a esse nível. Uma ligação da modulação serotoninérgica ao

desenvolvimento das sinapses no OSL, foi evidenciada num estudo em gerbil, indicando um

papel importante na plasticidade desenvolvimental e função auditiva, particularmente no

ajuste da localização sonora (Fitzgerald e Sanes, 1999).

Acetilcolina (ACh)

Nós buscamos caracterizar o NC e o COS do sagüi pela presença de

ACh, indiretamente pela identificação imuno-histoquímica da sua enzima de síntese, a colina

acetiltransferase (ChAT). No NC a expressão dessa enzima foi encontrada em pericários,

fibras e terminais no NCAV e NCD e apenas em fibras e terminais no NCPV e no COS, em

corpos celulares, fibras e terminais no CT e OSM. Presença de pericários e densa neurópila

foi observada no OSL com maior densidade na porção dorsal.

Este é o único estudo dessa natureza no sagüi. Estudos realizados em

outras espécies de primatas não humanos não trazem relato da presença colinérgica nos

núcleos auditivos (Mesulam et al, 1984; Satoh e Fibiger 1985). Em humanos foi descrita

imunorreatividade para Ach em OSL e OSM (Mizukawa et al, 1986). Presença de pericários

colinérgicos é descrita no NCD no rato (Tago et al, 1989), no NCD, NCV e OSL no rato

(Osen et al 1984; Henderson e Sherrif, 1991) e furão (Henderson e Sherrif, 1991) e no NCD e

NCV na cobaia (Motts et al, 2008). Um estudo combinado de fluorescência para o traçador

retrógrado fluorogold e a acetilcolinesterase confirmou em camundongo a presença de corpos

neuronais colinérgicos no núcleo ventral do corpo trapezóide e núcleo periolivar dorsal,

representando a origem do fascículo olivococlear medial (Brown e Levine, 2008).

A presença de inervação colinérgica em todo NC do rato é também

confirmada pela identificação imuno-histoquímica de receptores colinérgicos tanto

muscarínicos (Yao e Godfrey, 1995) como nicotínicos (Happe e Morley, 1998; Yao e

Godfrey, 1999a), bem como do transportador vesicular de Ach (VAChT) (Yao e Godfrey,

1999b).

A Ach é considerada um dos neurotransmissores no NC. Evidência

proveniente dos estudos anteriormente comentados indicam que o NC é primariamente uma

área de recepção, mais do que de projeção colinérgica. Estudos não confirmaram as hipóteses

iniciais que atribuíam à ACh o papel de neurotransmissor das fibras aferentes dos neurônios

do gânglio espiral (ver Guth e Melamed, 1982). Evidências experimentais indicam que as

terminações colinérgicas no NC resultam de colaterais do fascículo olivo-coclear, originado

em células do complexo olivar superior, cujo destino final é a cóclea, onde agem modificando

as sinapses entre as células ciliadas e as fibras aferentes, modificando o processamento do

sinal auditivo na cóclea. Assim, embora ainda não seja plenamente compreendida, a inervação

colinérgica do NC ao que tudo indica é parte das vias descendentes do sistema auditivo, que

caminham em paralelo às vias ascendentes, permitindo a retroalimentação a cada nível do

sistema (Fujino e Oertel, 2001; Mulders et al, 2003; Guinan Jr., 2006).

Proteínas ligantes de cálcio

No rombencéfalo do sagüi encontramos de forma variável a expressão

das três proteínas ligantes de cálcio tamponantes – CB, CR e PV – em grande quantidade de

pericários, fibras e terminais, contribuindo para delimitação dos núcleos do NC – NCAV,

NCPV, NCD e do COS – OSL, OSM e CT.

Não há relato de estudos dessas proteínas no NC do sagüi, embora elas

tenham sido investigadas nas células bipolares do gânglio espiral (Spatz e Löhle, 1995). A

presença de CB e PV foi investigada imuno-histoquimicamente no rato (Celio, 1990). De

acordo com este trabalho, há poucos terminais contendo CB no NCD e NCV e raros corpos

celulares no NCV, alguns perifericamente e outros formando uma ilha no NCPV. Há fibras e

terminais positivos para PV nos NCAV e NCPV, bem como pericários no NCPV. O NCD

contém numerosas fibras e terminais e raros pericários expressando PV (Celio, 1990). Em

outros trabalhos no rato, CB é também referida em pericários no NCD (Rogers e Résibois,

1992; Spatz, 1997; Föster e Illing, 2000). CB em corpos celulares e terminais está presente

também no NCD de cobaia (Spatz 1997). O NC do rato também exibe CR, em pericários,

fibras e terminais no NCD e no NCPV e apenas fibras e terminais no NCAV (Résibois e

Rogers, 1992). A presença de CB foi documentada em corpos neuronais, fibras e terminais no

NC, predominantemente no NCD de chinchila (Frisina et al 1995). CB também foi relatada

em fibras, terminais e pericários de tamanho pequeno a médio no NCD do musaranho

arborícola (Tupaia glis) (Spatz, 2003). Num estudo recente (Bazwinsky et al, 2008), os tipos

celulares de duas espécies, um eutério (gerbil, Meriones unguiculatus) e um marsupial

(gambá da cauda curta cinzenta, Monodephis domestica) foram caracterizados pelo seu

conteúdo em CB, CR ou PV e embora se trate de duas espécies taxonomicamente distantes,

mostram muitas semelhanças nas características morfológicas e imuno-histoquímicas quanto a

estas proteínas. Assim, PV é encontrada em praticamente todas as células do NC, enquanto

CB e CR são mais restritas a tipos celulares específicos, mostrando um padrão grosseiramente

complementar nos três núcleos do NC (Bazwinsky et al, 2008).

Em ratos, CB é expressada em muitos pericários no núcleo medial do

corpo trapezóide e em poucos corpos celulares numa densa neurópila no OSL (Förster e

Illing, 2000). CB e CR também foi descrita em porções diferenciais dos núcleos do COS em

cobaia (Caicedo et al, 1996). Imuno-histoquímica para CB, CR e PV, juntamente com

neurofilamento H foi utiizada para caracterizar o COS de humano, evidenciando-se terminais

imunomarcados para as três proteínas no OSL e OSM, estando ausente um núcleo (medial) do

corpo trapezóide, confirmando o padrão humano para o COS (Bazwinsky et al, 2003).

As proteínas ligantes de cálcio, particularmente CB e PV, devido a sua

grande solubilidade, preenchem o soma e os processos neuronais, facilitando estudos da

forma neuronal e conectividade. Por isso, são comumente usadas como marcadores neuronais

(Celio, 1990; Baimbridge et al, 1992; Andressen et al, 1993). Estas proteínas estão também

envolvidas numa variedade de atividades celulares, incluindo tamponamento e transporte do

cálcio (Baimbridge et al, 1992; Andressen et al, 1993). Consequentemente, níveis alterados de

proteínas ligantes de cálcio comprometem a homeostase do cálcio, podendo resultar no

surgimento de patologias (Baimbridge et al, 1992; Heizmann e Braun, 1992).

Devido ao seu papel na regulação da homeostasia do cálcio intracelular,

as proteínas ligantes de cálcio estão ligadas a fenômenos de plasticidade no sistema nervoso,

podendo ter sua expressão modificada durante o desenvolvimento, envelhecimento, atividade,

formação de memória, entre outros. Estudos no sistema auditivo fornecem evidências de que

as proteínas ligantes de cálcio desempenham um papel importante no processamento auditivo

central. Por exemplo, a ativação aferente induzida por estimulação sonora apresentada em

níveis supraliminares de sensibilidade acarreta aumento da expressão de CB e PV em corpos

celulares e neurópila do NCD e NCPV, indicando um possível papel protetor exercido pelas

proteínas ligantes de cálcio nos neurônios destes núcleos à exposição ao ruído (Idrizbegovic et

al 1998).

A interrupção transitória da atividade aferente do órgão auditivo

periférico acarreta modificações na expressão de proteínas ligantes de cálcio na via auditiva

central, em que CR é reduzida em pericários dos núcleos cocleares e seus axônios no

complexo olivar superior e CB exibe níveis mais altos nos pericários do corpo trapezóide e

seus axônios no núcleo olivar superior lateral. PV também se eleva com menor intensidade

(Caicedo et al, 1997). A desaferentação permanente por cocleotomia unilateral promove um

aumento substancial no número de fibras e botões terminais no NCAV e NCPV contralaterais

e em corpos celulares em todos os núcleos do NC ipsolateral, em muitos pericários no núcleo

medial do corpo trapezóide e em poucos corpos neuronais numa densa neurópila no OSL, os

quais aumentam contralateralmente após lesão coclear, além do surgimento de astrócitos

contendo CB no NCD e NCV (Föster e Illing, 2000). O efeito da ablação coclear unilateral

sobre a expressão de CR foi investigada em furão, resultando em decréscimo no nível total de

imunocoloração para CR dentro do OSL ipsolateralmente e dentro do MSO bilateralmente,

sem alterar o número de corpos celulares (Alvarado et al, 2004).

Alterações na expressão das proteínas ligantes de cálcio nas vias

auditivas centrais também acompanham o envelhecimento, como mostram vários estudos

realizados usando diferentes cepas de camundongos. O camundongo CBA/CaJ é uma cepa

que se caracteriza por apresentar deficiência neurossensorial em fase tardia da vida. Foi

observado um aumento percentual de pericários PV e CB, mas não de CR no NCD de animais

velhos (30-39 meses), comparado aos jovens (1 mês) e aumento percentual de PV no NCPV

do animal velho comparado ao jovem, sem alteração de CB ou CR (Idrizbegovic et al, 2001).

Num outro estudo, animais da mesma linhagem CBA/CaJ tiveram excisão bilateral da cóclea

aos 3 meses e sacrificados aos 24 meses (velhos surdos) para exame da expressão de CR no

NCD, comparado a um grupo controle de camundongos intactos da mesma linhagem (velhos

com audição residual) e a um grupo de camundongos intactos C57, que é uma linhagem

caracterizada por sofrer deficiência auditiva precoce. Como resultado foi encontrado um

decréscimo significativo de CR no NCD dos camundongos CBA velhos precocemente

desaferentados em relação ao grupo CBA intacto e apenas uma redução não significativa da

expressão de CR no grupo de camudongos C57, sugerindo que a audição residual de C57 aos

15 meses de idade pode garantir entrada auditiva para manter CR em níveis mais altos que os

camundongos CBA tornados completamente surdos aos 3 meses de idade, vivendo com maior

tempo (21 meses) de surdez (Zettel et al, 2003). Na mesma linha, foi mostrado que a

imunorreatividade a CB e PV é mais densa no NC (NCD e NCPV) do camundongo C57BL/6J

de 30 meses de idade em comparação com o de 1 mês, correlacionado com o nível de

degeneração coclear (Idrizbegovic et al 2003). Um outro estudo comparou o número de

corpos celulares expressando proteínas ligantes de cálcio no NC de camundongo C57 durante

o envelhecimento, tendo sido observado com a idade um decréscimo no número total de

corpos celulares no NCD e NCPV. A imunorreatividade no NCD, para PV, CB e CR, e no

NCPV, para PV e CB, exibiram aumentos percentuais relativos, indicando que aquelas

populações neuronais contendo essas proteínas são preservadas (Idrizbegovic et al, 2004).

Resultados semelhantes foram encontrados no camundongo BALB/c, outra linhagem modelo

de perda auditiva neurossensorial (Idrizbegovic et al 2006), indicando que esta resposta

plástica nesses camundongos com severo comprometimento auditivo, possa significar uma

estratégia de sobrevivência para os neurônios dos núcleos cocleares.

7. CONCLUSÕES

Os resultados do presente trabalho, discutidos com resultados de

trabalhos prévios, nos permitem chegar às seguintes conclusões sobre os núcleos auditivos

rombencefálicos do sagüi:

1º. O complexo nuclear coclear é composto de núcleo coclear dorsal,

núcleo coclear antero-ventral e núcleo coclear póstero-ventral;

2º. O núcleo coclear dorsal exibe características citoarquitetônicas que

lembra o padrão laminar de mamíferos;

3º. Todos os núcleos cocleares contêm corpos celulares, fibras e

terminais glutamatérgicos;

4º. Todos os núcleos cocleares contêm pericários, fibras e terminais

GABA-érgicos;

5º. Encefalina está presente predominantemente em corpos celulares nos

núcleos cocleares antero-ventral e póstero-ventral e em terminações no núcleo coclear dorsal;

6º. Todos os núcleos cocleares recebem considerável inervação

serotoninérgica;

7º. Todos os núcleos cocleares recebem inervação colinérgica, sendo que

os núcleos cocleares antero-ventral e dorsal também contêm corpos neuronais produtores de

acetilcolina;

8º. Os núcleos cocleares contêm uma distribuição diferencial de

calbindina, cal-retinina e parvalbumina em corpos celulares, fibras e terminais;

9º. O complexo olivar superior é composto de núcleo olivar superior

lateral, núcleo olivar superior medial e núcleo do corpo trapezóide;

10º. Todos os núcleos do complexo olivar superior contêm células, fibras

e terminais glutamatérgicos;

11º. Todos os núcleos do complexo olivar superior contêm corpos

celulares, fibras e terminais GABA-érgicos;

12º. Encefalina está presente em pericários e terminais no núcleo do

corpo trapezóide e olivar superior medial e apenas em terminais no núcleo olivar superior

lateral;

13º. Todos os núcleos do complexo olivar superior recebem abundante

inervação serotoninérgica;

14º. Acetilcolina está presente em pericários, fibras e terminais nos

núcleos olivar superior medial e do corpo trapezóide e na porção dorsal do núcleo olivar

superior lateral;

15º. Os núcleos do complexo olivar superior contêm uma distribuição

diferencial de calbindina, cal-retinina e parvalbumina em corpos de neurônios, fibras e

terminais.

8. CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS

O sagüi (Callithrix jacchus) é utilizado como modelo experimental em

pesquisas no Programa de pós-graduação em Psicobiologia da UFRN, desde a sua

implantação em 1985 e no Laboratório de Neuranatomia desde 1993, quando tiveram início as

pesquisas sobre as bases neurais da ritmicidade circadiana.

Nos últimos dois anos, desenvolveram-se três trabalhos de pós–

graduação no nível de mestrado no Laboratório de Neuranatomia da UFRN utilizando o sagüi

como sujeito experimental. Um deles trata da caracterização neuroquímica e expressão de fos

no núcleo pré-geniculado. Outro trabalho é focado na citoarquitetura e caracterização

neuroquímica da zona incerta e, por último, a nossa dissertação, que tem como objetivo

caracterizar a citoarquitetura e neuroquímica das estações rombencefálicas da via auditiva.

Deve ser destacado que este é o primeiro trabalho a estudar os centros auditivos nesse modelo

experimental neste laboratório, buscando reconhecer diversos neurotransmissores e

substâncias neuroativas como as proteínas ligantes de cálcio e a proteína nuclear neurônio-

específica (NeuN), dando inicio aos estudos envolvendo o sistema auditivo nessa base de

pesquisa. A partir da análise dos resultados, uma aparente relação foi encontrada entre as

estações auditivas rombemcefálicas e outras espécies previamente estudadas, registrando-se

variações quanto a citoarquitetura e organização neuroquímica. Em paralelo foi desenvolvido

um trabalho caracterizando os centros de vocalização corticais no sagüi nessa mesma pós-

graduação, em outro laboratório.

Este trabalho representa um instrumento essencial para estabelecer o

sagüi como modelo experimental para pesquisas envolvendo o sistema auditivo. Além disso,

os resultados discutidos aqui oferecem uma possibilidade de compreender os aspectos

funcionais e permitem inferências quanto a etiologia de patologias auditivas como

decorrências de alterações no mecanismo funcional das substâncias estudadas entre diversas

espécies de mamíferos, sejam eles roedores, marsupiais ou primatas não-humanos e humanos.

Assim, observamos claramente que existe uma relação direta entre estrutura e função auditiva

e que estudos funcionais podem e devem ser posteriormente realizados, visando confirmar as

possibilidades propostas nesse estudo e esclarecer um pouco mais sobre esse tão complexo

sistema que é responsável por possibilitar a comunicação entre seves vivos através da onda

sonora.

Este trabalho representa o início de uma linha de pesquisa voltada para o

estudo dos centros auditivos no sagüi e outras espécies, no sentido de contribuir para melhorar

a compreesão dos mecanismos auditivos. Sendo assim, a continuidade deste estudo pode

ocorrer a partir de um leque de possibilidades:

8.1. Estudo anatômico dos centros auditivos subcorticais do sagüi,

incluindo os núcleos do colículo inferior (mesencéfalo) e geniculado medial (tálamo);

8.2. Estudo funcional das estações auditivas subcorticais do sagüi,

observando a expressão de c-fos após estímulo de vocalização de co-específico;

8.3. Estudo do órgão coclear do sagüi;

8.4. Estudo hodológico dos centros auditivos subcorticais do sagüi;

8.5. Estudos comparativos, incluindo um roedor regional crepuscular, o

mocó (Kerodon rupestris);

8.6. Estudo de desenvolvimento das estações auditivas subcorticais do

sagüi, utilizando animais de diferentes idades;

8.7. Contribuir com o “Projeto Atlas” do sagüi através do mapeamento de

sua via auditiva central.

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