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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS
A RELEVÂNCIA DAS PROTEINAS CCN2 E CCN5 DA
FAMÍLIA CCN NA DIFERENCIAÇÃO CONDROCÍTICA IN
VITRO.
MARCOS DA SILVA PACHECO
TESE SUBMETIDA AO PROGRAMA DE CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS DA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO COMO PARTE DOS
REQUISITOS NECESSÁRIOS PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR
EM CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS
AGOSTO 2008
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MARCOS DA SILVA PACHECO
A RELEVÂNCIA DAS PROTEÍNAS CCN2 E CCN5 DA
FAMÍLIA CCN NA DIFERENCIAÇÃO CONDROCÍTICA IN
VITRO.
Tese submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências Morfológicas da
Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte dos requisitos necessários
para a obtenção do grau de Doutor em Ciências Morfológicas.
ORIENTADOR: JOSÉ GARCIA RIBEIRO ABREU JÚNIOR
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
DEPARTAMENTO DE ANATOMIA
AGOSTO 2008
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EXAMINADORES
Profa. Dra. Maria Eugênia Leite Duarte
Instituto Nacional de Traumatologia e Ortopedia – INTO
Departamento de Histologia – UFRJ
Profa. Dra. Tânia Ortiga Carvalho
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho – UFRJ
Dra. Cínthya Sternberg
Instituto Nacional do Câncer – INCa.
Prof. Dr. Alex Balduíno
Instituto de Traumatologia e Ortopedia – INTO. Revisor e suplente
Universidade Veiga de Almeida
Profa. Dra. Christina Maeda Takiya
Departamento de Histologia – UFRJ. Suplente
Prof. Dr. Jose Garcia Ribeiro Abreu Júnior
Departamento de Anatomia – UFRJ. Orientador
Prof. Dr. Vivaldo Moura Neto
Departamento de Anatomia – UFRJ. Coordenador do PCM
FICHA CATALOGRÁFICA
Pacheco, Marcos da Silva
A RELEVÂNCIA DAS PROTEINAS CCN2 E CCN5 DA FAMÍLIA CCN NA
DIFERENCIAÇÃO CONDROCÍTICA IN VITRO. Rio de Janeiro, Universidade
Federal do Rio de Janeiro/Programa de Ciências Morfológicas, 2008.
xii, 103p
Tese de Doutorado submetida ao Programa de Ciências Morfológicas
1 . CCN 2. ATDC5 3. Condrócito 4. Diferenciação 5. Disco epifisário 6.
CCN5/WISP2 I. Universidade Federal do Rio de Janeiro II. A relevância das
proteínas CCN2 e CCN5 da família CCN na diferenciação condrocítica in vitro.
AGRADECIMENTOS
Ao longo desta trajetória tive o privilégio de contar com um grande
número de pessoas, que foram amigos, colaboradores, conselheiros, tudo ao
mesmo tempo. São cerca de 6 anos batendo em portas, pedindo conselho,
ajuda, reagentes. Uma infinidade de favores, que não podem ser compensados
num agradecimento, mas que são pelo menos reconhecidos aqui.
Agradeço ao meu chefe o Prof. José Garcia Abreu, que me
conduziu por todos estes anos. Agradeço a todas as oportunidades que me
conferiu e que permitiram que minha carreira avançasse até onde eu nem
sequer imaginava. Isso ficará para sempre, sempre será lembrado, sempre será
reverenciado.
Aos amigos do Laboratório de Embriologia dos Vertebrados,
praticamente co-autores da tese: Fábio, Diego, Karla, Juliana, Débora, Natália,
Mariana, João.
À professora Karen M. Lyons, da UCLA, onde fiz parte do meu
doutorado. Obrigado pela ajuda na execução de experimentos que compuseram
a tese. Obrigado a toda equipe envolvida: Andrea, Bau-Lin, Robert, Ruth, Faith,
Bonny, Kelsey, e Buer.
Ao professor Vivaldo Moura Neto e toda equipe do Laboratório de
Morfogênese Celular: Rose, Luciana, Bruno, Giselle, Sheila, Ana, e todos os
demais.
À Professora Flávia Gomes, por todo o apoio ao longo da pós
graduação e aos membros do laboratório: Joice, Vivian, Juliana, Fernando,
Rômulo, Christiane, Tânia, Fernando e Aline.
Às professoras Cristina Maeda Takyia, Jane Amaral e Sandra
Konig pelo apoio.
Meu agradecimento especial à minha família que me sustentou,
em todos os sentidos, por todos estes anos. Meus amados pais David e Fátima,
que mesmo sem entender muito, morrem de orgulho a cada vitória alcançada.
Minha irmã, por apoiar e valorizar o trabalho do “geninho” e todos os outros
familiares, que ficam felizes com minhas conquistas.
Por fim, agradeço minha esposa e minha filha, minhas jóias,
minhas preciosidades, meus “fatores de crescimento”. Paula e Luisa me
atrapalharam da maneira mais especial possível: pedindo atenção. Vocês
tornam minha vida melhor em todos os sentidos, são pra quem eu quero correr
após dias difíceis, são de quem eu não quero ficar longe em tempo algum.
ABREVIATURAS
BMP – Proteína morfogenética do osso.
BMPR – Receptor de BMP
cDNA – DNA complementar
CR – Rico em cisteína
Cyr61 – Proteína rica em cisteína 61
CT – Carbóxi terminal
CTGF – Fator de crescimento do tecido conjuntivo
DMEM – Dulbecco’s modified Eagle’s medium
DNA – Ácido desoxirribonucléico
E – Idade embrionária
EDTA - ácido etilenodiamino tetra-acético
FGF – Fator de crescimento de fibroblasto
FGFR – Receptor de FGF
GAPDH – Gliceraldeído – fosfato desidrogenase
GDF – Fator de crescimento e diferenciação
HSPG – Proteoglicanos de heparan sulfato
IGF – Fator de crescimento insulina
IGFBP – Proteína ligadora de IGF
IHH – Indian hedghog
MMP – Metaloproteinase
NGS – Soro normal de cabra
NOV – Proteínas superexpressa em nefroblatomas
PBS – Tampão fosfato salino
PCNA – Antígeno de núcleo celular proliferante
PCR – Reação de polimerização em cadeia
PDGF – Fator de crescimento de plaquetas
PtHrP – Proteína relacionada ao paratormônio
PVDF – Fluoreto de polivinilideno
RNA – Ácido ribonucléico
RT-PCR – Reação de polimerização em cadeia pela ezima transcriptase reversa
SDS-PAGE – Dodecil sulfato de sódio – Gel eletroforético de acrilamida
SHH – Sonic hedgehog
siRNA – RNAs de interferência
TGF-β – Fator de crescimento transformante β
TSP1 – Trombospondina 1
TUNEL – Marcador de dUTP terminal
VEGF – Fator de crescimento do endotélio vascular
VWC – Fator von Willebrand C
WISP – Proteínas secretadas induzidas por Wnt
RESUMO
O processo de formação do disco epifisário conta com uma série de
eventos celulares que levarão a uma correta formação de estruturas ósseas.
Assim, as células neste processo deverão sofrer migração, agregação,
diferenciação, proliferação, hipertrofia e apoptose. A regulação destes eventos
depende de um fino balanço gênico, e a expressão de marcadores ao longo da
diferenciação pode ser feita principalmente por colágeno II (marcador de
diferenciação) e colágeno X (marcador de hipertrofia). Um grande número de
moléculas vem sendo atribuído como fundamentais para a diferenciação
condrocítica, dentre estas destacam-se as proteínas da família CCN, que são
proteínas multimodulares que desempenham importantes papéis em diversos
tecidos, e apresentam destaque na diferenciação condrocítica e ossificação.
Neste trabalho foi observado que CCN2 e CCN5 foram as proteínas da família
CCN mais expressas ao longo de processo de diferenciação condrocítica em
células ATDC5 tratadas com insulina. CCN2 e CCN5 puderam ser detectadas
também in vivo, por ensaio de imunohistoquímica, expressas nos condrócitos de
reserva e nos condrocítos hipertróficos. O silenciamento da expressão de CCN2
e CCN5 promoveu redução da expressão de marcadores da diferenciação
condrocítica (colágeno II) e da hipertrofia de condrócitos (colángeno X), além de
reduzir a deposição de glicosaminos sulfatados observados pela coloração por
Alcian Blue, desta forma, foi possível inferir que CCN2 e CCN5 são
fundamentais para a diferenciação condrocítica in vitro.
O papel de CCN2 e CCN5 também foi verificado em relação a regulação
de fatores de transcrição presentes durante a diferenciação condrocítica como
Runx2 e Sox9. Estes fatores tiveram seu padrão de expressão alterado em
culturas tratadas com siRNA para CCN2 ou para CCN5, mostrando que a
diferenciação condrocítica e a expressão de moléculas importantes deste
processo são alteradas pela ausência de CCN2 e CCN5. Neste trabalho também
foi mostrado que CCN2 e CCN5 reduziram a taxa de proliferação celular mas
não alteraram a taxa de morte celular, indicando que estas proteínas estão
regulando diferenciação, hipertrofia e proliferação, que são eventos cruciais da
diferenciação condrócita. Assim, foi concluir que CCN2 e CCN5 são moléculas
essenciais ao desenvolvimento ósseo e que sua ausência traz diversas
alterações no seu padrão de formação.
ABSTRACT
Bone is formed though a well organized and regulated process.
Mesenchymal precursor cells differentiate into skeletal elements by forming a
cartilaginous model, which then induces the bone formation process known as
endochondral ossification. This endochondral ossification is responsible for the
formation of the cartilaginous rudiment that is tightly regulated region in both the
differentiation and maturation of chondrocytes. Chondrocytes successively
differentiate through a well organized mechanistic procedure with migration,
proliferation, hypertrophy and apoptosis.
In the course of chondrogenesis, at least two steps are regulated by local
and systemic factors. These steps are mesenchymal condensation, giving rise to
proliferating chondrocytes, and differentiation of the proliferation chondrocytes to
hypertrophic cells, followed by mineralization of the cartilage matrix.
The murine ATDC5 chondrocyte cell line has been shown to undergo the
temporal sequences of events that occur during longitudinal bone growth in vivo
and, thereby, provides an excellent model to study the molecular mechanisms
underlying regulation of growth plate maturation and endochondral bone
formation. A great number of molecules have been addressed as important for
bone formation. CCN2 and CCN5 were the highly expressed proteins during
ATDC5 differentiation as well as in mouse growth plate.
The use of siRNA brought a great deal of information about CCN2 and
CCN5 during ATDC5 chondrogenesis. The silencing promoted though this
process led to reduction of collagen II and collagen X, markers for cell
differentiation and hypertrophy, indicating the relevance of these two molecules
during growth plate establishment.
CCN2 and CCN5 were able to regulate the expression of Runx2 and Sox9, well-
know genes involved in cartilage differentiation. In addition CCN2 and CCN5
were shown to be important in cell proliferation, which is reduced in the absence
of these two molecules. It was possible to conclude the CCN2 and CCN5 are
essential molecules during chondrogenesis regulating differentiation, proliferation
and hypertrophy, being extremely relevant in this process.
SUMÁRIO
1 - INTRODUÇÃO______________________________________________
1.1 – A família CCN de proteínas secretadas.
1.2 – Ossificação endocondral e o disco epifisário.
1.3 – Modelo in vitro da diferenciação condrocítica.
1.4 – A família CCN e seu papel na formação óssea.
2 - OBJETIVOS________________________________________________
2.1 - Objetivos gerais.
2.2 - Objetivos específicos.
3 - MATERIAIS E MÉTODOS_____________________________________
3.1 – Cultura de células ATDC5 e modelo condrocítico in vitro.
3.2 – Extração de RNA.
3.3 – RT-PCR em tempo real (REAL TIME PCR)
3.4 – Coloração e quantificação para Alcian Blue.
3.5 – Imunohistoquímica.
3.6 – Imunocitoquímica.
3.7 – siRNA (RNA de Interferência).
3.8 – Tratamento com CCN2 Recombinante.
3.9 – Western Blotting.
3.10 – Avaliação da morte celular por TUNEL
3.11 – Análise Estatística.
4 - RESULTADOS____________________________________________
4.1 – Análise da expressão dos membros da família CCN durante
a diferenciação condrocítica in vitro.
4.2 – Expressão de CCN2 e CCN5 in vivo.
4.3 - Expressão de CCN2 e CCN5 in vitro.
4.4 – Efeito do silenciamento de CCN2 e CCN5 no processo de
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45
diferenciação das células ATDC5.
4.5 – O papel de CCN2 e CCN5 na diferenciação condrocítica
in vitro e a relação entre CCN2 e CCN5 neste processo.
4.6 – O papel de CCN2 e CCN5 na regulação de marcadores
expressos durante a condrogênese.
4.7 – Análise da proliferação celular em células ATDC5 tratadas
ou não com siRNA para CCN2 e CCN5.
5 - DISCUSSÃO_______________________________________________
5.1 – A relevância da família CCN durante a formação óssea.
5.2 – A utilização da técnica de siRNA como ferramenta para
entender a participação de proteínas da família CCN na diferen
ciação condrocítica.
5.3 – A importância de CCN2 e CCN5 na diferenciação condro
cítica.
5.4 – A ação de CCN2 e CCN5 na proliferação e morte celulares.
6 - CONCLUSÕES_____________________________________________
7 - REFERÊNCIAS_____________________________________________
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83
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90
1
1 - INTRODUÇÃO
1.1– A família CCN de proteínas secretadas.
A família CCN de proteínas secretadas é composta por seis membros que
apresentam semelhanças estruturais e funcionais, sendo a sigla CCN referente
às iniciais dos três membros inicialmente descobertos: Cyr61/CCN1 (Cysteine-
rich 61 protein), CTGF/CCN2 (Connective Tissue Growth Factor), NOV/CCN3
(Nephroblastoma Overexpressed protein). Além destes membros, os fatores
WISP (Wnt induced secreted protein) 1, 2 e 3 também pertencem à família CCN.
A nomenclatura atual adotada para designar as proteínas da família CCN
classifica seus membros conforme a ordem cronológica em que foram
identificados. Desta forma, Cyr61 é chamado CCN1, CTGF é CCN2, NOV é
CCN3, WISP1-3 são chamados CCN4-6 respectivamente (BRIGSTOCK et al.,
2003).
As proteínas da família CCN apresentam uma estrutura multimodular na
qual podem ser identificados quatro módulos estruturais. A seqüência de
aminoácidos destas proteínas contém um domínio homólogo à proteína ligadora
do fator de crescimento insulina (IGFBP) na terminação amino, seguida pelo
domínio de repetição Chordin-like CR repeat (CR) ou von Willebrand factor C
(VWC), o domínio trombospondina tipo 1 (TSP 1) e um nó de cisteína na
terminação carboxi (BORK, 1993; BRIGSTOCK 1999; LAU & LAM 1999;
PERBAL, 2001). A única exceção é a proteína CCN5, que não apresenta o
2
quarto módulo, que é a porção C-terminal, cuja função já foi discutida como
sendo relacionada à proliferação celular, além de estar envolvida na ligação a
outras proteínas, como WNT (Figura 1) (PENNICA et al., 1998; ZHANG et al.,
1998; MERCURIO et al., 2004).
Estes módulo pode conferir uma função diferente às proteínas, como o
módulo CR que permite a ligação de CCNs a BMP e TGF-β, ou ainda o módulo
TSP-1 que permite a ligação com proteínas da matriz extracelular, e ainda o
módulo CT que permite a interação com WNTs. (PERBAL et al., 2003; ABREU
et al., 2002; MERCURIO et al., 2003).
Os membros da família CCN são proteínas matricelulares, ou seja,
proteínas secretadas presentes na matriz extracelular circundante às células
secretoras. São proteínas ricas em cisteína, que participam em eventos
celulares como migração, proliferação, diferenciação, adesão e morte celular. A
característica multifuncional das proteínas CCN faz com que estas estejam
envolvidas tanto em eventos ao longo do desenvolvimento embrionário, quando
em processos homeostásicos e em condições patológicas. Desta forma
destacam-se a regulação da angiogênese, crescimento tumoral, placentação,
implantação, embriogênese e ossificação endocondral. (MERCURIO et al., 2004;
IVKOVIC et al., 2003; ABREU et al., 2002; CHEN et al., 2007; DAVIES et al.,
2007).
As proteínas da família CCN apresentam grande afinidade por heparina e
podem ser localizadas na superfície celular ou na matriz extracelular, associadas
aos proteoglicanos de heparan sulfato (HSPG) (BRIGSTOCK et al., 1997).
3
Figura 1: A Família CCN.
Representação esquemática da família CCN com seus seis membros
representados na ordem em que foram descobertos. O primeiro domínio
representado é o domínio semelhante à proteína ligadora de IGF (IGFBP)
(vermelho). O segundo domínio é o vWC (verde), o terceiro domínio é o
Trombospondina 1 (TSP-1) (laranja) e o quarto é o domínio CT (azul). Todas as
proteínas da família CCN apresentam 4 domínios estruturais com exceção de
CCN5/WISP2 que não apresenta o domínio CT. Brigstock D.R. 178: 169-175
(2003 b).
4
As proteínas da família CCN podem ser detectadas nos tecidos
originados das três camadas germinativas, sugerindo seu papel na diferenciação
e funcionalidade dos sistemas nervoso, vascular, muscular e ósseo
(BRIGSTOCK, 1999). O padrão de expressão das proteínas CCN, bem como a
utilização de animais mutantes para proteínas da família CCN, trouxeram novas
informações acerca dos papéis desta família em processos como a
angiogênese, condrogênese e cicatrização. Com destaque, CCN2 já foi
identificada como sendo importante para a condrogênese, envolvida na
regulação da proliferação de condrócitos, promovendo redução da angiogênese
e deposição de matriz extracelular. Além disso, foi demonstrado que CCN2 atua
em processo de fibrose e cicatrização (TAKIGAWA, 2003; LAU & LAM, 1999;
IVKOVIC et al., 2003).
1.2 – Ossificação endocondral e o disco epifisário.
Os ossos são estruturas mineralizadas que apresentam uma grande
variedade de formas e funções. São fundamentais na locomoção, na
sustentação e proteção de órgãos vitais, tais como a medula óssea, o encéfalo,
a medula espinhal e órgãos torácicos. Os ossos também desempenham funções
metabólicas e homeostásicas, sendo importantes para o equilíbrio da
concentração de cálcio no organismo.
Os ossos são formados através dos processos de ossificação
intramembranosa ou endocondral. O processo de ossificação intramembranosa,
5
que é responsável pela formação principalmente de muitos ossos do crânio,
ocorre a partir de células mesenquimais que migram, se agregam e sofrem
diferenciação nas regiões de formação destes ossos.
A ossificação endocondral necessita da participação de condrócitos com
programa de diferenciação bem definido a fim de levar à formação de uma
matriz cartilaginosa própria para a colonização de osteoblastos e vasos
sanguíneos que levarão a formação dos tecidos ósseos.
O processo de ossificação endocondral ocorre a partir de uma matriz
cartilaginosa e tem como finalidade levar a formação de ossos do sistema
esquelético em vertebrados. A matriz cartilaginosa tem sua origem quando
células mesenquimais sofrem condensação, formando agregados celulares
aderidos através de moléculas de adesão. As células mesenquimais quando
adotam este destino passam a expressar um conjunto de genes que indicam
este comprometimento celular com a formação óssea (Figura 2 A, B) (HALL &
MIYAKE, 2000). Ao redor destas condensações encontram-se células que se
comprometerão com a formação do pericôndrio que é uma estrutura responsável
pela nutrição e manutenção da cartilagem (TICKLE, 1995).
As células que sofreram processo de condensação seguem uma via de
diferenciação que culminará com a formação dos condrócitos, que serão
responsáveis pela estruturação da cartilagem, produzindo a matriz extracelular
característica do tecido cartilaginoso (Figura 2 C e D). Os condrócitos formados
apresentam morfologia diferente da apresentada pelas células mesequimais,
podendo ser facilmente distintos destas, e expressam marcadores celulares
6
próprios, como Sox9, fator de transcrição fundamental para o estabelecimento e
função dos condrócitos (KRONENBERG, 2003). Ademais, o tecido cartilaginoso
apresenta matriz extracelular rica em colágeno tipo II e proteoglicano agrecana
(MENDLER, 1989).
O centro de ossificação primária é formado na parte média do tecido
cartilaginoso. Após a hipertrofia dos condrócitos e produção de matriz
extracelular calcificada, estas células sofrem apoptose levando a formação de
grandes lacunas, que são preenchidas por vasos e células osteoprogenitoras.
(KRONENBERG, 2003).
Uma vez que a ossificação primária é estabelecida, são identificadas
áreas chamadas centros de ossificação secundária, que são estabelecidas
quando condrócitos proliferativos mudam seu programa genético e páram de
proliferar. Estes condrócitos sofrem hipertrofia, passando por estágio de
condrócitos pré-hipertróficos e condrócitos hipertróficos.
Estes condrócitos são responsáveis pela produção da matriz extracelular
que servirá de arcabouço para a formação do osso. Uma vez que a matriz
extracelular é estabelecida, os condrócitos hipertróficos sofrem apoptose e a
matriz extracelular é preenchida por osteoblastos reiniciando o processo de
formação óssea.
7
Figura 2 – Ossificação Endocondral.
A – Presença de células mesenquimais nos sítios de formação óssea. B –
Células mesenquimais sofrem condensação. C – As células mesenquimais
condensadas se diferenciam em condrócitos. D – Os condrócitos nos centros da
área de condensação param de proliferar e se tornam hipertróficos. E – Células
pericondriais adjacentes aos condrócitos hipertróficos se diferenciam em
osteoblastos formando o colar ósseo (verde). Os condrócitos hipertróficos
direcionam a formação de matriz extracelular mineralizada atraindo vasos
sanguíneos e sofrendo apoptose. F - Os osteoblastos trabeculares acompanham
a invasão vascular formando o osso trabecular primário (cinza). G – Os
condrócitos proliferam, aumentando o tamanho do osso em comprimento. Os
osteoblastos do colar ósseo formam o osso cortical. H – Nas porções finais do
osso, ocorrem ossificações secundárias por ação de condrócitos hipertróficos,
invasão de vasos sanguíneos e atividade de osteoblastos. Kronenberg A.M.
Nature 423: 333-336 (2003).
8
Os condrócitos presentes ao longo do processo de diferenciação que
culmina na formação dos ossos se organizam espacialmente de forma bastante
definida. Desta forma, são detectadas faixas de células com morfologia e
disposição celulares distintas. Esta região que compreende as faixas de
condrócitos ao longo do processo de diferenciação condrocítica recebe o nome
de disco epifisário, pois forma discos evidentes de células condrocíticas entre
áreas ossificadas (Figura 2 G e H) (ORTH, 1999).
Os discos epifisários apresentam condrócitos com morfologia e expressão
gênica diferentes ao longo do processo de diferenciação, e portanto, podem ser
classificados em diversos tipos. Na porção mais apical do disco epifisário
encontram-se condrócitos de morfologia bastante regular, arredondada, com
baixa taxa de proliferação, constituindo uma população celular de reserva, sendo
denominados condrócitos de reserva (Figura 3). Estes condrócitos são
precursores dos condrócitos proliferativos que localizam-se na camada de
células subjacente. Os condrócitos proliferativos podem apresentar-se de forma
arredondada ou achatada, também denominados de condrócitos colunares.
Estas células se organizam em colunas e são as grandes responsáveis pelo
aumento do osso em extensão (Figura 3) (KRONENBERG, 2003). De um modo
geral, os condrócitos de reserva e os condrócitos proliferativos expressam
colágeno II e agrecana, como marcadores de sua diferenciação (LEFEBVRE &
SMITS, 2005).
A camada de células subsequente é a de condrócitos pré-hipertróficos,
que são condrócitos que param seu ciclo celular e alteram seu padrão de
9
expressão gênica e morfologia apresentando forma aumentada quando
comparados com os condrócitos proliferativos, além de apresentar expressão de
colágeno X, indicando que estas células estão sofrendo hipertrofia (Figura 3)
(DE CROMBURGGHE et al., 2001).
A camada de células seguinte é a de condrócitos hipertróficos, que
expressam colágeno X (OSAWA et al., 2006), e apresentam grande tamanho
quando comparados aos demais condrócitos (Figura 3). Esta camada apresenta
grande quantidade de matriz extracelular calcificada, que será de grande
importância para a formação do tecido ósseo, pois desempenhando a função de
arcabouço para a formação óssea. Os condrócitos hipertróficos formadores da
matriz extracelular sofrem apoptose e são substituídos por osteoblastos, que
juntamente com vasos sanguíneos colonizam a matriz, estabelecendo
posteriormente o tecido ósseo.
Em síntese, células mesenquimais apresentam expressão de colágeno I,
e quando se diferenciam em condrócitos, apresentam expressão de colágeno II
e agregana, por fim, quando estes condrócitos sofrem hipertrofia, passam a
expressar colágeno X. Estas proteínas são portanto marcadores de cada etapa
da diferenciação condrocítica, e portanto, uma relevante ferramenta na
compreensão de mecanismos reguladores de cada uma destas etapas de
diferenciação condrocítica.
Em função das sucessivas diferenciações, os ossos sofrem alongamento
e o disco epifisário se posiciona mais distalmente em relação ao centro da
estrutura óssea (Figura 2 A-H) (BALLOCK & OKEEFE, 2003).
10
Figura 3 – Estrutura dos ossos longos em crescimento
Diagrama destacando as principais zonas de ossificação dos ossos longos por
ossificação endocondral. Em azul estão representados condrócitos de reserva
de cartilagem articular e condrócitos proliferativos. Em roxo, condrócitos
proliferativos de forma achatada. Em branco os condrócitos pré-hipertróficos e
os condrócitos hipertróficos. O osso trabecular é invadido por vasos sanguíneos
(vermelho), e o osso cortical e o colar ósseo representados em vinho. O domínio
de expressão de genes responsáveis pelo desenvolvimento ósseo pode ser
percebido pelas setas de duas cabeças. Destacam-se a expressão de Colágeno
I, II e X, que são marcadores temporais do desenvolvimento ósseo, expressos
na cartilagem jovem, madura e nos ossos respectivamente. Provot & Schipani,
Biochem. & Biophys. Res. Comm 328: 658-665 (2005).
11
O disco epifisário é uma estrutura transitória, não sendo mais encontrado
após a puberdade. O processo de formação do disco epifisário depende de um
fino balanço gênico, e marcadores podem ser detectados ao longo deste
processo. A expressão de diferentes tipos de colágeno ao longo do processo de
diferenciação condrocítica está relacionada com o papel que estes
desempenham na matriz extracelular em cada processo. Desta forma, desde a
condensação das células mesenquimais até a ocorrência da apoptose em
condrócitos hipertróficos, uma série de marcadores podem ser identificados na
avaliação das etapas da diferenciação condrocítica (PROVOT & SCHIPANI,
2005).
O Indian Hedgehog (Ihh) é um gene fundamental para o desenvolvimento
ósseo, participando da regulação da proliferação e da diferenciação dos
condrócitos, além de controlar a diferenciação dos osteoblastos (VORTKAMP et
al., 1996). O Ihh é membro da família hedgehog de fatores secretados, sendo
intimamente relacionado com Sonic hedgehog (Shh). Durante a ossificação
endocondral, Ihh é expresso por condrócitos deixando o ciclo celular
(condrócitos pré-hipertróficos) e por condrócitos hipertróficos jovens.
Camundongos knockout para Ihh apresentam defeitos tardios no
desenvolvimento ósseo. Estes animais apresentam ossos mais curtos, defeitos
na proliferação de condrócitos e abundância de condrócitos hipertróficos, devido
a saída prematura do ciclo celular, resultando na formação de uma camada mais
espessa de condrócitos proliferativos. Este fenômeno pode ser compreendido
12
pelo fato dos animais knockout para Ihh não sintetizam a Proteína relacionada
ao Paratormônio (PTHrP) (ST.JACQUES et al., 1999).
O PTHrP é uma proteína secretada por células pericondriais e por
condrócitos proliferativos jovens. Seus receptores são expressos em baixos
níveis por condrócitos proliferativos e em altos níveis por condrócitos
hipertróficos. PTHrP atua na manutenção de condrócitos proliferativos e a
expressão de receptores constitutivos ativos de PTHrP resgata o fenótipo
conferido pelo knockout para Ihh, o que mostra que PTHrP é um mediador da
ação de Ihh (KARP et al., 2000). A interação entre Ihh e PTHrP leva à hipótese
de que estes dois fatores controlam a permanência dos condrócitos na fase
proliferativa.
O fator de crescimento de fibroblasto (FGF) é também crucial para a
regulação da proliferação e da diferenciação dos condrócitos. FGFs e seus
respectivos receptores são expressos em todos os estágios de diferenciação
dos condrócitos (ORNITZ & MARIE, 2002). Camundongos knockout para
FGFR3 apresentam aumento da proliferação dos condrócitos e aumento da faixa
de condrócitos proliferativos (COLVIN et al., 1996; DENG et al., 1996). Desta
forma, FGFs são considerados reguladores negativos da proliferação dos
condrócitos (ORNITZ & MARIE, 2002).
Durante o desenvolvimento inicial dos ossos longos, proteínas
morfogenéticas ósseas (BMPs) ou Fator de crescimento e diferenciação (GDFs)
apresentam papel fundamental na condensação das células mesenquimais e
também na formação das articulações (PIZETTE et al., 2000).
13
A utilização de camundongos mutantes para os receptores de BMP
(BMPR1A e BMPR1B) trouxe preciosas informações acerca dos papéis
desempenhados por BMPs durante o desenvolvimento dos ossos longos. Estes
animais apresentam defeitos na proliferação dos condrócitos resultando numa
zona proliferativa reduzida e zona hipertrófica aumentada (YOON et al., 2006). A
zona proliferativa reduzida se deve ao fato das células deixam o ciclo celular
precocemente e a zona proliferativa aumentada se deve ao fato de as células
não terminarem sua diferenciação e não sofrerem apoptose, ficando acumuladas
no estágio hipertrófico. De modo geral, estas mutações levam à condrodisplasia
generalizada nos camundongos estudados. Esta ação de BMP é mediada pela
indução da expressão de Ihh e pela inibição da via de FGF (YOON et al., 2005;
YOON et al., 2006).
Outros fatores de grande relevância para o estudo da diferenciação
condrocítica são as proteínas da família Sox (LEFEBRE & CROMBRUGGHE,
1998). Sox9 é um fator de transcrição essencial para a diferenciação de células
mesenquimais agregadas em condrócitos, e atua posteriormente em todos os
estágios de diferenciação condrocítica. Sox9 não é detectado nos condrócitos
hipertróficos (AKIYAMA et al., 2004) e regula positivamente a proliferação celular
de precursores condrocíticos, e negativamente a hipertrofia de condrócitos. Sox9
está envolvido na regulação da transcrição de proteínas de matriz extracelular
incluindo Colágeno 2a1, Colágeno 11a2 e agrecana (AKIYAMA et al., 2004; BI et
al., 2001). Camundongos knockout para Sox9 não apresentam condensação de
mesênquima e nenhum aumento de apoptose nas células mesenquimais pode
14
ser detectado (AKIYAMA et a., 2002). Sox5 e Sox6 também controlam os
estágios de maturação dos condrócitos ao longo do disco epifisário (Figura 3)
(SMITS et al., 2001; SMITS et al., 2004).
Uma outra molécula fundamental no controle da diferenciação
condrocítica é Runx2 que é um fator de transcrição com grande papel na
transição de condrócitos proliferativos para condrócitos hipertróficos.
Camundongos knockout para Runx2 não possuem osteoblastos diferenciados
(OTTO et al., 1997; KOMORI et al., 1997; KIM et al., 1999), e apresentam
defeitos na maturação dos condrócitos. A maioria dos ossos ou não se formam
ou não apresentam mineralização esperada. Além disso, a expressão de
Osteopontina ou de MMP13 está drasticamente reduzida (INADA et al., 1999).
Runx2 é expresso nas células condensadas e sua expressão é reduzida nos
condrócitos proliferativos, e posteriormente aumentada nos condrócitos pré-
hipertróficos e nos condrócitos hipertróficos (KIM et al., 1999).
A expressão de marcadores ao longo da diferenciação condrocítica, bem
como de fatores de transcrição de fundamental importância neste processo pode
ser brevemente relacionada na tabela abaixo:
Tabela 1: Presença de marcadores e fatores de transcrição ao longo
do processo de diferenciação condrocítica.
Marcador Células
indiferenciadas
Condrócitos
(diferenciação)
Condrocitos
hipertróficos
Colágeno I + - -
Colágeno II - + -
Colágeno X - - +
Runx2 + - +
Sox9 + + -
15
Embora já se conheça uma grande quantidade de proteínas envolvidas
ao longo do processo de diferenciação condrocítica, estudos recentes vêm
promovendo um maior conhecimento de outras moléculas igualmente
relevantes. Proteínas da família CCN vêm sendo estudadas durante a
diferenciação condrocítica e na formação endocondral, e a compreensão de
seus papéis pode ser obtida por abordagens in vitro.
1.3– Modelo in vitro da diferenciação condrocítica.
O processo de diferenciação condrocítica pode ser analisado através da
utilização de modelos in vitro que permitem estudar as diferentes etapas ao
longo desta diferenciação. A manipulação de células com destino condrocítico,
alcançado por determinadas condições de cultivo é uma ferramenta importante
para a compreensão dos eventos celulares e interações gênicas que ocorrem
durante este processo de diferenciação (PHORNPHUTKUL et al., 2006). Assim,
a utilização de células chamadas ATDC5, de linhagem condrocítica derivadas de
teratocarcinoma de camundongo, quando estimuladas por insulina (10µg/mL)
são induzidas a se diferenciar em condrócitos (ALTAF et al., 2006, HINOI et al.,
2007, UCHIHASHI et al., 2007). O tratamento de células ATDC5 com insulina
pode levar tanto a proliferação quanto diferenciação celular (PHORNPHUTKUL
et al., 2004; ATSUMI et al., 1990).
. Células ATDC5 indiferenciadas apresentam forma semelhante a
fibroblastos, expressam colágeno I e apresentam ciclo celular de
16
aproximadamente dezesseis horas. Na presença de insulina, regiões de
condensação celular ocorrem transitoriamente na cultura em áreas onde a
proliferação é mais acentuada, sendo um comportamento característico de
condrócitos proliferativos, que neste estádio expressam colágeno II
(SHUKUNAMI et al., 1996). Quando a formação dos nódulos de cartilagem está
completa, as células presentes na cultura têm característica de células
hipertróficas, e expressam colágeno X (SHUKUNAMI et al., 1997).
Semelhante ao que ocorre durante o processo de diferenciação
condrocítica in vivo, colágeno II e colágeno X são expressos de maneira
diferenciada. As células estimuladas por insulina passam a expressar colágeno
II e colágeno X em maior quantidade conforme os dias em cultura, sendo que
colágeno X tem sua expressão mais destacada já no final da cultura (ALTAF et
al., 2006, SHEN et al., 2002, CHEN et al., 2006, HIDAKA et al., 2003,
MUSHTAQ et al., 2002, NAKAJIMA et al., 2004). Quando as células passam
pelo processo de diferenciação condrocítica experimentam basicamente duas
etapas. A primeira etapa é a de diferenciação condrocítica, ou seja,
comprometimento das células mesenquimais que assumem características
próprias de condrócitos. Nesta etapa, o colágeno II é detectado como um
marcador da diferenciação condrocítica. A segunda etapa ocorre após o
estabelecimento da população condrocítica, que é a etapa de hipertrofia dos
condrócitos, e neste momento, a expressão de colágeno X é mais destacada
como um indicador da hipertrofia (LEFEBVRE & SMITS, 2005).
17
A avaliação da diferenciação condrocítica sofrida pelas célula ATDC5
pode der detectada pela coloração por Alcian Blue, que permite a detecção de
glicosaminoglicanos sulfatados e a formação de nódulos nestas culturas após
cerca de 21 dias de cultivo (CHEN et al., 2005; ALTAF et al., 2006; WATANABE
et al., 2007; CHEN et al., 2006; CHEN L et al., 2006; HAN et al., 2005;
NARUKAWA et al., 2007).
A diferenciação de células ATDC5 tem sido utilizada para estudar a
relevância de proteínas envolvidas em processos de ossificação com mais de
uma centena de trabalhos catalogados. Uma vez que proteínas da família CCN,
como CCN1 e CCN2 tem sido apontadas como importante para a
esqueletogênese, a diferenciação de células ATDC5 pode ser uma importante
ferramenta para o estudo das funções das proteínas CCN.
1.4 – A família CCN e seu papel na formação óssea.
Cyr61/CCN1 foi o primeiro membro da família CCN a ser identificado,
entretanto, pouco se sabe sobre seu papel nos processos de diferenciação
condrocítica. Foi demonstrado que CCN1 é superexpresso nos estágios iniciais
de diferenciação de células-tronco que fazem parte do processo de
diferenciação condrocítica. Neste processo, CCN1 é reconhecido como alvo da
via de sinalização de Wnt3A (SI et al., 2006).
No modelo condrocítico in vitro, CCN1 promove a produção de colágeno
característico de cartilagem em culturas de micromassas e estimula a
18
condrogênese, mitogênese e adesão em células mesenquimais dos membros
superiores e inferiores (O´BRIEN & LAU, 1992; WONG et al., 1997).
A expressão de CCN1 nos embriões de camundongos pode ser
correlacionada com seu papel no desenvolvimento de estruturas cartilaginosas,
incluindo os membros anteriores e posteriores, costelas e pré-vertebras
(O´BRIEN & LAU, 1992). Em cultura de micromassa, a proteína CCN1 é capaz
de promover agregação precoce de células mesenquimais, acelerar a expressão
de colágeno II, aumentar a síntese de matriz extracelular específica de
cartilagem e a quantidade de nódulos cartilaginosos (WONG et al., 1997).
A expressão de CCN1 é detectada em humanos em regiões de
remodelamento ósseo e também nos condrócitos hipertróficos. Em ratos, CCN1
foi detectado em calos ósseos. A expressão de CCN1 nos osteoblastos em
humanos é regulada por uma série de fatores de crescimento, incluindo FGF,
Fator de Crescimento de Plaquetas (PDGF) e TGF-β (SCHUTZE et al., 1998;
BRUNNER et al., 1991; HADJIARGYROU, 2000).
De todas as proteínas da família CCN, indubitavelmente CCN2/CTGF é a
mais bem estudada, e seu papel na condrogênese já foi abordado tanto por
técnicas in vitro como in vivo (IVKOVIC et al., 2003).
CCN2 é uma proteína secretada envolvida em múltiplos eventos
celulares, promovendo adesão, proliferação, migração, quimiotaxia e controle da
matriz extracelular, tendo como conseqüência implicações na esqueletogênese,
angiogênese e cicatrização (IVKOVIC et al., 2003; MOUSAD & BRIGSTOCK,
19
2000), e em situações patológicas está envolvido em fibrose e metástase
(CHANG et al., 2004).
CCN2 também está envolvido no processo de formação de estruturas
da região anterior do embrião, na formação da cartilagem de Meckel e estruturas
ósseas do crânio (IVKOVIC et al., 2003). Além disso, já foi descrito seu papel
como agente antimitótico e apoptótico (MOUSSAD & BRIGSTOCK, 2000).
Estudos in vivo mostram que CCN2 está fortemente expresso em
tecidos ósseos, vasculares e neurais. A expressão de CCN2 pode ser detectada
na cartilagem a partir da metade da gestação em camundongos. Durante a
esqueletogênese, CCN2 é expresso no pericôndrio em E12,5. Em E13,5 sua
expressão aumenta no pericôndrio e nos condrócitos subjacentes, bem como
nos condrócitos em estágio de maturação e no centro dos ossos longos em
desenvolvimento. Em E16,5 CCN2 é expresso em condrócitos hipertróficos, e
permanece até o nascimento. (IVKOVIC et al., 2003).
O papel da proteína CCN2 é evidenciado in vivo em camundongos
knockout para a molécula. Estes animais apresentam condrodisplasia
generalizada, com defeitos ao longo de toda a coluna vertebral, com vértebras
mais largas. O osso esterno é mais curto e as costelas apresentam dobras, o
que também é encontrado nos ossos dos membros superiores e inferiores.
Defeitos crânio-faciais também são detectados como mandíbula encurtada,
devido a defeitos na cartilagem de Meckel. Além disso, o osso etmóide está
deformado e os animais apresentam fenda palatina, além de calota craniana
deformada (IVKOVIC et al., 2003). Histologicamente, a zona hipertrófica nos
20
animais knockout está alargada e desorganizada em relação aos animais
selvagens. A proliferação celular apresenta-se reduzida nos estágios tardios do
desenvolvimento dos camundongos knockout. De um modo geral, o dimorfismo
apresentado pela falta de CCN2 ocorre como resultado da falha de proliferação
dos condrócitos e deficiência na composição da matriz extracelular dentro da
zona hipertrófica. A zona hipertrófica dos mutantes está expandida, e a
ossificação endocondral é interrrompida. Estes defeitos estão relacionados à
redução de expressão de Fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF)
nas zonas hipertróficas (IVKOVIC et al., 2003).
Estudos in vitro mostram que CCN2 é expresso de maneira diferenciada
durante a maturação condrocítica atuando como um modulador deste processo.
Os níveis mais altos de expressão de CCN2 foram detectados em condrócitos
hipertróficos e pós-hipertróficos, enquanto sua expressão foi relativamente
menor em células imaturas (NAKANISHI et al., 1997). Tratamento com CCN2
exógeno estimula a proliferação e a síntese de proteoglicanos em codrócitos
imaturos. Em condrócitos maduros, este tratamento leva ao aumento da
expressão de colágeno X e atividade da fosfatase alcalina, ou seja, à hipertrofia
(NAKANISHI et al., 2000).
O papel de CCN3/NOV na condrogênese ainda é pouco conhecido,
entretanto, sabe-se que a expressão de CCN3 esta presente no sistema nervoso
central, rim, córtex adrenal, músculo e particularmente a cartilagem
(MARTINERIE et al., 2001; NATARAJAN al., 2000; PERBAL, 2003).
21
Na embriogênese da galinha, CCN3 é expresso durante o
desenvolvimento das asas em E6 na zona proliferativa, e em E11/E12 é
expresso nos condrócitos hipertróficos no centro da região da diáfise. Em E14,
sua expressão é reduzida nestas células (PERBAL, 2001). Neste modelo
também foi demonstrado que CCN3 é um alvo de PTHrP, sendo regulado
negativamente por este (YU et al., 2003).
CCN3 é expresso durante o processo de diferenciação de células
ATDC5, ocorrendo nos momentos iniciais da diferenciação e também é expresso
em condrócitos primários extraídos de camundongos embrionários. CCN3 é um
regulador positivo da expressão de TGF-β2 e colágeno X, que são genes
envolvidos na diferenciação de condrócitos (LAFONT et al., 2005).
CCN4/WISP1 foi o quarto membro da família CCN e sua expressão foi
demonstrada durante o desenvolvimento embrionário restrita aos osteoblastos e
progenitores osteoblásticos do mesênquima pericondrial. Estudos in vitro
demonstraram que a expressão de CCN4 durante a diferenciação osteoblástica
promove a expressão de BMP2. CCN4 aumenta a sinalização de BMPs durante
processos de osteogênese e em áreas de cicatrização óssea (FRENCH et al.,
2004). Ainda, CCN4 promove proliferação de células mesenquimais e tem
função na repressão da diferenciação de condrócitos (FRENCH et al., 2004).
CCN5/WISP2 foi primeiramente identificado como rCOP1 e diferente
dos outros membros da família CCN apresenta apenas 3 módulos estruturais,
estando ausente a porção carbóxi terminal. Esta porção costuma ser
considerada responsável pela atividade mitogênica presente nos genes da
22
família CCN, o que poderia significar em uma ação diferenciada desta proteína
em processos patológicos (BRIGSTOCK, 1999). CCN5 foi identificado como
uma proteína alvo da via de sinalização WNT/β catenina (PENNICA et al., 1998).
A expressão de CCN5 foi identificada em osteoblastos de camundongos estando
envolvida em processos de adesão e na inibição da expressão de osteocalcina
(KUMAR et al., 1999). Além disso, CCN5 foi, depois de CCN2, o gene mais
expresso da família CCN, após indução por WNT3A durante a diferenciação
osteoblástica (SI et al., 2006).
CCN6/WISP3 é importante em muitos processos biológicos incluindo o
desenvolvimento ósseo, a formação de fibras nervosas, e a formação de vasos
sanguíneos através da regulação da proliferação e diferenciação (BORK, 1993),
atuando como ligante e promovendo a sinalização de forma parácrina ou
autócrina sendo secretado por condrócitos (DAVIES et al., 2007).
CCN6 foi o último membro da família CCN descrito, sua relevância está
associada a participação em doença genética em humanos. Mutação do gene
de CCN6 está envolvida no desenvolvimento de displasia pseudoreumatóide
progressiva (EHL et al., 2004; HURVITZ, 1999). Indivíduos portadores desta
doença são aparentemente normais ao nascimento, mas manifestam seus
sintomas por volta dos três anos de idade, com alterações radiológicas no
esqueleto axial e apendicular e mais tarde desenvolvem uma severa
degeneração das articulações na segunda década de vida (EL-SHANTI et al.,
1997; RESAI-DELUI et al., 1994). Nenhum outro defeito ou má formação pode
ser associado a esta mutação, o que deixa claro que o principal papel de CCN6
23
em humanos é o de regular o desenvolvimento ósseo e a homeostase da
cartilagem. Camundongos knockout para CCN6 não reproduziram nenhuma das
características encontradas nos humanos portadores da displasia
pseudoreumatóide. Além disso, camundongos trangênicos que
superexpressavam CCN6 na cartilagem também não apresentaram nenhum
alteração, sendo normais. Tal fato sugere que CCN6, embora seja importante
para o desenvolvimento ósseo em humanos, não é essencial para o
desenvolvimento ósseo em camundongos (KUTZ et al., 2005).
Em humanos, CCN6 é essencial para a manutenção da integridade da
cartilagem principalmente pela regulação da expressão de colágeno II. Além de
aumentar a expressão de colágeno II, CCN6 inibe a ativação de receptores de
IGF e inibe ERK cinase em condrócitos humanos (CUI et al., 2007).
Os papéis das proteínas da família CCN embora sejam identificados em
muitas abordagens experimentais tanto in vitro quando in vivo, ainda necessitam
de estudos mais detalhados. Das proteínas da família CCN, as mais bem
conhecidas e cujos papéis foram mostrados destacam-se CCN1 e CCN2. A
relevância que os outros membros da família CCN têm ainda não foi bem
avaliada e necessita de muitos estudos.
O papel dos outros membros da família CCN pôde ser avaliado em
outros modelos de estudo como câncer de mama e outros processo patológicos.
Devido à sua estrutura multimodular, e às propriedades semelhantes que estas
proteínas apresentam, a investigação de suas funções em modelos ósseos se
torna um campo de estudos de grande interesse.
24
Além disso, os eventos celulares, bem como o papel de proteínas
secretadas presentes nos discos epifisários ainda necessitam melhor
caracterização, principalmente de proteínas cujo potencial de participar de
processos importantes durante a diferenciação condrocítica já foram
parcialmente demonstrados, mas ainda não são completamente compreendidos.
Este trabalho tem especial interesse no estudo das funções das proteínas
da família CCN durante a diferenciação condrocítica no estabelecimento do
disco epifisário. Desta forma, buscamos avaliar a participação das proteínas da
família CCN, tanto as já bem conhecidas em estudos de formação cartilaginosa
e óssea, quanto as outras ainda pouco estudadas, necessitando, portanto, de
maior elucidação de seus papéis.
25
2 – OBJETIVOS
2.1- Objetivo Geral.
O objetivo geral deste trabalho foi avaliar a relevância de CCN2 e CCN5
na diferenciação condrócitica in vitro, considerando a expressão de marcadores
específicos da diferenciação.
2.2 – Objetivos Específicos.
Avaliar a expressão das proteínas da família CCN durante as etapas da
diferenciação condrocítica in vitro por RT-PCR em tempo real (Real Time PCR).
Avaliar a expressão e distribuição das proteínas CCN2 e CCN5 na placa
epifisária de camundongos recém natos através de técnica de
imunohistoquímica.
Avaliar o papel de CCN2 e CCN5 no processo de diferenciação
condrocítica in vitro, através da técnica de silenciamento por siRNA.
Analisar o padrão de proliferação celular ao longo do processo de
diferenciação das células ATDC5 sob estimulação por insulina tratadas ou não
com siRNA para CCN2 ou CCN5.
Analisar a morte celular ao longo do processo de diferenciação das
células ATDC5 sob estimulação por insulina tratadas ou não com siRNA para
CCN2 ou CCN5.
26
Determinar a ação de proteína CCN2 recombinante na diferenciação
condrocítica
Avaliar a influência de CCN2 e CCN5 na expressão de Runx2 e Sox9
durante a diferenciação condrocítica.
27
3 – METODOLOGIA
3.1 – Cultura de células ATDC5 e modelo condrocítico in vitro
As células ATDC5 são de uma linhagem estabelecida derivada de
carcinoma embrionário de camundongos (ATSUMI et al., 1990). Estas células
foram obtidas de um banco de células (Riken Cell Bank, Tsukuba, Japão), e
foram mantidas em meio de cultura contendo DMEM-F12 HAM (Invitrogen,
Carlsbad, CA, 11765-047) na proporção de 1:1. A esta solução foi acrescentado
solenito de sódio (Sigma Chemical, St. Louis, MO), 10µg/mL, transferrina (Sigma
Chemical, St. Louis, MO, T2036), 10µg/mL, piruvato de sódio (Gibco, Grand
Island, NY) 55 mg/L e soro fetal bovino 5% (Sigma, St. Louis, MO, F-4135)
conforme metologia empregada anteriormente (CHEN et al., 2005; ITOH et al.,
2008; UCHIHASHI et al., 2007; KONDO et al., 2007; HINOI et al., 2007). Para
promover a diferenciação condrocítica in vitro estas células foram cultivadas por
0, 3, 8, 14 e 21 dias, na presença de insulina (Sigma-Aldrich, I6634) na
concentração de 10µg/mL acrescentada ao meio de manutenção. O dia 0 foi
determinado quando as culturas atingiram confluência.
O meio de cultura foi trocado a cada dois dias. As células foram
cultivadas em estufa com 5% de gás carbônico e temperatura de 37°C. A
manutenção das células não diferenciadas foi feita trocando-se o meio de cultura
a cada três dias e repicadas a cada 5 dias por tripsinização (0,05% tripsina e
0,53 mM de EDTA) (Sigma-Audrich, St. Louis, MO, 59430C). Após os dias 0, 3,
28
8, 14 e 21, as células foram lavadas com PBS estéril por três vezes e então
removidas com tripsina e conservadas em RNA later (Qiagen, Valencia, CA,
767104), utilizado para preservar a integridade do RNA das células.
As células também foram cultivadas em placas de 24 poços para ensaios
de imunocitoquímica. Elas foram quantificadas em câmara de Neubauer e
plaqueadas na densidade de 1,0x10
4
células por poço (2cm
2
). Cada poço
continha uma lamínula de vidro previamente tratada com poli-L-ornitina
1,5µg/mL, PM 41.000 (Sigma Chemical, St. Louis, MO, P4957) por 1hora. As
lamínulas foram removidas e as reações de imuncitoquímica e de morte celular
foram feitas sobre as lamínulas.
3.2 – Extração de RNA.
A extração de RNA das células ATDC5 mantidas em cultura por 0, 3, 8,
14 e 21 dias foi feita com a utilização de kit RNAeasy (Qiagen, Valencia, CA,
74104). As células mantidas em RNA later foram dissociadas em tampão RLT
acrescido de 1% de β mercapto etanol em volume final de 600 µL. Em seguida o
material foi homogeneizado por centrifugação por 2 minutos a 8 000 g. Em
seguida foi adicionado o mesmo volume de etanol 70% e após, 700 µL deste
material foi transferido para uma coluna e centrifugado por 15 segundos a 8 000
g. A esta coluna foi então adicionado 700 µL de tampão RW1 e centrifugado por
15 segundos a 8 000 g. Em seguida o material foi lavado com tampão RPE por
duas vezes com a mesma rotação. O RNA foi recuperado quando se
29
acrescentou 50µL de água destilada na coluna e em seguida centrifugado por 1
minuto a 8 000 g.
3.3 – RT-PCR em tempo real (REAL TIME PCR)
A reação de amplificação em cadeia utilizando enzima transcriptase
reversa foi realizada com RNA extraído das células. O RNA obtido foi
primeiramente convertido em cDNA. O RNA purificado foi submetido à reação
com a enzima transcriptase reversa superscrit III (Invitrogen) para a construção
de uma dupla fita de DNA complementar ao RNA. Para esta reação foram
adicionados ao RNA (1,5µg), 1 µL de oligo (dT) (50mM), 1 µL de 10mM dNTP, e
água livre de nuclease atingindo o volume final de 20 µL. Em seguida, esta
mistura foi processada em termociclador PTC100
™
(MJ Research) por 5 minutos
a 65
o
C e incubada em gelo por 2 minutos. A seguir foi adicionado 4 µL de
tampão 5X, 1 µL de 0,1 M DTT, 1 µL de RNA out e 1 µL de Superscritp III
(Invitrogen). Novamente o material foi ao termociclador a 50
o
C por 60 minutos e
em seguida 70
o
C por 15 minutos.
O cDNA obtido a partir do RNA extraído das células foi submetido à
reação de PCR quantitativo, que foi utilizado pra determinar a quantidade de
DNA presente nas amostras a cada ciclo de amplificação.
Para cada condição analisada foram realizados experimentos em
triplicata, e para uma mair confiabilidade dos dados, cada experimento foi
realizado três vezes, permitindo assim a realização de análise estatística.
30
Para cada condição foram empregados 50 ng de cDNA (1µL), 100nM de
primer senso (1µL), 100nM de primer antisenso (1µL), água (7,5µL) e o iQ SYBR
Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA, 1708882) 12,5µL. O iQ SYBR Green
Supermix apresenta a seguinte composição: 100 mM KCl, 40 mM Tris-HCI, pH
8.4, 0.4 mM de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP e dTTP), iTaq DNA polimerase,
50 unidades/mL, 6 mM MgCl2, SYBR Green I, 20 nM fluoreceína e
estabilizantes. As seqüências utilizadas para a execução do Real Time PCR
estão relacionadas na tabela 2.
Tabela 2 – Relação de Primers para Real Time - PCR utilizados
CCN1 NM_010516 Senso
Antisenso
5’ GGA TGA ATG GTG CCT TGC 3’
5’ GTC CAC ATC AGC CCC TTG 3’
CCN2 NM_010217 Senso
Antisenso
5’ CCG CCA ACC GCA AGA TC 3’
5’ ACA GAA GCC ACC CAG CCA 3’
CCN3 NM_010930 Senso
Antisenso
5’ AGG AAT CGC CAG TGT GAG ATG 3
5’ ATT CTC GAA CTG TAG GTG GATG G 3’
CCN4 NM_018865 Senso
Antisenso
5’ AGG CCA CGA ACT TCA CTC TC 3’
5’ ACT GAT GGT CTT GGA CTT GTA GG 3’
CCN5 NM_016873 Senso
Antisenso
5’ TGG GAT GGA GGT CTT TCT TGC 3’
5’ AGG TGT CTG ACA GTG TGT GAA G 3’
Colágeno II NM_031163 Senso
Antisenso
5’ CAGGCGGAGACAGGAACTATC 3’
5’ TTGACACAGAATAGCACCATTGTG 3’
Colágeno X NM_009925 Senso
Antisenso
5’ TCCAGTAAGAGGAGAACAAGGC 3’
5’ CCTTGGAGTCCAGGACTTCC 3’
Sox9 NM_011448 Senso
Antisenso
5′ GAG GCC ACG GAA CAG ACT CA 3′
5′ CAG CGC CTT GAA GAT AGC ATT 3′
Runx 2 NM_009820 Senso
Antisenso
5’ CTA CCT GCC ATC ACT GAC G 3’
5’ AGA AGC GGC TCT CAG TGA G 3’
Gapdh NM_000884 Senso
Antisenso
5’ CTA GGC TTC CTG CTC TTC CA 3’
5’ CAG TCT GGT TGT TGG GGT CT 3’
31
Os resultados obtidos foram calculados e transformados em gráficos onde
o dia 0 foi tido como o valor relativo para o cálculo de todos os dias analisados.
3.4 – Coloração e quantificação para Alcian Blue.
As células mantidas em cultura foram submetidas à coloração pela
técnica do Alcian Blue. Nos dias 0, 3, 8, 14 e 21 as células foram fixadas por 15
minutos com paraformaldeído a 4% e em seguida imersas em solução de Alcian
Blue 8GX (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, A5268) 0,5% em 0,1M de ácido
clorídrico por 12 horas e lavadas com PBS em três banhos de 5 minutos cada
para em seguida serem fotografadas (SIEBLER et al., 2002; ALTAF et al., 2006;
CHEN et al., 2006).
As culturas de células submetidas à coloração pela técnica de Alcian
Blue passaram por um processo de extração do corante através de incubação
com guanidina 6M e ácido clorídrico por duas horas em temperatura ambiente
(Kirimoto et al., 2005). O material extraído teve sua densidade ótica medida em
espectrofotômetro em 630 nanômetros. O dia 0 foi utilizado para calibrar o
espectrofotômetro e as medições foram feitas nos dias 0, 3, 8, 14 e 21 de
cultura.
32
3.5 – Imunohistoquímica.
Os membros posteriores de embriões de camundongos suíços E18,5
foram removidos e fixados em paraformaldeído 4% por 24 horas. A idade
embrionária foi determinada considerando como meia idade embrionária (E0,5)
doze horas do dia seguinte ao acasalamento dos animais.
O material foi desidratado em concentrações crescentes de etanol a
70%, 80%, 90%, 95% e 100% por 1 hora cada. Após a desidratação, o material
foi imerso em xileno (J.T.Backer, Phillipsburg, NJ, X523-06) (por duas vezes) por
2 horas. Em seguida o material foi imerso em solução de Xileno/Paraplast 1:1
por 1 hora e Paraplat (McCormick Scientific, St. Louis, MO, 502004) por 2 horas.
As amostras incluídas em paraplast foram cortadas em micrótomo Leica
RM 2155 (Leica Microsystems, Nussloch, Alemanha) em espessura de 6 µm, Os
cortes foram obtidos de forma seriada, para que assim fosse possível ter
sobreposição das regiões imunomarcadas.
Para a realização da imunohistoquímica, os cortes foram mantidos em
estufa a 37°C por 16 horas e desparafinados em três banhos de xileno por 10
minutos cada e posteriormente foram hidratados em concentrações
decrescentes de etanol e água.
Os cortes histológicos foram lavados 6 vezes com PBS Triton X-100
0,3% por 5 minutos cada. O bloqueio dos sítios inespecíficos foi feito utilizando-
se soro normal de cabra (NGS) 5% diluído em PBS Triton 0,3%
.
Os anticorpos
33
primários utilizados foram diluídos em PBS Triton X-100 0,3% com soro normal
de cabra 5%, e incubados por 1 hora em temperatura ambiente ou por 16 horas
a 4ºC. Os anticorpos primários utilizados foram: Anti-CTGF (Abcam, Cambridge,
MA, Policlonal – Coelho, ab6992) na diluição 1:100; Anti-Wisp2 (Policlonal –
Coelho, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SC25442 ) na diluição de
1:100.
O controle negativo das reações foi obtido pela omissão do anticorpo
primário na solução de diluição dos anticorpos.
O anticorpo secundário utilizado foi o Alexa Fluor 555 (Invitrogen
Carlsbad, CA - A21428) 1: 1000. As diluições do anticorpo secundário foram
realizadas à partir de orientação do fabricante.
Após a incubação com anticorpos primários, os cortes foram novamente
lavados conforme descrito anteriormente e em seguida incubados com anticorpo
secundário diluído em PBS por 1 hora. Procedeu-se nova seqüência de lavagem
e por fim os cortes foram montados em meio de montagem contendo Dapi
(Vectashield – Vector Labs, Burlingame, CA, H - 1200).
. As lâminas foram observadas em microscópio E400 (Nikon, Japão), e
Eclipse TE 300 (Nikon, Japão) e as imagens foram capturadas com câmera
CoolPix 990 (Nikon, Japão), ou com câmera Cool SNAP Pro cf Color (Japão).
34
3.6 – Imunocitoquímica.
As reações de imunocitoquímica foram realizadas nas células ATDC5
estimuladas com insulina na concentração 10µg/mL, tratadas ou não com siRNA
para CCN2 e CCN5. As células foram fixadas por 5 minutos em paraformaldeído
4% em PBS, lavadas e permeabilizadas com PBS Triton X-100 0,3% três vezes
por 5 minutos cada. Após as lavagens, as células foram incubadas com solução
de bloqueio composta por PBS Triton 0,3% e NGS 5% por 1 hora. Em seguida,
as células foram incubadas a 4°C por 16 horas com os anticorpos primários anti-
CTGF policlonal (Abcam, Cambridge, MA, Policlonal – Coelho, ab6992) na
concentração de 1:500, anti-WISP2 policlonal (Santa Cruz Biotechnology, Santa
Cruz, CA, SC 25442) na concentração de 1:50, Anti-PCNA (Abcam, Cambridge,
MA, Policlonal –Coelho, ab18197) 1:100;. No dia seguinte as células foram
lavadas com PBS e incubadas por 1 hora a temperatura ambiente com anticorpo
secundário Alexa Fluor 555 (Invitrogen Carlsbad, CA - A21428) 1: 1000. Em
seguida, as células foram lavadas com PBS e montados em meio de montagem
contendo Dapi (Vectashield – Vector Labs, Burlingame, CA, H - 1200).
3.7 – siRNA (RNA de Interferência).
O silenciamento da expressão de CCN2 e CCN5 foi alcançado pela
técnica de RNA interferencial ou siRNA (small interference RNA). O siRNA
utilizado neste experimento foi obtido por síntese química, onde foram
35
adicionadas seqüências guiadoras para garantir um maior rendimento do
produto final. Estas seqüências foram eliminadas resultando na seqüência final
de 21 pares de base que foi transfectada nas células.
O RNA interferencial obtido foi introduzido na célula quando estas
atingiram 50-70% de confluência utilizando-se substância transfectante
RNAiFect (Qiagen, Valencia, CA, 301605). Para cada poço em placa de 24
poços (1,0x10
4
células) foi utilizado 4µL de substância transfectante em tampão
ECR ou no próprio meio de cultura das células no volume final de 100 µL. Após
15 minutos foi acrescentado o siRNA (1 µg) diluído em 1 µL. A solução
transfectante contendo o siRNA permaneceu em contato com as células por 24
horas e então foi substituída por meio de cultura já descrito. A eficiência do
silenciamento foi conferida por Real Time PCR e por Western Blotting.
Para a realização desta técnica foram utilizados oligonucleotídeos para
CCN2 e CCN5 que serviram de molde para a síntese química do siRNA. Os
oligonucleotídeos utilizados, bem como as seqüências alvo dos RNAs tanto de
CCN2 quanto de CCN5 estão listadas na tabela 3.
A partir dos oligonucleotídeos, foram sintetizados os siRNA (Ambion,
Austin, TX, A1620), para utilização na transfecção. Neste trabalho foram
utilizadas apenas as duas primeiras seqüências de siRNA pra CCN5 que se
mostraram suficientes para silenciar a expressão desta proteína.
36
Tabela 3 – Relação de seqüências e oligonucleotídeos para siRNA
Gene Sequência do RNA mensageiro Oligonucleotídeos para siRNA
CCN2(1) AAGAAGACTCAGCCAGATCCA GAAGACUCAGCCAGAUCCAUU
UGGAUCUGGCUGAGUCUUCUU
CCN2(2) AAAGCAGCTGCAAATACCAAT AGCAGCUGCAAAUACCAAUUU
AUUGGUAUUUGCAGCUGCUUU
CCN2(3) AACTATGATGCGAGCCAACTG CUAUGAUGCGAGCCAACUGUU
CAGUUGGCUCGCAUCAUAGUU
CCN2(4) AATGACAATACCTTCTGCAGA UGACAAUACCUUCUGCAGAUU
UCUGCAGAAGGUAUUGUCAUU
Gene Sequência do RNA mensageiro Oligonucleotídeos para siRNA
CCN5(1)
AACCCACTGATCCATCTTCTG CCCACUGAUCCAUCUUCUGTT
CAGAAGAUGGAUCAGUGGGUU
CCN5(2) AATGGTGTATTCCCAGCTGTG UGGUGUAUUCCCAGCUGUGUU
CACAGCUGGGAAUACACCAUU
CCN5(3) AAACCCAATTGCAGGGTTTTG ACCCAAUUGCAGGGUUUUGUU
CAAAACCCUGCAAUUGGGUUU
CCN5(4) AACTTTCTGCCCTTGTCACTC CUUUCUGCCCUUGUCACUCUU
GAGUGACAAGGGCAGAAAGUU
O controle negativo das reações de siRNA foi feito com a utilização de
siRNA que não reconheciam nenhuma seqüência nas células analisadas
(scrambled). Para tanto, foram sintetizados oligonucleotídeos aleatórios, que
atuaram como controle da transfecção e da utilização do siRNA. Para cada
experimento feito com siRNA de CCN2 e CCN5 foi utilizada siRNA feito a partir
de uma seqüência que não deveria produzir silenciamento: 5’ UUC UCC GAA
CGU GUC ACG UTT 3’ e 5’ ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3’.
37
3.8 – Tratamento com CCN2 Recombinante.
As células ATDC5 cultivadas em presença de insulina foram tratadas com
CCN2 recombinante. Estas células foram colocadas em cultura em presença de
meio apropriado já descrito, sem soro fetal bovino, e após 24 horas foram
tratadas com proteína CTGF recombinante (Cell sciences, Canton, MA,
CRC604B) na concentração de 50ng/mL. As células foram coletadas e tiveram
seu RNA extraído para ser processado para Real Time PCR para colágeno II e
colágeno X. O mesmo tratamento também foi realizado para células tratadas
com siRNA scrambled e siRNA para CCN2 e CCN5.
Células ATDC5 em processo de diferenciação condrocítica tratadas com
siRNA scrambled ou siRNA para CCN2 e CCN5 também foram tratadas com
esta proteína recombinate. O tratamento se procedeu por 21 dias, conforme
protocolo já demonstrado neste trabaho e as células foram coletadas e seu RNA
extraído e processado para Real Time PCR.
3.9 – Western Blotting
A verificação da expressão da proteína pelas células foi acessada pela
utilização de Western Blotting. Tampão RIPA (Pierce, Rockford, IL, 89901) foi
utilizado para se proceder a extração das proteínas. Em seguida, a quantidade
de proteína em cada amostra foi processada pelo método de Bradford (Bio-rad
Laboratories, Hercules, CA, 500-0203) e então dosada por espectrofotômetro
38
para determinação e equalização das concentrações. A concentração final de
cada amostra foi de 30mg/mL, e o ajuste da concentração das amostras foi
realizado pela adição de tampão RIPA.
O gel utilizado para a corrida das proteínas foi feito segundo protocolo
estabelecido para obtenção da concentração final de 12%. Seu preparo consistiu
em duas etapas: o gel de entrada da amostra e o gel de corrida. A amostra foi
carregada em gel de poliacrilamida 12 % na presença de dodecil sulfato de
sódio (SDS-PAGE). O gel de poliacrilamida consistiu de gel de entrada (25mM
de Tris/HCl, pH 6.8/ 0,15% de SDS/ 5% de acrilamida e 0,13% de bisacrilamida)
e um gel de corrida (0,4mM de Tris/HCl pH8.8/ 0,1% de SDS/ 12% de acrilamida
e 0,13% de bisacrilamida). A corrida eletroforética foi realizada a 100V
(aproximadamente 25mA) em tampão Tris-glicina (25mM Tris HCl/ 192mM de
glicina/ 3,5mM de SDS) por aproximadamente 2 horas. Após a corrida, as
proteínas foram transferidas por corrente elétrica para membrana de PVDF
(fluoreto de polivinilideno) de acordo com o método de Towbin (TOWBIN et al.,
1979). O gel foi embebido em tampão de transferência (25mM de Tris/HCl/
192mM de glicina/ 20% de metanol, 3,5mM de SDS) juntamente com a
membrana de PVDF. O gel foi colocado em contato com a membrana e a
transferência semi-seca ocorreu por 1hora e 30mim a 2mA por cm
2
de
membrana. Após a transferência, a membrana foi incubada com a solução de
bloqueio TBSt (20mM de Tris/HCl pH 7.6/ 137mM de NaCl com 0,1% de Tween
20), acrescidos de 5% de leite em pó desnatado, por 1hora, lavada com TBSt
por três vezes e incubada durante a noite a 4
o
C com os anticorpos Anti-CTGF
39
(Abcam, Cambridge, MA, Policlonal – Coelho, ab6992) na diluição 1:3300; Anti-
Wisp2 (Policlonal –Coelho, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA,
SC25442 ) 1:500 e anti-Actina (Abcam, Cambridge, MA, Policlonal – Coelho,
ab37063) na diluição 1:100 em TBSt-leite 5%. Após a incubação, a membrana
foi lavada novamente três vezes com TBSt e incubada com o anticorpo
secundário anti-IgG de coelho conjugado a peroxidase (Vector Laboratories,
Burlingame, CA, PI1000) na diluição de 1:2000 por 1 hora a temperatura
ambiente. Após a incubação com o anticorpo secundário, novas lavagens foram
feitas com TBSt e por fim a membrana foi revelada através do método de
intensificação da quimioluminescência pelo luminol (SuperSignal West Pico,
Pierce, Rockford, IL 34080).
Após a imunodetecção da primeira proteína, a membrana passou por um
processo de desligamento dos anticorpos primários e secundários, utilizando o
tampão Tris/SDS (62,5mM de Tris HCl pH 6.7/ 69mM de SDS/ adicionando na
hora, 1,4% de β-mercaptoetanol) durante 30 min a 45
o
C e posteriormente lavada
5 vezes com TBSt. Desta forma, uma nova imunodetecção foi feita para a
proteína utilizada como um controle do carregamento do gel (α-actina).
3.10 – Avaliação da morte celular por TUNEL.
A avaliação da morte celular presente nas culturas de célula ATDC5 foi
realizada em células tratadas com siRNA para CCN2 ou CCN5 e com siRNA
scrambled. A avaliação da morte celular foi verificada pela técnica TUNEL (In
40
Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein – Roche Indianapolis, IN, ). As células
foram fixadas em paraformaldeído 4% por 1 hora em temperatura ambiente,
lavadas com PBS e incubada em solução permeabilizadora (citrato de sódio
0,1% - Triton X-100 0,1%) em gelo por 2 minutos. Em seguida foi adicionado 50
µL de solução obtida no kit incubando-se por 1 hora a 37° C, seguida de
lavagem com PBS por 3 vezes.
3.11 - Análise Estatística
Os resultados deste trabalho foram obtidos em triplicata, e repetidos três
vezes. Os dados obtidos foram submetidos ao teste estatístico Manns-Whitney,
e só foram considerados representativos resultados com p< 0,05.
41
4 – RESULTADOS
4.1 – Análise da expressão dos membros da família CCN durante a
diferenciação condrocítica in vitro.
A expressão de CCN1 foi detectada em todos os dias do cultivo durante
a indução de condrogênese in vitro, entretanto, não apresentou grande alteração
quando comparada ao dia 0 (Figura 4 A). Pode-se observar que a maior
expressão foi detectada nos dias 8 e 14, sendo significativamente maior que o
controle apenas no dia 14, embora sendo menos pronunciada em comparação
aos outros membros da família CCN analisados (Figura 4 A).
A expressão de CCN2 ao longo do processo de diferenciação
apresentou um pequeno aumento no dia 8 em relação ao dia 0. O pico de
expressão ocorreu no dia 14, sendo 7 vezes maior que o dia 0 (Figura 4 B). O
dia 21 apresentou expressão significativa de CCN2, entretanto, menos
pronunciada que a do dia 14 (Figura 4 B).
A expressão de CCN3 apresentou um aumento no dia 8 de cerca de 6
vezes em relação ao dia 0 (Figura 4 C). No dia 14 sua expressão ainda é
signficativa, de cerca de 2 vezes maior que o dia 0, e no dia 21 sofre redução
ficando em níveis menores que o valor encontrado para o dia 0. (Figura 4 C).
A expressão de CCN4 ao longo do processo de diferenciação celular
permaneceu semelhante ao controle em todos os dias analisados, e nenhuma
alteração significativa pôde ser percebida (Figura 4 D).
42
Figura 4: Expressão por Real Time PCR da família CCN ao longo da
diferenciação de células ATDC estimuladas por insulina 10µg/mL.
Real Time PCR feito nas células ATDC5 mostra que CCN2 e CCN5 apresentam
destacada expressão ao longo do processo de diferenciação de células ATDC5.
A – CCN1 apresenta pouca expressão ao longo da cultura de células,
apresentando pico no dia 14. B - A expressão de CCN2 é mais abudante no dia
14, e significativa no dia 21. C – CCN3 apresentou destacada expressão, com
pico de 6,5 vezes em relação ao dia 0. D - A expressão de CCN4 não
apresentou aumento significativo por toda a cultura. E - CCN5 apresentou
grande aumento no dia 8 (4 vezes) e no dia 14 (9 vezes) em relação ao dia 0. *
P<0,05.
43
A expressão de CCN5 apresentou aumento significativo no dia 8 de
cerca de 4 vezes e no dia 14 de cerca de 9 vezes em relação ao dia 0 (Figura 4
E). No dia 21 ocorreu uma drástica redução da expressão de CCN5, ficando em
níveis semelhantes ao do dia 0 (Figura 4 E).
De todos os membros da família CCN analisados neste experimento, os
que tiveram maior expressão, foram CCN2, CCN3 e CCN5 (Figura 4 B, C e E).
Uma vez que a expressão de CCN3 já fora analisada previamente, este estudo
se concentrou na expressão de CCN2 e CCN5.
4.2 – Expressão de CCN2 e CCN5 in vivo.
A expressão da proteína CCN2 foi detectada nas células de reserva do
disco epifisário, sendo mais abundantemente observada na porção mais apical
do osso em formação e se tornando mais difusa inferiormente (Figura 5 B e E).
Sua expressão também pôde ser detectada em condrócitos proliferativos,
entretanto, menos intensa e ocupando extensão reduzida quando comparada a
expressão presente nas células de reserva. CCN2 também foi intensamente
detectado nos condrócitos pré-hipertróficos e nos condrócitos hipertróficos
formando uma faixa bastante visível de células e matriz extracelular marcados
para esta proteína (Figura 5 B e E).
44
Figura 5: Expressão de CCN2 e CCN5 in vivo nos discos epifisários de
camundongos recém natos.
CCN2 e CCN5 são expressos principalmente nos condrócitos de reserva e nos
condrócitos hipertróficos.
A e D – Controle negativo obtido pela omissão do anticorpo primário. B e E –
Expressão de CCN2 por imunohistoquímica e marcação por Dapi mostrando
marcação abundante nas células de reserva, nos condrócitos pré-hipertróficos e
nos condrócitos hipertróficos. C e F – Expressão de CCN5 abundantemente
detectada nas células de reserva, nos condrócitos pré-hipertróficos, nos
condrócitos hipertróficos e no osso recém formado.
45
Similar à expressão de CCN2, CCN5 também foi intensamente detectado
ao longo do disco epifisário, específicamente na zona de reserva e na camada
proliferativa (Figura 5 C e F). A expressão de CCN5 também foi mais
intensamente detectada na zona de reserva em comparação a zona de células
proliferativas. A expressão de CCN5 foi encontrada abundantemente nas zonas
pré-hipertrófica e hipertrófica.
A marcação para CCN5 também foi detectada na região óssea recém-
formada, o que pode sugerir a atuação de CCN5 em estágios posteriores de
ossificação.
Tanto CCN2 quanto CCN5 apresentaram pouca expressão no
pericôndrio, e uma tênue marcação de CCN2 pode ser detectada no colar
ósseo, próximo à zona hipertrófica e região de osso recém-formado. A
expressão de CCN5 no colar ósseo se mostrou mais intensa que a encontrada
para CCN2 (Figura 5 B e E, C e F).
4.3 -
Expressão de CCN2 e CCN5 in vitro.
A expressão de CCN2 e CCN5 foi detectada também por
imunocitoquímica nas células ATDC5 em processo de diferenciação
condrocítica. A expressão de CCN2 é detectada à partir do dia 0, ocorrendo
principalmente no citoplasma das células, e pouca expressão foi detectada no
espaço extracelular (Figura 6 A).
46
Figura 6: Expressão de CCN2 nas células ATDC5 ao longo do processo de
diferenciação condrocítica.
CCN2 apresenta padrão de expressão ao longo da cultura que se assemelha
aos achados nos experimentos de Real Time PCR.
A – Dia 0 de cultura, com a expressão de CCN2 restrita basicamente ao
citoplasma das células. B – A expressão passa a ser mais evidente no espaço
extracelular. C – A expressão de CCN2 no dia 8 se torna mais intensa quando
comparada ao dia 3. D – A expressão de CCN2 apresenta um pico em relação
aos outros dias, sendo evidente na matriz extracelular. E – A expressão de
CCN2 se mostra reduzida, atingindo níveis semelhantes ao do dia 8.
Barra de calibração: 100µm.
47
No dia 3 a expressão de CCN2 apresentou-se reduzida no citoplasma das
células em relação ao dia 0, entretanto, foi possível observar tênue expressão
na matriz extracelular (Figura 6 B). No dia 8, a expressão de CCN2 é mais
pronunciada em relação ao dia 3, sendo evidente sua presença na matriz
extracelular depositada pelas células em cultura (Figura 6 C). No dia 14, a
expressão de CCN2 foi maior, principalmente na matriz extracelular. A
expressão de CCN2 neste dia está de acordo com os achados nos experimentos
de REAL TIME PCR que também tiveram seu pico no dia 14 (Figura 6 D). No dia
21 a expressão de CCN2 foi detectada na matriz extracelular (Figura 6 E).
A expressão de CCN5 foi detectada no dia 0 de cultura, principalmente no
citoplasma das células, com pouca expressão detectada no espaço extracelular
(Figura 7 A). No dia 3, CCN5 foi detectado no espaço extracelular e também no
citoplasma das células (Figura 7 B). No dia 8 sua expressão foi observada, e
este padrão foi observado também nos dias 14 e 21 (Figura 7 C, D e E).
4.4 – Efeito do silenciamento de CCN2 e CCN5 no processo de
diferenciação das células ATDC5.
Com objetivo de avaliar o papel das proteínas CCN2 e CCN5 na
diferenciação de células ATDC5 realizamos o silenciamento por siRNA.
48
Figura 7: Expressão de CCN5 em células ATDC5 ao longo do processo de
diferenciação condrocítica.
CCN5 apresenta padrão de expressão ao longo da cultura que se assemelha
aos achados nos experimentos de Real Time PCR.
A – Dia 0 de cultura, apresenta expressão de CCN5 restrita ao citoplasma das
células em cultura. B – A expressão pouco intensa ocorre no espaço extracelular
C – A expressão de CCN5 no dia 8 foi intensa quando comparada ao dia 3. D –
A expressão de CCN2 apresentou um pico em relação aos outros dias,
evidenciada na matriz extracelular. E – Expressão de CCN5 se mostrou reduzida
semelhante ao dia 3. Barra de calibração: 100 µm.
49
A utilização do siRNA para CCN2 promoveu a redução da expressão
desta molécula ao longo de todo o processo de cultivo das células ATDC5,
sendo os dias 14 e 21 os que apresentam maior redução em relação a situação
controle (Figura 8 A e B).
A utilização de siRNA scrambled não alterou a expressão de CCN2 e de
CCN5, que ficou semelhante ao controle (Figura 8 A e Figura 4 B; Figura 8 C e
Figura 4 E). A expressão de CCN5 não foi alterada pela utilização de siRNA
para CCN2, permanecendo, em cada dia de cultura, semelhante a situação
controle (Figura 8 D).
O emprego de siRNA para CCN5 também se mostrou eficaz na redução
da expressão desta molécula ao longo do processo de diferenciação de células
ATDC5 (Figura 9 B). A utilização de siRNA scrambled mostrou que não houve
redução inespecífica da expressão de CCN5, que ficou em níveis semelhantes à
situação controle (Figura 4 E). A redução pelo emprego de siRNA para CCN5 foi
destacada nos dias 8 e 14, principalmente no 14 (Figura 9 B).
A utilização de siRNA para CCN5 também foi eficiente na redução da
expressão de CCN2, e todos os dias permaneceram com expressão semelhante
à detectada no dia 0, o que indica que CCN5 pode estar envolvido na regulação
da expressão de CCN2.
Para confirmar a eficiência da técnica de siRNA analisamos por Western
Blotting a expressão das proteínas CCN2 e CCN5 em células ATDC5
transfectadas com oligonucleotídeos controle.
50
Figura 8: Real Time PCR para CCN2 e CCN5 em células tratadas com
siRNA para CCN2.
siRNA para CCN2 é capaz de promever a redução da expressão de CCN2, mas
nao de CCN5 em células ATDC5.
A – Expressão de CCN2 em células ATDC5 tratadas com siRNA scrambled
mostrando que não houve nenhuma redução inespecífica de CCN2 pelo uso
desta técnica. B – Expressão de CCN2 em células tratadas com siRNA para
CCN2 mostrando grande redução de sua expressão. C – Expressão de CCN5
em células tratadas com siRNA scrambled, mostrando que não houve redução
inespecífica. D – Expressão de CCN5 em células tratadas com siRNA para
CCN2, mostrando que não houve redução da expressão de CCN5 ficando em
níveis semelhantes ao controle. * P<0,05.
51
Figura 9: Real Time PCR para CCN2 e CCN5 em células tratadas com
siRNA para CCN5.
siRNA para CCN5 reduz a expressão de CCN5 e de CCN2 em células ATDC5.
A – Expressão de CCN5 em células tratadas com siRNA scrambled mostrando
que não houve redução inespecífica de CCN5. B – Redução da expressão de
CCN5 pôde ser percebida pelo emprego de siRNA para esta molécula. C –
Expressão de CCN2 em células tratadas com siRNA scrambled. D – Expressão
de CCN2 mostrando-se reduzida em relação ao controle. * P <0,05.
52
Semelhante ao observado pela expressão por PCR em tempo real, a
proteína CCN2 pôde ser detectada a partir do dia 8 (Figura 10 A). Nos dias 14 e
21 a expressão de CCN2 foi mais evidente, o que coincidiu com a expressão
significativa desta molécula verificada por PCR quantitativo (Figura 10 A e Figura
4 B).
O emprego de siRNA para CCN2 promoveu a redução da proteína CCN2
evidenciado principalmente no dias 14 e 21 que apresentaram pico de
expressão na situação controle ou quando as células foram tratadas com siRNA
scrambled (Figura 10 B).
A utilização de siRNA para CCN2 nas células ATDC5 não promoveu
redução de CCN5, que permaneceu semelhante ao controle (Figura 10 C).
A expressão de CCN5 nas células ATDC5 em diferenciação foi detectada
a partir do dia 8, entretanto, sendo mais destacada no dia 14 (Figura 11 A),
coincidindo com a grande expressão de CCN5 por Real Time PCR (Figura 4 E).
No dia 21, a expressão de CCN5 apresentou-se reduzida a níveis inferiores aos
detectados no dia 8 (Figura 11 A).
O emprego de siRNA para CCN5 foi eficaz na redução da expressão da
proteína CCN5, principalmente no dia 14 cuja a expressão de CCN5 é mais
abundantemente detectada na situação controle (Figura 11 B).
A expressão de CCN2 foi reduzida nas células ATDC5 tratadas com
siRNA para CCN5, mostrando que a regulação negativa desta molécula também
pôde ser percebida pela redução da expressão por western blotting (Figura 11
C).
53
Figura 10: Western blotting em células ATDC5 tratadas com siRNA para
CCN2.
Expressão da proteína CCN2 durante o processo de diferenciação pôde ser
detectado westen blotting.
A – Células ATDC5 em cultura tratada com insulina expressaram CCN2 à partir
do dia 8, e expressão mais acentuada no dia 14 e no dia 21. B – Transfecção
destas células com siRNA para CCN2 promoveu redução da sua expressão
quando comparada ao controle. C - Expressão de CCN5 em células tratadas
com siRNA para CCN2, não mostrando alteração em comparação ao controle.
54
Figura 11 : Western Blotting para CCN5 em células ATDC5 tradas com
siRNA para CCN5.
Expressão da proteína CCN5 durante o processo de diferenciação pôde ser
detectado westen blotting.
A – A expressão de CCN5 por western bloting foi detectada nas células ATDC5
em processo de diferenciação a partir do dia 8, com pico de expressão no dia
14. Uma redução foi detectada no dia 21 a níveis inferiores aos encontrados no
dia 8. B – O emprego de siRNA para CCN5 promoveu redução da expressão de
CCN5, principalmente no dia 14. C – Expressão de CCN2 foi reduzida pela
utilização de siRNA para CCN5.
55
4.5 – O papel de CCN2 e CCN5 na diferenciação condrocítica in vitro e a
relação entre CCN2 e CCN5 neste processo.
O papél de CCN2 e CCN5 durante a diferenciação condrocítica foi
analisado pela expressão de colágeno II, colágeno X e pela coloração por Alcian
Blue. A expressão de colágeno II foi significativamente detectada a partir do dia
8. No dia 14 a expressão foi de cerca de 13 vezes maior que o dia 0 (Figura 12
A). No dia 21 sua expressão foi reduzida em 4 vezes quando comparado ao dia
0. As células iniciaram a diferenciação condrocítica cerca do dia 8, e no dia 14
esta diferenciação foi mais evidenciada pela expressão de colágeno II (Figura 12
A).
O silenciamento de CCN2 por siRNA para esta molécula levou a uma
drástica redução da expressão de colageno II ao longo do processo de cultivo.
No dia 14, houve uma redução de cerca de 12 vezes de colágeno II em relação
ao controle (siRNA scrambled) (Figura 12 B). A expressão nos dias 8 e 21
também foi reduzida, mostrando que a ausência de CCN2 pode inibir ou retardar
o processo de diferenciação condrocítica, aqui demonstrado pela expressão de
colágeno II (Figura 12 B).
56
Figura 12: Expressão de colágeno II em células ATDC5 tratadas ou não
com siRNA para CCN2 e CCN5.
CCN2 e CCN5 regulam positivamente a expressão de marcador da
diferenciação condrocítica: colágeno II.
A – Colágeno II tem expressão aumentada à partir do dia 8, atingindo pico de
expressão no dia 14, de cerca de 12 vezes em relação ao dia 0. No dia 21 foi
possível perceber expressão significativa de colágeno II. B – siRNA para CCN2
promoveu redução da expressão de colágeno II, principalmente no dia 14 em
comparação ao controle. C – A expressão de colágeno II é reduzida nas células
tratadas com siRNA para CCN5 em comparação ao controle. * p< 0,05.
57
O silenciamento de CCN5 gerou resultados mais pronunciados, com
redução maior de colágeno II principalmente nos dias 14 e 21 (Figura 12 C) em
relação ao controle. A expressão de colágeno II nestes dias foi de cerca de duas
vezes quando comparado ao dia 0 (Figura 12 C). A utilização de siRNA
scrambled não produziu alteração da expressão de colágeno II, ficando sua
expressão igual ao do controle (Figura 12 B e C).
A análise da expressão de colágeno X permitiu a verificação de hipertrofia
das células em cultura, e o emprego de siRNA para CCN2 e CCN5 permitiu a
demonstração do papél destas moléculas durante a hipertrofia nestas células,
acessado pela expressão de colágeno X.
A expressão de colágeno X nas células ATDC5 em cultura apresenta
níveis semelhantes do dia 0 até o dia 14 de cultura, atingindo níveis próximos a
duas vezes de aumento (Figura 13 A). No dia 21 de cultura, a expressão de
colágeno X teve um grande aumento, chegando a ser 7 vezes maior que o dia 0,
indicando que neste dia, as células estão sofrendo hipertrofia (Figura 13 A).
O silenciamento de CCN2 resultou numa grande redução da expressão
de colágeno X observado no dia 21 de cultura, com uma redução de cerca de 5
vezes (Figura 13 B) em relação ao mesmo dia nas amostras controle e tratadas
com siRNA scrambled (Figura 13 B). O silenciamento de CCN5 promoveu
redução da expressão de CCN5 no dia 21 de cultura (Figura 13 C), mostrando
que tanto CCN2 quanto CCN5 são importantes para o processo de hipertrofia de
condrócitos.
58
Figura 13: Expressão de colágeno X em células ATDC5 tratadas ou não
com siRNA para CCN2 e CCN5.
CCN2 e CCN5 regulam positivamente a expressão de marcador da hipertrofia
de condrócitos: colágeno X.
A – A expressão de colágeno X nas células ATDC5 apresentou-se estável até o
dia 14. No dia 21 apresenta um grande aumento de cerca de 6 vezes maior que
o dia 0. B – Expressão de colágeno X sofre grande redução no dia 21
comparada ao controle (scrambled) nas células tratadas com siRNA para CCN2.
C – Expressão de colágeno X reduzida no dia 21 em comparação a scrambled
em células tratadas com siRNA para CCN5. * P<0,05.
59
Com o objetivo de realizar o resgate da expressão de colágeno II e X
reduzida pela utilização de siRNA para CCN2, foi utilizada proteína
recombinante para CCN2 nos dois primeiros dias de cultura. A concentração de
50ng/mL de proteína funcional foi determinada conforme trabalhos previamente
publicados (NAKANISHI et al., 2000; YOSIMICHI et al., 2006) (Figura 14 A, B e
C e Figura 15 A, B e C). A expressão de colágeno II no dia 2 de cultura foi de
cerca de 6 vezes maior que no dia 0 (Figura 14 A), sendo superior a encontrada
no dia 8 da cultura controle (Figura 12 A). As células tratadas ao mesmo tempo
com CCN2 recombinante e siRNA para CCN2, tiveram a expressão de colágeno
II mais acentuada quando comparada a situação controle, resgatando a
expressão de colágeno II reduzida pela presença de siRNA para CCN2 (Figura
14 A’ e B). A adição de CCN2 recombinante à uma cultura de células tratada
com siRNA para CCN5 não foi capaz de aumentar a expressão de colágeno II,
indicando que CCN5 atua na expressão dessa de colágeno II
independentemente de CCN2 (Figura 14 C).
Células cultivadas por 21 dias na presença de CCN2 recombinante
apresentaram expressão de colágeno II aumentada prematuramente,
significativamente presente no dia 3, sendo cerca de 6 vezes maior que o dia 0
(Figura 14 D).
No dia 8, a expressão de colágeno II, foi muito superior à situação
controle. No dia 14, a expressão apresentou-se reduzida em relação ao controle,
e no dia 21 sua expressão foi semelhante ao controle (Figura 14 D).
60
Figura 14: Ação da proteína CCN2 recombinante sobre a expressão de
colágeno II.
CCN2 recombinante foi capaz de aumentar a expressão de colágeno II e de
resgatar a expressão deste em células tratadas com siRNA para CCN2.
A – O tratamento de células com CCN2 recombinante em células tratadas com
siRNA scrambled promoveu aumento da expressão de colágeno II. A’ – Controle
B – Células tratadas com siRNA para CCN2 e com CCN2 recombinante tiveram
expressão de colágeno II próxima às condições controle. C – O tratamento de
células com CCN2 recombinante não alterou a ação de siRNA para CCN5 sobre
a expressão de colágeno II. D – O tratamento de células ATDC5 com CCN2
recombinante alterou expressão de colágeno II, ocorrendo mais precocemente.
E – Células tratadas com siRNA para CCN2 e CCN2 recombinante tiveram
expressão semelhante à situação controle. F – Células tratadas com siRNA para
CCN5 tiveram expressão de colágeno II reduzida mesmo em presença de CCN2
recombinante. * P<0,05.
61
Figura 15: Efeito da proteína CCN2 recombinante sobre a expressão de
colágeno X.
CCN2 recombinante é capaz de aumentar a expressão de colágeno X e de
resgatar a expressão deste em células tratadas com siRNA para CCN2.
A – A expressão de colágeno X foi aumentada em células tratadas com CCN2
recombinate. B – O tratamento de células ATDC5 com siRNA para CCN2 e
proteína recombinante CCN2 resultou em expressão de colágeno X semelhante
ao controle. C – A expressão de colágeno X é reduzida nas células tratadas
siRNA para CCN5 mesmo em presença de CCN2 recombinante. D - O
tratamento com CCN2 recombinante aumentou a expressão de colágeno X a
partir do dia 3. E – Expressão de colágeno X é semelhante ao controle nas
células tratadas com siRNA para CCN2 e com CCN2 recombinante. F –
Redução da expressão de colágeno X por siRNA para CCN5 não pôde ser
resgatada pelo tratamento com CCN2 recombinante. * P<0,05.
62
Este experimento mostrou que a diferenciação ocorreu precocemente em
relação ao controle quando as células foram tratadas com CCN2 recombinante
(Figura 14 D e Figura 12 A).
Nas culturas tratadas com CCN2 recombinante e siRNA para CCN2, a
expressão de colágeno II se mostrou semelhante à situação controle, com pico
de expressão ocorrendo no dia 14 de 12 vezes maior que o dia 0 (Figura 14 E),
o que mostrou que CCN2 recombinante resgatou a expressão de colágeno II
reduzida pelo siRNA para CCN2. Quando estas células foram tratadas com
CCN2 recombinante e siRNA para CCN5, foi possível observar que a expressão
de colágeno II permaneceu reduzida em relação à situação controle, embora um
pequeno aumento pôde ser percebido (Figura 14 F e Figura 12 A). Este
resultado confirmou que CCN5 tem papel direto na redução da expressão de
colágeno II.
A expressão de colágeno X foi analisada em células ATDC5 tratadas com
proteína CCN2 recombinante por dois dias. O colágeno X apresentou aumento
de 3 vezes quando comparada ao dia 0 (Figura 15 A) e ao controlo (Figura 15
A’), sendo superior ao valor encontrado no dia 8 nas condições controle (Figura
13 A). As células tratadas com siRNA para CCN2 e com proteína CCN2
recombinante, tiveram expressão de colágeno II discretamente aumentada em
relação ao controle, entretanto entretanto este aumento não foi significativo
(Figura 15 B). Quando estas células foram tratadas com siRNA para CCN5 e
proteína CCN2 recombinante, esta não foi capaz de promover nenhum aumento
63
da expressão de colágeno X, mostrando que CCN5 atua diretamente na sua
expressão (Figura 15 C).
A expressão de colágeno X foi analisada nas cultura de célula ATDC5 por
21 dias tratadas com proteína CCN2 recombinante, foi possível perceber um
grande aumento a partir do dia 3, de cerca de 3 vezes, e no dia 14 pode ser
percebido o maior aumento em relação ao dia 0, de cerca de 7 vezes (Figura 15
D). O dia 21 apresentou aumento discreto, de 8 vezes em relação ao dia 0,
enquanto que na situação controle, o aumento foi de cerca de 6 vezes (Figura
13 A), o que mostra que CCN2 pode estar envolvido na hipertrofia dos
condrócitos diferenciados em cultura.
Quando siRNA para CCN2 e proteína CCN2 recombinante foram
adicionados à cultura, a expressão de colágeno X apresentou níveis
semelhantes ao controle, sendo ligeiramente aumentada, indicando que 50ng/ml
de proteína recombinante é suficiente para resgatar a expressão de colágeno X
reduzida pela adição de siRNA para CCN2 (Figura 15 E).
A combinação de siRNA para CCN5 e proteína recombinante CCN2,
levou a redução da expressão de colágeno II foi em relação a situação controle,
entretanto, a adição de CCN2 não foi capaz de resgatar totalmente a ação do
siRNA para CCN5, o que mostra que ele atua independentemente sobre a
hipertrofia (Figura 15 E). Neste caso, a expressão de colágeno X foi
significativamente maior que o dia 0, de cerca de 4 vezes maior (Figura 15 E).
64
4.6 – O papel de CCN2 e CCN5 na regulação de marcadores expressos
durante a condrogênese.
A coloração por Alcian Blue foi realizada nas células em cultura nos dias
0, 3, 8, 14 e 21. Nos dias 0 e 3 foi detectada fraca coloração por Alcian blue nas
culturas controle e tratadas com siRNA scrambled indicando que ainda não
havia a presença de glicosaminoglicanos sulfatados em concentração suficiente
para serem detectadas (Figura 16 A, B, E e F). A partir do dia 8 foi possível
observar a presença destes glicosaminoglicanos, evidenciados pela coloração
azul em regiões da cultura (Figura 16 I e J)). Os dias 14 e 21 apresentaram
coloração por Alcian Blue mais intensa, e nestes dias foi possível perceber a
presença de nódulos coloridos por Alcian Blue na superfície da cultura de
células, o que ficou evidente no dia 21 de cultura nas culturas controle e tratadas
com siRNA scrambled (Figura 16 M, N, Q e R).
O siRNA para CCN2 promoveu uma grande redução da deposição de
glicosaminoglicanos sulfatos. A coloração por Alcian Blue só pode ser percebida
de maneira bem discreta, a partir do dia 14, sofrendo um ligeiro aumento no dia
21, mas ainda assim inferior à condição controle (Figura O, P, S e T).
Culturas tratadas com siRNA para CCN5 apresentaram destacada
coloração para Alcian Blue no dia 21, entretanto nao foi percebida a presença de
nódulos, como ocorreu na situação controle, que apresenta coloração intensa a
partir do dia 8 (Figura 16 T). No dia 14 a coloração foi fracamente detectada, e
nos dias anteriores, nenhuma coloração foi percebida (Figura 16 D, H, L e P). A
65
Figura 16: Coloração por Alcian Blue em células ATDC5 em diferenciação
tratadas com siRNA para CCN2 e CCN5.
Células ATDC5 em processo de diferenciação condrocítica formam nódulos
coloridos por Alcian Blue.
A – D – Coloração para Alcian Blue pouco detectada no dia 0 de cultura, no
controle e nas células tratadas com siRNA para CCN2 e CCN5. E – H –
Coloração pouco detectada no dia 3 de cultura em todas as condições de
cultivo. I – J – No dia 8, a coloração para Alcian Blue nas condições controle
parece mais intensa que nas células tratadas com siRNA pra CCN2 e CCN5. M
– P – No dia 14, já se pôde perceber agregados celulares consistentes coloridos
por Alcian blue nas células controle, mas nenhuma alteração foi perceptível nas
células tratadas com siRNA para CCN2 e CCN5. Q – T – A presença de nódulos
se tornou evidente nas condições controle, o que não é perceptível nas células
tratadas com siRNA para CCN2 e CCN5.
66
coloração por Alcian Blue nas células tratadas com siRNA scrambled apresentou
alteração em relação ao controle, sendo detectada a partir do dia 8 e
apresentando nódulos fortemente coloridos no dia 21 (Figura 16 J, R e N).
Cultura de células coloridas por Alcian Blue tiveram seu corante extraído
por Guanidina 6M, dosado em espectrofotômetro a 630 nm e normalizada pela
concentração obtida no dia 0.
As culturas de células ATDC5 em diferenciação por insulina
apresentaram aumento gradativo da concentração de glicosaminoglicanos
sulfatados. Tomando o dia 0 como valor relativo da não presença destes
glicosaminoglicanos, foi possível perceber que no dia 8 já há um aumento
significativo da presença de Alcian Blue, sendo cerca de 3 vezes maior que o dia
0 (Figura 17 A). A presença de Alcian Blue foi máxima no dia 21, de cerca de 5
vezes maior que o dia 0 (Figura 17 A).
Nas culturas de célula tratadas com siRNA para CCN2 foi percebida
redução da presença de glicosaminoglicanos sulfatados. Até o dia 14, não houve
uma detecção significativa da coloração por Alcian Blue, e apenas no dia 21
houve um aumento que pudesse ser significativo, chegando a intensidade
relativa de 2 unidades (Figura 17 B).
A utilização de siRNA para CCN5 trouxe resultados semelhantes,
mostrando uma grande redução da coloração por Alcian Blue que não foi
detectada significativamente mesmo no dia 21 de cultura (Figura 17 C).
67
Figura 17: Quantificação da coloração por Alcian Blue em
espectrofotômetro das células ATDC5 em diferenciação.
Coloração por Alcian Blue medida em espectrofotômetro mostrou-se aumentada
ao longo do processo de diferenciação condrocítica.
A – Intensidade de coloração no dia 0 foi utilizada como medida para calibrar o
espectrofotômetro. A coloração aumenta até ser significativa no dia 8, atingindo
pico no dia 21. B – A coloração é reduzida em todos os dias nas culturas
tratadas com siRNA para CCN2, de modo que o dia 21 se assemelhou ao dia 8
na cultura controle. C – Coloração teve redução máxima em células tratadas
com siRNA para CCN5 em comparação às culturas tratadas com siRNA
scrambled. * P<0,05.
68
Cultura de células tratadas com siRNA scrambled não apresentaram
alterações em relação ao controle, mantendo padrão de marcação semelhante
ao longo de todo o processo de cultura (Figura 17 B e C).
A expressão de Runx2 e Sox9 foi verificada em culturas durante processo
de diferenciação tratadas com não com siRNA para CCN2 ou CCN5. Runx2 teve
expressão acentuada no inicio da cultura de células, sendo significavamente
maior que o dia 0 no dia 3 de cultura (Figura 18 A). No dia 8, Runx2 apresentou
seu primeiro pico de expressão, de cerca de 10 vezes maior que o dia 0. Em
seguida, a expressão de Runx2 sofreu redução para cerca de 7 sete vezes
maior que o dia 0. No dia 21, Runx2 teve seu segundo pico de expressão e ficou
cerca de 18 vezes maior que o dia 0 (Figura 18 A). Estes dados mostrara que
Runx2 é expresso nas células em condensação, no início da cultura, e nas
células em processo de hipertrofia.
Em presença de siRNA para CCN2, a expressão de Runx2 sofreu
redução mais acentuada nos dias 14 e 21 da cultura de célula em relação ao
controle nos mesmos dias (Figura 18 B).
O emprego de siRNA para CCN5 também promoveu a redução de Runx2,
mas com características diferentes das encontradas para siRNA de CCN2. A
redução foi detectada nos dias iniciais de cultura percebida principalmente no
dia 8, onde a expressão de CCN5 se apresentou mais alta (Figura 4 E). Nos dias
14 e 21 foi percebida redução da expressão de Runx2, de cerca de 5 e 9 vezes
maior que o dia 0 respectivamente (Figura 18 C). Foi possível detectar redução
da expressão de Runx2 nos dias 8, 14 e 21 em relação ao controle tratado com
69
Figura 18: Expressão de Runx2 em células ATDC5 em diferenciação, e
tratadas com siRNA para CCN2 e CCN5.
Runx2 tem padrão de expressão alterado nas células ATDC5 tratadas com
siRNA para CCN2 e CCN5.
A – Runx2 apresentou expressão mais destacada no dia 8, depois sofreu
redução no dia 14 e pico de expressão no dia 21. B – siRNA para CCN2 resultou
na redução da expressão de de Runx2 nos dias 8, 14 e 21, sendo mais
pronunciada no dia 21 em comparação às células tratadas com siRNA
scrambled. D – A expressão de Runx2 sofreu grande redução nos dias 8 e 14
devido ao tratamento das células por siRNA para CCN5. * P<0,05.
70
siRNA scrambled. O emprego de siRNA scrambled nas culturas de célula não
alterou o padrão de expressão de Runx2 em relação ao controle (Figura 18 B e
C).
A expressão de Sox9 pôde ser significativamente detectada a partir do dia
8, sendo duas vezes maior que a expressão no dia 0. No dia 14 sua expressão
foi de cerca de 4 vezes maior que o dia 0 (Figura 19 A). No dia 21, a expressão
de Sox9 foi pouco detectada, consistente com o fato deste fator de transcrição
não ser detectado em condrócitos hipertróficos (Figura 19 A).
Estas células tratadas com siRNA para CCN2 apresentaram redução da
expressão de Sox9 nos dias 8 e 14 (Figura 19 B). Foi observado aumento de
expressão no dia 21, indicando que neste dia as células ainda não estão
passando por processo de hipertrofia quando tratadas com siRNA para CCN2,
conforme observado na situação controle (Figura 19 B).
A utilização de siRNA para CCN5 trouxe resultados semelhantes em
relação à expressão de Sox9 que sofreu redução de sua expressão em todos os
dias de cultura, com excessão do dia 21, que apresentou aumento
discreto(Figura 19 C). siRNA scrambled não promoveu nenhuma alteração da
expressão de Sox9 nestas células em cultura (Figura 19 C).
71
Figura 19: Expressão de Sox9 em células ATDC5 em diferenciação,
tratadas com siRNA para CCN2 e CCN5.
Expressão de Sox9 é alterada em células ATDC5 tratadas com siRNA para
CCN2 e CCN5.
A – A expressão de Sox9 sofreu redução no dia 3 em relação ao dia 0, e
aumento significativo no dia 8, atingindo pico no dia 14, e depois sofrendo uma
queda, ficando cerca de 2 vezes maior que o dia 0. B – Em células ATDC5
tratadas com siRNA para CCN2 a expressão de Sox9 sofreu redução nos dias 8
e 14, e um aumento no dia 21, ficando semelhante ao dia 14 nas células
tratadas com siRNA scrambled. C – A expressão de Sox9 nas células tratadas
com siRNA para CCN5 sofreu redução em relação às células tratadas com
siRNA scrambled, ficando com um padrão similar ao encontrado quando foi feito
tratamento com siRNA para CCN2. * P<0,05.
72
4.7 - Análise da proliferação e morte celular em células ATDC5 tratadas ou
não com siRNA para CCN2 e CCN5.
Para se analisar influência das proteínas CCN2 e CCN5 na proliferação
celular das células ATDC5 tratadas com insulina, foi realizado ensaio de
proliferação celular utilizando anticorpo contra PCNA nos dias 0, 3, 8, 14 e 21 de
cultura.
No dia 0 de cultura a proliferação foi de cerca de 10% em relação ao
número total de células, no dia 3 as células apresentam grande aumento de
proliferação chegando a cerca de 35%, nos dias subsequentes a proliferação
sofre redução gradativa até atingir níveis inferiores ao dia 0 (Figura 20 A). A
utilização de siRNA para CCN2 promoveu redução da proliferação detectada a
partir do dia 3, de cerca de cerca de 28%, e também promoveu redução no dia 8
que apresentou de 23% de proliferação. Nos dias 14 e 21 a redução da
proliferação foi pouco perceptível, ficando próximo aos valores encontrados para
a cultura controle e a tratada com siRNA scrambled (Figura 20 A e B).
O tratamento com siRNA para CCN5 também promoveu redução da
proliferação nas culturas de célula ATDC5. Os dias 3 e 8 apresentaram a maior
redução, ficando em cerca de 28% e 22% respectivamente (Figura 20 A e B).
Também pôde ser percebida redução nos dias 14 e 21 que apresentaram
proliferação de cerca de 12 e 9% respectivamente (Figura 20 C).
A morte celular foi verificada utilizando-se técnica de TUNEL. No dia 0 a
morte célular foi detectada em torno de 10%, aumentando ao longo do processo
73
Figura 20: Análise da proliferação celular em células ATDC5 em
diferenciação e tratadas com siRNA para CCN2 e CCN5.
A proliferação celular foi reduzida nas células tratadas com siRNA para CCN2 e
CCN5.
A – A proliferação celular nas células ATDC5 apresentou um grande aumento no
dia 3, de cerca de 34%. Em seguida sofreu redução até atingir a menor
proliferação no dia 21, de cerca de 15%. B - A proliferação celular nas culturas
tratadas com siRNA para CCN2 sofre redução em todos os dias, sendo mais
evidente nos dias 3 e 8 quando comparada ao controle e às culturas tratadas
com siRNA scrambled. C – A proliferação celular em culturas tratadas com
siRNa para CCN5 também sofreu redução em todos os dias de cultura quando
comparada às culturas tratadas com siRNA scrambled. * P<0,05.
74
Figura 21: Análise da morte celular nas células ATDC5 em diferenciação e
tratadas com siRNA para CCN2 e CCN5.
A – A morte celular nas culturas em diferenciação vai sofrendo aumento gradual
ao longo dos dias em cultura, sendo significavamente dectável apenas no dia
21, com cerca de 20%. B – A utilização de siRNA para CCN2 promove aumento
não significativo de morte celular nas culturas de células ATDC5. C – A morte
celular não é significativamente aumentada nas células tratadas com siRNA para
CCN5. * P<0.05.
75
de cultura das células ATDC5 (Figura 21 A). No dia 3 foi percebido um pequeno
aumento, onde se percebeu morte celular de cerca de 18%. Nos dias finais de
cultura, a morte celular sofreu aumento significativo, sendo de cerca de 22%
(Figura 21 A).
Células tratadas com siRNA pra CCN2, mostraram um aumento discreto
da porcentagem de morte celular ao longo do processo diferenciação. O maior
aumento aconteceu no dia 3, mas nenhum aumento significativo ocorreu nos dia
de coleta da cultura de células (Figura 21 B).
Análise da morte celular nas culturas de células tratadas com siRNA para
CCN5 indicou que embora tenha sido percebido aumento da morte celular, em
nenhum dia este aumento foi estatisticamente significativo, indicando que CCN2
e CCN5 parecem não estar envolvidos na regulação da morte celular nas
culturas de célula ATDC5 estimuladas por insulina (Figura 21 C).
76
5 – DISCUSSÃO
No presente trabalho foi investigado o papel de proteínas da família CCN
durante o processo de diferenciação de células ATDC5, que são células que se
diferenciam em condrócitos quando estimuladas com insulina na concentração
de 10µg/mL. As proteínas da família CCN mais expressas durante o processo
de diferenciação destas células foram CCN2 e CCN5. CCN2 e CCN5 são
essenciais para o processo de diferenciação de células com destino
condrocítico, uma vez que seu silenciamento provoca alteração do padrão de
expressão de marcadores da diferenciação condrocítica. A ausência de CCN2 e
CCN5 levou à redução da proliferação celular, mas não promoveu alteração
significativa da morte celular nestas células em cultura. EM conjunto, estes
resultados elucidaram o papel das proteínas de CCN2 e CCN5 durante os
processos de diferenciação condrocítica in vitro.
A correlação que existe entre o processo de diferenciação condrocítica in
vitro e as camadas celulares presentes nos discos epifisários nos permite inferir
sobre a ação que CCN2 e CCN5 exercem nestes dois sistemas. A análise dos
camundongos knockout para CCN2 mostra que estes animais apresentam
defeitos ósseos como resultado da alteração do padrão de proliferação celular e
da deposição de matriz extracelular dentro da zona hipertrófica (Ivkovic et al.,
2003). Neste trabalho foi mostrado que ocorreram defeitos no remodelamento da
matriz extracelular dentro da zona hipertrófica, principalmente porque a falta de
CCN2 leva à redução da expressão de componentes da matriz extracelular e de
77
metaloproteinases. Histologicamente, também pôde ser observado que os
camundongos knockout para CCN2 apresentam zona hipertrófica expandida,
com perda da linearidade das colunas longitudinais de condrócitos (IVKOVIC et
al., 2003).
A redução da expressão de CCN2 pelo emprego de siRNA foi importante
para confirmar os achados publicados, mostrando que in vitro CCN2 se mostrou
uma proteína imprescidível para a diferenciação condrocítica, regulando a
expressão de moléculas reconhecidas como fundamentais para a diferenciação
condrocítica, como por exemplo Runx 2 e Sox9.
Análise in vitro da expressão de CCN2 se mostrou em conformidade com
os achados obtidos por imunohitoquímica para esta molécula, uma vez que nas
duas situações, CCN2 tem expressão pronunciada nos condrócitos hipertróficos.
A avaliação do papel de CCN5 durante a diferenciação condrocítica
trouxe informaçãos acerca desta molécula ainda pouco estudada. Poucos
estudos foram realizados para melhor compreensão da biologia da molécula
CCN5, e sua caracterização durante a formação óssea é de extrema relevância,
especialmente por se tratar de uma protéina pertencente a uma família cujos
membros já foram reconhecidos como importantes neste processo.
Desta forma, era esperado que CCN5 tivesse papel destacado na
diferenciação condrocítica, principalmente pelo fato de ter expressão presente
nas zonas de condrócitos pré-hipertróficos e hipertróficos e na zona de células
de reserva, padrão observado para CCN2.
78
5.1 – A relevância da família CCN durante a formação óssea.
A importância de alguns membros da família CCN já havia sido discutida
em trabalhos anteriores, com destaque para o trabalho de Ivkovic e
colaboradores (IVKOVIC et al., 2003) que mostrou in vivo o papel de CCN2 na
esqueletogênese. Neste trabalho foi mostrado que a ausência de CCN2, em
uma abordagem in vitro, compromete a diferenciação celular e também altera a
proliferação celular, confirmando os achados in vivo já publicados.
Pela utilização da Real Time PCR foi possível observar que a expressão
de CCN1 tem seu pico no dia 14, que é o dia em que a expressão de colágeno II
tem seu pico, indicando que CCN1 pode estar envolvido durante o processo de
diferenciação dos condrócitos, porém, em menor intensidade quando comparado
à outras proteínas da familia CCN durante este processo. De fato, CCN1 já fora
detectado em estruturas ósseas e cartilaginosas durante o desenvolvimento de
camundongos, entretanto, seu papel não se mostrou destacado durante a
diferenciação de células ATDC5.
CCN2 é a proteína mais bem caracterizada de toda família CCN, e seu
papél durante a condrogênese foi abordado em diversos trabalhos, aqui,
mostramos CCN2 como molécula importante na diferenciação condrocítica e
regulação da expressão de proteínas envolvidas neste processo. Foi possível
demonstrar que CCN2 é importante para a expressão de Runx2 e Sox9 em
células ATDC5 em diferenciação. CCN2 foi um importante controle ao longo
deste trabalho, uma vez que seu conhecido papél foi importante para se
79
estabelecer relação entre sua função e a função de CCN5, ainda pouco
estudada.
Foi possível demonstrar que a expressão de CCN2 foi alta no dia 14 na
cultura de céulas em diferenciação, coincidindo com o pico de expressão de
colágeno II, que indica diferenciação das células em condrócitos. Este dado
sugere a participação de CCN2 na diferenciação condrocítica neste processo.
Além disso, a expressão significativa de CCN2 no dia 21 pode estar relacionada
à hipertrofia presente nas células ATDC5, evidenciada pela expressão de
colágeno X.
A expressão de CCN3 teve seu pico antes das células em cultura
sofrerem diferenciação, e no dia em que estas células experimentam pico de
diferenciação máxima (grande expressão de colágeno II), a expressão de CCN3
ainda é significativa, o que indica que esta proteína pode ser importante no
processo de diferenciação condrocítica. A expressão de CCN3 em células
ATDC5 já fora demonstrada em trabalho recente (LAFONT et al., 2003), que
discutiu a relação entre esta proteína e TGF-β.
Este trabalho foi importante para se confirmar o padrão de expressão
encontrado para CCN2 e CCN3 nos experimentos de diferenciação de células
ATDC5 com insulina. A expressão de CCN4 não sofreu alteração ao longo do
processo de diferenciação condrocítica, mostrando que esta proteína pode não
participar dos processos de diferenciação e hipertrofia. A função de CCN4
durante a osteogênese está mais relacionada ao seu papel durante a
diferenciação osteoblástica. Na condrogênese, seu papel já fora discutido como
80
sendo de repressor da diferenciação de condrócitos (FRENCH et al., 2004), o
que justifica sua baixa expressão num sistema de cultura que visa a
diferenciação.
De um modo geral, a expressão dos membros da família CCN ocorre
mais pronunciadamente no dia 8 e no dia 14, que configura uma cultura de
células mais madura, começando a se diferenciar e posteriormente a sofrer
hipertrofia. O papel das proteínas CCN vem sendo cada vez mais bem
caracterizado, e neste trabalho foi feito um esforço para se tentar relacioná-las
num único estudo.
No trabalho presente mostramos a expressão de CCN5 e sua relevância
para a diferenciação condrocítica, permitindo um maior conhecimento dos
papéis desta molécula, uma vez que pouco se sabe sobre o papel de CCN5 nos
processos de formação óssea, já que a maioria dos estudos realizados em
CCN5 foi feita em câncer de mama. A confirmação da importância de CCN5, e
também de CCN2 foi conseguida com a verificação da expressão in vivo destas
proteínas por técnica de imunohistoquímica, mostrando que estas proteínas
estão expressas principalmente nas camadas de condrócitos pré-hipertróficos e
hipertróficos.
81
5.2 – A utilização da técnica de siRNA como ferramenta para entender a
participação de proteínas da família CCN na diferenciação condrocítica.
A presença das proteínas CCN durante a diferenciação condrocítica, com
destaque para CCN2 e CCN5, e o papél já bastante conhecido de CCN2 neste
processo foram fatores propícios para o desenvolvimento de siRNA para as
proteínas com expressão mais destacada identificada neste trabalho.
A marcação de CCN2 e CCN5 no disco epifisário mostra que estas
proteínas estão expressas em estágios importantes do estabelecimento do disco
epifisário, com destaque para a camada de células hipertróficas.
Comparativamente, a expressão de CCN2 parece ser mais evidente tanto na
camada de células de reserva quanto na camada de células hipertróficas,
entretanto, CCN5 parece ter um domínio de expressão mais abrangente que
CCN2. De qualquer forma, a expressão destas duas proteínas é bastante
semelhante, e o papel que desempenham também é.
O uso de técnica de siRNA é uma importante ferramenta para o
silenciamento da expressão de proteínas pela utilização de RNAs de dupla fita
complementar (SHARP, 2001). siRNA compreende uma fita dupla de RNA de 21
oligonucleotídeos que não geram resposta antiviral nas células de mamíferos,
como ocorre com RNAs interferenciais de maior tamanho (ELBASHIR et al.,
2001; CAPLEN et al., 2001; HUTVAGNER et al., 2001; JARVIS & FORD, 2001).
Uma das tarefas iniciais para o emprego do siRNA é o desenho de uma
seqüência de oligonucleotídeos que efetivamente seja funcional no
82
silenciamento dos RNAs. Uma vez de posse destes oligonucleotídeos foi
possível gerar as seqüências de siRNA desejadas. Estas seqüências foram
testadas uma a uma para se determinar qual é a mais apropriada.
Quanto se gera um siRNA é necessário se determinar: a seqüência mais
apropriada para o silenciamento, a concentração ideal para a experimentação,
se haverá ou não a necessidade de se conjugar mais de uma seqüência para se
atingir o resultado desejado, além disso, é importante se determinar a melhor
forma de transfecção bem com o tempo ideal para este procedimento. Uma vez
que todas estas variáveis são consideradas, espera-se que a redução seja de
pelo menos 70%, mas o ideal é que de 90 a 95% de silenciamento seja
conseguido.
O silenciamento realizado pelo emprego de siRNA para CCN2 e CCN5 foi
bastante eficaz, o que permitiu com que o papél destas proteínas pudesse ser
melhor compreendido durante a diferenciação condrocítica.
Embora a expressão de CCN5 não tenha sido alterada pelo emprego de
siRNA para CCN2, CCN2 apresentou grande redução nas células em cultura
quando tratadas com siRNA para CCN5, indicando que possa existir regulação
entre estas duas proteínas.
De fato, a redução da expressão de CCN5 leva à redução de CCN2, o
que foi demonstrado no experimento envolvendo a utilização de proteína
recombinante de CCN2, mostrando que mesmo se resgatando a presença da
proteína CCN2, ainda assim CCN5 atua promovendo a diferenciação
condrocítica, o que pode ser observado pela expressão de colágeno II e X.
83
5.3 – A importância de CCN2 e CCN5 na diferenciação condrocítica.
O silenciamento de CCN2 e CCN5 trouxe importantes informações acerca
do papel destas duas proteínas na diferenciação dos condrócitos. Neste trabalho
foi mostrado que a ausência de CCN2 e CCN5 levou a redução de marcadores
de diferenciação condrocítica (colágeno II) e de hipertrofia (colágeno X), e que a
produção de glicosaminoglicanos sulfatados também foi reduzida, o que foi
observado pela coloração por Alcian Blue.
A diferenciação condrocítica pode ser avaliada pela expressão de
colágeno II nas células ATDC5 em cultura. Neste experimento foi possível
avaliar que as células ATDC5 efetivamente sofreram diferenciação, evidenciada
pelo grande aumento de colágeno II, especialmente no dia 14, mostrando que as
células neste dia apresentavam-se diferenciadas em condrócitos. A redução da
expressão de colágeno II no dia 21 coincide com um grande aumento de
colágeno X neste mesmo dia, o que indica que as células passaram de de uma
condição não hipertrófica para uma condição hipertrófica. Colágeno X é um
marcador de hipertrofia em condrócitos, e sua grande expressão no dia 21
evidencia que estas células em cultura conseguem atingir fenótipo hipertrófico, o
que pode ser também confirmado pela coloração por Alcian Blue.
De um modo geral, parece que a redução de CCN5 produz um impacto
maior no processo de diferenciação das células ATDC5, Esta característica
pode ser devida ao fato de que CCN5 regula negativamente a expressão de
84
CCN2, o que poderia resultar num efeito somatório da redução destas duas
moléculas.
A utilização de CCN2 recombinante foi uma importante ferramenta para
elucidar a relação entre CCN5 e CCN2. Uma vez que a expressão de CCN2 é
reduzida quando a expressão de CCN5 era reduzida, foi preciso determinar se
os efeitos de CCN5 ocorriam direta ou indiretamente, e ainda determinar se o
siRNA para CCN5 era capaz de agir sobre a expressão de CCN2.
Pela adição de CCN2 recombinante foi possível demonstrar que CCN5
atua de modo independente, pois mesmo em presença de CCN2, a ação de
siRNA para CCN5 foi efetiva o suficiente para promover a redução de
marcadores da condrogênese como colágeno II e colágeno X.
Além disso, foi possível também desmonstrar que a proteína CCN2 foi
capaz de aumentar a expressão destes marcadores na ausência de siRNA,
mostrando que CCN2 foi eficiente tanto para resgatar a expressão de colágeno
II e X como aumentar sua expressão em situação onde siRNA não está
presente.
O padrão de expressão apresentado por CCN2 e CCN5 nas células
ATDC5 em cultura pode estar relacionado com o papel que estas proteínas
desempenham em cada momento do processo de diferenciação.
Uma vez que a expressão de CCN5 apresenta-se aumentada antes da
expressão de CCN2, pode ser que CCN5 atue em eventos anteriores como a
diferenciação das célula em condrócitos, principalmente porque esta protéina
está expressa um pouco antes e no mesmo momento que ocorre o pico de
85
expressão de colágeno II, relacionado com a diferenciação das células em
condrócitos.
A expressão de CCN2 tem seu pico um pouco mais tarde, sendo mais
destacada nos dias 14 e 21 podendo significar que esta proteína participe mais
efetivamente do processo de hipertrofia. É esperado entretanto, que estas duas
proteínas tenham sobreposição de funções, ou seja, que ambas participem dos
processos de diferenciação em condrócitos, e posteriormente da hipertrofia
destes condrócitos.
A coloração por Alcian Blue também foi uma ferramenta importante na
avaliação da eficiência da técnica de cultivo de células ATDC5 como também na
determinação da capacidade de CCN2 e CCN5 de promover a diferenciação
condrocítica in vitro. Pela coloração por Alcian Blue foi possível demonstrar que
na ausência tanto de CCN2 quanto de CCN5 a produção e deposição de
glicosaminoglicanos sulfatados foi reduzida. Tal fato ficou evidente pela redução
da coloração por Alcian Blue e de não ocorrer nódulos presentes na cultura de
células.
A redução da coloração por Alcian Blue foi confirmada pela sua extração
e posterior dosagem em espectrofotômetro, que se mostrou reduzida nas
culturas tratadas com siRNA para CCN2 e CCN5 quando comparadas com a
situação controle ou quando as culturas foram tratadas com siRNA scrambled.
Uma outra abordagem relevante para a compreensão da atuação de
CCN2 e CCN5 foi a avaliação de proteínas importantes no processo de
diferenciação condrocítica. Neste trabalho foi avaliada a expressão de Runx2 e
86
Sox9, que são fatores de transcrição com papel fundamental no estabelecimento
dos tecidos cartilaginosos.
Pelo emprego de Real Time PCR foi possível mostrar que a expressão de
Runx2 é importante para a diferenciação condrocítica, sendo expressa nas
células ainda indiferenciadas. Quando as células se diferenciam em condrócitos,
sua expressão sofre redução, voltando a ser expressas quando sofrem
hipertrofia, desta forma, pode-se perceber pico de expressão de Runx2 no dia 8
e no dia 21, que coincide com as células em cultura ainda não diferenciadas em
condrócito e após nas células consideradas hipertróficas.
A utilização de siRNA para CCN2 promoveu alteração do padrão de
expressão de Runx2, que normalmente tem alta expressão em condrócitos
hipertróficos. Como as células em cultura tratadas com siRNA para CCN2 não
se tornam hipertróficas, talvez seja esta a razão de sua expressão estar
reduzida no dia 21 da cultura de células (Figura 18 C). A alteração do padrão de
expressão encontrado para Runx2 quando tratado com siRNA para CCN5
mostra que as células ainda no dia 21 estão se diferenciando em condrócitos,
como um sinal de atraso do processo de diferenciação.
A expressão de Sox9 também foi alterada com a redução da expressão
de CCN2, que está aumentada no dia 21 provavelmente porque este dia não
representa o momento de hipertrofia das células, e sim que as células ainda
estão se diferenciando em condrócitos, devido a um provável atraso do processo
de cultura. A redução da expressão de CCN5 promoveu resultado semelhante,
87
embora um pouco mais efetivo, promovendo uma grande redução da expressão
de Sox9 ao longo de todo o processo de cultura (Figura 19 B e C).
5.4 – A ação de CCN2 e CCN5 na proliferação e morte celulares.
CCN2 e CCN5 são proteínas conhecidas como mitogênicas, uma
característica marcante das proteínas da família CCN. Neste estudo pudemos
constatar que a ausência destas proteínas resultou em redução da proliferação
celular por PCNA quando comparada à situação controle.
Estudos realizados em camundongos knockout mostraram que defeitos
na condrogênese podem ser devidos a problemas na proliferação celular
(Ivkovic et al., 2003). A redução da proliferação confirma os achados in vivo,
mostrando que CCN2 é importante para a proliferação celular durante o
desenvolvimento do disco epifisário.
Neste trabalho foi possível observar que a proliferação celular apresenta
grande aumento logo no início da cultura, e no dia 3 a proliferação celular é
máxima, e conforme a cultura avança em dias vai reduzindo, provalvemente pela
redução de espaço na cultura superconfluente. O aumento da proliferação
celular pode ter relação direta com a administração de insulina na cultura de
células que está relacionada com aumento da proliferação celular (ATSUMI et
al., 1990), entretanto, é esperado que a proliferação celular sofre redução devido
a grande presença de células na cultura.
88
Nas culturas tratadas com siRNA para CCN2 pode ser percebida uma
redução da proliferação em todos os dias analisados, embora tenha sido
registrada uma redução discreta em comparação ao controle. A proliferação
celular mais acentuada foi detectada nos dias 3 e 8, que são os dias onde a
proliferação é mais acentuada. O padrão de proliferação celular presente nas
células tratadas com siRNA para CCN5 foi bastante semelhante ao encontrado
para CCN2, podendo ser percebida redução em todos os dias de cultura, e
neste caso, uma redução mais destacada também foi percebida nos dias 3 e 8.
A morte celular, ao longo do processo de cultura foi sofrendo aumento
conforme o avançar dos dias. A maior detecção de morte celular foi percebida
no dia 21, com aumento significativamente detectado. O aumento gradativo da
morte pode ser devido à condição de superconfluência da cultura de célula, que
resulta num meio mais inóspito para as células.
Nas células tratadas com siRNA para CCN2 e CCN5, um pequeno
aumento da morte celular foi detectado, mas este aumento não foi
estatisticamente significativo, indicando que estes siRNA não foram capazes de
interferir na morte celular.
Neste trabalho foi mostrado que CCN2 e CCN5 são moléculas
importantes na diferenciação condrocítica. Elas são expressas in vivo e in vitro
nas células hipertróficas e são importantes no processo de hipertrofia. CCN e
CCN5 são capazes de regular a expressão de colágeno II e colágeno X, bem
como alterar o padrão de expressão de Runx2 e Sox9 ao longo da
diferenciação.
89
6 – CONCLUSÕES
1 – CCN2, CCN3 e CCN5 são os fatores da família CCN mais expressos ao
longo do processo de diferenciação de células ATDC5 com destino condrocítico
pelo estímulo por insulina.
2 – CCN2 e CCN5 são essenciais para a diferenciação condrocítica,
promovendo a expressão de marcadores da condrogênese como colágeno II e
X, além de promover a deposição de glicosaminoglicanos sulfatados.
3 – CCN2 e CCN5 são expressos in vivo nos discos epifisários, sendo expressos
principalmente na zona de condrócitos pré-hipertróficos e hipertróficos podem
ser detectado nas células ATDC5 ao longo do processo de diferenciação
condrocítica.
4 – CCN2 e CCN5 regulam a expressão de Runx2 e Sox9 durante a
diferenciação condrocítica de células ATDC5.
6 – CCN2 e CCN5 são importantes para a proliferação celular durante a
diferenciação de células com destino condrocítico .
7 – CCN2 e CCN5 não interferem na morte celular de cultura de células ATDC5
durante diferenciação condrocítica.
90
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