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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
INSTITUTO DE PSICOLOGIA
RAFAELA FADONI ALPONTI
Aminopeptidase neutra, dipeptidil peptidase IV, CD13, CD26 e
Fos no hipotálamo e hipocampo de ratos com obesidade induzida por glutamato
monossódico e privados de alimento
SÃO PAULO
2008
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RAFAELA FADONI ALPONTI
Aminopeptidase neutra, dipeptidil peptidase IV, CD13, CD26 e
Fos no hipotálamo e hipocampo de ratos com obesidade induzida por glutamato
monossódico e privados de alimento
Dissertação apresentada ao Instituto de Psicologia da
Universidade de São Paulo para obtenção do título de
Mestre em Neurociências e Comportamento
Área de Concentração: Neurociências e Comportamento
Orientador: Prof. Dr. Paulo Flávio Silveira
Co-orientadora: Maria Inês Nogueira, Profa. Associada
SÃO PAULO
2008
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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA
FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Catalogação na publicação
Serviço de Biblioteca e Documentação
Instituto de Psicologia da Universidade de São Paulo
Vendrame, Rafaela Fadoni Alponi
Aminopeptase neutra, dipeptidil peptidase IV, CD13, CD26e Fos
no hipotálamoe hipocampo de ra
tos com obesidade induzida por
glutamato monossódico e privados de alimentos / Rafaela Faldoni
Alponi Vendrame; orientador Paulo Flávio Silveira. --
São Paulo,
2008.
168 p.
Dissertação (Mestrado – Programa de Pós-Graduação em
Psicologia. Área de Concentração: Neurociências e Comportamento)
– Instituto de Psicologia da Universidade de São Paulo.
1. Obesidade 2. Peptideos 3. Glutamatos 4. Sistema Nervoso
Central I. Título.
RC628
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FOLHA DE APROVAÇÃO
Rafaela Fadoni Alponti
Aminopeptidase neutra, dipeptidil peptidase IV, CD13, CD26 e Fos no hipotálamo e
hipocampo de ratos com obesidade induzida por glutamato monossódico e privados de
alimento.
Dissertação apresentada ao Instituto de
Psicologia da Universidade de São Paulo para
a obtenção do grau de Mestre em
Neurociências e Comportamento
Aprovado em:
Banca Examinadora:
Prof(a). Dr(a).________________________________________________________________
Instituição:________________________Assinatura:_________________________________
Prof(a). Dr(a).________________________________________________________________
Instituição:________________________Assinatura:_________________________________
Prof(a). Dr(a).________________________________________________________________
Instituição:________________________Assinatura:_________________________________
Prof(a). Dr(a).________________________________________________________________
Instituição:________________________Assinatura:_________________________________
5
DEDICATÓRIA
À minha filha Alice, por ser a inspiração e o
motivo pelo qual quero seguir adiante,
procurando fazer sempre o melhor e ser
exemplo a essa pequenina que ainda vai
nascer.
Aos meus pais, Ademir e Maria Terezinha,
por me ensinarem diariamente como conseguir
entendimento e compreensão em minha
caminhada. Por sempre acreditarem e
confiarem em mim. Agradeço por excederem,
sempre, minhas expectativas.
À minha querida irmã, Letícia, pelo amor
existente em nossa relação. Por ser amiga,
companheira e eterna para mim.
Ao meu amor, Antonio Vendrame Filho, por
entender inúmeras vezes minha ausência. Por
não me deixar desistir, fazendo com que as
dificuldades fossem vistas como grande
aprendizado. Pelo amor constante, pela
paciência e, principalmente, por me mostrar
que este dia chegaria com êxito.
Ao Prof. Dr. Paulo Flávio Silveira, por ter
contribuído em muito do que sou hoje. Por ter
me mostrado que a busca pelo conhecimento
pode ser muito mais prazerosa do que
imaginamos. Pela paciência, confiança, pelas
conversas e também pelas merecidas broncas.
À Profa. Dra. Maria Inês Nogueira, por ter
me acolhido de forma muito carinhosa desde o
primeiro contato. Pelas palavras doces e sábias,
e pela colaboração na realização desse
trabalho.
6
AGRADECIMENTOS
À Deus, por me conceder uma vida maravilhosa, me permitir viver essa experiência e
propiciar o convívio com pessoas tão iluminadas e especiais. Por todas as dificuldades
impostas, as quais me fizeram valorizar ainda mais esse trabalho.
Ao meu amigo querido Leonardo Zambotti Villela, por sua paciência e carinho durante
todos esses anos de convívio, por todas as discussões sobre esse trabalho e pelos “puxões de
orelha”.
À querida amiga Simone Cristina Yamasaki, por todas as conversas e risadas, mas
principalmente, pela capacidade de me tranqüilizar durante a realização deste trabalho.
Aos amigos Juliana Marton Barone e Valter Alegre, muito queridos, que tornam o dia a
dia no laboratório muito mais divertido.
Aos amigos André Vieira e Vanessa Pereira, os mais novos membros da nossa “família”
do laboratório.
À Camila Eduardo Marinho, amiga querida, que tanto me ajudou, me aconselhou e
torceu por mim.
À Carolina Akkari Torres, por compartilhar todos os momentos da sua vida e por
permitir que os meus também fossem compartilhados. Pela maneira como sempre me
incentivou e valorizou. E, principalmente, por me considerar uma verdadeira irmã.
Aos amigos Camila Castellan, Paula Burckhardt, Vivian Konigame e Renato Pereira
por todas as conversas e risadas durante a transferência ou a corrida do blotting.
Aos amigos Milene Schmidt Luna, Leandro de Magalhães e Gustavo Yuzo Ujikawa,
por tornarem o dia a dia e principalmente os almoços mais agradáveis durante esses anos.
Aos integrantes da Unidade de Inflamação, do Laboratório de Farmacologia do Instituto
Butantan, Cristina Maria Fernandes, Renata do Amaral Olivo, Marlos Sampaio, Márcio
Matsubara, Sérgio Augusto de Lima, Pollyana Saito, Neide Galvão do Nascimento,
Silvia Zamuner, Élbio Leiguez Júnior, minha segunda “família”, por todo carinho, pelas
risadas, conversas e auxílio nos experimentos.
Aos amigos queridos Vanessa Moreira e Eduardo Purgatto, dois anjos que apareceram
na minha vida, pela disponibilidade e pelo dom de ajudar. Pela grande amizade e pelo apoio.
Aos novos e queridos amigos do Laboratório de Neurociência do ICB-III, Luciano
Gonçalves, Silvia Honda, Wilma Allemadi, Cleyton Rodrigo Sobrinho, Renata
Vasconcelos, Renata Frazão Vanderlei Rocha, Leila Grussoni, Paula Ito e Luiz
Fernando Takase, por terem me acolhido de forma tão carinhosa, fazendo com que me
sentisse a vontade. Por todos os “cafés” e risadas.
À Joana Darc Carvalho Vieira e Sônia Geiger, secretárias do Laboratório de
Farmacologia do Instituto Butantan, pela dedicação e auxílio.
7
Agradeço aos funcionários do Laboratório de Farmacologia do Instituto Butantan, Wilson
de Barros D Àvila, Wanda Regina Carrella da Silva (in memoriam), Maria Zelma da
Silva, Maria Aparecida da Silva e todos os demais que de alguma forma contribuíram para a
realização desta dissertação.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento e Pesquisa, pelo auxílio financeiro e pela
bolsa concedida.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, pelo auxílio financeiro que
tornou possível o desenvolvimento deste trabalho.
Ao Programa de pós-graduação Neurociências e Comportamento do Instituto de
Psicologia da Universidade de São Paulo.
RESUMO
ALPONTI, R.F. Aminopeptidase neutra, dipeptidil peptidase IV, CD13, CD26 e Fos no
hipotálamo e hipocampo de ratos com obesidade induzida por glutamato monossódico e
privados de alimento. 2008. 168 f. Dissertação (Mestrado em Neurociências e
Comportamento) – Instituto de Psicologia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.
Alterações na atividade de peptidases no sistema nervoso central (SNC) de adictos a
narcóticos, abstinentes dependentes de opióides, diabéticos e indivíduos com desequilíbrio
hidrosalino, têm sido achados instigantes no contexto atual dos conhecimentos sobre o
balanço energético. Neste sentido, são particularmente interessantes o fenômeno da proteólise
irrestrita e o envolvimento de diversos peptídeos do SNC, especialmente no hipotálamo e
hipocampo, como as incretinas, neuropeptídeo Y, peptídeo YY, peptídeos derivados da pro-
opiomelanocortina (melanocortinas e beta-endorfinas), somatostatina, vasopressina e
angiotensinas. O presente estudo avaliou a hipótese de que aminopeptidases que têm alguns
desses peptídeos como substratos, a aminopeptidase neutra (APN) (sensível – PSA, e
insensível – APM/CD13, à puromicina) e a dipeptidil peptidase IV (DPPIV/CD26) (sensível -
DPPIV-DS, e insensível - DPPIV-DI à diprotina), poderiam relacionar-se com a obesidade
induzida por glutamato monossódico (MSG) e com o estado de privação alimentar. Foram
analisadas as expressões gênica e protéica da CD13 e CD26, as atividades enzimáticas de
PSA, APM, DPPIV-DS e DPPIV-DI em fração solúvel e de membrana solubilizada, a
ativação celular (imuno-reatividade a Fos), a distribuição imuno-histoquímica regional de
CD13 e CD26 no hipotálamo e hipocampo e as correlações entre atividades peptidásicas,
massa corporal, índice de Lee, massa dos depósitos de gordura periepididimal e
retroperitoneal, comprimento naso-anal e glicemia de ratos obesos MSG e normais, sob
regime de privação ou alimentação normal. Comparativamente aos controles, os animais
MSG apresentaram: (i) aumento da massa absoluta de gordura retroperitoneal, índice de Lee,
expressão protéica CD13 membranal do hipocampo, expressão protéica policlonal CD26
membranal do hipotálamo, atividade DPPIV-DI e expressão protéica monoclonal CD26
membranal do hipocampo; e (ii) diminuição da massa corporal absoluta, comprimento naso-
anal, expressão gênica de CD13, expressão protéica membranal de CD13, expressão protéica
policlonal de CD26 solúvel e membranal, atividades PSA solúvel e DPPIV-DI solúvel e
membranal hipotalâmicas e DPPIV-DS membranal do hipocampo. A privação de alimento
também influencia alguns destes parâmetros. As correlações entre os parâmetros biométricos
confirmaram características deste modelo de obesidade e adicionalmente sugeriram que a
deficiência e a sobrecarga relativas de captação de glicose, respectivamente pela gordura
periepididimal e retroperitoneal, poderiam estar associadas ao desenvolvimento do diabetes
melito tipo 2 no obeso MSG. Confirmou-se a identidade da proteína CD13 com a atividade
peptidásica APM. A DPPIV-DI foi identificada como a CD26 canônica. Em geral, o presente
estudo evidenciou o envolvimento das atividades PSA, DPPIV-DI e -DS hipotalâmicas (mas
não da APM) e das proteínas CD13 e CD26, na regulação endócrina do balanço energético
(provavelmente via atuação sobre neuropeptídeo Y, somatostatina e opióides). No hipocampo,
o padrão destas alterações foi compatível com efeito deletério sobre memória, aprendizado
(PSA e APM) e comportamento emocional (DPPIV-DI e DS). CD13 e CD26 apresentaram
ampla distribuição no hipotálamo, a qual, em condições normais, foi coincidente com a
imuno-reatividade à Fos nos núcleos supraóptico, periventricular, retroquiasmático e
arqueado. Nestas áreas, relacionadas ao controle do balanço energético, ocorreram alterações
densitométricas da imuno-reatividade a CD13, CD26 e Fos em função da obesidade MSG
e/ou da privação de alimento. Em suma, proteínas com atividades de aminopeptidase neutra
9
ou dipeptidil peptidásica do tipo IV e/ou homólogas à CD13 ou CD26 são fatores
fisiopatológicos e alvos farmacológicos potenciais de distúrbios do metabolismo energético.
Palavras-chaves: peptidases, peptídeos, obesidade, glutamato monossódico, restrição
alimentar, Fos, sistema nervoso central
10
ABSTRACT
ALPONTI, R.F. Hypothalamic and hippocampal neutral aminopeptidase, dipeptidyl
peptidase IV, CD13, CD26 and Fos in glutamate monosodium induced obesity and food
deprivation in rats. 2008. 168 f. Dissertation (Master in Neurosciences and Behavior) –
Instituto de Psicologia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.
Alterations of peptidase activity levels in the central nervous system (CNS) in drug addicts,
abstinent opioid-dependent, diabetic and subjects with disrupted hydrosaline equilibrium,
have been arousing findings in the context of current knowledge about regulatory mechanisms
of food intake and energy balance. In this sense, the involvement of leptin, ghrelin, insulin
and other peptides in the CNS, including incretins, neuropeptide Y, peptide YY, pro-
opiomelanocortins (melanocortins and β-endorphin), somatostatin and vasopressin, which are
susceptible to hydrolysis by aminopeptidases (APs), mainly in the hypothalamus and
hippocampus, are particularly interesting. The present work evaluated if aminopeptidase
activities involved in the hydrolysis of these peptides, i.e. neutral AP (APN) (sensitive- or
insensitive-puromycin AP, PSA or APM/CD13, respectively) and dipeptidyl peptidase IV
(DPPIV/CD26) (sensitive- or insensitive-diprotin dipeptidyl peptidase, DPPIV-DS or DPPIV-
DI, respectively), are associated with monosodium glutamate (MSG) induced obesity and
food deprivation. It was analysed the gene and protein expressions of CD13 and CD26,
catalytic activities of PSA, APM, DPPIV-DS and DPPIV-DI in soluble and membrane-bound
fractions, cellular activation (Fos immunoreactivity) and regional immunohistochemistry
distribution of CD13 and CD26, in hypothalamus and hippocampus, and inter-relations
among these peptidase activities, body mass, Lee index, mass of epidydimal and
retroperitoneal fat pad, naso-anal length and glycemia in normal and obese MSG rats under
normal or deprived feeding regimens. Relative to control, MSG presented: (i) increased
retroperitoneal mass, Lee index, CD13 protein expression in membrane-bound fraction of
hippocampus, CD26 polyclonal protein expression in membrane-bound fraction of
hypothalamus, DPPIV-DI activity and CD26 monoclonal protein expression in membrane-
bound fraction of hippocampus; and (ii) reduction of body mass, naso-anal length, CD13 gene
expression, CD13 protein expression in membrane-bound fraction, CD26 polyclonal protein
expression in soluble and membrane-bound fraction, PSA activity in soluble fraction and
DPPIV-DI activity in soluble and membrane-bound fractions of hypothalamus, and DPPIV-
DS in membrane-bound fraction of hippocampus. Food deprivation also influenced some of
these parameters. The correlations between biometric parameters confirmed the
characteristics of this obesity model and further suggested that disability and overload on the
uptake of glucose, respectively by the epididymal and retroperitoneal fat, could be linked to
the development of diabetes mellitus type 2 in obese MSG. CD13 protein identity with APM
peptidase activity was confirmed. DPPIV-DI was identified as the canonical CD26 protein. In
general, the present work revealed the involvement of PSA, DPPIV-DI and DS hypothalamic
activities (but not the APM) and the CD13 and CD26 proteins, in endocrine regulation of
energy balance (probably through action on neuropeptide Y, somatostatin and opioids). In the
hippocampus, the patterns of these changes were consistent with deleterious effects on
memory, learning (PSA and APM) and emotional behavior (DPPIV-DI and DS). CD13 and
CD26 presented wide distribution in hypothalamus, which, in normal conditions, is coincident
with Fos immunoreactivity in the supraoptic, periventricular, retrochiasmatic and arcuate
nuclei. In these areas, related to the control of energy balance, densitometric changes of
CD13, CD26 and Fos immunoreactivity occurred according to the obesity MSG and/or food
deprivation. Briefly, proteins presenting neutral aminopeptidase or dipeptidyl peptidase IV
11
activities and/or CD13 or CD26 homologous are physiopathological factors and potential
pharmacological targets of energetic metabolism disturbances.
Key-words: peptidases, peptides, obesity, food restriction, Fos, monossodium glutamate,
central nervous system
LISTA DE ABREVIATURAS
aa aminoácido
ADHD transtorno do déficit de atenção/hiperatividade
AgRP proteína relacionada ao gene “agouti”
AH hipotálamo anterior
Ang angiotensina
AP aminopeptidase
APM aminopeptidase neutra de membrana insensível a puromicina
APN aminopeptidase neutra
ArcNH núcleo arqueado
AVP vasopressina
BSA albumina sérica bovina
C grupo de animais controles normais
C-P grupo de animais normais privados de alimento
CART “cocaine and amphetamine-regulated transcript”
CCK colecistocinina
CD13 grupo de diferenciação 13
CD26 grupo de diferenciação 26
CMD quimiocina derivada de macrófago
CN-A comprimento naso-anal do animal
CRH hormônio liberador de corticotrofina
DG giro denteado hipocampal
DMH núcleo hipotalâmico dorsomedial
DMSO dimetil-sulfóxido
DPPIV dipeptidil peptidase IV
DPPIV-DI dipeptidil peptidase IV insensível à diprotina
DPPIV-DS dipeptidil peptidase IV sensível à diprotina
DTT DL-ditiotreitol
EDTA ácido etilenodiamino tetra-acético
ELISA ensaio imunoenzimático
EPM erro padrão da média
FM fração de membrana solubilizada
FS fração solúvel
GAL galanina
GAPDH gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase
13
GH hormônio do crescimento
GHRH hormônio liberador do hormônio de crescimento
GIP peptídeo insulinotrófico dependente de insulina ou peptídeo inibidor gástrico
GLP1 peptídeo glucagon-símile tipo 1
GLP2 peptídeo glucagon-símile tipo 2
HC hipocampo
HCRT hipocretinas
HT hipotálamo
IMC índice de massa corporal
ip intraperitonial
IRAPs aminopeptidases reguladas por insulina
KPBS tampão fosfato de potássio
LDH desidrogenase láctica
LA hipotálamo lateral anterior
LH hipotálamo lateral
LRb receptores de leptina
MC massa corporal do animal
ME eminência mediana
MHC moléculas do complexo principal de histocompatibilidade
MSG ácido L-glutâmico sal monossódico ou grupo de animais tratados com ácido L-
glutâmico sal monossódico (glutamato monossódico)
MSG-P grupo de animais tratados com glutamato monossódico e privados de alimento
MSH hormônio melanócito-estimulante
NADH β-nicotinamida adenina di-nucleotídeo, forma reduzida
NPY neuropeptídeo Y
NTS núcleo do trato solitário
OX orexinas
OXM oxintomodulinas
Pe núcleo periventricular hipotalâmico
PBS tampão fosfato
POMC pro-ópiomelanocortina
PP polipeptídeo pancreático
PSA aminopetidase neutra sensível a puromicina
PVN núcleo paraventricular
PYY peptídeo YY
14
RCh núcleo retroquiasmático
RT-PCR reação em cadeia de polimerase com a enzima transcriptase reversa
sc subcutânea
SCh núcleo supraquiamático
SDS sódio dodecil sulfato
SNC sistema nervoso central
SO núcleo supraóptico
SRIF somatostatina
TGI trato gastrointestinal
TRH hormônio liberador de tireotrofina
UP picomoles de substrato hidrolisado por minuto
VMH núcleo hipotalâmico ventromedial
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Principais peptídeos, relacionados com a regulação do metabolismo energético,
susceptíveis de hidrólise pelas atividades de aminopeptidase neutra (APN) e dipeptidil
peptidase IV (DPPIV)...............................................................................................................37
Tabela 2 - Massa corporal, comprimento naso-anal, índice de Lee, massa dos depósitos de
gordura periepididimal e retroperitonial e glicemia de animais controles normais (C), normais
privados de alimento (C-P), tratados com glutamato monossódico (MSG) e tratados com
glutamato monossódico e privados de alimento (MSG-P).......................................................64
Tabela 3 - Influência da adsorção em Bio-beads sobre a capacidade hidrolítica da fração de
membrana solubilizada hipotalâmica e hipocampal sobre L-Ala-β-naftilamida (APN total) e
H-Gly-Pro-4-metoxi-β-naftilamida (DPPIV total)....................................................................67
Tabela 4 - Efeito da puromicina (0,02 mM) sobre a hidrólise dos substratos L-Ala-β-
naftilamida e H-Gly-Pro-4-metoxi-β-naftilamida pelas frações solúvel (FS) e de membrana
solubilizada (FM) dos tecidos hipotalâmico e hipocampal e pelo plasma de animais controles
normais......................................................................................................................................70
Tabela 5 - Efeito da diprotina A (0,1 mM) sobre as atividades de aminopeptidase neutra
sensível (PSA) e insensível (APM) à puromicina e sobre a hidrólise do substrato H-Gly-Pro-
4-metoxi-β-naftilamida pelas frações solúvel (FS) e de membrana solubilizada (FM) dos
tecidos hipotalâmico e hipocampal e pelo plasma....................................................................71
Tabela 6 - Atividades (UP mg proteína
-1
) de aminopeptidase neutra sensível (PSA) e
insensível à puromicina (APM) e de dipeptidil peptidase IV sensível (DPPIV-DS) e insensível
à diprotina (DPPIV-DI) em fração solúvel (FS) e de membrana solubilizada (FM) do
hipotálamo de animais controles normais (C), normais privados de alimento (C-P), tratados
com glutamato monossódico (MSG) e tratados com glutamato monossódico e privados de
alimento (MSG-P).....................................................................................................................72
Tabela 7 - Atividades (UP mg proteína
-1
) de aminopeptidase neutra sensível (PSA) e
insensível (APM) à puromicina e de dipeptidil peptidase IV sensível (DPPIV-DS) e insensível
(DPPIV-DI) à diprotina em fração solúvel (FS) e de membrana solubilizada (FM) do
hipocampo de animais controles normais (C), normais privado de alimento (C-P), tratados
com glutamato monossódico (MSG) e tratados com glutamato monossódico e privados de
alimento (MSG-P).....................................................................................................................73
Tabela 8 - Atividades (UP mg proteína
-1
) de aminopeptidase neutra sensível (PSA) e
insensível (APM) à puromicina e de dipeptidil peptidase IV sensível (DPPIV-DS) e insensível
(DPPIV-DI) à diprotina no plasma de animais controles normais (C), normais privado de
alimento (C-P), tratados com glutamato monossódico (MSG) e tratados com glutamato
monossódico e privados de alimento (MSG-P)........................................................................74
Tabela 9 - Análise de correlação linear combinatória pareada de todos os pârametros sob
estudo nos diferentes tratamentos.............................................................................................77
16
Tabela 10 – Extensão dos núcleos analisados ao longo do eixo ântero-posterior. Os valores
representam os níveis posteriores ao bregma............................................................................92
Tabela 11 – Densidade de CD13-ir no SNC de animais controles normais (C), normais
privados de alimento (C-P), tratados com glutamato monossódico (MSG) e tratados com
glutamato monossódico e privados de alimento (MSG-P).......................................................93
Tabela 12 – Densidade de CD26-ir no SNC de animais controles normais (C), normais
privados de alimento (C-P), tratados com glutamato monossódico (MSG) e tratados com
glutamato monossódico e privados de alimento (MSG-P).......................................................95
Tabela 13 – Densidade de Fos-ir no SNC de animais controles normais (C), normais privados
de alimento (C-P), tratados com glutamato monossódico (MSG) e tratados com glutamato
monossódico e privados de alimento (MSG-P)........................................................................99
Tabela 14 - Sumário das alterações encontradas nos parâmetros biométricos......................103
Tabela 15 - Sumário das alterações encontradas para a aminopeptidase neutra
hipotalâmica............................................................................................................................110
Tabela 16 - Sumário das alterações encontradas para a aminopeptidase neutra
hipocampal..............................................................................................................................113
Tabela 17 - Sumário das alterações encontradas para a aminopeptidase neutra
plasmática................................................................................................................................115
Tabela 18 - Sumário das alterações encontradas para a dipeptidil peptidase IV
hipotalâmica............................................................................................................................121
Tabela 19 - Sumário das alterações encontradas para a dipeptidil peptidase IV
hipocampal..............................................................................................................................123
Tabela 20 - Sumário das alterações encontradas para a dipeptidil peptidase IV
plasmática................................................................................................................................125
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Delineamento experimental......................................................................................47
Figura 2. Aparência do depósito de gordura periepididimal (em destaque) do animal tratado
com MSG (similar ao do animal controle)................................................................................65
Figura 3. Aparência do depósito de gordura retroperitoneal (em destaque) do animal controle
(A) e do animal tratado com MSG (B)......................................................................................65
Figura 4. Atividade da desidrogenase láctica (média ± EPM) das frações solúvel (FS) e de
membrana solubilizada (FM) no hipotálamo (HT) e hipocampo (HC) do rato........................66
Figura 5. CD26 (µg/mg de proteína) (média ± EPM) quantificado por ELISA nas frações
solúvel (FS) e de membrana (FM) do hipotálamo de animais controles normais (C), normais
privados de alimento (C-P), tratados com glutamato monossódico (MSG) e tratados com
glutamato monossódico e privados de alimento (MSG-P).......................................................80
Figura 6. CD26 (µg/mg de proteína) (média ± EPM) quantificado por ELISA nas frações
solúvel (FS) e de membrana (FM) do hipocampo de animais controles normais (C), normais
privados de alimento (C-P), tratados com glutamato monossódico (MSG) e tratados com
glutamato monossódico e privados de alimento (MSG-P).......................................................80
Figura 7. Análise de Western blotting da CD13 nas frações solúvel (FS) e de membrana (FM)
do hipotálamo dos animais controles normais (C), normais privados de alimento (C-P),
tratados com glutamato monossódico (MSG) e tratados com glutamato monossódico e
privados de alimento (MSG-P).................................................................................................83
Figura 8. Análise de Western blotting da expressão da CD13 na fração de membrana (FM) do
hipotálamo e hipocampo dos animais controles normais (C), normais privados de alimento
(C-P), tratados com glutamato monossódico (MSG) e tratados com glutamato monossódico e
privados de alimento (MSG-P).................................................................................................83
Figura 9. Análise de Western blotting da expressão da CD26 na fração solúvel (FS) do
hipotálamo e hipocampo dos animais controles normais (C), normais privados de alimento
(C-P), tratados com glutamato monossódico (MSG) e tratados com glutamato monossódico e
privados de alimento (MSG-P).................................................................................................84
Figura 10. Análise de Western blotting da expressão da CD26 na fração de membrana (FM)
do hipotálamo e hipocampo dos animais controles normais (C), normais privados de alimento
(C-P), tratados com glutamato monossódico (MSG) e tratados com glutamato monossódico e
privados de alimento (MSG-P).................................................................................................84
Figura 11. Visualização sob luz ultravioleta dos RNAs totais extraídos do hipotálamo (HT) e
do hipocampo (HC) dos animais controles normais (C), normais privados de alimento (C-P),
tratados com glutamato monossódico (MSG) e tratados com glutamato monossódico e
privados de alimento (MSG-P).................................................................................................86
18
Figura 12. Expressão do mRNA da CD13 no hipotálamo (HT) e hipocampo (HC) dos
animais controles normais (C), normais privados de alimento (C-P), tratados com glutamato
monossódico (MSG) e tratados com glutamato monossódico e privados de alimento (MSG-P),
detectada por reação em cadeia de polimerase via transcrição reversa (RT-PCR)...................87
Figura 13. Expressão do mRNA da CD26 no hipotálamo e hipocampo dos animais controles
normais (C), normais privados de alimento (C-P), tratados com glutamato monossódico
(MSG) e tratados com glutamato monossódico e privados de alimento (MSG-P), detectada
por reação em cadeia de polimerase via transcrição reversa (RT-PCR)...................................88
Figura 14. Imuno-reatividade a CD13 (CD13-ir) observada em cortes coronais do encéfalo de
rato............................................................................................................................................94
Figura 15. Imuno-reatividade a CD26 (CD26-ir) observada em cortes coronais do encéfalo de
rato............................................................................................................................................96
Figura 16. Imuno-reatividade a CD26 (CD26-ir) observada em cortes coronais do encéfalo de
rato............................................................................................................................................97
Figura 17.
Fotomicrografia de cortes coronais (40 um)
do encéfalo de rato.
Evidenciando
neurônios Fos-ir considerados na contagem.
..................................................................................98
Figura 18. Imuno-reatividade a Fos (Fos-ir) observada em cortes coronais do encéfalo de
rato..........................................................................................................................................100
Figura 19. Imuno-reatividade a Fos (Fos-ir) observada em cortes coronais do encéfalo de
rato..........................................................................................................................................101
19
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO----------------------------------------------------------------------------------- 23
1.1. Peptídeos na sinalização e controle do estado nutricional e balanço energético----- 23
1.2. Peptidases: APN/CD13 e DPPIV/CD26 ------------------------------------------------------ 31
1.2.1. Aminopeptidase neutra (APN) -------------------------------------------------------------------------------------- 33
1.2.2. DPPIV------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 34
1.3. Privação de alimento ----------------------------------------------------------------------------- 39
1.4. Indução da obesidade pelo glutamato monossódico (MSG)------------------------------ 40
1.5. Atividade neuronal e glial e proteínas da família do gene c-fos ------------------------- 41
2. OBJETIVOS------------------------------------------------------------------------------------------ 43
2.1. Objetivo geral -------------------------------------------------------------------------------------- 43
2.2. Objetivos específicos------------------------------------------------------------------------------ 43
3. ESTRATÉGIAS ------------------------------------------------------------------------------------- 45
FIGURA 1. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL-------------------------------------------- 47
4. MATERIAL E MÉTODOS ----------------------------------------------------------------------- 48
4.1. Animais e tratamentos --------------------------------------------------------------------------- 48
4.2. Parâmetros biométricos-------------------------------------------------------------------------- 49
4.3. Perfusão, retirada de sangue, obtenção e fixação do tecido encefálico ---------------- 49
4.4. Preparação das frações solúvel (FS) e de membrana solubilizada (FM) -------------- 50
4.5. Medida da desidrogenase láctica (LDH) ----------------------------------------------------- 51
20
4.6. Proteína e glicemia -------------------------------------------------------------------------------- 52
4.7. Quantificação fluorimétrica das peptidases ------------------------------------------------- 52
4.8. Ensaio imunoenzimático (ELISA) de CD26 ------------------------------------------------- 54
4.9. Western blotting de CD13 e CD26------------------------------------------------------------- 54
4.10. Extração do RNA total e RT-PCR para CD13 e CD26 ---------------------------------- 55
4.10.1. Extração do RNA total ----------------------------------------------------------------------- 55
4.10.2. Análise do RNA total ------------------------------------------------------------------------- 56
4.10.3. RT-PCR ----------------------------------------------------------------------------------------- 57
4.11. Histologia ------------------------------------------------------------------------------------------ 58
4.11.1. Imuno-histoquímica de Fos, CD13 e CD26 ---------------------------------------------- 58
4.11.2. Coloração de Nissl----------------------------------------------------------------------------- 59
4.11.3. Microdensitometria da imuno-reatividade à Fos, CD13 e CD26-------------------- 60
4.12. Análise estatística -------------------------------------------------------------------------------- 60
5. RESULTADOS -------------------------------------------------------------------------------------- 62
5.1. Parâmetros biométricos e glicemia ------------------------------------------------------------ 62
5.2. Atividade da desidrogenase láctica ------------------------------------------------------------ 62
5.3. Atividades peptidásicas da FM adsorvida em Bio-beads --------------------------------- 63
5.4. Atividades peptidásicas -------------------------------------------------------------------------- 68
21
5.5. Correlações entre os parâmetros biométricos, glicemia e atividades peptidásicas. - 75
5.6. ELISA de CD26 na FS e FM-------------------------------------------------------------------- 79
5.7. Western blotting da CD13 e CD26 na FS e FM--------------------------------------------- 81
5.8. Avaliação da qualidade do RNA --------------------------------------------------------------- 85
5.9. Expressão gênica da CD13 e CD26 ------------------------------------------------------------ 85
5.10. Distribuição imuno-histoquímica e alterações densitométricas de CD13, CD26 e
Fos entre os diferentes tratamentos----------------------------------------------------------------- 89
6. DISCUSSÃO-----------------------------------------------------------------------------------------102
6.1. Validação do procedimento de obtenção das frações solúvel e de membrana e
interferência do Triton X-100 na quantificação das atividades peptidásicas em fração de
membrana-----------------------------------------------------------------------------------------------102
6.2. Parâmetros biométricos e glicemia -----------------------------------------------------------103
6.3. Atividade catalítica e expressões protéica e gênica de aminopeptidase neutra sensível
e insensível à puromicina, CD13, dipeptidil peptidase IV sensível e insensível à diprotina
e CD26----------------------------------------------------------------------------------------------------106
6.3.1. Aminopeptidase neutra -----------------------------------------------------------------------109
6.3.1.1. Aminopeptidase neutra hipotalâmica ---------------------------------------------------------------------------110
6.3.1.2. Aminopeptidase neutra hipocampal-----------------------------------------------------------------------------113
6.3.1.3. Aminopeptidase neutra plasmática------------------------------------------------------------------------------115
6.3.1.4. Distribuição e análise densitométrica da imuno-reatividade a CD13 -------------------------------------117
6.3.2. Dipeptidil peptidase IV -----------------------------------------------------------------------119
6.3.2.1. Dipeptidil peptidase IV hipotalâmica---------------------------------------------------------------------------120
22
6.3.2.2. Dipeptidil peptidase IV hipocampal ----------------------------------------------------------------------------123
6.3.2.3. Dipeptidil peptidase IV plasmática------------------------------------------------------------------------------125
6.3.2.4. Distribuição e análise densitométrica da imuno-reatividade a CD26 -------------------------------------126
6.3.3. Correlações entre as atividades enzimáticas da aminopeptidase neutra sensível e
insensível à puromicina e dipeptidil peptidase IV sensível e insensível à diprotina A--129
7. Distribuição e análise densitométrica da imuno-reatividade a CD26 -------------------130
8. Aspectos comparativos da ativação neuronal e glial e da distribuição de CD13 e CD26
na obesidade induzida por MSG e na privação alimentar------------------------------------131
9. Quadro geral dos resultados obtidos e implicações sugeridas ----------------------------134
10. PERSPECTIVAS ---------------------------------------------------------------------------------135
11. CONCLUSÕES------------------------------------------------------------------------------------136
11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS -------------------------------------------------------138
23
1. INTRODUÇÃO
Considerando que concorrem para o balanço energético a proteólise irrestrita e uma ampla
variedade de peptídeos do sistema nervoso central (SNC) susceptíveis de hidrólise pelas
atividades de aminopeptidase neutra (APN) e de dipeptidil peptidase IV (DPPIV), o presente
estudo foi conduzido com o objetivo de contribuir para a avaliação de alguns parâmetros
biométricos e suas correlações na obesidade induzida por glutamato monossódico (MSG) e na
privação alimentar e, em especial, para evidenciar o envolvimento, nestas situações, de
peptidases com atividades APN e DPPIV e da ativação celular no hipotálamo e hipocampo.
A obesidade, ou sobrepeso mórbido, é um estado metabólico em que excesso de gordura
acumula-se nos tecidos periféricos, incluindo o tecido adiposo branco, músculos e fígado.
Trata-se de patologia pandêmica e prototípica da conjunção de fatores causais biológicos e
psicossociais. Desde a descoberta da leptina, o produto do gene ob (ZHANG et al. 1994), os
estudos desta patologia convergem para a tentativa de evidenciar os substratos moleculares e
sinalizadores metabólicos relacionados, principalmente, com a motivação para a ingestão de
alimento. Atualmente, há evidências de que as alterações nas vias endócrinas e neurais
implicadas na obesidade devem ser comuns a outros estados patológicos como a bulimia, a
anorexia e a caquexia (INUI e MEGUID 2003, KLEIN e WALSH 2003, ZIGMAN e
ELMQUIST 2003, WEISLO et al. 2004, ILLMAN et al. 2005).
1.1. Peptídeos na sinalização e controle do estado nutricional e balanço energético
24
Basicamente, duas teorias, a glicostática e a lipostática, foram propostas para explicar a
interação entre periferia-SNC no controle do balanço energético. Essas teorias apoiam-se no
fundamento de que fatores circulantes como a glicose (teoria glicostática) e os lipídeos (teoria
lipostática) são gerados em proporção ao armazenamento de gordura e/ou estado nutricional.
Esses fatores atuam como sinais para o SNC, elicitando mudanças na ingestão e no gasto
energético, tendo, então, efeitos moduladores sobre a síntese e secreção de insulina e leptina
(LAM et al. 2005, LÓPEZ et al. 2007). Na verdade, as evidências experimentais mostram que
os mecanismos homeostáticos envolvidos nesta manutenção são variados e redundantes. No
entanto, embora cada uma destas teorias não possa isoladamente explicar todos esses
mecanismos, ambas evidenciam uma nítida convergência na consideração do hipotálamo
(HT) como o centro regulador desses mecanismos (HORVATH 2005). O sensoriamento do
estado nutricional, a ingestão de alimento e o balanço energético são controlados, além do
HT, por interações entre o tronco cerebral, centros corticais e, perifericamente, o estômago,
intestino, fígado, tireóide e tecido adiposo (MARKUS 2005, NÄSLUND e HELLSTRÖM
2007). A hipótese do “centro dual” preconizava que o HT lateral (LH) seria um centro
parassimpático relacionado à fome, oposto ao núcleo hipotalâmico ventromedial (VMH), que
seria simpático e relacionado à saciedade (BRAY 1984, WYNNE et al. 2005). Atualmente,
sabe-se que a rede neural hipotalâmica envolvida nestas funções abrange o núcleo
dorsomedial (DMH), o núcleo paraventricular (PVN) e o núcleo arqueado (ArcNH) (COTA et
al. 2006). O PVN integra diversas vias de sinalização, inclusive vias aferentes de outras
regiões do cérebro, incluindo o ArcNH e o núcleo do trato solitário (NTS), este último é a
principal via de entrada de sinais vindos do trato gastrointestinal (TGI) (WYNNE et al. 2005,
NÄSLUND e HELLSTRÖM 2007). O DMH recebe projeções do VMH, LH e ArcNH, e
envia projeções ao PVN, o que sugere sua função como um centro integrador (BERNARDIS
e BELLINGER 1998, WYNNE et al. 2005). O ArcNH é tido como o principal local de
25
influxo de sinais periféricos, mediando informações sobre necessidade e estoque metabólicos
(NÄSLUND e HELLSTRÖM 2007). A ativação do eixo HT-hipófise-adrenal, na qual estão
envolvidos aminoácidos (aa) excitatórios, é também reconhecida como responsável pelos
efeitos deletérios da hipersecreção de glicocorticóides na obesidade e em patologias
neurodegenerativas. Neste sentido, o hipocampo (HC) também se apresenta como uma região
possivelmente relevante nestas patologias, já que concentra a maioria relativa dos receptores
de glicocorticóides do SNC (RABER 1998).
Diferentes peptídeos exercem significativos efeitos no controle do estado nutricional e do
balanço energético. Os sistemas peptidérgicos, proeminentemente viscerais, com reconhecido
envolvimento neste controle, são, especialmente, a colecitostocinina (CCK), as incretinas
(peptídeo insulinotrópico dependente de glicose – GIP, e os peptídeos glucagon-símiles tipos
1 e 2 - GLP-1 e GLP-2), oxintomodulinas (OXM) e grelina (WYNNE et al. 2005, WREN e
BLOOM 2007). Estes peptídeos apresentam amplo repertório de efeitos, alguns dos quais
mediados pelo SNC e outros diretamente induzidos por ação autócrina ou parácrina. No SNC,
outros peptídeos apresentam o mesmo envolvimento, tais como o neuropeptídeo Y (NPY),
peptídeo YY (PYY), polipeptídeo pancreático (PP), galanina (GAL), orexinas ou hipocretinas
(OX 1 e OX 2 ou HCRT 1 e HCRT 2), peptídeo CART, hormônio liberador de corticotrofina
(CRH) e os peptídeos derivados da pro-ópiomelanocortina (POMC) (melanocortinas e beta-
endorfinas) (WYNNE et al. 2005, ARORA e ANUBHUTI 2006, DHILLO 2007). Embora
não seja um sistema peptidérgico, aqui se inclui o sistema endocanabinóide, por seus efeitos
relevantes sobre a fome e saciedade. Particularmente, no contexto do envolvimento dos
opiódes endógenos e dos endocanabinóides emerge, ainda, a similaridade entre alguns fatores
neurobiológicos da adição às drogas e da obesidade (COTA et al. 2006). Entre outras
características, a relação entre opióides e comportamento alimentar parece ser um aspecto
conservado durante a história evolutiva, haja visto que a naloxana, antagonista opióide, inibe
26
a ingestão de alimento tanto em mamíferos, quanto em lesmas ou amebas (VOLKOW e WISE
2005).
A grelina, predominantemente produzida no estômago, é também encontrada centralmente,
inclusive no HT (BROGLIO et al. 2003, WYNNE et al. 2005). Em indivíduos obesos, a
grelina circulante apresenta-se em níveis mais baixos que em indivíduos magros, o que se
supõe ser uma resposta secundária à superalimentação (NÄSLUND e HELLSTRÖM 2007).
Têm sido detectados dois grupos distintos de células responsivas à leptina e grelina no
ArcNH, um co-expressa POMC e CART e é anorexígena, enquanto a outra é orexígena e co-
expressa NPY e proteína relacionada ao gene “agouti” (AgRP) (ZIGMAN e ELMQUIST
2003, WYNNE et al. 2005, ARORA e ANUBHUTI 2006). O GLP-1 e GLP-2, análogos do
glucagon, e a OXM também têm sido encontrados no SNC, porém, até o momento,
exclusivamente em pequenas populações de células nervosas no NTS, aparentemente a via
neural relacionando o sistema sensorial visceral do tronco cerebral aos núcleos hipotalâmicos
envolvidos na homeostase energética (LARSEN et al. 2003, WYNNE et al. 2005, ARORA e
ANUBHUTI 2006).
O glucagon, o GLP-1 e o GLP-2 atuam sobre a ingestão de nutrientes, motilidade
gastrointestinal, secreção pancreática, proliferação celular e apoptose, absorção e assimilação
de nutrientes e estimulação da secreção de insulina através de diferentes membros de uma
família específica de receptores acoplados à proteína G (BRUBAKER e DRUCKER 2002).
Está bem estabelecido que o glucagon é secretado em resposta à deficiência de glicose,
elevando o nível glicêmico circulante. Esta ação do glucagon ocorre pela ativação da
glicogênio fosforilase e inibição da glicogênio sintase (RODRIGUEZ-GIL et al. 1989). Já o
GLP-1 atua, entre outras coisas, na estimulação da expressão gênica da insulina, trofismo das
células beta, inibição da secreção de glucagon e promoção da saciedade, os quais normalizam
os níveis de glicose. Foi mostrado que o GLP-1 é rapidamente metabolizado por DPPIV,
27
resultando num metabólito antagonista do receptor do GLP-1 (KIEFFER et al. 1995,
BAGGIO e DRUCKER 2007). Por isso, uma importante possibilidade farmacológica na
terapêutica da obesidade, que já vem sendo aplicada para o diabetes melito tipo 2 (HOLST e
DEACON 1998, POSPISILIK et al. 2003, BRANDT et al. 2005, GREEN et al. 2006, IDRIS e
DONNELLY 2007, WAJCHENBERG 2007), refere-se ao uso dos inibidores da atividade
DPPIV, também conhecidos como gliptinas (GREEN et al. 2007). Duas gliptinas começaram
a ser comercializadas no Brasil em 2007: Galvus (Vildagliptina, desenvolvido pela Novartis)
e Januvia (Sitagliptina, desenvolvido pela Merck Sharp & Dohme). Estudos clínicos mostram
que, tanto o Galvus ([(2S)-{[(3-hidroxiadamantan-1-il)amino]acetil}-pirrolidina-2-
carbonitrila]) quanto o Januvia (7[(3R)-3amino-1-oxo-4-(2,4,5-trifluorfenil)butil]-5,6,7,8-
tetraidro-3-(trifluormetil)-1,2,4-triazol[4,3-a] pirazina (1:1), monoidratado, fosfato), quando
administrados em pacientes com diabetes tipo 2, sob dieta controlada, promovem um aumento
pós-prandial de GLP-1, concomitantemente com um decréscimo nos níveis de glicose e
glucagon (GALLWITZ 2007b, HE et al. 2007). No entanto, o GIP (YIP e WOLFE 2000,
MEIER et al. 2004), relacionado à superfamília do glucagon, também é susceptível de
hidrólise pela DPPIV (KIEFFER et al. 1995, DEACON 2004, BAGGIO e DRUCKER 2007,
GALLWITZ 2007a,b). GLP-1 e GIP respondem por aproximadamente metade da secreção de
insulina estimulada por nutrientes (MEIER et al. 2004). O Januvia, além de promover o
aumento dos níveis de GLP-1 em pacientes com diabetes tipo 2, também promove o aumento
nos níveis de GIP (GALLWITZ 2007b). Porém, não foi explorada a relação da DPPIV com o
GLP-1 e o GIP no que se refere a um possível envolvimento com a obesidade. Também, não
está explorada a relação da DPPIV com a formação de PYY(3-36) a partir do PYY(1-36). Por
outro lado, sabe-se que vários potenciais substratos da DPPIV estão relacionados com
esquizofrenia, doença bipolar, ansiedade, depressão, epilepsia, estresse e dor, e que um
inibidor (AMAC) da DPPIV apresenta
efeitos antipsicóticos, em camundongo (LAUTAR et
28
al. 2005). Já foi sugerido, inclusive, que inibidores de DPPIV, ou análogos de endorfina
resistentes à DPPIV, têm uso clínico potencial como analgésicos (SAKURADA et al. 2003).
Vale mencionar que a saliva venenosa do lagarto Heloderma horridum (monstro de gila)
também deu origem a um análogo (exenatide) do GLP-1, resistente à DPPIV, à venda desde o
segundo semestre de 2007, pela Emi Lilly e Amylin Pharmaceuticals, com o nome comercial
Byetta. Novos alvos moleculares para o tratamento da obesidade incluem esse sistema pré-
pró-glucagon.
A leptina, uma proteína de 145 aa, tem sua produção regulada principalmente pela insulina
(HAVEL 2000) e é secretada pelo tecido adiposo em proporção aos estoques de gordura.
Após sua liberação, a leptina age central e perifericamente, sinalizando a saciedade, ligando-
se aos seus receptores (LRb) (ZIGMAN e ELMQUIST 2003, KERSHAW e FLIER 2004,
WYNNE et al. 2005). A leptina tem alguns efeitos sobre o metabolismo de glicose similares e
outros opostos aos da insulina (ANDERWALD et al. 2002). Sabe-se que a leptina ativa os
neurônios POMC/CART e inibe os neurônios NPY/AgRP (ZIGMAN e ELMQUIST 2003,
WYNNE et al. 2005, ARORA e ANUBHUTI 2006). Os neurônios responsivos à leptina no
ArcNH influenciam a atividade de outros centros efetores hipotalâmicos, como o PVN e o
LH, além de afetarem neurônios do complexo dorsal do vago que contêm peptídeos
orexígenos e anorexígenos, como as OX, a CCK e o GLP-1. Além disso, a leptina também
exerce efeito sobre o apetite via tronco encefálico, atuando sobre seus receptores localizados
no NTS (WYNNE et al. 2005). No entanto, a expectativa de intervenção no quadro da
obesidade, com base em efeitos anorexígenos diretos da administração exógena de leptina, foi
desestimulada pela constatação de que a maioria dos indivíduos obesos têm elevado nível de
leptina e que esta não promove perda de apetite e massa corporal nestes indivíduos, ao
contrário do que ocorre em indivíduos deficientes em leptina. Esta resistência à leptina vem
sendo atribuída a mecanismos endócrinos de retroalimentação e ao papel de uma molécula
29
inibidora (SOCS3) das vias de sinalização dos receptores LRb (MÜNZBERG e MYERS
2005, WYNNE et al. 2005).
O NPY é um dos neuro-hormônios da família de polipeptídeos pancreáticos, a qual ainda
tem como membros o PP e o PYY, todos eles possuindo uma cadeia de 36 aa e produzidos
pela expressão de três genes distintos, mas compartilhando uma hélice estendida com três
prolinas, "PP-fold", como propriedade característica da estrutura terciária. Os subtipos
conhecidos de receptores para NPY e PYY são Y1, Y2, Y3, Y4, Y5 e Y6 (GORRELL 2005,
WYNNE et al. 2005, ARORA e ANUBHUTI 2006, CHEN et al. 2007). Enquanto a insulina
age no SNC suprimindo a fome, o NPY tem efeito oposto. O NPY parece ser liberado
somente de neurônios, enquanto o PP e o PYY têm sido encontrados, predominantemente, em
células endócrinas do intestino (BERGLUND et al. 2003, KONTUREK et al. 2003). Sabe-se
que o jejum decresce o nível plasmático de insulina e aumenta a síntese e liberação de NPY
hipotalâmico, por meio de algum mecanismo dependente da diminuição dos níveis de insulina
(SCHWARTZ et al. 1992, WILLIAMS et al. 2004, WYNNE et al. 2005, ARORA e
ANUBHUTI 2006). Um crescente número de evidências indica que a grelina e o PYY sejam
protagonistas fundamentais na regulação da fome e saciedade (ASAKAWA et al. 2003,
FUNAHASHI et al. 2003, HORVATH et al. 2003, NEARY et al. 2003).
O PYY é assim denominado por possuir resíduos de tirosina (Y) na porção carboxi-
terminal, tendo sido encontrado também no SNC (HAGAN 2002, BALLANTYNE 2006). Os
baixos níveis de PYY e GLP-1 em indivíduos obesos poderiam induzir o descontrole da
ingestão de alimento e, conseqüentemente, ao desenvolvimento da obesidade. O PYY tem
sido detectado endogenamente em duas formas, PYY(1-36) e PYY(3-36). O PYY(1-36) liga-
se ao Y1 e Y2 com igual afinidade, enquanto o PYY(3-36) liga-se seletivamente ao Y2. O
ArcNH expressa o subtipo Y2, pré-sináptico e o Y1, pós-sináptico (WYNNE et al. 2005).
Então, a clivagem dipeptídica N-terminal transforma um agonista não seletivo Y, em outro
30
altamente seletivo para Y2, receptor principalmente pré-sináptico, e em um inibidor natural da
liberação, por neurônios pré-sinápticos do ArcNH, de NPY (NÄSLUND e HELLSTRÖM
2007). Os receptores Y1 e Y2 diferenciam-se principalmente quanto a localização, o que
justifica o fato de agonistas do receptor Y1 agirem como anisiolíticos, enquanto os agonistas
de Y2 agem como anorexígenos (BERGLUND et al. 2003). Como o PYY tem uma prolina na
penúltima posição, há poucas enzimas capazes de gerar PYY (3-36) a partir do PYY (1-36) e,
entre aquelas avaliadas in vitro, a DPPIV é a que mostrou maior especificidade (GRANDT et
al. 1993, BATTERHAM et al. 2003), restando avaliar se assim atuaria fisiologicamente.
Pouco se sabe sobre o envolvimento direto da somatostatina (SRIF), vasopressina (AVP) e
angiotensinas (Ang) na obesidade. Está estabelecido que a SRIF inibe o hormônio do
crescimento (GH) (FROHMAN et al. 1990). Perifericamente, a SRIF inibe a secreção e
liberação de glucagon e insulina (STROWSKI et al. 2000). Sabe-se que a secreção espontânea
de GH e sua resposta a diversos estímulos está reduzida em obesos (ISIDRO et al. 2004) e
que a secreção de GH está aumentada na privação alimentar (NØRRELUND et al. 2002).
Quanto a AVP, sabe-se que decresce a ingestão de alimento (BRAY 2000). Resistência à
AVP ocorre em indivíduos com diabetes melito mal controlado, resultando em perda de
volume plasmático (AOYAGI et al. 2007). Já a AngII está aumentada no plasma de obesos
(SEGURA e RUILOPE 2007) e sabe-se que a conversão da AngII em AngIII resulta em
estímulo para a liberação de AVP (ZINI et al. 1996). A AngII e seus metabólitos, como a
AngIII (SPETH e KARAMYAN 2008), aumentam a lipogênese (JONES et al. 1997).
Alterações cinéticas influenciam substancialmente a ação de peptídeos (SONG e HEALY
1999). Por sua vez, alguns peptídeos alteram seu próprio metabolismo ou de outros peptídeos
(HUI et al. 1982). Ainda, alguns dos efeitos farmacológicos da administração de peptídeos
podem resultar da inibição competitiva sobre enzimas de degradação (inibindo a degradação
de peptídeos endógenos) mais que da interação direta com um receptor (LaBELLA et al.
31
1985, BRACCI et al. 2003). Poucas proteases contribuem para a hidrólise peptídica completa
até aa (KADOWAKI e KANAZAWA 2003), sendo as exopeptidases as principais enzimas
capazes de liberar aa livres como produto final. Endo- e exopeptidases hidrolisam vários
peptídeos envolvidos direta ou indiretamente no controle do estado nutricional e do balanço
energético.
1.2. Peptidases: APN/CD13 e DPPIV/CD26
As enzimas capazes de romper ligações peptídicas são conhecidas indistintamente como
peptidases ou proteases. Embora o termo protease seja amplamente empregado, o termo
peptidase é recomendado para descrever o subconjunto de hidrolases de peptídeos (sub-classe
E.C 3.4./ Int. Union of Biochem. Mol. Biol. - IUBMB).
As peptidases compreendem dois grupos de enzimas: endopeptidases e exopeptidases. As
endopeptidases também são chamadas de proteinases (seu uso restringe-se às endopeptidases
que clivam ligações internas em proteínas) ou oligopeptidases, quando clivam ligações
internas exclusivamente em peptídeos.
As peptidases foram classificadas em conformidade com os tipos de catálise e de
especificidade. Esta classificação pelos tipos catalíticos vem sendo ampliada pela
classificação por famílias, com base no relacionamento evolutivo entre as peptidases
(BARRETT et al. 1998). A classificação pela especificidade considera a posição da ligação
peptídica clivada dentro da cadeia do peptídeo (ou proteína) e é adotada pela "Enzyme
Nomeclature Commission", embora as carboxipeptidases e endopeptidases estejam
32
subdivididas pelo tipo de catálise. As exopeptidases clivam os peptídeos em regiões próximas
ao N- ou C- terminal. As endopeptidases quebram ligações peptídicas no interior da cadeia.
Quanto à funcionalidade, as peptidases são capazes de ativar e/ou inativar hormônios,
fatores de crescimento, transmissores e diferentes mediadores (MANTOVANI et al. 2000).
Processos fisiopatológicos vêm sendo relacionados a alterações sutis no controle de atividades
peptidásicas (VAN HAL et al. 1993, LAMBEIR et al. 2001, HATANAKA et al. 2002, LI et
al. 2005); algumas estão envolvidas no controle do balanço hidromineral (SILVEIRA et al.
2004, MOLINARO et al. 2006), na adição a drogas (IRAZUSTA et al. 2003, de GORTARI et
al. 2005, LARRINAGA et al. 2005) e no diabetes melito induzido por estreptozotocina
(ZAMBOTTI-VILLELLA et al. 2007a, ZAMBOTTI-VILLELA et al. 2007b, ZAMBOTTI-
VILLELLA et al. 2008).
De um modo geral, peptídeos envolvidos com a sinalização intercelular são inicialmente
degradados fora da célula, principalmente por peptidases unidas à membrana (O’CUINN
1998). Peptidases solúveis podem também atuar sobre peptídeos recaptados (internalizados
como parte do complexo peptídeo-receptor, como no caso de alguns hormônio-peptídeos nas
células-alvo) ou na hidrólise de pré-pró-peptídeos (GIBSON et al. 1989, HWANG et al.
2007). As vias citoplasmáticas são conhecidas por realizarem o metabolismo protéico e o
processamento de peptídeos antigênicos (HEEMELS e PLOEGH 1995), este último
fenômeno constituindo um tema de grande impacto (MURATA et al. 1999, PRECKEL et al.
1999, WICKNER et al. 1999, CALBO et al. 2000, KURIHARA et al. 2000, BHUTANI et al.
2007). Esses peptídeos são gerados ao lado dos produtos do metabolismo intracelular de
proteínas, principalmente pela via da ubiquitina-proteasoma (HOCHSTRASSER
1996,
VOGES
et al. 1999, BHUTANI et al. 2007). A maioria dos oligopeptídeos formados pelo
proteasoma é degradada com a contribuição de peptidases, gerando aa livres a serem usados
em nova síntese protéica ou na produção de energia.
33
Dentre as exopeptidases, as APs (EC 3.4.), alfa-aminoacil-peptídeo-hidrolases, são aquelas
que catalisam a remoção do extremo amino-terminal da cadeia peptídica. Desde sua primeira
detecção (MARKS et al. 1968), diversas APs foram identificadas em tecido encefálico de
mamíferos (O’CUINN 1998, GORRELL 2005, LARRINAGA et al. 2005, BJELKE et al.
2006).
1.2.1. Aminopeptidase neutra (APN)
A atividade APN catalisa a remoção de resíduos de aa neutros (SANDERINK et al. 1988,
SHIPP e LOOK 1993). Essa atividade é reconhecida como um marcador importante de
células da linhagem mielomonocítica em distúrbios hematopoiéticos malignos (ZIABER et al.
2000, ALFALAH et al. 2006) e foi descrita em uma grande variedade de outras células de
mamíferos como idêntica à CD13 (LOOK et al. 1989, LOHN et al. 2002, CHEN et al. 2007).
A atividade APN está envolvida no processamento de peptídeos relacionados ao MHC I e II
(LARSEN et al. 1996) e clivagem de citocinas (COWBURN et al. 2006). Os substratos
naturais conhecidos da APN incluem a interleucina-8, substância P, SRIF, AngIII, AVP, lisil-
bradicinina e neuropeptídeos como a dinorfina, leu- e met- encefalina e endorfina
(MIZUTANI et al. 1993, SAFAVI e HERSH 1995, PALTER et al. 2001, SONG e
MARVIZON 2003, BAUVOIS e DAUZONNE 2006, LUAN e XU 2007). A APN purificada
de placenta humana hidrolisa ativamente, in vitro, vários peptídeos imunomoduladores.
No SNC têm sido considerados dois tipos de atividades APN. Uma delas é sensível à
puromicina (APN-PS ou PSA - EC 3.4.11.14) e está presente em frações solúvel e de
membrana (MCDERMOTT et al. 1985, DYER et al. 1990, CONSTAM et al. 1995,
34
LARRINAGA et al. 2005). Neuropeptídeos que estão envolvidos diretamente no controle da
homeostase energética, como a β-endorfina e as encefalinas, são substratos da PSA
(APPLEYARD et al 2003, ARORA e ANUBHUTI 2006, COTA et al. 2006). Esses
neuropeptídeos estão aumentados em indivíduos obesos, estimulando a ingestão de alimento
(APPLEYARD et al 2003, ARORA e ANUBHUTI 2006, COTA et al. 2006). A outra
atividade APN é predominantemente de membrana e insensível à puromicina (APN-PI ou
APM - EC 3.4.11.2) (GIROS et al. 1986, LARRINAGA et al. 2005), a qual apresenta
identidade com a CD13 (MAHONEY et al. 2007). A atividade PSA de membrana do SNC
parece apresentar um direcionamento intracelular de seu sítio ativo (MCLELLAN et al.
1988). A atividade PSA solúvel, no córtex frontal de ratos administrados cronicamente com
morfina, decresce depois da retirada da droga (IRAZUSTA et al. 2003), sendo que o mesmo
decréscimo foi observado na avaliação postmortem de humanos adictos a heroína
(LARRINAGA et al. 2005). Os vários peptídeos relacionados com a regulação do
metabolismo energético, susceptíveis de hidrólise pela atividade APN, estão relacionados na
Tabela 1.
1.2.2. DPPIV
A atividade DPPIV, nas formas solúvel (não classificada pelo "Enzyme Nomeclature
Commission") e unida à membrana (EC 3.4.14.5), pertence ao grupo restrito de enzimas que,
especificamente, reconhecem a prolina em peptídeos (CUNNINGHAM e O´CONNOR 1997,
GORRELL 2005). Dada a sua estrutura cíclica peculiar, a prolina impõe restrições estruturais
para degradação e confere propriedades biológicas particulares a peptídeos e proteínas nos
35
quais está presente. Dentre estas propriedades, está a proteção contra a degradação
enzimática. A DPPIV remove dipeptídeos da porção N-terminal de peptídeos contendo Xaa-
Pro ou Xaa-Ala (GILMARTIN e O'CUINN 1999, MENTLEIN 1999, ROSENBLUM e
KOZARICH 2003, GORRELL 2005, BJELKE et al. 2006, UNNIAPPAN et al. 2006), sendo
inativa sobre Xaa-Pro-Pro ou Xaa-Pro-Hyp (MENTLEIN 1999, GORRELL 2005). Dentre os
peptídeos clivados in vitro pela DPPIV estão o GLP-1, GLP-2, GIP, PYY(1-36), NPY (1-36),
a endorfina-2, dinorfina, substância P e o hormônio liberador de hormônio do crescimento
(GHRH) (MEDEIROS e TURNER 1994, MENTLEIN 1999, GHERSI et al. 2001,
BATTERHAM et al 2002, GABRILOVAC et al. 2003, SAKURADA et al. 2003,
SAKURADA 2004, GORRELL 2005, BJELKE et al. 2006, UNNIAPPAN et al. 2006). Um
grande número de quimiocinas, citocinas e peptídeos sinalizadores também compartilham
uma ligação Xaa-Pro altamente conservada na porção N-terminal (MAE et al. 1999). A
DPPIV é a única enzima conhecida com a capacidade para clivar, em pH neutro, este N-
terminal Xaa-Pro de quimiocinas como a CCL5 (RANTES), fator-1 derivado de estroma e
quimiocina derivada de macrófago (CMD) (MANTOVANI et al. 2000). A forma membranal
da DPPIV apresenta identidade com a CD26, sendo assim relacionada com a ativação de
células T, ligando adenosina deaminase à superfície destas células e, então, protegendo-as da
inibição de sua proliferação (PETHIYAGODA et al. 2000, GORRELL et al. 2001).
Apesar de ser intensamente estudada em vários outros sistemas (HILDEBRANDT et al.
2000), são escassas as informações sobre a atividade DPPIV no SNC (SMYTH e O'CUINN
1994, FRERKER et al. 2007). Quanto a sua funcionalidade no SNC, até o momento foi
apenas sugerida sua relação com o controle da psicose e da dor (RONÁI et al. 1999,
LAUTAR et al. 2005, SAKURADA et al. 2003). Atualmente, a DPPIV (a canônica EC
3.4.14.5, idêntica à serino protease membranal CD26) já não é a única proteína conhecida
capaz de clivar dipeptídeos Xaa-Pro ou Xaa-Ala na porção N-terminal, já que outras
36
moléculas, exibindo vários graus de homologia estrutural e atividade similar à DPPIV, vêm
sendo descobertas. As proteínas DPP2 (MAES et al. 2007), DPP6 (NADAL et al. 2003),
DPP8, DPP9 (ABBOTT et al. 2000, OLSEN e WAGTMANN 2002, BJELKE et al. 2006,
FRERKER et al. 2007) e DPP10 (QI et al. 2003, JERNG et al. 2004, 2005) são as formas
relacionadas à DPPIV até aqui detectadas no SNC. A DPP2 possui baixa similaridade
estrutural com a proteína DPPIV, porém possui atividade catalítica DPPIV, cuja eficiência
diminui drasticamente quanto maior for o comprimento da cadeia peptídica do substrato
(MAES et al. 2007). O sítio ativo de serina é substituído pela glicina na DPP10, resultando na
perda de atividade DPPIV. O resíduo serina é também substituído na DPP6, a qual não
apresenta atividade peptidásica. A DPP8 e a DPP9 possuem, respectivamente, sítios ativos
74% e 69% similares ao da DPPIV (Gly-Trp-Ser-Tyr-Gly) (QI et al. 2003, BJELKE et al.
2006, FRERKER et al. 2007). A DPP8 hidrolisa substratos da DPPIV como Ala-Pro, Arg-Pro
and Gly-Pro. Contradizendo resultados prévios que sugeriram a inatividade enzimática da
DPP9 (KIN et al. 2001), estudos recentes mostraram que a DPP9 tem atividade de DPPIV,
com pH e sensibilidade a inibidores similares àquelas da DPPIV e DPP8 (QI et al. 2003,
BJELKE et al. 2006, FRERKER et al. 2007). Os vários peptídeos relacionados com a
regulação do metabolismo energético, susceptíveis de hidrólise pela atividade DPPIV, estão
relacionados na Tabela 1.
Tabela 1. Principais peptídeos susceptíveis de hidrólise pelas atividades de aminopeptidase neutra (APN) e dipeptidil peptidase IV (DPPIV) e
relacionados com a regulação do equilíbrio energético.
Localização Função
Peptídeo
SNC Periférico
SNC
(somente relacionada com
o controle energético)
Periférico
Vasopressina
(BAVOUIS e
DAUZONNE 2006,
LUAN e XU 2007)
Neurônios
magnocelulares do
PVN e núcleo
supraóptico (SO) e
neuro-hipófise
(KESSLER et al.
2007)
Plasma
(KESSLER et al.
2007)
Modula a ingestão de
alimento (BRAY 2000)
Vasoconstricção e antidiurese
(KESSLER et al. 2007)
Met- e Leu-encefalina
(IRAZUSTA et al.
2003, LARRINAGA et
al. 2005)
Neurônios do ArcNH
e HC (SIMMONS e
CHAYKIN 1996,
ARORA e
ANUBHUTI 2006,
DRAKE et al. 2007)
Coração, músculo,
rim e instestino
(DENNING et al.
2008)
Modula o comportamento
alimentar e processos de
aprendizagem e memória
(SIMMONS e CHAYKIN
1996, DRAKE et al. 2007)
Regulação cardíaca, dor e
crescimento celular
(DENNING et al. 2008)
Somatostatina
(MIZUTANI et al.
1993,
MA et al. 2003)
Neurônios do PVN,
ArcNH, HC e NTS
(BURGOS-RAMOS
et al. 2008)
Pâncreas, intestino
e estômago
Modula a secreção de GH e a
neuroproteção (BURGOS-
RAMOS et al. 2008)
Modula a secreção de insulina
e glucagon (STROWSKI et al.
2000)
APN
Angiotensina III
(PADIA et al. 2008)
Neurônios de vários
núcleos (BANEGAS
et al. 2006)
Plasma e tecido
adiposo (JONES et
al. 1997)
Modula a vasopressina (ZINI
et al. 1996) e controla a
pressão sanguínea
(BANEGAS et al. 2006) e a
ingestão de água (BLUME et
al. 2005)
Regula a lipogênese (JONES
et al. 1997) e controla a
pressão sanguínea (BANEGAS
et al. 2006)
38
Peptídeo glucagon-
símile 1 (BURCELIN
et al. 2007)
Neurônios do NTS
(ARORA e
ANUBHUTI 2006)
Pâncreas e intestino
(ARORA e
ANUBHUTI 2006)
Efeito anoréxico
(ARORA e ANUBHUTI
2006)
Homeostase da glicose,
esvaziamento gástrico,
secreção da insulina e
regulação da ingestão de
alimento (ARORA e
ANUBHUTI 2006)
Neuropeptídeo Y
(FRERKER et al.
2007)
Neurônios do
ArcNH, PVN,
interneurônios do
HC (WYNNE et al.
2005)
Plasma
Modula a ingestão de
alimento e influencia a
depressão e a ansiedade
(REDROBE et al. 2002,
WYNNE et al. 2005)
Modula a ingestão de alimento
DPPIV
Peptídeo YY
(MEDEIROS e
TURNER 1994)
Neurônios do NTS
(GLAVAS et al.
2008)
Intestino e plasma
(le ROUX e BLOOM
2005)
Efeito anoréxico
(UENO et al. 2008)
Modula a ingestão de alimento
e retardamento do
esvaziamento gástrico
(MEDEIROS e TURNER
1994, le ROUX e BLOOM
2005)
APN/DPPIV
β-endorfina
(FURUHASHI et al.
1988)
Neurônios do
ArcNH e PVN
(ARORA e
ANUBHUTI 2006)
Plasma
(OBUCHOWICZ e
OBUCHOWICZ
1997)
Modula o comportamento
alimentar (ARORA e
ANUBHUTI 2006, COTA et
al. 2006)
Modula o comportamento
alimentar, o estresse e a
analgesia (OBUCHOWICZ e
OBUCHOWICZ 1997,
JANSON e STEIN 2003,
BILKEI-GORZO et al. 2008)
1.3. Privação de alimento
A privação de alimento, por períodos que variam entre 24 - 72 h, vem sendo aplicada
experimentalmente, há quase duas décadas, para avaliar alterações de diversos fatores
neuroendocrinológicos que interagem no balanço nutricional e energético, tendo sua
eficiência amplamente comprovada, neste sentido, pelos resultados relatados em diversas
publicações (CAGAMPANG et al. 1990, HIRSCHBERG et al. 1991, FRANKISH et al. 1993,
SCHWARTZ et al. 1993, OLCHOVSKY et al. 1993, SUZUKI et al. 1995, PRESSE et al.
1996, ISHIKAWA et al. 1997, LOPEZ et al. 2000, FUJIKI et al. 2001, KASTIN et al. 2001,
ZAMMARETTI et al. 2001, CHELIKANI et al. 2004, CRANE et al. 2007).
As respostas à privação alimentar são geralmente iniciadas por mudanças hormonais em
resposta a diminuição dos níveis de glicose e aa na circulação (FINN e DICE 2006). Dentre as
alterações hormonais ocorridas durante a privação alimentar estão a diminuição dos níveis de
insulina e leptina, o aumento do glucagon (estímulo da gliconeogênese e da glicogenólise), do
GH (estímulo da lipogênese) (SPIEGELMAN e FLIER 2001, FINN e DICE 2006) e da
grelina (CAMIÑA et al. 2003). Uma das principais alterações durante a privação alimentar
ocorre na regulação do eixo hipotálamo-hipófise-tireóide. Há uma regulação negativa desse
eixo, caracterizada pela diminuição da concentração plasmática de tireotrofina, um
mecanismo adaptativo importante para conservação da energia durante períodos de escassez
alimentar (BOELEN et al. 2008).
Durante a privação alimentar há aumento na proteólise e na lipólise, fornecendo aa, ácidos
graxos e glicerol que serão utilizados na gliconeogênese e no metabolismo energético
(KETTELHUT et al. 1994, FINN e DICE 2006). Sabe-se que o GH está relacionado a esses
processos, porém não está claro de que forma esse hormônio atua (SAKHAROVA et al.
40
2008). Estão descritas algumas vias clássicas pelas quais ocorre a hidrólise de proteínas: a
dependente de ATP (sistema ubiquitina-proteasoma, por exemplo); a lisossomal; e a
independente de ATP (KETTELHUT et al. 1994), da qual fazem parte algumas proteases
como a tripeptidil peptidase III (TPPIII), capaz de realizar algumas das funções do
proteasoma (ANTÓN e VILLASEVIL 2008), bem como leucina aminopeptidase, cistil
aminopeptidase, aminopeptidase básica e aminopeptidase neutra (SHIPP e LOOK 1993,
MATSUI et al. 2006, DANZIGER 2008, HWANG e HOOK 2008).
O sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) é responsável pela hidrólise de proteínas do
músculo esquelético durante a privação alimentar. Dentre seus substratos estão proteínas
importantes para a progressão do ciclo celular, transcrição gênica e crescimento (FINN e
DICE 2006). Quanto às vias lisossomais, existem duas que são superestimuladas durante a
privação alimentar: a macroautofágica e a autofágica mediada por chaperonas. A
macroautofagia ocorre principalmente durante um curto período de privação alimentar e
consiste no seqüestro de uma porção do citosol que contém proteínas e/ou organelas pelo
autofagossomo. O autofagossomo se funde com o endossomo, formando o anfisomo, o qual
se funde com o lisossomo e adquire enzimas lisossomais que degradam os componentes
internos. Na autofagia mediada por chaperonas, que ocorre durante períodos longos (a partir
de 10 dias) de privação alimentar, os substratos desse sistema formam um complexo
substrato/chaperona/cochaperona que se liga a um receptor na membrana lisossomal e, então,
o substrato é internalizado e sofrerá ação de diversas enzimas lisossomais (FINN e DICE
2006).
1.4. Indução da obesidade pelo glutamato monossódico (MSG)
41
O HT desempenha papel central no controle da ingestão de alimento e homeostase
energética. Está comprovado, também, que a destruição de centros hipotalâmicos específicos
induz o que, classicamente, se definiu como obesidade hipotalâmica (BRAY et al. 1981,
WYNNE et al. 2005). A administração neonatal de ácido L-glutâmico sal monossódico
(glutamato monossódico - MSG) é reconhecida por produzir lesões no ArcNH e na ME
(LEIGH et al. 1992, DOLNIKOFF et al. 2001). Após repetidas doses de MSG, os animais
tornam-se obesos na vida adulta, segundo parâmetros biométricos como o índice de Lee
(BERNARDIS e PATTERSON 1968, NAKAGAWA et al. 2000) e a medida de hipertrofia
adipocítica (NEMEROFF et al. 1978, DOLNIKOFF et al. 2001). O índice de Lee é a razão
entre a massa corporal e o comprimento naso-anal (BERNARDIS e PATTERSON 1968,
NAKAGAWA et al. 2000). A hipertrofia adipocítica pode ser reconhecida por meio da
medida de massa dos depósitos de gordura periepididimal e retroperitoneal (BERNARDIS e
PATTERSON 1968, MACHO et al. 2000). Em relação aos animais normais, aqueles que
recebem tratamento com MSG vêm sendo descritos como apresentando menor crescimento e
massa corporal absolutos, enquanto são maiores os depósitos de gordura e a massa corporal
relativamente ao tamanho (KAUFHOLD et al. 2002). Este modelo experimental de obesidade
induzida por MSG é caracterizado pela ausência de hiperfagia (BUNYAN et al. 1976) e
decréscimo da secreção de GH (BLOCH et al. 1984, SHAPIRO et al. 1986), bem como
hiperinsulinemia (SCALLET e OLNEY 1986), corticosteronemia e leptinemia (PERELLO et
al. 2004).
1.5. Atividade neuronal e glial e proteínas da família do gene c-fos
42
O monitoramento da expressão de proteínas da família do gene c-Fos tem sido consagrado
como meio de avaliar uma ativação específica a diferentes estímulos. O proto-oncogene c-Fos
pertence à família de genes que acoplam sinais intracelulares transitórios com alterações de
longa duração na função neuronal, sendo expresso em múltiplas regiões do SNC (SHENG e
GREENBERG 1990). Também outras células, inclusive gliais, expressam o proto-oncogene
c-Fos (YU et al. 1995, STEINER et al. 2002). Em condições normais, sua expressão é
reduzida, mas logo após um estímulo eficaz, sua expressão é rapidamente induzida (SAGAR
et al. 1988, KRUKOFF 1993, JASMIN et al. 1994, ROWLAND et al. 1996, TRAUB et al.
1996, DINARDO e TRAVERS 1997). A proteína Fos, uma fosfo-proteína nuclear ligada ao
DNA, é o produto da expressão do proto-oncogene c-Fos, o qual interage com outro gene de
expressão precoce, c-Jun, para regular a transcrição gênica (KRUIJER et al. 1985, SAGAR et
al. 1988, SHENG e GREENBERG 1990, MORGAN e CURRAN 1991). Como a proteína Fos
é nuclear, técnicas de imuno-histoquímica irão corar apenas os núcleos das células ativadas. É
conhecido que a atividade celular medida pela imuno-reatividade a Fos é afetada nos núcleos
hipotalâmicos supramamilar e dorsomedial de camundongos obesos e na parte mediana do
núcleo perifornical hipotalâmico de camundongos privados de alimento (HUANG e WANG
1998). Camundongos privados de alimento também apresentam ativação do ArcNH, porém
esse efeito é revertido após re-alimentação (BECSKEI et al. 2008). Tanto animais magros
quanto animais com obesidade induzida por dieta hiperlipídica, quando privados de alimento
por 24 horas, apresentam aumento de neurônios imuno-reativos a Fos no ArcNH e diminuição
dessa imuno-reatividade no LH e DMH (LIN e HUANG 1999). Os animais com obesidade
induzida por dieta hiperlipídica, que não foram submetidos a privação alimentar, apresentam
alterações na imuno-reatividade a Fos em importantes áreas do hipotálamo, como LH, DMH e
núcleo perifornical hipotalâmico (LIN e HUANG 1999), aparentemente num padrão
consistente com seus efeitos obesogênicos (WANG et al. 1999).
43
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
O presente estudo pretende analisar alguns parâmetros biométricos e suas correlações na
obesidade induzida por MSG e na privação alimentar e, em especial, evidenciar o
envolvimento, nestas situações, das peptidases APN e DPPIV e da ativação hipotalâmica e
hipocampal.
2.2. Objetivos específicos
1. Avaliar se os parâmetros biométricos: massa corporal, comprimento naso-anal, índice de Lee,
massa dos depósitos de gordura periepididimal e retroperitoneal e glicemia, bem como suas inter-
relações, são modificados na obesidade induzida por MSG e na privação alimentar;
2. Avaliar se as atividades enzimáticas PSA, APM e DPPIV, em fração solúvel e de membrana de
HT e HC, assim como a expressão gênica e protéica da CD13 e CD26, são alteradas na obesidade
induzida por MSG e na privação alimentar;
3. Avaliar se as atividades enzimáticas PSA e APM, e DPPIV, em fração solúvel e de membrana de
HT e HC, são correspondentes, respectivamente, as proteínas CD13 e CD26;
4. Avaliar a distribuição regional da imuno-reatividade à CD13 e CD26 no HT e no HC e se há
alteração desta distribuição na obesidade induzida por MSG e na privação alimentar;
44
5. Avaliar se há alteração do padrão regional de ativação (imuno-reatívidade à Fos) do HT e HC, na
obesidade induzida por MSG e na privação alimentar;
6. Avaliar se há coincidências entre as alterações da ativação celular e da imuno-reatividade à
CD13 e à CD26 na obesidade induzida por MSG e na privação alimentar.
45
3. ESTRATÉGIAS
1. Comparar as medidas de massa corporal, comprimento naso-anal, índice de Lee, massa dos
depósitos de gordura periepididimal e retroperitoneal e glicemia nos animais tratados MSG,
tratados com MSG e privados de alimentos e nos animais normais privados de alimento,
relativamente aos animais controle normais;
2. Avaliar a eficácia do fracionamento para obtenção das frações solúvel e de membrana
solubilizada dos tecidos hipotalâmico e hipocampal, por meio da medida de atividade de
desidrogenase láctica;
3. Determinar o teor protéico das frações solúvel e de membrana solubilizada dos tecidos
hipotalâmico e hipocampal;
4. Quantificar as atividades enzimáticas PSA, APM e DPPIV das frações solúvel e de
membrana do HT e HC, utilizando substratos derivados de β-naftilamida, e caracterizá-las,
utilizando os inibidores puromicina e diprotina A;
5. Comparar as atividades enzimáticas PSA, APM e DPPIV do HT e HC de animais tratados
com MSG, tratados com MSG e privados de alimento e nos animais normais privados de
alimento, em relação aos animais controles normais;
6. Quantificar, por ELISA, a concentração de CD26 nas frações solúvel e de membrana
solubilizada do HT e HC nos animais tratados com MSG, tratados com MSG e privados de
alimento e nos animais normais privados de alimento, relativamente aos animais controles
normais;
7. Comparar a expressão protéica, por Western blotting, da CD13 e CD26 nos animais
tratados com MSG, tratados com MSG e privados de alimento e nos animais normais
privados de alimento, relativamente aos animais controles normais;
46
8. Comparar a expressão gênica, por reação de polimerase em cadeia com a enzima
transcriptase reversa (RT-PCR), da CD13 e CD26 nos animais tratados com MSG, tratados
com MSG e privados de alimento e nos animais normais privados de alimento,
comparativamente aos animais controles normais;
9. Determinar e comparar, por imuno-histoquímica, a localização da CD13 e CD26 no HT e
HC nos animais tratados com MSG, tratados com MSG e privados de alimento e nos animais
normais privados de alimento, comparativamente aos animais controles normais;
10. Comparar a ativação do HT e HC, por meio da expressão imuno-histoquímica da proteína
Fos nos animais tratados com MSG, tratados com MSG e privados de alimento e nos animais
normais privados de alimento, relativamente aos animais controles normais.
Figura 1. Delineamento experimental
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Animais e tratamentos
Ratos machos Wistar, de diferentes ninhadas, foram, imediatamente após o nascimento,
misturados e colocados, cada 10 filhotes e uma mãe lactante, em uma caixa de polipropileno
(comprimento x largura x altura 56×35×19 cm), com comida e água de torneira ad libitum, a
qual foi alojada em uma estante ventilada (Alesco Ind. Com. Ltda, Brasil), sob condições
controladas de temperatura (24 ± 2ºC), umidade relativa (65 ± 1%) e fotoperíodo 12:12
claro/escuro (início do período claro às 6:00 am).
Após 24 h do nascimento, os filhotes passaram a receber, diariamente, entre 7:30 – 9:00 h
do período claro, injeção subcutânea (sc), na região cervical, em bolus, de 4 mg ácido L-
glutâmico sal monossódico por g de massa corporal, num volume máximo de 0,2 mL de
salina 0,9% (animais MSG), ou o mesmo volume de salina 0,9% (animais controles normais -
C), até completarem 10 dias de idade. Aos 22 dias de idade os filhotes foram desmamados,
retirando-se a fêmea lactante das caixas (KAUFHOLD et al. 2002). Aos 90 dias de idade os
animais foram utilizados para os experimentos previstos.
A privação de alimento foi feita transferindo-se os animais, aos pares, para gaiolas para
jejum, mantendo-os sem alimento e com água ad libitum durante 72 h, a partir das 7:30 – 9:00
h do período claro. Tais grupos foram denominados da seguinte forma: MSG-P, animais
tratados com MSG e que, posteriormente, foram privados de alimento; e C-P, animais que
receberam injeção subcutânea de salina 0,9% e que, posteriormente, foram privados de
alimento.
49
Os animais e protocolos experimentais deste estudo estão em conformidade com a COBEA
- BRASIL e foram aprovados pelo Comitê de Ética do Instituto Butantan sob o n° 291/06.
4.2. Parâmetros biométricos
Foram mensurados a massa corporal (g) (MC), comprimento naso-anal (cm) (CN-A), bem
como a massa (g) dos depósitos de gordura periepididimal e retroperitoneal. O índice de Lee
foi calculado pela equação [MC
0,33
(em g)/CN-A(cm)] (BERNARDIS & PATTERSON 1968,
NAKAGAWA et al. 2000).
4.3. Perfusão, retirada de sangue, obtenção e fixação do tecido encefálico
Os animais foram anestesiados com solução de cloridrato de cetamina (100 mg/mL) e
cloridrato de xilazina (100 mg/mL) por injeção intraperitoneal (ip) de 0,2 mL/100 g MC entre
4:00 – 6:30 h durante a fase clara. Antes de prosseguir a perfusão, 3 mL de amostras
individuais de sangue foram imediatamente obtidas do ventrículo esquerdo de cada rato,
utilizando uma seringa heparinizada. Então, esta mesma agulha foi acoplada a uma cânula de
polietileno, iniciando-se o lavado vascular, mediante a perfusão com solução 0,9% NaCl em
50 mM tampão fosfato, pH 7,4, 5 – 10 min, fluxo de 12 – 15 mL/min, rompendo-se, também,
a aurícula direita, para permitir a drenagem do sangue e da solução de lavagem, assim
eliminando o sangue e evitando a formação de coágulos. Subseqüentemente, a aorta
50
descendente foi clampeada para assegurar uma melhor perfusão das estruturas encefálicas.
Este procedimento finaliza, nesta etapa, exceto para os animais destinados à imuno-
histoquímica (três animais de cada grupo), os quais continuaram a ser perfundidos, por mais 5
- 10 min, sob mesmo fluxo, a 4°C, com solução fixadora composta de 4% de paraformaldeído
em 4% de borato de sódio (borax), pH 9,5.
Após a perfusão, os animais foram decapitados em guilhotina e os encéfalos
imediatamente retirados, para uso imediato nos procedimentos de imuno-histoquímica,
Western blotting e RT-PCR, ou congelados em gelo seco e armazenados (no máximo por 10
dias) a – 80ºC, até o uso nos ensaios de atividade enzimática e medida de proteína.
As amostras individuais de sangue dos animais foram imediatamente centrifugadas a 3.000
X g, a 4 °C, por 20 min (microcentrífuga H-240 Hsiangtai Machinery Ind. Co. Ltd, Twaian)
para obtenção do plasma. O plasma foi armazenado a – 80ºC, até o uso nos ensaios de
atividade enzimática e teor protéico.
4.4. Preparação das frações solúvel (FS) e de membrana solubilizada (FM)
Após dissecção manual, os tecidos hipotalâmico e hipocampal foram imediatamente
homogeneizados em 10 mM tampão Tris-HCl, pH 7,4, por 3 min a 800 rpm com
homogeneizador (Tecnal modelo Te-099) com haste de teflon e potter de vidro e, então,
ultracentrifugados (Hitachi model HIMAC CP60E) a 100.000 X g por 35 min. A razão de
volume de tampão (mL) para massa úmida (g) foi de 4:1. Os sobrenadantes resultantes dessa
ultracentrifugação (correspondentes a FS) foram usados para medir as atividades peptidásicas,
teor protéico, atividade de desidrogenase láctica, ELISA e Western blotting. Para evitar
51
contaminação com a FS, o pellet resultante foi lavado três vezes com 10 mM tampão Tris-
HCl, pH 7,4. Então, este pellet foi re-homogeneizado por 3 min a 800 rpm em 10 mM tampão
Tris-HCl, pH 7,4, contendo 0,1% Triton X-100 e ultracentrifugado a 100.000 X g por 35 min.
Os sobrenadantes assim obtidos (correspondentes a FM) foram usados para medir as
atividades peptidásicas, teor protéico, atividade de desidrogenase láctica, ELISA e Western
blotting.
Para avaliar a eventual influência do Triton X-100 nas atividades peptidásicas sob estudo
na FM, pools desta fração do HT e HC de quatro animais controles normais, foram divididos
em duas partes, uma adsorvida por 2 h com Bio-beads (100 mg/ml) e outra sem adsorver. Em
ambas, foram medidas as atividades peptidásicas e o teor protéico.
Todos os passos acima descritos foram realizados a 4ºC.
4.5. Medida da desidrogenase láctica (LDH)
Como marcador do procedimento de fracionamento descrito no item 4.4, determinou-se a
atividade de LDH, pelo método de BERGMEYER e BRENT (1972), incubando-se 3 µL de
FS ou FM, em triplicata, com 297 µL de NADH (β-nicotinamida adenina di-nucleotídeo,
forma reduzida) dissolvida em tampão fosfato 100 mM, pH 7,4, contendo 1,6 mM de piruvato
e 200 mM NaCl. Os ensaios foram realizados em microplacas de 96 poços (Corning, Co.,
USA), utilizando leitura dos incubados a 340 nm, nos tempos de 0 e 10 min, em
espectrofotômetro leitor de microplaca Bio-Tek Power Wave X
(Bio-Tek Instruments,
EUA). O decréscimo dos valores obtidos, em relação ao tempo zero, foram extrapolados pela
comparação com a curva-padrão de NADH, dissolvido em tampão fosfato 100 mM, pH 7,4,
52
contendo 200 mM NaCl. A atividade da LDH foi expressa em mmol de NADH
oxidado/min/mg de proteína.
4.6. Proteína e glicemia
O teor protéico (homogenatos, FS e FM) foi medido a 630 nm, em triplicata, pelo kit Bio-
Rad (BRADFORD 1976), usando espectrofotômetro leitor de microplaca Bio-Tek Power
Wave X
e, como padrão, albumina sérica bovina (BSA) dissolvida no mesmo diluente da
amostra.
A glicemia foi mensurada na segunda gota de sangue, obtida, sem pressionar, de discreto
corte na ponta da cauda, no aparato Accu-Chek Advantage
(Produtos Roche Químicos e
Farmacêuticos S/A).
4.7. Quantificação fluorimétrica das peptidases
As atividades peptidásicas foram quantificadas pela medida de liberação de 4-metoxi-β-
naftilamina (para DPPIV) ou β-naftilamina (para a APN) (SILVEIRA et al. 2004). Essa
liberação representa o resultado da incubação, por 30 min, 37ºC, em microplacas, recicladas
em lavadora ELX 50/8 (Bio-Tek, USA), de volumes entre 10 - 100 µL de FS ou FM ou
plasma, com volumes (suficientes para completar 300 µL de volume total) de substratos
previamente aquecidos e diluídos para 0,125 mM (APN), ou para 0,2 mM (DPPIV), em 0,05
53
M do tampão correspondente, contendo 0,1 mg/mL de BSA. O conteúdo de compostos de
naftilamina foi estimado fluorimetricamente (fluorímetro leitor de microplaca Bio-Tek
FL600FA) no comprimento de onda de 460/40 nm de emissão, com uma excitação de 360/40
nm. O maior valor do incubado, correspondente ao tempo zero, ou na ausência da amostra, foi
descontado (branco) e a fluorescência relativa convertida em picomoles de β-naftilamina ou
metoxi-β-naftilamina pela comparação com as respectivas curvas-padrão (β-naftilamina ou
metoxi-β-naftilamina dissolvidas na mesma solução utilizada na incubação). As atividades
peptidásicas foram expressas em picomoles de substrato hidrolisado por minuto (UP) por
miligrama de proteína tendo, como pré-condição, a existência da relação linear do ensaio
fluorimétrico em função do tempo de hidrólise e do conteúdo protéico. Como as medidas de
atividade enzimática têm caráter comparativo, não foi considerada a possível interferência da
degradação inespecífica durante a homogenização.
Os seguintes substratos e condições foram utilizados:
4.7.1. APN, L-Ala-β-naftilamida (solubilizada em 0,012 N HCl) em tampão fosfato, pH 7,4,
contendo 1 mM DL-ditiotreitol (DTT) na presença e ausência de 0,02 mM de puromicina.
Assim, duas atividades APN diferentes foram mensuradas: aquela resultante do ensaio na
presença de puromicina (atividade insensível à puromicina APM) e aquela resultante da
subtração dos valores obtidos na presença de puromicina, daqueles obtidos na ausência de
puromicina (atividade sensível à puromicina PSA).
4.7.2. DPPIV, H-Gly-Pro-4-metoxi-β-naftilamida (solubilizada em dimetil-sulfóxido
[DMSO]) em tampão Tris-HCl, pH 8,3, na presença e na ausência de 0,1 mM de diprotina A.
Assim duas atividades DPPIV diferentes foram mensuradas: aquela resultante do ensaio na
presença de diprotina A (atividade insensível à diprotina A DPPIV-DI) e aquela resultante da
54
subtração dos valores obtidos na presença de diprotina A, daqueles obtidos na ausência de
diprotina A (atividade sensível à diprotina A DPPIV-DS).
4.8. Ensaio imunoenzimático (ELISA) de CD26
A concentração de CD26 foi medida, espectrofotometricamente, a 450 nm, em duplicata,
usando o kit Human sCD26 Elisa que utiliza anticorpo monoclonal contra CD26 (EC
3.4.14.5), em pools de FS e FM, do HT e HC, de quatro animais de cada tratamento, tendo
como padrão a enzima CD26 humana purificada (que acompanha o kit) dissolvida no tampão
de reação.
4.9. Western blotting de CD13 e CD26
As amostras de FS e FM do HT e HC (100 µg de proteína/poço) foram separadas por
eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida, otimizada para a separação de proteína na faixa de
peso molecular da CD13 e CD26 (SCHÄGGER e VON JAGOW 1987). As porcentagens de
poliacrilamida dos géis foram as seguintes: 10% para o gel de separação e 4% para o gel de
empilhamento (stacking) (LAEMMLI 1970, KAWAI et al. 2003). Foram usados os padrões
de massa molecular SDS-PAGE para análise das amostras por extrapolação.
As proteínas separadas foram transferidas eletroforeticamente para membranas de
nitrocelulose, por 1 h a 100 V. As membranas foram incubadas, por 1 h, em solução
55
bloqueadora e, por 1 h, com anti-CD13 policlonal de coelho (1:1.000 em solução
bloqueadora), ou com anti-CD26 policlonal de coelho (1:2.500 em solução bloqueadora), ou
com anti-β-actina (1:1.000 em solução bloqueadora). As membranas foram lavadas cinco
vezes, por 5 min, com solução de lavagem (tampão fosfato, 0,2% de Tween-20) e incubadas,
por 1 h, com anticorpo IgG anti-coelho, produzido em cabra, complexado à peroxidase de raíz
forte (1:5.000 em solução bloqueadora). As membranas foram lavadas, por cinco ciclos de 5
min, com solução de lavagem (tampão fosfato, 0,2% de Tween-20). As membranas foram
incubadas com 2 mL da solução de quimioluminêscencia (SuperSignal West Pico Trial Kit),
por 3 min, a temperatura ambiente (20°C) e, depois, foram expostas ao filme (Kodak Biomax
MS film, Z36300-6, Sigma), por 1 min.
As densidades das bandas imuno-reativas foram determinadas pelo densitômetro GS 700
(Bio Rad Laboratories, EUA) utilizando o programa de análise Molecular Analyst
®
(Bio Rad
Laboratories, EUA) e normalizadas a partir das densidades das bandas de β-actina.
4.10. Extração do RNA total e RT-PCR para CD13 e CD26
4.10.1. Extração do RNA total
Imediatamente após a remoção, os tecidos hipotalâmico e hipocampal frescos foram
macerados sobre gelo e homogeneizados a temperatura ambiente (20°C) com Trizol na
proporção de 100:1 (mg de tecido: mL de Trizol) (homogeneizador Tecnal modelo Te-099)
com haste de teflon e potter de vidro e, subseqüentemente, transferidos para um tubo de
56
polipropileno. Seqüencialmente, 1 mL de clorofórmio foi adicionado para cada 0,5 mL de
homogenato, misturando-se 20 vezes por inversão, após a adição do reagente. A suspensão
final foi resfriada, por 8 min a 4°C e, posteriormente, centrifugada (Micro-centrífuga CT-
14000R, Cientec, Brasil) a 12.000 X g, por 20 min, a 4°C. Após a centrifugação, observou-se
a formação de três camadas: a superior, ou fase aquosa, composta por RNA; a intermediária,
composta por DNA; e a inferior, ou fase fenol. A fase aquosa foi transferida para um novo
tubo, misturada com 250 µL de álcool isopropílico e, depois, colocada a –80°C, por 1 h, para
precipitação do RNA. A sedimentação foi realizada a 12.000 X g, por 15 min, e o pellet
resultante foi dissolvido em 0,5 mL etanol 75%, homogeneizado e centrifugado a 8.500 X g,
por 5 min, a 4°C. O sobrenadante resultante foi descartado, o pellet foi seco a temperatura de
20°C e ressuspendido em 0,015 mL de água autoclavada. A suspensão foi homogeneizada,
aquecida a 55°C, por 5 min, e armazenada a –80°C.
4.10.2. Análise do RNA total
O RNA total isolado foi quantificado espectrofotometricamente (espectrofotômetro Bio-
Tek Power Wave X
) e avaliado, quanto à pureza, pela razão entre as absorbâncias a 260 nm
e 280 nm. A qualidade do RNA total foi avaliada pela presença das bandas correspondentes
ao RNA ribossomal 25S e 18S, obtidas na eletroforese em gel de agarose 1% (p/v), preparado
em tampão Tris/acetato de sódio/EDTA 1x, pH 8,0, sob voltagem constante (80 V),
visualizadas por meio de coloração com solução de brometo de etídeo (0,5 µg/ mL) sob luz
ultravioleta.
57
4.10.3. RT-PCR
A transcrição reversa (RT) e a reação de polimerase em cadeia (PCR) foram realizadas
utilizando SuperScript
TM
One-Step RT-PCR with Platinum
Taq. A síntese do cDNA foi feita
a partir de RNA total (500 ng) (termociclador PerkinElmer 2400, PerkinElmer, EUA), em um
ciclo a 55ºC, por 20 min, e um ciclo a 94ºC, por 2 min, para uma pré-desnaturação da fita.
Para a amplificação por PCR foram realizados 30 ciclos: para APM/CD13 e para a enzima
gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) (controle) – 15 s a 94ºC, 30 s a 55ºC, 1 min a
72ºC, seguido de uma extensão final a 72ºC por 7 min; para CD26 - 15 s a 94ºC, 30 s a 50ºC,
1 min a 72ºC, seguido de uma extensão final a 72ºC por 7 min. Os primers utilizados foram:
1- CD26 de rato (EC 3.4.14.5)
CD26 sense - 5’-GCACAAGAGCTAATAACACCACT’-3’,
CD26 anti-sense – 5’-TGAAGGAGAACTATGATGCCCAGAATG-3’ (nº de acesso ao
GenBank: NM_012789);
2- APM/CD13 de rato (EC 3.4.11.2)
APM/CD13 sense – 5’-GCCCATTCCGTATCTCAAAA-3’,
APM/CD13 anti-sense – 5’-AAGTAGGCGAAGAGGGGTGT-3’ (DRINGEN et al. 2001) (nº
de acesso ao GenBank: NM_031012); e, como controle positivo, utilizamos o GAPDH, cujos
primers foram: GAPDH sense – 5’-TTCAACGGCACAGTCAAGGC-3’, GAPDH anti-sense
– 5’-CACCAGCATCACCCCATTTG-3’ (ALONSO et al. 2007) (nº de acesso ao GenBank:
NM_017008).
As densidades das bandas foram determinadas pelo densitômetro GS 700 (Bio Rad
Laboratories, EUA) utilizando o programa de análise Molecular Analyst
®
(Bio Rad
Laboratories, EUA) e normalizadas a partir das densidades das bandas de GAPDH.
58
4.11. Histologia
Os encéfalos perfundidos e pré-fixados, conforme descrito no item 4.3., foram pós-fixados
numa solução de paraformaldeído 4% contendo sacarose 20% (p/v), durante 4 h. Após esse
período, foram armazenados em solução crioprotetora (tampão fosfato de potássio 0,02 M, pH
7,4, contendo sacarose 20% - KPBS) por mais 24 h. Então, os encéfalos foram
criosseccionados em cortes coronais de 40 µm de espessura (a partir do Bregma -1,32, no
sentido rostro-caudal), utilizando-se criomicrótomo de congelamento (Leica SM 2000R,
Leica, Alemanha). Cinco séries de cortes foram coletadas para cada animal, em placa de
acrílico (25 poços, TPP, Suíça) com a solução anti-congelante (PBS 0,1 M, pH 7,4, contendo
sacarose 20% e etilinoglicol) e armazenadas a -20°C. Três séries de cortes foram submetidas
aos procedimentos discriminados a seguir:
4.11.1. Imuno-histoquímica de Fos, CD13 e CD26
Ao serem removidos da solução de KPBS, onde inicialmente ficaram armazenados, cortes
coronais foram submetidos a três lavagens. Na primeira, foram lavados em nova solução
KPBS (2 x 10 min); na segunda, com peróxido de hidrogênio 0,1% (1 x 10 min) e, na terceira,
novamente em KPBS (2 x 10 min). Em seguida, foram incubados em soluções com anticorpos
primários, produzidos em coelho, anti-c-Fos, ou anti-CD13, ou anti-CD26, por 48 h. Estas
soluções compõe-se de KPBS, Triton X-100 (0,3% em KPBS), soro normal de cabra (3% em
KPBS) e, respectivamente, anticorpo anti-Fos policlonal (1:10.000 em KPBS), ou anti-CD13
59
policlonal (1:1.000 em KPBS), ou anti-CD26 policlonal (1:1.000 em KPBS). Durante a
incubação, os cortes permaneceram em microtubos de 1,5 mL, posicionados em agitador
protegido da luz. Após a incubação, os cortes foram submetidos a lavagens em KPBS (2 x 10
min) e, posteriormente, incubados em solução com anticorpo secundário biotinilado, anti-
coelho, produzido em cabra, por 60 min. Esta solução compõe-se de KPBS, Triton X-100
(0,3% em KPBS) e anticorpo secundário biotinilado (1:500 em KPBS). Em seguida, os cortes
foram novamente submetidos a lavagens com KPBS (2 x 10 min) e incubados com o
complexo avidina-biotina-peroxidase (ABC Kit Vectastain Elite Standard) (diluídos em
KPBS, 1:500), por 60 min. Depois, os cortes foram submetidos a lavagens com KPBS (2 x 10
min) e, em seguida, à reação de imunoperoxidase com solução de 3,3-diaminobenzidina
(0,05% em KPBS) sulfato de níquel amônio (0,05% em KPBS) e peróxido de hidrogênio
(0,01% em KPBS). Para neutralizar esta reação, os cortes foram submetidos a lavagens com
KPBS (2 x 10 min).
Após montagem dos cortes em lâminas previamente cobertas com poli-L-lisina, estes
foram desidratados em concentrações crescentes de etanol (50%, 70%, 95%-I, 95%-II, 100%-
I, 100%-II, 100%-III, 3 min cada) e diafanizados em xilol (xilol-I, 3 min e xilol-II, 30 min).
Após os processos de desidratação e diafinização, as lâminas foram recobertas com Eukitt e
lamínula.
4.11.2. Coloração de Nissl
Cortes coronais foram submetidos ao processo de desidratação, iniciando-se com a água e,
em seguida, por uma seqüência crescente de concentrações de etanol (50%, 70%, 95%-I,
60
95%-II - 3 min cada, 100%-I, 100%-II, 100%-III – 5 min cada) e diafanização em xilol (xilol-
I, 5 min e xilol-II, 10 min). Em seguida, os cortes foram reidratados do xilol (xilol-II, 3 min)
até a água, passando por imersões em concentrações decrescentes de etanol (100%-III, 100%-
II, 100%-I – 3 min cada, 95%-II, 95%-I, 70%, 50% - 2 min cada). O procedimento seguinte
foi a imersão em tionina (20 s), seguida de 4 mergulhos em água destilada, para retirada do
excesso de corante. Os cortes foram desidratados novamente, da água até o xilol, 3 min em
cada, para posterior montagem com Eukitt e lamínula.
4.11.3. Microdensitometria da imuno-reatividade à Fos, CD13 e CD26
A captura das imagens e as análises microdensitométricas (densidade populacional) dos
cortes coronais foram realizadas com o microscópio Nikon Eclipse E-1000, equipado com a
câmera digital CoolSNAP
, utilizando o programa Image-Pro-Plus 4.0
(Media Cybernetics).
Os resultados quantitativos da expressão de Fos, CD13 e CD26 são referentes à freqüência de
estruturas coradas e não a concentrações absolutas destes compostos. A freqüência de
estruturas coradas foi obtida na área de cada núcleo analisado nos diferentes tratamentos, de
acordo com o atlas do encéfalo de ratos (PAXINOS e WATSON 2007).
4.12. Análise estatística
61
Os dados quantitativos foram apresentados como média ± erro padrão da média (EPM) e
analisados estatisticamente usando os programas computacionais GraphPad Instat,
GraphPad Prism e Prism 3.0. A análise de regressão foi utilizada para obter as curvas-
padrão de albumina, β-naftilamina, metoxi-β-naftilamina e NADH, bem como a correlação
linear entre os parâmetros sob estudo. O teste t de Student foi utilizado para comparar pares
de valores. Em todos os cálculos foi fixado o nível crítico mínimo de p<0,05.
62
5. RESULTADOS
5.1. Parâmetros biométricos e glicemia
Os valores da massa corporal, comprimento naso-anal, índice de Lee, massa dos depósitos
de gordura periepididimal e retroperitoneal e glicemia estão apresentados na Tabela 2.
Quando comparados ao grupo C, os tratamentos MSG e MSG-P induziram uma diminuição
significativa na massa corporal. O comprimento naso-anal dos animais MSG e MSG-P foi
menor em relação a C. Já o índice de Lee foi maior em MSG e MSG-P e menor em C-P, em
relação a C. Ocorreu aumento na massa absoluta dos depósitos de gordura retroperitoneal
relativa à massa absoluta corporal, em MSG e MSG-P, comparativamente a C. A massa
absoluta do depósito de gordura periepididimal não apresentou valores significativamente
alterados em função dos tratamentos aplicados, porém a massa percentual deste depósito de
gordura periepididimal relativa à massa corporal absoluta foi maior em MSG que em C. Os
valores de glicemia não tiveram alteração significativa em função dos tratamentos aplicados.
Na Figura 2, observa-se a aparência típica do depósito de gordura periepididimal dos
animais tratados com MSG (MSG e MSG-P), que foi similar aos animais C e C-P.
A Figura 3A mostra a aparência do depósito de gordura retroperitoneal dos animais C e C-
P, enquanto a Figura 3B mostra a aparência distinta desse depósito nos animais MSG.
5.2. Atividade da desidrogenase láctica
63
A Figura 4 mostra que a atividade de LDH foi maior em FS que em FM de ambas as áreas:
em FS, 1,1655
±
0,16 (HT) e 1,706
±
0,4 (HC); em FM, 0,6185
±
0,08 (HT) e 0,6407
±
0,1 (HC).
5.3. Atividades peptidásicas da FM adsorvida em Bio-beads
Na Tabela 3, observa-se a menor atividade DPPIV total na FM do HT adsorvida,
comparativamente a não adsorvida. No HC, houve diminuição da atividade APN total na FM
não adsorvida em relação à adsorvida.
64
Tabela 2 - Massa corporal, comprimento naso-anal, índice de Lee, massa dos depósitos de
gordura periepididimal e retroperitonial e glicemia de animais controles normais (C), normais
privados de alimento (C-P), tratados com glutamato monossódico (MSG) e tratados com
glutamato monossódico e privados de alimento (MSG-P).
Valores são média ± EPM.
Número de animais entre parênteses.
Os valores apresentados em cada coluna foram obtidos dos mesmos animais.
***p<0,0001, **p<0,004 e *p<0,05, em relação a C (teste t-Student não pareado, bicaudal).
C C-P MSG MSG-P
Massa Corporal
(mc)
(g)
370 ± 14,65
(7)
339 ± 14,2
(7)
325 ± 9,45
*
(8)
292 ± 10,25
**
(7)
Comprimento
Naso-anal (cn-a)
(cm)
23,6 ± 0,4
(7)
24,2 ± 0,2
(7)
20,8 ± 0,2
***
(8)
19,5 ± 0,2
***
(7)
Índice de Lee
(MC
0.33
/ CN-A)
(g / cm)
0,29 ± 0,0027
(7)
0,28 ± 0,0055
*
(7)
0,32 ± 0,0035
***
(8)
0,33 ± 0,0055
***
(7)
Gordura
Periepididimal
(g)
5,45 ± 0,86
(7)
4,0 ± 0,24
(7)
7,04 ± 0,65
(8)
5,67 ± 0,48
(7)
Gordura
Periepididimal
(% relativa à
massa corporal)
1,47 ± 0,23%
(7)
1,18 ± 0,07%
(7)
2,16 ± 0,20%
*
(8)
1,94 ± 0,16%
(7)
Gordura
Retroperitoneal
(g)
3,27 ± 0,50
(7)
2,95 ± 0,23
(7)
5,97 ± 0,55
**
(8)
4,97 ± 0,51
*
(7)
Gordura
Retroperitoneal
(% relativa à
massa corporal)
0,88 ± 0,13%
(7)
0,87 ± 0,07%
(7)
1,83 ± 0,17%
**
(8)
1,70 ± 0,17%
**
(7)
Glicemia
(mg/dL)
99,1 ± 9,0
(7)
84,3 ± 9,7
(7)
110 ± 14,5
(7)
88,6 ± 9,4
(7)
65
Figura 2. Aparência do depósito de gordura periepididimal (em destaque) do animal tratado
com MSG (similar ao do animal controle).
Figura 3. Aparência do depósito de gordura retroperitoneal (em destaque) do animal controle
(A) e do animal tratado com MSG (B).
66
Figura 4. Atividade da desidrogenase láctica (média ± EPM) das frações solúvel (FS) e de
membrana solubilizada (FM) no hipotálamo (HT) e hipocampo (HC) do rato.
Número de animais entre parênteses.
*p<0,01 relativamente a FM do mesmo tecido (teste t-Student não pareado, bicaudal).
67
Tabela 3 - Influência da adsorção em Bio-beads sobre a capacidade hidrolítica da fração de
membrana solubilizada hipotalâmica e hipocampal sobre L-Ala-β-naftilamida (APN total) e
H-Gly-Pro-4-metoxi-β-naftilamida (DPPIV total).
Valores são média ± EPM
Pool de 4 animais (medidas em duplicata).
UP = pmoles de substrato hidrolizado. min
-1
*p<0,02 relativamente à fração de membrana do mesmo tecido adsorvida (teste t-Student não
pareado, bicaudal).
Atividade (UP mg proteína
-
1
)
Hipotálamo Hipocampo
Substrato
Adsorvido Sem adsorver Adsorvido Sem adsorver
L-Ala-β-
naftilamida
19681,32 ±
770,01
23138,28 ±
944,43
23422,56 ±
441,33
27995,25 ±
419,75
*
H-Gly-Pro-4-
metoxi-β-
naftilamida
103,40 ±
3,5
226,72 ±
14,7
*
31,15 ±
1,7
92,88 ±
28,28
68
5.4. Atividades peptidásicas
Na Tabela 4, observa-se a influência da puromicina sobre a hidrólise dos substratos
sintéticos L-Ala-β-naftilamida (APN total) e H-Gly-Pro-4-metoxi-β-naftilamida (DPPIV
total) pelos tecidos hipotalâmico e hipocampal e pelo plasma. Na FS do HT e HC, a atividade
sobre L-Ala-β-naftilamida foi totalmente inibida pela puromicina. Já na FM do HT e HC,
observa-se a presença de atividade sobre L-Ala-β-naftilamida insensível à puromicina. A
partir desses resultados, adotou-se, no presente trabalho, a seguinte nomenclatura: PSA, para a
atividade APN sensível à puromicina, e APM, para a atividade APN insensível à puromicina.
A puromicina também apresentou efeito inibidor (menor que sobre L-Ala-β-naftilamida)
sobre a hidrólise do substrato H-Gly-Pro-4-metoxi-β-naftilamida pela FS e FM do HT e HC,
mas induziu um ligeiro aumento na hidrólise promovida pelo plasma.
Na Tabela 5, observa-se o efeito da diprotina A sobre a PSA, a APM e a atividade
hidrolítica sobre H-Gly-Pro-4-metoxi-β-naftilamida (DPPIV total). Na FS e FM do HT e HC,
assim como no plasma, a diprotina aumentou a atividade PSA. Na FM do HC e no plasma, a
diprotina diminuiu a atividade APM. Na FS e FM do HT e HC e no plasma, a diprotina
diminuiu a hidrólise do substrato H-Gly-Pro-4-metoxi-β-naftilamida. Baseado no perfil da
hidrólise de H-Gly-Pro-4-metoxi-β-naftilamida, na presença de diprotina, adotou-se, no
presente estudo, a seguinte nomenclatura: DPPIV-DS, para a atividade DPPIV sensível à
diprotina A, e DPPIV-DI, para a atividade DPPIV insensível à diprotina A.
As Tabelas 6 e 7 mostram que, no HT e HC, em C, a atividade PSA na FS é 7-10 vezes
mais elevada que na FM, a atividade PSA na FM é cerca de 4 vezes mais elevada que APM e
as atividades DPPIV-DS e DI na FS não diferem. A Tabela 6 mostra que a atividade DPPIV-
DS é cerca de 3 vezes menor que DPPIV-DI na FM do HT de C. Na Tabela 7 observa-se que
69
na FM do HC de C ocorre o inverso, i.e. a atividade DPPIV-DS é cerca de 10 vezes maior que
DPPIV-DI.
A Tabela 6 mostra que houve diminuição da atividade PSA na FS do HT em C-P e MSG,
em relação a C. Os animais MSG-P apresentaram significativa redução da atividade DPPIV-
DS na FS do HT comparativamente a C. A atividade DPPIV-DI foi menor na FS do HT em
MSG-P e na FS e FM do HT em MSG, em relação a C. Não houve diferença significativa nos
diferentes tratamentos (C-P, MSG e MSG-P) quanto à atividade APM na FM e FS do HT, em
relação a C.
A Tabela 7 mostra que não houve diferença significativa da atividade APM da FM e FS do
HC entre os diferentes tratamentos (C, C-P, MSG e MSG-P), mas houve um aumento
significativo na atividade PSA na FM do HC em MSG-P, em relação a C. A atividade
DPPIV-DS diminuiu na FS do HC em MSG-P, em relação a C. Já na FM, a atividade DPPIV-
DS foi menor em C-P e MSG, relativamente a C. A atividade DPPIV-DI aumentou na FM do
HC em C-P, MSG e MSG-P, em relação a C.
Na Tabela 8, observa-se, no plasma de C, que a atividade APM foi cerca de 2 vezes maior
que a PSA, enquanto a DPPIV-DI foi cerca de 5 vezes maior que DPPIV-DS. Não houve
diferença significativa das atividades PSA, APM e DPPIV-DS do plasma entre os diferentes
tratamentos (C, C-P, MSG e MSG-P). Já a atividade DPPIV-DI diminuiu no plasma em
MSG-P.
70
Tabela 4 - Efeito da puromicina sobre a hidrólise dos substratos L-Ala-β-naftilamida e H-
Gly-Pro-4-metoxi-β-naftilamida pelas frações solúvel (FS) e de membrana solubilizada (FM)
dos tecidos hipotalâmico e hipocampal e pelo plasma de animais controles normais.
Substrato
L-Ala-β-naftilamida H-Gly-Pro-4-metoxi-β-naftilamida
FS
NE
50 ± 4,77%
***
(5)
HIPOTÁLAMO
FM
5,95 ± 1,17%
***
(4)
71,4 ± 15,3%
**
(5)
FS
NE
54,93 ± 2,79%
**
(5)
HIPOCAMPO
FM
7,13 ± 2,8%
**
(3)
58,9 ± 11%
*
(5)
Atividade (% relativa à
ausência de puromicina)
PLASMA
73,65 ± 22,18%
(6)
112,03 ± 22,18%
***
(5)
Valores são média ± EPM.
Valor sem puromicina=100%
Concentração final de puromicina no incubado = 0,02 mM
Número de animais entre parênteses.
NE = não detectável por essa metodologia
*p<0,02, **p<0,003 e ***p<0,0008 em relação ao valor obtido sem puromicina (test t Student
pareado, bicaudal).
71
Tabela 5 - Efeito da diprotina A sobre as atividades de aminopeptidase neutra sensível (PSA) e insensível (APM) à puromicina e sobre a
hidrólise do substrato H-Gly-Pro-4-metoxi-β-naftilamida pelas frações solúvel (FS) e de membrana solubilizada (FM) dos tecidos hipotalâmico e
hipocampal e pelo plasma.
Valores são média ± EPM
Valor sem diprotina = 100%
Concentração final de diprotina A no incubado = 0,016 mM
Número de animais entre parênteses.
NE = não detectável por essa metodologia
*p<0,05, **p<0,01 em relação ao valor obtido sem diprotina (test t Student pareado, bicaudal).
Atividade (% relativa à ausência de diprotina)
Hipotálamo Hipocampo
Substrato
FS FM FS FM
Plasma
PSA
152,6 ± 19,49%
**
(6)
150,47 ± 19,49%
**
(5)
158,07 ± 50,46%
*
(7)
142,76 ± 29,6%
*
(7)
154,75 ± 67,62%
*
(3)
APM
NE
99,07 ± 25,05%
(7)
NE
38,26 ± 19,08%
*
(3)
56,83 ± 16,8%
*
(5)
H-Gly-Pro-4-metoxi-β-
naftilamida
52,51 ± 14,45%
**
(6)
73,67 ± 11,28%
**
(6)
59,97 ± 24,47%
*
(6)
36,1 ± 25,4%
**
(7)
72,41 ± 25,94%
*
(5)
72
Tabela 6 - Atividades (UP mg proteína
-1
) de aminopeptidase neutra sensível (PSA) e
insensível (APM) à puromicina e de dipeptidil peptidase IV sensível (DPPIV-DS) e insensível
(DDPIV-DI) à diprotina em fração solúvel (FS) e de membrana solubilizada (FM) do
hipotálamo de animais controles normais (C), normais privados de alimento (C-P), tratados
com glutamato monossódico (MSG) e tratados com glutamato monossódico e privados de
alimento (MSG-P).
PSA APM DPPIV-DS DPPIV-DI
FS
48852,07 ± 6256,3
(5)
NE
55,81 ± 9,07
(5)
39,88 ± 8,38
(5)
C
FM
4704,31 ± 748,4
(6)
1030,73 ± 188,82
(7)
103,23 ± 23,7
(6)
288,78 ± 44,23
(6)
FS
22119,9 ± 2957,9
**
(6)
NE
46,82 ± 15,33
(3)
28,73 ± 6,2
(5)
C-P
FM
4790,72 ± 937,28
(6)
1843,8 ± 595,11
(6)
174,33 ± 29,64
(5)
311,23 ± 90,78
(5)
FS
28121,1 ± 4344,4
*
(7)
NE
28,52 ± 5,89
(3)
19,74 ± 2,75
*
(6)
MSG
FM
4327,12 ± 1024,8
(5)
1566,15 ± 361,13
(8)
61,53 ± 14,36
(6)
49,88 ± 11,13
*
(4)
FS
29048,08 ± 7941,9
(6)
NE
21,91 ± 10,68
*
(4)
11,75 ± 2,49
*
(5)
MSG-P
FM
4990,38 ± 751,11
(6)
820,42 ± 106,17
(5)
58,48 ± 17,27
(3)
146,84 ± 64,63
(3)
Valores são média ± EPM.
Número de animais entre parênteses.
NE= não detectável por essa metodologia
UP=pmoles de substrato hidrolizado. min
-1
*p<0,05 e **p<0,009 em relação a C (teste t-Student não pareado, bicaudal).
73
Tabela 7 - Atividades (UP mg proteína
-1
) de aminopeptidase neutra sensível (PSA) e
insensível (APM) à puromicina e de dipeptidil peptidase IV sensível (DPPIV-DS) e insensível
(DPPIV-DI) à diprotina em fração solúvel (FS) e de membrana solubilizada (FM) do
hipocampo de animais controles normais (C), normais privados de alimento (C-P), tratados
com glutamato monossódico (MSG) e tratados com glutamato monossódico e privados de
alimento (MSG-P).
PSA APM DPPIV-DS DPPIV-DI
FS
34775,23 ± 6721,7
(6)
NE
23,47 ± 8,73
(4)
37,51 ± 8,73
(4)
C
FM
5225,5 ± 613,62
(7)
1510,07 ± 193,27
(6)
86,07 ± 23,54
(5)
7,96 ± 5,09
(6)
FS
36205,56 ± 8004,1
(7)
NE
51,77 ± 10,79
(6)
32,60 ± 11,41
(4)
C-P
FM
6181,63 ± 855,85
(7)
1494,84 ± 114,01
(6)
21 ± 9,81*
(4)
37,5 ± 14,97*
(3)
FS
46109,25 ± 9457
(8)
NE
30 ± 5,16
(5)
25,5 ± 5,7
(4)
MSG
FM
5238,6 ± 799,6
(7)
1338,37 ± 250,05
(7)
6,55 ± 2,02*
(3)
131,48 ± 33,15**
(4)
FS
52988,61 ± 9208,7
(5)
NE
15,33 ± 1,4*
(3)
23,63 ± 5,48
(3)
MSG-P
FM
11233,22 ± 2224,4*
(7)
2336,5 ± 664,9
(5)
51,03 ± 20,64
(5)
43,75 ± 6,25**
(4)
Valores são média ± EPM.
Número de animais entre parênteses.
NE= não detectável por essa metodologia
UP= pmoles de substrato hidrolizado. min
-1
*p<0,05 e **p<0,003 em relação a C (teste t-Student não pareado, bicaudal)
74
Tabela 8 - Atividades (UP mg proteína
-1
) de aminopeptidase neutra sensível (PSA) e
insensível (APM) à puromicina e de dipeptidil peptidase IV sensível (DPPIV-DS) e insensível
(DPPIV-DI) à diprotina no plasma de animais controles normais (C), normais privados de
alimento (C-P), tratados com glutamato monossódico (MSG) e tratados com glutamato
monossódico e privados de alimento (MSG-P).
PSA APM DPPIV-DS DPPIV-DI
C
425,74 ± 167,02
(4)
777,83 ± 234,27
(6)
364,12 ± 81,41
(5)
1533,57 ± 178,75
(4)
C-P
144,69 ± 37,99
(3)
377,58± 58
(6)
421,92 ± 150,24
(4)
1879,47 ± 149,5
(5)
MSG
159,99 ± 34,48
(4)
691,81 ± 186,54
(7)
320,33 ± 74,18
(5)
1969,84 ± 256,87
(5)
MSG-P
249,21 ± 53,56
(3)
302,7 ± 27,15
(5)
501,51 ± 85,75
(4)
1019,46 ± 95,65*
(5)
Valores são média ± EPM.
Número de animais entre parênteses.
UP= pmoles de substrato hidrolizado. min
-1
*p<0,04 em relação a C (teste t-Student não pareado bicaudal)
75
5.5. Correlações entre os parâmetros biométricos, glicemia e atividades peptidásicas.
A Tabela 9 mostra os resultados da prospecção de correlações significativas por análise de
regressão linear de todas as combinações pareadas possíveis dos parâmetros sob estudo.
Nos animais normais houve correlação entre comprimento naso-anal vs massa corporal
(positiva), gordura periepididimal vs massa corporal (positiva), gordura retroperitoneal vs
massa corporal (positiva), glicemia vs índice de Lee (negativa), gordura retroperitoneal vs
glicemia (negativa) e gordura retroperitoneal vs gordura periepididimal (positiva). É notável
que destas correlações detectadas nos animais normais nenhuma se mantém em animais
obesos MSG. Nos animais normais privados de alimento destas se mantém a correlação entre
gordura retroperitoneal vs gordura periepididimal (positiva). Nos animais obesos MSG
privados de alimento se mantêm as correlações entre gordura periepididimal vs massa
corporal (positiva) e glicemia vs índice de Lee (positiva). A correlação entre índice de Lee e
comprimento naso-anal (negativa) só existe em animais normais privados de alimento. A
correlação entre índice de Lee e massa corporal existe em animais normais privados de
alimento (positiva) e obesos MSG privados de alimento (positiva). A correlação entre gordura
periepididimal vs índice de Lee (positiva) só existe em obesos MSG privados de alimento.
Nos animais normais não houve correlação entre os parâmetros biométricos e glicemia vs
atividades peptidásicas plasmáticas e entre as próprias atividades peptidásicas plasmáticas.
Nos animais MSG ocorreu correlação entre DPPIV-DI plasmática vs massa corporal
(positiva) e PSA plasmática vs comprimento naso-anal (positiva). A privação de alimento nos
animais normais determinou correlações entre APM plasmática vs massa corporal (negativa),
PSA plasmática vs comprimento nasoanal (positiva), APM plasmática vs índice de Lee
(negativa), APM plasmática vs gordura retroperitoneal (negativa) e PSA plasmática vs
76
DPPIV-DS plasmática (negativa). Nos animais obesos MSG a privação de alimento
determinou correlações positivas entre DPPIV-DI plasmática vs massa corporal, DPPIV-DI
plasmática vs índice de Lee e DPPIV-DI plasmática vs gordura periepididimal.
Nos animais normais ocorreram correlações positivas entre DPPIV-DI FS HT vs massa
corporal, DPPIV-DI FM HT vs massa corporal, APM FM HC vs massa corporal, PSA FS HT
vs DPPIV-DI FS HT e DPPIV-DI FM HC vs PSA FM HC, e negativas entre DPPIV-DI FS
HT vs comprimento naso-anal, DPPIV-DI FS HT vs gordura periepdidimal, DPPIV-DI FM
HT vs gordura periepididimal, DPPIV-DI FS HT vs gordura retroperitoneal, DPPIV-DI FM
HT vs gordura retroperitoneal. Nos animais MSG ocorreram correlações entre DPPIV-DI FM
HT vs comprimento naso-anal (negativa), PSA FS HC vs comprimento naso-anal (positiva),
DPPIV-DI FM HT vs índice de Lee (positiva), DPPIV-DS FM HT vs gordura periepididimal
(negativa), PSA FS HT vs gordura retroperitoneal (positiva) e APM FM HC vs PSA FM HC
(positiva). Nos animais normais a privação alimentar determinou correlações negativas entre
DPPIV-DI FM HC vs massa corporal, DPPIV-DI FS HC vs índice de Lee, e positivas entre
DPPIV-DS FM HT vs gordura retroperitoneal, DPPIV-DS FM HT vs PSA FM HT, DPPIV-
DI FM HT vs PSA FM HT, DPPIV-DI FM HT vs DPPIV-DS FM HT e DPPIV-DI FS HC vs
PSA FS HC. A privação alimentar nos animais MSG determinou correlações entre DPPIV-DI
FS HT vs massa corporal (negativa), PSA FS HC vs glicemia (positiva), DPPIV-DI FM HC
vs gordura periepididimal (positiva) e DPPIV-DI FM HC vs PSA FM HC (positiva).
77
Tabela 9 - Análise de correlação linear combinatória pareada de todos os pârametros sob
estudo nos diferentes tratamentos.
Massa Corporal
C C-P MSG MSG-P
Comprimento Naso-
anal
s = 31,57 ± 10,43
p<0,03; r
2
= 0,65
A A A
Índice de Lee
A
s= 2454 ± 354,3
p<0,002; r
2
= 0.90
A
s= 0,0004 ± 0,0001
p<0,03; r
2
= 0,66
Gordura
Periepididimal
s= 0,055 ± 0,009
p<0,002; r
2
= 0,88
A A
s= 0,04 ± 0,006
p<0,0009; r
2
= 0,91
Gordura
Retroperitoneal
s= 0,032 ± 0,005
p<0,002; r
2
= 0,89
A A A
DPPIV-DI FS HT
s= 0,935 ± 0,214
p<0,008; r
2
= 0,79
A A
s= -3,58 ± 1,18
p<0,04; r
2
= 0,70
DPPIV-DI FM HT
s= 0,279 ± 0,079
p<0,03; r
2
= 0,76
A A A
APM FM HC
s= 0,067 ± 0,022
p<0,05; r
2
= 0,70
A A A
DPPIV-DI FM HC
A
s= -1,225 ± 0,4235
p<0,05; r
2
= 0,67
A A
APM PLASMA
A
s= -0,227 ± 0,076
p<0,05; r
2
= 0,70
A A
DPPIV-DI PLASMA
A A
s= 0,016 ± 0,0046
p<0,03; r
2
= 0,75
s= 0,053 ± 0,0088
p<0,002; r
2
=0,88
Comprimento Naso-anal
Índice de Lee
A
s= -28,29 ± 8,032
p<0,02; r
2
=0,71
A A
DPPIV-DI FS HT
s= -0,021 ± 0,007
p<0,03; r
2
=0,65
A A A
DPPIV-DI FM HT
A A
s= -0,0039 ± 0,0016
p<0,04; r
2
= 0,54
A
PSA FS HC
A A
s= 0,00001 ± 0,000005
p<0,04; r
2
=0,55
A
PSA PLASMA
A
s= 0,0031 ± 0,0010
p<0,03; r
2
=0,66
s= 0,0006 ± 0,0002
p<0,04; r
2
= 0,53
A
Índice de Lee
Glicemia
s= -1586 ± 420
p<0,015; r
2
=0,74
A A
s= 1142 ± 322
p<0,02; r
2
= 0,71
Gordura
Periepididimal
A A A
s= 72,18 ± 21,29
p<0,02; r
2
= 0,70
DPPIV-DI FM HT
A A
s= 0,00009 ± 0,00003
p<0,04; r
2
= 0,57
A
DPPIV-DI FS HC
A
s= -0,00022 ± 0,00007
p<0,04; r
2
= 0,61
A A
APM PLASMA
A
s= -0,00009 ± 0,00002
p<0,02; r
2
= 0,80
A A
DPPIV-DI PLASMA
A A A
s= 0,0003 ±
0,00000006
p<0,008; r
2=
0,79
Glicemia
Gordura
Retroperitoneal
s= -10,85 ± 2,634
p<0,01; r
2
= 0,77
A A A
78
Análise de regressão linear, software Prisma
®
3.0
s: slope; p: probabilidade; r
2
: coeficiente de determinação; A: correlação ausente.
Os parâmetros que não apresentaram correlação não foram mencionados.
PSA FS HC
A A A
s= 2207 ± 558,4
p<0,02; r
2=
0,80
Gordura Periepididimal
Gordura
Retroperitoneal
s= 0,570 ± 0,043
p<0,0001; r
2
= 0,97
s= 0,983 ± 0,17
p<0,003; r
2
= 0,87
A A
DPPIV-DI FS HT
s= -0,050 ± 0,016
p<0,03; r
2
= 0,65
A A A
DPPIV-DS FM HT
A A
s= -0,024 ± 0,009
p<0,05; r
2
= 0,53
A
DPPIV-DI FM HT
s= -0,017 ± 0,005
p<0,03; r
2
= 0,73
A A A
DPPIV-DI FM HC
A A A
s= 0,023 ± 0,0047
p<0,02; r
2
= 0,89
DPPIV-DI PLASMA
A A A
s= 0,002 ± 0,0004
p<0,003; r
2
= 0,87
Gordura Retroperitoneal
PSA FS HT
A A
s= 0,0001 ± 0,00003
p<0,02; r
2
= 0,75
A
DPPIV-DI FS HT
s= -0,029 ± 0,009
p<0,03; r
2
= 0,65
A A A
DPPIV-DS FM HT
A
s= 0,0073 ± 0,0020
p<0,04; r
2
= 0,81
A A
DPPIV-DI FM HT
s= -0,010 ± 0,002
p<0,02; r
2
= 0,83
A A A
APM PLASMA
A
s= -0,003801 ± 0,0012
p<0,04; r
2
= 0,70
A A
PSA FS HT
DPPIV-DI FS HT
s= 343,2 ± 102
p<0,04; r
2
= 0,80
A A A
PSA FM HT
DPPIV-DS FM HT
A
s= 0,024 ± 0,006
p<0,03; r
2
= 0,85
A A
DPPIV-DI FM HT
A
s= 0,070 ± 0,022
p<0,05; r
2
= 0,77
A A
DPPIV-DS FM HT
DPPIV-DI FM HT
A
s= 0,307 ± 0,064
p<0,02; r
2
= 0,88
A A
PSA FS HC
DPPIV-DI FS HC
A
s= 0,002 ± 0,0006
p<0,03; r
2
= 0,65
A A
PSA FM HC
APM FM HC
A A
s= 0,250 ± 0,085
p<0,04; r
2
= 0,62
A
DPPIV-DI FM HC
s= 0,006 ± 0,002
p<0,04; r
2
= 0,72
A A
s= 0,006 ± 0,0016
p<0,04; r
2
= 0,83
PSA PLASMA
DPPIV-DS PLASMA
A
s= -1,393 ± 0,213
p<0,008; r
2
=0,93
A A
79
5.6. ELISA de CD26 na FS e FM
A Figura 5 mostra que, em C, o teor de CD26 na FM é 3 vezes maior que na FS do HT. A
Figura 6 mostra que, no HC de C, o teor de CD26 é cerca de 7 vezes mais elevado em FS que
em FM.
A quantificação de CD26 (µg de CD26/ mg de proteína total) por ELISA evidenciou um
teor diminuído em MSG (54 ± 2,08) e MSG-P (152,12 ± 10,08) na FS do HT, em relação a C
(239,46 ± 27) (Figura 5). Na FM, observa-se uma diminuição no teor de CD26 em C-P (83,48
± 27,11), em relação a C (594,10 ± 111,82) (Figura 5).
Na Figura 6, observa-se que o teor de CD26 aumentou na FS do HC em C-P (212,44 ±
7,14) e diminuiu em MSG-P (61 ± 4,32), em relação a C (118,40 ± 2,87). Já na FM, o teor de
CD26 aumentou em C-P (260,88 ± 3,01), MSG (701,06 ± 11,40) e MSG-P (581,82 ± 41,64),
em relação a C (17,96 ± 4,44).
80
Figura 5. CD26 (µg/mg de proteína) (média ± EPM), quantificado por ELISA, nas frações
solúvel (FS) e de membrana (FM) do hipotálamo de animais controles normais (C), normais
privados de alimento (C-P), tratados com glutamato monossódico (MSG) e tratados com
glutamato monossódico e privados de alimento (MSG-P).
Número de animais entre parênteses.
*p<0,04, **p<0,003 em relação a C, na mesma fração (Teste t-Student não pareado bi-
caudal).
Figura 6. CD26 (µg/mg de proteína) (média ± EPM), quantificado por ELISA, nas frações
solúvel (FS) e de membrana (FM) do hipocampo de animais controles normais (C), normais
privados de alimento (C-P), tratados com glutamato monossódico (MSG) e tratados com
glutamato monossódico e privados de alimento (MSG-P).
Número de animais entre parênteses.
***p<0,0005 em relação a C, na mesma fração (Teste t-Student não pareado bi-caudal).
81
5.7. Western blotting da CD13 e CD26 na FS e FM
A Figura 7 mostra que, em C, a expressão de CD13 do HT foi cerca de 250 vezes maior
em FM que em FS. A Figura 8 mostra que, em C, a expressão de CD13 do HC em FS é 4
vezes maior em FM. As Figuras 9 e 10 mostram que, em C, a expressão de CD26 do HT e do
HC é cerca de 2-4 vezes maior em FM que em FS.
As Figuras 7(i) e 7(ii) mostram as bandas imuno-reativas para CD13, respectivamente, na
FS e FM do HT. A análise densitométrica destas bandas mostrou que houve aumento na
expressão de CD13 na FS em C-P (0,209 ± 0,021), MSG (0,844 ± 0,078) e MSG-P (0,215 ±
0,054), em relação a C (0,009 ± 0,002), como pode ser observado na Figura 7(iii). Já na FM,
houve diminuição na expressão de CD13 em C-P (0,330 ± 0,025), MSG (0,134 ± 0,023) e
MSG-P (0,35 ± 0,075), em relação a C (2,260 ± 0,712) (Figura 7iv).
Nas Figuras 8(i) e 8(ii) observa-se as bandas imuno-reativas para CD13, respectivamente,
na FS e FM do HC. A análise densitométrica destas bandas mostrou que houve aumento na
expressão de CD13 na FS em C-P (1,57 ± 0,184), assim como na FM em C-P (0,262 ± 0,005),
MSG (0,120 ± 0,014) e MSG-P (0,295 ± 0,085), em relação a C (FS, 0,520 ± 0,125; FM,
0,044 ± 0,001), como pode ser observado nas Figuras 8(iii) e 8(iv), respectivamente.
As Figuras 9(i) e 9(ii) mostram as bandas imuno-reativas para CD26, respectivamente na
FS e FM do HT. A análise densitométrica destas bandas mostrou que em C-P (0,313 ± 0,048)
e MSG-P (0,606 ± 0,094) há aumento na expressão protéica de CD26 na FS do HT, em
relação a C (0,123 ± 0,002) (Figura 9iii). Os animais MSG (2,056 ± 0,31) apresentaram
aumento da expressão protéica de CD26 na FM do HT, em relação a C (0,470 ± 0,071)
(Figura 9iv).
82
As bandas imuno-reativas para CD26 na FS e FM do HC podem ser observadas,
respectivamente nas Figuras 10(i) e 10(ii). A análise densitométrica destas bandas mostrou
que houve diminuição na expressão protéica de CD26 na FS em C-P (0,066 ± 0,002), MSG
(0,119 ± 0,043) e MSG-P (0,240 ± 0,046), em relação a C (0,441 ± 0,053) (Figura 10iii). Na
Figura 10(iv), observa-se a diminuição da expressão protéica de CD26 na FM em MSG
(0,152 ± 0,023) e MSG-P (0,321 ± 0,017), em relação a C (0,802 ± 0,184).
83
(i) (ii)
(iii)
(iv)
(i) (ii)
(iii) (iv)
Figura 7. Análise de Western blotting da CD13 nas frações solúvel (FS) e de membrana (FM)
do hipotálamo dos animais controles normais (C), normais privados de alimento (C-P),
tratados com glutamato monossódico (MSG) e tratados com glutamato monossódico e
privados de alimento (MSG-P). (i) e (ii): cem µg de proteína de FS e FM de hipotálamo foram
separadas por SDS-PAGE e submetidas ao procedimento de Western blotting, utilizando o
anticorpo anti-CD13 policlonal de coelho. (iii) e (iv): quantificação, por densitometria, das
bandas de CD13, normalizadas a partir da banda de β-actina. *p<0,05 e ***p<0,0009 em
relação a C, na mesma fração (Teste t-Student não pareado bicaudal).
Figura 8. Análise de Western blotting da CD13 nas frações solúvel (FS) e de membrana (FM)
do hipocampo dos animais controles normais (C), normais privados privados de alimento (C-
P), tratados com glutamato monossódico (MSG) e tratados com glutamato monossódico e
privados de alimento (MSG-P). (i) e (ii): cem µg de proteína de FS e FM de hipocampo foram
separadas por SDS-PAGE e submetidas ao procedimento de Western blotting, utilizando o
anticorpo anti-CD13 policlonal de coelho. (iii) e (iv): quantificação, por densitometria, das
bandas de CD13, normalizadas a partir da banda de β-actina. *p<0,05, **p<0,01 e
***p<0,001 em relação a C, na mesma fração (Teste t-Student não pareado bicaudal).
84
(i) (ii)
(iii) (iv)
Figura 9. Análise de Western blotting da CD26 nas frações solúvel (FS) e de membrana (FM)
do hipotálamo dos animais controles normais (C), normais privados privados de alimento (C-
P), tratados com glutamato monossódico (MSG) e tratados com glutamato monossódico e
privados de alimento (MSG-P). (i) e (ii): cem µg de proteína de FS e FM do hipotálamo
foram separadas por SDS-PAGE e submetidas ao procedimento de Western blotting,
utilizando o anticorpo anti-CD26 policlonal de coelho. (iii) e (iv): quantificação, por
densitometria, das bandas de CD26, normalizadas a partir da banda de β-actina. *p<0,02 e
**p<0,009 em relação a C, na mesma fração (Teste t-Student não pareado bicaudal).
Figura 10. Análise de Western blotting da CD26 nas frações solúvel (FS) e de membrana
(FM) do hipocampo dos animais controles normais (C), normais privados privados de
alimento (C-P), tratados com glutamato monossódico (MSG) e tratados com glutamato
monossódico e privados de alimento (MSG-P). (i) e (ii): cem µg de proteína de FS e FM do
hipocampo foram separadas por SDS-PAGE e submetidas ao procedimento de Western
blotting, utilizando o anticorpo anti-CD26 policlonal de coelho. (iii) e (iv): quantificação, por
densitometria, das bandas de CD26, normalizadas a partir da banda de
β-actina. *p<0,05 e
**p<0,01 em relação a C, na mesma fração (Teste t-Student não pareado bicaudal).
(iii)
(i)
(iv)
(ii)
85
5.8. Avaliação da qualidade do RNA
O método utilizado para a extração de RNA proporcionou qualidade adequada, como
mostra a Figura 11, na qual podem ser observadas duas bandas correspondentes aos RNAs
ribossomais, 25S e 18S.
5.9. Expressão gênica da CD13 e CD26
A Figura 12 mostra, em C, que a expressão gênica de CD13 foi cerca de 2 vezes maior no
HT que no HC. A Figura 13 mostra, em C, que a expressão gênica de CD26 foi 2 vezes menor
no HT que em HC.
Nas Figuras 12(i) e 12(ii) observam-se as bandas de expressão do mRNA da CD13 no HT
e HC, respectivamente. A análise densitométrica destas bandas mostra que MSG (0,743 ±
0,094) e MSG-P (0,551 ± 0,030) apresentaram diminuição na expressão do mRNA da CD13
no HT, em relação a C (1,7 ± 0,121) (Figura 12iii). C-P (0,931 ± 0,027) e MSG-P (1,20 ±
0,031) apresentaram aumento na expressão do mRNA da CD13 no HC, em relação a C (0,760
± 0,051) (Figura 12iv).
Nas Figuras 13(i) e 13(ii) observam-se as bandas de expressão do mRNA da DPPIV no HT
e HC, respectivamente. A análise densitométrica destas bandas mostra o aumento da
expressão do mRNA da CD26 no HT em C-P (0,653 ± 0,066), em relação a C (0,466 ± 0,015)
(Figura 13iii). Nenhum grupo apresentou diferença estatística na expressão do mRNA da
CD26 no HC, em relação a C (0,896 ± 0,252) (Figura 13iv).
86
Figura 11. Visualização, sob luz ultravioleta, dos RNAs totais extraídos do hipotálamo (HT)
e do hipocampo (HC) dos animais controles normais (C), normais privados de alimento (C-P),
tratados com glutamato monossódico (MSG) e tratados com glutamato monossódico e
privados de alimento (MSG-P). As bandas indicadas correspondem às subunidades 25S e 18S
do RNA ribossomal (rRNA).
87
(i) (ii)
(iii) (iv)
Figura 12. Expressão do mRNA da CD13 no hipotálamo (HT) e hipocampo (HC) de animais
controles normais (C), normais privados de alimento (C-P), tratados com glutamato
monossódico (MSG) e tratados com glutamato monossódico e privados de alimento (MSG-P),
detectada por reação em cadeia de polimerase, via transcrição reversa (RT-PCR). (i) e (ii):
Eletroforese em gel de agarose dos produtos da RT-PCR. Os produtos obtidos por PCR foram
visualizados por incorporação com brometo de etídeo. (iii) e (iv): quantificação, por
densitometria, das bandas do produto da expressão do mRNA, normalizadas a partir da banda
de GAPDH. *p<0,05 e **p<0,008 em relação a C, na mesma fração (Teste t-Student não
pareado bicaudal).
88
(i) (ii)
(iii) (iv)
Figura 13. Expressão do mRNA da CD26 no hipotálamo (HT) e hipocampo (HC) de animais
controles normais (C), normais privados de alimento (C-P), tratados com glutamato
monossódico (MSG) e tratados com glutamato monossódico e privados de alimento (MSG-P),
detectada por reação em cadeia de polimerase, via transcrição reversa (RT-PCR). (i) e (ii):
Eletroforese em gel de agarose dos produtos da RT-PCR. Os produtos obtidos por PCR foram
visualizados por incorporação com brometo de etídeo. (iii) e (iv): quantificação, por
densitometria, das bandas do produto da expressão do mRNA, normalizadas a partir da banda
de GAPDH. *p<0,05 em relação a C, na mesma fração (Teste t-Student não pareado
bicaudal).
89
5.10. Distribuição imuno-histoquímica e alterações densitométricas de CD13, CD26 e
Fos entre os diferentes tratamentos
A coloração de Nissl confirmou a lesão de ArcNH e ME, típica do modelo de obesidade
MSG (dados não mostrados).
Os animais C apresentaram imuno-reatividade à CD13 (CD13-ir) nos seguintes núcleos
hipotalâmicos: ArcNH, periventricular (Pe), PVN, retroquiasmático (RCh) e SO. Não se
observou CD13-ir no hipocampo dos animais C, assim como nos animais C-P, MSG e MSG-
P. A Figura 14 ilustra um dos locais onde detectou-se alterações significativas de CD13-ir nos
tratamentos C-P, MSG e MSG-P, em relação aos animais C, de acordo com a Tabela 11.
A Tabela 11 apresenta a densidade de CD13-ir nos diferentes tratamentos. Os animais
MSG-P apresentaram menor número de CD13-ir no ArcNH (119 ± 29) e no Pe (23 ± 4), em
relação aos animais C (ArcNH: 435 ± 29; Pe: 129 ± 25). O PVN e o ArcNH dos animais C-P
apresentaram menor número de CD13-ir (PVN: 12 ± 2; ArcNH: 302 ± 25), em relação a C
(PVN: 245 ± 20; ArcNH: 435 ± 29); CD13-ir foi ausente no RCh e no SO dos animais C-P.
Os animais MSG apresentaram aumento de CD13-ir no SO (133 ± 25) e redução de CD13-ir
no PVN (130 ± 11), em relação a C (SO: 69 ± 13; PVN: 245 ± 20).
Os animais C apresentaram imuno-reatividade à CD26 (CD26-ir) nos seguintes núcleos
hipotalâmicos: ArcNH, DMH, Pe, PVN, RCh e SO. No hipocampo dos animais C observou-
se CD26-ir no giro denteado (DG) e na fímbria (fi). A CD26-ir também foi detectada na pia
máter (PM). As Figuras 15 e 16 ilustram os locais onde detectou-se alterações significativas
da imuno-reatividade à CD26 (CD26-ir), em relação aos animais C, de acordo com a Tabela
12.
90
A Tabela 12 apresenta a densidade de CD26-ir nos diferentes tratamentos. Houve um
aumento de CD26-ir no ArcNH (490 ± 34), DMH (27 ± 1), Pe (134 ± 20), PVN (88 ± 7) e
RCh (41 ± 8) e diminuição de CD26-ir na PM (58 ± 7) nos animais C-P, em relação a C
(ArcNH: 306 ± 11; DMH: 14 ± 1; Pe: 63 ± 12; PM: 425 ± 37; PVN: 47 ± 5; RCh: 12 ± 1).
Nos animais C-P, a CD26-ir foi ausente no SO, DG e fi. Os animais MSG apresentaram
aumento de CD26-ir no RCh (138 ± 11) e no SO (79 ± 1), e diminuição de CD26-ir no
ArcNH (144 ± 16) e na PM (256 ± 21), comparativamente aos animais C (ArcNH: 306 ± 11
PM: 425 ± 37; RCh: 12 ± 1; SO: 8 ± 1). CD26-ir foi ausente no PVN, DG e fi dos animais
MSG. Já os animais MSG-P apresentaram diminuição de CD26-ir na PM (51 ± 5) e aumento
no Pe (144 ± 24), em relação a C (Pe: 63 ± 12; PM: 425 ± 37). A ausência de CD26-ir foi
observada no DG, DMH, fi, PVN e RCh dos animais MSG-P.
Observou-se a presença de imuno-reatividade à Fos (Fos-ir) nos seguintes núcleos
hipotalâmicos dos animais C: hipotálamo anterior (AH), ArcNH, DMH, Pe, PVN, RCh, SO e
VMH. Não se observou Fos-ir no hipocampo dos animais C, assim como nos animais C-P,
MSG e MSG-P. Na Figura 17 observa-se o aspecto das células Fos-ir consideradas na
contagem. As Figuras 18 e 19 ilustram os locais onde detectou-se alterações significativas de
Fos-ir, em relação aos animais C, de acordo com a Tabela 13.
A Tabela 13 apresenta a densidade de Fos-ir nos diferentes tratamentos. Os animais C-P,
MSG e MSG-P apresentaram diminuição do número de Fos-ir no PVN (C-P: 135 ± 14; MSG:
66 ± 7; MSG-P: 30 ± 5) e RCh (C-P: 65 ± 7; MSG: 22 ± 4; MSG-P: 66 ± 11), em relação a C
(PVN: 207 ± 16; RCh: 155 ± 20). Os animais C-P e MSG-P também apresentaram redução do
número de Fos-ir no VMH (C-P: 74 ± 13; MSG-P: 118 ± 22), em relação a C (408 ± 80). A
Fos-ir diminuiu no Pe e DMH dos animais MSG (Pe: 16 ± 1; DMH: 12 ± 2) e MSG-P (Pe: 16
± 2; DMH: 239 ± 41), em relação a C (Pe: 120 ± 16; DMH: 577 ± 111). Os animais MSG
também apresentaram redução de Fos-ir em AH (27 ± 5), comparativamente a C (63 ± 12). Os
91
animais MSG-P apresentaram redução de Fos-ir no ArcNH (101 ± 24), em relação a C (437 ±
68). A Fos-ir foi ausente no SO dos animais C-P, MSG e MSG-P, assim como no VMH dos
animais MSG.
92
Tabela 10. Extensão das regiões analisadas quanto a imuno-reatividade a CD13, CD26 e Fos
ao longo do eixo ântero-posterior do SNC. Os valores representam os níveis posteriores ao
bregma, segundo Atlas Paxinos e Watson 2007.
Núcleo Bregma
AH -1,32 a -2,28
ArcNH -1,71 a -4,36
CA1 -2,28 a -4,36
CA2 -2,28 a -4,36
CA3 -1,71 a -4,36
DG -1,71 a -4,20
DMH -2,28 a -3,84
Fi -1,32 a -4,20
Pe -1,32 a -3,48
PVN -1,32 a -2,28
Py -1,80 a -2,28
RCh -1,32 a -2,52
SO -1,32 a -2,52
VMH -1,72 a -3,36
AH: área anterior do hipotálamo; ArcNH: núcleo arqueado hipotalâmico; CA1: campo CA1
do hipocampo; CA2: campo CA2 do hipocampo; CA3: campo CA3 do hipocampo; DG: giro
denteado hipocampal; DMH: núcleo hipotalâmico dorsomedial; fi: fímbria hipocampal; Pe:
núcleo periventricular hipotalâmico; PVN: núcleo paraventricular hipotalâmico; Py: camada
de células piramidais do hipocampo; RCh: núcleo retroquiasmático hipotalâmico; SO: núcleo
supraóptico hipotalâmico; VMH: núcleo hipotalâmico ventromedial.
93
Tabela 11. Densidade de CD13-ir no SNC de animais controles normais (C), normais
privados de alimento (C-P), tratados com glutamato monossódico (MSG) e tratados com
glutamato monossódico e privados de alimento (MSG-P).
Regiões C C-P MSG MSG-P
ArcNH
435 ± 29
(3)
302 ± 25
*
(3)
344 ± 28
(3)
119 ± 29
**
(3)
Pe
129 ± 25
(3)
71 ± 5
(3)
132 ± 25
(3)
23 ± 4
*
(3)
PVN
245 ± 20
(3)
12 ± 2
***
(3)
130 ± 11
**
(3)
138 ± 16
*
(3)
RCh
40 ± 8
(3)
A 76 ± 11
(3)
60 ± 11
(3)
SO
69 ± 13
(3)
A 173 ± 33
*
(3)
133 ± 25
(3)
Valores são média ± EPM.
Número de animais entre parênteses.
A = imuno-reatividade ausente
*p<0,05, **p<0,008 e ***p<0,0004 em relação a C (test t Student pareado, bicaudal).
ArcNH: núcleo arqueado hipotalâmico; Pe: núcleo periventricular hipotalâmico; PVN: núcleo
paraventricular hipotalâmico; RCh: núcleo retroquiasmático hipotalâmico; SO: núcleo
supraóptico hipotalâmico.
94
Figura 14. Imuno-reatividade à CD13 (CD13-ir) observada em cortes coronais do encéfalo de rato. Núcleo paraventricular (em destaque) do
animal controle (A) e do animal controle privado de alimento (B) (aspecto semelhante a MSG e MSG privado de alimento). Bregma -1,44 mm.
Barras = 30 µm.
95
Tabela 12. Densidade de CD26-ir no SNC de animais controles normais (C), normais
privados de alimento (C-P), tratados com glutamato monossódico (MSG) e tratados com
glutamato monossódico e privados de alimento (MSG-P).
Regiões C C-P MSG MSG-P
ArcNH
306 ± 11
(3)
490 ± 34
**
(3)
144 ± 16
**
(3)
292 ± 26
(3)
DG
147 ± 24
(3)
A A A
DMH
14 ± 1
(3)
27 ± 1
**
(3)
10 ±1
(3)
A
fi
31 ± 6
(3)
A A A
Pe
63 ± 12
(3)
134 ± 20
*
(3)
52 ± 10
(3)
144 ± 24
*
(3)
PM
425 ± 37
(3)
58 ± 7
***
(3)
256 ± 21
*
(3)
51 ± 5
***
(3)
PVN
47 ± 5
(3)
88 ± 7
**
(3)
A A
RCh
12 ± 1
(3)
41 ± 8
*
(3)
138 ± 11
***
(3)
A
SO
8 ± 1
(3)
A 79 ± 1
***
(3)
A
Valores são média ± EPM.
Número de animais entre parênteses.
A = imuno-reatividade ausente
*p<0,05, **p<0,009 e ***p<0,0001 em relação a C (test t Student pareado, bicaudal).
ArcNH: núcleo arqueado hipotalâmico; DG: giro denteado hipocampal; DMH: núcleo
hipotalâmico dorsomedial; fi: fímbria; Pe: núcleo periventricular hipotalâmico; PVN: núcleo
paraventricular hipotalâmico; RCh: núcleo retroquiasmático hipotalâmico; SO: núcleo
supraóptico hipotalâmico.
96
Figura 15. Imuno-reatividade à CD26 (CD26-ir) observada em cortes coronais do encéfalo de
rato. Pia máter (em destaque) do animal controle (A) e do animal MSG privado de alimento
(B). Bregma -2.12 mm. Barras = 30 µm.
97
Figura 16. Imuno-reatividade à CD26 (CD26-ir) observada em cortes coronais do encéfalo de rato. Núcleo retroquiasmático (em destaque) do
animal controle (A) e do animal MSG (B). Bregma -1.44 mm. Barras = 30 µm.
98
Figura 17. Fotomicrografia de cortes coronais (40 µm) do encéfalo de rato. Evidenciando
neurônios Fos-ir considerados na contagem (setas pretas).
99
Tabela 13. Densidade de Fos-ir no SNC de animais controles normais (C), normais privados
de alimento (C-P), tratados com glutamato monossódico (MSG) e tratados com glutamato
monossódico e privados de alimento (MSG-P).
Regiões C C-P MSG MSG-P
AH
63 ± 12
(3)
51 ± 9
(3)
27 ± 5
*
(3)
60 ± 7
(3)
ArcNH
437 ± 66
(3)
352 ± 31
(3)
347 ± 62
(3)
101 ± 24
**
(3)
DMH
577 ± 111
(3)
443 ± 69
(3)
12 ± 2
**
(3)
239 ± 41
*
(3)
Pe
121 ± 16
(3)
78 ± 5
(3)
16 ± 1
**
(3)
16 ± 2
**
(3)
PVN
207 ± 16
(3)
135 ± 14
*
(3)
66 ± 7
**
(3)
30 ± 5
***
(3)
RCh
155 ± 20
(3)
65 ± 7
*
(3)
22 ± 4
**
(3)
66 ± 11
*
(3)
SO
25 ± 3
(3)
A A A
VMH
408 ± 80
(3)
74 ± 13
*
(3)
A 118 ± 22
*
(3)
Valores são média ± EPM.
Número de animais entre parênteses.
A = imuno-reatividade ausente
*p<0,05, **p<0,009 e ***p<0,0006 em relação a C (test t Student pareado, bicaudal).
AH: área anterior do hipotálamo; ArcNH: núcleo arqueado hipotalâmico; DMH: núcleo
hipotalâmico dorsomedial; Pe: núcleo periventricular hipotalâmico; PVN: núcleo
paraventricular hipotalâmico; RCh: núcleo retroquiasmático hipotalâmico; SO: núcleo
supraóptico hipotalâmico; VMH: núcleo hipotalâmico ventromedial.
100
Figura 18. Imuno-reatividade à Fos (Fos-ir) observada em cortes coronais do encéfalo de rato. Núcleo retoquiasmático do animal controle (A) e
do animal MSG (B) (aspecto semelhante ao encontrado nos animais normais e MSG, ambos privados de alimento). Bregma -1,60 mm. Barra =
30 µm.
101
Figura 19. Imuno-reatividade à Fos (Fos-ir) observada em cortes coronais do encéfalo de rato. Núcleo paraventricular do animal controle (A) e
do animal MSG privado de alimento (B) (aspecto semelhante ao encontrado nos animais normais privados de alimento e obesos MSG). Bregma -
1,6 mm. Barras = 30 µm.
102
6. DISCUSSÃO
6.1. Validação do procedimento de obtenção das frações solúvel e de membrana e
interferência do Triton X-100 na quantificação das atividades peptidásicas em fração de
membrana
Sendo a desidrogenase láctica um reconhecido marcador citosólico (HOSOKAWA et al.
1992, NORABERG et al. 2007), a obtenção de maior teor desta atividade enzimática em
fração solúvel que em fração de membrana, de ambas as estruturas sob estudo, reflete a
eficiência do procedimento de fracionamento adotado. Neste sentido, o rendimento mais
adequado seria aquele em que fosse alcançada a maior diferença no teor de desidrogenase
láctica entre as duas frações. Porém, há variações quanto ao teor celular de desidrogenase
láctica, considerando-se que, obviamente, não se trata somente de um marcador, mas de
enzima metabolicamente ativa. Sobretudo, até o momento, não há qualquer referência na
literatura preconizando uma razão ideal de atividade desidrogenase láctica que deva ser
adotada para aferir o rendimento ideal do processo de fracionamento empregado. Outro
importante indicador da eficiência desse fracionamento foi a presença da atividade
aminopeptidase neutra insensível à puromicina somente na fração de membrana do
hipotálamo e hipocampo, a qual é uma atividade enzimática reconhecidamente restrita à
fração de membrana de tecido cerebral (GILLESPIE et al. 1992, IRAZUSTA et al. 2003,
LARRINAGA et al. 2005).
Uma vez que, após reduzir a presença do Triton X-100 por adsorção em Bio-beads, a
atividade aminopeptidase neutra insensível à puromicina diminuiu no hipocampo e a atividade
103
dipeptidil peptidase IV diminuiu no hipotálamo, não se adotou este procedimento ao longo do
presente estudo. A diminuição destas atividades, em ambos os tecidos, após a adsorção do
Triton X-100, pode ser atribuída à susceptibilidade destas proteínas para a desnaturação e/ou
proteólise durante o acréscimo de tempo demandado pelo protocolo de adsorção (2 horas), o
qual retarda a armazenagem da fração de membrana a – 80ºC.
6.2. Parâmetros biométricos e glicemia
Tabela 14. Sumário das alterações encontradas nos parâmetros biométricos
C-P
MSG
MSG-P
Massa Corporal
=
▼ ▼
Comprimento Naso-anal
=
▼ ▼
Índice de Lee
▼ ▲ ▲
Gordura Periepididimal
= = =
Gordura Periepididimal
(% relativa à massa corporal)
=
▲
=
Gordura Retroperitoneal
=
▲ ▲
Gordura Retroperitoneal
(% relativa à massa corporal )
=
▲ ▲
Glicemia
= = =
Aumento (▲), diminuição (▼) ou similaridade (=) em relação aos controles.
Animais: normais privados de alimento (C-P), tratados com glutamato monossódico (MSG) e
tratados com glutamato monossódico e privados de alimento (MSG-P).
Os animais obesos MSG apresentam a massa corporal absoluta e comprimento naso-anal
menores, enquanto o índice de Lee é maior que nos animais controles normais. O maior índice
de Lee reflete a adiposidade no modelo MSG porque a razão da massa corporal em relação ao
comprimento naso-anal é maior nos animais obesos MSG que nos animais controles normais.
O menor comprimento naso-anal dos animais obesos MSG deve-se ao decréscimo na secreção
do GH (BLOCH et al. 1984, SHAPIRO et al. 1986). No presente estudo observa-se que o
104
índice de Lee decai durante a privação de alimento dos animais normais, mas não dos obesos
MSG, sugerindo maior dificuldade dos obesos em perder massa corporal no jejum,
comparativamente aos animais normais.
Além do índice de Lee, comprimento naso-anal e massa corporal, utilizou-se a massa dos
depósitos de gordura periepididimal e retroperitoneal como parâmetros comparativos entre
animais controles normais e obesos MSG. Há diversas classificações para os depósitos de
tecido adiposo. Alguns autores classificam-no como abdominal subcutâneo e intra-abdominal
(JENSEN 1997, CHAN et al. 2004), sendo este último subdividido em gordura omental
(visceral), mesentérica e retroperitoneal (WAJCHENBERG 2000). Vários trabalhos apontam
o excesso de gordura visceral como sendo o principal problema relacionado à obesidade e
subseqüente síndrome metabólica (JENSEN 1997, WAJCHENBERG 2000,
WAJCHENBERG et al. 2002, CHAN et al. 2004, DESPRÉS e LEMIEUX 2006). A
obesidade induzida pelo tratamento neonatal com MSG, em ratos, é caracterizada como
hipertrófica; i.e. há um aumento no conteúdo das células de gordura (REMKE et al. 1988,
MACHO et al. 2000), o que implicaria na diferença no aspecto dos depósitos de gordura
retroperitoneal, observada no presente trabalho, entre os animais normais e os tratados com
MSG. Os resultados do presente estudo não evidenciaram diferença quantitativa significativa
na massa absoluta dos depósitos de gordura periepididimal entre os tratamentos, apesar deste
depósito visualmente parecer espalhar-se por uma área maior nos animais MSG, em relação
aos controles. Trata-se de um resultado importante, pois deve significar que a afirmação de
outros autores (MACHO et al. 2000, RACEK et al. 2001) quanto ao aumento da massa
periepididimal em ratos obesos MSG é baseada no valor percentual relativo à massa corporal
absoluta destes animais, comparado com a massa percentual relativa desse mesmo depósito
nos animais controles e/ou, ainda, no aspecto visual e na distribuição local e não em sua
medida (massa) absoluta. Deixando de considerar a ausência de diferença do valor absoluto
105
da massa periepididimal entre animais normais e obesos MSG perde-se uma importante
informação acerca das características diferenciais dos depósitos de gordura e de uma possível
causa para o desenvolvimento de intolerância à glicose e resistência à insulina (HIRATA et al.
1997, MACHO et al. 2000, DOLNIKOFF et al. 2001), neste modelo experimental, conforme
discutido nos parágrafos seguintes. A captação de glicose pela gordura periepididimal e,
conseqüentemente, o acúmulo de triacilglicerol na gota lipídica podem ser naturalmente
menos eficientes, comparativamente a gordura retroperitoneal, e/ou podem estar prejudicados
nos animais obesos MSG aos 90 dias de idade; isto antes do estabelecimento efetivo e mais
tardio do diabetes melito tipo 2 nestes animais, pois conforme mostrado no presente estudo
estes foram normoglicêmicos nesta faixa etária.
Quanto ao depósito de gordura retroperitoneal, os animais MSG e MSG privados de
alimento apresentaram maior massa desta gordura que os controles, apesar de terem uma
menor massa corporal absoluta. Da mesma forma que nos controles, em relação aos normais
privados de alimento, a massa corporal absoluta dos ratos obesos MSG foi similar a dos MSG
privados de alimento, mostrando que o regime de privação adotado não tem efeito sobre este
parâmetro.
Os níveis de glicemia nos animais normais privados de alimento, MSG e MSG privados
de alimento também não apresentaram diferenças em relação aos animais controles normais.
Isso mostra que no balanço geral há normalidade da captação da glicose nos animais MSG,
independentemente da privação de alimento. Essa normalidade justificar-se-ia pela maior
sensibilidade dos adipócitos do depósito de gordura retroperitoneal dos animais MSG à
insulina. Dessa forma, os adipócitos desse depósito captariam mais glicose que os do depósito
periepididimal, servindo de substrato para a formação de triacilglicerol e levando a um
aumento da gota lipídica nessa célula e da massa deste depósito de gordura, observada nos
animais MSG em relação aos animais controles normais. Considerando que o depósito de
106
gordura periepididimal seria menos sensível à insulina, o aumento do depósito de gordura
retroperitoneal e a sobrecarga de sua função é que devem contribuir para o estabelecimento
tardio do diabetes melito tipo 2 na condição de obesidade induzida por MSG (HIRATA et al.
1997, DOLNIKOFF et al. 2001), ou seja o aumento da quantidade da gordura retroperitoneal
seria decisivo para a deterioração da sensibilidade à insulina e diminuição na secreção desse
hormônio, gradativamente elevando a glicemia (SCHAWARTZ e PORTE 2005). Corrobora
esta possibilidade o fato de que os níveis glicêmicos dos animais controles normais
correlacionam-se negativamente tanto com a massa dos depósitos de gordura retroperitoneal
quanto com o índice de Lee. Então, embora o aumento nos níveis de glicose plasmática possa
ser inicialmente acompanhado por um aumento compensatório na secreção de insulina, esta
capacidade das células β pancreáticas tende a esgotar-se ao longo do tempo. Ainda, neste
sentido, foram observadas correlações lineares positivas entre depósitos de gordura
periepididimal e retroperitoneal nos animais controle normais e normais privados de alimento,
as quais não existem nos animais tratados com MSG e MSG privados de alimento,
constituindo mais um achado que corrobora a tendência ao desenvolvimento do diabetes tipo
2 por resistência à insulina nos obesos e que pode ter origem nos depósitos de gordura
retroperitoneal. A análise de correlação também foi veemente em demonstrar como são
deterioradas as inter-relações normais entre os parâmetros estudados neste modelo de
obesidade, pois nenhuma das correlações detectadas nos animais normais se mantém em
animais obesos MSG.
6.3. Atividade catalítica e expressões protéica e gênica de aminopeptidase neutra sensível
e insensível à puromicina, CD13, dipeptidil peptidase IV sensível e insensível à diprotina
e CD26
107
Além das alterações na biossíntese, deve-se considerar a eventual influência, causada por
modulação, retroalimentação e/ou alterações na proteólise da proteína correspondente, na
interpretação das alterações da atividade catalítica da aminopeptidase neutra e dipeptidil
peptidase IV observadas entre os diferentes tratamentos. Por exemplo, a afinidade da
aminopeptidase A (EC 3.4.11.7) por substratos sintéticos aminoacil-MCAs é modulada por
cálcio (GOTO et al. 2008); a atividade leucil-aminopeptidase (EC 3.4.11.1) é retroalimentada
negativamente pelo teor de vasopressina, a qual promove a translocação de sua forma solúvel
para a membrana (MASUDA et al. 2003).
Quanto as divergências no sentido das alterações da atividade catalítica e expressão
protéica observadas no presente estudo, em função dos diferentes tratamentos, deve-se
considerar que alterações de conformação e danos ao tráfego intracelular, por modificações
pós-traducionais, tal como a perda de sítios de glicosilação da dipeptidil peptidase IV (FAN et
al. 1997), podem afetar a atividade catalítica, sem implicar em alterações da expressão
protéica. Por outro lado, as proteínas CD13 e CD26 não apresentam somente funções
catalíticas, de modo que sua expressão protéica não necessariamente implicaria em atividade
catalítica. Por exemplo, a proteína CD13 é receptora do coronavírus humano (HCoV-229E)
(WENTWORTH e HOLMES 2001, LI et al. 2007), enquanto a CD26 vem sendo apontada
como receptora de plasminogênio (GONZALEZ-GRONOW et al. 2008).
Quanto às divergências no sentido das alterações das expressões protéica e gênica
observadas no presente estudo, em função dos diferentes tratamentos, deve-se notar,
obviamente, que a análise de PCR adotada não distingue a expressão das formas solúvel e
membranal das proteínas sob estudo. Além disso, entre outros fatores, as divergências podem
ser resultantes de degradação do RNA, como, por exemplo, pelos chamados microRNAs
(miRNA). O miRNA é a classe de genes reguladores mais abundantes, ao menos 44 desses
genes foram encontrados distribuídos por 13 regiões do SNC de camundongos, incluindo o
108
hipotálamo e hipocampo (BAK et al. 2008). Estudos recentes indicam que muitos miRNAs
podem causar o rápido decaimento do mRNA alvo, reduzindo a quantidade de proteína
traduzida pelo mRNA (SHYU et al. 2008). Além da degradação de RNA por miRNA, as
divergências no sentido das alterações das expressões protéica e gênica observadas podem ser
causadas por splicing alternativo. Após a transcrição, as moléculas de mRNA sofrem retirada
de íntrons e junção de éxons (splicing). Porém, em aproximadamente 74% dos genes
codificadores de proteínas, o que ocorre é o splicing alternativo, ou seja, a retirada diferencial
de seqüências específicas de éxons do mRNA maduro. Uma forma crucial de geração de
diversidade protéica é a variação de splices de um único transcrito, que pode produzir
isoformas protéicas com funções distintas ou antagonistas (BLAUSTEIN et al. 2007).
Sobretudo, na interpretação comparativa dos resultados da atividade catalítica, ELISA,
Western blotting, PCR e imuno-histoquímica é preciso considerar as diferentes sensibilidades
de cada metodologia e a escolha de prioridades para o presente estudo, em função da qual
adotou-se a abordagem mais aprofundada (expressão gênica e protéica) da aminopeptidase
neutra insensível à puromicina/CD13 (menos abundante no SNC que a aminopeptidase
neutral sensível à puromicina, conforme mostra o presente estudo), tendo em vista a
perspectiva de continuidade do presente estudo com a aminopeptidase neutral sensível à
puromicina e a incerteza quanto a identidade definitiva da aminopeptidase neutra insensível à
puromicina com a CD13 (EC 3.4.11.2) no SNC. O estudo da CD26 (EC 3.4.14.5) também foi
priorizado porque não havia certeza da identidade desta proteína com a dipeptidil peptidase
IV no SNC.
Estudos adicionais serão necessários para abordar as possibilidades supramencionadas.
Porém, independentemente da identificação gênica e protéica das atividades catalíticas sob
estudo e dos mecanismos que induzem as alterações observadas, as alterações da atividade
catalítica, sob determinado tratamento ou situação fisiopatológica, têm significado próprio,
109
dada sua implicação em alterações na degradação de peptídeos substratos relacionados, o que
repercute na funcionalidade destes.
6.3.1. Aminopeptidase neutra
A influência da puromicina sobre a hidrólise do substrato sintético L-Ala-β-naftilamida
corrobora dados da literatura que apontam a existência de duas diferentes atividades de
aminopeptidase neutra no SNC (IRAZUSTA et al. 2003, LARRINAGA et al. 2005). Uma
delas é sensível à puromicina (PSA, EC 3.4.11.14) e está presente nas frações solúvel e de
membrana, a outra é insensível à puromicina (APM, EC 3.4.11.2) e está localizada
exclusivamente na fração de membrana. O presente estudo mostrou que o inibidor canônico
de dipeptidil peptidase IV, diprotina A, também diferencia as atividades aminopeptidase
neutra sensível e insensível à puromicina, uma vez que diminuiu ou não afetou a atividade
aminopeptidase neutra insensível à puromicina, mas aumentou a atividade aminopeptidase
neutra sensível à puromicina no hipotálamo, hipocampo e plasma. Os níveis de atividade
catalítica da aminopeptidase neutra sensível e da insensível à puromicina de animais controles
normais também diferem, predominando a aminopeptidase neutra sensível à puromicina em
ambas as frações e tecidos e a aminopeptidase neutra insensível à puromicina no plasma. A
atividade aminopeptidase neutra sensível à puromicina foi predominante na fração solúvel no
hipotálamo e hipocampo, enquanto a expressão protéica de CD13 foi predominante na fração
de membrana do hipotálamo e na fração solúvel do hipocampo, em animais controles
normais. As proteínas aminopeptidase neutra sensível e a insensível à puromicina apresentam
homologia estrutural (CONSTAM et al. 1995), mas não se sabia se seriam reconhecidas pelo
110
anticorpo anti-CD13, embora genes distintos sejam responsáveis pela transcrição dos mRNA
da aminopeptidase neutra sensível e da insensível à puromicina em humanos. O gene da
aminopeptidase neutra sensível à puromicina está localizado no cromossomo 17 (17q21) e o
gene da aminopeptidase neutra insensível à puromicina (CD13) está no cromossomo 15
(15q25-q26) (RIEMANN et al. 1999). Os resultados do presente estudo referem-se à
expressão do gene da aminopeptidase neutra insensível à puromicina (NM_001150). Nada se
sabe sobre a regulação da transcrição e tradução das aminopeptidases neutra sensível e
insensível à puromicina e CD13 no SNC de animais obesos, mas alguns estudos mostram que
em células endoteliais a transcrição do gene da aminopeptidase neutra insensível à puromicina
é regulada pelo proto-oncogene c-Maf (HEDGE et al. 1998, MAHONEY et al. 2007). O c-
Maf, em linfócitos T CD4
+
, é modulado por um miRNA, o MiR-155 (RODRIGUEZ et al.
2007).
6.3.1.1. Aminopeptidase neutra hipotalâmica
Tabela 15. Sumário das alterações encontradas para a aminopeptidase neutra hipotalâmica
Aminopeptidase neutra hipotalâmica
Atividada catalítica Western blotting APM/CD13
PSA FS
PSA FM
APM
FS FM
APM/CD13 mRNA
C-P
▼
= =
▲ ▼
=
MSG
▼
= =
▲
▼
▼
MSG-P
= = =
▲
▼
▼
Aumento (▲), diminuição (▼) ou similaridade (=) em relação aos controles.
Animais: normais privados de alimento (C-P), tratados com glutamato monossódico (MSG) e
tratados com glutamato monossódico e privados de alimento (MSG-P).
APM: aminopeptidase neutra insensível a puromicina; PSA: aminopeptidase neutra sensível à
puromicina; FS: fração solúvel; FM: fração de membrana.
111
Tendo em vista os resultados sumarizados na Tabela 15, observa-se, em relação aos
animais controles normais, concordância entre a diminuição da expressão protéica de CD13
membranal e gênica da aminopeptidase neutra insensível à puromicina nos animais MSG e
MSG privados de alimento, os quais não apresentaram alterações da atividade aminopeptidase
neutra membranal insensível à puromicina. Dessa forma, confirma-se que a proteína
membranal expressa no hipotálamo corresponde à aminopeptidase neutra insensível à
puromicina e apresenta teor reduzido, principalmente em função da condição de obesidade
MSG (concordância com a expressão gênica), o qual não tem reflexo detectável em sua
atividade catalítica de aminopeptidase neutra. Comparativamente aos animais controles
normais, o aumento da expressão protéica de CD13 na fração solúvel dos animais normais
privados de alimento e MSG privados de alimento, concomitantemente com a diminuição da
atividade aminopeptidase neutra sensível à puromicina, indica que são proteínas distintas;
ambas moduladas de forma oposta em função da condição de privação de alimento. Outro
dado que diferencia as proteínas aminopeptidase neutra sensível e a insensível à puromicina é
que a sensível está aumentada e a insensível inalterada ou inibida pela diprotina. Então, os
dados obtidos mostram a existência de duas proteínas hipotalâmicas homólogas relacionadas
com a aminopeptidase neutra: a aminopeptidase neutra insensível à puromicina (CD13) unida
à membrana e a aminopeptidase neutra sensível à puromicina (solúvel e unida à membrana).
Ainda, sugerem haver outra proteína solúvel estruturalmente similar a aminopeptidase neutra
insensível à puromicina/CD13, que deve ser codificada por outro gene. Há um relato sobre a
existência de uma aminopeptidase purificada, exclusivamente do SNC, denominada
aminopeptidase neural, que também é sensível à puromicina, abundante no citoplasma e com
reação cruzada com anticorpo anti-aminopeptidase neutra sensível à puromicina, mas
cineticamente diferente desta (HUI et al. 1998). A diminuição da expressão protéica de CD13
observada na fração membranal do hipotálamo nos animais privados de alimento, MSG e
112
MSG privados de alimento, sem alteração da atividade peptidásica, sugere que essa proteína
possa atuar como receptor, sem função catalítica. Ainda, como algumas aminopeptidases que
fazem parte do MHC II, seu sítio imuno-reativo pode estar bloqueado (VILLADANGOS et al.
1999, 2000).
A aminopeptidase neutra sensível à puromicina, na fração solúvel hipotalâmica (não
investigada, no presente estudo, quanto à expressão protéica e gênica), foi aquela cuja
atividade catalítica de aminopeptidase neutra mostrou-se afetada pela privação de alimento,
tanto nos animais normais quanto nos obesos MSG. A redução da atividade aminopeptidase
neutra sensível à puromicina, na fração solúvel do hipotálamo destes animais, em relação aos
controles normais, deve diminuir a degradação de peptídeos envolvidos na regulação do
balanço energético como, por exemplo, somatostatina, opióides endógenos e vasopressina
(BRAY 2000, VOLKOFF et al. 2005, COTA et al. 2006, BAVOUIS e DAUZONNE 2006).
Então, a redução da aminopeptidase neutra sensível à puromicina nos animais MSG seria um
dos fatores determinantes do maior teor de opióides (orexígenos) detectado em obesos
(JAROSZ et al. 2007) e, conseqüentemente, contribuiria com o desequilíbrio energético. Esta
redução da aminopeptidase neutra sensível à puromicina, em relação aos animais controles
normais, seria independente do teor de gordura retroperitoneal, pois esta correlaciona-se
positivamente com esta atividade enzimática na fração solúvel do hipotálamo dos animais
MSG. No caso dos animais normais privados de alimento, a redução da atividade
aminopeptidase neutra sensível à puromicina condiz com a necessidade de ingestão de
alimento (efeito orexígeno do aumento do teor de opióides). Durante a privação alimentar
ocorre redução do gasto energético, da expressão do mRNA da leptina (diminui cerca de 50-
80%, após 24 h de privação alimentar), do teor de peptídeos anorexígenos e, por sua vez,
aumento da liberação de peptídeos orexígenos, inclusive de opióides (BECK 2006, MORAN
2006, CRANE et al. 2007). Além disso, a diminuição da aminopeptidase neutra sensível à
113
puromicina, observada nos animais obesos MSG, resultaria no aumento do teor de
vasopressina e de angiotensina III no SNC. Sabe-se que no plasma de obesos há teores de
angiotensina II elevados em relação a indivíduos normais (SEGURA e RUILOPE 2007) e que
a conversão da angiotensina II em angiotensina III resulta em estímulo para a liberação de
vasopressina (ZINI et al. 1996). Inclusive, ambas (vasopressina e angiotensina III) são fatores
promotores de vasoconstrição (WEIHPRECHT et al. 1991) que podem contribuir para o
desenvolvimento de hipertensão em obesos.
6.3.1.2. Aminopeptidase neutra hipocampal
Tabela 16. Sumário das alterações encontradas para a aminopeptidase neutra hipocampal
Aminopeptidase neutra hipocampal
Atividada catalítica Western blotting APM/CD13
PSA FS
PSA FM
APM
FS FM
APM/CD13 mRNA
C-P
=
= =
▲ ▲ ▲
MSG
=
= =
=
▲
=
MSG-P
=
▲
=
=
▲
▲
Aumento (▲) ou similaridade (=) em relação aos controles.
Animais: normais privados de alimento (C-P), tratados com glutamato monossódico (MSG) e
tratados com glutamato monossódico e privados de alimento (MSG-P).
APM: aminopeptidase neutra insensível a puromicina; PSA: aminopeptidase neutra sensível à
puromicina; FS: fração solúvel; FM: fração de membrana.
Confrontando os resultados sumarizados nas Tabelas 15 e 16, confirma-se que a proteína
expressa no hipocampo corresponde à aminopeptidase neutra insensível à puromicina, a qual
apresenta teor aumentado em função da privação de alimento (inclui-se a expressão gênica) e
da condição de obesidade MSG que, por sua vez, também não tem reflexo detectável em sua
atividade catalítica de aminopeptidase neutra.
114
O aumento da atividade aminopeptidase neutra sensível à puromicina membranal no
hipocampo dos animais MSG privados de alimento, em relação aos controles, favorece a
degradação de somatostatina e opióides. O hipocampo é reconhecido como uma importante
área na modulação de comportamentos alimentares relacionados ao estado emocional
(WANG et al. 2006, DAVIDSON et al. 2007). Por outro lado, a obesidade tem sido
relacionada a doenças neurodegenerativas como o Alzheimer, na qual há degeneração
hipocampal (RAZAY et al. 2006, WHITMER 2007). Neste sentido, este aumento de
aminopeptidase neutra membranal sensível à puromicina pode ter relação com a
neurodegeneração nos animais MSG. Há cada vez mais evidências de que a obesidade
também exerce efeitos adversos no desempenho cognitivo (ELIAS et al. 2003, GUNSTAD et
al. 2006). Por exemplo, homens idosos obesos parecem apresentar mais dificuldade na
memória e fluência verbal (ELIAS et al. 2003). Além disso, a incidência de transtorno de
déficit de atenção/hiperatividade (ADHD) é elevada em indivíduos obesos e está relacionada
ao índice de massa corporal (ALTFAS 2002, FASSINO et al. 2003). A somatostatina tem um
papel neuroprotetor (FORLONI et al. 1997) e está envolvida com os processos de memória e
aprendizagem (BOEHM e BETZ 1997, NAKAGAWASAI et al. 2000), com a regulação da
proteína β-amilóide e, conseqüentemente, com a doença de Alzheimer (PANCHAL et al.
2004, IWATA et al. 2005, SAITO et al. 2005). A encefalina e a dinorfina também têm grande
importância nos processos de aprendizagem e memória (SIMMONS e CHAYKIN 1996,
DRAKE et al. 2007). Ainda, a estimulação gástrica em sujeitos obesos ativa regiões cerebrais,
inclusive o hipocampo, envolvidas no desejo obsessivo/compulsivo pela droga, observado em
viciados, o que sugere que os circuitos cerebrais envolvidos na motivação do uso de drogas
sejam similares àqueles envolvidos com a motivação da ingestão alimentar (WANG et al.
2006). Os opióides endógenos, além de estarem envolvidos com comportamento alimentar
(COTA et al. 2006), participam dos mecanismos centrais envolvidos na dependência
115
fisiológica (COTA et al. 2006) e compartilham os mesmos receptores com os opióides
exógenos (DRAKE et al. 2007). Os opióides modulam a plasticidade sináptica e regulam a
neurogênese hipocampal em adultos (SIMMONS e CHAYKIN 1996, DRAKE et al. 2007).
Em indivíduos obesos, os níveis plasmáticos de opióides estão aumentados em relação a
indivíduos normais (ATKINSON 1987). Considerando estes dados, a correlação positiva
entre aminopeptidase neutra solúvel sensível à puromicina do hipocampo e a glicemia nos
animais MSG privados de alimento, significa diminuição desta atividade enzimática na
hipoglicemia (animais privados de alimento = hipoglicemia). Esta diminuição implica em
redução do metabolismo de opióides, contribuindo com o aumento do teor destes peptídeos,
adicionalmente àquele devido ao aumento de sua liberação (aumento do teor de opióides e de
seu efeito orexígeno = vontade de ingerir alimento) na situação de privação alimentar
(hipoglicemia) (MORAN 2006), na ausência (privação alimentar) do estímulo de recompensa
(desejo obsessivo/compulsivo por alimento).
6.3.1.3. Aminopeptidase neutra plasmática
Tabela 17. Sumário da ausência de alterações da aminopeptidase neutra plasmática
C-P MSG MSG-P
PSA PLASMA
= = =
APM PLASMA
= = =
Similaridade (=) em relação aos controles.
Animais: normais privados de alimento (C-P), tratados com glutamato monossódico (MSG) e
tratados com glutamato monossódico e privados de alimento (MSG-P).
PSA: aminopeptidase neutra sensível à puromicina; APM: aminopeptidase neutra insensível a
puromicina.
116
Apesar da ausência de efeito dos tratamentos sobre os teores absolutos das atividades
catalíticas de aminopeptidases neutra sensível e insensível à puromicina no plasma, as
correlações destas atividades com vários outros parâmetros sob estudo são sugestivas. Por
exemplo, no caso da aminopeptidase neutra insensível à puromicina a correlação negativa
com o depósito de gordura retroperitoneal nos animais normais privados de alimento é um
indicativo de que o elevado nível plasmático de hormônio do crescimento encontrado durante
a privação alimentar (NØRRELUND et al 2002) esteja relacionado à modulação (redução)
dos níveis de somatostatina circulante por esta enzima. Além da modulação pela
aminopeptidase neutra insensível à puromicina, a presença da correlação positiva entre o
comprimento naso-anal e a aminopeptidase neutra sensível à puromicina nos animais normais
privados de alimento sugere que esta enzima também esteja envolvida na regulação da
somatostatina, visto que o aumento dos seus níveis de atividade causaria a diminuição dos
níveis de somatostatina, e conseqüentemente, o aumento do nível plasmático de hormônio do
crescimento. O mecanismo de regulação do nível plasmático de hormônio do crescimento
parece não ser ativado em animais com status energético em equilíbrio (animais controles
normais), uma vez que nestes não há correlação entre o depósito de gordura retroperitoneal e
esta enzima plasmática, sugerindo a existência de um limiar desencadeador do mecanismo de
regulação do nível do hormônio do crescimento vinculado à duração da inanição. Sabe-se que
o modelo experimental de obesidade adotado no presente estudo (e aqui confirmamos isto)
ocasiona lesão hipotalâmica, a qual implica numa menor produção/liberação do hormônio
liberador do hormônio do crescimento e, conseqüentemente, no decréscimo da secreção do
hormônio do crescimento (BLOCH et al. 1984, SHAPIRO et al. 1986). DePAOLO e
STEGER (1985) relatam que, neste modelo de obesidade, em comparação com animais
normais, a concentração de somatostatina hipotalâmica e plasmática está reduzida; a tecidual,
na região gastro-entero-hepática, está aumentada; e, mesmo com reposição hormonal do
117
hormônio do crescimento, os níveis plasmáticos de somatostatina não normalizam. Como não
há correlação da aminopeptidase neutra plasmática insensível à puromicina com quaisquer
dos parâmetros biométricos (gordura retroperitoneal, massa corporal e índice de Lee) nos
obesos MSG, é possível que o controle da concentração de somatostatina do plasma pela
aminopeptidase neutra insensível à puromicina esteja desabilitado em obesos.
6.3.1.4. Distribuição e análise densitométrica da imuno-reatividade a CD13
Sabe-se que a proteína aminopeptidase neutra sensível à puromicina está amplamente
distribuída no hipotálamo, córtex, hipocampo, glândula pineal, entre outras regiões do SNC
(ALPONTI et al. 2005, BANEGAS et al. 2006). O presente estudo avaliou a distribuição da
CD13-ir no hipotálamo e no hipocampo, permitindo confirmar a presença de intensa CD13-ir
nos corpos celulares de neurônios magnocelulares do núcleo supraóptico hipotalâmico, onde
observou-se um aumento da CD13-ir nos animais MSG, em relação aos animais controle. No
núcleo paraventricular, CD13-ir nos animais controle e MSG, ambos privados de alimento,
assim como nos animais obesos MSG, apresentou-se reduzida em relação aos animais
controle. Ambos os núcleos, supraóptico e paraventricular, são responsáveis pela produção de
vasopressina e ocitocina que, por sua vez, modulam a ingestão de alimento (BRAY 2000,
VALASSI et al. 2008). Dessa forma, o aumento da CD13-ir no núcleo supraóptico dos
animais MSG, sugere que a aminopeptidase neutra atue no sentido de estabilizar as
concentrações de vasopressina em indivíduos obesos, enquanto que na privação alimentar, a
diminuição da CD13-ir nos núcleos supraóptico e paraventricular dos animais normais e
MSG, seria justificada pela diminuição dos níveis de vasopressina e de outros peptídeos
118
anorexígenos liberados pelo núcleo paraventricular. No núcleo periventricular ocorreu a
diminuição de corpos celulares CD13-ir nos animais MSG privados de alimento, em relação
aos animais controles. Neste núcleo há células em contato com o fluido cerebrospinal, que são
sensíveis a alterações de osmolalidade e da concentração de neurotransmissores presentes no
fluído cerebrospinal, um tipo filogeneticamente antigo de transmissão não sináptica (VIGH et
al. 2004). No núcleo retroquiasmático a CD13-ir foi menor nos animais normais privados de
alimento, em relação aos controles. Este núcleo apresenta neurônios CART estimulados pela
leptina, os quais também co-expressam mRNA POMC (ELMQUIST 2001). A β-endorfina,
derivado da hidrólise da molécula POMC, também é um substrato da aminopeptidase neutra
insensível à puromicina/CD13 (FURUHASHI et al. 1988) e, portanto, a presença desta
imuno-reatividade neste local tem justificativa fisiológica. Ainda, observou-se acentuada
CD13-ir no núcleo arqueado, que é o núcleo mais importante na regulação do metabolismo
energético (ARORA e ANUBHUTI 2006). O fato de que somente os animais normais e
MSG, ambos privados de alimento, apresentaram diminuição na CD13-ir no núcleo arqueado,
em relação ao controle, corrobora a hipótese de regulação de peptídeos anorexígenos pela
proteína CD13. Esse núcleo possui receptores para peptídeos opióides (encefalinas e
dinorfinas) e neurônios que expressam POMC (COTA et al. 2006). O hipocampo não
apresentou CD13-ir em nenhum dos tratamentos avaliados no presente estudo, embora essa
região esteja envolvida em processos de aprendizagem e memória e possua neurônios que
expressam os dois principais peptídeos opióides endógenos, a encefalina e a dinorfina
(substratos da APM/CD13), conhecidos por modularem a excitabilidade hipocampal e a
neurogênese (DRAKE et al. 2007).
119
6.3.2. Dipeptidil peptidase IV
A diprotina A foi considerada até pouco tempo como um inibidor específico da atividade
dipeptidil peptidase IV. No entanto, atualmente sabe-se que não há uma única enzima com
atividade dipeptidil peptidase IV (MAES et al. 2007) e que estas também são inibidas pela
diprotina, como é o caso da dipeptidil peptidase 8 e da dipeptidil peptidase 9 (QI et al.2003).
Os resultados obtidos no presente estudo mostraram que na presença de diprotina A ocorre
inibição parcial da atividade dipeptidil peptidase IV nas frações solúvel e membranal do
hipotálamo e hipocampo e no plasma, o que distingue a existência de duas atividades:
dipeptidil peptidase IV sensível à diprotina (DPPIV-DS) e insensível à diprotina (DPPIV-DI).
O inibidor da aminopeptidase neutra (puromicina) mostrou-se capaz de influenciar também a
atividade dipeptidil peptidase IV total, especialmente nas frações solúvel e de membrana do
hipotálamo e hipocampo (evidentemente em menor grau que para a aminopeptidase neutra
sensível à puromicina). Nos animais controles normais, o nível de atividade catalítica de
dipeptidil peptidase IV sensível e insensível à diprotina na fração solúvel não difere em
ambos os tecidos, mas no plasma é maior para a insensível à diprotina. Porém, é notável que
na fração de membrana de animais controles normais o nível de atividade catalítica difere
entre os tecidos sob estudo, sendo menor no hipotálamo e maior no hipocampo para a
dipeptidil peptidase IV sensível à diprotina, relativamente a dipeptidil peptidase IV insensível
à diprotina. A proteína CD26 (EC 3.4.14.5) apresenta homologia estrutural com dipeptidil
peptidase 8 e dipeptidil peptidase 9 (não classificadas pelo “Enzyme Nomeclature
Commission") e com a proteína ativadora de fibroblastos α (FAPα) (EC 3.4.21.B28). No
entanto, somente a dipeptidil peptidase 8 tem sido encontrada no SNC (FRERKER et al.
2007). No presente estudo, o anticorpo anti-CD26 (contra EC 3.4.14.5), utilizado no ELISA, é
120
monoclonal. Assim, os resultados de ELISA obtidos devem corresponder à CD26 canônica.
Quanto à atividade catalítica, observa-se que nos animais controles normais há predominância
da atividade dipeptidil peptidase IV insensível à diprotina em relação à sensível à diprotina, e
do teor de CD26 (ELISA) membranal do hipotálamo em relação a forma solúvel, enquanto
que no hipocampo ocorre o inverso, ou seja, diminuição da atividade dipeptidil peptidase IV
insensível à diprotina em relação à sensível à diprotina, bem como diminuição do teor de
CD26 (ELISA) membranal em relação a forma solúvel. Esses dados sugerem fortemente que
a proteína CD26 é a que apresenta atividade dipeptidil peptidase IV insensível à diprotina.
Sabe-se que o gene da CD26 em humanos está localizado no cromossomo 2 (2q24.2) e o gene
da dipeptidil peptidase 8 está no cromossomo 15 (15q22) (FRERKER et al. 2007), sendo que
os resultados de PCR apresentados aqui referem-se à expressão do gene da CD26
(NM_012789.1). Já os resultados obtidos no Western blotting com anticorpo anti-CD26
policlonal podem corresponder a quaisquer dos homólogos da CD26. Gum et al. (2000)
identificou uma região 5’-flanqueadora, o promotor da dipeptidil peptidase IV (ainda não
identificado), de múltiplos conjuntos de elementos ligados ao DNA e fatores de transcrição,
mas nada se sabe sobre a regulação da transcrição e tradução de dipeptidil peptidase IV no
SNC de animais obesos. Cumpre notar que o presente estudo traz o primeiro relato sobre a
distinção das atividades dipeptidil peptidase IV sensível e insensível à diprotina no SNC.
6.3.2.1. Dipeptidil peptidase IV hipotalâmica
Tabela 18. Sumário das alterações encontradas para a dipeptidil peptidase IV hipotalâmica
121
Dipeptidil peptidase IV hipotalâmica
Atividada catalítica
CD26
ELISA
(monoclonal)
Western
blotting
CD26
(policlonal)
DPPIV-
DS
FS
DPPIV-
DS
FM
DPPIV-
DI
FS
DPPIV-
DI
FM
FS FM FS FM
CD26
mRNA
C-P
= = = = =
▼
▲
=
▲
MSG
= =
▼
▼
▼
=
=
▲
=
MSG-P
▼
=
▼
=
▼
=
▲
= =
Aumento (▲), diminuição (▼) ou similaridade (=) em relação aos controles.
Animais: normais privados de alimento (C-P), tratados com glutamato monossódico (MSG) e
tratados com glutamato monossódico e privados de alimento (MSG-P).
DPPIV-DS: dipeptidil peptidase IV sensível à diprotina; DPPIV-DI: dipeptidil peptidase IV
insensível à diprotina; FS: fração solúvel; FM: fração de membrana solubilizada.
Considerando os resultados sumarizados na Tabela 18, observa-se que o sentido das
alterações das atividades catalítica dipeptidil peptidase IV sensível e insensível à diprotina
não se opõe ao sentido das alterações do teor de CD26 (ELISA), em ambas as formas, solúvel
e membranal, o que sugere uma identidade comum. Nos animais controles normais a
expressão gênica de CD26 é maior no hipocampo que no hipotálamo. No entanto, em fração
membranal o teor de CD26 (ELISA) e a atividade catalítica de dipeptidil peptidase IV foram
maiores no hipotálamo que no hipocampo. O teor de CD26 (ELISA) em fração solúvel
também é maior no hipotálamo que no hipocampo. Portanto, a expressão gênica de CD26 não
corresponde exatamente à sua completa expressão protéica no hipocampo. Observa-se
também que o teor de CD26 (ELISA) membranal é maior que o solúvel no hipotálamo,
enquanto que no hipocampo ocorre o inverso. Ainda, nos animais controles normais
predomina a atividade catalítica dipeptidil peptidase IV insensível em relação à sensível à
diprotina, tanto no hipotálamo quanto no hipocampo. Além de apontarem diferentes
prevalências de cada uma das formas de dipeptidil peptidase IV estudadas (solúvel,
membranal, sensível e insensível à diprotina A) nestas duas áreas cerebrais, esses dados
sugerem fortemente que a proteína CD26 é a que apresenta atividade dipeptidil peptidase IV
122
insensível à diprotina. Tanto no hipotálamo como no hipocampo é preciso ainda considerar
que as divergências quanto ao sentido das alterações de conteúdo de proteína e expressão
gênica de CD26 e atividade catalítica dipeptidil peptidase IV discutidos nos tópicos seguintes
são compatíveis com a conhecida função receptora das proteínas homólogas à CD26
transdutora de sinais intracelulares (MENTLEIN 2004, PACHECO et al. 2005, HAVRE et al.
2008). Sobretudo, este é o primeiro relato sobre a distinção de duas formas de atividade
dipeptidil peptidase IV relacionadas à inibição por diprotina A no SNC.
O teor de atividade catalítica dipeptidil peptidase IV insensível à diprotina no hipotálamo
diminui nos animais obesos MSG (em ambas as formas, solúvel e membranal), acompanhado
de alteração no mesmo sentido na proteína CD26, detectável em fração solúvel destes animais
e também de animais obesos MSG privados de alimento, bem como em fração de membrana
de animais normais privados de alimento, comparativamente aos controles. A alteração da
dipeptidil peptidase IV sensível à diprotina em relação aos controles foi bem menos
expressiva, ocorrendo seu decréscimo somente na fração solúvel em animais submetidos aos
dois estímulos sob estudo (obesos MSG privados de alimento). As alterações de atividade
catalítica de dipeptidil peptidase IV (principalmente do tipo insensível à diprotina) no
hipotálamo devem promover alterações nos teores de neuropeptídeo Y (NPY), peptídeo
glucagon-símile tipo 1 e β-endorfina (GORRELL 2005, BJELKE et al. 2006, FRERKER et
al. 2007). O neuropeptídeo Y e a β-endorfina estão aumentados em indivíduos obesos
(DHILLO e BLOOM 2001, VOLKOFF et al. 2005, ARORA e ANUBHUTI 2006,
SCHAWARTZ e PORTE Jr 2005). A atividade dipeptidil peptidase IV promove a hidrólise
de neuropeptídeo Y (1-36) e gera o produto neuropeptídeo Y (3-36), o qual possui maior
afinidade ao receptor Y2 (MENTLEIN 1999). O Y2, por ser um receptor principalmente pré-
sináptico, modula (reduz) a liberação de neuropeptídeo Y (1-36) pelo neurônio pré-sináptico
(BERGLUND et al. 2003, KAMIJI e INUI 2007) e o neuropeptídeo Y (3-36), por ter maior
123
afinidade com esse receptor, seria importante nessa modulação. Assim, a diminuição da
atividade dipeptidil peptidase IV hipotalâmica deve contribuir com o desequilíbrio do balanço
energético nas situações estudadas, pois permitiria um maior teor de neuropeptideo Y (1-36) e
β-endorfina.
6.3.2.2. Dipeptidil peptidase IV hipocampal
Tabela 19. Sumário das alterações encontradas para a dipeptidil peptidase IV hipocampal
Dipeptidil peptidase IV hipocampal
Atividada catalítica
CD26
ELISA
(monoclonal)
Western
blotting
CD26
(policlonal)
DPPIV-
DS
FS
DPPIV-
DS
FM
DPPIV-
DI
FS
DPPIV-
DI
FM
FS FM FS FM
CD26
mRNA
C-P
=
▼
=
▲
▲
▲
▼
=
=
MSG
=
▼
=
▲
=
▲
▼
▼
=
MSG-P
▼
= =
▲
▼
▲
▼
▼
=
Aumento (▲), diminuição (▼) ou similaridade (=) em relação aos controles.
Animais: normais privados de alimento (C-P), tratados com glutamato monossódico (MSG) e
tratados com glutamato monossódico e privados de alimento (MSG-P).
DPPIV-DS: dipeptidil peptidase IV sensível à diprotina; DPPIV-DI: dipeptidil peptidase IV
insensível à diprotina; FS: fração solúvel; FM: fração de membrana solubilizada.
Embora o hipotálamo seja identificado como a estrutura cerebral que está envolvida com o
sensoriamento da saciedade, adiposidade e fome, o processamento final desses sinais pode
depender de regiões cerebrais envolvidas com controle comportamental, como, por exemplo,
o hipocampo (DAVIDSON et al. 2007). O hipocampo recebe sinais do status energético
vindos da periferia, via nervo vago (DAVIDSON et al. 2007) e possui grande densidade de
receptores de neuropeptídeo Y (XAPELI et al. 2007) e de opióides (SIMMONS e
124
CHAVIKIN 1996, EVA et al. 2006). As alterações de atividade catalítica de dipeptidil
peptidase IV hipocampal, sumarizadas na Tabela 19, podem ser relacionadas com a
modulação do neuropeptídeo Y na situação de estresse. O neuropeptídeo Y tem um
importante papel ansiolítico em estruturas límbicas, e sabe-se que o estresse causa o aumento
da sua expressão e liberação (SAJDYK et al. 2004, ARORA e ANUBHUTI 2006,
CARVAJAL et al. 2006). A atividade dipeptidil peptidase IV insensível à diprotina solúvel e
membranal no hipocampo dos animais normais privados de alimento apresentou correlação
negativa com a massa corporal e, também, com o índice de Lee, enquanto os animais MSG
privados de alimento apresentaram correlação positiva entre a dipeptidil peptidase IV
membranal insensível à diprotina e o depósito de gordura periepididimal. Isso corrobora a
hipótese de que o aumento da atividade de dipeptidil peptidase IV contribua com um aumento
da ansiedade em indivíduos obesos privados de alimento. O aumento do teor de CD26
(ELISA) membranal do hipocampo (há também uma tendência ao aumento da atividade
enzimática de dipeptidil peptidase IV) nos animais normais privados de alimento, MSG e
MSG privados de alimento, em relação aos animais controles normais, também sugere que a
dipeptidil peptidase IV possa estar relacionada ao estresse causado pela privação alimentar e
obesidade (SCOTT et al. 2008a,b). No entanto, na fração membranal do hipocampo, um
achado aparentemente paradoxal é que a mesma atividade catalítica de dipeptidil peptidase IV
apresenta sentido oposto de alteração quando na presença de diprotina, i.e. a insensível à
diprotina aumenta em animais normais privados de alimento, MSG e MSG privados de
alimento, enquanto a sensível à diprotina diminui em animais normais privados de alimento e
MSG privados de alimento, relativamente aos animais controles normais. Isto mostra que
ambas as formas de dipeptidil peptidase IV, insensível e sensível à diprotina, são proteínas
diferentes, apesar da atividade catalítica similar, indicando que estejam inter-relacionadas
fisiologicamente, já que o aumento da atividade da forma insensível à diprotina (e teor de
125
CD26 ELISA) deve compensar a diminuição da forma sensível à diprotina (e teor de CD26
reconhecido pelo anticorpo policlonal) nos animais normais privados de alimento, MSG e
MSG privados de alimento. Esta intrigante possibilidade pode estar relacionada à necessidade
de um controle refinado e redundante nesta área crítica do SNC. Ainda, assim como no
hipotálamo, divergências quanto ao sentido das alterações de expressão protéica e atividade
catalítica de dipeptidil peptidase IV no hipocampo são compatíveis com a função receptora
das proteínas homólogas à CD26.
6.3.2.3. Dipeptidil peptidase IV plasmática
Tabela 20. Sumário das alterações encontradas para a dipeptidil dipeptidase IV plasmática
Plasma C-P
MSG
MSG-P
DPPIV-DS
= = =
DPPIV-DI
= =
▼
Diminuição (▼) ou similaridade (=) em relação aos controles.
Animais: normais privados de alimento (C-P), tratados com glutamato monossódico (MSG) e
tratados com glutamato monossódico e privados de alimento (MSG-P).
DPPIV-DS: dipeptidil peptidase IV sensível à diprotina; DPPIV-DI: dipeptidil peptidase IV
insensível à diprotina.
A diminuição do valor absoluto da atividade dipeptidil peptidase IV plasmática insensível
à diprotina nos animais MSG privados de alimento em relação aos animais controles normais
vem adicionar mais uma evidência sobre o papel desta atividade catalítica nos distúrbios
metabólicos e reforçar importante achado anterior que mostrou que camundongos que não
possuem dipeptidil peptidase IV estão protegidos contra obesidade e resistência a insulina
(CONARELLO et al. 2003). Além desta alteração, o presente estudo mostra que a dipeptidil
peptidase IV plasmática insensível à diprotina correlaciona-se com parâmetros biométricos
126
em obesos (massa corporal) e obesos privados de alimento (massa corporal, gordura
periepididimal e índice de Lee). A falta de dipeptidil peptidase IV (CONARELLO et al. 2003)
e a diminuição de seu teor plasmático (presente estudo) devem estar associados com
alterações no teor plasmático dos vários peptídeos susceptíveis de hidrólise por esta enzima,
por exemplo promovendo níveis elevados de GLP-1 e melhorando o controle metabólico,
respectivamente em camundongos com genes de DPPIV cronicamente silenciados e em
jejum, comparativamente a ratos obesos MSG saciados.
6.3.2.4. Distribuição e análise densitométrica da imuno-reatividade a CD26
Apesar do destaque com que a CD26 vem sendo considerada nos últimos anos, devido ao
papel terapêutico dos inibidores da atividade dipeptidil peptidase IV no diabetes tipo 2, não
existem relatos anteriores sobre a distribuição da CD26 no SNC. No presente estudo,
detectou-se CD26-ir nos núcleos arqueado, dorsomedial, periventricular, retroquiasmático e
supraóptico hipotalâmicos. O núcleo arqueado é o núcleo mais importante na regulação do
metabolismo energético (ARORA e ANUBHUTI 2006), pois sintetiza neuropeptideo Y e
possui receptores para leptina e insulina (ZIGMAN e ELMQUIST 2003, WYNNE et al. 2005,
ARORA e ANUBHUTI 2006), os quais modulam a síntese e liberação de neuropeptídeo Y
(ZIGMAN e ELMQUIST 2003, WYNNE et al. 2005, ARORA e ANUBHUTI 2006). Durante
a privação alimentar ocorre o aumento de peptídeos orexígenos, entre eles os opióides e
neuropeptídeo Y, substratos da dipeptidil peptidase IV, o que justificaria o aumento de CD26-
ir neste núcleo. No entanto, os animais obesos MSG apresentaram diminuição da CD26-ir no
núcleo arqueado, o que pode ser resultante da lesão causada pelo glutamato monossódico
127
neste núcleo nos animais obesos MSG. Ainda, evidenciou-se um aumento da CD26-ir nos
animais MSG, em relação aos animais controles, no núcleo supraóptico, que é um dos núcleos
responsáveis pela síntese de vasopressina. Sabe-se que o teor de neuropeptídeo Y encontra-se
elevado em obesos (FRERKER et al. 2007) e altera a liberação de vasopressina (LEIBOWITZ
1991), justificando a presença de corpos celulares CD26-ir nesse núcleo. No núcleo
periventricular hipotalâmico também observou-se o aumento de CD26-ir nos animais normais
e MSG, ambos privados de alimento. Como mencionado anteriormente, esse núcleo possui
neurônios em contato com fluido cerebroespinal e, portanto é sensível a alterações na
composição desse fluido. O aumento de CD26-ir sugere o envolvimento dessa proteína na
regulação do metabolismo energético durante a privação alimentar, visto que há um aumento
do teor de peptídeos como neuropeptideo Y e β-endorfina (ARORA e ANUBHUTI 2006,
COTA et al. 2006). No núcleo retroquiasmático ocorre maior CD26-ir nos animais MSG e
nos animais normais privados de alimento e uma redução da CD16-ir nos animais MSG
privados de alimento. Este núcleo expressa mRNA POMC (ELMQUIST 2001). Como a
dipeptidil peptidase IV hidrolisa β-endorfina, derivado da POMC (FURUHASHI et al. 1988),
é provável que o aumento de CD26-ir neste núcleo também esteja relacionado com a
atividade dipeptidil peptidase IV da CD26, mas neste local atuando no controle do conteúdo
de β-endorfina. A CD26-ir no núcleo dorsomedial aumentou nos animais controle privados de
alimento e diminuiu nos animais MSG privados ou não de alimento. Esse núcleo tem uma
função integradora, visto que recebe projeções de vários outros núcleos hipotalâmicos,
principalmente do núcleo arqueado (BERNARDIS e BELLINGER 1998, WYNNE et al.
2005). Assim, o aumento de CD26-ir observado nos animais normais privados de alimento
indica que tal qual em alguns dos núcleos já citados, a CD26 atuaria no controle de peptídeos
orexígenos, como o neuropeptídeo Y. No entanto, a lesão causada pelo MSG no núcleo
arqueado dos animais obesos provavelmente causou a diminuição da CD26-ir no núcleo
128
dorsomedial, como conseqüência da diminuição das projeções vindas do núcleo arqueado,
assim como do núcleo paraventricular. Da mesma forma, nota-se uma diminuição da CD26-ir
também no núcleo paraventricular dos animais MSG, privados ou não de alimento. Este
núcleo também recebe projeções do núcleo arqueado.
Observou-se CD26-ir no hipocampo somente nos animais controle normais, e em apenas
duas regiões, a fímbria e o giro denteado. A fímbria é uma região rica em fibras nervosas e é
importante para o transporte de sinais hipocampais para outras regiões do encéfalo, e a
diminuição da CD26-ir nos animais normais privados de alimento, obesos MSG, privados ou
não de alimento, provavelmente resulta em alterações na integração do hipocampo com outras
regiões cerebrais. Já o giro denteado, além de sua importância nos processos de aprendizagem
e memória, possui interneurônios GABAérgicos que contém neuropeptídeo Y, o qual modula
(reduz) a excitabilidade do hipocampo através dos receptores pré-sinápticos Y2 (SPERK et al.
2007), pelos quais o neuropeptídeo Y (3-36) (resultante da hidrólise do neuropeptídeo Y (1-
36) pela dipeptidil peptidase IV) possui maior afinidade. Dessa forma, a diminuição da CD26-
ir no hipocampo dos animais normais privados de alimento e obesos MSG, privados ou não
de alimento, pode levar a um aumento da excitabilidade hipocampal devido a diminuição dos
teores de neuropeptídeo Y (3-36).
Outro achado interessante foi a presença de corpos celulares CD26-ir na pia-máter, a
meninge mais interna (delgada e recobre toda a superfície do encéfalo, adentrando nas
fissuras corticais) e rica em astrócitos. CD26-ir apresenta-se reduzida nesta meninge de
animais normais privados de alimento e obesos MSG, privados ou não de alimento, em
relação aos animais controles. Os astrócitos são importantes células da neuroglia e possuem
diversas funções, entre elas a regulação de neurotransmissores por meio de proteínas
transportadoras ancoradas a membrana que removem neurotransmissores da fenda sináptica,
como é o caso dos transportadores de glutamato (LEE et al. 2007).
129
6.3.3. Correlações entre as atividades enzimáticas da aminopeptidase neutra sensível e
insensível à puromicina e dipeptidil peptidase IV sensível e insensível à diprotina A.
As atividades catalíticas de dipeptidil peptidase IV insensível à diprotina e aminopeptidase
neutra sensível à puromicina, na fração solúvel do hipotálamo, nos animais controles normais,
correlacionam-se positivamente. Nos animais normais privados de alimento, correlacionam-se
positivamente as atividades dipeptidil peptidase IV insensível à diprotina e aminopeptidase
neutra sensível à puromicina, na fração de membrana do hipotálamo e na fração solúvel do
hipocampo. Este padrão de inter-relação sugere a tendência de ação sinérgica dessas
atividades (dipeptidil peptidase IV insensível à diprotina e aminopeptidase neutra sensível à
puromicina), especialmente hipotalâmicas, na condição de normalidade fisiológica,
independentemente da privação de alimento. Nos animais normais privados de alimento
também correlacionam-se positivamente as atividades dipeptidil peptidase IV insensível à
diprotina e dipeptidil peptidase IV sensível à diprotina, e dipeptidil peptidase IV sensível à
diprotina e aminopeptidase neutra sensível à puromicina, na fração de membrana do
hipotálamo. No plasma dos animais normais privados de alimento, correlacionam-se
negativamente as atividades dipeptidil peptidase IV sensível à diprotina e aminopeptidase
neutra sensível à puromicina. Este padrão de inter-relação sugere a privação de alimento
como fator independente que influencia, no mesmo sentido, as atividades membranais de
dipeptidil peptidase IV sensível e insensível à diprotina e aminopeptidase neutra sensível à
puromicina no hipotálamo, e a possível ação antagônica de dipeptidil peptidase IV sensível à
diprotina e aminopeptidase neutra sensível à puromicina circulantes na situação de privação
130
alimentar. As atividades aminopeptidase neutral sensível e insensível à puromicina
correlacionam-se positivamente na fração de membrana do hipocampo dos animais obesos
MSG. As atividades aminopeptidase neutra sensível à puromicina e dipeptidil peptidase IV
insensível à diprotina correlacionam-se positivamente na fração de membrana do hipocampo
dos animais MSG privados de alimento. Este padrão de inter-relação sugere a obesidade MSG
como fator independente que influencia, no mesmo sentido, as atividades membranais de
aminopeptidase neutra sensível e insensível à puromicina e dipeptidil peptidase IV insensível
à diprotina, no hipocampo. No caso deste padrão de inter-relação observado no hipocampo
dos animais obesos MSG, é notável a concordância com (i) a ação hidrolítica da dipeptidil
peptidase IV insensível à diprotina sobre o neuropeptídeo Y (1-36), formando neuropeptídeo
Y (3-36), e o seu significado fisiológico, i.e. maior afinidade do neuropeptídeo Y (3-36) pelo
receptor Y2 (BIJAK 1999), promovendo efeito ansiogênico (CARVAJAL et al. 2006a); e (ii)
com a ação hidrolítica das aminopeptidases neutra sensível e insensível à puromicina e
dipeptidil peptidase IV sobre a β-endorfina (FURUHASHI et al. 1988) e, ainda, das
aminopeptidases neutra sensível e insensível à puromicina sobre outros opióides (SAFAVI e
HERSH 1995, SONG e MARVIZON 2003, LUAN e XU 2007), cujo significado fisiológico
deve relacionar-se com prejuízos às sensações de recompensa e bem-estar (ESCH e
STEFANO 2004, COTA et al. 2006).
7. Distribuição e análise densitométrica da imuno-reatividade a Fos
Sabe-se que a imuno-reatividade a Fos está aumentada nos núcleos hipotalâmicos
supramamilar e dorsomedial de camundongos obesos e na parte mediana do núcleo
131
perifornical hipotalâmico de camundongos magros, após privação de alimento (HUANG &
WANG 1998). No presente trabalho, observou-se uma diminuição da Fos-ir no núcleo
dorsomedial nos animais obesos MSG, privados ou não de alimento. O modelo experimental
utilizado no presente estudo causa lesões no núcleo arqueado (LEIGH et al. 1992,
DOLNIKOFF et al. 2001), o que deve justificar o resultado contraditório observado no núcleo
dorsomedial nestes animais. Além disso, foi relatado que uma dieta de gorduras saturadas
modula a atividade neuronal hipotalâmica, avaliada pela imuno-reatividade a Fos, num padrão
consistente com seus efeitos obesogênicos (WANG et al. 1999). O núcleo ventromedial
também apresentou diminuição da Fos-ir nos animais normais privados de alimento, obesos
MSG, privados ou não de alimento, em relação aos controles, provavelmente por estes
animais não estarem saciados, já que o núcleo ventromedial é conhecido com centro da
saciedade. A ativação do núcleo arqueado nos animais tratados com MSG e privados de
alimento foi menor em relação aos animais controle, sugerindo uma diminuição da produção
de peptídeos anorexígenos e orexígenos, provavelmente prejudicada em função da lesão nesse
núcleo. Os núcleos paraventricular, retroquiasmático e supraóptico apresentaram diminuição
da For-ir nos animais normais privados de alimento, MSG e MSG privados de alimento,
resultando na diminuição da produção dos peptídeos orexígenos ou anorexígenos por esses
núcleos. Nos animais normais ou tratados não ocorreu Fos-ir no hipocampo.
8. Aspectos comparativos da ativação neuronal e glial e da distribuição de CD13 e CD26
na obesidade induzida por MSG e na privação alimentar
O mesmo sentido de alteração entre os teores de Fos-ir e CD13 (ambos diminuíram)
ocorreu no núcleo paraventricular hipotalâmico dos animais normais privados de alimento,
132
MSG e MSG privados de alimento, no núcleo periventricular hipotalâmico dos animais MSG
privados de alimento e nos núcleos arqueado e supraóptico dos animais normais privados de
alimento e MSG privados de alimento, o que pode significar uma menor produção de CD13
e/ou provavelmente de peptídeos anorexigênicos. Por exemplo, ocitocina, vasopressina e
hormônio liberador de tireotrofina são produzidos no núcleo paraventricular (VALASSI et al.
2008) e já é conhecido que durante a privação alimentar ocorre uma diminuição do teor de
peptídeos anorexigênicos (BERTILE et al. 2003), sendo que o decréscimo de CD13-ir deve
contribuir no estabelecimento deste teor neste núcleo.
No presente estudo os teores de Fos-ir e CD26 tiveram o mesmo sentido de alteração
(ambas diminuíram) no núcleo dorsomedial dos animais MSG privados de alimento, no
núcleo paraventricular dos animais MSG e MSG privados de alimento, no núcleo
retroquiasmático dos animais MSG privados de alimento e no núcleo supraóptico dos animais
normais privados de alimento e MSG privados de alimento. Essa diminuição também pode ser
interpretada no sentido de uma menor produção de CD26 e/ou do teor de peptídeos
produzidos nessas áreas.
Sentidos opostos de alteração entre os teores de Fos-ir e CD13 ocorreram no núcleo
supraóptico dos animais MSG e no núcleo retroquiasmático dos animais MSG e MSG
privados de alimento, enquanto Fos-ir e CD26 apresentaram sentidos opostos de alterações no
núcleo retroquiasmático dos animais normais privados de alimento e MSG, no núcleo
arqueado dos animais normais privados de alimento, MSG e MSG privados de alimento, no
núcleo periventricular dos animais normais privados de alimento, MSG e MSG privados de
alimento, no núcleo paraventricular dos animais normais privados de alimento, no núcleo
supraóptico dos animais MSG e no núcleo dorsomedial dos animais normais privados de
alimento. Uma das explicações para isso seria a existência de regulações de CD13 e CD26
133
(para baixo e para cima) induzidas nessas situações por células com expressão alterada de
Fos-ir nessas áreas cerebrais.
134
9. Quadro geral dos resultados obtidos e implicações sugeridas
Resultados Implicações
inalteração da massa absoluta do depósito
de gordura periepididimal dos obesos MSG
em relação aos animais controles normais
- menor captação de glicose e do preenchimento da gota
lipídica periepididimal em relação a retroperitoneal
- tendência para o desenvolvimento de resistência à insulina,
em função da maior exigência (compensatória) deste
hormônio pela gordura retroperitoneal aumentada nos
obesos MSG
aumento da massa dos depósitos de
gordura retroperitoneal dos obesos MSG
em relação aos animais controles normais
hipertrofia da gordura retroperitoneal é a principal
manifestação da obesidade MSG
glicemia inalterada entre os tratamentos
sob estudo
Funcionamento normal do mecanismo de captação de
glicose no obeso MSG e na privação de alimento
identidade da APM com a CD13
APM/CD13 predominantemente unida à membrana no
hipotálamo e predominantemente solúvel no hipocampo
identidade da PSA
distinta da APM e predominantemente solúvel; existência
de mais de um homólogo distinto da APM
identidade da DPPIV-DI com a CD26
DDPIV/CD26 é insensível à diprotina e predominantemente
unida à membrana no hipotálamo e predominantemente
solúvel no hipocampo
DPPIV-DS não identificada
DPPIV sensível à diprotina no hipotálamo e hipocampo
(predominantemente unida à membrana) pode ser DPP2 ou
DPP8
redução da atividade PSA (solúvel) do
hipotálamo em privados de alimento e
obesos MSG
aumento do teor de peptídeos orexígenos (opióides), AVP e
somatostatina
aumento da atividade PSA (membranal) do
hipocampo em obesos MSG privados de
alimento
diminuição do teor de AVP, somatostatina e peptídeos
orexígenos (opióides) relacionada a efeitos anorexígenos,
neurodegenerativos e deletérios na aprendizagem e memória
diminuição da atividade DPPIV-DI
(solúvel e membranal) e DPPIV-DS
(solúvel) do hipotálamo em obesos MSG e
obesos MSG privados de alimento
aumento do teor de peptídeos orexígenos (NPY) relacionada
a efeito deletério no balanço energético
alterações antagônicas da atividade DPPIV
DI e DS (membranal) do hipocampo de
privados de alimento e obesos privados ou
não de alimento
mecanismo compensatório para a manutenção do teor de
peptídeos orexígenos (NPY) (balanço entre efeito
ansiogênico e ansiolítico)
alterações da expressão protéica de CD13
sem alteração da atividade catalítica APM
em privados de alimento e obesos MSG
privados ou não de alimento
população alterada de receptores CD13?
alterações da expressão protéica de CD26
sem alteração da atividade catalítica
DPPIV-DI e DS em privados de alimento e
obesos MSG privados ou não de alimento
população alterada de receptores CD26?
aumento de CD13-ir no SO dos animais
obesos
possível relação com os níveis de AVP
aumento de CD26-ir no SO dos animais
obesos
possível regulação da ação do NPY sobre a AVP
redução da ativação neural no PVN, RCh e
SO dos animais normais privados de
alimento, obesos MSG privados ou não de
alimento
diminuição da produção de peptídeos anorexígenos ou
orexígenos
135
10. PERSPECTIVAS
O presente trabalho caracterizou as peptidases estudadas e sua relação com a obesidade e
privação alimentar. Vários aspectos desta integração necessitam ser aprofundados, tais como,
avaliação de alterações conformacionais e regulação da tradução e transcrição gênica da
APM, PSA e enzimas DPPIV-símiles no SNC, nas condições de obesidade MSG e privação
alimentar, a fim de esclarecer quais os mecanismos que induzem as alterações na atividade
catalítica destas peptidases; quantificação dos substratos peptídicos relacionados à APM, PSA
e DPPIV, no hipotálamo e hipocampo, e avaliação de possíveis alterações nas propriedades de
binding destes substratos aos seus receptores, nestes tecidos, nas condições de obesidade
MSG e privação de alimento. Além disso, requer investigação o envolvimento de peptidases,
dentre elas a APM, PSA e as DPPIV-símiles no metabolismo do tecido adiposo nas condições
de obesidade MSG e privação de alimento, e nas alterações dessas atividades mediante a
incubação com peptídeos relevantes para o metabolismo deste tecido.
136
11. CONCLUSÕES
Massa corporal, comprimento naso-anal, índice de Lee e massa dos depósitos de gordura
retroperitoneal alteram-se de forma correlacionada na obesidade induzida por MSG e na
privação alimentar, compondo um padrão compatível com as principais características
descritas deste modelo experimental. A gordura periepididimal acumulada nos obesos
MSG diferencia-se dos controles pela extensão e pela massa relativa, mas não pela massa
absoluta. A relação dos níveis de gordura retroperitoneal e periepididimal com a glicemia
sugere que a tendência ao desenvolvimento do diabetes tipo 2 no obeso MSG deve-se ao
aumento da gordura retroperitoneal.
As atividades catalíticas de PSA e DPPIV-DI e -DS, mas não a APM, bem como as
expressões gênica e protéica de CD13 e CD26 no hipotálamo e hipocampo são alteradas
em obesos MSG e em privados de alimento, demonstrando envolvimento na regulação
endócrina central do balanço energético (provavelmente via atuação sobre NPY, SRIF e
opióides). No hipocampo, o padrão destas alterações é compatível com efeito deletério
sobre o processo de memória e aprendizado (PSA e APM) e comportamento emocional
(DPPIV-DI e DS).
No hipotálamo e hipocampo do rato, a atividade enzimática APM corresponde à proteína
CD13, distinta da PSA, em conformidade com a literatura. Porém, a atividade enzimática
DPPIV-DI corresponde a proteína CD26 canônica, contrariando o conceito corrente de
que a DPPIV canônica é sensível ao inibidor diprotina.
137
A APM (forma predominante da aminopeptidase neutra no plasma) parece relacionada à
privação alimentar. O decréscimo da DPPIV-DI (forma predominante da DPPIV no
plasma) parece ser uma resposta homeostática associada à privação alimentar em ratos
obesos MSG.
CD13-ir e CD26-ir estão amplamente distribuídas no hipotálamo. Em todos os
tratamentos a presença de ambas coincide com a presença de Fos-ir no Pe e ArcNH,
regiões relevantes na regulação do metabolismo energético.
As alterações qualitativas e/ou quantitativas da distribuição da imuno-reatividade à CD13
e à CD26 na obesidade induzida por MSG e na privação alimentar são concordantes com
as alterações de atividade peptidásica e reforçam a hipótese do envolvimento dessas
proteínas na regulação do metabolismo energético.
Proteínas com atividades de aminopeptidase neutra e dipeptidil
peptidásica do tipo IV e/ou homólogas à CD13 ou CD26 são fatores
fisiopatológicos e potenciais alvos farmacológicos em distúrbios do
metabolismo energético.
138
11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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156
ANEXO
• REAGENTES
1-butanol puríssimo (Merck, Brasil)
3’3’ Diaminobenzidina – DAB (Sigma Chemical Co., EUA)
β-naftilamida (Sigma Chemical Co., EUA)
β-nicotinamida adenina di-nucleotídio forma reduzida - NADH (Sigma Chemical Co.,
EUA)
β-mercaptoetanol (BioRad Laboratories, EUA)
ABC Kit Vectastain Elite Standard (Vector Laboratories, EUA)
Ácido acético glacial (Merck, Brasil)
Ácido etilenediaminetetraacético-EDTA (Merck, Brasil)
Ácido L-glutâmico sal monossódico (Sigma Chemical Co., EUA)
Acrilamida ultrapura (Invitrogen Life Technologies, EUA)
Agarose (Amersham Bioscience, Suécia)
Água livre de Rnase e Dnase (Gibco, EUA)
Albumina bovina (Sigma Chemical Co., EUA)
Álcool isopropílico (Merck, Brasil)
Anticorpo anti-β-actina (Sigma Chemical Co., EUA)
Anticorpo anti-CD13 policlonal produzido em coelho (CD13, H-300: sc15360, Santa Cruz
Biotech., USA, Lote D1504)
Anticorpo anti-Fos produzido em coelho (Ab-5, Oncogen, Alemanha)
157
Anticorpo anti-CD26 policlonal produzido em coelho (CD26, H-270: sc9153, Santa Cruz
Biotech., USA, Lote F0304)
Anticorpo anti IgG-peroxidase (Amersham Pharmacia Biotech., EUA)
Anticorpo secundário biotinilado, anti-coelho, produzido em cabra (Vector Laboratories,
EUA, Lote T0730)
Azul de bromofenol (USB Corporation, EUA)
Bio-Beads SM-2 adsorvente (BioRad Laboratories, EUA)
Borato de sódio (Synth, Brasil)
Brometo de etídeo (Amersham Biosciences, Suécia)
CD26s Elisa Human kit (Bender MedSystems, Áustria)
Cloreto de hidrogênio - HCl (Merck, Brasil)
Cloreto de sódio - NaCl (Sigma Chemical Co., EUA)
Cloridrato de cetamina (König, Argentina)
Cloridrato de xilazina (Vetbrands, Brasil)
Clorofórmio (Synth, Brasil)
Coquetel de inibidores de protease (Sigma Chemical Co., EUA)
Dimetil sulfóxido – DMSO (Sigma Chemical Co., EUA)
Diprotina A (Bachem Bioscience Inc., EUA)
DL-ditiotreitol-DTT (Sigma Chemical Co., EUA)
Etanol PA (Merck, Brasil)
Etilenoglicol (Synth, Brasil)
Eukitt (Calibrated Instruments Inc., EUA)
Fixador Kodak (Kodak Co., EUA)
Fosfato de potássio dibásico (Synth, Brasil)
Fosfato de potássio monohidratado (Synth, Brasil)
158
Fosfato de sódio dibásico heptahidratado (Sigma Chemical Co., EUA)
Fosfato de sódio monobásico (Sigma Chemical Co., EUA)
Full-Range Rainbow Molecular Weight Markers (Amersham Biosciences, Suécia)
Glicerol UltraPuro (USB Corporation, EUA)
Glicil-L-prolina-4-metoxi-β-naftilamida (Peninsula Laboratories Inc., EUA)
Glicina ultrapura (BioRad Laboratories, EUA)
Heparina Sódica (Roche, Brasil)
Human sCD26 Elisa (Bender Medsystems, Áustria)
L-alanina-β-naftilamida (Sigma Chemical Co., EUA)
Low mass Ladder (Invitrogen Life Technologies, EUA)
Metanol PA (Merck, Brasil)
Metoxi-β-naftilamida (Sigma Chemical Co., EUA)
N´N´-methylene-bis-acrylamide (USB Corporation, EUA)
Paraformaldeído (Synth, Brasil)
Peróxido de hidrogênio – H
2
O
2
(Synth, Brasil)
Persulfato de amônia (BioRad Laboratories, EUA)
Piruvato (Sigma Chemical Co., EUA)
Poli-L-lisina (Sigma Chemical Co., EUA)
Ponceau S (Sigma Chemical Co., EUA)
Prestained SDS-PAGE standards High Range (BioRad Laboratories, EUA)
Protein Assay Kit (BioRad Laboratories, EUA)
Puromicina (Sigma Chemical Co., EUA)
Revelador Kodak (Kodak Co., EUA)
Sacarose (Synth, Brasil)
Sódio dodecil-sulfato (USB Corporation, EUA)
159
Soro normal de cabra (Vector Laboratories, EUA)
Sulfato de níquel (III) amônio hexahidratado (Sigma Chemical Co., EUA)
SuperScript
TM
One-Step RT-PCR with Platinum
Taq (Invitrogen Life Technologies, EUA)
SuperSignal West Pico Trial Kit (Pierce Biotechnology, EUA)
TEMED (Amersham Biosciences, Suécia)
Tionina (Fisher Scientific, EUA)
Triton X-100 (Union Carbide, EUA)
Trizma base (Sigma Chemical Co., EUA)
Trizol (Invitrogen Life Technologies, EUA)
Tween 20 (BioRad Laboratories, EUA)
Xilol (Labsynth, Brasil)
• SOLUÇÕES DE ROTINA
• Solução Tris Base 0,2 M
Tris Base ......................... 24,2 g
Água destilada ................ q.s.p. 1000 mL
• Solução de HCl 0,2 M
HCl ............................ 6,6 mL
Água destilada ........... q.s.p. 1000 mL
160
• Solução de BioRad
BioRad ....................... 4 mL
Água destilada ........... q.s.p. 20 mL
• Tampão Fosfato
Solução A .................. 9,5 mL
Solução B .................. 40,5 mL
Albumina ................... 0,02 g
Água destilada ........... q.s.p. 100 mL
Solução A Solução B
NaH
2
PO
4
H
2
O .......... 28 g Na
2
H
2
PO
4
7H2O ............. 54 g
Água destilada ........... q.s.p. 1000 mL Água destilada ................ q.s.p 1000 mL
• Tampão Tris/HCl pH 8,3
Solução A .................. 12,5 mL
Solução B .................. 4,2 mL
Albumina ................... 0,01 g
Água destilada ........... q.s.p. 50 mL
Solução A Solução B
C
4
H
11
NO
3
.................. 24,5 g HCl ................................. 6,2 mL
Água destilada ........... q.s.p. 1000 mL Água destilada ................ q.s.p. 1000 Ml
161
Soluções para ensaio da desidrogenase láctica (LDH)
• Tampão de uso
Solução A .................. 1,9 mL
Solução B .................. 8,1 mL
NaCl .......................... 0,23 g
NADH ....................... 0,0028 g
Piruvato de sódio ....... 0,32 mL
Água destilada ........... q.s.p. 20 mL
Solução A Solução B
NaH
2
PO
4
H
2
O .......... 28 g Na
2
H
2
PO
4
7H2O ............. 54 g
Água destilada ........... q.s.p. 1000 mL Água destilada ................ q.s.p 1000 mL
Soluções para Western blotting
• Tampão Tris/HCl 1,5 M pH 8,8
Tris ............................ 45,41 g
Água destilada ........... q.s.p. 250 mL
• Tampão Tris/HCl 0,5 M pH 6,8
162
Tris ............................ 15,13 g
Água destilada ........... q.s.p. 250 mL
• Solução SDS 10%
SDS ............................ 10 g
Água destilada ........... q.s.p. 100 mL
• Solução de acrilamida 30%
Acrilamida ................. 29,2 g
Bis-acrilamida ........... 0,8 g
Água destilada ........... q.s.p. 100 mL
• Persulfato de amônio 10% (APS 10%)
Persulfato de amônio .. 1 g
Água destilada ........... q.s.p. 10 mL
• Tampão de eletroforese
Tris ............................ 3,02 g
Glicina ....................... 14,41 g
163
SDS 10% ................... 10 mL
Água destilada ........... q.s.p. 1000 mL
• Tampão de transferência
Tris ............................ 3,6 g
Glicina ....................... 17,9 g
Água destilada ........... q.s.p. 1000 mL
• Tampão Fosfato (PBS) pH 7,2
NaCl .......................... 85 g
NaH
2
PO
4
H
2
O ........... 11,49 g
Na
2
HPO
4
H
2
O ........... 2,03 g
Água destilada ........... q.s.p. 1000 mL
• Tampão de lavagem
PBS ............................ 100 mL
Tween-20 ................... 2 mL
Água destilada ........... q.s.p. 1000 mL
• Gel de separação 10%
164
Tampão Tris/HCl 1,5 M pH 8,8 ..... 2,5 mL
SDS 10% ........................................ 0,1 mL
Acrilamida 30% ............................. 3,3 mL
APS 10% ........................................ 0,1 mL
TEMED .......................................... 0,01 mL
Água destilada ................................ 4,09 mL
• Gel de empilhamento 4%
Tampão Tris/HCl 0,5 M pH 6,8 ..... 2,5 mL
SDS 10% ........................................ 0,1 mL
Acrilamida 30% .............................. 1,3 mL
APS 10% ........................................ 0,1 mL
TEMED .......................................... 0,01 mL
Água destilada ................................ 6 mL
• Solução de bloqueio 5%
Albumina ........................................ 0,25 g
Tween 20 ......................................... 0,01 mL
Tampão de lavagem ........................ 5 mL
• Solução de Ponceau-S
Corante de Ponceau-S .................... 0,2 g
165
Ácido tricloacético ......................... 3 g
Água destilada ................................ q.s.p. 100 mL
• Tampão de amostra (Tampão Laemmli)
SDS ................................................. 2,4 g
Glicerol ........................................... 12 mL
Tris 150 mM pH 6,8 ....................... 6 mL
Β-mercaptoetanol ........................... 6 mL
Azul de bromofenol ....................... 0,03 g
Água destilada ............................... q.s.p. 25 mL
Soluções para perfusão
• Líquido de perfusão
NaCl ............................................... 9 g
Solução 1 ........................................ 5 mL
Água destilada ................................ q.s.p. 1000 mL
Solução 1
Solução A ....................................... 0,95 mL
Solução B ....................................... 4,05 mL
Água destilada ................................ q.s.p. 10 mL
166
Solução A Solução B
NaH
2
PO
4
H
2
O .......... 28 g Na
2
H
2
PO
4
7H2O ............. 54 g
Água destilada ........... q.s.p. 1000 mL Água destilada ................ q.s.p 1000 mL
• Paraformaldeído 4% pH 9,5
Paraformaldeído ............................. 40 g
NaOH ............................................. 4 g
Borato de sódio ............................... 38,14 g
Água destilada ................................ q.s.p. 1000 mL
• Solução pós-fixadora
Sacarose .......................................... 20 g
Paraformaldeído 4% ....................... 100 mL
• Solução crio-protetora
Sacarose .......................................... 20 g
PBS ................................................. 100 mL
• Solução anti-congelante
PBS ................................................. 500 mL
Sacarose .......................................... 300 g
167
Água destilada ................................ 500 mL
Etilenoglicol ................................... 600 mL
Soluções para imuno-histoquímica
• Tampão fosfato de potássio (KPBS) 0,02 M pH 7,4
NaCl ................................................ 36 g
K
2
HPO
4
........................................... 15,24 g
KH
2
PO
4 ………………………………………….
1,8 g
Água destilada ................................ q.s.p. 4000 mL
• KPBS “loaded”
Triton X-100 ................................... 3 mL
KPBS 0,2 M pH 7,4 ........................ 9997 mL
• Sulfato de níquel amônio 5%
NAS ................................................ 25 g
Água destilada ................................ 500 mL
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