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PATRÍCIA REGINA SANTOS
ATIVIDADE ANTIVIRAL DE ALCALÓIDES SINTÉTICOS β-
CARBOLÍNICOS 1, 3- DISSUBSTITUÍDOS.
MARINGÁ
2008
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
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PATRÍCIA REGINA SANTOS
ATIVIDADE ANTIVIRAL DE ALCALÓIDES SINTÉTICOS β-
CARBOLÍNICOS 1, 3- DISSUBSTITUÍDOS.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas da
Universidade Estadual de Maringá, como requisito
parcial para obtenção do grau de mestre em Ciências
Farmacêuticas.
Orientadora:
Prof
a
Dr
a
Tânia Ueda Nakamura.
Co-orientador:
Prof Dr Celso Vataru Nakamura.
MARINGÁ
2008
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À minha mãe,Vânia pelo amor, amizade, dedicação e
incentivo constante e ao Raphael, meu amor, pela
paciência e compreensão.
AGRADECIMENTOS.
À Prof
a
Dr
a
Tânia Ueda Nakamura pela valiosa orientação, pela confiança em mim
depositada e principalmente pelo meu crescimento profissional e formação
científica. Registro aqui minha eterna gratidão.
Ao Prof Dr Celso Vataru Nakamura pelo incentivo e pelas opiniões experientes
que contribuíram na realização deste trabalho.
Ao Prof Dr Benedito Prado Dias Filho pelo apoio e valiosas sugestões.
À
Prof
a
Dr
a
Maria Helena Sarragioto e Anelise Formagio pelo fornecimento dos
alcalóides sintéticos e pela ajuda.
Ao Prof Dr Benício Alves de Abreu Filho pelo incentivo.
Aos meus familiares, especialmente meus pais, pelo carinho e apoio.
Às amigas Adriana Santos, Amanda Oliveira, Andrea Koroishi, Karine Zanoli,
Helena Takahashi, Regina Santin e Miriam Yamaguchi que através da troca de
experiências, amizade e companheirismo, de forma direta ou indireta, muito me
ajudaram neste trabalho.
Aos colegas de laboratório, pela cordialidade, ajuda e companheirismo.
À técnica Jennifer Bevilaqua pela colaboração.
Ao Programa de Pós-Graduação do Departamento de Farmácia e Farmacologia
desta Universidade e ao corpo técnico/administrativo, pela oportunidade de
realização deste trabalho, apoio e serviços prestados.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico (CNPQ), (FINEP) CAPES
e à Fundação Araucária de Apoio ao Desenvolvimento Científico, pelo auxílio
financeiro.
RESUMO
Os vírus são parasitas intracelulares obrigatórios causadores de inúmeras doenças
humanas. Atualmente o tratamento das infecções virais conta com um arsenal de cerca
de 40 drogas licenciadas, a maioria utilizada para o tratamento da infecção pelo vírus da
imunodeficiência humana (HIV). A toxicidade de muitas drogas desenvolvidas bem
como o rápido surgimento de cepas resistentes às drogas, o aumento de pacientes
imunocomprometidos susceptíveis às infecções virais e o surgimento de novos vírus
patogênicos ao homem, justificam a procura de novos agentes antivirais.
Compostos β-carbolínicos e tetrahidro-β-carbolínicos representam uma grande classe de
alcalóides indólicos naturais e sintéticos que tem apresentado diversas atividades
farmacológicas, dentre elas, atividade antiviral.
O presente trabalho consistiu na avaliação in vitro da atividade antiviral e citotoxicidade
de alcalóides 3-carboidrazil- β-carbolínicos-1-benzossubstituídos frente ao poliovirus e/
ou HSV-1 através do método colorimétrico da sulforrodamina B. A determinação do
índice de seletividade (IS) permitiu a seleção de vários alcalóides com atividade anti-
poliovirus e/ou anti-HSV-1. O alcalóide 1-p-hidroxifenil-3-(p-dimetilaminofenil)-
carbohidrazida-β-carbolina (derivado 4) apresentou um bom índice de seletividade e,
portanto, foi avaliado através do método de redução de placas de lise para verificar um
possível mecanismo de ação. O derivado 4 não foi capaz de proteger as células VERO
da infecção pelo poliovírus na fase de adsorção, penetração e nem apresentou efeito
virucida, mas foi capaz de interferir durante a etapa de replicação do vírus. Estes
resultados sugerem que a substância pode estar interferindo nas etapas da síntese dos
componentes virais, contudo, estudos posteriores são necessários para a compreensão do
mecanismo de ação.
Palavras-chave: atividade antiviral, derivados β-carbolínicos, poliovírus e HSV-1.
ABSTRACT
Viruses are obligate intracelullar parasites that cause several human diseases. Currently,
the treatment to viral infections armamentarium comprises almost 40 licensed antiviral
drugs, most of them have been used for the treatment of human immunodeficiency virus
(HIV) infections. The toxicity of many developed drugs as well as the fast emerge of
drug resistant strains, the increase of imunocompromised patients susceptible to viral
infections and the emerge of new human pathogenic viruses justify the search of new
antiviral agents.
The β-carbolinic and tetrahidro-β-carbolinic compounds represent a great group of
natural and synthetic indolic alkaloids that have performed several pharmacologic
activities, including antiviral activity.
This present work consisted of in vitro evaluation of antiviral activity and cytotoxicity of
3-carboidrazil- β-carbolinic-1-benzossubstituted alkaloids against poliovirus and/or
HSV-1 using the Sulforhodamine B Colorimetric Method. Selectivity index (SI)
determination permitted the selection of many alkaloids with anti-poliovirus and/or anti-
HSV-1 activities. The 1-p-hidroxifenil-3-(p-dimetilaminofenil)-carbohidrazide-β-
carboline alkaloid (derivate 4) showed a good selectivity index, so that it was evaluated
using Plaque Reduction Assay Method to verify its possible mechanism of action.
Derivate 4 wasn’t able to protect VERO cells against poliovirus infection either on
adsortion, or on penetration phases, nor had any virucidal effect although it was able to
interfere during replication virus stage. These results suggest that the substance can
interfere on the viral components synthesis phase, however, further studies are necessary
to understand the mechanism of action.
Keywords: antiviral activity, β-carbolinic derivates, poliovirus and HSV-1.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Compostos β-carbolínicos (a) e tetraidro-β-carbolínicos (b) ....................12
Figura 2 Harmina (R= H) e harmano (R= OCH
3
)....................................................13
Figura 3 Estrutura química do N-butil-harmina.......................................................13
Figura 4 Derivados contendo o grupo metil na posição-1 e grupo carboxamida-
guanidil na posição-3.................................................................................13
Figura 5 Flazina (R=OH) e flazinamida (R=NH
2
)...................................................14
Figura 6 Estrutura química da debromoeudistomina K (a) e debromoeudistomina
U (b)...........................................................................................................14
Figura 7 Obtenção das 3-carboidrazil- β-carbolinas-1-benzossubstituídas.............16
Figura 8 Atividade antiviral do alcalóide 1-p-hidróxifenil-3-(-p-
dimetilaminofenil)-carbohidrazida-β-carbolina por ensaio de redução de
placas no tratamento pós-infecção.............................................................25
Figura 9 Atividade antiviral do alcalóide 1-p-hidróxifenil-3-(-p-
dimetilaminofenil)-carbohidrazida-β-carbolina determinada através do
método colorimétrico da sulforrodamina B...............................................26
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................9
1.1. Poliovírus................................................................................................................9
1.2. Vírus Herpes simplex .......................................................................................... 10
1.3 Quimioterapia antiviral.........................................................................................11
1.4. Alcalóides β-carbolínicos.....................................................................................12
2. OBJETIVOS..........................................................................................................15
3. MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................16
3.1. Síntese dos alcalóides 3-carboidrazil- β-carbolínicos-1-benzossubstituídos .......16
3.2. Cultura de Células ................................................................................................16
3.3. Vírus .....................................................................................................................17
3.4. Drogas...................................................................................................................17
3.5. Citotoxicidade.......................................................................................................17
3.6. Ensaio da atividade antiviral pelo método colorimétrico da sulforrodamina B...18
3.7. Ensaios para avaliar a atividade antiviral nas etapas de interação .......................19
vírus-célula pelo método de redução de placas
3.7.1. Tratamento das células após a infecção viral ....................................................19
3.7.2. Tratamento das células antes da infecção viral .................................................20
3.7.3. Tratamento das células durante a infecção viral................................................20
3.7.4. Efeito virucida ...................................................................................................20
3.8. Ensaios para avaliar a atividade antiviral nas etapas de interação .......................21
3.9. Análise estatística.................................................................................................21
4. RESULTADOS......................................................................................................22
5. DISCUSSÃO..........................................................................................................27
6. CONCLUSÃO........................................................................................................30
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................31
1. INTRODUÇÃO
Os vírus são parasitas intracelulares obrigatórios devido à sua incapacidade em
codificar os componentes necessários para a transcrição autônoma de seus RNAs
mensageiros bem como as enzimas requeridas para a síntese de suas proteínas
(Schneider & Mohr, 2003). Apresentam genoma (DNA ou RNA) envolto por uma capa
protéica (capsídeo) podendo ainda apresentar um envelope lipoprotéico (WAGNER &
HELWLETT, 1999)
Os vírus são capazes de causar inúmeras doenças humanas, tão simples quanto
um resfriado comum, ou fatal como o Ebola e a AIDS (JASSIM & NAJI, 2003). O
primeiro caso conhecido de infecção viral, provavelmente, foi o da varíola, relatado em
2000 anos a.C. na China e leste da Ásia, sendo responsável pela morte de milhões de
pessoas antes de erradicada, contemporaneamente, no final da década de 70
(HENDERSON, 1987). A caxumba, a poliomielite, a influenza e a febre amarela
também são doenças virais conhecidas desde a antiguidade (MIRANDA, 2002).
A inexistência de tratamento eficaz, bem como o aumento de pacientes
imunocomprometidos (portadores do vírus da imunodeficiência humana-HIV, pacientes
transplantados ou submetidos à quimioterapia) susceptíveis às infecções virais, a
toxicidade de muitas drogas desenvolvidas (ERNEST & FRANEY, 1998 ; DE CLERCQ
, 2001a), o rápido surgimento de cepas resistentes às drogas (FIELD, 2001; ZOULIM,
2001; GILBERT et al., 2002 ) e o surgimento de novos vírus patogênicos ao homem
como, por exemplo, o da Gripe Aviária que transcendeu a barreira entre as espécies,
fazem das doenças virais um importante problema mundial. (ZHONG et al, 2007).
1.1. Poliovirus
Poliovirus (PV), agente causal da poliomielite, é um membro do gênero
Enterovirus pertencente á família Picornaviridae, composta por virions pequenos, não-
envelopados e de genoma RNA de fita simples (RNAss) e de polaridade positiva. Outros
membros desta família incluem os gêneros Rhinovirus (vírus do resfriado comum) com
mais de 100 sorotipos, Hepatovirus incluindo o vírus humano da hepatite A e dois
gêneros de vírus proeminentemente animais, Cardiovirus e Apthovirus (MULLER et al,
2005). Coxsackievirus e Echovirus, que formam a maioria do gênero Enterovirus,
possuem um amplo espectro patológico causando doenças como meningites, encefalites,
miocardites, paralisia, diarréia e doenças respiratórias (MELNICK, 1996).
A partícula viral possui simetria icosaédrica sendo constituída por 60 proteínas
(VP1, VP2, VP3 e VP4) que formam o capsídeo. Existem 3 sorotipos de poliovírus e
não há imunidade cruzada entre eles. Os humanos são considerados os únicos
hospedeiros naturais, embora os primatas não humanos possam ser infectados
experimentalmente. A transmissão do vírus obedece a rota fecal-oral, sua multiplicação
inicial ocorre no intestino delgado e na garganta. Após esta, o vírus pode ser encontrado
no sangue, por um breve período, podendo espalhar-se para sítios distantes incluindo o
sistema nervoso central (MINOR, 1996).
A poliomielite caracteriza-se por um quadro de paralisia flácida acometendo em
geral membros inferiores, de forma assimétrica, tendo como principais características
flacidez muscular, com sensibilidade conservada e arreflexia no membro atingido
(PALLANSCH & ROSS, 2001). Estes sintomas acometem menos do que 1% dos
indivíduos infectados por PV (NATHANSON & MARTIN, 1979) sendo que a
poliomielite é considerada um “acidente’ nesta infecção entérica. Deste modo a
poliomielite pode apresentar-se de forma assintomática, ou com sintomas leves como
febre, dor de cabeça e de garganta (MULLER et al, 2005).
O poliovirus é um dos modelos virais mais estudados e bem conhecidos, a
estabilidade do capsídeo, a fácil purificação do vírion, a obtenção de altos títulos virais e
o baixo nível de bio-segurança requerido para sua manipulação em laboratório o fazem
uma ferramenta adequada para várias pesquisas sendo utilizado, por exemplo, como
modelo de vírus RNA na investigação de novas drogas antivirais (MULLER et al,
2005).
O amplo espectro de atividade antiviral da ribavirina (SIEDWELL et al, 1972)
permite sua utilização em estudos frente a diversos vírus, dentre eles o poliovírus.
Recentes investigações demonstraram que o tratamento com ribavirina induz mutações
em genomas de vírus RNA. O aumento na freqüência de mutações resultaria na
produção de genomas defectivos, sendo esta a possível base para a atividade antiviral da
ribavirina (ZHOU et al, 2003).
1.2. Vírus Herpes simplex
O vírus Herpes simplex (HSV), pertencente à família Herpesviridae –
subfamília Alphaherpesvirinae, é um vírus envelopado, cujo genoma é formado por
DNA de fita dupla. Tem dimensões que variam entre 120 e 200 nm de diâmetro e
simetria icosaédrica. Os dois tipos sorológicos (HSV-1 e HSV-2) apresentam antígenos
comuns e antígenos tipo-específicos, podendo ser distinguidos pelas manifestações
clínicas e bioquímicas. (CRAIGHEAD, 2004). É um patógeno humano comum cuja
prevalência em certas populações infectadas atinge a razão entre 60 a 95% para HSV-1 e
6 a 50% para HSV-2 (CUNNINGHAM & MIKLOSKA, 2001).
Ao sorotipo HSV-1 atribui-se lesões na face, lábios, olhos e infecção genital,
enquanto que ao HSV-2 relaciona-se infecção e lesão genital. A freqüência dos danos
em HSV-soropositivos é significativamente mais alta em populações infectadas com o
vírus da imunodeficiência adquirida (HIV) (RUSSEL et al., 2001). Além disso, tem-se
relatado estreita correlação entre o aumento do risco de transmissão do HIV por
pacientes contaminado com HSV genital (DICKERSON et al.; 1996; WASSERHEIT,
1992).
O aciclovir, um análogo acíclico da guanidina é usado para tratar infecções
herpéticas. Contudo, esta droga considerada padrão-ouro tem apresentado eficácia
limitada em episódios recorrentes de infecção por HSV. O desenvolvimento de cepas
resistentes ao aciclovir tem sido observado, o que constitui uma limitação na terapia das
doenças causadas por herpesvirus (COEN, 1996; KIMBERLIN & WHITLEY, 1996).
1.3. Quimioterapia antiviral
A íntima associação da multiplicação viral com o ciclo celular constitui um fator
que dificulta o desenvolvimento de drogas específicas. Entretanto, com a melhor
compreensão dos processos de replicação viral, vários eventos específicos desse
processo tornaram os vírus susceptíveis à quimioterapia seletiva (DE CLERCQ, 2001).
O ciclo de replicação viral pode ser dividido basicamente em cinco etapas:
adsorção, penetração, síntese dos componentes virais, maturação e liberação, sendo que
todas essas etapas são alvos potenciais de intervenção quimioterápica. As classes de
inibidores seletivos que atuam no estágio de adsorção/penetração são representadas por
bloqueadores de receptor e anticorpos anti-receptor; no estágio de desnudamento atuam
bloqueadores de cálcio, estabilizadores dos capsídios e inibidores da fusão protéica;
inibidores de DNA polimerase viral, RNA polimerase, transcriptase reversa, helicase,
primase ou integrase virais agem na fase de transcrição do RNAm viral; na tradução de
proteínas tem-se os oligonucleotídeos de sentido inverso, ribozimas e inibidores das
proteínas de coagulação; no estágio de maturação atuam inibidores de proteases. Os
inibidores seletivos do estágio de montagem da partícula viral são representados por
interferons e inibidores de síntese protéica; anticorpos antivirais e linfócitos citotóxicos
atuam no estágio de liberação viral (HAYDEN, 1996).
Apesar dos alvos para terapia antiviral serem etapas da replicação comuns a
todos os vírus, as diferenças na estrutura do vírion e na replicação do genoma viral
devem ser consideradas na procura por novas drogas antivirais específicas. Culturas de
células infectadas com diferentes vírus (genoma DNA ou RNA, envelopados ou nus) são
freqüentemente utilizadas como ferramenta para avaliar a atividade antiviral de
substâncias in vitro.
O tratamento das infecções virais conta com um arsenal de cerca de 40 drogas
licenciadas sendo que pelo menos metade destas é usada para tratamento de infecção por
HIV. O restante destina-se ao tratamento de infecção pelos vírus da hepatite B e C,
herpesvirus, varicela zoster, citomegalovírus e vírus influenza (DE CLERCQ, 2004). O
efeito tóxico dos antivirais disponíveis continua sendo uma barreira em muitos
tratamentos.
1.4. Alcalóides β-carbolínicos.
Compostos β-carbolínicos (Fig. 1a) e tetraidro-β-carbolínicos (Fig. 1b)
representam uma grande classe de alcalóides indólicos naturais e sintéticos. Devido à
sua importância biológica e farmacológica, estes compostos têm atraído a atenção de
pesquisadores de todo o mundo. Algumas propriedades relatadas para esta classe
incluem atividade anticonvulsiva, ansiolítica, hipnótica (BRAESTRUP et al., 1980;
SCHLECKER et al, 1995; BATH & DODD, 1998), antimicrobiana (MOLINA et al.,
1994), antitrombótica
(LIN et al, 2002), antifilarial (SRIVASTA et al, 1999),
intercalatores de DNA (HAYASHI et al, 1977;
CSANYN et al., 2000), inibição de CDK
e da topoisomerase (SONG et al, 2002; NII, 2003; DEVEAU et al., 2001); parasiticida
(RIVAS et al., 1999; GIORGIO et al, 2004), além de atuarem como agentes
antitumorais (CAO et al, 2005) e antivirais ( LIPPE et al, 1983; MOTY et al, 1997).
Figura 1 – Compostos β-carbolínicos (a) e tetraidro-β-carbolínicos (b).
Recentemente, muitos compostos contendo o esqueleto
β-carbolínico estão sendo
N
N
H
2
3
9
1
(a)
(b)
N
H
NH
2
3
9
1
isolados e/ou sintetizados e avaliados quanto sua atividade antiviral, dentre eles,
compostos contendo o esqueleto β-carbolínico como harmina, harmano (Fig. 2) e seus
derivados que foram altamente ativos contra o vírus anti-HIV
.
(
KUSURKAR et al.,
2004).
Figura 2 – Harmina (R= H) e harmano (R= OCH
3
).
Estudos descritos na literatura relatam derivados β-carbolínicos contendo o
esqueleto da harmina e harmano com potente atividade anti-HIV, como por exemplo, o
N-butil-harmina (Fig. 3) que apresentou EC
50
0,037µM (ISHIDA et al, 2001) e também
derivados contendo o grupo metil na posição-1 e grupo carboxamida-guanidil na
posição-3 (Fig. 4) (YU et al., 2004; YU et al, 2005).
Figura 3 – Estrutura química do N-butil-harmina.
Figura 4 – Derivados contendo o grupo metil na posição-1 e grupo carboxamida-
guanidil na posição-3: (R=H, n=2); (R=H, n=3); (R=H, n=6); (R=CH
3
, n=2); (R=CH
3,
n=3); (R=CH
3,
n=3).
O composto flazina (Fig. 5) isolado de Suillus granulatus, também apresentou
boa atividade anti-HIV e a modificação estrutural desse composto forneceu o derivado
flazinamida (Fig. 5), que melhorou a atividade antiviral, inibindo a replicação de HIV-1
e HIV-2 (WANG et al, 2007).
N
N
CH
3
H
R
N
N
CH
3
CH
2
CH
3
O
CH
2
CH
2
CH
3
Figura 5 – Flazina (R=OH) e flazinamida (R=NH
2
).
As eudistominas constituem uma classe de compostos com significante atividade
antiviral. A debromoeudistomina K e U (Fig. 6) foram as mais ativas, apresentando
propriedades anti-HIV e contra herpes simples HSV-1, respectivamente
(MAARSEVEEN et al, 1997).
Figura 6 – Estrutura química da debromoeudistomina K (a) e debromoeudistomina U
(b).
Tendo em vista a atividade biológica descrita na literatura para derivados
sintéticos β-carbolínicos e considerando a necessidade de se encontrar novas substâncias
efetivas no combate às infecções causadas por vírus, a demonstração da atividade
antiviral de novos derivados sintéticos β-carbolínicos poderá contribuir para o
desenvolvimento de novas formulações com atividade antiviral.
(b)
N
N
Br
H
H
2
N
O
S
O
H
3
CO
N
N
H
HO
Br
(a)
N
N
R
H
O
O
CH
2
OH
2. OBJETIVOS
• Avaliar a atividade antiviral de novos derivados sintéticos 1-
benzossubstituídos-β-carbolínicos contendo o grupo carboidrazida na posição-3 frente
ao HSV-1 e/ou poliovírus vacinal.
• Avaliar a citotoxicidade dos derivados β-carbolínicos (3-carboidrazil-β-
carbolínicos-1-benzossubstituídos).
• Verificar a ação de uma substância com atividade antiviral nas etapas da
interação vírus-célula utilizando o método de redução de placas e método colorimétrico
da sulforrodamina B.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Síntese dos alcalóides 3-carboidrazil- β-carbolínicos-1-
benzossubstituídos
Os compostos 3-carboidrazil- β-carbolínicos-1-benzossubstituídos foram
sintetizados e fornecidos pelo Departamento de Química da Universidade Estadual de
Maringá, sob responsabilidade da professora Dra. Maria Helena Sarragiotto.
Os derivados 3-carboidrazil- β-carbolínicos-1-benzossubstituídos foram
preparados pela condensação do L-triptofano comercial com três aldeídos aromáticos
(benzaldeído, m-nitrobenzaldeído, p-hidroxibenzaldeído), via reação de Pictet-Spengler
catalisada por ácido, seguida pela reação de esterificação, aromatização e reação de
substituição nucleofílica com hidrazina hidratada. Em seguida, foram submetidos a
posterior reação de adição nucleofílica aos aldeídos p-dimetilaminobenzaldeído,
benzaldeído e p-metóxibenzaldeído, em meio ácido (Fig. 7) (CAO et al, 2005; LEITE et
al, 1999).
Desta forma foram obtidos 9 derivados sintéticos 3-carboidrazil- β-carbolínicos-
1-benzossubstituídos que foram numerados de 1 a 9.
(1-9)
Figura 7 – Obtenção das 3-carboidrazil- β-carbolinas-1-benzossubstituídas.
3.2. Cultura de Células
Para os experimentos foram utilizadas células VERO (células de rim de macaco
verde africano) cultivadas em DMEM – Dulbecco´s Modified Eagle Medium- (Gibco
®
)
suplementado com 10% de soro fetal bovino (Gibco
®
) e 50µg/ml de gentamicina e
mantidas em estufa úmida (Fischer Scientific
®
, modelo Isotemp) à 37ºC com tensão de
5% de CO
2
, em garrafas plásticas de cultura de células (TPP
®
). O crescimento celular foi
β
-carbolina
carboidrazida
observado diariamente em microscópio invertido (Zeiss®, modelo Axiovert 25) e o meio
de cultura foi trocado quando acidificado.
A fim de promover a manutenção das células de linhagem contínua, elas foram
renovadas sempre que houvesse a formação de uma monocamada de células confluentes.
Para isto o meio foi retirado e adicionado PBS – “Phosphate Buffered Saline” - para
remover os restos de soro e metabólitos celulares. Após a remoção do PBS e adição de
solução de tripsina (Gibco®) a 37ºC por 1 minuto, o aspecto das células foi observado
em microscópio invertido. Após o descolamento da camada celular, estas foram
ressuspendidas em DMEM e subcultivadas nas mesmas condições acima descritas.
3.3. Vírus
O vírus herpes simples tipo 1 (isolado clínico) e o poliovírus vacinal (ATCC VR-
58) utilizados nos experimentos foram fornecidos pelo laboratório de Virologia da
Universidade Estadual de Londrina.
Para a obtenção das suspensões virais as monocamadas de células VERO
cultivadas em frascos de cultura (25 cm
2
) foram infectadas com HSV-1 ou poliovirus.
Após incubação durante 48 ou 72h, adicionou-se glicerol estéril (10%) ao meio e as
culturas foram submetidas a processos de congelamento e descongelamento. O
sobrenadante coletado foi centrifugado a 3000 rpm durante 10 min, dividido em
alíquotas e congelado a -20 ºC.
3.4. Drogas
Para a obtenção de uma solução estoque de concentração 1mg/ml, 0,001g de
cada composto foi completamente dissolvido em 50µl de DMSO e após, adicionado
950µl de DMEM. As soluções estoques dos padrões aciclovir (Sigma
®
) e ribavirina
(Sigma
®
) também foram preparadas nesta concentração.
3.5. Citotoxicidade
Os alcalóides sintéticos foram avaliados quanto ao potencial citotóxico in vitro
segundo a técnica colorimétrica da sulforrodamina B descrita por Skehan et al. (1990)
com algumas modificações. O corante sulforrodamina B liga-se às proteínas celulares
propiciando uma avaliação colorimétrica diretamente proporcional ao número de células
viáveis aderidas à superfície da placa.
Células VERO cultivadas em DMEM acrescido de 10% de SFB e 50 µg/ml de
gentamicina foram distribuídas em microplacas de 96 poços (TTP
®
) na concentração de
2,5 x 10
4
células/poço e incubadas em estufa úmida a 37ºC até a formação da
monocamada confluente. Após a formação desta, o meio dos poços foi substituído por
meio novo e então 100µl das várias diluições dos compostos foram adicionados aos
poços, em triplicatas. No controle de células adicionou-se 100µl de meio. As células
foram incubadas em estufa úmida a 37 ºC com 5% de CO
2
por 72h.
Passado este período as células mortas foram removidas, os poços lavados com
PBS e as células viáveis fixadas com 50 µl de ácido tricloroacético (Synth
®
) 10% a 4 ºC
por 1 hora. A placa foi lavada 5 vezes em água corrente e 50 µl de uma solução de 4%
de sulforrodamina B (Sigma
®
) em ácido acético 1% foi adicionado. Após incubação de
30 minutos a 4ºC ao abrigo da luz, o corante foi removido por 4 lavagens com ácido
acético 1%. O corante ligado às células viáveis foi dissolvido em 150 µl de solução Tris-
base 10 mM. A absorbância foi determinada em leitor de ELISA (Bio- Tek, modelo
Power XS) em 530 nm.
Os resultados foram comparados com o controle de células. A citotoxicidade foi
determinada de acordo com a seguinte fórmula:
% de toxicidade celular = 100- (DO tto / DO cc)
Onde: DO tto = densidade óptica do tratado.
DO cc = densidade óptica do controle de células.
Os valores de CC
50
(concentração tóxica para 50% das células) foram obtidos por
análise de regressão de curva dose-resposta.
Os alcalóides foram testados nas concentrações finais de 1000µg/ml, 500µg/ml,
250 µg/ml, 125µg/ml, 100µg/ml, 50µg/ml, 25µg/ml, 12,5µg/ml, 6,25µg/ml e
3,125µg/ml.
3.6. Ensaio da atividade antiviral pelo método colorimétrico da
sulforrodamina B.
Após a formação da monocamada confluente como descrito em 3.5, o
meio foi retirado, as células lavadas com PBS e infectadas com 25µl de
suspensão viral TCID
80
(Tissue Culture Infectious Dose - título viral capaz
de destruir 80% da monocamada) por 1 hora a 37ºC. Após este período
(adsorção viral) adicionou-se 75 µl de meio contendo gentamicina e em
seguida 100µl das várias diluições dos 9 alcalóides, em triplicata. As células
foram incubadas em estufa úmida à 37ºC por 48h para o Poliovírus e 72h
para o HSV-1. Controle de células (sem adição de partículas virais ou
alcalóides) e controle de vírus (sem a adição dos alcalóides) foram
realizados. A fixação, coloração e leitura da absorbância foram feitas
conforme descrito no item 3.5. Os resultados foram comparados com os
controles de células e vírus e a atividade antiviral determinada pela
porcentagem de inibição do efeito citopático propiciado pelos alcalóides
segundo Semple et al., 2001.
% de inibição = (DO tto − DO cv/ DO cc − DO cv) x 100
Onde: DO tto = densidade óptica do tratado.
DO cv = densidade óptica do controle de vírus.
DO cc = densidade óptica do controle de células.
Os valores de EC
50
(concentração que inibiu em 50% a replicação viral) foram
obtidos por análise de regressão de curva dose-resposta.
Inicialmente os alcalóides foram testados nas concentrações finais de 50µg/ml,
25µg/ml, 12,5µg/ml, 6,25µg/ml, 3,125µg/ml e 1,563µg/ml. Concentrações menores do
que 1,563µg/ml foram testadas quando necessário.
3.7. Ensaios para avaliar a atividade antiviral nas etapas de interação vírus-
célula pelo método de redução de placas.
Para este ensaio foi selecionado apenas um derivado sintético, o alcalóide 4 [1-p-
hidróxifenil-3-(-p-dimetilaminofenil)-carbohidrazida-β-carbolina], o qual apresentou boa
atividade antiviral e índice de seletividade.
3.7.1. Tratamento das células após a infecção viral
As células VERO foram cultivadas em placa de 24 poços, na concentração de 2,5
x 10
5
células/poço até a formação de monocamada confluente. O meio foi retirado, a
monocamada lavada com PBS por 2 vezes, infectada com 40-60 UFP/ 200µl de
suspensão de vírus e incubada por 1h a 37 ºC com 5% de CO
2
para permitir a adsorção
viral. O inóculo viral foi removido, a monocamada novamente lavada com PBS por 2
vezes e recobertas com meio DMEM duas vezes concentrado contendo as concentrações
do alcalóide e acrescido de carboximetilcelulose 1% (Synth
®
) (v/ v). Após incubação por
48h a 37ºC com 5% de CO
2
as células foram fixadas com formaldeído 10% e coradas
com cristal violeta 0,5%. A atividade antiviral foi calculada como porcentagem de
inibição de formação de placas de lise em relação ao controle (Kurokawa et al., 1995).
% inibição de placas = 1- (nº de placas de lise do tratado/nº de placas de lise do
controle de células) x 100.
3.7.2. Tratamento das células antes da infecção viral
Após cultivo das células e formação da monocamada como descrito em 3.7.1.
procedeu-se a retirada do meio de cultura seguida por lavagem com PBS, adição das
concentrações do alcalóide e incubação por 1 hora a 37ºC com 5% de CO
2.
Após
este
período o meio foi retirado, as células novamente lavadas com PBS, infectadas e
incubadas como descrito em 3.7.1. A remoção do inoculo, lavagem, adição da mistura de
DMEM e carboximetilcelulose, incubação, fixação, leitura e o cálculo da atividade
antiviral foi realizado como descrito acima.
3.7.3. Tratamento das células durante a infecção viral
Após cultivo das células e formação da monocamada como descrito em 3.7.1.
procedeu-se a retirada do meio seguida por lavagem com PBS, adição do inóculo viral
(40-60 UFP/ 200µl) contendo as concentrações do alcalóide e incubação por 1h à 37ºC
com 5% de CO
2.
A remoção do inóculo, lavagem, adição da mistura de DMEM e
carboximetilcelulose, incubação, fixação, leitura e cálculo da atividade antiviral foi
realizado conforme descrito em 3.7.1.
3.7.4. Efeito virucida
Após incubação do inoculo viral (40-60 UFP/ 200µl) com o alcalóide em várias
concentrações durante 1h a 37 ºC, distribuiu-se 200 µl desta mistura à monocamada de
células VERO e incubou-se por 1h à 37ºC com 5% de CO
2
. O inoculo foi removido, a
monocamada lavada com PBS e adicionou-se a mistura de DMEM e
carboximetilcelulose. Após 48h de incubação a 37 ºC com 5% de CO
2
as monocamadas
de células foram fixadas e coradas. As placas de lise foram contadas e o resultado
expresso conforme como descrito no item 3.7.1.
3.8. Ensaios para avaliar a atividade antiviral nas etapas de interação vírus-
célula pelo Método Colorimétrico da Sulforrodamina B.
A interferência do alcalóide nas etapas de adsorção viral (tratamento das células
antes da infecção viral); adsorção/ penetração (tratamento das células durante a infecção
viral); replicação (tratamento das células pós-infecção) bem como a capacidade de
inativar diretamente a partícula viral (efeito virucida) foram investigadas.
A atividade antiviral foi determinada pela porcentagem de redução do efeito
citopático como descrito por Camargo Filho, et al, 2008.
3.9. Análise estatística
Todos os experimentos de ensaio em placa foram realizados em quadruplicata
sendo os dados analisados por ANOVA seguido por teste de Dunnest. Valores de P <
0,05 foram considerados significativos.
4. RESULTADOS
Os 9 derivados 3-carboidrazil- β-carbolínicos-1-benzossubstituídos obtidos
através de síntese foram numerados de 1 a 9 e agrupados de acordo com o radical
comum na posição R, de modo que os alcalóides 1, 2 e 3 correspondem aos derivados 1-
fenil-3-carbohidrazil-β-carbolínicos; os alcalóides 4, 5 e 6 aos derivados 1-p-
hidroxifenil-3-carbohidrazil-β-carbolínicos e os alcalóides 7, 8 e 9 aos derivados 1-m-
nitrofenil--3-carbohidrazil-β-carbolínicos.
Na TABELA 1 estão apresentados as estruturas químicas dos 9 derivados
sintéticos bem como o resultado do teste de “screening” através do método colorimétrico
da sulforrodamina B para demonstrar o potencial antiviral (contra poliovírus e
herpesvirus) e também verificar a citotoxicidade dos compostos.
Os alcalóides que apresentaram atividade antiviral tiveram seu valor de CC
50
determinado. Pode-se observar que nenhum destes compostos demonstrou ser tóxico
para as células VERO. Dentre todos os derivados testados, o alcalóide 4 [1-p-
hidróxifenil-3-(-p-dimetilaminofenil)-carbohidrazida-β-carbolina] foi selecionado para o
teste de atividade antiviral nas diferentes etapas de interação vírus-célula. Assim como
outros derivados, esse alcalóide sintético apresentou boa atividade antiviral e um bom
índice de seletividade.
A investigação do modo de ação antiviral do alcalóide 1-p-hidróxifenil-3-(-p-
dimetilaminofenil)-carbohidrazida-β-carbolina em poliovírus foi realizada através do
método colorimétrico da sulforrodamina B e método de redução de placas de lise
Tabela 1 – Atividade antiviral e citotoxicidade de derivados sintéticos 1-
benzossubstituídos-
β-carbolínicos contendo o grupo carboidrazida na posição-3.
Anti-poliovirus Anti-HSV-1
EC
50
EC
50
Estrutura
CC
50
(µ
µµ
µM)
(µ
µµ
µM)
IS
(µ
µµ
µM)
IS
1
N
N
H
O
NH
N C
H
N
1.164,6 ± 208,3 0,87± 1,7 1.338,6
1,85 ± 0,63
630,0
2
N
N
H
O
NH
N C
H
776,9 ± 1,7 1,9 ± 0,04 398,0 >100 < 7,8
3
N
N
H
O
NH
N C
H
OCH
3
969,0 ± 67,3 0,9 ± 6,5 1.101,0
0,47 ± 0,25
2.447,0
4
N
N
H
O
NH
N C
H
N
OH
900,2 ± 94,5 2,6 ± 1,24 346,0 >100 < 9,0
5
N
N
H
O
NH
N C
H
OH
1.238,4 ± 487,6 1,0 ± 0,17 1.202,0 >100 < 12,0
6
N
N
H
O
NH
N C
H
OCH
3
OH
802,7 ± 100,5
>100 < 8,0
22,9 ± 7,29
35,0
7
N
N
H
O
NH
N C
H
N
NO
2
1.049,6 ± 100,5
>100 < 10,5
73,2 ± 7,61
14,3
8
N
N
H
O
NH
N C
H
NO
2
n.d. >100 n.d. >100 n.d.
9
N
N
H
O
NH
N C
H
OCH
3
NO
2
n.d. >100 n.d. >100 n.d.
CC
50
= concentração tóxica para 50% das células; EC
50
= concentração que inibiu em 50% a replicação viral e IS =
índice de seletividade (CC
50
/ EC
50
); n= 3 (sendo n = n
o
de experimentos independentes); n.d. = não-determinado.
A porcentagem de redução das unidades formadoras de placas de lise nas
diferentes estratégias de tratamento das culturas de células VERO infectadas com o
poliovírus utilizando o derivado 1-p-hidróxifenil-3-(-p-dimetilaminofenil)-
carbohidrazida-
β-carbolina está mostrada na Tabela 2. Podemos observar que o
composto não interferiu na etapa de adsorção viral, nem durante a infecção viral
tampouco apresentou efeito virucida. A atividade antiviral foi observada apenas no pós-
infecção e demonstrou ser uma atividade dose-dependente.
Tabela 2. Avaliação do modo de ação do alcalóide
1-p-hidróxifenil-3-(-p-dimetilaminofenil)-
carbohidrazida-β-carbolina
por Ensaio de Redução de Placas de Lise .(n=1)
% Redução de Unidades Formadoras de Placas (UFP)
0,825 µM 1,65 µM 3,3 µM 6,6 µM
Adsorção
0 0 0 0
Durante a infecção
0 0 0 0
Pós- infecção
0 32,0 66,3 88,3
Virucida
0 0 0 0
A redução no número de placas de lise no tratamento pós-infecção pode ser
observada na FIGURA 8, na qual a 1ª coluna corresponde ao controle de células, a 2ª
coluna ao controle de vírus e as colunas 4, 5 e 6 ás células infectadas e tratadas com o
derivado 1-p-hidróxifenil-3-(- p-dimetilaminofenil)-carbohidrazida-β-carbolina nas
concentrações de
6,6µM, 3,3µM, 1,65µM e 0,825µM respectivamente
. Comparando os
poços tratados com o derivado 1-p-hidróxifenil-3-(-p-dimetilaminofenil)-carbohidrazida-
β-carbolina e os controles de vírus pode-se observar não somente a redução no número
de placas de lise nos tratados como também uma diminuição no tamanho dessas placas.
indicando que no tratamento pós-infecção o derivado 1-p-hidróxifenil-3-(-p-
dimetilaminofenil)-carbohidrazida-β-carbolina atuou inibindo a replicação
viral(diminuição do número de placas) e também interferindo na capacidade de
disseminação viral a partir da célula inicialmente infectada para as células adjacentes e
não infectadas observada pela diminuição do tamanho das placas de lise.
CC CV 6,6 µM 3,3 µM 1,65 µM 0,825 µM
Figura 8. Atividade antiviral do alcalóide
1-p-hidróxifenil-3-(-p-dimetilaminofenil)-
carbohidrazida-β-carbolina
por ensaio de redução de placas no tratamento pós-infecção. CC −
controle se células VERO não infectadas; CV − controle de células VERO infectadas com
poliovirus e não tratadas. As células infetadas foram tratadas com o composto 4 nas
concentrações de 6,6; 3,3; 1,65 e 0,825 µM.
As mesmas estratégias de tratamento in vitro foram avaliadas através do método
colorimétrico da sulforrodamina B e os resultados obtidos pelo método da redução de
placa de lise foram confirmados conforme está demonstrado na FIGURA 9, na qual
observa-se que a redução do efeito citopático nas diferentes etapas de tratamento
(adsorção, durante a infecção, pós-infecção e efeito virucida) ocorreu somente no pós-
infecção. O resultado apresentado na FIGURA 9 foi obtido através da média de dois
experimentos independentes nos quais cada concentração do derivado 1-p-hidróxifenil-
3-(-p-dimetilaminofenil)-carbohidrazida-β-carbolina foi testada em quintuplicata.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
0 1 2 3 4 5 6 7
µM
% redução do ECP
Figura 9. Atividade antiviral do alcalóide
1-p-hidróxifenil-3-(-p-dimetilaminofenil)-
carbohidrazida-β-carbolina
determinada através do método colorimétrico da sulforrodamina
B: () pré-tratamento das células VERO com o composto.(adsorção); () mistura do vírus e
composto (durante a infecção); () tratamento da células previamente infectadas (pós-infecção)
e () pré-incubação do vírus com diferentes concentrações do composto (virucida). O resultado,
expresso como porcentagem de redução do Efeito Citopático (ECP), representa a média de dois
experimentos independentes.
O Método Colorimétrico da Sulforrodamina B foi monitorado através da
utilização dos padões aciclovir e ribavirina que apresentaram valores de CC
50
maiores do
que 4444,4 µM e maiores do que 4098,36 µM respectivamente. O EC
50
para o aciclovir
foi menor do que 4,44 µM e para a ribavirina entre 512,3 e 1024,6 µM.
Derivados sintéticos β-carbolínicos que possuem o grupamento carboxamida e
grupamento carboxamida-guanidil foram submetidos a teste de “screening”pelo metido
colorimétrico da sulforrodamina B frente ap poliovírus e HSV-1 sob as mesmas
condições que os derivados sintéticos 3-carboidrazil- β-carbolínicos-1-
benzossubstituídos. Não foi observada atividade antiviral (dados não mostrados).
5. DISCUSSÃO
Pelo fato dos vírus subverterem os processos celulares metabólicos e
reprodutivos para assegurar sua persistência e replicação, a idéia de identificar uma
droga antiviral segura e efetiva foi por muitos anos considerada impossível. Porém, os
conhecimentos adquiridos a partir da investigação da biologia dos vírus demonstraram
que existem eventos específicos no ciclo de multiplicação viral que podem ser alvos de
substâncias. Entre as drogas antivirais que atuam em alvos virais podemos citar a
amantadina para o vírus influenza e o aciclovir para o Herpes simplex e mais 25 drogas
contra 5 alvos virais do HIV. Apesar disso, várias infecções virais severas, incluindo as
causadas por vírus RNA altamente patogênico, continuam sem tratamento eficaz
(GREENSTONE et al, 2008).
No presente trabalho, avaliamos a atividade antiviral dos derivados beta-
carbolínicos baseando-se nos critérios descritos por Camargo Filho et al, (2008) que
atribuiram uma forte atividade antiviral a valores de EC
50
inferiores a 10µM, atividade
antiviral moderada para EC
50
entre 10 e 50 µM, atividade fraca entre 50 e 100 µM e
considera inativo compostos com EC
50
superior a 100 µM. Desta forma, verificou-se que
os alcalóides 1-fenil-3-carbohidrazil-β-carbolínicos (1, 2 e 3) apresentaram forte
atividade antiviral frente ao poliovirus. A mesma atividade foi observada frente ao HSV-
1, exceto com alcalóide 2. A substituição do radical fenil pelos radicais p-
dimetilaminofenil e p-metóxifenil conferiu maior atividade antiviral frente ao poliovirus
vacinal, e atividade frente ao HSV-1 sendo esta aproximadamente quatro vezes maior
com o radical p-metóxifenil (EC
50
= 0,47 ± 0.25 µM).
Entre os alcalóides 1-p-hidroxifenil-3-carbohidrazil-β-carbolínicos (4, 5 e 6) foi
observada forte atividade antiviral (poliovirus vacinal) com os radicais fenil e p-
dimetilaminofenil. O radical p-metóxifenil conferiu atividade antiviral moderada frente
ao HSV-1.
Entre alcalóides 1-m-nitrofenil 3-carbohidrazil-β-carbolínicos (7, 8 e 9) somente
o composto com radical p-dimetilaminofenil apresentou uma fraca atividade contra o
HSV-1.
Comparando-se os alcalóides 1-fenil-3-carbohidrazil-β-carbolínicos (1, 2 e 3) a
substituição do radical fenil pelo p-hidroxifenil e deste pelo p-dimetilaminofenil
promoveu uma gradual diminuição da citotoxicidade. Esta co-relação não foi observada
entre os alcalóides 1-p-hidroxifenil-3-carbohidrazil-β-carbolínicos (4, 5 e 6) onde o
aumento dos valores de CC
50
foi diretamente proporcional à substituição do radical p-
metóxifenil pelo p-dimetilaminofenil e deste pelo fenil atingindo assim a menor
toxicidade in vitro observada (CC
50
= 1238,4 ± 487,6). As relações descritas acima não
puderam ser feitas para os alcalóides 1-m-nitrofenil -3- carbohidrazil- β- carbolínicos (7,
8 e 9) visto que apenas o 7 apresentou atividade antiviral e, por isto, teve seu valor de
CC
50
determinado.
Atualmente a toxicidade de vários medicamentos antivirais constitui uma barreira
em muitos tratamentos (Ernest e Franey, 1998 ; De Clercq , 2001). Diante disso a
descoberta de medicamentos eficazes e não-tóxicos se faz necessária. Observando os
valores de índice de seletividade (IS) apresentados na TABELA 1 e considerando que
estes valores estes indicam quantas vezes os compostos foram mais ativos frente aos
vírus (Poliovírus e/ou HSV-1) do que tóxico para as células de mamíferos (células
VERO) pode-se verificar a maioria dos composto com atividade antiviral apresentou
índices de seletividade superiores a 300, o que significa que para atingir a concentração
tóxica (CC
50
) para as células é necessário utilizar 300 vezes a concentração efetiva
(EC
50
) em inibir a replicação viral. O maior índice de seletividade observado foi 2.447,0
com o alcalóide 3 frente ao HSV-1.
A avaliação da ação do alcalóide 1-p-hidróxifenil-3-(-p-dimetilaminofenil)-
carbohidrazida-β-carbolina nas etapas de interação vírus-células demonstrou que a
proteção celular se deu na fase de replicação viral, ou seja, a droga foi capaz de proteger
as células VERO previamente infectadas com o poliovírus. Não foi constatado efeito
profilático (interferência na adsorção viral) e nem efeito virucida. Estes resultados foram
observados através de duas metodologias diferentes (Sulforrodamina B e Redução de
Placas de Lise).
Analisando o efeito do composto 1-p-hidróxifenil-3-(-p-dimetilaminofenil)-
carbohidrazida-β-carbolina no ensaio de redução das placas de lise, em que há uma
diminuição não só no número, mas também no tamanho das placas de lise quando as
células já infectadas são tratadas, podemos sugerir que a ação da substância seja sobre os
eventos associados à replicação viral. Esta ação pode ser em nível de síntese protéica ou
replicação.
Estudos posteriores são necessários para verificar se em que nível da replicação
viral o alcalóide 1-p-hidróxifenil-3-(-p-dimetilaminofenil)-carbohidrazida-
β-carbolina
está atuando.
A atividade antiviral de derivados sintéticos β-carbolínicos que possuem o
grupamento carboxamida-guanidil não foi observada quando estes compostos foram
testados, pelo Método Colorimétrico da Sulforrodamina B, frente ao poliovirus e ao
HSV-1 (dados não demonstrados). Estes resultados contrariam a atividade antiviral
descrita na literatura para derivados sintéticos β-carbolínicos com este grupamento (YU
et al., 2004; YU et al, 2005)
Derivados sintéticos β-carbolínicos que possuem somente o grupamento
carboxamida também foram avaliados através dos critérios acima mencionados. A
atividade antiviral não foi observada. (dados não demonstrados).
6. CONCLUSÃO
Os resultados deste trabalho demonstraram potente atividade antiviral de
alcalóides 3-carboidrazil- β-carbolínicos-1-benzossubstituídos frente ao poliovirus e/ ou
HSV-1 in vitro bem como reduzida citotoxicidade, indicando significativa seletividade,
segurança e caráter promissor na busca por novos antivirais.
O estudo da atividade antiviral do composto 1-p-hidróxifenil-3-(-p-
dimetilaminofenil)-carbohidrazida-β-carbolina nas fases de interação vírus-célula
evidenciou a interferência deste na etapa de replicação do poliovirus, resultado
observado através das duas metodologias utilizadas. Contudo, estudos posteriores são
necessários para determinar em qual etapa do ciclo replicativo este alcalóide está
atuando.
A atividade antiviral de derivados sintéticos β-carbolínicos contendo os
grupamento carboxamida e carboxamida-guanidil frente ao poliovirus e ao HSV-1 foi
avaliada através do Método Colorimétrico da Sulforrodamina B. Nenhuma atividade foi
observada.(dados não demonstrados).
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