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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CAMPUS DE JABOTICABAL
ATIVIDADE DA REDUTASE DO NITRATO E ACÚMULO DE
PROLINA LIVRE EM RAÍZES DE CANA-DE-AÇÚCAR
SUBMETIDAS AOS ESTRESSES HÍDRICO E ÁCIDO NO
SOLO
Andressa Freitas de Lima Rhein
Engenheiro Agrônomo
JABOTICABAL - SÃO PAULO – BRASIL
2008
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Livros Grátis
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CAMPUS DE JABOTICABAL
ATIVIDADE DA REDUTASE DO NITRATO E ACÚMULO DE
PROLINA LIVRE EM RAÍZES DE CANA-DE-AÇÚCAR
SUBMETIDAS AOS ESTRESSES HÍDRICO E ÁCIDO NO SOLO
Andressa Freitas de Lima Rhein
Orientadora: Profa. Dra. Durvalina Maria Mathias dos Santos
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências
Agrárias e Veterinárias – Unesp, Campus de Jaboticabal,
como parte das exigências para obtenção de título de
Mestre em Agronomia (Produção Vegetal).
JABOTICABAL - SÃO PAULO – BRASIL
Julho – 2008
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Rhein, Andressa Freitas de Lima
R469
a Atividade da redutase do nitrato e acúmulo de prolina livre em
raízes de cana-de-açúcar submetidas aos estresses hídrico e ácido
no solo / Andressa Freitas de Lima Rhein. – – Jaboticabal, 2008
ix, 67 f. : il. ; 28 cm
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista,
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2008.
Orientador: Durvalina Maria Mathias dos Santos
Banca examinadora: Isabel Cristina Leite, Marcelo de Almeida
Silva
Bibliografia
1. Saccharum spp.-sistema radicular. 2. Metabolismo do
nitrogênio. 3. Estresses abióticos-osmoprotetor. I. Título. II.
Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias.
CDU 633.61
Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação –
Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Campus de Jaboticabal.
DADOS CURRICULARES DO AUTOR
ANDRESSA FREITAS DE LIMA RHEIN - nascida no município de São Paulo,
em 05 de agosto de 1979, Engenheira Agrônoma, graduada pela UNESP -
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Faculdade de Ciências
Agrárias e Veterinárias (FCAV), Campus de Jaboticabal, SP, em 06 de janeiro de 2006.
No período de setembro de 2002 a julho de 2005, foi bolsista do Programa de
Educação Tutorial da Secretaria de Ensino Superior do Ministério da Educação – PET
MEC/SESu e de agosto a dezembro de 2005, participou de atividades de monitoria na
disciplina de Artropodologia junto ao Departamento de Entomologia da UNESP/FCAV.
No período de março de 2003 a dezembro de 2007 foi professora de Química
Inorgânica do Cursinho Pré-Vestibular Ativo da UNESP/FCAV, onde também atuou
como coordenadora durante dois anos consecutivos (2006 e 2007), ambas as
atividades em caráter voluntário. Em março de 2006, ingressou no programa de Pós-
Graduação em Agronomia (Produção Vegetal), da Universidade Estadual Paulista “Júlio
de Mesquita Filho”, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Campus de
Jaboticabal, desenvolvendo a pesquisa da dissertação como bolsista da CAPES –
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, vinculada à área de
Fisiologia do Estresse. No ano de 2007 e início de 2008 também atuou como
professora voluntária de Química Inorgânica do Cursinho Unificado Popular, entidade
mantida pelo Lar do Colégio Santo André, da cidade de Jaboticabal. Também em 2007
foi aprovada em concurso da Secretaria da Agricultura e Abastecimento do Estado de
São Paulo para o cargo de Assistente Agropecuário I (classificação geral: 714º lugar).
Em julho de 2008 foi aprovada em concurso da Secretaria Municipal do Verde e Meio
Ambiente da Prefeitura do Município de São Paulo para os cargos de Especialista em
Meio Ambiente I com Habilitação em Engenharia Agronômica (classificação geral: 25º
lugar) e de Especialista em Desenvolvimento Urbano I Disciplina de Engenharia
Agronômica (classificação geral: 186º lugar).
“Quem sabe concentrar-se numa coisa e insistir nela como único objetivo,
obtém, ao cabo, a capacidade de fazer qualquer coisa”.
Mahatma Ghandi (*1869 - †1948)
A minha querida mãe Sandra Lúcia Freitas de Lima Rhein, que sempre foi o
motivo de toda minha luta, que com um abraço renova minhas forças e me faz sentir
que tudo vale à pena... A quem devo todos os valores e ensinamentos, exemplo de
caráter, honestidade e determinação. Obrigado pelo amor, carinho e toda atenção
dedicada em todos os momentos de minha vida.
A minha querida irmã Thammy Freitas de Lima Rhein cuja presença e
dedicação foram imprescindíveis para o meu sucesso acadêmico. Alicerce...
Inspiração... A quem devo o significado do verdadeiro amor...
Agradeço pela presença constante, por compartilharem todas as lutas, dificuldades,
conquistas e vitórias, por me ensinarem a viver...
OFEREÇO
Ao meu querido pai Wilson da Silva Rhein
Pelos grandes valores e ensinamentos de vida, pelo caráter, perseverança e determinação.
Ao meu querido padrasto Luís Barbosa Vargas
Pelo carinho, apoio, incentivo e luta sempre ao lado de minha mãe em favor do meu
crescimento profissional. Minha eterna gratidão.
Aos meus avós Rosaly Freitas de Lima e José Mariano de Lima, Tereza da Silva Rhein e
Wilson Ramos Rhein (in memoriam) pela luta incessante em favor do meu bem-estar, pelo amor,
apoio e dedicação, acompanhando-me em pensamento mesmo que distantes.
Aos meus tios Ana Cristina Freitas de Lima, Marco Aurélio Freitas de Lima e sua
esposa, Ana Cristina Mendes de Lima, pelo auxílio financeiro e incentivo fundamentais para
esta difícil conquista.
A minha querida e inesquecível família
Por todo amor, carinho, incentivo e atenção dedicados nesta difícil etapa de minha vida.
Obrigada...
A atenciosa e dedicada família Pavan da Silva, que adquiri com todo amor, carinho e
gratidão...
Ao meu amor Diogo Pavan da Silva
Por sempre estar ao meu lado compartilhando todos os momentos agradáveis e difíceis
que tenho passado. Por sua completa doação e amor... Que com um singelo olhar me fortalece e a
quem devo a certeza de dias melhores para sempre...
DEDICO
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelas dificuldades da vida que contribuíram para o meu crescimento pessoal,
pela possibilidade e valorização de mais uma grande conquista.
À Profª. Drª. Durvalina Maria Mathias dos Santos, uma profissional exemplar e de
grande competência, que me orientou durante toda a graduação e o mestrado,
mostrando-me o verdadeiro significado da disciplina e do profissionalismo. Agradeço
pela orientação incomensurável, grande amizade e confiança, determinantes para
minha formação acadêmico-científica.
Ao Prof. Dr. Pedro Luís da Costa Aguiar Alves, Coordenador do Programa de Pós-
Graduação em Agronomia (Produção Vegetal), por toda a atenção e auxílio
dispensados, além de seus valiosos conselhos e amizade que sempre acolheram
minhas lágrimas nos momentos mais difíceis.
À Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócio - APTA Pólo Regional Centro-Oeste
Jaú-SP, por intermédio do Pesquisador e excelente profissional Dr. Marcelo de Almeida
Silva que, gentilmente, forneceu as mudas da cv. IAC91-5155 de cana-de-açúcar, sem
as quais não seria possível a realização do trabalho.
Ao Prof. Dr. Antônio Orlando Di Mauro, do Departamento de Produção Vegetal da
UNESP/FCAV, pela concessão do uso da casa de vegetação para a montagem e
condução experimentais.
Ao Prof. Dr. José Frederico Centurion, do Departamento de Solos e Adubos da
UNESP/FCAV, pelas valiosas sugestões quanto ao solo utilizado no trabalho e aos
procedimentos adequados para a montagem e condução do experimento, e pela
realização das análises de solo.
Ao Prof. Dr. Jairo Osvaldo Cazetta, do Departamento de Tecnologia da UNESP/FCAV,
pelas informações indispensáveis quanto às análises da atividade da redutase do
nitrato e pela utilização do Laboratório de Bioquímica de Plantas para a determinação
da atividade enzimática.
Ao Prof. Dr. Manoel Vitor Franco Lemos, do Departamento de Biologia Aplicada à
Agropecuária da UNESP/FCAV, pela amizade, atenção e grande auxílio na elaboração
do Summary.
Aos Professores responsáveis pela banca de qualificação, Dr. José Frederico Centurion
e Dr. Jairo Osvaldo Cazetta, e aos Profissionais da comissão examinadora, Profª. Drª.
Isabel Cristina Leite e Dr. Marcelo de Almeida Silva, pela disponibilidade no exercício da
avaliação, pelas sugestões salutares que muito contribuíram para o aperfeiçoamento
deste trabalho e de minha formação acadêmica, além da grande amizade e
profissionalismo.
Às funcionárias da Seção de Pós-Graduação e da Seção de Graduação da
UNESP/FCAV, pela valiosa amizade, profissionalismo e auxílio em momentos difíceis.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, pela concessão da
bolsa de estudos, indispensável ao prosseguimento e finalização do trabalho.
À Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Faculdade de Ciências
Agrárias e Veterinárias, Campus de Jaboticabal, pela formação acadêmico-científica e
crescimento profissional.
À grande amiga Karina Mitie Navarro, pela amizade desmedida que desde
adolescência nos acompanha repleta de carinho, cumplicidade e respeito.
Às minhas queridas e inesquecíveis irmãs, amigas e companheiras da república
“Rancho das Ditas”: Rachel Rattis Motta, Tatiane Moreno Ferrarias, Aline Silva e Paula
e Michele do Carmo Souza, pela amizade, incentivo, irmandade, solidariedade,
convivência, carinho, afeto e apoio indeléveis nos momentos mais difíceis da minha
vida, a vocês minha eterna e singela gratidão...
À nova geração das “Ditas”: Josiane e Patrícia, pelo companheirismo e pelas horas de
descontração.
À grande amiga Samira Domingues Carlin, pela inesquecível amizade,
companheirismo, carinho, afeto e inabalável convivência durante a realização deste
trabalho.
À minha “mãezinha” e “protetora” Marisa, amiga de todas as horas, pela inesquecível
convivência, amizade, carinho, afeto, compreensão e apoio nas horas mais difíceis, a
você destino infindáveis gratidão e respeito...
Aos amigos do Laboratório de Fisiologia Vegetal: Adriano, Eric, Gisele Bonacin,
Giuliana, Juliana, Maísa, Marco, Maria Letícia, Luiz Felipe, Rafaela, Vanessa e Vinícius,
pela agradável convivência e momentos de descontração.
Aos meus queridos amigos Adão Marin, Antônio Machado (Tonhão) e Rodrigo Vezzani
Franzé (Bolaxão) pela amizade, afeto, respeito, companheirismo e auxílio profissional,
fundamentais para a continuidade deste trabalho.
À técnica do Laboratório de Fisiologia Vegetal, Sônia Maria Raymundo Carregari, pelo
grande amor, afeto e carinho característicos de uma verdadeira mãe, destinando-me
valiosa amizade, momentos agradáveis e incomensurável auxílio profissional na
execução deste trabalho.
Aos funcionários do Departamento de Biologia Aplicada à Agropecuária da
UNESP/FCAV Aldo Antônio de Souza, Jamil Aparecido Ferraz, Maria Lucina de Oliveira
Moraes da Silva, José Valcir Fidelis Martins e Ivana Aparecida Martucci Garcia, pela
valiosa amizade, momentos agradáveis e profissionalismo.
Ao inesquecível Grupo PET Agronomia e ao tutor Prof. Dr. José Eduardo Corá, pela
oportunidade em fazer parte de um programa cuja consciência coletiva, a harmonia, a
amizade e o amor à profissão sedimentam a ideologia do grupo.
Aos alunos, professores e coordenadores do Cursinho Pré-Vestibular Ativo da
UNESP/FCAV e do Cursinho Unificado Popular do Lar do Colégio Santo André, pela
amizade, agradável convivência, oportunidade de lecionar e compartilhar histórias de
vida, essenciais para o meu crescimento pessoal.
i
SUMÁRIO
Página
RESUMO ...................................................................................................................................iv
SUMMARY..................................................................................................................................v
I. INTRODUÇÃO .........................................................................................................................1
II. REVISÃO DE LITERATURA....................................................................................................3
2.1 A cultura da cana-de-açúcar...............................................................................................3
2.1.1 Origem e importância econômica.................................................................................3
2.1.2 Aspectos gerais da cultura...........................................................................................6
2.2 Estresses abióticos ............................................................................................................8
2.2.1 Deficiência hídrica no solo ...........................................................................................8
2.2.2 Acidez do solo............................................................................................................10
2.3 Mecanismos de tolerância aos estresses abióticos..........................................................12
2.3.1 Atividade da redutase do nitrato.................................................................................12
2.3.2 Prolina livre................................................................................................................15
III. MATERIAL E MÉTODOS.....................................................................................................18
3.1 Cana-de-açúcar cv. IAC91-5155 ......................................................................................18
3.2 Instalação e condução experimental ................................................................................19
3.3 Tratamentos de disponibilidade hídrica e acidez do solo..................................................20
3.4. Coleta e preparo das amostras .......................................................................................24
3.5. Avaliações bioquímico-fisiológicas ..................................................................................24
3.5.1. Atividade da redutase do nitrato................................................................................24
3.5.2. Teores de prolina livre...............................................................................................25
3.5.3. Crescimento inicial....................................................................................................26
3.6. Tratamento estatístico.....................................................................................................27
IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................................28
4.1. Atividade da redutase do nitrato......................................................................................28
4.2. Teores de prolina livre.....................................................................................................35
4.3. Crescimento inicial das raízes.........................................................................................47
V. CONCLUSÕES.....................................................................................................................51
VI. REFERÊNCIAS....................................................................................................................52
APÊNDICE................................................................................................................................67
ii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Análise química e granulométrica de um Latossolo Vermelho distrófico....................21
Tabela 2. Análise química de um Latossolo Vermelho distrófico, após 30 dias de incubação com
calcário calcinado (PRNT 130%)...............................................................................................23
Tabela 3. Análise de variância da atividade da redutase do nitrato em raízes de plantas jovens
de cana-de-açúcar cv. IAC91-5155 sob efeito associado da disponibilidade hídrica e da acidez
do solo, por 60 dias (90 DAP). Jaboticabal, SP. 2006-2007. .....................................................29
Tabela 4. Regressão polinomial da atividade da redutase do nitrato em raízes de plantas jovens
de cana-de-açúcar cv. IAC91-5155 sob efeito associado da disponibilidade hídrica e da acidez
do solo, por 60 dias (90 DAP). Jaboticabal, SP. 2006-2007. .....................................................30
Tabela 5. Análise de variância dos teores de prolina livre em raízes de plantas jovens de cana-
de-açúcar cv. IAC91-5155 sob efeito associado da disponibilidade hídrica e da acidez do solo,
por 60 dias (90 DAP). Jaboticabal, SP. 2006-2007....................................................................37
Tabela 6. Regressão polinomial dos teores de prolina livre em raízes de plantas jovens de cana-
de-açúcar cv. IAC91-5155 sob efeito associado da disponibilidade hídrica e da acidez do solo,
por 60 dias (90 DAP). Jaboticabal, SP. 2006-2007....................................................................38
Tabela 7. Análise de variância e teste de Tukey do crescimento de raízes (diâmetro médio;
densidade e massa seca) de plantas jovens de cana-de-açúcar cv. IAC91-5155 sob efeito
associado da disponibilidade hídrica e da acidez do solo, por 60 dias (90 DAP). Jaboticabal, SP.
2006-2007.................................................................................................................................50
APÊNDICE
Tabela I. Teste de Tukey da atividade da redutase do nitrato em raízes de plantas jovens de
cana-de-açúcar cv. IAC91-5155 sob efeito associado da disponibilidade hídrica e da acidez do
solo, por 60 dias (90 DAP). Jaboticabal, SP. 2006-2007. ...........................................................vi
Tabela II. Desdobramento do teste de Tukey da atividade da redutase do nitrato em raízes de
plantas jovens de cana-de-açúcar, cv. IAC91-5155, sob efeito associado da disponibilidade
hídrica e da acidez do solo, por 60 dias (90 DAP). Jaboticabal, SP. 2006-2007.........................vi
Tabela III. Teste de Tukey dos teores de prolina livre em raízes de plantas jovens de cana-de-
açúcar cv. IAC91-5155 sob efeito associado da disponibilidade hídrica e da acidez do solo, por
60 dias (90 DAP). Jaboticabal, SP. 2006-2007.......................................................................... vii
Tabela IV. Desdobramento do teste de Tukey dos teores de prolina livre raízes de plantas
jovens de cana-de-açúcar, cv. IAC91-5155, sob efeito associado da disponibilidade hídrica e da
acidez do solo, por 60 dias (90 DAP). Jaboticabal, SP. 2006-2007. .......................................... vii
iii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Atividade da redutase do nitrato em raízes de plantas jovens de cana-de-açúcar, cv.
IAC91-5155, sob efeito associado da disponibilidade hídrica e da acidez moderada do solo, durante
60 dias (90 DAP). Jaboticabal, SP. 2006-2007.................................................................................31
Figura 2. Atividade da redutase do nitrato em raízes de plantas jovens de cana-de-açúcar, cv.
IAC91-5155, sob efeito associado da disponibilidade hídrica moderada e da acidez do solo, durante
60 dias (90 DAP). Jaboticabal, SP. 2006-2007.................................................................................32
Figura 3. Teores de prolina livre em raízes de plantas jovens de cana-de-açúcar, cv. IAC91-5155,
sob efeito associado da disponibilidade hídrica e da acidez do solo, durante 60 dias (90 DAP).
Ausência de estresse ácido (A
1
= 55%) nos tratamentos de estresse hídrico. Jaboticabal, SP. 2006-
2007. ...............................................................................................................................................41
Figura 4. Teores de prolina livre em raízes de plantas jovens de cana-de-açúcar, cv. IAC91-5155,
sob efeito associado da disponibilidade hídrica e da acidez do solo, durante 60 dias (90 DAP).
Estresse ácido moderado (A
2
= 33%) nos tratamentos de estresse hídrico. Jaboticabal, SP. 2006-
2007. ...............................................................................................................................................42
Figura 5. Teores de prolina livre em raízes de plantas jovens de cana-de-açúcar, cv. IAC91-5155,
sob efeito associado da disponibilidade hídrica e da acidez do solo, durante 60 dias (90 DAP).
Estresse ácido severo (A
3
= 23%) nos tratamentos de estresse hídrico. Jaboticabal, SP. 2006-2007.
........................................................................................................................................................43
Figura 6. Teores de prolina livre em raízes de plantas jovens de cana-de-açúcar, cv. IAC91-5155,
sob efeito associado da disponibilidade hídrica e da acidez do solo, durante 60 dias (90 DAP).
Ausência de estresse hídrico (H
1
= 70%) nos tratamentos de estresse ácido. Jaboticabal, SP. 2006-
2007. ...............................................................................................................................................44
Figura 7. Teores de prolina livre em raízes de plantas jovens de cana-de-açúcar, cv. IAC91-5155,
sob efeito associado da disponibilidade hídrica e da acidez do solo, durante 60 dias (90 DAP).
Estresse hídrico moderado (H
2
= 55%) nos tratamentos de estresse ácido. Jaboticabal, SP. 2006-
2007. ...............................................................................................................................................45
Figura 8. Teores de prolina livre em raízes de plantas jovens de cana-de-açúcar, cv. IAC91-5155,
sob efeito associado da disponibilidade hídrica e da acidez do solo, durante 60 dias (90 DAP).
Estresse hídrico severo (H
3
= 40%) nos tratamentos de estresse ácido. Jaboticabal, SP. 2006-2007.
........................................................................................................................................................46
APÊNDICE
Figura I. Diâmetro de raízes de plantas jovens de cana-de-açúcar cv. IAC91-5155 sob efeito da
disponibilidade hídrica do solo, após 60 dias. ................................................................................. viii
Figura II. Densidade de raízes de plantas jovens de cana-de-açúcar cv. IAC91-5155 sob efeito da
disponibilidade hídrica do solo, após 60 dias. ................................................................................. viii
Figura III. Densidade de raízes de plantas jovens de cana-de-açúcar cv. IAC91-5155 sob efeito da
acidez do solo, após 60 dias.............................................................................................................ix
Figura IV. Massa seca de raízes de plantas jovens de cana-de-açúcar cv. IAC91-5155 sob efeito da
disponibilidade hídrica do solo, após 60 dias. ...................................................................................ix
iv
ATIVIDADE DA REDUTASE DO NITRATO E ACÚMULO DE PROLINA LIVRE EM
RAÍZES DE CANA-DE-AÇÚCAR SUBMETIDAS AOS ESTRESSES HÍDRICO E ÁCIDO
NO SOLO
RESUMO – No presente trabalho verificou-se a atividade da redutase do nitrato,
o acúmulo de prolina livre e o crescimento inicial em raízes de cana-de-açúcar, cv.
IAC91-5155, considerada tolerante à seca, sob interação dos estresses hídrico e ácido
no solo. O estudo teve o intuito de propor a utilização destes compostos como
indicadores bioquímico-fisiológicos, para aferir o grau de tolerância em plantas jovens
de cana-de-açúcar cultivadas sob efeito dos estresses associados. Aos 30 dias de
idade, as mudas, originadas da brotação de gemas, foram transferidas para vasos com
12 dm3 de Latossolo Vermelho distrófico e submetidas à associação de três
tratamentos de disponibilidade hídrica: sem estresse (70%), estresse moderado (55%) e
estresse severo (40%), de acordo com a capacidade de campo, e três níveis de acidez
no solo: sem estresse (55%), estresse moderado (33%) e estresse severo (23%),
considerando-se o índice de saturação por bases. O delineamento experimental foi em
blocos casualizados, em esquema fatorial 3x3, com quatro repetições. Aos 60 dias sob
associação dos estresses foram determinados os teores de prolina livre, a atividade da
redutase do nitrato e o crescimento inicial do sistema radicular de plantas jovens de
cana-de-açúcar. Pelos resultados obtidos evidenciou-se que a redução da atividade da
redutase do nitrato ocorreu em moderada acidez e restrição hídrica associadas à
severidade dos estresses. O acúmulo de prolina livre pode ser considerado indicador
fisiológico em plantas jovens de cana-de-açúcar, cv. IAC91-5155, sob condições
severas de disponibilidade hídrica e acidez do solo. A deficiência hídrica reduziu o
crescimento das raízes.
Palavras-Chave: crescimento inicial, estresses abióticos, nitrogênio, osmoprotetor, raiz,
Saccharum spp.
v
NITRATE REDUCTASE ACTIVITY AND FREE PROLINE ACCUMULATION IN
SUGARCANE ROOTS SUBMITTED TO WATER AND ACID STRESS IN SOIL
SUMMARY – In the present work it was observed the nitrate reductase activity,
the accumulation of free proline, and the sugarcane cv. IAC91-5155 roots initial growth,
under interaction between the water and acid stress in soil. The study reasoning was to
propose the use of these compounds as biochemical-physiological indicators, so as to
detect the tolerance level of sugarcane seedlings grown under the effect of the stress
factors. After 30 days the seedlings, originated from the shoot sprouting, were
transferred to pots with 12 dm3 of dystrophic Red Latosol and submitted to three
treatments of water availability: no stress (70%), moderate stress (55%) and severe
stress (40%), in accordance with field capacity and three acidity treatments: no stress
(55%), moderate stress (33%) and severe stress (23%), considering the base saturation
index. The experimental design was in randomized blocks under factorial scheme of
3x3, with four replicates. After 60 days under the stress association, the levels of free
proline, the nitrate reductase activity and the growth of the sugarcane roots system were
evaluated. The results indicate that the reduction of the nitrate reductase activity took
place under moderate levels of acidity and water restriction associated to the stress
intensities. The accumulation of free proline can be considered as a biochemical-
physiological indicator for sugarcane cv. IAC91-5155 seedlings, when under the
interaction of soil severe stress conditions. The water deficiency reduced the roots
growth.
Keywords: initial growth, abiotic stresses, nitrogen, osmoprotector, root, Saccharum
spp.
1
I. INTRODUÇÃO
A cana-de-açúcar, Saccharum spp., cultivada no Brasil desde o século XVI,
apresentou grande expansão nas últimas três décadas do século XX, destacando-se
como uma das principais plantas cultivadas no país (AGRIANUAL, 2008). Atualmente,
representa um dos grandes mercados agrícolas brasileiros, com previsão de aumento
de 40% na área plantada e da ordem de 100% na produção, nos próximos 10 anos
(CASARIN et al., 2006). Para alcançar estas previsões, a cultura deve apresentar
ganhos em produtividade, entretanto, os estresses ambientais influenciam
negativamente a agroindústria canavieira. Entre os diversos fatores abióticos, a
deficiência hídrica e a acidez do solo devem ser destacadas, devido aos efeitos
prejudiciais causados no desenvolvimento das plantas (VITORELLO et al., 2005).
A disponibilidade hídrica do solo é um dos fatores ambientais que mais
influenciam a produção da cana-de-açúcar, pois determina o estabelecimento da cultura
durante o estádio vegetativo (RAMESH, 2000). O aumento do aquecimento global tem
ocasionado a ampliação dos períodos de seca, influenciando de forma direta na
disponibilidade de água do solo em canaviais, o que reduz significativamente os
rendimentos destas áreas (TERAMOTO, 2003).
Além das condições hídricas desfavoráveis existentes no solo, a acidez também
pode interferir negativamente no estabelecimento de uma cultura. Aproximadamente
66% dos solos da América do Sul são ácidos, cuja elevada saturação por alumínio é
limitante para a agricultura no continente (DRUMMOND et al., 2001). Nestas regiões
tropicais e subtropicais, os solos tendem a ser ácidos pela ocorrência de elevada
precipitação, que lixivia quantidades apreciáveis de bases permutáveis, ou pela
ausência de minerais primários e secundários, responsáveis pela reposição dessas
bases (CUSTÓDIO et al., 2002).
A demanda por cultivares tolerantes às adversidades ambientais tem gerado
interesse na investigação dos mecanismos fisiológicos que possam ser utilizados pelas
plantas em respostas aos estresses abióticos (KAVI KISHOR et al., 2005). Dentre estes
mecanismos, destacam-se o ajustamento osmótico e a atividade da redutase do nitrato.
2
O ajustamento osmótico é importante para evitar a diminuição do potencial hídrico
celular mediante o acúmulo de solutos compatíveis (ABDUL JALEEL et al., 2007). Os
compostos envolvidos na osmolaridade dos vegetais compreendem substâncias
orgânicas, inorgânicas e, principalmente, aminoácidos livres, como a prolina, que se
acumula no citoplasma e mantém o turgor celular sob condições de estresse,
preservando a integridade das células para as atividades vitais do crescimento e
desenvolvimento vegetal (BARTELS & SUNKAR, 2005).
A deficiência hídrica e a acidez do solo também influenciam negativamente o
metabolismo de compostos nitrogenados, pelo fato de que o nitrogênio é um dos
nutrientes mais importantes para o crescimento e desenvolvimento das plantas
(FERREIRA et al., 2002). A redutase do nitrato, principal enzima responsável pela
assimilação de nitrogênio pelas plantas, tem a atividade influenciada pela
disponibilidade de água e pela acidez do solo (SHARMA & DUBEY, 2005), podendo ser
utilizada como parâmetro indicativo da resposta fisiológica das plantas aos estresses
ambientais (OLIVEIRA et al., 2005).
Atualmente, existe a necessidade de se compreender como os vegetais
respondem às condições adversas, uma vez que os mecanismos fisiológicos e
bioquímicos de tolerância das plantas aos estresses ambientais ainda não estão
completamente elucidados (GRENNAN, 2006). Devido à importância da cana-de-
açúcar, o entendimento destes mecanismos de tolerância aos estresses contribuirá
significativamente para indicar o melhor manejo visando obter maior produtividade
agrícola (KAVI KISHOR et al., 2005).
O objetivo do presente trabalho foi determinar o acúmulo de prolina livre e a
atividade da redutase do nitrato nas raízes da cana-de-açúcar, cv. IAC91-5155, sob
interação dos estresses hídrico e ácido no solo. O estudo teve o intuito de propor a
utilização destes compostos como indicadores bioquímico-fisiológicos, para aferir o grau
de tolerância em plantas jovens de cana-de-açúcar cultivadas sob efeito desses
estresses associados.
3
II. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 A cultura da cana-de-açúcar
2.1.1 Origem e importância econômica
A cana-de-açúcar, Saccharum spp., originária do sudeste Asiático, na região
central da Nova Guiné e Indonésia, é uma planta alógama, de ciclo semiperene e
elevada rusticidade (DANIELS & ROACH, 1987). A cultura foi usada inicialmente como
xarope, mas a primeira evidência do açúcar em sua forma sólida data do ano 500, na
Pérsia. A propagação da cultura da cana-de-açúcar no norte da África e sul da Europa
deve-se aos Árabes, na época das invasões. Nesse mesmo período, os chineses a
levaram para Java e Filipinas. A partir do século VIII, as conquistas árabes no Ocidente
disseminaram o cultivo da cana-de-açúcar nas margens do mar Mediterrâneo
(MOZAMBANI et al., 2006). A partir deste local, os portugueses e espanhóis
introduziram a cana-de-açúcar nas ilhas do Cabo Verde, Canárias, Madeira, São Tomé
e na África Ocidental (LANDELL et al., 2006). No Brasil, o desenvolvimento da cultura
se constituiu com a criação de engenhos e plantações por meio de mudas trazidas
pelos portugueses (MOZAMBANI et al., 2006).
Em 1532, Martim Afonso de Souza introduziu as primeiras mudas de cana-de-
açúcar no Brasil, provenientes da Ilha da Madeira, impulsionando a formação dos
primeiros engenhos no país (LANDELL et al., 2006). Essas instalações foram
responsáveis pelo desenvolvimento da produção, do comércio e da cultura do Nordeste
brasileiro, onde foi implantado o primeiro centro açucareiro do país (UNICA, 2004). No
final do século XVI, os estados de Pernambuco e Bahia lideravam a produção mundial
de açúcar, com grande repercussão no mercado europeu. No século XVII, a cultura
disseminou-se pelo planalto paulista, com a região de Itu destacando-se como maior
centro açucareiro do estado de São Paulo até meados do século XIX (MOZAMBANI et
al., 2006).
Atualmente, metade da produção mundial de cana-de-açúcar é assegurada por
4
quatro nações das Américas: Brasil, Cuba, México e EUA. Os países asiáticos Índia,
China e as Filipinas destacam-se por manter safras importantes. No Brasil, depois da
década de 1970, a crise do petróleo tornou intensa a produção de etanol a partir da
cana-de-açúcar, para a utilização direta em motores a explosão (hidratado) ou em
mistura com a gasolina (anidro). Desde então, o álcool combustível destacou-se como
matéria-prima, cuja fração principal destinava-se, sobretudo, à extração do açúcar
(MOZAMBANI et al., 2006).
A cana-de-açúcar destaca-se como uma das melhores opções de fonte de
energia renovável, justificando-se como importante cultura no país e no mundo, cujas
perspectivas são extremamente favoráveis a médio e longo prazo. Para cada unidade
de energia consumida na produção, o álcool de cana produz 8 unidades de energia
equivalentes; no caso do milho, a produção é de apenas 1,3 unidades equivalentes por
unidade de energia consumida (AGRIANUAL, 2008). O Brasil é o maior produtor
mundial de cana-de-açúcar e detém um pouco mais de um terço da cana cultivada no
mundo (CANAOESTE, 2006). Em 2005, o país produziu 386 milhões de toneladas de
cana-de-açúcar nos 5,9 milhões de hectares cultivados, os quais resultaram em 17
bilhões de litros de álcool e 26,7 milhões de toneladas de açúcar. A região Centro-Sul,
formada pelos estados de São Paulo, Rio de Janeiro, Espírito Santo, Minas Gerais,
Paraná, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul e Goiás, concentra 85% da produção do
setor sucroalcooleiro, cujo maior produtor e exportador é o estado de São Paulo,
responsável por 60% de todo o açúcar produzido no país (ORTOLAN, 2006).
A importância do setor sucroalcooleiro na sociedade brasileira é evidenciada pelo
grande potencial na geração de empregos diretos e indiretos, além das exportações de
açúcar colaborarem com o equilíbrio da balança comercial (MARQUES et al., 2006). As
estimativas para a safra brasileira de 2007/08 mostram um ganho superior a 2,5% na
produtividade média do país e acima de 12% na área plantada, de forma que a cana-
de-açúcar ocupa atualmente 6,92 milhões de hectares, dos quais 82% concentram-se
na região Centro-Sul. A colheita deve ultrapassar 547 milhões de toneladas de cana-de-
açúcar, representando um crescimento de 15% em relação à safra anterior. A indústria
sucroalcoleira deve moer 473,2 milhões de toneladas (86,5% do total) e o restante deve
5
ser destinado à alimentação animal, produção de mudas e cachaça e outros fins. A
redução nas cotações internacionais deve fazer com que a moagem seja destinada
primordialmente à produção de álcool (53,1%), que pode atingir 21,3 bilhões de litros
(22% superior à safra anterior). O álcool anidro, para mistura na gasolina, pode
representar 40,3% do total produzido e o hidratado 59,6%. A produção de açúcar,
estimada em 30 milhões de toneladas, deve apresentar exportação na ordem de 19
milhões de toneladas nesta safra. Com o intuito de atender à demanda internacional, o
Brasil terá de produzir mais de 750 milhões de toneladas de cana-de-açúcar na safra de
2017/18 e a área cultivada deverá ser de 11 milhões de hectares (AGRIANUAL, 2008).
Para alcançar essas previsões, a cultura deve apresentar ganhos em
produtividade, de forma que novas unidades produtoras terão que ser implantadas até
2010; muitas já estão em funcionamento desde 2004. Os investimentos na área
industrial estão calculados em R$ 14,3 bilhões, dos quais R$ 4,1 bilhões serão
investidos em projetos de expansão das usinas instaladas. O aumento da área plantada
deverá requisitar R$ 7,2 bilhões (ORTOLAN, 2006).
A perspectiva de ampliação da área total de cana-de-açúcar no país, para os
próximos dez anos, pode promover o deslocamento do cultivo para a região oeste
paulista, que dispõe de propriedades rurais mais baratas e logística para escoamento
da produção, constituindo-se em uma importante fronteira agrícola à cana-de-açúcar
(VIEIRA JUNIOR et al., 2008). Estima-se que, das 40 novas usinas previstas para
instalação até o ano de 2010, 30 serão implantadas no oeste do estado de São Paulo
(ANSELMI, 2005).
A região Centro-Oeste brasileira também se constitui em uma área de expansão
para a cultura, pois apresenta terrenos com topografia propícia à mecanização e
apenas 3,3% dos 17 milhões de hectares agricultáveis, cultivados com cana-de-açúcar
(IBGE, 2007). O relevo predominante na região Centro-Oeste caracteriza-se por
apresentar variações de plano a ondulado, adequado à agricultura mecanizada. Os
solos são antigos, profundos e, à exceção da depressão do Pantanal, bem drenados. O
bioma dos cerrados apresenta solos com baixa fertilidade natural e acidez
caracterizada, principalmente, pela elevada saturação por alumínio tóxico às plantas,
6
limitação superada pela técnica de “construção do solo de cerrado”, desenvolvida na
década de 1960. Esta técnica se consistiu na adequação da fertilidade dos solos de
cerrado para produção agrícola por uma sucessão de espécies pouco exigentes, como
o arroz, cultivado por dois a três anos, seguido por espécies medianamente exigentes,
como a soja. Após quatro a cinco anos de cultivos sucessivos com a cultura da soja, a
área encontra-se apta ao plantio da cana-de-açúcar (Miyasaka, 1986 citado por VIEIRA
JUNIOR et al., 2008).
A cana-de-açúcar apresenta ampla escala de adaptação sendo cultivada
principalmente em regiões situadas entre os paralelos 35°N e 35°S, e no Brasil as
variações climáticas possibilitam colheitas anuais de setembro a abril, no Norte-
Nordeste e de maio a dezembro, no Centro-Sul (ALFONSI et al., 1987). Embora o
cultivo da cana-de-açúcar se concentre nas regiões Sudeste e Nordeste, a produção se
desloca preferencialmente para a Região Centro-Oeste do país, notadamente nos
estados de Goiás e Mato Grosso do Sul (VIEIRA JUNIOR et al., 2008). Dessa forma, a
cana-de-açúcar é cultivada em diferentes tipos de solos, sob influência de diversos
fatores abióticos peculiares a cada região, evidenciando distintos níveis de produção
(MAULE et al., 2001).
2.1.2 Aspectos gerais da cultura
A cana-de-açúcar foi descrita por Linneu, em 1753, que a classificou como
Saccharum officinarum e Saccharum spicatum. Posteriormente, várias formas de
classificação foram apresentadas (MOZAMBANI et al., 2006). De acordo com Cronquist
(1981), a cana-de-açúcar pertence à Divisão Magnoliophyta; Classe Liliopsida; Ordem
Graminales; Família Poaceae; Gênero Saccharum; Espécies Saccharum officinarum,
Saccharum spontaneum, Saccharum sinensis, Saccharum barderi e Saccharum
robustum.
A espécie Saccharum officinarum L. apresenta alto teor de açúcar e baixa
porcentagem de fibra, constituindo-se das chamadas “canas nobres”. Consideradas
7
canas tropicais, possuem colmos grossos (3,5 cm de diâmetro ou mais), sistema
radicular reduzido e superficial; são exigentes quanto ao clima e solo, suscetíveis ao
mosaico, mas resistentes a um grande número de outras doenças (MOZAMBANI et al.,
2006). Até o século XX, a espécie Saccharum officinarum foi responsável por grande
parte da matéria-prima mundial, entretanto, o surgimento da doença do sereh,
posteriormente, o mosaico e a gomose contribuíram para o início do melhoramento
genético, a partir de 1980 (LANDELL et al., 2006). Os programas de melhoramento
genético desenvolveram híbridos resistentes aos estresses bióticos e adaptados às
diversas condições ambientais, favorecendo a expansão da cultura pelo Brasil e o
mundo (QUEIROZ, 2006).
Atualmente, os plantios comerciais são constituídos por híbridos provenientes do
cruzamento entre as espécies do gênero Saccharum spp., cuja variedade Crioula,
resultado da hibridação natural entre Saccharum officinarum e Saccharum barberi, foi
cultivada por aproximadamente 250 anos (LANDELL et al., 2006).
A cana-de-açúcar apresenta elevada taxa fotossintética e maior eficiência na
utilização de gás carbônico (CO
2
) da atmosfera, caracterizando-se como uma planta de
ciclo C
4
. Esta cultura, embora adaptada às condições de elevada intensidade luminosa,
altas temperaturas e relativa escassez de água, necessita de grandes quantidades de
água, uma vez que somente 30% do peso constitui-se de massa seca e 70% de água,
dependendo do estádio fenológico. A capacidade de assimilação hídrica pelas folhas é
superior às outras gramíneas, de forma que o orvalho e os chuviscos, que não atingem
o solo, também são absorvidos. No entanto, as raízes, através dos pêlos absorventes,
apresentam maior capacidade de absorção de água (SEGATO et al., 2006).
Em virtude de apresentar ciclo semiperene, a cana-de-açúcar é influenciada por
grandes variações climáticas durante o ano, o que pode interferir na produção,
maturação e qualidade da cultura. Para manter índices de produção satisfatórios, esta
cultura necessita de um período quente e úmido, com intensa radiação solar durante o
estádio vegetativo, seguido de um período seco na fase de maturação e colheita
(ALFONSI et al.,1987). A qualidade e a intensidade luminosa exercem influência no
crescimento vegetativo e na maturação, pois estabelece correlação direta com a
8
síntese, translocação e acúmulo de carboidratos das folhas para o colmo (MARQUES et
al., 2001).
A cana-de-açúcar é plenamente adaptada em regiões de clima tropical, quente e
úmido (SEGATO et al., 2006). Quanto às condições edáficas, os solos arejados,
profundos, férteis e com valores de pH entre 5,0 e 6,5 são satisfatórios às exigências da
cultura (Van RAIJ et al., 1997; MARQUES et al., 2001). No Brasil, a cana-de-açúcar tem
sido cultivada em escala comercial em todas as regiões, resultando em uma grande
diversidade de condições edafoclimáticas, que ocasionam variabilidade na adaptação
dos cultivares nas diversas regiões de cultivo de cana-de-açúcar (QUEIROZ, 2006).
2.2 Estresses abióticos
2.2.1 Deficiência hídrica no solo
O estresse é considerado um fator externo, que exerce influência desvantajosa
sobre a planta e induz respostas em todos os níveis funcionais do organismo. Em
condições naturais e agricultáveis, as plantas estão freqüentemente expostas aos
estresses ambientais, os quais limitam o desenvolvimento e as chances de
sobrevivência (ALEXIEVA et al., 2003).
Dentre os estresses ambientais que reduzem o crescimento e o desenvolvimento
vegetal, a deficiência hídrica constitui uma das mais importantes limitações à
produtividade e à distribuição dos vegetais, apresentando influência negativa em mais
de 10% das áreas agrícolas do globo terrestre (BARTELS & SUNKAR, 2005),
principalmente em lavouras de espécies economicamente importantes como o arroz, o
milho, o trigo e a cana-de-açúcar (GARG et al., 2002). Esta cultura necessita de
elevada disponibilidade de água, durante o estádio vegetativo, a fim de apresentar
rendimento adequado, sendo necessárias 130 a 150 litros de água para a produção de
1Kg de massa seca (CASTRO, 2000). No decorrer dos anos, verificou-se que a
9
produção da cana-de-açúcar foi negativamente influenciada pela deficiência hídrica do
solo, apresentado variações na produtividade (MAULE et al., 2001).
Os problemas causados pela diminuição da disponibilidade hídrica do solo são
comuns nos canaviais. O aumento do aquecimento global tem gerado a ampliação dos
períodos de seca, influenciando de forma direta na disponibilidade de água no solo
(TERAMOTO, 2003). Nas regiões brasileiras produtoras de cana-de-açúcar observou-
se, nos últimos anos, significativa redução nas quantidades de chuva, com conseqüente
aumento de “veranicos”, que causam maiores prejuízos quando ocorrem no estádio
vegetativo da planta (DIAS, 1999). Estes veranicos influenciaram negativamente a safra
de 2005/2006 da cana-de-açúcar, determinando redução na produtividade da cultura
em todas as regiões produtoras do Brasil (REVISTA ALCOOLBRAS, 2005).
Em condições de estresse hídrico, vários processos fisiológicos são alterados,
tais como: fotossíntese, respiração, transpiração, abertura estomática, produção de
ácido abscísico, abscisão foliar e ajuste osmótico (MARIN et al., 2006). Além disso, a
deficiência hídrica provoca severos danos no crescimento vegetal, através,
primordialmente, da diminuição da expansão celular. De fato, é indiscutível a
importância da água para o crescimento, devido à turgidez celular ocasionada pelo
influxo de água no vacúolo, quando os hormônios do crescimento vegetal (auxinas ou
giberelinas) estão promovendo o alongamento celular (TAIZ & ZEIGER, 2004).
Como a água é limitante para o crescimento e fundamental para a fotossíntese, a
produtividade das plantas depende da quantidade disponível deste recurso e da
eficiência de seu uso pelo vegetal. A diminuição da disponibilidade hídrica do solo
provoca redução do alongamento celular, e conseqüentemente, do consumo de
carbono e energia, sendo uma maior proporção de fotoassimilados distribuída ao
sistema radicular, diminuindo dessa forma a razão parte aérea/raiz das plantas,
provavelmente, porque em condições de deficiência hídrica o sistema radicular tende a
se desenvolver até que sua necessidade em fotoassimilados seja igual à quantidade
que é produzida na parte aérea (TAIZ & ZEIGER, 2004). Assim, as raízes
desempenham importante função de tolerância às condições de deficiência hídrica e
são determinantes para o estabelecimento das culturas (PADILHA et al., 2007).
10
Os estresses abióticos, como a deficiência hídrica, limitam a produtividade
vegetal, pois são considerados problemas eminentes para a agricultura e reduzem
significativamente os rendimentos das lavouras, além de restringir as latitudes e os
solos onde espécies comercialmente importantes podem ser cultivadas (MITTLER,
2006). No mundo, dos 3,3 bilhões de hectares considerados aptos para a agricultura,
aproximadamente 28% podem apresentar deficiência hídrica (PURCINO, 2004). Dessa
forma, um dos maiores desafios da agricultura está na manutenção da produtividade
sob deficiência hídrica, sendo necessária a compreensão dos mecanismos de
adaptação das plantas à seca (LIZANA et al., 2006; ABDUL JALEEL et al., 2007).
2.2.2 Acidez do solo
A acidez do solo causa sérios prejuízos ao desenvolvimento das plantas
(FUENTE-MARTINÉZ & HERRERA-ESTRELLA, 1999; MARIN, 2003; VITORELLO et
al., 2005). No Brasil, os solos que se apresentam alcalinos ou com pH próximo ao
neutro são praticamente raros (HUNGRIA & VARGAS, 2000). Na realidade, 2/3 do
território nacional, isto é, mais de 500 milhões de hectares são constituídos por solos
ácidos (VITORELLO et al., 2005). Assim, devido às grandes áreas de solos ácidos com
possibilidade de cultivo, a importância da acidez sob o aspecto prático é relevante
(CUSTÓDIO et al., 2002). Os problemas da baixa fertilidade dos solos ácidos são bem
generalizados em muitas partes do mundo, sendo particularmente comuns nos trópicos
úmidos (FUENTE-MARTINÉZ & HERRERA-ESTRELLA, 1999).
No mundo, cerca de 80% dos solos agricultáveis são ácidos e impossibilitam a
exploração economicamente viável das culturas, uma vez que os processos de
formação do solo que originam a acidez, freqüentemente, ocasionam também o
esgotamento de alguns elementos essenciais para as plantas (HAMEL et al., 1998).
Aproximadamente 40% desses solos aráveis e um ⅓ dos solos tropicais apresenta
acidez por causa da disponibilidade do alumínio solúvel (Al
3+
), que limita severamente o
crescimento das espécies (VITORELLO et al., 2005).
11
O alumínio é o terceiro elemento mais abundante da crosta terrestre, após o
oxigênio e o silício, sendo encontrado sob diferentes formas, como aluminossilicatos
insolúveis ou óxidos (DELHAIZE & RYAN, 1995). O principal íon presente sob
condições de acidez no solo está tanto na forma de Al
3+
quanto na forma de Al(OH)
+2
que pode tornar-se solúvel dependendo do valor do pH (HUNGRIA & VARGAS, 2000),
isto é, pH menor que 5,0 permite que a forma Al
3+
exista como hexahidrato octaedral,
(Al(H
2
O)
6
3+
), mas conforme o pH aumenta, ocorre sucessiva desprotonização do
Al(H
2
O)
6
3+
para a forma Al(OH)
+2
e Al(OH)
2
+1
(SIMPLÍCIO, 1999). A forma trocável Al³
+
é, predominantemente, encontrada em 32% dos solos brasileiros com pH abaixo de 5,6
(ABREU JR. et al., 2003). A maioria dos solos destinados à produção agrícola no Brasil
apresenta problemas de acidez e toxicidade por alumínio (Al
3+
), que em níveis tóxicos
no solo pode causar injúrias nas plantas, limitando o crescimento (MAZZOCATO et al.,
2002).
Em plantas de diversas espécies, os efeitos prejudiciais do Al
3+
são observados
na parte aérea e no sistema radicular, contudo, por ser um elemento de pouca
mobilidade dentro da planta, os efeitos biológicos do alumínio são muito mais evidentes
nas raízes (SANDERSON et al., 1997; BENNET, 1998; BENNET & GRANGER, 2000;
MARIN, 2003). A toxicidade do alumínio causa a inibição do alongamento celular
(VASCONCELOS et al., 2002), o engrossamento e a diminuição da permeabilidade das
células radiculares (BENNET & GRANGER, 2000), conseqüentemente, acarretando
efeitos prejudiciais na translocação e absorção de nutrientes (BENNET, 1998),
alterações em diversos processos fisiológicos e bioquímicos e, finalmente, inibição no
crescimento da planta (DRUMMOND et al., 2001). Entretanto, muitas espécies de
plantas comercialmente importantes, como a cana-de-açúcar, desenvolveram
mecanismos de tolerância à toxicidade do alumínio, mostrando-se mais adaptadas em
solos ácidos (WATT, 2003).
A necessidade de plantas tolerantes à toxicidade de alumínio vem despertando o
interesse de muitas áreas de pesquisa agrícola, particularmente quando se pretende
explorar eficientemente solos com acidez subsuperficial e elevado nível de alumínio, de
difícil correção com manejo químico (PANDEY et al., 1994).
12
A demanda por cultivares tolerantes às adversidades do ambiente tem gerado
interesse na investigação dos mecanismos fisiológicos, bioquímicos e moleculares que
possam ser utilizados pelas plantas em respostas aos estresses abióticos (KAVI
KISHOR et al., 2005).
As pesquisas têm revelado que as respostas das plantas devido à ocorrência de
um único estresse não podem ser diretamente extrapoladas às condições de ocorrência
simultânea de diferentes estresses, pois nestas condições as respostas podem ser
singulares; desta forma, os futuros programas de pesquisa deveriam investigar as
respostas das plantas sob efeito associado de estresses abióticos que retratam mais
fielmente a realidade dos ambientes agrícolas atuais (MITTLER, 2006).
2.3 Mecanismos de tolerância aos estresses abióticos
2.3.1 Atividade da redutase do nitrato
Os estresses ambientais também influenciam o metabolismo de compostos
nitrogenados, pelo fato de que o nitrogênio é o nutriente mineral mais limitante para o
crescimento e desenvolvimento das plantas (CAZETTA, 1997; TISCHNER, 2000). O
metabolismo do nitrogênio é influenciado negativamente pelo estresse ácido causado
pelo alumínio (AMARAL et al., 2000) e pela deficiência hídrica (FERREIRA et al., 2002).
O nitrogênio, constituinte de aminoácidos, nucleotídeos e enzimas, é o quarto
elemento mais abundante na planta, depois do carbono, hidrogênio e oxigênio
(DONATO et al., 2004). Em relação aos nutrientes essenciais, o nitrogênio é um dos
mais absorvidos pela cana-de-açúcar, perdendo apenas para o potássio (COLETI et al.,
2006); representa apenas 1% da matéria seca total da cana-de-açúcar e está envolvido
diretamente na síntese de aminoácidos, na composição da molécula de clorofila e na
produção de carboidratos (CONTIN, 2007). A necessidade do nitrogênio pela cana-de-
açúcar é crucial no período de formação da cultura, isto é, imediatamente após a
germinação até o fechamento do canavial, normalmente, entre o terceiro e o quinto
13
mês. Nessa época, ocorre a formação dos perfilhos, sendo determinante para o
estande final de plantas e, conseqüentemente, para a produtividade (CONTIN, 2007).
As plantas adquirem o nitrogênio do solo na forma de nitrato, amônia, uréia e
aminoácidos (MORIKAWA et al., 2004). A assimilação do nitrogênio é um processo vital
que controla o crescimento e o desenvolvimento das plantas e tem efeitos marcantes
sobre a produtividade final das culturas (LAM et al., 1996). Embora a maior parte do
nitrogênio seja absorvida pelas plantas na forma de nitrato (PEREZ, 2003), para que
possa ser utilizado é necessário que seja reduzido à amônia, e então incorporado em
composto orgânico. A conversão do nitrato à amônia é constituída por várias etapas,
sendo uma delas a redução do nitrato a nitrito, que é dependente da atividade da
enzima redutase do nitrato, e a conversão de nitrito à amônia, pela redutase do nitrito
(MEGURO & MAGALHÃES, 1987). A amônia produzida participa dos aminoácidos
elaborados pelas plantas em reações catalisadas por várias enzimas e magnésio.
Diversas proteínas são formadas pelas diferentes combinações de aminoácidos, nas
quais 18% são representadas pelo nitrogênio (EPSTEIN, 2006).
A redutase do nitrato (RN) é primeira enzima atuante na rota de assimilação do
N-inorgânico, assumindo, portanto, função de extrema importância no metabolismo
vegetal, além de ser induzida, caracteristicamente, pelo seu substrato (DONATO et al.,
2004). Essa enzima é uma flavoproteína formada por duas subunidades idênticas, com
três grupos: FAD, heme e o complexo constituído por molibdênio (Mo) e uma molécula
orgânica, a pterina, razão pela qual é, também, denominada de molibdopterina, que se
localiza no citossol das células corticais da epiderme da raiz e nas células do mesofilo
(Vaughn & Campbell, 1988 citados por ANDRADE NETTO, 2005).
Atualmente existem mais de 40 seqüências de aminoácidos da RN que
constituem as formas da enzima nas plantas superiores, algas e fungos. A maioria
dessas formas apresenta como agente redutor o NADH, produzido no citossol, ao
contrário de outras, cujo agente redutor é o NADPH, formado no cloroplasto. Entretanto,
algumas formas da enzima apresentam dupla especificidade, podendo utilizar ambos
agentes redutores (ANDRADE NETTO, 2005).
14
O fluxo catalítico da RN ou a capacidade total de redução do nitrato pelas plantas
depende: a) da disponibilidade de substrato no citoplasma (concentração em estado de
equilíbrio do NADPH e nitrato); b) do nível funcional de RN (quantidade de RN
polipeptídica e da disponibilidade de cofatores e íons metálicos, FAD, heme, Fe, Mo-
MPT (molibdênio-molibdopterina) e molibdênio; c) da intensidade da atividade da RN
funcional. Dessa forma, o teor de nitrato é, provavelmente, um dos metabólitos-chave
que controlam a capacidade de redução do nitrato nos vegetais (CAMPBELL, 1999).
Na célula, a meia vida de uma enzima RN, recém sintetizada, é de poucas horas
e, quando há diminuição do teor de nitrato para o vegetal, a quantidade da RN é
rapidamente reduzida (TAIZ & ZEIGER, 2004). Em condições de deficiência hídrica no
solo, ocorre decréscimo do fluxo de nitrato para a planta, contribuindo, portanto, para a
redução da atividade da enzima (ANDRADE NETTO, 2005).
Ainda que as causas fisiológicas sobre tolerância ao alumínio não estejam
totalmente esclarecidas, existem estudos que sugerem uma possível inter-relação entre
a toxidez de alumínio e o metabolismo do nitrogênio (AMARAL et al., 2000). Isto pode
ser comprovado, pelo fato da atividade da redutase do nitrato ser acentuadamente
reduzida em plantas sob estresse ácido (SHARMA & DUBEY, 2005). A estimativa da
atividade da enzima redutase de nitrato tem sido utilizada, com sucesso, como
parâmetro indicativo da resposta fisiológica de plantas submetidas às condições
adversas (OLIVEIRA et al., 2005; CASTRO et al., 2007).
A identificação e a compreensão dos mecanismos fisiológicos e bioquímicos
auxiliam significativamente no desenvolvimento e desempenho de novas cultivares mais
produtivas (MELONI et al., 2004). Devido à importância da cana-de-açúcar, o
entendimento dos mecanismos fisiológicos e bioquímicos da tolerância aos estresses
contribuirá significativamente para indicar o melhor manejo visando obter maiores
rendimentos e produtividade agrícola (KAVI KISHOR et al., 2005).
15
2.3.2 Prolina livre
Os estresses abióticos induzem respostas metabólicas e fisiológicas, como o
acúmulo de solutos compatíveis (BRAY et al., 2001). A capacidade de acúmulo de
solutos compatíveis é uma resposta comum em organismos sob estresses, e vem
sendo investigada, nos últimos anos, nos vegetais superiores (El-BASHITI et al., 2005;
HONGBO et al., 2006). Os solutos compatíveis são moléculas ou íons atóxicos que não
interferem no metabolismo e se acumulam, predominamente, no citoplasma, onde têm
a função de manter o turgor celular, além de estabilizar proteínas e estruturas celulares
(BRAY et al., 2001; BARTELS & SUNKAR, 2005).
A prolina livre é um “α – iminoácido”, que possui um grupo amino ligado a dois
átomos de carbono, conferindo características de neutralidade à molécula. O acúmulo
deste aminoácido pode ocorrer por duas vias paralelas nas plantas, uma direta,
dependente do glutamato, e outra indireta, dependente da ornitina (KAVI KISHOR et al.,
2005). Pela via direta, após a formação do glutamato semi-aldeído, a molécula se
transforma em uma estrutura cíclica (∆’-pirrolina-5-carboxilato), precursor da prolina. A
estrutura cíclica é formada pela reação intramolecular (não enzimática) dos grupos
amino e aldeído do glutamato-semi-aldeído. Na via dos derivados acetilados
(dependente de ornitina), a presença do grupo acetil ligado ao grupo 2-amino impede
essa reação interna e uma estrutura aberta, a ornitina, é formada e pode levar à
formação da estrutura cíclica da prolina, após a perda do grupo amino por
transaminação (SODEK, 2004).
A prolina é particularmente reconhecida pela efetiva participação como soluto
compatível (VERSLUES & BRAY, 2006). Este aminoácido é considerado osmólito-
chave para o ajustamento osmótico de plantas sob deficiência hídrica e toxicidade de
alumínio (GIANNAKOULA et al., 2008).
Em condições de estresse, o metabolismo de aminoácidos é amplamente
alterado, sendo a síntese de proteínas diminuída e a proteólise aumentada (SODEK,
2004). Como conseqüência disto, ocorre a indução da biossíntese de prolina promovida
pelo incremento de metabólicos como poliaminas, amônia, arginina, ornitina, glutamina
16
e glutamato (SILVEIRA et al., 2002). O aumento dos teores de prolina pode ativar
várias funções celulares: ajustamento osmótico, reserva de carbono e nitrogênio
utilizado no crescimento para restabelecimento após estresse, desintoxicação do
excesso de amônia, estabilizador de proteínas e membranas e eliminadores de radicais
livres. Adicionalmente, existem evidências de que a biossíntese desse aminoácido
poderia estar também associada à regulação do pH citosólico ou mediação do
incremento da razão NADP
+
/NADPH, influenciando o fluxo de carbono devido à via
oxidativa da pentose fosfato (SILVEIRA et al., 2002; KAVI KISHOR et al., 2005). Além
disso, pode atuar ainda como fonte acessível de energia, em que uma única molécula
oxidada é capaz de produzir 30 ATP (KAVI KISHOR et al., 2005).
Para tolerar os efeitos dos estresses ambientais, as plantas utilizam o
mecanismo de ajustamento osmótico, processo pelo qual o potencial hídrico pode
diminuir sem que haja redução da turgidez das células vegetais, permitindo a
continuidade de processos fisiológicos essenciais para o crescimento e
desenvolvimento das plantas (DI MARTINO et al., 2003; DESTRO, 2006). Este
mecanismo capacita a célula a acumular compostos, denominados solutos compatíveis
ou osmoprotetores, que preservam a integridade celular, principalmente de proteínas,
enzimas e membranas, e promovem a redução do potencial hídrico durante os períodos
de estresse osmótico proporcionados em condições de maior deficiência hídrica
(MELONI et al., 2004). O potencial matricial (y
m
) torna-se cada vez menor conforme
aumenta a restrição hídrica no solo, e a absorção de água pelas plantas decresce
devido o potencial hídrico celular ser maior que o potencial hídrico do solo (TAIZ &
ZEIGER, 2004). Na realidade, o ajustamento osmótico não é devido ao aumento na
concentração de solutos que ocorre durante a desidratação e na diminuição de volume
celular, pois neste mecanismo o aumento na concentração de solutos compatíveis é
independente das alterações no volume das células resultantes da perda de água
(VERSLUES & BRAY, 2006).
De um modo geral, a prolina livre está presente em pequenas quantidades nas
plantas, aproximadamente entre 1 a 5 µmol g
-1
de massa seca (NOGUEIRA et al.,
2001) e, devido à sua importância no ajustamento osmótico, é o composto mais
17
estudado em plantas sob estresses abióticos (KAVI KISHOR et al., 2005). O acúmulo
de prolina livre em plantas sob estresse pode ser conseqüência tanto do aumento na
sua síntese como do decréscimo na sua degradação (FERREIRA et al., 2002).
Em muitos trabalhos, tem sido relatado o aumento dos teores de prolina livre na
caracterização de cultivares tolerantes à seca (HONGBO et al., 2006). Na cultivar SP-
79-1011 de cana-de-açúcar, tolerante à deficiência hídrica, ocorreu acúmulo de prolina
livre conforme a redução dos níveis de água no solo (BIDOIA et al., 2006).
O acúmulo de prolina livre não ocorre somente como uma resposta das plantas à
restrição hídrica, também sob condições de elevada acidez do solo, proporcionada pelo
aumento da concentração de Al
3+
(MOSSOR, 2001).
Os efeitos associados do estresse hídrico e de alumínio causam aumento nos
teores de prolina, tanto na parte aérea quanto no sistema radicular de gramíneas, mas
para uma melhor compreensão desses efeitos ainda necessita-se de muitas pesquisas
em plantas agronomicamente importantes, pois são raras as informações na bibliografia
pertinente (ZAIFNEJAD et al., 1997).
18
III. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Cana-de-açúcar cv. IAC91-5155
A cultivar IAC91-5155, desenvolvida pelo Programa de Melhoramento de Cana
do Instituto Agronômico de Campinas (IAC), foi selecionada na região de Pindorama -
SP, onde predominam os argissolos. Esta cultivar também é indicada para as regiões
de Ribeirão Preto e Jaú, além dos estados de Minas Gerais e Goiás (JORNAL CANA,
2004). Ainda, apresenta grande adaptação às condições da região Centro-Oeste
brasileira (SOCICANA, 2006), cuja estação seca coincide com o período da colheita,
estágio em que as precipitações pluviais são importunas, isto é, o regime pluvial é uma
vantagem adicional para a produção da cana-de-açúcar (VIEIRA JUNIOR et al., 2008).
A tolerância à seca e aos solos de baixa fertilidade é uma das principais
características que justificam o plantio da cv. IAC91-5155 nessas regiões de produção,
destacando-se, ainda, pela rusticidade, elevada produtividade de soqueira em áreas de
cana crua e queimada, rápido crescimento inicial e adequado fechamento das
entrelinhas (ROSSETO, 2000). O período de utilidade industrial é longo, pois apresenta
adequada produção na cana-planta e elevada produção nas soqueiras; alto teor de
sacarose e baixo teor de fibra. Essa cultivar é apropriada para a colheita no período
compreendido entre maio a outubro, com satisfatória brotação sob palha em qualquer
período da safra (LANDELL et al., 2004). Ainda, por apresentar porte ereto, altura
uniforme e desfolha espontânea, a cv. IAC91-5155 favorece a colheita mecânica e
manual sem que haja queimadas (ROSSETO, 2000).
Quanto aos aspectos fitossanitários, é sensível à ferrugem, resistente ao carvão,
à escaldadura e à broca (Diatraea saccharalis), considerada a praga de maior
importância na cultura da cana-de-açúcar (LANDELL et al., 2004). Nas regiões mais
favoráveis à ferrugem, deve ser colhida no período inicial da safra, entre maio e julho
(SOCICANA, 2006).
19
3.2 Instalação e condução experimental
O experimento foi conduzido a 21º15´Sul e 48º18´Oeste, em casa de vegetação
localizada no Departamento de Produção Vegetal da UNESP - Universidade Estadual
Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV), Campus de
Jaboticabal, SP, no período de agosto a novembro de 2006. As avaliações dos
parâmetros fisiológicos e bioquímicos foram realizadas nos laboratórios do
Departamento de Biologia Aplicada à Agropecuária (DBAA) e do Departamento de
Tecnologia, respectivamente.
Para a obtenção das mudas da cultivar IAC91-5155 de cana-de-açúcar, os
toletes foram provenientes da Unidade de Pesquisa e Desenvolvimento (UPD) da
Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios (APTA), Pólo Regional Centro-
Oeste, localizada no município de Jaú, SP.
Após 24 horas da realização da coleta, os toletes foram plantados em recipientes
com capacidade de 250 cm
3
, contendo areia lavada e esterilizada. Para tanto, a areia
foi mantida em bacias de plástico com solução de ácido clorídrico (HCl), 50 mL L
-1
, por
aproximadamente 12 horas e, a seguir, foi lavada em água corrente até a completa
eliminação do ácido. Para verificar a presença do cloreto foi utilizada solução de nitrato
de prata (AgNO
3
) a 0,1%, pois a reação do cloreto com a prata forma um precipitado
branco, o cloreto de prata (AgCl), segundo a metodologia de VINCENT (1970). Após a
lavagem, a areia foi submetida à secagem em estufa de circulação forçada de ar.
As mudas, originadas da brotação das gemas, foram mantidas em areia estéril,
sem qualquer restrição hídrica, durante 30 dias. Após este período, as mudas foram
selecionadas quanto à sanidade e transferidas para vasos com 12 dm
3
de solo com os
respectivos tratamentos de disponibilidade hídrica e acidez do solo. Os efeitos da
associação dos estresses hídrico e ácido no solo foram verificados aos 90 dias de
crescimento das mudas (60 dias sob estresse). Este critério foi adotado devido ao
primeiro estádio da cana-planta, isto é, início do desenvolvimento e perfilhamento se
encerrar aos 180 dias (ROSENFELD & LEME, 1984).
20
3.3 Tratamentos de disponibilidade hídrica e acidez do solo
Para o estudo da cultivar IAC91-5155 de cana-de-açúcar sob efeito da interação
dos estresses hídrico e ácido no solo foi utilizado Latossolo Vermelho distrófico
(ANDRIOLI & CENTURION, 1999), retirado de área localizada na Fazenda
Experimental da UNESP, FCAV, Campus de Jaboticabal, na profundidade de 20-40 cm.
As análises química e granulométrica do solo foram realizadas no Departamento de
Solos e Adubos (Tabela 1).
Foram estabelecidos três tratamentos de disponibilidade hídrica e três níveis de
acidez. Os tratamentos de disponibilidade hídrica foram determinados a partir dos
valores de porosidade total, microporosidade, macroporosidade e capacidade de campo
(KIEHL, 1979; EMBRAPA, 1997). A porosidade total foi obtida pela diferença entre a
massa do solo saturado e a massa do solo seco em estufa a 110ºC durante 24h. A
microporosidade do solo foi determinada pelo método da mesa de tensão com uma
coluna de água de 60 cm de altura, considerando-se a densidade do solo, obtida pela
relação entre a massa do solo seco, em estufa a 110ºC durante 24 h, da amostra de
solo indeformada e o volume do cilindro. A macroporosidade foi calculada pela
diferença entre a porosidade total e a microporosidade (KIEHL, 1979; EMBRAPA,
1997). A capacidade de campo do solo foi estabelecida em 70% da microporosidade,
considerada adequada para a maioria das plantas cultivadas. De acordo com os valores
obtidos deste parâmetro, a quantidade de água, em litros, foi estabelecida para cada
tratamento de disponibilidade hídrica: H
1
- sem estresse (70%); H
2
- estresse moderado
(55%) e H
3
-estresse severo (40%).
Os vasos, umedecidos de acordo com os respectivos tratamentos H
1
, H
2
e H
3
,
constituíram-se as unidades experimentais formadas por uma única muda de cana-de-
açúcar. O controle do regime hídrico foi realizado pelo método das pesagens de acordo
com COGO & GUERRA (1978). Os vasos foram pesados a cada dois dias e a
reposição de água foi realizada sempre que a variação entre a massa inicial e a massa
obtida no dia da avaliação fosse igual ou superior a 2%, assim a diferença entre as
massas correspondeu à quantidade de água a ser completada (MARIN, 2003).
21
Tabela 1. Análise química e granulométrica de um Latossolo Vermelho distrófico.
Análise Química
pH CaCl
2
M.O.
P resina
K Ca Mg H+Al SB T
V
g dm
-3
mg dm
-3
mmol
c
dm
-3
%
4,1 14 4
1,4 3 2 42 6,4 48,4
13
Análise Granulométrica
Areia
Argila Limo
Fina Grossa
Classe
Textural
g Kg
-1
360 50 220 370
Argilosa
M.O.: Matéria Orgânica; SB: Soma de Bases; T: Capacidade de Troca de Cátions; V: Saturação por Bases·.
22
Para os níveis de acidez do solo foram adotados os critérios de Van RAIJ et al.
(1997), a saber: baixa (51% a 70%), média (26% a 50%) e alta (0 a 25%).
Considerando-se o índice de saturação por bases (V%) da análise de solo inicial
(Tabela 1) foram estabelecidos três tratamentos de acidez: A
1
– sem estresse (V = 55%;
0,0 mol
c
dm
-3
de Al
+3
), A
2
– estresse moderado (V = 33%; 3,0 mol
c
dm
-3
de Al
+3
) e A
3
-
estresse severo (V = 23%; 6,0 mol
c
dm
-3
de Al
+3
), que correspondem, respectivamente,
aos valores de pH CaCl
2
: 5,1; 4,6 e 4,2 obtidos através da incubação do solo com
calcário calcinado, por 30 dias (Tabela 2). Salienta-se que, o tratamento de ausência de
acidez (V = 55%) foi estabelecido por estar próximo ao de solos com índice de
saturação por bases igual a 60%, que proporciona adequada produtividade para a
cultura da cana-de-açúcar (ROSSETTO et al., 2004).
O delineamento experimental utilizado foi em blocos casualizados em esquema
fatorial 3x3, constituindo três tratamentos de deficiência hídrica (H
1
, H
2
e H
3
) e acidez
do solo (A
1
, A
2
e A
3
), com quatro repetições por tratamento.
23
Tabela 2. Análise química de um Latossolo Vermelho distrófico, após 30 dias de incubação com calcário calcinado
(PRNT 130%).
Análise Química
pH
CaCl
2
M.O.
P resina
K Ca Mg Al H+Al SB T
V m
Tratamentos
De
Acidez
g dm
-3
mg dm
-3
mmol
c
dm
-3
%
A
1
5,1 14 4
1,4 14 11 0,0 22 26,4 48,4
55 0,0
A
2
4,6 14 5
1,3 8 6 3,0 31 15,3 46,3
33 16,4
A
3
4,2 14 4
1,4 6 4 6,0 38 11,4 49,4
23 34,5
Análise inicial
4,1 14 4
1,4 3 2 8,0 42 6,4 48,4
13 55,6
M.O.: Matéria Orgânica; SB: Soma de Bases; T: Capacidade de Troca de Cátions; V: Saturação por Bases; m:
Saturação de Alumínio.
24
3.4. Coleta e preparo das amostras
Ao final do experimento, 60 dias sob efeito associado dos estresses hídrico e
ácido no solo (90 DAP)
1
, as plantas foram cortadas na altura do colo, para realização
das avaliações fisiológicas e bioquímicas nas raízes da cultivar IAC91-5155 de cana-
de-açúcar. Para tanto, imediatamente após o corte da parte aérea, o conteúdo de cada
vaso foi colocado sobre peneira de 16 mm para separar o sistema radicular do solo, por
meio de lavagem com direcionamento de corrente fraca de água. A seguir, as raízes
foram cuidadosamente separadas em alíquotas de 1 g, as quais foram acondicionadas
em envelopes de papel alumínio para imediata determinação da atividade da redutase
do nitrato por método in vivo. Os teores de prolina livre foram determinados em
alíquotas de 0,5 g de raízes acondicionadas em envelopes de papel alumínio e
armazenadas sob temperatura de 80ºC negativos.
As raízes restantes das raízes foram, cuidadosamente, separadas,
acondicionadas em frascos contendo solução de álcool a 20% (v/v) e conservadas sob
refrigeração, para as posteriores determinações de densidade (mm cm
-3
), diâmetro
médio (mm) e massa seca das raízes (g).
3.5. Avaliações bioquímico-fisiológicas
3.5.1. Atividade da redutase do nitrato
A atividade da redutase do nitrato no sistema radicular da cultivar IAC91-5155 de
cana-de-açúcar foi determinada de acordo com o método in vivo descrito por Jaworski
(1971) adaptado por CAZETTA (1997).
Imediatamente após a coleta de 1 g do sistema radicular dos respectivos
tratamentos, as raízes foram colocadas em frascos escuros com 10 mL do meio de
incubação composto por 6,0 mL de tampão fosfato 400 mM, pH 7,2; 6,0 mL de KNO3
1
Dias após o plantio.
25
200 mM; 6,0 mL de n-propanol 4% (v/v); 2,4 mL de triton X-100 a 0,1% (v/v) e 3,6 mL
de H
2
O deionizada. Os frascos, colocados em dessecador, foram submetidos a vácuo
com uma pressão de 60 cm Hg por um minuto, com posterior reintrodução do ar,
repetindo-se este procedimento por três vezes. Em seguida, os frascos foram
transferidos para incubação em banho-maria a 30ºC, no escuro, durante 90 minutos. A
reação foi interrompida com adição de 1 mL da solução de sulfanilamida a 1%. Devido
à formação de nitrito, pela reação com redutase do nitrato, 0,5 mL do meio de
incubação foi retirado para a determinação do nitrito segundo NICHOLAS et al. (1976).
Posteriormente, à esta alíquota adicionou-se 0,5 mL de solução de sulfanilamida a 1%
e 0,5 mL de solução de cloridrato de N-1naftil-etilendiamina a 0,02 %. Esta solução final
permaneceu em repouso por 20 minutos, quando, então, adicionou-se água deionizada
até completar o volume final para 4,0 mL.
A leitura de absorbância das amostras foi realizada em espectrofotômetro
Beckman DU 640 no comprimento de onda 540 nm (JAWORSKI, 1971). A curva de
padronização foi realizada para a determinação da concentração de NO
2
-
, utilizando-se:
solução padrão (1 mg de N–NO
2
mL
-1
), 500 µL de sulfanilamida 1% e 500 µL de
cloridrato N-naftil 0,02%. Esta solução foi homogeneizada, após 20 minutos de repouso
completou-se o volume para 4 mL com água deionizada e procederam-se as leituras
das absorbâncias, cuja curva de padronização definiu a equação: y = 0,8021x - 0,000 e
R
2
= 0,9987, por meio da qual foram determinadas as concentrações de nitrito (NO
2
-
) na
solução. A atividade da enzima redutase do nitrato foi calculada com base na equação
da curva de padronização, na quantidade e no tempo do meio de incubação, bem como
na massa fresca do tecido vegetal. Assim, a atividade da enzima foi expressa em mg g
-1
h
-1
N-NO
2
de massa fresca de raízes.
3.5.2. Teores de prolina livre
Os teores de prolina livre do sistema radicular da cultivar IAC91-5155 de cana-
de-açúcar foram determinados de acordo com o método descrito por BATES et al.
(1973), que consiste na homogeneização de 0,5 g de massa fresca das alíquotas do
26
sistema radicular de cada tratamento com 10 mL de ácido sulfosalicílico 3%. A solução
homogeneizada foi submetida a duas filtragens para eliminação parcial dos
interferentes e diluída com ácido ninhidrina. Primeiramente, procedeu-se o preparo do
ácido ninhidrina, para tanto, foi necessário a diluição sob aquecimento (60ºC) de 1,25 g
de ninhidrina (C
9
H
4
O
3
.H
2
O) em 30 mL de ácido acético glacial PA (CH
3
COOH) e 20 mL
de ácido fosfórico (H
3
PO
4
) 6 M. Em um tubo de ensaio foram colocados 2 mL do filtrado
das raízes que reagiram com 2 mL de ácido ninhidrina e 2 mL de ácido acético glacial
por 60 minutos em banho-maria à temperatura de 100ºC. Decorrido este tempo, o tubo
de ensaio foi colocado em um recipiente com gelo para finalizar a reação, em seguida
foram adicionados 4 mL de tolueno (C
6
H
5
CH
3
) e a solução foi homogeneizada agitando-
se por 15 a 20 segundos.
A leitura de absorbância das amostras foi realizada em espectrofotômetro
Beckman DU 640 no comprimento de onda 520 nm (BATES et al., 1973). A curva de
padronização foi realizada para quantificar a prolina, utilizando-se solução estoque na
concentração de 1 mM
de prolina PA e diluições em água destilada, segundo
metodologia descrita. De acordo com as leituras de absorbância obtidas da curva de
padronização definiu-se a equação: y = 0,0287x - 0,0255 e R
2
= 0,99, por meio da qual
foram determinadas as concentrações de prolina livre na solução. Os teores de prolina
livre nas raízes foram calculados com base na massa fresca, segundo a fórmula: [(mg
prolina/mL
x
mL tolueno)/115,5 mg/mmol] / [(g amostra)/5] = mmol de prolina/g massa
fresca de raízes.
3.5.3. Crescimento inicial
Para a determinação do comprimento e do diâmetro médio das raízes, foi
utilizado o sistema de análise de imagens Delta-T Devices LTD. Para tanto, as raízes
de cada planta foram submetidas à coloração com azul de metileno por
aproximadamente dois minutos e, em seguida, dispostas sobre uma bandeja com água
onde foi realizada a leitura da imagem por um scanner Hewlett Packard modelo 5C. A
imagem de cada sistema radicular foi analisada pelo software Delta-T Scan Root
27
Analysis System, que determina o comprimento (mm) e o diâmetro médio (mm) pelo
método de HARRIS & CAMPBELL (1989). A densidade das raízes foi calculada
dividindo-se o comprimento encontrado pelo volume de solo (mm de raiz cm
-3
de solo).
Após a mensuração da densidade e do diâmetro médio, as raízes foram
colocadas em saco de papel e levadas para secar em estufa de circulação forçada de
ar em temperatura de 80ºC até a obtenção da massa constante. Para determinação da
massa seca foi utilizada uma balança analítica Denver Instrument Company AA-200,
com precisão de 1x10
-8
g.
3.6. Tratamento estatístico
Para a análise dos resultados obtidos foi empregado o tratamento estatístico das
características individuais. A análise de variância foi realizada pelo teste F utilizando-se
do teste de Tukey para a comparação entre médias. A análise da regressão polinomial
foi utilizada para o desdobramento dos graus de liberdade dos fatores quantitativos,
disponibilidade hídrica e acidez do solo (BANZATTO & KRONKA, 2006).
28
IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Atividade da redutase do nitrato
A análise de variância da atividade da redutase do nitrato, nas raízes de plantas
jovens de cana-de-açúcar cv. IAC91-5155, sob efeito associado da disponibilidade
hídrica e da acidez do solo estão apresentados na Tabela 3.
De acordo com os resultados da análise de variância evidencia-se que a
interação HxA (disponibilidade hídrica x acidez do solo) e a acidez do solo foram
significativas para a atividade da redutase do nitrato. Entretanto, para a disponibilidade
hídrica (H) verifica-se que não houve efeito dos tratamentos H
1
, H
2
e H
3
para este
parâmetro bioquímico, evidenciando semelhança estatística entre os tratamentos
(Tabela 3; vide Tabelas I e II do apêndice).
Pelo desdobramento dos graus de liberdade da interação HxA, apresentado na
Tabela 4, constatou-se que a atividade da enzima aumentou sob associação de acidez
moderada (V = 33%) e até 53,17% de disponibilidade hídrica no solo (Figura 1). Este
aumento também se verificou na associação de estresse hídrico moderado e até
39,42% de saturação por bases (Figura 2). Nas raízes de plântulas de arroz também se
constatou elevada atividade da redutase do nitrato sob disponibilidade hídrica e acidez
moderada do solo (SHARMA & DUBEY, 2005).
A tolerância dos vegetais à redução da disponibilidade hídrica envolve
mecanismos complexos, dependentes da ação e da interação de características
morfológicas, fisiológicas e bioquímicas, como o aumento da atividade da redutase do
nitrato (MITRA, 2001). Esta enzima citosólica de extrema importância para o
metabolismo vegetal tem a síntese e atividade induzidas pelo substrato (DONATO et
al., 2004). Tal fato pode explicar o aumento da atividade enzimática até os valores de
menor disponibilidade hídrica e maior acidez no solo, provavelmente, devido à presença
constante do nitrato (NO
3
-
) no meio de incubação, que permite a síntese de novo da
enzima (ANDRADE NETTO, 2005). Isto porque o método de JAWORSKI (1971),
aplicado para a determinação da atividade da enzima, utiliza o n-propanol para
29
Tabela 3. Análise de variância da atividade da redutase do nitrato em raízes de plantas
jovens de cana-de-açúcar cv. IAC91-5155 sob efeito associado da
disponibilidade hídrica e da acidez do solo, por 60 dias (90 DAP). Jaboticabal,
SP. 2006-2007.
Causa G.L.
Quadrados Médios
da
Atividade da redutase do nitrato
Variação
(µg N-NO
2
g
-1
de massa fresca de raízes h
-1
)
Disponibilidade hídrica (H) 2 0,0103
ns
Acidez (A) 2 0,0347
**
Interação HxA 4 0,0146
*
Tratamentos 8 0,0185
Blocos 3 0,0242
**
Resíduo 24 0,0043
CV (%) 21,8005
ns: não significativo (P>0,05); *: significativo (P < 0,05); **: significativo (P<0,01); C.V.: coeficiente de
variação.
Tabela 4. Regressão polinomial da atividade da redutase do nitrato em raízes de plantas jovens de cana-de-açúcar
cv. IAC91-5155 sob efeito associado da disponibilidade hídrica e da acidez do solo, por 60 dias (90 DAP).
Jaboticabal, SP. 2006-2007.
Causa G.L. Quadrados Médios Coeficiente de
da Atividade da redutase do nitrato Determinação
Variação
(µg N-NO
2
g
-1
de massa fresca de raízes h
-1
)
(R
2
)
R.L. H
1
dentro de A 1 0,0002
ns
0,1375
R.Q. H
1
dentro de A 1 0,0011
ns
1,0000
R.L. H
2
dentro de A 1 0,0013
ns
0,0110
R.Q. H
2
dentro de A 1 0,1194
**
1,0000
R.L. H
3
dentro de A 1 0,0002
ns
0,0372
R.Q. H
3
dentro de A 1 0,0052
ns
1,0000
R.L. A
1
dentro de H 1 0,0045
ns
0,7579
R.Q. A
1
dentro de H 1 0,0014
ns
1,0000
R.L. A
2
dentro de H 1 0,0094
ns
0,1513
R.Q. A
2
dentro de H 1 0,0526
**
1,0000
R.L. A
3
dentro de H 1 0,0036
ns
0,3381
R.Q. A
3
dentro de H 1 0,0071
ns
1,0000
Resíduo 24 0,0043
ns: não significativo (P > 0,05); **: significativo (P < 0,01); R.L.: regressão linear; R.Q.: regressão quadrática. Disponibilidade
hídrica (H): H
1
= 70%, H
2
= 55%, H
3
= 40%. Acidez (A): A
1
= 55%, A
2
= 33%, A
3
= 23%.
30
31
Figura 1. Atividade da redutase do nitrato em raízes de plantas jovens de cana-de-
açúcar, cv. IAC91-5155, sob efeito associado da disponibilidade hídrica e da
acidez moderada do solo, durante 60 dias (90 DAP). Jaboticabal, SP. 2006-
2007.
75 70 65 60 55 50 45 40 35
0,20
0,24
0,28
0,32
0,36
0,40
0,44
0,48
A
2
= 33%
y = - 1,3077111 + 0,06640556x - 0,0006244444x
2
R
2
= 1,0000
Atividade da redutase do nitrato
(µg g
-1
h
-1
N-NO
2
)
Disponibilidade hídrica (%)
53,17%
32
Figura 2. Atividade da redutase do nitrato em raízes de plantas jovens de cana-de-
açúcar, cv. IAC91-5155, sob efeito associado da disponibilidade hídrica
moderada e da acidez do solo, durante 60 dias (90 DAP). Jaboticabal, SP.
2006-2007.
60 55 50 45 40 35 30 25 20
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
H
2
= 55%
y = -1,03253 + 0,07759x - 0,000984176x
2
R
2
= 1,0000
Atividade da redutase do nitrato
(µg g
-1
h
-1
N-NO
2
)
Saturação por bases (V%)
39,42%
33
23
33
aumentar a permeabilidade celular ao nitrato (NO
3
-
) e nitrito (NO
2
-
), além de facilitar a
transferência do nitrato presente no meio de incubação, ou oriundo do vacúolo, para o
citoplasma, onde se disponibiliza para ação da redutase de nitrato, saturada com o
substrato (OLIVEIRA et al., 2005).
Verifica-se que, sob moderada acidez (V = 33%) associada à diminuição da
disponibilidade hídrica do solo, as raízes da cv. IAC91-5155 apresentam redução da
atividade da redutase do nitrato, a partir de 53,17% de água no solo (Figura 1; vide
Tabela II do apêndice). Neste caso, a redução da atividade da enzima pode ser
explicada em função do decréscimo no fluxo de NO
3
-
por falta de umidade no solo, pois
este íon é o principal regulador da síntese da redutase do nitrato (ANDRADE NETTO,
2005).
Em cana-de-açúcar sob deficiência hídrica e acidez moderada do solo também
se constatou redução desta enzima (NAIK et al., 2002), corroborando com os
resultados do presente trabalho. Em raízes de plântulas de arroz e milho (SHARMA &
DUBEY, 2005; LIU-SHENGQUN & SONG-FENGBIN, 2007) e em Arabidopsis (XU &
ZHOU, 2004) houve redução da atividade da redutase do nitrato com o aumento da
severidade da deficiência hídrica no solo.
O estresse hídrico moderado (H
2
= 55%) associado aos tratamentos de acidez do
solo provocou redução da atividade da redutase do nitrato a partir de 39,42% de
saturação por base no solo (Figura 2; vide Tabela II do apêndice). Pelos resultados
obtidos sugere-se que condições moderadas de disponibilidade hídrica e acidez do solo
interferem na assimilação de nitrogênio na cana-de-açúcar cv. IAC91-5155.
De modo geral, o metabolismo do nitrogênio é influenciado negativamente pela
deficiência hídrica (FERREIRA et al., 2002) e pela acidez do solo (AMARAL et al.,
2000). A elevada acidez do solo pode causar inibição da atividade da redutase do
nitrato (SHARMA & DUBEY, 2005). Em plantas de milho cultivadas sob elevada acidez
do solo houve redução da atividade da enzima (LIN-XIANYONG et al., 2002). Este
decréscimo pode ser devido ao efeito inibitório do Al
+3
, principal íon presente sob
condições de acidez no solo, diretamente na atividade da enzima (CAMPBELL, 1999).
34
Nos solos ácidos, o amônio (NH
4
+
), o qual é a principal fonte de nitrogênio, fica
adsorvido às partículas coloidais, enquanto o nitrato (NO
3
-
), por ter carga negativa,
torna-se componente da solução do solo, facilmente lixiviado, e indisponível para a
absorção radicular (CORDEIRO, 2004). Considerando este aspecto, se houver
deficiência hídrica associada à acidez do solo, a absorção e o transporte de NO
3
-
pelas
raízes diminui significativamente. A redução da disponibilidade do íon nitrato para as
plantas pode inibir a transcrição do gene da redutase do nitrato, bem como a
estabilidade dos mRNAs desta enzima (SHARMA & DUBEY, 2005).
Pelos resultados obtidos no presente trabalho evidencia-se que as raízes da cv
IAC91-5155 de cana-de-açúcar apresentaram diminuição da atividade da redutase do
nitrato, em condições moderadas de acidez e restrição hídrica associadas à severidade
dos estresses abióticos estudados. Em virtude da importância da redutase do nitrato na
incorporação do nitrogênio e no metabolismo primário das plantas superiores,
quaisquer alterações na atividade desta enzima têm sido freqüentemente utilizadas
como indicadora de estresses nos vegetais (Oji et al., 1988 citados por SHARMA &
DUBEY, 2005; CASTRO et al., 2007). Deste modo, a redução da atividade da enzima
pode ser considerada um indicador fisiológico de estresses em plantas jovens de cana-
de-açúcar cv IAC91-5155.
35
4.2. Teores de prolina livre
A análise de variância dos teores de prolina livre nas raízes de plantas jovens de
cana-de-açúcar cv. IAC91-5155 sob efeito associado da disponibilidade hídrica e da
acidez do solo estão apresentados na Tabela 5.
Pelos resultados da análise de variância evidencia-se que a interação HxA
(disponibilidade hídrica x acidez do solo) e a acidez do solo foram significativas para os
teores de prolina livre (Tabela 5). Nos resultados do teste de Tukey para a
disponibilidade hídrica (H) verifica-se que não houve efeito dos tratamentos H
1
, H
2
e H
3
nos teores de prolina livre das raízes, evidenciando semelhança estatística entre esses
tratamentos (vide Tabela III do apêndice). Os níveis de acidez no solo (A) provocaram
efeito nos teores de prolina livre das raízes, em que o tratamento de estresse ácido
moderado (A
2
= 33%) causou alteração significativa no conteúdo deste aminoácido
quando comparado ao estresse ácido severo (Tabela III do apêndice). Nos vegetais,
verifica-se alta correlação entre modificações nos teores de prolina livre e o aumento da
tolerância ao estresse hídrico, particularmente. Todavia, atribui-se a estas modificações
resposta elementar ao efeito de um estresse abiótico (MADAN et al., 1995). Assim, para
as raízes da cultivar IAC91-5155 de cana-de-açúcar, os teores de prolina livre
dependeram da interação entre os fatores estudados (disponibilidade hídrica x acidez
do solo).
Pelo desdobramento dos graus de liberdade da interação HxA observa-se que
sob baixa acidez do solo (V = 55%), os teores de prolina livre aumentam linearmente
com o estresse hídrico (Figura 3 e Tabela 6; vide Tabela IV do apêndice). Mediante
estes resultados verifica-se que a prolina atuou como osmoprotetor para a manutenção
hídrica das células radiculares da cv. IAC91-5155. Em estudos realizados com esta
cultivar, também se constatou aumento linear dos teores de prolina livre, conforme a
diminuição da disponibilidade hídrica do solo (QUEIROZ, 2006).
Os vegetais, quando expostos aos estresses ambientais, especialmente a
deficiência hídrica, podem apresentar acúmulo de prolina livre. Este mecanismo
regulador da perda de água, mediante aumento da osmolaridade celular, tem sido
36
associado à tolerância das plantas às condições desfavoráveis (ASPINALL & PALEG,
1981). Para a cana-de-açúcar, outros autores também constataram aumento dos teores
deste aminoácido, conforme a diminuição da disponibilidade hídrica do solo, porém, o
acúmulo de prolina livre nas cultivares estudadas foi superior ao registrado no presente
trabalho (RÍNCONES, 1997; BIDOIA et al., 2006). O ajustamento osmótico em cana-de-
açúcar sob deficiência hídrica evidencia o acúmulo de prolina livre, porém, indica
significativas diferenças nas quantidades deste aminoácido entre as cultivares (NAIK et
al., 2004).
A concentração de prolina livre acumulada nas plantas varia conforme o estádio
vegetativo, tipo de órgão ou tecido e, principalmente entre espécies (KAVI KISHOR et
al., 2005). O aumento dos teores de prolina livre da cv. IAC91-5155, possivelmente,
pode ser devido a um aumento da biossíntese deste aminoácido, em função da redução
da disponibilidade de água nos tecidos, mostrando-se como um mecanismo de
proteção contra a falta de água (QUEIROZ, 2006). Isto ocorre porque a prolina auxilia a
diminuir o conteúdo de água dos tecidos radiculares, promovendo a retenção de água
in situ e a manutenção da integridade destes tecidos (KAVI KISHOR et al., 2005). Em
plantas sob estresse hídrico, é sintetizado também nos tecidos foliares, translocado
pelo floema até as raízes onde se acumula para preservar e manter o turgor das células
radiculares, como foi observado em milho (RAYMOND & SMIRNOFF, 2002). Nesse
contexto, é importante conhecer como o acúmulo de prolina livre influencia outras vias
relacionadas à produção de energia durante o estresse hídrico (KAVI KISHOR, et al.,
2005).
Verifica-se que sob moderada acidez (V = 33%) associada à diminuição da
disponibilidade hídrica do solo, as raízes da cv. IAC91-5155 apresentam diminuição dos
teores de prolina livre (Figura 4; vide Tabela IV do apêndice). O estresse hídrico
moderado (H
2
= 55%) associado aos tratamentos de acidez do solo não possibilitou o
acúmulo de prolina livre, cujo decréscimo apresentou comportamento linear (Figura 7;
Tabela 6; vide Tabela IV do apêndice). Mediantes estes resultados constata-se que
condições moderadas de disponibilidade hídrica e acidez do solo interferem na
capacidade da planta em acumular prolina livre, como um mecanismo de ajustamento
37
Tabela 5. Análise de variância dos teores de prolina livre em raízes de plantas jovens
de cana-de-açúcar cv. IAC91-5155 sob efeito associado da disponibilidade
hídrica e da acidez do solo, por 60 dias (90 DAP). Jaboticabal, SP. 2006-2007.
Causa G.L. Quadrados Médios
da
Teores de prolina livre
Variação
(µmol g
-1
de massa fresca de raízes)
Disponibilidade hídrica (H) 2 0,0143
ns
Acidez (A) 2 0,2797
**
Interação HxA 4 0,1621
**
Tratamentos 8 0,1545
Blocos 3 0,0096
ns
Resíduo 24 0,0058
CV (%) 10,6710
ns: não significativo (P>0,05); **: significativo (P<0,01); C.V.: coeficiente de variação.
Tabela 6. Regressão polinomial dos teores de prolina livre em raízes de plantas jovens de cana-de-açúcar cv.
IAC91-5155 sob efeito associado da disponibilidade hídrica e da acidez do solo, por 60 dias (90 DAP).
Jaboticabal, SP. 2006-2007.
Causa G.L. Quadrados Médios Coeficiente de
da
Teores de prolina livre
Determinação
Variação
(µmol g
-1
de massa fresca de raízes) (R
2
)
R.L. H
1
dentro de A 1 0,1499
**
0,3490
R.Q. H
1
dentro de A 1 0,2797
**
1,0000
R.L. H
2
dentro de A 1 0,2253
**
0,9754
R.Q. H
2
dentro de A 1 0,0057
*
1,0000
R.L. H
3
dentro de A 1 0,2392
**
0,4375
R.Q. H
3
dentro de A 1 0,3075
**
1,0000
R.L. A
1
dentro de H 1 0,3121
**
0,9631
R.Q. A
1
dentro de H 1 0,0120
ns
1,0000
R.L. A
2
dentro de H 1 0,0024
ns
0,0698
R.Q. A
2
dentro de H 1 0,0322
*
1,0000
R.L. A
3
dentro de H 1 0,0843
**
0,2645
R.Q. A
3
dentro de H 1 0,2342
**
1,0000
Resíduo 24 0,0058
ns: não significativo (P > 0,05); *: significativo (P < 0,05); **: significativo (P < 0,01); R.L.: regressão linear; R.Q.: regressão
quadrática. Disponibilidade hídrica (H): H
1
= 70%, H
2
= 55%, H
3
= 40%. Acidez (A): A
1
= 55%, A
2
= 33%, A
3
= 23%.
38
39
osmótico. Isto porque, como osmólito compatível, a prolina se acumula na planta,
principalmente, sob condições severas de estresse (MOLINARI, 2006). Os teores de
prolina livre das raízes da cana-de-açúcar também apresentaram significativa redução
até 52,40% de disponibilidade hídrica associada à acidez severa (V = 23%), entretanto,
a partir deste percentual de água no solo, houve acúmulo de prolina livre mesmo sob
condições de elevada acidez (Figura 5; vide Tabela IV do apêndice). As raízes da cana-
de-açúcar cv. IAC91-5155 apresentaram aumento dos teores de prolina livre sob a
associação dos estresses hídrico e ácido em condições severas, revelando o efeito
osmoprotetor deste aminoácido. Estes resultados corroboram com os encontrados em
plântulas de guandu, em que condições severas de acidez e restrição hídrica no solo
apresentaram um efeito sinergístico sobre os teores de prolina livre. (MARIN, 2003). Em
plântulas de arroz também foi observado o acúmulo de prolina livre sob condições
severas de deficiência hídrica e de acidez do solo (SHARMA & DUBEY, 2005). Nestas
condições, o acúmulo de prolina livre pode ser decorrente do decréscimo na
degradação ou do aumento da biossíntese deste aminoácido (HARE et al., 1999). A
indução da biossíntese de prolina pode ser provocada pelo aumento de metabólitos
como poliaminas, amônia, arginina, ornitina, glutamina, glutamato (SILVEIRA et al.,
2002). Assim, o metabolismo de aminoácidos em plantas sob estresse é amplamente
alterado (SODEK, 2004).
Ainda, a disponibilidade hídrica nos tratamentos de acidez do solo, verifica-se
que, na medida em que houve redução da saturação por bases a partir de 55%, os
teores de prolina livre também reduziram, apresentando diferentes valores mínimos
(42,59% e 36,47%), dependendo da disponibilidade hídrica (Figuras 6 e 8,
respectivamente). A partir destes valores, as raízes da cana-de-açúcar cv. IAC91-5155
apresentaram acúmulo de prolina livre, principalmente sob elevada acidez do solo
(Figuras 6 e 8). Notadamente, a associação dos estresses hídrico e ácido em condições
severas, revela o efeito osmoprotetor deste aminoácido e, conseqüentemente, um
mecanismo de ajustamento osmótico. Este mecanismo não é devido ao aumento na
concentração de solutos na célula durante a desidratação e diminuição de volume
celular, mas protege a integridade celular conduzindo ao aumento na concentração de
40
solutos independentemente das alterações no volume das células resultantes da perda
de água (VERSLUES & BRAY, 2006).
O acúmulo de prolina livre não está associado somente às plantas que se
desenvolvem sob condições de estresse hídrico, também pode ser verificado em
plantas sob condições de elevada acidez do solo (MOSSOR, 2001). No sistema
radicular de gramíneas sob efeito associado dos estresses hídrico e ácido, verificou-se
aumento nos teores de prolina livre (ZAIFNEJAD et al., 1997). Em plântulas de grão de
bico cultivadas sob elevada concentração de alumínio houve aumento dos teores de
prolina livre (SATAKOPAN et al., 1992). Em plantas de milho, o acúmulo de prolina livre
sob baixa saturação por bases revelou um mecanismo de tolerância à acidez severa
(GIANNAKOULA et al., 2008). Observou-se também que, sob elevada acidez, houve
aumento nos teores de prolina livre em raízes de sorgo e em genótipos de ervilha, trigo,
cevada, milho e ervilhaça, tolerantes ou sensíveis ao alumínio (Galvez et al., 1991 e
Klimashevskii, 1983 citados por ZAIFNEJAD, 1993). Assim, os mecanismos fisiológicos
envolvidos em resposta ao estresse ácido devem ser similares àqueles em resposta à
deficiência hídrica (ZAIFNEJAD et al., 1997).
41
Figura 3. Teores de prolina livre em raízes de plantas jovens de cana-de-açúcar, cv.
IAC91-5155, sob efeito associado da disponibilidade hídrica e da acidez do
solo, durante 60 dias (90 DAP). Ausência de estresse ácido (A
1
= 55%) nos
tratamentos de estresse hídrico. Jaboticabal, SP. 2006-2007.
70 65 60 55 50 45 40
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
Teores de prolina livre
(µmol g
-1
MF)
Disponibilidade hídrica (%)
A
1
= 55%
y = 1,558750 - 0,0136667x
R
2
= 0,9631
42
Figura 4. Teores de prolina livre em raízes de plantas jovens de cana-de-açúcar, cv.
IAC91-5155, sob efeito associado da disponibilidade hídrica e da acidez do
solo, durante 60 dias (90 DAP). Estresse ácido moderado (A
2
= 33%) nos
tratamentos de estresse hídrico. Jaboticabal, SP. 2006-2007.
70 65 60 55 50 45 40
0,44
0,46
0,48
0,50
0,52
0,54
0,56
0,58
0,60
0,62
Teores de prolina livre
(µmol g
-1
MF)
Disponibilidade hídrica (%)
A
2
= 33%
y = - 0,9266667 + 0,054875x - 0,0004883333x
2
R
2
= 1,0000
56,18%
43
Figura 5. Teores de prolina livre em raízes de plantas jovens de cana-de-açúcar, cv.
IAC91-5155, sob efeito associado da disponibilidade hídrica e da acidez do
solo, durante 60 dias (90 DAP). Estresse ácido severo (A
3
= 23%) nos
tratamentos de estresse hídrico. Jaboticabal, SP. 2006-2007.
70 65 60 55 50 45 40
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
Teores de prolina livre
(µmol g
-1
MF)
Disponibilidade hídrica (%)
A
3
= 23%
y = 4,170806 - 0,1380528x + 0,001317222x
2
R
2
= 1,0000
52,40%
44
Figura 6. Teores de prolina livre em raízes de plantas jovens de cana-de-açúcar, cv.
IAC91-5155, sob efeito associado da disponibilidade hídrica e da acidez do
solo, durante 60 dias (90 DAP). Ausência de estresse hídrico (H
1
= 70%) nos
tratamentos de estresse ácido. Jaboticabal, SP. 2006-2007.
60 55 50 45 40 35 30 25 20
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
Teores de prolina livre
(µmol g
-1
MF)
Saturação por bases (V%)
H
1
= 70%
y = 3,116223 - 0,128329x + 0,001506321x
2
R
2
= 1,0000
42,59%
33
23
45
Figura 7. Teores de prolina livre em raízes de plantas jovens de cana-de-açúcar, cv.
IAC91-5155, sob efeito associado da disponibilidade hídrica e da acidez do
solo, durante 60 dias (90 DAP). Estresse hídrico moderado (H
2
= 55%) nos
tratamentos de estresse ácido. Jaboticabal, SP. 2006-2007.
60 55 50 45 40 35 30 25 20
0,50
0,55
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
0,85
0,90
Teores de prolina livre
(µmol g
-1
MF)
Saturação por bases (V%)
H
2
= 55%
y = 0,3060488 + 0,01025093x
R
2
= 0,9754
33
23
46
Figura 8. Teores de prolina livre em raízes de plantas jovens de cana-de-açúcar, cv.
IAC91-5155, sob efeito associado da disponibilidade hídrica e da acidez do
solo, durante 60 dias (90 DAP). Estresse hídrico severo (H
3
= 40%) nos
tratamentos de estresse ácido. Jaboticabal, SP. 2006-2007.
60 55 50 45 40 35 30 25 20
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
Teores de prolina livre
(µmol g
-1
MF)
Saturação por bases (V%)
H
3
= 40%
y = 2,569234 - 0,1152136x + 0,001579261x
2
R
2
= 1,0000
36,47%
33
2
3
47
4.3. Crescimento inicial das raízes
A análise de variância das avaliações do crescimento inicial das raízes de
plantas jovens de cana-de-açúcar, cv. IAC91-5155, sob efeito associado da
disponibilidade hídrica e da acidez do solo está apresentada na Tabela 7. Pelos
resultados da análise de variância evidencia-se que a interação HxA (disponibilidade
hídrica x acidez do solo) não foi significativa para o crescimento de raízes. Entretanto,
verifica-se pelo teste de Tukey que houve diferenças significativas entre os tratamentos
de disponibilidade hídrica, nas avaliações de diâmetro, densidade e massa seca das
raízes, e de acidez do solo para a densidade de raízes (Tabela 7).
Pelo teste de Tukey nota-se que conforme o aumento da deficiência hídrica
houve redução em todos os parâmetros de crescimento avaliados nas raízes da cv.
IAC91-5155 de cana-de-açúcar (Tabela 7; Figuras I, II, III e IV do apêndice), fato que
pode comprometer o desenvolvimento desta cultivar e, portanto, reduzir a
produtividade. Em estudos realizados com cana-de-açúcar sob deficiência hídrica, por
120 dias, houve significativa redução da massa seca das raízes e da densidade das
raízes, conforme a diminuição da disponibilidade de água no solo (BIDOIA, 2005). No
período de máximo desenvolvimento da cana-de-açúcar, a deficiência hídrica provoca
significativa redução na produtividade (ROSENFELD & LEME, 1984). A deficiência
hídrica pode ser considerada fator limitante para a produtividade agrícola devido ao fato
de causar severos danos no crescimento vegetal, mediante, primordialmente, a
diminuição da expansão celular (TAIZ & ZEIGER, 2004).
No presente trabalho, o estresse hídrico severo (H
3
= 40%) provocou acentuada
redução na massa seca, na densidade e no diâmetro médio das raízes do cv. IAC91-
5155 de cana-de-açúcar (Tabela 7), indicando maior crescimento de raízes mais finas.
Estes resultados corroboram com os obtidos na literatura em estudos realizados com a
cv. IAC91-5155, que sob estresse hídrico severo também apresentou maior
crescimento de raízes mais finas (QUEIROZ, 2006). As plantas em condições de seca
apresentam maior produção de pêlos absorventes (raízes mais finas) para aumentar
absorção de água (FARONI, 2004).
48
Particularmente na cana-de-açúcar, o desenvolvimento do sistema radicular
constitui-se um importante aspecto para tolerância ao estresse hídrico, pois quanto
maior a profundidade máxima das raízes maior o potencial de produção, dependendo
da distribuição das chuvas e da demanda evaporativa durante a estação de
crescimento (Van den BERG et al., 2000). Em diferentes estádios de crescimento da
cana-de-açúcar submetida à deficiência hídrica, em condições de campo, houve
significativa diminuição da massa seca no estádio vegetativo, conduzindo a redução do
crescimento da cultura em 46,3% e 60,8%, sob condições de estresse hídrico
moderado e severo, respectivamente (RAMESH, 2000).
As modificações fisiológicas do sistema radicular em plantas de cana-de-açúcar
sob estresse hídrico são influenciadas pelo estádio vegetativo da cultura, pela
severidade e periodicidade da deficiência hídrica e, ainda, pelas características
granulométricas do solo, que interferem no conteúdo de água disponível (QUEIROZ,
2006). Assim, a produtividade das plantas, limitada pela água, depende da quantidade
disponível deste recurso e da eficiência de seu uso pelo vegetal (TAIZ & ZEIGER,
2004).
A acidez do solo também influenciou o sistema radicular da cv. IAC91-5155,
entretanto, somente a densidade de raízes evidenciou significativa redução, que se
verificou sob 35,11% de acidez do solo (Figura III do apêndice). Este resultado pode
inferir que a densidade de raízes é um parâmetro adequado para avaliar o crescimento
das raízes da cana-de-açúcar, cv. IAC91-5155, sob efeito da acidez do solo.
A densidade evidencia o crescimento em quantidade de raízes, enquanto que o
diâmetro evidencia o crescimento mais vigoroso das raízes (raízes mais grossas).
Assim, de acordo com os resultados apresentados na Tabela 7, verifica-se que a
deficiência hídrica é limitante para o crescimento das raízes da cana-de-açúcar, cv. IAC
91-5155, pois causou redução em todos os parâmetros avaliados. Além da restrição
hídrica no solo, o sistema radicular da cana-de-açúcar é influenciado pela acidez do
solo, principalmente quanto à toxicidade do alumínio, interferindo no desenvolvimento e
na absorção de água e nutrientes (SOBRAL & GUIMARÃES, 1992). Todavia, muitas
cultivares são adaptados aos solos ácidos e de baixa fertilidade (ROSSETTO et al.,
49
2004), haja vista a maioria dos solos destinados à produção agrícola no Brasil
apresentar problemas de acidez e toxicidade por alumínio (MAZZOCATO et. al., 2002).
O desenvolvimento das raízes é típico de cada variedade ou cultivar, havendo
crescimento radicular acumulativo durante os ciclos da cultura, da cana-planta para as
socas sucessivas, sendo que a morte ou a renovação do sistema radicular não é
causada pela colheita da cultura e sim pela deficiência hídrica, independente da fase de
desenvolvimento (FARONI, 2004). Portanto, no decorrer dos anos pode ser notado que
a produção da cana-de-açúcar é muito dependente da disponibilidade hídrica do solo,
proporcionando elevada variação na produtividade (TERAMOTO, 2003).
50
Tabela 7. Análise de variância e teste de Tukey do crescimento de raízes (diâmetro
médio; densidade e massa seca) de plantas jovens de cana-de-açúcar cv.
IAC91-5155 sob efeito associado da disponibilidade hídrica e da acidez do
solo, por 60 dias (90 DAP). Jaboticabal, SP. 2006-2007.
Causa G.L.
Quadrados Médios
da
Diâmetro
Densidade
Massa seca
Variação
(mm)
(mm cm
-3
)
(g)
Disponibilidade hídrica (H) 2 376,6398**
1702,8087** 40,0992**
Acidez (A) 2 0,2785
ns
55,7210*
0,3908
ns
Interação HxA 4 12,3195
ns
23,4839
ns
0,6923
ns
Tratamentos 8 100,3893
451,3744
10,4686
Blocos 3 10,4373
ns
12,9393
ns
0,1305
ns
Resíduo 24 4,4878
15,5261
0,6642
C.V.% 15,2808
19,7374
23,3900
Tratamentos
1
Teste de Tukey
2
H
1
= 70%
18,5038A
31,6073A
5,0112A
H
2
= 55%
15,4487B
20,4841B
3,9834B
H
3
= 40%
7,6398C
7,7999C
1,4588C
A
1
= 55%
13,7291A
22,2867A
3,6928A
A
2
= 33%
13,8322A
18,0300B
3,3819A
A
3
= 23%
14,0289A
19,5746AB
3,3786A
DMS 2,1587
4,0153
0,8305
ns: não significativo (P>0,05); *: significativo (P<0,05); **: significativo (P<0,01); C.V.: coeficiente
de variação; D.M.S.: Diferença Mínima Significativa;
1
Disponibilidade hídrica: H
1
= 70%, H
2
= 55%,
H
3
= 40%. Acidez: A
1
= 55%, A
2
= 33%, A
3
= 23%.
2
Médias seguidas de mesma letra na vertical
(nos tratamentos) não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05).
51
V. CONCLUSÕES
ü A redução da atividade da redutase do nitrato ocorreu em condições moderadas de
acidez e restrição hídrica associadas à severidade dos estresses.
ü O acúmulo de prolina livre pode ser considerado indicador fisiológico em plantas
jovens de cana-de-açúcar, cv. IAC91-5155, sob condições severas de disponibilidade
hídrica e acidez do solo.
ü A deficiência hídrica reduziu o crescimento das raízes.
52
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67
APÊNDICE
vi
Tabela I. Teste de Tukey da atividade da redutase do nitrato em raízes de plantas
jovens de cana-de-açúcar cv. IAC91-5155 sob efeito associado da
disponibilidade hídrica e da acidez do solo, por 60 dias (90 DAP). Jaboticabal,
SP. 2006-2007.
D.M.S.: Diferença Mínima Significativa;
1
Disponibilidade hídrica: H
1
= 70%, H
2
= 55%,
H
3
= 40%. Acidez: A
1
= 55%, A
2
= 33%, A
3
= 23%.
2
Médias seguidas de mesma letra
na vertical (nos tratamentos) não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05).
Tabela II. Desdobramento do teste de Tukey da atividade da redutase do nitrato em
raízes de plantas jovens de cana-de-açúcar, cv. IAC91-5155, sob efeito
associado da disponibilidade hídrica e da acidez do solo, por 60 dias (90 DAP).
Jaboticabal, SP. 2006-2007.
Teste de Tukey da atividade da redutase do nitrato
(µg N-NO
2
g
-1
de massa fresca de raízes h
-1
)
1
Disponibilidade
hídrica (H)
2
Acidez do solo (A)
2
(%)
55% 33% 23%
70
0,2574 aA
0,2814aB
0,2619aA
55
0,2581 bA
0,4565aA
0,2315bA
40
0,3048 aA
0,3498aAB
0,3044aA
DMS 0,1157
D.M.S.: Diferença Mínima Significativa;
1
Médias seguidas de mesma letra minúscula na
horizontal e maiúscula na vertical não diferem entre si pelo teste de Tukey (P > 0,05).
2
Disponibilidade hídrica: H
1
= 70%, H
2
= 55%, H
3
= 40%. Acidez: A
1
= 55%, A
2
= 33%, A
3
=
23%.
Tratamentos
1
Teste de Tukey
2
H
1
= 70%
0,2669A
H
2
= 55%
0,3153A
H
3
= 40%
0,3197A
A
1
= 55%
0,2734B
A
2
= 33%
0,3625A
A
3
= 23%
0,2660B
DMS 0,0668
vii
Tabela III. Teste de Tukey dos teores de prolina livre em raízes de plantas jovens de
cana-de-açúcar cv. IAC91-5155 sob efeito associado da disponibilidade
hídrica e da acidez do solo, por 60 dias (90 DAP). Jaboticabal, SP. 2006-2007.
Tratamentos
1
Teste de Tukey
2
H
1
= 70%
0,6994A
H
2
= 55%
0,6854A
H
3
= 40%
0,7509A
A
1
= 55%
0,8347A
A
2
= 33%
0,5409B
A
3
= 23%
0,7600A
DMS 0,0774
D.M.S.: Diferença Mínima Significativa;
1
Disponibilidade hídrica: H
1
= 70%, H
2
= 55%, H
3
=
40%. Acidez: A
1
= 55%, A
2
= 33%, A
3
= 23%.
2
Médias seguidas de mesma letra na vertical
(nos tratamentos) não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05).
Tabela IV. Desdobramento do teste de Tukey dos teores de prolina livre raízes de
plantas jovens de cana-de-açúcar, cv. IAC91-5155, sob efeito associado da
disponibilidade hídrica e da acidez do solo, por 60 dias (90 DAP). Jaboticabal,
SP. 2006-2007.
Teste de Tukey dos teores de prolina livre
(µmol g
-1
de massa fresca de raízes)
1
Disponibilidade
hídrica (H)
2
Acidez do solo (A)
2
(%) 55%
33%
23%
70
0,6150 bB
0,5216bA
0,9615aA
55
0,8793 aA
0,6143bA
0,5627bC
40
1,0098 aA
0,4869cA
0,7559bB
DMS
0,1341
D.M.S.: Diferença Mínima Significativa;
1
Médias seguidas de mesma letra minúscula na
horizontal e maiúscula na vertical não diferem entre si pelo teste de Tukey (P > 0,05).
2
Disponibilidade hídrica: H
1
= 70%, H
2
= 55%, H
3
= 40%. Acidez: A
1
= 55%, A
2
= 33%, A
3
=
23%.
viii
Figura I. Diâmetro de raízes de plantas jovens de cana-de-açúcar cv. IAC91-5155 sob
efeito da disponibilidade hídrica do solo, após 60 dias.
Figura II. Densidade de raízes de plantas jovens de cana-de-açúcar cv. IAC91-5155 sob
efeito da disponibilidade hídrica do solo, após 60 dias.
70 65 60 55 50 45 40
7,5
9,0
10,5
12,0
13,5
15,0
16,5
18,0
19,5
21,0
y = - 6,0539 + 0,36213x
R
2
= 0,9401
Diâmetro de raízes (mm)
Disponibilidade hídrica (%)
70 65 60 55 50 45 40 35
3,5
7,0
10,5
14,0
17,5
21,0
24,5
28,0
31,5
35,0
y = - 23,68313 + 0,79358x
R
2
= 0,9986
Densidade de raízes (mm dm
-3
)
Disponibilidade hídrica (%)
ix
Figura III. Densidade de raízes de plantas jovens de cana-de-açúcar cv. IAC91-5155
sob efeito da acidez do solo, após 60 dias.
Figura IV. Massa seca de raízes de plantas jovens de cana-de-açúcar cv. IAC91-5155
sob efeito da disponibilidade hídrica do solo, após 60 dias.
70 65 60 55 50 45 40
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
y = - 3,02827 + 0,11841x
R
2
= 0,9441
Massa seca de raízes (g)
Disponibilidade hídrica (%)
35,11%
60 55 50 45 40 35 30 25 20
18,0
18,9
19,8
20,7
21,6
22,5
23,4
y = 31,38003 - 0,76337x + 0,01087x
2
R
2
= 1,0000
Densidade de raízes (mm dm
-3
)
Saturação por bases (v%)
23
33
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