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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
Indução da Expressão e Caracterização de uma possível fosfatase ácida
ligada à membrana produzida por Burkholderia sp.
Tiago Henrique Rombola
Biomédico
JABOTICABAL – SÃO PAULO - BRASIL
2008
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
Expressão e Caracterização da fosfatase ácida ligada à
membrana produzida por Burkholderia sp.
Tiago Henrique Rombola
Orientador: Prof. Dr. João Martins Pizauro Junior
JABOTICABAL – SÃO PAULO - BRASIL
2008
Dissertação apresentada à faculdade de
ciências agrárias e veterinárias FCAVJ-
UNESP para obtenção do Grau de
Mestre em Microbiologia Agropecuária.
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Rombola, Tiago Henrique
R762i Indução da Expressão e Caracterização de uma possível
fosfatase ácida ligada à membrana produzida por Burkholderia sp. /
Tiago Henrique Rombola. – Jaboticabal, 2008
iv, 36 f. : il. ; 28 cm
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista,
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2008
Orientador: Prof. Dr. João Martins Pizauro Junior
Banca examinadora: Pietro Ciancaglini, Maria Inês Tiraboschi Ferro
Bibliografia
1. Fosfatase ácida. 2. Parâmetros Cinéticos. 3. Purificação. I.
Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias.
CDU 631.461.7
Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação –
Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal.
DADOS CURRICULARES DO AUTOR
TIAGO HENRIQUE ROMBOLA – nascido em Jaboticabal – SP aos 12 de Novembro de
1982, filho de Luiz Carlos Rombola e Maria Aparecida Lopes Rombola. Graduado em
Biomedicina pelo Centro Universitário de Araraquara –UNIARA- em Araraquara no ano
de 2005.
SUMÁRIO
Página.
1. Introdução. 1
1.1 Objetivos 7
2 Materiais e Métodos. 8
2.1 Isolamento e identificação da bactéria Burkholderia sp. 8
2.2 Meio de Manutenção do Microrganismo . 8
2.3 Meio de indução da produção de Fosfatase Ácida. 8
2.4 Obtenção da possível fosfatase ácida ligada à membrana. 8
2.5 Obtenção da fração de membrana . 8
2.6 Determinação de atividade fosfomonohidrolase da Fosfatase ácida. . 9
2.7 Determinação da atividae de pirofosfatase da fosfatase ácida ligada à
membrana.
9
2.8 Dosagem de Proteínas 9
2.9 Efeito do pH sobre a atividade da fosfatase ácida 9
2.10 Estabilidade da Amostra 10
2.11 Efeito da concentração do substrato sobre o pH na atividade da fosfatase ácida 10
2.12 Efeito da Temperatura sobre a Fosfatase ácida ligada à membrana 10
2.13 Inativação térmica da fosfatase ácida ligada à membrana 10
2.14 Efeito de diferentes inibidores sobre a atividade da fosfatase ácida Purificada 11
2.15 Determinação dos parâmetros cinéticos. 11
3 Resultados 12
4 Discussão 24
5 Conclusões 27
6 Bibliografia 28
ABREVIAÇÕES UTILIZADAS.
AMPOL 2- amino- 2- metil- 1- propanol
Km Constante de Michaelis
n Coeficiente de Hill
PNFF P-nitrofenilfosfato
Tris Tris-(hidroximetil)-aminometano
v Velocidade inicial
V Velocidade máxima.
Expressão e Caracterização da fosfatase ácida ligada à membrana produzida
por Burkholderia sp.
ROMBOLA, T.H
1
., PEDRINHO, E.A.N
1
., LEMOS, E.G.M
1
., PIZAURO, J.M
1
.
1
Depto. Tecnologia, FCAVJ-UNESP, Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castellane, s/n,
14884-900 - Jaboticabal-SP-Brasil. [email protected]; tiago_hr@yahoo.com.br .
Espécies de Burkholderia filogenéticamente distantes do complexo B. cepacia, são
versáteis solubilizadores de minerais insolúveis, através da produção de ácidos,
viabilizando nutrientes para as plantas. Descrevemos a purificação e caracterização da
fosfatase ácida ligada à membrana, produzida pela bactéria do gênero Burkholderia, isolada
de solo agrícola em Ponta grossa-PR-BRASIL, e identificada através da análise do 16s
rDNA. A expressão da enzima se mostrou estritamente dependente ao fósforo (expressão
ótima a 5 mM). A enzima ligada à membrana foi purificada por ultracentrifugação a
100.000g por 1 hora a 4°C e testada com atividade enzimática para p-nitrofenilfosfato
(PNFF) e Pirofosfato. O pH ótimo da enzima foi 6 e não foi afetado pela concentração de
PNFF. Em pH 6 a hidrolise do PNFF seguiu os seguintes parâmetros cinéticos com n=1.5,
Vm= 103.8 U.mg
-1
e K
0,5
=0,06 mM em uma faixa de 0,003 e 10 mM de PNFF. Estudos do
pH sobre os parâmetros cinéticos demonstraram 26 pontos de variação na faixa de 3,5 a 6 e
em seguida diminui até pH 8 enquanto K
0,5
não mostrou variação nesta faixa. O ∆H para
hidrólise do PNFF foi de 5,74 kcal.mol
-1
. A atividade PNFFase foi inibida pelo arsenato e
Cálcio, mas não por levamisol, EDTA, zinco e cobalto. A hidrolise do pirofosfato na
presença de 2 mM de MgCl
2
seguiu os parâmetros cinéticos de "Michaelis-Menten” com
Km= 0.142 mM e Vm= 237 U.mg
-1
.Os resultados sugerem que a produção da fosfatase
ácida ligada à membrana pode ser um mecanismo de solubilização de fosfato mineral por
essa bactéria.
Palavras chave: Fosfatase ácida; pirofosfatase ; p-nitrofenilfosfato.
Suporte financeiro: FAPESP, CNPq e CAPES
.
INDUCTION OF EXPRESSION AND KINETIC CHARACTERIZATION
OF MEMBRANE-BOUND ACID PHOSPHATASE PRODUCED BY
BURKHOLDERIA.
ROMBOLA, T.H.
1
, PEDRINHO, E.A.N.
1
, LEMOS, E.GM.
1
, PIZAURO, J.M.
1
1
Depto.Tecnologia, FCAVJ-UNESP, Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castellane, s/n,
14884-900 - Jaboticabal-SP-Brasil. [email protected], tiago_hr@yahoo.com.br .
Burkholderia species phylogenetically greatly distant from the B. cepacia complex species
are versatile organisms that solubilize insoluble minerals through the production of acids,
increasing the availability of nutrients to plants. Here we describe the purification and
characterization a membrane-bound acid phosphatase produced by bulkholderia isolated
from an agricultural soil in Ponta grossa-PR-BRASIL and identified through analysis of the
16S rDNA gene. The expression of this enzyme was demonstrated to be strictly regulated
by phosphorus (optimal expression at 5 mM). The membrane bound enzyme was purified
by centrifugation at 100.000g for 1 h at 4ºC and the enzyme was assayed for p-Nitrophenyl
phosphatase (PNPPase) and pyrophosphatase activities. The optimal pH (6.0) was not
affect by p-Nitrophenyl phosphate concentration. At pH 6.0 the hydrolysis of PNPP
following a cooperative kinetics with n= 1.5, Vm= 103.8 U.mg
-1
and K
0.5
= 0.60 mM in the
range between 0.003 and 10 mM. Studies of pH effects on kinetics parameters revealed a
26-folds variation in the range of pH 3.5 to 6 following decreases until pH 8.0, wile K
0,5
and cooperativity did not varied considerably in this range. The ∆H for hydrolysis of PNPP
was 5,74 kcal.mol
-1
. PNPPase activity was inhibited by arsenate, phosphate and calcium,
but not for levamisole, EDTA, zinc, magnesium and cobalt. The hydrolysis of
pyrophosphate in presence of 2 mM MgCl
2
follows "Michaelis-Menten” kinetics with Km=
0.142 mM and Vm= 237 U.mg
-1
. Our results suggesting that the production of membrane-
bound acid phosphatase might be one mechanism of mineral phosphate solubilization by
this genus of Bacterium.
Key-words: acid phosphatase, pyrophosphatase, p-nitrophenyl phosphate.
1- Introdução
Estudos da seqüência do rRNA16S, valores de homologia do DNA-DNA da
composição dos ácidos graxos e lipídios celulares e características fenotípicas mostraram
que o gênero Pseudomonas era constituído por organismos filogeneticamente muito
distintos e que eles poderiam ser dividido em 5 grupos (Yabuuchi et al., 1992). O grupo I
foi o único aceito como o verdadeiro gênero Pseudomonas e novos gêneros foram criados.
Sete espécies do gênero Pseudomonas spp foram transferidas para o novo gênero
denominado Burkholderia, incluindo Burkholderia cepacia (Palleroni e Holmes 1981),
Burkholderia caryophylli (Burkholder, 1942), Burkholderia gladioli (Severini, 1913), e
Burkholderia solanacearum (Smith, 1911). as espécies do grupo III são atualmente
incluídas dentro dos gêneros Acidovorax (Acidovorax delafieldii, Acidovorax facilis),
Comamonas (Comamonas testosteroni), Delftia (Delftia acidovorans) ou Pelomonas
(Pelomonas saccharophila); as espécies do grupo IV foram reclassificadas dentro do
gênero Brevundimonas (Brevundimonas diminuta, Brevundimonas vesicularis); e a única
espécies do grupo V é atualmente denominada Stenotrophomonas maltophilia
(YABUUCHI et al., 1995; COENYE e VANDAMME, 2003).
Desde sua criação em 1992, a lista de espécies do gênero burkholderia mudou
varias vezes. Muitas espécies foram removidas (Yabuuchi et al., 1995) e outras foram
inseridas (Gillis et al., 1995; Viallard et al., 1998).
Filogeneticamente, o gênero Burkholderia pertence ao grupo β- Proteobactérias e
inclui mais de 30 espécies que ocupam nichos ecológicos distintos desde o solo ao trato
respiratório do homem. O complexo da Burkholderia cepacia, constituído de 9 genovares,
encontra-se amplamente distribuído na natureza e tem sido encontrado no solo, na água
(incluindo água do mar), rizosfera de plantas, nos seres humanos e em diversas espécies
animais e no ambiente hospitalar. (COENYE e VANDAMME, 2003).
Tradicionalmente, as espécies de Burkholderia são conhecidas como patógenos de
plantas e bactérias do solo, infelizmente, algumas espécies estão envolvidas em infecções
humanas, e por questões relativas à segurança, estas infecções humanas são o que
dificultam as aplicações biotecnológicas, à maioria das espécies Burkholderia. Atualmente
são conhecidas como bactérias do solo, que apresentam diferentes tipos de interações não-
patogênicas com plantas. (COENYE e VANDAMME, 2003).
Interações entre Burkholderias e seres humanos ou aos animais são atribuídas as
cepas, B. mallei e B. pseudomallei. Que causam mormo em cavalos, mulas e burros, e foi
utilizada como uma das primeiras armas biológicas do século 20, sendo usado pela
Alemanha durante a Primeira Guerra Mundial (WHEELIS, 1998; COENYE e
VANDAMME, 2003). Mormo nos seres humanos é adquirido a partir de animais
infectados ou pelo contacto com os organismos que causam mormo através da ingestão ou
inalação (PALLERONI, 1984; COENYE e VANDAMME, 2003). Burkholderia
pseudomallei é o agente etiológico da mieloidose em seres humanos e animais, e é
endêmica a Ásia do Sudeste, Norte da Austrália e de regiões temperadas que a fronteira do
equador (DANCE, 2000; COENYE e VANDAMME, 2003). Entretanto, as maiorias das
burkholderias não são patogênicas e podem promover o crescimento em plantas pela
fixação biológica do nitrogênio e produção de fitoôrmonios. Alem disso, varias espécies
tem sido utilizadas em biorremediação, controle biológico e na industria para a produção de
biopolimeros.
Várias espécies de Burkholderia desenvolveram interações benéficas com as
plantas, sendo capazes de colonizar raízes, caule e folhas. Nesse sentido tais bactérias têm
sido exploradas no biocontrole, bioremediação e na promoção de crescimento de planta. A
capacidade de fixar nitrogênio atmosférico é atribuída a diversas Burkholderias, incluindo
espécies, como Burkholderia vietnamiensis e Burkholderia kururiensis. O nome
B.kururiensis foi proposto a uma única cepa isolada de um aqüífero poluído com
tricloroetileno (ZHANG et al., 2000; GILLIS et al., 1995; MAGALHÃES CRUZ et al.,
2001; ESTRADA-DE LOS SANTOS et al., 2001; COENYE e VANDAMME, 2003),
algumas espécies denominadas como Burkholderia tropicalis e Burkholderia brasilensis, e
outras que ainda não foram classificadas como representantes de cepas de novas espécies
(ESTRADA-DE LOS SANTOS et al., 2001; COENYE e VANDAMME, 2003).
Cepas do complexo Burkholderia cepacia tem sido utilizadas no controle de
doenças de raiz e mudas “in vitro”. Além disso, testes de campo demonstraram que essas
estirpes podem colonizar a rizosfera de diversas culturas, incluindo milho, arroz, ervilha,
girassol e rabanete, e assim, aumentam significativamente o rendimento agrícola (Parke et
al., 1991; MCLOUGHLIN et al., 1992; BOWERS e PARKE, 1993; HEBBAR et al., 1998;
TRAN VAN et al., 2000; COENYE e VANDAMME, 2003).
A versatilidade metabólica do complexo B. cepacia e estirpes que pertencem a
outras espécies de Burkholderia vêm sendo utilizadas para fins de biorremediação.
Constituintes de óleos brutos [incluindo compostos hidrocarbonetos aromáticos
policíclicos], herbicidas (incluindo ácido 2,4-diclorofenoxiacético e ácido 2,4,5-
triclorofenoxiacético, o principal componente do Agente Laranja) e derivados de éter
utilizados como aditivos na gasolina podem ser degradados por cepas de Burkholderia
isoladas (KIL BANE et al., 1982; FOLSOM et al., 1990; KRUMME et al., 1993; BHAT et
al., 1994; COENYE e VANDAMME, 2003).
Embora filogeneticamente bem definido, o gênero Burkholderia é um gênero
funcionalmente diverso. O conteúdo molecular e fisiológico desta diversidade e sua
adaptabilidade são em grande parte desconhecidos (COENYE e VANDAMME, 2003).
Além disso, pouco se sabe sobre os fatores que determinam à virulência, sugerindo que
uma identificação correta pode representar a primeira fase para a avaliação de risco e
controle da infecção. A maioria dos genomas de espécies de Burkholderia (incluindo o
complexo de espécies B. cepacia, B. glumae, B. glathei, B. gladioli e sp. LB400) consistem
de dois a quatro replicas circulares (CHENG E LESSIE, 1994; RODLEY et al., 1995;
LESSIE et al., 1996; WIGLEY e BURTON, 2000; PARKE e GURIAN-SHERMAN, 2001;
COENYE e VANDAMME, 2003).
Além disso, várias espécies Burkholderia abrigam uma ampla gama de inserções
genéticas, que podem estar envolvidos em rearranjos genômicos e na regulação da
expressão genética (LESSIE et al., 1996; TYLER et al., 1996; COENYE e VANDAMME,
2003).
Várias cepas de Burkholderia possuem potenciais de aplicações em biorremediação
são extremamente bem estudadas, mas biotecnológicamente e taxonomicamente ainda não
estão perfeitamente caracterizadas (COENYE e VANDAMME 2003).
As espécies Burkholderia colonizam diversos nichos ecológicos, desde plantas,
solos contaminados e seres humanos. Apresentam interações patogênicas e simbióticas com
plantas, entretanto em algumas circunstâncias atuam como agentes patogênicos
oportunistas em seres humanos. Apesar de não ser considerados importantes agentes
patogênicos para a população humana algumas são consideradas graves ameaças para
pacientes com fibrose cística, estas incluem todas as espécies do complexo Burkholderia
cepacia, Burkholderia gladioli e Burkholderia fungorum. (COENYE e VANDAMME,
2003). Atualmente novas espécies de Burkholderia fixadoras de nitrogênio e
filogeneticamente distante das espécies do complexo Burkholderia cepacia, tem sido
descobertas e consideradas candidatas promissoras para aplicações biotecnológicas, embora
sua distribuição ambiental e possível aplicações agro-biotecnológico são poucos
conhecido. (COENYE e VANDAMME, 2003).
B. cepacia foi a primeira espécie descrita como causadora de podridão em casca de
cebola. Algumas estirpes de Burkholderia sp têm sido estudadas como microorganismos
solubilizadores de fosfato, Burkholderia cepacia CC-A174 foi capaz de solubilizar fosfato
tricálcico, devido à sua produção de ácidos orgânicos. Há relatos que cepas de
Burkholderia cepacia estão envolvidas na remoção de fosfatos e acúmulo de poli fosfatos,
sob condições de baixo pH, (MULLAN et al, 2002).
O Fósforo participa em muitas reações que mantém as plantas e os animais vivos,
ele é parte de compostos essenciais na fotossíntese dos vegetais, para transformações
energéticas e para a atividade de alguns hormônios tanto nos animais como nas plantas
(DINKELAKER e MARSCHNER. 1992).
Naturalmente encontrado no solo, mas comparado com a maioria dos outros
nutrientes, o fósforo é de longe o menos disponível para os vegetais (KLUG. e TIEDJE,
1994). O fosfato é encontrado em duas diferentes formas, inorgânica e orgânica, seus níveis
diminuem pelo fato dele ser absorvido pelas partículas ou lavado por chuvas em excesso.
As águas nos solos usualmente contêm cerca de 0,05 mg/L de fósforo em solução, isto é
equivalente a 15g dele em um hectare, concentração essa muito baixa se comparada com as
necessidades das plantas (DAHAL, 1977).
O processo tradicional de se usar fertilizantes fosforados é considerado indesejável
ultimamente, devido liberação de alguns contaminantes relacionados a esses produtos que
apresentam um grande potencial de se contaminar as águas e o ar, sendo assim grandes
poluidores do meio ambiente (VASSILEV e VASSILEVA 2003).
Através de reações de solubilização do fósforo inorgânico e mineralização do
fósforo orgânico, os microrganismos formam fosfato solúvel para o desenvolvimento das
plantas (BERTOM et al, 1997).
Bactérias têm várias enzimas capazes de desfosforilar compostos orgânicos, que
desempenham papéis essenciais ou acessórios na fisiologia celular (Uerkvitz , 1988).
Estima-se que a população de microrganismos solubilizadores de fosfatos existente
nos solos está entre 10
4
e 10
7
g
-1
de solo (SILVA FILHO, 1998). Os microrganismos
responsáveis por essa solubilização do fósforo são aqueles que produzem enzimas
genericamente conhecidas pelo nome de fosfatases (FEDER, 1973), ou a fazem através da
produção de ácidos secretados no meio (MULLAN et al, 2002).
Quase todos os processos bioquímicos no meio ambiente envolvem
microrganismos, que têm um papel único no funcionamento do ecossistema e manutenção
da sustentabilidade na biosfera. Os microrganismos são muito conhecidos por sua
habilidade de realizar reações bioquímicas, e por disponibilizar elementos nutricionais para
as plantas e animais (PAUL e CLARK 1989).
Fosfatases ácidas não específicas Bacterianas, são enzimas secretadas, produzidas
como proteínas periplasmáticas solúveis ou como lipo-proteínas ligadas à membrana, que
geralmente são capazes de desfosforilar uma ampla variedade de substratos estruturalmente
independentes e exibem atividade catalítica ótima em valores de pH ácidos e neutros.
(ROSSOLINI et al., 1998). São proteínas monoméricas ou oligoméricas contendo
polipeptídeos componentes com um tamanho de 25-30 kDa, baseado na seqüência de
aminoácidos relatados. (ROSSOLINI et al., 1998).
As fosfatases bacterianas são enzimas secretadas, produzidas como proteínas
periplasmáticas solúveis ou proteínas ligadas à membrana, que geralmente são capazes de
desfosforilar uma estrutura de um substrato e exibir uma atividade catalítica (ROSSOLINI
et al, 1994). Muitas das enzimas fosfatases microbianas são secretadas para fora da
membrana plasmática, onde são liberadas em forma solúvel, outras são mantidas ligadas a
membrana (BEACHAM, 1979; WANNER, 1996) e outras ainda encontradas no citoplasma
e estão envolvidas em reações de desfosforilação que ocorrem durante sinais de transdução
e vias metabólicas dos microrganismos (STOCK et al 1995).
A classificação das fosfatases, incluindo as bacterianas é baseada em critérios
bioquímicos e biofísicos da enzima, como pH ótimo (ácido, alcalino ou neutro), substrato
(específico ou não específico) e no tamanho molecular. Seguindo critério de pH ótimo as
fosfatases são divididas em dois grandes grupos, o das fosfatases alcalinas, com pH ótimo
na faixa de 8 a 10,5 e o das fosfatases ácidas com pH ótimo de 2,5 a 6 (DVORAK et al,
1988). Como, exemplo de fosfatases ácidas temos a fosfatase ácida da Escherichia coli com
pH ótimo em 2,5 (TOUATI e DANCHIN 1987), a de Mycobacterium tuberculosis pH 6,5
(SALEH e BELISLE 2000), a de Streptococcus equisimilis com pH 5 (MALKE, 1998) e a
da Escherichia blattae com pH 6,0 (ISIKAWA, et al, 2000). E de acordo com peso
molecular as fosfatases podem apresentar diferenças, possuindo alto ou baixo peso
molecular (BAIROCH et al, 1995). Alguns estudos demonstram que diferentes bactérias
apresentam a produção de fosfatases ácidas contendo um baixo peso molecular (25 a 30
Kda), mesmo essas pertencendo a gêneros diferentes (THALLER et al, 1995), como a
fosfatase ácida da E. coli com 25 Kda (DVORAK et al, 1988), a de Salmonella entéric e S.
typhimurium, ambas com 25 Kda (KIER et al, 1977; UERKVITZ, 1988) e a dePrevotella
intermédia com 28 Kda (CHEN, et al, 1999).
Portanto, muitos pesquisadores têm procurado uma maneira de se utilizar esses
microrganismos na produção de biofertilzantes, para suprir o esta necessidade de fósforo
por meio destes microrganismos solubilizadores, sendo esta uma possível saída para cessar
o uso de fertilizantes poluentes (BANIK, 1983; BERTHELIN ET AL, 1991), por isso,
durante anos, microrganismos despertam os interesses de microbiologistas e ecólogos, por
apresentarem uma opção diferente para a solubilização do fósforo (GOLDSTEIN et al,
1993).
O interesse em fosfohidrolases bacterianas não está apenas relacionado às suas
múltiplas funções na biologia das células de procarióticos e para a suas participações
ocasionais na patogenicidade microbiana, mas também para a possibilidade de explorar
estas enzimas como instrumentos de investigação em enzimologia (KIM e WYCKOFF,
1991; OSTANIN et al , 1992; ROSSOLINI et al., 1998), na regulação dos genes expressão
(Makino et al, 1994; Touati et al, 1987; ROSSOLINI et al., 1998); paradigmas para a
evolução molecular (COCKS e WILSON, 1972; DASSA et al 1990; ROSSOLINI et al.,
1998) ; marcadores para a taxonomia bacteriana e de identificação (SHIBATA et al 1986,
THALLER et al 1992, ROSSOLINI et al., 1998) ; marcadores em imunologia e biologia
molecular(AVRAMEAS 1969; ROSSOLINI et al., 1998); ferramentas para a
biorremediação em microbiologia ambiental (MACASKIE, 1990; MACASKIE et al, 1992;
ROSSOLINI et al., 1998).
Por isso, o estudo das fosfatases microbianas, continua a ser um campo ativo, com
relevância para os diversos aspectos da fisiologia microbiana e biotecnologia (ROSSOLINI
et al., 1998).
1.1. Objetivos
Os objetivos do presente trabalho foram os de expressar e caracterizar
cinéticamente uma possível fosfatase ácida ligada à membrana produzida pela
bactéria do gênero Burkholderia
2. Materiais e Métodos:
2.1. Isolamento e identificação da bactéria Burkholderia sp.
O microrganismo utilizado no presente trabalho foi isolado da raiz de uma plântula
de Zea mays da região de Ponta Grossa-PR, e identificado através do sequênciamento do
gene 16s rDNA, como sendo do gênero Burkholderia (SILVEIRA et al., 2006; PEREIRA
et al., 2006).
2.2. Meio de Manutenção do Microrganismo.
O microrganismo foi mantido em placas de petri com meio de cultura sólido
contendo glicose (2 g/L), peptona (1,5 g/L), extrato de levedura (2 g/L), KH
2
PO
4
(0,5 g/L),
MgSO
4
.7H
2
O (0,5 g/L), ácido glutâmico (1,5 g/L), agar (9g/L), pH em 6.8, em estufa
B.O.D a 30° C.
2.3. Meio de indução da produção de Fosfatase Ácida.
Para a indução da fosfatase, o microrganismo foi cultivado em meio líquido
constituído de glicose (20 g/L), MgCl
2
. 6 H
2
O (1 g/L), MgSO
4
.7H
2
O ( 0,25 g/ L), KCl (
0,2 g/L), (NH
4
)
2
SO
4
(1,0 g/L), em pH 6,8., contendo diferentes concentrações de fósforo
solúvel (0 a 5mM).
2.4. Obtenção da possível fosfatase ácida ligada à membrana.
Após 3 dias de incubação a 30° C em agitação (140 rpm), as bactérias forma
recuperadas através de centrifugação a 10.000 x g, a 4°C, por 10 minutos, a 4 ºC. O
sobrenadante foi descartado e o precipitado contendo as células bacterianas foi
resuspendido, em uma proporção de uma parte de precipitado para oito de tampão acetato
0.059M pH 6,0, submetido à ultra sonicação, no aparelho Branson sonifier 250, a 50
micropulsos por minuto com ciclos de 30 segundos para rompimento das células.
2.5. Obtenção da fração de membrana:
Após o rompimento a amostra foi centrifugada a 10.000 x g, 4°C, durante 10
minutos, o precipitado foi descartado e o sobrenadante foi centrifugado a 100000 x g, 4°C,
por 1 hora. Findo tal período o sobrenadante foi descartado e o precipitado foi resuspendido
em tampão acetato 0.059 M, pH 6,0 com o auxilio de um homogeneizador tipo Potter,
dividido em alíquotas de 1 mL, congelado em nitrogênio liquido e armazenados a –70 ºC,
para posterior estudos de estabilidade térmica e caracterização cinética.
2.6. Determinação de atividade fosfomonohidrolase da possível Fosfatase ácida.
A atividade paranitrofenilfosfatásica da fosfatase ácida foi determinada
descontinuamente, a 37ºC, em meio de reação contendo tampão acetato 0,059M, em pH 6,0
e PNFF 10 mM , MgCl
2
100 mM e água,
em um volume final de 1mL. A reação foi
iniciada pela adição da fração de membrana (0,08mg/mL) e interrompida pela adição de
1mL de NaOH 1M em tempos previamente estabelecidos. O p-nitrofenolato (ε = 17.600 M
-
1
cm
-1
, pH 13) liberado foi quantificado pela leitura da absorbância em 410 nm em um
espectrofotômetro Hitachi U-2000.
2.7. Determinação da atividade de pirofosfatase da possível fosfatase ácida ligada à
membrana.
A atividade de pirofosfatase (Ppiase) da fosfatase ácida ligada à membrana foi
determinada descontinuamente a 37°C, através da dosagem do fosfato liberado segundo o
método de Heinonen and Lahti (1981). A reação foi iniciada pela adição da fração de
membrana (0,08mg/mL) no meio de reação contendo tampão acetato 0,059 M, em pH 6 e
MgCl
2
100mM em um volume final de 1 mL. Em tempos pré-estabelecidos a reação foi
interrompida pela adição de 0.5 mL de solução gelada de ácido tricloroacético (TCA) 50%
(p/v). Em cada experimento foram incluídos controles, sem a enzima, para se estimar a
hidrólise espontânea do substrato.
Uma unidade (U) de atividade enzimatica foi definida arbitrariamente como sendo 1
nmol de fosfato liberado por minuto, nas condições padrões do teste.
2.8. Dosagem de Proteínas:
As determinações de concentração de proteína foram realizadas pelo método de
Lowry, modificado por Hartree (1972). As determinações foram feitas, sempre em
duplicata, utilizando-se soro albumina bovina fração IV como padrão. A concentração de
proteína foi estimada a partir da regressão linear dos valores da curva padrão.
2.9. Efeito do pH sobre a atividade da possível fosfatase ácida ligada à membrana.
O estudo do efeito do pH ótimo aparente sobre a atividade da fosfatase ácida da
bactéria Burkholderia, foi realizado utilizando-se tampão acetato 0,059M (pH 3,5 a 6,5),
Tris 0,059M (pH7,0), AMPOL 0,059 M (pH 9 e 10), e em concentração de PNFF 100 mM.
A reação foi iniciada pela adição da enzima ao meio de reação e a atividade
paranitrofenilfosfatásica foi determinada conforme descrito em 2.6.
2.10. Estabilidade da Amostra:
As amostras de fração de membrana foram submetidas à estocagem a 4ºC e a –20°C, por
um período de 30 dias.
2.11. Efeito da concentração do substrato sobre o pH na atividade da possível
fosfatase ácida ligada à membrana:
O efeito da concentração do PNFF sobre a atividade da fosfatase ácida foi
estudado utilizando-se tampão acetato 0,059M (pH 3,5 a 6,5), Tris 0,059M (pH7,0),
AMPOL 0,059 M (pH 9 e 10). A reação foi iniciada pela adição da enzima ao meio de
reação contendo tampão adequado 0.059M e concentrações de PNFF compreendidas entre
0,001 a 10 mM sendo interrompida pela adição de 1mL de NaOH 1M em tempos
previamente estabelecidos. A atividade de fosfomonohidrolase da enzima foi determinada
através da formação do íon p-nitrofenolato (ε = 17.600 M
-1
cm
-1
, 410nm, pH 13).
Uma unidade de enzima (U) foi definida como sendo a quantidade de fosfatase ácida que
hidrolisa 1 nM de PNF por minuto, a 37ºC.
2.12. Efeito da Temperatura sobre a atividade da possível Fosfatase ácida ligada à
membrana.
O estudo foi realizado em tampão acetato 0,059 mM em pH 6,0 contendo MgCl
2
2mM e concentrações de PNFF compreendidas entre 0,001 a 10 mM, para temperaturas
entre 25 a 70º C, e calculado o ∆H de ativação através da equação de Arrhenius.
A reação foi iniciada pela adição de 40 µl (0,08 mg/ mL ) da enzima em meio
reacional e a atividade foi determinada conforme descrito em 2.6.
2.13. Inativação térmica da possível fosfatase ácida ligada à membrana.
O estudo de inativação térmica da fosfatase ácida ligada à membrana foi realizado
em tampão acetato 0.059 mM, pH 6, contendo MgCl
2
100 mM e PNFF 100 mM. A enzima
(2 mg/ml), em tãmpão acetato 0.059 mM, pH 6, foi incubada em temperaturas
compreendidas entre 50 e 70°C e em tempos previamente estabelecidos, foram retiradas
alíquotas de 40 µl (0,08 mg/mL) que foram mantidas em banho de gelo durante um
minuto. Finalemte, a atividade para PNFFase foi determinada conforme descrito em 2.6.
2.14. Efeito de diferentes inibidores sobre a atividade da possível fosfatase ácida
Purificada.
A ação de diferentes inibidores sobre a atividade da fosfatase ácida foi estudada
utilizando-se concentrações de inibidores compreendidas entre 1 e 10 mM. As soluções dos
inibidores foram preparadas em tampão acetato 0,059 M em pH 6. A atividade residual foi
determinada após a incubação da enzima a 37º C com os inibidores nas concentrações
descritas por 1 hora, e realizadas conforme descrito em 2.6..
2.15. Determinação dos parâmetros cinéticos.
A determinação dos parâmetros cinéticos foi realizada através do programa Sigrafw
(Windows version 2.0) de autoria de LEONE, F.A., BARANAUSKAS, J.A., FURRIEL,
R.P.M. e BORIN, I.A.,departamento de química da, Faculdade de Filosofia, Ciências e
Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo.
3. Resultados
O estudo do efeito da concentração d e fósforo na produção da possível enzima por
burkholderia é mostrado na (Figura 1). Conforme pode ser observado a concentração ideal
de fósforo para a produção da enzima foi de 5 mM, sugerindo que a produção é
dependente da concentração de fósforo no meio de cultivo.
0
0,3
0,6
0,9
50 100 200 500 1000 5000
Concentração de Fosfato em micro Mols/ L
Absorbância
Figura 1: Produção da enzima em diferentes concentrações de fosfato (0 a 5 mM),
atividade determinada em tampão acetato 0,059 M a 37°C em pH 6 e iniciada pela adição
da fração de membrana (0,03mg de proteína).
A obtenção da fração de membrana da bactéria foi feita através de centrifugações.
As células do meio de cultivo foram obtidas intactas por centrifugação a 10.000xg, por 10
minutos, a 4°C. A seguir o precipitado obtido foi resuspendido em tampão acetato 0,059
mM, e as células foram rompidas pelo processo de ultrasonicação, centrifugadas a 10.000 g
para retirar aquelas que não foram rompidas e o sobrenadante foi centrifugação a 100 000g
a 4°C por 1 hora. Finalmente a membrana presente no precipitado foi ressuspendida em
tampão acetato e utilizada em todos os experimentos do presente trabalho. Na Tabela I
são mostrados os valores de proteína total, atividade PNFFase da fosfatase acida,
fator de recuperação e de purificação obtidos durante o procedimento de
obtenção da enzima ligada á membrana.
Fator
1.0
0,1
1.1
(%) Recuperação em atividade
100
2.8
75.5
Atividade U/mg (nmoles/minutos/mg)
125.20
0.01
139.38
Proteína total ( mg/ml)
12.3
3.5
9.3
Etapas
Extrato Bruto
sobrenadante
100000 g
precipitadoa
100 000g
Tabela I: Purificação da fosfatase ácida ligada a membrana por meio de centrifugação.
O estudo da estabilidade térmica da atividade PNFFásica da enzima ligada a
membrana foi estudada armazenando-se as diferentes formas da em diferentes temperaturas
(4 e -20 ° C)(Figura 2), por um período de 30 dias (Figura 2.)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 2 5 10 15 25 30
Dias
Atividade Residual (%)
Figura 2: Estabilidade da possível fosfatase ácida: ∆ fração de membrana purificada a 4
°C, ▲ fração de membrana purificada a -20°C, □ fração bruta de membrana a 4°C, ■ fração
bruta de membrana a -20°C, atividade determinada em tampão acetato 0,059 M a 37°C em
pH 6 e iniciada com a adição da fração de membrana (0,08mg/ml).
Como pode se observar à enzima ligada à membrana manteve-se estável por um
período maior do que a amostra bruta recém obtida, apresentando mais de 90% de
manutenção para sua atividade enzimática por todo o período de 30 dias de
armazenamento, enquanto a amostra bruta mostrou-se inalterável perdendo sua atividade
rapidamente nos primeiros dois dias e a partir daí o perda da atividade mais lenta, chegando
a pouco mais de 40% de sua atividade inicial, sugerindo um comportamento bifásico de
enzima de membrana.
O estudo para o pH de atuação da enzima ligada a membrana foi realizado em
diferentes pHs (Figura 3), variando-se também as diferentes espécies de tampão.
.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 8 9 10
pH
Absorbância
Figura 3: Efeito do pH sobre a atividade da possível fosfatase acida ligada a membrana. A
rea;ao foi iniciada com a adição fração da enzima (0,08mg/ml) ao meio de reação e
interrompida com NaOH.
Observa-se que a atividade enzimática data putativa fosfatase ácida ligada à
membrana possui um ótimo de atuação em pH 6. Os resultados obtidos no estudo do efeito
da concentração de substrato (PNFF) sobre a atividade da possível fosfatase ácida ligada à
membrana (Figura 4) confirmou este pH ótimo de atuação e mostrou que a enzima
apresenta comportamento “Michaeliano” para a hidrolise desse substrato em todos os pHs
estudados. No que tange ao estudo da temperatura os resultados obtidos mostram que
apenas a velocidade máxima de atua;ao [e influenciada pela temperatura, enquanto os
valores de k e n permanecem inalterados, enquanto o ph influenciou tanto o K como o Vm.
Figura 4: Efeito da Temperatura e pH sobre a concentração de substrato e parâmetros
cinéticos da putativa fosfatase ácida purificada: ∆ variação da velocidade de reação, □
variação do K e ○ variação do N. Atividade determinada em tampão acetato 0,059 M
iniciada com a adição de 0,08mg de fração de membrana, e interrompida com NaOH.
O estudo da concentração do PNFF Figuras 5 e do Pirofosfato Figuras , sobre a
atividade da enzima ligada à membrana em seu pH ótimo de atuação revelou que a
hidrólise destes ésteres de fosfato ocorre através de uma única classe de sítios de
fixação do substrato A análise dos parâmetros cinéticos obtidos mostra
comportamento “Michaeliano” para a hidrolise de ambos os substrato. Esse estudo
revelou ainda, que p pirofosfato foi o substrato que apresentou a maior velocidade
máxima e o menor valor de Km Tabela II.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
20 25 30 35 37 40 45 50 55 60 65 70
Temperatura
U/v
0,09
0,095
0,1
0,105
20 25 30 35 37 40 45 50 55 60 65 70
Temperatura
K
1,2
1,3
1,4
20 25 30 35 37 40 45 50 55 60 65 70
Temperatura
N
0
20
40
60
80
100
120
3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 8 9
pH
U/v
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 8 9
pH
K
0,8
1,3
1,8
3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 8 9
pH
N
Figura 5: Efeito da concentração de PNFF sobre a putativa fosfatase ácida ligada à
membrana em pH 6 a 37°C, atividade determinada em tampão acetato 0,059 mM iniciada
com a adição da fração de membrana (0,08mg/ml), e interrompida com NaOH.
Figura 6: Efeito da concentração de Pirofosfato sobre a putativa fosfatase ácida ligada à
membrana em pH 6 a 37°C, atividade determinada em tampão acetato 0,059 mM iniciada
com a adição da fração de membrana (0,08mg/ml), e interrompida com NaOH.
Tabela II: Dados cinéticos da enzima frente aos substratos: PNFF e Pirofosfato.
Substrato pH V(U.mg
-
1
) n
h
K
0,5
(mM)
PNFF 3,5 39,7 1,3 0,2
PNFF 4,0 44,0 1,3 0,2
PNFF 4,5 56,8 1,3 0,3
PNFF 5,0 79,5 1,3 0,5
PNFF 5,5 103,8 1,3 0,6
PNFF 6,0 113,5 1,3 0,65
PNFF 6,5 95,1 1,3 0,55
PIROFOSFATO 6,0 237 1,3 0,14
A representação de Arrhenius determinada no estudo do efeito da temperatura sobre
a hidrólise do PNFF pela fosfatase ácida ligada à membrana revelou um ∆H de 5,74
kcal.mol
-1
(Figura 6).
Figura 6: Representação de Arrhenius para a hidrólise do PNFF pela putativa fosfatase
ácida ligada à membrana.
O estudo da inativação térmica da possível fosfatase ácida ligada à membrana é
demonstrado na Figura 7. As constantes de inativação térmica da putativa fosfatase ácida
ligada à membrana e os correspondestes tempos de meia vida são apresentados na tabela
III.
I.
Figura 7: Inativação térmica da possível fosfatase ácida ligada à membrana: (●) 25°C; (○)
55°C; (■) 60°C; (□) 65°C; (▲ ) 70°C. A atividade residual foi obtida através da adição da
fração de membrana e incubada na temperatura e passada ao banho de gelo em meio
reacional contendo tampão acetato 0,059 M em pH 6 e incubada novamente a 37°C por 10
minutos e interrompida com NaOH.
Observa –se a enzima e estável 55°C enzima e que a partir desta temperatura a
enzima e instável e aumenta com o aumento da temperatura ate 70ºC, temperatura ocorre
uma grande diminuição significativa da atividade, diminui;ao do tempo de meia vida e
aumento na constante inativação
.
Tabela III: Constantes de inativação térmica da fosfatase ácida ligada à membrana e
respectivos tempos de meia vida.
Temperatura (°C) K.10
-4
(min) T
0,5
(min)
55 5 1380
60 115,5 60
65 173,2 40
70 13860 5
O estudo do efeito de diferentes inibidores sobre a atividade da possível fosfatase
ácida ligado à membrana e mostrado na Tabela IV.
Tabela IV: Efeito de diferentes reagentes sobre a atividade da possível fosfatase ácida
ligada à membrana. Os valores são dados em porcentagem da atividade da enzima, onde
nenhum inibidor foi adicionado, esses valores foram obtidos pela adição da enzima após 1
hora de incubação em meio reacional contendo o respectivo inibidor.
Inibidores Atividade Residual (%)
1 mM 10 mM
Nenhum 100 % 100 %
Fosfato solúvel 88% 38 %
EDTA 91 % 86 %
Arsenato 14% 3 %
Cloreto de cálcio 82% 69%
Cloreto de Zinco 87% 90%
Cloreto de Cobalto 90% 90%
Levamisol 88% 93%
Ácido tricloroacético 90% 90%
Tartarato do sódio 98% 71%
Os obtidos resultados mostram claramente que o arsenato é o inibidor mais
eficiente, mesmo em concentração final de 1 mM (Tabela IV), enquanto que o fosfato
apresentou uma leve inibição a 10 mM(Tabela IV). A enzima e resistente ação do tartarato
de sódio mesmo em concentração de 100 mM, onde apresentou uma atividade residual de
aproximadamente 40% .
O estudo do da concentração dos inibidores arsenato e fosfato sobre a ativ idade PNFásica
da enzima revelou que o arsenato, um análogo estrutural do fosfato apresenta uma inibição
do tipo mista (figura 8) enquanto que o fosfato atua como um inibidor não competitiva
(figura 9).
Figura 8: Inibição da atividade PNFFase da putativa fosfatase ácida ligada à membrana
pelo arsenato. As concentrações utilizadas de arsenato foram: (∆) controle sem inibidor, (□)
0,05 mM, (■) 0,1 mM, (○) 0,5 mM. Reação efetuada em tampão acetato pH 6 contendo
MgCl
2
100mM e interrompida com NaOH.
Figura 9: Inibição da atividade PNFFase da fosfatase ácida ligada à membrana pelo
fosfato. As concentrações utilizadas de Fosfato foram: (∆) controle sem inibidor, (□) 0,05
mM, (■) 0,1 mM, (○) 0,5 mM. Reação efetuada em tampão acetato pH 6 contendo MgCl
2
100mM e interrompida com NaOH.
4. Discussão:
Fósforo é um nutriente essencial requerido em alto nível pelos seres vivos para o
seu crescimento e desenvolvimento (EHRLICH, 1990), participa da formação de
metabólicos fosforilados durante o processo anabólico e catabolicos das funções de
crescimento e diferenciação celular, da composição do DNA, RNA, dos fosfolipídios, do
ATP, da regulação da atividade de várias enzimas e do controle gênico (DINKELAKER e
MARSCHNER. 1992). Apesar de o fósforo ser um elemento químico relativamente
abundante no solo, geralmente é encontrado na forma de fosfato tricálcico (Ca
3
(PO
4
)
2
),
praticamente insolúvel e, portanto, não disponível para as plantas (HAYMAN, 1975),
somente uma fração muito pequena de fósforo solúvel de cerca de 1 ppm ou menos tem
sido encontrado no solo (FERNANDEZ e NOVO , 1988). O processo tradicional produção
de fertilizante é prejudicial ao meio ambiente devido a emissão de poluentes aqüíferos e
ambientais prejudiciais aos seres vivos (SONG et al, 2008). Ha mais de um século os
microbiologistas agrícolas e os ecólogos microbianos vêm investigando a habilidade de
alguns microrganismos em dissolver fosfato mineral indisponível as plantas tais como
fosfato de tri-cálcio e/ou a hidroxiapatita na forma de biofertilizante (KLOEPPER et al,
1988; KLOEPPER et al, 1989) visando encontrar um produto ideal sem acarretar
contaminação ambiental (SUSLOV, 1982). O principal mecanismo de solubilização de
fósforo mineral presente no solo e através da produção de ácidos orgânicos, como cítrico,
butirico, láctico, succinico, málico, gluconico, acético, fumarico, 2-cetogluconicos
(GLICK, et al, 1998) ou pela quitação (GLICK, et al, 1998; KLOEPPER, 1994). Essa
suposição é suportada pelo fato de que há evidências experimentais que apóia o papel de
ácidos orgânicos na solubilização do fosfato mineral (RODRIGUEZ E FRAGA 1999).
HALDER et al. mostraram que os ácidos orgânicos isolados de uma cultura de Rhizobium
leguminosarum solubilizaram uma quantidade de Pi equivalente àquela produzida pela
cultura inteira. Entretanto, alguns autores admitem que os fungos não produzam ácidos em
quantidade suficientes para solubilização de fósforo. Estudos realizados por vários autores
mostraram que a liberação de H+ para o meio externo por um mecanismo de troca e
captação de cátions através da atuação de uma H+ ATPase, poderia constituir em um
mecanismo alternativo para a solubilização do fósforo. Estudos nesse sentido têm sido
realizados em nosso laboratório. Tem sido demonstrado que bactérias do gênero
Burkholderia estão envolvidas na solubilização e remoção do fosfato em condições de
baixo pH, através da solubilização por formação de ácidos (MULLAN et al., 2002),
enquanto a fosfatase ácida é a responsável pela mineralização de fósforo no solo
(RODRIGUEZ E FRAGA 1999). Entretanto alguns autores admitem que tais bactérias são
indispensáveis para a liberação de fósforo para as plantas regulando seu crescimento e
desenvolvimento (RODRIGUEZ E FRAGA 1999).
A fim de satisfazer as suas necessidades de crescimento, os microrganismos
desenvolveram um sistema que os capacita obter fósforo quando as quantidades de fosfato
inorgânico do meio estão indisponíveis ou limitantes (LUGTENBERG,
1975
). Tem sido
demonstrado ainda que em altas concentrações de fosfato inorgânico atue como um repressor
da produção de fosfatases e que em condições limitantes de fósforo esses microrganismos
responde a essa condição sintetizando fosfatases denominadas de Pi-repressivel. Nesse sentido,
parece razoável admitir que a fosfatase produzida pela Burkholderia (figura 1) em condições
limitante de pi e um enzima repressível e sua expressão se
mostrou diretamente dependente aa
concentração de fosfato no meio ate 5 mM. É importante destacar que
altas concentrações
de bactérias solubilizadoras de fósforo tem sido encontradas na rizosfera de plantas quando
comparada com os valores encontrados no solo não rizosférico (
RODRIGUEZ E FRAGA
1999). A fração de membrana contendo a enzima foi obtida através ruptura da bactéria pó
sonicação e por centrifugação diferencial. Os resultados da tabela 1 mostram que cerca de
99% da enzima se encontra associada á membrana e o baixo fator de recuperação obtido
sugere que a única forma de enzima presente no extrato bruto e a enzima de membrana,
uma vez que a centrifugação diferencial a 100000 x g é um processo simples mas utilizado
com sucesso por vários autores para se obter frações de membranas (KUNDING e
ROSEMAN, 1970; KATAKURA e KOBAYASHI, 1988 ).
A fosfatase ácida ligada à membrana se mostrou estável ao armazenamento por 30
dias a temperaturas de estocagem de 4 e -20°C (Figura 2), entretanto o mesmo não
aconteceu quando o extrato bruto foi armazenado nas mesmas condições, sugerindo que a
presença de proteases nesse extrato poderia ser a principsl casudas da perda de atividade.
O pH ótimo atuação 6 A fosfatase ácida ligada à membrana apresenta (figura 3), é
similar aquele observados para enzimas que apresenta pH ótima na na faixa de pH de 2,5 a
6 (DVORAK et al, 1967) e de fosfatase obtidas de Escherichia battle (ISIKAWA et al,
2000), a fosfatase ácida de Shigella flexneri (UCHIYA et al, 1996).
O estudo da concentração de PNFF sobre pH (Figura 4) revelou que a fosfatase
ácida ligada à membrana apresentou comportamento cinético Michaeliano (tabela 2 e figura
5) para a hidrólise de PNFF e para a hidrólise do pirofosfato (Tabela 2 e Figura 5),
comportamento esse semelhante a de outras fosfatase acidas de bactérias como: Morganella
morganii, K
m
117 (mM) e V
max
6.09 U/mg; Providencia stuartii, K
m
156 (mM) e V
max
6.21
u/mg; Klebsiella planticola, K
m
231 (mM) e V
max
2.65 u/mg ( MIHARA et al, 2001) e
Escherichia battle, K
m
200 (mM) e V
max
2.78 u/mg (ISIKAWA et al, 2000).
A representação de Arrhenius para a hidrólise do PNFF pela fosfatase ácida ligada à
membrana apresento um ∆H de 5,74 kcal.mol
-1
(figura 6), comparável com aquele obtido
para a fosfatase acida de Yersinia sp de 6 kcal.mol
-1
( ZANG et al, 1992).
O ensaio de inativação térmica da enzima (Figura 7) revelou que a fosfatase ácida
ligada à membrana mostrou estável até 55°C com um t
0,5
de
1380 minutos (tabela 3), mas a
partir os 60°C sua atividade começa a cair atingindo um tempo de meia vida menor (t
0,5
=
60minutos). È importante destacar que as curvas de inativação obtidas não apresentam
quebras, sugerindo que não se trata de uma enzima transmenbranar e que a mudança de fase
de membrana não afeta seu comportamento. Além disso, parece razoável admitir que sua
interação com a membrana pode ser através da ligação ao glicocalix, visto que a adição de
tunicamycin ao meio de cultivo induz a síntese e a secreção de uma enzima solúvel,
modificação a sua forma de glicoproteína ligada a membrana via glicocalise para excretada
no meio na forma solúvel (KONDO et al 1996).
A o estudo do efeito de diferentes compostos sobre a atividade PNFFásica da
provável fosfatase ácida ligada à membrana demonstrou que o arsenato (Tabela 4) foi o
mais o inibidor mais potente e apresentou uma inibição do tipo mista (Figura 8), enquanto
que a inibição pelo fosfato foi menos eficiente (Tabela 4) e do tipo não competitiva
(Figura 9). Tendo em vista que o arsenato é um análogo estrutural do fosfato ainda não
temos uma explicação para mudança da inibição de mista para não competitiva.
5. Conclusões
Foi padronizado uma método rápido e eficiente para a produção e purificação da
fosfatase ácida ligada á membrana Pi-repressivel produzida por burkholderia, sendo 5
mmoles a melhor concentração de fosfato no meio de cultivo.
A fosfatase ácida ligada à membrana apresenta um pH ótimo de atuação em pH 6, é
estável ao quando armazenada a 4 e -20°C.
A enzima ligada apresenta comportamento cinético de “Michaeliano” para a hidrolise do
PNFF (V
m
= 113,5) e do pirofosfato (V
m
= 237).
A energia de ativação para a hidrólise do PNFF peal fosfatase ácida ligada à
membrana obtida é de 5,74 kcal.mol
-1
.
O estudo da estabilidade térmica revelou que a enzima é estável até 55 °C e partir
daí e inativada rapidamente.
A inibição da atividade PNFFáscia da enzima ligada à membrana pelo arsenato é
do tipo mista enquanto que a do fosfato é do tipo não competitiva.
A fosfatase ácida ligada à membrana produzida por esta bactéria pode representar
um mecanismo de solubilização do fosfato mineral no solo o tornado disponível para as
plantas favorecendo um melhor desenvolvimento das plantas, diferentemente de outras
bactérias do mesmo gênero, espécies diferentes, que fazem esta disponibilização através da
produção de ácidos.
6. Bibliografia:
AVRAMEAS S. Coupling of enzymes to proteins with glutaraldehyde. Use of
conjugates for the detection of antigens and antibodies. Immunochemistry 6: 43–52, 1969.
BAIROCH, A.; BUCHER,& HOFMANN, K. The prosite database. Nucleic acid
res., 24, 189-196, 1995.
BANIK, S. “Variation in potentiality of phosphate solubilizing soil
microorganisms with phosphate and energy source.” Zentralbl. Mikrobiol., 138, , 209-216,
1983
BEACHAM, I.R. Periplasmic enzymes in gram negative bacteria. Int J. Biochem,
10, 877- 883, 1979.
BERTHELIN, F.; LEYVAL, C.; LAHEURTE, F. & DE-GIUDICI,“Involvements
of roots and Rhizospere microflora in the chemical weathering of soil minerals.” In Plant
Root Growth; an Ecological Perspective, special Publication series of the British Ecological
Society, N. 10, Black-well Scientific, Oxford. 1991.
BERTON, R.S.; PRATT, P.F. & FRANKENBERGER, W.T. “Phosphorus
availability in soils amended with organic materials, estimated by three chemical methods
and two enzyme activities”. Revista Brasileira de Ciência do Solo, Campinas, v.21,
n.4,617-624, 1997.
BHAT, M.A., TSUDA, M., HORIIKE, K., NOZAKI, M., VAIDYANATHAN,
C.S., e NAKAZAWA, T. Identification e characterization of a new plasmid carrying genes
for degradation of 2,4-dichlorophenoxyacetate from Pseudomonas cepacia CSV90. Appl
Env Microbiol 60: 307–312, 1994.
BLUM, H.; BEIER, H. & GROSS, H.J. “Improved silver staining of plant proteins
RNA and DNA in poliacrylamide gels electrophoresis”, 8, 93-99, 1987.
BOWERS, J., e PARKE, J. Epidemiology of Pythium damping-off e Aphanomyces
root rot of peas after seed treatment with bacterial agents for biological control.
Phytopathology 83: 1466–1473, 1993.
BURKHOLDER, W. H. Three bacterial plant pathogens: Phytomonas caryophylli
sp.n., Phytomonas alliicola sp.n., and Phytomonas manihotis (Arthaud-Berthet et Bondar)
Viegas. Phytopathology, 32, 141-149, 1942.
CHEN, X., ANSAI, T.; AWANO, T.I.; BARIK, S. & TAKEHARA, T. “Isolation,
Cloning and Expression of an Acid Phosphatase Phosphotyrosyl Phosphatase Activity from
Prevotella intermedia.” Journal of Bacteriology, 7107-7114, 1999.
CHENG, H.P., e LESSIE, T.G. Multiple replicons constituting the genome of
Pseudomonas cepacia 17616. J Bacteriol 176: 4034–4042, 1994.
COCKS G. T. E WILSON A. C. Enzyme evolution in the Enterobacteriaceae. J.
Bacteriol. 110: 793–802, 1972.
COENYE, T. & VANDAMME,“Diversity and significance of Burkholderia species
occupying diverse ecological niches.”Enviromental Microbiology, 5, 719-729, 2003.
COENYE, T.; LAEVENS, S.; WILLEMS, A.; OHLÉN, M.; HANNANT, W.&
GOVAN, J.R.W. ” Burkholderia fungorum sp. nov. and Burkholderia caledonica sp. nov.,
two new species isolated from the environment, animals and human clinical samples.” Int J
Syst Evol Microbiol,51, p.1099–1107, 2001.
DAHAL, R.C. “Soil organic phosphorus. Advances in Agronomy.” 28, 1977, 83-
117.
DANCE, D.A. Ecology of Burkholderia pseudomalle e the interactions between
environmental Burkholderia spp. and human-animal hosts. Acta Trop 74: 159–168, 2000.
DASSA J., MARCK C. E BOQUET P. The complete nucleotide sequence of the
Escherichia coli gene appA reveals significant homology between pH 2.5 acid phosphatase
and glucose-1-phosphatase. J. Bacteriol. 172: 5497–5500, 1990.
DAVIS, B.J. “Disc electrophoresis – Method and application to human serum
proteins”.Ann N.Y. Acad. Science, 121, 404-427, 1964.
DINKELAKER, B. & MARSCHNER, H. “In vivo demonstration of acid
phosphatase activity in the rhizosphere of soil-grown plants.” Plant Soil, 144, 199-205,
1992.
DVORAK, H.F.; BROCKMAN, R.W. & HEPPEL, L.A. “ Purification and
properties of two acid phosphatase fractions isolatade from osmotic shock fluid of E. Coli.”
Biochemistry, 6, 1743- 1751, 1988.
EHRLICH, H.L. Mikrobiologische and biochemische Verfahrenstechbik. In Einsele
A, Finn RK, Samhaber w, editors. Geomicrobiology, 2 , Weinheim, VCH
Verlagsgesellschaft, 1990.
EL BANNA, N. e WINKELMAN, G. “Pyrrolnitrin from brukholderia cepacia
antibiotic activity against fungi and novel activities against streptomyces.” J. appl
Microbiol, 85, 69-78. , 1998
ESTRADA DE LOS SANTOS, P.; BUSTILLOS-CRISTABLES, R. &
CABALLERO-MELLADO, J. “Burkholderia, a genus rich in plant – associated nitrogen
fixers with wide enviromental and geographic distribution.” Appl environmental
microbiology, 67, 2790-2798, 2001.
FEDER, J. The phosphatases. In: GRIFITH, E.J.; BECTEN, A.; SPENCER, J.M.;
MITCHEL, D.T. Environmental phosphorus handbook. New York: John Wiley, 475-507,
1973.
FERNANDEZ, C., NOVO, R. Vida Microbiana en el Suelo, II. La Habana :
Editorial pueblo y educatión , 1988.
FOLSOM, B.R., CHAPMAN, P.J., e PRITCHARD, P.H. Phenol and
trichloroethylene degradation by Pseudomonas cepacia G4: kinetics and interactions
between substrates. Appl Env Microbiol 56: 1279–1285, 1990.
GILLIS, M.; VAN VAN, T.; BARDIN, R.; GOOR, M.; HEBBAR,& WILLEMS,
A. “Polyphasic taxonomy in the genus Burkholderia leading to an emended description of
the genus and proposition of Burkholderia vietnamiensis sp. nov. for N2-fixing isolates
from rice in Vietnam”. Int J Sys Bacteriol, 45, 274–289, 1995.
GLICK, B.R., PENROSE, D.M. e LI, J. A model for the lowering of plant ethylene
concentrations by plant growth promoting bactéria. J Theor Biol, 190, 63-68, 1998.
GOLDSTEIN, A.H.; ROGERS, R.D. & MEAD, G. “Separating phosphte from ores
via bioprocessing”. Bioresour. Technol., 11, 1250-1254, 1993
HALDER, A.K., MISHRA, A.K., BHATTACHARYYA, P. e CHAKRABARTTY
P.K. Solubilization of rock phosphate by Rhizbium and Bradyrhizobium . J. Gen appl
microbiol, 36, 81-92, 1990.
HANTKE, K.. “Regulation of ferric iron transport in Escherichia coli K12: isolation
of a constitutive mutant.” Mol. Gen. Genet., 288–292, 1981.
HAYATSU, M.; HIRANO, M. e TOKUDA, S. “Involvement of two plasmids in
fenitrothion degradation by Burkholderia sp. strain NF100”. Appl Environ Microbiol,. 66,
1737–1740, 2000.
HAYMAN, D.S., JOHNSON, A.M. E RUDDLESDIN, I.,The influence of
phosphate and crop species on endogone spores and vesicular arbuscular mycorrhiza under
field conditions . Plant and soil, 43, 489 – 495, 1975.
HEBBAR, P.K., MARTEL, M.H., e HEULIN, T. Suppression of pre- and
postemergence damping-off in corn by Burkholderia cepacia. Eur J Plant Path 104: 29–36,
1998.
HEINONEN, J.K. & LAHTI, R.J. “A new convenient colorimetric determination of
inorganic orthophosphate and its application to the assay inorganic pyrophosphatase.”
Analyt Biochem, 133, 313-317, 1981.
ISHIKAWA, K.; MIHARA, Y.; GONDOH, K.; SUZUKI, E. A e ASANO, Y. “X-
ray structures of a novel acid phosphatase from Escherichia blattae and its complex with the
translation-state analog molybdate.” The EMBO journal, 19, 2412-2423, 2000.
KATAKURA, K.& KOBAYASHI, A. “Acid Phosphatase Activity of Virulent and
Avirulent Clones of Leishmania donovani Promastigotes.” Infection and Immunity, 56,
2856-2860, 1988.
KIER, L.D.; WEPPELMAN, R. e AMES, B.N. “Resolution and purification of
three periplasmic phosphatases of Salmonella typhimurium.” J. Bacteriol, 130, 399-410,
1977.
KILBANE, J.J., CHATTERJEE, D.K., KARNS, J.S., KELLOGG, S.T., e
CHAKRABARTY, A.M. Biodegradation of 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid by a pure
culture of Pseudomonas cepacia. Appl Env Microbiol 44: 72–78, 1982.
KIM E. E WYCKOFF H. W. Reaction mechanism of alkaline phosphatase based on
crystal structures. Two-metal ion catalysis. J. Mol. Biol. 218: 449–464, 1991.
KLOEPPER J.W. Plant growth promoting bacteria (other systems). CRC press,
137-154, 1994.
KLOEPPER J.W., LIFSHITZ K. E ZABLOTOWICZ, R.M. Free living bacterial
inocula for enhancing crop productivity. Trends Biotchnol, 7, 39-43, 1989.
KLOEPPER, J.W., LIFSHITZ, K e SCHROTH M.N. Pseudomonas inoculants to
benefit plant production . ISI Atlas Sci Anim Plant Sci, 60-40, 1988.
KLUG, M. & TIEDJE, J. “Response of microbial communities to changing
environmental conditions: chemical and physiological approaches”.371-78 in R. Guerrero,
R. and C. Pedros-Alio, C. (eds.) Trends in Microbial Ecology, Barcelona: Spanish Society
for Microbiology, 1994.
KONDO E, KURATA T, NAIGOWIT P E KANAI K. Evolution of cell-surface
acid phosphatase of Burkholderia pseudomallei. Southeast Asian J Trop Med Public
Health, 27, 592-599, 1996.
KRUMME, M.L., TIMMIS, K.N., e DWYER, D.F. Degradation of
trichloroethylene by Pseudomonas cepacia G4 and the constitutive mutant strain G4, 5223
PR1 in aquifer microcosms. Appl Env Microbiol 59: 2746–2749, 1993.
KUNDIG, W. & ROSEMAN, S. “Characterization Of Constitutive Membrane-
Bound Enzymes Ii Of The Escherichia coli Phosphotransferase System.” The Journal of
Biological Chemistry, 246, 1407-1418, 1971
LESSIE, T.G., HENDRICKSON, W., MANNING, B.D., e DEVEREUX, R.
Genomic complexity and plasticity of Burkholderia cepacia. FEMS Microbiol Lett 144:
117–128, 1996.
LUGTENBERG, B., J. MEIERS, R. PETERS, P. VAH DER HOEK, e L. VAN
ALPHEN. Electrophoretic resolution of the "major outer protein" of Escherichia coli K12
into four bands. FEBS Lett. 58:254-258. 1975.
MACASKIE L. E. An immobilized cell bioprocess for the removal of heavy metals
from aqueous flows. J. Chem. Technol. Biotechnol. 49: 357–379, 1990.
MACASKIE L. E., EMPSON R. M., CHEETHAM A. K., GREY C. P. E
SKARNULIS A. J. Uranium bioaccumulation by a Citrobacter sp. as a result of
enzymatically mediated growth of polycrystalline HUO2PO4. Science 257: 782–784, 1992.
MAGALHAES CRUZ, L., DE SOUZA, E.M., WEBER, O.B., BALDANI, J.I.,
DOBEREINER, J., e PEDROSA FDE, O. 16S ribosomal DNA characterization of
nitrogen-fixing bacteria isolated from banana (Musa spp.) and pineapple (Ananas comosus
(L.) Merril). Appl Environ Microbiol 67: 2375– 2379, 2001.
MAKINO K., AMEMURA M., KIM S.-K., NAKATA A. E SHINAGAWA H.
Mechanism of transcriptional activation of the phosphate regulon in Escherichia coli. In:
Phosphate in Microorganisms. Cellular and Molecular Biology, pp. 5–12, Torriani- Gorini
A. M., Yagil E. and Silver S., ASM Press, Washington DC, 1994.
MALKE, H. “Cytoplasmic Membrane Lipoprotein os Streptococcus equisimilis
Functions as na Acid Phosphatase.” Applied and enviromental Microbiolgy, 2439 – 2442,
1998.
MCLOUGHLIN, T.J., QUINN, J.P., BETTERMANN, A., E BOOKLAND, R.
Pseudomonas cepacia suppression of sunflower wilt fungus and role of antifungal
compounds in controlling the disease. Appl Env Microbiol 58: 1760–1763, 1992.
MIHARA, Y.; UTAGAWA, T.; YAMADA, H. e ASANO Y. “Acid
Phosphotransferases from Enteric Bacteria.” Journal of Bioscience and Bioengineering, vol
92, 50-54, 2001.
MULLAN, A.; QUINN, J.P. e MCGRATH, J.W. “Enhanced phosphate uptake and
polyphosphate accumulation in Burkholderia cepacia grown under low pH conditions.”
Microb. Ecol, 44, 69-77, 2002
OSTANIN K., HARMS E. H., STEVIS P. E., KUCIEL R., ZHOU M.-M. E VAN
ETTEN R. L. Overexpression, site-directed mutagenesis and mechanism of Escherichia
coli acid phosphatase. J. Biol. Chem. 267: 22830–22836, 1992.
PALLERONI, N. J. e B. HOLMES. Pseudomonas cepacia sp. nov., Int. J. Syst.
Bacteriol. 31, 479-481, 1981.
PARKE, J.L., E GURIAN-SHERMAN, D. Diversity of the Burkholderia cepacia
complex and implications for risk assessment of biological control strains. Annu Rev
Phytopathol 39: 225–258, 2001.
PARKE, J.L., RAND, R.E., JOY, A.E., E KING, E.B. Biological control of Pythium
damping-off and Aphanomyces root rot of peas by application of Pseudomonas cepacia or
P. fluorescens to seed. Plant Dis 75: 987–992, 1991.
PAUL, E.A. e CLARK, F.E. “Soil microbiology and biochemistry”. Academic
Press, 273, 1989.
PEREIRA, R. M.; SILVEIRA, E. L. da; SCAQUITTO, D. C.; PEDRINHO, E. A.
N.; VAL-MORAES, S. P.; WICKERT, E.; CARARETO-ALVES, L. M.; LEMOS, E. G.
M.. Molecular characterization of bacterial populations of different soils. Brazilian Journal
of Microbiology, 37, 439-447, 2006.
POMPEI R., CORNAGLIA G., INGIANNI A. E SATTA G. Use of a novel
phosphatase test for simplified identification of the tribe Proteeae. J. Clin. Microbiol. 28:
1214–1218, 1990.
RODLEY, P.D., ROMLING, U., e TUMMLER, B.A. Physical genome map of the
Burkholderia cepacia type strain. Mol Microbiol 17: 57–67, 1995.
ROSSOLINI G. M., SCHIPPAB S., RICCIOA M. L., BERLUTTIB F.,
MACASKIEC L. E. e THALLERD M. C. Bacterial nonspecific acid phosphohydrolases:
physiology, evolution and use as tools in microbial biotechnology CMLS, Cell. Mol. Life
Sci. 54 833–850, 1998.
SALEH, M.T. e BELISLE, J.T. “Secretion of an Acid Phosphatase (SapM) by
Mycobacterium tuberculosis That Is Similar to Eukaryotic Acid Phosphatases.” Journal Of
Bacteriology, 6850–6853, 2000.
SCHNAITMAN, C. A.. Solubilization of the cytoplasmic membrane of Escherichia
coli by Triton X-100. J. Bacteriol, 545–552, 1971.
SEVERINI, G. Una bacteriosi dell’Ixia maculata e del Gladiolus Colvilli. Ann. Bot.
(Rome) 11, 413424, 1913.
SHIBATA K., TOTSUKA M. E WATANABE T. Phosphatase activity as a
criterion for differentiation of oral mycoplasmas. J. Clin. Microbiol. 23: 970–972, 1986.
SILVEIRA, E. L. da; PEREIRA, R. M.; SCAQUITTO, D. C.; PEDRINHO, E. A.
N.; VAL-MORAES, S. P.; WICKERT, E.; CARARETO-ALVES, L. M..; LEMOS, E. G.
M.. Bacterial diversity of soil under eucalyptus assessed by 16S rDNA sequencing analysis.
Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, 41, 1507-1516, 2006
SMITH, E.F. Bacteria in Relation to Plant Diseases.Washington: Carnegie Institute
Publications, pp.1–368, 1911.
SONG, O. I; LEEI S.; LEEI Y.; LEEI S.; KIMII K.; CHOII Y. Solubilization of
insoluble inorganic phosphate by Burkholderia cepacia DA23 isolated from cultivated soil.
Brazilian Journal of Microbiology, 39, 2008.
STOCK, J.B.; SURETTE, M.G.; LEVIT, M. e PARK,“ Two component signal
transduction systems: structure funcion relationships and mechanisms of catalysis in two
component signal transduction.” ASM press, 25-51, 1995
SUSLOV, T.V. Role of root colonizing bacteria in plant growth. Academic press,
187-223, 1982.
THALLER M. C., BERLUTTI F., RICCIO M. L. E ROSSOLINI G. M. A species-
specific DNA probe for Pro6idencia stuartii identification. Mol. Cell. Probes 6: 417–422,
1992.
THALLER, M.C.; BERLUTTI, F.; SCHIPPA, S.; IORI, P.; PASSARIELLO, C. e
ROSSOLINI, G.M. “Heterogeneous patterns of acid phosphatases containing low-
molecular-mass polypeptides in members of the family Enterobacteriaceae.” Int. J. Syst.
Bacter iol, 45, 255-261, 1995.
TOUATI E., DASSA E., DASSA J. E BOQUET P. L. Acid phosphatase (pH 2.5) of
Escherichia coli: regulatory characteristics. In: Phosphate Metabolism and Cellular
Regulation in Microorganisms, pp. 31–40, Torriani-Gorini A. M., Rothman F. G., Silver S.,
Wright A. and Yagil E., ASM Press, Washington DC, 1987.
TOUATI, E. e DANCHIN, A. “The structure of promoter and amino terminal
region of the pH 2,5 acid phosphatase gene of E. coli: a negative control of transcription
mediated by cyclic AMP.” Biochimie, 69, 215- 221, 1987.
TRAN VAN, V.; BERGE, O.; NOGO, K.S.; BALANDREAU, J. e HEULIN, T. “
Repeated beneficial effects of rice inoculation with a strain of Burkholderia vietnamiensis
on early and late yield components in low fertility sulphate acid soils of Vietnam.” Plant
soil, 218, 273- 284 , 2000
TYLER, S.D., ROZEE, K.R., E JOHNSON, W.M. Identification of IS1356, a new
insertion sequence, and its association with IS402 in epidemic strains of Burkholderia
cepacia infecting cystic fibrosis patients. J Clin Microbiol 34: 1610–1616, 1996.
UCHIYA, K., TOHSUJI, M., NIKAI, T., YOSHI SUGIHARA H. e SASAKAWA,
C. “Identification and Characterization of phoN-Sf, a Gene on the Large Plasmid of
Shigella flexneri 2a Encoding a Nonspecific Phosphatase.” Journal of Bacteriology, 4548–
4554, 1996.
UERKVITZ W. “Periplasmic non specific acid phosphatase II from Salmonella
typhimurium LT2.” J. Biol. Chem, 263, 15823–15830, 1988.
VASSILEV, N.; VASSILEVA, M. “Biotechnological solubilization of rock
phosphate on media containing agro-industrial wastes”. Appl. Microbiol. Biotechnol., 61,
435-440, 2003
VIALLARD, V., POIRIER, I., COURNOYER, B., HAURAT, J., WIEBKIN, S.,
OPHEL-KELLER, K., e BALANDREAU, J. Burkholderia graminis sp. nov., a
rhizospheric Burkholderia species, and reassesment of [Pseudomonas] phenazinium,
[Pseudomonas] pyrrocinia and [Pseudomonas] glathei as Burkholderia. Int J Syst
Bacteriol, 48, 549–563, 1998.
WANNER, B.L. “ Phosphorous assimilation and control of phosphate regulon in
E.coli and Salmonella.” Cellular an molecular Biology , 2° ed,1367- 1381, 1996.
WHEELIS, M. First shots fired in biological warfare. Nature 395: 213, 1998.
WIGLEY, P., E BURTON, N.F. Multiple chromosomes in Burkholderia cepacia
and B. gladioli and their distribution in clinical and environmental strains of B. cepacia. J
Appl Microbiol 88: 914–918, 2000.
YABUUCHI, E., KOSAKO, Y., YANO, I., HOTTA, H., E NISHIUCHI, Y.
Transfer of two Burkholderia and an Alcaligenes species to Ralstonia gen nov. proposal of
Ralstonia pickettii (Ralston, Palleroni and Doudoroff 1973) comb. nov., Ralstonia
solanacearum (Smith 1896) comb. nov. and Ralstonia eutropha (Davis 1969) comb. nov.
Microbiol Immunol 39: 897–904, 1995.
ZHANG, H.; HANADA, S.; SHIGEMATSU, T.; SHIBUYA, K.; KAMAGATA,
Y.; KANAGAWA, T. e KURANE, R. “Burkholderia kururiensis sp. nov., a
trichloroethylene (TCE) - degrading bacterium isolated from an aquifer polluted with
TCE.” Int J Syst Evol Microbiol, 50, 743–749, 2000.
ZOLG, W. E; OTTOW, J.C.G. “Pseudomonas glathei sp. nov., a new nitrogen
scavenging rod isolated from acid lateritic relicts in Germany”. Z Allg Mikrobiol, 15, 287–
299, 1975.
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