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Universidade Federal do Rio de Janeiro
Instituto de Ciências Biomédicas
Depto. de Histologia e Embriologia
Laboratório de Proliferação e Diferenciação Celular
Estabelecimento de modelo
epidérmico humano in vitro para sua
utilização em ensaios toxicológicos
para substâncias irritantes.
Maria Carolina Braga de Azeredo
Trabalho apresentado ao
Programa de Pós-Graduação em
Ciências Morfológicas da
Universidade Federal do Rio de
Janeiro como pré-requisito para
obtenção do grau de Mestre.
Orientador: Prof. Radovan Borojevic
Co-orientadora: Profª. Renata Brum Martucci
Julho/2008
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Livros Grátis
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Universidade Federal do Rio de Janeiro
Instituto de Ciências Biomédicas
Depto. de Histologia e Embriologia
Laboratório de Proliferação e Diferenciação Celular
Estabelecimento de modelo
epidérmico humano in vitro
para sua utilização em ensaios
toxicológicos para substâncias
irritantes.
Maria Carolina Braga de Azeredo
Orientador: Prof. Radovan Borojevic
Co-orientadora: Profª. Renata Brum Martucci
Julho/2008
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Examinadores
Dra. Cláudia dos Santos Mermelstein
Depto. de Histologia e Embriologia, UFRJ
Dra. Valéria de Mello Coelho
Depto. de Histologia e Embriologia, UFRJ
Dr. Paulo Antonio de Souza Mourão
Instituto de Bioquímica Médica, IBCCF-UFRJ
Dra. Neide Kalil Gaspar
Depto. de Dermatologia, UFF; Suplente Externa
Dra. Márcia Cury El-Cheikh
Depto. de Histologia e Embriologia, UFRJ; Revisora e Suplente
Dr. Radovan Borojevic
Depto. de Histologia e Embriologia, UFRJ; Orientador
À minha amada família,
Aurimar, Eliane,
Nathalia e vovó Maria,
por todo carinho e incentivo
Agradecimentos
Obrigada Deus por me dar sempre força e coragem para seguir em
frente e dar continuidade a nossa maior missão que é ser FELIZ!
Ao prof. Radovan, líder do nosso grupo, obrigada pela oportunidade e
pela confiança. Aprendi muito durante esses anos de convivência, no que se
refere à postura num laboratório de pesquisa. Muito Obrigada!
Obrigada a profª. Márcia Cury, por ter me recebido com todo carinho
em seu laboratório e por, em todo esse tempo juntas, ter me ensinado muito
mais do que uma postura ética e profissional em laboratório, mas também
uma nova forma de encarar as adversidades da vida. Pra sempre em meu
coração... Muito Obrigada!
Obrigada a minha co-orientadora e amiga Renata Brum por todo
carinho e cumplicidade em tantos momentos dessa jornada... Valeu Rê!!!
Aos grandes amigos que essa louca e maravilhosa experiência me
trouxe: Natália, Laure, Lígia, Virgínia (muuuuita saudade! Te amo amiga!),
Sicília, Felipe, Léo, Camila, Sara, Osama, Anderson, Gustavo (Paulista).
Muito obrigada pela força, incentivo e muitas risadas (muitas meeesmo!!!)...
rsrsrs
À minha super fofolete Paula Padilha, que foi um verdadeiro anjinho
que Papai do Céu colocou em minha vida, uma grande amiga e companheira,
sempre disposta a me ajudar e encarar os perrengues que foram se
apresentando (bem poucos... rsrsrs). Sinto muito orgulho e felicidade por ter
convivido com você!
À equipe do LPDC que trabalha nos bastidores: Edna, Gorete, Sílvio,
Roberto e Gustavo. Muito Obrigada por todo o apoio e carinho!
Ao Laboratório da profª Cristina Takya pelo suporte e grande
colaboração nas trabalhosas análises histológicas.
Aos meus amados pais e avó, por estarem sempre ao meu lado,
apoiando cada uma das minhas decisões, dispostos a “segurar a barra” que
fosse pela minha realização. Obrigada pela vida, por cada uma das broncas,
por cada incentivo, por acreditarem em mim mais do que eu mesma... por
nunca me deixarem desistir... NUNCA!!! Amo vocês com todo o coração!
Agradeço a minha irmã, Nathalia, luz dos meus olhos e o maior
presente que Deus me deu... Princesa, sem dúvidas esse amor me deu uma
força sobrenatural pra fazer sempre o certo e ser a melhor pessoa, o melhor
exemplo para você! Te amo minha linda!
Obrigada vô Braga por ter ajudado a me ensinar a ser uma mulher
forte e corajosa e por continuar a fazer o que sempre fez, guiar meu
caminho... A admiração que eu sinto por esse grande homem vai além do
tempo e do espaço e ele estará sempre no meu coração e em todas as
atitudes boas da minha vida! Pra sempre te amarei!
Obrigada a todos os meus familiares tão amados e grandes exemplos
na minha vida: Tio Rogério, Dinda Leda, Dindo Zemar, Gustavo, Marcela,
Leticinha (linda!!!), Tia Fátima e todos os demais que não caberiam aqui!
Obrigada mais uma vez a minha grande amiga Natália, por ter virado
uma verdadeira marida (hehe) no momento que eu mais precisei... rsrsrs
Companheira de aventuras pelo Nordeste a fora!!! E quantas hein, Nat? Por
falar em Nordeste... Obrigada à vida, ao destino, ou sei lá o que, pelas
grandes mudanças que possibilitaram o grande encontro que essa viagem
me trouxe... trazendo novos ares para minha vida e a esperança de que amar
sem medo pode ser um risco que vale muito a pena! rsrs
Obrigada a todas as outras pessoas amigas que fazem parte da minha
vida! Fica impossível colocar o nome de todas aqui. Obrigada pela torcida, de
pertinho ou de longe! A energia positiva é sempre bem vinda!
“
Com o tempo, todos os finais tristes se tornam alegres. O
final triste é só para o autor parar de contar a história. Mas
ela continua. Só não é contada.”
Luiz Fernando Veríssim
o
AZEREDO, MARIA CAROLINA B. DE
Estabelecimento de modelo epidérmico humano in vitro para sua
utilização em ensaios toxicológicos/ Maria Carolina B. de Azeredo
Rio de Janeiro: UFRJ/PCM, 2008.
VIII, 79, f.: il.
Orientador: prof. Radovan Borojevic
Co-orientadora: profª. Renata Brum Martucci
Dissertação de Mestrado – UFRJ/PCM, 2008-07-03
Referências Bibliográficas: f. 69-79
1. Epiderme in vitro 2. Queratinócitos 3. Ensaios Toxicológicos I.
Borojevic, Radovan II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Programa
de Pós-graduação em Ciências Morfológicas III. Estabelecimento de modelo
epidérmico humano in vitro para sua utilização em ensaios toxicológicos.
i
Sumário
Resumo...................................................................................................... iii
Abstract...................................................................................................... iv
Lista de abreviaturas................................................................................ v
I) Introdução.............................................................................................. 1
1) Pele...................................................................................... 1
1.1) Epiderme 2
2) Cultivo de queratinócitos in vitro 7
3) Substitutos de pele humana in vitro 11
4) Testes toxicológicos em modelos epidérmicos in vitro 12
II) Objetivos................................................................................................ 21
III) Metodologia.......................................................................................... 22
1) Obtenção e cultura dos queratinócitos humanos 22
2) Estabelecimento do modelo epidérmico............................................. 24
3) Análises Histológicas 27
4) Ensaios de Viabilidade Celular................... 28
5) Dosagens de mediadores pró-inflamatórios........ 29
6) RT-PCR semiquantitativo 30
7) Análises Estatísticas 32
IV) Resultados........................................................................................... 33
1) Estabelecimento das melhores condições de cultura 33
2) Ensaios de Viabilidade Celular 37
3) Dosagens de mediadores pró-inflamatórios 41
3.1) TGF-β1 41
3.2) IL-1α 43
ii
3.3) IL-6 45
3.4) IL-8 46
3.5) TNF-α 48
4) Análise da expressão gênica de mediadores pró-inflamatórios 50
4.1) TGF-β1 50
4.2) IL-1α 52
4.3) IL-6 54
4.4) IL-8 55
V) Discussão
56
VI) Conclusão........................................................................................ 66
VII) Perspectivas................................................................ 68
VIII) Referências Bibliográficas
69
iii
Resumo
Os modelos epidérmicos humanos in vitro têm sido bastante
incentivados como potenciais sucessores dos métodos clássicos. Esses
modelos tridimensionais in vitro podem ser obtidos através da cultura de
queratinócitos humanos em substratos diversos, como derme acelularizada,
matrizes de colágeno ou filtros inertes. Quando cultivados sob interface ar-
líquido tendem a exibir uma epiderme bem estratificada, com características
morfológicas normais, mimetizando de forma eficiente a pele in vivo. As
melhores condições de cultivo de nosso modelo já foram estabelecidas e
avaliadas através de ensaios de viabilidade celular e análises histológicas.
Foram realizados testes toxicológicos com duas substâncias de características
conhecidas, o Sulfato Dodecil de Sódio (SDS) e o Tween 20, e as respostas
obtidas em nosso modelo epidérmico foram bastante satisfatórias quanto aos
ensaios de viabilidade celular, dosagens pelo método de ELISA (IL-1α, IL-8, IL-
6, TGF-β1 e TNF-α) e análises por RT-PCR semi-quantitativo de mediadores
pro-inflamatórios (IL-1α, IL-8, IL-6 e TGF-β1), evidenciando sua capacidade
para responder discriminantemente a substâncias irritantes e não-irritantes,
apresentando-se, portanto, como um modelo potencialmente funcional para
testes toxicológicos in vitro.
iv
Abstract
In vitro human epidermal models have been taken into account as
potential successors of traditional methods. These three-dimensional in vitro
models can be obtained by culturing human keratinocytes on various
substrates, such as acellularized dermis, collagen matrices or inert filters.
When grown at an air-liquid interface, these cells proliferate and establish a
well-stratified epidermis with normal morphology, mimicking in vivo skin
efficiently. The best culture conditions of our model have already been
established and evaluated through histological analyses and cell viability
assays. Toxicological assays were performed with two substances whose
features were previously listed in the literature, the Sodium Dodecyl Sulfate
(SDS) and Tween-20. The responses obtained in our epidermal model were
very satisfactory concerning cell viability, measurement of pro-inflammatory
mediators (IL-1 α, IL-8, IL-6, TGF-β1 and TNF-α) by ELISA method and semi-
quantitative RT-PCR analysis (IL-1α, IL-8, IL-6 and TGF-β1) results. Hence, our
epidermal in vitro model has demonstrated itself capable of discriminating
irritating and non irritating substances, indicating to be a promising functional
model for in vitro toxicology tests.
v
_______ Lista de Abreviaturas
DMEM – Dulbeccos’s Modified Eagle Medium
DNCB – 2,4 - Dinitrofluorobenzeno
ECVAM – Centro Europeu para Validações de métodos Alternativos
EDTA - Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético
EEC - Comunidade Econômica Européia
EGF – Fator de Crescimento Epidérmico
GM-CSF - Fator Estimulador de Colônias Granulociticas-Macrofágicas
HBSS.CMF – Solução Salina livre de cálcio e magnésio
HE – Hematoxilina e Eosina
IC
50
– Inibição Celular em 50%
IL - Interleucina
KM – Meio para Queratinócitos
K-SFM - Meio para Queratinócitos quimicamente definido e Livre de Soro
MLV – Enzima Transcriptase Reversa
MTT – Dimetil Tiazol Difenil Brometo de Tetrazólio
OECD – Organização Européia de Desenvolvimento e Cooperação Econômica
PB – Pares de Bases
vi
PBS – Solução Salina Fosfatada
PLA2 – Fosfolipase A
2
RNA-m – Àcido Ribonuclêico Mensageiro
SDS – Sulfato Dodecil de Sódio
SFB – Soro Fetal Bovino
TBE – Tampão Bórico-EDTA
TGF - Fator de Crescimento Transformante
TNF-α – Fator de Necrose Tumoral Alfa
TNBS – Ácido Trinitrobenzeno-sulfônico
I. INTRODUÇÃO
1. Pele
A pele é o maior órgão do corpo humano, revestindo todo ele interna e
externamente. Desempenha muitas funções essenciais à manutenção da vida,
incluindo proteção contra danos físicos, químicos e biológicos; regulação da
temperatura corpórea, através do suor; recepção de sensações contínuas do
meio ambiente, como, dor, calor e tato; excreção de substâncias através das
glândulas sudoríparas; além de proteção e absorção da radiação ultravioleta do
sol, necessária à síntese da vitamina D (GARTNER AND HIATT,
1999).
Figura 1.1: Representação esquemática da pele humana. (Fonte: Adaptado de
GARTNER AND HIATT, 1999)
1
É constituída por duas camadas, uma mais externa, a epiderme, e uma
camada mais profunda de tecido conjuntivo, a derme. A epiderme é constituída
por um epitélio estratificado pavimentoso queratinizado derivado do ectoderma
e composta pelos queratinócitos (cerca de 90%), melanócitos, células de
Langerhans e células de Merkel (JUNQUEIRA E CARNEIRO, 2004).
A derme está situada logo abaixo da epiderme e é responsável, por
exemplo, por sua nutrição e oxigenação. É derivada do mesoderma e
constituída de tecido conjuntivo denso não modelado, sendo os fibroblastos o
principal tipo celular encontrado. Além dos vasos sanguíneos e linfáticos, e dos
nervos, também são encontradas na derme as seguintes estruturas derivadas
da epiderme: folículos pilosos, glândulas sebáceas e glândulas sudoríparas
(JUNQUEIRA E CARNEIRO, 2004).
Na interface epiderme-derme há presença de uma membrana basal
composta basicamente por colágeno IV, colágeno VII e lamininas, produzidos
principalmente pelos fibroblastos dérmicos, e também com contribuição dos
queratinócitos epidérmicos (DANIELS et al., 1997; GHALBZOURI et al., 2004).
1.1. Epiderme
A epiderme é um epitélio com múltiplas camadas, compostas
principalmente por queratinócitos, que possuem esse nome por conta de
sintetizarem importantes proteínas de filamento intermediário, chamadas
queratinas. Estas células mudam a sua aparência de uma camada para a
outra. Aquelas da camada mais interna, associadas à membrana basal
2
subjacente, são chamadas células basais, e são as grandes responsáveis pela
proliferação do tecido (GARTNER AND HIATT, 1999).
Acima das células basais estão várias camadas de grandes células
espinhosas, cujos numerosos desmossomos conferem aspectos de “espinhos”
a essas células. Sobre as células espinhosas se localizam as células
granulares, que possuem esse nome devido ao grande número de grânulos
querato-hialinos presentes em seus citoplasmas. A chegada ao estrato
granuloso marca o limite entre as camadas metabolicamente ativas e as
camadas mais externas, constituídas de células mortas. Essas células são
reduzidas a camadas achatadas, cheias de queratina densamente
empacotadas e constituem as camadas mais externas da epiderme, a camada
córnea (ALBERTS et al., 2002).
A típica organização da epiderme em quatro camadas (basal, espinhosa,
granular e córnea) revela ser o programa de diferenciação dos queratinócitos
altamente coordenado, visando à produção da barreira epidérmica. A diferente
morfologia entre essas camadas resulta de um progressivo processo de
maturação dos queratinócitos ao longo da epiderme (POUMAY AND
COQUETTE, 2007).
3
Figura 1.2: Representação esquemática da organização epidérmica em diferentes
camadas. (Fonte: Alberts et al., 2002).
A membrana basal permite a adesão das células basais via integrinas e,
consequentemente a proliferação dessas células, atuando também na
regulação do processo de diferenciação da epiderme (ROSDY et al., 1993).
A presença de filamentos de queratinas e desmossomos contribui para a
resistência física e a manutenção da integridade epidérmica (PARENTEAU et
al., 1999). As células do estrato basal sintetizam duas das quatro queratinas
encontradas na epiderme, as queratinas 5 e 14 (K5/K14), enquanto as células
4
do estrato espinhoso sintetizam as queratinas 1 e 10 (K1/K10), que formam
feixes mais grossos de filamentos (SHAW, 1996).
A dinâmica do processo de diferenciação terminal da epiderme inicia-se
através de um processo de proliferação multipotencial da população de células
tronco presentes na camada basal e da diferenciação de alguns queratinócitos
a partir dessas células progenitoras. Há então, um desprendimento de alguns
queratinócitos da camada basal da epiderme, que migram para as camadas
superiores, ou seja, para o estrato espinhoso. Esse início do processo de
diferenciação celular está intimamente relacionado com a interação célula-
matriz e com a regulação de proteínas, como, integrinas, fibronectina e
lamininas (SHAW, 1996).
A passagem das células do estrato espinhoso para o estrato granuloso é
marcada pela produção da proteína involucrina que é depositada, juntamente
com outras proteínas, como por exemplo, a loricrina, pela ação de enzimas
transglutaminases, do lado citoplasmático da membrana plasmática celular,
conferindo a essa membrana o reforço de uma camada forte e entrelaçada de
proteínas (envelope córneo) (PONEC, 2002; NETZLAFF et al., 2005). Além
disso, as células do estrato granuloso formam grânulos revestidos por
membrana, chamados de grânulos querato-hialinos, que mais tarde liberam
seu conteúdo rico em lipídeos nos espaços intercelulares, formando uma
barreira impermeável (GARTNER AND HIATT, 1999).
A maquinaria que sintetiza a queratina é paralisada após a entrada dos
queratinócitos no estrato granuloso. As células desta camada produzem
filagrina, uma proteína que parece atuar na construção de feixes mais grossos
5
a partir de filamentos de queratina. À medida que os queratinócitos alcançam
este estrato, enzimas liberadas de lisossomos digerem suas organelas e
núcleo, até finalmente chegarem ao estrato córneo, estando mortos, sem
núcleo ou organelas e cheias de feixes de filamentos de queratina densamente
empacotados, sendo chamadas de “esqueletos” celulares ou corneócitos
(NETZLAFF et al., 2005).
Estima-se que o período total entre a geração de um novo queratinócito
na camada basal até o fim de seu processo de diferenciação terminal,
culminando em sua descamação no estrato córneo, leve de 3 a 4 semanas
(GREEN, 1991).
O queratinócito é a única célula que realiza uma função fundamental à
sobrevivência, mesmo quando já morto, funcionando como uma barreira à
passagem de líquidos e microorganismos (LEIGH et al., 1994). A
impermeabilidade da barreira córnea reside na presença de um envelope
córneo e de múltiplas lamelas lipídicas nos espaços intercelulares dos
corneócitos (PONEC, 2002).
Além dos queratinócitos, encontra-se na epiderme populações menores
de outros tipos celulares. Os melanócitos são células encontradas nas
camadas basais e sua principal função é a produção de melanina, que é um
pigmento marrom que confere proteção à radiação ultravioleta (GARTNER
AND HIATT, 1999; ALBERTS et al., 2002; POUMAY AND COQUETTE, 2007).
Outros tipos celulares encontrados na epiderme são as células de
Langerhans, que estão localizadas principalmente no estrato espinhoso e
atuam na resposta imune, fagocitando e processando antígenos que invadam a
6
epiderme, migrando em direção do lúmen de vasos linfáticos até os nódulos
linfáticos, onde apresentam os epítopos dos antígenos processados para os
linfócitos T, sendo por isso, também chamadas de células apresentadoras de
antígenos (ALBERTS et al., 2002; POUMAY AND COQUETTE, 2007).
Já as células de Merkel, estão espalhadas entre os queratinócitos do
estrato basal e são especialmente encontradas nas pontas dos dedos, atuando
como mecanorreceptoras, estabelecendo sinapses com células nervosas que
atravessam a membrana basal (GARTNER AND HIATT, 1999).
Além das características já descritas, os queratinócitos têm grande
participação na resposta imune da pele. Em correspondência com fibroblastos,
células endoteliais e células imunes, comumente residentes na derme, os
queratinócitos desempenham um importante papel na iniciação, modulação e
regulação do processo inflamatório na epiderme (COQUETTE et al., 1999).
2. Cultivo de queratinócitos in vitro
RHEINWALD AND GREEN (1975) conseguiram estabelecer um
protocolo bastante importante para o cultivo de queratinócitos humanos em
larga escala. Durante o isolamento de uma linhagem de células epiteliais de
uma porção diferenciada de teratoma de rato, encontraram uma célula epitelial
que crescia com um padrão de maturação muito próximo ao da queratinização
epidérmica, quando cultivada com fibroblastos. Esses fibroblastos eram células
da linhagem 3T3, conhecidos como fibroblastos sustentadores para essa
7
linhagem de células epiteliais de rato, chamada linhagem XB, a qual foi
identificada pelos autores como sendo queratinócitos.
Os autores deduziram que as condições que favoreciam o fenótipo
epidérmico à linhagem celular do teratoma, ou seja, o cultivo destas células
associado aos fibroblastos da linhagem 3T3 poderia beneficiar também o
crescimento de queratinócitos epidérmicos normais. Para tanto, os fibroblastos
desta linhagem eram irradiados antes do plaqueamento, para que perdessem
seu potencial proliferativo e apenas sustentassem o crescimento dos
queratinócitos.
Os protocolos de cultivo de células da pele, estabelecidos antes do
trabalho de RHEINWALD AND GREEN (1975), tinham como principal
problemática à dificuldade em expandir essas células in vitro, dificilmente
conseguindo manter o seu potencial proliferativo por muito tempo (revisão feita
por GRAGNANI FILHO, 1999).
No protocolo de cultivo de RHEINWALD AND GREEN (1975), além da
feeder layer de fibroblastos 3T3 irradiados, para ajudar o crescimento das
colônias de queratinócitos, foram adicionados alguns suplementos ao meio de
cultura, como, soro, fator de crescimento epidérmico (EGF), insulina e toxina
colérica. Sob essas condições, o potencial proliferativo dessas células foi
bastante ampliado. Desta forma, a partir de uma biópsia de pele humana de
apenas 1 cm
2
foi possível uma expansão de mais de 5000 vezes em 3 a 4
semanas, gerando epitélio suficiente para recobrir a superfície corpórea total de
um adulto (GREEN, 1991).
8
Quando os queratinócitos começam a crescer e expandir suas colônias,
eles competem com os fibroblastos da feeder layer pelo substrato plástico da
garrafa de cultura. Então, os fibroblastos começam a se desprender do
substrato e os queratinócitos passam a ocupá-lo maciçamente formando uma
camada basal de células bem ancoradas e com alta capacidade proliferativa
(POUMAY AND COQUETTE, 2007).
Alguns queratinócitos além de ancorarem-se ao substrato, começam a
migrar verticalmente, ou seja, sofrem estratificação e induzem a diferenciação.
Já foi mostrado que queratinócitos em culturas submersas podem exibir
marcação para involucrina nas primeiras camadas suprabasais, o que é um
indício de diferenciação in vitro, mas difere da condição in vivo onde só há
marcação para esta proteína nas camadas superiores espinhosas e granulares
(BANKS-SCHLEGEL AND GREEN, 1981).
As primeiras utilizações clínicas da cultura de queratinócitos foram para
cobertura de áreas queimadas, nas quais as áreas doadoras de pele eram
insuficientes para determinar a cobertura total da lesão. Foram relatados dois
casos de crianças queimadas com 95% de área corporal acometida, nos quais
foi utilizado com bastante sucesso, auto-enxerto de pele cultivada em mais da
metade da lesão (GALLICO et al., 1984).
A cultura de queratinócitos em monocamada representou um grande
avanço para a pesquisa básica na biologia desse tipo celular. No entanto, há
várias limitações sob essas condições de cultura, não ocorrendo a formação de
estrato córneo e, portanto, impossibilitando estudos sobre o programa de
9
diferenciação em níveis de camadas granulares e córneas (POUMAY AND
COQUETTE, 2007).
PRUNIÉRAS et al (1983) demonstraram que era possível obter uma
epiderme in vitro totalmente diferenciada, simplesmente por elevar os
queratinócitos para uma interface ar-líquido. Aparentemente, essa interface
com o ar, estimula os queratinócitos a sintetizarem profilagrina e conferirem o
fenótipo granular com o desenvolvimento dos grânulos querato-hialinos. Esses
grânulos nunca são encontrados em condições de cultura submersa e têm um
papel essencial no processo de diferenciação terminal com formação da
barreira córnea.
A eficiência da barreira córnea formada in vitro, usando-se somente a
interface ar-líquido como estímulo, é bastante variável, como já foi evidenciado
por alguns trabalhos anteriores, que mostraram medidas de permeabilidade
maiores que as encontradas in vivo (MAK et al., 1991; CHEN et al., 1995;
PONEC, 2002). Mais recentemente, alguns trabalhos têm demonstrado que a
inclusão de vitamina C (ácido ascórbico) ao meio de cultura é um fator
essencial à proliferação e diferenciação dos queratinócitos em modelos
epidérmicos in vitro, pois ele atua na organização das lamelas lipídicas do
estrato córneo que são essenciais para a formação de uma barreira córnea
impermeável (SEPPÄNEN et al., 2001; KIM, et al., 2002).
10
3. Substitutos de pele humana in vitro
Na década de 80, a única forma de restabelecimento da cobertura
biológica corporal, por exemplo, em queimaduras era a utilização de
queratinócitos cultivados em monocamada, havendo um significante estímulo
de regeneração tecidual, porém, mantendo-se problemas de cicatrização e
contração da região lesionada (COMPTON, 1993).
A engenharia tecidual de substitutos de pele in vitro foi bastante
estimulada para sua utilização no tratamento de queimaduras e de feridas
agudas e crônicas. Vários substitutos de pele foram desenvolvidos (Integra®,
Alloderm®, Dermagraft® e Apligraft®) a partir de muita pesquisa básica na
biologia da pele em reparo tecidual e de experiências clínicas com curativos
biológicos de pele (PARENTEAU, 1999).
Os primeiros substitutos de pele in vitro utilizavam pele cadavérica
humana acelularizada, que funciona como um substrato inerte a implantes em
áreas lesionadas e oferece uma boa regeneração tecidual (CUONO et al.,
1986), tendo como versões comerciais o Alloderm® e o Dermagraft®. Outros
substratos utilizados nesse sentido são as matrizes dérmicas de colágeno e
glicosaminoglicanos, às quais, geralmente são incorporados fibroblastos
dérmicos autólogos, que promovem uma diminuição da cicatriz e melhora no
reparo do tecido (YANNAS et al., 1982). A versão comercial desse modelo é a
Integra®, utilizada amplamente em queimados.
A partir de 1983, com o trabalho de PRUNIÉRAS et al., importantes
avanços na engenharia de substitutos de pele foram evidenciados. Os
11
substitutos passaram a apresentar componentes tanto dérmicos quanto
epidérmicos para a utilização na cobertura de lesões na pele.
BOYCE AND HANSBROUGH (1988) desenvolveram um composto de
pele a partir de um substrato de colágeno-glicosaminoglicanos semeado com
fibroblastos e recoberto com queratinócitos epidérmicos postos na interface ar-
líquido, obtendo muito sucesso no tratamento de queimaduras extensas. Sua
principal versão comercial é o Apligraft® usado extensamente no tratamento de
queimaduras e úlceras venosas de perna (FALANGA et al., 1998).
4. Testes toxicológicos em modelos epidérmicos in vitro
Além da utilização clínica, modelos epidérmicos in vitro podem ser
utilizados em muitos aspectos, como, pesquisa básica e pesquisa aplicada, em
testes de verificação de potencial irritante, farmacologia, metabolismo,
absorção cutânea e fototoxicidade de substâncias (COQUETTE et al., 1999).
Para estudos em pesquisa aplicada, podem ser utilizados para a
construção de modelos epidérmicos in vitro, outros tipos de substratos além da
derme acelularizada (PRUNIÉRAS et al., 1983) ou da matriz de colágeno
(BELL et al., 1991), que são os filtros de insertos de cultura. Esses filtros
provêm um suporte físico para a adesão de células epidérmicas via integrinas,
que podem estratificar e queratinizar sob a interface ar-líquido, mimetizando a
epiderme in vivo (ROSDY AND CLAUSS, 1990).
Com a utilização dos insertos de cultura, as células podem ser expostas
facilmente à interface ar-líquido, uma vez que o meio de cultura fique presente
12
apenas no compartimento externo ao inserto (por fora). O diâmetro dos poros
do filtro pode ser tão pequeno que impeça completamente a migração dos
queratinócitos e uma eventual colonização deles por fora do inserto (POUMAY
AND COQUETTE, 2007).
Novas substâncias químicas ou produtos finais para utilização na pele
humana devem ser previamente testados quanto a seus possíveis potenciais
toxicológicos, irritantes ou corrosivos. O principal método desenvolvido com
esse intuito foi descrito por DRAIZE et al (1944), e utiliza coelhos como
preceptores de substâncias irritantes ou corrosivas à pele humana. Outros
animais, como camundongos, ratos, galinhas e macacos, também eram e são
utilizados intensamente para esses testes toxicológicos (ROBINSON et al.,
2002).
Grandes pressões realizadas pela sociedade civil e organizações não
governamentais de proteção aos animais, principalmente nos países da
Comunidade Européia, Japão e Estados Unidos, desejam restringir o uso de
animais em experimentos de toxicologia. Importantes efeitos nesse sentido já
foram já alcançados, como, por exemplo, temos a legislação européia que já
restringe a comercialização de vários produtos testados em animais (EEC,
1992).
Além disso, há um grande questionamento científico quanto às
respostas obtidas em animais comparadas aos humanos. Modelos animais não
refletem necessariamente a resposta de tecidos humanos, particularmente
tratando-se de moléculas de baixo nível de toxicidade. Um dos exemplos mais
13
marcantes é a talidomida, cujo efeito teratogênico para seres humanos não foi
detectado apesar dos inúmeros testes realizados em animais (ROWAN, 1984).
Todas estas questões éticas e científicas que se apresentam, tornam
urgente o desenvolvimento de métodos alternativos para substituir e
acrescentar dados aos estudos toxicológicos tradicionais. A recomendação do
Parlamento Europeu aos Estados membros da EEC é de prever uma data
limite para a proibição formal do uso de animais nesses estudos (Indans,
2002). Por outro lado, nos Estados Unidos já existe regulamentação permitindo
o uso de testes in vitro para a determinação do potencial de irritação ocular,
corrosividade cutânea, genotoxicidade, absorção e foto-irritação dérmica
(SCHREIBER et al., 2005).
Os primeiros testes toxicológicos alternativos utilizavam as células
epidérmicas de cultivo submerso. Como nesse modelo, não há uma
diferenciação completa da epiderme e, portanto, não há presença de estrato
córneo, o que impossibilita a aplicação tópica da substância e
conseqüentemente, uma comparação mais veemente com a resposta da
epiderme in vivo (ZHAO et al., 1999).
Dentro deste contexto, a possibilidade de se utilizar substitutos de pele
in vitro que possam simular a fisiologia da pele humana, sejam compostos
dermo-epidérmicos (fibroblastos e queratinócitos) ou modelos apenas
epidérmicos (queratinócitos), fortaleceu enormemente o estabelecimento de
métodos alternativos aos ensaios toxicológicos (REGNIER et al., 1990). Esses
modelos tridimensionais possibilitam uma aplicação tópica, ou seja, sobre o
14
estrato córneo, de substâncias a serem testadas, aproximando-se mais das
condições na pele nativa (ZHAO et al., 1999).
Os queratinócitos são as primeiras células de defesa da pele, pois são
os primeiros a ter contato com as substâncias aplicadas a ela e têm a
capacidade de alertar às demais células da pele sobre possíveis danos,
através da produção e liberação de mediadores pró-inflamatórios (GRAHAM et
al., 2004). Portanto, a utilização de modelos epidérmicos in vitro, mesmo que
de uma maneira simplificada, já que não levam em conta as interações
fisiológicas e celulares mais complexas existentes in vivo, podem atender à
predição de substâncias com potencial irritante à pele, através do estudo de
parâmetros de respostas dos queratinócitos mediante substâncias estudadas
(WILMER et al., 1994; COQUETTE et al., 1999).
Há uma importante busca por biomarcadores pró-inflamatórios a serem
utilizados nos testes toxicológicos in vitro, levando-se em consideração a
importante participação dos queratinócitos em processos alergênicos e/ou
inflamatórios. A resposta imunológica mediada por estas células é iniciada pela
liberação de citocinas primárias como IL-1α e TNF-α, que estimulam a síntese
e a liberação de citocinas secundárias multifuncionais, como as interleucinas,
fatores de crescimento e citocinas quimiotácticas, que irão direcionar uma
cascata inflamatória ou servir para reprimir a reação imune mediante um
feedback negativo (BERNHOFER et al., 1999).
Quando a epiderme está diante de uma substância irritante, como por
exemplo, o Sódio Dodecil Sulfato (SDS), pode haver ruptura de membrana
plasmática de alguns queratinócitos. O citoplasma dos queratinócitos de todas
15
as camadas epidérmicas contém constitutivamente a citocina pró-inflamatória
IL-1α, que é a mais importante indutora da cascata de inflamação na pele
(CORSINI et al., 1998). Na epiderme intacta, IL-1α é naturalmente eliminada na
descamação da camada córnea, porém, sua liberação para o meio extracelular
só ocorre mediante injúria à membrana plasmática celular, estimulando a
expressão de mais IL-1α e também de outras citocinas pró-inflamatórias
(DOUCET et al., 1996).
Dentre os principais mediadores secundários que têm sua expressão e
liberação induzidos pela liberação de IL-1α, temos como os mais importantes
as citocinas IL-6 e IL-8. Além disso, também há uma indução a ativação da
fosfolipase A
2
(PLA2) que é uma enzima chave na cascata do ácido aracdônico
que então, desencadeará importantes vias de respostas inflamatórias (WELSS
et al., 2004).
A IL-6 foi inicialmente descoberta em fibroblastos de pele, tendo
importante participação em respostas inflamatórias mediada pela liberação das
citocinas primárias, IL-1α e TNF-α. Mais tarde foi também descrita a
capacidade dos próprios queratinócitos expressarem essa citocina, porém,
modelos in vitro exclusivamente epidérmicos não evidenciaram um aumento
significativo de sua expressão ou liberação sob condições irritantes
(BRONNEBERG ET AL., 2007).
A IL-8 é uma citocina bastante importante na cascata inflamatória, sendo
expressa pelos queratinócitos e pelos fibroblastos como uma resposta
secundária à liberação das citocinas primárias. Apresenta forte efeito
quimiotáctico sobre os neutrófilos e os linfócitos, além de aumentar os níveis
16
extracelulares do íon cálcio e induzir a exocitose de grânulos citoplasmáticos
das células de defesa. Esta citocina é secretada inicialmente pelos fibroblastos,
que controlam e aumentam a expressão pelos queratinócitos (WELSS et al.,
2004).
Outro mediador pró-inflamatório é o TGF-β1, que tem um papel muito
importante no processo de cicatrização e reparo tecidual da pele (PHILIPPL et
al., 2004). Suas principais atuações nesse sentido estão relacionadas à sua
função de estimular a deposição de proteínas de matriz extracelular, como
colágeno e fibronectina, estimular a quimiotaxia de fibroblastos e prevenir a
hiperproliferação dos queratinócitos (NATH et al., 1994).
As primeiras fases do processo de cicatrização são marcadas por
eventos que se assemelham aos observados no processo de irritação cutânea,
incluindo a produção de várias citocinas pró-inflamatórias primárias, IL-1α e
TNF-α, e posteriormente, havendo o aumento da produção de citocinas e
fatores que orientam a proliferação celular, sendo o principal deles o TGF-β1
(FALANGA et al., 1998).
Existem outros mecanismos que desencadeiam respostas inflamatórias
na pele sem que para isso, a substância irritante cause necessariamente danos
à membrana plasmática dos queratinócitos, ou seja, por vias que independem
da liberação extracelular de IL-1α. Nesta situação, temos em queratinócitos a
citocina pro-inflamatória TNF-α, que tem sua expressão e produção
aumentadas após exposição dos mesmos a várias substâncias irritantes, por
uma outra via de sinalização inflamatória (CORSINI et al., 1998).
17
O TNF-α é uma citocina pró-inflamatória que influencia o
desenvolvimento da resposta imunológica por induzir a expressão de
moléculas de adesão cutâneas e endoteliais, sendo principalmente estocada
nos mastócitos da pele. Além disso, quando em situações de irritação cutânea
são expressos também pelos queratinócitos, apresentando-se como um
potencial biomarcador para respostas inflamatórias em modelos epidérmicos in
vitro (NETZLAFF et al., 2005).
A construção de modelos epidérmicos in vitro, utilizando como substrato
os filtros de insertos de cultura, mostra-se bastante promissora para a
realização de testes toxicológicos, por ser esse substrato relativamente inerte e
possibilitar a livre passagem de substâncias através dele, funcionando neste
aspecto de maneira mais eficiente do que os substratos com componentes
dérmicos (derme acelularizada ou colágeno), que podem de alguma maneira
influenciar negativamente na troca de substâncias do meio de cultura com as
células. Além disso, sendo esse substrato de menor custo e maior facilidade de
obtenção que os demais, torna-se atualmente a melhor opção para a obtenção
em larga escala de modelos epidérmicos in vitro, para esse tipo de utilização
dos mesmos (POUMAY et al., 2004).
Documentos produzidos pela Organização Européia de
Desenvolvimento e Cooperação Econômica (OECD, 2002; OECD, 2003)
prevêem que modelos epidérmicos humanos in vitro possam ser utilizados para
testes de corrosividade (classificados como R34 e R35) e irritação cutânea
(classificado como R38) baseando-se na regulamentação de avaliação de
substâncias químicas da Comunidade Européia (EEC, 1992). Uma série de
18
modelos epidérmicos in vitro produzidos em outros países e já comercializados
(EpiDerm
TM
, EpiSkin
®
e SkinEthic
®
), vem passando por processos de pré-
validações pelo Centro Europeu para Validações de Métodos Alternativos
(ECVAM), quanto as suas capacidades de responder discriminantemente entre
substâncias irritantes e não irritantes (BOTHAM, 2004; SCHREIBER et al.,
2005).
Até o momento, testes de pré-validações realizados pelo ECVAM
consistem, principalmente, na avaliação dos modelos epidérmicos in vitro
quanto à viabilidade celular e quanto à liberação de mediadores pró-
inflamatórios, buscando identificar o potencial irritante ou sensibilizante de
substâncias testadas nesses modelos. O principal objetivo desses testes é
buscar parâmetros que possam ser reprodutíveis em larga escala e diferentes
laboratórios sobre a distinção da resposta obtida diante de uma substância
irritante ou sensibilizante e de uma substância não irritante (ROBINSON et al.,
2002).
O ensaio de viabilidade celular é o principal teste de pré-validação
realizado nos modelos epidérmicos in vitro (ROBINSON et al., 2002; BOTHAM,
2004; NETZLAFF et al., 2005). A resposta das substâncias a serem testadas é
classificada como irritante ou não irritante, tendo como base o critério da
concentração da substância testada capaz de inibir em 50% a conversão
normal do MTT (IC
50
) (NAUGHTON et al., 1989). Quando a concentração da
substância testada for capaz de diminuir a viabilidade celular em 50% ou
menos, a mesma é considerada irritante ou tóxica, e quando a concentração de
19
uma substância mantiver o percentual de viabilidade celular maior que o IC
50
, a
mesma é considerada não-irritante ou não-tóxica.
Dentro deste contexto, torna-se bastante importante para a avaliação da
funcionalidade de modelos epidérmicos in vitro quanto ao seu potencial de
resposta a substâncias irritantes, a identificação de mediadores pró-
inflamatórios nestes modelos, que possam funcionar como biomarcadores,
possibilitando a diferenciação de substâncias irritantes de substâncias não
irritantes à pele. O ECVAM já vem realizando testes de pré-validações em
modelos epidérmicos in vitro disponíveis no mercado, utilizando-se da procura
por mediadores pró-inflamatórios que atendam ao perfil de resposta diferencial
para testes toxicológicos, sendo a IL-1α a principal citocina pró-inflamatória
investigada nesses testes, através da dosagem de sua concentração
extracelular (sobrenadantes) pelo método de ELISA (BOTHAM, 2004).
Mais recentemente, uma outra estratégia para a caracterização e
validação destes modelos epidérmicos in vitro vem sendo identificar genes de
mediadores pró-inflamatórios que sejam seletivamente modulados em resposta
a substâncias alergênicas e/ou tóxicas. Essa proposta de estudo busca
explorar a possibilidade de utilizar técnicas de biologia molecular, como o RT-
PCR semiquantitativo para identificar a expressão diferencial de genes, sendo
mais uma opção para testes toxicológicos in vitro (POUMAY AND COQUETTE,
2007).
20
II. OBJETIVOS
1. Objetivos Gerais
Este projeto tem como objetivo principal o estabelecimento de um
modelo epidérmico humano visando a padronização de parâmetros para a
realização de ensaios toxicológicos para identificação de substâncias irritantes
in vitro.
2. Objetivos específicos:
Estabelecer condições de cultura padrão que possibilitem a construção de
um modelo epidérmico humano que funcione como um método alternativo
para a realização de ensaios toxicológicos in vitro;
Avaliar a viabilidade celular no modelo epidérmico, por ensaios de MTT,
quando submetido a substâncias irritantes e não irritantes;
Dosar, pelo método de ELISA, mediadores pró-inflamatórios liberados pelo
modelo epidérmico quando submetido a substâncias irritantes ou não
irritantes;
Realizar a caracterização molecular, por RT-PCR semiquantitativo, do
modelo epidérmico quando submetido a substâncias irritantes ou não
21
irritantes, quanto à expressão gênica de alguns mediadores pró-
inflamatórios.
III. Metodologia
1. Obtenção e cultura dos queratinócitos humanos
Os queratinócitos foram obtidos a partir de fragmentos de pele humana,
oriundos de cirurgias plásticas de doadores voluntários, adultos e normais,
mediante a assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.
Em laboratório, os fragmentos de pele foram lavados 3 vezes em
solução salina livre de cálcio e magnésio (HBSS.CMF), adicionada dos
antibióticos ciprofloxacina (5 µg/mL) e anfotericina (1 µg/mL). O tecido
subcutâneo presente foi retirado com auxílio de pinças e bisturis.
A primeira dissociação do tecido foi realizada mecanicamente, sendo os
fragmentos epidérmicos, separados dos fragmentos dérmicos e cortados em
pedaços de 2 a 3 mm
2
, com auxílio de pinças e bisturis, sendo em seguida,
lavados com HBSS.CMF, adicionada dos antibióticos (Sigma). Os fragmentos
dissociados foram imersos em solução enzimática de tripsina 0,3% (Gibco)
com EDTA 0,02% (Sigma) em HBSS.CMF, e incubados a 4°C de 18 a 24
horas. Após o tempo de incubação, o sobrenadante contendo as camadas
córneas, foi cuidadosamente descartado e os fragmentos lavados novamente
com HBSS.CMF, adicionada dos antibióticos, por 3 vezes (PRUNIÉRAS et al.,
1979).
A segunda dissociação foi realizada adicionando-se solução enzimática
de tripsina 0,125% com EDTA 0,02% em HBSS.CMF a 37°C por 40 minutos
22
aos fragmentos epidérmicos já submetidos ao tratamento descrito acima
(PRUNIÉRAS et al., 1979). Após esse período, os fragmentos foram
vigorosamente homogeneizados com pipeta Pasteur, e a suspensão obtida foi
recolhida e transferida para tubo plástico de 50 mL (Falcon), contendo
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM – Sigma) suplementado com 10%
de Soro Fetal Bovino (SFB – Laborclin), ciprofloxacina (5 µg/mL), anfotericina
(1 µg/mL), penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (0,1 mg/mL). A suspensão
celular foi então centrifugada por 15 minutos à 2000g, e as células presentes
no fundo do tubo Falcon foram lavadas 3 vezes com HBSS.CMF e
quantificadas em câmara de Neubauer.
De acordo com o protocolo estabelecido por RHEINWALD AND GREEN
(1975), as culturas primárias foram obtidas a partir do plaqueamento das
células epidérmicas em uma densidade de 2 x 10
4
céls/cm
2
, em garrafas de 75
cm
2
(Corning), sendo co-cultivadas com uma camada alimentadora (feeder
layer) de fibroblastos murinos da linhagem 3T3, irradiadas previamente em
radiação gama (6000γ - Co
60
) por 60 segundos.
O meio de cultura utilizado foi uma mistura 3:1 de DMEM e Ham’s F12
(meio KM) (ambos Sigma), suplementado com 20% de SFB (Laborclin), 20
µg/mL de L-glutamina (Gibco), 20 µg/mL de transferrina (Sigma), 1,3 µg/mL de
tri-iodotironina (Sigma), 0,4 µg/mL de hidrocortisona (Sigma), 5 µg/mL de
insulina (Sigma), 10 ng/mL de fator de crescimento epidérmico (EGF – Sigma),
8,7 µg/mL de toxina colérica (Sigma), 5 µg/mL de ciprofloxacina, 1 µg/mL de
anfotericina, 100 U/mL de penicilina e 0,1 mg/mL de estreptomicina (adaptado
do protocolo de PRUNIÉRAS et al., 1979).
23
As culturas foram incubadas em estufa úmida a 37°C/5% de CO
2
, sendo
a troca de meio realizada de 2 a 3 vezes por semana. Antes da cultura atingir
totalmente a confluência, as células foram tripsinizadas e plaqueadas em outra
garrafa de 75 cm
2
(Corning), sobre uma nova feeder layer de 3T3 (cultura de
segunda passagem).
2. Estabelecimento do modelo epidérmico
Para a construção de nosso modelo epidérmico in vitro, utilizamos
insertos com membrana de policarbonato (0,63 cm de diâmetro) e com 0,4 µm
de diâmetro de poro (Millipore), os quais foram colocados em placas de 24
poços (Nunc). As células foram cultivadas dentro dos insertos, ou seja, sobre a
membrana de policarbonato, e o meio de cultura foi adicionado dentro e fora
dos insertos ou somente por fora dos mesmos (interface ar-líquido).
Foram utilizados queratinócitos de segunda passagem, e plaqueou-se
de 0,5-1,0 x 10
6
céls/inserto. As células foram cultivadas imersas em 300 µL de
meio de cultura por 7 dias. Após esse período, retirou-se o meio de cultura de
dentro do inserto, de tal forma que as células mantivessem contato com o meio
apenas pelo lado externo do inserto (600 µL), condição esta que se nomeia
como interface ar-líquido, mimetizando as condições da epiderme in vivo
(PRUNIÉRAS et al., 1983) (Esquema 1).
As epidermes in vitro foram mantidas na interface ar-líquido por 14 dias,
e durante todo o período de cultura, foram feitas trocas de meio a cada 48
horas.
24
Queratinócitos
Querat.inócitos
Imersos
7 dias
Interface
ar-líquido
14 dias
Esquema 1. Diagrama dos experimentos realizados com queratinócitos, cultivados sobre uma membrana
de policarbonato. Demonstração da condição de interface ar-líquido.
Visando estabelecer as melhores condições de cultura para os
queratinócitos, foram testados em nosso modelo epidérmico in vitro dois meios
de cultura distintos: o meio KM, suplementado com 1% de SFB, e o meio para
queratinócitos quimicamente definido e livre de soro (K-SFM, Gibco). Além
disso, outra condição de cultura testada foi a adição ou não de gelatina de
porco tipo A (Sigma), que é uma rica mistura de componentes de matriz
extracelular, como colágeno e laminina, sobre a membrana de policarbonato
dos insertos antes do plaqueamento das células (Esquema 2).
25
Amostras de pele de
voluntários adultos
(cirurgia plástica)
Queratinócitos
humanos
Dissociações
Densidade de
0,5-1,0 x 10
6
céls/inserto
Insertos de
policarbonato
KM sem gelatina
de porco
K
-SFM sem
gelatina de
porco
KM com
gelatina de
porco
K
-SFM com
gelatina de
porco
Esquema 2. Diagrama dos experimentos realizados com os modelos epidérmicos sob diferentes
condições de cultura.
No caso da utilização do meio de cultura KM, além da suplementação
com 1% de SFB, foram acrescentados todos os demais suplementos, já
anteriormente descritos para o mesmo meio em culturas primárias, com
exceção da toxina colérica. Quanto ao meio K-SFM, houve suplementação com
25 µg/mL de extrato de pituitária bovina (Gibco) e 10 ng/mL de EGF (Sigma).
Quando os insertos foram postos na interface ar-líquido, acrescentou-se 50
µg/mL de ácido ascórbico (Sigma) em ambos os meios de cultura testados.
26
3. Análises histológicas
Após 14 dias de cultivo do modelo epidérmico na interface ar-líquido,
sob diferentes condições de cultura, alguns insertos foram retirados para
avaliação histológica. Para tal, os insertos foram lavados 3 vezes com solução
salina fosfatada (PBS), sendo em seguida, fixados em formaldeído (Vetec) 10%
em tampão Sorensen 0,1 M, pH 7,4, durante 12 horas a 4°C. Após a primeira
fixação, adicionou-se 200 µL de agarose 3% sobre as epidermes, visando uma
melhor conservação do estrato córneo durante o processamento histológico e,
então, o material foi novamente fixado em formaldeído 10% tamponado por 12
horas a 4°C (STARK et al., 1999).
Uma vez fixado o material, as membranas com a epiderme foram
retiradas dos insertos, com auxílio de lâmina de bisturi e pinça, e coradas por 3
minutos com eosina, a fim de torná-las mais facilmente identificáveis durante o
processamento.
Os materiais foram submetidos a processos de desidratação em banhos
crescentes de etanol (15 minutos em cada solução), clarificação em banhos
crescentes de xilol (15 minutos em cada solução), seguidos de banhos em
parafina a 60°C (20 minutos em cada solução) e posterior inclusão em blocos
de parafina. Foram feitos cortes de 5 µm de espessura, que foram corados com
hematoxilina e eosina (HE), conforme protocolo já descrito na literatura (Shaw,
1996), e foram observados por microscopia óptica.
27
4. Ensaios de Viabilidade Celular
A viabilidade celular nos modelos epidérmicos in vitro foi avaliada para
cada uma das diferentes condições de cultura, as quais os mesmos foram
submetidos. Além disso, esse mesmo ensaio foi realizado para avaliação da
resposta citotóxica do modelo epidérmico a substâncias de características já
conhecidas na literatura, o SDS e o Tween 20 (Sigma), em diferentes
concentrações (COQUETTE et al., 1999).
Para a avaliação da resposta citotóxica do modelo, as substâncias a
serem testadas foram diluídas em DMEM sem soro em diferentes
concentrações, SDS (0,1 mg/mL, 1 mg/mL e 2 mg/mL) e Tween 20 (0,01%,
0,1% e 1%), sendo aplicados 100 µL da solução teste sobre o modelo
epidérmico (aplicação tópica) depois de 14 dias na interface ar-líquido. Os
insertos foram então incubados em estufa úmida a 37°C/5% de CO
2
por 24
horas.
Os insertos foram lavados 3 vezes com PBS e então, adicionou-se 500
µL de solução de MTT (Sigma) diluída em DMEM sem soro, em uma
concentração de 0,5 mg/mL. A solução de MTT foi incubada por 30 minutos em
estufa seca a 37°C/5% de CO
2
, sob constante agitação (agitador orbital).
Depois da incubação, a solução de MTT foi retirada e as células foram lavadas
2 vezes com PBS. Adicionou-se 1 mL de isopropanol (Vetec) acidificado com
HCl (0,04 N), incubando as células por 1 hora a temperatura ambiente sob
constante agitação, de modo que os cristais azuis formados pela reação
fossem dissolvidos (DOUCET et al., 1996).
28
Ao final desse tempo, foram retiradas alíquotas de 200 µL de cada
inserto, que foram transferidas para uma placa de 96 poços (Nunc), para a
realização da leitura a 570 nm em espectrofotômetro (Benchmark, BIO-RAD).
Os resultados foram expressos em percentual de viabilidade, utilizando-
se como controle, no caso da avaliação das diferentes condições de cultura, o
modelo epidérmico tratado com meio KM e sem cobertura de gelatina de porco.
No caso do teste para resposta citotóxica, foi utilizado como controle, o modelo
epidérmico não tratado com SDS ou Tween 20.
5. Dosagens de mediadores pró-inflamatórios
Os níveis extracelulares dos mediadores pró-inflamatórios (TGF-β1, IL-1α,
IL-6, IL-8 e TNF-α) foram avaliados nos sobrenadantes dos modelos
epidérmicos in vitro (após 14 dias na interface ar-líquido), não tratados
(controle) e tratados por 24 horas em estufa úmida 37°C/5% de CO
2
, com
diferentes concentrações de SDS e Tween 20.
Os sobrenadantes recolhidos foram estocados em freezer (-20°C), para
posterior dosagens, utilizando-se o kit de ELISA OptEIA (BD), conforme o
protocolo do fabricante.
As leituras foram feitas em leitor de ELISA (Benchmark, BIO-RAD), em
450 nm com correção em 570 nm e os cálculos realizados pelo programa Soft
Pro.
29
6. RT-PCR Semiquantitativo
Para avaliação da expressão gênica nas células de nosso modelo
epidérmico, foram realizados ensaios de RT-PCR nas seguintes condições:
após 14 dias do modelo epidérmico na interface ar-líquido, os não tratados
(controle) e os tratados por 24 horas em estufa úmida 37°C/5% de CO
2
,com
SDS (2 mg/mL) e Tween 20 (1%).
Foi adicionado 1 mL de solução de TRIzol Reagent
TM
(Gibco) a cada
inserto, homogeneizando a solução e posteriormente, adicionando-se 200 µL
de clorofórmio para separação do mRNA, conforme o protocolo do fabricante.
Por espectrofotometria, o RNA total foi quantificado.
Para a síntese de cada cDNA, foi utilizado a mesma quantidade de RNA
(1 µg de RNA total), para possibilitar uma comparação mais fidedigna entre as
diferentes amostras. A este, se adicionou 0,5 µg de oligo-(dT)
12-18
(Gibco),
incubando-se a 65°C por 10 minutos.
A 4°C foi adicionado 4 µL de tampão (5 vezes concentrado), 1 µL de
DTT (0,1 mM), 1 µL de dNTPs (10 mM), 200 unidades de MLV (transcriptase
reversa) (todos da Gibco) e 1 µL de água DEPC. As amostras foram incubadas
por 1 hora a 37°C e, ao final desse período, a temperatura foi elevada até 95°C
por 10 minutos. Foi adicionada água, a 4°C, até o volume de 100 µL a cada
tubo de reação.
O cDNA foi amplificado utilizando-se primers para 28S, IL-1α, IL-6, IL-8 e
TGF-β1, que foram selecionados de acordo com seqüências de cDNA já
publicadas (FALANGA et al., 1998). Para cada reação de PCR, foram utilizados
30
2,5 µL de cDNA, 0,5 U de Taq polimerase, 1,5 mM de MgCl
2
, 0,5 µL de dNTP
(10 mM) e 0,1 µg do senso e do anti-senso de primer. A temperatura de
anelamento varia de acordo com o par de primers a ser utilizado, seguindo as
especificações do fabricante.
Após a amplificação, as amostras foram misturadas com 5 µL do tampão
de corrida (azul de bromofenol + TBE + glicerol) e adicionadas a um gel de
agarose 2% em uma cuba contendo TBE 0,5 vezes, para análise por
eletroforese. Foi utilizado padrão de peso molecular de 100 pares de bases
(Gibco). A cuba foi ligada a uma fonte, e a corrida das amostras foi feita a
100mA.
Após eletroforese, o gel foi incubado em solução de brometo de etídeo e
posteriormente lavado em água corrente por 5-10 minutos para remoção do
excesso de brometo de etídeo. O gel foi analisado em transiluminador de luz
ultravioleta (Pharmacia) e o registro será feito através de imagem digitalizada.
As seqüências dos primers (Gene Link
TM
) utilizados para o PCR serão:
Primers
Seqüências
Número de
pares de bases
GAPDH senso 5’-CACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3’
anti-senso 5’-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3’
600 pb
IL-1α senso 5’-GTCTCTGAATCAGAAATCCTTCTATC-3’
anti-senso 5’-CATGTCAAATTTCACTGCTTCATCC-3’
421 pb
IL-6 senso 5’-AACTCCTTCTCCACAAGCGCCTT-3’
anti-senso 5’-CCGAAGAGCCCTCAGGCTGG-3’
626 pb
31
IL-8 senso 5’-CTAGGACAAGAGCCAGGAAG-3’
anti-senso 5’-AGTGTGGTCCACTCTCAATC-3’
237 pb
TGF-β1 senso 5’-TGAACCGGCCTTTCCTGCTTCTCATG-3’ 151 pb
anti-senso 5’-GCGGAAGTCAATGTACAGCTGCCGC-3’
7. Análise estatística
Para verificar se houve diferenças significativas entre os grupos controle
(n = 3) e tratados (n = 3, para cada tratamento), com relação aos percentuais
de viabilidade celular obtidos no teste do MTT, e para as dosagens de TGF-β1
por ELISA, os dados foram avaliados através do teste ANOVA. Os resultados
foram avaliados através do Teste t de Student para amostras não pareadas. As
diferenças somente foram consideradas significativas estatisticamente quando
p < 0,05.
32
IV. RESULTADOS
1. Estabelecimento das condições de cultura para o modelo epidérmico
O cultivo de modelos epidérmicos in vitro pode ser realizado sob
diversas condições de cultura, utilizando-se diferentes meios de cultura e
suplementos, visando uma melhor adesão, proliferação e diferenciação dos
queratinócitos (COSTEA et al., 2005).
Para estabelecer as melhores condições de cultura para os
queratinócitos em nosso modelo epidérmico in vitro foram testados os meios
KM (suplementado com 1% de SFB) e K-SFM (isento de SFB). Outra condição
de cultura testada foi o revestimento ou não de gelatina de porco tipo A sobre a
membrana de policarbonato dos insertos, antes do plaqueamento das células.
A proliferação e a viabilidade celular dos queratinócitos cultivados em
meio KM foi considerada como a condição controle (100 ± 3,46%). Nossos
ensaios mostraram que quando cultivados em meio K-SFM, houve um aumento
de 29,9 ± 9,39% na proliferação e viabilidade celular. Além disso, quando as
membranas de policarbonato dos insertos foram recobertas com a gelatina de
porco, as taxas de proliferação e viabilidade celular dos queratinócitos subiram
43,5 ± 2,63% em meio KM e 51,8 ± 3,32% em meio K-SFM, como mostrado na
Figura 1.
Apesar do meio K-SFM ter proporcionado a melhor condição de
viabilidade celular, nossos resultados demonstraram uma diferenciação
anormal dos queratinócitos sob essa condição, evidenciada pela presença de
33
células nucleadas nas camadas superiores da epiderme in vitro e ausência de
uma camada córnea efetiva (Prancha 1 – Figuras A e C).
Quando cultivados em meio KM e sobre a gelatina de porco, os
queratinócitos apresentaram, além de uma boa taxa de viabilidade celular, a
formação de uma epiderme in vitro com várias camadas celulares,
evidenciando uma estratificação com características similares à epiderme
humana in vivo, com presença de estrato basal, estrato espinhoso, estrato
granuloso (com vários grânulos querato-hialinos) e estrato córneo efetivamente
anucleado (Prancha 1 – Figura D).
34
Diferentes Condições de Cultura
KM sem gelatina
K-SFM sem gelatina
KM com
g
e
latina
K
-
SFM com
gelatina
90
100
110
120
130
140
150
160
Viabilidade Celular (%)
a
b
b
,
c
c
Figura 1: Viabilidade Celular dos queratinócitos em modelo epidérmico
desenvolvido in vitro, sob diferentes condições de cultura, por ensaio de MTT. A
condição do meio KM e sem gelatina de porco foi utilizada como controle, para
comparação com as demais condições de cultura testadas. Cada valor representa
a média ± desvio padrão (n = 3). Letras diferentes simbolizam diferenças
significativas (p < 0,01, ANOVA).
35
PRANCHA 1: Morfologia do modelo epidérmico desenvolvido in vitro sob
diferentes condições de cultura. Na figura D, está evidenciada a presença dos
quatro estratos principais que compõem uma epiderme normal: basal, espinhoso,
granular e córneo. As setas (Figuras A e B) mostram pontos de falta de adesão
dos queratinócitos à membrana do inserto. Os asteriscos (Figuras A e C) indicam a
presença de células ainda nucleadas nas camadas superiores da epiderme. (HE –
400x)
36
2. Ensaios de Viabilidade Celular
Uma vez tendo estabelecido as condições de cultura para o modelo
epidérmico, procurou-se estimar a relevância do mesmo quanto à sua resposta
toxicológica. Portanto, foram realizados testes de viabilidade celular (ensaio de
MTT) com diferentes concentrações de duas substâncias de características
toxicológicas já demonstradas na literatura para modelos epidérmicos in vitro, o
SDS descrito como uma substância irritante (DOUCET et al., 1996) e o Tween
20, como uma substância não-irritante (COQUETE et al., 1999).
A resposta das substâncias testadas foi classificada como irritante ou
não irritante, tendo como base o critério da concentração da substância testada
capaz de inibir em 50% a conversão normal do MTT (IC
50
) (NAUGHTON et al.,
1989), que é o principal teste aceito para validação de modelos epidérmicos in
vitro e que serão utilizados em ensaios toxicológicos (ROBINSON et al., 2002;
BOTHAM, 2004; NETZLAFF et al., 2005).
Quando o modelo epidérmico foi exposto à substância não-irritante,
Tween 20, os percentuais de viabilidade celular mantiveram-se constantes e
acima do IC
50
para todas as diferentes concentrações testadas, apresentando
valores de aproximadamente 98,96 ± 8,3% (Figura 2).
Quando exposto ao SDS, o modelo apresentou uma diminuição no
percentual de viabilidade celular dose-dependente, com percentuais de 83,21 ±
6,61% para 0,1 mg/mL, 49,11 ± 3,08% para 1 mg/mL e 44,78 ± 11,56% para 2
mg/mL de SDS (Figura 3). O IC
50
foi atingido em uma concentração de 0,99 ±
0,09 mg/mL de SDS, evidenciando similaridades com outros modelos já
descritos na literatura, conforme tabela 1.
37
Teste Toxicológico - MTT
Controle
0,01%
0,
1%
1
%
0
20
40
60
80
100
120
Viabilidade Celular (%)
Tween 20
Figura 2: Viabilidade Celular em modelo epidérmico desenvolvido in vitro, não
tratados (controle) ou sob diferentes concentrações de Tween 20 (dose-resposta)
por 24 horas, avaliados por ensaio de MTT. Cada valor representa a média ±
desvio padrão (n = 3). Sem diferenças significativas em relação ao controle (p >
0,05, ANOVA). A linha tracejada em vermelho evidencia o ponto correspondente
ao IC
.
50
38
Teste Toxicológico - MTT
Controle
0
,1 mg/mL
1
mg/
mL
2 mg/mL
0
20
40
60
80
100
120
Viabilidade Celular (%)
SDS
*
*
Figura 3: Viabilidade Celular em modelo epidérmico desenvolvido in vitro, não
tratados (controle) ou sob diferentes concentrações de SDS (dose-resposta) por 24
horas, avaliados por ensaio de MTT. Cada valor representa a média ± desvio
padrão (n = 3). Os asteriscos evidenciam diferenças significativas em relação ao
controle (p < 0,05, ANOVA). A linha tracejada em vermelho evidencia o ponto
correspondente ao IC
.
50
39
Tabela 1: Comparação de dados de IC
50
de alguns modelos epidérmicos in vitro já
estabelecidos, com os obtidos em nosso modelo. Cada valor apresentado de SDS
corresponde a média ± desvio padrão.
IC
50
Modelos Epidérmicos Humanos SDS (mg/mL) Tween 20 (mg/mL)
PRUNIERAS et al. (1979) Não-tóxico
1,00 + 0,1
TINOIS et al. (1991) Não-tóxico
0,96 + 0,08
NAUGHTON et al.(1989)
1,05 + 0,39 > 500
BELL et al. (1991)
Não-tóxico
+
1,00
0,2
AZEREDO et al. (2006)
Não-tóxico
0,99
+ 0,09
* Nossos resultados
40
3. Dosagens de mediadores pró-inflamatórios
Para avaliar a resposta toxicológica do modelo epidérmico através da
liberação de mediadores pró-inflamatórios, foram dosadas suas concentrações
extracelulares (sobrenadantes), por ensaio de ELISA.
3.1. TGF-β1
As dosagens foram feitas no meio de cultura utilizado nos testes
(DMEM), no modelo epidérmico não tratado (controle) e quando o modelo foi
submetido à exposição de Tween 20 e SDS em diferentes concentrações por
24 horas.
As dosagens realizadas no DMEM e na situação controle não
apresentaram diferenças significativas entre si (Figura 4).
Quando exposto ao Tween 20, mesmo na concentração mais alta
testada (1%), não houve elevação significativa dos níveis extracelulares de
TGF- β1 quando comparado ao controle (Figura 4).
No entanto, para o tratamento com SDS, na concentração de 1 mg/mL
houve um aumento na concentração de TGF- β1 em cerca de 3 vezes o valor
da condição controle, porém, sem apresentar diferença estatística significativa.
Já na concentração de 2 mg/mL de SDS, houve aumento significativo nos
níveis extracelulares de TGF-β1, representando cerca de 5 vezes o valor
apresentado pela condição controle (Figura 4).
41
Figura 4: Dosagem de TGF-β1 por ELISA. As dosagens foram feitas no meio de
cultura (DMEM) e nos sobrenadantes dos modelos epidérmicos in vitro, não
tratados (controle) e tratados por 24 horas com diferentes estímulos (SDS e Tween
20 em diferentes concentrações). Cada valor representa a média ± desvio padrão
(n = 3). O asterisco evidencia diferença significativa em relação ao controle (p <
0,05, ANOVA).
DMEM
C
o
n
tro
l
e
Tween 0,01%
Tw
e
e
n
0
,1
%
Tween 1%
S
DS
1mg
/
m
L
SD
S
2
mg/
m
L
0
100
200
300
400
500
600
700
800
TGF- beta1 (pg/mL)
*
42
3.2. IL-1α
As dosagens foram realizadas no modelo epidérmico não tratado
(controle) e quando o modelo foi submetido à exposição de Tween 20 (1%) e
SDS (2 mg/mL), sob uma cinética temporal de 12h, 24h, 48h e 72h após
estímulos.
Quando exposto ao Tween 20, não houve elevação significativa dos
níveis extracelulares de IL-1α quando comparado ao controle, em nenhum dos
tempos testados (Figura 5).
Quando exposto no entanto ao SDS, houve um aumento significativo na
concentração de IL-1α em relação à condição controle, em todos os tempos
avaliados. Após o período de 24h de exposição ao SDS, houve o aumento
mais significativo na liberação de IL-1α, sendo cerca de 50 vezes maior que o
valor apresentado pela condição controle (Figura 5), sendo este,
provavelmente, o melhor tempo para avaliação desta citocina.
43
0
100
200
300
400
500
600
IL-1 alfa (pg/mL)
Tween 20 (1%)
SDS
(2 / L)
controle
24 h 12 h
48 h 72 h
*
*
Figura 5: Dosagem de IL-1α por ELISA. As dosagens foram feitas nos sobrenadantes
dos modelos epidérmicos in vitro, não tratados (controle) e tratados por 12, 24, 48 e 72
horas com diferentes estímulos (SDS e Tween 20). Cada valor representa a média ±
desvio padrão (n = 3). O asterisco evidencia diferença significativa em relação ao
controle (p < 0,05, ANOVA).
44
3.3. IL-6
As dosagens foram realizadas no modelo epidérmico não tratado
(controle) e quando o modelo foi submetido à exposição de Tween 20 e SDS
em diferentes concentrações por 24 horas.
Não houve aumento significativo dos níveis extracelulares de IL-6
quando comparado ao controle, em nenhuma situação testada (Figura 6).
Data Table-1
controle Tween 2
0
Twee 20 SDS (1mSDS (2m
0
100
200
controle
Tween 20 (0,1%)
Tween 20 (1%)
SDS (1mg/mL)
SDS (2mg/mL)
IL-6 (pg/mL)
Figura 6: Dosagem de IL-6 por ELISA. As dosagens foram feitas nos
sobrenadantes dos modelos epidérmicos in vitro, não tratados (controle) e tratados
por 24 horas com diferentes estímulos (SDS e Tween 20 em diferentes
concentrações). Cada valor representa a média ± desvio padrão (n = 3). Não
houve diferença significativa em relação ao controle (p > 0,05, ANOVA).
45
3.4. IL-8
As dosagens foram realizadas no modelo epidérmico não tratado
(controle) e quando o modelo foi submetido à exposição de Tween 20 e SDS
em diferentes concentrações por 24 horas.
Quando exposto ao Tween 20, na concentração mais alta testada (1%),
houve elevação significativa dos níveis extracelulares de IL-8 quando
comparado ao controle (Figura 7).
No entanto, para o tratamento com Tween 20 (0,1%) ou com SDS, não
houve um aumento significativo na concentração de IL-8 (Figura 7).
46
750
Controle
*
Tween 20 (0,1%)
IL-8 (pg/mL)
Tween 20 (1%)
500
*
SDS (1mg/mL)
SDS (2mg/mL)
250
0
Figura 7: Dosagem de IL-8 por ELISA. As dosagens foram feitas nos
sobrenadantes dos modelos epidérmicos in vitro, não tratados (controle) e tratados
por 24 horas com diferentes estímulos (SDS e Tween 20 em diferentes
concentrações). Cada valor representa a média ± desvio padrão (n = 3). O
asterisco evidencia diferença significativa em relação ao controle (p < 0,05,
ANOVA).
47
3.5. TNF-α
As dosagens foram feitas no modelo epidérmico não tratado (controle) e
quando o modelo foi submetido à exposição de Tween 20 e SDS em diferentes
concentrações por 24 horas.
Quando exposto ao Tween 20, mesmo na concentração mais alta
testada (1%), não houve elevação significativa dos níveis extracelulares de
TNF-α quando comparado ao controle (Figura 8).
No entanto, para o tratamento com SDS, tanto na concentração de 1
mg/mL quanto na concentração de 2 mg/mL, houve um aumento significativo
na concentração de TNF-α em cerca de 3 vezes o valor da condição controle
(Figura 8).
48
Controle Tween 20
(
0
,
1
%)
Tween 20
(
1
%)
SDS
(
1m
g
/mL
)
SDS
(
2m
g
/mL
)
0
10
20
30
40
TNF-alfa (pg/mL)
*
*
controle
Tween (0,1%) Tween (1%) SDS (1mg/mL) SDS (2mg/mL)
Figura 8: Dosagem de TNF-α por ELISA. As dosagens foram feitas nos
sobrenadantes dos modelos epidérmicos in vitro, não tratados (controle) e tratados
por 24 horas com diferentes estímulos (SDS e Tween 20 em diferentes
concentrações). Cada valor representa a média ± desvio padrão (n = 3). O
asterisco evidencia diferença significativa em relação ao controle (p < 0,05,
ANOVA).
49
4. Análise da expressão gênica de mediadores pró-inflamatórios
Utilizando a técnica de RT-PCR semiquantitativo, foi avaliado o perfil de
expressão de mensagem para determinados mediadores pró-inflamatórios no
proposto modelo epidérmico in vitro, mediante exposição a uma substância
irritante e outra não irritante. A expressão de cada espécie de RNA-m nos
modelos tratados foi normalizada utilizando-se como parâmetro o nível de
expressão no controle (não-tratado).
4.1. TGF-β1
As dosagens foram feitas no modelo epidérmico não tratado (controle) e
quando o modelo foi submetido à exposição de Tween 20 (1%) e SDS (2
mg/mL) por 24 horas.
Quando exposto ao Tween 20, não houve aumento significativo da
expressão gênica de RNA-m de TGF- β1 quando comparado ao controle
(Figura 9).
No entanto, para o tratamento com SDS, houve um aumento significativo
da expressão gênica de RNA-m de TGF- β1 em cerca de 4 vezes o valor da
condição controle (Figura 9).
50
TGF-beta
Controle Tween 20
(
1
%
SDS
(
1m
g
/mL
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
Diferenças entre as taxas de RNA-m
Controle Tween
(
1%
)
SDS
(
2m
g
/mL
)
bp
GPDH (600)
TGF-β (151)
*
Figura 9: RT-PCR semi-quantitativo de TGF-β1 em modelo epidérmico in vitro em
diferentes condições, não tratados (controle) e tratados por 24 horas com diferentes
estímulos (SDS e Tween 20). Cada valor representa a média ± desvio padrão (n = 3).
O asterisco evidencia diferença significativa em relação ao controle (p < 0,05,
ANOVA).
51
4.2. IL-1α
As dosagens foram feitas no modelo epidérmico não tratado (controle) e
quando o modelo foi submetido à exposição de Tween 20 (1%) e SDS (2
mg/mL) por 24 horas.
Quando exposto ao Tween 20, não houve aumento significativo da
expressão gênica de RNA-m de IL-1α quando comparado ao controle (Figura
10).
No entanto, para o tratamento com SDS, houve um aumento significativo
da expressão gênica de RNA-m de IL-1α em cerca de 3 vezes o valor da
condição controle (Figura 10).
52
IL-1 alfa
Controle Tween 20
(
1
%)
SDS
(
1m
g
/mL
)
0.0
2.5
5.0
7.5
Diferenças entre as taxas de
RNA-m
Controle Tween
(
1%
)
SDS
(
2m
g
/mL
)
bp
GPDH (600)
IL-1α (421)
*
Figura 10: RT-PCR semi-quantitativo de IL-1α em modelo epidérmico in vitro em
diferentes condições, não tratados (controle) e tratados por 24 horas com
diferentes estímulos (SDS e Tween 20). Cada valor representa a média ± desvio
padrão (n = 3). O asterisco evidencia diferença significativa em relação ao controle
(p < 0,05, ANOVA).
53
4.3. IL-6
As dosagens foram feitas no modelo epidérmico não tratado (controle) e
quando o modelo foi submetido à exposição de Tween 20 (1%) e SDS (2
mg/mL) por 24 horas.
Não houve aumento significativo da expressão gênica de RNA-m de IL-6
em nenhuma das situações avaliadas quando comparado ao controle (Figura
11).
IL-6
Controle Tween 20
(
1
%
SDS
(
1m
g
/mL
)
0
1
2
3
4
5
Diferenças entre taxas de RNA-m
Controle Tween
(
1%
)
SDS
(
2m
g
/mL
)
bp
GPDH (600)
IL-6 (626)
Figura 11: RT-PCR semiquantitativo de IL-6 em modelo epidérmico in vitro em
diferentes condições, não tratados (controle) e tratados por 24 horas com diferentes
estímulos (SDS e Tween 20). Cada valor representa a média ± desvio padrão (n = 3).
Não houve diferença significativa em relação ao controle (p > 0,05, ANOVA).
54
4.4. IL-8
As dosagens foram feitas no modelo epidérmico não tratado (controle) e
quando o modelo foi submetido à exposição de Tween 20 (1%) e SDS (2
mg/mL) por 24 horas.
Não houve aumento significativo da expressão gênica de RNA-m de IL-8
em nenhuma das situações avaliadas quando comparado ao controle (Figura
12).
IL-8
controle Tween 20
(
1
%)
SDS
(
1m
g
/mL
)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Diferenças entre as taxas de RNA-m
Controle Tween
(
1%
)
SDS
(
2m
g
/mL
)
bp
IL-8 (237)
GPDH (600)
Figura 12: RT-PCR semiquantitativo de IL-8 em modelo epidérmico in vitro em
diferentes condições, não tratados (controle) e tratados por 24 horas com diferentes
estímulos (SDS e Tween 20). Cada valor representa a média ± desvio padrão (n = 3).
Não houve diferença significativa em relação ao controle (p > 0,05, ANOVA).
55
V. DISCUSSÃO
O modelo de epiderme humana in vitro proposto no presente trabalho foi
desenvolvido a partir de adaptações do protocolo geral estabelecido por
PRUNIÉRAS et al. (1983), sendo os queratinócitos cultivados em insertos de
membrana de policarbonato, imersos em meio de cultura por 7 dias e então,
colocados sob interface ar- líquido e mantidos em cultura por mais 14 dias. A
escolha do tipo de substrato utilizado para o cultivo dos queratinócitos levou em
consideração, sobretudo, o baixo custo e a facilidade de aquisição do mesmo.
Além disso, o substrato utilizado no cultivo dos queratinócitos precisa
apresentar boas condições para adesão, proliferação e diferenciação dos
mesmos (YANG et al., 2000). A morfologia dos nossos primeiros modelos
epidérmicos apresentava sérios problemas com a adesão dos queratinócitos à
membrana de policarbonato do inserto (dados não mostrados), o que levava
em conseqüência disso, uma má proliferação e diferenciação das células. Na
tentativa de solucionar este problema, foi testada a utilização de gelatina de
porco tipo A, que recobria o inserto antes do plaqueamento dos queratinócitos.
Quando o modelo epidérmico foi cultivado sobre a gelatina de porco
observou-se uma melhor adesão celular à membrana de policarbonato. Esse
resultado pode ser compreendido pelo fato da gelatina de porco possuir vários
componentes de matriz extracelular, como, laminina e colágeno, o que de certa
forma estaria mimetizando uma membrana basal de epiderme in vivo e
servindo como um excelente suporte para a adesão dos queratinócitos.
Alguns trabalhos já mostraram que a presença de componentes de
membrana basal em modelos epidérmicos in vitro é um facilitador da adesão
56
dos queratinócitos da camada basal, via integrinas (STARK et al., 2007) e
hemidesmossomos (GHALBZOURI et al., 2004). Além disso, já foi identificada
a capacidade dos queratinócitos, em modelos tridimensionais in vitro, de
sintetizar e depositar alguns componentes de membrana basal (ROSDY et al.,
1993; WANG et al., 2006), podendo ser influenciados pela presença dos
fibroblastos (DANIELS et al., 1997; KIM, et al., 2002), o que não é o caso do
nosso modelo visto que esse tipo celular não é utilizado, ou também pela
suplementação ao meio de cultura com EGF, que tem um papel muito
semelhante ao desempenhado pelos fibroblastos neste aspecto (GHALBZOURI
et al., 2002).
Diferentes meios de cultura podem ser utilizados na construção de um
modelo epidérmico in vitro, porém, há uma grande problemática sobre este
assunto, principalmente no que diz respeito à presença de soro como
suplemento do meio de cultura (STARK et al., 1999). Neste sentido, foram
testados dois meios de cultura, o meio KM que foi suplementado com 1% de
SFB e o meio K-SFM que é livre de SFB.
O processo normal de diferenciação e queratinização in vitro dos
queratinócitos requerem que uma série de condições de cultura estejam de
acordo (VICANOVÁ, et al., 1996). Por exemplo, já foi demonstrado que o ácido
ascórbico é um suplemento do meio de cultura essencial ao processo de
formação de camadas córneas com características efetivas e funcionais em
modelos epidérmicos in vitro (SEPPÄNEN et al., 2001; KIM, et al., 2002). Por
isso, ambos os meios testados foram suplementados com 50 µg/mL de ácido
ascórbico.
57
Considerando os modelos que tiveram recobertas as membranas dos
insertos com a gelatina de porco, quando cultivados com o meio K-SFM a
viabilidade celular mostrou-se um pouco mais alta (dados não significativos
estatisticamente) que com o meio KM, porém o aspecto morfológico do tecido
neste primeiro meio foi bastante prejudicado, com presença de queratinócitos
ainda nucleados nas camadas superiores e consequentemente, não
apresentando um estrato córneo efetivo. Já com o meio KM, a epiderme in vitro
teve um padrão de estratificação e queratinização muito mais similar ao da
epiderme in vivo, apresentando estrato basal, com células grandes e de
aspecto colunar, estrato espinhoso, estrato granular, com vários grânulos
querato-hialinos no citoplasma dos queratinócitos e por fim, estrato córneo,
com células mortas e anucleadas (corneócitos) (PRANCHA 1 – Figura D).
A boa funcionalidade do estrato córneo epidérmico está diretamente
relacionada à composição lipídica do mesmo, portanto, um meio de cultura
deficiente em lipídios, como alguns ácidos graxos essenciais, pode levar a
formação de uma barreira córnea não efetiva (ASSELINEAU, et al.,1986;
PONEC, 2002). Apesar de alguns trabalhos terem mostrado que altas
concentrações (acima de 5%) de SFB podem causar diferenciação anormal de
queratinócitos in vitro (MAK, et al., 1991; FARTASCH AND PONEC, 1994), em
baixas concentrações (1% como no nosso modelo), o SFB pode contribuir com
os lipídios essenciais necessários ao processo de diferenciação terminal e
formação de um estrato córneo similar ao da epiderme in vivo (SEPPÄNEN et
al, 2001; COSTEA et al., 2005), o que pode ser comprovado pela melhor
morfologia epidérmica de nosso modelo sob essa condição.
58
A principal vantagem da utilização de modelos epidérmicos
tridimensionais em relação aos modelos bidimensionais (monocamadas),
consiste no fato do primeiro apresentar estrato córneo, o que possibilita à
aplicação tópica de substâncias, aproximando os testes ainda mais com os
realizados in vivo (ZHAO, et al., 1999). Desta forma, também é possível avaliar
a efetividade da barreira córnea dos modelos testados, quando comparados
com respostas in vivo e quanto ao padrão de reprodutibilidade in vitro.
O principal teste de pré-validação de resposta irritante aguda realizado
pelo ECVAM em modelos epidérmicos in vitro, consiste na mensuração de
alterações de viabilidade celular e tecidual através do ensaio de MTT, levando-
se em consideração o critério de IC
50
, ou seja, baseado no tempo e na
concentração da substância testada que acarreta a diminuição da viabilidade
celular em 50%, sendo então classificada como “irritante para a pele” (R38)
(ROBINSON et al., 2002).
O modelo proposto foi avaliado quanto a sua resposta toxicológica para
irritação cutânea utilizando-se o método do MTT para diferentes concentrações
de uma substância não irritante, o Tween 20 e de outra irritante, o SDS,
expostos por 24 horas ao modelo. Para o Tween 20, a viabilidade celular
manteve-se constante e acima do IC
50
, de acordo com o que se esperava para
uma substância não irritante ou não tóxica, além disso, correspondendo com
dados já apresentados em outros modelos epidérmicos in vitro (Tabela 1). Já
quando o SDS foi utilizado, houve um decréscimo da viabilidade celular dose-
dependente e a substância atingiu o IC em uma concentração bastante
50
59
similar com a de outros modelos epidérmicos in vitro já avaliados para a
mesma substância nas mesmas condições (Tabela 1).
Esses dados mostraram-se bastante promissores, pois apontam para a
aptidão de nosso modelo em diferenciar uma substância irritante de uma
substância não irritante, através de respostas diferenciadas, quanto à
viabilidade celular pelo método do MTT, conforme alguns critérios
estabelecidos por comitês internacionais (OECD, 2003).
Coquette et al. (1999), mostraram que queratinócitos cultivados em
monocamadas produzem constitutivamente e quando sob algum fator indutor,
em maior quantidade, citocinas e fatores de crescimento, incluindo, dentre
outros, IL-1α, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α, GM-CSF, TGF-α e TGF-β. Modelos de
pele in vitro não irão conseguir reproduzir respostas idênticas a da pele nativa,
porém, esses modelos podem ser utilizados para a determinação de
parâmetros de respostas inflamatórias mediante agentes irritantes e
sensibilizantes em testes realizados in vitro (SCHREIBER et al., 2005).
O modelo epidérmico foi avaliado quanto à identificação de mediadores
inflamatórios que pudessem responder a situações de irritação cutânea, de
maneira a funcionar como parâmetros de resposta para classificação das
substâncias testadas em irritantes ou não irritantes.
Ao contrário de uma série de outros mediadores pró-inflamatórios (IL-1α,
IL-6 e IL-8) também expressos pelos queratinócitos e já estudados em modelos
epidérmicos in vitro (BERNHOFER et al., 1999; COQUETTE et al., 1999;
POUMAY et al., 2004), não foi encontrada nenhuma publicação que fizesse
uma correlação específica do TGF-β1, com respostas à irritação cutânea em
60
modelos epidérmicos in vitro. Esse foi um dos principais motivos que nos
levaram a escolha do TGF-β1 para ser avaliado em nosso modelo.
A dosagem de TGF-β1 nos sobrenadantes e a avaliação do aumento de
sua expressão gênica em nosso modelo epidérmico tratado com Tween 20,
não apresentaram diferenças significativas com o controle. Esse dado é
bastante interessante, pois corrobora com nossos resultados de viabilidade
celular nas mesmas condições, evidenciando uma coerência pelo fato do
Tween 20, sendo uma substância não irritante, manter a viabilidade celular
acima do IC
50
e não estimular o aumento da expressão gênica ou a liberação
extracelular do mediador pro-inflamatório testado.
Quando a dosagem foi realizada no modelo epidérmico tratado com
SDS, nossos resultados apontaram para um aumento significativo do TGF-β1
extracelular, somente quando o modelo foi exposto à concentração mais alta
de SDS (2 mg/mL). No entanto, os ensaios de viabilidade celular com nosso
modelo epidérmico exposto também ao SDS, evidenciaram que já na
concentração de 1 mg/mL a viabilidade decresceu abaixo do IC
50
e, portanto, já
nessa concentração o SDS foi considerado irritante ou tóxico.
Essa discrepância de resultados poderia ser interpretada com o auxílio
de um trabalho publicado por FALANGA et al. (1998), que mostraram que o
TGF-β1 em modelos epidérmicos in vitro sob condições de injúria mecânica,
demorava no mínimo 48 horas para que tivesse sua expressão extracelular
significativamente aumentada. Como nosso método de detecção do TGF-β1
ocorreu após um período de apenas 24 horas de exposição à substância
irritante, isso pode ter contribuído para o resultado apresentado.
61
Além do aumento de TGF-β1 no meio extracelular, quando o modelo
epidérmico foi submetido à exposição ao SDS, também houve um aumento
significativo na expressão gênica deste mediador, mostrando uma importante
correlação entre estes dois mecanismos de resposta inflamatória. Estes dados
mostram-se bastante interessantes, pois evidenciam importantes parâmetros a
serem avaliados em nosso modelo no julgamento de substâncias irritantes e
não irritantes.
Confirmando nossos resultados de viabilidade celular por MTT, a
dosagem de IL-1α nos sobrenadantes e a avaliação do aumento de sua
expressão gênica em nosso modelo epidérmico tratado com Tween 20, não
apresentaram diferenças significativas com o controle. Esses dados mostram-
se bastante coerentes com o esperado diante de uma substância não irritante a
pele (POUMAY AND COQUETTE, 2007).
Quando a dosagem foi realizada no modelo epidérmico tratado com
SDS, nossos resultados apontaram para um aumento significativo de IL-1α
extracelular em todos os tempos testados. No entanto, no tempo de 24 horas
pós-exposição ao SDS, é possível identificar a máxima liberação desta citocina,
sendo por isso, esse tempo o mais indicado para avaliações em testes
toxicológicos in vitro, conforme dados já publicados na literatura (KANDÁROVÁ
et al., 2006). Somando-se esse resultado ao do ensaio de viabilidade celular, é
possível constatar que nosso modelo epidérmico apresenta uma resposta
promissora na distinção entre uma substância irritante e uma não irritante.
As avaliações quanto à expressão gênica de RNA-m de IL-1α também
mostraram-se bastante promissoras, pois, quando o modelo foi exposto ao
62
Tween 20 não houve um aumento significativo, porém, quando o mesmo foi
exposto ao SDS houve um aumento significativo na expressão gênica. Isso nos
possibilita, unir mais um parâmetro para avaliação da resposta toxicológica de
nosso modelo in vitro.
Quando avaliamos a resposta de nosso modelo epidérmico para IL-6,
não foi possível fazer uma distinção de resposta entre o Tween 20 (não
irritante) e o SDS (irritante), tanto para a liberação extracelular quanto para a
expressão gênica de RNA-m, quando comparados a situação controle. Esses
dados evidenciam uma importante modulação desta citocina por queratinócitos
e fibroblastos, através de uma resposta inflamatória altamente integrada, o que
justifica IL-6 não ser tão promissora para utilização em modelos epidérmicos,
mas sim em modelos dermo-epidérmicos que constituem efetivamente esses
dois tipos celulares coexistindo (Welss et al., 2004).
Quando o modelo epidérmico foi avaliado quanto a liberação extracelular
de IL-8, não houve um aumento significativo sob estímulo de SDS e Tween 20
(0,1%), porém, Tween 20 na maior concentração testada (1%) promoveu um
aumento significativo de sua liberação. Em relação às avaliações de expressão
gênica de RNA-m de IL-8, não houve aumento significativo quando o modelo
foi exposto nem ao Tween 20 nem ao SDS em relação ao controle.
BERNHOFER et al. (1999) mostraram que como a resposta de IL-8 é
fortemente incrementada pela interação dos queratinócitos com os fibroblastos,
modelos somente epidérmicos, podem sofrer uma menor modulação na
expressão gênica e consequentemente na produção e liberação desse
63
mediador inflamatório. Esses dados na literatura nos possibilitam uma
interpretação satisfatória para nossos resultados.
Além disso, COQUETTE et al (2003) e NEPPELBERG et al (2007)
apresentaram uma importante correlação do aumento da concentração
extracelular de IL-8 dosada pelo método de ELISA, quando modelos
epidérmicos in vitro são submetidos a substâncias não irritantes, mas sim,
sensibilizantes/alergências, como, DNFB e TNBS. Esses trabalhos nos
remetem a considerar que o aumento da concentração extracelular de IL-8,
quando o modelo foi exposto a maior concentração de Tween 20 (1%),
evidencia que apesar dele não promover efeito citotóxico, pode provocar
alguma sensibilização, similar ao que faria um alergênico e com isso,
justificando o resultado apresentado.
O modelo epidérmico foi avaliado quanto à liberação extracelular de
TNF-α pelo método de ELISA, e, apresentou resultados bastante interessantes
na diferenciação da resposta entre o Tween 20 (não irritante), não havendo um
aumento significativo na concentração de TNF-α, e o SDS (irritante) que
promoveu um aumento significativo na liberação deste mediador inflamatório
nas duas concentrações testadas. Esses resultados, juntamente ao do ensaio
de viabilidade celular e resultados mostrados em outros trabalhos
(CHATTERJEE et al., 2006 e POUMAY AND COQUETTE, 2007), nos
possibilita constatar que nosso modelo epidérmico apresenta uma resposta
coerente na distinção entre uma substância irritante e uma não irritante,
utilizando-se a dosagem extracelular do TNF-α.
64
De maneira geral, nosso modelo epidérmico humano in vitro teve suas
condições de cultura estabelecidas, apresentando características morfológicas
similares à epiderme normal in vivo. Os experimentos de viabilidade celular,
dosagens extracelular de TGF-β1, IL-1α e TNF-α e avaliação do aumento da
expressão gênica de RNA-m de TGF-β1 e IL-1α, apontam para uma futura e
promissora utilização de nosso modelo para ensaios toxicológicos
farmacêuticos e/ou cosméticos, visando à identificação de substâncias como
irritantes/alergênicas ou não irritantes/alergênicas.
65
VI. CONCLUSÃO
As condições de cultura ideais para a construção do modelo epidérmico
humano in vitro foram estabelecidas, sendo os queratinócitos cultivados
em inserto com membrana de policarbonato recoberta com gelatina de
porco e com utilização de meio KM.
A viabilidade celular no modelo epidêmico, por ensaios de MTT, foi
estabelecida, mostrando-se o modelo plenamente capaz de responder à
substância irritante testada (SDS a partir de 1 mg/mL) com valores
inferiores ao IC
;
50
Através das dosagens pelo método de ELISA, foi possível estabelecer
um aumento significativo da concentração dos mediadores pró-
inflamatórios IL-1α e TNF-α quando o modelo epidérmico foi exposto a
substância irritante testada (SDS – 2 mg/mL) após 24 horas, em relação
aos controles (modelo não testado e exposto a substância não irritante
Tween 20).
A caracterização molecular, por RT-PCR semi-quantitativo, do modelo
epidérmico evidenciou que quando exposto a substância irritante testada
(SDS – 2 mg/mL) há, alem de um aumento da liberação um também
aumento da expressão gênica de RNA-m para os mediadores pró-
inflamatórios IL-1α, TNF-α e TGF-β1.
Os parâmetros gerais de viabilidade celular, dosagens extracelulares e
expressão gênica de mediadores pró-inflamatórios foram estabelecidos
para o modelo epidérmico proposto, mostrando-se o mesmo, bastante
66
promissor como um modelo alternativo para a realização de ensaios
toxicológicos in vitro.
67
VII. PERSPECTIVAS
Avaliar as respostas toxicológicas do modelo epidérmico proposto neste
trabalho, mediante outras substâncias irritantes e alergênicas utilizadas
na indústria farmacêutica/cosmética;
Avaliar o perfil lipídico da camada córnea formada no modelo
epidérmico, por estudos com HPLC, visando compara-lo com o da
epiderme humana nativa;
Desenvolver um modelo de maior complexidade que mimetize melhor a
pele humana, apresentando os componentes dermo-epidérmicos,
incluindo uma matriz de derme cadavérica acelularizada cultivada com
fibroblastos, e uma epiderme superior com queratinócitos cultivados nas
mesmas condições pré-estabelecidas neste trabalho.
68
VIII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALBERTS B., JOHNSON A., LEWIS J., RAFF M., ROBERTS K. AND
WALTER P. Molecular Biology of the Cell. New York. Garland Publishing 4
a
ed.., cap. 22.
ASSELINEAU D., BERNARD B.A., BAILLY C., DARMON M. AND
PRUNIÉRAS M. (1986) Human epidermis reconstructed by culture: is it
“normal”? The Journal of Investigative Dermatology 86, 181-186.
AZEREDO, M. C. B., MARTUCCI, R.B., BOROJEVIC, R. (2006)
Keratinocytes proliferation in a reconstructed human epidermis in vitro in a
different culture conditions. SBBC SIMEC.
BANKS-SCHLEGEL S. AND GREEN H. (1981) Formation of epidermis
by serially cultivated human epidermal cells transplanted as an epithelium to
athymic mice. Transplantation 29(4), 308-313.
BELL E., PARENTEAU N., GAY R., NOLTE C., KEMP P.,BILBO P.,
EKSTEIN B. AND JOHNSON E. (1991) The living skin equivalent: its
manufacture, its organotypic properties ans its responses to irritants. Toxicology
in Vitro 5, 591-596.
BERNHOFER L.P., SEIGER M. AND MARTIN K.M. (1999) The influence
of the response of skin equivalent system to topically applied consumer
products by epithelial-mesenchymal interactions. Toxicology in Vitro 13, 219-
229.
69
BOTHAM P.A. (2004) The validation of in vitro methods for skin irritation.
Toxicology Letters 149, 387-390.
BOYCE S.T. AND HANSBROUGH J.F. (1988) Biologic attachment,
growth, and differentiation of cultured human epidermal keratinocytes on a
graftable collagen and chondroitin-6-sulfate substrate. Surgery 103, 421-431.
BRONNEBERG D., SPIEKSTRA S.W., CORNELISSEN L.H., OOMENS
C.W.J., GIBBS S., BAAIJENS F.P.T. AND BOUTEN C.V.C. (2007) Cytokine
and chemokine release upon prolonged mechanical loading of the epidermis.
Experimental Dermatology 16, 567-573.
CHATTERJEE A., BABU R.J., KLAUSNER M. AND SINGH M. (2006) In
vitro and in vivo comparison of dermal irritancy of jet fuel exposure using
EpiDerm
TM
(EPI-200) cultured human skin and hairless rats. Toxicology Letters
167 85-94.
CHEN C.S.J., LAVKER R.M., RODECK U., RISSE B. AND JENSEN P.J.
(1995) Use of a serum-free epidermal culture model to show deleterious effects
of epidermal growth factor on morphogenesis and differentiation. The Journal of
Investigative Dermatology 104(1), 107-112.
COMPTON C.C. (1993) Wound healing potencial of cultured epithelium
Wounds 5(2), 97-111.
COQUETTE A., BERNA N., VANDENBOSCH A., ROSDY M. AND
POUMAY Y. (1999) Differential expression and release of cytokines by an in
vitro reconstructed human epidermis following exposure to skin irritant and
sensitizing chemicals. Toxicology in Vitro 13, 867-877.
70
COQUETTE A., BERNA N., VANDENBOSCH A., ROSDY M., DE
WEVER B. AND POUMAY. (2003) Analysis of interleukin-1α (IL-1α) and
interleukin-8 (IL-8) expression and release in in vitro reconstructed human
epidermis for the prediction of in vivo skin irritation and/or sensitization.
Toxicology in Vitro 17 311-321.
CORSINI E., PRIMAVERA A., MARINOVICH M. AND GALLI C.L. (1998)
Selective induction of cell-associated interleukin-1α in murine keratinocytes by
chemical allergens. Toxicology 129, 193-200
COSTEA D.E., DIMBA A.O.E., LORO L.L., VINTERMYR O.K. AND
JOHANNESSEN A.C. (2005) The phenotype of in vitro reconstituted normal
human oral epithelium is essentially determined by culture medium. Journal
Oral Pathology Medicine 34, 247-252.
CUONO C., LANGDON R. AND MCGUIRE J. (1986) Use of cultured
epidermal autografts and dermal allografts as skin replacement after burn injury.
Lancet 1, 1123-1124.
DANIELS J.T., KEARNEY J.N. AND INGHAM E. (1997) An investigative
into the potencial of extracellular matrix factors for attachment and proliferation
of human keratinocytes on skin substitutes. Burns 23, 26-31.
DOUCET O, ROBERT C AND ZASTROW L. (1996) Use of a serum-free
reconstituted epidermis as a skin pharmacological model. Toxicology in Vitro
10, 305-313.
DRAIZE J.H., WOODARD G. AND CALVERY H.O. (1944) Methods for
the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and
71
mucous membranes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics
82, 377-390.
EEC. (1992) Council Directive of 92/32/EEC of 30 of April amending for
the seventh time Directive 67/548/EEC on the approximation of the law,
regulations, and administrative provisions relating to the classification,
packaging and labeling of dangerous substances. Off. J Eur. Comm. 54, 1-29.
FALANGA V., ISAACS C., PAQUETTE D., DOWNING G., KOUTTAB N.,
BUTMARE J., BADIAVAS E. AND YOUNG J.H. (1998) Wounding of
bioengineered skin: cellular and molecular aspects after injury. The Journal of
Investigative Dermatology 119, 653-660.
FARTASCH M. AND PONEC M. (1994) Improved barrier structure
formation in air-exposed human keratinocyte culture systems. The Journal of
Investigative Dermatology 102, 366-374.
GALLICO G.G., O’CONNOR N.E. COMPTON C.C., KEHINDE O. AND
GREEN H. (1984) Permanent coverage of large burn wounds with autologous
cultured human epithelium. New England Journal of Medicine 311(7), 448-451.
GARTNER L.P. E HIATT J.L. (1999) Tratado de Histologia. Rio de
Janeiro. Guanabara Koogan 2ª ed., cap. 14.
GERBERICK G.F. AND SIKORSKI E.E. (1998) In vitro and in vivo testing
techniques for allergic contact dermatitis. American Journal of Contact
Dermatitis 9, 111-118.
72
GHALBZOURI A.E., LAMME E. AND PONEC M. (2002) Crucial role of
fibroblasts in regulating epidermal morphogenesis. Cellular Tissue Research
310, 189-199.
GHALBZOURI A.E., JONKMAN M.F., DIJKMAN R. AND PONEC M.
(2004) Basement membrane reconstruction in human skin equivalents is
regulated by fibroblasts and/or exogenously activated keratinocytes. The
Journal of Investigative Dermatology 124, 79-86.
GRAGNANI-FILHO M. (1999) Formação do Stratum Corneum in vitro e
in vivo no enxerto de queratinócitos cultivados e derme acelular humana:
estudo histológico e da capacitância elétrica superficial. Dissertação de
Doutorado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Cirurgia Plástica
Reparadora. Universidade Federal de São Paulo, São Paulo.
GRAHAM G.M., FARRAR M.D., CRUSE-SAWYER J.E., HOLLAND K.T.
AND INGHAM E. (2004) Proinflammatory cytokine production by human
keratinocytes stimulated with Propionibacterium acnes and P. acnes GroEL.
British Journal of Dermatology 150, 421-428.
GREEN H. (1991) Cultured cells for the treatment of disease: the
successful growth of human skin cells in culture has made it possible to restore
epidermis after severe burns and other forms of damage. Scientific American
Nov, 96-102.
INDANS I. (2002) The use and interpretation of in vitro data in regulatory
toxicology: cosmetics, toiletries and household products. Toxicology Letters
127, 177-182.
73
JUNQUEIRA L.C. E CARNEIRO J. (2004) Histologia Básica. Guanabara
Koogan, cap. 18.
KANDÁROVÁ H., LIEBSCH M., SPIELMANN H., GENSCHOW E.,
SCHMIDT E., TRAUE D., GUEST R., WHITTINGHAM A., WARREN N.,
GAMER A.O., REMMELE M., KAUFMANN T., WITTMER E., WEVER B.D.
AND ROSDY M. (2006) Assessment of the human epidermis model SkinEthic
RHE for in vitro skin corrosion testing of chemicals according to new OECD TG
431. Toxicology in Vitro 20, 547-559.
KIM S.W., LEE I.W., CHO H.J., CHO K.H., KIM K.H., CHUNG J.H.,
SONG P.I. AND PARK K.C. (2002) Fibroblasts ans ascorbate regulate
epidermalization in reconstructed human epidermis. Journal of Dermatogical
Science 30, 215-223.
LEIGH I.M., LANE E.B AND WATT F.M. (1994) The Keratinocyte
Handbook. Cambridge. University Press 1ª ed., 566p.
MAK V.H.W., CUMPSTONE M.B., KENNEDY A.H., HARMON C.S., GUY
R.H. AND POTTS R.O. (1991) Barrier function of human keratinocyte cultures
grown at the air-liquide interface. The Journal of Investigative Dermatology
96(3), 323-327.
NATH R.K., LAREGINA M., MARKHAM H., KSANDER G.A. AND
WEEKS P.M. (1994) The expression of transforming growth factor tybe beta in
fetal and adult rabbit skin wounds. Journal of Pediatric Surgery 29, 416-421.
74
NAUGHTON G.K., JACOB L. AND NAUGHTON B.A. (1989). A
physiological skin model for in vitro toxicity studies. In Alternative Methods in
Toxicology 7, 183-89.
NEPPELBERG E., COSTEA D.E., VINTERMYR O.K. AND
JOHANNESSEN A.C. (2007) Dual effects of sodium lauryl sulphate on human
oral epithelial structure. Experimental Dermatology 16 574-579.
NETZLAFF F., LEHR C.M., WERTZ P.W. AND SCHAEFER U.F. (2005)
The human epidermis models EpiSkin®, SkinEthic® and EpiDerm®: an
evaluation of morphology and their suitability for testing phototoxicity, irritancy,
corrosivity, and substance transport. European Journal of Pharmaceutics and
Biopharmaceutics 60, 167-178.
OECD. (2002) Skin absorption: in vitro Method. Draft Test Guideline 428.
OECD. (2003) Draft Guidance Document for the Conduct of Skin
Absorption Studies. OECD Series on Testing and Assessment.
PARENTEAU N. (1999)
Skin: the first tissue-engineered products.
Scientific American 280(4), 83-84.
PHILIPP K.. RIEDEL F., SAUERBIER M., HORMANN K. AND
GERMANN G. (2004) Targeting TGF-beta in human keratinocytes and its
potencial role in wound healing. International Journal of Molecular Medicine 14,
589-593.
75
PONEC M. (2002) Skin constructs for replacement of skin tissues for in
vitro testing. Advanced Drug Delivery Reviews 1, 19-30.
POUMAY Y., DUPONT F., MARCOUX S., LECLERCQ-SMEKENS M.,
HÉRIN M. AND COQUETTE A. (2004) A simple reconstructed human
epidermis: preparation of culture model and utilization in in vitro studies.
Archives of Dermatology Research 296, 203-211.
POUMAY Y. AND COQUETTE A. (2007) Modelling the human epidermis
in vitro: tools for basic and applied research. Archives of Dermatology Research
298, 361-369.
PRUNIÉRAS M., REGNIER M. AND SCHLOTTERER M. (1979)
Nouveau procédé de cultures épidermiques humaines sur derme homologue ou
hétérologue: préparation de greffons recombinés. Annales de Chirurgie
Plastique et Esthétique 24, 357-62.
PRUNIÉRAS M., REGNIER M. AND WOODLEY D. (1983) Methods for
cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. Journal of Investigative
Dermatology 81, 28-33.
REGNIER M, ASSELINEAU D, LENOIR M. (1990) Human epidermis
reconstructed on dermal substrates in vitro: an alternative to animals in skin
pharmacology. Skin Pharmacology 3, 70-85.
RHEINWALD J.G. AND GREEN H. (1975) Formation of keratinizing
epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma. Cell 6, 317-
330.
76
ROBINSON M.K., COHEN C., DE BRUGEROLLE DE FRAISSINETTE
A., PONEC M., WHITTLE E. AND FENTEM J.H. (2002) Non-animal testing
strategies for assessment of the skin corrosion and skin irritation potencial of
ingredients and finished products. Food and Chemical Toxicology 40, 573-592.
ROSDY M. AND CLAUSS L.C. (1990) Terminal epidermal differentiation
of human keratinocytes grown in chemically defined medium on inert filter
substrates at the air-liquid interface. Journal of Investigative Dermatology 95(4),
409-414.
ROSDY M., PISANI A. AND ORTONNE J.P. (1993) Production of
basement membrane components by a reconstructed epidermis cultured in the
absence of serum and dermal factors. British Journal of Dermatology 129, 227-
234.
ROWAN A.N. (1984) Of mice, models & men. Albany. State University of
New York Press.
SCHREIBER S., MAHMOUD A., VUIA A., RÜBBELKE M.K., SCHMIDT
E., SCHALLER M., KANDÁROVÁ H., HABERLAND A., SCHÄFER U.F., BOCK
U., KORTING H.C., LIEBSCH M. AND SCHÄFER-KORTING M. (2005)
Reconstructed epidermis versus human and animal skin in skin absorption
studies. Toxicology in Vitro 19, 813-822.
SHAW A.J. (1996) Epithelial Cell Culture. New York. Oxford University
Press 1ª ed., cap. 1, 2, 3 and 9.
SEPPÄNEN S.P., SUHONEN T.M., KIRJAVAINEN M., SUIHKO E.,
URTTI A., MIETTINEN M., KYTTINEN M., TAMMI M. AND TAMMI R. (2001)
77
Vitamin C enhances differentiation of a continuos keratinocyte cell line (REK)
into epidermis with normal stratum corneum ultrastructure and functional
permeability barrier. Histochemistry and Cell Biology 116, 287-297.
STARK H.J., BAUR M., BREITKREUTZ D., MIRANCEA N. AND
FUSENIG N.E. (1999) Organotypic keratinocyte cocultures in defined medium
with regular epidermal morphogenesis and differentiation. Journal of
Investigative Dermatology 112, 681-91.
STARK H.J., BOEHNKE K., MIRANCEA N., WILLHAUCK M., PAVESIO
A., FUSENIG N. AND BOUKAMP P. (2007) Epidermal homeostasis in long-
term scaffold-enforced skin equivalents. Journal of investigative Dermatology.
Simposium Proceedings 11(1), 93-105.
TINOIS E., TIOLLIER J., GAUCHERAND M., DUMAS H., TARDY M.
AND THIVOLIET J. (1991) In vitro and post-transplantation differentiation of
human keratinocyte growth on the human type IV collagen film of a bilayered
dermal substitute. Experimental Cell Research 193, 310-19.
VICANOVÁ J., MOMMAAS A.M., MULDER A.A., KOERTEN H.K. AND
PONEC M. (1996) Impaired desquamation in the in vitro reconstructed human
epidermis. Cellular Tissue Research 286, 115-122.
WANG T.W., SUN J.S., HUANG Y.C., WU H.C., CHEN L.T. AND LIN
F.H. (2006) Skin basement membrane and extracellular matrix proteins
characterization and quantification by real time RT-PCR. Biomaterials 27, 5059-
5068.
78
WELSS T., BASKETTER D.A. AND SCHRÖDER K.R. (2004) In vitro
skin irritation: facts and future. State of the art review of mechanisms and
models. Toxicology in Vitro 18, 231-243.
WILMER J.L., BURLESON F.G., KAYAMA F., KANNO J. AND LUSTER
M.I. (1994) Cytokine induction in human epidermal keratinocytes exposed to
contact irritants and its relation to chemical-induced inflammation in mouse skin.
Journal of Investigative Dermatology 102(6), 915-922.
YANG E.K., SEO Y.K., YOUN H.H., LEE D.H., PARK S.N. AND PARK
J.K. (2000) Tissue engineered artificial skin composed of dermis and epidermis.
Artificial Organs 24, 7-17.
YANNAS I.V., BURKE J.F., ORGILL D.P. AND SKRABUT E.M. (1982)
Wound tissue can utilize a polymeric template to synthesize a functional
extension of skin. Science 215, 174-176.
ZHAO J.F., ZHANG Y.J., KUBILUS J., JIN X.H., SANTELLA R.M.,
ATHAR M., WANG Z.Y. AND BICKERS D.R. (1999) Reconstituded 3-
dimensional human skin as a novel in vitro model for studies of carcinogenesis.
Biochemical and Biophysical Research Communications 254, 49-53.
79
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