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LUCIANA NOGAROLI CAVALCANTE
“A autotaxina e o ácido liso-fosfatídico na migração
e diferenciação de precursores de oligodendrócitos
cerebrais de roedores pós-natos”
TESE SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE
JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE
DOUTOR EM CIÊNCIAS
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
2 0 0 8
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ii
FICHA CATALOGRÁFICA
CAVALCANTE, Luciana Nogaroli
A autotaxina e o ácido liso-fosfatídico na migração e diferenciação de precursores
de oligodendrócitos cerebrais de roedores pós-natos /Luciana Nogaroli
Cavalcante – Rio de Janeiro: UFRJ/IBCCF, 2008
X, 130f.:il.
Orientadores: Cecília Hedin-Pereira e Babette Fuss
Tese (Doutorado) – UFRJ/IBCCF/Programa de Pós-graduação em Biofísica
Referências Bibliográficas: f.89–100
1. Autotaxina 2. Ácido liso-fosfatídico 3. Oligodendrócitos
4. Zona subventricular 5. Migração de progenitores
II. Universidade Federal do Rio de Janeiro
III. Título
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iii
O presente trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Neuroanatomia Celular do
Departamento de Anatomia da UFRJ, RJ – Brasil – e no Department of Anatomy and
Neurobiology, Virginia Commonwealth University, VA – Estados Unidos – sob
orientação da Dra. Cecília Hedin-Pereira e da Dra. Babette Fuss e na vigência dos
auxílios concedidos pelo Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento
(CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),
Programa de Doutorado no País com Estágio no Exterior – PDEE (CAPES), NIH-
National Multiple Sclerosis Society (B.F.) e Programa de Apoio a Núcleos de
Excelência/Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro
(PRONEX/FAPERJ) (C.H.P.).
iv
AGRADECIMENTOS
À professora Cecília Hedin Pereira pela amizade, orientação científica e apoio nos
momentos mais difíceis deste trabalho.
À professora Babette Fuss pela amizade, orientação e preocupação com minha
formação científica, sendo um exemplo de entusiasmo e união dentro do laboratório.
À professora Maira Fróes e ao professor João Menezes pelas orientações científicas
de todos os dias no laboratório.
Ao Leo Morita Myiakoshi pelos ensinamentos científicos, a amizade e o apoio
incondicional.
À Elisa Sasse pelo interesse e incrível dedicação ao trabalho. Além do prazer do
convívio.
Aos amigos do Laboratório de Neuroanatomia Celular pela amizade, o apoio do dia-
a-dia e por tornar o laboratório um ambiente divertido e prazeroso.
Aos amigos do Laboratório da Dra. Babette Fuss pela amizade; em especial ao Dr.
Jameel Dennis pelo entusiasmo e pelas constantes discussões científicas. Também
a Larra Yealling pelo incrível apoio nos momentos difíceis deste trabalho.
Ao Dr. Marcos Costa e Dr. Eduardo B. Sequerra pelos ensinamentos e discussões
científicas sempre produtivas e inquietantes.
Aos muitos que participaram deste trabalho comigo que, de alguma forma, direta ou
indiretamente, contribuíram para a sua realização.
v
SUMÁRIO
Lista de abreviaturas............................................................................................ vii
Resumo................................................................................................................ x
Abstract................................................................................................................ xi
1. INTRODUÇÃO................................................................................................. 1
1.1 - O desenvolvimento dos oligodendrócitos..................................................... 1
1.2 - O ácido liso-fosfatídico e seus receptores.................................................... 8
1.3 - A autotaxina................................................................................................. 12
1.3.1 - A atividade enzimática da ATX mediada pelo seu sítio ativo liso-PLD...... 14
1.3.2 - Propriedades do domínio MORFO............................................................ 16
1.3.3 - Expressão da ATX no sistema nervoso .................................................... 17
2. OBJETIVOS..................................................................................................... 21
3. MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................... 22
3.1 – Animais........................................................................................................ 22
3.2 – Anticorpos ................................................................................................... 22
3.3 - Cultura primária de células........................................................................... 24
3.3.1 - Preparação das placas para imunopanning .............................................. 24
3.3.2 - Seleção de progenitores A2B5
+
e OLGs O4
+
por immunopanning ........... 24
3.4 - Transfecção de oligodendrócitos com siRNA............................................... 26
3.5 - Tratamento das culturas com LPA exógeno ................................................ 27
3.5.1 - Culturas primárias..................................................................................... 27
3.5.2 - Células da linhagem CIMO ....................................................................... 28
3.6 - Cultura de células CIMO sobre mistura de substrato................................... 28
3.7 - Ensaio de Citotoxicidade com WST-1.......................................................... 29
3.8 - Imuno-citoquímica........................................................................................ 29
3.9 - Preparação de amostras para análise em immunoblotting e atividade Liso-PLD... 30
3.10 - Dosagem de proteínas totais ..................................................................... 31
3.11 - Análise de proteínas por Immunoblotting................................................... 31
3.12 - Ensaio da atividade liso-fosfolipase D........................................................ 32
3.13 - Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).................................................. 33
3.14 - PCR Quantitativo em Tempo Real (Real-Time PCR) ................................ 34
3.15 - Análise morfológica dos oligodendrócitos.................................................. 35
3.16 - Quantificação das células imuno-positivas para MBP................................ 36
3.17 - Análise morfométrica dos progenitores A2B5
+
........................................... 38
3.18 - Injeção intraventricular de LPA .................................................................. 38
3.19 - injeção intraperitoneal de BrdU.................................................................. 38
3.20 - Obtenção dos cortes histológicos............................................................... 39
3.21 - Imuno-histoquímica.................................................................................... 40
3.22 - Obtenção das imagens por microscopia confocal e de fluorescência........ 41
3.23 - Análise do número de células BrdU
+
.......................................................... 41
3.24 - Análise estatística ...................................................................................... 42
vi
4. RESULTADOS
CAPÍTULO I
4.1 - Expressão e atividade da ATX em oligodendrócitos.................................... 44
4.2 - Expressão de receptores de LPA por oligodendrócitos................................ 47
4.3 – O efeito de LPA exógeno na área total ocupada pela arborização ............. 47
4.4 – Resposta ao LPA exógeno é modulada pelo domínio MORFO da ATX em
células CIMO........................................................................................................ 51
4.5 - Efeito do LPA exógeno na morfologia de oligodendrócitos em condições sub-
reguladas de ATX................................................................................................. 57
4.6 - Efeito do LPA exógeno na formação de estruturas membranosas em condições
sub-reguladas de ATX.......................................................................................... 61
4.7 - Efeito do LPA exógeno na expressão de MBP em condições sub-reguladas de
ATX ...................................................................................................................... 64
CAPÍTULO II
4.8 - Efeito do LPA exógeno na morfologia de progenitores de oligodendrócitos in
vitro....................................................................................................................... 67
4.9 - Efeito do aumento de LPA no líquor sobre migração de células BrdU
+
in vivo
............................................................................................................................. 67
4. DISCUSSÃO.................................................................................................... 73
4.1 - O papel de LPA na maturação de oligodendrócitos .................................... 73
4.2 - LPA exógeno afeta a migração radial de progenitores da SVZ in vivo......... 78
5. CONCLUSÃO FINAL....................................................................................... 84
6. PERSPECTIVAS FUTURAS............................................................................ 85
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA .................................................................. 86
8. ARTIGOS PUBLICADOS ................................................................................ 98
8.1 - Lysophosphatidic Acid can Support the Formation of Membranous Structures
and an Increase in MBP mRNA Levels in Differentiating Oligodendrocytes......... 99
8.2 - Phosphodiesterase-Iα/Autotaxin’s MORFO domain regulates oligodendroglial
process network formation and focal adhesion organization................................ 111
8.3 - Phosphodiesterase-Ialpha/autotaxin (PD-Ialpha/ATX): a multifunctional protein
involved in central nervous system development and disease (Review).............. 125
vii
ABREVIATURAS
A2B5 gangliosídeo
ATX: autotaxina
BrdU: bromo-2-deoxi-5-uridina
BSA: albumina de soro bovina
BSA-FAF: albumina de soro bovino livre de ácidos graxos
cDNA DNA complementar
CIMO : células de linhagem oligodendroglial
CNPase: 2´, 3´- nucleotídeo cíclico-3´-fosfodiesterase
Cy3-TSA : Tyramid signal amplification Plus Cyanine
DAPI: 4´-6´-diamidino-2-phenyllindole
DIV: dias in vitro
DMEM: Dulbecco´s modified Eagle´s medium, meio de cultura de células
(E)NPPs ecto nucleotídeo fosfodiesterase pirofosfatase
Edg: genes de diferenciação endotelial
EGF: epidermal growth factor, fator de crescimento epidermal
FGFb: basic fibroblastic growth factor, fatordecrescimento basico de fibroblasto
FN: fibronectina
GFAP: glia fibrilary acidic protein, proteína fibrilar ácida glial
GPCRs: receptores acoplados à proteínas G
Hank´s: solução salina
HRP: horseradish peroxidase, peroxidase do rabanete
ICQ: imuno-citoquímica
INF interferon-
viii
LCE: líquido cérebro-espinhal
Liso-PLD: liso-fosfolipase D
LPA: ácido liso-fosfatídico
LPC: liso-fosfatidil colina
MBP: myelin basic protein, proteína básica de mielina
MEC: matriz extracelular
MOG: myelin oligodendrocyte glycoprotein, glicoproteína do oligodendrócito
MORFO: modulator of oligodrendrocyte remodelling and focal adhesion organization
NG2: proteoglicano
O/N: overnight, pernoite
O1: gangliosídeos
O4: galactocerebrosídeos sulfatado
OLGs: oligodendrócitos
PBS: phosfate buffer saline, solução tampão fosfato com salina
PC: plexo coróide
PCR: polymerase chain reaction, reação em cadeia da polimerase
PCRq: real time polymerase chain reaction, PCR em tempo real ou PCR quantitativo
PDGF: fator de crescimento de plaquetas
PDGFR receptor do fator de crescimento de plaquetas
PLP: proteína proteolipídica
pOLGs: progenitores de oligodendrócitos
PPARγ: peroxisome proliferator-activated receptor-gamma
PVDF: Hybond-P polyvinylidene difluoride
RNAm: RNA mensageiro
S1P : esfingosina 1-fosfato
ix
SB: substância branca
SC: substância cinzenta
SFB: soro fetal bovino
siATX: pool de fragmentos de RNAs complementarà ATX
siControle: pool de fragmentos de RNAs complementar à luciferase
siGLO pool de RNAs sem complementaridade marcados com fluoróforo, RISC-Free siRNA
siRNA: small interfering RNA. RNAde interferência
SNC sistema nervoso central
SVZ: subventricular zone, zona subventricular
T3: tri-iodo-tironina
TSA: tyramid signal amplification
VL: ventrículo lateral
VZ : ventricular zone, zona ventricular
WST-1: sal de tetrazolium
x
RESUMO
Durante o desenvolvimento pós-natal, os oligodendrócitos (OLGs) são
gerados na zona subventricular (SVZ) e migram radialmente para as substâncias
branca e cinzenta do córtex cerebral, onde mielinizam axônios. No processo de
diferenciação, os OLGs passam por diferentes etapas de maturação onde precisam
alterar drasticamente sua morfologia. Tanto progenitores de OLGs como OLGs
diferenciados expressão receptores de ácido liso-fosfatídico (LPA), mas apenas os
OLGs diferenciados expressam e secretam a principal enzima que sintetiza LPA, a
autotaxina (ATX). Contudo, o papel de LPA na migração e maturação de OLGs
ainda é desconhecido. Este estudo aborda o papel da ATX e do LPA em diferentes
etapas da diferenciação oligodendrocitária in vivo e in vitro.
Mostramos que a redução da expressão endógenas de ATX pelos OLGs in
vitro reduz tanto o comprimento dos prolongamentos quanto a complexidade da
arborização. A adição de LPA aumenta a formação de expansões da membrana
plasmática e a expressão da proteína básica da mielina (MBP). Estudos utilizando a
linhagem oligodendroglial imortalizada CIMO mostraram que o domínio MORFO
(modulador do remodelamento do OLG e organizador da adesão focal) da ATX
antagoniza o efeito de LPA sobre o citoesqueleto de actina. Dessa forma é possível
que em níveis reduzidos de ATX/MORFO, o LPA tenha plena ação sobre os OLGs –
o que não acontece na presença de níveis normais de proteína na cultura. Assim, a
ATX regularia de forma orquestrada sua ação na diferenciação dos OLGs de acordo
com a atividade dos seus domínios funcionais, onde primeiramente ATX (via
atividade do domínio MORFO) aumenta a complexidade celular e posteriormente
(via atividade de LPA) aumenta a formação da membrana de mielina e a expressão
de MBP.
Nos experimentos in vivo o aumento da concentração de LPA no líquor após
injeção intraventricular reduziu a densidade de células BrdU
+
na SVZ dorso-lateral
ao mesmo tempo em que aumentou na substância branca e cinzenta do córtex
sugerindo um efeito sobre o deslocamento destas células. Curiosamente, houve um
aumento na densidade de células BrdU
+
na SVZ medial. Conjuntamente, estes
resultados sugerem uma ação de LPA como modulador da proliferação e migração
de precursores gliais da SVZ para o parênquima cortical suprajacente.
Por fim, o LPA parece ter uma ação em diferentes estágios de diferenciação
de células da linhagem oligodendroglial: em estágios mais precoces, o LPA pode
regular eventos de proliferação, migração e diferenciação. Em estágios mais tardios,
o LPA regula eventos de maturação, como a formação de mielina.
xi
ABSTRACT
During postnatal development, oligodendrocytes (OLGs) are mainly generated
in the subventricular zone (SVZ) and migrate radially to the white and grey matters of
the cerebral cortex, where they myelinate axons. During differentiation OLGs go
through maturational steps which drastically alter their morphology. This study
investigates the roles of autotaxin (ATX) and lisophosphatidic acid (LPA) in different
stages of oligodendrocyte differentiation in vivo and in vitro.
We have shown that a reduction in endogenous levels of ATX in OLGs in vitro
reduces its arborization, affecting process length and complexity. The addition of LPA
increases the formation of plasma membrane expansions and the expression of
myelin basic protein (MBP). Studies with an oligodendroglial cell lineage (CIMO)
showed that the MORFO domain antagonizes the effect of LPA on actin
cytoskeleton. Therefore, it is possible that in reduced levels of ATX/MORFO, LPA
has full influence over OLGs, which does not normally occur with normal protein
levels in culture. Thus, ATX would orchestrate its actions in OLG differentiation
according to the activity of its functional domains, where first ATX (via MORFO
domain activity) increases cell complexity and later (via LPA activity increases the
formation of myelin membrane and MBP expression.
In vivo experiments, the increase in LPA concentration in the cerebrospinal
fluid after intraventricular infusion reduced the density of BrdU
+
cells in dorso-lateral
SVZ and increased the density of cells in cortical white and gray matters suggesting
an effect on cell displacement. Interestingly, medial SVZ showed an increase in
BrdU+ cell density. Taken together, these results suggest and action of LPA as a
modulator of proliferation and migration of glial precursors from SVZ to overlying
cortical parenchyma.
Finally, LPA appears to have an action in different stages of oligodendrocyte
lineage: Early on, LPA regulates pOLG proliferation and migration and later, LPA
regulates maturational events such as myelin formation by OLGs.
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 – O desenvolvimento dos oligodendrócitos
O sistema nervoso central (SNC) é composto de três principais classes de
células neurais derivadas do tubo neural: neurônios, astrócitos e oligodendrócitos
(OLGs) (Peters et al., 1990). Há outras células que compõem o tecido neural, no
entanto, tem diferentes origens, como por exemplo, a microglia, de origem
mesodérmica. Os OLGs são os responsáveis pela produção da mielina no SNC. A
mielina é definida como uma especialização da membrana plasmática dos OLGs,
rica em lipídeos e proteínas específicas (Barres e Barde, 2000). A membrana de
mielina envolve os axônios formando uma bainha rica em lipídeos que funciona
como isolante diminuindo a dissipação de carga elétrica ao longo do tronco axonal.
A bainha de mielina é descontínua, sendo intercalada por regiões livres de mielina
chamadas de nódulos de Ranvier. Estas regiões são ricas em canais de sódio
dependentes de voltagem e canais de potássio, importantes para a regeneração do
potencial de ação ao longo do axônio. O resultado é a condução rápida e saltatória
do impulso elétrico típica de axônios mielinizados (Sherman e Bropy, 2005). Um
único oligodendrócito é capaz de mielinizar até 60 diferentes axônios. A mielinização
é essencial ao funcionamento normal do SNC. Danos na mielina do SNC
ocasionadas por lesão, degeneração patológica ou disfunções genéticas levam a
graves deficiências neurológicas levando à incapacidade motora e até à morte. Um
exemplo disso é a esclerose múltipla, uma doença degenerativa autoimune que
provoca a desmielinização de tratos axonais pela ação de anticorpos que se ligam à
antígenos na mielina (Sauvageot e Stiles, 2002).
2
Durante a formação do SNC, os OLGs passam por sucessivos estágios de
desenvolvimento, onde eventos como geração de progenitores, proliferação,
migração, sobrevivência, diferenciação e maturação destas células resultam na
mielinização dos axônios. Também ocorre intensa remodelagem da morfologia
celular e expressão de diferentes marcadores de superfície (Figura 1) (Baumann e
Pham-Dinh, 2001; Pfeiffer et al., 1993). Primeiramente, temos o estágio de
progenitor, com forma bipolar, que se caracteriza por sua capacidade migratória e a
expressão dos marcadores A2B5 (anticorpo que reconhece gangliosídeos),
PDGFR (receptor do fator de crescimento de plaquetas) e o proteoglicano NG2.
Em um segundo estágio, o pro-oligodendrócito emite múltiplos prolongamentos, e
passa a expressar outros marcadores de superfície que são reconhecidos pelo
anticorpo monoclonal O4. O oligodendrócito imaturo expressa antígenos de
superfície reconhecidos pelo anticorpo monoclonal O1. Esta células, O1+ iniciam a
expressão de proteínas como a 2´, 3´- nucleotídeo cíclico-3´-fosfodiesterase (CNP) e
em seguida proteínas específicas da mielina como a proteína proteolipídica (PLP) e
a proteína básica de mielina (MBP). No contato físico com seus axônios alvo, o
oligodendrócito atinge seu estágio final de desenvolvimento, o oligodendrócito
mielinizante.
Durante o desenvolvimento do prosencéfalo, a geração dos três tipos celulares
ocorre em períodos distintos, mas apresenta um padrão de sobreposição entre eles
(Figura 2; Sauvageot and Stiles, 2002). Em ratos, o pico da oligodendrogênese
acontece em P14, contudo, a primeira onda de geração de OLGs ocorre durante o
período embrionário (Kessaris et al., 2006; Sauvageot and Stiles, 2002). No entanto,
estes OLGs são rapidamente eliminados do prosencéfalo antes do nascimento do
animal. A maior parte dos OLGs, que participa da mielinização na substâncias
3
Figura 1: Diferentes etapas do desenvolvimento de oligodendrócito. Os precursores de
oligodendrócitos originam-se nas zonas germinativas e migram dentro do SNC. Após
alcançarem seu destino final, tornam-se pró-oligodendrócitos pós-migratórios. Os pró-
oligodendrócitos perdem a capacidade proliferativa dando origem aos oligodendrócitos
imaturos. Estas células podem formar membranas de mielina in vitro ou bainha de mielina in
vivo, atingindo a fase final de desenvolvimento. Os diferentes estágios do desenvolvimento
dos oligodendrócitos podem ser identificados de acordo com marcadores celulares
específicos. O intervalo de expressão dos marcadores está mostrado nas linhas abaixo do
esquema. Os marcadores celulares incluem o anticorpo contra epítopo de gangliosídeo
(A2B5), proteoglicano (NG2), receptor do fator de crescimento de plaquetas, o PDGF
(PDGFR), galactocerebrosídeos sulfatados (O4), gangliosídeos (O1), 2,3-nucleotídeo
cíclico-3-fosfodiesterase (CNP), proteína básica da mielina (MBP) e proteína proteolipídica
(PLP).
A2B5
NG2
PDGF
R
O4
O1
CNP
MBP
PLP
Progenitor
Migratório
Pro
-
oligodendro
blasto
Pós-migratório
Oligodendrócito
Imaturo
Oligodendrócito
Mielinizante
in vitro
in vivo
4
Figura 2: Seqüência temporal da formação das três principais classes de células
neurais geradas no sistema nervoso central. A formação dos três tipos celulares dentro
do encéfalo apesar de apresentar sobreposição, é temporalmente distinta. Em ratos, o pico
de neurogênese ocorrem em E14, de astrogliogênese em P2 e de oligodendrogênese em
P14 (modificado de Sauvageot e Stiles, 2002).
Neurônios
Astrócitos
Oligodendrócitos
5
branca e cinzenta telencefálicas, é gerada após o nascimento e são originários de
precursores celulares da zona subventricular (SVZ) (Kessaris et al., 2006;
Richardson et al., 2006; Ventura e Goldman, 2006; Gorski et al., 2002). No
telencéfalo pós-natal, a camada germinativa de células da SVZ está posicionada
adjacente aos ventrículos. Esta é uma região densamente populada de progenitores
neurais capazes de proliferar por toda a vida em mamíferos (Altman e Bayer, 1990).
As células da SVZ dão origem não apenas aos OLGs, mas também aos
interneurônios do bulbo olfatório e a astrócitos (Suzuki e Goldman, 2003;
Parnavelas, 1999; Levison e Goldman, 1997; Lois e Alvarez-Buylla, 1994; Luskin e
Dermott, 1994; Levison e Goldman, 1993; Lois e Alvarez-Buylla, 1993; Luskin, 1993).
Tem sido postulado que estes três tipos celulares derivam de pelo menos duas
populações distintas de precursores migratórios: os precursores que migram
tangencialmente e se diferenciam em interneurônios e os que migram radialmente e
geram OLGs e astrócitos (Figura 3; Suzuki e Goldman, 2003).
Após a especificação fenotípica, os precursores de OLGs (pOLGs) migram em
direção ao parênquima, diferenciam-se e mielinizam os axônios que estão
distribuídos por todo o SNC. Recentemente, alguns trabalhos mostraram que a glia
radial poderia guiar ou pelo menos orientar a migração dos pOLGs no prosencéfalo
e na medula (Zerlin et al., 2004; Kakita e Goldman, 1999; Noll e Miller, 1993). O
arcabouço de glia radial, no entanto, é transitório e existe somente até sua
transformação em astrócitos (Noctor et al., 2004; Alves et al., 2002; Voigt, 1989).
Também foi demonstrado que os pOLGs estão intimamente associados ao trato
axonal, sugerindo que estas células possam se locomover através de migração
axonofílica, uma modalidade de migração importante para o deslocamento de
interneurônios GABAérgicos do teléncefalo basal até a placa cortical (Kessaris et al.,
6
Figura 3: Modelo das vias migratórias de progenitores da SVZ pós-natal. (A) Corte no
plano coronal. Vias migratórias dos progenitores gliais (G) para a substância branca e
substância cinzenta do córtex (setas laranja) e para o estriado (setas amarelas).
Progenitores neuronais (N) indicados pelos pontos roxos migram pela SVZ dorso-lateral no
plano perpendicular. (B) Plano parassagital, mostrando as vias migratórias dos progenitores
gliais (setas laranjas) e neuronais (setas roxas) para fora da SVZ. (C) Reconstrução da SVZ
(verde), do estriado (azul) e as correspondentes rotas migratórias dos progenitores
mostradas em (B). Migração em direção ao córtex dorsal (asterisco branco), córtex lateral
(asterisco vermelho) e córtex frontal (asterisco rosa). Setas amarelas indicam migração para
o estriado. (D) Reconstrução da SVZ (verde) e a via migratória de progenitores neurais
mostrada em A e B (retirado de Suzuki e Goldman, 2003).
7
2006). Neste sentido, a primeira onda de migração de OLGs, durante o período
embrionário, move-se tangencialmente e é similar à rota utilizada pelos
interneurônios GABAérgicos (Kessaris et al., 2006; Marshall e Goldman, 2002).
Independente do modo de migração (gliofílico, axonofílico ou livre), o
direcionamento dos pOLGs para fora da SVZ parece ser regulado por pistas
extracelulares repulsivas – fatores que possuem a capacidade de induzir a retração
de prolongamentos e assim alterar o sentido da migração (Wu et al., 1999). As pistas
moleculares que direcionam a migração dos interneurônios são foco de intensa
investigação e pistas comuns parecem afetar o movimento dos pOLGs (Tsai et al.,
2006; Jarjour et al. 2004; Cohen et al., 2003; Marin et al., 2003; Spassky et al. 2002;
Tsai e Miller, 2002; Sugimoto et al., 2001; Kiernan et al., 1996; Wang et al., 1994).
Por exemplo, sabe-se que pOLGs de nervo óptico respondem de forma direcionada
à semaforina IIIA (repulsivamente) e netrina-1 (repulsiva), ambas moléculas
envolvidas no direcionamento axonal e migração neuronal (Spassky et al., 2002).
Diferentes proteínas da matriz extracelular exercem efeitos diversos sobre os
pOLGs. Enquanto fibronectina e laminina promovem a migração, tenascina-C inibe a
migração de pOLGs (Frost et al, 1996; Kiernan et al., 1996). Não apenas
componentes da matriz extracelular são importantes para a migração dos pOLGs,
mas também fatores secretados podem modular o processo migratório. Entre estes
fatores estão o FGFb (sigla em inglês, basic fibroblastic growth factor), PDGF (sigla
em inglês, platelet-derived growth factor) e EGF (sigla em inglês, epidermal growth
factor) (Castro e Bribián, 2005).
Alguns destes fatores solúveis estão presentes nas proximidades do local de
geração de pOLG. Uma das prováveis fontes de fatores repulsivos, presentes na
SVZ que guiam os progenitores migratórios para fora da parede ventricular em
8
direção ao parênquima, é o plexo coróide (Sawamoto et al., 2006; Gard et al., 2004).
Um exemplo disso é a proteína slit, molécula com atividade modulatória negativa
(repulsiva) secretada pelas células epiteliais do plexo coróide. A ação repulsora
desta molécula é crucial para a migração dos neuroblastos para o bulbo olfatório
(Wu et al., 1999).
A diferenciação dos pOLGs em OLGs é um passo crítico para o
desenvolvimento da linhagem oligodendroglial mielinizante. Desta forma, após
pararem de migrar as células cessam a proliferação (Raff et al., 1990). A análise das
interações oligodendrócito-axôniais mostram que antes do primeiro contato com os
axônios, os OLGs pré-mielinizantes estendem múltiplos prolongamentos radiais que,
acredita-se, sejam importantes para a busca de axônios alvos para serem
mielinizados. Uma vez encontrado o axônio, a superfície dos ramos
oligodendrocitários se expande assim como seu citoplasma para iniciar o a formação
de um envoltório ao redor do axônio. Conforme este processo avança, há uma
redução no total de prolongamentos e inicia-se a expressão de proteínas associadas
à mielina como por exemplo MBP (sigla em inglês, myelin basic protein) (Dubois-
Dalcq et al., 1986). Este processo pode ser mimetizado in vitro na ausência de
axônio (Knapp et al., 1987). Entender a biologia dos OLGs, como são gerados,
migram e se diferenciam em células mielinizantes, é importante não só para
entender os mecanismos fisiológicos básicos de uma célula, mas também para obter
informações de possíveis reposições e/ou reparos após lesões no SNC.
Como indicado anteriormente, diferentes moléculas estão envolvidas na
regulação do desenvolvimento do oligodendrócito e no seu processo de mielinização
(Sherman e Brophy, 2005). Vários estudos apresentam indícios sugestivos do
envolvimento do ácido liso-fosfatídico (LPA) como um possível regulador da
9
diferenciação oligodendrocitária (; Yu et al., 2004; Cervera et al., 2002; Handford et
al., 2001; Moller et al., 1999; Allard et al., 1998; Weiner et al., 1998; Fuss et al.,
1997; Narita et al., 1994).
1.2 – O ácido liso-fosfatídico e seus receptores
O LPA é um tipo de liso-fosfolipídeo, caracterizado pela presença de um
glicerol, uma única cadeia de ácido graxo e uma grupamento polar. Em células do
SNC, o LPA mostrou ter efeito na mobilização de Ca
2+
, no aumento da proliferação
celular, na sobrevivência celular, na condutância de íons e em mudanças
morfológicas, como a retração de neuritos e o colapso de cones de crescimento
(Herr e Chun, 2007).
As ações fisiológicas do LPA são mediadas pela ativação de receptores de
membrana pertencentes à superfamília dos receptores acoplados à proteínas G
(GPCRs) (Valentine et al, 2007; Fukushima et al., 2004; Anliker et al., 2004; Chun et
al., 2002; Takuwa et al., 2002; Moolenar et al., 1999; Moolenar et al., 1995). Até o
momento foram descritos cinco tipos de receptores de LPA. Os três primeiros
identificados pertencem à família dos genes de diferenciação endotelial (Edg):
LPA1/Edg-2/vzg-1, LPA2/Edg-4 e LPA3/Edg-7. Receptores identificados mais
recentemente são pouco relacionados à família de receptores Edg (apenas 20 a
24% de homologia) e são mais relacionados à família de receptores purinérgicos:
GPR23/P2Y9 (LPA4) e GPR92 (LPA5) (Lee et al., 2006; Kotarsky et al., 2006;
Noguchi et al. 2003). A descoberta de que o PPARγ (da sigla em inglês peroxisome
proliferator-activated receptor-gamma) pode funcionar como receptor intracelular
10
reforçou ainda mais a idéia de quão complexos podem ser os mecanismos
subjacentes à sinalização por LPA (McIntyre et al, 2003).
O LPA1 é o receptor melhor caracterizado no sistema nervoso. Em
camundongos, foi mostrado que sua expressão obedece a variações espaço-
temporais durante o desenvolvimento (Fukushima et al., 2001). Em estágios
embrionários, o LPA1 é expresso predominantemente em neuroblastos da zona
ventricular (ZV) durante a neurogênese cortical (Hecht et al., 1996). Pouco antes do
nascimento, a expressão de LPA1 no córtex diminui, coincidindo com o final da fase
de proliferação da ZV cortical (Weiner et al., 1998; Hecht et al., 1996). Após o
nascimento, a expressão de LPA1 é detectada intensamente entre o décimo oitavo e
vigésimo primeiro dia pós-natal (P18 e P21). Esta expressão co-localiza com a
expressão de MBP, ou seja, ocorre em OLGs e coincide com os estágios iniciais da
mielinização (Weiner et al., 1998). Dessa forma, o perfil de expressão do LPA1 está
correlacionado com processos de neurogênese, migração neuronal e mielinização
(Fukushima e Chun, 2001; Fukushima et al., 2001; Chun, 1999).
O LPA2 e o LPA3 apresentam um padrão de expressão distinto do LPA1.
Durante o desenvolvimento embrionário, o LPA2 é expresso no córtex cerebral
humano e de camundongos, sendo praticamente indetectável no cérebro adulto
(Contos et al., 2000; Contos e Chun, 2000; An et al., 1998). Ainda no camundongo, o
LPA3 é expresso por volta do nascimento, mas não em etapas prévias do
desenvolvimento embrionário, e no adulto praticamente não é detectado no cérebro
(Contos et al., 2000). No cérebro humano, a expressão de LPA3 é proeminente na
amígdala, córtex frontal e hipocampo (Im et al., 2000).
O leque de possibilidades de ação do LPA, não é apenas decorrente dos
possíveis receptores aos quais pode ligar-se, mas também às diferentes proteínas G
11
associadas a esses receptores (Figura 4; Meyer zu Heringdorf e Jacobs, 2007).
Tanto LPA1 quanto o LPA2 podem associar-se a proteína Gi/0, Gq/11/14 e G12/13,
enquanto que o LPA3 pode ativar Gi/0 e Gq/11/14 (Fukushima, 2004). A ativação
destas proteínas G permite o desencadeamento de diferentes cascatas de
sinalização intracelular que podem levar ao estímulo de fosfolipase C, proteína
cinase C, Rho GTPases, proteínas Ras, proteína cinase ativada por mitógeno,
fosfoinositidio 3-cinase, além de inibição da adenilato ciclase.
Dentre as vias mais importantes de síntese de LPA está a via da autotaxina
(ATX) (Figura 5; que mostra também as outras vias conhecidas) que gera LPA a
partir da clivagem da liso-fosfatidil colina (LPC). Esta via de síntese é
particularmente relevante em OLGs uma vez que estas células expressam não só
receptores de LPA, mas também a enzima de síntese, a ATX. Além disso, o
processo de mielinização é o único evento no SNC que se correlaciona espaço-
temporalmente à expressão do LPA1 em um único tipo celular, o OLG diferenciado
(Yu et al., 2004; Cervera et al., 2002; Handford et al., 2001; Moller et al., 1999; Allard
et al., 1998; Weiner et al., 1998; Fuss et al., 1997; Narita et al., 1994;). Esta
observação sugere que no OLG diferenciado, o LPA produzido pode, de forma
autócrina, ligar-se ao receptor presente na membrana do próprio OLG, ou então, de
forma parácrina, estimular células vizinhas como neurônios e/ou astrócitos. Devido a
marcante expressão de LPA1 em OLGs diferenciados, vários trabalhos têm tentado
mostrar o papel do LPA no processo de diferenciação, maturação e mielinização por
estas células (Yu et al., 2004; Dawson et al., 2003; Stankoff et al., 2002; Moller et al.,
1999).
12
Figura 4: Receptores do ácido-lisofosfatídico e suas vias de sinalização. Abbreviações:
AC, adenilato ciclase; COX, ciclooxigenase; ERK, proteína cinase ativada por mitógeno; Akt,
proteína cinase B; PLC, fosfolipase C (retirado de Meyer zu Heringdorf e Jakobs, 2007).
Receptores Ligantes Distribuição no tecido Vias de transdução de sinais e efeitos celulares
13
Figura 5: Esquema das vias de síntese e degradação de ácido liso-fosfatídico. O LPA
pode ser formado extracelularmente por duas vias. O ácido fosfatídico (PA) pode ser
desacilado pela fosfolipase A1 (PLA1) ou a fosfolipase A2 secretada (sPLA2). A principal via
de síntese é a da autotaxina (ATX) que gera LPA pela clivagem da liso-fosfatidil colina
(LPC). A ATX é secretada como uma proteína solúvel. Depois de formado, o LPA liga-se a
seus receptores presentes na membrana, ou ainda pode ligar-se a receptores intracelulares
(PPAR). O LPA tem seus níveis controlados por enzimas como a lipídeo fosfatase (LPP) e
a lipídeo acil-transferase (LPAAT) que o transformam em outros lipídeos, controlando sua
atividade (retirado de Meyer zu Heringdorf e Jakobs, 2007).
14
1.3 – A autotaxina
A primeira menção à ATX na literatura científica data do início dos anos 90,
quando esta foi identificada durante a busca de fatores estimulatórios da metástase
tumoral (Stracke et al., 1992; 1993). O isolamento do cDNA, codificando para uma
glicoproteína de 125kDa, e o sequenciamento feito em seguida revelaram que a ATX
não exibia nenhuma homologia significativa com os fatores tumorais envolvidos em
crescimento e motilidade celular. No entanto, foi descoberto que a ATX contém um
domínio apresentando alta homologia com o domínio enzimático de proteínas
conhecidas por possuírem atividade nucleotídeo fosfodiesterase e pirofosfatase
(Murata et al., 1994; Buckley et al., 1990; Culp et al. 1985). Subsequentemente, foi
descoberto que essa homologia entre a ATX não se restringia ao sítio ativo, mas era
também presente ao longo de todos os segmentos extracelulares. Além disso, ficou
claro que as duas proteínas compartilhavam propriedades adicionais e domínios,
notadamente dois domínios “somatomedin B-like”, um domínio “nuclease-like”
(considerado cataliticamente inativo), e uma sequência “EF hand-like”. Devido à
homologia da porção N-terminal da ATX com proteínas da família, foi originalmente
interpretada como representando um domínio transmembranar, conferindo desta
forma um caráter de transmembrana do tipo II à ATX. No entanto não está claro se a
ATX é sintetizada como uma pre-pro-enzima, secretada após a remoção do peptídeo
sinal N-terminal e posteriormente clivada por uma protease do tipo furina (Pradere et
al. 2007; van Meeteren et al. 2005). Nos anos seguintes ao isolamento e
sequenciamento do cDNA da ATX, outras proteínas com domínios similares em
estrutura e função foram identificadas, levando à definição de uma nova família de
proteínas chamada ecto-nucleotídeo fosfodiesterase pirofosfatase ((E)NPP), que
15
atualmente consiste de sete moléculas diferentes (Stefan et al., 2005; Bollen et al.
2000; Goding et al., 1998).
O corolário da caracterização estrutural (e propriedades funcionais) da ATX
foi investigar quais seriam os domínios responsáveis pelo seu papel funcional.
Utilizando proteínas recombinantes de ATX Lee et al. (Lee et al., 1996) descobriram,
logo após a descrição da seqüência gênica da ATX, que o domínio catalítico desta
enzima é crucial para o estímulo à motilidade celular. Esse achado naturalmente
estimulou à busca da caracterização detalhada da atividade catalítica da ATX e sua
relação com a atividade de outros membros da família das (E)NPPs. No início foi
descrito que todas as (E)NPPs hidrolisavam ligações pirofosfato ou fosfodiester em
di-nucleotídeos e seus derivados (Bollen et al. 2000). No entanto, seus verdadeiros
substratos fisiológicos permanecem em grande parte desconhecidos. O que tem
ficado cada vez mais claro, no entanto, é que embora os (E)NPPs tenham um
domínio catalítico estruturalmente relacionado, eles diferem em relação à
especificidade dos seus substratos (Stefan et al., 2005; Cimpean et al., 2004;
Gisjsbers et al. 2001).
Em relação à ATX, a pista mais importante em relação ao seu provável
substrato fisiológico foi originada a partir das investigações sobre o lipídeo
sinalizador LPA. A descoberta de uma enzima catalítica extracelular responsável
pela conversão de LPC em LPA, isto é, uma Liso-PLD extracelular, revelou que a
ATX é funcionalmente idêntica à esta Liso-PLD extracelular (Xie et al., 2004; Ferry et
al. 2003; Tokumura, 2002; Umezu-Goto et al., 2002). No entanto, ficou claro que a
afinidade da ATX por LPC é significativamente maior que sua afinidade por
nucleotídeos, sugerindo assim uma preferência pela conversão enzimática do LPC
em detrimento de nucleotídeos (Todumura et al., 2002; Umezu-Goto et al., 2002). A
16
revelação de que a ATX poderia exercer seus efeitos biológicos por meio de sua
atividade liso-PLD claramente estabeleceram um divisor de águas em relação aos
estudos relacionados à ATX (Moolenar et al., 2002).
1.3.1 - A atividade enzimática da ATX mediada pelo seu sítio ativo Liso-PLD
Uma vez que o domínio Liso-PLD da ATX foi identificado, a caracterização da
atividade enzimática desta molécula foi revisitada. A atividade NPP da ATX foi
considerada por muito tempo como dependente de um único sítio de treonina
localizado no domínio catalítico (Clair et al., 1997). A análise mutacional mostrou que
o mesmo resíduo é crítico para a atividade Liso-PLD da ATX e que esta atividade
possui um mecanismo em comum com a atividade nucleotideo-5` fosfodiesterase
descrita originalmente (Gijsbers et al. 2003; Koh et al. 2003). No entanto, dentro da
família das proteínas (E)NPP, a atividade Liso-PLD parece ser exclusiva da ATX e
parece depender, além do crítico resíduo de treonina, sequências de aminoácidos
integrantes dos domínios C- e N- terminais da proteína (Stefan et al., 2005; Cimpean
et al., 2004; Gijsbers et al., 2003). Recentemente foi proposto que a especificidade
em relação ao substrato da atividade liso-PLD estende-se ao fosfoesfingolipídeo
esfingosina fosforilcolina (SPC), sugerindo dessa forma que a ATX não só é capaz
de gerar LPA, mas também esfingosina 1-fosfato (S1P) (Clair et al., 2003). Enquanto
esta propriedade catalítica da ATX está bem estabelecida in vitro, sua relevância
fisiológica in vivo ainda precisa ser demonstrada (van Meeteren et al., 2007). A ATX
plasmática é constitutivamente ativa e o LPC é abundante na membrana plasmática
e no soro (Croset et al., 2000). No entanto o nível de LPA é reconhecidamente
baixo, sugerindo que a atividade enzimática da ATX é regulada negativamente in
17
vivo (Baker et al., 2002; Sano et al., 2002; Eiccholtz et al.,1993). Na verdade os
produtos do sítio liso-PLD da ATX, LPA e S1P, parecem inibir a atividade enzimática
em concentrações biológicas relevantes (van Meeteren et al., 2005). Por outro lado,
devem existir mecanismos regulatórios de estímulo à produção dessas moléculas,
uma vez que os níveis séricos de LPA aumentam gradualmente após a ativação de
plaquetas (van Meeteren et al. 2007).
A atividade liso-PLD da ATX tem sido descrita em diversos processos
biológicos, durante o desenvolvimento normal e sob condições patológicas (Goding
et al., 2003). Durante o desenvolvimento participa de processos de adipogênese,
movimento celular intestinal e estruturação da morfologia de neurônios (Khurana et
al., 2008; Sato et al., 2005; Simon et al., 2005), enquanto em condições patológicas
os efeitos incluem participação em doença de Alzheimer, Hepatite crônica do tipo C,
Esclerose múltipla, processos de dor neuropática, obesidade e artrite reumatóide
(Zhao et al., 2008; Ferry et al, 2003; Santos et al., 1996).
1.3.2 - Propriedades do domínio MORFO
Estudos em OLGs revelaram que a ATX apresenta um segundo domínio
funcional, o domínio MORFO (do inglês, modulator of oligodrendrocyte remodelling
and focal adhesion organization). Este domínio foi caracterizado como um fator
extracelular envolvido na diferenciação de OLGs (Figura 6; Dennis et al., 2008; Fox
et al., 2003) e possui três características particulares: 1) está localizado na porção C-
terminal da proteína; 2) possui um domínio “nuclease-like” que não é considerado
cataliticamente ativoe 3) funciona independentemente da atividade enzimática da
ATX (Dennis et al., 2008; Dennis et al., 2005; Stefan et al., 2005; Fox et al., 2004;
18
Figura 6: Representação esquemática da autotaxina. Domínio hidrofóbico que funciona
como um peptídeo sinal para a clivagem na região a seguir (cabeça de seta). Dominio
“somatomedin B-like”. Domínio catalítico. Domínio “nuclease-like” que contém o motivo
“EF-hand-like” ( ). Os domínios funcionais também estão representados: o domínio
catalítico e o domínio MORFO. A sigla GPCR, representa os receptores acoplados a
proteína G envolvidos na sinalização pelos lipídeos LPA e S1P. As setas indicam os locais
conhecidos de processamento do RNA da ATX. A escala representada no topo da figura
indica o número de aminoácidos a partir do códon iniciador da metionina (retirado de Dennis
et al., 2005).
19
Fox et al., 2003; Gijsbers et al., 2001). Estudos iniciais revelaram que o domínio
MORFO é capaz de antagonizar a adesão de OLGs a moléculas presentes na matriz
como fibronectina, por meio de um processo ativo, que pode ser inibido pela toxina
pertussis (Fox et al., 2003). Estes achados implicam na classificação da ATX como
uma proteína da matriz extracelular, isto é, uma proteína que medeia um estado de
adesão intermediário, sugerindo dessa forma o envolvimento da ATX no
remodelamento celular por meio de seu domínio MORFO (Murphy-Ullrich et al,
2001). Reforçando esta hipótese, dados recentes demonstraram que o domínio
MORFO da ATX facilita a maturação morfológica de OLGs pré-mielinizantes, que
consistem das células pós-migratórias que ainda não expressam as proteínas
específicas de mielina (Dennis et al., 2008).
O fato dos efeitos do domínio MORFO da ATX durante o processo de
diferenciação serem mimetizados apenas parcialmente pelo domínio MORFO sugere
que um sítio ativo adicional poderia estar localizado dentro do domínio MORFO
(Dennis et al., 2008). O mais interessante é que a atividade enzimática da ATX e sua
habilidade de atuar como estimulante da mobilidade celular parece não ser
dependente do EF hand-like motif (Lee et al., 2001).
Na tentativa de caracterizar as bases moleculares subjacentes aos efeitos do
domínio MORFO da ATX durante a extensão de prolongamenos, foi descoberto que
este domínio medeia a formação de complexos de adesão focal (Dennis et al., 2008;
Fox et al., 2004). Em particular, foi revelado que o domínio MORFO estimula a
desfosforilação do resíduo de tirosina 925 da cinase de adesão focal e promove a
redistribuição da paxilina e da α-actinina para fora dos complexos de adesão. O
efeito de redistribuição da paxilina pode ser mimetizado por um peptídeo
correspondente à região EF hand loop, sugerindo que o motivo EF hand-like é
20
suficiente e necessário para que o domínio MORFO da ATX exerça seu efeito
(Dennis et al., 2008).
Os complexos de adesão focal são complexos e multi-moleculares de
sinalização que estabelecem uma ligação entre o citoesqueleto de actina e a matriz
extracelular (Zamir e Geiger, 2001a, Zamir e Geiger, 2001b). Para controlar o
remodelamento da morfologia celular, os complexos de adesão focal devem ter uma
alta taxa de renovação (turnover) constante, o que por sua vez leva à redução na
efetividade da ligação entre a MEC e o citoesqueleto (Webb et al., 2002). Desta
forma, é natural especular que a ATX, por meio do seu domínio MORFO, e em parte,
pelo EF hand-like motif, regula a dinâmica dos complexos de adesão focal,
permitindo o estabelecimento de um complexo e extenso processo de redes de
membrana pelos OLGs pós-migratórios, pré-mielinizantes.
1.3.3 - Expressão da ATX no sistema nervoso
A ATX é expressa no tecido embrionário e pós-natal. A análise da expressão
por hibridização in situ, durante o desenvolvimento embrionário do camundongo,
revela a presença da ATX a partir dos estágios iniciais da formação do embrião. A
ATX é expressa pelas células da placa do assoalho do tubo neural – por volta de
E10.5 – e pelas células epiteliais do plexo coróide – por volta de E12.5 (Bächner et
al., 1999). Durante o desenvolvimento pós-natal, tanto em ratos como em
camundongos, foram mostrados altos níveis de expressão pelas células do plexo
coróide e por OLGs (Bächner et al., 1999; Fuss et al., 1997). A expressão em OLGs
é iniciada por volta de P5 com pico de expressão em P20, coincidindo com os
estágios intermediários da diferenciação deste tipo celular e com eventos que
21
antecedem a formação da bainha de mielina (Fuss et al., 1997). Já no cérebro adulto
de camundongos, altos níveis de expressão podem ser encontrados em células
epiteliais secretoras como as do plexo coróide, do epitélio ciliar, células pigmentares
da íris e da retina, células leptomeningeais, células vasculares do SNC, além de
cartilagem e ossos cranianos (Sato et al., 2005; Hoelzinger et al., 2005; Fuss et al.,
1997; Lee et al, 1996; Narita et al., 1994). No tecido humano, ATX é principalmente
expressa no cérebro, placenta, ovário e intestino delgado (Lee et al., 1996).
As células epiteliais do plexos coróide (PC) são responsáveis pela secreção e
composição do líquido cérebro-espinhal (LCE), fluido que circula dentro dos
ventrículos, ao redor do encéfalo e medula (para revisão, Segal, 2001). O PC é
formado por uma camada única de células epiteliais que apresentam inúmeras
microvilosidades voltadas para a luz do ventrículo. Muitas destas células apresentam
longos cílios cujos batimentos são importantes para o fluxo do LCE e para a criação
de um gradiente de concentração de solutos dentro dos ventrículos (Sawamoto et
al., 2006; Segal, 2001). Cada vez mais, o PC é reconhecido como uma fonte de
neuropeptídeos, citocinas e fatores de crescimento, expondo o parênquima cortical a
moléculas sinalizadoras. Alguns estudos sugerem que estas moléculas influenciam o
desenvolvimento, manutenção e reparo do SNC (Segal, 2000; Strazielle e Ghersi-
Egea, 2000; Johanson et al., 2000). Uma das regiões que potencialmente sofre a
influência de moléculas do LCE é a SVZ.
A importância das interações moleculares para a migração de progenitores da
SVZ tem sido amplamente estudada. Já foram identificadas moléculas envolvidas
neste evento, como por exemplo, slit, netrina, relina, PSA-NCAM e 9-O-acetil GD3
(para revisão, Menezes et al., 2002; Hatten, 1999). Um exemplo de molécula
presente no LCE que pode modular a migração das células da SVZ é a proteína slit.
22
Estudos in vitro e in vivo demostraram que as proteínas Slit1 e 2, secretadas pelas
células do PC e do septum no LCE, estabelecem um gradiente quimiorepulsivo de
concentração orientando a migração das células da SVZ em direção ao bulbo
olfatório (Sawamoto et al., 2006; Nguyen-Ba-Charvet et al., 2004). Existem
evidências de que a ATX possa estar disponível para as células migratórias da SVZ,
visto que a ATX está presente no LCE é possível que o domínio MORFO da ATX
exerça uma função em processos regulatórios da migração e diferenciação destas
células.
Conforme mencionado, a ATX é expressa pelas células epiteliais do PC e está
presente no LCE (Umemura et al., 2006; Sato et al., 2005; Hammack et al., 2004;
Bächner et al., 1999; Fuss et al., 1997). Observações feitas in vitro mostraram que a
ATX presente no LCE de cães adultos era capaz de provocar mudanças
morfológicas em células PC12 (linhagem celular neuronal) via produção de LPA
(Sato et al., 2005). A adição de LCE, na presença de LPC exógeno, provocou
retração de neuritos nas células PC12. Também mostraram que a concentração de
LPA aumentava com o tempo de incubação das células com o LCE, indicando que
as células PC12 forneciam o substrato necessário (LPC) para a reação enzimática
da ATX. Estes resultados sugerem que ATX via formação de LPA pode regular o
movimento de células neuronais.
Outros dois estudos corroboram um possível papel da ATX do LCE. Foi
mostrado que pacientes com esclerose múltipla e Alzheimer, doenças degenerativas
que levam a perda de células neurais, apresentam níveis aumentados de ATX no
LCE (Umemura et al., 2006; Hammack et al., 2004). Esta observação sugere o
envolvimento da ATX, por meio de seu sítio ativo e/ou de seu domínio MORFO, na
patologia ou no reparo do tecido nervoso.
23
2. OBJETIVOS
1. Estudar o papel do LPA na morfologia de OLGs em cultura primária.
2. Relacionar possíveis efeitos de LPA com a atividade funcional do domínio
MORFO.
3. Verificar a influência de LPA sobre a migração de progenitores OLGs de in
vitro e in vivo.
24
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 - Animais
Os animais utilizados na primeira parte do estudo (capítulo I) foram ratos da
linhagem Sprague–Dawley, obtidos das empresas Zivic Miller (Pittsburg, PA, EUA)
ou Harlan (Indianapolis, IN, EUA).
Nos experimentos realizados na segunda parte (capítulo II) desta tese, os ratos
utilizados foram da linhagem Wistar, mantidos pelo biotério do Departamento de
Anatomia, do Instituto de Ciências Biomédicas, no Centro de Ciências da Saúde da
Universidade Federal do Rio de Janeiro. Estes animais foram mantidos em ciclo
claro/escuro de 12 h e com ração à vontade. O dia de nascimento dos filhotes foi
considerado como o dia 0 (P0).
Todos os procedimentos realizados nos animais estão de acordo com as leis
estadunidenses e brasileiras para experimentação animal, previamente aprovados
pelos Comitês para uso de animais em experimentação das instituições envolvidas.
3.2 – Anticorpos
As especificações dos anticorpos utilizados neste trabalho, nas técnicas de
imuno-citoquímica, imuno-histoquímica e immunoblotting, podem ser encontradas
nas tabelas abaixo (Tabela 1 e Tabela 2).
25
Tabela 1: Especificação dos anticorpos primários.
Anticorpo primário Especificação Origem Marcador de
A2B5
(anticorpo que
reconhece motivos em
gangliosídeo)
camundongo IgM,
monoclonal
Hibridoma clone A2B5,
ATCC
Progenitor glial
ATX 100A
(glicoproteína
secretada)
coelho IgG,
policlonal
Gentilmente cedido por J.
Aoki
BrdU
(análogo da timidina)
camundongo IgG,
monoclonal
Amersham#RP1000 Fase S do ciclo
celular
LPA1 (Edg-2)
(receptor de
membrana)
coelho IgG,
policlonal
Abcam#ab12250
Receptor de LPA
LPA2 (Edg-4)
(receptor de
membrana)
coelho IgG,
policlonal
Santa Cruz#sc25490
Receptor de LPA
LPA3 (Edg-7)
(receptor de
membrana)
coelho IgG,
policlonal
Santa Cruz#sc25492
Receptor de LPA
O4
(anticorpo que
reconhece motivos em
gangliosídeo)
camundongo IgM,
monoclonal
Hibridoma clone O4,
gentilmente cedido por S.
Pfeiffer
Oligodendrócito
imaturo
GFAP
(filamento
intermediário)
coelho IgG,
policlonal
Dako# Astrócito
Nestina
(filamento
intermediário)
camundongo IgG,
monoclonal
Chemicon# MAB353 glia radial e outros
progenitores neurais
Tabela 2: Especificação dos anticorpos secundários.
Anticorpo secundário (especificação) Origem
Alexa488 anti-IgM de camundongo
Invitrogen#A21042
Alexa488 anti-IgG de camundongo
Invitrogen#A11008
anti-IgG de camundongo conjugado à Cy3 Jackson Immuno Research
horseradish peroxidase (HRP) anti-coelho Vector Laboratories#PI-1000
Kit Tyramid signal amplification Plus Cyanine 3 (Cy3-TSA)
PerkinElmer
26
3.3 - Cultura primária de células
3.3.1 - Preparação das placas para imuno-seleção dos progenitores gliais
A2B5
+
e OLGs O4
+
Para cada preparação, utilizando 10 a 12 animais pós-natos, quatro placas de
150 mm, não tratadas (Corning # 351058), receberam 12,5 L de IgM e 25 mL de
tampão Tris/HCl 50 mM, pH 9,5 e foram incubadas à temperatura ambiente por 2 h
ou à 4
o
C durante toda a noite. Em seguida, o tampão foi substituído por meio
condicionado de hibridoma (previamente produzido e armazenado à -80
o
C)
contendo anticorpos A2B5 ou O4 (diluídos 1:1 em DMEM/ SFB 10%). As placas
foram incubadas à 4
o
C por toda noite. No dia seguinte, pouco antes de serem
utilizadas, as placas foram delicadamente lavadas, 2 vezes com PBS 0,1 M, e
incubadas com PBS 0,1 M à 37
o
C/ 5% CO
2
.
3.3.2 - Seleção de progenitores gliais A2B5
+
e OLGs O4
+
por immunopanning
As culturas primárias de progenitores gliais, a partir de cérebros de ratos P2, e
OLGs imaturos, a partir de cérebros de ratos P4, foram preparadas pela técnica de
immunopanning utilizando anticorpos A2B5 e O4, respectivamente (Fox et al., 2003;
Barres et al., 1992). No imunoplaqueamento, 10 a 12 animais de uma mesma
ninhada, foram decapitados e seus cérebros retirados da caixa craniana. Após
remoção dos bulbos olfativos, cerebelos e pia máter, os encéfalos foram macerados
em 5 mL de tampão Hank´s gelado e incubados na presença de DNAse 1 g/mL e
tripsina 0,25% por 15 min à 37
o
C em banho-maria, com homogeneização suave em
27
intervalos de 5 min. A reação enzimática foi interrompida pela adição do mesmo
volume de meio contendo soro (DMEM/ SFB 10%) e após centrifugação do tubo à
1.000 rpm por 5 min, o sobrenadante foi descartado cuidadosamente com o auxílio
de uma pipeta de 10 mL. O precipitado foi ressuspenso em 5 mL de DMEM/ SFB
10% e aspirado cinco vezes com seringa e agulha 16G1 e três vezes com seringa e
agulha 22G1. O homogenato de células isoladas teve seu volume elevado à 40 mL
com DMEM/ SFB 10%, e este foi distribuído em volumes iguais entre as quatro
placas de 150 mm, previamente preparadas com IgM e anticorpo A2B5 ou O4 (vide
preparação das placas abaixo), e incubado à 37
o
C/ 5% CO
2
. Após o tempo de
incubação, o meio de cultura das placas foi removido e iniciou-se um protocolo de
lavagem das placas com DMEM/ SFB 10% com o objetivo de remover as células
aderidas à placa de cultura. O volume resultante das lavagens foi filtrado em filtros
com poros de 40 m (BD Falcon#352350) e centrifugado à 1.000 rpm por 5 min. O
sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspenso em 10 mL de DMEM/ SFB
10% e plaqueado em placas, não tratadas, de 100 mm (Fisher#0875713). Esta
etapa é chamada de etapa de adesão diferencial, e é realizada para reduzir a
contaminação por astrócitos, uma vez que estes aderem primeiro ao plástico da
placa (Barres et al., 1992). As placas foram incubadas à 37
o
C/ 5% CO
2
por 10 min
e, em seguida, o meio foi removido e centrifugado à 1.000 rpm por 5 min. O
precipitado de células foi ressuspenso em meio de cultura na ausência de soro. No
caso de culturas de progenitores gliais A2B5-positivos (A2B5
+
), as células foram
ressuspensas em DMEM (Invitrogen#11995-065) contendo N2 1x (Invitrogen),
PDGF-AA 10 ng/mL (Invitrogen) e FGFb 5 ng/mL (Invitrogen). Este meio de cultura
mantém o estado imaturo e proliferativo das células. Para a cultura de OLGs
imaturos O4-positivos (O4
+
), as células são ressuspensas em meio de diferenciação
28
DMEM (Invitrogen#11995-065) contendo N2 1x e T3 40 ng/mL. Em ambas as
culturas, 3 x 10
4
células foram plaqueadas em lamínulas redondas previamente
preparadas com fibronectina 10 µg/mL (fibronectina de rato, Calbiochem#341668),
em placas de 24-poços. Após 1 h de incubação à 37
o
C/ 5% CO
2
, 450 L de meio de
cultura (DMEM/N2/T3) era adicionado. 24 h após o plaqueamento, o meio de cultura
das células era renovado. As culturas de progenitores gliais A2B5
+
eram mantidas
por 3 dias in vitro (3 DIV), enquanto as culturas de OLGs eram mantidas por 4 DIV.
Estes tempos em cultura são suficientes para aumentar o número de progenitores
por proliferação e permitir a extensão da arborização, respectivamente.
3.4 - Transfecção de OLGs com siRNA
A redução da expressão de ATX em OLGs foi realizada utilizando a técnica do
RNA de interferência ou siRNA (sigla em inglês de small interfering RNA) (Dennis et
al., 2006). No segundo dia in vitro, os OLGs em cultura foram incubados por 3 h por
DMEM/N2/T3 (na ausência de antibiótico) e uma mistura contendo lipofectamina
0,3% (Invitrogen), meio OptiMEM (Invitrogen) e 100 nM de siATX (siGenome Smart
pool ENPP2, Dharmacon#M-088743-00) ou siControle (siControle Non-targeting
siRNA pool, Dharmacon#D-001206-13-05). Em seguida, o meio contendo
lipofectamina foi substituído pelo DMEM/ / N2 1x/ T3 40 ng/mL e as células foram
mantidas em cultura por mais 2 dias. Ao final do 4º dia em cultura (e 48 horas após a
transfecção), as células foram utilizadas nos experimentos.
Para verificar a eficiência da transfecção, as células foram co-transfectadas
com siGLO (um pool de RNAs sem complementaridade marcados com um fluoróforo
- siGLO RISC-Free siRNA, Dharmacon#D-001600-01-05). A presença de siGLO no
29
interior da célula pode ser visualizada em microscópio confocal, utilizando um
comprimento de onda de excitação semelhante ao de Cy3 ou Rodamina (emissão
máxima em 570 nm). Os níveis de RNAm de ATX foram analisados por PCRq (ver
item 3.13 desta seção). A eficiência funcional da transfecção, ou seja, a redução dos
níveis de ATX foi verificada por immunoblotting a partir de 50 g da proteína total do
meio condicionado utilizando anticorpos contra ATX (1:1.000) - ver item 3.10 desta
seção).
3.5 – Preparação da solução de LPA e tratamento das culturas com LPA
exógeno
3.5.1 – Preparação da solução de LPA
Em condições estéreis, 5 L de LPA 52,5 mM (18:1; 1-oleoil-2-hidroxi-sn-
glicero-3-fosfato, diluído em clorofórmio, Avanti#857130) foi adicionado em um tubo
de vidro, previamente siliconizado. Após completa evaporação do clorofórmio, e
formação de um filme lipídico, 1 mL de DMEM contendo BSA-FAF 0,4% (albumina
de soro bovino livre de ácidos graxos, Sigma#A8806) foi adicionado ao tubo. A
solução estava pronta para uso após ser homogeneizada, sonicada por 30s em
sonicador de banho e incubada à 37
o
C em banho-maria por 5 min. A partir desta
solução de LPA 125 M, outras soluções de concentração inferior eram produzidas
diluindo-se em DMEM/ N2. Imediatamente antes de cada experimento uma nova
solução de LPA era preparada.
30
3.5.2 - Culturas primárias
Para o tratamento com LPA as células de cultura primária eram incubadas à 37
o
C/ 5% CO2 em DMEM/ N2 contendo LPA, nas concentrações e tempos indicados
em cada figura. Transcorrido o tempo de incubação, as células eram fixadas em
paraformaldeído 4% por 15 min à temperatura ambiente e, em seguida, lavadas 3
vezes em PBS 0,1 M por 5 min.
3.5.3 - Células da linhagem imortalizada CIMO
As células da linhagem oligodendroglial imortalizada CIMO foram mantidas em
meio DMEM contendo 5% SFB e interferon- (INF1 g/mL) à 33
o
C. Quando as
células CIMO foram utilizadas nos experimentos, 2,5 x 10
3
células foram plaqueadas
em FN 10 g/mL 24 h antes de cada experimento em DMEM/5 % SFB/0.01 % INF.
Duas horas antes da incubação com LPA as células eram incubadas em meio sem
soro (DMEM/N2), nas concentrações e tempos indicados em cada figura, à 33
o
C/
5% CO2. Transcorrido o tempo de incubação, as células foram fixadas em
paraformaldeído 4% por 15 min à temperatura ambiente e, em seguida, lavadas 3
vezes em PBS 0,1 M por 5 min.
3.6 - Cultura de células CIMO sobre mistura de substrato
O efeito do domínio MORFO foi investigado em células CIMO cultivando-as em
uma mistura de substrato contendo 10 µg/mL de FN e 50 µg/mL do fragmento
peptídico da região C-terminal da ATX contendo o domínio MORFO (como controle
31
foi utilizado a -galactosidase a partir do gene LacZ). Tanto o fragmento peptídico
contendo o domínio MORFO, quando o peptídeo -Gal são proteínas de fusão
contendo uma cauda His como “tag”. A produção e purificação das proteínas de
fusão estão descritas em trabalhos anteriores (Fox et al., 2004). Antes de serem
utilizadas, as proteínas de fusão tiveram sua função anti-adesiva avaliada em ensaio
de adesão utilizando as próprias células CIMO (Fox et al., 2004).
3.7 – Ensaio de Citotoxicidade com WST-1
O ensaio de citotoxicidade utilizando o reagente WST-1 (sal de tetrazolium,
Roche#1644807) foi realizado conforme instruções do fabricante e do artigo de
Buntinx e colaboradores (Buntinx et al., 2004). Desta forma, 1 x 10
4
células foram
plaqueados em placas de 96-poços previamente preparadas com fibronectina 10
µg/mL. Os OLGs foram mantidos em cultura por 4 dias e ao final deste tempo as
células eram tratadas com concentrações crescentes de LPA na presença de 10 L
do reagentes WST-1 por 4h à 37
o
C/ 5% CO2. A absorbância do composto formazan
resultante da reação era medida em espectrofotômetro de placa à 440nm. O
formazan (de cor vermelho escuro) é formado pela clivagem do sal de tetrazolium
WST-1 (de cor vermelho claro) pela ação de enzimas mitocondriais.
3.8 - Imuno-citoquímica
De uma forma geral, as etapas das imuno-citoquímicas realizadas estão
descritas na Tabela 3 e foram realizadas sobre a lamínula nos experimentos com
culturas de progenitores A2B5
+
e OLGs. Após etapa de incubação em solução de
32
bloqueio (DMEM com Soro Fetal Bovino a 10%), por 30 minutos, se seguiram as
incubações em primário e secundário. Os anticorpos primários foram diluídos em
solução de bloqueio e os anticorpos secundários em PBS 0,1 M. Três lavagens com
tampão fosfato salina (sigla PBS, do inglês phosphate buffered saline) preparado a
partir de tampão fosfato 0,1 M e NaCl a 0,9%, eram sempre realizadas após
incubações com o anticorpo primário, o anticorpo secundário e o corante nuclear
Hoechst 33258 1 g/ mL (Sigma) ou DAPI (4´-6´-diamidino-2-phenyllindole) 0,001
g/ mL (Sigma), quando indicado.
Tabela 3: Resumo dos protocolos das imuno-citoquímica realizadas.
ICQ para Bloqueio Anticorpo Primário Anticorpo secundário
A2B5
DMEM/ SFB
10%, 30 min
A2B5 camundongo IgM,
monoclonal (1:1), O/N, 4
o
C
Alexa 488 anti-camundongo
(1:250), 2h, T.A.
O4
DMEM/ SFB
10%, 30 min
O4 camundongo IgM,
monoclonal (1:1) , O/N, 4
o
C
Alexa 488 anti-camundongo
(1:250), 2h, T.A.
LPA1
DMEM/ SFB
10%, 30 min, 37
o
C
Anti-LPA1 coelho IgG, policlonal
(1:100) , O/N, 4
o
C
HRP anti-coelho (1:400), 2h +
Cy3-TSA (1:100), 10 min, T.A.
LPA2
DMEM/ SFB
10%, 30 min, 37
o
C
Anti-LPA2 coelho IgG, policlonal
(1:100) , O/N, 4
o
C
HRP anti-coelho (1:400), 2h +
Cy3-TSA (1:100), 10 min, T.A.
LPA3
DMEM/ SFB
10%, 30 min, 37
o
C
Anti-LPA3 coelho IgG, policlonal
(1:100) , O/N, 4
o
C
HRP anti-coelho (1:400), 2h +
Cy3-TSA (1:100), 10 min, T.A.
-tubulina
acetilada
DMEM/ SFB
10%, 30 min
Anti--tubulina acetilada coelho
IgG, policlonal (1:100) , O/N, 4
o
C
Alexa 594 anti-coelho
(1:400), 2h, T.A.
MBP
DMEM/ SFB
10%, 30 min
Anti-MBP mouse IgG, policlonal
(1:100) , O/N, 4
o
C
Alexa 488 anti-mouse
(1:400), 2h, T.A.
Onde: ICQ, imuno-citoquímica, O/N, pernoite.
33
3.9 - Preparação de amostras para análise em immunoblotting e atividade Liso-
PLD
O meio condicionado das culturas primárias foi coletado em tubos Falcon e
centrifugado a 1.500 rpm por 3 min para remover células e debris celulares. Volumes
iguais de meio condicionado eram transferidos para tubos AmicoUltra4 10,000
NMWL (Milipore#UFC801096). Estes tubos eram centrifugados por 10 a 20 min,
dependendo do volume inicial adicionado ao tubo, em centrífuga refrigerada, modelo
Sorvall à 4.000 xg (rotor SH-3000). O volume remanescente foi coletado em tubos
de 200 L. Cérebros de ratos P4 foram extraídos e homogeneizados em Potter com
tampão de lise na proporção de 10 L de tampão por mg de tecido. O tampão de lise
continha Hepes-Tris 40 mM (pH 7,4), NaCl 40 mM, EDTA 10 mM e um coquetel de
inibidores de protease (1 mL de coquetel para 20 g de tecido, Sigma#P8340), que
era adicionado momentos antes da homogeneização.
A amostras eram armazenadas à -20
o
C para posterior dosagem das proteínas
totais.
3.10 - Dosagem de proteínas totais
O conteúdo de proteína total no meio condicionado e homogenado de tecido
foi dosada pelo método de Bradford utilizando o kit da Pierce (Amersham#23235). A
curva padrão foi construída a partir de uma solução de albumina bovina do soro 2
mg/mL. A mistura de reagentes foi realizada em placas de 96-poços. As placas
foram incubadas por 1 h à 37
o
C e seu conteúdo avaliado em espectrofotômetro de
placa, no comprimento de onda de 570 nm.
34
3.11 – Análise de proteínas por Immunoblotting
Para o immunoblotting para detecção de ATX, 50 g de proteínas totais do
meio condicionado foram separadas em gel de SDS-PAGE (poliacrilamida 5%) por
eletroforese (100V por 2 h à temperatura ambiente). Após a separação, as proteínas
do gel foram transferidas para uma membrana do tipo PVDF (Hybond-P
polyvinylidene difluoride, Amersham/Pharmacia). A transferência foi realizada com
100V por 1,5 h à 4
o
C. A membrana foi incubada em solução de bloqueio (5% leite
desnatado/ PBS-T
1
) por 1 h à temperatura ambiente, seguida de uma incubação por
toda a noite com o anticorpo anti-ATX (1:1.000 diluído em 5% leite desnatado/ PBS-
T) à 4
o
C. No dia seguinte, a membrana era lavada com PBS-T por 5 min, 3 vezes e
incubada com o anticorpo secundário HRP (peroxidase do rabanete, sigla emsigla
em inglês horseradish peroxidase) anti-coelho (1:10.000 diluído em 5% leite
desnatado/ PBS-T) por 2 h à temperatura ambiente. Após 3 lavagens com PBS-T e 2
lavagens com PBS, as bandas marcadas na membrana foram reveladas pelo
método de quimioluminescência utilizando kit ECL (Amersham/GE ECL Plus). As
bandas foram detectadas utilizando o sistema VersaDoc (BioRad Laboratories) e a
densitometria das bandas foi avaliada pelo programa QuantityOne (BioRad
Laboratories). Como controle positivo para detecção de ATX, foi utilizado 1 g de
proteína total do meio condicionado de células COS-7 previamente transfectadas
com ATX (dados não mostrados).
1
PBS-T, Triton X-100 0,3% em PBS 0,1 M
35
3.12 - Ensaio da atividade liso-fosfolipase D
A dosagem da atividade Liso-fosfolipase D foi realizada utilizando o substrato
fluorescente FS3 (análogo ao LPC, substrato enzimático da Liso-PLD, Echelon
Biosciences Inc.), descrito por Ferguson e colaboradores (Ferguson et al., 2006). No
ensaio, 20 g de meio condicionado concentrado (ver item 3.8 nesta seção) foram
incubadas em placas de 96-poços (Corning # 3789), com NaCl 140 mM, KCl 5 mM,
CaCl
2
1 mM, MgCl
2
1 mM, Tris/HCl 5 mM (pH 8,0), BSA-FAF 1 mg/mL e FS3 2,5 M
à 37
o
C por 4,5 h. A intensidade de fluorescência do conteúdo da placa foi medida
em um fluorômetro de placa (PHERAstar multimode microplate reader, BMG
LABTECH Inc.), utilizando um comprimento de onda de excitação de 485 nm e de
emissão de 520 nm.
3.13 – Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
O RNA total dos progenitores gliais A2B5
+
após 3 DIV foi extraído utilizando o
reagente Trizol® (Invitrogen). As amostras de RNA foram quantificadas em
espectrofotômetro (Nanodrop ND-1000, Nanodrop Inc.) no comprimento de onda de
260 nm.
Para a obtenção do cDNA foi utilizado o kit SuperScript II
TM
First-Strand
Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen), de acordo com as orientações fornecidas
pelo fabricante. Resumidamente, em um microtubo foram reunidos, num volume final
de reação de 10 L, tampão 1x, 2 mM da mistura de dNTP (dATP, dCTP, dGTP,
dTTP), DTT 10 mM, 1 L de inibidor de RNase, 2,5 g de amostra de RNA e
SuperScrip (RT+) ou água-DEPC (RT-). A mistura foi incubada à 37
o
C por 45 min,
36
42
o
C por 35 min e 50
o
C por 10 min. O resultado desta reação (cDNA) foi utilizado
no PCR (descrito abaixo). Todos os componentes foram adquiridos da Invitrogen.
O PCR foi realizado reunindo em um microtubo, num volume final de reação de
10 L, tampão de PCR 1x, MgCl
2
2 mM, 0,25 mM da mistura de dNTP, Taq
polimerase 1 U, 2,5 L cDNA, 0,5 M de cada primer – senso e anti-senso – (MWG-
BIOTECH Inc, ver Tabela 4) e água-DEPC. A mistura foi incubada em um termo-
ciclador, utilizando o seguinte programa de amplificação: 94
o
C por 2 min, seguido
de 35 ciclos de 94
o
C por 30 seg, temperatura de anelamento (ver Tabela 4) por 45
seg e 72
o
C por 30 seg. Ao final, mais 10 min à 72
o
C. O produto obtido do PCR foi
separado em um gel de agarose 2% contendo 0,5 µg/ml de brometo de etídio em
TAE 1x (0,04 M Tris-acetato/ 0,01 M EDTA). Todos os componentes foram
adquiridos da Invitrogen.
Tabela 4: Os pares de primers e as temperaturas de anelamento para a
amplificação dos RNAs no PCR.
RNA amplificado
Primers senso e anti-senso Temp. anelamento
Tamanho
(pb)
LPA1 (Edg-2)
5’-GCACATCACAGTTTTCCGAATG-3’
5’-GTCTAGGGACAAATACTGCC-3’
52°C 789
LPA2 (Edg-4)
5’-ACTGCCTCTGTGACTTGGACAGTT-3’
5’-AAGCTGAGTAACGGGCAGACTTGT-3’
50°C 474
LPA3 (Edg-7)
5’- CTGATGTTTAACACAGGCCC -3’
5’- GACGTTGGTTTTCCTCTTGA -3’
52°C 402
3.14 – PCR Quantitativo em Tempo Real (Real-Time PCR)
O RNA total dos OLGs após 4 DIV foi extraído utilizando o kit RNeasy Micro
(Qiagen). As amostras de RNA foram quantificadas em espectrofotômetro (Nanodrop
ND-1000, Nanodrop Inc.) no comprimento de onda de 260 nm e sua qualidade foi
37
verificada usando o kit de análise Experion RNA HighSens Chips (BioRad). Para
obtenção do cDNA, os primers de oligo-dT foram utilizados com o kit Sensiscript ou
Omniscript RT (Qiagen).
O PCR quantitativo (PCRq) foi realizado de acordo com as recomendações do
fabricante usando a mistura para PCR SYBRGreen (iQ SYBR Green Supermix,
BioRad) e incubação no termo-ciclador Chromo 4 Four-Color Real-Time (BioRad).
Para a normalização da amplificação do RNA da ATX, foi utilizado o RNA ribossomal
18S. As condições do PCRq utilizadas foram: 95 °C por 15 min, seguido de 34 ciclos
de 94 °C por 15 seg, 20 seg de temperatura de anelamento (ver Tabela 5) e 20 seg
à 72°C. Para a quantificação do nível relativo de RNAm de receptor de LPA foi
utilizado o método descrito por Peirson et al (Peirson et al., 2003). Para a
comparação relativa dos níveis de RNAm de MBP e MOG (sigla em inglês, myelin
oligodendrocyte glycoprotein) foi utilizado o método ΔΔCT (Livak e Schmittgen,
2001).
Tabela 5: Os pares de primers e as temperaturas de anelamento para a
amplificação dos RNAs no PCRq.
RNA amplificado
Primers senso e anti-senso
Temp.
anelamento
ATX
5’-GACCCTAAAACCATTATTGCTAA-3’
5’-GGGAAGGTGCTGTTTCATGT-3’
60°C
MBP
5’-ACTTGGCCACAGCAAGTACCATGGACC-3’
5’-TTGTACATGTGGCACAGCCCGGGAC-3’
60°C
MOG
5’-CTCATTGCCCTTGTGCCTAT-3’
5’-GCACGGAGTTTTCCTCTCAG-3’
60°C
LPA1 (Edg-2)
5’-GACACCATGATGAGCCTTCTGA-3’
5’-CCCGGAGTCCAGCAGACA-3’
50°C
LPA2 (Edg-4)
5’-CGCTCAGCCTAGTCAAGACA-3’
5’-TTGCAGGATTTACAGTCCAGAC-3’
50°C
LPA3 (Edg-7)
5’-CACACGAGTGGCTCCATCAG-3’
5’-GGTCCAGCACACCACGAA-3’
50°C
18S rRNA
5’-TTCGGAACTGAGGCCATGAT-3’
5’-TTTCGCTCTGGTCCGTCTTG-3’
60°C
38
3.15 - Análise morfológica dos oligodendrócitos
Para analisar a morfologia dos OLGs O4
+
, pelo menos 30 células por lamínula
foram fotografadas aleatoriamente em microscópio de fluorescência (Figura 7A). O
programa de análise de imagem IPLab (BD Biosciences Bioimaging) foi utilizado
para calcular duas diferentes áreas: (1) a área total ocupada pela arborização
(Figura 7B) e (2) a área de cobertura de prolongamentos (Figura 7C). A medida da
área total ocupada pela arborização inclui a área dos espaços entre os
prolongamentos. Já a medida da área de cobertura de prolongamentos exclui esta
área. A partir dos valores de área citados acima, foi calculado o valor do índice de
complexidade (Figura 7).
A área total ocupada pela arborização indica o tamanho total da célula
(excluindo-se a área do corpo celular, Figura 7B), enquanto a área de cobertura de
prolongamentos indica o quanto desta área total é ocupada por prolongamentos
(Figura 7C). Desta forma, a segunda área terá sempre menor valor que a primeira. O
valor do índice de complexidade indica a complexidade da arborização (rede de
prolongamentos). Assim, quanto maior o índice de complexidade, maior a
complexidade da arborização. As células exemplificadas na Figura 7D foram
excluídas da avaliação, pois encontram-se em estágio mais avançado de maturação.
Estas células, não apresentam arborização e resultam em um índice de
complexidade igual ou muito próximo de 0.
39
Figura 4: Análise da morfologia dos OLGs O4
+
em cultura. (A) Imagem de
imunofluorescência de um OLG imunoreativo para O4. (B) Avaliação da área total ocupada
pela arborização (em rosa). (C) Avaliação da área de ocupada por prolongamentos (em
amarelo). (D) Exemplo de célula com grande expansão de membrana que foi excluída da
análise. Fórmula para o cálculo do índice de complexidade. Barra de calibração: 10 m.
Índice de Complexidade = 1
–
área de cobertura de prolongamentos
área total ocupada pela arborização
A
B
O4
C
D
40
3.16 - Quantificação das células imuno-positivas para MBP
Para identificar o número de células MBP-positivas (MBP
+
), após a imuno-
citoquímica para este antígeno pelo menos 5 campos por lamínula foram
fotografados em microscópio confocal. O número total de núcleos e células MBP
+
foram determinados utilizando o programa Image J (particle count plugin, Wright Cell
Imaging Facility) (Abramoff et al., 2004), seguindo os seguintes parâmetros: (1)
núcleo: limite de tamanho = 0-10 e circularidade = 0-1, (2) células MBP: limite de
tamanho = 0,5-5 e circularidade = 0-1.
3.17 - Análise morfométrica dos progenitores A2B5
+
Para verificar alterações morfológicas após o tratamento com LPA exógeno, os
progenitores gliais A2B5
+
foram imuno-marcados com o anticorpo A2B5 (Figura 8A).
Pelo menos 20 campos por lamínula, contendo em média 5 células por campo,
foram fotografados em microscópio de fluorescência. O comprimento dos
prolongamento das células foi medido utilizando o programa IPLab (Figura 8B).
3.18 - Injeção intraventricular de LPA
Injeção intraventricular de 5 L de LPA 1 M (ou BSA-FAF 0,004% como
controle) foi injetado no ventrículo lateral esquerdo de ratos no 5º dia pós-natal (P5).
Os animais foram anestesiados por hipotermia e posicionados em aparelho
estereotáxico. Um capilar de vidro acoplado a um microinjetor (Narishige) foi inserido
no ventrículo lateral esquerdo dos animais, nas coordenadas de 0 de Bregma, no
41
Figura 8: Análise da morfologia dos progenitores A2B5
+
em cultura. (A) Imagem de
imunofluorescência de um progenitor imunoreativo para A2B5. (B) Avaliação da extensão
dos prolongamentos (em rosa). Barra de calibração: 10 m.
A2B5
A B
42
eixo rostro-caudal (portanto em cima da fissura), 1mm lateral em relação à linha
média, e a 2,0 mm de profundidade (segundo, Wang et al., 2005). Após sobrevida
de 48 h, os animais foram sacrificados.
3.19 - injeção intraperitoneal de BrdU
Os animais tratados com LPA/BSA também foram tratados com BrdU (bromo-2-
deoxi-5-uridina). Com o animal anestesiado, uma solução de BrdU 10 mM, na
dosagem de 60 mg de BrdU/Kg de peso do animal, foi injetada intraperitonealmente.
Para os estudos de migração de progenitores a partir da SVZ, o BrdU foi
administrado logo após a injeção intraventricular seguido de 48h de sobrevida após
o qual os animais eram sacrificados como descrito na próxima seção.
3.20 - Obtenção dos cortes histológicos
Os animais foram anestesiados por inalação com éter e perfundidos com 10
mL de salina e 10 mL do fixador (conforme protocolos especificados mais abaixo).
Os cérebros foram removidos das caixas cranianas e imersos no mesmo fixador por
3 h para pós-fixação. Em seguida, foram transferidos para uma solução de sacarose
20% para obter-se crio-proteção e mantidos em geladeira. Após completa imersão,
os cérebros são transferidos para uma solução de sacarose 30%. Os cérebros
permanecem nesta solução à 4
o
C até submergirem totalmente, após o que são
incluídos em solução para criomicrotomia Tissue TEK.
Para os animais tratados com LPA/BSA o fixador utilizado foi o
paraformaldeído 4% (preparado em tampão fosfato 0,1M). Os cérebros foram
43
cortados coronalmente em criostato (Leica) em fatias de 12 m. Os cortes coronais
foram coletados a partir do início do ventrículo lateral até o início do terceiro
ventrículo, equivalendo ao terço médio do prosencéfalo. O cortes foram recolhidos
diretamente sobre lâminas previamente tratadas com poli-L-lisina 10 g/mL.
Para os animais que receberam anti-ATX, o fixador utilizado foi o PLP. Neste
caso, os cérebros foram cortados sagitalmente em criostato e em secções de 30 m.
Foram coletados cortes sagitais, do hemisfério contra-lateral ao injetado, contendo o
ventrículo lateral e a via migratória rostral.
As lâminas obtidas foram armazenadas à – 20
o
C. Sempre que utilizadas, as
lâminas eram deixadas ao ar por 30 min à temperatura ambiente.
3.21 - Imuno-histoquímica
Para imuno-detecção do BrdU incorporado pelas células, os cortes histológicos
foram pré-tratados com água destilada por 10 min, seguido de 30 min em HCl 2 N
(para desnaturação do DNA) e 10 min em tampão borato 0,1 M, pH 8,5 (para
neutralização do pH ácido). Todas as incubações aconteceram à 37 °C em câmera
úmida. Após este pré-tratamento, a imuno-histoquímica se deu como descrita a
seguir.
Os cortes foram lavados e incubados com solução de bloqueio (5% soro
normal de cabra (NGS)/PBS-T) por 30 min à temperatura ambiente. Em seguida os
cortes foram incubados com anticorpo anti-BrdU (1:3; diluído em solução de
bloqueio) por toda a noite à 4 °C. No dia seguinte, os cortes foram lavados e
incubados à temperatura ambiente por 2 horas com anticorpo secundário anti-
camundongo conjugado a Cy3 (1:800, diluído em PBS 0,1 M). Após nova lavagem,
44
os núcleos foram corados com DAPI 0,01 g/mL por 5 min, seguido de nova
lavagem. As lâminas foram montadas com n-propil-galato, seladas com esmalte de
unha e armazenadas à -20
o
C.
Todas as lavagens citadas anteriormente foram realizadas 3 três vezes por 5
min com PBS 0,1 M. As especificações dos anticorpos primários e secundários
utilizados nesta seção encontram-se nas Tabela 1 e 2, respectivamente.
A imuno-histoquímica para detectar ATX iniciou com a lavagem e incubação
com o anticorpo secundário anti-coelho (1:400, diluído em PBS 0,1M). As etapas
posteriores transcorreram conforme descrito acima.
3.22 - Obtenção das imagens por microscopia confocal e de fluorescência
A captura das imagens foi realizada usando um microscópio de fluorescência
invertido TE200 Eclipse (Nikon) ou um Olympus BX51 (Olympus America Inc.),
conectado a uma câmera CoolSnap. Para as imagens em microscópio confocal
foram utilzados o TCS SP2 AOBS, (Leica Microsystems, VCU) ou o LSM 510 META
(Carl Zeiss MicroImaging, Inc., FIOCRUZ). As imagens produzidas em microscópio
confocal foram editadas no software do próprio microscópio. Quando indicado na
legenda da figura, foram realizados cortes ópticos e edição do brilho e contraste.
3.23 - Análise do número de células BrdU
+
Para a análise da migração de progenitores da SVZ para a substância branca
e substância cinzenta do córtex cerebral, foram reconstruídas imagens de
imunofluorescência para BrdU e DAPI em aumentos de 200 e 400X. A espessura do
45
cortex cerebral foi divida em 3 grandes áreas: SVZ em torno de todo o ventrículo
lateral, substância branca (SB) e substância cinzenta (SC), corticais (Figura 9). A
reconstrução das imagens foi realizada com o programa Adobe Photoshop CS2. A
quantificação da SVZ se restringiu à uma região com 65 m de espessura a partir da
superfície ventricular e ao redor de todo o ventrículo lateral. Conforme mostrado na
Figura 9B, a área delimitada foi dividida em SVZ dorso-lateral e SVZ medial. A partir
destas áreas foram quantificadas as células BrdU
+
. As imagens de reconstrução em
DAPI (marcador nuclear) foram utilizadas para a determinação das regiões
analisadas. No caso do telencéfalo dorsal, uma caixa de 500 x 1.300 m (largura x
altura) foi posicionada, conforme indicado pela Figura 9C, delimitando em particular,
a largura da área para quantificação.
Foram utilizados os valores de densidade de células BrdU
+
e foram analisadas
pelo menos cinco fatias de cada animal e utilizados pelo menos dois animais em
cada uma das condições experimentais.
A quantificação do número de células BrdU
+
e a análise das áreas de SVZ, SB
e SC foram realizadas com o programa Image J, V. 1.36b (National Institutes of
Health).
3.24 - Análise estatística
Quando indicado, os dados foram submetidos ao Test t, com nível de
significância de p < 0,05 ou ANOVA. Neste caso, quando observada diferença
significativa foi realizado o teste post-hoc de Tukey. Os gráficos foram construídos
utilizando o programa Sigma Plot, V. 10.0 e a análise estatística foi realizada
utilizado o programa Sigma Stat, V. 3.5, ambos da Systat Software Inc.
46
Figura 9: Método de avaliação do número de células BrdU
+
. (A) Imagem em campo claro
de uma coloração em cresil, indicando uma corte representativo do terço-médio do encéfalo.
Os retângulos verde e rosa indicam as regiões representadas em B e C, respectivamente.
(B) Imagem de imunofluorescência para BrdU mostrando o ventrículo lateral e a marcação
do perímetro em torno do ventrículo com um raio de 65 m. A área da luz do ventrículo foi
removida e a região dorso-lateral da SVZ está limitada pelas linhas verdes. (C) Imagem de
imunofluorescência para BrdU mostrando o limite entre SB e SC (linha pontinhada) e a
região onde as células foram quantificadas (retângulo amarelo). VL, ventrículo lateral; SB,
substância branca; SC, substância cinzenta. Barra de calibração: 100 m.
SVZ Dorso-lateral
SB
SC
A
B
C
VL
SVZ Medial
47
4. RESULTADOS
CAPÍTULO I
4.1 - Expressão e atividade da ATX em oligodendrócitos
A cultura de OLGs O4+ após 4 DIV em meio de diferenciação, possui poucas
células A2B5
+
(0,97%0,55%), bem como MBP (1,98%4,61%). Em cultura, os
OLGs O4+ apresentam morfologia variada no que se refere a rede de
prolongamentos (Figura 10). A cultura apresenta células com morfologias mais
simples (Figura 10A), morfologias intermediárias (Figura 10B) e morfologias
complexas (Figura 10C). As células de morfologia intermediária são as mais
freqüentes, enquanto as de morfologias mais complexas são as mais raras
(aproximadamente 4% dos OLGs O4
+
). Algumas destas células de morfologia
complexa apresentam expansões da membrana plasmática, presentes apenas em
OLGs in vitro, consideradas estruturas análogas à mielina (Figura 10C, seta).
Como primeira etapa do estudo, buscou-se investigar se os OLGs em cultura
secretam ATX após 4DIV. Como pode ser observado por análise de immunoblotting
utilizando o meio condicionado, os OLGs expressam e secretam ATX no meio
extracelular (Figura 11A). Uma banda de ATX, em torno de 120 kDa foi reconhecida
pelo anticorpo em todas as culturas estudadas (Figura 11A, 1-6). Uma vez presente
na cultura, a ATX poderia, dependendo da disponibilidade de substrato enzimático,
gerar LPA por meio da atividade do seu sítio catalítico. Para verificar se a ATX
secretada pelos OLGs apresentava atividade catalítica, realizou-se ensaio da
atividade Liso-PLD por método fluorimétrico, onde a atividade era medida pelo
aumento da fluorescência da formação do produto, que é um análogo fluorescente
de LPA, com o tempo (Ferguson et al., 2006). A formação do produto se mostrou
48
Figura 10: A cultura de oligodendrócitos O4
+
apresenta células em diferentes estágios
de diferenciação. Oligodendrócitos são selecionados por immunopanning e cultivados por 4
dias in vitro em meio de diferenciação. Nestas condições a cultura apresenta células com
morfologias simples (A), intermediárias (B) e complexas (C). Seta indica expansão da
membrana plasmática semelhante à mielina in vitro.
A
B
C
49
tempo dependente nas três concentrações de proteína testadas (Figura 11B).
Quando foi adicionado 10 M de LPA ao meio de reação, a atividade Liso-PLD –
presente em 20 g de proteína total – foi inibida em 50% (Figura 11B, inset).
4.2 - Expressão de receptores de LPA por oligodendrócitos
Antes de iniciar o estudo do papel do LPA verificamos a expressão e presença
dos receptores de LPA nos OLGs. A avaliação do perfil e do nível de expressão dos
receptores de LPA foi verificada por PCR quantitativo (PCRq) utilizando o RNAm
isolado dos OLGs cultivados por 4 DIV. Observou-se a expressão dos receptores
LPA1, LPA2 e LPA3 (Figura 12), onde LPA1>LPA2>LPA3. Para verificar a
distribuição celular dos receptores realizou-se análise por imuno-citoquímica que
revelou uma marcação com padrão puntiforme para os 3 receptores (Figura 13). Na
análise individual de cada receptor, não foi observada diferença de intensidade ou
distribuição da marcação em relação aos diferentes tipos morfológicos de OLGs na
cultura. O padrão de marcação foi encontrado nas formas menos arborizadas e
também nas formas mais arborizadas (compare Figura 13A e 13B).
4.3 – O efeito de LPA exógeno na área total ocupada pela arborização
Para verificar a possível citotoxicidade de LPA para os OLGs, realizou-se um
ensaio colorimétrico que mede a atividade mitocondrial pela formação do composto
formazan a partir do sal de tetrazolium (reagente WST-1) (Buntinx et al, 2004; Fox et
al, 2003). Concentrações crescentes de LPA não foram tóxicas às células (Figura
14).
50
Figura 11: OLGs em cultura secretam ATX com atividade enzimática. (A)
Immunoblotting com anticorpo policlonal anti-ATX. Amostras de proteína do meio
condicionado de 6 diferentes culturas de OLGs (1 – 6) e do meio condicionado de células
COS-7 transfectadas com ATX (+, controle positivo). (B) Curso temporal da atividade Liso-
PLD. Inset: Ensaio da atividade Liso-PLD na presença de LPA 10 M por 4,5h. Os valores
do gráfico correspondem à média de 3 experimentos independentes, realizados em
triplicatas, erro padrão.
Tempo de incubação (min)
0 50 100 150 200 250 300
Atividade Liso-PLD (unidades arbitrárias)
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
ATX
~120kDa
(+) 1 2 3 4 5 6
A
B
100 g
50 g
10 g
Controle LPA
Atividade Liso-PLD (% do controle)
0
20
40
60
80
100
120
51
Figura 12: OLGs em cultura expressam receptores clássicos de LPA. Os níveis
relativos dos receptores de LPA foram determinados por PCRq e estão apresentados em
porcentagem. O nível de RNAm de LPA1 foi definido como 100% e os níveis de LPA2 e
LPA3 calculados de acordo. Os valores do gráfico correspondem à média de 3 experimentos
independentes, realizados em triplicatas.
LPA1 LPA2 LPA3
Níveis relativos de RNAm (em %)
0
20
40
60
80
100
120
52
Figura 13: OLGs O4
+
em cultura são imuno-positivos para os receptores clássicos de
LPA. (A) Imagens de microscopia confocal de OLGs de morfologia simples imunorreativos
para os receptores LPA 1, 2 e 3, à esquerda. À direita, reação imuno-citoquímica com
anticorpo O4. (B) As mesmas reações em OLGs de morfologia complexa. Barra de
calibração: 20 m.
A
B
53
Figura 14: LPA não afeta a sobrevivência de OLGs em cultura. OLGs em cultura foram
incubados com diferentes concentrações de LPA por 2 h na presença do reagente WST-1.
Os valores do gráfico correspondem à média de 3 experimentos, em triplicata, erro padrão.
LPA (µM)
0 0,01 0,1 1 10
Absorbância (450 nm)
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
54
Para verificar o efeito de LPA sobre a morfologia de OLGs em cultura, foi
medida a área total ocupada pela arborização nas células imuno-positivas para O4
na presença de concentrações crescentes de LPA exógeno, em diferentes tempos
de incubação (Figura 15). Observou-se um aumento, em torno de 38%, na área
medida com a adição de 0,1 M e 22% na presença de 1 M de LPA (Figura 15B).
Este efeito se mostrou tempo dependente, uma vez que só foi observado nos
primeiros minutos de incubação com LPA (30 min). Após 2 h de incubação com o
lipídeo, a área medida não se mostrava diferente entre as células tratadas e controle
(Figura 15B).
4.4 – Resposta ao LPA exógeno é modulada pelo domínio MORFO da ATX em
células CIMO
Efeitos na alteração morfológica em incubações de longo prazo (2h) poderiam
estar sendo mascarados ou inibidos pela presença de concentrações endógenas de
LPA ou ainda pela atividade do segundo domínio funcional da ATX, o domínio
MORFO. Esta segunda possibilidade foi investigada utilizando as células CIMO da
linhagem oligodendroglial. As células CIMO não expressam ATX (Figura 16A), no
entanto são capazes de responder ao seu efeito anti-adesivo (Dennis et al., 2008;
Fox et al., 2003).
Para verificar se estas células eram capazes de responder ao LPA, realizou-se
uma análise por PCR da expressão dos receptores. A análise por PCR mostrou que
as células CIMO expressam LPA1 e LPA2 (Figura 16B). Quando células CIMO
foram expostas a concentrações crescentes de LPA observou-se resposta de
contração do citoesqueleto de actina (Figura 16C). Este efeito foi dose e tempo
55
Figura 15: A resposta dos OLGs ao efeito de LPA sobre a área total ocupada pela
arborização é tempo dependente. (A) Imagem de imunofluorescência de um OLG imuno-
positivo para O4
+
(à esquerda). À direita a área total ocupada pela arborização (em rosa).
(B) Efeito de concentrações crescentes de LPA sobre a área total ocupada pela arborização
dos OLGs em diferentes tempos de incubação. A média da área dos OLGs do controle foi
considerada 100%. Os valores do gráfico correspondem à média de pelo menos 3
experimentos independentes, realizados em duplicatas, erro padrão. Teste post-hoc de
Tukey, onde *p<0,001 e **p<0,05 em relação ao controle de 30 min sem LPA. Barra de
calibração: 10 m.
A
O4
Área total ocupada pela
arborização
B
LPA (M)
0 0,1 1
Área total ocupada pela arborização (em %)
0
50
100
150
30 min
2 horas
*
*
56
Figura 16: Efeito do LPA na morfologia de células CIMO. (A) Immunoblotting para ATX a
partir do meio condicionado (MC) de COS-7 transfectadas com ATX (controle positivo, +) e
células CIMO. O meio condicionado das amostras foi coletado após 6 h em cultura na
ausência de SFB. (B) PCR mostra expressão dos receptores de LPA1 e LPA2 em células
CIMO. (C) Efeito de LPA sobre a contração do citoesqueleto de actina, gerando células
arredondadas, foi evidenciado após tratamento das células com faloidina acoplada a
rodamina. (D) Células CIMO foram incubadas com concentrações crescentes de LPA em
diferentes tempos de incubação.
A
C
LPA1
789 pb
LPA2
474 pb
(+) MC CIMO
ATX
120 kDa
LPA (µM)
0. 0,001. 0,01. 0,1. 1. 10.
% do número de células com
contração do citoesqueleto de actina
0
20
40
60
80
10 min
30 min
2 h
18 h
B
LPA
D
57
dependente e resultou na retração dos prolongamentos celulares e no
arredondamento da célula (Figura 16D). O pico de resposta foi observado na
concentração de 10 µM de LPA no tempo de incubação de 2 h. Esta condição
provocou o arredondamento de aproximadamente 60% das células CIMO (Figura
16D).
Para verificar se o efeito de LPA sobre as células CIMO era mediado por
sinalização intracelular, realizaram-se experimentos na presença de inibidores de
vias de sinalização envolvidas em alterações morfológicas mediadas por LPA. A pré-
incubação das células CIMO com Y-27632, um conhecido bloqueador da ativação
de ROCK (RhoA cinase), evitou o arredondamento da célula induzido por LPA
(Figura 17A). O efeito de LPA não foi alterado quando as células foram pré-
incubadas com a toxina pertussis (PTX), um bloqueador de proteína Gi (Figura 17B).
Para testar a hipótese de modulação dos efeitos de LPA pelo domínio MORFO,
as células CIMO foram plaqueadas em uma mistura de substrato contendo
fibronectina (FN) e um fragmento peptídico da região C-terminal da ATX que contém
o domínio MORFO (ver Materiais e Métodos; Fox et al., 2003). Nestas condições, o
efeito de LPA 10 M sobre a morfologia de CIMO foi abolido (Figura 18). A adição de
LPC e a utilização da mistura de substrato contendo FN e His-Gal foram utilizados
como controle. Este resultado indicou que a presença do domínio MORFO no meio
extracelular previne a resposta das células CIMO ao estímulo do LPA.
58
Figura 17: Ação de inibidores de cascatas intracelulares sobre a morfologia de células
CIMO estimuladas por LPA. O efeito estimulatório de LPA sobre células CIMO foi
verificado após pré-incubação por 30 min na presença e ausência de Y-27632 (A) e toxina
pertussis (PTX) (B). PTX, inibidor de proteína Gi; Y-27632, inibidor de ROCK (proteína
cinase dependente de RhoA). Os valores apresentados correspondem à média de 3
experimentos erro padrão. Teste t, onde * p 0,05 em relação ao tratado com LPA, na
ausência do inibidor.
Y-27632 (µM) _ 3 10
% do número de células com
contração do citoesqueleto de actina
0
20
40
60
80
Controle
LPA 10 µM, 2h
PTX (mg/mL) _ 0,2.
% do número de células cim
contração do citoesqueleto de actina
0
20
40
60
80
Controle
LPA 10 µM, 2 h
B
A
*
*
59
Figura 18: Ação do domínio MORFO da ATX sobre a morfologia de células CIMO
estimuladas por LPA. Células CIMO foram plaqueadas em uma mistura de substrato
contendo fibronectina (FN; 10 µg/ mL) e His-β-galactosidase (βGal; 50 µg/ mL) ou His-
MORFO (MORFO; 50 µg/ mL) por 1 h e incubadas em seguida com LPA por 2 h. His-βGal e
LPC foram utilizados como controle de His-MORFO e LPA, respectivamente. Os valores
apresentados correspondem pelo menos 2 experimentos (em triplicata).
*
FN FN + MORFO FN +
Gal
% do número de células com
contração do citoesqueleto de actina
0
20
40
60
80
Controle
LPA 10 µM
LPC 10 µM
60
4.5 - Efeito do LPA exógeno na morfologia de oligodendrócitos em condições
sub-reguladas de ATX
Para verificar o efeito de LPA em condições reduzidas de ATX endógena,
realizou-se transfecção utilizando RNA de interferência (siRNA) para reduzir os
níveis de endógenos da proteína. Quando as células foram co-transfectadas com
siGLO (um marcador da transfecção) foi possível localizar o marcador fluorescente
no interior da célula em imagem de microscopia confocal (Figura 19A). A análise dos
níveis de RNAm da ATX por PCRq mostrou uma redução de aproximadamente 60%
(Figura 19B).
A análise da presença da proteína no meio condicionado foi feita por
immunoblotting (Figura 20A). Dois dias após a transfecção com siRNA, os níveis da
proteína no meio condicionado da cultura reduziram-se em 60% comparados ao
siControle (controle da transfecção) (Figura 20B). Esta redução também refletiu na
redução da atividade Liso-PLD presente no meio condicionado (Figura 20C).
O primeiro parâmetro de análise morfológica avaliado foi a área total ocupada
pela arborização. Como era esperado, em condições siControle, a exposição das
células ao LPA 1 M por 2h não mostrou qualquer alteração na área medida (Figura
21 e Figura 15B). A redução da expressão de ATX provocou uma redução em 55%
na área total ocupada pela arborização. A adição de LPA nesta condição recuperou
quase que totalmente o valor da área (em torno de 45% de recuperação) (Figura 21).
Para separar o efeito do LPA sobre a fase de arborização ou a fase de
aumento da área de membrana (fase de diferenciação de OLGs in vitro considerada
equivalente à fase de mielinização in vivo (Buttery e ffrench-Constant, 2001)
analisamos dois parâmetros: a área de cobertura de prolongamentos e o índice de
61
Figura 19: A transfecção de OLGs em cultura com RNA de interferência reduz níveis
de RNAm de ATX após 48 h. (A) Imagem de microscopia confocal de células co-
transfectadas com siRNA e siGLO e imuno-marcadas com anticorpo O4. (B) A Análise dos
níveis de RNAm de ATX, após 2 dias da trasfecção, foi realizada por PCRq. Os valores dos
níveis de RNAm de siControle foram ajustados para 100% e os valores da condição siATX
calculados de acordo. Os valores do gráfico correspondem à média de 3 experimentos
independentes, realizados em triplicata, erro padrão. Teste-T, onde *p <0,05 em relação
ao siControle. Barra de calibração: 10 m.
A
siGlo O4
Níveis do RNAm
(% do siControle)
0
20
40
60
80
100
120
siATX
B
*
62
Figura 20: A transfecção de OLGs em cultura com siRNA reduz os níveis da proteína
ATX após 48 h. (A) Immunoblotting com anticorpo policlonal anti-ATX. Amostras de
proteína do meio condicionado das culturas de OLGs, nas condições indicadas, e do meio
condicionado de células COS-7 transfectadas com ATX (+, controle positivo). (B)
Quantificação da densidade ótica das bandas reveladas em torno de 120kDa. Os valores de
siControle foram ajustados para 100% em cada experimento e os valores da condição siATX
calculados de acordo. Os valores do gráfico correspondem à média de 4 experimentos
independentes erro padrão. (C) Ensaio da atividade Liso-PLD após 4,5h de incubação
com 20 g de proteína total a partir do meio condicionado dos OLGs transfectados. Os
valores do gráfico correspondem à média de 3 experimentos independentes, realizados em
triplicatas, erro padrão. Teste-T, onde *p <0,05 em relação ao valor siControle.
(+) Controle siControle siATX
A
ATX
~120kDa
Densidade ótica
(% do siControle)
0
20
40
60
80
100
120
siATX
Atividade Liso-PLD
(% do siControle)
0
20
40
60
80
100
120
siATX
C
B
*
*
63
Figura 21: LPA induz o aumento da área total ocupada pela arborização em condições
reduzidas de ATX endógena. Área total ocupada pela arborização de OLGs após 48 h da
transfecção, seguida de 2 h de tratamento com LPA 1 M. Os valores do gráfico
correspondem à média de 3 experimentos independentes, realizados em duplicata, erro
padrão. Teste post-hoc de Tukey, onde, *p<0,01 em relação ao siControle e # p<0,01 em
relação ao siATX.
s
i
C
o
n
t
r
o
l
e
s
i
C
o
n
t
r
o
l
e
+
L
P
A
s
i
A
T
X
s
i
A
T
X
+
L
P
A
Área total ocupada pela arborização (em %)
0
20
40
60
80
100
120
*
#
*
siControle siControle
+ LPA
siATX
siATX
+ LPA
64
complexidade (ver Materiais e Métodos item 3.15; Figura 22). A redução dos níveis
endógenos de ATX reduziu tanto a área de cobertura de prolongamentos quanto o
índice de complexidade das células (Figura 22B, Dennis et al., 2008). Esta redução
provocou um deslocamento de células para quadrantes abaixo da média (linha
tracejada) aumentando a freqüência de células com morfologia mais simples. O
tratamento com LPA recuperou a área de cobertura da célula, aumentando a
porcentagem destas no quadrante acima da média no quesito área de cobertura de
prolongamentos (Figura 22C). No entanto, o tratamento com LPA não aumentou o
número de células acima da média em relação ao índice de complexidade. Esta
informação pode ser melhor visualizada em um gráfico de barras onde a
porcentagem de células acima da média nos dois parâmetros foi contabilizada
(Figura 22D). Logo, o LPA atua principalmente na segunda fase de diferenciação, o
aumento da área ocupada pelos prolongamentos.
4.6 - Efeito do LPA exógeno na formação de estruturas membranosas em
condições sub-reguladas de ATX
O efeito de LPA aumentando a área de cobertura de prolongamentos sem
afetar o índice de complexidade poderia ser justificado pelo aumento de
prolongamentos não ramificados ou a presença de expansões de membrana.
Para quantificar estas estruturas membranosas presentes nos OLGs foi
utilizado um índice de membrana, conforme descrito em Materiais e Métodos (item
3.15). O índice de membrana não foi alterado com a redução nos níveis de ATX
endógena (Figura 23B). Contudo, o tratamento destas células com LPA aumentou,
significativamente, o valor do índice de membrana em torno de 18%
65
Figura 22: LPA induz o aumento na área de extensão de prolongamentos sem afetar o
índice de complexidade. A área de extensão de prolongamentos e o índice de
complexidade foram obtidos para cada célula como descrito em Materiais e Métodos.
Valores de área de extensão de prolongamentos e índice de complexidade foram ajustados
em relação à média do siControle (média de valores de siControle = 50, linha tracejada). A
porcentagem de células encontrada em cada quadrante está inicada nos gráficos. (A)
Distribuição das células em relação aos parâmetros analisados na condição Controle
(siControle). (B) Distribuição das células em relação aos parâmetros analisados após
redução dos níveis de ATX (siATX). (C) Distribuição das células em relação aos parâmetros
analisados após redução dos níveis de ATX e tratamento por 2 h com LPA 1 M. Imagens
de imunofluorescência de OLG são mostradas como exemplos representativos para as
condições siControle e siATX. (D) Gráfico de barras indica o somatório das porcentagens de
células nos quadrantes acima da média de siControle (linha tracejada). Os valores dos
gráficos correspondem à 4 experimentos independentes, com pelo menos 30 células por
condição/experimento. Test post-hoc de Tukey, onde *p<0,05 em relação ao siControle e
#p<0,05 em relação ao siATX.
Área de extensão de prolongamentos
10 100
Índice de Complexidade
1
10
100
1000
50
50
Área de extensão de prolongamentos
10 100
Índice de Complexidade
1
10
100
1000
50
50
Área de extensão de prolongamentos
10 100
Índice de Complexidade
1
10
100
1000
50
50
siControle
siATX
siATX + LPA
36%
19% 26%
19%
65%
19%
10%
6%
63%
20% 11%
16%
Células > Média do siControle (em %)
0
10
20
30
40
50
60
siControle
siATX
siATX + LPA
Área de
extensão
de prolongamentos
Índice de
Complexidade
*
#
*
*
*
A
B
D
C
66
Figura 23: LPA induz o aumento na área de extensão de prolongamentos por meio do
aumento de estruturas membranosas. (A) Imagens de microcopia confocal (máxima
projeção em 2D, com seções óticas de 0,5 m) como exemplos representativos de células
imuno-marcadas para O4 (esquerda) e -tubulina acetilada (direita). (B) Gráfico de barras
indica o índice de membrana, calculado conforme descrito em Materiais e Métodos. Os
valores do gráfico correspondem à 2 experimentos independentes, com pelo menos 30
células por condição/ experimento erro padrão. Teste post-hoc de Tukey, onde *p<0,05 em
relação ao siControle e ao siATX. Barra de calibração: 20 m.
siControle siATX siATX + LPA
Índice de membrana
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
*
A
B
-tubulina acetilada
-tubulina acetilada
siATX
siATX + LPA
67
(Figura 23B). Este resultado indicou que o LPA aumentou a área dos
prolongamentos através da formação de expansões membranosas.
4.7 - Efeito do LPA exógeno na expressão de MBP em condições sub-
reguladas de ATX
O aumento no índice de membrana observado com o tratamento de LPA é um
indicativo da modulação no programa de diferenciação/maturação celular. Para
investigar esta questão, avaliou-se o número de células MBP
+
(Figura 24). A imuno-
citoquímica para MBP revelou que a sub-expressão de ATX reduziu em 60% o
número de OLGs MBP
+
. O tratamento com LPA não só recuperou o valor do
controle, mas também aumentou em 83% o número de OLGs MBP
+
em relação ao
controle (Figura 24B).
O aumento no número de células MBP
+
poderia ser causado pelo aumento da
expressão do gene ou pela regulação nos eventos pós-transcricionais, tais como o
transporte do RNAm e/ou regulação pós-traducional. Para avaliar a expressão de
RNAm de MBP, realizou-se o PCRq (Figura 25). Os OLGs tratados com siATX
mostraram uma redução nos níveis do RNAm similar a redução no número de
células MBP
+
, em torno de 53% (Figura 25A). Diferente de MBP a expressão de
MOG, que é especificamente expressa por OLGs em mielinização, não foi alterada
pela expressão de ATX (Figura 25A). O tratamento dos OLGs com LPA aumentou os
níveis de MBP em 2,9 vezes, enquanto os níveis de MOG não foram afetados
(Figura 25B). Estes resultados demonstram que a redução na expressão de ATX e o
tratamento com LPA afetou especificamente a expressão de MBP, mas não de todos
os genes envolvidos na mielinização.
68
Figura 24: LPA induz o aumento no número de células MPB
+
na presença de níveis
reduzidos de ATX endógena. (A) Imagens de microscopia confocal (máxima projeção em
2D, com seções óticas de 0,5 m) com exemplos representativos de células imuno-
marcadas para MBP e núcleos evidenciados por Hoechst. (B) O gráfico de barras indica o
número de células MBP+ em relação ao siControle (100%). Os valores do gráfico
correspondem à 3 experimentos independentes, com pelo menos 30 células por condição/
experimento erro padrão. Teste post-hoc de Tukey, onde *p<0,05 em relação ao
siControle e ao siATX. Barra de calibração: 75 m.
siATX
siATX + LPA
A
B
siControle siATX siATX + LPA
Células MBP
+
(em %)
0
50
100
150
200
250
*
*
69
Figura 25: LPA aumenta a expressão de RNAm de MPB em OLGs. (A) Os níveis de
RNAm de MBP e MOG foram determinados por PCRq após transfecção dos OLGs com
siControle e siATX, conforme descrito em Materiais e Métodos. (B) Níveis de RNAm de MBP
e MOG acima dos níveis em siATX (ajustados para o valor de 1) após tratamento com LPA
1M por 2 h. Teste-T, onde *p <0,05 em relação ao valor siControle (A) e siATX (B).
A
B
siControle siATX siControle siATX
Níveis do RNAm (em %)
0
20
40
60
80
100
120
MBP
*
MOG
MBP MOG
Níveis do RNAm
(aumento acima do siATX)
0
1
2
3
4
*
siATX + LPA
Nível de RNAm
siATX
70
CAPÍTULO II
4.8 - Efeito do LPA exógeno na morfologia de progenitores de oligodendrócitos
in vitro
Os progenitores de OLGs A2B5
+
(pOLGs) após 3 DIV apresentam, na sua
maior parte, morfologia bipolar (70%) ou tripolar (20%) típica de pOLGs migratórios
(Figura 26A). Para investigar o efeito de LPA nos pOLGs, 10 M do lipídeo foi
incubado por 30min ou 2h com os pOLGs no 3
o
dia de cultura. LPA induziu a
retração dos prolongamentos em pOLGs (Figura 26B). A análise do tamanho dos
prolongamentos mostrou que o efeito de LPA nos primeiros minutos de exposição
sofre uma redução de 70% em relação ao controle (Figura 26C). Este efeito foi
mantido por até 2h, apesar de ligeira recuperação no tamanho dos prolongamentos
neste tempo. Análise por PCR mostrou que os pOLGs expressam LPA1, LPA2 e
LPA3 (Figura 27A) e que estes receptores estão presentes nos pOLGs bipolares
(Figura 27B).
4.9 - Efeito do aumento de LPA no LCE sobre migração de células BrdU
+
in
vivo
Para investigar o papel do LPA na migração de pOLGs in vivo, 1 M de LPA ou
0,004% de BSA-FAF (controle) foi injetado no ventrículo lateral dos animais pós-
natos. Ainda anestesiados, os animais receberam uma injeção intraperitoneal de
BrdU (60 mg/Kg). Após 2 dias de sobrevida, os animais foram sacrificados e o tecido
processado para imuno-histoquímica. A quantificação de células BrdU+
71
Figura 26: LPA induz retração dos prolongamento de progenitores gliais A2B5
+
em
cultura. (A) Imagem de imunofluorescência de progenitores de oligodendrócitos marcados
com anticorpo A2B5, núcleos evidenciados por Hoechst. (B) Imagem de imunofluorescência
evidenciando progenitores de oligodendrócitos na condição controle (à esquerda) e após o
tratamento com LPA 10 M por 30 min (à direita). (C) O gráfico indica a média do tamanho
dos prolongamentos por célula, em relação ao controle (100%, na ausência de LPA). Os
valores do gráfico correspondem à média de 3 experimentos independentes, realizados em
duplicata, erro padrão. Teste post-hoc de Tukey, onde *p<0,05 em relação ao controle (na
ausência de LPA). Barra de calibração em A: 50 m e B: 20 m.
Controle
LPA
A
C
30 min 2 h
Média de prolongamentos por célula
(% do controle)
0
20
40
60
80
100
120
A2B5
A2B5
*
*
Hoechst O4
B
72
Figura 27: Progenitores A2B5
+
em cultura expressam os receptores clássicos de LPA.
(A) Imagem de microscopia confocal de uma imuno-citoquímica utilizando anticorpos
policlonais para LPA1, LPA2 e LPA3, à esquerda. À direita, reação imuno-citoquímica com
anticorpo A2B5. (B) Análise da expressão dos receptores de LPA por PCR, na presença
(+RT) ou ausência (-RT) da enzima transcriptase reversa. Barra de calibração: 20 m.
A
B
A2B5
A2B5
A2B5
LPA1
LPA2
LPA3
LPA2
+RT -RT
LPA3
+RT -RT
LPA1
+RT -RT
73
Figura 28: LPA afeta o número de progenitores da zona subventricular pós-natal in
vivo. (A) Imagem de imunofluorescência para BrdU
+
, 48h após injeção intraventricular de
BSA 0,004% (Controle) ou LPA 1 M e injeção intraperitoneal de BrdU. (B) Gráfico
indicando o número de células BrdU
+
na SVZ dorso-lateral e medial (C). Valores do gráfico
correspondem à média erro padrão de células quantificadas de pelo menos 3 cortes
histológicos de cada animal. O número de animais está indicado nas barras. Barra de
calibração: 50 m.
B
A
Controle LPA
No. células BrdU
+
na SVZ d-l / área
(% do controle)
0
20
40
60
80
100
120
N=3
N=2
Controle
LPA
Controle LPA
No. células BrdU
+
SVZ medial / área (% do controle)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
N=3
N=2
C
Densidade células BrdU+ SVZdl
(% controle)
Densidade células BrdU+ SVZm (% controle)
74
revelou uma redução de 28% na densidade de células BrdU
+
na SVZ dorso-lateral
(Figura 28B). Esta redução foi acompanhada de um aumento de 16% na densidade
de células marcadas na substância branca e 42% na substância cinzenta do córtex
cerebral (Figura 29). Curiosamente, o LPA aumenta o número de células BrdU+ na
SVZ medial em quase 40% em relação ao controle (Figura 28C).
Considerando a possibilidade do aumento de células BrdU
+
no telencéfalo
dorsal ser causado por um aumento na proliferação de células no parênquima
cerebral, realizou-se imuno-histoquímica para GFAP (uma marcador de astrócitos)
(Figura 30). Uma análise qualitativa mostrou que a expressão de GFAP está
diminuída na SVZ dorsal e as outras regiões analisadas não mostraram alterações
significativas na marcação para GFAP (Figura 30).
A análise da marcação para nestina (um marcador da glia radial e de outros
progenitores neurais) não revelou alterações substanciais na expressão desta
molécula em nenhuma das regiões analisadas (Figura 31).
75
Figura 29: LPA aumenta o número de células BrdU
+
na substância branca e cinzenta
do córtex. (A) Imagem de corte histológico corado por cresil indicando a área quantificada
no córtex. (B) Imagem de imunofluorescência para BrdU de uma seção do telencéfalo dorsal
evidenciando células na substância branca (SB) e substância cinzenta (SC), 48h após
injeção intraventricular. Os gráfico indicam a porcentagem de células BrdU
+
por área na SB
(C) e SC (D). Os valores do gráfico correspondem à média erro padrão de células
quantificadas de pelo menos 3 cortes histológicos de cada animal. O número de animais
utilizados está indicado nas barras. Barra de calibração: 200 m.
A
C
VL
SB
CC
Controle LPA
No. células BrdU
+
/ área (% do controle)
0
20
40
60
80
100
120
140
N=2
N=2
D
Controle LPA
No. células BrdU
+
/ área (% do controle)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
N=2
N=2
B
Densidade células BrdU+ Subst. Cinzenta
(% controle)
Densidade células BrdU+ Subst. Branca
(% controle)
SC
76
Figura 30: LPA parece afetar a marcação para astrócitos. Imagens de
imunofluorescência para GFAP na condição controle (A-F, BSA-FAF) e após o tratamento
com LPA 1 M (G-L). Barra de calibração: 50 m.
Controle
LPA
SVZ dorsal
F
SVZ lateral
E K
Subst. Cinzenta
A
G
Subst. Branca
B
H
L
D
J
C
I
D
L
SVZ lm
SVZ medial
77
Figura 31: LPA não altera a marcação de nestina. Imagens de imunofluorescência para
nestina na condição controle (A-F, BSA-FAF) e após o tratamento com LPA 1 M (G-L).
Barra de calibração: 50 m.
A
G
B
H
F
L
K
D
L
SVZ dorsal
SVZ lateral
Subst. Cinzenta
Subst. Branca
E
Controle
LPA
C
I
D
J
SVZ lm
SVZ medial
78
4. DISCUSSÃO
CAPÍTULO I
4.1 - O papel de LPA na maturação de oligodendrócitos
O processo de amadurecimento dos OLGs é uma das etapas fundamentais
para o desenvolvimento do SNC. Os dados apresentados neste trabalho indicam
que o LPA está envolvido neste processo, tanto em fases iniciais como tardias.
Os resultados apresentados no capítulo I mostram que o LPA é capaz de
promover um aumento na área de cobertura de prolongamentos de OLGs em
cultura, promovendo o crescimento de estruturas de membrana consideradas
análogas aos estágios iniciais de formação da bainha de mielina in vivo. O LPA é
capaz também de induzir a síntese do mRNA que codifica a proteína MBP,
aumentando assim o número de células que expressam esta molécula. Por outro
lado, os níveis de mRNA para o marcador tardio MOG não são afetados. Os efeitos
descritos acima tiveram como condição fundamental a diminuição da expressão
endógena da ATX.
A diminuição da expressão de ATX reduz, consequentemente, a atividade do
domínio MORFO e, possivelmente, concentrações pré-existentes de LPA. A
diminuição per se da expressão de ATX parece reduzir a área e a complexidade da
arborização de OLGs (Dennis et al., 2008). Quando LPA é aplicado exogenamente,
a área total de cobertura do oligodendrócito é recuperada. No entanto, esta parece
ser ocupada majoritariamente por estruturas de membrana pré-mielinizante e não
por ramificações complexas. Desta forma demonstramos que a diminuição da
expressão da ATX permite que o LPA exerça um efeito de diferenciação sobre OLGs
79
em cultura, estimulando a transição de um estado onde as células apresentam a
formação de uma rede complexa de finos processos, para outro onde adquirem uma
morfologia análoga à bainha de mielina, com o concomitante aumento da expressão
de mRNA para MBP. No entanto, para que se possa observar o efeito de LPA sobre
o aumento da área de membrana e o aumento de expressão de mRNA para MBP é
necessário que haja a diminuição da expressão de ATX. Recentemente foi sugerido
que a formação da bainha de mielina envolve a desestabilização dos microtúbulos e
a desacetilação de α-tubulina (Southwood et al, 2007). O corolário desta observação
foi que o efeito do LPA sobre a morfologia dos OLGs passe pelo rearranjo do
citoesqueleto. Isto então permitiria a modificação da morfologia celular, a partir de
uma etapa de crescimento de prolongamentos de membrana, até a formação da
bainha mielina. Corroborando esta hipótese, foi mostrado anteriormente que o LPA
induz o rearranjo dos microtúbulos durante a remodelagem dos prolongamentos em
neurônios (Fukushima e Morita, 2006; Sayas et al., 2002).
Neste trabalho foi demonstrado que a diminuição nos níveis de ATX afeta
negativamente a expressão de MBP e a subsequente adição de LPA é capaz de
reverter este efeito. Estes resultados atestam o papel fundamental do LPA no
desenvolvimento do sistema nervoso central, uma vez que esta molécula está
envolvida na expressão de genes em OLGs durante o processo de mielinização. O
aumento da expressão de genes por meio da ativação de receptores de LPA em um
período de algumas horas já havia sido descrito anteriormente (Klemm et al., 2007;
Ye et al., 2005). Em sintonia com esses dados, o efeito do LPA descrito aqui é
supostamente mediado por uma via de sinalização que envolve pelo menos um, ou
provavelmente, mais de um tipo de receptor de membrana, expressos por OLGs em
diferenciação. Sob a estimulação de agonistas, a maior parte dos GPCRs é
80
rapidamente internalizada por vias endocíticas. A ativação de receptores de LPA tem
sido associada à endocitose mediada por vesículas (Urs et al., 2005; Murph et al.,
2003; Kranenburg et al., 1999; Luttrell et al., 1997). A marcação imuno-histoquímica
para os receptores de LPA do tipo 1, 2 e 3 revela uma marcação com um padrão
característico de localização intravesicular. Desta forma a ativação dos receptores
de LPA e a conseqüente ativação da via endocítica parece encontrar-se em pleno
funcionamento nas culturas primárias de OLGs utilizadas neste trabalho.
Até o momento não foi evidenciada nenhuma deficiência em relação à
mielinização em camundongos nocaute para receptores de LPA (Estivill-Torrus et al.,
2007;Contos et al., 2000). Esta observação, no entanto, não minimiza de forma
alguma a importância dos receptores de LPA na sinalização intracelular envolvida na
diferenciação de OLGs e na mielinização. A existência de vários receptores de LPA
(e ainda a possibilidade do descobrimento de novos receptores) e a redundância das
respostas celulares desencadeadas pelos liso-fosfolipídeos, tem revelado um
cenário de grande complexidade (Valentine et al., 2007).
Os dados apresentados aqui revelam a importância do LPA como uma
molécula-chave durante a etapa final da maturação dos OLGs. Ressaltamos que
estes efeitos somente são observados mediante a inibição da expressão da ATX.
Neste estudo demonstramos que a ATX secretada pelos OLGs em cultura
apresenta atividade Liso-PLD, sugerindo a existência de concentrações endógenas
de LPA. A pré-existência de concentrações endógenas de LPA poderia ser
responsável pelo efeito de LPA só ter sido observado na condição de níveis
reduzidos de LPA ou, na condição controle, nos primeiro minutos da cultura. Nesta
última situação, a troca de meio de cultura durante o experimento – para a adição de
meio contendo BSA/LPA exógeno – teria removido parte da concentração de LPA e
81
ATX pré-existentes na cultura. Com o passar do tempo de incubação, os OLGs
reporiam as concentrações endógenas de ATX e esta aumentaria as concentrações
endógenas de LPA novamente. Altas concentrações de LPA extracelular levariam a
uma dessensibilização dos receptores e conseqüente interrupção/redução do efeito
sobre a área ocupada pela arborização. A ativação de receptores de LPA tem sido
associada à endocitose mediada por vesículas (Urs et al., 2005; Murph et al., 2003;
Kranenburg et al., 1999; Luttrell etal., 1997). Desta forma, em 2h nenhuma diferença
entre a condição controle e tratada seria observada. Esta hipótese poderia ser
testada medindo-se os níveis de LPA endógeno antes e ao final do experimento.
Uma outra possibilidade é sugerida pelos experimentos utilizando as células
da linhagem oligodendroglial CIMO. Estas células não expressam ATX, mas
possuem a maquinaria celular capaz de responder ao domínio MORFO (Dennis et
al., 2008). O tratamento prévio das células CIMO com um peptídeo contendo o
domínio MORFO bloqueia/inibe a ação de LPA sobre o citoesqueleto de actina. Este
resultado sugere um controle por parte do domínio MORFO sobre a resposta celular
ao LPA. Esta hipótese se mostra muito atraente quando pensamos na ordem das
etapas de diferenciação/maturação: para que a etapa de formação da mielina inicie
é necessária a formação de uma rede complexa de prolongamentos.
À luz do conhecimento estabelecido atualmente em relação ao papel da ATX
como principal fonte geradora de LPA (van Meeteren e Moolenaar, 2007), é
perfeitamente razoável especular que durante a maturação dos OLGs o LPA seja
geradoa pela ATX a partir de seu sítio ativo liso-PLD. A síntese de LPA no momento
adequado do desenvolvimento pode representar o principal estímulo responsável
pela transição de uma morfologia celular caracterizada por uma complexa rede de
prolongamentos finos para outra típica da formação da bainha de mielina, associada
82
a um aumento da expressão de MBP. O mais interessante é que o estabelecimento
desta morfologia, caracterizada por uma complexa rede de prolongamentos, é
facilitada pelo segundo sítio funcional da ATX, o domínio MORFO (Dennis et al.,
2008). Esta enzima, portanto, parece promover a maturação dos OLGs por meio de
uma ação harmônica combinada de seus dois sítios funcionalmente ativos.
Consequentemente, dissecar em detalhes o papel da ATX nos mecanismos
subjacentes à mielinização durante o desenvolvimento normal in vivo, pode prover
informações importantes sobre os fatores reguladores da mielinização cuja disfunção
poderia levar à defeitos de mielinização em processos patológicos.
CAPÍTULO II
4.2 - LPA exógeno afeta a migração radial de progenitores da SVZ in vivo
A maior parte dos OLGs, que participa da formação da bainha de mielina no
telencéfalo dorsal é gerada após o nascimento (Kessaris et al., 2006; Richardson et
al., 2006; Ventura e Goldman, 2006; Gorski et al., 2002). Estes OLGs são originários
de precursores celulares da SVZ e migram radialmente em direção à substância
branca, onde estão mais densamente representados, e substância cinzenta cortical.
Nestas regiões podem ainda proliferar, para em seguida entrar em processo de
diferenciação e finalmente mielinizar axônios. A presença de LPA no LCE durante
este período, sugere o envolvimento deste lipídeo em eventos mais precoces do que
descrevemos anteriormente, como os de determinação fenotípica e migração
(Dottori et al., 2008; Fukushima et al., 2007; Cui e Qiao, 2006; Sato et al., 2005;
Svetlov et al., 2004).
Nossos resultados in vitro demonstraram que o LPA afeta o citoesqueleto dos
83
pOLGs migratórios resultando na retração de prolongamentos. Em células neuronais
migratórias, o LPA induz a contração do citoesqueleto de actina levando à retração
transitória dos prolongamentos. Esta reposta, no entanto, era seguida de
dessensibilização após 2h de exposição (Fukushima et al., 2002). Já em fibroblastos
e células de Schawnn a resposta ao LPA é mantida por mais tempo, de 3 a 6 h
(Fukushima et al., 2002; Weiner et al., 2001). Esta resposta transitória das células
neuronais migratórias tem sido associada com o remodelamento necessário para as
mudanças direcionais provocadas pelo LPA, que funcionaria como fator extracelular
não-permissivo ou mesmo repulsivo. Desta forma, uma vez presente no LCE, o LPA
poderia influenciar a migração dos progenitores para fora da SVZ de maneira a
repelíi-los para longe de sua fonte, em direção ao parênquima. Esta hipótese é
sugerida por nossos experimento in vivo cuja discussão se segue.
O aumento da concentração de LPA no LCE resultou em alterações na
distribuição de células BrdU
+
no córtex cerebral após 48 h. A redução na densidade
de células BrdU
+
na SVZ dorso-lateral (~28%) e o aumento da densidade de células
BrdU
+
na substância branca (~16%) e cinzenta do córtex (~42%) em relação ao
controle poderia ser indicativo do maior deslocamento de células da SVZ para as
substâncias branca e cinzenta do córtex cerebral suprajacente. À luz destes
resultados, algumas hipóteses principais se delineiam: (1) O LPA aumentou a
velocidade de migração radial de progenitores oligodendrocitários, (2) O LPA
aumentou a velocidade de deslocamento e diferenciação da glia radial em
transformação para astrócito, (3) O LPA diminuiu a duração do ciclo celular de
progenitores da SVZ resultando assim na migração precoce dos precursores gliais,
(4) O LPA aumentou a proliferação local de progenitores gliais localizados nas
substâncias cinzenta e branca e, de forma oposta, regulou negativamente a
84
proliferação na SVZ. (5) O LPA direcionou para migração radial neuroblastos da SVZ
que normalmente migrariam tangencialmente para o bulbo olfatório. O
enumeramento destas hipóteses não significa que estas sejam mutuamente
excludentes e que uma combinação de efeitos não possa ter lugar.
Estudos anteriores mostram que o LPA tem efeito sobre a migração celular,
mais especificamente inibe a migração de neurônios pós-mitóticos do córtex cerebral
e de neurônios granulares do cerebelo durante o desenvolvimento destas estruturas
(Fukushima et al., 2002; Sayas et al., 2002). Esta inibição, contudo se dá através de
mecanismos de retração do citoesqueleto de actina e de tubulina, compatíveis com a
hipótese de uma ação repulsora para o LPA e, portanto, estimulatória da migração
em sentido oposto à fonte de LPA. Não conhecemos nenhum ensaio biológico já
feito que tenha abordado este aspecto particular da ação de LPA. Acreditamos que
de acordo com a hipótese 1, o LPA pode ter aumentado a velocidade de migração
ou ter recrutado mais células para migração radial.
De acordo com a hipótese 2, o LPA poderia ter afetado uma população
celular que também se desloca radialmente neste período, a glia radial em processo
de transformação em astrócitos (Misson et al., 19911; Alves et al., 2002) ou mesmo
astrócitos em migração para o córtex cerebral (Suzuki e Goldman, 2003; Kakita and
Goldman, 1999; Zerlin e Goldman, 1997; Zerlin et al., 1995; Luskin e Boone, 1994;
Luskin and McDermott, 1994; Levison et al., 1993). A população de glia radial
presente no córtex cerebral de roedores na primeira semana pós-natal, justamente a
que analisamos, apresenta baixos níveis de incorporação de BrdU (Menezes et al.,
2008; manuscrito em preparação). Mesmo assim, se o deslocamento de populações
BrdU+, estivesse relacionado ao deslocamento dos corpos de glia radial para
camadas mais superficiais do córtex cerebral, esperaríamos encontrar um aumento
85
na expressão de GFAP nestas camadas. No entanto, nossos resultados não
apresentaram mudanças significativas na expressão deste marcador astrocitário. De
forma correspondente esperaríamos uma diminuição na expressão de nestina,
marcador de progenitores de glia radial. Este também não se altera
significativamente.
De acordo com a hipótese 3, o LPA poderia regular a proliferação celular, de
modo a diminuir a duração do ciclo celular de progenitores da SVZ. Este fenômeno
já foi observado em outro estudo com experimentos ex vivo (Kingsbury et al., 2003).
O LPA estimulou a mitose terminal de progenitores neurais embrionários da zona
ventricular. Contudo o pool proliferativo da VZ foi mantido, não havendo diferenças
na densidade de células BrdU+ depois de pulso curto de BrdU nas preparações ex
vivo. Os autores mostraram que LPA também reduziu a apoptose dos progenitores
neurais (Kingsbury et al., 2003). Este autores obtiveram um aumento significativo na
expressão de classe III beta tubulina, marcador neuronal, e sugeriram que o
encurtamento da mitose terminal na VZ embrionária resultava em aumento da
população de neurônios corticais. Nossos resultados na SVZ diferem destes autores,
pois encontramos uma menor densidade de células BrdU+ na SVZ. No entanto,
estes autores realizaram um pulso de 2 horas de BrdU ao passo que nossos animais
tiveram uma sobrevida de 48h. Desta forma, não podemos descartar a hipótese de
que houve encurtamento do ciclo celular e já estamos investigando esta hipótese
com o pulso curto de BrdU. Mesmo um aumento na proliferação celular na SVZ não
pode ser desconsiderado, visto que o aumento na densidade celular no telencéfalo
dorsal é praticamente duas vezes maior do que a diminuição na densidade de
células obtida na SVZ dorso-lateral. Corroborando esta idéia, LPA foi capaz de
aumentar a proliferação neuroblastos corticais (Fukushima et al., 2002; Fukushima et
86
al., 2000, Contos et al., 2000; Hecht et al., 1996) e células-tronco neurais a partir de
ensaios com neurosferas de cérebro embrionário e pós-natal (Cui e Qiao, 2006;
Svetlov et al., 2004).
É possível, como explanado na hipótese 4 que o LPA pudesse ter aumentado
a proliferação local de progenitores gliais presentes nas substâncias branca ou
cinzenta. É sabido que LPA aumenta a proliferação de astrócitos in vitro (Sorensen
et al., 2003; Ramakers e Moolenaar, 1998; Keller et al., 1996). Diferente do
observado in vitro, LPA não parece ter afetado a proliferação local de astrócitos in
vivo no nosso modelo como indicado pela expressão de GFAP que não foi
significativamente aumentada nas substâncias branca ou cinzenta corticais. No
entanto, resta investigar outros marcadores astrocitários para que esta hipótese
possa ser realmente refutada.
De acordo com a hipótese 5, LPA poderia agir sobre neuroblastos da SVZ
mudando sua direção de migração de tangencial para radial. Dados anteriores
mostram que a proteína slit também presente no LCE tem função repulsora de
neuroblastos, e esta função parece ser importante para que neuroblastos atinjam o
bulbo olfatório. No entanto, slit é incapaz de provocar a migração radial destas
células (Sawamoto et al., 2006; Nguyen-Ba-Charvet et al., 2004;Hu, 1999) sugerindo
que outros fatores são responsáveis por manter estas células restritas à SVZ.
Desta forma consideramos que experimentos adicionais precisam ser
realizados para definir qual ou quais destas hipóteses estão corretas. Nossos dados
apontam para uma influência de LPA no deslocamento de células precursoras de
OLGs da SVZ para o tecido cortical suprajacente.
87
5. CONCLUSÃO FINAL
LPA parece ter uma ação em diferentes estágios de diferenciação de células
da linhagem oligodendroglial: em estágios mais precoces, o LPA pode regular
eventos de proliferação e migração. Em estágios mais tardios, o LPA regula eventos
de maturação.
88
6. PERSPECTIVAS FUTURAS
1. Analisar os efeitos de LPA sobre a migração de progenitores pós-
natais da SVZ utilizando a videomicroscopia em explantes de SVZ
ou fatias telencefálicas, utilizando vírus ou outros marcadores vitais.
2. Realizar a identificação das populações de células BrdU+
encontradas nas substâncias cinzenta e branca do córtex cerebral
após tratamento com LPA. Utilizaremos marcadores de precursores
ou OLGs diferenciados tais como: Sox10, PDGFR, Olig2, O4 e MBP.
3. Realizaremos experimentos de pulso curto de BrdU para que
possamos avaliar os efeitos de LPA sobre o ciclo celular de
progenitores da SVZ.
89
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