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QUANTIFICAÇÃO DE CROMO TOTAL E ANÁLISES
ECOFISIOLÓGICAS EM PLANTAS DE Eichhornia crassipes (Mart.)
Solms (AGUAPÉ) DOS RIOS PARAÍBA DO SUL E IMBÉ
LUISA BRITO PAIVA
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
FEVEREIRO DE 2008
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QUANTIFICAÇÃO DE CROMO TOTAL E ANÁLISES
ECOFISIOLÓGICAS EM PLANTAS DE Eichhornia crassipes (Mart.)
Solms (AGUAPÉ) DOS RIOS PARAÍBA DO SUL E IMBÉ
LUISA BRITO PAIVA
“Dissertação apresentada ao Centro de
Ciência e Tecnologia da Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro
para obtenção do título de Mestre em
Ciências Naturais.”
Orientador: Profº. Dr. Marcelo Gomes da Silva
Co-orientadora: Prof
a
. Ângela Pierre Vitoria
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
FEVEREIRO DE 2008
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FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca do CCT / UENF
32/2008
Paiva, Luisa Brito
Quantificação de cromo total e análises ecofisiológicas em plantas
de Eichhornia crassipes (Mart.) Solms (aguapé) dos rios Paraíba do
Sul e Imbé / Luisa Brito Paiva. – Campos dos Goytacazes, 2008.
xiii, 88 f.. : il.
Dissertação (Mestrado em Ciências Naturais) --Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Centro de Ciência
e Tecnologia. Laboratório de Ciências Físicas. Campos dos
Goytacazes, 2008.
Orientador: Marcelo Gomes da Silva.
Co-orientadora: Ângela Pierre Vitória.
Área de concentração: Química e física do meio ambiente
Bibliografia: f. 75-87
1. Rio Paraíba do Sul 2. Rio Imbé 3. Cromo trivalente 4. Cromo
hexavalente 5. Ecofisiologia l. Universidade Estadual do Norte
QUANTIFICAÇÃO DE CROMO TOTAL E ANÁLISES
ECOFISIOLÓGICAS EM PLANTAS DE Eichhornia crassipes (Mart.)
Solms (AGUAPÉ) DOS RIOS PARAÍBA DO SUL E IMBÉ
LUISA BRITO PAIVA
“Dissertação apresentada ao Centro de
Ciência e Tecnologia da Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro
para obtenção do título de Mestre em
Ciências Naturais.”
Aprovada em 22 de fevereiro de 2008.
Banca Examinadora:
____________________________________________________________________
Prof. Ricardo Antunes de Azevedo (Dr. Bioquímica de plantas) - ESALQ/USP
____________________________________________________________________
Prof. Marcelo Silva Sthel (Dr. Física) - UENF/LCFIS
____________________________________________________________________
Prof. Jurandi Gonçalves de Oliveira (Dr. Biologia Vegetal) - UENF/LMGV
____________________________________________________________________
Prof. Marcelo Gomes da Silva - (Dr. Física) - UENF/LCFIS
(Orientador)
“E se alguém ama a justiça,
seus trabalhos são virtudes,
ela ensina a temperança e a prudência,
a justiça e a força,
não há ninguém que seja mais útil aos homens na vida”.
Livro da Sabedoria 8,7.
Aos meus pais, Maria da Penha e Clementino
Ao meu irmão Alexandre
Aos meus amigos e mestres
AGRADECIMENTOS
A Deus pela minha vida e por saber trabalhar perfeitamente com
ferramentas insuficientes como eu.
Aos meus maravilhosos pais, Maria da Penha e Clementino que amo
infinitamente, exemplos de luta e perseverança. Ao meu irmão Alexandre e a
minha avó Maria de Lourdes. Obrigada por confiarem em mim, por me apoiarem e
torcerem em todos os momentos da vida.
A Angela mais uma vez e sempre. Por depositar em mim sua confiança
para conduzir mais um trabalho. Pela sua disposição em me ajudar, em me
ensinar e por ter me mostrado que posso ser capaz de superar as coisas que
considero como desafiadoras. Pelos anos de amizade, respeito e compreensão.
Por ser meu espelho de profissionalismo e competência, entre outras tantas
qualidades.
Ao Marcelo, uma excelente pessoa e, acima de tudo, um raro profissional,
sempre disposto ajudar. Por ter aceitado conduzir esse trabalho. Por tantos
conhecimentos passados. Pela paciência e etc. Também meu espelho de
profissionalismo e competência, entre outras tantas qualidades.
A todos do LCA. As novas amizades. Aos momentos de diversão e muito
trabalho. Pelas grandes ajudas. Em especial, ao Leonardo, Fred (essencial nas
análises ecofisiológicas), Juliana, Flávia e Aline, Thiago, Bruno Esteves e
Gustavo. Cada um contribuindo de modo particular e indispensável.
Ao Douglas. Meu querido amigo, sua ajuda foi imprescindível. Sabemos o
quanto suamos (literalmente) com todo o trabalho. Não consigo nem pensar o que
seria de mim sem sua preciosa mão. De todo o meu coração: muito obrigada!
A todos do LCFIS, de maneira particular, ao Milton, Willy, as Milenas. Por
terem sido imensamente prestativos no decorrer do meu trabalho dentro deste
laboratório.
A todos do LCQUI, por alguns reagentes e equipamentos que utilizei nas
análises das minhas amostras, além dos amigos, é claro.
A todos os funcionários, colegas e professores, que embora não citados
não deixaram de ser importantes para minha formação e realização deste
trabalho.
As fontes financiadoras PIBIC/UENF, FAPERJ e FAPESP
indispensáveis
para o desenvolvimento deste trabalho.
MUITO OBRIGADA!!!
i
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS......................................................................................
iv
LISTA DE TABELAS.....................................................................................
vi
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS...................................
vii
RESUMO........................................................................................................
x
ABSTRACT.................................................................................................... xii
CAPÍTULO 1 - QUANTIFICAÇÃO DE Cr TOTAL E HEXAVALENTE EM
PLANTAS DE AGUAPÉ DO RIO PARAÍBA DO SUL……………………......
1
1.1 – INTRODUÇÃO................................................................................ 1
1.1.1 - O rio Paraíba do Sul e sua importância................................. 1
1.1.2 - Metais pesados e poluição ambiental.................................... 4
1.1.3 - Mecanismos de tolerância a metais pesados em plantas......
7
1.1.4 - Cr e estresse em plantas....................................................... 8
1.1.5 - Eichhornia crassipes (Mart.) Solms e estresse ambiental.....
11
1.2 – JUSTIFICATIVA.............................................................................. 15
1.3 – OBJETIVOS.................................................................................... 16
1.3.1. Objetivo geral.......................................................................... 16
1.3.2. Objetivos específicos...............................................................
16
1.4 - MATERIAL E MÉTODOS................................................................ 16
1.4.1 - Material vegetal e local de coleta........................................... 17
1.4.2 - Preparo da amostras para quantificação de Cr..................... 18
1.4.3 - Método colorimétrico da 1,5 difenilcarbazida (quantificação
de Cr
+6
).............................................................................................
19
1.4.4 – Análise dos resultados.......................................................... 19
1.5 - RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................... 20
1.5.1 - Quantificação de Cr total.........................................................
20
1.5.2 – Quantificação de Cr
+6
.............................................................
22
1.6 – CONCLUSÕES............................................................................... 23
ii
CAPÍTULO 2 - DETERMINAÇÃO DO LIMITE INFERIOR DE DETECÇÃO
DE Cr
+6
NA PRESENÇA DE Fe
+3
………………………………
24
2.1 – INTRODUÇÃO................................................................................ 24
2.1.1 - Presença de ferro no rio Paraíba do Sul e rio Imbé............... 24
2.2 – JUSTIFICATIVA.............................................................................. 26
2.3 – OBJETIVOS.................................................................................... 27
2.3.1 – Objetivos Gerais.................................................................... 27
2.4 - MATERIAL E MÉTODOS.................................................................
27
2.5 – RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................... 29
2.6 – CONCLUSÕES............................................................................... 33
CAPÍTULO 3 - ANÁLISES ECOFISIOLÓGICAS EM PLANTAS DE
AGUAPÉ SUBMETIDAS A Cr
+3
e Cr
+6
…………………………………………
34
3.1 – INTRODUÇÃO................................................................................ 34
3.1.1 - Emissão da fluorescência da Clorofila a................................
34
3.1.2 - Trocas Gasosas..................................................................... 37
3.1.3 - Pigmentos Fotossintéticos......................................................
38
3.1.4 - Alterações ecofisiológicas de plantas na presença de cromo
39
3.2 – JUSTIFICATIVA.............................................................................. 41
3.3 – OBJETIVOS.................................................................................... 43
3.3.1. Objetivo geral...........................................................................
43
3.3.2. Objetivos específicos...............................................................
43
3.4 - MATERIAL E MÉTODOS.................................................................
43
3.4.1 - Material vegetal e local de coleta........................................... 43
3.4.2 - Condições de cultivo.............................................................. 43
3.4.3 - Preparo das soluções nutritivas............................................. 44
3.4.4 - Preparo das soluções de Cr................................................... 45
3.4.5 - Parâmetros Ecofisiológicos.................................................... 46
3.4.5.1 – Indicativo do conteúdo de cor ver............................... 47
iii
3.4.5.2 – Quantificação dos Pigmentos Fotossintéticos............ 47
3.4.5.3 – Cinética de Emissão de Fluorescência da Clorofila a.
48
3.4.5.4 – Trocas Gasosas.......................................................... 48
3.4.6 - Preparo da amostras para quantificação de Cr......................
49
3.4.7 - Análises dos dados................................................................ 49
3.5 - RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................... 50
3.5.1 - Alterações morfológicas......................................................... 50
3.5.2 - Quantificação de Cr total........................................................ 52
3.5.3 - Espectros no UV-visível......................................................... 56
3.5.4 - Clorofila Total......................................................................... 60
3.5.5 – Conteúdo dos Pigmentos Fotossintéticos............................. 61
3.5.6 – Emissão da fluorescência da clorofila a................................
63
3.5.7 - Trocas Gasosas..................................................................... 69
3.6 – CONCLUSÃO..................................................................................
75
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................
75
ANEXOS.................................................................................................. 88
iv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1- a) Estruturas de E. crassipes (Mart.) Solms, 1- flor, 2- limbo
foliar, 3- pecíolo, 4- rizoma, 5- raíz e 6- estolão. b) Foto de um banco E.
crassipes (Mart.) Solms mostrando os limbos foliares e as flores..............
13
Figura 1.2 - Locais de coleta do material ao longo RPS e do rio Imbé. (1)
rio Imbé (controle), (2) baixo RPS, (3) médio RPS e (4) alto RPS..............
17
Figura 2.1 – Espectro de absorção de solução de 1 ppm de Cr
+6
com
DFC em meo ácido e sem DFC………........................................................
29
Figura 2.2 – Convoluções dos espectros de 0,5 ppm de Cr
+6
puro de
Fe+3 em diferentes em meio contendo DFC e ácido. a) 5 ppm de Fe
+3
e
b) 85 ppm Fe
+3
. OBS: As concentrações são referentes à mistura, ou
seja metades das concentrações originais..................................................
30
Figura 2.3 - Gráfico das concentrações de Fe
+3
pelas áreas de Cr
+6
em
unidades arbitrárias (u.a.) para as soluções de Cr
+6
e Fe
+3
em meio ácido
contendo DFC. As concentrações de Fe
+3
mostradas são a metades das
originais. Fe
+3
200 ppm não foi mostrada...................................................
31
Figura 3.1 – Experimento realizado na casa de vegetação. Recipientes
contendo as macrófitas, da esquerda para a direita: controle, 1mM de
Cr
+3
, 10mM de Cr
+3
, 1mM de Cr
+6
e 10mM de Cr
+6
.....................................
44
Figura 3.2 - Aspectos morfológicos das plantas de aguapé: Coluna da
esquerda: 2 dias de tratamento; coluna da direita: 4 dias de tratamento. a
e b – plantas-controle; c e d - plantas expostas a Cr
+3
1 mM; e e f -
plantas expostas a Cr
+3
10 mM; g e h - plantas expostas a Cr
+6
1 mM; i e
j - plantas expostas a Cr
+6
10 mM............................................................... 51
Figura 3.3
– Espectros de absorção para partes aéreas e raízes de
aguapé do controle (a) e após quatro dias de exposição a Cr
+6
1 mM (b)
e Cr
+3
1 (c) e 10 mM (d). As amostras são as plantas digeridas e 57
v
complexadas com 1,5-DFC em meio ácido................................................
Figura 3.4 - Espectros de absorção para plantas de aguapé após quatro
dias de exposição a Cr
+6
1 mM e Cr
+3
1 e 10 mM. a- partes aéreas e b-
raízes. As amostras são as plantas digeridas e complexadas com 1,5-
DFC em meio ácido.....................................................................................
59
Figura 3.5 – Indicativo do conteúdo de cor verde em plantas de aguapé
expostas a diferentes concentrações de Cr
+3
e Cr
+6
no tempo zero, dois
e quatro dias de tratamento. As barras representam o desvio padrão.
Letras maiúsculas comparam entre o mesmo tratamento em diferentes
tempos de exposição. Letras minúsculas, entre diferentes tratamentos no
mesmo tempo..............................................................................................
60
Figura 3.6 – Curva de resposta a luz para Condutância estomática e
Assimilação fotossintética (eixo esquerdo e direito das ordenadas,
respectivamente) pela PAR (radiação fotossinteticamente ativa) para
plantas de aguapé.......................................................................................
70
Figura 3.7 - Efeitos de Cr
+3
e Cr
+6
sobre a Assimilação Fotossinética (a),
o Carbono interno (b), a condutância estomática (c) e a
evapotranspiração (d) de plantas de aguapé. Controle (○), Cr
+3
1 mM (□),
Cr
+3
10 mM (∆), Cr
+6
1 mM (■) e Cr
+6
10 mM (▲). Os valores são médias
± o desvio-padrão........................................................................................
71
vi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.1 - Concentrações de Cr total (µg.g
-1
de massa seca) para plantas
de aguapé (partes aéreas e raízes) coletadas do rio Imbé e RPS durante dois
anos (4 coletas)...................................................................................................
21
Tabela 2.1 - Concentrações de Fe
+3
, Cr
+6
, reagentes e os volumes utilizados
no preparo das amostras.....................................................................................
28
Tabela 3.1 - Sais utilizados no preparo da solução de cultivo de
micronutrientes e de Fe+EDTA (Smart e Barko, 1985).......................................
45
Tabela 3.2 - Sais utilizados no preparo da solução de cultivo de
macronutrientes (Hoagland e Arnon,1950).....................................................
46
Tabela 3.3 - Equipamentos utilizados nas leituras de clorofila total
(1)
,
pigmentos fotossintéticos
(2)
, cinética de emissão da clorofila a
(3)
e trocas
gasosas
(4)
. ..........................................................................................................
47
Tabela 3.4 - Concentrações de Cr total (µg.g
-1
de massa seca) para plantas
de aguapé expostas a Cr
+3
1 e 10 mM e Cr
+6
1 mM após quatro dias de
tratamento. ..........................................................................................................
52
Tabela 3.5 - Conteúdo dos pigmentos fotossintéticos (µmol.cm
-2
): clorofila a
(clo a), clorofila b (clo b) e carotenóides (Carot.) para plantas de aguapé
expostas a Cr
+3
1 e 10 mM e Cr
+6
1 mM após quatro dias de tratamento...........
61
Tabela 3.6 - Valores de fluorescência da clorofila a para as plantas de aguapé
expostas a diferentes tratamentos com Cr
+3
e Cr
+6
nas concentrações de 1 e
10mM nos períodos de 2 e 4 dias. F
0
- fluorescência mínima; F
m
-
fluorescência máxima; F
v
– fluorescência variável; F
v
/F
m
- eficiência quântica
potencial; F
v
/F
0
– eficiência da capacidade fotossintética; qP – quenching
fotoquímico; qN e NPQ – quenching não-fotoquímico. Análise estatística
(Tukey, p< 5%): as letras (a, b, c, d e e) representam a estatística para
comparação entre os tratamentos. .....................................................................
64
vii
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
Al - alumínio
As - arsênio
CaCl
2
- cloreto de cálcio
CBB - Centro de Biociências e Biotecnologia
CCT - Centro de Ciência e Tecnologia
Cd - cádmio
Ci - carbono interno
Clo - clorofila
Clo a - clorofila a
Clo b - clorofila b
cm
3
- centímetro cúbico
Cr - cromo
Cr
+2
- cromo divalente
Cr
+3
- cromo trivalente
Cr
+5
- cromo pentavalente
Cr
+6
- cromo hexavalente
Cr
2
O
3
- trióxido de cromo
Cu - cobre
CuSO
4
- sulfato de cobre
DMSO - dimetilsulfóxido
DNA - ácido desoxirribonucleico
EDTA - ácido etilenodiamino tetraacético
et al. - e colaboradores
F
0
- fluorescência inicial
Fe - ferro
FeCl
3
- cloreto férrico
Fe(NO
3
)
3
.9H
2
O – nitrato férrico nonaidratado
F
m
- fluorescência máxima
viii
FS II - fotossistema II
F
v
- fluorescência variável
F
V
/F
m
- rendimento quântico máximo
g - grama
g
s
- condutância estomática
h - hora
H
2
SO
4
– ácido sulfúrico
Hg - mercúrio
K
2
Cr
2
O
7
- dicromato de potássio
K
2
SO
4
- sulfato de potássio
Kg - kilograma
KH
2
PO
4
– fosfato ácido de potássio
KHCO
3
– carbonato ácido de potássio
L - litro
m - metro
m
-2
– por metro quadrado
mg - miligrama
MgSO
4
- sufato de magnésio
min - minutomL - mililitro
mM - milimolar
Mn - manganês
MnSO
4
- sulfato de manganês
Mo – molibdênio
MPS – material particulado em suspensão
N - normal
NaHCO
3
- carbonato ácido de sódio
(NH
4
)
6
Mo
7
O
24
. 4H
2
O – molibdato de amônio tetraidratado
NH
4
NO
3
- nitrato de amônio
Ni - níquel
nm - nanômetro
ix
P - fósforo
PAR - radiação fotossinteticamente ativa
Pb - chumbo
ppm - parte por milhão
PSI - fotossistema I
PSII - fotossistema II
qN e NPQ - coeficientes de extinção de fluorescência não-fotoquímico
qP - coeficiente de extinção de fluorescência fotoquímica
RJ - Rio de Janeiro
ROS - espécies reativas de oxigênio
RPS – rio Paraíba do Sul
s
-1
– por segundo
Se - selênio
SO
4
- sulfato
t
f
- temperatura da folha
Zn - zinco
ZnSO
4
- sulfato de zinco
1,5 - DFC - 1,5 - Difenilvarbazida
ºC - graus Celsius
µg - micrograma
µmol - micromol
µmolfotons - micromol de fótons
% - porcentagem
x
RESUMO
O rio Paraíba do Sul (RPS) tem um papel decisivo no Estado do Rio de
Janeiro, abastecendo de água cerca de 80% da população e recebendo efluentes
industriais e urbanos. Na composição desses efluentes estão presentes alguns
metais pesados, como o Cr. Devido ao grande uso desse elemento (mais
especificamente na sua forma Cr
+6
) pelo setor siderúrgico, faz-se necessária a
detecção dessa forma química. Tal íon metálico é o estado de oxidação mais
tóxico do Cr, o que coloca em risco as espécies animais e vegetais relacionados
ao rio. O presente trabalho objetivou a determinação da concentração de cromo
total e hexavalente em plantas de Eichhornia crassipes. Esta espécie vegetal,
presente em grande quantidade no RPS e com alta capacidade de acumular
metais pesados sem comprometer seu metabolismo, permite seu próprio uso na
avaliação de contaminação do ambiente. As plantas foram coletadas nas regiões
do alto, médio e baixo RPS e no rio Imbé (considerado como ambiente controle).
Separadas as suas partes (raízes e partes aéreas), as análises foram conduzidas
em espectrofotômetro de absorção atômica (120 Varian Techtron). Foi possível
quantificar Cr total nas amostras, entretanto a obtenção dos resultados para Cr
+6
esbarrou na alta presença de Fe (principal interferente do Cr
+6
) dessas amostras.
Para tanto, foi necessário estabelecer o limite inferior de detecção de Cr
+6
na
presença de Fe. Com essa finalidade, foram preparadas misturas de soluções
padrões de Fe
+3
em diferentes concentrações e uma solução de 0,5 ppm de Cr
+6
em 1,5-DFC. A partir dos resultados obtidos, foi conduzido um experimento em
casa de vegetação, no qual as plantas citadas foram cultivadas durante um
período de quatro dias em soluções de Cr
+6
e Cr
+3
nas concentrações de 1 e 10
mM. Análises ecofisiológicas de trocas gasosas, emissão de fluorescência da
clorofila a e conteúdo dos pigmento fotossintéticos foram feitas em indivíduos
adultos de aguapé. Os resultados mostraram que as concentrações de Cr total
foram maiores para as raízes que para as partes aéreas quando se utilizou a
forma hexavalente do Cr. Os espectros obtidos no Uv-Visível para as mostras
tratadas com Cr
+3
foram claramente diferentes daqueles obtidos para o Cr
+6
. As
xi
análise ecofisiológicas mostraram que a presença de Cr
+3
nas concentrações de 1
e 10 mM foi capaz de estimular a assimilação fotossintética, evapotranspiração e
condutância estomática nas plantas analisadas em 2 dias de experimento. Porém
as plantas expostas a Cr
+6
1 e 10 mM sofreram queda nos parâmetros
fotossintéticos avaliados para o mesmo tempo de exposição ao metal pesado.
Quando analisadas em 4 dias, as plantas do tratamento com Cr
+3
1 e 10 mM e
Cr
+6
1mM apresentam queda dos parâmetros supracitados em relação às plantas
controle. Ao final do experimento os indivíduos expostos a Cr
+6
10 mM
encontravam-se bastate necrosados de forma que os resultados não foram
mostrados.
Palavras-chave: rio Paraíba do Sul, rio Imbé, Cr
+6
, Cr
+3
, Fe e ecofisiologia.
xii
ABSTRACT
The Paraíba do Sul river (PSR) has a decisive role in the Rio De Janeiro
State. It supplies about 80% of the population and receivies industrial and urban
effluents. In the composition of these effluents there are some heavy metals as the
chromium (Cr). Due to the large use of the Cr (more specifically in its Cr
+6
form) by
the siderurgical sector, the detection of this chemical form is necessary. Such
metallic ion is the most toxic Cr oxidation state, what it puts at risk the animal and
vegetal species related to the river. The present work had as objectifive
determinate the concentration of total and hexavalent Cr in plants of Eichhornia
crassipes (Mart.) Solms (water hyacinth). This vegetal species has high capacity to
accumulate heavy metals without compromising its metabolism, allowing to be
used in the evaluation of environmental contaminations. The plants has been
collected in the regions of the higher, medium and lower PSR and in the Imbé river
(considered as surrounding control). It was possible to quantify total Cr in these
samples, however the attainment of the results for Cr
+6
to came up against in the
high presence of iron (Fe) (main Cr
+6
interferent) of these samples. Thus, it was
necessary to establish the Cr
+6
detection minimum limit in the presence of Fe
+3
.
From these results, water hyacinth was exposed to Cr
+3
and Cr
+6
in the 1 and 10
mM concentrations during four days. The plants had its ecophisiologic parameters
(photosynthetic pigments, net photosynthetic rate, transpiration, stomatal
conductance, substomal CO
2
concentration and chlorophyll a fluorescence) and
the Cr concentrations in roots and shoot tissues were analyzed. The results
showed that more significant concentrations of Cr in the roots than in the shoots of
all plants for both chemical species. The higher concentration of chemicals to
which the plants were exposed correlated with the higher amount that was found in
its tissues. The Uv-Visible spectras for the cultiveted samples with Cr
+3
were
clearly different of those obtained for the Cr
+6
. The ecophisiologics analysis has
shown that Cr
+3
1 mM and 10 mM were able to stimulate net photosynthetic rate,
transpiration and stomatal conductance in the plants exposed during two days. The
xiii
plants exposed to Cr
+6
10 mM had died in the end of the experiment. It was found
that the substomal CO
2
concentration data followed the negative standard of the
stomatal conductance.
Keywords: Paraíba do Sul river, Imbé river, Cr
+6
, Cr
+3
, Fe and ecophisiology.
1
CAPÍTULO 1
QUANTIFICAÇÃO DE Cr TOTAL E HEXAVALENTE EM PLANTAS DE AGUAPÉ
DO RIO PARAÍBA DO SUL
1.1 - INTRODUÇÃO
Os ambientes aquáticos são utilizados em todo o mundo com distintas
finalidades. No entanto, nas últimas décadas, esses recursos vêm sendo
intensamente ameaçados pelas ações indevidas do homem. O setor industrial
constitui-se na principal e mais diversificada fonte de introdução de substâncias
tóxicas, sobretudo metais pesados, nestes ambientes.
A contaminação de corpos hídricos por metais pesados tem sido
largamente estudada e descrita por diversos autores (Prasad, 1995, Foster e
Charlesworth, 1996; Chaoui et al., 1997; Lagriffoul et al., 1998; Kefala et al., 1999).
Em sistemas fluviais, os diferentes compartimentos abióticos e bióticos podem ser
utilizados como fontes de informações sobre a qualidade da água através da
dinâmica e, ou das interações físico-químicas, que dirigem os processos de
disponibilidade dos metais pesados ao longo do curso d’água.
Muitas plantas aquáticas absorvem e acumulam metais pesados em
concentrações relativamente altas sem comprometimento aos seus processos
metabólicos, funcionando como filtros naturais e indicadores biológicos da
contaminação de sistemas fluviais. Essa capacidade tem sido intensamente
explorada em estudos de monitoramento de poluição ambiental de modo geral
(Jordão et al., 1999).
1.1.1 - O rio Paraíba do Sul e sua importância
O rio Paraíba do Sul (RPS) atravessa três estados economicamente
importantes e populosos do Brasil: São Paulo, Rio de Janeiro e Minas Gerais,
percorrendo aproximadamente 1.145 Km ao longo do seu curso com uma bacia
hidrográfica de aproximadamente 55.400 km
2
(CEIVAP, 2002).
2
Os principais afluentes do RPS são os rios Paraitinga e Paraibuna no estado
de São Paulo, Piraí e Paraibuna em Minas Gerais e os rios Pomba, Muriaé e Dois
Rios no estado do Rio de Janeiro. De acordo com as regiões que o curso d’água
do RPS percorre, recebe as denominações de alto, médio e baixo Paraíba
(CEIVAP, 2002).
Da nascente do rio, situada na Serra da Bocaina (SP), à cidade de São José
dos Campos (SP), é constituída a região do alto Paraíba com uma área de
drenagem de 13.900 km
2
.
Desta cidade até o município de Itaocara, já no Estado
do Rio de Janeiro, o rio recebe a denominação de médio Paraíba, totalizando uma
superfície drenada de 20.800 km². A partir desta localidade até o município de São
João da Barra na região Norte fluminense, correspondendo a uma área drenada
de 20.700 km², o rio recebe a denominação de baixo Paraíba (SEMADS, 2001;
CEIVAP, 2002).
As características sazonais, climáticas e constituintes dos solos variam
dentro das regiões acima descritas. Em geral, o clima é subtropical com um
regime de precipitação bem caracterizado com maior intensidade de chuva entre
os meses de novembro e janeiro. A média da temperatura estimada para toda a
bacia varia entre 26 e 28ºC. A temperatura atinge valores mais elevados no médio
e baixo Paraíba, com máximas variando entre 32 e 34ºC. Os solos originais da
bacia do RPS são considerados férteis, pois grande parte de sua extensão foi
coberta pela vegetação da floresta da Mata Atlântica, que hoje encontra-se
praticamente extinta devido a diferentes atividades de origem antrópicas (Carvalho
e Torres, 2002).
O RPS é de suma importância para as cidades localizadas ao longo do seu
curso. Suas águas são utilizadas principalmente na agricultura, na indústria e para
o consumo humano (cerca de 20 milhões de pessoas). Para o Estado do Rio de
Janeiro, o RPS desempenha um decisivo papel sócio-econômico, uma vez que
sua bacia ocupa metade da extensão deste Estado e abastece cerca de 80% da
população fluminense. Contudo, é relevante salientar que a própria utilização do
rio para tais fins implica na contaminação de suas águas, já que elas recebem
3
efluentes de todas as atividades humanas, geralmente sem tratamento ou com
tratamento insuficiente.
Historicamente, o curso d’água do RPS sofreu as conseqüências dos
diferentes “ciclos econômicos” (cana-de-açúcar, café e industrial). Primeiramente,
o plantio da cana-de-açúcar no baixo curso do Paraíba e o cultivo do café nas
porções média e alta impactaram consideravelmente a cobertura vegetal dos solos
e de suas águas com o uso intensivo de agroquímicos. Posteriormente, em
meados do século XX, o avanço industrial das regiões do médio e baixo Paraíba,
com a construção da represa do Funil (Itatiaia, RJ) e da barragem de Santa
Cecília em Barra do Piraí (RJ) reduziram substancialmente as vazões líquidas do
rio (UFRJ, 2002).
De maneira geral, a qualidade da água do RPS muda em função da região.
Próximo a nascente, na região do alto Paraíba, Estado de São Paulo, onde as
cidades são pequenas e de pequeno porte industrial, o rio ainda é utilizado para
turismo (Carvalho et al., 1999; Salomão et al., 2001).
Merece atenção a região do médio Paraíba, sobretudo no município de Volta
Redonda, com destaque para o parque industrial onde se encontra a Companhia
Siderúrgica Nacional (CSN), com elevado potencial contaminante do rio,
principalmente, por metais pesados. Já no baixo Paraíba, uma região pouco
industrializada, onde a agricultura é a atividade principal, os resíduos de
fertilizantes a base de substâncias tóxicas são também lançados no rio.
Adicionalmente ao despejo de dejetos das atividades industriais e agrícolas,
há o despejo no rio de esgoto doméstico em todas essas regiões. Entretanto, a
poluição de origem industrial na bacia do RPS é apontada por diversos estudos
como um dos principais fatores responsáveis pela degradação dos recursos
hídricos. A carga poluidora total de origem orgânica que a bacia do Paraíba
recebe, apenas no Estado do Rio de Janeiro, com 4.000 indústrias ao longo da
extensão da bacia, equivale à 330 toneladas por dia, dos quais cerca de 50%
derivam de efluentes domésticos e 45% industriais (CEIVAP, 2002). Para o trecho
4
fluminense (cerca de 700 indústrias), o despejo de substâncias tóxicas em geral
nas águas do rio é bastante significativo (UFRJ, 2002).
Em relação ao rejeito de metais pesados, o impacto causado ao ambiente e
às formas de vida existentes neste, dependem das concentrações e dos estados
de oxidação (formas químicas) em que estes metais se encontram. Estas
características são alteradas ao longo do rio. Além disto, os metais pesados
sofrem sedimentação e podem ter sua concentração diluída pela entrada de água
de afluentes menos contaminados. Na maioria das vezes, os baixos valores de
metais pesados encontrados em água de rios podem ser explicados pelo papel
concentrador da vegetação ribeirinha, demonstrando sua importância na dinâmica
dos metais pesados.
1.1.2 - Metais pesados e poluição ambiental
Os metais pesados representam um grupo de elementos químicos com
algumas características bem definidas, como: alta densidade (em comparação à
outros metais comuns), toxicidade e transporte através do ar, por gases, ou pela
sua adsorção/absorção em partículas (Baird, 2002). Alguns autores, ainda,
preferem classificá-los como aqueles elementos químicos com densidade igual ou
superior a 5 g.cm
-3
(Malavolta, 1994; Nies, 1999).
Deste grupo de elementos fazem parte o cádmio (Cd), o mercúrio (Hg), o
chumbo (Pb), o cromo (Cr), o molibdênio (Mo), o níquel (Ni), entre outros. Cobre
(Cu), zinco (Zn), manganês (Mn) e ferro (Fe) são micronutrientes para organismos,
plantas e animais. Porém, em altas concentrações, podem ser tão danosos quanto
aqueles que não têm seu papel biológico definido (Welch, 1995).
Os metais pesados podem ser introduzidos no ambiente por alguns
mecanismos de deposição atmosférica, intemperismo de rochas e solos, erosão
da matriz geológica e fontes termais ou através de fontes antropogênicas. Os
efluentes (das indústrias de beneficiamento de ferro e aço e agroquímicas)
contendo principalmente Cr, Cu, Pb, Ni, Zn e Cd, constituem as diversas fontes
antropogênicas de entrada de metais pesados nos ecossistemas aquáticos
(Carvalho e Gomes, 1993).
5
Em geral, os metais pesados se diferenciam de compostos orgânicos tóxicos
por não serem degradáveis, podendo se acumular nos compartimentos do
ambiente, principalmente solos e sedimentos, onde manifestam sua toxicidade. A
toxicidade destes elementos depende, em grande medida, da forma química do
próprio elemento, isto é, de sua espécie ou, ainda, do seu estado de oxidação.
Para alguns destes metais, como o mercúrio, a forma mais tóxica é aquela ligada
a grupos alquilas, dado que muitos desses compostos são solúveis no tecido
animal e podem passar através de membranas biológicas (Baird, 2002).
A espécie química em que um metal pesado está presente num meio
natural determina a sua interação física ou química com este meio e,
conseqüentemente, sua toxicidade. Esta, por sua vez, depende do pH e da
quantidade de carbono dissolvido e em suspensão, já que interações como
complexação e adsorção podem remover de forma satisfatória alguns íons
metálicos e eliminar sua atividade biológica potencial. Porém, em altas
concentrações esses íons podem se tornar fitotóxicos e afetar o desenvolvimento
de organismos (Vitória et al, 2001; Baird, 2002).
É sabido que o grande desenvolvimento industrial é um dos principais
responsáveis pela contaminação por metais pesados das águas fluviais e solos. A
negligência no tratamento de rejeitos contendo estes elementos, além de
acidentes e descuidos cada vez mais freqüentes, têm exposto os organismos
vivos a ambientes poluídos quimicamente complexos. O estudo da toxicidade dos
metais pesados causados aos animais e às plantas é de extrema importância para
avaliar os impactos nestes e ao ambiente e, desta forma, vem atraindo a atenção
de muitos cientistas de diferentes áreas tecnológicas (Prasad, 1995; Jordão et al.,
1999).
Paralelamente ao grande crescimento das indústrias nas últimas décadas, a
rápida urbanização concentrou populações de baixo poder aquisitivo em periferias
carentes de serviços essenciais de saneamento, as quais vieram desenvolvendo
diversas atividades clandestinas. Isto contribuiu para gerar poluição concentrada e
sérios problemas de drenagem agravados pela inadequada deposição de lixo,
6
assoreamento dos corpos d’água e conseqüente diminuição na velocidade de
escoamento das águas, aumentando, assim, as concentrações dos poluentes
químicos despejados nestes ambientes (Moraes e Jordão, 2002).
Em sistemas fluviais, a concentração de metais pesados é geralmente maior
na fração particulada do que na fração dissolvida, embora a partição desses
elementos dependa fortemente das características do íon. A importância relativa
da fração dissolvida para a carga total transportada em suspensão, em geral,
aumenta com o incremento da concentração total de metais pesados,
particularmente em rios contaminados por efluentes industriais (Foster e
Charlesworh, 1996).
Nos rios brasileiros, a carga em suspensão é bem maior que a carga
dissolvida, sobretudo nos meses da estação chuvosa, como pôde ser evidenciado
nas medições realizadas no RPS no município de Barra do Piraí, onde o rio
transportava 43 g/m
3
de material dissolvido contra 550 g/m
3
de material
particulado em suspensão na estação seca: e 10 g/m
3
de material dissolvido e
1200 g/m
3
de particulado na estação chuvosa (Gonçalves, 2003a apud
Christofoletti, 1981).
Outros estudos feitos na região do baixo Paraíba indicaram uma
sazonalidade nas concentrações de metais pesados nas frações dissolvidas e
particuladas, onde concentrações mais elevadas para as frações dissolvidas foram
encontradas na estação seca. Uma relação direta entre estas concentrações com
a concentração de carbono também foi estabelecida, indicando ser a matéria
orgânica um importante fator na dinâmica dos metais pesados na referida região
de estudo (Salomão, 1999).
Gonçalves (2003a) verificou que existe diferença na concentração de metais
pesados (Al, Mn, Fe, Cd, Cr, Cu e Pb) nas frações dissolvida e particulada no
RPS. Cerca de 99% das concentrações desses metais estiveram associados à
fração particulada. Foi possível observar também algumas variações temporais
em relação aos dois períodos de vazão fluvial (alta/chuvosa e baixa/seca), bem
como o fluxo destes metais nas referidas frações. Cr, Cd e Pb apresentaram uma
7
distribuição sazonal, com concentrações médias mais elevadas no período de
baixa vazão do rio. Al, Fe e Mn tiveram suas concentrações aumentadas no
período chuvoso. Durante a vazão alta as concentrações de Cr, Cd e Pb no
particulado estiveram abaixo do limite de detecção médio utilizado no estudo.
Hg, Pb, Cd e Cr são os metais pesados poluentes que apresentam maiores
riscos ambientais em razão de seu uso intenso, toxicidade e ampla distribuição
(Baird, 2002). Como discutido anteriormente, a especiação desses elementos é de
extrema importância, pois irá determinar o grau de toxicidade de cada elemento no
meio onde eles se encontram presentes. De maneira geral, eles são
indiscriminadamente absorvidos pelas plantas e podem promover uma série de
danos ao seu funcionamento (Koricheva et al., 1997).
1.1.3 - Mecanismos de tolerância a metais pesados em plantas
Para sobreviverem em ambientes poluídos, as plantas desenvolveram
algumas estratégias cuja função primordial é combater o estresse oxidativo
causado pela presença de metais pesados, evitando e/ou minimizando os
possíveis danos. De forma geral, o princípio de tolerância das plantas a metais
pesados consiste em passivar tais elementos, isto é, torná-los menos ou não
reativos.
Metais pesados são absorvidos e acumulados principalmente nas raízes.
Esta é uma das várias estratégias de defesa contra a toxicidade destes elementos
químicos, uma vez que raízes e microrganismos da rizosfera podem diminuir a
biodisponibilidade dos metais tanto para o ambiente quanto para a própria planta
(Mench et al., 1994). Adicionalmente, os processos que determinam a absorção e
o acúmulo de metais variam com a espécie vegetal e com o ambiente químico
onde ela se encontra.
Alguns mecanismos de detoxificação, a nível celular, podem ser
distinguidos: exclusão do metal; compartimentalização ou translocação, em geral
para o vacúolo, de complexos solúveis envolvendo o metal pesado e moléculas
biorgânicas. Tais mecanismos diminuem a quantidade de metal que seria
8
translocada para a parte aérea, consequentemente, amenizando os danos
provocados a biossíntese da clorofila e a fotossíntese (Vögeli-Lange e Wagner,
1990; Chaoui et al., 1997; Prasad, 1995).
Além destes, outros mecanismos de detoxificação utilizados pelas plantas
como defesa à ambientes poluídos por metais pesados são a complexação no
citoplasma (com ácidos orgânicos, fitoquelantes ou outros peptídeos), ativação
e/ou produção de uma série de enzimas antioxidantes que podem se ligar aos
metais pesados, diminuindo assim, os efeitos citotóxicos destes (Vitória et al.,
2001) e a ligação de metais às paredes das células. Esta ligação é mais
facilmente promovida quando não há competição entre alguns metais
quimicamente semelhantes pelos mesmos sítios de troca de íons nas paredes
celulares (Krämer et al., 2000). De modo geral, a imobilização de metais pesados
pelas plantas se deve principalmente a sua complexação, compartimentalização e
ligação com as paredes celulares, principalmente, no sistema radicular (Speiser et
al., 1992).
Desta forma, a capacidade de algumas plantas resistirem à ambientes
poluídos por metais pesados, é, muitas vezes, aproveitada para removê-los do
próprio ambiente. Tal característica faz dessas plantas excelentes alternativas
para o monitoramento de poluição por metais pesados do meio circundante
(Lacerda et al., 1985).
Várias espécies vegetais, principalmente macrófitas submersas, vêm sendo
utilizadas em diversos estudos como bioindicadoras da contaminação por metais
pesados por causa de sua abundância relativa e da grande biomassa produzida
(Schneider et al., 1995; Mazen e El Maghraby, 1998; Mohanty et al., 2006). Essas
espécies possuem a capacidade de acumular metais não essenciais, como Cr, em
concentrações que não comprometem o seu metabolismo.
1.1.4 - Cr e estresse em plantas
Cr (do grego chrôma = cor) é o vigésimo primeiro elemento mais abundante
em peso (122 ppm) na crosta terrestre. Possui número e massa atômica
equivalente a 24 e 52 unidades de massa atômicas, respectivamente. À
9
temperatura ambiente, encontra-se no estado sólido. À baixas temperaturas é
inerte por ser revestido por uma fina camada de óxido. Contudo, em elevadas
temperaturas é oxidado a Cr
2
O
3
(Gonçalves, 2003b).
O Cr é um importante contaminante ambiental liberado em corpos aquáticos
devido ao seu enorme uso industrial. O único minério de Cr de importância
comercial é a cromita (FeCr
2
O
4
). Alguns de seus subprodutos são empregados
principalmente em metalurgia para aumentar a resistência à corrosão e para
compor ligas metálicas, como por exemplo, o aço inoxidável, que possui cerca de
8% de Cr. Esse metal é ainda utilizado em indústrias de eletrodeposição. Nas
formas de óxidos e cromatos é bastante utilizado como catalisadores na produção
de amoníaco (NH
3
), na preservação de madeira, em corantes e pinturas, e nas
formas de sais, como mordentes. Misturas contendo H
2
SO
4
e Cr (misturas
sulfocrômicas) são usadas para a limpeza de vidrarias em laboratório. Outros
compostos à base de Cr podem ser empregados como material refratário pelo seu
alto ponto de fusão e pequeno coeficiente de dilatação térmica (Gonçalves,
2003b). No curtimento de couros é freqüente empregar compostos contendo Cr,
principalmente o hidroxisulfato de cromo III [Cr(OH)(SO
4
)] (Jordão et al., 1999).
O Cr existe na natureza em dois estados de oxidação: hexavalente (Cr
6+
) e
trivalente (Cr
3+
). Ambos diferem entre si em termos de mobilidade,
biodisponibilidade, capacidade de oxidação e toxicidade. Existem ainda alguns
poucos compostos de Cr
2+
e Cr
5+
, entretanto, estes são instáveis e se convertem à
compostos de Cr
3+
e Cr
6+
. A espécie hexavalente é fortemente oxidante e mais
tóxica que a trivalente uma vez que forma cromato e dicromato, que são
compostos altamente solúveis em água e encontram-se mais disponíveis para o
meio ambiente. Por outro lado, Cr
3+
é menos solúvel em água e, portanto, mais
estável e menos tóxico que Cr
6+
, sendo requerido em quantidades na nutrição de
animais (Lytle et al., 1998). Entretanto, ambas as formas têm a capacidade de
formar complexos com outras espécies (Bartlett, 1991) podendo alcançar níveis
variáveis de toxicidade.
10
Independente de a forma trivalente ser a predominante nos efluentes
industriais, reações químicas naturais de oxidação de Cr
3+
à Cr
6+
podem ser
favorecidas por algumas características do corpo d’ água receptor (pH,
concentração de O
2
dissolvido e a concentração do próprio metal), colocando em
risco todas as espécies vivas que utilizam estas águas, inclusive o homem.
Embora a forma hexavalente, em geral, apresente-se em menores concentrações,
a possibilidade de despejos de compostos de Cr contendo a forma trivalente deve
ser considerada, uma vez que, mesmo não sendo tão nociva, pode causar efeitos
maléficos em elevadas concentrações.
A forma hexavalente de Cr é um estado de oxidação tóxico biologicamente,
não existindo evidências indicando que esta desempenhe algum tipo de função ou
participação em rotas metabólicas em plantas. Tal espécie química é conhecida
por sua intensa ação mutagênica e carcinogênica, e embora o mecanismo
citotóxico deste elemento ainda não esteja completamente entendido, alguns
estudos revelam que ela possa induzir o estresse oxidativo, danos ao DNA e
alterar a expressão gênica (Bagchi et al., 2002; Panda e Choudhury, 2005).
Quantidades traço de Cr são necessárias na dieta dos mamíferos. O Cr
3+
e
a insulina estão envolvidos na manutenção do nível adequado de glicose no
sangue. Em casos de deficiência desta espécie, a velocidade de remoção da
glicose do sangue é a metade da velocidade normal. Alguns casos de diabetes
podem decorrer de problemas no metabolismo de Cr. Porém, o aspecto biomédico
mais preocupante em relação aos sais de Cr (cromatos e dicromatos) é o caráter
cancerígeno dos mesmos, quando ingeridos ou em contato com a pele, em
quantidades relativamente (Lee, 1999).
Em vegetais, o Cr tende a se acumular nas raízes, entretanto, o estresse
oxidativo induzido por este envolve peroxidação de lipídeos, causando danos
severos às membranas celulares de toda a planta. Outra alteração é a degradação
de pigmentos fotossintéticos, levando à diminuição do crescimento. Em altas
concentrações, o Cr pode causar distúrbios a estrutura dos cloroplastos e,
consequentemente, afetar o processo fotossintético (Panda e Choudhury, 2005).
11
Contudo, algumas plantas aquáticas podem remover Cr do ambiente, apesar da
presença deste metal diminuir sua biomassa (Staves e Knaus, 1985).
Corradi e colaboradores (1993) trataram plantas e sementes de Salvia
sclarea L. com concentrações diferentes de Cr hexavalente. A germinação das
sementes in vivo não foi afetada, porém quando o sistema radicular das plantas
permaneceu em contato com as soluções de Cr, o crescimento destas foi inibido,
embora a parte aérea tenha se desenvolvido normalmente. Transcorridos 48 h de
experimento, os conteúdos de clorofilas e carotenóides foram reduzidos,
demonstrando o estresse que o Cr hexavalente pode provocar quando as plantas
ficam expostas por tempos relativamente curtos à esta espécie química.
Para estudar as respostas da exposição de Cr
+6
em sementes, raizes e
folhas de Zea mays L., Lycopersicon esculentum e Brassica oleracea,
principalmente em termos de alterações estruturais, acumulação de Cr no vacúolo,
e produção de fitoquelatinas, Toppi e colaboradores (2002) fizeram um tratamento
com concentrações de 5 e 10 mg L
−1
de Cr
+6
. A porcentagem de germinação não
diferiu significativamente entre as amostras tratadas e o controle para todas as
espécies examinadas. Entretanto, foi verificada uma diminuição no crescimento
das raízes e partes aéreas. Através da microscopia eletrônica de transmissão
iônica e de raio-X, foram observadas alterações ultraestruturais e a presença de
precipitados contendo Cr nos tecidos foliares. Em plantas de Lycopersicon
esculentum não houve produção de fitoquelatina nas raizes ou nas folhas.
1.1.5 - Eichhornia crassipes (Mart.) Solms e estresse ambiental
Eichhornia crassipes (Mart.) Solms pertence a família Pontederiaceae. Essa
é uma pequena família de ampla distribuição pantropical, sendo composta por 10
gêneros com cerca de 30 espécies, encontradas apenas em ambientes aquáticos,
principalmente nas regiões tropicais (Souza e Lorenzi, 2005). Os gêneros mais
comuns no Brasil são: Eichhornia, Pontederia e Heteranthera. Kunth, um cientista
alemão, foi o primeiro a estabelecer, em 1842, o gênero Eichhornia. O nome dado
ao gênero foi uma homenagem a Jonh Albert Friedrich Eichhorn, ministro da
Educação, Cultura e Saúde da Alemanha na época.
12
E. crassipes (Mart.) Solms é abundante em rios e em áreas de inundação
fluvial, solos argilosos e siltosos férteis. Essa espécie é nativa da América do Sul
tropical e foi introduzida em todos os continentes (Gopal, 1987). Dependendo da
região encontrada é conhecida por diferentes nomes: camalote ou mururé na
Amazônia, baronesa, aguapé ou gigoga na região sudeste, jacinto de água na
Espanha e water hyacinth nos EUA.
A planta em questão é muitas vezes apresentada como “praga” e outras
vezes como agente despoluidor. Quando a planta é cultivada de forma correta, do
ponto de vista técnico-científico, a mesma pode ser um agente de despoluição,
como já descrito. Quando, no entanto, a planta cresce de forma descontrolada e
sem manejo adequado, pode se transformar em um problema ambiental
(Manfrinato,1991). Um aspecto interessante é que em condições climáticas
favoráveis (calor e luminosidade tropicais), a planta cresce na razão de uma
tonelada a cada dez mil metros quadrados por dia (Pompêo, 1996).
Segundo Pott e Pott (2000), E. crassipes (Mart.) Solms pode ser
caracterizada como erva aquática flutuante, livre, estolonífera e perene. Esta
espécie possui tanto propagação vegetativa quanto reprodução sexuada. A
primeira é usada porque ocorre de forma extremamente rápida favorecendo a
dominância da espécie em ambientes onde tenha sido introduzida ou mesmo em
áreas onde as condições ambientais passem a favorecer o seu desenvolvimento.
Esta forma de desenvolvimento constitui-se na formação de um estolão na base
do pecíolo de onde surge uma nova planta que mais tarde irá se desprender da
planta mãe. A reprodução sexuada é considerada pela maioria dos autores como
secundária e só ocorre nas áreas onde a mesma é nativa (Gopal, 1987; Nunes,
2003).
Morfologicamente, a espécie é descrita pela presença de rizoma, pecíolo,
limbo foliar, raiz adventícia e estolão. O caule flutuante é rastejante e forma
estolões. O pecíolo pode ser ocasionalmente inflado. As flores apresentam pétalas
de coloração lilás e ocorrem quase o ano todo (Figuras 1.1a e 1.1b).
13
a
b
Figura 1.1- a) Estruturas de E. crassipes (Mart.) Solms, 1- flor, 2- limbo foliar, 3- pecíolo,
4- rizoma, 5- raíz e 6- estolão. b) Foto de um banco de E. crassipes (Mart.) Solms
mostrando os limbos foliares e as flores.
Uma importante utilização da E. crassipes (Mart.) Solms, dentre suas
características já apresentadas, como, sua resistência à ambientes poluídos, é
como “agente purificador” em hidroponia - cultivo de vegetais em água sem solo
onde as raízes das plantas ficam submersas e as partes aéreas acima do nível da
água. As raízes absorvem nutrientes da água, o que facilita a purificação desta,
melhorando a qualidade dos efluentes onde são colocadas (Branco et al., 1985).
E. crassipes (Mart.) Solms também é utilizada para retirar do meio
circundante metais pesados, fenóis e outras substâncias. A eficiência da remoção
14
é determinada, principalmente, por parâmetros físico-químicos do meio como o
pH. O pH do meio está relacionado diretamente com a disponibilidade de
nutrientes para as plantas, influenciando uma série de reações, definindo
mecanismos de sorção e alterando o equilíbrio químico (Forstner e Wittman,
1981).
Em estudos sobre absorção de metais pesados provenientes de rejeitos de
indústrias químicas, Schneider e colaboradores (1995) utilizaram a biomassa seca
de plantas de E. crassipes (Mart.) Solms e verificaram que as raízes foram
excelentes órgãos acumuladores de íons de metais em solução e, portanto, tais
plantas poderiam ser utilizadas como agentes biosorvedores de baixo custo na
remoção destes elementos químicos.
Através da técnica de espectrometria de massa indutivamente acoplada a
um plasma (ICP-MS), Mangabeira e colaboradores (2004) determinaram as
concentrações de Cr em água, no sedimento e em amostras de raízes de plantas
de E. crassipes (Mart.) Solms coletados no rio Cachoeira no Estado da Bahia. Os
resultados obtidos mostraram que o Cr está presente em altas concentrações
principalmente nas raízes (média de 70 µg.g
-1
) e que tal espécie é uma
bioindicadora de poluição. Os valores de Cr na água e no sedimento foram de
0,38 µg.L
-1
e 63 µg.g
-1
, respectivamente.
Mohanty e colaboradores (2006) utilizando soluções de amostras de
biomassa dessa mesma espécie de planta como biosorvente, demonstraram a
porcentagem de remoção de uma concentração definida de Cr
6+
como uma função
do pH. Os resultados obtidos revelaram que quanto menor o valor de pH
(soluções ácidas), maior é a eficiência da remoção do metal pela planta.
Com o objetivo de entender a absorção quantitativa e o acúmulo de Cr pela
E. crassipes (Mart.) Solms e pela Pistia stratiotes L., Satyakala e Jamil (1992)
submeteram-nas em concentrações de 20, 50 e 100 µM de uma solução de
cromato de potássio (K
2
Cr
2
O
7
). Após o tratamento, as plantas foram separadas
em folhas, pecíolos e raízes. A quantificação de Cr foi feita em espectroscopia de
absorção atômica. Os resultados revelaram que houve um aumento linear da
15
absorção de Cr com o aumento das concentrações. A ordem de acumulação do
metal foi: raiz > pecíolo > folha para as amostras de E. crassipes (Mart.) Solms, e
raiz > folha > pecíolo para Pistia stratiotes L.
A redução de metais pesados in situ pelas plantas pode ser um mecanismo
de detoxificação útil para as mesmas. Utilizando espectroscopia de raio-X, Lytle e
colaboradores (1998) mostraram que E. crassipes (Mart.) Solms cultivada em
soluções contendo Cr
6+
acumularam Cr
3+
nas raízes. A redução de Cr
6+
à Cr
3+
parece ocorrer no sistema radicular da planta. O Cr
3+
foi translocado para as
folhas complexados a cristais de oxalato de cálcio. Desta forma, diferentes
caminhos de redução de Cr
6+
podem estar relacionados à mecanismos de reações
realizados abioticamente com íons aquosos, por transferência de elétrons em
superfícies minerais, redução com substâncias húmicas e outras moléculas
orgânicas e/ou por várias enzimas e microorganismos presentes nos próprios
tecidos das plantas.
1.2 - JUSTIFICATIVA
Macrófitas habitantes em corpos aquáticos poluídos têm sido amplamente
utilizadas para estudos de poluição ambiental por Cr por acumularem este metal
em concentrações variáveis nas diferentes partes das plantas. Diversos estudos
vêm sendo realizados visando a determinação da concentração de Cr total nestes
organismos, entretanto, sem a determinação do concentração da espécie química
mais tóxica (Cr
+6
).
Neste trabalho, plantas de aguapé foram utilizadas para a determinação
das concentrações de Cr total e Cr
+6
em diferentes partes da mesma. A escolha
desta espécie de planta é justificada pelo fato da mesma apresentar indivíduos em
todas as regiões do RPS (alto, médio e baixo) e rio Imbé (local com menor grau de
impacto antrópico em relação às regiões do RPS), o que tornará possível a
comparação dos dados entre as diferentes regiões. A determinação das
concentrações de Cr
+6
nesta espécie é de extrema importância, uma vez que tal
estado de oxidação é potencialmente tóxico aos organismos vivos expostos a ele.
16
1.3 - OBJETIVOS
1.3.1 – Objetivo geral
Este trabalho teve como objetivo a quantificação de Cr total e Cr
+6
em
raízes e partes aéreas de plantas de aguapé coletadas em diferentes locais ao
longo do RPS: alto, médio e baixo Paraíba e rio Imbé durante dois anos de coleta.
1.3.2 – Objetivos específicos
- quantificar Cr total e hexavalente nas raízes e nas partes aéreas de
amostras de plantas de aguapé;
- comparar os resultados obtidos entre as partes vegetais analisadas;
- inferir o local de maior contaminação por Cr dentre as regiões do RPS
estudadas;
- atribuir às concentrações de Cr encontradas as estações do ano em que
as plantas foram coletadas.
1.4 - MATERIAL E MÉTODOS
1.4.1 – Material vegetal e pontos de coleta
As análises foram feitas utilizando a macrófita aquática Eichhornia
crassipes (Mart.) Solms. Foram utilizadas partes aéreas e raízes. As partes aéreas
constaram de limbos foliares e pecíolos.
As áreas de trabalho estabelecidas para as coletas do material
compreenderam as seguintes regiões (Figura 1.2):
• Alto Paraíba - São José dos Campos (SP) (S: 23º 11’ 229”; W: 45º 55’
495”);
• Médio Paraíba – Volta Redonda (RJ) (S: 22º 28’ 937”; W: 44º 04’ 702”);
• Baixo Paraíba – Campos dos Goytacazes (RJ) (S: 21º 45’ 288”; W: 41º 19’
348”);
• Rio Imbé - Campos dos Goytacazes (RJ) (S: 21º 47’ 750”; W: 41º 33’ 375”).
17
Figura 1.2 - Locais de coleta do material ao longo RPS e do rio Imbé. (1) rio Imbé
(“controle”), (2) baixo RPS, (3) médio RPS e (4) alto RPS.
Foram feitas quatro coletas em duas épocas do ano: duas no final da
estação seca e duas no final da estação chuvosa nas regiões descritas acima. Os
meses e os anos das coletas foram: outubro de 2005 (estação seca), março de
2006 (estação chuvosa), outubro de 2006 e março de 2007.
Os parâmetros físico-químicos, pH, condutividade elétrica, temperaturas da
água e atmosférica e oxigênio dissolvido foram determinados no campo durante
as coletas das plantas. Tais dados foram extraídos do trabalho de Campaneli
(2008) e encontram-se em anexo.
1.4.2 - Preparo da amostras para quantificação de Cr
Após a coleta nos locais anteriormente descritos, as plantas foram levadas
para o Laboratório de Ciências Ambientais (LCA) da Universidade Estadual do
Norte Fluminense, onde foram lavadas com água destilada para retirar o material
18
particulado em suspensão e parasitas que se alojam nas raízes e separadas em
parte aérea e raíz. Este material foi congelado para posterior liofilização.
A liofilização de cada amostra durou em média 48h. Após este processo, as
amostras completamente desidratadas foram maceradas em nitrogênio liquido
(N
2
) e, em seguida, acondicionadas em tubos plásticos rosqueáveis.
Quinhentos miligramas de cada material vegetal foram acondicionados em
bombas de teflon, onde foram adicionados 10mL de ácido fluorídrico 48% e 10 mL
de ácido nítrico 65% (em capela). As bombas foram colocadas em blocos
digestores por 12h a 150°C. Posteriormente as bombas foram abertas para que a
solução evaporasse e atingisse um volume de aproximadamente 1mL. Em
seguida as bombas foram retiradas do bloco digestor até resfriarem e então foram
adicionados 10 mL de ácido nítrico a 0,5N. Após este procedimento, as amostras
retornaram para o bloco digestor por mais 30 min a 80°C. Transcorrido este
tempo, as amostras foram resfriadas, filtradas com filtro quantitativo Framex (Ø
12,50 ± 0,10 cm) faixa branca, acondicionadas em frascos de plástico e guardadas
em geladeira para análise posterior.
A quantificação de Cr total nas amostras foi realizada através da
Espectroscopia de Emissão Atômica (ICP-AES). Para a quantificação de Cr
+6
foi
seguido o método colorimétrico da 1,5 DFC e as leituras feitas utilizando
Espectroscopia de Absorção Ultravioleta-Visível (SHIMADZU, UV-160A).
1.4.3 - Método colorimétrico da 1,5 difenilcarbazida (quantificação de
Cr
+6
)
Resumidamente, os métodos calorimétricos são baseados na variação da
cor de um sistema em função da concentração. A colorimetria visa determinar a
concentração de uma substância pela medida da absorção relativa da luz,
tomando como referência a absorção da substância numa concentração
conhecida. Os métodos colorimétricos acoplados aos métodos fotométricos
proporcionam um meio simples para determinar pequenas quantidades de um
elemento químico.
19
O composto 1,5 difenilcarbazida (1,5-DFC) é um reagente altamente
seletivo para a determinação espectrofotométrica de Cr
+6
em meio ácido (pH
variando aproximadamente entre 1,6 e 2,2). O Cr hexavalente é determinado
colorimetricamente através de sua reação com a difenilcarbazida, formando um
complexo de cor vermelho-violeta, com absorção máxima em 540 nm. A reação da
1,5-DFC com o Cr
+6
é seletiva e ocorre de acordo com a seguinte equação:
2CrO
4
2-
+ 3H
4
L + 8H
+
→ [Cr
3+
(HL)
2
]
+
+ H
2
L + 8H
2
O,
onde H
4
L representa a 1,5-DFC e H
2
L a 1,5 difenilcarbazona (Lima, 1999).
Das amostras preparadas como no item 4.2 foram retirados 5 mL e
adicionados 400 µL de solução de 1,5-DFC. Esta por sua vez, foi preparada
dissolvendo 0,1 g do composto em 10 mL de acetona em grau analítico e
acondicionada em frasco escuro.
As misturas das soluções (amostras + 1,5-DFC) foram feitas 1 h antes do
início das leituras em Uv-Vis para garantir a total formação do complexo com Cr
+6
.
1.1.4 – Análises dos resultados
A análise de variância (ANOVA) foi utilizada para testar as diferenças entre
os dados de quantificação de Cr total. As médias foram comparadas através do
teste de Tukey (p≤0,05). Os dados referentes a Cr
+6
foram tratados através de
convoluções dos espectros das amostras puras aos espectros das misturas com o
auxílio do programa MATLAB (Versão 6.2).
20
1.5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
1.5.1 – Quantificação de Cr total
A tabela 1.1 mostra os valores das concentrações de Cr total nas amostras
de partes aéreas e raízes das plantas do rio Imbé e das três regiões (Alto, Médio e
Baixo) do RPS para as quatro coletas realizadas durante os dois anos de estudo.
Os resultados mostram que as concentrações de Cr total nas raízes foram
sempre superiores à parte aérea. As concentrações de Cr total variaram entre o
limite mínimo de detecção da metodologia empregada (0,07 µg.g
-1
) à 106,0 µg.g
-1
de massa seca do vegetal. Nas partes aéreas, não foi detectado Cr para a maior
parte das amostras, sendo 2,67 µg.g
-1
o maior valor encontrado.
Para a maioria das amostras não foi possível estabelecer um padrão
sazonal de concentração do metal pesado estudado, exceto as provenientes do
Baixo RPS, onde as mesmas foram maiores na estação seca. Em geral, as
maiores concentrações de Cr foram encontradas no Médio e Baixo RPS.
Para as amostras do rio Imbé, Baixo e Médio RPS, os resultados
estatísticos quanto à sazonalidade do primeiro ano de coleta tenderam a se repetir
no segundo ano. As amostras do alto RPS não apresentaram um padrão de
sazonalidade na bioacumulação de Cr e seus resultados não se repetiram durante
os anos de coleta.
Macrófitas como aguapés são consideradas importantes componentes de
ecossistemas aquáticos não apenas como fonte de alimento para invertebrados,
mas, sobretudo como agentes acumuladores eficientes de metais pesados
(Vardanyan e Ingole, 2006).
21
Tabela 1.1 - Concentrações de Cr total (µg.g
-1
de massa seca) para plantas de aguapé
(partes aéreas e raízes) coletadas do rio Imbé e RPS em 4 coletas durante dois anos.
Partes
Vegetais
Locais de
coleta
1º Coleta
(seca/2005)
2º Coleta
(chuvosa/2006)
3º Coleta
(seca/2006)
4º Coleta
(chuvosa/2007)
rio Imbé 1,42 ± 0,23
AbY
< 0,07
AcY
1,64 ± 0,25
AaY
< 0,07
AaY
Aérea
Baixo RPS 0,49 ± 0,29
AcY
0,09 ± 0,09
AbY
< 0,07
AcY
< 0,07
AbY
Médio RPS 1,30 ± 1,30
AcY
< 0,07
AcY
0,80 ± 0,80
AcY
< 0,07
AcY
Alto RPS < 0,07
AbY
< 0,07
AcY
< 0,07
AbY
< 0,07
AcY
rio Imbé 11,9 ± 0,53
CaY
10,0 ± 0,48
BaY
4,25 ± 2,00
DaY
3,78 ± 2,00
DaY
Raízes
Baixo RPS 45,9 ± 1,58
BaY
9,00 ± 0,40
BaZ
30,3 ± 1,25
BaY
11,6 ± 0,97
CaZ
Médio RPS
106 ± 2,31
AaY
17,0 ± 1,12
AbZ
58,0 ± 1,00
AaY
31,4 ± 2,00
AaZ
Alto RPS 10,9 ± 1,10
CaY
7,00 ± 0,80
BaY
13,8 ± 0,60
CaZ
18,6 ± 0,42
BaY
Os resultados são médias de três replicatas ± o desvio padrão. Letras maiúsculas
comparam a mesma estação do ano entre os diferentes pontos de coleta. Letras
minúsculas, as partes da planta na mesma estação do ano e local de coleta. Y e z
representam a comparação entre as estações do ano para um mesmo local de coleta
(Análise estatística, Tukey, p≤0,05).
A capacidade de acumulação de Cr em aguapé provenientes do rio
Cachoeira (Brasil), ambiente intensamente afetado por atividades agroindustriais,
foi de 70 µg.g
-1
no tecido radicular das mesmas (Mangabeira et al., 2004). Aqui
nesse estudo, o maior valor encontrado (106 µg.g
-1
), também no sistema radicular
das plantas, se referiu a uma região (Médio RPS) de alta capacidade industrial,
especificamente a indústria de aço, a qual o Cr faz parte da composição dos
efluentes desse tipo de indústria. Tal resultado pôde apontar a contaminação
desta região por Cr no ano de 2005.
22
De acordo com os resultados encontrados nas raízes das plantas das
regiões do RPS (exceto a do Alto) e rio Imbé foi possível estabelecer uma
variação sazonal para as concentrações de Cr, isto é, maiores nas estações secas
e menores nas chuvosas. O aumento da disposição de MPS e a retenção de
metais pesados durante o período de baixa vazão fluvial possibilitam maior
ciclagem dos metais entre os compartimentos do ecossistema (Campaneli, 2008),
o que pode explicar as maiores concentrações de Cr nas regiões do Médio e
Baixo RPS na estação seca. Nas partes aéreas, entretanto, esta variação não
pôde ser estabelecida, uma vez que os resultados não deferiram entre as
estações.
1.5.2 - Quantificação de Cr
+6
As amostras provenientes do RPS e rio Imbé apresentaram altos valores de
Fe (Tabela 8 em Anexo). Tais valores não permitiram que as quantificações de
Cr
+6
nas mesmas pudessem ser realizadas, uma vez que Fe é o principal
interferente nas medidas de Cr
+6
.
O método colorimétrico da 1,5-DFC é bastante utilizado para determinação
de Cr
+6
em diferentes amostras, principalmente amostras de efluentes. Em
materiais biológicos, porém, a utilização deste método é bastante restrita devido à
complexidade dos mesmos e da presença de interferentes que fazem parte da
composição do próprio material e que podem ser encontrados em altas
quantidades devido a atividades antrópicas ou não, como é o caso dos íons de
Fe
+3
(Milacic et al., 1992; Walsh e O’Halloran, 1996; Jung et al., 1997).
No Capítulo 2 deste trabalho (descrito a seguir) é apresentado um
procedimento realizado com o intuito de se determinar o limite inferior de detecção
de Cr
+6
na presença de Fe
+3
através de espectrometria no Uv-Visível e, assim,
podermos inferir a possibilidade de quantificar Cr
+6
nestas amostras.
23
1.6 – CONCLUSÕES
De acordo com a metodologia empregada foi possível determinar a
concentração de Cr total nas amostras analisadas. A região do Médio RPS,
município de Volta Redonda encontra-se contaminada por Cr, uma vez que teores
significativos deste metal foram encontrados nas raízes das plantas, sobretudo na
estação seca (ano de 2005). Entretanto, para a obtenção dos resultados da
quantificação de Cr
+6
nas mesmas amostras esbarrou-se nos altos teores de Fe
encontrados e no limite de detecção da metodologia empregada. A metodologia
utilizada na determinação de Cr
+6
deve ser otimizada no sentido de ser aplicada a
sistemas biológicos mais complexos como é o caso do aguapé.
24
CAPÍTULO 2
DETERMINAÇÃO DO LIMITE INFERIOR DE DETECÇÃO DE Cr
+6
NA
PRESENÇA DE Fe
+3
USANDO A ESPECTROMETRIA NO UV-VISÍVEL
2.1 - INTRODUÇÃO
A presença de metais pesados em sistemas aquáticos se deve a diversos
fatores de origem natural e antrópica, como discutido no Capitulo 1.
É importante ressaltar que elevadas concentrações de metais pesados
podem ser naturalmente encontradas em diversos rios do mundo a depender de
fatores como o clima, a geologia do local, a vegetação, regime de pluviosidade,
entres outros. Esses processos contribuem significativamente para a inserção de
metais, sobretudo ferro, alumínio e manganês, nos sistemas hídricos, uma vez
que estes fazem parte da composição da maioria dos solos que, ao sofrerem
intemperismo, podem ser facilmente lixivados e depositados nessas águas
(Fösterner e Wittmann, 1983).
As concentrações de metais pesados são ainda regidas por características
físico-químicas do meio, principalmente, pH, oxigênio dissolvido e temperatura. De
forma que esses metais podem se apresentar em suas formas livres e, portanto,
mais disponíveis para serem absorvidos pelas espécies animais e vegetais
relacionadas ao próprio meio.
2.1.1 - Presença de ferro no rio Paraíba do Sul e rio Imbé
O Ferro (Fe), do latim ferrum, é o quarto elemento em abundância na Terra,
representando 6,3% em peso da crosta terrestre. Possui massa e número
atômicos equivalentes a 55,84 e 26 respectivamente (Gonçalves, 2003b). Tal
elemento é considerado metal pesado por apresentar características referentes a
este grupo de elementos químicos, como alta densidade (7,86 g.mL
-1
), por
exemplo. Entretanto, por ser necessário ao metabolismo adequado de organismos
25
vivos em pequenas concentrações, é dito como essencial ou elemento
micronutriente.
O Fe faz parte da composição de enzimas envolvidas em processos de
oxiredução. Sua deficiência em vegetais causa sérios distúrbios à organização de
cloroplastos, eleva a síntese de ácidos orgânicos, afetando, consequentemente, a
fotossíntese (Marschner e Romheld, 1994). Já o seu excesso, pode levar a
formação de espécies reativas de oxigênio via reação de Fenton (conversão de
peróxido de hidrogênio em radical hidroxila -
•
OH, superóxido -
•
O
2
−
e hidroperoxil -
•
O
2
H, pela oxidação do Fe
+2
). Os principais componentes celulares suscetíveis a
danos por estas espécies químicas são proteínas, DNA, carboidratos e lipídios
(Mithöfer et al., 2004).
A absorção de Fe por organismos como plantas aquáticas, por exemplo,
pode ser favorecida pela presença de elevadas concentrações deste elemento
químico no meio onde estas vivem.
Os ecossistemas aquáticos são formados por diferentes compartimentos
abióticos (material particulado em suspensão - MPS, sedimento e água) e bióticos
(fauna e flora). Entre estes compartimentos, há uma tendência de um maior
acúmulo de metais pesados em materiais particulados em suspensão. Em média,
nos rios encontra-se cerca de 90% do ferro total associado ao MPS.
O RPS é um sistema hídrico que naturalmente apresenta altas
concentrações de Fe. Estudos realizados na porção do Baixo RPS mostraram que
a concentração deste elemento está em níveis maiores que a média mundial,
porém próxima a de rios localizados em regiões de clima tropical (Salomão et al.,
1999).
Nas regiões do RPS, entretanto, o Fe está em sua maior parte na fase
residual, ou seja, de 83 à 99% do total de Fe é encontrado no sedimento,
mostrando que os solos da bacia de drenagem do RPS são ricos em minerais
compostos por Fe (Almeida, 1998; Molisani, 1999; Pereira, 2004).
Maiores concentrações de Fe foram encontradas nos sedimentos da região
do Baixo RPS, seguidas pela do Médio nos períodos de seca que na estação
26
chuvosa. Amostras de sedimentos provenientes da região do Alto RPS foram as
que apresentaram menores concentrações de Fe, tanto na estação chuvosa
quanto na seca, quando comparadas às demais regiões do RPS e rio Imbé
(Campaneli, 2008).
Nas plantas de aguapé coletadas no Alto, Médio e Baixo RPS e no rio Imbé,
os valores de Fe foram sempre maiores para as raízes das plantas provenientes
da região do Baixo, seguidas pela região do Médio RPS, rio Imbé e Alto RPS
considerando a estação seca. Na estação chuvosa, as concentrações de Fe
seguiram a mesma tendência, com exceção para as maiores concentrações
encontradas no rio Imbé em relação ao Alto RPS (Campaneli, 2008).
2.2 - JUSTIFICATIVA
Fe
+3
é um dos principais interferentes na detecção de Cr
+6
. Em altas
concentrações, o Fe
+3
compete com o composto 1,5-difenilcarbazida, utilizado
para quantificação de Cr
+6
, apresentando uma intensa superposição com as
bandas de absorção do complexo Cr-DFC que deveria ser formado.
Estudos utilizando aguapés provenientes das regiões do Alto, Médio e
Baixo RPS e rio Imbé durante dois anos de coleta (duas na estação seca e duas
na chuvosa) revelaram altas concentrações de Fe nas raízes das referida plantas,
sobretudo naquelas coletadas no Baixo RPS coletadas nas estações chuvosas
(Campaneli, 2008).
Frente à dificuldade para realização das medidas de Cr
+6
em plantas de
aguapé, foi feito um estudo do limite inferior de detecção para 0.5 ppm de Cr
+6
na
presença de Fe
+3
em diferentes concentrações, para que, desta forma, fosse
estabelecido a proporção em que a espécie química +6 pudesse ser quantificada
através de métodos analíticos convencionais, como a espectrometria no Uv-
Visível, quando Fe está presente no mesmo meio.
27
2.3 – OBJETIVOS
2.3.1 – Objetivos Gerais
O objetivo desta etapa de trabalho foi determinar o limite inferior de
detecção de 0.5 ppm de Cr
+6
na presença de soluções de diferentes
concentrações de Fe+
3
utilizando a espectroscopia de absorção no UV-Visível.
2.4 - MATERIAL E MÉTODOS
As soluções de Cr
+6
foram preparadas a partir de K
2
Cr
2
O
7
e as de Fe
+3
a
partir de Fe(NO
3
)
3
.9H
2
O em água deonizada.
A concentração de Cr
+6
foi fixada em 1 ppm e as de Fe
+3
variando de 10 a
400 ppm. Como as soluções foram misturadas em proporções equivalentes (1:1),
as concentrações finais das soluções eram a metade das iniciais. Estas soluções
foram complexadas com 1,5-DFC como descrito no item 1.4.3 (Capítulo 1). Para
evitar a possível redução de Cr
+6
e ao mesmo tempo diminuir a interferência com
os íons de Fe
+3
, HNO
3
e 1,5-DFC foram simultaneamente adicionados as soluções
pré-misturadas de Cr
+6
e Fe
+3
. Na tabela 2.1 estão representadas as
concentrações e os volumes de todos os reagentes utilizados.
As amostras foram lidas em espectrômetro Uv-Visível (UV 160 1PC -
SHIMADZU) com os comprimentos de ondas variando de 350 à 750 nm.
Os dados foram tratados através de ajustes dos espectros das amostras
puras aos espectros das misturas com o auxílio do programa MATLAB (VERSÃO
6.2).
28
Tabela 2.1 - Concentrações de Fe
+3
, Cr
+6
, reagentes e os volumes utilizados no preparo
das amostras.
Reagentes Concentração (ppm) Volumes (mL)
10 2,5
20 2,5
30 2,5
40 2,5
50 2,5
60 2,5
80 2,5
100 2,5
110 2,5
120 2,5
140 2,5
170 2,5
Fe
+3
(Fe(NO
3
)
3
.9H
2
O)
200 2,5
Cr
+6
(K
2
Cr
2
O
7
)
1
2,5
*1,5-DFC
100 000 0,1
HNO
3
450 000 0,05
* 100 000 ppm ou 1,5-DFC 10%.
29
2.5 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
A figura 2.1 mostra o espectro para uma solução pura de 1 ppm de Cr
+6
(sem DFC) e com DFC em meio ácido. Tal concentração de Cr
+6
foi utilizada por
ser aquela que apresentou o melhor sinal de absorção, comparado com
concentrações menores. Foi ainda levado em consideração que essa
concentração de Cr
+6
seria reduzida a metade quando misturada em mesma
proporção às soluções de Fe
+3
.
Apenas na presença do reagente DFC e em meio ácido pôde ser observada
a formação do complexo devido ao sinal da banda de absorção em 540 nm,
aproximadamente, indicando a seletividade do composto 1,5-DFC em reagir com
Cr
+6
, como mostra a figura 2.1.
350 400 450 500 550 600 650 700 750
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Cr
+6
1ppm + DFC
Cr
+6
1ppm
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
Figura 2.1 – Espectro de absorção de solução de 1 ppm de Cr
+6
com DFC em meio ácido
e sem DFC.
As figuras 2.2 a e 2.2 b mostram os resultados experimentais (curva preta)
de uma amostra de 5 e 85 ppm de Fe
+3
, respectivamente, em solução com 0,5
ppm de Cr
+6
, DFC e meio ácido. As curvas verde e azul representam,
respectivamente, os espectros experimentais para as soluções de Fe
+3
e Cr
+6
na
faixa de 400 à 700 nm.. A curva vermelha representa o ajuste dos espectros das
30
soluções puras de Cr
+6
e Fe
+3
ao espectro experimental da mistura, considerando
vários ajustes feitos através do Método dos Mínimos Quadrados.
O aumento da concentração de Fe
+3
na mistura mascarou a contribuição do
sinal referente ao Cr
+6
no espectro resultante possível.
400 450 500 550 600 650 700
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Fe
+3
: 85 ppm
Cr
+6
: 0,5 ppm
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
Figura 2.2 - Ajustes dos espectros de Cr
+6
e de Fe
+3
ao espectro experimental obtido das
misturas das soluções desses metais em meio ácido contendo DFC. a) 0,5 ppm de Cr
+6
+
5 ppm de Fe
+3
e b) 0,5 ppm de Cr
+6
+ 85 ppm Fe
+3
. OBS: As concentrações são referentes
à mistura, ou seja metades das concentrações originais.
Fe
+3
: 5 ppm
Cr
+6
: 0,5 ppm
Fe
+3
: 5 ppm
Cr
+6
: 0,5 ppm
a
b
31
Com a finalidade de estimar a influência da presença de Fe+3 na solução, a
área abaixo da banda de absorção do complexo Cr+6-DFC foi calculada e divida
pela área total do espectro. Utilizando o mesmo procedimento para as demais
misturas, foi obtido o comportamento linear da área relativa para o Cr
+6
(figura
2.3).
Figura 2.3 - Áreas relativa referente à banda de absorção do Cr
+6
em função da
concentração de Fe
+3
(ppm). As soluções de Cr
+6
e Fe
+3
foram preparadas em meio ácido
adicionando DFC. As concentrações de Fe
+3
mostradas são a metades das originais.
A área relativa do complexo de Cr
+6
diminuiu com o aumento da
concentração de Fe
+3
, indicando que esta espécie compete com o Cr
+6
para a
formação do complexo com a 1,5-DFC. Os resultados mostram também que a
detecção de Cr
+6
(0,5 ppm) torna-se inviável quando presente em concentrações
de Fe
+3
acima de 85 ppm. Através desses resultados, pôde ser estabelecida uma
proporção Fe
+3
:Cr
+6
de 170:1. Isto é, acima de 170 partes de Fe
+3
para 1 parte de
Cr
+6
não é possível quantificar Cr
+6
utilizando espectroscopia UV-Visível.
Os efeitos da presença de íons de metais interferentes tais como o Fe
+3
na
determinação de Cr
+6
são bem conhecidos (Sikove et al., 1996). Em nosso
trabalho, tanto para as amostras provenientes do RPS quanto para as do rio Imbé,
não foi possível obter resultados de quantificação de Cr
+6
(como descrito no
Área relativa de Cr
+6
Área relativa de Cr
+6
32
Capítulo 1), uma vez que as mesmas amostras continham altas quantidades de Fe
maiores que a razão 170:1. As concentrações de Fe total determinadas por
Campaneli (2008) estão representadas em anexo.
Tomando a maior concentração de Cr total encontrada em nosso trabalho,
aquela referente às raízes das plantas provenientes da região do Médio RPS
(Tabela 1.1), 106 ± 2,31 µg.g
-1
de massa seca e a concentração de Fe total para a
mesma amostra (19901 ± 679 µg.g
-1
de massa seca) descrita por Campaneli
(2008), a razão Fe/Cr obtida é de 188, ou seja, superior ao limite de detecção
inferior de Cr
+6
na presença de Fe
+3
estabelecido anteriormente. É importante
ressaltar que a razão Fe/Cr não se trata somente das espécies catiônicas Fe
+3
e
Cr
+6
presentes em solução, sendo uma contribuição destas aos valores das
concentrações totais de cada elemento analisado. Logo, as concentrações de
cada espécie química devem ser menores e encontravam-se abaixo do limite de
detecção do equipamento utilizado (LD = 0,055 µg.g
-1
).
33
2.6 – CONCLUSÕES
Cromo hexavalente (0,5 ppm) pôde ser detectado quando as concentrações
de Fe
+3
foram iguais ou inferiores à 85 ppm. Desta forma, utilizando
espectroscopia de absorção UV-Visível, o limite inferior de detecção de Cr
+6
na
presença de Fe
+3
estabelecido foi de 170 partes de Fe
+3
para 1 parte de Cr
+6
.
Com a perspectiva de se quantificar Cr
+6
foi conduzido um experimento em
casa de vegetação utilizando altas concentrações de tal íon metálico, descrito no
capítulo a seguir (Capítulo 3).
34
CAPÍTULO 3
ANÁLISES ECOFISIOLÓGICAS EM PLANTAS DE AGUAPÉ SUBMETIDAS A
Cr
+3
e Cr
+6
3.1 – INTRODUÇÃO
O termo ecofisiologia designa a relação dos processos fisiológicos e das
respostas vitais das plantas diante de mudanças que ocorrem no meio onde estas
habitam (Davidson et al., 2002). O grande avanço tecnológico em relação ao
aperfeiçoamento e ao desenvolvimento de equipamentos cada mais eficazes para
medições de parâmetros ecofisiológicos aliados à interdisciplinaridade das
ciências de química, física e biologia têm permitido identificar e elucidar diversos
agentes estressantes aos quais uma espécie vegetal pode estar sujeita.
Análises da emissão da fluorescência da clorofila a, medidas de trocas
gasosas e quantificação de pigmentos fotossintéticos constituem importantes
ferramentas para estudos ecofisiológicos em plantas submetidas a estresse,
inclusive, por metais pesados. Tais parâmetros vêm sendo largamente usados por
oferecerem vantagens como a rápida obtenção de resultados e alta sensibilidade,
além de serem métodos quantitativos, permitindo a realização das medições tanto
em laboratório, quanto no campo (Van Kooten e Snel, 1990).
3.1.1- Emissão da fluorescência da Clorofila a
As moléculas de clorofila absorvem a energia luminosa (fótons) e alteram
temporariamente as suas configurações eletrônicas de um estado basal para um
estado de mais alta energia (singlet 1) muito instável e de vida curta
(aproximadamente de 8 à 10 nanosegundos). Essas moléculas tendem a dissipar
a energia recebida por meio de algumas vias como:
- Dissipação Fotoquímica: utilização da energia luminosa para os processos
fotoquímicos da fotossíntese (doação do elétron proveniente da molécula
de água para um aceptor oxidado denominado NADP
+
- Nicotinamida
adenina dinucleotídio fosfato oxidado);
35
- Dissipação Não-Fotoquímica: produção de calor na forma de radiação
infravermelha;
- Fluorescência: emissão de radiação na região do visível (vermelho)
(Maxwell e Johnson, 2000).
- Interconversões: transformação de energia entre as moléculas dos
pigmentos por ressonância.
O rendimento da fluorescência da clorofila a revela o nível de excitação da
energia no sistema de pigmentos que dirige a fotossíntese e fornece subsídios
para estimar a inibição ou o dano no processo de transferência de elétrons do
fotossistema II (PSII) (Bolhàr- Nordenkampf et al., 1989). A presença de elevados
níveis de metais pesados na planta pode alterar a eficiência destes processos, e
efeitos específicos de um dado metal na fotossíntese variam entre as espécies
(Heckathorn et al., 2004).
A fluorescência emitida pelas clorofilas do complexo antena do PSII pode
ser dividida em dois componentes constantes e um variável. Os componentes
constantes são a fluorescência mínima (F
0
), medida quando todos os centros de
reação estão abertos e fluorescência máxima (Fm), medida quando todos os
centros de reação estão fechados (ambas em folhas adaptadas ao escuro). O
componente variável é a fluorescência variável (Fv), a qual é determinada pelo
estado do centro de reação (aberto ou fechado), e é definida como a diferença
entre Fm e F
0
. Através destes componentes é possível ainda determinar o
rendimento quântico do PSII, dado pela razão Fv/Fm, a qual expressa a
capacidade do sistema em converter energia luminosa em energia química. Há
também parâmetros que medem a dissipação ou extinção da fluorescência: qP
(extinção fotoquímica) e qN e NPQ (extinção não-fotoquímica) (Van Kooten e
Snel, 1990).
As variáveis acima descritas podem ser medidas utilizando-se técnicas de
fluorescência modulada. Tais técnicas fornecem informações dos transientes que
ocorrem na escala de segundos, consistindo em aplicar um feixe de luz modulada
de baixa intensidade para excitar as moléculas de clorofila. A fluorescência
36
induzida por esta luz é seletivamente detectada através de um sistema de
detecção por resolução de fase. A fluorescência detectada quando somente a luz
modulada de baixa intensidade é aplicada, corresponde a F
0
. Para determinar Fm,
aplica-se um pulso de luz de alta intensidade, ou seja, um pulso de luz saturante,
de forma que todos os centros de reação sejam fechados.
Os efeitos sobre as respostas de fluorescência da clorofila a foram
investigados para plantas de trigo (Triticum aestivum L.) submetidas a tratamentos
com Cd (0, 265, 530 e 1000 µM) durante sete dias. As plantas tratadas com 1000
µM de Cd apresentaram uma diminuição de 35 e 7%, para F
0
e Fv/Fm,
respectivamente, em relação as plantas do controle. Fm e Fv diminuíram (16 e
19%, respectivamente) para as plantas expostas a 265 µM de Cd. Essa
diminuição foi mais significativa (de 50% para Fm e 53% para Fv) para as plantas
expostas a 1 mM de Cd ao final do experimento (Ouzounidou et al., 1996).
Visando determinar a utilidade de algas no monitoramento de Cd e Cu
dissolvidos na água do mar, e o estresse fisiológico causado por ambos os metais,
Barraza e Carballeira (1999) cultivaram algas (Ulva rigida) em solução de 0; 0,3;
0,9 e 2,7 mg L
-1
dos metais durante doze dias. Leituras de fluorescência da
clorofila a foram tomadas nos dias 1, 2, 5, 9 e 12 de tratamento. As amostras
expostas a concentrações de Cd e Cu acima de 0,3 mg L
-1
mostraram distúrbios
no PS II, evidenciado pela diminuição de Fv/Fm quando comparados aos
controles, sobretudo para Cu após o segundo dia de tratamento. Para as plantas
expostas a Cd, após nove dias de tratamentos, os efeitos sobre Fv/Fm puderam
ser observados.
Os efeitos da toxicidade de Cu, Cd e Pb sobre os parâmetros de
fluorescência em folhas de pepino (Cucumis sativus L.) foram estudados utilizando
concentrações de 20 µM de Cu, 20 e 50 µM de Cd, e 1000 µM de Pb. Cd foi
transportado para as folhas muito mais que Cu e Pb, independente das
concentrações. Porém os efeitos destes metais no rendimento quântico do PS II
37
(Fv/Fm) foram insignificantes durante o período de dez dias de tratamento
(Burzyński e Klobus, 2004).
3.1.2 – Trocas Gasosas
A presença de poluentes como metais pesados tóxicos em altas
concentrações, e de fatores como excesso de luz, alta temperatura e transpiração
podem levar a redução do rendimento quântico da fotossíntese e, por sua vez,
reduzir a assimilação de CO
2
por interferir na condutância estomática, afetando o
metabolismo da planta (Elfadl e Luukkanen, 2006).
Mecanismos de trocas gasosas dizem respeito à assimilação de CO
2
, a
processos de evaporação-transpiração, à condutância estomática e ao déficit ou o
excesso de carbono na câmara sub-estomática, uma vez que a água e o CO
2
compartilham a mesma rota de difusão (células estomáticas). Desta forma, é
necessário manter um equilíbrio entre assimilação de carbono e transpiração. Sob
algum tipo de estresse a taxa de assimilação de CO
2
declina em função da
redução na condutância estomática (Wong et al., 1985; Mattos et al., 1997; Prado
et al., 2004).
Medidas de parâmetros de troca gasosa constituem alternativas eficientes
para inferir danos ao processo fotossintético de plantas sob condições adversas
de crescimento.
Para estudar as respostas fisiológicas de Lemna trisulca L., uma macrófita
aquática conhecida por acumular e bioconcentrar metais pesados, Prasad e
colaboradores (2001) submeteram a espécie à elevadas concentrações de Cd
(0.1; 0.5; 1; 2; 5 e 10 mM) e de Cu (1; 2; 5; 10; 25; e 50 µM) durante 48 horas. A
atividade fotossintética e a condutância estomática foram aumentadas
significativamente quando Cu (1µM) estava presente na solução de cultivo das
plantas. Entretanto, em concentrações maiores que 2 µM, esses processos foram
suprimidos. As plantas referentes aos tratamentos com Cd acima de 5 mM
também apresentaram um decréscimo nos valores das medidas de trocas
gasosas.
38
O efeito da toxicidade de Zn sobre a fotossíntese líquida e a concentração
interna de CO
2
foi estudado em Lolium perene. O período de tratamento com
concentrações de 1; 5; 10 e 20 mM foi de 15 dias, dentro do qual as plantas
mostraram uma forte capacidade em se protegerem dos efeitos tóxico desse
metal. Acima de 10 mM, houve inibição do crescimento da planta. A taxa de
fotossíntese líquida obtida apresentou uma correlação negativa com a taxa de
concentração interna de CO
2
, ou seja, com o aumento das concentrações de Zn,
houve uma diminuição da primeira e um aumento da segunda ao final do
experimento (Monnet et al., 2001).
Em pepino (Cucumis sativus L.) foram observados os efeitos de
concentrações de Cu, Cd e Pb (20 µM; 20 e 50 µM; 1000 µM, respectivamente)
sobre as características dos parâmetros de troca gasosa durante dez dias. A taxa
de fotossíntese líquida e a condutância estomática em folhas tratadas com 50 µM
de Cu ou Cd foram similarmente reduzidas. Assim, Cu foi mais tóxico que Cd e Pb
para a fotossíntese. Entretanto, nenhum dos metais investigados alterou a
concentração de carbono interno (Burzyński e Klobus, 2004).
3.1.3 - Pigmentos Fotossintéticos
Os pigmentos cloroplastídicos são componentes importantes para a
fotossíntese. Eles interagem com a luz e, assim, mudam de estado eletrônico
iniciando o processo de oxirredução. No centro de reação dos PS I e II existe uma
clorofila a especial que é o pigmento que inicia o processo oxirredutivo. Xantofilas
e carotenos são pigmentos acessórios que, juntamente com as clorofilas b, outras
clorofilas e proteínas compõem o PS I e II.
Alguns pigmentos fotossintéticos agem como fotoprotetores, participando
de mecanismos de segurança e evitando danos ao organismo. Exemplos destes
tipos de pigmentos são os carotenos. Os carotenóides agem como fotoprotetores
através do rápido quenching (dissipação) dos estados excitados da clorofila, e as
xantofilas possuem um ciclo que desempenham um papel crítico na dissipação de
energia térmica (Guo et al., 2006).
39
O conteúdo dos pigmentos fotossintéticos de plantas em geral é
considerado um dos parâmetros mais sensíveis sob condições de estresse,
particularmente por metais pesados (Sinha et al., 2004).
Metais pesados como Zn, Fe, Cu e Mn são essenciais para as plantas e
constituintes de muitas enzimas de importância metabólica. Outros metais como
Pb, Cd, Cr e Al são biologicamente não-essenciais e tóxicos acima de certas
concentrações. A acumulação destes pode diminuir o crescimento de plantas,
entre outros fatores, pela redução dos pigmentos fotossintéticos (Panda e
Choudhury, 2005).
Para investigar os efeitos de excessos de Cu sobre Elsholtzia
haichowensis, Lou e colaboradores (2004) conduziram experimentos em
hidroponia utilizando concentrações de 0; 10; 50; 100; 300 e 500 µM de Cu
durante seis dias. Nenhuma variação significante foi observada nas concentrações
de clorofilas e carotenóides para as plantas tratadas com solução 10 µM de Cu.
Quando as concentrações de Cu aumentaram (acima de 50 µM) os valores
médios desses pigmentos mostraram uma tendência gradual de diminuição.
Os conteúdos de clorofila a e b foram estudados para Cucumis sativus L.
expostas por dez dias à concentrações de 20 µM de Cu, 20 e 50 µM de Cd, e
1000 µM de Pb. As plantas tratadas com 50 µM de Cu apresentaram maior
redução dos pigmentos fotossintéticos analisados (20% em relação aos controles).
Os demais tratamentos não promoveram redução significativa dos pigmentos
quando comparados ao controle (Burzyński e Klobus, 2004).
3.1.4 – Alterações ecofisiológicas de plantas na presença de cromo
Elevadas concentrações ou exposição por longos períodos a metais
pesados podem comprometer o metabolismo de plantas, inclusive, a fotossíntese
(Maxwell e Johnson, 2000).
Cromo pode influenciar muitos processos fisiológicos e bioquímicos em
plantas aquáticas durante sua bioacumulação (Panda e Patra, 2000; Vajpayee et
al., 2001; Panda, 2003). A diminuição na concentração das clorofilas a e b, (na
40
presença de Cr
+6
, especificamente) e carotenóides é bem estabelecida em plantas
sob estresse induzido por Cr (McGrath, 1982; Panda e Patra, 1998, 2000; Tripati e
Smith, 2000; Vajpayee et al., 2000; Panda, 2003; Panda e Khan, 2003; Panda et
al., 2003; Panda e Choudhury, 2004).
Entretanto, algumas plantas aquáticas apresentaram aumento no conteúdo
de carotenóides quando expostas a tratamento com Cr (Ralph e Burchett, 1998;
Tripati e Smith, 2000; Vajpayee et al., 2001). Esse aumento de conteúdo
provavelmente tem relação com sua ação antioxidante para as espécies reativas
de oxigênio geradas como resultado à toxicidade do Cr (Panda e Choudhury,
2005).
Corradi e colaboradores (1993) trataram plantas e sementes de Salvia
sclarea L. com concentrações diferentes de Cr hexavalente. A germinação das
sementes in vivo não foi afetada. Porém, quando o sistema radicular das plantas
permaneceu em contato com as soluções de Cr, o crescimento destas foi inibido,
embora as partes aéreas tenham se desenvolvido normalmente. Depois de 48 h,
os conteúdos de clorofila e carotenóides foram reduzidos, demonstrando o
estresse que o Cr hexavalente pode provocar quando as plantas são expostas por
tempos relativamente altos à esta espécie química.
Em plantas de Pistia stratiotes L., os efeitos de diferentes concentrações de
Cr (0, 10, 40, 80 e 160 µM) aplicadas durante 48, 96 e 144 horas, foram
acessados através de medidas dos conteúdos de clorofila total, entre outras. Os
conteúdos de clorofila diminuíram com o aumento das concentrações de Cr e com
o período de exposição, exceto para as plantas dos tratamentos com 10 e 40 µM
de Cr por 48 h. Foi observado ainda que, as plantas expostas a 160 µM de Cr por
períodos de 144 h tiveram uma diminuição de 43% da quantidade de clorofila total
em relação ao controle (Sinha et al., 2005).
Outros parâmetros fotossintéticos podem apresentar variação em função da
exposição à Cr. A proporção emitida de energia radiante na forma de
fluorescência é menor em plantas estressadas. Entretanto, em algumas situações,
a fluorescência aumenta sob condições de estresse, havendo ainda alterações
41
nos parâmetros derivados da própria fluorescência anteriormente citados
(Lichtenthaler e Rinderle, 1988).
Vernay et al. (2007) fizeram medições de troca gasosa, fluorescência da
clorofila a, conteúdo de pigmentos fotossintéticos e quantificação de Cr total, entre
outras medidas, em plantas de Lolium perenne L., expostas a diferentes
concentrações de Cr
+6
(0, 50, 100, 250 e 500 µM) durante 45 dias. A acumulação
de Cr foi maior nas raízes que nas folhas. Acima de 100 µM de Cr, foram
observadas diminuições do crescimento das plantas, bem como nas quantidades
de pigmentos. Os parâmetros de troca gasosa e de fluorescência, assimilação de
CO
2
e rendimento quântico, respectivamente, também apresentaram alterações
em relação aos controles no final do experimento para concentrações superiores a
100 µM de Cr
+6
.
Os efeitos de diferentes concentrações de Cr
+6
(1, 10 e 100 µM) sobre a
emissão de fluorescência da clorofila a e os parâmetros de trocas gasosas foram
investigados em crescimento hidropônico de Amaranthus viridis L. A fotossíntese
líquida, a taxa de evapotranspiração e a condutância estomática e concentração
de carbono interno foram reduzidas na presença de Cr
+6
10 e 100 µM. Os
parâmetros de fluorescência da clorofila, Fv/Fm e q
p
foram reduzidos nas plantas
tratadas com Cr
+6
10 e 100 µM, ao contrário de q
n
e NPQ (Liu et al., 2007)
3.2 - JUSTIFICATIVA
Os trabalhos atualmente existentes, que utilizam ferramentas
ecofisiológicas, se dedicam especialmente à aferições de estresse por fotoinibição
de plantas terrestres. Poucos trabalhos têm sido desenvolvidos no sentido de
esclarecer os impactos de diferentes espécies químicas de metais pesados sobre
as atividades fotossintéticas de plantas, principalmente, macrófitas aquáticas.
A toxicidade do Cr
+6
é bastante discutida para plantas em geral. Seu alto
potencial redox é responsável pela indução da formação de espécies de oxigênio
reativas que, por sua vez, são as responsáveis por diversos danos caudados ao
aparelho fotossintético.
42
Por outro lado, os íons de Cr
+3
apresentam menor toxicidade que os de
Cr
+6
. Algumas condições de tratamento, como elevada concentração e o tempo de
exposição às espécies trivalentes, podem se tornar tão danosos ao aparelho
fotossintético das plantas quanto às hexavalentes. Entretanto, tais condições
ainda não se encontram bem estabelecidos na literatura.
Desta forma, o presente trabalho visou contribuir com estudos sobre os
efeitos nas relações de emissão de fluorescência, pigmentos e de trocas gasosas
que as espécies químicas de Cr (+6 e +3) podem ter sobre as plantas em períodos
de exposição e concentrações pré-estabelecidos.
43
3.3 – OBJETIVOS
3.3.1 - Objetivo Geral
O trabalho teve como objetivos quantificar Cr total em plantas de Eichhornia
crassipes (Mart.) Solms (aguapé) submetidas a tratamento com Cr
+3
e Cr
+6
,
aliando a estes dados, medidas de parâmetros ecofisiológicos para observar quais
espécies químicas promoveriam maiores alterações nos processos fotossintéticos
da planta em questão.
3.3.2 – Objetivos Específicos
- Quantificar Cr total e identificar a presença de Cr
+3
e Cr
+6
nas raízes e nas
partes aéreas de amostras de plantas de aguapé;
- Determinar o indicativo do conteúdo de cor verde;
- Determinar o conteúdo de pigmentos fotossintéticos (Clo a, Clo b e
carotenóides);
- Determinar as variações na Emissão de Fluorescência da Clorofila a;
- Determinar as variações nos parâmetros de trocas gasosas (Assimilação
fotossintética, Condutância estomática, Evapotranspiração e Carbono interno);
3.4. MATERIAL E MÉTODOS
3.4.1 – Material vegetal e local de coleta
As análises foram feitas utilizando a macrófita aquática Eichhornia
crassipes (Mart.) Solms (aguapé) provenientes do rio Imbé.
As coletas do material vegetal foram realizadas nos meses de maio, junho e
julho (estação seca) do ano de 2007.
3.4.2 – Condições de cultivo
Após a coleta no rio Imbé, as plantas foram levadas para o LCA/UENF e
acomodadas em casa de vegetação para aclimatação durante cinco dias. Após o
período de aclimatação, as mesmas foram distribuídas em recipientes plásticos
44
(Figura 3.1), num somatório de cinco recipientes. A estes, foram adicionados
solução nutritiva de micro e macronutrientes e, em seguida, soluções de Cr
+3
e
Cr
+6
nas concentrações de 1 e 10 mM).
Bombas de ar foram colocadas dentro de cada recipiente para garantir a
oxigenação para as plantas.
Figura 3.1 – Experimento realizado na casa de vegetação. Recipientes contendo as
macrófitas, da esquerda para a direita: controle, 1mM de Cr
+3
, 10mM de Cr
+3
, 1mM de
Cr
+6
e 10mM de Cr
+6
.
3.4.3 - Preparo das soluções nutritivas
As soluções nutritivas de micro e macronutrientes foram preparadas de
acordo com Hoagland e Arnon (1950) e Smart e Barko (1985), respectivamente.
Os reagentes utilizados constam nas Tabelas 3.1 e 3.2.
Para obtenção da solução estoque de micronutrientes (Tabela 3.1), foram
misturadas em um balão volumétrico alíquotas de 10ml de cada solução e o volume
completado com água deionizada para 1000ml. Dessa nova solução, foram
retirados 100 mL e colocados em cada recipiente do tratamento. A solução estoque
apresenta as concentrações para diluição em 7L de água, que foi o volume utilizado
no experimento.
45
Tabela 3.1 – Sais utilizados no preparo da solução de cultivo de micronutrientes e
de Fe+EDTA (Smart e Barko, 1985).
Solução estoque
Reagentes
PM
Massa
(g)
Volume de
solução (mL)
*Concentração
final (µmol.L
-1
)
Volume na
solução
final (mL)
MnSO
4
. 2H
2
O 187 1,19 100 9,1 10
ZnSO
4
. 7H
2
O 319 0,17 100 0,8 10
CuSO
4
. 5H
2
O 281 0,052 100 0,3 10
H
3
BO
4
78 1,97 100 46,3 10
Micronutrientes
(NH
4
)
6
Mo
7
O
24
. 4H
2
O 1146 0,12 100 0,1 10
EDTA 186,12 11,91 400 32,0 7
Fe + EDTA
FeCl
3
161 5,19 400 32,0 7
* Concentração final utilizada para um volume final de 7 L de solução nos recipientes com
seus respectivos tratamentos.
A solução estoque de Ferro+EDTA foi preparada separadamente (400 mL de
cada uma). Essas soluções foram misturadas e o volume completado com água
deioniza para 1000 mL. Um litro de solução de cultivo deve conter 1 mL de solução
Fe-EDTA. Como o volume final de solução na unidade experimental foi de 7L, foram
retirados da solução (Fe-EDTA) um volume de 7 mL e colocados em cada recipiente
dos tratamentos.
Para a obtenção da solução nutritiva de macronutrientes foram preparadas
soluções estoques individuais das mesmas (Tabela 3.2). As adições destas
soluções foram realizadas separadamente em cada recipiente do experimento.
3.4.4 - Preparo das soluções de Cr
As soluções de Cr
+3
foram preparadas a partir de Cr
2
O
3
nas concentrações
de 1 e 10 mM. Já as de Cr
+6
, a partir de K
2
Cr
2
O
7
. Ambas para um volume final de
sete litros.
46
Tabela 3.2 – Sais utilizados no preparo da solução de cultivo de macronutrientes
(Hoagland e Arnon,1950).
Solução
Estoque
Reagentes
PM
Massa
(g)
Volume de
solução (mL)
Concentração
final (mg. L
-1
)
Volume na
solução final
(mL)
NH
4
NO
3
80 0,03 10 17,5 10
KH
2
PO
4
(P – PO
4
)
136 0,03 10 18,2 10
CaCl
2
.2H
2
O 146 9,17 7 91,7 7
KHCO
3
100 14,4 7 15,4 7
MgSO
4
.
7H
2
O
278 34 7 69 7
K
2
SO
4
(S - SO
4
)
135 0,03 10 80,5 10
Macronutrientes
NaHCO
3
84 58,4 7 58,4 7
3.4.5 - Parâmetros Ecofisiológicos
Os parâmetros ecofisiológicos analisados foram: clorofila total, conteúdo
dos pigmentos fotossintéticos, emissão de fluorescência da Clorofila a e medidas
de troca gasosa.
Todos os dados obtidos para as medidas ecofisiológicas foram coletados
em três tempos de exposição aos íons de Cr: zero, dois e quatro dias. O conteúdo
dos pigmentos fotossintéticos, em sendo uma análise destrutiva, foi obtido no
último dia de análise.
Os equipamentos utilizados em todas as medidas acima citadas estão
listados na tabela 3.3.
47
Tabela 3.3 - Equipamentos utilizados nas leituras de conteúdo de cor verde
(1)
,
pigmentos fotossintéticos
(2)
, cinética de emissão da clorofila a
(3)
e trocas
gasosas
(4)
.
EQUIPAMENTOS MARCA MODELO
1 - Medidor de clorofila portátil
2 - Espectrofotômetro UV-visível
3 - Fluorímetro modulado portátil
4 - Analisador de gás carbônico no
infravermelho (IRGA)
Minolta, Japan
Shimadzu
Hansatech, UK
PP Systems, UK
SPAD-502
UV-160A
FMS2
Ciras 2
3.4.5.1 – Indicativo do conteúdo de cor verde
Para obtenção destes dados foi utilizado o medidor de clorofila portátil,
modelo SPAD-502 (Minolta, Japan). Tal equipamento determina a intensidade de
cor verde das folhas por meio de sensores, podendo viabilizar uma inferência
sobre o teor de clorofila total.
Os dados desse parâmetro foram obtidos antes das medidas de cinética de
emissão da clorofila a e de troca gasosa, visando uma padronização das folhas
quanto ao teor de pigmento verde.
3.4.5.2 – Quantificação dos Pigmentos Fotossintéticos
Após a determinação dos parâmetros relacionados às trocas gasosas e à
fluorescência da clorofila a (técnicas não-invasivas), foram retirados discos de 1,1
cm de diâmetro do limbo foliar (técnica invasiva), sendo cortados em tiras e
colocados em frascos contendo 5 mL do solvente orgânico DMSO
(Dimetilsulfóxido). Os frascos foram envolvidos em papel alumínio, para que não
houvesse degradação do DMSO com a luz, e transportados para o laboratório.
Para cada tratamento, foram retirados três discos foliares e cada disco foi
colocado em um frasco contendo DMSO para posterior análise.
48
As leituras dos conteúdos dos pigmentos fotossintéticos clorofila a (Clo a), b
(Clo b) e carotenóides (Carot.) foram feitas em espectrofotômetro de absorção
atômica (UV-160A Shimadzu) nos comprimentos de onda de 665, 649 e 480 nm,
respectivamente, após cinco dias de extração com DMSO. Os cálculos para a
determinação das concentrações dos pigmentos analisados foram realizados de
acordo com o procedimento descrito por Wellburn (1994).
Todo o procedimento de laboratório foi realizado em ambiente com baixa
luminosidade para evitar possível degradação da clorofila.
3.4.5.3 – Cinética de Emissão de Fluorescência da Clorofila a
Para obtenção dos dados referentes à emissão de fluorescência da clorofila
a foi utilizado um fluorímetro modulado portátil, modelo FMS2 (Hansatech, UK). As
medidas foram feitas na superfície adaxial de 3 folhas intactas (totalmente
expandidas e livres de necrose ou ferimentos).
O experimento se processou ao expor as folhas anteriormente adaptadas
ao escuro (por 30 minutos), com o auxílio de pinças, a uma luz de medição
(aproximadamente 6 µmol de fótons m
-2
s
-1
a 660 nm), seguida pela exposição à
luz actínica (luz branca) de alta intensidade (10.000 µmol m
-2
s
-1
), aplicada por 0,8
segundos, adaptado de Genty et al. (1989) e Van Kooten e Snel (1990). Em
seguida os valores foram registrados e submetidos à análise das seguintes
variáveis: Fluorescência mínima (F
0
); Fluorescência máxima (F
m
); Fluorescência
variável (F
v
); Eficiência quântica potencial (F
V
/F
m
); Eficiência da capacidade
fotossintética (F
V
/F
0
); e coeficientes de extinção da fluorescência fotoquímico (qP)
e não-fotoquímico (qN e NPQ).
3.4.5.4 – Trocas Gasosas
As medidas de trocas gasosas foram realizadas na casa de vegetação
utilizando um analisador de gás carbônico no infravermelho (IRGA) portátil, de
circuito fechado, modelo CIRAS-2 (Portable Photosynthesis Systems, Hitchin,
Hertfordshire, UK - LCA). As folhas foram clipeadas com o auxílio de uma cuveta
Parkinson com 2,5 cm
2
de área foliar conectada ao CIRAS-2. As medidas foram
49
conduzidas na parte da manhã (entre 8:00 e 10:00 h). Luz artificial saturante,
umidade e concentração de CO
2
foram ajustadas para 2000 µmol m
-2
.s
-1
de fótons,
80% e 375 ppm, respectivamente.
Os seguintes parâmetros foram avaliados: Assimilação Fotossintética (AF:
µmol CO
2
m
2
s
-1
), taxa de Evapotranspiração (E: mmol m
2
s
-1
) condutância
estomática (g
s
: mmol H
2
O m
2
s
-1
) e Carbono interno (Ci: ppm).
Após a AF ter atingido valor constante, foram realizados 3 registros por
folha das plantas referente a cada tratamento.
Antes, porém do início das medidas de troca gasosa nas plantas dos
tratamentos, foi feita uma “curva de resposta a luz” para assimilação fotossintética
e condutância estomática no período da manhã (08:00 h). As medidas para
confecção das curvas de resposta a luz, foram feitas variando a radiação
fotossinteticamente ativa (PAR) de 0 a 2000 mol de fótons m
-2
.s
-1
. Umidade e
concentração de CO
2
foram ajustadas em 80% e 375 ppm, respectivamente.
3.4.6 - Preparo da amostras para quantificação de Cr
As amostras foram preparadas como descrito nos itens 1.4.2 e 1.4.3 do
Capítulo 1 para quantificação de Cr total e Cr
+6
respectivamente.
3.4.7 - Análises dos dados
A análise de variância (ANOVA) foi utilizada para testar as diferenças entre
os dados de quantificação de Cr total e os das análises ecofisiológicas. As médias
foram comparadas através do teste de Tukey (p≤0,05).
50
3.5 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados apresentados a seguir se referem a uma média de três
experimentos feitos nas mesmas condições de cultivo.
3.5.1 – Alterações morfológicas
Durante os quatro dias de experimento, foram observadas alterações nos
aspectos morfológicos das plantas. As plantas referentes ao tratamento com Cr
+6
na concentração de 10 mM foram as que sofreram maiores alterações. As figuras
3.2i e 3.2j mostram que, no segundo dia, as plantas referentes a este tratamento
estavam totalmente necrosadas, de forma que deixa de ter sentido apresentar os
resultados obtidos. Portanto, neste trabalho não serão apresentados os dados de
quantificação de Cr total e Cr
+6
,
indicativo do conteúdo de cor verde, conteúdo dos
pigmentos fotossintéticos, emissão da fluorescência da clorofila a e trocas
gasosas para o quarto dia do experimento (Cr
+6
10 mM).
Nos tratamentos com Cr
+3
foi possível notar que as plantas expostas à
concentração de 10 mM, em quatro dias de tratamento (Figura 3.2f),
apresentaram-se com aspectos mais saudáveis que as plantas-controle (Figura
3.2a e 3.2b) e que as expostas a Cr
+3
1 mM (Figura 3.2d).
Para as plantas expostas a Cr
+6
1 mM, pôde ser observado que em dois
dias de tratamento (Figura 3.2g), as mesmas apresentaram-se menos saudáveis
que as plantas-controle. Em quatro dias de tratamento (Figura 3.2h) algumas
necroses já podiam ser observadas nas folhas das plantas.
51
Figura 3.2 - Aspectos morfológicos das plantas de aguapé: Coluna da esquerda: 2 dias de
tratamento; coluna da direita: 4 dias de tratamento. a e b – plantas-controle; c e d -
plantas expostas a Cr
+3
1 mM; e e f - plantas expostas a Cr
+3
10 mM; g e h - plantas
expostas a Cr
+6
1 mM; i e j - plantas expostas a Cr
+6
10 mM.
52
3.5.2 – Quantificação de Cr total
Ao final do experimento, foram feitas as quantificações de Cr total para as
plantas de todos os tratamentos, exceto para as plantas do tratamento com Cr
+6
10 mM, como citado anteriormente. Na tabela 3.4 estão especificados os valores
de Cr total em µg.g
-1
de massa seca para as partes aéreas e as raízes,
respectivamente.
Tabela 3.4 - Concentrações de Cr total (µg.g
-1
de massa seca) para plantas de
aguapé expostas a Cr
+3
1 e 10 mM e Cr
+6
1 mM após quatro dias de tratamento.
Tratamentos
Partes vegetais Controle Cr
+3
1mM Cr
+3
10mM Cr
+6
1mM
Parte Aérea 3 ± 1.6 Bb 3 ± 1.3
Bb
51 ±
25.2
Bb
1560 ±
165.30
Ba
Raízes 142 ± 37.85
Ab
417 ± 324.20
Ab
1258 ±
360.66
Ab
3475 ±
942.51
Aa
Os resultados são médias de três replicatas ± o desvio padrão. Letras maiúsculas
representam comparações entre o mesmo tratamento nas diferentes partes da planta.
Letras minúsculas, comparação entre os diferentes tratamentos na mesma parte da planta
(p≤0,05).
As concentrações de Cr total foram maiores, independentemente dos
tratamentos recebidos, para as raízes que para as partes aéreas, variando de 142
à 3.475 e de 3 à 1.560 µg.g
-1
, respectivamente. A exposição das plantas a
concentrações crescentes (de 1 a 10 mM) de Cr aumentou significativamente a
absorção de Cr pelas raízes após quatro dias de tratamento. O conteúdo de Cr
total nos tecidos de aguapé foi significativamente maior, comparados às plantas
do controle, quando se utilizou a forma hexavalente do Cr.
Os valores de 3,0 e 142,0 µg.g
-1
de Cr total encontrados para a parte aérea
e raízes do controle, respectivamente, indicam a presença natural de Cr no rio
Imbé (local de coleta das plantas). Estes valores foram descontados, para efeito
de cálculo, dos valores obtidos das leituras para cada tratamento.
Entre todos os tratamentos, os maiores valores de Cr total foram
encontrados para as plantas tratadas com
Cr
+6
1 mM,
independente da parte
53
vegetal analisada. Isso deve estar relacionado a solubilidade do Cr
+6
que é maior
que a do Cr
+3
.
Para as plantas tratadas com Cr
+3
, os valores de Cr total foram maiores
para aquelas referentes à concentração de 10 mM. Com o aumento das
concentrações deste íon, houve um aumento significativo na translocação raiz-
parte aérea: 3 µg.g
-1
para as expostas a 1 mM contra 51 µg.g
-1
para as expostas a
10 mM.
Comparando os valores das raízes e partes aéreas das plantas dos
tratamentos com Cr
+3
e Cr
+6
de mesma concentração (1 mM), houve uma
absorção muito superior para àquelas expostas ao segundo tratamento. A
translocação das raízes para as partes aéreas foi muito mais efetiva para as
plantas deste tratamento do que para as do tratamento com Cr
+3
: 1.560 contra 3
µg.g
-1
, respectivamente.
Diversos estudos sobre acumulação de Cr por plantas de aguapé têm sido
realizados. Satyakala e Jamil (1992) observaram que a acumulação de Cr por tais
plantas cultivadas durante três dias em 0, 200 µM, 500 µM e 1 mM de Cr
+6
foi
maior para as raízes que para as partes aéreas: 40 e 12 mg.g
-1
de massa seca,
respectivamente, para as plantas cultivadas em 1 mM de Cr
+6
.
Aguapé foi testada por sua capacidade de acumular diversos metais
tóxicos, ente eles Cr. As plantas foram cultivadas em solução de Cr
+6
nas
concentrações de 0; 0.1; 0.3; 0.5; 1.0; 3.0 e 5.0 mM num período de 21 dias. A
acumulação de Cr no sistema radicular das plantas foi substancialmente maior
que nas folhas, tendendo a um aumento com o aumento da concentração de Cr
no meio externo (Odjegba e Fasidi, 2007).
A espécie Eichhornia crassipes foi descrita em outros trabalhos como uma
planta muito eficiente na acumulação de Cr, chegando a concentrar em suas
raízes 18.92 µmol de Cr por grama de peso seco (Chandra e Kulshreshtha, 2004).
Os trabalhos citados comprovam a capacidade que as plantas de aguapé
possuem de sobreviver a ambientes poluídos por metais pesados em
concentrações relevantes dos mesmos. Para isso elas tendem a acumulá-los
54
preferencialmente nas raízes, evitando, até certo ponto, que sejam translocados
para as partes aéreas como mecanismo de proteção as estruturas responsáveis
pela produção de energia necessária à sua sobrevivência.
De acordo com o critério de concentração, maior que 1000 mg. Kg
-1
de Cr
em tecidos de folha seca, sugerido por Baker e Brooks (1989) para plantas
terrestres, apenas duas espécies seriam classificadas como hiperacumuladoras
de Cr, Dicoma niccolifera e Sutera fodina, as quais as concentrações máximas de
Cr encontradas nos tecidos foliares foram 1.500 mg.Kg
-1
e 2.400 mg.Kg
-1
,
respectivamente (Reeves e Baker, 2000). Concentrações de 1.560 µg.g
-1
(massa
seca) de Cr total nas partes aéreas de aguapé encontradas em nosso trabalho,
permitem corroborar com outros estudos para classificar a planta, neste caso
aquática, como uma hiperacumladora de Cr.
Plantas de Vallisneria spiralis mostraram maior acumulação nas raízes
(1050 µg.g
-1
) que nas folhas (697 µg.g
-1
de massa seca) quando cultivadas em
solução nutritiva contendo 192 µM de Cr
+6
depois de 72 horas (Vajpayee et al.,
2001).
Em raízes de Bacopa monnieri e Scirpus lacustris uma acumulação de 1600
e 739 µg.g
-1
(peso seco) de Cr, respectivamente, foi encontrada quando as
mesmas permaneceram por 7 dias em solução contendo 96 µM de Cr (Gupta et
al., 1994).
Vernay e colaboradores (2007) encontraram concentrações de Cr em raízes
de plantas de Lolium perenne L., tratadas com concentração máxima de 500 µM
de Cr
+6
durante 40 dias, até dez vezes maiores que nas folhas.
Em nosso estudo, a concentração de Cr total nas raízes foi superior a das
partes aéreas, especialmente para as plantas submetidas a Cr
+3
no que diz
respeito aos fatores das concentrações do Cr total presente na raiz pela parte
aérea. Para as plantas tratadas com 1 e 10 mM de Cr
+3
os fatores foram de 139 e
25, respectivamente. Enquanto que para o Cr
+6
, esse fator foi de 2.2.
O estado de oxidação influencia fortemente a proporção de absorção de
Cr. Cr
+6
pode facilmente atravessar a membrana da célula e ser transportado por
55
carregadores de íons essenciais como os de sulfato, fosfato e ferro. Por outro
lado, Cr
+3
não utiliza nenhum carregador de íon específico. Desta forma, sua
entrada na célula se dá através de mecanismos de difusão, possível apenas
quando ele forma complexos com ligantes lipofílicos apropriados (Chandra e
Kulshereshtha, 2004; Shanker et al., 2005).
Plantas aquáticas absorvem os íons de metais pesados, em geral mais
solúveis no meio, como é o caso de Cr
+6
. Tal propriedade ajuda a explicar sua
maior toxicidade frente aos íons de Cr
+3
(até mesmo para maiores concentrações
desta espécie química). Entretanto, a capacidade de absorção de diferentes íons
de metais pesados também depende da espécie vegetal em questão. Por
exemplo, para plantas de Leersia hexandra S. cultivadas em solução de 400 µM
de Cr
+3
e Cr
+6
durante 45 dias, as concentrações encontradas nas raízes foram
maiores para aquelas cultivadas em Cr
+3
do que para as cultivada em Cr
+6
, 8.078
mg.kg
-1
e 2.109 mg.kg
-1
de massa seca, respectivamente (Zhang et al., 2007).
Em sete de dez espécies de plantas analisadas, houve maior acúmulo de
Cr nas raízes quando as plantas foram crescidas em solução contendo Cr
+6
que
quando em Cr
+3
(Zayed et al., 1998). A razão da alta acumulação em raízes de
plantas seria a imobilização de Cr nos vacúolos das células das raízes. O Cr
+6
nas
células é rapidamente reduzido a Cr
+3
, o qual é retido nas células do córtex
radicular sob baixas concentrações de Cr
+6
, o que em parte, explica a baixa
toxicidade da espécie trivalente. Embora, plantas vasculares não contenham
enzimas que reduzam Cr
+6
, têm sido largamente descrito que bactérias ou fungos
presentes no sistema radicular das mesmas desempenham essa função como
forma de diminuir os efeitos tóxicos deste íon (Shanker et al., 2005).
Os aspectos morfológicos das plantas deste experimento comprovam a
maior toxicidade da espécie química hexavalente em relação à trivalente para uma
mesma concentração e mesmo período de tratamento. Como houve uma
translocação maior de Cr para as partes aéreas das plantas submetidas a Cr
+6
,
estas encontraram-se, já a partir do segundo dia de experimento,
morfologicamente mais comprometidas que as submetidas a Cr
+3
. A espécie
56
hexavalente é um agente oxidante altamente forte. Sua presença concorre na
rápida formação de espécies de oxigênio reativas, principais responsáveis pelo
comprometimento do metabolismo das plantas.
3.5.3 – Espectros no UV-visível
As figuras 3.3 a, b, c e d representam os espectros de absorção para as
partes aéreas e raízes das plantas do controle e as expostas a Cr
+6
1 mM, Cr
+3
1 e
10 mM, respectivamente.
Comparando o espectro obtido para a amostra de raiz exposta a Cr
+6
com
aquele obtido para o controle (Figura 3a e 3b), pouca diferença foi encontrada.
Porém, pôde-se notar que a banda de absorção para a amostra exposta a Cr
+6
apresentou menor intensidade de absorbância na região de menor comprimento
de onda. Esse efeito deve estar relacionado a competição entre o Fe e o Cr
+6
de
se complexarem com a 1,5-difenilcarbazida (1,5-DFC). Sabendo que a capacidade
do Cr de reagir com a 1,5-DFC é maior do que a capacidade de reagir com o Fe
(Neto et al., 2005), isso pode explicar a redução da absorbância na região de
menores comprimentos de onda (região de sinal de absorbância relacionado ao
complexo 1,5-DFC/Fe). Assim, em termos relativos, a razão entre a área da banda
de absorbância situada ente 500 e 600 nm (centrada em 550 nm) e a área total foi
maior para as amostra submetidas à solução de 1 mM de Cr
+6
do que as plantas
do controle. Ou seja, como esperado, houve incorporação de Cr
+6
nas raízes.
Para a parte aérea, a diferença foi nítida entre os espectros obtidos para as
amostras do controle e aquelas expostas a solução de 1 mM de Cr
+6
. Comparado
às raízes, a parte aérea apresentou menor teor de Fe (Tabela 8 em anexo), isto
acarretou menor diferença entre as intensidades dos espectros na região de
menor comprimento de onda para as amostra do controle e tratadas. A fim de
facilitar a visualização, o espectro da parte aérea da amostra controle foi incluído
na figura 3b junto aos espectros de absorbância da amostra tratada com Cr
+6
.
Pôde-se notar uma intensidade maior de absorção na faixa entre 500 e 600 nm
para a amostra tratada.
57
450 500 550 600 650 700 750
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
Absorbância (cm
-1
)
Comprimento de onda (nm)
(b)
Cr
+6
1 mM
Parte aérea
Raiz
Controle
Parte aérea
450 500 550 600 650 700 750
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
Absorbância (cm
-1
)
Comprimento de onda (nm)
(c)
Cr
+3
1 mM
Parte aérea
Raiz
450 500 550 600 650 700 750
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
Absorbância (cm
-1
)
Comprimento de onda (nm)
(d)
Cr
+3
10 mM
Parte aérea
Raiz
Figura 3.3 – Espectros de bsorção para partes aéreas e raízes de aguapé do controle (a) e após quatro dias de exposição a Cr
+6
1 mM (b)
e Cr
+3
1 (c) e 10 mM (d). As amostras são as plantas digeridas e complexadas com 1,5-DFC em meio ácido.
58
Quanto aos resultados obtidos para a absorbância das amostras tratadas
com as soluções de Cr
+3
, além de uma protuberância semelhante àquela
encontrada para os espectros das amostras tratadas com Cr
+6
situada entre 500 e
600 nm, outra banda de absorção foi encontrada entre os comprimentos de onda
de 675 e 740 nm, centrada em torno de 710 nm. As figuras 4a e 4b mostram
separadamente os espectros obtidos para as partes áeras e raízes,
respectivamente.
Apesar dos resultados aqui apresentados para os tratamentos realizados
com Cr
+3
serem prelimares, os espectros obtidos foram claramente diferentes
àqueles obtidos para o Cr
+6
.
59
450 500 550 600 650 700 750
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
0.035
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
(a)
Parte aérea
Cr
+6
1 mM
Cr
+3
1 mM
Cr
+3
10 mM
450 500 550 600 650 700 750
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
(b)
Raíz
Cr
+6
1 mM
Cr
+3
1 mM
Cr
+3
10 mM
Figura 3.4 - Espectros de absorção para plantas de aguapé após quatro dias de
exposição a Cr
+6
1 mM e Cr
+3
1 e 10 mM. a- partes aéreas e b- raízes. As amostras são
as plantas digeridas e complexadas com 1,5-DFC em meio ácido.
60
3.5.4 – Indicativo do conteúdo de cor verde
A figura 3.5 mostra o gráfico (em unidades adimensionais) para clorofila
total das folhas referentes ao controle, dois e quatro dias de tratamentos.
Figura 3.5 – Indicativo do conteúdo de cor verde em plantas de aguapé expostas a
diferentes concentrações de Cr
+3
e Cr
+6
no tempo zero, dois e quatro dias de tratamento.
As barras representam o desvio padrão. Letras maiúsculas comparam entre o mesmo
tratamento em diferentes tempos de exposição. Letras minúsculas, entre diferentes
tratamentos no mesmo tempo.
Foi possível observar para as plantas do controle (tempo zero) uma
diferença significativa em relação àquelas dos controles dos demais tempos. Isso
pode ser atribuído às mudanças das condições naturais as quais elas estavam
adaptadas antes do início do experimento. Em dois dias de tratamento, as plantas
expostas a Cr
+6
10 mM apresentaram os maiores valores em relação às plantas
controle, variando de 65.6 e 41.6, respectivamente. As plantas expostas a Cr
+3
1 e
10 mM tiveram um aumento de seus conteúdos de clorofila total em relação as
plantas do controle, porém sem diferença significativa. Embora não tenha sido
observada diferença estatística para esses dois últimos tratamentos, as plantas
apresentaram-se mais saudáveis que as do controle (Figuras 3.2 c, d, e e f).
No quarto dia de experimento, as quantidades de clorofila total diferiram
entre os tratamentos quando comparadas apenas aos controles.
Clorofila total
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 2 4
Período de tratamento (dias)
Controle Cr+3 1mM Cr+3 10mM Cr+6 1mM Cr+6 10mM
Ba
Ba Aa
Aa
Ba
Aa
Cb
Aa
ABb Ab Ab
Ab
Ab
Ab
Clorofila total
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 2 4
Período de tratamento (dias)
Controle Cr+3 1mM Cr+3 10mM Cr+6 1mM Cr+6 10mM
Ba
Ba Aa
Aa
Ba
Aa
Cb
Aa
ABb Ab Ab
Ab
Ab
Ab
61
Alterações dos conteúdos de clorofila total em plantas sob estresse por Cr
têm sido bem relatadas (Panda e Choudhury, 2005). Tais alterações sugerem uma
possível inativação das enzimas responsáveis pela síntese das clorofilas e
proteínas que compõem os fotossistemas (Van Assche e Clijsters, 1990).
O crescimento de
Lolium perenne
L. foi afetado na presença de 50
µ
M de
Cr
+6
após 45 dias de exposição e as folhas tiveram perda de seus pigmentos. O
conteúdo de clorofila total aumentou com o tempo sem declínio significativo com o
aumento das concentrações de Cr no meio externo (exceto após 45 dias para Cr
+6
50
µ
M) (Vernay
et al
., 2007).
Sob altas concentrações (1 mM)
de Cr
+3
Scoccianti
e colaboradores (2006)
observaram uma pequena redução nas quantidades de clorofila total para
Apium
graveolens
L. ao final de 15 dias de tratamento.
3.5.5 – Conteúdo dos Pigmentos Fotossintéticos
Os valores relativos aos pigmentos fotossintéticos (em
µ
mol.cm
-2
) e as
relações obtidas para eles estão representados na Tabela 3.5.
Tabela 3.5 - Conteúdo dos pigmentos fotossintéticos (
µ
mol.cm
-2
): clorofila
a
(clo
a
), clorofila
b
(clo
b
) e carotenóides (Carot.) para plantas de aguapé expostas a
Cr
+3
1 e 10 mM e Cr
+6
1 mM após quatro dias de tratamento.
Tratamentos
Pigmentos
Controle Cr
+3
1 mM Cr
+3
10 mM Cr
+6
1 mM
Clo
a
0.050 ± 0.002 A 0.050 ± 0.001 A
0.050 ± 0.001 A
0.027 ± 0.003 B
Clo
b
0.018 ± 0.002 A 0.026 ± 0.006 A 0.025 ± 0.003 A 0.024 ± 0.011 A
Carot. 0.018 ± 0.000 A 0.019 ± 0.001 A 0.019 ± 0.001 A
0.012 ± 0.005 A
Clo
a
/Clo
b
2.711 ± 0.360 A 1.959 ± 0.480 A 1.986 ± 0.300 A 1.391 ± 0.220 A
Os resultados são médias de três replicatas ± o desvio padrão. As letras representam a
comparação entre os diferentes tratamentos para o mesmo pigmento.
62
As concentrações de clorofila
a
variaram entre 0,027 e 0,050
µ
mol.cm
-2
. Foi
possível observar um decréscimo significativo nas quantidades de clorofila
a
para
as plantas submetidas a Cr
+6
1 mM em relação às plantas-controle. Já as plantas
expostas a Cr
+3
nas duas concentrações não apresentaram variação para este
pigmento.
Os conteúdos de clorofila
b
variaram numa escala muito pequena para os
tratamento recebidos (entre 0,018 à 0,026
µ
mol.cm
-2
), não apresentando diferença
estatística entre eles. Naturalmente, clorofilas
b
são encontradas em menores
quantidades que as clorofilas
a
em plantas de ambientes ensolarados. Sob
condições de crescimento favoráveis, existe uma relação de 3:1 de clorofila
a
para
clorofila
b
(clo
a
/clo
b
). De acordo com os nossos resultados, a proporção clo a/clo
b foi de aproximadamente 3:1 para as plantas do controle; 2:1 para as plantas
expostas a Cr+
3
1 e 10 mM e de 1.4:1 para as expostas Cr
+6
1 mM. Embora
numericamente este último tratamento tenha apresentado a metade da proporção
em relação ao controle e, estatisticamente não tenha havido diferença entre eles,
biologicamente foi possível observar os danos que tal concentração provocou nas
plantas (ratificados pelos demais parâmetros ecofisiológicos descritos a seguir).
Em nosso experimento, os carotenóides foram os pigmentos de menores
concentrações (0.012 à 0.019
µ
mol.cm
-2
), sem diferença significativa entre os
tratamentos recebidos e as plantas-controle. A constância das concentrações
encontradas para esse pigmento na presença de Cr sugere que aguapé não utilize
apenas os carotenóides como meio de dissipação de energia para prevenir danos
ao seu aparelho fotossintético causados pela bioacumulação de metais pesados.
A toxicidade do Cr, especificamente Cr
+6
, em relação a parâmetros
bioquímicos e fisiológicos – clorofila
a
, clorofila
b
e carotenóides – tem sido
discutida por diversos autores. Em
Limnathemum cristatum
G., Cr
+6
causou
redução mínima nos conteúdos de clorofilas
a
e
b
e nenhuma nos de carotenóides
(Chandra e Garg 1992). Entretanto, com o aumento das concentrações de Cr
+6
no
cultivo de plantas de
Vallisneria spiralis
,
Cerathophyllum demersum
e
Najas indica,
foram observados um decréscimo significativo tanto para clorofilas quanto para
63
carotenóides. Indicando que tais parâmetros frente a tratamento com Cr
+6
variam
de espécie para espécie (Garg e Chandra, 1990; Sinha
et al
., 2002).
Em 2
µ
M de Cr
+6
, reduções nos conteúdos de clorofila
a
e
b
e,
consequentemente, no crescimento das plantas (
Lemna minor
e
Pistia stratiotes
)
puderam ser observadas (Bassi
et al
., 1990). Entretanto, em concentrações mais
elevadas de Cr
+6
(0.3 mM), plantas de
Pistia stratiotes
mostraram uma drástica
redução nos conteúdos dos pigmentos fotossintéticos e, após 3 dias de
tratamento, pôde ser constatada a morte das mesmas (Sen
et al
., 1987). Em
plantas de
Nelumbo nucifera
cultivadas em altas concentrações de Cr
+6
, os
conteúdos de clorofila foram reduzidos 74.7% em relação aos controles (Vaipayee
et al
., 1999).
Os efeitos de Cr
+6
sobre os conteúdos de pigmentos fotossintéticos são
reconhecidamente mais severos que os efeitos do Cr
+3
. Porém, em plantas de
Apium graveolens
L. submetidas ao estresse por Cr
+3
em concentrações de 0,01;
0.1; 1 e 10 mM em 15 dias de tratamento, um decréscimo significativo do
conteúdo de clorofila (
a
,
b
e total) foi detectado quando comparados ao controle.
Em 1 mM, houve um decréscimo maior para clorofila
b
que clorofila
a
(Scoccianti
et al
., 2006).
As plantas do nosso experimento (ao final de quatro dias) mostraram uma
redução na relação entre clo
a
/clo
b
para todos os tratamentos. Porém, pôde ser
observado que o conteúdo de clorofila a foi o mais afetado na presença de Cr
+6
1
mM, mostrando que a toxicidade do Cr dependeu mais da espécie química que da
concentração utilizada.
3.5.6 – Emissão da fluorescência da clorofila a
A tabela 3.6 mostra as diferentes variáveis de emissão da fluorescência da
clorofila
a
medidas durante o experimento e discutidas a seguir:
A F
0
(fluorescência mínima) variou durante o experimento de 319 à 148
(u.a.). Nenhuma diferença estatística foi mostrada para a maioria dos tratamentos,
com algumas exceções. O menor valor, 148, foi referente à exposição a Cr
+6
10
mM por dois dias. Em nosso experimento, a diminuição no conteúdo de clorofila
a
64
Tabela 3.6 – Valores de fluorescência da clorofila a para as plantas de aguapé expostas a diferentes tratamentos com Cr
+3
e Cr
+6
nas concentrações de 1 e 10mM nos períodos de 2 e 4
dias. F
0
- fluorescência mínima; F
m
- fluorescência máxima; F
v
– fluorescência variável; F
v
/F
m
- eficiência quântica potencial; F
v
/F
0
– eficiência da capacidade fotossintética; qP – quenching
fotoquímico; qN e NPQ – quenching não-fotoquímico. Análise estatística (Tukey, p< 5%): as letras (a, b, c, d e e) representam a estatística para comparação entre os tratamentos.
Tratamento
Concentração de
Cr (mM)
Tempo
(dias)
F
0
F
m
F
v
F
v
/F
m
F
v
/F
0
qP qN NPQ
0 274.5 ± 3.54 a 1678.5 ± 27.58
abc
1479.0 ± 4.24
ab
0.81 ± 0.01
a
5.12 ± 0.18
a
0.889±0.02
ab
0.271 ± 0.03
a
0.358 ± 0.06
a
2 291.5±13.44 a 1639.5 ± 16.26
abc
1598.0 ± 41.01
a
0.83 ± 0.04
a
5.48 ± 0.11
a
0.916±0.02
a
0.261 ± 0.00
ab
0.345 ± 0.04
a
Control 0
4 290.0 ± 8.49 a
1554.0 ± 32.53
bc
1564.0 ± 49.50
ab
0.82 ± 0.28
a
5.19 ± 0.33
a
0.900±0.03
a
0.249 ± 0.03
ab
0.336 ± 0.14
a
0 247.0 ± 2.83
ab
1678 ±26.87
abc
1313.5 ±26.16
ab
0.78 ±0.03 a 5.32 ± 0.40
a
0.863±0.03
ab
0.273 ± 0.03
a
0.349 ± 0.03
a
2 247.0 ± 2.83
ab
1618.5 ± 60.10
abc
1371.5 ± 2.93
ab
0.85 ± 0.01
a
5.55 ± 0.32
a
0.865±0.04
ab
0.225 ± 0.00
abc
0.169 ± 0.01
a
Cr
+3
1
4 265.5 ± 9.19 a 1843.5 ± 7.78
a
1578.0 ± 1.41
ab
0.86 ± 0.00
a
5.95 ± 0.21
a
0.924±0.05
a
0.140 ± 0.01
c
0.181 ± 0.08
a
0 270.5 ± 9.19 a 1560 ±49.50
bc
1276 ±2.83 b 0.82 ±0.02 a
5.53 ± 0.47
a
0.888±0.00
ab
0.270 ± 0.03
a
0.359 ±0.03
a
2 260.5 ± 0.71 a
1604.5 ± 14.85
abc
1344.0 ± 15.56
ab
0.84 ± 0.00
a
5.16 ± 0.07
a
0.944±0.02
a
0.274 ± 0.01
a
0.231 ± 0.00
a
10
4 263.5 ± 0.71 a
1798.5±132.23
ab
1535.0 ± 31.52
ab
0.85 ± 0.01
a
5.82 ± 0.48
a
0.882±0.01
ab
0.248 ± 0.02
ab
0.266 ± 0.02
a
0 268.0 ± 5.66 a
1507.5 ±16.26
c
1352 ±104.6
ab
0.82 ±0.08 a 5.32 ±0.40 a 0.886±0.00
ab
0.272 ± 0.03
a
0.349 ±0.03
a
2 319.0 ± 9.90 a 1722 ± 114.55
abc
1403.0 ± 24.45
ab
0.81 ± 0.02
a
4.41 ± 0.53
a
0.924±0.00
a
0.175 ± 0.02
bc
0.167 ± 0.02
a
Cr
+6
1
4 243.0 ± 4.24
ab
1162.5 ± 1768
d
796.5 ± 187.38
c
0.68 ± 0.15
ab
3.27 ± 0.71
b
0.914±0.02
a
0.268 ± 0.03
a
0.340 ± 0.15
a
0 273.5 ± 0.71 a
1646.5 ±72.83
abc
1356.5 ±36.06
ab
0.810 ±0.08
a
5.53 ± 0.47
a
0.896±0.01
a
0.273 ± 0.03
a
0.337 ± 0.03
a
10
2 148.0 ± 0.88 b 237.0 ± 96.17
e
89.0 ± 28.28 d 0.38 ± 0.04
b
0.86 ± 0.24
b
0.788±0.05
b
0.157 ± 0.01
c
0.056 ± 0.04
a
65
das plantas na presença de 10 mM do íon Cr
+6
no segundo dia de tratamento
induziu a diminuição na quantidade de fluorescência mínima emitida pelas
clorofilas
a.
A redução nesse valor mostra uma possível redução na transferência
de energia do complexo antena para o centro de reação PS II (Lui
et al.
, 2007).
A presença de Cr
+6
em plantas afeta a estrutura dos cloroplastos (Shanker
et al
., 2005). Em nosso experimento, as plantas submetidas a 10 mM de Cr
+6
tiveram os valores de F
0
significativamente diminuídos já no segundo dia quando
comparados aos controles.
De acordo com os dados obtidos, os valores de F
m
(fluorescência máxima)
variaram de 1843,5 à 237 com tendência a diminuírem na presença da espécie
química mais tóxica (Cr
+6
) no decorrer do experimento. Entretanto, comparando os
valores das plantas expostas a Cr
+3
, houve um aumento significativo de F
m
para
as cultivadas em 1 e em 10 mM no quarto dia de experimento.
Na presença de Cr
+6
, o declínio dos valores de F
m
, bem como os de F
0
,
sugere uma mudança na estrutura da membrana dos tilacóides e/ou danos
irreversíveis para o PS II (Long
et al.
, 1994).
Os valores de F
v
(fluorescência variável) variaram de 1598 para as plantas
do controle à 89 para as plantas do tratamento com Cr
+6
10 mM em dois dias de
tratamento. Nenhuma diferença significativa foi observada para as plantas
referentes ao tratamento com Cr
+3
1 mM durante os quatro dias de experimento.
Entretanto, as tratadas com Cr
+3
10 mM, apresentaram um aumento de F
v
do
segundo para o quarto dia.
No segundo dia de experimento, os valores de F
v
foram significativamente
reduzidos (aproximadamente quinze vezes) na presença de Cr
+6
10 mM do que na
presença de Cr
+6
1 mM (89 e 1403, respectivamente). As reduções dos valores de
F
v
, sobretudo para as plantas expostas a Cr
+6
, refletiram alterações nas variáveis
F
m
e F
0
afetadas pela presença da espécie química mais tóxica, sugerindo que o
centro de captação de energia (sistema de antenas) da planta não possuía sua
capacidade em condições ideais de funcionamento.
O componente F
v
/F
m
(rendimento quântico do PSII ou a eficiência quântica
potencial) revela, como descrito anteriormente, o nível de estresse ao qual uma
66
espécie vegetal pode estar submetida. Foi estabelecido que, se a relação entre
fluorescência variável e fluorescência máxima apresentar valores entre 0.77 e
0.83, em geral, as plantas são consideradas sadias e estão em condições normais
de crescimento (sem estresse) (Linchtenthaler e Burkart, 1996).
As plantas expostas ao Cr
+3
1 e 10 mM apresentaram valores de F
v
/F
m
variando próximos da faixa de referência pré-estabelecida, sem nenhuma
diferença significativa quando comparadas às plantas-controle durante todo o
experimento. Entretanto, foi possível observar uma redução bastante considerável
nos valores deste parâmetro quando as plantas foram expostas a 1 e 10 mM de
Cr
+6
, em quatro (0.68) e em dois dias (0.38) de tratamentos, respectivamente. Ou
seja, o potencial das plantas em converter energia na forma de luz em biomassa
foi drasticamente afetado na presença de Cr
+6
, na menor concentração, já no
segundo dia.
A presença de grandes quantidades de Cr
+6
nos tecidos foliares das plantas
em questão (tabela 4) pôde ter afetado a síntese de clorofilas, sobretudo a da
clorofila
a
especial, responsável pelos processos de dissipação da energia
luminosa absorvida.
Para plantas de
Lolium perenne
L., cultivadas em solução de Cr
+6
, a razão
F
v
/F
m
não foi afetada na presença de 50 a 100
µ
M. Um decréscimo significativo foi
observado a partir de concentrações de 250
µ
M após 45 dias de experimento. Em
500
µ
M, houve um decréscimo nessa razão de cerca de 24% em relação aos
controles ao final do experimento (Vernay
et al
., 2007).
A razão F
v
/F
0
fornece uma estimativa do rendimento máximo primário
fotoquímico do PS II e da capacidade fotossintética. Essa razão é conhecida como
boa indicadora das razões de conversão quântica fotossintética (Vernay
et al
.,
2007).
Os valores de F
v
/F
0
variaram 0.86 à 5.95 para as plantas tratadas com Cr
+6
10 mM em dois dias e Cr
+3
1 mM em quatro dias, respectivamente, com média de
5.16 para os controles.
67
O decréscimo da razão F
v
/F
0
com o aumento da concentração e o período
de exposição a espécie química +6, resultou de um decréscimo muito mais
pronunciado da variável F
v
que da variável F
0
.
Cr
+6
é um forte agente oxidante e pode causar em poucos dias danos ao
aparelho fotossintético. Entretanto, Vernay e colaboradores (2007) trabalhando
com
Lolium perenne
L. observaram que após um longo período de tempo (45 dias)
de tratamento com Cr
+6
em baixas concentrações (quando comparadas às
utilizadas em nosso experimento), os valores de F
v
/F
0
foram diminuídos em 30%
para 100 e 250
µ
M de Cr após 30 dias de exposição. A redução mais pronunciada
foi obtida com 500
µ
M e 45 dias (73%).
Os valores de q
p
(
quenching
fotoquímico) variaram de 0.788 à 0.944, não
havendo, porém, alterações significativas quando em comparação aos controles, a
não ser para as plantas tratadas com Cr
+6
10 mM no segundo dia. Os tratamentos
com Cr
+3
1 e 10 mM apresentaram valores variando entre 0.863 à 0.944,
respectivamente, em dois dias de tratamento.
O parâmetro q
p
é a dissipação de luz (na forma de fluorescência) para o
processo fotossintético, o qual fornece um indicativo da proporção de centros de
reação do PS II que estão abertos. Em outros termos, q
p
= (F
´
m
– F)/ (F
´
m
- F´
0
),
onde F
´
m
é a fluorescência máxima quando todos os centros de reação estão
fechados e adaptados a luz; F é o período dentro do qual a intensidade da
fluorescência não muda enquanto parâmetros externos permanecem constantes;
F´
0
é a fluorescência mínima quando todos os centros de reação estão abertos e
adaptados a luz (van Kooten e Snel, 1990).
A proporção do número de centros de reação do PS II abertos, ou seja, de
centros de reação oxidados, capazes de transportarem elétrons ao absorverem a
energia luminosa, ou ainda, capazes de serem reduzidos, tendeu a diminuir, com
o passar dos dias e com o aumento das concentrações de Cr
+6
utilizadas. O
contrário foi verificado para as plantas cultivadas em Cr
+3
, para as quais nenhuma
correlação como a anterior pôde ser estabelecida. Isto é, os valores de q
p
aumentaram do segundo para o quarto dia na concentração de 1 mM. Já os
valores para o tratamento com 10 mM alcançaram seu máximo no segundo dia,
68
voltando ao valor inicial (aproximadamente igual ao do controle) no quarto dia de
experimento.
Em plantas de
L. perenne
cultivadas com Cr
+6
, os valores deste parâmetro
aumentaram em função das concentrações de Cr no meio de cultivo (250
µ
M e 30
dias) (Vernay
et al
., 2007).
Os valores de q
N
e NPQ (
quenchings
não-fotoquímicos) variaram durante
os quatro dias de experimento de 0.274 à 0.140 e de 0.358 à 0.056,
respectivamente.
Diferenças estatisticamente significativas para os valores de q
N
puderam
ser observadas entre todos os tratamentos durante o experimento. As plantas
expostas a Cr
+6
10 mM apresentaram um redução drástica de q
N
no segundo dia
(0.157) em relação ao controle (0.261). De acordo com os valores apresentados,
as plantas tratadas com Cr
+3
1 mM foram mais sensíveis a q
N
do que as tratadas
com Cr
+6
na mesma concentração quando comparadas com os controles. O
menor valor de q
N
foi observado no quarto dia de exposição a Cr
+3
1 mM (0.140).
Para as plantas expostas a Cr
+6
1 mM, o menor valor foi para o segundo dia de
tratamento (0.175).
Ao contrário do observado para os resultados de q
N
, os valores de NPQ não
mostraram nenhuma diferença estatística para os tratamentos recebidos durante
todo o experimento.
Sob 100
µ
M de Cr
+6
, plantas de
L. perenne
tiveram seus valores de NPQ
significativamente aumentados após 30 dias de tratamento (Vernay
et al
., 2007).
Ao contrário destes resultados, plantas de
Amaranthus viridis
tiveram um
decréscimo de NPQ e q
n
na presença de 10 e 100
µ
M de Cr
+6
durante um período
de tratamento de 20 dias (Liu
et al
., 2007).
Os quenchings não-fotoquímicos (q
N
e NPQ) constituem os processos de
dissipação de energia na forma de calor (região do infravermelho no espectro
eletromagnético). Embora as duas variáveis expressem a dissipação de energia
na forma de calor, esse processo ocorre em diferentes compartimentos do
aparelho fotossintético. O q
n
ocorre antes da energia luminosa
ser conduzida ao
centro de reação ainda aberto, ou seja, uma parte da energia absorvida é
69
dissipada no complexo antena pelas clorofilas que o compõe. O NPQ, porém, se
dá no centro de reação do PS II quando este se encontra fechado (reduzido).
Em nosso trabalho, q
n
se mostrou mais sensível que NPQ de acordo com
as análises estatísticas para os tratamentos recebidos. Variações nos valores de
q
n
em plantas tratadas com Cr podem indicar um mecanismo de controle na
membrana do tilacóide que ajusta a dissipação térmica da energia de excitação
em excesso que é requerida para o metabolismo de carbono. Diversos estudos
têm mostrado que o aumento ou a diminuição da dissipação térmica nas antenas
do PS II compete com a transferência de energia de excitação das antenas para
os centros de reação do PS II (Vernay
et al
., 2007).
3.5.7 - Trocas Gasosas
As medidas para a confecção da curva de resposta a luz foram feitas em
plantas cultivadas em solução nutritiva sem adição dos íons de Cr.
A quantidade de radiação fotossinteticamente ativa (
PAR
) utilizada durante
o experimento para todos os parâmetros medidos em aguapé, uma planta de
ambiente ensolarado, foi definida como sendo 2000
µ
mol de fótons. m
-2
.s
-1
de
acordo com o gráfico a seguir (Figura 3.6).
A figura 3.6 representa a resposta para assimilação fotossintética e
condutância estomática com o aumento da
PAR.
Até 2000
µ
mol de fótons. m
-2
.s
-1
(máximo atingido pelo aparelho) houve um aumento na taxa de assimilação
fotossintética, alcançado aproximadamente 16
µ
mol de CO
2
.m
-2
.s
-1
. A condutância
estomática, no entanto, permanece quase constante para
PARs
de 500 à 2000
µ
mol de fótons.m
-2
.s
-1
, variando entre 600 e 800 mmol de H
2
O.m
-2
.s
-1
.
As figuras 3.7 a, b, c e d mostram os gráficos referentes à Assimilação
Fotossintética (
AF
), Carbono interno (
Ci
), Condutância estomática (
g
s
) e
Evapotranspiração (
E
), respectivamente.
70
Curva de Resposta a Luz
0
200
400
600
800
1000
0 500 1000 1500 2000
PAR (
µ
mol fótons.m
-2
.s
-1
)
g
s
(mmol H
2
O.m
-2
.s
-1
)
-5
0
5
10
15
20
AF ( mol CO
2
.m
-2
.s
-1
)
gs AF
Figura 3.6 – Curva de resposta a luz para Condutância estomática e Assimilação
fotossintética (eixo esquerdo e direito das ordenadas, respectivamente) pela
PAR
(radiação fotossinteticamente ativa) para plantas de aguapé.
Os valores de AF no tempo zero (plantas-controle) foram mantidos estáveis
e com uma pequena variação, entre 20 e 22
µ
mol de CO
2
m
-2
.s
-1
. No segundo dia
de exposição aos íons de Cr, pôde ser observado um aumento em relação ao
controle para as plantas expostas a Cr
+3
10 mM, e, principalmente, para àquelas
expostas a Cr
+3
1 mM. Esse padrão de comportamento se manteve para o quarto
dia, porém com um pequeno decréscimo.
As plantas expostas a Cr
+6
1 mM tiveram sua AF significativamente
reduzida no segundo dia quando comparadas ao controle. Para as plantas deste
tratamento, essa taxa alcançou valores negativos no quarto dia de tratamento,
indicando que os níveis das atividades respiratórias foram maiores que os níveis
das atividades fotossintéticas.
71
Figura 3.7 – Efeitos de Cr
+3
e Cr
+6
sobre a Assimilação Fotossintética (a), o Carbono interno (b), a condutância estomática (c) e a
evapotranspiração (d) de plantas de aguapé. Controle (○), Cr
+3
1 mM (□), Cr
+3
10 mM (∆), Cr
+6
1 mM (■) e Cr
+6
10 mM (▲). Os
valores são médias ± o desvio-padrão.
a
b
c
d
72
Zeid (2001) observou que em cultivo de ervilhas (
Phaseolus vulgaris
) com
concentrações de 10 mM de Cr+
3
durante quatro dias, a fotossíntese diminuiu
drasticamente. Em plantas de
Lolium perenne
L., a assimilação fotossintética e o
carbono interno foram afetados por concentrações de Cr
+6
superiores a 250
µ
M
após 45 dias de tratamento, ocorrendo um decréscimo significativo para o primeiro
parâmetro, enquanto que para o segundo, um aumento em relação ao controle
(Vernay
et al
., 2007).
Os valores de g
s
encontrados para as plantas-controle não apresentaram
diferenças entre si durante todo o experimento, variando entre 1000 e 1300 mmol
de H
2
O.m
-2
.s
-1
. Em geral, houve um aumento da g
S
para todos os indivíduos
expostos aos íon de Cr nas duas concentrações utilizadas após o segundo dia do
experimento. O aumento mais pronunciado pôde ser observado para as plantas
expostas ao Cr
+3
10 mM.
Após o quarto dia de tratamento, as plantas voltaram a exibir um padrão de
g
S
próximo as do controle, exceto para as submetidas a 1 mM de Cr
+6
. Estas,
apresentaram uma acentuada redução (aproximadamente a metade) quando
comparadas as do controle.
Os indivíduos expostos a Cr
+3
1 e 10 mM não apresentaram modificações
nos valores de
E
após o segundo dia de tratamento. Neste mesmo período, as
plantas expostas a Cr
+6
1 e 10 mM apresentaram um leve declínio e um aumento
significativo, respectivamente, em relação ao controle
Os indivíduos expostos à Cr
+6
1 mM no quarto dia de experimento
apresentaram os maiores valores de evapotranspiração em relação aos controles.
Com o aumento das concentrações de Cr
+3
, porém, houve um decréscimo dos
valores deste parâmetro no período de tratamento citado.
Plantas de
Amaranthus viridis
(uma planta terrestre) expostas a
concentrações de 0.01, 0.1 e 1µM de Cr
+6
por 20 dias tiveram suas taxas de
evapotranspiração diminuídas com o aumento das concentrações de Cr no meio
externo (Zou
et al
., 2006). Nossos resultados mostram uma tendência contraria ao
observado por Zou e colaboradores, isto é, em concentrações crescentes de Cr
+6
,
73
houve um aumento da taxa de
E
. Provavelmente isso de deve ao fato de que a
planta de nossos estudos não apresente limitação hídrica.
Respostas de g
s
para diferentes concentrações de Cr seguiram o
status
de
transpiração de folhas de
L. perenne
, o qual diminui significativamente 30 dias
após a adição de 100
µ
M de Cr
+6
na solução nutritiva de crescimento das plantas.
No entanto, variações significativas, com tendência a aumento dos valores
referentes à Ci dentro deste período, só puderam ser observadas para
concentrações de 500
µ
M (Vernay
et al
., 2007).
O estresse por Cr é um dos fatores que afetam a fotossíntese em termos de
fixação de CO
2
. Em plantas superiores, o efeito de Cr na fotossíntese é bem
descrito, entretanto, não está muito bem esclarecido se tal efeito é devido a
desorganização da estrutura dos cloroplastos, a inibição do transporte de elétrons
ou a influência do Cr sobre as enzimas do Ciclo de Kalvin ou uma ação conjunta
sobre esse processos (Shanker
et al
., 2005).
A provável inibição do transporte de elétrons pelos íons de Cr
+3
em altas
concentrações por curto período de tempo, assim como a exposição a Cr
+6
em
baixas concentrações e longos períodos, sugere que sejam provocados danos na
estrutura dos cloroplastos, diminuindo desta forma, a taxa de assimilação
fotossintética. É possível que os elétrons produzidos pelos processos fotoquímicos
não sejam necessariamente usados para fixação de carbono (Lösch e Köhl, 1999).
74
3.6 - CONCLUSÕES
Foi possível observar durante esse experimento que as plantas cultivadas
em solução contendo Cr
+6
foram as que apresentaram maiores valores de Cr total
em seus tecidos, principalmente nas raízes. Entretanto com o aumento das
concentrações utilizadas (ou mesmo na menor concentração e menor período de
tempo), houve uma maior translocação para as partes aéreas, que foi, sobretudo,
refletido nos conteúdos de cor verde, nas respostas de emissão da fluorescência
da clorofila
a
(F
v
/F
m
e F
v
/F
0
) e nos parâmetro de troca gasosa (AF, g
s
, E e Ci).
Cr
+3
pareceu oferecer algum estímulo às plantas, mais evidenciado para o
segundo dia de tratamento que para o quarto, apesar de ter sido significativamente
menos incorporado as raízes das mesmas. Seus efeitos menos tóxico, mesmo
comparando a maior concentração deste com a menor de Cr
+6
puderam ser
observados nas taxas de AF e g
s
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88
ANEXOS
89
Tabela 5 – Parâmetros físico-químicos medidos no rio Paraíba do Sul (Alto, Médio e Baixo RPS) e rio Imbé ao longo de dois anos de coleta ao final da
estação seca (setembro/outubro) e chuvosa (março). As medidas de temperatura, condutividade elétrica, pH e oxigênio dissolvido foram feitas in situ.
rio Imbé
Baixo RPS
Médio RPS
Alto RPS
Parâmetros
físico-químicos
estação seca
2005
estação
chuvosa 2006
estação seca
2005
estação
chuvosa 2006
estação seca
2005
estação
chuvosa 2006
estação seca
2005
estação
chuvosa 2006
Temperatura
ambiente (°C)
23,0
28,1
20,4
31,5
24,3
30,0
21,0
31,2
Temperatura da
água (°C)
20,4
26,1
22,8
29,6
25,4
27,7
22,5
27,6
Condutividade da
água (µS.cm
–1
)
27,4
21,5
76,0
53,4
102
126,4
151
120,3
pH da água
6,25
5,59
7,76
7,00
6,86
6,84
6,72
6,47
1º ano de coleta
Oxigênio
Dissolvido (mg/L)
5,74
4,82
6,87
5,53
5,40
11,8
5,40
11,6
rio Imbé
Baixo RPS
Médio RPS
Alto RPS
Parâmetros
físico-químicos
estação seca
2006
estação
chuvosa 2007
estação seca
2006
estação
chuvosa 2007
estação seca
2006
estação
chuvosa 2007
estação seca
2006
estação
chuvosa 2007
Temperatura
ambiente (°C)
24,8 32,6 26,0 25,0 23,0 25,9
21,0 22,0
Temperatura da
água (°C)
22,5 33,4 24,0 25,0 23,0 25,0
21,8 22,0
Condutividade da
água (µS.cm
–1
)
28,5 23,0 86,3 50,5 81,0 57,2
98,0 103
pH da água
6,30 6,53 7,10 6,46 6,41 7,02
6,32 6,95
2º ano de coleta
Oxigênio
Dissolvido (mg/L)
6,50 7,72 6,55 6,21 4,60 5,69
4,50 3,93
90
Tabela 8 – Concentração média de Fe (µg.g
-1
de matéria seca) nas diferentes partes do aguapé(pecíolo e limbo foliares, raízes jovens e adultas) coletados
em quatro pontos de coleta (rio Imbé, Alto, Médio e Baixo rio Paraíba do Sul) ao final de duas estações do ano (meses de setembro/outubro na estação seca
e março na estação chuvosa) em dois anos de coleta. Análise estatística (Tukey, p<5%): letras maiúsculas representam a estatística para a mesma estação
do ano entre os diferentes pontos de coleta (A, B, C, D, fundo escurecido compara com fundo escurecido, fundo claro compara com fundo claro); letras
minúsculas representam comparação entre as partes da planta em um mesmo ponto e mesma estação do ano (a, b, c); Y e Z representam a comparação
entre asa estações dos ano para um mesmo ponto de coleta.
Fe
rio Imbé
Baixo RPS
Médio RPS
Alto RPS
Partes do
vegetal
estação seca
2005
estação
chuvosa 2006
estação seca
2005
estação
chuvosa 2006
estação seca
2005
estação
chuvosa 2006
estação seca
2005
estação
chuvosa 2006
Limbo foliar
490 ± 40,3
AcY
56,5 ± 11,2
DcZ
519 ± 8,13
AcY
218 ± 12,9
BcZ
149 ± 40,0
BcZ
347 ± 33,5
AbY
133 ± 16,5
BcY
31,0 ± 6,16
CbZ
Pecíolo foliar
373 ± 27,2
AcY
15,7 ±
5,11
DcZ
364 ± 19,8
AcY
102 ± 11,9
BcZ
110 ± 19,1
BcZ
285 ± 6,13
AbY
108 ± 3,24
BcY
95,0 ± 12,3
BbY
Raiz jovem
10561
± 102
CbY
3706 ± 0,00
CbZ
21918 ± 231
AbY
5774 ± 322
BbZ
13856 ± 99,1
BbZ
14685 ± 198
AaY
5691 ± 76,40
DbY
173 ± 0,00
DbZ
1º ano de coleta
Raiz adulta
18337 ± 164
BaY
8815 ± 0,00
BaZ
31122 ± 2191
AaY
6913 ± 149
BCaZ
19901 ± 679
BaY
13656 ± 396
AaZ
9345 ± 103
CaY
5044 ± 851
CaY
Fe
rio Imbé
Baixo RPS
Médio RPS
Alto RPS
Partes do
vegetal
estação seca
2006
estação
chuvosa 2007
estação seca
2006
estação
chuvosa 2007
estação seca
2006
estação
chuvosa 2007
estação seca
2006
estação
chuvosa 2007
Limbo foliar
226 ± 1,26
CbY
91,0 ± 5,69
BcZ
351± 8,28
BcY
273 ± 14,1
AcZ
429 ± 6,91
AcY
121 ± 2,81
BcZ
138 ± 9,59
DcY
107 ± 8,70
BcY
Pecíolo foliar
157 ± 5,43
BbY
88,0 ± 8,83
CcZ
413 ± 9,01
AcZ
661 ± 31,8
AcY
430 ± 24,5
AcY
286 ± 16,4
BcZ
129 ± 13,9
BcY
97,0 ± 13,3
CcY
Raiz jovem
4153 ± 81,0
CaY
3275 ± 193
CbZ
16256 ± 397
AbY
7081 ± 862
BbZ
9876 ± 851
BbY
9980 ± 111
AbY
1502 ± 11,6
DbZ
5864 ± 194
BbY
2º ano de coleta
Raiz adulta
4057 ± 155
DaZ
8062 ± 561
CaY
20607 ± 680
AaY
9889 ± 140
BCaZ
16016 ± 158
BaZ
23890 ± 1173
AaY
7884 ± 260
CaZ
13090 ± 729
BaY
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