( PDF ) Exercício imediato versus tardio na regeneração do nervo isquiático de ratos após axoniotmese: análise morfométrica e funcional

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UNIVERSIDADE METODISTA DE PIRACICABA

FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOTERAPIA

Exercício imediato versus tardio na regeneração do nervo isquiático

de ratos após axoniotmese: análise morfométrica e funcional

Luciane Lobato Sobral

2007

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

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LUCIANE LOBATO SOBRAL

EXERCÍCIO IMEDIATO VERSUS TARDIO NA

REGENERAÇÃO DO NERVO ISQUIÁTICO DE

RATOS APÓS AXONIOTMESE: ANÁLISE

MORFOMÉTRICA E FUNCIONAL

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Fisioterapia, da

Universidade Metodista de Piracicaba,

para obtenção do Título de Mestre em

Fisioterapia. Área de concentração:

Intervenção Fisioterapêutica. Linha de

pesquisa: Plasticidade Neuromuscular.

Orientadora: Profª Drª Rosana Macher Teodori

PIRACICABA

2007

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Sobral, Luciane Lobato

Exercício imediato versus tardio na regeneração do nervo isquiático de ratos

após axoniotmese: análise morfométrica e funcional. Piracicaba, 2007

93 p.

Orientador: Profª Drª Rosana Macher Teodori

Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Fisioterapia,Uni-

versidade Metodista de Piracicaba.

1. Regeneração nervosa. 2. Exercício físico. 3. Morfometria. 4. Índice Fun-

cional do Ciático. 5. Plasticidade neuromuscular. I. Teodori, Rosana Macher.

II. Universidade Metodista de Piracicaba, Programa de Pós-Graduação

em Fisioterapia. III. Título.

Dedico este trabalho a minha avó

Odir Ana de Carvalho Lobato e aos

meus pais Acácio e Ana Lidia

Sobral, por toda uma vida de amor

e dedicação que muitas vezes

abdicaram de algo para contribuir

com a minha formação.

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

• Aos meus irmãos Viviane e André por serem os meus melhores

amigos e confidentes, nos quais tenho a certeza que poderei

confiar em todos os momentos da minha vida.

• Ao meu noivo Marcio, por sempre me apoiar em todos os

momentos e me ajudar a superar todas as dificuldades

encontradas nesses 6 anos de convivência.

• À minha segunda mãe Josefa Duvalina, por sempre pedir o meu

bem estar.

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

• À minha orientadora Profª Drª Rosana Macher Teodori, que me

mostrou o conhecimento científico e contribuiu para minha

formação profissional. Obrigada pelos ensinamentos, dedicação,

incentivo e compreensão.

• À Profª Drª Rosangela Verlêngia, por abrir as portas do LIP para

a realização do treinamento dos animais na esteira ergométrica.

• Às amigas Larissa, Sibele e Joice, por terem participado

ativamente deste trabalho, dedicando tempo e paciência.

• Ao apoio financeiro das instituições FAPESP e FAP- UNIMEP

AGRADECIMENTOS

• Primeiramente a Deus, por me dar saúde e a oportunidade de

chegar até aqui.

• À Profª Drª Viviane Balisardo Minamoto, pela amizade e pela

grande contribuição na minha formação.

• Às minhas companheiras e amigas de casa Larissa Salgado e

Clívia Bandeira, por esses 3 anos de convivência, amizade e

apoio.

• Às grandes amigas Roberta Zuttin e Ana Cristina, pela amizade

e disponibilidade em ajudar e escutar em alguns momentos

dessa caminhada.

• Às técnicas do Laboratório de Fisiologia Mel e Patrícia, pelo

auxílio, contribuindo com o desenvolvimento desta pesquisa.

• A todos os professores e funcionários da UNIMEP, que

contribuem para o crescimento deste curso, possibilitando que a

Fisioterapia seja uma profissão admirada por todos.

• A todos os amigos do Laboratório de Pesquisa em Plasticidade

Neuromuscular da UNIMEP: Rodrigo, Silvana, Fabio, Giovana,

Quélem, por compartilhar os bons momentos vividos naquele

ambiente e contribuir para a elaboração desta pesquisa.

• A todos os amigos do Mestrado em Fisioterapia da UNIMEP,

Rommel, João Paulo, Luciano, Viviane, Mariana, Silvia, Ana

Flávia, Giovana, Priscila, Vandenir, Érica e Karina. Espero não

ter esquecido ninguém. Caso sim, sintam-se agradecidos por,

de alguma forma, terem compartilhado comigo os momentos

dessa caminhada.

“O valor das coisas não está no

tempo que elas duram, mas na

intensidade com que acontecem.

Por isso existem momentos

inesquecíveis, coisas inexplicáveis

e pessoas incomparáveis”

Fernando Pessoa

RESUMO

Devido à controvérsia sobre o melhor momento para iniciar o exercício físico, bem

como sobre sua influência na regeneração nervosa, este estudo se propôs a

analisar morfológica e funcionalmente a influência do exercício físico em esteira,

aplicado na fase imediata e tardia do processo de regeneração do nervo isquiático

de ratos, após axoniotmese. Foram utilizados 20 ratos Wistar machos, pesando

229,05g (±18,02) divididos em 4 grupos: Controle (CON); Desnervado (D);

Desnervado + Exercício + Gaiola (DEG) e Desnervado + Gaiola + Exercício

(DGE). Após 24 horas da lesão, o grupo DEG iniciou exercício na esteira,

enquanto o grupo DGE iniciou no 14º dia. O protocolo de exercício foi: velocidade

8 m/minuto, sem inclinação, por 30 minutos durante 14 dias. Após 33 dias, o

nervo foi exposto e fixado in situ e a porção distal à lesão foi incluída em resina e

analisada em microscopia óptica. Cortes semifinos foram corados com azul de

toluidina e submetidos a análise morfométrica. Para análise funcional, foi

realizado o registro da marcha (pré-operatório, 7º, 14º, 21º e 28º dias pós-

operatório), através do Índice Funcional do Ciático (IFC). Aplicou-se o teste de

normalidade de Shapiro-Wilk. Para análise morfométrica, utilizou-se o teste Anova

- F (One-Way) seguido de Tukey; para análise funcional da marcha, utilizou-se o

teste Anova - F (Two-Way) na comparação intragrupos e o teste Anova F (One-

Way) seguido de Tukey na comparação intergrupos. Para comparação dos

resultados morfométricos e funcionais, utilizou-se o teste de correlação de

Pearson. Os resultados da análise morfométrica mostraram que apenas o

diâmetro do axônio do grupo DGE foi maior que o do grupo D, enquanto que o

diâmetro da fibra nervosa e a espessura da bainha de mielina em cada grupo

apenas apresentaram diferença significativa com o grupo CON. A razão G não

diferiu entre os grupos experimentais. Os grupos D, DEG e o DGE apresentaram

número de axônios maior que o grupo CON (p<0,05). Para análise funcional da

marcha, a comparação intergrupos não mostrou diferença estatisticamente

significativa, enquanto na comparação intragrupos, o 7º e o 14º dia diferem

significativamente do período pré-operatório, enquanto o 21º e o 28º dia diferem

significativamente do 7º e do 14º dia, durante os períodos de avaliação funcional.

O teste de correlação demonstrou fraca correlação entre os dados morfométricos

e funcionais. Conclui-se que o protocolo de exercício em esteira, tanto na fase

imediata como tardia da regeneração nervosa após esmagamento do nervo

isquiático de ratos, não influenciou o brotamento axonal, o grau de maturação das

fibras regeneradas, nem a funcionalidade dos músculos reinervados.

Palavra Chaves: regeneração nervosa, exercício físico, morfometria, Índice

Funcional do Ciático (IFC), plasticidade neuromuscular.

ABSTRACT

Due to there are controversies regarding the best moment to begin the physical

exercise, as well as its influence on nerve regeneration, the aim of this study was

to analyze morphologic and functionally the influence of the physical exercise on

treadmill applied on immediate and final phases of the rat sciatic nerve

regeneration process on rats after crush injury. It was used 20 males Wistar rats,

weighing 229.05 g (± 18.02) divided in 4 groups: Control (CON); Denervated (D);

Denervated + Exercise + Cage (DEC) and Denervated + Cage + Exercise (DCE).

After 24 hours of injury, the DEC group started the exercise on the treadmill while

the DCE group started on the 14th day. The exercise protocol was: speed 8

m/min, without inclination, for 30 min during 14 days. After 31 days, the sciatic

nerve was exposed and fixed in situ and the distal segment was include in resin

and analyses by optical microscopy. Semi-thin sections were stained in toluidine

blue and submitted to morphometric analysis. To the functional analyze it was

performed the hind footprints (pre operatory, 7th, 14th, 21st, 28th days pos

operatory) through the Sciatic Functional Index (SFI). It was applied a normality

Shapiro-Wilk test. To the morphmetric analysis it was used the ANOVA-F (one-

way) test followed by Tukey test; to walking track analysis, it was used the

ANOVA-F (two-way) test on the intra groups comparisons, the ANOVA-F (one-

way) test followed by Tukey test was applied on inter groups comparison. For

comparison of morphometric and functional results, it was used the PEARSON

test correlation. The results of morphometric analysis showed that only the axon

diameter of the DCE group was higher than the D group, whereas

the nerve fiber

diameter and myelin sheath thickness in each group only showed significant

differences with the CON group. The G-ratio did not show among the experimental

groups. The D, DEC and DCE groups, showed axonal number higher than the

CON group (p<0.05). For walking track analysis, an inter group comparison did not

show statistically significant difference, whereas the intra groups comparison, the

7th and 14th day differ significantly of the pre operatory period, while the 21th and

28th day differ significantly of the 7th and 14th day, during the periods of functional

evaluation. The correlation test showed weak correlation among the morphometric

and functional data. It is concluded that the treadmill exercise protocol, even on

immediate or delayed phase of nerve regeneration after rat sciatic nerve crush

injury, did not influence the axonal sprouting, the level of maturity of regenerated

fibers or the re-innervated muscles functionality.

Key word: nerve regeneration, physical exercise, morphometry, Sciatic Functional

Index (SFI), neuromuscular plasticity.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.....................................................................

2 REVISÃO DE LITERATURA............................................... 18

2.1 Estrutura do Nervo Periférico.....................................................

2.2 Lesão Nervosa Periférica...........................................................

2.3 Processo de Degeneração e Regeneração Nervosa Periférica.

2.4 Respostas do Músculo à Desnervação....................................

2.5 Avaliação Funcional da Marcha..................................................

2.6 Exercício Físico e Regeneração Nervosa Periférica..................

3 OBJETIVO............................................................................. 36

4 MATERIAL E MÉTODOS...................................................... 37

4.1 Aspectos Éticos..........................................................................

4.2 Local e Condições Ambientais do Estudo..................................

4.3 Grupos Experimentais................................................................

4.4 Seleção dos Animais para o Exercício em Esteira .....................

4.5 Adaptação dos Animais..............................................................

4.6 Lesão Nervosa............................................................................

4.7 Realização do Exercício Físico....................................................

4.8 Processamento do Nervo...........................................................

4.9 Análise Morfométrica...................................................................

4.10 Análise Quantitativa...................................................................

4.10.1 Número de Axônios................................................................

4.11 Análise Funcional da Marcha...................................................

4.12 Análise Estatística....................................................................

5 RESULTADOS...................................................................... 50

5.1 Esmagamento do Nervo Isquiático.............................................

5.2 Análise Histológica.....................................................................

5.3 Análise Quantitativa....................................................................

5.3.1 Número de Axônios..................................................................

5.4 Análise Morfométrica..................................................................

5.4.1 Diâmetro de Axônios...............................................................

5.4.2 Diâmetro das Fibras................................................................

5.4.3 Espessura das Bainhas de Mielina..........................................

5.4.4 Razão G...................................................................................

5.5 Análise Funcional da Marcha.....................................................

5.6 Correlação entre os dados Morfométricos e o Índice Funcional

do Ciático....................................................................................

6 DISCUSSÃO......................................................................... 65

6.1 Considerações Gerais sobre o Material e Métodos...................

6.1.1 Animais Experimentais............................................................

6.1.2 Modelo de Lesão Nervosa.......................................................

6.1.3 Protocolo de Exercício.............................................................

6.1.4 Regeneração Axonal e Análise Morfométrica .........................

6.1.5 Correlação entre os Resultados Morfométricos e Funcionais

6.1.6 Análise Funcional da Marcha..................................................

7 CONCLUSÃO........................................................................ 81

8 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................. 82

REFERÊNCIAS........................................................................ 83

ANEXO 1...................................................................................

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

BDNF – Brain-Derived Neurotrophic Factor (Fator Neurotrófico Derivado do

Cérebro)

E - Experimental

IFC – Índice Funcional do Ciático

IGF-I – Insulin-Like Growth Factor–I (Fator de Crescimento Semelhante à

Insulina)

ITS – Intermediate Toes Spread (Largura intermediária da pegada)

LA – Limiar de anaerobiose

Lan - Limiar anaeróbio

µm – Micrômetro

N – Normal

NCAM – Neural Cell Adhesion Molecule (Molécula de Adesão Celular Neural)

NGF – Nerve Growth Factor (Fator de Crescimento Nervoso)

NT-3 – Neurotrofina-3

NT-4 – Neutrofina-4

PL – Print Lengh (Comprimento da pegada)

TS – Toe Spread (Largura da pegada)

1 INTRODUÇÃO

Considerando a plasticidade do sistema nervoso, ou seja, a capacidade

de adaptar sua estrutura e função em resposta às exigências intrínsecas e

extrínsecas (Lundy-Ekman, 2000), sendo a regeneração nervosa periférica um

exemplo desta plasticidade (Machado, 1993; Lundy-Ekman, 2000; Johnson,

Zoubos e Soucacos, 2005), diversos estudos experimentais têm sido direcionados

a avaliar a lesão, a regeneração e a possível recuperação funcional após

esmagamento, estiramento ou secção completa de nervos (Herbison, Jaweed e

Ditunno, 1974; 1980a; Mira, 1979; Hie, Van Nie e Vermculen-Van der Zee, 1982;

Van Meeteren, 1997, Marqueste et al., 2004; Byun et al., 2005; Seo et al., 2006).

A desnervação produz profundas alterações motoras, sensitivas e

vasomotoras, que se caracterizam por diminuição da área de secção transversa

das fibras e aumento do tecido conjuntivo do músculo (Fernandes et al., 2005),

diminuição ou ausência da sensibilidade, e conseqüente incapacidade para

realizar função (Pachioni et al., 2006).

A Fisioterapia desempenha papel fundamental na prevenção e

tratamento dessas disfunções (Fernandes et al., 2005). Entretanto, a recuperação

funcional é um processo lento que depende da natureza e do grau da lesão, bem

como da regeneração e da maturação do nervo (Verdú et al., 2000; Robinson,

2000).

Os métodos mais utilizados para mensurar a regeneração nervosa são

a histologia, a morfometria, a eletrofisiologia e os estudos funcionais. Entretanto,

uma correlação dos resultados de tais análises é necessária (Dijkstra et al., 2000),

pois não há indicação de que o resultado de uma análise seja semelhante ao de

outra (Munro et al., 1998).

Para o tratamento da lesão nervosa, diferentes recursos podem ser

utilizados, como eletroestimulação fásica de baixa frequência (Fernandes et al.,

2005), eletroestimulação crônica de baixa frequência (Dennis et al., 2003), o laser

(Endo, 2002), o ultra-som (Monte-Raso et al., 2006) e o exercício físico (Herbison,

Jaweed e Ditunno 1974; 1980a; 1980b; 1982; Hie, Van Nie e Vermculen-Van der

Zee, 1982; Van Meeteren et al., 1997; Marqueste et al., 2004; Byun et al., 2005;

Seo et al., 2006), entre outras.

A cinesioterapia tem lugar de destaque como método fisioterapêutico

para reabilitação após lesão nervosa periférica, sendo capaz de determinar no

homem e em outros animais, um conjunto de adaptações funcionais e estruturais

(Herbison, Jaweed e Ditunno, 1980a, 1982; Seo et al., 2006).

Porém, a literatura aponta controvérsia sobre o melhor período para

realizar a atividade física, sendo que a maioria dos trabalhos discute os efeitos do

exercício físico na fase de reinervação do músculo (aproximadamente duas

semanas após a lesão nervosa), afirmando que deve haver um período de

repouso antes do exercício (Herbison, Jaweed e Ditunno, 1974; 1980a; Hie, Van

Nie e Vermculen-Van der Zee, 1982), devido ao número ainda insuficiente de

unidades contráteis, sendo a reinervação evidente somente entre o 14º e o 21º

dia pós-lesão (Herbison et al., 1973a).

Por outro lado, o exercício realizado na fase de desnervação (12 horas

ou um a três dias após a lesão nervosa), acelera o retorno da função sensório-

motora na fase inicial da recuperação da lesão (Van Meeteren et al.,1997) e

melhora a recuperação funcional, verificada por meio do Índice Funcional do

Ciático (IFC) (Van Meeteren et al.,1997; Byun et al., 2005, Seo et al., 2006) e da

diminuição do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) (Byun et al., 2005).

Considerando a controvérsia sobre o melhor momento para iniciar o

exercício após a lesão nervosa, este estudo se propôs a investigar a influência do

exercício iniciado na fase de desnervação (imediata) e de reinervação (tardia),

sobre as características morfológicas e funcionais do nervo isquiático regenerado

após axoniotmese, bem como a correlação entre os dados morfométricos e

funcionais, com o propósito de fornecer subsídios para futuras investigações

clínicas e discussão sobre novas condutas durante a reabilitação.

2 REVISÃO DA LITERATURA

2. 1 Estrutura do Nervo Periférico

Os nervos são responsáveis por conduzir informações da periferia para

o sistema nervoso central e deste para os órgãos efetores, sendo que qualquer

lesão no seu trajeto ocasiona déficits sensoriais e motores permanentes ou

transitórios. Desta forma, a compreensão de sua anatomia é fundamental

(Johnson, Zoubos e Soucacos, 2005).

O nervo é constituído por feixes de fibras nervosas envolvidas por

bainhas conjuntivas. As fibras podem ser mielínicas ou amielínicas. Nas fibras

mielínicas, em que o calibre varia entre 7,5 a 20 µm (Fugleholm, Schmalbruch e

Krarup, 2000), as células de Schwann formam uma bainha envolvendo cada

axônio, que não é continua, sendo interrompida a cada 1 a 2 mm por nodos de

Ranvier. As células de Schwann se originam do ectoderma e, durante o

crescimento, envolvem várias vezes o axônio para formar a bainha de mielina,

sendo que cada uma apresenta-se revestida por membrana basal (Todd e

Bowman, 1975; Kefalides et al., 1979 apud Teodori, 1996).

Nas fibras amielínicas, cujo calibre varia de 0,5 a 2 µm, uma célula de

Schwann pode envolver vários axônios, não sendo separadas entre si por nodos

de Ranvier (Machado, 1993; Guyton e Hall, 2002).

O suprimento vascular do nervo é bem desenvolvido, estando os vasos

dispostos nas várias camadas que compõem a bainha conjuntiva, regulando o

fluxo sanguíneo local (Pachioni et al., 2006).

As bainhas conjuntivas, representadas pelo endoneuro, perineuro e

epineuro, fornecem resistência, elasticidade e proteção aos nervos. Além disso,

cada camada apresenta uma estrutura individual e peculiaridades funcionais que

são extremamente importantes para a nutrição, integridade das fibras e

transmissão do impulso nervoso (Sunderland, 1965).

O endoneuro é uma delicada camada de tecido conjuntivo sobre cada

fibra nervosa, composta de fibroblastos, capilares e fibras colágenas, sendo a

maioria dessas fibras disposta longitudinalmente. Apesar de apresentar

elasticidade e resistência, a fibra nervosa é muito suscetível à compressão e ao

estiramento. Assim, esta camada necessita da proteção do perineuro e do

epineuro (Sunderland, 1965; Welch, 1996).

O perineuro é uma fina, mas densa e distinta bainha de células

achatadas e dispostas concentricamente, que envolve determinado número de

fibras nervosas que constituem um fascículo. Sua função é proteger as fibras que

envolvem e funcionar como uma barreira bidirecional de difusão, preservando o

microambiente (Sunderland, 1965; Oldfors e Johansson, 1979).

O epineuro é uma densa bainha de tecido conjuntivo que envolve todo

o nervo. Essa camada contém fibras colágenas e elásticas, mastócitos,

macrófagos e fibroblastos. O tecido adiposo raramente é observado, mas pode se

constituir em elemento importante para proteção do nervo contra forças

deformadoras (Sunderland, 1965).

2. 2 Lesão Nervosa Periférica

Devido à grande distribuição e à localização dos nervos, lesões

nervosas são freqüentes e geralmente resultam de traumas (Robinson, 2000).

Atualmente, lesões decorrentes de acidentes automobilísticos são mais

freqüentes que aquelas causadas por trauma penetrante, resultando em

consideráveis incapacidades motoras e diminuição ou ausência de sensibilidade

no território do nervo acometido (Robinson, 2000; Johnson, Zoubos e Soucacos,

2005). No membro superior, os nervos mais suscetíveis à lesão são: o radial,

seguido pelo ulnar e mediano, devido à proximidade do nervo radial com o úmero;

enquanto no membro inferior, os mais suscetíveis são o nervo isquiático, seguido

pelo nervo fibular e, mais raramente, pelo nervo femoral e tibial devido à

proximidade do nervo isquiático com a articulação do quadril (Robinson, 2000;

Ferreira, 2006).

Seddon (1943) apud Burnet e Zager (2004), estabeleceu uma

classificação da lesão nervosa periférica, considerando três tipos de lesão:

neuropraxia, axoniotmese e neurotmese, estabelecidas de acordo com a

preservação ou perda do tecido conjuntivo do nervo após a lesão.

A neuropraxia é a forma mais branda de lesão, onde há um bloqueio de

condução, não havendo perda de continuidade axonal, nem degeneração dos

constituintes axonais, sendo a recuperação rápida e completa em poucas

semanas (Welch, 1996; Robinson, 2000; Burnett e Zager, 2004; Omura et al.,

2005).

A axoniotmese é uma lesão mais grave, apresentando danos

suficientes para promover a degeneração Walleriana. O prognóstico da

recuperação funcional depende da regeneração nervosa, que ocorre

espontaneamente, uma vez que os envoltórios conjuntivos e a microcirculação

foram preservados. (Lundborg, 1987; Robinson, 2000; Burnett e Zager, 2004;

Omura et al., 2005).

A neurotmese é o tipo de lesão mais grave, havendo completa ruptura

do nervo. A regeneração nervosa depende da reconexão cirúrgica dos cotos.

Porém, mesmo com um reparo adequado, o prognóstico de recuperação funcional

é limitado devido à possibilidade de formação de neuroma entre os cotos, o qual

se constitui numa importante barreira à recuperação funcional (Stoll e Muller,

1999; Omura et al., 2005).

Outra classificação, estabelecida por Suderland (1978) e citada por

Burnett e Zager (2004), caracteriza a lesão nervosa periférica em cinco graus. Os

graus I e II correspondem respectivamente à neuropraxia e axoniotmese,

definidas anteriormente por Seddon (1943). Os graus III, IV e V são denominados

de acordo com o acometimento dos envoltórios conjuntivos. Assim, o grau III

determina uma perda da continuidade axonal com lesão do endoneuro; o grau IV

considera uma lesão no axônio juntamente com o endoneuro e perineuro; e o

grau V se caracteriza pelo acometimento de todas as estruturas do nervo.

A compreensão adequada do tipo de lesão nervosa é extremamente

importante para clínica terapêutica, pois permite o estabelecimento de

prognósticos funcionais, bem como de um plano de tratamento adequado (Burnett

e Zager, 2004).

2.3 Processo de Degeneração e Regeneração Nervosa Periférica

Diversas modificações bioquímicas, celulares e moleculares estão

presentes após a secção ou esmagamento nervoso, com a finalidade de

recuperar a função do nervo danificado (Burnett e Zager, 2004).

Após axoniotmese ou neurotmese ocorre a desintegração do axônio e

da bainha de mielina, seguida de profundas alterações da célula nervosa no local

da lesão, bem como nas regiões proximal e distal a esta.

Quando um nervo é seccionado ou esmagado, evidenciam-se um

segmento proximal, em continuidade com o centro trófico, e um segmento distal,

separado do corpo celular (Bishop, 1982; Stoll e Muller, 1999; Burnet e Zager,

2004; Johnson, Zoubos e Soucacos, 2005).

As modificações morfológicas e estruturais que ocorrem na porção

proximal após a lesão nervosa são denominadas de efeito retrógrado (Lieberman,

1971). Dentre essas, a cromatólise é um evento caracterizado pela dissociação

do corpúsculo de Nissl, desintegração de grandes porções de retículo

endoplasmático rugoso e a dispersão dos ribossomos no citoplasma da célula.

Além disso, observa-se aumento de volume do corpo celular, migração do núcleo

para a periferia e alterações metabólicas, como a diminuição de componentes do

citoesqueleto (Welch, 1996; Stoll e Muller, 1999; Burnett e Zager, 2004; Johnson,

Zoubos e Soucacos, 2005).

Quando o segmento nervoso distal perde a comunicação com o centro

trófico da célula, não consegue manter sua estrutura e integridade. Inicia-se então

a degeneração Walleriana, que se evidencia pela remoção dos restos finais da

degradação e fagocitose da substância axonal, o que deixa o tubo endoneural

vazio, numa preparação para o crescimento de novos axônios (Bishop, 1982;

Lundborg, 1987; Burnett e Zager, 2004; Johnson, Zoubos e Soucacos, 2005).

Durante esse processo, a bainha de mielina ao redor do axônio é fagocitada,

inicialmente pelas células de Schawnn (aproximadamente 24 horas após a lesão)

e, secundariamente, pelos macrófagos (Burnett e Zager, 2004). Após remoção do

material degenerado os macrófagos retornam aos capilares e as células de

Schawnn, através de um processo de interdigitação de seus citoplasmas, formam

cordões lineares denominados de “bandas de Bungner” ou “coluna de células de

Schwann” (Stoll e Muller, 1999; Johnson, Zoubos e Soucacos, 2005) e irão atuar

no sentido de favorecer a regeneração nervosa.

Durante a degeneração Walleriana, a lâmina basal das células de

Schwann permanece íntegra, o qual consiste de uma matriz de colágeno tipo IV

associada à glicoproteínas como a laminina, desenvolvendo importante papel na

formação, manutenção e degeneração da bainha de mielina (Fried e Bruck, 1993;

Perry, Brown e Andersson, 1993; Welch, 1996; Stoll e Muller 1999; Maki, 2002).

No que se refere ao papel das células de Schwann nesse processo,

Fawcett e Keynes (1990) atribuem a elas uma das atuações mais relevantes na

regeneração, servindo como fatores promotores de neuritos na produção do fator

de crescimento nervoso (NGF) e do BDNF e auxiliando os macrófagos a

fogocitarem os restos de axônio e mielina, provenientes da degeneração.

A regeneração inicia-se poucas horas após o trauma, quando a

extremidade axonal ligada ao corpo celular origina um grande número de finos

prolongamentos (brotos axonais), que avançam distalmente (Brushart, 1993). No

caso de neurotmese, esses brotos axonais podem ser mal direcionados devido à

presença de tecido cicatricial, resultando em conexões nervosas anormais,

restrições da maturação das fibras nervosas e alterações na arquitetura muscular

(Gutmann e Jakoubek, 1963; Carter et al., 1998).

O sucesso da regeneração depende de vários fatores, como a

interação do cone de crescimento e dos neuritos com as substâncias do meio

extracelular até que o alvo seja atingido (Stolll e Muller, 1999), das alterações no

corpo celular (cromatólise) e da atuação das células de Schwann, macrofágos e

fibroblastos (Fawcett e Keynes, 1990).

Fatores também importantes para a regeneração nervosa periférica

são: a molécula de adesão celular neural (NCAM), a N-caderina e o fator de

crescimento semelhante à insulina-I

(IGF-I), que atuam favorecendo o

crescimento do axônio, promovendo a proliferação de células de Schwann e

inibindo apoptose (Ide, 1996; Johnson, Zoubos e Soucacos, 2005). Omura et al.

(2005) citam que as proteínas como o BDNF, neurotrofina-3 (NT3) e neurotrofina-

4 (NT4), expressadas de acordo com o tipo de lesão nervosa, favorecem a

sobrevida, diferenciação e regeneração no sistema nervoso central e periférico.

A etapa que sucede a regeneração é a de maturação dos axônios,

visando “recuperação” das dimensões das fibras e da velocidade de condução

nervosa. Porém, a recuperação completa raramente é alcançada (Verdú et al,

2000).

2.4 Respostas do Músculo à Desnervação

A desnervação causa perda imediata das atividades motora e reflexa

do músculo e, conseqüentemente, atrofia progressiva durante as semanas que

sucedem a lesão, podendo ocasionar alterações permanentes nas fibras

musculares e no tecido conjuntivo, além de uma série de mudanças fisiológicas,

bioquímicas e funcionais (Bishop, 1982; Deschenes, Maresh e Kraemer, 1997).

Esse comprometimento é seguido por degeneração das fibras e

substituição por tecido fibroso ou adiposo, resultando em incapacidade para a

realização das funções musculares. Jaweed, Herbison e Dittuno (1975) citam que

a desnervação do músculo sóleo de ratos proporciona aumento na proporção de

fibras tipo II, com diminuição de fibras do tipo I, sugerindo transformação dos tipos

de fibra muscular, o que contribui para o aumento da fatigabilidade (Deschenes,

Maresh e Kraemer, 1997; Ferreira et al., 2004).

A desnervação provoca também a redução na sensibilidade à insulina

e na atividade das vias reguladoras do metabolismo da glicose. Além disso,

diminui a captação da glicose, a expressão gênica dos transportadores GLUT-1 e

GLUT-4 e o metabolismo muscular da glicose, os quais também podem

desencadear o processo de atrofia muscular (Silva et al., 1999; Polacow et al.,

2003; Coderre et al., 1992 apud Forti et al., 2004).

De acordo com o tipo de lesão nervosa periférica, a alteração evidente

no músculo será transitória ou permanente, sendo que na neuropraxia, as

alterações são mais leves, enquanto que nas situações de axoniotmese e

neurotmese são mais evidentes.

Em relação ao tempo necessário à regeneração do nervo isquiático em

ratos após esmagamento, existem diversos estudos experimentais na literatura

científica. Devor et al. (1979) relatam que a recuperação funcional do nervo

isquiático após esmagamento em ratos tem início no 4º dia após a lesão e que,

em torno do 20º dia, já se evidencia retorno importante da sensibilidade nos

territórios comprometidos pela lesão. Mira (1979) cita que as fibras regeneradas

do nervo isquiático de ratos após lesão por esmagamento estão presentes entre o

10º e 15º dia, com retorno da normalidade no 2º mês.

Em outros estudos, Gorio et al., (1983) e Carmignoto et al., (1983)

afirmam que 25% das fibras musculares já estão poliinervadas em

aproximadamente 15 dias após o esmagamento do nervo isquiático, alcançando o

máximo entre 21 e 25 dias. Em seguida, os contatos sinápticos excessivos

começam a ser eliminados (eliminação sináptica), pois a concentração dos fatores

neurotróficos diminui devido ao restabelecimento das características biofísicas do

músculo, tornando a fibra monoinervada no 60º dia, sendo que em 90 dias a fibra

muscular recupera suas condições normais.

O crescimento axonal em ratos após axoniotmese é, em média, de 3 a

4 mm/dia (Gorio et al., 1983), porém, após neurotmese, a velocidade média é de

2,5 mm/ dia (Stoll e Muller, 1999), enquanto que para o homem este crescimento

é de, em média, 1 a 2 mm/dia (Stoll e Muller, 1999; Gordon, Sulaiman e Boyd,

2003).

2.5 Avaliação Funcional da Marcha

Para avaliar a função após esmagamento do nervo isquiático, De

Medinacelli, Freed e Wyatt (1982) propuseram um método não invasivo,

denominado de IFC, que apresenta boa confiabilidade e reprodutibilidade quando

comparado a outros previamente utilizados, como análise eletrofisiológica do

nervo e do músculo e de transporte axonal.

Este método foi modificado por Bain, Mackinnon e Hunter (1989) e

Hare et al. (1992), com a finalidade de aprimorá-lo e de avaliar a função de outros

nervos após esmagamento, transecção e reparo. Esses pesquisadores

observaram que o grau de recuperação funcional depende do nervo envolvido,

sendo que o nervo isquiático apresenta 41% de recuperação após transecção,

enquanto o tibial apresenta 54% e o fibular 100%, após 52 dias do reparo

cirúrgico (Hare et al., 1992; Varejão et al., 2001). Essa variabilidade na

recuperação funcional se deve à relativa complexidade dos nervos envolvidos,

que possuem fibras sensoriais, motoras e simpáticas, havendo conexões

inapropriadas entre as fibras regeneradas (Hare et al., 1992). Entretanto, esses

autores afirmam que, quando a lesão ocorre por esmagamento do nervo

isquiático e tibial, a recuperação é completa.

O instrumento de avaliação consta de um corredor, medindo 42 cm de

comprimento e 8,2 cm de largura, sendo que em uma de suas extremidades se

localiza uma caixa escura (De Medinaceli, Freed e Wyatt, 1982). O animal é

colocado no corredor e, após duas ou três passagens do animal pelo corredor

para reconhecimento do ambiente, posiciona-se uma tira de papel branco ou

papel fotográfico sobre o assoalho do corredor, para registro das pegadas

(Dijkstra et al., 2000; Varejão et al., 2004).

Em seguida, as patas posteriores do animal são marcadas com tinta

preta de impressão digital e este é posicionado no início do corredor, por onde

caminha em direção ao ambiente escuro, deixando impressas as faces plantares

das patas traseiras experimental (lesado) e normal (De Medinaceli, Freed e Wyatt,

1982; Varejão et al., 2001; 2003; 2004).

Para mensuração das imagens das pegadas, coleta-se a distância do

terceiro dedo ao calcanhar (PL), o afastamento dos dedos, ou seja, a medida do

1º dedo ao 5º dedo (TS) e o afastamento dos dedos intermediários, ou seja, a

distância do 2º dedo ao 4º dedo (ITS) da pata normal (N) e experimental (E) (Bain,

Mackinnon e Hunter, 1989; Varejão et al., 2001; 2003; 2004).

A medição desses parâmetros pode ser realizada manualmente ou por

meio de um programa de computador (Bain, Mackinnon e Hunter, 1989; Varejão

et al., 2001; Selli 1998 apud Endo, 2002). Os dados obtidos por meio desse

registro das pegadas são introduzidos na seguinte equação, de acordo com De

Medinacelli, Freed e Wyatt (1982) e adaptada por Bain, Mackinnon e Hunter

(1989):

IFC= - 38.3 x EPL - NPL + 109.5 x ETS – NTS + 13.3 x EIT – NIT – 8.8

NPL NTS NIT

Os resultados obtidos na fórmula expressam que o valor 0, representa

uma função normal e o valor –100, uma perda funcional significativa (Varejão et

al., 2001; 2003; 2004).

2.6 Exercício Físico e Regeneração Nervosa Periférica

O exercício físico é capaz de múltiplos ajustes fisiológicos, sendo que

nenhuma outra atividade proporciona tamanha sobrecarga aos sistemas

biológicos (Gallo et al., 1995), podendo ser utilizado na clínica terapêutica para o

tratamento de doenças, prevenção de atrofia muscular, ganho de amplitude de

movimento e recuperação da motricidade, além de favorecer o equilíbrio

metabólico.

Para Herbison e Gordon (1973b), o exercício estimula significativas

mudanças histológicas, bioquímicas e funcionais no músculo, como o aumento da

massa muscular, dos capilares sanguíneos, do número e tamanho da

mitocôndria, entre outras. Para Seo et al. (2006), a atividade física induz

alterações no sistema nervoso central (facilita o aprendizado e a memória) e

periférico (acelera a regeneração axonal).

O aumento da atividade contrátil, considerando diferentes tipos e

intensidades de exercício, favorece também um aumento do GLUT-4. Estes

dados sugerem que a prática regular de exercício eleva a captação de glicose

pelas fibras musculares (Forti et al., 2004).

Considerando os benefícios do exercício, diferentes formas de

treinamento em ratos estão sendo estudadas por diversos pesquisadores, com a

finalidade de aumentar e acelerar a recuperação funcional do músculo após lesão

nervosa periférica (Herbison, Jaweed e Ditunno, 1974; Crockett e Edgerton, 1975;

Van Meeteren et al., 1997; Seo et al., 2006).

Vecchi (1929), citado por Van Meeteren et al. (1997) foi o primeiro a

tentar estimular a regeneração de nervo esmagado em ratos, utilizando a esteira

ergométrica. Apesar da data da primeira publicação utilizando esse recurso para o

tratamento das lesões nervosas, observa-se uma escassez de dados na literatura

atual relacionados ao impacto da atividade física na fase inicial da desnervação.

Além da escassez de pesquisas, existem diversos dados controversos

na literatura, provavelmente decorrentes do uso de diferentes protocolos de

treinamento, uma vez que a qualidade dos ajustes fisiológicos da atividade física,

tanto no homem com no animal, depende basicamente das características do

treinamento físico, como natureza, intensidade, duração e freqüência do exercício

(Seo et al., 2006).

Assim, Herbison, Jaweed e Ditunno (1974, 1980a) relatam não haver

estudos que definam a intensidade ou tempo ideais para iniciar o exercício, mas

afirmam ser a fase de reinervação a melhor fase, uma vez que o dano muscular

pode ocorrer durante a fase de desnervação quando o número de unidades

contráteis é insuficiente ou quando o exercício é de alta intensidade.

Com a intenção de demonstrar que o exercício realizado durante duas

horas, imediatamente após a lesão do nervo isquiático, inibe o processo de

reinervação, diminuindo as propriedades contráteis do músculo, Herbison,

Jaweed e Ditunno (1974) propuseram um protocolo de treinamento no qual a

natação era iniciada na 3º semana (o que consideraram fase imediata) com

duração de três semanas, onde um grupo nadava durante uma hora e outro

durante duas horas. Outros dois grupos iniciavam a natação na 4º semana (o que

consideraram fase tardia) após desnervação, treinando por duas semanas,

durante uma e duas horas, respectivamente. O grupo que realizou exercício no

início da reinervação (3º semana) durante duas horas apresentou diminuição da

concentração total de proteína muscular devido à presença de poucas unidades

contráteis após a desnervação e a alta intensidade de atividade.

Em 1980a, Herbison, Jaweed e Ditunno repetiram um protocolo

semelhante ao anterior para ratos submetidos a axoniotmese, porém utilizando

esteira. O exercício não alterou o diâmetro da fibra muscular, nem a reinervação

do músculo, mas aumentou a proporção de fibras tipo II na região profunda do

músculo plantar, sugerindo que as alterações ocorrem de acordo com o programa

específico de exercício físico.

Hie, Van Nie e Vermculen-Van der Zee (1982) optaram também por um

programa de treinamento similar, em que ratos desnervados realizavam

exercícios em esteira (inclinação de 25% e velocidade de 12 m/min por duas

horas/dia durante 18 semanas) após 18 dias da secção do nervo isquiático,

afirmando que o exercício dinâmico nessa fase de reinervação ocasiona efeitos

positivos no peso, na contração e nas características histológicas do músculo,

proporcionando condições fisiológicas favoráveis para a recuperação funcional.

Cinco anos mais tarde, em 1987, os mesmos autores refizeram o

estudo com objetivo de avaliar se a recuperação funcional do músculo estava

sendo acompanhada com o aumento da capacidade oxidativa. Concluíram que o

protocolo de esteira utilizado não altera a reinervação e a distribuição das fibras

musculares, nem ocasiona danos musculares.

Apesar desses estudos, Van Meeteren et al. (1997) relataram que a

atividade física na fase de desnervação aumenta o retorno da função sensório-

motora e esse resultado persiste na fase tardia da reinervação, apontando que o

exercício 24 horas após a lesão por esmagamento do nervo isquiático apresenta

benefícios para o crescimento axonal, recuperação das propriedades contráteis

do músculo e maturação do nervo. Para obter esses resultados na fase tardia, os

animais experimentais foram observados aos 50, 75, 100, 125 e 150 dias após a

lesão, obtendo-se dados eletrofisiológicos. Aos 150 dias, a velocidade de

condução do nervo motor era significativamente melhor nos grupos treinados do

que no grupo controle.

Em outro estudo semelhante, Byun et al. (2005) submeteram ratos a

exercício na esteira após 72 horas do esmagamento do nervo isquiático, na

velocidade de 8 m/min e inclinação de 0%, por 30 minutos, uma vez ao dia,

durante 12 dias consecutivos. Concluíram que o exercício foi efetivo na

recuperação funcional, aumentando os valores do IFC e inibindo a expressão do

mRNA do BDNF.

Marqueste et al. (2004) ressaltaram que o exercício na esteira,

aproximadamente uma semana após neurotmese e reparo cirúrgico, proporciona

benefícios, como o aumento da resistência à fadiga, recuperação das

propriedades contráteis e da mecano-sensibilidade do músculo.

Em estudo recente, Seo et al. (2006) submeteram ratos a treinamento

na esteira após 12 horas do esmagamento do nervo isquiático, em velocidade de

18 m/min e 0% de inclinação, por 30 minutos, duas vezes ao dia, durante 3-14

dias. Observaram que o exercício na esteira acelera a regeneração axonal e

consequente recuperação motora funcional por meio do IFC.

Além da discussão sobre a melhor fase para realizar o exercício físico,

o estresse promovido pelos estímulos negativos, como o choque elétrico por meio

de esteiras equipadas com grade e o afogamento, na natação, para incentivar os

ratos a realizarem os exercícios, pode afetar os resultados dos experimentos,

comprometendo a recuperação funcional (Irintchev, Draguhn e Werning, 1990;

Irintchev, Carmody e Werning, 1991). Apesar disso, diversos estudos citam a

utilização de ameaça de afogamento (Gutmann e Jakoubek, 1963) e choque

elétrico (Herbison, Jaweed e Dittuno, 1980a; 1980b; Hie, Van Nie e Vermculen-

Van der Zee, 1982; Seo et al., 2006) para motivar os ratos a realizarem o

exercício.

A freqüência do exercício é outra variável bastante discutida.

Deschenes, Maresh e Kraemer (1997) afirmam que a freqüência moderada de

cinco dias/semana de exercício na esteira (velocidade de 24 m/min e inclinação

de 0%) por seis semanas, não é suficiente para alterar os efeitos da desnervação

sobre a morfologia muscular (tamanho e tipo da fibra muscular). Entretanto,

Sakakima et al. (2004) concluíram que a corrida realizada na freqüência de três e

de seis vezes por semana traz benefícios para recuperação da atrofia e contratura

muscular em ratos previamente imobilizados quando comparado a freqüência de

uma vez por semana e a um grupo que não realizou exercício.

Diante da variabilidade de fatores envolvidos com o exercício físico no

processo de regeneração nervosa, deve-se fazer uma prescrição adequada e

segura do exercício, onde programas de tratamento devem ser baseados no

limiar de anaerobiose para serem propostos, a fim de obter baixos riscos de

intercorrências durante a realização do mesmo.

O limiar de anaerobiose (LA) pode ser definido como a intensidade do

exercício sobre o qual a produção de energia pelo mecanismo aeróbio é

suplementada pelo mecanismo anaeróbio, o qual fornece importantes

informações acerca dos principais sistemas fisiológicos envolvidos na realização

do exercício físico (Wasserman et al., 1999).

Assim, o acúmulo do lactato sanguíneo depende da duração e da

intensidade do exercício, sendo que o aumento desta ocasiona um crescimento

exponencial na concentração do lactato (Wasserman et al., 1999). No caso de

esteira para ratos, a intensidade do treinamento é considerada pela velocidade,

enquanto na natação, é considerada pela adição de cargas progressivas à cauda

ou tórax do animal (Pills et al., 1993; Langfort et al., 1996).

A produção de lactato em excesso pode, por inibição da via glicolítica,

impedir o desempenho e contribuir para fadiga, além de prejudicar as

propriedades de contratilidade muscular, por interferir na condutibilidade elétrica

da membrana e na atividade metabólica, modificando variáveis fisiológicas e

bioquímicas (Montgomery, 1990).

Pills et al. (1993) realizaram um protocolo de determinação de limiar

anaeróbio (Lan) para ratos, onde mediram o nível de lactato em repouso, e

iniciaram a corrida a 13 m/min, com 10º de inclinação, durante 3 minutos. Em

seguida, retiraram os ratos da esteira para uma imediata dosagem e, após 3

minutos, recolocaram-nos na esteira com um incremento de 4 m/min até atingirem

33 m/min. Neste estudo, percebeu-se que os ratos a 10% de inclinação com 25

m/min de velocidade na esteira, produzem mais lactato, acumulando íons de

hidrogênio no músculo e no sangue, diminuindo o pH sanguíneo e cessando o

exercício por acidose num intervalo muito pequeno. Os autores definiram a

velocidade de 17 m/min como sendo a de equilíbrio entre a produção e remoção

do lactato para ratos normais em esteiras.

Utilizando outro protocolo para ratos, Machado et al. (2005) afirmaram

que o lactato sanguíneo está estabilizado na velocidade de 15 m/min e a

concentração de lactato começa a se elevar na velocidade de 20 m/min, sendo

que a partir desta velocidade há um aumento progressivo da concentração de

lactato. Entretanto, até o momento não foi encontrado na literatura dados que

determinem o Lan para ratos desnervados na esteira.

Apesar disso, Herbison, Jaweed e Ditunno (1982) relatam um protocolo

de esteira com inclinação de 35% e velocidade de 27 m/min após duas ou três

semanas da lesão por esmagamento do nervo isquiático em ratos, afirmando que

o estímulo do treinamento aumenta a porcentagem da fibra tipo II, sem causar

danos durante a reinervação. Para Van Meeteren et al. (1997), esse protocolo não

traz benefícios, uma vez que a sobrecarga do treinamento é prejudicial para a

pata sadia do rato, causando danos musculares.

Considerando que os dados disponíveis na literatura atual sobre a

utilização do exercício físico como recurso para facilitar a regeneração e a

recuperação funcional após lesão nervosa periférica são contraditórios, este

estudo investigou a influência do exercício físico iniciado imediata e tardiamente

após a lesão sobre o processo de regeneração nervosa em ratos, visando

subsidiar discussões relacionadas ao tratamento de lesões nervosas periféricas

na clínica fisioterapêutica.

3 OBJETIVOS

Analisar comparativamente a influência do exercício em esteira

aplicado na fase imediata e tardia da regeneração do nervo isquiático de ratos

após axoniotmese, por meio de análise morfométrica e funcional.

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Aspectos Éticos

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação

com Animais da Universidade Federal de São Carlos, sob protocolo nº 027/2006

(anexo 1).

4.2 Local e Condições Ambientais do Estudo

Todos os procedimentos experimentais foram realizados no Laboratório

de Pesquisa em Plasticidade Neuromuscular, do Programa de Pós-graduação em

Fisioterapia da Universidade Metodista de Piracicaba (UNIMEP).

Os animais foram mantidos em gaiolas de polietileno, com água e

ração comercial “ad libitum”, sob temperatura controlada e ciclo automático de

iluminação de 12 horas claro e 12 horas escuro.

4. 3 Grupos Experimentais

Foram utilizados 20 ratos Wistar machos, com idade entre 6 e 7

semanas, pesando (229,05 ±18,02 gramas), procedentes do Biotério Central da

UNIMEP. Os animais foram divididos em 4 grupos (n=5):

Grupo I - Controle (CON): animais sem qualquer intervenção.

Grupo II - Desnervado (D): animais submetidos à lesão por

esmagamento do nervo isquiático e mantidos na gaiola durante 33 dias.

Grupo III - Desnervado + Exercício + Gaiola (DEG): animais

submetidos ao treinamento após 24 horas da lesão durante 14 dias, mantidos na

gaiola por 14 dias e sacrificados no 33º dia.

Grupo IV - Desnervado + Gaiola + Exercício (DGE): os animais

iniciaram treinamento no 14º dia após a lesão nervosa, sendo sacrificados no 33º

dia.

Os animais dos grupos III e IV realizaram exercício na esteira

ergométrica por cinco dias sucessivos na semana, respeitando os finais de

semana, sendo que cada grupo realizou 14 dias de atividade física.

4.4 Seleção dos Animais para Exercício em Esteira

Cinquenta animais foram submetidos a um processo de seleção

durante uma semana, em esteira ergométrica da marca REBOOK TR2

PREMIERRUN TREADMILL

(Figura 1), para a seleção de 10 animais corredores

natos. O critério para identificação dos corredores natos foi apresentar

capacidade para correr de cinco a dez minutos em velocidade de 17 m/min (Pills

et al., 1993; Gobatto et al., 2001; Machado et al., 2005).

Figura 1 – Vista superior da esteira ergométrica REBOOK TR2 PREMIERRUN

TREADMILL

4.5 Adaptação dos Animais

Os animais selecionados foram adaptados na esteira antes de iniciar o

experimento. O protocolo de adaptação consistiu em colocar os animais na

esteira por uma semana, sem inclinação, com velocidade de 17 m/min, mas com

aumento progressivo do tempo de corrida até alcançar 30 minutos (Pills et al.,

1993; Machado et al., 2005).

4.6 Lesão Nervosa

Os animais submetidos à cirurgia para esmagamento do nervo

isquiático receberam anestesia intramuscular de uma mistura de Ketalar

(Cloridrato de Ketamina - 50 mg/mL) e Rompum

(Cloridrato de Tiazina - 2g/100

mL), na proporção 1:1, na dose de 0,3 mL/100g do peso corporal.

A seguir, os ratos foram tricotomizados na região glútea esquerda,

onde se realizou uma incisão de aproximadamente 1,5 cm sobre a pele para

exposição dos planos musculares, que foram afastados até a visualização do

nervo isquiático (Figura 2A). O nervo foi delicadamente separado do tecido

conjuntivo ao redor e esmagado com pinça hemostática adaptada ERWIN GUTH

de 12 cm, por quatro pinçamentos de 20 segundos e intervalo de um segundo

entre eles, de acordo com Fernandes et al. (2005), sendo padronizada a

compreensão até o 3º dente da cremalheira (Figura 2B). Para todos os animais, o

esmagamento foi feito pelo mesmo indivíduo. A Figura 2C mostra o aspecto

macroscópico do nervo, imediatamente após a lesão.

Em seguida, os planos muscular e cutâneo foram fechados com fio de

sutura Ethicon 6-0.

Figura 2 – A: Nervo isquiático exposto (seta); B:

Esmagamento do nervo (seta); C: Aspecto macroscópico do

nervo após esmagamento (seta).

Após recuperação anestésica, administrou-se 4µL de dipirona sódica

(500 mg/mL) por via oral, com efeito analgésico e PVP (Povidine) – I 10% (uso

tópico) no local da incisão, a cada 12 horas, no primeiro e segundo dia pós-

operatório.

4.7 Realização do Exercício Físico

Os animais foram treinados em esteira ergométrica REBOOK TR2

PREMIERRUN TREADMILL

adaptada para ratos, com oito raias. O treinamento

ocorreu durante 30 minutos/dia, 5 vezes por semana, com velocidade de 8 m/min

e inclinação de 0%, por um período de 14 dias (período vespertino), respeitando-

se os finais de semana.

Os animais dos grupos DEG foram submetidos ao treinamento em

esteira após 24 horas da lesão nervosa (fase imediata), enquanto que o grupo

DGE iniciou treinamento no14º dia após a lesão (fase tardia).

Para reduzir o estresse dos animais durante o treinamento, o

dispositivo que transfere corrente elétrica para motivar os ratos a correr não foi

utilizado, sendo o estímulo substituído por uma “espátula” de material plástico,

conforme mostra a Figura 3.

Figura 3 – Vista geral dos animais durante treinamento em

Esteira ergométrica REBOOK TR2

PREMIERRUN TREADMILL

, com estímulo da

espátula (A).

4.8 Processamento do Nervo

Após 30 dias da lesão nervosa, os animais de todos os grupos foram

anestesiados conforme citado anteriormente e tiveram o nervo isquiático

esquerdo exposto e fixado in situ à 4ºC, durante 10 minutos, com fixador de

Karnovsky (1965) modificado, contendo 1% de paraformaldeído e 2% de

glutaraldeído em tampão cacodilato de sódio a 0,1M, pH 7.3.

Em seguida, a porção distal do nervo isquiático foi retirada e os animais

foram eutanasiados por deslocamento cervical. Os fragmentos do nervo foram

mantidos em solução fixadora (Karnovsky) por 24h e pós-fixados em tetróxido de

ósmio a 1% em tampão cacodilato de sódio 0,1M, pH 7.3, por duas horas,

imersos em uranila 5% durante 24h, para coloração em bloco, desidratados em

soluções crescentes (30% a 100%) de acetona e incluídos em resina Araldite

(UEGAMA).

Foram obtidos cortes transversais de 1µm da porção distal do nervo

com navalha de vidro, em ultramicrótomo LKB, que foram corados com azul de

toluidina a 1%, em solução aquosa de bórax a 1%, para microscopia óptica

(Reynolds, 1963 apud Teodori, 2000).

4.9 Análise Morfométrica

As lâminas histológicas foram observadas em microscópio de luz

(modelo ZEISS, Standard 25) acoplado a um sistema analisador de imagens que

utiliza o software IMAGE PRÓ-PLUS – 4.0 MEDIA CYBERNETICS

A calibração do sistema de análise de imagens para obtenção de

medidas na unidade de micrômetros (µm) foi realizada com o auxilio de uma

lâmina micrometrada (ZEISS 5

+ 100/100

mm).

Analisou-se um corte por nervo de cada animal, do qual foram obtidas

imagens em objetiva de 10X, para determinação da área do nervo e em objetiva

de 100X, para seleção dos campos da amostra (5 campos aleatoriamente

definidos em cada corte), sendo analisadas aproximadamente 400 fibras nervosas

mielinizadas.

Em seguida, a imagem de cada campo foi captada pelo sistema e

visualizada on line no display, para realizar a normalização e congelamento da

imagem, para se obter o número de axônios, diâmetro da fibra e do axônio.

As medidas foram realizadas de forma semi-automática, sendo que em

cada fibra nervosa mielinizada foram obtidos valores (em micrômetros) do

diâmetro do axônio e da fibra nervosa. Os valores da espessura da bainha de

mielina e da razão G foram calculados a partir dos dados do diâmetro do axônio e

diâmetro da fibra nervosa.

Considerando que as imagens foram obtidas em câmera de vídeo JVC

modelo TK-C620U e em câmera digital OLYMPUS – C-5050, 5.0 megapixels, com

resolução de 2560 x 1920 dpi, acoplada a fotomicroscópio OLYMPUS BX 4.1,

utilizou-se um fator de correção para calibração do software analisador de

imagens. Esse fator de correção foi obtido circulando-se os diâmetros internos e

externos dos mesmos axônios em imagens obtidas nas duas câmeras:

Diâmetro externo obtido em imagem da câmera JVC = x µm

Diâmetro externo obtido em imagem da câmera OLYMPUS = y µm

Fator de correção = x µm = Z

y µm

Em seguida, utilizando o programa Excel, o fator de correção (z) foi

aplicado a cada valor obtido para o número de axônios.

A seguir, o diâmetro médio dos axônios de cada animal foi obtido a

partir da somatória dos diâmetros dos axônios, dividido pelo número de axônios

mensurados. O cálculo do diâmetro da fibra seguiu a mesma lógica.

Os valores de espessura das bainhas de mielina foram obtidos

subtraindo-se o diâmetro do axônio do diâmetro da fibra e, em seguida, dividindo-

se por dois. Já o valor da razão G foi calculado pela divisão do diâmetro do axônio

pelo diâmetro da fibra nervosa.

A espessura média das fibras também foi obtida dividindo-se a

somatória das espessuras das bainhas de mielina pelo número de fibras nervosas

analisadas.

4.10 Analise Quantitativa

4.10.1 Número de Axônios

O número total de axônios em cada nervo foi calculado a partir da

somatória do número de axônios obtidos em 5 campos, em objetiva de 100X.

Para isso, foi estabelecida a proporção entre a área da amostra e a área total do

nervo, obtida em objetiva de 10X. As fórmulas a seguir demonstram como foram

calculados a porcentagem da amostra e o número total de axônios em cada

nervo, respectivamente:

% amostra: Σ área dos campos x 100 = 5%

Σ área do nervo

Número total de axônios: Σ número axônios x 100

% amostra

4.11 Análise Funcional da Marcha

As impressões das pegadas dos ratos para realizar o Índice Funcional

do Ciático (IFC) foram feitas de acordo com De Medinacelli, Freed e Wyatt (1982).

Para isso, foi construída uma passarela (8,2 x 42 cm) com um abrigo escuro na

extremidade (Figura 4). Considerando a tendência dos ratos em se direcionar

para locais com menor luminosidade, quando colocados no início da passarela,

percorrem seu trajeto até a caixa escura.

Após treino inicial, os animais foram colocados para caminhar na

passarela revestida com papel sulfite, com as patas posteriores marcadas com

tinta de impressão digital, a fim de realizar o registro das impressões plantares

das patas normal e experimental.

Figura 4 - Instrumento utilizado para obten-

ção das impressões plantares re-

ferentes ao IFC. Pegadas do ani-

mal (seta).

Em seguida, foram obtidas as distâncias descritas a seguir, conforme

mostra a Figura 5.

1. Entre a extremidade do terceiro dedo e o calcâneo - Comprimento

da pegada (PL);

2. Entre o primeiro e o quinto dedo - Largura da pegada (TS);

3. Entre o segundo e quarto dedo - Largura intermediária da pegada

(ITS).

42 cm

8,2 cm

Figura 5 - Parâmetros de medidas de comprimento para o cál-

culo do Índice Funcional do Ciático (IFC). Fonte: Va-

rejão et al. (2004).

As medidas foram tomadas das patas experimental (E) e normal (N),

por meio de um paquímetro digital da marca MITUTOYO

. Os valores obtidos

foram aplicados na equação proposta por Bain, Mackinnon e Hunter (1989), antes

(pré-operatório) e após o 7º, 14º, 21º e 28º dias da cirurgia de esmagamento do

nervo isquiático.

Os resultados obtidos dessa equação expressam a perda funcional em

termos percentuais, sendo que o valor 0 (zero) representa a função normal ou

ausência de disfunção e o valor -100 (menos cem) representa a perda total da

função nervosa. Portanto, quanto mais próximo de 0 (zero) o valor obtido, melhor

a função.

4.12 Análise Estatística

A análise de distribuição dos dados de todas as variáveis estudadas

nas diferentes condições mostrou distribuição normal, utilizando-se o teste

Shapiro-Wilk. Testes estatísticos paramétricos foram escolhidos para comparação

dos dados.

Para análise morfométrica foi realizado o teste Anova - F (One-Way)

seguido de Tukey e, para análise funcional da marcha, o teste Anova - F (Two-

Way) foi realizado para avaliar cada grupo, nos diferentes períodos de avaliação

(comparação intragrupos) e o teste Anova F (One-Way) seguido de Tukey, para

comparar os grupos entre si (comparação intergrupos). Utilizou-se o teste de

correlação de Pearson para análise dos dados morfométricos e funcionais.

O nível de significância estabelecido em todos os testes estatísticos foi

de 5%, sendo todos os procedimentos realizados a partir do aplicativo “BioEstat

4.0” e o “SPSS 11.0”. Os valores foram expressos em média e desvio padrão.

5 RESULTADOS

5.1 Esmagamento do Nervo Isquiático

Em estudo piloto realizado no Laboratório de Pesquisa em Plasticidade

Neuromuscular do Programa de Pós-graduação em Fisioterapia da Universidade

Metodista de Piracicaba (UNIMEP), 5 animais desnervados foram sacrificados

após 6 dias da lesão, com a finalidade de comprovar a eficácia do protocolo

utilizado para produzir lesão nervosa do tipo axoniotmese.

Todos os animais apresentaram intenso processo de degeneração

axonal, com evidente retração e desintegração das bainhas de mielina (Figura 6).

Figura 6 – Fotomicrografia de corte transversal do nervo isquiático: A- nervo normal; B-

após 6 dias da lesão por esmagamento, observando-se degeneração axonal

com retração e desintegração da bainha de mielina (seta). Barra = 10 µm.

Coloração: Azul de Toluidina.

5.2 Análise Histológica

Na figura 7 expressam-se as características histológicas entre os

grupos experimentais: CON, D, DGE e DEG.

No grupo CON (Figura 7A) foram observados axônios de diferentes

tamanhos, enquanto no grupo D (Figura 7B) observou-se aumento do número de

axônios e diminuição do diâmetro das fibras.

Nos grupos DEG (Figura 7C) e DGE (Figura 7D), também se observam

axônios com diâmetros variados e reduzidos, havendo aparentemente maior

número de fibras com menor calibre e bainhas de mielina mais delgadas, quando

comparado ao grupo controle. Axônios degenerados e macrófagos são

observados nos grupos desnervados.

Figura 7 - Fotomicrografia de corte transversal do nervo isquiático: Controle (A);

Desnervado (B); Desnervado + Exercício + Gaiola (C); Desnervado +

Gaiola + Exercício (D). Observar axônios em degeneração (cabeça de

seta) e macrófagos (seta). Barra = 10 µm. Coloração: Azul de Toluidina.

5.3 Análise Quantitativa

5.3.1 Número de Axônios

A figura 8 expressa o número de axônios nos diferentes grupos

estudados. Esse número foi maior nos grupos D (21345 ±2372), DEG (18591

±2305), DGE (18436 ±2520) que no grupo CON (11976 ±1439) (p<0,05).

Figura 8 - Número de axônios nos grupos: Controle (CON), Desnervado (D),

Desnervado + Exercício + Gaiola (DEG) e Desnervado + Gaiola +

Exercício (DGE). (*) Difere do grupo CON (p<0,05).

5.4 Análise Morfométrica

5.4.1 Diâmetro dos Axônios

O diâmetro dos axônios nos grupos desnervados: D (3,60 ±0,23), DEG

(3,77 ±0,18) e DGE (4,18 ±0,36) foi sempre menor que no grupo CON (5,62

±0,19) (p<0,01). No grupo DGE o diâmetro dos axônios foi maior que no grupo D

(p<0,05).

Figura 9 - Diâmetro dos axônios nos grupos: Controle (CON), Desnervado (D),

Desnervado + Exercício + Gaiola (DEG) e Desnervado + Gaiola +

Exercício (DGE). (*) Difere do grupo CON (p<0,01); (**) Difere do grupo D

(p<0,05).

5.4.2 Diâmetro das Fibras

A figura 10 expressa o diâmetro das fibras nervosas, nos diferentes

grupos. Observa-se que os valores dos grupos desnervados: D (5,80 ±0,30), DEG

(6,06 ±0,41) e DGE (6,55 ±0,76) foram menores que os do grupo CON (9,12

±0,33) (p<0,01), não havendo diferença entre os grupos desnervados.

Figura 10 - Diâmetro das fibras nervosas nos grupos: Controle (CON), Desnervado

(D), Desnervado + Exercício + Gaiola (DEG) e Desnervado + Gaiola +

Exercício (DGE). (*) Difere do grupo CON (p<0,01).

5.4.3 Espessura das Bainhas de Mielina

A figura 11 representa a espessura das bainhas de mielina, nos

diferentes grupos. Observa-se que os valores dos grupos desnervados: D (1,10

±0,05), DEG (1,14 ±0,12) e DGE (1,18 ±0,20) foram menores que os do grupo

CON (1,75 ±0,16) (p<0,01), não havendo diferença entre os grupos desnervados.

Figura 11 - Espessura da bainha de mielina nos grupos: Controle (CON),

Desnervado (D), Desnervado + Exercício + Gaiola (DEG) e

Desnervado + Gaiola + Exercício (DGE). (*) Difere do grupo CON

(p<0,01).

5.4.4 Razão G

A Tabela 1 expressa os valores da razão G. Os resultados foram

semelhantes em todos os grupos estudados (p>0,05).

Tabela 1 - Razão G nos grupos Controle (CON), Desnervado (D), Desnervado +

Exercício + Gaiola (DEG) e Desnervado + Gaiola + Exercício (DGE).

Grupos CON D DEG DGE

Média ±DP 0,61 ±0,02 0,62 ±0,01

0,62 ±0,01 0,64 ±0,01

5.5 Análise Funcional da Marcha

Os dados da análise do IFC dos grupos experimentais durante os

períodos de avaliação funcional estão descritos na Tabela 2.

Tabela 2 – Valores do IFC nos diferentes períodos de avaliação funcional.

Tempo D DEG DGE

Pré-operatório

-16,18 ±14,24 -6,44 ±9,46 -8,06 ±9,30

7º dia

-77,62 ±25,17 -80,62 ±11,61 -92,84 ±20,94

14º dia

-78,00 ±13,66 -70,62 ±7,95 -64,93 ±24,38

21º dia

-20,20 ±15,57 -17,01 ±11,85 -9,91 ±18,18

28º dia

-14,66 ±8,70 -5,60 ±21,21 -16,47 ±16,25

Nas comparações intergrupos dos valores do IFC nos diferentes

períodos de avaliação (Figura 12), verifica-se que as diferenças não foram

estatisticamente significativas (p>0,05).

Figura 12 – Comparação intergrupos dos valores de IFC nos grupos: Desnervado

(D), Desnervado + Exercício + Gaiola (DEG) e Desnervado + Gaiola +

Exercício (DGE), nos diferentes períodos de avaliação

Nas comparações intragrupos dos valores do IFC nos diferentes

períodos de avaliação (Figura 13), verifica-se que as diferenças foram

estatisticamente significantes (p<0,05).

Para todos os grupos experimentais foram observados que o 7º e o 14º

dia diferem significativamente do período pré-operatório, enquanto o 21º e o 28º

dia diferem significativamente do 7º e do 14º dia durante os períodos de avaliação

funcional.

Figura 13 – Comparação intragrupos dos valores de IFC nos grupos: Desnervado (D),

Desnervado + Exercício + Gaiola (DEG) e Desnervado + Gaiola +

Exercício (DGE), nos diferentes períodos de avaliação

. (

*) em relação ao

pré-operatório; (**) em relação ao 7º dia e 14º dia (p<0,05).

Na análise das pegadas das patas normal (N) e experimental (E),

percebe-se uma evolução semelhante em todos os grupos durante os diferentes

períodos de avaliação por meio do IFC.

Na comparação dos registros das pegadas no pré-operatório com o 7º

dia pós-lesão (Figura 14), verifica-se um aumento do parâmetro PL e uma

diminuição dos parâmetros TS e ITS.

Figura 14 - Registro das pegadas das patas normal e

experimental na avaliação do IFC nos períodos

pré-operatório (A) e no 7º dia pós-lesão (B).

Na comparação do registro das pegadas no pré-operatório com o 28º

dia pós-lesão (Figura 15), percebe-se que as pegadas são semelhantes nos

diferentes períodos de avaliação.

Figura 15 - Registro das pegadas das patas normal e

experimental na avaliação do IFC nos períodos

pré-operatório (A) e no 28º dia pós-lesão (B).

5.6 Correlação entre os Dados Morfométricos e o Índice Funcional do

Ciático (IFC)

Na tabela 3 estão expressos os valores de correlação entre os dados

morfométricos e funcionais do grupo Desnervado (D).

A correlação entre os valores de diâmetro do axônio e da fibra nervosa

mostrou-se forte, com r= 0,93.

Tabela 3 - Correlações entre os dados morfométricos e o Índice Funcional do Ciático

(IFC) do grupo Desnervado (D).

N°. Axônio

∅

∅∅

∅

Axônio

∅

∅∅

∅ Fibra

Esp. Mielina Razão G IFC-28º

N°Axônios

∅

∅∅

∅ Axônio

-0,17 1

∅

∅∅

∅ Fibra

-0,36

0,93

Esp.Mielina

-0,56 0,42 0,72

Razão G

-0,30 -0,63 0,31 -0,44 1

IFC-28º

-0,61 -0,51 -0,47 -0,19 -0,33 1

Nº = número;

∅

∅∅

∅

= diâmetro; Esp. = espessura; IFC-28º

= Índice Funcional do Ciático no

28º dia. * p<0.05

Na tabela 4 estão expressos os valores de correlação entre os dados

morfométricos e funcionais do grupo Desnervado + Exercício + Gaiola (DEG).

A correlação entre os valores do diâmetro do axônio e da fibra nervosa

(r= 0,92), diâmetro da fibra nervosa e espessura da bainha de mielina (r=0,96),

razão G e espessura da bainha de mielina (r=-0,93) mostrou-se forte.

Tabela 4 - Correlações entre os dados morfométricos e o Índice Funcional do Ciático

(IFC) do grupo Desnervado + Exercício + Gaiola (DEG).

N°. Axônios

∅

∅∅

∅ Axônio ∅

∅∅

∅ Fibra

Esp. Mielina

Razão G IFC-28º

N°. Axônios

∅

∅∅

∅ Axônio

-0,58 1

∅

∅∅

∅ Fibra

-0,53

0,92

Esp. Mielina

-0,44 0,76

0,96

Razão G

-0,25 -0,46 -0,77

-0,93

IFC-28º

0,49 0,16 -0,01 -0,14 0,26 1

Nº = número;

∅

∅∅

∅

= diâmetro; Esp. = espessura; IFC-28º

= Índice Funcional do Ciático no

pré-operatório 28º dia. * p<0,05.

Na tabela 5 estão expressos os valores de correlação entre os dados

morfométricos e funcionais do grupo Desnervado + Gaiola + Exercício (DGE).

A correlação entre os valores do diâmetro do axônio com o diâmetro da

fibra nervosa (r= 0,99) e com a espessura da bainha de mielina (r=0,96); diâmetro

da fibra nervosa com a espessura da bainha de mielina (r=0,99) e com a razão G

(r=-0,91), e entre a espessura da bainha de mielina e a razão G (r=0,96), mostrou-

se forte.

Tabela 5 - Correlações entre os dados morfométricos e o Índice Funcional do Ciático

(IFC) do grupo Desnervado + Gaiola + Exercício (DGE).

N°. Axônios

∅

∅∅

∅ Axônio

∅

∅∅

∅ Fibra

Esp. Mielina

Razão G IFC-28º

N°. Axônios

∅

∅∅

∅ Axônio

-0,80 1

∅

∅∅

∅ Fibra

-0,75

0,99

Esp. Mielina

-0,70

0,96

0,99

Razão G

0,57 -0,84

-0,91

-0,96

IFC-28º

-0,27 0,11 -0,04 -0,16 0,44 1

Nº = número;

∅

∅∅

∅

= diâmetro; Esp. = espessura; IFC-28º

= Índice Funcional do Ciático no

pré-operatório 28º dia. * p<0,05.

6 DISCUSSÃO

6.1 Considerações Gerais sobre o Material e Métodos

6.1.1 Animais Experimentais

Para realização desta pesquisa, o animal adotado foi o rato da

linhagem Wistar, uma vez que a maior parte das pesquisas experimentais, quase

90% do total, emprega animais de pequeno porte (camundongo, rato, hamster)

(Schanaider e Silva, 2004) por serem animais de baixo custo, de fácil manuseio e

disponibilidade, e que apresentam anatomia microscópica semelhante à de

nervos humanos (Varejão et al., 2003; 2004; Mazzer et al., 2006; Pachioni et al.,

2006). Além disso, o fato de o nervo isquiático ser de fácil acesso cirúrgico

favorece a escolha desse animal para pesquisas que analisam as conseqüências

da desnervação (Varejão et al., 2004; Seo et al., 2006).

Para padronização da amostra, utilizou-se ratos do gênero masculino

com idade entre 6 e 7 semanas. Ratos do gênero feminino foram excluídos do

estudo por apresentarem ciclo estral que pode afetar o comportamento motor

(alteração da intensidade da ambulação) e, conseqüentemente, influenciar os

resultados da pesquisa (Junior e Morato, 2002).

Em relação à idade dos animais, foram utilizados ratos jovens,

considerando que a regeneração nervosa declina com o avanço da idade (Verdú

et al., 2000).

6.1.2 Modelo de Lesão Nervosa

O anestésico utilizado para sedação dos animais (mistura de Ketalar

Rompum

- i.m.) é indicado para animais de pequeno porte, por mantê-los em

plano anestésico durante aproximadamente 40 a 60 minutos, evitando o risco de

vida (Schanaider e Silva, 2004). Esse tempo é suficiente para a realização da

lesão nervosa experimental.

A lesão do tipo axoniotmese foi escolhida por ser uma modalidade útil e

reprodutível para o estudo da regeneração nervosa periférica, onde a agressão ao

nervo é suficiente para causar degeneração Walleriana na porção distal e permitir

regeneração nervosa, devido à preservação dos envoltórios conjuntivos, da

membrana basal e da microcirculação local (Lunn, Brown e Perry, 1990).

Além disso, os resultados obtidos por Bridge et al. (1994), que

avaliaram e compararam os efeitos de vários métodos de lesão por esmagamento

em ratos, usando fórceps de joalheiro e pinça hemostática com tempos de

compressão variando de 15 a 30 segundos, demonstraram a presença de

degeneração Walleriana após 2 semanas, em todos os grupos experimentais, não

havendo diferença histológica no nervo nos diferentes métodos empregados.

Neste estudo, para investigar a eficácia do protocolo de esmagamento

proposto sobre a estrutura do nervo, um estudo piloto foi desenvolvido em nosso

laboratório, utilizando cinco animais que foram desnervados e sacrificados após 6

dias, quando o processo de degeneração Walleriana deveria ser evidente.

Observou-se intensa degeneração axonal e desintegração da bainha de mielina, o

que ratifica a eficiência do protocolo de lesão utilizado.

Entretanto, a reprodutibilidade do protocolo de indução da lesão

nervosa utilizado neste estudo é bastante discutida na literatura, uma vez que não

existe um método padrão estabelecido para induzir determinada lesão nervosa,

considerando que cada pesquisa utiliza uma técnica diferente (Mazzer et al.,

2006).

6.1.3 Protocolo de Exercício

A literatura é escassa no que se refere à discussão dos efeitos do

exercício físico na fase imediata da lesão nervosa (Seo et al., 2006). Desta forma,

este estudo pode contribuir para subsidiar discussões sobre a conduta

empregada na clínica fisioterapêutica.

A atividade física promove várias alterações fisiológicas, morfológicas e

bioquímicas no homem e no animal (Gutmann e Jakoubeck, 1963; Herbison,

Jaweed e Ditunno, 1974; 1980a; 1980b; Hie, Van Nie, Vermculen-Van der Zee,

1982; Van Meeteren et al., 1997; Byun et al., 2005), além de induzir alterações

permanentes, tanto no sistema nervoso central como no periférico (Seo et al.,

2006). Nesse sentido, o exercício na esteira é um recurso utilizado para estudar a

regeneração axonal (Herbison, Jaweed e Ditunno, 1980; Hie, Van Nie e

Vermculen-Van der Zee, 1982; Van Meeteren et al., 1997; Byun et al., 2005), por

ser possível controlar devidamente seus parâmetros (Seo et al., 2006).

Realizou-se uma seleção dos ratos mais aptos para participar do

estudo, sendo escolhidos aqueles que correram de cinco a dez minutos em

velocidade de 17 m/min, com inclinação de 0%, durante uma semana,

considerando que o rato não nasce com habilidade de correr, como ocorre com a

de nadar (Pills et al., 1993; Gobatto et al., 2001; Machado et al., 2005). A opção

pela velocidade de 17 m/min, deveu-se ao fato de que tal velocidade é a de

equilíbrio entre a produção e remoção do lactato para ratos normais em esteira

ergométrica (Pills et al., 1993).

A breve adaptação à esteira teve por objetivo familiarizar os animais ao

futuro protocolo de exercício, reduzindo o estresse, contudo, sem promover

adaptações físicas (Jaweed, Herbison e Ditunno, 1975; Herbison, Jaweed e

Ditunno, 1982).

Neste estudo utilizou-se o exercício na esteira durante 30 minutos/dia,

na velocidade de 8 m/min e inclinação de 0%, por se tratar de animais

desnervados e com base nos resultados de Byun et al. (2005), em que essa

intensidade permitiu efetiva recuperação funcional após a desnervação. A

frequência de estimulação de cinco vezes por semana foi baseada no estudo de

Sakakima et al. (2004), que aplicaram exercício físico na esteira de três a seis

vezes por semana e observaram benefícios ao trofismo muscular.

A afirmação de Seo et al. (2006) de que os valores baixos de

velocidade e inclinação de 0% proporcionam regeneração axonal em animais

desnervados também serviu de fundamentação para este estudo. No entanto, a

intensidade utilizada no presente estudo não está fundamentada no limiar de

anaerobiose, uma vez que não existem dados na literatura para ratos

desnervados.

A escolha do tempo para análise morfométrica e funcional do nervo

isquiático após lesão se fundamentou nos achados de Carmignoto et al. (1983) e

Gorio et al. (1983), que estudaram o processo de reinervação muscular após

axoniotmese em ratos e observaram que após 10 dias da lesão, nenhum axônio

havia estabelecido contato com o músculo, o que ocorria a partir da segunda

semana da lesão, quando se observou que 25% das fibras musculares estavam

re-inervadas por mais de um axônio (poliinervação). Entre 21º e 25º dias ocorreu

o “pico” de poliinervação, que foi seguida pelo processo de eliminação dos

contatos sinápticos (eliminação sináptica). Aos 60 dias da lesão, as fibras

estavam monoinervadas e, a partir daí, o nervo mantinha o crescimento e

ocupava completamente a fenda pós-sináptica no 90º dia. Assim, considerando

que a partir do 14º dia após a axoniotmese os axônios regenerados estariam

recuperando seus contatos com as fibras musculares, optou-se por verificar se o

exercício aplicado previamente a esse momento (na fase imediata de

regeneração) ou após este período (fase tardia de regeneração) poderia modificar

a evolução desse processo.

Quanto ao início de atividade física, houve um grupo que realizou

exercício na fase de desnervação (imediata) e outro na fase de reinervação

(tardia), uma vez que os efeitos do exercício variam de acordo com o momento de

sua realização. De acordo com a literatura, os resultados podem ser benéficos,

havendo aumento do retorno da função sensório-motora na fase inicial da

recuperação da lesão quando o exercício é realizado na fase precoce (Van

Meteeren et al., 1997); deletérios, havendo inibição do brotamento axonal quando

a atividade física é realizada imediatamente após a desnervação do músculo tibial

anterior (Tam et al, 2001; Tam e Gordon, 2003); ou indiferentes, não havendo

interferência sobre a reinervação muscular quando o exercício é realizado na fase

tardia (Hie, Van Nie e Vermculen-Van der Zee, 1982).

Os estudos realizados por Herbison, Jaweed e Ditunno (1982) e Van

Meeteren et al. (1997), que avaliaram os efeitos do exercício aplicado 2 semanas

e 24 horas após a axoniotmese, respectivamente, fundamentam os períodos de

análise escolhidos para esta pesquisa.

6.1.4 Regeneração axonal e Análise morfométrica

Diversos estudos experimentais mostram que o exercício físico tem

ação estimulante para a regeneração nervosa (Herbison, Jaweed e Ditunno,

1974; 1980a; 1980b; Hie, Van Nie, Vermculen-Van der Zee, 1982; Van Meteeren

et al., 1997; Byun et al., 2005; Seo et al., 2006). No entanto, ainda não há

consenso sobre o melhor momento para iniciar a prática dessa atividade após

axoniotmese.

A hipótese para este estudo era que o exercício praticado a partir de 24

horas da lesão nervosa inibisse a regeneração nervosa, pois o aumento da

atividade neuromuscular inibe a liberação de fatores neurotróficos, como a

molécula de adesão celular neural (NCAM), necessária para que ocorra a

regeneração (Tam et al, 2001; Lieber, 2002; Tam e Gordon, 2003).

Entretanto, observou-se que a realização do exercício, tanto na fase

imediata quanto tardia, não influenciou o brotamento axonal, fato que se evidencia

pela semelhança no número de axônios regenerados nos três grupos

desnervados, onde o número de axônios praticamente duplicou após 30 dias da

lesão. Esse aumento do número de axônios na porção distal à lesão se deve ao

fato de que cada axônio lesado emite dois ou três brotos em direção ao músculo,

sendo que o primeiro a fazer contato com a fibra muscular permanece, enquanto

os demais sofrem degeneração (Fawcett e Keynes, 1990).

Sob a ótica da prática clínica, esse resultado sugere que a indução do

exercício físico após desnervação, com objetivo de retardar as alterações tróficas

no músculo, poderia não prejudicar o processo de regeneração nervosa.

Entretanto, há relatos de que o aumento da atividade neuromuscular

provocado pelo exercício de corrida na roda durante 8 horas diárias, na fase

aguda da lesão, inibe o brotamento axonal no músculo desnervado (Tam et al.

2001; Tam e Gordon, 2003). É possível que o prejuízo à reinervação se deva ao

tempo do exercício realizado.

No que se refere à maturação das fibras regeneradas, Verdú et al.

(2000) afirmam que esta dificilmente atinge valores semelhantes aos do controle

após a lesão nervosa. Os autores relataram que o diâmetro da fibra atinge 75%

dos valores controle após a lesão.

Neste estudo, o diâmetro da fibra do grupo D atingiu 63,59% dos

valores controle, enquanto no grupo DGE esse valor atingiu 71,82% e no grupo

DEG, 66,44%. Entretanto, vale ressaltar que essa análise foi obtida após 33 dias

da lesão. Uma análise após períodos mais prolongados poderia expressar valores

mais próximos aos relatados na literatura.

O diâmetro médio das fibras em nervo normal varia entre 8 (Calder e

Green, 1995) e 12,45 µm (Teodori, 2000) sendo que para os axônios esse valor

varia entre 4,52 (Lenihan et al, 1998) e 7,83 µm (Teodori, 2000). Para a

espessura das bainhas de mielina, os valores médios variam entre 1,11 (Santo

Neto et al., 2004) e 1,94 (Souza, 2005).

Nos grupos desnervados, a atividade física em esteira na fase imediata

ou tardia da lesão não influenciou o grau de maturação das fibras regeneradas

após 33 dias da lesão, uma vez que apenas o diâmetro de axônio do grupo DGE

foi maior que do grupo D, enquanto os demais parâmetros analisados não

diferiram entre os grupos desnervados.

A ausência de dados morfométricos referentes a nervos de ratos

desnervados submetidos a exercício em esteira, em qualquer fase da

regeneração nervosa após axoniotmese, impossibilitou a confrontação dos

resultados obtidos neste estudo. Uma vez que a regeneração nervosa influencia a

resposta muscular, discute-se a seguir alguns efeitos do exercício físico no

músculo desnervado, tanto na fase imediata como na tardia.

Deschenes, Maresh e Kraemer (1997) citam que a prática de exercício

na esteira com um grupo de animais sedentários e outro de animais exercitados

(velocidade de 24 m/min e inclinação de 0%) durante cinco dias/semana por um

mês e meio na fase tardia, não foi suficiente para alterar os efeitos da

desnervação sobre o músculo, não havendo diferença significativa no tipo e no

tamanho da fibra muscular entre os grupos. Concluíram que o exercício de

moderada intensidade com esses parâmetros da esteira não influência a

morfologia muscular no animal desnervado.

Herbison, Jaweed e Ditunno (1974, 1980a, 1980b) e Hie, Van Nie e

Vermculen-Van der Zee (1982) afirmaram que a pausa de duas semanas na

gaiola após a lesão nervosa é necessária para realizar o exercício físico de forma

segura, uma vez que antes desse período (fase de desnervação) não há uma

quantidade suficiente de unidades contráteis para serem recrutadas, o que pode

gerar danos musculares, pois o processo de reinervação começa entre a segunda

e a terceira semana. Além disso, a alta intensidade do exercício durante o

processo da desnervação gera lesão muscular por ocasionar estresse no animal.

Contrariamente, Marqueste et al. (2004), afirmaram que o protocolo de

exercício na esteira com velocidade de 10 m/min e inclinação de 0% após uma

semana da secção do nervo fibular, proporciona aumento da resistência à fadiga,

recuperação das propriedades contráteis e da mecanosensibilidade do músculo,

devido a combinação de baixos parâmetros da esteira com início precoce do

exercício.

Ao analisar esses relatos, pode-se considerar que os efeitos gerados

pela atividade física após lesão nervosa periférica dependem do momento do

início da atividade física, bem como dos parâmetros da esteira, havendo ainda

controvérsia entre os diferentes estudos.

Os valores de razão G, semelhantes em todos os grupos, estão dentro

dos padrões de normalidade para uma velocidade de condução nervosa ideal, ou

seja, entre 0,5 e 0,7 (Waxmann e Bennet, 1972; Anssellin, Fink e Davey, 1997),

reforçando o fato de que a prática de exercício em esteira, tanto na fase imediata

como tardia, não prejudicou a maturação dos axônios regenerados. Valores G

acima ou abaixo dessa faixa de normalidade representam hipomielinização ou

hipermielinização, respectivamente (Anssellin, Fink e Davey, 1997).

Os valores de razão G observados neste estudo são semelhantes aos

encontrados por Santo Neto et al. (2004), que observaram 0,63 para o controle,

0,73 para o grupo onde o nervo isquiático foi lesado e um implante de músculo

tibial anterior tratado com cloridrato de lidocaína 2% foi suturado entre os cotos

após 15 minutos e 0,72 quando um enxerto muscular tratado da mesma forma foi

implantado após 24 horas.

Mazzer et al. (2006), que relataram 0,53 para o controle e 0,42 para os

animais submetidos à compressão do nervo isquiático com carga de 500 gramas.

Wolthers et al. (2005) obtiveram valor de razão G de 0,49 para o

controle e 0,54 para os animais desnervados após axoniotmese.

Ao considerar os benefícios do exercício físico para o animal

desnervado, como o aumento do número e do diâmetro dos axônios (Gutmann e

Jakoubeck, 1963), elevação do peso e da força muscular (Hie, Van Nie e

Vermculen-Van der Zee, 1982), aumento da capacidade oxidativa do músculo

(Herbison, Jaweed e Ditunno, 1982), rápido retorno da função sensório-motora na

fase inicial e tardia, acelerando a recuperação funcional (Van Meeteren et al.,

1997), aumento da mielinização das fibras (Seo et al., 2006), entre outros,

reafirma-se a importância de investigar e discutir a prática clínica, uma vez que a

indução de atividade neuromuscular (a partir do protocolo de exercício

empregado) em músculos desnervados não prejudicou o processo de

regeneração axonal. Desta forma, seus benefícios ao músculo poderiam

sustentar sua aplicabilidade, especialmente no sentido de retardar atrofia, o que

poderia refletir diretamente em recuperação funcional mais efetiva após a

regeneração nervosa.

O protocolo de exercício em esteira aplicado neste estudo, na fase

imediata ou tardia da regeneração nervosa, não influenciou o brotamento axonal

nem a maturação das fibras regeneradas. Considerando que a desnervação

provoca profundas alterações no músculo (Deschenes, Maresh e Kraemer, 1997),

é razoável a afirmação de Van Meeteren et al. (1997), Byun et al. (2005) e Seo et

al. (2006), de que a realização do exercício físico na fase imediata após a lesão

nervosa é a melhor opção.

Entretanto, ao considerar a possibilidade de ampla variação dos

parâmetros empregados, como velocidade e inclinação da esteira, além da

duração e freqüência do exercício, novos estudos são necessários para investigar

as respostas do sistema nervoso periférico e associá-las à condição clínica.

6.1.5 Correlação entre os Resultados Morfométricos e Funcionais

A eletrofisiologia, a histomorfometria e os testes funcionais têm sido

bastante utilizados para quantificar a regeneração nervosa em estudos

experimentais. Assim, vários autores analisam a correlação entre essas

mensurações (Kanaya, Firrell e Breidenbach, 1996; Munro et al., 1998; Wolthers

et al., 2005).

A correlação entre os aspectos morfológicos e funcionais de nervos

regenerados representa importância clínica, pois possibilita a análise de

resultados de diferentes formas de intervenção que podem favorecer a

regeneração nervosa e, conseqüentemente, a recuperação funcional. Entretanto,

no presente estudo não foi possível evidenciar clara correlação entre os dados

morfométricos e a recuperação funcional, avaliada por meio do IFC.

A ausência de correlação entre os resultados fisiológicos, morfológicos

e funcionais pode ser devida ao fato de que cada avaliação mensura aspectos

diferentes da regeneração nervosa (Kanaya, Firrell e Breidenbach, 1996; Munro et

al. 1998). Além disso, Kanaya, Firrell e Breidenbach (1996) citaram três hipóteses

para essa pobre correlação: (1) o IFC mensura a função total do nervo; (2) as

demais mensurações consideram vários parâmetros (como diâmetro do axônio,

diâmetro da fibra, espessura da bainha de mielina, entre outras), não sendo

possível relacionar com apenas um parâmetro do IFC; (3) a avaliação de um

único parâmetro não é suficiente para mensurar a função total do nervo. Desta

forma, é importante a associação de diversos parâmetros.

Assim, um baixo grau de recuperação funcional não indica o mesmo

resultado na análise morfométrica e histológica quando se correlaciona diferentes

componentes de mensuração. Por outro lado, Varejão et al. (2001) apontam

moderada correlação entre os três parâmetros comumente utilizados para avaliar

regeneração nervosa em ratos após axoniotmese.

Dellon e Mackinnon (1989) demonstraram significativa correlação entre

os parâmetros eletrofisiológicos e morfométricos, no entanto, apontam não haver

correlação entre os parâmetros fisiológicos e os testes funcionais, como o Índice

Funcional do Ciático (IFC).

Contrariamente, Oliveira et al. (2001) afirmam que há uma clara

correlação entre os dados morfométricos e a recuperação funcional, medida pelo

Índice Funcional do Ciático (IFC), onde perceberam uma melhora da recuperação

funcional acompanhada do aumento do número e da qualidade de fibras

regeneradas.

Para Munro et al. (1998), a significativa correlação entre a função e as

demais mensurações da regeneração nervosa encontrada em alguns estudos se

deve a amostras pequenas ou à utilização de animais com nervos completamente

normais ou completamente danificados, sem prognóstico de recuperação.

Kobayashi et al. (1997) relataram que a recuperação funcional não

apresenta uma relação diretamente proporcional ao tempo em que o músculo

permaneceu desnervado, uma vez que as mudanças morfológicas no músculo

são intensas imediatamente após a lesão e mais discretas a partir do primeiro

mês, afetando a massa corporal e a recuperação funcional de ratos que tiveram o

nervo tibial anterior seccionado e reparado cirurgicamente em diferentes períodos.

Neste estudo, onde o grupo DGE iniciou o exercício quando já

apresentava alteração do trofismo muscular e o DEG iniciou antes de desenvolver

tais modificações, não foi realizada análise morfométrica do músculo reinervado.

Entretanto, o momento de início do exercício físico não influenciou a regeneração

axonal, nem os valores do IFC.

6.1.6 Análise Funcional da Marcha

O IFC apresenta algumas vantagens em relação aos métodos

tradicionais de avaliação da regeneração nervosa periférica, como a

eletrofisiologia, a histologia e a morfometria, pois além de não ser invasivo e ser

facilmente reproduzível, apresenta baixo custo e confiabilidade para avaliar o

processo de regeneração (Varejão et al., 2004), integra o sistema sensorial e o

motor (Kanaya, Firrell e Breidenbach, 1996), o que o torna fidedigno (Varejão et

al., 2001).

Dash et al. (1996) citam o IFC como importante indicador para analisar

a recuperação funcional de lesões nervosas de curta duração (5 segundos de

compressão), pois permitiu identificar uma diminuição da função na primeira

semana e um retorno gradual a partir da terceira semana.

Entretanto, por mais fidedigno que seja o método de avaliação, alguns

fatores, como a presença de autotomia, contratura em flexão, entre outros, podem

limitar a coleta da impressão da pata normal e experimental em papel sulfite ou

papel fotográfico (Dijkstra et al., 2000; Varejão et al., 2001; 2004).

Observou-se também neste estudo que os valores do IFC dos grupos

experimentais apresentaram desvio padrão alto, porém, esses valores foram

semelhantes entre os grupos e nos diferentes tempos de análise, sugerindo que

esta variação esteja relacionada às características individuais de cada animal.

Neste estudo não se observou contratura em flexão, provavelmente devido

à mobilização constante do membro desnervado durante o exercício, o que pode

influenciar positivamente a fase de regeneração (Van Meeteren et al., 1997) e ao

tipo de lesão nervosa – axoniotmese – onde a regeneração é espontânea e a

reinervação do músculo ocorre em curto período de tempo. Também não se

observou autotomia, pois esta é mais comum na neurotmese (Varejão et al.,

2001) que na axoniotmese. A ausência de autotomia também pode ser devida à

recuperação funcional bem sucedida (Dijkstra et al., 2000), conforme observado

neste estudo.

Quando se comparou a modificação nas pegadas dos animais

desnervados no pré-operatório e no 7º dia, os resultados foram semelhantes aos

relatados por Bain, Mackinnon e Hunter (1989), que demonstraram aumento do

parâmetro PL e da dorsiflexão e diminuição dos parâmetros IT e ITS,

característicos após desnervação. Esse resultado reafirma a eficácia do protocolo

de esmagamento do nervo realizado neste estudo.

Ao comparar os resultados do IFC entre os grupos desnervados,

observa-se que o exercício em esteira aplicado na fase imediata ou tardia da

regeneração nervosa após axoniotmese não influenciou o grau de recuperação

funcional. Reporta-se novamente aqui à importância da estimulação precoce de

músculos desnervados, pois além de não prejudicar a regeneração nervosa e a

recuperação funcional, conforme observado neste estudo, atua no sentido de

evitar a atrofia pós-desnervação (Marqueste et al., 2004; Tanaka, Tusubaki e

Tachno, 2005), o que pode favorecer ainda mais a recuperação da função após

regeneração nervosa.

No entanto, Byun et al., (2005) apontaram o exercício em esteira,

realizado na fase precoce da regeneração, como fator efetivo na recuperação

funcional (valores do IFC perto do zero) após esmagamento do nervo isquiático

em ratos. Provavelmente esse resultado seja devido ao momento de início da

atividade (72 horas após a lesão), uma vez que os parâmetros da esteira foram

semelhantes aos do presente estudo. Dados semelhantes foram encontrados por

Seo et al. (2006), que obtiveram resultados funcionais positivos, avaliados por

meio do IFC, ao realizar exercício em esteira na fase de desnervação (12 horas

após a lesão) com velocidade de 18 m/min e 0% de inclinação.

Ao considerar esses relatos, nota-se a importância dos parâmetros

empregados na atividade física, como velocidade e inclinação da esteira, assim

como a duração e freqüência do exercício, como fatores relevantes para alterar as

respostas do sistema nervoso periférico.

Numa comparação intragrupos dos valores do IFC, observou-se

diferença significativa entre os tempos de análise. Esses dados estão de acordo

com diversos pesquisadores que afirmam haver boa recuperação funcional no

decorrer das avaliações após esmagamento do nervo isquiático de ratos (Varejão

et al., 2001; 2003; 2004; Byun et al., 2005; Seo et al., 2006).

Os valores de IFC perto de -100 no 7º dia após a lesão demonstram as

conseqüências da desnervação, com perda completa de função. A partir do 14º

dia, houve diminuição dos valores de IFC, o que coincide com o período em que

inicia a reinervação muscular, quando 25% das junções neuromusculares estão

reinervadas (poliinervadas). Entre o 21º e o 25º dia, ocorre o pico de poliinervação

(Gorio et al., 1983), evidenciado por valores de IFC próximos de zero,

caracterizando recuperação funcional. Do 21º ao 28º dia a regeneração

prossegue, porém em ritmo mais lento até iniciar a eliminação sináptica e

consequente monoinervação (atingida aos 60 dias).

Hare et al. (1992) também observaram valores médios do IFC de ratos

perto de zero (função normal), a partir da segunda semana após esmagamento

do nervo isquiático.

Com base no estudo de Dash et al. (1996), que citam o valor médio de

0 a -20% para referir função normal no IFC, pode-se afirmar que os valores

médios obtidos no 28º dia em todos os grupos experimentais neste estudo

refletem condição funcional compatível com a de nervos normais.

Os resultados obtidos da avaliação do IFC indicam que a

funcionalidade do membro posterior de ratos após esmagamento do nervo

isquiático é alcançada, independentemente da realização do exercício na esteira

e da fase em que este é iniciado.

No entanto, apesar do IFC ser um método bem estabelecido e

fundamentado na literatura, Kanaya, Firrell e Breidenbach (1996) relatam que

apenas um teste não é suficiente para determinar a função de ratos desnervados,

mas sim uma combinação de vários testes. Desta forma, a confrontação do teste

funcional com os testes morfológico e morfométrico fornece subsídios

consistentes para sustentar a conclusão que emerge deste estudo.

7 CONCLUSÃO

Com base nos dados encontrados neste estudo, conclui-se que:

• O protocolo utilizado para aplicação de exercício em esteira,

tanto na fase imediata como tardia da regeneração nervosa

após esmagamento do nervo isquiático de ratos, não influenciou

o brotamento axonal, o grau de maturação das fibras

regeneradas, nem a funcionalidade dos músculos re-inervados.

• Os resultados do IFC apontam que não houve prejuízo à

reinervação do músculo após aplicação do protocolo de

exercício, independente do momento de início da atividade

física. Este fato sugere que na clínica fisioterapêutica, a

realização de exercício em esteira imediatamente após a lesão

nervosa periférica não prejudica a recuperação funcional.

8 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Considerando os resultados deste estudo, deve-se ressaltar que o

grupo de pesquisa pretende dar continuidade às investigações, analisando os

efeitos do exercício em esteira, aplicado tanto na fase imediata como tardia sobre

o perfil morfométrico do músculo sóleo. Esses dados poderiam sinalizar se o

protocolo de exercício aplicado neste estudo teria evitado ou atrasado a atrofia

pós-desnervação, como observado na literatura. Além disso, o grupo também tem

interesse de analisar se a realização deste inibiu ou não a liberação de fatores

neurotróficos, como a NCAM.

Outro aspecto que necessita ser estudado é a ampla variação dos

parâmetros empregados, como: a inclinação e a velocidade da esteira, a variação

do momento de início da atividade, da freqüência e da duração da atividade, uma

vez que os parâmetros utilizados neste estudo não influenciaram a maturação de

nervos regenerados, a reinervação muscular e a funcionalidade dos músculos

reinervados. É possível que a variação de um desses parâmetros possa gerar

outros efeitos que necessitam ser avaliados.

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