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SILVIA CRISTINA CUNHA DOS SANTOS
Análise da comunidade bacteriana durante a
biorremediação in situ de solo contaminado com óleo
bruto e/ou água produzida
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE MICROBIOLOGIA PROF. PAULO DE GÓES
RIO DE JANEIRO
2008
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2
SILVIA CRISTINA CUNHA DOS SANTOS
Análise da comunidade bacteriana durante a
biorremediação in situ de solo contaminado com óleo
bruto e/ou água produzida
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências (Microbiologia) do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de
Góes, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos
requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências
Biológicas (Microbiologia).
Orientadora: Professora Dra. Lucy Seldin
Co-orientador: Dr. Charles William Greer
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE MICROBIOLOGIA PROF PAULO DE GÓES
RIO DE JANEIRO
2008
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O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Genética Microbiana, do
Departamento de Microbiologia Geral, do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de
Góes, Centro de Ciências da Saúde (CCS), Universidade Federal do Rio de Janeiro,
sob a orientação da Profa. Dra. Lucy Seldin e no Laboratório de Microbiologia
Ambiental (Environmental Microbiology Group) do Instituto de Pesquisas em
Biotecnologia (Biotechnology Research Institute - BRI) do Conselho Nacional de
Pesquisas do Canadá (National Research Council Canada - NRCC) sob a co-orientação
do Dr. Charles William Greer.
4
FICHA CATALOGRÁFICA
_________________________________________________________
SANTOS, Silvia Cristina Cunha dos.
Análise da comunidade bacteriana durante a biorremediação in situ de
solo contaminado com óleo bruto e/ou água produzida/ Silvia Cristina
Cunha dos Santos. – Rio de Janeiro: UFRJ/ IMPPG, 2008.
xvi, 204 fls.: il.; 31 cm.
Tese [Doutorado em Ciências (Microbiologia)]
Universidade Federal do Rio de Janeiro/ Instituto de Microbiologia
Prof. Paulo de Góes, 2008.
Orientador: Lucy Seldin
Co-orientador: Charles William Greer
Referências Bibliográficas: fls.183-204.
1. Contaminação por petróleo. 2. água produzida. 3.
biorremediação do solo. 4. bioestimulação. 5. atenuação natural. 6.
diversidade bacteriana. 7. DGGE. 8. microarranjo de DNA. I. Seldin,
Lucy. II. UFRJ, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes,
Doutorado em Ciências (Microbiologia). III. Análise da comunidade
bacteriana durante a biorremediação in situ de solo contaminado com
óleo bruto e/ou água produzida.
5
FOLHA DE APROVAÇÃO
SILVIA CRISTINA CUNHA DOS SANTOS
Análise da comunidade bacteriana durante a biorremediação in
situ de solo contaminado com óleo bruto e/ou água produzida
Rio de Janeiro,.......de maio de 2008.
(Lucy Seldin, doutora em Ciências (Microbiologia) pela Universidade Federal do Rio
de Janeiro, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, UFRJ)
(Alexandre Soares Rosado, doutor em Ciências (Microbiologia) pela Universidade
Federal do Rio de Janeiro (1997) e Research Institute For Plant Protection,
Wageningen/Holanda, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, UFRJ)
(Magali Christe Cammarota, Doutora em Bioquímica pelo IQ/UFRJ, Escola de
Química, UFRJ)
(Selma Gomes Ferreira Leite, doutora em Ciências (Microbiologia) pela Universidade
Federal do Rio de Janeiro, Escola de Química, UFRJ)
Rosalie Reed Rodrigues Coelho, doutora em Ciências (Microbiologia) pela
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de
Góes, UFRJ (revisora)
6
Aos meus pais
7
Você não sabe o quanto eu caminhei
Pra chegar até aqui...
A Estrada (Cidade Negra)
8
"Quero, um dia, poder dizer às pessoas que nada foi em vão... que
o amor existe, que vale a pena se doar às amizades a às pessoas, que a
vida é bela sim, e que eu sempre dei o melhor de mim... e que valeu a
pena!"
Luís Fernando Veríssimo
9
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela vida e presença em todos os momentos em que busquei forças para
superar os obstáculos e desafios no decorrer dessa caminhada que chamamos vida,
A meus pais que, em toda sua humildade, sempre quiseram para mim e meus irmãos
um futuro melhor e se esforçaram muito para isso,
Aos meus irmãos Evandro e Andrea, meus sobrinhos Hipácia Caroline e Fernando
Gabryel e minha cunhada Simone, por me apoiarem, por existirem, porque são a minha
família,
Ao meu amigo, namorado e grande incentivador Marcio, pelo apoio, pela
compreensão e pelo auxílio de sempre, por me esperar pacientemente por 9 meses
enquanto eu estava no Canadá e depois por me esperar mais “um pouco” até que eu
terminasse a tese,
À eterna professora Maria Stella de Paiva Daumas e sua sobrinha e também professora
Carmem Lúcia de Paiva pela grande influência em minha formação no despertar da
pesquisadora que havia em mim,
À professora Lucy Seldin por ter pacientemente se dedicado à minha orientação do
mestrado ao doutorado e pelo grande exemplo de pesquisadora e professora (quero ser
como você quando eu crescer),
Ao Dr. Charles Greer por ter aceitado me receber em seu grupo de trabalho, por ter
me recebido com tanto carinho, pelo cuidado, pela dedicação e pelo bom-humor sempre,
A Nathalie Fortin, Sylvie Sanschagrin e Julie Champagne pela valiosa ajuda no IRB,
À Vanessa, ao Diobs e à Joana que aceitaram a minha colaboração em seus trabalhos
e compreenderam a minha ausência no encerramento dos mesmos,
Aos amigos do “062” Janaína, Renata, Vanessa, Márcia, Elisa, Diobs, Diju, Joana,
Simone Cotta, Natália, Luciano e também Irene, Natalie e Fabio pela amizade, pela troca
de experiência, pela ajuda e colaboração e às novas amigas Juliana e Simone Siqueira pela
acolhida simpática e o começo de novas amizades,
Às amigas Janaína Nascimento, Uliana Pontes e Hilana Ceotto e também Amina,
Patrícia, Andreza e Karla pelos bons momentos, pelo ombro amigo e pelos “programas de
meninas” inesquecíveis (incluindo “todas numa kit em BSB”!),
Às amigas Christine Martineau e Elisabeth Lefrançois pelos momentos inesquecíveis,
pelos piqueniques e churrascos, por me apresentarem o Quebec e por me ensinarem a
patinar no gelo,
10
Às amigas Ester, Mayra, Ana Paula e Vanice por serem amigas e por torcerem por mim
sempre,
Aos amigos do IRB Christine, Elisabeth, Charles, Dave, Nathalie, Claude (“Cou-cou
Claude”), Danielle O. (“ça marche pas”), Suzanne, Danielle B., Loui, Samah, Alberto,
Punita, Nancy Lee, Olivia, Béatrice, Céline, Marck, Hong Mei, Nancy, Diane e William pela
acolhida, pela amizade e pela colaboração com o meu trabalho,
Ao Biotechnology Research Institute (BRI) - National Research Council Canada (NRCC)
por aceitar esta colaboração no Environmental Microbiology Group onde foi realizada parte
dos experimentos deste projeto, pelo material e pelos equipamentos, pelo espaço e por
todas as facilidades oferecidas,
À Petrobras, pelo projeto, pelo apoio financeiro e pela oportunidade de trabalhar no
IRB,
À equipe da gerência de Biotecnologia e Tratamentos Ambientais (BTA) do CENPES,
em especial, à Gina, ao Ronalt e à Renata, pela colaboração e esforços na realização deste
projeto,
Ao Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes na pessoa de sua coordenadora,
Dra. Agnes Marie Sá Figueiredo, aos professores e ao pessoal técnico e administrativo pelas
facilidades oferecidas,
Às professoras Celuta, Rosalie e Eliana e ao professor Valter pelo carinho, pela
dedicação e pelo exemplo,
Ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia do Instituto de Microbiologia Prof.
Paulo de Góes, na pessoa de sua coordenadora, Dra. Thaïs Cristina Baeta Soares Souto-
Padrón, aos professores e ao pessoal técnico e administrativo pela formação e pelas
facilidades oferecidas,
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes), pela bolsa
de doutorado e pela bolsa concedida pelo Programa de Doutorado com Estágio no Exterior
(PDEE),
A todos aqueles que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste
trabalho,
A todos os amigos e amigas e aqueles chamados apenas colegas, mas que
colaboraram para a formação do meu caráter pelo exemplo, amizade e tudo o mais que as
pessoas deixam em nossa vida ao passar por ela. A vocês dedico as palavras de Fernando
Pessoa: “O valor das coisas não está no tempo em que elas duram, mas na intensidade com
11
que acontecem. Por isso existem momentos inesquecíveis, coisas inexplicáveis e pessoas
incomparáveis”.
12
PRODUÇÃO CIENTÍFICA
Durante o desenvolvimento deste projeto de doutorado foram publicados
alguns trabalhos (em anexo) resultantes de outros projetos na área de microbiologia
do petróleo:
SANTOS, S. C. C., Alviano, D. S., Alviano, C. S., Goulart, F. R., de Pádula, M.,
Leitão, A. C., Martins, O. B., Ribeiro, C. M., Sassaki, M. Y., Matta, C. P., Bevilaqua,
J., Sebastián, G. V. & Seldin, L. Comparative studies of phenotypic and genetic
characteristics between two desulfurizing isolates of Rhodococcus erythropolis and
the well-characterized R. erythropolis strain IGTS8. J. Ind. Microbiol. Biotechnol.,
34(6), 423-431, 2007.
SANTOS, S. C. C., Alviano, D. S., Alviano, C. S., Pádula, M., Leitão, A. C.,
Martins, O. B., Ribeiro, C. M. S., Sassaki, M. Y., Matta, C. P., Bevilaqua, J.,
Sebastián, G. V. & Seldin, L. Characterization of Gordonia sp. strain F.5.25.8
capable of dibenzothiophene desulfurization and carbazole utilization. Appl.
Microbiol. Biotechnol., 71(3), 355-362, 2006.
Como produtos diretos associados a este projeto, destacam-se trabalhos
apresentados em um congresso internacional e outro nacional, um resumo
submetido para apresentação em congresso internacional e um artigo científico em
fase de preparação:
SANTOS, S.C.C., Casella, R., Rosado, A.S., Seldin, L. & Greer, C.W.
Characterization of the salt tolerant, hydrocarbon degrading bacterial community in
a Brazilian petroleum extraction field soil. In: 57th CSM Meeting, 2007, Québec,
Canada.
SANTOS, S.C.C., Alvarez, V.M., Casella, R., Vital, R.L. Sebastián, G.V., Fortin,
N., Rosado, A.S., Seldin, L., Greer, C.W. Análise do impacto de água produzida e
petróleo e efeito da bioestimulação sobre a comunidade bacteriana degradadora de
13
hidrocarbonetos do petróleo em solo do campo petrolífero de Carmópolis (Sergipe,
Brasil). In: 24º Congresso Brasileiro de Microbiologia, 2007, Brasília.
SANTOS, S.C.C., Alvarez, V.M., Casella, R.C., Vital, R.L., Rosado, A.S., Seldin,
L., Fortin, N., Sanschagrin, S. & Greer, C.W. Analysis of the bacterial community
during the in situ bioremediation of oil and/or produced water contaminated soil.
Resumo submetido ao 12th International Symposium on Microbial Ecology - ISME12,
2008, Cairns, Australia.
SANTOS, S.C.C., Alvarez, V.M., Casella, R.C., Vital, R.L., Rosado, A.S., Seldin,
L., Fortin, N., Sanschagrin, S. & Greer, C.W. Analysis of the bacterial community
during the in situ bioremediation of oil and/or produced water contaminated soil.
Artigo em fase de preparação.
14
RESUMO
Análise da comunidade bacteriana durante a biorremediação in situ de solo
contaminado com óleo bruto e/ou água produzida
Silvia Cristina Cunha dos Santos
Orientadora: Lucy Seldin
Co-orientador: Dr. Charles William Greer
Resumo da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-graduação em
Ciências (Microbiologia), do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, da
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à
obtenção do título de Doutor em Ciências (Microbiologia).
Estudos sobre biorremediação de ambientes contaminados com petróleo geralmente
baseiam-se em experimentos laboratoriais em microcosmos. O presente estudo
buscou: monitorar os efeitos da água produzida, do petróleo e da bioestimulação
sobre a comunidade bacteriana total e sobre a comunidade bacteriana com
potencial para degradar os hidrocarbonetos do petróleo in situ, considerando-se a
influência das condições ambientais. Experimentos de campo na região produtora
de petróleo em Carmópolis (Sergipe) foram realizados com adição de água
produzida e petróleo (fase I), seguido de nova adição de água produzida e petróleo
(fase II) e pela avaliação da bioestimulação (fase III). As etapas foram realizadas
seqüencialmente nas mesmas porções de solo. A avaliação indireta da comunidade
bacteriana resultou no isolamento de uma variedade (187) de bactérias
halotolerantes crescendo entre 7,5% e 30% NaCl. Mais de 30% das estirpes (62)
mostraram ser degradadoras de petróleo, somente duas degradaram fenantreno e
uma foi capaz de degradar petróleo e crescer em até 30% NaCl. O DNA extraído do
solo foi analisado por eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE) do
gene rrs (que codifica o rRNA 16S) e alkB amplificados por PCR e por hibridização
com oligonucleotídeos imobilizados em lâminas de vidro (microarranjos catabólico e
taxonômico) para avaliar a diversidade bacteriana total e degradadora de
hidrocarbonetos. Mudanças significativas nos perfis de DGGE com amplicons do gene
rrs foram observadas principalmente nas amostras tratadas com petróleo. Algumas
bandas foram extraídas do gel de DGGE e foram seqüenciadas. As seqüências
obtidas foram principalmente similares a alfa-proteobactérias e actinomicetos,
destacando-se Novosphingobium aromaticivorans e Dietzia sp. ice-oil-71
degradadoras de hidrocarbonetos do petróleo e Sphingomonas sp. R1 degradadora
de bifenila. A estabilidade da comunidade degradadora de alcanos foi revelada
através de PCR e hibridização sobre microarranjo catabólico com gene alkB. O
seqüenciamento de bandas revelou alta similaridade com a enzima alcano
hidroxilase de Mycobacterium vanbaalenii PYR-1, degradadora de hidrocarbonetos
aromáticos, Ralstonia sp. PT11 e Burkholderia xenovorans LB400 isoladas de solo de
floresta contaminado com petróleo e Thalassolituus oleivorans MIL-1 e Alcanivorax
dieselolei P40, estirpes marinhas degradadoras de hidrocarbonetos. Nenhum
15
produto de PCR ou sinal de hibridização sobre o microarranjo catabólico do gene
ndoB (via de degradação do naftaleno) ou de genes da via de degradação do
fenantreno pôde ser detectado. Porém, foi observada hibridização com outros
genes de degradação de naftaleno e de outros hidrocarbonetos aromáticos. Os
fracos sinais de hibridização sobre o microarranjo de genes funcionais pode refletir
a falta de um banco de genes consistente e representativo de ambientes brasileiros,
uma vez que a maioria dos dados usados para projetar os oligonucleotídeos são
derivados de outros ambientes, principalmente de clima temperado. No entanto, o
isolamento de estirpes bacterianas degradadoras de hidrocarbonetos do petróleo e
as análises de DGGE e os microarranjos de DNA mostraram ser ferramentas úteis
para a detecção e o monitoramento da diversidade bacteriana estrutural e
funcional durante a biorremediação de solo contaminado.
Palavras-chave: Contaminação por petróleo, água produzida, biorremediação do
solo, bioestimulação, atenuação natural, diversidade bacteriana, DGGE,
microarranjo de DNA.
Rio de Janeiro
2008
16
ABSTRACT
Analysis of the bacterial community during bioremediation in situ of oil and/or
produced water contaminated soil
Silvia Cristina Cunha dos Santos
Supervisors: Lucy Seldin and Charles William Greer
Abstract da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-graduação em
Ciências (Microbiologia), do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, da
Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências (Microbiologia).
Bioremediation studies of oil-polluted environments often focus on laboratory
microcosm experiments. The present study aimed of monitor the effects of
produced water, petroleum, and biostimulation on the indigenous bacterial
community, and the bacterial community with catabolic potential to degrade
petroleum hydrocarbons in situ, considering the environmental conditions. Field
experiments in the petroleum extraction zone of Carmópolis (Sergipe) were
conducted with produced water and oil spills (step I), followed by one more
produced water and oil controlled spills (step II) and by biostimulation evaluation
(step III). All steps were performed sequentially in the same soil plots.
Microbiological assays for culturable bacteria resulted on the isolation of a variety
of salt tolerant bacteria (187 isolates) growing between 7.5% and 30% NaCl. More
than 30% of them (62) were hydrocarbon-degrading strains, only two could degrade
phenanthrene, and one strain was able to degrade crude oil and grow at up to 30%
NaCl. The soil DNA extracts were analyzed by denaturing gradient gel
electrophoresis (DGGE) of PCR amplified 16S rRNA and alkB genes and by
hybridization to oligonucleotides immobilized on glass slides (catabolic and
taxonomic microarrays) to assess the diversity of total bacterial community and
hydrocarbon degraders. Significant changes in the DGGE profiles of 16S rRNA gene
amplicons were observed mainly with the oiled samples. Some bands were
extracted from DGGE and sequenced. The resulting sequences were highly similar
to Alphaproteobacteria and Actinobacteria, such as the hydrocarbon degrading
bacteria Novosphingobium aromaticivorans and Dietzia sp. ice-oil-71 and the
byphenil degrader Sphingomonas sp. R1. A stable pattern for alkane degrader
community was revealed by the analysis of the alkB gene by PCR, DGGE, and
hybridization on catabolic microarrays. Sequenced bands from DGGE revealed high
similarity with the alkane hydroxylase enzyme from Mycobacterium vanbaalenii
PYR-1, a hydrocarbon degrading bacterium, Ralstonia sp. PT11 and Burkholderia
xenovorans LB400 isolated from forest soils contaminated with fuel hydrocarbon,
and two marine bacteria
Thalassolituus oleivorans MIL-1 and Alcanivorax dieselolei
that obligately utilize hydrocarbons. No product or signal could be detected
following PCR or hybridization on catabolic microarrays analyses for the ndoB gene
(from naphthalene catabolic pathway) or for phenanthrene degradation pathway
17
genes. However, signals of hybridization for others naphthalene and others
aromatic hydrocarbon catabolic genes were detected in the microarrays analysis.
The faint signals detected using the catabolic microarray might reflect the lack of a
robust and representative gene bank for Brazilian environments, since the majority
of the data used to design the oligonucleotides targets are derived from other
environments, mainly from temperate climate. However, microbiological assays as
the isolation of petroleum hydrocarbon degrading bacteria and molecular
techniques as DGGE and DNA microarrays showed to be useful tools for the
detection and monitoring of the structural and functional bacterial diversity during
the bioremediation of contaminated soil.
Key-words:
Oil contamination; produced water; soil bioremediation; Biostimulation;
Natural attenuation; bacterial diversity; DGGE; microarray.
Rio de Janeiro
Março de 2008
18
SUMÁRIO
SUMÁRIO......................................................................................... 18
LISTA DE FIGURAS .............................................................................21
LISTA DE TABELAS.............................................................................24
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS .........................................................25
INTRODUÇÃO ...................................................................................28
1. O petróleo .................................................................................. 28
1.1. O impacto ambiental da contaminação por petróleo............................ 34
2. Biorremediação ............................................................................ 35
2.1. A biorremediação no Brasil .......................................................... 44
3. Água produzida............................................................................. 51
3.1. O impacto ambiental da contaminação por água produzida ................... 53
4. Bactérias halofílicas e halotolerantes na biorremediação em ambientes salinos54
5. Análise da diversidade e da função da comunidade microbiana em ambientes
contaminados.................................................................................. 58
5.1. Isolamento de bactérias degradadoras de óleo no ambiente .................. 59
5.2. Análises de Biologia Molecular ...................................................... 62
5.2.1. Extração de DNA do solo ......................................................... 63
5.2.2. Reação em cadeia da enzima DNA-polimerase (PCR) ....................... 64
5.2.3. Eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE).................... 66
5.2.4. Microarranjo de DNA.............................................................. 69
5.3. Análises de Microbiologia Clássica x Biologia Molecular ........................ 73
JUSTIFICATIVA .................................................................................75
OBJETIVOS ...................................................................................... 77
1. OBJETIVO GERAL........................................................................... 77
2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................. 77
ETAPAS .......................................................................................... 79
1. TRATAMENTO DO SOLO ................................................................... 79
2. ANÁLISES DE MICROBIOLOGIA CLÁSSICA................................................ 79
3. ANÁLISES DE BIOLOGIA MOLECULAR .................................................... 80
MATERIAIS & MÉTODOS.......................................................................81
1. MATERIAIS UTILIZADOS.................................................................... 81
1.1. O petróleo, a água produzida e o solo ............................................. 81
1.2. Tampões ................................................................................ 83
1.3. Soluções................................................................................. 85
1.3. Meios de cultura ....................................................................... 89
2. METODOLOGIA APLICADA ................................................................. 91
19
2.1. TRATAMENTO DO SOLO ............................................................... 91
2.1.1. Definição da área de estudo e preparo das células-piloto.................. 91
2.1.2. Primeiro Tratamento - Fase I.................................................... 92
2.1.2.1. Aplicação dos Contaminantes........................................................ 92
2.1.2.2. Procedimento de composição de amostras e amostragem ...................... 94
2.1.3. Segundo Tratamento - Fase II ................................................... 96
2.1.3.1. Aplicação dos Contaminantes........................................................ 96
2.1.3.2. Procedimento de composição de amostras e amostragem ...................... 96
2.1.4. Terceiro Tratamento - Fase III .................................................. 96
2.1.4.1. Aplicação dos nutrientes e dos contaminantes.................................... 96
2.1.4.2. Procedimento de Composição de amostras e amostragem...................... 97
2.1.4.3. Monitoramento ......................................................................... 98
2.2. ANÁLISES DE MICROBIOLOGIA CLÁSSICA...........................................100
2.2.1. Isolamento de estirpes degradadoras de petróleo na presença de sal ..100
2.2.2. Teste de crescimento dos tipos morfológicos isolados em diferentes
concentrações de sal.....................................................................103
2.2.3. Teste de degradação de petróleo dos morfotipos isolados ................103
2.2.4. Teste de utilização de fenantreno pelas bactérias degradadoras de
petróleo Sergipano Terra................................................................104
2.3. ANÁLISES DE BIOLOGIA MOLECULAR ...............................................105
2.3.1. Extração de DNA total da comunidade microbiana das amostras de solo
..............................................................................................105
2.3.1.1. “kit” de extração de DNA para solo (FastDNA
®
SPIN Kit for Soil) ............105
2.3.1.2. Protocolo segundo Fortin e colaboradores (2004) ...............................105
2.3.2. Amplificação por PCR com iniciadores universais para o gene rrs .......108
2.3.2.1. DNA extraído com o “kit” de extração de DNA para solo – iniciadores U968f-
GC1 e L1401r .....................................................................................
108
2.3.2.2. DNA extraído segundo protocolo para amostras ambientais contaminadas –
iniciadores U341F-GC2 e U758.................................................................
109
2.3.3. Eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE) - gene rrs ......111
2.3.3.1. DNA extraído com o “kit” e PCR com os iniciadores U968f-GC1 e L1401r ...111
2.3.3.2. DNA extraído com o protocolo para amostras contaminadas com alto
conteúdo de matéria orgânica – iniciadores U341F-GC2 e U758 .........................
112
2.3.4. Amplificação por PCR com iniciadores universais para o gene alkB .....116
2.3.5. Eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE) - gene alkB ....117
2.3.6. Amplificação por PCR com iniciadores específicos para o gene ndoB ...119
2.3.7. Microarranjo de DNA.............................................................120
2.3.7.1. Microarranjo de genes estruturais - Microarranjo Taxonômico................120
2.3.7.1.1. Amplificação por PCR com iniciadores universais para os genes rrs e cpn60
....................................................................................................
121
2.3.7.1.2. Marcação dos produtos de PCR com o fluoróforo cianina 5 ................122
2.3.7.1.3. Hibridização com microarranjo de genes estruturais - chip taxonômico 123
2.3.7.1.4. Lavagem do chip taxonômico ...................................................124
2.3.7.1.5. Leitura (scanner) e quantificação..............................................124
2.3.7.2. Microarranjo de genes funcionais - Microarranjo Catabólico ..................124
2.3.7.2.1. Marcação do DNA total com o fluoróforo cianina 5 .........................125
2.3.7.2.2. Hibridização com microarranjo de genes catabólicos - chip catabólico .125
2.3.7.2.3. Lavagem do chip catabólico ....................................................126
20
2.3.7.2.4. Leitura (scanner) e quantificação..............................................126
RESULTADOS.................................................................................. 127
1. Isolamento e caracterização de estirpes bacterianas capazes de degradar o óleo
na presença de sal ...........................................................................127
1.1. Isolamento de estirpes bacterianas hidrocarbonoclásticas e halotolerantes
................................................................................................127
1.2. Avaliação dos morfotipos coloniais isolados quanto à capacidade de
crescimento em diferentes concentrações de sal ....................................131
1.3. Avaliação dos isolados quanto à capacidade de degradação de óleo ........132
1.4. Avaliação dos isolados degradadores de óleo quanto à capacidade de
degradação de fenantreno ...............................................................
138
2. Análises com técnicas de biologia molecular ........................................138
2.1. Extração de DNA total da comunidade microbiana das amostras de solo...138
2.2. DGGE do gene rrs.....................................................................140
2.2.1. Amplificação por PCR com iniciadores universais para o gene rrs .......140
2.2.2. DGGE - PCR com iniciadores universais para o gene rrs ...................141
2.3. DGGE do gene alkB...................................................................160
2.3.1. Amplificação por PCR com iniciadores universais para o gene alkB .....160
2.3.2. DGGE - PCR com iniciadores universais para o gene alkB .................161
2.4. Amplificação por PCR com iniciadores específicos para o gene ndoB .......170
2.5. Microarranjo de DNA.................................................................170
2.5.1. Microarranjo de genes estruturais para avaliar a diversidade estrutural
das amostras de solo - Microarranjo Taxonômico ...................................170
2.5.2. Microarranjo de genes funcionais para avaliar a diversidade funcional das
amostras de solo - Microarranjo Catabólico............................................. i
DISCUSSÃO .......................................................................................vi
CONCLUSÕES .................................................................................xxiii
BIBLIOGRAFIA..................................................................................xxv
21
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Área experimental.................................................................. 92
Figura 2. Aplicação de 5 l de água produzida na célula-piloto 2 no início da fase I do
projeto. ....................................................................................
93
Figura 3. Tratamento da célula-piloto 3 com 5 l de uma mistura de água produzida
associada a petróleo na proporção 3:1 no início da fase I do projeto. .......... 94
Figura 4. Contaminação com 5 l de petróleo na célula-piloto 4 no início da fase I do
projeto. .................................................................................... 94
Figura 5. Seções de amostragem (1, 2 e 3) e pontos de coleta (A, B e C) para a
composição das amostras de solo de cada célula-piloto. .......................... 95
Figura 6. Amostragem de solo das células-piloto. ........................................ 95
Figura 7. Área experimental após o tratamento da fase III. ............................ 97
Figura 8. Gráfico da leitura da concentração de DNA DO entre 200 e 700 nm em
espectrofotômetro NanoDrop para verificar a eficiência da reação de marcação
com o fluoróforo Cy5 e a qualidade do DNA marcado. ............................123
Figura 9. Morfologia de algumas colônias isoladas de amostras de solo tratado com
óleo por meio de enriquecimento com 1% de óleo Sergipano Terra
exemplificando características como cor, formato e opacidade. ...............127
Figura 10. Enriquecimento com 1% de óleo Sergipano Terra da amostra de solo
tratado com óleo coletada 43 dias após o início dos experimentos. ............130
Figura 11. Teste de biodegradação de 1% óleo Sergipano Terra das estirpes isoladas
das amostras de solo tratado com óleo realizado em microplacas de 24
cavidades em meio Bushnell-Hass com 7,5% de NaCl. .............................133
Figura 12. a) Eletroforese em gel de agarose a 0,8% em tampão TEB de DNA obtido
com “kit” de extração de DNA para solo das amostras coletadas 1 dia e 136 dias
após o início dos experimentos. b) Eletroforese em gel de agarose a 0,7% em
tampão TAE contendo SYBR Safe de DNA obtido através do protocolo para
amostras ambientais modificado das amostras coletadas 1 dia (fase I), 136 dias
(fase II) e 429 dias (fase III) após o início dos experimentos. ....................139
Figura 13. a) Eletroforese em gel de agarose 1,4% dos produtos de PCR com os
iniciadores U968f-GC1 e L1401r das amostras coletadas 1 dia e 136 dias após o
início dos experimentos. b) Eletroforese em gel de agarose a 1,4% em tampão
TAE contendo SYBR Safe dos produtos de PCR com os iniciadores U341F-GC2 e
U758 das amostras coletadas 1 dia (fase I), 136 dias (fase II) e 429 dias (fase III)
após o início dos experimentos........................................................
141
Figura 14. DGGE em gradiente desnaturante linear de 45% a 75% dos produtos de
PCR com iniciadores U968f-GC1 e L1401r para o gene rrs a partir do DNA
extraído através de “kit” de extração de DNA para solo das amostras coletadas
1 dia após o início dos experimentos. ................................................
142
Figura 15. DGGE em gradiente desnaturante linear de 40% a 65% dos produtos de
PCR com iniciadores U341F-GC2 e U758 para o gene rrs a partir do DNA extraído
das triplicatas das amostras de solo coletadas 429 dias após o início dos
experimentos. ............................................................................
143
Figura 16. Análise do gel de DGGE dos produtos de PCR com os iniciadores U341F-
GC2 e U758 para o gene rrs do DNA extraído das triplicatas das amostras de
22
solo coletadas 429 dias após o início dos experimentos, realizada com o
programa GelComparII, utilizando-se o coeficiente de Dice e o método de
aglomeração de Ward. ..................................................................144
Figura 17. DGGE em gradiente desnaturante linear de 40% a 65% dos produtos de
PCR com iniciadores U341F-GC2 e U758 para o gene rrs a partir do DNA extraído
das amostras de solo controle (célula-piloto 1). ...................................145
Figura 18. Análise do gel de DGGE dos produtos de PCR com os iniciadores universais
U341F-GC2 e U758 para o gene rrs do DNA extraído das amostras de solo
controle (célula-piloto 1), realizada através do programa GelComparII,
utilizando-se o coeficiente de Dice e o método de aglomeração de Ward.....146
Figura 19. DGGE em gradiente desnaturante linear 40% a 65% dos produtos de PCR
com iniciadores U341F-GC2 e U758 para o gene rrs a partir do DNA extraído das
amostras de solo tratadas com água produzida nas fases I e II e bioestimuladas
na fase III..................................................................................148
Figura 20. Análise do gel de DGGE dos produtos de PCR com os iniciadores U341F-
GC2 e U758 para o gene rrs do DNA extraído das amostras de solo tratadas com
água produzida (A) nas fases I e II e bioestimuladas (B) na fase III, realizada
com o programa GelComparII, usando-se o coeficiente de Dice e o método de
agrupamento de Ward. .................................................................149
Figura 21. DGGE em gradiente desnaturante linear 40% a 65% dos produtos de PCR
com iniciadores U341F-GC2 e U758 para o gene rrs do DNA extraído das
amostras de solo tratadas com mistura de água produzida e óleo nas fases I e II
e bioestimuladas e tratadas com óleo na fase III. ..................................150
Figura 22. Análise do gel de DGGE dos produtos de PCR com os iniciadores U341F-
GC2 e U758 para o gene rrs do DNA extraído das amostras de solo tratadas com
mistura de água produzida e óleo (M) nas fases I e II e bioestimuladas e
tratadas com óleo (BO) na fase III, realizada através do programa GelComparII,
utilizando-se o coeficiente de Dice e o método de aglomeração de Ward.....151
Figura 23. DGGE em gradiente desnaturante linear 40% a 65% dos produtos de PCR
com iniciadores U341F-GC2 e U758 para o gene rrs do DNA extraído das
amostras de solo tratadas com petróleo (célula-piloto 4). .......................
152
Figura 24. Análise do gel de DGGE dos produtos de PCR com os iniciadores U341F-
GC2 e U758 para o gene rrs do DNA extraído das amostras de solo tratadas com
petróleo (célula-piloto 4), realizada através do programa GelComparII,
utilizando-se o coeficiente de Dice e o método de agrupamento de Ward. ...153
Figura 25. Análise dos géis de DGGE dos produtos de PCR com os iniciadores U341F-
GC2 e U758 para o gene rrs, realizada com o programa GelComparII, utilizando-
se o coeficiente de Dice e o método de aglomeração de Ward. .................
155
Figura 26. Eletroforese em gel de agarose a 1,4% com SYBR Safe em tampão TAE dos
produtos de PCR com iniciadores alkH1FGC2 e alkH3R para o gene alkB das
amostras coletadas 1 dia (fase I), 136 dias (fase II), 429 dias (fase III) e 638
(fase III) dias após o início dos experimentos. ......................................
160
Figura 27. DGGE em gradiente desnaturante linear de 45% a 65% dos produtos de
PCR com os iniciadores alkH1FGC2 e alkH3R para o gene alkB, das amostras
coletadas 1 dia (fase I), 136 dias (fase II) e 429 dias (fase III) após o início dos
experimentos. ............................................................................161
23
Figura 28. Análise do gel de DGGE dos produtos de PCR com os iniciadores
alkH1FGC2 e alkH3R para o gene alkB, realizada com o programa GelComparII,
utilizando-se o coeficiente de Dice e o método de aglomeração de Ward.....169
Figura 29. Hibridização dos produtos de PCR dos genes rrs e cpn60 marcados com o
fluoróforo cianina 5 (Cy5) das amostras tratadas com petróleo (célula-piloto 4)
coletadas 1 dia (A) e 429 dias (B) após o início dos experimentos sobre um
microarranjo de genes rrs e cpn60 (Microarranjo taxonômico). .................170
Figura 30. Hibridização sobre microarranjo de genes funcionais de DNA
(Microarranjo catabólico). ............................................................... ii
24
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Composição química do solo do Campo de Sergipe. ......................... 81
Tabela 2. Análise elementar do petróleo Sergipano Terra produzido no Campo de
Sergipe......................................................................................
82
Tabela 3. Análise físico-química da água produzida da Estação Coletora de Entre
Rios do Campo de Sergipe. .............................................................. 83
Tabela 4. Relação das coletas de amostras de solo das células-piloto estudadas,
data e tempo da coleta.................................................................. 98
Tabela 5. Tipos morfológicos isolados de solo tratado com óleo Sergipano Terra de
acordo com o sistema de enriquecimento utilizado. ..............................128
Tabela 6. Morfotipos coloniais isolados de solo tratado com óleo Sergipano Terra de
acordo com os meios de cultura utilizados. .........................................
131
Tabela 7. Teste de halotolerância das estirpes isoladas de solo tratado com óleo
Sergipano Terra. .........................................................................131
Tabela 8. Morfotipos coloniais isolados de solo tratado com óleo Sergipano Terra
capazes de degradar o óleo Sergipano Terra em meio Bushnell-Hass na presença
de 7,5% de NaCl ou de coalescer a gota de óleo. ..................................133
Tabela 9. Morfotipos coloniais isolados de solo tratado com óleo Sergipano Terra
degradadores do óleo Sergipano Terra em meio Bushnell-Hass na presença de
7,5% de NaCl, meios de enriquecimento e isolamento e halotolerância. ......134
Tabela 10. Morfotipos coloniais isolados de solo tratado com óleo Sergipano Terra
capazes de coalescer o óleo Sergipano Terra em meio Bushnell-Hass na
presença de 7,5% de NaCl, meios de enriquecimento e isolamento e
halotolerância. ...........................................................................137
Tabela 11. Estirpes bacterianas cultiváveis mais próximas às seqüências obtidas das
bandas do DGGE dos produtos de PCR com iniciadores U341F-GC2 e U758 para o
gene rrs do DNA das amostras de solo................................................157
Tabela 12. Amostras não cultivadas mais próximas a seqüências obtidas das bandas
do DGGE dos produtos de PCR com os iniciadores U341F-GC2 e U758 para o
gene rrs do DNA das amostras de solo................................................
159
Tabela 13. Seqüências homólogas encontradas com os programas Blastn, Blastx e
fasta mais próximas às seqüências obtidas das bandas do DGGE dos produtos de
PCR com os iniciadores alkH1FGC2 e alkH3R para o gene alkB do DNA das
amostras de solo. ........................................................................
164
Tabela 14. Espécies bacterianas do microarranjo de genes estruturais rrs e cpn60
(Microarranjo Taxonômico) que hibridizaram com o DNA extraído das amostras
de solo. ....................................................................................
172
Tabela 15. Espécies observadas e sinais de hibridização das amostras de DNA de solo
com o microarranjo tanonômico. .....................................................173
Tabela 16. Genes funcionais do microarranjo catabólico. ................................ i
Tabela 17. Genes do microarranjo catabólico que hibridizaram com as amostras de
DNA de solo submetidos aos diferentes tratamentos. ...............................iii
Tabela 18. Sinais de hibridização com o microarranjo catabólico e proporções
relativas dos genes funcionais. ...........................................................
v
25
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ARDRA - Análise de restrição do DNA ribossomal amplificado (“amplified rDNA
restriction analysis”)
ATCC - “American Type Culture Collection”
BHI - Meio de cultura “Brain Heart Infusion”
BLAST - “Basic Local Alignment Search Tool”
BTA - gerência de Biotecnologia e Tratamentos Ambientais
bpd - Barris por dia
BSA - Soro-albumina bovina (“bovine serum albumin”)
BTEX - benzeno, tolueno, etilbenzeno e xileno
cDNA - DNA complementar (“complementary DNA”)
CENPES - Centro de Pesquisas e Desenvolvimento Américo Leopoldo Miguez de Mello
da Petrobras
CETESB - Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental
Cy3 - Fluoróforo cianina 3 (“cyanine 3”)
Cy5 - Fluoróforo cianina 5 (“cyanine 5”)
DGGE - Eletroforese em gel de gradiente desnaturante (“Denatured Gradient Gel
Electrophoresis”)
DNA - Ácido desoxirribonucléico (“Deoxyribonucleic Acid”)
dCTP - Desoxinucleotídeo citosina trifosfato
dCTP-Cy3 - Desoxinucleotídeo citosina trifosfato ligado ao fluoróforo cianina 3
dCTP-Cy5 - Desoxinucleotídeo citosina trifosfato ligado ao fluoróforo cianina 5
DDBJ – Banco de dados de DNA do Japão (“DNA DataBank of Japan”)
dNTP - deoxinucleotídeo trifosfato
EDTA – Etilenodiaminotetracetato
EMBL – Laboratório de Biologia Molecular Europeu (“European Molecular Biology
Laboratory”)
GC/MS - cromatografia gasosa e espectrometria de massa
GB - Meio de cultura “Glucose Broth”
GNL - Gás Natural Liquefeito
HPA - Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (“Polycyclic Aromatic Hydrocarbons -
PAH)
IMPPG - Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes
26
LB - Meio de cultura “Luria-Bertani Broth”
MPE – Extração Multifásica (“Multiphase Extraction”)
mRNA – RNA mensageiro (“Messenger Ribonucleic Acid”)
nm – nanômetros
NPK - nitrogênio, fósforo e potássio
OHCB - bactérias hidrocarbonoclásticas obrigatórias (“Obligate Hydrocarbonoclastic
Bacteria”)
OPEP - Organização dos Países Exportadores de Petróleo (“Organization of the
Petroleum Exporting Countries”)
pb – pares de base
PCB – Bifenilas policloradas (“Polychlorinated Biphenyls”)
PCR - Reação em cadeia da polimerase (“Polymerase Chain Reaction”)
PDB – Banco de dados de proteínas (“Protein Data Bank”)
PLFA – Análise de ácidos graxos de fosfolipídeos (“Phospholipid Fatty Acids
Analysis”)
p/p - peso por peso
m/v - peso por volume
PVPP - polivinilpolipirrolidona
q.s.p. - quantidade suficiente para
RAPD – DNA polimórfico amplificado randomicamente (“Random Amplified
polymorphic DNA”)
RISA - Análise do espaço intergênico ribossomal (“Ribosomal Intergenic Spacer
Analysis”)
RNA – Ácido ribonucléico (“Ribonucleic Acid”)
rRNA 16S - subunidade menor do RNA ribossomal (“Ribosomal Ribonucleic Acid”)
RNase A – Ribonuclase A
SDS – Dodecil Sulfato de Sódio
SSC - Tampão Salina-Citrato de Sódio
SSCP – Polimorfismo da conformação da fita simples (“Single Strand Conformação
Polymorphism”)
SsDNA – DNA de esperma de salmão (Salmon sperm DNA)
TE - Tampão Tris/EDTA
TAE – Tampão Tris/Ácido acético/EDTA
TBN - Meio de cultura Tiamina/Biotina/Nitrogênio
27
TEB - Tampão Tris/EDTA/ Ácido bórico
TGGE – Eletroforese em gel de gradiente de temperatura (“Temperature Gradient
Gel Electrophoresis”)
TPH - Hidrocarbonetos totais do petróleo (“Total Petroleum Hydrocarbons”)
T-RFLP – Polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição terminal
(“Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism”)
Tris - trishidroximetilaminometano
tRNA - RNA transportador (“Transporter Ribonucleic Acid”)
TSB - Meio de cultura “Trypticase Soy Broth”
UFRJ - Universidade Federal do Rio de Janeiro
UFRRJ - Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
UN-SEAL - Unidade de Negócios Sergipe-Alagoas
VOC - Compostos Orgânicos Voláteis (“Volatile Organic Compounds”)
28
INTRODUÇÃO
1. O petróleo
O petróleo é uma substância oleosa, inflamável, geralmente menos densa que
a água, com cheiro característico e coloração que pode variar desde o castanho
claro até o preto. Antes do refino, é designado “óleo bruto” ou “óleo cru”
(http://pt.wikipedia.org/wiki/Petroleo, http://www2.petrobras.com.br/Espaço
Conhecer/sobrepetroleo/Origemperspectivas.asp). A densidade do óleo cru é
geralmente medida em graus, de acordo com a escala desenvolvida pelo Instituto
Americano do Petróleo (API). A Conferência Mundial de Energia classifica o óleo cru
pesado como o óleo cru abaixo de 22º API, o óleo cru médio como o óleo entre 22º e
31º API, e óleo cru leve como o óleo cru acima de 31º API (TSALIK & SCHIFFRIN,
2005).
Os óleos crus leves, médios e pesados são considerados “óleos crus
convencionais.” Alguns tipos de óleo crus podem ser misturados para produzir a
qualidade que interessa aos refinadores. Os óleos leves geralmente são mais caros
que os pesados, principalmente devido ao alto rendimento de produtos refinados
valiosos, como a gasolina ou o combustível de aviação. Os óleos do Mar do Norte,
como o Brent e o Ekofisk, o óleo cru nigeriano como o Bonny Light, e outros óleos
crus africanos são óleos leves enquanto que a maior parte do óleo cru do Oriente
Médio é da variedade mais pesada. O óleo abaixo de 10º API é comumente
conhecido como betume e requer tratamento especial. O betume é extraído por
escavação da areia, do arenito, ou outras rochas sedimentares, enquanto que os
óleos crus convencionais são extraídos por perfuração. O betume, um dos muitos
óleos crus não convencionais, é atualmente produzido a partir da areia betuminosa
existente no Canadá e na Venezuela. O betume passa por vários processos de
lavagem e tratamento para separar o conteúdo de óleo da areia, água e minerais, e
é então diluído com petróleo. Pelo fato de passar por esses processos, o betume
ficou conhecido como “óleo cru sintético”, apesar de, em termos lingüísticos
rigorosos, ele não ser sintético (TSALIK & SCHIFFRIN, 2005).
29
O petróleo bruto possui em sua composição uma mistura complexa de
hidrocarbonetos que podem ser classificados em três grupos: alifáticos, alicíclicos e
aromáticos. Os hidrocarbonetos alifáticos são compostos de cadeias abertas e estão
subdivididos em alifáticos saturados (hidrocarbonetos mais estáveis conhecidos
como parafinas ou alcanos) e alifáticos insaturados (hidrocarbonetos menos estáveis
conhecidos como olefinas ou alcenos). Os hidrocarbonetos alicíclicos (cicloalcanos)
têm alguns ou todos os átomos arranjados em uma estrutura em anel e podem ser
saturados ou insaturados. Os hidrocarbonetos aromáticos (arenos) contêm ao menos
um anel de benzeno. Os que possuem apenas um anel de benzeno são chamados de
hidrocarbonetos monocíclicos, enquanto aqueles com mais de um deste tipo de anel
são chamados de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPA) (LEYTHAEUSER &
RÜCKHEIM, 1989; QIAN & DECHERT, 2002).
Embora os hidrocarbonetos sejam quantitativamente seus constituintes mais
importantes, o petróleo também é constituído por outros compostos orgânicos,
incluindo alguns constituintes organometálicos contendo vanádio e níquel (CHANG,
1994; VAN HAMME, SINGH & WARD, 2003), compostos sulfurosos (como sulfetos,
polissulfetos e benzotiofenos), compostos nitrogenados (como piridinas, quinolinas
e indóis), compostos oxigenados (como ácidos carboxílicos, fenóis e ésteres),
resinas e asfaltenos (LEYTHAEUSER & RÜCKHEIM, 1989; HUANG et al., 2004).
Além disso, as reservas de óleo cru podem produzir hidrocarbonetos líquidos
mais leves tais como o propano e o butano, que são classificados como gases
naturais liquefeitos (GNLs). Porém, é importante notar que quando as organizações
falam sobre a produção de petróleo ou as reservas de petróleo, elas podem ou não
incluir GNLs em seus registros. A Organização dos Países Exportadores de Petróleo
(OPEP) exclui GNLs das quotas de produção de seus membros, mesmo que eles
contribuam significativamente para a produção total de hidrocarbonetos de alguns
países membros da OPEP (TSALIK & SCHIFFRIN, 2005).
Um reservatório de petróleo, por definição, é formado por 3 elementos: a
rocha matriz, a rocha impermeável e a rocha reservatório. A rocha matriz é a rocha
na qual o petróleo cru é formado e a partir da qual, posteriormente, o mesmo
migra até encontrar um terreno apropriado para se concentrar. Estes terrenos são
30
denominados bacias sedimentares ou rochas reservatórios, formadas por camadas
ou lençóis porosos de areia, arenitos ou calcários. É a permeabilidade das rochas
reservatórios que irá permitir o acúmulo de petróleo nos poros, formando jazidas.
Normalmente, esta rocha possui uma grande capacidade de estocar fluidos ricos em
hidrocarbonetos. Ali são encontrados gás natural, na parte mais alta, e petróleo e
água nas mais baixas (PLANCKAERT, 2005).
A rocha reservatório funciona como uma esponja, pois ela pode armazenar e
expelir o fluido. Já o papel da rocha impermeável é conter a migração dos
hidrocarbonetos, permitindo assim a formação dos reservatórios de petróleo. Por
possuir uma densidade inferior a das rochas que constituem o subsolo, o petróleo
tende a migrar para a superfície. Se no caminho para a superfície, através das
camadas de rochas adjacentes, o petróleo encontra uma estrutura geológica
impermeável (uma rocha selante), que detenha seu caminho, fazendo o seu
confinamento e impedindo a sua migração, acaba se formando um reservatório de
petróleo. Vale salientar que esse processo ocorre lentamente, levando alguns
milhares de anos (PLANCKAERT, 2005).
Alguns pesquisadores defendem que os fluidos do petróleo são produzidos pela
hidrólise térmica do material orgânico fóssil procedente da superfície terrestre
contido nos sedimentos (detritos orgânicos), e que este processo é, provavelmente,
a fonte da maioria dos depósitos descobertos até o momento (PLANCKAERT, 2005).
Esta hipótese leva em conta que, com o incremento de temperatura, as moléculas
do querogênio (parte insolúvel da matéria orgânica modificada por ações
geológicas) começariam a ser hidrolisadas, gerando compostos orgânicos líquidos e
gasosos, em um processo denominado catagênese em que, com o aumento da
pressão, o querogênio se altera e o petróleo é formado. Durante essa fase as
moléculas maiores irão se converter em moléculas menores e mais simples, por
craqueamento. Craqueamento é como se denominam vários processos químicos na
indústria, principalmente na indústria do petróleo, onde um composto é dividido
em partes menores pela ação de calor e/ou de um catalisador
(http://pt.wikipedia.org/wiki/Petroleo, http://www2.petrobras.com.br/Espaco
Conhecer/sobrepetroleo/Origemperspectivas.asp).
31
Outros pesquisadores acreditam que os reservatórios de petróleo formaram-se
na crosta terrestre como resultado da decomposição anaeróbia de matéria animal,
vegetal e planctônica por bactérias (CHANG, 1994). Dessa forma, é aceito que os
hidrocarbonetos naturais sejam formados em sua maior parte pela decomposição
térmica de matéria orgânica (termogênese) ou por processos bacterianos
(bacteriogênese). Porém, os avanços obtidos em estudos de astronomia, astrofísica,
oceanologia, biologia, termodinâmica, entre outros permitem supor uma origem
abiogênica para o petróleo, com sua posterior contaminação por bactérias às quais
serve de nutriente. Estes hidrocarbonetos abiogênicos são formados geralmente
pela redução do dióxido de carbono, um processo que ocorre em sistemas
hidrotérmicos durante interações da água com a rocha (HORITA & BERNDT, 1999;
LOLLAR et al., 2002; PROSKUROWSKI et al., 2008).
Registros históricos da utilização do petróleo remontam a 4000 a.C. devido a
exsudações e afloramentos freqüentes no Oriente Médio. Os povos da Mesopotâmia,
do Egito, da Pérsia e da Judéia já utilizavam o betume (popularmente conhecido
como piche, uma mistura de hidrocarbonetos que pode aparecer na natureza ou ser
obtida em processo de destilação do petróleo) para pavimentação de estradas,
reparação de barcos, calafetação de grandes construções, aquecimento e
iluminação de casas e como lubrificantes. No Egito, era usado como matéria prima
para os processos de embalsamamento de múmias, como remédio para curar
doenças de pele e mais tarde como fonte de energia para iluminação
(http://pt.wikipedia.org/wiki/Petroleo, http://www2.petrobras.com.br/Espaco
Conhecer/sobrepetroleo/Origemperspectivas.asp).
Heródoto, historiador grego do século V a.C. (485? - 420), mencionou que ele
era transportado pelos rios como um “precioso produto comercial”. No livro bíblico
da Gênese foi citado o uso de argamassa a base de petróleo no templo de Salomão e
que a Arca de Noé deveria ser construída com madeira resinosa e depois calafetada
com betume. Na China antiga (século II d. C.) há indícios de que haviam poços de
petróleo e gás natural (com até mil metros de profundidade) servindo para
iluminação e aquecimento, usando bambus para canalização e transporte, um tipo
de protótipo dos primeiros oleodutos (http://pt.wikipedia.org/wiki/Petroleo).
32
No início da era cristã, os árabes davam ao petróleo fins bélicos e de
iluminação. O petróleo de Baku, capital e maior cidade do Azerbaijão, localizada às
margens do Mar Cáspio, já era produzido em escala comercial, para os padrões da
época, quando Marco Polo viajou pelo norte da
Pérsia, em 1271. Até o
desenvolvimento da exploração de
hidrocarbonetos na Sibéria, Baku foi o principal
centro petrolífero da URSS (http://pt.wikipedia.org/wiki/Petroleo).
O primeiro registro oficial da abertura de um poço, ocorreu na França no início
do século XV na cidade de Alsácia. E, na América Central, no século XVI, há
referência de que os Astecas e Incas também usavam petróleo na pavimentação de
estradas, nas suas construções, bem como na área médica fazendo unguento a base
de alcatrão. Além disso, alguns historiadores afirmam que, quando Pizarro chegou
ao Peru em 1527, lá encontrou uma pequena refinaria rudimentar
(http://www2.petrobras.com.br/EspacoConhecer/sobrepetroleo/Origemperspectiv
as.asp).
A moderna indústria petrolífera data de meados do século XIX. Em 1850, na
Escócia, James Young descobriu que o petróleo podia ser extraído do carvão e xisto
betuminoso e criou processos de refinação (http://pt.wikipedia.org/wiki/Petroleo,
http://www2.petrobras.com.br/EspacoConhecer/sobrepetroleo/Origemperspectiva
s.asp).
Em agosto de 1859 o norte-americano Edwin Laurentine Drake, conhecido
como Coronel Drake, perfurou o primeiro poço para a procura do petróleo (a uma
profundidade de 21 m), em Titusville, uma cidade da
Pensilvânia. O poço revelou-se
produtor e a data passou a ser considerada a do nascimento da moderna indústria
petrolífera. A produção de óleo cru nos Estados Unidos, de dois mil barris em 1859,
aumentou para aproximadamente três milhões em 1863, e para dez milhões de
barris em 1874 (http://pt.wikipedia.org/wiki/Petroleo, http://www2.
petrobras.com.br/Espaco Conhecer/sobrepetroleo/Origemperspectivas.asp).
Mas foi mesmo quando apareceram os primeiros automóveis que o petróleo
começou a ser uma fonte de energia muito importante. A “era da propulsão
mecânica”, iniciada em 1887, com a invenção dos motores à explosão, passou a
utilizar a gasolina e o diesel como combustível. Além disso, a indústria
33
petroquímica surgiu em 1930, possibilitando a utilização de derivados do petróleo
como componentes de explosivos (glicerina e tolueno), matéria sintética para
roupas, solventes e medicamentos entre outros, que tiveram muita utilidade na
Segunda Guerra Mundial (1939-1945) e que são utilizados até hoje
(http://www2.petrobras.com.br/EspacoConhecer/sobrepetroleo/Origemperspectiv
as.asp).
No Brasil, a primeira sondagem foi realizada no município de Bofete (SP),
entre 1892 e 1896, por Eugênio Ferreira de Camargo, quando ele fez a primeira
perfuração numa profundidade de 488 m. Contudo, o poço jorrou somente água
sulfurosa. Foi somente no ano de 1939 que foi descoberto petróleo na cidade de
Lobato, em Salvador (BA) e foi chamado de “óleo de Lobato”
(http://pt.wikipedia.org/wiki/Petroleo, http://www2.petrobras.com.br/Espaco
Conhecer/sobrepetroleo/Origemperspectivas.asp).
Da década de trinta até os dias atuais, a indústria do petróleo vem crescendo
progressivamente. Foram descobertos novos campos petrolíferos, aperfeiçoadas as
explorações submarinas, construídos superpetroleiros transoceânicos, inaugurados e
ampliados terminais de carga e descarga de petróleo e derivados, refinarias e
construídos polidutos de dimensão interestadual e internacional. O Brasil se destaca
dos outros países pela instalação de unidades de produção de petróleo em altas
profundidades, por intermédio das plataformas da Bacia de Campos, na costa do Rio
de Janeiro, profundidades estas que variam entre 1.080 e 1.250 metros
(http://www2.petrobras.com.br/EspacoConhecer/sobrepetroleo/Origemperspectiv
as.asp).
O uso principal atual do petróleo é como combustível para aviões e
automóveis. No mundo industrializado, nada menos do que 97% dos meios de
transporte são movidos a petróleo. Além disso, é amplamente utilizado na indústria
petroquímica para a produção de plásticos, e em sua forma mais bruta, na
pavimentação de ruas e estradas (TSALIK & SCHIFFRIN, 2005). Sendo a principal
fonte de energia do planeta, uma riqueza distribuída de forma não igual entre os
países e um recurso não-renovável, o petróleo se tornou provavelmente a mais
importante substância negociada entre países e corporações, e tem sido, desde o
34
século XX, um fator político importante e causador de crises entre governos,
levando explícita ou, na maior parte dos casos, implicitamente, a guerras,
massacres e extermínios.
1.1. O impacto ambiental da contaminação por petróleo
A invenção do motor de combustão interna e sua adoção rápida nas mais
diversas formas de transporte ampliaram o emprego desse recurso natural,
aumentando a demanda e com isso a produção, o transporte, a armazenagem, o
refino e a distribuição tanto do óleo cru quanto de seus derivados. Todas essas
atividades envolvem riscos de derrames acidentais, que podem ser minimizados,
mas não totalmente eliminados. Estas atividades estão envolvidas em 90% dos
acidentes resultantes da exploração e utilização do petróleo, e somente os 10%
restantes são atribuídos às grandes catástrofes de derrames, principalmente em
alto mar, resultando na contaminação de regiões costeiras (PRINCE, 1993; BALBA,
AL-AWANDI & AL-DAHER, 1998; ANDRADE et al., 2004; TRINDADE et al., 2005; WEI,
MATHER & FOTHERINGHAM, 2005; OKOH & TREJO-HERNANDEZ, 2006).
A contaminação dos solos pelo petróleo e seus derivados pode ser distribuída
pelas três fases do solo (gasosa, líquida e sólida), devido à volatilidade, à
solubilidade e à carga iônica do contaminante gerando grande impacto ambiental
(CACCIATORE & MCNEIL, 1995). Os hidrocarbonetos ligam-se fortemente a
superfícies sólidas, incluindo os solos, e a remediação destes materiais representa
um grande desafio. Como o petróleo contém compostos tóxicos como benzeno,
tolueno, etilbenzeno, xilenos e naftaleno, esta contaminação pode ser perigosa
para plantas, animais e humanos (TING, HU & TAN, 1999; VASUDEVAN & RAJARAM,
2001; OKOH & TREJO-HERNANDEZ, 2006). Os hidrocarbonetos mais leves, além de
tóxicos, tendem a volatilizar na atmosfera, reduzindo a qualidade do ar. De
maneira geral, o petróleo e seus derivados estão associados ao aumento da
incidência de diversos tipos de câncer e outras doenças no homem (SEYMOUR &
HENRY, 2001; CAIRNEY et al., 2002; HIEDA, TSUJINO & TAKESHITA, 2005). Além
disso, tanto os HPAs quanto seus derivados possuem um potencial tóxico,
mutagênico e carcinogênico (PEREIRA NETTO et al., 2000; BOSETTI, BOFFETTA & LA
35
VECCHIA, 2007; BURSTYN et al., 2007). Os HPAs que apresentam entre 4 e 6 anéis
aromáticos são altamente mutagênicos e carcinogênicos, enquanto os de 2 a 3 anéis
aromáticos, apesar de menos mutagênicos, são altamente tóxicos (NYLANDER et
al., 1978; HALDER et al., 1986; HENRY, 1998; RITCHIE et al., 2001).
Visando tornar o processo de descontaminação acessível economicamente,
pesquisadores vêm testando estratégias tecnológicas, que incluem esquemas
biotecnológicos, para tratar locais contaminados. Nestes tratamentos, os
microrganismos podem representar uma alternativa eficaz na recuperação do
ambiente atingido (SINGH, MULLIN & WARD, 2001).
2. Biorremediação
A busca de alternativas para reduzir os impactos e aumentar a capacidade de
recuperação do meio ambiente no caso de eventuais derrames de óleo é
imprescindível. Além disso, a remediação de solos contaminados com
hidrocarbonetos do petróleo também diminui o risco da contaminação dos lençóis
freáticos (HUGHES et al., 1997; MARGESIN, 2000; OKOH & TREJO-HERNANDEZ,
2006).
Solos contaminados por vazamentos de petróleo e água produzida podem ser
tratados por diversos processos biológicos, físicos, químicos ou físico-químicos. Os
tratamentos físicos envolvem a separação das fases do solo e contaminante. Já os
tratamentos químicos se baseiam nas diferenças das propriedades químicas dos
diversos componentes dos contaminantes e envolvem, geralmente, uma ou mais
reações químicas de neutralização, fotólise e/ou oxirredução (KHAN, HUSAIN &
HEJAZI, 2004).
Os processos biológicos, quando comparados aos processos físico-químicos, são
mais seguros, menos onerosos e menos agressivos ao meio ambiente. São, portanto
ecologicamente aceitáveis, uma vez que, na maioria dos casos, concentram seus
esforços em otimizar, tão somente, o processo naturalmente existente nos solos
utilizando a atividade microbiana para degradar os contaminantes sendo por isso
conhecido como biorremediação (MOLINA-BARAHONA et al., 2004; D'ANNIBALE et
al., 2006).
36
O conceito de biorremediação foi introduzido no fim da década de 1980.
Atualmente é definida como qualquer processo que use microrganismos ou suas
enzimas para remover ou reduzir a concentração de poluentes do ambiente. Os
poluentes são degradados através do metabolismo microbiano sob condições
aeróbias ou anaeróbias resultando na mineralização completa dos contaminantes,
sendo convertidos a dióxido de carbono e água e compostos inorgânicos de
nitrogênio, fósforo e enxofre. Ou os poluentes são transformados em compostos não
tóxicos ou menor toxicidade em concentrações não dectáveis ou, se detectável, em
concentrações abaixo do limite estabelecido como seguro ou aceitável pelas
agências de controle ambiental (KORDA et al., 1997; SHUHONG et al., 2005; OKOH
& TREJO-HERNANDEZ, 2006).
É um processo atrativo devido à baixa relação custo-benefício na
mineralização do poluente. Entre os fatores que contribuem para a redução de
custos do processo de biorremediação pode-se citar que esta tecnologia requer
menos insumos para o monitoramento e a manutenção (OKOH & TREJO-HERNANDEZ,
2006).
A biorremediação oferece uma alternativa eficiente para o tratamento da
poluição pelo petróleo, já que a maioria das moléculas encontradas no petróleo cru
e nos produtos refinados é biodegradável e os microrganismos degradadores de óleo
são ubíquos (FAYAD & OVERTON, 1995; AISLABIE, MCLEOD & FRASER, 1998;
CHAINEAU et al., 2000).
A biorremediação de solos contaminados com petróleo vem sendo investigada
desde o fim da década de 1940, mas o interesse neste campo cresceu após o
derrame de óleo de Exxon Valdez, um petroleiro da empresa Exxon, em 1989. O
navio havia partido do terminal petrolífero de Valdez, no Alasca, em 23 de março e
bateu em um recife nas primeiras horas do dia 24 de março. Com o rompimento do
casco do navio, de 50.000 m³ a 150.000 m³ de óleo foram derramados no mar e a
área atingida chegou a 1.200 km
2
(LINDSTROM et al., 1991; MARGESIN & SCHINNER,
1997; JACKSON & PARDUE, 1998). Desde então, um grande número de estudos já
foram realizados e a biorremediação se mostrou quase sempre um tratamento
efetivo de locais contaminados com hidrocarbonetos (HUESEMANN & MOORE, 1993;
37
LI, ZHANG & XU, 1995; ZHOU & CRAWFORD, 1995; HUGHES et al., 1997; LIEBEG &
CUTRIGHT, 1999; VIDALI, 2001; MEDINA-BELLVER et al., 2005; SCOW & HICKS, 2005;
LEFEBVRE & MOLETTA, 2006; GARCIA-BLANCO et al., 2007; JØRGENSEN, 2007;
SALINAS-MARTÍNEZ et al., 2007).
Diferentes técnicas são utilizadas no processo de biorremediação e podem ser
aplicadas in situ ou ex situ. Nos processos in situ, a remediação é feita no próprio
local onde ocorreu a contaminação, sem a necessidade de escavação e remoção do
solo contaminado. No caso de técnicas ex situ, o solo é escavado, para ser tratado
numa instalação de depuração específica no local (on site) ou o solo contaminado é
transportado para um outro local (off site), para só então ser tratado. A aplicação
de técnicas que podem ser realizadas in situ é sempre recomendável por questões
econômicas e de menor agressão ao meio ambiente. Entretanto, existem casos cuja
remoção do material contaminado de sua origem para um local adequado, com um
tratamento posterior, é exigida para evitar riscos de alastramento da área
contaminada, como contaminação de cursos de água ou lençóis freáticos. As
tecnologias de biorremediação in situ possuem um baixo custo relativo quando
comparadas às tecnologias ex situ, entretanto há uma grande dificuldade de aplicá-
las na recuperação em solos que apresentem características argilosas (ALEXANDER,
1999; PLETSCH, ARAUJO & CHARLWOOD, 1999; BOOPATHY, 2000).
A atenuação natural ou bioatenuação consiste simplesmente em observar ao
longo de um certo tempo a degradação natural dos contaminantes. Concentra-se na
capacidade de biodegradação intrínseca das comunidades microbianas indígenas. É
viável nos casos em que ocorrem condições naturais favoráveis, mas é necessário
monitorar o progresso da degradação pela comunidade microbiana autóctone para
assegurar que a concentração de contaminantes diminuiu ao longo do tempo. Este
monitoramento é válido quando não existem grandes ameaças à saúde humana e
onde o impacto não está se espalhando rapidamente (PHILP & ATLAS, 2005; SCOW &
HICKS, 2005).
Os microrganismos do solo possuem uma ampla gama de atividades catabólicas
e uma forma simples de degradar poluentes é deixar que a comunidade microbiana
do solo possa atuar. Sanchez e colaboradores (2000) descrevem a atenuação natural
38
como uma coleção de processos biológicos, químicos e físicos que ocorrem
naturalmente resultando na contenção, transformação ou destruição das
substâncias químicas indesejáveis no ambiente.
A bioestimulação ocorre através do estímulo intencional das populações de
microrganismos indígenas degradadores de xenobiontes. É realizada pela adição de
doadores de elétrons, água e nutrientes como nitrogênio, fósforo, potássio e
elementos traço visando fomentar o crescimento e conseqüentemente o aumento
da atividade metabólica na degradação de contaminantes. A introdução de
nutrientes pode ser feita sob a forma de fertilizantes orgânicos e/ou inorgânicos.
Nesse mesmo processo, também são realizadas correções de parâmetros como
umidade, temperatura e pH (ORZECH, SOLYST & THOMPSON, 1991; TRINDADE et
al., 2005; OKOH & TREJO-HERNANDEZ, 2006; SALINAS-MARTÍNEZ et al., 2007).
Um exemplo de aplicação bem sucedida da bioestimulação foi após o acidente
com o navio Exxon Valdez que derramou toneladas de óleo cru contaminando
quilômetros de praia. Para a limpeza da areia foram adicionados fertilizantes para
acelerar crescimento de microrganismos e conseqüentemente a degradação do
óleo. A degradação de hidrocarbonetos foi intensificada durante um dos maiores
tratamentos de biostimulação, no qual aproximadamente 50.000 kg de N e 5.000 kg
de P foram adicionados ao longo de sucessivos verões após o derrame (LINDSTROM
et al., 1991; PRITCHARD et al., 1992; BRAGG et al., 1994).
A estratégia de bioaumento ou bioenriquecimento se realiza a introdução de
microrganismos crescidos em laboratório que possuem características apropriadas
para a degradação dos compostos poluentes (PRINCE, 1993; ATLAS & CERNIGLIA,
1995; KORDA et al., 1997; WIDADA, NOJIRI & OMORI, 2002; SCOW & HICKS, 2005).
O bioaumento é um método que envolve a introdução direta no solo de
microrganismos crescidos em laboratório com habilidade para a degradação do
poluente. O objetivo é aumentar a biodegradação do composto poluente e reduzir o
período de adaptação dos microrganismos presentes nos locais contaminados. Estes
microrganismos podem ser provenientes do próprio local contaminado ou
comercializados por grandes empresas ou geneticamente modificados. Quando os
microrganismos inoculados são endógenos, extraídos do próprio solo contaminado,
39
crescidos in vitro e re-introduzidos no ambiente em maior concentração, esta
estratégia recebe a denominação de bioaumento.Quando os microrganismos
inoculados são exógenos, a estratégia é denominada bioenriquecimento. É
especialmente aplicada em situações onde a população microbiana degradadora dos
sítios contaminados é pequena ou não é capaz de degradar o poluente porém, é
necessário que os microganismos escolhidos tenham habilidade de degradar a maior
parte dos contaminantes, possuam estabilidade genética, alto nível de atividade
enzimática, capacidade de competir com a população intrínseca do solo, não sejam
patogênicos e não produzam substâncias tóxicas durante o processo de
biodegradação. Os microrganismos devem ser submetidos a uma seleção induzida
com o objetivo de aumentar a sua capacidade de degradar contaminantes
específicos e melhorar a adaptação às condições do sistema contaminado. A
possibilidade de efeitos ecológicos adversos a partir da introdução de
microrganismos exógenos ou geneticamente modificados deve ser examinada e
minimizada (LEAHY & COLWELL, 1990; ORZECH, SOLYST & THOMPSON, 1991;
PROVIDENTI, LEE & TREVORS, 1993; ROMANTSCHUK et al., 2000; EL FANTROUSSI &
AGATHOS, 2005; SINGER, VAN DER GAST & THOMPSON, 2005; THOMPSON et al.,
2005; URGUN-DEMIRTAS, STARK & PAGILLA, 2006; COPPOTELLI et al., 2007).
Esses métodos de biorremediação podem ainda ser otimizados e combinados
para acelerar o processo de biodegradação natural e diversos métodos biológicos já
foram descritos para o processamento dos resíduos petrolíferos em solos
contaminados com óleo (PRINCE, 1993; ATLAS & CERNIGLIA, 1995; KORDA et al.,
1997).
O “landfarming” é um sistema de tratamento ex situ de resíduos e efluentes
contaminados no solo, muito utilizado para a disposição e degradação de resíduos
oleosos (borra) resultante de operações de refino de petróleo. Os resíduos são
misturados ao solo por meio de equipamentos convencionais, como tratores
equipados com arados e/ou grades. São então submetidos a uma bioestimulação
através do uso de técnicas agrícolas, adição de nutrientes e aeração mecânica pelo
revolvimento freqüente para aumentar a atividade decompositora dos
microrganismos presentes no solo. Os resíduos são dispostos em células de
40
tratamento de grandes dimensões e misturados à camada superficial do solo onde
há maior atividade microbiana. Desta forma, o processo de biodegradação se dá na
camada superior do solo, entre 15 e 20 centímetros (MARIN, HERNANDEZ & GARCIA,
2004; KATSIVELA et al., 2005; HARMSEN et al., 2007). No entanto, não se
recomenda esta técnica para a areia retirada das praias porque a incorporação ao
solo não permite seu reaproveitamento e também porque à adição de grandes
quantidades de areia reduz a eficiência do landfarming, alterando suas
características físicas, químicas e biológicas
(http://www.cetesb.sp.gov.br/emergencia/acidentes/vazamento/acoes/
residuos_tratamento.asp).
O sistema de biopilhas é uma tecnologia ex situ de biorremediação, que
envolve o empilhamento do solo contaminados. A biopilha utiliza área menor
porque o material contaminado é disposto em pilhas sobrepostas verticalmente. O
objetivo do processo é estimular a atividade microbiana aeróbia acelerando a
degradação do poluente pela aeração, adição de nutrientes e correção de umidade,
pH e temperatura do solo. Há um maior controle em termos de emissões poluentes
e risco de contaminação ambiental (através do uso de base de material
impermeável e cobertura da biopilha para controle de emissões atmosféricas)
(KHAN, HUSAIN & HEJAZI, 2004; LI et al., 2004). Este sistema tem muito sucesso na
remediação de locais contaminados por compostos orgânicos, em especial, na
degradação de hidrocarbonetos de petróleo (JØRGENSEN, PUUSTINEN & SUORTTI,
2000; LI et al., 2004).
A fitorremediação é a técnica de utilização de plantas para a remediação in
situ de solos contaminados e utiliza processos que ocorrem naturalmente nas
plantas para acelerar a degradação e a remoção de contaminantes. Os principais
processos são: fito-estabilização dos contaminantes que são incorporados à lignina
da estrutura vegetal; fito-estimulação dos microrganismos degradadores da
rizosfera; fito-volatilização de íons que são absorvidos pelas raízes, convertidos em
formas não tóxicas e liberados à atmosfera; fito-degradação de contaminantes
orgânicos nas células vegetais, e rizo-filtração dos contaminantes em meio aquoso
41
através do sistema radicular das plantas (FLATHMAN & LANZA, 1998; US EPA, 1999,
2000a, 2001; THOMA, BEYROUTY & WOLF, 2001).
Os biorreatores são sistemas completamente fechados onde o poluente e o
microrganismo ou a comunidade microbiana são colocados em contato. Além disso,
nos biorreatores, há maior controle das variáveis do processo como aeração,
umidade, temperatura e pH (PLETSCH, ARAUJO & CHARLWOOD, 1999; BOOPATHY,
2000; POINTING, 2001; LITCHFIELD, 2005).
Diversos autores destacam que o emprego de biorreatores no tratamento de
solos contaminados por hidrocarbonetos de petróleo tende a melhorar a
biodegradação destes contaminantes devido à melhor incorporação de oxigênio, de
nutrientes e um sistema eficiente de homogeneização. Neste caso pode-se aplicar
tanto reatores de fase semi-sólida (ou reatores de lama), quanto reatores de fase
sólida. No tratamento em biorreatores de fase semisólida, após a escavação e
peneiramento do solo contaminado, este é misturado a água em um reator
geralmente vertical. A lama gerada poderá conter mais ou menos sólidos (de 10 a
40%) em função do tipo de solo, dos equipamentos de agitação e aeração
disponíveis e da taxa de remoção dos contaminantes a ser atingida. Este tipo de
reator é mais indicado para solos que contenham partículas finas. No tratamento
em biorreatores de fase sólida, adiciona-se ao solo apenas quantidade de água
suficiente para manter a atividade microbiana (50 a 75% de sólidos) e o
equipamento, geralmente, é disposto horizontalmente, podendo apresentar tambor
rotativo ou tambor fixo (BRINKMANN, RÖHRS & SCHÜGERL, 1998; ALEXANDER, 1999;
WOO & PARK, 1999).
Recentemente, uma técnica designada “surface display”, que permite a
expressão de proteínas funcionais na superfície celular dotando microrganismos
com novas habilidades, vem sendo aplicada como uma nova área na
biorremediação. A remediação é realizada através da utilização de microrganismos
geneticamente modificados expressando proteínas ou peptídeos específicos para a
absorção ou adsorção de contaminantes inorgânicos e a biodegradação de
xenobiontes. Uma variedade de novos sistemas de expressão de superfície já foi
relatada para leveduras e bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (CHEN &
42
GEORGIOU, 2002; ZHANG et al., 2004b; LEI, MULCHANDANI & CHEN, 2005; DONG et
al., 2006b; NARITA et al., 2006; SALEEM et al., 2008; WU, MULCHANDANI & CHEN,
2008).
Muitos microrganismos são eficientes na degradação de hidrocarbonetos e
possuem uma versatilidade metabólica que permite a utilização do petróleo como
única fonte de carbono (BOUWER & ZEHNDER, 1993; VAN HAMME, SINGH & WARD,
2003). A capacidade dos microrganismos do solo em degradar os hidrocarbonetos
provenientes de derrames de petróleo e derivados, convertendo estas moléculas
complexas em moléculas mais simples e/ou menos tóxicas, já foi amplamente
estudada (SHIARIS, 1989; ATLAS & BARTHA, 1993; KORDA et al., 1997; WU et al.,
2008). Além disso, uma grande quantidade de microrganismos com capacidade de
degradar diversos compostos, como benzeno, fenol e naftaleno, já foi isolada e
caracterizada (DICKEL, HAUG & KNACKMUS, 1993; FAISON, 2001). Dentre eles, as
bactérias são as mais estudadas para aplicação na biorremediação. Este fato se
deve à facilidade de cultivo e manipulação genética, capacidade de metabolizar
organo-clorados, capacidade de mineralização de diversos compostos químicos e a
utilização dos mesmos como fonte de energia (BROSSERT & BARTHA, 1984; BOUWER
& ZEHNDER, 1993; ATLAS & CERNIGLIA, 1995).
Vale ressaltar que, embora o potencial dos microrganismos em degradar
compostos orgânicos sob condições favoráveis seja elevado, já tendo sido relatado
que cada microrganismo individualmente pode mineralizar somente um número
limitado de hidrocarbonetos. Ainda não foi descrita nenhuma espécie capaz de
degradar todos os componentes do petróleo e não há relatos de nenhum “super
organismo” degradador de óleo desenvolvido por engenharia genética. Compostos
orgânicos de baixo massa molecular e estrutura molecular simples são os preferidos
pela maioria dos microrganismos (ATLAS & CERNIGLIA, 1995). Compostos com
estruturas mais complexas, como HPAs, com mais de cinco anéis de benzeno, são
mais resistentes à ação microbiana (CERNIGLIA et al., 1985; CERNIGLIA, WHITE &
HEFLICH, 1985; BROSSERT & BARTHA, 1986). Dessa forma, a biodegradação eficaz
do petróleo requer uma mistura de grupos de populações, com uma ampla gama de
capacidade enzimática, composta de diversos gêneros, cada qual capaz de
43
metabolizar seus respectivos compostos (KORDA et al., 1997; GHAZALI et al., 2004).
Devido à esperada superioridade e versatilidade metabólica de misturas de culturas
sobre as culturas puras, elas vêm sendo aplicadas para o tratamento de petróleo e
derivados, bem como de resíduos da indústria do petróleo (VAN HAMME, ODUMERU
& WARD, 2000; DIAZ et al., 2002; RAHMAN et al., 2002; JACQUES et al., 2008;
SALINAS-MARTÍNEZ et al., 2007) e não somente para aplicação na descontaminação
de solo como também de água (ANONYMOUS, 1993b; CHEN & TAYLOR, 1997).
Várias estirpes de fungos e actinomicetos já foram confirmadas como agentes
importantes na biorremediação de áreas contaminadas com hidrocarbonetos (APRIL,
FOGHT & CURRAH, 2000; MEYSAMI & BAHERI, 2003; HAMAMURA et al., 2006; ZHANG
et al., 2006). A maioria dos microrganismos que são freqüentemente identificados
como membros ativos de consórcios microbianos de biorremediação pertencem aos
gêneros Acinetobacter, Actinobacter, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus,
Berjerinckia, Burkholderia, Flavobacterium, Methylosinus, Mycobacterium,
Mycococcus, Nitrosomonas, Nocardia, Penicillium, Phanerochaete, Pseudomonas,
Rhizoctonia, Serratia, Trametes e Xanthobacter (OKOH et al., 2001; CHAILLANA et
al., 2004; OKOH & TREJO-HERNANDEZ, 2006).
Algumas estirpes comerciais vêm sendo utilizadas para a realização de
bioaumento (RASNICK, 1998), como Rhodococcus erythropolis BKM Ac-1339D
(ANONYMOUS, 1993a), Bacillus sp. BKPM B-5467 (ANONYMOUS, 1992), Pseudomonas
putida CCM 4307 (ANONYMOUS, 1993b), Candida sp. M23-2 (ANONYMOUS, 1994a) e
Trichoderma sp. AP-5 (ANONYMOUS, 1994b).
No entanto, embora excelentes resultados tenham sido obtidos em
experimentos de biorremediação em laboratório, não existe garantia de que os
microrganismos terão o mesmo comportamento em campo. Muitos compostos que
são facilmente metabolizados in vitro não são degradados eficientemente no
ambiente. Isto pode estar relacionado à diminuição da biodisponibilidade causada
pela adsorção dos compostos nas partículas do solo ou em soluções de fase líquida
não-aquosas e à distribuição das populações bacterianas no solo. Dessa forma,
muitos pesquisadores vêm ressaltando a importância dos fatores que controlam a
biodisponibilidade dos contaminantes orgânicos e dos métodos para aumentar a
44
viabilidade e atividade microbiana, além do monitoramento da biorremediação, da
ecologia e do destino de microrganismos eventualmente introduzidos no ambiente
(ALEXANDER, 1991; KORDA et al., 1997).
A estratégia de biorremediação de escolha depende de peculiaridades do local
contaminado e do tipo de contaminante. Quatro aspectos são importantes:
composição microbiana, tipo de contaminante, geologia e condições químicas do
ambiente contaminado (AICHBERGER et al., 2005; CAPPELLO et al., 2007). Uma
avaliação detalhada deve ser realizada, para compreender as populações
microbianas presentes no solo; identificar a existência de populaçoes microbianas
que degradem o contaminante; identificar as necessidades químicas dessas
populações e maximizar a produção de energia; reconhecer os sub-produtos de
degradação dos contaminantes; identificar a existência de compostos e efeitos
inibidores; estimar a taxa de biodegradação, e projetar e dimensionar o sistema de
biorremediação. Além disso, são necessários estudos de otimização das condições
do processo para a aplicação de estratégias de biorremediação em zonas climáticas
diversas (CETESB, 2001a; OKOH & TREJO-HERNANDEZ, 2006).
2.1. A biorremediação no Brasil
A tecnologia de biorremediação tem sido aplicada em escala operacional nos
Estados Unidos e no Canadá e em países da Europa, como a Alemanha, Holanda,
França e Itália (WINTER, MEYERS & DEEVER, 1993; SPILBORGHS & CASARINI, 1998;
WARD & SINGH, 2001).
No Brasil, somente o estado de São Paulo, por intermédio da Companhia de
Tecnologia de Saneamento Ambiental (CETESB), que fiscaliza e orienta a maioria
dos projetos de remediações do Brasil, estabeleceu valores orientadores de
proteção da qualidade de solo e de águas subterrâneas (CETESB, 2001b; CETESB,
2005, Seabra, 2005). Novos procedimentos, apresentados na metade de 2007, foram
incluídos no manual de gerenciamento de áreas contaminadas da CETESB. Este fato,
aliado ao aumento da fiscalização ambiental, vem incentivando a expansão do
segmento de empresas especializadas na remediação de solos e águas subterrâneas
(FURTADO, 2008).
45
No entanto, a maioria dos projetos de biorremediação no Brasil permanece
ainda no campo da teoria, com poucos casos práticos de uso. Em São Paulo, por
exemplo, as tecnologias de remediação implantadas em sua maioria são em postos
de gasolina e utilizam as tecnologias mais básicas, de bombeamento e tratamento
(“pump and treat”), onde são instaladas bombas para extrair a água contaminada e
tratá-la, bombas de extração de vapores e extração multifásica (MPE), onde são
combinadas bombas de vácuo para extrair vapores e água subterrânea para remover
as fases líquida e gasosa do mesmo poço. Somente algumas poucas tecnologias
utilizadas em São Paulo são de biorremediação (FURTADO, 2006).
Um exemplo de empresa que se desenvolveu para atender à demanda em
postos de combustível é a Servmar, de São Paulo. De propriedade de um grupo
especializado em distribuição de combustíveis, o Unipetro, a Servmar há cerca de
três anos passou a formar uma equipe de engenharia ambiental para atender à
demanda dos postos. Nesse período foram iniciados cerca de 90 casos de
remediação de hidrocarbonetos em postos. A maior parte dos serviços de
remediação foram de “pump and treat” e de MPE, mas a biorremediação também
foi utilizada nessas contaminações de hidrocarbonetos (FURTADO, 2005).
No entanto, o número de sistemas de biorremediação de solo pode ser maior
que o observado uma vez que nem todos são relatados. A técnica de biopilha, por
exemplo, já foi aplicada em diferentes regiões do Brasil em escala semi-industrial e
industrial. Contudo, poucos foram os registros dos resultados apresentados na
literatura técnica (Seabra, 2005).
Apesar das pesquisas e de várias consultas para a aplicação em solos, grande
parte da aplicação de consórcios microbianos consumidos como “aditivos
biológicos” no Brasil ainda se destina à remoção de material orgânico em efluentes,
tanto industriais, como domiciliares, em biodegradação de caixas de gordura, fossas
sépticas ou redes de esgoto de restaurantes (FURTADO, 2006).
As principais empresas são de grupos internacionais, presentes no Brasil desde
o início da década de 90. Além da BioSystems, há cerca de sete anos com filial em
São Paulo, vale destacar a americana Micro-Bac, uma das primeiras a vender seus
produtos no País por meio de uma representante em Cotia (SP). A produção local de
46
formulações de microrganismos fica por conta da Hábil Química, uma empresa de
Sorocaba (SP) que, depois de dois anos de estudos, ingressou nesse mercado em
2000 ofertando produtos a custos menores do que os de seus concorrentes
importadores (FURTADO, 2000).
Embora ainda não tenha sido publicada resolução do IBAMA para registro de
consórcios microbianos utilizados em biorremediação como “aditivos biológicos”,
essas empresas não são proibidas de comercializar os aditivos para a indústria, visto
que limitações só existam para os produtos geneticamente modificados. Quando a
aplicação é domiciliar, mercado mais atendido pela Bio-Brasil com sua linha de
bactérias para supermercados e lojas especializadas, o Ministério da Saúde concede
registro (FURTADO, 2000).
Para a indústria, os produtos da Bio-Brasil são específicos para
hidrocarbonetos, fenóis, proteínas e açúcares. Os da Micro-Bac, empresa mais
concentrada no setor industrial, são divididos em três linhas: a Mega-Bac, aditivos
bacterianos para efluentes e caixas de gordura com óleos insaturados de curtumes,
frigoríficos e de indústria de alimentos; o Lacto-Bac, voltado para degradar restos
de gordura, óleo, leite, carboidratos e proteínas; e a linha M-1000, indicada para
poluentes persistentes, sobretudo clorados (FURTADO, 2000).
O início das operações da Micro-Bac, empresa do Texas, EUA, tem a ver com o
desenvolvimento de bactérias para poços de petróleo, nos quais microrganismos
(especialmente Anthrobacter sp.) degradavam apenas o acúmulo de parafina nos
poços, permitindo melhor extração do petróleo. Esse conhecimento em plataformas
petrolíferas levou a empresa a explorar essas espécies em derrames de petróleo e
de resíduos petroquímicos. Atualmente, a linha M1000 está em estudo de aplicação
em biorremediação na COPENE, em Camaçari, na Bahia (FURTADO, 2000).
Além do propósito de criar uma solução ambiental brasileira, a pesquisa da
EMBRAPA Meio Ambiente, de Jaguariúna (SP), em biorremediação de solos
contaminados por agrotóxicos, utiliza microrganismos nativos e visa também
baratear a descontaminação. Depois de cinco anos em desenvolvimento a EMBRAPA
já possui os granulados com os microrganismos inoculados. A única etapa ainda a
ser finalizada é a da formulação por escrito dos aditivos biológicos, para efeito de
47
patenteamento da tecnologia. Vários tipos de fungos e bactérias já se tornaram o
princípio ativo de granulados com argila e matriz polimérica. E cada um desses
aditivos, de forma seletiva, tem a função de degradar os principais pesticidas
consumidos no Brasil, atualmente considerado o terceiro maior país consumidor do
mundo. Alguns deles atingiram mais de 80% de degradação de pesticidas em sete
dias de exposição (FURTADO, 2000).
Empresas do mercado local contam com estratégias voltadas para acelerar a
atenuação natural. A Geoklock, de São Paulo, firmou um acordo em 2003 com a
consultoria alemã IBL-Umwelt-Und Biotechnik. Este acordo permitiu que o grupo
passasse a estudar e a lentamente aplicar as técnicas de bioestimulação como
técnica complementar a programas de extração física em alguns casos de
remediação sob sua responsabilidade. O contato com os técnicos alemães, que já
traziam a experiência européia no assunto, serviu em uma primeira análise para
identificar as possibilidades da tecnologia no Brasil. As dificuldades estavam
relacionadas à heterogeneidade do solo brasileiro (principalmente no que se refere
aos solos argilosos, muito comuns no país) que dificultava a distribuição dos
nutrientes para a bioestimulação. A técnica foi empregada no bairro de Santo
Amaro, em São Paulo, em solo contaminado por percloroetileno, proveniente de
uma metalúrgica que utilizava este solvente clorado para desengraxe. A equipe da
Geoklock montou um sistema de injeção de amônia, polifosfato e melaço para
bioestimular o metabolismo bacteriano de forma complementar a um programa de
extração multifásica, que remove compostos líquidos e voláteis, iniciado em 2005
(FURTADO, 2006).
Uma outra empresa da área, a Arcadis Hidroambiente (a empresa holandesa
Arcadis que adquiriu 70% da nacional Hidroambiente em 2001) com filial em Cotia
(SP), também começa a se enveredar no mercado da biorremediação com uma
tecnologia utilizada pelo grupo em vários lugares do mundo baseada na injeção de
doadores de elétrons, uma fonte de carbono com água. No Brasil, a fonte utilizada
é o melaço de cana. Em um experimento de bioestimulação de colônias de
bactérias de um sítio contaminado por BTEX da Akzo Nobel em Cotia, cuja
remediação é feita pela Arcadis, as bactérias bioestimuladas com oxigênio,
48
nutrientes (NPK), vitaminas e sais minerais conseguiram acelerar a degradação
natural dos hidrocarbonetos de 350 dias para uma média de 8 a 12 dias (FURTADO,
2006).
A Tecnohidro Projetos Ambientais é uma empresa de Engenharia e Consultoria
Ambiental para indústrias de mineração, construtoras e companhias de petróleo e
energia. Sediada na cidade de São Paulo, com filial em Belo Horizonte (MG), desde
2005 a Tecnohidro desenvolve projetos de estações de tratamento de efluentes
industriais e sistemas de remediação ambiental em bases, terminais de distribuição
de combustível, refinarias de petróleo e áreas industriais da Petrobras, distribuídas
em todo o Brasil. Em março de 2003, a Tecnohidro foi contratada para desenvolver
a avaliação de risco toxicológico da contaminação gerada pela disposição de
resíduos em valas escavadas no solo e subseqüente estudo de alternativas de
remediação. A avaliação de risco toxicológico apontou que o resíduo encontrado
caracterizava-se por óleo de alimentação de caldeiras, restringindo os compostos
químicos de interesse a TPHs e compostos orgânicos voláteis (VOCs). Esses últimos
não foram detectados na área e, portanto, não apresentavam riscos no local. O
estudo de alternativas de remediação apontou a técnica de biodegradação em
biopilha como ideal para a mitigação da contaminação ocorrida na área. A etapa de
remediação da área foi concluída satisfatoriamente, tanto para a companhia
contratante como para o órgão ambiental (www.tecnohidro.com.br).
A Lumina Engenharia Ambiental, empresa da Organização Odebrecht em
parceria com a Cetrel, empresa de engenharia ambiental, atua no tratamento de
resíduos industriais, a atuação se dá através da associação da Lumina com a Cetrel,
que resultou na formação da Cetrel Lumina, empresa criada por ambas as
companhias para este fim. Fundada há 27 anos para tratar os resíduos das empresas
do Pólo Petroquímico de Camaçari (BA), a Cetrel hoje presta serviços a outras
indústrias em outras regiões do Brasil. Outro foco de atuação da Cetrel Lumina é a
descontaminação de áreas degradadas e serviços de emergência nos derramamentos
de óleo, trabalhando em ações integradas com os centros de Defesa Ambiental e de
Defesa Civil para intervir após um acidente com potencial de agressão ao meio
ambiente. Após a definição da necessidade da recuperação da área, a Cetrel
49
Lumina elabora, implanta e opera de projetos de remediação em áreas
contaminadas, utilizando tecnologias de biorremediação como atenuação natural,
biopilha e “landfarming” (http://www.luminaambiental.com.br).
Em 2002 a Petrobras investiu mais de R$ 100 milhões no tratamento de 787 mil
toneladas de resíduos, na maior parte borras oleosas, produzidos pela empresa e
que estavam estocados sem o tratamento adequado. A empresa optou pelo sistema
de biopilhas, aplicado na refinaria de São José dos Campos
(http://infoener.iee.usp.br/infoener/hemeroteca/imagens/60858.htm).
Foi também realizado trabalho de recuperação de área da Petrobrás
degradada por resíduos de óleo, no município de Madre de Deus (BA). Os processos
incluíram dessorção térmica e decomposição em biopilhas. Cada biopilha constituía
um volume aproximado de 90 mil toneladas de solo contaminado do qual foi feito o
monitoramento químico avaliando-se a taxa de degradação do poluente e
monitoramento microbiológico visando a adição de nutrientes para estimular a ação
dos microrganismos indígenas. Com estas práticas, um grande volume de solo
contaminado foi tratado e devolvido ao ambiente para aterro ou rehabilitação nos
anos de 2004 e 2005 (http://www.cnpmf.embrapa.br/index.php?p=pesquisa-
tecnologias-monitoramento_zoneamento.php&menu=3).
Essas resoluções fazem parte do Programa de Desenvolvimento Sustentável da
Petrobras, que começou a ser implementado em meados de 2000. Parte da
motivação veio dos acidentes que ocorreram com a empresa na Baía de Guanabara,
no Rio de Janeiro, em janeiro de 2000 e na refinaria Repar, em Araucária, região
metropolitana de Curitiba, em julho do mesmo ano. A partir destes eventos, todos
os planos de contingência foram revistos e concluiu-se que a remediação de áreas
impactadas era bem mais cara que o tratamento de resíduos
(http://infoener.iee.usp.br/infoener/hemeroteca/imagens/60858.htm).
O segundo maior derramamento de petróleo do País, ocorrido na Refinaria
Presidente Getúlio Vargas (Repar) na localizada em Araucária (PR), está na fase
final de biorremediação. O acidente ocorrido em 16 de julho de 2000 provocou o
vazamento de 4 milhões de litros de petróleo tipo Colombiano que percorreram em
torno de 2 km de áreas internas da Repar, que compreendem o arroio Saldanha.
50
Para as áreas atingidas pelo óleo que ficou retido no solo e no subsolo, foram
determinados estudos de bioestimulação através da utilização de nitrato de
potássio e peróxido de hidrogênio (Castro et al., 2005) e bioaumento (FURTADO,
2002).
Esse foi considerado o maior derrame ocorrido em rio no Brasil. A
biorremediação foi aplicada com o objetivo de remover 96 mil litros de petróleo
retidos no solo de uma área de 15 hectares, entre o local do vazamento e o Rio
Barigüi, afluente do Iguaçu. Dos 4 milhões de litros, cerca de 570 mil evaporaram
nos primeiros dias. Nos três meses seguintes, por volta de 1,3 milhões de litros de
petróleo foram removidos fisicamente dos rios Barigüi e Iguaçu e de suas margens,
ao longo de 65 km, com mantas absorventes e barreiras flutuantes para conter o
avanço da mancha. Dos 2,7 milhões retidos na área interna da Petrobrás, a maior
parte foi recuperada de imediato por bombas a vácuo e manualmente por uma
equipe de 2.700 pessoas. Restaram 132 mil litros de petróleo no solo, dos quais 36
mil em fase livre foram removidos pelo lençol freático superior (a menos de 1 metro
da superfície) por meio de um sistema de canalização que arrasta o óleo do fluxo
subterrâneo para separadores. Portanto, apenas os 96 mil litros restantes desse
óleo, agregados no solo da floresta nativa local, foram submetidos à
biorremediação (FURTADO, 2002).
Antes de iniciar o processo microbiológico em várias áreas contaminadas pelo
vazamento, a empresa já operava com a biorremediação para tratar parte dos
resíduos oleosos gerados pela estação de tratamento de efluentes da refinaria. A
Repar mantém seis terrenos em uma ampla área de “landfarming”, desde meados
da década de 90 para a biodegradação dos resíduos. Essa experiência anterior ao
acidente levou os técnicos de meio ambiente da Petrobrás e uma empresa de
consultoria canadense (Hidrogéo) contratada para coordenar a remediação, a testar
a viabilidade da biorremediação. Para avaliar a biodegradabilidade do óleo
derramado no solo, foram realizadas análises laboratoriais para descobrir sua
toxicidade, o teor de metal pesado e o potencial de biodegradação dos
microrganismos do solo (FURTADO, 2002).
51
Os testes revelaram baixa toxicidade e baixo percentual de metal pesado no
óleo leve derramado (tipo colombiano) o que favoreceria a biorremediação. Em
outubro de 2000, uma das áreas contaminadas, um terreno de 700 metros
quadrados situado ao lado da tubulação onde ocorreu o vazamento, foi utilizada
para experiência piloto (FURTADO, 2002).
Esse terreno foi considerado de média contaminação, por ter na época nível
de TPH entre 10.000 e 30.000 µg/g de solo. Após 70 dias de inoculação com os
microrganismos, o local mostrou-se satisfatoriamente recuperado. Nesse período de
teste, o índice de TPH da sub-área 1 caiu para 3.723 µg/g de solo, inferior ao
considerado pela norma holandesa (Dutch Reference Framework STI – Values) como
medida de solo contaminado e passível de intervenção. O limite é de 5 mil µg/g de
solo (FURTADO, 2002).
Esse experimento piloto viabilizou a biorremediação em outras áreas com
contaminação alta e média através do bioaumento com microrganismos autóctones
(do solo local) desenvolvidos nas áreas de biorremediação dos resíduos, alcançando
índices de eficiência de biodegradação até seis vezes maiores do que o usual no
mundo e levando a Petrobrás a bater um recorde mundial de biorremediação de
solos contaminados por hidrocarbonetos. A tecnologia desenvolvida pela Petrobrás e
cujas pesquisas contaram com o suporte de universidades do sul do País encontra-se
em processo de patenteamento (FURTADO, 2002).
3. Água produzida
Na fase de produção, o petróleo pode vir à superfície espontaneamente,
impelido pela pressão interna dos gases (poços surgentes), mas, quando isso não
ocorre, é preciso usar equipamentos para promover a elevação artificial dos fluidos.
Para manter as condições de pressão na rocha reservatório, fundamentais para a
migração do petróleo para os poços, efetua-se uma operação de injeção de água
nas camadas inferiores da rocha reservatório, e/ou gás nas camadas superiores
(PLANCKAERT, 2005).
A água de injeção é a água introduzida em um reservatório, com o objetivo de
forçar a saída do petróleo da rocha-reservatório, deslocando-o para um poço
52
produtor. Este método é conhecido como “recuperação secundária” e é empregado
quando a pressão do poço torna-se insuficiente para expulsar naturalmente o
petróleo. Além disso, a água é normalmente abundante em unidades de rochas que
acumulam óleo e gás. Como conseqüência desta associação, as cavidades de óleo
produzem tipicamente volumes de água que são muitas vezes mais abundantes que
o óleo (US EPA, 2000b; PLANCKAERT, 2005).
Dessa forma, durante o processo efetivo de extração de petróleo e gás,
grandes volumes de água com sólidos suspensos e dissolvidos são também trazidos à
superfície. Denominada “água produzida”, esta água extraída geralmente contém
várias substâncias altamente tóxicas, incluindo metais pesados (tais como chumbo,
zinco, e mercúrio) e compostos orgânicos voláteis (tais como benzeno e tolueno).
Pode também conter elevados níveis de sal (US EPA, 2000b; TSALIK & SCHIFFRIN,
2005).
À medida que a vida econômica dos poços vai se esgotando, o volume de água
produzida pode exceder até dez vezes o volume de óleo produzido (PLANCKAERT,
2005). Nos Estados Unidos corresponde a aproximadamente oito barris de água para
cada barril de petróleo produzido. A quantidade de água produzida é menor para
poços de gás natural (US EPA, 2000b).
A composição da água produzida fornece informação relevante sobre o
reservatório de petróleo, determina a necessidade do uso de aditivos emulsificantes
e anti-corrosivos, interfere no desenho de manejo e de sistemas de tratamento da
água. O tipo e a abundância dos constituintes dissolvidos na água produzida (sais e
outros compostos) variam dentro e entre bacias geológicas (COLLINS, 1985; DALY &
MESING, 1995). A variabilidade é o resultado de reações geoquímicas entre a água e
a rocha, bem como da história hidrológica e geológica (LAND & PREZBINDOWSKI,
1981; STUEBER, SALLER & ISHIDA, 1998). A ampla distribuição espacial das áreas de
produção de petróleo e a diversidade de composição de água produzida levaram à
criação de um banco de dados americano sobre água produzida com informações
sobre a localização, a situação geológica, tipo de amostra e composição química
(http://energy.cr.usgs.gov/prov/ prodwat/intro.htm).
53
3.1. O impacto ambiental da contaminação por água produzida
O tratamento e a disposição inadequados de água produzida, podem gerar
danos significativos para os residentes, animais e vegetação locais. A água
produzida pode também conter elevados níveis de sal e, se lançada ao solo, pode
ser extremamente prejudicial ao crescimento das plantas nos ecossistemas locais.
Dessa forma, o lançamento de água produzida altamente tóxica ou salina em cursos
d’água ou no solo pode ser extremamente prejudicial aos ecossistemas e o seu
descarte representa um sério problema ambiental. Cuidados especiais devem ser
tomados com o descarte destes efluentes (TSALIK & SCHIFFRIN, 2005).
O derrame da água produzida sem tratamento no ambiente, com quantidades
variadas de sal, inibe o crescimento das plantas, leva ao aumento da erosão e perda
da superfície do solo e gera a contaminação dos lençóis freáticos por sais e
hidrocarbonetos (NICHOLSON & FATHEPURE, 2004). Como altas concentrações de
sal comprometem os processos convencionais de tratamento microbiológico de
águas residuais pelo efeito prejudicial do sal sobre a atividade microbiana
(LUDZACK & NORAN, 1965; LEFEBVRE & MOLETTA, 2006), a biorremediação de
ambientes contaminados com água produzida somente pode ser realizada se as
bactérias indígenas apresentarem característica de biodegradação de compostos do
petróleo e características halofílicas ou halotolerantes, sendo capazes de resistir ao
impacto causado pela alta salinidade da água produzida, mantendo a capacidade de
degradação do óleo (NICHOLSON & FATHEPURE, 2004; LEFEBVRE & MOLETTA, 2006).
A água produzida pode ser tratada através de várias técnicas de remediação,
incluindo processos biológicos. Em muitos casos, a água produzida é reintroduzida
no poço para auxiliar a criar pressão suficiente para a extração. Nesses casos, a
água deve ser tratada adequadamente antes da reinserção para prevenir a
contaminação do solo e do lençol freático. Em alto-mar, a água produzida é
raramente reaproveitada, mas deve ser transportada para o continente para
tratamento (US EPA, 2000b; TSALIK & SCHIFFRIN, 2005).
No Brasil, em 1998, um volume estimado de mais de 93 milhões de litros de
água produzida foi liberado no mar por sete plataformas fixadas na Bacia de
Campos (JEREZ VEGUERIA, GODOY & MIEKELEY, 2002). No entanto, a água
54
produzida gerada durante o processo de extração pode ser utilizada na recuperação
secundária do petróleo. Para tal, a água produzida é re-injetada no aqüífero do
reservatório de petróleo para manter a pressão e empurrar o óleo até os poços de
produção (PLANCKAERT, 2005). Os Estados Unidos produzem cerca de 20 a 30
bilhões de barris de água produzida por ano. A maior parte dessa água produzida é
reciclada pela re-injeção na subsuperfície para manter a pressão de óleo no
reservatório. Entretanto, um percentual estimado de 35% da água produzida requer
descarte porque não pode ser reciclada (http://toxics.usgs.gov/
sites/ph20_page.html).
O campo de Carmópolis (SE), descoberto em 1963, representa a maior
acumulação de petróleo bruto em terra da Petrobras. O pico de produção foi
alcançado em 1989 quando produziu 27 mil barris por dia (bpd). Em dezembro de
2006 foram feitos investimentos visando aumentar os níveis de injeção de água e
aumentar, centralizar e racionalizar as instalações de injeção, produção e
tratamento de água produzida, com significativos ganhos de escala, resultando no
aumento da produção devido ao aumento da recuperação de petróleo. O projeto
previa uma maciça perfuração de poços de produção e injeção e os sistemas de
injeção de água seriam ampliados em 500 mil bpd. O investimento também foi
conferido ao campo de Canto do Amaro no Rio Grande do Norte para eliminar o
descarte de efluentes líquidos, uma vez que toda a água produzida seria re-injetada
nos poços. Em Carmópolis atualmente já não há descarte de efluentes líquidos
(www.acionista.com.br/home/petrobras/221206_investimentos.pdf).
4. Bactérias halofílicas e halotolerantes na biorremediação em ambientes
salinos
Os microrganismos halofílicos e halotolerantes, que possuem a capacidade de
crescer em ambientes salinos, são encontrados nos três domínios da vida: Archaea,
Bacteria e Eukarya (MADIGAN & OREN, 1999; OREN, 1999; MADERN, EBEL & ZACCAI,
2000; MARGESIN & SCHINNER, 2001b; OREN, 2002a,b; NICHOLSON & FATHEPURE,
2005). Existem pelo menos três mecanismos de adaptação a diferentes
concentrações de sal. O primeiro seria um mecanismo passivo no qual o conteúdo
55
de íons citoplasmático seria sempre igual ao do meio. Um segundo mecanismo,
muito usado por diversos organismos, envolve a concentração de solutos
compatíveis para criar um balanço osmótico entre o citoplasma e o ambiente
externo. O terceiro mecanismo envolve mudanças na fisiologia celular para
controlar o movimento de água permitindo a manutenção da célula com um
citoplasma ionicamente diluído (VREELAND, 1987). Como resultado da sua
adaptação a esses ambientes, tais microrganismos desenvolveram propriedades
únicas que podem ser aplicadas em vários campos da biotecnologia: na degradação
ou transformação de poluentes orgânicos, na produção e fermentação de alimentos
e na produção de biopolímeros (como biossurfactantes e enzimas), entre outros
(MARGESIN & SCHINNER, 2001a; OREN, 2002a,b; SANCHEZ-PORRO et al., 2003;
GARCIA, VENTOSA & MELLADO, 2005; LEFEBVRE & MOLETTA, 2006).
Os microrganismos dependentes de sal para crescer são denominados
halofílicos, enquanto os microrganismos que são capazes de crescer tanto na
ausência quanto na presença de sal são chamados de halotolerantes. Os
microrganismos halotolerantes que possuem a capacidade de crescer acima de 15%
(w/v) NaCl são considerados halotolerantes extremos (MARGESIN & SCHINNER,
2001a,b). A classificação mais utilizada para os microrganismos halofílicos é a de
Kushner (1978), que classifica os microrganismos como: ligeiramente halofílicos,
quando apresentam a concentração ótima de NaCl para crescimento em torno de 3%
(0,5 M); halofílicas moderadas, quando os microrganismos apresentam o
crescimento ótimo em meio contendo de 3 a 15% (0,5 a 2,5 M) de NaCl; halofílicas
extremas, quando os microrganismos apresentam ótimo crescimento em meio
contendo de 15 a 30% (2,5 a 5 M) de NaCl. Estes organismos halofílicos moderados e
extremos são de grande interesse no tratamento de efluentes hipersalinos. As
bactérias halotolerantes crescem em ambientes contendo menos de 3% de NaCl,
mas também podem resistir a altas concentrações de sal, coexistindo com bactérias
halofílicas em ambientes hipersalinos (MARQUEZ, VENTOSA & RUIZ-BERRAQUERO,
1987).
Diversos estudos indicam o envolvimento de bactérias halofílicas e
halotolerantes na degradação de poluentes, como óleo cru, hidrocarbonetos e
56
compostos derivados do refino do petróleo (WARD & BROCK, 1978; GAUTHIER et al.,
1992; KUZNETSOV et al., 1992; MCMEEKIN et al., 1993; ASHOK, SAXENA &
MUSARRAT, 1995; PLOTNIKOVA et al., 2001; BRUSA et al., 2001; NICHOLSON &
FATHEPURE, 2004; YAKIMOV, TIMMIS & GOLYSHIN, 2007). Em 1996, foi caracterizada
uma estirpe de Halomonas halodurans isolada de areia da ilha italiana de
Pantelleria e capaz de degradar benzoato (ROMANO et al., 1996). Em 2003, foi
isolada a estirpe halotolerante Bacillus krulwichiae a partir de amostras de solo de
jardim contaminadas com compostos aromáticos, no Japão, capaz de crescer na
presença de 0 a 14% de NaCl e de utilizar benzoato e m-hidroxibenzoato (YUMOTO
et al., 2003). Ainda em 2003, foi isolada próxima do Soap Lake a estirpe de
Halomonas campisalis capaz de degradar fenol e catecol (ALVA & PEYTON, 2003).
Além desses, outros estudos documentaram a degradação de fenol (WOOLARD &
IRVINE, 1995), nitrofenóis (OREN et al., 1992), pesticidas (DEFRANK & CHENG, 1991)
e de herbicidas (MALTSEVA et al., 1996) por organismos halofílicos e halotolerantes.
Entretanto, a habilidade destes microrganismos em sobreviver sob condições
in situ ainda não foi demonstrada. Há pouca informação sobre o efeito da
salinidade sobre a biorremediação de solos. Rhykerd e colaboradores (1995)
observaram um efeito inibitório de salinidade artificial sobre a mineralização de
óleo motor em que o solo foi fertilizado com N e P inorgânicos e acrescido de NaCl
(0,4, 1,2 e 2% m/v). Após 80 dias a 25°C, a maior concentração de sal (a
condutividade da água do solo correspondeu a aproximadamente quatro vezes a da
água do mar) inibiu consideravelmente a mineralização do óleo (inibição de 44% em
solo argiloso e 20% em solo arenoso). A remoção de sal dos solos contaminados com
óleo reduziu o tempo necessário para a biorremediação. Ward & Brock (1978)
relataram uma relação inversa entre a biodegradação de hidrocarbonetos do
petróleo e a salinidade, demonstrando uma menor degradação de óleo mineral em
amostras de culturas de enriquecimento do “Great Salt Lake” com elevada
salinidade, não sendo detectada degradação do óleo em concentrações de sal acima
de 20,4%. Além disso, os autores demonstraram que a degradação de hexadecano
também foi menor nas amostras de elevada salinidade. A oxidação de óleo mineral,
de hexadecano e de glutamato foi do mesmo modo reduzida, indicando que a
57
salinidade representa um problema geral no metabolismo de compostos orgânicos.
Neste estudo, não foi possível obter, através de experimentos de enriquecimento,
microrganismos capazes de usar óleo mineral como uma única fonte de carbono e
energia nas amostras com concentrações de sal acima de 20,4%. Este resultado
corrobora que a salinidade extrema é uma barreira natural ao metabolismo de
hidrocarbonetos. Kerr & Capone (1988) também observaram uma relação entre a
taxa de mineralização de naftaleno e a salinidade em sedimentos do rio Hudson que
era dependente da salinidade do ambiente.
No entanto, Shiaris (1989) reportou uma correlação geralmente positiva entre
a salinidade e o grau de mineralização de fenantreno e naftaleno em sedimentos
estuarinos. Há relatos de microrganismos capazes de oxidar hidrocarbonetos do
petróleo mesmo na presença de 30% de NaCl, como Streptomyces albaxialis, uma
espécie degradadora de óleo cru (KUZNETSOV et al., 1992), uma degradadora de n-
alcano (C10-C30) do gênero Halobacterium (KULICHEVSKAYA et al., 1992) e as oito
estirpes halotolerantes relacionadas a Pseudomonas mendocina isoladas do mar
Mediterrâneo, capazes de degradar tolueno na presença de NaCl (BRUSA et al.,
2001). Bactérias halofílicas já foram empregadas no tratamento de águas residuais
hipersalinas. Um biofilme de halofílicas isoladas do “Great Salt Lake” foi capaz de
remover mais de 99% do fenol do resíduo salino sintético contendo 15% de NaCl. O
biofilme manteve a atividade mesmo com mudanças na concentração de NaCl de 5,
10 e 15% (WOOLARD & IRVINE, 1995). Hinteregger & Streichsbier (1997) relataram a
eficiência de uma estirpe moderadamente halofílica de Halomonas sp. no
tratamento de resíduos fenólicos salinos. Esta estirpe foi capaz de degradar fenol
como fonte única de carbono e energia na presença de até 14% de NaCl. Diaz e
colaboradores (2002) descreveram a biodegradação de petróleo em diferentes
concentrações de sal por um consórcio bacteriano extremamente halotolerante
imobilizado em fibras de polipropileno. A espécie halofílica Methylomicrobium sp.
assimiladora de metano, capaz de oxidar hidrocarbonetos em meios aquosos com 2
a 6% de sal, foi patenteada para biorremediação de água do mar (FUSE et al.,
1998).
58
5. Análise da diversidade e da função da comunidade microbiana em ambientes
contaminados
O maior desafio no campo da biorremediação é determinar a diversidade de
microrganismos presentes em um ambiente contaminado. Analisar a diversidade de
comunidades microbianas, em termos de riqueza e estrutura, é uma forma de se
compreender como estas comunidades reagem no seu ambiente à presença de
contaminantes exógenos. De uma maneira mais ampla, é um meio possível de
avaliar a questão da modulação das comunidades microbianas por contaminantes e
fatores ambientais. Muitas dificuldades são encontradas durante as tentativas de
caracterizar as comunidades microbianas naturais em ambientes contaminados com
hidrocarbonetos do petróleo. Apesar das dificuldades, muitas ferramentas estão
sendo desenvolvidas na tentativa de melhorar os estudos que visam quantificar os
microrganismos e verificar a sua distribuição no ambiente natural, na esperança de
associar essas comunidades com funções do ecossistema (VAN HAMME, SINGH &
WARD, 2003).
Os motivos para a realização de tais análises incluem: descrever o papel dos
microrganismos na gênese do petróleo através do tempo geológico (OMORI et al.,
1992; MARGOT, OLLIVIER & PATEL, 2000), avaliar os efeitos a longo-prazo da
poluição pelo petróleo (LINDSTROM, BARRY & BRADDOCK, 1999), desenvolver e
avaliar a remediação dos resíduos gerados (KA, YU & MOHN, 2001; SICILIANO et al.,
2003) e rastrear o enriquecimento de microrganismos patogênicos durante a
remediação (FOGHT et al., 1996; BERG, ROSKOT & SMALLA, 1999).
As amostras ambientais podem ser usadas para o isolamento de estirpes
microbianas ou para o isolamento de ácidos nucléicos para posterior análise. Dessa
forma, os métodos para analisar a diversidade microbiana e a função da
comunidade no ambiente podem ser divididos em métodos dependentes de cultivo e
independentes de cultivo, sendo que ambos devem incluir técnicas de
caracterização genética (VAN HAMME, SINGH & WARD, 2003).
59
5.1. Isolamento de bactérias degradadoras de óleo no ambiente
Tradicionalmente, a diversidade pode ser acessada pelo uso de métodos
tradicionais, dependentes de cultivo, baseados nas características morfológicas e
fisiológicas dos microrganismos. Isto inclui inóculo em meios de cultura, contagem
dos microrganismos viáveis, a seleção e o isolamento de diferentes morfotipos
coloniais, a caracterização e a identificação dos morfotipos isolados, coloração de
Gram, microscopia e análise bioquímica (WATANABE et al., 1998; VAN HAMME,
SINGH & WARD, 2003; KIRK et al., 2004).
Com relação aos isolados de ambientes contaminados, é importante também
determinar a capacidade de degradação do poluente, suas frações e compostos
derivados (VAN HAMME, SINGH & WARD, 2003; DAS & MUKHERJEE, 2007). Estas
análises devem ser complementadas com técnicas de caracterização genética (VAN
HAMME, SINGH & WARD, 2003).
Os métodos de análise microbiológica clássica podem ser rápidos e de baixo
custo e podem fornecer informações sobre o componente heterotrófico ativo da
população (BALBA, AL-AWANDHI & AL-DAHER, 1998; KIRK et al., 2004). Além disso,
existem sistemas comercialmente disponíveis para avaliar o potencial fisiológico
microbiano através de padrões de assimilação e fermentação de diversas fontes de
carbono como Biolog (Hayward, CA, USA, www.biolog.com) e API (bioMérieux,
France) que geram um perfil fisiológico ou metabólico da comunidade bacteriana ou
fúngica estudada (CLASSEN et al., 2003; KIRK et al., 2004). Estas metodologias são
relativamente fáceis de usar, são reprodutíveis, produzem uma grande quantidade
de dados refletindo as características metabólicas das comunidades e já foram
aplicadas com bastante sucesso em diversos estudos de ecologia microbiana
(GARLAND & MILLS, 1991; ZAK et al., 1994; CAMPBELL, GRAYSTON & HIRST, 1997;
BECKER & STOTTMEISTER, 1998; CHOI & DOBBS, 1999; CLASSEN et al., 2003).
O solo pode ter potencial para transformar ou degradar compostos orgânicos
introduzidos no ambiente, por meio do enriquecimento das populações microbianas
dotadas com a habilidade de degradar tais compostos. Dessa forma, o solo pode ser
encarado como fonte de microrganismos e genes para a degradação ou a
60
transformação de vários compostos orgânicos (IBEKWE, PAPIERNIK & YANG, 2004;
ZHANG et al., 2004a; DUBEY, TRIPATHI & UPADHYAY, 2006).
Fungos e bactérias vêm sendo isolados de solos contaminados com
hidrocarbonetos totais do petróleo (TPH) com o objetivo de determinar a
capacidade dos isolados em degradar petróleo ou frações de hidrocarbonetos do
petróleo, incluindo as frações de hidrocarbonetos alifáticos e HPAs e não somente o
de conhecer a diversidade de cultiváveis presentes ou selecionados na área atingida
(ASHOK, SAXENA & MUSARRAT, 1995; WATANABE et al., 1998; WATANABE, 2001;
LIU, ZHANG & ZHANG, 2004; DAS & MUKHERJEE, 2007; JACQUES et al., 2008;
MANCERA-LÓPEZ et al., 2007; SEO et al., 2007; ZHAO et al., 2007).
Diversos estudos mostram que espécies de Pseudomonas são os microrganismos
mais detectados em diferentes ambientes contaminados com hidrocarbonetos tanto
utilizando-se abordagens dependentes de cultivo (DAGHER et al., 1997; AITKEN et
al., 1998; STAPLETON, BRIGHT & SAYLER, 2000; BELHAJ, DESNOUES & ELMERICH,
2002; SAADOUN, 2002; BHATTACHARYA et al., 2003; ZOCCA et al., 2004; VACCA,
BLEAM & HICKEY, 2005; MA, WANG & SHAO, 2006; MANCERA-LÓPEZ et al., 2007),
como independentes de cultivo (MARGESIN et al., 2003; KAPLAN & KITTS, 2004;
RÖLING et al., 2004; POPP, SCHLÖMANN & MAU, 2006; MARGESIN, HÄMMERLE &
TSCHERKO, 2007). Entretanto, outros estudos indicam que esta não é uma
tendência universal, uma vez que diversos outros gêneros têm sido isolados desses
ambientes como o gênero relacionado Sphingomonas (MUELLER et al., 1997; LIU,
ZHANG & ZHANG, 2004; XIA et al., 2005; ZHAO et al., 2007), espécies Gram-
positivas (MANCERA-LÓPEZ et al., 2007) e espécies de actinomicetos (HAMAMURA et
al., 2006; JACQUES et al., 2008).
A partir do estudo desses microrganismos, vias catabólicas vêm sendo
estudadas e vários genes codificando enzimas catabólicas, particularmente
dioxigenases, já foram identificados (YANG, CHEN & SHIARIS, 1994; TAKIZAWA et
al., 1999; LLOYD-JONES et al., 1999; PIEPER & REINEKE, 2000; SAITO, IWABUCHI &
HARAYAMA, 2000; KAHNG, 2002; VAN HERWIJNEN et al., 2003).
As técnicas microbiológicas tradicionais têm sido usadas com grande sucesso
na caracterização de espécies microbianas isoladas de ambientes contaminados. No
61
entanto, uma vez que os procariotos são bastante diversos, mas esta diversidade
nem sempre se reflete na morfologia (apresentando diferenças morfológicas
relativamente pequenas que, por vezes, dificultam a distinção até mesmo com a
utilização de microscópio), a utilização de métodos clássicos dependentes de
cultivo e de comparação morfológica acabam por refletir uma parcela muito
pequena da comunidade analisada. Além disso, as culturas do enriquecimento
acabam favorecendo as espécies bacterianas de crescimento rápido e aquelas
capazes de crescer nos meios e nas condições experimentais utilizadas (GARLAND &
MILLS, 1991; GARLAND, 1996; BALBA, AL-AWANDHI & AL-DAHER, 1998; TABACCHIONI
et al., 2000; YAO et al., 2000; TORSVIK & OVREAS, 2002; KASSEN & RAINEY, 2004;
KIRK et al., 2004).
Outra problemática, utilizando os métodos de microbiologia clássica, se refere
à enumeração e ao monitoramento de populações bacterianas degradadoras de
xenobiontes em ambientes contaminados que podem levar um período de tempo
muito longo e, na maioria das vezes, subestimar a diversidade como resultado da
complexidade dos processos de biodegradação (LLOYD-JONES et al., 1999). Além
disso, é importante ressaltar que o solo representa um ecossistema complexo no
qual as relações e as interações entre microrganismos são também complexas. Os
microrganismos adaptam-se aos microhabitats e vivem em consórcios interagindo
entre si e com o ambiente. Estima-se que 1 g de solo possa abrigar até 10 bilhões
de bactérias, porém, apenas alguns poucos milhares desses microrganismos já
foram formalmente descritos (WARD, WELLER & BATESON, 1990; AMANN, LUDWIG &
SCHLEIFER, 1995; PACE, 1997; ROSELLO-MORA & AMANN, 2001; DUBEY, TRIPATHI &
UPADHYAY, 2006). Dessa forma, as técnicas de microbiologia clássica
invariavelmente subestimam a diversidade estrutural e funcional como resultado da
dificuldade existente em cultivar a maioria dos microrganismos do ambiente. De
fato, já foi observado em muitas amostras ambientais que as bactérias que são as
mais dominantes e abundantes nem sempre são cultiváveis (TORSVIK & OVREAS,
2002).
62
5.2. Análises de Biologia Molecular
A introdução de técnicas moleculares na análise da estrutura da comunidade
bacteriana tem aumentado nossa capacidade de entender a diversidade microbiana
de forma mais clara. Na última década, o número de grupos filogenéticos nos
domínios Bacteria e Archaea aumentou significativamente através do emprego de
técnicas moleculares (AMANN & LUDWIG, 2000).
Atualmente, estas técnicas vêm sendo utilizadas para caracterizar os ácidos
nucléicos dos microrganismos contidos na comunidade microbiana de amostras
ambientais, o que tem ajudado na descoberta de um grande número de
microrganismos que não podem ser cultivados em laboratório mas que
desempenham um papel ecológico significativo em seus respectivos ambientes. O
principal benefício dessas análises moleculares é a possibilidade de estudar
comunidades microbianas sem a necessidade do cultivo, pois as análises de
microbiologia clássica são indiretas e provocam mudanças na estrutura e na
atividade metabólica da comunidade microbiana. Os métodos moleculares diretos,
no entanto, preservam o ‘status’ metabólico in situ e a composição da comunidade
microbiana, porque as amostras são congeladas imediatamente após a coleta.
Também, a extração direta dos ácidos nucléicos de amostras ambientais conta com
uma proporção muito maior de microrganismos que não são cultiváveis em
laboratório, mas podem estar relacionadas à atividade biodegradadora de interesse
(BROCKMAN, 1995). Estas vantagens, associadas ao longo período necessário para os
métodos de cultivo, têm resultado na popularidade de abordagens moleculares para
o estudo das populações bacterianas do solo.
A aplicação de técnicas de biologia molecular abre, dessa forma, novas
perspectivas à análise das comunidades microbianas no solo, possibilitando o
mapeamento da biodiversidade e facilitando a avaliação do efeito de derrames de
petróleo sobre a diversidade nativa, bem como a realização de um estudo das
populações microbianas que persistem e/ou são selecionadas após a ocorrência de
derrames acidentais (BROCKMAN, 1995; PŁAZA et al., 2001).
63
5.2.1. Extração de DNA do solo
A extração de ácidos nucléicos é a etapa inicial de quase todos os
experimentos genéticos e envolve, basicamente, a lise das células da amostra
ambiental, a extração dos ácidos nucléicos, a precipitação de ácidos nucléicos e
eliminação das impurezas co-extraídas através de purificação das amostras. O
objetivo principal é a obtenção de um DNA em quantidade, que seja representativo
dos microrganismos presentes nestas amostras e isento de substâncias do solo como
colóides, argilas, metais, nucleases e material húmico que podem interferir nas
análises posteriores (TREVORS, 1996; DONG et al., 2006a; DUBEY, TRIPATHI &
UPADHYAY, 2006).
Vários protocolos já foram descritos para a extração de ácidos nucléicos do
ambiente (OGRAM, SAYLER & BARKAY, 1987; OGRAM et al., 1988; MASSOL-DEYA et
al., 1995; VAN ELSAS, WELLINGTON & TREVORS, 1997; YEATES et al., 1998; OGRAM,
2000; SMALL et al., 2001; ROH et al., 2006). Atualmente já podemos contar com
“kits” comerciais rápidos e eficientes fabricados para a extração de DNA do solo.
Alguns “kits” têm sido aplicados com bastante sucesso em diversos estudos de
ecologia microbiana (IBEKWE et al., 2002; POUSSIER et al., 2002; ROH et al., 2006;
WHITEHOUSE & HOTTEL, 2007). Fortin e colaboradores (2004) descreveram um
protocolo de extração de DNA de amostras ambientais contaminadas e com alto
teor de matéria orgânica. Através desse protocolo, lavagens com agentes quelantes
e surfactantes são realizadas anteriormente à lise celular e à extração do DNA
propriamente dita, para contornar a interferência causada pelos contaminantes e
por substâncias presentes no solo.
Várias etapas do processo de extração de DNA podem vir a influenciar não só a
qualidade do DNA extraído, mas também sua representatividade. Alguns
microrganismos, como as bactérias Gram-positivas e fungos, apresentam estruturas
celulares que são difíceis de romper, e por isso, dependendo do método de lise
empregado no processo de extração de DNA, não é garantido que uma parcela
significativa da comunidade esteja sendo avaliada (FROSTEGÅRD et al., 1999).
Além disso, uma extração mal feita ou que favoreça a obtenção de um grupo
seleto de microrganismos acarreta resultados não muito confiáveis e que não
64
reproduzem fielmente a comunidade microbiana local. Sendo assim, o investimento
em métodos eficientes de extração de DNA dos diferentes tipos de organismos a
partir de amostras ambientais é essencial para que se tenha um resultado confiável.
5.2.2. Reação em cadeia da enzima DNA-polimerase (PCR)
A etapa seguinte na análise da comunidade bacteriana inclui o isolamento de
genes conservados filogeneticamente ou de genes para grupos específicos a partir
do ácido nucléico extraído. A amplificação de DNA através da reação em cadeia da
polimerase (PCR) tornou-se uma das ferramentas mais úteis para um estudo mais
detalhado da comunidade microbiana.
A técnica de PCR foi descrita por Saiki e colaboradores (1985) e foi utilizada
inicialmente na amplificação do gene que codifica a β globulina para o diagnóstico
pré-natal de anemia falciforme (SAIKI et al., 1985; MULLIS & FALOONA, 1987). A
introdução da enzima DNA polimerase termoestável, obtida de Thermus aquaticus,
possibilitou a automação da técnica (SAIKI et al., 1988).
Ela consiste na síntese enzimática in vitro de seqüências específicas de DNA
gerando várias cópias destas. Para que a amplificação ocorra é necessário utilizar
um par de iniciadores que são oligonucleotídeos que flanqueiam a região do DNA a
ser amplificada (seqüência alvo). Geralmente envolvem de 30 a 45 ciclos de
amplificação, sendo cada ciclo constituído de etapas de: 1) desnaturação do DNA,
2) anelamento dos iniciadores, 3) extensão ou alongamento pela enzima Taq
polimerase. A utilização desta enzima termoestável obtida de Thermus aquaticus se
deve às altas temperaturas empregadas na desnaturação do DNA.
A eficiência e especificidade do método é influenciada por uma série de
fatores como o iniciador utilizado, o regime de repetição dos ciclos, os reagentes e
suas concentrações, a presença de aditivos, o grau de pureza das amostras entre
outros (ROSADO et al., 1997).
Esta metodologia apresenta alta especificidade, sensibilidade e
reprodutibilidade e tem sido modificada de uma variedade de formas (como PCR em
tempo real, Touchdown-PCR, Nested-PCR, etc.) para aplicações específicas na
exploração da diversidade microbiana no solo. Embora as técnicas de PCR sejam
65
uma das formas mais rápidas de monitorar a diversidade bacteriana no solo as
limitações inerentes à técnica requerem consideração. Em particular, a
amplificação preferencial de algumas seqüências, amplificação de DNA
contaminante e formação de seqüências quiméricas podem afetar a avaliação da
diversidade bacteriana através de técnicas de PCR (REYSENBACH et al., 1992;
HUGENHOLTZ, GOEBEL, & PACE, 1998).
Vários grupos de pesquisa têm apresentado propostas de estudos ambientais
baseados em diferentes sistemas de PCR. Vários protocolos com diferentes
iniciadores, número de ciclos e tratamento de amostras vêm sendo desenvolvidos
para a análise de amostras ambientais. Através do uso de técnicas de PCR, hoje é
possível detectar a presença e dominância de bactérias desempenhando funções
específicas no ambiente (MUYZER, DE WAAL, & UITTERLINDEN, 1993;
STACKEBRANDT et al., 1993; RANJARD, POLY & NAZARET, 2000; DUARTE et al.,
2001).
Diversos métodos baseados na amplificação e comparação de seqüências do
gene que codifica o rRNA 16S têm sido aplicados a amostras ambientais, fornecendo
informação com alta resolução sobre mudanças na estrutura da comunidade
bacteriana total. Estes métodos incluem a análise de restrição do DNA ribossomal
amplificado ou ARDRA (“amplified rDNA restriction analysis”), a análise do espaço
intergênico ribossomal ou RISA (“ribosomal intergenic spacer analysis”), a análise
de polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição terminal ou T-RFLP
(“terminal restriction fragment length polymorphism”), a análise do DNA
polimórfico amplificado randomicamente ou RAPD (“random amplified polymorphic
DNA”), a eletroforese em gel de gradiente desnaturante ou DGGE (“denatured
gradient gel electrophoresis”), a eletroforese em gel de gradiente de temperatura
ou TGGE (“temperature gradient gel electrophoresis”) e o polimorfismo da
conformação da fita simples ou SSCP (“single strand conformation polymorphism”)
(KENT & TRIPLETT, 2002; DUBEY, TRIPATHI & UPADHYAY, 2006).
66
5.2.3. Eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE)
A separação de seqüências específicas de DNA, ou a detecção de pequenas
diferenças existentes entre elas, pode fornecer informações importantes sobre a
estrutura da comunidade e a diversidade de microrganismos contendo um
determinado gene. Geralmente essas técnicas são acopladas com a reação de PCR
para amplificar seqüências que não são abundantes. Os produtos de PCR
amplificados podem ser examinados utilizando técnicas como DGGE e TGGE, que
detectam substituições únicas na seqüência de nucleotídeos (SCHNEEGURT-MARK &
KULPA-CHALER, 1998; KIRK et al., 2004; DUBEY, TRIPATHI & UPADHYAY, 2006).
DGGE e TGGE são métodos pelos quais fragmentos de DNA obtidos por meio de
amplificação por PCR e de mesmo tamanho, mas que apresentam seqüências
nucleotídicas diferentes, podem ser separados por eletroforese (MUYZER, 1999).
Enquanto a técnica de DGGE baseia-se na eletroforese dos produtos de PCR em géis
de poliacrilamida contendo um gradiente crescente de agentes desnaturantes (uréia
e formamida), o TGGE utiliza gradiente de temperatura (KIRK et al., 2004; DUBEY,
TRIPATHI & UPADHYAY, 2006).
A separação é baseada no decréscimo da mobilidade eletroforética da dupla
fita desnaturada parcialmente em géis de poliacrilamida contendo o gradiente
linear de uréia e formamida ou de temperatura (MUYZER, WAAL & UITTERLINDEN,
1993). A presença de estruturas de fita simples e fita dupla na molécula de DNA
reduz a sua mobilidade eletroforética se comparada à mobilidade da estrutura de
fita dupla e depende da quantidade de fita simples de DNA e da quantidade de
estruturas secundárias formadas entre as regiões de fita simples (DAFFONCHIO et
al., 2003).
Os fragmentos que possuem o mesmo tamanho e seqüências nucleotídicas
diferentes podem ser separados pela diferença na mobilidade das moléculas após a
desnaturação de seus domínios chamados “Melting Domains” (domínios de
desnaturação) caracterizados por condições de desnaturação idênticas, o que faz
com que, em determinada concentração dos desnaturantes químicos, ocorra uma
desnaturação completa nesses domínios, distribuídos ao longo da molécula. Quando
o DNA é submetido à eletroforese em condições crescentes de desnaturação, as
67
estruturas de fita dupla se mantêm até que alcancem as condições necessárias para
a desnaturação desses domínios. Quando eles se desnaturam, processa-se uma
transição da molécula passando para parcialmente desnaturada e, nessa situação, a
migração da molécula no gel é interrompida. As moléculas que possuem seqüências
nucleotídicas diferentes irão parar de migrar em posições diferentes no gel,
gerando perfis diferenciados, o que não era possível de se verificar através da
visualização em gel de agarose. Quando se acrescenta à extremidade 5’ de um dos
iniciadores um segmento de DNA rico em GC contendo de 30 a 50 nucleotídeos
(“grampo” de GC), há um impedimento da dissociação das fitas de DNA, porque é
introduzido no fragmento amplificado um domínio de alta resistência à
desnaturação, aumentando a detecção das variações existentes (KIRK et al., 2004).
A técnica de DGGE foi inicialmente desenvolvida para detectar mutações
pontuais em seqüências de DNA, mas Muyzer, Waal & Uitterlinden (1993)
expandiram este uso para o estudo da estrutura da comunidade microbiana em
amostras ambientais. Diversas amostras podem ser analisadas simultaneamente,
tornando possível avaliar mudanças nas populações microbianas (MUYZER, 1999;
MUYZER & SMALLA, 1999). Dessa forma, esta metodologia pode ser aplicada na
determinação direta da diversidade genética de populações microbianas complexas
em amostras ambientais (DUINEVELD et al., 1998, 2001; PEIXOTO et al., 2002) e
pode ser usada para complementar o monitoramento nos estudos de impactos
ambientais. Além de avaliar a diversidade genética de amostras ambientais,
estudando o efeito da presença de um determinado poluente na estrutura da
comunidade microbiana, é possível verificar aqueles microrganismos que se
adaptam e atuam no processo de biorremediação. Pode também ser aplicada no
monitoramento de microrganismos inoculados in situ, avaliando sua permanência ou
eliminação nos processos de bioaumentação (SCHNEEGURT-MARK & KULPA-CHALER,
1998).
Quando as análises de genes que codificam o rRNA são combinadas com
hibridização usando sondas filogenéticas ou com sequenciamento, a relação
filogenética dos membros dominantes da comunidade pode ser obtida (BODELIER et
al., 2000; RANJARD, POLY & NAZARET, 2000).
68
Esta metodologia já foi usada para a avaliação da diversidade microbiana de
rizosfera (DUINEVELD et al., 1998, 2001; SMALLA et al., 2001), bem como para a
avaliação de mudanças na diversidade microbiana causadas pela adição de
nutrientes (IWAMOTO et al., 2000) ou de outros compostos químicos (TORSVIK et
al., 1998; EL FANTROUSSI et al., 1999; MACNAUGHTON et al., 1999; WHITELEY &
BAILEY, 2000). Ela mostrou-se útil para identificar variações temporais e espaciais
na estrutura da comunidade bacteriana em campos de arroz (RANJARD, POLY &
NAZARET, 2000) e para analisar variações estruturais de comunidades bacterianas
metanotróficas em solos e rizosfera (BODELIER et al., 2000).
Um estudo realizado por Watanabe e colaboradores (1998) usou uma
combinação de métodos microbiológicos clássicos e moleculares para detectar e
caracterizar as bactérias degradadoras de fenol em lodo ativado. As análises de
TGGE dos produtos da PCR do gene rrs (que codifica o rRNA 16S) e do gene que
codifica a subunidade maior da fenol hidroxilase (LmPH) demonstraram poucas
populações bacterianas dominantes após 20 dias de incubação utilizando fenol como
fonte de carbono. Comparações das seqüências dos diferentes isolados bacterianos
e de bandas extraídas do gel de TGGE revelaram duas espécies bacterianas
dominantes responsáveis pela degradação do fenol.
Em 2001, Watts e colaboradores fizeram uma análise comparativa de
comunidades degradadoras de PCB (bifenilas policloradas) em culturas de
enriquecimento utilizando três técnicas moleculares: ARDRA, DGGE e t-RFLP. Eles
concluíram que todos estes métodos eram úteis para a análise qualitativa e
identificaram o mesmo microrganismo, sendo considerado o DGGE o mais rápido e
eficiente para o monitoramento dos microrganismos de uma cultura enriquecida.
Nicholson & Fathepure (2005) avaliaram o impacto da salinidade sobre a
diversidade bacteriana de enriquecimento com benzeno em diferentes
concentrações de sal, variando de 0 a 4 mol/l de NaCl. A análise de DGGE revelou a
presença de diferentes filotipos predominantes em diferentes concentrações de
NaCl, provando ser um método sensível e eficiente para a avaliação da diversidade
e de variações na estrutura da comunidade relacionadas às condições de cultivo
levando um melhor entendimento da dinâmica microbiana.
69
Além disso, enquanto os genes que codificam o rRNA são os mais usados para
estudos de diversidade microbiana usando DGGE, alguns pesquisadores têm usado
genes catabólicos, como o que codifica a metano monoxigenase (KNIEF, LIPSKI &
DUNFIELD, 2003). Esta abordagem pode fornecer informação sobre a diversidade de
grupos específicos de microrganismos com alguma função definida como degradação
de poluentes (KIRK et al., 2004).
5.2.4. Microarranjo de DNA
Para avaliar a diversidade microbiana com relação aos fatores ambientais e à
complexidade do ecossistema, é necessário caracterizar a diversidade das
comunidades funcionais de interesse e avaliar a atividade dos indivíduos da
comunidade sob as diferentes circunstâncias ambientais. Entre os diversos métodos
desenvolvidos com esta finalidade, a análise de microarranjos de DNA atingiu uma
reputação ímpar porque o processo é relativamente simples, não requer
seqüenciamento de DNA em larga escala e permite a quantificação simultânea de
milhares de genes. Esta tecnologia, também denominada de “chip de DNA”, “chip
de genes” ou “biochip”, representa um grande potencial para caracterizar
comunidades microbianas e suas funções no ambiente (GUSCHIN et al., 1997; JAIN,
2000; LUCCHINI, THOMPSON & HINTON, 2001; SOUTHERN, 2001; HELLER, 2002; KIRK
et al., 2004).
Esta é outra técnica molecular que pode ser aplicada na investigação da
comunidade degradadora de hidrocarbonetos presente em locais que sofreram
derrame de óleo, pois possui um enorme potencial na análise da estrutura, da
função e da dinâmica da comunidade microbiana por um lado e, por outro,
representa uma ferramenta específica, sensível e quantitativa para a detecção,
identificação e caracterização dos microrganismos no solo (ZHOU & THOMPSON,
2002, 2004; KIRK et al., 2004).
O microarranjo de DNA é uma técnica experimental da Biologia Molecular que
opera através do princípio de hibridação ou hibridização de moléculas com
seqüências complementares. É composta por um arranjo de milhares de fragmentos
de DNA imobilizados sobre uma superfície sólida (lâmina de sílica, de plástico ou de
70
vidro, substrato sólido de náilon ou silicone, entre outros) para detectar e
quantificar ácidos nucléicos em larga escala (BRAZMA et al., 2001; VO-DINH, 2001;
FRIEND & STOUGHTON, 2002; KOK et al., 2002).
As seqüências de DNA-alvo nos microarranjos são sondas de DNA que
representam os genes de interesse. Os microarranjos podem ser encontrados em
dois tipos de plataformas: uma com DNA complementar (cDNA) e outra com
oligonucleotídeos como sondas de DNA. O microarranjo de cDNA é constituído por
longas moléculas de DNA e é freqüentemente usado para estudos de expressão
gênica e em triagens com grande número de amostras. O microarranjo de
oligonucleotídeos é constituído de seqüências curtas de DNA sintetizadas
artificialmente e é muito utilizado para detecção de mutações, mapeamento
genético e estudos de expressão gênica. Os arranjos de oligonucleotídeos têm custo
mais elevado, mas podem detectar alterações moleculares de menor porte, tanto
quantitativa como qualitativamente (DERISI et al., 1996; DUGGAN et al., 1999;
BRAZMA et al., 2001; VO-DINH, 2001; FRIEND & STOUGHTON, 2002; KIRK et al.,
2004; FRANKE-WHITTLE, KLAMMER & INSAM, 2005).
Estes arranjos são quimicamente ligados a uma superfície sólida, como lâminas
de microscópio revestidas com compostos que conferem carga positiva ou
membranas de náilon positivamente carregadas e são subseqüentemente
hibridizados com o DNA isolado da amostra. As moléculas derivadas da amostra
biológica podem ser DNA genômico, cDNA, mRNA (ou RNA total) ou com os produtos
de PCR. A detecção é possível porque os ácidos nucléicos das amostras são
“marcados” com fluorocromos cianina 3 (Cy3) ou cianina 5 (Cy5) quando se utiliza
microarranjos em vidro ou com o isótopo
33
P quando os arranjos são preparados em
membranas de náilon. Em seguida, os fragmentos marcados que não hibridizaram
são removidos por uma lavagem e a intensidade da fluorescência de cada arranjo é
determinada por um “scanner” (BRAZMA et al., 2001; SMALL et al., 2001; VO-DINH,
2001; FRIEND & STOUGHTON, 2002).
Com base no tipo de sonda arranjado, os microarranjos usados em estudos
ambientais podem ser divididos em três classes principais. Os arranjos de
oligonucleotídeos filogenéticos contêm sondas de seqüências derivadas do gene que
71
codifica o rRNA e são usadas primariamente para a análise filogenética da
composição e da estrutura da comunidade microbiana (ZHOU & THOMPSON, 2002).
Os arranjos de genes funcionais contêm genes que codificam enzimas chaves
envolvidas em vários processos de ciclagem biogeoquímicas (como por exemplo
desnitrificação e nitrificação) e são úteis para monitorar o status fisiológico e as
atividades funcionais das comunidades microbianas nos ambientes naturais (WU et
al., 2001; ZHOU & THOMPSON, 2002). Estas sondas podem também ser desenhadas
a partir de genes específicos envolvidos em etapas enzimáticas chaves de vias
microbianas de degradação de poluentes ambientais e podem ser usadas para
examinar tanto ambientes virgens quanto ambientes contaminados (ATLAS et al.,
1992; GREER et al., 2001; MARGESIN et al., 2003).
A análise de genes funcionais no ambiente é uma tarefa difícil por causa da
necessidade de identificação de regiões conservadas da seqüência de DNA para
desenhar sondas oligonucleotídicas para hibridização ou iniciadores para
amplificação por PCR. A metodologia de microarranjo de DNA não requer essa
conservação de seqüência porque todas as seqüências gênicas de diferentes
populações do mesmo grupo funcional podem ser agrupadas em um único arranjo
(ZHOU & THOMPSON, 2002; KIRK et al., 2004).
A vantagem desse sistema sobre os experimentos de hibridização tradicionais é
exatamente o fato de que milhares de sondas podem ser aplicadas sobre a
superfície do microarranjo (arranjos de oligonucleotídeos de alta densidade) o que
permite a detecção de milhares de reações simultaneamente. Outras vantagens
sobre o sistema tradicional de hibridização são elevada sensibilidade, rápida
detecção, automação e baixos níveis de “background” (DERISI et al., 1996; SHALON,
SMITH & BROWN, 1996; LIPSHUTZ et al., 1999; KIRK et al., 2004; GILBRIDE, LEE &
BEAUDETTE, 2006)
A tecnologia dos microarranjos impulsionou de maneira importante a pesquisa
de genômica funcional dos diferentes organismos, desde bactérias até o homem,
incluindo situações normais e patológicas (câncer, doenças autoimunes e doenças
degenerativas entre outras). Uma das principais desvantagens deste método é o
fato de que a solução de hibridização contendo os fragmentos de DNA marcados
72
com fluoresceína permanece estática sobre o arranjo durante o teste, reduzindo a
taxa de hibridização. Além disso, arranjos com alta concentração de sondas podem
impedir fisicamente a hibridização dos fragmentos marcados (LUCCHINI, THOMPSON
& HINTON, 2001; VO-DINH, 2001; FRIEND & STOUGHTON, 2002; KOK et al., 2002).
Ao contrário dos estudos usando culturas puras, a análise de microarranjo de
ácidos nucléicos ambientais apresenta diversos desafios técnicos que devem ser
contornados. Primeiramente, em estudos ambientais, as seqüências alvo e as
sondas são muito diversas. Não está claro se o desempenho dos microarranjos com
diferentes amostras ambientais é similar àquele com amostras de cultura pura ou
como a diferença de seqüência é refletida na intensidade do sinal de hibridização.
Além disso, as amostras ambientais geralmente são contaminadas com substâncias
como a matéria húmica, contaminantes orgânicos e metais, que podem interferir
com a hibridização de DNA sobre os microarranjos. Outra limitação da análise de
microarranjo com amostras ambientais é que, ao contrário das culturas puras, a
biomassa recuperável em amostras ambientais é geralmente baixa,
conseqüentemente, não está claro se a hibridização em microarranjo é sensível o
bastante para detectar microrganismos em todos os tipos de amostras ambientais
(ZHOU & THOMPSON, 2002). Estudos adicionais e otimizações metodológicas são
necessárias para que os microarranjos de DNA possam ser usados para a avaliação
de comunidades microbianas. Dessa forma, esta tecnologia vem sendo aprimorada e
também utilizada como ferramenta para a avaliação do papel ecológico e das
relações filogenéticas de populações bacterianas no solo. Diversos tipos de
microarranjos têm sido recentemente desenvolvidos e avaliados para a detecção
bacteriana e análise de comunidade microbiana (ZHOU & THOMPSON, 2002; DENNIS
et al., 2003; ZHOU, 2003; RHEE et al., 2004; FRANKE-WHITTLE, KLAMMER & INSAM,
2005; DUBEY, TRIPATHI & UPADHYAY, 2006). Alguns estudos desenvolveram
microarranjos para analisar as funções de bactérias do solo redutoras de sulfato e
fixadoras de nitrogênio (TARONCHER-OLDENBURG et al., 2003; LOY et al., 2004;
STEWART et al., 2004).
Diversos grupos de pesquisa têm investigado o grande potencial dos
microarranjos de DNA na caracterização de microrganismos de uma variedade de
73
ambientes, para avaliar tanto a diversidade estrutural como a funcional em relação
a fatores ambientais e à complexidade do ecossistema (SMALL et al., 2001; GREENE
& VOORDOUW, 2003; TARONCHER-OLDENBURG et al., 2003; DENNIS et al., 2003;
GUPTA et al., 2003; RHEE et al., 2004; FRANKE-WHITTLE, KLAMMER & INSAM, 2005).
Além disso, os microarranjos podem ser associados à técnica de PCR para aumentar
o limite de detecção para a seqüência de DNA em questão (FRANKE-WHITTLE,
KLAMMER & INSAM, 2005; SMALL et al., 2001; TARONCHER-OLDENBURG et al., 2003;
WU et al., 2001).
5.3. Análises de Microbiologia Clássica x Biologia Molecular
A análise das variações que ocorrem na população de um local contaminado
por métodos moleculares, acompanhada por uma mudança na função de uma
comunidade, auxilia na identificação das populações funcionalmente dominantes
(BOND et al., 1995; BORNEMAN & TRIPLETT, 1997). Entretanto, os pesquisadores
têm enfatizado que experimentos de cultura pura são indispensáveis para a análise
detalhada das funções de cada população e que o isolamento das populações
funcionalmente dominantes em uma comunidade microbiana é muito importante
(WATANABE et al., 1998).
Existe uma vasta gama de métodos disponíveis para o estudo da diversidade
estrutural e funcional da comunidade microbiana em ambientes contaminados.
Cada metodologia tem suas limitações e fornece apenas informação parcial de um
aspecto da diversidade microbiana. As técnicas moleculares que têm sido usadas
para superar as limitações das metodologias clássicas também apresentam suas
próprias limitações (KIRK et al., 2004).
Alguns estudos de análise da diversidade microbiana no solo foram realizados
através da utilização de uma combinação de métodos dependentes (microbiologia
clássica) e indepentes (moleculares) de cultivo. Foram utilizadas diversas técnicas
para determinar os efeitos de poluentes e práticas de biorremediação sobre a
estrutura e/ou função da comunidade microbiana (EL FANTROUSSI et al., 1999;
RÖLING et al., 2000; ELLIS et al., 2003). Uma visão mais completa dessa diversidade
74
pode ser obtida através do uso de uma variedade de metodologias, cada uma delas
com um enfoque diferente (KIRK et al., 2004).
É válido ressaltar que os métodos microbiológicos clássicos combinados aos
métodos moleculares contribuem para uma melhor avaliação da comunidade
microbiana do local estudado e sua resposta aos processos de biorremediação, seja
o bioaumento, a bioestimulação e/ou atenuação natural (BROCKMAN, 1995). É
necessário um processo multidisciplinar, incorporando métodos microbiológicos e
moleculares. A combinação de técnicas de microbiologia clássica e de técnicas
moleculares pode fornecer uma visão mais global das transformações que ocorrem
no ambiente durante os processos de contaminação e também de biorremediação,
aumentando a compreensão dos mecanismos de biorremediação, o que é essencial
para o desenvolvimento de estratégias de biorremediação. Assim, estimativas da
diversidade bacteriana no solo devem incluir metodologias múltiplas integrando
medidas para análise da comunidade total bem como análises parciais dos
subconjuntos estruturais e funcionais (BALBA, AL-AWANDHI & AL-DAHER, 1998;
WATANABE et al., 1998).
75
JUSTIFICATIVA
Um projeto sobre a diversidade bacteriana em solo contaminado com petróleo
foi conduzido em uma parceria entre o Centro de Pesquisas e Desenvolvimento
Américo Leopoldo Miguez de Mello da Petrobras (CENPES) e os laboratórios de
Genética Microbiana, coordenado pela professora Lucy Seldin e de Ecologia
Molecular Microbiana, coordenado pelo professor Alexandre Soares Rosado do
Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes (IMPPG) da Universidade Federal do
Rio de Janeiro (UFRJ). Este projeto teve como objetivos simular um derrame de
petróleo Árabe Leve da Bacia de Campos em sistemas de microcosmos contendo
solo proveniente de uma região próxima da reserva ecológica de Poço das Antas no
município de Silva Jardim no Rio de Janeiro e avaliar o efeito desta contaminação
sobre a diversidade bacteriana através de métodos convencionais e moleculares e
estudar as populações microbianas que persistiram ou foram selecionadas durante o
experimento de simulação através de métodos moleculares. Foram usados
microcosmos contendo solo virgem sem tratamento (controle), solo bioestimulado,
solo contaminado com petróleo e solo contaminado com petróleo e bioestimulado
(EVANS et al., 2004a,b).
Durante o desenvolvimento deste projeto foram feitas contagens de
microrganismos presentes nas diferentes amostras de solo. Os resultados
evidenciaram que a população característica do solo (Bacillus, actinomicetos,
heterotróficas totais e fungos) se manteve estável ao longo de todo o experimento
(15 meses), ainda que com a presença de petróleo. Este resultado indicou que esta
população microbiana não foi atingida significativamente pelo derrame do óleo
havendo, em alguns casos, inclusive, um crescimento populacional nos solos
bioestimulados com óleo. A bioestimulação do solo favoreceu também o
crescimento da população bacteriana responsável pela biodegradação do petróleo
(hidrocarbonoclásticas), normalmente selecionada em solos contaminados com
petróleo, que apresentou um aumento no crescimento populacional ao longo de
todo o experimento. Além disso, experimentos de DGGE com produtos gerados por
PCR utilizando-se iniciadores universais para o gene que codifica o rRNA16S e
iniciadores específicos para o gênero Pseudomonas e gêneros afins para comparação
entre as populações nos diferentes solos ao longo do experimento mostraram que,
de acordo com os perfis de bandas observados, parece ter ocorrido um aumento no
número de alguns grupos bacterianos entre os períodos de 30 a 90 dias de
contaminação, ao comparar-se o solo virgem com o solo contaminado. Estes grupos
devem ser mais tolerantes ao óleo e/ou podem ser degradadores de
hidrocarbonetos. O efeito do óleo cru sobre a comunidade bacteriana dominante foi
melhor observado a partir de 90 dias de contaminação. A adição de nutrientes
inorgânicos ao solo pelo processo de bioestimulação exerceu grande e rápido efeito
sobre a comunidade bacteriana dominante a partir de 15 dias. A mudança no perfil
da comunidade bacteriana entre amostras controle e contaminada foi observada em
90 dias, permanecendo estável até o fim do experimento. A comunidade de
Pseudomonas sp. apresentou pouca variação ao longo das amostragens. O
seqüenciamento revelou a possível presença de bactérias Gram-positivas nas
amostras contaminadas com óleo. Destaca-se a possível presença de uma bactéria,
76
Planococcus southpolaris, com capacidade de degradar hidrocarbonetos do
petróleo, segundo literatura disponível.
No entanto, na medida em que o referido projeto de análise da diversidade
bacteriana durante o processo de biodegradação de hidrocarbonetos foi realizado
através da simulação de derrame de óleo e bioestimulação em microcosmos,
algumas questões permaneciam: o que realmente acontece com a população
bacteriana do ambiente, in situ, ao longo do processo de contaminação por
petróleo e de sua degradação? Que populações permanecem ou são selecionadas
nas novas condições impostas pelo contaminante e pela bioestimulação? O que
ocorre quando há a influência dos fatores abióticos? O potencial de
biodegradabilidade determinado pela presença de degradadores de petróleo
observado em microcosmos mantém-se com a interferência desses fatores
abióticos?
As respostas eram ainda desconhecidas e encontrá-las tornou-se um desafio
para o grupo. Sendo assim, foi proposto este novo projeto de análise da diversidade
da população bacteriana em larga escala, diretamente no ambiente, sob a
influência de condições climáticas e ambientais.
Para que fosse possível o estudo em campo, uma área na cidade de Carmópolis
(SE), na região de produção e exploração de petróleo da Unidade de Negócios
Sergipe-Alagoas (UN-SEAL) da PETROBRAS, foi preparada em sistemas denominados
de “células-piloto” (macrocosmos). Em especial, nesta unidade, a presença de água
produzida contendo grande quantidade de sal (cerca de 7%) é um problema
adicional à contaminação com óleo. Ou seja, além do grave problema representado
pela contaminação do solo por derrames acidentais de óleo existe a problemática
da água produzida salina resultante do processo de extração do petróleo.
Considerando-se este problema, os experimentos foram montados e conduzidos de
forma a avaliar o impacto da contaminação do petróleo e também da água
produzida. Acrescentou-se ao projeto a bioprospecção de estirpes bacterianas
degradadoras de petróleo e halofílicas ou halotolerantes.
77
OBJETIVOS
1. OBJETIVO GERAL
O objetivo geral deste projeto foi avaliar o efeito de derrames controlados de
petróleo e água produzida e da bioestimulação sobre as comunidades bacterianas
do solo através de estudo em campo, diretamente no ambiente, sob a influência de
condições climáticas e ambientais.
2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
De acordo com o objetivo geral, alguns objetivos específicos foram
estabelecidos:
• Avaliar o impacto dos derrames de petróleo e água produzida sobre as
comunidades bacterianas.
• Identificar e caracterizar as populações funcionalmente importantes no
processo de degradação de hidrocarbonetos de petróleo associado ou não à água
produzida, através de técnicas de cultivo convencionais e de análises moleculares.
• Investigar os efeitos da aplicação da técnica de bioestimulação sobre a
diversidade bacteriana do solo.
Para isso, o estudo em campo foi realizado através de derrames controlados
de petróleo Sergipano Terra e/ou água produzida da Estação Coletora de Entre Rios
em solo sem histórico de contaminação no campo de extração de petróleo de
Carmópolis (SE). Os derrames foram realizados em 3 etapas consecutivas: a
primeira com duração de 90 dias e as duas etapas seguintes com duração de 196 e
233 dias, respectivamente. Todas as etapas foram realizadas no mesmo sistema de
4 áreas de solo denominadas “células-piloto”. Uma dessas 4 áreas foi mantida sem
tratamento como controle do experimento. Diversas coletas de amostras de solo de
cada célula-piloto foram realizadas. O DNA total das populações microbianas foi
extraído de todas as amostras de solo e foram feitos isolamentos de microrganismos
presentes em amostras de solo tratado com petróleo.
A avaliação das comunidades bacterianas foi feita através de isolamento e
caracterização parcial de estirpes bacterianas halotolerantes e/ou
hidrocarbonoclásticas, com potencial para utilização em estratégias de
biorremediação. Foram utilizadas técnicas de plaqueamento em diferentes meios
de cultura, seleção de diferentes morfotipos, testes de crescimento em diferentes
concentrações de NaCl e de biodegradação de petróleo cru e de hidrocarbonetos do
petróleo.
A avaliação da diversidade da comunidade bacteriana geral também foi feita
através da amplificação por PCR do DNA total das amostras de solo utilizando-se
78
iniciadores universais para o gene que codifica o 16S rRNA, DGGE, extração de
bandas, reamplificação por PCR e sequenciamento e microarranjo taxonômico de
DNA.
A avaliação da diversidade da população bacteriana com potencial para
biodegradação de hidrocarbonetos foi feita através de amplificação por PCR
utilizando-se iniciadores específicos para genes de degradação de hidrocarbonetos,
DGGE, extração de bandas, reamplificação por PCR e sequenciamento e
microarranjo catabólico de DNA.
79
ETAPAS
1. TRATAMENTO DO SOLO
1. Definição da área de estudo e preparo das células-piloto.
2. Primeiro Experimento - Fase I.
a) Aplicação dos Contaminantes.
Célula-piloto 1: Sem contaminação (Controle)
Célula-piloto 2: Contaminação com água produzida
Célula-piloto 3: Contaminação com água produzida e petróleo
Célula-piloto 4: Contaminação com petróleo
b) Procedimentos de composição de amostras e de amostragem
3. Segundo Experimento - Fase II
a) Aplicação dos Contaminantes.
Célula-piloto 1: Sem contaminação (Controle)
Célula-piloto 2: Contaminação com água produzida
Célula-piloto 3: Contaminação com água produzida e petróleo
Célula-piloto 4: Contaminação com petróleo
b) Procedimentos de composição de amostras e de amostragem
4. Terceiro Experimento - Fase III
a) Aeração: revolvimento mecânico do solo.
b) Correção da umidade: adição de água ao solo.
c) Aplicação de nutrientes (bioestimulação) e petróleo.
Célula-piloto 1: Sem bioestimulação e sem contaminação (Controle)
Célula-piloto 2: Bioestimulação
Célula-piloto 3: Bioestimulação e contaminação com petróleo
Célula-piloto 4: Contaminação com petróleo (sem bioestimulação)
d) Procedimentos de composição de amostras e de amostragem
2. ANÁLISES DE MICROBIOLOGIA CLÁSSICA
80
1. Pré-enriquecimento com petróleo de amostras de solo da célula-piloto
contaminada com petróleo (célula-piloto 4) em:
a) Meio mineral Bushnell-Haas contendo 7,5% NaCl ou
b) Meio mineral Bushnell-Haas contendo 7,5% NaCl com etapa inicial de
pasteurização a 80ºC ou
c) Água produzida
2. Isolamento através de plaqueamento em diferentes meios de cultura.
3. Seleção dos diferentes morfotipos coloniais.
4. Teste de crescimento em diferentes concentrações de NaCl.
5. Teste de biodegradação de petróleo cru.
6. Teste de biodegradação de hidrocarboneto aromático.
3. ANÁLISES DE BIOLOGIA MOLECULAR
1. Extração de DNA total da comunidade microbiana das amostras de solo das
áreas tratadas e da área controle.
2. Amplificação por PCR utilizando-se iniciadores universais para o gene que
codifica o rRNA 16S.
3. Amplificação por PCR utilizando-se iniciadores específicos para genes de
degradação de hidrocarbonetos.
4. Eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE) dos produtos de PCR
obtidos.
5. Extração de bandas de DGGE.
6. Reamplificação por PCR das bandas de DGGE.
7. Sequenciamento dos produtos da reamplificação por PCR.
8. Microarranjo taxonômico de DNA.
9. Microarranjo catabólico de DNA.
81
MATERIAIS & MÉTODOS
1. MATERIAIS UTILIZADOS
1.1. O petróleo, a água produzida e o solo
O estudo de campo foi realizado na região produtora de petróleo localizada na
cidade de Carmópolis (SE) da Unidade de Negócios Sergipe-Alagoas (UN-SEAL) de
propriedade da PETROBRAS.
O solo do campo de exploração e produção de petróleo de Sergipe é um solo
classificado como franco-argiloso, com um conteúdo de argila de 58%, 37% de areia
e 5% de silte. Apresenta capacidade de retenção de água de 28% e uma relação
C:N:P de 100:6.86:0.39. O pH é de 6,0. A análise química do solo, realizada no
laboratório do Departamento de Solos da Universidade Federal Rural do Rio de
Janeiro (UFRRJ), é apresentada na tabela 1.
Tabela 1. Composição química do solo do Campo de Sergipe.
Composto químico Concentração (g/kg)
Al 0,0
C 0,58%
Ca 0,52
Cu 0,008
Fe 21,84
K 1,43
Mg 0,47
Mn 0,05
N 1,16
P 0,339
Zn 0,02
Foi utilizado o petróleo bruto Sergipano Terra produzido no campo de
exploração e produção de petróleo de Sergipe de propriedade da PETROBRAS (UN-
SEAL).
O óleo Sergipano Terra é um óleo relativamente fluido, com 24,8º API e ponto
de fluidez a 15ºC. Em termos de famílias químicas, este óleo contém 57,8% de
82
hidrocarbonetos saturados, 21,6% de hidrocarbonetos aromáticos, 18,9% de resinas
e 1,7% de asfaltenos, sendo caracterizado como um óleo de caráter parafínico.
Além disso, o óleo possui 5,7 mg NaCl/l. A análise elementar do mesmo,
apresentada na tabela 2, foi realizada no laboratório de Tratamento de Resíduos
Sólidos e Áreas Impactadas da Gerência de Biotecnologia e Tratamentos Ambientais
(BTA) do Centro de Pesquisas e Desenvolvimento Américo Leopoldo Miguez de Mello
da Petrobras (CENPES).
Tabela 2. Análise elementar do petróleo Sergipano Terra produzido no Campo
de Sergipe.
Composto químico Concentração
Carbono 86,2%
Hidrogênio 12,3%
Enxofre 0,42%
Nitrogênio 0,25%
Níquel 25 mg/kg
Vanádio < 5 mg/kg
A água produzida utilizada foi coletada na Estação Coletora de Entre Rios da
região produtora de petróleo de Carmópolis (SE) de propriedade da PETROBRAS
(UN-SEAL).
A análise físico-química da água produzida, foi realizada no laboratório de
Tratamento de Resíduos Sólidos e Áreas Impactadas da Gerência de BTA do CENPES
e é apresentada na tabela 3.
83
Tabela 3. Análise físico-química da água produzida da Estação Coletora de Entre
Rios do Campo de Sergipe.
Característica Resultado Limite Inferior Limite Superior
Salinidade 90.118,7 mg/l
- 350.000,0
densidade a 20/4◦C 1,0300
0,9970 1,3000
pH 6,5
1,0 14,0
Bário 24,1 mg/l
- 100,0
Cloretos 54.617,4 mg/l
- 200.000,0
Ferro Total 46,2 mg/l
- 100,0
Cálcio 1.931,7 mg/l
- 6.000,0
Magnésio 634,3 mg/l
- 2.000,0
Estrôncio 49,7 mg/l
- 100,0
Sódio 20.266,6 mg/l
- 100.000,0
Potássio 365,2 mg/l
- 50.000,0
Hidróxidos 0,0 mg/l
- 100,0
Carbonatos 0,0 mg/l
- 150,0
Bicarbonatos 558,3 mg/l
- 2.000,0
Sulfatos 42,3 mg/l
- 2.500,0
Alumínio Total 3,8 mg/l
- 1,5
Cromo Total 0,2 mg/l
- 1,1
Manganês Total 1,4 mg/l
- 1,0
Cádmio < 0,01 mg/l
- 0,20
Chumbo 0,07 mg/l
- 0,50
Cobre Total 0,20 mg/l
- 1,00
Níquel 0,02 mg/l
- 2,00
Prata < 0,01 mg/l
- 0,10
Zinco 0,04 mg/l
- 5,00
1.2. Tampões
Tampão de lavagem de solo 1
Tris-HCl pH 8,3 50 mM
NaCl 200 mM
EDTA 5 mM
Triton X-100 0,05% (v/v)
Tampão de lavagem de solo 2
Tris-HCl pH 8,3 50 mM
NaCl 200 mM
84
EDTA 5 mM
Tampão de lavagem de solo 3
Tris-HCl pH 8,3 10 mM
EDTA 0,1 mM
Tampão TE
Tris-HCl 10 mM
EDTA 1 mM
pH 8,0
O ajuste do pH foi realizado com ácido clorídrico.
Tampão TEB
Tris-HCl 89 mM
EDTA 2,5 mM
H
3
BO
3
89 mM
pH 7,8
O ajuste do pH foi realizado com ácido clorídrico.
Tampão TAE 50x
Tris 2 mol/l
Ácido acético glacial 1 mol/l
EDTA 0,1 mol/l
pH 7,8
O ajuste do pH 7,8 foi realizado com ácido acético glacial.
Tampão SSC 20x
NaCl 3 mol/l
Citrato de Sódio 0,3 mol/l
pH 7,0
85
1.3. Soluções
Solução de micronutrientes
A solução de micronutrientes, utilizada no preparo do meio de cultura TBN, foi
preparada em água destilada contendo H
3
BO
3
a 0,29% (m/v), ZnSO
4
.7H
2
O a 0,022%
(m/v), MnCl
2
.4H
2
O a 0,18% (m/v) e CuSO
4
.5H
2
O a 0,008% (m/v).
Solução de Lisozima (Sigma Chemical Co.)
A solução de lisozima, utilizada no processo de extração de DNA do solo
através do protocolo descrito para amostras ambientais (FORTIN et al., 2004), foi
preparada em tampão Tris-HCl pH 8,0 250 mM em uma concentração final de 0,1
mg/µl. A solução foi preparada alguns minutos antes da utilização e mantida em
banho-maria a 37°C até o momento de ser usada.
Solução de Proteinase K (Sigma Chemical Co.)
A solução de proteinase K, utilizada no processo de extração de DNA do solo
através do protocolo descrito para amostras ambientais (FORTIN et al., 2004), foi
preparada em água Milli-Q em uma concentração final de 20 mg/ml e tratada a
37°C por 30 min. A solução foi estocada a -20°C.
Solução de RNase A (Sigma Chemical Co.)
A solução de RNase, utilizada no processo de extração de DNA do solo através
do protocolo descrito para amostras ambientais (FORTIN et al., 2004), foi preparada
em água Milli-Q em uma concentração final de 10 mg/ml e tratada a 80°C por 10
min. A solução foi estocada a -20°C.
Suspensão de polivinilpolipirrolidona (PVPP) (Sigma Chemical Co.)
A polivinilpolipirrolidona (PVPP), utilizada no processo de extração de DNA do
solo através do protocolo descrito para amostras ambientais (FORTIN et al., 2004),
foi previamente submetida a lavagem ácida com HCl 3M como descrito por Holben e
colaboradores (1988). Para tanto, 150 g de PVPP foram adicionados a 4 l de HCl 3M
e deixados sob agitação à temperatura ambiente por 12 a 16 h. Em seguida, a
86
suspensão foi deixada por 30 a 60 min para sedimentação espontânea e o
sobrenadante foi descartado. Foram adicionados 3,5 l de tampão fosfato de
potássio 200 mM (pH 7,0) e a suspensão foi deixada sob agitação por 1 a 2 h. O
processo de decantação e descarte do sobrenadante e suspensão em tampão fosfato
de potássio 200 mM (pH 7,0) foi repetido mais duas vezes checando-se o pH de
alíquotas do sobrenadante até que se aproximasse do valor 7,0. Alíquotas da
suspensão final foram transferidas para frascos menores e autoclavados por 15 min
a 121°C. Cada suspensão foi estocada a 4°C.
Suspensão de Sefacril S-400 HR (Amersham Biosciences)
A resina de Sefacril S-400 HR (Amersham Biosciences), utilizada no processo de
extração de DNA do solo através do protocolo descrito para amostras ambientais
(FORTIN et al., 2004), possui uma apresentação suspensa em etanol pelo
fornecedor, sendo necessário substituir o etanol por tampão TE pH 7,6. Dessa
forma, a resina foi previamente submetida a 5 lavagens em tampão TE pH 7,6. Para
tanto, a resina suspensa em etanol foi homogeneizada por inversão e 25 ml da
suspensão foram transferidos para um tubo Falcon e submetidos à centrifugação a
2.000 rpm em uma centrífuga Centra IEC (Fisher Scientific) por 1 min. O
sobrenadante foi removido por aspiração com o auxílio de pipeta. Foram
adicionados 25 ml de tampão TE pH 7,6 e a suspensão foi homogeneizada por
inversão.
Após centrifugação a 2.000 rpm em centrífuga Centra IEC (Fisher Scientific)
por 1 min, o sobrenadante foi removido por aspiração com o auxílio de pipeta e o
processo de adição de 25 ml de tampão TE pH 7,6, homogeneização por inversão,
centrifugação a 2.000 rpm por 1 min e remoção do sobrenadante por aspiração foi
repetido mais 4 vezes. Após a quinta remoção do sobrenadante, foi adicionado
tampão TE pH 7,6 até o volume final de 25 ml (cerca de 5 ml de tampão TE). A
suspensão foi estocada a 4°C.
87
Solução corante de corrida para eletroforese de DNA em gel de agarose
Glicerol 50% (v/v)
EDTA, pH 7,5 20 mM
Azul de bromofenol 0,05% (m/v)
Xileno cianol 0,05% (m/v)
Água destilada (q.s.p.) 100 ml
Solução corante de corrida para DGGE
Glicerol 70% (v/v)
Azul de bromofenol 0,05% (m/v)
Xileno cianol 0,05% (m/v)
Água Milli-Q (q.s.p.) 100 ml
Solução corante de gradiente para DGGE
Azul de bromofenol 0,5% (m/v)
Xileno cianol 0,5% (m/v)
Tampão TAE 50x 2 ml
Água Milli-Q (q.s.p.) 100 ml
Solução de Acrilamida/ Bis-acrilamida 40% (m/v)
Acrilamida 38,93 g
Bis-acrilamida 1,07 g
Água Milli-Q (q.s.p.) 100 ml
A acrilamida foi dissolvida em 30% do volume final de água Milli-Q. A bis-
acrilamida foi acrescentada aos poucos e o volume completado com água Milli-Q. A
solução foi filtrada em membrana Millipore de 0,45 μm e estocada a 4°C ao abrigo
da luz.
Solução de formamida deionizada
Resina AG501-X8 (Bio-Rad) 5 g
Formamida 100 ml
88
A resina foi adicionada à formamida e a mistura foi colocada sob agitação em
placa por aproximadamente 1 h. Em seguida, a mistura foi filtrada em papel de
filtro Whatman n° 4 e estocada à temperatura ambiente ao abrigo da luz.
Solução 0% desnaturante – gel de acrilamida 6% (m/v)
Solução de Acrilamida/Bis-acrilamida 40% (m/v) 15 ml
Tampão TAE 50x 2 ml
Água Milli-Q (q.s.p.) 100 ml
A solução foi filtrada em membrana Millipore de 0,45 μm e estocada a 4°C ao
abrigo da luz.
Solução 100% desnaturante– gel de acrilamida 6% (m/v)
Solução de Acrilamida/Bis-acrilamida 40% (m/v) 15 ml
Tampão TAE 50x 2 ml
Formamida deionizada 40 ml
Uréia 42 g
Água Milli-Q (q.s.p.) 100 ml
A solução foi filtrada em membrana Millipore de 0,45 μm e estocada a 4°C ao
abrigo da luz.
Solução de persulfato de amônio
A solução de persulfato de amônio, utilizada na polimerização do gel de
acrilamida nos experimentos de DGGE, foi preparada em água Milli-Q em uma
concentração final de 100 mg/ml no momento da utilização.
Solução de pré-hibridização para microarranjo taxonômico
A solução de pré-hibridização, utilizada nos experimentos de hibridização
sobre microarranjo de genes estruturais (microarranjo taxonômico), foi preparada
pela adição de 5% (m/v) de soro-albumina bovina (BSA) em tampão comercial DIG
Easy Hyb buffer (Boehringer Mannheim). A solução foi preparada no momento da
utilização.
89
Solução de pré-hibridização para microarranjo catabólico
A solução de pré-hibridização, utilizada nos experimentos de hibridização
sobre microarranjo de genes funcionais (microarranjo catabólico), foi preparada
pela adição de 1% (m/v) de BSA em tampão preparado com SSC 5x e SDS 0,1%
(m/v). A solução foi preparada no momento da utilização.
1.3. Meios de cultura
Bushnell-Haas (Difco)
Sulfato de Magnésio 0,2 g
Cloreto de Cálcio 0,02 g
Fosfato de potássio monobásico 1 g
Fosfato de amônio dibásico 1 g
Nitrato de potássio 1 g
Cloreto Férrico 0,05 g
Água destilada (q.s.p.) 1000 ml
pH 7,0
Ágar Nutriente
Peptona 5 g
Extrato de carne 3 g
Água destilada (q.s.p.) 1000 ml
pH 7,0
BHI -“Brain Heart Infusion” (Difco)
Brain Heart Infusion 37 g
Água destilada (q.s.p.) 1000 ml
pH 7,3
90
GB -“Glucose Broth” (SELDIN, VAN ELSAS & PENIDO,1983)
Glicose 10 g
Peptona 10 g
NaCl 5 g
Extrato de carne 2 g
Extrato de levedura 1 g
Água destilada (q.s.p.) 1000 ml
pH 7,0
LB -“Luria-Bertani Broth” (SCHLEIF & WENSINK,1981)
Triptona 10 g
Extrato de levedura 5 g
NaCl 5 g
Água destilada (q.s.p.) 1000 ml
pH 7,2
TBN -“Tiamina/Biotina/Nitrogênio” (SELDIN & PENIDO, 1986)
Glicose 10 g
Extrato de levedura 1 g
MgSO
4
.6H
2
O (10% -m/v- em água destilada) 2 ml
NaOH 2N 2 ml
Biotina (0,1% -m/v- em água destilada) 1 ml
Tiamina (0,1% -m/v- em água destilada) 1 ml
Solução de Micronutrientes 1 ml
Azul de bromotimol (0,5% -v/v- em etanol) 1 ml
Água destilada (q.s.p.) 1000 ml
pH 7,2
91
TSB -“Trypticase Soy Broth” (Difco)
“Trypticase Soy Broth” 30 g
Água destilada (q.s.p.) 1000 ml
pH 7,3
YTS 250 -“Yeast extract, Triptone, Starch” (GREER, HAWARI & SAMSON, 1990)
Extrato de levedura 250 g
Triptona 250 g
Amido 250 g
Água destilada (q.s.p.) 1000 ml
pH 7,2
Para experimentos de plaqueamento, os meios de cultura foram acrescidos de
1,2% de ágar e autoclavados a 121°C por 15 min. Ao meio TBN foi acrescido 1% (v/v)
de K
2
HPO
4
a 8% (m/v) após a autoclavação. Para experimentos que exigiam a
utilização de diferentes concentrações de NaCl, não foi adicionado o NaCl da
formulação própria dos meio GB e LB.
2. METODOLOGIA APLICADA
2.1. TRATAMENTO DO SOLO
2.1.1. Definição da área de estudo e preparo das células-piloto
Para condução dos experimentos em campo foi selecionada uma área da
região produtora de petróleo de propriedade da PETROBRAS (UN-SEAL), localizada
próximo à estação coletora de Bonsucesso, na cidade de Carmópolis. Alguns fatores
foram levados em consideração para a seleção da área experimental, tais como:
inexistência de um histórico de contaminação por hidrocarbonetos de petróleo e
dificuldade de acesso de pessoas e de animais.
Para o preparo da área de estudo procedeu-se inicialmente à retirada da
vegetação rasteira, através de capina e demarcação de todo o perímetro utilizando-
se cerca de arame farpado. Durante a execução de tais procedimentos, tomou-se o
cuidado de não alterar de forma significativa a compactação natural do solo, de
92
maneira que a percolação da água produzida e do petróleo pudessem ocorrer
conforme as características originais do solo, da água produzida e do próprio óleo,
evitando-se, assim, interferências exógenas.
Nesta área experimental foram preparadas quatro áreas isoladas (denominadas
de “células-piloto”) com dimensões de 3 m de largura e 3 m de comprimento e com
um distanciamento de 1 m entre si. Foram preparadas barreiras de 30 cm de altura,
com o próprio solo, em torno de cada célula-piloto, bem como em torno de toda a
área experimental, para evitar o extravasamento dos contaminantes entre as
células-piloto e para o ambiente. A área foi cercada para dificultar o acesso de
animais (Figura 1).
Figura 1. Área experimental. Subdividida em 4 células-piloto com
dimensões de 3 x 3 m, distanciamento de 1m entre si e barreiras feitas do
próprio solo de 30 cm de altura em torno de cada célula-piloto e de toda a área
experimental.
2.1.2. Primeiro Tratamento - Fase I
2.1.2.1. Aplicação dos Contaminantes
Na primeira etapa do projeto (fase I), de forma a simular em campo uma
contaminação acidental, foi realizada a adição do óleo cru e água produzida ao solo
sem contaminação.
Os experimentos foram iniciados no dia 29 de abril de 2005 através da
aplicação de petróleo Sergipano Terra e água produzida coletados na Estação
Coletora de Entre Rios, simulando uma contaminação de porte médio. A
93
contaminação foi realizada adicionando-se 5 l de contaminante em cada célula-
piloto. Nenhum contaminante foi adicionado à célula-piloto 1, denominada
“controle”. Na célula-piloto 2, denominada “água produzida”, foi aplicada água
produzida. Na célula-piloto 3, designada “mistura”, foi aplicada água produzida
associada a petróleo, na proporção de 3:1 (três partes de água produzida para cada
parte de petróleo). Finalmente, na célula-piloto 4, designada “óleo”, foi aplicado
petróleo cru. As figuras 2, 3 e 4 demonstram como os contaminantes foram
aplicados.
Figura 2. Aplicação de 5 l de água produzida na célula-piloto 2 no início da
fase I do projeto.
94
Figura 3. Tratamento da célula-piloto 3 com 5 l de uma mistura de água
produzida associada a petróleo na proporção 3:1 no início da fase I do projeto.
Figura 4. Contaminação com 5 l de petróleo na célula-piloto 4 no início da
fase I do projeto.
2.1.2.2. Procedimento de composição de amostras e amostragem
Levando-se em consideração questões relevantes como, por exemplo, a
representatividade das amostras a serem avaliadas nos experimentos montados e
devido à impossibilidade de se trabalhar com um número elevado de amostras por
células-piloto, optou-se por trabalhar com três amostras compostas a partir de 9
coletas de cada célula-piloto estudada. Dessa forma, cada célula-piloto foi
subdividida longitudinalmente em três seções 1, 2 e 3. A composição por seção foi
feita a partir da homogeneização de alíquotas provenientes de 3 pontos (A, B e C)
ao longo de cada seção, conforme demonstrado nas figuras 5 e 6. As amostras de
solo foram coletadas de uma profundidade entre 10 e 20 cm por equipe técnica da
PETROBRAS e a composição das amostras foi realizada no laboratório de Tratamento
de Resíduos Sólidos e Áreas Impactadas da gerência de BTA do CENPES.
95
Figura 5. Seções de amostragem (1, 2 e 3) e pontos de coleta (A, B e C)
para a composição das amostras de solo de cada célula-piloto.
Esta primeira etapa do projeto teve uma duração de 90 dias. Durante este
período foram realizadas 11 coletas de amostras de solo. A primeira coleta foi
realizada 24 horas após a exposição ao óleo e/ou à água produzida. Devido ao
excesso de chuva, a segunda coleta não pôde ser realizada 7 dias após o tratamento
das células-piloto, sendo feita 14 dias após a primeira coleta. As 7 coletas seguintes
foram realizadas com um intervalo de 7 dias. Nas 2 últimas coletas, o intervalo foi
aumentado para 14 dias (Tabela 4).
Figura 6. Amostragem de solo das células-piloto.
1
2
3
A
B
C
96
2.1.3. Segundo Tratamento - Fase II
O objetivo dessa fase foi avaliar os efeitos causados à comunidade bacteriana
do solo ao ser atingida por um derrame de petróleo mais severo, associado ou não à
água produzida. Para que a avaliação não sofresse nenhum tipo de interferência,
não foi realizado nenhum tipo de intervenção nas células-piloto.
2.1.3.1. Aplicação dos Contaminantes
O segundo tratamento das células-piloto foi realizado no dia de 22 de agosto
de 2005 através da aplicação de petróleo Sergipano Terra e água produzida
coletados na Estação Coletora de Entre Rios. Em cada célula-piloto foram aplicados
30 l de contaminante, respeitando-se o desenho previamente estabelecido: na
célula-piloto 1, nada foi aplicado; na célula-piloto 2 foi aplicada água produzida; na
célula-piloto 3 foi aplicada água produzida associada ao petróleo, na proporção de
3:1, e na célula-piloto 4 foi aplicado petróleo cru.
2.1.3.2. Procedimento de composição de amostras e amostragem
Para evitar a inserção de uma nova variável nos experimentos e para permitir
a comparação com os resultados obtidos na fase I, os procedimentos de composição
de amostras e de amostragem adotados na fase II foram idênticos aos utilizados na
fase I, optando-se por trabalhar novamente com três amostras compostas por
célula-piloto, coletadas a partir de 3 pontos ao longo de cada uma das 3 seções pré-
determinadas (Figuras 5 e 6.)
Esta segunda etapa do projeto teve uma duração de 196 dias. Durante este
período foram realizadas 17 coletas de amostras de solo. A primeira coleta foi
também realizada 24 horas após a exposição ao óleo e/ou à água produzida. Foram
realizadas mais 9 coletas com um intervalo de aproximadamente 1 semana entre
uma e outra. As 6 coletas seguintes foram realizadas com intervalo de
aproximadamente 15 dias. A última coleta foi realizada 1 mês após a anterior
(Tabela 4).
2.1.4. Terceiro Tratamento - Fase III
Esta fase teve por objetivo a avaliação do comportamento da comunidade
bacteriana do solo contaminado por petróleo submetida ao processo de
bioestimulação.
2.1.4.1. Aplicação dos nutrientes e dos contaminantes
O terceiro tratamento das células-piloto foi realizado no dia 08 de junho de
2006. Manteve-se a mesma área de estudo das fases anteriores, ajustando-se
97
apenas a configuração das células-piloto. O ajuste se deu em função da
configuração dos experimentos anteriores. Não mais foi testada água produzida
como contaminante. Foi investigado apenas o comportamento da comunidade
bacteriana do solo contaminado com petróleo submetido à bioestimulação. Dessa
forma, foi inserido um controle para a bioestimulação, permanecendo uma das
células-piloto sem adição de petróleo, mas com adição de nutrientes (para
investigar o efeito da bioestimulação sobre a comunidade bacteriana do solo não
tratado com óleo).
Sendo assim, a célula-piloto 1 permaneceu sem tratamento algum (sem
contaminação com petróleo ou água produzida ou adição de nutrientes, isto é, sem
bioestimulação) sendo ainda denominada controle. À célula-piloto 2 foram
aplicados nutrientes (nitrogênio, fósforo e potássio - NPK), passando a ser avaliada
como controle do processo de bioestimulação e recebendo a denominação
“bioestimulada”. Na célula-piloto 3 foram aplicados nutrientes (NPK) e petróleo (5
l), passando a ser denominada “bioestimulada com óleo”. Por fim, à célula-piloto 4,
foi aplicado petróleo (5 l), continuando a ser designada “óleo”. Os nutrientes foram
aplicados tendo como referência a relação C:N:P:K de 100:10:1:1. A disposição dos
experimentos da fase III pode ser observada na Figura 7.
Figura 7. Área experimental após o tratamento da fase III. 1) célula-piloto
controle, sem tratamento; 2) célula-piloto tratada com água produzida nas fases
I e II e bioestimulada na fase III; 3) célula-piloto tratada com mistura de água
produzida e óleo nas fases I e II e bioestimulada e tratada com óleo na fase III; 4)
célula-piloto tratada com óleo nas 3 fases.
2.1.4.2. Procedimento de Composição de amostras e amostragem
1
2
3
3
98
Para permitir a comparação com os resultados obtidos nas fases anteriores, os
procedimentos de composição de amostras e de amostragem adotados na fase III
foram idênticos aos utilizados nas fases I e II, trabalhando-se novamente com três
amostras compostas por célula-piloto (Figuras 5 e 6).
A terceira etapa do projeto teve uma duração de 233 dias. Durante este
período foram realizadas 6 coletas de amostras de solo. A primeira coleta foi
também realizada 24 horas após a exposição ao óleo e aos nutrientes. As 5 coletas
seguintes foram realizadas 23, 44, 90, 117 e 232 dias após a primeira (Tabela 4).
Ao longo de todo o projeto, foram realizadas 35 coletas (Tabela 4). Tendo sido
coletadas três amostras compostas por célula-piloto, resultando em 12 amostras a
cada coleta realizada, ao todo, foram coletadas 420 amostras de solo.
2.1.4.3. Monitoramento
Nas fases anteriores dos experimentos não houve nenhum tipo de intervenção
nas células-piloto. Nessa fase, como foi utilizado o processo de bioestimulação, um
fator de relevância foi a realização de correções de parâmetros como umidade e
oxigênio. A correção da umidade foi feita através de adição de água ao solo visando
à manutenção de uma concentração mínima de água que fosse capaz de manter a
vida microbiana. O aporte de oxigênio foi feito através do revolvimento mecânico
do solo. Desta forma, antes de cada amostragem, as células-piloto foram
homogeneizadas mecanicamente visando prover uma melhor oxigenação do solo.
Durante o período de condução da fase III, devido às constantes chuvas, o
procedimento de correção da umidade foi realizado por três vezes.
99
Tabela 4. Relação das coletas de amostras de solo das células-piloto estudadas,
data e tempo da coleta.
Coleta Fase Tempo (em dias) Data da Coleta
1ª I 1 dia 29/04/2005
2ª I 15 dias 13/05/2005
3ª I 22 dias 20/05/2005
4ª I 29 dias 27/05/2005
5ª I 36 dias 03/06/2005
6ª I 43 dias 10/06/2005
7ª I 48 dias 15/06/2005
8ª I 56 dias 23/06/2005
9ª I 63 dias 30/06/2005
10ª I 77 dias 14/07/2005
11ª I 91 dias 28/07/2005
12ª II 116 dia 23/08/2005
13ª II 122 dias 29/08/2005
14ª II 129 dias 05/09/2005
15ª II 136 dias 12/09/2005
16ª II 143 dias 19/09/2005
17ª II 151 dias 27/09/2005
18ª II 157 dias 03/10/2005
19ª II 164 dias 10/10/2005
20ª II 171 dias 17/10/2005
21ª II 178 dias 24/10/2005
22ª II 193 dias 08/11/2005
23ª II 221 dias 06/12/2005
24ª II 234 dias 19/12/2005
25ª II 249 dias 3/1/202006
26ª II 263 dias 17/01/2006
27ª II 276 dias 30/01/2006
28ª II 311 dias 06/03/2006
29ª II 378 dias 12/05/2006
30ª III 406 dias 09/06/2006
31ª III 429 dias 03/07/2006
32ª III 450 dias 24/07/2006
33ª III 496 dias 05/09/2006
34ª III 523 dias 02/10/2006
35ª III 638 dias 25/01/2007
100
2.2. ANÁLISES DE MICROBIOLOGIA CLÁSSICA
Foram utilizadas técnicas de microbiologia clássica para o isolamento de
estirpes bacterianas degradadoras de hidrocarbonetos do petróleo e halotolerantes
a partir de pré-enriquecimento a 28ºC sob agitação por 21 dias com 1% de petróleo
Sergipano Terra em meio mineral Bushnell-Haas acrescido de 7,5% de NaCl, para 6
amostragens de solo da célula-piloto contaminada com petróleo (célula-piloto 4)
aleatoriamente selecionadas (43, 136, 157, 193, 234 e 311 dias), ou em meio
Bushnell-Haas acrescido de 7,5% de NaCl com uma etapa de pasteurização a 80ºC ou
em água produzida para uma amostragem da fase I (43 dias) e duas da fase II (157 e
193 dias).
2.2.1. Isolamento de estirpes degradadoras de petróleo na presença de sal
Para a bioprospecção de estirpes bacterianas capazes de degradar
hidrocarbonetos do petróleo mesmo na presença da água produzida, foram
utilizados 5g de uma mistura das 3 amostras compostas (triplicatas) de 6 diferentes
amostragens selecionadas aleatoriamente, uma amostragem da primeira etapa do
projeto (fase I), coletada 43 dias após a contaminação com óleo, e 5 da segunda
etapa (fase II), coletadas 136, 157, 193, 234 e 311 dias após a primeira
contaminação com óleo. Vale ressaltar que as amostragens da segunda etapa foram
expostas a dois derrames de óleo, sendo coletadas 21, 42, 78, 119 e 193 dias após o
segundo tratamento com óleo.
Foram utilizados três sistemas de enriquecimento das amostras de solo com
petróleo Sergipano Terra: (1) em meio mineral Bushnell-Haas acrescido de 7,5% de
NaCl, (2) em meio Bushnell-Haas acrescido de 7,5% de NaCl com uma etapa de
pasteurização a 80ºC e (3) em água produzida, apresentando naturalmente um
conteúdo de NaCl em torno de 7%. Para evitar a inviabilidade dos experimentos
pela impossibilidade de se trabalhar com um número muito elevado de amostras e
para permitir a comparação entre os diferentes sistemas de enriquecimento
propostos, os enriquecimentos em meio Bushnell-Haas com 7,5% de NaCl submetidos
ao processo de pasteurização a 80ºC bem como os enriquecimentos em água
101
produzida foram realizados somente com as amostragens de 43 dias (fase I) e de
157 e 193 dias (fase II).
A etapa de pasteurização a 80ºC por 10 min foi implementada com o objetivo
de obter estirpes bacterianas formadoras de esporos.
O enriquecimento em água produzida foi realizado para selecionar estirpes
bacterianas capazes de crescer na presença da água produzida e com potencial para
uso em biorremediação de ambientes contaminados com água produzida. Este
sistema de enriquecimento foi também utilizado para selecionar estirpes
halotolerantes ou halofílicas, uma vez que a água produzida apresenta em sua
composição uma salinidade em torno de 7% de NaCl.
Já foi observado que derrames envolvendo esta água produzida impediam a
cobertura vegetal do solo atingido mesmo após tentativas de restauração através do
uso de diferentes processos de remediação. O sistema de enriquecimento em água
produzida poderia ser útil para estimar se a mesma representa um fator limitante
ao crescimento de estirpes bacterianas do solo, através da comparação dos
resultados obtidos com os do enriquecimento em meio mineral Bushnell-Haas
acrescido de 7,5% de NaCl.
Desta forma, o sistema de enriquecimento em água produzida foi
implementado para: avaliar se o NaCl é o sal causador do efeito deletério da água
produzida no ambiente, determinar o efeito (positivo ou negativo) da água
produzida sobre os microrganismos cultiváveis do solo e para selecionar estirpes
bacterianas capazes de crescer na presença da água produzida e com potencial para
uso em biorremediação de ambientes contaminados com água produzida.
Os diferentes sistemas de enriquecimento foram preparados em frascos
Erlenmeyer contendo 45 ml de meio Bushnell-Haas acrescido de 7,5% de NaCl (1 e
2) ou 45 ml de água produzida (3) aos quais foram adicionadas as amostras de cinco
gramas de solo e um suplemento de 1% de petróleo Sergipano Terra.
Os frascos dos três sistemas foram colocados a 28ºC sob agitação. Após um
período de 30 min, os frascos do sistema 2 foram submetidos a um processo de
pasteurização a 80ºC por 10 min e foram novamente incubados a 28ºC sob agitação.
102
Todos os frascos foram mantidos a 28ºC sob agitação por 7 dias. Ao final deste
período, uma alíquota de 5 ml de cada amostra foi transferida para frascos
contendo 45 ml de meio mineral com 7,5% de NaCl (para os dos sistemas 1 e 2) ou
45 ml de água produzida (para os frascos do sistema 3) e suplementados com 1% de
petróleo. Uma outra alíquota de 1 ml foi utilizada em diluições até 10
-3
. Das
diluições 10
-1
e 10
-3
foram semeadas alíquotas de 100 μl em placas de meio de
cultura acrescido de 7,5% de NaCl: Ágar Nutriente, BHI, GB, LB, TBN ou TSB.
As placas foram incubadas a 32ºC e os frascos de enriquecimento (os frascos
inoculados com o solo e os frascos recém-inoculados) foram colocados a 28ºC sob
agitação por 14 dias.
As placas foram incubadas a 32ºC e foram observadas após 24h e 48h de
incubação. Um exemplar de cada morfotipo colonial foi selecionado e a pureza foi
verificada semeando-se em placas com o mesmo meio de cultura do qual o tipo
morfológico foi selecionado.
Os frascos de enriquecimento (os frascos inoculados com o solo e os frascos
recém-inoculados) foram colocados a 28ºC sob agitação. Após o período de 14 dias,
foram feitas diluições até 10
-3
a partir de alíquotas de 1 ml retiradas dos frascos de
enriquecimento (tanto dos frascos inoculados com o solo enriquecidos por 21 dias
quanto dos frascos enriquecidos por 14 dias). As diluições de 10
-3
foram semeadas
em placas de meio de cultura Ágar Nutriente, BHI, GB, LB, TBN ou TSB acrescido de
7,5% de NaCl e foram incubadas a 32ºC. Após 24h e 48h foram selecionados
diferentes morfotipos coloniais cuja pureza foi verificada semeando-se em placas
com o mesmo meio de cultura no qual os tipos morfológicos foram selecionados.
Os morfotipos isolados foram estocados à temperatura ambiente em tubos
contendo o meio de cultura no qual foram selecionados, sem o suplemento de 7,5%
de NaCl (para evitar a cristalização do sal) e acrescido de 1,2% de ágar.
103
2.2.2. Teste de crescimento dos tipos morfológicos isolados em diferentes
concentrações de sal
Com o objetivo de determinar se os tipos morfológicos selecionados eram
bactérias halofílicas ou halotolerantes, cada um dos isolados foi inoculado em tubos
contendo o mesmo meio de cultura usado para a sua seleção, mas sem a adição de
NaCl. Os morfotipos incapazes de crescer na ausência de NaCl foram considerados
halofílicos.
No caso de estirpes halotolerantes, com o objetivo de identificar a máxima
concentração de NaCl na qual seriam capazes de crescer, foi empregado um teste
de halotolerância utilizando-se diferentes concentrações de NaCl.
As estirpes halotolerantes foram crescidas no mesmo meio de cultura usado
para o isolamento sem a adição de NaCl e 0,1 ml deste crescimento foi inoculado
em tubos contendo 3 ml do mesmo meio acrescido de 7,5%, 10%, 15% ou 20% de
NaCl. Os tubos foram incubados a 32º C por 7 dias e o crescimento bacteriano foi
observado diariamente. A turvação do meio indicaria a presença de crescimento.
Para cada concentração de NaCl foi preparado um tubo sem inóculo bacteriano
(controle negativo) para descartar a possibilidade de a turbidez causada pela alta
concentração de NaCl ser confundida com crescimento bacteriano. Para os testes
positivos na concentração de 20% de NaCl, foram realizados também testes nas
concentrações de 25% e 30%. Não foi possível testar concentrações superiores a 30%
por causa da turbidez causada pela precipitação do sal no tubo usado como controle
negativo.
2.2.3. Teste de degradação de petróleo dos morfotipos isolados
Com o objetivo de identificar, dentre os tipos morfológicos isolados, aqueles
capazes de degradar o petróleo mesmo com a interferência da salinidade da água
produzida, foi realizado teste de degradação do petróleo Sergipano Terra em placas
de 24 cavidades contendo meio mineral Bushnel Haas acrescido de 7,5% de NaCl.
As estirpes isoladas foram crescidas no mesmo meio usado para o isolamento e
lavadas 3 vezes em solução salina. Os testes de degradação de petróleo foram
realizados através do inóculo de 0,1 ml do crescimento bacteriano lavado em 1,8 ml
104
de meio Bushnell-Haas acrescido de 7,5% de NaCl. Em cada placa teste foi mantida
uma cavidade sem inóculo bacteriano como controle negativo. Como controle
positivo da degradação do petróleo, foi utilizada a estirpe Dietzia cinnamea P4
(VON DER WEID et al., 2007). Após o acréscimo de 1 gota do petróleo, as placas
foram mantidas por um período de 7 dias a 32°C e foi feita a observação diária da
degradação do petróleo. A turvação do meio foi verificada para confirmar a
presença de crescimento e modificações da camada de óleo em cada cavidade
associada à ausência de alterações na cavidade sem inóculo indicariam a presença
de biodegradação do óleo.
2.2.4. Teste de utilização de fenantreno pelas bactérias degradadoras de
petróleo Sergipano Terra
Com o objetivo de identificar, dentre as estirpes degradadoras de petróleo
Sergipano Terra (identificadas no teste de degradação de petróleo descrito
anteriormente), aquelas capazes de degradar a fração de HPAs do petróleo, foi
realizado teste de degradação do fenantreno em meio de cultura YTS 250 (GREER,
HAWARI & SAMSON, 1990).
O fenantreno é um hidrocarboneto tricíclico aromático, isto é, composto de
três anéis de benzeno fusionados e este foi escolhido nesta análise como composto
modelo de HPA.
As estirpes degradadoras de petróleo foram crescidas em meio YTS 250
acrescido de 1,5% de agar. O teste de degradação do fenantreno foi realizado em
placas contendo o meio YTS 250, acrescido de 50 µl de uma solução de fenantreno
2,5 g/l preparado em acetona. As estirpes foram semeadas nas placas e após 48 h à
temperatura ambiente foram observadas em aparelho macroscópico binocular.
Zonas claras em torno das colônias foram consideradas como teste positivo.
105
2.3. ANÁLISES DE BIOLOGIA MOLECULAR
2.3.1. Extração de DNA total da comunidade microbiana das amostras de solo
As amostras de solo foram submetidas à extração de DNA total da comunidade
microbiana. Foram utilizadas diferentes técnicas de extração para obter o melhor
rendimento e a melhor qualidade do DNA extraído.
2.3.1.1. “kit” de extração de DNA para solo (FastDNA® SPIN Kit for Soil)
A primeira técnica empregada foi a de lise mecânica utilizando-se o método
de extração direta com o “kit” de extração de DNA para solo (FastDNA® SPIN Kit for
Soil) da BIO101 (Califórnia, EUA).
Para verificar a pureza e a qualidade do DNA obtido, alíquotas de 5 µl de cada
amostra foram submetidas à eletroforese horizontal em gel de agarose a 0,8% (m/v)
preparado em tampão TEB a 8 V por cm em tampão TEB por aproximadamente 2h à
temperatura ambiente. O “1 Kb Plus DNA Ladder” (Invitrogen Life Technologies) foi
utilizado como marcador de massa molecular. Após a corrida eletroforética, o gel
foi corado com brometo de etídio (2 µg/ml) e os fragmentos de DNA foram
observados e fotografados sob luz UV em sistema de análise de imagem IMAGO
(B&L, Holanda).
2.3.1.2. Protocolo segundo Fortin e colaboradores (2004)
As amostragens foram também submetidas ao protocolo de extração de DNA
para amostras ambientais descrito por Fortin e colaboradores (2004). Este protocolo
foi descrito originalmente com o objetivo de otimizar a recuperação de DNA total
da comunidade microbiana a partir de sedimentos contaminados e com alto teor de
matéria orgânica através da utilização de lavagens prévias dos sedimentos com
soluções contendo surfactantes e agentes quelantes e foi adaptado às amostras de
solo deste projeto.
Antes do processo de lise celular e da extração de DNA dos microrganismos
indígenas, amostras de 1 g de solo foram submetidas a etapas de lavagem para
facilitar a separação dos contaminantes.
106
A cada tubo com capacidade para 2 ml foi colocado 1 g de solo. Foram
adicionados 1,5 ml de tampão de lavagem de solo 1 que foram misturados ao solo
utilizando-se vórtex na velocidade 4 por 30 s e depois por inversão durante 1 min e
30 s. Após centrifugação por 5 min a 4°C a 6.500 rpm em centrífuga para
eppendorf, o sobrenadante foi removido com o auxílio de pipeta.
Foram adicionados 1,5 ml de tampão de lavagem de solo 2 e o sedimento foi
ressuspenso utilizando-se vórtex na velocidade 4 por 30 s e depois misturando-se
por inversão durante 1 min e 30 s. Após uma etapa de centrifugação a 4°C por 5
min a 6.500 rpm, o sobrenadante foi removido por aspiração com o auxílio de
pipeta e o sedimento foi ressuspenso em tampão de lavagem de solo 3 através da
utilização de vórtex na velocidade 4 por 30 s seguido de inversão manual por 1 min
e 30 s. Após uma etapa de centrifugação a 4°C por 10 min a 10.000 rpm, o
sobrenadante foi removido por aspiração com o auxílio de pipeta.
Após a etapa de lavagem, as amostras foram ressuspensas em 900 µl de
tampão fosfato de sódio (100 mM, pH 8,0) utilizando-se vórtex na velocidade 4 por
aproximadamente 2 s. Foram adicionados 100 µl de lisozima (0,1 mg/µl) em tampão
Tris-HCl (250 mM, pH 8,0) e os tubos foram deixados sob incubação a 37°C com
homogeneização por inversão em rotor (Cole-Parmer-Roto-Torque model 7637) por
1 h. Foram adicionados 10 µl de proteinase K (20 mg/ml) e, após o perído de 1 h a
37°C sob homogeneização por inversão em rotor (Cole-Parmer-Roto-Torque model
7637) foram adicionados 100 µl de SDS 20% (m/v). Os tubos foram transferidos para
banho-maria a 85°C e submetidos à homogeneização manual por inversão a cada 10
min por um período total de 30 min. Os tubos foram centrifugados a 13.000 rpm por
10 min à temperatura ambiente e o sobrenadante foi transferido para um tubo
eppendorf de 2 ml.
Alternativamente, para otimizar o processo de extração de DNA, foram
adicionados 350 µl de tampão fosfato de sódio (100 mM, pH 8,0) ao tubo com o
sedimento que foi ressuspenso com o auxílio de vórtex na velocidade 4 por
aproximadamente 10 s. Após centrifugação a 13.000 rpm por 10 min à temperatura
ambiente o sobrenadante foi transferido para o tubo eppendorf de 2 ml com o
sobrenadante da primeira centrifugação. Os sobrenadantes foram homogeneizados
107
e ½ volume foi transferido para outro tubo eppendorf de 2 ml. O DNA em cada tubo
foi então precipitado através da adição de ½ volume de acetato de amônia (7,5
mol/l), seguida de homogeneização suave por inversão e incubação em gelo por 15
min.
Após centrifugação a 13.000 rpm por 5 min a 4°C e transferência do
sobrenadante para novos tubos de 2 ml, foram adicionados aos sobrenandantes,
RNase A (10 mg/ml) em volume suficiente para uma concentração final de 100
ng/µl. Os tubos foram deixados a 37°C por 1 h e, em seguida, foram adicionados
1/10 do volume de NaCl 5 mol/l e 1 volume de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico
(25:24:1). Os tubos foram gentilmente homogeneizados por inversão por 2 min e
centrifugados a 13.000 rpm por 5 min à temperatura ambiente. O sobrenadante foi
transferido para outro tubo eppendorf de 2 ml e precipitado a -20°C por uma noite
com igual volume de 2-propanol gelado.
Os tubos foram centrifugados a 13.200 rpm por 15 min a 4°C. O sobrenadante
foi descartado e o DNA foi lavado em 500 µl de etanol 70% (v/v) à temperatura
ambiente. Após centrifugação a 13.200 rpm por 5 min à temperatura ambiente o
sobrenadante foi descartado e o DNA foi seco à temperatura ambiente por
aproximadamente 30 min e ressuspenso em 200 µl de tampão TE (100 μl para cada
tubo). Os tubos foram acondicionados em um recipiente com gelo e colocados sobre
uma placa agitadora (“shaking platform”) sob agitação suave por aproximadamente
1 h até a dissolução do DNA. O DNA de cada tubo foi combinado e estocado a -20ºC.
A purificação do DNA foi realizada pelo protocolo descrito por Berthelet,
Whyte & Greer (1996) modificado. Foram utilizadas colunas vazias de purificação de
1,25ml de plástico autoclavável (Microspin columns) da Amersham Biosciences e
suspensões de polivinilpolipirrolidona (PVPP) e de Sefacril S-400 HR. O DNA foi pré-
aquecido a 37°C por 10 min. Foram adiconados 625 μl da suspenção de PVPP em
tampão fosfato de potássio 200 mM a cada coluna vazia e estéril colocada dentro de
tubos Eppendorf de 2 ml. Após um período de 10 min, foram adiconados 625 μl de
Sefacril S-400 HR em tampão TE pH 7,6. Os tubos contendo as colunas foram
centrifugados por 2 min a 2.900 rpm à temperatura ambiente. As colunas foram
transferidas para novos tubos de 2 ml e 50 μl de DNA pré-aquecido a 37 ºC por 10
108
min foram cuidadosamente aplicados no centro das colunas. Os tubos cotendo as
colunas foram submetidos à centrifugação por 2 min a 2.900 rpm à temperatura
ambiente. O DNA foi estocado a -20 ºC.
Para verificar a qualidade do DNA obtido através deste protocolo de extração,
alíquotas de 5 μl do DNA purificado de cada amostra, foram submetidas à
eletroforese horizontal em gel de agarose a 0,7% (m/v) contendo 0,5 μl de SYBR
Safe (Invitrogen Life Technologies) para cada 30 ml de solução de agarose
preparada em tampão TAE. As amostras foram aplicadas no gel misturadas com
aproximadamente 1/3 do volume de corante de corrida para eletroforese em gel de
agarose. Uma série de diluições (20ng, 40ng e 80ng) do DNA do fago λ (Pharmacia)
foi também aplicada no gel para quantificar o DNA.
Após corrida eletroforética por 10 min a 95 V e posteriormente por 45 min a
25V, em tampão TAE, à temperatura ambiente, as amostras de DNA foram
observadas, digitalizadas e quantificadas em sistema de análise de imagem
ChemiImager (Alpha Innotech Corporation - Califórnia, EUA).
2.3.2. Amplificação por PCR com iniciadores universais para o gene rrs
2.3.2.1. DNA extraído com o “kit” de extração de DNA para solo – iniciadores
U968f-GC1 e L1401r
Esta metodologia foi aplicada às amostras de DNA extraídas através de “kit”
de extração de DNA para solo (FastDNA® SPIN Kit for Soil) utilizando-se amostras de
solo coletadas durante as duas primeiras etapas do projeto.
Foi realizada a amplificação por PCR utilizando-se os iniciadores universais
U968f-GC1 (5’ AAC GCG AAG AAC CTT AC 3’) e L1401r (5’ CGG TGT GTA CAA GAC CC
3’) descritos por Nübel e colaboradores (1996) para a amplificação de parte do gene
rrs que codifica o rRNA 16S. A seqüência do iniciador direto (U968f-GC1) é
precedida de uma seqüência de nucleotídeos rica em GC (5’ CGC CCG CCG CGC GCG
GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G 3’) conhecida como “grampo-GC1”, que
109
permite a posterior análise dos fragmentos amplificados através da técnica de
DGGE.
Cada reação foi realizada em um volume final de 50 µl com 5 mM de MgCl
2
, 2
mM de cada um dos quatro deoxinucleotídeos trifosfatados (dNTP), 0,2 µM de cada
iniciador, 1,25 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen Life Technologies) e o tampão
específico da enzima (20 mM Tris-HCl pH 8,4, 50 mM KCl). Além disso, em cada
reação foi adicionado 10 μg de soro-albumina bovina (BSA) e 1% de formamida (v/v)
para melhorar a eficiência da amplificação do DNA alvo no solo (CHAKRABARTI &
SCHUTT, 2001; KREADER, 1996). A essa reação foi adicionado 1 μl (50 a 100 ng) de
DNA. Foi incluída uma reação na qual não foi adicionado DNA (controle negativo). A
reação de amplificação foi realizada em um ciclo de desnaturação inicial de 2 min a
94°C seguida de 35 ciclos com desnaturação de 1 min a 94°C, anelamento de 1 min
e 30 s a 50°C e extensão de 2 min a 72°C e um ciclo final de extensão de 10 min a
72°C.
Para verificar a eficiência das reações de amplificação por PCR, os fragmentos
obtidos foram submetidos à eletroforese horizontal em gel de agarose a 1,4% (m/v)
como descrito no item 2.3.1.1 (“kit” de extração de DNA para solo (FastDNA® SPIN
Kit for Soil)) para verificar a presença de fragmento de DNA do tamanho esperado
(de 473 pb).
2.3.2.2. DNA extraído segundo protocolo para amostras ambientais
contaminadas – iniciadores U341F-GC2 e U758
Estas análises foram realizadas após a conclusão da terceira etapa do projeto
com o DNA extraído utilizando-se o protocolo para a extração de DNA de amostras
ambientais contaminadas com alto conteúdo de matéria orgânica (FORTIN et al.,
2004) modificado para este projeto.
As amostras de DNA purificadas foram submetidas à amplificação por PCR
utilizando-se os iniciadores universais U341F-GC2 (5’ CCT ACG GGA GGC AGC AG 3’)
e U758 (5’ CTA CCA GGG TAT CTA ATC C 3’) descritos por van de Peer, Chapelle &
De Wachter (1996) para o gene rrs que codifica o rRNA 16S. O iniciador direto
U341F-GC2 é acrescido de uma seqüência de nucleotídeos rica em GC denominada
110
“grampo-GC2” (5’ GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCG CGG CGG GCG GGG
CGG GGG 3’), descrita por Sheffield e colaboradores (1989) para permitir a
posterior análise dos fragmentos amplificados através de DGGE. Para as reações de
amplificação para seqüenciamento, foi utilizado o iniciador direto sem o grampo-
GC2. O procedimento de amplificação por PCR utilizado foi descrito por Chenier e
colaboradores (2003). Dessa forma, 1 μl de DNA (50 a 100 ng) foi adicionado a 49 μl
de uma mistura para a reação contendo 1 mM de MgCl
2
, 0,2 mM de cada um dos
quatro desoxinucleotídeos trifosfatados, 0,5 µM de cada iniciador, 2,5 U da enzima
Taq DNA polimerase (Amersham Pharmacia Biotech) e o tampão específico para a
enzima (10 mM Tris-HCl pH 9,0, 500 mM KCl, 15 mM MgCl
2
).
Além disso, em cada reação de amplificação por PCR foram utilizados 6,25 μg
de BSA para melhorar a eficiência da amplificação do DNA alvo no solo
(CHAKRABARTI & SCHUTT, 2001; KREADER, 1996). Foi incluída uma reação em que
não foi adicionado DNA, mas 1 μl de água Milli-Q como controle negativo. Cada
reação foi submetida a uma etapa inicial de desnaturação a 96ºC por 5 min seguida
de uma etapa de “touchdown” (DON et al., 1991) com temperatura de anelamento
inicial de 65ºC que foi reduzida de 1ºC a cada ciclo até 55ºC. Em seguida, mais 20
ciclos foram realizados a 55ºC. A desnaturação foi realizada a 94ºC por 1 min; o
anelamento foi realizado por 1 min e a extensão a 72ºC por 3 min. O ciclo de
extensão final foi realizado a 72ºC por 3 min.
Após as reações de amplificação por PCR, os fragmentos obtidos foram
submetidos à eletroforese horizontal em gel de agarose a 1,4% (m/v) como descrito
no item 2.3.1.2 (Protocolo segundo Fortin e colaboradores (2004)) para verificar a
presença do fragmento de DNA de tamanho esperado (de 509 pb). A corrida
eletroforética foi realizada por 45 min a 75 V.
Para a obtenção de uma imagem da estrutura da comunidade bacteriana no
experimento de DGGE, com boa resolução das bandas para posterior análise, foram
acumulados 750 ng de fragmentos de PCR. Desta forma, foram realizadas diversas
reações de PCR, de acordo com a qualidade do produto obtido no gel de agarose,
com uma média de 8 a 10 reações por amostra de DNA purificado. As diferentes
reações da mesma amostra de DNA com a qualidade necessária para o DGGE (banda
111
única) foram combinadas para concentrar o DNA que foi precipitado a –20°C por
uma noite com 1/10 do volume de acetato de sódio 3 mol/l pH 5,2 e 2,5 volumes de
etanol absoluto. Após centrifugação a 13.000 rpm por 15 min a 4°C, o DNA foi
lavado com 500 μl de etanol a 70% (v/v). Após nova centrifugação a 13.000 rpm por
5 min à temperatura ambiente, o DNA foi seco à temperatura ambiente por cerca
de 30 min e ressuspenso em 15 μl de tampão TE.
Para quantificar o DNA precipitado, alíquotas de 0,5 μl de cada amostra do
DNA purificado, simultaneamente a uma série de diluições do “gene ruler 100 bp
DNA Ladder” (Fermentas) de modo que a banda de 500 pb se apresentasse nas
concentrações de 8,2 ng, 16,4 ng, 32,8 ng e 65,6 ng, foram submetidas à
eletroforese horizontal em gel de agarose a 1,4% (m/v). As condições da corrida
eletroforética foram as mesmas utilizadas para verificar a presença do fragmento
de DNA após as reações de amplificação por PCR.
2.3.3. Eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE) - gene rrs
2.3.3.1. DNA extraído com o “kit” e PCR com os iniciadores U968f-GC1 e L1401r
Para estimar a diversidade da comunidade bacteriana total nas amostras de
solo submetidas aos diferentes tratamentos, bem como nas amostras de solo
controle (isentas de tratamentos), foi realizada análise de DGGE dos produtos de
PCR obtidos com os iniciadores U968f-GC1 e L1401r (NÜBEL et al., 1996) a partir do
DNA extraído através de “kit” (FastDNA® SPIN Kit for Soil) das amostras de solo
coletadas durante as duas primeiras etapas do projeto.
Primeiramente, foram realizados diversos testes para definir as melhores
condições experimentais para as amostras estudadas. Alíquotas de 20 μl a 30 μl dos
produtos de PCR a serem analisados, misturadas com 10 μl a 15 μl da solução
corante de corrida para DGGE, foram submetidas à eletroforese vertical em gel de
poliacrilamida a 6% (m/v) preparado em tampão TAE 1x, contendo um gradiente
linear de desnaturantes (uréia e formamida) variando de 35% a 65%, de 40% a 70%,
de 45% a 75% e de 45% a 55%, a uma voltagem variando de 60 a 75 V em tampão TAE
112
1x por 16 h a 60°C. As condições selecionadas para o trabalho foram as seguintes:
amostras de 30 μl dos produtos de PCR, misturadas com 10 μl da solução corante de
corrida para DGGE foram aplicadas em gel de poliacrilamida a 6% (m/v) preparado
em tampão TAE 1x com gradiente desnaturante linear de 45% a 75% preparado
utilizando-se as soluções 0% desnaturante (sem desnaturantes) e 100%
desnaturante.
Foram utilizados como marcadores de massa molecular, para permitir a
comparação de dois ou mais géis, o “1 Kb Plus DNA Ladder” (Invitrogen Life
Technologies) e uma mistura de produtos de PCR realizado no laboratório utilizando
os iniciadores U968f-GC1 e L1401r a partir do DNA extraído de amostras de culturas
puras de gêneros bacterianos diferentes. Cada gel de poliacrilamida foi
polimerizado com a adição de 10 μl de TEMED e 50 μl de persulfato de amônio a 10%
(m/v) para cada 12 ml de gel. A corrida eletroforética foi realizada a 75 V em
tampão TAE 1x por 18h a 60°C no sistema “Dcode Universal Mutation Detection
System” da Bio-Rad (Richmond, USA).
Após a corrida eletroforética, os géis foram corados com SYBR Green I
(Molecular Probes) durante 40 min na ausência de luz e os fragmentos de DNA foram
observados com o auxílio de um transiluminador (Pharmacia) e digitalizados
utilizando-se o sistema de imagens IMAGO (B&L) ou em sistema Storm Scanner
(Amersham).
2.3.3.2. DNA extraído com o protocolo para amostras contaminadas com alto
conteúdo de matéria orgânica – iniciadores U341F-GC2 e U758
Foi também utilizada a técnica de DGGE com os produtos de PCR obtidos com
os iniciadores U341F-GC2 e U758 (CHENIER et al., 2003) a partir do DNA extraído
utilizando-se o protocolo para a extração de DNA de amostras ambientais
contaminadas com alto conteúdo de matéria orgânica (FORTIN et al., 2004)
modificado para este projeto. Como já mencionado, estas análises foram realizadas
após a conclusão da terceira etapa do projeto, também utilizando o sistema “Dcode
Universal Mutation Detection System” da Bio-Rad (Richmond, USA).
113
Uma alíquota de 15 μl dos produtos de PCR concentrados (750 ng de DNA),
misturadas com 15 μl da solução corante de corrida para DGGE, foi submetida à
eletroforese vertical em gel de poliacrilamida a 6% (m/v) preparado em tampão TAE
1x, contendo gradiente linear de desnaturantes (uréia e formamida) de 40% a 65%
formado utilizando-se as soluções 0% desnaturante (sem desnaturantes) e 100%
desnaturante. Cada gel de poliacrilamida foi polimerizado com a adição de 10 μl de
TEMED e 50 μl de persulfato de amônio a 10% (m/v) para cada 12 ml de gel.
Foi utilizado o “gene ruler 100 bp DNA Ladder” (Fermentas) para permitir a
comparação de dois ou mais géis. Adicionalmente, foi utilizada uma mistura de
fragmentos de DNA obtidos a partir da re-amplificação por PCR utilizando-se os
iniciadores U341F-GC2 e U758 de diferentes bandas cortadas de géis de DGGE. Estas
bandas foram obtidas a partir de produtos de amplificação por PCR com os
iniciadores U341F-GC2 e U758 de amostras ambientais.
A eletroforese foi realizada por 16 h a 80 V em tampão TAE 1x a 60°C. Após a
corrida eletroforética, os géis foram corados por 30 min em uma diluição 1:10.000
de Vistra Green (Amersham) em tampão TAE 1X sob suave agitação na ausência de
luz e depois descorados por 30 min em tampão TAE 1X sob suave agitação, na
ausência de luz e digitalizados em sistema de imagens FluorImager (Invitrogen Life
Technologies).
A análise dos padrões de bandas dos géis de DGGE foi realizada através do
programa GelComparII. As imagens analisadas incluíram duas linhas de referências
representadas pelo “gene ruler 100 bp DNA Ladder” (Fermentas) e pela mistura de
bandas cortadas de géis de DGGE reamplificadas. Para avaliar as similaridades entre
os padrões de bandas, foi utilizado para o cálculo da distância métrica o coeficiente
de correlação de Dice (DICE, 1945) e como método de agrupamento o Ward (WARD,
1963).
Diferentes bandas de fragmentos de DNA de interesse foram cortadas de cada
gel e eluidas por uma noite a 4°C com 60 μl de água Milli-Q estéril. Após
centrifugação a 13.000 rpm por 1 min em centrífuga para eppendorf, o
sobrenadante foi transferido para um outro tubo estéril e 50 μl foram purificados
com “kit” de purificação de produtos de amplificação por PCR QIAquick (QIAquick
114
PCR Purification Kit) da QIAGEN. Os 10 μl restantes foram mantidos a -20°C. O DNA
purificado foi reamplificado utilizando-se os mesmos iniciadores, porém, sem o
“grampo GC”. Dessa forma, 1 μl de DNA purificado (diluído 1:10 no caso das bandas
mais fortes) foi adicionado a 49 μl de uma mistura para a reação contendo 1 mM de
MgCl
2
, 0,2 mM de cada um dos quatro desoxinucleotídeos trifosfatados, 6,25 μg de
BSA, 0,5 µM de cada iniciador, 2,5 U da enzima Taq DNA polimerase (Amersham
Pharmacia Biotech) e o tampão específico para a enzima (10 mM Tris-HCl pH 9,0,
500 mM KCl, 15 mM MgCl
2
). Cada reação foi submetida a 25 ciclos de desnaturação
a 94ºC por 1 min, anelamento a 64ºC por 1 min e extensão a 72ºC por 1 min.
Após as reações de amplificação por PCR, os fragmentos obtidos foram
submetidos à eletroforese horizontal em gel de agarose a 1,4% (m/v) contendo 0,5
μl de SYBR Safe (Invitrogen Life Technologies) para cada 30 ml de solução de
agarose preparada em tampão TAE à temperatura ambiente por 45 min a 75 V, em
tampão TAE, para verificar a presença e a qualidade do fragmento de DNA. As
amostras foram aplicadas no gel misturadas com aproximadamente 1/3 do volume
da solução corante de corrida para eletroforese de DNA em gel de agarose. O “gene
ruler 100 bp DNA Ladder” (Fermentas) foi utilizado como padrão de tamanho de
DNA linear. Os fragmentos de DNA foram observados e digitalizados em sistema de
análise de imagem ChemiImager (Alpha Innotech Corporation - Califórnia, EUA) e
colocados em categorias de acordo com o tipo de banda observada no gel de
agarose: banda única, fraca ou dupla. As bandas eluídas foram então reamplificadas
utilizando-se as condições de PCR específicas para cada categoria de bandas com o
objetivo de acumular 150 ng de fragmentos de PCR (de banda única) para
sequenciar ambas as fitas do DNA. Cada reação para as bandas classificadas como
únicas foi submetida a 25 ciclos de desnaturação a 94ºC por 1 min, anelamento a
64ºC por 1 min e extensão a 72ºC por 1 min. As reações para as bandas classificadas
como fracas foram submetidas a 30 ciclos de desnaturação a 94ºC por 1 min,
anelamento a 64ºC por 1 min e extensão a 72ºC por 1 min. Para as bandas duplas,
foram testados de 20 a 30 ciclos de desnaturação a 94ºC por 1 min, anelamento a
65ºC por 30 s e extensão a 72ºC por 1 min.
115
Os produtos obtidos com as reações de reamplificação foram combinados e o
DNA foi precipitado com 1 μl de glicogênio (20 mg/ml), 1/10 do volume de acetato
de sódio 3 mol/l pH 5,2 e 2,5 volumes de etanol absoluto a –20°C por uma noite.
Depois de centrifugados a 13.000 rpm por 15 min a 4°C, os DNAs foram lavados com
500 μl de etanol a 70% (v/v) à temperatura ambiente e novamente centrifugados a
13.000 rpm por 5 min à temperatura ambiente. Após secagem à temperatura
ambiente por aproximadamente 1 h, o DNA foi ressuspenso em 30 μl de água Milli-Q
estéril.
Após solubilização do DNA, todo o volume foi aplicado em gel de agarose a
1,4% (m/v) contendo 0,5 μl de SYBR Safe para cada 30 ml de solução de agarose
preparada em tampão TAE 1X. Depois da corrida eletroforética por 45 min a 75 V,
em tampão TAE 1X, à temperatura ambiente, os fragmentos de DNA foram
observados e digitalizados em sistema de análise de imagem ChemiImager (Alpha
Innotech Corporation - Califórnia, EUA) e as bandas foram cortadas do gel e
purificadas com “kit” de purificação de DNA GFX (Amersham Biosciences).
Para quantificar o DNA purificado, alíquotas de 1 μl de DNA, simultaneamente
a uma série de diluições do “gene ruler 100 bp DNA Ladder” (Fermentas) de modo
que a banda de 500 pb se apresentasse nas concentrações de 8,2 ng, 16,4 ng, 32,8
ng e 65,6 ng, foram submetidas à eletroforese horizontal em gel de agarose a 1,4%
(m/v) contendo 0,5 μl de SYBR Safe para cada 30 ml de solução de agarose
preparada em tampão TAE 1X. Após corrida eletroforética por 45 min a 75 V, em
tampão TAE 1X, à temperatura ambiente, os fragmentos de DNA foram observados,
digitalizados e quantificados em sistema de análise de imagem ChemiImager (Alpha
Innotech Corporation - Califórnia, EUA). Alíquotas de 20 μl das amostras de DNA
extraídas a partir do gel de DGGE foram enviadas para seqüenciamento na
Universidade de Laval (Quebec, Canadá).
As sequências obtidas foram testadas para a possível ocorrência de quimeras
através do programa Bellerophon, um programa desenvolvido para a detecção de
quimeras do gene que codifica o rRNA 16S em bibliotecas de clones de produtos de
PCR de amostras ambientais mas que pode ser aplicado a outros alinhamentos de
seqüências de nucleotídeos (HUBER, FAULKNER & HUGENHOLTZ, 2004) e foram
116
analisadas através do programa BioEdit e comparadas com o banco de dados
(GenBank) através do programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool -
ALTSCHUL et al., 1997).
2.3.4. Amplificação por PCR com iniciadores universais para o gene alkB
As amostras de DNA extraídas das diferentes amostragens de solo tratado e
não tratado (controle), utilizando-se o protocolo para a extração de DNA de
amostras ambientais contaminadas com alto conteúdo de matéria orgânica (FORTIN
et al., 2004), foram também submetidas à amplificação por PCR utilizando-se os
iniciadores universais alkH1FGC2 (5’ CIG IIC ACG AII TIG GIC ACA AGA AGG 3’) e
alkH3R (5’ IGC ITG ITG ATC III GTG ICG CTG IAG 3’) descritos por Chenier e
colaboradores (2003) para o gene alkB que codifica a enzima alcano hidroxilase
(envolvida na degradação de alcanos). O iniciador direto, alkH1FGC2, é acrescido
da seqüência do grampo-GC2 (SHEFFIELD et al., 1989) que permite a posterior
análise dos fragmentos amplificados através de DGGE. Para as reações de
amplificação para seqüenciamento, foi utilizado o iniciador direto sem o grampo-
GC2.
O procedimento de amplificação por PCR foi descrito por Chenier e
colaboradores (2003). Essencialmente, 1 μl de DNA (50 a 100 ng) foi adicionado a 49
μl de uma mistura para a reação contendo 1 mM de MgCl
2
, 0,2 mM de cada um dos
quatro desoxinucleotídeos trifosfatados, 0,5 µM de cada iniciador, 2,5 U da enzima
Taq DNA polimerase (Amersham Pharmacia Biotech) e tampão para a enzima (10
mM Tris-HCl pH 9,0, 500 mM KCl, 15 mM MgCl
2
). Além disso, em cada reação de
amplificação por PCR foram utilizados 6,25 μg de BSA para melhorar a eficiência da
amplificação do DNA alvo no solo (CHAKRABARTI & SCHUTT, 2001; KREADER, 1996).
Foi incluída uma reação em que não foi adicionado DNA, mas 1 μl de água Milli-Q
como controle negativo. Como controle positivo foi utilizado o DNA da estirpe
Pseudomonas oleovorans ATCC 29347. As reações foram submetidas a um ciclo
inicial de desnaturação a 96ºC de 5 min, seguido de 30 ciclos de desnaturação a
94ºC por 1 min, anelamento a 60ºC por 1 min e extensão a 72ºC por 1 min e um
ciclo de extensão final a 72ºC por 3 min.
117
Para verificar a eficiência das reações de amplificação por PCR, os fragmentos
obtidos foram submetidos à eletroforese horizontal em gel de agarose a 1,4% (m/v)
como descrito no item 2.3.2.2 (DNA extraído segundo protocolo para amostras
ambientais contaminadas – iniciadores U341F-GC2 e U758).
Para a obtenção de uma imagem da estrutura da comunidade bacteriana
degradadora de hidrocarbonetos alcanos no experimento de DGGE, com boa
resolução das bandas para posterior análise, foram acumulados 350 ng de
fragmentos de PCR. Desta forma, foram realizadas diversas reações de PCR, de
acordo com a qualidade do produto obtido no gel de agarose, com uma média de 6
a 8 reações por amostra de DNA purificado. As diferentes reações da mesma
amostra de DNA foram combinadas para concentrar o DNA que foi precipitado a –
20°C por uma noite com 1/10 do volume de acetato de sódio 3 mol/l pH 5,2 e 2,5
volumes de etanol absoluto. Após centrifugação a 13.000 rpm por 15 min a 4°C, o
DNA foi lavado com 500 μl de etanol a 70% (v/v). Após nova centrifugação a 13.000
rpm por 5 min à temperatura ambiente, o DNA foi seco à temperatura ambiente por
cerca de 30 min e ressuspenso em 15 μl de tampão TE.
Para quantificar o DNA precipitado, alíquotas de 0,5 µl de cada amostra do
DNA purificado, simultaneamente a uma série de diluições do “gene ruler 100 bp
DNA Ladder” (Fermentas) de modo que a banda de 500 pb se apresentasse nas
concentrações de 8,2 ng, 16,4 ng, 32,8 ng e 65,6 ng, foram submetidas à
eletroforese horizontal em gel de agarose a 1,4% (m/v) como descrito no item
2.3.2.2 (DNA extraído segundo protocolo para amostras ambientais contaminadas –
iniciadores U341F-GC2 e U758).
2.3.5. Eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE) - gene alkB
Foi utilizada a técnica de DGGE com os produtos de PCR obtidos com os
iniciadores universais alkH1FGC2 e alkH3R (CHENIER et al., 2003) para o gene alkB
para estimar a diversidade da população bacteriana degradadora de
hidrocarbonetos alcanos nas amostras de solo submetidas aos diferentes
tratamentos e também das amostras de solo controle.
118
A eletroforese foi realizada em sistema “Dcode Universal Mutation Detection
System” da Bio-Rad (Richmond, USA) em gel de poliacrilamida a 6% (m/v)
preparado em tampão TAE 1x, contendo gradiente linear de desnaturantes (uréia e
formamida) de 45% a 65%. As condições de eletroforese foram as mesmas utilizadas
para o gene rrs descritas no item 2.3.3.2 (DNA extraído com o protocolo para
amostras contaminadas com alto conteúdo de matéria orgânica – iniciadores U341F-
GC2 e U758).
Foi utilizado o “gene ruler 100 bp DNA Ladder” (Fermentas) para permitir a
comparação de dois ou mais géis. Como marcador do fragmento do gene alkB foi
utilizado o produto de PCR obtido nas mesmas condições que as reações de
amplificação realizadas para as amostras de solo a partir do DNA da estirpe P.
oleovorans ATCC 29347.
Os padrões de bandas observados no gel foram analisados através do programa
GelComparII, sendo incluídas nas imagens analisadas, duas linhas de referências
representadas pelo “gene ruler 100 bp DNA Ladder” (Fermentas) e o produto de
PCR obtido da estirpe P. oleovorans ATCC 29347 com os iniciadores universais
alkH1FGC2 e alkH3R (CHENIER et al., 2003). Foi utilizado para o cálculo da
distância métrica, o coeficiente de Dice (DICE, 1945) e como método de
aglomeração o Ward (WARD, 1963).
Diferentes bandas de fragmentos de DNA de interesse foram cortadas do gel,
eluidas e purificadas com “kit” de purificação de produtos de amplificação por PCR
QIAquick (QIAGEN). O DNA purificado foi reamplificado algumas vezes nas mesmas
condições e utilizando-se os mesmos iniciadores, porém, sem o “grampo GC” com o
objetivo de acumular 150 ng de fragmentos de PCR para sequenciar ambas as fitas
do DNA.
Os produtos obtidos com a reamplificação de cada banda foram combinados e
o DNA foi precipitado e quantificado nas mesmas condições descritas para os
experimentos de DGGE do gene rrs no item 2.3.3.2 (DNA extraído com o protocolo
para amostras contaminadas com alto conteúdo de matéria orgânica – iniciadores
U341F-GC2 e U758).
119
As amostras de foram também enviadas para seqüenciamento na Universidade
de Laval e as sequências obtidas foram analisadas através do programa BioEdit e
comparadas com o banco de dados (GenBank) através do programa BLAST
(ALTSCHUL et al., 1997) e FASTA (LIPMAN & PEARSON, 1985; PEARSON & LIPMAN,
1988; PEARSON, 1990).
2.3.6. Amplificação por PCR com iniciadores específicos para o gene ndoB
O DNA extraído das amostras de solo submetidas aos diferentes tratamentos,
bem como a amostra controle (não tratada) utilizando-se o protocolo para a
extração de DNA de amostras ambientais contaminadas com alto conteúdo de
matéria orgânica (FORTIN et al., 2004) modificado, foi ainda submetido à
amplificação por PCR utilizando-se dois pares de iniciadores específicos para o gene
ndoB que codifica a subunidade maior (subunidade alfa) da enzima naftaleno 1,2-
dioxigenase, envolvida na via de degradação do naftaleno. O naftaleno é um
hidrocarboneto bicíclico aromático e, por este motivo, serve como modelo para
compreender as propriedades de uma ampla classe de hidrocarbonetos, os
policíclicos aromáticos.
Foram realizadas reações de amplificação por PCR utilizando dois sistemas de
iniciadores específicos para o gene ndoB. Os iniciadores ndoBbGC (5’ CAC TCA TGA
TAG CCT GAT TCC TGC CCC CGG CG 3’) e ndoBe (5’ CCG TCC CAC AAC ACA CCC ATG
CCG CTG CCG 3’) foram descritos por Kurkela e colaboradores (1988) enquanto os
iniciadores ndoB(F2)GC (5’ GCT TCC ATG GCT TCA TCT ACG GTT GCT TGC A 3’) e
ndoB(R2) (5’ GGC TAG TCT TTT TCG ACC ATG GCC CAC GTC 3’) foram desenhados
por Greer em 2000 (comunicação pessoal) com base em alinhamentos dos genes phn
RP007, ndo, dox e nah (genes que também codificam a subunidade alfa da
naftaleno 1,2-dioxigenase). O iniciador ndoB(F2)GC é homólogo à região 925-954 do
gene ndoB e o iniciador ndoB(R2) é homólogo à região 1506-1477 deste mesmo gene
da estirpe Pseudomonas putida ATCC 17484. Os iniciadores diretos, ndoBbGC e
ndoB(F2)GC, são acrescidos de grampo-GC2 (SHEFFIELD et al., 1989) que permite a
posterior análise dos fragmentos amplificados através de DGGE.
120
Cada reação foi realizada em um volume final de 50 µl com 1 mM de MgCl
2
, 0,2
mM de cada um dos quatro desoxinucleotídeos trifosfatados, 0,5 µM de cada
iniciador, 2,5 U de Taq DNA polimerase e tampão para a enzima (10 mM Tris-HCl pH
9,0, 500 mM KCl, 15 mM MgCl
2
). Além disso, em cada reação de amplificação por
PCR foram utilizados 6,25 μg de BSA para melhorar a eficiência da amplificação do
DNA alvo no solo (CHAKRABARTI & SCHUTT, 2001; KREADER, 1996). A cada reação
foi adicionado 1 μl de DNA (50 a 100 ng). Foi incluída uma reação em que não foi
adicionado DNA, mas 1 μl de água Milli-Q como controle negativo. Como controle
positivo foi utilizada o DNA da estirpe P. putida ATCC 17484. A reação de
amplificação foi realizada em um ciclo de desnaturação inicial de 5 min a 96°C
seguida de 30 ciclos com desnaturação de 30 s a 94°C, anelamento de 30 s a 65°C e
extensão de 30 s a 72°C e um ciclo final de extensão de 7 min a 72°C.
Após as reações de amplificação por PCR, as amostras foram submetidas à
eletroforese horizontal em gel de agarose a 1,4% (m/v) como descrito no item
2.3.2.2 (DNA extraído segundo protocolo para amostras ambientais contaminadas –
iniciadores U341F-GC2 e U758) para verificar a presença de fragmento de DNA do
tamanho esperado (de 642 pb para os iniciadores ndoBbGC e ndoBe e de 553 pb
para os iniciadores ndoB(F2)GC e ndoB(R2)).
2.3.7. Microarranjo de DNA
2.3.7.1. Microarranjo de genes estruturais - Microarranjo Taxonômico
Foram realizados experimentos com microarranjo de genes estruturais para
avaliar a diversidade estrutural das amostras ambientais (Microarranjo
Taxonômico). Para isso, foi realizada amplificação por PCR do gene rrs que codifica
para o rRNA 16S e do gene cpn60 que codifica para a proteína GroEL, para a análise
da diversidade bacteriana das amostras de DNA do solo através da identificação das
espécies bacterianas presentes nas amostras e suas proporções relativas utilizando-
se a hibridização sobre um microarranjo desses genes estruturais.
121
Os produtos de PCR obtidos com os iniciadores para cada um dos genes e com
o DNA total das diferentes amostras de solo foram marcados com o fluoróforo Cy5.
Para cada amostra, os produtos de amplificação por PCR dos genes rrs e cpn60
foram combinados para hibridização sobre a lâmina contendo o microarranjo com
oligonucleotídeos dos genes rrs e cpn60 de diversas espécies bacterianas,
denominada “chip taxonômico”.
2.3.7.1.1. Amplificação por PCR com iniciadores universais para os genes rrs e
cpn60
As amostras de DNA selecionadas extraídas de diferentes amostragens de solo
utilizando-se o protocolo para a extração de DNA de amostras ambientais
contaminadas com alto conteúdo de matéria orgânica (FORTIN et al., 2004), foram
submetidas à amplificação por PCR do gene rrs e do gene cpn60 (MAYNARD et al.,
2005).
Para a amplificação do gene rrs, que codifica o rRNA 16S, foram usados os
iniciadores universais F1 (5’ GAG TTT GAT CCT GGC TCA G 3’) e R13 (5’ AGA AAG
GAG GTG ATC CAG CC 3’) descritos por Dorsch & Stachebrandt (1992).
De acordo com o procedimento de amplificação descrito por Dorsch &
Stachebrandt (1992), 1 μl de DNA (50 ng) foi adicionado a 49 μl de uma mistura para
a reação contendo 5 mM MgCl
2
, 2 mM de cada um dos quatro desoxinucleotídeos
trifosfatados, 25 ρmol de cada iniciador, 2,5 U da enzima Taq DNA polimerase
(Amersham Pharmacia Biotech) e o tampão específico para a enzima (10 mM Tris-
HCl pH 9,0, 500 mM KCl, 15 mM MgCl
2
). Foi incluída uma reação em que não foi
adicionado DNA, mas 1 μl de água Milli-Q como controle negativo. Cada reação foi
submetida a um ciclo inicial de desnaturação a 94ºC de 5 min, seguido de 35 ciclos
de desnaturação a 94ºC por 30 s, anelamento a 50ºC por 30 s e extensão a 72ºC por
1 min e um ciclo de extensão final a 72ºC por 7 min.
Para o gene cpn60, foram utilizados os iniciadores universais WDF (5’ GAI III
GCI GGI GAY GGN ACN ACN AC 3’) e WDR (5’ KIY KIT CIC CRA ANC CNG GNG CYT T
3’) descritos por Maynard e colaboradores (2005).
122
A reação de amplificação por PCR foi realizada como descrito por Maynard e
colaboradores (2005) num volume final de 50 μl com 50 ng de DNA, 25 mM MgCl
2
, 2
mM de cada um dos quatro desoxinucleotídeos trifosfatados, 100 ρmol de cada
iniciador, 2,5 U da enzima Taq DNA polimerase (Amersham Pharmacia Biotech) e o
tampão específico para a enzima (10 mM Tris-HCl pH 9,0, 500 mM KCl, 15 mM
MgCl
2
). Foi incluída uma reação em que não foi adicionado DNA, mas 1 μl de água
Milli-Q como controle negativo. Cada reação foi submetida a um ciclo inicial de
desnaturação a 94ºC de 5 min, seguido de 35 ciclos de desnaturação a 94ºC por 30 s,
anelamento a 55ºC por 30 s e extensão a 72ºC por 1 min e um ciclo de extensão
final a 72ºC por 7 min.
Para verificar a eficiência das reações de amplificação por PCR, os fragmentos
obtidos foram submetidos à eletroforese horizontal em gel de agarose a 1,4% (m/v)
como descrito no item 2.3.2.2 (DNA extraído segundo protocolo para amostras
ambientais contaminadas – iniciadores U341F-GC2 e U758) para verificar a presença
de fragmento de DNA do tamanho esperado (de 1,5 kb para o gene rrs e de 555 pb
para o gene cpn60).
2.3.7.1.2. Marcação dos produtos de PCR com o fluoróforo cianina 5
Foi realizada a marcação enzimática de 100 ng dos produtos de PCR obtidos
com os iniciadores universais para os genes rrs e cpn60 utilizando-se o fluoróforo
Cy5 ligado ao dCTP (dCTP-Cy5) com o “kit” BioPrime (Invitrogen Life Technologies).
Após a reação de marcação, os produtos de PCR marcados foram purificados
utilizando-se o “kit” de purificação de DNA PureLink™ PCR Purification Kit
(Invitrogen Life Technologies).
Para determinar a concentração de DNA, a eficiência da reação de marcação e
a qualidade do DNA marcado foi realizada a leitura da DO entre 200 e 700 nm de
cada amostra (ver exemplo na figura 8) utilizando-se o aparelho espectrofotômetro
NanoDrop. Para uma rápida estimativa do percentual de incorporação, foi calculada
a razão da DO do pico do fluoróforo Cy5 (650 nm) pelo pico na DO de 260 nm (DNA).
A razão da absorção a 260 nm (DNA) e 280 nm (proteínas) forneceu uma estimativa
da qualidade da amostra de DNA. A concentração de DNA foi calculada pela DO a
123
260 nm.
Figura 8. Gráfico da leitura da concentração de DNA DO entre 200 e 700
nm em espectrofotômetro NanoDrop para verificar a eficiência da reação de
marcação com o fluoróforo Cy5 e a qualidade do DNA marcado. Este gráfico do
DNA extraído da amostra da célula-piloto 2 tratada com água produzida coletada
1 dia após o início dos experimentos é apresentado apenas como exemplo.
2.3.7.1.3. Hibridização com microarranjo de genes estruturais - chip
taxonômico
Foi realizada a pré-hibridização colocando-se o “chip taxonômico” em tampão
de pré-hibridização (DIG Easy Hyb buffer da Boehringer Mannheim e 5% de BSA) a
50°C por 1h sob agitação no aparelho SlideBooster 400 Hybridization Station
(Advalytix AG). Após este período, o chip pré-hibridizado foi lavado em SSC 0,1x
pré-aquecido a 37°C e seco com o auxílio de uma bomba de ar comprimido.
Para as reações de hibridização com o microarranjo taxonômico, foram
testadas 3 concentrações diferentes (100, 200 e 400 ng) dos produtos de
amplificação por PCR dos genes rrs e cpn60 para padronizar esta metodologia para
as amostras de solo estudadas. A quantidade necessária de cada gene amplificado
(rrs e cpn60) para a hibridização foi transferida para um mesmo tubo e evaporada
em SpeedVac, evitando-se a secagem completa.
124
A mistura de produtos de PCR dos genes rrs e cpn60 marcados foi ressuspensa
em tampão de hibridização (DIG Easy Hyb buffer da Boehringer Mannheim) e
incubada a 95°C por 5 min para desnaturação. Em seguida foi colocada sobre o chip
e coberto com uma lamínula de hibridização (LifterSlip). O chip foi incubado a 50°C
por 16 h sob agitação no SlideBooster 400 Hybridization Station (Advalytix AG).
2.3.7.1.4. Lavagem do chip taxonômico
Após a etapa de hibridização, o chip foi lavado 3 vezes em SSC 0,1x e SDS 0,1%
(m/v) pré-aquecido a 50°C. Em seguida, o chip foi lavado com SSC 0,1x pré-
aquecido a 37°C e foi seco com o auxílio de uma bomba de ar comprimido.
2.3.7.1.5. Leitura (scanner) e quantificação
Foi realizada a leitura do sinal do fluoróforo Cy5, com geração de imagens de
hibridização, obtida por meio de leitores (scanners) de fluorescência a laser
utilizando-se o ScanArray Express (PerkinElmer Life Sciences). As imagens geradas
foram utilizadas para a quantificação dos sinais gerados pelo fluoróforo utilizando-
se o mesmo aparelho. Os valores gerados foram analisados e calculados em planilha
eletrônica Excel (Microsoft Office Excel).
2.3.7.2. Microarranjo de genes funcionais - Microarranjo Catabólico
Foi realizada a análise do DNA total da comunidade microbiana extraído
utilizando-se o protocolo para amostras ambientais contaminadas com alto
conteúdo de matéria orgânica (FORTIN et al., 2004), através de hibridização sobre
um microarranjo de genes funcionais para determinar a presença e as proporções
relativas de microrganismos indígenas com a capacidade de degradar ou
transformar poluentes orgânicos ou inorgânicos ou que participam da ciclagem
biogeoquímica de elementos.
Em geral, este procedimento envolve a marcação do DNA total extraído das
amostras de solo com o fluoróforo Cy5 e do DNA controle com o fluoróforo Cy3, a
subseqüente hibridização com o microarranjo de genes funcionais, a detecção a
laser e a quantificação do sinal hibridizado.
125
2.3.7.2.1. Marcação do DNA total com o fluoróforo cianina 5
As amostras de DNA total extraído de cada uma das amostras de solo
selecionadas para esta análise e o DNA do fago λ, empregado nesse experimento
como controle, foram marcados de acordo com o protocolo do fabricante com o
“kit” BioPrime (Invitrogen Life Technologies).
Foi realizada a marcação enzimática de 100 ng do DNA total extraído de cada
uma das amostras de solo selecionadas para esta análise utilizando-se dCTP-Cy5
com o “kit” BioPrime (Invitrogen Life Technologies). O DNA do fago λ foi marcado
com o fluoróforo Cy3 também ligado ao dCTP (dCTP-Cy3).
Após a reação de marcação, o DNA foi purificado utilizando-se o “kit” de
purificação de DNA PureLink™ PCR Purification Kit (Invitrogen Life Technologies). A
eficiência da reação de marcação, a qualidade e a concentração de DNA obtido
foram avaliadas através de absorção entre 200 e 700 nm utilizando-se NanoDrop. O
percentual de incorporação foi calculado pela razão da DO do pico do fluoróforo
(Cy3 a 550 nm e Cy5 a 650 nm) pelo pico na DO de 260 nm (DNA). A razão da
absorção a 260 nm (DNA) e 280 nm (proteínas) foi utilizada para avaliar a qualidade
da amostra de DNA marcado. A concentração de DNA foi obtida através da DO a 260
nm.
2.3.7.2.2. Hibridização com microarranjo de genes catabólicos - chip catabólico
Foi realizada a pré-hibridização colocando-se a lâmina contendo o
microarranjo de genes funcionais, denominada “chip catabólico”, em tampão de
pré-hibridização (BSA 1% (m/v), SSC 5x e SDS 0,1% (m/v)) a 42°C por 1h. Após este
período, o chip pré-hibridizado foi lavado 3 vezes em SSC 0,1x, seguido de uma
lavagem com água deionizada e foi seco sob uma corrente de nitrogênio filtrado ou
em uma microcentrífuga para lâminas.
Para as reações de hibridização com o microarranjo catabólico, foram testadas
2 concentrações diferentes (1000 e 2000 ng), bem como a quantidade total de DNA
obtido através da reação de marcação com o fluoróforo Cy5 (cerca de 4000 a 5000
ng) para padronizar esta técnica para as amostras de solo estudadas. A quantidade
126
necessária de DNA para a hibridização foi transferida para um tubo e evaporada em
SpeedVac para secar, evitando-se a secagem completa.
O DNA marcado foi ressuspenso em tampão de hibridização (DIG Easy Hyb
buffer da Boehringer Mannheim), contendo 1 µl de RNA transportador (tRNA) 10
mg/ml e 1 µl de DNA de esperma de salmão (SsDNA) 10 mg/ml. O tRNA e o SsDNA
foram utilizados com controle interno.
As amostras de DNA marcado em tampão de hibridização foram desnaturadas a
95°C por 2 min e transferidas para o chip. O chip foi coberto com uma lamínula de
hibridização (LifterSlip), transferido para uma câmara de hibridização e incubado a
50°C por 16 h em banho-maria.
2.3.7.2.3. Lavagem do chip catabólico
Após a hibridização, o chip catabólico foi lavado 3 vezes em SSC 0,1x e SDS
0,1% (m/v) pré-aquecido a 50°C e, posteriormente, em SSC 0,1x. Após rinsagem em
isopropanol, o chip foi seco sob uma corrente de nitrogênio filtrado ou em uma
microcentrífuga para lâminas.
2.3.7.2.4. Leitura (scanner) e quantificação
Foi realizada a leitura do sinal dos fluoróforos Cy3 e Cy5, com a geração de
imagens de hibridização, obtida por meio de leitores (scanners) de fluorescência a
laser utilizando-se o ScanArray Express (PerkinElmer Life Sciences). A partir das
imagens geradas foi feita a quantificação dos sinais gerados pelos fluoróforos, no
mesmo aparelho. Os valores gerados foram analisados e calculados em planilha
eletrônica Excel (Microsoft Office Excel).
127
RESULTADOS
1. Isolamento e caracterização de estirpes bacterianas capazes de degradar o
óleo na presença de sal
Foram selecionadas colônias com características morfológicas diferentes (cor,
formato, opacidade, etc) em cada meio de cultura utilizado para o plaqueamento.
Colônias semelhantes isoladas de meios diferentes foram consideradas morfotipos
diferentes (Figura 9).
Figura 9. Morfologia de algumas colônias isoladas de amostras de solo
tratado com óleo (célula-piloto 4) por meio de enriquecimento com 1% de óleo
Sergipano Terra exemplificando características como cor, formato e opacidade.
1.1. Isolamento de estirpes bacterianas hidrocarbonoclásticas e halotolerantes
A diversidade morfológica das colônias isoladas a partir do enriquecimento em
meio Bushnell-Haas com 7,5% de NaCl (não-pasteurizados) foi bastante elevada,
sendo isolados 134 tipos morfológicos diferentes. A distribuição desses isolados
pelas amostragens foi bastante heterogênea. A maior diversidade morfológica foi
observada na amostragem de 234 dias, da qual foi possível isolar 30% dos tipos
morfológicos. Esse percentual caiu para 21% e 20% para as amostragens 43 e 136
128
dias e para 13% e 11% para as amostragens 311 e 193 dias, respectivamente. A
menor diversidade colonial observada foi de 5% dos morfotipos isolados na
amostragem de 157 dias (Tabela 5).
Tabela 5. Tipos morfológicos isolados de solo tratado com óleo Sergipano Terra
(célula-piloto 4) de acordo com o sistema de enriquecimento utilizado.
Tipos morfológicos isolados
Sistema de enriquecimento
Amostragens
usadas para
o isolamento
Bushnell-Hass
(1)
80ºC/10 min
(2)
Água produzida
(3)
Total
43 dias 28 8 4 40
136 dias 27 - - 27
157 dias 7 2 12 21
193 dias 15 20 7 42
234 dias 40 - - 40
311 dias 17 - - 17
Total 134 30 23 187
(1) sistema de enriquecimento em meio mineral Bushnell-Haas acrescido de 7,5% de NaCl, (2)
enriquecimento em meio Bushnell-Haas acrescido de 7,5% de NaCl com etapa prévia de
pasteurização a 80ºC por 10 min, (3) enriquecimento em água produzida.
Através do enriquecimento para a seleção de estirpes formadoras de esporos
realizado pela incubação prévia das amostras a 80ºC por 10 min, realizado a partir
de 3 das amostragens de solo contaminado com petróleo, uma da fase I (coleta de
43 dias) e duas da fase II (coletas de 157 e 193 dias) foi possível obter 30 diferentes
tipos morfológicos coloniais diferentes. Das mesmas amostragens, com o sistema de
enriquecimento em meio Bushnell-Hass que não foi pasteurizado foram isolados 50
morfotipos. No entanto, a distribuição dos isolados pasteurizados pelas amostragens
de solo foi bastante irregular, com 2/3 dos morfotipos selecionados da amostra de
solo de 193 dias (Tabela 5).
Do enriquecimento em água produzida realizado com o objetivo de obter
estirpes halotolerantes ou halofílicas resistentes aos diferentes componentes da
água produzida, também realizado a partir de 3 das amostragens de solo
129
contaminado com petróleo foi isolado um número de morfotipos (23) inferior ao
isolado das mesmas amostragens no sistema de enriquecimento em meio Bushnell-
Hass sem pasteurização (50). A distribuição dos isolados pelas amostragens de solo
foi igualmente irregular, com metade dos isolados selecionados da amostra de solo
de 157 dias (Tabela 5).
Comparando-se os três sistemas de enriquecimento com petróleo utilizados
para 3 diferentes amostragens de solo da célula-piloto contaminada com petróleo,
foi possível observar que, de um modo geral, o número de isolados foi maior com o
enriquecimento em meio Bushnell-Hass, exceto quando foi utilizada a amostra de
solo coletada 157 dias, de onde foi possível isolar 12 morfotipos a partir de água
produzida e apenas 7 a partir de meio Bushnell-Hass. Mesmo para as amostragens
submetidas ao processo de pasteurização, das quais foram isolados mais morfotipos
que do enriquecimento em água produzida, o número de isolados da amostragem
157 dias (2) foi inferior aos do sistema de enriquecimento em água produzida
(Tabela 5).
Considerando-se todos os sistemas de enriquecimento e amostragens
utilizadas, ao todo foram isolados 187 morfotipos coloniais (Tabela 5).
Ao final do período de enriquecimento, a degradação do óleo nos frascos
Erlenmeyer foi visível (Figura 10). Esta degradação foi maior nos frascos que
permaneceram por 14 dias incubados (inoculados a partir dos frascos de
enriquecimento que permaneceram incubados por 21 dias e que foram inoculados
diretamente com as amostras de solo).
130
Figura 10. Enriquecimento com 1% de óleo Sergipano Terra da amostra de
solo tratado com óleo (célula-piloto 4) coletada 43 dias após o início dos
experimentos. 1) 1º inóculo; 2) 2º inóculo; A) meio Bushnell-Haas acrescido de
7,5% de NaCl; B) meio Bushnell-Haas 7,5% de NaCl submetido a etapa de
pasteurização a 80ºC por 10 min; C) água produzida. Os frascos foram
fotografados ao final do período total de enriquecimento.
O número de tipos morfológicos isolados variou bastante conforme o meio de
cultura empregado para o plaqueamento das diluições dos enriquecimentos. O meio
de cultura TSB foi o meio com o qual foi possível observar o maior número de
morfotipos coloniais (32%), seguidos pelos meios BHI (23,5%) e LB (21,5%) e pelos
meios GB (9,6%) e TBN (8,6%). Somente foi possível isolar estirpes a partir do meio
ágar nutriente quando foi utilizada para o enriquecimento amostra de solo coletada
193 dias após o início dos experimentos (4,8%). De modo semelhante, um número
maior de estirpes isoladas foi obtido a partir do plaqueamento da amostra de solo
de 193 dias em meio BHI (Tabela 6).
A1 B1
C1
A2
B2
C2
131
Tabela 6. Morfotipos coloniais isolados de solo tratado com óleo Sergipano Terra
(célula-piloto 4) de acordo com os meios de cultura utilizados.
Número de morfotipos coloniais isolados
Meio de cultura usado para plaqueamento
Amostragens
usadas para o
isolamento
Ágar Nutriente BHI GB LB TBN TSB
Total
43 dias 0 2 2 15 0 21 40
136 dias 0 8 3 0 6 10 27
157 dias 0 8 6 2 0 5 21
193 dias 9 26 7 0 0 0 42
234 dias 0 0 0 16 8 16 40
311 dias 0 0 0 7 2 8 17
Total 9 44 18 40 16 60 187
1.2. Avaliação dos morfotipos coloniais isolados quanto à capacidade de
crescimento em diferentes concentrações de sal
Todas as estirpes foram capazes de crescer normalmente no mesmo meio de
cultura usado para a seleção do morfotipo colonial sem, no entanto, a adição de
NaCl indicando não existir estirpes halofílicas entre os isolados.
Todas as estirpes isoladas (187) foram capazes de crescer na presença de 7,5%
de NaCl. Apenas 4 estirpes (1 isolada a partir da amostra coletada em 193 dias, 1 da
amostra de 234 dias e 2 de 311 dias) não apresentaram crescimento em meio de
cultura contendo 10% de NaCl. Enquanto 95% das estirpes cresceram na presença de
15% de NaCl, apenas a metade (51%) foi capaz de crescer quando a concentração de
sal foi aumentada para 20% (Tabela 7).
Somente uma estirpe (O5p1LB) isolada da única amostra da primeira fase do
projeto utilizada nos experimentos de isolamento (coletada 43 dias após a
contaminação com óleo), foi capaz de crescer em 30% de NaCl (Tabela 7). Esta
estirpe foi isolada a partir do inóculo em placa de meio LB do enriquecimento com
o óleo Sergipano Terra em meio Bushnell-Haas acrescido de 7,5% de NaCl com etapa
de pasteurização por 10 min a 80ºC.
132
Tabela 7. Teste de halotolerância das estirpes isoladas de solo tratado com óleo
Sergipano Terra (célula-piloto 4): crescimento no mesmo meio de cultura de
isolamento contendo diferentes concentrações de NaCl.
Halotolerância* (nº de isolados halotolerantes) Amostragens
usadas para o
isolamento
até 7,5%
de NaCl
até 10%
de NaCl
até 15%
de NaCl
até 20%
de NaCl
até 25%
de NaCl
até 30%
de NaCl
43 dias 40 40 40 35 15 1
136 dias 27 27 21 21 6 0
157 dias 21 21 14 7 0 0
193 dias 42 41 31 11 3 0
234 dias 40 39 32 14 1 0
311 dias 17 15 8 7 2 0
Total 187 183 146 95 27 1
*concentração máxima de NaCl com crescimento.
1.3. Avaliação dos isolados quanto à capacidade de degradação de óleo
A degradação do óleo Sergipano Terra foi considerada positiva, quando
qualquer alteração na camada de óleo foi observada em até 7 dias após o inóculo
da estirpe estudada. Além disso, foi utilizada a estirpe Dietzia cinnamea P4 (VON
DER WEID et al., 2007) como controle positivo da degradabilidade do óleo Sergipano
Terra. Como controle negativo do experimento de degradação, em cada placa teste
foi mantida uma cavidade sem inóculo bacteriano (Figura 11).
Mais de 30% das estirpes isoladas (62) foram capazes de crescer degradando o
óleo usado para contaminar as amostras de solo (Tabela 8).
133
Figura 11. Teste de biodegradação de 1% óleo Sergipano Terra das estirpes
isoladas das amostras de solo tratado com óleo (célula-piloto 4) realizado em
microplacas de 24 cavidades em meio Bushnell-Hass com 7,5% de NaCl. Esta
placa foi escolhida como exemplo para demonstrar a aparência do teste logo
após o inóculo (A) e após 3 (B), 5 (C) e 7 (D) dias de incubação a 32°C.
Degradação (teste positivo): redução da camada de óleo em até 7 dias (círculos
laranjas). Controle negativo: sem inóculo bacteriano (círculo azul). Controle
positivo: Dietzia cinnamea P4 (VON DER WEID et al., 2007; círculo vermelho).
Coalescência (círculos rosas).
Tabela 8. Morfotipos coloniais isolados de solo tratado com óleo Sergipano Terra
(célula-piloto 4) capazes de degradar o óleo Sergipano Terra em meio Bushnell-
Hass na presença de 7,5% de NaCl ou de coalescer a gota de óleo.
Degradação Amostragens usadas
para o isolamento
Isolados
+ -
Coalescência
do óleo
43 dias 40 17 23 4
136 dias 27 6 21 1
157 dias 21 11 10 4
193 dias 42 17 25 1
234 dias 40 7 33 6
311 dias 17 4 13 2
Total 187 62 125 18
A
B
C
D
134
Dentre estas estirpes degradadoras de petróleo, 45% (28) foram selecionadas a
partir de enriquecimento em meio Bushnell-Haas com 7,5% de NaCl, 31% (19) a
partir de enriquecimento submetido a pasteurização e 24% (15) a partir de
enriquecimento com água produzida. De um modo geral, essas estirpes foram
isoladas a partir de placas de BHI (14 isolados), GB (12 isolados), LB (13 isolados) e
TSB (13 isolados). Poucas foram isoladas a partir dos meios ágar nutriente (8
isolados) e TBN (2 isolados). Todas as estirpes degradadoras de óleo isoladas de
placas de meio ágar nutriente foram isoladas da amostragem de 193 dias, a partir
de enriquecimento pasteurizado e apresentaram halotolerância até 15% de NaCl e
as duas degradadoras que foram isoladas de meio TBN foram isoladas da
amostragem de 234 dias, a partir de enriquecimento em meio Bushnell-Haas com
7,5% de NaCl não pasteurizado e com halotolerância a até 20% de NaCl (Tabela 9).
Tabela 9. Morfotipos coloniais isolados de solo tratado com óleo Sergipano Terra
(célula-piloto 4) degradadores do óleo Sergipano Terra em meio Bushnell-Hass
na presença de 7,5% de NaCl, meios de enriquecimento e isolamento e
halotolerância.
amostragem
isolados enriquecimento meio halotolerância
43 dias O5.1.2LB Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
LB 20%
43 dias O5p1LB Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
+ 80ºC/10 min
LB 30%
43 dias O5p3LB Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
+ 80ºC/10 min
LB 20%
43 dias O5p4LB Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
+ 80ºC/10 min
LB 15%
43 dias O5p5LB Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
+ 80ºC/10 min
LB 20%
43 dias O5p6LB Bushnell-Haas + 7,5% de
NaCl
+ 80ºC/10 min
LB 25%
43 dias O5p7LB Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
+ 80ºC/10 min
LB 25%
43 dias O5.1.5TSB Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
TSB 25%
43 dias O5.1.6aTSB Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
TSB 25%
43 dias O5.1.6bTSB Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
TSB 25%
43 dias O5.1.8TSB Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
TSB 20%
43 dias O5.1.9TSB Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
TSB 25%
43 dias O5.1.11TSB Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
TSB 25%
43 dias O5.1.12bTSB Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
TSB 20%
43 dias O5.2.1TSB Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
TSB 20%
135
Continuação: Tabela 10. Morfotipos coloniais isolados de solo tratado com óleo
Sergipano Terra (célula-piloto 4) degradadores do óleo Sergipano Terra em meio
Bushnell-Hass na presença de 7,5% de NaCl, meios de enriquecimento e
isolamento e halotolerância.
amostragem
isolados enriquecimento meio halotolerância
43 dias O5.2.5TSB Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
TSB 25%
43 dias O5H
2
O6GB Água produzida GB 20%
136 dias O14.1.1BHI Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
BHI 20%
136 dias O14.1.2BHI Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
BHI 20%
136 dias O14.1.3BHI Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
BHI 25%
136 dias O14.1.4BHI Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
BHI 20%
136 dias O14.1.6BHI Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
BHI 20%
136 dias O14.2.3GB Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
GB 25%
157 dias O17LB1 Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
LB 10%
157 dias O17H
2
O1bGB Água produzida GB 20%
157 dias O17H
2
O2GB Água produzida GB 20%
157 dias O17H
2
O3GB Água produzida GB 20%
157 dias O17H
2
O4GB Água produzida GB 20%
157 dias O17H
2
O5GB Água produzida GB 20%
157 dias O17H
2
O1bBHI Água produzida BHI 15%
157 dias O17H
2
O3BHI Água produzida BHI 15%
157 dias O17H
2
O5BHI Água produzida BHI 15%
157 dias O17H
2
O10BHI Água produzida BHI 15%
157 dias O17p1BHI Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
+ 80ºC/10 min
BHI 10%
157 dias O17p3BHI Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
+ 80ºC/10 min
BHI 20%
193 dias O21H
2
O2GB Água produzida GB 20%
193 dias O21H
2
O3GB Água produzida GB 20%
193 dias O21H
2
O6GB Água produzida GB 20%
193 dias O21H
2
O7GB Água produzida GB 10%
193 dias O21H
2
O8GB Água produzida GB 20%
193 dias O21p2BHI Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
+ 80ºC/10 min
BHI 10%
193 dias O21p4BHI Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
+ 80ºC/10 min
BHI 25%
193 dias O21p10BHI Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
+ 80ºC/10 min
BHI 15%
193 dias O21p2AN Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
+ 80ºC/10 min
Ágar
Nutriente
15%
193 dias O21p5aAN Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
+ 80ºC/10 min
Ágar
Nutriente
15%
136
Continuação: Tabela 11. Morfotipos coloniais isolados de solo tratado com óleo
Sergipano Terra (célula-piloto 4) degradadores do óleo Sergipano Terra em meio
Bushnell-Hass na presença de 7,5% de NaCl, meios de enriquecimento e
isolamento e halotolerância.
amostragem
isolados enriquecimento meio halotolerância
193 dias O21p5bAN Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
+ 80ºC/10 min
Ágar
Nutriente
15%
193 dias O21p6AN Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
+ 80ºC/10 min
Ágar
Nutriente
15%
193 dias O21p7AN Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
+ 80ºC/10 min
Ágar
Nutriente
15%
193 dias O21p8AN Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
+ 80ºC/10 min
Ágar
Nutriente
15%
193 dias O21p9AN Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
+ 80ºC/10 min
Ágar
Nutriente
15%
193 dias O21p15AN Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
+ 80ºC/10 min
Ágar
Nutriente
15%
234 dias O23.2lTSB Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
TSB 10%
234 dias O23.4bTSB Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
TSB 15%
234 dias O23.4lTSB Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
TSB 15%
234 dias O23.6cLB Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
LB 15%
234 dias O23.10T1TBN
Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
TBN 20%
234 dias O23.10ptTBN Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
TBN 20%
234 dias O23.12LB Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
LB 20%
311 dias O27.3LB Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
LB 25%
311 dias O27.6LB Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
LB 20%
311 dias O27.8b1LB Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
LB 10%
311 dias O27.8b2TSB Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
TSB 10%
A maioria (40%) das estirpes degradadoras de petróleo mostraram-se capazes
de crescer em até 25% de NaCl. A estirpe O5p1LB, que apresentou halotolerância de
30% de NaCl, mostrou-se capaz de degradar o óleo Sergipano Terra na presença de
7,5% de NaCl.
Foi também observado o fenômeno de coalescência do óleo em 10% das
estirpes isoladas testadas durante o teste de degradação em placas de 24
cavidades. Este fenômeno foi observado logo em seguida ao inóculo da estirpe
bacteriana a ser testada, quando foi adicionado o óleo à cavidade da microplaca, e
caracterizou-se pelo não espalhamento da gota de óleo em uma camada fina sobre
o meio Bushnell-Haas como observado para as demais estirpes, bem como nas
cavidades dos controles positivo e negativo. A coalescência do óleo foi considerada
137
quando este efeito permaneceu por todo o período do experimento sem desfazer-se
(Figura 11).
A maioria das estirpes capazes de coalescer a gota de óleo desde o instante do
inóculo até o final do experimento foi selecionada a partir de enriquecimento em
meio Bushnell-Haas com 7,5% de NaCl e isolamento em meio TSB e mostraram-se
capazes de crescer em até 20% de NaCl. No entanto, entre estas estirpes com a
capacidade de coalescência do óleo, foram observados morfotipos isolados dos três
sistemas de enriquecimento e em praticamente todos os meios de cultura
empregados, exceto no meio ágar nutriente e com halotolerância variando de 7,5%
a 25% de NaCl (Tabela 10).
Tabela 12. Morfotipos coloniais isolados de solo tratado com óleo Sergipano
Terra (célula-piloto 4) capazes de coalescer o óleo Sergipano Terra em meio
Bushnell-Hass na presença de 7,5% de NaCl, meios de enriquecimento e
isolamento e halotolerância.
Isolados amostragem enriquecimento meio de
cultura
halotolerância
O27.4LB 311 dias Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl LB 20%
O23.6vpTBN 234 dias Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl TBN 7,5%
O23.3.2TBN 234 dias Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl TBN 10%
O23.3.3TBN 234 dias Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl TBN 15%
O23.6capTBN 234 dias Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl TBN 15%
O17.1TSB 157 dias Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl TSB 10%
O17.2TSB 157 dias Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl TSB 10%
O23.2TSB 234 dias Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl TSB 10%
O27.2iTSB 311 dias Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl TSB 10%
O14.3.4TSB 136 dias Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl TSB 20%
O23.2mTSB 234 dias Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl TSB 20%
O5p8LB 43 dias Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
+ 80ºC/10 min
LB 15%
O5p2LB 43 dias Bushnell-Haas + 7,5% de NaCl
+ 80ºC/10 min
LB 20%
O5H
2
O1BHI 43 dias Água produzida BHI 15%
O17H
2
O1aBHI 157 dias Água produzida BHI 15%
O5H
2
O8BHI 43 dias Água produzida BHI 25%
O17H
2
O1aGB 157 dias Água produzida GB 20%
O21H
2
O1GB 193 dias Água produzida GB 20%
138
1.4. Avaliação dos isolados degradadores de óleo quanto à capacidade de
degradação de fenantreno
Todas as estirpes testadas foram capazes de crescer em placas de meio YTS
250 acrescidas de fenantreno preparado em acetona. No entanto, só foram
observados halos em torno do crescimento de 2 estirpes.
A estirpe O21p9AN foi isolada a partir da amostra coletada 193 dias após o
primeiro tratamento da célula-piloto 4 com óleo Sergipano Terra. Seu isolamento
foi realizado através do inóculo em placa de meio ágar nutriente do enriquecimento
com óleo Sergipano Terra em meio Bushnell-Haas acrescido de 7,5% de NaCl com
etapa de pasteurização por 10 min a 80ºC. A estirpe O23.4l1LB foi isolada através
do enriquecimento com óleo Sergipano Terra em meio Bushnell-Haas acrescido de
7,5% de NaCl (sem a etapa de pasteurização) e inóculo em placa de meio LB da
amostra coletada 234 dias após o início dos experimentos. Ambas apresentaram um
perfil de halotolerância de 15% de NaCl, isto é, foram capazes de crescer na
presença de 15% de NaCl mas não na presença de 20% deste sal.
2. Análises com técnicas de biologia molecular
2.1. Extração de DNA total da comunidade microbiana das amostras de solo
A obtenção de amostras de DNA de boa qualidade tornou-se um fator limitante
para a realização posterior das análises moleculares de PCR, DGGE e microarranjo
de DNA. Essa limitação metodológica demandou o investimento em estratégias
eficientes de extração de DNA das amostras ambientais. Dessa forma, foi utilizado o
protocolo de extração de DNA de amostras ambientais contaminadas e com alto
teor de matéria orgânica (FORTIN et al., 2004). Alguns ajustes metodológicos foram
necessários para viabilizar a extração de DNA total da comunidade microbiana a
partir das amostras de solo franco-argiloso.
As amostras de solo submetidas à extração de DNA total da comunidade
microbiana utilizando-se o “kit” de extração de DNA para solo (FastDNA® SPIN Kit
for Soil) apresentaram-se no gel de agarose com um índice de degradação bem mais
139
alto que as amostras submetidas ao protocolo de extração de DNA para amostras
ambientais modificado (Figura 12). Estas, por sua vez, apresentaram-se com
diferentes concentrações de DNA (Figura 12b), indicando que a eficiência do
método variou entre as amostras de solo.
Figura 12. a) Eletroforese em gel de agarose a 0,8% em tampão TEB de DNA
obtido com “kit” de extração de DNA para solo das amostras coletadas 1 dia
(canaletas superiores) e 136 dias (canaletas inferiores) após o início dos
experimentos. b) Eletroforese em gel de agarose a 0,7% em tampão TAE
contendo SYBR Safe de DNA obtido através de protocolo para amostras
ambientais (FORTIN et al., 2004) modificado das amostras coletadas 1 dia (fase
I), 136 dias (fase II) e 429 dias (fase III) após o início dos experimentos. A
numeração (1, 2 e 3) indica que foram utilizadas cada uma das triplicatas de
cada amostra de solo analisada. Marcadores de massa molecular: kb) “1 Kb Plus
DNA Ladder” e bp) “gene ruler 100 bp DNA Ladder”; λ) DNA do fago λ: 20 ng
(λ1), 40 ng (λ2) e 80 ng (λ3); C) amostras de solo controle (célula-piloto 1); A e
B) amostras tratadas com água produzida (A) nas fases I e II e bioestimuladas (B)
na fase III (célula-piloto 2); M e BO) amostras tratadas com mistura de água
produzida e óleo (M) nas fases I e II e bioestimuladas e tratadas com óleo (BO) na
fase III (célula-piloto 3); O) amostras tratadas com óleo (célula-piloto 4). Estes
géis foram escolhidos como exemplo para demonstrar a aparência do DNA após a
utilização das duas técnicas de extração testadas.
kb C A M
O
.
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
λ DNA
429 dias bp
λ1 λ2 λ3 C B BO O
λ DNA
1 dia
136 dias bp
λ1 λ2 λ3 C A M O C A M O
a b
m C A
M
O
.
b1 b2 b3 b4 C A M O C A M O C A M O
140
2.2. DGGE do gene rrs
2.2.1. Amplificação por PCR com iniciadores universais para o gene rrs
As reações de amplificação por PCR com os iniciadores U968f-GC1 e L1401r
(NÜBEL et al., 1996) realizadas a partir das amostras de DNA extraído com o “kit”
de extração de DNA para solo (FastDNA® SPIN Kit for Soil) resultaram,
invariavelmente, em uma banda difusa, por vezes em banda dupla. Além disso, não
foi possível observar fragmento de DNA para algumas amostras. As condições de
amplificação precisaram ser adaptadas concentrando-se ou diluindo o DNA,
aumentando a concentração de MgCl
2
de 5 mM para 7,5 mM, bem como reduzindo a
temperatura de anelamento de 50°C para 48°C. No entanto, não houve incremento
da qualidade das reações de amplificação (Figura 13a).
Ao utilizar as amostras de DNA obtido segundo o protocolo descrito por Fortin
e colaboradores (2004) em reações de amplificação com os iniciadores U341F-GC2 e
U758 (VAN DE PEER, CHAPELLE & DE WACHTER, 1996) foi possível observar a
migração de uma banda única do tamanho esperado e com elevada concentração de
DNA em eletroforese em gel de agarose 1,4% (Figura 13b).
141
Figura 13. a) Eletroforese em gel de agarose 1,4% dos produtos de PCR com
os iniciadores U968f-GC1 e L1401r (NÜBEL et al., 1996) das amostras coletadas
1 dia (canaletas superiores) e 136 dias (canaletas inferiores) após o início dos
experimentos. b) Eletroforese em gel de agarose a 1,4% em tampão TAE
contendo SYBR Safe dos produtos de PCR com os iniciadores U341F-GC2 e U758
(CHENIER et al., 2003) das amostras coletadas 1 dia (fase I), 136 dias (fase II) e
429 dias (fase III) após o início dos experimentos. A numeração (1, 2 e 3) indica
que foram utilizadas cada uma das triplicatas de cada amostra de solo analisada.
kb) marcador de massa molecular: “1 Kb Plus DNA Ladder”; bp) marcador de
massa molecular: “gene ruler 100 bp DNA Ladder”; seta (→): banda de 500pb:
8,2 ng (b1), 16,4 ng (b2), 32,8 ng (b3) e 65,6 ng (b4); C) amostras de solo
controle (célula-piloto 1); A e B) amostras tratadas com água produzida (A) nas
fases I e II e bioestimuladas (B) na fase III (célula-piloto 2); M e BO) amostras
tratadas com mistura de água produzida e óleo (M) nas fases I e II e
bioestimuladas e tratadas com óleo (BO) na fase III (célula-piloto 3); O) amostras
tratadas com óleo (célula-piloto 4); CN) Controle negativo. Estes géis foram
escolhidos como exemplo para demonstrar a aparência do DNA obtido com as
reações de PCR das amostras de DNA obtidas com as duas técnicas de extração
testadas.
2.2.2. DGGE - PCR com iniciadores universais para o gene rrs
Não foi possível obter boa resolução das bandas em experimentos de DGGE dos
fragmentos de DNA obtidos pela amplificação por PCR com os iniciadores U968f-GC1
e L1401r (NÜBEL et al., 1996) para o gene rrs que codifica o rRNA 16S quando o DNA
M
1 dia
136 dias 429 dias .
b1 b2 b3 b4 C A M O C A M O C B BO O
Kb C A M
O CN
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
a b
142
molde utilizado foi extraído através de “kit” de extração de DNA para solo (Figura
14).
Figura 14. DGGE em gradiente desnaturante linear de 45% a 75% dos
produtos de PCR com iniciadores U968f-GC1 e L1401r (NÜBEL et al., 1996) para
o gene rrs a partir do DNA extraído através de “kit” de extração de DNA para
solo das amostras coletadas 1 dia após o início dos experimentos. A numeração
(1, 2 e 3) indica que foram utilizadas cada uma das triplicatas da amostra de
solo analisada. kb) marcador de massa molecular: “1 Kb Plus DNA Ladder”; P)
mistura de produtos de PCR com os iniciadores U968f-GC1 e L1401r de
diferentes amostras de culturas bacterianas puras; C) amostras sem tratamento
(controle); A) amostras tratadas com água produzida; M) amostras tratadas com
mistura de água produzida e óleo; O) amostras tratadas com óleo.
A estratégia de lavagens das amostras de solo previamente ao processo de
extração de DNA para remoção de substâncias que poderiam interferir nas reações
de amplificação por PCR e a metodologia de reamplificação dos fragmentos obtidos
por PCR para acumular 750 ng de DNA favoreceu a obtenção de imagens de boa
qualidade, com boa resolução das bandas no experimento de DGGE.
Primeiramente, foi feito um ensaio de DGGE utilizando as três amostras
compostas (triplicatas) de algumas amostragens para observar se os resultados
seriam reprodutíveis nas triplicatas, com o objetivo de reduzir o número de
kb P C A
M
O
P kb
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
143
amostras e possibilitar a realização de todos os experimentos planejados, sem
perder a representatividade das amostragens (Figura 15).
Figura 15. DGGE em gradiente desnaturante linear de 40% a 65% dos
produtos de PCR com iniciadores U341F-GC2 e U758 (VAN DE PEER, CHAPELLE &
DE WACHTER, 1996) para o gene rrs a partir do DNA extraído das triplicatas das
amostras de solo coletadas 429 dias após o início dos experimentos. A
numeração (1, 2 e 3) representa cada uma das triplicatas da amostra de solo
analisada. bp) marcador de massa molecular: “gene ruler 100 bp DNA Ladder”;
P) mistura de produtos de PCR com os iniciadores U341F-GC2 e U758 de
diferentes bandas cortadas de géis de DGGE; C) amostras controle (célula-piloto
1); B) amostras tratadas com água produzida nas fases I e II e bioestimuladas na
fase III (célula-piloto 2); BO) amostras tratadas com mistura de água produzida e
óleo nas fases I e II e bioestimuladas e tratadas com óleo na fase III (célula-piloto
3).
bp P C B BO .
1 2 3 1 2 3 1 2 3
144
A análise do gel de DGGE a partir de sua imagem digitalizada revelou um
elevado grau de similaridade (entre 96,8 e 100%) entre as diferentes amostragens
coletadas da mesma célula-piloto (Figura 16).
Figura 16. Análise do gel de DGGE dos produtos de PCR com os iniciadores
U341F-GC2 e U758 (VAN DE PEER, CHAPELLE & DE WACHTER, 1996) para o gene
rrs do DNA extraído das triplicatas das amostras de solo coletadas 429 dias após
o início dos experimentos, realizada com o programa GelComparII, utilizando-se
o coeficiente de Dice e o método de aglomeração de Ward. C1 a C3) Triplicatas
de amostras controle (célula-piloto 1); B1 a B3) Triplicatas de amostras tratadas
com água produzida nas fases I e II e bioestimuladas na fase III (célula-piloto 2);
BO1 a BO3) Triplicatas de amostras tratadas com mistura de água produzida e
óleo nas fases I e II e bioestimuladas e tratadas com óleo na fase III (célula-piloto
3).
Com base nesta análise, os demais experimentos de DGGE foram realizados
utilizando-se apenas uma das triplicatas para cada amostra estudada (Figuras 17 a
25).
A Figura 17 apresenta a imagem digitalizada obtida do experimento de DGGE
das amostras de solo da célula-piloto controle. Foi possível observar uma variação
no padrão de bandas nas amostras ao longo do tempo. Como estas amostras não
foram submetidas a nenhum tratamento com petróleo, água produzida ou
bioestimulação, as mudanças ocorridas nos perfis de bandas e que refletem
145
mudanças nas comunidades dos solos indicam que houve interferência de fatores
ambientais nestas amostras como períodos de seca e de chuva, por exemplo.
Figura 17. DGGE em gradiente desnaturante linear de 40% a 65% dos
produtos de PCR com iniciadores U341F-GC2 e U758 (VAN DE PEER, CHAPELLE &
DE WACHTER, 1996) para o gene rrs a partir do DNA extraído das amostras de
solo controle (célula-piloto 1). bp) marcador de massa molecular: “gene ruler
100 bp DNA Ladder”; P) mistura de produtos de PCR com os iniciadores U341F-
GC2 e U758 de diferentes bandas cortadas de géis de DGGE; 1) 1dia; 2) 43 dias;
3) 91 dias; 4) 116 dias; 5) 136 dias; 6) 234 dias; 7) 406 dias; 8) 429 dias e 9) 638
dias. As setas indicam bandas cortadas para seqüenciamento (apresentadas nas
Tabelas 11 e 12).
Fase I
Fase II
Fase III .
bp P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 P bp
146
A análise da imagem digitalizada do DGGE através do programa GelComparII
confirmou a variabilidade entre as amostras do solo controle (Figura 18).
A amostra da coleta 429 dias destacou-se das demais com apenas 40% de
similaridade. As demais amostras agruparam-se em dois grupos relativamente
heterogêneos com 48% de similaridade. A população bacteriana presente nas
amostras da fase III (406 e 638 dias) mostrou-se mais próxima à amostra de solo
controle da primeira coleta (1 dia), porém, as amostras da fase II e as demais
amostras da fase I agruparam-se formando dois grupos distintos com 57% de
similaridade entre si.
Figura 18. Análise do gel de DGGE dos produtos de PCR com os iniciadores
universais U341F-GC2 e U758 (VAN DE PEER, CHAPELLE & DE WACHTER, 1996)
para o gene rrs do DNA extraído das amostras de solo controle (célula-piloto 1),
realizada através do programa GelComparII, utilizando-se o coeficiente de Dice e
o método de aglomeração de Ward. A numeração indica que a amostra foi
coletada 1, 43 e 91 dias (fase I), 116, 136 e 234 dias (fase II) e 406, 429 e 638
dias (fase III) após o início dos experimentos.
A partir do experimento de DGGE das amostras de solo submetidas ao
tratamento com água produzida (fases I e II) e bioestimulação (fase III), foi possível
observar uma diferença entre as três fases experimentais. Foi possível também
147
observar que as amostras bioestimuladas apresentam um perfil de bandas bastante
diferente, refletindo mudanças maiores nas comunidades bacterianas dessas
amostras (Figura 19).
É possível observar bandas com ocorrência em todas as amostras, como a
banda b, também presente nas amostras do solo controle, representando genótipos
pouco afetados pela água produzida ou pela adição de nutrientes ao solo. Por outro
lado, algumas bandas parecem exclusivas das primeiras fases, desaparecendo ao
longo do tempo, como a banda w presente apenas nas amostras da fase I e a banda
3 que desapareceu com a introdução da bioestimulação. De modo contrário, é
possível observar bandas aparecendo ou tornando-se mais intensas com o passar do
tempo, como a banda o (Figura 19). Estas variações sinalizam pressões de seleção
distintas da água produzida e da bioestimulação a favor ou contra determinados
genótipos.
148
Figura 19. DGGE em gradiente desnaturante linear 40% a 65% dos produtos
de PCR com iniciadores U341F-GC2 e U758 (VAN DE PEER, CHAPELLE & DE
WACHTER, 1996) para o gene rrs a partir do DNA extraído das amostras de solo
tratadas com água produzida nas fases I e II e bioestimuladas na fase III. bp)
marcador de massa molecular: “gene ruler 100 bp DNA Ladder”; P) mistura de
produtos de PCR com os iniciadores U341F-GC2 e U758 de diferentes bandas
cortadas de géis de DGGE; 1) 1dia; 2) 43 dias; 3) 91 dias; 4) 116 dias; 5) 136
dias; 6) 234 dias; 7) 406 dias; 8) 429 dias e 9) 638 dias. As setas indicam bandas
cortadas para seqüenciamento (apresentadas nas Tabelas 11 e 12).
Com a análise do gel, foi possível confirmar a distinção entre o tratamento
com água produzida e o tratamento de bioestimulação sobre a comunidade
bacteriana do solo (Figura 20). As populações bacterianas presentes nas amostras
Fase I
Fase II
Fase III .
bp
P
1
2
3
4
5 6
7
8 9
P
bp
149
de solo bioestimulado são mais próximas entre si, formando um grupo com 37% de
similaridade com as amostras tratadas com água produzida.
A população bacteriana presente na última amostra coletada na fase I (91
dias) mostrou-se mais próxima das amostras da fase II.
Figura 20. Análise do gel de DGGE dos produtos de PCR com os iniciadores
U341F-GC2 e U758 (VAN DE PEER, CHAPELLE & DE WACHTER, 1996) para o gene
rrs do DNA extraído das amostras de solo tratadas com água produzida (A) nas
fases I e II e bioestimuladas (B) na fase III, realizada com o programa
GelComparII, usando-se o coeficiente de Dice e o método de agrupamento de
Ward. A numeração indica que a amostra foi coletada 1, 43 e 91 dias (fase I),
116, 136 e 234 dias (fase II) e 406, 429 e 638 dias (fase III) após o início dos
experimentos.
Também com o DNA extraído das amostras de solo coletadas da célula-piloto 3
submetida ao tratamento com mistura de água produzida e óleo nas fases I e II e
bioestimulada e tratada com óleo na fase III, foi possível observar alterações nos
perfis de DGGE mais acentuadas nas amostras da fase III (Figura 21).
A banda b também foi observada nessas amostras, sofrendo pressão negativa
na fase III, ao passo que outras bandas foram selecionadas e foram observadas
apenas em amostras da fase III, como a banda z, da mesma forma que o observado
150
nas amostras da célula-piloto 2 tratada com água produzida (fases I e II) e
bioestimulada (fase III), sugerindo que a adição de nutrientes favoreceu algumas
populações em detrimento de outras.
Figura 21. DGGE em gradiente desnaturante linear 40% a 65% dos produtos
de PCR com iniciadores U341F-GC2 e U758 (VAN DE PEER, CHAPELLE & DE
WACHTER, 1996) para o gene rrs do DNA extraído das amostras de solo tratadas
com mistura de água produzida e óleo nas fases I e II e bioestimuladas e tratadas
com óleo na fase III. bp) marcador de massa molecular: “gene ruler 100 bp DNA
Ladder”; P) mistura de produtos de PCR com os iniciadores U341F-GC2 e U758
de diferentes bandas cortadas de géis de DGGE; 1) 1dia; 2) 43 dias; 3) 91 dias; 4)
116 dias; 5) 136 dias; 6) 234 dias; 7) 406 dias; 8) 429 dias e 9) 638 dias. As setas
indicam bandas cortadas para seqüenciamento (apresentadas nas Tabelas 11 e
12).
Fase I
Fase II
Fase III .
bp P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 P bp
151
Outros genótipos sofreram pressão negativa com a introdução da segunda
contaminação com a mistura de água produzida e petróleo, como indicado pela
banda w, presente somente nas amostras da fase I, fenômeno observado também na
célula-piloto 2.
As bandas presentes nas amostras das fases I e II podem representar
populações halotolerantes selecionadas pela água produzida.
A análise do gel de DGGE através do programa GelComparII, revelou que, como
o esperado, as populações bacterianas presentes nas amostras tratadas com mistura
de água produzida e óleo nas fases I e II são mais próximas entre si, formando
subgrupos (Figura 22).
Figura 22. Análise do gel de DGGE dos produtos de PCR com os iniciadores
U341F-GC2 e U758 (VAN DE PEER, CHAPELLE & DE WACHTER, 1996) para o gene
rrs do DNA extraído das amostras de solo tratadas com mistura de água
produzida e óleo (M) nas fases I e II e bioestimuladas e tratadas com óleo (BO) na
fase III, realizada através do programa GelComparII, utilizando-se o coeficiente
de Dice e o método de aglomeração de Ward. A numeração indica que a amostra
foi coletada 1, 43 e 91 dias (fase I), 116, 136 e 234 dias (fase II) e 406, 429 e
638 dias (fase III) após o início dos experimentos.
152
A população bacteriana da amostra 116 dias, primeira amostra coletada na
fase II mostrou-se mais próxima das amostras da fase I. As amostras às quais foram
adicionados nutrientes mostraram-se diferentes em relação às demais com apenas
24% de similaridade (Figura 22).
Os perfis de DGGE das amostras de solo tratadas com petróleo mostraram-se
bastante heterogêneos (Figura 23).
Figura 23. DGGE em gradiente desnaturante linear 40% a 65% dos produtos
de PCR com iniciadores U341F-GC2 e U758 (VAN DE PEER, CHAPELLE & DE
WACHTER, 1996) para o gene rrs do DNA extraído das amostras de solo tratadas
com petróleo (célula-piloto 4). bp) marcador de massa molecular: “gene ruler
100 bp DNA Ladder”; P) mistura de produtos de PCR com os iniciadores U341F-
GC2 e U758 de diferentes bandas cortadas de géis de DGGE; 1) 1dia; 2) 43 dias;
3) 91 dias; 4) 116 dias; 5) 136 dias; 6) 234 dias; 7) 406 dias; 8) 429 dias e 9) 638
dias. As setas indicam bandas cortadas para seqüenciamento (apresentadas nas
Tabelas 11 e 12).
Fase I
Fase II
Fase III .
bp P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 P bp
153
Foi possível observar diversas bandas com ocorrência em todas as amostras,
como a banda b, indicando que alguns genótipos foram pouco afetados pela
contaminação por petróleo. Para outras bandas há variações entre as amostras das
diferentes fases, como a banda w, presente somente na fase I e que pode estar
representando um genótipo sensível à presença do petróleo. Já a banda y, presente
somente a partir da fase II, pode estar indicando a seleção de bactérias
hidrocarbonoclásticas.
A partir da análise com o programa GelComparII da imagem digitalizada do gel
foi possível observar que a população bacteriana presente nas amostras da fase III
mostrou-se diferente em relação às demais, embora a amostra da última coleta
(638 dias) tenha se mostrado mais próxima às outras amostras com 38% de
similaridade (Figura 24).
Figura 24. Análise do gel de DGGE dos produtos de PCR com os iniciadores
U341F-GC2 e U758 (VAN DE PEER, CHAPELLE & DE WACHTER, 1996) para o gene
rrs do DNA extraído das amostras de solo tratadas com petróleo (célula-piloto
4), realizada através do programa GelComparII, utilizando-se o coeficiente de
Dice e o método de agrupamento de Ward. A numeração indica que a amostra
foi coletada 1, 43 e 91 dias (fase I), 116, 136 e 234 dias (fase II) e 406, 429 e
638 dias (fase III) após o início dos experimentos.
154
As amostras de 406 e 429 dias destacaram-se das demais com 31% de
similaridade. As amostras das fases I e II agruparam-se em dois grupos
relativamente heterogêneos com 56% de similaridade.
Para melhor avaliar a reação da comunidade bacteriana do ambiente ao
processo de contaminação por petróleo e água produzida e à introdução de
nutrientes para a bioestimulação, bem como observar a influência de outros fatores
através da comparação com as amostras de solo controle, foi realizada a análise das
imagens digitalizadas dos géis de DGGE de todas as amostragens (Figura 25).
155
Figura 25. Análise dos géis de DGGE dos produtos de PCR com os iniciadores
U341F-GC2 e U758 (VAN DE PEER, CHAPELLE & DE WACHTER, 1996) para o gene
rrs, realizada com o programa GelComparII, utilizando-se o coeficiente de Dice e
o método de aglomeração de Ward. A numeração indica que a amostra foi
coletada 1, 43 e 91 dias (fase I), 116, 136 e 234 dias (fase II) e 406, 429 e 638
dias (fase III) após o início dos experimentos. C) amostras de solo controle
(célula-piloto 1); A e B) amostras tratadas com água produzida (A) nas fases I e II
e bioestimuladas (B) na fase III (célula-piloto 2); M e BO) amostras tratadas com
mistura de água produzida e óleo (M) nas fases I e II e bioestimuladas e tratadas
com óleo (BO) na fase III (célula-piloto 3); O) amostras tratadas com óleo (célula-
piloto 4).
I
II
1
2
a
c
d
b
156
Com a imagem formada, é possível observar bandas com ocorrência em todas
ou quase todas as amostras, mas com variação de intensidade, representando
genótipos mais resistentes às diferentes condições ambientais e aos diferentes
tratamentos. Algumas bandas presentes nos perfis das diferentes amostras
desapareceram ou diminuíram de intensidade enquanto outras surgiram ou ficaram
mais intensas, demonstrando a seleção negativa ou positiva de diferentes
populações. Além disso, foi possível observar a formação de dois grupos principais.
O grupo I, formado por amostras de solo controle e o grupo II, formado pelas
amostras submetidas aos diferentes tratamentos. Há, no entanto, a exceção de
duas amostragens de solo sem tratamento (amostragens de 1 dia e 429 dias, C.1 e
C.429, respectivamente) que se dispersaram entre as amostragens das células-
pilotos tratadas.
Dentro do grupo de amostras de solos tratados (grupo II), as amostras de solo
submetidas ao tratamento com petróleo foram as mais diferentes em relação às
demais, formando um grupo relativamente homogêneo (grupo 1), exceto por duas
amostras da fase III (406 e 429 dias) que mostraram-se mais próximas de amostras
bioestimuladas e tratadas com óleo da célula-piloto 3.
O outro grupo de amostras de solo tratado, grupo 2, se subdividiu em dois
subgrupos: o grupo a, formado principalmente de amostras de solo bioestimulado e
tratado com óleo e o grupo b que também se subdividiu no grupo c, formado
principalmente pelas amostras de solo tratado com água produzida e de solo
bioestimulado e no grupo d formado exclusivamente por amostras de solo tratado
com a mistura de óleo e água produzida.
A amostra de solo bioestimulada (célula-piloto 2) da coleta 406 dias
(denominada B406 na Figura 25) destacou-se das demais amostras bioestimuladas,
agrupando-se com as amostras da fase III tratadas com óleo (célula-piloto 4) e
bioestimuladas e tratadas com óleo (célula-piloto 3).
As seqüências dos bancos de dados mais próximas às seqüências das bandas de
fragmentos de DNA foram, na maioria das vezes, de microrganismos não cultivados
como seqüências de clones e de bandas de DGGE. As espécies de estirpes
bacterianas cultiváveis mais próximas às seqüências obtidas são apresentadas na
157
Tabela 11, bem como o percentual de identidade das mesmas com as seqüências
das bandas selecionadas.
Tabela 13. Estirpes bacterianas cultiváveis mais próximas às seqüências obtidas
das bandas do DGGE dos produtos de PCR com iniciadores U341F-GC2 e U758
(VAN DE PEER, CHAPELLE & DE WACHTER, 1996) para o gene rrs do DNA das
amostras de solo.
banda
nº de acesso estirpe bacteriana mais próxima identidade
a AB267723.1 Chitinophaga soli Gsoil 219 92%
b AB220141.1 Sphingomonadaceae PB304 97%
d AB220141.1 Sphingomonadaceae PB304 96%
f U20756.2
Novosphingobium aromaticivorans SMCC
F199
98%
g U20756.2
Novosphingobium aromaticivorans SMCC
F199
96%
h
AY136096.1 Sphingomonas sp. KIN169 94%
i
DQ858957.1 Sphingomonas sp. R1 93%
l
AY136096.1 Sphingomonas sp. KIN169 86%
n
CP000304.1 Pseudomonas stutzeri A1501 90%
p
AB299762.1 Sphingomonas sp. SNRW7-1 94%
q
AB127971.1 Kaistina koreensis Y5 86%
r
DQ340863.1 Sphingomonas sp. BR12200 96%
s
EF117913.1 Thiohalomonas denitrificans HLD 14 90%
u
AB196496.1 Mesorhizobium sp. NH-14 95%
v
DQ520826.1 Oxalobacteraceae NR164 88%
w
AM689992.1 Arthrobacter sp. SCP-6 94%
z
AB299756.1 Dietzia sp. ice-oil-71 100%
3
DQ997046.1 Streptomyces serianimatus YIM 45720 91%
4
L40616.1 Frankia sp. Dryas 91%
5
AB070464.1 Leptothrix ginsengisoli 88%
A maioria dessas seqüências são de espécies de Alphaproteobacteria da
família Sphingomonadaceae. A estirpe Sphingomonadaceae PB304 é fototrófica e foi
isolada a partir de um estudo de análise de diversidade de bactérias aeróbias
fototróficas de amostras ambientais (GenBank, número de acesso AB220141.1). A
estirpe SMCC F199 de Novosphingobium aromaticivorans é degradadora de
hidrocarbonetos aromáticos isolada de sedimento de subsuperfície terrestre
(FREDRICKSON et al., 1995; BALKWILL et al., 1997). A estirpe Sphingomonas sp.
158
KIN169 foi isolada de água do Lake Kinneret (PINHASSI & BERMAN, 2003). A estirpe
Sphingomonas sp. R1 é degradadora de bifenila (GenBank, número de acesso
DQ858957.1). A estirpe diazotrófica Sphingomonas sp. BR12200 foi isolada de arroz
(Oryza sativa) plantada em solo brasileiro (GenBank, número de acesso
DQ340863.1). Por fim, a estirpe Sphingomonas sp. SNRW7-1 foi isolada do lago Biwa
no Japão (GenBank, número de acesso AB299762.1).
Algumas seqüências pertencem a espécies de Alphaproteobacteria da família
Rhizobiales. A estirpe Mesorhizobium sp. NH-14 tem atividade de denitrificação
(GenBank, número de acesso AB196496.1) e a estirpe Kaistina koreensis Y5 é
fixadora de nitrogênio (GenBank, número de acesso AB127971.1).
Outro grupo predominante foi o de actinomicetos. A estirpe Dietzia sp. ice-oil-
71 é um actinomiceto adaptado ao frio e capaz de degradar hidrocarbonetos do
petróleo em baixas temperaturas (GenBank, número de acesso AB299756.1).
Streptomyces serianimatus YIM 45720 é uma estirpe de actinomiceto isolada de solo
de floresta tropical de Singapura (WANG et al., 2007). Frankia sp. Dryas é uma
estirpe endofítica que forma nódulos em angiospermas de regiões frias como
Canadá, Alasca e Nova Zelândia (BENSON & SILVESTER, 1993). E a estirpe
Arthrobacter sp. SCP-6 foi isolada de solo no oeste do Himalaia, na Índia (GenBank,
número de acesso AM689992.1).
Algumas seqüências pertencentes a espécies de Betaproteobacteria da família
Burkholderiales também foram observadas como as estirpes Oxalobacteraceae
NR164, isolada de solo no norte de Nova Delhi, na Índia (GenBank, número de
acesso DQ520826.1) e Leptothrix ginsengisoli isolada de solo plantado com ginseng
(GenBank, número de acesso AB070464.1).
Também foram observadas algumas seqüências pertencentes a espécies de
Gammaproteobacteria como Pseudomonas stutzeri A1501, uma fixadora de
nitrogênio associada a raízes (LIN et al., 2000) e Thiohalomonas denitrificans HLD
14 uma halofílica desnitrificante de habitats hipersalinos (GenBank, número de
acesso EF117913.1).
159
Também foi observada uma estirpe da família Bacteroidetes. A estirpe Gsoil
219 é a estirpe-tipo da espécie Chitinophaga soli e foi isolada de solo plantado com
ginseng na Coréia do Sul (AN et al., 2007).
Algumas bandas não puderam ser identificadas com seqüências de
microrganismos cultiváveis. Além de apresentarem similaridade apenas com
seqüências de amostras não cultivadas, como clones e bandas de DGGE, o
percentual de identidade foi relativamente baixo, indicando tratar-se de seqüências
ainda não descritas nos bancos de dados (Tabela 12).
Tabela 14. Amostras não cultivadas mais próximas a seqüências obtidas das
bandas do DGGE dos produtos de PCR com os iniciadores U341F-GC2 e U758
(VAN DE PEER, CHAPELLE & DE WACHTER, 1996) para o gene rrs do DNA das
amostras de solo.
banda Nº de acesso Seqüência mais próxima % de identidade
c EF020296.1 Sphingomonadaceae não cultivada 98%
e DQ814450.1 Bactéria não cultivada 93%
j DQ857223.1 Bactéria Rhodobacterales não
cultivada, clone BR01BF03
91%
m AY905678.1 Bactéria não cultivada, banda de
DGGE DB04U
90%
o DQ906983.1 Bactéria de solo não cultivada, clone
SoilA-18
89%
t DQ192223.1 Mesorhizobium sp. não cultivada,
banda de DGGE RH.Soil.230
93%
x AY988962.1 Bactéria de solo não cultivada
L1A.6C03
93%
1 AY905678.1 Bactéria não cultivada, banda de
DGGE DB04U
91%
2 DQ643714.1 Bactéria de solo não cultivada, clone
W4Ba50
94%
Vale ressaltar que a informação obtida a partir do sequenciamento das bandas
dos géis de DGGE não é conclusiva uma vez que o tamanho do fragmento de DNA é
de apenas 500 pb e o tamanho total do gene rrs é de aproximadamente 1,5 kb.
160
2.3. DGGE do gene alkB
2.3.1. Amplificação por PCR com iniciadores universais para o gene alkB
Todas as amostras testadas apresentaram produtos de reação de amplificação
por PCR com iniciadores universais para o gene alkB que codifica a enzima alcano
hidroxilase. Porém, estes produtos apresentaram intensidade de bandas diferentes
no gel de agarose, indicando haver maior concentração de fragmentos de DNA em
algumas amostras que em outras (Figura 26).
Figura 26. Eletroforese em gel de agarose a 1,4% com SYBR Safe em tampão
TAE dos produtos de PCR com iniciadores alkH1FGC2 e alkH3R (CHENIER et al.,
2003) para o gene alkB das amostras coletadas 1 dia (fase I), 136 dias (fase II),
429 dias (fase III) e 638 (fase III) dias após o início dos experimentos. bp)
marcador de massa molecular: “gene ruler 100 bp DNA Ladder”; C) amostras de
solo controle (célula-piloto 1); A e B) amostras tratadas com água produzida (A)
nas fases I e II e bioestimuladas (B) na fase III (célula-piloto 2); M e BO) amostras
tratadas com mistura de água produzida e óleo (M) nas fases I e II e
bioestimuladas e tratadas com óleo (BO) na fase III (célula-piloto 3); O) amostras
tratadas com óleo (célula-piloto 4); N) Controle negativo; P) Controle positivo:
Pseudomonas oleovorans ATCC 29347.
bp 1 dia 136 dias 429 dias 638 dias N P
C A M O C A M O C B BO O C B BO
161
2.3.2. DGGE - PCR com iniciadores universais para o gene alkB
Foi obtida, uma imagem da estrutura da comunidade bacteriana degradadora
de hidrocarbonetos alcanos através de experimento de DGGE dos produtos da
amplificação por PCR do gene alkB (Figura 27).
Figura 27. DGGE em gradiente desnaturante linear de 45% a 65% dos
produtos de PCR com os iniciadores alkH1FGC2 e alkH3R (CHENIER et al., 2003)
para o gene alkB, das amostras coletadas 1 dia (fase I), 136 dias (fase II) e 429
dias (fase III) após o início dos experimentos. bp) marcador de massa molecular:
“gene ruler 100 bp DNA ladder”; P) Controle positivo: Pseudomonas oleovorans
ATCC 29347; C) amostras de solo controle (célula-piloto 1); A e B) amostras
tratadas com água produzida (A) nas fases I e II e bioestimuladas (B) na fase III
(célula-piloto 2); M e BO) amostra tratadas com mistura de água produzida e
óleo (M) nas fases I e II e bioestimuladas e tratadas com óleo (BO) na fase III
(célula-piloto 3); O) amostra tratadas com óleo (célula-piloto 4). As setas
indicam bandas cortadas para seqüenciamento (apresentadas na Tabela 13).
bp P 1 dia
136 dias
429 dias P bp
C A M O C A M O C B BO O
162
Foi possível observar a presença de uma comunidade de degradadores de
hidrocarbonetos alcanos já estabelecida no solo da área estudada no Campo de
extração de petróleo de Carmópolis. Esta área não tem histórico de derrames de
petróleo ou água produzida. Entretanto, foi possível observar a presença de bandas
de DNA nas amostras de solo controle (célula-piloto 1). As populações bacterianas
desta célula-piloto não sofreram pressão alguma pela presença de óleo ou água
produzida ou mesmo pela adição de nutrientes. No entanto, observou-se também
uma baixa diversidade nas amostras testadas, com uma discreta variação no perfil
de bandas do DGGE.
As seqüências obtidas de bandas selecionadas do gel de DGGE foram analisadas
através do programa BioEdit e comparadas com o banco de dados do NCBI
(“National Center for Biotechnology Information”), o GenBank, o EMBL (“European
Molecular Biology Laboratory”), o DDBJ (“DNA Data Bank of Japan”) e o PDB
(“Protein Data Bank”) através dos programas BLAST e FASTA (LIPMAN & PEARSON,
1985; PEARSON & LIPMAN, 1988; PEARSON, 1990).
O Blastn usa o algoritmo do BLAST para comparar uma seqüência de
nucleotídeos com as seqüências de nucleotídeos do banco de dados do NCBI
identificando seqüências que compartilham regiões de homologia. No entanto,
quando foi usado o Blastn, avaliando-se o valor de "E", que indica a chance de se ter
alcançado homologia num banco de dados ao acaso, foram encontradas pontuações
baixas, refletindo alinhamentos pobres.
Como alternativa, foi utilizado o Blastx que utiliza a seqüência traduzida em 6
proteínas. O Blastx compara a seqüência de nucleotídeos traduzida em todas as
seqüências de leitura abertas com bancos de dados de seqüências de proteínas,
tentando encontrar, dessa forma, proteínas homólogas à seqüência de nucleotídeos.
Ainda assim, o número de seqüências homólogas observadas com o programa
Blastx foi relativamente pequeno. Algumas bandas não foram identificadas nem
através de Blastn e tampouco com Blastx.
Recorreu-se então ao fasta que utiliza algoritmos FASTA para buscar em
bancos de dados de proteínas ou de seqüências de DNA, seqüências similares à
seqüência de nucleotídeos traduzida em todas as seqüências de leitura abertas.
163
Similaridades não observadas através do Blastn e do Blastx foram encontradas com
o fasta (Tabela 13).
164
Tabela 15. Seqüências homólogas encontradas com os programas Blastn, Blastx e fasta mais próximas às seqüências obtidas
das bandas do DGGE dos produtos de PCR com os iniciadores alkH1FGC2 e alkH3R (CHENIER et al., 2003) para o gene alkB do
DNA das amostras de solo.
Bandas Amostras Blastn Blastx Fasta
.1, M.1,
O.429
Sem similaridade significativa
.1, O.1,
M.136
Bactéria não-cultivada, clone alkW1-125
Limnobacter sp. MED105
Ralstonia sp. PT11
O.429
Mycobacterium vanbaalenii PYR-1 Mycobacterium vanbaalenii PYR-1
Mycobacterium vanbaalenii PYR-1
f1
O.429 Bactéria não-cultivada, clone alkW1-125 Limnobacter sp. MED105 Ralstonia sp. PT11
f2
O.429 Sem similaridade significativa Limnobacter sp. MED105 Burkholderia xenovorans LB400
BO.429
Mycobacterium vanbaalenii PYR-1 Mycobacterium vanbaalenii PYR-1
Mycobacterium vanbaalenii PYR-1
f3
O.429 Sem similaridade significativa Limnobacter sp. MED105 Burkholderia xenovorans LB400
O.1 Bactéria não-cultivada, clone alkW1-125 Limnobacter sp. MED105 Ralstonia sp. PT11
g
BO.429 Mycobacterium vanbaalenii PYR-1 Mycobacterium vanbaalenii PYR-1 Mycobacterium vanbaalenii PYR-1
A.136 Prauserella rugosa NRRL B-2295 Prauserella rugosa NRRL B-2295 Prauserella rugosa NRRL B-2295 h
BO.429 Mycobacterium vanbaalenii PYR-1 Mycobacterium vanbaalenii PYR-1 Mycobacterium vanbaalenii PYR-1
.1, M.1,
O.429
Sem similaridade significativa
.1, O.1
Bactéria não-cultivada, clone alkW1-125
Limnobacter sp. MED105
Ralstonia sp. PT11
.429
Mycobacterium ratisbonense FR13 Mycobacterium sp. TY-6 Mycobacterium sp. TY-6
i
O.429
Mycobacterium vanbaalenii PYR-1 Mycobacterium vanbaalenii PYR-1
Mycobacterium vanbaalenii PYR-1
165
.429
Sem similaridade significativa Limnobacter sp. MED105 Ralstonia sp. PT11
.136
Prauserella rugosa NRRL B-2295 Prauserella rugosa NRRL B-2295 Prauserella rugosa NRRL B-2295
O.429
Mycobacterium vanbaalenii PYR-1 Mycobacterium vanbaalenii PYR-1
Mycobacterium vanbaalenii PYR-1
.136
Sem similaridade significativa Limnobacter sp. MED105 Ralstonia sp. PT11
O.429
Mycobacterium vanbaalenii PYR-1 Mycobacterium vanbaalenii PYR-1
Mycobacterium vanbaalenii PYR-1
.1, A.1,
O.1, O.429
Bactéria não-cultivada, clone alkW1-125 Limnobacter sp. MED105 Ralstonia sp. PT11
.136
Sem similaridade significativa Thalassolituus oleivorans MIL-1 Thalassolituus oleivorans MIL-1
.429
Mycobacterium ratisbonense FR13 Mycobacterium sp. TY-6 Mycobacterium sp. TY-6
O.429
Mycobacterium vanbaalenii PYR-1 Mycobacterium vanbaalenii PYR-1
Mycobacterium vanbaalenii PYR-1
.1
Bactéria não-cultivada, clone alkW1-125 Limnobacter sp. MED105 Ralstonia sp. PT11
.136
Sem similaridade significativa Sem similaridade significativa Rhodococcus sp. 28/19
.429
Mycobacterium ratisbonense FR13 Mycobacterium sp. TY-6 Mycobacterium sp. TY-6
O.429
Mycobacterium vanbaalenii PYR-1 Mycobacterium vanbaalenii PYR-1 Mycobacterium vanbaalenii PYR-1
.1
Bactéria não-cultivada, clone alkW2-6 Rhodococcus sp. SoD Rhodococcus sp. SoD
.1
Sem similaridade significativa Pseudomonas aeruginosa UMI-88 Pseudomonas aeruginosa UMI-88
166
.136,
O.136
Rhodococcus sp. SoD Rhodococcus sp. SoD Rhodococcus sp. SoD
.1
.136
Sem similaridade significativa Sem similaridade significativa Alcanivorax dieselolei P40
167
Todas as seqüências encontradas tanto usando Blastn e Blastx, como fasta
foram seqüências que codificam a enzima alcano hidroxilase, que também recebe a
denominação de alcano 1-monoxigenase, confirmando que os fragmentos de DNA
obtidos pela reação de PCR com os iniciadores alkH1FGC2 e alkH3R (CHENIER et al.,
2003) eram realmente do gene alkB (Tabela 13).
Entre estas seqüências, não houve o predomínio de espécies de
Alphaproteobacteria da família Sphingomonadaceae, como o observado para o gene
rrs, mas de espécies de actinomicetos, Betaproteobacteria e
Gammaproteobacteria.
Entre as seqüências de actinomicetos destacam-se as estirpes de
Mycobacterium, Prauserella rugosa e Rhodococcus. Um grande número de
seqüências mostrou ser similar à estirpe Mycobacterium vanbaalenii PYR-1, um
actinomiceto capaz de degradar diversos hidrocarbonetos, entre os quais,
hidrocarbonetos aromáticos (KHAN et al., 2001; STINGLEY, KHAN & CERNIGLIA,
2004; STINGLEY et al., 2004; BREZNA et al., 2006). A estirpe Mycobacterium sp. TY-
6 é capaz de utilizar propano (KOTANI et al., 2006). As estirpes Prauserella rugosa
NRRL B-2295 (SMITS et al., 1999; SMITS et al., 2002; VAN BEILEN et al., 2002) e
Rhodococcus sp. SoD (QUATRINI et al., 2008) são degradadoras de alcanos e a
estirpe Rhodococcus sp. 28/19 é degradadora de hidrocarbonetos da Antártica
(EMBL, número de acesso DQ376004).
As duas seqüências de Betaproteobacteria são de estirpes da família
Burkholderiaceae. As estirpes Ralstonia sp. PT11 e Burkholderia xenovorans LB400
foram isoladas a partir de um estudo de diversidade bacteriana em solos de floresta
contaminados com hidrocarbonetos do petróleo (EMBL, números de acesso
DQ182291 e CP000271)
As seqüências de Gammaproteobacteria são da estirpe Pseudomonas
aeruginosa UMI-88 isolada de ambiente contaminado com hidrocarbonetos no
Marrocos (BELHAJ, DESNOUES & ELMERICH, 2002) e duas estirpes marinhas de
Oceanospirillales degradadoras de hidrocarbonetos, a estirpe MIL-1 que é a estirpe-
tipo da espécie Thalassolituus oleivorans (YAKIMOV et al., 2004) e a estirpe
Alcanivorax dieselolei P40 (LIU & SHAO, 2005).
168
As seqüências de clones (alkW1-125 e alkW2-6) são oriundas de estudos de
novas metodologias baseadas em PCR e hibridização para a detecção de genes
homólogos ao alkB a partir do DNA extraído de solo na Alemanha (KLOOS, MUNCH &
SCHLOTER, 2006).
Diversas bandas sequenciadas apresentaram similaridades às mesmas
seqüências com todos os programas utilizados (Blastn, Blastx e fasta). No entanto,
foram observadas algumas divergências entre as similaridades observadas entre os 3
programas utilizados. Porém, estas similaridades eram, na maioria das vezes, entre
microrganismos da mesma família, como Limnobacter sp., Burkholderia xenovorans
e Ralstonia sp. classificadas na família Burkholderiaceae, e até mesmo dentro do
mesmo gênero, como é o caso de Mycobacterium ratisbonense e Mycobacterium sp.
Foram observadas bandas de diferentes amostras migrando em uma mesma
altura no gel mas que parecem codificar enzimas de diferentes microrganismos. De
forma análoga, bandas que migraram em diferentes posições no gel de DGGE
mostraram que codificam a mesma enzima. Estas últimas podem significar
diferentes cópias do gene.
A banda f3, por exemplo, observada nas amostras BO.429 e O.429 migrando
nas mesma altura em cada uma dessas amostras, apresentou homologia com
diferentes espécies bacterianas, variando com a amostra de DNA de solo. Na
amostra de solo bioestimulada e tratada com óleo da amostragem de 429 dias
(BO.429), esta banda mostrou-se similar à enzima codificada pela estirpe PYR-1
Mycobacterium vanbaalenii, enquanto na amostra de solo tratado com óleo também
da amostragem de 429 dias (O.429) mostrou maior similaridade com a espécie
Burkholderia xenovorans LB400.
A banda f foi similar à enzima alcano hidroxilase da estirpe Ralstonia sp. PT11
para as amostras C.1, A.1, M.1, O.1, M.136 e O.429 e à da estirpe Mycobacterium
vanbaalenii PYR-1 para a amostra BO.429. Já a banda m foi similar às estirpes
Ralstonia sp. PT11 (amostras C.1, A.1, O.1 e O.429), Pseudomonas fluorescens Pf-5
(O.136), Mycobacterium sp. TY-6 (B.429) e Mycobacterium vanbaalenii PYR-1
(BO.429). Todas as bandas da amostra BO.429 foram similares à enzima alcano
hidroxilase da estirpe Mycobacterium vanbaalenii PYR-1, assim como as bandas
169
sequenciadas da amostra B429 foram similares ao gene da alcano hidroxilase da
estirpe Mycobacterium sp. TY-6.
Com a análise do gel de DGGE foi possível observar um alto índice de
similaridade entre os perfis de bandas, confirmando a estabilidade da comunidade
de degradadores de hidrocarbonetos alcanos tanto nas amostras de solo controle
quanto nas amostras submetidas aos diferentes tratamentos. Aparentemente, as
populações bacterianas degradadoras de alcanos não foram selecionadas de forma
significativa pela presença de óleo ou água produzida ou pela adição de nutrientes.
O perfil que mais diferiu dos demais foi o da amostra de solo bioestimulado e
tratado com óleo de 429 dias (BO429) com 89% de similaridade (Figura 28).
Figura 28. Análise do gel de DGGE dos produtos de PCR com os iniciadores
alkH1FGC2 e alkH3R (CHENIER et al., 2003) para o gene alkB, realizada com o
programa GelComparII, utilizando-se o coeficiente de Dice e o método de
aglomeração de Ward. A numeração 1, 136 e 429 indica que a amostra foi
coletada 1 dia (fase I), 136 dias (fase II) e 429 dias (fase III) após o início dos
experimentos, respectivamente. C) amostras de solo controle (célula-piloto 1);
A e B) amostras tratadas com água produzida (A) nas fases I e II e bioestimuladas
(B) na fase III (célula-piloto 2); M e BO) amostras tratadas com mistura de água
produzida e óleo (M) nas fases I e II e bioestimuladas e tratadas com óleo (BO) na
fase III (célula-piloto 3); O) amostras tratadas com óleo (célula-piloto 4).
170
2.4. Amplificação por PCR com iniciadores específicos para o gene ndoB
Ao contrário do observado para o gene alkB, não foi possível observar produtos
da reação de amplificação por PCR de nenhum dos dois sistemas de iniciadores
específicos para o gene ndoB utilizados em nenhuma das amostras analisadas
embora tenham sido testadas diferentes condições de amplificação. Mesmo
utilizando-se as amostras submetidas ao tratamento com óleo (bioestimuladas ou
não) não foi possível observar produtos após a reação de PCR.
2.5. Microarranjo de DNA
2.5.1. Microarranjo de genes estruturais para avaliar a diversidade estrutural
das amostras de solo - Microarranjo Taxonômico
Os sinais emitidos pelo fluoróforo Cy5 nas reações de hibridização com o
microarranjo de genes estruturais apresentaram-se com boa resolução para a
análise. A imagem da hibridização de cada amostra sobre o microarranjo
taxonômico revelou diferenças entre as amostragens (Figura 29).
Figura 29. Hibridização dos produtos de PCR dos genes rrs e cpn60
marcados com o fluoróforo cianina 5 (Cy5) das amostras tratadas com petróleo
(célula-piloto 4) coletadas 1 dia (A) e 429 dias (B) após o início dos experimentos
sobre um microarranjo de genes rrs e cpn60 (Microarranjo taxonômico).
a b
171
Um total de 93 espécies bacterianas foram observadas entre as amostras
estudadas (Tabela 14), com intensidade do sinal de hibridização variando de 2,0 a
127,6%. O cálculo da intensidade foi realizado pela razão do sinal de hibridização
das amostras de DNA de solo com os oligonucleotídeos dividida pela intensidade do
sinal de hibridização com o oligonucleotídeo controle do microarranjo
(oligonucleotídeo universal para Eubacteria). Foi possível observar gêneros (e
mesmo espécies) correlatos com os observados através do seqüenciamento de
bandas extraídas do experimento de DGGE do gene que codifica o rRNA 16S, como
Arthrobacter sp., Dietzia maris, Mesorhizobium loti, Oxalobacter formigenes,
Pseudomonas stutzeri, Sphingomonas paucimobilis e Streptomyces sp. Da mesma
forma, foi também observada a presença de gêneros (e também espécies)
observados no seqüenciamento de bandas do experimento de DGGE do gene alkB
como Burkholderia, Pseudomonas aeruginosa, Ralstonia e Rhodococcus sp.
As espécies mais abundantes são comparadas entre as amostras de solo
controle e de solo tratado na Tabela 15. A comparação é feita através das
proporções relativas dadas pela intensidade do sinal de hibridização.
O maior sinal de hibridização observado foi observado entre a amostra de solo
bioestimulado de 406 dias e a espécie Sporosarcina psychrophila. Algumas espécies
foram observadas somente nas amostras de solo tratado como Acidovorax facilis e
Delftia acidovorans. A espécie Nitrobacter sp. foi observada em praticamente todas
as amostras testadas. Outra espécie presente em praticamente todas as amostras
foi a espécie degradadora de alcanos Rhodococcus sp. Q15.
172
Tabela 16. Espécies bacterianas do microarranjo de genes estruturais rrs e cpn60 (Microarranjo Taxonômico) que
hibridizaram com o DNA extraído das amostras de solo.
Acidovorax facilis Citrobacter freundii Pantoea stewartii
Acinetobacter baumannii Clostridium orbiscindens Planctomyces limnophilus
Acinetobacter calcoaceticus Comamonas terrigena Pseudomonas aeruginosa
Acinetobacter haemolyticus Comamonas testosteroni Pseudomonas oleovorans
Acinetobacter radioresistens Cytophaga hutchinsonii Pseudomonas oryzihabitans
Acinetobacter sp. Delftia acidovorans ATCC 15668_OP1 Pseudomonas pseudoalcaligenes ATCC 17440
Aeromonas schubertii Desulfovibrio vulgaris Pseudomonas putida ATCC 12633
Ancylobacter aquaticus SP6_OP1 Dietzia maris IMV 195_OP4 Pseudomonas sp.
Arthrobacter sp. mA3_OP1 Enterobacter amnigenus Pseudomonas stutzeri CA10 (0M1)
Bacillus anthracis Enterobacter asburiae Pseudomonas syringae NCPPB281
Bacillus cereus ATCC 14579_OP1 Enterobacter cloacae Pseudonocardia sulfidoxydans 592
Bacillus coagulans IAM 12463 Enterobacter intermedius Paenibacillus sp., Paenibacillus phyllosphaerae
Bacillus fumarioli Enterococcus casseliflavus Ralstonia (Pseudomonas) solanacearum GMI1000
Bacillus licheniformis Enterococcus cecorum Ralstonia sp.
Bacillus megaterium, B. stearothermophilus
Escherichia coli Rhizobium tropici
Bacillus mycoides Exiguobacterium acetylicum Rhodobacter sphaeroides
Bacillus pumilus ATCC 7061_OP1 Flavobacterium aquatile 11947_OP5 Rhodobium orientis
Bacillus sp. Geobacillus thermoglucosidasius Rhodococcus equi ATCC 6939_OP2
Bacillus subtilis ATCC 9799_OP1 Geobacter sulfurreducens Rhodococcus sp. Q15
Beijerinckia sp. Geothrix fermentans Rhodopseudomonas palustris
Bifidobacterium adolescentis Kineococcus radiotolerans Rikenella microfusus
Bifidobacterium bifidum Klebsiella oxytoca Sphingomonas paucimobilis ATCC 29837_OP1
Bifidobacterium pseudolongum Klebsiella pneumoniae Sporichthya polymorpha 46113_OP2
Bradyrhizobium japonicum Mesorhizobium loti Staphylococcus saccharolyticus
Brevundimonas diminuta Moraxella catarrhalis ATCC 25238 Stenotrophomonas maltophilia
Burkholderia cepacia NCTC10744 Nitrobacter sp. Streptococcus criceti
Burkholderia glathei N 15 Nostoc sp. Streptococcus infantarius
Burkholderia sp. Ochrobactrum anthropi Streptococcus lutetiensis
Campylobacter gracilis Oxalobacter formigenes Streptococcus oligofermentans
Chromobacterium violaceum Paenibacillus popilliae Streptomyces sp.
173
Tabela 17. Espécies observadas e sinais de hibridização das amostras de DNA de solo com o microarranjo tanonômico.
Espécies C.1 C.136
C.638
A.1 B.406 B.429
BO.406
BO.638
O.1 0.406
O.429
Acidovorax facilis 0,0
0,0
0,0
0,0
0,0 2,1
0,0
0,0
3,8
38,3
21,9
Acinetobacter baumannii 0,0
0,0
0,0
11,4
0,0 0,0
0,0
0,0
56,6
0,0
0,0
Acinetobacter haemolyticus 6,4
0,0
0,0
0,0
0,0 0,0
0,0
0,0
24,8
0,0
0,0
Acinetobacter radioresistens 20,4
0,0
0,0
2,8
0,0 0,0
0,0
0,0
15,3
0,0
0,0
Aeromonas schubertii 4,7
3,8
2,2
11,1
0,0 5,0
0,0
16,4
11,8
3,2
58,5
Arthrobacter sp. 0,0
0,0
0,0
0,0
0,0 0,0
0,0
0,0
25,2
0,0
0,0
Bacillus anthracis 9,6
0,0
3,4
4,3
5,1 0,0
0,0
0,0
30,0
0,0
4,8
Bacillus megaterium 11,6
3,1
3,2
5,3
9,9 0,0
0,0
0,0
32,9
0,0
10,7
Bacillus mycoides 8,0
0,0
0,0
2,6
2,7 0,0
0,0
0,0
10,3
0,0
2,4
Bacillus sp. 0,0
0,0
0,0
0,0
24,5 0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
Beijerinckia sp. 5,6
3,0
6,2
5,6
2,5 0,0
2,3
7,9
7,0
0,0
14,6
Bifidobacterium adolescentis 9,2
8,3
7,3
9,5
2,1 4,2
2,0
9,5
13,6
0,0
29,6
Bifidobacterium pseudolongum 7,8
18,3
6,6
14,3
3,4 0,0
0,0
0,0
7,4
0,0
11,5
Bradyrhizobium japonicum 7,9
5,3
4,0
5,8
7,7 3,2
8,4
3,0
18,1
7,3
11,6
Burkholderia cepacia 8,2
4,3
0,0
10,7
0,0 0,0
0,0
18,3
17,9
4,0
40,1
Burkholderia glathei 12,5
4,1
0,0
12,4
0,0 0,0
0,0
18,1
18,1
22,5
0,0
Burkholderia sp. 20,5
7,6
5,9
13,0
4,7 11,3
4,6
11,8
32,7
65,9
0,0
Comamonas terrigena 0,0
0,0
0,0
0,0
0,0 2,1
0,0
0,0
13,7
9,9
80,3
Comamonas testosteroni 0,0
0,0
0,0
0,0
0,0 0,0
0,0
0,0
14,2
0,0
98,8
Delftia acidovorans 0,0
0,0
0,0
0,0
0,0 2,5
0,0
0,0
3,2
0,0
17,6
Enterobacter intermedius 3,9
0,0
0,0
10,6
0,0 0,0
0,0
0,0
12,7
0,0
0,0
Geobacillus thermoglucosidasius 0,0
0,0
0,0
0,0
2,3 0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
Geobacter sulfurreducens 0,0
2,5
0,0
3,3
0,0 0,0
0,0
0,0
3,8
0,0
17,9
Geothrix fermentans 0,0
0,0
0,0
0,0
0,0 0,0
0,0
0,0
0,0
95,2
0,0
Klebsiella oxytoca 0,0
0,0
0,0
11,3
0,0 0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
174
Continuação: Tabela 15. Espécies observadas e sinais de hibridização das amostras de DNA de solo com o microarranjo
tanonômico.
Espécies C.1 C.136
C.638
A.1 B.406 B.429
BO.406
BO.638
O.1 0.406
O.429
Mesorhizobium loti 0,0
2,8
3,6
3,6
0,0 4,9
0,0
4,7
2,8
2,2
20,0
Nitrobacter sp. 14,5
12,7
8,4
11,0
15,1 9,4
22,7
7,5
31,9
0,0
29,7
Paenibacillus popilliae 0,0
0,0
0,0
38,6
0,0 0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
Pseudomonas aeruginosa 4,6
7,0
4,0
8,1
2,9 10,1
0,0
42,7
7,6
0,0
35,3
Pseudomonas oleovorans 0,0
0,0
0,0
2,4
0,0 6,0
0,0
0,0
3,4
0,0
3,2
Pseudomonas oryzihabitans 0,0
0,0
0,0
2,4
0,0 0,0
0,0
0,0
2,9
0,0
21,4
Pseudomonas sp. 4,5
0,0
0,0
29,6
0,0 9,1
0,0
30,3
8,3
2,7
32,5
Pseudomonas stutzeri CA10 0,0
0,0
0,0
0,0
0,0 42,7
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
Ralstonia solanacearum 14,4
5,4
4,3
11,4
0,0 0,0
0,0
3,3
56,5
0,0
12,5
Ralstonia sp. 3,8
0,0
0,0
2,8
0,0 0,0
0,0
0,0
4,7
0,0
2,1
Rhizobium tropici 11,0
0,0
0,0
0,0
0,0 0,0
0,0
0,0
4,5
0,0
2,2
Rhodobium orientis 3,5
0,0
0,0
3,1
0,0 0,0
0,0
0,0
14,6
0,0
4,2
Rhodococcus sp. Q15 6,0
0,0
0,0
3,0
0,0 2,2
0,0
0,0
13,3
0,0
0,0
Rhodopseudomonas palustris 0,0
0,0
0,0
4,1
0,0 0,0
0,0
3,3
4,7
0,0
16,6
Sphingomonas paucimobilis 4,8
0,0
2,2
2,7
2,3 2,6
2,1
0,0
4,6
0,0
0,0
Sporichthya polymorpha 10,2
0,0
0,0
3,9
0,0 0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
Sporosarcina psychrophila 0,0
0,0
0,0
0,0
19,9 0,0
127,6
0,0
0,0
0,0
0,0
Stenotrophomonas maltophilia 7,2
0,0
0,0
10,4
0,0 5,2
0,0
2,2
12,6
0,0
8,6
Streptococcus criceti 0,0
0,0
0,0
0,0
0,0 0,0
0,0
66,0
0,0
0,0
0,0
Streptomyces sp. 5,0
2,0
2,1
6,2
5,6 0,0
2,3
2,8
7,7
0,0
0,0
Paenibacillus macerans 0,0
0,0
0,0
0,0
2,9 0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
2.5.2. Microarranjo de genes funcionais para avaliar a diversidade funcional
das amostras de solo - Microarranjo Catabólico
Os experimentos de microarranjo de genes funcionais mostraram uma fraca
hibridização das amostras com o microarranjo (Tabela 16).
Tabela 18. Genes funcionais do microarranjo catabólico.
Via catabólica (composto) Genes
Controles 16S, gfp, lambda, luxA e zntA
Controle negativo pSL
1,2-dicloroetano dhlA
1-aminociclopropano-1-
carboxilato
acdS
ácido 2,4-diclorofenoxiacético
tfdA, tfdB, tfdC, tfdC (JMP134), tfdC (P4a), tfdC
(RASC), tfdD
3-clorocatecol cbzE
anilina atdB, atdC, atdD, atdE, atdG, catA1, catA2
antranilato (via do carbazol) antA-1, antA-2
compostos aromáticos isoA, isoB
arsênico arsC
aril ésteres (ésteres de
salicilato)
areB, areC
atrazina atzA, atzB, atzC
benzoato benA, benD
bifenila bphA1 (KF707), bphD, bphH-1, bphH-2, bphI
cadmio cadA-1, cadA-2, cadA-3, cadB
carbazol carAa, carAc, carAd, carBa, carBb, carC, carD,
carE, carF
catecol catA-1, catA-2
compostos monoaromáticos edoA
clorocatecol clcA, clcA2
cobalto, zinco e cadmio czcA-1, czcA-2, czcA-3
haloacetato (cloroacetato) dehH2
hexadecano alkM (Ac)
isopropilbenzeno ipbA1, ipbB, ipbC, ipbD, ipbE
metano mmoX, mmoY, pmoA
metil tert-butil éter (MTBE) mpdB
n-alcano alkB (Pp), alkB (pp5), alkB1 (Ab), alkB1 (Q15),
alkB2 (Q15), alkB3 (Q15 G), alkB3 (Q15 S), alkB4
(Q15 G), alkB4 (Q15 S)
naftaleno nahAc-1, nahAc-2, nahB, nahC, nahD, nahE,
nahF, nahG, nahH, narAa, ndoB, nidA
naftalenossulfonato mpcII
ciclo do nitrogênio narH-1, nirK, nirS, norB, nosZ
nitrotolueno ntdAa-1
ii
p-cimeno cymAa
Continuação: Tabela 19. Genes funcionais do microarranjo catabólico.
Via catabólica (composto) Genes
pentaclorofenol pcpB, pcpC
fenantreno phnAc, phnE1, phnE2
fenol pheA, pheB, pheB (A2), pheB (A7)
fenol/3,4-dimetilfenol dmpE, dmpG, dmpN
ftalato pht3
HPA katG
estireno paaF2, paaK, styB, styC, styD, styE, styR
sulfato dsvA
tolueno bdo, ntnM-2, todC1, todD, todE, todF, todG,
todH, xylB (pWWO), xylC, xylC (pDK1), xylE, xylE
(B1), xylE (pDK1), xylK (pWWO), xylL, xylM, xylX
uréia ureC
A figura 30 ilustra estes resultados, apresentando a imagem obtida da
hibridização do DNA marcado da amostra da célula-piloto 3 coletada 429 dias
após o início dos experimentos (A).
Figura 30. Hibridização sobre microarranjo de genes funcionais de DNA
(Microarranjo catabólico). a) DNA total extraído da amostra da célula-piloto 3
tratada com mistura de água produzida e óleo nas fases I e II e bioestimulada
e tratadas com óleo na fase III coletada 429 dias após o início dos
experimentos, marcado com o fluoróforo cianina 5 (Cy5). b) DNA do fago λ
marcado com o fluoróforo cianina 3 (Cy3).
É possível afirmar que as hibridizações observadas foram fracas,
comparando-as aos resultados obtidos com o DNA do fago λ, usado como
a b
iii
controle (B). Além disso, é possível observar sinais de hibridização mais fortes,
na amostra (A), resultantes da hibridização dos controles internos do
experimento, como o tRNA e da hibridização com genes controles do
microarranjo, como o gene que codifica o rRNA 16S.
Os valores obtidos da leitura e a quantificação dos sinais gerados pelos
fluoróforos foram utilizados para determinar quais genes funcionais estariam
presentes nas amostras estudadas e calcular suas proporções relativas nas
mesmas (Tabelas 17 e 18).
Tabela 20. Genes do microarranjo catabólico que hibridizaram com as
amostras de DNA de solo submetidos aos diferentes tratamentos.
Gene Composto (via
catabólica)
Enzima ou proteína Nº de acesso
alkB1 (Q15) n-alcano alcano-1-monoxigenase AF388181
alkB2 (Q15) n-alcano alcano-1-monoxigenase AF388182
alkB3 (Q15G)
n-alcano alcano-1-monoxigenase AF388179
antA-1 antranilato (via do
carbazol)
antranilato 1,2-dioxigenase AB047548
atzB atrazina hidroxiatrazina hidrolase U66917
bphD bifenila 2-hidroxi-6-oxo-6-fenilhexa-2,4-
dienoato hidrolase
X66123
bphI bifenila 4-hidroxi-2-oxovalerato aldolase X76500
catA-1 catecol catecol 1,2 dioxigenase X99622
catA-2 catecol catecol 1,2 dioxigenase D83237
clcA clorocatecol clorocatecol 1,2 dioxigenase AF003948
cymAa p-cimeno p-cimeno monoxigenase U24215
dmpE fenol/3,4-dimetilfenol 2-oxopenta-4-dienoato hidratase X60835
dmpN fenol/3,4-dimetilfenol fenol hidroxilase M60276
katG hidrocarboneto
policíclico aromático
catalase-peroxidase AF207899
nahC naftaleno 1,2-dihidroxinaftaleno dioxigenase AF039533
nahE naftaleno hidratase-aldolase AF039533
nahF naftaleno salicilaldeído dehidrogenase AF039533
nahG naftaleno salicilato hidroxilase M60055
nirK ciclo do nitrogênio nitrito redutase Z21945,
AF083948
nirS ciclo do nitrogênio nitrito redutase M80653,
X16452,
X91394,
U05002
norB ciclo do nitrogênio citocromo b ou óxido nítrico redutase
X53676
nosZ ciclo do nitrogênio óxido nitroso redutase X53676
iv
ntdAa-1 nitrotolueno 2-nitrotolueno dioxigenase U49504
Continuação: Tabela 21. Genes do microarranjo catabólico que hibridizaram com
as amostras de DNA de solo submetidos aos diferentes tratamentos.
Gene Composto (via
catabólica)
Enzima ou proteína Nº de acesso
paaK estireno Anel de oxidação complexo proteína
5
AJ000330
pcpC pentaclorofenol TeCH redutivo dehalogenase AF512952
styE estireno proteína de membrana AJ000330
styR estireno regulador de resposta ao estireno AJ000330
tfdA ácido 2,4-
diclorofenoxiacético
ácido 2,4-
diclorofenoxiacético
dioxigenase
M16730
tfdB ácido 2,4-
diclorofenoxiacético
clorofenol monoxigenase M35097
tfdC (P4a) ácido 2,4-
diclorofenoxiacético
clorocatecol 1,2 dioxigenase AY078159
todD tolueno Cis-toluene dihidrodiol
dehidrogenase
J04996
todF tolueno 2-hidroxi-6-oxohepta-2,4-dienoato
hidrolase
M64080
ureC uréia urease (subunidade alfa) NC_005966
xylE (pDK1) tolueno catecol 2,3 dioxigenase M65205
xylK (pWWO)
tolueno 4-hidroxi-2-oxovalerato aldolase AJ344068
Na maioria das amostras, não foi possível observar nenhum sinal de
hibridização como se nenhum dos genes funcionais do chip catabólico estivesse
presente. Das amostras da primeira coleta (24 h após o início dos experimentos),
apenas o DNA extraído da célula-piloto tratada com a mistura de água produzida
e petróleo apresentou sinal de hibridização significativo. Apesar disso, os sinais
corresponderam apenas aos genes ntdAa-1 e tfdC. O gene ntdAa-1 codifica o
componente redutase da enzima 2-nitrotolueno dioxigenase, da via de
degradação do nitrotolueno, um composto orgânico nitrogenado derivado do
hidrocarboneto aromático tolueno e o gene tfdC codifica a enzima clorocatecol
1,2 dioxigenase, da via de degradação do ácido 2,4-diclorofenoxiacético, um
herbicida usado no controle de ervas daninhas (Tabela 18).
Além disso, amostras da última coleta (638 dias) das células-piloto 2
(bioestimulada) e 4 (tratada com óleo) hibridizaram apenas com os genes tfdC
(célula-piloto bioestimulada), ntdAa-1 (célula-piloto tratada com óleo) e antA-1
(ambas). O gene antA-1 codifica a subunidade maior do componente terminal
v
oxigenase da enzima antranilato 1,2-dioxigenase, da via de degradação do
hidrocarboneto heterocíclico aromático carbazol (Tabela 18).
Tabela 22. Sinais de hibridização com o microarranjo catabólico e proporções
relativas dos genes funcionais.
Nome M.1 B.429 BO.429
O.429 B.638 BO.638 O.638
alkB1-Q15 0 0 0 0 0 3 0
alkB2-Q15 0 5 4 0 0 2 0
alkB3-Q15 G 0 0 0 0 0 3 0
antA-1 0 10 8 16 33 15 0
atzB 0 0 0 0 0 1 0
bphD 0 0 0 0 0 1 0
bphI 0 0 0 17 0 0 0
catA-1 0 2 7 0 0 2 0
catA-2 0 7 4 0 0 1 0
clcA 0 0 0 0 0 1 0
cymAa 0 3 2 0 0 3 0
dmpE 0 0 0 0 0 1 0
dmpN 0 5 3 16 0 0 0
katG 0 2 4 0 0 3 0
nahC 0 0 0 13 0 1 0
nahE 0 0 0 13 0 1 0
nahF 0 0 0 0 0 2 0
nahG 0 11 3 14 0 5 0
nirK 0 8 3 15 0 5 0
nirS 0 6 3 15 0 1 0
norB 0 0 0 0 0 1 0
nosZ 0 16 11 17 0 5 0
ntdAa-1 22 11 6 19 0 4 2
paaK 0 4 3 16 0 3 0
pcpC 0 0 0 0 0 1 0
styE 0 0 0 0 0 1 0
styR 0 0 0 0 0 0,23 0
tfdA 0 0 0 0 0 1 0
tfdB 0 5 3 15 0 3 0
tfdC-P4a 22 16 8 18 33 7 0
todD 0 4 4 0 0 1 0
todF 0 7 6 16 0 5 0
ureC 0 0 0 0 0 2 0
xylE-pDK1 0 8 9 19 0 29 0
xylK-pWWO 0 8 4 0 0 2 0
B) amostras tratadas com água produzida nas fases I e II e bioestimuladas na fase III
(célula-piloto 2); M e BO) amostras tratadas com mistura de água produzida e óleo (M) nas fases I
e II e bioestimuladas e tratadas com óleo (BO) na fase III (célula-piloto 3); O) amostras tratadas
com óleo (célula-piloto 4). 1, 429 e 638: amostra coletada 1 dia (fase I), 429 dias (fase III) e 638
dias (fase III) após o início dos experimentos.
vi
DISCUSSÃO
Este trabalho buscou evidenciar o que acontece à comunidade bacteriana
do solo ao longo do processo de contaminação por petróleo e água produzida,
bem como a resposta desta comunidade ao tratamento de bioestimulação e
determinar o potencial de biodegradabilidade do solo através de demonstração
de campo na região produtora de petróleo de propriedade da PETROBRAS em
Carmópolis (SE).
O perfil da comunidade bacteriana do solo e as alterações nesta
comunidade após os tratamentos com petróleo e água produzida e de
bioestimulação foi avaliado através de análise de DGGE do gene que codifica o
rRNA 16S e de microarranjo taxonômico contendo o gene que codifica o rRNA 16S
e o gene cpn60 de diversas espécies bacterianas.
O potencial de biodegradabilidade de petróleo na presença ou não de água
produzida foi avaliado através do isolamento de estirpes degradadoras de
petróleo e halofílicas ou halotolerantes.
Além disso, o potencial de biodegradabilidade do solo foi avaliado através
da análise da presença e da estrutura de populações degradadoras de
hidrocarbonetos com análises moleculares de PCR do DNA extraído do solo e
DGGE de genes envolvidos em processos de degradação de hidrocarbonetos do
petróleo e com microarranjo catabólico de genes funcionais de diversas vias de
degradação ou transformação de poluentes orgânicos ou inorgânicos ou que
participam da ciclagem biogeoquímica de elementos.
O isolamento foi realizado utilizando-se estratégias para o enriquecimento
de estirpes halotolerantes ou halofílicas, formadoras de esporos,
hidrocarbonoclásticas e resistentes à água produzida e através de técnicas de
plaqueamento em diferentes meios de cultura, seleção de diferentes morfotipos,
testes de crescimento em diferentes concentrações de NaCl e de biodegradação
de petróleo cru e de hidrocarbonetos do petróleo.
O número de isolados enriquecidos em água produzida foi menor que o
número de isolados enriquecidos em meio mineral e pasteurizados. Era de se
esperar que tanto as amostras formadoras de esporos quanto as não
esporogênicas fossem isoladas dos enriquecimentos não pausterizados. Essa
vii
hipótese foi confirmada com os enriquecimentos em meio Bushnell-Haas, mas
não naqueles realizados em água produzida.
O reduzido número de morfotipos isolados a partir do enriquecimento em
água produzida (23) em contraste com o observado para o enriquecimento em
meio mineral acrescido de NaCl (50) demonstra o efeito negativo da água
produzida sobre os microrganismos cultiváveis do solo e sugere que outros
componentes da água produzida, que não o NaCl possam ser limitantes para o
crescimento de microrganismos.
Estes experimentos de isolamento a partir de diferentes sistemas de
enriquecimento com óleo Sergipano Terra nos permitiu verificar que o NaCl não
é o fator deletério na composição da água produzida, uma vez que foi possível
obter um número superior de morfotipos coloniais através da utilização de meio
mineral suplementado com uma concentração de NaCl semelhante à da água
produzida.
A água produzida da Estação Coletora de Entre Rios apresentou elevada
salinidade e elevado conteúdo de alumínio e manganês. De um modo geral, água
produzida contém normalmente grande quantidade de sais dissolvidos,
normalmente sais de magnésio e estrôncio, e componentes tóxicos indesejáveis,
como metais traço e até mesmo contaminantes radioativos (radionuclídeos),
além de hidrocarbonetos (DIAZ et al., 2002; RINCÓN et al., 2003; LEFEBVRE &
MOLETTA, 2006).
Além disso, a composição da água de injeção também interfere na
composição da água produzida. A injeção de água é um dos métodos mais
comuns de recuperação de óleo embora conduza a determinados problemas de
produção após a chegada da água (água produzida), como corrosão, incrustação
e formação de sulfato de bário ou barita (BaSO
4
) que ocorre a partir da mistura
das salmouras. A formação de barita no poço e nas tubulações de produção
ocorre em muitos campos petrolíferos quando a água de injeção rica em sulfato
se mistura com água de formação rica em bário próximo ou diretamente no
poço. Isso foi detectado em vários campos da Bacia de Campos
(www.petrobras.com.br).
A água produzida pode ser caracterizada da seguinte forma: ausência de
oxigênio dissolvido, salinidade significativa (cloretos, sulfatos ou bicarbonatos),
viii
alta temperatura (40 a 90°C), pequena quantidade de partículas em suspensão,
uma grande concentração e variedade de hidrocarbonetos, alguns álcoois
(fenóis), alguns metais, como zinco, chumbo ou cobre e alguns ácidos
(PLANCKAERT, 2005).
Os isolados podem ser úteis para identificar o composto presente na água
produzida responsável pela redução de diversidade observada sobre a
comunidade bacteriana cultivável do solo. Diferentes compostos, selecionados
com base na composição da água produzida, podem ser avaliados quanto à
inibição de crescimento dos isolados, bem como quanto à interferência no
processo de biodegradação do petróleo, uma vez que este estudo confirmou que
o NaCl, na concentração de 7,5% não interfere na capacidade dos isolados de
degradar o petróleo. Estas avaliações podem auxiliar na indicação de um sistema
de remediação de solos contaminados com este tipo de água produzida.
Nicholson & Fathepure (2005) avaliaram a degradação de benzeno e tolueno na
presença de diferentes sais mono e divalentes como NaCl, KCl, MgCl
2
e CaCl
2
e
observaram que o benzeno foi completamente degradado somente no
microcosmos suplementado com NaCl e nenhuma degradação foi observada na
presença de KCl, MgCl
2
ou CaCl
2
.
Além disso, as estirpes isoladas através do enriquecimento em água
produzida também apresentam um potencial biotecnológico para uso em
biorremediação de ambientes contaminados com água produzida por serem
resistentes não somente ao NaCl como também a outros componentes da água
produzida.
Ainda não havia sido relatada a presença de bactérias halofílicas ou
halotolerantes no solo de Carmópolis. Este estudo também avaliou a capacidade
de crescimento em concentrações de até 30% (m/v) de NaCl, correspondente à
máxima concentração em que o NaCl é solúvel (5M). Através dos experimentos
de enriquecimento, foi isolado grande número (187) de morfotipos coloniais que
mostraram características halotolerantes crescendo em uma ampla faixa de
concentração de NaCl (variando de 7,5% a 30% de NaCl). Estas estirpes podem
representar um potencial não somente para aplicações de biorremediação de
resíduos salinos, mas também em outras indústrias, pela produção de enzimas ou
substâncias de valor agregado.
ix
No entanto, nenhuma estirpe halofílica foi isolada sugerindo que ou elas
não estão presentes no solo estudado, ou estão presentes em quantidades
inferiores às estirpes halotolerantes (sendo superadas pela competição por
nutrientes), ou são sensíveis ao tratamento com o petróleo Sergipano Terra (uma
vez que apenas as amostras de solo tratado com petróleo foram utilizadas nos
sistemas de enriquecimento), ou não são cultiváveis nas condições utilizadas
para o enriquecimento e para a seleção de tipos morfológicos.
Também não haviam relatos sobre a capacidade de bactérias halotolerantes
presentes no solo do campo de extração de petróleo de Carmópolis em degradar
hidrocarbonetos do petróleo. Foi possível observar a degradação do óleo em
todos os frascos de enriquecimento em meio suplementado com 7,5% de NaCl ou
em água produzida (com aproximadamente 7% de NaCl). Além disso, mais de 30%
das estirpes halotolerantes isoladas foram capazes de crescer degradando o
petróleo usado para contaminar as amostras de solo e para o enriquecimento.
Diversos estudos relatam o isolamento de bactérias halofílicas e
halotolerantes capazes de degradar tanto o óleo cru quanto os compostos
derivados do refino do petróleo e diferentes frações de hidrocarbonetos do
petróleo. Um dos estudos mais antigos relata o isolamento de estirpes halofílicas
degradadoras de hexadecano do Great Salt Lake (WARD & BROCK, 1978). De
forma similar, bactérias degradadoras de hexadecano e fenantreno foram
isoladas de um lago salino na Antártica (MCMEEKIN et al., 1993). Em 1992
(GAUTHIER et al., 1992), foram descritas a bactéria halotolerante extrema
Marinobacter hydrocarbonoclasticus, que possui a capacidade de degradar uma
variedade de hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos e a estirpe halo e
termotolerante Streptomyces albaxialis, isolada de um campo petrolífero na
Rússia, capaz de degradar óleo cru e produtos de petróleo (KUZNETSOV et al.,
1992). Em 1995, quatro estirpes dos gêneros Micrococcus, Pseudomonas e
Alcaligenes isoladas de solo próximo a uma refinaria de petróleo mostraram ser
tolerantes a 7,5% de NaCl e capazes de crescer em naftaleno e antraceno
(ASHOK, SAXENA & MUSARRAT, 1995). Em 2001, foram isoladas de solos e
sedimentos contaminados com sal e resíduos químicos dez estirpes bacterianas
halotolerantes capazes de utilizar naftaleno, fenantreno e bifenil como fontes
únicas de carbono e de energia (PLOTNIKOVA et al., 2001) e oito estirpes
x
halotolerantes relacionadas a Pseudomonas mendocina obtidas de uma bacia
anóxica hipersalina no mar Mediterrâneo capazes de degradar tolueno (BRUSA et
al., 2001). Em 2004, Nicholson & Fathepure relataram a biodegradação de
benzeno, tolueno, etilbenzeno e xileno (BTEX) por culturas mistas obtidas de
ambiente salino contaminado com óleo. No ano seguinte, o mesmo grupo relatou
a biodegradação de benzeno e tolueno sob condições hipersalinas (NICHOLSON &
FATHEPURE, 2005).
A estirpe O5p1LB, halotolerante a 30% de NaCl e capaz de degradar o óleo
Sergipano Terra na presença de 7,5% de NaCl, tem um grande potencial
biotecnológico, não somente para a biorremediação de ambientes salinos
contaminados com hidrocarbonetos do petróleo. Uma avaliação e melhor
caracterização desta estirpe deverá ser realizada para estimar a sua
aplicabilidade em diferentes processos biotecnológicos.
Há relatos de microrganismos capazes de degradar hidrocarbonetos do
petróleo mesmo na presença de NaCl, como a degradadora de n-alcanos do
grupo Halobacterium (KULICHEVSKAYA et al., 1992) e as oito estirpes
halotolerantes relacionadas a Pseudomonas mendocina isoladas do mar
Mediterrâneo, capazes de degradar tolueno na presença de NaCl (BRUSA et al.,
2001). A estirpe Streptomyces albaxialis foi capaz de degradar óleo cru na
presença de 30% de NaCl (KUZNETSOV et al., 1992). A espécie halofílica
Methylomicrobium sp. assimiladora de metano, capaz de oxidar hidrocarbonetos
em meios aquosos com 2 a 6% de sal, foi patenteada para biorremediação de
água do mar (FUSE et al., 1998). Uma estirpe de Bacillus sp. também foi
patenteada para degradação de fenol, petróleo e óleo diesel em água do mar
(ANONYMOUS, 1992). Um consórcio bacteriano de estirpes halotolerantes
imobilizadas em fibras de polipropileno foi desenvolvido para a degradação de
óleo cru numa ampla faixa de salinidade (DIAZ et al., 2002). Um outro consórcio
capaz de utilizar benzeno e tolueno como fonte única de carbono e energia na
presença de 2,5 mol/l NaCl foi desenvolvido por Nicholson & Fathepure (2005).
O fenômeno de coalescência do óleo, nas condições experimentais deste
estudo, não foi relatado na literatura disponível atualmente. Esta característica,
no entanto, se assemelha à dos surfactantes, que são polímeros emulsificadores
que possuem ação superficial, devido às suas características anfifílicas (presença
xi
de grupos hidrofílicos e hidrofóbicos numa mesma molécula), sendo responsáveis
pela formação de micelas que se acumulam na interface entre líquidos de
diferentes polaridades como, por exemplo, água e óleo, aumentando a
solubilidade, motilidade e biodisponibilidade e, conseqüentemente, a
biodegradação de compostos hidrofóbicos. Os biossurfactantes, produzidos por
microrganismos, têm ampla aplicabilidade, devido ao seu modo de ação
específico e propriedades únicas como alta biodegradabilidade, baixa toxicidade
e eficiência em temperatura, pH e salinidade extremos, em vários campos da
indústria, incluindo a farmacêutica, a de alimentos, a petrolífera, a
petroquímica, a cosmética, na agricultura e vêm ganhando importância na área
de biorremediação ambiental, nos processos de tratamento de solos
contaminados com hidrocarbonetos de petróleo. Estas moléculas desempenham
um papel importante aumentando a solubilidade do petróleo e seus
componentes e, conseqüentemente, a recuperação destes compostos, pela
efetiva redução da tensão interfacial do óleo e da água in situ (HEALY, DEVINE &
MURPHY, 1996; DESAI & BANAT, 1997; BANAT, MAKKAR & CAMEOTRA, 2000;
MUKHERJEE, DAS & SEM, 2006; SINGH, VAN HAMME & WARD, 2007).
No entanto, enquanto os biossurfactantes são capazes de reduzir as tensões
superficiais e interfaciais entre as fases fluidas com diferentes polaridades, o
efeito de coalescência observado neste estudo parece ser inverso, resultando na
redução da solubilidade do óleo em meio aquoso. Este efeito pode ser útil na
recuperação de ambientes aquáticos na medida em que pode ser usado para
evitar a dispersão do óleo e facilitar a sua remoção.
Estirpes com capacidade de coalescer o óleo Sergipano Terra foram isoladas
dos três sistemas de enriquecimento e em praticamente todos os meios de
cultura empregados (exceto no meio ágar nutriente), e com halotolerância
variando de 7,5% a 25% de NaCl, revelando um grande potencial para aplicações
biotecnológicas múltiplas que incluem não somente a biorremediação, mas
também a produção de enzimas e biopolímeros.
Uma baixa degradação de aromáticos foi observada na fração cultivável
uma vez que apenas 3% das estirpes degradadoras de Sergipano Terra, foram
capazes de utilizar o fenantreno. No entanto, a proporção de hidrocarbonetos
aromáticos na composição do petróleo Sergipano Terra é baixa (21%), o que pode
xii
ter favorecido o enriquecimento de degradadoras das frações mais leves e mais
acessíveis.
O isolamento de estirpes capazes de crescer na presença de até 30% de
NaCl e a capacidade de 30% dos isolados de degradar o petróleo Sergipano Terra
na presença de 7,5% de NaCl reflete o potencial da comunidade bacteriana do
solo de se adaptar a diferentes concentrações de sal e de responder a derrames
de óleo e de água produzida.
Este estudo também avaliou o impacto do petróleo, da água produzida e da
estratégia de bioestimulação sobre a diversidade bacteriana e sobre a
diversidade da comunidade degradadora de hidrocarbonetos do petróleo através
de técnicas moleculares como PCR, DGGE e microarranjo de DNA.
A primeira etapa para a realização de análises moleculares a partir das
amostras de solo foi a extração de DNA. O principal desafio para esta etapa foi a
eliminação das impurezas co-extraídas. Em uma avaliação preliminar, esta
dificuldade pode ser devida ao tipo de solo utilizado neste estudo. Além de
ácidos húmicos, o solo do campo de extração de petróleo de Carmópolis é rico
em argilas que também têm ação inibitória sobre enzimas e podem interferir
diretamente nas análises genéticas posteriores reduzindo não somente a
qualidade, como também a quantidade de DNA extraído. Em particular, os solos
franco-argilosos possuem uma maior capacidade de absorção e retenção do óleo,
que também pode interferir no processo de extração e posterior análise do DNA.
A qualidade do DNA extraído utilizando-se o “kit” de extração de DNA para
solo (FastDNA® SPIN Kit for Soil) comprometeu todas as análises posteriores
como as reações de amplificação por PCR e os experimentos de DGGE, mesmo
quando foram aplicadas diferentes modificações nas técnicas com o objetivo de
melhorar o rendimento das mesmas.
Para a obtenção de resultados de qualidade e confiáveis nas análises
moleculares, foi avaliado um protocolo de extração de DNA (FORTIN et al., 2004)
específico para amostras ambientais contaminadas e que apresentam alto teor
de matéria orgânica. Através de uma etapa de lavagens com agentes quelantes e
surfactantes previamente à etapa de lise celular foi possível obter amostras de
DNA com menor índice de degradação, quando comparadas às amostras extraídas
através de “kit”.
xiii
Além disso, a estratégia para a realização de experimentos de DGGE
envolveu a amplificação por PCR para acumular 750 ng de fragmentos de DNA
favorecendo a obtenção de imagens de boa qualidade e com boa resolução de
bandas e permitindo inferir que a variação de intensidade de bandas reflita a
variabilidade quantitativa das populações bacterianas presentes nas amostras de
solo.
As análises de DGGE foram reprodutíveis ao avaliar-se as amostras
compostas (triplicatas) de cada célula-piloto com um elevado grau de
similaridade (entre 96,8 e 100%) entre as diferentes amostragens coletadas da
mesma célula-piloto. Dessa forma, os experimentos de DGGE de cada
amostragem foram realizados utilizando-se apenas uma das triplicatas.
Na ausência de tratamentos, a comunidade bacteriana sofreu alterações
sugerindo uma suscetibilidade às variações climáticas. A variabilidade observada
nas amostras de solo controle não pode estar relacionada à adaptabilidade da
comunidade bacteriana aos hidrocarbonetos do petróleo ou à salinidade da água
produzida ou mesmo à adição de nutrientes, mas a fatores ambientais como
temperatura e umidade.
O início do projeto coincidiu com o período chuvoso da região, com um
elevado índice pluviométrico. A segunda fase, ao contrário da primeira, não
sofreu influência do período chuvoso, mas sim do período de seca. Como nessa
fase, o objetivo do projeto previa apenas avaliar o comportamento da
comunidade bacteriana submetida aos diferentes tratamentos, não foi realizado
nenhum tipo de intervenção para minimizar o impacto causado pela redução da
umidade do solo. A umidade do solo no início dos experimentos era de 13%.
Durante a fase II do projeto, os níveis de umidade atingiram valores muito
baixos, atingindo o menor valor (1,5%) após 149 dias do início dos experimentos.
Estas análises foram realizadas pelo laboratório de Tratamento de Resíduos
Sólidos e Áreas Impactadas da gerência de BTA do CENPES. A fase III, assim como
a fase I, transcorreu durante o período de chuva, porém, com índice
pluviométrico menor.
Apesar dessa variabilidade nos perfis de DGGE das amostras de solo
controle, foi possível observar nas amostras submetidas aos diferentes
tratamentos, ao longo das 3 fases de experimentos, uma variação da
xiv
comunidade bacteriana diferente da observada nas amostras controle. Essa
diferença foi provavelmente ocasionada pelos tratamentos empregados.
Em um solo sem histórico de contaminação por poluentes, a água produzida
mostrou efeito maior a partir da segunda aplicação. O efeito do óleo cru sobre a
comunidade bacteriana dominante foi bastante acentuado com perfis bastante
heterogêneos ao longo de todo experimento. A adição de nutrientes inorgânicos
ao solo pelo processo de bioestimulação exerceu grande efeito sobre a
comunidade bacteriana dominante, favorecendo algumas populações em
detrimento de outras.
Evans e colaboradores (2004a) relataram aumentos de pH e dos níveis de
fósforo, potássio, cálcio e magnésio em solos bioestimulados e que a adição de
compostos inorgânicos ao solo juntamente com a contaminação por petróleo
teve um impacto sobre a comunidade bacteriana maior que a contaminação por
óleo sozinha. Os padrões de DGGE das amostras de solo bioestimulado mostraram
mudanças severas devido ao decréscimo no número de bandas comparado às
amostras controle a partir de 15 dias após a adição de nutrientes ao solo (EVANS
et al., 2004a).
Evans e colaboradores (2004a) concluiram que uma mudança ocorre na
comunidade bacteriana como resultado da bioestimulação e que a adição de
nutrientes possivelmente representa um efeito irreversível sobre estas
comunidades, provavelmente devido à ativação da comunidade bacteriana pelo
input de nutrientes, favorecendo mudanças por adaptação e aumento (quando
presente) da capacidade de biodegradação nas populações autótocnes de
degradadores previamente selecionados.
Evans e colaboradores (2004b) também relataram mudanças nos perfis de
DGGE das populações de Pseudomonas em solos contaminados com óleo ou
bioestimulados ao longo de 270 dias de experimentos em microcosmos. Duas ou
três bandas foram observadas nas amostras de solo bioestimulado e contaminado
com óleo após 90 dias. No entanto, uma dessas bandas também apareceu em
amostras bioestimuladas mas que não foram contaminadas com petróleo após
180 dias, sugerindo que a estrutura da comunidade de Pseudomonas foi afetada
pela aplicação de nutrientes (EVANS et al., 2004b).
xv
O impacto da introdução de nutrientes sobre comunidades microbianas no
ambiente já foi estudado por meio de diferentes abordagens (BRAGG et al.,
1994; DEGENS, 1998; OGINO et al., 2001). Entretanto, embora os dados obtidos
desses estudos mostrem uma mudança, tanto em função quanto em número das
comunidades microbianas, não fornecem dados consistentes sobre a estrutura e
diversidade de grupos bacterianos específicos ao longo do processo de
bioestimulação.
Margesin, Hämmerle & Tscherko (2007) avaliaram a comunidade microbiana
em solo sem história de contaminação por hidrocarbonetos na Áustria através de
análise de PLFA e demonstraram que os perfis observados foram afetados
principalmente pelo conteúdo de TPH, em primeiro lugar, e pela bioestimulação,
em segundo lugar, bem como pela interação desses dois fatores. O período de
incubação (de 7, 21 e 38 dias) afetou apenas discretamente a comunidade
microbiana. Os níveis de contaminação em microcosmos de 2500 e 10000 mg de
TPH/kg de solo tiveram maior influência sobre os perfis de PLFA da comunidade
bacteriana total, bem como para perfis específicos para bactérias Gram-
negativas e algas do solo. Os perfis de PLFA específicos para bactérias Gram-
positivas e para a comunidade fúngica não foram influenciados por nenhum dos
fatores analisados ou por interações dos mesmos.
Mckew e colaboradores (2007) utilizaram reações de amplificação por PCR
quantitativo (Q-PCR) de genes funcionais (alkB, alkB2 e phnA) que codificam
enzimas das vias de degradação de alcanos e hidrocarbonetos aromáticos para
avaliar as mudanças em concentrações de bactérias hidrocarbonoclásticas
durante estratégias de biorremediação envolvendo a adição de nutrientes (N e P)
e de emulsificantes em experimentos de microcosmos com água do mar e 0,1%
(v/v) de óleo cru. Foi demonstrado um aumento significativo de 29% de
populações degradadoras de hidrocarbonetos do petróleo dos gêneros
Alcanivorax e Thalassolituus a partir de 15 dias.
Macnaughton e colaboradores (1999) avaliaram 3 técnicas de
biorremediação de petróleo cru da região costeira da baía de Delaware nos
Estados Unidos. Através da comparação de tratamentos com óleo, óleo e
nutrientes e óleo e nutrientes com inóculo de um consórcio microbiano, a
estrutura da comunidade microbiana foi monitorada por análises de PLFA e DGGE
xvi
de produtos de PCR do gene que codifica o rRNA 16S. Os resultados das análises
de PLFA demonstraram um aumento da comunidade de Gram-negativas nas
amostras contaminadas com óleo. A análise de DGGE do solo controle não-
tratado revelaram uma estrutura populacional simples ao longo do experimento.
Este padrão de bandas foi alterado nas amostras de solo contaminado com óleo,
indicando mudanças na estrutura da comunidade bacteriana dominante. No
entanto, não foram observadas alterações nas amostras com a adição de
nutrientes (MACNAUGHTON et al., 1999).
As análises de DGGE, realizadas no presente estudo, revelaram alta
diversidade de bactérias nos solos estudados, com grande número de bandas
presentes nos padrões obtidos.
Foi possível observar bandas nos experimentos de DGGE com ocorrência em
praticamente todas as amostras, representando populações bacterianas pouco
afetadas pelas condições e tratamentos estudados. Foram observadas bandas
presentes apenas em algumas amostras, indicando que os tratamentos
exerceram ações distintas a favor ou contra determinadas populações.
Uma das bandas proeminentes presente em quase todas as amostras foi
denominada banda b e sua seqüência mostrou-se similar à família
Sphingomonadaceae, com maior similaridade com a estirpe fototrófica PB304.
Entre as bandas que sofreram pressão de seleção negativa a banda w
mostrou-se resistente às variações climáticas, estando presente em
praticamente todas as amostragens da célula-piloto controle, mas mostrou-se
sensível à segunda etapa de tratamentos, estando presente apenas na fase
inicial dos experimentos das demais células-piloto. Sua seqüência foi similar a
actinomicetos, sendo mais similar à estirpe Arthrobacter sp. SCP-6 isolada de
solo no oeste do Himalaia, um ambiente de baixas temperaturas. A banda z
parece ter sido selecionada pela adição de óleo e nutrientes, na medida em que
só foi observada em amostras de solo bioestimulado e tratado com óleo. A
seqüência também mostrou similaridade a actinomicetos, sendo mais similar à
estirpe Dietzia sp. ice-oil-71 degradadora de hidrocarbonetos do petróleo
adaptada a baixas temperaturas.
O seqüenciamento de bandas de fragmentos de DNA revelou a possível
presença principalmente de Alphaproteobacteria e actinomicetos nas amostras
xvii
de solo. Destaca-se a possível presença de Novosphingobium aromaticivorans e
Dietzia sp. ice-oil-71 com capacidade de degradar hidrocarbonetos do petróleo e
Sphingomonas sp. R1 degradadora de bifenila. Algumas bandas não mostraram
similaridade com nenhuma bactéria cultivada.
Macnaughton e colaboradores (1999) avaliaram 3 técnicas de
biorremediação de petróleo cru da região costeira da baía de Delaware nos
Estados Unidos. O sequenciamento de bandas de DGGE de produtos de PCR do
gene que codifica o rRNA 16S de amostras de solo tratado com petróleo indicou
que o tratamento com óleo favoreceu populações de Alphaproteobacteria, que
não foram observadas nos solos controle sem tratamento.
Popp, Schlömann & Mau (2006) demonstraram a predominância de
Gammaproteobacteria em solos contaminados com hidrocarbonetos do petróleo
em Rositz, na Alemanha. Alphaproteobacteria e Betaproteobacteria foram
outros dois grupos dominantes e actinomicetos e Bacteroidetes foram
detectados em quantidades menores. A maioria dos clones relacionados a
Alphaproteobacteria mostrou similaridade a espécies de Sphingomonas (Popp,
Schlömann & Mau, 2006). Mills e colaboradores (2003) também relataram a
predominância de espécies de Sphingomonas depois das Pseudomonas em um
tratamento de solo contaminado com petróleo em biorreator. Além disso,
espécies de Sphingomonas foram detectadas em todos os solos investigados com
contaminação por HPA, independentemente das propriedades geológicas e
químicas e da origem geográfica dos solos (LEYS et al., 2004). As espécies do
gênero Sphingomonas são características em uma variedade de ambientes de
subsuperfície e são conhecidas pelo amplo potencial de degradação (VOMBERG &
KLINNER, 2000; THIEL et al., 2005). Conseqüentemente, estes microrganismos
podem ter desempenhado um papel significativo no processo de biorremediação
do solo estudado.
A análise de DGGE mostrou ser uma metodologia sensível para avaliar a
diversidade e as mudanças na estrutura da comunidade bacteriana devido à
presença de petróleo e água produzida, atuando também como uma ferramenta
para o monitoramento da bioestimulação levando a uma melhor compreensão da
dinâmica bacteriana do solo durante os processos de biorremediação (atenuação
natural e bioestimulação).
xviii
O grande número de espécies observadas através dos experimentos de
hibridização sobre o microarranjo de genes cpn60 e rrs corroborou a grande
diversidade bacteriana das amostras de solo estudadas observada através da
análise de DGGE dos amplicons do gene rrs.
O gene cpn60 codifica a proteína GroEL, uma chaperonina altamente
conservada que apresenta moderada diversidade da seqüência de DNA, o que faz
desse gene uma ferramenta útil em taxonomia bacteriana (GOH et al., 1996;
BROUSSEAU et al., 2001; HILL et al., 2004; MAYNARD et al., 2005). As
chaperoninas são subunidades das chaperonas que estão envolvidas no
dobramento de proteínas e apresentam uma morfologia geral de dois anéis
sobrepostos, cada um composto de 7 a 9 chaperoninas (SWAIN & GIERASCH,
2005). As chaperonas estão entre as maquinárias moleculares melhor
compreendidas estrutural e funcionalmente (FENTON & HORWICH, 1997; SIGLER
et al., 1998; SAIBIL & RANSON, 2002; SAIBIL, HORWICH & FENTON, 2002; SWAIN
& GIERASCH, 2005; HORWICH et al., 2007).
A análise dos experimentos de hibridização sobre microarranjo taxonômico
revelou gêneros (e mesmo espécies) correlatos com os observados através do
seqüenciamento de bandas extraídas do experimento de DGGE, como
Arthrobacter sp., Dietzia maris, Mesorhizobium loti, Oxalobacter formigenes,
Pseudomonas stutzeri, Sphingomonas paucimobilis e Streptomyces sp.
Um outro objetivo deste trabalho foi o de determinar o potencial de
biodegradabilidade do ambiente testado. A amplificação por PCR do gene alkB,
inclusive nas amostras de solo controle, indica um potencial desse solo em
biodegradar hidrocarbonetos alcanos. A observação desse gene através de
hibridização em microarranjo catabólico de DNA confirmou esse potencial de
degradação de alcanos.
O perfil observado para este gene através de experimentos de DGGE indica
uma grande estabilidade da comunidade ao longo do processo de contaminação
por petróleo e de biorremediação, quer por atenuação natural, quer por
bioestimulação. A pouca variedade do gene alkB observada através de
hibridização com microarranjo catabólico de DNA (apenas 3 dos 9
oligonucletídeos deste gene no microarranjo apresentaram sinais de hibridização
com as amostras de solo testadas) corrobora essa estabilidade da comunidade
xix
bacteriana degradadora de alcanos. No entanto, esta estabilidade é relativa às
condições experimentais utilizadas.
Aparentemente, as populações bacterianas degradadoras de alcanos não
foram selecionadas de forma significativa pela presença de óleo ou água
produzida ou pela adição de nutrientes. O perfil que mais diferiu dos demais foi
o da amostra de solo bioestimulado e tratado com óleo de 429 dias (BO429) com
89% de similaridade.
Se a seqüência é nucleotídica e se deseja acessar o gene ao qual ela
pertence, a melhor opção é utilizar o Blastn. Por esse motivo essa foi a escolha
para a análise das seqüências obtidas com a amplificação com iniciadores para o
gene rrs. No entanto, as pesquisas nucleotídeo-nucleotídeo não são indicadas
para encontrar regiões codificadoras de proteínas homólogas em outros
microrganismos, uma vez que o código genético é degenerado. Neste caso, o
melhor é pesquisar por proteínas, com traduções das seqüências de
nucleotídeos.
Os programas BLAST e FASTA são bastante utilizados para pesquisas em
banco de dados porque são rápidos. Eles usam técnicas ligeiramente diferentes
para encontrar seqüências similares. BLAST é mais rápido que FASTA mas, por
causa disso, pode haver uma perda de sensibilidade para as relações de distância
entre as seqüências. Além disso, similaridades não observadas com o programa
BLAST puderam ser encontrados com FASTA.
Ao contrário do observado para o gene rrs, não houve o predomínio de
seqüências de Alphaproteobacteria da família Sphingomonadaceae, sugerindo
que esse não é um grupo predominantemente de estirpes degradadoras de
hidrocarbonetos no solo estudado. O seqüenciamento de bandas do experimento
de DGGE do gene alkB revelou a possível presença principalmente de
actinomicetos, Betaproteobacteria e Gammaproteobacteria degradadores de
alcanos nas amostras de solo. Destaca-se a possível presença de Mycobacterium
vanbaalenii PYR-1, um actinomiceto capaz de degradar diversos
hidrocarbonetos, entre os quais, hidrocarbonetos aromáticos, Ralstonia sp. PT11
e Burkholderia xenovorans LB400 isoladas a partir de solo de floresta
contaminados com hidrocarbonetos do petróleo e duas estirpes marinhas
degradadoras de hidrocarbonetos do grupo Oceanospirillales, a estirpe MIL-1 que
xx
é a estirpe tipo da espécie Thalassolituus oleivorans e a estirpe Alcanivorax
dieselolei P40.
Os experimentos de hibridização sobre microarranjo taxonômico revelou a
possível presença de gêneros (e espécies) também observados através do
seqüenciamento de bandas do experimento de DGGE do gene alkB como
Burkholderia, Pseudomonas aeruginosa, Ralstonia e Rhodococcus sp.
As espécies Thalassolituus oleivorans (YAKIMOV et al., 2004) e a estirpe
Alcanivorax dieselolei (LIU & SHAO, 2005) fazem parte um grupo
fisiologicamente incomum de bactérias marinhas degradadoras de
hidrocarbonetos, recentemente descrito. Estas bactérias são designadas
“Bactérias Hidrocarbonoclásticas Obrigatórias” (OHCB) por possuírem uma
especificidade de substrato altamente especializada exibindo um perfil de Biolog
(Hayward, CA, USA, www.biolog.com) característico crescendo somente com
dois substratos, Tween 40 e Tween 80, dos 95 substratos (YAKIMOV, TIMMIS &
GOLYSHIN, 2007). Esse perfil parece ser mais característico para bactérias
degradadoras de hidrocarbonetos marinhas que para bactérias do solo. De fato,
apenas 3 bactérias degradadoras de parafina isoladas de ambientes terrestres
apresentaram um perfil semelhante (BOGAN et al., 2003; YAKIMOV, LUNSDORF &
GOLYSHIN, 2003). As seqüências do gene que codifica o rRNA 16S de bancos de
dados como GenBank e RDP do gênero Thalassolituus são originadas de
comunidades bacterianas tanto de ambientes marinhos como de ambientes
terrestres, como cavernas. Por outro lado, bactérias do gênero Alcanivorax
foram detectadas em um número limitado de ambientes terrestres com
características semelhantes às de ecossistemas marinhos como salinidade
(YAKIMOV, TIMMIS & GOLYSHIN, 2007).
A observação de bandas de diferentes amostras migrando em uma mesma
altura no gel mas codificando enzimas de diferentes microrganismos e de bandas
migrando em diferentes posições no gel de DGGE mas que codificam a mesma
enzima, reflete a existência de diferentes cópias do gene alkB, a exemplo da
heterogeneidade entre as cópias do gene que codifica o rRNA 16S em muitas
espécies bacterianas. Devido à heterogeneidade deste gene diversas bandas por
espécie podem ser vistas em uma análise de DGGE (FOGEL et al. 1999; DAHLLÖF,
BAILLIE & KJELLEBERG, 2000).
xxi
A ausência de amplificação por PCR e de hibridização sobre o microarranjo
catabólico do gene ndoB, bem como a ausência de hibridização sobre o
microarranjo catabólico dos genes phnAc, phnE1 e phnE2 que codificam enzimas
envolvidas na via de degradação do fenantreno, não exclui um potencial de
biodegradação de hidrocarbonetos aromáticos neste solo.
A observação de sinal de hibridização com outros genes envolvidos na
degradação de naftaleno (nahC, nahE, nahF e nahG) pode indicar que o gene
ndoB (nahA) pode estar presente no ambiente porém, a seqüência desse gene
deve diferenciar daquelas presentes nos bancos de dados (com base nas quais
foram desenhados os oligonucleotíeos utilizados nos experimentos de
amplificação por PCR e de hibridização com microarranjo catabólico de DNA). Os
sinais de hibridização com genes envolvidos na degradação de naftaleno e de
outros hidrocarbonetos aromáticos, bem como o isolamento de pelo menos duas
estirpes degradadoras de fenantreno indicam que existe o potencial para a
degradação de hidrocarbonetos aromáticos no solo.
Os fracos sinais de hibridização observados no microarranjo catabólico
indicam que essa técnica precisa ser melhor adaptada ao tipo de amostras
utilizadas. Além disso, podem estar refletindo a falta de um banco de genes
consistente e representativo para genes brasileiros de degradação de
hidrocarbonetos do petróleo, uma vez que as características do nosso solo e
clima são distintos e a maioria dos dados usados para projetar os
oligonucleotídeos de genes funcionais são derivados de outros ambientes.
Uma das modificações para a otimização desta metodologia envolveu a
utilização do equipamento SlideBooster (Advalytix AG) para melhorar a
hibridização, porque reduz a formação de bolhas e mantém a solução de
hibridização contendo o DNA marcado em movimento sobre o microarranjo
durante o período de incubação através da microagitação.
Para a avaliação da hibridização com microarranjos de DNA neste projeto
foi necessário chegar aos limites de detecção para visualizar os sinais do
fluoróforo e a quantificação dos sinais foi dificultada. O controle positivo (DNA
do fago λ) apresentou forte sinal de hibridização com o DNA do microarranjo.
Além disso, foram utilizados tRNA e DNA de esperma de salmão misturados às
amostras de DNA testadas como controles internos do experimento. Os sinais
xxii
observados com estes controles também foram fortes, alcançando a saturação,
mesmo nas lâminas em que as amostras testadas não geraram nenhum sinal de
hibridização. Isto pode ser resultado de uma baixa concentração de genes
homólogos aos oligonucleotídeos dos microarranjos nas amostras de DNA de solo.
É possível também que o DNA extraído do solo pudesse ainda conter substâncias
capazes de inibir a hibridização do DNA marcado com o microarranjo ou que
algum outro parâmetro no procedimento de hibridização possa ter resultado na
perda de sinal e precise ser revisto.
O objetivo de utilizar os microarranjos de DNA foi o de obter uma avaliação
mais profunda do impacto do petróleo, da água produzida e da estratégia de
bioestimulação sobre a diversidade bacteriana e sobre a diversidade da
comunidade degradadora de hidrocarbonetos do petróleo. Foram os primeiros
passos dentro de um campo relativamente desconhecido aplicando técnicas a um
sistema novo, que obviamente leva a uma carga de trabalho preliminar e de
desenvolvimento. Diversos procedimentos usados neste estudo, especialmente
para o uso das metodologias de microarranjo de DNA, foram estabelecidos
durante o desenvolvimento dos experimentos e demandam otimização.
Tanto a especificidade quanto a sensibilidade do microarranjo dependem
de fatores experimentais envolvendo a fabricação do arranjo e a hibridização: a
química da superfície da lâmina, a morfologia do microarranjo, a concentração
dos oligonucleotídeos, as condições de hibridização e de lavagem (ZHOU &
THOMPSON, 2002; TARONCHER-OLDENBURG et al., 2003; ZHOU & THOMPSON,
2004; FRANKE-WHITTLE, KLAMMER & INSAM, 2005). Como estes fatores são
difíceis de ajustar, existem ainda algumas modificações a serem aplicadas para
otimizar os sistemas de microarranjo, especialmente para aplicações ambientais.
No entanto, os resultados alcançados neste projeto são úteis para o
estabelecimento de experimentos de microarranjo de DNA, especialmente de
genes funcionais com todos os procedimentos técnicos que poderão ser aplicados
no futuro para estudos mais qualitativos e quantitativos tanto para dar
continuidade a este estudo como para estudos similares.
xxiii
CONCLUSÕES
Este foi o primeiro estudo realizado diretamente no ambiente combinando
metodologias de microbiologia clássica e técnicas moleculares de PCR, DGGE e
microarranjos de DNA para a análise e o monitoramento da comunidade
bacteriana total e funcional durante a biorremediação de solo contaminado com
petróleo e água produzida.
Através da simulação de derrames de porte médio de petróleo e água
produzida diretamente no ambiente, foi possível evidenciar as alterações da
comunidade bacteriana do solo ao longo do processo de contaminação, bem
como do tratamento de bioestimulação. Além disso, foi também possível
determinar o potencial de biodegradabilidade de hidrocarbonetos do petróleo da
comunidade bacteriana do solo.
A estratégia utilizada para a avaliação dos perfis de populações bacterianas
cultiváveis em solo contaminado com petróleo permitiu o isolamento de grande
número de morfotipos coloniais halotolerantes e também de estirpes
degradadoras de petróleo Sergipano Terra. No entanto, a metodologia não foi
eficiente para o isolamento de estirpes halofílicas nem para a detecção de
estirpes capazes de degradar fenantreno.
Para as análises de biolobia molecular, a utilização de “kit” comercial para
a extração de DNA de solo não foi eficiente com as amostras de solo estudadas.
A estratégia de lavagens previamente à extração do DNA apresentou um melhor
rendimento de DNA.
Foi possível observar mudanças devidas a fatores climáticos através da
análise de amostras de solo que não sofreu qualquer tratamento com óleo, água
produzida ou bioestimulação.
Através do seqüenciamento de bandas de DGGE e da hibridização com o
microarranjo de DNA, foi possível observar uma grande diversidade bacteriana e
identificar os principais grupos dominantes no solo sem tratamento e nos solos
submetidos aos diferentes tratamentos.
O sistema empregado também permitiu detectar a grande estabilidade das
populações de degradadores de alcanos no solo estudado.
No entanto, a ausência de amplificação por PCR e de hibridização com o
gene ndoB (envolvido na degradação de naftaleno) do microarranjo catabólico,
xxiv
bem como a ausência de hibridização dos genes phnAc, phnE1 e phnE2 que
codificam enzimas envolvidas na via de degradação do fenantreno, pode estar
relacionada ao baixo conteúdo de hidrocarbonetos aromáticos no óleo Sergipano
Terra. Porém, tendo sido detectado sinal de hibridização com outros genes
envolvidos na degradação de naftaleno (nahC, nahE, nahF e nahG) e de outros
hidrocarbonetos aromáticos, estas observações, bem como o fato de todos os
sinais de hibridização detectados no microarranjo catabólico term sido fracos,
podem estar refletindo a falta de um banco de genes consistente e
representativo para genes brasileiros de degradação de hidrocarbonetos do
petróleo. As características do nosso solo e clima são bastante distintos e a
maioria dos dados usados para projetar oligonucleotídeos para microarranjos de
DNA e para reações de amplificação por PCR são geralmente derivados de outros
ambientes, principalmente de clima temperado.
Desta forma, conclui-se que as metodologias utilizadas mostraram-se úteis
para as análises propostas, mas precisam ser adaptadas aos ecossistemas
brasileiros.
De um modo geral, os resultados demonstram que existe o potencial para a
biodegradação de hidrocarbonetos do petróleo no solo de Carmópolis, que não
tem histórico prévio de contaminação.
xxv
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