( PDF ) Atividade antileucêmica de claconas sintéticas

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

Centro de Ciências da Saúde

Programa de Pós-Graduação em Farmácia

ATIVIDADE ANTILEUCÊMICA DE CHALCONAS SINTÉTICAS

Syntia Sorgato

Florianópolis - SC, Março 2007.

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SYNTIA SORGATO

ATIVIDADE ANTILEUCÊMICA DE CHALCONAS SINTÉTICAS

Dissertação apresentada ao programa de Pós-

graduação em Farmácia da Universidade

Federal de Santa Catarina, como requisito

parcial para obtenção do grau de Mestre em

Farmácia. Área de concentração: Fármacos e

Medicamentos

Orientadora: Prof.ª Dr.ª Tânia Beatriz

Creczynski Pasa

Florianópolis - SC, Março 2007.

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Syntia Sorgato

ATIVIDADE ANTILEUCÊMICA DE CHALCONAS SINTÉTICAS

Esta Dissertação foi julgada e aprovada para a obtenção do título de

Mestre em Farmácia no Programa de Pós-Graduação em Farmácia da

Universidade Federal de Santa Catarina.

Florianópolis-SC, 26 de março de 2007.

__________________________________

Prof. Dr.º Marcos Antônio Segatto Silva

Coordenador do Programa

BANCA EXAMINADORA:

_______________________________

Prof.ª Dr.ª Tânia B. Creczynski Pasa

Orientadora

_______________________________

Prof.ª Dr.ª Cidônia Lourdes Vituri

(ACL - UFSC)

_______________________________

Prof.ª Dr.ª Maria Luiza Bazzo

(ACL - UFSC)

_______________________________

Prof.ª Dr.ª Ionara Rodrigues Siqueira

(UFRGS)

AGRADECIMENTOS

Mais árduo que realizar este trabalho é encontrar palavras certas para

agradecer às pessoas especiais que fazem parte da minha vida, e sem as quais eu

jamais teria chegado até aqui. Através destas páginas simbólicas, deixo registrado

meu profundo agradecimento:

A Deus, pela vida e por proporcionar-me diferentes caminhos, dando-me

sempre oportunidades de escolha e guiando-me através delas.

Aos meus pais, Anacleto e Terezinha, pela contribuição na formação do meu

caráter, pelo amor incondicional, apoio, incentivo e dedicação da vida toda.

Aos meus irmãos, Márcio e Vinícius, pela valiosa ajuda nos problemas

encontrados com programas, computadores e pelo apoio durante a realização de

todo este trabalho.

Ao meu namorado, Osmar, pelo amor, compreensão e incentivo durante toda

esta trajetória.

A Prof.ª Tânia Pasa, pela orientação, amizade e significativo aprendizado

científico durante estes dois anos.

A Prof.ª Maria Cláudia, por ter guiado meus primeiros passos na cultura

celular.

A Prof.ª Maria Luiza, pelas valiosas contribuições, em que curtas conversas

nos corredores do laboratório fizeram grandes diferenças na realização dos

experimentos.

A Prof.ª Cidônia, por propiciar o desenvolvimento dos testes de toxicidade em

células progenitoras no seu laboratório.

A todos os amigos e colegas do Laboratório de Bioenergética e Bioquímica de

Macromoléculas, que propiciaram o desenvolvimento deste trabalho, especialmente

“as meninas da cultura de células”.

Às amigas Patrícia Decker, Tatiana Becker e Tadiane Dacroce pela amizade

sincera e ombro amigo nos momentos difíceis.

À amiga Angela Juliani Melo, pela amizade, compreensão e ajuda nos

momentos conturbados.

Ao Prof.° Rosendo A. Yunes e seus alunos Louise D. Chiaradia e Paulo C.

Leal, pela colaboração, síntese das chalconas utilizadas neste trabalho e discussões

sobre reações e estruturas químicas.

Ao Laboratório de Análises Clínicas (HU-UFSC), aos Laboratórios de

Pesquisa I, II e III (HU) e ao Hospital Universitário, pela disponibilidade da estrutura

para realização de parte deste trabalho.

Ao Programa de Pós Graduação em Farmácia da Universidade Federal de

Santa Catarina, por ter proporcionado a realização desta minha formação acadêmica

e científica.

E, finalmente, a todos que contribuíram, direta ou indiretamente, para a

realização deste trabalho.

“No meio de qualquer dificuldade encontra-se a oportunidade”.

“Algo só é impossível até que alguém duvide e acabe provando o contrário”.

Albert Einstein

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE ABREVIATURAS, SIMBOLOS E SIGLAS

RESUMO

ABSTRACT

INTRODUÇÃO

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1

Leucemia linfóide aguda

2.1.1

Manifestações clínicas

2.1.2

Classificação FAB, imunofenotipagem, citogenética e

diagnóstico

2.1.3

Alterações genéticas

2.1.4

Tratamento

2.2

Morte celular: apoptose e necrose

2.3

Mitocôndria, potencial energético celular e GSH

2.4

Flavonóides

2.5

Chalconas

OBJETIVOS

3.1

Objetivo Geral

3.2

Objetivos Específicos

MATERIAIS E MÉTODOS

4.1

Reagentes

4.2

Síntese das chalconas

4.2.1

Procedimento geral para a preparação das chalconas

derivadas do 3,4-metilenodioxibenzaldeído

4.3

Cultura de células

4.3.1

Tratamento das células

4.4

Ensaio de viabilidade celular (teste do MTT)

4.5

Análise de apoptose pelo método de fragmentação nuclear

4.6

Análise de apoptose e viabilidade celular pelo método de

fluorescência com laranja de acridina e brometo de etídio

4.7

Determinação das curvas de tempo-resposta e concentração-

resposta

4.8

Determinação da concentração de glutationa total

4.9

Determinação da concentração de ATP

4.10

Ensaio de células progenitoras grânulo-monocíticas (Ensaio GM-

CFC)

4.11

Análise estatística

4.12

Desenho experimental

RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1

Síntese

5.2

Determinação da atividade citotóxica através da viabilidade celular

5.3

Análise da apoptose por fragmentação do DNA

5.4

Análise da apoptose e viabilidade celular por fluorescência

5.5

Tempo resposta

5.6

Concentração resposta

5.7

Concentração de glutationa

5.8

Concentração de ATP

5.9

Citotoxicidade em células normais e células progenitoras grânulo-

monocíticas

CONCLUSÕES

PERSPECTIVAS

REFERÊNCIAS

Anexos

9.1

Trabalhos apresentados em congressos

100

9.2

Artigo submetido na revista “Bioorganic & Medicinal Chemistry”

101

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.

Mecanismos de morte celular: necrose e apoptose

Figura 2.

As duas principais vias apoptóticas

Figura 3.

Mitocôndria

Figura 4.

Estrutura da glutationa

Figura 5.

Núcleo fundamental das chalconas

Figura 6.

Desenho Experimental

Figura 7.

Etapas de deprotonação e ataque nucleofílico para formação do

produto de condensação

Figura 8.

Etapa de desidratação para obtenção da chalcona

Figura 9.

Síntese de chalconas derivadas do 3,4-

metilenodioxibenzaldeído

Figura 10.

Efeito citotóxico das chalconas sobre células L1210

Figura 11.

Fragmentação do DNA induzida por chalconas em células

L1210

Figura 12.

Células normais e apoptóticas coradas com laranja de acridina

e brometo de etídio

Figura 13.

Viabilidade das chalconas sobre células L1210 por

fluorescência

Figura 14.

Tempo resposta da atividade das chalconas sobre células

L1210

Figura 15.

Concentração resposta da atividade das chalconas sobre

células L1210 em 24h

Figura 16.

Concentração resposta da atividade das chalconas sobre

células L1210 em 48h

Figura 17.

Comparação entre o efeito das chalconas sobre a concentração

de GSH total e a viabilidade em células L1210

Figura 18.

Efeito das chalconas sobre a concentração de ATP em células

L1210

Figura 19.

Efeito citotóxico das chalconas sobre células VERO (células

não tumorais)

LISTA DE TABELAS

Tabela 1.

Constituintes das camadas de cultura em meio semi-sólido/placa

Tabela 2.

Comparação da viabilidade celular pelos métodos de microscopia

de fluorescência (MF) com laranja de acridina e brometo de etídio

e teste do MTT

Tabela 3.

Comparação da viabilidade celular entre as linhagens L1210 e

VERO

Tabela 4.

Ensaio de células progenitoras grânulo-monocíticas (Ensaio GM-

CFC)

LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E SIGLAS

AIF Fator de indução a apoptose

Apaf-1 Protease apoptótica ativadora de fator-1

ATP Adenosina trifosfato

B16-4A5 Linhagem de células de melanoma murino

BFM Protocolo Berlim-Frankfurt-Munique para tratamento de

leucemias

CFC-GM Células formadoras de colônia de granulócitos e

macrófagos

GM-CSF Fator estimulador de colônias de macrófagos e

granulócitos

COX Ciclooxigenase

DMEM Meio Eagle modificado por Dulbecco

DMSO Dimetil sulfóxido

DNA Ácido desoxirribonucléico

DNTB Ácido 5,5’-ditio-bis-2-nitrobenzóico

EDTA Ácido etilenodiaminotetraacético

EGIL Grupo Europeu para a Classificação Imunológica das

Leucemias

EROs Espécies Reativas de Oxigênio

GPx Glutationa Peroxidase

GR Glutationa Redutase

GSH Glutationa (forma reduzida)

GSSG Glutationa dissulfeto (forma oxidada)

GST Glutationa S-transferase

HEPES Ácido N-[2-Hidroxietil]piperazina-N’-[2-etanosulfônico]

HL-60 Linhagem de células de leucemia humana

HLA Antígeno de histocompatibilidade

IAP Proteínas inibidoras de apoptose

Concentração que inibe 50% do crescimento celular

IMDM Meio Dulbecco modificado por Iscove

K562 Linhagem de células de leucemia humana

Kb Kilobase

L1210 Linhagem de células de leucemias linfoblástica murina

LLA Leucemia Linfóide Aguda

MRPs Proteínas associadas à resistência a múltiplas drogas

MTT Brometo de dimetiazol difeniltetrazólio

NADPH Fosfato de nicotinamida adenina dinucleotídeo

NK Células “Natural Killer”

OMS Organização Mundial da Saúde

PCK Proteína C quinase

SFB Soro fetal bovino

SNC Sistema nervoso central

TNB Ácido 5-tio-2-nitrobenzóico

TNF Fator de necrose tumoral

TNF-R Receptor do fator de necrose tumoral

VERO Linhagem de células normais, de rim de macaco

RESUMO

As chalconas são compostos intermediários essenciais na biossíntese dos

flavonóides. São amplamente distribuídas no reino vegetal e encontradas em

pequenas e grandes plantas. Muitos trabalhos demonstraram efeitos biológicos para

as chalconas, incluindo efeito antiinflamatório, antioxidante, antimalárico e

antitumoral. Diferentes substituintes nos anéis das chalconas podem resultar em

compostos com diferentes atividades biológicas. O objetivo deste trabalho foi estudar

a atividade antitumoral de dez chalconas derivadas quimicamente do 3,4-

metilenodioxibenzaldeído nas células leucêmicas linfoblásticas L1210. Foram

analisadas a viabilidade celular, o mecanismo de morte celular, as concentrações

intracelulares de GSH e ATP e a toxicidade in vitro das chalconas em células

progenitoras da medula óssea. Foi observado que as chalconas 5, 7 e 11 reduziram

fortemente o número de células viáveis em 90.5 ± 1.2%, 87.1 ± 1.1% e 86.3 ± 2.2%,

respectivamente, quando comparadas com o controle, e induziram a fragmentação

do DNA na concentração de 100 µM. Dentre as dez chalconas testadas somente a

5, a 7 e a 11 apresentaram efeito citotóxico acentuado. A chalcona 5 mostrou o

menor valor de IC

em 24h e em 48h, nas concentrações de 45 e 22 µM,

respectivamente. Os grupos metóxi que aumentam a densidade eletrônica do anel A,

presentes nos compostos 5, 7, e 11, parecem aumentar sua citotoxicidade. A

depleção de GSH mostrou-se proporcional à morte celular. As concentrações

intracelulares de ATP foram esgotadas de maneira concentração-dependente,

sugerindo que os compostos podem interferir no potencial de membrana

mitocondrial e na síntese do ATP. A chalcona 7 foi o composto menos tóxico para

células normais da medula óssea. Nossos resultados mostraram que as chalconas

5, 7 e 11 induziram à apoptose células L1210 e apresentam a chalcona 7 como a

mais promissora para dar continuidade às investigações.

ABSTRACT

Chalcones are essential intermediate compounds in the flavonoids biosynthesis.

They are widely distributed in nature and easily found in arboreal or smaller plants.

Many works have demonstrated biological effects from chalcones including anti-

inflammatory, antioxidant, antimalaric and antitumoral. Differents substitutions at

rings of chalcones molecules can result in compounds with different biological

actions. The objective of this work was study the antitumoral activity of ten chalcones

chemically derived from 3,4-metilenodioxibenzaldeide in murine lymphoblastic

leukemia cells L1210. The cellular viability, the mecanism of cell death, intracellular

concentration of ATP and glutathione and in vitro toxicity from chalcones to normal

cells from bone marrow were analyzed. We observed that the chalcones 5, 7 and 11

strongly reduced the number of viable cells in 90,5 ± 1,2%, 87,1 ± 1,1% and 86,3 ±

2,2%, respectively, when compared with the control and induced DNA fragmentation

at concentration 100 µM. Among ten chalcones tested, only the number 5, 7 and 11

showed accentuated citotoxic effect. Compound 5 showed the lower IC

value in 24

and 48 hours, 45 and 22 µM, respectively. The methoxy groups which increase the

electronic density of the A-ring, present in the compounds 5, 7, and 11, seem to

increase the citotoxicity. GSH depletion was proportional to cell death. ATP

concentration was depleted showing a concentration-dependent profile. These

results suggest that the compounds may be interfering in mitochondrial membrane

potential and ATP synthesis. Chalcone 7 was the compound which showed smaller

toxic effects to normal cells from bone marrow. Our results showed that the synthetic

chalcones 5, 7 and 11 induced apoptosis in L1210 cells and present the chalcone 7

as a prominence compound to follow with mechanisntic investigations.

INTRODUÇÃO

INTRODUÇÃOINTRODUÇÃO

INTRODUÇÃO

Leucemia é uma doença decorrente da proliferação neoplásica de células

hematopoiéticas linfóides ou mielóides, resultante da mutação de uma única célula-

tronco, cuja prole forma um clone de células leucêmicas. As mutações podem

ocorrer em diferentes fases da diferenciação de precursores linfóides ou mielóides

ou, ainda, em uma célula-tronco pluripotente, com capacidade para diferenciar-se,

tanto em células mielóides quanto linfóides. Geralmente, ocorrem várias alterações

genéticas para transformação maligna, incluindo expressão inadequada de

oncogenes e perda de função de genes supressores de tumor. As leucemias agudas

caracterizam-se por um defeito na maturação, o que ocasiona um desequilíbrio entre

a proliferação e a maturação celular; uma vez que as células do clone leucêmico

continuam a proliferar-se, sem chegar aos estágios de maturação e morte,

ocorrendo uma expansão contínua do clone leucêmico e predomínio das células

imaturas (BAIN, 2003).

As bases do tratamento com compostos antileucêmicos estão suportadas na

inibição da proliferação celular (HERR & DEBATIN, 2001), na indução à apoptose ou

na diferenciação dos blastos leucêmicos, que invariavelmente evoluirão para

apoptose (LESZCZYNIECKA et al., 2001).

Os mecanismos que regulam a apoptose são complexos e consistem na ativação

de numerosas sinalizações que integram vários sistemas paralelos ou inter-relacionados,

culminando na autodestruição celular. Deficiências nos mecanismos de apoptose podem

contribuir para a carcinogênese, criando um ambiente permissivo à instabilidade genética

e acúmulo de mutações, contribuindo para persistência e expansão de células

neoplásicas (REED, 1999).

A mitocôndria é responsável por 80% a 90% do ATP necessário para respiração e

sobrevivência celular, regula o fluxo de cálcio e tem um papel importante nos estímulos

pró e anti-apoptóticos (DIAS & BAILLY, 2005). Alguns trabalhos demonstram que a

deficiência energética ou depleção de ATP (trifosfato de adenosina) induz as células a

apoptose. CARIATI et al. (2003) mostraram que o composto mofaroteno (um retinóide

ativo) induziu à apoptose células de linfoma de Burkitt’s através da despolarização da

membrana mitocondrial, ativação das caspases 3 e 9, e aumento da produção de

espécies reativas de oxigênio. Estes efeitos foram relacionados à pequena quantidade do

conteúdo intracelular de ATP. GARLAND & HALESTRAP (1997) mostraram que a

depleção intracelular de ATP, pelo desacoplamento da ATPase mitocondrial, induziu a

morte celular apoptótica exibindo fragmentação do DNA em células pré-B dependentes

de interleucina-3. Substâncias que comprometem a integridade estrutural e funcional da

mitocôndria, conseqüentemente o metabolismo energético celular, podem ser novas

oportunidades para impedir a proliferação de células tumorais.

O entendimento da complexa interação entre os diferentes mecanismos de

defesa, em resposta ao estresse celular, pode identificar alvos moleculares de

sensibilidade ou resistência em células tumorais e contribuir para novas intervenções

na terapia do câncer. A demonstração de que a depleção de glutationa aumenta a

sensibilização de células tumorais aos efeitos citotóxicos de vários compostos

alquilantes e radiações já está bem descrita na literatura. Em contrapartida,

concnetrações elevadas de glutationa intracelular estão associados à resistência de

várias linhagens celulares tumorais a fármacos quimioterápicos, como leucemia

linfoblástica L1210 (KRAMER et al., 1987), plasmocitoma humano (MEDH et al.,

1991), carcinoma gástrico (BARRANCO et al., 1990) e carcinoma ovariano (LOUIE

et al., 1985).

Chalconas são precursores biossintéticos de flavonóides e isoflavonóides.

São largamente distribuídas na natureza, desde sementes até grandes plantas.

Quimicamente, apresentam dois anéis aromáticos ligados por três carbonos, uma

carbonila e dois carbonos α-, β-insaturados. Apresentam diversas atividades

biológicas, são potentes agentes antiinflamatórios e têm sido identificadas como

compostos com interessantes propriedades citotóxicas e antitumorais. SAYDAM et

al. (2003) estudaram o efeito citotóxico e inibitório da proliferação da 4,4’

dihidroxichalcona em células de leucemia humana. Estes pesquisadores mostraram

que a 4,4’ dihidroxichalcona apresenta uma alta citotoxicidade e atividade

antitumoral nas células HL-60. Porém, não conseguiram demonstrar o mecanismo

pelo qual a chalcona inicia o processo de morte das células. Entretanto, foi

demonstrada a degradação do DNA e, conseqüentemente, concluído que a morte

ocorre por apoptose.

NAKATANI et al. (2005) mostraram que dihidroxichalconas C-benziladas

isoladas da Uvaria acuminata, uvauretina, isouvaretina e diuvaretina, inibiram o

crescimento de células de leucemia promielocítica humana HL-60. O mecanismo de

citotoxicidade foi avaliado pela observação da fragmentação do DNA, da ativação

da caspase-3 e da morfologia celular. Foi demonstrado que estas hidroxichalconas

induzem as células HL-60 a morte, por apoptose (ICHIMARU et al., 2004;

NAKATANI et al., 2005).

Um estudo realizado com hidroxichalconas por SABZEVARI et al. (2004)

mostrou que todas as hidroxichalconas estudadas depletaram GSH de hepatócitos

isolados de rato e oxidaram GSH à GSSG. Todas as chalconas estudadas também

causaram citotoxidade nos hepatócitos. O mecanismo de citotoxicidade foi por

desacoplamento mitocondrial, evidenciado pelo aumento de consumo de oxigênio e

colapso do potencial de membrana mitocondrial. Em algumas hidroxichalconas, o

mecanismo de citotoxicidade também foi associado à oxidação da GSH.

Nosso objetivo foi estudar o efeito citotóxico (atividade antitumoral) de

chalconas sintéticas derivadas do 3,4-metilenodioxibenzaldeído sobre células

leucêmicas linfoblásticas L1210.

REVISÃO

REVISÃOREVISÃO

REVISÃO

BIBLIOGR

BIBLIOGRBIBLIOGR

BIBLIOGRÁ

ÁÁ

ÁFICA

FICAFICA

FICA

2.1 Leucemia linfóide aguda

Leucemia linfóide aguda (LLA) é uma doença caracterizada pela proliferação

descontrolada de células progenitoras linfóides imaturas na medula óssea, que

resulta em acúmulo de células neoplásicas (PLASSCHAERT et al., 2004). A etiologia

das leucemias não é conhecida, embora fatores possam contribuir para o

desenvolvimento da doença, como as mutações genéticas (VIELE, 2003).

A LLA ocorre em adultos e crianças, mas a maior incidência verifica-se em

crianças abaixo dos cinco anos de idade, sendo responsável por cerca de 80% dos

casos de leucemia aguda na infância (LAKS et al., 2003) e 50% de todas as

malignidades hematopoiéticas (DOWNING & SHANNON, 2002). Segundo a revisão

realizada por PLASSCHAERT et al., (2004) a incidência em crianças de até cinco

anos é de 5,7 por 100.000 pessoas por ano, e em adultos é de 0,4 por 100.000

pessoas aos 40 anos, aumentando para 0,8 acima dos 75 anos de idade. Em

adultos a LLA é uma leucemia relativamente rara, contabilizando 2% a 3 % das

malignidades hematopoiéticas (DOWNING & SHANNON, 2002).

O prognóstico, em crianças, é o mais favorável de todos os cânceres, com

mais de 95% de remissão completa e taxas de sobrevida, sem a doença, de 63% a

83% (SCHRAPPE et al., 2000). PUI & EVANS (1988) citam que a taxa de cura na

infância, com quimioterapia intensiva, é de 70% a 80%. Adultos com LLA

apresentam prognóstico pior, com remissão completa de 75% a 89% e taxa de

sobrevida a longo prazo, sem a doença, de 28% a 39% (GOKBUGET & HOELZER,

2002). Os progressos no tratamento de pacientes com LLA levaram a melhora das

taxas de sobrevida, sendo as crianças as mais beneficiadas. A taxa de cura nos

adultos, com quimioterapia, é de apenas 25% a 40%, por causa do alto risco de

reincidência (POPAT et al., 2003).

Sugeriu-se que cânceres pediátricos resultam de defeitos genéticos

relacionados com o crescimento e desenvolvimento de diferentes órgãos e tecidos,

durante períodos de risco de estresse proliferativo (GREAVES, 1993). Esta sugestão

é baseada na observação de diferentes períodos de risco para tumores pediátricos,

dependendo da idade. O pico de incidência de LLA é entre dois

e cinco anos,

quando células progenitoras de linfócitos B estão proliferando extensivamente e

rearranjando seus genes para imunoglobulinas (GREAVES, 1986).

Diferenças nas características e no prognóstico da LLA em adultos,

comparando-se com crianças, podem resultar do fato de que, na infância, a LLA

acomete células progenitoras linfóides maduras, enquanto que na idade adulta

acomete células-tronco multipotentes “stem cell” (GREAVES, 1993; GREAVES,

1999). Estas células sofrem transformações na LLA e mantêm algumas das suas

características equivalentes às células normais. Os progenitores linfóides

acometidos têm uma capacidade limitada de renovação e são dependentes de

citocinas e de fatores de crescimento para sua proliferação e diferenciação, sendo

mais sensíveis à indução a apoptose, por quimioterapia ou retirada de citocinas. As

células-tronco multipotentes têm uma grande capacidade de renovação e são mais

resistentes à quimioterapia do que os progenitores linfóides. Portanto, o

acometimento de células tronco multipotentes poderia originar um clone leucêmico

mais agressivo (GREAVES, 1993).

Crianças com alterações genéticas, como trissomia do cromossomo 21,

anemia de Fanconi e síndrome de Bloom, têm maior risco de desenvolverem LLA.

Ambas anemia de Fanconi e síndrome de Bloom apresentam defeitos no reparo do

DNA. Pacientes com história precedente de hemopatias malignas, como

hemoglobinúria paroxística noturna, síndrome mielodisplásica, doenças

mieloproliferativas e anemia aplástica apresentam risco aumentado de desenvolver

leucemia aguda. A exposição a substâncias químicas, como benzeno e radiação

ionizante, também aumentam o risco de desenvolver leucemia aguda (VIELE, 2003).

2.1.1 Manifestações clínicas

As manifestações clínicas das leucemias devem-se, diretamente ou

indiretamente, à proliferação de células leucêmicas e à sua infiltração nos tecidos

normais. A elevada proliferação celular tem conseqüências metabólicas, e as células

infiltrantes também causam distúrbios na função dos tecidos (BAIN, 2003). As

manifestações clínicas podem ser divididas em primárias e secundárias. As

manifestações primárias envolvem infiltração da medula óssea pelas células

leucêmicas, impedindo a proliferação de células normais. Como conseqüência estes

pacientes podem apresentar anemia, trombocitopenia e neutropenia. Como

resultado da neutropenia e da plaquetopenia pode-se observar infecções sucessivas

e hemorragias (BAIN, 2003; VIELE, 2003). Fadiga, palidez, sangramentos,

equimoses, febre e suscetibilidade a infecções são sintomas da leucemia aguda

(VIELE, 2003). As manifestações secundárias são indicativas de outros sistemas do

organismo envolvido. Além do sistema nervoso central, outros órgãos podem ser

suscetíveis à infiltração de blastos leucêmicos, como o fígado, o baço e os

linfonodos, causando hepatoesplenomegalia e linfoadenopatia. O sistema nervoso

central (SNC) é o local extramedular mais freqüentemente envolvido. Pacientes com

infiltração no SNC já no diagnóstico, tanto adultos como crianças, requerem

direcionamento adicional do tratamento para o SNC. Uma estratégia comum é a

aplicação de antineoplásicos via intratecal e, em alguns casos, radioterapia

(PLASSCHAERT et al., 2004).

Crianças podem ser mais suscetíveis ao envolvimento do SNC devido a

diferenças na composição da barreira hemato-encefálica. Entretanto, células

leucêmicas de adultos e crianças podem diferir na sua habilidade em infiltrar-se no

SNC, mas até agora isto não foi estudado (PLASSCHAERT et al., 2004).

2.1.2 Classificação FAB, imunofenotipagem, citogenética e diagnóstico

A Classificação Franco-Americana-Britânica (FAB), proposta por um grupo de

colaboração de hematologistas Franceses, Americanos e Britânicos, desde 1976

divide a LLA em três subtipos, L1, L2 e L3, de acordo com a morfologia microscópica

(BENNETT et al., 1976). Os subtipos L1 e L2 podem envolver linfócitos B ou T. O

subtipo L1 é observado mais freqüentemente em crianças (76% a 89%) do que em

adultos (31% a 43%), (BENNETT et al., 1981; LILLEYMAN et al., 1992; KAMPS et

al., 2000), enquanto que o subtipo 2 é observado mais freqüentemente em adultos

(49% a 60% em adultos versus 14% a 22% em crianças), (BENNETT et al., 1981;

LILLEYMAN et al., 1992; KAMPS et al., 2000). O subtipo 3 está associado com LLA

de células-B maduras. É raro, sendo observado mais freqüentemente em adultos do

que em crianças.

O prognóstico nos diferentes subtipos da classificação FAB permanece

obscuro. Em crianças ou adultos, alguns estudos têm mostrado um melhor

prognóstico para pacientes do tipo L1 e uma maior taxa de recaída para pacientes

L2 (MILLER et al., 1981; MANDELLI et al., 1996; KANERVA et al., 1999). Entretanto,

existem controvérsias com outros estudos que não confirmam o mesmo prognóstico

para subtipos L1 e L2 da classificação FAB (DAVEY et al., 1983; DURRANT &

RICHARDS, 1993).

Embora, historicamente, a classificação FAB para LLA tenha sido

amplamente utilizada, seu uso clínico é discutido atualmente. A reprodutibilidade

desta classificação é limitada devido à heterogeneidade dos blastos leucêmicos ao

microscópio ótico e a subjetividade na subclassificação. A eficácia atual da

imunofenotipagem e da citogenética, em combinação com prognósticos duvidosos

dos diferentes subtipos, tem limitado o uso da classificação FAB na conduta clínica

da LLA.

O diagnóstico e a classificação precisos são fundamentais na identificação

exata do tipo de leucemia e na determinação do melhor tratamento para cada

paciente. Com o desenvolvimento de anticorpos monoclonais, a caracterização de

progenitores linfóides normais e leucêmicos pode ser realizada por

imunofenotipagem. A diferenciação de progenitores das linhagens B e T e de células

maduras B e T se caracteriza pela expressão de antígenos específicos durante os

estágios de desenvolvimento. A citogenética identifica variações no cariótipo de

células leucêmicas. O número de cromossomos e as anormalidades cromossômicas

estruturais podem ser identificados e são eficientes indicadores do prognóstico para

escolha da terapêutica.

Com a finalidade de superar as limitações da classificação FAB, e

considerando as características morfológicas, imunofenotípicas e

genética/moleculares dos blastos, em 2001, a Organização Mundial de Saúde

(OMS), em conjunto com a Sociedade de Hematologia Americana e a Associação

Européia de Hematologia, publicou uma nova classificação para neoplasias do

sistema hematopoiético e linfóide. A LLA foi subdividida conforme a marcação

imunofenotípica em linhagem B (Pró-B, Comum, Pré-B e LLA-B) e linhagem T (Pré-T

e LLA-T), (JAFFE et al., 2001). Segundo o Grupo Europeu para a Classificação

Imunológica das Leucemias (EGIL), os blastos da linhagem B expressam antígenos

específicos para anticorpos monoclonais CD19, CD79a e CD22, e os blastos de

linhagem T para o anticorpo CD3. Deve-se observar que o antígeno de

histocompatibilidade de classe 2 (HLA-DR) é expresso, na grande maioria dos

casos, de LLA de linhagem B, independente do grau de maturação da célula, ao

passo que na LLA-T a expressão do HLA-DR está relacionada com um

imunofenótipo mais maduro (SZCZEPANSKI et al., 2003).

Para confirmar o diagnóstico de LLA, a aspiração da medula óssea e a

imunofenotipagem dos blastos do sangue periférico ou da medula óssea são

essenciais. Também é recomendável fazer a análise citogenética, para identificar

subgrupos de importância diagnóstica.

2.1.3 Alterações genéticas

As alterações genéticas que levam a uma transformação leucêmica

geralmente são provocadas por alterações importantes nos cromossomos. O

número de cromossomos no clone leucêmico pode ser subdividido em: alta

hiperdiploidia (com mais de 50 cromossomos), baixa hiperdiploidia (com 47 a 50

cromossomos), pseudodiploidia (46 cromossomos com anormalidades estruturais),

diploidia (46 cromossomos normais) e hipodiploidia (menos que 46 cromossomos).

Clinicamente, hiperploidia com mais de 50 cromossomos está fortemente associada

com um bom prognóstico (PLASSCHAERT et al., 2004).

A translocação Filadélfia t(9;22) ocorre em células leucêmicas de 3% a 5%

das crianças e 15% a 25% dos adultos (PUI & EVANS, 1998). Vários estudos têm

mostrado um aumento na incidência da translocação Filadélfia, com o aumento da

idade. A translocação está associada com um mau prognóstico (SECKER-WALKER

et al., 1991).

Pacientes com translocação t(4;11) têm o pior prognóstico de todas as

alterações cromossômicas conhecidas. Foi observada a incidência em crianças até o

primeiro ano de vida de 70% a 80% (RUBNITZ et al., 1994; PUI et al., 1995),

enquanto que em crianças de até 15 anos de idade a incidência é de 2% e, em

adultos, parece estar próxima de 8%.

A translocação t(12;21) é a alteração genética mais comum observada em

crianças com LLA. Mais de 26% das crianças e 3% a 4% dos adultos com LLA têm

esta alteração (PUI & EVANS, 1998). Considera-se a presença desta translocação

favorável para o prognóstico (RUBNITZ et al., 1997; SEEGER et al., 1998).

Em resumo, as translocações t(4;11) e t(9;22) estão associadas com um

prognóstico desfavorável, enquanto que hiperdiploidia e translocação t(12;21) são

indicadores de bom prognóstico.

2.1.4 Tratamento

Em geral, os protocolos de tratamento são comparáveis entre si. Iniciam com

terapia de indução, usando múltiplos quimioterápicos, seguido das fases de

consolidação e manutenção. Os quimioterápicos utilizados incluem vincristina,

dexametasona, daunorrubicina, doxorrubicina, metotrexato e mercaptopurina. A

profilaxia do sistema nervoso central é necessária para aumentar as taxas de

sobrevida e evitar infiltração no SNC (PLASSCHAERT et al., 2004).

Para crianças, o tratamento profilático consiste em metotrexato intratecal para

os casos de baixo risco, com adicional metotrexato intravenoso para os grupos de

alto risco (PUI, 1995). Em adultos, há poucas terapias direcionadas à profilaxia do

SNC, e a prioridade é ter uma remissão completa e duradoura da medula óssea,

além da prevenção de infiltração no SNC. Os resultados mais favoráveis são obtidos

com altas doses de quimioterapia, combinada com terapia intratecal e irradiação do

SNC. A maioria dos regimes de tratamento em adultos para LLA já inclui altas doses

de quimioterapia para reduzir os riscos de recaída (BENNETT et al., 1981).

Um dos protocolos de maior notoriedade internacional é o desenvolvido pelo

grupo alemão Berlim-Frankfurt-Munique (BFM), (VIANA et al., 1994; SACKMANN-

MURIEL et al., 1999). Esse protocolo utiliza a estratificação dos pacientes conforme

grupos de risco para ocorrência de recidiva. Os pacientes com maior risco são

tratados com quimioterapia intensiva. O tratamento inclui quatro fases: indução de

remissão, consolidação, manutenção e profilaxia do SNC. O principal objetivo do

tratamento é induzir a remissão completa, ou seja, atingir menos de 5% de blastos

na medula óssea e restaurar a hematopoiese normal. Logo após, inicia-se a fase de

consolidação, cujo objetivo é reduzir a doença residual mínima (presença de células

leucêmicas na medula óssea indetectáveis à microscopia ótica, entretanto

detectáveis por citometria de fluxo) e ajustar a intensidade do tratamento, conforme

a estratificação do risco de recidiva. O protocolo BFM utiliza a chamada terapia de

reindução durante a fase de consolidação, que consiste na utilização dos mesmos

fármacos administrados durante a fase de indução. Após esta fase é realizada a

terapia de manutenção, cujo objetivo é a erradicação de células leucêmicas

residuais. Nesta fase, a quimioterapia é menos intensiva. A profilaxia do SNC é

iniciada durante a fase de indução, e inclui radioterapia e quimioterapia (LAKS et al.,

2003).

A maioria das crianças e alguns adultos com LLA podem ser curados com

quimioterapia intensiva. Para aqueles pacientes que sofrem recaída ou não

conseguem remissão completa, o transplante de células-tronco hematopoiéticas

oferece melhores possibilidades de controle da doença, a longo prazo. O risco da

relação transplante/mortalidade precisa ser balanceado com o potencial de cura

apenas pela quimioterapia convencional. O transplante de células-tronco, após a

terapia de indução, é recomendável em pacientes que têm um alto risco de recaída

após a quimioterapia (POPAT et al., 2003).

Os fármacos quimioterápicos provêm benefício terapêutico, mas também

significante toxicidade. A sensibilidade e resistência das células tumorais aos

agentes quimioterápicos dependem da capacidade destes fármacos induzirem a

morte celular.

2.2 Morte celular: apoptose e necrose

A morte celular pode ocorrer por vias distintas, apoptose ou necrose.

Entretanto, os eventos bioquímicos que precedem o fenômeno e que direcionam o

mecanismo de morte celular permanecem obscuros. Segundo HIGUCHI (2004), o

mesmo insulto pode levar à apoptose ou à necrose, dependendo da sua intensidade,

da subpopulação de células envolvidas, das espécies e do genótipo do organismo

envolvido.

A necrose aparece como resultado de uma disfunção celular aguda em

resposta a condições severas de estresse ou depois da exposição a agentes

tóxicos. É um processo relativamente passivo, associado com a rápida depleção de

ATP celular. Morfologicamente, a necrose é caracterizada pelo aumento do volume

celular e ruptura da membrana plasmática, em que todo o conteúdo intracelular

extravasa para o meio intercelular (GORES et al., 1990) (Figura 1). Esta saída do

conteúdo de células mortas para o espaço extracelular pode causar dano ao tecido,

por afetar as células vizinhas ou por atrair células pró-inflamatórias à lesão

(HASLETT, 1992).

Apoptose ou morte celular programada é um processo fisiológico essencial

envolvido no desenvolvimento e homeostasia dos tecidos. É um fenômeno que

apresenta um papel fundamental na embriogênese, homeostasia celular, renovação

de tecidos e regressão de tumores. No sistema imune, tem sido descrito que a

apoptose é crucial na seleção de células T, depleção de células T e de linfócitos B

reativos, remoção de células T efetoras periféricas após o término da resposta

imune, regulação da memória imunológica e regulação da citotoxicidade de células

alvo por células NK (“Natural Killer”) (GUPTA, 2003). Entretanto, a apoptose também

ocorre em várias situações patológicas (CHANDRA et al., 2000; ZIMMERMANN et

al., 2001). O desenvolvimento de tumores malignos resulta da proliferação

desregulada ou de uma inabilidade das células em seguir para morte apoptótica

(HERR & DEBATIN, 2001).

A apoptose foi primeiramente descrita por KERR et al., (1972), e foi definida

pela aparência morfológica das células, incluindo enrugamento da membrana

(“blebbing”), condensação da cromatina, fragmentação nuclear e diminuição do

tamanho celular (Figura 1). As características bioquímicas, associadas com a

apoptose, incluem clivagem do DNA internucleossomal, externalização da

fosfatidilserina (MARTIN et al., 1995) e clivagem proteolítica de substratos

intracelulares (MARTIN & GREEN, 1995). Como resultado das mudanças na

membrana plasmática, as células apoptóticas são rapidamente fagocitadas antes do

extravasamento do conteúdo intracelular e sem indução de uma resposta

inflamatória.

Figura 1: Mecanismos de morte celular: necrose e apoptose.

Fonte: Adaptado do Catálogo BioAgency 2004-05, Cap. 9 - Apoptose e Inflamação. Disponível em:

http://www.bioagency.com.br/informacao/default.asp. Acesso em 22 de dezembro de 2006.

A apoptose é firmemente regulada pela ativação de uma cascata de

aspartato-cisteína proteases (caspases). As caspases são zimogênios solúveis no

citoplasma, no espaço intermembrana mitocondrial e na matriz nuclear de todas as

células (NICHOLSON & THORNBERRY, 1997). Existem duas vias principais que

levam à ativação das caspases. A primeira destas depende da participação da

mitocôndria (receptor-independente) e a segunda envolve interação dos receptores

da superfície celular como Fas ou TNF-R (receptor do fator de necrose tumoral),

chamados de “receptores de morte”, com seus ligantes (CHANDRA et al., 2000;

ZIMMERMANN et al., 2001; GUPTA, 2003). Membros pró e anti-apoptóticos da

família Bcl-2 regulam a via mitocondrial. O estresse celular induz a translocação de

membros pró-apoptóticos da família Bcl-2 do citosol para a mitocôndria, induzindo a

saída do citocromo c, enquanto proteínas anti-apoptóticas da família Bcl-2 trabalham

para prevenir a saída do citocromo c da mitocôndria e preservar a sobrevivência

celular (ZIMMERMANN et al., 2001). Uma vez no citoplasma, o citocromo c catalisa

a oligomerização da protease apoptótica ativadora de fator-1 (Apaf-1), promovendo

a ativação da procaspase-9 (CHANDRA et al., 2000; ZIMMERMANN et al., 2001),

formando um complexo chamado “apoptossoma” (HERR & DEBATIN 2001), o qual

ativa a procaspase-3 (ZIMMERMANN et al., 2001). Apaf-1 contém sítios de ligação

para o citocromo c e ATP (CHANDRA et al., 2000). Alternativamente, a ligação nos

receptores de morte, como o TNF-R e o receptor Fas, causam a ativação da

procaspase-8. A caspase-8 ativada pode ativar diretamente a procaspase-3 ou clivar

a proteína pro-apoptótica Bid, a qual subseqüentemente induz a saída do citocromo

c (ZIMMERMANN et al., 2001), (Figura 2).

Figura 2: As duas principais vias apoptóticas. Na via mitocondrial o estresse celular induz a

translocação de membros da família Bcl-2 pró-apoptóticos do citosol para a mitocôndria, onde

induzem a saída do citocromo c. O citocromo c no citosol promove a ativação do Apaf-1 e da pró-

caspase 9, formando o apoptossoma, o qual ativa a pró-caspase 3, induzindo à apoptose. O

citocromo c e o Smac/DIABLO são liberados da mitocôndria após estímulos apoptóticos. Enquanto o

citocromo c ativa o Apaf-1, o Smac/DIABLO inibe a ligação das caspases as IAPs (Proteínas

Inibidoras da Apoptose). A segunda via é dependente do receptor. A ativação da pró-caspase 8 pela

ligação ao receptor de morte está ilustrada. O Fas-ligante (FasL) asocia-se a FAAD na região

intracelular. Este complexo ativa a pró-caspase 8. A caspase-8 ativada pode ativar diretamente a

procaspase-3 ou clivar a proteína pró-apoptótica Bid, a qual subseqüentemente induz a saída do

citocromo c.

Fonte: Adaptado de HENGARTNER, 2000

Os mecanismos fundamentais dos quimioterápicos, para induzirem a morte

celular, podem ser causando dano ao DNA, aos lipídios componentes da membrana

celular e a proteínas celulares, o que ocasiona um desequilíbrio na homeostasia

Bid ativa

Citocromo c

Substratos apoptóticos

Apoptossoma

celular, comumente designada de estresse celular. Estas mudanças iniciam a

ativação de uma complexa cascata de moléculas sinalizadoras induzidas na

tentativa de retornar ao equilíbrio celular. Como resposta aos danos no DNA

acionam-se a regulação do ciclo celular e os mecanismos de reparo (como a

proteína p53). O tipo e a dose de estresse dentro do contexto celular parecem ditar o

resultado da resposta celular, o qual é convertido a vias complexas para controle do

ciclo celular ou a morte celular. A apoptose parece ser induzida quando o dano

excede a capacidade a mecanismos de reparo (HERR & DEBATIN, 2001).

2.3 Mitocôndria, potencial energético celular e GSH

As mitocôndrias têm um papel central no metabolismo energético. Geram

80% a 90% do ATP necessário para respiração e sobrevivência celular por

fosforilação oxidativa, regulam o fluxo de cálcio e têm um importante papel na

integração de estímulos pró e anti-apoptóticos (DIAS & BAILLY, 2005).

Nos últimos anos, aumentou o entendimento do papel da mitocôndria na

morte celular (KROEMER & REED, 2000; MARTINOU & GREEN, 2001; GREEN &

EVAN, 2002). Numerosos estímulos, incluindo agentes quimioterápicos, radiação

UV, espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, e falta do fator de crescimento

parecem mediar a apoptose via mitocondrial, uma via independente de receptor

(GUPTA, 2003). A mitocôndria é uma organela com dois compartimentos bem

definidos: a matriz, circundada por uma membrana interna, e um espaço

intermembrana, circundado pela membrana externa (Figura 3). A membrana interna

contém várias moléculas, incluindo ATP sintetase e cadeia transportadora de

elétrons. Em condições fisiológicas estas moléculas possibilitam que a cadeia

respiratória crie um gradiente eletroquímico (potencial de membrana). A membrana

externa contém canais voltagem-dependente. O espaço intermembrana contém

citocromo c, algumas pro-caspases, adenilato quinase 2, Smac/Diablo (Segundo

ativador mitocondrial de caspases/Inibidor da ligação das caspases as IAPs) e

fatores de indução da apoptose (AIF). Também estão presentes na mitocôndria,

proteínas inibidoras de apoptose (IAPs). A permeabilização da membrana externa,

conseqüentemente, resulta na saída destas moléculas para o citoplasma. A

permeabilização da membrana interna leva a mudanças no potencial de membrana

mitocondrial. A saída do citocromo c é um dos principais passos na via mitocondrial

da apoptose, está associada com a permeabilização da membrana externa, e

promove a formação do apoptossoma, o qual ativa as capases executoras da

apoptose (GUPTA, 2003).

Figura 3: Mitocôndria

Fonte: Figura adaptada. Disponível em: http://linux.ajusco.upn.mx/fotosintesis/mitocondria.html.

Acesso em 19 dezembro de 2006.

As mitocôndrias são induzidas a liberar o citocromo c em resposta a

quimioterápicos e outros estresses celulares, por abertura de canais na membrana

externa ou por causa do aumento de tamanho e rompimento da organela, que

ocorre pela transição de permeabilidade, após abertura de poros (REED, 1999;

KROEMER & REED, 2000). A família de proteínas Bcl-2 tem um papel central no

controle da via mitocondrial de apoptose. Em humanos, mais de 20 membros desta

família já foram identificados, incluindo proteínas supressoras da apoptose (Bcl-2,

Bcl-xl e outras) e proteínas promotoras da apoptose (Bax, Bak, Bad, Bid, Bim, Bcl-

Xs, entre outras), (HERR & DEBATIN, 2001).

Como a mitocôndria é o principal local a consumir oxigênio na célula, também

é o principal local para gerar espécies reativas de oxigênio (EROs). Embora o

transporte de elétrons normal na mitocôndria envolva a redução de quatro elétrons

do oxigênio molecular para água, reações de redução parciais podem ocorrer,

desequilibrando situações fisiológicas, causando liberação de ânion superóxido e

peróxido de hidrogênio. Condições patológicas, como o estresse oxidativo, podem

levar a danos na função mitocondrial, aumentando a liberação de EROs. Um grande

número de enzimas mitocondriais, incluindo desidrogenases e ATPases

transportadoras, contém grupos sulfidril que devem ser mantidos na forma reduzida

para exercerem a função. Além disso, componentes sensíveis ao estado redox na

cadeia transportadora de elétrons, como íons de ferro no grupo prostático heme,

podem ser oxidados com a perda do balanço redox, produzindo disfunções

mitocondriais (LASH, 2006).

O desequilíbrio entre a produção de espécies reativas de oxigênio e de

nitrogênio e o sistema de defesa antioxidante endógeno é o fator predominante para

causar uma série de mudanças fisiológicas que caracterizam o estresse oxidativo. A

produção destas moléculas reativas é neutralizada pelas defesas antioxidantes,

estabelecendo uma homeostase no metabolismo oxidativo. Porém, em certas

condições patológicas, pode haver um desequilíbrio na homeostase, ocasionando

um excesso de produção de espécies reativas, causando ações deletérias aos

organismos (SIES, 1997).

Para minimizar os efeitos deletérios associados à constante formação de

EROs, oriundas da presença e da utilização do oxigênio nas células e nos tecidos,

os organismos aeróbicos foram dotados, ao longo do tempo evolutivo, de distintas

defesas antioxidantes enzimáticas e não enzimáticas. Dentre as defesas enzimáticas

destacam-se as enzimas catalase, superóxido dismutase, glutationa redutase (GR),

glutationa peroxidase (GPx) e o conjunto das glutationas S-transferases (GSTs). As

glutationas S-transferases, embora não atuem diretamente contra os radicais livres,

são importantes na defesa celular, pois estão associadas a biotransformação de

xenobióticos, como herbicidas, inseticidas e agentes carcinogênicos. Estas enzimas

catalisam a reação de conjugação da glutationa na forma reduzida (GSH) com estes

compostos, aumentando a solubilidade e facilitando a excreção.

Falhas ou danos mitocondriais podem levar rapidamente à inibição da

sobrevivência e da proliferação celular. Fármacos que comprometem a integridade

estrutural e funcional da mitocôndria podem prover novas oportunidades para

combater a proliferação de células neoplásicas. Locais específicos na mitocôndria

podem ser alvos moleculares, tais como: a cadeia respiratória, o DNA mitocondrial,

os canais de potássio, a família de proteínas Bcl-2 e os poros de transição da

permeabilidade (DIAS & BAILLY, 2005).

A glutationa (GSH) é um tripeptídeo, γ-glutamilcisteinilglicina, o principal tiol

não protéico, de baixo peso molecular, presente em todas as células aeróbicas. Sua

importância funcional como antioxidante está na presença do grupo tiol no resíduo

de cisteína (Figura 4).

Figura 4: Estrutura da glutationa

Fonte: Retirado de LASH, 2006.

Os aminoácidos L-glutamina, cisteína e glicina são precursores na síntese da

GSH. A síntese ocorre por uma reação dependente de ATP no citoplasma, e é

catalisada pela γ-glutamil-cisteína-sintetase e pela GSH sintase. A maior parte, se

não toda atividade biossintética, reside no citoplasma, com pouca ou nenhuma

atividade em outras organelas (GRIFFITH & MEISTER, 1985; MCKERNAN et al.,

1991). As mitocôndrias são organelas importantes na manutenção do balanço redox.

O balanço entre as concentrações de glutationa reduzida e oxidada depende do

estado redox da célula, como também da síntese de GSH.

O papel antioxidante da GSH contra compostos oxidantes e eletrofílicos

compreende a oxidação da GSH em glutationa dissulfeto (GSSG). As concentrações

de GSH são restauradas através da reação catalisada pela glutationa redutase (GR)

dependente de NADPH (Fosfato de nicotinamida adenina dinucleotídeo), (SANTOS-

SILVA, et al., 2006). Alterações no status de GSH mitocondrial são associadas com

ativação de vias de sinalização e expressão de genes que regulam a apoptose

L-

-glutamil

L-cisteinil

glicina

(RICHTER et al., 1996; ZAMZAMI et al., 1996; KLUCK et al., 1997; MARCHETTI et

al., 1997; YANG et al., 1997; DAVIS et al., 2001), o crescimento e a diferenciação

celular (HAMMOND et al., 2001; FILOMENI et al., 2002).

O conteúdo de GSH nas células tumorais é relevante nos mecanismos de

regulação mutagênica, na síntese do DNA, no crescimento e para a resistência a

múltiplas drogas (MDR). Nos tumores malignos, a resistência está associada, na

maioria dos casos, com altas concentrações de GSH no interior das células

tumorais. Desta maneira, tentativas de tratamento para o câncer baseado na

modulação de GSH deveriam controlar possíveis mudanças no crescimento,

associadas a GSH e sua síntese nestas células. Apesar do potencial benéfico da

estratégia de depleção seletiva de GSH na terapia do câncer, esta abordagem em

tratamentos ainda permanece indefinida (ESTRELA et al., 2006).

Vários mecanismos têm sido descritos como mediadores da resistência a

fármacos quimioterápicos: a) aqueles que aumentam a taxa de efluxo do fármaco

pela célula, reduzindo a interação do fármaco com seu alvo, e os exemplos são a

glicoproteína-P e proteínas associadas à resistência a múltiplas drogas (MRPs); b)

diminuição da sensibilidade aos fármacos pelo aumento do alvo, superando a dose

do fármaco, ou pela mutação do alvo, tornado deste modo o fármaco inefetivo; c)

aumento dos mecanismos de reparo de DNA e d) processos de detoxificação que

protegem a célula contra o dano. Este último mecanismo pode ser mediado pelo

sistema de detoxificação glutationa/glutationa-S-transferase (GSH/GST). A

conjugação da GSH com o composto, espontaneamente, ou catalisada pela GST,

confere ao composto menos toxicidade contra os alvos celulares, tornando-o mais

hidrofílico e, desta maneira, facilmente excretável (O'BRIEN & TEW, 1996).

2.4 Flavonóides

Os flavonóides constituem um grupo de pigmentos vegetais de ampla

distribuição na natureza. São biossintetizados a partir da via dos fenilpropanóides e

estão presentes em relativa abundância entre os metabólitos secundários. Mais de

4200 flavonóides são conhecidos, os quais são agrupados em diferentes classes de

acordo com suas características químicas e biossintéticas (ZUANAZZI, 2000). Sua

presença nos vegetais parece estar ligada com funções de defesa (proteção contra

raios ultravioleta, ações antifúngicas e antibacterianas) e de atração de polinizadores

(SANTOS, 2000).

Além disso, estes compostos possuem importância farmacológica, que resulta

de algumas propriedades importantes, atribuídas a representantes da classe, como

por exemplo: anticarcinogênicas, antialérgicas, antiulcerogênicas, antivirais, entre

outras (ZUANAZZI, 2000). Muitos estudos têm demonstrado que os flavonóides são

potentes inibidores de enzimas-chaves, que fazem a transdução de sinais celulares.

Eles inibem várias quinases, como a proteína C quinase (PCK), tirosina quinases ou

lipídio quinases (AGULLO et al., 1997). Afetam várias vias metabólicas, como

ativação de enzimas glicolíticas ou síntese de proteínas (LEE et al., 1994);

promovem interrupção do ciclo celular nas fases G

ou G

/M, dependendo da sua

estrutura e do modelo celular (LEPLEY et al., 1996; KANG & LIANG, 1997; LEPLEY

& PELLING, 1997); interagem nos locais de ligação do estrogênio tipo II, regulando o

crescimento de células mamárias (SCAMBIA et al., 1993) e induzem a apoptose em

diferentes linhagens celulares (KUNTZ et al., 1999; WANG et al., 1999).

2.5 Chalconas

As chalconas são consideradas precursoras biossintéticas dos flavonóides.

Uma característica marcante neste grupo é a de apresentar pigmentação amarela,

que passa a vermelha em meio alcalino. Chalconas e auronas são identificadas em

geral nas mesmas plantas, tendo um papel importante em sistemas ecológicos em

função das cores que produzem nos vegetais. As cores estão implicadas na

polinização como atraentes de insetos e/ou pássaros (ZUANAZZI, 2000). Ocorrem

principalmente no pigmento de pétalas. Também são encontradas no cerne, na

casca da árvore, nas folhas, nas frutas e nas raízes, numa variedade de árvores e

plantas (NI et al., 2004).

Quimicamente, apresentam dois anéis aromáticos ligados por três carbonos,

uma carbonila e dois carbonos α-, β-insaturados (Figura 5). Uma classificação

primária das chalconas leva em conta o número de substituintes presentes no núcleo

B, que podem ser um, dois ou três. As chalconas de origem vegetal são sempre

substituídas e, entre as mais comuns, localizadas no núcleo aromático, estão

hidroxilas, metoxilas, O-glicosilas, C-glicosilas e C-alquilas (ZUANAZZI, 2000).

Figura 5: Núcleo fundamental das chalconas.

As chalconas são de grande interesse químico e farmacológico por

apresentarem diversas atividades biológicas, as quais variam conforme os diferentes

substituintes presentes nas moléculas. Vários trabalhos têm demonstrado atividades

biológicas para chalconas isoladas de plantas ou sintetizadas. Dentre as atividades

relatadas estão: atividade antibacteriana (DIMMOCK et al., 1999; NIELSEN et al.,

2004) e bacteriostática (inclusive contra Mycobacterium tuberculosis (PAPPANO et

al., 1985)), atividade antiviral (ISHITSUKA et al., 1982; NINOMIYA et al., 1990;

DIMMOCK et al., 1999), atividade antifúngica (DIMMOCK et al., 1999;

OPLETALOVA & SEDIVY, 1999; LOPEZ et al., 2001; BOECK et al., 2005), atividade

antimalárica (LI et al., 1995; DIMMOCK et al., 1999; RAM et al., 2000; DOMINGUEZ

et al., 2001; LIU et al., 2001; DOMINGUEZ et al., 2005) e atividade antileishmânia

(NIELSEN et al., 1998; DIMMOCK et al., 1999; KAYSER & KIDERLEN, 2001;

BOECK et al., 2006). Ainda são descritos efeitos antioxidante (ANTO et al., 1995;

DIMMOCK et al., 1999; MUKHERJEE et al., 2001), antiinflamatório (BATT et al.,

1993; SOGAWA et al., 1993; HERENCIA et al., 1998; DESHPANDE et al., 1999;

DIMMOCK et al., 1999; HERENCIA et al., 1999; HERENCIA et al., 2002; ROJAS et

al., 2002; KO et al., 2003; MENG et al., 2004; RANI et al., 2004; WON et al., 2005) e

antitumoral (YAMAMOTO et al., 1991; SHIBATA, 1994; ANTO et al., 1995;

DIMMOCK et al., 1999; XIA et al., 2000; MUKHERJEE et al., 2001; NAM et al., 2003;

RAO et al., 2004; TAKAHASHI et al., 2004; WON et al., 2005).

Todas as chalconas com atividade antioxidante têm, no mínimo, um grupo

fenol livre na molécula. A presença de cetonas insaturadas e grupos hidroxila

também é considerada essencial para a atividade antioxidante (DIMMOCK et al.,

1999). Xanthohumol (HARAGUCHI et al., 1998), a principal chalcona encontrada no

lúpulo e na cerveja, mostrou ser um antioxidante mais efetivo na inibição da

oxidação de lipoproteína de baixa densidade (LDL) do que o

-tocoferol (MIRANDA

et al., 2000). LEBEAU et al. (2000) demonstraram que uma chalcona sintética teve

melhor potência antioxidante que a vitamina E ou a quercetina, num sistema de

oxidação da LDL induzido por íons Cu(II).

Várias chalconas têm mostrado inibir estímulos inflamatórios e atenuar a

inflamação. Conforme publicado por NI et al. (2004), o Instituto Statens Serum da

Dinamarca divulgou uma patente com chalconas que inibem potencialmente a

produção de TNF-

(citocina pró-inflamatória), em células mononucleares de sangue

periférico humano, estimuladas por exoantígeno malárico ou por lipopolisacarídeos

bacterianos (LPS). Os Laboratórios Nippon Hypox publicaram uma patente com uma

série de 3,4-dihidroxichalconas como agentes antiinflamatórios. Muitos compostos

desta série mostraram efeito inibitório sobre a ciclooxigenase (COX), (NI et al. 2004).

O dano induzido pela inflamação crônica é uma causa bem conhecida da

carcinogênese de colo de útero. A COX-2, enzima que converte ácido araquidônico

a prostanóides, é conhecida por ter um papel importante na inflamação. Foi relatado

que a chalcona isoliquiritigenina suprime o nível de COX-2, em macrófagos murinos

RAW264.7, e inibe a proliferação celular, via indução da apoptose, em células de

câncer de colo (TAKAHASHI et al., 2004).

Vários trabalhos mostram atividade antitumoral das chalconas em diversos

tipos de cânceres. Dentre eles, alguns descrevem atividade antileucêmica. DUCKI et

al., (1998) sintetizaram uma série de chalconas substituídas e estudaram a atividade

citotóxica contra a linhagem de células de leucemia humana K562 - a chalcona com

mais atividade foi a (E)-3-(3‘’-Hidroxi-4’’-metoxifenil)-2-metil-1-(3’,4’,5’-trimetoxifenil)-

prop-2-en-1-one com IC

de 0,21 nM. KOBORI et al. (1999) mostraram que a

chalcona floretina induziu, a apoptose, células HL-60 de leucemia humana e células

B16-4A5 de melanoma murino. Os autores sugerem que a floretina induziu células

B16 a apoptose, pela inibição do transportador de glicose, pela indução da

expressão da proteína Bax e ativação de caspases. Entretanto, a indução à de

células HL-60 a apoptose, pela floretina, utilizou vias diferentes. Os autores sugerem

que ocorreu através da inibição da atividade da proteína C quinase. Nas células HL-

60, a floretina reduziu os níveis de caspase-3, não alterando os níveis da Bcl-2 e não

aumentando os níveis da Bax.

Nesse sentido, em busca de novas moléculas anticarcinogênicas, que

ofereçam efetividade no tratamento, seletividade contra células tumorais e redução

da intensidade e dos efeitos adversos, realizou-se, neste trabalho, um estudo sobre

a atividade antileucêmica de uma série de dez chalconas derivadas do 3,4

metilenodioxibenzaldeído.

OBJETIVOS

OBJETIVOSOBJETIVOS

OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral:

Estudar a sensibilidade da linhagem de células linfoblásticas leucêmicas

L1210 aos compostos derivados do 3,4-metilenodioxibenzaldeído.

3.2 Objetivos Específicos:

1. Avaliar o efeito citotóxico dos compostos derivados do 3,4-

metilenodioxibenzaldeído (chalconas) sobre linhagem de células linfoblásticas

leucêmicas L1210;

2. Identificar a via pela qual as chalconas causam morte celular, se por apoptose

ou por necrose;

3. Relacionar as concentrações intracelulares de glutationa e a proteção celular

contra os efeitos citotóxicos causados pelas chalconas;

4. Avaliar a influência das chalconas no teor energético das células

(concentração de ATP);

Analisar o efeito das chalconas sobre células não tumorais VERO;

Investigar o efeito sobre o crescimento de células progenitoras grânulo-

monocíticas da medula óssea, em decorrência do tratamento com as

chalconas.

MATERIAIS E

MATERIAIS EMATERIAIS E

MATERIAIS E

MÉTODOS

MÉTODOSMÉTODOS

MÉTODOS

4.1 Reagentes

O meio de cultura Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e o soro fetal

bovino (SFB) foram adquiridos da Cultilab (São Paulo, Brasil). A penicilina e a

estreptomicina foram compradas da Gibco® (Grand Island, NY). O ácido clorídrico, o

isopropanol, o dimetil sulfóxido (DMSO) e o tris(hidroximetil)aminometano foram

adquiridos da Merck® (Darmstat, Alemanha). O ácido etilenodiaminotetraacético

(EDTA) foi adquirido da Reagen (Rio de Janeiro, Brasil). A proteinase K foi adquirida

da Invitrogen® (Alemanha). O brometo de dimetiazol difeniltetrazólio (MTT), o ácido

N-[2-Hidroxietil]piperazina-N’-[2-etanosulfônico] (HEPES), a albumina, o meio de

cultura Dulbecco modificado por Iscove (IMDM), a agarose, a RNase, a glutationa

redutase (GR), o fosfato de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADPH), o ácido

5,5’-ditio-bis-2-nitrobenzóico (DTNB), e outros reagentes utilizados nos experimentos

foram adquiridos da Sigma® (St. Louis, MO, USA). O Kit luciferin-luciferase foi

adquirido da Bioorbit (Tuku, Finland).

4.2 Síntese das chalconas

A síntese das chalconas derivadas do 3,4-metilenodioxibenzaldeído foi

realizada no Departamento de Química da Universidade Federal de Santa Catarina

(UFSC), pelo grupo de pesquisa do Prof. Rosendo Augusto Yunes.

4.2.1 Procedimento geral para a preparação das chalconas derivadas do 3,4

metilenodioxibenzaldeído

Em um balão de 100 mL e uma boca, colocou-se o 3,4-

metilenodioxibenzaldeído (1,50 g; 10 mM), a acetofenona (10 mM) e o metanol (30

mL). Dissolveram-se os reagentes sob agitação magnética e, em seguida, adicionou-

se o KOH 50% v/v (10 mL). Deixou-se a reação sob agitação magnética, à

temperatura ambiente, por 24h. Após este período, adicionou-se água destilada à

reação e acidificou-se a mesma, com ácido clorídrico 10%, o que provocou a

precipitação dos compostos. Filtrou-se em funil de Büchner, verificou-se a pureza

por cromatografia em camada delgada (CCD) e, quando necessário, as chalconas

foram recristalizadas em hexano e diclorometano. Para todos os compostos, foram

realizadas análises de RMN de

H e de

C, espectroscopia no IV e leitura do ponto

de fusão.

4.3 Cultura de células

Foram utilizadas linhagens de células leucêmicas linfoblásticas de origem

murina (L1210) e células não tumorais, fibroblastos de rim de macaco (VERO). As

células L1210 foram obtidas da American Type Culture Cell (ATCC) e as células

VERO da Associação Técnico-Científica Paul Ehrlich (APABCAM, Rio de Janeiro,

Brasil). As células foram mantidas em garrafas plásticas de cultura, contendo meio

DMEM, suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 U/mL de penicilina, 100

µg/mL de estreptomicina, 10 mM HEPES, pH 7.4, em estufa umidificada, a 37

C e

com 5% CO

. Antes da realização de todos os experimentos, o número de células

viáveis foi avaliado pelo método de Azul de Trypan (FRESHNEY, 1987), e a

contagem realizada em câmara de Newbauer.

4.3.1 Tratamento das células

As chalconas sintéticas derivadas do 3,4-metilenodioxibenzaldeído foram

dissolvidas em uma solução de DMSO 10 mM e armazenadas, à temperatura de

4°C a 8°C. Estas soluções-estoque foram diluídas em meio de cultura para atingir as

concentrações de 10 a 200 µM utilizadas nos experimentos. As células foram

incubadas em placas de 24 ou 96 poços, tratadas com os compostos e mantidas em

estufa úmida, a 37

C, com 5% de CO

por um período de 6h a 48h, conforme o

procedimento experimental. As células VERO, que crescem aderidas, foram

incubadas em placas de 96 poços e mantidas a 37

C em estufa com 5% de CO

por

um período de 3h, antes do tratamento com os compostos.

Foram utilizados controles de células sem tratamento e com tratamento de

DMSO diluído em meio de cultura, na mesma proporção utilizada para dissolver os

compostos.

4.4 Ensaio de viabilidade celular (teste do MTT)

A viabilidade celular foi analisada pelo método do MTT (brometo de dimetiazol

difeniltetrazólio), (VAN DE LOOSDRECHT et al., 1991). O MTT é um sal de

tetrazólio de cor amarela, que é reduzido a formazan de cor azulada pela atividade

oxidativa das células, funcionando, portanto, como um indicador da função

mitocondrial e, por conseguinte, da viabilidade celular. Brevemente, 3 x 10

células

L1210 e 7 x 10

células VERO foram incubadas em triplicata com os compostos, em

placas de 96 poços. Depois de decorrido o tempo de incubação, foi retirado e

acrescentado um novo meio de cultura e, então, o MTT (0,25µg/µL) foi adicionado,

seguido de incubação por 3h, a 37°C. O meio de cultura foi retirado, o precipitado

formazan foi dissolvido com uma solução ácida de isopropanol (isopropanol com

HCL 0,04 N) e a absorbância foi medida a 540 nm, com o uso de um leitor de

microplacas (Organon Teknika, Belgium). A densidade óptica obtida do grupo

controle, ou seja, das células sem tratamento, foi considerada como 100% de células

viáveis.

4.5 Análise de apoptose pelo método de fragmentação nuclear

O isolamento de fragmentos apoptóticos do DNA foi realizado seguindo o

método de HAN (1997). As células, 1 x 10

foram incubadas com as chalconas

sintéticas, em placas de 24 poços, na concentração de 100 µM e mantidas por 24

horas, a 37°C, com 5% de CO

em estufa umidificada. As células foram lavadas

duas vezes com PBS gelado e após foram lisadas com tampão de lise (10 mM

EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.25% NP-40, 0.5 mg/mL proteinase K) a 50

C, por

2h. O DNA foi precipitado com 2,5 vol de etanol-NaCl overnight, a -25°C. Após foi

centrifugado a 12.000g, por 30 minutos. O pellet foi lavado duas vezes com etanol

70%, gelado, secado à temperatura ambiente, dissolvido em tampão (10 mM Tris-

HCl pH 8.0, 0,1 mM EDTA), contendo 0,6 g/mL de RNase A e incubado a 37

C, por

1h.

A concentração do DNA extraído de cada amostra foi determinada

espectrofotometricamente (SAMBROOK, J. & RUSSELL, D. W., 2001). As amostras

foram diluídas a 1:100 em água destilada, a absorbância foi medida em 260 nm e a

concentração de DNA calculada pela equação: Concentração DNA (mg/mL) =

(Abs/ε) x diluição. O coeficiente de extinção (ε) foi considerado igual a 20. As bases

nitrogenadas da dupla fita de DNA apresentam uma absorção máxima no

comprimento de onda de 260 nm. Neste comprimento de onda, o coeficiente de

extinção (ε

0,1%;1cm

) igual a 20 indica que o DNA, em uma concentração de 1 mg/mL,

terá uma absorbância (A

260nm

) igual a 20. A relação entre a concentração do DNA e

a absorbância (A

260nm

)

é linear até o valor de 2,0.

A fragmentação do DNA foi analisada por eletroforese em gel de agarose a

1%, corado com 1 µL de brometo de etídio (1g/100mL). A corrrida foi realizada a

200V, por 10 minutos, em tampão TAE (Tris - ácido acético – EDTA). Foram

aplicados 2 µg de DNA de cada amostra. Os géis foram fotografados sob iluminação

ultravioleta de 320nm (Hoefer-MacroVue UV-20), utilizando-se um sistema de

fotodocumentação de géis (Doc-Print®).

4.6 Análise de apoptose e viabilidade celular pelo método de fluorescência

com laranja de acridina e brometo de etídio

Inicialmente, 3 x 10

células foram tratadas com as chalconas estudadas e

mantidas por 24h, a 37°C, com 5% de CO

em estufa umidificada. Após o tempo de

incubação, as células foram concentradas por centrifugação, o meio de cultura com

as chalconas foi descartado, o pellet celular resuspenso com PBS contendo laranja

de acridina e brometo de etídio, nas concentrações de 10 e 5 µg/mL,

respectivamente, seguido de incubação por um minuto, à temperatura ambiente. As

células, então, foram observadas em microscópio de fluorescência entre lâmina e

lamínula no aumento de 40X para contagem. Para fotografar as células foi utilizado

o aumento de 100X. Células não-apoptóticas e apoptóticas foram contadas em

quatro campos, até um total de 100 células. O resultado foi obtido em percentual.

4.7 Determinação das curvas de tempo-resposta e concentração-resposta

Para determinação da curva de tempo-resposta, 3 x 10

células foram

incubadas com as chalconas na concentração de 100 µM, em estufa umidificada a

C, com 5% de CO

, por 6h, 12h, 18h e 24h. Após cada período de incubação, foi

realizada a análise da viabilidade celular pelo método do MTT.

Para determinação da curva de concentração-resposta, 3 x 10

células foram

incubadas com as chalconas sintéticas em concentrações crescentes (0, 10, 25, 50,

75, 100, 150 e 200 µM), em estufa umidificada, a 37

C, com 5% de CO

seguido

pelo método do MTT, após 24h. Além disso, após 48 horas, outra curva de

concentração resposta foi realizada com incubação de 1 x 10

células, com os

compostos em concentrações crescentes (0, 10, 20, 30 e 50 µM), em estufa

umidificada, a 37

C, com 5% CO

seguido do ensaio do MTT.

A IC

, concentração que inibe 50% do crescimento celular, foi calculada em

24 e 48 horas, através da equação de Hill (curva Sigmoidal de concentração-

resposta).

4.8 Determinação da concentração de glutationa total

A glutationa total (GSH + GSS) foi quantificada empregando-se o método da

glutationa redutase, proposto por TIETZE (1969). Nesse método, os grupamentos

sulfidrilas da GSH interagem com o DTNB, originando a GSTNB (forma oxidada de

GSH), que, na presença da glutationa redutase e de NADPH, é reduzida novamente

à GSH. Concomitantemente à formação de GSTNB e GSH, há liberação de ácido 5-

tio-2-nitrobenzóico (TNB), um composto de coloração amarela. Sendo assim, a

intensidade de cor produzida pelo TNB é diretamente proporcional à atividade da

glutationa redutase sobre a GSTNB e GSH intracelular. Brevemente, 1 x 10

células

foram tratadas com compostos na concentração de 100 µM e incubadas durante

24h. Em seguida, foram lavadas três vezes com PBS, resuspensas em 100 µL de

EDTA 1 mM e submetidas a ultra-som por 10 segundos. Vinte µL de cada

homogenato foram transferidos para placas de 96 poços, seguido da adição de 180

µL da solução de reação (DTNB 75 µM; NADPH 120 µM, glutationa redutase 1 U/mL

e EDTA 10 mM em tampão fosfato 100 mM, pH 7.4). A absorbância foi medida após

15 minutos a 412 nm, com um leitor de microplacas (Organon Teknika). Os valores

foram expressos em percentual em relação ao controle.

4.9 Determinação da concentração de ATP (Luciferin – luciferase)

O método luciferin/luciferase é muito utilizado na determinação da

concentração de ATP em amostras biológicas. Foi inicialmente desenvolvido por

STREHLER & TOTTER (1954), e adaptado por FROMME et al. (1987). O primeiro

passo da reação consiste na ativação da enzima luciferase pela ligação no ATP, na

presença de MgCl

. O ATP é hidrolisado a AMP que permanece ligado à luciferin e

ao pirofosfato (PPi). Este complexo reage subseqüentemente com O

, resultando na

emissão de um feixe de luz (hv), na liberação de AMP, CO

e oxiluciferin (DELUCA,

1976). A quantidade de luz emitida é naturalmente proporcional à quantidade inicial

de ATP existente no meio de reação, o qual foi medido da seguinte forma: Em uma

cubeta de plástico adicionou-se o tampão luciferin/luciferase. Em seguida adicionou-

se, ao tampão, a solução contendo luciferin/luciferase, misturou-se cuidadosamente.

A cubeta foi colocada no luminômetro para a medida do sinal de fundo, o qual foi

medido através de um registrador previamente calibrado. Tendo o sinal de fundo

registrado, a amostra foi adicionada e então foi realizada uma segunda leitura, na

qual o sinal da amostra foi adicionado ao sinal do fundo e registrado. A terceira

adição foi da solução padrão de ATP, com concentração conhecida, que foi

registrada e somada às leituras anteriores. A concentração de ATP foi calculada com

a utilização de um programa de computador LUMI (FROMME et al., 1987).

4.10 Ensaio de células progenitoras grânulo-monocíticas (Ensaio GM-CFC)

O ensaio GM-CFC foi realizado no Laboratório de Citologia Clínica do

Departamento de Análises Clínicas da Universidade Federal de Santa Catarina

(UFSC) e coordenado pela Prof.ª Cidônia de Lourdes Vituri. O procedimento foi

realizado de acordo com o método descrito por TESTA & MOLINEUS (1993),

modificado e validado pela European Centre for the Validation of Alternative Methods

(ECVAM), em 1995 (BALLS et al., 1995). A cultura em meio semi-sólido foi

constituída de duas camadas distintas: camada base e camada de células (Tabela

1).

Tabela 1. Constituintes das camadas de cultura em meio semi-sólido/placa.

Camada Base

(%)

Camada de Células

(%)

IMDM com 1 % albumina bovina 40% 20%

SFB 20% 30%

rmGM-CSF (100ng/mL) - 10%

Suspensão celular (10

/mL) - 10%

Ágar 1,25% 40% 30%

IMDM: Meio Dulbecco modificado por Iscove

SFB: Soro fetal bovino

rmGM-CSF: Fator estimulador de colônias de macrófagos e granulócitos (rm – recombinate)

A camada base foi preparada contendo 40% de meio IMDM duas vezes

concentrado, 20% de soro fetal bovino e 40% de ágar, a 1,25%. Com auxílio de uma

pipeta tipo Pasteur, a mistura foi rapidamente homogeneizada e distribuída em

placas de Petri de 35 mm de diâmetro, em volume de 1 mL, conferindo uma

concentração final de 0,5% de ágar. As placas foram mantidas a 4°C, por 10

minutos, para consolidar o gel.

A camada de células foi preparada contendo IMDM, acrescido de 1% de

albumina bovina duas vezes concentrada, 30% de soro fetal bovino, 10% de rmGM-

CSF (fator estimulante de colônia de granulócito-macrófago), em concentração de

100 ng/mL, e 10% de uma solução contendo 10

células/mL de células

hematopoiéticas nucleadas, retiradas da medula óssea do fêmur de camundongos.

Acrescentou-se ágar a 1,25% na camada de células, para se chegar à concentração

final de 0,38%. Após a mistura ser rapidamente homogeneizada, alíquotas de 10

células/placa foram semeadas em triplicata, nas placas de Petri, sobre a camada

base previamente consolidada. As placas foram mantidas a 4°C, por 5 minutos, para

consolidar o gel e incubadas a 36,8°C em atmosfera contendo 5% de CO

durante

sete dias. Após fixação em vapor de formol 10%, overnight, o número de colônias foi

avaliado através de contagem em microscópio invertido. Para identificação das

células presentes nas colônias, o meio semi-sólido foi removido das placas de Petri

em banho de água gelada e transferido para lâminas de microscopia, as quais foram

secas à temperatura ambiente. Posteriormente foram fixadas, sob imersão, em

corante May-Grünwald por três minutos e lavadas em água corrente. As lâminas

foram, então, imersas em corante Giemsa diluído 1:20 em tampão de Sorensen pH

6,8, por 15 minutos. Depois de lavadas em água corrente, as lâminas foram secas à

temperatura ambiente e as colônias observadas sob microscopia óptica

convencional.

4.11 Análise estatística

Os resultados foram expressos como a média

erro-padrão da média (EPM).

Cada experimento foi repetido pelo menos três vezes. Para a análise estatística, foi

utilizada a análise de variância de uma via (ANOVA), seguida do teste t de

Bonferroni. Para comparação da viabilidade celular entre as linhagens L1210 e

VERO foi utilizado o teste t Student. Um valor de P < 0,05 foi considerado

estatisticamente significativo.

4.12 Desenho experimental

Foi estudado o efeito citotóxico de todos compostos, por meio do ensaio de

viabilidade celular (Teste do MTT). Os compostos que apresentaram citotoxicidade

estatisticamente significativa foram avaliados quanto à forma de morte celular, pela

técnica de fragmentação nuclear e pela técnica de fluorescência com laranja de

acridina e brometo de etídio. Para os compostos que induziram à morte celular por

apoptose, foi avaliada a possibilidade da indução de depleção de glutationa e de

ATP intracelulares. A toxicidade em células não tumorais (linhagem VERO) e a

inibição do crescimento de células progenitoras grânulo-monocíticas da medula

óssea também foram verificadas (Figura 6).

Figura 6: Desenho Experimental

Chalconas

Efeito sobre células leucêmicas L1210

Citotóxicas

Não Citotóxicas *

(* foram desconsideradas)

Avaliação da morte celular

(morfologia celular e fragmentação do DNA)

Necrose*

(*nenhum dos compostos estudados

causou morte por necrose)

Apoptose

Avaliação

Efeito sobre o crescimento de

células progenitoras da

medula óssea

Concentrações intracelulares

de GSH

Concentração de ATP

Tempo e Concentração

resposta (IC

)

Efeito sobre células não

tumorais (VERO)

RESULTADOS E

RESULTADOS ERESULTADOS E

RESULTADOS E

DISCUSSÃO

DISCUSSÃODISCUSSÃO

DISCUSSÃO

5.1 Síntese

O mecanismo de ação na formação das chalconas foi o da condensação

aldólica, seguida de desidratação básica (Figuras 7 e 8). Primeiramente, ocorreu a

etapa de deprotonação, em que a base removeu um hidrogênio alfa ácido da

molécula de cetona, para formar o íon enolato, estabilizado por ressonância. Através

de ataque nucleofílico, o íon enolato atacou uma molécula de aldeído (na posição

alfa ao grupo carbonila eletrofílico), formando um íon alcóxido (intermediário

tetraédrico). A protonação do íon alcóxido gerou o produto de condensação e

regenerou o catalisador básico (Figura 7).

Figura 7: Etapas de deprotonação e ataque nucleofílico para formação do produto de

condensação.

Fonte: CHIARADIA, 2006.

A formação da enona conjugada ocorreu por desidratação, que pode ser

catalisada por base ou por ácido. Neste caso, em condições básicas, um hidrogênio

ácido foi abstraído da posição alfa para resultar em um íon enolato, que eliminou o

grupo de saída –OH, formando a chalcona (Figura 8). Em condições ácidas, seria

formado o enol, o grupo –OH seria protonado e a água, eliminada.

Figura 8: Etapa de desidratação para obtenção da chalcona.

Fonte: CHIARADIA, 2006.

Foram sintetizadas dez chalconas a partir da condensação aldólica entre o

3,4-metilenodioxibenzaldeído (1) e diferentes acetofenonas, utilizando hidróxido de

potássio como base e metanol como solvente, à temperatura ambiente por 24h,

como apresentado na figura 9. Oito compostos já foram descritos na literatura (2, 3,

4, 5, 6, 8, 9, 11), (ARIYAN & SUSCHITZKY, 1961; SCHWARTZ et al., 1977;

WATTANASIN & MURPHY, 1980; LI et al., 2002; PATHAK et al., 2003; POTTER &

BUTLER, 2003) e dois são inéditos (7, 10).

O O

2 R: H

3 R: 4'-Br

4 R: 4'-NO

5 R: 2',5'-OCH

6 R: 2'-OH

7 R: 3'-OCH

-4'-OH*

8 R: 4'-OCH

9 R: 3',4'-OCH

10 R: 3'-NO

11 R: 3',4',5'-OCH

Figura 9: Síntese de chalconas derivadas do 3,4-metilenodioxibenzaldeído (1).

a) KOH 50% v/v, metanol, t.a., 24 h (*novos compostos).

5.2 Determinação da atividade citotóxica através da viabilidade celular

A síntese de chalconas para atividade citotóxica parece ser um campo pouco

explorado, ainda. Os mecanismos de toxicidade contra várias linhagens celulares

tumorais humanas ainda é obscuro. Neste sentido, a identificação de novos

análogos de chalconas pode ser importante para continuar o desenvolvimento desta

classe de compostos como agentes antitumorais.

Foi realizado um estudo com todas as chalconas sintetizadas (Figura 9), nas

concentrações 1, 10 e 100 µM, para investigar a sensibilidade das células L1210.

Verificou-se que as concentrações de 1 e 10 µM não apresentaram efeito sobre a

viabilidade celular (dados não mostrados). Portanto, a concentração de 100 µM foi

escolhida para realizar uma triagem das chalconas que viessem apresentar atividade

citotóxica.

Os resultados de viabilidade celular dos controles, ou seja, células

submetidas ao tratamento de DMSO nas mesmas concentrações utilizadas para

dissolver os compostos não mostraram diferença significativa comparando-se com

os resultados obtidos com as células sem tratamento (dados não mostrados). Por

conseguinte, em todos os gráficos estão representados somente como controles.

Os compostos que apresentaram efeito citotóxico pronunciado foram os de

número 5, 7 e 11, diminuindo a viabilidade celular em 90,5 ± 1,2%, 87,1 ± 1,1% e

86,3 ± 2,2%, respectivamente, pelo teste do MTT. A chalcona 2 reduziu a viabilidade

celular somente em 28,6 ± 2,7%, quando comparada ao controle. Entretanto, a

morte celular foi estatisticamente significativa. As chalconas 3, 4, 6, 8 e 9 não

mostraram efeito citotóxico significativo e a chalcona 10 não apresentou

citotoxicidade (Figura 10).

0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

100

***

Chalconas (100µ

µµ

µM)

Células vivas (%)

(2)

OCH

(5)

(7)

OCH

(11)

Figura 10: Efeito citotóxico das chalconas sobre células L1210. As células foram incubadas com

as chalconas, por 24h. A viabilidade celular foi avaliada pelo método do MTT. A densidade óptica do

grupo controle (0, células sem tratamento) foi considerada como 100% de viabilidade celular. Cada

ponto representa a média ± E.P.M. Um valor de *P<0,05 e ***P<0,001 foi considerado

estatisticamente significativo quando comparado com o controle, usando ANOVA seguido de teste t

de Bonferroni. Estruturas químicas das chalconas: (2), (5), (7) e (11).

Os grupos Br e NO

diminuem a densidade eletrônica no anel A, diminuindo a

citotoxicidade. Estes grupos estão presentes nas chalconas 3, 4 e 10. NAM et al.

(2003) sintetizaram e testaram a toxicidade de uma série 2’,5’-dihidroxichalconas

contra células tumorais e células endoteliais venosas umbilicais humanas (HUVEC),

mostrando que as chalconas com substituintes, que retiram elétrons do anel B,

apresentam potente atividade citotóxica em várias linhagens tumorais, enquanto que

os compostos com grupos que doam elétrons para o anel foram menos potentes, de

uma forma geral. Já neste trabalho está sendo mostrado que modificações que

provocam o aumento da densidade eletrônica no anel A, aparentemente, resultam

em maior citotoxicidade dos compostos. Observamos que os grupos metóxi que

aumentam a densidade eletrônica no anel A, e estão presentes nos compostos 5, 7

e 11, parecem aumentar sua citotoxicidade. Entretanto, a chalcona 9, que possui

dois grupos metóxi ligados ao anel A, não apresentou atividade citotóxica

significativa. As chalconas 5 e 9 possuem dois grupos metóxi ligados ao anel A. No

entanto, na chalcona 5 os grupos metóxi estão em posição para e na chalcona 9 em

posição orto entre si. A chalcona 7 possui um grupo metóxi e um grupo hidroxila

ligado ao anel A, em posição orto entre si, e a chalcona 11 possui três grupos metóxi

nas posições 3’, 4’ e 5’. O resultado obtido com a chalcona 7, vem de acordo com as

observações de DIMMOCK et al. (1998), em que a introdução de grupos hidroxila na

estrutura das chalconas aumenta o efeito citotóxico. LEBLANC et al. (2005)

compararam o efeito da substituição no anel A de estruturas relacionadas com

chalconas e mostraram que os compostos contendo três grupos metóxi, geralmente,

são mais ativos contra as linhagens celulares L1210 e B16, quando comparados

com os compostos com dois grupos metóxi. Comparando com nossos resultados,

com exceção da chalcona 9, os compostos com dois ou três grupos metóxi, ligados

ao anel A (chalconas 5 e 11), apresentaram atividade citotóxica semelhante.

NAKATANI et al. (2005) mostraram que as toxicidades da uvaretina e da

diuvaretina (Dihidroxichalconas C-benziladas isoladas da raiz da planta Uvaria

acuminata) foram mais intensas do que a da isovauretina. Os autores sugerem que a

substituição 5’ pelo grupo 2-hidroxibenzil aumentou a citotoxicidade. Nossos

resultados sugerem que a substituição na mesma posição, pelo grupo metóxi,

aumentou a citotoxicidade das chalconas. O grupo metóxi na posição 5’ do anel A,

presente na chalcona 5, e na posição 3’, nas chalconas 7 e 11, estão estericamente

na mesma posição.

A chalcona 11, chamada por SALE et al. (2006) DMU-135, foi testada por

estes pesquisadores, tendo sido adicionada na dieta de camundongos (0,2%).

Nestas condições, o composto não apresentou efeitos sistêmicos. Ao contrário,

reduziu a multiplicidade do adenoma gastrointestinal em 46 ± 18,3%, quando

comparado com os controles.

Vários mecanismos de ação foram propostos para a atividade antitumoral das

chalconas, como inibição da angiogênese (NAM et al., 2003), indução do

desacoplamento mitocontrial, colapso da membrana mitocondrial (SABZEVARI et al.,

2004) e interrupção do ciclo celular (DUCKI et al., 1998; LAWRENCE et al., 2000;

FU et al., 2004; WON et al., 2005). As chalconas também apresentaram atividade

antimitótica, ligando-se no sítio de ligação da colchicina à tubulina, provocando a

inibição da polimerização da tubulina e interrupção da mitose (EDWARDS et al.,

1990; DUCKI et al., 1998). A associação de chalconas metoxiladas com atividade

antimitótica também foi descrita na literatura, em parte pela observação de que

inibidores conhecidos da polimerização da tubulina, como a combretastatina A e a

colchicina, apresentam vários grupos metóxi na estrutura (EDWARDS et al., 1990;

DUCKI et al., 1998; LAWRENCE et al., 2000; LEBLANC et al., 2005).

Com base na atividade citotóxica, escolhemos as chalconas 5, 7 e 11 para

dar continuidade à pesquisa. A chalcona 2 também foi usada para comparação, já

que possui a estrutura mais simples, sem nenhum substituinte ligado ao anel A.

5.3 Análise da apoptose por fragmentação do DNA

O desenvolvimento de novos compostos, para o tratamento de leucemias e

tumores malignos, é baseado na capacidade destes compostos de inibirem a

proliferação celular e induzirem à apoptose (HERR & DEBATIN, 2001). Na apoptose,

em contraste com a necrose, ocorre a ativação de uma cascata de eventos, os quais

resultam na destruição da célula, sem causar reação inflamatória (FRIEDLANDER,

2003). Algumas mudanças celulares que ocorrem durante a apoptose são a

condensação da cromatina, a fragmentação nuclear (KERR et al., 1972), a clivagem

do DNA internucleossomal e a externalização da fosfatidilserina (MARTIN & GREEN,

1995). A degradação do DNA durante a apoptose é regulada e inicia com a

formação de fragmentos maiores, de 300 a 50 Kilobases (Kb) (OBERHAMMER et

al., 1993; WALKER et al., 1999). Quando a endonuclease ataca as regiões de

ligação entre as duas fitas de DNA, ocorre a clivagem internucleossomal, que resulta

na formação de fragmentos de 180 a 200 pares de base e seus múltiplos. Na

eletroforese em gel de agarose, corada com brometo de etídio, estes fragmentos

apresentam um padrão de bandas característico quando visualizados em luz UV. Em

contraste, os eventos de clivagem do DNA na necrose são randômicos e mostram

degradação das histonas, produzindo uma mancha difusa na eletroforese de DNA.

Os fragmentos de DNA necrótico são maiores, e significantemente em menor

número do que os fragmentos do DNA apoptótico (ALLEN et al., 1997). Através da

eletroforese em gel de agarose verificamos que as chalconas 5, 7 e 11 causaram

fragmentação do DNA nas células leucêmicas L1210, com padrão de bandas

característico de apoptose (Figura 11). A chalcona 2 também causa morte por

apoptose. Entretanto, na foto, a banda C2 ficou pouco visível, provavelmente por

conter pouco DNA fragmentado, em virtude de causar apenas 28,6 ± 2,7% de morte.

Para análise da apoptose em gel de agarose, foi utilizada a concentração de 100

µM, por ser a concentração que causa maior morte celular e, conseqüentemente,

maior fragmentação do DNA.

C- C2 C5 C7 C11

Figura 11: Fragmentação do DNA induzida por chalconas em células L1210. As células foram

incubadas com os compostos na concentração de 100µM, por 24h (C - controle negativo, células sem

tratamento; C2, C5, C7 e C11 chalconas 2, 5, 7 e 11, respectivamente). Os extratos nucleares foram

obtidos e a fragmentação do DNA foi analisada por eletroforese em gel de agarose 1,0%, corado pelo

brometo de etídio, como descrito nos materiais e métodos.

5.4 Análise da apoptose e viabilidade celular por fluorescência

A apoptose também foi analisada pelo método de fluorescência com laranja

de acridina e brometo de etídio. O método consiste na ligação do laranja de acridina

ao DNA e RNA, que cora o núcleo, mesmo quando a membrana encontra-se intacta

ou danificada, emitindo uma coloração verde-fluorescente. O brometo de etídio liga-

se ao DNA, corando o núcleo somente se a membrana estiver danificada, emitindo

uma coloração vermelha-fluorescente que predomina sobre o laranja de acridina.

Células normais apresentam uma coloração verde-brilhante uniforme do núcleo e

coloração laranja do citoplasma (Figura 12 – Painel A), (LEITE et al., 1999). As

células L1210 são linfoblastos murinos e apresentam pouca quantidade de

citoplasma. Nas células apoptóticas precoces, o núcleo é corado em verde.

Entretanto, a condensação da cromatina é visível pela forma de manchas verde-

brilhantes (Figura 12 – setas brancas painéis B, C e D). Células apoptóticas tardias

apresentam a cromatina condensada no núcleo, com coloração laranja (Figura 12 –

setas vermelhas painíes B e D). Células necróticas apresentam o núcleo com uma

coloração laranja-brilhante uniforme (LEITE et al., 1999).

Figura 12: Células normais e apoptóticas coradas com laranja de acridina e brometo de etídio.

Células L1210 foram incubadas com os compostos (50 µM) por 24h. Foram observadas ao

microscópio de fluorescência (aumento 1000X): A - controle (células sem tratamento); B - chalcona 5;

C - chalcona 7; D - chalcona 11. Obs.: as setas brancas nos painéis B, C e D indicam as células

apoptóticas precoces; as setas vermelhas nos painéis B e D indicam as células apoptóticas tardias.

Na análise da apoptose por flurorescência foi utilizada a concentração de 50

µM, pois a maior concentração (100 µM) causa morte celular muito acentuada,

dificultando a visualização das células.

Enquanto uma grande quantidade de dados indica que fármacos citotóxicos

induzem e ativam componentes da via de apoptose, em resposta ao estresse

celular, um grande número de questões-chave ainda está aberto e não resolvido.

Por exemplo, o ponto de vista de que a apoptose representa o principal mecanismo

pelo qual as células tumorais morrem pode não ser uma verdade universal

(SCHMITT et al., 2000). Células com dano no DNA, suficiente para tornar incapaz a

proliferação, podem morrer por causa de uma falha mitótica, a qual não é detectada

na análise da apoptose. Elementos-chave na via de morte celular são ligados a

outros sistemas complexos de sinalização, como resposta ao dano ao DNA e

controle do ciclo celular (LAKIN & JACKSON, 1999; VOUSDEN, 2000).

As análises in vitro têm demonstrado convincentemente que a desregulação

na expressão de moléculas mediadoras da apoptose pode conferir resistência a uma

diversidade de fármacos (KAUFMANN & EARNSHAW, 2000; ZHANG et al., 2000).

A viabilidade celular também foi avaliada pelo método de fluorescência com

laranja de acridina e brometo de etídio (Figura 13). Pelo método de fluorescência,

foram analisadas as concentrações de 10, 25, 50 e 100 µM.

0 10 25 50 100

100

Chalcona 2

Chalcona 5

Chalcona 7

Chalcona 11

Chalconas (µ

µµ

µM)

Células Vivas (%)

(2)

OCH

(5)

(7)

OCH

(11)

Figura 13: Viabilidade das chalconas sobre células L1210 por fluorescência. Células foram

incubadas com as chalconas (10, 25, 50 e 100 µM) por 24h. A viabilidade celular foi analisada por

microscopia de fluorescência. A densidade óptica do grupo controle (0, células sem tratamento) foi

considerada como 100% de viabilidade celular. Cada ponto representa a média ± E.P.M. Um valor de

P < 0,001 foi considerado estatisticamente significativo, quando comparado com o controle, usando

ANOVA, seguido de teste t de Bonferroni. Estruturas químicas das chalconas: (2), (5), (7) e (11).

5.5 Tempo resposta

Foi estudado o efeito citotóxico das chalconas 5, 7 e 11 em relação ao tempo.

A toxicidade foi analisada nos tempos de 6, 12, 18 e 24 horas, comparando-se com

a chalcona 2, que não foi tão efetiva para causar morte nas células leucêmicas

quanto às outras chalconas selecionadas, e é a estrutura mais simples (Figura 14).

Em 18h de incubação, na concentração de 100 µM, as chalconas 5, 7 e 11

começaram a induzir significativamente a morte celular. Como esperado, a chalcona

2, em 18h, não causou efeito citotóxico significativo. Apenas o composto 7 diminuiu

a viabilidade celular de forma significativa em 12h e os compostos 5, 7 e 11

causaram alta citotoxicidade em 24h como mostrado nas figuras 10 e 14.

0 6 12 18 24

100

Chalcona 2

Chalcona 5

Chalcona 7

Chalcona 11

Tempo (h)

Células Vivas (%)

***

(2)

OCH

(5)

(7)

OCH

(11)

Figura 14: Tempo resposta da atividade das chalconas sobre células L1210. As células foram

incubadas com os compostos (100 µM) por 6, 12, 18 e 24 horas. A viabilidade celular foi avaliada pelo

método do MTT. A densidade óptica do grupo controle (0, células sem tratamento) foi considerada

como 100% de viabilidade celular. Cada ponto representa a média ± E.P.M. Um valor de *P < 0,05 e

***P < 0,001 foi considerado estatisticamente significativo, quando comparado com o controle, usando

ANOVA, seguido de teste t de Bonferroni. Estruturas químicas das chalconas: (2), (5), (7) e (11).

5.6 Concentração resposta

A influência do aumento da concentração dos compostos na toxicidade, nos

tempos de 24 e 48 horas de incubação, foi analisada e os resultados são mostrados

nas figuras 15 e 16. As chalconas 2, 5, 7 e 11 causaram morte celular de forma

concentração-dependente (Figura 15). Os valores de IC

dos compostos 2, 5, 7 e

11, em 24h, foram 164, 45, 63, e 64 µM, respectivamente. A chalcona 5 apresentou

o menor valor de IC

, em 24h, e a chalcona 2 o valor mais elevado.

0 25 50 75 100 125 150 175 200

100

Células Vivas (%)

Chalconas (

µµ

C2 = IC

= 164

C5 = IC

= 45

C7 = IC

= 63

C11 = IC

= 64

(2)

OCH

(5)

(7)

OCH

(11)

Figura 15: Concentração resposta da atividade das chalconas sobre células L1210 em 24h.

Células, 3 x 10

, células foram incubadas com as chalconas (10 µM - 200 µM). A viabilidade celular

foi avaliada pelo método do MTT. A densidade óptica do grupo controle (0, células sem tratamento)

foi considerada como 100% de viabilidade celular. Cada ponto representa a média ± E.P.M. Um valor

de *P < 0,05, **P < 0,01 e

P < 0,001 foi considerado estatisticamente significativo, quando

comparado com o controle, usando ANOVA, seguido de teste t de Bonferroni.

Em 48h de incubação (Figura 16), concentrações menores foram utilizadas,

considerando que o tempo de exposição das células aos compostos foi maior. As

chalconas 5, 7 e 11 mostraram valores de IC

de 22, 38 e 37 µM, respectivamente.

Não foi possível determinar a IC

da chalcona 2, em 48h, pois esta chalcona

apresentou pouca citotoxicidade e a concentração máxima testada nesta condição

foi de 50 µM. Os compostos 5, 7 e 11 diminuíram aproximadamente à metade o

valor da IC

quando analisados em 48h.

0 10 20 30 40 50

100

Células Vivas (%)

Chalconas (

µµ

C 2 = IC

> 50

C 5 = IC

= 22

C 7 = IC

= 38

C11 = IC

= 37

(2)

OCH

(5)

(7)

OCH

(11)

Figura 16: Concentração resposta da atividade das chalconas sobre células L1210 em 48h. As

células, 1 x 10

, foram incubadas com as chalconas (10, 20, 30 e 50 µM). A viabilidade celular foi

avaliada pelo método do MTT. A densidade óptica do grupo controle (0, células sem tratamento) foi

considerada como 100% de viabilidade celular. Cada ponto representa a média ± E.P.M. Um valor de

**P < 0,01 e

P < 0,001 foi considerado estatisticamente significativo, quando comparado com o

controle, usando ANOVA, seguido de teste t de Bonferroni.

Abaixo, na tabela 2, encontra-se a comparação da viabilidade celular

realizada em concentração resposta pelos métodos do MTT e fluorescência.

Ocorreram variações entre os dois métodos. No entanto, estas variações não

alteraram o comportamento dos compostos. Em ambos os métodos, a morte celular

ocorreu de maneira concentração-dependente.

Tabela 2: Comparação da viabilidade celular pelos métodos de microscopia de

fluorescência (MF) com laranja de acridina e brometo de etídio e teste do MTT.

Chalcona 2 Chalcona 5 Chalcona 7 Chalcona 11 Concentração

(µM) MF

(%)

MTT

(%)

MTT

(%)

MTT

(%)

MTT

(%)

0 100 100 100 100 100 100 100 100

10 97 98 96 87 97 90 97 101

25 90 96 78 83 93 93 85 92

50 90 93 17 36 91 70 75 66

100 86 71 7 9 3 12 6 13

* Células L1210 foram incubadas com as chalconas por 24h.

5.7 Concentração de glutationa

A glutationa (GSH) é um importante antioxidante e o mais abundante tiol não

protéico intracelular, presente na faixa de concentração milimolar, na maioria das

células aeróbicas (SIES, 1999; NORDBERG & ARNER, 2001). A GSH, associada à

glutationa S-transferase (GST), representa a maior via de detoxificação do

metabolismo de xenobióticos e produtos endógenos do estresse oxidativo, a qual

tem sido extensivamente estudada pelo seu papel em metabolizar agentes

antitumorais (O'BRIEN et al., 1999).

SABZEVARI et al. (2004) investigaram o mecanismo de citotoxicidade da

floretina, isoliquiritigenina e outras chalconas hidroxiladas sobre hepatócitos isolados

de rato. Todas as chalconas estudadas causaram citotoxidade nos hepatócitos. A

mais citototóxica foi a 2’-hidroxichalcona com LD

de 115 ± 13 µM (concentração

das chalconas para causar 50% de citotoxicidade após 2 horas de incubação, a

37°C) e a floretina foi a chalcona com maior LD

sendo igual a 400 ± 35 µM. Todas

as chalconas depletaram GSH dos hepatócitos, algumas por oxidação da GSH em

GSSG, outras provavelmente pela formação de um conjugado com a GSH.

Nossos resultados mostraram que a chalcona 2 não apresentou depleção da

concentração de GSH total (Figura 17 –A). As chalconas 5, 7 e 11 causaram

depleção da GSH total, entretanto, praticamente nas mesmas concentrações em que

ocorreu significativa morte celular (Figura 17). A chalcona 5 apresentou depleção de

GSH total de maneira concentração dependente igual à morte celular (Figura 17 –

B). A chalcona 7 apresentou maior depleção de GSH total que morte celular na

concentração de 100 µM, nas concentrações de 50 e 75 µM a morte induzida nas

células L1210 foi mais significativa do que a depleção de GSH (Figura 17 – C).

0 25 50 75 100

100

110

GSH total

Viabilidade

Chalcona 2 (µ

µµ

µM)

% em relação ao controle

0 25 50 75 100

110

GSH total

Viabilidade

Chalcona 5 (µ

µµ

µM)

% em relação ao controle

0 25 50 75 100

100

GSH total

Viabilidade

Chalcona 7 (µ

µµ

µM)

% em relação ao controle

0 25 50 75 100

100

GSH total

Viabilidade

Chalcona 11 (µ

µµ

µM)

% em relação ao controle

Figura 17: Comparação entre o efeito das chalconas sobre a concentração de GSH total e a

viabilidade em células L1210. Os compostos (25, 50, 75 e 100 µM) foram adicionados às células e

incubados, por 24h. As células foram lisadas e a concentração de GSH foi quantificada pelo método

de Tietze (1969). A viabilidade celular foi avaliada pelo método do MTT. O controle (0, células sem

tratamento) apresentou 598 nM de GSH total e foi considerado como 100% da concentração de GSH

total (GSH+GSSG) e 100% de viabilidade celular. Cada ponto representa a média ± E.P.M. Um valor

P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Com a chalcona 11, nas concentrações de 75 e 100µM, a depleção de

glutationa foi significativa e maior do que a indução à morte celular (Figura 17 – D).

Estes resultados sugerem que as chalconas 5 e 7 não exercem seu efeito via

depleção de GSH, entretanto, mais estudos serão necessários para comprovar o

não envolvimento da glutationa no mecanismo de morte celular causado pelas

chalconas, que poderia ocorrer tanto por consumo da glutationa reduzida quanto por

conjugação da GSH com estes compostos.

5.8 Concentração de ATP

As mitocôndrias possuem um duplo papel, atuando tanto no metabolismo

energético quanto na morte celular (REGULA et al., 2003). Diversos compostos

podem afetar a bioenergética mitocondrial, o que significa um grande risco para a

sobrevivência celular. Estas substâncias podem provocar alterações na

permeabilidade da membrana mitocondrial interna e/ou na velocidade do transporte

de elétrons, através da cadeia respiratória. Os compostos conhecidos como

desacopladores promovem o aumento da permeabilidade da membrana mitocondrial

interna a prótons. Desta forma, ocorre à transferência de elétrons, mas não há

formação do potencial eletroquímico de prótons e, conseqüentemente, não ocorre

síntese de ATP. Entre os compostos que agem como desacopladores estão alguns

antiinflamatórios com grupos ionizáveis, incluindo os agentes não esteroidais:

diclofenaco, piroxicam, meloxicam, aspirina, indometacina e nimesulida (MAHMUD

et al., 1996). A ação desacopladora destes compostos foi observada em

mitocôndrias isoladas e em fígado de rato perfundido, em concentrações que

correspondem às doses utilizadas na terapêutica (PETRESCU & TARBA, 1997;

MORENO-SANCHEZ et al., 1999). Outros compostos, que também tiveram seus

efeitos desacopladores demonstrados, incluem alguns fármacos antitumorais,

antipsicóticos, antidepressivos, antimicóticos, antihelmínticos, além de herbicidas e

inseticidas (WALLACE & STARKOV, 2000).

0 10 25 50 100

100

Chalcona 2

Chalcona 5

Chalcona 7

Chalcona 11

Chalconas (µ

µµ

µM)

ATP (% em relação

ao controle)

(2)

OCH

(5)

(7)

OCH

(11)

Figura 18: Efeito das chalconas sobre a concentração de ATP em células L1210. Os compostos

(10, 25, 50 e 100 µM) foram adicionados às células e incubados, por 24h. As células foram lisadas e

a concentração de ATP foi quantificada pelo método luciferin-luciferase conforme descrito em

Materiais e Métodos. O controle (0, células sem tratamento), contendo 70 ± 1,2 µM de ATP foi

considerado como 100% da concentração de ATP. Cada ponto representa a média ± E.P.M. Um valor

de *P < 0,05, **P < 0,01 e

P < 0,001 foi considerado estatisticamente significativo, usando ANOVA,

seguida de teste t de Bonferroni. Estruturas químicas das chalconas: (2), (5), (7) e (11).

Nossos resultados demonstraram que as chalconas 2, 5, 7 e 11 depletaram

ATP de maneira concentração-dependente, ou seja, quanto maior a concentração

do composto, maior foi a depleção intracelular de ATP. Até mesmo a chalcona 2,

que causou pouca morte celular nas células L1210, depletou o ATP de maneira

significativa. A chalcona 5 apresentou depleção significativa a partir da concentração

de 10 µM, a chalcona 7 depletou ATP de forma significativa nas concentrações de

50 e 100 µM e a chalcona 11 apresentou depleção significativa a partir da

concentração de 25 µM. (Figura 18)

As chalconas hidroxiladas estudadas por Sabzevari et al. (2004) causaram

um desacoplamento na fosforilação oxidativa mitocondrial, ou seja, um colapso no

potencial de membrana mitocondrial e aumentaram o consumo de oxigênio. Além

disso, substratos da via glicolítica ou do ciclo do ácido cítrico (como sorbitol, xilitol,

frutose e piruvato) preveniram a citotoxicidade e o colapso no potencial de

membrana mitocondrial. O mais alto pka das chalconas foi o mais efetivo para

causar colapso no potencial de membrana mitocondrial, o que sugere que a

atividade citotóxica destas chalconas está, provavelmente, relacionada à habilidade

de causar desacoplamento na mitocôndria.

Nossos resultados mostraram depleção de ATP, sugerindo que as chalconas

podem estar interferindo no potencial de membrana mitocondrial, diminuindo a

respiração celular e prejudicando a síntese de ATP.

5.9 Citotoxicidade em células normais e células progenitoras grânulo-

monocíticas

Estudamos os efeitos das chalconas numa linhagem de células não tumorais

(VERO). Na figura 19, é possível observar a toxicidade dos compostos 2, 5, 7 e 11

sobre estas células. A quantidade de morte celular foi 25,1 ± 4,0%, 35,5 ± 2,1%, 41,7

± 1,7% e 47,8 ± 2,5%, respectivamente, quando comparadas ao controle (100% de

células viáveis). Comparando as figuras 10 e 19 é possível observar que a

viabilidade nas células não tumorais VERO foi maior do que nas células leucêmicas

L1210.

0 2 5 7 11

100

Chalconas (100 µ

µµ

µM)

Células vivas (%)

(2)

OCH

(5)

(7)

OCH

(11)

Figura 19: Efeito citotóxico das chalconas sobre células VERO (células não tumorais). As

células foram incubadas com as chalconas por 24h. A viabilidade celular foi avaliada pelo método do

MTT. A densidade óptica do grupo controle (0, células sem tratamento) foi considerada como 100%

de viabilidade celular. Cada ponto representa a média ± E.P.M. de pelo menos três experimentos

idênticos. Um valor de

P < 0,001 foi considerado estatisticamente significativo, quando comparado

com o controle, usando ANOVA, seguido de teste t de Bonferroni. Estrutura química das chalconas:

(2), (5), (7) e (11).

Na tabela 3, foi comparada a viabilidade celular dos compostos 5, 7 e 11 entre

as duas linhagens celulares. O valor de P foi extremamente significante, mostrando

que a morte induzida pelas chalconas foi mais evidente nas células tumorais.

Tabela 3: Comparação da viabilidade celular entre as linhagens L1210 e VERO.

Chalconas

L1210

(Células viáveis

em relação ao controle)

VERO

(Células viáveis

em relação ao controle)

5 9,5 ± 1,2% 64,5 ± 2,1% < 0.0001

7 12,9 ± 1,1% 58,3 ± 1,7% < 0.0001

11 13,7 ± 2,2% 52,2 ± 2,5% = 0.0002

* As células foram incubadas com os compostos (100µM), por 24h. A viabilidade celular foi analisada

pelo método do MTT. O controle foi considerado 100% de células viáveis para as células L1210 e

VERO. O valor de P foi determinado pelo teste t Student.

A toxicidade dos fármacos antineoplásicos para as células progenitoras

normais da medula óssea é um dos obstáculos encontrados na maioria das terapias

antitumorais. O ensaio de formação de colônias é empregado para investigar

reações adversas, causadas por xenobióticos na formação de células sangüíneas.

Células-tronco hematopoiéticas, também chamadas de unidades formadoras de

colônias (CFU), originam progenitores comprometidos a diferenciarem-se em

diferentes linhagens de células sangüíneas maduras, dependendo dos fatores de

crescimento e citocinas presentes no microambiente. Neste sentido, para investigar

a toxicidade das chalconas 5, 7 e 11, foi realizado o ensaio com células formadoras

de colônias grânulo-monocíticas (Ensaio GM-CFC). Neste ensaio foram utilizadas

células de medula óssea murina, que foram tratadas com as chalconas nas

concentrações descritas na tabela 4. As concentrações utilizadas no tratamento

foram baseadas no valor de IC

, em 24 horas; foi utilizada uma concentração menor

que a IC

e outra sendo aproximadamente o valor da IC

(IC

50 em 24h

chalcona 5 =

45 µM, chalcona 7 = 63 µM e chalcona 11 = 64 µM).

Tabela 4: Ensaio de células progenitoras grânulo-monocíticas (Ensaio GM-CFC)

Composto Inibição do crescimento de colônias

Chalcona 5 - 20 µM 100%

Chalcona 5 - 50 µM 100%

Chalcona 7 - 30 µM 9,90% ± 0,6%

Chalcona 7 - 60 µM 28,5% ± 1,3%

Chalcona 11 - 30 µM 100%

Chalcona 11 - 60 µM 100%

As chalconas 5 e 11 inibiram totalmente o crescimento de colônias, nas duas

concentrações testadas, sendo altamente citotóxicas para células da medula óssea

progenitoras de granulócitos e macrófagos. Somente a chalcona 7 permitiu o

crescimento de colônias a partir das células progenitoras hematopoiéticas. Este

resultado mostra que a chalcona 7 é a menos citotóxica para células normais da

medula óssea, permitindo o crescimento de granulócitos e macrófagos.

Após a quimioterapia, a medula óssea precisa se restabelecer, sendo que

antineoplásicos que sejam menos tóxicos para células normais da medula óssea

podem apresentar mais benefícios para o tratamento e recuperação do paciente

CONCLUSÕES

CONCLUSÕESCONCLUSÕES

CONCLUSÕES

As chalconas compõem ou fazem parte de uma classe de estruturas naturais

ou sintéticas de grande interesse, devido às suas várias propriedades biológicas.

Uma área de grande interesse, evidenciada na literatura, é seu potencial como

agente antitumoral.

A presente pesquisa, nas condições que foi desenvolvida, permite as

seguintes conclusões:

 Dos dez compostos testados, as chalconas 5, 7 e 11 mostraram efeito

citotóxico pronunciado sobre as células L1210 e foram escolhidas para dar

continuidade à investigação;

 Os substituintes no anel A destas chalconas têm papel fundamental para a

toxicidade. O efeito dos substituintes na toxicidade é evidenciado pela comparação

com a chalcona 2, que não tem substituintes ligados ao anel A e apresentou menor

citotoxicidade;

 A morte celular, induzida pelos compostos 5, 7 e 11, ocorreu por apoptose;

 Em 18h de incubação, estas chalconas começaram a induzir,

significativamente, a morte celular;

 Os compostos 2, 5, 7 e 11 demonstraram causar a morte celular de forma

concentração-dependente;

 A chalcona 5 apresentou o menor valor de IC

, em 24 horas, e a chalcona 2,

o valor mais elevado;

 A chalcona 7 parece não exercer seu efeito via

depleção de glutationa, entretanto, os resultados não são conclusivos e este efeito

terá que ser mais estudado;

 Os compostos depletaram ATP de maneira concentração-dependente. A

depleção de ATP foi maior que a morte celular e ocorreu até nas menores

concentrações testadas, sugerindo que as chalconas podem estar interferindo no

potencial de membrana mitocondrial, diminuindo a respiração celular e,

conseqüentemente, prejudicando a síntese de ATP;

 A toxicidade das chalconas estudadas foi significativamente melhor nas

células leucêmicas L1210, do que nas células não tumorais VERO;

 A chalcona 7 não inibiu o crescimento de granulócitos e macrófagos a partir

das células progenitoras normais da medula óssea. Este resultado nos mostra que o

composto 7 é o menos tóxico para células da medula óssea, sendo um composto

promissor para a continuidade das investigações de novos fármacos antitumorais.

PERSPECTIVAS

PERSPECTIVASPERSPECTIVAS

PERSPECTIVAS

A depleção de GSH e de ATP é um indicativo de que as chalconas provocam

um estresse oxidativo celular. Não conhecemos, nas células L1210, o mecanismo do

estímulo inicial, que resulta na morte celular por apoptose. Duas hipóteses podem

ser levantadas: uma seria por meio de dano direto ao DNA, proteínas ou lipídios de

membrana e a outra seria pela interferência no ciclo celular pela ligação à tubulina.

Realizamos ensaios em modelos de membrana lipídica (lipossomos e

microssomos de fígado de rato), com altas concentrações de chalconas, e estas não

causaram peroxidação lipídica nestas estruturas. Na célula, a peroxidação lipídica

poderia ocorrer através de metabólitos secundários das chalconas. Entretanto, pela

técnica colorimétrica disponível no laboratório, este processo não foi detectado,

provavelmente pela baixa sensibilidade da metodologia em detectar pequenas

concentrações dos marcadores da peroxidação lipídica, como esperado para células

em cultura.

A continuidade da pesquisa para elucidar o mecanismo que a chalcona 7

utiliza para desencadear a apoptose e o desenvolvimento de testes in vivo estão

sendo considerados, uma vez que este composto apresentou baixa toxicidade às

células não tumorais e às células progenitoras de medula óssea.

Os tratamentos antineoplásicos existentes são altamente tóxicos e

freqüentemente não específicos. Adicionalmente, a resistência das células tumorais

aos fármacos é uma grande barreira aos tratamentos. A pesquisa e o

desenvolvimento de novos compostos, que ultrapassem a barreira da resistência,

sejam mais específicos para células tumorais, menos tóxicos e apresentem menos

efeitos indesejáveis, pode contribuir para a efetividade dos tratamentos, para a

diminuição do número de recidivas e para o aumento do potencial de cura.

REFERÊNCIAS

REFERÊNCIASREFERÊNCIAS

REFERÊNCIAS

AGULLO, G., GAMET-PAYRASTRE L., et al. Relationship between flavonoid

structure and inhibition of phosphatidylinositol 3-kinase: a comparison with tyrosine

kinase and protein kinase C inhibition. Biochem Pharmacol, 53(11): 1649-57, 1997.

ALLEN, R. T., HUNTER, W. J. et al. Morphological and biochemical characterization

and analysis of apoptosis. J Pharmacol Toxicol Methods, 37(4): 215-28, 1997.

ANTO, R. J., SUKUMARAN, K., et al. Anticancer and antioxidant activity of synthetic

chalcones and related compounds. Cancer Lett, 97(1): 33-7,1995.

ARIYAN, Z. S. & SUSCHITZKY H. Heterocyclic compounds of the chalcone type.

Journal of the Chemical Society, (Abstracts): 2242-2244, 1961.

BAIN, B. J. Diagnóstico em leucemias. Rio de Janeiro: Editora Revinter, 2003,

Cap. 1, 01-56.

BALLS, M., BLAAUBEER, B. J. et al. Pratical aspects of the validation of toxicity tests

procedures. The report of Recomendatious of ECVAM workshop. Atla, 23: 129-147,

1995.

BARRANCO, S. C., TOWNSEND, C. M. Jr., et al. Changes in glutathione content

and resistance to anticancer agents in human stomach cancer cells induced by

treatments with melphalan in vitro. Cancer Res, 50(12): 3614-8, 1990.

BATT, D. G., GOODMAN, R. et al. 2'-substituted chalcone derivatives as inhibitors of

interleukin-1 biosynthesis. J Med Chem, 36(10): 1434-42, 1993.

BENNETT, J. M., CATOVSKY, D. et al. Proposals for the classification of the acute

leukaemias. French-American-British (FAB) co-operative group. Br J Haematol,

33(4): 451-8, 1976.

BENNETT, J. M., CATOVSKY, D. et al. The morphological classification of acute

lymphoblastic leukaemia: concordance among observers and clinical correlations. Br

J Haematol, 47(4): 553-61, 1981.

BOECK, P., BANDEIRA FALCAO, C. A. et al. Synthesis of chalcone analogues with

increased antileishmanial activity. Bioorg Med Chem, 14(5): 1538-45, 2006.

BOECK, P., LEAL, P. C. et al. Antifungal activity and studies on mode of action of

novel xanthoxyline-derived chalcones. Arch Pharm (Weinheim), 338(2-3): 87-95,

2005.

CARIATI, R., ZANCAI, P. et al. Inhibition of oxidative phosphorylation underlies the

antiproliferative and proapoptotic effects of mofarotene (Ro 40-8757) in Burkitt's

lymphoma cells. Oncogene, 22(6): 906-18, 2003.

Catálogo BioAgency 2004-05, Cap. 9 - Apoptose e Inflamação. Disponível em

http://www.bioagency.com.br/informacao/default.asp. Acesso em 22 de dezembro de

2006.

CHANDRA, J., SAMALI, A. et al. Triggering and modulation of apoptosis by oxidative

stress. Free Radic Biol Med, 29(3-4): 323-33, 2000.

CHIARADIA, L. D. Obtenção de chalconas sintéticas com potencial atividade

biológica. 2006. 199f. Dissertação (Mestrado em Química) - Universidade Federal

de Santa Catarina, Florianópolis, Santa Catarina, 2006.

DAVEY, F. R., CASTELLA, A. et al. Prognostic significance of the revised French-

American-British classification for acute lymphocytic leukaemia. Clin Lab Haematol,

5(4): 343-51, 1983.

DAVIS, W., RONAI, Z. Jr. et al. Cellular thiols and reactive oxygen species in drug-

induced apoptosis. J Pharmacol Exp Ther, 296(1): 1-6, 2001.

DELUCA, M. Firefly luciferase. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol, 44: 37-68,

1976.

DESHPANDE, A. M., ARGADE, N. P. et al. Synthesis and screening of a

combinatorial library of naphthalene substituted chalcones: inhibitors of leukotriene

B4. Bioorg Med Chem, 7(6): 1237-40, 1999.

DIAS, N. & BAILLY, C. Drugs targeting mitochondrial functions to control tumor cell

growth. Biochem Pharmacol, 70(1): 1-12, 2005.

DIMMOCK, J. R., ELIAS, D. W. et al. Bioactivities of chalcones. Curr Med Chem,

6(12): 1125-49, 1999.

DIMMOCK, J. R., KANDEPU, N. M. et al. Cytotoxic activities of Mannich bases of

chalcones and related compounds. J Med Chem, 41(7): 1014-26, 1998.

DOMINGUEZ, J. N., CHARRIS, J. E. et al. Synthesis of quinolinyl chalcones and

evaluation of their antimalarial activity. Eur J Med Chem, 36(6): 555-60, 2001.

DOMINGUEZ, J. N., LEON, C. et al. Synthesis and antimalarial activity of

sulfonamide chalcone derivatives. Farmaco, 60(4): 307-11, 2005.

DOWNING, J. R. & SHANNON, K. M. Acute leukemia: a pediatric perspective.

Cancer Cell, 2(6): 437-45, 2002.

DUCKI, S., FORREST, R. et al. Potent antimitotic and cell growth inhibitory

properties of substituted chalcones. Bioorg Med Chem Lett, 8(9): 1051-6, 1998.

DURRANT, I. J. & RICHARDS, S. M. Results of Medical Research Council trial

UKALL IX in acute lymphoblastic leukaemia in adults: report from the Medical

Research Council Working Party on Adult Leukaemia. Br J Haematol, 85(1): 84-92,

1993.

ECVAM - European Centre for the Validation of Alternative Methods. The Colony

Forming Unit-Granulocyte/Macrophage (CFU-GM). Disponível em:

http://ecvam-

sis.jrc.it. Acesso em: 05 novembro de 2006.

EDWARDS, M. L., STEMERICK, D. M. et al. Chalcones: a new class of antimitotic

agents. J Med Chem, 33(7): 1948-54, 1990.

ESTRELA, J. M., ORTEGA, A. et al. Glutathione in cancer biology and therapy. Crit

Rev Clin Lab Sci, 43(2): 143-81, 2006.

FILOMENI, G., ROTILIO, G. et al. Cell signalling and the glutathione redox system.

Biochem Pharmacol, 64(5-6): 1057-64, 2002.

FRIEDLANDER, R. M. Apoptosis and caspases in neurodegenerative diseases. N

Engl J Med, 348(14): 1365-75, 2003.

FRESHNEY, R. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. New

York, Alan R. Liss, Inc., 1987, p.117.

FROMME, P., BOEKEMA, E. J. et al. Isolation and characterization of a supramolar

complex of subunit-III of the ATP-synthase from chloroplasts. Z. Naturforsch,

42c(11-12): 1239-1245, 1987.

FU, Y., HSIEH, T. C. et al. Licochalcone-A, a novel flavonoid isolated from licorice

root (Glycyrrhiza glabra), causes G2 and late-G1 arrests in androgen-independent

PC-3 prostate cancer cells. Biochem Biophys Res Commun, 322(1): 263-70, 2004.

GARLAND, J. M. & HALESTRAP, A. Energy metabolism during apoptosis. Bcl-2

promotes survival in hematopoietic cells induced to apoptose by growth factor

withdrawal by stabilizing a form of metabolic arrest. J Biol Chem, 272(8): 4680-8,

1997.

GOKBUGET, N. & HOELZER, D. Recent approaches in acute lymphoblastic

leukemia in adults. Rev Clin Exp Hematol, 6(2): 114-41; discussion 200-2, 2002.

GORES, G. J., HERMAN, B. et al. Plasma membrane bleb formation and rupture: a

common feature of hepatocellular injury. Hepatology, 11(4): 690-8, 1990.

GREAVES, M. Molecular genetics, natural history and the demise of childhood

leukaemia. Eur J Cancer, 35(2): 173-85, 1999.

GREAVES, M. F. Differentiation-linked leukemogenesis in lymphocytes. Science,

234(4777): 697-704, 1986.

GREAVES, M. F. Stem cell origins of leukaemia and curability. Br J Cancer, 67(3):

413-23, 1993.

GREEN, D. R. & EVAN, G. I. A matter of life and death. Cancer Cell, 1(1): 19-30,

2002.

GRIFFITH, O. W. & MEISTER, A. Origin and turnover of mitochondrial glutathione.

Proc Natl Acad Sci U S A, 82(14): 4668-72, 1985.

GUPTA, S. Molecular signaling in death receptor and mitochondrial pathways of

apoptosis (Review). Int J Oncol, 22(1): 15-20, 2003.

HAMMOND, C. L., LEE, T. K., et al. Novel roles for glutathione in gene expression,

cell death, and membrane transport of organic solutes. J Hepatol, 34(6): 946-54,

2001.

HAN, R. Research and Development of Anticancer Drugs and Experimental

Tecniques. Beijing: Pekin Medical University Pekin Union Medical College joint

Publishing House, 395-399, 1997.

HARAGUCHI, H., ISHIKAWA, H. et al. Antioxidative and superoxide scavenging

activities of retrochalcones in Glycyrrhiza inflata. Bioorg Med Chem, 6(3): 339-47,

1998.

HASLETT, C. Resolution of acute inflammation and the role of apoptosis in the tissue

fate of granulocytes. Clin Sci (Lond), 83(6): 639-48, 1992.

HENGARTNER, M. O. The biochemistry of apoptosis. Nature, 407(6805): 770-6,

2000.

HERENCIA, F., FERRANDIZ, M. L. et al. Synthesis and anti-inflammatory activity of

chalcone derivatives. Bioorg Med Chem Lett, 8(10): 1169-74, 1998.

HERENCIA, F., FERRANDIZ, M. L. et al. Novel anti-inflammatory chalcone

derivatives inhibit the induction of nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 in

mouse peritoneal macrophages. FEBS Lett, 453(1-2): 129-34, 1999.

HERENCIA, F., LOPEZ-GARCIA, M. P. et al. Nitric oxide-scavenging properties of

some chalcone derivatives. Nitric Oxide, 6(2): 242-6, 2002.

HERR, I. & DEBATIN, K. M. Cellular stress response and apoptosis in cancer

therapy. Blood, 98(9): 2603-14, 2001.

HIGUCHI, Y. Glutathione depletion-induced chromosomal DNA fragmentation

associated with apoptosis and necrosis. J Cell Mol Med, 8(4): 455-64, 2004.

ICHIMARU, M., NAKATANI, N. et al. Cytotoxic C-benzylated dihydrochalcones from

Uvaria acuminata. Chem Pharm Bull (Tokyo), 52(1): 138-41, 2004.

ISHITSUKA, H., NINOMIYA, Y. T. et al. Direct and specific inactivation of rhinovirus

by chalcone Ro 09-0410. Antimicrob Agents Chemother, 22(4): 617-21, 1982.

JAFFE, E. F., HARRIS, N. L. et al. World Healthy Organization Classification of

Tumours: Patology and Genetics of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid

Tissues. Lyon: IARC Press, 2001.

KAMPS, W. A., VEERMAN, A. J. et al. Long-term follow-up of Dutch Childhood

Leukemia Study Group (DCLSG) protocols for children with acute lymphoblastic

leukemia, 1984-1991. Leukemia, 14(12): 2240-6, 2000.

KANERVA, J., SAARINEN-PIHKALA, U. M. et al. Reemphasis on lymphoblast L2

morphology as a poor prognostic factor in childhood acute lymphoblastic leukemia.

Med Pediatr Oncol, 33(4): 388-94, 1999.

KANG, T. B. & LIANG, N. C. Studies on the inhibitory effects of quercetin on the

growth of HL-60 leukemia cells. Biochem Pharmacol, 54(9): 1013-8, 1997.

KAUFMANN, S. H. & EARNSHAW, W. C. Induction of apoptosis by cancer

chemotherapy. Exp Cell Res, 256(1): 42-9, 2000.

KAYSER, O. & KIDERLEN, A. F. In vitro leishmanicidal activity of naturally occurring

chalcones. Phytother Res, 15(2): 148-52, 2001.

KERR, J. F., Wyllie, A. H. et al. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-

ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer, 26(4): 239-57, 1972.

KLUCK, R. M., BOSSY-WETZEL, E. et al. The release of cytochrome c from

mitochondria: a primary site for Bcl-2 regulation of apoptosis. Science, 275(5303):

1132-6, 1997.

KO, H. H., TSAO, L. T. et al. Structure-activity relationship studies on chalcone

derivatives. The potent inhibition of chemical mediators release. Bioorg Med Chem,

11(1): 105-11, 2003.

KOBORI, M., IWASHITA, K. et al. Phloretin-induced apoptosis in B16 melanoma 4A5

cells and HL-60 human leukemia cells. Biosci Biotechnol Biochem, 63(4): 719-25,

1999.

KRAMER, R. A., GREENE, K. et al. Chemosensitization of L-phenylalanine mustard

by the thiol-modulating agent buthionine sulfoximine. Cancer Res, 47(6): 1593-7,

1987.

KROEMER, G. & REED, J. C. Mitochondrial control of cell death. Nat Med, 6(5): 513-

9, 2000.

KUNTZ, S., WENZEL, U. et al. Comparative analysis of the effects of flavonoids on

proliferation, cytotoxicity, and apoptosis in human colon cancer cell lines. Eur J Nutr,

38(3): 133-42, 1999.

LAKIN, N. D. & JACKSON, S. P. Regulation of p53 in response to DNA damage.

Oncogene, 18(53): 7644-55, 1999.

LAKS, D., LONGHI, F. et al. Survival evaluation of children with acute lymphoblastic

leukemia treated with Berlin-Frankfurt-Munich trial. J Pediatr (Rio J), 79(2): 149-58,

2003.

LASH, L. H. Mitochondrial glutathione transport: physiological, pathological and

toxicological implications. Chem Biol Interact, 163(1-2): 54-67, 2006.

LAWRENCE, N. J., MCGOWN, A. T. et al. The interaction of chalcones with tubulin.

Anticancer Drug Des, 15(2): 135-41, 2000.

LEBEAU, J., FURMAN, C. et al. Antioxidant properties of di-tert-butylhydroxylated

flavonoids. Free Radic Biol Med, 29(9): 900-12, 2000.

LEBLANC, R., DICKSON, J. et al. Synthesis and cytotoxicity of epoxide and pyrazole

analogs of the combretastatins. Bioorg Med Chem, 13(21): 6025-34, 2005.

LEE, Y. J., ERDOS, G. et al. Mechanism of quercetin-induced suppression and delay

of heat shock gene expression and thermotolerance development in HT-29 cells. Mol

Cell Biochem, 137(2): 141-54, 1994.

LEITE, M., QUINTA-COSTA, M. et al. Critical evaluation of techniques to detect and

measure cell death-study in a model of UV radiation of the leukaemic cell line HL-60.

Anal Cell Pathol, 19(3-4): 139-51, 1999.

LEPLEY, D. M., LI, B. et al. The chemopreventive flavonoid apigenin induces G2/M

arrest in keratinocytes. Carcinogenesis, 17(11): 2367-75, 1996.

LEPLEY, D. M. & PELLING, J. C. Induction of p21/WAF1 and G1 cell-cycle arrest by

the chemopreventive agent apigenin. Mol Carcinog, 19(2): 74-82, 1997.

LESZCZYNIECKA, M., ROBERTS, T. et al. Differentiation therapy of human cancer:

basic science and clinical applications. Pharmacol Ther, 90(2-3): 105-56, 2001.

LI, J. T., YANG, W. Z. et al. Improved synthesis of chalcones under ultrasound

irradiation. Ultrason Sonochem, 9(5): 237-9, 2002.

LI, R., KENYON, G. L. et al. In vitro antimalarial activity of chalcones and their

derivatives. J Med Chem, 38(26): 5031-7, 1995.

LILLEYMAN, J. S., HANN, I. M. et al. Cytomorphology of childhood lymphoblastic

leukaemia: a prospective study of 2000 patients. United Kingdom Medical Research

Council's Working Party on Childhood Leukaemia. Br J Haematol, 81(1): 52-7, 1992.

LIU, M., WILAIRAT, P. et al. Antimalarial alkoxylated and hydroxylated chalcones

[corrected]: structure-activity relationship analysis. J Med Chem, 44(25): 4443-52,

2001.

LOPEZ, S. N., CASTELLI, M. V. et al. In vitro antifungal evaluation and structure-

activity relationships of a new series of chalcone derivatives and synthetic analogues,

with inhibitory properties against polymers of the fungal cell wall. Bioorg Med Chem,

9(8): 1999-2013, 2001.

LOUIE, K. G., BEHRENS, B. C. et al. Radiation survival parameters of antineoplastic

drug-sensitive and -resistant human ovarian cancer cell lines and their modification

by buthionine sulfoximine. Cancer Res, 45(5): 2110-5, 1985.

MAHMUD, T., RAFI, S. S. et al. Nonsteroidal antiinflammatory drugs and uncoupling

of mitochondrial oxidative phosphorylation. Arthritis Rheum, 39(12): 1998-2003,

1996.

MANDELLI, F., ANNINO, L. et al. The GIMEMA ALL 0183 trial: analysis of 10-year

follow-up. GIMEMA Cooperative Group, Italy. Br J Haematol, 92(3): 665-72, 1996.

MARCHETTI, P., DECAUDIN, D. et al. Redox regulation of apoptosis: impact of thiol

oxidation status on mitochondrial function. Eur J Immunol, 27(1): 289-96, 1997.

MARTIN, S. J. & GREEN, D. R. Protease activation during apoptosis: death by a

thousand cuts? Cell, 82(3): 349-52, 1995.

MARTIN, S. J., REUTELINGSPERGER, C. P. et al. Early redistribution of plasma

membrane phosphatidylserine is a general feature of apoptosis regardless of the

initiating stimulus: inhibition by overexpression of Bcl-2 and Abl. J Exp Med, 182(5):

1545-56, 1995.

MARTINOU, J. C. & GREEN, D. R. Breaking the mitochondrial barrier. Nat Rev Mol

Cell Biol, 2(1): 63-7, 2001.

MCKERNAN, T. B., WOODS, E. B. et al. Uptake of glutathione by renal cortical

mitochondria. Arch Biochem Biophys, 288(2): 653-63, 1991.

MEDH, R. D., GUPTA, V. et al. Reversal of melphalan resistance in vivo and in vitro

by modulation of glutathione metabolism. Biochem Pharmacol, 42(2): 439-41, 1991.

MENG, C. Q., ZHENG, X. S. et al. Discovery of novel heteroaryl-substituted

chalcones as inhibitors of TNF-alpha-induced VCAM-1 expression. Bioorg Med

Chem Lett, 14(6): 1513-7, 2004.

MILLER, D. R., LEIKIN, S. et al. Prognostic importance of morphology (FAB

classification) in childhood acute lymphoblastic leukaemia (ALL). Br J Haematol,

48(2): 199-206, 1981.

MIRANDA, C. L., STEVENS, J. F. et al. Antioxidant and prooxidant actions of

prenylated and nonprenylated chalcones and flavanones in vitro. J Agric Food

Chem, 48(9): 3876-84, 2000.

MORENO-SANCHEZ, R., BRAVO, C. et al. Inhibition and uncoupling of oxidative

phosphorylation by nonsteroidal anti-inflammatory drugs: study in mitochondria,

submitochondrial particles, cells, and whole heart. Biochem Pharmacol, 57(7): 743-

52, 1999.

MUKHERJEE, S., KUMAR, V. et al. Synthetic and biological activity evaluation

studies on novel 1,3-diarylpropenones. Bioorg Med Chem, 9(2): 337-45, 2001.

NAKATANI, N., ICHIMARU, M. et al. Induction of apoptosis in human promyelocytic

leukemia cell line HL-60 by C-benzylated dihydrochalcones, uvaretin, isouvaretin and

diuvaretin. Biol Pharm Bull, 28(1): 83-6, 2005.

NAM, N. H., KIM, Y. et al. Cytotoxic 2',5'-dihydroxychalcones with unexpected

antiangiogenic activity. Eur J Med Chem, 38(2): 179-87, 2003.

NI, L., MENG, C. Q. et al. Recent advances in therapeutic chalcones. Expert Opin

Trher Patents, 14(12): 1669-1691, 2004.

NICHOLSON, D. W. & THORNBERRY, N. A. Caspases: killer proteases. Trends

Biochem Sci, 22(8): 299-306, 1997.

NIELSEN, S. F., BOESEN, T. et al. Antibacterial chalcones--bioisosteric replacement

of the 4'-hydroxy group. Bioorg Med Chem, 12(11): 3047-54, 2004.

NIELSEN, S. F., CHRISTENSEN, S. B. et al. Antileishmanial chalcones: statistical

design, synthesis, and three-dimensional quantitative structure-activity relationship

analysis. J Med Chem, 41(24): 4819-32, 1998.

NINOMIYA, Y., SHIMMA, N. et al. Comparative studies on the antirhinovirus activity

and the mode of action of the rhinovirus capsid binding agents, chalcone amides.

Antiviral Res, 13(2): 61-74, 1990.

NORDBERG, J. & ARNER, E. S. Reactive oxygen species, antioxidants, and the

mammalian thioredoxin system. Free Radic Biol Med, 31(11): 1287-312, 2001.

O'BRIEN, M. L. & TEW, K. D. Glutathione and related enzymes in multidrug

resistance. Eur J Cancer, 32A(6): 967-78, 1996.

O'BRIEN, M. L., VULEVIC, B. et al. Glutathione peptidomimetic drug modulator of

multidrug resistance-associated protein. J Pharmacol Exp Ther, 291(3): 1348-55,

1999.

OBERHAMMER, F., WILSON, J. W. et al. Apoptotic death in epithelial cells:

cleavage of DNA to 300 and/or 50 kb fragments prior to or in the absence of

internucleosomal fragmentation. Embo J, 12(9): 3679-84, 1993.

OPLETALOVA, V. & SEDIVY, D. Chalcones and their heterocyclic analogs as

potential antifungal chemotherapeutic agents. Ceska Slov Farm, 48(6): 252-5, 1999.

PAPPANO, N. B., PUIG DE CENTORBI, O. et al. Kinetics of the bacteriostatic

activity of natural and synthetic chalcones on a strain of Staphylococcus aureus. Rev

Argent Microbiol, 17(1): 27-32, 1985.

PATHAK, V. N., OZA, C. K. et al. Synthesis and Spectral Studies of Some New

bis(1,4-Diketonato)palladium (II) Complexes. Synthesis and Reactivity in Inorganic

and Metal-Organic Chemistry, 33(4): 607-624, 2003.

PETRESCU, I. & TARBA, C. Uncoupling effects of diclofenac and aspirin in the

perfused liver and isolated hepatic mitochondria of rat. Biochim Biophys Acta,

1318(3): 385-94, 1997.

PLASSCHAERT, S. L., KAMPS, W. A. et al. Prognosis in childhood and adult acute

lymphoblastic leukaemia: a question of maturation? Cancer Treat Rev, 30(1): 37-51,

2004.

POPAT, U., CARRUM, G. et al. Haemopoietic stem cell transplantation for acute

lymphoblastic leukaemia. Cancer Treat Rev, 29(1): 3-10, 2003.

POTTER, G. A. & BUTLER, P. C. 3,4-methylenedioxy-substituited chalcones as

therapeutic agents. UK WO 03/028713, 2003, 100 p.

PUI, C. H. Childhood leukemias. N Engl J Med, 332(24): 1618-30, 1995.

PUI, C. H. & EVANS, W. E. Acute lymphoblastic leukemia. N Engl J Med, 339(9):

605-15, 1998.

PUI, C. H., KANE, J. R. et al. Biology and treatment of infant leukemias. Leukemia,

9(5): 762-9, 1995.

RAM, V. J., SAXENA, A. S. et al. Oxygenated chalcones and bischalcones as

potential antimalarial agents. Bioorg Med Chem Lett, 10(19): 2159-61, 2000.

RANI, P., SRIVASTAVA, V. K. et al. Synthesis and antiinflammatory activity of

heterocyclic indole derivatives. Eur J Med Chem, 39(5): 449-52, 2004.

RAO, Y. K., FANG, S. H. et al. Differential effects of synthesized 2'-oxygenated

chalcone derivatives: modulation of human cell cycle phase distribution. Bioorg Med

Chem, 12(10): 2679-86, 2004.

REED, J. C. Mechanisms of apoptosis avoidance in cancer. Curr Opin Oncol, 11(1):

68-75, 1999.

REGULA, K. M., ENS, K. et al. Mitochondria-assisted cell suicide: a license to kill. J

Mol Cell Cardiol, 35(6): 559-67, 2003.

RICHTER, C., SCHWEIZER, M. et al. Control of apoptosis by the cellular ATP level.

FEBS Lett, 378(2): 107-10, 1996.

ROJAS, J., DOMINGUEZ, J. N. et al. Synthesis and inhibitory activity of

dimethylamino-chalcone derivatives on the induction of nitric oxide synthase. Eur J

Med Chem, 37(8): 699-705, 2002.

RUBNITZ, J. E., DOWNING, J. R. et al. TEL gene rearrangement in acute

lymphoblastic leukemia: a new genetic marker with prognostic significance. J Clin

Oncol, 15(3): 1150-7, 1997.

RUBNITZ, J. E., LINK, M. P. et al. Frequency and prognostic significance of HRX

rearrangements in infant acute lymphoblastic leukemia: a Pediatric Oncology Group

study. Blood, 84(2): 570-3, 1994.

SABZEVARI, O., GALATI, G. et al. Molecular cytotoxic mechanisms of anticancer

hydroxychalcones. Chem Biol Interact, 148(1-2): 57-67, 2004.

SACKMANN-MURIEL, F., FELICE, M. S. et al. Treatment results in childhood acute

lymphoblastic leukemia with a modified ALL-BFM'90 protocol: lack of improvement in

high-risk group. Leuk Res, 23(4): 331-40, 1999.

SALE, S., TUNSTALL, R. G. et al. Effects of the potential chemopreventive agent

DMU-135 on adenoma development in the ApcMin+ mouse. Invest New Drugs,

24(6): 459-64, 2006.

SAMBROOK, J & RUSSELL D. W. Molecular Cloning: a laboratory manual. 3 ed.

New York: Cold Spring Harbor, 2001, Appendix 8 - Quantitation of nucleic acids, p.

A8.19-21.

SANTOS-SILVA, M. C., FREITAS, M. S. et al. Involvement of NF-kappaB and

glutathione in cytotoxic effects of nitric oxide and taxol on human leukemia cells.

Leuk Res, 30(2): 145-52, 2006.

SANTOS, R. I. dos. Metabolismo básico e origem dos metabólitos secundários. In:

SIMÕES, C. M. O.; et al. (orgs). Farmacognosia: da planta ao medicamento. 3 ed.

Florianópolis: Editora Editora da UFSC, Porto Alegre: Editora da UFRGS, 2000. Cap

16. p. 323-54.

SAYDAM, G., AYDIN, H. H. et al. Cytotoxic and inhibitory effects of 4,4'-dihydroxy

chalcone (RVC-588) on proliferation of human leukemic HL-60 cells. Leuk Res,

27(1): 57-64, 2003.

SCAMBIA, G., RANELLETTI, F. O. et al. Quercetin induces type-II estrogen-binding

sites in estrogen-receptor-negative (MDA-MB231) and estrogen-receptor-positive

(MCF-7) human breast-cancer cell lines. Int J Cancer, 54(3): 462-6, 1993.

SCHMITT, C. A., ROSENTHAL, C. T. et al. Genetic analysis of chemoresistance in

primary murine lymphomas. Nat Med, 6(9): 1029-35, 2000.

SCHRAPPE, M., CAMITTA, B. et al. Long-term results of large prospective trials in

childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia, 14(12): 2193-4, 2000.

SCHWARTZ, M. A., ROSE, B. F. et al. Intramolecular Oxidative Coupling of

Diphenolic, Monophenolic, and Nonpphenolic Substrates. Journal of the American

Chemical Society, 99(8): 2571-2578, 1977.

SECKER-WALKER, L. M., CRAIG, J. M. et al. Philadelphia positive acute

lymphoblastic leukemia in adults: age distribution, BCR breakpoint and prognostic

significance. Leukemia, 5(3): 196-9, 1991.

SEEGER, K., ADAMS, H. P. et al. TEL-AML1 fusion transcript in relapsed childhood

acute lymphoblastic leukemia. The Berlin-Frankfurt-Munster Study Group. Blood,

91(5): 1716-22, 1998.

SHIBATA, S. Anti-tumorigenic chalcones. Stem Cells,12(1): 44-52, 1994.

SIES, H. Oxidative stress: oxidants and antioxidants. Experimental Physiology, 82:

291-5, 1997.

SIES, H. Glutathione and its role in cellular functions. Free Radic Biol Med, 27(9-

10): 916-21, 1999.

SOGAWA, S., NIHRO, Y. et al. 3,4-Dihydroxychalcones as potent 5-lipoxygenase

and cyclooxygenase inhibitors. J Med Chem, 36(24): 3904-9, 1993.

STREHLER, B. L. & TOTTER, J. R. Determination of ATP and related compounds:

firefly luminescence and other methods. Methods Biochem Anal, 1: 341-56, 1954.

SZCZEPANSKI, T., VAN DER VELDEN, V. H. et al. Classification systems for acute

and chronic leukaemias. Best Pract Res Clin Haematol, 16(4): 561-82, 2003.

TAKAHASHI, T., TAKASUKA, N. et al. Isoliquiritigenin, a flavonoid from licorice,

reduces prostaglandin E2 and nitric oxide, causes apoptosis, and suppresses

aberrant crypt foci development. Cancer Sci, 95(5): 448-53, 2004.

TESTA, M. G. & MOLINEUX, G. Haemopoiesis: a pratical approach. New York:

Oxford University Press inc. 1993, 293p.

TIETZE, F. Enzymic method for quantitative determination of nanogram amounts of

total and oxidized glutathione: applications to mammalian blood and other tissues.

Anal Biochem, 27(3): 502-22, 1969.

VAN DE LOOSDRECHT, A. A., NENNIE, E. et al. Cell mediated cytotoxicity against

U 937 cells by human monocytes and macrophages in a modified colorimetric MTT

assay. A methodological study. J Immunol Methods, 141(1): 15-22, 1991.

VIANA, M. B., MURAO, M. et al. Malnutrition as a prognostic factor in lymphoblastic

leukaemia: a multivariate analysis. Arch Dis Child, 71(4): 304-10, 1994.

VIELE, C. S. Diagnosis, Treatment, and Nursing Care of Acute Leukemia. Seminars

in Oncology Nursing, 19(2): 98-108, 2003.

VOUSDEN, K. H. p53: death star. Cell, 103(5): 691-4, 2000.

WALKER, P. R., LEBLANC, J. et al. Detection of DNA fragmentation and

endonucleases in apoptosis. Methods, 17(4): 329-38, 1999.

WALLACE, K. B. & STARKOV, A. A. Mitochondrial targets of drug toxicity. Annu Rev

Pharmacol Toxicol, 40: 353-88, 2000.

WANG, I. K., LIN-SHIAU, S. Y. et al. Induction of apoptosis by apigenin and related

flavonoids through cytochrome c release and activation of caspase-9 and caspase-3

in leukaemia HL-60 cells. Eur J Cancer, 35(10): 1517-25, 1999.

WATTANASIN, S. & MURPHY, W. S. An improved procedure for the preparation of

chalcones and related enones. Synthesis, 8: 647-650, 1980.

WON, S. J., LIU, C. T. et al. Synthetic chalcones as potential anti-inflammatory and

cancer chemopreventive agents. Eur J Med Chem, 40(1): 103-12, 2005.

XIA, Y., YANG, Z. Y. et al. Antitumor agents. Part 202: novel 2'-amino chalcones:

design, synthesis and biological evaluation. Bioorg Med Chem Lett, 10(8): 699-701,

2000.

YAMAMOTO, S., AIZU, E. et al. The potent anti-tumor-promoting agent

isoliquiritigenin. Carcinogenesis, 12(2): 317-23, 1991.

YANG, J., LIU, X. et al. Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c

from mitochondria blocked. Science, 275(5303): 1129-32, 1997.

ZAMZAMI, N., SUSIN, S. A. et al. Mitochondrial control of nuclear apoptosis. J Exp

Med, 183(4): 1533-44, 1996.

ZHANG, L., YU, J. et al. Role of BAX in the apoptotic response to anticancer agents.

Science, 290(5493): 989-92, 2000.

ZIMMERMANN, K. C., BONZON, C. et al. The machinery of programmed cell death.

Pharmacol Ther, 92(1): 57-70, 2001.

ZUANAZZI, J. A. S. Flavonóides. In: SIMÕES, C. M. O.; et al. (orgs).

Farmacognosia: da planta ao medicamento. 3 ed. Florianópolis: Editora Editora

da UFSC, Porto Alegre: Editora da UFRGS, 2000. Cap 23. p. 489-516.

ANEXOS

ANEXOSANEXOS

ANEXOS

100

9.1 Trabalhos apresentados em congressos

SORGATO, Syntia; BONETTI, Aline N; CHIARADIA, Louise D; YUNES, Rosendo A.;

NUNES, Ricardo José; SILVA, Maria Cláudia Santos; CRECZYNSKI-PASA, T. B.

Citotoxic effect of synthetic chalcones on lymphoblastic leukemia cells L-1210. In: IV

São Paulo Research Conference Cancer Today from Molecular Biology to

Treatment, 2005, São Paulo. Applied Cancer Research, 2005. v. 1. p. 100-101.

SORGATO, Syntia; CHIARADIA, Louise Domeneguini; YUNES, Rosendo Augusto;

NUNES, Ricardo José; SILVA, Maria Cláudia Santos da ; CRECZYNSKI-PASA, T. B.

Differents mechanisms of apoptosis induced by synthetic chalcones on lymphoblastic

leukemia cells L1210. In: 58a. Reunião Anual da SBPC, 2006, Florianópolis. Anais

da 58a. Reunião Anual da SBPC, 2006. v. 1. p. 52-52.

101

9.2 Artigo submetido

Antitumoral activity of synthetic chalcones on L1210 leukemia cells

Louise Domeneghini Chiaradia

, Syntia Sorgato

, Paulo César Leal

, Maria Cláudia Santos

Silva

, Ricardo José Nunes

, Tânia Beatriz Creczinsky Pasa

and Rosendo Augusto Yunes

Universidade Federal de Santa Catarina,

Departamento de Química e

Departamento de

Ciências Farmacêuticas, Campus Trindade, CEP: 88040-900, Florianópolis, SC, Brasil.

Keywords:

chalcones, leukemia, antitumoral

Corresponding Author:

Prof. Dr. Rosendo Augusto Yunes

Universidade Federal de Santa Catarina

Centro de Ciências Físicas e Matemáticas

Departamento de Química

Campus Trindade

CEP: 88040-900, Florianópolis – SC, Brasil

Tel.: +55 48 3331-9759

Fax: +55 48 3331-6844

E-mail: ryunes@qmc.ufsc.br

1. Introduction

Chalcones are essential intermediate compounds in the flavonoids biosynthesis, and

they are easily found in arboreal or smaller plants. Many works have been demonstrated anti-

inflammatory,

1-12

antinociceptive,

antioxidant

1,14,15

and antitumoral

1,2,15-20

activities for

several chalcones, besides others pharmacological effects. Changes in chalcones molecules

can result in different biological activities; rings bounded-group alterations can affect the

pharmacological activities.

102

Nakatami

et al.

(2005) showed

-benzylated dihydrochalcones isolated from roots of

Uvaria acuminata

induced apoptosis in HL-60 cells.

Kobori

et al.

(1999) described that

dihydrochalcone phloretin induced apoptosis of B16 mouse melanoma 4A5 and HL-60 human

leukemia cell lines.

LeBlanc et al. (2005) synthesized twenty-six epoxide and corresponding

pyrazole derivatives structurally related chalcones and tested for in vitro citotoxicity against

two murine cancer cell lines, B16 melanoma and L1210 leukemia, due to their planar

conformations the pyrazoles were typically less active than the corresponding chalcones,

which adopt angular conformations.

The 3,4-methylenedioxybenzaldehyde (piperonal or 1,3-benzodyoxol-5-

carboxaldehyde) is an aldehyde derivative from safrole (Figure 1)

24,25,26

a recent example of

natural active substance used as raw-material of hits for leads of new drugs. The safrole is one

of the most abundant chemical components of Brazilian volatile oils, being 80% of the

Ocotea

sp.

oil composition;

25,26

other natural sources include the Amazonian plants

Piper

hispidenervium

P. callosum

, have in their composition 98% and 64% of safrole,

respectively,

and also the Panamanian specie

P. auritum

, whose oils are composed of 70%

safrole.

In Medicinal Chemistry, the presence of the 1,3-benzodyoxolic subunit uphold to

the compound as a double hydrogen acceptor, useful in the interaction with bioreceptors,

promoting the natural product as a sinton of new hits of drugs.

Figure 1: Safrole structure.

Chalcones derived from 3,4-methylenedioxybenzaldehyde, showed high

citotoxicity in cells MDA-468 (advanced breast cancer cell line) in comparison with low

toxicity in MCF-10A (normal breast cell line).

Thus, the objective of this work was to study the toxicity of ten synthetic

chalcones chemically derived from 3,4- (metilenodioxibenzaldeide) in murine lymphoblastic

leukemia cells L1210. The objective is based on the fact that tumor cells develop resistance to

antineoplastic drugs, and multidrug resistance is one the major causes of chemotherapy

failures by human malignances.

30,31

New drugs with increased efficacy and less adverse

effects are necessary.

103

2. Results and discussion

2.1. Synthesis

Ten synthetic chalcones derived from 3,4-methylenedioxybenzaldehyde (1) was

prepared as presented in Figure 2. This method provided the attainment of compounds

substituted in the ring A.

O O

2 R: H

3 R: 4'-Br

4 R: 4'-NO

5 R: 2',5'-OCH

6 R: 2'-OH

7 R: 3'-OCH

-4'-OH*

8 R: 4'-OCH

9 R: 3',4'-OCH

10 R: 3'-NO

11 R: 3',4',5'-OCH

Figure 2: Synthesis of chalcones derived from 3,4-methylenedioxybenzaldehyde (1). a) KOH

50% v/v, methanol, r.t., 24h (* new compound).

The compounds 3 and 9 presented experimental melting points different of those

related in the literature, however, all the spectroscopic data, including the elementary analysis,

confirmed the proposed structures for these two chalcones. The compounds 7 and 10 were not

published yet, and their structures showed in this work were confirmed by chemical

identification data.

H NMR spectra revealed that all the structures were geometrically pure

and configured E (

Hα-Hβ

= 15,2-16 Hz).

2.2. Biological Assays

The Figure 3 shows the toxicity of chalcones for L1210 cells. In this figure is possible

to observe that 100 µM of the compounds 5, 7 e 11 strongly reduced the cells viability in 90.5

± 1.2%, 87.1 ± 1.1% and 86.3 ± 2.2%, respectively, when compared with the control (non

treated cells).

104

The chalcone 2 reduced the viable cells only in 28.6 ± 2.7% when compared with the

control, however, this compound was used to compare with others synthetic chalcones since it

has a simple structure, and presents any group bound at A-ring. Chalcones 3, 4, 6, 8 and 9 did

not show effective citotoxicity as well, they reduced the viable cells similarly to chalcone 2,

while chalcone 10 was not citotoxicy et all (Figure 3).

0 2 3 4 5 6 7 8 9 1011

100

***

Chalcones (100 µ

µµ

µM)

Viable cells (%)

Figure 3: Toxicity of synthetic chalcones for murine L1210 lymphoblastic leukemia cells. The

compounds were incubated with the cells for 24h. The cell viability was monitored through MTT

assay. Optical density of control groups (0) was taken as 100% of cell viability. The cell viability was

checked in the beginning of experiment by Trypan Blue exclusion. Each point represents the mean ±

S.E.M. of three identical experiments. *P < 0.05 and ***P < 0.001 compared to control groups, using

ANOVA followed by Bonferroni's t test.

The groups NO

and Br that decrease the electronic density of ring-A did not improve

the toxicity for L1210 cells, these groups are present in chalcones 3, 4 and 10. The methoxy

groups that increase the electronic density of the A-ring, present in the compounds 5, 7, 9 and

11, seem to increase the citotoxicity. However, chalcone 9, which have two methoxy groups

didn’t present effectiveness in induce cell death. Chalcones 5 and 9 contain two methoxy

groups at A-ring; nevertheless, in chalcone 5 the methoxy groups are in position

para

and

chalcone 9 in position

orto

between its selves. Chalcone 7 have one methoxy and one

hydroxyl groups in A-ring position

orto

between its selves and chalcone 11 contain three

methoxy groups in position 3’, 4’and 5’.

LeBlanc

et al.

(2005) compared the effect of a substitution in the A-ring of the

structures related chalcones and showed that the compounds containing three methoxy groups

were generally more active against B16 e L1210 cell lines than those containing only two

105

methoxy groups in the A-ring.

Comparing with our results, except chalcone 9, the

compounds with two or three methoxy groups in the A-ring (chalcones 5 and 11) showed

similar citotoxicity.

Nakatami

et al

. (2005) showed that the toxicity of uvareitin and diuvaretin was

stronger than that of isovauretin, the authors suggested that the 5’-substitution of the 2-

hydroxybenzyl group increased the citotoxicity.

Our results suggest that the substitution in

the same position by methoxy group increased the citotoxicity. The methoxy group in position

5’ in the A-ring on chalcone 5, and in position 3’ in chalcones 7 and 11 are sterically in the

same position (Figure 4). This fact suggests that the substitution at position 5’ is important for

activity, independent which group is binding. These two associated effects, density electronic

increases and 5’-substitution seems to be the important to assure the citotoxicity. Besides,

chalcones with

log P

between 2.6 and 2.85 showed higher cytotoxic effects, with the

exception of chalcone 9.

Compound 11, called by Sale, S. et al. (2006) DMU-135 (3,4-methylenedioxy-3’-4’-

5’-trimetoxy chalcone), was also tested by them, adding 0,2% in the diet mice. In this

condition no systemic side-effects were observed, on the contrary, the modified diet reduced

the mouse gastrointestinal adenoma multiplicity by 46 ± 18,3% compared to controls.

We investigated the cytotoxic effect of the compounds 5, 7 and 11 in the time-

response curve from 6 to 24 hours, comparing with compound 2 that was not effective killing

tumor cells (Figure 3). In 18 hours of incubation at concentration of 100 µM chalcones 2, 5, 7

and 11 began to induce significant cell death, however, as expected chalcone 2 did not (Figure

4).

106

0 6 12 18 24

100

Chalcone 2

Chalcone 5

Chalcone 7

Chalcone 11

***

Time (h)

Viable cells (%)

Figure 4: Time-response of the activity of chalcones on murine L1210 lymphoblastic leukemia

cells. Cells were incubated with the compounds (100 µM) for 6h, 12h, 18h and 24h and processed for

MTT assay. Optical density of control groups (0) was taken as 100% of cell viability. Cell viability

was checked in the beginning of experiment by Trypan Blue exclusion. Each point represents the

mean ± S.E.M. of three identical experiments. *P < 0.05 and ***P < 0.001 compared to control

groups, using ANOVA followed by Bonferroni's t test.

We also investigated the cytotoxic effect of the compounds 5, 7 and 11 in the

concentration-response curve in 24 and 48 hours. In 24 hours of incubation the concentration-

response was analyzed and the IC

value, which reduced the viable cell number by 50%, was

determined from the eight-point concentration-response curve. The compounds 2, 5, 7 and 11

showed a concentration-dependent cell death in 24 hours (Figure 5). The IC

value of the

compounds 2, 5, 7 and 11 were 164, 45, 63 e 64 µM, respectively. Compound 5 showed lower

value in 24 hours, and compound 2 showed the higher IC

value. In 48 hours, the

concentration-response was analyzed and the IC

value was determined from the five-point

concentration-response curve, considering that the cell exposition time to the compounds was

higher, smaller concentrations were used. The chalcones 5, 7 and 11 showed the IC

value

22, 38 and 37 µM, respectively. The IC50 of chalcone 2 in 48 hours was not possible to

determined, because this compound presented very low citotoxicity and the maximum

concentration tested in this condition was 50 µM. Chalcones 5, 7 and 11 decreased

approximately the half of IC

value when tested in 48 hours (Figure 6).

107

0 10 25 50 75 100 150 200

100

Chalcone 2

Chalcone 5

Chalcone 7

Chalcone 11

Chalcones (µ

µµ

µM)

Viable cells (%)

Figure 5: Concentration-response in 24 hours of chalcones 2, 5, 7 and 11 on murine

lymphoblastic leukemia L1210 cell line. Cells, 3 x 10

, were incubated with the compounds (10 -

200 µM) in triplicate for 24h, after that the cells were washed and processed for MTT assay. Optical

density of control groups (0) was taken as 100% cell viability. Each bar represents the mean ± S.E.M.

of three identical experiments. *P < 0.05, **P < 0.01 and

P < 0.001 compared to control groups, using

ANOVA followed by Bonferroni's t test.

0 10 20 30 50

100

Chalcone 2

Chalcone 5

Chalcone 7

Chalcone 11

Chalcones (µ

µµ

µM)

Viable cells (%)

Figure 6: Concentration-response in 48 hours of synthetic chalcones 2, 5, 7 and 11 on murine

lymphoblastic leukemia L1210 cell line. Cells, 1.5x10

, were incubated with the compounds (10 – 50

µM) in triplicate for 48h, after that they were washed and processed for MTT assay. Optical density of

control groups (0) was taken as 100% cell viability. Each bar represents the mean ± S.E.M. of three

identical experiments. **P < 0.01 and

P < 0.001 compared to control groups, using ANOVA followed

by Bonferroni's t test.

In the Figure 7 it is possible to observe the toxicity of the compounds 2, 5, 7 and 11

for VERO cells (normal cell line). The amount of cell death was 25.1 ± 4.0%, 35.5 ± 2.1%,

41,7 ± 1,7% and 47,8 ± 2.5% respectively, when compared with the control (100% of viable

108

cells). Comparing the Figures 1 and 7 it is possible to observe that the cell viability for VERO

cells was higher than that for L1210 cells. In table 1 we compared the cell viability of the

chalcones 5, 7 and 11 across both cell lines. Data showed that the compounds were much

more toxic for the tumor cell line, with P value extremely significant.

Table 1: Comparison of the cellular viability across L1210 (leukemia cell) and VERO (normal

cell line) cells.

Chalcone L1210

(Viable cells, % of control)

VERO

(Viable cells, % of control)

P value

9.5 ± 1.2 64.5 ± 2.1 < 0.0001

12.9 ± 1.1 58.3 ± 1.7 < 0.0001

13.7 ± 2.2 52.2 ± 2.5 = 0.0002

Cells were incubated with compounds (100 µM) in triplicate for 24 h, after that the cells were

washed and processed for MTT assay. Control group was taken as 100% of cell viability for L1210

and VERO cell line. P value was determinate using Student t test.

In summary, we have synthesized ten chalcones derived from 3,4-

methylenedioxybenzaldehyde and showed compounds 5, 7 and 11 were cytotoxic for L1210

cells. Compound 5 showed the lower IC

value in 24 hours and 48 hours, 45 and 22 µM,

respectively. In addition the chalcones 7 and 10 didn’t publish until this moment.

0 2 5 7 11

100

***

Chalcones (100 µ

µµ

µM)

Viable cells (%)

Figure 7: Citotoxic effect of synthetic chalcones on VERO cells (normal cell line). Compounds

were added to cells, left for 24 h, washed and cells were processed for MTT assay. Optical density of

control groups (0) was taken as 100% cell viability. Cell viability was checked in the beginning of

experiment by Trypan Blue exclusion. Each point represents the mean ± S.E.M. of three identical

experiments. *** P < 0,001 compared to control groups, using ANOVA followed by Bonferroni's t

test.

109

3. Experimental

3.1. Synthesis

The compounds were synthesized as presented in Figure 2. All reagents used were

obtained commercially (Merck, Sigma-Aldrich). The substituted chalcones (2-11) were

prepared by magnetic agitation of 3,4-methylenedioxybenzaldehyde (1) (1.50 g; 10 mmol),

methanol (30 mL), KOH 50% v/v (5 mL) and the corresponding acetophenone (10 mmol), at

room temperature for 24 hours. Was added distilled water and chloride acid 10% in the

reaction to the total precipitation of the compounds that were obtained by vacuum filtration

and later recrystallized in dichloromethano and hexane. The chalcones 2, 3, 4, 6, 8 and 9 were

previously cited, respectively, for Li and col.,

Pathak and col.,

Ariyan and Suschitzky,

Casanova,

Schwartz and col.

and for Wattanasin e Murphy.

The compounds 5 and 11

were described for Potter and Butler,

and the structures 7 and 10 were not published yet.

3.2. Physico-chemical data of synthesized compounds

The purified chalcones were obtained in yields between 40% and 88%. The structures

were identified using melting points (m.p.), infrared spectroscopy (IR),

H and

C nuclear

magnetic resonance spectroscopy (NMR), and to the unpublished, also elementary analyses.

Melting points were determined with a Microquímica MGAPF-301 apparatus and are

uncorrected. IR spectra were recorded with a Abb Bomen FTLA 2000 spectometer on KBr

disks. NMR (

H and

C NMR) were recorded on Brucker Ac-200F (200 MHz) or Varian

Oxford AS-400 (400 MHz), using tetramethylsilane as an internal standard. Elementary

analyses were obtained on a CHNS EA 1110. Percentages of C and H were in agreement with

the product formula (within + 0.4% of theoretical values to C). The purity of the synthesized

chalcones was analyzed by thin-layer chromatography (TLC) using Merck silica pre-coated

aluminum plates 200

m in thickness with several solvent systems of different polarities.

Compounds were visualized with ultraviolet light (

= 254 e 360 nm) and using sulfuric

anisaldehyde solution followed by heat as developing agent and purified by recrystallization

from hexane and dichloromethane.

H NMR spectra revelated that all the structures were

geometrically pure and configured E (

Hα-Hβ

= 15,2-16 Hz). The

log

of the chalcones were

obtained by HyperChem

program, Release 6.01 for Windows, Copyright



2000

Hypercube, Inc.

110

Compound 2: (2

)-3-(1,3-BENZODIOXOL-5-YL)-1-PHENIL-2-PROPEN-1-ONE.

, yellow light solid, m.p.: 115-117 ºC (lit. m.p.: 117 ºC)

; IV

max

/cm

-1

1658, 1215

(C=O), 1589 (C=C), 1254, 1020 (C-O), 3070, 2940, 1603, 1501, 1488, 1448, 1105, 919, 776,

699 (Ar) (KBr).

H NMR (CDCl

)

6.03 (s, 2H, -OCH

O-), 6.85 (d, 1H,

= 8.00 Hz, H5),

7.13 (d, 1H,

= 8.00 Hz, H6), 7.17 (s, 1H, H2), 7.37 (d, 1H,

= 15.6 Hz, H

), 7.48-7.58 (m,

3H, H3’, H4’, H5’), 7.74 (d, 1H,

= 15.6 Hz, H

), 8.00 (d, 2H,

= 6.8 Hz, H2’, H6’).

NMR (CDCl

)

101.88 (-OCH

O-), 106.89 (C2), 108.91 (C5), 120.33 (C6), 125.49 (C

128.65-128,83 (C2’, C3’, C5’, C6’), 129.59 (C1), 132.88 (C4’), 138.63 (C1’), 144.92 (C

148.65-150.16 (C3, C4), 190.63 (C=O).

log

: 3.36. Yield = 66%.

Compound 3: (2

)-3-(1,3-BENZODIOXOL-5-YL)-1-(4’-BROMO-PHENIL)-2-

PROPEN-1-ONE. C

BrO

, yellow light solid, m.p.: 137-139 ºC (lit. m.p.: 111-113

ºC)

144

; IV

max

/cm

-1

1657, 1215 (C=O), 1593 (C=C), 1251, 1028 (C-O), 2881, 2750, 1517,

1494, 1447, 1396, 1098, 985, 938, 799 (Ar) (KBr).

H NMR (CDCl

)

6.05 (s, 2H, -OCH

O-

), 6.85 (d, 1H,

= 8.00 Hz, H5), 7.12 (d, 1H,

= 8.00 Hz, H6), 7.16 (s, 1H, H2), 7.30 (d, 1H,

= 15.6 Hz, H

), 7.63 (d, 2H,

= 6.8 Hz, H3’, H5’), 7.74 (d, 1H,

= 15.6 Hz, H

), 7.87 (d,

2H,

= 6.8 Hz, H2’, H6’).

C NMR (CDCl

)

101.94 (-OCH

O-), 106.88 (C2), 108.94 (C5),

119.65 (C6), 125.69 (C

), 127.95 (C1), 129.38 (C4’), 130.77 (C2’, C6’), 132.11 (C3’, C5’),

137.33 (C1’), 145.48 (C

), 148.69-150.35 (C3, C4), 189.40 (C=O). Anal. Calcd for C

C, 58.03; H, 3.35; found: C, 57.94; H, 3.66.

log

: 4.15. Yield = 76%.

Compound 4: (2

)-3-(1,3-BENZODIOXOL-5-YL)-1-(4’-NITRO-PHENIL)-2-PROPEN-

1-ONE. C

, yellow solid, (1,498 g); m.p.: 200-202 ºC (lit. m.p.: 206 ºC)

145

; IV

max

/cm

-1

1656, 1212 (C=O), 1579 (C=C), 1250, 1035 (C-O), 1522, 1343, 847 (N=O), 3115,

2913, 1600, 1496, 1451, 1107, 1010, 928, 806 (Ar) (KBr).

H NMR (CDCl

)

6.05 (s, 2H, -

OCH

O-), 6.87 (d, 1H,

= 8.00 Hz, H5), 7.15 (d, 1H,

= 8.00 Hz, H6), 7.18 (s, 1H, H2), 7.31

(d, 1H,

= 15.6 Hz, H

), 7.77 (d, 1H,

= 15.6 Hz, H

), 8.13 (d, 2H,

= 8.0 Hz, H2’, H6’),

8.35 (d, 2H,

= 8.0 Hz, H3’, H5’).

C NMR (CDCl

)

102.06 (-OCH

O-), 106.91 (C2),

109.05 (C5), 119.47 (C6), 124.07 (C3’, C5’), 126.21 (C

), 129.02 (C1), 129.54 (C2’, C6’),

143.54 (C4’), 146.91 (C1’, C

), 148.82-150.52 (C3, C4), 189.06 (C=O).

log

: 3.31. Yield =

85%.

Compound 5: (2

)-3-(1,3-BENZODIOXOL-5-YL)-1-(2’,5’-DIMETHOXY-PHENIL)-2-

PROPEN-1-ONE. C

, yellow light solid, m.p.: 96-98 ºC (lit. m.p.: 101 ºC)

; IV

max

/cm

-1

1652 (C=O), 1581 (C=C), 1246, 1223, 1042, 1027 (C-O), 2992, 2834, 1602, 1491,

1445, 1412, 1100, 975, 834, 726 (Ar) (KBr).

H NMR (CDCl

)

3.80 (s, 3H,

-OCH

), 3.85

(s, 3H,

-OCH

), 6.00 (s, 2H, -OCH

O-), 6.81 (d, 1H,

= 8.00 Hz, H5), 6.93 (d, 1H,

= 8.00

Hz, H6), 7.01-7.03 (d, 1H,

= 8.00 Hz, H3’), 7.05-7.07 (d, 1H,

= 8.00 Hz, H4’), 7.10 (s,

1H, H6’), 7.17 (s, 1H, H2), 7.24 (d, 1H,

= 16.0 Hz, H

), 7.56 (d, 1H,

= 16.0 Hz, H

NMR (CDCl

)

56.08 (

-OCH

), 56.74 (

-OCH

), 101.79 (-OCH

O-), 106.91 (C2), 108.84

(C5), 113.61 (C6’), 114.64 (C3’), 119.20 (C6), 125.29-125.32 (C1’, C4’), 129.83 (C

130.08 (C1), 143.48 (C

), 148.55-149.92 (C3, C4), 152.70-153.84 (C2’, C5’), 192.55 (C=O).

log

: 2.85. Yield = 74%.

Compound 6: (2

)-3-(1,3-BENZODIOXOL-5-YL)-1-(2’-HIDROXY-PHENIL)-2-

PROPEN-1-ONE. C

, yellow solid, m.p.: 135-137 ºC (lit. m.p.: 140 ºC)

146

; IV

max

/cm

-1

3440 (OH), 1640, 1203 (C=O), 1570 (C=C), 1242, 1038 (C-O), 3076, 2925, 1619,

1502, 1491, 1440, 1098, 977, 826, 760 (Ar) (KBr).

H NMR (CDCl

)

6.04 (s, 2H, -OCH

O-

111

), 6.85-7.03 (m, 4H, H5, H6, H5’, H6’), 7.18 (s, 1H, H2), 7.49 (d, 2H,

= 15.2 Hz, H

, H4’),

7.85 (d, 1H,

= 15.2 Hz, H

), 7.91 (d, 1H, H3’), 12.87 (s, 1H, OH).

C NMR (CDCl

)

101.99 (-OCH

O-), 106.98 (C2), 109.00 (C5), 118.24 (C3’), 118.85 (C6), 119.03 (C1’),

120.31 (C5’), 125.99 (C6’), 129.32 (C1), 129.76 (C

), 136.47 (C4’), 145.58 (C

), 148.75-

150.54 (C3, C4), 163.79 (C2’), 193.79 (C=O).

log

: 3.08. Yield = 62%.

Compound 7: (2

)-3-(1,3-BENZODIOXOL-5-YL)-1-(3’-METHOXY-4-HIDROXY-

PHENIL)-2-PROPEN-1-ONE. C

, yellow solid, m.p.: 134-136 ºC; IV

max

/cm

-1

3216

(OH), 1643, 1215 (C=O), 1568 (C=C), 1254, 1032 (C-O), 3088, 2900, 1602, 1500, 1447,

1427, 1102, 975, 931, 801 (Ar) (KBr).

H NMR (CDCl

)

3.97 (s, 3H, OCH

), 6.02 (s, 2H, -

OCH

O-), 6.26 (s, 1 H, OH), 6.84 (d, 1H,

= 8.00 Hz, H5), 6.99 (d, 1H,

= 8.00 Hz, H6),

7.12 (d, 1H,

= 8.00 Hz, H6’), 7.17 (s, 1H, H2), 7.39 (d, 1H,

= 15.6 Hz, H

), 7.62 (s, 1H,

H2’), 7.63 (d, 1H,

= 8.00 Hz, H5’), 7.73 (d, 1H,

= 15.6 Hz, H

C NMR (CDCl

)

56.37 (OCH

), 101.85 (-OCH

O-), 106.84 (C2), 108.89 (C5), 110.67 (C2’), 114.03 (C5’),

119.82 (C6), 123.77 (C6’), 125.32 (C

), 129.74 (C1), 131.37 (C1’), 144.08 (C

), 147.09-

148.59 (C3, C4), 149.97 (C4’), 150.52 (C3’), 188.66 (C=O). Anal. Calcd for C

: C,

68.45; H, 4.73; found: C, 68.18; H, 5.23.

log

: 2.82. Yield = 47%.

Compound 8: (2

)-3-(1,3-BENZODIOXOL-5-YL)-1-(4’-METHOXY-PHENIL)-2-

PROPEN-1-ONE. C

, yellow light solid, m.p.: 131-132 ºC (lit. m.p.: 134-135 ºC)

147

;

max

/cm

-1

1652, 1219 (C=O), 1582 (C=C), 1243, 1219, 1036, 1021 (C-O), 2945, 2903,

1600, 1499, 1442, 1419, 1098, 993, 929, 812 (Ar) (KBr).

H NMR (CDCl

)

3.87 (s, 3H,

OCH

), 6.01 (s, 2H, -OCH

O-), 6.84 (d, 1H, H5), 6.97 (d, 2H,

= 7.6 Hz, H3’, H5’), 7.01 (d,

1H, H6), 7.16 (s, 1H, H2), 7.40 (d, 1H,

= 16.0 Hz, H

), 7.70 (d, 1H,

= 16.0 Hz, H

), 8.02

(d, 2H,

= 7.6 Hz , H2’, H6’).

C NMR (CDCl

)

55.73 (OCH

), 101.84 (-OCH

O-), 106.83

(C2), 108.87 (C5), 114.03 (C3’, C5’), 120.04 (C6), 125.30 (C

), 129.74 (C1’), 130.95 (C2’,

C6’), 131.44 (C1), 144.04 (C

), 148.59-149.96 (C3, C4), 163.54 (C4’), 188.78 (C=O).

log

3.11. Yield = 77%.

Compound 9: (2

)-3-(1,3-BENZODIOXOL-5-YL)-1-(3’,4’-DIMETHOXY-PHENIL)-2-

PROPEN-1-ONE. C

, yellow light solid, m.p.: 126-128 ºC (lit. m.p.: 143-144 ºC)

148

;

max

/cm

-1

1656 (C=O), 1581 (C=C), 1261, 1248, 1040, 1025 (C-O), 3015, 2886, 1595,

1499, 1464, 1413, 1096, 992, 932, 791 (Ar) (KBr).

H NMR (CDCl

)

3.96 (s, 3H, OCH

3.97 (s, 3H, OCH

), 6.02 (s, 2H, -OCH

O-), 6.84 (d, 1H,

= 8.4 Hz, H5), 6.92 (d, 1H,

= 8.4

Hz, H6), 7.12 (d, 1H,

= 7.6 Hz, H6’), 7.17 (s, 1H, H2), 7.39 (d, 1H,

= 15.6 Hz, H

), 7.61

(s, 1H, H2’), 7.66 (d, 1H,

= 7.6 Hz, H5’), 7.73 (d, 1H,

= 15.6 Hz, H

C NMR (CDCl

)

56.28 (OCH

), 101.85 (-OCH

O-), 106.81 (C2), 108.88 (C5), 110.15 (C5’), 110.90 (C2’),

119.81 (C6), 123.11 (C6’), 125.34 (C

), 129.71 (C1), 131.64 (C1’), 144.08 (C

), 148.58-

149.97 (C3, C4), 149.39 (C3’), 153.35 (C4’), 188.69 (C=O). Anal. Calcd for C

: C,

69.22; H, 5.16; found: C, 69.29; H, 5.56.

log

: 2.85. Yield = 72%.

Compound 10: (2

)-3-(1,3-BENZODIOXOL-5-YL)-1-(3’-NITRO-PHENIL)-2-

PROPEN-1-ONE. C

, brown solid, m.p.: 144-146 ºC; IV

max

/cm

-1

1661, 1211

(C=O), 1588 (C=C), 1248, 1036 (C-O), 1527, 1347, 850 (N=O), 3040, 2900, 1609, 1503,

1489, 1446, 1102, 927, 808, 700 (Ar) (KBr).

H NMR (CDCl

)

6.05 (s, 2H, -OCH

O-), 6.86

(d, 1H,

= 8.0 Hz, H5), 7.15 (d, 1H,

= 8.0 Hz, H6), 7.19 (s, 1H, H2), 7.36 (d, 1H,

= 15.2

Hz, H

), 7.70 (m, 1H, H5’), 7.81 (d, 1H,

= 15.2 Hz, H

), 8.33 (d, 1H,

= 8.0 Hz, H6’), 8.43

(d, 1H,

= 8.0 Hz, H4’), 8.81 (s, 1H, H2’).

C NMR (CDCl

)

102.06 (-OCH

O-), 107.00

(C2), 109.02 (C5), 118.80 (C6), 123.40 (C

), 126.18 (C6'), 127.15 (C1), 129.02 (C4’), 130.09

112

(C5’), 134.26 (C2’), 139.93 (C1’), 146.85 (C

), 148.62 (C3’), 148.79-150.77 (C3, C4),

188.06 (C=O). Anal. Calcd for C

: C, 64.65; H, 3.73; N, 4.71; found: C, 65.02; H,

4.35; N, 4.99.

log

: 3.31. Yield = 40%.

Compound 11: (2

)-3-(1,3-BENZODIOXOL-5-YL)-1-(3’,4’,5’-TRIMETHOXY-

PHENIL)-2-PROPEN-1-ONE. C

, yellow light solid, m.p.: 133-134ºC (lit. m.p.: 135

ºC)

; IV

max

/cm

-1

1651, 1227 (C=O), 1572 (C=C), 1261, 1244, 1067, 1039 (C-O), 2900,

2960, 1501, 1447, 1410, 992, 933, 834, 804 (Ar) (KBr).

H NMR (CDCl

)

3.91 (s, 3H,

OCH

), 3.92 (s, 3H, OCH

), 3.93 (s, 3H, OCH

), 6.00 (s, 2H, -OCH

O-), 6.82 (d, 1H,

= 8.0

Hz, H5), 7.10 (d, 1H,

= 8.0 Hz, H6), 7.15 (s, 1H, H2), 7.24 (s, 2H, H2’, H6’), 7.30 (d, 1H,

= 15.6 Hz, H

), 7.72 (d, 1H,

= 15.6 Hz, H

C NMR (CDCl

)

56.58 (

-OCH

), 61.21

(

-OCH

), 101.91 (-OCH

O-), 106.11 (C2), 106.11-106.84 (C2’, C6’), 108.91 (C5), 119.86

(C6), 125.53 (C

), 129.54 (C1), 133.91 (C1’), 142.49 (C4’), 144.83 (C

), 148.62-150.15 (C3,

C4), 153.33 (C3’, C5’), 189.26 (C=O).

log

: 2.60. Yield = 88%.

3. Biological Assays

3.3.2. Reagents

Tissue culture media and fetal bovine serum were purchased from CULTILAB (São

Paulo, Brazil), penicillin/streptomycin were purchased from GIBCO (Grand Island, NY), isopropanol

were purchased from Merck (Darmstat, Germany), 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-

diphenyltetrazolium bromide (MTT) and N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N’-2-ethanesulfonic acid]

(HEPES) were purchased from Sigma (St. Louis, MO, USA).

3.3.3. Cell lines, Cell Culture

Murine L1210 lymphoblastic leukemia cells were obtained from American Type

Culture Cell (ATCC) and VERO cells were obtained from Associação Técnico Científica

Paul Ehrlich (APABCAM, Rio de Janeiro, Brazil). The cells were cultured in DMEM

supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL

streptomycin and 10 mM HEPES. The cell cultures were maintained at 37

C in a 5% CO

humidified atmosphere and pH 7.4. In all experiments, viable cells were checked in the

beginning of experiment by Trypan Blue exclusion.

3.3.4. Citotoxicity

The citotoxic effect of synthetic chalconas was evaluated using a MTT assay.

Briefly, 3 x

cells/well were incubated in triplicate with compounds dissolved in DMSO and diluted with

medium culture to their final concentrations (10 - 200 µM) in microplates 96-well. After the

incubation time at 37ºC, the cells were washed with new medium culture and 10 µl MTT (5mg/mL)

was added followed by 3 h incubation at 37ºC. The precipitated formazan was dissolved in 100 µl acid

113

isopropanol solution (isopropanol containing HCL 0.04 N) and the absorbance was measured at 540

nm using microwell system reader (Organon Teknika, Belgium).

For time-response curve, 3 x 10

cells were incubated with synthetic chalcones at

concentration 100 µM for 6, 12, 18 and 24 hours following with MTT assay.

For concentration-response curves, the cells, 3 x 10

were incubated with synthetic

chalcones at concentration range of 10 to 200 µM for 24h and 1.5 x 10

cells were incubated

for 48h at concentration 10 to 50 µM following with MTT assay. The IC

value (a

concentration produces 50% reduction in the viable cell number) was calculated from the

concentration-response curves.

3.3.5. Statistical analysis

The results are presented as mean ± S.E.M. of triplicates from three independent experiments.

Statistical significance was assessed by ANOVA followed by Bonferroni’s

-test, and P <

0.05 was taken as statistically significant.

4. References

1. Dimmock, J. R.; Elias, D. W.; Beazely, M. A.; Kandepu, N. M.

Curr Med Chem

. 1999,

1125-1149.

2. Won, S. J.; Liu, C. T.; Tsao; L. T.; Weng, J. R.; Ko, H. H.; Wang, J. P.; Lin, C. N.

Eur J

Med Chem

. 2005,

(1), 103-112.

3. Ko, H. H.; Tsao, L. Y.; Yu, K. L.; Liu, C. T.; Wang, J. P.; Lin, C. N.

Bioor Med Chem

2003,

, 105-111.

4. Herencia, F.; Ferrandiz, M. L.; Ubeda, A.; Dominguez, J. N.; Charris, J. E.; Lobo, G. M.;

Alcaraz, M. J.

Bioorg Med Chem Lett

. 1998,

(10), 1169-1174.

5. Meng, C. Q.; Zheng, X. S.; Ni, L.; Ye, Z.; Simpson, J. E.; Worsencroft, K. J.; Hotema, M.

R.; Weingarten, M. D.; Skudlarek, J. W.; Gilmore, J. M.; Hoong, L. K.; Hill, R. R.; Marino,

E. M.; Suen, K. L.; Kunsch, C.; Wasserman, M. A.; Sikorski, J. A.

Bioorg Med Chem Lett

2004,

(6), 1513-1517.

6. Deshpande, A. M.; Argade, N. P.; Natu, A. A.; Eckman, J.

Bioorg Med Chem

. 1999,

(6),

1237-1240.

7. Rani, P.; Srivastava, V. K.; Kumar, A.

Eur J Med Chem

. 2004,

(5), 449-452.

8. Sogawa, S.; Nihro, Y.; Ueda, H.; Izumi, A.; Miki, T.; Matsumoto, H.; Satoh, T.

J Med

Chem

. 1993,

(24), 3904-3909.

9. Batt, D. G.; Goodman, R.; Jones, D. G.; Kerr, J. S.; Mantegna, L. R.; McAllister, C.;

Newton, R. C.; Nurnberg, S.; Welch, P. K.; Covington, M. B.

J Med Chem

. 1993,

(10),

1434-1442.

10. Herencia, F.; Ferrandiz, M. L.; Ubeda, A.; Guillen, I.; Dominguez, J. N.; Charris, J. E.;

Lobo, G. M.; Alcaraz, M. J.

FEBS Lett

. 1999,

453

(1-2), 129-134.

114

11. Herencia, F.; Lopez-Garcia, M. P.; Ubeda, A.; Ferrandiz, M. L. Nitric Oxide. 2002,

(2),

242-246.

12. Rojas, J.; Dominguez, J. N.; Charris, J. E.; Lobo, G.; Paya, M.; Ferrandiz, M. L.

Eur J

Med Chem

. 2002,

(8), 699-705.

13. Correa, R.; Pereira, M. A.; Buffon, D.; dos Santos, L.; Cechinel Filho, V.; Santos, A. R.;

Nunes, R. J.

Arch Pharm

. 2001.

334

(10), 332-334.

14. Anto, R. J.; Sukumaran, K.; Kuttan, G.; Rao, M. N.; Subbaraju, V.; Kuttan, R.

Cancer

Lett

. 1995,

(1), 33-37.

15. Mukherjee, S.; Kumar, V.; Prasad, A. K.; Raj, H. G.; Bracke, M. E.; Olsen, C. E.; Jain, S.

C.; Parmar, V. S.

Bioorg Med Chem

. 2001,

(2), 337-345.

16. Nam, N. H.; Kim, Y.; You, Y. J.; Hong, D. H.; Kim, H. M.; Ahn, B. Z.

Eur J Med Chem

2003,

(2), 179-187.

17. Rao, Y. K.; Fang, S. H.; Tzeng, Y. M.

Bioorg Med Chem

. 2004,

(10), 2679-2686.

18. Xia, Y.; Yang, Z. Y.; Xia, P.; Bastow, K. F.; Nakanishi, Y.; Lee, K. H.

Bioorg Med Chem

Lett

. 2000,

(8), 699-701.

19. Shibata, S.

Stem Cells

. 1994,

(1), 44-52.

20. Yamamoto, S.; Aizu, E.; Jiang, H.; Nakadate, T.; Kiyoto, I.; Wang, J. C.; Kato, R.

Carcinogenesis

. 1991,

(2), 317-23.

21. Nakatani, N.; Ichimaru, M.; Moriyasu, M.; Kato A.

Biol Pharm Bull

. 2005,

(1), 83-86.

22. Kobori, M.; Iwashita, K.; Shinmoto, H.; Tsushida, T.

Biosci Biotechnol Biochem

. 1999,

(4), 719-725.

23. LeBlanc, R.; Dickson, J.; Brown, T.; Stewart, M.; Pati, H. N.. VanDerveer, D.; Arman,

H.; Harris, J.; Pennington, W.; Holt, H. L.; Lee, M.

Bioorg Med Chem

. 2005,

(21), 6025-

6034.

24. Lima, P. C.; Lima, L. M.; da Silva, K. C.; Leda, P. H.; de Miranda, A. L.; Fraga, C. A.;

Barreiro, E. J.

Eur J Med Chem

. 2000,

(2), 187-203.

25. Barreiro, E. J. In

Plantas Medicinais: sob a ótica da Química Medicinal Moderna

; Yunes,

R. A.; Calixto, J. B.; Ed.; Argos: Chapecó, 2001. pp. 238-260.

26. Barreiro, E. J.; Fraga, C. A. M.; Araújo Jr.; J. X. de. In: Farmacognosia: da planta ao

medicamento; Simões, C. M. O.; et al.; Ed; Editora da UFSC: Florianópolis, Editora da

UFRGS: Porto Alegre, 2001. pp 127-138.

27. Maia, J. G. S.; da Silva, M. L.; Luz, A. I. R.; Zoghbi, M. G. B.; Ramos, L. S.

Quim Nova

1987,

(3), 200-204.

28. Gupta, M. P.; Arias, T. D.; Williams, N. H.; Bos, R.; Tattje, D. H. E.

J Nat Prod

. 1985,

(2), 330.

29. Potter, G. A.; Butler, P. C. UK

WO 03/028713

. 2003. 100p.

30. Stavrovskaya, A. A.

Biochemistry

. 2000,

(1), 95-106.

31. Ozben T.

FEBS Lett

. 2006,

580

(12), 2903-2909.

32. Sale, S.; Tunstall, R. G.; Ruparelia, K. C.; Butler, P. C.; Potter, G. A.; Steward, W. P.;

Gescher, A. J.

Invest New Drugs

. 2006,

(6), 459-464.

33. Li, J. T.; Yang, W. Z.; Wang, S. X.; Li, S. H.; Li, T. S.

Ultrason Sonochem

. 2002,

(5),

237-239.

115

34. Pathak, V. N.; Oza, C. K.; Gupta, R.; Tiwari, R.; Chaudhary, S.

Synthesis and Reactivity

in Inorganic and Metal-Organic Chemistry

. 2003,

(4), 607-624.

35. Ariyan, Z. S.; Suschitzky, H.

J Chem Soc

. 1961, Abstracts, 2242-2244.

36. Casanova, J. France

Nº 73 43938

. 1973. 21 p.

37. Schwartz, M. A.; Rose, B. F.; Holton, R. A.; Scott, S. W.

J Am Chem Soc

. 1977,

(8),

2571-2578.

38. Wattanasin, S.; Murphy, W. S.

Synthesis

. 1980,

, 647-650.

39. van de Loosdrecht, A. A.; Nennie, E.; Ossenkoppele, G. J.; Beelen, R. H.; Langenhuijsen,

M. M.

J Immunol Methods

. 1991,

141

(1),15-22.

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