( PDF ) Avaliação do efeito de chalconas sobre a linhagem celular B16-F10 de melanoma

Download PDF

ads:

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

Centro de Ciências da Saúde

Programa de Pós-Graduação em Farmácia

AVALIAÇÃO DO EFEITO DE CHALCONAS SOBRE A LINHAGEM CELULAR

B16-F10 DE MELANOMA

ANDRÉIA LILIAN FORMENTO NAVARINI

Florianópolis - SC, DEZEMBRO, 2007.

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

ANDRÉIA LILIAN FORMENTO NAVARINI

AVALIAÇÃO DO EFEITO DE CHALCONAS SOBRE A LINHAGEM CELULAR

B16-F10 DE MELANOMA

Dissertação apresentada ao programa de Pós-

graduação em Farmácia da Universidade

Federal de Santa Catarina, como requisito

parcial para obtenção do grau de Mestre em

Farmácia. Área de concentração: Fármacos e

Medicamentos

Orientadora: Prof.ª Dr.ª Tânia Beatriz

Creczynski Pasa

Florianópolis - SC, DEZEMBRO 2007.

ads:

Andréia Lílian Formento Navarini

AVALIAÇÃO DO EFEITO DE CHALCONAS SOBRE A LINHAGEM CELULAR

B16-F10 DE MELANOMA

Esta Dissertação foi julgada e aprovada para a obtenção do título de

Mestre em Farmácia no Programa de Pós-Graduação em Farmácia da

Universidade Federal de Santa Catarina.

Florianópolis-SC, 17 de dezembro de 2007.

__________________________________

Prof. Dr. Marcos Antônio Segatto Silva

Coordenador do Programa

BANCA EXAMINADORA:

_______________________________

Prof.ª Dr.ª Tânia B. Creczynski Pasa

Orientadora

_______________________________

Prof.ª Dr.ª Cidônia Lourdes Vituri

(ACL - UFSC)

_______________________________

Prof.ª Drº Márcio Alvarez da Silva

(ACL - UFSC)

_______________________________

Prof.ª Dr.ª Maike Weber Biavati

(UNIVALI)

AGRADECIMENTOS

Quando nos propomos a realizar algo, levamos em consideração uma série

de elementos essenciais para a obtenção do êxito. Além da nossa disponibilidade,

dedicação e determinação em atingir as metas propostas, o principal fator

considerado é o universo familiar, de amigos e de colaboradores, com quem

contamos estar lado a lado, até o fim da missão, numa intensa relação fraternal e de

trabalho, sem a qual não sairíamos da fase embrionária, padeceríamos pelo

caminho.

Palavras são palavras e nada mais. Pudera eu retribuir individualmente às

pessoas que estiveram comigo durante essa caminhada, sem as quais eu não teria

alcançado o meu objetivo. A vocês é que dedico os mais sinceros agradecimentos:

A Deus pela serenidade e discernimento nas horas de dúvida, que cuidou de

mim, que iluminou o meu caminho;

Ao meu marido Neivo pelo amor, apoio, compreensão, paciência e

colaboração na realização deste trabalho;

À minha filha Izabella, em quem me inspiro, por ter compreendido e entendido

o porquê de às vezes não termos ficado mais tempo juntas;

Aos meus pais e irmãs pelo estímulo e compreensão, minha gratidão;

À prof.ª Tânia Beatriz Creczynski Pasa pela amizade sincera,

companheirismo, engajamento incondicional e pela impecável orientação que

resultou em relevante aprendizado, que me acompanhará e me guiará pelos tempos;

À Prof.ª Maria Cláudia por todos os ensinamentos, especialmente na fase de

aprendizado de cultura celular, e por disponibilizar a estrutura de seu laboratório.

Aos laboratórios de pesquisa do Hospital Universitário (HU) e aos bioquímicos

por disponibilizarem equipamentos utilizados na pesquisa, em especial à professora

Maria Luíza Bazzo pela atenção e disponibilidade;

Às bioquímicas do laboratório de hematologia, Samira, Marlene e Nicéia, pelo

apoio prestado;

Às colegas do laboratório de pesquisa do HU, Marley, Aline Costa, Aline

Bonetti, Flávia e Fernanda, pelo apoio e companheirismo;

Àos colegas do laboratório de bioenergética e bioquímica de macromoléculas,

Vânia Lima, Vânia Noldin, Márcio, Ana, Betina, Francisco, Juliana, Maurícia, Andrea,

Evelyn, Clarissa, Melina e Tiago, pelo companherismo e troca de experiências;

Ao Prof. Rosendo A. Yunes e suas alunas Louise e Alessandra pela síntese

das chalconas utilizadas neste trabalho, pela constante dedicação e disponibilidade;

À Claudriana pelo apoio incondicional em todas as etapas do meu mestrado,

mostrando-se companheira, amiga, estando sempre disponível em ajudar e ensinar;

À Syntia pela disposição em repassar seus conhecimentos, pela amizade e

apoio;

À Mirela por ter-me dado inúmeras orientações, principalmente no início dos

meus trabalhos;

Ao Programa de Pós Graduação em Farmácia da Universidade Federal de

Santa Catarina por ter proporcionado a realização desta minha formação

profissional, acadêmica e científica;

A CAPES e ao CNPq pelo suporte financeiro;

A todos os que de uma forma ou de outra contribuíram para que eu

alcançasse este objetivo, expresso os meus mais sinceros agradecimentos.

O homem, esse curioso, não se satisfaz com o conhecimento do meio em que

se agita.

Impelido por uma curiosidade instintiva, contempla, perscruta, ausculta,

esvurma e punciona o abismo hiante que o insula na mesquinhez de sua pequenina

morada perdida na imensidão do universo, procurando com ânimo sempre renovado

conhecer a verdade incognoscível e inatingível que se oculta além, esfumando-se no

éter qual miragem fugidia.

Tudo em vão! Embora aumente dia-a-dia a superfície da pequenina ilha do

seu conhecimento, o homem verifica atônito que ela nada representa no oceano

imensurável do desconhecido.

Nelson de Sampaio Mitke

RESUMO

Chalconas são compostos intermediários essenciais para a biossíntese dos

flavonóides em plantas. Têm demonstrado uma grande variedade de efeitos

farmacológicos, como: atividade antibacteriana, antiinflamatória, antiviral,

antitumoral, entre outros. Em vista disso, o objetivo deste trabalho foi estudar a

atividade antitumoral das chalconas derivadas quimicamente do 3,4–

metilenodioxibenzaldeído e da 2,4,6-trimetoxiacetofenona e a das chalconas

hidroxiladas, em células murinas de melanoma B16-F10. Foi analisada a viabilidade

celular em células tumorais e em células não-tumorais (Vero), bem como o

mecanismo de morte celular. Observou-se que as chalconas derivadas do 3,4-

metilenodioxibenzaldeído 3-(1,3-benzodioxol-5-il)-1-fenil-2-propen-1-ona (1), 3-(3-

metoxifenil-1-fenil)-2-propen-1-ona (2) e 3-(1,3-benzodioxol-5-IL)-1-(3'-metoxi-4-

hidroxiI-fenil)-2-propen-1-ona (7) reduziram a quantidade de células viáveis em 47%,

78% e 57%, respectivamente, e mostraram menor efeito tóxico para as células Vero

em 32%, 54% e 48%, respectivamente. Porém, induziram a morte celular por

necrose. Dentre as chalconas derivadas da 2,4,6-trimetoxiacetofenona, os

compostos 3-(3-nitro-fenil)-1-(2',4',6'-trimetoxi-fenil)-2-propen-1-ona (1), 3-(3,4-

dicloro-fenil)-1-(2',4',6'-trimetoxi-fenil)-2-propen-1-ona (2) e 3-(2-cloro-fenil)-1-(2',4',6'-

trimetoxi-fenil)-2-propen-1-ona (9) reduziram o número de células viáveis em 82%,

90% e 75%, respectivamente e induziram a fragmentação do DNA. Todavia, quando

testadas nas células Vero, diminuíram significativamente a viabilidade celular em

72%, 77% e 64%. Enquanto que as hidroxichalconas -3-(1-naftalenil)-1-(3’-hidroxi-

fenil)-2-propen-1-ona (1), -3-(1-naftalenil)-1-(2’-hidroxi-fenil)-2-propen-1-ona (3) e 2-

carboxi-3’-bromo-2’-hidroxi-4’,6’-dimetoxichalcona (13) reduziram a viabilidade

celular da B16-F10, em 98%, 75% e 50%, e da célula Vero, em 83%, 39% e 30%,

respectivamente, quando comparadas com o grupo controle. Apenas as

hidroxichalconas (1) e (3) induziram a fragmentação do DNA, quando testadas nas

50,

57µM e 63µM, respectivamente, em 24h. A hidroxichalcona 1 mostrou o menor

valor de IC

em 24 e em 72 horas, nas concentrações de 57µM e 12µM,

respectivamente. A hidroxichalcona 3 apresentou o menor valor de IC

em 48h,

28µM. Através de ensaios com análogos metoxilados, no anel A, pode-se sugerir

que os grupos hidroxilas, presentes somente neste anel, sejam responsáveis pela

citotoxicidade dos compostos 1 e 3. Além disso, foi avaliado o potencial pró-

oxidante, a concentração citosólica de glutationa total (GSH), a concentração

mitocondrial de glutationa total, a concentração intracelular de ATP e a habilidade

das chalconas hidroxiladas 1, 3 e 13 em inibir a adesão celular. A depleção de GSH

citosólica mostrou-se proporcional à produção de espécies reativas de oxigênio

pelos compostos 1, 3 e 13. Entretanto, a depleção da GSH mitocondrial pode ser

conseqüência da disfunção mitocondrial, sugerindo que os compostos 1 e 3, que

induzem morte celular por apoptose, podem interferir no potencial de membrana

mitocondrial e na síntese do ATP. Considerando também a habilidade das

hidroxichalconas 1 e 3 para inibir a adesão celular, essas chalconas hidroxiladas,

potencialmente antimetastáticas, são promissoras para a continuidade de futuras

investigações.

ABSTRACT

Chalcones are essential intermediate compounds in the flavonoid

biosynthesis. They display a wide variety of pharmacological effects, including

antibacterial, anti-inflammatory, antiviral, antitumor, besides others. The objective of

this work was study the antitumoral activity of chalcones chemically derived from 3,4-

methylenedioxybenzaldheyde, from 2,4,6-trimethoxyacetophenone and of

hydroxychalcones in murine B16-F10 melanoma cells. It was analyzed the cellular

viability in tumoral and non tumoral cells (Vero) as well as the mechanism of cell

death. We observed that the chalcones derivative of 3,4-

methylenedioxybenzaldheyde: 3-(1,3-benzodioxol-5-il)-1-phenyl-2-propen-1-one (1);

3-(3-methoxyphenyl-1-phenyl-2-propen-1-one (2) and 3-(1,3-benzodioxol-5-iI)-1-(3'-

methoxy-4-hydroxyI-phenyl)-2-propen-1-one (7) reduced the number of viable cells in

48%, 78% and 57%, respectively and showed smaller toxicity to Vero cells 33%, 54%

and 48% respectively, when compared with the control. However, they induced cell

death by necrosis. Among the chalcones derivative of 2,4,6-trimethoxyacetophenone

the compounds 3-(3-nitro-phenyl)-1-(2',4',6'-trimethoxy-phenyl)-2-propen-1-one (1);

3-(3,4-dicloro-phenyl)-1-(2',4',6'-trimethoxy-phenyl)-2-propen-1-one (2) and 3-(2-

cloro-phenyl)-1-(2',4',6'-trymethoxy-phenil)-2-propen-1-one (9) decreased the number

of viable cells in 82%, 90% and 75%, respectively, when compared with the control

and induced DNA fragmentation. However, when tested in Vero cells they reduced

significatively the cell viability in 72 %, 77% e 64%. While the hydroxychalcones -3-

(1-naphtalenyl)-1-(3’-hydroxy-phenyl)-2-propen-1-one (1); -3-(1-naphtlenyl)-1-(2’-

hydroxy-phenyl)-2-propen-1-one were analyzed (3) and 2-carboxy-3’-bromo-2’-

hydroxy-4’,6’-dimethoxychalcone (13) reduced the cell viability B16-F10 line in 98%,

75% and 50% and of Vero cells in 82%, 39% and 30%, respectively, when compared

with the control. Only the hydroxychalcones (1) and (3) induced the DNA

fragmentation in IC

57µM and 63µM, respectively, in 24h. The compound 1 showed

smaller IC

value in 24h e 72h, 57µM and 12µM respectively. The hydroxychalcone

3 showed the smallest IC

value in 48h, 28µM. We suggest that the hydroxyl groups,

present only in the A-ring, increased the cytotoxicity of compounds 1 and 3, while the

presence of others substituents on the A-ring decreased the cytotoxic effect of

compound 13. Besides, it was evaluated the pro-oxidant potential, cytosolic

glutathione cellular concentration; mitochondrial glutathione concentration,

intracellular ATP concentration and the ability of hidroxichalcones 1, 3 e 13 inhibiting

the cell adhesion. Cytosolic GSH depletion was proportional to the production of

reactive oxygen species induced by compounds 1, 3 e 13. However, mitochondrial

GSH depletion can be a consequence of mitochondrial dysfunction, suggesting that

the compounds 1 e 3 that induced apoptosis in B16-F10 may be interfering on

mitochondrial membrane potential and consequently on ATP synthesis. Considering

these properties and the ability of hydroxychalcones 1 e 3 inhibiting cell adhesion,

these hydroxychalcones antimetastatic potentially, are prominence compound for

further investigation.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

1. INTRODUÇÃO

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Câncer de pele não-melanoma 20

2.2 Câncer de pele melanoma 21

2.3 Moléculas de adesão celular 25

2.4 Apoptose e necrose 27

2.5 Estresse oxidativo e glutationa 31

2.6 Metabolismo energético de células tumorais 35

2.7 Flavonóides e chalconas 37

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral 42

3.2 Objetivos específicos 42

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Reagentes 45

4.2 Síntese das chalconas 45

4.3 Cultura de células 45

4.3.1 Tratamento das células 46

4.4 Ensaio de viabilidade celular (teste do MTT) 46

4.5 Análise de apoptose pelo método de fragmentação nuclear 47

4.6 Determinação da curva dependente de concentração 48

4.7 Determinação da citotoxicidade dos compostos na presença dos

antioxidantes SOD e TROLOX®

4.8 Avaliação da produção de espécies reativas de oxigênio através de

microscopia de fluorescência

4.9 Determinação da concentração de glutationa total citosólica 49

4.10 Determinação da concentração de glutationa total mitocondrial 50

4.11 Determianção da concentração de ATP, método luciferin-luciferase 50

4.12 Análise da inibição de adesão celular pelo método do cristal violeta 51

4.13 Análise estatística 51

4.14 Desenho experimental 52

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Síntese das chalconas 55

5.1.1 Chalconas derivadas do 3,4-metilenodioxibenzaldeído 55

5.1.2 Chalconas derivadas da 2,4,6-trimetoxiacetofenona 55

5.1.3 Chalconas hidroxiladas 56

5.2 Citototoxicidade das chalconas em células tumorais, células não-

tumorais e análise do DNA

5.3 Atividade das hidroxichalconas dependente de concentração 67

5.4 Citotoxicidade das hidroxichalconas na presença de antioxidantes 69

5.5 Produção de espécies reativas de oxigênio pelas hidroxichalconas 73

5.6 Concentração de glutationa total citosólica 75

5.7 Concentração de glutationa total mitocondrial 77

5.8 Concentração de ATP 79

5.9 Adesão celular 82

6. CONCLUSÕES

7. PERSPECTIVAS

8. REFERÊNCIAS

9. ANEXOS

104

9.1 Trabalhos apresentados em congressos 105

9.2 Artigo a ser submetido na revista “European Journal of Medicinal

Chemistry”

107

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.

A - Carcinoma basocelular, B - Carcinoma epidermóide 20

Figura 2.

Melanoma maligno 21

Figura 3.

Mecanismos de morte celular: necrose e apoptose 27

Figura 4.

As duas principais vias apoptóticas 29

Figura 5.

Estrutura da glutationa 33

Figura 6.

Núcleo fundamental das chalconas 38

Figura 7.

Desenho experimental 53

Figura 8.

Reação da síntese das chalconas derivadas do 3,4-

metilenodioxibenzaldeído

Figura 9.

Reação da síntese das chalconas derivadas da 2,4,6-

trimetoxiacetofenona

Figura 10.

Reação da síntese das hidroxichalconas 56

Figura 11.

Efeito citotóxico das chalconas derivadas do 3,4-

metilenodioxibenzaldeído em células B16-F10

Figura 12.

Efeito citotóxico das chalconas derivadas do 3,4-

metilenodioxibenzaldeído em células Vero (não-tumorais)

Figura 13.

Necrose induzida por chalconas derivadas do 3,4-

metilenodioxibenzaldeído em células B16-F10

Figura 14.

Efeito citotóxico das chalcona derivadas da 2,4,6-

trimetoxiacetofenona em células B16-F10

Figura 15.

Fragmentação do DNA induzida por chalconas derivadas da

2,4,6-trimetoxiacetofenona em células B16-F10

Figura 16.

Efeito citotóxico das chalconas derivadas da 2,4,6

trimetoxiacetofenona em células Vero (não-tumorias)

Figura 17.

Efeito citotóxico das hidroxichalconas em células B16-F10

Figura 18.

Figura 19.

Figura 20.

Efeito citotóxico das hidroxichalconas em células Vero (não-

tumorais)

Fragmentação do DNA induzida por hidroxichalconas em células

B16-F10

Atividade das hidroxichalconas dependente de concentração em

células B16-F10, em 24h

Figura 21.

Figura 22.

Figura 23.

Figura 24.

Figura 25.

Figura 26.

Figura 27.

Figura 28.

Figura 29.

Atividade das hidroxichalconas dependente de concentração em

células B16-F10, em 48h

Atividade das hidroxichalconas dependente de concentração em

células B16-F10, em 72h

A – Atividade da SOD dependente de concentração em células

B16-F10 e B – Atividade das hidroxichalconas 1, 3 e 13

dependente de concentração, associadas à SOD em células

B16-F10

A - Atividade do TROLOX® dependente de concentração em

células B16-F10 e B - Atividade das hidroxichalconas 1, 3 e 13

dependente de concentração, associadas ao TROLOX® em

células B16-F10

Avaliação da produção de espécies reativas de oxigênio pelas

hidroxichalconas 1, 3 e 13, por microscopia de fluorescência

A – Atividade das hidroxichalconas dependente de concentração

em células B16-F10 e B – Efeito das hidroxichalconas na

concentração de glutationa total em células B16-F10

A – Efeito das hidroxichalconas na concentração de glutationa

total em células B16-F10 e B – Efeito das hidroxichalconas na

concentração de glutationa total mitocondrial em células B16-F10

A – Efeito das hidroxichalconas na concentração de ATP em

células B16-F10 e B – Efeito das hidroxichalconas na

concentração de glutationa total mitocondrial em células B16-F10

Viabilidade e adesão celular dependentes de concentração das

hidroxichalconas nas células B16-F10

LISTA DE TABELAS

Tabela 1

Comparação da viabilidade das células B16-F10 e células Vero

tratadas com chalconas derivadas do 3,4-

metilenodioxibenzaldeído

Tabela 2

Comparação da viabilidade das células B16-F10 e células Vero

tratadas com chalconas derivadas da 2,4,6-trimetoxiacetofenona

Tabela 3

Comparação da viabilidade das células B16-F10 e células VERO

tratadas com hidroxichalconas

Tabela 4

Valores de IC

das hidroxichalconas 1, 3 e 13, em 24, 48 e 72

horas de incubação, nas células de melanoma B16-F10

Tabela 5

Comparação das IC

(hidroxichalconas e hidroxichalconas

+ SOD) em células B16-F10

Tabela 6

Comparação das IC

(hidroxichalconas e hidroxichalconas

+ TROLOX®) em células B16-F10

Tabela 7

Comparação das concentrações de glutationa total citosólica

(GSH) e glutationa total mitocondrial (GSHm), em células B16-F10

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AIF Fator indutor de apoptose

AMP Adenosina monofosfato

APAF-1 Fator ativador de proteases – 1

ATP

A431

Adenosina trifosfato

Linhagem de células de carcinoma epidermóide humana

A549

B16-F10

B16-F4A5

Linhagem de células epiteliais pulmonares humanas

Linhagem de células de melanoma murino

Bcl-2

CAMs

CAT

DMEM

DMSO

DNA

DTIC

Proteína anti-apoptótica

Moléculas de adesão celular

Catalase

Meio de cultura Eagle modificado por Dulbecco

Dimetil sulfóxido

Ácido desoxirribonucléico

Dopaquinona

Dacarbazina

DTNB

DCF

DCFH-DA

Ácido 5,5’-ditio-bis-2-nitrobenzóico

Diclorofluoresceína

Acetato de diclorofluoresceína

EDTA Ácido etilenodiaminotetracético

EROs Espécies Reativas de oxigênio

ERNs Espécies Reativas de nitrogênio

FAAD Proteína adaptadora associada à proteína Fas

Faz Receptor de superfície celular

GPx Glutationa Peroxidase

GR Glutationa Redutase

GSH

GSHm

Glutationa reduzida

Glutationa mitocondrial

GSSG Glutationa forma oxidada

GST

•

Glutationa S-transferase

Radical hidroperoxil

HCT-116

Peróxido de Hidrogênio

Linhagem de celular de câncer de cólon

HeLa

HEPES

HL-60

HT-29

HUVEC

Linhagem de células de adenocarcinoma cervical

Ácido N-[2-Hidroxietil]piperazina-N’-[2-etanosulfônico]

Linhagem de células de leucemia humana

Linhagem de células de adenocarcinoma de cólon

Linhagem de células endoteliais de cordão umbilical humano

IAP Proteínas inibidoras de apoptose

ICAM-1

IFN-α

IL-2

IL-3n

Concentração que inibe 50% do crescimento celular

Molécula de adesão intercelular-1

Interferon-α

Interleucina-2

Interleucina-3

INCA Instituto Nacional do cancer

K562 Linhagem de células de leucemia humana

•

Radical peroxil lipídico

MCF-7 Linnhagem de células de adenocarcinoma mamário humano

MDR Resistência a múltiplos fármacos

MRP Proteína de resistência a múltiplos fármacos

DNAmt

NADPH

•

DNA mitocondrial

Nicotinamida adenina dinucleotídeo

Radical ânion superóxido

Radical hidroxil

MTT Brometo de dimetilazol difeniltetrazólio

OMS Organização Mundial da Saúde

PBS

Ppi

•

SFB

Smac

SOD

TAE

Salina tamponada com fosfatos

Pirofosfato

Radical peroxil

Soro fetal bovino

Ativador secundário de caspases derivado da mitocôndria

Superóxido dismutase

Solução de tris e ácido acético

Linhagem de células de carcinoma renal humano

TNB Ácido 5-tio-2-nitrobenzóico

TNF

U/mL

Fator de necrose tumoral

Unidades internacionais por mililitro

Ultravioleta

VCAM-1 Molécula de adesão vascular-1

Vero Linhagem de células epiteliais de rim de macaco

INTRODUÇÃO

Câncer é o nome dado a um conjunto de mais de 100 doenças, que têm em

comum o crescimento desordenado de células, que invadem os tecidos e órgãos,

podendo espalhar-se para outras regiões do corpo (INCA, 2007).

Segundo dados da Organização Mundial de Saúde (OMS), a cada ano o

câncer é diagnosticado em mais de onze milhões de pessoas e provoca a morte de

cerca de sete milhões em todo o mundo. As estimativas para 2008 apontam para

470.000 novos casos de câncer no Brasil (INCA, 2007). As causas que contribuem

para o desenvolvimento do câncer envolvem fatores externos ou ambientais:

tabagismo, produtos químicos, radiação e agentes infecciosos; envolvem também

fatores endógenos: mutações hereditárias, hormônios, condições imunológicas e

mutações decorrentes do metabolismo (GUIMARÃES, 2004).

O câncer de pele é uma das três malignidades humanas mais comuns

(GRAY-SCHOPFER et al., 2007). Está dividido em duas categorias: câncer de pele

melanoma e câncer de pele não-melanoma. Dos tipos não-melanoma, o carcinoma

basocelular e o carcinoma epidermóide são os cânceres de pele mais freqüentes,

com 75% e 20% dos casos, respectivamente (BAGHERI & SAFAI, 2001). Embora o

melanoma só represente 5% dos cânceres de pele, é considerado o mais grave,

devido à elevada possibilidade de produzir metástase. Para o ano de 2008, estão

previstos 5.920 novos casos de melanoma no Brasil, dentre os quais 510 novos

casos apenas no estado de Santa Catarina (INCA, 2007).

O melanoma tem origem nos melanócitos, que são células responsáveis pela

pigmentação da pele, dos olhos e dos cabelos (CARVALHO et al., 2004; GRAY-

SCHOPFER et al., 2007). Essa pigmentação ocorre através da síntese de melanina,

que é resultado de sucessivas reações oxidativas do aminoácido tirosina e, durante

este processo, há uma grande geração de peróxido de hidrogênio e de dopaquinona

(DQ). Essas substâncias são altamente reativas, geram peroxidação lipídica,

causam alteração no DNA e desencadeiam a carcinogênese (FRANK et al., 2001).

Portanto, a glutationa (GSH) está envolvida na síntese de melanina, pois se conjuga

com DQ, através da ação da enzima glutationa-S-transferase (GST), e reduz o

peróxido de hidrogênio por intermédio da ação da glutationa peroxidase. Desse

modo, a GSH protege o melanócito do efeito tóxico do peróxido de hidrogênio,

durante a síntese de melanina (PROTA, 1992). Elevados níveis de GSH são

importantes na manutenção da viabilidade dos melanócitos e das células de

melanoma. Não obstante, elevados níveis de GSH nas células de melanoma

metastático também estão envolvidos no mecanismo de resistência à ação de

agentes quimioterápicos, uma vez que a conjugação da GSH com esses compostos

diminui sua ação terapêutica (FRANK et al., 2001; BENLLOCH et al., 2005).

A cura do melanoma está diretamente relacionada com o diagnóstico e a

terapia no início do seu desenvolvimento. Os sinais que induzem a suspeita de uma

lesão maligna são associados à denominada regra ABCD: assimetria, bordas

irregulares, cor variável e diâmetro. Porém, o exame clínico baseado nesses sinais

fornece apenas 65% de precisão no diagnóstico (RIKER et al., 2005). A utilização da

microscopia de superfície, também conhecida como dermoscopia, aperfeiçoou o

diagnóstico do melanoma e aumentou a sensibilidade e a especificidade do

diagnóstico clínico para 90%, sem a necessidade de realização de biópsia para

confirmação. Contudo, o exame histopatológico do tumor primário é fundamental

para estimar a possibilidade de doença metastática (RHODES, 2006).

A progressão tumoral de muitos cânceres, incluindo melanoma maligno, com

conseqüente formação de metástase, pode ser causada pela desorganização da

atividade das moléculas de adesão (JOHNSON, 1999). Enquanto melanócitos

normais expressam poucas moléculas receptoras de adesão celular do gene da

superfamília imunoglobulina (CAMs), células de melanoma apresentam elevação

significativa na expressão destas moléculas, de forma que o conhecimento das

possíveis modificações na interação das células que estão associadas com o

desenvolvimento e a progressão do melanoma pode ajudar, futuramente, no

desenvolvimento de novas terapias para essa doença (HAASS et al., 2005).

Atualmente, o regime padrão de tratamento para o melanoma inclui a retirada

do tumor por cirurgia, seguida de quimioterapia, de imunoterapia e/ou de

radioterapia. Entretanto, nem todos respondem à terapia, e muitos pacientes têm

recaída ou progressão da doença (SOMASUNDAR et al., 2005). Apesar de ser uma

doença com grande capacidade para produzir metástase, o melanoma é

potencialmente curável, se detectado em estágio precoce. A ocorrência de

metástases normalmente leva à sobrevida média de apenas seis a nove meses,

tornando-o o terceiro tumor metastático mais comum, depois dos cânceres de

pulmão e de mama (EWEND et al., 1996; JOHNSON & YOUNG, 1996; TARHINI &

AGARWALA, 2004).

Na atualidade, ainda não há um agente terapêutico conhecido que

proporcione o prolongamento da vida dos pacientes com melanoma metastático. As

estratégias quimioterápicas têm sido baseadas no uso de dacarbazina, na forma de

monoterapia, que é o fármaco mais ativo para a doença, com resposta de 10% a

20% (TARHINI & AGARWALA, 2006). A temozolomida é o fármaco selecionado para

os pacientes com melanoma mestastático que precisam de tratamento sistêmico

(MIDDLENTON et al., 2000). A poliquimioterapia e a imunoterapia são alternativas

para o tratamento do melanoma. Não obstante, a combinação da dacarbazina com

outros quimioterápicos não demonstra vantagens significativas em relação ao

tratamento efetuado apenas com dacarbazina. Da mesma forma, a

imunoquimioterapia não proporciona aumento significativo da sobrevida de

pacientes com melanoma metastático, e tem como conseqüência a alta toxicidade

(SASSE et al., 2007; LUI et al., 2007).

A maioria dos fármacos utilizada no tratamento de células malignas tem a

indução de apoptose como mecanismo principal. O melanoma apresenta baixo nível

de apoptose espontânea in vivo, comparado com outros tipos de células tumorais, e

este fator está relacionado com a resistência à quimioterapia, à radioterapia e à

imunoterapia (SOENGAS & LOWE, 2003). A autodestruição celular é desencadeada

por mecanismos complexos, que consistem na ativação de inúmeras sinalizações,

os quais fazem parte de vários sistemas paralelos ou inter-relacionados, regulando,

desta forma, a apoptose. O desenvolvimento e a persistência do câncer são

favorecidos quando esses mecanismos são alterados pela desregulação gênica em

favor da sobrevivência e da proliferação celular (REED, 2000).

A mitocôndria também tem um papel importante nos estímulos pró e

antiapoptóticos, sendo responsável por 80% a 90% do ATP necessário para a

respiração e a sobrevivência celular (DIAS & BAILLY, 2005). A depleção intracelular

de ATP, pelo desacoplamento mitocondrial, provoca a fragmentação do DNA e

demonstra que a deficiência energética induz a célula à apoptose. Isso sugere que a

proliferação de células tumorais pode ser impedida por substâncias que

comprometam a integridade estrutural e funcional da mitocôndria e,

conseqüentemente, o metabolismo energético celular (GARLAND & HALESTRAP,

1997). Estudos realizados por Sabzevari e colaboradores (2004) sugerem que a

citotoxicidade das chalconas, para os hepatócitos e células tumorais, deve-se à

habilidade desses compostos em formar radicais pró-oxidantes e desacoplamento

mitocondrial.

Com o propósito de alcançar resultados mais eficazes, o meio científico

aumentou os estudos farmacológicos com compostos extraídos de plantas

medicinais e com seus análogos sintéticos. Dentre os mesmos, destacam-se os

flavonóides, os quais estão comumente presentes em várias plantas e são

conhecidos por apresentarem efeitos benéficos pela ampla atividade antioxidante,

pelo efeito inibitório da atividade de crescimento do tumor e pela atividade indutora

de apoptose, em várias linhagens de células tumorais. Em plantas, os flavonóides e

isoflavonóides são sintetizados a partir de hidroxichalconas que estruturalmente

possuem dois anéis aromáticos e uma insaturação na cadeia. As hidroxichalconas

são abundantemente distribuídas nas plantas e chamam atenção por sua efetividade

como agentes antitumorais (antimitóticos e inibidores do crescimento celular) em

culturas de células tumorais. Sabzevari e colaboradores (2004) avaliaram a

efetividade citotóxica das chalconas e concluíram que aquelas contêm fenol em

ambos os anéis, A e B, são mais tóxicas do que outras possuidoras de um anel

benzênico B e um polifenol. Como exemplo de maior citotoxicidade, citam a 2’,2-

dihidroxichalcona. Demonstraram também que a citotoxicidade da chalcona

2’,4’,6’,4-tetrahidroxidihidrochalcona (Floretina) diminuiu pelo aumento da

quantidade de hidroxilas no anel A. Iwashita e colaboradores (2000) demonstraram

que os flavonóides isoliquiritigenina e buteina inibiram a proliferação celular e

induziram apoptose em células do melanoma B16-F10. Nas células tratadas com

esses compostos, ocorreu a condensação do núcleo e a fragmentação do DNA

nuclear.

Chalconas, derivadas do 3,4-metilenodioxibenzaldeído e da 2,4,6,-

trimetoxiacetofenona, e hidroxichalconas, todas sintetizadas pelo grupo do prof.

Rosendo A. Yunes, serão avaliadas quanto ao seu efeito citotóxico (atividade

antitumoral) nas células da linhagem celular B16-F10.

REVISÃO

BIBLIOGRÁFICA

2.1 Câncer de pele não-melanoma

O câncer de pele é uma das três malignidades humanas mais comuns, e a

sua incidência em âmbito global está aumentando em proporções alarmantes,

ocorrendo nas formas de câncer de pele não-melanoma ou melanoma (GRAY-

SCHOPFER et al., 2007).

Os cânceres de pele não-melanoma compreendem o carcinoma basocelular,

ou de células basais, e o carcinoma epidermóide, ou carcinoma de células

escamosas. Sua freqüência entre os cânceres de pele é de 70% e 25%,

respectivamente. Aparecem mais freqüentemente em partes do corpo expostas ao

sol, tais como: orelhas, face, pescoço e antebraço. Isso implica que a exposição

repetida à radiação ultravioleta é o maior fator causal da doença (INCA, 2007).

Figura 1: A - Carcinoma basocelular e B – Carcinoma epidermóide.

Fonte: WHO - World Health Organization. Disponível em: http//www.who.int/uv/

health/uv_health2/en/index1.html. Acesso em 18 de novembro de 2007.

O carcinoma basocelular se origina da epiderme e dos apêndices cutâneos

localizados acima da camada basal, como pelos (Figura 1 – A). Já o carcinoma

epidermóide tem origem no queratinócito da epiderme, também podendo surgir no

epitélio escamoso das mucosas (Figura 1 – B). O carcinoma basocelular é

diagnosticado através de uma lesão com evolução lenta, ao passo que o carcinoma

epidermóide surge por meio de uma ferida, que evolui rapidamente, e vem

acompanhada de secreção e de prurido. Neste, a maior gravidade está relacionada

à ocorrência de metástases, embora raramente sejam letais. Nesses casos, a

cirurgia é o tratamento mais indicado. O tratamento cirúrgico geralmente é curativo,

apesar de ser muito dolorido e, às vezes, até desfigurante. Porém, dependendo da

extensão, o carcinoma basocelular pode ser tratado também através de

medicamento tópico ou radioterapia (WHO, 2007).

A exposição excessiva ao sol é o principal fator de risco do câncer de pele.

Os países tropicais possuem também os maiores índices de câncer de pele, e as

pessoas que habitam os mesmos estão mais expostas a essa doença. Por isso, a

melhor maneira de evitar sua manifestação é a prevenção através de proteção

adequada à exposição solar (INCA, 2007).

2.2 Câncer de pele melanoma

A principal causa de morte de pessoas acometidas por doenças de pele está

intimamente relacionada ao melanoma, que é uma neoplasia maligna (Figura 2). Em

estágio avançado é letal, pois atualmente há poucos tratamentos eficazes que

resultam em melhora efetiva do paciente vítima dessa moléstia.

Figura 2: Melanoma maligno.

Fonte: WHO - World Health Organization. Disponível em: http//www.who.int/uv/

health/uv_health2/en/index1.html. Acesso em 18 de novembro de 2007.

A incidência do melanoma vem aumentando de 3% a 7% anualmente, no

mundo inteiro (LENS & DAWES, 2004; INCA, 2007; LUI et al., 2007). O mesmo

origina-se a partir dos melanócitos, que são células pigmentadas especializadas,

responsáveis pela pigmentação, encontradas predominantemente na pele, nos

cabelos e nos olhos, locais onde produzem melanina (CARVALHO et al., 2004;

SCHOPFER-GRAY et al., 2007).

Na pele encontramos melanócitos localizados na camada basal da epiderme

e nos folículos capilares, os quais são estimulados pelos queratinócitos epidermais a

produzirem melanina, em resposta à radiação ultravioleta (UV). Os queratinócitos

secretam fatores que regulam a sobrevivência, a diferenciação, a proliferação e a

motilidade dos melanócitos, que, como resposta, resulta no bronzeamento da pele.

Assim, os melanócitos têm papel fundamental na proteção da pele aos efeitos

prejudiciais da radiação UV e na prevenção do câncer de pele. Conseqüentemente,

pessoas sem melanócitos funcionais e com distúrbios pigmentares, como vitiligo e

albinismo, são hipersensíveis à radiação UV (GRAY-SCHOPFER et al., 2007).

A pigmentação da pele ocorre através da síntese de melanina, que resulta de

sucessivas reações oxidativas do aminoácido tirosina. Durante esse processo, há

uma grande geração de substâncias altamente reativas, podendo levar à

peroxidação lipídica e à alteração no DNA, as quais desencadeiam o processo de

carcinogênese (FRANK et al., 2001).

O fator de risco mais importante para o desenvolvimento do melanoma é o

número de nevos melanocíticos na pele, enquanto que o segundo fator de risco mais

importante é a presença de nevos melanocíticos atípicos. Alguns aspectos destas

lesões, como: bordas não-definidas, bordas irregulares, lesão com coloração

variada, diâmetro igual ou superior a 5 mm e a presença do componente macular

aumentam o risco de desenvolvimento do melanoma.

Os nevos melanocíticos desenvolvem-se principalmente durante a infância e

a adolescência, sendo que a quantidade desses nevos aumenta com o avanço da

idade. O desenvolvimento dos nevos melanocíticos, na infância, deve-se

principalmente à exposição solar, que causa queimadura da pele. Entretanto, não

são necessárias queimaduras para o desenvolvimento de nevos melanocíticos, pois

a simples incidência de sol moderado já é suficiente para causar tais lesões. O tipo

de pele, a reação após a exposição solar e a herança genética também são fatores

de risco associados ao desenvolvimento de nevos melanocíticos em crianças

(GARBE & EIGENTLER, 2007).

A ocorrência de mutações somáticas em genes melanocíticos regulatórios

tem como conseqüência a origem e a progressão do melanoma. O primeiro gene

encontrado alterado especificamente no melanoma foi o NRAS, responsável por

15% a 25% das mutações em células de melanoma. Já mutações no gene BRAF

são encontradas em 50% a 70% dos casos. Genes como KIT e CDK4 também se

encontram alterados no melanoma, porém em menor freqüência (DAHL &

GULDBERG, 2007).

O melanoma cutâneo é uma neoplasia potencialmente letal, mas que tem

grande possibilidade de cura, se diagnosticado precocemente. No estágio inicial, o

melanoma pode ser extirpado por incisão da lesão primária, e a cirurgia também

pode remover as metástases em linfonodos regionais. Porém, pacientes com

melanoma metastático, em locais distantes do tumor primário, têm um prognóstico

desfavorável, com sobrevida somente de seis a dez meses, em média (LEE et al.,

2000).

Um significativo progresso no diagnóstico precoce do melanoma cutâneo

ocorreu com o desenvolvimento da dermoscopia, ou seja, a microscopia de

superfície. É um método utilizado para auxiliar o exame de lesões de pele a olho nu,

que aumenta a sensibilidade e a especificidade do diagnóstico clínico do melanoma

cutâneo, de 60% para mais de 90%. Não necessita de biópsia para confirmação,

apesar de que o exame histopatológico do tumor primário é o procedimento inicial

mais utilizado para estimar a existência de doença metastática, mesmo não havendo

atualmente marcador molecular que possa prever com precisão o potencial

metastático para o melanoma. O auto-exame periódico da pele e a detecção da

doença na fase inicial otimizam o prognóstico e reduzem significativamente a

mortalidade por melanoma cutâneo (RHODES, 2006).

O regime padrão de tratamento para o melanoma inclui a retirada do tumor

por cirurgia, seguido de quimioterapia, de imunoterapia, de bioquimioterapia

(associação das duas) e de radioterapia. A cirurgia raramente tem potencial curativo,

e a radioterapia é apenas paliativa. Além disso, poucos pacientes respondem à

quimioterapia (10% a 20%), e muitos têm recaída ou progressão da doença

(EWEND et al.1996; SOMASUNDAR et al., 2005).

Atualmente não há agente terapêutico conhecido no mercado que

proporcione um prolongamento da vida dos pacientes com melanoma metastático.

As estratégias quimioterápicas baseiam-se no uso de dacarbazina (agente

alquilante), também conhecida como DTIC, na forma de monoterapia. A dacarbazina

é o único quimioterápico aprovado pelo USA-FDA, e é o mais ativo no tratamento do

melanoma metastático, com resposta entre 10% a 20%. No entanto, fármacos como

a carmustina, o paclitaxel, o temozolomida e a cisplatina também têm apresentado

atividade no melanoma metastático, quando utilizados sozinhos (TARHINI &

AGARWALA, 2006). A temozolomida é o fármaco selecionado para os pacientes

com melanoma mestastático que precisam de tratamento sistêmico, sendo que

possui a mesma eficácia da dacarbazina, e tem a capacidade de atravessar a

barreira hematoencefálica e facilitar o efeito no tratamento de metástases no SNC. É

um agente citotóxico análogo à dacarbazina, e seu metabólito ativo é o monometil

triazenoimidazole carboxamide (MTIC) (MIDDLENTON et al., 2000).

A poliquimioterapia, combinação de dois a quatro fármacos, pode resultar em

aumento da resposta, que varia entre 30% a 50%. Porém, vários estudos

randomizados não demonstraram vantagem significativa da mesma em relação à

monoterapia (CHAKRABARTY & GEISSE, 2004; LUI et al., 2007).

A imunoterapia também é uma alternativa para o tratamento do melanoma.

Recentemente, trabalhos mostraram que agentes sintéticos que modificam a

resposta imune, bem como os próprios agentes imunológicos testados em pacientes

com melanoma, apresentaram uma resposta de 15% a 20% melhor do que a

quimioterapia (RIKER et. al., 2006). O interferon-α (IFN-α) e a interleucina-2 (IL-2)

são imunomoduladores freqüentemente utilizados como adjuvantes na terapia do

melanoma em estágio avançado, mesmo com baixas taxas de resposta, alto custo e

elevada toxicidade (TARHINI et al., 2006).

O melanoma é uma doença extremamente agressiva, com grande potencial

metastático e alta resistência a agentes quimioterápicos. Possui baixo índice de

apoptose espontânea in vivo, comparado aos outros tipos de células tumorais. Essa

resistência à apoptose é, possivelmente, a razão da resistência do melanoma à

quimioterapia, à radioterapia e à imunoterapia, sendo o maior obstáculo para o

insucesso do tratamento desta neoplasia (SOENGAS & LOWE, 2003; GRAY-

SCHOPFER et al., 2007). Uma alternativa promissora no tratamento do melanoma

maligno pode ser a manipulação da via apoptótica como tentativa de impedir

desenvolvimento de metástases, através do desenvolvimento de novas terapias

antitumorais que tenham este mecanismo como alvo terapêutico.

2.3 Moléculas de adesão celular

O melanoma cutâneo é um dos tumores humanos mais analisados, em

termos de expressão de moléculas de adesão celular (HART et al., 1991; NESBIT &

HERLIN, 1994). Isso se justifica pelo fácil acesso às lesões melanocíticas e ao

estudo histopatológico, o qual define os estágios do melanoma e a progressão

tumoral (CLARK et al., 1984; CLARK et al., 1989; GUERRY et al., 1993).

A progressão tumoral de muitos cânceres, incluindo melanoma maligno, com

conseqüente formação de metástases, pode ser causada pela desorganização da

atividade das moléculas de adesão (JOHNSON, 1999). As moléculas de adesão

celular (CAMs) são moléculas de superfície que intermedeiam a adesão entre duas

células de um mesmo tipo e entre células de origens teciduais diferentes. Muitos

tipos de moléculas podem mediar a adesão celular, mas a maioria faz parte da

família das integrinas, das caderinas e da superfamília das imunoglobulinas

(CHOTIA & JONES, 1997).

As integrinas formam uma classe de moléculas de adesão estruturalmente

similares. São heterodímeros constituídos de subunidades α e β. As subunidades

individuais α podem formar receptores funcionais com várias subunidades β

diferentes entre si, e vice-versa, permitindo uma grande variedade de ligações

célula-célula e célula-matriz (HYNES, 1992; HAASS et al., 2005). Na maioria dos

melanomas, a subunidade α

forma, com a subunidade β3, um complexo (α

β3).

Este complexo tem um papel fundamental na progressão do melanoma, pois,

quando o mesmo está expresso, o tumor passa da fase de crescimento radial para a

fase de crescimento vertical, metastática. Isso indica as integrinas como as

prováveis moléculas promotoras de metástase de células de melanoma.

(JOHNSON, 1999; MCGARY et al., 2002).

As caderinas constituem uma família de moléculas de adesão dependentes

de cálcio. São classificadas em caderinas E (epitelial), P (placental) e N (neural).

Estão expressas nas células que formam tecidos sólidos (JOHNSON, 1999). Na

pele, as caderinas são responsáveis pela manutenção da homeostase, por

regularem as interações entre melanócitos e queratinócitos epidermais, e também

interações entre fibroblastos dermais e células endoteliais. O contato entre os

melanócitos e queratinócitos não é apenas estrutural, mas também funcional, pois

controla a proliferação, a diferenciação e a expressão de moléculas de superfície

celular, nos melanócitos. Na ausência do contato entre melanócitos e queratinócitos,

os melanócitos proliferam rapidamente e podem ocorrer falhas na divisão celular. Os

melanócitos expressam moléculas na superfície, como as MCAM/MUC18, que são

moléculas de adesão celular, as quais conferem potencial metastático e aumentam a

carcinogenicidade em células de melanoma. A perda da adesão, mediada pela E-

caderina entre células de melanoma e queratinócitos, deixa as células de melanoma

livres da regulação estrutural e funcional dos queratinócitos e resulta em aumento da

motilidade, aumento da proliferação e do potencial invasivo das células de

melanoma (MCGARY et al., 2002).

Enquanto melanócitos normais expressam poucas moléculas receptoras de

adesão celular do gene da superfamília imunoglobulina (CAMs), células de

melanoma apresentam um aumento na expressão de: MCAM, Mel-CAM, MUC18 e

CD146; molécula de adesão celular L1 (L1-CAM, CD171); molécula de adesão

celular ativadora de leucócito (ALCAM, CD166); molécula de adesão celular vascular

1 (VCAM-1, CD106); molécula de adesão celular intercelular 1 (ICAM-1, CD54);

molécula de adesão celular 1, relacionada com o antígeno embriogênico

(CEACAM1, CD66a), (HAASS et al., 2005).

A molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) e a molécula de adesão

vascular 1 (VCAM-1) fazem parte da superfamília das imunoglobulinas. Estas têm

participação significativa no prognóstico do melanoma, considerando a maior

expressão da ICAM-1 em lesões malignas do que em lesões benignas. Isso se deve

ao aumento da espessura vertical dos tumores primários. A expressão de ICAM-1

em melanomas primários tem relevância clínica, pois pacientes em estágio 1, com

tumores e ICAM positivo, possuem prognóstico desfavorável e curto período de vida

(NATALI et al., 1997; JOHNSON, 1999). A VCAM-1 é uma molécula de adesão

celular vascular, que também está expressa no endotélio de peles normais em

mínimas quantidades e em maior quantidade em melanoma maligno. É uma

receptora para algumas integrinas, como a (α

), e facilita a adesão do melanoma

ao endotélio vascular (HOLZMANN et al., 1998).

As moléculas de adesão celular não agem isoladamente. Pelo contrário, a

função de adesão de uma molécula é modulada pela atividade de outra molécula de

adesão. Assim, a modulação dessas moléculas é uma alternativa relevante no

tratamento de tumores malignos, como o melanoma metastático.

2.4 Apoptose e necrose

A morte celular é um fator essencial no funcionamento normal dos

organismos multicelulares (BRÁS et al., 2005). Durante muitos anos, esse fato foi

menosprezado cientificamente em favor de outros processos biológicos, como a

ativação, a proliferação e a diferenciação celular. Keer et al. (1972) propuseram uma

classificação morfológica e bioquímica, que ajudou a esclarecer e a definir o papel

fisiológico para a morte celular.

Figura 3: Mecanismos de morte celular: necrose e apoptose.

Fonte: Adaptado do Catálogo BioAgency 2004-05, Cap. 9 - Apoptose e Inflamação. Disponível em:

http://www.bioagency.com.br/informacao/default.asp. Acesso em 15 de novembro de 2007.

APOPTOSE

Condensação nuclear

Fragmentação

Corpos apoptóticos

NECROSE

Célula Normal

Intumescimento

irrreversível

Desintegração

Dois diferentes tipos de morte celular, necrose e apoptose, foram

responsabilizados por remover as células injuriadas ou indesejadas (Figura 3). A

necrose acontece em situações de estresse violento, geralmente em situações

patológicas, fenômeno este impossível de ser controlado genética ou

farmacologicamente. É um processo de destruição dramático e desregulado,

resultado de uma catástrofe bioenergética, incompatível com a sobrevivência celular

(EDINGER & THOMPSON, 2004; OKADA & MAK, 2004).

Morfologicamente, a necrose é caracterizada pela presença de vacúolos no

citoplasma, pela perda da integridade das membranas plasmáticas e das organelas,

pelo aumento do volume celular e por indução de inflamação ao redor da célula, em

conseqüência da liberação do conteúdo celular e de moléculas inflamatórias. As

células que morrem por necrose freqüentemente exibem mudanças na morfologia

nuclear, mas não na organização da cromatina e na fragmentação do DNA

(EDINGER & THOMPSON, 2004; OKADA & MAK, 2004). Por outro lado, quando o

estresse é leve, o sinal gerado será analisado pelo conjunto de mitocôndrias que

irão decidir se a célula viverá ou se será eliminada por mecanismos apoptóticos

(AMARANTE-MENDES, 2003).

Apoptose ou morte celular programada é uma morte “fisiológica” que ocorre

durante toda a vida de um organismo. É essencial para a homeostase dos tecidos

em organismos multicelulares; no sistema imunológico; no desenvolvimento

embrionário, com a perda das membranas interdigitais; na formação das vilosidades

intestinais; na renovação de células hematopoiéticas e outros (AMARANTE-

MENDES, 2003; OKADA & MAK, 2004).

Alguns defeitos no mecanismo de morte celular podem levar à

carcinogênese, através da resistência à apoptose, e podem ainda induzir a morte

celular por mecanismos não apoptóticos. Isso explica o envolvimento da

desregulação da apoptose em inúmeras patologias neurodegenerativas, doenças

auto-imunes, desordens hematopoiéticas, infertilidade e câncer (KIECHLE &

ZHANG, 2002).

A morte celular programada é definida pela aparência morfológica da célula

apoptótica que apresenta fragmentação do DNA genômico em fragmentos

oligonucleossomais, condensação da cromatina e perda do volume celular, sem a

perda da integridade da membrana. São mantidas as estruturas das organelas,

ocorre formação de “pregas” na membrana plasmática e a conseqüente

fragmentação nuclear em corpos apoptóticos (ZIMMERMANN et al., 2001). Esses

corpos apoptóticos são reconhecidos e removidos rapidamente por células

fagocíticas, não causando inflamação nas imediações da célula morta. Se não

houver fagocitose dos corpos apoptóticos, os mesmos devem morrer por necrose

secundária (EDINGER & THOMPSON, 2004).

Figura 4: As duas principais vias apoptóticas: via mitocondrial ou intrínseca e via extrínseca.

Fonte: Adaptado de HENGARTNER, 2000.

Várias proteases participam dos processos de indução da morte celular, em

que as mais conhecidas são as caspases. As caspases são proteases aspartato

específicas, que contêm cisteínas, as quais estão presentes entre as membranas

mitocondriais e na matriz nuclear, na forma de zimogênios. São executoras da morte

por apoptose e compreendem duas classes diferentes, ou seja, as iniciadoras

FasL

Smac/DIABLO

Dano ao DN

p53

Bax

Bcl-2

AIF

IAPs

Pró-caspase-9

Apaf-1

Citocromo-c

Pró-caspase-3

Caspase-3

Substratos apoptóticos

Caspase-8

Bid ativa

Bid

FADD

Pró-caspase-8

Apoptossoma

(caspases-2, -8, -9 e -10) e as efetoras (caspases-3, -6 e -7) (KIECHLE & ZHANG,

2002; AMARANTE-MENDES, 2003; RIEDL & SHI, 2004).

Existem duas vias principais que levam à ativação das caspases: a via

extrínseca, ou via citoplasmática, e a via intrínseca, ou mitocondrial (Figura 4). A via

extrínseca é desencadeada por um dos membros da superfamília de receptores de

necrose tumoral (TNF). Tais receptores, quando estimulados, associam-se, através

de proteínas adaptadoras como a FADD, à caspase-8 e/ou à caspase-10, ativando-

as e acionando, desta forma, as caspases executoras ou gerando sinais para a via

intrínseca (KIECHLE & ZHANG, 2002; AMARANTE-MENDES, 2003; RIEDL & SHI,

2004). A via intrínseca ou mitocondrial é iniciada por sinais de estresse provenientes

do interior da célula, detectados pelas mitocôndrias, responsáveis por decidir se a

célula entrará em processo de morte ou não. Caso isso ocorra, as mitocôndrias

sofrem um desacoplamento mitocondrial e liberam, para o citosol, o citocromo c, as

proteínas SMAC/Diablo (segunda ativadora das caspases derivada da mitocôndria)

e o AIF (fator indutor de apoptose). O citocromo-c liberado se liga à APAF-1 (fator

ativador de proteases – 1). Esse complexo, na presença de ATP, ativa a caspase-9,

que ativará a caspase-3. Por outro lado, a SMAC inativa as IAPs (proteínas

inibidoras de apoptose), ativa a caspase-3 e culmina em apoptose (KIECHLE &

ZHANG, 2002; AMARANTE-MENDES, 2003; RIEDL & SHI, 2004).

Proteínas como a p-53, chamadas de “guardiãs do genoma”, são acionadas

com o objetivo de reparar os danos no DNA. Quando o dano excede os mecanismos

de reparo, essa proteína induz a célula à apoptose (BROWN & ATTARDI, 2005).

Algumas proteínas, membros da família Bcl-2, constituem um grupo que exerce

funções opostas. Algumas atuam como proteínas antiapoptóticas e protegem a

célula da morte (Bcl-2, Bcl-x

, Bcl-w, Mcl-1 etc), outras proteínas pró-apoptóticas

levam a célula à apoptose (Bax, Bak, Bad, Bid, etc). Essas proteínas participam dos

sinais de sobrevida ou morte celular, em função da supressão ou promoção de

alterações na permeabilidade da membrana mitocondrial, controlando, assim, a

liberação do citocromo c para o citosol, sinais esses gerados nos meios intra e

extracelulares (GHOBRIAL et al., 2005).

No melanoma, a via mitocondrial tem uma grande importância no controle da

apoptose (RAISOVA et al., 2001; HOSSINI et al., 2003). Nesse tipo de tumor, as

proteínas antiapoptóticas Bcl-2 parecem estar superexpressas e podem ser as

principais responsáveis pela resistência a muitos agentes quimioterápicos (JANSEN

et al., 2000). Adicionalmente, a diminuição dos níveis da proteína pró-apoptótica Bax

resulta em progressão do melanoma, em redução da susceptibilidade à resposta

imune e à quimioterapia (FECKER et al., 2006). Takaola et al. (1997) demostraram

um aumento na expressão da proteína Bcl-2 em células de melanoma, com severa

metástase pulmonar. Jun et al. (2007) relacionaram a apoptose, em células de

melanoma B16-F10, com a inibição da proteína Bcl-2, após o tratamento das

mesmas com capsaicina. Assim, a modulação da via mitocondrial e/ou das proteínas

relacionadas com os mecanismos pró-apoptóticos e anti-apoptóticos pode ser

considerada uma estratégia promissora no tratamento quimiopreventivo ou

quimioterapêutico do melanoma mestastático.

2.5 Estresse oxidativo e glutationa

Os mecanismos de morte celular também podem ser influenciados por um

desequilíbrio da homeostase no metabolismo oxidativo, denominado estresse

oxidativo (McCONKEY, 1998; ALLEN & TRESINI, 2000). Enquanto um elevado ou

moderado nível de estresse oxidativo é potencialmente citotóxico e bloqueia a

proliferação, por induzir células à apoptose e até à necrose, um baixo nível de

estresse pode estimular a divisão celular e o crescimento tumoral (DREHER &

JUNOD, 1996).

O estímulo carcinogênico pode estar relacionado ao desequilíbrio redox

intracelular, como conseqüência do acúmulo de espécies reativas que ocorrem

devido a injúrias endógenas e exógenas (VALKO et al., 2006). Não obstante, a

persistência do estresse oxidativo em células tumorais pode ativar protooncogenes e

fatores de transcrição; levar a uma instabilidade genômica e a uma resistência à

quimioterapia e à radioterapia; provocar invasão celular e metástase (NAVARRO et

al., 1999).

As espécies reativas de oxigênio (EROs) e as espécies reativas de nitrogênio

(ERNs) são moléculas quimicamente instáveis e altamente reativas; promovem

reações de redução e de oxidação, prejudicando funções fisiológicas (SIES, 1997).

Não obstante, essas moléculas são produzidas fisiologicamente durante o

metabolismo na respiração celular mitocondrial, geradas pela incidência de radiação

ultravioleta, de raios X e de raios gama; são produtos de reações catalisadas por

metais; estão presentes em forma de poluentes na atmosfera e são produzidas por

neutrófilos e macrófagos nos processos inflamatórios. Essas moléculas reativas

também são benéficas para o organismo, pois desempenham inúmeras funções

fisiológicas na defesa contra agentes infecciosos e atuam como antitumorais ao

induzir a célula à apoptose. Contudo, altas concentrações dessas espécies reativas

podem prejudicar as estruturas celulares, causar peroxidação lipídica, oxidação de

proteínas e oxidação do DNA (MATES et al., 1999; VALKO et al., 2006).

Os efeitos dessas espécies reativas no organismo são equilibrados por

mecanismos de defesa antioxidante, enzimáticas e não enzimáticas. Os mais

eficientes antioxidantes enzimáticos envolvem a superóxido dismutase (SOD), a

catalase (CAT), a glutationa peroxidase (GPx) e a glutationa transferase (GSTs).

Dentre os antioxidantes não-enzimáticos, encontram-se: melanina, glutationa,

estrogênios, ácido úrico, vitamina C, vitamina E, carotenóides, flavonóides naturais,

entre outros (SIES, 1997; McCALL & FREI, 1999; MATÉS, 2000; NORDBERG &

ARNÉR, 2001).

A melanina, responsável pela pigmentação cutânea, é resultante de

sucessivas reações oxidativas do aminoácido tirosina. Durante esse processo há

uma grande geração de peróxido de hidrogênio e dopaquinona (DQ). Essas

substâncias são altamente reativas, podendo levar à peroxidação lipídica e à

alteração do DNA, o que possibilita o desencadeamento do processo de

carcinogênese (FRANK et al., 2001).

A superóxido dismutase (SOD) é uma das mais efetivas enzimas

antioxidantes, a qual catalisa a dismutação de O

•-

e forma espécies menos reativas,

como o H

(McCORD & FRIDOVICH, 1969). Estão descritas três isoformas de

SOD em humanos: a Zn-SOD e a Cu-SOD, que estão presentes no citosol, e ainda

a Mn-SOD, que está presente na mitocôndria. A presença de SOD é fundamental

devido à formação de O

•-

pela cadeia respiratória (McCORD & FRIDOVICH, 1969;

NORDBERG & ARNÉR, 2001).

As catalases (CAT) são enzimas antioxidantes que estão localizadas na

maioria das células de organismos aeróbios, em uma organela chamada de

peroxissoma, em que o peróxido de hidrogênio é convertido em água e oxigênio

molecular. Assim sendo, a catalase protege a célula do peróxido de hidrogênio

gerado dentro da célula. As catalases também exercem uma função muito

importante ao prevenirem a formação do

•

OH, via reação de Fenton, catalisada por

/Cu

(NORDBERG & ARNÉR, 2001). A glutationa é o mais importante sistema

antioxidante e compreende diferentes sistemas enzimáticos, como as peroxidases

(GPx), as transferases (GST), as redutases (GR) e a glutationa (GSH). O tripeptídeo

glutationa (L-γ-glutamil-L-cistenil-glicina) é um importante antioxidante e o mais

abundante tiol não-protéico intracelular. Sua forma reduzida é a GSH e a forma

oxidada é a GSSG, glutationa dissulfito. A característica antioxidante da GSH é

determinada pelo grupamento –SH (sulfidrila), presente no resíduo cisteína.

(DELEVE & KAPLOWITZ, 1991).

Figura 5: Estrutura da glutationa

Fonte: LASH, 2006.

A GSH é a primeira e a mais importante defesa antioxidante não-enzimática

intracelular contra produtos tóxicos de oxigênio, especialmente na mitocôndria, local

onde, com alta intensidade, ocorre a síntese de intermediários reativos de oxigênio

(DELEVE & KAPLOWITZ, 1991). A maior parte da GSH é sintetizada no fígado, mas

sua síntese ocorre em todas as células do corpo, a partir dos aminoácidos L-

glutamina, cisteína e glicina. A reação para síntese do GSH depende de ATP, que é

catalisada pela γ-glutamil-cisteína-sintetase e pela GSH sintase. A GSH é importante

na síntese de proteínas estruturais e de DNA, na ativação transcricional de genes

específicos, na regulação do ciclo celular, bem como na regulação e manutenção do

estado redox da célula (WANG & BALLATORI, 1998; BALLATORI et al., 2005).

Em situações fisiológicas, a maioria da GSH é mantida em estado reduzido

pela glutationa redutase (GR). Porém, em situações de estresse oxidativo acontece

L-γ-glutamil

L-cisteinil

Glicina

a desregulação dos níveis de GSH e de GSSG (WANG & BALLATORI, 1998). A

quantidade de glutationa oxidada acumula-se dentro da célula, e a relação entre

GSH/GSSG pode ser usada como indicador de estresse oxidativo no organismo

(HWANG et al., 1992).

A GSH participa de reações de detoxificação, protege a célula contra danos

oxidativos e nitrosativos, bem como é importante na metabolização de compostos

tóxicos eletrofílicos e quimioterápicos (WANG & BALLATORI, 1998; BALLATORI et

al., 2005). Todos os organismos aeróbios estão propensos ao estresse oxidativo,

como conseqüência do metabolismo, ao passo que distúrbios no seu estado redox

estão envolvidos na origem e na progressão de inúmeras doenças. A perda de GSH

citoplasmática é um evento característico de morte celular por apoptose, interferindo

na capacidade redox da célula, tornando-a intolerante à presença de agentes

oxidantes (SLATER et al., 1995). Vários estudos relacionam a incidência de câncer

com várias desordens nas funções enzimáticas, as quais estão ligadas à GSH

(PASTORE et al., 2003).

No melanoma, altos níveis de GSH são importantes na manutenção da

viabilidade dos melanócitos e das células de melanoma. A GSH está envolvida na

síntese de melanina conjugada com a dopaquinona (DQ), através da ação da

enzima glutationa-S-transferase (GST), e reduz o peróxido de hidrogênio por

intermédio da ação da glutationa peroxidase. Desta forma, a GSH protege o

melanócito do efeito tóxico do peróxido de hidrogênio durante a síntese de melanina

(PROTA, 1992). Níveis elevados de GSH nas células de melanoma metastático

também estão envolvidos no mecanismo de resistência à ação de agentes

quimioterápicos, uma vez que a conjugação de GSH com estes compostos diminui

sua ação terapêutica (FRANK et al., 2001; BENLLOCH et al., 2005). Sendo assim, a

permanência de altos níveis de GSH dentro da célula parece ser fundamental para a

sobrevivência de células metastáticas intravascularmente e para a progressão

extravascular (BENLLOCH et al., 2005).

A glutationa pode interagir com o fármaco, em local específico, através do seu

grupamento tiol, e resultar em uma conjugação fármaco-glutationa. Tal conjugado,

menos ativo e mais hidrossolúvel, pode ser expulso da célula com a participação de

proteínas transportadoras, inclusive a proteína associada à resistência a múltiplos

fármacos (STAVROVSKAYA, 2000).

A resistência das células tumorais a múltiplos fármacos (MDR) é um dos

principais motivos do insucesso da quimioterapia em tumores malignos. Mediada por

diferentes mecanismos, essa resistência atua em diferentes etapas da ação

citotóxica. Dentre os mecanismos de resistência, podemos citar: ativadores das

proteínas transmembranas, responsáveis pelo efluxo de fármaco da célula (a

glicoproteína-P e as proteínas de resistência a múltiplos fármacos); ativadores de

enzimas do sistema de detoxificação da glutationa, que protegem a célula de vários

danos; mecanismos envolvidos na alteração das proteínas; genes que controlam a

apoptose (STAVROVSKAYA, 2000; GOTTESMAN et al., 2002).

A alta concentração de GSH intracelular é relacionada à resistência tumoral a

vários agentes quimioterápicos (ISHIKAWA et al., 1996; FOJO & BATES, 2003). A

resistência pode ocorrer devido ao efluxo desses agentes quimioterápicos presentes

nas células, através de MRP, com participação ativa da GSH (SALERNO &

GARNIER-SUILLEROT, 2001). Portanto, a depleção da GSH pode ser uma

estratégia potente na sensibilização das células cancerígenas e no controle da

resistência a diversos quimioterápicos (STRAVROVSKAYA, 2000; FOJO & BATES,

2003; KACHADOURIAN & DAY, 2006).

2.6 Metabolismo energético de células tumorais

A perda da GSH citoplasmática é um evento característico da morte celular

por apoptose. Porém, quando há também uma diminuição nos níveis da GSH

mitocondrial, a produção de energia (ATP) celular é afetada (SLATER et al., 1995).

Os níveis de ATP celular estão relacionados com o tipo de morte celular. Altos

níveis de ATP levam à morte celular por apoptose, mas intensa depleção energética

causa morte por necrose. Enquanto a morte por apoptose requer energia, a necrose

ocorre quando não há mais ATP dentro da célula (REGULA et al., 2003;

SKULACHEV, 2006).

As células animais nucleadas têm duas formas de produzir energia: através

da via mitocondrial e/ou através da glicólise. Em contraste com a maioria das células

normais, onde as mitocôndrias são responsáveis por produzirem a maioria do ATP

utilizado como combustível para o crescimento celular, no câncer a glicólise pode

contribuir com até metade da energia necessária (PEDERSEN, 2007).

Células tumorais têm seu metabolismo energético alterado, com aumento

significativo na capacidade glicolítica, mesmo na presença de oxigênio em altas

concentrações (PEDERSEN, 1978; GATENBY & GILLIES, 2004; PEDERSEN,

2007). Contudo, tal característica pode ser uma estratégia metabólica para garantir o

crescimento e a sobrevivência dessas células em ambientes com pouco oxigênio

(GATENBY & GILLIES, 2004). Em 1956, Warburg relatou que a alta taxa glicolítica,

em células tumorais, devia-se a uma deficiência na cadeia respiratória. Mais tarde,

em 1978, Pedersen verificou que a atividade das mitocôndrias retiradas de células

normais era tão eficiente quanto mitocôndrias retiradas de células tumorais,

concluindo que a deficiência na fosforilação oxidativa era resultado da menor

quantidade de mitocôndrias nas células tumorais.

As mitocôndrias são organelas que participam de muitos mecanismos

essenciais para a vida e a morte celular. São fundamentais para o metabolismo

energético, por produzir, através da fosforilação oxidativa, 80% a 90% da energia

necessária para a respiração e a sobrevivência celular. Regulam o fluxo de cálcio e

têm um importante papel na integração de estímulos pró e anti-apoptóticos

relacionados com o processo de morte celular (DIAS & BAILLY, 2005).

Algumas disfunções mitocondriais são citadas como marca característica da

morte por apoptose: perda do potencial de membrana mitocondrial, interrupção do

transporte de elétrons, geração de espécies reativas de oxigênio e liberação de

fatores pró-apoptóticos, como o citocromo c, o Smac/Diablo, a AIF e outros,

desencadeando a ativação de proteínas executoras de apoptose, as caspases

(ZIMMERMANN et al., 2001; BRÁS et al., 2004; DIAS & BAILLY, 2005).

Alguns tumores, como o melanoma, que são caracterizados pelo rápido

desenvolvimento e por propriedade metastática, apresentam uma modificação

energética em comparação com seu tecido de origem (PEDERSEN, 1978; ZU &

GUPPY, 2004). O metabolismo energético pode ser um alvo alternativo para o

tratamento de muitas neoplasias. Considerando o metabolismo predominantemente

oxidativo do melanoma, a utilização de fármacos que comprometam a integridade

estrutural e funcional da mitocôndria pode ser uma alternativa para combater a

proliferação das células neoplásicas, tornando-a uma relevante estratégia

terapêutica. (ZU & GUPPY, 2004; DIAS & BAILLY, 2005; MORENO-SÁNCHEZ et

al., 2007).

2.7 Flavonóides e chalconas

Os flavonóides fazem parte de uma família de compostos polifenólicos, que

existem nos vegetais, e representam uma das mais predominantes classes de

compostos (HOLLMAN & KATAN, 1997). Mais de 8.000 compostos com estrutura de

flavonóides estão identificados, formados a partir de um esqueleto básico e

combinações de vários grupos substituintes, como hidroxilas e metoxilas (HODEK et

al., 2002). Dentre os flavonóides, podemos citar: chalconas, flavonas, flavononas,

flavonóis, antrocianinas e isoflavonas (CANIVENC-LAVIER et al., 1996).

De uma forma geral, os flavonóides, além de sua função fisiológica nos

vegetais, apresentam atividade ansiolítica, antiinflamatória, antiviral, antiprotozoária

e antitumoral (MANTHEY et al., 2001; MARDER & PALADINI, 2002; FOURNET &

MUÑOZ, 2002; CÁRDENAS et al., 2006). Exercem várias propriedades bioquímicas

e farmacológicas, e um dos efeitos mais investigados é sua participação na

prevenção do câncer (CANIVENC-LAVIER et al., 1996; SHIH et al., 2000).

A atividade antitumoral dos flavonóides tem sido atribuída a uma grande

variedade de mecanismos, incluindo seqüestro de radicais livres, participação de

enzimas que detoxificam carcinógenos e inibição da ação de promotores de tumor

(CANIVENC-LAVIER et al., 1996; SHIH et al., 2000). As atividades antioxidantes,

bem como as propriedades citotóxicas dos flavonóides, são influenciadas pelo seu

grau de pureza, pela posição dos substituintes e pela quantidade de hidroxilas

(SCHROETER et al., 2002).

Recentes trabalhos mostram que flavonóides, como a quercetina, têm efeito

antiproliferativo e podem induzir a morte da célula por apoptose, em variados tipos

de câncer, como: leucemia (SHEN et al., 2003; CHEN et al., 2005; MERTENS-

TALCOTT & PERCIVAL, 2005), câncer de mama (HAKIMUDDIN et al., 2004),

câncer de ovário (CHAN et al., 2003), câncer de pulmão (NGUYEN et al., 2004),

entre outros. Os flavonóides podem induzir as células à morte, por diferentes

mecanismos apoptóticos (RAMOS, 2007). Nakagawa et al. (2004) mostraram a

atividade do EGCG, flavonóide presente no chá verde, na inibição de células de

leucemia linfoblástica aguda, Jurkat, com concomitante aumento intracelular da

atividade da caspase-2. Outra característica desse composto é a inibição de

proteínas anti-apoptóticas, como a Bcl-2 e a Bcl-x

(LEONE et al., 2003).

Em plantas, os flavonóides e os isoflavonóides são sintetizados a partir das

chalconas, que estão abundantemente distribuídas nesses vegetais.

Majoritariamente, as chalconas são encontradas nas pétalas das flores, sendo

responsáveis pela pigmentação das mesmas. Também estão presentes em folhas,

frutos, cascas, raízes de várias árvores e plantas (Ni et al., 2004).

Quimicamente, as chalconas formam um grupo de flavonóides de cadeia

aberta, em que dois anéis aromáticos são ligados por três carbonos, sendo uma

carbonila e dois carbonos α,β-insaturados (Figura 6). As chalconas são classificadas

de acordo com as substituições no anel A e B, por grupos OH e OCH

. A presença

de ligação α,β-insaturada e a ausência de um anel-C são duas características

específicas das chalconas que fazem esses compostos serem quimicamente

diferentes de outros flavonóides (KOZLOWSKI et al., 2007). Tais características

estruturais são responsáveis por diversas atividades biológicas, e a remoção de

alguns desses aspectos resulta em perda de atividade do composto (MENG et al.,

2004).

Figura 6: Núcleo fundamental das chalconas

As chalconas têm apresentado numerosas atividades biológicas, observadas

nesses últimos anos. Dentre elas estão atividades: anti-ulcerogênica (YAMAMOTO

et al., 1992), anti-hipertensiva (OGAWA et al., 2007), antimalárica (DOMINGUEZ et

al., 2001; LIU et al., 2001; LIU, et al., 2003; DOMINGUEZ et al., 2005),

antileishmaniose (ZHAI et al., 1999; CHEN et al., 2001; LIU et al., 2003; BOECK et

al., 2006), antifúngica (LÓPEZ et al., 2001; BOECK et al., 2005; KONIECZNY et al.,

2007; BATOVSKA et al., 2007), antioxidante (ZHAN & YANG, 2006; COTELLE et al.,

2005; CHIN et al., 2007; CHOI et al., 2007; KOZLOWSKI et al., 2007), antibacteriana

(ROJAS et al., 2002; SELVAKUMAR et al., 2006; KONIECZNY et al., 2007),

antimicobacteriana (KONIECZNY et al., 2007; SIVAKUMAR et al., 2007),

antiinflamatória (HERÊNCIA et al., 1999; ROJAS et al., 2002; MENG et al., 2004;

RANI et al., 2004; WON et al., 2005; LIU, et al., 2007) e antitumoral (KOBORI et

al.,1999; IWASHITA et al., 2000; XIA et al., 2000; NAM et al., 2003; SABZEVARI, et

al., 2004; RAO, et al., 2004; HSU, et al., 2004; YE, et al., 2004; NAKATAMI et al.,

2005; WON et al., 2005; FOREJTNÍKOVÁ et al., 2005; BHAT et al., 2005; HSU et al.,

2005; LIU & GO, 2006; HSU et al., 2006; MODZELEWSKA et al., 2006; CABRERA

et al., 2007).

Dentre as atividades farmacólogicas antitumorais das chalconas, pode-se

citar a inibição da angiogênese. A formação de novos capilares, angiogênese ou

neovascularização, é vital para a sobrevivência e o desenvolvimento de uma massa

tumoral. Robinson et al. (2005) sintetizaram chalconas substituídas, análogas à

curcumina, um composto natural que tem exibido propriedades antitumorais. Os

resultados mostraram que as chalconas têm igual ou maior habilidade para inibir o

crescimento de células endoteliais in vitro, que a curcumina. Nam et al. (2003)

produziram uma série de 2’,5’-dihidroxichalconas com potente atividade citotóxica,

em três linhagens celulares, incluindo melanoma murino B16, células tumorais de

câncer de cólon HCT-116 e carcinoma epidermóide humano A431. Observaram

também que vários compostos mostraram-se seletivamente citotóxicos para células

endoteliais de cordão umbilical humano (HUVEC) e, conseqüentemente, inibidores

da angiogênese.

Cabrera et al. (2007) sintetizaram uma grande quantidade de chalconas,

incluindo hidroxichalconas, que se mostraram mais tóxicas que flavononas e

flavonas, quando avaliadas quanto à sua capacidade antitumoral contra o carcinoma

renal humano TK-10, o adenocarcinoma mamário humano MCF-7 e

adenocarcinoma de cólon HT-29.

Estudos feitos por Kobori et al. (1999) descreveram que a 2’,4’,6,’4-

tetrahidroxidihidrochalcona (floretina) induziu apoptose em células de melanoma

murina B16-4A5 e em células de leucemia humana HL-60. Já Iwashita et al. (2000)

demostraram que a isoliquiritigenina (2’,4’,4-trihidroxichalcona) e a buteína (2’,4’,3,4-

tetrahidroxichalcona) inibiram significativamente a proliferação celular e induziram

células de melanoma B16- 4A5 à apoptose. Também Hsu et al. (2005) notaram que

a isoliquiritigenina induziu células tumorais de hepatócito humano Hep G2 à

apoptose e ao bloqueio do ciclo celular.

No desenvolvimento de agentes antitumorais contra o melanoma, uma das

mais importantes características que o composto pode ter é a capacidade de

promover a morte celular por apoptose, devido à fraca resposta dessas células aos

estímulos apoptóticos (KLUZA et al., 2002). Outro fator é o desenvolvimento de

resistência dos tumores sólidos a fármacos antineoplásicos. Essa resistência a

múltiplos fármacos é uma das principais causas de falhas da quimioterapia em

malignidades humanas.

O crescimento e a metástase das células tumorais malignas dependem, entre

outras propriedades, da sua habilidade para implantar, migrar, aderir, penetrar e

atravessar barreiras estruturais, alcançando os vasos sangüíneos e o tecido alvo de

metástase. A linhagem de melanoma murina B16, numerada B16-F1 à B16-F10,

apresenta um heterogêneo potencial metastático, sendo que a sub linhagem F10

apresenta-se como a mais metastática nos pulmões, quando comparada a sub

linhagem F1 (FIDLER, 1975; 1977; 1978).

O elevado potencial metastático da linhagem celular de melanoma B16-F10 e

a difícil resposta a agentes citotóxicos justifica a pesquisa de novos fármacos que

aumentem a eficácia e diminuam os efeitos adversos dos mesmos.

OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral:

Estudar a sensibilidade da linhagem celular de melanoma B16-F10 a chalconas,

derivadas do 3,4-metilenodioxibenzaldeído e derivadas da 2,4,6-

trimetoxiacetofenona, e a hidroxichalconas.

3.2 Objetivos específicos:

1. Avaliar o efeito citotóxico de 13 chalconas derivadas do 3,4-

metilenodioxibenzaldeído, de 11 chalconas derivadas da 2,4,6-trimetoxiacetofenona,

e de 13 hidroxichalconas sobre a linhagem celular de melanoma B16-F10, através

do teste do MTT

2. Analisar o efeito das chalconas ativas em células não-tumorais Vero, através

do teste do MTT;

3. Identificar por qual via as chalconas causam morte celular: se por apoptose

ou por necrose, através da fragmentação nuclear;

4. Investigar se o potencial citotóxico das chalconas é resultante do efeito pró-

oxidante das mesmas, através da associação com agentes antioxidantes;

5. Investigar a possível produção de espécies reativas de oxigênio intracelular,

pelas chalconas, através da microscopia de fluorescência;

6. Relacionar as concentrações intracelulares de glutationa total citosólica com

os possíveis efeitos citotóxicos causados pela chalconas;

7. Relacionar as alterações das concentrações intracelulares da glutationa total

mitocondrial com a glutationa total citosólica, com espécies reativas de oxigênio e

concentrações de ATP;

8. Avaliar a influência das chalconas selecionadas, no teor energético das

células (concentração de ATP);

9. Verificar se as chalconas selecionadas têm potencial antimetastático, através

da possível inibição da adesão celular.

MATERIAIS E

MÉTODOS

4.1 Reagentes

O meio de cultura Eagle, modificado por Dulbecco (DMEM), e o soro fetal

bovino (SFB) foram adquiridos da Cultilab (São Paulo, Brasil); A penicilina e a

estreptomicina foram compradas da Gibco® (Grand Island, NY, EUA); O ácido

clorídrico, o isopropanol, o dimetil sulfóxido (DMSO) e o tris (hidroximetil)

aminometano foram adquiridos da Merck® (Darmstat, Alemanha); O ácido

etilenodiaminotetraacético (EDTA) foi adquirido da Reagen (Rio de Janeiro, Brasil);

A proteinase K foi adquirida da Invitrogen® (Alemanha); O brometo de dimetiazol

difeniltetrazólio (MTT), a superoxido dismutase (SOD), a vitamina E hidrossolúvel

(TROLOX®), o ácido N-[2-Hidroxietil]piperazina-N’-[2-etanosulfônico] (HEPES), a

albumina, o meio de cultura Dulbecco modificado por Iscove (IMDM), a agarose, a

RNase, a glutationa redutase (GR), o fosfato de nicotinamida adenina dinucleotídeo

(NADPH), o ácido 5,5’-ditio-bis-2-nitrobenzóico (DTNB) e outros reagentes utilizados

nos experimentos foram adquiridos da Sigma® (St. Louis, MO, EUA); O Kit luciferin-

luciferase foi adquirido da Bioorbit (Tuku, Finlândia).

4.2 Síntese das chalconas

A síntese das chalconas, derivadas do 3,4-metilenodioxibenzaldeído e da

2,4,6 trimetoxiacetofenona, e a síntese das hidroxichalconas foram realizadas no

Departamento de Química da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), pelo

grupo de pesquisa do Prof. Rosendo Augusto Yunes.

4.3 Cultura de células

Foram utilizadas linhagens celulares de melanoma, B16-F10, de origem

murina, e células não-tumorais, fibroblastos de rim de macaco (VERO). As células

B16-F10 foram obtidas da American Type Culture Cell (ATCC) e as células Vero, da

Associação Técnico-Científica Paul Ehrlich (APABCAM, Rio de Janeiro, Brasil). As

células foram mantidas em garrafas plásticas de cultura, contendo meio DMEM,

suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100U/mL de penicilina, 100µg/mL de

estreptomicina, 10mM HEPES, pH 7.4, em estufa umidificada, a 37

C, com 5% de

. Antes da realização de todos os experimentos, o número de células viáveis foi

avaliado pelo método de Azul de Trypan (FRESHNEY, 1987), e a contagem

realizada em câmara de Neubauer.

4.3.1 Tratamento das células

Os compostos foram dissolvidos em uma solução de DMSO 10mM e

armazenados em ambiente com temperatura de 4°C a 8°C. Essas soluções estoque

foram diluídas em meio de cultura para atingir as concentrações de 10µM a 200µM

nos experimentos. As células B16-F10 e as células Vero foram incubadas em placas

de 12, 24 ou 96 poços, dependendo do procedimento experimental, mantidas por um

período de 3horas em estufa úmida, a 37

C, com 5% de CO

, antes do tratamento

com os compostos, para que pudessem aderir à placa, exceto no experimento para

verificação da adesão celular. Após a adição dos compostos, as células

permaneceram no ambiente acima citado por um período de 6 a 72 horas, conforme

o experimento.

Foram utilizados controles de células sem tratamento e com tratamento de

DMSO, diluído em meio de cultura, na mesma proporção utilizada para dissolver os

compostos.

4.4 Ensaio de viabilidade celular (teste do MTT)

A viabilidade celular foi analisada pelo método do MTT (brometo de dimetiazol

difeniltetrazólio) (VAN DE LOOSDRECHT et al., 1991). O MTT é um sal de tetrazólio

de cor amarela, que é reduzido a formazan de cor azulada, pela atividade oxidativa

das células, funcionando, pois, como um indicador da função mitocondrial e, por

conseguinte, da viabilidade celular. As células B16-F10, 1 x 10

, e células Vero, 1 x

, foram incubadas por 24 horas, em triplicata, com os compostos, em placas de

96 poços; 2 x 10

células B16-F10 foram incubadas por 48 horas e 1 x 10

células

B16-F10, por 72 horas. Depois de decorrido o tempo de incubação, o meio de

cultura foi retirado e acrescentado um novo meio e, então, o MTT (0,25µg/µL) foi

adicionado, seguido de incubação por 3 horas, a 37°C. O meio de cultura foi

retirado, o precipitado formazan foi dissolvido com uma solução ácida de isopropanol

(isopropanol com HCL 0,04 N) e a absorbância foi medida a 540nm, com o uso de

um leitor de microplacas (Organon Teknika, Belgium). A densidade óptica, obtida do

grupo controle, células sem tratamento, foi considerada como 100% de células

viáveis.

4.5 Análise de apoptose pelo método de fragmentação nuclear

O isolamento de fragmentos apoptóticos do DNA foi realizado seguindo o

método de HAN (1997). As células, 5 x 10

foram incubadas com os compostos, em

placas de 24 poços, na concentração de 100µM, mantidas por 24 horas, a 37°C,

com 5% de CO

em estufa umidificada. As células foram lavadas duas vezes com

PBS gelado. Posteriormente, foram lisadas com tampão de lise (10mM EDTA, 50mM

Tris-HCl pH 8.0; 0,25% NP-40, 0,5 mg/mL proteinase K) a 50

C, por 2 horas. O DNA

foi precipitado com 2,5 vol. de etanol-NaCl overnight, a 25°C. As amostras foram,

então, centrifugadas a 12.000g, por 30 minutos. O pellet foi lavado duas vezes com

etanol a 70%, gelado, secado à temperatura ambiente, dissolvido em tampão (10mM

Tris-HCl pH 8.0; 0,1mM EDTA), contendo 0,6 g/mL de RNase A e incubado a 37

por 1 hora.

A concentração do DNA extraído de cada amostra foi determinada

espectrofotometricamente (SAMBROOK & RUSSELL, 2001). As amostras foram

diluídas a 1:100 em água destilada; a absorbância foi medida em 260nm; a

concentração de DNA foi calculada pela equação: Concentração DNA (mg/mL) =

(Abs/ε) x diluição. O coeficiente de extinção (ε) foi considerado igual a 20. As bases

nitrogenadas da dupla fita de DNA apresentam uma absorção máxima no

comprimento de onda de 260nm. Neste comprimento de onda, o coeficiente de

extinção igual a 20 indica que o DNA, em uma concentração de 1mg/mL, terá uma

absorbância (A

260nm

) igual a 20. A relação entre a concentração do DNA e a

absorbância (A

260nm

)

é linear até o valor de 2,0.

A fragmentação do DNA foi analisada por eletroforese, em gel de agarose a

1%, e corado com 1µL de brometo de etídio (1g/100mL). A corrida foi realizada a

200V, por 10 minutos, em tampão TAE (Tris - ácido acético – EDTA). Foram

aplicados 2µg de DNA de cada amostra. Os géis foram fotografados sob iluminação

ultravioleta de 320nm (Hoefer-MacroVue UV-20), utilizando-se um sistema de

fotodocumentação de géis (Doc-Print®).

4.6 Determinação da curva dependente de concentração

Para determinar a curva dependente de concentração, 1 x 10

células foram

incubadas, por 24 horas, com os compostos em concentrações crescentes (0, 25,

50, 100, 150 e 200µM); para a curva de 48 horas, foram incubadas 2 x 10

células

com os compostos em concentrações crescentes (0, 10, 20, 30 e 50µM); para a

curva de 72 horas, foram incubadas 1 x 10

células com os compostos em

concentrações crescentes (0; 2,5; 5; 10; 20µM). Todas as incubações foram feitas

em estufa umidificada, a 37

C, com 5% CO

seguido do ensaio do MTT.

A IC

, concentração que inibe 50% do crescimento celular, foi calculada em

24, 48 e 72 horas, através das curvas dependentes de concentração, por regressão

linear.

4.7 Determinação da citotoxicidade das hidroxichalconas associadas aos

antioxidantes SOD e TROLOX®

Um elevado ou moderado nível de espécies reativas é potencialmente

citotóxico para a célula, bloqueando sua proliferação, por induzir a morte por

apoptose e até por necrose (DREHER & JUNOD, 1996).

Neste experimento, verificou-se a possível citotoxicidade dos compostos pela

produção de espécies reativas de oxigênio. Para tal, utilizaram-se agentes

antioxidantes como a superóxido dismutase (SOD) e um análogo hidrossolúvel da

vitamina E (Trolox®). As células, 1 x 10

, foram incubadas com os compostos

sintéticos em concentrações crescentes (0, 25, 50, 75, 100 µM) juntamente com

100U/mL da SOD. Além disso, foram incubadas 1 x 10

células com os compostos

sintéticos em concentrações crescentes (0, 25, 50, 75, 100 µM) juntamente com

100µM Trolox®. As células tratadas foram mantidas em estufa umidificada, a 37

com 5% CO

seguido do ensaio do MTT, após 24 horas.

4.8 Avaliação da produção de espécies reativas de oxigênio, através de

microscopia de fluorescência

Este método, proposto por Sauer et al. (2003) consiste em avaliar a presença

de espécies reativas de oxigênio no interior da célula, através da adição de acetato

de diclorofluoresceína (DCFH-DA) à célula. Esse composto é transformado, no

citoplasma, em diclorofluoresceína reduzida (DCFH) pelas esterases que, por sua

vez, na presença de espécies reativas de oxigênio, é oxidada em diclorofluoresceína

(DCF), emitindo fluorescência. As células, 8 x 10

, foram tratadas com os

compostos, na concentração de 25µM, em placas de 12 poços, e mantidas por 5

horas, a 37°C, com 5% de CO

em estufa umidificada. Adicionou-se a DCFH-DA

10µM às células, e estas foram mantidas por 30 minutos, a 37ºC, com 5% CO

estufa umidificada. As células foram centrifugadas e lavadas cinco vezes com PBS.

Em seguida foram analisadas por microscopia de fluorescência, sob luz azul.

4.9 Determinação da concentração de glutationa total citosólica

A glutationa total citosólica (GSH + GSS) foi quantificada empregando-se o

método da glutationa redutase, proposto por Tietze (1969). Nesse método, os

grupamentos sulfidrilas da GSH interagem com o DTNB, originando a GSTNB (forma

oxidada de GSH) que, na presença da glutationa redutase e de NADPH, é reduzida

novamente em GSH. Concomitantemente à formação de GSTNB e GSH, há a

liberação de ácido 5-tio-2-nitrobenzóico (TNB), um composto de coloração amarela.

Sendo assim, a intensidade de cor produzida pelo TNB é diretamente proporcional à

atividade da glutationa redutase sobre a GSTNB e GSH intracelular. As células, 3 x

, tratadas com compostos nas concentrações 25, 50, 75, 100µM e não tratadas

(controles) foram incubadas durante 24 horas. Em seguida, foram lavadas três vezes

com PBS, ressuspensas em 100µL de EDTA 1mM e ultra-sonicadas por 10

segundos. Uma quantidade de 20µL de cada homogenato foi transferida para placas

de 96 poços, seguida da adição de 180µL da solução de reação (DTNB 75µM,

NADPH 120µM, glutationa redutase 1U/mL e EDTA 10mM em tampão fosfato

100mM, pH 7.4). A absorbância foi medida após 15 minutos, a 412nm, com um leitor

de microplacas (Organon Teknika). Os valores foram expressos em percentuais em

relação ao controle.

4.10 Determinação da concentração de glutationa total mitocondrial

Para determinar a concentração da glutationa mitocondrial, mitocôndrias

foram isoladas por centrifugação em tampão Tris-sacarose (10mM/250mM),

(SCHENKMAN & CINTI, 1978). A glutationa mitocondrial (GSH + GSS) foi

quantificada empregando-se o método da glutationa redutase, proposto por Tietze

(1969). As células, 3 x 10

, tratadas com compostos nas concentrações 25, 50, 75,

100µM e não tratadas (controles) foram incubadas durante 24 horas, em placas de

24 poços. Em seguida, foram lavadas três vezes com PBS, ressuspensas em

1000µL de Tampão Tris/Sacarose 10mM/250mM, homogeneizadas, centrifugadas a

1500rpm, ressuspensas em 100µL de EDTA 1mM e ultra-sonicadas por 10

segundos. Um total de 20µL de cada homogenato foi transferido para placas de 96

poços, seguido da adição de 180µL da solução de reação (DTNB 75µM, NADPH

120µM, glutationa redutase 1U/mL e EDTA 10mM em tampão fosfato 100mM, pH

7,4). A absorbância foi medida após 15 minutos, a 412nm, com um leitor de

microplacas (Organon Teknika). Os valores foram expressos em percentuais, em

relação ao controle.

4.11 Determinação da concentração de ATP através do método luciferin –

luciferase

O método luciferin/luciferase é muito utilizado na determinação da

concentração de ATP em amostras biológicas. Foi inicialmente desenvolvido por

Strehler & Totter (1954) e adaptado por Fromme et al. (1987). O primeiro passo da

reação consiste na ativação da enzima luciferase pela ligação no ATP, na presença

de MgCl

. O ATP é hidrolisado a AMP, que permanece ligado à luciferin e ao

pirofosfato (PPi). Esse complexo reage subseqüentemente com O

, resultando na

emissão de um feixe de luz (hv), na liberação de AMP, CO

e oxiluciferin (DELUCA,

1976). A quantidade de luz emitida é naturalmente proporcional à quantidade inicial

de ATP existente no meio de reação, o qual foi medido da seguinte forma: em uma

cubeta de plástico, adicionou-se o tampão luciferin/luciferase; em seguida,

adicionou-se, ao tampão, a solução contendo luciferin/luciferase; misturou-se

cuidadosamente; a cubeta foi colocada no luminômetro para a medida do sinal de

fundo, o qual foi medido através de um registrador previamente calibrado; tendo o

sinal de fundo registrado, a amostra foi adicionada e então foi realizada uma

segunda leitura, na qual o sinal da amostra foi adicionado ao sinal de fundo e

registrado; a terceira adição foi a da solução padrão de ATP, com concentração

conhecida, que foi registrada e somada às leituras anteriores; a concentração de

ATP foi calculada com a utilização de um programa de computador não comercial

LUMI (FROMME et al., 1987).

4.12 Análise da inibição de adesão celular pelo método do cristal violeta

A inibição de moléculas de adesão celular pode desestabilizar alguns tumores

potencialmente metastáticos (JOHNSON, 1999). Para avaliar o potencial inibitório

dessas moléculas de adesão, foi utilizado o método colorimétrico proposto por

Amarante-Mendes, 1994. As células B16-F10, 2 x 10

, foram incubadas com 25, 50,

75, 100 μM dos compostos, e mantidas por 24 horas, a 37°C, com 5% de CO

estufa umidificada. Após esse período, retirou-se o sobrenadante e adicionou-se

200

μL de glutaraldeído 0,2%. A placa com as células aderidas ficou uma noite sob

refrigeração e, após, as mesmas foram lavadas duas vezes com PBS. Adicionou-se

100μL de cristal violeta e manteve-se em estufa a 37°C, por 30 minutos. Em

seguida, lavou-se em água corrente e eluiu-se com 100

μL de metanol. A leitura foi

realizada em 620nm.

4.13 Análise estatística

Os resultados foram expressos como a média

± erro-padrão da média (EPM);

cada experimento foi repetido pelo menos três vezes, em triplicata; para a avaliação

estatística, foi utilizada a análise de variância de uma via (ANOVA), seguida do teste

t de Bonferroni; para comparação da viabilidade celular, entre as linhagens B16-F10

e Vero, foi utilizado o teste t Student; um valor de P < 0,05 foi considerado

estatisticamente significativo.

4.14 Desenho experimental

Neste trabalho, foram estudados os efeitos citotóxicos das chalconas

derivadas do 3,4-metilenodioxibenzaldeído, da 2,4,6 trimetoxiacetofenona e das

hidroxichalconas, por meio do ensaio de viabilidade celular (teste do MTT). Os

compostos que apresentaram citotoxicidade estatisticamente significativa foram

avaliados quanto à toxicidade em células não-tumorais (linhagem Vero) e quanto à

forma de morte celular, pela técnica de fragmentação nuclear. Os compostos que

não foram significativamente tóxicos para as células Vero e induziram a morte

celular por apoptose das células de melanoma, foram avaliados quanto à atividade

dependente de concentração e quanto à produção de espécies reativas de oxigênio,

através da inibição desses compostos associados a antioxidantes e através da

microscopia de fluorescência. Foram avaliados quanto à possibilidade da indução de

depleção de glutationa total citosólica e glutationa total mitocondrial, de possível

depleção de ATP intracelular e da possibilidade da inibição de moléculas de adesão

celular (Figura 7).

Figura 7: Desenho experimental

Chalconas

Efeito em células de melanoma B16-F10

Citotóxicas para

células B16-F10

Não Citotóxicas *

(

* foram desconside

adas

)

Avaliação da morte celular

(fragmentação do DNA)

Necrose

Apoptose

Análise

Efeito na adesão celular

Produção de EROs

(

SOD/TROLOX

e fluorescência

)

Concentração de GSH total citosólica

Atividade dependente de

concentração (IC

)

Concentração de GSH total mitocondrial

Tóxicas para células VERO

Concentração de ATP

RESULTADOS E

DISCUSSÃO

5.1 Síntese das chalconas

5.1.1 Chalconas derivadas do 3,4-metilenodioxibenzaldeído

2 R: H

3 R: 4'-Br

4 R: 4'-NO

5 R: 2',5'-OCH

6 R: 2'-OH

7 R: 3'-OCH

-4'-OH*

8 R: 4'-OCH

9 R: 3',4'-OCH

10 R: 3'-NO

11 R: 3',4',5'-OCH

Figura 08: Reação da síntese das chalconas derivadas do 3,4-metilenodioxibenzaldeído.

(*novos compostos).

5.1.2 Chalconas derivadas da 2,4,6-trimetoxiacetofenona

CO OCH

O OCH

CO OCH

O OCH

CO OCH

xantoxilina

2,4,6-trimetoxiacetofenona

OCH

CO OCH

OCH

CO OCH

1 R: 3-NO

2 R: 3,4-Cl

3 R: 3,4-OCH

O-

4 R: 4-OCH

5 R: 2,6-Cl

7 R: 4-O(CH

)

9 R: 2-Cl *

10 R: 2-NO

11 R: 4-NO

12 R: 4-N(CH

)

13 R: 4-Cl

35 R: 3-Cl *

Figura 09: Reação da síntese das chalconas derivadas da 2,4,6-trimetoxiacetofenona.

(*novos compostos).

5.1.3 Chalconas hidroxiladas

anel B

anel B =

1 R

, R

=H; R

=OH

3 R

, R

=H; R

=OH

*6 R

=OH; R

=H; R

=OCH

anel B =

4 R

=OH; R

*5 R

=H; R

=OCH

; R

=OH

OOH

2 R

=H; R

=NO

7 R

=H; R

=Cl

*8 R

=Br; R

=OCH

; R

*9 R

=Br; R

=H; R

=O(n)But

*10 R

=Br; R

=H; R

=NO

11 R

=Br; R

=H; R

=Cl

12 R

=Br; R

=H; R

=OCH

*13 R

=Br; R

=H; R

=COOH

Figura 10: Reação da síntese das hidroxichalconas.

(*novos compostos).

5.2 Citotoxicidade das chalconas em células tumorais, células não-tumorais e

análise do DNA

Apesar de recentes avanços no conhecimento dos processos biológicos

responsáveis pelo surgimento do câncer, ainda não se conhecem os mecanismos de

citotoxicidade contra várias linhagens celulares tumorais humanas. Considerando o

potencial citotóxico de muitos produtos naturais, a síntese de compostos baseados

no núcleo básico chalcona pode ser uma estratégia promissora no desenvolvimento

de fármacos antitumorais.

Em busca de novas chalconas com atividade citotóxica para células de

melanoma B16-F10, realizou-se uma triagem com as chalconas derivadas do 3,4-

metilenodioxibenzaldeído e da 2,4,6-trimetoxiacetofenona e com as chalconas

hidroxiladas (hidroxichalconas), na concentração de 100µM (Figuras 11, 14, 17). Em

cada experimento efetuou-se um controle apenas com o DMSO, nas mesmas

concentrações utilizadas para dissolver os compostos. Esses resultados não foram

significativamente diferentes do controle das células sem tratamento (dados não

mostrados). Dessa forma, está representado nos gráficos apenas o controle das

células (sem tratamento).

01234567891011

100

***

Chalconas (100μM)

Células vivas %

Figura 11: Efeito citotóxico das chalconas derivadas do 3,4-metilenodioxibenzaldeído em

células B16-F10. As células, 1 x 10

, foram incubadas com as chalconas, por 24h, e a viabilidade

celular foi avaliada pelo método do MTT. A densidade óptica do grupo controle (0, células sem

tratamento) foi considerada como 100% de viabilidade celular. Cada ponto representa a média ±

E.P.M. (n=3). Um valor de *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001 foi considerado estatisticamente

significativo quando comparado com o controle, usando ANOVA, seguido de teste t de Bonferroni.

Dentre as chalconas derivadas do 3,4-metilenodioxibenzaldeído, as que

apresentaram efeito citotóxico relevante foram as de número 1, 2 e 7, diminuindo a

viabilidade celular em 52 ± 0,03%; 78 ± 2,4% e 57 ± 6,2%, respectivamente, pelo

teste do MTT. As chalconas 3, 5, 6 e 11 reduziram a viabilidade celular em 41 ±

2,1%; 40 ± 3,9%; 22 ± 6,4 e 26 ± 6,2, e os resultados, quando comparados ao

controle, também foram considerados estatisticamente significativos. As chalconas

4, 8, 9 e 10 não apresentaram efeito citotóxico significativo (Figura 11).

0127

100

***

Chalconas (100μM)

Células vivas %

Figura 12: Efeito citotóxico das chalconas derivadas do 3,4-metilenodioxibenzaldeído em

células VERO (não-tumorais). As células, 1 x 10

, foram incubadas com as chalconas, por 24h, e a

viabilidade celular foi avaliada pelo método do MTT. A densidade óptica do grupo controle (0, células

sem tratamento) foi considerada como 100% de viabilidade celular. Os ensaios foram realizados em

triplicata e cada ponto representa a média ± E.P.M. (n=3). Um valor de **P<0,01 e ***P<0,001 foi

considerado estatisticamente significativo quando comparado com o controle, usando ANOVA,

seguido de teste t de Bonferroni.

Tabela 1: Comparação da viabilidade das células B16-F10 e das células Vero

tradadas com chalconas derivadas do 3,4-metilenodioxibenzaldeído.

Chalconas

(3,4-metilenodioxibenzaldeído)

B16-F10

(% viabilidade celular)

Vero

(% viabilidade celular)

valor p

48 ± 0,03 67 ± 5,8 Ns

22 ± 2,4 46 ± 5,7 = 0,008

43 ± 6,2 52 ± 0,9 Ns

* O valor de P foi determinado usando o Student t test. Valores não significativos = ns.

Motivados pela atividade citotóxica das chalconas 1, 2 e 7 nas células B16-

F10, estes compostos foram selecionados para darmos continuidade à pesquisa.

Considerando que um fármaco antineoplásico deve ter como alvo principal a

célula tumoral, devendo proporcionar pouca ou nenhuma toxicidade às células

normais, testamos a ação das chalconas escolhidas em células não-tumorais Vero,

que consiste na linhagem celular estável de rim de macaco, recomendada para a

investigação de compostos químicos tóxicos

in vitro (LABRADOR et al., 2007). Os

compostos 1, 2 e 7 reduziram a viabilidade das células Vero em 33 ± 5,8%; 54 ±

5,7% e 48 ± 0,9%, respectivamente (Figura 12). Comparando a toxicidade desses

compostos, pode-se perceber que os mesmos foram menos tóxicos para as células

Vero do que para as células de melanoma B16-F10 (Tabela 1).

Além da menor toxicidade para as células não-tumorais, são desejáveis

fármacos antitumorais capazes de inibir a proliferação e induzir a morte celular por

apoptose (JUN

et al., 2007). O processo apoptótico envolve a participação ativa das

células afetadas na cascata de autodestruição, que culmina em desintegração

nuclear, degradação do DNA e formação de “corpos apoptóticos”, os quais são

rapidamente retirados do tecido por macrófagos (WYLLIE

et al., 1980; WYLLIE,

1985; ARENDS

et al., 1990). A apoptose acontece sem causar reação inflamatória,

ao contrário da necrose que ocorre geralmente em resposta à injúria severa às

células, sendo esta caracterizada morfologicamente por inchaço citoplasmático e

mitocondrial, pela ruptura da membrana plasmática e por liberação do conteúdo

extracelular. Conseqüentemente, ocorre a geração de uma resposta inflamatória,

que pode causar lesão e até morte de células vizinhas. Nessas condições, células,

em quantidade significativa, são prejudicadas ao mesmo tempo.

Devido ao desencadeamento do processo inflamatório, há alterações

irreversíveis no tecido e/ou órgão afetado (CURTIN

et al., 2002).

A fim de saber se esses compostos causavam apoptose ou necrose, foi

realizada uma eletroforese em gel de agarose, em que se verificou que as chalconas

1, 2 e 7, na concentração de 100µM, não fragmentaram o DNA das células B16-F10.

Isso indica que a morte celular foi induzida por necrose (Figura 13).

Figura 13: Necrose induzida por chalconas derivadas do 3,4-metilenodioxibenzaldeído em

células B16-F10. As células, 5 x 10

, foram incubadas com os compostos 1, 2 e 7, por 24h, na

concentração de 100µM, representados na figura com os respectivos números e por C - controle,

(células sem tratamento). Os extratos nucleares foram obtidos e o DNA foi analisado por eletroforese

em gel de agarose 1%, corado pelo brometo de etídio, como descrito nos materiais e métodos.

012345678910111213

100

***

Chalconas (100μM)

Células vivas %

Figura 14: Efeito citotóxico das chalconas derivadas da 2,4,6-trimetoxiacetofenona em células

B16-F10. As células, 1 x 10

, foram incubadas com as chalconas, por 24h, e a viabilidade celular foi

avaliada pelo método do MTT. A densidade óptica do grupo controle (0, células sem tratamento) foi

considerada como 100% de viabilidade celular. Cada ponto representa a média ± E.P.M. (n=3). Um

valor de **P<0,01 e ***P<0,001 foi considerado estatisticamente significativo quando comparado com

o controle, usando ANOVA, seguido de teste t de Bonferroni.

C 7 1 2

Com a intenção de se encontrar um composto com maior potencial

antitumoral do que os anteriormente testados, e ao mesmo tempo menos citotóxico

para as células normais, procurou-se investigar outras chalconas que atendessem a

esses requisitos. Foi investigado o grupo de chalconas derivadas da 2,4,6-

trimetoxiacetofenona. Dentre estas, algumas chalconas apresentaram pronunciado

efeito citotóxico. As chalconas de número 1, 2 e 9 diminuíram a viabilidade celular

em 82 ± 3,8%; 90 ± 2,5% e 75 ± 1,9%, respectivamente. A chalcona 6 e a 13

apresentaram uma menor citotoxicidade do que as chalconas anteriormente citadas:

27 ± 4,7% e 36 ± 5,7%, respectivamente. Portanto, também foram consideradas

significativamente citotóxicas, ao passo que as chalconas 3, 4, 5, 7, 8, 10, 11 e 12

não apresentam efeito citotóxico relevante (Figura 14).

Considerando a atividade citotóxica dos compostos 1, 2 e 9, estes foram

escolhidos para analisar o possível dano ao DNA que viessem causar, através de

eletroforese em gel de agarose. Verificou-se que tais compostos fragmentaram o

DNA das células B16-F10, através do aparecimento de bandas características, que

confirmaram a morte celular por apoptose (Figura 15).

C12

Figura 15: Fragmentação do DNA induzida por chalconas derivadas da 2,4,6-

trimetoxiacetofenona em células B16-F10. As células, 5 x 10

,foram incubadas com os compostos

1, 2, e 9, por 24h, na concentração de 100µM, sendo representados na figura pelos respectivos

números e por C - controle (células sem tratamento). Os extratos nucleares foram obtidos e a

fragmentação do DNA foi analisada por eletroforese em gel de agarose 1,0%, corado pelo brometo de

etídio, como descrito nos materiais e métodos.

0129

100

***

Chalconas (100μM)

Células vivas %

Figura 16: Efeito citotóxico das chalconas derivadas da 2,4,6-trimetoxiacetofenona em células

VERO (não tumorais). As células, 1 x 10

, foram incubadas com as chalconas, por 24h, e a

viabilidade celular foi avaliada pelo método do MTT. A densidade óptica do grupo controle (0, células

sem tratamento) foi considerada como 100% de viabilidade celular. Cada ponto representa a média ±

E.P.M. (n=3). Um valor de

***

P < 0,001 foi considerado estatisticamente significativo, quando

comparado com o controle, usando ANOVA, seguido de teste t de Bonferroni.

Tabela 2: Comparação da viabilidade das células B16-F10 e células VERO

tratadas com chalconas derivadas da 2,4,6 trimetoxiacetofenona.

Chalconas

(2,4,6 trimetoxiaceofenona)

B16-F10

(% viabilidade celular)

Vero

(% viabilidade celular)

valor p

18 ± 3,8 28 ± 4,6 Ns

10 ± 2,5 22 ± 3,1 Ns

25 ± 1,9 36 ± 4,1 Ns

* O valor de P foi determinado usando o Student t test. Valores não significativos = ns.

Com o objetivo de verificar a ação dos compostos estudados em células não

tumorais, testamos as chalconas derivadas 2,4,6-trimetoxiacetofenona em células

Vero. Na figura 16 é possível observar a toxicidade dos compostos 1, 2 e 9 sobre as

células Vero. A porcentagem de morte celular foi de 72 ± 4,6 %; 78 ± 3,1 e 64 ±

4,1%, respectivamente, se comparada ao controle (100% de células viáveis).

Comparando a viabildade celular das B16-F10 e das células Vero tratadas com as

chalconas 1, 2 e 9, é possível verificar que a diferença não é significativa (Tabela 2).

Como a maioria dos fármacos disponíveis atualmente para o tratamento do

câncer é tóxica para células normais, e considerando também a toxicidade

demonstrada pelas chalconas 1, 2 e 9 para células não-tumorais, conclui-se que

estes compostos apontam para a inviabilidade da continuidade das pesquisas com

os mesmos.

012345678910111213

100

***

Hidroxichalcona (100μM)

Células vivas %

Figura 17: Efeito citotóxico das hidroxichalconas em células B16-F10. As células, 1 x 10

, foram

incubadas com as hidroxichalconas, por 24h, e a viabilidade celular foi avaliada pelo método do MTT.

A densidade óptica do grupo controle (0, células sem tratamento) foi considerada como 100% de

viabilidade celular. Cada ponto representa a média ± E.P.M. (n=3). Um valor de *P<0,05, **P<0,01 e

***P<0,001 foi considerado estatisticamente significativo quando comparado com o controle, usando

ANOVA, seguido de teste t de Bonferroni.

Na busca por compostos mais efetivos e menos citotóxicos para as células

não-tumorais, as hidroxichalconas foram testadas em células B16-F10 e em células

Vero. As hidroxichalconas que apresentaram maiores efeitos citotóxicos, nas células

B16-F10, foram as de número 1, 3 e 13, reduzindo a viabilidade celular em 98 ±

0,7%, 75 ± 1,5% e 50 ± 1,9%, respectivamente. As hidroxichalconas 5, 6, 7, 8, 11 e

12 reduziram a viabilidade celular em 16 ± 1,7%; 19 ± 2,6%; 25 ± 4,2%; 18 ± 1,5; 15

± 2% e 13 ± 0,13, respectivamente (Figura 17). As demais hidroxichalconas

apresentaram baixa ou nenhuma atividade citotóxica para essa linhagem celular.

Sabzevari

et al. (2004) observaram a importância da presença do grupo

hidroxila no anel-A e/ou no anel B das chalconas para a citotoxicidade destas e

descreveram que uma maior quantidade de hidroxilas no anel-A tende a diminuir o

efeito citotóxico destes compostos. As hidroxichalconas testadas nos experimentos

realizados apresentam uma hidroxila no anel-A, característica que indica ser

responsável pela maior citotoxicidade das hidroxichalconas 1, 3 e 13. Dimmock

et al.

(1999) também descreveram que a introdução de grupos hidroxilas na estrutura das

chalconas aumenta o efeito citotóxico. Porém, esta atividade pode ser regulada pela

configuração da molécula, como pode ser observado nos anéis A e B das

hidroxichalconas 4 e 5. O mesmo fato é observado com a chalcona 6, quando a

presença do grupo metóxi, na posição 5, pode mudar a conformação da molécula.

Isso também pode explicar a falta de significativa atividade das chalconas

hidroxiladas 2, 7, 8, 9, 10, 11 e 12 (Figura17).

01313

100

***

Hidroxichalcona (100 μM)

Células vivas %

Figura 18: Efeito citotóxico das hidroxichalconas em células VERO (não tumorais). As células,

1 x 10

, foram incubadas com as hidroxichalconas, por 24h, e a viabilidade celular foi avaliada pelo

método do MTT. A densidade óptica do grupo controle (0, células sem tratamento) foi considerada

como 100% de viabilidade celular. Cada ponto representa a média ± E.P.M. (n=3). Um valor de ***P <

0,001 foi considerado estatisticamente significativo, quando comparado com o controle, usando

ANOVA, seguido de teste t de Bonferroni.

Na figura 18, é possível observar a toxicidade das hidroxichalconas 1, 3, e 13

sobre as células Vero. A porcentagem de morte celular foi de 82 ± 2,5%; 39 ± 1,8% e

30 ± 1,0%, respectivamente, comparada com o grupo controle (100% de células

viáveis). A viabilidade das células Vero foi significativamente maior que a das células

de melanoma, mostrando que a morte das células tumorais, induzida pelas

hidroxichalconas, foi mais evidente (Tabela 3), e o valor de P foi extremamente

significativo.

Tabela 3: Comparação da viabilidade das células B16-F10 e das células VERO

tratadas com hidroxichalconas.

Hidroxichalconas B16-F10

(% viabilidade celular)

Vero

(% viabilidade celular)

valor p

2 ± 0,7 18 ± 2,5 < 0.0003

25 ± 1,5 61 ± 1,8 < 0.0001

50 ± 1,9 70 ± 1,0 < 0.0001

O valor de P foi determinado usando o Student t test.

C1 313C1 313C1 313

Figura 19: Fragmentação do DNA induzida por hidroxichalconas em células B16-F10. As

células, 5 x 10

, foram incubadas com os compostos 1, 3 e 13, por 24h, nas respectivas IC

de 57µM,

63µM e 123µM, sendo representados na figura pelos respectivos números e por C - controle (células

sem tratamento). Os extratos nucleares foram obtidos e a fragmentação do DNA foi analisada por

eletroforese em gel de agarose 1,0%, corado pelo brometo de etídio, como descrito nos materiais e

métodos.

Devido à atividade citotóxica das hidroxichalconas 1, 3 e 13, nas células B16-

F10, e a menor toxicidade nas células não tumorais, prosseguimos com a análise do

DNA, através da eletroforese em gel de agarose. Verificamos que as

hidroxichalconas 1 e 3 causaram fragmentação do DNA das células B16-F10, com o

surgimento de bandas características da morte celular por apoptose, enquanto que a

hidroxichalcona 13 não fragmentou o DNA, o que caracteriza a morte celular por

necrose (Figura 19). A principal característica da apoptose é a fragmentação do

DNA por DNases que atacam as regiões de ligação da dupla fita de DNA, ocorrendo

a clivagem internucleossomal e a conseqüente formação de fragmentos de 180-200

pares de base (WYLLIE, 1980).

Apoptose ou morte celular programada é um mecanismo que controla a

proliferação celular (GHOBRIAL

et al., 2005). Estudos citam as chalconas

hidroxiladas como indutoras de apoptose em várias linhagens celulares.

Kobori et al.

(1999) descreveram a morte celular por apoptose de células de melanoma murino

B16-4A5 e de leucemia humana HL-60, induzidas pela 2’,4’,6,’,4-

tetrahidroxidihidrochalcona (floretina). Iwashita

et al. (2000) demostraram que a

isoliquiritigenina (2’,4’,4-trihidroxichalcona) e a buteina (2’,4’,3,4-

tetrahidroxichalcona) inibiram, de forma evidente, a proliferação celular e induziram

células de melanoma B16-4A5 à apoptose. A indução da apoptose em células

tumorais metastáticas, como o melanoma, é considerada uma das promissoras

estratégias preventivas ou quimioterapêuticas (JUN

et al., 2007). Entretanto, a

maioria dos trabalhos é focada em alvos específicos, não mostrando se a toxicidade

ocorreu através de apoptose.

O desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento de tumores

malignos, como o melanoma, pode ser baseado na capacidade inibitória da

proliferação celular desses compostos, bem como na capacidade de induzirem

células à apoptose, pois a habilidade da célula maligna em evitar esta forma de

morte celular é uma marca característica do câncer, e a resistência à apoptose

constitui um importante problema clínico (HANAHAN & WEINBERG, 2000).

5.3 Atividade das hidroxichalconas dependente de concentração

Foi analisada a influência de diferentes concentrações das hidroxichalconas

para a citotoxicidade do melanoma B16-F10, nos tempos de 24, 48 e 72 horas de

incubação.

0 25 50 100 150 200

100

Hidroxichalcona (μM)

Células vivas %

Figura 20: Atividade das hidroxichalconas dependente de concentração em células B16-F10,

em 24h. Células, 1 x 10

, foram incubadas com as chalconas (0-200µM). A viabilidade celular foi

avaliada pelo método do MTT. A densidade óptica do grupo controle (0, células sem tratamento) foi

considerada como 100% de viabilidade celular. Cada ponto representa a média ± E.P.M. (n=3). Um

valor de

P < 0,001 foi considerado estatisticamente significativo, quando comparado com o controle,

usando ANOVA, seguido de teste t de Bonferroni.

As chalconas 1, 3 e 13 causaram morte celular de maneira dependente de

concentração. Os valores da IC

desses compostos, em 24 horas, foram 57µM,

63µM e 123µM, respectivamente (Figura 20). Em 48 horas foram utilizadas menores

concentrações das hidroxichalconas, pois o tempo de exposição a esses compostos

foi maior.

0 10 20 30 50

100

Hidroxichalconas (μM)

Células vivas %

Figura 21: Atividade das hidroxichalconas dependente de concentração em células B16-F10,

em 48h. Células, 2 x 10

, foram incubadas com as chalconas (0-50µM). A viabilidade celular foi

avaliada pelo método do MTT. A densidade óptica do grupo controle (0, células sem tratamento) foi

considerada como 100% de viabilidade celular. Cada ponto representa a média ± E.P.M. (n=3). Um

valor de *P < 0,05 e

P < 0,001 foi considerado estatisticamente significativo, quando comparado com

o controle, usando ANOVA, seguido de teste t de Bonferroni.

Tabela 4: Valores de IC

das hidroxichalconas 1, 3 e 13 em 24, 48 e 72 horas

de incubação, nas células de melanoma B16-F10.

Hidroxichalconas

(μM)

24h

(μM)

48h

(μM)

72h

57 30 12

63 28 17

123 50 30

Os valores das IC

, das hidroxichalconas 1, 3 e 13, em 48 horas, foram

30µM, 28µM e 50µM, respectivamente, diminuindo aproximadamente para a metade

os valores das IC

obtidos em 24 horas (Figura 21). Em 72 horas de incubação, a

atividade das hidroxichalconas dependente de concentração foi analisada, e os

valores da IC

das hidroxichalconas 1, 3 e 13 foram 12µM, 17µM e 30µM,

respectivamente (Figura 22). Como observado na tabela 4, os valores das IC

24, 48 e 72 horas diminuíram de acordo com o tempo de incubação.

0 2,5 5 10 20 40

100

Hidroxichalconas (μM)

Células vivas %

Figura 22: Atividade das hidroxichalconas dependente de concentração em células B16-F10,

em 72h. Células, 1 x 10

, foram incubadas com as chalconas (0-40µM). A viabilidade celular foi

avaliada pelo método do MTT. A densidade óptica do grupo controle (0, células sem tratamento) foi

considerada como 100% de viabilidade celular. Cada ponto representa a média ± E.P.M. (n=3). Um

valor de **P < 0,01 e

P < 0,001 foi considerado estatisticamente significativo, quando comparado

com o controle, usando ANOVA, seguido de teste t de Bonferroni.

5.4 Citotoxicidade das hidroxichalconas na presença de antioxidantes

Antes de associar a enzima SOD (superóxido dismutase) e o Trolox® (forma

hidrossolúvel análoga a vitamina E) aos compostos, no tratamento das células B16-

F10, estes antioxidantes foram testados em diversas concentrações, a fim de

mostrar qual concentração não seria citotóxica para a B16-F10: 100, 500 e 1000

U/mL, de SOD; 25, 50, 100, 150 e 200µM, de Trolox®. A SOD, na concentração de

100U/mL, e o Trolox®, na concentração de 100µM, mostraram não alterar a

viabilidade celular pelo teste do MTT (Figura 23 – A e 24 - A). Portanto, esses

antioxidantes, nessas concentrações, foram associados às hidroxichalconas 1, 3 e

13 para a verificação da suposta atividade pró-oxidante das mesmas (Figuras 23 –

B, C e D e 24 – B, C e D).

0 100 500 1000

100

SOD

SOD (U/mL)

Células vivas %

0 25 50 75 100

100

1 + SOD

Hidroxichalcona (μM)

Células vivas %

0 25 50 75 100

100

3 + SOD

Hidroxichalcona (μM)

Células vivas %

0 75 100 125 150

100

13 + SOD

Hidroxichalcona (μM)

Células vivas %

Figura 23: A – Atividade da SOD dependente de concentração em células B16-F10. Células, 1 x

, foram incubadas com a SOD (100, 500, 1000 u/mL) por 24h. B, C e D – Atividade das

hidroxichalconas 1, 3 e 13 dependente de concentração, associadas à SOD (100U/mL) em

células B16-F10. Células, 1 x 10

, foram incubadas com as hidroxichalconas 1 e 3 (0-100µM); 13

(0-150µM) por 24h. A viabilidade celular foi avaliada pelo método do MTT. A densidade óptica do

grupo controle (0, células sem tratamento) foi considerada como 100% de viabilidade celular. Cada

ponto representa a média ± E.P.M. (n=3). Um valor de

P < 0,001 foi considerado estatisticamente

significativo, quando comparado com o controle, usando ANOVA, seguido de teste t de Bonferroni.

As hidroxichalconas 1 e 3, quando associadas à SOD, foram menos

citotóxicas para as células B16-F10 do que quando utilizadas sozinhas, pois a morte

celular diminuiu significativamente. As concentrações dessas hidroxichalconas para

matar 50% das células de melanoma (IC

), em 24 horas, foram de 57µM e de

63µM. Após a associação com a SOD, a IC

aumentou para 68µM e 68,5µM,

respectivamente, enquanto que a morte celular induzida pela hidroxichalcona 13 não

foi afetada pela adição de SOD ao experimento, pois não alterou significativamente

a IC

desse composto (Tabela 5).

Tabela 5: Comparação das IC

(hidroxichalconas e hidroxichalconas + SOD)

em células B16-F10

Hidroxichalconas Hidroxichalconas

(IC

) µM

+ SOD

(IC

) µM

valor p

57 68 < 0.0001

53 68.5 =0.0014

123 125 ns

O valor de P foi determinado usando o Student t test. Valores não significativos = ns.

Tais resultados podem sugerir a formação de espécies reativas de oxigênio

(EROs), mais especificamente radicais superóxido (O

•−

), como conseqüência do

tratamento das células B16-F10 com os compostos 1 e 3. Provavelmente, a

associação da SOD aos compostos foi o fator determinante na diminuição da

geração de EROs e, conseqüentemente, da citotoxicidade. Vários compostos

naturais podem induzir a morte celular por apoptose, em células tumorais, por

aumentar a produção de EROs mitocondriais, seguida pela formação de poros na

mitocôndria, tornando-a permeável, ocasionando a liberação de citocromo c (LEE

al., 2001). Li et al. (2003) relacionaram a produção mitocondrial de EROs à liberação

de citocromo c e à ativação da caspase-3, pela linhagem de leucemia promielocítica

humana HL-60, com a morte celular por apoptose, após o tratamento dessas células

com o composto rotenona.

0 25 50 100 150 200

100

TROLOX

Trolox (μM)

Células vivas %

0 25 50 75 100

100

1 + Trolox

Hidroxichalcona (μM)

Células vivas %

0 25 50 75 100

100

3 + Trolox

Hidroxichalcona (μM)

Células vivas %

0 75 100 125 150

100

13 + Trolox

Hidroxichalcona (μM)

Células vivas %

Figura 24: A – Atividade do TROLOX® dependente de concentração em células B16-F10.

Células, 1 x 10

, foram incubadas com TROLOX® (0-200µM) por 24h. B, C e D – Atividade das

hidroxichalconas 1, 3 e 13 depende de concentração, associadas ao TROLOX® (100µM) em

células B16-F10. Células, 1 x 10

, foram incubadas com as hidroxichalconas 1 e 3 (0-100µM); 13

(0-150µM) por 24h. A viabilidade celular foi avaliada pelo método do MTT. A densidade óptica do

grupo controle (0, células sem tratamento) foi considerada como 100% de viabilidade celular. Cada

ponto representa a média ± E.P.M. (n=3). Um valor de *P < 0,05, **P < 0,01 e

P < 0,001 foi

considerado estatisticamente significativo, quando comparado com o controle, usando ANOVA,

seguido de teste t de Bonferroni.

O análogo hidrossolúvel da vitamina E (Trolox®), quando associado à

hidroxichalcona 1 e à hidroxichalcona 13, também reduziu a citotoxicidade desses

compostos e aumentou significativamente a IC

50,

de 57µM para 68µM e de 123µM

para uma concentração maior que 150µM, respectivamente, enquanto que a

hidroxichalcona 3, associada ao Trolox®, não foi significativamente menos citotóxica

(Tabela 6).

Tabela 6: Comparação das IC

(hidroxichalconas e hidroxichalconas +

TROLOX®), em células B16-F10

Hidroxichalconas Hidroxichalconas

(IC

) µM

+ Trolox

(IC

) µM

valor p

57 83 < 0.0001

63 64.5 ns

123 >150 < 0.0001

* O valor de P foi determinado usando o Student t test. Valores não significativos = ns.

A vitamina E inibe a peroxidação lipídica através do seqüestro de radicais

peroxil lipídicos (LO

•−

); adicionalmente reage com o radical hidroxil (

•

OH), com o

radical peroxil (RO

•

), com o radical superóxido (O

•−

); provavelmente, reage com o

radical hidroperoxil (HO

•

) (HALLIWEL, 2000); tem um efeito protetor no organismo,

resultado da inibição dos radicais livres, e reduz também a citotoxicidade de alguns

agentes antitumorais (GREENBERG

et al., 1994; SYLVESTER, 2007). Através dos

resultados mostrados até aqui, podemos inferir que a associação da SOD ou do

Trolox®, com as hidroxichalconas, diminuiu a toxicidade para as células de

melanoma B16-F10, evidenciando a característica pró-oxidante destas moléculas.

5.5 Produção de espécies reativas de oxigênio pelas hidroxichalconas

Níveis elevados ou moderados de espécies reativas de oxigênio (EROs) são

potencialmente citotóxicos e bloqueiam a proliferação celular, por induzirem a morte

por apoptose e até por necrose (DREHER & JUNOD, 1996).

Figura 25: Avaliação da produção de espécies reativas de oxigênio pelas hidroxichalconas 1, 3

e 13, por microscopia de fluorescência. As células B16-F10, 8 X 10

, foram incubadas com as

hidroxichalconas (25µM), por 5h, posteriormente foram tratadas com (DCF-DA). C - A, células sem

tratamento (microscopia óptica); C - B, células sem tratamento (microscopia de fluorescência);

A - (1, 3 e 13) controle (células incubadas com DCF-DA); B - (1, 3 e 13) células tratadas com os

compostos e com DCF-DA).

C - A C - B

13 - A 13 - B

1 - A 1 - B

3-A 3 - B

A produção intracelular de EROs pelas hidroxichalconas 1, 3 e 13 também foi

avaliada pelo método da acetato diclorofluoresceína (DCFH-DA), que é

transformada, no citoplasma, em diclorofluoreceína reduzida (DCFH). Na presença

de espécies reativas de oxigênio, é oxidada à diclorofluoresceína (DCF), que emite

fluorescência. Neste experimento não quantitativo, as EROs foram observadas mais

intensamente nas células tratadas com as hidroxichalconas 1 e 3, apresentando-se

fluorescentes. Nas células tratadas com a hidroxichalcona 13, também foram

evidenciadas espécies reativas intracelularmente, comparadas ao controle (Figura

25). Esses resultados condizem com os experimentos anteriores, onde todas as

hidroxichalconas parecem ter algum potencial pró-oxidante.

5.6 Concentração de glutationa total citosólica

A glutationa (GSH) é o mais abundante antioxidante celular dos mamíferos.

Trata-se de um nucleófilo celular que tem como função reagir com eletrófilos

gerados em conseqüência do processo metabólico, que envolve compostos

endógenos e xenobióticos (LASH, 2006).

As células tumorais tendem a exibir altos níveis de GSH intracelular,

possivelmente como uma resposta adaptativa ao seu metabolismo acelerado e aos

seus elevados níveis de espécies reativas de oxigênio (BATIST

et al., 1996). Por sua

vez, as células de melanoma B16-F10 também possuem uma alta concentração de

glutationa intracelular, e este fator é relacionado à resistência dessas células à

quimioterapia e à radioterapia. Assim, a depleção de GSH tem sido descrita como

uma potencial estratégia para a sensibilização das células tumorais (BENLLOCH

al., 2005).

As chalconas têm chamado atenção de pesquisadores pelo seu potencial

citotóxico e pela capacidade em depletar GSH. Sabzevari

et al. (2004) investigaram

os mecanismos citotóxicos da floretina, da isoliquiritigenina e de outras

hidroxichalconas em hepatócitos isolados de ratos. Observaram que todas as

chalconas testadas foram citotóxicas, e a hidroxichalcona 2’,3’,4’-THC foi a mais

potente na depleção da GSH. Isso ocorre provavelmente pela formação de um

conjugado entre as já citadas hidroxichalconas e a GSH. Como conseqüência, a

depleção da GSH dos hepatócitos provocou um aumento significativo na

citotoxicidade dessas hidroxichalconas. Kachadouriam & Day (2006) compararam a

indução da depleção da glutationa pelas hidroxichalconas e flavonas em células

tumorais. As hidroxichalconas demonstraram-se mais efetivas em células epiteliais

pulmonares humanas A549 e em células de leucemia humana HL-60, pois

depletaram mais de 50% da GSH intracelular. Park

et al. (2007) comprovaram, em

seus experimentos, o envolvimento da depleção de GSH e a produção de EROs,

induzidos por antimycina A (AMA), sobre células de adenocarcinoma cervical HeLa.

Também constataram que a depleção de GSH e a produção de EROs provocam a

morte celular por apoptose.

0 25 50 75 100

100

Hidroxichalcona (μM)

Células vivas %

0 25 50 75 100

100

Hidroxichalcona (μM)

Glutationa total %

Figura 26: A – Atividade das hidroxichalconas dependente de concentração em células B16-

F10. Células, 1 x 10

, foram incubadas com as chalconas (0-100µM), por 24h. A viabilidade celular foi

avaliada pelo método do MTT. A densidade óptica do grupo controle (0, células sem tratamento) foi

considerada como 100% de viabilidade celular. B - Efeito das hidroxichalconas na concentração

de glutationa total citosólica em células B16-10. Os compostos (0-100µM) foram adicionados às

células, 3 x 10

, e incubados por 24h. As células foram lisadas e os níveis de GSH foram

quantificados pelo método de Tietze (1969). O controle (0, células sem tratamento) foi considerado

como 100% da concentração de GSH total (GSH+GSSG). Cada ponto representa a média ± E.P.M.

(n=3). Um valor de **P < 0,01 e

P < 0,001 foi considerado estatisticamente significativo, usando

ANOVA, seguido de teste t de Bonferroni.

Em nosso trabalho pode-se sugerir que a morte das células B16-F10, por

apoptose induzida pelas hidroxichalconas 1 e 3, foi provocada pela produção de

EROs e pela conseqüente depleção da glutationa dessas células (Figuras 19, 23,

24, 25, 26). As hidroxichalconas 1 e 3 depletaram GSH a partir da concentração de

50µM e 25µM, respectivamente, sendo que, em 50µM e em maiores concentrações,

a morte das células B16-F10, induzida pela hidroxichalcona 1, foi muito mais

significativa do que a depleção de GSH. Igualmente, a morte celular induzida pela

hidroxichalcona 3, nas concentrações de 25µM e 50µM, foi significativamente maior

do que a depleção de glutationa (Figura 26). A hidroxichalcona 3 foi a que mais

depletou GSH, um total de 50%, quando as células de melanoma B16-F10 foram

tratadas com a concentração de 60.3µM, enquanto que a hidroxichalcona 1 depletou

50% da GSH, quando utilizada na concentração de 85,8µM, revelando a

necessidade de uma concentração maior da hidroxichalcona 1 para a depleção de

GSH. A hidroxichalcona 13 foi o composto que menos induziu a produção de

espécies reativas de oxigênio, e o composto que menos depletou glutationa

intracelular, das B16-F10. Considerando que a depleção da GSH citoplasmática é

uma característica de morte celular por apoptose e a hidroxichalcona 13 induziu as

células de melanoma à morte, por necrose, acredita-se em outros mecanismos

envolvidos na atividade citótoxica desse composto.

A única hidroxila presente no anel A das hidroxichalconas 1, 3 e 13 é, em

princípio, a responsável pela atividade desses compostos na depleção da GSH.

Sabzevari

et al. (2004) apontaram chalconas com apenas uma hidroxila no anel A

como sendo mais citotóxicas do que as chalconas que apresentam hidroxila apenas

no anel B. Esses radicais fenoxil das hidroxichalconas facilmente oxidam a GSH em

GSSG. Outra forma de depletar GSH, quando a mesma não é oxidada, é a

conjugação com chalconas, por adição à ligação

α,β-insaturadas da carbonila.

Porém, as concentrações das hidroxichalconas 1 e 3 para depletar a GSH foram

maiores que as concentrações necessárias para causar a morte celular das células

de melanoma. Isso pode indicar outros fatores envolvidos na morte celular, induzida

pelas hidroxichalconas, além da depleção da GSH.

5.7 Concentração de glutationa total mitocondrial

O maior antioxidante celular, a glutationa, está majoritariamente localizada no

citoplasma, mas uma pequena porção, 15%, encontra-se na mitocôndria (GRIFFITH

& MEISTER, 1985; MEISTER, 1995).

Recentemente, tem-se associado alterações na concentração de GSH

mitocondrial (GSHm) com a ativação das vias sinalizadoras e com a expressão de

genes que regulam a apoptose, o crescimento e a diferenciação celular (ZAMZAMI

et al., 1996; FILOMENI, 2002). A glutationa mitocondrial tem um papel fundamental

no controle da geração de espécies reativas de oxigênio e na modulação da morte

celular por várias vias (GARCIA-RUIZ & FERNANDEZ-CHECA, 2006). Alterações

nas concentrações de GSH e no estado redox da mitocôndria associam-se com o

estresse oxidativo induzido por vários agentes oxidantes (McKERNAN

et al. 1991;

BRODIE & REED, 1992).

0 25 50 75 100

100

Hidroxichalcona (μM)

Glutationa total %

0 25 50 75 100

100

Hidroxichalcona (μM)

Glutationa mitocondrial %

Figura 27: A - Efeito das hidroxichalconas na concentração de glutationa total citosólica em

células B16-F10. Os compostos (0-100µM) foram adicionados às células, 3 x 10

, e incubados por

24h. As células foram lisadas e os níveis de GSH foram quantificados pelo método de Tietze (1969).

O controle (0, células sem tratamento) foi considerado como 100% da concentração de GSH total

(GSH+GSSG). B - Efeito das hidroxichalconas na concentração de glutationa total mitocondrial

em células B16-F10. Os compostos (0-100µM) foram adicionados às células, 3 x 10

, e incubados

por 24h. As mitocôndrias das células foram isoladas e lisadas. Os níveis de GSH total mitocondrial

foram quantificados pelo método de Tietze (1969). Cada ponto representa a média ± E.P.M. (n=3).

Um valor de **P<0,01 e

P < 0,001 foi considerado estatisticamente significativo, usando ANOVA,

seguido de teste t de Bonferroni.

Nos experimentos realizados, as hidroxichalconas 1 e 3 foram as que mais

depletaram GSH mitocondrial (Figura 27). Se compararmos a habilidade desses

compostos na formação de EROs com a depleção de GSH mitocondrial, podemos

perceber que as hidroxichalconas 1 e 3, que têm o maior efeito pró-oxidante,

apresentado em experimentos anteriores, são as que mais proporcionam depleção

da GSHm. Não obstante, a hidroxichalcona 13 também tem um efeito pró-oxidante,

porém menor, e também depleta GSH mitocondrial.

Tabela 7: Comparação das concentrações de glutationa total citosólica (GSH) e

glutationa total mitocondrial (GSHm) ± E. P. M., em células B16-F10

[µM]

(%GSH)

(%GSHm)

(% GSH)

(%GSHm)

(% GSH)

(%GSHm)

99,5 ± 2,6 99,8 ± 1,9 84,5 ± 4,3 95,0 ± 4,6 94,0 ± 2,1 87,5 ± 5,2

97,6 ± 7,9 79,0 ± 5,2 76,6 ± 1,7 48,8 ± 1,3 94,1 ± 5,2 71,61 ±4,4

74,8 ± 3,9 26,3 ± 1,7 24,0 ± 3,1 35,6 ± 0,1 87,6 ± 4,3 68,1 ± 2,7

100

24,4 ± 2,5 22,2 ± 3,1 15,7 ± 0,5 18,1 ± 1,1 69,7 ± 4,8 60,8 ± 2,5

Slater

et al. (1995) postularam que a perda da GSH citoplasmática seria um

dos eventos característicos de morte celular por apoptose, através da influência na

capacidade redox tamponante da célula, tornando-a intolerante à presença de

agentes oxidantes. Além disso, citaram também que pode ocorrer diminuição dos

níveis de glutationa mitocondrial que afeta a produção de energia celular.

Geralmente, em nossos resultados, as hidroxichalconas depletaram mais a GSH

total mitocondrial que a GSH total celular (Tabela 7).

5.8 Concentração de ATP

A mitocôndria é responsável por 80% a 90% do ATP necessário para a

respiração e a sobrevivência celular e tem um importante papel nos estímulos pró e

anti-apoptóticos (DIAS & BAILLY, 2005). O objetivo deste experimento está baseado

no interesse por agentes antitumorais que tenham capacidade de promover a morte

celular por apoptose, através da depleção energética celular, tendo em vista a difícil

resposta a estímulos apoptóticos das células de melanoma (KLUZA & LANSIAUX,

2002).

0 25 50 75 100

100

Hidroxichalcona (μM)

ATP %

0 25 50 75 100

100

Hidroxichalcona (μM)

Glutationa mitocondrial %

Figura 28: A - Efeito das hidroxichalconas na concentração de ATP em células B16-10. Os

compostos (0-100µM) foram adicionados às células, 3 x 10

,e incubados por 24h. As células foram

lisadas e os níveis de ATP foram quantificados pelo método luciferin-luciferase, conforme descrito em

Materiais e Métodos. B - Efeito das hidroxichalconas na concentração de glutationa total

mitocondrial em células B16-10. Os compostos (0-100µM) foram adicionados às células, 3 x 10

, e

incubados por 24h. As mitocôndrias foram isoladas e lisadas, os níveis de GSH mitocondrial foram

quantificados pelo método de Tietze (1969). Cada ponto representa a média ± E.P.M. (n=3). Um valor

de *P < 0,05, **P < 0,01 e

P < 0,001 foi considerado estatisticamente significativo, usando ANOVA,

seguida de teste t de Bonferroni.

Nossos resultados demonstraram que as hidroxichalconas 1, 3 e 13

depletaram ATP das células B16-F10, de maneira dependente de concentração. Os

compostos 1 e 3 causaram depleção significativa de ATP a partir da concentração

de 25µM, ao passo que a hidroxichalcona 13 depletou ATP de forma significativa

apenas na concentração de 100µM (Figura 28). Sabzevari

et al. (2004) sugerem que

a citotoxicidade da floretina, da isoliquiritigenina e de outras dez chalconas

hidroxiladas, testadas em leucemia K562 e em células de melanoma, seja

consequência da disfunção mitocondrial induzida por estes compostos.

As hidroxichalconas 1 e 3, evidenciadas nesse experimento pela depleção do

ATP, também induziram a apoptose nas células B16-F10. A morte celular por

apoptose pode ser conseqüência da perda gradativa de energia celular causada

pelas hidroxichalconas. Skulachev (2006) mostrou as inter-relações entre processos

bioenergéticos e morte celular programada, onde o mau funcionamento da

mitocôndria normalmente resulta em diminuição gradual dos níveis intracelulares de

ATP, dando início à apoptose. Porém, em alguns casos, pode ocorrer um aumento

no potencial de membrana e na concentração de ATP no estágio inicial da morte

celular por apoptose, mas, no decorrer do processo, os níveis energéticos diminuem.

Em nossos resultados não foi observado um aumento inicial dos níveis de ATP,

como sugerido acima. Tal fato talvez fosse evidenciado se tivéssemos utilizado uma

concentração inicial menor que 25µM. Hu

et al. (2007) demonstraram que

IN6CPPBD induz apoptose em melanoma humano, através de disfunção

mitocondrial. Garland e Halestrap (1997) mostraram que a depleção de ATP

intracelular, por desequilíbrio mitocondrial, induziu a morte celular por apoptose e

provocou a fragmentação do DNA em células da linhagem pró-B, dependentes de

interleucina-3 (IL-3).

A hidroxichalcona 13 possivelmente induziu a morte celular por necrose e,

surpreendentemente, não apresentou diminuição significativa nos níveis de ATP

celular. Contraditoriamente, Edinger & Thompson (2004) definem a necrose como

resultado final de um amplo distúrbio energético a níveis incompatíveis com a

sobrevivência celular, como resultado de estímulos exógenos que ocorrem após

uma situação de estresse.

Quando se compara os níveis de ATP das células tratadas com as

hidroxichalconas 1 e 3, com a quantidade de glutationa mitocondrial, observa-se que

a depleção do ATP foi maior que a depleção da glutationa mitocondrial. Este fato

pode estar relacionado com o estresse oxidativo, disfunção mitocondrial e

diminuição da síntese de ATP gerados por tais compostos. Cao

et al. (2006)

demonstraram que a curcumina induz estresse oxidativo ao DNA mitocondrial

(DNAmt), de maneira dependente de concentração. O mecanismo é baseado no

elevado nível de EROs e peroxidação lipídica, causados pela curcumina. A depleção

do DNAmt reduz a fosforilação oxidativa, diminui a síntese de ATP e induz a

disfunção mitocondrial. Kachadouriam & Day (2006) relacionaram baixas

concentrações de GSH em células epiteliais humanas de pulmão A549, tratadas

com 2’,5’ hidroxichalcona, com a disfunção na mitocondria destas células. Podemos

relacionar a depleção da GSH mitocondrial e a depleção do ATP com o potencial

pró-oxidante das hidroxichalconas. Slater

et al. (1995) relacionaram a perda da GSH

citoplasmática e da GSH mitocondrial com a presença de agentes oxidantes, sendo

que esta última tem como conseqüência a perda do ATP celular.

Nossos resultados mostraram que as características pró-oxidantes das

hidroxichalconas 1 e 3 podem ser responsáveis pela depleção da GSH

citoplasmática e mitocondrial. Dessa forma, a diminuição das citadas GSH

citoplasmática e GSH mitocondrial prejudicam a mitocôndria e, conseqüentemente,

depletam o ATP. Esses compostos também podem interferir no potencial de

membrana mitocondrial, diminuir a respiração celular e prejudicar a síntese de ATP.

5.9 Adesão celular

As duas principais características do câncer são a proliferação celular

descontrolada e a formação de metástase, sendo que esta é uma das maiores

causas que levam à mortalidade (DEMIERRE & NATHANSON, 2003).

Várias etapas estão envolvidas na metástase tumoral, como: adesão, invasão

e migração, sendo que o processo de adesão celular está envolvido na maioria, se

não em todos os passos intermediários da cascata metastática (ZHANG

et al. 2001).

A maioria das pesquisas tem como alvo o crescimento tumoral. Entretanto,

poucos trabalhos têm como objetivo a pesquisa de fármacos específicos para

prevenir a metástase.

1-A 1-B 3-A 3-B 13-A 13-B

100

Células vivas e adesão %

Figura 29: Viabilidade e adesão celular dependentes de concentração das hidroxichalconas

nas B16-F10, em 24h.

A viabilidade celular foi avaliada pelo método do MTT, representada por 1-A,

3-A

e 13-A. Células, 1 x 10

foram incubadas com as hidroxichalconas 1, 3 e 13 nas concentrações

de 25, 50, 75 e 100 µM. A densidade óptica do grupo controle (células sem tratamento) foi

considerada como 100% de viabilidade. As barras

1-B, 3-B e 13-B representam a decrescente

adesão celular das B16-F10, 1 x 10

, tratadas com as hidroxichalconas nas concentrações de 25, 50,

75 e 100 µM, avaliada pelo método colorimétrico utilizando cristal violeta. Cada ponto representa a

média ± E.P.M. (n=3). Um valor de

P < 0,001 foi considerado estatisticamente significativo, quando

comparado ao controle, usando ANOVA, seguido de teste

t de Bonferroni.

Assim sendo, foi avaliada, através de um método colorimétrico, a inibição da

adesão de células de melanoma B16-F10, tratadas com hidroxichalconas nas

concentrações de 25, 50, 75 e 100µM, por 24 horas. A inibição da adesão celular foi

comparada com a avaliação da viabilidade celular, em que as células foram tratadas

com 25, 50, 75 e 100µM, por 24 horas. Uma significativa inibição da adesão das

células de melanoma B16-F10, pelas hidroxichalconas 1, 3 e 13 (Figura 29), foi

observada. Comparando-se com a viabilidade celular, pôde-se observar uma maior

inibição da adesão pelos compostos 1 e 3. As hidroxichalconas 1 e 3, na

concentração de 25µM, foram citotóxicas para 1,4 ± 0,8 % e 20 ± 1,3% das células

B16-F10, enquanto que a inibição da adesão celular por esses compostos foi de 45

± 2,1 % e 50 ± 1,1%, respectivamente. A baixa citotoxicidade dessas

hidroxichalconas para as células, na concentração de 25µM, e a maior inibição da

adesão exclui a hipótese de que a inibição da adesão estaria sendo causada pela

morte celular. Mas o contrário pode ser sugerido, pois a inibição da adesão está

envolvida no processo de morte celular, porém não é o único fator que deve ser

considerado. Gava e colaboradores (2005) testaram o complexo de rutênio (NAMI-A)

em células de melanoma B16,

in vivo e in vitro, e observaram a diminuição da

expressão de moléculas de adesão celular CD44, CD54 e β

-integrina nas células

tratadas com esse composto. Eles sugerem que o controle da metástase deve-se à

inibição da invasão da célula tumoral.

Já a inibição da adesão celular provocada pela hidroxichalcona 13 foi menor,

comparando-se com a morte causada por este mesmo composto. Acredita-se que a

morte celular induzida pelo composto 13 esteja pouco relacionada com o mecanismo

de adesão celular. Nesse caso, a inibição da adesão pode ter ocorrido em

decorrência da morte célular. Zhang

et al. (2001) estudaram o comportamento da

quercetina, um flavonóide citotóxico para células de melanoma B16-BL6, e

verificaram que tal composto inibe a invasão e a mobilidade das células, mas não

afeta a adesão celular. Eles sugerem que a interferência em uma das etapas da

metástase tumoral pode mudar o comportamento das células metastáticas,

conduzindo-as à apoptose ou a uma parada no ciclo celular.

CONCLUSÕES

Dentre os compostos naturais, semi-sintéticos e sintéticos, que despertam

interesse por suas propriedades biológicas, as chalconas, particularmente as

hidroxiladas, destacam-se pelo seu potencial antitumoral. Quanto aos mecanismos

possíveis de ação desses compostos, os resultados obtidos na pesquisa nos

guiaram para as seguintes conclusões:

¾ Das chalconas derivadas do 3,4-metilenodioxibenzaldeído testadas nas

células de B16-F10, as que apresentaram efeito citotóxico relevante foram as

chalconas 1, 3 e 7. Porém, essas chalconas, apesar de apresentarem pouco efeito

citotóxico para as células não-tumorais, induziram células de melanoma à morte, por

necrose;

¾ Das chalconas derivadas da 2,4,6 trimetoxiacetofenona, as que apresentaram

efeito citotóxico pronunciado para as células de melanoma foram as denominadas 1,

3 e 9. Por conseguinte, esses compostos provocaram a morte celular por apoptose,

mas não agiram seletivamente contra as células tumorais;

¾ Dentre as chalconas testadas, as hidroxiladas foram as selecionadas para

continuação da pesquisa, como conseqüência do maior efeito citotóxico das

hidroxichalconas 1, 3 e 13 para as células de melanoma, do menor efeito citotóxico

para as células não-tumorais e por indução da morte celular por apoptose;

¾ Atribui-se a citotoxicidade das hidroxichalconas 1, 3 e 13 às hidroxilas no

anel-A aromático, que têm fundamental importância para esses compostos. Já a

presença de outros substituintes na molécula do composto 13 parece ter diminuído o

efeito citotóxico desse composto;

¾ Os compostos 1, 3 e 13 demonstraram causar a morte celular de forma

dependente de concentração;

¾ As hidroxichalconas 1, 3 e 13 foram menos citotóxicas quando associadas

aos agentes antioxidantes, tornando notória a atividade pró-oxidante das mesmas

para as células de melanoma. Além disso, a produção de radicais livres

intracelulares também foi verificada após o tratamento das células com os mesmos

compostos;

¾ A depleção da concentração da GSH total citosólica, proporcionada pelos

compostos 1, 3 e 13, pode estar relacionada com a atividade pró-oxidante destes

compostos;

¾ As hidroxichalconas 1, 3 e 13 depletaram significativamente a GSH total

mitocondrial, que foi proporcional à produção de espécies reativas pelas células

tratadas com estes compostos. A depleção da GSH total mitocondrial

hipoteticamente está relacionada com a disfunção mitocondrial e com a morte

celular por apoptose, induzida pelos compostos 1 e 3.

¾ Os compostos 1, 3 e 13 depletaram ATP de maneira dependente de

concentração. Essa perda energética é o provável motivo da morte por apoptose das

células de melanoma tratadas com as hidroxichalconas 1 e 3, que certamente está

relacionada à produção de EROs, depleção de GSH total citosólica e GSH total

mitocondrial;

¾ Somando-se às evidências anteriores, a inibição da adesão celular pode

contribuir para a atividade das hidroxichalconas 1 e 3 nas células de melanoma,

fator este que está relacionado ao potencial antimetastático.

PERSPECTIVAS

As hidroxichalconas 1 e 3 mostraram-se promissoras para a continuidade da

pesquisa. Nesse sentido, poder-se-á avaliar mecanismos de ação mais específicos

ainda não elucidados. A disfunção da mitocôndria, causada por esses compostos,

pode ser investigada através da avaliação do potencial de membrana mitocondrial,

enquanto que a conseqüente morte por apoptose, pela via intrínseca, pode ser

confirmada através da liberação do citocromo c, pois este é liberado quando a

mitocôndria sofre algum estímulo pró-apoptótico, injúria mitocondrial ou estímulo de

proteínas pró-apoptóticas;

Outra forma de avaliar a morte celular pela via intrínseca seria investigar

esses compostos quanto à capacidade de inibição das proteínas anti-apoptóticas,

como a Bcl-2, que está presente em altas concentrações no melanoma e o torna

resistente a diversos fármacos, e avaliar a capacidade de ativação de proteínas pró-

apoptóticas, como a Bax;

O conhecimento de quais moléculas de adesão (CAMs) estão sendo inibidas

pelas hidroxichalconas 1 e 3 também pode nos fornecer um resultado específico a

respeito do potencial metastático destes compostos;

Considerando a aplasia medular como um efeito tóxico dos quimioterápicos

em geral, é fundamental testar os compostos de interesse em células progenitoras

da medula óssea, a fim de conhecer o potencial citotóxico destes para estas células;

Como tais compostos mostraram potencial antitumoral significativo e são

menos tóxicos para as células não tumorais, a continuidade da pesquisa é

justificável, considerando a resistência das células tumorais aos fármacos já

disponíveis e os efeitos indesejáveis causados pelos mesmos.

REFERÊNCIAS

ALLEN, R. G. & TRESINI, M. Oxidative stress and gene regulation. Free Radical

Biology, v. 28, n. 3, p. 463-499, 2000.

AMARANTE-MENDES, G. P. Apoptose: programa molecular de morte celular.

Einstein, p. 15-18, 2003.

AMARANTE-MENDES, J. G.; STAROBINAS, N.

et al. Colorimetric assay for the

measurement of thymocyte/thymic stromal cell adhesion. Journal Brazilian of

Medical and Biological Research, v. 27, n. 6, p. 1321-1330, 1994.

ARENDS, M. J.; MORRIS, R. G.

et al. Apoptosis : the role of the endonuclease.

American Journal of Pathology, v. 136, p. 593-608, 1990.

BAGHERI, M. & SAFAI, B. Cutaneous malignancies of keraticocytic origin. Clinical

Dermatology, v. 19, p. 244-252, 2001.

BALLATORI, N.; HAMMOND, C. L.

et al. Molecular mechanisms of reduced

glutathione transport: role of the MRP/CFTR/ABCC and OATP/SLC21A families of

membrane proteins. Toxicology and Applied Pharmacology, v. 204, p. 238– 255,

2005.

BATIST, G.; SCHEETER, R. L.

et al. Glutathione system and drug resistance.

New York: Dekker, p. 503-521, 1996.

BATOVSKA, D.; PARUSHEV, S.

et al. Study on the substituents’ effects of a series

of synthetic chalcones against the yeast

Cândida Albicans. European Journal of

Medicinal Chemistry, v. 42, p. 87-92, 2007.

BENLLOCH, M.; ORTEGA, A.

et al. Acceleration of glutathione efflux and inhibition

γ-glutamyltranspeptidase sensitive metastatic B16 melanoma cells to endothelium-

induced cytotoxicity. The Journal of Biological Chemistry, v. 280, n. 8, p. 6950-

6959, 2005.

BHAT, B. A.; DHAR, K. L.

et al. Synthesis and biological evaluation of chalcones and

their derived pyrazoles as potencial cytotoxic agents. Bioorganic & Medicinal

Chemistry Letters, v. 15, p. 3177-3180, 2005.

BOECK, P.; FALCÃO, C. A. B.

et al. Synthesis of chalcone analogues with increased

antileishmanial activity. Bioorganic and Medicinal Chemistry, v. 14, p. 1538-1545,

2006.

BOECK, P.; LEAL, P. C.

et al. Antifungal activity and studies on mode of action of

novel xanthoxyline-derived chalcones. Archive der Pharmazie, v. 338, n. 2-3, p. P.

87-95, 2005.

BRÁS, M.; QUEENAN, B.

et al. Programmed cell death via mitochondria: different

modes of dying. Biochemistry, v. 70, n. 2, p. 231-239, 2005.

BRODIE, A. E. & REED, D. J. Glutathionedisulfite reduction in tumor mitochondria

after-butylhidroperoxide treatment. Chemico-Biological Interactions, v. 84, p. 125 -

132, 1992.

BROWN, J. M. & ATTARDI, L. D. The role of apoptosis in cnacer development and

treatment response. Nature, v. 5, p. 231-237, 2005.

CABRERA, M.; SIMOENS, M.

et al. Synthetic chalcones, flavanones, and flavones

as antitumoral agents: Biological evaluation and structure-activity relationships.

Bioorganic & Medicinal Chemistry, v. 15, p. 3356-3367, 2007.

CANIVENC-LAVIER, M. C.; VERNEVAUT, M. F.

et al. Comparative effects of

flavonoids and model inducers on drug-metabolizing enzymes in rat liver.

Toxicology, v. 114, p. 19-27, 1996.

CAO, J.; JIA, L.

et al. Mitochondrial and nuclear DNA damage induced by curcumin

in human hepatoma G2 cells. Toxicological Sciences, v. 91, p. 476-483, 2006.

CÁRDENAS, M.; MARDER, M.

et al. Antitumor activity of some natural flavonoids

and synthetic derivatives on various human and murine cancer cell lines. Bioorganic

and Medicinal Chemistry, v. 14, n. 9, p. 2966-2971, 2006.

CARVALHO, A. C.; GIUGLIANI, R.

et al. Melanoma hereditário: prevalência de

fatores de risco em um grupo de pacientes no Sul do Brasil. Brazilian Annals of

Dermatology, v. 79, n. 1, p. 53-60, 2004.

CHAKRABARTY, A. & GEISSE, J. K. Medical therapies for non-melanoma skin

cancer. Clinics in Dermatology, n. 22, p.183-188, 2004.

CHAN, M.; FONG, D.

et al. Inhibition of growth and sensitization to cisplatin-mediated

killing of ovarian cancer cells by polyphenolic chemopreventive agents. Journal of

Cellular Physiology, v. 194, p. 63-70, 2003.

CHEN, D.; DANIEL, K.

et al. Dietary flavonoids as proteasome inhibitors and

apoptosis inducers in human leukemia cells. Biochemical Pharmacology, v. 69, p.

1421-1432, 2005.

CHEN, M.; ZHAI, L.

et al. Inhibition of fumarate reductase in Leishmania major and

Leishmania donavani by chalcones. Antimicrobial Agents and Chemotherapy., v.

45, n. 7, p. 2023-2029, 2001.

CHIN, Y. W.; JUNG, H. A.

et al. Antioxidant constituents of the roots and stolons of

licorice (G

lycyrrhiza glabra). Journal of Agriculture and Food Chemistry, v. 55, p.

4691-4697, 2007.

CHOI, J. M; YOON, B. S

. et al. Antioxidant properties of neohesperidin

dihydrochalcone: inhibition of hypochlorous acid-induced DNA strand breakage,

protein degradation, and cell death. Biological and Pharmaceutical Bulletin, v. 30,

n. 2, p. 324-330, 2007.

CHOTIA, J. & JONES, E. Y. The molecular structure of cell adhesion molecules.

Annual Review Biochemistry, v. 66, p. 823-862, 1997.

CLARK, W. H.; ELDER, D. E. et al. A study of tumor progression. The precursor

lesions of superficial spreading and nodular melanoma. Human Pathology, v. 15, p.

1147-1165, 1984.

CLARK, W. H.; ELDER, D. E.

et al. Model predicting survival in stage I melanoma

based on tumor progression. Journal of the National Cancer Institute, v. 81, p.

1893-1904, 1989.

COTELLE, N.; HAPIOT, P.

et al. Polyphenols deriving from chalcones: investigations

of redox activities. Journal of Physical Chemistry, v. 109, p. 23720-23729, 2005.

CURTIN, J. F.; DONOVAN, M.

et al. Regulation and measurement of oxidative stress

in apoptosis. Journal of Immunological Methods, v. 265, p. 49-72, 2002.

DAHL, C.; GULDBERG, P. The genome and epigenome of malignant melanoma.

APMIS, v. 115, p. 1161-1176, 2007.

DELEVE, L. D. & KAPLOWITZ, N. Glutathione metabolism and its role in

hepatotoxicity. Pharmacology and Therapeutcs, v. 52, n. 3, p. 287-305, 1991.

DELUCA, M. Firefly luciferase. Advances in Enzymology and Related Areas of

Molecular Biology, v. 44, p. 37-68, 1976.

DEMIERRE, M. F. & NATHANSON, L. Chemoprevention of melanoma: an

unexplored strategy. Journal of Clinical Oncology, v. 21, p. 158-165, 2003.

DIAS, N. & BAILLY, C. Drugs targeting mitochondrial functions to control tumor cell

growth. Biochemical Pharmacology, v. 70, p. 1-12, 2005.

DIMMOCK, J. R. ELIAS, D. W. Bioactivities of chalcones. Current Medicinal

Chemistry, v. 6, n. 12, p. 1125-1149, 1999.

DOMINGUEZ, J. N. ; CHARRIS, J. E.

et al. Synthesis of quinolinyl chalcones and

evaluation of their antimalarial activity. European Journal of Medicinal Chemistry,

v. 36, n. 6, p. 555-60, 2001.

DOMINGUEZ, J. N.; LEON, C.

et al. Synthesis and antimalarial activity of

sulfonamide chalcone derivatives. Farmaco, v. 60, n. 4, p. 307-11, 2005.

DREHER, D. & JUNOD, A. F. Role of oxygen free radicals in cancer development.

European Journal of Cancer. v. 32 (A), p. 30-38, 1996.

EDINGER, A. L. & THOMPSON, C. B. Death by design: apoptosis, necrosis, and

autophagy. Current Opinion in Cell Biology, v. 16, p. 663-669, 2004.

EWEND, M. G.; CAREY, L. A.

et al. Treatment of melanoma metastases in the brain.

Seminars in Surgical Oncology, v. 12, n. 6, p. 429-435, 1996.

FECKER, L. F.; GEILEN, C. C.

et al. Loss of proapoptotic Bcl-2-related multidomain

proteins in primary melanomas os associated with poor prognosis. Journal of

Investigative Dermatology, v. 126, p. 1366-1371, 2006.

FIDLER, I. J. Biological behaviour of malignant melanoma cells correlated to their

survival

in vivo. Cancer Research, v. 35, p. 218-224, 1975.

FIDLER, I. J. & Kripke, M. L. Metastasis results from preexisting variant cells within a

malignant tumor. Science, v. 197, p. 893-895, 1977.

FIDLER, I. J. Tumor heterogeneity and the biology of cancer invasion and

metastasis. Cancer Research, v. 38, 2651-2660, 1978.

FILOMENI, G.; ROTILIO, G.

et al. Cell signaling and the glutathione redox system.

Biochemical Pharmacology, v. 64, p. 1057-1064, 2002.

FOJO, T. & BATES, S. Strategies for reversing drug resistance. Oncogene, v. 22, p.

7512-7523, 2003.

FOREJTNÍKOVÁ, H.; LUNEROVÁ, K.

et al. Chemoprotective and toxic potentials of

synthetic and natural chalcones and dihydrochalcones in vitro. Toxicology, v. 208, p.

81-93, 2005.

FOURNET, A. & MUÑOZ V. Natural products as trypanocidal, antileishmanial and

antimalarial drugs. Current Topics in Medicinal Chemistry, v. 2, n. 11, p. 1215-

1237, 2002.

FRANK, L.; MEYSKENS, J.

et al. Redox Regulation in Human Melanocytes and

melanoma. Pigment Cell Research, v. 14, p. 148-154, 2001.

FRESHNEY, R. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. New

York, Alan R. Liss, Inc., 1987, p.117.

FROMME, P., BOEKEMA, E. J.

et al. Isolation and characterization of a supramolar

complex of subunit-III of the ATP-synthase from chloroplasts. Verlag der Zeitschrift

für Naturforschung, v. 42, n. 11-12, p. 1239-1245, 1987.

GARBE, C. & EIGENTLER, T. K. Diagnosis and treatment of cutaneous melanoma:

state of the art 2006. Melanoma Research, v. 17, p. 117-127, 2007.

GARCIA-RUIZ, C. & FERNANDEZ-CHECA, J. C. Mitochondrial glutathione:

hepatocellular survival-death switch. Journal of Gastroenterology and

Hepatology, v. 3, p. 3-6, 2006.

GARLAND, J. M. & HALESTRAP A. Energy metabolism during apoptosis: Bcl-2

promotes survival in hematopoietic cells induced to apoptose by growth factor

withdrawal by stabilizing a form of metabolic arrest. The Journal of Biological

Chemistry, v. 272, n. 8, p. 4680-4688, 1997.

GATENBY R. A. & GILLIES R. J. Why do cancers have high aerobic glycolysis

Nature Reviews Cancer, v. 4, p. 891-899, 2004.

GAVA, B.; ZORZET, S.

et al. Inhibition of B16 melanoma metastases with the

ruthenium complex imidazolium trans-imidazoledimethylsulfoxide-

tetrachlororuthenate and down-regulation of tumor cell invasion. The Journal of

Pharmacology and Experimental Therapeutics, v. 317, n. 1, p. 284-291, 2005.

GHOBRIAL, I. M.; WITZIG, T. E.

et al. Targeting apoptosis pathways in cancer

therapy. Cancer Journal for Clinicians, v. 55, p. 178-194, 2005.

GOTTESMAN, M. M.; FOJO, T.

et al. Multidrug resistance in cancer; role of ATP-

dependent transporters. Nature Reviews, Cancer, v. 2, p. 48-58, 2002.

GRAY-SHOPFER, V.; WELLBROCK, C.

et al. Melanoma biology and new targeted

therapy. Nature, v. 445, p. 851-857, 2007.

GREENBERG, E. R.; BARON, J. A.

et al. Clinical-trial of antioxidant vitamins to

prevent colorectal adenoma, The New England Journal of Medicine, v. 331, p.

141-147, 1994.

GRIFFITH, O. W. & MEISTER, A. Origin and turnover of mitochondrial glutathione.

Proceedings of National Academy of Sciences, v. 82, p. 4668-4672, 1985.

GUERRY, D.; SYNNESTVEDT, M. et al. Lessons from tumor progression: the

invasive radial growth phase of melanoma is common, incapable of metastasis, and

indolent. Journal of Investigative Dermatology, v. 100, p. 342-345, 1993.

GUIMARÃES, J. R. Q. Manual de Oncologia.1ed. São Paulo: BBS, 2004, 725 p.

HAASS, N. K.; SMALLEY, K. S. M.

et al. Adhesion, migration and communication in

melanocytes and melanoma. Pigment Cells Research, v. 18, p. 150-159, 2005.

HAKIMUDDIN, F.; PALIYATH, G.

et al. Selective cytotoxicity of a red grape wine

flavonoid fraction against MCF-7 cells. Breast Cancer Research and Treatment, v.

85, p. 65-79, 2004.

HALLIWELL, B.; GUTTERIDGE, M. C. Free radicals in biology and medicine. New

York: Oxford University Press, 2000.

HAN, R. Research and Development of Anticancer Drugs and Experimental

Tecniques. Beijing: Pekin Medical University Pekin Union Medical College joint

Publishing House, p. 395-399, 1997.

HANAHAN D. & WEINBERG R. A. The hallmarks of cancer. Cell, v. 100, p. 57-70,

2000.

HART, I. R.; BIRCH, M.

et al. Cell adhesion receptor expression during melanoma

progression and metastasis. Cancer Metastasis Reviews, v. 10, p. 115-128, 1991.

HERÊNCIA, F.; FERRÁNDIZ, M. L.

et al. Novel anti-inflammatory chalcone

derivatives inhibit the induction of nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 in

mouse peritoneal macrophages. FEBS Letters, v. 453, n. 1-2, p. 129-134, 1999.

HODEK, P.; TREFIL, P. et al. Flavonoids-potent and versatile biologically active

compounds interacting with cytochromes P450. Chemico-Biological Interactions,

v. 139, p. 1-21, 2002.

HOLLMAN, P. C. & KATAN, M. B. Absorption, metabolism and health effects of

dietary flavonoids in man. Biomedicine and Pharmacotheraphy, v. 51, p. 305-310,

1997.

HOLZMANN, B.; GOSSLAR, U.

et al. Alpha 4 integrins and tumor metastasis.

Current Topics in Microbiology and Immunology, v. 231, p. 125-141, 1998.

HOSSINI, A. M.; EBERLE, J.

et al. Conditional expression of exogenous Bcl-X(S)

triggers apoptosis in human melanoma cells in vitro and delays growth of melanoma

xenografts. FEBS letters, v. 553, p. 250-256, 2003.

HSU, Y. L.

; KUO, P. L. et al. Isoliquiritigenin inhibits the proliferation and induces the

apoptosis of human non-small cell lung cancer A549 cells. Clinical and

Experimental Pharmacology and Physiology, v. 31, p. 414-418, 2004.

HSU, Y. L.; KUO, P. L.

et al. Chalcone inhibits the proliferation of human breast

cancer cell by blocking cell cycle progression and inducing apoptosis. Food and

Chemical Toxicology, v. 44, p. 704-713, 2006.

HSU, Y. L.; KUO, P. L.

et al. Isoliquiritigenin induces apoptosis and cell cycle arrest

through p53-dependent pathway in Hep G2 cells. Life Sciences, v. 77, p. 279-292,

2005.

HU, W. P.; YU, H. S.

et al. DC-81-Idole conjugate agent induces mitochondria

mediated apoptosis in human melanoma A375 cells. Chemical Research in

Toxicology, v. 20, p. 905-912, 2007.

HWANG, C.; SINSKEY, H. F.

et al. Oxidized redox state of glutathione in the

endoplasmic-reticulum. Scince, v. 57, p. 1496-1502, 1992.

HYNES, R. O. Integrins: versatility, modulation, and signaling in cell adhesion. Cell,

v. 69, p. 11-25, 1992.

INCA - INSTITUTO NACIONAL DO CÂNCER. www.inca.gov, acesso em 25 nov.

2007.

ISHIKAWA, T.; BAO, J. J.

et al. Coordinated Induction of MRP/GS-X Pump and γ-

glutamylcysteine synthetase by heavy metals in human leukemia cells. The Journal

of Biological Chemistry, v. 271, n. 25, p. 14981-14988, 1996.

IWASHITA, K.; KOBORI, M.

et al. Flavonoids inhibit cell growth and induce apoptosis

in B16 melanoma 4A5 cells. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, v. 64,

p. 1813-1820, 2000.

JANSEN, B.; Wacheck, V.

et al. Chemosensitisation of malignant melanoma by Bcl-2

antisense therapy. Lancet, v. 356, p. 1728-1733, 2000.

JOHNSON, J. D. & YOUNG B. Demographics of brain metastasis. Neurosurgery

Clinics of North America, v. 7, n. 3, p. 337-344, 1996.

JOHNSON, J. P. Cell adhesion molecules in the development and progression of

malignant melanoma. Cancer and Metastasis Reviews, v. 18, p. 345-357, 1999.

JUN, H. S.; PARK, T. e

t al. Capsaicin induced apoptosis of B16-F10 melanoma cells

through down-regulation of bcl-2. Food and Chemical Toxicology, v. 45, p. 708-

715, 2007.

KACHADOURIAM, R. & DAY, B. J. Flavonoid-induced glutathione depletion:

Potential implications for câncer treatment. Free Radical Biology & Medicine, v. 41,

p. 65-76, 2006.

KEER, J. F. R.; WYLLIE, A. H.

et al. Apoptosis: a basic biological phenomenon with

wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer, v. 26, p. 239-

257, 1972.

KIECHLE, F. L. & ZHANG, X. Apoptosis: biochemical aspects and clinical

implications. Clinica Chimica Acta, v. 326, p. 27-45, 2002.

KLUZA, J.; LANSIAUX, A. Induction of apoptosis in HL-60 leukemia and B16

melanoma cells by the acronycine derivative S23906-1. Biochemical

Pharmacology, v. 63, p. 1443-1452, 2002.

KOBORI, M.; IWASHITA, K.

et al. Phloretin-induced apoptosis in B16 melanoma 4A5

cells and HL60 human leukemia cells. Bioscience, Biotechnology, and

Biochemistry, v. 63, n. 4, p. 719-725, 1999.

KONIECZNY, M. T.; KONIECZNY, W.

et al. Synthesis of isomeric, oxathiolone fused

chalcones, and comparison of their activity toward various microorganisms and

human cancer cells line. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, v. 55, n. 5, p. 817-

820, 2007.

KOZLOWSKI, D.; TROUILLAS, P.

et al. Density functional theory study of the

conformational, electronic, and antioxiant properties of natural chalcones. Journal of

Physical Chemistry A, v. 111, p. 1138-1145, 2007.

LABRADOR, V; FREIRE, P. F.

et al. Cytotoxicity of butylated hydroxyanisole in Vero

cells. Cell Biology and Toxicology, v. 23, p. 189-199, 2007.

LASH, L. H. Mitochondrial glutathione transport; physiological, pathological and

toxicological implications. Chemico-Biolical Interactions, v. 163, n. 1-2, p. 54-67,

2006.

LEE, M. G.; LEE, K. T. et al. Costunolide induces apoptosis by ROS-mediated

mitochondrial permeability transition and citocrome c release. Biological and

Pharmaceutical Bulletin, v. 24, p. 3003-306, 2001.

LEE, M. L.; TOMSU, K. et al. Duration of survival for disseminated malignant

melanoma: results of a meta-analysis. Melanoma Research, v. 10, n. 81, p. 154-

160, 2000.

LENS, M. B. & DAWES, M. Global perspectives of contemporany epidemiological

trends of cutaneous malignant melanoma. British Journal of Dermatology, v. 150,

p. 179-185, 2004.

LEONE, M.; ZHAI, D.

et al. Cancer prevention by tea polyphenols is linked to their

direct inhibition of antiapoptotic Bcl-2 family proteins. Cancer Research, v. 63, p.

8118-21, 2003.

LI, N.; RAGHEB, K.

et al. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces

apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen speciesproduction. The

Journal of Bilological Chemistry, v. 278, n. 10, p. 8516-8525, 2003.

LIU, M., WILAIRAT, P.

et al. Antimalarial alkoxylated and hydroxylated chalcones

[corrected]: structure-activity relationship analysis. Journal of Medicinal Chemistry,

v. 44, n. 25, p. 4443-52, 2001.

LIU, M.; WILAIRAT, P.

et al. Structure-activity relationships of antileishmanial and

antimalarial chalcones. Bioorganic and Medicinal Chemistry, v. 11, p. 2729-2738,

2003.

LIU, X. & GO, M. L. Antiproliferative properties of piperidinylchalcones. Bioorganic &

Medicinal Chemistry, v. 14, p. 153-163, 2006.

LIU, Y. C.; HSIEH, C. W.

et al. Chalcone inhibits the activation of NF-κB and STAT3

in endothelial cells via endogenous electrophile. Life Sciences, v. 1-11, 2007.

LOPEZ, S. N.; CASTELLI, M. V.

et al. In vitro antifungal evaluation and structure-

activity relationships of a new series of chalcone derivatives and synthetic analogues,

with inhibitory properties against polymers of the fungal cell wall. Bioorganic and

Medicinal Chemistry, v. 9, n. 8, p. 1999-2013, 2001.

LUI, P.; CASHIN, R.

et al. Treatments for metastatic melanoma: Synthesis of

evidence from randomized trials. Cancer Treatment, p. 1-16, 2007.

MANTHEY, J. A.; GROHMANN, K.

et al. Biological properties of citrus flavonoids

pertaining to cancer and inflammation. Current Medicinal Chemistry, v. 8, n. 2, p.

135-153, 2001.

MARDER, M. & PALADINI, A. C. GABA(A)-Receptor ligands of flavonoid structure.

Current Topics in Medicinal Chemistry, v. 2, n. 8, p. 853-867, 2002.

MATES, J. M.; PEREZ-GOMEZ, C.

et al. Antioxidante enzymes e human diseases.

Clinical Biochemistry, v. 32, p. 595-603, 1999.

MATÉS, N. Effects antioxidant enzymes in the molecular control of reactive oxygen

species toxicology. Toxicology., n. 153, p. 83-104, 2000.

McCALL, M. R. & FREI, B. Can antioxidant vitamins materially reduce oxidative

damage in humans? Free Radical Biology and Medicine, v. 26, p. 1034-1053,

1999.

McCONKEY, D. J. Biochemical determinants of apoptosis and necrosis. Toxicology

Letters, v. 99, p. 157-168, 1998.

McCORD, J. M. & FRIDOVICH, I. Superoxide dismutase an enzymic function for

erythrocuprein (hemocuprein). The Journal of Biological Chemistry, v. 244, p.

60409-60455, 1969.

McGARY, E. C.; LEV, D. C.

et al. Cellular Adhesion Pathways and Metastatic

Potential of Human Melanoma. Cancer Biology and Therapy, v. 1, n. 5, p. 459-465,

2002.

McKERNAN, T. M.; WOODS, E. B.

et al. Uptake of glutathione by renal cortical

mitochondria. Archies Biochemistry and Biophyscs, v. 288, p. 653-663, 1991.

MEISTER, A.; Mitochondrial changes associated with glutathione deficiency.

Biochimica Biophysica Acta, v. 1271, p. 35-42, 1995.

MENG, C. Q.; ZHENG, X. S. et al. Discovery of novel heteroaryl-substituted

chalcones as inhibitors of TNF-

α-induced VCAM-1 expression. Bioorganic and

Medicinal Chemistry Letters, v. 14, n. 6, p. 1513-1517, 2004.

MERTENS-TALCOTT, S. & PERCIVAL, S. Ellagic acid and quercetin interact

synergistically with resveratrol in the induction of apoptosis and cause transient cell

cycle arrest in human leukemia cells. Cancer Letters, v. 218, p. 141-151, 2005.

MIDDLETON, M. R.; GROB, J. J.

et al. Randomized phase III study of temozolomide

versus dacarbazine in the treatment of patients with advanced metastatic malignant

melanoma. Journal of Clinical Oncololy, v. 18, p.158-166, 2000.

MODZELEWSKA, A.; PETTIT, C.

et al. Anticancer activities of novel chalcone and

bis-chalcone derivatives. Bioorganic & Medicinal Chemistry, v. 14, p. 3491-3495,

2006.

MORENO-SÁNCHEZ, R.; ENRÍQUEZ-RODRIGUEZ, S.

et al. Energy metabolism in

tumor cells. FEBS Journal, v. 274, p. 1393-1418, 2007.

NAKAGAWA, H.; HASUMI, K.

et al. Generation of hydrogen peroxide primarily

contributes to the induction of Fe(II)-dependent apoptosis in Jurkat cells by

epigallocatechin gallate. Carcinogenesis, v. 25, p. 1567-1574, 2004.

NAKATAMI, N.; ICHIMARU, M.

et al. Induction of apoptosis in human promyelocytic

leukemia cell line HL-60 by C-benzylated dihydrochalcones, uvaretin, isouvaretin and

diuvaretin. Biological and Pharmaceutical Bulletin, v. 28, n. 1, p. 83-86, 2005.

NAM, N. H.; KIM, Y.

et al. Cytotoxic 2’,5’ dihydroxychalcones with unexpected

antiangiogenic activity. European Journal of Medicinal Chemistry, v. 38, p. 179-

187, 2003.

NATALI, P. G.; HAMBY, C. V.

et al. Clinical significance of alpha(v)beta3 integrin and

intercellular adhesion molecule-1 expression in the cutaneous malignant melanoma

lesions. Cancer Research, v. 57, p. 1554-1560, 1997.

NAVARRO, J.; OBRADOR, E.

et al. Changes in glutathione status and the

antioxidant system in blood and in cancer cells associate with tumor growth in vivo.

Free Radical Biology & Medicine, v. 23, n. 3-4, p. 410-418, 1999.

NESBIT, M. & HERLYN, M. Adhesion receptors in human melanoma progression.

Invasion Metastasis, v. 14, p. 131-146, 1994.

NGUYEN, T.; TRAN, E.

et al. The role of activated MEK-ERK pathway in quercetin-

induced growth inhibition and apoptosis in A549 lung cancer cells. Carcinogenesis,

v. 25, p. 647-659, 2004.

NI, L.; MENG, C. Q.

et al. Recent advances in therapeutic chalcones. Expert

Opinion, v. 14, n. 12, p. 1669-1691, 2004.

NORDBERG, J. & ARNÉR, E. S. J. Reactive oxygen species, antioxidants, and the

mammalian thioredoxin system. Free Radical Biology & Medicine, v. 31, p. 1287-

1312, 2001.

OGAWA, H.; OKADA, Y.

Beneficial effect of xanthoangelol, a chalcone compound

from angelica keiskei, on lipid metabolism in stroke-prone spontaneously

hypertensive rats. Clinical and Experimental Pharmacology Physiology, v. 34, p.

238-243, 2007.

OKADA, H. & MAK, T. W. Pathways of apoptotic and non-apoptotic death in tumour

cells. Nature, v. 4, p. 592-603, 2004.

PARK, W. H. HAN, Y. W.

et al. An ROS generator, antimycin A, inhibits the growth of

HeLa cells via apoptosis. Journal of Cellular Biochemistry, v. 102 n. 1, p. 98-109,

2007.

PASTORE, A.; FEDERICI, E.

et al. Analysis of glutathione: implication in redox and

detoxification. Clinica Chimica Acta, v. 333, p. 19-39, 2003.

PEDERSEN P. L. The cancer cell’s “power plants” as promising therapeutic targets:

An overview. Journal of Bioenergetics and Biomembranes, v. 39, n. 1, p. 1-12,

2007.

PEDERSEN, P. L. Tumor mitochondria and the bioenergetics of câncer cells.

Progress in Experimental Tumor Research, v. 22, p. 190-274, 1978.

PROTA, G. Melanins and melanogenesis. San Diego: Academic Press Inc, p. 55,

1992.

RAISOVA, M.; HOSSINI, A. M.

et al. The bax/bcl-2 ratio determines the susceptibility

100

of human melanoma cells to CD95/Fas-mediated apoptosis. Journal of

Investigative Dermatology, v. 117, p. 333-340, 2001.

RAMOS, S. Effects of dietary flavonoids on apoptotic pathways related to câncer

chemoprevention. Journal of Nutritional Biochemistry, v. 18, p. 427-442, 2007.

RANI, P.; SRIVASTAVA, V. K.

et al. Synthesis and antiinflammatory activity of

heterocyclic indole derivatives. European Journal of Medicinal Chemistry, v. 39, n.

5, p. 449-52, 2004.

RAO, Y. K.; FANG, S. H.

et al. Differential effects of synthesized 2’-oxygenated

chalcona derivatives: modulation of human cell cycle phase distribution. Bioorganic

& Medicinal Chemistry, v. 12, p. 2679-2686, 2004.

REED, J. C. Apoptosis and cancer: strategies for integrating programmed cell death.

Seminars in Hematology, p. 37, n. 4, p. 9-16, 2000.

REGULA, K. M.; ENS, K.

et al. Mitochondria-assisted cell suicide: a license to Hill.

Journal of Molecular and Cellular Cardiology, v. 35, p. 559-567, 2003.

RHODES, A. R. Cutaneous melanoma and intervention strategies to reduce tumor-

related mortality: what we know, what we don’t know, and what we think we know

that isn’t so. Dermatologic Therapy, v. 19, p. 50-69, 2006.

RIEDL, S. J & SHI, Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis.

Nature, v. 5, p. 897-906, 2004.

RIKER, A. I.; GLASS, F.

et. al. Cutaneous melanoma: methods of biopsy and

definitive surgical excision. Dermatologic Therapy, v. 18, n. 387-393, 2005.

RIKER, I. A.; JOVE, R.

et al. Immunotherapy as part of a multidisciplinary approach

to melanoma treatment. Frontiers in Bioscience, v. 11, p. 1-14, 2006.

ROBINSON, T. P.; HUBBARD, R. B.

et al. Synthesis and biological evaluation of

aromatic enones related to curcumin. Bioorganic and Medicinal Chemistry, v. 13,

p. 4007-4013, 2005.

ROJAS, J.; DOMINGUEZ, J. N.

et al. Synthesis and inhibitory activity of

dimethylamino-chalcone derivatives on the induction of nitric oxide synthase.

European Journal of Medicinal Chemistry, v. 37, n. 8, p. 699-705, 2002.

SABZEVARI, O.; GALATI, G.

et al. Molecular cytotoxic mechanisms of anticancer

hydroxychalcones. Chemico-Biological Interactions, v. 148, p.57-67, 2004.

SALERNO, M. & GARNIER-SUILLEROT, A. Kinetics of glutathione and

daunorubicicin efflux from multidrug resistance protein overexpressing small-cell lung

cancer cells. European Journal of Phamacology, v. 421, p. 1-9, 2001.

SAMBROOK, J. & RUSSELL, D. W. Molecular Cloning: a laboratory manual. 3.

ed. New York: Cold Spring Harbor, 2001, Appendix 8 - Quantitation of nucleic acids,

101

p. 19-21.

SASSE, A. D.; SASSE, E. C.

et al. Chemoimmunotherapy versus chemotherapy for

metastatic malignant melanoma. Cochrane Database Sistematic Reviews, v. 24,

n.1, 2007.

SAUER, H.; WEFER, K., et al. Regulation of intrinsic prion protein by growth factors

and TNF-

α: the role of intracellular reactive oxygen species, Free Radical Biology

Medicine, v. 35, p. 586- 594, 2003.

SCHENKMAN, J. B.; CINTI, D. L. Preparation of microsomes with calcium. Methods

Enzymology, v. 52, p. 83-89, 1978.

SCHROETER, H.; BOYD, J. P. E. et al. MAPK signaling in neurodegeneration:

influences of flavonoids and of nitric oxide. Neurobiology of Aging, v. 23, p. 861-

880, 2002.

SELVAKUMAR, N.; KUMAR, G. S.

et al. Synthesis, SAR and antibacterial studies on

novel chalcone oxazolidinone hybrids. European Journal of Medicinal Chemistry,

p. 1-6, 2006.

SHEN, S.; CHEN, Y.

et al. Differential apoptosis-inducing effect of quercetin and its

glycosides in human promyeloleukemic HL-60 cells by alternative activation of the

caspase 3 cascade. Journal of Cellular and Biochemistry, v. 89, p. 1044-1055,

2003.

SHIH, H.; PICKWELL, G. V.

et al. Differential effects of flavonoid compounds on

tumor promoter-induced activation of the human CYP1A2 enhancer. Archives of

Biochemistry and Biophycs, v. 372, p. 287-294, 2000.

SIES, H. Oxidative stress: oxidants and antioxidants. Experimental Physiology, v.

82, p. 291-295, 1997.

SIVAKUMAR, P. M.; SEENIVASAN, S. P.

et al. Synthesis, antimycobacterial activity

evaluation, and QSAR studies of chalcone derivatives. Bioorganic and Medicinal

Chemistry Letters, v. 17, p. 1695-1700, 2007.

SKULACHEV, V. P. Bioenergetic aspects of apoptosis, necrosis and mitoptosis.

Apoptosis, v. 11, p. 473-485, 2006.

SLATER, A. F. G.; STEFAN, C.

et al. Signalling mechanisms and oxidative stress in

apoptosis. Toxicology Letters, v. 82-83, p. 149-153, 1995.

SOENGAS, M. S. & LOWE, S. W. Apoptosis and melanoma chemoresistance.

Oncogene, v. 22, p. 3138-3151, 2003.

SOMASUNDAR, P.; RIGGS, D. R.

et al. Inhibition of melanoma growth by

hemocyanin occurs via early apoptotic pathways.The American Journal of Surgery,

v.190, p. 713-716, 2005.

102

STAVROVSKAYA, A. A. Cellular mechanisms of multidrug resistance of tumor cells.

Biochemistry, v. 65, n. 1, p. 112-126, 2000.

STREHLER, B. L. & TOTTER, J. R. Determination of ATP and related compounds:

firefly luminescence and other methods. Methods of Biochemical Analysis, v. 1, p.

341-56, 1954.

SYLVESTER, P. W. Vitamin E and apoptosis. Vitamins and Hormones, v. 76, p.

329-356, 2007.

TAKAOKA, A.; ADACHI, M.

et al. Anti-cell death activity promotes pulmonary

metastasis of melanoma cells. Oncogene, v. 14, p. 2971-2977, 1997.

TARHINI, A. A. & AGARWALA, S. S. Cutaneous melanoma: available therapy for

metastic disease. Dermatologic Therapy, v.19, p. 19-25, 2006.

TARHINI, A. A. & AGARWALA, S. S. Management of brain metastases in patients

with melanoma. Current Opinion in Oncology, v. 16, p. 161-166, 2004.

TIETZE, F. Enzymic method for quantitative determination of nanogram amounts of

total and oxidized glutathione: applications to mammalian blood and other tissues.

Analytical Biochemistry, v. 27, n. 3, p. 502-22, 1969.

VALKO, M.; RHODES, C. J. et al. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative

stress-induced cancer. Chemico-Biological Interactions, v. 160, p. 1-40, 2006.

VAN DE LOOSDRECHT, A. A., NENNIE, E.

et al. Cell mediated cytotoxicity against

U 937 cells by human monocytes and macrophages in a modified colorimetric MTT

assay. A methodological study. Journal of Immunological Methods, v. 141, n.1,

p.15-22, 1991.

WANG, W. & BALLATORI, N. Endogenous glutathione conjugates: occurrence and

biological functions. Pharmacological Reviews, v. 50, n. 3, p. 335-355, 1998.

WARBURG, O. On the origin of cancer cells. Science, v. 123, p. 309-314, 1956.

WHO - World Health Organization. Disponível em: <http: www.who.int/cancer>,

Acesso em 25 nov. 2007.

WON, S. J.; LIU, C. T.

et al. Synthetic chalcones as potential anti-inflammatory and

cancer chemopreventive agents. European Journal of Medicinal Chemistry, v. 40,

n. 1, p. 103-12, 2005.

WYLLIE, A. H. Glucorticoid-induced thymocyte apoptosis in associated with

endogenous endonuclease activation. Nature, v. 284, p. 555-556, 1980.

WYLLIE, A. H.; KERR, J. F. K.

et al. Cell death: the significance of apoptosis.

International Review of Cytology, v. 68, p. 251-305, 1980.

WYLLIE, A. H.The biology of cell death in tumors. Anticancer Research, v. 5, p.

103

131-142, 1985.

XIA, Y.; YANG, Z. U.

et al. Antitumor agents. Part 202: Novel 2’-Amino Chalcones:

Design, Synthesis and Biological Evaluation. Bioorganic & Medicinal Chemistry

Letters, v. 10, p. 699-701, 2000.

YAMAMOTO, K.; Kakegawa, H.

et al. Gastric cytoprotective anti-ulcerogenic actions

of hydroxychalcones in rats. Planta Medica, v. 58, n. 5, p. 389-393,1992.

YE, C. L.; LIU, J. W.

et al. In vitro anti-tumor activity of 2’,4’-dihidroxy-6’-methoxy-

3’,5’-dimethylchalcone against six established human cancer cell lines.

Pharmacological Research, v. 50, p. 505-510, 2004.

ZAMZAMI, N.; SUSIN, S. A.

et al. Mitochondrial control of nuclear apoptosis. The

Journal of Experimental Medicine, v. 183, p. 1533-1544, 1996.

ZHAI, L.; CHEN, M. et al. The antileishmanial activity of novel oxygenated chalcones

and their mechanism of action. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 43, p.

793-803, 1999.

ZHAN, C. & YANG, J. Protective effects of isoliquiritigenin in transient middle

cerebral artery occlusion-induced focal cerebral ischemia in rats. Pharmacological

Research, v. 53, p. 303-309, 2006.

ZHANG, X.; XU, Q.

et al. Quercetin inhibits the invasion and mobility of murine

melanoma B16-BL6 cells through inducing apoptosis via decreasing Bcl-2

expression. Clinical Experimental Metastasis, v. 18, p. 415-421, 2001.

ZIMMERMANN, K. C.; BONZON, C.

et al. The machinery of prorammed cell death.

Pharmacology and Therapeutics, v. 92, p. 57-70, 2001.

ZU, X, L. & GUPPY, M. Cancer metabolism: facts, fantasy, and fiction. Biochemical

and Biophysical Research Communications, v. 313, p. 459-465, 2004.

ANEXOS

105

9.1 Trabalhos apresentados em eventos

NAVARINI, Andréia L. F.; LOCATELLI, Claudriana; CHIARADIA, Louise D.;

MASCARELLO, Alessandra; NUNES, Ricardo José; YUNES, Rosendo A.;

CRECZYNSKI-PASA, Tânia. B. Citotoxic effect of synthetic hydroxychalcones on

melanoma cells. In: Reunión Latinoamericana de Química Medicinal 1ª, 2007,

Montevideo. Anais da 1ª Reunión Latinoamericana de Química Medicinal, 2007, v. 1,

p. 46.

LOCATELLI, Claudriana; NAVARINI, Andréia L. F.; CRECZYNSKI-PASA, Tânia. B.;

LEAL, Paulo C.; YUNES, Rosendo A.; Gallic acid esters derivatives induce apoptosis

in melanoma cells by gsh depletion and promote inhibition of cell adhesion. In:

Reunión Latinoamericana de Química Medicinal 1ª, 2007, Montevideo. Anais da 1ª

Reunión Latinoamericana de Química Medicinal, 2007, v. 1, p. 50.

CHIARADIA, Louise D.; NAVARINI, Andréia L. F.; SILVA, Maria Cláudia Santos da;

LEAL, Paulo C.; CRECZYNSKI-PASA, Tânia. B. NUNES, Ricardo José; YUNES,

Rosendo A. Ação de chalconas derivadas do 3,4-metilenodioxenzaldeído e da 2,4,6-

trimetoxiatetofenona em células de melanoma (B16-F10). Reunião Anual da

Sociedade Brasileira de Química 30º, 2007, Águas de Lindóia. Anais eletrônicos...

Disponível em: http://www.sec.sbq.org.br/cdrom/30ra/index2.htm.

MASCARELLO, Alessandra; NAVARINI, Andréia L. F; CHIARADIA, Louise D.; LEAL,

Paulo C.; FRITZEN, Márcio; CRECZYNSKI-PASA, Tânia. B. NUNES, Ricardo José;

YUNES, Rosendo A. Obtenção de chalconas hidroxiladas e avaliação de sua

atividade em células de melanoma B16-F10. Reunião Anual da Sociedade Brasileira

de Química 30º, 2007, Águas de Lindóia. Anais eletrônicos... Disponível em:

http://www.sec.sbq.org.br/cdrom/30ra/index2.htm

NAVARINI, Andréia L. F.; FRITZEN, Márcio; CHIARADIA, Louise D.; YUNES,

Rosendo A; SILVA, Maria Cláudia Santos da; CRECZYNSKI-PASA, Tânia. B. Ação

de Chalconas sobre células de melanoma (B16-F10). In: Reunião Anual da SBPC

58ª, 2006, Florianópolis. Anais eletrônicos... Florianópolis: UFSC, 2006. Disponível

em: http://www.sbpcnet.org.br/livro/58ra.

106

LOCATELLI, Claudriana; FRITZEN, Márcio; NAVARINI, Andréia L. F.;

CRECZYNSKI-PASA, Tânia. B. Novas perspectivas para o tratamento de melanoma.

In: Seminário de Desenvolvimento de Pesquisa da UnC, 2006, Caçador. Anais...

Caçador, 2006, 1 CD-ROM.

107

9.2 Artigo a ser submetido na revista "European Journal of Medicinal

Chemistry”

Hydroxychalcones induce apoptosis on B16-F10 melanoma

cells suggesting be through ATP depletion

Andréia Lilian Formento-Navarini

, Louise Domeneghini Chiaradia

, Alessandra

Mascarello

, Márcio Fritzen

, Ricardo Jose Nunes

, Rosendo Augusto Yunes

, and

Tânia Beatriz Creczynski-Pasa

Departamento de Ciências Farmacêuticas,

Departamento de Química,

Universidade Federal de Santa Catarina,

Campus Trindade,

CEP: 88040-900, Florianópolis, SC, Brasil.

Keywords: hydroxychalcones, melanoma, antitumoral, apoptosis, ATP

Corresponding Author:

Tânia Beatriz Creczynski-Pasa

Universidade Federal de Santa Catarina

Centro de Ciências da Saúde

Departamento de Ciências Farmacêuticas

Campus Trindade

CEP: 88040-900, Florianópolis – SC, Brasil

Tel.: +55 48 3721-8057

Fax: +55 48

E-mail: [email protected]

# These authors contributed equally to this study.

108

Abstract

Searching leads compounds of new drugs for cancer therapy, we studied the

toxicity of thirteen hydroxychalcones never tested against melanoma cells line (B16-

F10). The compounds were obtained by aldolic condensation between aldehydes

and hydroxylated acetophenones, in alkaline conditions. Three of these chalcones

showed cytotoxicity for the melanome cell line. Two of them induced mitochondrial

GSH and ATP depletion and induced cell death through apoptosis in melanoma cells

preferentially to a non-tumoral cell line (Vero). And one of the chalcones tested

induced cell death through necrosis but did not decrease significantly the intracellular

mitochondrial GSH and ATP levels in melanoma cells. The structure-activity analysis

reveals that the predominant factor for the activity is the molecule shape, and

secondarily the number of hydroxyl groups.

Introduction

Malignant melanoma is a highly lethal disease, and the incidence and mortality

associated to this kind of cancer is increasing worldwide. Currently, between 2 and 3

million non-melanoma skin cancers and 132,000 melanoma skin cancers occurs

globally each year.

Many factors predispose an individual to skin cancer including

personal and family history of the disease and geographic location.

The clinical

direction of melanoma is determined by dissemination of the tumor and the phase at

diagnosis is a important factor. Metastasis of malignant melanoma is related with a

poor prognosis and the median survival time with advanced disease. The metastasis

and growth of tumors depend on the cell capability to migrate, implant, adhere and

penetrate into the membrane, reaching the blood vessel and the tissue.

3,4

Selected

B16 murine cell lines (B16-F10 and B16-F1) showed a different metastatic potential:

the F10 line colonized in the lungs more efficiently than F1; the F10 cell line was the

most invasive and also the most virulent in subcutaneous implantation model.

Among the drugs exerting anticancer activity against malignant melanoma,

dacarbazine has been extensively used, however, with response rates of 11 to 25%

and with short survival time. Thus, the development of chemotherapy agents against

malignant melanoma is justified.

109

Chalcones are essential intermediate compounds in the flavonoid biosynthesis

in plants.

Naturally occurring chalcones are mainly in hydroxlated form and several

reports have documented their biological properties.

6,7

Many studies have

demonstrated antileucemic,

8-11

antitumoral,

9,12-24

antiinflammatory,

25-27

antibacterial,

anti-ulcerogenic,

antioxidant,

6,7,12,30,31

antimalarial,

antileishmaniosis

32,33

and

hypotensive

activities for hydroxychalcones, besides others pharmacological

effects. Concerning antitumoral activity, Kobori

et al. (1999) described that the

2’,4’,6,’,4-tetrahydroxidihydrochalcone (phloretin) induced cell death by apoptosis in

B16 mouse melanoma 4A5 and in HL-60 human leukemia cell lines;

Iwashita et al.

(2000) showed that the isoliquiritigenin (2’,4’,4-trihydroxychalcone) and butein

(2’,4’,3,4-tetrahydroxychalcone) inhibited cell proliferation and induced apoptosis in

B16 melanoma 4A5 cells;

also, Hsu et al. (2005) described that isoliquiritigenin

induced apoptosis and blocking cell cycle progression in Hep G2 (human hepatoma

cells).

For new antitumoral agents it is very important to show cell toxicity

through apoptosis. The death through apoptosis is characterized by nuclear

condensation what induces DNA fragmentation caused by endonucleolytic cleavage

of genomic DNA.

The apoptosis or programmed cell death is a mechanism to

control the cell proliferation, thus the resistance of malignant cell to apoptosis is

hallmark of cancer and constitutes an important clinical problem.

36,37

The mitochondria is responsible for the production of 80-90% of ATP needed

for cell respiration and survival and play an important role in the pro- and anti-

apoptotic stimuli.

Skulachevev (2006) showed the interrelations between

bioenergetics processes and programmed death phenomena, and concluded that

ATP is required for certain steps of apoptosis and necrosis. Usually the

malfunctioning of mitochondria results in strong decrease in the cellular ATP initial

level, however, in some cases, the apoptosis is accompanied by ATP increases at

early stage followed by a decrease at the final stage.

The energy production is also

affected when mitochondrial glutathione (GSH) is depleted, besides changes on

mitochondrial GSH levels have been related with apoptosis regulation, cell

differentiation and growth.

40,41

The objective of this research is based on the idea that in the development of

antitumoral agents, one of the most important characteristics whose the compound

must have is the capacity to promote the cell death through apoptosis, and the

melanoma cells have a relatively poor answer to the apoptotic stimulus.

Also is

110

based on the fact that solid tumor cells develop resistance to antineoplasic drugs,

and multidrug resistance is one of the major causes of chemotherapy failures by

human malignances.

43,44

The B16-F10 melanoma cell line has high metastatic

potential, and in general does not respond easily to cytotoxic agents, justifying the

research of new drugs with increased efficacy and less adverse effects. Thus, in this

work we studied and characterized, for the first time, as apoptosis the murine B16-

F10 melanoma cell death, induced by synthetic hydroxychalcones, suggesting being

through mitochondrial GSH and ATP depletion. A structure-activity analysis was

done to find out a relationship with the cytotoxic effects.

Results and discussion

Synthesis

Thirteen hydroxychalcones were prepared by aldolic condensation as

presented in Figure 1. Chalcones 1, 3 and 6 are derived from 1-naphtaldehyde;

chalcones 2 and 7 are derived from xanthoxyline (2-hydroxy-4,6-

dimethoxyacetofenone); chalcones 4 and 5 are derived from 2-naphtaldehyde; and

chalcones 8 to 13 are derived from monobromide xanthoxyline (2-hydroxy-3-bromo-

4,6-dimethoxychalcone). The obtained yields were between 36 and 66%. The

medium yields were due to the presence of hydroxyl groups in the acetophenones.

Even in the cases that the hydroxyl group are in the position 2 (making a hydrogen

bond between this hydrogen atom and the oxygen atom of the carbonyl group), is

possible that in the reaction, the hydrogen atom is abstracted by the basic catalyst,

resulting in secondary products.

111

Figure 1. Synthesis of chalcones. The reaction consists in an aldolic condensation

as described in the Material and Methods a) methanol, KOH 50%, r.t., 24h. *new

compounds.

The structures of the compounds 5, 6, 8, 9, 10 and 13, (new compounds),

were confirmed by chemical identification data:

H NMR,

C NMR, IR and elementar

analysis. To the chalcone 1, the corresponding peak to the hydroxyl group is not

shown because during the analysis it possibly changed with deutered hydrogen atom

of the used solvent, chloroform.

H NMR spectra revealed that all structures were

geometrically pure and configured

E (J

Hα-Hβ

= 15,2-16,4 Hz).

112

Biological Assays

Initially, a screening of the hydroxychalcones toxicity for melanoma B16-F10

cells was done. In the figure 2 is possible to observe that the compounds 1, 3 e 13

reduced the cells viability in 97.7 ± 0.7%, 75.2 ± 1.5% and 50 ± 1.9%, respectively,

when compared with the control (non treated cells). All others chalcones presented

an inexpressive effect at the concentration tested. We choose 100µM as the maximal

concentration since much higher than that concentration does not normally reach the

plasma blood

45,46

and we are looking for compounds with high activity (low IC

)

which eventually could be used in a future as a drug for chemotherapy with very low

or without side effects.

C12345678910111213

100

***

Hydroxychalcones (100μM)

Viable Cells %

Figure 2: Toxicity of hydroxychalcones for murine melanoma B16-F10 cell line.

The compounds, 100µM, were incubated with the cells (1x10

) for 24h. The cell

viability was monitored through MTT assay. Optical density of control groups (C) was

taken as 100% of cell viability. The cell viability was checked in the beginning of

experiment by Trypan Blue exclusion. Each point represents the mean ± S.E.M. of

three experiments in triplicates. *P < 0.05, **P < 0.01 and ***P < 0.001 compared to

control groups, using ANOVA followed by Bonferroni's

t test.

Recently, Cabrera

et al. (2007) have analyzed the relation between the

structure of some chalcones, flavonones and flavones with their activity against the

human kidney carcinoma cells TK-40, human mammary adenocarcinoma cells MCF-

7 and human colon adenocarcinoma cells HT-29. In general, no cytotoxic selectivity

between the different cellular lines was observed. However, in the same substituted

series the activity decreases in the order chalcones > flavonones > flavones. Some

113

others requirements for the activity are the presence of the hydroxyl group that have

hydrogen bond donor ability and the conjugated enone group considering that the

compounds lack their activity when are changed to an aldol structure.

The importance of the presence of an hydroxyl substituent was indicated

previously by Sabzevari

et al. (2004) working with the cytotoxic activity of twelve

hydroxylated chalcones against K562 leukemia or melanoma cells.

They observed

that an increase in the number of hydroxyl groups on an aromatic ring decreases the

pka value of the first hydroxyl group and that seems that chalcones with lower pKa

values are less toxic to hepatocytes because they have more hydroxyl groups on

their A-ring. However, it should be considered that the arrangement of the hydroxyl

groups on the A-ring or B-ring plays a crucial role in determining the mechanism of

cytotoxicity towards isolated rat hepatocytes. Thus, if hydroxyl group is in ortho

position the chalcone can be metabolized to a quinone intermediate which can react

with cell nucleophile and deplete GSH.

In this case the importance of the hydroxyl group in A-ring is also important to

the activity as can be observed in chalcones 1 and 3. However, this activity is

conditioned by the conformation of the molecule as can be observed with chalcones

4 and 5 where the B-ring is a 1-naphtyl or 2-naphtyl groups. This same fact is

observed with chalcone 6 where the presence of a methoxyl group in position 6 may

also change the conformation of the molecule. This fact may explain also the lack of

strong activity of chalcones 2, 7, 8, 9, 10, 11 and 12, xanthoxyline derivatives. The

presence of a methoxy group in position 6 should give a steric effect forcing the

carbonyl group out of the plane of the A-ring and then decreasing the hydrogen bond

between the 2-hydroxyl groups. This conformation change appears to be important to

maintain the activity of these compounds. Chalcone 13 with a carboxyl substituent in

B-ring exhibits a good activity that may be explained by the probable formation of a

non member ring between this group and the carbonyl group. Thus, the planarity and

the rigidity of the molecular structure seem to be important factors to the activity in

these cases.

We further investigated the cytotoxic effect of the more active compounds: 1, 3

and 13. The IC

values were determined from concentration-response curve, which

are 12 +

0.7 μM, 17 + 1.5 μM and 30 + 1.9 μM, to the chalcones 1, 3 and 13

respectively (Figure 3).

114

-2 -1 0 1 2 3 4

-25

100

125

log [Hydroxychalcones]

Viable cells (%)

Figure 3: Concentration-response of synthetic hydroxychalcones 1, 3 and 13

on murine melanoma B16-F10 cell line. Cells, 1 x 10

, were incubated with the

compounds (0 – 40 µM) in triplicate for 72h, after that they were washed and

processed for MTT assay. Optical density of control groups was taken as 100% of

cell viability. Each bar represents the mean ± S.E.M. of three experiments. **P < 0.01

and

P < 0.001 compared to control groups, using ANOVA followed by Bonferroni's t

test.

In order to verify if the compounds would show some selectivity they were

tested against a non-tumoral cell line (VERO). In the Figure 4 it is possible to observe

the toxicity of compounds 1, 3 and 13. The concentrations of the compounds tested

were those that correspond to the IC

for B16-F10 cells. The results are summarized

in Table 1. Comparing the cell death promoted in VERO cells is possible to observe

that the cytotoxicity was higher in B16-F10 cells with significant

p value.

115

C 1 (12

M) 3 (17

M) 13 (30

100

***

Hydroxychalcones

Viable cells %

Figure 4: Cytotoxic effect of synthetic hydroxychalcones 1, 3 and 13 on VERO

cells (non-tumoral cell line). Cells, 1 x 10

, were incubated for 72h, with the

compounds at concentration which corresponds to the IC

for cell toxicity for B16-

F10 (12, 17 and 30 µm respectively), after that they were washed and processed for

MTT assay. Optical density of control groups (C) was taken as 100% of cell viability.

Cell viability was checked in the beginning of the experiment by Trypan Blue

exclusion. Each point represents the mean ± S.E.M. of three experiments. *** P <

0,001 compared to control groups, using ANOVA followed by Bonferroni’s

t test.

Table 1: Comparison of the cellular viability in B16-F10 and VERO cells lines

after treatment with hydroxychalcones.

Hydroxychalcone B16-F10

(IC

+ EPM, μM)

Vero

(Viable cells + EPM, %

of control)

p value*

12 ± 0.7 63.6 ± 4.6 < 0.0001

17 ± 1.5 68.4± 0.45 < 0.0001

30 ± 1.9 76.4 ± 1.0 < 0.0001

P values were determined using Student t test.

In order to elucidate the mechanism of death of B16-F10 cells induced by

hydroxychalcones it was investigated if these compounds could induce DNA

fragmentation, a biochemical mark of apoptosis.

The cell death induced by the

chalcones 1 and 3 (bands B and C) seems to be through apoptosis, which is

expected for antitumoral drugs (Figure 5). The cell death induced by the

116

hydroxychalcone 13 (band D), seems to be through necrosis. The band without

treatment with hydroxychalcones (A) showed a uniform chromatin. The results were

obtained by DNA fragmentation revealed in agarose gel electrophoresis.

ABCDABCDABCD

Figure 5. Citotoxyc effect of synthetic hydroxychalcones on induced DNA

fragmentation in B16-F10 cells. B16-F10 cells (5 x 10

cells) were treated for 24

hours with hydroxychalcones at: 0 µM, Lane A - Control untreated; Lane B - 12 µM

hydroxychalcone 1; Lane C - 17 µM hydroxychalcone 3; Lane D - 30 µM

hydroxychalcone 13 (IC

concentrations for cell toxicity). After incubation, the

samples were processed for DNA extraction and analysed through agarose gel

electrophoresis as described in Materials and Methods.

The mitochondria is a central organelle involved in apoptosis, with the capacity

to activate directly the execution pathways.

Hu et al. (2007) demonstrated that

IN6CPBD induces apoptosis in human melanoma through a mitochondrial

dysfunction.

Sabzevari et al. (2004) suggests that the cytotoxic activity of the

phloretin, isoliquiritigenin, and of ten other hydroxylated chalcones, in K562 leukemia

or melanoma cells, are due their ability to mitochondrial uncoupling.

Cao et al.

(2007) also detected the induction of apoptosis through mitochondrial

hyperpolarization and mtDNA damage in human hepatoma G2 cells by curcumin.

Garland and Halestrap (1997) also showed that the depletion of intracelular ATP, by

ATPase mitochondrial uncoupling, induced cell death through apoptosis, exhibiting

DNA fragmentation in cell lines pro-B interleukin-3 (IL-3)-dependent.

117

In the Figure 6, it is possible to see that the hydroxychalcones 1 and 3

decreased the levels of ATP in the melanoma cells in a concentration-dependent

manner; the ATP depletion was higher than the death of these cells. The cell death

through apoptosis can be a consequence energy cell loss, caused by the

compounds.

It is supposed that the hydroxychalcone 13 induced cell death through

necrosis, since it was not observed DNA breakage induced by this compound (Fig.5).

However unexpectedly it did not alter significantly ATP intracellular level of

melanoma cells as expected for death induced by necrosis. The necrosis has

believed to occur as a consequence of cell injury and depletion of ATP; since

apoptosis require ATP and necrosis does not.

50,51

0 25 50 75 100

100

Hydroxychalcone (μM)

Viable cells %

0 25 50 75 100

100

Hydroxychalcone (μM)

ATP %

Figure 6. Effect of hydroxychalcones 1, 3 and 13 on ATP levels, compared to

cytotoxic effect, in B16-F10 cells. Cells, 1 x 10

, were incubated with the

compounds (0 – 100 µM) for 24h, after that they were washed and processed for

MTT assay, to analyze the cell viability. Cells 3 x 10

were incubated with the

compounds at the same concentrations for 24h, for ATP concentration

measurements. The cellular ATP content was measured with luciferin-luciferase kit,

as described in Materials and Methods. Each bar represents the mean ± S.E.M. of

three experiments in triplicate. *P < 0.05, **P < 0.01 and

P < 0.001 compared to

control groups, using ANOVA followed by Bonferroni's

t test.

We further analyzed a possible effect of hydroxychalcones on mitochondria

work measuring mitochondrial GSH levels in melanoma cells after treatment with the

compounds. Besides of antioxidants properties of flavonoids the chemopreventive

activity of some compounds may be due their prooxidants characteristics. They also

118

can potentiate the cytotoxicity of prooxidants agents in tumor cells and its effects

involve mitochondrial dysfunction.

Kachadouriam & Day (2006) showed that lower GSH levels in the

mitochondria of in human lung epithelial cells A549, treated with 2’,5’-

hydroxychalcone involved mitochondrial dysfunction.

The Figure 7 shown that only

compounds 1 and 3 reduced the level of mitochondrial GSH at 24 h, fact that may be

related to ATP depletion induced by these compounds. The GSH, present in

mitochondria, plays an important role in the control of reactive oxygen species

generation, in the integrity of mitochondrial membranes, release of proapoptotic

factors and in the modulation of cell death by several pathways.

53,54

Besides the GSH

in mitochondria protect the integrity of mitochondrial components, thus playing a

determinant role in the response of apoptosis. The hydroxychalcones 1 e 3 may be

considered promising compounds, based on the fact that mitochondrial GSH

depletion cause mitochondrial dysfunction, and the rapid growth of tumor cells is also

highly energy-dependent.

0 25 50 75 100

100

Hydroxychalcone (μM)

Mitochondrial glutathione %

Figure 7. Effect of hydroxychalcones 1, 3 and 13 on mitochondrial GSH levels.

Cells 3 x 10

were incubated with the compounds (0 - 100 µM) for 24h. Mitochondrial

glutathione (GSH + GSSG) was measured in cell lysates using the glutathione

reductase method, as described in Materials and Methods section. Each bar

represents the mean ± S.E.M. of three experiments in triplicate. *P < 0.05, **P < 0.01

and

P < 0.001 compared to control groups, using ANOVA followed by Bonferroni's t

test.

In summary, thirteen hydroxychalcones were synthesized, and 1, 3 and 13

exhibited effective cytotoxicity against melanoma B16-F10 cells. Compound 1 was

119

the most active, with IC

value of 12μM. Compounds 1 and 3 induced apoptosis

suggesting to be through mitochondrial GSH ant ATP depletion. Compound 13

induced cell death through necrosis and no ATP depletion. The main characteristic

between chalcones 1 and 3 is the presence of unit 1-naphtyl at B-ring. The higher

activity of compound 1 seems to be due to the free hydroxyl group at A-ring.

The compounds 1 and 3 are promising to continue the research. Further

studies are being developed by our group to elucidate the mechanism of action. The

structure-activity analysis reveals that the predominant factor for the activity is the

molecule shape, and secondarily the number of hydroxyl groups in the chalcone.

Experimental

Preparation of the compounds: The compounds were prepared by aldolic

condensation. All reagents used were obtained commercially (Merck, Sigma-Aldrich),

except the xanthoxyline (2-hydroxy-4,6-dimethoxyacetofenone) and the

monobromide xanthoxyline (2-hydroxy-3-bromo-4,6-dimethoxychalcone), that were

prepared as previously described.

All chalcones were prepared by magnetic

agitation of hydroxilated acetophenone (2 mmol), methanol (30 ml), KOH 50% w/v (5

ml) and the corresponding aldehyde (2 mmol), at room temperature for 24 hours.

Distilled water and chloridric acid 10% were added in the reaction for total

precipitation of the compounds. The compounds were then obtained by vacuum

filtration and later recrystallized in dichloromethane and hexane. The chalcones 1, 3,

4, 7 and 12 were previously cited, respectively, by Hollinshead (1996),

Subbanwad

and Vibhute (1993),

Liu et al. (2003),

Hsu et al. (1959)

and by Bora et al.

(2000).

The compounds 2 and 11 were described by Boeck and co-workers

(2006)

and the structures 5, 6, 8, 9, 10 and 13 are new chalcones.

Physico-chemical data of the compounds: The purified chalcones were obtained

in yields between 36% and 66%. The structures were identified using melting points

(m.p.), infrared spectroscopy (IR),

H and

C nuclear magnetic resonance

spectroscopy (NMR), and to the unpublished ones, also elementary analyses.

Melting points were determined with a Microquímica MGAPF-301 apparatus and are

uncorrected. IR spectra were recorded with a Abb Bomen FTLA 2000 spectrometer

120

on KBr disks. NMR (

H and

C NMR) were recorded on Varian Oxford AS-400 (400

MHz), using tetramethylsilane as an internal standard. Elementary analyses were

obtained with a CHNS EA 1110. Percentages of C and H were in agreement with the

product formula (within +

0.4% of theoretical values to C). The purity of the

synthesized chalcones was analyzed by thin-layer chromatography (TLC) using

Merck silica pre-coated aluminum plates 200

μm in thickness with several solvent

systems of different polarities. Compounds were visualized with ultraviolet light (

λ =

254 e 360 nm) and using sulfuric anisaldehyde solution followed by heat as

developing agent and purified by recrystallization from hexane and dichloromethane.

H NMR spectra revealed that all the structures were geometrically pure and

configured E (

Hα-Hβ

= 15,2 -16,4 Hz).

Physico-chemical data of synthesized compounds:

1 – (2

E)-1-(3’-hydroxyphenyl)-3-(1-naphtyl)-2-propen-1-one. Yellow solid, m.p.

174-175.

H NMR (CDCl

) δ 7.10 (d, 1H, J = 8.0 Hz, H4’), 7.40 (dd, 1H, H5’), 7.51-

7.65 (m, 5H, H3, H4, H6, H7, H2’), 7.60 (d, 1H,

J = 15.6 Hz, Hα), 7.90 (d, 2H, H5,

H8), 7.94 (d, 1H,

J = 8.4 Hz, H6’), 8.26 (d, 1H, J = 8.0 Hz, H2), 8.67 (d, 1H, J = 15.6

Hz, H

β).

C NMR (CDCl

) δ 115.07 (C2’), 120.22 (C4’), 120.32 (C6’), 123.41 (Cα),

124.97 (C2), 125.56 (C3), 125.89 (C8), 126.52 (C6), 127.30 (C7), 129.07 (C4),

130.08 (C5), 130.93 (C5’), 132.01 (C9), 132.34 (C10), 134.16 (C1), 139.91 (C1’),

140.39 (C

β), 158.06 (C3’), 189.09 (C=O). IR ν

max

/cm

-1

3176, 1642, 1351, 1571, 1273,

1475, 1172, 962, 772, 707 (KBr). Anal. Calcd for C

: C 83.19, H 5.14. Found:

C 83.42, H 5.21. Yield: 51%.

2 – (2

E)-1-(2’-hydroxy-4’,6’-dimethoxyphenyl)-3-(3-nitrophenyl)-2-propen-1-one.

Orange solid, m.p. 171-172 ºC.

H NMR (CDCl

) δ 3.85 (s, 3H, OCH

), 3.94 (s, 3H,

OCH

), 5.98 (s, 1H, H5’), 6.12 (s, 1H, H3’), 7.74 (d, 1H, J = 15.6 Hz, Hα), 7.84-7.88

(m, 2H, H4, H5), 7.98 (d, 1H,

J = 15.6 Hz, Hβ), 8.22 (d, 1H, J = 7.75 Hz, H6), 8.46 (s,

1H, H2), 14.09 (s, 1H, OH).

C NMR (CDCl

) δ 55.56 (OCH

), 55.82 (OCH

), 91.37

(C5’), 93.84 (C3’), 106.20 (C1’), 122.08 (C2), 123.99 (C4), 129.78 (C

α), 130.51 (C5),

134.01 (C6), 137.43 (C1), 138.68 (C

β), 148.71 (C3), 162.45 (C2’), 166.45 (C6’),

168.46 (C4’), 191.78 (C=O). IR

max

/cm

-1

1640, 4580 (KBr). Anal. Calcd for

: C 62.00, H 4.59, N 4.59. Found: C 62.08, H 4.26. Yield: 51%.

3 – (2

E)-1-(2’-hydroxyphenyl)-3-(1-naphtyl)-2-propen-1-one. Yellow solid, m.p.

106-108ºC.

H NMR (CDCl

) δ 6.97 (dd, 1H, J = 7.4 Hz, H5’), 7.06 (d, 1H, J = 8.4 Hz,

H3’), 7.51-7.62 (m, 4H, H3, H6, H7, H4’), 7.76 (d, 1H,

J = 15.2 Hz, Hα), 7.90-7.99 (m,

4H, H6’, H4, H5, H8), 8.29 (d, 1H,

J = 8.4 Hz, H2), 8.79 (d, 1H, J = 15.2 Hz, Hβ),

12.88 (s, 1H, OH).

C NMR (CDCl

) δ 118.93 (C3’), 119.17 (C5’), 122.99 (Cα),

123.67 (C2), 125.59 (C8), 125.68 (C1’), 126.67 (C3), 127.41 (C6), 129.07 (C4, C5),

121

130.00 (C9, C6’), 131.48 (C10), 136.74 (C1, C4’), 142.66 (Cβ), 163.93 (C2’), 194.12

(C=O). IR

max

/cm

-1

3451, 1635, 1351, 1576, 1203, 1015, 3047, 1435, 1162, 972, 760

(KBr). Anal. Calcd for C

: C 83.19, H 5.14. Found: C 83.88, H 5.18. Yield:

57%.

4 – (2

E)-1-(2’-hydroxyphenyl)-3-(2-naphtyl)-2-propen-1-one. Yellow solid, m.p.:

135-137 ºC (lit. p.f.: 146-148 ºC)

132

H NMR (CDCl

) δ 6.96 (d, 1H, J = 8.0 Hz, H3’),

7.03-7.10 (m, 1H, H5’), 7.48- 7.54 (m, 3H, H3, H4, H4’), 7.75 (d, 1H,

J = 16.0 Hz,

α), 7.78- 7.89 (m, 5H, H5, H6, H7, H8, H6’), 7.93 (d, 1H, J = 16.0 Hz, Hβ), 8.04 (s,

1H, H1), 12.89 (s, 1H, OH).

C NMR (CDCl

) δ 118.89 (C3’), 120.41 (C5’), 121.93

(C3), 123.89 (C

α), 125.65 (C1’), 126.80 (C6), 127.13 (C7), 127.33 (C1), 128.40 (C5),

129.08 (C8), 129.94 (C4), 131.39 (C6’), 132.31 (C10), 133.57 (C9), 134.78 (C2),

136.65 (C4’), 145.79 (C

β), 163.86 (C2’), 193.91 (C=O). IR ν

max

/cm

-1

3195 (OH), 1689

(C=O), 1568 (C=C), 3046, 1482, 1432, 1021, 985, 819, 752 (Ar) (KBr). Anal. Calcd

for C

: C 83.19, H 5.14. Found: C 82.04, H 5.18. Yield: 66%.

5 – (2

E)-1-(3’-methoxy-4’-hydroxyphenyl)-3-(2-naphtyl)-2-propen-1-one. Light

yellow solid, m.p.: 166-168 ºC.

H NMR (CDCl

) δ 4.01 (s, 3H, OCH

), 6.10 (s, 1H,

OH), 7.02 (d, 1H,

J = 8.0 Hz, H5’), 7.29 (s, 1H, H2’), 7.52-7.54 (m, 1H, H6’), 7.66-

7.72 (m, 3H, H3, H6, H7), 7.83 (d, 1H,

J = 15.6 Hz, Hα), 7.80-7.87 (m, 3H, H4, H5,

H8), 7.97 (d, 1H,

J = 15.6 Hz, Hβ), 8.05 (s, 1H, H1).

C NMR (DMSO-d

) δ 56.37 (m-

OCH

), 110.74 (C2’), 114.05 (C5’), 121.99 (C3), 123.96 (Cα), 126.97 (C6’), 127.51

(C6), 128.03 (C7), 128.85 (C1), 128.91 (C8), 130.68 (C4, C5), 131.33 (C1’), 132.81

(C10), 133.63 (C9), 134.54 (C2), 144.30 (C

β), 147.15 (C4’), 150.64 (C3’), 188.74

(C=O). IR

max

/cm

-1

3265 (OH), 1643, 1202 (C=O), 1280, 1025 (C-O), 1563 (C=C),

2950, 2835, 1522, 1445, 970, 844, 816, 779 (Ar) (KBr). Anal. Calcd for C

: C

78.93, H 5.30. Found: C 78.86, H 5.76. Yield: 39%.

6 – (2

E)-1-(2’-hydroxy-4’,6’-dimethoxyphenyl)-3-(1-naphtyl)-2-propen-1-one.

Yellow solid, m.p. 116-117 ºC.

H NMR (CDCl

) δ 3.85 (s, 3H, OCH

), 3.92 (s, 3H,

OCH

), 5.98 (s, 1H, H3’), 6.14 (s, 1H, H5’), 7.50-7.61 (m, 3H, H3, H6, H7), 7.83-7.92

(m, 3H, H4, H5, H8), 7.97 (d, 1H,

J = 15.2 Hz, Hα), 8.31 (d, 1H, H2), 8.61 (d, 1H, J

=15.2 Hz, Hβ), 12.83 (OH).

C NMR (CDCl

) δ 55.87 (OCH3), 56.15 (OCH3), 91.54

(C5’), 94.03 (C3’), 101.63 (C1’), 124.00 (C

α), 125.39 (C2), 125.71 (C8), 126.46 (C3),

127.03 (C6), 128.93 (C7), 130.46 (C4), 130.55 (C5), 132.02 (C9), 133.32 (C10),

133.99 (C1), 139.49 (C

β), 162.79 (C2’), 166.55 (C6’), 168.68 (C4’), 192.79 (C=O). IR

max

/cm

-1

3450, 1627, 1341, 1571, 1215, 1109, 1440, 1153, 975, 810, 768 (KBr).

Anal. Calcd for C

: C 75.43, H 5.43. Found: C 75.66, H 5.94. Yield: 58%.

7 – (2

E)-1-(2’-hydroxy-4’,6’-dimethoxyphenyl)-3-(3-chlorophenyl)-2-propen-1-

one. Yellow solid, m.p.: 104-106 ºC.

H NMR (CDCl

) δ 3.84 (s, 3H, OCH

), 3.93 (s,

3H, OCH

), 5.97 (s, 1H, H3’), 6.11 (s, 1H, H5’), 7.33-7.35 (m, 3H, H4, H5, H6), 7.57

(s, 1H, H2), 7.68 (d, 1H,

J = 15.6 Hz, Hα), 7.87 (d, 1H, J = 15.6 Hz, Hβ), 13.95 (s,

1H, OH).

C NMR (CDCl

) δ 55.89 (OCH

), 56.19 (OCH

), 91.58 (C5’), 94.02 (C3’),

106.50 (C1’), 126.88 (C

α), 128.09 (C6), 129.10 (C2), 130.07 (C4), 130.35 (C5),

135.06 (C3), 137.68 (C1), 140.70 (C

β), 162.73 (C2’), 166.68 (C6’), 168.68 (C4’),

192.51 (C=O). IR

max

/cm

-1

3451 (OH), 1624, 1215 (C=O), 1029 (C-O), 1576 (C=C),

122

2936, 1439, 977, 909, 822 (Ar) (KBr). Anal. Calcd for C

ClO

: C 64.06, H 4.74.

Found: C 64.61, H 5.39. Yield: 36%.

8- (2

E)-1-(2’-hydroxy-3’-bromo-4’,6’-dimethoxyphenyl)-3-(2,6-dimethoxyphenyl)-

2-propen-1-one. Orange solid, m.p. 193-194

H NMR (CDCl

) δ 3.91 (s, 6H,

OCH

), 3.96 (s, 6H, OCH

), 6.04 (s, 1H, H5’), 6.57 (d, 2H, J = 8.4 Hz, H3, H5), 7.28

(t, 1H, H4), 8.29 (d, 1H,

J = 15.6 Hz, Hα), 8.34 (d, 1H, J = 15.6 Hz, Hβ), 14.65 (s, 1H,

OH).

C NMR (acetone-d

) δ 55.72 (2 OCH

), 56.06 (OCH

), 56.32 (OCH

), 88.35

(C5’), 94.76 (C3’), 104.21 (C1’, C3, C5), 112.81 (C1), 129.11 (C

α), 132.35 (C4),

134.85 (C

β), 160.81 (C2, C6), 162.35 (C6’), 162.91 (C2’), 166.31 (C4’), 205.56

(C=O). IR

max

/cm

-1

3442, 2941, 1616, 1552, 1325, 1253, 1193, 916, 782 (KBr). Anal.

Calcd for C

BrO

: C 53.92, H 4.52. Found: C 53.67, H 4.44. Yield: 42%.

9 – (2

E)-1-(2’-hydroxy-3’-bromo-4’,6’-dimethoxyphenyl)-3-(4-buthoxyphenyl)-2-

propen-1-one. Yellow solid, m.p. 172-173 ºC.

H NMR (CDCl

) δ 0.98 (t, 3H, -CH

1.47-1.60 (m, 2H, -CH

), 1.75-1.81 (m, 2H, -CH

), 3.98 (s, 3H, OCH

3.99 (s, 3H, OCH

), 4.01 (t, 2H, -OCH

), 6.06 (s, 1H, H5’), 6.91 (d, 2H, J = 8.4 Hz,

H3, H5), 7.54 (d, 2H,

J = 8.4 Hz, H2, H6), 7.75 (d, 1H, J = 15.6 Hz, Hα), 7.83 (d, 1H,

J = 15.6 Hz, Hβ), 14.96 (OH).

C NMR (acetone-d

) δ 13.42 (CH

), 19.18 (-CH

31.28 (-CH

), 56.25 (OCH

), 67.86 (-OCH

-), 88.37 (C5’), 94.61(C3’), 104.43

(C1’), 115.19 (C3, C5), 124.46 (C

α), 128.04 (C1), 130.71 (C2, C6), 143.72 (Cβ),

160.02 (C4), 168.46 (C2’), 168.82 (C6’), 176.12 (C4’), 198.07 (C=O). IR

max

/cm

-1

3450, 2945, 1615, 1554, 1221, 963 (KBr). Anal. Calcd for C

BrO

: C 57.94, H

5.33. Found: C 57.27, H 5.27. Yield: 47%.

10 – (2

E)-1-(2’-hydroxy-3’-bromo-4’,6’-dimethoxyphenyl)-3-(4-nitrophenyl)-2-

propen-1-one. Yellow solid, m.p. 230-231 ºC.

H NMR (CDCl

) δ 3.94 (s, 3H, OCH

3.97 (s, 3H, OCH

), 6.03 (s, 1H, H5’), 7.61 (d, 2H, J = 8.0 Hz, H2, H6), 7.74 (d, 1H, J

= 16.0 Hz, H

α), 7.93 (d, 1H, J = 160 Hz, Hβ), 8.24 (d, 2H, J = 8.0 Hz, H3, H5), 14.73

(s, 1H, OH).

C NMR (CDCl

) δ 55.74 (OCH

), 56.32 (OCH

), 86.69 (C5’), 91.63

(C3’), 106.55 (C1’), 109.77 (C3, C5), 123.78 (C

α), 126.66 (C2, C6), 128.82 (C1),

131.03 (C

β), 150.47 (C4), 161.92 (C6’), 162.62 (C2’), 162.68 (C4’), 203.27 (C=O). IR

max

/cm

-1

3450, 2943, 1600, 1509, 1345, 1093, 976, 852 (KBr). Anal. Calcd for

BrNO

: C 50.02, H 3.46, N 3.43. Found: C 49.57, H 3.02, N 4.53. Yield: 42%.

11 – (2

E)-1-(2’-hydroxy-3’-bromo-4’,6’-dimethoxyphenyl)-3-(2-chlorophenyl)-2-

propen-1-one. Light yellow solid, m.p. 210-212 ºC.

H NMR (CDCl

) δ 3.98 (s, 3H,

OCH

), 4.04 (s, 3H, OCH

), 6.21 (s, 1H, H5’), 7.29-7.32 (m, 2H, H4, H5), 7.43 (d, 1H,

H3), 7.67 (d, 1H, H6), 7.83 (d, 1H,

J = 15.2 Hz, Hα), 8.18 (d, 1H, J = 15.2 Hz, Hβ),

14.67 (s, 1H, OH).

C NMR (acetone-d

) δ 56.85 (OCH

), 57.08 (OCH

), 87.80 (C5’),

92.80 (C3’), 106.00 (C1’), 127.72 (C

α), 128.60 (C5), 130.22 (C6), 131.06 (C3),

131.62 (C4), 134.33 (C2), 136.21 (C1), 139.49 (C

β), 162.90 (C2’), 163.00 (C6’),

163.93 (C4’), 193.25 (C=O). IR

max

/cm

-1

3450, 2934, 1618, 1557, 1216, 1125, 965,

788 (KBr). Anal. Calcd for C

BrClO

: C 51.35, H 3.55. Found: C 51.45, H 3.58.

Yield: 62%.

123

12 – (2E)-1-(2’-hydroxy-3’-bromo-4’,6’-dimethoxyphenyl)-3-(4-methoxyphenyl)-

2-propen-1-one. Yellow solid, m.p. 144-146 ºC.

H NMR (CDCl

) δ 3.86 (s, 3H,

OCH

), 3.97 (s, 3H, OCH

), 3.99 (s, 3H, OCH

), 6.07 (s, 1H, H5’), 6.93 (d, 2H, J = 8.8

Hz, H3, H5), 7.56 (d, 2H,

J = 8.8 Hz, H2, H6), 7.79 (d, 1H, J = 16.4 Hz, Hα), 7.89 (d,

1H,

J = 16.4 Hz, Hβ), 14.81 (OH).

C NMR (acetone-d

) δ 55.17 (OCH

), 56.25

(OCH

), 56.37 (OCH

), 88.34 (C5’), 94.76 (C3’), 106.66 (C1’), 114.70 (C3, C5),

124.61 (C

α), 128.10 (C1), 130.68 (C2, C6), 143.59 (Cβ), 162.17 (C4), 162.92 (C2’,

C6’), 163.28 (C4’), 205.72 (C=O). IR

max

/cm

-1

3443, 1615, 1557, 1220, 1177, 824

(KBr). Anal. Calcd for C

BrO

: C 54.98, H 4.36. Found: C 51.95, H 4.46. Yield:

40%.

13 - (2

E)-1-(2’-hydroxy-3’-bromo-4’,6’-dimethoxyphenyl)-3-(2-carboxyphenyl)-2-

propen-1-one. Yellow solid, m.p. 230 ºC.

H NMR (acetone-d

) δ 3.79 (s, 3H, OCH

3.85 (s, 3H, OCH

), 6.00 (s, 1H, H5’), 7.64 (t, 1H, J = 8.0 Hz, H4), 7.64 (d, 1H, J =

16.0 Hz, H

α), 7.79 (d, 1H, J = 8.0 Hz, H6), 7.87 (t, 1H, J = 8.0 Hz, H5), 7.87 (d, 1H, J

= 16.0 Hz, H

β), 7.92 (d, 1H, J = 8.0 Hz, H3), 14.23 (COOH), 14.57 (OH).

C NMR

(acetone-d

) δ 57.25 (OCH

), 57.74 (OCH

), 88.12 (C5’), 94.78 (C3’), 106.14 (C1’),

124.40 (C

α), 126.49 (C6), 130.09 (C4), 130.73 (C2), 132.61 (C3), 134.88 (C5),

135.66 (C1), 136.76 (C

β), 156.72 (C6’), 165.62 (C2’), 166.90 (C4’), 180.67 (COOH),

206.97 (C=O). IR

max

/cm

-1

3441, 2942, 2640, 1627, 1559, 1216, 1125, 964, 781

(KBr). Anal. Calcd for C

BrO

: C 53.09, H 3.71. Found: C 49.08, H 3.71. Yield:

59%.

Biological Assays

Reagents: Tissue culture media and fetal bovine serum were purchased from

CULTILAB (São Paulo, Brazil), penicillin/streptomycin were purchased from GIBCO

(Grand Island, NY), isopropanol were purchased from Merck (Darmstat, Germany),

3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and N-[2-

Hydroxyethyl]piperazine-N’-2-ethanesulfonic acid] (HEPES) were purchased from

Sigma (St. Louis, MO, USA). The luciferin-luciferase kit was purchased from Bio-

Orbit® (Turku, Finland).

Cell Culture: Murine B16-F10 melanoma cells line were obtained from American

Type Culture Cell (ATCC) and VERO cells Associação Técnico Científica Paul

Ehrlich (APABCAM, Rio de Janeiro, Brazil). The cells were cultured in DMEM

supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, 100 U/ml penicillin, 100

µg/ml streptomycin and 10 mM HEPES. The cell cultures were maintained at 37

C in

a 5% CO

humidified atmosphere and pH 7.4. Once the cells reached 90%

124

confluency, a cell suspension was prepared by trypsinization cultures (B16-F10 and

Vero). In all experiments, viable cells were checked in the beginning of experiment by

Trypan Blue exclusion.

Cytotoxity: The cytotoxic effect of synthetic hydroxychalcones was evaluated using

a MTT assay. Briefly, 1 x 10

cells/well were incubated in triplicate with compounds

dissolved in DMSO (0,1% final concentration) and diluted with medium culture to

their final concentrations in 72h, respectively, in microplates 96-well. After the

incubation time at 37 ºC, the cells were washed with new medium culture and 10µl

MTT (5mg/ml) was added followed by 3h of incubation at 37 ºC. The precipitated

formazan was dissolved in 100µl acid isopropanol solution (isopropanol containing

HCl 0.04M) and the absorbance was measured at 540nm using microwell system

reader (Organon Teknika, Belgium). The cells, 1 x 10

cells were incubated with the

hydroxychalcones in concentration range of 0 - to 40µM for 72h, following with MTT

assay. The IC

s values (a concentration that produces 50% reduction in the viable

cell number) were calculated from the concentration-response curves. The cell

viability was checked in the beginning of experiment by Tripan Blue exclusion.

DNA fragmentation analysis by gel eletrophoresis: Briefly, 5 x 10

cells/well were

incubated with compounds dissolved in DMSO (0,1% final concentration) at

concentration IC

and diluted with medium culture to their final concentrations, in

24h. To isolate DNA fragments cells were harvested and washed twice with cold

phosphate buffer saline (PBS). Cell pellets were then incubated in a lyses buffer

containing 10 mM EDTA, 50 mM Tris–HCl, pH 8.0, 0.25% NP-40, 0.5 g/L proteinase

K at 50 °C for 2 h. DNA was then precipitated with 2.5 vol of ethanol-Nacl at -25 °C

overnight and dried in air. After washing with ice-cold 70% ethanol, the pellets were

then dissolved in TE buffer containing 10 mM Tris–HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA and 0.6

mg/ml RNase A and incubated at 37 °C for 1 h. DNA solutions were then separated

in 1.5% agarose gels, stained with ethidium bromide and visualized by 2UV

Transilluminator (MacroVue UV-20 Hoefer) for ladder formation.

Bioluminescent assay for ATP: The amount of intracellular ATP was determined by

bioluminescent assay measuring the light output of the luciferin-luciferase reaction.

Approximately 3

cells were incubated in the presence of hydroxychalcones at

125

different concentrations then they were pelleted and extracted with 40 µL of 1.25%

trichloroacetic acid. The extracts were kept on ice for 30’ min. and neutralized with 20

µL of 1 M Tris-acetate, pH 7.5. After centrifugation, the supernatants were diluted

with the supplied dilution buffer (X4) and used for ATP quantification.

Mitochondrial glutathione measurement: Mitochondria enriched preparation was

obtained by centrifugation. Total glutathione (GSH + GSSG, reduced and disulphide

forms, respectively) was measured through the glutathione reductase method [25].

Approximately 3

cells were washed in PBS and homogenized in a buffer containing

Tris-sacarose 10mM/250mM, resuspended in 100 µL chilled Milli-Q water containing

1mM EDTA and sonicated for 10 s. Then, 20 µL of each homogenate were

transferred to a 96-well plate followed by addition of 180 µL of the reaction medium

containing DTNB 75 µM; NADPH 120 µM, glutathione reductase 1 U/mL and EDTA

10 mM in phosphate buffer 100 mM, pH 7.4. A standard curve was made with GSH

(0.001–1 µM). The absorbance was measured immediately and then every min

during 5 min at 412 nm using a Microwell Systems (Organon Teknika). Values were

expressed as percentage of control GSH values.

Statistical analysis: The statistical program GraphPad Prism® 4.0 Windows (Graph

Pad software, Inc., San Diego CA 2003)

was used to calculate the IC

and the

statistical significance. The results were presented as mean ± S.E.M. of triplicates

from three independent experiments. Statistical significance was assessed by

ANOVA followed by Bonferroni’s

t-test, for comparisons of cell viability between B16-

F10 and VERO lines the

t Student test was used. p values < 0.05 was taken as

statistically significant.

Acknowledgments

This research was supported by grants and fellowships from CNPq (Conselho

Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), CAPES (Coordenação de

Pessoal de Nível Superior) and FAPESC (Fundação de Amparo à Ciência e

Tecnologia de Santa Catarina). This work is part of the thesis of Andreia L. F.

Navarini and Alessandra Mascarello, who are MSc students in Pharmacy and

Chemistry, respectively. We would like to thank the Department of Chemistry and

126

also to Hospital Universitário for some facilities, both from Universidade Federal de

Santa Catarina.

References

1. WHO. World Health Organization. Disponível em: <www.who.int/cancer>. Acessed in 30

may 2007.

2. Xu, L. Y.; Koo, J.

Int J Dermato. 2006, 45, 1275-1283.

3. Fidler, I. J.

Cancer Research. 1978, 38, 2651-2660. Fidler, I. J. Cancer Research. 1975, 35,

218-224.

4. Freitas, Z. F. O.; Rodrigues, E. G.; Oliveira V.; Carmona, A. K.; Travassos, L. R.

Melanoma Research. 2004, 14, 333-344.

5. Avril, M. F.; Aamdal, S.; Grob, J. J.; Hauschild, A.; Morhr, P.; Bonerandi, J. J.;

Weichenthal, M.; Neuber, K.; Bieber, T.; Gilde, K.; Porta, V. Guillem; Fra, J.;

Bonneterre, J.; Saiag, P.; Kamanabrou, D.; Pehamberger, H.; Sufliarsky, J.; Larriba,

J. L. Gonzalez; Scherrer, A.; Menu, Y.

J Clin Oncol. 2004, 22, 1118-1125.

6. Dimmock, J. R.; Elias, D. W.; Beazely, M. A.; Kandepu, N. M. Curr Med Chem. 1999,

6(12),1125-49.

7. Ni, L.; Meng, Q. C.; Sikorski, J. A.

Expert Opin Ther Patents. 2005, 14(12), 1669-1691.

8. Nakatani, N.; Ichimaru, M.; Moriyasu, M.; Kato, Atsushi.

Biol Pharm Bull. 2005, 28(1),

83-86.

9. Kobori, M.; Iwashita, K.; Shinmoto, H.; Tsushida, T.

Cells Biosci Biotechnol Biochem.

1999,

63(4), 719-725.

10. Saydam, G.; Aydin, H. H.; Sahin, F.; Kucukoglu, O.; Erciyas, E.; Terzioglu, E.;

Buyukkececi, F.; Omay, S. B.

Leuk Res. 2003, 27, 57-64.

11. Rao,Y. K.; Fang, S. H.; Tzeng, Y. M.

Bioorg Med Chem. 2004, 12, 2679-2686.

12. Go, M. L.; Wu, X.; Liu, X. L.

Curr Med Chem. 2005, 12, 483-499.

13. Hsu, Y. L.; Kuo, P. L.; Chiang, L. C.; Lin, C. C.

Clin Exper Pharm Physiol. 2004, 31,

414-418.

14. Sabzevari, O.; Galati, G.; Moridani, M. Y.; Siraki A.; Brien P. J. O.

Chem-Biol Int. 2004,

148, 57-67.

15. Chun-Lin, Y.; Liu, J. W.; Wei D. Z.; Lu, Y. H.; Qian F.

Pharm Res. 2004, 50, 505-510.

16. Iwashita, K.; Kobori, M.; Yamaki, K.; Tsushida, T.

Biosci Biotechnol Biochem. 2000,

64(9), 1813-1820.

17. Won, S. J.; Liu, C. T.; Tsao, L. T.; Weng J. R.; Ko, H. H.; Wang, J. P.; Lin, C. N.

Eur J

Med Chem

. 2005, 40, 103-112.

18. Takahashi, T.; Baba, M.; Nischino, H.; Okuyama T.

Cancer Lett. 2006, 231, 319-325.

19. Yakamoto, S.; Aizu, E.; Jiang, H.; Nakadate, T.; Kiyoto, I.; Wang, J. C; Kato, R.

Carcinogenisis. 1991, 12, 317- 323.

20. LeBlanc, R.; Dickson, J.; Brown, T.; Stewart, M.; Pati, H. N.; VanDerveer, D.; Arman,

H.; Harris, J.; Pennington, W.; Holt, H. L.; Lee, M.

Bioorg Med Chem. 2005, 13(21), 6025-

6034.

21. Tatsuzaki, J.; Bastow, K. F.; Nakagawa-Goto, K.; Nakamura, S.; Itokawa, H.; Kuo-

Hsiung L.

J Nat Prod. 2006, 69, 1445-1449.

22. Cabrera, M.; Somoens, M.; Falchi, G.; Lavaggi, M. L.; Piro, O. E.; Castellano, E. E.;

Vidal, A.; Azqueta, A.; Monge, A.; Ceráin, A. L.; Sagrera, G.; Seoane, G.; Cerecetto, H.;

González, M.

Bioorg Med Chem. 2007, 15, 3356-3367.

127

23. Kachadourian, R.; Day, B. J.

Free Rad Biol Medicine. 2006, 41, 65-76.

24. Hsu, Y. L.; Kuo, P. L.; Lin, C. C.

Life Scien. 2005, 77, 279-292.

25. Sogawa, S.; Nihro, Y.; Ueda, H.; Izumi, A.; Miki, T.; Matsumoto, H.; Satoh, T.

J Med

Chem. 1993, 36, 3904-3909.

26. Liu, Y. C.; Hsieh, C. W.; Wu, C. C.; Wung, B. S.

Life Scien. 2007, 80(15), 1420-1430.

27. Ko, H. H.; Tsao, L. T.; Yu, K. L.; Liu, C. T.; Wang, J. P.; Lin, C. N.

Bioorg Med Chem.

2003,

11, 105-11.

28. Lin, Y. M.; Zhou, Y.; Flavin. M. T.; Zhou, L. M.; Nie, W.; Chen, F. C.

Bioorg Med Chem.

2002,

10, 2795-2802.

29. Yamamoto, K.; Kakegawa, H.; Ueda, H.; Matsumoto, H.; Sudo, T.; Miki, T.; Satoh, T.

Planta Medica. 1992, 58 (5), 389-393.

30. Anto, R. J.; Sukumran, K.; Kuttan, G.; Rao, M. N. A.; Subbaraju, V.; Kuttan, R.

Cancer

Lett. 1995, 97, 33-37.

31. Zhan, C.; Yang, J.

Pharmacol Res. 2006, 53, 303-309.

32. Liu, M.; Wilairat, P.; Croft, S. L.; Tan, A. L. C.; Go, M. L.

Bioorg Med Chem. 2003, 11,

2729-2738.

33. Boeck, P.; Falcão, C. A. B.; Leal, P. C.; Yunes, R. A.; Cechinel, V.; Torres-Santos, E. C.;

Rossi-Bergamann, B.

Bioorg Med Chem. 2006, 14, 1538-1545.

34. Ogawa, H.; Okada, Y.; Kamisako, T.; Baba, K.

Clin Exper Pharm Physiol. 2007, 34, 238-

243.

35. Lowe, S. W.; Rusley, H. E.; Jacks, T.; Houseman, D. E.

Cell. 1993, 74, 957-967.

36. Ghobrial, I. M.; Witzig, T. E.; Adjei, A. A.

CA Cancer J Clin. 2005, 55, 178-194.

37. Hanahan, D.; Weinberg, R. A.

Cell. 2000, 100, 57-70.

38. Dias, N.; Bailly, C.

Biochem Pharm. 2005, 70, 1-12.

39. Skulachev, V. P.

Apoptosis. 2006, 11, 473-485.

40. Garland, J. M.; Halestrap, A.

J Biol Chem. 1997, 272 (8), 4680-4688.

41. Lash, L. H.

Chem Biol Interact. 2006, 163 (1-2), 54-67.

42. Kluza, J.; Lansiaux, A.; Wattez, N.; Hildebrand, M. P. ; Léonce, S. ; Pierré, A.; Hickman,

J. A.; Bailly, C.

Biochemical Pharmacology. 2002, 63, 1443-1452.

43. Stavrovskaya, A. A.

Biochemistry. 2000, 65 (1), 95-106.

44. Ozben, T.

FEBS Lett. 2006, 580 (12), 2903-2909.

45. Cos, P.; Calomme, M.; Sindambiwe, J. B.; De Bruyne, T.; Cimanga, K.; Pieters,

L.; Vlietinck, A. J.; Vanden Berghe, D.

Planta Med. 2001, 67(6), 515-519.

46. Cos, P., Rajan, P., Vedernikova, I.; Calomme, M.; Pieters, L.; Vlietinck, A. J.;

Augustyns, K.; Haemers, A.; Vanden Berghe, D.

Free Rad Res. 2002, 36(6), 711-

716.

47. Wyllie, A. H.; Kerr, J. F. K.; CurrieE, A. R.

Int Rev Cytol. 1980, 68, 251-305.

48. Cao, J.; Liu, Y.; Jia, L.; Zhou H. M.; Kong, Y.; Yang, G.; Jiang, L. P.; Li, Q. J.; Zhong

L. F.

Free Radical Biology & Medicine. 2007, 43, 968-975.

49. Hu, W. P.; Yu, H.; Sung, P. J.; Tsai, F. Y.; Shen, Y. K.; Chang, L. S.; Wang, J. J.

Chem,

Res. Toxicol. 2007, 20, 905-912.

50. Regula, K. M.; Ens, K.; Kirshenbaum. L. A.

Journal of Molecular and Cellular

Cardiology. 2003, 35, 559-567.

51. Wyllie, A. H. Br J Cancer. 1993, 67 (2), 205-208.

52. Kachadouriam, R.; Day, B. J.

Free Radical & Biology & Medicine. 2006, 41, 65-

76.

53. Férnandez-Checa J. C.

Biochemical and Biophysical Research Communications.

2003,

304, 471-479.

54. Garcia-Ruiz, C.; Férnandez-Checa J. C. J. Gastroenterol. Hepatol. 2006, 3, 3-6.

128

55. Cechinel, V. F.; Vaz, Z. R.; Zunino, L.; Calixto, J. B.; Yunes, R. A. Eur. J. Med.

Chem. 1996, 31, 833-839.

56. Hollinshead, S. P. Tetrahedron Let. 1996, 51, 9157-9160.

57. Subbanwad, G. R.; Vibhute, Y. B.

Asian J Chem. 1993, 5, 352-357.

58. Liu, M.; Wilairat, P.; Croft, S. L.; Tan, A. L. C.; Go, M. L.

Bioorg Med Chem. 2003, 11,

2729-2738.

59. Hsu, K. K.; Hung, M.; Chen, F. C.

Taiwan Kexue. 1959, 13, 92-94.

60. Bora, U.; Bose, G.; Chaudhuri, M. K.; Dhar, S. S.; Gopinath, R.; Khan, A. T.; Patel, B. K.

Organic Letters. 2000, 2 (3), 247-249.

61. Motulsky, H. J.; A. Christopoulos.

Ed. GraphPad software Inc. 2003, 257-275.

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 