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SILVANA VIRGINIA GAGLIOTTI VIGIL
Estudo do efeito do Tacrolimus sobre a resposta inflamatória
induzida pela carragenina no modelo da bolsa de ar, em
camundongos
Florianópolis
2008
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA
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SILVANA VIRGINIA GAGLIOTTI VIGIL
Estudo do Tacrolimus sobre a resposta inflamatória induzida pela
carragenina no modelo da bolsa de ar, em camundongos
Dissertação apresentada ao curso de Pós-
graduação em Farmácia do Centro de
Ciências da Saúde da Universidade Federal
de Santa Catarina como requisito parcial para
obtenção do título de Mestre em Farmácia,
sob a orientação da Profa. Dra. Tânia Silvia
Fröde.
Florianópolis
2008
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA
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A Pedra
“O distraído nela tropeçou. O bruto a usou
como projétil. O empreendedor, usando-a,
construiu. O camponês, cansado da lida,
dela fez assento. Para meninos, foi
brinquedo. Drummond a poetizou. Já, David
matou Golias e Michelangelo extraiu-lhe a
mais bela escultura. E em todos esses
casos, a diferença não esteve na pedra, mas
no homem! Não existe "pedra" no seu
caminho que você não possa aproveitá-la
para o seu próprio crescimento.”
(
(
A
A
u
u
t
t
o
o
r
r
d
d
e
e
s
s
c
c
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o
n
n
h
h
e
e
c
c
i
i
d
d
o
o
)
)
A meus pais, José Luiz e Maria Inés, por
todo amor, apoio e incentivo incondicional.
Cada etapa da minha vida é uma conquista
nossa.
A minha avó, meus irmãos e amigos,
pelos momentos de alegria,
companheirismo e compreensão.
A professora Dra. Tânia Silvia Fröde
pelos anos de dedicação, amizade e
inestimável contribuição para minha
formação.
AGRADECIMENTOS
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela benção da vida e por dar-me saúde e equilíbrio para superar os
obstáculos durante minha caminhada, não me deixando perder as esperanças nem desistir
dos meus objetivos.
Aos meus pais, José Luiz Fortunato Vigil e Maria Inés Gagliotti de Vigil, que
sempre acreditaram em mim, deram apoio, incentivo, amor e estrutura para chegar cada vez
mais longe e sonhar cada vez mais alto. Pai e mãe, a vocês dedico minha eterna gratidão.
À minha avó Teresa Alvarez, aos meus irmãos Anna Karenina G. Vigil e Martin
Augusto G. Vigil, aos meus tios José Luis Gagliotti e Nádia Gagliotti e ao meu primo
Guilherme Gagliotti por todos os momentos de alegria e companheirismo. Graças a Deus eu
tenho vocês. Graças a Deus eu tenho uma família.
Aos amigos do laboratório registro meus sinceros agradecimentos. Obedecendo à
ordem cronológica dos acontecimentos, agradeço ao Eduardo Dalmarco, à Vanessa Valgas,
ao Marcelo Spillere, à Denise Geremias e ao Álvaro Vargas. A todos vocês obrigada pela
amizade e por tudo que me ensinaram durante minha iniciação científica. Aos meus amigos,
Robson Pereira, Ziliani Buss, Silvana Zucolotto, Janaína Koelzer, Jucélia Benincá, Vanessa
Engelmann, Gustavo do Reis, Giliard Astolfi e Diana Pereira, pelos momentos de alegria,
pelos experimentos realizados juntos, pelos congressos, enfim obrigada por tudo. À Stella
Goulart pelos momentos inesquecíveis, por sua eterna amizade, companheirismo e apoio
dentro e fora do laboratório. Ao Rafael de Liz por ter sido tão importante nesta fase da minha
vida e por ter me acompanhado durante essa caminhada. Obrigada pelos momentos de
alegria, apoio e incentivo.
Às minhas amigas Flora Ewerling, Janaína Basílio, Amanda Santos, Luciana Leite,
Rosana Alves, Gabriela Borsatto, Ananda Caixeta, Ângela Bet, Andréia Voigt e Samira
Nienkoter que, presentes ou não, sempre me deram força e acreditaram em mim.
À professora Dra. Tânia Silvia Fröde por todos os anos de dedicação, orientação,
paciência e confiança em mim depositada.
À Universidade Federal de Santa Catarina, aos professores e funcionários da
Graduação e do Programa de Pós-graduação em Farmácia por minha formação e pela
oportunidade de adquirir novos e importantes conhecimentos. Enfim, a todos aqueles que
acreditaram em mim e que de alguma forma contribuíram para realização deste sonho e a
todos aqueles que fazem parte da minha vida, meus sinceros agradecimentos.
SUMÁRIO
SUMÁRIO
Pág
.
LISTA DE ABREVIAÇÕ
ES
7
LISTA DE FIGURAS 9
RESUMO 10
ABSTRACT
11
1 INTRODUÇÃO 12
1.1 TACROLIMUS 12
1.2 O PROCESSO INFLAMATÓRIO 13
1.3 MODELOS DE INFLAMAÇÃO 20
2 OBJETIVOS 22
2.1 OBJETIVO GERAL 22
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 22
3 ARTIGO PUBLICADO - Transplant Immunology 23
4 DISCUSSÃO 39
5 CONCLUSÕES 45
6 PERSPECTIVAS 47
REFERÊNCIAS 48
APÊNDICE A: Protocolo do estudo da atividade antiinflamatória do
tacrolimus
58
ANEXO A: Protocolo e cadastro da Comissão de Ética no Uso de Animais 60
LISTA DE ABREVIAÇÕES
LISTA DE ABREVIAÇÕES
A
1
Receptor de adenosina tipo 1
A
2A
Receptor de adenosina tipo 2A
A
2B
Receptor de adenosina tipo 2B
A
3
Receptor de adenosina tipo 3
ADA Adenosina-deaminase
ADA-1 Adenosina-deaminase isoforma 1
ADA-2 Adenosina-deaminase isoforma 2
ALT Alanina aminotransferase
ALT-146e Agonista seletivo para receptor A
3
APP Inibidor de adenosina-deaminase
BSA Albumina sérica bovina
C Família de quemocinas quimiotáticas para linfócitos T
CC Família de quemocinas quimiotáticas para monócitos, macrófagos,
basófilos, linfócitos T e eosinófilos
CD11b/CD18
Molécula de adesão do tipo β2-integrina expressa em neutrófilos
CD66 Molécula de adesão expressa em neutrófilos
CD67 Molécula de adesão expressa em neutrófilos
CF-101 Agonista de receptor A
3
Cg Carragenina
CGRP Peptídeo relacionado ao gene da calcitonina
CsA Ciclosporina A
CV Coeficiente de variação
CXC Família de quemocinas quimiotáticas para neutrófilos, linfócitos T e
B e células Natural Killer
CX
3
C Família de quemocinas quimiotáticas para linfócitos T e células
Natural Killer
CXCR1 Receptor 1 de quemocinas CXC
CXCR2 Receptor 2 de quemocinas CXC
DF 2162 Inibidor de receptores para quemocinas CXC
ELISA Enzima imuno ensaio
E-selectina Molécula de adesão do tipo Selectina, expressa em células
endoteliais
FKBP-12 Proteína intracelular chamada imunofilina
GMPc Guanosina monofosfato cíclica
HaCAT Linhagem celular de queratinócitos humanos
HMVEC Células endoteliais da microvasculatura humana
HIV Vírus da imunodeficiência humana
ICAM-1 Molécula de adesão intercelular tipo 1
IFN-γ Interferon-γ
IL-1α
Interleucina-1 alfa
IL-1β
Interleucina-1 beta
IL-1Ra
Antagonista natural do receptor de IL-1β
IL-2 Interleucina-2
IL-5 Interleucina-5
IL-6 Interleucina-6
IL-8 Interleucina-8
IL-17 Interleucina-17
i.p. Intraperitoneal
i.v. Endovenosa
KC Quemocina de neutrófilo
LFA-1 Antígeno relacionado à função do leucócito-1
L-NAME L-nitroarginina metil éster
LPS Lipopolissacarídeo
L- selectina Molécula de adesão do tipo Selectina expressa em leucócitos
Mac-1 Antígeno de macrófago-1
MIP-2 Proteína inflamatória de macrófago-2
MMP25 Matriz Metaloproteinase 25
LISTA DE ABREVIAÇÕES
MPO Mieloperoxidase
NADPH Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
NF-AT Fator nuclear de linfócitos T ativados
NF-κB
Fator de transcrição nuclear kappa B
NO
x
Óxido nítrico
NO
2
-
Nitrito
NO
3
-
Nitrato
NOS
Óxido nítrico sintase
NOSc Óxido nítrico sintase constitutiva
NOSe
Óxido nítrico sintase constitutiva, expressa em células endoteliais
NOSn
Óxido nítrico sintase constitutiva, expressa em células neuronais
NOSi Óxido nítrico sintase induzida
O
3
Ozônio
PGD
2
Prostaglandina D
2
PGE
2
Prostaglandina E
2
PGI
2
Prostaglandina I
2
ou Prostaciclina
PGF
2
α
Prostaglandina F
2
α
p.o. Via oral
P-selectina Molécula de adesão do tipo Selectina expressa em plaquetas
RANTES Quemocina secretada, expressa e regulada sob ativação de
linfócitos T normais
RNAm Ácido ribonucléico mensageiro
s.c Via subcutânea
Tac Tacrolimus
TNF-α
Fator de necrose tumoral alfa
VCAM-1 Molécula de adesão vascular tipo 1
v.o. Via oral
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Atividade antiinflamatória proposta para o tacrolimus 46
RESUMO
RESUMO
Estudo do Tacrolimus sobre a resposta inflamatória induzida pela carragenina
no modelo da bolsa de ar, em camundongos
Introdução: Tacrolimus é um imunossupressor da classe dos macrolídeos utilizado na
clínica para evitar a regeição em transplantes de órgãos e no tratamento da dermatite
atópica.
Objetivo: O objetivo do presente estudo foi elucidar a atividade antiinflamatória do
tacrolimus na inflamação induzida pela carragenina, no modelo da bolsa de ar, em
camundongos.
Metodologia: Camundongos albinos Swiss receberam injeção de 1,5 ml de ar no dorso,
durante três dias alternados, para formação da bolsa de ar. No sexto dia, os animais
receberam carragenina (Cg, 1%, s.c.) e 24 h após foram sacrificados e a bolsa foi aberta
e lavada com 1 ml de salina estéril. Os parâmetros inflamatórios observados foram:
acúmulo de leucócitos, exsudação, atividade da mieloperoxidase (MPO) e da
adenosina-deaminase (ADA), concentração de nitrato/nitrito (NO
x
) e níveis de fator de
necrose tumoral alfa (TNF-α), interleucina-1 beta (IL-1β) e quimiocina para neutrófilo
(KC) foram avaliados 24 h depois. Para avaliar a exsudação, 1 h antes da Cg foi
administrado 0,2 ml de azul de Evans (25 mg/kg, i.v.). Para determinação da curva dose
e tempo resposta, inicialmente diferentes grupos de animais receberam diferentes doses
de tacrolimus (1 a 10 mg/kg, v.o.) 0,5 h antes da injeção de carragenina e a migração
celular e a exsudação foram avaliadas 24 h após. Em outros experimentos, diferentes
grupos receberam uma única dose de tacrolimus (2 mg/kg, v.o.) em diferentes períodos
de tempo (0,5 – 4 h) e os parâmetros inflamatórios foram avaliados 24 h após. De
acordo com este protocolo, tacrolimus (2 mg/kg, v.o.) administrado 0,5 h antes da Cg, foi
utilizado para analisar o seu efeito sobre a atividade de MPO e ADA e níveis de NO
x
,
TNF-α, IL-1 e KC. A indometacina (5 mg/kg, i.p.) e a dexametasona (0,5 mg/kg, i.p.)
foram utilizadas como fármacos de referência. Os resultados foram expressos como
média ± erro padrão da média. As diferenças estatísticas foram determinadas pela
análise de variância (ANOVA), seguido de teste de Dunnett ou teste t de Student.
Valores de P < 0,05 foram considerados significantes.
Resultados: O tacrolimus (Tac: 2 mg/kg, v.o.) inibiu o acúmulo de leucócitos e de
neutrófilos e reduziu a exsudação, os níveis de TNF-α, IL-1, KC e óxido nítrico, além da
atividade da MPO e da ADA (P < 0,05).
Conclusão: Estes resultados demonstram que o tacrolimus apresenta importante
atividade antiinflamatória, similar a da indometacina e da dexametasona. A inibição de
citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1, KC), enzimas (MPO e ADA) e liberação de
mediadores inflamatórios (NO
x
) parecem fazer parte da atividade antiinflamatória do
tacrolimus.
Unitermos: Tacrolimus, inflamação, bolsa de ar, mediadores da inflamação,
camundongos.
ABSTRACT
ABSTRACT
Study of Tacrolimus on the inflammatory response induced by carrageenan in
the mouse model of air pouch.
Background: Tacrolimus is a macrolide immunosuppressant drug widely used for organ
transplantation and to treat atopic dermatitis.
Objective: The aim of the present work was to evaluate the mechanisms of anti-
inflammatory action of tacrolimus in the air pouch model induced by carrageenan, in
mice.
Methods: Swiss mices received injections of 1.5 ml of air on three alternated days to
induce the air pouch. On the sixth day, the animals received carrageenan (Cg, 1%, s.c.)
and 24 h later were sacrificed. Their cavities of air pouch were open and were washed
with 1.0 ml of sterile saline. The inflammatory parameters: leukocytes, exudation,
myeloperoxidase (MPO) and adenosine-deaminase (ADA) activities, nitrate/nitrate
concentrations (NO
x
), tumor necrosis factor alpha (TNF-α), interleukin-1 beta (IL-1β) and
chemokines to neutrophils (KC) levels were evaluate 24 h after. To evaluate the
exudation a group of animals received 0.2 ml of Evans blue dye (25 mg/ kg, i.v.) 0.5 h
before Cg administration. To stablish a standard for tacrolimus, together with the dose
and timing to be used in the experimets, different groups of animals were treated with
different doses of tacrolimus (1 to 10 mg/kg, p.o.) 0.5 h before carrageenan injection and
the cell migration and exudation were analyzed after 24 h. In another set of experiments,
different groups of animals were pretreated with a single dose of tacrolimus (2 mg/kg,
p.o.), at different time points (0.5 - 4 h), and the inflammatory parameters were evaluated
24 h after. According to this protocol, tacrolimus (2 mg/kg, p.o.) administered 0.5 h
before Cg injection, was selected the dose to be used to analyze its effect upon MPO,
ADA, NO
x
, TNF-α, IL-1β and KC levels. Indomethacin (5.0 mg/kg, i.p.) and
dexamethasone (0.5 mg/kg, i.p.) were used as reference drug. Data is reported as the
mean ± standard error of the mean. Significant differences between groups were
determined by analysis of variance (ANOVA), Dunnett or Student’s t tests. P < 0.05 was
considered as indicative of significance.
Results: Tacrolimus (Tac: 2.0 mg/kg, p.o.) significantly inhibited leukocyte and,
neutrophils accumulation, exudation, TNF-α, IL-1β, KC, nitric oxide levels and MPO and
ADA activities (P < 0.05)
Conclusion: These results indicate that tacrolimus shows important anti-inflammatory
properties and the majority of its actions were similar to those induced by indomethacin
and dexamethasone. The inhibition of proinflammatory cytokine (TNF-α, IL-1β, KC),
enzyme (MPO and ADA) and mediator (NO
x
) release and/or action appears to account
for tacrolimus’s action.
Keywords: Tacrolimus, inflammation, air pouch, mediators of inflammation, mice.
INTRODUÇÃO
12
1 INTRODUÇÃO
1.1 TACROLIMUS
O tacrolimus, também conhecido como FK506, é um fármaco
imunossupressor da classe dos macrolídeos, isolado do Streptomyces tsukubaensis
(KINO et al., 1987). Trata-se de um fármaco utilizado para evitar a rejeição no
transplante de órgãos (BUSH; LIN, 2006; MCCORMACK; KEATING, 2006; WENTE
et al., 2006), na dermatite atópica (NAKAGAWA, 2006) e na psoríase (EZQUERRA
et al., 2006). Estudos clínicos têm revelado a eficácia do tacrolimus no tratamento
da artrite reumatóide (KITAHARA; KAWAI, 2007). O tacrolimus, assim como a
clicosporina A, pertence à classe de imunossupressores denominada inibidores da
calcineurina e exerce atividade imunossupressora através da inibição da ativação
dos linfócitos T (ROEHRL et al., 2004). Mesmo pertencendo à mesma classe de
imunossupressores, estudos revelam que o tacrolimus é até 100 vezes mais potente
que a ciclosporina A (ALLISON, 2000).
O mecanismo de ação do tacrolimus envolve a formação de um
imunocomplexo por meio da ligação do fármaco à proteína intracelular FKBP-12.
Este complexo promove a inibição da calcineurina fosfatase, enzima envolvida na
desfosforilação e conseqüente ativação do fator nuclear de linfócitos T ativados (NF-
AT), que é necessário para a expressão de genes que expressam citocinas, ativando
os linfócitos T (ROEHRL et al., 2004). Desta forma, a inibição da calcineurina pelo
tacrolimus resulta no bloqueio da produção e liberação de diversas citocinas,
incluindo fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interleucina-2 (IL-2) e interferon-γ
(IFN-γ), pelas células T (VENKATESH et al., 2004).
Além do efeito imunossupressor, o tacrolimus também apresenta
propriedades antiinflamatórias. Sasakawa et al., (2005) demonstraram que o
tacrolimus inibe a síntese de citocinas inflamatórias, como o TNF-α e IL-1β, em
modelos experimentais in vitro de artrite. Além disso, Lan et al., (2005)
demonstraram que o tacrolimus inibe a secreção de TNF-α por queratinócitos
humanos via inibição do fator de transcrição nuclear kappa B (NF-κB).
Apesar do tacrolimus apresentar potencial atividade antiinflamatória em
modelos animais, o mecanismo pelo qual este fármaco exerce o efeito
antiinflamatório ainda permanece pouco esclarecido.
INTRODUÇÃO
13
Uma vez que estamos estudando o efeito antiinflamatório do tacrolimus, é
pertinente comentar alguns aspectos importantes da resposta inflamatória.
1.2 O PROCESSO INFLAMATÓRIO
A inflamação é um processo biológico intensamente estudado desde o início
do século XIX. A inflamação é uma resposta fisiológica desencadeada por lesão
tecidual ou estímulos antigênicos e que muitas vezes pode ser prejudicial ao
organismo (SCHMID-SCHÖNBEIN, 2006; RAO et al., 2007).
Clinicamente, a inflamação é caracterizada por apresentar cinco sinais
cardinais: eritema, edema, calor, dor e perda da função (HEIDLAND et al., 2006).
Porém, esse processo pode ser definido como uma cascata inflamatória, pelo qual
ocorre a ativação de mediadores e células que tem como objetivo o reparo do tecido
lesado (SUZUKI et al., 2003; SCHMID-SCHÖNBEIN, 2006).
De uma forma didática, o processo inflamatório pode ser dividido em três
diferentes fases. Inicialmente, ocorre uma fase aguda, de duração variável e que é
caracterizada pela vasodilatação local e aumento da permeabilidade vascular. Esta
etapa do processo inflamatório é seguida de uma fase subaguda caracterizada por
infiltração de leucócitos e de células fagocíticas. Por fim, ocorre a fase de resolução
da inflamação, quando acontece a regeneração tecidual e fibrose (SUZUKI et al.,
2003; SCHMID-SCHÖNBEIN, 2006).
A vasodilatação, característica da fase aguda, ocorre devido à liberação
local de diferentes mediadores químicos, tais como óxido nítrico (NO
x
), cininas,
histamina, serotonina, leucotrienos, fração C5a do sistema complemento,
prostaglandinas (PGD
2
, PGE
2
, PGI
2
, PGF
2α
) e substâncias liberadas das
terminações nervosas, como as taquicininas e o peptídeo relacionado ao gene da
calcitonina (CGRP), entre muitos outros (SCHMID-SCHÖNBEIN, 2006).
A fase subaguda é acompanhada pela migração de leucócitos e de outras
células fagocitárias para o sítio de inflamação, mediada por um processo
denominado de quimiotaxia. A quimiotaxia de leucócitos é o processo no qual há
liberação de moléculas solúveis que atraem essas células, os chamados fatores
quimiotáticos, entre os quais a IL-2, IL-5, IL-8 e RANTES (SEELY; PASCUAL;
CHRISTOU, 2003; KELLY; HWANG; KUBES, 2007; SEGERER; SCHLÖNDORFF,
INTRODUÇÃO
14
2007). Essas moléculas não servem apenas para direcionar o fluxo de células,
como também recrutam os leucócitos específicos para o tecido inflamado, como
os neutrófilos em resposta a uma inflamação bacteriana aguda e os eosinófilos
em caso de alergia (SEELY; PASCUAL; CHRISTOU, 2003; KELLY; HWANG;
KUBES, 2007).
A etapa seguinte de rolamento, adesão e transmigração dos leucócitos
para o sítio de inflamação é um processo mediado por diferentes famílias de
moléculas de adesão, tais como: 1) Selectinas (P-selectina, expressa em
plaquetas, L-selectina, expressa em leucócitos e E-selectina, expressa nas células
endoteliais); 2) Integrinas, expressas em linfócitos (LFA-1 – leukocyte function
associated antigen) e em macrofagos (Mac-1 – macrophage-1 antigen); 3)
Superfamília das imunoglobulinas: molécula de adesão intercelular (ICAM-1) e
molécula de adesão vascular (VCAM-1) (SEELY; PASCUAL; CHRISTOU, 2003;
KELLY; HWANG; KUBES, 2007). Ao chegar ao local da inflamação, os leucócitos
ativados liberam oxidantes, proteases e citocinas promovendo a fagocitose e a
destruição do agente lesivo.
Os leucócitos são células essenciais para o sistema de defesa e estão
divididos em diferentes subtipos celulares: mononucleares (linfócitos, monócitos e
macrófagos) e polimorfonucleares. Estas células são responsáveis pela defesa do
organismo contra microrganismos, fagocitando-os e destruindo-os de forma
inespecífica, enquanto que os mononucleares do tipo linfócitos são os responsáveis
pela resposta imune adaptativa.
Os monócitos circulantes representam cerca de 5 a 10% dos leucócitos
totais, em humanos. A população de monócitos é altamente heterogênea, pois este
tipo celular apresenta grande variação de marcadores de superfície, capacidade de
fagocitose e potencial de diferenciação. Os monócitos são capazes de se diferenciar
em uma variedade de fagócitos, incluindo macrófagos, células dendríticas,
osteoclastos, microglia, no sistema nervoso central, e células de Kupffer, no fígado
(SETA; KUWANA, 2007).
Quando necessário, os monócitos circulantes no sangue migram para o
tecido em resposta a um estímulo lesivo ou fatores quimiotáticos, onde então se
transformam em macrófagos que fagocitam ativamente microrganismos, bem como
células tumorais.
INTRODUÇÃO
15
Os polimorfonucleares, também chamados de neutrófilos, são as primeiras
e as mais abundantes células a chegar ao local da inflamação. Por isso, são
reconhecidos como a primeira linha de defesa do organismo.
Os neutrófilos possuem o citoplasma repleto de grânulos, cujo conteúdo
é constituído principalmente por peptídeos antimicrobianos e enzimas
proteolíticas utilizadas para destruir e degradar os agentes estranhos.
Tradicionalmente, os grânulos dos neutrófilos são classificados como
peroxidase-positivos ou peroxidase-negativos de acordo com a presença ou não
de mieloperoxidase. Os grânulos peroxidase-positivos são também chamados
de grânulos primários ou azurófilos, já os peroxidase-negativos são também
denominados de grânulos secundários ou específicos. Um terceiro tipo de
grânulo dos neutrófilos é denominado grânulos terciários. Os grânulos azurófilos
contêm proteases, enzimas hidrolíticas defensivas, peptídeos microbicidas e a
mieloperoxidase (SEELY; PASCUAL; CHRISTOU, 2003;
BORREGAARD;
SØRENSEN; THEILGAARD-MÖNCH
, 2007
). Os grânulos específicos contêm,
entre outros elementos, proteínas bactericidas como a lactoferrina e a lisozima,
proteases como a colagenase e a gelatinase, além de suas membranas
apresentarem receptores para sustâncias quimiotáticas, como o TNF-α, e as
moléculas de adesão do tipo CD11b/CD18, CD66 e CD67. Por outro lado, os
grânulos terciários contêm as proteases do tipo gelatinase, arginases e
metaloproteinases (MMP25), e as membranas apresentam o receptor
CD11b/CD18 e CD67, essencial para a adesividade da célula no endotélio
(SEELY; PASCUAL; CHRISTOU, 2003;
BORREGAARD;
SØRENSEN;
THEILGAARD-MÖNCH
, 2007
). Os grânulos específicos sofrem degranulação
tanto nas vesículas fagocíticas quanto no ambiente externo, destruindo os
microrganismos ingeridos (SEELY; PASCUAL; CHRISTOU, 2003;
BORREGAARD;
SØRENSEN; THEILGAARD-MÖNCH
, 2007
).
A mieloperoxidase (MPO) é uma peroxidase abundante nos grânulos
azurófilos dos neutrófilos, mas que também está presente nos monócitos, porém em
menor quantidade (ARNHOLD, 2004). A MPO promove a liberação de espécies
reativas de oxigênio a partir da conversão do oxigênio molecular em ânion
superóxido, promovido pela enzima nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
(NADPH) oxidase. A enzima superóxido dismutase converte o ânion superóxido em
INTRODUÇÃO
16
peróxido de hidrogênio, o qual possui ação microbicida. A reação subseqüente é a
reação entre o peróxido de hidrogênio e o ânion cloreto, para posterior formação de
ácido hipocloroso, o qual também possui intensa atividade microbicida (ARATANI et
al., 2004; ARNHOLD, 2004).
Em algumas situações, a MPO e o peróxido de hidrogênio podem ser
liberados para fora da célula. Isso aumenta o potencial de destruição do alvo
extracelular, mas também pode promover destruição tecidual no sítio inflamatório.
Além disso, a liberação do ácido hipocloroso leva à formação de espécies reativas
de oxigênio que também lesam o tecido. Níveis elevados de MPO são encontrados
em pacientes com asma brônquica (EKMEKCI et al., 2004), no infarto do miocárdio e
na aterosclerose (TSIMIKAS, 2006).
Outra enzima importante no processo inflamatório é a adenosina-deaminase
(ADA). Esta é uma enzima envolvida no metabolismo das purinas, catalizando a
deaminação hidrolítica da adenosina ou 2-deoxiadenosina em inosina ou 2-
deoxinosina e amônia. Trata-se de uma enzima liberada principalmente por
linfócitos, monócitos e macrófagos durante o processo inflamatório, que regula os
níveis plasmáticos de adenosina, a qual está associada diretamente com a resposta
inflamatória e a liberação de citocinas (PACHECO et al., 2005). A atividade da ADA
é o resultado da ação de suas duas isoformas: ADA1 e ADA2. ADA1 é uma enzima
muito estudada e está relacionada com a proliferação e o crescimento de linfócitos,
sendo que sua deficiência congênita resulta em uma severa síndrome de
imunodeficiência, caracterizada pela ausência de linfócitos T e B funcionais
(CONLON; LAW, 2004). Por outro lado, pouco se sabe sobre a estrutura e a
regulação da isoforma ADA2, cujo papel fisiológico e patológico permanece pouco
elucidado. Entretanto, níveis elevados de ADA2 são observados em diversas
doenças, como meningite tuberculosa, em paciente HIV positivo, e tuberculose
(CORRAL et al., 2004; LAMSAL et al., 2007). A adenosina é um mediador que pode
apresentar atividade pró- ou antiinflamatória dependendo do tipo de receptor de
adenosina ativado. Os receptores de adenosina pertencem à família de receptores
acoplados a proteína G e são classificados em quatro diferentes subtipos: A
1
, A
2A
,
A
2B
e A
3
, sendo a atividade antiinflamatória da adenosina mediada principalmente
pela ativação do receptore A
2A
(CARUSO; HOLGATE; POLOSA, 2006; SPICUZZA;
DI MARIA; POLOSA, 2006).
INTRODUÇÃO
17
O processo inflamatório também envolve uma série de mediadores, além de
células e enzimas, responsáveis pelo desenvolvimento da resposta inflamatória.
Dentre eles pode-se destacar o óxido nítrico. O óxido nítrico (NO) é um radical livre
gasoso que regula funções celulares em condições fisiológicas e patológicas,
incluindo o relaxamento vascular, a inibição da agregação plaquetária, a
neurotransmissão, as atividades antimicrobiana e anti-tumoral dos macrófagos, entre
outras (DUSSE; VIEIRA; CARVALHO, 2003; KOLIOS; VALATAS; WARD, 2004).
O NO é sintetizado a partir do metabolismo do aminoácido L-arginina
mediado pela enzima oxido nítrico sintase (NOS). A oxidação da porção N-terminal
do aminoácido libera NO e L-citrulina. Três isoformas de NOS já foram identificadas:
duas delas são constitutivas e estão presentes nos tecidos neuronal (NOSn) e
endotelial (NOSe) e são chamadas de NOS constitutivas (NOSc), enquanto a
terceira isoforma é expressa após indução por mediadores pró-inflamatórios,
endotoxinas bacterianas entre outros, e é chamada de óxido nítrico sintase induzida
(NOSi) (DUSSE; VIEIRA; CARVALHO, 2003).
O processo de liberação do NO é o resultado de uma série de eventos
oxidativos e redutores, envolvendo um grande número de cofatores. O NO gerado
difunde-se pelas células e ativa a guanilato ciclase solúvel que, por sua vez,
promove a formação da guanosina monofosfato cíclica (GMPc). O aumento da
concentração de GMPc resulta no relaxamento das células musculares e na inibição
da agregação plaquetária e na adesão dos leucócitos (DUSSE; VIEIRA;
CARVALHO, 2003; KOLIOS; VALATAS; WARD, 2004). Em processos infecciosos, a
ação citotóxica do NO consiste principalmente na liberação de espécies reativas de
oxigênio, como o ânion superóxido, formando o peroxinitrito (DUSSE; VIEIRA;
CARVALHO, 2003).
Em estados fisiológicos, o NO atua como agente protetor, mas quando é
liberado em quantidades excessivas, pode contribuir para lesão tecidual. O NO está
relacionado a diversas doenças, como artrite reumatóide, esclerose múltipla e sepse,
condições nas quais o aumento na produção de NO promove lesão tecidual e
contribui para a progressão da doença (JEAN-BAPTISTE, 2007; MOK et al., 2007;
VUOLTEENAHO et al., 2007).
Além do óxido nítrico, outros mediadores são liberados durante o processo
inflamatório, entre eles as citocinas e as quimiocinas. As citocinas são pequenas
INTRODUÇÃO
18
proteínas de baixo peso molecular (8 a 40.000 daltons), produzidas e liberadas por
diferentes células, tais como mastócitos, macrófagos, monócitos e linfócitos, e estão
envolvidas na quimiotaxia celular, na inflamação, no crescimento e na diferenciação
celular, além do reparo e remodelamento tecidual, e na regulação da resposta
imunológica (WONG; FISH, 2003; SCHMID-SCHÖNBEIN, 2006).
Em geral, as citocinas possuem função antogônica e/ou pleiotrópica, ou
seja, a mesma citocina pode ter efeitos opostos quando liberada por diferentes
tipos de células ou quando agem em diferentes tipos de receptores celulares.
Além disso, a síntese de citocinas pode ser influenciada por outras citocinas
liberadas simultaneamente da mesma célula (efeito autócrino) ou de outras
células alvo (efeito parácrino) (SCHMID-SCHÖNBEIN, 2006).
As citocinas se ligam a receptores específicos na célula alvo para
promoverem o efeito biológico. Estes receptores estão localizados na membrana
celular ou no citoplasma, e normalmente estão presentes em pequeno número
(WONG; FISH, 2003).
Dentre as principais citocinas que participam ativamente do processo
inflamatório destacam-se o TNF-α e a IL-1β.
O TNF-α é uma citocina produzida e liberada principalmente por macrófagos
e é considerada um dos principais mediadores da inflamação (BLOEMEN et al.,
2007; TILG; MOSCHEN; KASER, 2007). Trata-se de uma das principais citocinas
associadas a doenças inflamatórias, dentre elas a artrite reumatóide, a asma
brônquica e a colite ulcerativa (WILLIAMS, 2006; BLOEMEN et al., 2007; OLSEN et
al., 2007). Mesmo em baixas concentrações, o TNF-α induz a expressão de
moléculas de adesão em células endoteliais e estimula macrófagos e outras células
a secretarem quimiocinas (BLOEMEN et al., 2007). Além disso, o TNF-α é um dos
principais reguladores da produção e liberação de IL-1β, outra importante citocina
pró-inflamatória (SASAKAWA et al., 2005).
A família da Interleucina-1 (IL-1α, IL-1β e IL-1Ra) desempenha um
importante papel no desenvolvimento da resposta imune e do processo inflamatório
através da indução da expressão de outras citocinas e quimiocinas, além de
aumentar a formação de eicosanóides como a prostaglandina E2, a expressão de
NOSi e de metaloproteinases (BARKSBY et al., 2007; JACQUES et al., 2006).
INTRODUÇÃO
19
A IL-1β é a principal citocina envolvida na inflamação. Este mediador é
sintetizado principalmente por monócitos e macrófagos (BARKSBY et al., 2007). A
IL-1β age sinergicamente com TNF-α ativando a resposta inflamatória, aumentando
a expressão de moléculas de adesão nas células endoteliais e nos leucócitos e
promovendo a diapedese leucocitária na resposta inflamatória aguda (BARKSBY et
al., 2007). Além disso, a IL-1β está associada a doenças de caráter inflamatório,
como a artrite reumatóide (JACQUES et al., 2006), a doença pulmonar obstrutiva
crônica (CHUNG, 2005;), a sepse (BOZZA et al., 2007) e a pielonefrite (SHEU et al.,
2007).
A família das quimiocinas é composta por citocinas quimiotáticas que
regulam a migração de leucócitos através da interação com receptores que estão
acoplados a proteína G (ROSTÈNE; KITABGI, 2007). As quemocinas são
classificadas em quatro diferentes subfamílias: CXC, CC, C, CX
3
C, sendo as
subfamílias CXC e CC as principais envolvidas no processo inflamatório. As
quemocinas CXC estão diretamente envolvidas na quimiotaxia de neutrófilos,
linfócitos T e B e células Natural Killer, enquanto as quemocinas CC regulam a
migração de monócitos, macrófagos, basófilos, linfócitos T e eosinófilos (ROSTÈNE;
KITABGI, 2007; ZEREMSKI; PETROVIC; TALAL, 2007). Estudos experimentais têm
demonstrado a participação das quemocinas no desenvolvimento da resposta
inflamatória, como na fibrose pulmonar (KAI et al., 2007), aterosclerose (LIN et al.,
2007), artrite (FERRANDI et al., 2007) e sepse (GUO et al., 2006). Por outro lado,
outros estudos têm evidenciado o envolvimento dessas quemocinas com diferentes
doenças, como asma (WARK et al., 2007), câncer colorretal (RUBIE et al., 2007) e
artrite reumatóide (DESMETZ et al., 2007).
Os principais agentes antiinflamatórios são representados pelos
glicocorticóides e pelos antiinflamatórios não-estereóides (AINEs).
Os glicocorticóides, como a dexametasona, são fármacos que possuem
efeitos antiinflamatórios e imunossupressores. O mecanismo de ação destes
fármacos depende da interação com receptores intracelulares (complexos
esteróides) que resulta na indução da síntese de proteínas, como a lipocortina-1. Os
glicocorticóides também promovem a inibição da ação de fatores de transcrição
INTRODUÇÃO
20
como AP-1 e NF-κB, resultando na supressão da transcrição de genes da COX-2 e
de interleucinas (IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, TNF-α) (TAMAOKI et al., 2008).
Os antiinflamatórios não-esteróides (AINEs), como a indometacina, são
fármacos que possuem efeito antiinflamatório, analgésico e antipirético. O
mecanismo de ação destes fármacos consiste na inibição da ciclooxigenase (COX),
e, portanto, inibição da produção de prostaglandinas (PGE
2
, PGI
2
) e tromboxanos
(KAPUR; CHANG, 2007).
1.3 MODELO DE INFLAMAÇÃO
Diversos modelos animais de inflamação são utilizados para avaliar a
eficácia de novos fármacos para o tratamento de doenças inflamatórias ou mesmo
estudar o mecanismo de ação de medicamentos já utilizados na clínica, mas que
não tem o mecanismo de ação farmacológica ainda totalmente esclarecido. Isto se
deve ao fato que, apesar da maioria das reações inflamatórias apresentarem
características comuns, a etiologia e as manifestações clínicas diferem
significativamente, necessitando, portanto, de modelos específicos que reproduzam
as características básicas. Desta forma é fácil compreender também porque o
tratamento de doenças inflamatórias é bastante diversificado.
Esforços são realizados no sentido de se identificar modelos experimentais
apropriados para cada tipo de reação inflamatória, como asma brônquica, artrite
reumatóide e colite ulcerativa, entre muitos outros. Protocolos experimentais onde o
processo inflamatório é induzido agudamente são utilizados para estudos desta
reação abordando, entre outros, a participação de mediadores químicos, diferentes
tipos celulares, além de possibilitar a triagem de fármacos com potencial ação
antiinflamatória.
A bolsa de ar no dorso, também conhecida como air pouch, é um modelo de
inflamação muito utilizado para a triagem de fármacos com potencial ação
antiinflamatório. Esta técnica é de fácil execução e permite a avaliação de diversos
parâmetros inflamatórios como, por exemplo, estudo da celularidade, exsudação,
além de mediadores inflamatórios (citocinas, óxido nítrico (NO), mieloperoxidase
(MPO) e adenosina-deaminase (ADA)). O modelo da bolsa de ar é o modelo animal
que mimetiza a artrite reumatóide. Neste modelo, a indução da inflamação pela
INTRODUÇÃO
21
carragenina na bolsa de ar subcutânea forma uma membrana com características
semelhantes à membrana sinovial inflamada de pacientes com artrite reumatóide. A
introdução da carragenina induz um processo inflamatório com as mesmas
características e curso da inflamação observada na artrite reumatóide, com
infiltração de polimorfonucleares e liberação de mediadores pró-inflamatórios
(SEDGWICK; LEES, 1986).
OBJETIVOS
22
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a atividade antiinflamatória do tacrolimus no modelo da bolsa de ar
induzido pela carragenina, em camundongos.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
I. Avaliar o efeito antiinflamatório do tacrolimus sobre a migração dos leucócitos
(polimorfonucleares e mononucleares) e a exsudação no lavado da bolsa de ar
de animais tratados com carragenina.
II. Investigar o efeito do tacrolimus sobre a atividade da mieloperoxidase (MPO) e
da adenosina-deaminase (ADA), bem como a concentração de nitrito/nitrato
(NO
x
) e níveis de fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), de interleucina-1 beta
(IL-1β) e da quemocina para neutrófilos (KC).
ARTIGO PUBLICADO
23
3 ARTIGO PUBLICADO
Efficacy of tacrolimus in inhibiting inflammation
caused by carrageenan in a murine model of air
pouch
Silvana Virginia Gagliotti Vigil
1
, Rafael de Liz
1
Yara Santos Medeiros
2
and Tânia
Silvia Fröde
1
*
1
Department of Clinical Analysis, Center of Health Sciences, Federal University of
Santa Catarina, Campus Universitário - Trindade, 88040-970, Florianópolis, SC,
Brazil.
2
Department of Pharmacology, Center of Biological Science, Federal University of
Santa Catarina, Campus Universitário - Trindade, 88049-900, Florianópolis, SC,
Brazil.
* Corresponding author: Tel.: +55 48 99614846, Fax: +55 48 32440936.
E-mail address: [email protected]sc.br or [email protected] (T. S. Fröde).
ARTIGO PUBLICADO
24
Abstract
Background: Tacrolimus (Tac) is a macrolide immunosuppressant drug isolated
from Streptomyces tsukubaensis, widely used in organ transplantation.
Objective: This study examined the effect of tacrolimus administered by oral route
(p.o.) on inflammation in mouse subcutaneous air pouch triggered by carrageenan
(Cg 1%).
Methods: The air pouch was induced as described by Benincá et al., 2007. The
inflammatory parameters (leukocytes, exudation, myeloperoxidase (MPO) and
adenosine-deaminase (ADA) activities, as well as nitrate/nitrate concentrations
(NO
x
), interleukin-1 beta (IL-1β), chemokine to neutrophil (KC) and tumor necrosis
factor-alpha (TNF-α) levels were analysed 24 h after injection of carrageenan.
Results: Tacrolimus, indomethacin and dexamethasone significantly inhibited
leukocytes, neutrophils and exudation (P < 0.05) when they were administered 0.5 h
before inflammation. These drugs, under the same conditions, decreased MPO and
ADA activities (P < 0.05), NO
x
and IL-1β levels (P < 0.01). Tacrolimus and
indomethacin, but not dexamethasone, inhibited KC levels (P < 0.01). On the other
hand, tacrolimus and dexamethasone, but not indomethacin, decreased TNF-α levels
(P < 0.01).
Conclusions: Results of this study indicate that tacrolimus has an important anti-
inflammatory property, showing not only inhibition of proinflammatory mediators
release, but also inhibition of activated leukocyte infiltration into the site of
inflammation. Furthermore, these results showed that most of the anti-inflammatory
actions of tacrolimus were similar to those observed in animals treated with either
indomethacin or dexamethasone.
Keywords: Tacrolimus; Anti-inflammatory activity; Cytokines; Enzymes; Leukocytes;
Exudation.
ARTIGO PUBLICADO
25
1. Introduction
Tacrolimus formerly FK506 is a natural antifungal macrolide
immunosuppressant drug isolated from Streptomyces tsukubaensis [1], which is
widely used in organ transplantation [2, 3, 4], and to treat atopic dermatitis [5],
psoriasis [6] and bowel disease [7]. Clinical studies have also demonstrated the
efficacy of tacrolimus in the treatment of rheumatoid arthritis (RA) [8, 9].
Tacrolimus exerts its immunosuppressive effects primarily by interfering with
the activation of T cells [10, 11]. Its mechanism of action is linked to the binding of
intracellular proteins called immunophilins (FKBP-12) forming a tacrolimus-FKBP-12
complex. This complex promotes the inhibition of calcineurin phosphatase, an
enzyme involved in activation of the nuclear factor of activated T cells (NF-AT), a
transcription factor required for expression of cytokine genes in T cells. This results in
a complete blockage of the production of T cell-derived cytokines such as tumor
necrosis factor alpha (TNF-α), interleukin-2 (IL-2) and interferon-γ [10]. Another
calcineurin inhibitor, cyclosporine A (CsA), exerts similar inhibitory effects on
inflammatory cytokine, although the inhibitory effect of CsA is less potent than that of
tacrolimus [12]. Additionally, inflammatory cytokines such as tumor necrosis factor,
interleukin-1 beta (IL-1β), and interleukin-8 (IL-8), and other mediators such as nitric
oxide (NO), as well as pro-inflammatory enzymes such as myeloperoxidase (MPO)
and adenosine deaminase (ADA) are, in part, involved in the inflammatory response
and they are the target of studies on drugs that have anti-inflammatory properties,
such tacrolimus. Previous data obtained in our laboratory [13] revealed that
tacrolimus administered systemically exerted important anti-inflammatory effects by
inhibiting leukocytes and proinflammatory mediators in a murine model of pleurisy
induced by carrageenan.
2. Objectives
This study was designed to examine the effect of tacrolimus administered by
oral route (p.o) on acute inflammation in a murine model compared to those obtained
with classical non-steroidal and steroidal anti-inflammatory drugs (indomethacin and
ARTIGO PUBLICADO
26
dexamethasone). Specifically, we evaluated the effect of this drug on inflammation
induced by carrageenan, in the air pouch model.
3. Materials and methods
3.1. Animals
Swiss mice, weighing 18–22 g, were housed under standardized conditions
(room at constant temperature (22 ± 2°C) with alternating 12 h periods of light and
darkness and humidity (50-60%)) and fed a standard mouse diet with water ad
libitum before use. All experiments were in agreement with guidelines on ethical
standards of investigation of experimental procedures in animals [14]. This study was
approved by the Committee for Ethics in Animal Research (CEUA of our university,
protocol number 23080.007040/2006-39) and performed in accordance with norms of
the Brazilian College of Animal Experimentation (COBEA).
3.2. Experimental protocol
In this experimental protocol, different groups of animals received air
injection (1.5 ml) on three alternate days to induce the air pouch. On the sixth day
animals received carrageenan (Cg: 1%) administered by subcutaneous route (s.c.)
and 24 h later animals were killed by an overdose of ether [15]. Animals were fixed
on a surgical table and an incision in the dorsal skin was made perforating the air
pouch. The cavity was washed with 1.0 ml of sterile PBS (pH 7.6, composition mmoL:
NaCl 137, KCl 2.7 and phosphate buffer salts 10) containing heparin (20 IU/ml) [15].
Cell migration, exudation, MPO and ADA activities, as well as NO
x
, IL-1β, KC and
TNF-α levels were evaluated 24 h after phlogogen administration. Indomethacin (5.0
mg/kg) and dexamethasone (0.5 mg/kg) administered by intraperitoneal route (i.p.)
0.5 h before inflammation were used as reference drugs [13, 15].
Initially, to establish a standard for the tacrolimus, together with doses and
time periods to be used in the experiments, different groups of animals were treated
(0.5 h before Cg) with different doses of tacrolimus (1.0 to 10.0 mg/kg
) administered
0.5 h (p.o.) before Cg or treated with sterile saline (NaCl 0.9 %) administrated by
ARTIGO PUBLICADO
27
subcutaneous route (s.c.), and the inflammatory parameters (cell migration and
exudation) were analyzed 24 h after carrageenan injection. In another set of
experiments, animals were pretreated with tacrolimus (2.0 mg/kg, p.o.), at different
time points (0.5 - 4 h) and the same inflammatory parameters were evaluated 24 h
after carrageenan-induced inflammation. According to this protocol, 2.0 mg/kg of
tacrolimus was selected in the experiments to analyse its effects on MPO and ADA
activities, as well as on NO
x
, IL-1β, KC and TNF-α levels.
3.3. Quantification of cell migration and exudation
After killing animals with an overdose of ether, samples from the air pouch
exudate were collected for determinations of total and differential leukocytes. Total
leukocyte counts were performed in a Neubauer chamber diluting the exudate in Türk
solution (1:20), and cytospin preparations of exudate were stained with May–
Grünwald–Giemsa for the differential leukocyte counts, which were performed under
an oil immersion objective [15].
To evaluate the degree of exudation, animals were previously challenged
with a solution of Evans blue dye (25.0 mg/kg) administered by intravenous route
(i.v.), 5 min after treatment with carrageenan [15]. The amount of dye was estimated
by colourimetry using an Elisa plate reader (Organon Teknika, Roseland, NJ, USA) at
600 nm, by interpolation from a standard curve of Evans blue dye in the range of
0.01 to 50.0 µg/ml.
3.4. Quantification of nitrate/nitrite concentrations
Nitric oxide was measured as its breakdown product of nitrite (NO
2
-
) and
nitrate (NO
3
-
) using the Griess method [16]. Samples of the air pouch cavity lavage
obtained from control and treated animals that did not receive Evans blue dye
injection were separated and stocked at -70
0
C. On the day of the experiments, the
samples were thawed and deproteinized by the addition of 6 mM sodium hydroxide
and 0.6% of zinc sulfate. Afterwards, 250 µl of air pouch cavity lavage was diluted in
30 µl of ammonium format, 30 µl of hydrated disodium hydrogen phosphate-12 and 30
ARTIGO PUBLICADO
28
µl of Escherichia coli (EC ATCC 25922: diluted (1:10) in PBS), and then the mixture
was incubated for 2 h at 37
0
C. After centrifugation at 50 x g for 5 min, 250 µl of the
supernatant was transferred to cuvettes and the same volume of fresh Griess reagent
(5% (vol./vol.) of H
3
PO
4
, 1% of sulfanilic acid and 0.1% of N-(1-naphythyl)
ethylenediamine) was added and incubated for 10 min at room temperature. The
reaction of NO
2
-
with this reagent produces a pink color, which was quantified at 543 nm
against standards (0 - 150 µM) on a spectrophotometer Hitachi U2001, model 121-0031
(Tokyo, Japan) [17]. Results were expressed as µM.
3.5. Quantification of myeloperoxidase and adenosine-deaminase activities
In-house assays of both myeloperoxidase and adenosine-deaminase
activities were employed according to the methods described in the literature [18, 19].
Using conventional reagents, the concentration of each enzyme was estimated by
means of colourimetric measurements (absorbances of 450 and 620 nm,
respectively) with an ELISA plate reader (Organon Teknika, Roseland, NJ, USA).
Results were expressed as mU/ml (MPO) and U/l (ADA).
3.6. Quantification of IL-1β, TNF-
α
and KC levels
Samples of exudate were collected and immediately prepared for the
analysis of cytokine levels. In this protocol, commercially available kits were used
with specific antibodies for each cytokine. The cytokine levels were measured by
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) according to the manufacturer’s
instructions. When necessary the fluid exudate samples were diluted 1:3 or 1:10 with
specific diluents (buffered with 0.09% sodium azide for TNF-α or buffer diluent with
1% bovine serum albumin (BSA) plus 0.05% Tween 20 in PBS for KC) to determine
the TNF-α and KC levels, respectively. The range of values detected by these
assays was: IL-1β (100.0 - 6400.0 pg/ml), KC (23.4 - 1500.0 pg/ml) and TNF-α (5.0 -
2000.0 pg/ml). The intra- and inter-assay coefficients of variation (CV) for IL-1β, KC
and TNF-α were: intra CV: IL-1β: = 6.2 ± 0.4%, KC = 9.7 ± 0.9% and TNF-α = 7.8 ±
ARTIGO PUBLICADO
29
0.9%, inter CV: IL-1β = 5.1 ± 0.6%, KC = 4.1 ± 0.9% and TNF-α = 9.6 ± 2.2%, with
sensitivity values of IL-1β = 1.7 pg/ml, KC = 23.4 pg/ml and TNF-α = 5.0 pg/ml. All
cytokine levels were estimated by means of colourimetric measurement at 450 nm
with an ELISA plate reader (Organon Teknika, Roseland, NJ, USA) by interpolation
from a standard curve.
3.7. Drugs
The following drugs and reagents were used: tacrolimus (Prograf, Fujisawa
Ireland Ltd., Killorgin, Ireland), dexamethasone (Prodome Química e Farmacêutica
Ltda., Campinas, SP, Brazil), carrageenan (degree IV), human neutrophil
myeloperoxidase, indomethacin, (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA),
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for quantitative determination of rat IL-
1β, mouse KC (IBL - Immuno Biological Laboratories Co. Ltd., Fujioka, Gunma,
Japan) and mouse TNF-α (BD - Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, USA),
Evans Blue and May-Grunwald Giemsa dyes (Laborclin, São José dos Pinhais, PR,
Brazil). Others reagents used were of analytical grade and were obtained from
different commercial sources.
3.8. Statistical analysis
Data is reported as the mean ± SEM. Significant differences between groups
were determined by Student’s t test and analysis of variance (ANOVA)
complemented with Dunnett’s test when necessary. P < 0.05 was considered as
indicative of significance.
4. Results
4.1. Effects of tacrolimus, indomethacin and dexamethasone on cellular infiltration
and exudation
ARTIGO PUBLICADO
30
Analysis of the inhibitory profile with the studied doses of tacrolimus (2.0 to
10 mg/kg,) indicated that this effect was not dose-dependent since maximal effect
was obtained with the dose of 2.0 mg/kg (leukocyte migration (% of inhibition: 89.6 ±
1.1 %) (P < 0.01), neutrophils (% of inhibition: 93.0 ± 0.4 %) (P < 0.01) and exudation
(% of inhibition: 47.2 ± 1.9) (P < 0.01)) (Table 1). This drug did not modify the
mononuclear cells (P > 0.05) (Table 1).
In the time course profile study, results showed that tacrolimus (2.0 mg/kg,
p.o.), significantly decreased leukocytes, neutrophils and exudation when it was
administered only 0.5 h before carrageenan (P < 0.01) (results not shown).
As expected indomethacin and dexamethasone used as a reference drugs
at doses of 5.0 and 0.5 mg/kg, respectively administered by intraperitoneal route (i.p.)
0.5 h before Cg caused a significant inhibition of leukocytes, neutrophils and
exudation (P < 0.01) (Table 1).
4.2. Effects of tacrolimus, indomethacin and dexamethasone on myeloperoxidase,
adenosine-deaminase activities and nitrate/nitrite concentrations
Tacrolimus (2.0 mg/kg), indomethacin (5.0 mg/kg) and dexamethasone (0.5
mg/kg) caused a marked reduction in MPO and ADA activities and NO
x
(tacrolimus:
% of inhibition: MPO: 30.1 ± 5.2, ADA: 44.7 ± 4.7 and NO
x
: 53.6 ± 3.8) (P < 0.01),
(indomethacin: % of inhibition: MPO: 31.7 ± 1.2, ADA: 13.0 ± 6.5 and NO
x
: 34.9 ±
8.0) (P < 0.05) and (dexamethasone: % of inhibition: MPO: 69.5 ± 3.1, ADA: 70.7 ±
5.5 and NO
x
: 58.9 ± 2.9) (P < 0.01) (Table 2).
4.3. Effects of tacrolimus, indomethacin and dexamethasone on cytokine levels
In this protocol, tacrolimus (2.0 mg/kg), indomethacin (5.0 mg/kg) and
dexamethasone (0.5 mg/kg), significantly decreased IL-1β levels (% of inhibition:
tacrolimus: 54.3 ± 10.8, indomethacin: 68.7 ± 14.4 and dexamethasone: 98.8 ± 0.25)
(P < 0.01) (Table 2). Furthermore, tacrolimus and indomethacin, but not
dexamethasone, inhibited KC levels (% of inhibition: tacrolimus: 71.3 ± 2.5 and
indomethacin: 69.3 ± 4.1) (P < 0.01) (Table 2). On the other hand, tacrolimus and
ARTIGO PUBLICADO
31
dexamethasone, but not indomethacin, inhibited TNF-α level (% of inhibition:
tacrolimus: 60.8 ± 5.9 and dexamethasone: 47.0 ± 3.4) (P < 0.01) (Table 2).
5. Discussion
Our study in the mouse air pouch induced by carrageenan demonstrated
that tacrolimus presented important anti-inflammatory activities which were more
pronounced at the level of cell migration, as well as in the content of proinflammatory
mediators, such as NO
x
, TNF-α, IL-1β and KC levels, and MPO and ADA activities.
Results of the study here reported are in agreement with those of others studies [11]
including prior report from our laboratory [13] and extends the evidence that this drug
may exert anti-rheumatic effects due to its potential to down regulate proinflammatory
cytokines.
Tacrolimus, cyclosporine and sirolimus belong to the class of
immunosupressant agents that have been used widely in organ transplantation and
more recently in autoimmune diseases [8, 9, 20]. Furthermore, experimental studies
suggest that this drug is also effective in inhibiting inflammation in several
experimental models not directly related to autoimmune basis. However, whereas
some studies presented only results regarding inhibition of cell migration (chronic
colitis, leukocyte infiltration into the airways of ovalbumin-challenged guinea-pigs [21,
22, 23] by either evaluating cell migration content [22, 23] or measuring enzyme
activities (MPO) [21] released by activated leucocytes in the site of inflammation, the
present work (mouse air pouch model) and prior study (mouse pleurisy) from our
laboratory [13] provide unique opportunities to evaluate both cell migration and
exudation following acute administration of tacrolimus either by systemic or oral
routes. Although the profile of each animal model and experimental designs were
quite different, both parameters were significantly inhibited and are in agreement with
those reported by Whooley et al (2004) that have also demonstrated that tacrolimus
inhibited both cell migration and fluid leakage in an experimental model of lung
ischemia-reperfusion [24]. Another point to consider is that the air pouch model has
been reported to have histological similarity to synovial membranes and when
challenged via an injection of carrageenan the inflammatory reaction is histologically
similar to that observed in the chronic synovial inflammation [25]. Thus, in the present
ARTIGO PUBLICADO
32
study the reduction in exudation induced by tacrolimus is, in part, in agreement with
the studies of Magari et al (2003) in an animal model of rheumatoid arthritis induced
by adjuvant and supports its role as an analgesic agent [26].
This study also confirms that the pre-treatment of the animals with tacrolimus
inhibits the production of pro-inflammatory cytokines like TNF-α and IL-1β that play
joint injury by inducing activation and recruitment of leukocytes and exudation at the
site of inflammation in experimental model of arthritis [27]. The same inhibitory effect
was observed in the model of arthritis induced by collagen or adjuvant in rats, where
TNF-α and IL-1β levels were inhibited [26, 28], including also the decrease of
nuclear-factor kappa beta activation [23]. On the other hand, chemokines such as KC
which are responsible for the chemotaxis of leukocytes from blood to inflamed tissues
[29] were also inhibited. Altogether, the findings that tacrolimus significant inhibited
TNF-α, IL-1β and KC levels at the site of inflammation suggests that it is occurring a
down regulation of cellular adhesion molecules expression that is a key factor to
recruit further leukocytes.
In line with the comments above, it has also been demonstrated that
tacrolimus also inhibited the expression of inducible NO-synthase [30], which
explains the significant reduction of NO
x
at the site of inflammation. Other studies
have led to similar results, such as that observed by us in a murine model of pleurisy
[13] and by Strestikova et al. (2001) who demonstrated that tacrolimus reduced the
LPS-induced NO
x
production in a dependent manner in macrophage cells in rats [30].
It is interesting to comment that the inhibitory properties presented by the
studied calcineurin inhibitor in this work presented similarities with the anti-
inflammatory effects produced by indomethacin and dexamethasone. These drugs
were effective in inhibiting cell migration, NO
x
, MPO and ADA activities and IL-1β
levels. Fluid leakage was inhibited by tacrolimus, dexamethasone and indomethacin.
Although all drugs inhibited IL-1β, dexamethasone and indomethacin inhibited TNF-α
and KC, respectively. However, limitations in the experimental design including
pharmacokinetics, peak of action and mechanism of action, among others restrict
adequate comparisons of these findings.
Another important fact to comment is that tacrolimus in the air pouch model
at dose of 1.0 mg/kg had no effect and increasing dosages have declining, but
significant effects upon leukocyte migration, neutrophils and exudation. According to
ARTIGO PUBLICADO
33
these data, it is possible to speculate that tacrolimus has a “narrow inhibitory window”
since the dose of 2.0 mg/kg caused 89.6±1.1% and 47.2±1.9% inhibitory effects upon
either cell migration and exudation, respectively, whereas higher doses did not
present the same efficacy. This property is common to immunosuppressive drugs, a
characteristic that limits both their use and duration of therapy in humans [8].
To conclude, it is suggested that the efficacy of tacrolimus as an anti-
inflammatory drug promoting inhibition of cell influx and exudation to the site of the
inflammatory response caused by carrageenan is certainly related to the inhibition of
TNF-α, IL-1β, KC levels and NO
x
. Furthermore, these results showed that most of the
anti-inflammatory actions of tacrolimus present some similarities to those observed in
animals treated with indomethacin or dexamethasone, suggesting that these drugs
may have a common via of anti-inflammatory action. These results also indicate that
other studies must be done to clarify the mechanisms of action of tacrolimus prior the
analysis of the effect of this drug upon mRNA for pro-inflammatory cytokines, as well
as inhibition of nuclear factors transcription such as NF-kappa B and AP-1. Further,
other studies should be done to explore its possible effects upon apoptosis
pathways.
ARTIGO PUBLICADO
34
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ARTIGO PUBLICADO
37
Table 1 – Effects of tacrolimus, indomethacin and dexamethasone on cell migration and
exudation on inflammation induced by carrageenan in the murine air pouch model.
Groups/doses Leukocytes
(x10
6
)
Neutrophils
(x10
6
)
Mononuclear cells
(x10
6
)
Exudate
(µ
µµ
µg/ml)
C
a
7.9 ± 0.2
7.4 ± 0.1 0.5 ± 0.1 12.9 ± 1.0
Tac (1.0 mg/kg)
b
7.2 ± 0.4 6.4 ± 0.3* 0.8 ± 0.3 12.9 ± 0.6
Tac (2.0 mg/kg)
b
0.8 ± 0.1** 0.4 ± 0.2** 0.4 ± 0.1 6.8 ± 0.2**
Tac (5.0 mg/kg)
b
2.3 ± 0.2** 1.5 ± 0.3** 0.8 ± 0.1 9.7 ± 0.5**
Tac (10.0 mg/kg)
b
5.2 ± 0.5** 4.5 ± 0.4** 0.7 ± 0.1 12.3 ± 0.8
Indo (5.0 mg/kg)
c
2.7 ± 0.3** 2.0 ± 0.4** 0.7 ± 0.2 7.9 ± 0.8**
Dexa (0.5 mg/kg)
c
3.8 ± 0.2** 2.9 ± 0.2** 0.9 ± 0.1 9.3 ± 1.1**
Tac = tacrolimus (1.0-10.0 mg/kg) administered in different groups of animals 0.5 h before
inflammation induced by carrageenan. C = control = responses in animals treated only with
carrageenan (1%). Indo = responses in animals pretreated with indomethacin (5.0 mg/kg,
i.p.). Dexa = responses in animals pretreated with dexamethasone (0.5 mg/kg, i.p.).
* P < 0.05 and ** P < 0.01. a = administered by subcutaneous route; b = administered by
oral route and c = administered by intraperitoneal route. N = 5 animals.
ARTIGO PUBLICADO
38
DISCUSSÃO
39
4 DISCUSSÃO
Neste estudo, avaliamos o efeito do tacrolimus administrado por via oral
sobre a quimiotaxia de leucócitos, formação de exsudato e produção e/ou liberação
de mediadores pró-inflamatórios solúveis, tais como TNF-α, IL-1β, KC e NO. Neste
mesmo estudo ainda avaliamos o efeito do tacrolimus sobre a liberação de enzimas
pró-inflamatórias como a MPO e a ADA.
Estes resultados demonstraram que o tacrolimus apresentou importante
atividade antiinflamatória, caracterizada pela diminuição de: exsudato, número de
células infiltradas, especialmente de neutrófilos, e a redução da produção e/ou
liberação de diversos mediadores pró-inflamatórios, incluindo TNF-α, IL-1β, KC e
NO. Resultados semelhantes foram observados com o tratamento dos animais com
indometacina ou dexametasona.
As citocinas pró-inflamatórias como o TNF-α e a IL-1β estão envolvidos na
lesão tecidual, uma vez que promovem a ativação e o recrutamento de leucócitos,
além da formação de exsudato no sítio da inflamação. Exemplo deste fato são
aqueles descritos por Bressan et al., (2006) pelo qual demonstraram que a injeção
intra-articular de anticorpo anti-TNF-α ou anti-IL-1β reduziu a formação de edema e
a infiltração de células na articulação do joelho de ratos, no modelo experimental de
artrite induzida por carragenina e lipopolissacarídeo (LPS). Já, Nakae et al., (2007)
avaliaram a participação do TNF-α no desenvolvimento da resposta inflamatória nos
pulmões de camundongos sensibilizados com ovalbumina. Os resultados
demonstraram que animais deficientes de TNF-α apresentaram diminuição da
infiltração de neutrófilos nos pulmões, além de níveis reduzidos de mieloperoxidase
e de citocinas pró-inflamatórias do tipo IL-4, IL-5 e IL-17 no lavado broncoalveolar,
quando comparados com o grupo controle. Barsante et al., (2007) demonstraram
ainda que a administração oral de DF 2162, um inibidor de receptores para
quemocinas da família CXC (CXCR1/2), ou anticorpo anti-TNF-α, inibiu a infiltração
de neutrófilos na articulação tíbio-tarsal e o edema na pata, na artrite induzida por
injeção subcutânea de Mycobacterium butyricum, em ratos.
Outros estudos, utilizando diferentes modelos de inflamação, têm
demonstrado a participação do TNF-α na amplificação do processo inflamatório.
Kumar et al., (2007) observaram que, ao incubar TNF-α em uma cultura de
células endoteliais de cordão umbilical humano tratadas com piperina, um inibidor de
DISCUSSÃO
40
TNF-α, houve inibição da expressão de moléculas de adesão ICAM-1, VCAM-1 e E-
selectina.
Além de indução da quimiotaxia de neutrófilos e formação de edema, o
TNF-α ainda induz a produção e/ou liberação de IL-1β. Exemplo deste fato são
aqueles demonstrados pelo estudo desenvolvido por Cho et al., (2007) no qual foi
observado a inibição da liberação de IL-1β por células HaCAT induzidas com TNF-α
in vitro, quando as mesmas foram tratadas com curcumina, um inibidor de NF-κB.
A IL-1β é uma citocina pró-inflamatória secretada por diferentes células, tais
como monócitos, macrófagos, células dendríticas, queratinócitos e fibroblastos, e
desempenha um importante papel no desenvolvimento do processo inflamatório e na
defesa do hospedeiro (BARKSBY et al., 2007). A participação da IL-1β no processo
inflamatório é amplamente estudada. Yamamoto et al., (2007) demonstraram que a
administração endovenosa de lipopolissacarídeo (LPS) promoveu aumento dos
níveis de IL-1β no soro de camundongos. Frank et al., (2007) avaliaram o efeito da
administração endovenosa do antagonista natural do receptor de IL-1β (IL-1Ra)
sobre o desenvolvimento da inflamação pulmonar induzida por ventilação mecânica,
em camundongos. Os resultados demonstraram inibição da infiltração de neutrófilos
e da formação de edema nos pulmões de camundongos. Em outros estudos, McColl
et al., (2007) demonstraram que a administração intraperitoneal de IL-1β
potencializou a inflamação induzida por LPS, administrado por via intraperitoneal,
aumentando a formação de edema, a infiltração de neutrófilos e os níveis de KC e
proteína inflamatória de macrófago-2 (MIP-2) no cérebro de ratos, no modelo de
isquemia cerebral induzida por obstrução da artéria cerebral média.
Outros estudos, como o desenvolvido por Zwerina et al., (2007), observaram
que a da IL-1β está envolvida no processo de erosão óssea, inflamação da
cartilagem e formação de osteoclastos, no modelo de artrite induzida por TNF-α, em
camundongos.
A quimiotaxia leucocitária está intimamente relacionada à liberação de
citocinas específicas que promovem a migração de leucócitos. Dentre estas
podemos destacar as quemocinas para neutrófilos (KC). Estudos desenvolvidos por
Tateda et al., (2001) demonstraram que a inoculação intratraqueal de Legionella
pneumophila promoveu o aumento da infiltração de neutrófilos e da expressão do
RNAm para KC no pulmão de camundongos. No mesmo estudo, os pesquisadores
DISCUSSÃO
41
observaram a diminuição da migração de neutrófilos para os pulmões dos
camundongos sensibilizados com Legionella pneumophila quando administrado
anticorpo anti-KC, via intraperitoneal.
Johnston et al., (2005) demonstraram que camundongos BALB/cJ com
deficiência de receptor CXCR2 apresentavam diminuição da infiltração de neutrófilos
no lavado broncoalveolar, após inalação de ozônio (O
3
). Tanimoto et al., (2007)
observaram que a administração de anticorpo anti-KC, via intraperitoneal, diminuiu a
infiltração de neutrófilos na cavidade peritoneal de camundongos BALB/c
sensibilizados com células leucêmicas P388.
Em nossos experimentos, observamos que o tacrolimus inibiu de forma
significativa os níveis TNF-α, IL-1β e KC no exsudato de animais tratados com
carragenina. A redução dos níveis destas citocinas no local da inflamação foi
relacionada à inibição na infiltração de leucócitos na cavidade da bolsa de ar,
durante a resposta inflamatória. Nossos resultados estão de acordo com aqueles
relatados por Cetinkale et al., (1999), que observaram que o tacrolimus,
administrado por via intramuscular, inibiu a infiltração de neutrófilos no pulmão,
fígado e rins, no modelo experimental de lesão da pele induzida por queimadura, em
ratos. Além disso, Rau et al., (2006) observaram que o tacrolimus também inibiu a
infiltração de neutrófilos e reduziu a expressão do RNAm para TNF-α, IL-1β e IL-2,
no modelo experimental de pancreatite aguda induzida por taurocolato, em ratos.
Em nossos experimentos, observamos que o tacrolimus também reduziu os
níveis de NO
x
. Os efeitos do NO na resposta inflamatória são complexos e envolvem
a quimiotaxia de leucócitos e o aumento da permeabilidade vascular. Franco-
Penteado et al., (2001) demonstraram que a administração endovenosa de nitro-L-
arginina metil éster (L-NAME), um inibidor não seletivo da óxido nítrico sintase
(NOS), inibiu a formação de edema e a infiltração de neutrófilos, no modelo de
edema de pata induzido pela injeção subplantar de enterotoxina estafilocócica, em
ratos.
Além disso, Sakaguchi et al., (2006) demonstraram que a administração
intraperitoneal de L-NAME inibiu a formação de edema, no modelo experimental de
edema de pata induzido pela carragenina, em ratos. Em outros experimentos,
Sakaguchi et al., (2006) observaram que a administração intraperitoneal de L-NAME
reduziu a formação de exsudato e os níveis de albumina, na pleurisia induzida pela
carragenina, em ratos. Farsky et al., (2004) observaram que o tratamento via oral
DISCUSSÃO
42
com L-NAME inibiu o influxo de leucócitos na cavidade da bolsa de ar, em
camundongos inflamados com veneno de Bothrops jararaca.
Outros estudos obtiveram resultados semelhantes ao obtido em nossa
pesquisa, como o desenvolvido por Kato et al., (2007) que demonstraram que o
tacrolimus inibiu a expressão do RNAm para enzima óxido nítrico sintase induzida
(NOSi), no modelo experimental de úlcera induzida por indometacina, em ratos.
Além disso, estudos in vitro realizados por Tuñón et al., (2003) demonstraram que o
tacrolimus inibiu a expressão de RNAm para NOSi em hepatócitos de ratos,
incubados com lipopolissacarídeo (LPS). Em estudos anteriores desenvolvidos por
Pereira et al., (2006) também demonstraram que o tacrolimus, quando administrado
por via intraperitoneal, diminuiu de forma significativa os níveis de NO
x
na cavidade
pleural de camundongos tratados com carragenina.
A infiltração de leucócitos no tecido é regulada não só pela concentração de
mediadores pró-inflamatórios, mas também pela expressão coordenada de
moléculas de adesão. Este processo envolve a expressão de selectinas, integrinas e
superfamília de moléculas de adesão (RIDGER; HELLEWELL; NORMAN, 2005;
KINASHI, 2007). Uma vez ativado este sistema, ocorre o rolamento, a adesão e a
transmigração dos leucócitos do meio intravascular para o local da inflamação
(RIDGER; HELLEWELL; NORMAN, 2005; KINASHI, 2007).
Em nossos experimentos, o tacrolimus inibiu significativamente o influxo de
leucócitos às custas da inibição da migração de neutrófilos no local da inflamação.
Resultados semelhantes foram observados nos animais tratados com indometacina
ou dexametasona. Noto et al., (2007) demonstraram que a administração
endovenosa de tacrolimus em ratos inibiu a infiltração de granulócitos no cérebro e a
expressão de moléculas de adesão do tipo ICAM-1, P-selectina e E-selectina por
células endoteliais, no modelo experimental de isquemia cerebral induzida por
obstrução da artéria cerebral média.
Estudos in vitro desenvolvidos por Sasakawa et al., (2005) demonstraram
que o tacrolimus foi efetivo em inibir a expressão de moléculas de adesão do tipo E-
selctina, ICAM-1 e VCAM-1 em células endoteliais humanas. Neste contexto, a
hipótese de que o tacrolimus inibe a expressão de moléculas de adesão, no modelo
em estudo, não pode ser descartada.
Outro importante resultado obtido neste trabalho foi que o tacrolimus inibiu a
atividade da mieloperoxidase e da adenosine-deaminase, ambas enzimas
DISCUSSÃO
43
intimamente envolvidas na infiltração de leucócitos ativados no local da inflamação
(FRÖDE; MEDEIROS, 2001). Semelhantes resultados foram obtidos com os animais
tratados previamente com os fármacos de referência.
A mieloperoxidase (MPO) é uma enzima presente nos grânulos azurófilos
dos neutrófilos, cuja função é promover a formação de espécies reativas de oxigênio
auxiliando na destruição de agentes patogênicos. Por ser um produto dos grânulos
dos neutrófilo, a atividade de mieloperoxidase é considerada um marcador de
infiltração destas células no local da inflamação (ARNHOLD, 2004).
Vários trabalhos demonstraram a participação da MPO na resposta
inflamatória. Dentre eles cita-se o trabalho realizado por Ng et al., (2007) pelo qual
se observou aumento da atividade da mieloperoxidase no pulmão, fígado e rins de
camundongos, no modelo de sepse induzida por injeção intraperitoneal de LPS. Em
outros estudos, Hedge et al., (2007) observaram ainda aumento na atividade da
mieloperoxidase no pulmão de camundongos, no modelo de sepse induzida por
extravasamento fecal. Bezerra et al., (2007) demonstraram aumento da atividade da
mieloperoxidase no exsudato sinovial de ratos, no modelo de artrite induzida por
injeção intra-articular de zimosan. Nosál'ová et al., (2007) demonstraram também
aumento na atividade da mieloperoxidase no colón de ratos, no modelo de colite
induzida por ácido acético.
A adenosina-deaminase é uma enzima liberada principalmente por
monócitos e macrófagos durante o processo inflamatório e, dependendo o receptor
ativado, apresenta efeito pró ou antiinflamatório (PACHECO et al., 2005). Law et al.,
(2003) demonstraram que a administração intraperitoneal ou endovenosa de
pentostatina, um inibidor de adenosina-deaminase, inibiu a ativação de leucócitos
bem como aumentou a sobrevida de ratos, no modelo de sepse induzida por
extravasamento fecal. Antonioli et al., (2007) observaram que ao administrar via
intraperitoneal o 4-amino-2-(2-hidroxi-1-decil)pirazole[3,4-d]pirimidina (APP), um
inibidor de adenosina-deaminase, em ratos, ocorreu redução da lesão tecidual e
redução dos níveis de MPO, TNF-α e IL-6 no colón, no modelo de colite induzida por
ácido 2,4-dinitrobenzenossulfônico administrado via intra-retal.
Odashima et al., (2006) demonstraram que a administração intraperitoneal
de agonista seletivo para receptores A
2A
, ATL-146e, em camundongos, reduziu os
níveis de alanina aminotransferase (ALT), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α),
DISCUSSÃO
44
interleucina-6 (IL-6) e interferon-γ (IFN-γ), no modelo de lesão hepática induzida pela
administração endovenosa de concanavalina A. Estudos in vitro desenvolvidos por
Hamano et al., (2007) demonstraram que a ativação de receptores A
2A
inibiu a
expressão de moléculas de adesão ICAM-1 e a liberação de TNF-α, por células
mononucleares do sangue periférico humano, estimuladas com LPS.
Outros estudos têm destacado a participação do receptor
A
3
no processo
inflamatório. Este receptor parece ter uma participação controversa na
inflamação, podendo apresentar efeitos pró ou antiinflamatórios quando
ativado. Ochaion et al., (2006) demonstraram que o tratamento com
metotrexato não só aumenta a concentração de adenosina, mas também
aumenta a expressão de receptores adenosina A
3
na pata e em células
mononucleares do sangue periférico de ratos, no modelo de artrite induzida
por
Mycobacterium tuberculosis
. Este mesmo estudo observou que o tratamento
combinado de metotrexato e CF-101
, um potente agonista de receptor A
3
,
apresentou efeito antiinflamatório, reduzindo significativamente a infiltração de
células e a destruição da cartilagem e do osso na articulação de ratos, no modelo de
artrite induzida por Mycobacterium tuberculosis.
Em modelo experimental de peritonite séptica induzida por
extravasamento fecal, Lee et al., (2006) observaram aumento da mortalidade
e da disfunção renal e hepática em camundongos deficientes de receptores
adenosina A
3
.
Pereira et al., (2006) também observaram que o tacrolimus inibiu a atividade
das enzimas MPO e ADA na inflamação induzida pela carragenina em
camundongos, no modelo da pleurisia.
Desta forma, foi possível observar estudos que a eficácia do tacrolimus
como fármaco antiinflamatório não se restringe somente à diminuição dos níveis de
mediadores pró-inflamatórios TNF-α, IL-1β, KC e óxido nítrico e da atividade das
enzimas MPO e ADA, mas também inclui a inibição da infiltração de leucócitos ao
sitio de inflamação, na resposta induzida pela carragenina. Os resultados obtidos
com o tacrolimus foram também muito semelhantes aos observados em animais
tratados com indometacina ou dexametasona, sugerindo que este fármaco tenha um
efeito antiinflamatório semelhante ao dos fármacos de referência.
CONCLUSÕES
45
5 CONCLUSÕES
1. A atividade antiinflamatória do tacrolimus parece estar relacionada à inibição de
enzimas (mieloperoxidase e adenosina-deaminase), citocinas (TNFα, IL-1β e
KC), bem como de mediadores pró-inflamatórios (óxido nítrico).
2. O efeito antiinflamatório do tacrolimus exibiu um perfil antiinflamatório
semelhante ao da indometacina e da dexametasona.
CONCLUSÕES
46
PERSPECTIVAS
47
6 PERSPECTIVAS
1. Avaliar o efeito do tacrolimus sobre a expressão de RNAm para mediadores e
citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1β e KC).
2. Avaliar o efeito antiinflamatório do tacrolimus em outros modelos experimentais.
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APÊNDICE
58
APÊNDICE A - Protocolo do estudo da atividade antiinflamatória do tacrolimus
APÊNDICE
59
Triagem inicial
Curva dose/tempo-resposta
Melhor dose
Melhor tempo
Mediadores da inflamaçãoEnzimas da inflamação
NO Citocinas
MPO ADA
TNFα
αα
α
IL-1β
ββ
β
KC
Triagem inicial
Curva dose/tempo-resposta
Melhor dose
Melhor tempo
Mediadores da inflamaçãoEnzimas da inflamação
NO Citocinas
MPO ADA
TNFα
αα
α
IL-1β
ββ
β
KC
Mediadores da inflamaçãoEnzimas da inflamação
NONO CitocinasCitocinas
MPO ADA
TNFα
αα
α
IL-1β
ββ
β
KC
TNFα
αα
αTNFα
αα
α
IL-1β
ββ
βIL-1β
ββ
β
KCKC
Apêndice 1 - Protocolo do estudo da atividade antiinflamatória do tacrolimus.
ANEXO
60
ANEXO A - Protocolo e Cadastro da Comissão de Ética no Uso de Animais
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