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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
STELLA GOULART
Estudo do mecanismo da ação antiinflamatória de extratos de
Solidago chilensis Meyen no modelo da pleurisia induzida por
diferentes agentes flogísticos, em camundongos
Florianópolis
2006
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Livros Grátis
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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
STELLA GOULART
Estudo do mecanismo da ação antiinflamatória de extratos de
Solidago chilensis Meyen no modelo da pleurisia induzida por
diferentes agentes flogísticos, em camundongos
Dissertação apresentada ao curso de Pós-
graduação em Farmácia do Centro de
Ciências da Saúde da Universidade Federal
de Santa Catarina como requisito parcial para
obtenção do título de Mestre em Farmácia,
sob a orientação da Profa. Dra. Tânia Silvia
Fröde.
Florianópolis
2006
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“As pessoas sempre culpam as
circunstâncias por aquilo que são. Eu não
acredito em circunstâncias. Quem se sai
bem nesse mundo são as pessoas que
saem à procura das circunstâncias que
desejam e se não as encontram, criam-nas.”
G
G
e
e
o
o
r
r
g
g
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e
B
B
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e
r
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n
a
a
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S
S
h
h
a
a
w
w
A meus pais, José e Maria Salete, por
todo incentivo, carinho, preocupação e
apoio tão essenciais.
Aos meus irmãos e amigos, pelos
momentos de alegria, companheirismo e
compreensão.
A professora Tânia pela sua dedicação,
paciência, disponibilidade e amizade.
AGRADECIMENTOS
AGRADECIMENTOS
A Deus, ser de infinita sabedoria, por dar-me força e saúde para superar e
enfrentar tantos obstáculos ao longo desses dois anos, fazendo-me acreditar que
tudo é possível, basta ter persistência e vontade de vencer.
Deixo aqui registrado o meu sincero agradecimento aos meus pais, José e
Maria Salete, pois sem o auxílio e a dedicação de ambos, não teria galgado tantos
degraus para atingir os meus objetivos. Agradeço também por toda a confiança
depositada e por acreditarem que eu sou capaz de conquistar os meus sonhos.
Aos meus irmãos, Adriano e Giselle, aos meus cunhados, Ana Cristina e
Robson, aos meus sobrinhos, Giulia, Giovana e César Augusto, por todos os
momentos de alegria, ternura, apoio e intermináveis finais de semana.
Aos meus novos e mais do que especiais amigos, minha nova família: Silvana
Vigil, Rafael, Jucélia, Ziliani, Robson, Vanessa, Silvana Zucolotto e Aerton, pelos
momentos de descontração, pelo apoio e incentivo constantes, pelos muitos
experimentos realizados juntos, pelos congressos, pelas festas, enfim, obrigada por
serem meus amigos. Agradeço também a Ana Beatriz por toda a sua disposição em
me ensinar o modelo experimental e pela sua amizade.
Agradeço a todos os meus amigos de infância, de graduação, de trabalho e
de mestrado: Dianne, Douglas, Andréia, Ângela, Analice, Raquel, Eduardo, Ranilda
e Wilma, que presentes ou não, sempre me auxiliaram e incentivaram de alguma
maneira e, acreditaram na realização deste trabalho.
Um agradecimento, em especial, à professora Dra Tânia Silvia Fröde, a quem
rendo minhas homenagens diante dos esforços, disposição e dos ensinamentos a
mim transmitidos.
Ao professor Dr. Eloir Paulo Schenkel, à Karen Luise Lang e à Maria Izabel
Goularte Moritz, pela produção dos extratos estudados e pelas importantes
sugestões para a realização deste trabalho.
Aos funcionários do laboratório de análises clínicas do Hospital Universitário
pelo auxílio e disposição na realização das técnicas.
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de Santa Catarina, aos professores, funcionários do
Programa de Pós-graduação em Farmácia pela oportunidade de conviver e adquirir
novos e importantes conhecimentos.
Enfim, a todos aqueles que de alguma maneira acreditaram na realização e
no sucesso deste trabalho, a todos que a mim dedicaram seu tempo e esforço e a
todos que fazem parte da minha vida.
Meus sinceros agradecimentos!
.
SUMÁRIO
SUMÁRIO
Pag.
LISTA DE ABREVIAÇÕES
7
LISTA DE FIGURAS
9
RESUMO
10
ABSTRACT
11
1. INTRODUÇÃO
12
1.1. PLANTAS MEDICINAIS
12
1.2. O GÊNERO Solidago
12
1.3. O PROCESSO INFLAMATÓRIO
14
1.4. MODELOS DE INFLAMAÇÃO
20
2. OBJETIVOS
22
2.1. OBJETIVO GERAL
22
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
22
3. ARTIGO SUBMETIDO À PUBLICAÇÃO – Journal of Ethnopharmacology
23
4. DISCUSSÃO
53
5. CONCLUSÕES
62
6. PERSPECTIVAS
64
REFERÊNCIAS
65
ANEXO 1: Organogramas da triagem dos extratos e do mecanismo da
ação antiinflamatória dos extratos e frações
77
ANEXO 2: Protocolo e cadastro da Comissão de Ética no Uso de Animais
79
LISTA DE ABREVIAÇÕES
LISTA DE ABREVIAÇÕES
A
1
Receptor de adenosina tipo 1
A
2A
Receptor de adenosina tipo 2A
A
2B
Receptor de adenosina tipo 2B
A
3
Receptor de adenosina tipo 3
ADA Adenosina-deaminase
ADA-1 Adenosina-deaminase isoforma 1
ADA-2 Adenosina-deaminase isoforma 2
AMPc Adenosina monofosfato cíclica
B
B
1
Receptor da bradicinina tipo 1
BB
2
Receptor da bradicinina tipo 2
BK Bradicinina
BuOH Fração butanólica obtida do extrato aquoso das raízes de Solidago
chilensis
cav. Cavidade
CD99 Molécula de adesão expressa em células T
Cg Carragenina
COX-1 Ciclooxigenase tipo 1
COX-2 Ciclooxigenase tipo 2
DNA Ácido desoxirribonucléico
EA Extrato aquoso liofilizado obtido das raízes de Solidago chilensis
ECA Enzima conversora de angiotensina
ELAM-1 Moléculas de adesão endotelial tipo 1
E-selectina Molécula de adesão do tipo selectina, expressa em células
endotelial
FR234938 Inibidor da enzima adenosina-deaminase
H
1
Receptor da histamina tipo 1
H
2
Receptor da histamina tipo 2
H
3
Receptor da histamina tipo 3
H
4
Receptor da histamina tipo 4
HIST Histamina
i.p. Intraperitoneal
i.pl. Intrapleural
i.v. Intravenoso
ICAM-1 Moléculas de adesão intracelular tipo 1
IFN-γ
Interferon gama
IL Interleucina
IL-1α
Interleucina-1 alfa
IL-1Ra Interleucina-1 Ra
IL-1β Interleucina-1 beta
I-κB Proteína inibidora do fator de transcrição nuclear NF-kappa B
J774 Linhagem celular de macrófagos de camundongos
LFA Ácido lisofosfatídico
L-NAME N
G
-nitro-L-arginina metil éster
LOX Lipoxigenase
LPS Lipopolissacarídeo
MPO Mieloperoxidase
NADPH Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxidase
NF-κB
Fator de transcrição nuclear kappa B
NF-AT Fator de transcrição nuclear de células T
NK
1
Receptor das taquicininas tipo 1
NK
2
Receptor das taquicininas tipo 2
NK
3
Receptor das taquicininas tipo 3
NK
4
Receptor das taquicininas tipo 4
NO Óxido nítrico
NOS
Óxido nítrico sintase
NOSe e NOS III
Óxido nítrico sintase constitutiva, expressa em células endoteliais
NOSi e NOS II
Óxido nítrico sintase induzida
NOSn e NOS I
Óxido nítrico sintase constitutiva, expressa em células neuronais
LISTA DE ABREVIAÇÕES
PMA Acetato de forbol miristato
P-selectina Molécula de adesão do tipo selectina, expressa em células
epiteliais
R-954 Antagonista do receptor da bradicinina tipo 1
RA Resíduo aquoso obtido do extrato aquoso das raízes de Solidago
chilensis
RAW 264.7 Linhagem de macrófagos de camundongos
RNAm Ácido ribonucléico mensageiro
RNS Espécies reativas de nitrogênio
ROS Espécies reativas de oxigênio
SNC Sistema nervoso central
SP Substância P
SR140333 Antagonista do receptor das taquicininas tipo 1
SR142801 Antagonista do receptor das taquicininas tipo 3
SR48968 Antagonista do receptor das taquicininas tipo 2
TGFβ
Fator de crescimento transformante do tipo beta
TH Linfócito T auxiliar
TH1 Linfócito T auxiliar tipo 1
TH2 Linfócito T auxiliar tipo 2
TNFα
Fator de necrose tumoral alfa
TPA (12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato)
U-937 Linhagem celular de monócitos humanos
VCAM-1 Moléculas de adesão vascular tipo 1
VCAM-2 Moléculas de adesão vascular tipo 2
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Folhas e flores de Solidago chilensis Meyen 13
Figura 2 Mecanismo da ação antiinflamatória proposto para o extrato aquoso
das raízes de Solidago chilensis e suas frações: BuOH e RA
63
RESUMO
RESUMO
Estudo do mecanismo da ação antiinflamatória de extratos de Solidago
chilensis Meyen no modelo da pleurisia induzida por diferentes agentes
flogísticos, em camundongos.
Introdução: A espécie Solidago chilensis Meyen, nativa da América do Sul e
comumente conhecida como “arnica do Brasil”, tem demonstrado importante atividade
antifúngica, antioxidante e antimicrobiana. No entanto, existem poucos estudos em
relação a sua atividade antiinflamatória. Objetivo: O objetivo deste trabalho foi estudar o
efeito e o mecanismo de ação antiinflamatório dos extratos de Solidago chilensis Meyen,
no modelo experimental da pleurisia, em camundongos. Materiais e Métodos: As
raízes de Solidago chilensis foram coletadas em Caibi, Santa Catarina, Brasil, em Março
de 2005. As raízes de Solidago chilensis foram secas à temperatura ambiente e
protegidas da luz e do calor. Os extratos foram obtidos por infusão em água fervente por
10 min. Estes foram filtrados e liofilizados (E-C.Micromodulyo Freeze Dryer, USA). Duas
frações (fração butanólica: BuOH e o resíduo aquoso: RA) foram obtidas a partir do
extrato aquoso liofilizado que foi fracionado com acetato de etila e n-butanol. Todos os
extratos foram administrados por via intraperitoneal (i.p.). Os animais utilizados para
todos os experimentos foram camundongos albinos suiços, 2 meses de idade. A
pleurisia foi induzida por uma injeção de 0,1 mL de diferentes agentes flogísticos: Cg
(1%/cav.), BK (10 nmol/cav.), HIST (100 μg/cav.) ou SP (20 nmol/cav.) administrados
por via intrapleural (i.pl.). A migração celular e a exsudação foram avaliadas 4 h após a
administração do agente flogístico. Mieloperoxidase (MPO), adenosina-deaminase
(ADA), óxido nítrico (NO), níveis de fator de necrose tumoral alfa (TNFα) e interleucina-1
beta (IL-1β) foram avaliados somente no protocolo da pleurisia induzida pela
carragenina. Para estudar a exsudação, um grupo de animais recebeu solução de azul
de Evans (25 mg/kg, 0,2 mL), administrado por via intravenosa (i.v.), 1 h antes da
indução da inflamação. A análise estatística entre os grupos foi determinada pelos
testes ANOVA, Dunnett ou teste T de Student. Valores de P < 0.05 foram considerados
significativos. Resultados: Na inflamação induzida pela carragenina, os extratos
etanólicos e aquosos das raízes, folhas ou inflorescências inibiram os leucócitos e os
neutrófilos (P < 0.05). Os extratos aquosos reduziram a exsudação (P < 0.05). O extrato
aquoso das raízes (EA) e suas frações: fração butanólica (BuOH) e resíduo aquoso (RA)
inibiram os leucócitos, os neutrófilos, os níveis de mieloperoxidase, adenosina-
deaminase e TNFα induzida pela carragenina (Cg) (P < 0.05). EA e BuOH, mas não RA,
inibiram a exsudação, os níveis de óxido nítrico e IL-1β (P < 0.05). Este extrato e suas
frações também inibiram os leucócitos e os mononuclears na inflamação causada pela
bradicinina (BK) (P < 0.01), os leucócitos totais e diferencial na inflamação induzida pela
histamina (HIST) ou substância P (SP) (P < 0.05). EA, BuOH e RA não inibiram a
exsudação causada por BK, HIST ou SP. A indometacina inibiu os leucócitos totais e
diferencial na pleurisia induzida por Cg, BK, HIST ou SP e a exsudação, os níveis de
mieloperoxidase, adenosina-deaminase, óxido nítrico e IL-1β na pleurisia induzida pela
Cg (P < 0.05). Conclusão: Estes resultados demonstraram que a Solidago chilensis
apresentou importante efeito antiinflamatório no modelo de inflamação aguda, em
camundongos. As duas frações (butanólica e resíduo aquoso) das raízes de Solidago
chilensis demonstraram ser efetivas na inibição dos parâmetros inflamatórios estudados,
podendo ser futuramente utilizadas para o desenvolvimento de novos fármacos para o
tratamento de doenças inflamatórias.
Unitermos: Solidago chilensis, inflamação, pleurisia, mediadores da inflamação,
camundongos.
ABSTRACT
ABSTRACT
Study of the mechanism of antiinflammatory action of Solidago chilensis
extracts in the mouse model of pleurisy induced by different phlogogens.
Introduction: The specie Solidago chilensis Meyen, native of South America and
commonly known as “arnica of Brazil”, has demonstrated a important antifungal,
antioxidant and antimicrobial properties. Otherwise, there are few studies in relation to its
antiinflammatory activity. Objective: The aim of this study was to evaluate the effect, as
well as, the mechanism of antiinflammatory action of extracts of Solidago chilensis
Meyen in the mouse model of pleurisy induced by different phlogogens. Material and
methods: The rhizomes of Solidago chilensis were collected in Caibi, Santa Catarina,
Brazil, in March 2005. Solidago chilensis rhizomes were dried at room temperature and
protected from light and heat. Extracts were obtained by infusion in boiling water for 10
min. It was filtered and lyophilized in an Edward® (E-C.Micromodulyo Freeze Dryer,
USA). Subsequently, two fractions (butanolic fraction: BuOH and aqueous residue
fraction: AR) were obtained from the aqueous lyophilized extract that was partitioned with
ethyl acetate and n-butanol. All extracts were administrated by intraperitoneal route (i.p.).
Non-fasted adult Swiss mice, aged 2 months, were used throughout the experiments.
The pleurisy was induced by a single injection of 0.1 mL of different phlogistic agents: Cg
(1%/cav.), BK (10 nmol/cav.), HIST (100 μg/cav.) or SP (20 nmol/cav.) administered by
intrapleural route (i.pl.). Cell migration and exudation was evaluated 4 h after phlogogen
administration. Myeloperoxidase (MPO), adenosine-deaminase (ADA), nitric oxide (NO),
tumor necrosis factor alpha (TNFα) and interleukin-1 beta (IL-1β) levels were evaluated
only in the protocols of carrageenan-induced pleurisy. To study the exudation, a group of
animals received Evans blue dye (25 mg/kg, 0.2 mL), administered by intravenous route
(i.v.), 1 h before the inflammation induction. Significant differences between groups were
determined by analysis of variance (ANOVA), Dunnett’s or Student’s t tests. Values of P
< 0.05 were considered significant. Results: In the inflammation induced by carrageenan
the ethanolic and aqueous extracts of rhizomes, leaves or inflorescences inhibited
leukocytes and neutrophils (P < 0.05). Only the aqueous extracts reduced exudate (P <
0.05). The rhizomes extract aqueous (AE) and their two fractions: butanolic fraction
(BuOH) and aqueous residue (AR) inhibited leukocytes, neutrophils, myeloperoxidase,
adenosine-deaminase and TNFα levels induced by carrageenan (Cg) (P < 0.05). AE and
BuOH, but not AR, inhibited exudate, nitric oxide and IL-1β concentrations (P < 0.05).
This extract and their two fractions also inhibited leukocytes and mononuclears in the
inflammation caused by bradykinin (BK) (P < 0.01), total and differential leukocytes
induced by histamine (HIS) or substance P (SP) (P < 0.05). AE, BuOH and AR did not
inhibited the exudate caused by either BK, HIS or SP. Indomethacin, inhibited total and
differential leukocytes in the pleurisy induced by Cg, BK, HIS and SP and exudation,
myeloperoxidase, adenosine-deaminase, nitric oxide and IL-1β levels in the pleurisy
induced by Cg (P < 0.05). Conclusion: These results demonstrated that Solidago
chilensis has an important antiinflammatory effect in the acute mouse model of
inflammation. The two fractions (butanolic and aqueous residue) from rhizomes of
Solidago chilensis demonstrated important pharmacological activities that may be
relevant potential new candidate drugs from plant sources to treat antiinflammatory
disease.
Keywords: Solidago chilensis, inflammation, pleurisy, mediators of inflammation, mice.
INTRODUÇÃO
12
1. INTRODUÇÃO
1.1. PLANTAS MEDICINAIS
O uso de produtos naturais com propriedades terapêuticas é tão antigo
quanto à civilização humana e por um longo período de tempo, minerais, produtos
animais e plantas foram a principal fonte de moléculas biologicamente ativas
(RATES, 2001; SCHENKEL; GOSMANN; PETROVICK, 2003).
A biodiversidade da flora brasileira aliada ao seu vasto potencial terapêutico
tem levado inúmeros pesquisadores a investigarem as propriedades químicas e
biológicas de uma grande variedade de plantas utilizadas na medicina popular, bem
como no sentindo de dar uma base científica ao uso popular (SZELENYI; BRUME,
2002). Além disso, uma grande proporção da população tem acesso somente a
preparações de origem vegetal para o tratamento de várias doenças.
Ao se considerar perspectiva de obtenção de novos fármacos, dois aspectos
distinguem os produtos de origem natural dos sintéticos: a diversidade molecular e a
função biológica. A diversidade molecular dos produtos naturais é muito superior
àquela derivada dos processos de síntese, que apesar dos avanços consideráveis,
ainda é limitada. No Brasil, estima-se que 25% dos US$ 10 bilhões do faturamento
da indústria farmacêutica nacional sejam originados de medicamentos derivados do
reino vegetal. É importante ressaltar, que apenas 8% das espécies vegetais da flora
brasileira foram estudadas em busca de compostos bioativos e somente 1.100
espécies vegetais foram estudadas em relação as suas propriedades medicinais
(GUERRA; NODARI, 2003).
1.2. O GÊNERO Solidago
O gênero Solidago (Asteraceae) abrange cerca de 120 espécies nativas das
Américas do Norte e do Sul, Europa e Ásia (WEYERSTAHL et al., 1993). A Solidago
chilensis Meyen é uma espécie nativa da América do Sul, incluindo o sul e sudeste
do Brasil, sendo conhecida na medicina popular como arnica, arnica-do-Brasil,
arnica-brasileira, arnica silvestre, erva-lanceta, entre outros (SIMÕES et al., 1998).
Estes nomes populares são aplicados pela similaridade de uso medicinal com a
arnica-verdadeira, denominada Arnica montana L., nativa das regiões montanhosas
da Europa, sendo de rara ocorrência no Brasil.
INTRODUÇÃO
13
Solidago chilensis Meyen já é citada na Farmacopéia Brasileira de 1929,
possui até 1,2 m de altura, é perene e pode se reproduzir por sementes e,
principalmente, pelos rizomas. As folhas possuem forma de lança e as flores são de
cor amarela (Figura 1). Esta espécie possui um crescimento vigoroso e persistente,
por isso ocorre espontaneamente em terrenos baldios, beira de estradas e
pastagens, sendo considerada planta daninha (LORENZI; MATOS, 2002).
Figura 1: Folhas e flores de Solidago chilensis Meyen
Fonte: http://www.geocities.com/riberan/FotosFlores/Solidago_chilensis
As espécies do gênero Solidago têm sido tradicionalmente utilizadas na
medicina popular em vários países por mais de 700 anos, principalmente para o
tratamento de infecções e/ou inflamações, como por exemplo, nefrite, cistite, litíase
renal e reumatismo (HÄNSEL et al., 1994; BLUMENTHAL; BUSSE; GOLDBERG,
1998). Além disso, este gênero tem apresentado propriedades terapêuticas, dentre
elas diurética e espasmolítica (BONGARTZ; HESSE, 1995; THIEM; GOSLINSKA,
2002).
Solidago chilensis Meyen é uma espécie considerada medicinal por suas
propriedades anti-sépticas, analgésicas e cicatrizantes. Além disso, também tem
sido observado efeito anti-hemorrágico, sendo também utilizada no tratamento de
contusões, distensões e inflamações da pele (BORGES, 2001). Estudos realizados
por Vila e colaboradores (2002) demonstraram ainda, que o óleo volátil extraído
INTRODUÇÃO
14
desta espécie pode ser considerado um eficiente agente antifúngico contra os
dermatófitos patogênicos ao homem.
No Paraguai, a utilização da Solidago chilensis na medicina popular data de
1710, pelo qual a decocção das inflorescências era utilizada com finalidades
diurética e anti-helmíntica (SCHMEDA- HIRSCHMANN, 1987).
Investigações químicas com espécies do gênero Solidago demonstraram que,
das partes aéreas foram isolados mono e sesquiterpenos (KREPINSKY; HEROUT,
1962; BOHLMANN et al., 1980), diterpenos (ANTHONSON et al., 1969; BOHLMANN
et al., 1980), flavonóides (BATYUK; KOL’TSOVA, 1968; BATYUK; KOVALEVA,
1985), saponinas (REZNICEK; JURENITSCH; HASLINGER, 1989; REZNICEK et al.,
1991) e poliacetilenos (LU et al., 1993).
Das raízes de Solidago chilensis já foram isolados diterpenos (solidagenona)
(SCHMEDA-HIRSCHMANN, 1987) e esses apresentaram efeitos de proteção no
modelo de lesão gástrica induzido pela solução ácido clorídrico e etanol, em
camundongos (SCHMEDA-HIRSCHMANN; RODRIGUEZ; ASTUDILLO, 2002). Já
das partes aéreas de Solidago chilensis foram isolados flavonóides glicosilados da
família do canferol e, em maior quantidade, o flavonóide quercitrina (TORRES;
AKISUE; ROQUE, 1987; GÜNTNER et al., 1999).
1.3. O PROCESSO INFLAMATÓRIO
A reação inflamatória é um evento complexo que envolve o reconhecimento
do agente ou estímulo lesivo, para sua posterior destruição e formação de um novo
tecido (SCHMID-SCHÖNBEIN, 2006). O reconhecimento desencadeia a ativação e a
amplificação do sistema imune resultando na ativação de células e na liberação de
diversos mediadores inflamatórios que são responsáveis pela vasodilatação,
extravasamento do plasma e migração de leucócitos (CORSINI et al., 2005;
SCHMID-SCHÖNBEIN, 2006).
O sistema fagocítico mononuclear é composto por dois tipos de células que
participam na defesa imune do hospedeiro, desenvolvendo funções distintas: os
macrófagos e os monócitos. Os macrófagos têm a função de remover antígenos
particulados e atuar como células apresentadoras de antígeno, internalizando e
apresentando antígenos aos linfócitos T (KIM; KIM; LEE, 2003). Os monócitos
encontram-se circulando no sangue e, quando necessário, migram para diferentes
INTRODUÇÃO
15
órgãos e cavidades do corpo em reposta a um estímulo lesivo, diferenciando-se em
macrófagos.
Os leucócitos polimorfonucleares são as primeiras células que são ativadas
na defesa imune do hospedeiro contra a infecção. Estas células migram e infiltram-
se no sítio inflamatório por gradientes quimiotáticos, onde juntamente com os
macrófagos, fagocitam e destroem o agente causador da inflamação (BIASI et al.,
2003; ARNHOLD, 2004). A destruição do agente estranho ocorre por meio da
liberação de enzimas hidrolíticas, proteínas bactericidas e espécies reativas de
oxigênio (ROS) estocadas nos grânulos dos polimorfonucleares (ARNHOLD, 2004).
Dentre estas enzimas, pode-se destacar a mieloperoxidase, uma protease presente
nos grânulos azurófilos de neutrófilos e em monócitos (RODRIGUES et al., 2002;
ARNHOLD, 2004; HANSSON; OLSSON; NAUSEEF, 2006).
A mieloperoxidase juntamente com o sistema nicotinamida adenina
dinucleotídeo fosfato (NADPH) oxidase estão envolvidas na liberação de ROS. O
NADPH oxidase reduz o oxigênio molecular ao radical ânion superóxido (ARNHOLD,
2004). A seguir, a enzima superóxido dismutase converte o ânion superóxido em
peróxido de hidrogênio, o qual possui função de destruir bactérias diretamente ou
após sua conversão em íons hidroxila ou ácido hipocloroso (ARNHOLD, 2004;
KLEBANOFF, 2005). Além disso, o ácido hipocloroso é considerado um potente
agente microbicida que possui papel importante na defesa do hospedeiro contra
invasão de bactérias, fungos e vírus (NEVE; PARIJ; MOGUILEVSKY, 2001;
HANSSON; OLSSON; NAUSEEF, 2006). Contudo, o aumento dos níveis de
polimorfonucleares ativados em tecidos e a liberação excessiva dessas espécies
reativas podem promover lesão tecidual e vascular, especialmente se estes
neutrófilos ativados estiverem aderidos às células endoteliais (REYNOLDS;
STEGEMAN; TERVAERT, 2002; HANSSON; OLSSON; NAUSEEF, 2006).
Outra enzima importante que está envolvida na resposta inflamatória é a
adenosina-deaminase. Esta enzima é liberada principalmente por linfócitos ativados
(GINES et al., 2002) e também possui um papel importante na maturação e na
ativação de monócitos e linfócitos (ALDRICH et al., 2003).
A adenosina-deaminase participa do metabolismo das purinas catalisando
irreversivelmente a deaminação da desoxiadenosina e adenosina em desoxinosina e
inosina, respectivamente. A atividade desta enzima ocorre por meio da ação das
isoenzimas denominadas ADA-1 e ADA-2 (NAKAMACHI et al., 2003).
INTRODUÇÃO
16
As respostas biológicas para esta enzima são mediadas por quatro receptores
distintos (A1, A2A, A2B e A3) e a estimulação de cada receptor induz a uma
resposta funcional distinta, podendo ser uma ação pró ou antiinflamatória
(LIVINGSTON; HEANEY; ENNIS, 2004; YOUNG et al., 2004; SPICUZZA; DI MARIA;
POLOSA, 2006). O fato de receptores de adenosina estarem presentes em muitos
tipos de células envolvidas na inflamação das vias aéreas deixa claro o envolvimento
desta enzima na resposta inflamatória da asma e em outras doenças inflamatórias
pulmonares (SPICUZZA; DI MARIA; POLOSA, 2006).
Nas fases iniciais do processo inflamatório, além da migração de leucócitos e
da liberação dos seus mediadores químicos, também ocorre a vasodilatação
induzida por diferentes agentes flogísticos (bradicinina, histamina, substância P) e
pelo óxido nítrico (WOTHERSPOON et al., 2005; YOUSIF, 2005; CHEN et al., 2006).
O óxido nítrico (NO) é um gás solúvel derivado do metabolismo da L-arginina pela
ação da enzima óxido nítrico sintase (NOS). O óxido nítrico tem uma função
importante na sinalização celular e está envolvido no relaxamento vascular, na
modulação da agregação plaquetária e na inibição da adesão leucocitária
(TAKEUCHI et al., 2004). Outros efeitos deletérios do óxido nítrico são decorrentes
da sua interação com ROS, formando outras espécies reativas de nitrogênio (RNS).
Desta forma, quando células e tecidos são expostos a um estresse oxidativo
induzido por poluentes ambientais, infecções, reações inflamatórias ou diminuição
nos níveis de antioxidantes, o aumento nos níveis de ROS e RNS pode induzir
diversas doenças, como câncer, aterosclerose e doenças neuro-degenerativas
(RICCIARDOLO et al., 2004; DAI et al., 2006). Estas espécies são capazes de lesar
o ácido desoxirribonucléico (DNA), os lipídeos microbianos e as células vizinhas
saudáveis, sendo esse o mecanismo responsável pela maioria dos processos
inflamatórios observados em doenças auto-imunes (RICCIARDOLO et al., 2004;
MENEGAZZI et al., 2006).
A óxido nítrico sintase (NOS) existe em três isoformas distintas: NOS neuronal
(NOSn ou NOS I), NOS endotelial (NOSe ou NOS III), ambas formas são
constitutivas e estão localizadas no tecido nervoso central e nas células endoteliais,
respectivamente. A NOS induzida (NOSi ou NOS II) é ativada em resposta a
estímulos inflamatórios, como por mediadores endógenos: quemocinas e citocinas
pró-inflamatórias (interleucina-1 beta: IL-1β, fator de necrose tumoral alfa: TNFα,
interferon gama: IFN-γ, etc.), bem como por fatores exógenos: endotoxinas
INTRODUÇÃO
17
bacterianas, infecções virais, poluentes ambientais (estresse oxidativo), hipóxia,
tumores, alergenos, entre outros (RICCIARDOLO et al., 2004; BOVE; VLIET, 2006).
Após estimulação, a NOSi libera grandes quantidades de NO em minutos, podendo
até mesmo, manter essa liberação por horas ou dias (RICCIARDOLO, 2003).
A expressão de NOSi nas reações inflamatórias é encontrada
predominantemente em células epiteliais (HEMMRICH et al., 2005), mas também em
macrófagos (MUHL; DINARELLO, 1997), neutrófilos (EISERICH et al., 1998),
mononucleares (ROUZAUT et al., 1999), eosinófilos (FERREIRA et al., 2002a) e
células da musculatura lisa vascular (CHAN; FISCUS, 2004).
Além do óxido nítrico, outros mediadores que participam do processo
inflamatório são as citocinas. Estas também estão envolvidas no crescimento,
diferenciação e ativação celular, na imunidade e no reparo tecidual, além de outras
funções (BUDHU; WANG, 2006). Diversos são os estímulos para a liberação das
citocinas, incluindo infecção bacteriana, viroses, parasitoses, micoses, tumores,
traumas, estímulos físicos (queimaduras, irradiações), necrose tecidual (infarto),
respostas imunológicas (doença auto-imune) (BUDHU; WANG, 2006), entre outros.
Dentre as células que produzem citocinas destacam-se os linfócitos T
auxiliares (TH) que são divididos em duas subpopulações, TH1 e TH2. As células
TH1 secretam principalmente IFN-γ e TNFα, enquanto as células TH2 liberam
interleucinas: IL-4, IL-5 e IL-13 (NGOC et al., 2005). As células do tipo TH1 estão
envolvidas em processos inflamatórios, enquanto as do tipo TH2 regulam
principalmente a ativação de eosinófilos e a produção de imunoglobulinas E, que
são importantes na inflamação alérgica (NGOC et al., 2005).
De forma geral, as citocinas são classificadas em subgrupos, como:
interleucinas, fatores de necrose tumoral, fatores de crescimento, quemocinas,
interferons e fatores estimuladores de colônia ou ainda, podem ser classificadas
conforme sua atividade biológica como por exemplo: pró-inflamatórias (IL-1, IL-
6, IL-8, TNFα, fator de crescimento transformante do tipo beta: TGFβ) e
antiinflamatórias (interleucina-1 Ra: IL-1Ra, IL-4, IL-10, IL-13) (WONG; FISH,
2003). Um balanço inadequado entre citocinas pró e antiinflamatórias durante uma
resposta imune é crítico na resolução, ou não, da inflamação local (CORSINI et al.,
2005).
INTRODUÇÃO
18
Dentre as principais citocinas que possuem efeitos pró-inflamatórios
destacam-se o TNFα e a IL-1β. O TNFα é uma citocina envolvida na patogênese
das doenças inflamatórias crônicas, pois regula o crescimento, a proliferação, a
diferenciação e a viabilidade de leucócitos ativados. O TNFα também estimula a
liberação celular de outras citocinas, quemocinas ou mediadores inflamatórios que
exibem efeitos antivirais e antimicrobianos (NAIR et al., 2006). A IL-1β é produzida e
secretada em diversas doenças inflamatórias e que estão associadas com a dor e a
hiperalgesia, como por exemplo, nas neuropatias, nos tumores e nas doenças
inflamatórias crônicas (artrite reumatóide) (SOMMER; KRESS, 2004).
O processo inflamatório nas vias aéreas é acompanhado por liberação de
TNFα e IL-1β. Estas citocinas agem sinergicamente amplificando a resposta
inflamatória pulmonar estimulando a liberação de fatores quimioatraentes de
macrófagos alveolares e de células epiteliais das vias aéreas, além de induzirem a
expressão de moléculas de adesão em eosinófilos, neutrófilos e células endoteliais.
Desta forma, estas citocinas são consideradas potentes indutoras do recrutamento
de leucócitos (PETTERSEN; ADLER, 2002; ALBA-LOUREIRO et al., 2004). Uma
diminuição na produção destas citocinas pode comprometer o desenvolvimento da
resposta de defesa contra patógenos bacterianos e virais (CORSINI et al., 2005).
Outro mediador envolvido na resposta inflamatória e considerado um potente
vasodilatador é a histamina. Esta é uma amina vasoativa, sintetizada a partir da
histidina pela ação da histidina descarboxilase e armazenada dentro de grânulos
secretores nos mastócitos e nos basófilos (MARONE et al., 2003). Em humanos, a
histamina está armazenada em mastócitos e basófilos, células enterocromafins do
trato gastrointestinal e nervos histaminérgicos no SNC. Além disso, tem se
observado também a presença de histamina em linfócitos, monócitos e plaquetas
humanas (MacGLASHAN, 2003).
Já foram identificados quatro subtipos de receptores histaminérgicos: H
1
, H
2
,
H
3
e H
4.
A ativação do receptor H
1
está envolvida em eventos intracelulares
caracterizados pelo aumento dos níveis de cálcio intracelular promovendo, por
exemplo, a contração do músculo liso das vias aéreas, em humanos (KAWANO et
al., 2004). Já a ativação do receptor H
2
promove uma resposta intracelular
caracterizada pela elevação dos níveis de adenosina monofosfato cíclica (AMPc) em
células de linhagem celular de monócitos humanos: U-937 (DELGADO; FUENTES;
FERNÁNDEZ-ALFONSO, 2003). A ativação deste receptor promove ainda a
INTRODUÇÃO
19
secreção de ácido gástrico em animais e em humanos (BAROCELLI; BALLABENI,
2003). A ativação dos receptores H
3
e H
4
também está relacionada ao aumento do
cálcio e do AMPc intracelular (MacGLASHAN, 2003).
Os basófilos e os mastócitos humanos podem ser estimulados a liberar
histamina. Basófilos podem ser encontrados no sítio da inflamação durante reações
de hipersensibilidade tardia, bem como na asma brônquica humana. Isto sugere que
a histamina é liberada localmente por mastócitos e basófilos infiltrados, sendo um
importante mediador endógeno na inflamação alérgica (MARONE et al., 2003).
A bradicinina, outro mediador da inflamação, é uma cinina formada a partir
dos cininogênios, α
2
-globulinas de alto e baixo pesos moleculares, ambas derivadas
de um único gene (BLAIS et al., 2000) por ação de cininogenases. Este mediador é
um potente peptídeo pró-inflamatório sintetizado no local da inflamação,
promovendo contração da musculatura lisa, aumento da permeabilidade vascular,
extravasamento de plasma, infiltração de células inflamatórias e aumento na
secreção de muco (GAMA LANDGRAF et al., 2004; ABRAHAM; SCURI; FARMER,
2006).
Regoli e Barabe propuseram em 1980, através de ensaios biológicos, a
classificação de receptores da bradicinina em B
1
e B
2
. Atualmente estudos avaliaram
a expressão dos receptores B
1
e B
2
na inflamação das vias aéreas (ZHANG;
ADNER; CARDELL, 2005; ABRAHAM; SCURI; FARMER, 2006).
O receptor B
2
é expresso constitutivelmente em diversos tecidos do
organismo, incluindo o sistema nervoso central (SNC) de animais de várias espécies
(FERREIRA et al., 2002b). A ativação destes receptores promove a maioria dos
efeitos fisiológicos da bradicinina, como broncoconstrição, hipotensão, reação
inflamatória aguda, formação de edema, dor e hiperalgesia via estimulação das
fibras C (ABRAHAM; SCURI; FARMER, 2006). Já o receptor B
1
geralmente é
expresso em condições patológicas através de estímulos inflamatórios, como
lipopolissacarídeos e citocinas (IL-1β, IL-6 e TNFα) (GAMA LANDGRAF et al., 2004;
MEDEIROS et al., 2004). Os principais efeitos da ativação dos receptores B
1
incluem
vasodilatação, extravasamento de plasma, hiperalgesia, ativação e migração de
leucócitos (ABRAHAM; SCURI; FARMER, 2006). Desta forma, os efeitos da
bradicinina podem ser mediados diretamente pela ativação dos seus receptores
(GAMA LANDGRAF et al., 2004).
INTRODUÇÃO
20
Outros importantes mediadores pró-inflamatórios relacionados a dor são as
taquicininas, pertencentes a uma família de pequenos peptídeos liberados tanto em
nível de SNC como no sistema nervoso periférico (LIU; BURCHER, 2005). Cinco
peptídeos desta família têm sido identificados em mamíferos: a neurocinina A, a
neurocinina B, a substância P, o neuropeptídeo γ e o neuropeptídeo K (O’CONNOR
et al., 2004).
Dentre os principais efeitos biológicos destes peptídeos destacam-se:
vasodilatação, aumento da permeabilidade vascular, extravasamento plasmático,
quimiotaxia de neutrófilos, contração da musculatura lisa, secreção de muco e
ativação das fibras nervosas sensoriais (CIRINO; FIORUCCI; SESSA, 2003). Estes
peptídeos também estão envolvidos em processos imunológicos, inflamatórios e na
inflamação neurogênica através da liberação de citocinas (HARRISON; GEPPETTI,
2001; PENNEFATHER et al., 2004; LIU; BURCHER, 2005).
Os efeitos das taquicininas são mediados pela ativação de três receptores
taquicinérgicos específicos: NK
1
, NK
2
e NK
3
e estes são ativados preferencialmente
pela susbtância P, neurocinina A e neurocinina B, respectivamente (O’CONNOR et
al., 2004). Recentemente estudos demonstraram a presença de um quarto receptor
para as taquicininas, o NK
4
(DONALDSON; HASKELL; HANLEY, 2001).
Estudos demonstraram que a substância P participa no processo inflamatório
em diversas doenças dos sistemas respiratório, gastrointestinal e músculo-
esquelético. Isto se deve ao fato desta substância possuir efeitos pró-inflamatórios e
ser secretada por diferentes tipos celulares, como macrófagos, eosinófilos, linfócitos,
células dendríticas e neurônios (O’CONNOR et al., 2004).
1.4. MODELOS DE INFLAMAÇÃO
Dentre os modelos experimentais para o estudo do processo inflamatório e
para a triagem de novos fármacos, citam-se: pleurisia, indução de edema de pata,
bolsa de ar, artrite e implantes de esponjas embebidas com agentes irritantes no
subcutâneo (SEDGWICK; WILLOUGHBY, 1985).
O modelo da pleurisia é caracterizado por um aumento da exsudação e uma
infiltração imediata por neutrófilos que ocorre 4 h após a administração do agente
flogístico carragenina na cavidade pleural de camundongos. Nesta fase inicial da
inflamação ocorre, ainda, a liberação de histamina, 5-hidroxitriptamina, bradicinina e
liberação de espécies reativas de oxigênio pelos neutrófilos, como peróxido de
INTRODUÇÃO
21
hidrogênio, aniôn superóxido e radicais hidroxilas, bem como a liberação de outros
mediadores (CORSINI et al., 2005). 48 h após, ocorre aumento também da
exsudação e infiltrado de células do tipo mononucleares (SALEH; CALIXTO;
MEDEIROS, 1996). Nesta fase tardia participam, principalmente, prostaglandinas e
citocinas pró-inflamatórias (CORSINI et al., 2005).
Desta forma, o modelo da pleurisia é útil para se estudar a inflamação
propriamente dita, e também, fármacos ou produtos naturais que possuem
propriedades antiinflamatórias.
A técnica de pleurisia possui vantagens em relação às outras técnicas, pois a
partir da coleta dos lavados da cavidade pleural é possível analisar e quantificar
diversos parâmetros inflamatórios como celularidade, exsudação, mediadores pró-
inflamatórios (citocinas, óxido nítrico, entre outros), além da participação de enzimas
como mieloperoxidase e adenosina-deaminase, sem necessitar recorrer a
procedimentos complicados de extração e quantificação. Uma outra vantagem
adicional em relação aos modelos citados é a sua fácil execução, pois diferentes
agentes flogísticos (específicos e não específicos) podem ser estudados.
Neste trabalho, optou-se pelo modelo experimental da pleurisia. A escolha
deste modelo foi baseada em evidências já comentadas acima, destacando sua
utilidade, servindo para o estudo da reação inflamatória, bem como avaliação dos
extratos vegetais com potencial propriedades antiinflamatórias. Como citado, o
volume de fluido extravasado, o acúmulo de células e os mediadores químicos que
participam da reação podem ser quali e quantitativamente analisados.
OBJETIVOS
22
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Estudar o efeito e o mecanismo da ação antiinflamatória de extratos de
Solidago chilensis Meyen no modelo experimental da pleurisia, em camundongos.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
9 Realizar triagem dos extratos etanólicos e aquosos obtidos das raízes, folhas e
inflorescências de Solidago chilensis, avaliando-se o perfil de atividade
antiinflamatória no modelo da pleurisia induzida pela carragenina (Anexo 1);
9 Estudar o mecanismo da ação antiinflamatória dos extratos que apresentarem
melhores resultados na triagem, bem como das frações obtidas de seu
fracionamento, analisando-se o efeito destes sobre os parâmetros inflamatórios:
leucócitos, exsudação, atividade da mieloperoxidase (MPO) e da adenosina-
deaminase (ADA), níveis de nitrato/nitrito (NO), fator de necrose tumoral alfa
(TNFα) e interleucina-1 beta (IL-1β), no modelo da pleurisia induzida pela
carragenina (Anexo 1);
9 Verificar se o extrato escolhido e suas frações inibem outros mediadores da
inflamação (bradicinina, histamina e substância P), estudando-se o efeito destes
sobre a migração dos leucócitos e exsudação na inflamação induzida por estes
agentes flogísticos (Anexo 1).
ARTIGO SUBMETIDO À PUBLICAÇÃO
23
3. ARTIGO SUBMETIDO À PUBLICAÇÃO
Antiinflammatory evaluation of Solidago chilensis
Stella Goulart
a
, Maria Izabel Goularte Moritz
b
, Eloir Paulo Schenkel
b
and Tânia Silvia
Fröde
a
*
Journal of Ethnopharmacology
Impact factor: 1.554
Qualis: A
Short title: Antiinflammatory effects of Solidago chilensis
a
Department of Clinical Analysis, Center of Health Sciences, Federal University of Santa
Catarina, Campus Universitário - Trindade, 88040-970, Florianópolis, SC, Brazil.
b
Department of Pharmaceutical Science, Center of Health Sciences, Federal University of
Santa Catarina, Campus Universitário - Trindade, 88040-970, Florianópolis, SC, Brazil.
* Corresponding author: Phone: +55 48 99614846, FAX: +55 48 32440936.
e-mail address: [email protected] or t[email protected] (T. S. Fröde).
ARTIGO SUBMETIDO À PUBLICAÇÃO
24
Abstract
The aim of this study was: 1) To study and elucidate the antiinflammatory
effect of several extracts and their fractions of Solidago chilensis administered by
intraperitoneal route on the pleurisy in mice. Results: The ethanolic and aqueous
extracts of rhizomes, leaves or inflorescences inhibited leukocytes and neutrophils (P
< 0.05) in the inflammation induced by carrageenan. Only the aqueous extracts
reduced exudate (P < 0.05). The rhizomes extract aqueous (AE) and their two
fractions: butanolic fraction (BuOH) and aqueous residue (AR) inhibited leukocytes,
neutrophils, myeloperoxidase, adenosine-deaminase and TNFα induced by
carrageenan (Cg) (P < 0.05). AE and BuOH, but not AR, inhibited exudate, nitric
oxide and IL-1β levels (P < 0.05). This extract and their two fractions inhibited
leukocytes and mononuclears in the inflammation caused by bradykinin (BK) (P <
0.01) and AR also inhibited neutrophils (P < 0.05), total and differential leukocytes
induced by histamine (HIS) or substance P (SP) (P < 0.05). AE, BuOH and AR did
not inhibited the exudate caused by either BK, HIS or SP. Conclusion: Solidago
chilensis ethanolic and aqueous extracts have an important anti-inflammatory effect,
inhibiting cells in the inflammation caused by carrageenan. In addition, the rhizomes
aqueous extract and its derived fractions also decreased the pro-inflammatory
mediators release into the site of the inflammatory process. The rhizomes aqueous
extract and the butanolic fraction showed more evident anti-inflammatory actions.
Keywords: Solidago chilensis; Inflammation; Pleurisy; Mediators of inflammation;
Mice.
ARTIGO SUBMETIDO À PUBLICAÇÃO
25
1. Introduction
The large genus Solidago is placed in the family Asteraceae, comprising about
120 species natives of the North and South America, Europe and Asia (Weyerstahl et
al., 1993). In Brazil there is a diverse flora of Solidago chilensis Meyen, commonly
known as erva-lanceta, but it can also be referred to as “arnica”, “arnica-brasileira”,
“arnica-do-campo”, “arnica-silvestre”, a denomination derived from its usage as a
substitute for Arnica montana. Solidago chilensis is native of South America and is
present at Brazilian Pharmacopoeia (Brazilian Pharmacopoeia, 1929).
Solidago species have been used in popular medicine in several countries for
the treatment of several conditions of infection and inflammation (Apáti et al., 2003).
In Brazil, Solidago chilensis has ethnomedical application due to its important
antifungal, antioxidant and antimicrobial properties (Güntner et al., 1999; Duarte et
al., 2005; Morel et al., 2006).
Previous chemical investigations in a species of genus Solidago resulted in
the isolation of mono and sesquiterpenes (Bohlmann et al., 1980), diterpenes
(Bohlmann et al., 1980; Lu et al., 1993), flavonoids (Batyuk and Kovaleva, 1985),
saponins (Reznicek et al., 1991) and polyacetylenes (Lu et al., 1993). Investigations
of the rhizomes of Solidago chilensis reported in the isolation of components as the
labdane diterpene (solidagenone) (Schmeda-Hirschmann, 1987), showed to display
gastroprotective effect (Schmeda-Hirschmann et al., 2002). Since of the aerial parts
of Solidago chilensis resulted in the isolation of glycosilated flavonoids quercetrin
(Güntner et al., 1999).
In this work, the aim were:1) To screen approach of the ethanolic and aqueous
extracts obtained from rhizomes, leaves and inflorescences of Solidago chilensis
Meyen to identifying potential antiinflammatory properties, in the mouse model of
ARTIGO SUBMETIDO À PUBLICAÇÃO
26
pleurisy, 2) To elucidate the antiinflammatory effect of the extract that was more
effective in exhibiting the antiinflammatory activity, included their fractions, observing
it effect on leukocytes, exudation, myeloperoxidase, adenosine-deaminase, nitric
oxide, TNFα and IL-1β levels in the mouse model of pleurisy induced by Cg, BK, HIS
and SP.
2. Materials and methods
2.1. Plant materials
Rhizomes, leaves, and inflorescences of Solidago chilensis Meyen were
collected in Caibi, a city located in the State of Santa Catarina, Brazil. They were
collected in March of 2005, and were identified by the botanist Prof. Dr. Daniel
Falkenberg of the Department of Botany at the Federal University of Santa Catarina,
Florianópolis, SC, Brazil, where the voucher specimen (FLOR 34673) currently
deposited.
2.2. Preparation of the extracts and fractions
Solidago chilensis rhizomes, leaves or inflorescences were air-dried at room
temperature for 7 days. To attain the ethanolic extracts, the dried and powdered
rhizomes, leaves or inflorescences were macerated in hydrated ethanol 92,8° (plant:
solvent, 1:10, w/v) for 7 days. Subsequently, the extracts were filtered and
concentrated with a rotaevaporator apparatus. The yield were 10, 11 e 5%,
respectively. To obtain the aqueous extracts, the powdered rhizomes, leaves or
inflorescences were extracted using hot water at 90°C (plant: solvent, 1:10, w/v)
under infusion during 10 min, yielding 12, 10 e 8% respectively. Thereafter, the
extracts were filtered and an aliquot was lyophilized (Edward
®
E-C Micromodulyo
ARTIGO SUBMETIDO À PUBLICAÇÃO
27
Freezer Dryer, USA). Part of the aqueous extract of the rhizomes was partitioned
three times with 50 mL of n-BuOH, resulting in the butanolic fraction (yield 12,9%)
and aqueous residual fraction (yield 87,1%). These fractions were evaporated under
reduced pressure at temperature below 50º C, yielding dry residues, referred to in the
present study as “butanolic fraction (BuOH)” and “aqueous residue fraction (AR)”.
2.3. Animals
Swiss mice, weighing 18-25 g, were housed under standardized conditions
(room at constant temperature (25
0
C) with alternating 12-h periods of light and
darkness), humidity of 50-60 %, and were fed a standard mouse diet with water ad
libitum before use. This study was approved by the Committee for Ethics in Animal
Research of our university and performed in accordance with norms of the Brazilian
College of Animal Experimentation.
2.4. Experimental protocol
Pleurisy experiments were carried out as previously described (Saleh et al.,
1996; 1997; Fröde-Saleh et al., 1999; Da Cunha et al., 2001) and different phlogistic
agents were employed (carrageenan: Cg, bradykinin: BK, histamine: HIS and
substance P: SP). Cell migration and exudation was evaluated 4 h after phlogogen
administration. Myeloperoxidase (MPO), adenosine-deaminase (ADA), nitrate/nitrite
concentrations (NO
x
), tumor necrosis factor alpha (TNFα) and interleukin-1 beta (IL-
1β) levels were evaluated only in the protocols of carrageenan-induced pleurisy. In
separate experimental protocols it was used the indomethacin (5 mg/kg),
administered by intraperitoneal route (i.p.), 0.5 h before pleurisy induction, as a
reference drug.
ARTIGO SUBMETIDO À PUBLICAÇÃO
28
Samples of the fluid collected from the pleural cavity were stored in a freezer (-
20
o
C) and determinations of the exudation (amount of Evans Blue dye) were made
as scheduled on different days. Enzymes and cytokine assays were processed on
the same day as the pleurisy protocols.
Initially we evaluated the effect of ethanolic and aqueous extracts obtained
from rhizomes, leaves and inflorescences of Solidago chilensis on the mouse model
of pleurisy induced by Cg. In this protocol, different groups of animals were treated
(0.5 h before) with different doses (10-200 mg/kg) of these extracts administered by
intraperitoneal route (i.p.). The inflammatory parameters (cell migration and
exudation) were analyzed 4 h after. In this protocol we selected the rhizomes
aqueous extract that showed the best antiinflammatory action by inhibiting leukocytes
and/or exudation at lower doses than the other extracts. We also analyzed the
antiinflammatory properties of the two fractions of the rhizomes aqueous extract:
butanolic (BuOH) and aqueous residue (AR).
In another protocol to establish a standard the studied rhizomes aqueous
extract (AE) and their two isolated fractions (BuOH, AR) dose and timing to be used
in the experiments, different groups of animals were treated (0.5 h before) with
different doses of butanolic or aqueous residue fractions at doses of 10-200 mg/kg,
i.p. and the inflammatory parameters (cell migration and exudation) were analyzed 4
h after carrageenan injection. In another set of experiments, different groups of
animals were pretreated with one dose of aqueous extract, butanolic fraction or
aqueous residue at different time points (0.5-4 h) and the same inflammatory
parameters were evaluated 4 h after pleurisy induction. According to this protocol,
aqueous extract (25 mg/kg), butanolic fraction (25 mg/kg) or aqueous residue (50
ARTIGO SUBMETIDO À PUBLICAÇÃO
29
mg/kg) administered 0.5 h before carrageenan induction were elected as the doses
to be used in the experiments below.
In this protocol animals were randomly allocated in twenty one groups: 1)
Control-treated with sterile saline (NaCl 0.9%, i.pl.), 2) Cg (1%, i.pl.), 3) Cg (1%, i.pl.)
plus AE (10-200 mg/kg, i.p.), 4) Cg (1%, i.pl.) plus BuOH (10-200 mg/kg, i.p.), 5) Cg
(1%, i.pl.) plus AR (10-200 mg/kg, i.p.), 6) Cg (1%, i.pl.) plus indomethacin (0.5
mg/kg, i.p.), 7) BK (10 nmol, i.pl.), 8) BK (10 nmol, i.pl.) plus AE (25 mg/kg, i.p.), 9)
BK (10 nmol, i.pl.) plus BuOH (25 mg/kg, i.p.), 10) BK (10 nmol, i.pl.) plus AR (50
mg/kg, i.p.), 11) BK (10 nmol, i.pl.) plus indomethacin (0.5 mg/kg, i.p.), 12) HIS (100
µg, i.pl.), 13) HIS (100 µg, i.pl.) plus AE (25 mg/kg, i.p.), 14) HIS (100 µg, i.pl.) plus
BuOH (25 mg/kg, i.p.), 15) HIS (100 µg, i.pl.) plus AE (50 mg/kg, i.p.), 16) HIS (100
µg, i.pl.) plus indomethacin (0.5 mg/kg, i.p.), 17) SP (20 nmol, i.pl.), 18) SP (20 nmol,
i.pl.) plus AE (25 mg/kg, i.p.), 19) SP (20 nmol, i.pl.) plus BuOH (25 mg/kg, i.p.), 20)
SP (20 nmol, i.pl.) plus AR (50 mg/kg, i.p.) and 21) SP (20 nmol, i.pl.) plus
indomethacin (0.5 mg/kg, i.p.).
All extracts and indomethacin were administered 0.5 h prior to pleurisy
induction.
In the pleurisy induced by bradykinin, the animals were also treated with
captopril (5 mg/kg, i.p, 0.5 h before) to prevent the action of kininases (Campos and
Calixto, 1995).
2.4.1. Quantification of cell migration and exudation
After killing the animals (4 h after pleurisy), samples of the pleural cavity fluid
were collected for determinations of total and differential leukocyte contents and
exudation. Total leukocyte counts were determined in a Neubauer chamber diluting
ARTIGO SUBMETIDO À PUBLICAÇÃO
30
the exudates in Türk solution (1:20), and cytospin preparations of exudates were
stained with May-Grünwald-Giemsa for the differential count, which was performed
under an oil immersion objective.
The degree of exudation was determined by the measurement of the amount
of Evans blue dye extravasation in the exudate as previously described (Saleh et al.,
1996; 1997; Fröde-Saleh et al., 1999; Da Cunha et al., 2001). Thus, in each
experimental group, animals were previously challenged (1 h) with a solution of
Evans blue dye (25 mg/kg) administered by intravenous route (i.v.) in order to
evaluate the degree of exudation in the pleural cavity. On the day of the experiments,
a batch of stored samples was thawed at room temperature and the amount of dye
was estimated by colorimetry using an Elisa plate reader (Organon Teknika,
Roseland, New Jersey, USA) at 600 nm, by interpolation from a standard curve of
Evans blue dye in the range of 0.01 to 50 µg/mL.
2.4.2. Quantification of myeloperoxidase and adenosine-deaminase activities in
carrageenan-induced pleurisy
In-house assays of both MPO and ADA were employed according to the
methods developed by Rao et al. (1993) and Giusti and Galanti (1984). Using
conventional reagents, the concentration of each enzyme was estimated by means of
colorimetric measurements (absorbances of 450 and 630 nm, respectively) in an
ELISA plate reader (Organon Tecknica). Results were expressed as mU/ml (MPO)
and U/l (ADA). Detailed descriptions of these assays have been previously published
[Fröde and Medeiros, 2001].
ARTIGO SUBMETIDO À PUBLICAÇÃO
31
2.4.3. Quantification of nitrate/nitrite concentrations in carrageenan-induced pleurisy
Nitric oxide was measured as its breakdown products nitrite (NO
2
-
) and nitrate
(NO
3
-
) using the Griess method (Di Rosa et al., 1996). Samples of the exudation
obtained from control (treated with sterile saline), carrageenan-treated animals and
animals pretreated with either extracts or indomethacin were collected, separated
and stored at -20
0
C. The levels of nitrate/nitrite were determined as previously
described by Saleh et al. (1999). Results were expressed as μM.
2.4.4. Quantification of TNFα and IL-1β in carrageenan-induced pleurisy
Samples of the exudates obtained from control and carrageenan-treated
animals, and animals pretreated with either extracts or indomethacin, were collected
and immediately prepared for the analysis of cytokine levels. In this protocol,
commercially available kits were used with monoclonal specific antibodies for each
cytokine. The cytokine levels were measured by enzyme-linked immunosorbent
assay (ELISA), using Bioscience Pharmigen, USA (for TNFα) and Immuno Biological
Laboratories Co. Ltda, Japan (for IL-1β) kits according to the manufacturers
instructions. The ranges of the values detected by these assays were: TNFα (5 -
2000 pg/mL) and IL-1β (100 - 6400 pg/mL). The intra and interassay coefficients of
variation (CV) for TNFα and IL-1β were: intra CV: TNFα = 7.8±0.9% and IL-1β =
6.2±0.4%; inter CV: TNFα = 9.6±2.1% and IL-1β = 5.1±0.6%, sensitivities of TNFα =
5 pg/ml and IL-1β = 1.67 pg/ml. All cytokine concentrations were estimated by means
of colorimetric measurement at 450 nm on an ELISA plate reader (Organon Teknika,
Roseland, NJ, USA) by interpolation from a standard curve.
ARTIGO SUBMETIDO À PUBLICAÇÃO
32
2.5. Drugs
The following drugs and reagents were used: carrageenan (degree IV),
bradykinin, histamine, substance P, human neutrophil myeloperoxidase,
indomethacin, diphenylboryloxyethylamina (Sigma Chemical Co., St. Luis, MO, USA),
captopril (Ranbaxy Laboratories Limited Industrial, Dewas Madhya Pradesh, India),
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for quantitative determination of
mouse TNFα (BD - Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, USA) and rat IL-1β
(IBL - Immuno Biological Laboratories Co. Ltd., Fujioka-city, Gunma, Japan). May-
Grünwald dye (Newprov, Pinhais, PR, Brazil) and Giemsa dye (Laborclin, Pinhais,
PR, Brazil). For chromatographic analysis, we used diphenylboryloxyethylamina as
color reagent and aluminium sheets coated with silica gel GF 254 (Merk, Darmstadt,
Germany). Other reagents used were of analytical grade and were obtained from
different commercial sources.
2.6. Statistical analysis
Data are reported as mean ± SEM. Significant differences between groups
were determined by analysis of variance (ANOVA) complemented with Dunnett’s
and/or Student’s t tests. P < 0.05 was considered as indicative of significance.
3. Results
3.1. Pleurisy induced by carrageenan
3.1.1. Screening of the extracts
The ethanolic extracts of the rhizomes, leaves and inflorescences of Solidago
chilensis (100-200 mg/kg) were effective in inhibited leukocytes and neutrophils (P <
0.05), but they failed to reduce exudation (P > 0.05) (data not show). On the other
ARTIGO SUBMETIDO À PUBLICAÇÃO
33
hand, the aqueous extracts (10-200 mg/kg) inhibited leukocytes, neutrophils and
exudation (P < 0.05) (results not shown).
Our results also showed that rhizomes aqueous extract inhibited
antiinflammatory parameters (leukocytes and/or exudation) at lower doses (25
mg/kg) than leaves or inflorescences (50 mg/kg) (P < 0.05) (results not shown). By
this fact the following experiments were realized using rhizomes aqueous extract and
their two fractions (butanolic and aqueous residue) for investigate other inflammatory
parameters.
3.1.2. Effects of rhizomes extracts of Solidago chilensis and indomethacin on cellular
migration and exudation
The rhizomes aqueous extract of Solidago chilensis (10 to 200 mg/kg)
significantly decreased the leukocyte migration by 31 ± 6 to 77 ± 4 % (P < 0.01) (Fig.
1A), due to neutrophils inhibition by 32 ± 11 to 99 ± 1 % (P < 0.05) (Fig. 1B).
Furthermore, this extract at dose of 200 mg/kg produced a significant increase of
mononuclears by 53 ± 25 % (P < 0.05) (Fig. 1C). Under the same experimental
conditions, aqueous extract (25 to 200 mg/kg) were able to reduce the exudate by 24
± 5 to 40 ± 4 % (P < 0.05) (Fig. 1D) in the inflammation induced by carrageenan.
The analysis of the two fractions from rhizomes aqueous extract revealed that
the butanolic fraction (25 to 200 mg/kg) were effective in inhibiting leukocyte
migration by 72 ± 1 to 76 ± 2 % (P < 0.01) (Fig. 2A), due to neutrophils inhibition by
93 ± 1 to 98 ± 1 % (P < 0.01) (Fig. 2B). The butanolic fraction did not change
mononuclear cells (P > 0.05) (Fig. 2C) and the exudation was inhibited only at dose
of 50 mg/kg by 19 ± 2 % (P < 0.05) (Fig. 2D). The butanolic fraction (10 mg/kg) did
not vary any the studied inflammatory parameters.
ARTIGO SUBMETIDO À PUBLICAÇÃO
34
The aqueous residue (50 to 200 mg/kg) produced a significant decrease of
leukocyte by 48 ± 3 to 67 ± 3 % (P < 0.01) (Fig. 3A), via inhibition of neutrophils by
63 ± 8 to 79 ± 11 % (P < 0.01) (Fig. 3B). In addition, the aqueous residue failed to
reduce the mononuclear cells and exudation (P > 0.05) (Figs. 3C and 3D). The doses
of 10 and 25 mg/kg of aqueous residue did not modify the studied parameters.
The time course profile analysis for rhizomes aqueous extract and two
fractions of Solidago chilensis demonstrated that only the pretreatment of 0.5 h was
effective in inhibiting the inflammatory parameters studied (results not shown).
The curve dose-response and time course profile studied indicated that the
inhibitory effects of the aqueous extract, butanolic fraction or aqueous residue
observed upon leukocyte migration or exudate were optimal in animals injected 0.5 h
earlier with 25 mg/kg to AE and BuOH or 50 mg/kg to AR. For this reason these
doses and pre-treatment time were chosen for other experiments.
As expected, the indomethacin (cyclooxygenase inhibitor, 5 mg/kg),
administered 0.5 h before, caused a significant inhibition of leukocyte migration by 63
± 5 % (P < 0.01), neutrophils by 64 ± 5 % (P < 0.01), mononuclear cells by 66 ± 11 %
(P < 0.05) and exudation by 31 ± 5 % (P < 0.01) in the mouse model pleurisy induced
by carrageenan (Figs. 1, 2 and 3).
3.1.3. Effects of rhizomes extracts of Solidago chilensis and indomethacin on
myeloperoxidase, adenosine-deaminase activities and nitrate/nitrite levels
The pretreatment (0.5 h) of animals with rhizomes aqueous extract and their
two fractions caused a marked reduction in myeloperoxidase (% of inhibition: AE: 35
± 7; BuOH: 33 ± 7 and AR: 63 ± 10) (P < 0.01) (Fig. 4A) and adenosine-deaminase
activities (% of inhibition: AE: 56 ± 6; BuOH: 27 ± 10 and AR: 42 ± 8) (P < 0.01) (Fig.
ARTIGO SUBMETIDO À PUBLICAÇÃO
35
4B). Under the same conditions, the aqueous extract and butanolic fraction
decreased the nitrate/nitrite concentrations (% of inhibition: AE: 48 ± 5 and BuOH: 60
± 5) (P < 0.01) (Fig. 4C). The aqueous residue was ineffective in inhibiting
nitrate/nitrite levels (P > 0.05) (Fig. 4C).
The indomethacin pretreatment presented an inhibitory effect on
myeloperoxidase by 39 ± 7 %, adenosine-deaminase activities by 65 ± 2 % and
nitrate/nitrite levels by 56 ± 8 % (P < 0.01) (Figs. 4A, 4B and 4C).
3.1.4. Effects of rhizomes extracts of Solidago chilensis and indomethacin on
cytokine levels
The rhizomes aqueous extract and two fractions studied was also effective in
inhibiting TNFα levels (% of inhibition: AE: 72 ± 8; BuOH: 70 ± 9 and AR: 72 ± 12) (P
< 0.05) (Fig. 5A). In addition, the aqueous extract and butanolic fraction at dose of 25
mg/kg, but not aqueous residue (50 mg/kg), showed a small reduce in IL-1β levels
(% of inhibition: AE: 33 ± 0 and BuOH: 35 ± 0) (P < 0.05) (Fig. 5B).
The indomethacin treatment showed a significant enhancement in TNFα levels
by 131 ± 4 % (P < 0.01) (Fig. 5A) and a significant inhibition in IL-1β levels by 41 ± 0
% (P < 0.01) (Fig. 5B).
3.2. Pleurisy induced by bradykinin, histamine or substance P
3.2.1. Effects of rhizomes extracts of Solidago chilensis and indomethacin on cellular
migration and exudation
The rhizomes aqueous extract and their fractions analyzed significantly
reduced leukocyte and mononuclear influxes in the pleurisy induced by BK, HIS or SP
(P < 0.05) (Table 1) and neutrophils in the pleurisy induced by HIS or SP (P < 0.05)
ARTIGO SUBMETIDO À PUBLICAÇÃO
36
(Table 1). However only aqueous residue (AR: 50 mg/kg) inhibited neutrophils
induced by BK (P < 0.05) (Table 1). In this protocol no extracts inhibited the exudation
(P > 0.05) (results not shown).
In relation to indomethacin as expected, this drug significantly inhibited
leukocytes and neutrophils stimulated by all studied phogogens (P < 0.05) (Table 1).
Indomethacin was also able to inhibit mononuclears induced by either, BK and HIS (P <
0.05) (Table 1) and exudation induced by HIS (P < 0.05) (results not shown).
4. Discussion
Our results demonstrated that ethanolic and aqueous extracts from rhizomes,
leaves, and inflorescences of Solidago chilensis have important anti-inflammatory
properties which inhibit the inflammation caused by different phlogistic agents in an
acute model of inflammation, in mice. Furthermore, in this particular model, the
rhizomes aqueous extract displayed an anti-inflammatory effect at lower doses than
did the other extracts analyzed by inhibiting the same inflammatory parameters. The
observed anti-inflammatory effects of the rhizomes aqueous extract and its two
derived fractions were similar to those obtained with animals pre-treated with
indomethacin, an inhibitor of cyclooxygenase.
The antiinflammatory actions of Solidago chilensis were demonstrated by
inhibition of leukocytes in the pleurisy induced by different phogogens: carrageenan,
bradykinin, histamine and substance P. The antiinflammatory effect was more
evident in animals pretreated with aqueous extract and butanolic fraction, once lower
doses of these (25 mg/kg) inhibited the same inflammatory parameters than aqueous
residue (50 mg/kg).
ARTIGO SUBMETIDO À PUBLICAÇÃO
37
Leukocytes migration in response to inflammatory stimulus involves interaction
of leukocytes with chemotactic/chemoattractant and expression of adhesion
molecules (Schmid-Schonbein, 2006).
Carrageenan, bradykinin, histamine and substance P are substances involved
in the inflammatory responses promoting the recruitment of leukocytes and/or
exudation by different mechanisms (Saleh et al., 1997; Fröde-Saleh et al., 1999;
Endo, 2001; Santos et al., 2003; O´Connor et al., 2004).
In our work Solidago chilensis inhibited the leukocytes induced by all the
studied phogogens. This inhibitory effect was associated with a marked reduction of
myeloperoxidase and adenosine-deaminase activities, as well as the inhibition of
TNFα and IL-1β levels.
Many studies have been demonstrated that the release of myeloperoxidase
(MPO) or adenosine deaminase (ADA) from leukocytes at the site of injury reflect the
activation of both neutrophils and lymphocytes (Fröde and Medeiros, 2001). The
decrease of these enzymes can corroborate to the inhibitory effect on both
neutrophils and mononuclears.
TNFα and IL-1β are recognize to stimulate cellular chemotaxis and adhesion
molecules expression (Borish and Steinke, 2003).
Nitric oxide is another important mediator that is recognized to be involved in
exudation and leukocyte migration in the inflammatory process (Cuzzocrea et al.,
2000).
We can hypothesized that the anti-inflammatory actions of Solidago Chilensis
in the mouse pleurisy model may be direct to the inhibition of TNFα and IL-1β levels,
as well as inhibition of pro-inflammatory mediators (substance P, bradykinin,
histamine and nitric oxide levels) at local of inflammation. This hypothesis is based
ARTIGO SUBMETIDO À PUBLICAÇÃO
38
on the fact that TNFα and IL-1β can release many proinflammatory mediators such
as SP, BK and histamine to the local inflammatory process. Furthermore these
phlogistic agents can release TNFα and IL-1β from activated cells promoting the
amplification of inflammatory cascade. Example can be cited which TNFα and IL-1β
can release nitric oxide in experimental model of arthritis (O´Shaughnessy et al.,
2006). IL-1β can also release substance P and nitric oxide via cyclooxygenase-2
pathway in rat dorsal root ganglion cells in in vitro experiments (Morioka et al., 2002).
Bradykinin promotes the neutrophils influx and release of TNFα and IL-1β in different
inflammation models (Santos et al., 2003). TNFα and IL-1β can induce histamine-
forming enzyme histidine decarboxilase to release histamine from mast cells and
basophils promoting immune responses and variety of inflammatory diseases (Endo,
2001).
It is important to comment that the constituents of Solidago Chilensis alone or
together can be involved in these anti-inflammatory effects demonstrated here.
Many studies in vivo or in vitro have addressed the antiinflammatory effects of
flavonoids such as the inhibition of cytokines including tumour necrosis factor-α in
different inflammatory and allergy models [Nair et al., 2006]; adhesion molecules
such as E-selectin [Takano-Ishikawa et al., 2003]; inducible isoforms of
cyclooxygenase, nitric oxide, protein exudation and leukocyte influx [Pelzer et al.,
1998; Sakata et al., 2003].
Antiinflammatory properties of sesquiterpenes compounds have also been
demonstrated by Feltenstein et al. (2004) and Jimenez-Estrada et al. (2006) by
inhibiting paw oedema induced by carrageenan in rats, or by preventing NF-kappa B
and NF-AT activating (Siedle et al., 2004).
ARTIGO SUBMETIDO À PUBLICAÇÃO
39
Kim et al (2006) have also been related that saponins inhibited VCAM-1 and
ICAM-1 expression on human endothelial cells stimulated by TNFα.
Conclusion
Based on the results described here we can conclude that Solidago chilensis
rhizomes, leaves, and inflorescences ethanolic and aqueous extracts have an
important anti-inflammatory effect, inhibiting cells in the inflammation caused by
carrageenan. In addition, the rhizomes aqueous extract and its derived fractions
decreased the pro-inflammatory mediators release into the site of the inflammatory
process. The rhizomes aqueous extract and the butanolic fraction showed more
evident anti-inflammatory actions.
Acknowledgements
The authors would like to thank student Karen Luise Lang for providing
excellent technical support during the study. This study was supported by
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Brazil).
ARTIGO SUBMETIDO À PUBLICAÇÃO
40
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46
Legends
Figure 1- Effect of Solidago chilensis rhizomes aqueous extract (AE: 10-200 mg/kg,
i.p.) on leukocytes (A), neutrophils (B), mononuclears (C) and exudation (D) on
carrageenan-induced pleurisy in mice. *P < 0.05 and **P < 0.01. C = Control =
Saline, Cg = Carrageenan (1%), Indo = Indomethacin (5 mg/kg, i.p.). N = 5-8.
Figure 2- Effect of butanolic fraction of Solidago chilensis rhizomes (BuOH: 10-200
mg/kg, i.p.) on leukocytes (A), neutrophils (B), mononuclears (C) and exudation (D)
on carrageenan-induced pleurisy in mice. *P < 0.05 and **P < 0.01. C = Control =
Saline, Cg = Carrageenan (1%), Indo = Indomethacin (5 mg/kg, i.p.). N = 5-8.
Figure 3- Effect of aqueous residue of Solidago chilensis rhizomes (AR: 10-200
mg/kg, i.p.) on leukocytes (A), neutrophils (B), mononuclears (C) and exudation (D)
on carrageenan-induced pleurisy in mice. *P < 0.05 and **P < 0.01. C = Control =
Saline, Cg = Carrageenan (1%), Indo = Indomethacin (5 mg/kg, i.p.). N = 5-8.
Figure 4- Effect of aqueous extract (AE: 25 mg/kg, i.p.), butanolic fraction (BuOH: 25
mg/kg, i.p.) or aqueous residue (AR: 50 mg/kg, i.p.) of Solidago chilensis rhizomes on
myeloperoxidase (A) and adenosine-deaminase (B) activities and nitrite/nitrate levels
(C) on carrageenan-induced pleurisy in mice. *P < 0.05 and **P < 0.01. C = Control =
Saline, Cg = Carrageenan (1%), Indo = Indomethacin (5 mg/kg, i.p.). N = 5-8.
Figure 5- Effect of aqueous extract (AE: 25 mg/kg, i.p.), butanolic fraction (BuOH: 25
mg/kg, i.p.) or aqueous residue (AR: 50 mg/kg, i.p.) of Solidago chilensis rhizomes on
TNFα (A) and IL-1β (B) levels on carrageenan-induced pleurisy in mice. *P < 0.05
and **P < 0.01. C = Control = Saline, Cg = Carrageenan (1%), Indo = Indomethacin
(5 mg/kg, i.p.). N = 5-8.
ARTIGO SUBMETIDO À PUBLICAÇÃO
47
Table 1- Effects of Solidago chilensis rhizomes extracts upon cell migration in the
pleurisy induced by bradykinin, histamine or substance P.
Groups/Doses Bradykinin Histamine Substance P
Leukocytes (x10
6
)
C
a
2.40 ± 0.21 2.29 ± 0.36 2.72 ± 0.15
AE 25 mg/kg
b
1.08 ± 0.17** 0.95 ± 0.11** 1.17 ± 0.15**
BuOH 25 mg/kg
b
1.40 ± 0.10** 1.23 ± 0.20* 1.12 ± 0.34**
AR 50 mg/kg
b
1.22 ± 0.12** 1.01 ± 0.09** 1.56 ± 0.20**
Indo 5 mg/kg
b
0.97 ± 0.19** 1.01 ± 0.15** 2.10 ± 0.29*
Neutrophils (x10
6
)
C
a
0.21 ± 0.07 0.41 ± 0.09 0.91 ± 0.13
AE 25 mg/kg
b
0.12 ± 0.05 0.04 ± 0.01** 0.10 ± 0.02**
BuOH 25 mg/kg
b
0.11 ± 0.04 0.21 ± 0.02* 0.14 ± 0.03**
AR 50 mg/kg
b
0.06 ± 0.02* 0.09 ± 0.01* 0.14 ± 0.01**
Indo 5 mg/kg
b
0.04 ± 0.01* 0.08 ± 0.02** 0.60 ± 0.08**
Mononuclears (x10
6
)
C
a
2.19 ± 0.22 1.88 ± 0.27 1.81 ± 0.09
AE 25 mg/kg
b
0.96 ± 0.13** 0.91 ± 0.11* 1.07 ± 0.14**
BuOH 25 mg/kg
b
1.29 ± 0.10** 1.02 ± 0.19* 0.98 ± 0.31*
AR 50 mg/kg
b
1.16 ± 0.12** 0.92 ± 0.09* 1.42 ± 0.19*
Indo 5 mg/kg
b
0.93 ± 0.19** 0.93 ± 0.15* 1.50 ± 0.23
Aqueous extract (AE: 25 mg/kg), butanolic fraction (BuOH: 25 mg/kg) or aqueous
residue (AR: 50 mg/kg) of Solidago chilensis rhizomes administered in different
groups of animals 0.5 h before pleurisy induction by bradykinin, histamine or
substance P. C = Bradykinin (10 nmol/cav.), histamine (100 μg/cav.) or substance P
(20 nmol/cav.). Indo = Indomethacin (5 mg/kg). *P < 0.05 and **P < 0.01. a =
administered by intrapleural route; b = administered by intraperitoneal route. N = 5 to
8.
ARTIGO SUBMETIDO À PUBLICAÇÃO
48
C Cg Indo 10 25 50 100 200
0
2
4
6
8
**
**
**
**
**
**
**
Leukocytes (x10
6
)
AE (mg/kg, i.p.)
C Cg Indo 10 25 50 100 200
0
2
4
6
8
**
**
*
**
**
**
**
Neutrophils (x10
6
)
AE (mg/kg, i.p.)
C Cg Indo 10 25 50 100 200
0
1
2
3
*
*
Mononuclears (x10
6
)
AE (mg/kg, i.p.)
C Cg Indo 10 25 50 100 200
0
3
6
9
12
15
**
**
**
**
**
*
Exudation (
μ
g/mL)
AE (mg/kg, i.p.)
A
B
C
D
ARTIGO SUBMETIDO À PUBLICAÇÃO
49
C Cg Indo 10 25 50 100 200
0
2
4
6
8
**
**
**
**
**
**
Leukocytes (x10
6
)
BuOH (mg/kg, i.p.)
C Cg Indo 10 25 50 100 200
0
2
4
6
8
**
**
**
**
**
**
Neutrophils (x10
6
)
BuOH (mg/kg, i.p.)
C Cg Indo 10 25 50 100 200
0
1
2
3
*
Mononuclears (x10
6
)
BuOH (mg/kg, i.p.)
C Cg Indo 10 25 50 100 200
0
3
6
9
12
15
*
**
**
Exudation (
μ
g/mL)
BuOH (mg/kg, i.p.)
A
B
C
D
ARTIGO SUBMETIDO À PUBLICAÇÃO
50
C Cg Indo 10 25 50 100 200
0
2
4
6
8
**
**
**
**
**
Leukocytes (x10
6
)
AR (mg/kg, i.p.)
C Cg Indo 10 25 50 100 200
0
2
4
6
8
**
**
**
**
**
Neutrophils (x10
6
)
AR (mg/kg, i.p.)
C Cg Indo 10 25 50 100 200
0
1
2
3
*
Mononuclears (x10
6
)
AR (mg/kg, i.p.)
C Cg Indo 10 25 50 100 200
0
3
6
9
12
15
**
**
Exudation (
μ
g/mL)
AR (mg/kg, i.p.)
A
B
C
D
ARTIGO SUBMETIDO À PUBLICAÇÃO
51
C Cg Indo AE BuOH AR
0
50
100
150
200
250
**
**
**
**
**
Myeloperoxidase (mU/mL)
C Cg Indo AE BuOH AR
0
3
6
9
12
15
** **
**
**
**
Adenosine-deaminase (U/L)
C Cg Indo AE BuOH AR
0
5
10
15
20
25
**
**
**
**
Nitrate/Nitrite (
μ
M)
A
B
C
ARTIGO SUBMETIDO À PUBLICAÇÃO
52
C Cg Indo AE BuOH AR
0
1000
2000
3000
4000
5000
**
**
**
**
*
TNFα (pg/mL)
C Cg Indo AE BuOH AR
0
250
500
750
1000
1250
1500
**
**
*
*
IL-1β (pg/mL)
A
B
DISCUSSÃO
53
4. DISCUSSÃO
Os resultados obtidos demonstraram que entre os diferentes extratos
estudados: etanólicos e aquosos das raízes, folhas e inflorescências de Solidago
chilensis, os aquosos apresentaram melhores efeitos antiinflamatórios, inibindo os
leucócitos e a exsudação na pleurisia induzida pela carragenina. Esta afirmação está
baseada no uso de doses menores dos extratos aquosos (10-200 mg/kg), que
inibiram a migração de leucócitos quando comparados as doses dos extratos
etanólicos (100-200 mg/kg), e no fato de que apenas os extratos aquosos inibiram a
exsudação neste processo inflamatório. Outro fator importante é que o extrato
aquoso das raízes demonstrou melhor efeito antiinflamatório, quando comparado
aos das folhas e das inflorescências, inibindo a exsudação em doses menores (25
mg/kg) do que as das folhas e das inflorescências (50 mg/kg).
Uma vez que o extrato aquoso das raízes foi o mais eficaz em inibir a
migração leucocitária e a exsudação no modelo da pleurisia induzida pela
carragenina em camundongos, todos os demais experimentos para avaliação do
mecanismo da ação antiinflamatória de Solidago chilensis foram realizados
utilizando-se o mesmo e mais duas frações obtidas a partir dele: a fração
butanólica e o resíduo aquoso.
A ação antiinflamatória deste extrato e suas frações foi demonstrada pela
inibição da migração de leucócitos na pleurisia induzida por diferentes agentes
flogísticos: carragenina, bradicinina, histamina e substância P. O efeito mais
evidente foi aquele observado nos animais tratados com o extrato aquoso e a fração
butanólica, uma vez que estes em doses menores (25 mg/kg), inibiram o influxo de
leucócitos quando comparado com aqueles animais tratados com o resíduo aquoso
(50 mg/kg).
A migração de leucócitos em reposta a um estímulo inflamatório envolve a
interação de leucócitos com as moléculas de adesão (MULLER-LADNER et al.,
2005; SCHMID-SCHONBEIN, 2006). Neste contexto, o estudo realizado por Yun,
DeCarlo e Hunter (2006) demonstrou uma correlação positiva entre o aumento da
expressão das moléculas de adesão endotelial tipo 1 (ELAM-1), intracelular tipo 1
(ICAM-1), vascular tipo 1 (VCAM-1) e aquelas expressas em células T (CD99) com o
aumento da aderência de leucócitos humanos à células endoteliais de veias
umbilicais, concluindo-se que o recrutamento dos leucócitos é dependente da
expressão de moléculas de adesão.
DISCUSSÃO
54
Os agentes flogísticos estudados: carragenina, bradicinina, histamina e
substância P estão envolvidos na resposta inflamatória promovendo o recrutamento
de leucócitos e/ou exsudação por diferentes mecanismos.
No modelo da pleurisia induzida pela carragenina foi observado aumento
significativo da migração de leucócitos às custas de neutrófilos após a administração
da carragenina dentro da cavidade pleural de camundongos (SALEH; CALIXTO;
MEDEIROS, 1996). Nesta fase ocorre um aumento da exsudação em nível local e a
participação de diversos mediadores da inflamação como enzimas do tipo
mieloperoxidase e adenosina-deaminase, metabólitos do óxido nítrico (nitrato e
nitrito) e citocinas do tipo pró-inflamatórias (SALEH; CALIXTO; MEDEIROS, 1996;
1999; FRÖDE; MEDEIROS, 2001; FRÖDE; SOUZA; CALIXTO, 2001, 2002;
DALMARCO; FRÖDE; MEDEIROS, 2002, 2004). Corroborando com o descrito
acima, o estudo realizado por Menegazzi e colaboradores (2006) demonstrou que a
carragenina induziu o aumento da expressão de moléculas de adesão do tipo ICAM-
1 no modelo da pleurisia induzida pela carragenina, em camundongos.
O extrato aquoso das raízes de Solidago chilensis e suas frações:
butanólica e resíduo aquoso também foram efetivos em inibir a migração de
leucócitos às custas de mononucleares induzidos pela bradicinina, no modelo
experimental estudado.
A bradicinina é um importante vasodilatador e modulador da reação
inflamatória. Este mediador é rapidamente degradado pela enzima conversora de
angiotensina (ECA) e outras proteinases. A inibição desta degradação aumenta a
concentração e os efeitos da bradicinina. Devido ao aumento nos níveis de cálcio e
à liberação de óxido nítrico derivado da ativação da NOSe, a bradicinina é
estimulada e contribui para a vasodilatação. Esta substância promove também a
contração de células endoteliais e a formação de edema intersticial, via ativação dos
fatores de transcrição, tal como o fator de transcrição nuclear NF-kappa B (NF-κB)
(FREISE; PALMES; SPIEGEL, 2006).
Estudos também têm demonstrado o efeito da bradicinina no influxo
leucocitário, como por exemplo, Saleh, Calixto e Medeiros (1997) demonstraram que
a bradicinina promoveu aumento do influxo de leucócitos às custas de
mononucleares no modelo da pleurisia, em camundongos. Outros estudos
demonstraram que no modelo de inflamação pulmonar alérgica em camundongos
sensibilizados com ovoalbumina, a administração do antagonista seletivo do receptor
DISCUSSÃO
55
BB
1
da bradicinina (R-954) reduziu o influxo de polimorfonucleares e a secreção de
muco no lavado broncoalveolar destes animais (GAMA LANDGRAF et al., 2004).
Outros resultados obtidos neste estudo demonstraram, ainda, que o extrato
aquoso, a fração butanólica e o resíduo aquoso das raízes de Solidago chilensis
foram efetivos em inibir a migração leucocitária às custas da migração de neutrófilos
e de mononucleares para a cavidade pleural, na inflamação mediada por histamina.
A histamina é um mediador pró-inflamatório envolvido na quimiotaxia celular e
na exsudação, além da ativação de citocinas pró-inflamatórias (interleucina-1 alfa:
IL-1α, interleucina-6: IL-6 e interleucina-1 beta: IL-1β) e na contração da musculatura
lisa (JUTEL; BLASER; AKDIS, 2005; AKDIS; SIMONS, 2006; HASHIMOTO; OHATA;
HONDA, 2006). Outros exemplos são os estudos in vitro que demonstraram que a
liberação de histamina em cultura de mastócitos induzida pelo ácido lisofosfatídico
(LFA) promoveu o aumento da exsudação (HASHIMOTO; OHATA; HONDA, 2006).
O estudo realizado por Da Cunha e colaboradores (2001) demonstrou
aumento significante na exsudação e na migração de leucócitos às custas de
mononucleares no modelo da pleurisia induzida pela histamina, em camundongos.
Saleh, Calixto e Medeiros (1999) demonstraram, também, a participação da
histamina via a ativação de seu receptor H
1
, no modelo da pleurisia induzida por
carragenina, em camundongos. Este efeito foi observado quando os animais
inflamados foram tratados com terfenandina, antagonista seletivo de receptores H
1
,
causando inibição da migração de leucócitos e de polimorfonucleares na cavidade
pleural de animais com pleurisia.
Nos experimentos observou-se também que o extrato aquoso das raízes de
Solidago chilensis e as frações butanólica e resíduo aquoso mais uma vez inibiram
de forma significativa a migração de leucócitos às custas de neutrófilos e de
mononucleares para a cavidade pleural na inflamação induzida pela substância P.
A substância P é um potente mediador envolvido em diversas reações
inflamatórias por promover o aumento da permeabilidade vascular, a formação de
edema, o aumento da expressão de moléculas de adesão em células endoteliais, a
ativação de neutrófilos, além da contração da musculatura lisa (CHEN et al., 2006).
Um estudo recente relatou que em animais previamente tratados com
antagonistas específicos para os receptores NK
1
, NK
2
e NK
3
(SR140333, SR48968 e
SR142801, respectivamente), observou-se diminuição do influxo de leucócitos para
a cavidade peritoneal no modelo de hiperalgesia induzida pela formalina, em ratos
DISCUSSÃO
56
(SANTOS et al., 2004). Outro estudo revelou que a substância P age via receptor de
taquicinina NK
1
promovendo o influxo de leucócitos induzidos por TNFα, no modelo
de inflamação cutânea, em camundongos (COSTA et al., 2006).
Nestes experimentos o extrato estudado de Solidago chilensis e suas frações
inibiram a migração de leucócitos induzida por todos estes agentes flogísticos
citados anteriormente. Este efeito foi associado à redução das atividades das
enzimas mieloperoxidase e adenosina-deaminase, bem como dos níveis de TNFα e
IL-1β. Observou-se, também, que o extrato aquoso das raízes e a fração butanólica
inibiram a maioria dos parâmetros inflamatórios quando comparados ao do resíduo
aquoso. Além disso, o extrato aquoso e a fração butanólica, mas não o resíduo
aquoso, inibiram os níveis de IL-1β.
Muitos estudos têm demonstrado que a liberação da mieloperoxidase (MPO)
ou adenosina-deaminase (ADA) pelos leucócitos no sítio de inflamação reflete a
ativação de neutrófilos e linfócitos, respectivamente (FRÖDE; MEDEIROS, 2001;
GINES et al., 2002; KINHULT et al., 2003; LAU et al., 2005). A inibição destas
enzimas pode colaborar para o efeito de inibição dos leucócitos observados neste
estudo.
É reconhecido que a enzima mieloperoxidase participa da defesa do
hospedeiro auxiliando na destruição do agente estranho por meio da liberação de
espécies reativas de oxigênio (ROS) e também, pode estar envolvida na progressão
de lesões teciduais em processos inflamatórios crônicos (HANSSON; OLSSON;
NAUSEEF, 2006).
A importância desta enzima foi observada em estudos utilizando-se
camundongos knockout para a molécula de adesão P-selectina, tendo sido
constatado que esses animais apresentaram diminuição significativa da atividade da
mieloperoxidase, indicando a inibição do influxo de neutrófilos ativados, no modelo
de falência renal induzida por isquemia/reperfusão, em camundongos (SINGBARTL;
GREEN; LEY, 2000).
Já a atividade da enzima adenosina-deaminase é proporcional à
concentração do autacóide adenosina, que se encontra aumentado na inflamação,
onde as células ativadas liberam grandes quantidades deste autacóide
(BLACKBURN, 2003). Um estudo recente demonstrou que em camundongos
deficientes de adenosina-deaminase, a aplicação desta enzima contribuiu para o
aumento nos níveis de adenosina, fato este associado com a inflamação pulmonar,
DISCUSSÃO
57
a deposição de colágeno e a alteração da estrutura de vias aéreas de camundongos
(CHUNN et al., 2005). Kuno e colaboradores (2006) demonstraram que a
administração de um inibidor da enzima adenosina-deaminase humana (FR234938)
diminuiu a produção da citocina pró-inflamatória TNFα e aumentou a produção da
citocina antiinflamatória interleucina-10 (IL-10) no modelo de inflamação induzido por
lipopolissacarídeo (LPS), em camundongos.
Outros resultados também demonstraram que a inibição de leucócitos foi
associada à inibição dos níveis das citocinas pró-inflamatórias TNFα e IL-1β, que
são reconhecidas por estimularem a quimiotaxia celular e a expressão de moléculas
de adesão (BORISH; STEINKE, 2003; MOLLER; VILLIGER, 2006). Estudos in vitro
realizados por Butler e colaboradores (2005) demonstraram que o TNFα
estimulou a quimiotaxia de neutrófilos, em cultura de células endoteliais de
veias umbilicais humanas.
No modelo da pleurisia induzida pela carragenina, em camundongos, já
foi relatado que tanto a IL-1β como o TNFα promoveram aumento dos leucócitos
e dos neutrófilos no lavado pleural dos camundongos inflamados (FRÖDE;
SOUZA; CALIXTO, 2001). Estudos in vitro relataram que o TNFα induziu
significativamente a expressão de moléculas de adesão E-selectina, ICAM-1 e
VCAM-1 e a ativação do NF-κB em culturas de células endoteliais da
microvasculatura pulmonar humana (JIANG et al., 2005).
Neste contexto vale a pena comentar sobre o fator de transcrição NF-κB, que
possui papel central na regulação da expressão de genes que codificam as citocinas
pró-inflamatórias (IL-1, IL-6 e TNFα), quemocinas (IL-8), moléculas de adesão
(ICAM-1) e enzimas pró-inflamatórias (NOSi e ciclooxigenase-2) (CHRISTMAN;
SADIKOT; BLACKWELL, 2000). Desta forma, a regulação e o controle da ativação
do fator NF-κB pode ser uma importante estratégia terapêutica na inibição da
liberação de mediadores pró-inflamatórios e da expressão de moléculas de adesão
(BREMER; HEINRICH, 2002; ZINGARELLI; SHEEHAN; WONG, 2003). Estudos
demonstraram ainda que a atividade do NF-κB está significativamente aumentada 24
h e diminuída 48 h após a indução da inflamação no modelo da pleurisia induzida
pela carragenina, em ratos. Este aumento na atividade foi correlacionado com a
formação do exsudato e a infiltração de leucócitos na cavidade pleural destes
animais (D’ACQUISTO et al., 1999).
DISCUSSÃO
58
O vegetal em estudo também inibiu a exsudação e a concentração de
nitrato/nitrito no modelo da pleurisia induzida pela carragenina. Observou-se, ainda,
que o extrato aquoso das raízes e a fração butanólica, mas não o resíduo aquoso,
inibiram a exsudação e os níveis de nitrato/nitrito. Este fato demonstra um efeito
antiinflamatório mais evidente nos animais tratados com o extrato aquoso e a fração
butanólica.
O óxido nítrico é um importante mediador pró-inflamatório envolvido na
exsudação (CUZZOCREA et al., 2000; DAL SECCO et al., 2006; PRADO et al.,
2006). No modelo do edema de pata induzido por enterotoxina B de Staphylococcus,
observou-se aumento da exsudação e dos níveis de mieloperoxidase, em
camundongos, indicando a presença de leucóticos ativados. O edema e a atividade
de mieloperoxidase foram inibidos quando os animais receberam tratamento prévio
com N
G
-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) ou aminoguanidina (inibidores
seletivos da NOSi), por via intravenosa ou subplantar (FRANCO-PENTEADO et al.,
2001). Outros estudos ainda relataram que na pleurisia induzida por carragenina
ocorreu aumento da migração de leucócitos e dos níveis de metabólicos do óxido
nítrico, em camundongos (SALEH; CALIXTO; MEDEIROS, 1999; DALMARCO;
FRÖDE; MEDEIROS, 2002, 2004).
Além disso, a inibição da exsudação observada com o extrato aquoso das
raízes e suas frações também parece estar relacionada à inibição das citocinas pró-
inflamatórias TNFα e IL-1β, reconhecidas por promoverem a exsudação em
diferentes modelos experimentais in vitro e in vivo (FRÖDE; SOUZA; CALIXTO,
2001; CHUNG et al., 2005; CUZZOCREA et al., 2006).
Todos os efeitos antiinflamatórios de Solidago chilensis observados neste
estudo poderiam ser atribuídos em parte aos seus constituintes flavonoídicos, para
os quais já foram demonstradas propriedades antiinflamatórias.
Muitos estudos in vitro e in vivo já relataram tais efeitos antiinflamatórios dos
flavonóides. Por exemplo Ueda, Yamazaki e Yamazaki (2004) demonstraram que
substâncias desta classe inibiram os níveis de TNFα em experimentos in vitro
estimulados por LPS, bem como em experimentos in vivo (modelo de edema de
orelha) induzido por 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA). O flavonóide
quercetina também diminuiu a produção e a expressão da citocina pró-inflamatória
TNFα em cultura de mononucleares de humanos estimulados por acetato de forbol
miristato (PMA). Este efeito foi associado à inibição do NF-κB (NAIR et al., 2006).
DISCUSSÃO
59
Estudo relatou ainda que os flavonóides inibiram a expressão de moléculas de
adesão do tipo E-selectina em células endoteliais de veias umbilicais humanas
estimuladas por TNFα (TAKANO-ISHIKAWA; GOTO; YAMAKI, 2003).
Outros estudos demonstraram que os flavonóides apresentaram efeitos
antiinflamatórios inibindo a exsudação no modelo de edema de pata induzido pela
carragenina, em camundongos (PELZER et al., 1998). Os flavonóides inibiram
também a enzima ciclooxigenase tipo 2 (COX-2) em cultura de células RAW 264.7
estimuladas por LPS e também as enzimas ciclooxigenase tipo 1 (COX-1) e a
lipoxigenase (LOX) em homogenatos de plaquetas obtidas de sangue bovino (CHI et
al., 2001).
Estudo demonstrou ainda que a liberação de óxido nítrico induzida por LPS
em células J774 foi inibida por flavonóides por diminuição da expressão da NOSi e
pela inibição da atividade da NOSi no pulmão de ratos estimulados pelo LPS
(PERGOLA et al., 2006).
Outras substâncias já identificadas nas espécies do gênero Solidago são as
saponinas. Estudos realizados por Kim e colaboradores (2006a) demonstraram que
as saponinas inibiram significativamente a adesão de monócitos humanos às células
endoteliais induzida pelo TNFα, bem como diminuíram a expressão de ácido
ribonucléico mensageiro (RNAm) para molécula de adesão vascular tipo 2 (VCAM-2)
e molécula de adesão intraceular tipo 1 (ICAM-1) em cultura de células endoteliais
estimuladas por TNFα, este efeito foi devido à inibição da ativação de NF-κB. Huang
e colaboradores (2005) demonstraram que uma saponina triterpênica inibiu também
a expressão da molécula de adesão do tipo ICAM-1 na aorta de ratos e inibiu o
aumento da permeabilidade capilar induzida pelo calor, em ratos.
Kang e colaboradores (2005) relataram que as saponinas inibiram a liberação
de óxido nítrico e os níveis de TNFα em cultura de macrófagos peritoneais
estimulados por LPS.
Estudo demonstrou também que outras saponinas apresentaram efeitos
antiinflamatórios inibindo os níveis de TNFα e PGE
2
no modelo da bolsa de ar
induzido pela carragenina, em ratos (KIM et al., 2006b).
Os sesquiterpenos, também já isolados de plantas do gênero Solidago, são
substâncias conhecidas por seus efeitos antiinflamatórios in vitro e in vivo. Como por
exemplo, estudos demonstraram que os sesquiterpenos inibiram os níveis de NO em
DISCUSSÃO
60
linhagem de macrófagos de camundongos RAW 264.7 ativados por LPS e IFN-γ
(WANG; UNEHARA; KITANAKA, 2005).
Os compostos sesquiterpenos apresentaram ainda atividade antiinflamatória
inibindo o exsudato no modelo de edema de pata induzida pela carragenina, em
ratos (JIMENEZ-ESTRADA et al., 2006). Outros estudos demonstraram que os
sesquiterpenos diminuíram o edema e a hiperalgesia, também no mesmo modelo de
inflamação, via inibição da ciclooxigenase tipo 2 (COX-2) e de citocinas pró-
inflamatórias (FELTENSTEIN et al., 2004) ou ainda, por inibir a ativação de NF-κB
via aumento da proteína inibidora I-κB (HEHNER et al., 1999). Além disso, estudos
demonstraram ainda que os sesquiterpenos do tipo lactonas isolados da Arnica
também inibiram a ativação dos fatores de transcrição nuclear kappa B (NF-κB) e de
células T (NF-AT) em concentrações micromolares (MERFORT, 2003; SIEDLE et al.,
2004).
Vale a pena comentar que neste estudo os efeitos antiinflamatórios do extrato
aquoso, fração butanólica e resíduo aquoso das raízes de Solidago chilensis
apresentaram ainda, efeitos antiinflamatórios semelhantes aos da indometacina
(inibidor de ciclooxigenase). Estes resultados demonstraram que Solidago chilensis
e a indometacina podem ter vias comuns de ação antiinflamatória.
Uma vez que a interação entre estes mediadores e células é bastante
complexa foi possível propor um mecanismo para a ação antiinflamatória de
Solidago chilensis no modelo estudado. Um dos mecanismos poderia ser atribuído à
inibição dos níveis de TNFα e IL-1β, bem como de mediadores pró-inflamatórios
como bradicinina, histamina, substância P e óxido nítrico no local da inflamação.
Estes mediadores BK, HIST, SP, TNFα, IL-1β e NO são capazes de promover a
liberação um do outro resultando na amplificação da resposta inflamatória (ENDO,
2001; CAMPOS et al., 2002; MORIOKA et al., 2002; SANTOS; CALIXTO; SOUZA,
2003; PASSOS et al., 2004; COSTA et al., 2006; O’SHAUGHNESSY et al., 2006)
(Figura 2).
Por fim, os resultados obtidos neste trabalho demonstraram que Solidago
chilensis apresentou importante efeito antiinflamatório. O extrato aquoso e suas
frações foram efetivos em inibir de forma significativa os parâmetros inflamatórios:
migração de leucócitos, exsudação, enzimas mieloperoxidade e adenosina-
deaminase, o óxido nítrico e citocinas TNFα, IL-1β, bem como a migração
DISCUSSÃO
61
leucocitária induzida por bradicinina, histamina e substância P, no modelo de
inflamação estudado.
CONCLUSÕES
62
5. CONCLUSÕES
1. O efeito antiinflamatório do extrato aquoso das raízes de Solidago chilensis foi
mais evidente que o dos extratos etanólicos e/ou aquosos das outras partes da
planta.
2. O mecanismo de ação antiinflamatório parece estar relacionado à inibição de
enzimas (mieloperoxidase e adenosina-deaminase), citocinas (TNFα e IL-1β),
bem como de mediadores pró-inflamatórios (óxido nítrico, bradicinina,
histamina e substância P).
3. O efeito antiinflamatório do extrato aquoso das raízes de Solidago chilensis
parece estar relacionado às suas frações: butanólica e resíduo aquoso.
ÕES
63
Figura 2: Mecanismo da ação antiinflamatória proposto para o extrato aquoso das raízes de Solidago chilensis e suas frações: BuOH e RA. TNFα= fator de
necrose tumoral alfa; IL-1β= interleucina 1 beta. ( - ) = Efeito inibitório da Solidago chilensis.
Exsudação
Polimorfonucleares Mononucleares
Liberação
de histamina
Liberação de
óxido nítrico
Adenosina-deaminase Mieloperoxidase
( - )
( - )
( - )
( - )
( - )
( - )
( - )
Liberação de citocinas
TNFα e IL-1β
Recrutamento
de leucócitos
Recrutamento
de leucócitos
Liberação de
substancia P
Inflamação
( - )
Extrato aquoso
das raízes de
Solidago chilensis
e suas frações:
BuOH e RA
≅
Indo
( - )
Liberação de
bradicinina
CONCLUS
PERSPECTIVAS
64
6. PERSPECTIVAS
1. Isolar compostos bioativos do extrato aquoso e da fração butanólica das raízes
de Solidago chilensis, para elucidar as suas estruturas químicas e estudar os
seus efeitos antiinflamatórios.
2. Verificar se o efeito antiinflamatório observado é via inibição da expressão de
mediadores pró-inflamatórios como TNFα, IL-1β e NOSi.
3. Comparar este efeito com aquele observado com fármacos glicocorticóides.
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ANEXO
77
ANEXO 1
Organogramas da triagem dos extratos e do mecanismo da ação
antiinflamatória dos extratos e frações
ANEXO
78
Triagem Inicial - Curva Dose-resposta (i.p.)
Avaliação da inibição de leucócitos
e/ou exsudação
Folhas
Extratos Aquosos
Inflorescências
Raízes
Folhas
Extratos Etanólicos
Inflorescências
Raízes
Extrato e Frações com efeito
antiinflamatório
Extrato Fração 2
Fração 1
Mecanismo da Ação
BK, HIST, SP
MPO ADA NO
Cg
Citocinas
TNF
α
IL-1
β
ANEXO
79
ANEXO 2
Protocolo e cadastro da Comissão de Ética no Uso de Animais
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
