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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA
ESTUDO QUÍMICO DAS RAÍZES E FOLHAS DE
Wilbrandia
ebracteata
COGN.
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
ANDRESSA CÓRNEO GAZOLA
Florianópolis
2008
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA
ESTUDO QUÍMICO DAS RAÍZES E FOLHAS DE Wilbrandia
ebracteata
COGN.
Dissertação apresentada ao programa
de Pós-graduação em Farmácia por
Andressa Córneo Gazola como requisito
parcial para obtenção do grau de Mestre
em Farmácia
ORIENTADOR: Prof. Dr. Eloir Paulo Schenkel
Florianópolis
2008
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DEDICATÓRIA
Aos meus pais: Geraldo e Sestina
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus que sempre foi uma base sólida nos momentos de
angústia e preocupação, além de estar sempre presente nos momentos
felizes.
Agradeço a todas as pessoas que, de uma forma ou de outra,
contribuíram para a realização deste trabalho, especialmente:
Ao Prof. Dr. Eloir Schenkel, pela sua orientação, compreensão,
incentivo e principalmente, pela sua contribuição em minha formação
científica e humana;
Profa. Dra. Mareni Rocha Farias, pela orientação e o carinho dados
durante minha iniciação científica, além de despertar em mim o interesse
nessa área;
Ao Prof. Dr. Flávio Henrique Reginatto, pelo auxílio no trabalho,
especialmente com o cromatógrafo líquido, além de sempre “sair” com ótimas
sugestões;
À Profa. Dra. Fátima Regina Mena Barreto Silva e à aluna de
mestrado Poliane Folador, pela realização dos experimentos para
determinação da atividade anti-hiperglicêmica de extratos e substâncias
isoladas de
Wilbrandia ebracteata;
A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em
Farmácia da Universidade Federal de Santa Catarina, pelo carinho e atenção;
Ao Prof. Dr. Sérgio A. L. Bordignon pela identificação do material
vegetal;
Aos meus pais, Geraldo e Sestina por todo esforço que fizeram para
eu concluir a faculdade e o mestrado. Muito obrigada! Amo vocês!
Ao meu irmão e minha cunhada, Anderson e Erica, por todos os
momentos de apoio e carinho. Amo vocês!
Ao meu namorado André, por todo carinho, cumplicidade, apoio,
dedicação e paciência. Te amo!
Às técnicas do laboratório Solange e Claudinha que me ajudaram
em vários apuros, além de compartilharem dos lanchinhos e das conversas.
Agradeço muito pela amizade e dedicação;
À amiga Silvana, agradeço pela amizade e pela grande ajuda
durante todo o mestrado, tanto no lado profissional quanto pessoal.
Aos amigos, Karen, Cíntia, Maria Isabel, Flora, Clara, Leopoldo,
Samanta, Geison, Fernanda, Carize, Rodrigo e Caroline, por toda atenção
dispensada, pelas brincadeiras, conversas e ajudas que tornaram muito mais
fácil a realização deste trabalho. Muitos de vocês são amigos para a vida
inteira.
Aos demais amigos de outros laboratórios em especial: Izabella,
Débora, Thiago, Mônica, Rafael, Fábio, Amarílis, Jarbas além de outros, pela
companhia, amizade e auxílio na realização do trabalho.
Às minhas amigas que dividiram ou dividem apartamento comigo,
por todas as horas de descontração, em especial: Lia e Juliana que tornaram
mais fácil minha adaptação em Florianópolis. Adoro todas!
“Não é o desafio com que nos deparamos que determina quem somos
e o que estamos nos tornando,
mas sim a maneira com que respondemos ao desafio (...)
E, enquanto acreditamos no nosso sonho, nada é por acaso.”
Henfil
RESUMO
Wilbrandia ebracteata pertence à família Cucurbitaceae e é popularmente
conhecida no Brasil como taiuiá. Muitas outras espécies também são conhecidas
com essa denominação, sendo que Cayaponia tayuya é a espécie que consta na
Farmacopéia Brasileira I. No presente trabalho, as análises cromatográficas
indicaram a presença de flavonóides
C-glicosídeos nas raízes e folhas de Wilbrandia
ebracteata
, sendo que as cucurbitacinas foram observadas apenas nas raízes da
espécie. Repetidos processos cromatográficos realizados com a fração
diclorometano das raízes de Wilbrandia ebracteata possibilitaram o isolamento de
uma mistura dos isômeros identificados como 16
α,23α-epoxi-2-O-β-glicopiranosil-
3β,20β-diidroxi-10α,23β-cucurbit-5,24-dien-11-ona e 16α,23α-epoxi-2-O-β-
glicopiranosil-3β,20β-diidroxi-10α,23α-cucurbit-5,24-dien-11-ona, além do 2-O-β-
glicopiranosídeo da diidrocucurbitacina B. Da fração butanólica também das raízes
foram isoladas e identificadas através de comparação com amostras autênticas as
C-glicosilflavonas spinosina e isovitexina, enquanto que para swertisina e um O-
glicosídeo da isoswertisina, denominado BRIV, foram necessários métodos
espectroscópicos. Já para as folhas de Wilbrandia ebracteata foram isolados da
fração butanólica os flavonóides C-glicosídeos spinosina e o composto BRIV,
identificados por comparação com amostras autênticas, enquanto para a fração
insolúvel em água foi isolada uma 4’,5-diidroxi-7-metoxi-flavona, cuja estrutura não
foi elucidada totalmente. Cromatograficamente, as frações butanólicas obtidas das
raízes e das folhas de Wilbrandia ebracteata são compostas principalmente de
flavonóides C-glicosídeos, sendo identificados em ambas as frações os compostos:
vitexina, orientina, isovitexina, swertisina, isoorientina, spinosina e a substância
BRIV.
Palavras chave: Wilbrandia ebracteata, cucurbitacinas, flavonóides C-glicosídeos
ABSTRACT
Wilbrandia ebracteata belongs to the Cucurbitaceae family and is popularly
known in Brazil as taiuiá. Many other species are also known by this denomination in
the popular medicine, but Cayaponia tayuya is the only specie included in the
Brazilian Pharmacopoeia I (1926). In the present work, the compositon of roots and
aerial parts are compared considering the flavonoids
C-glycosides and cucurbitacin
profiles. The chromatographic analyses indicated the presence of flavonoids
C-
glycosides in the roots and leaves of Wilbrandia ebracteata, while the cucurbitacins
were observed only in the roots of the specie. Repeated chromatographic processes
with the dichloromethane fraction of the roots allowed the isolation of the 2-
O-β-
glycopyranoside of the dihydrocucurbitacin B and of a mixture of the isomers
16
α,23α-epoxy-2-O-β-glycopyranosyl-3β,20β-dihydroxy-10α,23β-cucurbit-5,24-dien-
11-one and 16α,23α-epoxy-2-O-β-glycopyranosyl-3β,20β-dihydroxy-10α,23α-
cucurbit-5,24-dien-11-one. The presence of the C-glycosylflavones spinosin,
isovitexin, swertisin and a O-glycoside of isoswertisin (named BRIV) were identified
in the butanolic fraction of the roots by chromatographic comparison with authentic
samples and spectroscopic methods. For the leaves of Wilbrandia ebracteata the
flavonoids C-glycosides spinosin and the substance BRIV were isolated from the
butanolic fraction, while for the insoluble fraction in water was isolated 4',5-dihydroxy-
7-metoxy-flavon, whose the structure was not totally elucidated.
Chromatographically, the butanolic fractions from the roots and leaves of Wilbrandia
ebracteata are composed mainly of flavonoids C-glycosides. Were identified in both
fractions the substances: vitexin, orientin, isovitexin, swertisin, isoorientin, spinosin
and the substance BRIV.
Keywords: Wilbrandia ebracteata, cucurbitacins, flavonoids C-glycosides
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...................................................................................................14
2 REVISÃO DA LITERATURA .............................................................................18
2.1 Wilbrandia ebracteata Cogn.................................................................................................. 20
2.1.1 Classificação botânica ......................................................................................................................... 20
2.1.2 Constituintes químicos descritos para Wilbrandia ebracteata....................................................... 21
2.1.2.1 Cucurbitacinas descritas para Wilbrandia ebracteata ................................................................. 21
2.1.2.2 Flavonóides descritos para Wilbrandia ebracteata...................................................................... 24
2.1.3 Propriedades farmacológicas descritas para Wilbrandia ebracteata ........................................... 26
2.2 Cayaponia tayuya (Vell.) Cogn.............................................................................................. 29
2.2.1 Classificação botânica ......................................................................................................................... 29
2.2.2 Constituintes químicos descritos para Cayaponia tayuya.............................................................. 30
2.2.3 Propriedades farmacológicas descritas para Cayaponia tayuya .................................................. 34
2.3 Cucurbitacinas ....................................................................................................................... 35
2.3.1 Atividades farmacológicas descritas para cucurbitacinas.............................................................. 36
2.4 Flavonóides C-glicosídeos.................................................................................................... 37
2.4.1 Atividades farmacológicas descritas para flavonóides C-glicosídeos .......................................... 38
3 OBJETIVOS.......................................................................................................39
3.1 Objetivo geral ......................................................................................................................... 40
3.2 Objetivos específicos ............................................................................................................ 40
4 MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................41
4.1 Procedimentos gerais............................................................................................................ 42
4.1.1 Acetilação de substâncias isoladas................................................................................................... 43
4.1.2 Hidrólise ácida de substâncias isoladas ........................................................................................... 43
4.2 Material Vegetal ...................................................................................................................... 44
4.3 Obtenção dos Extratos e Frações das Raízes de
Wilbrandia ebracteata ........................ 44
4.3.1 Obtenção dos extratos a partir das raízes de Wilbrandia ebracteata .......................................... 44
4.3.2 Obtenção das frações a partir das raízes de Wilbrandia ebracteata............................................ 45
4.4 Análise química da fração diclorometano das raízes de Wilbrandia ebracteata............. 47
4.4.1 Isolamento das substâncias DRI e DRII a partir da fração diclorometano das raízes de
Wilbrandia ebracteata ........................................................................................................................................ 47
4.5 Análise química da fração butanólica das raízes de Wilbrandia ebracteata ................... 50
4.5.1 Isolamento das substâncias BRI, BRII, BRIII e BRIV a partir da fração butanólica das raízes
de
Wilbrandia ebracteata................................................................................................................................... 50
4.5.2 Análise cromatográfica de compostos da fração butanólica das raízes de Wilbrandia
ebracteata
........................................................................................................................................................... 51
4.6 Obtenção do extrato e das frações das folhas de Wilbrandia ebracteata ....................... 52
4.6.1 Obtenção do extrato a partir das folhas de Wilbrandia ebracteata............................................... 52
4.6.2 Obtenção das frações a partir das folhas de Wilbrandia ebracteata............................................ 52
4.7 Análise química da fração butanólica das folhas de Wilbrandia ebracteata ................... 54
4.7.1 Isolamento das substâncias BFI e BFII a partir da fração butanólica das folhas de Wilbrandia
ebracteata
............................................................................................................................................................ 54
4.7.2 Análise cromatográfica de compostos da fração butanólica das folhas de Wilbrandia
ebracteata
........................................................................................................................................................... 55
4.8 Análise química da fração insolúvel das folhas de Wilbrandia ebracteata ..................... 56
4.8.1 Isolamento da substância IFI a partir da fração insolúvel em água das folhas de Wilbrandia
ebracteata
........................................................................................................................................................... 56
4.9 Identificação e elucidação estrutural das substâncias isoladas ...................................... 57
4.10 Análise cromatográfica comparativa entre as frações butanólicas das raízes e das
folhas de
Wilbrandia ebracteata ........................................................................................................ 58
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO.........................................................................58
5.1 Análise química das raízes de Wilbrandia ebracteata........................................................ 59
5.1.1 Análise química da fração diclorometano das raízes de Wilbrandia ebracteata ........................ 59
5.1.1.1 Isolamento das substâncias DRI e DRII a partir da fração diclorometano das raízes de
Wilbrandia ebracteata ........................................................................................................................................ 59
5.1.1.2 Identificação e elucidação estrutural das substâncias DRI e DRII a partir da fração
diclorometano das raízes de
Wilbrandia ebracteata ..................................................................................... 60
5.1.1.2.1 Identificação e elucidação estrutural de DRI............................................................................. 60
5.1.1.2.2 Identificação e elucidação estrutural de DRII ........................................................................... 77
5.1.2 Análise da presença das substâncias DRI e DRII na fração diclorometano das raízes de
Wilbrandia ebracteata do material adquirido da indústria Lohmman.......................................................... 90
5.1.3 Análise química da fração butanólica das raízes de Wilbrandia ebracteata ............................... 91
5.1.3.1 Isolamento das substâncias BRI, BRII, BRIII e BRIV a partir da fração butanólica das raízes
de
Wilbrandia ebracteata................................................................................................................................... 92
5.1.3.2 Identificação e elucidação estrutural das substâncias BRI, BRII, BRIII e BRIV isoladas a
partir da fração butanólica das raízes de
W. ebracteata .............................................................................. 93
5.1.3.2.1 Identificação de BRI...................................................................................................................... 93
5.1.3.2.2 Identificação de BRII..................................................................................................................... 95
5.1.3.2.3 Identificação de BRIII.................................................................................................................... 98
5.1.3.2.4 Elucidação estrutural de BRIV .................................................................................................. 101
5.1.4 Análise cromatográfica de compostos da fração butanólica das raízes de Wilbrandia
ebracteata
......................................................................................................................................................... 112
5.2 Estudo químico das folhas de Wilbrandia ebracteata...................................................... 115
5.2.1 Análise química da fração butanólica das folhas de Wilbrandia ebracteata ............................. 115
5.2.1.1 Isolamento das substâncias BFI e BFII a partir da fração butanólica das folhas de
Wilbrandia ebracteata ...................................................................................................................................... 115
5.2.1.2 Identificação das substâncias BFI e BFII isoladas a partir da fração butanólica das folhas de
Wilbrandia ebracteata ...................................................................................................................................... 116
5.2.1.2.1 Identificação de BFI .................................................................................................................... 116
5.2.1.2.2 Identificação de BFII ................................................................................................................... 118
5.2.1.3 Análise cromatográfica de compostos da fração butanólica das folhas de Wilbrandia
ebracteata ..............
......................................................................................................................................... 120
5.2.2 Análise química da fração insolúvel em água das folhas de Wilbrandia ebracteata ............... 123
5.2.2.1 Isolamento da substância IFI da fração insolúvel em água das folhas de Wilbrandia
ebracteata ............
............................................................................................................................................ 123
5.2.2.2 Elucidação estrutural da substância IFI isolada da fração insolúvel das folhas de Wilbrandia
ebracteata
.......................................................................................................................................................... 123
5.2.2.2.1 Elucidação estrutural de IFI ....................................................................................................... 123
5.3 Análise cromatográfica comparativa entre as frações butanólicas das raízes e das
folhas de
Wilbrandia ebracteata ...................................................................................................... 129
6 CONCLUSÕES................................................................................................130
7 REFERÊNCIAS ...............................................................................................133
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Exemplar da espécie Wilbrandia ebracteata Cogn. .................................. 20
Figura 2: Partes aéreas e raiz de Cayaponia tayuya (Vell.) Cogn. .......................... 29
Figura 3: Estrutura geral das cucurbitacinas, núcleo cucurbitano ............................ 36
Figura 4: Obtenção dos extratos das raízes de
W. ebracteata e das frações após o
fracionamento do extrato metanólico ....................................................... 46
Figura 5: Esquema representativo da CCD realizada pela Prof
a
. Dr
a
. Mareni Rocha
Farias ....................................................................................................... 47
Figura 6: Isolamento das substâncias DRI e DRII a partir da fração diclorometano
das raízes de W. ebracteata .................................................................... 49
Figura 7: Isolamento das substâncias BRI, BRII, BRIII e BRIV a partir da fração
butanólica das raízes de W. ebracteata ................................................... 51
Figura 8: Obtenção do extrato e das frações a partir das folhas de W. ebracteata . 53
Figura 9: Isolamento das substâncias BFI e BFII a partir da fração butanólica das
folhas de W. ebracteata ........................................................................... 55
Figura 10: Isolamento da substância IFI a partir da fração insolúvel das folhas de
W.
ebracteata
................................................................................................ 57
Figura 11: Espectro IV da substância DRI ............................................................... 61
Figura 12: Espectro
1
H-RMN da substância DRI em CDCl
3
..................................... 67
Figura 13: Espectro COSY da substância DRI em CDCl
3
........................................ 68
Figura 14: Espectro
1
H-RMN da substância DRI acetilada em CDCl
3
..................... 71
Figura 15: Espectro
1
H-RMN ampliado da substância DRI acetilada em CDCl
3
..... 72
Figura 16: Espectro
1
H-RMN ampliado da substância DRI acetilada em CDCl
3
..... 73
Figura 17: Espectro
1
H-RMN ampliado da substância DRI acetilada em CDCl
3
..... 74
Figura 18: Espectro COSY ampliado da substância DRI acetilada em CDCl
3
......... 75
Figura 19: Fórmulas estruturais das substâncias denominadas DRI ....................... 76
Figura 20: Espectro IV da substância DRII .............................................................. 78
Figura 21: Espectro
13
C-RMN da substância DRII em CDCl
3
.................................. 83
Figura 22: Espectro
1
H-RMN da substância DRII em CDCl
3
................................... 84
Figura 23: Espectro
1
H-RMN ampliado da substância DRII em CDCl
3
.................... 85
Figura 24: Espectro COSY da substância DRII em CDCl
3
....................................... 86
Figura 25: Espectro COSY ampliado da substância DRII em CDCl
3
....................... 87
Figura 26: Espectro HSQC da substância DRII em CDCl
3
...................................... 88
Figura 27: Espectro HSQC ampliado da substância DRII em CDCl
3
....................... 89
Figura 28: Fórmula estrutural da 2-O-β-glicopiranosídeo da diidrocucurbitacina B . 90
Figura 29: Cromatografia em camada delgada apresentando o perfil cromatográfico
da fração diclorometano das raízes de W. ebracteata adquiridas na
indústria Lohmman e das substâncias DRI e DRII .................................. 91
Figura 30: Cromatografia em camada delgada apresentando o perfil cromatográfico
das frações butanólicas das raízes de
W. ebracteata realizadas por Farias
(1991) e com o material vegetal adquirido na indústria Lohmman .......... 92
Figura 31: Fórmula estrutural do núcleo genkwanina .............................................. 94
Figura 32: Co-cromatografia em camada delgada realizada com a substância BRI e
spinosina .................................................................................................. 95
Figura 33: Fórmula estrutural da spinosina .............................................................. 95
Figura 34: Fórmula estrutural do núcleo apigenina .................................................. 96
Figura 35: Co-cromatografias entre BRII e isovitexina ............................................. 97
Figura 36: Fórmula estrutural da isovitexina ............................................................ 97
Figura 37: Espectro
1
H-RMN da substância BRIII em CD
3
OD ............................... 100
Figura 38: Fórmula estrutural da swertisina ........................................................... 101
Figura 39: Espectro
1
H-RMN da substância BRIV acetilada em CDCl
3
................. 105
Figura 40: Espectro
1
H-RMN ampliada da substância BRIV acetilada em CDCl
3
. 106
Figura 41: Espectro
1
H-RMN ampliado da substância BRIV acetilada em CDCl
3
. 107
Figura 42: Espectro
1
H-RMN ampliado da substância BRIV acetilada em CDCl
3
. 108
Figura 43: Espectro COSY da substância BRIV acetilada em CDCl
3
.................... 109
Figura 44: Espectro COSY ampliado da substância BRIV acetilada em CDCl
3
.... 110
Figura 45: Espectro HSQC da substância BRIV acetilada em CDCl
3 ..............................
111
Figura 46: CCD comparativa entre a fração butanólica das raízes de W. ebracteata e
padrões de flavonóides C-glicosídeos ................................................... 113
Figura 47: CLAE comparativo entre a fração butanólica das raízes de W. ebracteata
e padrões de flavonóides C-glicosídeos ................................................ 114
Figura 48: Co-cromatografia realizada com BFI e spinosina ................................. 117
Figura 49: Co-cromatografia entre BFII e a substância BRIV isolada a partir da
fração butanólica das raízes de W. ebracteata neste trabalho .............. 119
Figura 50: CCD comparativa entre a fração butanólica das folhas de W. ebracteata e
padrões de flavonóides C-glicosídeos ................................................... 121
Figura 51: CLAE comparativo entre a fração butanólica das folhas de W. ebracteata
e padrões de flavonóides C-glicosídeos ................................................ 122
Figura 52: Espectro
1
H-RMN da substância IFI em CD
3
OD .................................. 126
Figura 53: Espectro
1
H-RMN ampliado da substância IFI em CD
3
OD ................... 127
Figura 54: Espectro COSY da substância IFI em CD
3
OD ...................................... 128
Figura 55: CCD comparativa entre as frações butanólicas das raízes e das folhas de
W. ebracteata ......................................................................................... 129
Figura 56: CLAE comparativo entre as frações butanólicas das raízes e das folhas
de
W. ebracteata .................................................................................... 130
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Espécies conhecidas popularmente como Taiuiá segundo a literatura ... 19
Tabela 2: Estruturas e nomenclatura dos compostos descritos por Schenkel e
colaboradores (1992) ............................................................................... 22
Tabela 3: Estruturas dos compostos descritos por Farias e colaboradores (1993) . 23
Tabela 4: Estruturas dos compostos descritos por Santos; Santos; Schenkel (1996)
.................................................................................................................. 24
Tabela 5: Estruturas dos flavonóides descritos por Coelho (2004) .......................... 25
Tabela 6: Substâncias descritas por Bauer e colaboradores (1983; 1985) ............. 31
Tabela 7: Glicosídeos de nor-cucurbitacinas com anel A aromático descritas por
Himeno e colaboradores (1992; 1993; 1994a; 1994b; 1994c) ................. 33
Tabela 8: Glicosídeos de nor-cucurbitacinas não aromáticos descritos por Himeno e
colaboradores (1992, 1993, 1994a; 1994b; 1994c) ................................. 34
Tabela 9: Massas e rendimentos dos extratos obtidos das raízes de W. ebracteata
.................................................................................................................. 45
Tabela 10: Massas e rendimentos das frações obtidas a partir do extrato MeOH das
raízes de W. ebracteata ........................................................................... 45
Tabela 11: Massa e rendimento do extrato bruto das folhas de W. ebracteata ....... 52
Tabela 12: Massas e rendimentos das frações obtidas das folhas de W. ebracteata
.................................................................................................................. 53
Tabela 13: Comparação dos dados espectrais de
1
H-RMN da substância DRI com a
substância W-6 descritas por Farias (1991) ............................................. 63
Tabela 14: Comparação dos dados espectrais de
1
H-RMN da substância DRI com a
substância W-7 descritas por Farias (1991) ............................................. 65
Tabela 15: Comparação entre os sinais de hidrogênio do açúcar para matesaponina
2 peracetilada (GOSMANN et al., 1995) e DRI acetilada ........................ 69
Tabela 16: Comparação dos dados espectrais de
13
C-RMN da substância DRII com
diidroisocucurbitacina B descrita por Farias (1991) ................................. 80
Tabela 17: Comparação dos dados espectrais de
1
H-RMN da substância DRII com
diidrocucurbitacina B descrita por Farias (1991) ...................................... 81
Tabela 18: Dados espectrais de
1
H-RMN e
13
C-RMN para DRII ............................. 82
Tabela 19: Massas e rendimento dos quatro flavonóides C-glicosídeos isolados a
partir da fração butanólica das raízes de W. ebracteata .......................... 93
Tabela 20: Máximos de absorção e deslocamentos observados após a adição de
reagentes nos espectros UV da substância BRI ...................................... 94
Tabela 21: Máximos de absorção e deslocamentos observados após a adição de
reagentes nos espectros UV da substância BRII ..................................... 96
Tabela 22: Máximos de absorção e deslocamentos observados após a adição de
reagentes nos espectros UV da substância BRIII .................................... 98
Tabela 23: Valores de
1
H-RMN obtidos para BRIII confrontados com a literatura ... 99
Tabela 24: Máximos de absorção e deslocamentos observados após a adição de
reagentes nos espectros UV da substância BRIV ................................. 102
Tabela 25: Dados espectrais de RMN para a região dos açúcares de BRIV ........ 104
Tabela 26: Máximos de absorção e deslocamentos observados após a adição de
reagentes nos espectros UV da substância BFI .................................... 116
Tabela 27: Máximos de absorção e deslocamentos observados após a adição de
reagentes nos espectros UV da substância BFII ................................... 118
Tabela 28: Máximos de absorção e deslocamentos observados após a adição de
reagentes nos espectros UV da substância IFI ...................................... 124
LISTA DE ABREVIATURAS
NP: reagente natural A (1%)
PEG: solução alcoólica de polietilenoglicol-4000 (5%)
CCD: cromatografia em camada delgada
CLAE: cromatografia líquida de alta eficiência
UV: ultravioleta
IV: infravermelho
1
H-RMN: ressonância magnética nuclear de hidrogênio
13
C-RMN: ressonância magnética nuclear de carbono 13
COSY: correlated spectroscopy
HMBC: heteronuclear multiple bond correlation
i.p.: administração intra-peritonial
v.o.: administração via oral
COX: enzima ciclooxigenase
HSV-1: vírus herpético simples tipo 1
1 INTRODUÇÃO
15
Na medicina popular, o nome taiuiá tem sido utilizado para designar
algumas espécies de trepadeiras da família Cucurbitaceae Juss, que apresentam
raízes de amargor característico. O uso de plantas com essa denominação remonta
à medicina indígena, sendo provável que o vocábulo “
Tay-Ubá” do tupi tenha
originado o termo “tayuya” ou “taiuiá”. Peckolt (1937) menciona que o nome indígena
se refere ao fruto, já que
tay significa pimenta e ubá corresponde a fruto, ou seja,
“fruto de pimenta”.
Publicações dos séculos XIX e XX sobre plantas medicinais citam como
taiuiá várias espécies dos gêneros
Cayaponia, Trianosperma, Dermophylla,
Druparia, Bryonia, Melothria, Momordica, Apodanthera
e Wilbrandia (MARTIUS,
1854; MOREIRA, 1862; D’ÁVILA, 1910; HOEHNE, 1920; 1939; PIO CORRÊA, 1926-
1978; PECKOLT, 1937; ORTH, 1937; LIMA, 1941). Entre as décadas de 30 e 80 do
século passado, as publicações a respeito do emprego de taiuiá tornaram-se raras,
entretanto, materiais vegetais com essa denominação eram e ainda são
comercializados. Esses produtos, quando registrados como medicamentos, portam,
de modo geral, a declaração de conteúdo como sendo Cayaponia tayuya, espécie
esta declarada como taiuiá na Farmacopéia Brasileira I (1926). Porém, estudos
cromatográficos comparando a composição química de alguns produtos
comercializados mostraram diferentes composições em relação ao perfil de
cucurbitacinas e de flavonóides (Farias et al., 1986). Isso levou ao aprofundamento
da investigação quanto à efetiva identidade das espécies vegetais utilizadas
industrialmente sob o nome Cayaponia tayuya. Com esse objetivo, ainda na década
e 80, foram coletadas espécies de Cucurbitáceas popularmente designadas como
taiuiá na região sul do Brasil, bem como foram realizadas consultas
*
aos
responsáveis pelos herbários do Rio Grande do Sul, Rio de Janeiro, São Paulo,
Pernambuco e Ceará acerca da existência de registros de coletas de Cayaponia
tayuya (Vell.) Cogn, no intuito de obter material vegetal autêntico. As respostas
fornecidas sugeriram que essa espécie é de ocorrência rara. Essas informações
levam a uma questão: alguns autores estrangeiros afirmam que realizam seus
estudos utilizando com matéria-prima vegetal Cayaponia tayuya, porém esses
trabalhos não apresentam declaração quanto aos locais e época de coleta, nem a
herbarização de material testemunho. Alguns desses trabalhos ainda citam que o
*
Eloir Paulo Schenkel: informação pessoal
16
material vegetal foi enviado do Brasil, porém existem evidências de que algumas
empresas brasileiras comercializam raízes de Wilbrandia ebracteata com a
declaração de Cayaponia tayuya.
O gênero
Wilbrandia é composto por espécies tropicais e subtropicais,
próprias da América do Sul, cuja área de dispersão estende-se do Rio Grande do
Sul até o Espírito Santo. Muito provavelmente, o centro de origem desse grupo
compreende os estados de Santa Catarina, São Paulo e Rio de Janeiro.
Wilbrandia
ebracteata
é uma espécie da família cucurbitaceae que habita a parte austral do
Brasil (Rio Grande do Sul, Santa Catarina e Paraná), leste do Paraguai e nordeste
da Argentina (região das Missões) (CROVETTO, 1960). Assim como outras plantas
denominadas taiuiá
Wilbrandia ebracteata é citada na medicina popular como
purgativa, no tratamento da sífilis, úlceras gástricas, furúnculos, entre outros
(CORRÊA, 1978).
Cabe aqui ressaltar que as plantas apresentam uma ampla variedade e
complexidade de substâncias químicas que são responsáveis pelos mais diversos
efeitos biológicos (GUERRA; NODARI, 2003; GOTTLIEB; BORIN, 2003). A pesquisa
destes compostos é tida como uma rica fonte para o desenvolvimento de novos
medicamentos, sejam eles na forma de substância isolada (fármaco) ou na forma de
extratos (fitoterápico) (ELISABETSKY, 1991; SCHENKEL; GOSSMANN;
PETROVICK, 2003). Newman, Cragg e Snader (2003) afirmam que 52% de todos os
novos fármacos descobertos e em processo de desenvolvimento entre 1981 e 2002
são produtos naturais ou derivados desses. Ainda mais estimulante é observar que
decorridos quatro anos os produtos naturais e seus derivados continuam
responsáveis por mais da metade de todas as novas entidades químico-
farmacêuticas (Newman; Cragg, 2007).
Duas classes de substâncias encontradas em grande quantidade nas
frações de Wilbrandia ebracteata são as cucurbitacinas e os flavonóides C-
glicosídeos. Cucurbitacinas são triterpenos tetracíclicos poliidroxilados encontrados
tanto na forma de agliconas, quanto como heterosídeos, as quais conferem sabor
amargo às plantas da família cucurbitaceae (LAVIE; GLOTTER, 1971; SCHENKEL
et al., 1992). Flavonóides C-glicosídeos diferenciam dos demais flavonóides por
apresentar a ligação açúcar-genina diretamente a um carbono do núcleo aglicônico
a qual se dá principalmente entre o carbono C-1 (anomérico) do açúcar e os
17
carbonos 6 e/ou 8 do anel A do flavonóide. (CHOPIN; BOUILLANT, 1975;
ZUANAZZI; MONTANHA, 2003).
O presente trabalho está centrado no isolamento e identificação de
flavonóides
C-glicosídeos e cucurbitacinas com caráter mais polar do que as
descritas por Farias e colaboradores (1993) a partir das raízes e das folhas de
Wilbrandia ebracteata. O isolamento dos flavonóides C-glicosídeos a partir da fração
butanólica das folhas e raízes da espécie em questão foi realizado com o intuito de
promover estudos acerca das propriedades biológicas/farmacológicas dessas
substâncias. Já para as cucurbitacinas, a finalidade foi verificar a presença de novos
compostos ainda não isolados das raízes de Wilbrandia ebracteata.
O presente trabalho está organizado da seguinte forma: inicialmente será
apresentada uma revisão da literatura sobre Wilbrandia ebracteata, Cayaponia
tayuya e as classes de compostos cucurbitacinas e flavonóides C-glicosídeos. Após
serão apresentados os objetivos e materiais e métodos, seguidos pelos resultados e
as discussões referentes à análise das raízes e das folhas.
2 REVISÃO DA LITERATURA
19
Muitas são as espécies que recebem o nome popular Taiuiá, geralmente
espécies pertencentes aos gêneros Ceratosanthes, Melothria, Wilbrandia,
Cayaponia e Cyclanthera, como se pode visualizar na tabela 1:
Tabela 1: Espécies conhecidas popularmente como Taiuiá segundo a literatura
Tribo Subtribo Gênero Espécie
Melothriinae Anguiinae
Ceratosanthes
Burm
Melothria L.
Wilbrandia
Manso
C. hilariana Cogn.
M. fluminensis Gardn.
M. warmingii Cogn.
W. verticillata Cogn.
W. hibiscoides Manso
W. ebracteata Cogn.
W. glaziovii Cogn.
Cucurbiteae Abobriinae
Cayaponia
Manso
C. diversifolia (Cogn.) Cogn.
C. bonarensis (Mill.) RM Crovetto
C. podantha Cogn.
C. tayuya (Vell.) Cogn.
C. racemosa Cogn.
C. glandulosa (Poepp. Et Endl)
Cogn.
C. martiana (Cogn.) Cogn.
Cyclanthereae
Cyclanthera
Schrad
C. pedata Schrad var edulis Naud
C. Eichleri Cogn.
C. elegans Cogn.
Fonte: FARIAS, 1991.
Das espécies apresentadas na tabela 1, Wilbrandia ebracteata e
Cayaponia tayuya são as mais citadas na literatura, seja aquela por sua grande
utilização na medicina popular ou essa por estar presente na Farmacopéia Brasileira
I (1926) como sendo a droga vegetal Taiuiá. Além disso, em 1986, Farias e
colaboradores descreveram que algumas amostras comerciais onde o fabricante
declarava tratar-se de Cayaponia tayuya apresentavam o mesmo perfil
cromatográfico, em relação às frações diclorometano (cucurbitacinas) e butanólica
(flavonóides C-glicosídeos), de Wilbrandia ebracteata. Desta forma, esta revisão
está direcionada aos constituintes químicos e às atividades
biológicas/farmacológicas dessas duas espécies.
20
2.1 Wilbrandia ebracteata Cogn.
O gênero Wilbrandia é composto por espécies tropicais e subtropicais,
próprias da América do Sul, cuja área de dispersão estende-se do Rio Grande do
Sul até o Espírito Santo. Muito provavelmente, o centro de dispersão desse grupo
compreende os estados de Santa Catarina, São Paulo e Rio de Janeiro. A espécie
Wilbrandia ebracteata habita a parte austral do Brasil (Rio Grande do Sul, Santa
Catarina e Paraná), leste do Paraguai e nordeste da Argentina (região das Missões)
(CROVETTO, 1960).
2.1.1 Classificação botânica
Ordem: Cucurbitales
Família: Cucurbitaceae
Subtribo: Melothriinae
Gênero: Wilbrandia Manso
Seção: Euwilbrandia
Espécie: Wilbrandia ebracteata Cogn. (Fig. 1)
Variedades: pedunculata, ebracteata, bracteata
Figura 1: Exemplar da espécie Wilbrandia ebracteata Cogn.
Foto: Andressa Córneo Gazola
21
2.1.2 Constituintes químicos descritos para Wilbrandia ebracteata
Ao verificar que alguns produtos comerciais declarados como provenientes
de
Cayaponia tayuya na verdade eram provenientes de Wilbrandia ebracteata o
grupo liderado por Schenkel realizou uma grande coleta de raízes de W. ebracteata
na década de 80, identificadas pelo Prof. Dr. Sérgio A. L. Bordignon com base nas
flores e frutos da espécie, a qual deu origem a quase totalidade dos estudos
químicos e a maior parte dos estudos farmacológicos até hoje publicados para as
raízes de Wilbrandia ebracteata. Com outro material vegetal, Coelho (2004)
apresenta o isolamento e a identificação de substâncias a partir das folhas de W.
ebracteata. Até o presente momento, duas classes de compostos foram descritas:
as cucurbitacinas e os flavonóides.
2.1.2.1 Cucurbitacinas descritas para Wilbrandia ebracteata
Schenkel e colaboradores (1992) descrevem o isolamento e identificação
de três 22-deoxo-cucurbitacinas a partir da fração diclorometano das raízes de
Wilbrandia ebracteata. Dessas três novas cucurbitacinas, duas delas se diferenciam
apenas na posição do radical ligado ao carbono 23. Suas estruturas estão
apresentadas na tabela 2.
22
Tabela 2: Estruturas e nomenclatura dos compostos descritos por Schenkel e colaboradores (1992)
2β,3β,16α,20,25-pentaidroxi-10α-
cucurbit-5,23-dien-11-ona
O
OH
OH
H H
H
OH
OH
OH
16α,23α-epoxi-2β,3β,20β-triidroxi-
10
α,23α-cucurbit-5,24-dien-11-ona
O
OH
OH
H H
O
H
OH
H
H
16α,23α-epoxi-2β,3β,20β-triidroxi-
10
α,23β-cucurbit-5,24-dien-11-ona
O
OH
OH
H H
O
H
OH
H
H
Em 1993, Farias e colaboradores descreveram o isolamento de mais
algumas cucurbitacinas provenientes da mesma fração diclorometano. Dentre elas
encontram-se 22-deoxo-cucurbitacinas, diidrocucurbitacinas, diidroisocucurbitacinas,
isocucurbitacinas e uma 29-nor-cucurbitacina. Essa última foi descrita
posteriormente por Himeno e colaboradores (1994c) com o nome de cayaponosídeo
A
5
(ver compostos descritos para Cayaponia tayuya). Na tabela 3 são apresentadas
as fórmulas estruturais dos compostos descritos por Farias e colaboradores (1993).
23
Tabela 3: Estruturas dos compostos descritos por Farias e colaboradores (1993)
O
1
2
R
R
1
H H
23
H
OH
24
R
4
OH
R
2
R
3
R R
1
R
2
R
3
R
4
Outros
Diidrocucurbitacina E
OH
O
O
H
O-Acetila
Δ
1,2
Diidrocucurbitacina B
OH O O
H
O-Acetila
Diidroisocucurbitacina B
O
OH
O
H
O-Acetila
Cucurbitacina B
OH O O
H
O-Acetila
Δ
23,24
Cucurbitacina E
OH
O O H
O-Acetila
Δ
1,2
Δ
23,24
Cucurbitacina D
OH O O
H
OH
Δ
23,24
Cucurbitacina R
OH O O
H
OH
3-epi-isocucurbitacina G
O OH O
OH
OH
Cucurbitacinas G e H
OH O O
OH
OH
Cucurbitacinas J e K
OH
O O
OH
OH
Δ
1,2
22-deoxo-cucurbitacina D
OH O
H H
OH
Cucurbitacina P
OH OH O
H
OH
Diidrocucurbitacina E-2-
glicosídeo
O-Glicose
O O
H
O-Acetila
Δ
1,2
Diidroisocucurbitacina B-3-
glicosídeo
O
O-Glicose
O
H
O-Acetila
Diidrocucurbitacina B-2-
glicosídeo
OH
O-Glicose
O
H
O-Acetila
Cayaponosídeo A
5
O
Glicose-O
OH
H
H
OH
O-Acetila
OH
O
24
2.1.2.2 Flavonóides descritos para Wilbrandia ebracteata
O isolamento e a identificação de flavonóides C-glicosídeos a partir da
fração butanólica das raízes de Wilbrandia ebracteata foram descritos em 1996 por
Santos, Santos e Schenkel. Nesse trabalho os autores verificaram a presença de
spinosina, swertisina, isoswertisina, vitexina, isovitexina, vicenina-2, orientina e
isoorientina, cujas estruturas são apresentadas na tabela 4.
Tabela 4: Estruturas dos compostos descritos por Santos; Santos; Schenkel (1996)
OR
R
1
OH O
R
2
R
4
R
3
R R
1
R
2
R
3
R
4
Flavonóides C-glicosídeos
Spinosina
OCH
3 Glicose-O-Glicose
H H OH
Swertisina
OCH
3 Glicose
H H OH
Isoswertisina
OCH
3
H
Glicose
H OH
Vitexina
OH H
Glicose
H OH
Isovitexina
OH
Glicose
H H OH
Vicenina-2
OH
Glicose Glicose
H OH
Orientina
OH H
Glicose
OH OH
Isoorientina
OH
Glicose
H OH OH
No único trabalho sobre a composição das folhas de Wilbrandia
ebracteata, Coelho (2004) descreve o isolamento de oito flavonóides, dos quais
25
quatro deles são C-glicosídeos que também ocorrem nas raízes da espécie. As
fórmulas estruturais das substâncias isoladas por Coelho (2004) são apresentadas
na tabela 5.
Tabela 5: Estruturas dos flavonóides descritos por Coelho (2004)
OR
1
R
OH O
R
2
R
5
R
4
R
3
R R
1
R
2
R
3
R
4
R
5
Flavonóides
3’,4’,5,6,7,8-hexaidroxiflavonol
OH OH OH OH OH OH
Luteolina
H
OH H H OH OH
3’,4’,5,6-tetraidroxi-7-metoxi-
flavona
OH
OCH
3
H H OH OH
Vitexina
H
OH
Glicose
H H OH
Isovitexina
Glicose
OH H H H OH
Orientina
H
OH
Glicose
H OH OH
Isoorientina
Glicose
OH H H OH OH
Proposta para we5
OO
O
OH
OH
OH
CH
3
O
26
2.1.3 Propriedades farmacológicas descritas para Wilbrandia ebracteata
A partir de frações e substâncias provenientes de raízes de Wilbrandia
ebracteata
cuja coleta foi citada no item 2.1.2 foram realizados estudos quanto às
atividades antiinflamatória, analgésica, antiviral e mutagênica, as quais são descritas
abaixo.
A investigação da atividade analgésica foi realizada através do teste de
contorção induzido por injeção intra-peritonial (i.p.) de ácido acético 0,6% em
camundongos. A fração diclorometano foi testada e o controle positivo utilizado foi
ácido acetilsalicílico, todos administrados i.p. Os autores verificaram que a fração
diclorometano mostrou atividade significativa na dose de 10 mg/Kg. Além disto,
ainda foi realizado o teste da formalina induzindo a dor e do edema de pata induzido
pela carragenina. A fração diclorometano foi eficaz nas doses de 1; 3 e 10 mg/Kg i.p.
e 3; 10 e 30 mg/Kg v.o. no teste da formalina. Para o edema de pata de ratos
induzido pela carragenina foram testados além da fração diclorometano a fração
acetato de etila e as cucurbitacinas B e E. A fração diclorometano inibiu o edema em
90% e 60% quando administrados 10 mg/Kg (i.p.) e 30 mg/Kg (v.o.),
respectivamente. A fração acetato de etila inibiu apenas 10% do edema quando
administrados 10 mg/Kg (i.p.). As cucurbitacinas B e E na dose de 1 mg/Kg (i.p.)
inibiram 61% e 58%, respectivamente (PETERS; FARIAS; RIBEIRO-DO-VALLE,
1997).
Em outro trabalho (PETERS et al., 1999) é descrita a atividade
antiinflamatória da fração diclorometano e da cucurbitacina B no modelo da pleurisia
induzida pela carragenina em camundongos. A fração diclorometano (0,3 mg/Kg, i.p.
e 3 mg/Kg, v.o.) inibiu o influxo de células e o exsudato para dentro da cavidade
pleural, além de reduzir significativamente o nível de prostaglandina-E
2
no exsudato
quando administrada i.p. (0,01 – 10 mg/Kg) e v.o. (0,1 – 10 mg/Kg). Cucurbitacina B
inibiu 53% do nível dessa prostaglandina quando administrada na dose de 0,1
mg/Kg, i.p.
No teste de contorções abdominais induzidas pelo zimosan (i.p.) Peters e
colaboradores (2003) verificaram atividade da fração diclorometano nas doses de 1,
3 e 10 mg/Kg (v.o.). O teste rota-rod comprovou que a fração diclorometano nas
doses de 10 e 30 mg/Kg, v.o. não afetou a coordenação motora dos camundongos.
27
No modelo da artrite induzida pela zimosan em ratos a fração diclorometano reduziu
a incapacidade articular nas doses de 1, 3 e 10 mg/Kg (v.o.), sendo que na dose de
10 mg/Kg (v.o.) também foi capaz de reduzir o influxo de células para dentro da
cavidade articular e a liberação de nitrito, efeito esse também observado na dose de
3 mg/Kg (v.o.). Foi realizado também um ensaio para avaliar o efeito ulcerogênico na
mucosa do estômago de ratos. Nesse teste, a fração diclorometano (30 mg/Kg, v.o.)
ao contrário da indometacina (30 mg/Kg, v.o.) e do ácido acetilsalicílico (100 mg/Kg,
v.o.) não provocou lesões gástricas hemorrágicas. Para elucidar o mecanismo da
ação antiinflamatória, os autores realizaram um teste
in vitro para verificar se a
fração diclorometano tinha atividade sobre as enzimas ciclooxigenase 1 e 2 (COX-1
e COX-2) humanas. Em relação à COX-1 não foi observada alteração, porém
quando as células foram expostas a 1 e 10 µg/mL da fração diclorometano houve
inibição da atividade de COX-2.
No modelo de edema de pata de camundongo induzido pela carragenina,
diidrocucurbitacina B inibiu 26%, 44% e 56% do pico de resposta da carragenina nas
doses de 0,3; 1 e 3 mg/Kg, i.p., respectivamente. No teste da pleurisia induzida pela
carragenina ficou evidente que a diidrocucurbitacina B inibiu o acúmulo de leucócitos
na cavidade pleural, diminuiu o influxo de células (10 mg/Kg, i.p.) e inibiu a produção
de leucotrieno B
4
(3 e 10 mg/Kg, i.p.). Diidrocucurbitacina B (10 µg/mL) ainda inibiu
72% da produção de prostaglandina-E
2
pela enzima COX-2 humana in vitro. Os
autores afirmaram que o efeito antiinflamatório in vivo da diidrocucurbitacina B
ocorre através da inibição da enzima COX-2 (SIQUEIRA et al., 2007).
A atividade antiviral também foi avaliada para as frações acetato de etila e
butanólica do mesmo material vegetal. A fração acetato de etila inibiu 50% do efeito
citopático viral (CE
50
) nas doses de 62 µg/mL para o vírus herpético simples tipo 1
(HSV-1) cepa KOS e 25 µg/mL para o HSV-1 cepa 29-R A fração butanólica
apresentou CE
50
nas doses de 125 µg/mL para HSV-1 cepa KOS e 12 µg/mL para
HSV-1 cepa 29-R. Não foi constatada atividade para o poliovirus tipo 2
(ANDRIGHETTI-FRÖHNER et al., 2005).
Em relação à toxicidade, os extratos metanol e metanol:água – 1:1 assim
como as frações diclorometano, acetato de etila, butanólica e o resíduo aquoso,
realizados com o mesmo material vegetal, foram testados quanto a sua capacidade
mutagênica frente às cepas TA98, TA100 e TA102 de Salmonella typhimurium.
28
Nenhuma das frações apresentou toxicidade, porém para os extratos foi observada
mutagenicidade espontânea (PEREIRA; FARIAS; VARGAS, 1996).
Abaixo serão apresentados trabalhos cujos materiais vegetais são
diferentes do citado no item 2.1.2.
Pereira, Gonçalves e Pereira (1992) relataram que o extrato aquoso de
raízes de W.ebracteata (1 g/Kg, v.o.) foi capaz de inibir 30% do edema de pata de
camundongos induzido pelo veneno de Bothrops jararaca.
Através do ensaio de captação de radicais livres (DPPH) foi observado
que o extrato aquoso, proveniente de raízes de
Wilbrandia ebracteata coletadas no
estado do Paraná, reduziu 50% dos radicais livres na dose de 170 µg/mL
(MENEZES; SCHWARZ; SANTOS, 2004).
Todos os trabalhos citados anteriormente foram realizados com raízes de
Wilbrandia ebracteata. Com material proveniente das folhas da espécie foi
observado que a fração hidrometanólica inibiu 73% das lesões gástricas induzidas
por etanol em camundongos, porém não foi eficaz nas lesões induzidas por
indometacina. A fração hidrometanólica não apresentou qualquer efeito analgésico
nos testes de contorções induzidas pelo ácido acético e imersão da cauda
(GONZALEZ; STASI, 2002).
29
2.2 Cayaponia tayuya (Vell.) Cogn.
Cayaponia é um gênero com mais de 60 espécies, sendo assim,
provavelmente é o maior gênero da família Cucurbitacea. Ele está distribuído través
da América tropical e subtropical, sendo que poucas espécies ocorrem no sudeste
dos Estados Unidos e uma espécie ocorre na África (MONRO, 1996).
2.2.1 Classificação botânica
Ordem: Cucurbitales
Família: cucurbitaceae
Gênero: Cayaponia
Espécie: Cayaponia tayuya (Vell.) Cogn. (Fig. 2)
Figura 2: Partes aéreas e raiz de Cayaponia tayuya (Vell.) Cogn.
Foto: Sérgio A. L. Bordignon
30
2.2.2 Constituintes químicos descritos para Cayaponia tayuya
Os trabalhos citados a seguir foram realizados por grupos de
pesquisadores da Alemanha, do Japão e da Espanha. Cabe destacar que em
nenhum desses trabalhos é relatado o local e a época de coleta.
Bauer e colaboradores (1983) relatam que as raízes de
Cayaponia tayuya
foram adquiridas da empresa alemã F.G. Celo. No segundo trabalho (1985) eles
descrevem que a matéria-prima vegetal foi adquirida no comércio e também obtida
através do Prof. Luis H. Berganza, do Paraguai. Nesses trabalhos são descritos os
isolamentos de cucurbitacinas e de flavonóides C-glicosídeos a partir da fração
clorofórmio e do extrato metanol:água, respectivamente. As substâncias obtidas
foram as agliconas e os C-2 glicosídeos das cucurbitacinas R, B e da
diidrocucurbitacina B, além dos flavonóides C-glicosídeos swertisina, spinosina,
vitexina, isovitexina, vicenina-2, orientina e isoorientina, cujas estruturas são
apresentadas na tabela 6. Essas mesmas cucurbitacinas foram também descritas
para Wilbrandia ebracteata (FARIAS et al, 1993), assim como os C-
glicosilflavonóides que são os mesmos descritos por Santos, Santos e Schenkel
(1996) também para raízes de Wilbrandia ebracteata.
31
Tabela 6: Substâncias descritas por Bauer e colaboradores (1983; 1985)
1
2
23
24
R
2
R
R
1
H
H
O
OHH
OH
O
R
R
1
R
2
outros
Cucurbitacinas
1 cucurbitacina B
OH O
OCOCH
3
23,24
2 cucurbitacina R
OH O
OH
3
cucurbitacina B-
glicosídeo
O-Glicose
O
OCOCH
3
23,24
4
cucurbitacina R-
glicosídeo
O-Glicose
O
OH
5 diidrocucurbitacina B
OH O
OCOCH
3
6
diidrocucurbitacina
B-2
-
-D-glicosídeo
O-Glicose
O
OCOCH
3
23,24
7 diidroisocucurbitacina B
O
OH
OCOCH
3
OR
R
1
OH O
R
2
R
4
R
3
R
R
1
R
2
R
3
R
4
Flavonóides C-glicosídeos
8 spinosina
OCH
3 Glicose-O-Glicose
H H
OH
9 swertisina
OCH
3
Glicose
H H
OH
10 vitexina
OH
H
Glicose
H
OH
11 isovitexina
OH
Glicose
H H
OH
12 vicenina-2
OH
Glicose Glicose
H
OH
13 orientina
OH
H
Glicose
OH OH
14 isoorientina
OH
Glicose
H
OH OH
32
Ríos e colaboradores (1990) isolaram os flavonóides C-glicosídeos
vicenina-2 e spinosina do extrato butanólico das raízes de Cayaponia tayuya. O
único dado apresentado quanto à origem do material vegetal foi: “Raízes de C.
tayuya
foram coletadas no Brasil em 1984”.
Um grupo de pesquisa do Japão (HIMENO et al., 1992; 1993; 1994a;
1994b; 1994c) realizou uma série de trabalhos visando à obtenção de compostos
químicos mais polares que os descritos por Bauer e colaboradores (1983; 1985). Ao
todo, foram obtidos 24 compostos, todos 29-nor-cucurbitacinas na forma de
glicosídeos com a glicose nas posições 2 ou 3, denominados como cayaponosídeos.
As estruturas dos compostos isolados por Himeno e colaboradores (1992; 1993;
1994a; 1994b; 1994c) são apresentadas nas tabelas 7 e 8 considerando a presença
ou ausência de anel A aromático.
33
Tabela 7: Glicosídeos de nor-cucurbitacinas com anel A aromático descritas por Himeno e
colaboradores (1992; 1993; 1994a; 1994b; 1994c)
O
OH
R
OH
Glicose-O
OH
R Outros R Outros
15 Cayaponosídeo A
OAc
O
16
Cayaponosídeo
A
3
OBu
OH
17 Cayaponosídeo A
4
O
18
Cayaponosídeo
A
5
OAc
O
Δ
6,7
19 Cayaponosídeo A
6
O
20
Cayaponosídeo
B
OH
21 Cayaponosídeo B
2
OH
22
Cayaponosídeo
B
3
OH
23 Cayaponosídeo B
4
OCH
3
OH
24
Cayaponosídeo
B
5
OH
Δ
6,7
25 Cayaponosídeo C
OH
O
26
Cayaponosídeo
C
5a
OH
O
27
Cayaponosídeo
C
5b
OH
O
Δ
6,7
28
Cayaponosídeo
D
OH
OH
29 Cayaponosídeo D
1
OH
OH
30
Cayaponosídeo
D
2
OH
OH
Δ
6,7
31 Cayaponosídeo C
2
Glu-O
OH
O
O
OH
32
Cayaponosídeo
C
4
Glu-O
OH
O
O
OH
34
Tabela 8: Glicosídeos de nor-cucurbitacinas não aromáticos descritos por Himeno e colaboradores
(1992, 1993, 1994a; 1994b; 1994c)
O
OH
R
OH
O
Glicose-O
R R
33 Cayaponosídeo A
1
OAc
O
34
Cayaponosídeo
B
6a
OH
35
Cayaponosídeo
B
6b
OH
36 Cayaponosídeo C
3
OH
O
37
Cayaponosídeo
D
3a
OH
OH
38
Cayaponosídeo
D
3b
OH
OH
2.2.3 Propriedades farmacológicas descritas para Cayaponia tayuya
Em 1995, Konoshima e colaboradores relataram que os vinte e quatro
cayaponosídeos isolados por Himeno e colaboradores (1992; 1993; 1994a; 1994b;
1994c) inibiram a ativação do vírus Epstein-Barr induzida por TPA in vitro. Esse
trabalho ainda relata que os cayaponosídeos B, D e C
2
inibiram o segundo estágio
da carcinogênese em tumores de pele em camundongos observados através da
diminuição da porcentagem dos papilomas nas primeiras 10 semanas e da
diminuição do número de papilomas por camundongos.
Ríos e colaboradores (1990) avaliaram a atividade antiinflamatória dos
extratos clorofórmio e metanol, das frações acetato de etila e butanólica e dos
flavonóides C-glicosídeos vicenina-2 e spinosina no modelo de edema plantar
induzido pela carragenina em camundongos. Os extratos, as frações, bem como
vicenina-2 e spinosina foram eficazes quando administrados i.p, porém apenas o
extrato clorofórmio foi eficaz por v.o.
Em um modelo in vitro foi avaliada a capacidade da vicenina-2 e da
spinosina em inibir a redução do azul de tetrazólio pelo ânion superóxido. Os
35
compostos na concentração de 100 µM inibiram a redução do azul de tetrazólio em
25% e 21%, respectivamente (HUGUET; MÁÑES; ALCARAZ, 1990).
Cucurbitacina R e diidrocucurbitacina B foram eficazes nos modelos de
edema de pata de camundongo induzido pela carragenina (v.o.), edema de orelha
de camundongo (v.o. e tópico) e edema de pata de camundongo induzido pela
carragenina (subcutâneo), no entanto apenas a cucurbitacina R inibiu o edema de
pata de camundongo induzido pela fosfolipase A
2
quando administrada i.p. Com
relação à atividade analgésica, nenhum dos compostos (5 mg/Kg, v.o.) apresentou
ação significante no teste de contorção induzida pelo ácido acético em
camundongos (Recio et al., 2004).
Escandell e colaboradores (2006; 2007) demonstraram que a
cucurbitacina R e a diidrocucurbitacina B auxiliam na diminuição do processo
inflamatório e de outros sintomas presentes em modelo artrítico em ratos. Alguns
efeitos após a administração dessas cucurbitacinas (1 mg/Kg, v.o.) são redução na
perda de peso, redução da inflamação e do edema, decréscimo da expressão de
COX-2 e óxido nítrico sintetase-2, inibição da produção de prostaglandina-E
2
e fator
de necrose tumoral-α in vivo além de diminuição do dano causado na articulação.
2.3 Cucurbitacinas
Cucurbitacinas são triterpenos tetracíclicos poliidroxilados caracterizados
pelo núcleo cucurbitano (Fig.3), denominado 19-(10→9b)-abeo-10a-lanost-5-eno
(também conhecido como 9b-metil-19-norlanosta-5-eno) que pode ser encontrado
livre ou glicosilado. Além de serem as substâncias referidas como os princípios
amargos da família Cucurbitaceae essas são encontradas, com menor
representatividade, em outras famílias de Angiospermas, tais como Begoniaceae,
Cruciferae, Datisceae, Desfontainiaceae, Elaeocarpaceae, Euphorbiaceae,
Polemoniaceae, Primulaceae, Rubiaceae, Scrophulariadeae e Sterculiaceae, sendo
as cucurbitacinas B e E as mais frequentemente relatadas (NEUWINGER, 1994;
MIRÓ, 1995; PAGOTO; KAPLAN; GOTTLIEB, 1996; CHEN et al., 2005). Para
maiores informações estruturais ver as revisões recentes de Chen e colaboradores
(2005) e Valente (2004).
36
10
5
1
4
2
3
9
8
6
7
11
12
14
13
CH
3
30
CH
3
28
CH
3
29
15
17
16
H
CH
3
20
22
CH
3
21
23
24
25
CH
3
26
CH
3
27
CH
3
H
H
H
19
18
Figura 3: Estrutura geral das cucurbitacinas, núcleo cucurbitano
2.3.1 Atividades farmacológicas descritas para cucurbitacinas
Além das atividades já descritas para as cucurbitacinas provenientes de
Wilbrandia ebracteata e de Cayaponia tayuya, abaixo são descritas outras atividades
farmacológicas desse grupo de substâncias.
Plantas da família Cucurbitaceae têm sido usadas desde a
antigüidade como vermífugos e eméticos devido às propriedades tóxicas das
cucurbitacinas (LAVIE; GLOTTER, 1971; GUHA; SEM, 1975; NEUWINGER, 1994;
MIRÓ, 1995). Essas substâncias também são conhecidas por suas atividades
citotóxica e anti-tumoral (DUNCAN et al., 1996; DUNCAN; DUNCAN; 1997; GUHA;
SEN, 1975; KONOSHIMA et al., 1995; LAZARIS et al, 1998; MIRÓ, 1995; RAO et al.,
1991; RYU et al., 1995). Witkowski e Konopa (1981) relataram a competição entre
as cucurbitacinas B, I, J e R com o cortisol, sendo a ligação com o receptor
reversível e dose-dependente. As cucurbitacinas B, D, I e R têm a capacidade de
inibir a biossíntese de DNA, RNA e proteínas em células HeLa S3, levando à
inibição da proliferação celular (WITKOWSKI; WOYANAROWSKA; KONOPA, 1984).
Edery, Schatzber-Porath e Gitter (1961) realizaram diversos testes
farmacológicos com a cucurbitacina D isolada de Ecballium elaterium. Foram
registrados o aumento da permeabilidade capilar, edema pulmonar, queda na
37
pressão arterial, ausência de liberação de histamina e aumento na motilidade
gastrintestinal.
Um di-glicosídeo (posições 2 e 25) da cucurbitacina R, isolado das raízes
de
Bryonia alba, induziu elevação dos níveis plasmáticos de prostaglandina-E
2
em
ratos submetidos a estresse por imobilização. Também foi constatada inibição da
liberação de ácido araquidônico, o que diminuiu a biossíntese de eicosanóides
(mediadores da inflamação) e aumento na biossíntese e secreção de
corticoesteóides (PANOSSIAN; GABRIELIAN; WAGNER, 1997; 1999; WAGNER;
NORR; WINTERHFF, 1994).
Shohat e colaboradores (1972) descreveram efeito contraceptivo para a
diidrocucurbitacina D em estudo com camundongos, sendo que não foi observado
efeito antagônico ou sinérgico com estrogênio. Em ovários maduros foram
constatados inibição da ovulação e hiperplasia das glândulas.
2.4 Flavonóides C-glicosídeos
Flavonóides C-glicosídeos são flavonóides cujo açúcar está ligado
diretamente à aglicona por uma ligação carbono-carbono. Devido a essa ligação,
normalmente não ocorre hidrólise ácida, o observado é que prolongado tratamento
ácido resulta em isomerização parcial da molécula (HARBORNE; MABRY; MABRY,
1975). Esse grupo de compostos está presente em briófitas, pteridófitas,
gimnospermas e angiospermas mono e dicotiledôneas, sendo que grande parte das
espécies são pertencentes às angiospermas dicotiledôneas (JAY; VIRICEL;
GONNET, 2006). Para mais informações a respeito de flavonóides podem-se
consultar Andersen e Markham (2006), Grotewold (2006) ou ainda Harborne e
Willians (2000).
38
2.4.1 Atividades farmacológicas descritas para flavonóides C-
glicosídeos
Neste item serão apresentados alguns trabalhos para exemplificar as
atividades farmacológicas descritas para flavonóides C-glicosídeos. Devido ao
grande número de publicações apenas um trabalho será apresentado para cada
atividade.
A atividade hipoglicemiante da isoorientina foi descrita por Andrade-Cetto
e Wiedenfeld (2001) em modelo de diabetes induzido pela estreptozotocina. Após
administração oral de isoorientina, as concentrações de glicose plasmática foram
avaliadas nos tempos 0, 1, 2 e 3 horas. O composto mostrou boa atividade na dose
de 15 mg/Kg após 1 hora da administração, continuando com atividade nas duas
horas seguintes. Esses efeitos são comparáveis aos efeitos mostrados em animais
após a administração de glibenclamida.
Em relação à atividade antifúngica, isoorientina apresentou efeito contra
Trichophyton mentagrophytes (SANTHIAMOORTHY et al., 2007).
Li e colaboradores (2002) avaliaram a atividade antiviral para orientina e
vitexina contra a cepa parainfluenza tipo 3. Ambos os flavonóides C-glicosídeos
exibiram atividade antiviral para essa cepa, sendo os valores de CE
50
iguais a 11,7 e
20,8 µg/mL e os índices de seletividade iguais a 32,1 e 16,0, respectivamente.
Estudos para observar atividade antiinflamatória acerca de flavonóides
são muito encontrados. Para flavonóides C-glicosídeos foram encontrados artigos
que apresentam testes in vivo e in vitro para essa atividade, sendo que o trabalho in
vivo será apresentado. Quando administrada oralmente, vicenina-2 mostrou
significante atividade antiinflamatória no modelo de edema de pata de rato induzido
pela carragenina nas doses de 15 e 90 mg/Kg. Na dose de 15 mg/Kg, o composto
inibiu o edema da pata na terceira e quarta horas, enquanto na dose de 90 mg/Kg a
inibição começou na segunda hora e permaneceu por todo o experimento como o
controle positivo (indometacina, 5 mg/Kg) (GOBBO-NETO et al., 2005).
A atividade anti-oxidante para isovitexina foi demonstrada por Lin e
colaboradores (2005), nesse trabalho, isovitexina foi capaz de reduzir a produção de
39
peróxido de hidrogênio induzido pelo lipopolisacarídeo (LPS) em macrófagos de
camundongos RAW264.7.
Há trabalhos que demonstram efeito radio-protetor para esse grupo de
substâncias. Hien e colaboradores (2002) avaliaram o efeito radio-protetor de
Vitexina, um produto contendo a C-glicosilflavona vitexina como composto
majoritário. Pacientes em estágio II e III de câncer de mama foram incluídos no
estudo e foram alocados em dois grupos: pacientes tratados com Vitexina e
pacientes do grupo placebo. O grupo da Vitexina recebia 4 cápsulas (400 mg de
composto ativo) diariamente, durante seis semanas da radioterapia, os pacientes do
grupo placebo receberam 4 cápsulas sem o composto ativo. A dose total de
radiação (Cobalto-60) foi 5000 rad. Efeitos adversos frequentemente encontrados
em pacientes expostos à radiação, tais como dores de cabeça, fadiga, falta de sono
e apetite não foram notáveis nos pacientes do grupo da Vitexina. Também não
houve perda de peso relevante, ou até mesmo ocorreu aumento de peso em 70%
dos pacientes do grupo da Vitexina, enquanto isso, 73% do grupo placebo perderam
de 1 a 2 Kg após as seis semanas de radioterapia. Em relação aos exames
hematológicos, o grupo da Vitexina apresentou vantagem em eritrócitos, leucócitos,
plaqueta e hemoglobina em relação ao grupo placebo.
O efeito anti-espasmódico da isoorientina foi demonstrado por Afifi, Khalil
e Abdalla (1999) em aorta, íleo, traquéia e útero isolados de rato e em útero de
cobaia. Esse composto não apresentou efeito significante no íleo, traquéia e aorta
de rato, porém houve decréscimo da freqüência e da amplitude das contrações em
segmentos uterinos isolados de rato e cobaia.
Vicenina-2 mostrou significante atividade in vitro contra a forma
tripomastigota de Trypanossoma cruzi na concentração de 500 µg/mL (GRAEL;
ALBUQUERQUE; LOPES, 2005).
Isoorientina exibiu significante efeito hepatoprotetor quando a
hepatotoxicidade era induzida por tetracloreto de carbono com administração de 15
mg/Kg v.o. (ORHAM et al., 2003).
3 OBJETIVOS
40
3.1 Objetivo geral
Estudar quimicamente as raízes e folhas de Wilbrandia ebracteata Cogn.
3.2 Objetivos específicos
 Analisar a fração diclorometano das raízes de Wilbrandia ebracteata para o
isolamento de glicosídeos de cucurbitacinas;
 Isolar flavonóides C-glicosídeos da fração butanólica das raízes de Wilbrandia
ebracteata;
 Isolar substâncias a partir das frações obtidas das folhas de Wilbrandia
ebracteata;
 Caracterizar cromatograficamente os constituintes químicos presentes nas
frações butanólicas das raízes e folhas de Wilbrandia ebracteata;
 Comparar os constituintes químicos presentes nas frações butanólicas das raízes
e das folhas de Wilbrandia ebracteata através de métodos cromatográficos.
4 MATERIAIS E MÉTODOS
42
4.1 Procedimentos gerais
Os solventes e reagentes de grau P.A. para análise fitoquímica foram de
procedências variadas: Nuclear
, Merck
e CRQ
. A água utilizada nos
experimentos foi destilada no laboratório. O etanol empregado nas macerações foi o
comercial com graduação alcoólica de 92,8°. Para as análises em Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência (CLAE) os solventes empregados foram de procedência
Nuclear
grau HPLC e água milli Q.
As cromatografias em coluna foram realizadas em gel de sílica 60 de
procedência Merck
®
(tamanho de partícula 0,04–0,063 mm, quando utilizado o
tamanho de partícula 0,05-0,2mm será mencionado no texto), gel de permeação
molecular Sephadex
®
LH-20 de procedência Pharmacia
®
e sílica gel de fase reversa
60 G RP-18 de procedência EMD
e tamanho de partícula 0,040-0,063 mm. As
cromatografias tipo flash foram realizadas em gel de sílica 60 G para CCD de
procedência Vetec
.
Os extratos e as frações obtidas das colunas cromatográficas foram
concentrados em evaporador rotatório sob pressão reduzida em temperatura inferior
a 60 ºC.
As cromatografias em camada delgada (CCD) foram realizadas em
cromatoplacas de alumínio, gel de sílica 60 F
254
de procedência Macherey-Nagel
®
e
Merck
®
. Para a detecção dos flavonóides foram utilizados Reagente Natural A (1%)
(NP) e solução etanólica de polietilenoglicol-4000 (5%) (PEG), enquanto que para as
cucurbitacinas os agentes cromogênicos utilizados foram vanilina-fosfórica e solução
alcoólica de cloreto férrico 2,5%.
Os equipamentos utilizados nesta dissertação foram:
 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência: cromatogramas obtidos em
equipamento Shimadzu SCL-10A, bombas do modelo LC-10AD e detector ultra-
violeta SPD-10AV.
 Ponto de Fusão: obtidos em equipamento Microquímica MQAPF-301.
43
 Espectroscopia na região do ultra-violeta: espectros obtidos em equipamento
Perkin Elmer UV/VIS espectrometer Lambda 10.
 Espectroscopia na região do infra-vermelho: espectros obtidos em equipamento
Shimadzu IRPrestige-21 Fourier Transform Infrared Spectrophotometer.
 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear: espectros obtidos em
equipamento Bruker AM 500 MHZ
†
e em equipamento Varian AS 400 MHZ
‡
.
4.1.1 Acetilação de substâncias isoladas
A acetilação de compostos isolados foi realizada do modo tradicional, com
dissolução da amostra em piridina e adição de anidrido acético (1:3, v/v). Após 3
dias de reação em temperatura ambiente, foi adicionada água destilada gelada.
4.1.2 Hidrólise ácida de substâncias isoladas
A amostra seca foi solubilizada com solução aquosa de ácido clorídrico
1% e refluxada a 100 ºC por 1 hora. Essa solução foi particionada com
diclorometano, resultando na porção aglicona (fração diclorometano) e a porção
açúcar (resíduo aquoso) do composto.
A porção aglicona foi cromatografada em cromatografia em camada
delgada de gel de sílica, eluente éter de petróleo: acetato de etila:isopropanol
(20:5:0,8; v/v/v) com padrões de cucurbitacinas. A detecção foi realizada através de
observação sob luz UV 254 nm e revelação com vanilina fosfórica e aquecimento.
A porção açúcar foi cromatografada em cromatografia em camada delgada
em gel de sílica, eluente clorofórmio:etanol:ácido acético (8:6:0,2; v/v/v) com
†
Pelos espectros realizados agradecemos ao Prof. Dr. Jorge Palermo do Departamento de Química Orgânica da
Faculdade de Ciências Exatas e Naturais da Universidade de Buenos Aires, Argentina.
‡
Pelos espectros realizados agradecemos ao Prof. Dr. Miguel Soriano Balparda Caro do Departamento de
Química do Centro de Física e Matemática da Universidade Federal de Santa Catarina, Brasil.
44
padrões autênticos de açúcar. A detecção foi realizada com solução de anisaldeído
sulfúrico e aquecimento.
4.2 Material Vegetal
a. Para os procedimentos de isolamento a partir das raízes de Wilbrandia
ebracteata
foram utilizadas frações cedidas pela Prof. Dr
a
. Mareni Rocha Farias
obtidas durante sua tese de doutorado (Farias, 1991). O material vegetal com
flores e frutos foi coletado em dezembro de 1987 em Nova Petrópolis-RS,
identificado pelo Prof. Dr. Sérgio A. L. Bordignon cuja exsicata está depositada
no herbário da Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
b. Alternativamente em 2007 foram adquiridas na empresa Lohmman de Nova
Petrópolis-RS raízes de Wilbrandia ebracteata para verificação da estabilidade
das frações citadas no item a.
c. Para o estudo fitoquímico das folhas de Wilbrandia ebracteata, as partes aéreas
da espécie foram coletadas no município de Siderópolis-SC em Outubro de 2006.
O material foi identificado pelo Prof. Dr. Sérgio A. L. Bordignon
(Exsicata:
herbário ICN do Departamento de Botânica da Universidade Federal de
Santa Catarina, FLOR 35829). As folhas foram separadas das demais
partes aéreas e secas em estufa de ar circulante com temperatura igual a
35°C por três dias. Com esse material foram realizadas as frações para a
investigação química das folhas de
Wilbrandia ebracteata.
4.3 Obtenção dos Extratos e Frações das Raízes de Wilbrandia
ebracteata
4.3.1 Obtenção dos extratos a partir das raízes de Wilbrandia ebracteata
45
A extração das raízes de Wilbrandia ebracteata foi realizada através da
maceração de aproximadamente 500 g de raízes com éter de petróleo. Após, o
material vegetal que foi macerado com álcool metílico por
5 dias, na proporção 50
g (droga vegetal) / 100 mL (líquido extrator). Os extratos éter de petróleo e
metanólico foram concentrados em evaporador rotatório sob pressão reduzida
à temperatura inferior a 60 ºC sendo seus rendimentos avaliados com base na
quantidade de raízes moídas maceradas (tabela 9).
Tabela 9: Massas e rendimentos dos extratos obtidos das raízes de W. ebracteata
Extratos Massa Rendimento*
Éter de petróleo 2,7 g 0,5 %
Metanol 73,9 g 14,8 %
*Rendimento em relação ao material vegetal seco e moído
4.3.2 Obtenção das frações a partir das raízes de Wilbrandia ebracteata
As frações foram obtidas a partir do fracionamento do extrato metanólico
com solventes de polaridade crescente. O extrato metanólico foi ressuspendido em
água e particionado com éter de petróleo (3 x 100 mL), diclorometano (4 x 100 mL),
acetato de etila (4 x 100 mL) e n-butanol (3 x 100 mL). As frações obtidas foram
secas com auxílio de evaporador rotatório sob pressão reduzida com temperatura
inferior a 60°C. Os rendimentos das frações foram calculados em relação ao extrato
metanólico e à matéria-prima vegetal (tabela 10).
Tabela 10: Massas e rendimentos das frações obtidas a partir do extrato MeOH das raízes de W.
ebracteata
Frações Massa Rendimento MP* Rendimento EB
#
Éter de petróleo 54,6 mg 0,01 % 0,07 %
Diclorometano 3,5 g 0,7 % 4,7 %
Acetato de etila 1,6 g 0,3 % 2,2 %
Butanol 33,6 g 6,7 % 45,5 %
Resíduo aquoso 18,3 g 3,7 % 24,8 %
*Rendimento em relação ao material vegetal seco e moído
#
Rendimento em relação ao extrato metanólico
Na figura 4 é demonstrada a obtenção dos extratos e das frações a partir
das raízes de Wilbrandia ebracteata.
46
Figura 4: Obtenção dos extratos das raízes de W. ebracteata e das frações após o fracionamento do
extrato metanólico
47
4.4 Análise química da fração diclorometano das raízes de
Wilbrandia ebracteata
4.4.1 Isolamento das substâncias DRI e DRII a partir da fração diclorometano
das raízes de Wilbrandia ebracteata
O processo de isolamento das substâncias DRI e DRII (Fig. 6) foi realizado
a partir de frações cedidas pela Prof
a
. Dr
a
. Mareni Rocha Farias codificadas como
MC
2
XII e MC
2
XIII (Fig. 5) provenientes da fração diclorometano que foi
cromatografada em coluna em gel de sílica (0,063-0,2 mm), eluente éter de
petróleo:acetato de etila (1:3,5; v/v) (Farias, 1991). Essas duas frações foram
utilizadas porque são compostas pelas substâncias mais polares da fração
diclorometano, o que sugere a presença de glicosídeos de cucurbitacinas.
Figura 5: Esquema representativo da CCD realizada pela Prof
a
. Dr
a
. Mareni Rocha Farias com a
fração diclorometano e suas subfrações obtidas após cromatografia em coluna.
Adsorvente: gel de sílica 60 F
254
Eluente: EP:AcOEt (1:3,5; v/v)
Amostras: 1- fração diclorometano 8- fração MC
2
VII
2- fração MC
2
I 9- fração MC
2
VIII
3- fração MC
2
II 10- fração MC
2
IX
4- fração MC
2
III 11- fração MC
2
X
5- fração MC
2
IV 12- fração MC
2
XI
6- fração MC
2
V 13- fração MC
2
XII
7- fração MC
2
VI 14- fração MC
2
XIII
48
Com a fração MC
2
XIII (471 mg) foi realizada cromatografia em coluna em
gel de sílica (0,063-0,2 mm), eluente acetato de etila:metanol em polaridade
crescente resultando nas frações CC2B (275 mg) e CC2C (132 mg). A fração CC2C
foi cromatografada em coluna cromatográfica em gel de sílica, eluente
clorofórmio:etanol:água (30:5:0,1; v/v/v) obtendo dessa forma as frações CC3B (31
mg) e CC3E (38 mg). A fração CC3E foi cromatografada em coluna em sílica de fase
reversa, eluente acetonitrila:metanol:água (1:1:1; v/v/v) resultando na fração RPC1B
(24 mg) que foi cromatografada nas mesmas condições da coluna em sílica de fase
reversa descrita resultando no isolamento de DRI (12 mg).
Uma coluna cromatográfica em gel de sílica (0,063-0,2 mm) foi empregada
na purificação da fração MC
2
XII (378 mg) com eluentes de polaridade crescente
compostos por acetato de etila:metanol. Dessa coluna foi obtida a fração CC1B (275
mg) que juntamente com as frações CC2B e CC3B foram cromatografadas através
de coluna cromatográfica em gel de sílica, eluente clorofórmio:metanol (5:1; v/v).
Essa coluna forneceu a fração CC5B (416 mg) a qual foi cromatografada em coluna
em gel de sílica com clorofórmio:etanol:água (30:5:0,1; v/v/v) resultando na fração
CC6B (366 mg). A fração CC6B foi cromatografada em cromatografia em coluna em
gel de sílica, eluente éter de petróleo:acetato de etila:isopropanol (1:1:0,5; v/v/v)
resultando na fração CC8C (429 mg). Aproximadamente metade da fração CC8C
(220 mg) foi cromatografada em coluna em sílica de fase reversa, eluente
acetonitrila:metanol:água (1:1:1; v/v/v) resultando no isolamento de DRII (78 mg).
49
Figura 6: Isolamento das substâncias DRI e DRII a partir da fração diclorometano das raízes de W.
ebracteata
50
4.5 Análise química da fração butanólica das raízes de Wilbrandia
ebracteata
4.5.1 Isolamento das substâncias BRI, BRII, BRIII e BRIV a partir da fração
butanólica das raízes de Wilbrandia ebracteata
A partir de 5 g da fração butanólica das raízes de W. ebracteata foi
realizada cromatografia tipo flash em sílica para CCD, eluentes
diclorometano:metanol com polaridade crescente. Dessa coluna foram obtidas duas
frações de interesse, sendo elas V1D e V1E.
A fração V1D (564 mg) foi re-cromatografada em coluna em gel de sílica
com acetato de etila:metanol:água (100:16,5:13,5; v/v/v) onde foi obtida a substância
BRI (194 mg).
A fração V1E (1,7 g) foi cromatografada em coluna tipo flash em gel de
sílica com eluentes de polaridade crescente compostos por acetato de etila e
metanol. Dessa coluna foi obtida a fração V3C (1,3 g) a qual foi re-cromatografada
em coluna tipo flash nas mesmas condições cromatográficas resultando a fração
V4B (1,0 g). A fração V4B foi cromatografada em coluna em gel de sílica, eluente
acetato de etila:ácido acético:água (8:1:1; v/v/v) resultando 3 substâncias isoladas
denominadas BRII (143 mg), BRIII (148 mg) e BRIV (270 mg).
Na figura 7 é demonstrado o processo de isolamento de substâncias BRI,
BRII, BRIII e BRIV a partir da fração butanólica das raízes de Wilbrandia ebracteata.
51
Figura 7: Isolamento das substâncias BRI, BRII, BRIII e BRIV a partir da fração butanólica das raízes
de
W. ebracteata
4.5.2 Análise cromatográfica de compostos da fração butanólica das raízes de
Wilbrandia ebracteata
As cromatografias em camada delgada foram desenvolvidas em
cromatoplacas em gel de sílica 60 F
254
, eluente acetato de etila:ácido fórmico:água
(8:1:1; v/v/v) no caso dos compostos com características menos polares, para
compostos mais polares foi utilizado acetato de etila:metanol:ácido acético (11:4:0,3;
v/v/v). As cromatografias foram reveladas com reagente natural A (1 %) e solução
etanólica de polietilenoglicol e observadas sob luz UV 366 nm.
A análise por CLAE da fração butanólica foi realizada através da utilização
de uma coluna fenila Bondclone 10 (300 X 3,9 mm; 10 µm), fase móvel acetonitrila
na bomba A e solução aquosa de ácido acético 1% (ajuste para pH 3,0 com NaOH)
52
na bomba B. O gradiente de eluição seguia os seguintes parâmetros: 85 % de B nos
primeiros 15 min, 85 – 60 % de B nos 10 min subseqüentes e 60 % de B nos últimos
9 min de análise. A detecção das substâncias ocorreu por absorção UV em 330 nm
e o fluxo do eluente foi igual a 1,0 mL/min.
4.6 Obtenção do extrato e das frações das folhas de Wilbrandia
ebracteata
4.6.1 Obtenção do extrato a partir das folhas de Wilbrandia ebracteata
A extração foi realizada com cerca de 290 g de folhas secas moídas
de
W. ebracteata, por maceração em etanol comercial, durante o período de 5
dias, na proporção 10 g (droga vegetal) / 100 ml (líquido extrator). O
macerado foi filtrado e concentrado em evaporador rotatório sob pressão
reduzida à temperatura inferior a 60 ºC. O rendimento do extrato etanólico,
também denominado extrato bruto, foi avaliado com base na quantidade de
folhas secas e moídas (tabela 11).
Tabela 11: Massa e rendimento do extrato bruto das folhas de W. ebracteata
Extrato Massa Rendimento*
Etanólico (bruto) 50 g 17,2%
*Rendimento calculado em relação ao material vegetal seco e moído.
4.6.2 Obtenção das frações a partir das folhas de Wilbrandia ebracteata
As frações foram obtidas a partir do fracionamento do extrato bruto com
solventes de polaridade crescente. O extrato bruto foi ressuspendido em água,
porém uma porção desse extrato não foi solúvel, a qual foi separada e denominada
fração insolúvel em água. A parte solúvel foi particionada com diclorometano (6 x
300 mL) e n-butanol (9 x 300 mL). As frações obtidas foram secas com auxílio de
53
evaporador rotatório sob pressão reduzida com temperatura inferior a 60°C. Os
rendimentos das frações foram calculados em relação ao extrato bruto e à matéria-
prima vegetal (tabela 12).
Tabela 12: Massas e rendimentos das frações obtidas das folhas de W. ebracteata
Frações Massa Rendimento MP* Rendimento EB
#
Insolúvel em água 14 g 4,8 % 28,0 %
Diclorometano 681 mg 0,2 % 1,4 %
Butanólica 5 g 1,7 % 10,0 %
Resíduo aquoso 8 g 2,8 % 16,0 %
*Rendimento em relação à matéria-prima seca e moída
#
Rendimento em relação ao extrato bruto
Na figura 8 é demonstrada a obtenção dos extratos e das frações a partir
das folhas de Wilbrandia ebracteata.
Figura 8: Obtenção do extrato e das frações a partir das folhas de W. ebracteata
54
4.7 Análise química da fração butanólica das folhas de Wilbrandia
ebracteata
4.7.1 Isolamento das substâncias BFI e BFII a partir da fração butanólica
das folhas de
Wilbrandia ebracteata
A partir de 5 g da fração butanólica das folhas de W. ebracteata foi
realizada cromatografia tipo flash em sílica para CCD, eluentes
diclorometano:metanol com polaridade crescente, resultando na fração VF1E (1,2 g).
Aproximadamente metade da massa obtida dessa fração (486 mg) foi
cromatografada em coluna em gel de sílica com acetato de etila:ácido acético:água
(8:1:1,1; v/v/v) resultando nas frações CFA4 (126 mg) e CFA6 (98 mg).
Uma coluna cromatográfica em gel de sílica foi empregada na purificação
da fração CFA6, eluente diclorometano:metanol:água (70:20:3; v/v/v), resultando na
substância denominada BFI (10 mg).
A fração CFA4 foi cromatografada através de coluna cromatográfica em
gel de sílica, eluente clorofórmio:metanol:água (70:20:3; v/v/v). Essa coluna forneceu
a fração CFC7 (31 mg), a qual foi cromatografada em coluna em Sephadex
®
LH-20
com metanol, resultando assim na substância BFII (17 mg).
Na figura 9 é apresentado o processo de isolamento de substâncias BFI e
BFII a partir da fração butanólica das raízes de
Wilbrandia ebracteata.
55
Figura 9: Isolamento das substâncias BFI e BFII a partir da fração butanólica das folhas de W.
ebracteata
4.7.2 Análise cromatográfica de compostos da fração butanólica das
folhas de
Wilbrandia ebracteata
As cromatografias em camada delgada foram desenvolvidas em
cromatoplacas em gel de sílica 60 F
254
, eluente acetato de etila:ácido fórmico:água
(8:1:1; v/v/v) no caso dos compostos com características menos polares e acetato de
etila:metanol:ácido acético (11:4:0,3; v/v/v) para compostos mais polares. As
cromatografias foram reveladas com reagente natural A (1 %) e solução etanólica de
polietilenoglicol e observadas sob luz UV 366 nm.
A análise por CLAE da fração butanólica foi realizada através da utilização
de uma coluna fenila Bondclone 10 (300 X 3,9 mm; 10 µm), fase móvel acetonitrila
na bomba A e solução aquosa de ácido acético 1% (ajuste para pH 3,0 com NaOH)
na bomba B. O gradiente de eluição seguia os seguintes parâmetros: 85 % de B nos
primeiros 15 min, 85 – 60 % de B nos 10 min subseqüentes e 60 % de B nos últimos
56
9 min de análise. A detecção das substâncias ocorreu por absorção UV em 330 nm
e o fluxo do eluente foi igual a 1,0 mL/min.
4.8 Análise química da fração insolúvel das folhas de Wilbrandia
ebracteata
4.8.1 Isolamento da substância IFI a partir da fração insolúvel em água
das folhas de
Wilbrandia ebracteata
A partir de 5 g da fração insolúvel em água das folhas de Wilbrandia
ebracteata foi realizada cromatografia tipo flash em sílica para CCD, eluentes
clorofórmio:metanol com polaridade crescente. Dessa coluna foi obtida a fração
VIF1E (214 mg) que foi cromatografada em coluna em gel de sílica com
clorofórmio:metanol (5:1; v/v) onde foi obtida a fração CIF1A (70 mg). Essa por sua
vez foi cromatografada em coluna em Sephadex
®
LH-20 com metanol, resultando na
substância IFI (10 mg).
Na figura 10 é apresentado o processo de isolamento da substância IFI a
partir da fração insolúvel em água da folhas de Wilbrandia ebracteata.
57
Figura 10: Isolamento da substância IFI a partir da fração insolúvel das folhas de W. ebracteata
4.9 Identificação e elucidação estrutural das substâncias isoladas
Devido às suas características cromatográficas as substâncias BRI, BRII,
BRIII, BRIV, BFI, BFII e IFI foram analisadas através de espectros UV com o auxílio
de reagentes de deslocamento para a elucidação da porção aglicônica de
flavonóides como descritos por Mabry, Markham e Thomas (1970) e Markham
(1982). Além disso, as substâncias BRI, BRII, BFI e BFII foram comparadas
cromatograficamente com amostras autênticas de flavonóides
C-glicosídeos e as
substâncias BRIII, BRIV e IFI foram analisadas através de seus espectros de
ressonância magnética nuclear (RMN).
Para as substâncias DRI e DRII foram importantes seus espectros na
região do infravermelho (IV), suas características cromatográficas, em especial as
colorações quando reveladas com os reagentes cromogênicos vanilina-fosfórica e
cloreto-férrico (2,5 %) além de seus espectros de RMN.
Para análise dos espectros de RMN foram utilizados como material
bibliográfico, além de artigos que serão descritos para cada substância, as seguintes
58
referências: BREIATMAIER (1993); AGRAWAL (1989); RÜCKER; NEUGEBAUER;
WILLEMS (2001) e SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE (2005).
4.10 Análise cromatográfica comparativa entre as frações
butanólicas das raízes e das folhas de
Wilbrandia ebracteata
As frações butanólicas das raízes e das folhas de Wilbrandia ebracteata
foram comparadas cromatograficamente através da utilização de cromatografia em
camada delgada e CLAE.
A cromatografia em camada delgada foi desenvolvida em cromatoplaca
em gel de sílica 60 F
254
, eluente acetato de etila:ácido fórmico:água (8:1:1; v/v/v),
revelada com reagente natural A (1 %) e solução etanólica de polietilenoglicol
observada sob luz UV 366 nm.
As análises das frações butanólicas por CLAE foram realizadas através da
utilização de uma coluna fenila Bondclone 10 (300 X 3,9 mm; 10 µm), fase móvel
acetonitrila na bomba A e solução aquosa de ácido acético 1% (ajuste para pH 3,0
com NaOH) na bomba B. O gradiente de eluição seguia os seguintes parâmetros: 85
% de B nos primeiros 15 min, 85 – 60 % de B nos 10 min subseqüentes e 60 % de B
nos últimos 9 min de análise. A detecção das substâncias ocorreu por absorção UV
em 330 nm e o fluxo do eluente foi igual a 1,0 mL/min.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
59
Neste trabalho é descrita a análise de raízes e folhas de Wilbrandia
ebracteata. Das raízes foram analisadas as frações diclorometano e butanólica com
o intuito de isolar cucurbitacinas e flavonóides C-glicosídeos, respectivamente. Das
folhas foram analisadas as frações, diclorometano, butanólica e insolúvel em água.
5.1 Análise química das raízes de Wilbrandia ebracteata
As frações diclorometano e butanólica obtidas a partir do extrato
metanólico foram analisadas buscando o isolamento de cucurbitacinas e flavonóides
C-glicosídeos, respectivamente. Nesta seção serão descritos os resultados e as
discussões referentes à fração diclorometano, seguidos pelos da fração butanólica.
5.1.1 Análise química da fração diclorometano das raízes de Wilbrandia
ebracteata
5.1.1.1 Isolamento das substâncias DRI e DRII a partir da fração diclorometano
das raízes de
Wilbrandia ebracteata
A presente análise foi realizada visando o isolamento de compostos mais
polares dos até então descritos para essa fração das raízes de Wilbrandia
ebracteata (FARIAS et al., 1993; SCHENKEL et al., 1992) com a hipótese da
possível presença de glicosídeos de cucurbitacinas com anel A aromático similares
àqueles descritos por Himeno e colaboradores (1992; 1993; 1994a; 1994b; 1994c).
Após a realização de diferentes processos cromatográficos foi possível isolar das
raízes de Wilbrandia ebracteata duas substâncias, denominadas DRI (15 mg) e DRII
(78 mg).
60
5.1.1.2 Identificação e elucidação estrutural das substâncias DRI e DRII a partir
da fração diclorometano das raízes de Wilbrandia ebracteata
5.1.1.2.1 Identificação e elucidação estrutural de DRI
A substância DRI apresentou Rf igual a 0,57 quando cromatografada em
placas de gel de sílica, eluente clorofórmio:metanol (5:1; v/v). Essa substância não
apresenta extinção de fluorescência quando observada na luz UV 254 nm e adquire
coloração azul quando revelada com vanilina fosfórica. Esses dados sugeriram que
o composto isolado pudesse ser uma cucurbitacina com cadeia lateral saturada.
Estruturas com grupamentos α,β-insaturados na cadeia lateral geralmente
apresentam coloração violeta quando revelados com vanilina fosfórica, enquanto
que a coloração azul normalmente indica uma 22-deoxo-cucurbitacina (GMELIN,
1964; ZIELINSKI; KONOPA, 1968; SNATZKE et al., 1967).
O espectro IV (Fig. 11) apresenta uma banda alargada em 3404 cm
-1
sugerindo a presença ligações O-H de álcool, o que é confirmado por duas bandas
alargadas em 1080 e 1033 cm
-1
provenientes de estiramentos C-O de álcool. Esse
dado somado a polaridade da substância na cromatografia em camada delgada
sugere a presença de açúcar na molécula. Além disso, na região de 1685 cm
-1
ocorre apenas uma banda característica de carbonila de cetona e em 1375 cm
-1
uma
banda característica de metilas (PAVIA; LAMPMAN; KRIZ, 1996), o que é
compatível com o núcleo cucurbitano (VALENTE, 2004; CHEN et al., 2005).
61
Figura
11: Espectro IV da substância DRI
62
Para a elucidação estrutural foram obtidos espectros de
1
H-RMN e COSY
da substância em sua forma original (Figs. 12 e 13) e acetilada, essa última por
apresentar resultado melhor na região dos hidrogênios do açúcar. O espectro obtido
com a substância original foi comparado com espectros da literatura (FARIAS, 1991)
para cucurbitacinas com as características citadas. Nas tabelas 13 e 14 são
apresentadas as comparações entre DRI e as substâncias 16α,23α-epoxi-2β,3β,20β-
triidroxi-10α,23α-cucurbit-5,24-dien-11-ona e 16α,23α-epoxi-2β,3β,20β-triidroxi-
10
α,23β-cucurbit-5,24-dien-11-ona, codificadas como W-6 e W-7, respectivamente
no trabalho de Farias (1991). Nessas tabelas estão destacados em cinza os valores
diferentes entre W-6 e W-7.
63
Tabela 13: Comparação dos dados espectrais de
1
H-RMN da substância DRI com a substância W-6
descritas por Farias (1991)
W-6
(300 MHz; CDCl
3
)
DRI
(400 MHz; CDCl
3
)
H M
δ (ppm) J (Hz) COSY δ (ppm) J (Hz) COSY
1α m 1,64
12
4
4
1
H-
1β
H-2
H-10
H-3
1,64
H-
1β
H-2
H-10
H-3
1β
ddd 1,44
12
12
11
H-
1α
H-10
H-2
1,39
H-
1α
2 ddd 3,90
11
4
3
H-
1α
H-1β
H-3
3,91
H-
1α
H-3
3 dd 3,45
3
1
H-2
H-
1α
3,86
H-2
H-
1α
6 ddd 5,71
6
2
2
H-
7α
H-7β
H-10
5,66 H-
7α
7α m 1,90
19
6
2
H-
7β
H-6
H-10
1,86
H-
7β
H-6
7β m 2,43
19
8
3
2
H-
7α
H-8
H-10
H-6
2,38
H-
7α
H-8
H-10
8 d 1,97
8
1
H-
7β
Me-32
1,97
H-
7β
10 m 2,27
12
4
3
2
2
H-
1α
H-1β
H-7α
H-7β
H-6
2,29
H-1α
12α dd 3,00
14
1,5
H-
12β
Me-18
3,04
14
1,5
H-
12β
12β d 2,43 14 H-12α 2,44 14 H-12α
15α dd 1,37
13
3,5
H-15β
H-16
1,37
H-15β
H-16
15β m 1,83
13
10
H-
15α
H-16
Me-32
1,83
H-
15α
H-16
16 ddd 4,55
10
10
3,5
H-17
H-15β
H-15α
4,55
H-17
H-15β
H-15α
17 d 1,96 10
H-16
Me-18
1,95
H-16
Me-18
22α dd 1,89
14
7
H-22β
H-23
1,86
H-22β
H-23
22β dd 1,48
14
2
H-22α
H-23
1,47
H-22α
64
Tabela 13: Comparação dos dados espectrais de
1
H-RMN da substância DRI com a substância W-6
descritas por Farias (1991)
W-6
(300 MHz; CDCl
3
)
DRI
(400 MHz; CDCl
3
)
H M
δ (ppm) J (Hz) COSY δ (ppm) J (Hz) COSY
23 ddd 4,68
8
7
2
H-24
H-22α
H-22β
4,68 7
2
H-24
H-22α
24
d
sept
5,91
8
1,5
H-23
Me-26
Me-27
5,91
8
1,5
H-23
Me-18 d 0,94 1,5
H-
12α
H-17
0,92 1,5
H-
12α
H-17
Me-19 s 1,13 1,11
Me-21 s 1,29 1,30
Me-26 d 1,65 1,5 H-24 1,67 H-24
Me-27 d 1,72 1,5 H-24 1,72 H-24
Me-30 s 0,99 Me-31 0,97 Me-31
Me-31 s 1,22 Me-30 1,25 Me-30
Me-32 br s 1,18
H-17
H-8
1,19
M = multiplicidade
Estão destacados os valores diferentes entre as substâncias W-6 e W-7 (cinza)
65
Tabela 14: Comparação dos dados espectrais de
1
H-RMN da substância DRI com a substância W-7
descritas por Farias (1991)
W-7
(300 MHz; CDCl
3
)
DRI
(400 MHz; CDCl
3
)
H M
δ (ppm) J (Hz) COSY δ (ppm) J (Hz) COSY
1α m 1,64
12
4
4
1
H-
1β
H-2
H-10
H-3
1,64
H-
1β
H-2
H-10
H-3
1β
ddd 1,44
12
12
11
H-
1α
H-10
H-2
1,39
H-
1α
2 ddd 3,90
11
4
2,5
H-
1α
H-1β
H-3
3,91
H-
1α
H-3
3 dd 3,45
2,5
1
H-2
H-
1α
3,86
H-2
H-
1α
6 ddd 5,71
6
2
2
H-
7α
H-7β
H-10
5,66 H-
7α
7α m 1,90
19
6
2
H-
7β
H-6
1,86
H-
7β
H-6
7β m 2,43
19
8
3
2
H-
7α
H-8
H-6
2,38
H-
7α
H-8
H-10
8 d 1,97
8
1
H-
7β
Me-32
1,97
H-
7β
10 m 2,27
12
4
3
2
2
H-
1α
H-1β
H-6
2,29
H-
1α
12α dd 3,00
14
1,5
H-
12β
Me-18
3,04
14
1,5
H-
12β
12β d 2,44 14 H-12α 2,44 14 H-12α
15α dd 1,46
14
4
H-15β
H-16
1,50
H-15β
15β m 1,84
14
10
H-
15α
H-16
Me-32
1,83
H-
15α
H-16
16 ddd 4,35
10
10
4
H-17
H-15β
H-15α
4,35
H-17
H-15β
17 d 1,93 10
H-16
Me-18
1,95
H-16
Me-18
22α dd 1,45
14
11
H-22β
H-23
1,45
H-22β
H-23
22β dd 1,35
14
3
H-22α
H-23
1,36
H-22α
H-23
66
Tabela 14: Comparação dos dados espectrais de
1
H-RMN da substância DRI com a substância W-7
descritas por Farias (1991)
W-7
(300 MHz; CDCl
3
)
DRI
(400 MHz; CDCl
3
)
H M
δ (ppm) J (Hz) COSY δ (ppm) J (Hz) COSY
23 ddd 4,53
11
8
3
H-24
H-22α
H-22β
4,55
H-24
H-22α
H-22β
24
d
sept
5,13
8
1,5
H-23
Me-26
Me-27
5,15
8
1,5
H-23
Me-26
Me-27
Me-18 d 0,90 1,5
H-
12α
H-17
0,92 1,5
H-
12α
H-17
Me-19 s 1,13 1,11
Me-21 s 1,30 1,30
Me-26 d 1,67 1,5 H-24 1,67 H-24
Me-27 d 1,70 1,5 H-24 1,72 H-24
Me-30 s 0,99 Me-31 0,97 Me-31
Me-31 s 1,22 Me-30 1,25 Me-30
Me-32 br s 1,17
H-17
H-8
1,19
M = multiplicidade
Estão destacados os valores diferentes entre as substâncias W-6 e W-7 (cinza)
A comparação indica deslocamentos químicos e multiplicidades similares
para a maioria dos sinais. Dessa forma, a aglicona de DRI foi identificada como
sendo a mistura de dois isômeros anteriormente descritos por Farias (1991), porém
na forma de heterosídeos.
67
Figura
12: Espectro
1
H-RMN da substância DRI em CDCl
3
68
Figura 13: Espectro COSY da substância DRI em CDCl
3
69
Os espectros
1
H-RMN e COSY (Figs. 14-18) de DRI acetilada foram
analisados para verificar qual o tipo de açúcar e em que posição esse se liga à
aglicona. Na região próxima a 2,0 ppm podem ser visualizados cinco sinais que
sugerem a presença de metilas ligadas à carbonila de éster, ou seja, os sinais
correspondentes às acetilas. Quatro dessas acetilas apresentam valores próximos,
enquanto uma delas está mais afastada, o que sugere um açúcar com quatro
hidroxilas, sendo a outra acetila proveniente da hidroxila da aglicona. Para as
cucurbitacinas glicosiladas encontradas na literatura (Chen et al., 2005) glicose é o
açúcar mais frequentemente ligado a aglicona, sendo assim, foi admitido glicose
como o açúcar ligado as geninas. Na tabela 15 é mostrada a comparação entre
sinais de hidrogênios da região de açúcar obtidos para DRI acetilada e para
matesaponina 2 peracetilada (GOSMANN et al., 1995).
Tabela 15: Comparação entre os sinais de hidrogênio do açúcar para matesaponina 2 peracetilada
(GOSMANN et al., 1995) e DRI acetilada
Matesaponina 2
peracetilada
(300 MHz; CDCl
3
)
DRI acetilada
(400 MHz; CDCl
3
)
H M
δ (ppm) δ (ppm) COSY
1’ d 4,63
4,63 (J = 7,93 Hz)
H-2’
2’ t 4,92 4,92
H-1’
H-3’
3’ t 5,0-5,4 5,16
H-2’
H4’
4’ t 5,0-5,4 5,06
H-3’
H-5’
5’ m 3,48 3,70
H-4’
H-6a’
H-6b’
6a’ dd 4,21 4,29
H-5’
H-6b’
6b’ dd 4,05 4,12
H-5’
H6a’
M = Multiplicidade
A similaridade dos sinais obtidos para DRI com a glicose, juntamente com
as correlações observadas através do COSY, sugerem que o açúcar ligado às
geninas é a glicose. Além disso, a constante de acoplamento observada para H-1’ (J
= 7,93 Hz) sugere configuração β para a glicopiranose (LEMIEUX; KOTO, 1974;
AGRAWAL, 1992).
70
Ainda no espectro
1
H-RMN da substância DRI acetilada ocorre um singleto
em 4,97 ppm que não ocorria no espectro
1
H-RMN da substância em sua forma
original. Esse singleto não está correlacionado através do COSY com nenhum sinal
correspondente aos hidrogênios da porção açúcar da molécula, sendo então
atribuído à aglicona da mesma. Os hidrogênios que podem sofrer deslocamento
químico após a reação de acetilação da substância são aqueles ligados aos
carbonos que apresentam uma hidroxila ligada a eles. Na porção aglicônica da
molécula ocorrem hidroxilas nas posições 2, 3 e 20, sendo que as hidroxilas mais
reativas são as ligadas aos carbonos 2 e 3, o que sugere que o açúcar da molécula
e a reação de acetilação ocorrem nessas posições. Por ser um singleto, o sinal em
4,97 ppm pode ser atribuído ao hidrogênio ligado ao carbono 3. Dessa forma, foi
possível concluir que a hidroxila em 3 estava na forma livre antes da reação de
acetilação com a substância DRI, sendo assim, foi possível afirmar que a glicose
está ligada à aglicona na posição 2.
71
Figura 14: Espectro
1
H-RMN da substância DRI acetilada em CDCl
3
72
Figura 15: Espectro
1
H-RMN ampliado da substância DRI acetilada em CDCl
3
73
Figura 16: Espectro
1
H-RMN ampliado da substância DRI acetilada em CDCl
3
74
Figura 17: Espectro
1
H-RMN ampliado da substância DRI acetilada em CDCl
3
75
Figura 18: Espectro COSY ampliado da substância DRI acetilada em CDCl
3
76
Frente aos resultados e discussões é possível afirmar que a substância
DRI é uma mistura dos isômeros descritos por Farias (1991) e Schenkel e
colaboradores (1992) na forma de 2-O-β-glicopiranosídeo, são elas: 16α,23α-epoxi-
2-
O-β-glicopiranosil-3β,20β-diidroxi-10α,23β-cucurbit-5,24-dien-11-ona e 16α,23α-
epoxi-2-
O-β-glicopiranosil-3β,20β-diidroxi-10α,23α-cucurbit-5,24-dien-11-ona (Fig.
19). Não há na literatura qualquer menção sobre o isolamento dessas cucurbitacinas
na forma glicosilada.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
1'
2'
3'
4'
5'
6'
O
O
OH
OH
OH
OH
O
H H
O
H
OH
H
H
OH
O
O
OH
OH
OH
OH
O
H H
O
H
OH
H
H
OH
Figura 19: Fórmulas estruturais das substâncias denominadas DRI
77
5.1.1.2.2 Identificação e elucidação estrutural de DRII
A substância DRII fundiu entre 150,5 – 151,2 °C e apresentou Rf igual a
0,69 quando cromatografada em placas de gel de sílica, eluente clorofórmio:metanol
(5:1; v/v). Essa substância não apresenta extinção de fluorescência quando
observada na luz UV 254 nm, adquire coloração amarela quando revelada com
vanilina fosfórica e não reage quando revelada com solução alcoólica de cloreto
férrico 2,5 %. Devido às colorações adquiridas com os reagentes cromogênicos, foi
possível sugerir que a estrutura apresenta cadeia lateral saturada, já que
cucurbitacinas com insaturação na cadeia lateral apresentam coloração violeta
quando reveladas com vanilina fosfórica, além de não apresentar sistema diosfenol
no anel, pois se assim houvesse reagiria com cloreto férrico (GMELIN, 1964;
ZIELINSKI; KONOPA, 1968).
O espectro IV (Fig. 20) apresenta uma banda alargada em 3421 cm
-1
sugerindo a presença de ligações O-H de álcool, o que é confirmado por três bandas
alargadas em 1024, 1056 e 1078 cm
-1
provenientes de estiramentos C-O de álcool.
Esse dado somado a polaridade da substância na cromatografia em camada
delgada sugere a presença de açúcar na molécula. Além disso, na região das
carbonilas (1800 – 1685 cm
-1
) ocorrem duas ou mais bandas, sendo a banda em
1710 cm
-1
característica de carbonila de éster, o que indica a presença de uma
acetila. Segundo a literatura (CHEN et al., 2005) as posições mais comuns para as
acetilas nas cucurbitacinas ocorrem nos carbonos 25 e 16. Em 1369 cm
-1
ocorre
banda característica de metilas (PAVIA; LAMPMAN; KRIZ, 1996), que são estruturas
compatíveis com o núcleo cucurbitano (VALENTE, 2004; CHEN et al., 2005).
78
Figura 20: Espectro IV da substância DRII
79
Com a hipótese de tratar-se de um glicosídeo, DRII foi hidrolisada em
meio ácido e as porções aglicona e açúcar provenientes da hidrólise foram
cromatografadas em cromatografias de camada delgada. O observado foi que a
aglicona degradou formando seis compostos com coloração roxa após revelação
com vanilina fosfórica e aquecimento. Na porção açúcar foi observada apenas uma
mancha quando revelada com anisaldeído sulfúrico e aquecimento cujo Rf e
coloração eram idênticos aos apresentados pelo padrão de glicose.
Para a elucidação estrutural foram obtidos espectros de
1
H-RMN,
13
C-
RMN, COSY e HSQC da substância em sua forma original (Figs. 21-27). Os
espectros obtidos foram comparados com espectros da literatura para cucurbitacinas
com características similares (FARIAS, 1991).
O espectro
13
C-RMN apresenta quatro sinais característicos de carbonilas.
Os sinais em 215, 214 e 211 ppm podem ser provenientes de carbonilas de cetonas
saturadas, grupo funcional presente nas cucurbitacinas (VALENTE, 2004; CHEN et
al,. 2005). O sinal em 170,7 ppm pode ser devido à presença de carbonila de éster
que segundo a literatura (VALENTE, 2004; CHEN et al,. 2005) é facilmente
encontrada nas cucurbitacinas que contém acetila. Ainda no espectro
13
C-RMN
ocorrem dois sinais de carbonos de ligação dupla (140 e 120 ppm) e um sinal em
104 ppm típico de carbono anomérico de glicose (YAMADA; HAGIWARA; IGUCHI,
1977; ROTHENBURGER; HASLINGER, 1995). Outro dado relevante é a presença
de oito sinais em campo alto do espectro
13
C-RMN que apresentam correlação no
HSQC com oito sinais de hidrogênios na região de metilas. Essas oito metilas são
características essenciais para o esqueleto cucurbitano (VALENTE, 2004; CHEN et
al., 2005) que juntamente com os demais dados descritos acima confirma que este
composto é uma cucurbitacina.
Os dados descritos acima sugeriram que DRII pudesse ser um glicosídeo
da diidrocucurbitacina B ou um de seus derivados, tais como a diidroisocucurbitacina
B. Os espectros
1
H-RMN e
13
C-RMN foram comparados aos dados obtidos por
Farias (1991) para essas cucurbitacinas. Os deslocamentos químicos observados
para DRII são muito semelhantes aos da diidrocucurbitacina B. Nas tabelas 16 e 17
os deslocamentos químicos obtidos nos espectros
13
C-RMN e
1
H-RMN da
substância DRII são confrontados com da diidrocucurbitacina B (FARIAS, 1991).
Também são mostradas as correlações entre os sinais dos carbonos com os sinais
80
de seus respectivos hidrogênios através do HSQC e a correlação entre hidrogênios
vizinhos através do COSY.
Tabela 16: Comparação dos dados espectrais de
13
C-RMN da substância DRII com
diidroisocucurbitacina B descrita por Farias (1991)
Diidrocucurbitacina B
(75 MHz; CDCl
3
)
DRII
(100 MHz; CDCl
3
)
C
δ (ppm) δ (ppm) HSQC
1 36,0 42,5
2 71,6 68,9
3 211,8 211,3
4 50,2 50,7
5 140,3 140,0
6 120,2 120,5 5,77 ppm
7 23,9 26,2
8 42,3 45,7 1,42 ppm
9 48,4 48,5
10 33,8 34,3 2,79 ppm
11 212,7 214,3
12 48,7 48,9 2,70 ppm
13 48,4 48,6
14 50,6 51,5
15 45,5 46,5
16 70,9 71,2 4,38 ppm
17 57,8 58,2 2,55 ppm
18 19,8 20,1 0,95 ppm
19 20,1 20,2 1,06 ppm
20 78,9 79,9
21 24,5 24,6 1,43 ppm
22 213,6 214,8
23 30,7 29,7
24 34,8 35,0 ~2,0 ppm
25 81,2 81,5
26 26,2 29,2 1,28 ppm
27 25,9 26,4 1,46 ppm
30 29,4 31,0 1,25 ppm
31 21,3 21,5 1,28 ppm
32 18,8 19,0 1,36 ppm
CH
3
CO 22,4 22,7 1,97 ppm
CH
3
CO 170,1 170,7
81
Tabela 17: Comparação dos dados espectrais de
1
H-RMN da substância DRII com
diidrocucurbitacina B descrita por Farias (1991)
Diidrocucurbitacina B
(300 MHz; CDCl
3
)
DRII
(400 MHz; CDCl
3
)H M
δ (ppm) J (Hz) COSY δ (ppm) J (Hz) COSY
1α ddd 2,29
13
6
3
2,37
H-
1β
H-2
H-10
1β
ddd 1,21
13
13
13
1,42
H-
1α
H-2
H-10
2 ddd 4,40
13
6
4
4,62
13
6
4
H-
1α
H-1β
6 ddd 5,78
6
2
2
5,77 H-7α
7α m ~1,9 2,0
H-6
H-
7β
7β m 2,40
20
8
3
3
2,43
H-
7α
H-8
8 d ~2,0 1,42
H-
7α
H-7β
10 m 2,72 13 2,79 14
H-
1α
H-1β
12α dd 3,25
14,5
1
3,36 14
H-
12β
Me-18
12β d 2,75 14,5 2,70 14,5 H-12α
15α dd 1,39 14 1,43 H-15β
15β m 1,82
14
8,5
1,84
H-
15α
H-16
16 dd 4,27
8,5
7
4,38
9,5
7
H-
15β
H-17
17 d 2,52 7 2,55 7 H-16
23a dd 2,81
17
8
7
2,85
17
8
7
H-24a
H-24b
H-23b
23b dd 2,50
17
8
7
2,50
17
8
7
H-23a
H-24a
H-24b
24a dd 2,03
8
7
2,04
8
7
H-23a
H-23b
H-24b
24b dd 2,03
8
7
2,06
8
7
H-24a
H-23a
H-23b
Me-18 br s 0,95 H-12α 0,95 H-12α
Me-19 s 1,06 1,06
Me-21 s 1,40 H-12β 1,43
Me-26 s 1,42 1,28 H-23ª
Me-27 s 1,44 1,46
Me-30 s 1,32 1,25
Me-31 s 1,27 1,28
Me-32 br s 1,35
H-8
H-
15β
1,36
CH
3
CO s 1,94 1,97
M = Multiplicidade
82
A comparação com a literatura juntamente com a análise dos espectros de
correlação possibilitou identificar a aglicona de DRII como diidrocucurbitacina B.
A analise dos deslocamentos químicos observados na região do açúcar e
suas correlações são apresentados na tabela 18. Farias e colaboradores (1993)
identificaram o 2-glicosídeo da diidrocucurbitacina B nas raízes de Wilbrandia
ebracteata. Essa informação associada à desproteção do carbono 1 observada pela
mudança do deslocamento químico desse carbono para campo mais baixo propõe
que a glicose está ligada à genina na posição 2.
Tabela 18: Dados espectrais de
1
H-RMN e
13
C-RMN para DRII
DRII
(400 MHz; CDCl
3
)
Carbono
δ (ppm) HSQC
Hidrogênio
M δ (ppm) J (Hz) COSY
1’ 103,8 4,35 ppm 1’
d 4,35 8
H-3
H-2’
2’ 74,0 3,44 ppm 2’ t 3,44
8
9
H-1’
H-3’
3’ 76,5 3,56 ppm 3’ t 3,56
8
9
H-2’
H-4’
4’ 70,2 3,50 ppm 4’ t 3,50
8
9
H-3’
H-5’
5’ 76,5 3,37 ppm 5’ m 3,37
H-4’
H-6a'
H-6b’
6a' dd 3,93
11
7
H-5’
6’ 62,5
3,93 ppm
3,83 ppm
6b’ dd 3,83
11
7
H-5’
M = Multiplicidade
83
Figura
21: Espectro
13
C-RMN da substância DRII em CDCl
3
84
Figura 22: Espectro
1
H-RMN da substância DRII em CDCl
3
85
Figura
23: Espectro
1
H-RMN ampliado da substância DRII em CDCl
3
86
Figura 24: Espectro COSY da substância DRII em CDCl
3
87
Figura 25: Espectro COSY ampliado da substância DRII em CDCl
3
88
Figura 26: Espectro HSQC da substância DRII em CDCl
3
89
Figura 27: Espectro HSQC ampliado da substância DRII em CDCl
3
90
Levando em consideração os resultados e as discussões abordadas
juntamente com a constante de acoplamento do hidrogênio anomérico igual a 8,0 Hz
que sugere configuração
β para a glicopiranose (LEMIEUX; KOTO, 1974;
AGRAWAL, 1992), foi possível identificar DRII como o 2-
O-β-glicopiranosídeo da
diidrocucurbitacina B (Fig. 28).
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
1'
2'
3'
4'
5'
6'
32
31
30
O
H H
H
OH
O
OAc
OH
O
O
O
OH
OH
OH
OH
Figura 28: Fórmula estrutural da 2-O-β-glicopiranosídeo da diidrocucurbitacina B
Krepski (2003) demonstrou que existem 65 mg de diidrocucurbitacina B
para cada 100g de raízes de Wilbrandia ebracteata. A autora utilizou métodos de
espectroscopia na região do UV para realizar o doseamento. Provavelmente o
glicosídeo da diidrocucurbitacina B, que é o glicosídeo de cucurbitacina majoritário
das raízes da espécie, também deve ter sido dosado como diidrocucurbitacina B.
Não há relatos sobre o isolamento dessa cucurbitacina glicosilada a partir
da fração diclorometano das raízes de Wilbrandia ebracteata. Farias (1991) relatou a
identificação da mesma e seu isolamento em mistura com outras duas
cucurbitacinas glicosiladas através de cromatografia em camada delgada por
comparação das agliconas provenientes da hidrólise enzimática com padrões.
5.1.2 Análise da presença das substâncias DRI e DRII na fração diclorometano
das raízes de Wilbrandia ebracteata do material adquirido da indústria
Lohmman
A fração diclorometano obtida das raízes de Wilbrandia ebracteata
adquiridas na indústria Lohmman em 2007 foi cromatografada através de
cromatografia em camada delgada (fig. 29) com as substâncias DRI e DRII isoladas
91
a partir das frações MC
2
XII e MC
2
XIII cedidas pela Prof
a
. Dr
a
. Mareni Rocha Farias
(Farias, 1991) para verificar a presença dessas duas cucurbitacinas em material
recém coletado. Como adsorvente foi utilizado gel de sílica 60 F
254
, eluente
clorofórmio:metanol (5:1, v/v) e observação após a revelação das substâncias com o
agente cromogênico vanilina fosfórica. O observado foi que ambas as substâncias
apresentavam Rfs e colorações idênticas aos de substâncias presentes na fração
diclorometano, comprovando dessa forma que ambas estão presentes na fração em
material recém coletado.
Figura 29: Cromatografia em camada delgada apresentando o perfil cromatográfico da fração
diclorometano das raízes de
W. ebracteata adquiridas na indústria Lohmman (2) e das substâncias
DRI
(1) e DRII (3)
Adsorvente: gel de sílica 60 F
254
Eluente: CHCl
3
:MeOH (5:1, v/v)
Detecção: Vanilina fosfórica e aquecimento.
5.1.3 Análise química da fração butanólica das raízes de Wilbrandia
ebracteata
Para verificar a estabilidade da fração butanólica cedida pela Prof. Dra.
Mareni Rocha Farias, foi realizado o mesmo processo de extração apresentado por
Farias (1991) com o material vegetal descrito no item 4.2 b. Abaixo, é apresentada a
comparação entre as frações butanólicas através de cromatografia em camada
92
delgada (Fig. 30). As frações apresentaram o mesmo perfil cromatográfico o que
confirma a grande estabilidade da fração butanólica cedida por Farias. Como fase
estacionária para a cromatografia foi utilizado gel de sílica 60 F
254
, eluente acetato
de etila:ácido acético:água (8:1:1, v/v/v) e observação sob luz UV 366 nm após a
revelação com NP/PEG.
Figura 30: Cromatografia em camada delgada apresentando o perfil cromatográfico das frações
butanólicas das raízes de
W. ebracteata realizadas por Farias (1991) (1) e com o material vegetal
adquirido na indústria Lohmman
(2)
Adsorvente: gel de sílica 60 F
254
Eluente: AcOEt:CH
3
COOH:H
2
O (8:1:1, v/v/v)
Detecção: NP/PEG e aquecimento/UV 366 nm
5.1.3.1 Isolamento das substâncias BRI, BRII, BRIII e BRIV a partir da fração
butanólica das raízes de Wilbrandia ebracteata
O isolamento de flavonóides do tipo C-glicosídeos das raízes de
Wilbrandia ebracteata não foi realizado com o objetivo principal de encontrar novas
moléculas, tendo em vista o trabalho anteriormente realizado por Santos em 1989.
Buscou-se a obtenção de flavonóides C-glicosídeos objetivando realizar estudos
biológicos dessas substâncias em parceria com outros laboratórios além de
identificar compostos não descritos anteriormente.
93
O isolamento das substâncias majoritárias a partir de 5 g da fração
butanólica das raízes de Wilbrandia ebracteata foi realizado por cromatografias tipo
flash e colunas em gel de sílica. As substâncias isoladas foram denominados BRI,
BRII, BRIII e BRIV, suas massas e rendimentos estão na tabela 19.
Tabela 19: Massas e rendimento dos quatro flavonóides C-glicosídeos isolados a partir da fração
butanólica das raízes de
W. ebracteata
Substâncias Massa Rendimento*
BRI 194 mg 3,9 %
BRII 270 mg 5,4 %
BRIII 143 mg 2,9 %
BRIV 148 mg 3,0 %
*Rendimento em relação à fração butanólica
5.1.3.2 Identificação e elucidação estrutural das substâncias BRI, BRII, BRIII e
BRIV isoladas a partir da fração butanólica das raízes de Wilbrandia
ebracteata
5.1.3.2.1 Identificação de BRI
A substância BRI apresentou ponto de fusão em 228,3 °C com
decomposição e valor de Rf 0,62 no sistema Acetato de etila:ácido acético:água
(8:1:1, v/v/v). Após revelação com NP/PEG e aquecimento ela apresentou
fluorescência verde-azulada sob luz UV 366 nm.
Os espectros UV obtidos em solução metanólica e também após a adição
dos reagentes de deslocamento descritos por Mabry, Markham e Thomas (1970) e
Markham (1982) sugerem aglicona 4’,5-diidroxiflavona, com ausência de hidroxila
em 7, o que é compatível ao núcleo genkwanina (Fig. 31), ou seja, uma 5,4’-diidroxi-
7-metoxi-flavona. Os valores dos máximos de absorção e os deslocamentos
observados encontram-se na tabela 20.
94
O
OH O
OH
MeO
2
3
4
5
6
7
8
2'
3'
4'
5'
6'
A
C
B
Figura 31: Fórmula estrutural do núcleo genkwanina
Tabela 20: Máximos de absorção e deslocamentos observados após a adição de reagentes nos
espectros UV da substância BRI
λ máximo (nm) deslocamento (nm)
Solvente/
Reagente
banda I
banda II banda I banda II
Informações
estruturais
MeOH 332 272
flavona ou flavonol
3-
O-subs.
NaOMe 389 277
+57 nm (s/
decres.
intensidade)
com –OH livre em
C-4’
NaOAc
389
348
271
sem + 5-20
nm
sem –OH livre em
C-7
NaOAC +
H
3
BO
3
339 272
sem + 12-36
nm
sem o-diidroxi
AlCl
3
380
347
302
284
sem
deslocamento
+ em relação
AlCl
3
+ HCl
sem o-diidroxi nos
anéis A e B
AlCl
3
+
HCl
380
350
300
283
+ 48 nm
com –OH livre em
C-5
Levando em consideração os dados cromatográficos que sugeriram tratar-
se de um glicosídeo e o núcleo fundamental indicado pelo espectro UV, BRI foi co-
cromatografada com spinosina, uma C-glicosilflavona di-glicosilada descrita
anteriormente por Santos (1989) para as raízes de Wilbrandia ebracteata cuja
polaridade e o núcleo fundamental eram compatíveis. Através dessa co-
cromatografia realizada em gel de sílica 60 F
254
, eluente acetato de
etila:metanol:ácido acético (11:4:0,3; v/v/v) e a detecção com reagente natural A e
aquecimento (Fig. 32) foi possível confirmar a identidade de BRI como spinosina.
95
Figura 32: Co-cromatografia em camada delgada realizada com a substância BRI e spinosina
Adsorvente: gel de sílica 60 F
254
Eluente: AcOEt: MeOH:CH
3
COOH (11:4:0,3; v/v/v)
Detecção: Reagente natural A e aquecimento
Amostras:1- BRI
2- BRI + spinosina
3- spinosina
Dessa forma foi possível afirmar que BRI é spinosina. A fórmula estrutural
da mesma é apresentada na figura 33.
O
O
OH
MeO
OH
O
O
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
Figura 33: Fórmula estrutural da spinosina
5.1.3.2.2 Identificação de BRII
A substância BRII fundiu no intervalo de 208,6 – 209,8 °C e apresentou
valor de Rf 0,43 no sistema Acetato de etila:ácido acético:água (8:1:1, v/v/v). Após
revelação com NP/PEG e aquecimento ela apresentou fluorescência verde-
amarelada sob luz UV 366 nm.
96
Os espectros UV obtidos em solução metanólica e também após a adição
dos reagentes de deslocamento descritos por Mabry, Markham e Thomas (1970) e
Markham (1982) sugerem uma 4’,5,7-triidroxi-flavona, o que é compatível com o
núcleo apigenina (Fig. 34). Os valores dos máximos de absorção e os
deslocamentos observados encontram-se na tabela 21.
O
OH O
OH
OH
2
3
4
5
6
7
8
2'
3'
4'
5'
6'
A
C
B
Figura 34: Fórmula estrutural do núcleo apigenina
Tabela 21: Máximos de absorção e deslocamentos observados após a adição de reagentes nos
espectros UV da substância BRII
λ máximo (nm) deslocamento (nm)
Solvente/
Reagente
banda I
banda II banda I banda II
Informações
estruturais
MeOH 337 272
flavona ou flavonol
3-O-subs.
NaOMe
395
331
279
+58 nm (s/
decres.
intensidade)
com –OH livre em
C-4’
NaOAc 343 275 + 3 nm
com –OH livre em
C-7
NaOAC +
H
3
BO
3
335 272
sem + 12-36
nm
sem o-diidroxi
AlCl
3
380
349
304
279
sem
deslocamento
+ em relação
AlCl
3
+ HCl
sem o-diidroxi nos
anéis A e B
AlCl
3
+
HCl
380
350
303
280
+ 43 nm
com –OH livre em
C-5
Levando em consideração os dados cromatográficos que sugeriram tratar-
se de um glicosídeo e os deslocamentos observados nos espectros UV, BRII foi
inicialmente cromatografada com vitexina e isovitexina, duas C-glicosilflavonas do
tipo apigenina anteriormente descritas por Santos (1989) cuja polaridade e o núcleo
fundamental eram compatíveis. Após revelação com reagente natural A e
97
aquecimento, foi observado que BRII apresentava Rf muito semelhante à isovitexina.
Dessa forma, a identidade de BRII foi confirmada através de co-cromatografia com
isovitexina realizada em gel de sílica 60 F
254
, eluente acetato de etila:ácido
acético:água (8:1:1; v/v/v) e a detecção com reagente natural A e aquecimento
(Fig.35).
Figura 35: Co-cromatografias entre BRII e isovitexina
Adsorvente: gel de sílica 60 F
254
Eluente: AcOEt:CH
3
COOH:H
2
O (8:1:1; v/v/v)
Detecção: Reagente natural A e aquecimento/UV 366 nm
Amostras:1- BRII
2-BRII + isovitexina
3-isovitexina
Dessa forma foi possível afirmar que BRII é isovitexina. A fórmula
estrutural da mesma é apresentada na figura 36.
O
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
OH
Figura 36: Fórmula estrutural da isovitexina
98
5.1.3.2.3 Identificação de BRIII
A substância BRIII apresentou ponto de fusão em 227,5 °C com
decomposição e valor de Rf 0,40 no sistema acetato de etila:ácido acético:água
(8:1:1, v/v/v). Após revelação com NP/PEG e aquecimento ela apresentou
fluorescência azul sob luz UV 366 nm.
Os espectros UV obtidos em solução metanólica e também após a adição
dos reagentes de deslocamento descritos por Mabry, Markham e Thomas (1970) e
Markham (1982) sugerem uma 4’,5-diidroxi-flavona substituída em 7, o que é
compatível com o núcleo genkwanina (Fig. 31). Os valores dos máximos de
absorção e os deslocamentos observados encontram-se na tabela 22.
Tabela 22: Máximos de absorção e deslocamentos observados após a adição de reagentes nos
espectros UV da substância BRIII
λ máximo (nm) deslocamento (nm)
Solvente/
Reagente
banda I
banda II banda I banda II
Informações
estruturais
MeOH 333 270
flavona ou flavonol
3-O-subs.
NaOMe 390
269
241
+57 nm (s/
decres.
intensidade)
com –OH livre em
C-4’
NaOAc 338
271 sem + 5-20
nm
sem –OH livre em
C-7
NaOAC +
H
3
BO
3
336 271
sem + 12-36
nm
sem o-diidroxi
AlCl
3
380
350
300
280
243
sem
deslocamento
+ em relação
AlCl
3
+ HCl
sem o-diidroxi nos
anéis A e B
AlCl
3
+
HCl
380
350
300
280
242
+ 47 nm
com –OH livre em
C-5
Levando em consideração os dados cromatográficos do composto BRIII,
principalmente a proximidade de seu Rf ao do composto BRII (isovitexina),
juntamente com a estrutura proposta através da análise dos dados espectrais
obtidos por UV foi possível sugerir que BRIII pudesse ser um derivado da isovitexina
99
com a presença de uma metoxila ligada ao carbono 7 da aglicona, ou seja, que BRIII
pudesse ser swertisina.
Como não havia disponibilidade de amostra autêntica para confirmar a
identidade dessa substância, foi obtido espectro de
1
H-RMN da substância BRIII. Na
tabela 23 são comparados os valores obtidos experimentalmente e encontrados na
literatura para swertisina (KUMARASAMY et al., 2004). Logo abaixo é apresentado o
espectro de
1
H-RMN da substância BRIII (Fig. 37).
Tabela 23: Valores de
1
H-RMN obtidos para BRIII confrontados com a literatura (KUMARASAMY et
al., 2004)
Swertisina
400 MHz CD
3
OD
BRIII
500 MHz CD
3
ODH M
δ (ppm) δ (ppm)
3 s 6,54 6,58
7-OMe s 3,90 3,87
8 s 6,60 6,64
2’ d 7,78 7,83
3’ d 6,87 6,91
5’ d 6,87 6,91
6’ d 7,78 7,83
1’’ 4,86 (sobreposto) 4,83 (sobreposto)
2’’ t 4,13 4,23
3’’ 3,56 (encoberto) 3,49 (encoberto)
4’’ 3,51 (encoberto) 3,48 (encoberto)
5’’ 3,41 (encoberto) 3,47 (encoberto)
6a’’ 3,72 (encoberto) 3,71
6b’’ 3,90 (encoberto) 3,90 (sobreposto)
M = Multiplicidade
100
Figura
37: Espectro
1
H-RMN da substância BRIII em CD
3
OD
101
O espectro apresentou sinais compatíveis para quatro hidrogênios no anel
B (7,78 ppm, 2 H e 6,87 ppm, 2 H), um hidrogênio no carbono 8 (6,60 ppm), além de
uma metoxila (3,90 ppm). A comparação detalhada com dados da literatura
confirmou que BRIII é swertisina (Fig. 38).
O
OH
MeO
OH
O
O
OH
OH
OH
OH
Figura 38: Fórmula estrutural da swertisina
5.1.3.2.4 Elucidação estrutural de BRIV
A substância BRIV apresentou ponto de fusão em 214,2 °C com
decomposição e valor de Rf 0,18 no sistema acetato de etila:ácido acético:água
(8:1:1, v/v/v). Após revelação com NP/PEG e aquecimento ela apresentou
fluorescência verde-azulada sob luz UV 366 nm. Cromatograficamente, BRIV
encontra-se na região dos flavonóides C-glicosídeos di-glicosilados, como é o caso
da vitexina-2-O-ramnosídeo, cujo Rf é 0,16 nesse sistema. Como essa substância
não corresponde às anteriormente descritas por Santos (1989), aqui é apresentada
sua elucidação estrutural.
Os espectros UV obtidos em solução metanólica e também após a adição
dos reagentes de deslocamento descritos por Mabry, Markham e Thomas (1970) e
Markham (1982) sugerem que a parte aglicônica da molécula seja proveniente do
núcleo genkwanina (Fig. 31). Os valores dos máximos de absorção e os
deslocamentos observados encontram-se na tabela 24.
102
Tabela 24: Máximos de absorção e deslocamentos observados após a adição de reagentes nos
espectros UV da substância BRIV
λ máximo (nm) deslocamento (nm)
Solvente/
Reagente
banda I banda II banda I banda II
Informações
estruturais
MeOH 335 273
flavona ou flavonol
3-O-subs.
NaOMe 390
271
233
+55 nm (s/
decres.
intensidade)
com –OH livre em
C-4’
NaOAc
385
339
272 sem + 5-20
nm
sem –OH livre em
C-7
NaOAC +
H
3
BO
3
338 272
sem + 12-36
nm
sem o-diidroxi
AlCl
3
380
351
304
283
sem
deslocamento
+ em relação
AlCl
3
+ HCl
sem o-diidroxi nos
anéis A e B
AlCl
3
+
HCl
380
352
302
283
+ 45 nm
com –OH livre em
C-5
Foram realizados os espectros
1
H-RMN, COSY e HSQC com a substância
BRIV acetilada. No espectro
1
H-RMN foi possível verificar um dubleto em 7,92 ppm
atribuído aos hidrogênios 3’ e 5’; em 7,29 ppm ocorre outro dubleto proveniente dos
hidrogênios 2’ e 6’, confirmando a presença de apenas uma hidroxila no anel B.
Esses dois dubletos apresentam correlação no COSY entre eles e no HSQC com os
carbonos 128 e 122 ppm, respectivamente. No espectro
1
H-RMN há um singleto em
6,59 ppm que se correlaciona pelo HSQC com o sinal do carbono em 106 ppm
esses foram atribuídos ao hidrogênio e ao carbono 3, respectivamente e confirma a
flavona sugerida nos espectros UV. Ainda em 3,95 ppm ocorre um singleto típico de
metoxila, esse sinal está correlacionado no HSQC com o sinal do carbono em 56,4
ppm e confirma o núcleo genkwanina proposto a partir dos espectros UV. O singleto
em 6,49 ppm pode ser devido à presença ou do hidrogênio ligado ao carbono 8 ou
ao carbono 6, o que juntamente com a hipótese de que BRIV seja uma C-
glicosilflavona di-glicosilada sugerem que esses dois açúcares devem estar ligados
entre si, ou seja, BRIV é um O-glicosídeo de um flavonóide C-glicosídeo. Pelo
HSQC foi possível observar uma correlação entre o sinal em 6,49 ppm com o sinal
do carbono em 89 ppm. Na região entre 1,63 – 2,35 ppm é possível observar oito
singletos que devido às integrações dos mesmos correspondem aos hidrogênios de
103
nove acetilas. Dois desses sinais são provenientes da acetilação das hidroxilas do
núcleo flavônico da molécula, dessa forma restam sete acetilas que sugerem dois
açúcares do tipo piranose. No HSQC se observa doze sinais de carbonos
correlacionados com 14 sinais de hidrogênios na região de açúcares, ou seja,
existem dois CH
2
o que sugere que esses dois açúcares sejam duas glicoses.
Através da comparação com dados da literatura para O-glicosídeos de flavonóides
C-glicosídeos (AGRAWAL, 1989; CHENG et. al., 2000) foi possível concluir qual
glicose está ligada à aglicona e qual está ligada ao primeiro açúcar devido aos
valores obtidos para os carbonos anoméricos. O observado é que o carbono
anomérico ligado através de uma ligação C-C apresenta deslocamento químico em
torno de 70 ppm, enquanto na ligação do tipo C-O o deslocamento químico
observado é de aproximadamente 104 ppm. Na tabela 25 os valores de
deslocamento dos sinais relativos aos carbonos e aos hidrogênios dos açúcares da
substância BRIV são listadas juntamente com as correlações observadas no COSY
e HSQC. Nas figuras 39-45 são apresentados os espectros obtidos em clorofórmio
deuterado para a substância BRIV acetilada.
104
Tabela 25: Dados espectrais de RMN para a região dos açúcares de BRIV
BRIV acetilada
(100 MHz; CDCl
3
)
BIV acetilada
(400 MHz; CDCl
3
)
C δ (ppm)
HSQC
H
M δ (ppm) COSY
1’’ 72,2 4,96 ppm 1’’
d 4,96 H-2’’
2’’ 73,2 4,99 ppm 2’’ t 4,99
H-1’’
H-3’’
3’’ 77,2 5,29 ppm 3’’ t 5,29
H-2’’
H-4’’
4’’ 69,1 5,19 ppm 4’’ t 5,19
H-3’’
H-5’’
5’’ 76,0 3,79 ppm 5’’ m 3,79
H-4’’
H-6a’’
6a’’ dd 4,30
H-5’
H-6b’’
6’’ 62,4
3,92 ppm
3,62 ppm
6b’’ dd 4,16
H-5’
H-6a’’
1’’’ 102,0 4,59 ppm 1’’’ d 4,59 H-2’’’
2’’’ 71,2 4,72 ppm 2’’’ t 4,72
H-1’’’
H-3’’’
3’’’ 74,2 4,97 ppm 3’’’ t 4,97
H-2’’’
H-4’’’
4’’’ 68,0 4,77 ppm 4’’’ t 4,77
H-3’’’
H-5’’’
5’’’ 71,6 3,45 ppm 5’’’ m 3,45
H-4’’’
H-6a’’’
6a’’’ dd 3,92
H-5’’’
H-6b’’’
6’’’ 61,8
4,30 ppm
4,16 ppm
6b’’’ dd 3,65 H-6a’’’
M = Multiplicidade
105
Figura 39: Espectro
1
H-RMN da substância BRIV acetilada em CDCl
3
106
Figura
40: Espectro
1
H-RMN ampliada da substância BRIV acetilada em CDCl
3
107
Figura 41: Espectro
1
H-RMN ampliado da substância BRIV acetilada em CDCl
3
108
Figura
42: Espectro
1
H-RMN ampliado da substância BRIV acetilada em CDCl
3
109
Figura 43: Espectro COSY da substância BRIV acetilada em CDCl
3
110
Figura 44: Espectro COSY ampliado da substância BRIV acetilada em CDCl
3
111
Figura 45: Espectro HSQC da substância BRIV acetilada em CDCl
3
112
Uma forma de elucidar a ligação açúcar-açúcar é por comparação dos
valores dos sinais dos carbonos da primeira glicose com os mesmos valores na
literatura, sendo que a maior diferença entre os deslocamentos químicos é onde
ocorre a ligação. Nesse caso, porém, não foi possível, pois os espectros foram
realizados com a substância acetilada o que já modifica os valores de deslocamento.
Devido ao exposto será necessário realizar o espectro de correlação HMBC da
substância acetilada ou o espectro de carbono da substância em sua forma original.
BRIV foi elucidada como sendo um
O-glicosídeo de um flavonóide C-
glicosídeo com o núcleo fundamental genkwanina, sendo a cadeia de açúcares
formada por duas glicoses. Os açúcares possivelmente estão ligados ao carbono 8
da aglicona, pois se estivessem ligados ao carbono 6 poderia ser spinosina ou um
derivado da mesma, o que não condiz com os dados cromatográficos. Além disso,
Mabry, Markham e Thomas (1970) e Wagner e Bladt (1996) demonstram que
flavonóides
C-glicosídeos cujo açúcar está ligado à posição 8 apresentam RF maior
que seus derivados com açúcar ligado ao carbono 6, como é o caso entre BRIV e
spinosina. BRIV foi elucidada parcialmente como um di-glicosídeo da 4’,5-diidroxi-7-
metoxi-flavona.
5.1.4 Análise cromatográfica de compostos da fração butanólica das
raízes de
Wilbrandia ebracteata
Devido ao perfil cromatográfico das substâncias encontradas na fração
butanólica e também por ser essa uma fração conhecidamente rica em flavonóides,
a mesma foi comparada cromatograficamente através da utilização de cromatografia
em camada delgada e CLAE com padrões de flavonóides C-glicosídeos disponíveis
no laboratório: orientina
§
, vitexina
**
, isovitexina
2
, swertisina
††
, isoorientina
1
, vitexina-
2-O-ramnosídeo
2
, spinosina
‡‡
e crisina-6,8-di-C-glicosídeo
§§
, sendo os cinco
primeiros mono-glicosídeos e os três últimos di-glicosídeos.
§
Extrasynthèse
**
Fluka
††
Isolada e identificada nesta dissertação
‡‡
Isolada a partir da raízes de Wilbrandia ebracteata e identificada por Santos (1989)
§§
Isolada a partir das folhas de Lichnophora ericoides, cedida pelo Prof. Dr. Norberto Peporino Lopes
113
Nas cromatografias em camada delgada (Fig. 46) foi observada a
predominância de oito compostos com características de flavonóides do tipo C-
glicosídeos, sendo que a comparação com compostos referência demonstrou que
essa fração apresenta vitexina, orientina, isovitexina, swertisina, isoorientina e
spinosina. Apesar de uma das substâncias apresentar valor de Rf muito semelhante
ao da vitexina-2-O-ramnosídeo na cromatografia em camada delgada foi possível
verificar através de CLAE que nem ela nem crisina-6,8-di-C-glicosídeo estão
presentes na fração butanólica das raízes de
Wilbrandia ebracteata. Através de
CLAE (Fig. 47) também foi possível observar que os compostos majoritários são as
C-glicosilflavonas isovitexina, swertisina, spinosina e a substância BRIV.
Figura 46: CCDs comparativas entre a fração butanólica das raízes de W. ebracteata e padrões de
flavonóides
C-glicosídeos
Adsorvente: gel de sílica 60 F
254
Eluente: A - AcOEt:CH
3
COOH:H
2
O (8:1:1, v/v/v)
B - AcOEt: MeOH:CH
3
COOH (11:4:0,3, v/v/v)
Detecção: NP/PEG e aquecimento/UV 366 nm
Amostras:1- fração butanólica das raízes de
W. ebracteata
2- vitexina
3- orientina
4- isovitexina
5- swertisina
6- isoorientina
7- vitexina-2-
O-ramnosídeo
8- spinosina
9- crisina-6,8-di-
C-glicosídeo
114
Figura 47: CLAE comparativo entre a fração butanólica das raízes de W. ebracteata e padrões de
flavonóides
C-glicosídeos
Adsorvente: Fenila
Eluente: CH
3
CN:CH
3
COOH 1% - gradiente
Detecção: 330 nm
Fluxo: 1 mL/min
Amostras:Preto- fração butanólica das raízes de
W. ebracteata
Rosa- spinosina
Cinza- isovitexina
Vermelho- swertisina
Verde- BRIV
Os resultados encontrados estão de acordo com os descritos por Santos;
Santos e Schenkel (1996), diferindo-se apenas pela presença de BRIV, não descrita
anteriormente.
115
5.2 Estudo químico das folhas de Wilbrandia ebracteata
As frações butanólica e insolúvel em água obtidas a partir do extrato
etanólico das folhas de
Wilbrandia ebracteata foram analisadas buscando o
isolamento de flavonóides. Nesta seção serão descritos os resultados e as
discussões referentes à fração butanólica, seguidos pelos da fração insolúvel em
água. A cromatografia em camada delgada realizada em gel de sílica, eluente
diclorometano:metanol (12:1) e revelada com vanilina fosfórica/aquecimento da
fração diclorometano das folhas de Wilbrandia ebracteata não apresentou machas
características para cucurbitacinas, dessa forma essa fração não foi estudada neste
trabalho.
5.2.1 Análise química da fração butanólica das folhas de Wilbrandia
ebracteata
5.2.1.1 Isolamento das substâncias BFI e BFII a partir da fração butanólica das
folhas de Wilbrandia ebracteata
Após o emprego de diversos métodos cromatográficos foram isolados a partir de 5 g
da fração butanólica das folhas de Wilbrandia ebracteata dois compostos
denominados BFI (36 mg) e BFII (17 mg).
116
5.2.1.2 Identificação das substâncias BFI e BFII isoladas a partir da fração
butanólica das folhas de Wilbrandia ebracteata
5.2.1.2.1 Identificação de BFI
A substância BFI apresentou ponto de fusão em 230,1 °C com
decomposição e valor de Rf 0,62 no sistema acetato de etila:ácido acético:água
(8:1:1, v/v/v). Após revelação com reagente natural A e aquecimento ela apresentou
fluorescência verde-azulada sob luz UV 366 nm.
Os espectros UV obtidos em solução metanólica e também após a adição
dos reagentes de deslocamento descritos por Mabry, Markham e Thomas (1970) e
Markham (1982) sugerem que para a aglicona uma 4’,5-diidroxi-flavona o que condiz
com o núcleo genkwanina (Fig. 31). Os valores dos máximos de absorção e os
deslocamentos obtidos encontram-se na tabela 26.
Tabela 26: Máximos de absorção e deslocamentos observados após a adição de reagentes nos
espectros UV da substância BFI
λ máximo (nm) deslocamento (nm)
Solvente/
Reagente
banda I
banda II banda I banda II
Informações
estruturais
MeOH 333 273
flavona ou flavonol
3-O-subs.
NaOMe 390
271
235
+57 nm (s/
decres.
intensidade)
com –OH livre em
C-4’
NaOAc
355 271 sem + 5-20
nm
sem –OH livre em
C-7
NaOAC +
H
3
BO
3
335 272
sem + 12-36
nm
sem o-diidroxi
AlCl
3
380
352
301
281
sem
deslocamento
+ em relação
AlCl
3
+ HCl
sem o-diidroxi nos
anéis A e B
AlCl
3
+
HCl
380
353
297
283
+ 47 nm
com –OH livre em
C-5
117
Levando em consideração os dados cromatográficos e o núcleo aglicônico
sugerido pelo UV, BFI foi co-cromatografada com spinosina (cujas características
eram compatíveis) através de cromatografia em camada delgada em gel de sílica 60
F
254
, eluente acetato de etila:metanol:ácido acético (11:4:0,3; v/v/v) e a detecção
com reagente natural A e aquecimento (Fig. 48).
Figura 48: Co-cromatografia realizada com BFI e spinosina
Adsorvente: gel de sílica 60 F
254
Eluente: AcOEt: MeOH:CH
3
COOH (11:4:0,3; v/v/v)
Detecção: Reagente natural A e aquecimento/366 nm
Amostras:1- BFI
2-BFI + spinosina
3-spinosina
A co-cromatografia permitiu identificar BFI como spinosina, cuja fórmula
estrutural é apresentada na figura 33.
O único estudo realizado com as folhas de Wilbrandia ebracteata que
apresentou enfoque químico foi realizado por Coelho (2004). Nesse trabalho, a
autora isolou flavonóides não glicosilados e os flavonóides C-glicosídeos mono-
glicosilados orientina, isoorientina, vitexina e isovitexina. Dessa forma, este é o
primeiro relato sobre isolamento e identificação de spinosina proveniente das folhas
de Wilbrandia ebracteata.
118
5.2.1.2.2 Identificação de BFII
A substância BFII apresentou ponto de fusão em 215,8 °C com
decomposição e valor de Rf 0,18 no sistema acetato de etila:ácido acético:água
(8:1:1, v/v/v). Após revelação com reagente natural A e aquecimento ela apresentou
fluorescência verde-azulada sob luz UV 365 nm.
Os espectros UV obtidos em solução metanólica e também após a adição
dos reagentes de deslocamento descritos por Mabry, Markham e Thomas (1970) e
Markham (1982) sugerem uma 4’,5-diidroxi-flavona o que condiz com o núcleo
genkwanina (Fig. 31). Os valores dos máximos de absorção e os deslocamentos
obtidos encontram-se na tabela 27.
Tabela 27: Máximos de absorção e deslocamentos observados após a adição de reagentes nos
espectros UV da substância BFII
λ máximo (nm) deslocamento (nm)
Solvente/
Reagente
banda I
banda II banda I banda II
Informações
estruturais
MeOH 335 273
flavona ou flavonol
3-O-subs.
NaOMe 391
272
233
+56 nm (s/
decres.
intensidade)
com –OH livre em
C-4’
NaOAc
386
338
272 sem + 5-20
nm
sem –OH livre em
C-7
NaOAC +
H
3
BO
3
336 272
sem + 12-36
nm
sem o-diidroxi
AlCl
3
380
351
302
279
sem
deslocamento
+ em relação
AlCl
3
+ HCl
sem o-diidroxi nos
anéis A e B
AlCl
3
+
HCl
380
353
300
280
+ 45 nm
com –OH livre em
C-5
Levando em consideração os dados cromatográficos e o núcleo sugerido
pela espectroscopia UV, BFII foi co-cromatografada com a substância BRIV, descrita
nesta dissertação isolada a partir da fração butanólica das raízes de Wilbrandia
ebracteata, através de cromatografia em camada delgada em gel de sílica 60 F
254
,
119
eluente acetato de etila:ácido acético:água (8:1:1; v/v/v) e detecção com NP/PEG e
aquecimento (Fig. 49).
Figura 49: Co-cromatografia entre BFII e a substância BRIV isolada a partir da fração butanólica das
raízes de
W. ebracteata neste trabalho
Adsorvente: gel de sílica 60 F
254
Eluente: AcOEt:CH
3
COOH:H
2
O (8:1:1; v/v/v)
Detecção: NP/PEG e aquecimento/366 nm
Amostras:1- BFII
2-BFII + substância BRIV
3- substância BRIV
Dessa forma foi possível afirmar que BFII é a substância BRIV. Assim
como nas raízes o isolamento de BRIV proveniente das folhas de Wilbrandia
ebracteata é inédito.
120
5.2.1.3 Análise cromatográfica de compostos da fração butanólica das folhas
de Wilbrandia ebracteata
Devido ao perfil cromatográfico das substâncias encontradas na fração
butanólica e também por ser essa uma fração conhecidamente rica em flavonóides,
a mesma foi comparada cromatograficamente através da utilização de cromatografia
em camada delgada e CLAE com padrões de flavonóides
C-glicosídeos disponíveis
no laboratório: orientina
***
, vitexina
†††
, isovitexina
2
, swertisina
‡‡‡
, isoorientina
1
,
vitexina-2-O-ramnosídeo
2
, spinosina
§§§
e crisina-6,8-di-C-glicosídeo
****
, sendo os
cinco primeiros mono-glicosídeos e os três últimos di-glicosídeos.
Nas cromatografias em camada delgada (Fig. 50) foi observada a
predominância de sete compostos com características de flavonóides do tipo C-
glicosídeos, sendo que a comparação com compostos referência demonstrou que
essa fração apresenta vitexina, isovitexina, swertisina, isoorientina e spinosina,
enquanto apenas traços de orientina foram identificados. Apesar de uma das
substâncias apresentar valor de Rf muito semelhante ao da vitexina-2-O-ramnosídeo
na cromatografia em camada delgada, foi possível verificar através de CLAE que
nem ela nem crisina-6,8-di-C-glicosídeo estão presentes na fração butanólica das
folhas de Wilbrandia ebracteata. Através de CLAE (Fig. 51) também foi possível
observar que os compostos majoritários são as C-glicosilflavonas swertisina,
spinosina e a substância BRIV.
***
Extrasynthèse
†††
Fluka
‡‡‡
Isolada e identificada nesta dissertação
§§§
Isolada a partir da raízes de Wilbrandia ebracteata e identificada por Santos (1989)
****
Isolada a partir das folhas de Lichnophora ericoides, cedida pelo Prof. Dr. Norberto Peporino Lopes
121
Figura 50: CCDs comparativas entre a fração butanólica das folhas de W. ebracteata e padrões de
flavonóides
C-glicosídeos
Adsorvente: gel de sílica 60 F
254
Eluente: A - AcOEt:CH
3
COOH:H
2
O (8:1:1, v/v/v)
B - AcOEt: MeOH:CH
3
COOH (11:4:0,3, v/v/v)
Detecção: NP/PEG e aquecimento/UV 366 nm
Amostras:1- fração butanólica das raízes de
W. ebracteata
2- vitexina
3- orientina
4- isovitexina
5- swertisina
6- isoorientina
7- vitexina-2-
O-ramnosídeo
8- spinosina
9- crisina-6,8-di-
C-glicosídeo
122
Figura 51: CLAE comparativo entre a fração butanólica das folhas de W. ebracteata e padrões de
flavonóides
C-glicosídeos
Adsorvente: Fenila
Eluente: CH
3
CN:CH
3
COOH 1% - gradiente
Detecção: 330 nm
Fluxo: 1 mL/min
Amostras:Preto- fração butanólica das folhas de
W. ebracteata
Rosa- spinosina
Cinza- isovitexina
Vermelho- swertisina
Verde- BRIV
Os resultados são compatíveis aos de Coelho (2004), diferindo-se pela
presença de swertisina, spinosina e a substância BRIV que não foram isoladas
anteriormente da folhas de Wilbrandia ebracteata.
123
5.2.2 Análise química da fração insolúvel em água das folhas de
Wilbrandia ebracteata
5.2.2.1 Isolamento da substância IFI da fração insolúvel em água das folhas de
Wilbrandia ebracteata
Após o emprego de métodos cromatográficos foram isoladas a partir de 5 g da
fração insolúvel em água das folhas de
Wilbrandia ebracteata 10 mg da substância
IFI.
5.2.2.2 Elucidação estrutural da substância IFI isolada da fração insolúvel das
folhas de Wilbrandia ebracteata
5.2.2.2.1 Elucidação estrutural de IFI
A substância IFI apresentou valor de Rf 0,61 no sistema acetato de
etila:ácido acético:água (8:1:1, v/v/v). Após revelação com reagente natural A e
aquecimento ela apresentou fluorescência verde-azulada sob luz UV 366 nm.
Os espectros UV obtidos em solução metanólica e também após a adição
dos reagentes de deslocamento descritos por Mabry, Markham e Thomas (1970) e
Markham (1982) sugerem para a parte aglicônica uma 4’,5-diidroxi-flavona o que
condiz com o núcleo genkwanina (Fig. 31). Os valores dos máximos de absorção e
os deslocamentos obtidos encontram-se na tabela 28.
124
Tabela 28: Máximos de absorção e deslocamentos observados após a adição de reagentes nos
espectros UV da substância IFI
λ máximo (nm) deslocamento (nm)
Solvente/
Reagente
banda I banda II banda I banda II
Informações
estruturais
MeOH 331 271
flavona ou flavonol
3-O-subs.
NaOMe 388
270
234
+57 nm (s/
decres.
intensidade)
com –OH livre em
C-4’
NaOAc 332
270 sem + 5-20
nm
sem –OH livre em
C-7
NaOAC +
H
3
BO
3
331 270
sem + 12-36
nm
sem o-diidroxi
AlCl
3
372
346
302
280
sem
deslocamento
+ em relação
AlCl
3
+ HCl
sem o-diidroxi nos
anéis A e B
AlCl
3
+
HCl
371
344
300
280
+ 40 nm
com –OH livre em
C-5
Com a amostra em sua forma original foram realizados espectros
1
H-RMN
e COSY (Figs. 52-54). Na região dos hidrogênios aromáticos, ou seja, entre 8,5 - 5,9
ppm foi possível observar dois dubletos em campo mais baixo e dois singletos em
campo mais alto. Os dubletos em 7,87 e 6,93 ppm estão correlacionados pelo COSY
e são característicos dos hidrogênios 2’, 6’ e 3’, 5’, respectivamente do anel
aromático B presente no núcleo flavonoídico. O singleto em 6,67 ppm pode ser do
hidrogênio em 6 ou em 8. Segundo Mabry, Markham e Thomas (1970) no espectro
1
H-RMN os sinais dos hidrogênios em 8 apresentam deslocamento químico em
campo mais baixo do que os sinais dos hidrogênios em 6. Levando esse dado em
consideração, juntamente com o deslocamento químico do sinal do hidrogênio em 8
(6,60 ppm) obtido para swertisina por Kumarasamy e colaboradores em 2004 foi
possível sugerir que a aglicona de IFI apresenta um hidrogênio ligado ao carbono 8.
O outro singleto em 6,61 ppm ocorre devido à presença do hidrogênio em 3 do
núcleo flavona. Em 3,90 ppm há um singleto que é devido à metoxila ligada ao
carbono 7. Em 4,82 ppm (encoberto pelo sinal do solvente) aparentemente ocorre
um dubleto, que pode ser do hidrogênio do carbono anomérico de um açúcar. Esse
sinal apresenta correlação pelo COSY com um dubleto em 4,46 ppm, sinal esse que
não corresponde aos sinais para o hidrogênio ligado ao carbono 2 de açúcares na
125
literatura. Ainda em 2,02 ppm ocorre um singleto intenso que inicialmente foi
atribuído à acetona, solvente utilizado para lavagem dos tubos em que são
colocadas as amostras para realização dos espectros. Porém após busca na
literatura, foi encontrado um trabalho (ZANG; XU, 2002) relatando o isolamento e a
elucidação estrutural de dois flavonóides cujos açúcares apresentavam uma acetila.
Os hidrogênios dessa acetila eram visualizados no espectro
1
H-RMN como um
singleto em 1,96 ppm no caso da 3-O-acetil-glicopiranose (em DMSO) e 2,02 ppm
no caso da 2-
O-acetil-glicofuranose (em piridina), porém os outros valores para os
hidrogênios do açúcar não eram compatíveis aos de IFI. Apesar da boa resolução do
espectro, o mesmo apresenta sinais de impurezas na amostra que não foram
visualizadas em cromatografia em camada delgada o que dificulta a conclusão da
estrutura. Dessa forma, será realizada acetilação da substância para realização de
novos espectros. IFI foi elucidada parcialmente como uma 4’,5-diidroxi-7-metoxi-
flavona.
126
Figura 52: Espectro
1
H-RMN da substância IFI em CD
3
OD
127
Figura 53: Espectro
1
H-RMN ampliado da substância IFI em CD
3
OD
128
Figura 54: Espectro COSY da substância IFI em CD
3
OD
129
5.3 Análise cromatográfica comparativa entre as frações
butanólicas das raízes e das folhas de
Wilbrandia ebracteata
As análises por cromatografia em camada delgada (Fig. 55) e CLAE (Fig.
56) mostraram que as frações butanólicas das raízes e das folhas de
Wilbrandia
ebracteata
apresentam seus perfis cromatográficos muito semelhantes, podendo-se
verificar por exemplo a presença de spinosina, isovitexina, swertisina e da
substância BRIV isolada neste trabalho. Além disso, a análise cromatográfica por
CLAE também demonstrou que a área relativa ao pico da isovitexina é maior na
fração butanólica proveniente das raízes do que na mesma fração provinda das
folhas, o que indica que a concentração desse composto é mais elevada nas raízes
de Wilbrandia ebracteata. Outro dado obtido é a diferença quanto aos flavonóides C-
glicosídeos do tipo luteolina que aparentemente são mais concentrados nas folhas
do que nas raízes de
Wilbrandia ebracteata. Isso pode ser visualizado através da
cromatografia em camada delgada pela presença de maior número de manchas com
fluorescência alaranjada nas folhas, o que segundo Wagner e Bladt (1996) é
característico de flavonóides com núcleo tipo luteolina, ou seja, 5,3’,4’-triidroxi-
flavona.
Figura 55: CCD comparativa entre as frações butanólicas das raízes e das folhas de W. ebracteata
Adsorvente: gel de sílica 60 F
254
Eluente: AcOEt:CH
3
COOH:H
2
O (8:1:1; v/v/v)
Detecção: NP/PEG e aquecimento/UV 366 nm
Amostras:1- fração butanólica das raízes de
W. ebracteata
2- fração butanólica das folhas de W. ebracteata
130
Figura 56: CLAE comparativo entre as frações butanólicas das raízes e das folhas de W. ebracteata
Adsorvente: Fenila
Eluente: CH
3
CN:CH
3
COOH 1% - gradiente
Detecção: 330 nm
Fluxo: 1 mL/min
Amostras:Preto- fração butanólica das raízes de
W. ebracteata
Vermelho- fração butanólica das folhas de W. ebracteata
6 CONCLUSÕES
131
 Para as raízes de Wilbrandia ebracteata;
 Da fração diclorometano das raízes de Wilbrandia ebracteata foram isolados
os glicosídeos de cucurbitacinas:
16α,23α-epoxi-2-O-β-glicopiranosil-3β,20β-diidroxi-10α,23β-cucurbit-5,24-
dien-11-ona e 16α,23α-epoxi-2-O-β-glicopiranosil-3β,20β-diidroxi-10α,23α-
cucurbit-5,24-dien-11-ona, em mistura, substâncias essas que ainda não
foram descritas na literatura;
2-O-β-glicopiranosídeo da diidrocucurbitacina B descrita previamente em
mistura com outros glicosídeos de cucurbitacinas nas raízes de Wilbrandia
ebracteata
.
 Da fração butanólica das raízes de Wilbrandia ebracteata foram isolados os
flavonóides C-glicosídeos: spinosina, isovitexina, swertisina e um di-glicosídeo
da 4’,5-diidroxi-7-metoxi-flavona denominado BRIV. Esse último não havia
sido identificado até o momento em frações provenientes de
Wilbrandia
ebracteata
.
Adicionalmente, através de análise por cromatografia em camada delgada
e CLAE foi comprovada a presença de vitexina, orientina e isoorientina na
fração butanólica das raízes de Wilbrandia ebracteata. Isovitexina,
swertisina, spinosina e a referida substância BRIV são os compostos
majoritários, enquanto vitexina-2-O-ramnosídeo e crisina-6,8-di-C-
glicosídeo não estão presentes na fração.
 Para as folhas de Wilbrandia ebracteata:
 Da fração butanólica das folhas de Wilbrandia ebracteata foram isoladas as
C-glicosilflavonas spinosina e a substância BRIV, isolada da raiz de
Wilbrandia ebracteata neste trabalho. Esses resultados são inéditos, na
medida em que o único trabalho com as folhas de Wilbrandia ebracteata não
relatou o isolamento de flavonóides di-C-glicosídeos.
Adicionalmente, através de cromatografia em camada delgada e CLAE foi
comprovada a presença de vitexina, isovitexina, swertisina, isoorientina e
traços de orientina na fração butanólica das folhas de Wilbrandia
ebracteata. Swertisina, spinosina e a substância BRIV são os compostos
majoritários enquanto vitexina-2-O-ramnosídeo e crisina-6,8-di-C-
glicosídeo não estão presentes na fração.
132
 As frações butanólicas das raízes e da folhas de Wilbrandia ebracteata
apresentam similaridade de composição em vista da predominância de
flavonóides C-glicosídeos. No entanto, nas folhas ocorre prevalência de
flavonóides
C-glicosídeos com o núcleo luteolina enquanto que nas raízes
predominam os C-glicosídeos com o núcleo da apigenina. Além disso, na raiz,
isovitexina é um dos compostos majoritários, o que não ocorre nas folhas.
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