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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
CAUSAS INFECCIOSAS DE ABORTOS E NATIMORTALIDADE EM SUÍNOS
NO SUL DO BRASIL
Caroline Argenta Pescador
Porto Alegre
2008
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
CAUSAS INFECCIOSAS DE ABORTOS E NATIMORTALIDADE EM SUÍNOS
NO SUL DO BRASIL
Caroline Argenta Pescador
Tese apresentada como requisito para a
obtenção do grau de Doutor em Ciências
Veterinárias na área de concentração
em Cirurgia, Morfologia e Patologia
Animal, da Universidade Federal do Rio
Grande do Sul.
Orientador: David Driemeier
Co-orientador: Luís Gustavo Corbellini
Porto Alegre
2008
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AGRADECIMENTOS
Agradeço inicialmente aos meus pais Ivete Terezinha Argenta Pescador e Clóvis
Alberto Pescador (in memorian) que apesar de todas as dificuldades sempre priorizaram
a educação de suas duas filhas. Ao meu orientador, professor David Driemeier pelos
ensinamentos passados durante estes sete anos de convivência e também pela total
liberdade oferecida para realizar este trabalho. Agradeço ao meu Co-orientador,
professor Luís Gustavo Corbellini, pelo incentivo de fazer com que eu desse sempre um
passo a frente como profissional, buscando sempre algo mais. Agradeço ao professor
Fernando Osorio, David Steffen e Judith Galeota da Universidade de Nebraska,
Lincoln, (EUA) pela oportunidade de complementar a análise deste trabalho nesta
instituição e por terem me recebido tão bem em Nebraska. Não posso deixar de
agradecer as técnicas do Centro de Diagnóstico Veterinário de Nebraska, Liping Xie,
Jules Russ e Quin pela grande amizade e por todo conhecimento transmitido durante os
cinco meses de estudo no Dignostic Veterinary Center (VDC). Agradeço as técnicas
Marília e Ângela do Setor de Patologia Veterinária UFRGS pela imensa ajuda
oferecida. Agradeço aos alunos de graduação e pós-graduação do SPV-UFRGS,
especialmente ao Paulo Mota Bandarra, Nadia Aline Bobbi Antoniassi, Adriana da
Silva Santos e Eduardo Conceição de Oliveira pelo auxílio no andamento do projeto.
Agradeço também ao professor David E. Barcellos (UFRGS) e ao médico veterinário
Luiz Mezzomo (Sadia) pelos contatos e materiais enviados.
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS ......................................................................................................5
GLOSSÁRIO ....................................................................................................................6
LISTA DE FIGURAS.......................................................................................................7
RESUMO ..........................................................................................................................8
ABSTRACT........................................................................................................................9
1. INTRODUÇÃO ..........................................................................................................10
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA....................................................................................12
2.1 Influência de patógenos específicos no aborto suíno............................................12
2.2 Procedimentos de necropsia..................................................................................13
2.2.1 Exame do feto e placenta ...............................................................................13
2.2.2 Exame de natimortos......................................................................................16
Morte pré-parto .......................................................................................................17
Morte intra-parto.....................................................................................................17
Morte pós-parto.......................................................................................................17
2.3 Exame laboratorial ................................................................................................19
2.4 Principais rotas de acesso ao sistema reprodutivo da fêmea suína .......................21
2.5 Causas infecciosas associadas à falhas reprodutivas em suínos ...........................22
2.5.1 Agentes virais.................................................................................................22
Circovírus suíno tipo 2 (PCV2) ..............................................................................22
Síndrome Reprodutiva e Respiratória Suína (PRRS) .............................................25
Parvovírus suíno (PPV)...........................................................................................27
Outros agentes virais...............................................................................................28
2.5.2 Agentes bacterianos .......................................................................................29
Leptospira sp...........................................................................................................29
Outros agentes bacterianos......................................................................................30
3. ARTIGOS ...................................................................................................................33
3.1 Artigo 1: “Diagnostic survey of swine abortion, mummified fetuses and stillborn
piglets in Southern Brazil.”.........................................................................................34
3.2 Artigo 2: “Co-infection by porcine circovirus type 2 and porcine parvovirus in
aborted fetuses and stillborn piglets in southern Brazil.” ...........................................52
.....................................................................................................................................53
3.3 Artigo 3: “Lesões de pele causadas por Erysipelothrix rhusiopathiae em um feto
suíno abortado.” ..........................................................................................................54
3.3 Artigo 3: “Lesões de pele causadas por Erysipelothrix rhusiopathiae em um feto
suíno abortado.” ..........................................................................................................55
3.3 Artigo 3: “Lesões de pele causadas por Erysipelothrix rhusiopathiae em um feto
suíno abortado.” ..........................................................................................................56
3.3 Artigo 3: “Lesões de pele causadas por Erysipelothrix rhusiopathiae em um feto
suíno abortado.” ..........................................................................................................57
3.3 Artigo 3: “Lesões de pele causadas por Erysipelothrix rhusiopathiae em um feto
suíno abortado.” ..........................................................................................................58
4. DISCUSSÃO E CONCLUSÕES................................................................................75
4.1 Levantamento das causas de aborto suíno ............................................................75
4.2 Co-infecção entre Circovírus suíno tipo 2 (PCV2) e Parvovírus suíno (PPV) em
fetos suínos abortados .................................................................................................78
4.3 CONCLUSÕES ........................................................................................................81
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................82
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Estimativa da idade gestacional de fetos suínos..............................................14
Tabela 2. Características externas do leitão ao nascer e principais alterações
macroscópicas à necropsia, relacionadas ao momento da morte (pré-parto, intra-parto e
pós-parto). .......................................................................................................................18
Tabela 3 Amostras necessárias para o diagnóstico de aborto em suínos........................20
Tabela 4. Freqüência percentual de agentes infecciosos diagnosticados em
levantamentos de causas de perdas reprodutivas em suínos...........................................31
GLOSSÁRIO
Aborto/abortamento – é definido como nascimento/expulsão da leitegada antes do
término do período normal (fisiológico) de gestação da fêmea suína. Qualquer leitegada
nascida antes do dia 110 de gestação é considerada um aborto quando nenhum dos fetos
sobrevive além de 24 horas (Sobestiansky et al., 2007).
Natimorto – é o feto que morre após 90 dias de gestação, podendo ser classificado em
tipo I: quando a morte ocorre antes do término da gestação (morte pré-parto) e tipo II:
quando a morte ocorre durante o parto (morte intra-parto) (Sobestiansky et al., 2007).
Nested-PCR – é uma variação da reação em cadeia pela polimerase que envolve dois
conjuntos de primers para amplificar um fragmento. O objetivo é melhorar a eficiência
da reação. Information about Nested-PCR or polymerase chain reaction. Disponível em
<www.pcrstation.com/nested-pcr/>. Acesso em 23 de julho de 2008.
Slippers – extensões de tecido cartilaginoso provinda da cápsula decidual que recobre
os cascos dos fetos (Carr et al., 1990), podendo ser também denominada de chinelas
(Dial et al., 1992).
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Desenho esquemático demonstrando a medição da nuca até a inserção da
cauda de um feto suíno....................................................................................................14
Figura 2. A. Feto suíno. Áreas de hemorragia na pele. B. Língua. Hiperplasia epitelial.
C. Placenta. Áreas esbranquiçadas na superfície. D. Vesículas (aréolas) na superfície
placentária. ......................................................................................................................15
Figura 3. Natimortalidade pré, intra e pós-parto em suínos. A. Morte de fetos suínos
pré-parto. Fetos mumificados. B. Morte de fetos intra-parto. Extensões de tecido
cartilaginoso nos cascos. C. Ausência de tecido cartilaginoso (chinelas). D. Morte de
fetos intra-parto. Pulmão de coloração vermelha púrpura sem evidência de aeração. E.
Morte de fetos intra-parto. Presença de mecônio (material de coloração amarelada)
sobre a pele. F. Morte pós-parto. Pulmão aerado............................................................19
RESUMO
O estudo resultou em dois artigos principais relacionados ao aborto suíno de origem
viral e outros dois relatos de caso de aborto suíno de origem bacteriana. O primeiro
artigo retrata a análise de 117 casos de aborto durante 1,5 anos. A causa de aborto foi
identificada em 25,5% dos casos. Infecção por parvovírus suíno foi observada em
16,2% dos fetos. Aborto bacteriano foi diagnosticado em 5,1% dos casos (6/117),
seguido por infecção de PCV2 (3,4%) e associações (2,5%). No segundo artigo, casos
de aborto e natimortalidade suína por co-infecção entre circovírus suíno tipo 2 (PCV2) e
parvovírus suíno (PPV) foram descritos, onde sete de 121 (5,78%) fetos suínos
abortados apresentavam lesões compatíveis com origem viral e foram positivos pelas
técnicas de imunoistoquímica e PCR para PCV2. Além disso, três (2,47%) desses sete
casos também foram confirmados como co-infectados com PPV através da PCR.
Dilatação ventricular, áreas pálidas no miocárdio e edema de mesocólon foram as
alterações macroscópicas observadas. Lesões microscópicas incluíram miocardite não
supurativa, necrose e fibrose cardíacas, focos de mineralização e corpúsculos de
inclusão em cardiomiócitos e pneumonia intersticial mononuclear. O terceiro artigo
retrata lesões de pele observadas em um feto suíno abortado devido à infecção por
Erysipelothrix rhusiopathiae, enfatizando seus aspectos macroscópicos,
histopatológicos e microbiológicos. No quarto artigo é descrito um caso de aborto suíno
por Escherichia coli O157: H7 em que dois fetos analisados apresentavam lesões
macroscópicas caracterizadas por líquido e fibrina na cavidade torácica e abdominal e
petéquias no pericárdio. Microscopicamente foram observadas broncopneumonia
supurativa e pleurite supurativa foram observadas. O teste de imunoistoquímica foi
positivo para E. coli O157: H7.
ABSTRACT
This study resulted in two main articles on viral swine abortion and two articles
describing bacterial swine abortion. The first article 117 cases of swine abortion were
analyzed during 1.5 year period. The cause of swine abortion was identified in 25.5% of
cases. Parvovirus infection was observed in 16.2% of fetuses. Bacterial infection
accounted for 5.1% (6/117) followed by PCV2 infection 3.4% (4/117) and associations
2.5% (3/117). In the second article swine abortion and stillbirth cases by co-infection
between porcine circovirus type 2 (PCV2) and porcine parvovirus was describe in
which 7/121 (5.78%) swine fetuses had lesions consistent with viral cause and showed
both positive anti-PCV2 immunostaining as well as PCV2-PCR. In samples from 3
(2.47 per cent) of these 7 fetuses, co-infection with PPV was confirmed by Nested-PCR.
Ventricular dilatation, myocardial pale areas, and mesocolic edema were the gross
lesions observed. Microscopic lesions included non-suppurative myocarditis,
myocardial necrosis and fibrosis, mineralization foci and intranuclear inclusion bodies
in cardiomyocytes, and interstitial mononuclear pneumonia. In the third article describes
skin lesions in an aborted swine fetus due to Erysipelothrix rhusiopathiae with special
emphasis on macroscopic, histopathology and microbiology aspects. In the forth article
a case about swine abortion due to Escherichia coli O157:H7 is described, in which two
fetuses analyzed showed macroscopic lesions characterized by fluid with fibrin
exudation in the corporal cavities and petechial hemorrhages in the pericardium.
Microscopically, these lesions were characterized by focally-extensive suppurative
pleuritis and fibrin-purulent interstitial bronchopneumonia in which were abundant
gram-negative rods with morphology consistent with Escherichia coli. The
immunohistochemistry test was positive for E. coli O157:H7.
10
1. INTRODUÇÃO
A suinocultura é uma das atividades econômicas mais importantes da Região Sul
do Brasil. Os estados do Rio Grande do Sul e Santa Catarina concentram 43% do
rebanho suíno brasileiro e são responsáveis por mais de 83% das exportações de carne
suína no país. (IBGE, 2007).
Taxas elevadas de abortos em granjas suínas é uma causa de falhas reprodutivas
na suinocultura brasileira. Os abortos diminuem a produtividade do rebanho,
principalmente, por diminuir o número de leitões nascidos vivos e por aumentar
significativamente o descarte de animais e as taxas de reposição de matrizes. A infecção
pelo vírus de Aujeszky em uma granja, por exemplo, pode resultar em perda total do
rebanho para o produtor e suspensão de exportações de carne do estado atingido,
afetando sobremaneira a economia local.
Aborto suíno é definido como o nascimento/expulsão da leitegada antes do
término normal (fisiológico) de gestação da fêmea suína. O período médio normal de
gestação é de 114 dias. Qualquer leitegada nascida antes do 110
º
dia de gestação é
considerada um aborto quando nenhum dos fetos sobrevive além de 24 horas
(SOBESTIANSKY et al., 2007).
Muitos agentes infecciosos têm sido incriminados em casos de abortos e falhas
reprodutivas em suínos em diversas partes do mundo (NEILL et al., 1985; SADTLER et
al, 1990; OLIVEIRA et al., 1995; WALDVOGEL et al., 1995, ROSSOW et al., 1996;
OLIVEIRA et al., 1997; SCRUGGS & SORDEN, 2001; FRANTZ et al., 2002;
MALDONADO et al., 2005). Alguns têm sido implicados de maneira individual e
esporádica, enquanto outros têm sido considerados agentes responsáveis por epidemias
de aborto e morte fetal em diversas granjas (SOBESTIANSKY et al., 1999).
Um estudo realizado nos Estados Unidos com 824 fetos suínos abortados,
durante um período de seis anos, constatou que 22% dos casos foram ocasionados por
vírus e 16,5% por agentes bacterianos. Dentre as causas virais, o Enterovírus foi o mais
freqüentemente isolado (10,9%), seguido por Parvovírus (4.9%), Reovírus (4.4%),
Aujezsky (1%) e Adenovírus (0,8%). Leptospirose foi à infecção bacteriana mais
comumente observada, sendo diagnosticada em 9,8% dos casos (KIRKBRIDE et al.,
1978). Na Espanha, a análise de 293 fetos suínos abortados identificou 9% de fetos
infectados pelo vírus da Síndrome Reprodutiva e Respiratória Porcina (PRRSV), sendo
11
este indicado como o principal agente de abortos naquele país (MALDONADO et al.,
2005).
Entretanto, o diagnóstico etiológico de abortos é bastante difícil e em geral
conclusivo em apenas 30-40% dos casos (STRAW et al., 1999). Não é possível
determinar causas de aborto somente através do exame clínico. É necessária a colheita
apropriada de material para exames sorológicos, histopatológicos e bacteriológicos,
entre outros (SOBESTIANSKY et al., 1999).
No Brasil, informações muito limitadas estão disponíveis sobre causas
infecciosas de aborto em suínos. Em um trabalho realizado em Porto Alegre, a coleta de
amostras de tecidos fetais de duas propriedades com histórico de abortos, retornos ao
estro e descargas vulvares revelou o isolamento de Arcobacter spp (OLIVEIRA et al.,
1997). Um estudo soroepidemiológico realizado pelo Ministério da Agricultura
Pecuária e Abastecimento em conjunto com a Embrapa Suínos e Aves indicou ausência
de casos de PRRSV no Brasil e uma prevalência inferior a 0,8% na população suína
testada (ZANELLA, 2001). Recentemente, Borges et al., (2005), analisaram fatores de
risco de mumificação fetal e natimortalidade em quatro rebanhos suínos no Brasil e
observaram que quanto maior o tamanho da leitegada, maior foram as perdas fetais por
mumificação e natimortalidade.
O objetivo deste estudo foi realizar um levantamento das causas de aborto em
suínos na Região Sul do Brasil através de técnicas de imunodiagnóstico, PCR, exames
histopatológicos e testes microbiológicos.
12
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Influência de patógenos específicos no aborto suíno
Doenças reprodutivas na suinocultura industrial causam extenso prejuízo
econômico em todo o mundo. Em suínos a manifestação clínica de doenças reprodutivas
é bastante variável podendo oscilar desde a infecção subclínica à interrupção da
gestação. O padrão da doença é largamente influenciado pela fisiologia reprodutiva do
suíno e pelo patógeno envolvido (GRESHAM et al.,2003).
Na fêmea suína, a interrupção da gestação pode causar efeitos na fêmea e na
leitegada, afetando todo o concepto simultaneamente, resultando em mumificação fetal
ou aborto devido à septicemia, toxemia e pirexia (GRESHAM et al., 2003).
O período fetal inicia por volta dos 35 dias de gestação, e neste estágio a fase de
ossificação esquelética começa. Antes desse período se o feto morre, mumifica, ou
ocorre aborto, muitas vezes há retorno ao cio/estro. O período de imunocompetência
fetal inicia a partir de 70 a 75 dias de gestação, podendo os fetos suínos a partir deste
período se tornar mais resistentes à infecção (BARLOW, 1998).
Um grande número de agentes infecciosos tem sido associado ao aborto e falhas
reprodutivas em suínos e incluem certos tipos de vírus (ex: vírus de Aujesky, vírus da
Influenza suína, vírus da Síndrome Reprodutiva e Respiratória Porcina (PRRSV), vírus
da Peste suína e Adenovírus), agentes bacterianos específicos (ex: Erysipelothrix
rhusiopathie, Leptospira pomona, Brucella suis) e protozoários (ex: Toxoplasma
gondii). Recentemente o circovírus suíno tipo 2 (PCV2), agente etiológico da Síndrome
Multissistêmica do Definhamento, foi associado com abortamento tardio em porcas
(SOBESTIANSKY et al., 2007).
Segundo Wrathall (1971), os agentes infecciosos associados com doença
reprodutiva em suínos podem ser classificados em três grupos: o grupo 1 compreende
bactérias e fungos comensais ou ambientais e que ocasionalmente são reconhecidos
como patógenos oportunistas. Alguns microrganismos como espécies de Streptococcus
sp. e Aspergillus sp. podem produzir severa doença sistêmica na fêmea suína
ocasionando rápida perda da gestação, estão incluídos neste grupo. Adicionalmente,
bactérias como Erysipela, Escherichia coli, Pasteurella spp, Staphylococcus spp, dentre
outras, estão comumente associadas com incidentes esporádicos de falha reprodutiva.
13
Endometrite supurativa e aborto também pertencem a este grupo; o grupo 2
compreende microorganismos presentes de forma endêmica na maioria de rebanhos
suínos como, por exemplo, o Parvovírus porcino (PPV); e o grupo 3: compreende
microorganismos que causam severa doença reprodutiva e apresentam significativa
importância econômica. Neste grupo estão incluídas enfermidades como PRRS,
circovirose suína, doença de Aujeszky e leptospirose. Entretanto, a importância destes
vários microorganismos como causa de doença reprodutiva em suínos podem apresentar
diversas variações entre laboratórios de todo o mundo (BROLL et al., 1993;
MALDONADO et al., 2005).
2.2 Procedimentos de necropsia
2.2.1 Exame do feto e placenta
Baseia-se inicialmente em um exame externo cuidadoso com o objetivo de
averiguar possíveis alterações macroscópicas que possam auxiliar no diagnóstico.
Qualquer anormalidade fetal como, por exemplo, fenda palatina, rins policísticos,
agenesia ou outra anormalidade visceral deve ser registrada. Todos os fetos suínos
incluíndo suas placentas devem ser coletados, pesados e medidos da nuca até a inserção
da cauda (BARLOW, 1998), pois geralmente a entrada de agentes infecciosos no útero
gravídico poderá causar a morte de fetos em diferentes idades gestacionais (Tabela 1).
Usando a fórmula abaixo, pode ser calculada a idade gestacional aproximada dos fetos
(Figura 1).
Fórmula: Idade gestacional aproximada (dias) = 21 + (3x a medida da nuca até a
inserção da cauda em cm).
14
Figura 1. Desenho esquemático demonstrando a medição da nuca até a inserção da
cauda de um feto suíno.
Fonte: Barlow, 1998. A guide to the investigation of porcine abortion/stillbirth. Farm
Animal Practice. In Practice, 559-564.
Tabela 1. Estimativa da idade gestacional de fetos suínos.
Idade Gestacional (dias) Medida (cm) Peso corporal (g) sem placenta.
34 4 -
40 6 -
52 10 -
61 13 100
70 16 190
82 20 370
91 23 557
100 26 800
Fonte: Barlow, 1998. A guide to the investigation of porcine abortion/stillbirth. Farm
Animal Practice. In Practice, 559-564.
É conveniente o envio de fetos suínos abortados refrigerados (não congelados)
juntamente com a placenta para serem necropsiados. Rotineiramente pode-se limitar a
investigação com a análise de três fetos suínos e todos os mumificados de uma
leitegada. Embora os procedimentos de necropsia possam variar entre laboratórios, é
importante que os patologistas desenvolvam um protocolo que facilite averiguar a
presença de lesões macroscópicas e a coleta apropriada de amostras (HOLLER, 1994).
Lesões macroscópicas não são frequentemente observadas em fetos suínos e quando
observadas não são específicas de um determinado agente etiológico. Congestão e
15
hemorragia na pele (Figura 2A) e tecidos, hiperplasia do epitélio da língua (Figura 2B),
combinada com a presença de líquidos nas cavidades pleural, pericárdica e cavidade
peritoneal são achados comumente observados, mas que não colaboram no diagnóstico
(HOLLER, 1994). A placenta também deve ser examinada minuciosamente, pois áreas
esbranquiçadas (Figura 2C) (calcificação) comumente presentes em sua superfície,
podem ser confundidas com infecção por fungos do gênero Aspergillus sp.
Adicionalmente, vesículas chamadas de aréolas (Figura 2D) ricas em glicoproteínas, das
quais uma está envolvida no transporte de ferro da mãe para o feto, a uteroferrina são
frequentemente observadas na superfície corioalantóide não havendo significado
patológico algum.
Inflamações específicas também podem manifestar-se na placenta. Casos de
placentite necrótica e infiltrado de células mononucleares já foram relatadas em doenças
como Aujeszky (pseudoraiva suína) e PRRSV, respectivamente (HSU et al., 1980;
LAGER et al., 1996).
Figura 2. A. Feto suíno. Áreas de hemorragia na pele. B. Língua. Hiperplasia
epitelial. C. Placenta. Áreas esbranquiçadas na superfície. D. Vesículas (aréolas) na
superfície placentária.
A B
C
D
16
2.2.2 Exame de natimortos
Na suinocultura industrial a natimortalidade é a maior causa de perdas de leitões
seguida pela mortalidade neonatal, na qual o esmagamento, inanição e leitões fracos são
as causas mais freqüentes (DIAL et al., 1992). Leitões natimortos são aqueles que se
encontravam vivos no início do parto, mas morreram durante o mesmo. Entretanto, na
ausência de alterações autolíticas óbvias, leitões que morrem antes do início do parto,
também são denominados pelos suinocultores, como natimortos, o mesmo ocorrendo
para leitões que morrem logo após o nascimento (DIAL et al., 1992). Em outras
definições os natimortos são classificados em tipo I, quando as mortes ocorrem no pré-
parto, e tipo II quando as mortes ocorrem no período intra-parto (ENGLISH et al.,
1982).
A mortalidade pré-parto geralmente está associada a causas infecciosas. Por sua
vez, a mortalidade intra-parto normalmente resulta de causas não infecciosas
(SPRECHER et al., 1974), sendo a anóxia fetal, que ocorre durante o processo de parto,
reconhecida como a maior de suas causas (ALONSO-SPILSBURY et al., 2005;
MOTA-ROJAS et al., 2005).
Dentre as causas infecciosas a leptospirose e a parvovirose são as doenças mais
importantes causadoras de natimortalidade. Epidemias de leptospirose são
freqüentemente associadas com o aumento da taxa de natimortos, elevadas taxas de
abortos e mortes neonatais (SOBESTIANSKY et al., 1999). O parvovírus suíno
normalmente causa elevada taxa de fetos mumificados. Porém, em leitoas infectadas,
que desenvolvem imunidade durante o terço médio da prenhês podem também
demostrar elevada taxa de natimortos (DIAL et al., 1992). Na Europa e América do
Norte a PRRS é uma doença bastante prevalente, causadora de grandes prejuízos,
incluíndo entre outros, mumificação fetal, natimortalidade e leitões nascidos fracos
(DIAL et al, 1992).
Para a implemetação de um programa de controle de natimortos em granjas, é
necessária a determinação prévia de percentual de leitões mortos antes, durante e logo
após o parto (DIAL et al., 1992). Desta forma, a observação de determinadas
características externas e internas do leitão natimorto durante o procedimento de
necropsia auxilia de forma significativa nesta classificação.
17
Morte pré-parto
Freqüentemente estes fetos são expulsos envolvidos em membranas fetais, as
quais sofrem descoloração. Pele descolorida, olhos profundos e córneas azuladas
(autólise), indicando que o feto morreu a mais de 24 horas podem também ser
observadas (CARR et al., 1990). Nesta categoria estão incluídos também fetos
mumificados (Figura 3A), os quais são facilmente reconhecidos pela aparência.
Macroscopicamente, os órgãos parenquimatosos apresentam-se friáveis e descoloridos;
há excessivo volume de líquidos serosanguinolentos nas cavidades corporais e pulmões
não flutuam quando colocados em água.
Morte intra-parto
O natimorto intra-parto apresenta aparência normal ao ser expulso (DIAL et al.,
1992). Pode apresentar-se úmido e com cianose, particularmente ao redor da face. Nas
extremidades dos membros, os leitões apresentam extensões de tecido cartilaginoso
(Figura 3B) nos cascos (“slippers” ou chinelas) que no leitão vivo são perdidos dentro
de 15 minutos (Figura 3C) após nascimento (CARR et al., 1990). Edema de tecido
subcutâneo, excesso de líquido e congestão das vísceras; pulmões de coloração
vermelho púrpura (Figura 3D), firmes e sem evidências de aeração; presença de
mecônio sobre a pele (Figura 3E), na laringe, na traquéia e nos brônquios são
observados. O estômago pode estar repleto de mecônio e os pulmões não flutuam na
água (CARR et al., 1990).
Morte pós-parto
O leitão apresenta aparência normal ao ser expulso, podendo apresentar
batimentos cardíacos e ou movimentos respiratórios (DIAL et al., 1992). Estes leitões
podem apresentar as extensões cartilaginosas nos cascos (“slippers” ou chinelas) se
morreram antes de 15 minutos do nascimento (CARR et al., 1990). Congestão
subcutânea e visceral, pulmões com evidências de aeração (Figura 3F), flutuando na
água (WILSON, 1986) são alterações observadas à necropsia. Se o leitão morreu após
ter mamado, o estômago pode conter leite (CARR et al., 1990).
18
Na tabela 2 estão sumarizadas as principais caracteristicas dos leitões mortos no
pré-parto, no intra-parto e no pós-parto.
Tabela 2. Características externas do leitão ao nascer e principais alterações
macroscópicas à necropsia, relacionadas ao momento da morte (pré-parto, intra-parto e
pós-parto).
Aspecto
examinado
Morte pré-parto Morte intra-parto
(distocia)
Morte
pós- parto
Pele
Edema, descolorida, presença
ou não de mecônio
Pálida, seca, cianótica,
com mecônio
Manchada,
avermelhada
(hematoma)
Olhos
Profundos e córneas azuladas Edematosos,
protuberantes
Normal
Mecônio
Tingindo a pele Na boca, narina, traquéia
e estômago
-
Pulmão
Atelectásico Atelectásico
Aerado
Patas
Chinelas Chinelas Ausência de
chinelas
Cordão
umbilical
Longo, com variável grau de
autólise
Longo, úmido Curto e seco
Outros
órgãos
Autólise variável Edema tecidual Autólise
variável
Fonte: Christensen, 1994. Dead piglets – aging dead piglets as an aid in problem
solving. Pig Health and Productivity 161, 21-22.
19
Figura 3. Natimortalidade pré, intra e pós-parto em suínos. A. Morte de fetos suínos
pré-parto. Fetos mumificados. B. Morte de fetos intra-parto. Extensões de tecido
cartilaginoso nos cascos. C. Ausência de tecido cartilaginoso (chinelas). D. Morte
de fetos intra-parto. Pulmão de coloração vermelha púrpura sem evidência de
aeração. E. Morte de fetos intra-parto. Presença de mecônio (material de coloração
amarelada) sobre a pele. F. Morte pós-parto. Pulmão aerado.
2.3 Exame laboratorial
Considerando que o aborto muitas vezes possa ser um problema multifatorial,
sugere-se um procedimento sistemático de coleta de material, independente da suspeita
inicial ou do diagnóstico presuntivo. Quando a necropsia é realizada no laboratório, o
A
B
C
D
E
F
20
patologista pode coletar e enviar amostras apropriadas para a histopatologia, virologia e
bacteriologia. Quando a necropsia é realizada a campo a coleta e o seu envio tornam-se
mais críticos (HOLLER, 1994). O envio do histórico completo da granja incluíndo a
idade correta dos animais afetados, quantos animais abortaram, o status de vacinação do
rebanho, se houve introdução de animais novos na granja, mudança de alimentação,
ambiente ou alguma doença prévia diagnosticada no rebanho pode contribuir de forma
significativa no diagnóstico. Na tabela 3 são listados os órgãos a serem coletados
durante a necropsia e os respectivos exames que podem ser realizados.
Tabela 3 Amostras necessárias para o diagnóstico de aborto em suínos.
Amostra Exames que podem ser realizados
Tecido refrigerado
Pulmão, fígado, conteúdo do estômago e
placenta
Bacteriologia
Amostra de rim ou pulmão IFD para Leptospira sp
Amostra de pulmão, baço, linfonodo
inguinal, timo
PCR para Parvovírus suíno
Soro fetal (líquido do tórax) Sorologia para Leptospira sp. e PCR
PRRSV e Parvovirus suíno.
Tecido fixado em formol 10%
Cérebro, fígado, rim, pulmão, coração,
músculo esquelético, baço, cólon, timo,
linfonodo inguinal e placenta
Coração, linfonodo, pulmão e timo
Histopatologia
Imunoistoquímica PCV2 e PRRSV
PCR: reação de polimerase em cadeia. IFD: imunofluorescência direta.
O conteúdo do estômago e pulmão fetal são os tecidos geralmente escolhidos na
rotina de isolamento bacteriano. O fígado também pode ser enviado para cultivo quando
o conteúdo do estômago não está disponível (BARLOW, 1998). O diagnóstico de
aborto bacteriano geralmente é estabelecido quando há isolamento moderado a puro do
agente a partir das amostras enviadas associado à evidência de lesão inflamatória. A
maioria dos abortos bacterianos é esporádica. Bactérias como Streptococcus suis e
Erysipelothrix spp apontadas como causa de doença sistêmica podem estar associadas a
epidemias de aborto (HOLLER, 1994).
Fetos suínos tornam-se imunocompetentes a partir dos 70 dias de idade
gestacional. Uma vez em que não há transferência de anticorpos maternais para os fetos
suínos, devido ao tipo de placentação (epiteliocorial), a presença de títulos no fluído
fetal geralmente tende a ser mais significativa que a presença de títulos observados no
21
soro sangüíneo da fêmea suína. Testes sorológicos como inibição da hemaglutinação
(HI) para a detecção do parvovírus suíno ou o teste de microaglutinação (MAT) para
detecção de Leptospira sp. podem ser realizados caso seja indicado (BARLOW, 1998).
Os exames histopatológicos de tecidos fetais usualmente não apresentam lesões
microscópicas significativas. Entretanto, ocasionalmente lesões inflamatórias focais ou
pneumonia podem ser observadas sugerindo um processo infeccioso. A ausência de
lesões histológicas não elimina a possibilidade de estabelecer o diagnóstico etiológico.
Lesões macroscópicas e microscópicas significativas podem ser prejudicadas pela
autólise tecidual (HOLLER, 1994).
2.4 Principais rotas de acesso ao sistema reprodutivo da fêmea suína
Numerosos vírus e bactérias podem causar falhas reprodutivas na fêmea suína
(VANNIER, 1999), tendo duas rotas de infecção principais. A primeira, via trato genital
através de uma forma ascendente de infecção, na qual os agentes infecciosos são
introduzidos no útero através da vagina durante o estro ou parto. A segunda forma
ocorre pela corrente sangüínea, sendo que os agentes infecciosos atingem o concepto
após episódios de viremia e ou bacteremia (VANNIER, 1999).
Septicemia ocorre quando uma grande quantidade de microrganismos invade a
corrente sangüínea e geralmente é acompanhada por toxemia e febre. A forma pela qual
a gestação é afetada depende do estágio de desenvolvimento fetal bem como da
quantidade e fatores de virulência do agente infeccioso presente (WRATHALL, 1975).
Os efeitos da toxemia são proporcionais ao número de toxinas envolvidas no processo.
A febre é o terceiro e maior efeito sistêmico usualmente associado com viremia,
septicemia e toxemia o qual pode contribuir também para o aborto da fêmea gestante
(MUIRHEAD et al., 1997).
O aborto freqüentemente ocorre devido à toxemias, as quais podem interferir no
controle endócrino e ou causar danos ao tecido endometrial uterino. Do mesmo modo, o
efeito sistêmico e a febre, presentes nos casos de infecções agudas, podem também
originar falha maternal com o subseqüente abortamento dos fetos. Se ocorrer o
desenvolvimento de placentite, em resposta a um processo infeccioso o processo
inflamatório irá causar a liberação de prostaglandinas F2α, que por sua vez irão atuar
sobre os ovários e causar a regressão dos corpos lúteos. Estes são essenciais para a
22
manutenção da gestação em suínos, pois são as estruturas ovarianas responsáveis pela
secreção de altos níveis de progesterona (SOBESTIANSKY et al., 2007).
A progesterona é o hormônio esteróide indispensável para a nutrição dos
embriões, durante os estágios iniciais de desenvolvimento e para o controle endócrino
da gestação, isto é, manutenção da inatividade do miométrio uterino e retroalimentação
negativa na secreção hormonal oriunda do hipotálamo e hipófise. Enquando persistirem
altos níveis de progesterona os eventos fisiológicos da parição não serão iniciados
(SOBESTIANSKY et al., 2007).
2.5 Causas infecciosas associadas à falhas reprodutivas em suínos
O suscesso da produção de suínos depende em parte da prevenção de doenças
infecciosas que afetam a performace reprodutiva (MENGELING et al., 2000). Um
grande número de vírus e bactérias tem sido apontado como causa de falhas
reprodutivas sendo capaz de causar doença clínica na fêmea suína adulta ou atravessar a
barreira placentária e infectar o concepto suíno.
2.5.1 Agentes virais
Circovírus suíno tipo 2 (PCV2)
A circovirose suína, enfermidade reconhecida apenas recentemente, foi descrita
na Alemanha, Reino Unido, Canadá, Nova Zelândia, Estados Unidos (KIUPEL et al.,
1998), Dinamarca, Irlanda do Norte (ALLAN et al., 1999), Grécia (SAOULIDIS et al.,
2002), Tailândia (KIATIPATTANASAKUL-BANLUNARA et al., 2002), Espanha
(SEGALÉS et al., 1997), França (MADEC et al., 2000), Hungria (MOLNÁR et al.,
2002), Coréia (CHOI et al., 2000), Japão (ONUKI et al., 1999), México (TRUJANO et
al., 2001), Argentina (SARRADEL et al., 2002) e no Brasil (ZANELLA et al., 2003,
FRANÇA, 2004, CORRÊA et al. 2006).
A primeira doença associada a infecção pelo PCV2 foi a síndrome do
definhamento multissistêmico suíno (SDMSD) (HAEDING et al., 1997). Devido ao
fato de que a terminologia SDSM descrevia somente uma porção de doenças associadas
23
ao PCV2 em 2002 foi proposto a retirada do termo SDSMD sendo inserido outra
terminologia denominada doença da circovirose suína (PCVD) (ALLAN et al., 2002).
No Norte da America foi determinado que qualquer termo novo atribuído em conecxão
com PCV2 deveria incluir a palavra associado, o que levou a introdução do termo
doenças associadas a circovirose suína (PCVAD). O PCVAD inclui no presente
momento infecções sistêmicas, PCV2 associado à pneumonia, PCV2 associado a
enterite, PCV2 associado a problemas reprodutivos e PCV2 associado a sindrome de
dermatite e nefropatia (OPRIESSING et al., 2007). Recentemente um novo vírus
denominado torque teno virus (TTV) tem sido correlacionado ao PCV2 (KRAKOWKA
et al., 2008; MARTIN-VALLS et al., 2008).
O envolvimento do PCV2 na gênese das falhas reprodutivas em suínos tem
causado interesse considerável, embora esse tipo de ocorrência não seja freqüente em
surtos de SDMSD. No Canadá (WEST et al., 1999, O’CONNOR et al., 2001), nos
Estados Unidos (EUA) e Oeste da Europa (JANKE 2000, OHLINGER et al., 2000), há
trabalhos que associam a falha reprodutiva em porcos ao PCV2, reportando aborto,
mumificação fetal e de neonatos com quantidade variável de antígeno de PCV2 em
tecidos e em lesões cardíacas (JOLIE et al., 2000). Recentemente, foram realizados
estudos retrospectivos em tecidos do sistema reprodutor de suínos, coletados entre 1995
e 1998, e nenhum antígeno ou ácido nucléico de PCV1 e PCV2 foi detectado pelo PCR
ou por imunoistoquímica (BOGDAN et al., 2001); concluiu-se que as alterações
reprodutivas associadas com PCV2 podem constituir uma recente manifestação clínica
da doença e que a transmissão vertical não é o mecanismo primário para a disseminação
do vírus.
O tropismo celular do PCV2 parece mudar com a idade dos suínos. Sánchez et
al. (2003) reportaram que fetos de suínos infectados no útero aos 57, 75 e 92 dias de
gestação têm diferentes distribuições do vírus no tecido. Fetos inoculados aos 57 dias
tinham elevada quantidade de vírus em cardiomiócitos e, em menor escala, em
macrófagos e hepatócitos. Na fase final da gestação ou após o nascimento, o vírus foi
encontrado principalmente em macrófagos e era escasso em outros tecidos. Em adição
observou-se apenas 5% ou menos de células com PCV2 no núcleo. Em um segundo
estudo, linfócitos T foram infectados quando leitões eram inoculados após o nascimento
com PCV2 (SÁNCHEZ et al., 2003). Quando fetos suínos foram infetados com PCV2,
a distribuição do vírus foi relacionada com tecidos ou células com alta taxa mitótica,
semelhante ao que ocorre com cardiomiócitos de fetos (SANCHÉZ et al., 2003). Nos
24
leitões, em geral, o antígeno do PCV2 foi encontrado no citoplasma de monócitos;
macrófagos e de outras células apresentadoras de antígeno, como células Kupffer e
células dentríticas, porém raramente no núcleo destas células (ROSELL et al., 1999,
GILPIN et al., 2001, CHIANINI et al., 2003, GILPIN et al., 2003, VINCENT et al.,
2003). Diante disso, alguns autores sugeriram que a propriedade fagocitária dos
macrófagos é responsável pela presença do vírus em seu citoplasma e que as células
monocíticas-macrofágicas não são as que suportam a replicação de PCV2 (GILPIN et
al., 2003).
A patogênse da ocorrência natural de SDMSD em animais adultos é altamente
especulativa no presente momento. Alguns experimentos têm sugerido que a infecção
intra-uterina, no momento do cruzamento, deve ter um papel importante no
desenvolvimento de desordens reprodutivas no terço final da gestação (CARIOLET et
al., 2001b). Em contraste, os mesmos pesquisadores, observaram que o PCV2 não foi
capaz de atravessar a barreira placentária quando foi inoculado pelas vias intra-traqueal
e intramuscular, em porcas gestantes (CARIOLET et al., 2001a). Abortos têm sido
esporadicamente associados com a infecção pelo PCV2, em especial, em granjas
recentemente formadas (WEST et al., 1999, SANFORD, 2002). Embora poucos casos
naturais de aborto tenham sido analisados, o coração é o órgão onde ocorre a replicação
e as lesões degenerativas no feto (WEST et al., 1999). O PCV2 já foi isolado de leitões
abortados no Canadá; um dos animais tinha severa miocardite com grande quantidade
de antígeno de PCV2 detectado por imunoistoquímica no coração, fígado, pulmão, rim e
outros órgãos; não foi estabelecida se havia associação com PPV, PRRSV e enterovírus
nesse surto (WEST et al., 1999).
Estudos experimentais com PCV2 em fetos também suportam que o coração tem
um papel importante na patogênese da infecção viral (PENSAERT et al., 2001). Este
fato contrasta com a ocorrência natural de SDMSD, na qual lesões cardíacas, raramente,
são observadas e sinais clínicos de insuficiência cardíaca são pouco importantes
(SEGALÉS et al., 2004). Infecção subclínica em cachaços tem sido reportada em
experimentos e casos naturais (LAROCHELLE et al., 2000, LE TALLEC et al., 2001),
mas a sua relevância e implicações clínicas para uma futura minhada também são
desconhecidas (SEGALÉS et al., 2004).
25
Síndrome Reprodutiva e Respiratória Suína (PRRS)
A Síndrome Reprodutiva e Respiratória Suína (PRRSV) é uma doença causada
por um vírus RNA pequeno pertencente à família Arteriviridae (CAVANAGH, 1997). É
uma doença que causa um grande impacto econômico na suinocultura mundial, sendo
que nos Estados Unidos ela sozinha é responsável pela perda de U$$ 560 milhões de
dólares anualmente (NEUMAN et al., 2005).
Apesar de a doença estar disseminada em rebanhos suínos em todo o mundo,
inclusive na América do Sul (RAMÍREZ et al., 2007), ainda não existe relato da PRRS
no Brasil (ZANELLA et al., 2004).
O vírus é altamente infeccioso, sendo baixa a dose do agente necessária para
induzir a infecção. A transmissão da doença se dá por contato direto ou indireto com
secreções e excreções de animais (MENGELING et al., 2000). Tanto na Europa, como
na América do Norte a doença é amplamente difundida, e são raras as granjas não
infetadas (SOBESTIANKY et al., 2007).
A patogenicidade do PRRSV está diretamente relacionada à cepa do vírus que
podem ser classificadas em dois grupos, de alta e baixa patogenicidade (HALBUR et
al., 1996; PARK et al., 1996). O PRRS tem tropismo pelos macrófagos alveoláres, os
quais desempenham várias funções imunológicas importantes. A destruição de
macrófagos alveoláres pode induzir a uma pneumonia intersticial e predispor os animais
a vários tipos de infecções respiratórias secundárias (GALINA et al., 1994;
KOBAYASHI et al., 1996; VAN REETH et al., 1996).
A capacidade de o vírus cruzar a placenta foi demostrada após a infecção
intranasal de porcas em gestação (TERPSTRA et al., 1991; CHRISTIANSON et al.,
1992a). A infecção ocorre com maior freqüência quando porcas são infectadas após os
90 dias de gestação (MENGELING et al., 1994), porém fetos mais novos infectados no
útero suportam a replicação do vírus (CHRISTIANSON et al., 1992b). A placenta
parece apresentar susceptibilidade diferenciada ao PRRSV, de acordo com os estágios
da gestação. É provável também que o PRRSV atravesse a placenta carregada por
macrófagos infectados, o que é favorecido pela diminuição da barreira sangüínea
materno-fetal, durante o final da gestação. A morte dos fetos ocorre provavelmente
devido as lesões no cordão umbilical (LAGER et al., 1996).
Os sinais clínicos sistêmicos da PRRS incluem febre, letargia, cianose petequial
dérmica temporária, anorexia, agalactia e eventualmente morte, principalmente nos
26
casos agudos (DONE et al., 1996). Os sinais clínicos reprodutivos na fêmea são partos
precoces ou aborto no final da gestação; na mesma leitegada pode-se encontrar tanto
leitões normais, como leitões fracos, natimortos, em decomposição ou mumificados
(DONE et al., 1996).
Um estudo detalhado de lesões da infecção por PRRSV foi relatado por Halbur
et al (1996). De acordo com este estudo, as lesões macroscópicas presentes se restrigem
aos pulmões e linfonodos; a área afetada dos pulmões varia de 10 a 70%, dependendo
da cepa do vírus.
Além de fetos mortos e mumificados, a infecção uterina por PRRSV pode causar
o rompimento da placenta fetal da maternal; a placenta fetal pode ser encontrar marrom-
esverdeada e com uma consistência adiposa (STOCKHOFE-ZURWIEDEN et al.,
1993).
As lesões microscópicas são mais proeminentes nos pulmões e linfonodos. Nos
pulmões se observa pneumonia intersticial multifocal caracterizada pelo espessamento
dos septos alveolares devido à infiltração de células mononucleares, hipertrofia e
hiperplasia de pneumócitos tipo 2, e a presença de exsudato no espaço alveolar, o qual
geralmente contém macrófagos, células multinucleadas e dentritos celulares (POL et al.,
1991; HALBUR et al., 1996). Fetos abortados têm lesões pulmonares semelhantes às
descritas acima (LAGER et al., 1994). O cordão umbilical pode conter hemorragia
extensiva no tecido conectivo ao redor das veias ou artérias (LAGER et al., 1996).
As lesões uterinas consistem em endometrite, placentite e separação multifocal
da área de contato da placenta materno-fetal; pode ocorrer infiltração multifocal de
linfócitos e macrófagos na lâmina própria do endométrio, no tecido conectivo
perivascular e na parede vascular (STOCKHOFE-ZUEWIEDEN et al., 1993; LAGER
et al., 1996).
O diagnóstico de PRRS é baseado no isolamento do vírus ou através da
utilização da técnica de PCR (MENGELING et al., 2000). O vírus pode ser isolado de
vários órgãos tais como medula óssea, timo, baço, coração, cérebro, fígado, rim, tonsila
e linfonodos de animais adultos, ou fetos abortados. Porém, o vírus é preferencialmente
isolado de amostras de soro (VAN ALSTINE et al., 1993). O vírus também pode ser
detectado através da transcrição reversa acoplada à reação de polimerase em cadeia
(RT-PCR) (MARDASSI et al., 1994; SUAREZ et al., 1994; VAN WOENSEL et al.,
1994), a qual pode ser tão sensível quanto o isolamento viral em cultivo celular.
27
Antigeno viral pode ser detectado em órgãos fixados em formalina através de
métodos imunoistoquímicos. (MAGAR et al., 1993; HALBUR et al., 1994;
LAROCHELLE et al., 1994; SUR et al., 1996). Métodos sorológicos para a detecção de
anticorpos contra o PRRSV incluem imunofluorescência direta (YOON et al., 1992) e
soroneutralização viral (YOON et al., 1994).
A vacinação de animais parece proteger contra o desafio com a mesma cepa do
vírus, mas não contra o isolado (LAGER et al., 1995). A vacina também oferece
proteção parcial contra problemas reprodutivos (abortos, mumificação fetal e
disseminação do vírus pelo sêmen), mas não contra problemas respiratórios (PLANA
DURAN et al., 1995; KRITAS et al., 1995). Foi demostrado que o vírus proveniente da
vacina pode atravessar a placenta e infectar os fetos (MENGELING et al., 1996).
Parvovírus suíno (PPV)
A parvovirose é uma síndrome de distribuição mundial de alta prevalência,
caracterizada por morte embrionária, mumificação, natimortos e leitegadas de tamanho
reduzido quando atinge fêmeas não imunes em gestação (SOBESTIANSKY et al.,
2007). Usualmente, a infecção em fetos antes dos 70 dias de gestação leva à morte,
enquanto que fetos infectados após este período sobrevivem, eliminando a infecção e
desenvolvendo anticorpos contra o vírus (MENGELING et al., 2000; ZEEUW et al.,
2007).
Presente em todos os continentes, a parvovirose suína é considerada uma das
principais causas infecciosas de problemas reprodutivos na espécie suína (THACKER
et al., 1988; DEE, 1995; MENGELING et al., 2000). Um levantamento realizado em
250 casos de aborto suíno em Iowa revelou que 20% eram de origem viral e o
parvovírus porcino estava presente em 12% destes casos (HOLTER et al., 1976). No
Brasil, inquéritos sorológicos em propriedades cujos animais não eram vacinados
apontaram elevada ocorrência de anticorpos anti-PPV indicando que o PPV já está
estabelecido no país há pelo menos duas décadas (MARTINS et al., 1984; GOUVÊIA
et al., 1984; BERSANO et al., 1993). Recentemente, PPV foi detectado em amostras de
tecidos fetais de fêmeas suínas com distúrbios reprodutivos provenientes dos estados de
São Paulo, Minas Gerais e Goiás através da PCR (SOARES et al., 1999; SOARES et
al., 2003). Lesões macroscópicas geralmente não são observadas durante a necropsia
28
dos fetos infectados por parvovírus suíno. A alteração macroscópica mais tipicamente
associada à parvovirose é a mumificação fetal. Os fetos mumificados se apresentam
usualmente em diferentes tamanhos, provavelmente devido à difusão lenta da infecção
feto a feto (SOBESTIANSKY et al., 2007). Lesões microscópicas quando presentes são
caracterizadas pela presença de células inflamatórias mononucleares associadas a focos
de necrose em diversos órgãos fetais (PROZESKY et al., 1980; BROLL et al., 1993).
O PPV pode potencializar infecções pelo Circovírus tipo 2 (PCV2). Infecções
experimentais com PPV e PCV2 permitiram uma multiplicação viral mais acentuada em
animais infectados com ambos os vírus do que em controles contaminados com cada um
deles isoladamente (ELLIS et al., 2000; KIM et al., 2003). Adicionalmente, co-infecção
entre PCV2 e PPV tem sido observada de forma significativa em casos de SMDS em
suínos da Coréia e Cánada (CHOI et al., 2000; ELLIS et al., 2000; KIM et al., 2001;
KIM et al., 2002).
O diagnóstico de infecção pelo parvovírus suínos pode ser realizado mediante a
identificação de antígenos virais através da imunofluorescência direta (MENGELING,
1976), teste de hemaglutinação (JOO et al., 1976), hibridização in situ,
imunoistoquímica e PCR (KIM et al., 2004).
Outros agentes virais
Agentes virais como o vírus da encefalomiocardite suína (EMC) e pseudoraiva
suína também têm sido apontados como causa de falha reprodutiva em suínos
(KIRKBRIDE et al., 1978). O vírus da encefalomiocardite (EMC) foi inicialmente
relatado como causa de mortalidade em suínos no Panamá em 1958 (MURNAME et al.,
1960), sendo após esta data mencionado em vários países (GAINER, 1967; ACLAND
& LITTLEJOHNS, 1975; ROEHE et al., 1985; KOENEN et al., 1991). Este vírus
causa alta mortalidade em suínos jovens atribuída à miocardite e encefalite podendo
ocasionar problemas reprodutivos (JOO et al., 1992). Evidências de transmissão
transplacentária do vírus (EMC) em fêmeas suínas prenhas têm sido demonstradas
através de infecção natural e experimental (LINKS et al., 1986; LOVE et al., 1986). Um
estudo realizado com soro fetal ou líquido torácido de 478 fetos suínos mumificados ou
natimortos revelou a presença do vírus da encefalomiocardite em 36,6 % das amostras
testadas (KIM et al., 1989). Outro estudo realizado em Minesota com soro de fetos
29
suínos abortados revelou uma titulação de 1:128 a 1:4096 para o EMC, sugerindo que o
líquido torácico de fetos abortados podem ser utilizados para o diagnóstico deste agente
(JOO et al., 1988).
A pseudoraiva suína (Doença de Aujeszky) é uma virose que afeta
primariamente a espécie suína caracterizada por sinais clínicos nervosos, respiratórios,
alto índice de mortalidade entre leitões não imunes e por graves transtornos
reprodutivos em porcas prenhes (SOBESTIANSKY et al., 2007). Um levantamento de
824 fetos suínos abortados realizados nos EUA durante um período de 6 anos revelou a
pseudoraiva suína em 1% dos fetos analisados (KIRKBRIDE et al., 1978). Outro
levantamento realizado com 293 amostras de tecidos fetais provenientes da Espanha não
foi constatado a doença de Aujeszky nas amostras analisadas (MALDONADO et al.,
2005). Adicionalmente um outro estudo sorológico realizado em rebanhos suínos na
Espanha apontou uma soropositividade de 73% para Aujeszky (GUTIÉRREZ-MARTÍN
et al., 2000). No Brasil a enfermidade foi diagnosticada pela primeira vez em 1912, e já
foi identificada nos estados do Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paraná, Minas
Gerais, São Paulo, Rio de Janeiro, Bahia, Ceará, Goiás, Mato Grosso do Sul e Distrito
Federal. Nos últimos anos, a infecção foi mais frequëntemente relatada em Santa
Catarina, o que levou a implementação de um programa de erradicação
(SOBESTIANSKY et al., 2007).
2.5.2 Agentes bacterianos
Leptospira sp.
A leptospirose é uma zoonose de ampla distribuição geográfica, geralmente tem
carácter ocupacional, representando risco para a saúde pública (FARR, 1995; FAINE et
al., 1999). Leptospira interrogans sorovar pomona é o patógeno mais importante do
grupo de leptospiras para o suíno. Entretanto, outros sorovares como
icterohaemorrhagiae, grippotyphosa, canicola e bratislava também têm sido isoladas
(BOLIN et al., 1991;WILLIAM et al., 1992).
Em suínos, a leptospirose caracteriza-se pela ocorrência de abortamento no terço
final da gestação, repetição de cio, mumificação fetal, natimortalidade, nascimento de
leitões fracos, baixo número de leitões nascidos, descarga vulvar e morte embrionária
30
(ELLIS, 1989). Um estudo realizado em fetos suínos abortados revelou uma prevalência
de leptospirose em 9,8% dos casos (KIRKBRIDE et al., 1978). Adicionalmente uma
outra investigação de causas de aborto e mumificação fetal revelou o isolamento de
Leptospira interrogans sorovar australis em 91% dos isolados (ELLIS et al., 1986).
O diagnóstico de leptospirose em produtos fetais geralmente é difícil, sendo
realizado na maioria das vezes através da técnica de imunofluorescência a partir de
amostras de impressões de rim e ou fluído fetal (BOLIN et al., 1991). Outros métodos
de diagnósticos utilizados são PCR (KEE et al., 1994; VITALE et al., 2005) e
imunoistoquímica (SCANZIANI et al., 1991).
Outros agentes bacterianos
Agentes bacterianos como Actinobacillus suis, Escherichia coli, Erysipelothrix
sp, Arcanobacterium pyogenes, Mycobacterium avium, Staphylococcus sp.,
Pseudomonas sp., dentre outras bactérias também tendo sido reladas em casos
esporádicos e surtos de aborto em suínos (ELLSWORTH et al.,1979; YANGER et al.,
1996; HOFFMANN et al., 2002; MAUCH et al., 2004).
A infecção por Actinobacillus suis tem sido associada a casos esporádicos de
septicemia e morte de suínos jovens (TAYLOR, 1999; WILSON et al., 2000). Surtos de
doença clínica ocorrem com maior freqüência em rebanhos com alto status sanitário
(MINIATS et al., 1989; SANFORD et al., 1990), possivelmente devido à baixa
imunidade deixando que amostras virulentas de A. suis expressem seu potencial
patogênico. Macroscopicamente os fetos suínos abortados apresentam hemorragias
petequiais nos pulmões, rim, coração, fígado, baço, pele e intestino (MAUCH et al.,
2004). Microscopicamente, lesões pulmonares caracterizadas por extensas áreas de
hemorragia e pneumonia fibrinonecrótica acompanhada com proeminente quantidade de
colônias bacterianas são as lesões mais significativas (YANGER et al.,1996).
A erisipela ou ruiva é uma doença de distribuição mundial (PENRITH et al.,
2004), de caráter hemorrágico e que usualmente cursa com lesões cutâneas, articulares,
cardíacas, septicemias, aborto e mumificação fetal além de outros transtornos
reprodutivos. Adicionalmente, baixa fertilidade, caracterizada por aumento na taxa de
abortos e natimortos e nascimento de leitegadas pequenas tem sido atribuída à infecção
crônica por Erisipela suína (HOFFMANN et al., 2002)
31
Casos de abortos por Mycobacterium avium têm sido relatados em Dakota do
Sul (ELLSWORTH et al., 1979) e na Europa (MCERLEAN, 1959).
Na tabela 4 estão sumarizados alguns levantamentos de causas infecciosas de
abortos em suínos
Tabela 4. Freqüência percentual de agentes infecciosos diagnosticados em
levantamentos de causas de perdas reprodutivas em suínos.
Vírus
Referências Bactéria
PPV PRRSV PCV2
Fungos
Infecção não
determinada
Maldonado et al., 2005 - - 9 - -
Ritzmann et al., 2005 - - - 27,1 -
On et al., 2002 41,8% - - - -
Kim et al., 2004 - - - 13,1 -
Lyoo et al., 2001 - 8,1 31,4 46,5 -
Thoma et al., 1997 3,6 - - - -
Broll et al., 1993 8,2 29,2 52
William et al., 1991 - 33 - - -
Kirkbride et al., 1978 16,8 4,9 - - 7,0 60
2.6 Causas não infecciosas de aborto em suínos
Mais de 60% dos abortos em suínos são devidos a causas não infecciosas, onde
uma parte importante deve-se aos abortos estacionais que acometem, sobretudo, fêmeas
nulíparas e primíparas (SOBESTIANSKY et al., 2007).
Muitos estudos têm relatado um padrão estacional de infertilidade englobando o
intervalo desmame-cio, os retornos pós-cobertura, a taxa de parição e os abortamentos,
na fêmea suína. Estes estudos, conduzidos na sua grande maioria no hemisfério norte
relatam a tendência da fêmea suína em não manter a gestação no período verão-outono,
sendo denominada de “complexo de infertilidade de verão” ou “infertilidade estacional”
ou “síndrome de abortamento de outono” (SAO).
A condição de síndrome do abortamento de outono (SAO) pode atingir uma
freqüência de até 10% em certos rebanhos. O estágio de gestação em que os abortos
ocorrem varia desde 30 até 110 dias de gestação, embora seja um fato bastante comum
os fetos abortados estarem com 5-7 semanas de idade. Os fetos não apresentam lesões
32
histopatológicas específicas e são de tamanho normal (WRATHALL et al., 1986) A
combinação de fatores ambientais, nutricionais e de manejo contribuem para a
ocorrência da SAO (ALMOND et al., 1985; PELTONIEMI et al., 2000). Ingestão
energética deficiente e/ou falha em manter temperaturas ambientais no período de
gestação, quando as temperaturas externas baixam rápida e drasticamente após um dia
com temperatura média parecem estar envolvidos (PRUNIER et al., 1997). Por outro
lado, a ocorrência de SAO parece envolver, também, distúrbios na secreção homornal
das fêmeas suínas (LOVE, 1981; WRATHALL et al., 1986). Alguns trabalhos têm
demostrado que a redução gradativa na quantidade de horas-luz diárias que ocorre
normalmente no outono está relacionada com níveis mais baixos de progesterona
durante a gestação (PRUNIER et al., 1996).
Outras causas de aborto podem ser doenças do aparelho locomotor e deficiências
nutricionais. Problemas reprodutivos por deficiências nutricionais agudas estão se
tornando muito raros na suinocultura moderna, por outro lado, as contaminações com
micotoxinas são cada vez mais freqüentes. A fumonisina, micotoxina produzida pelo
fungo Fusarium sp., pode produzir aborto subseqüente ao consumo de altos níveis dessa
toxina (OSWEILER et al., 1990). O mecanismo está relacionado à anóxia fetal devido
ao edema pulmonar.
Outros fatores capazes de predispor ou provocar abortamentos incluem: estresse,
claudicações, baixo nível de higiene, falta de contato com o cachaço no início da
gestação, reação vacinal, substâncias tóxicas, temperaturas extremas, queimaduras
solares, velocidade excessiva de ventiladores, baixa iluminações e incompatibilidade
genética (SOBESTYANSKY et al., 2007).
33
3. ARTIGOS
3.1 Artigo 1: “Diagnostic survey of swine abortion, mummified fetuses and stillborn
piglets in Southern Brazil.”
3.2 Artigo 2: “Co-infection by porcine circovirus type 2 and porcine parvovirus in
aborted fetuses and stillborn piglets in southern Brazil.”
3.3 Artigo 3: “Lesões de pele causadas por Erysipelothrix rhusiopathiae em um feto
suíno abortado.”
3.4. Artigo 4: “Escherichia coli O157: H7 – as a cause of abortion in swine.”
34
3.1 Artigo 1: “Diagnostic survey of swine abortion, mummified fetuses and
stillborn piglets in Southern Brazil.”
Caroline Argenta Pescador, Luís Gustavo Corbellini, David Steffen, Bruce Brodersen,
David Driemeier
1
1
Este artigo está em andamento e será submetido à Journal of Veterinary Diagnostic
Investigation.
35
Abstract
Various infectious agents have been implicated in reproductive failure in sows,
resulting in serious economic losses. The objective of this survey was to determine the
distribution pattern of infectious abortion in Southern Brazil. A total of 117 cases of
swine abortion, mummified and stillborn piglets were submitted from June 2005 to
March 2007 to the Laboratory of Veterinary Pathology, Veterinary Faculty, Federal
University of Rio Grande do Sul, Brazil. Diagnostic procedures performed on fetuses
included necropsy, histology, immunohistochemistry (IHC) for porcine circovirus type 2
(PCV2), porcine parvovirus (PPV) and
porcine reproductive and respiratory syndrome
virus (
PRRSV), bacteriology, Nested-PCR for PPV and direct immunofluorescence test using
multivalent Leptospira sp.
The cause of abortion was identified in 25.5% of cases.
Overall, 0.86% (1/117) of the fetuses was considered to be infected with parvovirus
(PPV) infection by immunohistochemistry and 14.5% (17/117) by Nested-PCR. PCV2
infection was seen in 5.98% (7/117). In samples from 3 (2.56%) of these seven fetuses,
co-infection with porcine parvovirus by Nested-PCR was also confirmed. Bacterial
infection accounted for 5.1% (6/117) of cases. Viral antigens for PRRSV were not
detected by immunohistochemistry technique. The results suggest that PPV, PCV2 and
bacterial agents could be important infectious pathogens linked to fetal infection leading
to mummification and fetal losses in Brazil.
Key Words: swine abortion, diagnosis, immunohistochemistry, infectious agents.
1
1
From the Department of Veterinary Pathology (Pescador, Driemeier) and Department of Preventive
Veterinary Medicine (Corbellini), Federal University of Rio Grande do Sul (UFRGS) Av. Bento
Goncalves 9090, 91540-000 Porto Alegre, RS, Brazil.
1
Corresponding Author: David Driemeier, Departamento de Patologia Clinica Veterinaria, Faculdade de
Veterinaria, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Avenida Bento Goncalves, n
0
9090, 91540-000
Porto Alegre RS, Brazil.
2
From the Department of Veterinary and Biomedical Science (Steffen, Brodersen). Veterinary Diagnostic
Center, University of Nebraska – Lincoln, P.O. Box 82646 Fair Street and East Campus Loop, Lincoln,
NE 68501-2646, USA.
36
Introduction
Reproductive failure in swine is often a difficult diagnostic problem. Work has
been done with infections causes of swine abortion in many parts of the world (Broll et
al.1993, Kim et al 2004, Ritzmann et al 2005, Maldonado et al 2005) and a variety of
infectious agents have been implicated in pregnancy losses in sows, resulting in severe
economic impact (Eustis et al 1981, Broll et al 1993, Scruggs & Sorden 2001, Lyoo et
al 2001, Brunborg et al 2007). Historic studies suggest that less than half of the
incidents of swine abortion, fetal mummification and stillborn are correctly diagnosed
(Holter et al 1979). New and improved techniques are gradually improving the
diagnosis success and creates a need to periodically review disease prevalence.
Necropsy procedures vary, but as in all necropsies, it is important for
practitioners or diagnosticians to develop a consistent protocol that they feel
comfortable with and that facilitates their ability to detect gross lesions and collect
appropriate samples. Gross lesions are infrequently observed in porcine fetuses and
when observed are often not specific (Holler 1994). Histologic examination of fetal
tissue is often unrewarded in swine abortion diagnostics, because evidence of
inflammation is rare in fetal tissues. Also, absence of histology lesions does not
preclude finding etiologic diagnosis (Holler 1994).
Viral or bacterial infections such as porcine reproductive and respiratory
syndrome (PRRSV), porcine parvovirus (PPV), porcine circovirus type 2 (PCV2),
Leptospira sp, Actinobacillus suis, Erysipelothrix sp, Staphylococcus aureus,
Streptococcus sp and other abortificiant pathogens are associated with severe
reproductive disease in many parts of the world (Holder 1976, Kirkbride et al 1978,
Hathaway et al 1982, Waldvogel et al 1995, Mauch et al 2004, Ritzmann et al 2005).
Limited information concerning infectious causes of swine abortion exists for Brazil
and only few reports of viral and bacterial infection in swine aborted fetuses are
available (de Oliveira et al. 1997, Castro et al. 2004).
The purpose of this communication is to report the distribution pattern of swine
infectious abortion in Southern Brazil, using modern diagnostic techniques.
37
Materials and Methods
A total of 117 aborted fetuses or stillborn piglets from ten pig farms were
received to Laboratory of Veterinary Pathology, University Federal of Rio Grande do
Sul between July 2005 and March 2007 for diagnostic evaluation. Abortion was defined
as the fetal death and expulsion between 35 and 112 days of gestation (William et al
1992), and the unit was the aborted female. Gestational age was estimated by the crown-
rump length (William et al., 1992) or determined by insemination records. At necropsy,
samples of brain, heart, lung, liver, kidney, skeletal muscle, lymph nodes, thymus, spiral
colon and spleen were collected from all cases. Subsequently, these samples were fixed
in 10% buffered formalin, processed by routine methods, sectioned at 4µm, mounted
and stained with hematoxylin and eosin (HE), and microscopically evaluated. Samples
of the lungs, liver and stomach contents of each case were cultured for aerobic bacteria
on 5% ovine blood agar and MacConkeys’s agar.
Samples from all cases were also screened for the presence of porcine circovirus
type 2 (PCV2)
a
, porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
b
and
porcine parvovirus (PPV)
b
by immunohistochemistry and Nested polymerase chain
reaction (PCR) for PPV. Detection of spirochetes in kidney smears through the use of
multivalent antibody conjugated with fluorescein
c
at 1:20 dilution was employed for the
diagnosis of Leptospira spp. infection (Miller et al. 1989). Immunohistochemistry was
performed as previously described by Sorden et al 1999 and with the following
modifications. Heart and lung sections were deparaffined, rehydrated, and digested with
0.05% protease XIV
d
in Tris buffered saline (TBS)
e
for 10 minutes at room temperature
followed by endogenous peroxidase blocking in power block
f
solution for 10 minutes. A
polyclonal rabbit anti-PCV2 antibody and monoclonal mouse anti-PRRSV were used at
a dilution of 1:1500 and 1:50 in TBS (001 M, pH 7.4) at room temperature for 30
minutes respectively. After washing in TBS, an Alkaline Phosphatase kit
g
was
employed for 15 min as the IHC detection system. The sections were washed in TBS
and then BioRed
h
substrate was applied for 15 minutes. Finally, the sections were
lightly counterstained with Mayer’s haematoxylin for light microscopic examination.
Positive controls were included in each immunohistochemical (IHC) procedure.
Furthermore, IHC staining was also applied on formalin fixed, paraffin embedded
porcine fetuses lung tissue to detect antigens of porcine parvovirus (PPV) using a
monoclonal antibody anti-porcine parvovirus
b
at 1:500 dilution. Monoclonal antibody
38
was coated on the slides and incubated for 30 minutes at room temperature. The final
reaction was produced by immersing the sections in a solution of red substrate
h
for 15
minutes (Kim et al 2004). Lung tissue from a mummified porcine fetus infected with
PPV previously detected by immunofluorescence technique (FA) served as the positive
control.
Total DNA extracted using the Ultraclean Tissue DNA Isolation Kit
i
from 30mg
of aborted fetus lung was used as template in nested-PCR analysis. The PCR primers for
PPV were the same of those used by Soares et al. (1999). The amplifications were
performed in a 50μl reaction mixture containing 3mM MgCl2 for PPV, 1x PCR buffer,
0.2mM of each dNTP, 20pmol of each primer, and 2.5U of Taq DNA polymerase
(Cenbiot enzimas), at temperature of 55
o
C for PPV (Soares et al. 1999). The PCR
reactions were performed in triplicate in automated DNA thermal cycler
s
. Control DNA
from the reference strain for PPV, was included in each reaction. PCR products were
resolved on a 1.5% agarose gel in TBE buffer and visualized by ethidium bromide
staining. The diagnosis of swine abortion was made, based on the combination of
observed histopathological changes, microbiological findings and results from PCR and
IHC staining. An abortion was considered as bacterial etiology when a bacterial species
was isolated in pure culture from the fetal tissues in association with histopathological
lesions characterized primarily by neutrophilic infiltration and necrosis. The criteria
used to diagnose viral abortion was polymerase chain reaction assay (PCR) and/or
detection of viral antigen by immunohistochemistry. The diagnosis of PCV-2 was based
on the presence of multifocal myocarditis associated with a positive result in the
immunohistochemistry test. Diagnosis of PPV was made through PCR technique
associated or not associated with the presence of mononuclear infiltration in heart and
kidney. Abortions were considered to be idiopathic when no lesions or agents were
identified. Fetuses that had significant histology lesions, but infectious agents were not
isolated or identified were classified as abortion of unknown etiology.
A chi-square test for trend was done to verify if there was an association
between conclusive diagnostic and the number of fetuses submitted in each case. For
this, diagnostic results (response variables) were categorized in conclusive and
indeterminate and the number of fetuses (explanatory variable) was categorized in 1 to
≥ 4.
39
Results
From July 2005 to March 2007, samples from 117 aborted swine fetuses were
submitted from ten pig farms to the Laboratory of Veterinary Pathology at the Federal
University of Rio Grande do Sul, Southern Brazil. Most of porcine fetuses were from
State of Santa Catarina. The mean gestational age (±SD) was 103 days (±20).
Evidence for a specific cause of death was found in 30 out of 117 porcine fetuses
(25.5%). One out of 87 cases with no confirmed diagnosis had inflamatory lesions of
unknown origin. Overall, 14.5% (17/117) of the fetuses were infected solely with
porcine parvovirus (PPV) detected by nested PCR, of which one was confirmed by IHC.
Porcine circovirus type 2 accounted for 5.9% (7/117). Additionally, three of those
fetuses with PCV2 infection had also co-infection with PPV; overall, 17% (20/117) of
the fetuses were infected by a viral agent. Bacterial infection accounted for 5.1%
(6/117) of cases. The results of the survey are summarized in Table 2.
Significant gross lesions were found in six aborted swine fetuses which were
characterized by uni- or bilaterally ventricular dilatation and myocardial pale areas
(Figure 1) in the heart (n = 4); excessive thoracic fluid with fibrin exudation adhered in
the lung, liver and colon surfaces (n = 1) and well circumscribed whitish areas in the
skin of the periocular region, face, neck, scapula, and hindquarter (n = 1). Microscopic
lesions linked to infectious agent were observed in 12,8% (15/117) of the fetuses
analyzed, and were characterized by multifocal fibronecrosis and mononuclear cells
infiltrations (n = 7) in the heart (Figure 2); suppurative pleuritis and severe, multifocal
purulent interstitial bronchopneumonia (n = 4); mild, focal mononuclear dermatitis (n =
1); moderate, multifocal non-suppurative encephalitis (n=1); severe, multifocal
mononuclear nephritis (Figure 3) (n = 1), and diffuse pulmonary hemorrhage with
colonies of gram-negative coccobacilli bacteria associated with meconium and cellular
debris (Figure 4) within the bronchiole (n = 1). PCV2 was detected by IHC in seven out
of 117 cases of swine abortion. In samples from three of these fetuses, co infection with
PPV was confirmed by Nested-PCR. Both viruses were detected in fetuses at different
stages of gestation. Viral antigens of PCV2 were detected by IHC mainly in
macrophages and myocytes (Figure 5). Of the 20 fetuses in which PPV DNA was
detected, only one was positive on IHC procedures (Figure 5). The antigen was seen in
the pulmonary tissue which was characterized by a marked staining in the epithelial cell
of the bronchiole (figure 6). There was no evidence of PRRSV in any of the fetuses
examined by immunohistochemistry.
40
There was a linear association between number of submitted fetuses and
diagnostic success (p = 0.03), in which an increasing odds for conclusive diagnosis was
observed when the number o fetuses submitted in each case increased. There was 3.5
more chances for conclusive diagnosis when ≥4 fetuses were submitted comparing to 1
fetus.
Discussion:
The precise cause of swine abortion was found in 25.5% of cases, which is
similar with other swine abortion surveys (Holter et al 1976; Kirkbride et al 1978;
Maldonado et al 2005).
The present results indicate that PPV may be an important endemic agent
associated a reproductive failure in Southern Brazil. The detection of PPV in
mummified and stillborn fetuses was expected, since this infection is routinely
identified historically, in our country (Sobestiansky et al 2007). It is well know that the
most common consequences of PPV infection are fetal resorption in early gestation and
fetal mummification in the midgestation (William et al 1992). Numerous studies have
reported no significant histopathological changes in fetuses or piglets infected with PPV
(Mengeling 1975; Cultip et al 1975). However, in the present study, inflammatory
reaction characterized by non-suppurative myocarditis and mononuclear nephritis were
seen in two cases suggesting that the presence of lesion is dependent upon the age of the
fetus at the time of infection (Prozesky et al 1980). The present findings indicate that
PCR was more sensitive for the detection of PPV than immunohistochemistry in fetal
tissue making it useful in the routine diagnostic process. In addition, the easiness of
preparation of DNA probes for PCR compared with the generation of monoclonal
antibodies, combined with the increasing availability of probes and sequence databases,
ensures the expansion of this technique in diagnosis and research (Kim et al 2004).
Recently, PCV2 has been added to the list of virus which may cause
transplacental infection in sows (Pensaert et al 2004) and although PCV2 infection of
fetuses during pregnancy has been demonstrated experimentally, little is known about
PCV2 titer in fetuses under field conditions (Brunborg et al 2007). In our study, high
amounts of PCV2 antigen were found in seven out of 117 fetuses with myocardial
lesions characterized by multifocal fibronecrosis and infiltrations by mononuclear cells
suggesting that myocardium is a target tissue for PCV2 in porcine fetuses (Sanchez et al
2003) and should be collected for routine PCV2 testing. Additionally, porcine
41
parvovirus was demonstrated in the lungs of stillborn fetuses by PCR in three cases in
combination with PCV2. This synergistic action of PCV2 and PPV in aborted swine
fetuses had also been demonstrated in Germany (Alterr et al 2003) and has also
associated with naturally (Ellis et al 2000) and experimentally (Kennedy et al 2000)
SDMSD affected pigs. This co-infection could be expected, since both viruses are
endemic in swine population worldwide (Mengeling 1992, Allan et al 2000).
Prevalence studies from other countries have reported that the infection of PCV2
in stillbirths and abortion is less significant than infectious with PPV or PRRS virus
(Altherr et al 2003, Kim et al 2004, Lyoo et al 2001, Maldonado et al 2005). Porcine
reproductive and respiratory syndrome was not detected in the fetuses examined in the
present study and is consistent with previous reports that evidence of PRRS infection is
absent in Brazilians swine herds (Ciacci-Zanella et al 2004). Future studies might
utilize PCR for viral detection as PCR was more sensitive than IHC for detection of
PPV and may be for PRRS (Maldonado et al 2005).
In the present survey, porcine abortion associated with bacteria was observed in
six cases. Many species of bacteria have been associated with reproductive failure in
swine herds in the world (Mauch et al 2004, Yaeger 1996, On et al 2002, Hoffmann et
al 2002). Most bacterial infections are sporadic and may involve only one sow in a herd
(Kirkbride et al 1978). It was not possible to establish the route which the bacteria
usually invade the uteri but, it had been suggested that many of the organisms come
from the environment and enter the uteri by ascending genital or hematogenous routes
(Vannier 1999) leading to severe endometritis, placentitis, and abortion.
A strong association between conclusive diagnostic and the number of fetuses
submitted in each case suggest that it is important to send at least three or four porcine
fetuses for necropsy investigation as previously described (Long, 1986) in order to
increase diagnosis success.
In summary, the data presented indicated that PPV and PCV2 is an important
viral infectious agent associated with reproductive disorders leading to mummification
and fetal losses in Brazil.
42
Acknowledgement: The senior author wish to thank Steve Braswell, and Judith
Galeota for dedicated and expert technical contributions. This study was supported by
grants from the Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior (CAPES).
Sources and manufacturers:
a. Department of Veterinary Diagnostic and Production Animal Medicine, Iowa
State University, Ames, IA.
b. VMRD, Inc., Pullman, WA.
c. Animal and Plant Health Inspection Service. National Veterinary Services
Laboratories (NVLS). P.O. Box 844. Ames, Iowa 50010.
d. Sigma Chemical Co., ST Luis, MO.
e. Dako Tris Buffer Saline (TBS) solution, Dako Corp., Carpinteria, CA.
f. Biogenex Corporation
g. Alcaline phosphatase Kit (Dako Cytomation K0674)
h. BioPath Laboratories Inc: BP-600-FR
i. Mobbio Laboratories, Inc.
j. Eppendorf Mastercycler®, personal, Westbury, NY.
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48
Table 2
Diagnostic outcomes following the examination of 117 aborted porcine fetuses in
Southern Brazil
Classification N
o
of cases % of total
1.Causes determined
1.1 Infectious
Viral 21
Porcine parvovirus 17 14.52
Porcine circovirus type 2 04 3.42
Bacterial 06
Escherichia coli
03 2.56
Arcanobacterium sp 01 0.86
Actinobacillus suis
01 0.86
Erysipelothrix sp 01 0.86
Association 03
PCV2 + PPV 03 2.56
2. Not determined
Unknown 86 73.5
Infectious lesions 01 0.86
Total 117 100
49
Figuras
Figura 1. Infecção por PCV2. Feto suíno abortado. Coração. Áreas pálidas
no miocárdio.
Figura 2. Infecção por PCV2. Feto suíno abortado. Coração. Miocardite
não supurativa focal moderada. HE, obj. 20x.
50
Figura 3. Infecção por Parvovírus suíno. Natimorto. Rim, nefrite intersticial
mononuclear multifocal moderada.
Figura 4. Infecção por Actinobacillus suis. Feto suíno abortado. Pulmão.
Descamação celular e mecônio no interior de brônquio. Há grumos
bacterianos no interior de alvéolos. HE, Obj 40x.
51
Figura 5. Infecção pelo PCV2. Feto suíno abortado. Coração. Antígenos
virais de PCV2 fortemente marcados em vermelho. Imunoistoquímica,
fosfatase alcalina, obj. 20x.
Figura 6. Infecção pelo parvovírus suíno. Feto suíno mumificado. Pulmão.
Antígenos virais de parvovírus suíno no interior de células epiteliais de
brônquios. Imunoistoquímica, fosfatase alcalina, obj. 40x.
52
3.2 Artigo 2: “Co-infection by porcine circovirus type 2 and porcine parvovirus in
aborted fetuses and stillborn piglets in southern Brazil.”
53
54
55
56
57
58
3.3 Artigo 3: “Lesões de pele causadas por Erysipelothrix rhusiopathiae em um feto
suíno abortado.”
59
60
61
62
63
3.4. Artigo 4: “Escherichia coli O157:H7 – as a cause of abortion in swine.”
Caroline Argenta Pescador, Paulo Mota Bandarra, Luis Gustavo Corbellini,
David
Steffen, David Driemeier
1
1
Este artigo está em andamento e irá ser submetido à Journal of Veterinary Diagnostic
Investigation.
64
Abstract: Escherichia coli infections in swine occur worldwide and can be a major
economic significance. Enteritis and septicemia have been the most common
syndromes, while agalactiae and abortion occur less often. Here we report evidence of
of Escherichia coli serotype O157:H7 infection in two swine fetuses. Gross lesions
were red-yellowish fluid with fibrin exudation in the abdominal and thoracic cavities,
fibrin deposits on the serosa of liver, colon, and lungs, and petechial hemorrhages in the
pericardium. Microscopically, lesions were characterized by focally-extensive
suppurative pleuritis and fibrin-purulent interstitial bronchopneumonia in which
abundant gram-negative rods with morphology consistent with Escherichia coli were
present. Suppurative multifocal colitis, myocarditis and hepatitis were also observed.
Aerobic cultivation from samples of lung, liver, stomach contents, and thoracic fluid
revealed pure cultures of Escherichia coli. Escherichia coli serotype O157:H7 antigen
was detected by immunohistochemistry intravascular and in vessels of kidney, lungs
and lymph nodes and within leukocytes of the lung.
Key words: swine abortion, Escherichia coli, O157:H7, immunohistochemistry.
2
2
From the Department of Veterinary Pathology (Pescador, Bandarra, Driemeier) and Department of
Preventive Veterinary Medicine (Corbellini), Federal University of Rio Grande do Sul (UFRGS) Av.
Bento Goncalves 9090, 91540-000 Porto Alegre, RS, Brazil.
1
Corresponding Author: David Driemeier, Departamento de Patologia Clınica Veterinaria, Faculdade de
Veterinaria, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Avenida Bento Goncalves, n
0
9090, 91540-000
Porto Alegre RS, Brazil.
2
From the Department of Veterinary and Biomedical Science (Steffen). Veterinary Diagnostic Center.
University of Nebraska-Lincoln, P.O Box 82646, Fair Street and East Campus Loop, Lincoln, NE 68501-
2646, USA.
65
Introduction:
Enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) comprise a group of emerging
zoonotic pathogens of worldwide importance (Nataro et al 1998, Phillipis et al 2000).
The most prominent serotype within the EHEC group is O157:H7 which has been
responsible for several human outbreaks and numerous sporadic cases of hemorrhagic
colitis (HC) with potential complications such as hemolytic uremic syndrome (HUS),
which may lead to death (Levine 1987, Francis et al 1989, Blanco et al 2003). Young
children (0-4 years of age) and the elderly are particular risk groups (Karmali et al
1995).
E.coli O157:H7 is prevalent in the gastrointestinal tracts of cattle and other
ruminants (Chapman et al 1996, Kudva et al 1996, Elder et al 2000). Infections,
particularly with serogroup O157:H7, are associated with consumption of a variety of
food and water vehicles such as undercooked meat, including pork meat, unpasteurized
dairy products, vegetables, or water contaminated by ruminant feces (Doyle et al 1997,
Johnson et al 1999) Although ruminants to be a major reservoir for E. coli O157:H7,
these bacteria are carried by a variety of non-ruminant animals. Flies, wild birds,
turkeys, horses, dogs and pigs have all been found to carry E.coli O157:H7 (Booher et
al 2002). Escherichia coli serotype O157:H7 has been isolated from healthy swine in
Japan, The Netherlands, Sweden, Canada, Norway and the United States (Erikkson et al
2003, Feder et al 2003, Heuvelink et al 1999, Nakazawa et al 1999). Although the
prevalence of the organism in these studies is generally low (01. to 6%), a family
outbreak associated with consumption of dry fermented salami made with pork meat
only was reported (Conedera et al 2007). In Chile, the prevalence of E.coli O157:H7
reported from pigs (10.8%) was greater than that reported from cattle (2.9%),
suggesting that swine may be an important source of this organism in some countries
(Borie et al 1997).
Several virulence factors are produced by EHEC, including toxins known as
Shiga-like or Vero toxins I and II (Pai et al 1986). Studies have indicated that Stx2 and
Stx2c, encoded by different genotypic subtypes of stx2, have been associated with more
severe human diseases, while the stx2d genotype is apparently of lesser clinical
significance (Friederich et al 2002). Several other virulence factors involved in the
pathogenicity of STEC have been described. The intimin encoded by the eae gene,
located in the chromosomal locus of enterocyte effacement, is responsible for the
66
intimate adherence of bacteria to enterocytes, which causes attaching and effacing
lesions (Nataro et al 1998).
In Brazil, non-O157:H7 STEC strains have also been more frequently isolated
from human infections; and serotypes O26:H11, O103: H2, and O111: H8 accounted
for most of the cases (Guth et al 2002, Guth et al 2005, Vaz et al 2004). A limited
information about human outbreaks associated with E. coli serotype O157:H7 has been
reported in this country (Vaz et al 2006). This report describes the association of
Escherichia coli serotype 0157:H7 with swine abortion in Southern Brazil.
Materials and Methods:
In August 2005, two Large White cross Landrace aborted near-term porcine
fetuses from a litter of twelve were submitted to the Laboratory of Veterinary Pathology
- UFRGS for necropsy investigation. At necropsy, samples of brain, heart, lung, liver,
kidney, skeletal muscle, lymph nodes, thymus, spiral colon and spleen were collected,
fixed in 10% buffered formalin, and processed by standard methods for histologic
examination. Selected sections were stained with Gram Brown-Hopps (Arrington,
1992). Samples of lungs, liver, thoracic fluid and stomach contents were cultured for
aerobic bacteria on 5% sheep blood and MacConkey agar. Attempts at detection of
spirochetes in kidney smears through the use of multivalent antibody conjugated with
fluorescein
a
at 1:20 dilution was employed for diagnosis of Leptospira sp (Miller et al
1989). Tissue sections of lung, kidney and lymph nodes were examined by
immunohistochemistry (IHC). For IHC, 4μm paraffin sections were deparaffinized and
rehydrated. Sections were incubated with citrate buffer, pH6.0 in a microwave oven at
750 W, for 20 minutes for antigen retrieval and then blocked for 10 min at room
temperature with powerblock
b
at 1:10 dilution. Sections were then incubated with rabbit
anti-Escherichia coli serotype 0157:H7 polyclonal antibody
c
at 1:1000 dilution for 30
minutes at room temperature. A streptavidin-biotin alkaline phosphatase kit
d
was
employed for 10 min each as the IHC detection system. Sections were then washed in
TBS and the reaction was “visualized” by applying fast red
e
for 15 minutes. Finally, the
sections were lightly counterstained with Mayer’s haematoxylin for light microscopic
examination. Intestine from a swine inoculated with Escherichia coli O157:H7 served
as positive control. Additionally, sections of the lung and heart were also stained by
IHC for porcine parvovirus virus
f
(PPV), porcine reproductive and respiratory syndrome
67
virus
f
(PRRSV) and porcine circovirus type 2
g
(PCV-2) antigens as previously
described (Sorden et al 1999, Boenisch 2001, Kim et al 2004).
Results:
Abortion occurred in the sow’s third pregnancy, at approximately 103 days of
gestation. The sow had been vaccinated against Leptospira spp., porcine parvovirus
virus (PPV), Erysipelothrix sp., Mycoplasma sp., and Haemophilus parasuis before
breeding. Besides the abortion, no clinical illness was seen in the sow. Fetuses
submitted had 29 and 31cm crown-rump length. Abdomen of fetuses was moderately
distended. Upon opening, the abdominal and pleural cavities showed an excessive
amount of red-yellowish fluid with numerous chunks of matted fibrin. Fibrin deposits
adhered to the liver, colon, and lung surfaces (Figure1A), and petechial hemorrhages in
the pericardium were also observed. Microscopically, there was interstitial
bronchopneumonia composed by a severe infiltration of neutrophils throughout the
alveolar lumens (Figure 1B) and in many bronchus and bronchioles (Figure 1C). In
some areas, abundant fibrin exudation was mixed with suppurative infiltrate.
Aggregates of neutrophils were also commonly scattered throughout the pleural surface
(Figure 1D). Occasional small aggregates of meconium in airways were present.
Additionally, mild suppurative multifocal colitis, myocarditis and hepatitis were seen.
Lung sections showed numerous Gram negative rods within the inflammatory infiltrate
and in the blood vessels. Escherichia coli was recovered in pure culture from samples of
lung, liver, thoracic fluid, and stomach content on MacConkey agar. Morphologically,
E. coli colonies measured about 1-2mm in diameter, were smooth, shiny low-convex,
and pink colored. Direct immunofluorescence test for Leptospira sp. was negative.
Large amounts of Escherichia coli O157:H7 antigens were observed in the cytoplasm
from intralesional neutrophils located in the bronchus, bronchioles (Figure 1E) and
pleural surface. The most intense anti-E.coli immunostaining was observed in the lung,
lymph nodes (Figure 1F), and kidney vessels. Immunohistochemistry for PPV, PCV2
and PRRSV were negative.
68
Discussion:
This report indicates that Escherichia coli O157:H7 may be a potential cause of
swine abortion. Previous studies suggest that pigs are biologically competent host of E.
coli O157:H7 and the majority of swine herds do not come in contact with an infectious
dose of E. coli O157:H7. Although, pigs are not considered to be a major source of
VTEC O157 (Wasteson, 2001) previous studies indicate that pork products should not
be neglected in E. coli O157 outbreaks investigations (Conedera et al 2007). In the
Netherlands, surveillance of laboratory confirmed VTEC infections yielded an annual
incidence of 0.25 cases per 100,000 inhabitants, with 40% of patients being hospitalized
(Van Duijnhoven et al 2002). In the United State, Escherichia coli O157:H7 causes
73,000 illnesses annually (Rangel et al 2005). Additionally E. coli O157:H7 was
responsible for an outbreak involved 158 people (mostly children) in Spain due to pork
and contained other meat sources (Blanco et al 2003).
Bacterial infections can enter into the sow by many routes including artificial
insemination, urogenital infection or from insufficient vulvar hygiene through vagina
and cervix (Carabin et al 1996). Except during estrus and parturition, some factors keep
the bacterial count ratio from 1:10 to 1:100 between the caudal and cranial vagina
(Vlcek et al 1980, Berner 1984). An increase in cranial vaginal bacterial count has been
show at estrus and parturition and a higher caudal vaginal bacterial charge at the time of
artificial insemination has been considered as a risk factor for uterine contamination
(Carabin et al 1996). The infection may reach the placenta by the hematogenous route
or from the vagina-uterus, reaching the fetus through the umbilical vein or amniotic
fluid (Ho et al 2006). Although the placenta has not been submitted for investigation, an
ascending infection of the genital tract cannot be excluded because the bacterium was
found in various fetal tissues, suggesting septicemia. Previous studies indicate that
Escherichia coli O157:H7 infections in pigs most commonly manifested as syndromes
associated with enteritis and hemorrhagic colitis with areas of superficial necrosis
(Henton et al 1997; Francis et al 1986; Mead et al 1998). In the present study, the most
important microscopic finding was bronchopneumonia followed by pleuritis, which
could be caused by inhalation of amniotic fluid containing bacteria, probably in
association with fetal hypoxia (Alonso-Spilsbury et al 2005). In many countries,
verotoxin-producing Escherichia coli O157:H7 has been frequently isolated from cattle,
sheep and feedstuffs. Although most E.coli O157 strains from Europe (Thomas et al
69
1996), North America (Cimolai et al 1994, Slutsker et al 1997), and Japan (National
institute, 1996) have been reported to produce Shiga toxin 2, it was not possible to
clearly establish the specific role for toxins in the pathogenis of abortion. The
identification of organism within the lesion by immunohistochemistry clearly relates
Escherichia coli O157:H7 with abortion in these piglets.
Acknowledgement: The authors sincerely thanks Dr. Rodney A. Moxley, Department
of the Veterinary and Biomedical Science, University of Nebraska for supplying the
primary antibody anti-Escherichia coli serotype 0157:H7, the pathologist Dr. Bruce
Brodersen of Veterinary Diagnostic Center, University of Nebraska for your invaluable
help and Steve Braswell of the Veterinary Diagnostic Center, University of Nebraska
for excellent technical assistance in immunohistochemical staining. This work was
supported by grants from the Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nivel
Superior (CAPES).
Sources and manufacturers:
a. Animal and Plant Health Inspection Service. National Veterinary Services
Laboratories (NVLS). P.O. Box 844. Ames, Iowa 50010.
b. Biogenex Corporation
c. Department of Veterinary and Biomedical Science. University of Nebraska,
Lincoln, NE.
d. Dako LSAB+AP 2 kit, Dako Corp., Carpinteria, CA.
e. BioPath Laboratories, Inc.
f. VMRD, Inc., Pullman, WA.
g. Department of Veterinary Diagnostic and Production Animal Medicine, Iowa
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Figura 1. Aborto suíno por Escherichia coli O157: H7. A. Feto suíno. Cavidade
torácica e abdominal. Líquido de coloração vermelho-amarelada e deposição de
fibrina no parênquima do pulmão, fígado e cólon. B. Pulmão. Pneumonia
supurativa focal moderada com presença de mecônio. HE, obj. 40x. C. Pulmão.
Bronquite supurativa focal acentuada. HE, obj. 40x. D. Pulmão. Pleurite
supurativa difusa acentuada. HE, obj. 20x. E. Pulmão. Antígenos viras de E. coli
O157: H7 no interior de neutrófilos. Imunoistoquímica, fosfatase alcalina, obj.
40x. F. Linfonodo. E. coli O157: H7 fortemente marcadas em vermelho.
Imunoistoquímica, fosfatase alcalina, obj.100x.
A
B
C
D
E
F
75
4. DISCUSSÃO E CONCLUSÕES
4.1 Levantamento das causas de aborto suíno
Causas de aborto foram determinadas em 25,5% dos casos, similar ao
encontrado em outros estudos (HOLTER et al., 1976; KIRKBRIDE et al., 1978;
MALDONADO et al., 2005). Os resultados desse levantamento sugerem que o
parvovirus suíno (PPV) seja uma importante causa de mumificação fetal e
natimortalidade em fêmeas suínas no sul do Brasil, sendo encontrado em tecidos fetais
em 14,5% dos casos. Estudos de causa de aborto têm demostrado uma freqüência de
infecção por PPV entre 4,9 a 29,2% (KIRRBRIDE et al., 1978; BROLL et al., 1993).
Neste levantemento, provavelmente a freqüência de infecção observada esteja sendo
subestimada tendo em vista que o número de fetos analisados por granja foram baixos.
Estudos têm demostrado que lesões histopatológicas significativas são dificilmente
observadas em fetos infectados experimentalmente por parvovírus suíno (CULTIP et
al., 1975). Em contraste, Lenghaus et al (1978) observou necrose celular e corpúsculos
de inclusão no fígado, pulmão, rim e cerebelo de fetos inoculados em 35, 50 e 60 dias
de gestação. Estes achados não foram observados no presente estudo. Entretanto,
infiltrados inflamatórios mononucleares em fragmentos de coração e rim foram
visualizados em dois casos, sugerindo que a presença de lesões inflamatórias está
diretamente relacionada com a idade e o tempo em que o feto é infectado pelo agente
(PROZESKY et al., 1980). Lesões microscópicas são mais pronunciadas em fetos
suínos inoculados aos 71 dias de gestação, sendo muito mais severas quando inoculadas
em 79 a 80 dias, e ausente em fetos inoculados aos 96 dias de idade gestacional
(PROZESKY et al., 1980). Fetos de idade gestacional mais avançada são menos
susceptíveis a infecção por PPV sendo isso explicado pela ausência de lesões vasculares
encontradas em estudos anteriormente realizados (PROZENSKY et al., 1980). Sendo
assim, sugere-se que as lesões histológicas observadas nos dois produtos fetais do
presente estudo tenham sido estabelecidas em um contato prévio com o vírus antes do
período de imunocompetência fetal (65-75 dias) resultado assim, no aparecimento das
lesões microscópicas acima mencionadas.
Diversas técnicas de diagnóstico têm sido realizadas com o objetivo de detectar
o PPV em tecidos fetais (MENGELING et al., 1976; CAO et al., 2005; RITZMANN et
76
al., 2005). No presente estudo, a técnica de PCR demostrou resultados mais satisfatórios
que a técnica de imunoistoquímica na detecção de PPV. Este resultado já era esperado,
tendo em vista que trabalhos prévios apontam a PCR como método de diagnóstico mais
sensível na detecção de PPV que o isolamento viral e a imunohistoquímica
(MENGELING et al., 2000; KIM et al., 2004). Outro fator que contribui para este
aumento na sensibilidade é o fato de que na PCR a quantidade de tecido utilizada é
maior, enquanto que na imunoistoquímica o tecido utilizado fica limitado a um corte
histológico de 5µm diminuíndo assim as chances de se obter um resultado satisfatório
(KIM et al., 2004).
O Circovírus Suíno tipo 2 (PCV2), recentemente descoberto como causa de
falhas reprodutivas em fêmeas suínas, foi observado em 5,9% dos fetos analisados. Este
resultado difere ao encontrado por Kim et al. (2004), Ritzmann et al. (2005) e Lyoo et
al. (2001) que em um estudo com fetos abortados observaram uma prevalência de
PCV2 em 13,1%, 27,1% e 46,5% respectivamente. Estudos recentes demostram que a
infecção por PCV2 cursa com aborto, mumificação fetal e natimortalidade em fêmeas
suínas (KIM et al., 2004; HARDING 2004). No presente estudo, a detecção de
antígenos de PCV2 em suínos natimortos sugere que este agente possa estar presente em
grande quantidade dentro de fetos infectados no útero e que a transmissão vertical pode
ser uma importante forma de infecção. Adicionalmente, a transmisão transplacentária
por PCV2 em porcas tem sido relatada (LADEKJAER-MIKKELSEN et al., 2001). A
patogênese de infecção por PCV2 em fêmeas suínas prenhas parece ser diferente da
infecção pelo vírus da sindrome reprodutiva e respiratória suína (PRRSV), na qual o
vírus atravessa a placenta somente na fase final da gestação (CHRISTIANSON et al.,
1993). Fetos infectados por PRRS podem apresentar áreas de edema e hemorragia que
variam de 1-2cm no cordão umbilical e que microscopicamente correspondem a áreas
de arterite hemorrágica necrosante (LAGER et al., 1996). No presente estudo, lesões
similares ás acima mencionadas não foram observadas em nenhum dos fetos analisados
e o teste de imunoistoquímica foi negativo em todos os fragmentos de pulmões fetais
analisados. Este resultado reforça o que foi previamente mencionado por Ciacci-Zanella
et al. (2004) em que evidências da presemça de PRRSV no Brasil não foram ainda
observadas.
Inúmeros agentes bacterianos como Leptospira sp.; Escherichia coli, Erysipela
rhrusiopathiae, Mycobacterium avium, Staphylococcus sp., Streptococcus sp.,
Arcobacter sp., Corynebacterium sp., Actinobacillus suis dentre outros têm sido
77
apontados como causa de falhas reprodutivas em fêmeas suínas (ELLSWORTH et al.,
1979; YAEGER et al., 1996; ON et al., 2002; HOFFMANN et al., 2002; MAUCH et
al., 2004). Levantamentos de causa de aborto em suínos relatam uma prevalência de
8,2% a 16,5% por agentes bacterianos (BROLL et al., 1993; KIRKBRIDE et al., 1978).
No presente estudo, o critério utilizado para definir aborto de origem bacteriana baseou-
se no diagnóstico histopatológico através da visualização de lesões inflamatórias
supurativas em amostras de tecidos fetais e crescimento puro e ou abundante da bactéria
envolvida como já foi previamente descrito por Holler et al., 1994. Dentre os agentes
baterianos isolados (Tabela 2), Escherichia coli O157: H7 apresenta uma importância
bastante significativa dentro do isolado em fetos suínos, devido ao freqüente relato de
infecção em humanos (MEAD et al., 1998). Em cada ano nos Estados Unidos, é
estimado que E. coli O157: H7 cause aproximadamente 2.168 hospitalizações e 61
mortes de seres humanos (MEAD et al., 1999), sendo apontada, também, como uma
importante causa de falha renal aguda em crianças (NEILL et al., 1987; SIEGLER et
al., 1994). Ruminantes e em particular bovinos têm sido considerados os principais
reservatórios de verotoxina Escherichia coli O157 (VTEC), sendo o alimento de origem
bovina como, por exemplo, carne e produtos lácteos os mais freqüentemente associados
a epidemias (GRIFFIN et al., 1991). Embora suínos não sejam considerados a maior
fonte de infecção pela VTEC O157 (WASTESON, 2001), estudos anteriores indicam
que produtos suínos não devem ser negligenciados na investigação de epidemias
(CONEDERA et al., 2007). No presente caso, não foi possível estabelecer a porta de
entrada ao trato genital pela E.coli O157: H7 causando o quadro de abortamento.
Entretanto, rotas de infecção como inseminação artificial, infecção urogenital ou higiene
vulvar insuficiente podem estar relacionadas (CARBIN et al., 1996). A visualização de
lesões fetais caracterizadas por pleurite e broncopneumonia supurativa no feto suíno
abortado, sugere um quadro de hipóxia fetal levando a inalação de líquido aminiótico
contendo a bactéria (ALONSO-SPILSBURY et al., 2005).
Erysipelothrix sp também foi isolada de um feto suíno abortado que apresentava
lesões macroscópicas e microscópicas de pele. Infecções por Erysipelothrix sp têm sido
demostradas como causa de aborto em fêmeas suínas em final de gestação (KEMENES
et al., 1971), cujos sinais clínicos caracterizados por apatia, anorexia, febre e descargas
vulvares (HOFFMANN et al., 2002) são freqüentes. No presente caso, lesões
microscópicas caracterizadas por perivasculite mononuclear foram os achados mais
significativos, sendo indicativos de infecção por Erysipelothrix rhusiopathiae (WOOD
78
et al., 1999). A presença de lesões de pele em produtos fetais tem sido fortemente
associada a infecções micóticas, como resultado do contato da pele ao líquido
aminiótico contaminado por fungos (MILLER et al., 1977). Entretanto no presente caso,
estruturas de imagem negativa, semelhantes a hifas e o cultivo micológico foram
negativos. O diagnóstico baseou-se nos achados macroscópicos e microscópicos
associado ao crescimento puro de E. rhusiopathiae em amostras de pele, pulmão, fígado
e conteúdo do estômago.
Do total de 117 fetos analisados, 86 (73,5%) tiveram diagnóstico indeterminado.
Este resultado reforça a idéia de que somente 30% a 40% dos casos apresentam um
diagnóstico etiológico definitivo (BARLOW, 1998). A análise estatística revelou uma
forte associação entre o número de fetos enviados com o diagnóstico definitivo. Ficou
visualizado que as chances de se obter um diagnóstico definitivo aumentam em 3,47
vezes quando enviados quatro ou mais fetos suínos abortados para a análise, reforçando
a importância de envio de mais de um produto de abortamento para aumentar as chances
de sucesso no diagnóstico.
4.2 Co-infecção entre Circovírus suíno tipo 2 (PCV2) e Parvovírus suíno (PPV) em
fetos suínos abortados
Co-infecção entre PCV2 e PPV foi observada em 2,5% dos fetos suínos
analisados, sendo similar ao encontrado por Altherr et al. (2003). Estudos recentes têm
demonstrado a presença de PPV em suínos infectados naturalmente por PCV2 (ALLAN
et al., 1999) em casos de SDMS.
Embora a SDMS tenha sido recentemente observada em rebanhos suínos de todo
mundo, problemas reprodutivos caracterizados por aborto, mumificação fetal associado
a presença de lesões cardíacas tem sido relatada com certa freqüência (WEST et al.,
1999; JANKE 2000; OHLINGER et al., 2000; O’CONNOR et al., 2001). Lesões
cardíacas de fetos suínos abortados infectados por PCV2 são caracterizadas por
dilatação ventricular uni ou bilateral e áreas pálidas no miocárdio que
microscopicamente correspondem a extensas áreas de necrose e degeneração de
cardiomiócitos associados a intenso infiltrado inflamatório composto por linfócitos,
plasmócitos e macrófagos (WEST et al., 1999). No presente estudo, lesões similares as
acima mencionadas foram observadas em sete produtos fetais analisados, nos quais
grande quantidade de antígenos virais foi observada no coração pela técnica de
79
imunoistoquímica, sugerindo que a distribuição do vírus está relacionada com células de
alta taxa mitótica, semelhante ao que ocorre em miócitos cardíacos de fetos (SANCHÉZ
et al., 2003). Em contraste, em um recente estudo não conseguiram detectar antígenos
de PCV2 através da técnica de imunoistoquímica e hibridização in situ no coração de
fetos suínos abortados, sendo esta marcação observada em órgãos linfóides (Park et al.
2005). Segundo os autores, a variedade nas amostras de PCV2, diferenças entre o
período de imunocompetência fetal e tempo de infecção, dentre outros fatores, são as
principais razões observadas que podem estar relacionadas à diferença de marcação.
Adicionalmente, a presença de lesões no miocárdio parece estar relacionada com o
estabelecimento da infecção no começo da gestação (PARK et al., 2005).
Muitos autores relatam que a SDMS seja causada pela co-infecção do PCV2
com outros patógenos, como o PPV (KIM et al., 2003), PRRS (ROVIRA et al., 2002) e
torque teno vírus (TTV) (KARAKOWKA et al., 2008; MARTIN-VALLS et al., 2008).
Acredita-se que estes vírus, por estimularem a migração e proliferação de células
histiocíticas, bem como a síntese de DNA e citocinas, propiciariam as condições ideais
para o desenvolvimento de PCV2 (KIM et al., 2003). Reproduziu-se o quadro típico de
SDMS em leitões gnotobióticos infectados com PCV2 e co-infetados por PPV (ALLAN
et al., 1999; KRAKOWKA et al., 2000; KIM et al., 2003). Por outro lado, em um outro
estudo experimental, não houve reprodução dos sinais clínicos e das lesões anátomicas e
histopatológicas características associadas à SDMS em leitões SPF (“specific pathogen-
free”) que receberam colostro, infectados experimentalmente com PCV-2 e co-
infectados com PPV (FERNANDES et al., 2003).
No presente estudo três fetos suínos infectados por PCV2 apresentaram co-
infecção com PPV, sendo que as lesões observadas microscopicamente foram mais
severas que em fetos infetados somente por PCV2. A co-infecção agrava as lesões
(FENAUX et al., 2002). Acredita-se que por estimular a produção de histiócitos, o PPV
criaria condições ideais para a replicação do PCV2, devido ao aumento da síntese de
DNA (KIM et al., 2003).
Em casos de SDMS é comum encontrarmos, além do PCV2, outros agentes. Em
um estudo retrospectivo na Coréia, com 133 animais que apresentavam emagrecimento
pós-desmame, todos estavam infectados por PCV2, porém só em 20 animais foi
detectado apenas PCV2; 43 animais estavam infectados, concomitantemente com o
Haemophilus parasuis, com PRRS, Actinobacillus pleuropneumoniae e com o vírus da
Influenza Suína – SIV (KIM et al., 2002). Adicionalmente co-infecção com
80
Mycoplasma hyopneumoniae, Escherichia coli, Salmonella sp., Staphylococcus sp.
(SORDEN et al., 2000) e, menos frequentemente Pneumocystis carinii (SANCHES et
al., 2006; CLARK 1997) e Cryptosporidium parvum (NUNES et al., 2003) também têm
sido relatadas. No presente estudo, PRRSV não foi observado em nenhum produto fetal
analisado, fortalecendo a idéia de que este vírus não está presente no Brasil (CIACCI-
ZANELLA et al., 2004). Edema de mesocolon, lesão observada em infecções por
Escherichia coli, foi visualizada em dois fetos suínos abortados em associação com
PCV2, a qual isolou-se em cultura pura a partir de amostras de fígado, pulmão e
conteúdo do estômago, sugerindo que PCV2 possa ter contribuído para estas lesões,
uma vez que o vírus causa dano vascular (KENNEDY et al., 2000).
81
4.3 CONCLUSÕES
O PPV foi observado em 14,5% dos casos sendo considerado um importante
agente etiológico como causa de mumificação fetal e natimortalidade em fetos suínos no
Sul do Brasil.
Os resultados deste estudo apontam a consistente associação entre PCV2 e PPV
em fetos suínos abortados confirmando o aparente sinergismo destes dois vírus
causando severa lesão no miocárdio de fetos abortados.
O coração foi o órgão que obteve melhor marcação de imunoistoquímica para
PCV2 em fetos suínos abortados, seguido de órgãos linfóides, sugerindo que o coração
é o órgão alvo onde ocorre a replicação viral.
O PRRS não foi identificado em nenhum produto fetal analisado reafirmando a
hipótese de que este vírus não esteja presente no Brasil.
Agentes bacterianos com Escherichia coli O157:H7 e Erysipelothrix sp dentre
outros devem ser considerados como causa de aborto em suínos no Sul do Brasil.
82
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