( PDF ) Estudo fitoquímico e avaliação biológica de Swartzia apetala var. glabra

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ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DE Swartzia

apetala VAR. GLABRA

Marcelo Francisco de Araújo

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO

CENTRO DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA

CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ

AGOSTO de 2007

ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DE Swartzia

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apetala VAR. GLABRA

Marcelo Francisco de Araújo

Tese apresentada ao Centro de

Ciências e Tecnologias da

Universidade Estadual do Norte

Fluminense Darcy Ribeiro, como

parte das exigências para

obtenção do título de Mestre em

Ciências Naturais.

Orientadora: Prof. Dra. Leda Mathias

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO

CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ

AGOSTO de 2007

ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DE Swartzia

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FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada pela Biblioteca do CCT / UENF

39/2007

apetala VAR. GLABRA

Araújo, Marcelo Francisco de

Estudo fitoquímico e avaliação biológica de Swartzia apetala var.

glabra / Marcelo Francisco de Araújo. – Campos dos Goytacazes,

2007.

xvi, 168 f. : il.

Dissertação (Mestrado em Ciências Naturais) --Universidade

Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Centro de Ciência

e Tecnologia. Laboratório de Ciências Químicas. Campos dos

Goytacazes, 2007.

Orientadora: Leda Mathias.

Co-orientadores: Ivo José Curcino Vieira e Raimundo Braz-Filho

Área de concentração: Química de produtos naturais

Inclui bibliografia

1. Swartzia apetala 2. Artemia salina 3. DPPH 4. Atividade

antifúngica l. Universidade Estadual do Norte Fluminense

CDD 547.7

Marcelo Francisco de Araújo

Tese apresentada ao Centro de

Ciências e Tecnologias da

Universidade Estadual do Norte

Fluminense Darcy Ribeiro, como

parte das exigências para

obtenção do título de Mestre de

Ciências Naturais.

COMISSÃO EXAMINADORA:

______________________________________________________________

Prof. Mário Geraldo de Carvalho (D. Sc., Química Orgânica) - UFRRJ

_______________________________________________________________

Prof. Carlos Roberto Ribeiro Matos (D. Sc., Química Orgânica) – UENF

_______________________________________________________________

Prof. Olney Vieira da Motta (D. Sc., Biociências e Biotecnologia) – UENF

_______________________________________________________________

Prof.ª Leda Mathias (D. Sc., Química de Produtos Naturais) – UENF

(Orientadora)

“Os químicos são uma estranha classe de mortais, impelidos por um impulso quase que insano

a procurar seus prazeres em meio a fumaça e vapor, fuligem e chamas, venenos e pobreza, e,

no entanto, entre todos esses males, tenho a impressão de viver tão agradavelmente que

preferiria morrer a trocar de lugar com o rei da Pérsia”.

Johanm Joachim Becher, Physica Subterrânea (1667).

AGRADECIMENTOS

Quero deixar a sicera gratidão a todos que colaboraram de uma certa

forma na produção deste trabalho.

A Deus por iluminar minha vida e me dar forças para suportar os

obstáculos do dia-a-dia

Aos meus pais in memorian Francisco Elias de Araújo e Maria Silva de

Araújo, por sempre me implantarem o interesse no estudo

A minha irmã Márcia Araújo de Saavedra pelas palavras de incentivo e

compreensão nos momentos difíceis

A minha noiva Débora pela amizade, carinho, companheirismo e

paciência

A professora Raquel pela amizade, carinho e pelos ensinamentos

A professora Leda Mathias pela amizade, paciência e pelas instruções

valiosas que somaram no meu conhecimento e prazer pela pesquisa

Ao professor Ivo pela amizade e pelas colaborações valiosas durante o

trabalho

Ao professor Carlos pelas valiosas ajudas, idéias e amizade

Ao professor Raimundo Braz pela ajuda na elucidação dos espectros

Ao professor Olney Vieira da Motta pela colaboração e ensinamentos em

microbiologia

Aos amigos que compõe o grupo de pesquisa de produtos naturais e

que fazem a rotina do laboratório ser menos estressante, Aluan, Cecília, Elaine,

Graziela, Gustavo, Ildomar, Jucimar, Lanamar, Lara, Leonardo, Luis Fernando,

Márcia, Moema, Vinícius, Virginia e Wagner

A amiga Luisa companheira desde a graduação

Aos técnicos do LCQUI Marta e Roberto pelos espectros de IV e

RMNAos técnicos do LSA Lurdes e Gina pela ajuda nos ensaios antifúngicos

Ao professor Luciano Canellas do lab. de análises de solos CCTA pela

ajuda nas análises estatísticas e por liofilizar algumas amostras

SUMÁRIO

Pág.

Lista de Tabelas...............................................................................................IV

Lista de Esquemas...........................................................................................VI

Lista de Figuras................................................................................................VII

Lista de Abreviaturas e Símbolos.....................................................................XI

Resumo............................................................................................................XIII

Abstract.............................................................................................................XV

Introdução.........................................................................................................1

Referências Bibliográficas...........................................................................3

Capítulo I: Revisão da Literatura.......................................................................4

1.1. A Família Fabaceae..............................................................................4

1.2. Divisão Taxonômica..............................................................................4

1.3. O gênero Swartzia.................................................................................6

1.4. A espécie Swartzia apetala...................................................................11

1.5. Considerações sobre os metabólitos secundários encontrados gênero

Swartzia................................................................................................12

1.5.1. Saponinas..................................................................................12

1.5.2. Flavonóides................................................................................14

1.5.3. Isoflavonóides............................................................................16

1.6. Referências Bibliográficas.....................................................................17

Capítulo II: Extração, Fracionamento e Isolamento das substâncias................21

2.0. Constituintes químicos isolados das folhas e madeira de Swartzia

apetala..................................................................................................21

2.1. Materiais e Reagentes utilizados...........................................................24

2.2. Procedimento experimental...................................................................25

2.2.1. Levantamento bibliográfico.........................................................25

2.2.2. Material botânico: coleta e identificação.....................................25

2.2.3. Secagem e moagem do material vegetal...................................25

2.2.4. Preparação dos extratos brutos..................................................25

2.2.4.1. Folhas............................................................................25

2.2.4.2. Madeira..........................................................................26

2.2.5. Testes químicos..........................................................................27

2.2.5.1. Teste para saponinas ...................................................27

Pág.

VII

2.2.5.2. Teste para flavonóides..................................................28

2.2.6. Reveladores................................................................................28

2.2.7. Fracionamento dos extratos brutos e purificação das

Substâncias.................................................................................29

2.2.7.1. Fracionamento do extrato metanólico das folhas de

S. apetala........................................................................29

2.2.7.2. Fracionamento do extrato hexânico da madeira de

S. apetala........................................................................31

2.3. Referências bibliográficas.......................................................................33

Capítulo III: Resultados e Discussão.................................................................34

3.1. Determinação Estrutural dos Constituintes Químicos Isolados de Folhas

de Swartzia apetala................................................................................34

3.1.1. Determinação estrutural da substância SAFM-01..........34

3.1.2. Determinação estrutural da substância SAFM-02..........53

3.1.3. Determinação Estrutural da substância SAFM-03..........71

3.1.4. Determinação estrutural da substância SAFM-04...........78

3.2. Constituintes Químicos Identificados na Madeira de S. apetala............95

3.2.1. Determinação estrutural da substância SAMH-01...........96

3.2.2. Determinação estrutural da substância SAMH-02.........105

3.2.3. Determinação estrutural da substância SAMH-03.........115

3.2.4. Determinação estrutural da substância SAMH-04.........123

3.2.5. Determinação estrutural da substância SAMH-05.........129

3.3. Constantes Físicas e Dados Espectroscópicos das Substâncias

Isoladas......................................................................................................139

3.4. Referências bibliográficas....................................................................145

Capítulo IV: Ensaios Biológicos.......................................................................147

4.0. Introdução............................................................................................147

4.1. Avaliação do Potencial Antioxidante....................................................148

4.1.1. Materiais e reagentes utilizados....................................150

4.1.2. Procedimento experimental...........................................151

4.1.3. Resultados e discussão.................................................153

4.2. Bioensaio de letalidade contra as larvas de Artemia salina Leach .....155

4.2.1. Materiais e Reagentes utilizados.....................................156

Pág.

4.2.2. Procedimento Experimental.............................................156

VIII

4.2.3. Resultados e discussão...................................................157

4.3. Avaliação da atividade antifúngica.......................................................158

4.3.1. Fungos.............................................................................159

4.3.2. Materiais e Reagentes utilizados.....................................159

4.3.3. Procedimento Experimental.............................................160

4.3.4. Resultados e discussão...................................................161

4.4. Referências bibliográficas....................................................................165

Conclusões......................................................................................................168

Lista de Tabelas

Pág.

Tabela 1 - Substâncias isoladas de espécies de Swartzia................................7

Tabela 2 - Classificação botânica da espécie Swatzia apetala Raddi

var. glabra........................................................................................11

Tabela 3 - Dados espectrais de RMN

C e

H da saponina SAFM-01

em Py-d

...........................................................................................37

Tabela 3’- Dados espectrais da unidade glicosídica da saponina SAFM-01....38

Tabela 4 - Dados espectrais de RMN

C e

H da saponina SAFM-02

em CD

OD.......................................................................................55

Tabela 4’ - Dados espectrais das unidades glicosídicas da saponina

SAFM-02........................................................................................56

Tabela 5 - Dados espectrais de RMN

C e

H do flanonóide SAFM-03

em CD

OD......................................................................................73

Tabela 6 - Dados espectrais de RMN

C e

H do flanonóide SAFM-04

em CD

OD.......................................................................................80

Tabela 6’ - Dados espectrais das unidades glicosídicas do flanonóide

SAFM-04.........................................................................................81

Tabela 7 - Dados espectrais de RMN

C e

H do estilbeno SAMH-01

em CDCl

.........................................................................................97

Tabela 8 - Dados espectrais de RMN

C e

H da flavanona SAMH-02

em CDCl

........................................................................................108

Tabela 9 - Dados espectrais de RMN

C e

H do pterocarpano SAMH-03

em CDCl

........................................................................................117

Tabela 10 - Dados espectrais de RMN

C do triterpeno SAMH-04

em CDCl

........................................................................................124

Tabela 11 - Dados espectrais de RMN

C dos esteróides SAMH-05a/b/c

em CDCl

......................................................................................131

Tabela 12 - Valores de CE

e dados estatísticos dos extratos de S. apatala.

Rutina foi usado como padão.....................................................154

Tabela 13 - Resultados do bioensaio com larvas de Artemia salina...............157

Tabela 14 - Atividade antimicrobiana do fenol e derivados

(coeficiente fenólico)......................................................................158

Pág.

Tabela 15 - Fungos utilizados no ensaio.........................................................160

Tabela 16 - Inibição do crescimento fúngico dos extratos de S. apetala.........162

Tabela 17 - Inibição do crescimento fúngico das substâncias isoladas do

extrato metanólico das folhas de S. apetala....................................................163

Tabela 18 - Inibição do crescimento fúngico das substâncias isoladas do

extrato hexânico da madeira de S. apetala.....................................................164

Lista de Esquemas

Pág.

Esquema 1 - Preparação dos extratos brutos das folhas de S. apetala..........26

Esquema 2 - Preparação dos extratos brutos da madeira de S. apetala.........27

Esquema 3 - Fracionamento do extrato em metanol........................................29

Esquema 4 – Purificação das saponinas das folhas de S. apetala...................30

Esquema 5 - Isolamento dos flavonóides das folhas de S. apetala..................31

Esquema 6 – Fracionamento cromatográfico do extrato hexânico....................32

Esquema 7 - Propostas de fragmentação da substância SAFM-03..................72

Esquema 8 - Propostas de fragmentação da substância SAMH-01.................98

Esquema 9 - Propostas de fragmentação da substância SAMH-02...............107

Esquema 10 - Propostas de fragmentação da substância SAMH-03.............118

Esquema 11 - Propostas de fragmentação da substância SAMH-04.............128

Esquema 12 - Propostas de fragmentação da substância SAMH-05a...........137

Esquema 13 - Propostas de fragmentação da substância SAMH-05b...........137

Esquema 14 - Propostas de fragmentação da substância SAMH-05c.......... 138

Esquema 15 - Mecanismo de ação do DPPH frente a substâncias

fenólicas...................................................................................149

Esquema 16 - Relação estrutura versus atividade antioxidante

de flavonóides..........................................................................149

Esquema 17 - Procedimento experimental (análise quantitativa)....................152

XII

Lista de Figuras

Pág.

Figura 1 - Substâncias utilizadas como fitofármacos.........................................1

Figura 2 - Quinina e análogos sintéticos............................................................2

Figura 3 - Estrutura básica de isoflavonóides....................................................5

Figura 4 - Flavonóides de Swartzia....................................................................8

Figura 5 - Saponinas de Swartzia.......................................................................9

Figura 6 - Pterocarpanos de Swartzia...............................................................10

Figura 7 - Agliconas esteroidais........................................................................12

Figura 8 - Agliconas de caráter básico..............................................................13

Figura 9 - Biossíntese das saponinas triterpênicas...........................................13

Figura 10 - Biossíntese geral dos flavonóides...................................................15

Figura 11 - Classe de isoflavonóides.................................................................16

Figura 12 - Saponinas isoladas de Swartzia apetala.........................................21

Figura 13 - Flavonóides isolados de Swartzia apetala......................................22

Figura 14 - Estilbeno, triterpeno, esteróides e pterocarpano isolados

de S. apetala...................................................................................23

Figura 15 - Interações 1,3-sin-diaxial da substância SAFM-01.........................36

Figura 16 - Espectro de infravermelho da substância SAFM-01.......................39

Figura 17 - Espectro de RMN

H da substância SAFM-01................................40

Figura 18 - Ampliação do espectro RMN

H da substância SAFM-01

(região de 0,66 a 2,4 ppm)...............................................................41

Figura 19 - Ampliação do espectro RMN

H da substância SAFM-01

(região de 3,1 a 4,8 ppm).................................................................42

Figura 20 - Espectro de RMN

C-APT da substância SAFM-01......................43

Figura 21 - Ampliação do espectro RMN

C-APT da substância

SAFM-01 (região de 15 a 35 ppm)..................................................44

Figura 22 - Ampliação do espectro RMN

C-APT da substância

SAFM-01(região de 36 a 57ppm)....................................................45

Figura 23 - Ampliação do espectro RMN

C-APT da substância

SAFM-01 (região de 62 a 82 ppm)..................................................46

Figura 24 - Espectro de HMQC da substância SAFM-

01..................................47

Pág.

XIII

Figura 25 - Ampliação do espectro de HMQC da substância SAFM-01

(região de 0,7 a 1,8 ppm)...................................................................48

Figura 26 - Ampliação do espectro de HMQC da substância SAFM-01

(região de 3,6 a 4,7 ppm)...................................................................49

Figura 27 - Espectro de HMBC da substância SAFM-01..................................50

Figura 28 - Ampliação do espectro de HMBC da substância SAFM-01

(região de 0,6 a 1,5 ppm)................................................................51

Figura 29 - Ampliação do espectro de HMBC da substância SAFM-01

(região de 0,7 a 1,7 ppm).................................................................52

Figura 30 - Espectro de infravermelho da substância SAFM-02.......................57

Figura 31 - Espectro de RMN

H da substância SAFM-02................................58

Figura 32 - Ampliação do espectro de RMN

H da substância SAFM-02

(região de 0,7 a 1,4 ppm).................................................................59

Figura 33 - Ampliação do espectro de RMN

H da substância SAFM-02

(região de 1,3 a 2,1 ppm).................................................................60

Figura 34 - Ampliação do espectro de RMN

H da substância SAFM-02

(região de 3,3 a 3,9 ppm).................................................................61

Figura 35 - Ampliação do espectro de RMN

H da substância SAFM-02

(região de 3,9 a 4,35 ppm)...............................................................62

Figura 36 - Espectro de COSY (

H x

H) da substância SAFM-02....................63

Figura 37 - Espectro de RMN

C-APT da substância SAFM-02.......................64

Figura 38 - Ampliação do espectro de RMN

C-APT da substância SAFM-02

(região de 16 a 50 ppm)...................................................................65

Figura 39 - Ampliação do espectro de RMN

C-APT da substância SAFM-02

(região de 57 a 84 ppm).....................................................................66

Figura 40 - Espectro de HMQC da substância SAFM-02..................................67

Figura 41 - Ampliação do espectro de HMQC da substância SAFM-02

(região de 0,7 a 1,5 ppm)...................................................................68

Figura 42 - Espectro de HMBC da substância SAFM-02..................................69

Figura 43 - Ampliação do espectro de HMBC da substância SAFM-02

(região de 0,7 a 2,1 ppm)...................................................................70

Figura 44 - Espectro de infravermelho substância da SAFM-03.......................74

Figura 45 - Espectro de massas da substância SAFM-03................................75

Pág.

Figura 46 - Espectro de RMN

H da substância SAFM-03................................76

XIV

Figura 47 - Espectro de RMN

C-APT da substância SAFM-03......................77

Figura 48 - Espectro de massas da substância SAFM-04................................82

Figura 49 - Espectro de infravermelho da substância SAFM-04.......................83

Figura 50 - Espectro de RMN

H da substância SAFM-04................................84

Figura 51 - Ampliação do espectro de RMN

H da substância SAFM-04

(região de 3,2 a 3,81 ppm)................................................................85

Figura 52 - Ampliação do espectro de RMN

H da substância SAFM-04

(região de 3,86 a 4,13 ppm).............................................................86

Figura 53 - Espectro de COSY (

H x

H) da substância SAFM-04....................87

Figura 54 - Espectro de RMN

C-APT da substância SAFM-04......................88

Figura 55 - Ampliação do espectro de RMN

C-APT da substância

SAFM-04 (região de 64 a 78 ppm)...................................................89

Figura 56 - Ampliação do espectro de RMN

C-APT da substância

SAFM-04 (região de 91 a 107 ppm)................................................90

Figura 57 - Espectro de HMQC da substância SAFM-04..................................91

Figura 58 - Ampliação do espectro de HMQC da substância SAFM-04

(região de 3,2 a 4,1 ppm)................................................................92

Figura 59 - Espectro de HMBC da substância SAFM-04.................................93

Figura 60 - Ampliações do espectro de HMBC da substância SAFM-04.........94

Figura 61 - Espectro de massas da substância SAMH-01...............................98

Figura 62 - Espectro de RMN

H da substância SAMH-01...............................99

Figura 63 - Ampliação do espectro de RMN

H da substância SAMH-01

(região de 6,9 a 7,6 ppm)..............................................................100

Figura 64 - Espectro de RMN

C-APT da substância SAMH-01....................101

Figura 65 - Ampliação do espectro de RMN

C-APT da substância

SAMH-01 (região de 101 a 130 ppm)............................................102

Figura 66 - Espectro de HMBC da substância SAMH-01................................103

Figura 67 - Ampliação do espectro de HMBC da substância SAMH-01

(região de 6,6 a 7,6 ppm)...............................................................104

Figura 68 - Espectro de massas da substância SAMH-02..............................109

Figura 69 - Espectro de infravermelho da substância SAMH-02.....................110

Figura 70 - Espectro de RMN

H da substância SAMH-02.............................111

Pág.

Figura 71 - Espectro de RMN

C-APT da substância SAMH-02....................112

Figura 72 - Espectro de HMQC da substância SAMH-02...............................113

Figura 73 - Espectro de HMBC da substância SAMH-02................................114

Figura 74 - Espectro de massas da substância SAMH-03..............................118

Figura 75 - Espectro de RMN

H da substância SAMH-03..............................119

Figura 76 - Espectro de RMN

C-APT da substância SAMH-03....................120

Figura 77 - Espectro de HMQC da substância SAMH-03................................121

Figura 78 - Espectro de HMBC da substância SAMH-

03.................................122

Figura 79 - Espectro de RMN

H da substância SAMH-04..............................125

Figura 80 - Espectro de RMN

C-APT da substância SAMH-04.....................126

Figura 81 - Ampliação do espectro de RMN

C-APT da substância

SAMH-04 (região de 0 a 60 ppm)...................................................127

Figura 82 - Espectro de massas da substância SAMH-04...............................128

Figura 83 - Espectro de RMN

H das substâncias SAMH-05a/b/c..................132

Figura 84 - Espectro de RMN

C-APT das substâncias SAMH-05a/b/c.........133

Figura 85 - Ampliação do espectro de RMN

C-APT das substâncias

SAMH-05a/b/c (região de 12 a 58 ppm)........................................134

Figura 86 - Espectro de CG das substâncias SAMH-05a/b/c.........................135

Figura 87 - Espectro de massas da substância SAMH-05a............................135

Figura 88 - Espectro de massas da substância SAMH-05b............................136

Figura 89 - Espectro de massas da substância SAMH-05c............................136

Figura 90 - Análise qualitativa da atividade antioxidante.................................153

Figura 91 - Avaliação do potencial antioxidante (%AA x concentração).........154

XVI

Lista de Abreviaturas e Símbolos

AA% Porcentagem de Atividade Antioxidante

Abs Absorbância

APT Attached Proton Test

ATCC Americam Type Culture Collection

Ax Axial

CC Cromatografia em Coluna

CDCl

Clorofórmio deuterado

CCDA Cromatografia em Camada Delgada Analítica

CCDP Cromatografia em camada delgada preparativa

Concentração Efetiva a 50%

CG/EM Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de

Massas

-1

Centímetro recíproco (unidade de número de onda)

COSY Correlation SpectroscopY

Dose Letal suficiente para 50% da população testada

δ Deslocamento químico (ppm)

d sinal duplo

dd duplodupleto

dl sinal duplo largo

EM Espectro de Massas

eq equatorial

eV elétron volt

Glc glicose

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HMQC Heteronuclear Multiple Quantun Coherence

IV Infravermelho

J Constante de acoplamento (medida em Hertz)

λ Comprimento de Onda

m sinal multiplo

MeOH-d

Metanol deuterado

nm namômetro

XVII

m/z Relação massa/carga

a. página

ppm Parte por milhão

RDA Rearranjo do tipo Diels-Alder

Rha Raminose

RMN

H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

RMN

C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13

s sinal simples

SAFD Swartzia apetala Folhas Diclorometano

SAFM Swartzia apetala Folhas Metanol

SAMH Swartzia apetala Madeira Hexano

sl sinal largo

t sinal triplo

UV Ultravioleta

Xyl Xilose

XVIII

RESUMO

ARAÚJO, Marcelo Francisco de; Universidade Estadual do Norte

Fluminense; agosto de 2007; Estudo Fitoquímico e Avaliação Biológica de

Swartzia apetala; Orientadora: Leda Mathias; Co-orientadores: Raimundo

Braz-Filho, Ivo José Curcino Vieira; Colaborador: Olney Vieira da Motta

O estudo fitoquímico dos extratos de um espécime de Swartzia apetala

Raddi var. glabra (Fabaceae) coletada na reserva do Vale do Rio Doce em

Linhares (ES) em julho de 2002, conduziu ao isolamento e a identificação de

constituintes de diferentes classes de metabólitos especiais. Das folhas

foram isoladas duas saponinas: 3-hidroxi-olean-12-en-28-acetato de-O-

-D-

glicopiranosila (SAFM-01), 3-O-

-D-xilopiranosil-(1’”→4”)-O-

-D-

ramnopiranosil-olean-12-em-28-acetato de -

-D-glicopiranosila (SAFM-02);

dois flavonóides: 3, 5, 7,4’-tetraidroxiflavonol (SAFM-03), 5,7,4’-triidróxi-3- O-

-D-glicopiranosil-(1”’ → 6”)-O-

-L-raminopiranosil-(1”” →2”’)-O-

-L-

raminopiranosil-flavonol (SAFM-04). Da madeira foi isolado um flavonóide:

5,7-diidróxiflavanona (SAMH-02); um estilbeno: 3-metoxi-5-hidroxiestilbeno

(SAMH-01); um pterocarpano: 7-hidroxi-3’,4’-metilenodioxipterocarpano

(SAMH-03); um triterpeno: lupeol (SAMH-04); e uma mistura de esteróides:

sitosterol, estigmasterol e campesterol (SAMH-05a/b/c).

As substâncias SAFM-01, 02, 03, 04 e SAMH-01 e 02 estão sendo

citadas pela primeira vez no gênero Swartzia e pelo melhor do nosso

conhecimento as substâncias SAFM-02 e 04 são inéditas na literatura.

A determinação estrutural das substâncias foi realizada através de

técnicas de RMN

H e

C a uma e duas dimensões, infravermelho (IV),

cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas (CG-EM),

espectrometria de massa de baixa e alta resolução, bem como por

comparação com dados da literatura.

Paralelo à avaliação fitoquímica foram realizados testes biológicos de

citotoxicidade frente às larvas de Artemia salina e antioxidante utilizando o

método com DPPH, com os extratos brutos; atividade antifúngica foi

utilizando o método de difusão em agar frente a nove cepas padrão ATCC do

XIX

gênero Candida, dos extratos brutos e das substâncias isoladas. A atividade

antifúngica foi observada em todos os extratos testados e as substâncias

responsáveis pela atividade nos extratos foram as: SAFM-01, 02, 03 e 04 no

extrato hexânico foram SAMH-01, 02 e 03.

ABSTRACT

ARAÚJO, Marcelo Francisco de; Universidade Estadual do Norte

Fluminense; agosto de 2007; Phytochemistry study and biological evaluation

of Swartzia apetala; Orientadora: Leda Mathias; Co-orientadores: Raimundo

Braz-Filho, Ivo José Curcino Vieira; Colaborador: Olney Vieira da Motta

The phytochemistry study of extracts of a specimen of Swartzia

apetala var. glabra (Fabaceae) collected in the reserve of the Vale do Rio Doce

in Linhares (ES) in July of 2002, lead to the isolation and the constituent

identification of different class of special metabolites. Of leaves two saponins had

been isolated: acid-3-O-β-hydroxi-28-β- O-D-glucopyranosyl ester SAFM-01, 3-β-

D-O-xylopyranosyl- (1'” →4”) [α-D-ramnopyranosyl] - 28-O-β-D-glucopyranosyl

ester SAFM-02; two flavonoids: 3, 5, 7,4' - tetrahydroxiflavonol SAFM-03, 5,7,4' -

trihydroxi-3- β-O-D-glucopyranosyl- (1”' → 6”) - O-α-L-ramnopyranosyl- (1”” →2”')

- O-α-L-ramnopyranosyl-flavonol SAFM-04. Of the wood was isolated one

flavonoid: 5,7-dihydroxiflavanone SAMH-02; a stilbene: 3-methoxi-5-hydroxi

stilbene SAMH-01; a pterocarpan: 7-hydroxi-3', 4' - methyilenedioxipterocarpan

SAMH-03; a triterpen: lupeol SAMH-04 and one mixture of steroids: sitosterol,

stigmasterol and campesterol SAMH-05a/b/c.

The substances SAFM-01, 02, 03, 04 and SAMH-01 and 02 were

identified for the first time in the Swartzia genera and for optimum of our

knowledge substances SAFM-02 and 04 they are unknown in literature.

The structural determination of substances was carried through RMN of

H and

techniques to one and two dimensions, infrared (IV), gas chromatography connected to the mass

(CG-EM), spectrometry of mass of low and high resolution, as well as comparison with data of

literature. Followed of the phytochemistry evaluation biological tests had been carried through of

toxicity against the larvae of Artemia salina and antioxidant using the method with DPPH, with

crude extracts; antifungal activity using the method of diffusion in gel front nine yeast standard

ATCC of the Candida genera, crude extracts and isolated substances.

XXI

Introdução

___________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO

Desde a antecedência de Cristo povos primitivos já utilizavam plantas

para cura de certas enfermidades. Como exemplo pode-se citar Hipócrates

considerado pai da medicina moderna e que viveu no século 5 a.C, que tomou

a natureza como guia na escolha de remédios. Tais plantas possuíam

substâncias (princípios ativos) capazes de provocar reações benéficas no

organismo, causando desta forma a recuperação do enfermo. Estas

propriedades intrigaram os estudiosos por vários anos que passaram a

investigar as plantas com a finalidade de identificar esses princípios ativos.

Este trabalho árduo envolve a colaboração de pesquisadores de várias

áreas como: botânica, fitoquímica e farmacologia que juntos enriquecem os

conhecimentos sobre a inesgotável fonte de medicina natural: a flora mundial.

O Brasil é o país que detém a maior parcela da biodiversidade, em torno

de 15 a 20% do total mundial conhecido, com destaque para as plantas

superiores mais precisamente as angiospermas, nas quais detém

aproximadamente 20% da biodiversidade (Lewinsohn & Prado, 2004). Entre os

elementos que compõe a biodiversidade, as plantas superiores são as

principais matérias-primas para a fabricação de fitoterápicos e outros

medicamentos.

Em uma planta pode conter uma ou várias substâncias ativas que atuam

em conjunto formado um complexo fitoterápico.

As plantas, além de seu uso na medicina popular com fins terapêuticos, também são

importantes para obtenção de fitofármacos, até hoje amplamente utilizados na clínica. Como

exemplo citamos o cardenolídeo digitoxigenina (cardiotônico) isolado de espécies de Digitalis e

o alcalóide morfina (analgésico), isolado de Papaver Sonmniferum, entre outros (Figura 1)

(Hostettmann et al., 2003).

Uma vez obtida a substância biologicamente ativa, pode-se lançar mão de estudos

relacionando estrutura química e atividade biológica para o planejamento racional de moléculas

novas.

Introdução

___________________________________________________________________________________________

N CH

Morfina

Digitoxigenina

Figura 1 - Substâncias utilizadas como fitofármacos

Dessa forma, essas substâncias ativas funcionam como modelo para síntese ou semi-

síntese de substâncias análogas mais potentes e seletivas que podem ser obtidas mais

facilmente e, em alguns casos, a custos menores. Um exemplo da aplicação deste trabalho é a

síntese, após II Guerra Mundial, dos antimaláricos cloroquina e mefloquina apartir do alcalóide

quinina isolado de espécies de Cinchona (Figura 2) (Viegas Jr, et al.2006).

Quinina

Cloroquina

Mefloquina

Figura 2 – Quinina e análogos sintéticos

Outro aspecto importante dentro da química de produtos naturais é a espetacular

diversidade molecular de padrões estruturais que se encontram nas distintas classes de

substâncias, como alcalóides, cumarinas, flavonóides, terpenoídes, saponinas, entre outras

que representam fontes inesgotáveis de modelos originais que possibilitam sua utilização como

matérias-primas na síntese de substâncias bioativas.

No intuito de se identificar a diversidade molecular que possa ser utilizada como

fitofármacos ou modelos para síntese ou semi-síntese, foi realizado o estudo fitoquímico e

avaliação da atividade biológica de um espécime de Swartzia apetala Raddi var. glabra.

Referências Bibliográficas.

Hostettmann, K., Queiroz, F.E. Vieira, C.P. (2003). Princípio Ativo de Plantas

Superiores. São Carlos: Ed.UFSCar, vol. IV. 9 - 44p.

Introdução

___________________________________________________________________________________________

Lewinsohn, T.M., Prado, P.I. (2004). Biodiversidade Brasileira: Síntese do

Estado Atual do Conhecimento. 2. Ed. - São Paulo: Contexto. 1-10p.

Viegas Jr, C., Bolzani, V.S., Barreiro, E.J. (2006). Os Produtos Naturais e a

Química Medicinal Moderna. Química Nova. 29(2)

Capítulo I – Revisão da Literatura

____________________________________________________________________________

1.1. A Família Fabaceae

A família Fabaceae possui uma ampla distribuição geográfica, que é representada por

aproximadamente 650 gêneros e mais de 18000 espécies espalhadas em todo o mundo,

especialmente nas regiões tropicais e subtropicais (Barroso et al., 1991; Joly, 2002).

A espécie Swartzia apetala, pertence à família Fabaceae (ordem Fabales, tribo

Swartizieae). Esta familia é uma das maiores dentre as dicotiledôneas (Heywood, 1971;

Hutchinson, 1971), sendo considerada uma das mais importantes do ponto de vista econômico,

visto constituir-se numa inestimável fonte de alimentos, como por exemplo, feijão, ervilha,

lentilha, soja, amendoim, entre outros (Buckinghamn, 1994; Heywood, 1971; Rawitscher, 1979).

Espécies desta família apresentam a propriedade de aumentar a fertilidade do solo, por

meio do mecanismo de fixação de nitrogênio por quimiossíntese de moléculas orgânicas,

através de um processo de simbiose com bactérias do gênero Rhizobium (Joly, 2002).

Outras espécies são usadas como plantas forrageiras, ornamentais, como fonte de

taninos, resinas e madeira fina para fabricação de móveis em geral (Heywood, 1971; Robins et

al., 1964).

1.2. Divisão Taxonômica

A familia Fabaceae está subdividida em três subfamílias: Mimosoideae,

Caesalpinoideae e Papilionoideae. A subfamília Papilionoideae está representada por

aproximadamente, 482 gêneros e 12000 espécies de ampla distribuição mundial (Barroso et

al., 1991). A maioria de seus representantes arbóreos são encontrados nos trópicos e

hemisfério sul e os arbustivos e herbáceos em regiões temperadas do globo (Hutchinson, 1971;

Joly, 2002; Heywood, 1971; Cronquist, 1981).

Do ponto de vista fitoquímico, a subfamília Papilionoideae caracteriza-se por conter

cerca de 90% dos isoflavonóides de origem vegetal identificados (Ingham, 1983). Apesar da

distribuição restrita dos isoflavonóides dentro do reino vegetal, a variação estrutural encontrada

nessas substâncias é grande, e isto se deve tanto ao número e complexidade dos substituintes

existentes no sistema 3-fenilbenzopirano, como também aos diferentes níveis de oxidação no

esqueleto básico e a presença de anéis heterocíclicos extra (Dewick, 1988) (Figura 3).

Capítulo I – Revisão da Literatura

____________________________________________________________________________

Sistema 3-Fenilbenzopirano

Figura 3- Estrutura básica de isoflavonóides

1.3. O gênero Swartzia

O gênero Swartzia compreende aproximadamente 125-150 espécies das quais apenas

nove foram estudadas quimicamente (Tabela 1, p. 7). Sua distribuição abrange principalmente

a América do Sul e África (Schultes, 1979).

Espécies do gênero estão caracterizadas quimicamente pela produção de flavonóides

com atividade larvicida, antibacteriana e antifúngica (Bézanger-Beauquesne & Pinkas, 1967;

Osawa et al., 1992; Dubois & Sneden, 1995 e 1996; Sanchez et al., 1999; Rojas et al., 2006)

(Figura 4, p. 8), saponinas com atividade moluscocida, larvicida e ictiotóxica (Suter et al., 1986;

Minjas et al., 1986; Borel & Hostettmann, 1987; Borel et al., 1987; Lwambo & Moyo, 1991;

Sanchez et el., 1999; Abdel-Kader et al., 2000; Magalhães et al., 2003; Neuwinger, 2004)

(Figura 5, p. 9) e outros metabólitos especiais bioativos como, por exemplo: os pterocarpanos

(Harper et al., 1965 e 1969; Donnely & Fitzgerald, 1971; Formiga et al., 1975; Braz-Filho et al.,

1980) (Figura 6, p. 10).

Capítulo I – Revisão da Literatura

____________________________________________________________________________

Tabela 1 - Substâncias isoladas de espécies de Swatzia

Espécies Material Metabólito Subst. Referências

S. brachyrachis madeira

madeira

flavonóide

saponina

15-16

1””-2””

Sanchez et al., 1999

S. laevicarpa madeira

madeira

flavonóide

pterocarpano

11-21

Braz-Filho et al., 1980

S. langsdorffii raiz saponina 1-2 Magalhães et al., 2003

S. leiocalycina madeira pterocarpano 24-29 Donnelly & Fitzgerald, 1971

S. madagascariensis fruto

madeira

saponina

pterocarpano

1”’-8”’

1-8

9-10

Borel & Hostettmann, 1987

Harper et al., 1965

Harper et al., 1969

S. polyphylla madeira

madeira

flavonóide

7-13

3-5

1-2

6 e 8

Osawa et al., 1992

Dubois & Sneden, 1995

Dubois & Sneden, 1996

Rojas et al., 2006

S. schomburgkii folha saponina 1”-8” Abdel-Kader et al., 2000

S. simplex folha saponina 1’-7’a Borel et al., 1986

S. ulei madeira pterocarpano 22-23 Formiga et al., 1975

Capítulo I – Revisão da Literatura

____________________________________________________________________________

9. R

= OH, R

= H, R

= OCH

10. R

= OH, R

= OCH

11. R

= OCH

, R

= OH, R

= OH

12. R

= OH, R

= OH

OH O

15. R = OH

16. R = OCOCH

OCH

OMe

OOCH

7. R

= OH, R

= H

8. R

= OH, R

= OH

OCH

MeO

OMe

OHO

HO OH

OHO

. R = H

. R = OH

OH O

HO O

Figura 4 - Flavonóides isolados do gênero Swartzia

Capítulo I – Revisão da Literatura

____________________________________________________________________________

1"". R = H

2"". R = COCH

1"'. CH

H H Rha

2"'. CHO H H Rha

3"'. CH

H Gli Rha

4"'. CHO H Gli Rha

5"'. CH

Gli Gli Rha

6"'. CH

H Gli H

7"'. CHO H Gli H

8"'. CH

H H H

COOR

HOOC

6".

8".

5".

4".

7".

3".

2".

1".

Gli

Xyl

Gli

COOR

HOOC

COOR

1. R = Raminose

2. R = H

COO

Glicose

HOOC

H H Rha H

CHO Gli H H H

Gli H H H

H H H H

Gli H Rha H

H H Rha H

Gli H H Gli

H H H Gli

Gli Xyl Rha H

H Xyl Rha H

H Xyl H H

COOH Gli H H H

COOH H H H H

1'.

2'.

3'.

3'a.

4'.

4'a.

5'.

5'a.

6'.

6'a.

6'b.

7'.

7'a.

Figura 5 – Saponinas isoladas do gênero Swartzia

Capítulo I – Revisão da Literatura

____________________________________________________________________________

OCH

22. R = H

23. R =Ac

17. R

= R

= OH, R

= R

= OMe, R

= R

= H

18. R

= R

= OH, R

= R

= OMe, R

= H

19. R

= H, R

= R

= OMe, R

= OH

20. R

= R

= OH, R

= R

= OMe

21. R

= R

= H

OMe

MeO

OMe

11. R

= OH, R

= OMe, R

= R

= OCH

O, R

= R

= H

12. R

= R

= OH, R

= R

= OMe, R

= R

= H

13. R

= R

= OH, R

= R

= OMe, R

= H

14. R

= H, R

= R

= OMe, R

= OH

15. R

= R

= OH, R

= R

= OMe

1. R

= OH, R

= R

= H, R

= OMe

2. R

= OMe, R

= R

= H, R

= OMe

3. R

= OH, R

= OMe, R

= H, R

= OMe

4. R

= R

= OMe, R

= H

5. R

= OH, R

=H, R

= R

= OCH

6. R

= OMe, R

= H, R

= R

= OCH

7. R

= OH, R

= OMe, R

= R

= OCH

8. R

= R

= OMe, R

= R

= OCH

OMe

Figura 6 – Pterocarpanos isolados do gênero Swartzia

1.4. A espécie Swartzia apetala Raddi var. glabra

A espécie Swartzia apetala Raddi var. glabra é conhecida popularmente como “arruda

rajada”, devido à coloração da sua madeira cujo valor comercial reside na sua resistência e

durabilidade. A madeira do caule de S. apetala apresenta-se dura, pesada, compacta, lisa,

Capítulo I – Revisão da Literatura

____________________________________________________________________________

muito resistente a deteriorização, fácil de plainar e adquirindo brilho intenso mediante

polimento. Devido a sua durabilidade pode ser usada na fabricação de tacos luxuosos, estacas,

vigas, construção civil e obras hidráulicas, visto constar que é impenetrável ao gusano marinho

(Rizzini & Mors, 1995).

Sua região original de ocorrência está no leste de Minas Gerais, em Sergipe e na

floresta da costa do Espírito Santo. A floração ocorre entre os meses de fevereiro e agosto e a

maturação dos frutos ocorre no mês de outubro (Mansano & Tozzi, 1999).

Tabela 2 – Classificação botânica da espécie Swatzia apetala Raddi var. glabra

CLASSIFICAÇÃO BOTÂNICA

CLASSE ANGIOSPERMAE

SUBCLASSE DICOTILEDONEAE

SUPERORDEM ROSANAE

ORDEM FABALES

FAMÍLIA FABACEAE

SUBFAMÍLIA PAPILONOIDEAE

TRIBO SWARTZIEAE

GÊNERO Swartzia

ESPÉCIE Swartzia apetala Raddi var. glabra

1.5. Considerações sobre os metabólitos secundários encontrados no gênero Swartzia

1.5.1. Saponinas

São glicosídeos de esteróides ou de terpenos policíclicos. Por possuírem em sua

estrutura uma parte lipofílica (triterpeno ou esteróide) e outra hidrofílica (açúcar), estes

metabólitos possuem um poder de redução da tensão superficial da água garantindo assim

ações detergentes e emulsificantes, que em solução aquosa formam espuma persistente. A

espuma formada é estável à ação de ácidos minerais diluídos (Schenkel, 1999).

Saponinas são metabólitos de elevada massa molecular (600 a 2000u), devido à

presença de agliconas com um número variado de gliconas. As mesmas também tem sido de

grande interesse farmacêutico, sejam como adjuvantes em formulações, componentes ativos

em drogas vegetais, ou até mesmo, como matéria-prima para a síntese de esteróides (Simões

et al., 2001).

Esses metabólitos podem ser classificados em dois grupos baseados na natureza do

esqueleto da aglicona. O primeiro grupo consiste de saponinas esteroidais, os quais são quase

exclusivos de monocotiledôneas em angiospermas. O segundo grupo consiste de saponinas

triterpenoidais, onde sua ocorrência é mais comum principalmente em dicotiledôneas de

angiospermas. Além destes dois grupos, outros autores classificam um terceiro grupo chamado

de aminas esteroidais, e que são também classificadas como alcalóides esteroidais (Sparg et

al., 2004).

Capítulo I – Revisão da Literatura

____________________________________________________________________________

As saponinas esteroidais são formadas por um esqueleto de 27 átomos de carbonos

dispostos num sistema tetracíclico e apresentam duas estruturas básicas comuns: o

espirostano e o furostano (Simões et al., 2001) (Figura 7, p. 12).

Furostano

Espirostano

açúcar

Figura 7 - Agliconas esteroidais

As saponinas de caráter básico possuem nitrogênio no anel F e são conhecidas por

dois tipos de estruturas: o espirosolano (onde o nitrogêno é secundário) e o solanidano (onde o

nitrogênio é terciário) (Simões et al., 2001) (Figura 8).

Solasodina

Tomatidina

Solanidima

Figura 8 - Agliconas de caráter básico.

No entanto as mais encontradas na natureza são as triterpênicas. Os triterpenos

pentacíclicos podem ser divididos em três classes: oleananos (β-amirina), ursanos (α-amirina)

e o lupanos (lupeol) (Simões et al., 2001). Sua via biossintética deriva do mevalonato (Figura

9).

Capítulo I – Revisão da Literatura

____________________________________________________________________________

= Glc-Rha

Óxido

esqualeno

Cátion

damarenila

Cátion

bacanerila

Cátion

lupenila

Cátion

oleanila

-Amirina

Cátion

taraxaterila

Taraxasterol

-Amirina

Lupeol

Saponina

triterpenoidal

Ác. melavônico

Figura 9 - Biossíntese das saponinas triterpênicas

Com o avanço tecnológico das técnicas cromatográficas e espectroscópicas esta

classe de metabólito passou a ser estudada com grande freqüência por vários grupos de

pesquisa tanto em fitoquímica no isolamento e elucidação estrutural como em microbiologia

avaliando diversas propriedades biológicas. O comportamento anfifílico das saponinas e a

capacidade de formar complexos com esteróides, proteínas e fosfolipídeos de membranas

determinam um número variado de propriedades biológicas para essas substâncias, as quais

se destacam: atividade hemolítica, ictiotóxica, moluscocida, antiinflamatória, antiviral,

microbiana e antiparasitária (Sparg et al., 2004).

1.5.2. Flavonóides

São substâncias que contém um ou mais substituintes aromáticos que são

normalmente definidos como fenólicos ou polifenólicos e são conhecidos por constituírem um

grupo de metabólitos especiais mais diversos e difundido no reino vegetal.

O interesse sobre estas substâncias resulta particularmente das visíveis e lindas cores

desses pigmentos localizados principalmente em plantas vasculares, estando distribuídos nas

partes aéreas dos vegetais, como flores, folhas e frutos. Os mesmos atuam na defesa química

das plantas contra fungos e bactérias. Esta classe é amplamente distribuída no reino vegetal.

Alguns representantes foram identificados em briófitas, também encontrados em pteridófitas,

Capítulo I – Revisão da Literatura

____________________________________________________________________________

mas a variedade estrutural é pequena. Todavia, estão presentes em abundância em

angiospermas, apresentando nesse grupo enorme diversidade estrutural (Simões, et al, 2001).

Em geral, as agliconas flavonoídicas aparecem sob forma de cristais amarelos quase

sempre solúveis em água. São responsáveis pelo aroma dos alimentos e possuem

propriedades como: antiinflamatórios, antivaricosos, diuréticos, antioxidante e antimicrobiano

(Castro et al., 2001).

Ocorrem com uma variedade de formas estruturais, todas contendo 15 átomos de

carbono em seu esqueleto básico e são arranjados em uma configuração (C

) (Agrawal &

Markham, 1989). Sua via biossintética deriva do acetato e chiquimato (Figura 10, p. 15).

A vasta distribuição nas plantas, sua relativa estabilidade química e a facilidade com

que são identificados, tem considerado os flavonóides como marcadores taxonômicos na

classificação das plantas (Agrawal & Markham, 1989).

Capítulo I – Revisão da Literatura

____________________________________________________________________________

C NH

CoASOC

PAL C4H

4CL

COSCoA

COOH

CHI

OHO

OCH

OHO

OCH

OHO

OCH

OHO

OCH

IFS

Chalcona

Flavanona

IOMT

Isoflavona

I2'H

IFR

DMID

2'-hidroxi-isoflavanona

Isoflavonóides

Rota Geral dos Fenilpropanóides

Fenilalanina

Ác. cinâmico

Ác. p-cumárico

4-Cumaril-CoA

Malonil-CoA

R=H;OH

CHI

F3'H

Aurona

IFS

OHO

Flavona

CHS/CHR

STS

Estilbenos

F3H

3-OH-Flavanonas (diidroflavonol)

FLS

DRF

OH OH

Flavonol

Flavan-3,4-diol

LDOX

3-OH-Antocianidina

OMT

UFGT

OGlc-O

O-Glc

O-Glc-O-Rha

Antocianidina

Flavan-3-ol

LCR

Taninos Condensados

(protocianidinas)

OOGlc

Rha-O

O-Glc-O-Rha

UFGT

Flavonol Glicosilado

Flavanonas

Flobafenos

Flavan-4-ol

OHOH

PAL - Fenilalanina Amônia Liase

C4H - Cinnamato-4-Hidroxilase

4CL - 4-Coumaroil:CoA-ligase

CHS - Chalcona Sintase

CHR - Chalcona Redutase

STS - Estilbeno sintase

F3'H - Flavonoide 3' Hidroxilase

CHI - Chalcona Isomerase

IFS - Isoflavona Sintase

F3H - Flavanna 3-Hidroxiilase

IOMT - Isoflavona O-MetilTransferase

I2'H - Isoflavona 2'-Hidroxilase

FLS - Flavonol Sintase

IFR - Isoflavona Redutase

DFR - Dihidroflavonol 4-Redutase

RT - Ramnosil Tranferase

UFGT - Flavonoide Glicosil Transferase

VR - Vestitona Redutase

LDOX - Leucoantocianidina DiOXigenase

LCR - Leucoantocianidina Redutase

DMID - 7,2'-Dihidroxi, 4'-MetoxiIsoflavonol

Dehidratase

OMT - O-MetilTransferase

Figura 10 - Biossíntese geral dos flavonóides (Winkel-Shirley 2001)

1.5.3. Isoflavonóides

Possuem um sistema de três anéis similar aos flavanóides e são caracterizados por

uma cadeia C

-C

- C

(Agrawal & Markham, 1989).

Ao contrário dos flavonóides, sua distribuição taxonômica é restrita. Salvo raríssimas

exceções, são de ocorrência exclusiva de Fabaceae. Apesar dessa restrição a uma só família

Capítulo I – Revisão da Literatura

____________________________________________________________________________

botânica, tal classe apresenta uma diversidade estrutural importante: isoflavonas,

isoflavanonas, isoflavanas, aril-3-cumarinas, pterocarpanos, cumestanos, cumaronocromonas e

rotenóides, os quais possuem um carbono complementar no sistema heterocíclico (Agrawal &

Markham, 1989) (Figura 11).

Em vegetais, uma grande parte dos isoflavonóides comporta-se como fitoalexinas

(substâncias produzidas pela planta em resposta a uma infecção por um agente patogênico)

(Simões, et al, 2001).

Pterocarpano

3- Aril-cumarina

Cumestano

Isoflavanona

Rotenóide

Isoflavona

O O

Isoflavana

Cumaranocromona

Figura 11 - Classe de isoflavonóides

1.6. Referências Bibliográficas.

Abdel-kader, M.S., Bahler, B.D., Malone, S., Werkhoven, M.C.M., Wisse, J.H.,

Neddermann, K.M., Bursuker, I., Kingston, D.G.I. (2000). Bioactive saponins

from swartzia schomburgkii from the Surinami rainforest. Journal Natural

Products. 63(11): 1461p.

Agrawal, P.K., Markham, K.R. (1989). Carbon-13NMR of Flavonoids. Studies in

Organic Chemistry nº 39, Ed. Elsevier. 1-39p.

Capítulo I – Revisão da Literatura

____________________________________________________________________________

Barroso, G.M., Peixoto, A.L., Ichaso, C.L.F., Costa, C.G., Guimarães, E.T. (1991). Sistemática

de Angiospermas do Brasil. Visoça, UFV. V. 2. 15-97p.

Bézanger-Beauquesne, L., Pinkas, M. (1967). On the flavonoside of the fruit of

the Swartzia madagascariensis. Desv., African leguminous plant. Comptes

Rendus Hebdmadaires des Seances de l`Academie des Sciences. Serie D:

Sciences Naturelles. 264(2): 401p.

Borel, C., Gupta, M. P. & Hostettmann, K. (1986). Molluscicidal saponins from

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Capítulo II - Extração, Fracionamento e Isolamento das substâncias 21

__________________________________________________________________________________________

2.0. Constituintes químicos isolados das folhas e madeira de Swartzia apetala

Raddi var. glabra

O estudo fitoquímico das folhas e madeira de Swartzia apetala Raddi var. glabra

permitiu o isolamento e a caracterização de duas saponinas (Figura 12), três flavonóides

(Figura 13, p. 22), um estilbeno, um pterocarpano, um triterpeno e três esteróides (Figura 14,

p. 23).

SAFM-01

SAFM-02

Figura 12 - Saponinas isoladas de Swartzia apetala

Capítulo II - Extração, Fracionamento e Isolamento das substâncias 22

__________________________________________________________________________________________

OOH

SAFM-03

SAFM-04

SAMH-02

Figura 13- Flavonóides isolados de Swartzia apetala

Capítulo II - Extração, Fracionamento e Isolamento das substâncias 23

__________________________________________________________________________________________

OMe

SAMH-01

SAMH-05c

SAMH-05b

SAMH-05a

SAMH-03

SAMH-04

Figura 14 - Estilbeno, triterpeno, esteróides e pterocarpano isolados de S.

apetala

2.1. Materiais e Reagentes utilizados.

Capítulo II - Extração, Fracionamento e Isolamento das substâncias 24

__________________________________________________________________________________________

No processo de extração, fracionamento e purificação foram utilizados

os seguintes materiais:

• Na etapa de extração bem como no fracionamento e purificação foi

utilizado solventes Synth e Vetec;

• A concentração dos extratos foi efetuada sob pressão reduzida em

evaporador rotativo, Büchi B-480 e Fisatom 802;

• As soluções aquosas foram liofilizadas em liofilizador Thermo Savant;

• Nas etapas de fracionamento e purificação, foram utilizadas, sílica gel

60G (0,063-0,200 mm) Merck, sílica gel 60 (0,040-0,063 mm) Merck,

sílica gel silanizada 60 (0,063-0,200 mm) Merck, Lichrospher RP-18 (12

µm) Merck, Sephadex LH-20 Pharmacia e Amberlite XAD-2 Merck;

• Utilizou como agente dessecante: Na

anidro Vetec;

• Nas análises comparativas através de cromatografia em camada

delgada (CCD) utilizou-se cromatofolhas de sílica gel 60 F

254

e RP-18

254

Merck;

• As cromatoplacas foram reveladas através de irradiação com luz na

região do ultravioleta em comprimento de onda λ = 254 e 366 nm e/ou

com revelador cromatogênico [vanilina, cloreto férrico, NP/PEG

(Difenilboriloxietilamina + PoliEtilenoGlicol)] reagentes Merck;

2.2. Procedimento experimental

2.2.1. Levantamento bibliográfico

O levantamento bibliográfico foi realizado através de pesquisas bibliográficas de

periódicos em bibliotecas e em sítios disponíveis na INTERNET.

Capítulo II - Extração, Fracionamento e Isolamento das substâncias 25

__________________________________________________________________________________________

2.2.2. Material botânico: coleta e identificação

As folhas e a madeira de um espécime de S. apetala Raddi var. glabra

foram coletadas na Reserva Floresta da Cia. Vale do Rio Doce, Linhares – ES

em junho de 2002, onde se encontra uma exsicata de nº. 395 no herbário

CVRD.

2.2.3. Secagem e moagem do material vegetal

O material vegetal após seco à temperatura ambiente foi moído em

moinho do tipo Willey.

2.2.4. Preparação dos extratos brutos

2.2.4.1. Folhas

As folhas de S. apetala Raddi var. glabra após secas e moídas foram

pesadas obtendo-se uma massa de 347 g. Em seguida foram submetidas à

extração por maceração exaustiva em ordem crescente de polaridade

utilizando os seguintes solventes e obtendo as respectivas massas de extratos:

(hexano 5,78 g, 1,67 % da massa do material seco, diclorometano 3,41 g,

0,100 % da massa do material seco, metanol 34,5 g, 9,94 % da massa do

material seco e metanol/água (80:20) 31,9 g, 9,19 % da massa do material

seco (Esquema 1, p. 26).

Capítulo II - Extração, Fracionamento e Isolamento das substâncias 26

__________________________________________________________________________________________

Folhas

347 g

Hexano

Extrato em Hexano

SAFH

- 5,78 g

Resíduo

Extrato em CH

SAFD

- 3,41 g

Resíduo

MeOH

Extrato em MeOH

SAFM

- 34,5 g

Resíduo

MeOH/H

O(80:20)

Extrato em MeOH/H

SAFHA

- 31,9 g

* Extratos inativos aos testes descritos nos ítens (2.2.5 – 1 e 2) p.28-29.

** Extratos ativos aos testes descritos nos ítens (2.2.5 – 1 e 2) p. 28-29.

Esquema 1 - Preparação dos extratos brutos das folhas de S. apetala

2.2.4.2. Madeira

A madeira (580 g) após seca e moída foi submetida à maceração

exaustiva com os seguintes solventes: hexano 2,26 g de extrato (0,39 % da

massa do material seco, diclorometano 3,08 g (0,53 % da massa do material

vegetal) e metanol 29,0 g (3,72 % da massa do material vegetal) (Esquema 2,

p. 27).

Assim, os extratos brutos obtidos foram submetidos aos ensaios biológicos orientando

desta forma o fracionamento cromatográfico na busca de possíveis princípios ativos.

Capítulo II - Extração, Fracionamento e Isolamento das substâncias 27

__________________________________________________________________________________________

Madeira

580 g

Extrato em hexano

SAMH

(2,26 g)

Extrato em CH

SAMD

(3,08 g)

Extrato em MeOH

SAMM

(29,0 g)

Resíduo

* Extratos ativos aos testes descritos nos itens (2.2.5 – 1 e 2) p.28-29.

Esquema 2 - Preparação dos extratos brutos da madeira de S. apetala

2.2.5. Testes químicos

2.2.5.1. Teste para saponinas

Para detecção de saponinas foi realizado o teste da formação de

espuma persistente em solução de ácido diluído (Schenkel, 1999).

• Solução Ácida:

Teste específico para saponinas.

Observação de espuma persistente após agitação constante da solução.

Composição:

Solução 1,00 mol/L de HCl em água.

Modo de usar:

Diluir 3,00 mg de extrato em 10,0 mL da solução ácida em um tubo de

ensaio e em seguida agitar fortemente durante 2 a 3 minutos, observando

assim a formação de espuma persistente (colarinho).

Capítulo II - Extração, Fracionamento e Isolamento das substâncias 28

__________________________________________________________________________________________

2.2.5.2. Teste para flavonóides

Para detecção dos flavonóides foi utilizado o teste com solução etanólica

5% de FeCl

e solução metanólica de NP e solução etanólica de PEG [NP/PEG

(formação de coloração verde em CCDA e de fluorescência respectivamente)]

(Wagner & Blandt, 1995).

• Solução metanólica de NP (Difenilboriloxietilamina) e etanólica de PEG

(PoliEtilenoGlicol):

Reveladores específicos para compostos fenólicos com cloração

alaranjada em exposição à luz ultravioleta λ = 356 nm.

Composição:

Solução 1% de NP em metanol.

Solução 5% de PEG em etanol.

Modo de usar:

Imergir a cromatoplaca na solução de NP e em seguida na solução de

PEG após imersão, observar a coloração produzida.

• Solução etanólica de Cloreto férrico (FeCl

Revelador específico para compostos fenólicos.

Coloração específica para flavonóides: marrom escuro.

Composição:

5 % de FeCl

em Etanol

Modo de usar:

Borrifar a cromatoplaca com a solução observando a formação bastante

característica de manchas verdes escura.

2.2.6. Reveladores

• Solução de Vanilina sulfúrica:

Revelador para terpenóides, derivados de fenilpropanóides, compostos

fenólicos, etc.

Capítulo II - Extração, Fracionamento e Isolamento das substâncias 29

__________________________________________________________________________________________

Coloração característica: Para terpenóides e saponinas é violeta após

aquecimento.

Para flavonóis é amarelada após aquecimento.

Para derivados de fenilporpanóides e flavanonas é vermelho carmim.

Composição:

3% de vanilina em solução com 45 mL de água, 45 mL de etanol e 10

mL ácido sulfúrico.

Modo de usar:

Borrifar a cromatoplaca com a solução e em seguida levá-la ao

aquecimento.

2.2.7. Fracionamento dos extratos brutos e purificação das substâncias

2.2.7.1. Fracionamento do extrato metanólico das folhas de S. apetala

O extrato em metanol (34,5 g) foi solubilizado em água e submetido à partição

utilizando acetato de etila seguido de n-butanol resultando em três frações. As frações em

acetato de etila (10,2 g) e n-butanol (15,5 g) foram concentradas em evaporador rotativo e a

fração aquosa (8,40 g) foi liofilizada (Esquema 3).

Fração

butanólica

15,5 g

Fração

aquosa

8,40 g

Fração

AcOEt

10,2 g

Partição

Extrato em

MeOH

34,5 g

* Frações ativas aos testes descritos nos ítens (2.2.5 – 1 e 2).

Esquema 3 - Fracionamento do extrato em metanol.

A fração em AcOEt (10,2 g) foi submetida a processo de precipitação

com Éter Etílico. O precipitado (parte insolúvel) foi cuidadosamente separado

do sobrenadante (parte solúvel) gerando assim duas frações (FA e FB)

(Esquema 4, p.30).

A fração FB solúvel em éter etílico (5,20 g) foi submetida à filtração em

Capítulo II - Extração, Fracionamento e Isolamento das substâncias 30

__________________________________________________________________________________________

gel Sephadex LH-20 com MeOH como eluente. A filtração gerou duas sub-

frações FB1 (3,10 g) e FB2 (1,35 g) (Esquema 4). Uma alíquota da sub-fração

FB1 (350 mg) (Esquema 4, p. 30) foi submetida a uma CCDP utilizando o

seguinte sistema de eluentes: [AcOEt/MeOH/H

O (60:10:8)] produzindo a

saponina (SAFM-01, 70,0 mg) (Figura 12 p.21). Utilizando o mesmo

procedimento aplicado para FB1, uma alíquota de (350 mg) da sub-fração FB2,

produziu a saponina (SAFM-02, 83,0 mg, Figura 12 p.21) (Esquema 4).

SAFM-02

83 mg

SAFM-01

70 mg

CCDP [AcOEt/MeOH/H

O (60:10:8)]

Filtração gel Sephadex LH-20

em MeOH

FB2

(1,35 g)

alíquota 350 mg

FB1

(3,10 g)

alíquota 350 mg

Fração Insolúvel em

Éter etílico -

4,30 g

Fração Solúvel em

Éter etilíco -

5,20 g

Precipitação

Éter Etílico

Fração

AcOEt

10,2 g

Esquema 4 – Isolamento das saponinas das folhas de S. apetala

A fração FA insolúvel em éter etílico (4,30 g) foi cromatografada em

sílica gel RP-18 com [metanol/água (3:2)] obtendo 25 frações (Esquema 5, p

31). Após comparação do perfil cromatográfico utilizando CCDA as mesmas

foram reunidas gerando assim as sub-frações: 1-6 (1,50 g), 7-19 (1,45 g) e 20-

25 (1,08 g).

A sub-fração 7-19 (1,45 g) (Esquema 5, p. 31) após filtração em sílica

gel silanizada eluída com AcOEt saturado em água e metanol em ordem

crescente de polaridade, possibilitou o isolamento do flavonol [SAFM-03, (5,00

mg)] (Figura 13, p. 22).

Capítulo II - Extração, Fracionamento e Isolamento das substâncias 31

__________________________________________________________________________________________

A sub-fração 20-25 (1,08 g) (Esquema 5, p. 31) foi submetida à filtração

com gel Sephadex LH-20 em MeOH, obtendo desta forma o flavonol [SAFM-

04, (35,0 mg)] (Figura 13, p. 22).

Inpurezas

SAFM-04

35,0 mg

Filtração Gel Sephadex LH-20

em MeOH

SAFM-03

5,00 mg

CC sílica silanizada [AcOEt saturado, MeOH]

ordem crescente de polaridade

Sub-fração 20 - 25

1,08 g

Sub-fração 7-19

1,45 g

Sub-fração 1- 6

1,50 g

CC RP-18 em

[MeOH/H

O (3:2)]

Fração Insolúvel em

Éter Etílico -

4,30 g

Fração Solúvel em

Éter Etilíco -

5,20 g

Precipitação

Éter Etílico

Fração

AcOEt

10,2 g

Esquema 5 - Isolamento dos flavonóides das folhas de S. apetala

2.2.7.2. Fracionamento do extrato hexânico da madeira de S. apetala

O extrato hexânico (2,26 g) foi solubilizado em diclorometano e

submetido a processo de precipitação com AcOEt formando duas frações:

[F1sobrenadante (1,03 g)] e [F2 precipitado (1,09 g)] ( Esquema 6, p. 32).

A fração F1 (1,03 g) foi submetida a cromatografia em coluna com sílica

gel em ordem crescente de polaridade (hexano, CH

, MeOH), obtendo assim

47 frações. As mesmas foram analisadas por CCDA e de acordo com perfil

cromatográfico foram reunidas formando as seguintes sub-frações: F1A (115

mg), F1B (110 mg), F1C (355 mg) e F1D (230 mg) (Esquema 6, p. 32).

A sub-fração F1B (110 mg) (Esquema 6, p. 32) após ser submetida à CC

com sílica gel em ordem crescente de polaridade usando (hexano, CH

Capítulo II - Extração, Fracionamento e Isolamento das substâncias 32

__________________________________________________________________________________________

AcOEt, MeOH), possibilitou o isolamento de um estilbeno [SAMH-01, (7,00

mg)] (Figura 14, p. 23) e uma flavanona [SAMH-2 (18,0 mg)] (Figura 13, p. 22).

A sub-fração F1C (355 mg) (Esquema 6) após ser submetida ao mesmo

processo cromatográfico anterior, produziu 19 frações que foram reunidas após

análise por CCDA: 1-9 (21,0 mg), 10-13 (45,3 mg) e 14-19 (33,5 mg). A fração

1-9 (21,0 mg) foi submetida a CCDP [hexano:CH

(3:2)] o qual possibilitou

no isolamento de um triterpeno [SAMH-04 (4,00 mg)] (Figura 14, p. 23). A

fração 14-19 (33,5 mg) foi submetida ao mesmo processo cromatográfico da

fração (1-9) com o sistema de eluentes: [hexano/AcOEt (4:1)], onde foi possível

chegar ao isolamento de um pterocarpano [SAMH-03 (13,0 mg)] (Figura 14, p.

23).

A sub-fração F1D (230 mg) (Esquema 7, página 34) após ser submetida

CC com sílica gel flash usando [éter de petróleo/AcOEt (8:2)], possibilitou o

isolamento de uma mistura de esteróides [SAMH-05a/b/c (35,0 mg)] (Figura

14, p. 23).

CCDP

[Hexano/CH

(3:2)]

SAMH-03

4,00 mg

CC sílica gel

[Hexano, CH

, MeOH]

Fração -

1,09 g

Fração -

1,03 g

Precipitação com

AcOEt

Extrato hexânico

2,26 g

ÁC. graxos

SAMH-04

13,0 mg

CCDP

[Hexano/AcOEt (4:1)]

SAMH-05a/b/c

35,0 mg

CC sílica gel flesh

[Éter de petróleo/AcOEt (8:2)]

Fração 14-19

33,5 mg

Fração 10-13

45,3 mg

Fração 1-9

21,0 mg

SAMH-02

18,0 mg

SAMH-01

7,00 mg

CC sílica gel

[Hexano, CH

, AcOEt, MeOH]

Sub-fração

F1D

230 mg

Sub-fração

F1C

355 mg

Sub-fração

F1B

110 mg

Sub-fração

F1A

115 mg

*Sub-frações ativas ao teste descrito no item (2.2.5.2) p.29.

Esquema 6 – Fracionamento cromatográfico do extrato hexânico

2.3. Referências bibliográficas.

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Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

3.0. Resultados e Discussão

3.1. Determinação Estrutural dos Constituintes Químicos Isolados das Folhas

de Swartzia apetala

O estudo fitoquímico do extrato metanólico das folhas de S. apetala

possibilitou o isolamento e a identificação de duas saponinas triterpênicas

(SAFM-01 e SAFM-02) (Figura 12, p. 21) e dois flavonóides (SAFM-03 e

SAFM-04) (Figura 13, p. 22).

3.1.1. Determinação estrutural da substância SAFM-01.

O tratamento cromatográfico (CCDP [AcOEt/MeOH/H

O (60:10:8)]) da fração

FB1 (Item 2.2.7.1, p. 29-30) forneceu uma substância que apresentou-se como um

sólido branco amorfo, solúvel em MeOH e com faixa de fusão 219-224 ºC.

O espectro de absorção na região do infravermelho (Figura 16, p. 39), da

substância SAFM-01, mostra forte absorção em 3416 cm

-1

correspondente a vibração da

deformação axial de O-H, uma banda de estiramento de grupo carbonila de éster 1736

-1

e bandas intensas de vibrações assimétricas acopladas (C(=O)-O) e (O-C-C) em

1072 cm

-1

e 1043 cm

-1

respectivamente. A banda em 1608 cm

-1

corresponde ao

estiramento (C=C) de grupo olefínico e a banda em 2943 cm

-1

a deformação axial de

grupos metilênicos de hidrocarbonetos cíclicos (Silverstein & Webster, 2000).

As evidências espectrais encontradas para SAFM-01 sugerem tratar-se de uma

saponina triterpenoidal, pois dos 36 átomos de carbono assinalados no espectro de RMN

C-APT (Figuras 20-23, p. 43-46), 30 foram atribuídos a unidade aglicona e os 6

restantes para o resíduo de açúcar. Os espectros de RMN de

H e

C-APT da substância

apresentaram sinais do resíduo aglicona característico do ácido oleanóico (Tabelas 3 e

3’, p. 37-38).

O espectro de RMN

H (Figura 17-19, p. 40-42) mostra sinais característicos de

saponina triterpênica evidenciada pelos sinais relativos aos grupos metila entre δ

0,78-

1,24 (Figura 18, p. 41). O sinal largo em δ

5,41 pode ser atribuído ao hidrogênio H-12.

O resíduo de açúcar pode ser evidenciado pelo sinal do hidrogênio anomérico da

unidade glicopiranosila a δ

6,29 (d, J= 7,3 Hz) que devido ao alto valor da constante de

acoplamento foi assinalado como

-glicopiranosil e os sinais distintos dos hidrogênios

metilênicos a δ

4,75 (d, J= 7,3) e δ

4,71 correspondentes a H-6’a e H-6’b (Figura 19,

p. 42). Os sinais restantes do resíduo de açúcar estão sobrepostos no espectro na região

entre δ

3,50-4,46.

Através da análise dos espectros de RMN

C-APT (Attached Proton Test)

(Figuras 20-23, p. 43-46) foi possível observar a presença dos onze carbonos

metilênicos, dez carbonos metínicos, sete carbonos metílicos e oito átomos de carbonos

não hidrogenados, sugerindo uma estutura triterpênica para a unidade aglicona.

Os triterpenos pertencentes à série olean-12-eno estão caracterizados pela

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

posição dos deslocamentos químicos de CH-12, C-13 e CH-18, que na substância

SAFM-01 aparecem a δ

123,95; 144,01 e 41,62 respectivamente (Mahato & Kundu,

1994). A linha espectral em δ

89,25 é característica de carbono carbinólico e foi

atribuída ao carbono CH-3 do esqueleto triterpênica.

O mapa de correlação heteronuclear com detecção no canal de hidrogênio

HMQC (

) (Figuras 24-26, p. 47-49) permitiu verificar os deslocamentos químicos

dos hidrogênios ligados aos respectivos carbonos, possibilitando desse modo associar

inequivocamente a absorção dos carbonos dos grupos metilas com os respectivos

hidrogênios, do hidrogênio olefínico e o carbono C-12, do hidrogênio H-3 e o carbono

carbinólico C-3. O sinal do hidrogênio anomérico H-1’a δ

(6,29) é observado através

do sinal

com C-1’ δ

(95,63) (Figura 24, p. 47).

A atribuição dos deslocamentos químicos dos grupos metilas também pode ser

confirmada considerando-se as interações 1,3-sin-diaxiais existentes na molécula

conforme observado na figura 15 (Mahato & Kundu 1994). As metilas em conformação

axial não estão situadas no dentro do cone de desblindagem provocado pelo efeito

anisotopico dos elétrons σ da ligação C-C.

Figura 15 - Interações 1,3-sin-diaxiais da substância SAFM-01

O mapa de correlação heteronuclear a longa distância HMBC (

, n=2 e n=3)

(Figuras 27-29, p. 50-52) permitiu definir inequivocamente a posição do resíduo de

açúcar em C-28 devido ao acoplamento a longa distância existente entre C-28 a δ

(176,34) da aglicona e H-1’ a δ

(6,29) da unidade

-glicopiranosil (Figura 27, p. 50).

Os demais acoplamentos revelados pelo espectro da substância SAFM-01 estão

resumidos nas tabelas 3 e 3’ , p. 37 e 38.

Os dados espectrais apresentados para substância SAFM-01 e a comparação

com dados da literatura (Wen-Cai Ye et al., 2000) possibilitou confirmar a estrutura do

3-hidroxi-olean-12-en-28-acetato de-O-

-D-glicopiranosila.

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

Tabela 3 - Dados espectrais de RMN

C e

H da saponina SAFM-01 em Py-d

Deslocamentos químicos em ppm.

C δ

(Wen-Cai Ye et al., 2000)

4 39,31 39,4 - 3H-23; 3H-24 -

8 39,77 39,8 - 3H-26 3H-27

10 36,78 36,9 - - -

13 144,01 144,0 - - 3H-27

14 42,01 42,00 - 3H-27 3H-26

17 46,88 46,9 - - -

20 30,61 30,7 - 3H-29; 3H-30 -

28 176,36 176,4 - - H-1’

3 89,25 88,9 3,28 (d, 8,4) - 3H-23; 3H-24

5 55,66 55,7 0,67 (m) - 3H-23; 3H-24

9 47,86 47,9 1,56 - 3H-25; 3H-26

12 123,95 122,9 5,41 (s) - -

18 41,62 41,6 3,17 (d, 13,2) - -

1 38,55 38,8 - H-5

2 26,21 26,6 - -

6 18,36 18,4 - -

7 33,92 33,00 - 3H-26

11 23,30 23,7 - -

15 28,14 28,2 - -

16 23,64 23,3 - -

19 46,12 46,2 - 3H-29; 3H-30

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

21 31,94 33,9 - 3H-29; 3H-30

22 32,39 32,5 - -

23 28,09 28,8 1,23 (s) - 3H-24

24 16,83 17,00 0,90 (s) - H-5; 3H-23

25 15,39 15,5 0,78 (s) - -

26 18,51 17,4 1,05 (s) - -

27 25,97 26,00 1,24 (s) - -

29 33,03 33,1 0,88 (s) - 3H-30

30 23,55 33,6 0,87 (s) - 3H-29

Tabela 3’ - Dados espectrais da unidade glicosídica da saponina SAFM-01.

C δ

C literatura

 δ

1’ 95,63 95,7 6,29 (d, 7,3)

- H-5’

2’ 73,98 74,1 4,27 (t, 8,8)

H-3’ -

3’ 79,15

78,8 4,35-4,39

H-2’ -

4’ 71,02 71,0 3,61-3,69 (m)

H-3’ -

5’ 78,73

79,3

4,19 H-4’ -

6’ 62,12 62,1

4,75 (d, 7,3)

4,71(sl)

- -

** Valores intertrocáveis

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

100

110

592

669

1043

1072

1261

1385

1414

1608

1736

2943

3416

% T

-1

-C

-C=O

-C(=O)-O

-C-OH

-C=C

Figura 16 - Espectro de infravermelho da substância SAFM-01

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

abunda nce

-3 0.0 -10.0 10.0 30.0 50.0 70 .0 9 0.0 11 0.0 130. 0 150 .0 17 0.0 1 90.0 210.0 2 30.0

X : parts per Million : 1H

6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0

6.3 030

6.2 847

5.4 064

4.7 461

4.7 095

4.6 023

4.3 706

4.2 928

4.2 708

4.2 516

4.2 506

4.0 198

3.9 979

3.8 779

3.6 846

3.6 444

3.6 068

3.2 945

3.2 734

3.1 846

3.1 516

2.0 599

2.0 544

1.9 610

1.9 290

1.7 000

1.6 872

1.5 626

1.2 888

1.2 448

1.2 274

1.0 553

0.9 161

0.9 005

0.8 675

0.6 651

Filename = SAFM03P_1d_spectrum-3

Author = Jan Schripsema

Experiment = single_pulse.exp

Sample_id = SAFM03P

Solvent = PYRIDINE-D5

Creation_time = 16-APR-2004 19:56:01

Revision_time = 12-APR-2007 19:33:36

Current_time = 12-APR-2007 19:40:52

Comment = Single Pulse Experime

Data_format = 1D COMPLEX

Dim_size = 16384

Dim_title = 1H

Dim_units = [ppm]

Dimensions = X

Site = Eclipse+ 400

Spectrometer = DELTA_NMR

Field_strength = 9.389766[T] (400[MHz]

X_acq_duration = 2.7312128[s]

X_domain = 1H

X_freq = 399.78219838[MHz]

X_offset = 7[ppm]

X_points = 16384

X_prescans = 0

X_resolution = 0.36613771[Hz]

X_sweep = 5.99880024[kHz]

Mod_return = 1

Scans = 8

X_90_width = 14.7[us]

X_acq_time = 2.7312128[s]

X_angle = 45[deg]

X_pulse = 7.35[us]

Initial_wait = 1[s]

Phase_preset = 3[us]

Recvr_gain = 15

Relaxation_delay = 4[s]

Temp_get = 25[dC]

Unblank_time = 2[us]

’

OGli

Figura 17- Espectro de RMN

H da substância SAFM-01

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

ab unda nce

-10. 0 10.0 3 0.0 50.0 7 0.0 90.0 110 .0 130 .0 1 50.0 170 .0 1 90.0 210 .0 2 30.0 250 .0 27 0.0

X : parts per Million : 1H

2.4 2.3 2.2 2.1 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7

2.0 599

2.0 544

1.9 610

1.9 290

1.7 000

1.6 872

1.5 626

1.3 914

1.3 758

1.2 888

1.2 448

1.2 274

1.0 553

0.9 738

0.9 518

0.9 161

0.9 005

0.8 803

0.8 675

0.8 300

0.7 814

0.6 651

OGli

Figura 18 - Ampliação do espectro RMN

H da substância SAFM-01 (região de 0,66 a

2,4 ppm)

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

ab un da nce

-2 0.0 -10.0 0 10.0 20 .0 3 0.0 40.0 50 .0 60.0 70. 0 8 0.0 90.0 10 0.0 110.0

X : parts per Million : 1H

4.8 4.7 4.6 4.5 4.4 4.3 4.2 4.1 4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 3.2 3.1

4.7 644

4.7 461

4.7 095

4.6 023

4.4 595

4.4 347

4.3 917

4.3 706

4.3 468

4.3 239

4.2 928

4.2 708

4.2 516

4.2 506

4.2 369

4.2 11 3

4.1 911

4.1 700

4.1 334

4.0 198

3.9 979

3.9 567

3.9 447

3.9 310

3.8 935

3.8 816

3.8 779

3.8 696

3.6 966

3.6 846

3.6 709

3.6 444

3.6 068

3.2 945

3.2 734

3.1 846

3.1 516

H - 2’

’

H -

4’

’

Figura 19 - Ampliação do espectro RMN

H da substância SAFM-01 (região de 3,1 a 4,8

ppm)

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

(T h ou san ds )

-1.0 0 1 .0 2.0

X : parts per Million : 13C

170.0 160.0 150.0 140.0 130.0 120.0 110.0 100.0 90.0 80.0 70.0 60.0 50.0 40.0 30.0 20.0

176.3 464

144.0 154

123.9 500

95.6 336

89.2 485

79.1 546

78.7 264

73.9 777

71.0 183

62.1 250

55.6 634

47.8 636

46.8 848

46.1 201

42.0 061

41.6 237

39.7 732

39.3 067

38.5 497

36.7 833

33.0 286

28.0 888

23.5 465

23.3 018

18.3 619

16.8 326

15.3 949

Filename = SAFM01P_apt_copy-2.jd

Author = Jan Schripsema

Experiment = apt.exp

Sample_id = SAFM03P

Solvent = PYRIDINE-D5

Creation_time = 14-APR-2004 11:35:43

Revision_time = 19-APR-2007 08:45:41

Current_time = 19-APR-2007 08:47:53

Content = APT Experiment

Data_format = 1D COMPLEX

Dim_size = 32768

Dim_title = 13C

Dim_units = [ppm]

Dimensions = X

Site = Eclipse+ 400

Spectrometer = DELTA_NMR

Field_strength = 9.389766[T] (400[MHz]

X_acq_duration = 1.3008896[s]

X_domain = 13C

X_freq = 100.52530333[MHz]

X_offset = 100[ppm]

X_points = 32768

X_prescans = 4

X_resolution = 0.76870474[Hz]

X_sweep = 25.18891688[kHz]

Irr_domain = 1H

Irr_freq = 399.78219838[MHz]

Irr_offset = 5[ppm]

Mod_return = 1

Scans = 21726

X_90_width = 10[us]

X_acq_time = 1.3008896[s]

X_angle = 45[deg]

X_pulse = 5[us]

Initial_wait = 1[s]

J_constant = 140[Hz]

Phase_preset = 3[us]

Recvr_gain = 15

Relaxation_delay = 1[s]

Temp_get = 25[dC]

Unblank_time = 2[us]

’

Figura 20 - Espectro de RMN

C-APT da substância SAFM-01

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

(Th ousan ds )

-1.0 -0.9 - 0.8 - 0.7 -0.6 -0.5 - 0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

X : parts per Million : 13C

35.0 34.0 33.0 32.0 31.0 30.0 29.0 28.0 27.0 26.0 25.0 24.0 23.0 22.0 21.0 20.0 19.0 18.0 17.0 16.0 15.0

33.9 233

33.0 286

32.3 863

31.9 428

30.6 122

28.1 423

28.0 888

26.2 153

25.9 706

23.6 459

23.5 465

23.3 018

18.5 072

18.3 619

16.8 326

15.3 949

OGli

2930

Figura 21 - Ampliação do espectro RMN

C-APT da substância SAFM-01 (região de 15

a 35 ppm)

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

(T h ou san ds )

- 1.0 - 0.9 - 0.8 - 0.7 - 0.6 - 0.5 - 0.4 - 0.3 - 0.2 - 0.1 0 0. 1 0. 2 0. 3 0 .4 0 .5 0 .6 0 .7 0 .8 0 .9

X : parts per Million : 13C

57.0 56.0 55.0 54.0 53.0 52.0 51.0 50.0 49.0 48.0 47.0 46.0 45.0 44.0 43.0 42.0 41.0 40.0 39.0 38.0 37.0

55.6 634

47.8 636

46.8 848

46.1 201

42.0 061

41.6 237

39.7 732

39.3 067

38.5 497

36.7 833

OGli

Figura 22 - Ampliação do espectro RMN

C-APT da substância SAFM-01 (região de 36

a 57 ppm)

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

(T h ou sa n ds )

- 1 .0 - 0 .9 - 0 .8 - 0 .7 - 0 .6 - 0 .5 - 0 .4 - 0 .3 - 0 .2 - 0.1 0 0 . 1 0. 2 0. 3 0 .4 0 .5 0 .6 0 .7 0 .8 0 .9

X : parts per Million : 13C

82.0 81.0 80.0 79.0 78.0 77.0 76.0 75.0 74.0 73.0 72.0 71.0 70.0 69.0 68.0 67.0 66.0 65.0 64.0 63.0 62.0

79.1 546

78.7 264

73.9 777

71.0 183

62.1 250

’

Figura 23 - Ampliação do espectro RMN

C-APT da substância SAFM-01 (região de 62

a 82 ppm)

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

X : parts per Million : 1H

6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0

Y : parts per Million : 13C

130.0 120.0 110.0 100.0 90.0 80.0 70.0 60. 0 50.0 40.0 30 .0 20.0 10.0

(Thousands)

0 10.0 20.0

abundance

0 200.0 400.06 00.0

Filename = SAFM01P_pfg_hmqc-2.jd

Author = Jan Schripsema

Experiment = hmqc_irr_pfg_s.e

Sample_id = SAFM03P

Solvent = PYRIDINE-D5

Creation_time = 18-APR-2004 14:01:01

Revision_time = 16-APR-2007 22:02:11

Current_time = 16-APR-2007 22:09:19

Content = gradient enhanced HMQ

Data_format = 2D REAL REAL

Dim_size = 1024, 256

Dim_title = 1H 13C

Dim_units = [ppm] [ppm]

Dimensions = X Y

Site = Eclipse+ 400

Spectrometer = DELTA_NMR

Field_strength = 9.389766[T] (400[MHz]

X_acq_duration = 0.2561024[s]

X_domain = 1H

X_freq = 399.78219838[MHz]

X_offset = 5[ppm]

X_points = 1024

X_prescans = 4

X_resolution = 3.90468812[Hz]

X_sweep = 3.99840064[kHz]

Y_domain = 13C

Y_freq = 100.52530333[MHz]

Y_offset = 100[ppm]

Y_points = 128

Y_prescans = 0

Y_resolution = 157.51008065[Hz]

Y_sweep = 20.16129032[kHz]

Mod_return = 1

Scans = 256

X_acq_time = 0.2561024[s]

X_pulse = 14.7[us]

Y_acq_time = 6.3488[ms]

Y_pulse = 9.5[us]

Grad_1 = 1[ms]

Grad_1_amp = 10[pnt]

Grad_1_value = 10[pnt*ms]

Grad_2 = 1[ms]

Grad_2_amp = 10[pnt]

Grad_2_value = 10[pnt*ms]

Grad_3 = 1[ms]

Grad_3_amp = 5[pnt]

Grad_3_value = 5[pnt*ms]

Grad_recover = 0.2[ms]

Grad_selection = 13C = 2:2:1

Grad_shape = square

Grad_type = 0

Initial_wait = 0.1[s]

J_constant = 140[Hz]

Phase_preset = 3[us]

Recvr_gain = 15

Refocus_comp = 2.57142857[ms]

Relaxation_delay = 2[s]

T1 = 1[us]

Temp_get = 25[dC]

Unblank_time = 2[us]

C-1’

H-1’

Figura 24 - Espectro de HMQC da substância SAFM-01

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

X : parts per Million : 1H

1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8

Y : p arts per Milli on : 1 3C

35.0 34.0 33.0 32.0 31. 0 30 .0 29 .0 28 .0 2 7.0 2 6.0 25.0 24.0 23.0 22.0 21.0 20.0 19. 0 18 .0 17 .0 1 6.0 1 5.0 1 4.0 13.0 12.0 11.0

(Thousands)

0 1.0

a bund an ce

0 1 00.0 200.0

C-6

2H-6

C-26

3H-26

C-24

3H-24

C-25

3H-25

C-29

3H-29

C-30

3H-30

C-27

3H-27

C-23

3H-23

C-25

C-24

C-6

C-26

C-30

C-27

C-23

C-20

C-22

C-21

C-29

C-10

Figura 25 - Ampliação do espectro de HMQC da substância SAFM-01

(região de 0,7 a 1,8 ppm)

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

X : parts per Million : 1H

4.7 4.6 4.5 4.4 4.3 4.2 4.1 4.0 3.9 3.8 3.7 3.6

Y : p art s pe r M illio n : 1 3C

82.08 1 .0 8 0.0 79.0 7 8.0 77 .0 7 6.0 75.0 74.0 73. 0 7 2.0 71.0 70.0 6 9. 0 68 .0 67.0 66.0 65.0 64 .0 6 3.0 62.0 6 1.0 60 .0 5 9.0 5 8.0 57.056.0

abundance

-400.0 -100.0 200.0 500.0

ab u nd an ce

0 1 00.0

C-4’

C-3’

C-6’

C-5’

’

H - 3 ’

2 H -6 ’

C-6’

2H-6’

C-4’

H-4’

C-5’

H-5’

C-3’

H-3’

Figura 26 - Ampliação do espectro de HMQC da substância SAFM-01

(região de 3,6 a 4,7 ppm)

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

X : parts per Million : 1H

6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0

Y : parts p er Mil lion : 13C

170 .0 160.0 150 .0 140.0 13 0.0 120.0 110.0 100.0 90 .0 80.0 70 .0 60.0 50 .0 40.0 30 .0 20.0

(Thousands)

0 10.0

ab u nd an ce

0 3 00.0 6 00.0

Filename = SAFM01P_pfg_hmbc-2.jd

Author = Jan Schripsema

Experiment = hmbc_pfg_s.exp

Sample_id = SAFM03P

Solvent = PYRIDINE-D5

Creation_time = 17-APR-2004 17:21:30

Revision_time = 16-APR-2007 22:34:42

Current_time = 16-APR-2007 22:39:15

Content = gradient enhanced HMB

Data_format = 2D REAL REAL

Dim_size = 1024, 512

Dim_title = 1H 13C

Dim_units = [ppm] [ppm]

Dimensions = X Y

Site = Eclipse+ 400

Spectrometer = DELTA_NMR

Field_strength = 9.389766[T] (400[MHz]

X_acq_duration = 0.2561024[s]

X_domain = 1H

X_freq = 399.78219838[MHz]

X_offset = 5[ppm]

X_points = 1024

X_prescans = 4

X_resolution = 3.90468812[Hz]

X_sweep = 3.99840064[kHz]

Y_domain = 13C

Y_freq = 100.52530333[MHz]

Y_offset = 100[ppm]

Y_points = 128

Y_prescans = 0

Y_resolution = 157.51008065[Hz]

Y_sweep = 20.16129032[kHz]

Mod_return = 1

Scans = 256

X_acq_time = 0.2561024[s]

X_pulse = 14.7[us]

Y_acq_time = 6.3488[ms]

Y_pulse = 9.5[us]

Grad_1 = 1[ms]

Grad_1_amp = 10[pnt]

Grad_1_value = 10[pnt*ms]

Grad_2 = 1[ms]

Grad_2_amp = 10[pnt]

Grad_2_value = 10[pnt*ms]

Grad_3 = 1[ms]

Grad_3_amp = 5[pnt]

Grad_3_value = 5[pnt*ms]

Grad_recover = 0.2[ms]

Grad_selection = 13C = 2:2:1

Grad_shape = square

Grad_type = 0

Initial_wait = 1[s]

J_constant = 140[Hz]

Long_range_j = 8[Hz]

Phase_preset = 3[us]

Recvr_gain = 15

Relaxation_delay = 2[s]

T1 = 1[us]

Temp_get = 25[dC]

Unblank_time = 2[us]

C-13

3H-27

C-28

H-1’

C-1’

H-5’

C-3’

H-4’

C-4’

H-3’

O H

Figura 27 - Espectro de HMBC da substância SAFM-01

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

X : parts per Million : 1H

1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6

Y : pa rts p er M i llion : 13C

50. 0 40.0 30.0 2 0.0

(Thousands)

-1.0 0

ab un da nc e

0 100 .0 2 00 .0

-6

-24

-26

---------------CH

-30

-11

-16

-27

-2

-23

-15

C-20

-22

-21

-29

-7

C-10

-1

C-4

C-8

CH-18

C-14

-19

C-17

CH-9

CH-5

-24

H-5

-30

3H-29

-24

3H-23

-23

3H-24

-29

3H-30

-7

3H-26

-1

2H-5

CH-5

3H-23

CH-5

3H-24

CH-9

3H-26

C-4

3H-23

C-8

3H-27

C-8

3H-26

C-4

3H-24

-19

3H-29; 30

C-20

3H-29; 30

Figura 28 – Ampliação do espectro de HMBC da substância SAFM-01

(região de 0,6 a 1,5 ppm)

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

X : parts per Million : 1H

1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7

Y : p art s pe r Millio n : 1 3C

9 0.0 80 .0 70.0 60.0 5 0.0

(Thousands)

-1.0 0

ab un da nce

0 100 .0 200 .0

CH-5

CH-3

3H-24

CH-5

3H-23

CH-5

3H-24

CH-3

3H-23

CH-3

Figura 29 – Ampliação do espectro de HMBC da substância SAFM-01

(região de 0,7 a 1,7 ppm)

3.1.2. Determinação estrutural da substância SAFM-02.

O tratamento cromatográfico (CCDP) da fração FB2 (Item 2.2.7.1, p. 29-30)

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

forneceu uma substância que apresentou-se como um sólido branco amorfo, solúvel em

MeOH e com faixa de fusão 209-216 ºC.

O espectro de absorção na região do infravermelho (Figura 30, p. 57), da

substância SAFM-02, mostra forte absorção em 2924 cm

-1

correspondente a vibração da

deformação axial de grupo alinfático (-C-H), uma banda intensa de estiramento de

grupo carbonila de éster em 1755 cm

-1

e bandas intensas de vibrações assimétricas

acopladas (C(=O)-O) e (O-C-C) em 1076 cm

-1

e 1039 cm

-1

respectivamente. A banda

em 2852 cm

-1

corresponde a deformação axial de grupos metilênicos e metínicos de

hidrocarbonetos cíclicos (Silverstein & Webster, 2000).

O espectro de RMN

H de SAFM-02 (Figuras 31-35, p. 58-62)

apresentou sete sinais simples relativos aos hidrogênios dos grupos metila na

região de δ

(0,78-1,14) revelando o esqueleto triterpênico para a substância e

um sinal duplo a δ

(1,23; d, J= 6,6) que foi atribuído aos hidrogênios do grupo

metila 3H-6’” do resíduo de ramnose acoplando com o hidrogênio H-5’” a δ

(4,07; (m)), que foi confirmado através da correlação existente entre esses

hidrogênios no mapa de correlação homonuclear COSY (Figura 36, p. 63).

Através do número de linhas espectrais revelado pelo espectro de RMN

C-APT (Figuras 37-39, p. 64-66) foi possível observar a presença de 47

sinais, sendo [7 carbonos não hidrogenados; 19 carbonos metinos CH dos

quais 9 são carbinólicos a δ

(90,89; 73,94; 78,29; 69,75; 71,17; 78,67; 72,32;

72,70; 74,16) ; 5 fazendo parte ao grupo éter]; 12 metilênicos CH

, sendo dois

oximetilênicos a δ

CH2

(62,45 e 68,56) e 8 metílicos CH

O sinal a δ

177,97 confirma a função detectada no espectro de

infravermelho através da banda forte a 1755 cm

-1

referente a estiramento de

grupo C=O de éster (Figura 30, p. 57). As interações 1,3-sin-diaxias

observadas nos grupos metilas C-24, C-25 e C-26 de SAFM-01 também

aparecem na substância SAFM-02 confirmando sua estereoquímica.

O mapa de correlação heteronuclear a uma ligação HMQC (

) auxiliou

no assinalamento inequívoco dos carbonos metílicos com os respectivos

hidrogênios, do carbono olefínico C-12 com o respectivo hidrogênio as demais

correlações estão resumidas nas figuras 40-41, p. 67-68.

O mapa de correlação heteronuclear HMBC (Figura 42-43, p. 69-70) nos

auxiliou nas atribuições dos deslocamentos químicos dos átomos de carbono,

principalmente os não hidrogenados revelando o acoplamento entre o átomo

de carbono não hidrogenado C-28 e o hidrogênio anomérico H-1’, o carbono

CH-2” e o hidrogênio anomérico H-1”, o carbono metínico CH-3 e o hidrogênio

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

anomérico H-1”, o carbono metínico CH-3” e o hidrogênio H-2”, carbono

metínico CH-4” e os hidrogênios 2H-5” e H-1”’. Essas correlações confirmam as

ligações do resíduo de glicose ao carbono C-28 da aglicona e a ligação do

resíduo de ranmose ligado ao CH-4” de um resíduo de xilose e este ligado ao

CH-3 da aglicona.

A análise do conjunto de dados juntamente com a comparação com dados da literatura

(Wen-Cai Ye et al., 2000), possibilitou confirmar a estrutura da substância SAFM-02 como

sendo a 3-O-

-D-xilopiranosil-(1’”→4”)-O-

-D-ramnopiranosil-olean-12-em-28-acetato de -

-D-

glicopiranosila.

Pelo melhor do nosso conhecimento, a substância SAFM-02 está sendo

citada pela primeira vez na literatura.

2324

25 26

1'"

2'"

3'"

4'"

5'"

6'"

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

Tabela 4 - Dados espectrais de RMN

C e

H da saponina SAFM-02 em

OD. Deslocamentos químicos δ

(em ppm).

(Wen-Cai Ye et

al., 2000)

4 40,18 39,4 - 3H-23; 3H-24

8 40,70 39,8 - 3H-26 3H-27

10 37,88 36,9 - H-9

13 144,75 144,0 - H-18 3H-27

14 42,91 42,00 - 3H-27 H-12; 3H-26

17 48,07 46,9 -

20 31,52 30,7 - 3H-29; 3H-30

28 177,97 176,4 - H-1’’’

3 90,89 88,9 3,17(dd,11,3; 3,7) H-1’; 3H-23; 3H-24

5 56,94 55,7 0,77 (dl) 3H-23; 3H-24; 3H-25

9 48,79 47,9 1,57 (d, 7,0) H-12; 3H-25; 3H-26

12 123,86 122,9 5,24 (sl) H-18

18 42,62 41,6 2,83 (dd,7,0; 3,6) H-12

1 39,82 38,8 3H-25

2 26,89 26,6 2,01; 1,69

6 19,35 18,4 1,70; 1,39

7 34,94 33,00 1,51; 1,49 3H-26

11 24,01 23,7 1,88

15 28,89 28,2 3H-27

16 24,58 23,3

19 47,17 46,2 1,72; 1,20 3H-29; 3H-30

21 33,14 33,9 3H-29; 3H-30

22 33,95 32,5

23 28,57 28,8 1,03 (s) 3H-24

24 17,04 17,00 0,83 (s) 3H-23

25 16,04 15,5 0,92 (s)

26 17,89 17,4 0,78 (s)

27 26,29 26,00 1,14 (s)

29 33,47 33,1 0,90 (s)

30 23,98 33,6 0,93 (s) 3H-29

Tabela 4’ - Dados espectrais das unidades glicosídicas da saponina SAFM-02

(Wen-Cai Ye

et al., 2000)

1’ 95,70

95,7

4,33 (d, 8,04) H-2’

2’ 73,94

73,9

3,33

3’ 78,29

78,3

3,38 H-2’

4’ 69,75

71,1

3,50 2H-5’ H-1”

5’ 76,16

78,7

3,79

6’ 62,45

62,4

3,82

1” 106,48

105,2

5,17 (s)

2” 71,17

75,2

3,93 (m) H-1”

3” 78,67

77,6

3,57

4” 83,60

71,2

3,69 3H-6”

5” 68,56

66,9

4,08 (m) 3H-6”

1’” 102,44 5,37 (d, 7,7)

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

2’” 72,32 3,30

3’” 72,70 3,71

4’” 74,16 3,36

5’” 69,16 3,64 (m)

6’” 17,76 1,23 (d, 6,6) H-1”

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

3000 2000 1000

100

600

908

982

1039

1076

1225

1373

1464

1755

2852

2924

% T

-1

-C(=O)-O

-C-OH

-C

-H

-C=O

-CH-

-C

Figura 30 - Espectro de infravermelho da substância SAFM-02

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

abundance

0 100.0 200.0

X : parts per Million : 1H

5.0 4.0 3.0 2.0 1.0

5.3780

5.3588

5.2407

5.1729

4.6133

4.3413

4.3212

4.1032

4.0867

4.0775

3.9255

3.7945

3.7057

3.6956

3.5161

3.5024

3.3513

3.3339

3.1873

3.1782

2.8631

2.8540

2.8293

2.0462

2.0380

1.8914

1.8722

1.7018

1.6890

1.5810

1.5636

1.2787

1.2366

1.2201

1.1423

1.0342

0.9216

0.8272

0.7842

Filename = SAFM02_1d_spectrum-2.

Author = Jan Schripsema

Experiment = single_pulse.exp

Sample_id = SAFM06_

Solvent = METHANOL-D3

Creation_time = 17-SEP-2004 19:14:49

Revision_time = 12-APR-2007 20:03:58

Current_time = 12-APR-2007 20:04:30

Comment = Single Pulse Experime

Data_format = 1D COMPLEX

Dim_size = 16384

Dim_title = 1H

Dim_units = [ppm]

Dimensions = X

Site = Eclipse+ 400

Spectrometer = DELTA_NMR

Field_strength = 9.389766[T] (400[MHz]

X_acq_duration = 2.7312128[s]

X_domain = 1H

X_freq = 399.78219838[MHz]

X_offset = 7[ppm]

X_points = 16384

X_prescans = 0

X_resolution = 0.36613771[Hz]

X_sweep = 5.99880024[kHz]

Mod_return = 1

Scans = 8

X_90_width = 14.7[us]

X_acq_time = 2.7312128[s]

X_angle = 45[deg]

X_pulse = 7.35[us]

Initial_wait = 1[s]

Phase_preset = 3[us]

Recvr_gain = 15

Relaxation_delay = 4[s]

Temp_get = 29.3[dC]

Unblank_time = 2[us]

’

”

2324

1'"

2'"

3'"

4'"

5'"

6'"

Figura 31 - Espectro de RMN

H da substância SAFM-02

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

abundance

10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0 100.0 110.0 120.0 130.0 140.0 150.0 160.0 170.0 180.0 190.0 200.0 210.0 220.0

X : parts per Million : 1H

1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7

1.3135

1.2787

1.2366

1.2201

1.1423

1.0809

1.0342

0.9353

0.9216

0.9014

0.8272

0.7842

0.7530

’

”

2324

1'"

2'"

3'"

4'"

5'"

6'"

Figura 32 - Ampliação do espectro de RMN

H da substância SAFM-02

(região de 0,7 a 1,4 ppm)

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

abundance

0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0

X : parts per Million : 1H

2.1 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4

2.0462

2.0380

1.8914

1.8722

1.7247

1.7138

1.7018

1.6890

1.6130

1.5810

1.5636

1.5388

1.5086

1.3923

1.3868

1.3602

OGli

Figura 33 – Ampliação do espectro de RMN

H da substância SAFM-02

(região de 1,3 a 2,1 ppm)

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

abundance

0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0 100.0 110.0 120.0 130.0

X : parts per Million : 1H

3.8 3.7 3.6 3.5 3.4

3.82 11

3.79 45

3.72 86

3.72 04

3.70 57

3.69 56

3.67 82

3.65 72

3.64 89

3.63 89

3.58 85

3.56 74

3.53 72

3.51 61

3.50 24

3.48 13

3.40 62

3.38 24

3.35 68

3.35 13

3.33 39

”

’

”

’

”

’

2324

1' "

2'"

3'"

4'"

5'"

6'"

Figura 34 - Ampliação do espectro de RMN

H da substância SAFM-02

(região de 3,3 a 3,9 ppm)

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

abundance

0 10.0 20.0 30.0

X : parts per Million : 1H

4.354.344.33 4.324.31 4.3 4.294.28 4.274.26 4.254.244.23 4.224.21 4.2 4.194.184.174.16 4.154.144.13 4.124.11 4.1 4.094.08 4.074.06 4.054.044.03 4.024.01 4.0 3.993.983.973.96 3.953.943.93 3.92 3.91

4.3 4 13

4.3 2 12

4.1 0 32

4.0 8 67

4.0 7 75

4.0 6 29

4.0 4 73

3.9 3 28

3.9 2 92

3.9 2 55

3.9 2 09

”

’

”

1'"

2'"

3'"

4'"

5'"

6'"

Figura 35 - Ampliação do espectro de RMN

H da substância SAFM-02

(região de 3,9 a 4,35 ppm)

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

X : parts per Million : 1H : RANGED

5.0 4.0 3.0 2.0 1.0

Y : pa rt s p er Mi llion : 1H : R AN GED

5.0 4.0 3 .0 2.0 1.0

abundance

0 100.0 200.0

ab un da nce

0 1 00.0 200 .0

Filename = SAFM02_cosy-2.jdf

Author = Jan Schripsema

Experiment = cosy.exp

Sample_id = SAFM06

Solvent = METHANOL-D3

Creation_time = 18-SEP-2004 12:55:57

Revision_time = 25-APR-2007 16:45:38

Current_time = 25-APR-2007 16:53:47

Content = absolute value COSY

Data_format = 2D REAL REAL

Dim_size = 512, 1024

Dim_title = 1H 1H

Dim_units = [ppm] [ppm]

Dimensions = X Y

Site = Eclipse+ 400

Spectrometer = DELTA_NMR

Field_strength = 9.389766[T] (400[MHz]

X_acq_duration = 0.1163776[s]

X_domain = 1H

X_freq = 399.78219838[MHz]

X_offset = 5[ppm]

X_points = 512

X_prescans = 4

X_resolution = 8.59271887[Hz]

X_sweep = 4.39947206[kHz]

Y_domain = 1H

Y_freq = 399.78219838[MHz]

Y_offset = 5[ppm]

Y_points = 256

Y_prescans = 0

Y_resolution = 17.18543775[Hz]

Y_sweep = 4.39947206[kHz]

Mod_return = 1

Scans = 150

X_90_width = 14.7[us]

X_acq_time = 0.1163776[s]

X_pulse = 14.7[us]

Y_acq_time = 58.1888[ms]

Initial_wait = 1[s]

Phase_preset = 3[us]

Pulse_1 = 14.7[us]

Pulse_2 = 14.7[us]

Pulse_angle_1 = 90[deg]

Pulse_angle_2 = 90[deg]

Recvr_gain = 15

Relaxation_delay = 1.5[s]

T1 = 1[us]

Temp_get = 31.4[dC]

Unblank_time = 2[us]

’

”

’

”

’

”

’

H-1’”

”

’

”

’

”

Figura 36 - Espectro de COSY (

H x

H) da substância SAFM-02

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

abundance

-400.0 -300.0 -200.0 -100.0 0 100.0 200.0 300.0 400.0 500.0

X : parts per Million : 13C

180.0 170.0 160.0 150.0 140.0 130.0 120.0 110.0 100.0 90.0 80.0 70.0 60.0 50.0 40.0 30.0 20.0

177.9738

144.7480

123.8567

106.4677

102.4455

95.7009

90.8987

83.6265

78.6636

78.3042

74.1749

73.9302

72.3932

72.3014

62.4752

57.0076

48.0684

47.1355

42.6009

40.1692

37.9057

33.9982

33.5011

33.1341

30.7329

28.5689

24.6001

23.9654

19.5073

17.8785

17.7638

Filename = ESPC SAFM-02-2.jdf

Author = Jan Schripsema

Experiment = apt.exp

Sample_id = SAFM06

Solvent = METHANOL-D3

Creation_time = 4-FEB-2004 17:07:25

Revision_time = 23-APR-2007 23:16:44

Current_time = 23-APR-2007 23:18:24

Content = APT Experiment

Data_format = 1D COMPLEX

Dim_size = 32768

Dim_title = 13C

Dim_units = [ppm]

Dimensions = X

Site = Eclipse+ 400

Spectrometer = DELTA_NMR

Field_strength = 9.389766[T] (400[MHz]

X_acq_duration = 1.3008896[s]

X_domain = 13C

X_freq = 100.52530333[MHz]

X_offset = 100[ppm]

X_points = 32768

X_prescans = 4

X_resolution = 0.76870474[Hz]

X_sweep = 25.18891688[kHz]

Irr_domain = 1H

Irr_freq = 399.78219838[MHz]

Irr_offset = 5[ppm]

Mod_return = 1

Scans = 7920

X_90_width = 10[us]

X_acq_time = 1.3008896[s]

X_angle = 45[deg]

X_pulse = 5[us]

Initial_wait = 1[s]

J_constant = 140[Hz]

Phase_preset = 3[us]

Recvr_gain = 15

Relaxation_delay = 1[s]

Temp_get = 25.1[dC]

Unblank_time = 2[us]

”

’

”

20 21

2324

25 26

1'"

2'"3'"

4'"

5'"

6'"

Figura 37 - Espectro de RMN

C-APT da substância SAFM-02

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

abundance

-400.0 -300.0 -200.0 -100.0 0 100.0 200.0 300.0 400.0 500.0 600.0 700.0 800.0 900.0

X : parts per Million : 13C

50.0 49.0 48.0 47.0 46.0 45.0 44.0 43.0 42.0 41.0 40.0 39.0 38.0 37.0 36.0 35.0 34.0 33.0 32.0 31.0 30.0 29.0 28.0 27.0 26.0 25.0 24.0 23.0 22.0 21.0 20.0 19.0 18.0 17.0 16.0

48.7872

48.0684

47.1737

42.9068

42.6162

40.7045

40.1845

39.8251

37.8828

33.4705

33.1417

31.5206

28.8977

28.5689

26.8866

26.2977

24.5772

23.9807

19.5073

19.3467

17.8862

17.7562

17.0374

16.0433

’

”

2324

1'"

2'"

3'"

4'"

5'"

6'"

Figura 38 - Ampliação do espectro de RMN

C-APT da substância SAFM-02

(região de 16 a 50 ppm)

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

abundance

-5 00.0 -400.0 -30 0.0 -200. 0 -1 00.0 0 100. 0 2 00.0 300 .0 400.0

X : parts per Million : 13C

84.0 83.0 82.0 81.0 80.0 79.0 78.0 77.0 76.0 75.0 74.0 73.0 72.0 71.0 70.0 69.0 68.0 67.0 66.0 65.0 64.0 63.0 62.0 61.0 60.0 59.0 58.0 57.0

83.6 035

78.6 713

78.2 889

76.1 631

74.1 596

73.9 379

72.3 167

71.1 697

69.7 550

69.1 586

68.5 621

62.4 522

56.9 388

’

”

’

”

’

”

H O

2324

1'"

2'"

3'"

4'"

5'"

6'"

Figura 39 - Ampliação do espectro de RMN

C-APT da substância SAFM-02

(região de 57 a 84 ppm)

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

X : parts per Million : 1H

5.0 4.0 3.0 2.0 1.0

Y : part s p er M il lion : 13C

18 0.01 70.0 160.0 150 .0 1 40.0 130.0 120 .0 110 .0 100.0 90.0 80 .0 70.0 60.0 50 .0 40.0 30.0 20 .0

abundance

-100.0 200.0

ab u nd an ce

0 200 .0

Filename = SAFM02-HMQC_PFG-3.jdf

Author = Roberto Couto

Experiment = hmqc_irr_pfg_m.e

Sample_id = SAFM06

Solvent = METHANOL-D3

Creation_time = 18-APR-2007 14:06:46

Revision_time = 23-APR-2007 10:44:37

Current_time = 23-APR-2007 11:06:07

Content = gradient enhanced HMQ

Data_format = 2D REAL REAL

Dim_size = 1024, 256

Dim_title = 1H 13C

Dim_units = [ppm] [ppm]

Dimensions = X Y

Site = Eclipse+ 400

Spectrometer = DELTA_NMR

Field_strength = 9.389766[T] (400[MHz]

X_acq_duration = 0.1067008[s]

X_domain = 1H

X_freq = 399.78219838[MHz]

X_offset = 8[ppm]

X_points = 1024

X_prescans = 4

X_resolution = 9.37200096[Hz]

X_sweep = 9.59692898[kHz]

Y_domain = 13C

Y_freq = 100.52530333[MHz]

Y_offset = 120[ppm]

Y_points = 128

Y_prescans = 0

Y_resolution = 197.28535354[Hz]

Y_sweep = 25.25252525[kHz]

Mod_return = 1

Scans = 16

X_acq_time = 0.1067008[s]

X_pulse = 12.5[us]

Y_acq_time = 5.0688[ms]

Y_pulse = 15[us]

Grad_1 = 1[ms]

Grad_1_amp = 60[%]

Grad_2 = 1[ms]

Grad_2_amp = 60[%]

Grad_3 = 1[ms]

Grad_3_amp = 30[%]

Grad_recover = 0.2[ms]

Grad_selection = 13C = 2:2:1

Grad_shape = square

Grad_type = 0

Initial_wait = 0.1[s]

J_constant = 145[Hz]

Phase_preset = 3[us]

Recvr_gain = 30

Refocus_comp = 2.44827586[ms]

Relaxation_delay = 1[s]

T1 = 1[us]

Temp_get = 25[dC]

Unblank_time = 2[us]

C-12

H-12

Figura 40 - Espectro de HMQC da substância SAFM-02

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

X : parts per Million : 1H

1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8

Y : part s p er M il lion : 13C

40.0 30.0 20 .0

abundance

-400.0 -200.0 0 200.0

ab u nd an ce

100 .0 2 00.0

C-25

3H-25

C-24

3H-24

C-26

3H-26

C-30

3H-30

C-29

3H-29

C-23

3H-23

C-27

3H-27

C-6’”

2H-6’”

H -2 6

H -2 4

H - 2 9

H -2 5

H -3 0

H -2 3

H -2 7

H - 6 ’ ”

C-26

C-24

C-25

C-29

C-23

C-27

C-30

----------C-6’”

Figura 41 - Ampliação do espectro de HMQC da substância SAFM-02

(região de 0,7 a 1,5 ppm)

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

X : parts per Million : 1H

5.0 4.0 3.0 2.0 1.0

Y : parts per Million : 13C

180.0170.0 160.0 150.0 140.0 130.0 120.0 110.0 100.0 90.0 80.0 70.0 60.0 50.0 40.0 30.0 20.0 10.0

(Thousands)

0 1.0

(Thousands)

0 1.0

Filename = SAFM02_pfg_hmbc-2.jdf

Author = Jan Schripsema

Experiment = hmbc_pfg_s.exp

Sample_id = SAFM06

Solvent = METHANOL-D3

Creation_time = 19-SEP-2004 18:44:25

Revision_time = 12-APR-2007 20:46:55

Current_time = 12-APR-2007 20:52:36

Comment = gradient enhanced HMB

Data_format = 2D REAL REAL

Dim_size = 1024, 512

Dim_title = 1H 13C

Dim_units = [ppm] [ppm]

Dimensions = X Y

Site = Eclipse+ 400

Spectrometer = DELTA_NMR

Field_strength = 9.389766[T] (400[MHz]

X_acq_duration = 0.4268032[s]

X_domain = 1H

X_freq = 399.78219838[MHz]

X_offset = 3.0[ppm]

X_points = 1024

X_prescans = 4

X_resolution = 2.34300024[Hz]

X_sweep = 2.39923225[kHz]

Y_domain = 13C

Y_freq = 100.52530333[MHz]

Y_offset = 100[ppm]

Y_points = 128

Y_prescans = 0

Y_resolution = 157.51008065[Hz]

Y_sweep = 20.16129032[kHz]

Mod_return = 1

Scans = 256

X_acq_time = 0.4268032[s]

X_pulse = 14.7[us]

Y_acq_time = 6.3488[ms]

Y_pulse = 9.5[us]

Grad_1 = 1[ms]

Grad_1_amp = 10[pnt]

Grad_1_value = 10[pnt*ms]

Grad_2 = 1[ms]

Grad_2_amp = 10[pnt]

Grad_2_value = 10[pnt*ms]

Grad_3 = 1[ms]

Grad_3_amp = 5[pnt]

Grad_3_value = 5[pnt*ms]

Grad_recover = 0.2[ms]

Grad_selection = 13C = 2:2:1

Grad_shape = square

Grad_type = 0

Initial_wait = 1[s]

J_constant = 140[Hz]

Long_range_j = 8[Hz]

Phase_preset = 3[us]

Recvr_gain = 15

Relaxation_delay = 2[s]

T1 = 1[us]

Temp_get = 29.4[dC]

Unblank_time = 2[us]

C-28

H-1’

C-13

3H-27

CH-1”

H-3

CH-1’

H-2’

CH-3

H-1”

CH-3

3H-23

CH-3

3H-24

C-18

C-13

CH-1”

CH-1’

CH-3

’

”

CH-4”

H-1’”

’

”

O H

28 1'

’

”

-------------CH-5’”

CH-5’”

H-6’”

31"

1'"

2'"

3'"

4'"

5'"

6'"

HO O

H H

OHHO

Figura 42 - Espectro de HMBC da substância SAFM-02

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

X : parts per Million : 1H

2.1 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7

Y : part s p er Mil lion : 13C

50.0 40 .0 3 0.0 20.0

abundance

-300.0-100.0 100.0 300.0500.0

abu n da nce

0 100.0 200 .0

-24

H-5

-26

3H-27

-24

3H-23

-26

H-9

-30

3H-29

-15

3H-27

-23

3H-24

C-4

3H-23

-25

H-5

-25

-24

--------------CH

-26

-----------CH

-30

--------CH

-27

------------CH

-23

-15

C-4

3H-24

-2

H-1

-29

3H-30

-1

3H-25

-19

3H-29

C-8

3H-26

CH-5

3H-24

CH-5

3H-25

CH-5

3H-23

-2

C-8

3H-27

------------CH

-29

---------CH

-1

C-4------

C-8

-19

CH-5

Figura 43 - Ampliação do espectro de HMBC da substância SAFM-02

(região de 0,7 a 2,1 ppm)

3.1.3. Determinação Estrutural da substância SAFM-03.

O tratamento cromatográfico (CC-sílica silanizada) da sub-fração 7-19 oriunda

da fração FA (Item 2.2.7.1, p. 30) forneceu uma substância que se apresentou como um

sólido amarelo amorfo, solúvel em MeOH e com coloração verde escura na presença de

solução alcoólica de cloreto férrico (Item 2.2.5.2, p. 28).

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

O espectro de absorção na região do infravermelho (Figura 44, p. 74), da

substância SAFM-03, mostra forte absorção em 3321 cm

-1

correspondente a vibração da

deformação axial de O-H, uma banda intensa de estiramento de grupo carbonila de

cetonas em 1614 cm

-1

e uma banda a 1506 cm

-1

atribuída a carbonos (C=C) do anel

aromático. As bandas em 1176 e 1009 cm

-1

correspondem a deformações axiais

assimétrica e simétrica do sistema (C-O-C) de grupo éter respectivamente. (Agrawal,

1989 e Silverstein & Webster, 2000).

O espectro de massas (Figura 45, p. 75) da substância SAFM-03

apresentou pico do íon molecular a m/z 286. Este valor aliado às informações

do espectro de RMN

H permitiu deduzir a fórmula molecular C

O espectro de RMN

H (Figura 46, p. 76) apresenta sinais típicos de

substituição para padrão de flavonol, evidenciado por dois sinais duplos e

duplos sinais duplos em δ

[6,17 (d, J= 1,9); 6,39 (d, J= 2,1)] que são

característicos de hidrogênios com acoplamento meta no anel A de

flavonóides.

Os sinais a δ

[8,08 (dd, J= 9,1; 2,2) e 6,89 (dd, J= 9,1; 2,2)] são

característicos de sistema AA’ BB’ do anel B do flavonol. A ausência de um

sinal simples na região de δ

(6,3) que seria atribuído ao H-3 sugere para a

substância SAFM-03 a estrutura de um flavonol (Markham & Mabry, 1975). A

análise desse resultado juntamente com os padrões de fragmentação do

espectro de massas m/z 152 e 108 [relativos a fragmentação retro Diels-Alder

do anel C ( Budzikiewicz et al., 1964)] e o sinal m/z 258 (relativo a perda da

carbonila do anel C), confirmam para SAFM-03 a estrutura de um flavonol

(Esquema 7, p. 72).

O espectro de RMN

C-APT (Figura 47, p. 77) revelou a presença de

quatro sinais de carbonos metínicos que estão de acordo com o padrão de

substituição do anel A deste flavonol. O sistema AA’ BB’ do anel B está

representado pelo deslocamento a δ

(129,30) para os CH-2’/6’ e em δ

(115,02) para os CH-3’/5’ que juntamente com os resultados obtidos no

espectro de hidrogênio e massas confirmaram a identificação deste produto

natural como sendo um flavonol onde o anel A encontra-se disubstituído δ

[(93,12 CH-8) e (97,96 CH-6)] e o anel B monosubstituído δ

[129,30 (CH-2’/6’)

e 115,02 (CH-3’/5’)]. Os sinais do anel heterocíclico C aparecem a δ

[147,19

(C-2); 134,96 (C-3) e 177,60 (C-4)]. Os carbonos C-5, C-7, C-9, C-10, C-1’ e C-

4’ aparecem a δ

(160,49; 164,36; 156,97; 100,96; 122,43 e 159,48)

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

respectivamente. O conjunto desses dados, aliados a comparação com dados

da literatura (Markham & Chari, 1976), confirmam que a substância SAFM-03

corresponde ao flavonol (3, 5, 7,4’-tetraidroxiflavonol), conhecido como

canferol.

A substância SAFM-03 está sendo citada pela primeira vez no gênero

Swartzia.

m/z 152

RDA

-C

-CO

m/z 286

m/z 121

m/z 93

m/z 108

-CO

m/z 258

Esquema 7 - Propostas de fragmentação da substância SAFM-03

OOH

Tabela 5 - Dados espectrais de RMN

C e

H do flavonóide SAFM-03 em

OD.

C δ

C literatura (DMSO)

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

2 147,19 146,8 -

3 134,96 135,6 -

4 177,60 175,9 -

5 160,49 160,7 -

7 164,36 163,9 -

9 156,97 156,2 -

10 100,96 103,1 -

1’ 122,43 121,7 -

4’ 159,48 159,2 -

6 97,96 98,2 6,17 (d, 1,9)

8 93,12 93,5 6,39 (d, 2,1)

2’/6’ 129,30 129,5 8,08 (d, 9,1; 2,2)

3’/5’ 115,02 115,4 6,89 (d, 9,1; 2,2)

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

3000 2000 1000 0

723

819

1009

1176

1506

1614

3321

3852

% T

-1

-C=C-

-C-O-C-

-C=O

Figura 44 - Espectro de infravermelho substância da SAFM-03

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

Figura 45 - Espectro de massas da substância SAFM-03

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

ab un da nce

-1 0.0 0 10.0 20 .0 30.0 40 .0 50.0 60 .0 70.0 80 .0 90.0 10 0.0

X : parts per Million : 1H

8.0 7.0 6.0 5.0 4.0

8.0 924

8.0 695

6.9 089

6.8 861

6.3 910

6.3 857

6.1 754

6.1 707

4.8 804

4.8 348

3.6 137

3.3 094

3.3 054

3.3 013

3.2 973

3.2 926

Filename = SAFM05A_1d_spectrum-2

Author = Jan Schripsema

Experiment = single_pulse.exp

Sample_id = SAFM05A

Solvent = METHANOL-D3

Creation_time = 5-OCT-2004 15:14:30

Revision_time = 25-APR-2007 18:40:02

Current_time = 25-APR-2007 18:40:36

Content = Single Pulse Experime

Data_format = 1D COMPLEX

Dim_size = 16384

Dim_title = 1H

Dim_units = [ppm]

Dimensions = X

Site = Eclipse+ 400

Spectrometer = DELTA_NMR

Field_strength = 9.389766[T] (400[MHz]

X_acq_duration = 3.7240832[s]

X_domain = 1H

X_freq = 399.78219838[MHz]

X_offset = 5[ppm]

X_points = 16384

X_prescans = 0

X_resolution = 0.26852246[Hz]

X_sweep = 4.39947206[kHz]

Mod_return = 1

Scans = 8

X_90_width = 14.7[us]

X_acq_time = 3.7240832[s]

X_angle = 45[deg]

X_pulse = 7.35[us]

Initial_wait = 1[s]

Phase_preset = 3[us]

Recvr_gain = 15

Relaxation_delay = 4[s]

Temp_get = 30.2[dC]

Unblank_time = 2[us]

’

Figura 46 - Espectro de RMN

H da substância SAFM-03

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

abunda nc e

-100.0 -9 0.0 -80.0 -70.0 -60.0 -50.0 -40.0 -30 .0 -20.0 -10.0 0 10.0 20.0 3 0.0 40.0 5 0.0

X : parts per Million : 13C

180.0 170.0 160.0 150.0 140.0 130.0 120.0 110.0 100.0

177.6005

164.3638

160.4868

159.4774

156.9692

153.3981

147.1965

134.9615

129.3028

122.4283

115.0185

100.9635

97.9659

93.1255

Filename = SAFM05A_apt-2.jdf

Author = Jan Schripsema

Experiment = apt.exp

Sample_id = SAFM05A

Solvent = METHANOL-D3

Creation_time = 5-OCT-2004 15:52:28

Revision_time = 25-APR-2007 19:15:01

Current_time = 25-APR-2007 19:17:06

Content = APT Experiment

Data_format = 1D COMPLEX

Dim_size = 32768

Dim_title = 13C

Dim_units = [ppm]

Dimensions = X

Site = Eclipse+ 400

Spectrometer = DELTA_NMR

Field_strength = 9.389766[T] (400[MHz]

X_acq_duration = 1.3008896[s]

X_domain = 13C

X_freq = 100.52530333[MHz]

X_offset = 100[ppm]

X_points = 32768

X_prescans = 4

X_resolution = 0.76870474[Hz]

X_sweep = 25.18891688[kHz]

Irr_domain = 1H

Irr_freq = 399.78219838[MHz]

Irr_offset = 5[ppm]

Mod_return = 1

Scans = 852

X_90_width = 10[us]

X_acq_time = 1.3008896[s]

X_angle = 45[deg]

X_pulse = 5[us]

Initial_wait = 1[s]

J_constant = 140[Hz]

Phase_preset = 3[us]

Recvr_gain = 15

Relaxation_delay = 1[s]

Temp_get = 30.1[dC]

Unblank_time = 2[us]

’

Figura 47 - Espectro de RMN

C-APT da substância SAFM-03

3.1.4. Determinação estrutural da substância SAFM-04.

O tratamento cromatográfico (CC-Sephadex LH-20/MeOH) da sub-

fração 20-25 oriunda da fração FA (Item 2.2.7.1, p. 30) forneceu uma

substância que apresentou-se como um sólido amarelo amorfo, com faixa de

fusão de 157-169 ºC, solúvel em MeOH e com coloração verde escura na

presença de solução alcoólica de cloreto férrico (Item 2.5.5.2, p. 28).

O espectro de absorção na região do infravermelho (Figura 49, p. 83), da

substância SAFM-04, mostra forte absorção em 3392 cm

-1

correspondente a

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

vibração da deformação axial de O-H, uma banda em 2933 cm

-1

de deformação

axial de grupo metila, uma banda de estiramento de grupo carbonila de cetonas

em 1662 cm

-1

e bandas a 1608 e 1508 cm

-1

atribuída a anéis aromáticos. As

bandas em 1209 e1051 cm

-1

correspondem a deformação axial assimétrica do

sistema (C-O-C) de grupo éter. (Agrawal, 1989 e Silverstein & Webster, 2000).

O espectro de massas de alta resolução QTOF com análise em módulo

negativo [M-H] (Figura 48, p. 82) da substância SAFM-04 exibiu pico do íon

molecular a m/z 739,2065 apresentando para fórmula C

uma margem

de erro de apenas (2,84 ppm) em relação ao valor calculado de 740,2164

confirmando a formula para a substância.

A análise do espectro de RMN

H do flavonol SAFM-03 (Figura 46, p. 76;

Tabela 5 p. 73) foi utilizada para comparação e, a partir deste, percebemos a

existência de sinais adicionais na região de δ

(5,60-3,34) que sugerem a

presença de resíduos de açúcar. Os sinais a δ

5,59 (1H, d, J= 7,5), 5,21 (1H,

s) e 4,49 (1H, s) foram atribuídos a hidrogênios anoméricos dos resíduos de

açúcar. O valor elevado da constante de acoplamento do hidrogênio anomérico

da glicose (J > 6 Hz), permite sugerir um

-glicopiranosil. Os hidrogênios

anoméricos dos resíduos de raminose aparecem como sinais simples

sugerindo tratar-se de resíduos

-raminosil (Figura 50-52, p. 84-86).

Na região de hidrogênios de anéis aromáticos observamos dois pares de

sinais duplos a δ

[6,17 (d, 1,9) e 6,37 (d, 1,9)] atribuídos aos hidrogênios H-6 e

H-8 meta acoplados, característicos do anel A e δ

[8,05 (d, 9,1) e 6,89 (d, 8,8)]

que foram atribuídos ao sistema AA’BB’ dos hidrogênios H-2’/6’ e H-3’/5’ do

anel B. Esses dados mostram que o padrão de substituição dos anéis A, B e C

são idênticos àqueles verificados para substância anterior SAFM-03.

O espectro de RMN

C-APT (Figuras 54-56, p. 88-90) apresentou 31

sinais sendo que 13 deles compatíveis com aglicona de esqueleto flavonoídico.

Os deslocamentos químicos a δ

[179,40 (atribuído a carbonila de cetona C-4

em ligação de hidrogênio com a hidroxila HO-5); 158,68 e 134,46 atribuídos

aos carbonos C-2 e C-3 do anel heterocíclico C]. Para o anel A foram

observados os sinais a δ

[99,74 e 94,66 (atribuídos aos carbonos metínicos

CH-6 e CH-8) e 163,07; 165,55; 158,39 e 105,85 (atribuídos aos carbonos não

hidrogenados C-5, C-7, C-9 e C-10)]. Para o anel B foram observados os sinais

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

a δ

[132,17 e 116,15 (atribuídos ao sistema AA’BB’ dos carbonos metínicos

CH-2’/6’ e CH-3’/5’) e 123,05 e 161,27 (atribuídos aos carbonos não

hidrogenados C-1’ e C-4’)]. Os 18 sinais restantes foram atribuídos aos três

resíduos de açúcar. Os sinais observados a δ

(100,84; 102,56 e 101,80) foram

atribuídos aos carbonos anoméricos CH-1”, CH-1”’ e CH-1”” respectivamente.

Os sinais a δ

(17,47 e 17,93) foram atribuídos aos carbonos metílicos CH

-6”’/

6”” dos resíduos de raminose e o sinal a δ

(67,12) foi atribuído ao carbono

metilênico CH

-6” do resíduo de glicose.

O mapa correlação heteronuclear a uma ligação HMQC (

) (Figuras

57-58, p. 91-92) permitiu confirmar a atribuição feita para o CH-6 δ

(99,74)

através da correlação com o hidrogênio H-6 δ

(6,17); do carbono CH-8 δ

(94,66) com o hidrogênio H-8 δ

(6,37); do carbono CH-3’/5’ δ

(116,15) com os

hidrogênios H-3’/5’ δ

(6,89), do carbono CH-1” δ

(100,84) com o hidrogênio H-

1” δ

(5,59), do carbono CH-1”’ δ

(102,56) com o hidrogênio H-1”’ δ

(5,21) e do

carbono CH-1”” δ

(101,80) com o hidrogênio H-1”” δ

(4,49).

O mapa de correlação heteronuclear a longa distância HMBC (

, n=2

e n=3) permitiu, confirmar inequivocamente os pontos de ligação dos resíduos

de açúcar através das seguintes correlações: C-3 δ

(134,46) com o H-1” δ

5,59 (d, J= 7,5); o CH-1’” δ

(102,56) com o H-2” δ

(3,88) e o CH

-6” δ

(67,12)

com o H-1”” δ

(4,49). As demais correlações encontradas para a molécula

estão resumidas nas figuras 59-60, p. 93-94.

Com base na discussão acima, e dos dados descritos na literatura

(Markham & Chari, 1976) foi proposto para a substância SAFM-04 a estrutura

da 5,7,4’-triidroxi-3-O-

-D-glicopiranosil-(1”’ → 6”)-

-O-L-raminopiranosil-(1”” →

2”’)-

-O-L-raminopiranosil-flavonol.

Pelo melhor do nosso conhecimento, a substância SAFM-04 está sendo

citada pela primeira vez na literatura.

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

1'"

2'"

3'"

4'"

5'"

6'"

1""

2""

3""

4""

5""

6""

Tabela 6 - Dados espectrais de RMN

C e

H do flavonóide SAFM-04 em

OD.

(Markham & Chari, 1976) δ

2 158,68 156,6 -

3 134,46 133,5 -

4 179,40 177,5 -

5 163,07 161,3 -

7 165,55 164,2 -

9 158,36 156,9 -

10 105,85 104,2 -

1’ 123,05 121,1 -

4’ 161,27 159,9 -

6 99,74 98,8 6,17 (s)

8 94,66 93,8 6,37 (s)

2’/6’ 132,17 130,9 8,05 (d, 9,1)

3’/5’ 116,15 115,2 6,89 (d, 8,8)

Tabela 6’ - Dados espectrais das unidades glicosídicas do flanonóide

SAFM-04.

(Pizzolatti et al.,

2003)

1’’ 100,84 101,4 5,59 (d, 7,5)

2’’ 77,54 81,5 3,88 (m)

3’’ 75,68 77,5 3,78 (m)

4’’ 69,83 71,9 3,72 (m)

5’’ 75,23 77,7 3,64 (t, 6,4)

6’’ 67,12 63,3 3,72; 3,44 (m)

1’’’ 102,56 101,8 5,21 (s)

2’’’ 72,27 72,6 3,92 (dd, 9,2; 7,8)

3’’’ 72,36 71,8 3,69

4’’’ 74,04 73,8 3,34 (t, 9,6)

5’’’ 70,70 71,5 3,99 (m)

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

6’’’ 17,93 17,1 0,97 (d, 5,8)

1’’’’ 101,80 4,51 (s)

2’’’’ 72,05 3,57 (m)

3’’’’ 72,31 3,52

4’’’’ 73,86 3,24

5’’’’ 69,68 3,51 (m)

6’’’’ 17,47 1,17 (d, 6,5)

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

Figura 48 - Espectro de massas da substância SAFM-04

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

100

110

891

1051

1209

1360

1456

1508

1608

1662

2933

3392

-1

C-O-C

Figura 49 - Espectro de infravermelho da substância SAFM-04

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

abundance

-20.0 -10.0 0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0

X : parts per Million : 1H

8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0

8.0648

8.0420

6.9008

6.8787

6.3716

6.1727

5.6072

5.5884

5.2116

4.5191

4.4969

4.4929

3.8044

3.7890

3.7776

3.7682

3.7185

3.6943

3.5747

3.5667

3.3403

3.3007

1.1742

1.1580

0.9814

0.9659

Filename = SAFM09-1d_spectrum-5.

Author = Jan Schripsema

Experiment = single_pulse.exp

Sample_id = SAFM09

Solvent = METHANOL-D3

Creation_time = 5-FEB-2007 16:31:24

Revision_time = 10-APR-2007 20:53:26

Current_time = 10-APR-2007 20:54:09

Comment = Single Pulse Experime

Data_format = 1D COMPLEX

Dim_size = 16384

Dim_title = 1H

Dim_units = [ppm]

Dimensions = X

Site = Eclipse+ 400

Spectrometer = DELTA_NMR

Field_strength = 9.389766[T] (400[MHz]

X_acq_duration = 3.7240832[s]

X_domain = 1H

X_freq = 399.78219838[MHz]

X_offset = 5[ppm]

X_points = 16384

X_prescans = 0

X_resolution = 0.26852246[Hz]

X_sweep = 4.39947206[kHz]

Mod_return = 1

Scans = 8

X_90_width = 14.7[us]

X_acq_time = 3.7240832[s]

X_angle = 45[deg]

X_pulse = 7.35[us]

Initial_wait = 1[s]

Phase_preset = 3[us]

Recvr_gain = 14

Relaxation_delay = 4[s]

Temp_get = 25[dC]

Unblank_time = 2[us]

’

”

’

”

’

”

1'"

2'"

3'"

4'"

5'"

6'"

1""

2""

3""

4""

5""

6""

Figura 50 - Espectro de RMN

H da substância SAFM-04

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

abundance

10.0 20.0 30.0 40.0 50.0

X : parts per Million : 1H

3.8 3.7 3.6 3.5 3.4 3.3

3.8118

3.8044

3.7890

3.7776

3.7682

3.7332

3.7185

3.7084

3.6943

3.6802

3.6580

3.6419

3.6271

3.5935

3.5747

3.5667

3.5378

3.5217

3.5163

3.5082

3.4981

3.4928

3.4854

3.4578

3.4417

3.4323

3.4169

3.3974

3.3638

3.3403

3.3007

3.2631

3.2395

3.2322

H-3”

H -4”

H-5”

H-6” a

H-6”b

H -3’”

H -4’”

-2””

H -3””

H-5””

H -4” ”

1'"

2'"

3'"

4'"

5'"

6'"

1""

2""

3""

4""

5""

6""

Figura 51 – Ampliação do espectro de RMN

H da substância SAFM-04

(região de 3,2 a 3,81 ppm)

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

abundance

0 10.0 20.0 30.0

X : parts per Million : 1H

4.13 4.12 4.11 4.1 4.09 4.08 4.07 4.06 4.05 4.04 4.03 4.02 4.01 4.0 3.99 3.98 3.97 3.96 3.95 3.94 3.93 3.92 3.91 3.9 3.89 3.88 3.87 3.86

4.07 91

4.06 37

4.05 56

4.03 95

4.00 26

3.99 79

3.94 61

3.92 60

3.92 26

3.90 32

3.88 17

”

’

”

’

”

1'"

2'"

3'"

4'"

5'"

6'"

1""

2""

3""

4""

5""

6""

Figura 52 - Ampliação do espectro de RMN

H da substância SAFM-04

(região de 3,86 a 4,13 ppm)

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

X : parts per Million : 1H

8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0

Y : parts per Million : 1H

8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0

abundance

0 100.0

abundance

-20.0 0 20.0 40 .0

Filename = SAFM04-cosy-2.jdf

Author = Jan Schripsema

Experiment = cosy.exp

Sample_id = SAFM09

Solvent = METHANOL-D3

Creation_time = 7-FEB-2007 01:25:23

Revision_time = 26-APR-2007 10:51:17

Current_time = 26-APR-2007 10:55:44

Content = absolute value COSY

Data_format = 2D REAL REAL

Dim_size = 512, 1024

Dim_title = 1H 1H

Dim_units = [ppm] [ppm]

Dimensions = X Y

Site = Eclipse+ 400

Spectrometer = DELTA_NMR

Field_strength = 9.389766[T] (400[MHz]

X_acq_duration = 0.1280512[s]

X_domain = 1H

X_freq = 399.78219838[MHz]

X_offset = 5[ppm]

X_points = 512

X_prescans = 4

X_resolution = 7.80937625[Hz]

X_sweep = 3.99840064[kHz]

Y_domain = 1H

Y_freq = 399.78219838[MHz]

Y_offset = 5[ppm]

Y_points = 256

Y_prescans = 0

Y_resolution = 15.6187525[Hz]

Y_sweep = 3.99840064[kHz]

Mod_return = 1

Scans = 64

X_90_width = 14.7[us]

X_acq_time = 0.1280512[s]

X_pulse = 14.7[us]

Y_acq_time = 64.0256[ms]

Initial_wait = 1[s]

Phase_preset = 3[us]

Pulse_1 = 14.7[us]

Pulse_2 = 14.7[us]

Pulse_angle_1 = 90[deg]

Pulse_angle_2 = 90[deg]

Recvr_gain = 13

Relaxation_delay = 1.5[s]

T1 = 1[us]

Temp_get = 25[dC]

Unblank_time = 2[us]

’

”

’

”

H-2’/6’

H-3’/5’

H-8

H-6

H-1”

H-1’”

H-1””

Figura 53 - Espectro de COSY (

H x

H) da substância SAFM-04

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

(Thousan ds )

-60.0 -50.0 -40. 0 -30. 0 -20 .0 -10 .0 0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0

X : parts per Million : 13C

180.0 170.0 160.0 150.0 140.0 130.0 120.0 110.0 100.0 90.0 80.0 70.0 60.0 50.0 40.0 30.0 20.0

179.4 020

165.5 535

163.0 683

161.2 560

158.6 790

158.3 884

134.4 613

132.1 749

123.0 521

116.147 0

105.8 543

102.5 584

101.8 014

100.8 379

99.7 444

94.6 592

73.8 597

72.3 609

72.3 150

72.2 691

72.0 474

69.8 298

69.6 768

17.9 303

17.4 715

Filename = SAFM09-apt-5.jdf

Author = Jan Schripsema

Experiment = apt.exp

Sample_id = SAFM09

Solvent = METHANOL-D3

Creation_time = 6-FEB-2007 06:19:18

Revision_time = 10-APR-2007 20:29:39

Current_time = 10-APR-2007 20:30:49

Comment = APT Experiment

Data_format = 1D COMPLEX

Dim_size = 32768

Dim_title = 13C

Dim_units = [ppm]

Dimensions = X

Site = Eclipse+ 400

Spectrometer = DELTA_NMR

Field_strength = 9.389766[T] (400[MHz]

X_acq_duration = 1.3008896[s]

X_domain = 13C

X_freq = 100.52530333[MHz]

X_offset = 100[ppm]

X_points = 32768

X_prescans = 4

X_resolution = 0.76870474[Hz]

X_sweep = 25.18891688[kHz]

Irr_domain = 1H

Irr_freq = 399.78219838[MHz]

Irr_offset = 5[ppm]

Mod_return = 1

Scans = 21381

X_90_width = 10.05[us]

X_acq_time = 1.3008896[s]

X_angle = 45[deg]

X_pulse = 5.025[us]

Initial_wait = 1[s]

J_constant = 140[Hz]

Phase_preset = 3[us]

Recvr_gain = 28

Relaxation_delay = 1[s]

Temp_get = 25[dC]

Unblank_time = 2[us]

”

’

”

’

Figura 54 - Espectro de RMN

C-APT da substância SAFM-04

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

Figura 55 - Ampliação do espectro de RMN

C-APT da substância SAFM-04

(região de 64 a 78 ppm)

(Thousands)

-50.0 -40.0 -30.0 -20.0 -10.0 0 10.0 20.0

X : parts per Million : 13C

77.0 76.0 75.0 74.0 73.0 72.0 71.0 70.0 69.0 68.0 67.0 66.0 65.0

77.5378

75.6796

75.2285

74.0432

73.8597

72.3609

72.3150

72.2691

72.0474

70.7015

69.8298

69.6768

68.2698

67.1228

64.6758

”

’

”

’

”

’

”

’

”

1'"

2'"

3'"

4'"

5'"

6'"

1""

2""

3""

4""

5""

6""

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

(Thousands)

-30.0 -20.0 -10.0 0 10.0

X : parts per Million : 13C

107.0 106.0 105.0 104.0 103.0 102.0 101.0 100.0 99.0 98.0 97.0 96.0 95.0 94.0 93.0 92.0 91.0

105.8543

102.5584

101.8014

100.8379

99.7444

94.6592

’

”

1'"

2'"

3'"

4'"

5'"

6'"

1""

2""

3""

4""

5""

6""

Figura 56 – Ampliação do espectro de RMN

C-APT da substância SAFM-04

(região de 91 a 107 ppm)

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

X : parts per Million : 1H

8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0

Y : p arts pe r M illio n : 1 3C

130. 0 1 20.0 110.0 100.0 90 .0 80.0 7 0.0 60.0 50.0 40 .0 30.0 2 0.0

Filename = SAFM04-pfg_hmqc-3.jdf

Author = Jan Schripsema

Experiment = hmqc_irr_pfg_m.e

Sample_id = SAFM09

Solvent = METHANOL-D3

Creation_time = 6-FEB-2007 10:56:08

Revision_time = 26-APR-2007 11:33:23

Current_time = 26-APR-2007 11:43:17

Content = gradient enhanced HMQ

Data_format = 2D REAL REAL

Dim_size = 1024, 256

Dim_title = 1H 13C

Dim_units = [ppm] [ppm]

Dimensions = X Y

Site = Eclipse+ 400

Spectrometer = DELTA_NMR

Field_strength = 9.389766[T] (400[MHz]

X_acq_duration = 0.2561024[s]

X_domain = 1H

X_freq = 399.78219838[MHz]

X_offset = 5[ppm]

X_points = 1024

X_prescans = 4

X_resolution = 3.90468812[Hz]

X_sweep = 3.99840064[kHz]

Y_domain = 13C

Y_freq = 100.52530333[MHz]

Y_offset = 100[ppm]

Y_points = 128

Y_prescans = 0

Y_resolution = 197.28535354[Hz]

Y_sweep = 25.25252525[kHz]

Mod_return = 1

Scans = 16

X_acq_time = 0.2561024[s]

X_pulse = 14.7[us]

Y_acq_time = 5.0688[ms]

Y_pulse = 10[us]

Grad_1 = 1[ms]

Grad_1_amp = 60[%]

Grad_2 = 1[ms]

Grad_2_amp = 60[%]

Grad_3 = 1[ms]

Grad_3_amp = 30[%]

Grad_recover = 0.2[ms]

Grad_selection = 13C = 2:2:1

Grad_shape = square

Grad_type = 0

Initial_wait = 0.1[s]

J_constant = 140[Hz]

Phase_preset = 3[us]

Recvr_gain = 30

Refocus_comp = 2.57142857[ms]

Relaxation_delay = 2[s]

T1 = 1[us]

Temp_get = 25[dC]

Unblank_time = 2[us]

’

”

’

”

’

”

C-6’”

3H-6’”

C-6””

3H-6””

C-3’/5’

H-3’/5’

C-2’/6’

H-2’/6’

C-1””

H-1””

C-1’”

H-1’”

C-1”

H-1”

C-8

H-8

C-6

H-6

Figura 57 - Espectro de HMQC da substância SAFM-04

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

X : parts per Million : 1H

4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 3.2

Y : part s per Mil lion : 13C

80.0 79.0 78 .0 77.0 76 .0 75.0 7 4.0 73.0 72.0 71. 0 70.0 69 .0 68.0 6 7.0

’

”

’

”

’

”

’

”

C-6”

H-6”a

C-5””

H-5””

C-4”

H-4”

C-5’”

H-5’”

C-2””

H-2””

C-2’”

H-2’”

C-3””

H-3””

C-3’”

H-3’”

C-4””

H-4””

C-4’”

H-4’”

C-5”

H-5”

C-3”

H-3”

C-2”

H-2”

C-6”

H-6”b

Figura 58 – Ampliação do espectro de HMQC da substância SAFM-04

(região de 3,2 a 4,1 ppm)

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

X : parts per Million : 1H

5.4 5.3 5.2 5.1 5.0 4.9 4.8 4.7 4.6 4.5 4.4 4.3 4.2 4.1 4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4

Y : parts per Million : 13C

78.0 77.0 76.0 75.0 74.0 73.0 72.0 71.0 70.0 69.0 68.0 67.0 66.0

’

”

’

”

’

”

’

”

H-4’”

”

-6”

CH-5””

CH-4”

CH-5’”

CH-2””

CH-2’”

CH-3””

CH-3’”

CH-4””

CH-4’”

CH-5”

CH-3”

CH-2”

-6”

H-1’”

CH-5””

H-1””

CH-4”

H-5”

CH-5’”

H-3’”

CH-5””

H-4””

CH-5’”

H-4’”

CH-5’”

H-1’”

CH-3””

H-2””

CH-3’”

H-5’”

CH-4””

H-3””

CH-4’”

H-2’”

CH-5”

H-4”

CH-2”

H-1””

1'"

1""

5'"

5""

Figura 59 - Espectro de HMBC da substância SAFM-04

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

X : parts per Million : 1H

3.5 3.4 3.3 3.2 3.1 3.0 2.9 2.8 2.7 2.6 2.5 2.4 2.3 2.2 2.1 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0

Y : parts per Million : 13C

19.0 18.0 17.0 16.0 15.0

-6’”

-6””

’

”

’

”

-6””

H-4””

-6’”

H-4’”

-6””

H-6””

-6’”

H-6’”

C-3

H-1”

C-3

H-1”

6""

6'"

4'"

4""

Figura 60 - Ampliações do espectro de HMBC da substância SAFM-04

3.2. Determinação Estrutural dos Constituintes Químicos Isolados da Madeira

de S. apetala

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

O estudo fitoquímico do extrato hexânico da madeira de S. apetala

possibilitou o isolamento de um estilbeno (SAMH-01), uma flavanona (SAMH-

02) e um pterocarpano (SAMH-03), um triterpeno (SAMH-04) e mistura de três

esteróides (SAMH-05a/b/c) (Figura 13-14, p. 22-23).

3.2.1. Determinação estrutural da substância SAMH-01.

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

A fração F1B (Item 2.2.7.2, p. 31) após fracionamento em (CC-sílica gel)

forneceu uma substância que apresentou-se como um sólido branco amorfo,

solúvel em CHCl

e com coloração verde escura na presença de solução

alcoólica de cloreto férrico e vermelho carmim quando revelado em CCDA com

solução de vanilina sulfúrica (Itens 2.5.5.2 e 2.5.6, p. 28).

O espectro de RMN

H (Figuras 62-63, p. 99-100) apresentou um sinal

simples a δ

(3,82) característico de hidrogênios de grupo metoxila e um sinal

largo a δ

(4,89) atribuído a hidrogênio de hidroxila. A presença de sinais na

região de δ

(7,50-6,33) são indicativos da presença de anéis aromáticos na

substância. Os sinais duplos a δ

[6,99 (d, J= 17,2) e 7,06 (d, J= 15,8)], que

devido ao valor das constantes de acoplamento caracterizam uma olefina trans

conjugada com o sistema aromático (Silverstein & Webster, 2000).

O padrão de substituição (1,3,5-trissubstituído) do anel aromático A foi

estabelecido com base na multiplicidade dos sinais dos hidrogênios a δ

[6,64

(sl) H-4; 6,33 (sl) H-2 e 6,60 (sl) H-6]. Os sinais a δ

[7,49 (d, J= 7,3); 7,25 e

7,35 (t, J= 9,52)] foram atribuídos ao anel aromático B.

O espectro de

C-APT (Figuras 64-65, p. 101-102) apresentou 13 sinais

sendo um atribuído a carbono metílico sp3, oito a carbonos metínico sp2 e

quatro a carbonos não hidrogenados sp2. A análise desses resultados

juntamente com a análise do espectro de massas de baixa resolução (Figura

61, p. 98) que exibiu pico do íon molecular a m/z 226 e fragmentos com m/z

211(relativo a perda de metila) e a m/z 194 (relativo a perda de CH

OH)

(Esquema 8, p. 98) sugerem para a substância SAMH-01 a fórmula molecular

, correspondente a estrutura de um trans-estilbeno.

O sinal a δ

(55,46) foi atribuído ao carbono do grupo metoxila e os

sinais a δ

(149,38 e 156,94) foram atribuídos aos carbonos C-5 (C-OH) e C-3

(C-OCH

) do anel aromático A. Os demais sinais estão listados na tabela 6, p.

97. O mapa de correlação heteronuclear a longa distância HMBC (

)

(Figuras 66-67, p. 103-104) auxiliou nas atibuições feitas para a molécula,

através da correlação existente entre o carbono C-3 a δ

(156,94) e os

hidrogênios da metoxila a δ

(3,82); do carbono CH-7 a δ

(128,39) e o

hidrogênio H-6 a δ

(6,61); do carbono C-1 a δ

(139,66) e o hidrogênio H-8 a

(6,99); dos carbonos CH-10/14 a δ

(126,69) e o hidrogênio H-12 a δ

(7,25).

As demais correlações encontradas para a molécula estão ilustradas nas

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

figuras 66-67, p. 103-104. O conjunto desses dados comparados com a

literatura (Ngo & Brown, 1998), confirmam que a substância SAMH-01 trata-se

do estilbeno (3-metoxi-5-hidroxiestilbeno) conhecido como pinosilvina-

monometil éter citado pela primeira vez no gênero.

OMe

Tabela 7 - Dados espectrais de RMN

C e

H do estilbeno SAMH-01 em

CDCl

C δ

(Ngo & Brown, 1997) δ

1 140,66 139,6 - - -

3 156,94 160,9 - OMe -

5 149,38 157,3 - - H-8

9 137,65 137,1 - - H-11/13

2 105,05 104,7 6,33 (sl) - H-6

4 101,08 101,2 6,64 (sl) - H-6

6 106,00 106,3 6,60 (sl) - -

7 128,39 128,4 7,06 (d, 15,8) - H-6

8 129,49 129,2 6,99 (d, 17,2) - -

10/14 126,69 126,6 7,49 (d, 7,3) - H-12

11/13 128,78 128,6 7,35 (t, 7,9) H-11/14 -

12 127,88 127,7 7,25 H-11/13 -

MeO 55,46 55,3 3,82 (s) - -

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

OMe

-CH

m/z 226

m/z 211

m/z 194

Esquema 8 - Propostas de fragmentação da substância SAMH-01

Figura 61 - Espectro de massas da substância SAMH-01

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

ab un da nce

0 1 00.0 200 .0 3 00.0

X : parts per Million : 1H

7.0 6.0 5.0 4.0

7.5 028

7.4 845

7.3 718

7.3 526

7.3 325

7.2 775

7.2 537

7.0 843

7.0 449

7.0 11 9

6.9 689

6.6 437

6.6 034

6.3 342

4.8 926

3.8 165

Filename = SAMH01-1d_spectrum-24

Author = Roberto Ottoni Portel

Experiment = single_pulse.exp

Sample_id = SAMH01

Solvent = CHLOROFORM-D

Creation_time = 19-MAR-2007 12:26:39

Revision_time = 30-APR-2007 14:47:19

Current_time = 30-APR-2007 14:50:33

Content = Single Pulse Experime

Data_format = 1D COMPLEX

Dim_size = 16384

Dim_title = 1H

Dim_units = [ppm]

Dimensions = X

Site = Eclipse+ 400

Spectrometer = DELTA_NMR

Field_strength = 9.389766[T] (400[MHz]

X_acq_duration = 2.7312128[s]

X_domain = 1H

X_freq = 399.78219838[MHz]

X_offset = 7[ppm]

X_points = 16384

X_prescans = 0

X_resolution = 0.36613771[Hz]

X_sweep = 5.99880024[kHz]

Mod_return = 1

Scans = 2

X_90_width = 14.7[us]

X_acq_time = 2.7312128[s]

X_angle = 45[deg]

X_pulse = 7.35[us]

Initial_wait = 1[s]

Phase_preset = 3[us]

Recvr_gain = 21

Relaxation_delay = 1[s]

Temp_get = 25[dC]

Unblank_time = 2[us]

OMe

Figura 62 - Espectro de RMN

H da substância SAMH-01.

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

ab un da nce

0 10 .0 20.0 30 .0 40.0 50 .0 60.0 7 0.0 80.0 9 0.0 100 .0 11 0.0 120 .0 130.0 14 0.0 150.0 16 0.0 170.0 18 0.0 190. 0 2 00.0

X : parts per Million : 1H

7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0

7.5 028

7.4 845

7.3 718

7.3 526

7.3 325

7.2 775

7.2 537

7.0 843

7.0 449

7.0 11 9

6.9 689

OMe

Figura 63 - Ampliação do espectro de RMN

H da substância SAMH-01

(região de 6,9 a 7,6 ppm)

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

(Thousands)

-14.0 -13.0 -12.0 -11.0 -10.0 -9.0 -8.0 -7.0 -6.0 -5.0 -4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0 1 .0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0

X : parts per Million : 13C

150.0 140.0 130.0 120.0 110.0 100.0 90.0 80.0 70.0 60.0

156.9387

149.3835

140.6584

139.6567

129.4940

128.7829

127.8805

126.6876

106.0028

105.0469

101.0859

55.4646

Sample_id = SAMH01

Solvent = CHLOROFORM-D

Creation_time = 19-OCT-2006 16:29:37

Revision_time = 30-APR-2007 15:17:32

Current_time = 30-APR-2007 15:19:34

Content = APT Experiment

Data_format = 1D COMPLEX

Dim_size = 32768

Dim_title = 13C

Dim_units = [ppm]

Dimensions = X

Site = Eclipse+ 400

Spectrometer = DELTA_NMR

Field_strength = 9.389766[T] (400[MHz]

X_acq_duration = 1.3008896[s]

X_domain = 13C

X_freq = 100.52530333[MHz]

X_offset = 100[ppm]

X_points = 32768

X_prescans = 4

X_resolution = 0.76870474[Hz]

X_sweep = 25.18891688[kHz]

Irr_domain = 1H

Irr_freq = 399.78219838[MHz]

Irr_offset = 5[ppm]

Mod_return = 1

Scans = 10790

X_90_width = 10.05[us]

X_acq_time = 1.3008896[s]

X_angle = 45[deg]

X_pulse = 5.025[us]

Initial_wait = 1[s]

J_constant = 140[Hz]

Phase_preset = 3[us]

Recvr_gain = 28

Relaxation_delay = 1[s]

Temp_get = 25[dC]

Unblank_time = 2[us]

OMe

Figura 64 - Espectro de RMN

C-APT da substância SAMH-01.

100

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

(T h ou san ds )

-14.0 -13.0 -12 .0 - 11.0 -10.0 -9. 0 - 8.0 -7.0 -6. 0 - 5.0 -4.0 -3 .0 - 2.0 -1.0 0 1 .0 2.0 3.0 4 .0 5.0 6.0

X : parts per Million : 13C

130.0 129.0 128.0 127.0 126.0 125.0 124.0 123.0 122.0 121.0 120.0 119.0 118.0 117.0 116.0 115.0 114.0 113.0 112.0 111.0 110.0 109.0 108.0 107.0 106.0 105.0 104.0 103.0 102.0 101.0

129.4 940

128.7 829

128.3 929

127.8 805

126.6 876

106.0 028

105.0 469

101.0 859

OMe

Figura 65 - Ampliação do espectro de RMN

C-APT da substância SAMH-01

(região de 101 a 130 ppm).

101

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

X : parts per Million : 1H

7.0 6.0 5.0 4.0

Y : part s p er Mill ion : 13C

17 0.0 1 60.0 150.0 140 .0 13 0.0 120.0 110.0 100 .0 90.0

Filename = SAMHO1-pfg_hmbc-4.jdf

Author = Roberto Ottoni Portel

Experiment = hmbc_pfg_m.exp

Sample_id = SAMHO1

Solvent = CHLOROFORM-D

Creation_time = 19-MAR-2007 21:52:48

Revision_time = 30-APR-2007 16:01:11

Current_time = 30-APR-2007 16:10:50

Content = gradient enhanced HMB

Data_format = 2D REAL REAL

Dim_size = 1024, 512

Dim_title = 1H 13C

Dim_units = [ppm] [ppm]

Dimensions = X Y

Site = Eclipse+ 400

Spectrometer = DELTA_NMR

Field_strength = 9.389766[T] (400[MHz]

X_acq_duration = 0.2561024[s]

X_domain = 1H

X_freq = 399.78219838[MHz]

X_offset = 5[ppm]

X_points = 1024

X_prescans = 4

X_resolution = 3.90468812[Hz]

X_sweep = 3.99840064[kHz]

Y_domain = 13C

Y_freq = 100.52530333[MHz]

Y_offset = 125[ppm]

Y_points = 128

Y_prescans = 0

Y_resolution = 197.28535354[Hz]

Y_sweep = 25.25252525[kHz]

Mod_return = 1

Scans = 128

X_acq_time = 0.2561024[s]

X_pulse = 14.7[us]

Y_acq_time = 5.0688[ms]

Y_pulse = 10[us]

Grad_1 = 1[ms]

Grad_1_amp = 60[%]

Grad_2 = 1[ms]

Grad_2_amp = 60[%]

Grad_3 = 1[ms]

Grad_3_amp = 30[%]

Grad_recover = 1[ms]

Grad_selection =

Grad_shape =

Grad_type = 0

Initial_wait = 1[s]

J_constant = 140[Hz]

Long_range_j = 8[Hz]

Phase_preset = 3[us]

Recvr_gain = 30

Relaxation_delay = 1[s]

T1 = 1[us]

Temp_get = 25[dC]

Unblank_time = 2[us]

C-3

OCH

C-3

CH-6

H-4

CH-2

H-6

C-1

H-8

C-9

H-11/1 3

CH-6

CH-2

C-1

C-9

CH-10/14

H-12

CH-10/14

H-8

{

H-11 /13

OCH

Figura 66 - Espectro de HMBC da substância SAMH-01.

102

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

X : parts per Million : 1H

7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6

Y : parts per Mi llion : 13C

13 2.0 131.0 13 0.0 129.0 128.0 127.0 126.0

CH-10/14

CH-12

CH-7

CH-11/13

CH-8

CH-7

H-6

CH-8

H-7

CH-10/14

H-8

CH-10/14

H-12

CH-12

H-10/14

CH-7

H-10/14

CH-11/13

H-10/14

CH-8

H-11/13

CH-11/13

H-12

OCH

Figura 67 - Ampliação do espectro de HMBC da substância SAMH-01

(região de 6,6 a 7,6 ppm).

3.2.2. Determinação estrutural da substância SAMH-02.

A segunda substância obtida do fracionamento em coluna (CC-sílica gel)

103

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

da fração F1B (Esquema 6, p. 32) apresentou-se como um sólido amarelo

escuro, amorfo, solúvel em CHCl

e com coloração verde escura em presença

de solução alcoólica de cloreto férrico (Item 2.2.5.2, p. 28).

O espectro de absorção na região do infravermelho (Figura 69, p. 110), da

substância SAMH-02 mostra banda de deformação axial em 2924 cm

-1

característico de

grupo metino de hidrocarbonetos alinfáticos e 1466 cm

-1

atribuída a estiramento (C=C)

de aromáticos, uma banda intensa de estiramento de grupo carbonila conjugada (=C-

C=O) em 1632 cm

-1

. As bandas de absorção em 1302 e 1169 cm

-1

que foram atribuídas a

deformação axial (C-O) de fenóis e (C-O-C) de éteres, respectivamente (Silverstein &

Webster, 2000).

O espectro de massas de baixa resolução da substância SAFM-02

(Figura 68, p. 109) exibiu pico do íon molecular a m/z 256 correspondente a

fórmula molecular C

O espectro de RMN

H (Figura 70, p. 111) apresentou um sinal duplo em

[5,4 (J= 13,6)] atribuído ao hidrogênio oximetínico H-2 que acopla com os

hidrogênios metilênicos H-3

, δ

[2,8 (d,J= 17,2)] e H-3

, δ

[3,09 (t, J= 16,5)]

característicos de flavanonas (Mabry et al., 1970). A presença um sinal simples

a δ

[6,0 (H-6/8) e um sinal simples de intensidade maior a δ

[7,4 (H-

2’/3’/4’/5’/6’)] indicam um padrão dissubstituído para o anel A e a ausência de

substituintes no anel B. O sinal simples a δ

(12,04) foi atribuído ao hidrogênio

fenólico OH-5 em ligação hidrogênio com o carbono carbonílico C-4.

O espectro de RMN

C-APT (Figura 71, p. 112) apresentou doze sinais

sendo um sinal de carbono metilênico, cinco de carbonos metínicos e seis de

carbonos não hidrogenados. A presença dos sinais a δ

[79,3 (CH-2); 43,4

(CH

-3) e 195,9 (C-4)] atribuídos ao anel heterocíclico C confirmam a estrutura

de uma flavanona para a substância SAMH-02 (Mabry et al., 1970; Markham &

Chari, 1976). Os sinais a δ

(126,2 e 128,9) atribuídos aos carbonos (CH-2’/6’)

e (CH-3’/4’/5’) respectivamente confirmam a ausência de substituintes no anel

B. A presença dos sinais a δ

[96,8 (CH-6) e 95,5 (CH-8)] confirmam o padrão

de substituição do anel A. Os demais carbonos não hidrogenados C-5, C-7, C-

9, C-10 e C-1’aparecem a δ

(164,6; 164,5; 163,2; 103,3 e 138,4)

respectivamente.

O mapa de correlação heteronuclear a uma ligação HMQC (

) (Figura

72, p. 113) permitiu confirmar as atribuições feitas com base nos espectros de

RMN

H e

C-APT, através das correlações existentes entre o carbono CH

-3 a

(43,4) com os hidrogênios H-3α a δ

(2,8) e H-3β a δ

(3,09); o carbono CH-2

104

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

a δ

(79,3) com o hidrogênio H-2 a δ

(5,43); os carbonos C-6 a δ

(96,8) e C-8

a δ

(95,5) com os hidrogênios H-6/8 a δ

(6,0); os carbonos C-2’/6’ a δ

(126,2)

e C-3’/4’/5’ a δ

(128,9) com os hidrogênios H-2’/3’/4’/5’/ 6’ a δ

(7,4).

O mapa de correlação heteronuclar a longa distância HMBC (

)

permitiu correlacionar de forma inequívoca os pontos de ligação da substância

através das correlações do carbono CH-2 a δ

(79,3) com os hidrogênios H-

2’/6’ a δ

(7,4); do carbono C-4 a δ

(195,9) com o hidrogênio H-3α a δ

(2,8); do

carbono C-10 a δ

(103,3) com os hidrogênios H-6/H-8 a δ

(6,0). As demais

correlações encontradas na substância estão na figura 73, p. 114.

Os sinais relativos ao hidrogênio oximetínico H-2 a δ

[5,4 (J= 13,6)] e a

(5,3) e os sinais dos hidrogênios metilênicos H-3α, a δ

[2,8 (d, J= 17,2)] e

H-3

, a δ

[3,09 (t, J= 30,4)] juntamente com a análise dos dados de RMN

C-

APT e do espectro de massas que exibiu sinal do íon molecular a m/z 256 e

padrões de fragmentação a m/z 152 e 124 relativos a decomposição do tipo

retro Diel-Alder do anel C (Budzikiewicz et al., 1964) e o sinal m/z 179 relativo a

perda do anel B (Esquema 9, p. 107) permitiram confirmar a estrutura da

substância SAMH-2 como sendo a da flavanona (5,7-diidróxiflavanona)

conhecida como pinocembrina (Markham & Chari, 1976).

A substância está sendo citada pela primeira vez no gênero Swartzia.

105

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

OOH

RDA

-C

OOH

OHOH

-H

m/z 238

m/z 256

m/z 55

m/z 179

m/z 152

m/z 124

Esquema 9 - Propostas de fragmentação da substância SAMH-02

OOH

106

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

Tabela 8 - Dados espectrais de RMN

C e

H da flavanona SAMH-02 em

CDCl

C δ

(Markham & Mabry,

1975)

4 195,8 195,8 - H-3a

5 164,6 163,6 -

7 164,5 166,6 - H-6 e H-8 OH

9 163,2 162,7 - H-8

10 103,3 101,9 - OH H-6 e H-8

1’ 138,4 138,0 -

2 79,3 78,4 5,3 (sl)

5,43 (d, 17,2)

H-2’ e H-6’

6 96,8 96,1 6,00 (s) OH

8 95,5 95,1 6,00 (s)

2’/6’ 126,2 126,5 7,43

3’/4’/5’ 128,9 128,5 7,43

3 43,4 42,2 3,09 (t, 16,5)

2,83 (d, 17,2)

107

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

Figura 68 - Espectro de massas da substância SAMH-02.

108

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

3000 2500 2000 1500 1000 500 0

559

698

825

1169

1302

1466

1632

2924

% T

-1

=C-H

-C=C-

=C-C=O

-C-OH

-C-O-C-

Figura 69 - Espectro de infravermelho da substância SAMH-02.

109

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

ab undanc e

0 100.0 200 .0 3 00.0 400.0

X : parts per Million : 1H

12.0 11.0 10.0 9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0

12.0 371

7.4 442

7.2 592

6.0 026

5.4 431

5.4 092

5.3 423

3.1 287

3.0 875

3.0 527

2.8 476

2.8 045

Filename = SAMH02-1d_spectrum-3.

Author = Marcelo

Experiment = single_pulse.exp

Sample_id = SAMH02

Solvent = CHLOROFORM-D

Creation_time = 18-OCT-2006 10:32:14

Revision_time = 28-APR-2007 16:47:59

Current_time = 28-APR-2007 16:49:14

Content = Single Pulse Experime

Data_format = 1D COMPLEX

Dim_size = 16384

Dim_title = 1H

Dim_units = [ppm]

Dimensions = X

Site = Eclipse+ 400

Spectrometer = DELTA_NMR

Field_strength = 9.389766[T] (400[MHz]

X_acq_duration = 2.7312128[s]

X_domain = 1H

X_freq = 399.78219838[MHz]

X_offset = 7[ppm]

X_points = 16384

X_prescans = 0

X_resolution = 0.36613771[Hz]

X_sweep = 5.99880024[kHz]

Mod_return = 1

Scans = 8

X_90_width = 14.7[us]

X_acq_time = 2.7312128[s]

X_angle = 45[deg]

X_pulse = 7.35[us]

Initial_wait = 1[s]

Phase_preset = 3[us]

Recvr_gain = 20

Relaxation_delay = 4[s]

Temp_get = 25[dC]

Unblank_time = 2[us]

’

Figura 70 - Espectro de RMN

H da substância SAMH-02

110

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

(Thousands)

-60.0 -50.0 -40.0 -30.0 -20.0 -10.0 0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0

X : parts per Million : 13C

190.0 180.0 170.0 160.0 150.0 140.0 130.0 120.0 110.0 100.0 90.0 80.0 70.0 60.0 50.0

195.8689

164.5702

164.4632

163.2550

138.3720

128.9893

126.2288

103.3340

96.8495

95.5572

79.3305

43.4360

Filename = samh-02 espectro-2.jd

Author = Marcelo

Experiment = apt.exp

Sample_id = SAMH02

Solvent = CHLOROFORM-D

Creation_time = 19-OCT-2006 07:51:32

Revision_time = 29-APR-2007 11:29:08

Current_time = 29-APR-2007 11:29:56

Content = APT Experiment

Data_format = 1D COMPLEX

Dim_size = 32768

Dim_title = 13C

Dim_units = [ppm]

Dimensions = X

Site = Eclipse+ 400

Spectrometer = DELTA_NMR

Field_strength = 9.389766[T] (400[MHz]

X_acq_duration = 1.3008896[s]

X_domain = 13C

X_freq = 100.52530333[MHz]

X_offset = 100[ppm]

X_points = 32768

X_prescans = 4

X_resolution = 0.76870474[Hz]

X_sweep = 25.18891688[kHz]

Irr_domain = 1H

Irr_freq = 399.78219838[MHz]

Irr_offset = 5[ppm]

Mod_return = 1

Scans = 33104

X_90_width = 10.05[us]

X_acq_time = 1.3008896[s]

X_angle = 45[deg]

X_pulse = 5.025[us]

Initial_wait = 1[s]

J_constant = 140[Hz]

Phase_preset = 3[us]

Recvr_gain = 28

Relaxation_delay = 1[s]

Temp_get = 25[dC]

Unblank_time = 2[us]

’

Figura 71 - Espectro de RMN

C-APT da substância SAMH-02.

111

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

X : parts per Million : 1H

7.0 6.0 5.0 4.0 3.0

Y : part s p er Mil lion : 13C

13 0.0 120.0 110.0 1 00.0 90.0 80 .0 70.0 60.0 5 0.0 40.0

(Thousands)

0 100.0

ab u nd an ce

0 200 .0 4 00.0

Filename = flavanona-pfg_hmqc-2.

Author = Marcelo

Experiment = hmqc_irr_pfg_m.e

Sample_id = SAMH02

Solvent = CHLOROFORM-D

Creation_time = 15-NOV-2006 01:29:56

Revision_time = 6-MAY-2007 10:30:49

Current_time = 6-MAY-2007 10:42:12

Content = gradient enhanced HMQ

Data_format = 2D REAL REAL

Dim_size = 1024, 256

Dim_title = 1H 13C

Dim_units = [ppm] [ppm]

Dimensions = X Y

Site = Eclipse+ 400

Spectrometer = DELTA_NMR

Field_strength = 9.389766[T] (400[MHz]

X_acq_duration = 0.1828864[s]

X_domain = 1H

X_freq = 399.78219838[MHz]

X_offset = 7[ppm]

X_points = 1024

X_prescans = 4

X_resolution = 5.46787514[Hz]

X_sweep = 5.59910414[kHz]

Y_domain = 13C

Y_freq = 100.52530333[MHz]

Y_offset = 100[ppm]

Y_points = 128

Y_prescans = 0

Y_resolution = 197.28535354[Hz]

Y_sweep = 25.25252525[kHz]

Mod_return = 1

Scans = 64

X_acq_time = 0.1828864[s]

X_pulse = 14.7[us]

Y_acq_time = 5.0688[ms]

Y_pulse = 10[us]

Grad_1 = 1[ms]

Grad_1_amp = 60[%]

Grad_2 = 1[ms]

Grad_2_amp = 60[%]

Grad_3 = 1[ms]

Grad_3_amp = 30[%]

Grad_recover = 0.2[ms]

Grad_selection = 13C = 2:2:1

Grad_shape = square

Grad_type = 0

Initial_wait = 0.1[s]

J_constant = 140[Hz]

Phase_preset = 3[us]

Recvr_gain = 30

Refocus_comp = 2.57142857[ms]

Relaxation_delay = 2[s]

T1 = 1[us]

Temp_get = 25[dC]

Unblank_time = 2[us]

-3

CH-2

CH-8

CH-6

CH-3’/4’/5’

CH-2’/6’

’

C-3’/4’/5’

H-3’/4’/5’

C-2’/6’

H-2’/6’

C-6

H-6

C-8

H-8

C-2

H-2

C-3

H-3

C-3

H-3

Figura 72 - Espectro de HMQC da substância SAMH-02

112

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

X : parts per Million : 1H

12.0 11.0 10.0 9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0

Y : part s p er Mi llion : 13C

20 0.0190.0 180. 0 170 .0 16 0.0 1 50.0 1 40.0 130.0 120. 0 110.0 10 0.0 90 .0 8 0.0 70.0 60.0 50.0 40 .0

Filename = flavanona-pfg_hmbc-2.

Author = Marcelo

Experiment = hmbc_pfg_m.exp

Sample_id = SAMH02

Solvent = CHLOROFORM-D

Creation_time = 14-NOV-2006 20:29:36

Revision_time = 6-MAY-2007 10:50:20

Current_time = 6-MAY-2007 10:57:29

Content = gradient enhanced HMBC

Data_format = 2D REAL REAL

Dim_size = 1024, 512

Dim_title = 1H 13C

Dim_units = [ppm] [ppm]

Dimensions = X Y

Site = Eclipse+ 400

Spectrometer = DELTA_NMR

Field_strength = 9.389766[T] (400[MHz]

X_acq_duration = 0.1828864[s]

X_domain = 1H

X_freq = 399.78219838[MHz]

X_offset = 7[ppm]

X_points = 1024

X_prescans = 4

X_resolution = 5.46787514[Hz]

X_sweep = 5.59910414[kHz]

Y_domain = 13C

Y_freq = 100.52530333[MHz]

Y_offset = 100[ppm]

Y_points = 128

Y_prescans = 0

Y_resolution = 197.28535354[Hz]

Y_sweep = 25.25252525[kHz]

Mod_return = 1

Scans = 64

X_acq_time = 0.1828864[s]

X_pulse = 14.7[us]

Y_acq_time = 5.0688[ms]

Y_pulse = 10[us]

Grad_1 = 1[ms]

Grad_1_amp = 60[%]

Grad_2 = 1[ms]

Grad_2_amp = 60[%]

Grad_3 = 1[ms]

Grad_3_amp = 30[%]

Grad_recover = 1[ms]

Grad_selection = 13C = 2:2:1

Grad_shape = square

Grad_type = 0

Initial_wait = 1[s]

J_constant = 140[Hz]

Long_range_j = 8[Hz]

Phase_preset = 3[us]

Recvr_gain = 30

Relaxation_delay = 2[s]

T1 = 1[us]

Temp_get = 25[dC]

Unblank_time = 2[us]

H - 3

H -3

H - 2

H -6 / 8

H -2 ’-6 ’

O H -5

-3

CH-2

CH-8

CH-6

CH-2’/6’

CH-3’/4’/5’

C-1’

C-9

C-7

C-5

C-4

H-3

C-7

H-6/8

C-5

OH-5

C-10

H-6/8

C-10

OH-5

C-6

OH-5

CH-2

H-2’/6’

OOH

Figura 73 - Espectro de HMBC da substância SAMH-02

3.2.3. Determinação estrutural da substância SAMH-03

O tratamento cromatográfico [CCDP-hexano:AcOEt (4:1)] da fração 14-

19 oriunda da sub-fração F1C (item 2.2.7.2, p. 31) resultou no isolamento de

um sólido amarelo escuro, amorfo, solúvel em CHCl

, com coloração verde

escura em presença de solução alcoólica de cloreto férrico e vermelho carmim

quando revelado com solução ácida de vanilina em CCDA (Item 2.2.6, p. 28).

O espectro de massas da substância SAMH-03 (Figura 74, p. 118)

113

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

apresentou pico do íon molecular a m/z 284 e sinais no espectro de RMN

H e

C característico para estrutura de pterocarpano (Braz-Filho et al., 1980).

O espectro de RMN

H (Figura 75, p. 119) apresentou sinais

característicos do anel heterocíclico C a δ

[3,63 (t, J= 11 Hz) e 4,22 (dd, J= 11

e 4,8 Hz)] relativos aos hidrogênios metilênicos 2H-2; δ

[3,46 (m)] relativo ao

hidrogênio de carbono metiníco H-3 e a δ

[5,47 (d, J= 6,9 Hz)] relativo ao

hidrogênio de carbono metino H-4. Sabe-se que pterocarpanos naturais

ocorrem em duas formas enantioméricas, 3S, 4S e 3R, 4R e comparando os

valores das constantes de acoplamento dos hidrogênios do grupo metileno

-2 e os hidrogênios do grupos metinícos CH-3 e CH-4 conclui-se que a

substância possui uma junção-cis do anel C com o anel D (Máximo &

Lourenço, 1998). Os hidrogênios do grupo metilenodioxi (-OCH

O-) aparecem

a δ

(5,89 e 5,93). Os anéis aromáticos estão caracterizados pelos sinais a δ

[7,36 (H-5, d, J= 8,4); 6,55 (H-6, d, J= 8,04) 6,42 (s) H-8] atribuídos ao anel A e

[6,72 (s) H-2’ e 6,43 (s) H-5’] atribuídos ao anel B.

O espectro de RMN

C-APT (Figura 76, p. 120) apresentou 16 sinais,

sendo dois grupos metilênicos a δ

[66,44 (CH

-2) e 101,28 (O-CH

-O)] e dois

carbonos metínicos sp

a δ

[40,14 (CH-3) e 78,44 (CH-4)]. Os sinais restantes

foram atribuídos aos anéis aromáticos A e B através dos deslocamentos a δ

[132,10 (CH-5); 109,76 (CH-6); 157,04 (CH-7); 103,66 (CH-8); 156,62 (C-9);

112,62 (C-10); 117,90 (C-1’); 104,72 (CH-2’); 141,71 (C-3’); 148,09 (C-4’);

93,82 (CH-5’) e 154,31 (C-6’)].

O mapa de correlação heteronuclear a uma ligação HMQC (

) (Figura

77, p. 121) permitiu confirmar as atribuições feitas anteriormente nos espectros

de RMN

H e

C-APT, através das correlações existentes entre o carbono CH-

4 a δ

(78,44) com o hidrogênio H-4 a δ

(5,47); o carbono CH-5’ a δ

(93,82)

com o hidrogênio H-5’ a δ

(5,92); o carbono C-2’ a δ

(104,72) com o

hidrogênio H-2’ a δ

(6,72); o carbono C-6 a δ

(109,76) com o hidrogênio H-6 a

(6,55); o carbono metilenodioxi (O-CH

-O) a δ

(101,28) com seus

respectivos hidrogênios a δ

(5,89 e 5,93).

O mapa de correlação heteronuclar a longa distância HMBC (

)

permitiu correlacionar de forma inequívoca os pontos de ligação da substância

através das correlações do carbono C-7 a δ

(157,04) com os hidrogênios [H-5

114

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

a δ

(7,4); OH-7 a δ

(5,11)]; do carbono CH-3 a δ

(40,14) com os hidrogênios

[H-2α a δ

(3,63) e H-2β a δ

(4,22)]; do carbono C-4’ a δ

(148,09) com os

hidrogênios do grupo metilenodioxi a δ

(5,89 e 5,93). As demais correlações

encontradas na substância estão assinaladas na figura 78, p. 122.

O conjunto dos dados de RMN analisados da substância SAMH-03

juntamente com espectro de massas que exibiu sinal do íon molecular a m/z

284 e fragmentações em m/z 267 relativo a perda de radical hidroxila e m/z 162

relativo a decomposição do tipo retro Diel-Alder do anel C (Budzikiewicz et al.,

1964) (Esquema 10, p. 118) mostraram similaridade com aqueles descritos

para (7-hidroxi-3’,4’-metilenodioxipterocarpano) conhecida como maackiaina

descrita no gênero (Bedir et al., 1999; Braz-Filho et al., 1980).

Tabela 9 - Dados espectrais de RMN

C e

H do pterocarpano SAMH-03 em

CDCl

C δ

*δ

Bedir et al., 1999 δ

115

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

7 157,04 159,7 - HO-7 H-5

9 156,62 157,2 - H-8

H-2β; H-4

1’ 117,90 118,0 - - H-5’

3’ 141,71 141,8 - H-2’ H-5’

4’ 148,09 148,2 - H-5’ H-2’; OCH

6’ 154,31 154,3 - - H-2’

10 112,62 112,6 - - H-6

5 132,10 132,2 7,36 (d, 8,4) - H-4

6 109,76 109,8 6,55 (d, 8,04) - H-8

8 103,66 103,8 6,42 (s) - H-6

3 40,14 40,2 3,44-3,49 (m)

H-2α; H-2β

H-2’

2’ 104,72 104,8 6,72 (s) - -

5’ 93,82 93,9 5,92 (s) - -

4 78,44 78,6 5,47 (d, 6,9) - H-5

2 66,44 66,6 3,63 (t, 11)

4,22 (dd, 11; 4,8)

- H-4

OCH

O 101,28 101,4 5,89 (s)

5,93 (s)

- -

116

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

-C

m/z 175

m/z 284

m/z 267

m/z 162

Esquema 10 - Propostas de fragmentação da substância SAMH-03

Figura 74 - Espectro de massas da substância SAMH-03.

117

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

abundance

0 100.0 200.0 300.0 400.0

X : parts per Million : 1H

7.0 6.0 5.0 4.0

7.3700

7.3489

7.2574

6.7152

6.5549

6.5348

6.4294

6.4129

5.9184

5.8909

5.4742

5.4577

5.1097

4.2232

4.2085

4.1957

3.6645

3.6361

3.6086

3.4804

3.4667

3.4539

Filename = SAMH04-1d_spectrum-5.

Author = Jan Schripsema

Experiment = single_pulse.exp

Sample_id = SAMH04

Solvent = CHLOROFORM-D

Creation_time = 13-FEB-2007 07:19:10

Revision_time = 28-APR-2007 13:23:48

Current_time = 28-APR-2007 13:24:59

Content = Single Pulse Experime

Data_format = 1D COMPLEX

Dim_size = 16384

Dim_title = 1H

Dim_units = [ppm]

Dimensions = X

Site = Eclipse+ 400

Spectrometer = DELTA_NMR

Field_strength = 9.389766[T] (400[MHz]

X_acq_duration = 2.7312128[s]

X_domain = 1H

X_freq = 399.78219838[MHz]

X_offset = 7[ppm]

X_points = 16384

X_prescans = 0

X_resolution = 0.36613771[Hz]

X_sweep = 5.99880024[kHz]

Mod_return = 1

Scans = 8

X_90_width = 14.7[us]

X_acq_time = 2.7312128[s]

X_angle = 45[deg]

X_pulse = 7.35[us]

Initial_wait = 1[s]

Phase_preset = 3[us]

Recvr_gain = 22

Relaxation_delay = 4[s]

Temp_get = 25[dC]

Unblank_time = 2[us]

’

Figura 75 - Espectro de RMN

H da substância SAMH-03

118

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

(Thousands)

-30.0 -20.0 -10.0 0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0

X : parts per Million : 13C

150.0 140.0 130.0 120.0 110.0 100.0 90.0 80.0 70.0 60.0 50.0 40.0

157.1298

156.7245

154.3081

148.1906

141.8055

132.2086

118.0007

112.7091

109.8492

104.8252

103.7470

101.3841

93.9207

78.5887

66.5220

40.1938

Author = Jan Schripsema

Experiment = apt.exp

Sample_id = SAMH04

Solvent = CHLOROFORM-D

Creation_time = 1-FEB-2007 06:47:08

Revision_time = 4-MAY-2007 11:30:58

Current_time = 4-MAY-2007 11:35:27

Comment = APT Experiment

Data_format = 1D COMPLEX

Dim_size = 32768

Dim_title = 13C

Dim_units = [ppm]

Dimensions = X

Site = Eclipse+ 400

Spectrometer = DELTA_NMR

Field_strength = 9.389766[T] (400[MHz]

X_acq_duration = 1.3008896[s]

X_domain = 13C

X_freq = 100.52530333[MHz]

X_offset = 100[ppm]

X_points = 32768

X_prescans = 4

X_resolution = 0.76870474[Hz]

X_sweep = 25.18891688[kHz]

Irr_domain = 1H

Irr_freq = 399.78219838[MHz]

Irr_offset = 5[ppm]

Mod_return = 1

Scans = 25747

X_90_width = 10.05[us]

X_acq_time = 1.3008896[s]

X_angle = 45[deg]

X_pulse = 5.025[us]

Initial_wait = 1[s]

J_constant = 140[Hz]

Phase_preset = 3[us]

Recvr_gain = 28

Relaxation_delay = 1[s]

Temp_get = 22.9[dC]

Unblank_time = 2[us]

’

Figura 76 - Espectro de RMN

C-APT da substância SAMH-03

119

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

X : parts per Million : 1H

7.0 6.0 5.0 4.0

Y : parts p er Mil lion : 13C

130. 0 120 .0 110.0 10 0.0 90 .0 80 .0 7 0.0 6 0.0 50.0 40.0

(Thousands)

-20.0 0

a bu nd an ce

0 200.0 400.0600.0

Filename = pterocarpano-pfg_hmqc

Author = Jan Schripsema

Experiment = hmqc_irr_pfg_m.e

Sample_id = SAMH04

Solvent = CHLOROFORM-D

Creation_time = 13-FEB-2007 10:37:46

Revision_time = 4-MAY-2007 14:06:53

Current_time = 4-MAY-2007 14:13:35

Content = gradient enhanced HMQ

Data_format = 2D REAL REAL

Dim_size = 1024, 256

Dim_title = 1H 13C

Dim_units = [ppm] [ppm]

Dimensions = X Y

Site = Eclipse+ 400

Spectrometer = DELTA_NMR

Field_strength = 9.389766[T] (400[MHz]

X_acq_duration = 0.1828864[s]

X_domain = 1H

X_freq = 399.78219838[MHz]

X_offset = 7[ppm]

X_points = 1024

X_prescans = 4

X_resolution = 5.46787514[Hz]

X_sweep = 5.59910414[kHz]

Y_domain = 13C

Y_freq = 100.52530333[MHz]

Y_offset = 100[ppm]

Y_points = 128

Y_prescans = 0

Y_resolution = 172.84292035[Hz]

Y_sweep = 22.12389381[kHz]

Mod_return = 1

Scans = 8

X_acq_time = 0.1828864[s]

X_pulse = 14.7[us]

Y_acq_time = 5.7856[ms]

Y_pulse = 10[us]

Grad_1 = 1[ms]

Grad_1_amp = 60[%]

Grad_2 = 1[ms]

Grad_2_amp = 60[%]

Grad_3 = 1[ms]

Grad_3_amp = 30[%]

Grad_recover = 0.2[ms]

Grad_selection = 13C = 2:2:1

Grad_shape = square

Grad_type = 0

Initial_wait = 0.1[s]

J_constant = 140[Hz]

Phase_preset = 3[us]

Recvr_gain = 30

Refocus_comp = 2.57142857[ms]

Relaxation_delay = 2[s]

T1 = 1[us]

Temp_get = 25[dC]

Unblank_time = 2[us]

C-3

C-4

C-5

C-2

C-8

-----C-2’

C-5’

O-CH

-O

C-6

’

C-5

H-5

C-6

H-6

C-2’

H-2’

C-5’

H-5’

O-CH

-O

C-4

H-4

Figura 77 - Espectro de HMQC da substância SAMH-03

120

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

X : parts per Million : 1H : RANGED

7.0 6.0 5.0 4.0

Y : parts per Million : 13C : RANGED

160.0 150.0 140.0 130.0 120.0 110.0 100.0 90.0 80.0 70.0 60.0 50.0 40.0

Filename = pterocarpano-pfg_hmbc

Author = Jan Schripsema

Experiment = hmbc_pfg_m.exp

Sample_id = SAMH04

Solvent = CHLOROFORM-D

Creation_time = 13-FEB-2007 09:59:36

Revision_time = 7-MAY-2007 22:17:27

Current_time = 7-MAY-2007 22:23:48

Content = gradient enhanced HMB

Data_format = 2D REAL REAL

Dim_size = 1024, 512

Dim_title = 1H 13C

Dim_units = [ppm] [ppm]

Dimensions = X Y

Site = Eclipse+ 400

Spectrometer = DELTA_NMR

Field_strength = 9.389766[T] (400[MHz]

X_acq_duration = 0.1828864[s]

X_domain = 1H

X_freq = 399.78219838[MHz]

X_offset = 7[ppm]

X_points = 1024

X_prescans = 4

X_resolution = 5.46787514[Hz]

X_sweep = 5.59910414[kHz]

Y_domain = 13C

Y_freq = 100.52530333[MHz]

Y_offset = 100[ppm]

Y_points = 128

Y_prescans = 0

Y_resolution = 172.84292035[Hz]

Y_sweep = 22.12389381[kHz]

Mod_return = 1

Scans = 32

X_acq_time = 0.1828864[s]

X_pulse = 14.7[us]

Y_acq_time = 5.7856[ms]

Y_pulse = 10[us]

Grad_1 = 1[ms]

Grad_1_amp = 60[%]

Grad_2 = 1[ms]

Grad_2_amp = 60[%]

Grad_3 = 1[ms]

Grad_3_amp = 30[%]

Grad_recover = 1[ms]

Grad_selection = 13C = 2:2:1

Grad_shape = square

Grad_type = 0

Initial_wait = 1[s]

J_constant = 140[Hz]

Long_range_j = 8[Hz]

Phase_preset = 3[us]

Recvr_gain = 30

Relaxation_delay = 2[s]

T1 = 1[us]

Temp_get = 25[dC]

Unblank_time = 2[us]

CH-3

-2

CH-4

CH-5’

---CH-8

------------CH-2’

CH-6

C-10

C-1’

CH-5

C-3’

C-4’

----C-6’

----------C-9

C-7

O-CH

-O

’

C-9

H-2

C-7

HO-7

C-9

H-4

C-9

H-8

C-6’

H-2’

C-7

H-5

C-4’

H-2’

C-3’

H-5’

CH-5

H-4

C-1’

H-5’

CH-6

H-8

C-10

H-6

C-8

H-6

CH-4

H-5

-2

H-4

CH-3

H-2’

CH-3

H-2

CH-3

H-2

C-6’

H-5’

C-3’

H-2’

C-4’

H-5’

C-4 ’

O-CH

-O

Figura 78 - Espectro de HMBC da substância SAMH-03

3.2.4. Determinação estrutural da substância SAMH-04.

121

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

O tratamento cromatográfico da fração 1-9 [CCDP hexano:CH

(3:2)]

originária da sub-fração F1C (item 2.5.7.2, p. 31) possibilitou o isolamento de

um sólido branco e amorfo, solúvel em CHCl

A elucidação estrutural da substância SAMH-04 foi feita com base na

análise dos espectros de RMN

H e

C-APT, CG-EM e comparação com dados

da literatura (Campos et al., 1991; Arisawa, et al., 1980)

O espectro de RMN

H (Figura 79, p. 125) mostra sinais característicos

de triterpenos com o aparecimento de sinais simples a δ

(0,75-1,67), sendo

que o sinal a δ

(1,67) foi atribuído aos hidrogênios da metila CH

-30 que

aparece em freqüência mais alta pelo fato de estar ligada a um carbono com

hibridização sp

. Na região de hidrogênios carbinólicos foi observado um duplo

sinal duplo a δ

[3,18 (dd, J=10,4 e 4,8 Hz)] relativo ao hidrogênio do carbono

metínico CH-3. A presença do metileno terminal foi confirmada através dos

sinais na região de hidrogênios olefínicos a δ

[4,68 (d, J=2,2 Hz) e 4,59] cujo

valor da constante de acoplamento confirma a ocorrência de um acoplamento

geminal (Silverstein & Webster, 2000). Podemos observar ainda o sinal múltiplo

a δ

(2,36 m) relativo ao hidrogênio H-19.

O espectro de RMN

C-APT (Figuras 80 e 81, p. 126 e 127) confirmou

as atribuições feitas no espectro RMN

H. Neste podemos notar a presença

dos carbonos sp2 de vinila em δ

[153,31(CH-20) e 109,40 (CH-29)], um

carbono oxigenado em δ

[79,08 (CH-3)]. As demais atribuições feitas para a

molécula estão resumidas na tabela 10, p. 124.

O espectro de massas (Figura 82, p. 128) que apresentou o pico do íon

molecular a m/z 426 e em m/z 218 relativo a fragmentação do anel C e em m/z

411 relativo a perda de grupo metila (-

) (Budzikiewicz et al., 1967)

confirmam a estrutura do triterpeno lupeol para a substância SAMH-04, as

demais fragmentações estão ilustradas no esquema 11, p. 128.

Tabela 10 - Dados espectrais de RMN

C do triterpeno SAMH-04 em CDCl

SAMH-04 Lupeol*

C δ

(Campos

et al., 1991 e Arisawa, et al., 1980)

122

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

1 38,80 38,6

2 26,02 27,3

3 79,08 78,9

4 38,96 38,8

5 55,39 55,2

6 18,40 18,2

7 34,37 34,2

8 41,09 40,7

9 50,52 50,3

10 39,34 37,1

11 21,01 20,9

12 25,22 25,0

13 37,20 38,0

14 43,08 42,7

15 27,51 27,4

16 35,67 35,5

17 42,40 42,9

18 48,07 48,2

19 47,49 47,9

20 150,31 150,8

21 29,45 29,8

22 40,08 39,9

23 28,07 27,9

24 15,44 15,3

25 16,19 16,1

26 16,19 15,9

27 14,20 14,5

28 18,09 17,9

29 109,40 109,3

30 19,65 19,2

123

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

ab un da nce

0 100.0 200.0

X : parts per Million : 1H

4.0 3.0 2.0 1.0

4.6 829

4.6 774

4.5 593

3.6 480

3.6 324

3.6 169

3.1 993

3.1 873

3.1 727

2.3 768

2.3 622

2.3 493

2.3 411

1.6 735

1.6 524

1.5 581

1.5 407

1.3 831

1.3 557

1.2 091

1.2 000

1.0 232

0.9 609

0.9 380

0.8 895

0.8 730

0.8 236

0.7 814

0.7 549

Filename = lupeol-1d_spectrum-4.

Author = Jan Schripsema

Experiment = single_pulse.exp

Sample_id = SAMH03

Solvent = CHLOROFORM-D

Creation_time = 13-MAR-2007 06:25:05

Revision_time = 4-MAY-2007 13:27:38

Current_time = 4-MAY-2007 13:28:14

Content = Single Pulse Experime

Data_format = 1D COMPLEX

Dim_size = 16384

Dim_title = 1H

Dim_units = [ppm]

Dimensions = X

Site = Eclipse+ 400

Spectrometer = DELTA_NMR

Field_strength = 9.389766[T] (400[MHz]

X_acq_duration = 2.7312128[s]

X_domain = 1H

X_freq = 399.78219838[MHz]

X_offset = 7[ppm]

X_points = 16384

X_prescans = 0

X_resolution = 0.36613771[Hz]

X_sweep = 5.99880024[kHz]

Mod_return = 1

Scans = 8

X_90_width = 14.7[us]

X_acq_time = 2.7312128[s]

X_angle = 45[deg]

X_pulse = 7.35[us]

Initial_wait = 1[s]

Phase_preset = 3[us]

Recvr_gain = 21

Relaxation_delay = 4[s]

Temp_get = 27.5[dC]

Unblank_time = 2[us]

3 H -3 0

H -3

2 H - 2 9

H - 1 9

25 26

Figura 79 - Espectro de RMN

H da substância SAMH-04

124

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

(T h ou san ds )

-10.0 0 10. 0 20. 0

X : parts per Million : 13C

150.0 140.0 130.0 120.0 110.0 100.0 90.0 80.0 70.0 60.0 50.0 40.0 30.0 20.0 10.0 0

153.3 140

144.1 378

123.0 171

109.4 057

90.2 273

79.0 858

63.2 644

55.3 881

48.0 700

47.4 889

43.0 843

41.0 885

40.0 791

39.3 373

38.8 020

35.6 668

34.3 668

29.4 499

28.0 735

27.5 152

25.2 212

21.0 154

18.4 002

18.0 866

16.1 902

14.1 944

Filename = lupeol-apt-3.jdf

Author = Jan Schripsema

Experiment = apt.exp

Sample_id = SAMH03

Solvent = CHLOROFORM-D

Creation_time = 14-MAR-2007 06:30:10

Revision_time = 4-MAY-2007 14:02:40

Current_time = 4-MAY-2007 14:03:35

Content = APT Experiment

Data_format = 1D COMPLEX

Dim_size = 32768

Dim_title = 13C

Dim_units = [ppm]

Dimensions = X

Site = Eclipse+ 400

Spectrometer = DELTA_NMR

Field_strength = 9.389766[T] (400[MHz]

X_acq_duration = 1.3008896[s]

X_domain = 13C

X_freq = 100.52530333[MHz]

X_offset = 100[ppm]

X_points = 32768

X_prescans = 4

X_resolution = 0.76870474[Hz]

X_sweep = 25.18891688[kHz]

Irr_domain = 1H

Irr_freq = 399.78219838[MHz]

Irr_offset = 5[ppm]

Mod_return = 1

Scans = 36584

X_90_width = 10.05[us]

X_acq_time = 1.3008896[s]

X_angle = 45[deg]

X_pulse = 5.025[us]

Initial_wait = 1[s]

J_constant = 140[Hz]

Phase_preset = 3[us]

Recvr_gain = 29

Relaxation_delay = 1[s]

Temp_get = 25.1[dC]

Unblank_time = 2[us]

25 26

Figura 80 - Espectro de RMN

C-APT da substância SAMH-04

125

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

(Thousan ds )

-12.0 -10.0 -8 .0 -6.0 -4.0 -2.0 0 2.0 4 .0 6. 0 8.0 10.0 12.0 1 4.0

X : parts per Million : 13C

50.0 40.0 30.0 20.0 10.0

55.3 881

50.5 171

48.0 700

47.4 889

43.0 843

42.3 961

41.0 885

40.0 791

39.3 373

38.9 626

38.8 020

37.3 415

35.6 668

34.3 668

29.4 499

28.0 735

27.5 152

25.2 212

22.7 589

21.0 154

19.6 466

18.4 002

18.0 866

16.1 902

15.4 408

14.1 944

25 26

Figura 81 - Ampliação do espectro de RMN

C-APT da substância SAMH-04

(região de 0 a 60 ppm).

126

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

-CH

m/z 426

m/z 411

m/z 207

m/z 189

m/z 218

m/z 425

-H

-C

Esquema 11 - Padrões de fragmentação da substância SAMH-04

Figura 82 - Espectro de massas da substância SAMH-04

127

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

3.2.5. Determinação estrutural da substância SAMH-05

Os fitoesteróides ocorrem amplamente no reino vegetal. Normalmente

aparecem em mistura de difícil separação, pois apresentam propriedades

espectroscópicas semelhantes.

Misturas contendo estigmasterol são facilmente identificadas nos

espectros de RMN

H, pelos sinais referentes aos hidrogênios vinínilicos (H-22

e H-23) que aparecem como dois duplos dupletos entre δ 5,00 e 5,20.

Na determinação do número de fitoesteróides em uma mistura, bem

como sua identificação, a técnica de CG-EM é muito útil. Esta técnica foi

utilizada primeiramente para identificar a mistura de fitoesteróides presentes

em SAMH-05 isolada da sub-fração F1D (Esquema 6, p. 32) como um sólido

cristalino, solúvel em CHCl

A análise do cromatograma (Figura 86, p. 135) da substância SAMH-05

mostrou tratar-se de uma mistura de esteróides. O espectro de massas de

cada componente confirmou a presença do β-sitosterol, pico do íon molecular a

m/z 414, estigmasterol a m/z 412 e campesterol a m/z 400 (Figura 87-89, p.

135-136).

O espectro de RMN

H (400 MHz) da mistura (Figura 83, p. 132),

apresentou dois sinais largos a δ

(3,53), atribuído ao hidrogênio do carbono

carbinólico H-3 e a δ

(5,35) referente ao hidrogênio olefínico H-6. Foram ainda

observados um grande acúmulo de sinais na região de δ

(0,68 a 1,01) relativo

aos hidrogênios dos grupos metílicos esqueleto esteroidal. Os dois duplos

sinais duplos a δ

5,01 (dd, J= 8,08; 14,5 Hz, H-22) e 5,15 (dd, J= 8,4; 14,8 Hz,

H-23) foram atribuídos aos hidrogênios olefínicos da cadeia lateral da estrutura

do estigmasterol.

O espectro de RMN

C-APT da mistura (Figuras 84-85, p. 133-134),

possibilitou distinguir as substâncias SAMH-05a e b através dos sinais a δ

(121,70 e 140,72) (CH-6 e CH-5) presentes no β-sitosterol e no estigmasterol e

(129,24 e 138,30) (CH-23 e CH-22), presente apenas no estigmasterol (Seo,

S., et al., 1988).

O outro esteróide detectado na mistura, o campesterol SAMH-05c,

apresentou grande semelhança com o β-sitosterol, com a exceção de um grupo

metilênico a menos em CH-24 na cadeia lateral, o que torna praticamente

128

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

indistinguível do β-sitosterol no espectro de RMN

H. A distinção entre as

substâncias foi feita principalmente pela análise de CG/EM, cujos fragmentos

estão ilustrados nos esquemas 12, 13 e 14, p. 137 e 138.

SAMH-05a SAMH-05c

SAMH-05b

129

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

Tabela 11 - Dados espectrais de RMN

C dos esteróides SAMH-05a/b/c em

CDCl

SAMH-05a Sitosterol SAMH-05b Stigmasterol SAMH-05c Campesterol

C δ

1 37,34 37,3 37,34 37,3 37,34 37,3

2 31,74 31,9 31,74 31,9 31,74 31,9

3 71,90 71,8 71,90 71,8 71,90 71,8

4 42,37 42,2 42,37 42,2 42,37 42,2

5 140,83 140,7 140,83 140,7 140,83 140,7

6 121,81 121,7 121,81 121,7 121,81 121,7

7 34,02 33,9 34,02 33,9 34,02 33,9

8 31,97 31,9 31,97 31,9 31,97 31,9

9 50,23 50,1 50,23 50,1 50,23 50,1

10 36,60 36,1 36,60 36,1 36,60 36,1

11 21,16 21,1 21,16 21,1 21,16 21,1

12 39,77 39,8 39,77 39,8 39,77 39,8

13 42,37 42,3 42,37 42,3 42,37 42,3

14 56,95 56,8 56,95 56,8 56,95 56,8

15 24,46 24,3 24,46 24,3 24,46 24,3

16 29,01 28,9 29,01 28,9 29,01 28,9

17 56,03 56,0 56,03 56,0 56,03 56,0

18 12,35 12,3 12,35 12,3 12,35 12,3

19 19,48 19,4 19,48 19,4 19,48 19,4

20 40,60 39,8 40,60 39,8 36,23 37,3

21 19,07 18,8 19,91 20,5 19,07 14,1

22 31,74 32,0 138,41 138,3 31,74 32,0

23 26,14 26,0 129,36 129,3 28,34 31,6

24 45,91 45,8 51,33 51,2 45,91 45,8

25 29,22 29,0 31,97 31,9 31,97 31,9

26 19,91 19,8 21,31 21,2 21,31 21,2

27 19,48 19,8 19,48 19,8 21,18 20,2

28 23,15 23,0 23,15 25,4 18,87 18,2

29 11,95 11,8 12,14 11,9 - -

130

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

ab un da nce

-1 0.0 10 .0 30.0 50 .0 70.0 90.0 11 0.0 130 .0 1 50.0 170. 0 19 0.0 210.0 23 0.0 250.0

X : parts per Million : 1H

5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0

5.3 460

5.1 500

5.1 335

5.112 4

5.0 337

5.0 126

3.5 216

2.2 724

2.2 285

1.9 949

1.9 464

1.8 530

1.8 255

1.6 350

1.5 205

1.4 875

1.0 177

1.0 031

0.9 206

0.9 087

0.8 355

0.8 162

0.7 961

0.7 823

0.6 898

0.6 724

-0.008 0

Filename = SAMH05-1d_spectrum-3.

Author = Jan Schripsema

Experiment = single_pulse.exp

Sample_id = SAMH05

Solvent = CHLOROFORM-D

Creation_time = 10-NOV-2006 14:53:40

Revision_time = 30-APR-2007 15:26:27

Current_time = 30-APR-2007 15:28:56

Content = Single Pulse Experime

Data_format = 1D COMPLEX

Dim_size = 16384

Dim_title = 1H

Dim_units = [ppm]

Dimensions = X

Site = Eclipse+ 400

Spectrometer = DELTA_NMR

Field_strength = 9.389766[T] (400[MHz]

X_acq_duration = 2.7312128[s]

X_domain = 1H

X_freq = 399.78219838[MHz]

X_offset = 7[ppm]

X_points = 16384

X_prescans = 0

X_resolution = 0.36613771[Hz]

X_sweep = 5.99880024[kHz]

Mod_return = 1

Scans = 8

X_90_width = 14.7[us]

X_acq_time = 2.7312128[s]

X_angle = 45[deg]

X_pulse = 7.35[us]

Initial_wait = 1[s]

Phase_preset = 3[us]

Recvr_gain = 14

Relaxation_delay = 4[s]

Temp_get = 19[dC]

Unblank_time = 2[us]

HO HO

Figura 83 - Espectro de RMN

H das substâncias SAMH-05a/b/c

131

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

(Thousands)

-120.0 -100.0 -80.0 -60.0 -40.0 -20.0 0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 120.0

X : parts per Million : 13C

140.0 130.0 120.0 110.0 100.0 90.0 80.0 70.0 60.0 50.0 40.0 30.0 20.0 10.0

140.8343

138.4103

129.3564

121.8089

77.0900

71.8901

56.9481

56.8410

56.0305

51.3276

50.2341

45.9136

42.3731

40.5991

39.8573

39.7655

37.3415

36.5997

31.9734

31.7440

29.0140

25.5041

24.4565

21.3060

21.1607

19.4860

19.0731

12.3515

12.1374

Filename = SAMH05-apt-2.jdf

Author = Jan Schripsema

Experiment = apt.exp

Sample_id = SAMH05

Solvent = CHLOROFORM-D

Creation_time = 13-NOV-2006 04:50:38

Revision_time = 30-APR-2007 15:36:58

Current_time = 30-APR-2007 15:38:00

Content = APT Experiment

Data_format = 1D COMPLEX

Dim_size = 32768

Dim_title = 13C

Dim_units = [ppm]

Dimensions = X

Site = Eclipse+ 400

Spectrometer = DELTA_NMR

Field_strength = 9.389766[T] (400[MHz]

X_acq_duration = 1.3008896[s]

X_domain = 13C

X_freq = 100.52530333[MHz]

X_offset = 100[ppm]

X_points = 32768

X_prescans = 4

X_resolution = 0.76870474[Hz]

X_sweep = 25.18891688[kHz]

Irr_domain = 1H

Irr_freq = 399.78219838[MHz]

Irr_offset = 5[ppm]

Mod_return = 1

Scans = 36480

X_90_width = 10.05[us]

X_acq_time = 1.3008896[s]

X_angle = 45[deg]

X_pulse = 5.025[us]

Initial_wait = 1[s]

J_constant = 140[Hz]

Phase_preset = 3[us]

Recvr_gain = 28

Relaxation_delay = 1[s]

Temp_get = 21.7[dC]

Unblank_time = 2[us]

HO HO

CH-22

(SAMH -05b)

(

)

SAMH-05a

SAMH-05b SAMH-05c

Figura 84 - Espectro de RMN

C-APT das substâncias SAMH-05a/b/c

132

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

(Thousands)

-80.0 -70.0 -60.0 -50.0 -40.0 -30.0 -20.0 -10.0 0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0 100.0

X : parts per Million : 13C

58.057.0 56.0 55.0 54.0 53.0 52.0 51.0 50.0 49.0 48.0 47.046.0 45.0 44.043.0 42.0 41.0 40.0 39.0 38.0 37.0 36.0 35.0 34.0 33.032.031.0 30.0 29.0 28.0 27.0 26.0 25.0 24.0 23.0 22.0 21.0 20.0 19.0 18.0 17.0 16.0 15.0 14.0 13.0 12.0

56.9481

56.8410

56.1222

56.0305

51.3276

50.2341

45.9136

42.3731

40.5991

39.8573

39.7655

37.3415

36.5997

36.2327

34.0227

31.9734

31.7440

29.2205

29.0140

28.3411

26.1388

25.5041

24.4565

24.3953

23.1489

21.3060

21.1836

21.1607

19.9142

19.4860

19.0731

18.8666

12.3515

12.1374

11.9462

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

HO HO

SAMH-05a

SAMH-05c

SAMH-05b

Figura 85 - Ampliação do espectro de RMN

C-APT das substâncias SAMH-

05a/b/c (região de 12 a 58 ppm).

133

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

SAMH-05a

SAMH-05b

SAMH-05c

Figura 86 - Espectro de CG das substâncias SAMH-05a/b/c

Figura 87 - Espectro de massas da substância SAMH-05a

134

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

Figura 88 - Espectro de massas da substância SAMH-05b

Figura 89 - Espectro de massas da substância SAMH-05c

135

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

m/z 135

m/z 79 m/z 105

m/z 381

m/z 399

m/z 138

m/z 255

m/z 414

m/z 273

-C

-CH

-H

-C

Esquema 12 - Propostas de fragmentação da substância SAMH-05a

m/z 273

m/z 412

m/z 255

m/z 274

m/z 397

m/z 379

m/z 105m/z 79

m/z 135

-CH

-C

-H

-C

-H

-C

Esquema 13 - Propostas de fragmentação da substância SAMH-05b

136

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

m/z 135

m/z 79 m/z 105

m/z 385

m/z 138

m/z 255

m/z 400

m/z 273

-C

-CH

-H

-C

m/z 121

-C

m/z 123

-OH

Esquema 14 - Padrões de fragmentação da substância SAMH-05c

3.3. Constantes Físicas e Dados Espectroscópicos das Substâncias Isoladas

Saponina (SAFM-01)

ácido-3-O-

-hidroxi-28-

-O-D-glicopiranosil éster

F.M. = C

P.M. = 618 u.m.a.

Pf = 219-224 ºC

137

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

Aspecto = sólido branco

Solubillidade = metanol

Espectroscopia de RMN

H (400 MHz, Piridina-d

, Hz): δ (3,28, d 8,4, H-3); (0,67, m, H-5);

(1,56, H-9); (5,41, s, H-12); (3,17, d 13,2, H-18); (1,23, s, H-23); (0,90, s, H-24); (0,78, s, H-25);

(1,05, s, H-26); (1,24, s, H-27); (0,88, s, H-29); (0,87, s, H-30); (6,29,d 7,3, H-1’); (4,27, t 16,5,

H-2’); (4,35-4,39, m, H-3’); (3,61-3,69, m, H-4’); (4,19, H-5’); (4,57, d 7,3; 4,71, sl; 2H-6’).

Espectroscopia de RMN

C (100 MHz, Piridina-d

, Hz): δ 38,55 (CH

-1); 26,21 (CH

-2);

89,25 (CH-3); 39,31 (C-4); 55,66 (CH-5); 18,36 (CH

-6); 33,92 (CH

-7); 39,77 (C-8); 47,86 (CH-

9); 36,78 (CH-10); 23,30 (CH

-11); 123,95 (CH-12); 144,01 (C-13); 42,01 (C-14); 28,14 (CH

15); 23,64 (CH

-16); 46,88 (C-17); 41,62 (CH-18); 46,12 (CH

-19); 30,61 (C-20); 31,94 (CH

21); 32,39 (CH

-22); 28,09 (CH

-23); 16,83 (CH

-24); 15,39 (CH

-25); 18,51 (CH

-26); 25,97

(CH

-27); 176,36 (C-28); 33,03 (CH

-29); 23,55 (CH

-30); 95,63 (CH-1’); 73,98 (CH-2’); 79,15

(CH-3’); 71,02 (CH-4’); 78,73 (CH-5’); 62,12 (CH

-6’).

Espectroscopia na região do infravermelho: IV

max

KBr (cm

-1

): 3616, 2943, 1736, 1608, 1414,

1385, 1072, 1043.

Saponina (SAFM-02)

-D-O-xilopiranosil-(1’”→4”)[

-D-ramnopiranosil]-28-O-

-D-glicopiranosil éster

F.M. = C

P.M. = 897 u.m.a.

Pf = 209-216 ºC

Aspecto = sólido branco

Solubilidade = metanol

Espectroscopia de RMN

H (400 MHz, MeOH-d

, Hz): δ (3,17, dd 11,3; 3,7; H-3); (0,77, dl, H-

5); (1,57, d 7,0, H-9); (5,24, sl, H-12); (2,83, dd 7,0; 3,6; H-18); (2,01; 1,69; 2H-2); (1,70; 1,39;

2H-6); (1,51; 1,49; 2H-7); (1,88, 2H-11); (1,72; 1,20; 2H-19); (1,03, s, H-23); (0,83, s, H-24);

(0,92, s, H-25); (0,78, s, H-26); (1,14, s, H-27); (0,90, s, H-29); (0,93, s, H-30); (4,33, d 8,04, H-

1’); (3,33, H-2’); (3,38, H-3’), (3,50, H-4’), (3,79, H-5’); (3,82, 2H-6’); (5,17, s, H-1”); (3,93, m, H-

2”); (3,57, H-3”); (3,69, H-4”); (4,08, m, 2H-5”); (5,37, d 7,7, H-1’”); (3,30, H-2’”); (3,71, H-3’”);

(3,36, H-4’”); (3,64, m, H-5’”); (1,23, d 6,6, 3H-6’”).

138

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

Espectroscopia de RMN

C (100 MH

, MeOH-d

, H

): δ 39,82 (CH

-1); 26,89 (CH

-2); 90,89

(CH-3); 40,18 (CH-4); 56,94 (CH-5); 19,35 (CH

-6); 34,94 (CH

-7); 40,70 (C-8); 48,79 (CH-9);

37,88 (C-10); 24,01 (CH

-11); 123,86 (CH-12); 144,75 (C-13); 42,91 (C-14); 28,89 (CH

-15);

24,58 (CH

-16); 48,07 (C-17); 42,62 (CH-18); 47,17 (CH

-19); 31,52 (C-20); 33,14 (CH

-21);

33,95 (CH

-22); 28,57 (CH

-23); 17,04 (CH

-24); 16,04 (CH

-25); 17,89 (CH

-26); 26,29 (CH

27); 33,47 (CH

-29); 23,98 (CH

-30); 95,70 (CH-1’); 73,94 (CH-2’); 78,29 (CH-3’); 69,75 (CH-4’);

76,16 (CH-5’); 62,45 (CH

-6’); 106,48 (CH-1”); 71,17 (CH-2”); 78,67 (CH-3”); 83,60 (CH-4”);

68,56 (CH

-5”); 102,44 (CH-1’”); 72,32 (CH-2’”); 72,70 (CH-3’”); 74,16 (CH-4’”); 69,16 (CH-5’”);

17,76 (CH

-6’”).

Espectroscopia na região do infravermelho: IV

max

KBr (cm

-1

): 2924, 2852, 1755, 1464, 1373,

1225, 1076, 1039.

Flavonóide (SAFM-03)

3,5,7,4’-tetraidroxiflavonol

F.M. = C

P.M. = 286 u.m.a.

Aspecto = sólido amarelo

Solubilidade = metanol

Espectroscopia de RMN

H (400 MHz, MeOH-d

, Hz): δ (6,17, d 1,9, H-6); (6,39, d 2,1, H-8);

(8,08, dd 9,1; 2,2; H-2’/6’); (6,89, dd 9,1; 2,2; H-3’/5’).

Espectroscopia de RMN

C (100 MH

, MeOH-d

, H

): δ 147,19 (C-2); 134,96 (C-3); 177,60

(C-4); 160,49 (C-5); 97,96 (CH-6); 164,36 (C-7); 93,12 (CH-8); 156,97 (C-9); 100,96 (C-10);

122,43 (C-1’); 159,48 (C-4’); 129,30 (CH-2’/6’); 115,02 (CH-3’/5’).

Espectroscopia de massas: (70 eV) m/z (int. rel): 286 (M

•

, 100), 121 (45), 65 (32), 51 (27),

258 (18), 229 (16), 93 (15), 143 (14), 213 (11).

Espectroscopia na região do infravermelho: IV

max

KBr (cm

-1

): 3321, 1614, 1506, 1176, 1009,

819.

Flavonóide (SAFM-04)

5,7,4’-triidroxi-3-

-O-D-glicopiranosil-(1”’ → 6”)-O-

-L-raminopiranosil-(1”” →2”’)-O-

-L-

raminopiranosil-flavonol

F.M. = C

P.M. = 740 u.m.a.

Pf = 157-169 ºC

Aspecto = sólido amarelo

139

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

Solubilidade = metanol

Espectroscopia de RMN

H (400 MHz, MeOH-d

, Hz): δ (6,17, s, H-6); (6,37, s, H-8); (8,05, d

9,1, H-2’/6’); (6,89, d 8,8, H-3’/5’); (5,59, d 7,5, H-1”); (3,88, m, H-2”); (3,78, m, H-3”); (3,72, m,

H-4”); (3,64, t 12,4, H-5”); (6,72 m; 3,44 m; 2H-6”); (5,21, s, H-1’”); (3,92, dd 9,2; 7,8; H-2’”);

(3,69, H-3’”); (3,34, t 9,6, H-4’”); (3,99, m, H-5’”); (0,97, d 5,8, 3H-6’”); (4,51, d 8,9, H-1””); (3,57,

m, H-2””); (3,52, H-3””); (3,24, H-4””); (3,51, m, H-5””); (1,17, d 6,5, 3H-6””).

Espectroscopia de RMN

C (100 MHz, MeOH-d

, Hz): δ 158,68 (C-2); 134,46 (C-3); 179,40

(C-4); 163,07 (C-5); 99,74 (CH-6); 165,55 (C-7); 94,66 (CH-8); 158,36 (C-9); 105,85 (C-10);

123,05 (C-1’); 161,27 (C-4’); 132,17 (CH-2’/6’); 116,15 (C-3’/5’); 100,84 (CH-1”); 77,54 (CH-2”);

75,68 (CH-3”); 69,83 (CH-4”); 75,23 (CH-5”); 67,12 (CH

-6”); 102,56 (CH-1’”); 72,27 (CH-2’”);

72,36 (CH-3’”); 74,04 (CH-4’”); 70,70 (CH-5’”); 17,93 (CH

-6’”); 101,80 (CH-1””); 72,05 (CH-2””);

72,31 (CH-3””); 73,86 (CH-4””); 69,68 (CH-5””); 17,47 (CH

-6””).

Espectroscopia na região do infravermelho: IV

max

KBr (cm

-1

): 3416, 2943, 1608, 1385, 1072,

669.

Estilbeno (SAMH-01)

3-metoxi-5-hidroxiestilbeno

F.M. = C

P.M. = 226 u.m.a.

Aspecto = sólido branco

Solubilidade = clorofórmio

Espectroscopia de RMN

H (400 MHz, MeOH-d

, Hz): δ (6,33, sl, H-2); (6,64, sl, H-4); (6,60,

sl, H-6); 7,06, d 15,8, H-7); (6,99, d 17,2, H-8); (7,49, d 7,3, H-10/14); (7,35, t 7,9, H-11/13);

(7,25, H-12); (3,82, s, MeO).

Espectroscopia de RMN

C (100 MHz, MeOH-d

, Hz): δ 140,66 (C-1); 105,05 (CH-2); 156,94

(C-3); 101,08 (CH-4); 149,38 (C-5); 106,00 (CH-6); 128,39 (CH-7); 129,49 (CH-8); 137,65 (C-

9); 126,69 (CH-10/14); 128,78 (CH-11/13); 127,88 (CH-12); 55,46 (OMe).

Espectroscopia de massas: (70 eV) m/z (int. rel): 226; 221; 194; 165.

Flavanona (SAMH-02)

5,7-diidroxiflavanona

F.M. = C

P.M. = 256 u.m.a.

140

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

Aspecto = sólido amarelo

Solubilidade = clorofórmio

Espectroscopia de RMN

H (400 MHz, MeOH-d

, Hz): δ (5,43, sl 17,2, H-2); (6,00, s, H-6/8);

(7,43, s, H-2’-6’); (3,07, dd 15,0, H-3

); (2,83, dd 17,2, H-3

Espectroscopia de RMN

C (100 MHz, MeOH-d

, Hz): δ 79,3 (CH-2); 43,4 (CH

-3); 195,8 (C-

4); 164,6 (C-5); 96,8 (CH-6); 164,5 (C-7); 95,5 (CH-8); 163,2 (C-9); 103,3 (C-10); 138,4 (C-1’);

126,2 (CH-2’/6’); 128,9 (CH-3’/4’/5’).

Espectroscopia de massas: (70 eV) m/z (int. rel): 256; 238; 213; 179; 152; 124; 69.

Espectroscopia na região do infravermelho: IV

max

KBr (cm

-1

): 2924, 1632, 1466, 1302, 1169.

Pterocarpano (SAMH-03)

7-hidroxi-3’,4’-metilenodioxipterocarpano

F.M. = C

P.M. = 284 u.m.a.

Aspecto = sólido amarelo

Solubilidade = clorofórmio

Espectroscopia de RMN

H (400 MHz, MeOH-d

, Hz): δ (7,36, d 8,4, H-5); (6,55, d 6,6, H-6);

(6,42, d 6,2, H-8); (3,44-3,49, m, H-3); (6,72, s, H-2’); (5,92, s, H-5’); (5,47, d 6,9, H-4); (3,63, H-

); (4,22, dd 15,8; 4,8; H-2

); (5,89; 5,93; OCH

O).

Espectroscopia de RMN

C (100 MHz, MeOH-d

, Hz): δ 66,44 (CH

-2); 40,14 (CH-3); 78,44

(CH-4); 132,10 (CH-5); 109,76 (CH-6); 157,04 (C-7); 103,66 (CH-8); 156,62 (C-9); 112,62 (C-

10); 117,90 (C-1’); 104,72 (CH-2’); 141,71 (C-3’); 148,09 (C-4’); 93,82 (CH-5’); 154,31 (C-6’);

101,28 (OCH

O).

Espectroscopia de massas: (70 eV) m/z (int. rel): 284, 267, 162, 134, 175.

Triterpeno (SAMH-04)

Lupeol

F.M. = C

P.M. = 426 u.m.a.

Aspecto = sólido branco

Solubilidade = clorofórmio

Espectrometria de RMN

C (100 MHz, MeOH-d

, Hz): δ 38,80 (CH

-1); 26,02 (CH

-2); 79,08

(CH-3); 38,96 (C-4); 55,39 (CH-5); 18,40 (CH

-6); 34,37 (CH

-7); 41,09 (C-8); 50,52 (CH-9);

39,34 (C-10); 21,01 (CH

-11); 25,22 (CH

-12); 37,20 (CH-13); 43,08 (C-14); 27,51 (CH

-15);

35,67 (CH

-16); 42,40 (C-17); 48,07 (CH-18); 47,49 (CH-19); 150,31 (C-20); 29,45 (CH

-21);

141

Capítulo III – Resultados e Discussões

______________________________________________________________________________________________

40,08 (CH

-22); 28,07 (CH

-23); 15,44 (CH

-24); 16,19 (CH

-25); 16,19 (CH

-26); 14,20 (CH

27); 18,09 (CH

-28); 109,40 (CH

-29); 19,65 (CH

-30).

Espectrometria de massas: (70 eV) m/z (int. rel): 426, 411, 315, 218, 207, 189, 135, 107, 95,

81.

3.4. Referências bibliográficas.

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Capítulo III – Resultados e Discussões

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143

Capítulo IV – Ensaios Biológicos

147

___________________________________________________________________

4.0. Introdução

A biodiversidade da vegetação dos países tropicais está sendo pouco

explorada. Os produtos naturais do terceiro mundo é um recurso valioso o qual

existe uma grande diversidade de plantas e uma medicina folclórica

inexplorada.

O aparecimento de resistência a antibióticos e outras drogas

antimicrobianas, foi e continuará sendo um dos grandes problemas da

medicina, pois é causado pelo que há de mais natural e essencial para a

origem e evolução dos microrganismos: “mutação espontânea e recombinação

de genes (reprodução), que criam variabilidade genética sobre a qual atua a

seleção natural, dando vantagem aos mais aptos” (Souza, 1998).

Um dos objetivos de muitos fitoquímicos das nações do terceiro mundo é

simplesmente isolar, caracterizar e publicar um grande número de novas

substâncias de origem natural, sem se importar muito com as possíveis

atividades biológicas que estas substâncias possam apresentar.

O emprego de bioensaios sensíveis para estudar, fracionar e isolar

novos protótipos de drogas é um dos objetivos do químico de produtos naturais

da atualidade, o qual combina três técnicas essenciais para este trabalho que

são: técnicas de separação (cromatografia), métodos de elucidação estrutural e

bioensaios simples.

Visando este enfoque atual utilizou-se ensaios químico e biológicos

paralelos ao estudo fitoquímico de um espécime de Swartzia apetala Raddi var.

glabra em busca de substâncias bioativas.

Capítulo IV – Ensaios Biológicos

148

___________________________________________________________________

4.1. Avaliação do Potencial Antioxidante

O uso de plantas com fins terapêuticos parece ser tão antigo quanto à

própria espécie humana. Entretanto, o conhecimento de suas propriedades

antioxidantes é relativamente recente, especialmente nas últimas décadas

observou-se um grande interesse no estudo dos antioxidantes devido

principalmente, às descobertas sobre o efeito dos radicais livres no organismo.

A oxidação é parte fundamental da vida aeróbica e do metabolismo

humano e, desse modo, os radicais livres são produzidos naturalmente ou por

alguma disfunção biológica. Esses radicais livres possuem espécies que

apresentam elétrons desemparelhados principalmente nos átomos de oxigênio

e nitrogênio sendo classificados pelas siglas ERO (Espécies Reativas de

Oxigênio) e ERN (Espécies Reativas de Nitrogênio) (Barreiros et al., 2006).

Essas espécies encontram-se no organismo envolvidos com a produção

de energia, fagocitose, regulação do crescimento celular e síntese de

substâncias biológicas. Seu excesso apresenta efeitos prejudiciais, tais como:

peroxidação de lipídios de membranas, enzimas, carboidratos e DNA (Babior,

2000).

A ocorrência desses efeitos está relacionada a várias patologias tais

como: artrite, choque hemorrágico, doenças cardiovasculares, catarata,

disfunções cognitivas e câncer (Barreiros et al., 2006).

O excesso de radicais livres no organismo é combatido por antioxidantes

produzidos pelo corpo ou absorvido da dieta. Antioxidantes são substâncias

que dificultam ou retardam a oxidação de outras substâncias, dificultando

desse modo o início da propagação de reações em cadeia (Bergman, 2001).

Antioxidantes naturais constituem uma larga gama de substâncias incluindo

nitrogenadas, fenóis, carotenóides, terpenóides, saponinas entre outras. Existem vários relatos

sobre a correlação de substâncias antioxidantes com outros efeitos biológicos como: ação

antibacteriana, doenças cardiovasculares, antiviral, envelhecimento precoce (Yunes & Calixto,

2001).

A técnica para avaliação do potencial antioxidante, que utiliza o DPPH (1,1-difenil-

2-picril-hidrazil) como radical livre, baseia-se em um ensaio qualitativo e quantitativo do grau da

atividade antioxidante e na habilidade das substâncias de agirem como seqüestrantes de

radicais livres.

Capítulo IV – Ensaios Biológicos

149

___________________________________________________________________

DPPH é um radical livre estável a temperatura ambiente com produção de uma solução

de coloração violeta em etanol (Mensor et al., 2001). Devido ao seu elétron ímpar, a solução

etanólica de DPPH exibe uma forte banda de absorção na faixa de 515-518 nm. Sua função no

ensaio é a captura dos radicais hidrogênio em substâncias estáveis avaliando-se desse modo o

comportamento das substâncias como radical livre (Esquema 15).

Esquema 15 - Mecanismo de ação do DPPH frente a substâncias fenólicas

Estudos recentes demonstram que a relação do potencial antioxidante com DPPH

depende da conformação estrutural, da posição e do número de grupos hidroxilas presentes na

molécula analisada (Mensor et al., 2001) (Esquema 16).

R O

R = H, R = OH

Esquema 16 - Relação estrutura versus atividade antioxidante de flavonóides

N N

ROH

N N

Capítulo IV – Ensaios Biológicos

150

___________________________________________________________________

4.1.1. Materiais e reagentes utilizados

Na análise qualitativa foram utilizados os seguintes reagentes e materiais:

• DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazil);

• Metanol;

• Balão volumétrico (5,0 mL);

• Pipetas volumétricas (0,5 e 2,0 mL);

• Cromatofolha de sílica gel;

• Capilares;

• Recipiente de plástico (30X10X5 cm);

• Rutina.

Na análise quantitativa foram utilizados os seguintes reagentes e materiais:

• DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazil);

• Etanol absoluto;

• Balões volumétricos (10, 20 e 25 mL);

• Pipetas volumétricas (0,5, 1,0, 2,5 mL);

• Espectrofotômetro;

• Tubos de ensaio;

• Rutina.

4.1.2. Procedimento experimental

As análises foram realizadas no Laboratório de Química de Produtos

Naturais (fitoquímica) e Química Analítica LCQUI-UENF.

Na análise qualitativa e quantitativa foi empregado o método com o

Capítulo IV – Ensaios Biológicos

151

___________________________________________________________________

DPPH como radical livre (Mensor et al., 2001; Argolo et al., 2004).

No método qualitativo foi feito uma solução estoque 5,00 mg/mL em

etanol com as amostras e com o controle positivo que foram diluídas nas

seguintes concentrações: 2,50; 1,25; 0,625; 0,312 e 0,156 mg/mL. Aplicou-se

2μL de cada concentração das amostras, do controle positivo e do negativo em

uma cromatofolha de sílica gel 60 e em seguida imergiu-se a cromatofolha em

uma solução etanólica 0,3 mM de DPPH durante 15 segundos. A observação

da atividade antioxidante foi confirmada com a mudança de coloração das

amostras aplicadas na placa de sílica e comparação com o controle positivo.

Como controle negativo foi utilizado metanol, solvente onde amostras foram

solubilizadas.

No método quantitativo uma solução estoque de concentração 1,00

mg/mL foi preparada com 10,0 mg de amostra em 10,0 mL de etanol, a qual foi

submetida a uma série de diluições de: 25,0; 50,0; 125 e 250 μg/mL. A análise

foi realizada reagindo-se 1,00 mL de uma solução etanólica 0,30 mM de DPPH

com 2,50 mL de cada concentração das amostras em triplicata. Após 30

minutos, fez-se a leitura em um espectrofotômetro de luz ultravioleta a 518 mn

(Esquema 17, p. 152).

Os valores das absorbâncias foram convertidos para porcentagem de Atividade

Antioxidante (AA%) usando a seguinte fórmula:

AA%= 100 – { [(Abs

amostra

– Abs

branco

) x 100]/ Abs

controle

}

O valor da concentração efetiva necessária para se obter 50% do efeito antioxidante

máximo estimado em 100% (EC

) foi calculado através de uma regressão linear para cada

extrato onde a abscissa representa as concentrações da amostra e a ordenada a porcentagem

de Atividade Antioxidante (AA%).

Como controle positivo foi utilizando o flavonóide rutina Merk

utilizando o mesmo

procedimento feito para as amostras. Esse controle foi utilizado para comparação dos valores

de (EC

) das amostras analisadas, onde valores menores ou próximos aos obtidos para o

controle indica que as amostras são ativas.

Como controle negativo foi utilizado 1 mL de solução de DPPH e 2,5 mL

de etanol. A leitura do branco foi feita com 2,5 mL de cada diluição das

amostras mais 1 mL de etanol.

Capítulo IV – Ensaios Biológicos

152

___________________________________________________________________

Estoque 1 mg/mL

Diluições

250 125

g/mL

2,5 mL

1 mL

2,5 mL

1 mL

Solução DPPH 0,3 mM

Após 30 min., fazer as leituras

no espectrofotômetro a 518 nm

Esquema 17 - Procedimento experimental (análise quantitativa)

4.1.3. Resultados e discussão

A análise qualitativa indicou a presença de atividade antioxidante nos

extratos metanólico (SAFM) e hidroalcoólico (SAFMA) das folhas e hexânico da

madeira quando comparados ao controle positivo (Rutina) que mostrou

atividade em quase todas as concentrações. Observando o controle negativo

(MeOH), conclui-se que o mesmo não interferiu na análise (Figura 90).

Capítulo IV – Ensaios Biológicos

153

___________________________________________________________________

Figura 90 - Análise qualitativa da atividade antioxidante.

Com os resultados obtidos na análise qualitativa, realizou-se a análise

quantitativa onde os resultados da CE

de cada extrato estão ilustrados tabela

12 com os respectivos desvios padrão (s) e coeficiente de variação (C.V.). Os

extratos mais polares foram os que apresentaram maior capacidade de

seqüestrar radicais livres na metodologia testada, provavelmente pela presença

de substâncias fenólicas (Cotelle et al., 1996).

Os valores de CE

(tabela 12) foram comparados por análise de

variância pelo teste ANOVA, seguido do teste de TuKey-Kramer, sendo

estatísticamente significativo quando p<0,05.

Tabela 12 - Valores de CE

e dados estatíticos dos extratos de S. apatala.

Rutina foi usado como padrão.

Extratos CE

± s Coeficiente de Variação

SAFD 56,54 ±0,32 μg/mL 0,57 %

SAFM 15,54 ±0,07 μg/mL 0,45 %

SAFMA 5,36 ±0,03 μg/mL 0,56 %

SAMH 29,49 ±0,16 μg/mL 0,54 %

RUTINA 26,96 ±0,19 μg/mL 0,70 %

Os valores de CE

indicam a Concentração Efetiva suficiente para obter

Capítulo IV – Ensaios Biológicos

154

___________________________________________________________________

50% do máximo da eficiência estimada em 100% para reduzir o radical livre

DPPH. Os valores baixos de (s) e (C.V.) mostram a alta precisão das análises

que confirmam a influência mínima de fatores não controlados, o que se chama

de variação do acaso.

O extrato hexânico da madeira apesar de ser um extrato apolar, mostrou

uma atividade antioxidante bastante acentuada CE

= 29,49 ±0,16 μg/mL,

quando comparado com o controle positivo rutina CE

= 26,96 ±0,19 μg/mL

confirmando mais uma vez a correlação da atividade com substâncias fenólicas

presentes no extrato (capítulo 2, p. 22-23).

Observando a figura 91, pode-se concluir que ocorre um aumento linear

da porcentagem de atividade antioxidante com o aumento da concentração.

Somente o extrato hidroalcoólico das folhas (SAFMA) permaneceu quase que

constante em todas as concentrações analisadas.

Potencial antioxidante

100

25 50 125 250

Concentração (μg/mL)

% AA

Rutina

SAFM

SAFMA

SAFD

SAMH

Figura 91 - Avaliação do potencial antioxidante (%AA x concentração).

4.2. Bioensaio de letalidade contra as larvas de Artemia salina Leach

O bioensaio que utiliza larvas de camarão de água salgada (A. salina) foi proposto por

McLaughlin e é caracterizado como um ensaio simples para determinar a DL

(µg/mL) para

substâncias puras e extratos. (McLaughlin et al., 1995).

Artemia salina é um microcrustáceo de água salgada que é utilizado como alimento

para peixes e seus ovos podem ser facilmente encontrados em lojas de piscicultura. A

praticidade e simplicidade que envolve o bioensaio favorecem sua utilização sistemática dentro

de um laboratório de pesquisa. A técnica tem a vantagem de apresentar baixo custo, rapidez e

não exigir técnicas assépticas (Meyer et al., 1982).

Capítulo IV – Ensaios Biológicos

155

___________________________________________________________________

Então com o objetivo de se identificar substâncias bioativas presentes na espécie S.

apetala foi realizado neste trabalho à investigação da atividade citotóxica dos extratos brutos

das folhas e madeira frente às larvas de A. salina.

O teste baseia-se no princípio da toxicidade que as substâncias bioativas apresentam

em altas doses. Deste modo, a mortalidade in vivo de organismo de maior simplicidade na

escala zoológica pode indicar a bioatividade de novas substâncias. Na literatura há vários

trabalhos que tentam relacionar a toxicidade sobre as larvas de Artemia salina com atividades,

tais como: antifúngica, viruscida, antimicrobiana, parasiticida e tripanossomocida (Siqueira et

al., 1998).

A literatura também mostra a correlação existente entre a toxicidade sobre o crustáceo

e a citotoxicidade para células cancerosas do tipo P-388 (Meyer et al., 1982).

Segundo McLaughlin, valores de DL

≤ 1000 µg/mL são considerados ativos para

extratos brutos e < 30 µg/mL, muito ativos para substâncias puras.

4.2.1. Materiais e Reagentes utilizados

• Ovos de Artemia salina;

• NaCl (24,0 mg), CaCl

.2H

O (1,50 mg), KBr (0,10 mg), KCl (0,70 mg), Na

(4,00

mg), NaHCO

(0,20 mg) e MgCl.6H

O (11,0 mg) (Para 2,00 L de solução de água do

mar artificial);

• K

(50,0 mg);

• DMSO;

• H

• Pipeta automática (100 μL);

• Pipeta Pasteur;

• Recipiente (10X5X3 cm);

• Balão volumétrico (5,00 mL);

• Tubos de ensaio

• Luminária.

4.2.2. Procedimento Experimental

As análises foram realizadas no Laboratório de Química de Produtos

Naturais (fitoquímica) LCQUI-UENF.

Capítulo IV – Ensaios Biológicos

156

___________________________________________________________________

Na análise foi utilizado 50 mg de cada extrato que foram diluídos em um

volume de 5 mL no seguinte sistema de solventes: [H

O:DMSO (3:2)],

formando soluções estoque de 10 mg/mL.

Foram adicionados em tubos de ensaio alíquotas de: 50, 100, 200, 300 e

500 μL que foram diluídas a um volume final de 5 mL com água do mar

artificial. As concentrações finais das alíquotas foram de: 100, 200, 400, 600 e

1000 μg/mL. O teste foi realizado em quaduplicata.

Em cada tubo foram adicionadas aproximadamente 15 larvas de A.

salina com as diluições descritas acima, após 24 horas em presença de luz foi

realizada a contagem dos indivíduos vivos e mortos. A quantificação dos

resultados foi realizada através do programa Finey Probit que forneceu a

(DL

), dose letal para 50% da população de microcrustáceos presente nos

tubos nas concentrações definidas.

Para o controle positivo foi utilizado uma solução de dicromato de

potássio (K

), nas mesmas concentrações das amostras.

Para o controle negativo foi utilizado o sistema de solventes H

O:DMSO

(3:2) a uma concentração de 100 μg/mL.

4.2.3. Resultados e discussão

Segundo McLaughlin, valores de DL

≤ 10

µg/mL são considerados ativos para

extratos brutos.

Os resultados obtidos no ensaio estão ilustrados na tabela 12, onde se pode observar

que os extratos diclorometânico das folhas (SAFD) e hexânico da madeira (SAMH)

apresentaram DL

>> 10

μg/mL sendo considerados desta forma inativos. Os extratos

hidroalcoólico das folhas (SAFMA) (DL

= 467,4 μg/mL) e o metanólico das folhas (DL

= 289,8

μg/mL) foram ativos frente as larvas, o que pode se associado a detecção uma grande

concentração de saponinas.

Tabela 13 - Resultados do bioensaio com larvas de Artemia salina.

Porcentagem de mortos após 24 H

Extratos 100

μg/mL

200

μg/mL

400

μg/mL

600

μg/mL

1000

μg/mL

Intervalo de

confiança a 95%

SAMH 1,92 1,92 7,69 11,54 36,54 >1000 -

SAFD 1,92 3,47 5,77 7,69 9,61 >1000 -

SAFM 5,77 11,54 40,38 48,09 80,77 289,8 (217,2-432,5)

SAFMA 3,85 13,46 15,38 23,07 48,08 467,4 (349,1-757,6)

Capítulo IV – Ensaios Biológicos

157

___________________________________________________________________

4.3. Avaliação da atividade antifúngica

Nas últimas duas décadas houve um considerável aumento nos casos de infecções

causadas por microrganismos, que pode ser associado a imunodeficiências causadas pelo HIV,

quimioterapias e transplantes.

A descoberta de novas substâncias com atividade antimicrobiana constitui uma

necessidade urgente devido ao aumento da incidência de enfermidades infecciosas novas e re-

emergentes e também, devido à alta capacidade dos microrganismos de desenvolverem

resistência aos antibióticos usados clinicamente (Mallavarapu, 2001).

Diversos microrganismos são patógenos aos seres vivos. Nos homens, esses

microrganismos causam várias doenças.

O gênero Swartzia é caracterizado pela produção de flavonóides, substâncias que

possuem grupos fenólicos (Bézanger-Beauquesne & Pinkas, 1967; Osawa et al., 1992; Dubois

& Sneden, 1995 e 1996; Sanchez et al., 1999; Rojas et al., 2006). Fenóis são grupos químicos

que se caracterizam como anti-sépticos pelo fato de lesionarem as células microbianas pela

alteração da permeabilidade seletiva da membrana citoplasmática, causando o extravasamento

das substâncias intracelulares vitais (Pelczar Jr. et al., 1997) (Tabela 14). Dependendo da

concentração utilizada, eles podem atuar como bactericidas ou bacteriostáticos.

Tabela 14 - Atividade antimicrobiana do fenol e derivados (coeficiente fenólico)

Microrganismos/substâncias Salmonela typhy S. aureus C. albicans

Fenol 1,0 1,0 1,0

o-Cresol 2,3 2,3 2,0

m-Cresol 2,3 2,3 2,0

p-Cresol 2,3 2,3 2,0

Etilfenol 6,3 6,3 7,8

2,4-Dimetilfenol 5,0 4,4 5,0

4.3.1. Fungos

São organismos eucariotos que possuem parede celular rígida e podem ser uni ou

multicelulares. Podem ser classificados em bolores ou leveduras.

Espécies de Candida são reconhecidas como as leveduras mais usualmente

envolvidas na etiologia de infecções micóticas. A candidíase caracteriza-se como uma infecção

Capítulo IV – Ensaios Biológicos

158

___________________________________________________________________

fúngica mais comum, sendo C. albicans seu agente etiológico mais freqüente. Esta levedura

tem um papel relevante no desencadeamento de infecções bucais, porém espécies

consideradas patogênicas como C. krusei, C. tropicalis, C. glabrata, entre outras tem sido em

casos de candidose principalmente em indivíduos relacionados a imunodepressão (Anaissie,

1992).

4.3.2. Materiais e Reagentes utilizados

• Placas de Petri

• Cloreto de Sódio

• Meio Saboraud dextrose (agar)

• Suabe

• Nitrato de Miconasol (Vodol

)

• Tubos de ensaio

• Fotômetro

• Alça de Drigalsky

Tabela 15 - Fungos utilizados no ensaio

Espécies Descrição

Candida albicans ATCC 36802

Candida inconspícua

ATCC 16783

Candida glabrata

ATCC 2001

Candida tropicalis

ATCC 13803

Candida krusei

ATCC 34135

Candida guilliermondii

ATCC 6260

Candida parapsilosis

ATCC 22019

Candida lusitaniae

ATCC 34449

Candida spp.

ATCC 34147

4.3.3. Procedimento Experimental

As análises foram realizadas no Laboratório de Sanidade Animal LSA-

UENF.

Capítulo IV – Ensaios Biológicos

159

___________________________________________________________________

Para a realização deste ensaio, foi empregada a técnica de difusão em

agar (Hadaceck & Greger, 2000).

Difusão em agar

Como meio de cultura foi utilizado Ágar Sabouraud dextrose (Acumedia,

EUA) que foi adicionado em placas de Petri de 14 cm de diâmetro até atingir

uma espessura de 5 mm de agar.

Com o auxílio de um suabe foi semeada sobre o meio uma alícota de

100μL do inoculo das leveduras (Tabela 15) previamente preparada com uma

suspensão de células em solução salina. A padronização da solução foi

realizada pela Escala de McFarland nº 0,5 (1,5x10

células/mL). Após a

semeadura do microrganismo, foram feitas perfurações (poços no meio de

cultura), que receberam um volume de 50 μL das amostras analisadas. Foi

utilizado uma concentração de 25 mg/mL para extratos e 3 mg/mL para

substâncias puras isoladas. Como controle positivo foi utilizado uma solução 20

μg/mL de Nitrato de Miconazol (Vodol

lote 606401, União Química, Brasil).

Após aplicação das amostras e do controle as placas foram incubadas

em estufa por um período de 24-36 h à 37 ºC.

Uma distância de aproximadamente 1,5 cm foi mantida para que não

ocorresse sobreposição dos halos.

A leitura dos resultados foi realizada medindo-se o diâmetro dos halos

de inibição, considerando ativas as amostras que apresentaram um halo de

inibição ≥ 1,00 cm de diâmetro (Lima et al., 2006). O ensaio foi realizado em

triplicata.

4.3.4. Resultados e discussão

Foram testados os extratos metanólico (SAFM), diclorometânico (SAFD)

e hidroalcoólico (SAFMA) das folhas e o extrato hexânico (SAMH) da madeira.

Todas as substâncias isoladas também foram testadas, os dados relativos

avaliação da atividade antifúngica dos extratos e substâncias isoladas através

da formação do halo de inibição do crescimento fúngico em diâmetro (cm)

estão compilados nas tabelas (16-18, p. 161-163).

Capítulo IV – Ensaios Biológicos

160

___________________________________________________________________

Os resultados mostraram uma discreta atividade dos extratos

comparada aos valores obtidos para o controle positivo frente às leveduras.

Destacam-se entre os extratos o diclorometânico das folhas (SAFD) com

melhor reação frente a C. albicans (2,2) e C. parapsilosis (1,4) e o extrato

hexânico da madeira (SAMH) com melhores valores de halos de inibição frente

a C. guillermondii (1,85) e C. inconspícua (1,7). Os resultados obtidos para os

extratos metanólico (SAFM) e hidroalcoólico (SAFMA) estão descritos na tabela

16, p.162.

Tabela 16 - Inibição do crescimento fúngico dos extratos de S. apetala

Dentre as substâncias isoladas no extrato destacam-se os resultados

obtidos para os flavonóides SAFM-03 frente às leveduras C. albicans (2,00), C.

parapsilosis (1,50) e C. Krusei (1,20) e SAFM-04 frente a C. albicans (2,10), C.

spp. (1,10), C. parapsilosis (1,10), C. guillermondii (1,10). A saponina SAFM-01

apresentou uma discreta atividade frente a apenas três cepas C. tropicalis

(1,00), C. parapsilosis (1,00) e C. glabrata (1,20) e a saponina SAFM-02

apresentou atividade apenas em C. spp. (1,10) e C. glabrata (1,20). A atividade

dos flavonóides apesar de discreta a maioria das leveduras deve-se a presença

de grupos fenólicos que caracterizam esta classe de substâncias (Pelczar Jr. et

al., 1997). Os demais resultados estão ilustrados na tabela 17, p. 163.

Capítulo IV – Ensaios Biológicos

161

___________________________________________________________________

Tabela 17 - Inibição do crescimento fúngico das substâncias isoladas do

extrato metanólico das folhas de S. apetala

Os resultados obtidos para as substâncias isoladas no extrato hexânico

da madeira mostrou que a atividade encontrada neste extrato deve-se a

presença de três substâncias fenólicas no extrato. O estilbeno SAMH-01 e o

flavonóide SAMH-02 mostraram atividade frente a todas as cepas analisadas

destacando os valores de (1,5 ± 0,45) C. albicans, (1,6 ± 0,66) C. parapsilosis e

(1,6 ± 0,85) C. guillermondii para SAMH-01 e (1,4 ± 0,51) C. albicans e (1,5 ±

0,60) C. parapsilosis para SAMH-02. Dentre os resultados para o pterocarpano

SAMH-03 destaca-se (1,3 ± 0,53) obtido frente à cepa de C. guillermondii. Os

demais resultados estão ilustrados na tebela 18, p. 164.

Tabela 18 - Inibição do crescimento fúngico das substâncias isoladas do

extrato hexânico da madeira de S. apetala

Capítulo IV – Ensaios Biológicos

162

___________________________________________________________________

4.4. Referências bibliográficas

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Conclusões

___________________________________________________________________________________________

Conclusões

O estudo fitoquímico do extrato metanólico das folhas (SAFM) e

haxânico da madeira (SAMH) de Swartzia apetala var. glabra resultou no

isolamento de duas saponinas: 3-hidroxi-olean-12-en-28-acetato de-O-

-D-

glicopiranosila SAFM-01, 3-O-

-D-xilopiranosil-(1’”→4”)-O-

-D-ramnopiranosil-

olean-12-em-28-acetato de -

-D-glicopiranosila (SAFM-02); três flavonóides: 3,

5, 7,4’-tetraidroxiflavonol (SAFM-03), 5,7,4’-triidróxi-3- O-

-D-glicopiranosil-(1”’

→ 6”)-O-

-L-raminopiranosil-(1”” →2”’)-O-

-L-raminopiranosil-flavonol (SAFM-

04), 5,7-diidróxiflavanona (SAMH-02); um estilbeno: 3-metoxi-5-hidroxiestilbeno

(SAMH-01); um pterocarpano: 7-hidroxi-3’,4’-metilenodioxipterocarpano

(SAMH-03); um triterpeno: lupeol (SAMH-04); e uma mistura de esteróides:

sitosterol, stigmasterol e campesterol (SAMH-05a/b/c).

A revisão bibliográfica da espécie mostrou que até o momento não há

estudo fitoquímico com a mesma. Embora existam referências na literatura com

o isolamento de saponinas, flavonóides e pterocarpanos em espécies do

gênero, encontramos referências que descrevem apenas o isolamento do

pterocarpano 7-hidroxi-3’,4’-metilenodioxipterocarpano (SAMH-03) sendo as

saponinas (SAFM-01 e 02), os flavonóides (SAFM-03 e 04 e SAMH-02) e o

estilbeno (SAMH-01) descritos pela primeira vez no gênero.

As substâncias 3-O-

-D-xilopiranosil-(1’”→4”)-O-

-D-ramnopiranosil-

olean-12-em-28-acetato de -

-D-glicopiranosila (SAFM-02) e 5,7,4’-triidróxi-3-

O-

-D-glicopiranosil-(1”’ → 6”)-O-

-L-raminopiranosil-(1”” →2”’)-O-

-L-

raminopiranosil-flavonol (SAFM-04), pelo melhor do nosso conhecimento, são

inéditas na literatura.

A avaliação da citotoxicidade com larvas de Artemia salina indicou os

extratos polares (SAFM e SAFMA) como ativos de acordo com a metodologia

proposta por McLaughlin.

A avaliação do potencial antioxidante dos extratos usando o método com

o radical livre DPPH, confirmou a correlação existente entre a atividade e a

168

Conclusões

___________________________________________________________________________________________

presença de substâncias fenólicas no extrato. Os extratos que apresentaram

maior potencial foram os extratos metanólico (SAFM) e hidroalcoólico (SAFMA)

das folhas apresentando atividade superior ao do controle rutina e o hexânico

da madeira que apresentou atividade próxima ao do controle (SAMH).

A análise da atividade antifúngica dos extratos e substâncias isoladas

frente a cepas padrão de espécies Candida, apresentou os extratos

diclorometânico das folhas (SAFD) e hexânico da madeira (SAMH) como os

que demonstraram melhor desempenho frente a maioria das cepas. Entre as

substâncias isoladas as que apresentaram maior desempenho foram as

substâncias fenólicas isoladas da madeira (SAMH-01, 02 e 03) e os

flavonóides isolados das folhas (SAFM-03 e 04).

O presente trabalho contribuiu para o conhecimento da composição

química da espécie Swartzia apetala var. glabra e da avaliação da atividade

biológica dos extratos e substâncias isoladas incentivando desta forma ao

estudo dos demais extratos e avaliação de outros testes biológicos, já que as

substâncias isoladas se apresentam estruturalmente semelhantes a outras

descritas na literatura com atividades biológicas já definidas.

169

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