( PDF ) Estudo comparativo de sistemas reveladores em ensaios imunoenzimáticos para detecção de anticorpos específicos no diagnóstico da leishmaniose tegumentar americana

Download PDF

ads:

Fundação Oswaldo Cruz

Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas

Pós-Graduação em Pesquisa Clínica em Doenças Infecciosas

Dissertação de Mestrado

Estudo comparativo de sistemas reveladores em ensaios

imunoenzimáticos para detecção de anticorpos específicos no

diagnóstico da leishmaniose tegumentar americana

Lílian Dias Nascimento

Rio de Janeiro

2007

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

Curso de Pós-Graduação em Pesquisa Clínica em Doenças Infecciosas

Estudo comparativo de sistemas reveladores em ensaios

imunoenzimáticos para detecção de anticorpos específicos no

diagnóstico da leishmaniose tegumentar americana

Lílian Dias Nascimento

Orientador:

Dr. Mauro Célio de Almeida Marzochi

Co-orientadora:

Dra. Sonia Regina Lambert Passos

Dissertação apresentada ao Instituto de

Pesquisa Clínica Evandro Chagas como

requisito parcial para obtenção do título de

Mestre em Ciências e desenvolvida no Serviço

de Parasitologia (IPEC - FIOCRUZ).

Rio de Janeiro

2007

ads:

Curso de Pós-Graduação em Pesquisa Clínica em Doenças Infecciosas

Esta Dissertação intitula-se:

“Estudo comparativo de sistemas reveladores em ensaios imunoenzimáticos

para detecção de anticorpos específicos no diagnóstico da

leishmaniose tegumentar americana”

Apresentada por:

Lílian Dias Nascimento

Orientador: Dr. Mauro Célio de Almeida Marzochi

Co-orientadora: Dra. Sonia Regina Lambert Passos

Local: Auditório do Pavilhão de Ensino do Instituto de Pesquisa Clínica

Evandro Chagas

Data: 27/04/2007. Horário: 9 horas

Banca Avaliadora

Dra. Rosely Maria Zancopé Oliveira - IPEC/FIOCRUZ (Presidente)

Dra. Graziela Maria Zanini - IPEC/FIOCRUZ

Dr. Valmir Laurentino Silva - ENSP/FIOCRUZ

Dra. Maria de Fátima Madeira - IPEC/FIOCRUZ (Suplente)

iii

FICHA CATALOGRÁFICA

Nascimento, Lílian Dias

Estudo comparativo de sistemas reveladores em ensaios

imunoenzimáticos para detecção de anticorpos específicos no

diagnóstico da leishmaniose tegumentar americana / Lílian Dias

Nascimento - Rio de Janeiro, 2007.

75 p.: il.

Dissertação (Mestrado) - Curso de Pós-Graduação em Pesquisa

Clínica em Doenças Infecciosas, Instituto de Pesquisa Clínica Evandro

Chagas - IPEC, FIOCRUZ.

1. Leishmania (Viannia) braziliensis 2. Imunoensaio 3. Sistemas

Reveladores 4. Validação I. Marzochi, Mauro Célio de Almeida

(Orient.) II. Passos, Sonia Regina Lambert (Co-orient.) III. Título

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador, Dr. Mauro Célio de Almeida Marzochi, a quem admiro pela

sua sabedoria, competência, profissionalismo e atenção a mim dedicada;

À minha co-orientadora, Dra. Sonia Regina Lambert Passos, pela orientação,

incentivo, paciência e dedicação durante a realização deste trabalho;

À “chefe” Msc. Eliame Mouta Confort pelo apoio, incentivo e confiança sempre

a mim dispensada;

À Dra. Maria de Fátima Madeira e equipe pela colaboração na realização das

culturas;

Às “meninas” da sorologia, Marta, Andréia, Flávia, Patrícia, Elaine e Jamyra, e

também Viviane e Tatiana pela ajuda e principalmente amizade nas horas

difíceis (amigas.... obrigada por ter pessoas como vocês ao meu lado);

A todos do Serviço de Parasitologia - IPEC, pelo constante apoio que

contribuíram para a realização deste trabalho;

Aos colegas de Mestrado, pela convivência e amizade nos momentos em que

passamos juntos;

À Coordenação de Pós-Graduação, em especial ao secretário Marcelo

Eduardo Timóteo, por me receber com atenção, estando sempre disponível a

ajudar;

Aos professores do Curso de Pós-Graduação que contribuíram com novos

conhecimentos;

A todas as pessoas que me apoiaram direta ou indiretamente na realização

deste trabalho.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ABTS - 2,2’-azino-bis-3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico

AP - Fosfatase Alcalina

AUC - Area under the ROC curve (Área sob a curva ROC)

BHI - Brain Heart Infusion

BL - Blank

CEP - Comitê de Ética em Pesquisa

CN - Controle Negativo

CP - Controle Positivo

CRLeish - Centro de Referência em Leishmanioses

DNA - Ácido desoxirribonucléico

DO - Densidade Óptica

ELISA - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

FIOCRUZ - Fundação Oswaldo Cruz

HIV - Vírus da Imunodeficiência Humana

HPPA - 3 - p - hidroxifenil ácido propiônico

HRP - Horseradish Peroxidase

HSP - Heat Shock Protein (Proteína de choque térmico)

IC - Intervalo de Confiança

ICC - Intraclass Correlation Coefficient (Coeficiente de Correlação Intraclasse)

IDRM - Intradermorreação de Montenegro

IPEC - Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas

IFI - Imunofluorescência indireta

IgA - Imunoglobulina A

IgG - Imunoglobulina G

IgM - Imunoglobulina M

LC - Leishmaniose cutânea

LCD - Leishmaniose cutânea difusa

LCM - Leishmaniose cutânea-mucosa

LM - Leishmaniose mucosa

LT - Leishmaniose tegumentar

LTA - Leishmaniose tegumentar americana

LV - Leishmaniose visceral

MS - Ministério da Saúde

MUP - 4-Metilumbeliferilfosfato

Nm - Nanômetro

OMS - Organização Mundial de Saúde

OPD - O-fenilenodiamino

PBS - Salina tamponada com fosfatos

PBS-T - PBS pH 7,2 com 0,05% de Tween 20

PBS-TL - PBS-T com 1% de leite desnatado

PCR - Reação em cadeia da polimerase

pH - Potencial Hidrogeniônico

PMP - Monofosfato de fenolftaleína

pNPP - p-nitrofenil fosfato

RFC - Reação de fixação de complemento

RFU - Relative Fluorescence Units

ROC - Receiver Operator Characteristic

RV+ - Razão de Verossimilhança para o teste positivo

RV- - Razão de Verossimilhança para o teste negativo

SFB - Soro Fetal Bovino

SPSS - Statistical Package for the Social Science

STARD - Standards for Reporting of Diagnostic Accuracy

SUS - Sistema Único de Saúde

TAD - Teste de aglutinação direta

Th1 - Células TCD4+ secretoras do padrão 1 de citocinas

Th2 - Células TCD4+ secretoras do padrão 2 de citocinas

TMB - 3,3’,5,5’-Tetrametilbenzidina

VPN - Valor Preditivo Negativo

VPP - Valor Preditivo Positivo

WHO - World Health Organization

iii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Freqüência (%) dos diagnósticos no grupo controle. ....................... 28

Tabela 2: Razões entre as médias dos controles positivos (CP) e as médias

dos controles negativos (CN) para cada diluição do conjugado e substrato.

... 35

Tabela 3: Resultados positivos e negativos do imunoensaio para os diferentes

grupos segundo os três substratos.

................................................................. 38

Tabela 4: Valores de sensibilidade, especificidade, VPP, VPN, RV+ e RV- com

seus respectivos IC de 95% para cada substrato.

........................................... 39

Tabela 5: Comparação das áreas sob a curva (AUC) do ensaio enzimático com

os diferentes substratos

................................................................................... 40

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Reação do o-fenilenodiamino com horseradish peroxidase - peróxido

de hidrogênio.................................................................................................... 15

Figura 2: Reação da 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina com horseradish peroxidase -

peróxido de hidrogênio.

.................................................................................... 15

Figura 3: Reação do 4-metilumbeliferilfosfato com fosfatase alcalina.............. 16

Figura 4: Diluições do conjugado anti-IgG HRP para o cromógeno OPD. ....... 34

Figura 5: Diluições do conjugado anti-IgG HRP para o cromógeno TMB. ....... 34

Figura 6: Diluições do conjugado anti-IgG AP para o fluorógeno MUP............ 35

Figura 7: Distribuição das Densidades Ópticas no ELISA com o cromógeno

OPD nos dois grupos - LTA (N= 189) e controle (N= 189).

.............................. 36

Figura 8: Distribuição das Densidades Ópticas no ELISA com o cromógeno

TMB nos dois grupos - LTA (N= 189) e controle (N= 189).

.............................. 37

Figura 9: Distribuição das Unidades Relativas de Fluorescência nos ensaios

imunoenzimáticos com o fluorógeno MUP nos dois grupos - LTA (N= 189)

e controle (N= 189).

.......................................................................................... 37

Figura 10: Áreas sob a curva ROC dos três sistemas reveladores.................. 40

RESUMO

O presente trabalho tem como objetivo comparar a acurácia e confiabilidade de

três sistemas reveladores de ensaios imunoenzimáticos na detecção de

anticorpos IgG específicos para o diagnóstico da LTA causada por Leishmania

(Viannia) braziliensis. Trata-se de um estudo diagnóstico, mascarado, com

repetições independentes, em população total de 378 pacientes de um

ambulatório de referência no Rio de Janeiro, dos quais 189 amostras de soro

de pacientes com diagnóstico parasitológico positivo para LTA e 189 com

diagnóstico confirmado para outras doenças cutâneas do espectro de

diagnóstico diferencial de LTA. Nos ensaios imunoenzimáticos foram

empregados antígenos parcialmente solúveis obtidos de formas promastigotas

de L. (V.) braziliensis e na revelação, dois cromógenos, 1,2-ortofenilenodiamino

(OPD) e 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB) e um fluorógeno, 4-

metilumbeliferilfosfato (MUP). O desempenho de cada sistema revelador foi

comparado através dos seus parâmetros de acurácia, Coeficiente de

Correlação Intraclasse (ICC) e as áreas sob a curva ROC (Receiver Operating

Characteristic). A sensibilidade foi idêntica (97,4%) para todos os sistemas. A

confiabilidade foi excelente (ICC = 98,61%; 98,74% e 99,11%) e a

especificidade variou de 93,7%, 95,8% a 97,4% para OPD, MUP e TMB,

respectivamente, sem significância estatística. A não diferença entre as

excelentes performances dos três reveladores sugere que se utilize o TMB por

possuir vantagens de ordem operacionais como baixo custo referente ao

equipamento de leitura, fácil manipulação, estabilidade e menor toxicidade.

ABSTRACT

The present work has the objective to compare accuracy and reliability of three

revealing systems of immunoenzymatic assays in the detection of specific IgG

antibodies for the diagnosis of ATL caused by Leishmania (Viannia) braziliensis.

This is a diagnostic, masked study, with independent repetitions, in a total

population of 378 patients of a reference clinic in Rio de Janeiro, of which 189

serum samples of patients with positive parasitological diagnosis for ATL and

189 with diagnostic confirmed for other cutaneous pathologies of the spectrum

of differential diagnosis with ATL. The immunoenzymatic assays was performed

using partially soluble antigens obtained from promastigote forms of L. (V.)

braziliensis and as substrates, two chromogenics, 1,2-o-phenylenediamine

(OPD) and 3,3',5,5' - tetramethylbenzidine (TMB) and one fluorogenic, 4-

methylumbelliferyl phosphate (MUP). Performance of each revealing system

was compared through its accuracy parameters, Intraclass Correlation

Coefficient (ICC) and the areas under the ROC curve (Receiver Operating

Characteristic). Sensitivity was identical (97.4%) for all systems. Reliability was

excellent (ICC = 98.61%, 98.74% and 99.11%) and specificity varied of 93,7%,

95.8% and 97.4% for OPD, MUP and TMB, respectively, without statistically

significance. The lack of difference between the excellent performances of

these three substrates suggests the usage of TMB because its operational

advantages like low cost of the reading equipment, easy manipulation, stability

and less toxicity.

vii

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS .......................................................................................... i

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ..............................................................ii

LISTA DE TABELAS ..........................................................................................iv

LISTA DE FIGURAS .......................................................................................... v

RESUMO............................................................................................................vi

ABSTRACT.......................................................................................................vii

1. INTRODUÇÃO............................................................................................ 1

1.1. O PARASITA E SUA TRANSMISSÃO............................................................. 1

1.2. A APRESENTAÇÃO CLÍNICA NO HOMEM...................................................... 1

1.3. EPIDEMIOLOGIA...................................................................................... 3

1.4. DIAGNÓSTICO DA LTA............................................................................. 4

1.4.1. Diagnóstico Parasitológico............................................................ 6

1.4.2. Diagnóstico Sorológico ................................................................. 8

1.4.2.1. Resposta imune a Leishmania............................................... 8

1.4.2.2. Testes sorológicos................................................................. 9

1.4.2.2.1. Ensaios Imunoenzimáticos ...........................................................12

1.5. AVALIAÇÃO DE TESTES DIAGNÓSTICOS .................................................. 16

1.5.1. Roteiro para determinar a validade de um teste diagnóstico...... 20

2. JUSTIFICATIVA........................................................................................ 23

3. OBJETIVOS.............................................................................................. 25

3.1. OBJETIVO GERAL ................................................................................. 25

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................... 25

4. SUJEITOS E MÉTODOS.......................................................................... 26

4.1. DELINEAMENTO DO ESTUDO.................................................................. 26

4.2. SUJEITOS DA PESQUISA ........................................................................ 26

4.2.1. População do Estudo.................................................................. 26

4.2.2. Tamanho Amostral...................................................................... 26

4.2.3. Critérios de elegibilidade e seleção da amostra.......................... 27

4.3. PARASITAS E ANTÍGENOS UTILIZADOS NOS TESTES .................................. 28

4.3.1. Cultura axênica de L. (V.) braziliensis......................................... 28

4.3.2. Preparação antigênica................................................................ 29

4.4. PROTOCOLO TÉCNICO DO ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO............................... 30

4.5. CONFIABILIDADE E MASCARAMENTO....................................................... 31

4.6. ANÁLISE ESTATÍSTICA........................................................................... 31

4.7. ASPECTOS ÉTICOS ............................................................................... 32

5. RESULTADOS.......................................................................................... 33

5.1. DILUIÇÕES DOS CONJUGADOS ANTI-IGG................................................. 33

5.2. ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS ................................................................ 36

5.2.1. Definição dos pontos de cortes (cut-off) ..................................... 36

5.2.2. Acurácia dos testes..................................................................... 38

5.2.3. Comparação do desempenho dos três reveladores utilizando a

curva ROC

................................................................................................ 39

viii

5.3. CONFIABILIDADE DOS ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS................................. 41

6. DISCUSSÃO............................................................................................. 42

7. CONCLUSÃO ...........................................................................................47

8. REFERÊNCIAS......................................................................................... 48

9. ANEXOS................................................................................................... 60

ANEXO 2 - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO .......................... 66

ANEXO 3 - TERMO DE COMPROMISSO E RESPONSABILIDADE .............................. 73

ANEXO 4 - APROVAÇÃO NO CEP/IPEC ............................................................ 74

1. INTRODUÇÃO

1.1. O parasita e sua transmissão

As leishmanioses constituem um complexo de doenças amplamente

distribuídas nos países do Novo e Velho Mundo com uma importante

diversidade clínica e epidemiológica (Desjeux, 1996).

As leishmanioses são antropozoonoses causadas por protozoários

flagelados pertencentes ao gênero Leishmania da ordem Kinetoplastida e

família Trypanosomatidae. Estes protozoários são parasitas intracelulares

obrigatórios e heteroxênicos, necessitando de pelo menos dois hospedeiros

para completar seu ciclo biológico. Apresentam duas formas morfologicamente

distintas: promastigota, presente no trato digestivo do vetor, e amastigota,

encontrada nas células fagocíticas do hospedeiro vertebrado (Lainson et al.,

1987a; Killick-Kendrick, 1990a). As formas promastigotas são transmitidas ao

hospedeiro através da picada de fêmeas de dípteros da sub-família

Phlebotominae, pertencentes aos gêneros Phlebotomus no Velho Mundo e

Lutzomyia no Novo Mundo (Killick-Kendrick, 1990b).

1.2. A apresentação clínica no homem

Dependendo da espécie de Leishmania envolvida e da relação do

parasita com seu hospedeiro, a doença pode apresentar diferentes formas

clínicas variando de lesões autoresolutivas ou persistentes que acometem, seja

isolada ou concomitantemente, a pele e mucosas do nariz, boca, faringe e

laringe e, por isso, recebem o nome de leishmaniose tegumentar (LT) até um

comprometimento visceral acometendo principalmente o baço e fígado (Saravia

et al., 1989; Grimaldi & McMahan-Pratt, 1991).

A leishmaniose visceral (LV) é a forma sistêmica da doença em que os

parasitas apresentam acentuado tropismo por células do sistema fagocítico

mononuclear do baço, fígado, medula óssea e tecidos linfóides. Também

conhecida como Calazar, a LV se caracteriza por febre irregular, perda de peso,

hepatoesplenomegalia, linfadenopatia e anemia, podendo ser fatal antes ou

mesmo após o tratamento (Desjeux, 1996).

Pelo envolvimento cutâneo e de mucosas no continente americano, a

leishmaniose tegumentar americana (LTA) pode ser classificada em

leishmaniose cutânea (LC), leishmaniose mucosa (LM), leishmaniose cutâneo-

mucosa (LCM) e leishmaniose cutânea difusa (LCD) (Marzochi & Marzochi,

1994).

A LC é a forma clínica mais freqüente que produz exclusivamente lesões

cutâneas, ulcerosas ou não, porém limitadas. Esta forma inicia-se geralmente

como uma pápula no local da picada do inseto, progredindo para uma úlcera

cutânea arredondada ou ovóide com bordas elevadas bem delimitadas e

eritrematosas com fundo granuloso (Marsden & Nonato, 1975; Marsden, 1985;

Costa et al., 1987). As lesões podem ser múltiplas ou uma única curando-se

espontaneamente ou após tratamento terapêutico específico (Marzochi &

Marzochi, 1994; Oliveira-Neto et al., 2000). Cerca de 3 a 5% dos casos de LC

progridem para a forma cutâneo-mucosa (Marsden et al., 1986).

A LCM é classicamente descrita como secundária e metastática, com a

possibilidade de ocorrer acometimento da mucosa por contigüidade a lesões de

pele ou por inoculação direta do parasita (Marzochi & Marzochi, 1994). A

mucosa nasal, isoladamente ou associada a outras áreas, constitui a

localização mais comum. Esta forma não tende a evoluir para a cura

espontânea e as lesões são mais resistentes à terapêutica antimonial (Marsden

et al., 1986; Oliveira-Neto et al., 1998).

A LCD é a forma anérgica da doença que se caracteriza por lesões

cutâneas múltiplas, não ulceradas, ricas em parasitas, formadas distantes do

local da picada do inseto, estendendo-se por grande área da superfície corporal

e de difícil tratamento (Marzochi & Marzochi, 1994). Na LTA, as principais

espécies relacionadas à doença são L. (Leishmania) amazonensis, L. (L.)

mexicana, L. (Viannia) peruviana, L. (V.) guyanensis, L. (V.) panamensis e L.

(V.) braziliensis, sendo esta última encontrada em todas as regiões endêmicas

do Brasil (Lainson et al., 1987b; Marzochi & Marzochi, 1994; Desjeux, 1996;

Weigle & Saravia, 1996).

1.3. Epidemiologia

Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS/WHO), as

leishmanioses são endêmicas em 88 países, 21 do Novo Mundo e 66 do Velho

Mundo. Estima-se que aproximadamente 350 milhões de pessoas no mundo

estejam expostas a fatores de risco para as infecções, com uma incidência de

dois milhões de novos casos por ano, sendo que 1,5 milhões de LT e 500 mil

de LV. Do número total de casos de LT, 90% ocorrem em apenas seis países:

Afeganistão, Arábia Saudita, Irã, Síria, Brasil e Peru (World Health

Organization, 1998).

Nos últimos 20 anos, a incidência de LTA no Brasil vem aumentando em

praticamente todos os Estados. A existência de surtos epidêmicos nas regiões

Sudeste, Centro-Oeste, Nordeste e mais recentemente na região Amazônica

está relacionada à mudança nos perfis epidemiológicos da doença, que era

considerada predominantemente silvestre. Com o processo migratório,

urbanização de áreas adjacentes a ambientes rurais e ocupação de encostas

nas periferias urbanas, a transmissão passou também a ocorrer no peridomicílio

e no intradomicílio, condicionado à adaptação de algumas espécies de

flebotomíneos ao meio ambiente urbano e envolvendo animais domésticos,

principalmente o cão, como reservatórios (Dias et al., 1977; Oliveira-Neto et al.,

1988; Marzochi & Marzochi, 1994).

A LTA constitui um problema de saúde pública em nosso país e sua

importância reside não somente na sua alta incidência e ampla distribuição

geográfica, mas também na possibilidade da existência de lesões destrutivas,

desfigurantes e até incapacitantes, com grande repercussão no campo

psicossocial do indivíduo (Gontijo & Carvalho, 2003).

1.4. Diagnóstico da LTA

O diagnóstico da LTA abrange aspectos epidemiológicos, clínicos e

laboratoriais. Freqüentemente a associação de alguns desses elementos é

necessária para se chegar ao diagnóstico final.

Diante do amplo espectro de lesões produzidas pela LTA, o diagnóstico

clínico nem sempre se torna simples e imediato, mas pode ser realizado com

base nas características dessas lesões associadas a anamnese, onde os

dados epidemiológicos são de grande importância (Saravia et al., 1989). No

entanto, existem diversas doenças cujas formas cutâneas se assemelham às

da leishmaniose tegumentar. Dentre elas estão as úlceras traumáticas,

piodermites, paracoccidioidomicose, neoplasias cutâneas, hanseníase,

tuberculose cutânea e esporotricose, fazendo-se necessário o diagnóstico

diferencial antes do início do tratamento adequado (Furtado, 1980; Kar, 1995;

Ministério da Saúde, 2006; Barros et al., 2005).

O teste cutâneo, a intradermorreação de Montenegro (IDRM) é

largamente utilizada na rotina ambulatorial e possui um grande valor presuntivo

no diagnóstico da LTA, sendo também bastante útil nos inquéritos

epidemiológicos de áreas endêmicas (Shaw & Lainson, 1975). Esse teste

detecta reações de hipersensibilidade tardia uma vez que a resposta imune

característica da LT é do tipo celular (Carvalho et al., 1995). No entanto, a

IDRM apresenta restrições quanto a ausência de discriminação entre doença e

infecção; doença atual e pregressa, podendo permanecer positiva mesmo após

o tratamento (Montenegro, 1926); e ainda em pacientes com leishmaniose

cutânea difusa e em imunodeprimidos, o resultado tende a ser negativo. Um

outro problema apresentado em alguns pacientes foi a alergia ao diluente do

reagente do teste, o que acarretou em um resultado falso positivo na IDRM,

levando ao fabricante a trocar o thimerosal utilizado como veículo pelo fenol

(Marzochi et al., 1998; Paranhos-Silva et al., 2001; Fagundes et al., 2003).

1.4.1. Diagnóstico Parasitológico

Na LTA, o diagnóstico parasitológico é considerado diagnóstico de

certeza ou definitivo, pois se baseia na evidenciação do parasita através de

pesquisa direta ou indireta (Garham, 1971; Furtado, 1972).

A pesquisa direta é o procedimento de primeira escolha, por ser rápido,

de fácil execução e ter baixo custo. O material é obtido da lesão por

escarificação, punção aspirativa ou biópsia da borda (imprint), fixado em uma

lâmina de vidro e corado pelas técnicas de Giemsa ou Leishman para a

posterior visualização das formas amastigotas. A sensibilidade do método

apresenta valores que variam entre 42% (Pirmez et al., 1999), 56,4% (Weigle

et al., 2002) e 77% (Lopez et al., 1993b), devido à espécie de Leishmania

envolvida, à escassez de parasitas na lesão e também pode ser ainda menor

em lesões onde o tempo de evolução é superior a um ano (Ministério da

Saúde, 2007).

Na pesquisa indireta é realizado o cultivo dos parasitas, o qual pode ser

in vitro ou in vivo. No cultivo in vitro, o material de biópsia da lesão deve ser

inoculado diretamente em meios de cultura apropriados, estéreis, para se

tentar o isolamento do parasita, pois a freqüente contaminação fúngica e

bacteriana pode impossibilitar o diagnóstico. No cultivo in vivo, o parasita pode

ser isolado através da inoculação em animais de laboratório. Desvantagens

como o longo tempo necessário para a evolução da doença no animal, a

exigência de um espaço físico adequado para a manutenção desses animais e

a eficácia do isolamento variar conforme a espécie de Leishmania faz com que

não se utilize essa técnica para o diagnóstico (Melo, 1981; Ministério da Saúde,

2007).

Sob o ponto de vista histológico, as lesões de LTA, tanto cutâneas

quanto mucosas, são descritas como uma reação inflamatória crônica

granulomatosa. O infiltrado dérmico é constituído sobretudo por linfócitos,

plasmócitos e histiócitos, onde os parasitas são dificilmente encontrados

(Pessôa & Barretto, 1948; Magalhães et al., 1986). No entanto, o diagnóstico

histopatológico de certeza só é possível mediante a detecção do parasita. Caso

contrário, as alterações serão somente sugestivas do diagnóstico (Gontijo &

Carvalho, 2003).

Baixa sensibilidade, tempo elevado para a execução e necessidade de

técnicos treinados são limitações dos métodos para a evidenciação da

Leishmania. Por isso, novas técnicas para a identificação do parasita vêm

sendo utilizadas como a técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR)

(Pirmez et al., 1999; Oliveira et al., 2003). Esta técnica consiste na amplificação

do DNA ribossomal e DNA do minicírculo do cinetoplasto provenientes de

materiais como sangue periférico e biópsias de lesões de pacientes, sendo

esses os alvos ideais pois estão presentes em múltiplas cópias e possuem

regiões conservadas e regiões variáveis (Bruijn & Barker, 1992; Meredith et al.,

1993; Uliana et al., 1994). Por ser um método com altos índices de

sensibilidade que variam de 80% (Lopez et al., 1993b), 94% (Pirmez et al.,

1999) a 100% (Oliveira et al., 2003), espera-se que a utilização dessa

ferramenta possa auxiliar em situações onde a escassez do parasita inviabilize

o isolamento, em pacientes com infecção subclínica ou em inquéritos

epidemiológicos (Lopez et al., 1993a; Coutinho et al., 2002; Leontides et al.,

2002). Entretanto, as exigências técnicas e o custo relativamente elevado ainda

reduzem seu emprego na rotina laboratorial.

1.4.2. Diagnóstico Sorológico

1.4.2.1. Resposta imune a Leishmania

Em 1970, Bryceson postulou que na leishmaniose experimental a

resistência à infecção é dependente da imunidade celular envolvendo linfócitos

e macrófagos. Além disso, que a interação entre estas células, associada à

produção local de fatores solúveis, poderia resultar em um efeito citotóxico

sobre os macrófagos parasitados na lesão e concomitantemente destruição

dos parasitas.

A resolução da infecção é dependente da espécie de Leishmania

envolvida e da resposta imune do hospedeiro (Coutinho et al., 1987). A partir

da década de 80, estudos mostraram a importância dos linfócitos T, CD4+ e

CD8+, na resolução da infecção (Mitchell et al., 1980; Milon et al., 1995). O

balanço entre as respostas do tipo Th1 e Th2 são fundamentais para o curso

da infecção, sendo a resistência mediada por Th1 e a susceptibilidade por Th2

(Coutinho et al., 1998; Rocha et al., 1999).

Na resposta imune humoral, a produção de anticorpos específicos anti-

Leishmania, independente da forma clínica, é predominantemente constituída

por imunoglobulina G (IgG). Estudos relatam baixas concentrações séricas de

imunoglobulina A (IgA) anti-Leishmania em pacientes com leishmaniose

cutâneo-mucosa (LCM), níveis moderados de imunoglobulina M (IgM) anti-

Leishmania nos dois primeiros meses de infecção e assim como a correlação

entre a dosagem de subclasses de IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) com os

diferentes perfis clínicos da doença (Guimarães et al., 1989; Guimarães et al.,

1990; O'Neil et al., 1993; Ulrich et al., 1995; Souza et al., 1998).

1.4.2.2. Testes sorológicos

Apesar das controvérsias na literatura a respeito da sensibilidade e

especificidade das técnicas aplicadas ao imunodiagnóstico, do seu valor

limitado devido aos baixos níveis séricos de anticorpos específicos na

leishmaniose tegumentar e das reações cruzadas que ocorrem freqüentemente

com amostras de pacientes portadores de outras doenças infecciosas, os

testes sorológicos são as principais ferramentas utilizadas no diagnóstico em

situações onde a evidenciação do parasita não é possível (Roffi et al., 1980;

Teixeira & Vexenat, 1996).

Em 1919, Moses descreveu a reação de fixação de complemento (RFC),

o primeiro teste sorológico para a leishmaniose visceral. A RFC foi utilizada em

inquéritos soro-epidemiológicos e considerada importante no diagnóstico

precoce da doença e no monitoramento da eficácia do tratamento (Pampiglione

et al., 1974; Bettini et al., 1977). No entanto, o teste apresentava reações

cruzadas com outras doenças parasitárias e infecções micóticas (Manuel &

Behin, 1982).

O teste de hemaglutinação indireta foi utilizado por Cascio et al. (1963)

em pacientes também com leishmaniose visceral. Além de não haver diferença

na resposta às diversas espécies de Leishmania, o teste possui reação

cruzada com soros de pacientes de outras doenças como a malária,

esquistossomose, doença de chagas entre outras (Bray & Lainson, 1967;

Antunes et al., 1972).

Chaffee (1963) descreveu padrões diferentes de precipitação obtidos

através da imunodifusão dupla de Ouchterlony a partir de preparações

antigênicas de Leishmania donovani, L. tropica e L. braziliensis, porém sem

especificidade na resposta do soro com o antígeno homólogo (Bray & Lainson,

1966). A contraimuneletroforese é mais sensível que a imunodifusão e o tempo

de execução do teste é menor (Kar, 1995).

Outro teste sorológico utilizado no diagnóstico da leishmaniose é o teste

de aglutinação direta (TAD) descrito por Allain e Kagan (1975). No diagnóstico

da LV, o TAD possui limitações no que diz respeito à não distinção entre

infecção recente, de cura e reações cruzadas com soros de pacientes com

tripanosomíase africana (Harith et al., 1987). A simplicidade no preparo do

antígeno, a facilidade na execução e estabilidade dos reagentes permitiu a

recomendação deste teste quando outras técnicas não estivessem disponíveis

(Barral-Netto et al., 1986).

Diferentemente da LV, os anticorpos circulantes na leishmaniose

tegumentar não estão em concentrações suficientemente elevadas para

permitirem um excelente desempenho dos testes sorológicos acima descritos.

Por isso, somente após o advento de técnicas de marcação, como as reações

de imunofluorescência e os ensaios imunoenzimáticos, é que o papel dos

anticorpos específicos anti-Leishmania foi melhor estudado (Behforuz et al.,

1976; Anthony et al., 1980).

A partir de sua descrição na década de 60 por Oddo e Cascio (1963), a

reação de imunofluorescência indireta (IFI) vem sendo amplamente utilizada no

diagnóstico da LT, em área de L. (V.) braziliensis, devido à sua boa

sensibilidade, 76,4% (Souza et al., 1982), e especificidade, 85,6% e 86,2%

(Guimarães et al., 1991; Barroso-Freitas, 2006), embora apresente reações

cruzadas com pacientes de leishmaniose visceral e tripanosomíases (Camargo

& Rebonato, 1969; Furtado, 1980). Em área de L. (V.) guyanensis e em casos

isolados de infecção por L. (L.) amazonensis, a sensibilidade da IFI é menor

(Silveira et al., 1999; Ministério da Saúde, 2007).

Vários estudos foram realizados utilizando como antígenos de IFI

diferentes espécies de Leishmania tanto nas formas promastigotas quanto nas

amastigotas (Convit & Pinardi, 1969; Guimarães et al., 1974; Badaro et al.,

1983), comparando o uso de antígeno homólogo e heterólogo em relação ao

agente infeccioso (Shaw & Voller, 1964) e também a utilização de soros não

diluídos ou em diluições muito baixas visando avaliar a ocorrência de reações

cruzadas com soros de pacientes de outras doenças endêmicas (Araujo &

Mayrink, 1968).

Diversos autores observaram que os níveis dos anticorpos circulantes na

leishmaniose tegumentar diminuem ou desaparecem após o tratamento

específico ou na vigência de regressão espontânea. Esse fato possibilita a

utilização da IFI no monitoramento terapêutico e no controle de cura (Chiari et

al., 1973; Walton, 1980; Souza et al., 1982; Schubach et al., 1998).

No Brasil, o Ministério da Saúde (MS) preconiza a utilização da IFI, no

Sistema Único de Saúde (SUS), como teste de referência para o diagnóstico

sorológico da leishmaniose visceral humana e canina. Na LTA, a IFI e o ensaio

imunoenzimático são úteis nos casos de lesões extensas ou múltiplas e nos

casos de lesões mucosas, e devem ser realizados preferencialmente em

centros de referência (Ministério da Saúde, 2007).

1.4.2.2.1. Ensaios Imunoenzimáticos

Nos últimos anos, vários ensaios imunoenzimáticos vêm sendo descritos

para a detecção de anticorpos específicos na leishmaniose. Métodos como o

Dot-ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), cujo antígeno é adsorvido

em papel de nitrocelulose e o aparecimento de cor na superfície do papel

indicando positividade é facilmente observado, possui grande utilidade em

inquéritos epidemiológicos para LV podendo mesmo ser usado nas áreas

endêmicas (Pappas et al., 1983); e o immunoblotting que além de ter elevadas

sensibilidade (91%) (Brito et al., 2000) e especificidade (100%) (Brito et al.,

2000; Gonçalves et al., 2002), permite identificar perfis de proteínas antigênicas

da Leishmania reconhecidos pelos soros de indivíduos infectados. Entretanto,

seu emprego no diagnóstico é restrito por ser uma técnica que necessita de

equipamentos e reagentes próprios, sua execução é demorada e não existe

uma padronização do perfil antigênico das espécies de Leishmania.

O teste de ELISA é o mais empregado por ser um teste rápido, que

permite automação, possui desempenho semelhante à reação de

imunofluorescência indireta (Engvall & Perlmann, 1972; Voller et al., 1976) e

ainda possibilita a utilização de extratos solúveis de Leishmania como antígeno

(Hommel et al., 1978; Anthony et al., 1980).

Os antígenos utilizados nos ensaios imunoenzimáticos são de

importância crucial para a acurácia do teste. Autores descrevem que a

utilização no ELISA de antígenos homólogos em substituição a antígenos

heterólogos no diagnóstico da LTA pode aumentar a sensibilidade e a

especificidade (Nascimento et al., 2003; Barroso-Freitas, 2006). No entanto, o

mesmo não ocorreu quando Guimarães et al. (1991) compararam extratos

antigênicos de L. braziliensis e L. major-like, não mostrando diferença na

performance entre ambos.

Ainda em relação aos antígenos, alguns estudos identificaram certas

moléculas com propriedades imunogênicas como a proteína de choque térmico

(HSP) 60 (Rey-Ladino et al., 1997), HSP83 (Celeste et al., 2004) e a

glicoproteína 63 (Bouvier et al., 1985), sendo algumas destas espécie-

específicas, como potenciais candidatas a sua utilização no imunodiagnóstico,

porém ainda não houve comprovação da eficácia dessas frações antigênicas.

Outro parâmetro que pode afetar o desempenho do ensaio

imunoenzimático é o limiar de detecção do sistema revelador. Geralmente, a

utilização de reveladores cromogênicos nos imunoensaios é sensível o

suficiente para ser usada na rotina sorológica. Todavia, quando os

constituintes-alvo estão presentes em pequenas concentrações, como os

baixos níveis de anticorpos na LTA, é necessário o uso de procedimentos

capazes de amplificar o sinal enzimático (Avrameas, 1992).

Um desses mecanismos é a utilização de reveladores que geram

produtos fluorescentes ou luminescentes. Compostos fluorescentes podem ser

detectados mesmo estando presentes em quantidades extremamente

pequenas (Avrameas & Guilbert, 1971; Ishikawa, 1973).

Na década de 60 os sistemas reveladores utilizavam radioisótopos como

moléculas de detecção. No decorrer dos anos outras moléculas foram

desenvolvidas e atualmente as mais utilizadas são as enzimas que convertem

substratos incolores em coloridos ou moléculas não fluorescentes em

fluorescentes. O ensaio é quantitativo e a intensidade da cor gerada é

proporcional à quantidade da enzima presente.

As enzimas mais utilizadas são a horseradish peroxidase (HRP) e a

fosfatase alcalina (AP). A HRP é uma glicoproteína pertencente ao grupo de

ferroprotoporfirinas e é composta por uma cadeia polipeptídica com quatro

pontes dissulfídricas e 18% de carboidratos. O pH ótimo para sua atividade é

aproximadamente 5,0, onde se liga ao peróxido de hidrogênio (H

)

resultando em um complexo que oxida uma variedade de aminas e fenóis

doadores de hidrogênio (Shannon et al., 1966).

O-fenilenodiamino (OPD) (C

. HCl) é um cromógeno cuja oxidação

pela HRP-H

produz 2,3-diaminofenazina (Figura 1), um composto solúvel

cuja cor varia de laranja a marrom, e após a adição de ácido sulfúrico ou

clorídrico sua intensidade pode ser medida em espectrofotômetro a 492 nm

(Bovaird et al, 1982).

Figura 1: Reação do o-fenilenodiamino com horseradish peroxidase -

peróxido de hidrogênio.

3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB) (C

) é o cromógeno mais

utilizado nos imunoensaios onde a enzima catalisadora da reação é a HRP.

Sua oxidação (Figura 2) produz um composto de cor azul que com a

acidificação torna-se amarelo cuja absorbância é obtida a 450 nm (Frey et al.,

2000).

Figura 2: Reação da 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina com horseradish

peroxidase - peróxido de hidrogênio.

Fonte: Frey, A., Meckelein, B., Externest, D. and Schmidt, M. A. 2000. A stable and highly sensitive 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine-based substrate

reagent for enzyme-linked immunosorbent assays. J Immunol Methods, 233 (1-2): 47-56.

2,3-diaminofenazina

Outra enzima utilizada nos ensaios imunoenzimáticos é a fosfatase

alcalina, uma metaloenzima com dois átomos de zinco por molécula. 4-

metilumbeliferilfosfato (MUP) (C

P) é um substrato cuja hidrólise pela

fosfatase alcalina gera um composto, 4-metilumbeliferone (Figura 3), que é

intensamente fluorescente em pH 10,3, com emissão de fluorescência a 448

nm e excitação máxima a 364 nm (Fernley & Walker, 1965) .

Figura 3: Reação do 4-metilumbeliferilfosfato com fosfatase alcalina.

Fosfatase Alcalina

4-metilumbeliferilfosfato 4-metilumbeliferone

1.5. Avaliação de Testes Diagnósticos

Os médicos dedicam grande parte de seu tempo determinando

diagnóstico para as queixas ou anormalidades de seus pacientes. A maioria

dos bons clínicos usa juízo crítico, conhecimento amplo da literatura e um tipo

de abordagem empírica de como organizar a informação diagnóstica.

Entretanto, estabelecer um diagnóstico é um processo imperfeito resultando

em probabilidade e não em certeza de se estar correto e a utilização das leis

de probabilidade auxilia na interpretação do testes diagnósticos (Fletcher et al.,

1996).

Clínicos e epidemiologistas sempre solicitam exames sorológicos para o

diagnóstico e esperam resultados que sejam confiáveis, porém, em alguns

casos, os exames podem gerar informações que nem sempre são compatíveis

com o diagnóstico.

A grande quantidade de métodos e técnicas empregados nos exames

sorológicos é uma indicação da dificuldade de obtenção de resultados com

absoluta acurácia. Essa finalidade poderia ser atendida por um método

altamente sensível e específico, mas que inexiste (Teixeira & Vexenat, 1996).

Na avaliação da qualidade de testes diagnósticos são utilizados dois

conceitos: a precisão e a validade de um “teste” (OPAS, 1997).

A precisão ou confiabilidade não constitui um atributo do desenho da

investigação como um todo, e sim uma qualidade exclusiva dos instrumentos

de coleta de dados (Almeida Filho & Rouquaryol, 2002). Portanto, refere-se à

concordância dos resultados de um exame ou de um instrumento na mão de

diferentes avaliadores, em momentos distintos. A confiabilidade marca a

variação da medida, definindo a estabilidade ou consistência da mensuração.

Outras terminologias utilizadas são reprodutibilidade, quando o teste é

realizado em laboratórios e com avaliadores distintos, e repetibilidade, quando

o mesmo avaliador realiza o teste em momentos diferentes.

Os resultados gerados pelos ensaios imunoenzimáticos expressos sob a

forma de densidade óptica (DO) são variáveis contínuas e a confiabilidade

destas é medida através do Coeficiente de Correlação Intraclasse (ICC -

Intraclass Correlation Coefficient). O ICC combina informações sobre

correlação e diferenças sistemáticas entre leitores ou aferições, ele varia de -1

a 1 e quanto maior o ICC, menor a contribuição dos erros no processo de

medida na variação total .

Validade ou acurácia de um teste refere-se ao grau em que o exame é

capaz de determinar o verdadeiro valor do que está sendo medido, informa se

os resultados representam a “verdade” ou o quanto se afastam dela. Para tal,

comparam-se os resultados do teste com um “padrão-ouro”, este é o indicador

mais fiel da verdade e pode ser o verdadeiro estado do paciente, um conjunto

de exames julgados mais adequados ou uma outra forma de diagnóstico que

sirva de referência (OPAS, 1997).

Da mesma forma que o descrito para a confiabilidade, a acurácia pode

ser medida através de propriedades inerentes ao teste diagnóstico como:

• Sensibilidade: É a capacidade do teste de detectar a doença quando

ela está de fato presente, ou seja, expressa a probabilidade de um

teste dar positivo na presença da doença (verdadeiros positivos);

• Especificidade: É a capacidade do teste de afastar a doença quando

ela está ausente, ou seja, expressa a probabilidade de um teste dar

negativo na ausência da doença (verdadeiros negativos);

• Valores preditivos: É a probabilidade de doença dados os resultados

de um teste diagnóstico. O valor preditivo positivo (VPP) expressa a

probabilidade de um paciente com o teste positivo ter a doença e o

valor preditivo negativo (VPN), a probabilidade de um paciente com

teste negativo não ter a doença;

• Razão de Verossimilhança (Likelihood Ratio): É a razão entre a

probabilidade de um determinado resultado de um teste diagnóstico

em indivíduos portadores da doença e a probabilidade do mesmo

resultado em indivíduos sem a doença. A razão de verossimilhança

para o teste positivo (RV+) expressa quantas vezes é mais provável

encontrar um resultado positivo em pessoas doentes quando

comparado com pessoas não doentes e razão de verossimilhança

para o teste negativo (RV-), quantas vezes é mais provável encontrar

um resultado negativo em pessoas doentes quando comparado com

pessoas não doentes.

Um teste sensível é o teste de escolha quando a penalidade por deixar

de diagnosticar a doença é grande ou na fase inicial de um processo

diagnóstico onde um grande número de possibilidades está sendo considerado

e se quer reduzi-lo. Um teste específico é útil para confirmar um diagnóstico

sugerido por outros dados e é necessário quando os resultados falsos positivos

podem lesar o paciente física, emocional ou financeiramente.

Sem dúvida, é desejável dispor de um teste 100% sensível e 100%

específico que raramente é encontrado na prática, pois na tentativa de

melhorar a sensibilidade freqüentemente resulta na piora da especificidade

(OPAS, 1997). Assim, para um teste como o ensaio imunoenzimático no qual

se utilizam medidas contínuas é necessário determinar um ponto de corte (cut-

off) entre os valores considerados positivos e negativos.

Uma maneira de expressar a relação entre sensibilidade e especificidade

é através da construção da curva ROC (Receiver Operator Characteristic).

Desenvolvida na década de 1950 para a análise de detecção de sinal de

radares e introduzida na área médica na década de 1960, a curva ROC se

tornou uma importante ferramenta na avaliação de testes diagnósticos (Zweig

& Campbell, 1993).

A curva ROC é construída plotando-se a taxa de verdadeiros positivos

(sensibilidade) contra a taxa de falsos positivos (1-especificidade) ao longo de

uma faixa de pontos de corte. Os valores nos eixos vão de uma probabilidade

de 0 a 1 (0 a 100%). Testes de bom poder discriminatório concentram-se no

canto superior esquerdo da curva ROC e testes de menor poder discriminatório

têm curvas mais próximas à diagonal que vai da esquerda inferior à direita

superior. Esta diagonal mostra a relação entres a taxa de resultados

verdadeiros positivos e falsos positivos que seria obtida por um teste que não

traz nenhuma informação diagnóstica (Fletcher et al., 1996).

Além de auxiliarem na identificação do melhor ponto de corte, as curvas

ROC são muito utilizadas para comparar dois ou mais testes diagnósticos para

a mesma doença. Nesse caso, o poder discriminatório do teste pode ser

mensurado através do cálculo da área sob a curva ROC (AUC - Area under the

ROC curve), quanto maior a AUC melhor será o teste diagnóstico.

1.5.1. Roteiro para determinar a validade de um teste diagnóstico

O delineamento de estudos para avaliar a utilidade clínica ou

populacional de testes diagnósticos deve incorporar dois aspectos. O primeiro

deles diz respeito aos princípios de randomização e mascaramento (OPAS,

1997). A randomização ou aleatorização corresponde ao processo de alocação

aleatória de pacientes ou espécimes clínicos em grupos buscando uma

distribuição equilibrada de variáveis de confundimento. E o mascaramento é

realizado para minimizar o viés de mensuração, impedindo o comportamento

de um modo sistemático por parte do avaliador, caso saiba que tipo de

intervenção ou confirmação diagnóstica está submetido aquele paciente ou

espécime clínica (Almeida Filho & Rouquaryol, 2002). O segundo aspecto a ser

levado em conta refere-se à prática clínica vigente como, por exemplo, se o

teste será aplicado nas mesmas condições de seu uso na rotina laboratorial

(OPAS, 1997).

Em 1999, um grupo do Cochrane Colloquium discutindo sobre a baixa

qualidade metodológica de artigos que reportavam avaliações de testes

diagnósticos, desenvolveram um roteiro de itens que deveriam ser incluídos em

trabalhos sobre estudos de acurácia diagnóstica. Esse roteiro foi denominado

STARD (Standards for Reporting of Diagnostic Accuracy) (Bossuyt et al., 2003).

O STARD inicia-se com a certificação através da identificação de

palavras-chave de que se trata de um estudo de acurácia diagnóstica seguido

de questionamentos sobre a justificativa do estudo, como vantagens na

introdução de um novo teste ou comparação de acurácia entre diversos testes

e/ou grupos participantes.

A metodologia deve contemplar os seguintes tópicos:

• Sujeitos da pesquisa: definição da procedência e dos critérios de

elegibilidade da população a ser estudada, qual a base clínica e

laboratorial para o recrutamento, qual o critério adotado para a

definição da amostragem, é o estudo prospectivo ou retrospectivo;

• Métodos: Etapas do processamento do teste índice e do teste de

referência, especificações técnicas dos materiais utilizados,

detalhamento da interpretação dos resultados dos testes que serão

avaliados, informação sobre mascaramento na realização dos testes;

utilização de métodos estatísticos para a análise dos resultados.

Os resultados devem conter informações referentes às características

clínicas e demográficas da população do estudo e se em todos os participantes

foram aplicados os testes propostos, tabulação dos resultados do testes índice

e de referência, estimações de parâmetros de acurácia diagnóstica com

medidas de quantificação de incerteza (intervalo de confiança - IC), destino dos

resultados perdidos ou indeterminados. E finalizando, a discussão deve

abordar a aplicabilidade clínica dos achados do estudo.

2. JUSTIFICATIVA

No Centro de Referência em Leishmanioses (CRLeish), situado no

Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas (IPEC), foram atendidos cerca

de 230 pacientes com LTA provenientes do Estado do Rio de Janeiro entre os

anos de 2002 e 2004. Esses pacientes foram submetidos à rotina clínica e

laboratorial, na qual os métodos diagnósticos (IDRM, sorologia, histopatologia,

cultura e exame direto) são realizados.

Os testes sorológicos contribuem para o diagnóstico da LTA, apesar do

seu valor limitado devido à baixa resposta humoral e às reações cruzadas com

outras doenças (Roffi et al., 1980; Teixeira & Vexenat, 1996), com sinais

clínicos semelhantes, especialmente a esporotricose cuja incidência aumentou

recentemente no Rio de Janeiro (Barros et al., 2001; Barros et al., 2004).

Vários outros parâmetros podem afetar o desempenho dos métodos

imunoenzimáticos, como as frações antigênicas empregadas, o grau de avidez

e afinidade dos anticorpos pelos antígenos e o limiar de detecção da técnica.

Alguns autores relacionaram o aumento da sensibilidade no ensaio

imunoenzimático com o uso de

reveladores fluorogênicos e sua utilização em

detrimento dos cromógenos (Shalev et al., 1980; Labrousse et al., 1982;

Rakhmanova & MacDonald, 1998).

Neste estudo, pretendeu-se comparar a acurácia de três tipos de

reveladores no ensaio imunoenzimático para LTA. Baseado na literatura foram

selecionados os cromógenos OPD (o-fenilenodiamino-Sigma®), utilizado na

rotina do nosso laboratório, o TMB (3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina-Sigma®) e o

fluorógeno MUP (4-metilumbeliferilfosfato-Molecular Probes®), cujos limiares

de detecção para IgG são, respectivamente, 2; 0,3 e 0,5 ng/mL (Porstmann &

Kiessig, 1992).

A escolha do antígeno L. braziliensis a ser empregado no ensaio

imunoenzimático deste estudo decorreu ao fato desta espécie ser a mais

prevalente e identificada como etiologicamente associada a LTA no Rio de

Janeiro e, também pelos resultados de estudos de acurácia do ELISA

realizados por nosso grupo, comparando antígenos L. braziliensis e L. major-

like. Nascimento et al. (2003) observaram uma sensibilidade de 65,4% com

antígeno L. major-like e 84,4% com L. braziliensis, e especificidade de 84,4% e

91,7%, respectivamente. Os resultados de Barroso-Freitas (2006)

corroboraram os nossos, com sensibilidade e especificidade de 95,7% e 100%

para L. braziliensis e de 78,7% e 82,8% para L. major-like.

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo Geral

Comparar a acurácia de três sistemas reveladores utilizados em ensaios

imunoenzimáticos para a detecção de anticorpos IgG específicos no

diagnóstico da leishmaniose tegumentar americana causada por Leishmania

(Viannia) braziliensis.

3.2. Objetivos Específicos

• Comparar a sensibilidade, especificidade, valores preditivos e razões de

verossimilhança dos ensaios imunoenzimáticos para os sistemas

reveladores;

• Determinar a confiabilidade do ensaio imunoenzimático para os diferentes

sistemas reveladores;

• Indicar o revelador mais adequado no ensaio imunoenzimático para o

diagnóstico sorológico da LTA no Serviço de Parasitologia do IPEC.

4. SUJEITOS E MÉTODOS

4.1. Delineamento do Estudo

Estudo diagnóstico seccional, mascarado, randomizado, com repetições

independentes para comparação de três sistemas reveladores em ensaios

imunoenzimáticos para o diagnóstico da leishmaniose tegumentar americana,

em população de pacientes atendidos no ambulatório do CRLeish - IPEC.

4.2. Sujeitos da Pesquisa

4.2.1. População do Estudo

A população do estudo foi constituída de pacientes atendidos no

ambulatório do CRLeish - IPEC no período de janeiro de 2003 a julho de 2005.

4.2.2. Tamanho Amostral

O tamanho amostral calculado foi de 378 indivíduos, sendo 189 em cada

grupo (casos versus controles) considerando uma sensibilidade esperada de

84% (para o método em avaliação - ensaio imunoenzimático) (Nascimento et

al., 2003); uma diferença limite de equivalência entre os dois métodos de 5%,

um nível de significância de 5% e um poder de 80% utilizando-se a fórmula de

cálculo amostral para equivalência de duas proporções. As variações de

tamanho amostral ocorreram segundo a expectativa de performance para o

teste ELISA convencional, em avaliação, e segundo a magnitude da margem

de erro admitida.

4.2.3. Critérios de elegibilidade e seleção da amostra

As amostras de soro incluídas no estudo foram provenientes de

pacientes atendidos no ambulatório de CRLeish e que foram submetidos ao

protocolo padrão de rotina clínica (Anexo 1) no período acima citado.

O critério de confirmação para o grupo de pacientes com LTA foi o

diagnóstico parasitológico positivo obtido através da cultura, imprint ou

histopatologia. Amostras de soro de pacientes com outras doenças cutâneas

que compõe o espectro do diagnóstico diferencial com LTA foram utilizadas

como grupo controle, e a confirmação do diagnóstico realizada pela

positividade na cultura, histopatologia ou exame direto para a dada doença.

A partir do banco de dados de pacientes do CRLeish, as amostras de

soro foram selecionadas aleatoriamente utilizando o programa EPI-Info 6.0. A

fim de que não houvesse erro na classificação, o prontuário de todos os

pacientes selecionados foi revisto para a confirmação do diagnóstico.

Dos 189 pacientes com LTA, 166 possuíam leishmaniose cutânea, 14

com leishmaniose cutâneo-mucosa e nove com a forma mucosa. No grupo

controle, o diagnóstico encontrado mais freqüente foi o de esporotricose,

seguido de piodermite, úlcera vascular, neoplasia, dermatofitose, sífilis e

paracoccidioidomicose (Tabela 1).

Para este estudo, foi considerada somente a primeira amostra de soro

coletada do paciente para diagnóstico e antes do início da terapêutica

apropriada. Todas as amostras utilizadas foram diluídas 1:2 em glicerina e

estocadas no freezer (-20ºC) no Serviço de Parasitologia, IPEC.

Tabela 1: Freqüência (%) dos diagnósticos no grupo controle.

Diagnóstico Diferencial N %

Esporotricose 158 83,6

Piodermite 14 7,4

Úlcera Vascular 11 5,9

Neoplasia 3 1,6

Dermatofitose 1 0,5

Sífilis 1 0,5

Paracoccidioidomicose 1 0,5

TOTAL 189 100

4.3. Parasitas e antígenos utilizados nos testes

Neste estudo foram utilizados antígenos parcialmente solúveis obtidos

de formas promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis

(MHOM/BR/75/M2903). Os parasitas foram obtidos de cultura em fase

logarítmica de crescimento, a partir de uma curva de crescimento e definiu-se o

terceiro dia como o melhor ponto para a obtenção desses parasitas (Barroso-

Freitas, 2006).

4.3.1. Cultura axênica de L. (V.) braziliensis

Inicialmente, realizou-se um repique da cultura de manutenção (meio

bifásico-NNN+Schneider) para 50 mL do meio líquido utilizado para o

crescimento parasitário. Após três dias, a cultura foi quantificada em câmara de

Neubauer empregando-se o Azul de Trypan (0,2% em salina tamponada com

fosfatos - PBS). Um novo repique foi realizado com um inóculo inicial de 1x10

células/mL para garrafas de cultura com 250 mL do meio BHI (Brain Heart

Infusion - Difco®) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB), 200

U/mL de penicilina, 200 µg/mL de estreptomicina e 1% de urina humana

(Shamsuzzaman et al., 1999). Após três dias de incubação em estufa a 26-

28ºC, tempo estipulado pela curva de crescimento, os parasitas foram

coletados e processados.

4.3.2. Preparação antigênica

As culturas foram transferidas para tubos cônicos estéreis de 50 mL e

centrifugados a 5500g por 10 minutos a 4ºC (Centrífuga Refrigerada Coulter

Allegra 21R - Beckman®). Descartando-se o sobrenadante, o sedimento foi

ressuspenso em PBS pH 7,2 e centrifugado novamente a 5500g por 10

minutos a 4ºC. Esse processo foi repetido três vezes. Após a última lavagem, o

sedimento foi ressuspenso em tampão de lise contendo inibidores de protease

(1mM iodoacetamina, 1mM phenylmethylsulphonyl fluoride e 1mM

phenantroline), e submetidos a 30 ciclos de congelamento (gelo seco + etanol)

e descongelamento (banho-maria à 60ºC) adicionado de duas horas de ultra-

som (50/60 Hz - Transsonic 310 - Elma®) para o rompimento total dos

parasitas. A seguir, o material foi novamente centrifugado, agora a 10000g por

5 minutos a 4°C e o sobrenadante coletado para a dosagem do teor protéico

pelo método de Folin-Lowry (Lowry et al., 1951). O antígeno foi separado em

alíquotas e conservado a -20°C até o momento do uso.

4.4. Protocolo técnico do ensaio imunoenzimático

Utilizou-se a metodologia descrita por

Voller et al.(1976), descrita a

seguir.

Placas de poliestireno de 96 poços (nº 436110 para fluorógeno e nº

439454 para cromógeno - Nunc Maxisorp®) foram sensibilizadas com 100 µL

do antígeno total parcialmente solúvel de Leishmania (V.) braziliensis na

concentração de 5 µg/mL diluído em tampão carbonato-bicarbonato pH 9,6 e

posteriormente incubadas overnight (18 horas) a 4ºC. Após quatro lavagens

com PBS pH 7,2 com 0,05% de Tween 20 (PBS-T), em lavadora automática

(Tecan - Columbus Washer®), foi

adicionado em cada poço 100 µL das

amostras de soro diluídas a 1:40 em PBS-T com 1% de leite desnatado

(Molico®; PBS-TL), incubando-se por 45 minutos a 37ºC em câmara úmida.

Seguindo-se mais quatro novas lavagens, foram adicionados 100 µL de anti-

IgG cadeia γ-específica conjugada à peroxidase (HRP) (A3187 - Sigma®), nas

diluições de 1:4000 para OPD e 1:12000 para TMB, ou à fosfatase alcalina

(AP) (A3150 - Sigma®) na diluição de 1:150000 para MUP, diluídos em PBS-

TL. Após 45 minutos de incubação a 37ºC em câmara úmida e quatro novas

lavagens, foram adicionados 100 µL da solução reveladora.

• OPD: 10 mg de OPD (P6912 - Sigma®), 10 µL de peróxido de

hidrogênio (H

) em 25 mL de tampão citrato-fosfato pH 5,0;

• TMB: Solução pronta para o uso (T0440 - Sigma®);

• MUP: 0,1mM de MUP (M6491 - Molecular Probes®) em tampão

dietanolamina pH 9,8.

As placas foram incubadas por 15 minutos (OPD) e 30 minutos (TMB e

MUP) na ausência de luz, interrompendo-se a reação por adição a cada poço

de 50 µL de 1N H

(OPD e TMB) e 100 µL 3N NaOH (MUP). A densidade

óptica e a fluorescência (Relative Fluorescence Units - RFU) dos poços foram

determinadas em leitor de placas (Tecan Genius®). Na leitura das placas com

os cromógenos OPD e TMB utilizaram-se os filtros com comprimento de onda

de 492 nm e 450 nm, respectivamente; e para o fluorógeno MUP os filtros de

emissão de 465 nm e excitação de 360 nm.

4.5. Confiabilidade e Mascaramento

Para avaliar a confiabilidade dos testes, foram realizadas duas aferições

de cada amostra pelo mesmo técnico em dois momentos distintos para cada

sistema revelador. Os testes foram realizados com mascaramento das

amostras, isto é, sem que o avaliador soubesse o grupo ao qual pertencia a

amostra, se caso ou controle a fim de minimizar viés.

4.6. Análise Estatística

A sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivo, negativo e as

razões de verossimilhança foram calculados utilizando o Statistical Package for

the Social Science (SPSS) versão 11.0, com respectivos intervalos de

confiança de 95%. A confiabilidade do ensaio imunoenzimático foi analisada

pelo coeficiente de correlação intraclasse com intervalo de confiança de 95%.

Foram estabelecidos cut-offs para cada tipo de ensaio imunoenzimático

segundo o sistema revelador utilizado. Os resultados foram expressos em DO

e RFU e tratados como variáveis contínuas mediante a curva ROC. O

desempenho dos diferentes testes foi comparado através de suas curvas ROC

(AUC), utilizando-se o software MedCalc 8.2. Os valores das áreas sob a curva

foram comparados pelo teste Anova.

4.7. Aspectos Éticos

A rotina clínica de atendimento dos pacientes, incluindo a obtenção de

espécimes clínicos para os estudos e a realização de teste de Montenegro, foi

previamente submetida ao Comitê de Ética em Pesquisa do IPEC, constituindo

o projeto: “Estudo para a sistematização do atendimento de pacientes com

Leishmaniose Tegumentar Americana no Centro de Referência em LTA-

Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas - FIOCRUZ”, aprovado no

CEP/IPEC sob o número 0016.0.009-02. Os pacientes assinaram um termo de

consentimento livre e esclarecido (Anexo 2) para a realização da rotina clínica

e/ou entrada no Programa de Leishmanioses do IPEC. Este estudo não

acarretou em modificações na rotina de atendimento ambulatorial de pacientes

e um termo de compromisso (Anexo 3) para manter o anonimato dos sujeitos

da pesquisa foi assinado pelos responsáveis do projeto e aprovado no

CEP/IPEC sob o número 0015.0.009.000-06 (Anexo 4).

5. RESULTADOS

5.1. Diluições dos conjugados anti-IgG

Para a titulação do conjugado foram utilizadas quatro amostras de soro

positivas de pacientes confirmados parasitologicamente para leishmaniose

como controles positivos (CP) e quatro amostras de soro negativas de

indivíduos saudáveis como controles negativos (CN).

A concentração ótima para o conjugado anti-IgG HRP foi encontrada a

partir da sua diluição em 1:2000, 1:4000 e 1:8000 para o cromógeno OPD

(Figura 4) e em 1:6000, 1:12000 e 1:18000 para o TMB (Figura 5). Para o

fluorógeno MUP, diluiu-se o conjugado anti-IgG AP nas concentrações

1:50000, 1:100000, 1:150000 e 1:200000 (Figura 6). Para a definição dessas

concentrações, considerou-se a diluição com a maior razão entre a média dos

controles positivos e a média dos controles negativos.

As diluições escolhidas foram 1:4000, 1:12000 e 1:150000 para OPD,

TMB e MUP, respectivamente. A tabela 2 mostra as razões para cada diluição

e cada sistema revelador na qual derivaram a escolha das diluições do

conjugado.

Figura 4: Diluições do conjugado anti-IgG HRP para o cromógeno OPD.

BL: Blank; CN: Controle Negativo; CP: Controle Positivo; DO: Densidade Óptica

Figura 5: Diluições do conjugado anti-IgG HRP para o cromógeno TMB.

BL: Blank; CN: Controle Negativo; CP: Controle Positivo; DO: Densidade Óptica

0,0

0,2

onjugado

0,4

000,6

000,8

001,0

001,2

001,4

001,6

001,8

002,0

2,200

1:2000 1:4000 1:8000

Diluições do c

BL CN1 CN2 CN3 CN4 CP1 CP2 CP3 CP4

0,000

onjugado

1,600

1,400

1,200

1,000

0,800

0,600

0,400

0,200

1:6000 1:12000 1:18000

Diluições do c

BL CN1 CN2 CN3 CN4 CP1 CP2 CP3 CP4

Figura 6: Diluições do conjugado anti-IgG AP para o fluorógeno MUP.

BL: Blank; CN: Controle Negativo; CP: Controle Positivo; RFU: Unidade Relativa

de Fluorescência

Tabela 2: Razões entre as médias dos controles positivos (CP) e as

médias dos controles negativos (CN) para cada diluição do conjugado e

sistema revelador.

Revelador Diluições Média CP Média CN Razão

1:2000 1,511 0,374 4,0

1:4000 1,129 0,156 7,2

OPD

1:8000 0,582 0,139 4,2

1:6000 1,286 0,252 5,1

1:12000 1,230 0,142 8,7

TMB

1:18000 0,706 0,092 7,7

1:50000 39605 12106 3,3

1:100000 37338 8523 4,4

1:150000 34443 5556 6,2

MUP

1:200000 14730 2796 5,3

000

onjugados

00020

00025

00030

00035

00040

00045

50000

1:50000 1:100000 1:150000 1:200000

Diluições dos c

RFU

BL CN1 CN2 CN3 CN4 CP1 CP2 CP3 CP4

5.2. Ensaios Imunoenzimáticos

Com as concentrações ótimas definidas, foram realizadas duas aferições

de cada grupo (casos e controles) para cada sistema revelador.

5.2.1. Definição dos pontos de cortes (cut-off)

Os pontos de corte (cut-off) dos imunoensaios foram definidos através

da curva ROC. A leitura de densidade óptica (DO) considerada como cut-off

para o OPD foi 0,203 e 0,239 para o TMB, e a unidade relativa de fluorescência

(RFU) para o MUP foi 11103. As figuras 7,8 e 9 representam a distribuição dos

resultados, em DO ou RFU, de cada grupo no ensaio imunoenzimático para

cada revelador (OPD, TMB E MUP, respectivamente), tendo como cut-off os

valores acima.

Figura 7: Distribuição das Densidades Ópticas no ELISA com o

cromógeno OPD nos dois grupos - LTA (N= 189) e controle (N= 189).

OPD

1,800

1,600

1,400

1,200

1,000

0,800

0,600

0,400

0,200

0,000

LTA Controles

0,203

Figura 8: Distribuição das Densidades Ópticas no ELISA com o

cromógeno TMB nos dois grupos - LTA (N= 189) e controle (N= 189).

Figura 9: Distribuição das Unidades Relativas de Fluorescência nos

ensaios imunoenzimáticos com o fluorógeno MUP nos dois grupos -

LTA (N= 189) e controle (N= 189).

TMB

0,239

ControlesLTA

0,000

0,150

0,300

0,450

0,600

0,750

0,900

1,050

1,200

1,350

1,500

MUP

11103

ControlesLTA

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

Os resultados nos imunoensaios das amostras de cada grupo (189

pacientes de LTA e 189 pacientes com outras doenças cutâneas) com os três

reveladores estão descritos na tabela 3. Não foram observadas diferenças com

significância estatística entre as médias das leituras obtidas para os pacientes

de leishmaniose cutânea, leishmaniose cutâneo-mucosa e leishmaniose

mucosa para os reveladores OPD (0,874; 0,940; 0,967) p= 0,505, TMB (0,820;

0,831; 0,884) p= 0,179 e MUP (25973; 28798; 29489) p= 0,180,

respectivamente. As amostras (N=5) com resultados falso-negativos foram as

mesmas em todos os sistemas reveladores.

Tabela 3: Resultados - N (%) - positivos e negativos do imunoensaio para

os diferentes grupos segundo os três reveladores.

Teste OPD TMB MUP

LTA (%)

Controles (%)

LTA (%)

Controles (%)

LTA (%)

Controles (%)

Positivo 184 (97,4) 12 (6,4) 184 (97,4) 6 (3,2) 184 (97,4) 8 (4,2)

Negativo 5 (2,6) 177 (93,6) 5 (2,6) 183 (96,8) 5 (2,6) 181 (95,8)

Total 189 (100) 189 (100) 189 (100) 189 (100) 189 (100) 189 (100)

5.2.2. Acurácia dos testes

Os parâmetros de acurácia indicaram sensibilidade de 97,4% para os

três reveladores e especificidade de 93,7%, 97,4% e 95,8% para OPD, TMB e

MUP, respectivamente (Tabela 4). A utilização do TMB revelou uma

especificidade ligeiramente maior que o OPD (p= 0,082) e MUP (p= 0,397),

com valor preditivo positivo e negativo de 97,4%. A razão de verossimilhança

para o teste negativo foi idêntica nos três sistemas e no TMB, a razão de

verossimilhança para o teste positivo foi 36,8, ou seja, há uma chance 36,8

vezes maior de se encontrar um resultado positivo no teste em pacientes com a

doença quando comparado com pacientes sem a doença.

Tabela 4: Valores de sensibilidade, especificidade, VPP, VPN, RV+ e RV-

com seus respectivos IC de 95% para cada revelador.

Revelador

Sensibilidade (%)

(IC 95%)

Especificidade (%)

(IC 95%)

VPP (%)

(IC 95%)

VPN (%)

(IC 95%)

RV -

OPD

97,4

(93,9; 99,1)

93,7

(89,2; 96,7)

93,9

(89,3; 96,9)

97,3

(93,4;98,9)

15,3

0,03

TMB

97,4

(93,9; 99,1)

97,4

(93,9; 99,1)

97,4

(92,9; 98,7)

97,4

(93,6;99,0)

36,8

0,03

MUP

97,4

(93,9; 99,1)

95,8

(91,8; 98,1)

95,8

(91,7;98,0)

97,3

(93,5;99,0)

23,0

0,03

VPP: valor preditivo positivo; VPN: valor preditivo negativo; RV+: razão de

verossimilhança positiva; RV-: razão de verossimilhança negativa e IC:

Intervalo de Confiança

5.2.3. Comparação do desempenho dos três reveladores utilizando a curva

ROC

A área sob a curva (IC 95%) para o OPD e TMB foi idêntica 0,984

(0,966; 0,994 e 0,965; 0,994, respectivamente) e para o MUP foi 0,986 (0,968;

0,995), essa pequena diferença não atingiu significância estatística (Tabela 5).

A observação da figura 10 mostra que as AUC se sobrepõem independente do

tipo de revelador utilizado.

Tabela 5: Comparação das áreas sob a curva (AUC) do ensaio enzimático

com os diferentes reveladores

Diferença entre AUC Erro padrão IC 95% da

diferença

p valor

OPD e TMB 0,000 0,006 -0,012 a 0,013 0,976

OPD e MUP 0,002 0,007 -0,012 a 0,015 0,797

TMB e MUP 0,002 0,006 -0,009 a 0,013 0,722

Figura 10: Áreas sob a curva ROC dos três sistemas reveladores

1 - Especificidade

1,0,8,5,30,0

Sensibilidade

1,0

0,0

Legenda

Linha de referência

MUP

TMB

OPD

5.3. Confiabilidade dos ensaios imunoenzimáticos

Para a avaliação da confiabilidade foram realizados estudos de

repetibilidade, isto é, um mesmo avaliador realizou o teste para cada amostra

em dois momentos distintos e o resultado foi analisado pelo coeficiente de

correlação intraclasse (ICC).

O valor do ICC para o OPD foi 0,993 (0,991; 0,994), 0,996 (0,995; 0,996)

para o TMB e 0,994 (0,992; 0,995) para o MUP, com seus respectivos IC de

95%. A confiabilidade foi considerada excelente para os três sistemas

reveladores.

6. DISCUSSÃO

O problema do diagnóstico acurado em LTA continua relevante e atual

tendo em vista que nos últimos 20 anos, a incidência de LTA vem aumentando

consideravelmente, com uma média anual de 32 mil novos casos, tornando-se

cada vez mais um grave problema de saúde pública (Ministério da Saúde,

2006).

Em nosso estudo asseguramos o padrão de referência para os casos

selecionados através do sugerido na literatura, isto é, a identificação de

amastigotas em amostras teciduais ou esfregaços, e a cultura in vitro de

parasitas presentes em biópsias (Melo, 1981; Gontijo & Melo, 2004).

Por se tratar de um estudo diagnóstico do tipo caso-controle e com

vistas a maximizar a representatividade interna da amostra, assegurou-se que

os controles fossem provenientes do mesmo ambulatório em que os casos

foram captados, e que por isso compartilharam a suspeita clínica inicial de LTA.

Outros aspectos de robustez do delineamento deste estudo foram a

randomização dos controles e o mascaramento na realização dos testes

(Bossuyt et al., 2003).

Como tem ocorrido em outros trabalhos do grupo do IPEC, a

esporotricose foi o diagnóstico diferencial mais freqüente (Barroso-Freitas,

2006) tendo em vista a ocorrência de surto no Rio de Janeiro (Barros et al.,

2001; Barros et al., 2004). Fato que contribui para a generabilidade externa

deste estudo, talvez para clientela do Estado do Rio de Janeiro.

Como preconizado em estudos diagnósticos avaliamos a confiabilidade

das técnicas realizadas. Comparando-se com um estudo para o diagnóstico da

LTA, nossos índices de confiabilidade (ICC: OPD - 0,993; TMB - 0,996; MUP -

0,994) foram excelentes, em consonância com o encontrado por Barroso-

Freitas (2006) no teste ELISA com o antígeno de L. braziliensis (ICC 0,940).

Não houve a possibilidade de pesquisar reprodutibilidade, ou seja, a análise

destas mesmas amostras em outro laboratório.

As técnicas imunoenzimáticas vêm sendo utilizadas em inúmeras

doenças, inclusive em inquéritos soro-epidemiológicos, devido a sua facilidade

e rapidez na execução, automatização, boa acurácia e baixo custo (Paranhos-

Silva et al., 1996; Braga et al., 1998). Este estudo se insere no âmbito da

utilização destes imunoensaios no diagnóstico das leishmanioses e

especificamente no que tange aos aperfeiçoamentos quanto à busca de uma

preparação antigênica ideal para a pesquisa de anticorpos anti-Leishmania,

dos limiares de positividade das amostras (cut-off), das melhores diluições dos

conjugados enzimáticos e dos reveladores a serem utilizados (Barral-Netto et

al., 1986).

Possivelmente devido à opção por utilizar o antígeno de Leishmania

(Viannia) braziliensis nos imunoensaios, a qual é a espécie predominante no

Rio de Janeiro, obtivemos ótimos parâmetros de acurácia, independente do

revelador utilizado. Este resultado confirma estudos anteriores que também

demonstraram o aumento da acurácia dos testes pela utilização de antígenos

homólogos em detrimento dos heterólogos (Mosleh et al., 1995; Nascimento et

al., 2003; Saha et al., 2005; Barroso-Freitas, 2006).

Embora seja um item imprescindível para a execução de um ensaio

imunoenzimático e existam inúmeros tipos de reveladores disponíveis no

mercado, são raros os estudos que elegem o revelador como objeto de

avaliação (Shekarchi et al., 1985; Crowther et al., 1990; Roberts et al., 1991), e

não encontramos em nossa revisão de literatura estudos com este

delineamento para a pesquisa de anticorpos específicos anti-Leishmania no

diagnóstico da LTA.

Também a definição da diluição ótima dos anticorpos anti-IgG cadeia γ-

específica, conjugados à peroxidase e à fosfatase alcalina que permitiria

melhor distinguir indivíduos não infectados de pacientes com LTA, é de difícil

comparação porque em estudos publicados estas decisões não têm os

métodos descritos, sendo um item rotineiro mencionado na metodologia do

teste. No estado da arte, há consenso que a determinação de diluições deva

ser determinada nas condições de cada laboratório e a cada mudança de lote,

uma vez que inúmeras variáveis influenciam o desempenho.

Apesar de alguns dados na literatura apontarem o aumento da

sensibilidade através do uso de fluorógenos (Shalev et al., 1980; Avrameas,

1992), essa afirmativa não foi observada em nossos resultados. A sensibilidade

encontrada (97,4%) em nosso estudo foi idêntica nos três sistemas

reveladores, resultado congruente com o de Crowther et al. (1990) que

utilizando os mesmos reveladores na detecção do vírus da febre aftosa

também encontraram sensibilidades similares entre o fluorógeno e o

cromógeno. E com o de Shekarchi et al. (1985), quando comparou o

cromógenos pNPP e o fluorógeno MUP para a detecção de anticorpos contra o

vírus da rubéola e antígenos do vírus herpes simplex.

Por outro lado, Roberts et al. (1991) detectaram melhor desempenho

com fluorógenos, utilizando os cromógenos TMB, ABTS (2,2’ - azino-bis - 3 -

etilbenzotiazolina - 6 - ácido sulfônico), PMP (monofosfato de fenolftaleína) e

pNPP (p-nitrofenil fosfato), e os fluorógenos HPPA (3 - p - hidroxifenil ácido

propiônico) e MUP na detecção de anticorpos anti-HIV. A sensibilidade obtida

pelo fluorógeno HPPA foi ligeiramente superior (limite de detecção 1,7 vezes

maior) ao TMB e MUP, e estes últimos foram equivalentes. O cromógeno ABTS

que segundo Bos et al. (1981) possui performance semelhante ao OPD, obteve

um desempenho inferior ao TMB.

Shekarchi et al. (1985) concluíram pela utilização de um revelador

fluorogênico para a detecção de anticorpos contra o vírus da rubéola e de

antígenos do vírus herpes simplex com base em outros parâmetros uma vez

que a acurácia foi semelhante. Foi menor o tempo de incubação necessário

para a revelação do MUP em ambos os vírus, e mais baixa a concentração de

antígeno usado na detecção dos anticorpos anti-rubéola. Não detectamos

diferenças relevantes no tempos de incubação nem na concentração de

antígeno Leishmania (V.) braziliensis que foi de 5 µg/mL em todos os sistemas

testados.

Entretanto, uma desvantagem no ensaio imunoenzimático revelado com

o fluorógeno MUP reside no rápido decréscimo na emissão do sinal de

fluorescência, exigindo que a leitura seja realizada imediatamente para não

prejudicar o resultado, e no fato do equipamento apropriado para a medição da

intensidade da fluorescência ter um custo bastante elevado, reafirmando o

benefício do uso dos cromógenos (Crowther et al., 1990; Gee et al., 1999).

É interessante ressaltar que obtivemos uma pequena diferença nas

especificidades para os três reveladores sem significância estatística, sendo a

mais elevada para o TMB. No entanto, uma limitação no que diz respeito ao

desenho de estudo se refere ao fato do cálculo do tamanho amostral ter sido

realizado estimando diferenças percentuais nos parâmetros de acurácia da

ordem de 5%, que foi uma estimativa maior do que as diferenças encontradas.

Do ponto de vista clínico-laboratorial uma diferença de desempenho desta

magnitude (5%) ou maior apontaria para não similaridade.

Uma vez que as acurácias dos reveladores têm sido indistinguíveis,

outros parâmetros estão sendo considerados para a escolha do sistema

revelador adequado. Assim, alguns autores propõem a utilização do TMB por

ser altamente estável e não mutagênico e/ou carcinogênico (Bos et al., 1981),

possuir baixo custo em relação aos fluorógenos, fácil manipulação (Blais et al.,

2004), disponibilidade comercial sob a forma de kits (Frey et al., 2000; Blais et

al., 2004), além de ser mais sensível que o OPD cujas propriedades

mutagênicas foram demonstradas no teste de Ames (que detecta a

citotoxicidade e mutagenicidade causadas por compostos químicos) (Voogd et

al., 1980; Porstmann & Kiessig, 1992).

Considerando os argumentos acima e a acurácia similar dos três

reveladores pretendemos substituir o OPD pelo TMB na rotina do laboratório.

7. CONCLUSÃO

1 - Os três reveladores (OPD, TMB e MUP) nos ensaios imunoenzimáticos

revelaram índices de sensibilidade idênticos (97,4%) e especificidade

semelhantes (OPD - 93,7%; TMB - 97,4%; MUP - 95,8%), sem diferença

estatística significante na detecção de anticorpos IgG para o diagnóstico da

LTA.

2 - O desempenho dos sistemas reveladores, comparados através da curva

ROC, mostrou uma pequena diferença entre eles, porém sem significância

estatística.

3 - A confiabilidade foi excelente nos três sistemas reveladores.

4 - A utilização do revelador TMB como escolha para sua implementação no

ensaio imunoenzimático para o diagnóstico da LTA no Serviço de Parasitologia

deve-se ao fato de ser estável, não mutagênico ou carcinogênico e de fácil

manipulação.

8. REFERÊNCIAS

Allain, D. S. and Kagan, I. G. 1975. A direct agglutination test for leishmaniasis.

Am J Trop Med Hyg, 24 (2): 232-6.

Almeida Filho, N. and Rouquaryol, M. Z. 2002. Introdução à Epidemiologia. 3ª

ed. Rio de Janeiro: Medsi.

Anthony, R. L., Christensen, H. A. and Johnson, C. M. 1980. Micro enzyme-

linked immunosorbent assay (ELISA) for the serodiagnosis of New World

leishmaniasis. Am J Trop Med Hyg, 29 (2): 190-4.

Antunes, L. J., Reis, A. P., Pereira Tavares, C. A. and Pellegrino, J. 1972.

Determination of immunoglobulins and passive hemagglutination reaction in

patients with mucocutaneous leishmaniasis. Rev Inst Med Trop Sao Paulo, 14

(3): 203-6.

Araujo, F. G. and Mayrink, W. 1968. Fluorescent antibody test in visceral

leishmaniasis. II. Studies on the specificity of the test. Rev Inst Med Trop Sao

Paulo, 10 (1): 41-5.

Avrameas, S. 1992. Amplification systems in immunoenzymatic techniques. J

Immunol Methods, 150 (1-2): 23-32.

Avrameas, S. and Guilbert, B. 1971. A method for quantitative determination of

cellular immunoglobulins by enzyme-labeled antibodies. Eur J Immunol, 1 (5):

394-6.

Badaro, R., Reed, S. G. and Carvalho, E. M. 1983. Immunofluorescent antibody

test in American visceral leishmaniasis: sensitivity and specificity of different

morphological forms of two Leishmania species. Am J Trop Med Hyg, 32 (3):

480-4.

Barral-Netto, M., Badaro, R., Barral, A. and Carvalho, E. M. 1986. Immunology

of cutaneous leishmaniasis. Rev Soc Bras Med Trop, 19 (3): 173-91.

Barros, M. B. L., Schubach, A., Francesconi-do-Valle, A. C., Gutierrez-

Galhardo, M. C., Schubach, T. M., Conceição-Silva, F., Salgueiro, M. M.,

Mouta-Confort, E., Reis, R. S., Madeira, M. F., Cuzzi, T., Quintella, L. P., Silva

Passos, J. P., Conceição, M. J. and Marzochi, M. C. A. 2005. Positive

Montenegro skin test among patients with sporotrichosis in Rio De Janeiro. Acta

Trop, 93 (1): 41-7.

Barros, M. B. L., Schubach, A. O., Francesconi-do-Valle, A. C., Gutierrez-

Galhardo, M. C., Conceição-Silva, F., Schubach, T. M., Reis, R. S., Wanke, B.,

Marzochi, K. B. and Conceição, M. J. 2004. Cat-transmitted sporotrichosis

epidemic in Rio de Janeiro, Brazil: description of a series of cases. Clin Infect

Dis, 38 (4): 529-35.

Barros, M. B. L., Schubach, T. M. P., Gutierrez-Galhardo, M. C., Schubach, A.

O., Monteiro, P. C., Reis, R. S., Zancopé-Oliveira, R. M., Lazera, M. S., Cuzzi-

Maya, T., Blanco, T. C., Marzochi, K. B., Wanke, B. and Francesconi-do-Valle,

A. C. 2001. Sporotrichosis: an emergent zoonosis in Rio de Janeiro. Mem Inst

Oswaldo Cruz, 96 (6): 777-9.

Barroso-Freitas, A. P. T. 2006. Avaliação da reação imunoenzimática (ELISA) e

imunofluorescência indireta (IFI) para o diagnóstico da leishmaniose

tegumentar americana [Mestrado]. Rio de Janeiro: Fundação Oswaldo Cruz.

Behforuz, N., Rezai, H. R. and Gettner, S. 1976. Application of

immunofluorescence for detection of antibody in Leishmania infection. Ann.

Trop. Med. Parasitol, 70: 293-301.

Bettini, S., Pampiglione, S. and Maroli, M. 1977. Studies on Mediterranean

leishmaniasis. V. A preliminary epidemiological survey of human leishmaniasis

in Tuscany. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 71 (73).

Blais, B. W., Leggate, J., Bosley, J. and Martinez-Perez, A. 2004. Comparison

of fluorogenic and chromogenic assay systems in the detection of Escherichia

coli O157 by a novel polymyxin-based ELISA. Lett Appl Microbiol, 39 (6): 516-

22.

Bos, E. S., Van der Doelen, A. A., Van Rooy, N. and Schuurs, A. H. 1981.

3,3',5,5' - Tetramethylbenzidine as an Ames test negative chromogen for horse-

radish peroxidase in enzyme-immunoassay. J Immunoassay, 2 (3-4): 187-204.

Bossuyt, P. M., Reitsma, J. B., Bruns, D. E., Gatsonis, C. A., Glasziou, P. P.,

Irwig, L. M., Lijmer, J. G., Moher, D., Rennie, D. and de Vet, H. C. 2003.

Towards complete and accurate reporting of studies of diagnostic accuracy: the

STARD initiative. Standards for Reporting of Diagnostic Accuracy. Clin Chem,

49 (1): 1-6.

Bouvier, J., Etges, R. J. and Bordier, C. 1985. Identification and purification of

membrane and soluble forms of the major surface protein of Leishmania

promastigotes. J Biol Chem, 260 (29): 15504-9.

Bovaird, J.H., Ngo, T.T. and Lenhoff, H.M. 1982. Optimizing the o-

phenylenediamine assay for horseradish peroxidase: effects of phosphate and

pH, substrate and enzyme concentrations, and stopping reagents. Clin Chem,

28(12): 2423-6.

Braga, M. D., Coelho, I. C., Pompeu, M. M., Evans, T. G., MacAullife, I. T.,

Teixeira, M. J. and Lima, J. W. 1998. Control of canine visceral leishmaniasis:

comparison of results from a rapid elimination program of serum-reactive dogs

using an immunoenzyme assay and slower elimination of serum-reactive dogs

using filter paper elution indirect immunofluorescence. Rev Soc Bras Med Trop,

31 (5): 419-24.

Bray, R. S. and Lainson, R. 1966. The immunology and serology of

leishmanisis. IV. Results of Ouchterlony double diffusion tests. Trans R Soc

Trop Med Hyg, 60 (5): 605-9.

Bray, R. S. and Lainson, R. 1967. Studies on the immunology and serology of

leishmaniasis. V. The use of particles as vehicles in passive agglutination tests.

Trans R Soc Trop Med Hyg, 61 (4): 490-505.

Brito, M. E., Mendonça, M. G., Gomes, Y. M., Jardim, M. L. and Abath, F. G.

2000. Identification of potentially diagnostic Leishmania braziliensis antigens in

human cutaneous leishmaniasis by immunoblot analysis. Clin Diagn Lab

Immunol, 7 (2): 318-21.

Bruijn, M. H. and Barker, D. C. 1992. Diagnosis of New World leishmaniasis:

specific detection of species of the Leishmania braziliensis complex by

amplification of kinetoplast DNA. Acta Trop, 52 (1): 45-58.

Bryceson, A. D. 1970. Immunological aspects of clinical leishmaniasis. Proc R

Soc Med, 63 (10): 1056-60.

Camargo, M. E. and Rebonato, C. 1969. Cross-reactivity in fluorescence tests

for Trypanosoma and Leishmania antibodies. A simple inhibition procedure to

ensure specific results. Am J Trop Med Hyg, 18 (4): 500-5.

Carvalho, E. M., Correia Filho, D., Bacellar, O., Almeida, R. P., Lessa, H. and

Rocha, H. 1995. Characterization of the immune response in subjects with self-

healing cutaneous leishmaniasis. Am J Trop Med Hyg, 53 (3): 273-7.

Cascio, G., Purpura, A. and Prilosi, A. 1963. Test dell'emoagglutinazione

condizionata per la recerca della agglutinin anti-Leishmania. Peditria (Napoles),

71: 251.

Celeste, B. J., Angel, S. O., Castro, L. G., Gidlund, M. and Goto, H. 2004.

Leishmania infantum heat shock protein 83 for the serodiagnosis of

tegumentary leishmaniasis. Braz J Med Biol Res, 37 (11): 1591-3.

Chaffee, E. F. In: Proc. VII Int. Congr. Trop. Med. Malaria; 1963; Rio de Janeiro;

1963. p. 309.

Chiari, C. A., Mayrink, W. and Magalhães, P. A. 1973. Indirect

immunofluorescent reaction in the control and treatment of American cutaneous

leishmaniasis. Rev Inst Med Trop Sao Paulo, 15 (5): 298-303.

Convit, J. and Pinardi, M. E. 1969. Applying the indirect immunofluorescency

test to the study of American cutaneous leishmaniasis. Dermatol Int, 8 (1): 17-

20.

Costa, J. M., Netto, E. M., Vale, K. C., Osaki, N. K., Tada, M. S. and Marsden,

P. D. 1987. Spontaneous healing of cutaneous Leishmania braziliensis

braziliensis ulcers. Trans R Soc Trop Med Hyg, 81 (4): 606.

Coutinho, S. G., C., P., Mendonça, S. C. F., Conceição-Silva, F. and Dórea, R.

C. C. 1987. Pathogenesis and immunopathology of leishmaniasis. Mem Inst

Oswaldo Cruz, 82: 214-228.

Coutinho, S. G., Da-Cruz, A. M., Bertho, A. L., Santiago, M. A. and De-Luca, P.

1998. Immunologic patterns associated with cure in human American

cutaneous leishmaniasis. Braz J Med Biol Res, 31 (1): 139-42.

Coutinho, S. G., Pirmez, C. and Da-Cruz, A. M. 2002. Parasitological and

immunological follow-up of American tegumentary leishmaniasis patients. Trans

R Soc Trop Med Hyg, 96 Suppl 1: S173-8.

Crowther, J. R., Angarita, L. and Anderson, J. 1990. Evaluation of the use of

chromogenic and fluorogenic substrates in solid-phase enzyme linked

immunosorbent assays (ELISA). Biologicals, 18 (4): 331-6.

Desjeux, P. 1996. Leishmaniasis. Public health aspects and control. Clin

Dermatol, 14 (5): 417-23.

Dias, M., Mayrink, W., Deane, L. M., da Costa, C. A., Magalhães, P. A., Melo,

M. N., Batista, S. M., Araujo, F. G., Coelho, M. V. and Williams, P. 1977.

Epidemiology of mucocutaneous leishmaniasis Americana. I. Study of

reservoirs in an endemic region of the State of Minas Gerais. Rev Inst Med Trop

Sao Paulo, 19 (6): 403-10.

Engvall, E. and Perlmann, P. 1972. Enzyme-linked immunosorbent assay,

Elisa. 3. Quantitation of specific antibodies by enzyme-labeled anti-

immunoglobulin in antigen-coated tubes. J Immunol, 109 (1): 129-35.

Fagundes, A., Marzochi, K. B. and Marzochi, M. C. 2003. Immediate and

generalized reaction to Montenegro skin test. Rev Soc Bras Med Trop, 36 (3):

413-4.

Fernley, H.N. and Walker, P.G. 1965. Kinetic Behaviour of Calf-Intestinal

Alkaline Phosphatase with 4-Methylumbelliferyl Phosphate. Biochem. J., 97:95-

103.

Fletcher, R. H., Fletcher, S. W. and Wagner, E. H. 1996. Epidemiologia Clínica:

Elementos Essenciais. 3ª ed. Porto Alegre: Artmed.

Frey, A., Meckelein, B., Externest, D. and Schmidt, M. A. 2000. A stable and

highly sensitive 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine-based substrate reagent for

enzyme-linked immunosorbent assays. J Immunol Methods, 233 (1-2): 47-56.

Furtado, T. 1972. Diagnóstico Laboratorial da Leishmaniose Tegumentar

Americana. Anais Brasileiros de Dermatologia, 47: 211-228.

Furtado, T. 1980. Critérios para diagnóstico da LTA. Anais Brasileiros de

Dermatologia, 65: 51-86.

Garham, P. 1971. The genus Leishmania. Bull. Org. Mond. Santé, 44: 477-491.

Gee, K. R., Sun, W. C., Bhalgat, M. K., Upson, R. H., Klaubert, D. H., Latham,

K. A. and Haugland, R. P. 1999. Fluorogenic substrates based on fluorinated

umbelliferones for continuous assays of phosphatases and beta-

galactosidases. Anal Biochem, 273 (1): 41-8.

Gonçalves, C. C., Reiche, E. M., Abreu Filho, B. A., Silveira, T. G., Felizardo, T.

C., Maia, K. R., Costacurta, R., Padovesi, E. J., Dias Filho, B. P., Jankevicius,

S. I. and Jankevicius, J. V. 2002. Evaluation of antigens from various

Leishmania species in a Western blot for diagnosis of American tegumentary

leishmaniasis. Am J Trop Med Hyg, 66 (1): 91-102.

Gontijo, B. and Carvalho, M. L. 2003. American cutaneous leishmaniasis. Rev

Soc Bras Med Trop, 36 (1): 71-80.

Gontijo, C. M. F. and Melo, M. N. 2004. Leishmaniose Visceral no Brasil:

quadro atual, desafios e perspectivas. Revista Brasileira de Epidemiologia, 7

(3): 338-349.

Grimaldi, G., Jr. and McMahan-Pratt, D. 1991. Leishmaniasis and its etiologic

agents in the New World: an overview. Prog Clin Parasitol, 2: 73-118.

Guimarães, M. C., Celeste, B. J., Corrales, E. M. and Antunes, C. M. 1991.

Comparison on the performance of Leishmania major-like and Leishmania

braziliensis braziliensis as antigen for New World leishmaniasis IgG-

immunofluorescence test. Rev Inst Med Trop Sao Paulo, 33 (6): 503-8.

Guimarães, M. C., Celeste, B. J. and Franco, E. L. 1990. Diagnostic

performance indices for immunofluorescent tests and enzyme immunoassays of

leishmaniasis sera from northern and north-eastern Brazil. Bull World Health

Organ, 68 (1): 39-43.

Guimarães, M. C., Celeste, B. J., Franco, E. L., Cuce, L. C. and Belda, W., Jr.

1989. Evaluation of serological diagnostic indices for mucocutaneous

leishmaniasis: immunofluorescence tests and enzyme-linked immunoassays for

IgG, IgM and IgA antibodies. Bull World Health Organ, 67 (6): 643-8.

Guimarães, M. C., Giovannini, V. L. and Camargo, M. E. 1974. Antigenic

standardization for mucocutaneous leishmaniasis immunofluorescence test.

Rev Inst Med Trop Sao Paulo, 16 (3): 145-8.

Harith, A. E., Kolk, A. H., Kager, P. A., Leeuwenburg, J., Faber, F. J., Muigai,

R., Kiugu, S. and Laarman, J. J. 1987. Evaluation of a newly developed direct

agglutination test (DAT) for serodiagnosis and sero-epidemiological studies of

visceral leishmaniasis: comparison with IFAT and ELISA. Trans R Soc Trop

Med Hyg, 81 (4): 603-6.

Hommel, M., Peters, W., Ranque, J., Quilici, M. and Lanotte, G. 1978. The

micro-ELISA technique in the serodiagnosis of visceral leishmaniasis. Ann Trop

Med Parasitol, 72 (3): 213-18.

Ishikawa, E. 1973. Enzyme immunoassay of insulin by fluorimetry of the insulin-

glucoamylase complex. J Biochem (Tokyo), 73 (6): 1319-21.

Junqueira Pedras, M., Orsini, M., Castro, M., Passos, V. M. and Rabello, A.

2003. Antibody subclass profile against Leishmania braziliensis and Leishmania

amazonensis in the diagnosis and follow-up of mucosal leishmaniasis. Diagn

Microbiol Infect Dis, 47 (3): 477-85.

Kar, K. 1995. Serodiagnosis of leishmaniasis. Crit Rev Microbiol, 21 (2): 123-52.

Killick-Kendrick, R. 1990a. The life-cycle of Leishmania in the sandfly with

special reference to the form infective to the vertebrate host. Ann Parasitol Hum

Comp, 65 Suppl 1: 37-42.

Killick-Kendrick, R. 1990b. Phlebotomine vectors of the leishmaniases: a

review. Med Vet Entomol, 4 (1): 1-24.

Labrousse, H., Guesdon, J. L., Ragimbeau, J. and Avrameas, S. 1982.

Miniaturization of beta-galactosidase immunoassays using chromogenic and

fluorogenic substrates. J Immunol Methods, 48 (2): 133-47.

Lainson, R., Ryan, L. and Shaw, J. J. 1987a. Infective stages of Leishmania in

the sandfly vector and some observations on the mechanism of transmission.

Mem Inst Oswaldo Cruz, 82 (3): 421-4.

Lainson, R., Shaw, J. J. and Silveira, F. T. 1987b. Dermal and visceral

leishmaniasis and their causative agents. Trans R Soc Trop Med Hyg, 81 (4):

702-3.

Leontides, L. S., Saridomichelakis, M. N., Billinis, C., Kontos, V., Koutinas, A.

F., Galatos, A. D. and Mylonakis, M. E. 2002. A cross-sectional study of

Leishmania spp. infection in clinically healthy dogs with polymerase chain

reaction and serology in Greece. Vet Parasitol, 109 (1-2): 19-27.

Lopez, M., Inga, R., Cangalaya, M., Echevarria, J., Llanos-Cuentas, A., Orrego,

C. and Arevalo, J. 1993a. Diagnosis of Leishmania using the polymerase chain

reaction: a simplified procedure for field work. Am J Trop Med Hyg, 49 (3): 348-

56.

Lopez, M., Inga, R., Cueva, N., Alvarez, E. and Arevalo, J. 1993b. PCR: a tool

for diagnosis of American tegumentary leishmaniasis in a health post of rural

endemic areas. Arch Inst Pasteur Tunis, 70 (3-4): 499-504.

Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. and Randall, R. J. 1951. Protein

measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem, 193 (1): 265-75.

Magalhães, A. V., Moraes, M. A., Raick, A. N., Llanos-Cuentas, A., Costa, J.

M., Cuba, C. C. and Marsden, P. D. 1986. Histopathology of tegumentary

leishmaniasis caused by Leishmania braziliensis braziliensis. 3. Cellular

reactions in tissues. Rev Inst Med Trop Sao Paulo, 28 (5): 300-11.

Manuel, J. and Behin, R. Leishmaniasis: immunity, immunopathology and

immunodiagnosis. In: Immunology of Parasitic Infections. Boston: Blackwell

Scientific; 1982. p. 299.

Marsden, P. D. 1985. Clinical presentations of Leishmania braziliensis

braziliensis. Parasitol Today, 1 (5): 129-33.

Marsden, P. D., Netto, E. M., Badaro, R., Cuba, C. A., Costa, J. L. and Barreto,

A. C. 1986. Apparent cure of a difficult treatment problem in a patient with

mucosal leishmaniasis. Am J Trop Med Hyg, 35 (2): 449.

Marsden, P. D. and Nonato, R. R. 1975. Mucocutaneous leishmaniasis: review

of clinical aspects. Rev Soc Bras Med Trop, 10: 309-326.

Marzochi, K. B., Marzochi, M. A., Silva, A. F., Grativol, N., Duarte, R., Confort,

E. M. and Modabber, F. 1998. Phase 1 study of an inactivated vaccine against

American tegumentary leishmaniasis in normal volunteers in Brazil. Mem Inst

Oswaldo Cruz, 93 (2): 205-12.

Marzochi, M. C. and Marzochi, K. B. 1994. Tegumentary and visceral

leishmaniases in Brazil: emerging anthropozoonosis and possibilities for their

control. Cad Saúde Publica, 10 Suppl 2: 359-75.

Melo, M. N. 1981. Cultivation of Leishmania in chemically defined media. Trans

R Soc Trop Med Hyg, 75 (5): 756.

Meredith, S. E., Zijlstra, E. E., Schoone, G. J., Kroon, C. C., van Eys, G. J.,

Schaeffer, K. U., el-Hassan, A. M. and Lawyer, P. G. 1993. Development and

application of the polymerase chain reaction for the detection and identification

of Leishmania parasites in clinical material. Arch Inst Pasteur Tunis, 70 (3-4):

419-31.

Milon, G., Del Giudice, G. and Louis, J. A. 1995. Immunobiology of

experimental cutaneous leishmaniasis. Parasitol Today, 11 (7): 244-7.

Ministério da Saúde. 2007. Manual de Vigilância da Leishmaniose Tegumentar

Americana. 2ª ed., Brasília: Editora do Ministério da Saúde, 182 p. (Série A.

Normas e Manuais Técnicos)

Ministério da Saúde. 2006. Atlas de Leishmaniose Tegumentar Americana -

Diagnósticos Clínico e Diferencial. 2ª ed., Brasília: Editora do Ministério da

Saúde, 136 p. (Série A. Normas e Manuais Técnicos)

Mitchell, G. F., Curtis, J. M., Handman, E. and McKenzie, I. F. 1980. Cutaneous

leishmaniasis in mice: disease patterns in reconstituted nude mice of several

genotypes infected with Leishmania tropica. Aust J Exp Biol Med Sci, 58 (5):

521-32.

Montenegro, J. 1926. Cutaneous reaction in leishmaniasis. Archives of

dermatology and Syphiology, 13: 187.

Moses, A. 1919. De fixaca do complemento na leishmaniose tegumentar. Bras.

Med., 33 (107).

Mosleh, I. M., Saliba, E. K., al-Khateeb, M. S., Bisharat, Z., Oumeish, O. Y. and

Bitar, W. 1995. Serodiagnosis of cutaneous leishmaniasis in Jordan using

indirect fluorescent antibody test and the enzyme-linked immunosorbent assay.

Acta Trop, 59 (2): 163-72.

Nascimento, L. D., Schubach, A. O., Freitas, A. P. T. B., Madeira, M. F., Duarte,

R., Marzochi, M. C. A. and Confort, E. M. 2003. Análise retrospectiva de ELISA

com antígenos de L. major e L. braziliensis em soros de pacientes com

leishmaniose tegumentar americana (LTA) do Estado do Rio de Janeiro. Anais

do XVIII Congresso Brasileiro de Parasitologia: 58.

Oddo, F. G. and Cascio, G. 1963. The Immuno-Fluorescence Test in Visceral

and Cutaneous Leishmaniasis. Riv Ist Sieroter Ital, 38: 139-45.

Oliveira, C. I., Bafica, A., Oliveira, F., Favali, C. B., Correa, T., Freitas, L. A.,

Nascimento, E., Costa, J. M. and Barral, A. 2003. Clinical utility of polymerase

chain reaction-based detection of Leishmania in the diagnosis of American

cutaneous leishmaniasis. Clin Infect Dis, 37 (11): e149-53.

Oliveira-Neto, M. P., Mattos, M., Souza, C. S., Fernandes, O. and Pirmez, C.

1998. Leishmaniasis recidiva cutis in New World cutaneous leishmaniasis. Int J

Dermatol, 37 (11): 846-9.

Oliveira-Neto, M. P., Mattos, M. S., Perez, M. A., Da-Cruz, A. M., Fernandes,

O., Moreira, J., Goncalves-Costa, S. C., Brahin, L. R., Menezes, C. R. and

Pirmez, C. 2000. American tegumentary leishmaniasis (ATL) in Rio de Janeiro

State, Brazil: main clinical and epidemiologic characteristics. Int J Dermatol, 39

(7): 506-14.

Oliveira-Neto, M. P., Pirmez, C., Rangel, E., Schubach, A. and Grimaldi Junior,

G. 1988. An outbreak of American cutaneous leishmaniasis (Leishmania

braziliensis braziliensis) in a periurban area of Rio de Janeiro city, Brazil: clinical

and epidemiological studies. Mem Inst Oswaldo Cruz, 83 (4): 427-35.

O'Neil, C. E., Labrada, M. and Saravia, N. G. 1993. Leishmania (Viannia)

panamensis-specific IgE and IgA antibodies in relation to expression of human

tegumentary leishmaniasis. Am J Trop Med Hyg, 49 (2): 181-8.

OPAS. 1997. Métodos de investigação epidemiológica em doenças

transmissíveis. 1ª ed. Brasília: Organização Pan-Americana de Saúde e

Fundação Nacional de Saúde.

Pampiglione, S., La Placa, M. and Schlick, C. 1974. Studies on Mediterranean

leishmaniasis. I. An outbreak of visceral leishmaniasis in northern Italy. Trans.

R. Soc. Trop. Med. Hyg., 68 (349).

Pappas, M. G., Hajkowski, R. and Hockmeyer, W. T. 1983. Dot enzyme-linked

immunosorbent assay (Dot-ELISA): a micro technique for the rapid diagnosis of

visceral leishmaniasis. J Immunol Methods, 64 (1-2): 205-14.

Paranhos-Silva, M., Freitas, L. A., Santos, W. C., Grimaldi, G. J., Pontes-de-

Carvalho, L. C. and Oliveira-dos-Santos, A. J. 1996. A cross-sectional

serodiagnostic survey of canine leishmaniasis due to Leishmania chagasi. Am J

Trop Med Hyg, 55 (1): 39-44.

Paranhos-Silva, M., Pontes-de-Carvalho, L. C., Sá Oliveira, G. G., Nascimento,

E. G. and dos-Santos, W. L. 2001. Skin reactions to thimerosal and Leishmania

in dogs from a leishmaniasis endemic area: it is better to keep them apart. Mem

Inst Oswaldo Cruz, 96 (5): 679-81.

Pessôa, S. B. and Barretto, M. P. 1948. Leishmaniose Tegumentar Americana:

Ministério da Educação e Saúde.

Pirmez, C., da Silva Trajano, V., Oliveira-Neto, M. P., da-Cruz, A. M.,

Goncalves-da-Costa, S. C., Catanho, M., Degrave, W. and Fernandes, O. 1999.

Use of PCR in diagnosis of human american tegumentary leishmaniasis in Rio

de Janeiro, Brazil. J Clin Microbiol, 37 (6): 1819-23.

Porstmann, T. and Kiessig, S. T. 1992. Enzyme immunoassay techniques. An

overview. J Immunol Methods, 150 (1-2): 5-21.

Rakhmanova, V. A. and MacDonald, R. C. 1998. A microplate fluorimetric assay

for transfection of the beta-galactosidase reporter gene. Anal Biochem, 257 (2):

234-7.

Rey-Ladino, J. A., Joshi, P. B., Singh, B., Gupta, R. and Reiner, N. E. 1997.

Leishmania major: molecular cloning, sequencing, and expression of the heat

shock protein 60 gene reveals unique carboxy terminal peptide sequences. Exp

Parasitol, 85 (3): 249-63.

Roberts, I. M., Jones, S. L., Premier, R. R. and Cox, J. C. 1991. A comparison

of the sensitivity and specificity of enzyme immunoassays and time-resolved

fluoroimmunoassay. J Immunol Methods, 143 (1): 49-56.

Rocha, P. N., Almeida, R. P., Bacellar, O., Jesus, A. R., Filho, D. C., Filho, A.

C., Barral, A., Coffman, R. L. and Carvalho, E. M. 1999. Down-regulation of Th1

type of response in early human American cutaneous leishmaniasis. J Infect

Dis, 180 (5): 1731-4.

Roffi, J., Dedet, J. P., Desjeux, P. and Garre, M. T. 1980. Detection of

circulating antibodies in cutaneous leishmaniasis by enzyme-linked

immunosorbent assay (ELISA). Am J Trop Med Hyg, 29 (2): 183-9.

Saha, S., Mazumdar, T., Anam, K., Ravindran, R., Bairagi, B., Saha, B.,

Goswami, R., Pramanik, N., Guha, S. K., Kar, S., Banerjee, D. and Ali, N. 2005.

Leishmania promastigote membrane antigen-based enzyme-linked

immunosorbent assay and immunoblotting for differential diagnosis of Indian

post-kala-azar dermal leishmaniasis. J Clin Microbiol, 43 (3): 1269-77.

Saravia, N. G., Valderrama, L., Labrada, M., Holguin, A. F., Navas, C., Palma,

G. and Weigle, K. A. 1989. The relationship of Leishmania braziliensis

subspecies and immune response to disease expression in New World

leishmaniasis. J Infect Dis, 159 (4): 725-35.

Schubach, A., Marzochi, M. C., Cuzzi-Maya, T., Oliveira, A. V., Araujo, M. L.,

Oliveira, A. L., Pacheco, R. S., Momen, H., Conceição-Silva, F., Coutinho, S. G.

and Marzochi, K. B. 1998. Cutaneous scars in American tegumentary

leishmaniasis patients: a site of Leishmania (Viannia) braziliensis persistence

and viability eleven years after antimonial therapy and clinical cure. Am J Trop

Med Hyg, 58 (6): 824-7.

Shalev, A., Greenberg, A. H. and McAlpine, P. J. 1980. Detection of attograms

of antigen by a high-sensitivity enzyme-linked immunoabsorbent assay (HS-

ELISA) using a fluorogenic substrate. J Immunol Methods, 38 (1-2): 125-39.

Shamsuzzaman, S. M., Furuya, M., Korenaga, M., Imamura, K. and Hashiguchi,

Y. 1999. Use of urine samples from healthy humans, nephritis patients or other

animals as an alternative to foetal calf serum in the culture of Leishmania (L.)

donovani in vitro. Ann Trop Med Parasitol, 93 (6): 613-20.

Shannon, L.M., Kay, E. and Lew, J.Y. 1966. Peroxidase isozymes from

horseradish roots. I. Isolation and physical properties. J Biol Chem., 241(9):

2166-72.

Shaw, J. J. and Lainson, R. 1975. Leishmaniasis in Brazil: X. Some

observations of intradermal reactions to different trypanosomatid antigens of

patients suffering from cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Trans R

Soc Trop Med Hyg, 69 (3): 323-35.

Shaw, J. J. and Voller, A. 1964. The detection of circulating antibody to Kala-

Azar by means of immunofluorescent techniques. Trans R Soc Trop Med Hyg,

58: 349-52.

Shekarchi, I. C., Sever, J. L., Nerurkar, L. and Fuccillo, D. 1985. Comparison of

enzyme-linked immunosorbent assay with enzyme-linked fluorescence assay

with automated readers for detection of rubella virus antibody and herpes

simplex virus. J Clin Microbiol, 21 (1): 92-6.

Silveira, T. G., Arraes, S. M., Bertolini, D. A., Teodoro, U., Lonardoni, M. V.,

Roberto, A. C., Ramos, M., Nerilo Sobrinho, A., Ishikawa, E. and Shaw, J.

1999. The laboratory diagnosis and epidemiology of cutaneous leishmaniasis in

Parana State, southern Brazil. Rev Soc Bras Med Trop, 32 (4): 413-23.

Souza, W. J., Coutinho, S. G., Marzochi, M. C., Toledo, L. M. and Gottlieb, M.

V. 1982. Use of the indirect immunofluorescence test in the therapeutic follow-

up of cutaneous leishmaniasis americana. Mem Inst Oswaldo Cruz, 77 (3): 247-

53.

Souza, W. J., Santos, J. R., Medeiros, S. M., Schubach, A., Da-Cruz, A. M. and

Coutinho, S. G. 1998. Leishmanioses: Reação de imunofluorescência indireta

para pesquisa de anticorpos IgM em frações de soros separadas por

cromatografia de gel filtração. Jornal Brasileiro de Patologia, 34: 280-285.

Teixeira, A. R. and Vexenat, A. C. 1996. The true significance of serological

exams in the diagnosis of endemic diseases. Rev Soc Bras Med Trop, 29 (4):

379-82.

Uliana, S. R., Nelson, K., Beverley, S. M., Camargo, E. P. and Floeter-Winter,

L. M. 1994. Discrimination amongst Leishmania by polymerase chain reaction

and hybridization with small subunit ribosomal DNA derived oligonucleotides. J

Eukaryot Microbiol, 41 (4): 324-30.

Ulrich, M., Rodriguez, V., Centeno, M. and Convit, J. 1995. Differing antibody

IgG isotypes in the polar forms of leprosy and cutaneous leishmaniasis

characterized by antigen-specific T cell anergy. Clin Exp Immunol, 100 (1): 54-

Voller, A., Bidwell, D. E. and Bartlett, A. 1976. Enzyme immunoassays in

diagnostic medicine. Theory and practice. Bull World Health Organ, 53 (1): 55-

65.

Voogd, C. E., Van der Stel, J. J. and Jacobs, J. J. 1980. On the mutagenic

action of some enzyme immunoassay substrates. J Immunol Methods, 36 (1):

55-61.

Walton, B. C. 1980. Evaluation of chemotherapy of American leishmaniasis by

the indirect fluorescent antibody test. Am J Trop Med Hyg, 29 (5): 747-52.

Weigle, K. and Saravia, N. G. 1996. Natural history, clinical evolution, and the

host-parasite interaction in New World cutaneous Leishmaniasis. Clin Dermatol,

14 (5): 433-50.

Weigle, K. A., Labrada, L. A., Lozano, C., Santrich, C. and Barker, D. C. 2002.

PCR-based diagnosis of acute and chronic cutaneous leishmaniasis caused by

Leishmania (Viannia). J Clin Microbiol, 40 (2): 601-6.

World Health Organization. 1998. Leishmania and HIV in Gridlock. World Health

Organ and Joint United Nations Programme on HIV/AIDS: 27.

Zweig, M. H. and Campbell, G. 1993. Receiver-operating characteristic (ROC)

plots: a fundamental evaluation tool in clinical medicine. Clin Chem, 39 (4): 561-

77.

9. ANEXOS

Anexo 1 - Protocolo de Atendimento Clínico do Projeto “Estudo para a

sistematização do atendimento de pacientes com Leishmaniose Tegumentar

Americana no Centro de Referência em LTA - Instituto de Pesquisa Clínica

Evandro Chagas - Fiocruz”, CEP/IPEC nº 0016.0.009-02.

Centro de Referência em Leishmaniose Tegumentar Americana

Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas – Fiocruz

Rotina para o atendimento de pacientes

Critério Clínico para encaminhamento de pacientes para o IPEC

Paciente proveniente de área endêmica ou suspeita; apresentando lesão

cutânea ulcerosa ou tuberosa, única ou múltipla, com evolução superior a 30

dias; com ou sem adenopatia associada e reação de Montenegro positiva

(superior a 5 mm de enduração).

Outros pacientes provenientes de área endêmica, porém, de difícil

diagnóstico: apresentando lesões sugestivas e reação de Montenegro negativa;

adenomegalia localizada sem lesão cutânea; má resposta ou recidiva após um

primeiro tratamento para LTA.

Rotina para Diagnóstico Clínico-Laboratorial (pré-tratamento)

Avaliação clínica e dermatológica: Exame clínico geral e exame

dermatológico com descrição e documentação fotográfica ou filmagem das

lesões.

Avaliação otorrinolaringológica: Realizada com fibra ótica, para descrição e

documentação fotográfica ou filmagem das lesões.

Sangue:

Resposta linfoproliferativa a antígenos de Leishmania e S. schenckii "in vitro"

Reação em cadeia da polimerase (PCR) para Leishmania

Sorologias para LTA, VDRL, paracoccidioidomicose, histoplasmose,

esporotricose

Eletroforese de hemoglobina (úlceras de perna)

Hemograma

Bioquímica: glicose, uréia, creatinina, TGO, TGP, fosfatase alcalina, gama GT,

amilase, lipase

Coagulograma (pacientes com indicação de biópsia mucosa)

Eletrocardiograma (ECG)

Reações intradérmicas: PPD, esporotriquina e Montenegro (nos casos

negativos inicialmente)

Utiliza-se a leishmanina produzida por Biomanguinhos – Fiocruz, contendo 40

µg de nitrogênio protéico por mililitro e fenol 0,4% como conservante. Após

assepsia local com álcool 70

, injeta-se 0,1 mL de antígeno por via intradérmica

na face anterior do antebraço. O grau de resposta cutânea é medido 48 horas

após a injeção. A enduração é marcada com caneta esferográfica, medida em

milímetros, decalcada em papel umedecido e arquivada no prontuário do

paciente. Uma enduração de 5 mm ou mais em seu maior diâmetro é

considerada positiva.

Aspirado do bordo da lesão cutânea e / ou de gânglio periférico:

Direto no tubo a vácuo (cultura para Leishmania)

Após injeção de 0,1 mL de salina estéril (com antibiótico) 0,9% no tubo à vácuo

(cultura para Leishmania)

Biópsia cutânea e/ou mucosa e / ou de gânglio periférico:

Formol (histopatologia e imunohistoquímica)

Solução salina estéril (cultura para fungos e micobactéria)

Solução salina estéril com antibiótico (cultura para Leishmania)

Imprint em lâmina de vidro

Congelação a –70

C (imunopatologia e reação em cadeia da polimerase -

PCR)

Radiografia do tórax e dos seios da face: direcionados pela história e/ou

exame clínico (rotina apenas nos casos mucosos)

Outros exames: direcionados pela história e/ou exame clínico

Tratamento Padrão

Medidas Gerais:

Tratamentos para outras doenças concomitantes como hipertensão arterial,

diabetes etc. deverão, preferencialmente, ser iniciados antes ou durante a

investigação diagnóstica, a fim de se iniciar o tratamento específico com o

paciente o mais compensado possível.

A infecção secundária deverá ser tratada com cuidados locais (água, sabão

de coco e anti-sépticos) e, se necessário, antibióticos orais, pelo menos, na

semana que anteceder à biópsia de pele, a fim de diminuir a contaminação

bacteriana das culturas para Leishmania.

No caso da presença de crostas e obstrução nasal, as cavidades nasais

deverão ser instiladas com solução fisiológica de cloreto de sódio 0,9% por

várias vezes ao dia durante todo o período do acompanhamento, a fim de

possibilitar uma boa visualização das mucosas das cavidades nasais, assim

como o alívio sintomático do paciente.

Nos casos de lesões abaixo dos joelhos, o repouso com os membros

inferiores elevados durante o maior tempo possível, é um excelente método

terapêutico auxiliar.

Medidas específicas:

Em princípio, todos os pacientes deverão ser tratados, ambulatorialmente,

com antimoniato de N-metil-glucamina (Glucantime

) na dosagem de 5 mg

/kg/dia

IM. A administração EV, quando indicada para diminuir o

desconforto local, deverá ser realizada, de preferência, em ambiente hospitalar.

Pacientes idosos ou apresentando outras complicações clínicas, poderão ser

tratados em regime de internação ou de hospital-dia.

O antimoniato de N-metil-glucamina (antimoniato de meglumina) é

apresentado em ampolas de 5 mL contendo 1,5g de N-metil-glucamina,

equivalente a 405 mg de Sb

. Portanto, 5 mL correspondem a 405 mg de Sb

e cada mL a 81 mg de Sb

Os pacientes com a forma cutânea serão tratados inicialmente durante 30

dias. Caso seja indicado, o tratamento poderá ser prorrogado, na mesma

dosagem, por mais 10 a 30 dias consecutivos (ver acompanhamento clínico).

Os pacientes com a forma mucosa serão tratados por um mínimo de 30

dias, porém o tratamento será continuado, preferencialmente sem interrupção,

até a epitelização e/ou desinfiltração das mucosas.

Pacientes com lesões na laringe ou com extensas lesões nas vias aéreas e

digestivas superiores deverão ser internados a fim de prevenir a instalação de

um quadro de insuficiência respiratória por edema local, mais provável de

ocorrer nas primeiras 72 horas após início do tratamento. A profilaxia com

corticosteróides deverá ser iniciada antes da primeira dose do tratamento

específico. Utiliza-se hidrocortisona 100 mg EV 6/6h durante um mínimo de 24

horas e descontinuada durante os próximos dois dias,

Pacientes que necessitem interromper temporariamente o tratamento por

toxicidade, ao recomeçar, deverão dar seqüência ao tratamento a partir da

última dose administrada, como se não tivesse havido qualquer interrupção.

Os casos de lesões recidivantes e as possíveis evoluções para forma

mucosa (ver acompanhamento clínico), deverão ser retratadas, inicialmente,

com a mesma dosagem e pelo mesmo período que os pacientes virgens de

tratamento, porém se possível, em regime de internação ou hospital-dia.

Em caso de insucesso no segundo tratamento, avaliar a possibilidade de

utilização da dose de 10-20 mg Sb

/kg/dia

ou de outra droga como a

anfotericina B ou a pentamidina.

A anfotericina B deverá ser diluída em solução de glicose 5% a uma

concentração de 0,1 mg/mL (não utilizar soluções contendo eletrólitos). A

administração deve ser diária ou em dias alternados, por um período de 1 a 4

horas de infusão endovenosa. A dose inicial é de 0,3-0,5 mg/Kg/dia

aumentando-se progressivamente até 1 mg/Kg/dia, até alcançar a dose

Exemplo de cálculo de dose para um paciente de 60 kg:

5 mg Sb

/kg/dia = 300 mg Sb

/dia = 3,7 mL/dia, arredondando, = 3,5 mL/dia EV ou IM.

20 mg Sb

/kg/dia = 1200 mg Sb

/dia = 14,8 mL/dia, arredondando, = 15 mL/dia EV ou IM.

máxima diária de 50 mg. As doses totais recomendadas são de 1 a 1,5g para

LC e, de 2,5 a 3g para LM.

A Pentamidina pode ser encontrada sob a formulação de mesilato e de

isotionato, em frascos/ampolas contendo 300 mg. A formulação de isotionato

costuma ser melhor tolerado. A droga deve ser administrada após a

alimentação devido a sua ação hipoglicemiante. A dose habitual é de 2-4

mg/Kg, IM, em dias alternados durante 5 a 25 semanas, ou por período mais

prolongado se necessário. O Ministério da Saúde recomenda que a dose total

não ultrapasse 2g e alguns autores têm utilizado esquemas curtos com

sucesso.

Pacientes com uma ou duas lesões cutâneas, que por qualquer motivo

apresentem impossibilidade de receber medicação parenteral regular ou que

apresentem sinais de toxicidade importante à medicação sistêmica, poderão

ser submetidos a tratamento intralesional com N-metil-glucamina.

Rotina de Acompanhamento

Exames laboratoriais para monitorização da toxicidade:

Hemograma, glicose, uréia, creatinina, TGO, TGP, fosfatase alcalina, gama

GT, amilase, lipase e ECG deverão ser realizados durante o tratamento a cada

7, 10 ou 15 dias; imediatamente após o tratamento; e depois, apenas os

exames alterados, até a sua normalização. Em casos de alterações

persistentes ou rapidamente progressivas, recomenda-se a suspensão

temporária do tratamento até a normalização dos exames.

Para Anfotericina B acrescentar dosagens de Na e K e utilizar intervalos de

uma semana ou menos.

Ao utilizar-se a Pentamidina, a glicemia deve ser acompanhada

mensalmente durante 6 meses sempre que a dose total ultrapassar 1g.

Sorologias para LTA: Deverão ser realizadas em todas as consultas de

retorno.Quando as consultas forem realizadas em outros locais, o sangue

deverá ser centrifugado e o soro poderá ser transportado imediatamente em

isopor com gelo ou estocado congelado (preferencialmente a –20

C) e

posteriormente transportado em isopor com gelo para o laboratório.

Sorologia anti-HIV: Deverá ser solicitada nos casos de evolução aberrante

(lesões fora do padrão clínico usual, apresentando exuberância parasitária,

teste de Montenegro não reator etc.) e má resposta terapêutica.

Acompanhamento clínico

Casos cutâneos

Avaliação clínica e dermatológica:

Devem ser repetidas a cada 15, 10 ou 7 dias durante o tratamento, de

acordo com as condições clínicas do paciente, e no 30

dia.

Ao término do tratamento espera-se que as lesões estejam com

pouquíssima infiltração (não endurecidas à palpação) e epitelizadas (recoberta

por uma "pele fina"), embora mantenham algum eritema (cicatriz rósea).

Nos casos em que não ocorra epitelização das lesões (geralmente úlceras

localizadas abaixo dos joelhos), manter sem tratamento (apenas cuidados

locais) e reavaliar quinzenalmente. Caso não ocorra uma tendência

progressiva para a epitelização, reavaliar o diagnóstico (principalmente nos

casos sem comprovação parasitológica) e/ou a necessidade de repetir o

tratamento.

A partir da constatação da epitelização das lesões, os pacientes deverão ser

reavaliados após 1, 3, 6, 12 meses e então anualmente, pelo mínimo de 5

anos. Ao longo do primeiros 6-12 meses deve-se observar a progressiva

regressão do eritema e da infiltração da cicatriz, geralmente acompanhada de

atrofia da epiderme e áreas de hiper e de hipopigmentação.

Avaliação otorrinolaringológica

Nos pacientes sem lesão mucosa anterior ao tratamento, devem ser

realizadas, no mínimo, com 6 e 12 meses e então anualmente, por um mínimo

de 5 anos, para constatar que não houve desenvolvimento de lesões mucosas.

Casos mucosos

Avaliação clínica:

Devem ser repetidas a cada 15, 10 ou 7 dias durante o tratamento, de

acordo com as condições clínicas do paciente, e no 30

dia. Caso haja

indicação de prorrogação do tratamento as reavaliações devem seguir com a

periodicidade necessária.

Avaliação otorrinolaringológica:

Após o 30

dia de tratamento deverão ser a cada 15, 10 ou 7 dias de

prorrogação do tratamento, de acordo com as condições clínicas do paciente.

A partir da constatação da epitelização das lesões, os pacientes deverão ser

reavaliados após 1, 3, 6, 12 meses e então anualmente, por um mínimo de 5

anos, para constatar a manutenção da cicatrização das lesões. Recidivas de

lesões e/ou evolução de um caso de forma cutânea para a forma mucosa

Pacientes com lesões recidivantes, deverão reiniciar a investigação

diagnóstica (principalmente aqueles sem comprovação parasitológica) e/ou

repetir o tratamento, de preferência em regime de internação ou hospital-dia.

Pacientes que evoluírem da forma cutânea para a forma mucosa,

necessariamente deverão seguir a rotina de investigação inicial para pacientes

mucosos.

Em ambos os casos, atentar para a possibilidade para a co-infecção pelo

HIV ou outras doenças associadas de natureza infecciosa ou degenerativa.

Calendário para pacientes tratados em outras unidades de saúde

Pacientes de Forma Cutânea

OMENTO FREQÜÊNCIA LOCAL

Confirmação do diagnóstico: IPEC

Durante o tratamento: A cada 15, 10 ou 7 dias Unidade de origem

Imediatamente após o

tratamento:

No 30

dia Unidade de origem

Caso persista lesão não

epitelizada:

Quinzenalmente até a constatação da

epitelização (dentro de mais 2 meses)

Unidade de origem

Caso persista a lesão aberta ou caso

ocorra piora nesse período

IPEC

Primeiro ano após o tratamento: 2 e 4 meses Unidade de origem

1, 6 e 12 meses IPEC

Anos subseqüentes: Anualmente durante no mínimo 5 anos IPEC

Pacientes de Forma Mucosa

OMENTO FREQÜÊNCIA LOCAL

Confirmação do diagnóstico: IPEC

Durante o tratamento: A cada 15, 10 ou 7 dias Unidade de origem

Imediatamente após o

tratamento:

No 30

dia IPEC

Caso necessite prorrogar o

tratamento:

A cada 7 ou 10 dias para

acompanhamento clínico geral

Unidade de origem

A cada 10 ou 15 dias até a

constatação da cura clínica

IPEC

Primeiro ano após o tratamento: 1, 3, 6 e 12 meses IPEC

Anos subseqüentes: Anualmente durante no mínimo 5 anos IPEC

Anexo 2 - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

INSTITUIÇÃO: INSTITUTO DE PESQUISA CLÍNICA EVANDRO CHAGAS -

FIOCRUZ

COORDENADOR DA PESQUISA: ARMANDO DE OLIVEIRA SCHUBACH

ENDEREÇO: Av. Brasil 4365-Manguinhos-Rio de Janeiro-RJ-CEP 21045-900

TELEFONES:(0xx21)598-4260/598-4263/598-4266/290-1943/FAX(0xx21)590-9988

NOME DO PROJETO DE PESQUISA: ESTUDO PARA A SISTEMATIZAÇÃO

DO ATENDIMENTO DE PACIENTES COM LEISHMANIOSE TEGUMENTAR

AMERICANA NO CENTRO DE REFERÊNCIA EM LTA - INSTITUTO DE

PESQUISA CLÍNICA EVANDRO CHAGAS - FIOCRUZ

NOME DO VOLUNTÁRIO: _________________________________________

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma doença que atinge seres

humanos e animais, incluindo o cão, causada por parasitos chamados

leishmanias. A doença é transmitida pelo "mosquito palha", que vive em

regiões de mata, plantações de banana, manga etc. localizadas próximas às

moradias humanas, onde costuma entrar para se alimentar de sangue de

pessoas e animais domésticos. A LTA se apresenta como feridas na pele de

difícil cicatrização. Algumas vezes, a LTA pode se tornar mais grave,

envolvendo as mucosas de revestimento interno do nariz e da garganta,

mesmo vários anos após a cicatrização da ferida na pele. Atualmente, não

temos como saber qual paciente adoecerá de novo e qual permanecerá curado

definitivamente.

Outras doenças como infecções por bactérias, tuberculose, sífilis,

esporotricose, outras micoses, tumores e etc. podem se manifestar de forma

via: Prontuário Médico 2

via: Paciente

parecida com a leishmaniose e precisam ser diferenciadas para que se possa

iniciar o tratamento correto. Entretanto, com os exames existentes atualmente,

nem sempre se consegue ter certeza absoluta sobre qual a doença em

questão.

No momento, várias perguntas precisam ser respondidas como: de que

outras maneiras a LTA pode se manifestar? Como se comportam os exames

de laboratório antes, durante e após o tratamento? Quais pacientes, mesmo

após o tratamento, irão reabrir suas cicatrizes ou irão desenvolver doença

dentro do nariz ou na garganta? Que outras doenças parecidas estão sendo

confundidas com a LTA e quais exames devem ser utilizados para

esclarecimento? Qual o papel dos seres humanos como reservatórios da

doença? Quais as melhores formas de tratamento? Que medidas devem ser

tomadas para controlar o problema?

Pelo presente documento, você está sendo convidado(a) a participar de uma

investigação clínica a ser realizada no IPEC-FIOCRUZ, com os seguintes

objetivos:

 Descrever aspectos da LTA: manifestações clínicas e exames de

laboratório, tentando estabelecer padrões de apresentação da doença e seu

modo de evolução, comparando com outras doenças.

 Avaliar o uso dos antimoniais e outras drogas utilizadas no tratamento da

LTA levando em consideração o tempo de tratamento, toxicidade, facilidade

de administração, custo e ausência de envolvimento das mucosas do nariz

e da garganta.

 Isolar, identificar e comparar as leishmanias causadoras da LTA

provenientes de diversas localidades.

Este documento procura esclarecê-lo sobre o problema de saúde em estudo

e sobre a pesquisa que será realizada, prestando informações, detalhando os

procedimentos e exames, benefícios, inconvenientes e riscos potenciais.

A sua participação neste estudo é voluntária. Você poderá recusar-se a

participar de uma ou todas as etapas da pesquisa ou, mesmo, se retirar dela a

qualquer momento, sem que este fato lhe venha causar qualquer

constrangimento ou penalidade por parte da Instituição. O seu atendimento

médico não será prejudicado caso você decida não participar ou caso decida

sair do estudo já iniciado. Os seus médicos poderão também interromper a sua

participação a qualquer momento, se julgarem conveniente para a sua saúde.

A sua participação com relação ao Projeto consiste em autorizar a realização

de uma série de exames para o diagnóstico da sua doença, e que parte deste

material, assim como os resultados destes exames de rotina, sejam utilizados

neste estudo. Também será necessária a sua autorização: 1) para a utilização

de documentação fotográfica ou filmagem de suas lesões para estudo 2) para

que parte do material coletado periodicamente para a realização de exames

para acompanhamento da evolução da sua doença, assim como os resultados

destes exames de rotina e do seu tratamento sejam utilizados neste estudo 3)

para que parte das amostras coletadas seja estocada a fim de servir para

outros estudos que tenham como finalidade a melhor compreensão da doença,

o desenvolvimento e avaliação de novos métodos diagnósticos; avaliação da

resposta ao tratamento etc., desde que tal estudo seja previamente analisado e

autorizado por um Comitê de Ética em Pesquisa.

Os exames e procedimentos aplicados lhe serão gratuitos. Você receberá

todos os cuidados médicos adequados para a sua doença. Participando deste

estudo você terá algumas responsabilidades: seguir rigorosamente as

instruções do seu médico; comparecer à unidade de saúde nas datas

marcadas; relatar a seu médico todas as reações que você apresentar durante

o tratamento, tanto positivas quanto negativas.

Caso você necessite de atendimento médico, durante o período em que

estiver participando do estudo, procure o Instituto de Pesquisa Clínica Evandro

Chagas - FIOCRUZ, mesmo fora do seu agendamento. Em caso de

necessidade ligue para o Dr. Armando de Oliveira Schubach, Dra. Fátima

Conceição-Silva ou Dra. Mariza Salgueiro nos telefones acima. Caso você

apresente qualquer quadro clínico que necessite de internação, a equipe

médica providenciará seu leito no Instituto de Pesquisa Clínica Evandro

Chagas - FIOCRUZ. Seus animais com suspeita de LTA poderão ser

atendidos gratuitamente pela médica veterinária Dra. Tânia Maria Pacheco

Schubach no Serviço de Zoonoses do IPEC.

Sua identidade será mantida como informação confidencial. Os resultados do

estudo poderão ser publicados sem revelar a sua identidade e suas imagens

poderão ser divulgadas desde que você não possa ser reconhecido.

Entretanto, se necessário, os seus registros médicos estarão disponíveis para

consulta para a equipe envolvida no estudo, para o Comitê de Ética em

Pesquisa, para as Autoridades Sanitárias e para você.

Você pode e deve fazer todas as perguntas que julgar necessárias antes de

concordar em participar do estudo, assim como a qualquer momento durante o

tratamento. O seu médico deverá oferecer todas as informações necessárias

relacionadas à sua saúde, aos seus direitos, e a eventuais riscos e benefícios

relacionados à sua participação neste estudo.

Procedimentos, exames e testes que serão utilizados:

Antes do tratamento haverá coleta de informações sobre a doença; exame

médico geral e exame da pele com descrição e documentação fotográfica ou

filmagem das lesões; exame interno do nariz e da garganta com um aparelho

chamado fibra ótica, que permite ver lesões pequenas ou em locais de difícil

acesso, para descrição e documentação fotográfica ou filmagem das lesões (se

necessário será aplicado "spray" anestésico local). Retirada, com anestesia

local, de um pequeno fragmento da lesão de pele, de mucosa ou de "íngua"

para realização de exames tanto para diagnóstico (aspecto microscópico do

tecido doente e culturas para tentativa de isolamento de possíveis agentes de

doença como fungos, bactérias e leishmanias) quanto para pesquisa

(identificação de células e outros componentes da resposta inflamatória, assim

como novos métodos de identificação dos possíveis agentes da doença).

Outros materiais também poderão ser coletados na tentativa de isolamento do

agente causador da doença: aspiração com seringa e agulha do bordo da lesão

e de secreções em lesões de pele fechadas.

Outros exames também serão realizados para diagnosticar outras doenças

possíveis de serem confundidas com a LTA, para classificar a gravidade da

doença e avaliar os efeitos dos medicamentos a serem utilizados durante o seu

tratamento: um a quatro testes cutâneos (injeção da décima parte de um

mililitro de um reativo para determinada doença na pele da região anterior do

antebraço, a qual deverá ser revista entre 2 a 3 dias após a injeção); exames

de sangue (quantidade equivalente a aproximadamente três colheres de sopa),

exame de saliva (coletada com um tipo de cotonete), radiografia dos pulmões e

da face (se necessário complementada por tomografia computadorizada); e

eletrocardiograma.

O tratamento da LTA em pacientes humanos costuma ser com o

medicamento glucantime por via intramuscular (IM), intravenosa (IV) uma

injeção ao dia, geralmente, durante um período de 30 dias contínuos ou com

intervalos de descanso. Excepcionalmente, para idosos, pacientes com

doenças graves ou que não tolerem o tratamento normal, poderá ser utilizada a

via intralesional (IL). O tempo do tratamento poderá ser diminuído ou

aumentado conforme a necessidade. Outras opções de tratamento são a

anfotericina B (IV) e a pentamidina (IM), ambas injetáveis e necessitando

medidas de acompanhamento parecidas com as do glucantime.

Após o início do tratamento, você deverá comparecer a aproximadamente

três consultas dentro de 10, 20 e 30 dias. Caso as lesões não cicatrizem

totalmente, o tratamento poderá ser continuado pelo período de tempo

necessário. Ao se atingir a cura clínica, você deverá retornar para consulta de

reavaliação em 1, 3, 6, 9 e 12 meses após o término do tratamento. E, a partir

de então, pelo menos uma vez por ano durante um prazo indefinido (no mínimo

5 anos).

A cada retorno deverão ser realizados avaliação médica e exames de

sangue (na quantidade aproximada de uma ou duas colheres de sopa) para

avaliar os efeitos dos medicamentos utilizados no seu tratamento e/ou para

avaliar a evolução da doença. Outros exames, como o eletrocardiograma

durante o tratamento, poderão ser realizados quando indicados.

Inconvenientes e riscos principais conhecidos até os dias atuais:

A coleta de sangue poderá causar alguma dor no momento da punção venosa

e, eventualmente, poderá haver a formação de uma área arroxeada no local,

que voltará ao normal dentro de alguns dias.

Ocasionalmente, os testes na pele poderão, apresentar uma reação forte

com inflamação do local, formação de bolhas e, mais raramente, formação de

ferida. Todo o processo costuma regredir dentro de alguns dias a poucas

semanas.

Tanto os testes na pele quanto o anestésico injetado no momento da biópsia

(retirada de um pequeno fragmento de pele para exame) poderão causar

alergia, geralmente limitada ao aparecimento de áreas vermelhas, empoladas e

com coceira na pele e que respondem bem a medicamentos anti-alérgicos.

Mais raramente poderá haver uma reação mais severa com dificuldade de

respirar e necessidade de cuidados mais intensos, existentes no IPEC.

No local da biópsia poderá ocorrer inflamação e dor, acompanhados ou não

de infecção por bactérias. Caso isso ocorra, poderá ser necessário o uso de

medicamentos para dor e antibióticos.

Os medicamentos glucantime e pentamidina costumam causar efeitos

indesejáveis, não devem ser utilizados na gravidez e seu uso em mulheres em

idade reprodutiva deve ser acompanhado de uso de método anticoncepcional

eficaz como preservativo de látex masculino ou feminino ("camisinha"),

diafragma feminino ou anticoncepcional oral ("pílula"). Quando o tratamento

não puder ser adiado, a anfotericina B poderá ser utilizada na gravidez. Os

exames com raios-x também não devem ser realizados em grávidas.

Formas de ressarcimento:

Sempre que necessário, nos dias de seu atendimento, poderá ser fornecida

alimentação conforme rotina do Serviço de Nutrição e Serviço social do IPEC

para pacientes externos.

Benefícios esperados:

Espera-se que, ao final do tratamento, você esteja curado da LTA, embora

as consultas de retorno por vários anos após o tratamento sejam necessárias

para a confirmação da cura. Os resultados deste estudo poderão ou não

beneficiá-lo diretamente, mas no futuro, poderão beneficiar outras pessoas,

pois espera-se também que este estudo contribua para que o diagnóstico e

acompanhamento do tratamento de pacientes com LTA possa ser feito de

forma mais eficaz e segura. Caso a sua investigação demonstre outro

diagnóstico diferente de LTA, você será devidamente orientado a buscar o

tratamento mais adequado para o seu caso.

Declaro que li e entendi todas as informações referentes a este estudo e que

todas as minhas perguntas foram adequadamente respondidas pela equipe

médica, a qual estará à disposição para responder minhas perguntas sempre

que eu tiver dúvidas.

Recebi uma cópia deste termo de consentimento e pelo presente consinto,

voluntariamente, em participar deste estudo de pesquisa.

_______________________________________________ _______________

Nome paciente: Data

_______________________________________________ _______________

Nome médico: Data

_______________________________________________ _______________

Nome testemunha

: Data

_______________________________________________ _______________

Nome testemunha

: Data

Apenas no caso de pacientes impossibilitados de manifestar o seu consentimento por escrito.

No caso de menores de 18 anos, deverá ser assinado pelo pai, mãe ou responsável legal.

Anexo 3 - Termo de Compromisso e Responsabilidade

TERMO DE COMPROMISSO E RESPONSABILIDADE

Eu, Mauro Célio de Almeida Marzochi, coordenador do projeto de

pesquisa intitulado “Estudo comparativo de sistemas reveladores em

ensaios imunoenzimáticos para detecção de anticorpos específicos no

diagnóstico da leishmaniose tegumentar americana (LTA) causada por

Leishmania (Viannia) braziliensis”, comprometo-me a manter o anonimato e

a confidencialidade dos participantes do projeto.

A identidade dos participantes, assim como os resultados obtidos com

este projeto, serão mantidos em um banco de dados sob a minha

responsabilidade.

Os resultados obtidos com esta pesquisa serão divulgados em

comunicações científicas mantendo o anonimato dos participantes e o material

biológico utilizado nesse projeto só poderá ser empregado em outras pesquisas

após submissão e aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa.

Rio de Janeiro, 04 de julho de 2005.

Mauro Célio de Almeida Marzochi Sonia Regina Lambert Passos

Orientador Co-orientadora

Lílian Dias Nascimento

Mestranda

Anexo 4 - Aprovação no CEP/IPEC

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 