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Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Ciências Biomédicas
Carolina Batista
Papel do condroitim sulfato na plasticidade
dos barris corticais de ratos
Rio de Janeiro
2008
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II
PAPEL DO CONDROITIM SULFATO NA PLASTICIDADE
DOS BARRIS CORTICAIS DE RATOS
Carolina Batista
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Morfológicas visando o grau de Mestre em Ciências
Morfológicas
Orientadora: Professora Doutora Daniela Uziel Rozental
Professora Adjunta do Instituto de Ciências Biomédicas, UFRJ
Laboratório de Ontogênese e Regeneração Neural
Instituto de Ciências Biomédicas
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Rio de Janeiro
2008
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III
Batista, Carolina.
Papel do Condroitim Sulfato na Plasticidade dos Barris Corticais de Ratos/ Carolina Batista.
Rio de Janeiro: UFRJ, PCM / ICB, 2008.
xix, 110p.
Orientadora: Daniela Uziel Rozental.
Dissertação de Mestrado – Universidade Federal do Rio de Janeiro/Programa de Pós-
Graduação em Ciências Morfológicas/ PCM, Instituto de Ciências Biomédicas / ICB, 2008.
Referências bibliográficas: p. 84-96.
1. Plasticidade do Sistema Nervoso Central. 2. Barris. 3. Condroitim Sulfato.
4. Elvax®. 5. Condroitinase ABC.
I. Uziel, Daniela. II – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Programa de Pós-Graduação
em Ciências Morfológicas
Carolina Batista
IV
Papel do Condroitim Sulfato na Plasticidade dos Barris Corticais de Ratos
Carolina Batista
Dissertação submetida ao corpo docente do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Morfológicas / ICB, Universidades Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos
requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre.
Aprovada em ______________ de _______________________ de 2008.
_________________________________
Prof. Vivaldo Moura Neto (presidente da banca)
ICB-UFRJ
_________________________________
Prof. João Guedes da Franca (revisor)
IBCCF-UFRJ
__________________________________
Prof
a
Daniela Uziel Rozental (Orientadora)
ICB-UFRJ
__________________________________
Profª Ana Maria Blanco Martinez
ICB-UFRJ
__________________________________
Profª Silvana Allodi
ICB-UFRJ
__________________________________
Profª Mônica Santos Rocha
ICB-UFRJ
V
O presente trabalho foi realizado sob orientação da professora Daniela
Uziel Rozental e desenvolvido no laboratório de Ontogênese e Regeneração
Neural, do Departamento de Anatomia, do Instituto de Ciências Biomédicas (ICB),
localizado na Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), na vigência dos
auxílios concedidos pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq) e pela Fundação de Amparo e Pesquisa do Estado do Rio
de Janeiro (FAPERJ) e de bolsa da Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior (CAPES).
VI
A minha mãe e minhas tias
por não me deixarem desistir.
VII
AGRADECIMENTOS
A minha mãe. Por tudo! "A distância impede que eu te veja, mas não
impede que eu te ame", Luiz Carlos Ijalbert.
Ao meu pai... "Deus nos concede, a cada dia, uma página de vida nova no
livro do tempo. Aquilo que colocarmos nela, corre por nossa conta", Chico Xavier.
A minhas tias queridas, irmãs, irmão e primos. Sábio foi aquele que um dia
disse que quem tem família tem tudo na vida. Demorei um pouco pra entender,
mas posso dizer que tenho tudo sem saber se mereço tanto. “Num deserto sem
água, numa noite sem lua, numa terra nua, por maior que seja o desespero,
nenhuma ausência é mais profunda que a tua!", Sophia de Mello Breyner
Andreseno.
A Daniela Uziel Rozental. Cinco anos passaram rápido, mas deixaram
muitas marcas. O muito que aprendi contigo levarei pra onde quer que o vento
me levar. Partir dói demais e dá medo, mas é importante saber quando acabar
um capítulo da vida e começar um novo. Obrigada por tudo! "O valor das coisas
não está no tempo que elas duram, mas na intensidade com que acontecem. Por
isso, existem momentos inesquecíveis, coisas inexplicáveis e pessoas
incomparáveis", Fernando Pessoa.
Ao Carlomagno. Jamais terei como retribuir tanta confiança que tivestes
por mim. "Os dias prósperos não vêm por acaso; nascem de muita fadiga e
persistência", Henry Ford.
Ao Roberto Lent, o chefe dos neuroplásticos et al. Uma pena que
inteligência não se passa, mas saiba que sua cultura nos inspira. "O ganho de
nosso estudo é termo-nos tornado melhores e mais sábios", Montaigne.
As minhas amigas queridas lá da princesa da serra. Como foram ótimas
nossas terapias em grupo via e-mail... E como foram maravilhosas minhas
viagens pra terrinha... “Fácil é ser colega, fazer companhia a alguém, dizer o que
ele deseja ouvir. Difícil é ser amigo para todas as horas e dizer sempre a verdade
quando for preciso. E com confiança no que diz”, Carlos Drummond de Andrade.
Ao Jean. Amigo, acho que nossas histórias nunca se acabarão! Não deixe
que os outros digam o que você deva ser ou fazer. Para se tornar um grande
homem é preciso... peraí! Você já é um grande homem! Aperte o start e curta as
VIII
fases de sua vida! E não se esqueça do doutorado feliz! "O que fazemos durante
as horas de trabalho determina o que temos; o que fazemos nas horas de lazer
determina o que somos", Charles Schulz. Ah! Um agradecimento final pela ótima
ajuda no Corel. Valeu amigo!
A Danielle. Adoro ser sua amiga! Obrigada pelo socorro nos experimentos
que tive que fazer no segundo tempo da prorrogação. Obrigada pelo
empurrãozinho que você me deu para meu futuro feliz! "Não há espelho que
melhor reflita a imagem do homem do que suas palavras", Luís Vives.
Ao Adiel, a Lena e a Ludmila. Se não fossem vocês... "Paciência e
perseverança tem o efeito mágico de fazer as dificuldades desaparecerem e os
obstáculos sumirem", John Quincy Adams.
Ao meu namorado, Leonardo. Por tudo que passamos juntos e por tudo
que ainda iremos enfrentar. “Há vários motivos para não se amar uma pessoa e
um só para amá-la; este prevalece”, Carlos Drummond de Andrade.
A todos os outros neuroplásticos, ontogênicos e agregados. Obrigada
pelos almoços, pelas conversas, pelas fofocas, pelas risadas, pelos papos-
cabeça, pelos conselhos... Obrigada por vocês estarem sempre por aí! "A falsa
ciência gera ateus; a verdadeira ciência leva os homens a se curvar diante de
Deus", Voltaire.
E como diria Drummond:
“Desejo a vocês...
Fruto do mato Cheiro de jardim Namoro no portão Domingo sem chuva
Segunda sem mau humor Sábado com seu amor Filme do Carlitos
Chope com amigos Crônica de Rubem Braga Viver sem inimigos
Filme antigo na TV Ter uma pessoa especial E que ela goste de você
Música de Tom com letra de Chico Frango caipira em pensão do interior
Ouvir uma palavra amável Ter uma surpresa agradável
Ver a Banda passar Noite de lua cheia Rever uma velha amizade
Ter fé em Deus Não ter que ouvir a palavra não
Nem nunca, nem jamais e adeus. Rir como criança
Ouvir canto de passarinho Sarar de resfriado
Escrever um poema de Amor Que nunca será rasgado Formar um par ideal
Tomar banho de cachoeira Pegar um bronzeado legal
IX
Aprender um nova canção Esperar alguém na estação
Queijo com goiabada Pôr-do-Sol na roça
Uma festa Um violão Uma seresta
Recordar um amor antigo Ter um ombro sempre amigo
Bater palmas de alegria Uma tarde amena
Calçar um velho chinelo Sentar numa velha poltrona
Tocar violão para alguém Ouvir a chuva no telhado
Vinho branco Bolero de Ravel E muito carinho meu.”
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XI
RESUMO
Os mamíferos apresentam uma representação completa da superfície do
corpo no córtex somestésico primário. Em alguns roedores, como os ratos, a
região relacionada à representação do focinho é composta por uma distribuição
dos axônios tálamo-corticais e células na camada IV, formando módulos que
correspondem à distribuição espacial das vibrissas da face contralateral (a região
do campo de barris). A formação dos barris inicia-se durante o período
embrionário e se prolonga por idades pós-natal, sendo moldado pela atividade
elétrica. Durante as primeiras semanas pós-natal, os barris são estruturas muito
plásticas, modificáveis pelo ambiente externo. O término da plasticidade do
campo dos barris corresponde a maturação da matriz extracelular (MEC) e suas
especializações, como as redes perineuronais (RPNs), encontradas na superfície
de corpos celulares e dendritos proximais de neurônios. As RPNs são compostas
por um grupo diversificado de macromoléculas, muitas das quais proteoglicanos
de condroitim sulfato (PGCS), que inibem o crescimento axonal e a plasticidade.
Para verificarmos se a degradação do condroitim sulfato pela enzima
condroitinase ABC prolongaria a plasticidade do córtex somestésico primário,
ratos neonatos tiveram todas as vibrissas retiradas durante o período de P0 a
P10. A retirada das vibrissas leva a uma desorganização do padrão dos barris.
Nas idades de P20, P40 ou P70 esses animais foram submetidos à cirurgia para
implante de fatia do polímero Elvax® saturado com a enzima condroitinase ABC
(50 U/ml) ou com tampão fosfato salina (PBS) (controle). Três ou dez dias após o
implante, os córtices foram aplanados e cortados em criostato e submetidos a
diferentes reaçõe histoquímicas. As análises para determinar a eficácia da
enzima e a distribuição do condroitim sulfato foram feitas através de
imunofluorescências para o anticorpo que reconhece o glicosaminoglicano (GAG)
de condroitim sulfato (CS56, SIGMA) e anticorpo que reconhece um epítopo
exposto no núcleo protéico após a digestão do GAG do PGCS. A histoquímica
para a atividade da enzima citocromo oxidase revelou o padrão de barris após o
tratamento, e para a glicoproteína Vicia villosa, marcou o PGCS presente nas
redes perineuronais. O uso do Elvax® como veículo para a difusão lenta da
droga, mostrou-se eficaz para um tratamento crônico, pois houve liberação da
enzima durante os cinco primeiros dias. Todos os animais sacrificados após dez
dias apresentaram a recuperação morfológica dos barris. Após três dias de
implante somente os animais que sofreram implante precocemente (P20) tiveram
uma resposta relevante. A alteração das RPNs através da digestão do condroitim
sulfato promove a plasticidade no córtex somestésico, já que foi possível
recuperar o padrão normal os barris que havia sido alterado pela retirada das
vibrissas. Essa manipulação da MEC pode ser usada para promover a
plasticidade do córtex adulto.
XII
ABSTRACT
In mammals, there is a complete representation of body surface in the
primary somatosensory cortex. In rats and some other rodents, in the region
related to the snout presents an organized distribution of thalamocortical axons
and layer IV cells forming tridimensional arrangements called barrels. Each barrel
represents each one of the long vibrissae of the snout. The barrels are formed
during late embryonic and early post-natal life, when they are sculpted by eletrical
activity. Barrels are plastic structures strongly influenced by the animal’s
periphery. Barrel plasticity decreases by the third postnatal week when the
extracellular matrix (ECM) perineuronal nets (PNNs) present in the cell body
surfaces and proximal dendrites of mature neurons. PNNs are composed of a
large group of macromolecules, including proteoglicans like chondroitin sulfate
(PGCS), which inhibit axonal growth and plasticity. To verify if the degradation of
chondroitin sulfate by ABC chondroitinase can lead to prolonged plasticity in the
primary somatosensory cortex, neonate rats had their vibrissae removed during
10 consecutive days (P0-P10). Vibrissae removal leads to a misorganization of
the barrelfield. At P20, P40 or P70 a pellet of Elvax® polymer containing 50 U/ml
of ABC chondroitinase or phosphate buffered saline - PBS (control) was inserted
in the cortex. Three or ten days after Elvax® implantation, cortices were flattened
and cut using a cryostat. To verify if the chondroitin sulfate was degraded, we
used two different antibodies (against the glycosamineglycans and against the
remaining epitope of the protein after the enzymatic digestion) for
immunohistochemistry. Histochemistry for cytochrome oxidase was used to check
barrels morphology and for Vicia villosa glycoprotein to verify PNNs. Our results
show that chondroitinase is slowly delivered from Elvax® during 5 days. After 10
days of recovery after vibrissae removal, all animals presented a morphologic
recovery of the barrel field. Only animals that were early treated (P20) with
chondroitinase had a relevant acute response after 3 days of Elvax® implantation,
showing barrel recover. Our results suggest that PNNs digestion by chondroitin
sulfate digestion promotes plasticity of the somatosensory cortex. Manipulation of
MEC can potentially be used to promote cortex plasticity in adult rats.
XIII
SUMÁRIO
Páginas
Resumo.................................................................................................................XI
Abstract................................................................................................................XII
Lista de Ilustrações............................................................................................XV
Lista de Tabelas.................................................................................................XVI
Lista de Abreviaturas......................................................................................XVIII
1. INTRODUÇÃO..................................................................................................20
1.1. O córtex somestésico primário e o campo de barris..............................21
1.2. Desenvolvimento do córtex de barris.....................................................25
1.3. A matriz extracelular...............................................................................29
1.4. As redes perineuronais..........................................................................33
1.5. O proteoglicano de condroitim sulfato....................................................36
1.6. Plasticidade do sistema nervoso central................................................41
2. OBJETIVO........................................................................................................45
3. MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................46
3.1. Preparação do Elvax® saturado com a enzima condroitinase ABC......47
3.1.1. Informações gerais sobre o Elvax®.............................................47
3.1.2. Preparação do Elvax®.................................................................49
3.2. Implante de Elvax® saturado com condroitinase ABC no
córtex cerebral..............................................................................................51
3.3. Curva padrão de liberação da condroitinase ABC.................................52
3.4. Histoquímica para revelar a atividade da citocromo oxidase................55
3.5. Histoquímica para lecitina Vicia villosa..................................................55
3.6. Lavagem, desidratação e montagem.....................................................56
3.7. Imunofluorescência para detecção de condroitim sulfato......................56
3.8. Análise dos materiais.............................................................................58
4. RESULTADOS..................................................................................................60
4.1. Cinética de liberação da condroitinase ABC..........................................60
4.2. Alterações no padrão de marcação para citocromo oxidase nos
barris do campo do PMBSF..........................................................................64
4.3. Recuperação da morfologia do campo dos barris do PMBSF após
implante de Elvax® saturado com a enzima condroitinase ABC..................68
4.4. Ausência de marcação para o glicosaminoglicanos de condroitim
sulfato após o implante do Elvax® saturado com a condroitinase ABC.......78
XIV
5. DISCUSSÃO.....................................................................................................87
5.1. Considerações técnicas.........................................................................88
5.2. Alteração no campo dos barris...............................................................91
5.3. Expressão do proteoglicano de condroitim sulfato.................................92
5.4. Ação da condroitinase ABC promovendo a plasticidade
no córtex somestésico...................................................................................94
6. CONCLUSÃO...................................................................................................98
7. REFERÊNCIAS……………………………………………………………..............99
XV
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figuras Páginas
1 As áreas sensoriais somáticas do córtex humano......................................22
2 Representação do campo de barris no córtex somestésico primário de
Roedores adultos de pequeno porte..........................................................23
3 Diagrama esquemático da via trigeminal até o córtex cerebral..................25
4 Chegada das aferências talâmicas ao córtex durante o
desenvolvimento cortical............................................................................28
5 Marcação para Vicia villosa durante o desenvolvimento
pós-natal do PMBSF...................................................................................36
6 Sulfatação dos proteoglicanos de condroitim sulfato..................................38
7 Ilustração do processo de privação dos ratos e o implante
do Elvax®...................................................................................................51
8 Imagem ilustrativa do procedimento para realização da curva 1 de
cinética de liberação da ChABC.................................................................53
9 Imagem ilustrativa para os procedimentos para realização da curva
2 de cinética de liberação da ChABC.........................................................54
10 Cinética de liberação da ChABC pelo Elvax® no modelo de
curva 1........................................................................................................61
11 Cinética de liberação da ChABC pelo Elvax® no modelo de
curva 2........................................................................................................63
12 Marcação para CO na região do PMBSF de ratos sacrificados
em P73, privados no período pós-natal de P0 a P10.................................65
13 Cortes seqüenciais da região do PMBSF de ratos sacrificados
em P73, privados no período pós-natal de P0 a P10.................................66
14 Desenho região do PMBSF de ratos sacrificados em P73, privados
no período pós-natal de P0 a P10..............................................................67
15 Marcação para CO na região do PMBSF de ratos sacrificados em
P23 ou P30, privados no período pós-natal de P0 a P10 e que
receberam o implante de Elvax® + ChABC ou Elvax® + PBS
na idade de P20..........................................................................................70
XVI
16 Desenho da região do PMBSF de ratos sacrificados em P23 ou
P30, privados no período pós-natal de P0 a P10, e que receberam
o implante de Elvax® + ChABC ou Elvax® +PBS na idade de P20...........71
17 Marcação para CO na região do PMBSF de ratos sacrificados em
P43 ou P50, privados no período pós-natal de P0 a P10 e que
sofreram o implante de Elvax® + ChABC ou Elvax® +PBS
na idade de P40..........................................................................................73
18 Desenho da região do PMBSF de ratos sacrificados em P43 ou
P50, privados no período pós-natal de P0 a P10, e que receberam
o implante de Elvax® + ChABC ou Elvax® +PBS na idade de 40.............74
19 Marcação para CO na região do PMBSF de ratos sacrificados em
P73, privados no período pós-natal de P0 a P10 e que sofreram
o implante de Elvax® + ChABC ou Elvax® +PBS na idade de P70...........76
20 Desenho da região do PMBSF de ratos sacrificados em P73, privados
no período pós-natal de P0 a P10, e que receberam o implante de
Elvax® + ChABC ou Elvax® +PBS na idade de 70....................................77
21 Marcação do anticorpo CS56 (SIGMA) na região do PMBSF de
ratos sacrificados em P73, privados no período pós-natal de P0 a
P10 e que sofreram o implante de Elvax® + ChABC ou Elvax® +PBS
na idade de P70....................................................................................79, 80
22 Marcação para anticorpo C4S (Chemicon) na região do PMBSF de
ratos sacrificados em P73, privados no período pós-natal de P0 a P10
e que sofreram o implante de Elvax® + ChABC o Elvax® +PBS
na idade de P70..........................................................................................82
23 Marcação para lectina Vicia villosa na região do PMBSF
de ratos sacrificados em P43, privados no período pós-natal de
P0 a P10 e que sofreram o implante de Elvax® + ChABC ou Elvax®
+PBS na idade de P40...............................................................................84
24 Marcação para lectina Vicia villosa na região do PMBSF
de ratos sacrificados em P50, privados no período pós-natal de P0
a P10 e que sofreram o implante de Elvax® + ChABC ou de Elvax®
+ PBS na idade de P40..............................................................................86
XVII
LISTA DE TABELAS
Tabelas Páginas
1 Proteoglicanos de condroitim sulfato presentes no SNC.........................40
2 Quantidade de animais que sofreram procedimento cirúrgico para
implante do Elvax®..................................................................................47
XVIII
LISTA DE ABREVIATURAS
AH: ácido hialurônico (hialuronana ou hialuronato)
BDNF: do inglês, Brain-derived neurotrophic factor
CG: camada granular
ChABC: condroitinase ABC
CIG: camada infragranular
CO: citocromo oxidase
CS: condroitim sulfato
CSG: camada supragranular
CY3: carbocianina 3
C4S: condroitim-4-sulfato
C6S: condroitim-6-sulfato
DAB: diaminobenzidina
DACS: do inglês, DAndelion Clock-like Structure
DAPI: diamino-fenil-indol
DS: dermatam sulfato
EGF-R: receptor de fator de crescimento epidermal (do inglês, Epidermal Growth
Factor Receptor)
Elvax® 40W: polímero metil-etil-acetato
FGF: fator de crescimento de fibroblasto (do inglês, Fibroblast Growth Factor)
GABA: ácido γ-aminobutírico
GAG: glicosaminoglicano
GalNac: N-acetil-D-galactosamina
GlcA: ácido glucurônico (do inglês, Glucuronic Acid)
GND: glicose oxidase-diaminobenzidina-níquel
GPI: glicosil-fosfatidil-inositol
HS: heparam sulfato
KCl: cloreto de potássio
KS: keratam sulfato
MEC: matriz extracelular
MMPs: metaloproteinases de matriz
NaCl: cloreto de sódio
NADPH-d: nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato-diaforase
NGS: soro normal de cabra (do inglês, Normal Goat Serum)
NG2: neuroglican 2
NMDA: N-metil-D-aspartato
O: átomo de oxigênio
PB: tampão fosfato (do inglês, Phosphate Buffer)
PBS: Tampão Fosfato Salina (do inglês, Phosphate Buffer Saline)
PBST: Tampão Fosfato-Salina-Triton (do inglês, Phosphate Buffer Saline Triton)
PC: placa cortical
PFA: paraformaldeído
PGCS: proteoglicano de condroitim sulfato
PKC: proteína cinase C (do inglês, Protein Kinase C)
PMBSF: subcampo de barris póstero-medial (do inglês, Postero Medial Barrel
Subfield)
XIX
PNNs: redes perineuronais (do inglês, Perineuronal Nets)
POm: porção medial do núcleo posterior
PP: pré-placa
RPN: rede perineuronal
SB: substância branca
Ser: serina
SNC: sistema nervoso central
SNP: sistema nervoso periférico
SP: subplaca
S1: córtex somestésico primário
S2: córtex somestésico secundário
Thr: treonina
WFA: Wisteria floribunda
VB: complexo ventrobasal
VPL: núcleo ventral-posterior-lateral
VPM: núcleo ventral-posterior-medial
Vv: Vicia villosa
V1: córtex visual primário
ZI: zona intermediária
ZM: zona marginal
ZSV: zona subventricular
ZV: zona ventricular
1. Introdução
O córtex cerebral é provavelmente a estrutura de maior complexidade dos
organismos vivos, formado por bilhões de neurônios, precisamente organizados e
interconectados. Seu processo de formação ocorre, majoritariamente, durante o
período embrionário e o pós-natal imediato, havendo variações entre diferentes
espécies, e converge para uma organização em camadas e em áreas (O`LEARY
et al., 2007).
O neocórtex adulto é dividido em áreas que apresentam diferentes
características citoarquitetônicas, conexões peculiares e expressão diferencial de
moléculas de matriz. Cada uma das áreas apresenta seis camadas caracterizadas
pela morfologia de seus neurônios e pela densidade celular. O conjunto dessas
características é que determina a identidade funcional de cada uma dessas áreas
(CHEUNG et al., 2007).
O córtex visual primário de primatas (V1) (HUBEL & WIESEL, 1972) e o
córtex somestésico primário de pequenos roedores (S1) (WOOSLEY & VAN DER
LOOS, 1970) são duas áreas corticais muito utilizadas como modelo de
organização cortical. Inibição da atividade neural com uso de fármacos
(GOODMAN & SHATZ, 1993; HENSCH & STRYKER, 1996; KATZ & SHATZ,
1996; FOX et al., 1996), lesão periférica ou privação precoce (SHATZ &
STRYKER, 1978; JEANMONOD et al., 1981) podem levar a alterações das
características destas estruturas, sugerindo uma influência importante dos
aferentes provenientes da periferia na organização morfológica e funcional das
células das áreas visual e somestésica.
21
1.1. O córtex somestésico primário e o campo de barris
Em humanos, o córtex somestésico primário (S1) localiza-se no chamado
giro pós-central do lobo parietal e apresenta quatro áreas funcionalmente distintas,
as áreas 3a, 3b, 1 e 2 de Brodmann (Figura 1). S1 recebe densas aferências
talâmicas vindas do complexo ventrobasal do tálamo (núcleo ventral-posterior-
lateral (VPL) e núcleo ventral-posterior-medial (VPM)), terminando nas áreas 3a e
3b, que por sua vez projetam suas aferências para as áreas 1, 2 e também para a
área somestésica secundária (S2). As áreas 3b e 1 respondem preferencialmente
a estímulos cutâneos superficiais de toda a superfície corporal, enquanto que as
áreas 3a e 2 respondem preferencialmente a estímulos profundos (transmitidos
por receptores nas articulações e músculos) (BEAR et al., 2002).
Os axônios provenientes do tálamo chegam principalmente à camada IV de
S1 (DAW et al., 2007), semelhante ao que se observa também em outras áreas de
processamento primário, como o V1 (BEAR et al., 2002). Os neurônios da camada
IV projetam-se, por sua vez, para as células das camadas II/III (LÓPEZ-BENDITO
& MOLNÁR, 2003).
22
Figura 1: As áreas sensoriais somáticas do córtex humano. Todas as áreas da ilustração
encontram-se no lobo parietal. A ilustração inferior mostra que o giro pós-central (em verde)
contém S1, que consiste na sub-área 3b cortical. Adaptado de BEAR et al., 2002.
Em roedores, uma grande parte do território de S1 é dedicada às vibrissas
do focinho, enquanto uma área menor é dedicada aos dedos de suas patas. Os
sinais sensoriais do folículo de cada vibrissa se dirigem para os neurônios da
camada IV que, em pequenos roedores, formam agregados que recebem o nome
de barris (WOOLSEY & VAN DER LOOS, 1970). Cada barril é a representação
cortical, anatômica e eletrofisiológica, das vibrissas da face contralateral (Figura
2).
Córtex Somatosensorial Primário
(S
)
Sulco
Central
Córtex
Parietal
Posterior
(areas 5, 7)
Córtex
Somatosensorial
Sulco
Central
Giro Pós-
central
23
Figura 2: Representação do campo de barris no córtex somestésico primário de roedores
adultos de pequeno porte. (A) Figura esquemática do córtex de mamíferos em corte coronal. Em
alguns roedores há a formação do campo dos barris na camada IV (B, C). (B) Marcação para
citocromo oxidase de secção tangencial da camada IV de SI, com marcação intensa dos barris e
mais clara na região dos septos entre os barris. A organização dos barris se dá em fileiras (A, B, C,
D e E) e em colunas (1, 2, 3, 4, 5 e 6). (C) Secção coronal de rato P19 visualizada por contraste de
fase. Os barris estão identificados na camada IV e indicados pelas estrelas. Em (A) e (C) os
números romanos indicam as camadas corticais. a, anterior; m, medial; v, ventral. Modificado de
LENT, 2002 e SCHUBERT et al., 2007.
Os barris são claramente visíveis em secções processadas para diversas
técnicas histológicas como a tradicional técnica de Nissl, ou pela atividade de
enzimas como a citocromo oxidase (CO) (WONG-RILEY & WELT, 1980),
succinato desidrogenase (WALLACE, 1987) e a nicotinamida adenina
dinucleotídeo fosfato-diaforase (NADPH-d) (FRANCA & VOLCHAN, 1995). A
distribuição das aferências tálamo-corticais no núcleo ventral-posterior também
gera um mapa correspondente a cada vibrissa do focinho do animal, os
barrilóides. Vibrissas rostrais são menores e menos inervadas que as mais
caudais (KILLACKEY et al., 1995). No interior dos barris encontram-se as
aferências tálamo-corticais e poucas células corticais, mais presentes nas regiões
de septo entre os barris e na parede de cada barril (LÓPEZ-BENDITO &
MOLNÁR, 2003).
200
Subst. Branca
A
24
O principal subcampo de barris é o póstero-medial (PMBSF, do inglês
Postero Medial Barrel Subfield) e está associado com a representação das
grandes vibrissas do focinho do roedor. As cinco fileiras de barris corticais
relacionam-se de forma precisa com as cinco fileiras das vibrissas faciais.
A informação sensorial, desencadeada por um estímulo em uma vibrissa, é
carreada dos folículos das vibrissas até núcleos trigeminais no tronco encefálico
(núcleo principal, sub-núcleos interpolar e caudal), pelos prolongamentos centrais
dos neurônios do gânglio trigeminal (BELFORD & KILLACKEY, 1979). Nestes
núcleos, as fibras aparecem segregadas e irão formar estruturas semelhantes aos
barris corticais, chamados barriletes; as informações seguem para o núcleo VPM
do tálamo contralateral, onde se encontra os barrilóides, e daí para o centro do
barril cortical (INAN & CRAIR, 2007). Quando o estímulo ocorre entre as vibrissas,
a informação sensorial também é carreada para os barriletes presentes no núcleo
trigeminal, mas daí a informação segue para a porção medial do núcleo posterior
(POm) do tálamo. No córtex, a informação vinda do tálamo chegará ao septo entre
os barris (Figura 3).
25
Figura 3: Diagrama esquemático da via trigeminal até o córtex cerebral. Ao estimular uma
vibrissa a informação segue via nervo trigêmio em direção ao barrilete correspondente, no tronco
encefálico, seguindo para os barrilóides presentes no núcleo VPM do tálamo até chegarem aos
barris presentes no córtex S1 (via indicada pelas setas vermelhas). Estímulos nos septos entre os
barris seguem pelo nervo trigêmio para o tronco encefálico, e no tálamo chegam ao núcleo POm,
para daí seguirem ao septo correspondente entre barris no córtex. Modificado de BAHIA, 2005.
1.2. Desenvolvimento do córtex de barris
A diferenciação do encéfalo deriva do desenvolvimento de três vesículas
primárias do tubo neural: o prosencéfalo, o mesencéfalo e o rombencéfalo. Essas
vesículas geradas das intensas transformações morfogenéticas se devem em
grande parte à intensa atividade proliferativa por que passam as células
precursoras dos neurônios e da neuroglia (LENT, 2002). O córtex cerebral é
proveniente de um par de vesículas em ambos os lados do prosencéfalo (encéfalo
anterior), as vesículas telencefálicas, que juntas formam o telencéfalo (BEAR et
al., 2002).
Durante o desenvolvimento do córtex cerebral ocorrem eventos
progressivos – gênese das células nervosas, migração, diferenciação morfológica
e funcional (expressão de neurotransmissores, emissão de prolongamentos etc),
Nervo trigêmio
Barriletes
Barrilóides
26
busca dos alvos, sinaptogênese e mielinização – e eventos regressivos. Parte dos
eventos progressivos (neurogênese, migração, diferenciação e crescimento
neurítico) ocorre durante a vida embrionária dos roedores, enquanto a
sinaptogênese, a mielinização e os fenômenos regressivos se estendem durante a
vida pós-natal (O`LEARY et al., 1994a).
Nos períodos mais precoces do desenvolvimento, a parede das vesículas
será constituída por apenas duas camadas: a zona ventricular (ZV) e a marginal
(para referências ver BEAR et al., 2002). Dentro destas camadas das vesículas
telencefálicas originam-se os neurônios e as células de glia que formarão as
camadas corticais, por exemplo. Células precursoras originadas na ZV migram
deslizando em finas fibras, derivadas de células de glia radial, que irradiam da
zona ventricular em direção a pia (ANDERSON et al., 2001). Os neuroblastos
(neurônios imaturos) seguem este caminho radial da ZV rumo à superfície
encefálica. Neuroblastos destinados a serem células da pré-placa estão entre os
primeiros a migrar para fora da zona ventricular e os destinados a se tornarem o
córtex adulto migram em seguida, dividindo a pré-placa em uma zona marginal e
uma subplaca e se interpondo entre as duas para formar a placa cortical (MARÍN
& RUBENSTEIN, 2003). Desse modo a parede do tubo neural, que inicialmente é
formada por uma única camada de células, passa a ser constituída por várias
camadas que, finalmente, originarão as regiões laminadas do sistema nervoso,
como acontece no córtex cerebral (KAAS & COLLINS, 2001). As primeiras células
a chegarem à placa cortical serão aquelas que se tornarão os neurônios da
camada VI, seguidas das células da camada V, camada IV e assim por seguinte
em uma formação “de dentro para fora”.
27
Após a migração dos neuroblastos, para assumir sua posição correta no
sistema nervoso, os neurônios se diferenciam e estendem seus prolongamentos,
os neuritos, tornando-se axônio e dendritos (HUBER et al., 2003). O crescimento
axonal ocorre somente quando a matriz extracelular (MEC) contém as proteínas
certas para interagirem com moléculas presentes na superfície celular e, assim,
promover o alongamento do axônio. Substratos permissivos, rodeados por outros
repulsivos, podem proporcionar corredores que guiam os axônios em crescimento
ao longo de caminhos específicos (HARI et al., 2004).
O desenvolvimento das conexões entre o córtex e o tálamo ocorre entre o
13º e 18º dia do período embrionário (E13-E18) em camundongos. Durante esse
período, as conexões tálamo-corticais seguem para o córtex, navegando via
moléculas direcionadoras que são expressas para assegurar a inervação cortical.
No córtex, neurônios da subplaca (SP) atuariam como alvos temporários das
conexões tálamo-corticais, já que as células da camada IV, seus alvos definitivos,
ainda estão em período de migração (INAN & CRAIR, 2007).
Os axônios talâmicos permanecem na SP por dois ou três dias (E16-E19,
em roedores), para daí invadirem a placa cortical (PC), antes mesmo que as
camadas corticais estejam completamente formadas (CATALANO et al., 1996;
LÓPEZ BENDITO & MOLNAR, 2003). Dois dias depois, penetram na camada IV
em desenvolvimento, formando suas arborizações em agregados (ERZURUMLU
& JHAVERI, 1990). A formação dos barris ocorre nos dias subseqüentes pela
agregação dos aferentes talâmicos, de aferentes serotoninérgicos e das células
da camada IV (LANE et al., 2006). No primeiro dia pós-natal (P0) já existe um alto
grau de segregação das fibras talâmicas (AGMON et al., 1995), indicando a
importância primária destes elementos na formação dos barris. Só após a
28
segregação destes aferentes é que as células da camada IV se agregam na
periferia dos barris. Igualmente, moléculas da MEC podem ser identificadas
delimitando seus contornos (STEINDLER et al., 1989). Desta forma, os barris
parecem completamente formados em P3-P4, mas, para que o padrão adulto seja
atingido, muitas mudanças, principalmente no que concerne à espessura e à área
de superfície, ainda ocorrerão durante o desenvolvimento pós-natal. De P4 a P8
cada barril recebe informações vindas do seu barrilóide específico do complexo
ventrobasal (VB) (AGMON et al., 1995) (Figura 4). Entre P6 e P12, a densidade de
arborização das conexões tálamo-corticais aumenta na camada IV, principalmente
dentro do limite do córtex de barril, com dendritos preferencialmente orientados
para dentro do barril (RICE, 1985; para revisão ver INAN & CRAIR, 2007). A
correspondência entre os folículos das vibrissas e sua representação cortical é
devida à segregação de axônios tálamo-corticais nos domínios dos barris
(WOOLSEY & VAN DER LOOS, 1970).
Figura 4: Chegada das aferências talâmicas ao córtex durante o desenvolvimento cortical.
Esquema de secção coronal de córtex de camundongo demonstrando a laminação cortical e o
crescimento de fibras talâmicas na direção cortical. No período embrionário de E11, as primeiras
células pós-mitóticas migram para a camada cerebral mais externa, formando a pré-placa (PP), a
partir daí separando-se da zona marginal (ZM) e da subplaca (SP) para a chegada de neurônios à
placa cortical. Quando os axônios talâmicos (linhas vermelhas) chegam ao córtex em E15,
acumulam-se na SP. Durante os primeiros períodos pós-natais, muitas fibras talâmicas invadem a
PC e as camadas V e VI. Axônios talâmicos organizam-se na camada IV impondo uma
organização dos neurônios, formando os barris. SB: substância branca; ZI: zona intermediária;
ZSV: zona subventricular; ZV: zona ventricular. Adaptado de López-Bendito & Molnár, 2003.
ZM
PC
SP
ZI
ZSV
ZV
ZM
PC
VI
SP
ZI
ZSV
ZV
ZM
PC
V
VI
SP
ZI
ZSV
ZV
ZM
PC
V
VI
SP
SB
I
II/
III
IV
V
VI
SP
SB
PP
ZSV
ZV
29
Durante um longo período do desenvolvimento ocorre um refinamento das
conexões, com redução das sinapses e eliminação de neurônios, constituindo o
período regressivo. Populações inteiras são eliminadas durante a formação das
vias por um processo chamado de morte celular programada, que reflete a
competição por fatores presentes no meio e o rearranjo sináptico é o passo final
no processo da formação das conexões (GOODMAN & SHATZ, 1993). Os
eventos regressivos permitem a interação das células neurais umas com as
outras, e delas com o microambiente cerebral. Dessa forma, não é necessário
haver um controle ultra preciso da produção do número de neurônios correto ou
nos mecanismos de direcionamento, já que células quantitativamente ou
qualitativamente inadequadas serão retiradas (McCONNELL, 1995). Nesta etapa
é possível, então, que o sistema seja alterado e o padrão adulto seja modificado,
como demonstramos em nossos experimentos.
1.3. A matriz extracelular
A matriz extracelular (MEC) é uma enorme e complexa rede de
macromoléculas presente no espaço extracelular, variando seus componentes
entre os organismos, em diferentes tecidos de um mesmo organismo, e com o
período de desenvolvimento. Esta matriz é composta por várias proteínas e
polissacarídeos que são secretados localmente e organizados em uma rede
associada à superfície celular que os produz (ALBERTS et al., 2002).
As variações nas quantidades relativas dos diversos tipos de
macromoléculas na MEC e o modo como são organizadas, gera uma diversidade
de formas, cada uma adaptada às necessidades funcionais particulares de cada
tecido (GULLBERG & EKBLOM, 1995). No tecido nervoso adulto, a MEC ocupa
30
aproximadamente 20% do volume do SNC e é formada por uma complexa rede de
proteínas e carboidratos secretados tanto por neurônios quanto por células da glia
(RUOSLAHTI, 1996; RAUCH, 1997; NICHOLSON & SYKOVÁ, 1998) e apresenta
como funções principais (1) carrear informações, por meio de difusão de
moléculas, e (2) promover sítios de ligação para outras moléculas, permitindo
interações célula-célula e célula-matriz.
As duas classes principais de macromoléculas extracelulares que formam a
matriz são (1) cadeias de polissacarídeos da classe chamada glicosaminoglicanos
(GAGs), que são em geral encontrados ligados covalentemente a proteínas na
forma de proteoglicanos, e (2) proteínas fibrosas de dois tipos funcionais:
predominantemente estruturais (colágeno e elastina, por exemplo) e
predominantemente adesivas (fibronectina e laminina) (ALBERTS et al., 2002).
Os GAGs são cadeias polissacarídicas não ramificadas compostas por
unidades dissacarídicas repetidas (de 20 a 200 repetições), ligados a um núcleo
protéico através de um resíduo serina e um carboidrato característico na região de
ligação (KJELLÉN & LINDAHL, 1991), formando os proteoglicanos,
polissacarídeos não-ramificados constituídos por resíduos alternados de ácido
urônico e de hexosamina (VOET et al., 2000). São chamadas GAGs porque um
dos açúcares do dissacarídeo repetido sempre é um açúcar aminado (N-
acetilglicosamina ou N-acetilgalactosamina) e normalmente sulfatado; o segundo
açúcar normalmente é um ácido urônico (glicurônico ou idurônico) (ALBERTS et
al., 2002). Devido aos grupos sulfato e carboxila, os GAGs são carregados
negativamente. São divididos em quatro grupos principais de acordo com a
molécula de açúcar, o tipo de ligação entre eles, o número e a localização dos
grupos sulfato: (1) hialuronana (ácido hialurônico ou hialuronato) (AH), (2)
31
condroitim sulfato e dermatam sulfato (CS/DS), (3) heparam sulfato (HS) e (4)
keratam sulfato (KS) (HÖKE, 2005). Com exceção da hialuronana, todos os outros
GAGs encontram-se ligados covalentemente a proteínas na forma de
proteoglicanos (VOET et al., 2000).
A diversidade de proteoglicanos é dependente da expressão diferencial de
genes que codificam o corpo protéico e os diferentes tipos e tamanho de cadeia
de GAGs (BANDTLOW & ZIMMERMANN, 2000), sendo classificados dependendo
da natureza bioquímica dos GAGs que estão ligados à proteína central. Um corpo
protéico pode carrear uma variedade de GAGs, e diferentes corpos protéicos
podem apresentar o mesmo tipo de GAG (DAVIES, 2001). Micrografias
eletrônicas e outras evidências indicam que os proteoglicanos têm uma arquitetura
molecular em forma de escova de garrafa, com cerdas ligadas de modo não-
covalente a um suporte filamentoso de hialuronana (VOET et al., 2000). As cerdas
consistem de uma proteína central, o núcleo protéico, à qual os
glicosaminoglicanos, mais freqüentemente o keratam sulfato e o condroitim
sulfato, estão covalentemente ligados. Os oligossacarídeos menores estão
normalmente ligados à proteína central, próxima ao seu sítio de ligação. As
cadeias de keratam sulfato e de condroitim sulfato são ligadas por ligações
glicosídicas à proteína central via oligossacarídeos que são covalentemente
ligados a átomos de oxigênio (O) de cadeias laterais de resíduos específicos de
serina (Ser) ou treonina (Thr).
Os proteoglicanos apresentam uma variedade de funções, mas parecem
possuir função fundamental em sinalização química entre as células, pois se ligam
a várias moléculas sinalizadoras, como proteínas que são fatores de crescimento
(fator de crescimento de fibroblasto (FGF), por exemplo), concentrando-os na
32
MEC e prevenindo sua difusão para outras partes do organismo (DAVIES, 2001).
Além disso, ligam-se e controlam as atividades de outros tipos de proteínas
secretadas, como enzimas proteolíticas (proteases) e inibidores de proteases
(ALBERTS et al., 2002).
A maioria dos proteoglicanos encontrados no SNC inclui membros da
família das lecticanas (também chamadas hialectanas), que possuem GAGs de
hialuronana ligados no N terminal ou uma outra porção contendo ligação de GAGs
de CS. Lecticanas, como o proteoglicano de condroitim sulfato (PGCS), são
postulados os principais organizadores da matriz extracelular do SNC (RAUCH,
2007), implicados na regulação da proliferação celular, sobrevivência, migração e
diferenciação celular (BANDTLOW & ZIMMERMANN, 2000). O núcleo protéico
desses proteoglicanos apresenta muitas atividades biológicas, acumulando
evidências que sugerem que GAGs associados a essas proteínas, assim como
com outros GAGs presentes na matriz extracelular, apresentam funções distintas
que podem influenciar a sobrevivência celular durante o desenvolvimento e em
lesões do SNC. Condroitim sulfato e hialuronana são GAGs que se associam a
proteoglicanos e a componentes distintos da matriz, implicam na regulação de
células-tronco neurais e na diferenciação , expansão e migração de progenitores
celulares durante o desenvolvimento do SNC (SHERMAN & BACK, 2007). Vale
lembrar também que ambos os GAGs descritos estão presentes em altas
concentrações após lesão do SNC, quando impedem a regeneração neuronal e
remielinização (GALTREY et al., 2007).
33
1.4. As redes perineuronais
Uma das especializações da MEC são as redes perineuronais (RPN),
descritas por Camillo Golgi, em 1898, como uma malha reticular encontrada na
superfície de corpos celulares e dendritos proximais (CELIO et al., 1998). Durante
o desenvolvimento pós-natal, esses componentes se acumulam em um padrão
característico que persiste ao longo da vida (CÉLIO & BLÜMCKE, 1994).
Estudos imunohistoquímicos mostraram que algumas moléculas de adesão
da MEC estão presentes na RPN, incluindo as lecticanas, hialuronana, tenascina-
C e tenascina-R (YAMAGUCHI, 2000).
Os PGCS presentes nas RPNs compreendem três classes principais: i) as
lecticanas ou hialectanas, que incluem agrecam, versicam, neurocam e brevicam;
ii) proteoglicanos associados à MEC, como a fosfacam; e iii) proteoglicanos da
superfície celular, tal como neuroglicam C (OOHIRA et al., 2000; MIYATA et al.,
2005). O PGCS forma agregados com o hialuronana, constituindo o maior
componente da matriz extracelular de cérebros adultos (DELPECH et al., 1982).
No cérebro de mamíferos em desenvolvimento, as principais classes de
PGCS são as da família da (i) agrecam, (ii) fosfacam e (iii) neuroglicam C
(OOHIRA et al., 2000). A composição das RPNs pode diferir dependendo do tipo
neuronal, região cerebral ou mesmo espécie animal a ser considerada
(BANDTLOW & ZIMMERMANN, 2000; DEEPA et al., 2006). Algumas proteínas
das RPNs, como a tenascina, são restritas a interneurônios presentes no córtex
cerebral de roedores (CELIO & CHIQUET-EHRISMANN, 1993; VIGGIANO, 2000),
enquanto outras podem ser encontradas em neurônios piramidais no córtex
cerebral de marsupiais ou primatas (HAUSEN et al., 1996; BRÜCKNER et al.,
1998a). As áreas corticais primárias (somestésica, auditiva, visual) apresentam
34
uma variação no padrão de RPN quando comparadas com outras regiões
cerebrais como o córtex límbico (BRÜCKNER et al., 1994).
As RPNs são identificáveis no final do período crítico, quando o sistema
nervoso é suscetível a modificações e, no seu final, os circuitos corticais são
estabelecidos em resposta a atividade uso-dependente, ocorrendo uma redução
da plasticidade sináptica (LANDER et al., 1997). No caso do córtex visual, a
digestão de alguns componentes dessas redes pela condroitinase ABC pode
influenciar a dominância ocular presente no córtex, sugerindo que os PGCS, e em
particular o CS, regula a plasticidade neuronal (PIZZORUSSO et al., 2002), o que
será discutido mais a frente.
Uma maneira de marcar as RPNs é utilizando lectinas, proteínas que
possuem alta afinidade por carboidratos (JESSEL et al., 1990). Em neurociências,
lectinas extraídas de plantas, como a Vicia villosa (Vv) e a Wisteria floribunda
(WFA), são usadas para revelar a estrutura das redes perineuronais de neurônios
piramidais e não-piramidais em diversos mamíferos, como ratos (DELLER et al.,
1996) e camundongos (BRÜCKNER et al., 2000). Três lectinas apresentam
afinidade para o terminal N-acetil-D-galactosamina (GalNac) de cadeias de
glicoconjugados (aglutinina Dolichos diflorus, aglutinina Glicina max e a aglutinina
Vicia villosa B), incluindo o condroitim sulfato (para detalhes ver BERTOLOTTO et
al., 1995).
No sub-campo póstero-medial de barris (PMBSF), as marcações para
lectinas estão presentes nos septos entre os barris (COOPER & STEINDLER,
1986; McCANDLISH et al., 1989). A tenascina, por exemplo, encontra-se presente
no córtex somestésico entre 24 e 48 horas após o nascimento, em um prospecto
35
do que será o limite do campo dos barris. Entre P6 e P7 a marcação é mais
prevalente nos septos entre os barris (STEINDLER et al., 1989).
Bahia (2005) demonstrou mudanças no padrão de marcação nas redes
perineuronais, após observar alteração na marcação para a lectina Vicia villosa
durante o desenvolvimento pós-natal do campo de barris. Ele determinou que
durante a formação do córtex de barris do rato, os seguintes estágios de
marcação são encontrados: durante as duas primeiras semanas, há uma
distribuição difusa de proteoglicanos marcados para Vv no interior dos barris, não
associada aos corpos celulares. No final da terceira semana há uma mudança
drástica no padrão de marcação, concentrada na superfície das células, com o
aspecto típico de RPN e localizadas preferencialmente nos septos entre os barris
(Figura 5). O último padrão torna-se mais evidente durante as semanas pós-natal
seguintes, quando o número de células marcadas para a Vv aumenta e o padrão
adulto fica evidente no final do primeiro mês, com células marcadas no
compartimento septal do PMBSF. Quando ocorre a privação no dia do
nascimento, com a cauterização do folículo, os barris não se formam, originando
somente “bandas contínuas”, orientadas longitudinalmente, marcadas para a CO e
para a Vv até a idade de P17. Nas idades de P24, P32e P60, a lectina não marca
os septos nem as bandas, havendo marcação celular sem uma organização
evidente.
36
Figura 5: Marcação para Vicia villosa durante o desenvolvimento pós-natal do PMBSF de
rato. Fotomicrografias de secções tangenciais na região da camada IV de P5 a P60. De P5 a P17
a marcação em rato é difusa e mais intensa no interior dos barris. Em um aumento maior (centro e
coluna da direita), o produto da reação pode ser visto disperso pelo neurópilo. A partir de P24 a
marcação concentra-se ao redor do corpo celular, preferencialmente localizado no septo. Adaptado
de BAHIA, 2005.
1.5. O proteoglicano de condroitim sulfato
Os mais abundantes glicosaminoglicanos são os de condroitim sulfato (CS).
Sua característica é a repetição de unidades dissacarídicas de N-acetil-D-
galactosamina (GalNac) ligadas ao ácido D-glucurônico por uma ligação a β-1,3
glicosídica ligada a uma região do corpo protéico (xilose-galactose-galactose-
ácido glucurônico) (SCHWARTZ, 2001). Uma cadeia de condroitim pode
apresentar mais de 100 unidades dissacarídicas sulfatadas ou não-sulfatadas em
posições e quantidades variadas. As unidades dissacarídicas do CS podem ser
37
monossulfatados na posição C4 ou C6 do resíduo GalNac (VOET et al., 2000) ou
dissulfatados na posição 2 e 6 no ácido glucurônico e GalNac, respectivamente, e
nas posições 4 e 6 de GalNac (GALTREY & FAWCETT, 2007) (Figura 6). A
maioria dos PGCS presentes no SNC são membros da família das hialectanas:
agrecam, versicam, neurocam e brevicam. A maioria é secretada pela célula, mas
alguns PGCS são retidos na superfície da célula por um domínio transmembrana
ou por uma espécie de âncora de glicosil-fosfatidil-inositol (GPI).
A síntese do CS ocorre nos compartimentos do complexo de Golgi através
da atividade de glicosiltransferases e sulfotransferases em diferentes tipos
celulares do SNC. O passo inicial para a biossíntese do CS envolve a formação da
região de ligação, onde um resíduo de xilose é ligado a uma serina do núcleo
protéico por duas galactoses e um ácido glucurônico. O processo é seguido pela
polimerização do condroitim, quando a N-acetilgalactosamina e o ácido
glucurônico são adicionados seqüencialmente na cadeia em formação. O sulfato é
concomitantemente transferido aos grupos hidroxil nas posições específicas dos
resíduos de N-acetilgalactosamina e do ácido glucurônico pela 3´-fosfoadenosina-
5´-fosfosulfato transferase. O núcleo protéico do PGCS pode ser degradado por
metaloproteinases de matriz (MMPs), que degradam os polímeros de CS com
clivagens endolíticas das cadeias longas de oligossacarídeos, formando pequenos
fragmentos através da atividade da hialuronidase, seguido da remoção lisossomal
de sulfatos através de sulfatases e favorecendo a degradação pela ação da β-N-
acetilhexosaminidases e β-glucuronidase (SHERMAN & BACK, 2007).
38
Figura 6: Sulfatação dos proteoglicanos de condroitim sulfato. As cadeias dos
glicosaminoglicanos de condroitim sulfato (CS) consistem na repetição das unidades de
dissacarídeos formados pela N-acetilgalactosamina (GalNac) e ácido glucurônico (GlcA). Essas
cadeias de CS são modificadas pela sulfatação e as posições de sulfatação definidas pelo tipo de
CS. Os dissacarídeos de CS podem ser sulfatados de quatro maneiras diferentes. (A) CS é
monossulfatado na posição 4 do resíduo GalNac, (B) CS é monossulfatado na posição 6 do
resíduo de GalNac, (C) CS é dissulfatado nas posições 2 e 6 de GlcA e GalNac e (D) CS é
dissulfatado nas posições 4 e 6 de GalNac. Adaptado de GALTREY & FAWCETT, 2007.
Ácido
Glucurônico
(GlcA)
N
-
acetil
-
galactosamin
a (GalNac)
Monossulfatado na
posição 4 do
resíduo GalNac
Monossulfatado n
a
posição 6 do
resíduo GalNac
Dis
s
ulfatado na
posição 2 do GlcA e
na posição 6 do
resíduo GalNac
Dis
s
ulfatado nas
posições 4 e 6 do
resíduo GalNac
(A)
(B)
(C)
(D)
39
Tanto o CS quanto o PGCS são inibidores da migração celular e do
crescimento axonal. Os PGCS são os maiores componentes da MEC no sistema
nervoso e muitos são os estudos que revelam sua distribuição e expressão
cerebral. São importantes em processos como a neurogênese, migração celular,
crescimento de neuritos e direcionamento axonal. PGCS são largamente
distribuídos no cérebro embrionário, incluindo as camadas germinativas do
cérebro de camundongos (VON HOLST et al., 2006) e uma variedade de regiões
durante o desenvolvimento do SNC de galinha (SCHWARTZ & DOMOWICZ,
2004), mas mais restritos em adultos (CRESPO et al., 2007) (Tabela 1). Duas
regiões ricas no PGCS são a zona ventricular (ZV) e a zona subventricular (ZSV),
onde estão presentes as células progenitoras durante a embriogênese e em
adultos, respectivamente, e sua ação nessas regiões estaria associada à
regulação da proliferação celular e à decisão do destino celular, entre linhagens
neuronais e glial (SIRKO et al., 2007). Está claro que essas atividades dependem
do sítio de ligação do CS no núcleo protéico e de sua interação com outros GAGs,
incluindo o ácido hialurônico (SHERMAN & BACK, 2007).
No SNC de adultos o PGCS exibe uma distribuição diferente daquela
encontrada no período embrionário. Como exemplos, temos o neurocam e o
versicam, produzidos por astrócitos e precursores de oligodendrócitos
respectivamente, que estão presentes na substância branca em adultos; o
neuroglican 2 (NG2), que está distribuído por todo o cérebro marcando células
precursoras de oligodendrócitos; e o fosfacam, que está presente em altos níveis
em células da glia do cerebelo (RHODES & FAWCETT, 2004). A sua distribuição
em adultos concentra-se nas regiões das RPNs, descritas no tópico anterior, e
têm como papel principal a estabilização das sinapses e manutenção das relações
40
celulares, devido a sua ação inibitória ao crescimento axonal e restrição à
plasticidade sináptica (GALTREY & FAWCETT, 2007). Recentemente Hayashi e
colaboradores (2007) identificaram PGCS envolvendo neurônios corticais não-
GABAérgicos em uma estrutura que eles denominaram como DACS (do inglês,
DAndelion Clock-like Structure); ocorre em cérebros pós-natal e esses
proteoglicanos estariam correlacionados com a maturação do córtex cerebral,
além de envolvidos com a regulação da plasticidade sináptica. Esta estrutura seria
análoga à RPN, já que apresentam desenvolvimento semelhante; porém a RPN
está localizada no corpo celular e dendritos proximais de neurônios inibitórios,
enquanto a DACS se localiza no neurópilo ao redor de um grupo de neurônios
não-GABAérgicos.
Proteoglicanos de Condroitim Sulfato do SNC
Nome GAG Célula de Origem Família
Matriz Extracelular
Agrecam CS Neurônios Lecticanas
Brevicam CS Neurônios e Glia Lecticanas
Neurocam CS
Neurônios e Precursoras de
Oligodendrócitos Lecticanas
Versicam CS Precursoras de Oligidendrócitos Lecticanas
Fosfacam
CS e
KS Glia e Neurônios RPTPβ
Biglicam
CS e
DS Astrócitos e Glia único
Decorina
CS e
DS Astrócitos e Glia único
Membrana
Brevicam-GPI CS Glia da substância branca Lecticanas
NG2 CS Precursoras de Oligidendrócitos Único
RPTPβ CS Glia e Neurônios RPTPβ
Neuroglicam-C CS Neurônios único
Apicam CS Astrócitos APP
Tabela 1: Proteoglicanos de condroitim sulfato presentes no SNC. Adaptado de CRESPO et
al., 2007.
41
Enzimas que degradam o condroitim sulfato podem ser purificadas de
algumas espécies de bactérias. Algumas dessas enzimas são expressas
constitutivamente, enquanto outras são induzidas através da adição do PGCS no
meio de crescimento. A enzima usada exclusivamente para o “reparo cerebral”, a
condroitinase ABC (ChABC) de Proteus vulgaris, contém atualmente duas
enzimas capazes de degradar o proteoglicano, uma endoeliminase capaz de
despolimerizar o condroitim sulfato, e uma exoeliminase que atua,
preferencialmente, no tetra e hexassacarídeo para gerar dissacarídeos (HAMAI et
al., 1997; PRABHAKAR, 2005). As letras “ABC” presentes no nome da enzima
referem-se às formas 4S, DS e 6S do PGCS. Visando analisar o efeito da enzima
para desorganização da MEC, administrações de ChABC têm sido feitas in vivo
para determinar a dose ideal para os diferentes modelos experimentais.
Aparentemente, o efeito da ChABC persiste até o final da primeira semana, mas
não duas semanas após injeção no SNC (CRESPO et al., 2007).
1.6. Plasticidade do sistema nervoso central
O cérebro em desenvolvimento possui uma notável capacidade plástica em
resposta a alterações de longa duração no padrão de atividade sensorial
periférica. Durante o desenvolvimento, as conexões neurais podem ser
modificadas, não só por alterações no microambiente das células, mas, sobretudo
pela influência do meio ambiente (SERFATY et al., 2008). Este período, no qual o
sistema nervoso é suscetível a modificações uso-dependentes, é denominado
período crítico, que se iniciam geralmente após o nascimento, e possui uma
duração variável dependendo da modalidade sensorial (BERARDI et al., 2000).
42
Períodos críticos são relevantes para diversos níveis de aquisição de
habilidades, tais como o desenvolvimento de acuidade sensorial, desenvolvimento
motor e aquisição de linguagem (BERARDI et al., 2000; HENSCH et al., 2005).
Muitos fatores são determinantes para o seu estabelecimento, incluindo
receptores NMDA (N-metil-D-aspartato), neurotrofinas e circuito inibitório (GABA –
ácido γ-aminobutírico) (BERARDI et al., 2000). A plasticidade implica na
remodelação das redes sinápticas e algumas moléculas presentes durante o
desenvolvimento podem ser importantes para isso, incluindo fatores de
crescimento, proteases e moléculas de adesão (CABELLI et al., 1995). No sistema
visual, parte dessa modelagem dependente de atividade das conexões ocorre
antes do nascimento, em resposta a descargas neuronais espontâneas. Porém,
uma parte significativa desse desenvolvimento depende de atividade que ocorrerá
após o nascimento, com influências sensoriais obtidas durante as primeiras fases
do desenvolvimento pós-natal, durante o período crítico.
Um modelo clássico de estudo acerca do período crítico e plasticidade
cerebral é o de privação monocular. Wiesel e Hubel (WIESEL, 1982) mostraram a
plasticidade e o período crítico das colunas de dominância ocular quando da
privação monocular, em que um olho é ocluso, e o resultado é de que as colunas
da camada IV do olho aberto se expandem em largura, enquanto as colunas do
olho ocluso diminuem. Além disso, estes efeitos de privação podem ser revertidos
quando da oclusão do olho que estava aberto e se abre o que estava fechado, o
que faz com que as colunas de dominância ocular encolhidas do olho que estava
fechado, expandam, e que as colunas expandidas do olho aberto, diminuam.
Esses autores observaram que a plasticidade de coluna de dominância ocular não
ocorre durante a vida toda, mostrando que, se a privação começar mais tarde na
43
vida, os efeitos anatômicos descritos não serão observados, existindo um período
crítico para as modificações estruturais (ALBERTS et al., 2002).
No córtex de barris, a diferenciação normal dos barris depende da
informação recebida da periferia sensorial via aferentes tálamo-corticais durante o
período crítico do desenvolvimento (O’LEARY et al., 1994b). Por exemplo, se uma
das vibrissas for retirada durante a primeira semana pós-natal, a área cortical
responsável por receber as informações da vibrissa terá sua coluna diminuída e
as áreas vizinhas irão se expandir pela região da coluna removida (BUONOMANO
& MERZENICH, 1998).
As descobertas dos períodos críticos levaram os pesquisadores a
concluírem que nos adultos não haveria plasticidade axônica, ou seja, a
capacidade de mudanças dos circuitos neurais se extinguiria após certa idade.
Essa informação mostrou-se equivocada quando se observou que a extensão do
período crítico é resultado das mudanças na expressão de moléculas, mas não
está estabelecido quais dessas moléculas são determinantes para tal alteração,
sendo candidatas as neurotrofinas como o BDNF (do inglês, Brain-derived
neurotrophic factor) e o receptor de glutamato tipo NMDA (BERARDI et al., 2000).
Também pouco se sabe sobre as propriedades de dinamismo das RPNs em
animais adultos, mas o processo de reorganização e modificação dos
componentes da matriz podem ser vitais para manter o funcionamento dos
neurônios e a integridade dos contatos sinápticos (INAN & CRAIR, 2007).
Como já foi dito anteriormente, o PGCS têm uma importante função na
modulação sináptica durante a plasticidade. Se os PGCS presentes nas RPNs
estão envolvidos com a plasticidade, a formação das RPNs ao redor de
determinados neurônios pode coincidir com o final do período crítico. No córtex de
44
barris de camundongos, a expressão das RPNs mostra-se dependente de
estímulos sensoriais apropriados durante os primeiros trinta dias após o
nascimento; a privação sensorial durante o período crítico diminui o número de
RPNs detectadas ao redor de células da camada IV do córtex de barris (McRAE,
2007). Estudos recentes, com injeções de condroitinase ABC (ChABC)
diretamente no córtex visual de ratos adultos mostra uma restauração das colunas
de dominância ocular, sugerindo que o PGCS atua na supressão da plasticidade
sináptica. Pizzorusso e colaboradores (2002, 2006) apresentaram dados
indicando que cérebros de animais adultos respondem como cérebros jovens,
após ação da enzima ChABC, que altera a composição bioquímica das RPNs ao
redor do córtex visual. Normalmente, neurônios do córtex visual de ratos
apresentam plasticidade de quatro a cinco semanas após o nascimento, ou seja,
antes do amadurecimento da MEC. A ação inibitória dos PGCS no direcionamento
axonal sugere que a degradação da rede perineuronal remove o substrato não
permissivo para a geração de conexões axonais dependentes de estímulos ou
para a reorganização sináptica.
Os resultados de Pizzorusso e colaboradores (2002, 2006) nos
direcionaram a investigar se a remoção seletiva dos proteoglicanos que formam
as RPNs promoveria a recuperação morfofuncional do PMBSF em ratos que
tiveram as vibrissas de um dos lados do focinho retiradas diariamente durante os
10 primeiros dias de vida pós-natal (P0-10).
2. Objetivo
O objetivo principal deste trabalho é estudar as implicações regenerativas
da remoção das moléculas de proteoglicanos no PMBSF de ratos usando a
condroitinase ABC, visando contribuir para o entendimento dos mecanismos
responsáveis pela organização citoarquitetônica do córtex sensorial e pela
estabilização das sinapses tálamo-corticais.
Objetivos específicos:
(1) Verificar os efeitos da remoção das moléculas de PGSCs, pela enzima
condroitinase ABC, na plasticidade do PMBSF decorrente de alterações no padrão
de atividade sensorial periférica induzida pela remoção das vibrissas.
(2) Verificar a eficácia do polímero metil-etil acetato (Elvax®, DUPONT)
como agente para a liberação lenta e controlada da condroitinase ABC no córtex
somestésico primário.
(3) Verificar se a remoção das moléculas de PGSCs promove a
recuperação morfológica do PMBSF em animais que sofreram privação sensorial
desde o nascimento.
3. Materiais e Métodos
Utilizamos 26 ratos (Ratus norvegicus) da linhagem Wistar, de ambos os
sexos e com idades distintas (P20, P40 e P70). Vinte e quatro ratos passaram
pelo procedimento cirúrgico de implante do polímero Elvax® 40W, quinze desses
recebendo o Elvax® saturado com a ChABC e oito recebendo o Elvax® com
Tampão Fosfato Salina (PBS) (Tabela 2). Três animais que sofreram a retirada
das vibrissas não receberam qualquer Elvax®, sendo um sacrificado na idade de
P30 e outros dois na idade de P70.
A escolha do rato como modelo experimental deve-se ao fato de: (a) este
animal apresentar módulos corticais isomórficos, o campo de barris, no córtex
somestésico primário, com vasta informação disponível acerca da morfologia e
fisiologia desses módulos; (b) o PMBSF ser um dos principais modelos
estabelecidos para o estudo do desenvolvimento, plasticidade e regeneração do
sistema nervoso e, por fim, (c) o rato possuir um cérebro pequeno e liso, o que
facilita os procedimentos histológicos e a análise dos dados obtidos.
Todos os procedimentos com animais estavam de acordo com as
recomendações do Comitê de Ética do Centro de Ciências da Saúde da UFRJ.
Todos os esforços foram realizados de modo a minimizar o número de animais
utilizados e seus sofrimentos.
Durante os 10 primeiros dias de vida (dia do nascimento = P0) os animais
foram anestesiados diariamente por hipotermia e tiveram as cinco fileiras de
vibrissas do lado esquerdo do focinho retiradas com auxílio de uma pinça,
assegurando a integridade dos respectivos folículos.
47
Em P20, P40 e P70 os animais foram submetidos à cirurgia de implante do
polímero metil-etil acetato (Elvax® 40W, DuPont) saturado com 50 U/mL de
condroitinase ABC (ChABC, SIGMA) na região da área S1. Todo o procedimento
de preparação do polímero Elvax® 40W saturado com a enzima CHABC será
explicado no item 3.2 de Materiais e Métodos desta dissertação.
Idade dos animais
utilizados
Procedimento Período P20 P40 P70
Elvax® + ChABC 3 DIAS 2
3
5
Elvax® + PBS 3 DIAS 2
0
2
Elvax® + ChABC 10 DIAS 2
3
0
Elvax® + PBS 10 DIAS 1
3
0
Tabela 2: Quantidade de animais que sofreram procedimento cirúrgico para implante do
Elvax®.
3.1. Preparação do Elvax® saturado com a enzima condroitinase ABC
3.1.1. Informações gerais sobre o Elvax®
As resinas copolímero e terpolímero Elvax® EVA (acetato de etileno vinil)
da DuPont estão disponíveis em uma ampla variedade de graus, usados em
adesivos, calçados, fios & cabos, e outras aplicações. Misturadas com ceras de
petróleo e resinas tackifiers, as resinas Elvax® são a base para muitos adesivos
de fusão quente. Estes copolímeros de especialidade incluem graus que são
extruídos, expansíveis, moldáveis por injeção, moldáveis por sopro e indicados
por composições com outras resinas olefinicas e borrachas. As resinas são
inerentemente flexíveis, elásticas, duras, e resistentes a rachaduras por tensão de
ozônio e ambientais.
Os 22 graus de Elvax® disponíveis para aplicações de fios e cabos variam
em conteúdo de acetato de vinil, de 9 a 40 por cento, e em índice de fusão, de 0.3
48
a 52. Os graus de Elvax® com maiores índices de fusão estão disponíveis, mas
não são tipicamente utilizados em aplicações de fios e cabos, por causa da
necessidade de um alto desempenho mecânico. Estas versáteis resinas oferecem
uma excelente resistência de quebra por tensão, e mantêm sua flexibilidade sobre
uma ampla variedade de temperaturas, de - 60°C a 150°C [-76°F a 302°F], sem a
necessidade de plastificantes. Elvax® pode ter a cor composta com pigmentos,
para obter uma grande variedade de cores transparentes, matizes e efeitos sem
igual, além das mais tradicionais cores opacas.
A seleção entre os 22 graus da resina de copolímero de acetato de
etileno/vinil Elvax® é ditada pelas propriedades necessárias, e pelo equipamento
de processamento utilizado. Para uma orientação geral, a resistência química e a
flexibilidade melhoram com um conteúdo de acetato de vinil crescente; porém,
altos polímeros de acetato de vinil (maior do que 30 por cento) são um pouco mais
difíceis de serem processados, porque eles podem tornar-se suaves e pegajosos.
Polímeros com maior índice de fusão são extrudados mais facilmente, mas têm
menores propriedades físicas.
As resinas Elvax® são providas na forma de bolinhas pequenas e livres.
Elas têm distribuições de peso molecular de estreitas a largas e, dependendo do
tipo da resina, pode ser usado em operações de extrusão cast ou por sopro.
Quando processadas como mono-filmes ou coextrusões, estas resinas oferecem
qualidades como boa dureza de impacto, resistência a perfurações, tachamento
quente, formabilidade, resistência a quebra por flexão, vedação a quente, de baixa
temperatura, e a adesão a outros materiais, juntamente com um bom equilíbrio de
características de processamento.
49
A temperaturas ambientes, as resinas Elvax® são toxicologicamente bem
inertes. Elas são resistentes a ataques da maioria dos ácidos aquosos e bases, a
temperaturas ambientes, mas podem ser atacadas por ácidos de oxidação fortes,
a altas temperaturas. As resinas Elvax® podem ser dissolvidas, particularmente
as de alto conteúdo de acetato de vinil, com vários tipos de solventes orgânicos.
As resinas Elvax® não devem ser expostas diretamente à luz solar, por longos
períodos de tempo, a menos que um estabilizador ultravioleta seja utilizado.
Mais detalhes sobre cada um dos 22 tipos da resina podem ser
encontrados no site da DuPont (www.dupont.com ou www.dupont.com.br) na
página dedicada aos polímeros desenvolvidos pela empresa.
3.1.2. Preparação do Elvax®
A eficiência terapêutica da condroitinase ABC depende da sua liberação no
tecido de maneira lenta e constante por um período de tempo (LANGER, 1990).
Para isso, desenvolveram-se inúmeras estratégias por vários grupos de pesquisa
visando reduzir a área de implante do agente terapêutico (no nosso caso, a
enzima condroitinase ABC) e os distúrbios que essa aplicação possa causar
(REIPRICH et al., 2004; TESTER et al., 2007).
Para iniciar o processo de preparação do polímero metil-etil-acetato
(Elvax® 40W, DuPont) com a ChABC, lavamos uma pequena quantidade de
Elvax® 40W em álcool comercial (90-95%), sob agitação constante por 24 horas.
Dessa pequena quantidade lavada, dissolvemos 200 mg de Elvax® em 2 mL de
diclorometano (VETEC) em tubo de vidro (para cada amostra). Fechamos os
tubos e os agitamos no vórtex até o polímero dissolver por completo.
50
Antes de ser adicionada ao Elvax®, a ChABC foi diluída em PBS. Para 1 L
de PBS concentrado 10x utilizamos 80 g de NaCl (ISOFAR), 2 g KCl (ISOFAR),
7.6 g Na
2
HPO
4
x2H
2
O (ISOFAR), 2 g KH
2
PO
4
(ISOFAR) diluídos em 1 L de H
2
O
destilada.
Dessas misturas, colocamos alíquotas de 2 mL em tubos de 70x9 mm e
adicionamos a enzima.
Em seguida, adicionamos 20 µL de condroitinase ABC (SIGMA) na
concentração de 50 U/mL para cada 2 mL de Elvax® e 20 µL de Fast Green 0,1%,
que facilita a visualização da solução. Para controle, adicionamos 20 µL de
Tampão Fosfato-Salina 0,1 M (PBS – pH 7,4) mais 20 µL de Fast Green.
Homogeneizamos os volumes resultantes de cada tubo imediatamente durante 1
minuto em vórtex.
Após a homogeneização, imergimos os tubos abertos em gelo seco
acrescido de acetona ou álcool (temperatura de aproximadamente -80°C) por 30
minutos.
Em seguida, quebramos os tubos cuidadosamente e retiramos os
polímeros, saturados com a enzima ou com o PBS, para que fossem congelados e
armazenados a -20°C por cinco dias para uma total evaporação do diclorometano.
Depois desses cinco dias, colocamos as amostras em tubos de liofilização
e as submetemos ao vácuo por 24 horas, a uma temperatura em torno de -4°C
(tubos imersos em isopor contendo uma mistura de gelo e álcool comercial).
Finalmente, cortamos as amostras cilíndricas do polímero saturado com a
enzima e com o tampão, em um criostato (LEICA) em fatias de 200 µm de
espessura e os cortes foram mantidos a -20°C até o momento do implante.
51
3.2. Implante de Elvax® saturado com condroitinase ABC no córtex cerebral
Anestesiamos, via intramuscular, os animais com uma mistura de cloridrato
de cetamina (100 mg/kg) (Ketalar, PARKER-DAVIS), cloridrato de tiazina (5
mg/kg) (Rompun, BAYER), valium (1,5 mg/kg) (ROCHE), seguido de atropina (0,2
mg/kg) (ISOFARMA) para prevenir a obstrução das vias respiratórias e decadron
(0,6 mg/kg) (ACHÊ) para prevenir a formação de edema no cérebro.
Realizamos uma ampla abertura na caixa craniana na região do lobo
parietal de cada animal, abrimos as meninges para então implantarmos o polímero
saturado com a ChABC, na concentração de 50 U/mL ou com PBS, sobre o
córtex, exatamente na região do PMBSF (Figura 7).
Figura 7: Ilustração do processo de privação dos ratos e o implante do Elvax®. As vibrissas
foram retiradas desde o momento do nascimento até a idade de P10, todos os dias, com o auxílio
de uma pinça. Após a idade de P10 os animais foram mantidos até o momento da cirurgia. Nas
idades de P20, P40 ou P70 os animais receberam o polímero Elvax® saturado com ChABC ou
com PBS e tiveram sobrevida de 3 dias ou de 10 dias. Os animais operados em P20 foram
sacrificados em P23 ou P30; os animais P40 foram sacrificados em P43 ou P50 e os animais que
sofreram cirurgia em P70 foram sacrificados em P73. Modificado de GLAZEWSKI et al., 2007.
Retirada das
vibrissas de P0 a
P10 todos os dias
Crescime
nto do animal
(P20, P40, P70)
P10
GRUPO 3 DIAS DE
SOBREVIDA APÓS
CIRURGIA
GRUPO 10 DIAS
DE SOBREVIDA
APÓS CIRURGIA
Implante do
Elvax® saturado
com ChABC nas
idades de P20,
P40
ou
P70
Implante do
Elvax® saturado
com ChABC nas
idades de P20 ou
P40
Implante do
Elvax® com PBS
nas idades de P20
ou P40
Implante do
Elvax® com PBS
nas idades de P20,
P40 ou P70
P0
52
Após 3 ou 10 dias, anestesiamos os animais com dose letal de uma mistura
de 75% de cloridrato de cetamina e 25% cloridrato de tiazina pela via
intramuscular e os perfundimos com cerca de 200 mL de salina 0,9% e 600 mL de
paraformaldeído a 4% (PFA, VETEC). Para cada 600 mL de PFA a 4% foram
utilizados 24 g de paraformaldeído (VETEC) diluídos em 600 mL de PBS com
quatro gotas de NaOH 5 M (REAGEN).
Removemos os encéfalos e aplainamos os hemisférios, entre duas lâminas,
por cerca de 12 horas para obtenção de cortes tangenciais em vibrátomo (LEICA)
na espessura de 50 µm. Coletamos os cortes em tampão fosfato 0,1 M (PB, pH
7,4) para os procedimentos histológicos.
3.3. Curva padrão de liberação da condroitinase ABC
Analisamos a taxa de liberação da ChABC pelo polímero Elvax® de duas
formas diferentes para validarmos nossos resultados.
Fizemos a primeira curva através da incubação a 37°C de uma única fatia
do Elvax® saturado com a enzima em 50 µl de PBS, em tubos com tampa do tipo
eppendorf. Cada tubo com o volume descrito representou um ponto da nossa
curva de liberação e foram incubados ao mesmo tempo. Durante uma semana
fizemos a curva com tempos regulares de remoção do Elvax® de cada tubo.
Todos os dias, retiramos o polímero do tubo correspondente ao ponto da curva.
Congelamos o tubo com o volume do PBS mais a enzima que se difundiu do
Elvax® para o tampão a -20°C até que retiramos o último Elvax® do último tubo
para que as futuras análises fossem feitas (Figura 8).
53
Figura 8: Imagem ilustrativa do procedimento para realização da curva 1 de cinética de
liberação da ChABC. Foi observada a liberação em PBS pH 7,4 da ChABC presente no Elvax®
durante intervalos de tempos pré-determinados. O ponto zero foi somente o PBS, utilizado como
branco no momento da leitura a 595 nm feita no ELISA.
Uma segunda curva foi feita incubando, a 37°C, uma única fatia de 200 µm
do polímero em cada tubo do tipo eppendorf com 50 µl de PBS. Nos mesmos
intervalos da curva 1, já descrita, retiramos o volume do tampão e congelamos
imediatamente, enquanto era adicionado 50 µl de PBS na mesma fatia do Elvax®
já incubada. Após a retirada do último volume do tubo as análises começaram a
ser feitas (Figura 9).
X
18 h
0 h
(Elvax® + ChABC) + PBS incubados a 37°C
Retirada do Elvax® + ChABC e armazenagem do PBS dentro do
tubo até o momento de dosagem de proteína no ELISA a 595 nm
24 h
42 h
48 h
66 h
72 h
90 h
96 h
114 h
54
Figura 9: Imagem ilustrativa para o procedimento de realização da curva 2 de cinética de
liberação da ChABC. Foi observada a liberação em PBS pH 7,4 da ChABC presente no Elvax®
durante intervalos de tempos pré-determinados. O ponto zero foi somente o PBS, nosso branco no
momento da leitura a 595 nm feita no ELISA. A diferença para a curva anterior é que foi observado
a liberação de somente 1 Elvax®, ao contrário do experimento anterior em que cada ponto da
curva apresentou 1 Elvax® incubado com o PBS.
A diferença entre as duas curvas é que na curva 1 observamos o
comportamento de liberação da fármaco ao longo do tempo, saturando o tampão
com a enzima, além de considerar que as fatias de Elvax® comportam-se de
maneira semelhante. Na curva 2, cada amostra foi feita utilizando uma única fatia
do polímero. Observamos a liberação de enzima, mas sem saturar o PBS, que era
trocado nos períodos pré-estabelecidos.
Para dosarmos a quantidade de enzima liberada nos dois casos,
analisamos a quantidade de enzima presente em 5 µl de cada amostra congelada,
das duas curvas pelo método de Bradford (1976) (para detalhes ver
NASCIMENTO et al., 2003), com leitura no ELISA, no comprimento de onda de
(Elvax® + ChABC) +
PBS incubado a 37°C
Retirada do PBS e
armazenagem deste a -20°C
até o último ponto ser
coletado
Adição de novo PBS no tubo
com o mesmo Elvax®
anteriormente incubado
18 h
24 h
42 h
48 h
66 h
72 h
90 h
96 h
114 h
Dosagem de proteínas a
595 nm após a retirada do
último ponto da curva.
Novo PBS no mesmo
Elvax®+ ChABC
incubado a 37°C
Adição de novo PBS no
tubo com o mesmo
Elvax® anteriormente
incubado
Novo PBS no mesmo
Elvax®+ ChABC
incubado a 37°C
X
0 h
55
595 nm, e os dados analisados no programa Excel (Microsoft Office 2003) e no
programa GraphPad Prism 4 (2003).
Os resultados observados nas duas curvas foram confrontados para, assim,
validarmos nossos resultados.
3.4. Histoquímica para revelar a atividade da citocromo oxidase
Para revelarmos a atividade da enzima citocromo oxidase (CO) em S1 de
ratos, para assim localizarmos os barris, utilizamos um protocolo adaptado de
Wong-Riley (1979).
Após seccionarmos os tecidos a 50 µm em vibrátomo, lavamos as secções
em PB 0,1 M por três vezes de 10 minutos cada, para retirarmos o excesso do
fixador PFA a 4%. Posteriormente, incubamos os cortes na solução de CO
contendo 0,05% de diaminobenzidina (DAB, SIGMA), 0,02% de catalase (SIGMA)
e 0,03% de citocromo C (SIGMA) dissolvidos em PB 0,1 M (pH 7,2-7,4%), sob
agitação suave e constante por um período de 12 a 16 horas, protegidos da luz e
à temperatura ambiente.
No final do período, lavamos os cortes por duas vezes, 20 minutos cada
lavagem, em PB 0,1 M (pH 7,2-7,4) e os montamos em lâminas gelatinizadas.
3.5. Histoquímica para lectina Vicia villosa
Após corte em vibrátomo a 50 µm e coleta das fatias em PB 0,1 M, lavamos
os cortes com PB por mais três vezes, 10 minutos cada lavagem. Logo em
seguida incubamos o material numa solução contendo lectina Vicia villosa
(VECTOR), à concentração de 50 µg/mL, diluída em Tampão Fosfato-Salina-
56
Triton a 6% (pH 7,2-7,4) (Triton X-100, VETEC) por, no mínimo 16h, com agitação
suave e constante, à temperatura ambiente.
Depois da incubação, lavamos os cortes em PBS 0,1 M (pH 7,2-7,4) por
duas vezes, 10 minutos cada lavagem, seguindo com a incubação numa solução
contendo o complexo avidina-biotina-peroxidase (complexo ABC, VECTOR) (1
gota de A e uma gota de B para cada 5 mL de PB-Triton a 6%) por 24 horas.
Por fim, lavamos novamente os cortes em PB por duas vezes, 20 minutos
cada lavagem, e iniciamos a reação para revelar a peroxidase pelo método da
glicose oxidase-diaminobenzidina-níquel (GND, GIBCO), proposto por Shu e
colaboradores (1988) e adaptado para histoquímica da Vicia villosa (Bahia, 2005).
O controle dessa reação histoquímica foi feito através da incubação das
secções em soluções sem a presença da lectina.
3.6. Lavagem, desidratação e montagem
As secções das reações histoquímicas para a enzima CO e para a lectina
Vv foram montadas em lâminas gelatinizadas. Desidratamos em bateria de álcool
com concentrações de 50%, 70%, 80%, 90% e a 100% (10 minutos em cada
álcool) (VETEC), e clareamos em xileno (10 minutos) (VETEC). Em seguida,
cobrimos as lâminas com lamínula com o auxílio de um meio de inclusão
(Entellan, MERCK).
3.7. Imunofluorescência para detecção de condroitim sulfato
Após o corte dos hemisférios aplainados a 200 µm em vibrátomo,
montamos as fatias em lâminas gelatinizadas e, assim, armazenamos a -20°C até
57
serem processadas para a reação de imunofluorescência para o GAG condroitim
sulfato (CS56, SIGMA) ou condroitim-4-sulfato (C4S, CHEMICON).
É importante lembrar que o anticorpo da empresa Sigma liga-se
diretamente à cadeia de GAG, enquanto o anticorpo da empresa Chemicon liga-se
ao produto da degradação de um proteoglicano, por isso os cortes devem ser
previamente submetidos à clivagem enzimática do GAG, para exposição dos sítios
de reconhecimento dos anticorpos. No caso de nossos experimentos, somente os
cortes correspondentes aos hemisférios-controle foram tratados com a enzima
ChABC antes de serem incubados com o anticorpo da Chemicon, o C4S.
Depois de retiradas da temperatura de -20°C, lavamos as lâminas com PFA
a 4%, para uma melhor fixação dos cortes na superfície das lâminas, por 10
minutos. Em seguida, lavamos o material com PBS-Triton a 6% (PBST) por três
vezes, 10 minutos cada lavagem.
No caso do anticorpo CS56, lavamos os cortes com cloreto de amônio 50
mM por 10 minutos, e novamente com PBST (três vezes de 10 minutos cada),
para então submetermos o material à reação de imunobloqueio com soro normal
de cabra (NGS, INVITROGEN), incubando com PBS-Triton 6%-NGS 20% por 1
hora, a temperatura ambiente. Em seguida, incubamos o material com o anticorpo
primário na diluição de 1:100, por 48 horas, à temperatura de 4°C.
No caso do anticorpo C4S, incubamos os cortes dos hemisférios não-
privados (controle experimental) a 37°C com a enzima ChABC (SIGMA), na
concentração de 0,1 U/mL, enquanto que os cortes do hemisfério direito
permaneciam banhados em PBS. Seguiram-se três lavagens de 10 minutos cada
com PBST e a lavagem de 10 minutos com o cloreto de amônio 50 mM (ISOFAR).
Lavamos novamente com o PBST, por três vezes, 10 minutos cada lavagem, para
58
então imunobloquearmos por 1 hora, à temperatura ambiente utilizando NGS a
20% (PBST 6%-NGS 20%). Em seguida incubamos os cortes com o anticorpo
para C4S na diluição de 1:5000 (PBST + anticorpo), por 48 horas, à temperatura
de 4°C.
Após o período de 48 horas, lavamos os cortes por três vezes, 10 minutos
cada lavagem, com PBS e os incubamos com anticorpo secundário conjugado a
Cy-3 (cabra-anti-camundongo, JACKSON) diluído em PBS nas proporções de
1:200 para o CS56 e de 1:1200 para o C4S, por duas horas, à temperatura
ambiente.
Depois, fizemos mais três lavagens, de 10 minutos cada, em PBS, seguidas
da contra-coloração com DAPI a 100 mg/l (diamino-fenil-indol, SIGMA) durante 5
minutos.
Para finalizar, mais uma lavagem de cinco minutos com PBS e a montagem
das lâminas com N-propil galato 4% (SIGMA) em glicerol 80% diluído em tampão
fosfato 0,1 M pH 8,0, vedadas com esmalte. As lâminas foram conservadas a 4°C
para preservar a fluorescência por até duas semanas.
Lâminas-controle foram preparadas segundo o protocolo acima, somente
omitindo o anticorpo primário.
3.8. Análise dos materiais
Todo o material foi observado em um microscópio Zeiss (Axioplan, Carl
Zeiss) equipado com lâmpada de fluorescência HBO 50W (Carl Zeiss).
Analisamos os cortes, selecionamos e fotografamos utilizando a câmera
Axiovision HRc (Carl Zeiss). Lâminas-controle e experimentais das
59
imunofluorescências foram fotografadas com o mesmo tempo de exposição e com
os mesmos ajustes do programa computacional Axiovision AC (Carl Zeiss).
Todas as imagens foram armazenadas em CD-R e as montagens das
pranchas, além dos ajustes de brilho e contraste, realizadas utilizando o programa
Canvas X (ACD Systems).
Os desenhos esquemáticos, correspondentes aos cortes de CO no
aumento de 2,5x, foram feitos utilizando o programa Corel DRAW 10 (Corel
Corporation, 2000).
4. Resultados
4.1. Cinética de liberação da condroitinase ABC
Para confirmarmos a difusão da enzima ChABC do Elvax® para o meio,
duas curvas de liberação foram feitas de maneiras distintas.
As análises dos dados de cinco experimentos (Figura 10) nos indica que
cada fatia de Elvax® libera uma quantidade de ChABC diferente, porém há
semelhança no comportamento de liberação. Em (A) observamos uma grande
quantidade de enzima liberada nas primeiras horas (18-24 h) e uma liberação alta
em torno de 72 horas em três amostras. Há uma elevação em torno de 96 horas
de incubação. Após 96 horas, a curva cai, indicando uma maior degradação da
enzima do que liberação pelo Elvax®. Tendo em vista a quantidade pequena de
experimentos e que a quantidade de enzima encontrada em solução foi variada, a
curva média apresentou um grande desvio padrão nos pontos analisados (Figura
10 B).
61
(A)
Cinética de liberação da
ChABC pelo Elvax® 40W
Tempo de incubação do
Elvax® 40W + ChABC (horas)
(B)
Cinética de liberação da
ChABC pelo Elvax® 40W
Tempo de incubação do
Elvax® 40W + ChABC (horas)
Figura 10: Cinética de liberação da ChABC pelo Elvax® no modelo de curva 1. (A) A análise
de cinco amostras indica o comportamento singular de cada fatia de Elvax®, porém há o indício de
que a ChABC é liberada em até 96 horas. Cada linha indica um experimento realizado, com seus
pontos de retirada do Elvax® saturado com a ChABC da incubação com PBS. (B) Curva média dos
cinco experimentos realizados indica uma máxima liberação em 96 horas. As barras de erro
indicam o desvio padrão da média.
62
Nas análises de cinética da segunda curva de liberação (Figura 11), quando
um único Elvax® foi utilizado em cada experimento, observamos uma grande
diferença de droga liberada em cada experimento e uma grande variação no
comportamento de cada fatia. Há uma grande quantidade de ChABC sendo
liberado nas primeiras horas pelas fatias de Elvax® (Figura 11 A). Em duas fatias
(curva vermelha e curva azul) mostraram uma tendência de aumento de liberação
em torno de 96 horas, mas não é possível afirmar devido a falta de pontos após
96 horas.
A curva média indica a grande variação na quantidade de enzima liberada
por cada experimento (Figura 11 B). Após a tendência de liberação máxima
observada em 96 h, espera-se que ocorra uma queda na quantidade de fármaco
liberada, como observado na Figura 10.
63
(A)
Tempo de incubação do
Elvax® 40W + ChABC (horas)
Cinética de liberação da
ChABC pelo Elvax® 40W
(B)
Tempo de incubação do
Elvax® 40W + ChABC (horas)
Cinética de liberação da
ChABC pelo Elvax® 40W
Figura 11: Cinética de liberação da ChABC pelo Elvax® no modelo de curva 2. (A) A análise
de três amostras indica o comportamento singular de cada fatia de Elvax®. Cada linha indica um
experimento realizado, com seus pontos de retirada do Elvax® saturado com a ChABC da
incubação com PBS. (B) Curva média dos três experimentos realizados indica que há um aumento
na liberação entre 90 e 96 horas. As barras de erro indicam o desvio padrão da média.
64
4.2. Alterações no padrão de marcação para citocromo oxidase nos barris do
PMBSF
A retirada das vibrissas de um dos lados do focinho de ratos neonatais, nas
idades de P0 a P10 provoca alterações morfológicas no perfil dos barris do
PMBSF. A marcação para citocromo oxidase (CO) indicou a ausência de alguns
barris e de alguns septos no PMBSF do hemisfério privado.
Nas imagens da Figura 12 (A-C) temos o padrão de marcação para a CO
em um hemisfério normal adulto não-privado. Observamos a presença de todos os
barris e dos septos entre eles. Nas fotomicrografias (D-F) temos um exemplo de
hemisfério privado, com a ausência de barris (D) e de septos entre os barris (F),
em diferentes aumentos. Note que em (A) não é possível visualizar todos os barris
no mesmo corte, no entanto, uma análise cuidadosa os evidencia nos cortes
adjacentes. Tomamos o cuidado de checar todas as secções apresentando barris,
para que não ocorresse um erro na interpretação dos resultados, nos certificando
da ausência de determinados barris nos hemisférios privados. Para exemplificar,
na Figura 13 apresentamos cortes seqüenciais da Figura 12, mostrando que no
hemisfério não-privado os barris ausentes na secção (A) encontram-se na secção
seguinte, corte mais profundo (B). No hemisfério privado (D, E, F), note que o
campo do PMBSF encontra-se presente somente no corte mais superficial (D).
Para uma melhor visualização dos barris ausentes nas fotomicrografias da
Figura 12, desenhos esquemáticos dos cortes do aumento de 2.5x foram feitos
com auxílio de programa computacional (Figura 14). Na Figura 14 B notamos a
ausência de poucos barris (C3, E4, E2) e a fusão de outros barris, devido à
ausência de septos entre eles (D1 e D2).
65
(A) (B) (C)
(D) (E) (F)
Figura 12: Marcação para CO na região do PMBSF de ratos sacrificados em P73, privados
no período pós-natal de P0 a P10. A retirada das vibrissas nos períodos iniciais pós-natal
provoca alterações no padrão estrutural do campo de barris. No hemisfério não privado,
apresentado nas figuras (A-C) em diferentes aumentos, nota-se o perfil do padrão de marcação do
PMBSF através da CO. No hemisfério privado, representado nas figuras (D-F), observamos a
ausência de alguns barris (seta na figura D), barris mal formados (seta branca, figura E) ou
ausência de septos entre os barris de uma mesma fileira (setas pretas, figura E). Comparando as
figuras de maior aumento (C, F), observamos que na figura (C) septos e barris bem evidentes,
enquanto que na figura (F) observamos os barris, mas o septo não é tão evidente. Os grupos de
figuras representando os hemisférios não privado (A-C) e o privado (D-F) estão agrupados em
ordem crescente de aumento: 2.5x (A, D), barra de escala 200 µm; 5x (B, E), barra de escala 200
µm e 10x (C, F), barra de escala 200 µm. As áreas de aumento estão indicadas pelas linhas
tracejadas nas figuras à esquerda.
66
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
(F)
Figura 13: Cortes seqüenciais da região do PMBSF de ratos sacrificados em P73, privados
no período pós-natal de P0 a P10. (A-C) Hemisfério não-privado. Observe que a análise do
campo do PMBSF deve ser minuciosa, visto que barris ausentes em uma secção (A) encontram-se
presente no corte posterior (B). Cortes mais profundos não apresentam barris do PMBSF (C). (D-
F) Hemisfério privado. A ausência de barris pode ser confirmada pela análise dos cortes
seqüenciais, visto que barris do PMBSF ausentes no corte (D) não se encontram presentes na
secção seguinte (E), reiterando que a retirada das vibrissas nos primeiros dias de vida pós-natal
provoca desorganização do PMBSF. Aumento de 2.5x (A-F), barra de escala: 200 µm.
67
E1
E2
E3
E4
E5
D2
D3
D4
D5
C1
C2
C3
C4
B1
B2
B3
B4
A1
A2
A3
A4
(A)
A1
A2
A3
A4
B1
B2
B3
B4
C3
C4
C5
D1/D2
D3
D4
D5
E1
E3
E5
(B)
Figura 14: Desenho da região do PMBSF de ratos sacrificados em P73, privados no período
pós-natal de P0 a P10. A retirada das vibrissas nos períodos iniciais pós-natal provoca alterações
no padrão estrutural do campo de barris. (A) Hemisfério não-privado com barris e septos bem
formados. (B) No hemisfério privado, observamos a ausência de alguns barris (C1 e C2, por
exemplo), e a fusão de outros (A4 e A5, por exemplo), dada a ausência do septo entre eles. As
imagens foram geradas dos cortes da Figura 12 A e 13 D, aumento de 2.5x das secções reagidas
para a enzima CO. Aumento: 2.5x (A, B), barra de escala 200 µm.
68
4.3. Recuperação da morfologia do campo dos barris do PMBSF após
implante de Elvax® saturado com a enzima condroitinase ABC
O primeiro grupo de animais analisados foram aqueles que tiveram suas
vibrissas retiradas de um lado do focinho entre P0 e P10 e tiveram o Elvax®
saturado com ChABC ou com PBS implantados no hemisfério privado na idade de
P20. Após três dias (P23) ou dez dias (P30) os animais foram sacrificados, seus
hemisférios dissecados, aplanados e cortados para análise histológica.
Os resultados obtidos desse grupo de animais estão demonstrados nas
imagens seguintes. As Figuras 15 A, 15 B e 15 C do hemisfério não-privado,
mostram a presença de todos os septos e barris, como no hemisfério não-privado
dos animais que não sofreram o implante (Figura 12). Após três dias do implante
do Elvax® saturado com a enzima ChABC (Figuras 15 G a I) ou com PBS
(Figuras 15 D a F), podemos observar que há desorganização no PMBSF, mas
esta é maior nos animais que só receberam o PBS. Na Figura 15 G observamos
um maior número de barris e septos comparado ao encontrado nos animais
controles, exemplificado pela imagem na Figura 15 D. Em uma análise qualitativa,
observamos que a desorganização nos animais que receberam o Elvax® + PBS é
semelhante à encontrada nos animais privados que não receberam o implante de
Elvax®.
A mesma ausência de septos e barris foi encontrada nos animais controle
que receberam Elvax® + PBS e tiveram sobrevida de dez dias (Figura 15 J a L).
Uma grande organização foi encontrada após análise da marcação para CO dos
hemisférios privados que receberam o polímero saturado com a ChABC, em
animais que tiveram sobrevida de 10 dias a partir do implante. Barris (Figura 15 N)
e septos (Figura 15 O) bem formados foram encontrados em todos os animais
69
deste grupo experimental. Note uma grande desorganização no PMBSF de
animais que receberam o Elvax® com PBS (Figura 16 B, D) em comparação com
os animais que receberam o polímero saturado com a enzima ChABC (Figura 16
C, E). Na Figura 16 A observamos claramente a presença de todos os barris do
PMBSF no hemisfério não-privado em ambas as idades de sacrifício do animal.
70
(G)
P23 (ChABC)
(H)
P23 (ChABC
)
(I)
P23 (ChABC)
(A)
P23
(B)
P23
(C)
P23
(D)
P23 (PBS)
(E)
P23 (PBS)
(F)
P23 (PBS
)
(M)
P30 (ChABC)
(N)
P30 (ChABC)
(O)
P30 (ChABC)
(J)
P30 (PBS)
(K)
P30 (PBS)
(L)
P30 (PBS)
Figura 15: Marcação para CO no PMBSF de ratos sacrificados em P23 ou P30, privados no
período pós-natal de P0 a P10, e que receberam o implante de Elvax® + ChABC ou Elvax® +
PBS na idade de P20. (A-C) Hemisfério controle não-privado. (D-O) Fotomicrografia de
hemisférios privados, que receberam implante de Elvax® + PBS (D-F, J-L) ou Elvax® saturado
com a ChABC (G-I, M-O). Nos animais que receberam a ChABC observamos após 3 dias do
implante (G-I) desorganização no campo do PMBSF, com ausência de alguns septos e de alguns
barris (setas nas figuras D e E), mas menos desorganizados que o encontrado no hemisfério que
recebeu Elvax® + PBS (D-F). Após 10 dias do implante (M-O) do Elvax® saturado com ChABC, já
havia organização bem maior do que após 3 dias de implante, com septos (seta branca, figura O) e
barris (seta preta, figura N) melhor formados. O grupo controle, que em P20 recebeu o Elvax® com
PBS e foram sacrificados 3 (D-F) ou 10 (J-L) dias após o implante, observamos desorganização no
campo do PMBSF, independente do período de exposição ao Elvax® + PBS, indicando que este
não interfere na reorganização plástica. Note a ausência de muitos barris (seta preta, D, J, K, L) e
ausência de septos entre barris (seta branca E, F). Os grupos de figuras representando os
hemisférios não-privado (A-C) e os privados (D-O) estão agrupados em ordem crescente de
aumento: 2.5x (A, D, G, J, M), barra de escala 200 µm; 5x (B, E, H, K, N), barra de escala 200 µm
e 10 µm (C, F, I, L, O), barra de escala 200 µm. As áreas do aumento da figura seguinte de cada
grupo de hemisférios estão representadas com um tracejado na imagem à esquerda.
71
E1
E2
E3
E4
E5
E6
E7
E8
E9
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
B1
B2
B3
B4
A1
A2
A3
A4
E1/E2
D1
C1
B1
A1
E3
E4
E5
E6
D2
D3
D4
D5
C2/C3
C4
B2
B3/B4
E1
E2
E3
E4
E5
E6
E7
E8
E9
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
B1
B2
B3
B4
A1/A2
A3/A4
E1/E2/E3/E4
E5
E6
E7
E8
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
C1
C2
C3
C4/C5
C6
C7
B3
A1
A2
A3
A4
B1
B2
B4
C1
C2
C3
B3
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
C4
C5
C6
C7
E2/E3E4
E5
E6
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
Figura 16: Desenho da região do PMBSF de ratos sacrificados em P23 ou P30, privados no
período pós-natal de P0 a P10, e que receberam o implante de Elvax® + ChABC ou Elvax® +
PBS na idade de P20. (A) Hemisfério controle não-privado de animal P30, somente para mostrar a
organização normal do PMBSF. A retirada das vibrissas nos períodos iniciais pós-natal provoca
alterações no padrão estrutural do campo de barris. Desenho de hemisférios privados que
receberam implante de Elvax® com PBS (B, D) ou Elvax® saturado com a ChABC (C, E). Para
detalhes ver Figura 15, aumento de 2.5x das secções reagidas para a enzima CO, que serviram de
modelo das ilustrações. Barra de escala 100 µm.
72
O segundo grupo com a marcação para CO analisados são de animais que
foram privados entre P0 e P10 e receberam o implante do Elvax® saturado com
ChABC ou com PBS na idade de P40. Esses foram sacrificados, três (P43) ou dez
(P50) dias, após a cirurgia de implante do Elvax®.
Assim como observado no grupo de animais que recebeu o implante de
Elvax® em P20 (Figuras 15 e 16), observamos a presença de um maior número
de barris do PMBSF após o período de dez dias do implante do Elvax® saturado
com ChABC na região de S1 (Figura 17 J, L). Três dias após o implante ainda
havia uma grande desorganização (Figura 17 D), ao contrário do observada no
grupo que recebeu o implante de Elvax® em P20 (Figura 15 D-I), quando em três
dias já havia sido observada uma organização maior do que a encontrada nos
animais controle privados que não receberam implante de qualquer Elvax®
(Figura 12 D-F) e animais controle que receberam o Elvax® com PBS (Figura 17
G-I). Comparando as imagens de hemisfério privado (Figura 17 G-I) que
receberam o Elvax® com PBS e o hemisfério privado do animal controle (Figura
12), observamos que dez dias após o implante a desorganização no campo do
PMBSF é mantida (Figura 17 C), com ausência de alguns barris e de fusão entre
outros (ausência de septos).
Para melhor detalhamento das imagens apresentadas na Figura 17 A, D, G,
J, desenhos foram feitos sobre as figuras, mostrando com mais clareza a ausência
de barris e septos nos hemisférios privados e a presença desses após o
tratamento com a ChABC e quais barris estão ausentes (Figura 18).
73
(G)
P50 (PBS)
(H)
P50 (PBS)
(I)
P50 (PBS)
(D)
P43 (ChABC)
(E)
P43 (ChABC)
(F)
P43 (ChABC)
(A)
P43
(B)
P43
(C)
P43
(J)
P50 (ChABC)
(K)
P50 (ChABC)
(L)
P50 (ChABC)
Figura 17: Marcação para CO na região do PMBSF de ratos sacrificados em P43 ou P50,
privados no período pós-natal de P0 a P10 e que sofreram o implante de Elvax® + ChABC
ou Elvax® + PBS na idade de P40. (A-C) Hemisfério controle não-privado. (D-L) Fotomicrografia
de hemisférios privados que sofreram implante de Elvax® saturado com a ChABC (D-F, J-L) ou
Elvax® com PBS (G-I). Após 3 dias do implante de ChABC (D-F) havia uma desorganização no
campo dos barris do PMBSF, com ausência de alguns septos e de alguns barris (indicado pelas
setas nas figuras D-F). Porém, após 10 dias do implante (J-K) já havia organização mais evidente,
com septos (seta branca, figura L) e barris (seta preta, figura L) quase que totalmente formados. O
grupo controle, no qual os animais em P40 receberam o Elvax® com PBS e foram sacrificados 10
dias após o implante (G-I), observamos desorganização no PMBSF, indicando que o Elvax®
sozinho não interfere na plasticidade cortical. Note a ausência de muitos barris (seta preta, figura
G) e de septos (seta branca, figura H e I). Os grupos de figuras representando os hemisférios não-
privados (A-C) e os privados (D-L) estão agrupados em ordem crescente de aumento: 2.5x (A, D,
G, J), barra de escala 200 µm; 5x (B, E, H, K), barra de escala 200 µm e 10x (C, F, I, L), barra de
escala 200 µm. As áreas do aumento da figura seguinte de cada grupo de hemisférios estão
representadas com um tracejado na imagem à esquerda.
74
E1
E2
E3
E4
E5
D1
C1
B1
A1
A2
A3
A4
B2
B3
B4
C2
C3
C4
D2
D3
D4
D5
C5
E1
E2
E3
E4
E5
E6
D2
D3
D4
D5
D6
E1
E2
E3
E4
E5
D1
D2
D3
D4
D5
C1/C2
C3
C4
B1
B2
E1
E2
E3
E4
E5
D1
D2
D3
D4
D5
C1
C2
C3
C4
C5
B1
B2
B4
B3
A1
A2
A3
(C)
(B)
(D)
(A)
A4
Figura 18: Desenho da região do PMBSF de ratos sacrificados em P43 ou P50, privados no
período pós-natal de P0 a P10, e que receberam o implante de Elvax® + ChABC ou Elvax® +
PBS na idade de 40. (A) Hemisfério controle não-privado. Hemisférios privados que receberam
implante de Elvax® com PBS (C) ou Elvax® saturado com a ChABC (B, D). Para detalhes ver
Figura 17, aumento de 2.5x das secções reagidas para a enzima CO, que serviram de modelo das
ilustrações. Barra de escala 100 µm.
75
O último grupo analisado foi o de animais que tiveram as vibrissas de um
dos lados do focinho removidas nos dez primeiros dias de vida pós-natal e que
receberam o implante do Elvax® na idade de P70, sendo sacrificados três dias
após implante.
Após três dias do implante do polímero saturado com a ChABC (Figuras 19
G-I) o grau de desorganização encontrado foi um pouco maior do que o
encontrado nos hemisférios que receberam o Elvax® com PBS (Figuras 19 D-F),
porém menor do que a encontrada nos animais que sofreram o implante em P20 e
foram sacrificados em P23 (Figuras 15), porém como a desorganização
encontrada no modelo é aleatória não podemos concluir se esse menor
desorganização é por conta da ChABC.
Novamente foram feitos desenhos sob as imagens das Figuras 20 A, D e G,
para uma melhor visualização dos detalhes (Figura 20).
76
(D)
P73 (PBS)
(E)
P73 (PBS)
(F)
P73 (PBS)
(A)
P73
(B)
P73
(C)
P73
(G)
P73 (ChABC)
(H)
P73 (ChABC)
(I)
P73 (ChABC)
Figura 19: Marcação para CO na região do PMBSF de ratos sacrificados em P73, privados
no período pós-natal de P0 a P10 e que sofreram o implante de Elvax® + ChABC ou Elvax®
+ PBS na idade de P70. (A-C) Hemisfério controle não-privado. (D-I) Fotomicrografia de
hemisférios privados que receberam implante de Elvax® com PBS (D-F) ou Elvax® saturado com
a ChABC (G-I). Após 3 dias do implante de ChABC (G-I) havia um grau de desorganização no
campo dos barris do PMBSF, com ausência de alguns septos e de alguns barris (indicado pelas
setas nas figuras G-I), mas a organização é maior do que a encontrada nos animais controle, que
receberam o Elvax®+PBS ( setas nas figuras D-F). Os grupos de figuras representando os
hemisférios não-privados (A-C) e os privados (D-I) estão agrupados em ordem crescente de
aumento: 2.5x (A, D, G), barra de escala 200 µm; 5x (B, E, H), barra de escala 200 µm e 10x (C, F,
I), barra de escala 200 µm. A área do aumento está indicada nas figuras menores agrupadas ao
lado direito das fotos; o aumento é sempre em relação à figura anterior do grupo e os retângulos
indicam a área evidenciada na figura maior.
77
A1
B1
B2
C1
C2
D1
D2
D3
E1
E2
E3
A2 A3
A4
B1
B2
B3
B4
C1
C2
C3
C4
C5
D2
D3
D4
D5
E4
E1
E2
E3
E4
E5
D1
D2
D3
D4
D5
C1
C2
C3
C4
C5
B1
B2
B3
B4
A1
A2
A3
A4
(C)
(B)
(A)
Figura 20: Desenho da região do PMBSF de ratos sacrificados em P73, privados no período
pós-natal de P0 a P10, e que receberam o implante de Elvax® + ChABC ou Elvax® + PBS na
idade de 70. (A) Hemisfério controle não-privado. Hemisférios privados que receberam implante
de Elvax® com PBS (B) ou Elvax® saturado com a ChABC (C). Para detalhes ver Figura 19,
aumento de 2.5x das secções reagidas para a enzima CO, que serviram de modelo das
ilustrações. Barra de escala 100 µm.
78
4.4. Ausência de marcação para o glicosaminoglicanos de condroitim sulfato
após o implante do Elvax® saturado com a condroitinase ABC
Para confirmarmos que a enzima condroitinase ABC está se difundindo
pelo córtex na região do campo dos barris e promovendo a plasticidade,
constatada pela reorganização morfológica anteriormente observada pela
marcação para a enzima CO, fizemos marcação imunoshistoquímica com o
anticorpo que reconhece o GAG do proteoglicano (CS56, SIGMA) e com o
anticorpo que reconhece um epítopo que fica exposto no núcleo protéico após
degradação do GAG (C4S, CHEMICON).
Na marcação por imunofluorescência com o anticorpo que reconhece o CS,
tivemos marcação nos hemisférios controle não-privado (Figura 21 A, E) e nos
hemisférios privados que tiveram o implante do Elvax® com PBS (Figura 25 B, F).
Nos cortes de hemisférios privados de animais que receberam o Elvax® saturado
com a ChABC não encontramos marcação para esse anticorpo (Figura 21 C, G),
assim como o observado no controle da imunohistoquímica (cortes que não
receberam anticorpo primário) (Figura 21 D, H).
Esta ausência de marcação nos hemisférios que entraram em contato com
o Elvax® saturado com a enzima apresenta-se como um forte indício de que a
condroitinase está se difundindo do Elvax® para o tecido nervoso e está havendo
atividade enzimática, atuando de modo eficaz na degradação dos GAGs do
proteoglicano.
79
Figura 21: Marcação do anticorpo CS56 (SIGMA) na região do PMBSF de ratos sacrificados
em P73, privados no período pós-natal de P0 a P10 e que sofreram o implante de Elvax® +
ChABC ou Elvax® + PBS na idade de P70. (A, E) Hemisfério controle não-privado. (B, F)
Fotomicrografia de hemisfério privados que sofreu implante de Elvax® com PBS. (C, G)
Fotomicrografia de hemisfério privados que sofreu implante de Elvax® saturado com a ChABC. (D,
H) Controle da imunohistoquímica, fatias de hemisfério controle não-privados, não recebendo o
anticorpo CS56 durante o período de incubação. Para uma melhor visualização, as
fotomicrografias de mesmo aumento e das diferentes situações analisadas foram agrupadas. (A-D)
No aumento de 40x, a marcação específica no hemisfério não-privado (A) e no privado, que
recebeu Elvax®+PBS (B), é evidente, não apresentando dupla marcação com o DAPI, ou seja, a
marcação não é nuclear. Neste aumento, podemos observar claramente que não há marcação nos
cortes de hemisfério que recebeu Elvax®+ChABC (C), semelhando com os cortes de hemisfério
controle não-privado que não recebem o anticorpo primário CS56 (D). Setas em (A) e (B) mostram
marcação específica de matriz extracelular (ver setas nas figuras de sobreposição das imagens no
mesmo local das imagens de CS56). Barras de escala: (A-D) 20 µm. As marcações para o
anticorpo CS56 são representadas das imagens da coluna à esquerda, em vermelho; a
contracoloração com DAPI encontra-se na coluna central.
80
Figura 21: Continuação. No aumento de 100x, a marcação específica na matriz extracelular é
claramente observada no hemisfério não-privado (E) e no privado que recebeu Elvax®+PBS (F).
Ausência de marcação clara nos cortes de hemisfério privado que recebeu Elvax®+ChABC (G),
semelhando com os cortes de hemisfério controle não-privado, os que não receberam o anticorpo
primário CS56 (H). Setas em (E) e (F) mostram marcação específica de matriz extracelular (ver
setas nas figuras de dupla marcação no mesmo local das imagens de CS56) (seta branca em M e
N indicando núcleo). Barras de escala: (E-H) 5 µm.
81
A imunohistoquímica para o anticorpo que reconhece um epítopo exposto
no núcleo protéico após a digestão dos GAGs do proteoglicano pela ChABC
também confirmou a ação da enzima liberada pelo Elvax®.
Antes da marcação dos hemisférios-controle não-privados, os cortes foram
tratados com a enzima ChABC, antes da incubação com o anticorpo (Figura 22 A).
Ao contrário do hemisfério-controle, os cortes correspondentes aos hemisférios
privados não receberam a enzima antes da incubação para o anticorpo primário,
justamente para sabermos se a enzima liberada pelo polímero está ativa no córtex
dos animais após três dias do implante.
Encontramos marcação para o anticorpo C4S nos hemisférios que
receberam o Elvax® saturado com ChABC (Figura 22 B) e nenhuma marcação
nos hemisférios privados que receberam o Elvax® com PBS (Figura 22 C).
Não foi encontrada marcação com o anticorpo C4S em cortes de
hemisférios privados que receberam o Elvax® saturado com a ChABC, nos
indicando que após dez dias do implante não há mais enzima sendo liberada em
quantidade para agir no córtex.
82
Figura 22: Marcação para anticorpo C4S (Chemicon) na região do PMBSF de ratos
sacrificados em P73, privado no período pós-natal de P0 a P10 e que sofreram o implante de
Elvax® + ChABC ou Elvax® + PBS na idade de P70. (A) Hemisfério controle não-privado. (B)
Fotomicrografia de hemisfério privado que sofreu implante de Elvax® saturado com a ChABC. (C)
Fotomicrografia de hemisfério privado, que sofreu implante de Elvax® com PBS. A presença de
marcação ocorre em (A) porque os cortes foram tratados com a enzima antes de serem incubados
cm o anticorpo. Os cortes de hemisférios que receberam Elvax®+ChABC ou Elvax®+PBS não
foram tratados com a enzima antes da incubação, por isso não observamos a marcação no
Elvax®+PBS (C), enquanto que no Elvax®+ChABC existe um marcação nos cortes mais
superficiais, nos cortes que apresentam o campo de barris do PMBSF (B). As marcações para o
anticorpo C4S são representadas das imagens da coluna à esquerda, em vermelho; a contra
coloração com DAPI encontra-se na coluna central e a sobreposição das imagens, na coluna da
direita. Setas em (A) e (B) mostram sinais de marcação para o anticorpo. Barras de escala: (A-C)
10 µm.
83
Além da imunosfluorescência para os dois anticorpos nos hemisférios
privados que sofreram implante tanto do Elvax® com PBS quanto com Elvax®
saturado com ChABC, também observamos a ação da ChABC sobre o GAG do
PGCS através de imunohistoquímica para a lectina
Vicia villosa
. A marcação dos
septos entre os barris foi encontrada no hemisfério controle não-privado (Figura 23
A-C) e entre os septos de alguns barris existentes nos hemisférios privados que
receberam o Elvax® com PBS (Figura 23 D-F).
Nos hemisférios privados, que receberam o implante do Elvax® saturado
com a ChABC, observamos ausência de marcação para a lectina nos cortes mais
superficiais na região diretamente abaixo do local de implante do polímero (Figura
23 G-I). Nos cortes mais profundos a marcação da lectina foi igual à encontrada
nos hemisférios-controle não-privados ou nos privados que receberam o Elvax®
com PBS (Figura 23 J-O).
84
Figura 23: Marcação para lectina Vicia villosa na região do PMBSF de ratos sacrificados em
P43, privados no período pós-natal de P0 a P10 e que sofreram o implante de Elvax® +
ChABC ou Elvax® + PBS na idade de P40. (A-C) Aumentos crescentes da área de PMBSF do
hemisfério controle não-privado. Em (B) a seta indica um barris do PMBSF. (D-F)Hemisfério
privado que sofreu implante de Elvax® com PBS evidenciando alguns barris do PMBSF. (G-O)
Hemisfério privado que sofreu implante de Elvax® saturado com ChABC, observando pouca
marcação nos cortes mais superficiais em que encontra-se o PMBSF (seta Figura I), aumentando
a quantidade de células marcadas nos cortes mais profundos (J-O). Em G e H, imagens de mesmo
aumento retiradas do mesmo corte onde deveria estar presente o PMBSF de animal privado e
podemos observar que na região exatamente abaixo do local de implante do Elvax® não
encontramos marcação para a lectina (G) e numa região mais distante do implante já encontramos
algumas poucas células marcadas (H). Nos cortes de hemisférios controle que receberam
Elvax®+PBS a marcação está presente de maneira difusa devido à ausência de muitos barris e
septos por conta de privação nos primeiros dias pós-natal. Aumentos: 5x (A, D, G, J, M), barra de
escala 200 µm; 10x (B, E, H, N), barra de escala 200 µm e 20x (C, F, I, L, O), barra de escala 200
µm. CSG: camada supragranular, CG: camada granular, CIG: camada infragranular.
85
Análises para lectina Vv de hemisférios cerebrais de animais privados entre
P0 e P10 e que receberam implantes do Elvax® saturado com ChABC ou com
PBS nas mesmas idades da análise da CO, mostraram que, após 10 dias de
implante, houve marcação para a lectina nos hemisférios que receberam a enzima
(Figura 24). Isso indica que após dez dias não há mais condroitinase no córtex e
que o Elvax® provavelmente liberou a quantidade total de enzima existente no
seu interior.
86
(C)
(A)
(B)
Figura 24: Marcação para lectina Vicia villosa na região do PMBSF de ratos sacrificados em
P50, privação no período pós-natal de P0 a P10 e que sofreram o implante de Elvax® +
ChABC ou de Elvax® + PBS na idade de P40. (A) Hemisfério controle não-privado e que não
sofreu implante de qualquer Elvax®. (B) Hemisfério privado que sofreu implante de Elvax®+PBS.
(C) Hemisfério controle privado que sofreu implante de Elvax® saturado com ChABC. Imagem
representando cortes que apresentam a região dos barris do PMBSF. Em todos os casos há
presença de marcação para a lectina, indicando que, após 10 dias do implante, já ocorreu à ação
enzima e esta já foi degradada pelo organismo. Aumento de 1.25x, barra de escala 100 µm.
5. Discussão
Apesar do SNC apresentar uma capacidade limitada de autorreparação,
evidências indicam que o cérebro pode apresentar uma capacidade plástica que
pode contribuir com sua recuperação funcional. Há um considerável interesse em
identificar moléculas que podem representar alvos para promoção de plasticidade.
Assim, moléculas como fatores de crescimento, proteases ou moléculas de
adesão celular, presentes durante o desenvolvimento do SNC são candidatas a
um interesse especial (HÖKE, 2005; MATESZ, 2005).
Uma grande atenção está sendo dada aos PGCS, já que estes possuem
funções importantes em várias doenças e injúrias do SNC (GALTREY &
FAWCETT, 2007). Após uma lesão, por exemplo, o aumento na expressão de
PGCS contribui para a inibição da regeneração axonal e restringe a plasticidade.
A reorganização do circuito neural contribui com a recuperação após uma lesão
cerebral (KISS
et al.
, 2001).
Porém, antes de sabermos como o SNC de adultos reage a tratamentos
que apresentam como foco os proteoglicanos estudados, é importante sabermos
como um cérebro sem lesões se comporta quando ocorre a remoção do CS.
Tratamentos com enzimas que degradam proteoglicanos estão sendo largamente
utilizados em estudos que apresentam como alvo a promoção de plasticidade em
diferentes áreas do SNC (MASSEY
et al.
, 2006).
Estudos com animais mostram que as representações corticais são
capazes de se alterar ao longo da vida por influências de estímulos sensoriais ou
do ambiente. No caso do córtex somestésico, há necessidade de uma atividade
periférica apropriada durante os primeiros momentos do período crítico para a
88
formação correta do seu padrão cortical (Huntley, 1997). Aqui, nós demonstramos
que nosso modelo de privação alterou o padrão morfológico do campo dos barris
do PMBSF, porém não foi possível determinar de modo quantitativo se houve uma
diminuição no número de células que apresentam as redes perineuronais, como
sugerido por McRae e colaboradores em seu recente estudo (2007).
5.1. Considerações técnicas
Estudos prévios utilizando a ChABC para promover a regeneração do SNC
utilizaram a infusão contínua (YICK
et al
., 2000; CHAU
et al
., 2004), repetidas
injeções no local (MOON
et al
., 2001; BRADBURY
et al
., 2002) ou a administração
de uma única dose nas proximidades do sítio da lesão (LIN
et al
., 2008). Para
evitar lesões no córtex dos animais e, assim, alterar a expressão do PGCS no
local, sugerimos o implante do polímero de Elvax® 40 saturado com a enzima
sobre a região onde desejamos a degradação do proteoglicano, visando um
aumento da plasticidade.
A eficácia do Elvax® como veículo para que uma fármaco difunda-se para o
SNC é bem descrita para fármacos bloqueadores do receptor NMDA, seja
observando efeitos plásticos durante o desenvolvimento da medula (BEGGS
et al
.,
2002) ou do sistema retinotectal (RENTERÍA
et al
., 1999). Smith e colaboradores
(1995) indicam que a máxima liberação de fármacos pelo Elvax® dá-se entre o
segundo e o terceiro dia após implante. Quando fizemos as análises dos córtices
após dez dias do implante, observamos a reorganização do PMBSF; porém os
experimentos de imunofluorescência e de imunohistoquímica indicavam que o
proteoglicano estava íntegro (ver item 4.4 em Resultados). Após três dias de
implante o proteoglicano está sendo degradado, mas a plasticidade parece mais
89
evidente nos animais privados entre P0 e P10 e que sofreram o implante do
polímero Elvax® saturado com a ChABC na idade de P20 (Figuras 15 e 16).
Para verificarmos se a liberação da enzima ChABC é semelhante à
liberação das outros fármacos que foram saturadas em Elvax®, fizemos os
ensaios de cinética de liberação. Duas formas de medir a liberação de ChABC
pelo Elvax® foram feitas para que pudéssemos observar atividade ao longo do
tempo, partindo do princípio de que todas as fatias do polímero apresentam o
mesmo comportamento (ver item 4.1 em Resultados). Inicialmente observamos a
liberação do fármaco ao longo do tempo, saturando o PBS com a enzima que
estava sendo liberada pelo polímero. A seguir, analisamos a atividade de um
único Elvax® por vez, observando a liberação de ChABC ao longo do tempo em
uma solução tampão que sempre estava sendo trocada (ver ítem 4.1 em
Resultados). As análises das curvas de liberação indica que há uma liberação
inicial da ChABC em cerca de 24 horas e uma liberação alta até 96 horas. Há
indicação de que após o quarto dia, a quantidade de enzima liberada pelo Elvax®
é muito baixa, o que explica a ausência de marcação com o anticorpo C4S no
décimo dia após o transplante (ver item 4.4 em Resultados). Transportando o
ensaio de cinética de liberação enzimática para o que estaria acontecendo nos
animais
in vivo
sugerimos que logo após o implante ocorre uma difusão das
moléculas de ChABC que estão na superfície da fatia de Elvax®. Essas moléculas
se difundiriam pelo tecido cortical de forma lenta. Enquanto as moléculas de
ChABC se difundem pelo tecido, elas digerem o GAG de CS, além de sofrer
degradação pelo organismo. Por fim, as moléculas da enzima localizadas mais no
centro da fatia do Elvax® acabam por ser liberadas até o quarto dia de implante.
90
Após o quinto dia ocorre uma liberação residual que, segundo a literatura, pode
prosseguir por até dois meses (SMITH
et al
., 1995; REIPRICH
et al
., 2004).
Nossos resultados mostram uma ação imediata da enzima ChABC, devido
aos indícios de uma rápida plasticidade observada através da reatividade à
citocromo oxidase. Como a liberação da enzima diminui em torno do quinto dia, no
décimo dia a ação da enzima deve ser muito baixa se ainda houver, visto a
presença de marcação para lectina dez dias após o implante (Figura 24). Por
conta disso, o campo do PMBSF tem seu período de plasticidade concluído e
ocorre o reestabelecimento das redes perineuronais com a presença do PGCS.
Lin e colaboradores (2008) observaram a presença da enzima ChABC após dez
dias de uma única injeção, utilizando anticorpo específico para reconhecer a
ChABC, o que poderia ter nos ajudado indicando se após o décimo dia ainda
temos a presença das moléculas da enzima no tecido nervoso do animal
submetido ao tratamento.
Não notamos diferença na resposta à reorganização plástica, após dez dias
de implante, entre os animais que receberam o Elvax® saturado com a
condroitinase mais próximos do período de retirada das vibrissas (animais
operados em P20) e os animais operados em um período mais tardio (P40 e P70).
Notamos que o animal operado em P20 parece responder mais rápido ao
tratamento quando analisamos seu córtex após três dias do implante (ver Figuras
12 e 13 em Resultados).
91
5.2. Alteração no Campo dos Barris
Nos primeiros dias pós-natais de roedores, o córtex ainda encontra-se em
desenvolvimento, tornando possível os estudos do estabelecimento dos mapas
topográficos e experimentos que influenciam suas formas finais (FOX, 2002). Os
mapas somatotópicos são formados principalmente na primeira semana pós-natal,
quando as células corticais da camada IV formam a estrutura característica dos
barris, apesar dos aferentes talâmicos já terem chegado ao córtex ainda na fase
pré-natal (KILLACKEY
et al
., 1995).
Em nossos estudos, a retirada das vibrissas foi feita diariamente de forma a
não causar danos nos folículos e nas terminações nervosas, ao longo dos dez
primeiros dias de vida pós-natal, visto que a plasticidade diminui rapidamente na
camada IV entre P0 e P4 (FOX, 1992). Modelos anteriormente descritos (FOX,
1992; McRAE
et al
., 2007) indicam que, para que ocorra um total desarranjo do
PMBSF é preciso que as vibrissas sejam retiradas por um longo intervalo de
tempo, por dias alternados, para que elas não cresçam, sendo diferente a
resposta quando as vibrissas são retiradas nos períodos iniciais de vida pós-natal
ou em períodos mais tardios, na fase adulta.
No caso do modelo deste estudo, a formação de alguns barris mesmo após
a privação mostra que o período crítico desses animais é mais tardio, além do
décimo dia. Nós encontramos uma moderada alteração do PMBSF após a
privação, provavelmente suficiente para alterações na conectividade do córtex de
barris, mas insuficiente para uma extensa alteração na organização colunar, tal
como evidenciado pela marcação para CO. Trabalhos presentes na literatura
indicam que o período crítico do PMBSF limita-se à idade de P4 (WOOLSEY &
WANN, 1976; HENSCH, 2004), mas grande parte desses são estudos analisando
92
o que ocorre quando há a retirada de uma vibrissa ou uma fileira delas (FOX,
1992; HODGE
et al.
, 2002).
Visto que o estabelecimento das redes perineuronais no padrão adulto é
encontrado a partir da idade de P24 (BAHIA, 2005), poderíamos acreditar que a
partir daí se dá o final do período crítico de S1 nesses animais e para que
houvesse uma total perturbação do campo dos barris, as vibrissas deveriam ser
retiradas todos os dias até essa idade, ou em dias alternados até P24.
5.3. Expressão do proteoglicano de condroitim sulfato
Como já foi dito, PGCS são componentes da MEC e, em adultos, o padrão
de expressão é alcançado durante os períodos tardios do desenvolvimento,
quando alguns desses proteoglicanos se condensam ao redor do corpo celular e
dos dendritos proximais de alguns neurônios, formando as RPNs. A expressão
das RPNs no córtex de barril é dependente de estimulação sensorial durante o
desenvolvimento (McRAE
et al
., 2007). Injeções intracerebrais de ChABC
mostram que esta enzima apresenta uma ação limitada na mudança da MEC,
incluindo a perda da RPN. Alguns meses após a injeção, o padrão de distribuição
dos componentes da matriz parece reconstituir-se completamente (BRÜCKNER
et
al
., 1998b).
A ação do ChABC resultou na perda de marcação para a lectina Vv e para
o anticorpo CS56 nos cortes mais superficiais do córtex aplanado (ver Figuras 20
e 21 em Resultados), o que mostra que a N-acetilgalactosamina presente na
unidade dissacarídica do CS foi removida durante o processo de digestão. A
digestão do CS, como aplicada no presente estudo, não corresponde ao passo
inicial da degradação do proteoglicano
in vivo
. O catabolismo dos proteoglicanos
93
em diferentes tecidos dá-se pela clivagem do núcleo protéico por proteinases
extracelulares e a subseqüente endocitose dos produtos da degradação (WIEGEL
et al
., 1997). No cérebro, metaloproteinases são fatores de degradação da MEC
(BIGNAMI
et al
., 1994; ROMANIC & MADRI, 1994). No caso da aplicação da
enzima ChABC no tecido nervoso do animal, o organismo deve responder de
maneira imediata para a degradação deste, considerando a enzima um “corpo
estranho” que deve ser rapidamente degradado, mas não tão rapidamente para
que a enzima não possa agir na digestão do CS. Assim como no caso de uma
lesão no SNC, quando há a expressão de moléculas e a formação de uma
barreira para impedir com que esta se alastre pelo parênquima, moléculas devem
agir da mesma forma impedindo que a enzima ChABC difunda-se pelo SNC,
deixando com que este atue somente nas regiões mais próximas da lesão (ver
Figura 21 em Resultados).
A reconstrução dos agregados da MEC, após ação da ChABC, parece
seguir as rotas metabólicas normais do organismo (LANDER, 1993). Nos nossos
experimentos, a marcação da RPN reaparece em um curto período de tempo.
Após dez dias do implante do Elvax® saturado com a enzima, um significante
reaparecimento dos componentes da matriz foi detectado pela presença de
marcação para Vv e CS56 nos cortes mais superficiais, o que não se evidencia
após três dias do implante.
Utilizando um anticorpo para a ChABC, Lin e colaboradores (2008)
observaram que a enzima encontra-se presente no córtex dez dias após a injeção
da enzima no córtex somestésico. Não podemos confirmar se o mesmo ocorreu
no nosso modelo, mas sugerimos que, se ainda houver condroitinase no meio
extracelular após dez dias de implante, a quantidade é muito baixa, visto a
94
recuperação das redes perineuronais na região do PMBSF evidenciado pela
marcação para Vv (Figura 23).
Não sabemos se a marcação evidente das redes perineuronais é
semelhante nos animais privados e nos animais não-privados no nosso modelo de
estudo, já que não foi possível uma análise quantitativa do material devido à baixa
quantidade de material obtido neste experimento. McRae e colaboradores (2007)
determinaram que o número de células de circuito inibitório marcadas para um
subtipo de PGCS diminui no córtex de barris após a privação sensorial durante os
primeiros trinta dias após o nascimento. Após dez dias de retirada das vibrissas,
podemos ter alterado o número de células GABAérgicas marcadas positivamente
para as RPNs, porém a marcação deve ser maior do que a observada por McRae
e colaboradores (2007), se considerarmos o período de retirada das vibrissas.
Visto que a atividade altera a expressão das redes perineuronais de
subpopulações celulares do córtex somestésico (McRAE
et al
., 2007), se a
plasticidade induzida após a digestão do PGCS presente nas redes perineuronais
provocou uma alteração nas células por este curto período de tempo do
tratamento, a expressão das RPNs pode ser induzida em células que,
anteriormente ao tratamento, não as expressaram por conta da privação sensorial
promovida pela retirada das vibrissas.
5.4. Ação da condroitinase ABC promovendo a plasticidade no córtex
somestésico
No cérebro, a plasticidade estrutural e o remodelamento sináptico
dependem de uma contínua re-elaboração das interações celulares, papel este
que cabe à matriz extracelular (SERFATY
et al
., 2008). As moléculas da MEC, tais
95
como o PGCS, são importantes reguladores que podem tornar o microambiente
permissivo ou não ao crescimento de neuritos. Já está bem aceito na literatura
que a ChABC promove a plasticidade e a recuperação funcional quando ocorre
lesão do SNC. O que não está claro é como a degradação do CS pode promover
tanto a plasticidade quanto a recuperação funcional do SNC. Uma possibilidade é
a de que o CS tem um efeito inibitório em neurônios, via um receptor específico,
mesmo não se tendo evidências da existência deste (CRESPO
et al
., 2007). O
que se sabe é que o PGCS induz o aumento e liberação de Ca
2+
intracelular, o
que atuaria na regulação do avanço do cone de crescimento (TANG
et al
., 2003).
PGCS ativam a proteína cinase C (PKC) em neurônios granulares do cerebelo em
experimento
in vitro
, e a inibição de PKC leva ao crescimento de neuritos sobre o
PGCS (SIVASANKARAN
et al
., 2004). A ativa uma pequena Rho GTPase
(SIVASANKARAN
et al
., 2004), que, quando inativada, diminui os efeitos
inibitórios dos PGCS (CRESPO
et al
., 2007). Recentemente, descreveu-se que os
efeitos inibitórios dos PGCS podem ser diminuídos pela supressão da atividade
cinase de receptor de fator de crescimento epidermal (EGF-R), os PGCS induzem
a fosforilação de EGF-R de maneira cálcio dependente, sugerindo que o influxo de
cálcio atua no efeito inibitório dos PGCS (CRESPO
et al
., 2007).
Uma outra possibilidade pode ser a liberação de fatores que estão ligados
ao PGCS depois da ação da ChABC, assim permitindo a difusão e interação
desses com receptores da superfície de células neuronais. Para Crespo e
colaboradores (2007), se esses fatores forem neurotróficos ou promotores do
crescimento axonal, a ChABC exerceria um efeito benéfico para a plasticidade e
recuperação funcional.
96
Já está descrito que um dos produtos da digestão do PGCS pela ChABC, o
dissacarídeo C6S, promove o reparo e a plasticidade no SNC (ROLLS
et al
.,
2004).
In vitro
, os produtos da digestão pela ChABC são principalmente tetra e
dissacarídeos, mas isto não é necessariamente o que ocorre
in vivo
, sendo mais
provável a produção de uma alta quantidade de oligossacarídeos de tamanhos
variáveis (CRESPO
et al
., 2007).
Como a remoção do PGCS pode promover a plasticidade do campo dos
barris? A ação inibitória do PGCS no direcionamento e crescimento axonal sugere
que a degradação da RPN remove o substrato não permissivo para a geração ou
reorganização das conexões sinápticas, dois processos que promovem a
plasticidade. O tratamento com a ChABC não altera as propriedades funcionais
dos neurônios corticais (PIZZORUSSO
et al
., 2002). Enquanto os circuitos
excitatórios são freqüentemente assumidos como mediadores primários da
plasticidade dos mapas corticais, evidências indicam que o GABA atuaria nos
circuitos contribuindo para a plasticidade (JONES, 1993). As sinapses
GABAérgicas exibem plasticidade dependente de atividade, com níveis de GABA,
receptores GABA
A
e de enzimas que sintetizam o GABA regulados pela privação
sensorial e aprendizado
in vivo
, aumentando o número dessas sinapses inibitórias
(FOELLER & FELDMAN, 2004). Knott e colaboradores (2002) demonstraram
alterações plásticas em sinapses GABAérgicas em S1 de camundongos adultos,
observando que em um curto período de estimulação causa um rápido aumento
na densidade de sinapses inibitórias.
Após lesão no SNC há um aumento de expressão moléculas repulsoras,
que inibem o crecimento axonal em direção ao local da injúria. Algumas dessas
moléculas são PGCS, que contribuem para o impedimento de recuperação
97
funcional através da restrição da regeneração axonal e da plasticidade sináptica.
A remoção enzimática do CS pela enzima ChABC reduz a inibição dessas
moléculas de PGCS, favorecendo o crescimento axonal e a plasticidade, levando
à recuperação funcional (TROPEA
et al
., 2003; MASSEY
et al
., 2006). A
observação de que os PGCS aumentam em áreas que apresentam uma
diminuição da plasticidade durante o desenvolvimento (LANDER
et al
., 1997) e
que sua remoção favorece a plasticidade (PIZZORUSSO
et al
., 2002), é
fundamental para identificar estratégias para reparo de regiões do SNC que
sofreram algum tipo de lesão.
6. Conclusão
Nosso conjunto de resultados levou-nos às seguintes conclusões:
(1) O tratamento com ChABC favorece a plasticidade no campo de barris
do PMBSF;
(2) O Elvax® 40W é eficaz como meio para a enzima difundir-se para o
tecido nervoso sem causar lesões no parênquima. Porém, a enzima não se
difunde por todo o tecido, ficando mais concentrada na região tecidual logo abaixo
da fatia do polímero;
(3) Animais mais jovens respondem mais rapidamente ao tratamento, visto
que, animais que sofreram o implante do Elvax® saturado com a enzima ChABC
em P20, tiveram evidências de plasticidade já no terceiro dia após o implante, ao
contrários dos animais que sofreram o implante em P40 ou em P70.
7. Referências
AGMON, A.; YANG, L.T.; JONES, E.G.; O’DOWD, D.K.
Topological
precision in the thalamic projection to neonatal mouse barrel córtex
.
J
Neurosci
, 15: 549-561. 1995;
ALBERTS, B.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.;
WALTER, P.
Molecular Biology of The Cell
. Capítulo 19. 4ª Edição: Garland
Science. Páginas: 1090-1118. 2002;
ANDERSON, S.A.; MARÍN, O.; HORN, C.; JENNISNC, K.; RUBENSTEIN,
J.L.
Distinct cortical migrations from the medial and lateral ganglionic
eminences
.
Develop
, 128(3): 353-363. 2001;
BAHIA, C.P.
Padrão de marcação da lecitina Vicia villosa durante o
desenvolvimento do córtex somestésico primário (SI) de ratos
. Dissertação
de Mestrado. Belém, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal do
Pará, 99 p. 2005;
BANDTLOW, C.E.; ZIMMERMANN, D.R.
Proteoglycans in the
developing brain: new conceptual insights for old proteins
.
Physiol Rev
,
80(4): 1267-1290. 2000;
BEAR, M.F.; CONNORS, B.W.; PARADISO, M.A.
Neurociências:
Desvendando o Sistema Nervoso
. Capítulos: 7, 12, 22. 2ª Edição, Porto Alegre:
Artmed. Páginas: 183, 198, 705 – 737. 2002;
BEGGS, S.; TORSNEY, C.; DREW, L.J.; FITZGERALD, M.
The postnatal
reorganization of primary afferent input and dorsal horn cell receptive fields
in the rat spinal cord is an activity-dependent process
.
Europ J Neurosci
, 16:
1249-1258. 2002;
BELFORD, G.R.; KILLACKEY, H.P.
Vibrissae representation in
subcortical trigeminal centers of the neonatal rat
.
J Comp Neurol
, 183(2): 305-
321. 1979;
BERARDI, N.; PIZZORUSSO, T.; MAFFEI, L.
Critical periods during
sensory development
.
Cur Op Neurobiol
, 10: 138-145. 2000;
100
BERTOLOTTO, A.; MANZARDO, E.; IUDICELLO, M.; LOVISETTO, C.;
RICCIO, A.
Disappearance of the Vicia villosa-positivity from the perineuronal
net containing chondroitin proteoglycan after chondroitinase digestion
.
Brain
Res
, 673: 344-348. 1995;
BRADBURY, E.J.; MOON, L.D.; POPAT, R.J.; KING, V.R.; BENNETT,
G.S.; PATEL, P.N.; FAWCETT, J.W.; MACMAHON, S.B.
Chondroitinase ABC
promotes functional recovery after spinal cord injury
.
Nature
, 416: 636-640.
2002;
BRADFORD, M.
A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding
.
Anal Biochemistry
, 72: 248-254. 1976;
BRÜCKNER, G.; BRINGMANN, A.; HÄRTIG, W.; KÖPPE, G.; DELPECH,
B.; BRAUER, K.
Acute and long-lasting changes in extracellular-matrix
chondroitin-sulphate proteoglycans induced by injection of chondroitinase
ABC in the adult rat brain
.
Exp Brain Res
, 121: 300-310, 1998b;
BRÜCKNER, G.; GROSCHE, J.; SCHMIDT, S.; HÄRTIG, W.; MARGOLIS,
R.U.; DELPECH, B.; SEIDENBECHER, I.; CZANIERA, R.; SCHACHNER, M.
Posnatal development of perineuronal nets in wild-type mice and in a mutant
deficient in tenascin-R
.
J Comp Neurol
, 428: 616-629. 2000;
BRÜCKNER, G.; HÄRTIG, W.; SEEGER, J.; RÜBSAMEN, R.; REIMER, K.;
BRAUER, K.
Cortical perineuronal nets in the gray short-tailed opossum
(Monodelphis domestica) a distribution pattern contrasting with that show in
placental mammals
.
Anat Embryol
, 197: 249-262. 1998a;
BRÜCKNER, G.; SEEGER, G.; BRAUER, K.; HÄRTIG, W.; KACZA, J.;
BIGL, V.
Cortical areas are revealed by distribution patterns of proteoglycan
components and parvalbumin in Mongolian gerbil and rat
.
Brain Res
, 658(1-
2): 67-86. 1994;
BUONOMANO, D.V.; MERZENICH, M.M.
Cortical plasticity: from
synapses to maps
.
Ann Rev Neurosci
, 21: 149-186. 1998;
CABELLI, R.J.; HOHN, A.; SHATZ, C.J.
Inhibition of ocular dominance
column formation by infusion of NT-4/5 or BDNF
.
Science
, 267(5204): 1662-
1666. 1995;
101
CATALANO, S.M.; ROBERTSON, R.T.; KILLACKEY, H.P.
Individual axon
morphology thalamocortical topography in developing rat somatosensory
cortex
.
J Comp Neurol
, 367(1): 36-53. 1996;
CELIO, M.R.; BLÜMCKE, I.
Perineuronal Nets – a specialized form of
extracellular matrix in the adult nervous system
.
Brain Res Brain Res Rev
,
19(1): 128-145. 1994;
CELIO, M.R.; CHIQUET-EHRISMANN, R.
“Perineuronal nets” around
cortical interneurons expressing parvalbumin are rich in tenascin
.
Neurosci
Letters
, 162: 137-140. 1993;
CELIO, M.R.; SPREAFICO, R.; DE BIASE, S.; VITELLARO-ZUCCARELLO,
L.
Perineuronal nets: past and present
.
TRENDS Neurosci
, 21: 510-515. 1998;
CHAU, C.H.; SHUM, D.K.; LI, H.; PEI, J.; LUI, Y.Y.; WIRTHLIN, L.; CHAN,
Y.S.; XU, X.M.
Chondroitinase ABC enhances axonal regrowth through
Schwann cell-seeded guidance channels after spinal cord injury
.
FASEB
Journal
, 18: 194-2196. 2004;
CHEUNG, A.F.; POLLEN, A.A.; TAVARE, A.; DePROTO, J.; MÓLNAR, Z.
Comparative aspects of cortical neurogenesis in vertebrates
.
J. Anat
, 211(2):
164-176. 2007;
COOPER, N.G.F.; STEINDLER, D.A.
Lectins demarcate the barrel
subfield in the somatosensory cortex of the early posnatal mouse
.
J Comp
Neurol
, 249: 157-169. 1986;
CRESPO, D.; ASHER, R.A.; LIN, R.; RHODES, K.E.; FAWCETT, J.W.
How
does chondroitinase promote functional recovery in the damage CNS? Exp
Neurol
, 206: 159-171. 2007;
DAVIES, J.A.
Extracellular matrix. Encyclopedia of Life Sciences
: 1-7.
2001;
DAW, M.I.; SCOTT, H.L.; ISAAC, J.T.R.
Developmental synaptic
plasticity at the thalamocortical input to barrel cortex: mechanisms and
roles
.
Mol Cell Neurosci
, 34: 493-502. 2007;
102
DEEPA, S.S.; CARULLI, D.; GALTREY, C.; RHODES, K.; FUKUDA, J.;
MIKAMI, T.; SUGAHARA, K.; FAWCETT, J.W.
Composition of perineuronal net
extracellular matrix in rat brain: a different disaccharide composition for the
net-associated proteoglycans
.
J Biol Chem
, 281(26): 17789-17800. 2006;
DELLER, T.; NITSCH, R.; FROTSCHER, M.
Heterogeneity of the
commissural projection to the rat dentate gyrus: a Phaseolus vulgaris
leucoagglutinin tracing study. Neurosci
, 72(1): 111-121. 1996;
DELPECH, A.; GIRARD, N.; DELPECH, B.
Localization of hyaluronectin
in the nervous system
.
Brain Res
, 245 (2): 251-257. 1982;
ERZURUMLU, R.S.; JHAVERI, S.
Thalamic axons confer a blueprint of
the sensory periphery onto the developing rat somatosensory cortex
.
Brain
Res Dev Brain Res
, 56(2): 229-234. 1990;
FOELLER, E.; FELDMAN, D.E.
Synaptic basis for developmental
plasticity in somatosensory cortex
.
Curr Op Neurobiol
, 14: 89-95. 2004;
FOX, K.
A critical period for experience-dependent synaptic plasticity
in rat barrel cortex
.
J Neurosci
, 12(5): 1826-1838.1992;
FOX, K.; CATERSON, B.
Freeing the brain from the perineuronal net
.
Science
, 298: 1187-1189. 2002;
FOX, K.; SCHLAGGAR, B.L.; GLAZEWSKI, S.; O’LEARY, D.D.
Glutamate
thalamocortical and columnar organization in somatosensory cortex
.
Proc
Nati Acad Sci USA
, 93(11): 5584-5589. 1996;
FRANCA, J.G.; VOLCHAN, E.
NADPH diaphorase histochemistry as a
marker for barrels in rat somatosensory cortex
.
Braz J Med Biol Res
, 28(7):
787-790. 1995;
GALTREY, CM; ASHER, R.A.; NOTHIAS, F.; FAWCETT, J.W.
Promoting
plasticity in the spinal cord with chondroitinase improves functional
recovery after peripheral nerve repair
.
Brain
, 130(4): 926-939. 2007;
GALTREY, C.M.; FAWCETT, J.W.
The role of chondroitin sulfate
proteoglycans in regeneration and plasticity in the central nervous system
.
Brain Res Rev
, 54: 1-18. 2007;
103
GLAZEWSKI, S.; BENEDETTI, B.L.; BARTH, A.L.
Ipsilateral whiskers
suppress experience-dependent plasticity in the barrel cortex
.
J Neurosci
,
27(14): 3910-3920. 2007;
GOODMAN, C.S.; SHATZ, C.J.
Developmental mechanisms that
generate precise patterns of neuronal connectivity
.
Cell
, 72: 77-98. 1993;
GULLBERG, D.; EKBLOM, P.
Extracellular matrix and its receptors
during development
.
Int J Devel Biol
, 39(5): 845-854. 1995;
HAMAI, A.; HASHIMOTO, N.; MOCHIZUKI, N.; KATO, F.; MAKIGUCHI, Y.;
HORIE, K.; SUZUKI, S.
Two distinct chondroitinsulfate ABC lyases. An
endoeliminase yelding tetrasaccharides and an exoeliminase preferentially
acting on oligosaccharides
.
J Biol Chem
, 272: 9123-9130. 1997;
HARI, A.; DJOHAR, B.; SKUTELLA, T.; MONTAZERI, S.
Neurotrophins
and extracellular matrix molecules modulate sensory axon outgrowth
.
Int J
Devel Neurosci
, 22: 113-117. 2004;
HAUSEN, D.; BRÜCKNER, G.; DRLICEK, M.; HÄRTIG, W.; BRAUER, K.;
BIGL, V.
Pyramidal cells ensheathed by perineuronal nets in human motor
and somatosensory cortex
.
Neuroreport
, 7:1725-1729. 1996;
HAYASHI, N.; TATSUMI, K.; OKUDA, H.; YOSHIKAWA, M.; ISHIZAKA, S.;
MIYATA, S.; MANABE, T.; WANAKA, A.
DACS, novel matrix structure
composed of chondroitin sulfate proteoglycan in the brain
.
Biochem Biophy
Res Commun
, 364: 410-415. 2007;
HENSCH, T.K.
Critical period plasticity in local cortical circuits
.
Ann
Rev Neurosci
, 27: 549-579. 2004;
HENSCH, T.K.
Critical period regulation
.
Nature Rev Neurosci
, 6(11):
877-888. 2005;
HENSCH, T.K.; STRYKER, M.P.
Ocular dominance plasticity under
metabotropic glutamate receptor blockade
.
Science
, 272(5261): 554-557. 1996;
104
HODGE, C.; STEVENS, R.; YAMAMOTO, T.; NGUYEN, T.; DUBROFF, J.;
ZHU, W.; McCASLAND, J.
A new model of cortical plasticity using rat whisker
barrel cortex
.
Intern Cong Series
, 1247: 383-393. 2002;
HÖKE, A.
Proteoglycans in axonal regeneration
.
Exp Neurol
, 195: 273-
277. 2005;
HUBEL, D.H.; WIESEL, T.N.
Laminar and columnar distribution of
geniculo-cortical fobers in the macaque monkey
.
J Comp Neurol
, 146(4): 421-
450. 1972;
HUBER, A.B.; KOLODKIN, A.L.; GINTY, D.D.; CLOUTIER, J.F.
Signaling
at the growth cone: ligand-receptor complexes and the control of axon
growth and guidance
.
Ann Rev Neurosci
, 26: 509-563. 2003;
HUNTLEY, G.W.
Differential effects of abnormal tactile experience on
shaping representation pattern in developing and adult motor cortex
.
J
Neurosci
, 17: 9220-9232. 1997;
INAN, M.; CRAIR, M.C.
Development of cortical maps: perspectives
from the barrel cortex
.
The Neuroscientist
, 1: 49-61. 2007;
JEANMONOD, D.; RICE, F.L.; VAN DER LOOS, H.
Mouse
somatosensory cortex: alterations in the barrelfield following receptor injury
at different early postnatal ages
.
Neuroscience
, 6(8): 1503-1535. 1981;
JESSEL, T.M.; HYNES, M.A.; DODD, J.
Carbohydrates and
carbohydrate-binding proteins in the nervous system
.
Ann Rev Neurosci
, 13:
227-255. 1990;
JONES, E.G.
GABAergic neurons and their role in cortical plasticity in
primates
.
Cerebral Cortex
, 3: 361-372. 1993;
KAAS, J.H.; COLLINS, C.E.
The organization of sensory cortex
.
Curr
Opin Neurobiol
, 11(4): 498-504. 2001;
KATZ, L.C.; SHATZ, C.J.
Synaptic activity and the construction of
cortical circuits
.
Science
, 274(5290): 1133-1138. 1996
;
105
KILLACKEY, H.P.; RHOADES, R.W.; BENNETT-CLARKE, C.A.
The
formation of a cortical somatotopic map
.
TRENDS Neurosci
, 18: 402-407.
1995;
KISS, J.Z.; TRONCOSO, E.; DJEBBARA, Z.; VUTSKITS, L.; MULLER, D.
The role of neural cell adhesion molecules in plasticity and repair
.
Brain Res
Rev
, 36: 175-184. 2001;
KJELLÉN, L.; LINDAHL, U.
Proteoglycans: structures and interactions
.
Ann Rev Biochem
, 60: 443-475. 1991;
KNOTT, G.W.; QUAIRIAUX, C.; GENOUD, C.; WELKER, E.
Formation of
dendritic spines with GABAergic synapses induced by whisker stimulation in
adult mice
.
TRENDS Neurosci
, 25: 564-570. 2002;
LANDER, A.D.
Proteoglycans in the nervous system
.
Curr Opin
Neurobiol
, 3(5): 716-723. 1993;
LANDER, C.; KIND, P.; MALESKI, M.; HOCKFIELD, S.
A family of
activity-dependent neuronal cell-surface chondroitin sulfate proteoglycans in
cat visual cortex
.
J Neurosci
, 17(6): 1928-1939. 1997;
LANE, R.D.; CHIAIA, N.L.; KESTERSON, K.L.; RHOADES, R.W.;
MOONEY, R.D.
Boundary-limited serotonergic influences on pattern
organization in rat sensory cortex
.
Neurosci Let
,
395: 165-169.
2006;
LANGER, R.
New methods of drug delivery
.
Science
, 249: 1527-1533.
1990;
LENT, R.
Cem bilhões de neurônios: conceitos fundamentais de
neurociências
. Capítulo 2. 1ª Edição, São Paulo: Atheneu. Páginas: 31-64. 2002;
LIN, R.; KWOK, J.C.F.; CRESPO, D.; FAWCETT, J.W.
Chondroitinase
ABC has a long-lasting effect on chondroitin sulphate glycosaminoglycan
content in the injured rat brain
.
J Neurochem
, 104: 400-408. 2008;
LÓPEZ-BENDITO, G.; MOLNÁR, Z.
Thalamocortical development: how
are we going to get there?
Nature Rev Neurosci
, 4(4): 276-289. 2003;
106
MARÍN, O.; RUBENSTEIN, J.L.
Cell migration in the forebrain
.
Ann Rev
Neurosci
, 26: 441-483. 2003;
MASSEY, J.M.; HUBSCHER, C.H.; WAGONER, M.R.; DECKER, J.A.;
AMPS, J.; SILVER, J.; ONIFER, S.M.
Chondroitinase ABC digestion of the
perineuronal net promotes functional collateral sprouting in the cuneate
nucleus after cervical spinal cord injury
.
J Neurosci
, 26(16): 4406-4414. 2006;
MATESZ, C.; MODIS, L.; HALASI, G.; SZIGETI, Z.M.; FELSZEGHY, S.;
BACSKAI, T.; SZEKELY, G.
Extracellular matrix molecules and their possible
roles in the regeneration of frog nervous system
.
Brain Res Bull
, 66: 526-531.
2005;
McCANDLISH, C.; WATERS, R.S.; COOPER, N.G.
Early development of
the representation of the body surface in SI cortex barrel field in neonatal
rats as demonstrated with peanut agglutinin binding: evidence for
differential development within the rattunculus
.
Exp Brain Res
, 77: 425-431.
1989;
McCONNELL, S.K.
Constructing the cerebral cortex: neurogenesis and
fate determination
.
Neuron
, 15: 761-768. 1995;
McRAE, P.A.; ROCCO, M.M.; KELLY, G.; BRUMBERG, J.C.; MATTHEWS,
R.T.
Sensory deprivation alters aggrecan and perineuronal net expression in
the mouse barrel cortex
.
J Neurosci
, 27(20): 5405-5413. 2007;
MIYATA, S.; NISHIMURA, Y.; HAYASHI, N.; OOHIRA, A.
Construction of
perineuronal net-like structure by cortical neurons in culture
.
Neuroscience
,
136: 95-104. 2005;
MOON, L.D.; ASHER, R.A.; RHODES, K.E.; FAWCETT, J.W.
Regeneration of CNS axons back to their target following treatment of adult
rat brain with chondroitinase ABC
.
Nature Neurosci
, 4: 465-466. 2001;
NASCIMENTO, D.S.; REIS, C.U.; GOLDENBERG, R.C.; ORTIGA-
CARVALHO, T.M.; PAZOS-MOURA, C.C.; GUGGINO, S.E.; GUGGINO, W.B.;
MORALES, M.M.
Estrogen modulates CIC-2 chloride channel gene
expression in rat kidney
.
Europ J Physiol
, 446: 593-599. 2003;
NICHOLSON, C.; SYKOVÁ, E.
Extracellular space structure revealed by
diffusion analysis
.
TRENDS Neurosci
, 21(5): 207-215. 1998;
107
O’LEARY, D.D.; CHOU, S.J.; SAHARA, S.
Area patterning of the
mammalian cortex
.
Neuron
, 56(2): 252-269. 2007;
O’LEARY, D.D.; RUFF, N.L.; DYCK, R.H.
Development, critical period
plasticity, and adult reorganizations of mammalian somatosensory systems
.
Curr Opin Neurobiol
, 4(4): 535-544. 1994a;
O’LEARY, D.D.; SCHLAGGAR, B.L.; TUTTLE, R.
Specification of
neocortical areas and thalamocortical connections
.
Ann Rev Neurosci
, 17:
419-439. 1994b;
OOHIRA, A.; KUSHIMA, Y.; TOKITA, Y.; SUGIURA, N.; SAKURAI, K.;
SUZUKI, S., KIMATA K.
Effects of lipid-derivatized glycosaminoglycans
(GAGs), a novel probe for functional analyses of GAGs, on cell-to-
substratum adhesion and neurite elongation in primary cultures of fetal rat
hippocampal neurons
.
Arch Biochem Biophy
, 378(1): 78-83. 2000;
PIZZORUSSO, T.; MEDINI, P.; BERARDI, N.; CHIERZI, S.; FAWCETT,
J.W.; MAFFEI, L.
Reactivation of ocular dominance plasticity in the adult
visual cortex
.
Science
, 298: 1248-1251. 2002;
PIZZORUSSO, T.; MEDINI, P.; LANDI, S.; BALDINI, S.; BERARDI, N.;
MAFFEI, L.
Structural and functional recovery from early monocular
deprivation in adult rats
.
Proc Natl Acad Sci USA
, 103(22): 8517-8522. 2006;
PRABHAKAR, V.; RAMAN, R.; CAPILA, I.; BOSQUES, C.J.; POJASEK, K.;
SASISEKHARAN, R.
Biochemical characterization of the chondroitinase ABC
I active site
.
Bioch J
, 390: 395-405. 2005;
RAUCH, U.
Brain matrix: structure, turnover and necessity
.
Biochem
Soc Trans.
, 35(4): 656-660. 2007;
RAUCH, U.
Modeling an extracellular environment for axonal
pathfinding and fasciculation in the central nervous system
.
Cell Tissue Res
,
290: 349-356. 1997;
REIPRICH, P.; KILB, W.; LUHMANN, H.J.
Neonatal NMDA receptor
blockade disturbs neuronal migration in rat somatosensory cortex in vivo
.
Cerebral Cortex
, 15: 349-358. 2004;
108
RENTERÍA, R.C.; CONSTANTINE-PATON, M.
Nitric Oxide in the
retinotectal system: a signal but not a retrograde messenger during map
refinement and segregation
.
J Neurosci
, 19(16): 7066-7076. 1999;
RICE, F.L.
Gradual changes in the structure of the barrels during
maturation of the primary somatosensory cortex in the rat
.
J Comp Neurol
,
236: 496-503. 1985;
RHODES, K.E.; FAWCETT, J.W.
Chondroitin sulphate proteoglycans:
preventing plasticity or protecting the CNS? J Anat
, 204: 33-48. 2004;
ROLLS, A.; AVIDAN, H.; CAHALON, L.; SCHORI, H.; BAKALASH, S.;
LITVAK, V.; LEV, S.; SCHWARTZ, M.
A disaccharide derived from chondroitim
sulphate proteoglycan promotes central nervous system repair in rats and
mice
.
Europ J Neurosci
, 20: 1973-1983. 2004;
RUOSLAHTI, E.
Brain extracelular matrix
.
Glycobiology
, 6(5): 489-492.
1996;
SCHUBERT, D.; KÖTTER, R.; STAIGER, J.F.
Mapping functional
connectivity in barrel-related columns reveals layer- and cell type-specific
microcircuits
.
Brain Struct. Function
, 212: 107-119. 2007;
SCHWARTZ, N.B.
Proteoglycans. Encyclopedia of Life Sciences
: 1-7.
2001;
SCHWARTZ, N.B.; DOMOWICZ, M.
Proteoglycans in brain
development
.
Glycoconjugate J
, 21: 329-341. 2004;
SERFATY, C.A.; OLIVEIRA-SILVA, P.; CAMPELLO-COSTA, P.
Período
crítico e plasticidade no sistema nervoso central
.
Neurociências
, 4(1): 46-53.
2008.
SHATZ, C.J.; STRYKER, M.P.
Ocular dominance in layer IV of the cat’s
visual cortex and the effects of monocular deprivation
.
J Physiol
, 281: 267-
283. 1978;
109
SHERMAN, L.S.; BACK, A.S.
A “GAG” reflex prevents repair of the
damaged CNS
.
TRENDS Neurosci
, 31(1): 44-52. 2007;
SHU, S.; JU, G.; DAN, L.
The glucose oxidase-DAB-nickel method in
peroxidase histochemistry of yhe nervous system
.
Neurosci Letters
, 85: 169-
171. 1988;
SIRKO, S.; VON HOLST A.; WIZENMANN, A.; GÖTZ, M.; FAISSNER, A.
Chondroitin sulfate glycosaminoglycans control proliferation, radial glia cell
differentiation and neurogenesis in neural stem/progenitor cells
.
Development
, 134: 2727-2738. 2007;
SIVASANKARAN, R.; PEI, J.; WANG, K.C.; ZHANG, Y.P.; SHIELDS, C.B.;
XU, X.M.; HE, Z.
PKC mediates inhibitory effects of myelin and chondroitin
sulfate proteoglycans on axonal regeneration
.
Nature Neurosci
, 7(3): 261-268.
2004;
SMITH, A.L.; CORDEY, P.M.; THOMPSON, L.D.
Manufacture and release
characteristics of ELVAX® polymers containing glutamate receptor
antagonists
.
J Neurosci Methods
, 60: 211-217. 1995.
STEINDLER, D.A.; COOPER, N.G.; FAISSNER, A.; SCHACHNER, M.
Boundaries defined by adhesion molecules during development of the
cerebral cortex: the J1/tenascin glycoprotein in the mouse somatosensory
cortical barrel filed
.
Devel Biol
, 131(1): 243-260. 1989;
TANG, F.; DENT, E.W.; KALIL, K.
Spontaneous calcium transients in
developing cortical neurons regulate axon outgrowth
.
J Neurosci
, 23(3): 927-
936. 2003;
TESTER NJ, PLAAS AH, HOWLAND DR.
Effect of body temperature on
chondroitinase ABC’s ability to cleave chondroitin sulfate
glycosaminoglycans
.
J Neurosci Res
, 85: 1110-1118. 2007;
TROPEA, D.; CALEO, M.; MAFFEI, L.
Synergistic effects of brain-
derived neurotrophic factor and chondroitinase ABC on retinal fiber
sprouting after denervation of the superiorcolliculus in adult rats
.
J Neurosci
,
23(18): 7034-7044. 2003;
WALLACE, M.N.
Histochemical demonstration of sensory maps in the
rat and mouse cerebral cortex
.
Brain Res
, 418(1): 178-182. 1987;
110
WIESEL, T.
Postnatal development of the visual cortex and the
influence of the environment
.
Nature
, 299: 583-592. 1982;
WONG-RILEY, M.T.T.
Changes in the visual-system of monoculary
sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome-oxidase
histochemistry
.
Brain Res
, 171: 11-28. 1979;
WONG-RILEY, M.T.T.; WELT, C.
Histochemical changes in cytochrome
oxidase of cortical barrels after vibrissal removal in neonatal and adult mice
.
Proc Natl Acad Sci USA
, 77(4): 2333-2337. 1980;
WOOLSEY, T.A.; VAN DER LOOS, H.
The structural organization of
layer IV in the somatosensory regions (SI) of mouse cerebral cortex: the
description of a cortical fields composed of discrete cytoarchitectonic units
.
Brain Res
, 17(2): 205-242. 1970;
WOOLSEY, T.A.; WANN, J.R.
Areal changes in mouse cortical barrels
following vibrissal damage at different postnatal ages
.
J Comp Neurol
, 170(1):
53-66. 1976;
VIGGIANO, D.
The two faces of perineuronal nets
.
Neuroreport
, 11:
2087-2090. 2000;
VOET, D.; VOET, J.G.; PRATT, C.W.
Fundamentos de Bioquímica
.
Capítulo 8. 1ª Edição, Porto Alegre: Artmed. Páginas: 207-210. 2000;
VON HOLST, A.; SIRKO, S.; FAISSNER, A.
The unique 473HD-
chondroitinsulfate epitope is expressed by radial glia and involved in neural
precursor cell proliferation
.
J Neurosci
, 26(15): 4082-4094. 2006;
YAMAGUCHI, Y.
Lecticans: organizers of the brain extracellular matrix
.
Cell Mol Life Sciences
, 57: 276-289. 2000;
YICK, L.W.; WU, W.; SO, K.F.; YIP, H.K.; SHUM, D.K.
Chondroitinase
ABC promotes axonal regeneration of Clarke`s neurons after spinal cord
injury
.
Neuroreport
, 11: 1063-1067. 2000;
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