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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
TESE PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE DOUTOR
EM FARMACOLOGIA
ESTUDO SOBRE A ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE SUBSTÂNCIAS
EXTRAÍDAS E PURIFICADAS DE SECREÇÕES DA PELE DE ANFÍBIOS
CARLOS IBERÊ ALVES FREITAS
FORTALEZA - CE
- 2003 -
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
ESTUDO SOBRE A ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE SUBSTÂNCIAS
EXTRAÍDAS E PURIFICADAS DE SECREÇÕES DA PELE DE ANFÍBIOS
CARLOS IBERÊ ALVES FREITAS
Tese submetida à Coordenação do Curso de Pós-Graduação
em Farmacologia como requisito parcial para obtenção do
Título de Doutor em Farmacologia
Orientador:. Professor Dr. Krishnamurti de Moraes Carvalho
Fortaleza - CE
- 2003 -
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i
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Krishnamurti de Moraes Carvalho por sua orientação e participação que
ajudaram na elaboração, execução e revisão deste trabalho.
Ao Professor José Luciano Moreira do departamento de Patologia e Medicina Legal desta
Universidade, por sua amizade e dedicação inestimáveis, por sua participação no início deste
trabalho.
Aos colegas e amigos Professores da Universidade Federal Rural de Pernambuco, Dr. George
Jimenez, por suas valiosas sugestões e auxílio na análise estatística, bem como Dr. Eduardo Coli que
pelo apoio e amizade ao longo de nossa jornada.
Ao Coordenador do Curso de Pós graduação em Farmacologia Dr. Ronaldo Albuquerque pela
consideração e aos ensinamentos como professor.
Aos demais que de alguma maneira contribuiram, sejam: colegas, bolsistas, funcionários e
professores do Departamento de Departamento de Fisiologia e Farmacologia em especial a Dra.
Helena Serra Azul, Dra Gisela Costa Camarão, Dr. Vietla S.
Rao, Dr. Rui Capaz.
Ao Departamento de Química Orgânica, onde foi realizado parte dos estudos de
determinação das estruturas, sob a coordenação do Prof. Dr. Edilberto R. Silveira.
Aos colegas de convivívio na Universidade Estadual do Ceará José Eduardo Honório Júnior,
Patrícia Campêlo, Jackson Cortez, Cláudio Patrocínio, Valéria, Rosa Germana, Marcelo Monteiro,
Juliana, Solane, Clemilson, AronaiAlexandre, Carla, Andrea, Janaína, Ana, Inez, Luciana que
sempre me ofereceram sua amizade e contribuição, cada um a seu modo, para a realização deste
trabalho.
Ao colega e amigo Dr. Bruno Andrade Cardi pelos conselhos e ajuda.
À bolsista e amiga Amanda Xavier pela e inestimável colaboração neste trabalho.
Aos amigos Flávio Cyreneu, Ana Kelen, Karlliely, Rosemeire, Fernando Albuquerque e
Marcelo Bezerra pelo apoio neste final de percurso.
A Eduardo Ferreira Araújo por me possibilitar o bom funcionamento do computador e aos
esclarecimentos técnicos e apoio recebido.
Aos meus pais.
E agradeço em especial à minha esposa Marinalva por seu companheirismo, carinho,
dedicação, paciência, sugestões e incenivo na digitação deste trabalho, também aos meus filhos
ii
Carlos Eduardo e Gabriel por terem sempre um sorriso dedicado a mim nas horas de dificuldade,
mesmo com tantas ausências.
Este trabalho foi realizado graças aos auxílios das seguintes instituições:
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), através de
convênios com a Universidade Esadual do Ceará.
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), por meio de
convênio com o Curso de Pós-Graduação em Farmacologia, Departamento de Fisiologia e
Farmacologia, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Ceará e da concessão de Bolsa
de Doutorado.
Aos Laboratórios de Bioquímica Humana na pessoa da Dra. Lia Magalhães de Almeida e
Neurofarmacologia, do Dr. Krishnamurti de Moraes Carvalho na Universidade Estadual do Ceará,
onde foram desenvolvidos os experimentos necessários à realização deste trabalho.
E acima de tudo e de todos, a Deus, por me fazer aceitar com paciência tudo o que não podia
iii
“Seríamos melhores se não
tentássemos ser tão bons”
Sigmund Freud
iv
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS
i - ii
SUMÁRIO
iv - vii
LISTA DE TABELAS
ix
LISTA DE FIGURAS
x - xiv
RESUMO
xv - xvi
ABSTRACT
xvii-xviii
JUSTIFICATIVA
xvix-xxi
LISTA DE ABREVIATURAS
xxii
1. INTRODUÇÃO
1 - 37
1.1. Um Breve Histórico das Drogas Antimicrobianas e a Resistência Bacteriana
1 - 3
1.2. Os Anfíbios
3 - 16
1.2.1. Considerações Gerais
3 - 4
1.2.2. Presença dos Anfíbios na Cultura do Homem
5
1.2.3. Distribuição
6
1.2.4. Características Pele dos Anfíbios
6 - 9
1.2.4.1. Glândulas Mucosas
9
1.2.4.2. Glândulas Granulosas
9
1.2.5. Componentes da Secreção de Anfíbios – Visão geral
10 - 14
1.2.6. Esteróides
15
1.2.6.1. Bufadienolídeos
15
Ocorrência na Natureza
16
1.3. Detecção de Atividade Antimicrobiana de Secreções Oriundas de Anfíbios –
Visão geral
16 - 17
1.3.1. Bufadienolídeos com Atividade Antimicrobiana
17 - 18
18
1.3.1.1. Bufadienolídeos Antineoplásicos
1.3.2. Diversas Substâncias Antimicrobianas Isoladas de Anfíbios Não Esteroidais -
Visão geral
18 - 19
1.3.3. Antimicrobianos Peptídicos Isolados de Anuras - Os mais estudados
19
1.3.3.1. Propriedades e Possíveis Mecanismos de Ação
19 - 21
v
1.3.3.2. Famílias Conhecidas de Peptídeos Antimicrobianos
21
a) Discoglossidae
21 - 23
Bombina variegata
21
Bombina orientalis
22
Bombina maxima
22 - 23
b) Pipidae
23 - 24
Xenopus laevis
23
Xenopus tropicalis
23 - 24
c) Hylidae
24 - 29
c.1. Phyllomedusinae
24 - 25
Phyllomedusa sauvagii
24
Phyllomedusa bicolor
24 - 25
Phyllomedusa distincta
25
Phyllomedusa hypochondrialis
25
Phyllomedusa tarsius
25
Phyllomedusa oreades
25
c2. Pelodryadinae
26 - 29
Litoria caerulea
26
Litoria chloris
26
Litoria citropa
26 - 27
Litoria dahlii
27
Litoria genimaculata
27 - 28
Litoria infrafrenata
28
Litoria aurea & L. raniformis
28
Litoria. splendida
28 - 29
Litoria xanthomera
29
d) Hyperoliidae
29
Kassina senegalensis
29
e) Pseudidae
30
Pseudis paradoxa
30
f) Ranidae
30 - 35
Rana brevipoda porsa
30
Rana rugosa
30
Rana catesbeiana
30
Rana sphenocephala
31
Rana clamitans
31
Rana esculenta
31 - 32
Rana ridibunda
32
Rana temporaria
32
Rana grylio
32
Rana palustris
32 - 33
Rana sylvatica
33
vi
Rana tigerina
33
Rana berladieri, Rana luteiventris, Rana pipiens
33
Rana aerolata
34
Rana japonica
34
Rana tarahumarae
35
Rana tagoi
35
g) Myobatrachidae
36
Uperoleia mjobergi
36
h) Bufonidae
36
Bufo boreas, B. bufo, B. viridis
36
Bufo bufo gargarizans
36
1.3.4. Peptídeos Antineoplásicos.
37
1.3.4.1. Magainina 2 e peptídeos análogos
37
1.3.4.2. Litoria. aurea & L. raniformis
37
2. OBJETIVOS
38
3. MATERIAL E MÉTODOS
39 - 48
3.1. Animais Utilizados na Obtenção das Amostras
39
3.1.1. Bufo schneideri Werner, 1894- Bufonidae
39
3.1.2. Leptodactylus pentadactylus Laurenti, 1768 Leptodactylidae : Leptodactylinae
39
3.2. Obtenção do Veneno de Bufo schneideri
40
3.3. Obtenção de Extratos de Pele de Bufo schneideri
40
3.4. Obtenção do Veneno de Leptodactylus pentadactylus
41
3.5. Purificação por Cromatografia em Colunas
41
3.6. Cromatografia em Placa Delgada de Sílicagel
42
3.7. Obtenção de Dados para Avaliação dos Índices de Rendimento de Extração do
Veneno Bruto de Bufo schneideri
42
3.8. Estudos quanto a Variabilidade do Veneno Bruto e seus Componentes em
Diversas Localidades de Coleta
42
3.9. Determinação de Proteínas
43
3.10. Eletroforese
43
3.11. Determinação da Estrutura das Substâncias Utilizadas
43
3.11.1. Determinação da sequência de aminoácidos dos peptídeos
43
3.11.2. Determinação da estrutura das novas substâncias biologicamente ativas
(não proteicas)
43
vii
3.12. Ensaio de Atividade Hemolítica
43 - 44
3.13. Ensaio de Atividade Antimicrobiana
44 - 47
3.13.1. Obtenção de Microorganismos
44
3.13.2. Preparação do Inóculo para Cultivo
45
3.13.3. Teste de Avaliação da Sensibilidade Antimicrobiana
45 - 47
a) Em Meio Sólido
45 - 46
Inoculação em Placa
45
Aplicação dos Discos e Amostra - Teste
45 - 46
Leitura de Resultados por Mensuração dos Halos
46
b) Em Meio Líquido
46 - 47
3.14. Avaliação dos Dados por Modelos Matemáticos e Estatísticos
47 - 48
3.14.1. Equação de Gompertz
47
3.14.2. Equação de Regressão Não Linear
48
3.14.3. Análise Estatística
48
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
49 – 119
4.1. Purificações Cromatográficas das Amostras de Bufo schneideri
49 - 50
4.1.1. Recromatografia do Pico1 parcialmente purificado de Bufo schneideri (F1)
50
4.2. Determinação da Estrutura das Novas Substâncias Biologicamente Ativas
(não proteicas)
51 - 55
4.2.1. Hellebrigenin
52
4.2.2. Telocinobufagin
53
4.2.3. Marinobufagin
53 - 54
4.2.4. Bufalin
54 - 55
4.3. Obtenção de Dados para Avaliação dos Índices de Rendimento Extração do
Veneno Bruto de Bufo schneideri
56
4.4. Cromatografia em Placa Delgada de Sílica
56 - 58
4.5. Estudos da Variabilidade do Veneno Bruto e seus Componentes em Diversas
Localidades de Coleta:
59 - 60
4.6. Purificações Cromatográficas das Amostras de Leptodactylus pentadactylus
61 - 64
4.6.1. Purificações Cromatográficas das Amostras de L. pentadactylus em Coluna
Filtrante Sephacryl S-400
61
4.6.1.1. Eletroforese do Pico 8 obtido pela Cromatografia em Coluna Filtrante Sephacryl
S-400
61 - 62
4.6.2. Purificações dos peptídeos de Leptodactylus pentadactylus
62 - 64
viii
4.7. Avaliação da Atividade Biológicas
65 - 119
4.7.1. Atividade hemolítica de amostras obtidas de Bufo schneideri
65 - 67
4.7.2. Atividade hemolítica de amostras obtidas de Leptodactylus pentadactylus
68 - 72
Amostras de natureza protéica
68 - 69
Amostras de natureza peptídica obtida em coluna hidrofóbica C18 com CLAE
70 - 72
4.7.3. Avaliação da Atividade Antimicrobiana
73- 107
4.7.3.1. Em Meio Sólido
73 - 78
a) Bufo schneider
73 - 77
b) Leptodactylus pentadactylus
78
4.7.3.2. Em Meio Líquido
78 - 119
a) Amostras de Bufo scneider
78 - 88
a.1. Extratos de Pele de B. schneideri
78 - 84
a.2 Amostras dos picos purificados obtidos de B. scneider
84 - 88
b) Amostras de Leptodactytlus pentadactylus
89- 111
b.1. Peptídeos 5, 6 e 7 de Leptodactytlus pentadactylus obtidos pela CLAE em C18
89
b.1.1. Avaliação da atividade tempo-dependente
89- 106
b.1.2. Avaliação da influência do pH na atividade antimicrobiana dos peptídeos de
L. pentadactylus
106
b.2. Ensaio antimicrobiano com amostras do L. pentadactylus obtidas em coluna
filtrante Sephacryl S-400 em meio líquido
106
b.2.1. Avaliação tempo/dependente da atividade antimicrobiana de substâncias
extraídas de L. pentadactylus e influência da fervura.
109- 118
b.2.2. Determinação da concentração inibitória mínima antimicrobiana do pico 8 obtido
da cromatografia em coluna filtrante Sephacryl S 400 da secreção de
Leptodactylus pentadactylus
118 - 119
5. CONCLUSÃO
120-122
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
123-156
ix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 -
Farmacologia da bufotenina em humanos (OTT, 2001).
8
Tabela 2 -
Classificação química dos produtos até então isolados da pele de anfíbios e
alguns exemplos
12
Tabela 3 -
Principais classes de polipeptídeos da pele de anfíbios e algumas
características de ação biológica
14
Tabela 4 -
Resultado da leitura em espectrofotômetro a 541 nm do sobrenadante dos
poços da placa de microtitulação da avaliação da atividade hemolítica dos
das amostras obtidas da secreção da pele de Bufo schneideri
65
Tabela 5 -
Resultado da leitura em espectrofotômetro a 541 nm do sobrenadante dos
poços da placa de microtitulação da avaliação da atividade hemolítica dos
das amostras obtidas da cromatografia em Sephacryl S-400 da secreção da
pele de Leptodactylus pentadactylus contra suspensão a 5% de sangue de
ratos albinos Wistaro
68
Tabela 6 -
Resultado da leitura em espectrofotômetro a 541 nm do sobrenadante dos
poços da placa de microtitulação da avaliação da atividade hemolítica dos
das amostras peptídicas obtidas da cromatografia em coluna absorção
hidrofóbica de fase reversa C18 de aminoetilagarose eluído em programa
isocrático a 5 % com acetonitrila acrescida de ácido trifluoroacético da
secreção da pele de Leptodactylus pentadactylus.
70
Tabela 7 -
Tamanho dos halos de inibição de .amostras obtidas da secreção da pele de
Bufo schneideri frente aos microorganismos testados.
73
Tabela 8 -
Ensaio antimicrobiano com amostras do Leptodactylus pentadactylus obtidas
em coluna filtrante Sephacryl S-400 em meio líquido
107
Tabela 9 -
Tempo para inicio do crescimento bacteriano (lag) e taxa de crescimento
máximo (Tax), estimadas segundo as equações de Gompertz, para
Salmonella choleraesus choleraesus var typhi, submetidas à várias
condições de tratamento com amostras obtidas na coluna Sephacryl S 400 da
secreção de Leptodactylus pentadactylus.
116
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 -
Esqueleto básico dos Bufadienolídeos
15
Figura 2 –
Foto de um espécime Bufo schneideri W.
39
Figura 3 –
Foto de um espécime Leptodactylus pentadactylus L.
39
Figura 4 –
Representação esquemática da área de mensuração do halo de inibição na
placa de ensaio com meio sólido de Müeller – Hinton.
47
Figura 5 –
Cromatograma do extrato bruto de Bufo schneideri em CLAE em coluna
adsorção hidrofóbica de fase reversa C18 de aminoetilagarose eluído em em
gradiente de 0 (zero) a 40 % com acetonitrila acrescido de ácido
trifluoroacético.
49
Figura 6 –
Cromatograma obtido do pico 1 em coluna adsorção hidrofóbica de fase
reversa C18 de aminoetilagarose eluído em programa isocrático a 30 % com
acetonitrila acrescida de ácido trifluoroacético
50
Figura 7 –
Estrutura do Pico 1B: Hellebrigenin (3β, 5β, 14β - trihidroxi–19–oxo–20, 22 -
bufadienolídeo)
52
Figura 8 –
Estrutura do Pico 2: Telocinobufagin (3β, 5β, 14β - trihidroxi – 20, 22 –
bufadienolídeo)
53
Figura 9 –
Estrutura do Pico 3: Marinobufagin (14β, 15β - epóxi-3β, 5β -dihidroxi–20, 22
bufadienolídeo)
54
Figura 10 –
Estrutura do Pico 4: Bufalin (3β, 14β - dihidroxi – 5β– bufa– 20, 22 -dienolídeo
55
Figura 11 –
Esquema do resultado do extrato bruto de B. scneider aplicado na Lâmina de
Silicagel AL60 tendo como eluente o clorofórmio e sistema revelador a base
de vanilina.
57
Figura 12 –
Esquema do resultado do extrato bruto de B. scneider aplicado na Lâmina de
Silicagel AL60 tendo como eluente uma mistura de clorofórmio-metanol
(9:1) e sistemarevelador o iodo.
58
Figura 13 -
Cromatogramas de amostras de veneno de Bufo schneideri oriundas de
Areia (PB) e Fortaleza (CE).
60
Figura 14 -
Cromatograma da purificação de proteínas em coluna preparativa filtrante
Sephacryl - S 400 (0,6 cm diãmetro por 46 cm comprimento) e eluída por
tampão Tris– HCl 0,05 N
61
Figura 15 –
Avaliação eletroforética para a análise de pureza da toxina (P8) em gel de
poliacrilamida 6% sob condições não desnaturantes e desnaturantes com
SDS 1 % e β - mercaptoetanol.
62
xi
Figura 16 –
Cromatograma da obtenção dos peptídeos do exsudato liofilizado de
Leptodactylus pentadactylus fracionado por CLAE com coluna C18 eluído
num gradiente de 5 a 80 % de acetonitrila durante 75 min., fluxo de 5
ml/min.
63
Figura 17 -
Cromatograma de verificação da pureza cromatografia analítica em coluna
de adsorção hidrofóbica fase reversa C4 dos picos 5, 6 e 7 peptídicos de
Leptodactylus pentadactylus respectivamente.
64
Figura 18 –
Efeitos de variações parciais de da estrutura e grupos na atividade citotóxica
de bufodienolídeos, cardienolídeos de ocorrência natural e seus análogos
relacionados.
67
Figura 19 -
(A) Estrutura da squalamina, um aminosterol, 3β-N-1- [N(3-[4-aminobutil])
1,3 diaminopropano] - 7α - hydroxi - 5α - colestan – 24 R - il sulfato e em
(B) o sintético MSI- 1436 com R1 = espermina, R2 = R-OH e R3 = OH.
75
Figura 20 -
Estrutura dos quatro bufadienolídeos isolados de B. schneideri.
77
Figura 21 -
Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras de
extratos de diferentes regiôes de pele de Bufo schneideri contra Enterobacter
aerogenes em meio líquido
79
Figura 22 -
Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras de
extratos de diferentes regiôes de pele de Bufo schneideri contra Escherichia
coli em meio líquido.
80
Figura 23 -
Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras de
extratos de diferentes regiôes de pele de Bufo schneideri contra Klebsiella
pneumoniae em meio líquido.
81
Figura 24 -
Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras de
extratos de diferentes regiôes de pele de Bufo schneideri contra Salmonella
choleraesuis choleraesuis var typhi em meio líquido.
82
Figura 25 -
Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras de
extratos de diferentes regiôes de pele de Bufo schneideri contra Bacillus
subtilis em meio líquido.
83
Figura 26 -
Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras de
extratos de diferentes regiôes de pele de Bufo schneideri contra
Staphylococus aureus em meio líquido.
84
xii
Figura 27 -
Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras obtidas
da secreção da pele de Bufo schneideri contra Enterobacter aerogenes em
meio líquido.
85
Figura 28 -
Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras obtidas
da secreção da pele de Bufo schneideri contra Escherichia coli em meio
líquido.
86
Figura 29 -
Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras obtidas
da secreção da pele de Bufo. schneideri contra Bacillus subtilis em meio
líquido.
87
Figura 30 -
Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras obtidas
da secreção da pele de Bufo schneideri contra Staphylococcus aureus em
meio líquido.
88
Figura 31 -
Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras
peptídicas 5, 6 e 7 obtidas de Leptodactylus pentadactylus contra Bacillus
subtilis.
90
Figura 32 -
Análise dos dados da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da
placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as
amostras peptídicas obtidas de Leptodactylus pentadactylus pelo modelo de
Gompertz contra Bacillus subtilis.
91
Figura 33 -
Análise dos dados da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da
placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as
amostras peptídicas obtidas de Leptodactylus pentadactylus pelo modelo de
Equação de Regressão Não Linear contra Bacillus subtilis.
92
Figura 34 -
Representação gráfica do resultado do Teste de Comparação Múltipla de
Tukey da influência das amostras peptídicas de Leptodactylus pentadactylus
no início do crescimento (START) do Bacillus subtilis.
93
Figura 35 -
Representação gráfica do resultado do Teste de Comparação Múltipla de
Tukey da influência das amostras peptídicas na inclinação (K) para análise
da cinética de crescimento de Bacillus subtilis
94
Figura 36 -
Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras
peptídicas 5, 6 e 7 obtidas de Leptodactylus. pentadactylus contra Klebsiella
pneumoniae.
95
Figura 37 -
Análise dos dados da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da
placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as
amostras peptídicas obtidas de Leptodactylus pentadactylus pelo modelo de
Gompertz contra Klebsiella pneumoniae.
96
xiii
Figura 38 -
Análise dos dados da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da
placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as
amostras peptídicas obtidas de Leptodactylus. pentadactylus pelo modelo de
Equação de Regressão Não Linear contra Klebsiella pneumoniae.
97
Figura 39 -
Representação gráfica do resultado do Teste de Comparação Múltipla de
Tukey da influência das amostras peptídicas de Leptodactylus pentadactylus
no início do crescimento (START) de Klebsiella pneumoniae.
98
Figura 40 -
Representação gráfica do resultado do Teste de Comparação Múltipla de
Tukey da influência das amostras peptídicas de Leptodactylus pentadactylus
na inclinação (K) para análise da cinética de crescimento de Klebsiella
pneumoniae.
99
Figura 41 -
Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras
peptídicas 5, 6 e 7 obtidas de Leptodactylus pentadactylus contra
Staphyloccoccus aureus.
100
Figura 42 -
Análise dos dados da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da
placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as
amostras peptídicas obtidas de Leptodactylus pentadactylus pelo modelo de
Gompertz contra Staphylococcus aureus.
101
Figura 43 -
Análise dos dados da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da
placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as
amostras peptídicas obtidas de Leptodactylus pentadactylus pelo modelo de
Equação de Regressão Não Linear contra Staphylococcus aureus.
103
Figura 44 -
Representação gráfica do resultado do Teste de Comparação Múltipla de
Tukey da influência das amostras peptídicas de Leptodactylus pentadactylus
no início do crescimento (START) de Staphyloccoccus aureus.
104
Figura 45 -
Representação gráfica do resultado do Teste de Comparação Múltipla de
Tukey da influência das amostras peptídicas na inclinação (K) para análise
da cinética de crescimento de Staphyloccoccus aureus.
105
Figura 46 -
Valores de absorbância a 492 nm com 6 horas de cultivo de Pseudomonas
aeruginosa obtidas com os picos 8, 10 e 11 da cromatografia em coluna de
Sephacryl S-400 de Leptodactylus pentadactylus, com e sem desnaturação
pelo calor
109
Figura 47 -
Valores de absorbância a 492 nm com 12 horas de cultivo de Pseudomonas
aeruginosa obtidas com os picos 8, 10 e 11 da cromatografia em coluna de
Sephacryl S-400 de Leptodactylus pentadactylus, com e sem desnaturação
pelo calor.
110
Figura 48 -
Valores de absorbância a 492 nm com 24 horas de cultivo de Pseudomonas
aeruginosa obtidas com os picos 8, 10 e 11 da cromatografia em coluna de
Sephacryl S-400 de Leptodactylus pentadactylus, com e sem desnaturação
pelo calor.
xiv
Figura 49 -
Curva de crescimento bacteriano estimada pela variação de densidade óptica
a 492 nm segundo as equações de Gompertz para Pseudomonas aeruginosa
submetidas à várias condições de tratamento com amostras obtidas na coluna
Sephacryl S 400 da secreção de Leptodactylus pentadactylus.
111
Figura 50 -
Análise dos dados da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da
placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as
amostras peptídicas obtidas de L. pentadactylus pelo modelo de Equação de
Regressão Não Linear contra Pseudomonas aeruginosa.
112
Figura 51 -
Valores de absorbância a 492 nm com 6, 12 e 24 horas de cultivo de
Salmonella choleraesus choleraesus var typhi obtidas com os picos 8, 10 e
11 da cromatografia em coluna de Sephacryl S-400 de L. pentadactylus, com
e sem desnaturação pelo calor.
114
Figura 52 -
Curva de crescimento bacteriano estimada pela variação de densidade óptica
(492 nm) segundo as equações de Gompertz, para Salmonella choleraesus
choleraesus var typhi, submetidas à várias condições de tratamento com,
substratos extraídos de L. pentadactylus.
115
Figura 53 -
Análise dos dados da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da
placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as
amostras peptídicas obtidas de L. pentadactylus pelo modelo de Equação de
Regressão Não Linear contra Salmonella choleraesus choleraesus var typhi
117
xv
RESUMO
ESTUDO SOBRE A ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE SUBSTÂNCIAS EXTRAÍDAS E
PURIFICADAS DE SECREÇÕES DA PELE DE ANFÍBIOS. Carlos Iberê Alves Freitas. Tese de
Doutoramento – Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, 2003. Orientador: Prof.
Dr. Krishnamurti Morais Carvalho. Curso de Pós-graduação em Farmacologia, do Dept. de Fisiologia
e Farmacologia.
A emergência de mocroorganismos resistente a multidrogas, tais como Staphylococcus aureus as
resistentes a meticilina, Enterococcus resistente a vancomicina, e Mycobacterium tuberculosis
resistente a drogas, tem incitado esforçospara desenvolver e pesquisar novas classes de antibióticos
que possam ter utilidade clínica. Nos últimos anos, uma variedade de antibióticos de baixo peso
molecular têm sido isolados de diversas espécies animais. Estes agentes incluem peptídeos, lipídios, e
alcalóides, exibem atividade antibiótica contra micróbios do meio ambiente e considera-se que
desempenhem um papel na imunidade inata. Compostos com largo espectro de atividade
antimicrobiana que são sintetizados pelas glândulas granulares presentes na pele de anuras (rãs e
sapos) têm recebido uma crescente atenção como agentes terapêuticos em potencial. Nós relatamos
aqui a descoberta de um antibiótico esteroidal de atividade de largo espectro, bufadienolídeos,
chamados hellebrigenin, telocinobufagin, marinobufagin e bufalin de Bufo schneideri, um sapo
Brasileiro, com atividade inibitória diferenciada contra sete microorganismos e nenhuma atividade
contra Pseudomonas aeruginosa. A secreção da pele do sapo foi obtida porcompressão manual das
glândulas paracnemis e tibial. Tr~e peptídeos com estruta possivelmente relacionada com uma
potente atividade inibitória para bactéria gram positiva, Staphylococcus aureus e uma potente
proteína com forte atividade antimicrobiana contra Pseudomonas aeruginosa (MIC = 9,64 μg/ml) foi
isolada com secreções da pele de Leptodactylus pentadactylus estimuladas por adrenalina obtidas por
injeção subcutânea de 500 μl (100 μg/ml) e caracterizada. Os bufadienolídeos foram obtidos com
separação em CLAE de fase reversa sendo executado utilizando-se uma coluna C-18 (15 μm, 100 A
o
,
Shim-pack PREP 250 mm x 25 mm) com um gradiente de 0-40 % de acetonitrila/água e 0,05 % de
ácido trifluoroacético. Análise de NMR de alta resolução das amostras purificadas por aplicação de
seqüência de pulsos modernos tais como
1
H,
1
H-COSY e NOESY, e determinação da correlação
heteronuclear dos carbono-hidrogênio ligados diretamente
1
H,
13
C-COSY (HETCOR) e via detecção
do hidrogênio inversa (HMQC), bem como o seqüenciamento a longa distância, COLOC e HMBC,
permitindo assim sua identificação como um esteróide do tipo bufodienolídeo. A proteína de L.
pentadactylus foi purificada por cromatografia em Sephacryl S-400 (460 mm x 6 mm) eluída com um
tampão (Tris – HCl 0,05 N) e sua pureza foi avaliada poreletroforese em condições desnayurantes e
não desnaturantes.A proteína total foi determinada pelo método de Bradford usando albumina soro
bovina como padrão. O isolamento dos peptídeos foi efetuado usando-se o exsudato liofilizado e
redissolvendo em água bidestilada/TFA 0,05 % (20:1; P:V) e corrido numa coluna C18 de fase
reversa em CLAE (15 μm, 100 A
o
, Shim-pack PREP 250 mm x 25 mm) eluída com um gradiente
linear de 5 - 80% em 103 min num fluxo de 5 ml/min com acetonitrila/água e ácido trifluoroacético
0.05 %. A atividade antimicrobiana de todas as amostras foi monitorada pelos métodos de Bauer –
Kirby e placa de microdiluição padrãousando Escherichia coli ATCC 25922, Enterobacter aerogenes
ATCC 1304, Klebsiella pneumoniae ATCC 10031, Salmonella choleraesus choleraesus var typhi
ATCC 6534, Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6538 P e Pseudomonas
aeruginosa HUWC 1. No primeiro método, cada placa com agar Müeller –Hinton após promover
incubação por 24 h a 35 °C. As zonas claras na superfície do agar foram tomadas como indicativoda
xvi
atividade antibacteriana. O diâmetro destas foram mensuradas e a atividade foi expressa em área das
zonas claras (mm
2
). As incubações com os microorganismos foram feitas em caldo de B.H.I. por
diferentes tempos até 24 h a 35°C e estimada a influência da desnaturação na atividade das amostras
protéicas. Após incubação, na absorbância de 492 nm cada poço foi determinado usando-se um
Detector Shimadzu UV – VS modelo SPD - 10A VP. A mínima concentração inibitória (MICs) se
possível foi determinada pelo método da microdiluição padrão. Todos os procedimentos foram
executados de acordo com os manuais de instrução do Comitê National de Padronização para
Laboratórios Clínicos (Wayne, PA, USA). A hemólise induzida por amostras foi determinada por
incubação de uma suspensão 5% (v/v) de hemácias humanas dos tipos antigênicos A e O, rato e
caprinos em tampão fosfato - salina com quantidades apropriadas das amostras a 37 ºC até 24 h. O
sobrenadante foi mensurado em densidade optical a 541 nm. Esta foi comparada a uma suspensão
tratada com detergente a 0,1 % com agitação enérgica e definido o % de hemólise. Todos os
compostos manifestaram moderado ou nenhuma atividade hemolítica. A proteína de L. pentadactylus
apresentou uma concentração hemolítica mínima de 2,09 x 10
-4
, 1,34x10
-2
, 1,07x10
-1
e 1,34x10
-2
μg
para rato, caprino, tipos antigênicos humanos A e O humanos respectivamente. Sob refrigeração estes
valores decrescem. Para analisar interrelação entre a assimetria e mecanismos, estimativa de
parâmetros cinéticos foram obtidos pelos modelos matemáticos de equações de Gompertz e regressão
não linear, ANOVA e teste de comparação múltipla de Tukey.
Palavras-chave: Antimicrobianos, anfíbios, purificação, metabolismo bacteriano.
xvii
ABSTRACT
STUDIE OF ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF EXTRACTED SUBSTANCES OF AMPHIBIANS
PURIFIED SKIN SECRETIONS. Carlos Iberê Alves Freitas. Tese de Doutoramento – Faculdade de
Medicina da Universidade Federal do Ceará, 2003. Orientador: Prof. Dr. Krishnamurti Morais
Carvalho. Curso de Pós-graduação em Farmacologia, do Dept. de Fisiologia e Farmacologia.
The emergence of multidrug-resistant microorganisms, such as methicillin-resistant Staphylococcus
aureus, vancomycin-resistant Enterococcus, and drug-resistant Mycobacterium tuberculosis, has
prompted efforts to develop and search for new classes of antibiotics that may have clinical utility. In
recent years, a variety of low molecular weight antibiotics have been isolated from diverse animal
species. These agents include peptides, lipids, and alkaloids, exhibit antibiotic acivity against
environmental microbes and are thought to play a role in innate immunity. Compounds with a broad
spectrum of antimicrobial activity that are synthesized in granular glands present the skin of anurans
(frogs and toads) have received increasing attention as potential therapeutic agents. We report a here
the discovery of a broad – spectrum steroidal antibiotic activity, bufadienolides, called hellebrigenin,
telocinobufagin, marinobufagin and bufalin of Bufo schneideri, a Brazilian toad, with differential
growth-inhibitory activity against seven microorganisms and neither activity against Pseudomonas
aeruginosa. Toad skin secretion was obtained by manual compression of the paracnemis and tibial
glands. Three possible structurally related peptides with potent growth-inhibitory activity towards
Gram-positive bacterium, Staphylococcus aureus and a potent novel antimicrobial protein with strong
activity against Pseudomonas aeruginosa (MIC = 9,64 μg/ml) was isolated from the adrenaline
stimulated Leptodactylus pentadactylus skin secretions obtained by a subcutaneous injection of 500μl
(100μg/ml) and characterized. Bufadienolides was obtained with HPLC reversed-phase separation
was achieved using a C-18 column (15 μm, 100 A
o
, Shim-pack PREP 250 mm x 25 mm) with a
gradient of 0 - 40 % acetonitrile/aqueous and 0.05 % trifluoroacetic acid. High resolution NMR
analysis of the purified samples by application of modern pulse sequencies such as
1
H,
1
H-COSY and
NOESY,
1
H,
13
C-COSY (HETCOR) and hydrogen-detected inverse (HMQC) heteronuclear
correlation of directly attached carbon-hydrogen, as well as the long- range equivalent sequencies,
COLOC and HMBC, allowed its identification as a steroid of the bufodienolide type. The protein of
L. pentadactylus was purified by Sephacryl S-400 chromatography (460 mm x 6 mm) eluted with a
buffer (0,05 N Tris – HCl) and its purity was evaluated by denaturing and non-denaturing gel
eletrophoresis. Total protein was determined by the method of Bradford using bovine serum albumin
as standard. Peptides isolation was perfomed using lyophilized exsudate and redissolved in bidestilled
water/TFA 0,05 % (20:1; W:V) and run on a C18 reversed-phase HPLC column (15 μm, 100 A
o
,
Shim-pack PREP 250 mm x 25 mm) eluted with a linear gradient of 5-80% in 103 min at a flow rate
of 5 ml/min with acetonitrile/aqueous and 0.05 % trifluoroacetic acid. Antimicrobial activity of the all
samples was monitored by Bauer – Kirby and Standard microdilution plate methods using
Escherichia coli ATCC 25922, Enterobacter aerogenes ATCC 1304, Klebsiella pneumoniae ATCC
10031, Salmonella choleraesus choleraesus var typhi ATCC 6534, Bacillus subtilis ATCC 6633,
Staphylococcus aureus ATCC 6538 P and Pseudomonas aeruginosa HUWC 1. In first method each
plate with Müeller –Hinton agar before further incubation for 24 h at 35 °C. Clear zones in the agar
underlays were taken as indicating antibacterial activity. The diameter of these were measured and
activity was expressed as clear zone area (mm
2
). Incubations with microorganisms were carried out in
B.H.I. broth for different time until 24 h at 35°C and was estimated the influence of desnaturation in
activity for proteic samples. After incubation, the absorbance at 492 nm of each well was determined
xviii
using a UV – VS Detector Shimadzu model SPD- 10A VP. Minimal inhibitory concentrations
(MICs) if possible were determined by a standard microdilution method. All procedures were
performed according to the guidelines of the National Committee for Clinical Laboratory Standards
(Wayne, PA, USA). Hemolysis induced by samples was determined by incubating a 5% (v/v)
suspension of human A and O antigenic type, rat and goat red blood cells (RBC) in phosphate-
bufered saline with the appropriate amount of samples at 37 ºC until 24 h. The supernatant was
measured in the optical density at 541 nm. The relative optical density compared to that of the
suspension treated with 0.1% detergent with energetic agitation defined % hemolysis. All compound
manifest moderate or no hemolytic activity. Protein of L. pentadactylus showed a minimal hemolytic
concentration of the 2,09 x 10
-4
, 1,34x10
-2
, 1,07x10
-1
and 1,34x10
-2
μg for rat, goat, A and O human
antigenic types respectivily. At refrigeration this values is decrease. To analyze the relationship
between asymmetry and mechanisms, estimation of cinetic parameter was obtained from the
Gompertz and non linear regression equation mathematical models, ANOVA and Tukey’s multiple
comparison test.
Keywords: Antimicrobial, amphibians, purification, bacterial metabolism.
xix
JUSTIFICATIVA
As doenças infecciosas estão entre as principais causas de morte da população humana. Esse
fato é devido, em grande parte, ao surgimento de microorganismos multi-resistentes aos antibióticos,
destacando-se as infecções estafilocóccicas e por gram negativos, sendo que os danos causados por
microrganismos resistentes não atingem somente a saúde humana, causam queda de produção e morte
de animais, assim como grande quebras de safra na agricultura. Portanto, apesar da disponibilidade de
um grande número de antibióticos de última geração, torna-se ainda fundamental buscar compostos
que possam atuar como novas drogas a serem utilizadas no combate as doenças infecciosas
(POPKIROV & FITSCHEV, 1980; BOMAN, 1995; CUDIC et al., 2002).
O surgimento do grande número atual de cepas bacterianas resistentes pode ter várias origens,
sendo uma delas decorrente do próprio tipo de vida do ser humano. O principal fator é, sem dúvida, o
consumo excessivo e inapropriado dos antibióticos por homens, outros animais e na agricultura. A
prescrição do antibiótico é geralmente empírica e sem a identificação prévia do agente patogênico
através de exames laboratoriais. Além disso, a sua venda sem exigência de uma prescrição médica em
alguns países, associada ao suprimento irregular desse medicamento, à baixa qualidade da medicação
e ao seu mau uso pelos pacientes que muitas vezes não completam o tratamento, contribuem para a
seleção de novos microorganismos multi-resistentes. Associada a isso, uma grande quantidade de
agentes antimicrobianos vem sendo usado na agropecuária para promover o crescimento de plantas e
animais, o que ocasiona um aumento da resistência de microorganismos que são transmitidos para o
homem. Ao mesmo tempo, o aumento da migração da população e o transporte de animais ou de
produtos de origem animal trazem doenças para áreas onde nunca haviam se instalado, resultando no
espalhamento de microorganismos resistentes aos antibióticos. Mudanças ambientais, tais como
desmatamento e alterações climáticas também proporcionam contato mais íntimo dos homens com
animais e insetos que transmitem doenças muitas vezes desconhecidas, além de ameaçarem plantas e
animais que poderiam vir a ser novas fontes em potencial de antibióticos e outros fármacos
(LOHNER & STAUDEGGER, 2001; BOYCE, 2001; FDA - CVM, 1999). Assim sendo, várias
medidas sócio – político - econômicas deveriam ser tomadas para a contenção do desenvolvimento e
de transmissão de resistência antimicrobiana. Redução do uso inapropriado e excessivo dos
antibióticos no tratamento de doenças em geral, tanto humanas quanto de animais domésticos e da
própria agricultura, poderia ser uma dessas medidas (CUNHA, 1998). Paralelamente, para que se
consiga um efetivo controle das doenças infecciosas, tornou-se vital investir em pesquisa e em
xx
pesquisadores que possam se dedicar à busca de substâncias naturais ou sintéticas que exibam
atividades antimicrobianas específicas e, acima de tudo, que as exerçam através de mecanismos de
ação alternativos daqueles dos antibióticos disponíveis (LEVY, 1998). Neste último aspecto temos
que a conservação dos recursos genéticos do planeta, bem como sua exploração sustentável é tão
importante que em vários países do mundo estão sendo criados programas de bioprospecção (SEIDL,
2002), integrando universidades, institutos de pesquisas, museus e a indústria farmacêutica, para
descobrir e desenvolver novos fármacos, este trabalho desenvolvido assim como outros no
Laboratório de Neurofarmacologia da UECE se integram a esta nova visão.
Nesse contexto, a pesquisa, a purificação, e a caracterização química, biológica e estrutural de
novas substâncias antimicrobianas provenientes da fauna e da flora brasileira são valiosas, uma vez
que a própria evolução tratou de selecionar um vastíssimo espectro de substâncias eficientes que
defendem contra infecções.
A importância é tão grande que em termos de atividade biológica dos metabólitos pesquisados
em universidades e centros de pesquisa os antibióticos representam 58%, antitumorais 10% e
antifúngicos 5%. Os maiores conglomerados farmacêuticos, as multinacionais, parecem sofrer de
uma "verdadeira febre de procura" por novos compostos moldados pela natureza durante milhões de
anos de evolução, visto que este "laboratório" decididamente já testou bilhões de possibilidades para
cada caso, e nos apresenta um verdadeiro tesouro pronto para ser explorado. A área de produção de
moléculas bioativas com atividade farmacológica é uma das mais exploradas em Biotecnologia,
envolvendo principalmente empresas de países industrializados, sendo que analisando diferentes
metabólitos, quanto a sua atividade biológica, pesquisados nestas empresas, temos que os antibióticos
constituem 26%, antitumorais 24% e antifúngicos 3%(FAT - Base de Dados Tropical, 1999), contudo
isto deve ser feito de maneira coerente, pois muitos destes ecossistemas apresentam um equilíbrio
frágil (TULP & BOHLIN, 2002).
Os vertebrados, mais precisamente os anfíbios da ordem Anura, representam um verdadeiro
laboratório de bioquímica, tendo em vista o arsenal de toxinas que fabricam. Atualmente, peptídeos
antimicrobianos de origem animal estão sendo utilizados como modelos para o desenho de novas
drogas com aplicação nas áreas agrícola e de saúde. Para tanto, seqüências anfifílicas de peptídeos
vêm sendo desenhadas, sintetizadas e testadas in vitro, a fim de permitirem a obtenção de genes com
potencial de resistência a fitopatógenos, bem como compostos ativos para a fabricação de drogas de
xxi
amplo espectro e de múltipla aplicabilidade (BOMAN, 1995; BARRA et al., 1998, FLEURY et al.,
1998; PRATES & BLOCH JÚNIOR, 2000).
No Laboratório tem se procurado desenvolver trabalhos com a fauna encontrada na região
Nordeste, além de contribuir para a valorização também de idéias conservacionistas, haja visto que
existem várias espécies de anfíbios caminhando para a extinção quer por destruição de seus habitats,
contaminação com poluentes ou mesmo por não ser um animal que na maioria das pessoas inspire
simpatia.
Mais de 210 peptídeos antimicrobianos de anfíbios já foram isolados, tendo como principal
característica a natureza catiônica e a capacidade de permeabilizar membranas de microrganismos.
Podem ser agrupados segundo sua estrutura primária e muitos são encontrados em indivíduos do
mesmo gênero e até mesmo em indivíduos de gêneros distintos, pertencentes à mesma subfamília ou
não. Mas não basta obter novos compostos com ação antimicrobiana e sim também buscar
especificidade e novos mecanismos de ação. Atento a isto, nos trabalhos efetuados buscou-se
substâncias que tivessem ação contra bactérias de importância em termos de resistência, sendo
encontrado atividade intensa e de grande especificidade contra duas das espécies bactérias que
foram, segundo Hooper (2001) foram as primeiras nas quais devenvolveram através de mutações
simples alterações suficientes para causar causar níveis clínicos consideráveis de perigo, sendo elas a
Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa, e em menor intensidade para Escherichia coli,
um exemplo de uma bactéria que só com múltiplas mutações desenvolveram resistência.
xxii
LISTA DE ABREVIATURAS
ATCC -
American Type Cell Culture
B.H.I -
Brain heart infusion (Infusão de cérebro e coração)
CLAE
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CHM
Concentração hemolisante mínima
COLOC
Correlation Spectroscopy via Long-range Coupling (Correlação heteronuclear a
longa distância de detecção normal)
1
H,
1
H-COSY
Carbon Detected, Hydrogen– Hydrogen-1 Chemical Shift Correlated
Spectroscopy
1
H,
13
C-COSY
Carbon Detected, Hydrogen–Carbon-13 Chemical Shift Correlated Spectroscopy
HETCOR
Heteronuclear Chemical Shift Correlation Spectroscopy (Correlação
heteronuclear de detecção normal)
HMBC
1
H- Detected Heteronuclear Multiple – Bond Correlated Spectroscopy
HMQC
1
H- Detected Heteronuclear Multiple – Quantum Coherence
MIC
Minimal Inhibition Concentration (Mínima concentração inibitória)
RMN
Ressonância Magnética Nuclear
NO
Óxido nítrico
NOESY
Nuclear Overhauser Enhancement and Exchange Spectroscopy
SDS -
Sulfato dodecil de sódio
TFA -
Ácido trifluoroacético
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Um Breve Histórico das Drogas Antimicrobianas e a Resistência Bacteriana
As doenças infecciosas estão entre as principais causas de morte da população humana. Esse
fato é devido, em grande parte, ao surgimento de microorganismos multi-resistentes aos antibióticos.
Mesmo tendo a disponibilidade de um grande número de antibióticos de última geração, torna-se
ainda fundamental buscar compostos que possam atuar como novas drogas a serem utilizadas no
combate as doenças infecciosas (BOMAN, 1995; CUDIC et al., 2002)
No começo da década de 40, antes do advento da penicilina como substância pura e
produzida em larga escala, as doenças infecciosas de origem bacteriana se apresentavam com
índices de mortalidade quase absolutos, tal como ocorria com a endocardite bacteriana, a febre
tifóide e a própria pneumonia comunitária. Com os antibióticos, a evolução e o prognóstico dessas
infecções reduziram-se a níveis dramáticos, suscitando a falsa impressão de que o universo
bacteriano estaria fadado ao extermínio (COLLINS & LINE, 1976).
Nestes anos que se seguiram, a cada passo temos sido testemunhas de uma batalha
incessante, tendo de um lado o extraordinário desempenho biológico desses seres microscópicos,
que com enorme plasticidade genética, vêm desenvolvendo mecanismos sofisticados de resistência
que anulam os efeitos dos antibióticos e do outro, o empenho continuado dos pesquisadores e da
indústria farmacêutica na busca de novas drogas que permitam-nos continuar à frente dos patógenos.
Esta disputa praticamente se inicia na década de 60, quando começaram a ser relatados nos
hospitais, graves surtos de infecções por estafilococos resistentes à penicilina, logo controlados com
a descoberta da meticilina e oxacilina, beta - lactâmicos similares que resistiam à penicilinase
elaborada pelo germe. Seguem-se como acontecimentos principais, as resistências do Haemophylus
influenzae à ampicilina e dos bacilos gram-negativos às cefalosporinas de 1ª e 2ª gerações e
aminoglicosídeos, principalmente gentamicina (HORODNICEANU et al., 1979, BANTAR et al.,
1991).
Para se contrapor a esta ameaça, surgem as cefalosporinas de 3ª geração, os carbapenemas e
monobactâmicos, representados respectivamente pelo Imipenem, meropenem e aztreonam. A
resposta defensiva das bactérias se faz logo em seguida, pela produção das chamadas beta-
lactamases de espectro ampliado, elaboradas notadamente por Pseudomonas aeruginosa, Serratia,
2
Klebiella pneumoniae, Enterobacter, entre outros, e que passam a impedir a ação daqueles
antibióticos (SANDERS et al., 1984,).
A partir da década de 90 os gram positivos assumem o predomínio das infecções
hospitalares, com o aumento da incidência dos Estafilococos resistentes a meticilina e oxocilina e o
crescimento do Enterococo, um típico emergente resultante da pressão seletiva exercida
principalmente pelas cefalosporinas de longa meia vida e excreção biliar, usadas de forma abusiva
em nosso país. Essas resistências obrigam a uma maior utilização dos glicopeptídeos, notadamente a
vancomicina, até então o último trunfo disponível. (AUSTIN et al., 1999).
Um estudo realizado no Rio de Janeiro, entre 1997 e 1998, mostrou que nas amostras
bacterianas de 206 crianças analisadas, 24% eram resistentes à penicilina e 52 %, à sulfa, um
antibiótico usado com freqüência pelo Sistema Único de Saúde.
Somando-se a esses acontecimentos, neste começo de novo século, estamos enfrentando
problemas ainda mais graves, destacando-se a resistência do Streptococcus pneumoniae à penicilina
e a outros beta-lactâmicos e macrolídeos, cepas de Mycobacterium tuberculosis resistentes às drogas
disponíveis, Enterococos resistentes a vancomicina, estafilococos tolerantes à vancomicina e a
emergência de agentes até então pouco considerados, como Acinetobacter baumanii e
Stenotrophomanonas (Xanthomonas) maltophilia, multirresistentes. Ainda que se tenha reduzido a
produção de novas drogas, cumpre destacar o lançamento das quinolonas de 3ª geração,
levofloxacina, gatifloxacona e moxifloxacina, mais efetivas para gram-positivos, incluindo
Streptococcus pneumoniae penicilino resistentes, Estafilococos meticilino sensíveis e igualmente
para germes de infecções respiratórias como M. catarrhalis, H. influenzae, Chlamydia pneumoniae,
Mycolasma e Legionella (ISENBERG et al., 1999, SCULLY, 1999, SAHM et al., 2000, McCAIG et
al., 2003).
É importante ressaltar que se deve aprender também como utilizar este arsenal de drogas
antimicrobianas, pois segundo dados dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças, nos Estados
Unidos, um país que tem controle sobre a venda de medicamentos, dos 150 milhões de receitas nos
quais antimicrobianos são prescritos, pelo menos 50 milhões são desnecessários, sendo que na
França temos 36 % dos antimicrobianos sendo indevidamente prescritos. Temos que o próprio
homem um dos principais responsáveis pelo fenômeno da multi – resistência (TEMINE et al., 2003,
GUILLEMOT et al., 1998).
3
Nesse contexto temos que a pesquisa, purificação, e a caracterizações química, biológica e
estrutural de novas substâncias antimicrobianas provenientes da fauna e da flora brasileira são
valiosas, pois a própria evolução tratou de selecionar um vasto espectro de substâncias eficientes
que contra infecções.Nossa biodiversidade é tão grande que apesar de um desmatamento de 20.000
Km
2
por ano na floresta Amazônica brasileira (INPE, 1998), foram encontradas 163 espécies
diferentes de anfíbios em 28 inventários realizados no ano de 2002 (AZEVEDO – RAMOS &
GALATTI, 2002)
1.2. Os Anfíbios
1.2.1. Considerações Gerais
Os anfíbios têm um berço num cenário Devoniano, 300 a 250 milhões de anos, quando
emergiram das águas vertebrados que tinham a capacidade devido a mudanças evolucionárias, de
viver tanto na água como na terra e que dariam origem aos animais que encontramos hoje em dia,
sendo que evidências fósseis sugerem uma múltipla origem para os anfíbios.
Os anfíbios vivos ou Lissanfíbios podem ser definidos zoologicamente como animais que
nas primeiras fases da vida respiram o ar dissolvido na água, mediante brânquias, e no estágio adulto
o ar atmosférico. A classe Anfibia, quando definida de modo a incluir as linhagens recentes e os
tetrapodes primitivos do paleozóico, representa um grupo parafilético correspondendo aos Tetrapoda
exceto Aminiota. Entretanto, as linhagens modernas, classificados como pertencentes a uma destas
três ordens descritas abaixo constituem um grupo monofilético fundamentado por várias
características derivadas exclusivas (MICHL & KAISER, 1963, STORER et al., 1984, LAURENT,
1986; POUGH et. al. 2003).
1) Gymnophiona ou Apodos, anfíbios que são destituídos de membros, de aspecto vermiforme e
podendo ou não apresentar escamas, a exemplo da cobra - cega ou cecílias. Dentre as 175
espécies conhecidas, sua maioria é de distribuição tropical (DUELLMAN & TRUEB, 1994);
2) Caudata ou Urodela, é distinguida dos outros anfíbios obviamente pela presença de uma cauda
em todas as fases (larva, juvenil e adultos), e por ter um conjunto de membros em ângulos retos com
o corpo e de tamanhos aproximadamente iguais (posteriores e anteriores), a exceção da família
Sirenidae, a qual não apresentam membros posteriores. Salamandras são distinguidas das rãs e
4
cecílias também por numerosas características em seu esqueleto e musculatura (LARSON &
DIMMICK, 1993).
Estão divididos taxonomicamente em dez famílias baseadas na filogenia e características
anatômicas, sendo que no Brasil só conhecida apenas uma espécie, Bolitoglossa altamazonica Cope
1874, uma salamandra, sendo que talvez um maior conhecimento da fauna amazônica venha a
revelar a existência de mais salamandras, pois na vizinha Venezuela, na região limítrofe com o
Brasil, se conhecem dois gêneros, Spelerpes e Bolitoglossa, com quatro espécies (LEITÃO,
1977).Isto nos abrem novas possibilidades e estimula-nos a pensar o quanto temos em nosso País
por descobrir.
3) Anura ou Salientia, é constituída 28 famílias conhecidas e conta com mais de 4100 espécies
conhecidas, apresentando corpo curto e troncudo, provido de quatro membros (mais longos os
posteriores) adaptados à locomoção saltatória e reúnem: pererecas (tupi; originado de pere'reg, “ir
aos saltos”) designação comum aos anfíbios anuros, arborícolas, de ventosas nos dedos, sobretudo
os da família dos hilídeos; rãs e sapos (SOKOL, 1977, SEBBEN & SCHWARTZ, 1993).
As inter-relações entre as três ordens de anfíbios vivos têm sido difícil de resolver, mesmo
tendo sido efetuados além de estudos morfológicos, vários moleculares, tendo como a hipótese mais
aceita, com uma segurança de 54 %, a da existência de uma inter-relação filogenética maior entre
Caudata e Anura (hipótese batraquia) que a poucos anos tem sido alvo de contestação veemente
(FELLER & HEDGES, 1998; ZARDOYA & MEYER, 2000). Com os estudos desenvolvidos nestas
últimas décadas, é possível que em breve poderemos ter uma posição com relação a estes
questionamentos de uma quimiotaxonomia.
O Brasil é o país que apresenta o maior número de espécies de anfíbios, aproximadamente
517 espécies, das quais 61% são endêmicas (Núcleo de Informática Biomédica, 1997) o que pode
ser ainda bem questionável.
5
1.2.2. Presença dos Anfíbios na Cultura do Homem
Através da história, envenenamento por toxinas animais tem fascinado o homem, sendo que
raramente é um fenômeno médico, muito mais por associação religiosa, simbolismo, trocadilhos e
provocar divergências profissionais. As toxinas animais têm feito uma importante contribuição para
o aumento do conhecimento na fisiologia humana e farmacologia, tanto pelo conhecimento dos
mecanismos das mesmas ou pela sua utilização como ferramentas farmacológicas
(KARALLIEDDE, 1995).
Nem sempre ou em todos lugares sapos e rãs são sinais do mal. Para muitas culturas, são
símbolos conectados a poderes divinos de fertilidade, regeneração, renovação e renascimento. No
antigo Egito eles não eram conhecidos apenas como uma praga, mas como sinal de fertilidade e
água, representada pela deusa Heket, sendo também representantes da esposa do deus Heqit, o qual
regia a concepção e o nascimento. Na Mesoamérica pré -Colombiana, por muitas tribos era
conhecido como Ceneotl, o patrono dos recém-nascidos e fertilidade. Também, rãs e sapos eram
considerados espíritos da chuva e para os quais existiam vários rituais. Os primeiros Astecas
chamavam o sapo de Tlaltecuhti, a deusa mãe terra, que governava o ciclo da vida, a morte e
também o renascimento.
Os antigos chineses que o sapo uma força predominantemente feminina - negativa, yin em
oposição ao positivo - homem, yang. A lua, um símbolo yin, e para muitos contos chineses referem-
se ao sapo cuja face é visível na lua cheia, ocasionalmente quando engole a esta causa eclipses.
Rãs e sapos habitam o imaginário popular povoando fábulas, piadas e crendices. Em muitos
contos e lendas chinesas, os sapos são ladinos e mágicos, um mestre em escapadas e encantamentos.
Mas também é guardião também de segredos realmente poderosos do mundo, tais como o da
imortalidade. Muitas lendas envolvem um sábio peregrino chamado Liu Hai e seus três lendários
sapos de companhia Ch'an Chu que revelaram a este homem o segredo da vida eterna.
Uma outra forma do poder dos sapos e rãs é o de que em muitas culturas e mitos participa
química ou alquimicamente. Em muitos casos, estes mitos têm algum fundo de verdade, haja vista
que algumas espécies contêm compostos tanto tóxicos como alucinógenos. Muitas tribos das
Américas do Sul e Central usavam compostos de rãs e sapos como venenos e drogas alucinógenas
para rituais de caça e religiosos (WADE & WEIL, 1994).
6
1.2.3. Distribuição
Sua distribuição está atrelada à versatilidade destes animais devido a uma série de adaptações
fisiológicas que permitem a sua sobrevivência em diferentes habitats, sob diversas condições.
Os anfíbios são encontrados em todo mundo, exceto Groelândia e Antártida, apesar de
existirem espécies a exemplo da Rana sylvatica que tem uma grande tolerância ao frio (MATUTTE
b
et al., 2000).
Vivem principalmente na água ou em locais úmidos, nunca no mar, apesar de tolerarem
ambientes de alta salinidade (J∅RGENSEN, 1997).
Comuns em regiões temperadas úmidas e mais abundantes em florestas tropicais.
Diversos anfíbios atingem o norte do círculo polar ártico, tolerando condições de
congelamento.
Um representante da família Bufonidae foi encontrado nos Andes a 4850 metros
(COCHRAN, 1985).
Os anfíbios vivem em áridos desertos, tais como o da Austrália e Sudoeste dos Estados
Unidos, a exemplo de espécies como o B. alvarius que só é encontrado no deserto de Sonora
(CLARKE, 1997; J∅RGENSEN, 1997).
Características tais como aonde este animal vive influenciam na composição de substâncias
secretadas pela pele quantitativamente e qualitativamente (CHRISTIAN & PARRY, 1997).
1.2.4. Características da Pele dos Anfíbios
A pele dos vertebrados tem a mesma origem embrionária ectodermal que o cérebro, por isto,
não é estranho encontrar substâncias na pele de anfíbios tais como peptídeos no trato gastrointestinal
e cérebro de mamíferos ou mesmo destes (DEUCHAR, 1966, BARRA & SIMMACO, 1995), assim
como encontramos semelhanças pelo menos em Xenopus laevis em células da mucosa gastroentérica
com as granulosas da pele, morfológica e bioquimicamente, inclusive produzindo vários peptídeos
em comum tais como as magaininas e a PGLa (peptídeo com amino-terminal glicina e carboxi-
terminal leucinamida) (MOORE et al., 1992)
Nos anfíbios, a pele tem para estes diversas funções vitais além de ser apenas uma estrutura
de revestimento, desempenhando principalmente o transporte de água e solutos, fazendo a
respiração, a regulação da temperatura corporal e defesa contra o ataque de microorganismos e
7
predadores. Em estudos anatômicos comparativos da pele de diversas espécies de anuras indicam
que uma camada situada entre o stratum compactum e o stratum spongiosum o qual é acelular é
composto de mucopolissacarídeos e cálcio, sendo ausente em espécies aquáticas, já nas terrestres é
proeminente por desempenhar um importante papel no mecanismo de defesa contra a dessecação
(ELKAN, 1968, DALY, 1995).
Segundo Daly e colaboradores (1984) sugerem que o desenvolvimento evolucionário dos
compostos de defesa de anfíbios deriva em duas categorias: (1) uma extensa variedade de compostos
ativos que ocorrem naturalmente, tais como peptídeos ou aminas biogênicas que são elaborados em
excessivas quantidades para uma função primariamente fisiológica e secundária de defesa e, (2) uma
nova substância biologicamente ativa, freqüentemente com uma estrutura complexa e elaborada
basicamente para uma função de defesa, a exemplo da batracotoxina, um alcalóide esteroidal
extraordinariamente tóxico (TOKUYAMA & DALY, 1983, SULLIVAN et al., 2002).
Na natureza certas cores da pele servem de alerta, a isto se dá o nome de aposematismo e ela
ocorre quando a distinta aparência (coloração particular) funciona para advertir a inaproveitabilidade
(não palatabilidade,toxicidade, ou habilidade em escapar a predação) a predadores. Isto é valido para
vários anfíbios a exemplo da família Dendrobatidae, na qual Summers e Clough (2000)
desenvolveram estudos tentando correlacionar a evolução da coloração e a toxicidade com análises
das seqüências de DNA, estudos com programas de computador avaliando níveis de contraste de
cada cor de vários espécimes em fotos com a vegetação, experimentos com camundongos e
experimentos com predadores vertebrados e invertebrados.
Curiosamente Lipps e Khan (2000) encontraram em estudos utilizando o método de ELISA
que o veneno do sapo Bufo arenarum, uma espécie comum na região do Colorado, Estados Unidos,
tem reatividade antigênica cruzada com veneno de Crotalus atrox, sendo que os autores não
souberam explicar os resultados encontrados.
A utilização de secreções de anfíbio como droga ilícita é ainda bem difundida. É descrito
para o veneno de Bufo alvarius em humanos como classificação das dosagens de consumo o valor
de 4 a 8 mg como o limiar inicial, leve (8 a 20 mg), comum (20 a 40 mg) e forte (40 a 80 mg).
Sendo que podemos ver características da farmacologia da bufotenina e do 5-metoxi-N,N-dimetil
triptamina (5-MeO-DMT) seus principais componentes psicoativos responsáveis pelos seus efeitos
como droga (WADE & WEIL,1994, OTT, 2001). Podemos ver a seguir, na Tabela 1, alguns efeitos
farmacológicos da bufotenina em humanos com as respectivas vias de aplicação.
8
Tabela 1 – Farmacologia da bufotenina em humanos (OTT, 2001).
VIA DOSAGEM (mg) EFEITOS
Intravenoso 1 - 16 Alucinogênico
1,4
Intravenoso 2,5 - 20 Não psicoativo
1,4
Intravenoso 6,4 - 11,1 "Alucinações"
2
Intravenoso 2 - 8 "Psicoticomimético"
3
Intramuscular 10 - 12,5 "Alucinações"
1
Intranasal <14,3 Não psicoativo
5
Intranasal 6 - 10 Não psicoativo
6
Intranasal 1 - 16 Não psicoativo
3
Intranasal 40 - 100 Psicoativo
1
Sublingual 50 Psicoativo
1
Oral 100 Psicoativo
1
Inalado (vapor) 2 - 8 Psicoativo
1
Intraretal 50 Psicoativo
7
1) Como sal de sulfato de creatinina (expresso como base).
2) Como 12-16 mg sal de oxalato (sal mono ou bi-oxalato, não especificado)
3) Como solução de oxalato de bufotenina (expresso como base; 2 e 4 mg, inativo i.v.).
4) Citando experimentos conduzidos por H.S. Isbell (pers. com. 4 Oct. 1956).
5) Como <40 mg de sal de sulfato de creatinina em solução em spray.
6) Base e sal de sulfato de creatinina (aparentemente expresso como base).
7) Com 10 mg sal dihidrato hidroclorídrico harmalina (30 mg não psicoativo).
9
Lacombe e colaboradores (2000) após estudos ultraestruturais e imunocitoquímicos
descrevem três tipos de glândulas integumentares em representantes do gênero Phyllomedusa
adultos responsáveis pelas secreções, lipídica, serosa e mucosa. As características glandulares bem
como sua composição tem uma grande variação nas diferentes espécies de anfíbios, mas de uma
maneira geral podemos descrever a participação principal de dois tipos de glândulas: a mucosa e a
granulosa.
1.2.4.1. Glândulas Mucosas
É a produção de exuberante secreção mucosa altamente hidrófila que garante a manutenção
da umidade da superfície externa o que possibilita fundamentalmente a respiração cutânea que é
uma característica dos anfíbios. Por ser viscosa, dificulta a preensão por predadores.
Esta secreção facilita a muda de pele por estar entre as camadas córneas que se destacam e as
camadas de epiderme subjacentes, possivelmente exercendo pressão sobre as mais externas.
1.2.4.2. Glândulas Granulosas
É nos anfíbios uma derivação do epitélio que aparece primeiramente durante a metamorfose
e que no Xenopus laevis foi encontrada uma participação em resposta aos hormônios da tireóide no
desenvolvimento e expressão de componentes de sua secreção (REILLY et al., 1994). Embora a
secreção mucosa colabore na defesa, a secreção das glândulas granulares é a principal responsável
pela defesa passiva dos anfíbios. Esta freqüentemente é tóxica ou repelente e estão dispersas pelo
corpo, sendo mais abundantes na cabeça, dorso e extremidades ou concentradas numa determinada
região do animal a exemplo das glândulas parotóides encontradas em sapos do gênero Bufo e ainda,
Litoria splendida e Salamandra salamandra (DUELMANN & TRUEB, 1986; WABNITZ et al.,
1998).
Apresenta aspecto viscoso, leitoso e ocorre através de secreção holócrina, normalmente após
stress ou injúria. As glândulas granulosas são controladas por inervação simpática e seu conteúdo é
secretado de 80 a 90% sob regulação neuronal, possivelmente neuropeptídeos liberados pela
presença do predador (BEVINS & ZASLOFF, 1990; BARRA & SIMMACO, 1995, CASTILLO &
ORCE, 1997).
Após depleção, a glândula leva cerca de duas semanas em média para o conteúdo ser outra
vez sintetizado.
10
1.2.5. Componentes da Secreção de Anfíbios – Visão geral
A secreção produzida por anfíbios constitui num conjunto muito amplo e diversificada de
substâncias, sendo que podem ser classificadas quanto a sua atividade em categorias de atividade
biológicas diferentes a serem estudadas, pois ainda pouco se sabe a este respeito destas substâncias,
bem como os mecanismos de ação das mesmas sobre outros sistemas biológicos vivos, haja vista
que até o momento cerca de apenas 300 delas já foram isoladas e agrupadas, sendo que sua
composição pode variar em na proporção de componentes em função da fase de vida do animal ou
estímulos externos (BROWN et al., 1977, BEVINS & ZASLOFF, 1990, REILLY et al., 1994).
O potencial destas substâncias bioativas pode ser ilustrado pela epibatidina, um alcalóide
azabicicloheptano, que foi isolado de um veneno da pele de um sapo equatoriano chamado
Epipedobates tricolor por Daly e colaboradores (1980) e teve sua estrutura elucidada 12 anos mais
tarde (SPANDE
a
et al., 1992) e apresenta ação de analgesia 200 vezes mais potente que a morfina.
Com o decorrer dos estudos determinou-se que a ação da epibatidina é via receptor neuronal
nicotínico para acetilcolina, contudo, causava uma série de efeitos colaterais tais como paralisia,
derrames e freqüentemente morte o que o teria descartado para o uso como um agente analgésico
caso pesquisadores não a tivessem utilizado para molécula modelo para modificações por síntese e
após testes com mais de 500 compostos achou-se um, o ABT 595, que tinha efeitos antinoceptivos
iguais aos da morfina, entretanto sem causar dependência física, achando-se no momento ainda em
testes na Europa para ser liberada para o uso em humanos (BADIO et al., 1997, BANNON et al.,
1998, SHU, 1998, SPANG et al., 2000).
O trabalho de Daly com a epibatidina também é de interesse por servir como um alerta, pois
ao remover o espécime de estudo de seu habitat natural foi constatado que a substância alcalóide que
Epipedobates tricolor produzia foi gradualmente diminuindo até não ser detectado mais na secreção
deste anfíbio, o que sugere que a matéria-prima para esta substância era obtida da alimentação deste
animal (DALY, 1998). Outra questão que deve ser mantida em foco é a variabilidade na composição
da secreção da pele que pode ocorrer em função do sexo, idade ou outras diferenças fisiológicas que
impõem muitas vezes flutuações sazonais. Como podemos observar no trabalho de Wabnitz e
colaboradores (2000) com machos e fêmeas de um hilídeo australiano Litoria splendida no qual
após três anos de estudos evidenciaram que no período reprodutivo no macho era encontrado um
peptídeo que funcionava como feromônio, a splendiferina, em concentração dez vezes maior do que
fora deste período; um segundo peptídeo antimicrobiano, a caerina 1.10, foi encontrada apenas no
11
macho e apresentou concentração constante durante o ano, sendo que existem outros peptídeos
antimicrobianos que inclusive são mais potentes que este e estão presentes em ambos sexos. Ainda
um terceiro encontrado nos dois sexos, a ceruleína que é um neuropetídeo, sofreu variação marcante
durante o ano com o aparecimento de substâncias derivadas, uma cerulina dessulfatada e a Phe8 -
ceruleína que aumentavam em quantidade diretamente em proporção ao decréscimo da cerulina por
razões que os autores não souberam explicar, quanto a atividade destes compostos, haja vista que a
cerulina é um vasodilatador potente, analgésico e hormônio, neste trabalho não foi avaliado. Outro
trabalho com o mesmo animal procurou detectar a partir de quando era possível a detecção de
peptídeos de defesa e observou que desde muito cedo com apenas dez dias da deposição dos ovos,
ainda girinos, eram produzidos e continuavam ao longo da metamorfose, contudo não foram
detectados nos ovos (WABNITZ et al., 1998).
Existe uma seletividade quanto a resposta comportamental em função do predador em
questão, o que foi objeto de estudo por Schmidt e colaboradores (2001) com girinos de
Phyllomedusa tarsius, um anuro neotropical, i sto podendo possívelmente se refletir na composição
de suas secreções.
Muitos estudos têm sido direcionados as secreções da pele de anfibios da ordem anura (sapos, rãs e
pererecas), com muitos poucos às salamandras e somente pouco mais de três estudos a investigação
de bioatividade da cecílias. Dentre estes temos os trabalhos de Moodie (1978) que obeservou que as
secreções da pele de uma cecília aquática, Typhlonectes compressicauda, era tóxica para um peixe
Hoplias malabarius e o de Sawaya (1940) que demonstrou a cardiotoxicidade da secreção da peleda
cecília Siphonops annulatus, mas não investigaram o seu mecanismo de ação. Um terceiro trabalho
de Schwartz e colaboradores (1997).detectou atividade semelhante no coração, além de atividade
hemolítica em Siphonops paulensis, gerando outro trabalho (SCHWARTZ et al., 1999) no qual o
mesmo grupo encontrou indícios de que a atividade cardiotóxica era indireta e era atribuída ao fato
de que a secreção da pele deste anfíbio ocasionava primeiramente uma atividade hemolítica que
fazia com que aumentassem os níveis de potássio no meio.
Farmacologicamente, os produtos bioativos atuam como irritantes locais, cardio, mio e
neurotoxinas, agentes colinomiméticos, simpatomiméticos, alucinogênicos, anestésicos, hemolíticos,
agentes citotóxicos e antimicrobianos (DALY & WITKOP, 1971; ROSEGHINI et al., 1988).
12
A classificação química dos produtos até então isolados da pele de anfíbios podem ser
distribuída em 5 grupos: aminas biogênicas, peptídeos, proteínas proteolíticas, alcalóides e
esteróides (HABERMEHL, 1969). Na tabela 2, podem ser observados estes grupos e alguns
exemplos representantes dos mesmos.
Tabela 2 - Classificação química dos produtos até então isolados da pele de anfíbios e alguns
exemplos.
CLASSE EXEMPLO
Alcalóides
Como uma potente neurotoxina do Atelopus charquiensis, Chiriquitoxina
(YANG & KAO, 1992, SEBBEN & SCHWARTZ, 1993).
A pumiliotoxina-B, um alcalóide indolizinico da pele do Dendrobates
pumilio, rã neotropical, afeta a anatomia e imunohistoquímica a reatividade e
condutibilidade de fibras nervosas (TOKUYAMA et al., 1992, SPANDE
a
et
al., 1992, D’Este et al. 1999).
Aminas biogênicas
Destacam-se dos demais compostos encontrados na pele de anfíbios devido a
sua ampla distribuição entre as diversas famílias de anuros. Ex:
Leptodactilina - Leptodactylus ocellatus (CEI et al., 1967).
Esteróides
Substâncias de marcada atividade cardiotônica e cardiotóxica,
Bufadienolídeos, isoladas de sapos do gênero Bufo (SHIMADA et al., 1985)
Peptídeos
Magaininas, possuindo 23 resíduos de aminoácidos, com poder
antimicrobiano e cicatrizantedo Xenopus laevis (ZASLOFF, 1987).
Proteínas
proteolíticas
Endopeptidase inativadora de hormônios peptídicos (CARVALHO et al.,
1992, JORDIOU et al., 1993).
13
Eventualmente são relatados casos na literatura médica de pessoas que venham a ser
intoxicadas por veneno de sapos no homem, sendo mais comum em cães. Devemos atentar para o
fato de que estes anfíbioss não são capazes de inocular seu veneno voluntariamente, apesar de que a
secreção pode ser lançada a uma certa distância quando as glândulas parotóideas são comprimidas
ou como no caso de alguns hilídeos quando aprisionados, liberando secreção cutânea como uma
forma de defesa contra predadores (POLUMBO et al., 1975, ROBERTS et al., 2000).
Segundo Mignogna e colaboradores (1997), têm sido demonstrados há muito tempo já que a
pele de anfíbios neotropicais e sul americano da subfamília Phyllomedusinae são uma das mais ricas
fontes até então estudadas de peptídeos biologicamente ativos. Isto é confirmado facilmente, com
mais de três dúzias de peptídeos isolados da pele destes animais e distribuindo-se por dez diferentes
famílias: taquicininas, bradicininas, ceruleínas, bombesinas, sauvaginas, peptídeos opióides
(dermorfinas e deltorfinas), peptídeos antimicrobianos (dermaseptinas e adenorregulinas),
triptopfilinas, e um peptídeo NPY-like (MOR et al., 1994). Vários destes, tais como peptídeos
opióides, sauvagina e as dermaseptinas, tem sido somente encontrados na pele destes hilídeos.
Infelizmente, apesar de toda esta quantidade e variedade de substâncias, segundo Chen e
colaboradores (2003), o estudo das secreções de anfíbios para a descoberta de novos peptídeos está
com o tempo contado devido ao seu rápido declíneo global.
Na tabela a seguir podemos ver para ilustrar a diversidade comentada mais acima, as
principais classes de polipeptídeos da pele de anfíbios e algumas características de ação destas, bem
como exemplos de onde podem ser encontradas.
14
Tabela 3 - Principais classes de polipeptídeos da pele de anfíbios e algumas características de ação
biológica.
CLASSES CARACTERÍSTICAS
Bombesinas
Possuem um largo espectro de ações sobre a musculatura lisa vascular e extravascular.
Inicialmente isolados da pele de anfíbios europeus do gênero Bombina, sendo que
posteriormente foram isolados peptídeos análogos a partir de tecido cerebral e do trato
gastrointestinal de mamíferos (NAGALLA et al., 1996).
Bradicininas
Além da bradicinina, reúne outros sete peptídeos, encontrados na sua maioria, em
espécies da família Ranidae (ERSPAMER, 1984, ERSPAMER et al., 1986).
Ceruleínas
A ação destes ainda não está bem esclarecida, contudo sabe-se que reproduzem na
musculatura lisa da bexiga urinária e do intestino e nas secreções exócrinas do
pâncreas, estômago e fígado as ações do hormônio intestinal colecistocinina-
pancreozimina, presente em mamíferos. Inicialmente isolada da pele de um hilídeo
australiano, Litoria caerulea(BEVINS & ZASLOFF, 1990).
Dermofinas
Opióides que têm o mesmo espectro de ação das endorfinas (substâncias analgésicas
endógenas) isolados da pele de algumas espécies de Phyllomedusa (NEGRI et al.,
1992).
Sauvaginas
Possuem 40 resíduos de aminoácidos, tendo ação hipotensora moderada, agindo de
forma complexa sobre a hipófise anterior, estimulando a liberação de hormônio
adrenocorticotrópico (HACT) e de β-endorfinas. Primeiramente obtida da pele de
Phyllomedusa sauvagei (DALY et al. 1992).
Taquicininas
Grupo composto por substâncias relacionadas com a substância P (polipeptídeo
presente no trato gastrointestinal e no sistema nervoso de mamíferos). Estas
substâncias agem intensamente sobre a musculatura lisa, vascular e extravascular,
além do efeito estimulante sobre glândulas salivares e lacrimais. Como exemplo
podendo-se destacar um dos mais potentes hipotensivos encontrados na natureza, o
fisalemina, obtido da pele de várias espécies do gênero Physalaemus (SEVERINE et
al., 2000).
15
1.2.6. Esteróides
A presença de colesterol na secreção de glândulas granulosas na pele de anfíbios, segundo
Croce e Bolognani (1975), tem sido descrita somente nos gêneros Bufo e Triturus. Estes autores
atribuem como significado biológico e bioquímico do colesterol como estando relacionado com a
biossíntese de glicosídeos cardíacos no veneno do gênero Bufo assim como esteróides não
glicosídeos e ainda, componentes estruturais a exemplo dos fosfolipídios e sulfolipídios de
membrana.
1.2.6.1. Bufadienolídeos
Bufadienolídeos ou bufodienolídeos é definido como sendo esteróides cardiotóxicos C-24
juntamente com os cardienolídeos, ambos apresentando similaridade de ação biológica causando
aumento da força contrátil do coração e um núcleo perhidrofenantreno na sua estrutura, diferindo
por apresentarem no carbono C – 17 respectivamente um substituto pentadienolídeo e o outro um
butenolídeo. A eficácia dessas substâncias já era conhecida pelos antigos egípcios que usavam
“squill”, um bufodienolídeo contido em uma planta do gênero Scilla no tratamento de doenças do
coração (KRENN & KOPP, 1988). Escilarena A, do grupo das escilareninas, um dos principais
glicosídios dessa fonte, foi o primeiro bufodienolídeo que teve a sua estrutura elucidada em 1933
por Stoll e colaboradores. Nos anos seguintes, vários destes esteróides derivados de plantas ou de
animais tiveram sua estrutura elucidada.
Os bufadienolídeos de sapo ocorrem na forma conjugada e não conjugada, sendo os maiores
bufadienolídeos de sapo são derivados de esteróides (STEYN & HEERDEN, 1998).
O
O
R
O
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
Figura 1 - Esqueleto básico dos Bufadienolídeos
16
Ocorrência na Natureza
Bufadienolídeos têm sido encontrados em plantas e em alguns animais, sendo neste último
muito mais comum na família Bufonidae. Os venenos de sapos de diferentes espécies são usados
para remédios na Ásia denominados Ch’an Su na China ou Senso no Japão que foram alvos de
inúmeras investigações por pesquisadores, resultando no isolamento de vários bufadienolídeos e
seus ésteres (KRENN & KOPP, 1988; KAMANO et al., 1998).
Em 1922, Wieland e colaboradores separaram do veneno de um sapo japonês, Bufo vulgaris
formosus Boulenger, a então chamada “bufotoxina” que posteriormente em 1949 teve sua estrutura
designada bufotalina 14 – suberoil arginina éster (SHIMADA
a
et al., 1977).
Nos besouros da família Lampyridae do gênero Photinus, sendo este o primeiro relato de
isolamento de bufadienolídeos em artrópodes, investigações encontraram esteróides com o nome
genérico de lucibufageninas que participam do mecanismo de defesa destes coleópteros conferindo-
lhes gosto desagradável aos pássaros (EISNER et al. 1978; GOETZ et al., 1979). Do mesmo modo
no gênero Bufo as bufotoxinas tornam os girinos pouco palatáveis e assim escapando de vários
predadores aquáticos como, por exemplo, peixes (KIESECKER et al., 1996).
Num representante da família Colubridae, Rhabdophis tigrinus, foram obtidas de material
glandular material que resultou no isolamento e elucidação estrutural de várias geninas a exemplo da
desacetilcinobufagina - 3 - O – hemissuccinato e bufotalina.
Dimitrieva e colaboradores (2000) sugerem que um bufadienolídeo de mamífero endógeno
pode estar envolvido na regulação da atividade Na
+
,K
+
- ATPase e a patogênese da hipertensão
arterial sendo sintetizado do colesterol no córtex da adrenal por uma via metabólica que é
independente da clivagem de cadeia lateral do colesterol.
1.3. Detecção de Atividade Antimicrobiana de Secreções Oriundas de Anfíbios – Visão geral
Uma pergunta que certamente se fizeram pesquisadores foi o por quê de anfíbios quando se
feriam não apresentavam infecções em seus cortes. A despeito de habitar um ambiente aquático e
terrestre potencialmente rico em patógenos tais como rios de fluxo lento, lagos, poças, água
estagnada, oculto na copa das árvores e no solo de florestas, refugiado no subsolo embaixo de
superfícies e em buracos de tocos de árvore rachados, locais particularmente convenientes a
promoção do crescimento fúngico, anfíbios raramente sucumbiam a infecções fúngicas ou
17
bacterianas da pele, exceto nos casos de quebra da integridade das mesmas (DUELLMAN &
TRUEB, 1994). Contrapondo em parte o que foi dito, Zasloff (1987) ao realizarem incisões na pele
de Xenopus laevis, mantendo – os em água contaminada posteriormente, não observaram
contaminação. A resposta a isto pode ser ilustrada com o trabalho de Bettin e Greven (1986) que
mostraram que salamandras (Salamandra salamandra) quando privadas de suas secreções
glandulares da pele morriam de variadas infecções a menos que mantida sob condições de
esterilidade.
Pavan em 1952 realizou testes com extratos brutos das glândulas granulares de Bufo viridis
Laur., B. vulgaris Laur., Triton cristatus Laur. e Salamandra maculosa Laur., tendo detectado para
os sapos uma fraca atividade apenas contra Proteus vulgaris e para a S. maculosa atividade para as
13 bactérias testadas. Já em Plethodon cinereus, um salamandra terrestre, foi encontrado em frações
obtido em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) a partir de amostras de pele da cauda e
glândula dermal atividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus e atividade hemolítica em
células de cobaio (FREDERICKS & DANKERT, 2000). Lai
b
e colaboradores (2002) com secreções
de Tylototriton verrucosus evidenciaram um largo espectro antimicrobiano, atividades proteolítica,
inibidora de tripsina sendo que em contraste, nenhuma atividade hemolítica nem hemorrágica foi
encontrada.
1.3.1. Bufadienolídeos com Atividade Antimicrobiana
Kamano e colaboradores (1988) descreveram a inibição de uma série de Rhinovirus após
testarem trinta e quatro bufadienolídeos e dois cardenolídeos relacionados isolados do Ch’an Su e da
pele de Bufo formosus Boulenger, bem como por modificações químicas de compostos destes
obtidos, sendo os 14 β - hidroxi bufadienolídeos em geral foram os que apresentaram uma mais forte
atividade antiviral, contudo também eram os mais tóxicos do que os correspondentes 14 β, 15 β -
epoxi bufadienolídeos.
Squalamina, um antibiótico aminosterol isolado de um tubarão, Squalus acanthias, foi
caracterizada sua potente atividade antimicrobiana contra fungos, bactérias e protozoários. Este
esteróide catiônico solúvel em água é, portanto mais uma evidência do potencial destas substâncias
(MOORE et al., 1993).
18
Outro trabalho que encontrou atividade antimicrobiana contra a bactéria Bacillus subtilis foi
realizado com uma planta africana Bersama abyssinica por Taniguchi e Kubo (1993) e estes
atribuem esta atividade possivelmente a bufadienolídeos.
1.3.1.1. Bufadienolídeos Antineoplásicos
Kupchan e colaboradores (1969) isolaram e caracterizaram as Hellebrigenina 3 – acetato e
3,5 – diacetato da planta Bersama abysinica que inibiram significativamente in vitro uma cultura de
células de carcinoma humano do nasofaríngeo e in vivo, apenas a primeira das duas contra
carcinoma intramuscular de Walker 256 em ratos.
Foi verificado que a bufalina, um bufadienolídeo que é um dos princípios ativos do Ch’an
Su, induziu uma apoptose típica em células leucêmicas humanas U937 (WATABE et al., 1996).
Nogawa e colaboradores (2001), obtiveram cinco novos bufadienolídeos, 3-beta-formil-oxi-
resibufogenina, 19-oxobufalina, 19-oxodesacetilcinobufagina, 6-alfa-hidroxicinobufagina, e 1-beta-
hidroxibufalina, juntamente com bufadienolídeos previamente conhecidos métodos
espectroscópicos. Os bufadienolideos citados acima tiveram significante atividade inibitória contra
as linhagens de células cancerosa KB e HL-60. Além disto, o primeiro bufadienolídeo citado
apresentou-se ativo contra a linhagem MH-60.
1.3.1. Diversas Substâncias Antimicrobianas Isoladas de Anfíbios Não esteroidais
A grande maioria dos antimicrobianos isolados até então são peptídeos, contudo existem
outras substâncias que também possuem este efeito. A samandarona e a samandarina são alcalóides
isolados de algumas espécies de anfíbios que inibem o crescimento de vários microorganismos. Já a
espinacaemina, assim como a bufotenina, aminas biogênicas encontradas na pele de Leptodactylus
pentadactylus e Bufo spp. respectivamente, atuam tanto sobre bactérias gram negativas como
positivas e alguns fungos (HABERMEHL & PREUSSER, 1969, HABERMEHL & PREUSSER,
1970; PREUSSER et al., 1975). Os ácidos graxos miristoléico, linoléico e palmitoléico que são
encontrados em secreções cutâneas do urodela Plethodon cinereus Green, teve efeitos sobre o
Bacillus cereus (RICKRODE et al., 1986). Kamiya e colaboradores (1997) estudando o muco das
salamandras gigante japonesa e chinesa, Megalobatrachus japonicus e Andrias davidanus
respectivamente, caracterizou atividade de uma proteína do tipo lectínica inibida por N – acetil – D
19
– glicosamina, lactose, mucina tipo I, asialomucina tipo I que entre outras coisas apresentava ação
antimicrobiana contra Bacillus subtilis.
1.3.3. Antimicrobianos Peptídicos Isolados de Anuras - Os mais estudados
Desde de 1969, num dos trabalhos pioneiros de Csórdas & Michl para agora, foram isolados
alguns grupos de peptídeos com propriedades anfifílicas que representam um grupo heterogêneo e
em geral apresentam múltiplos modos de ação como:
a) Antimicrobiano, hemolítico e citotóxico
b) Liberador de histamina in vitro e atividade quimiotáxica, que facilita a atração de macrófagos
(SALMON et al., 2001).
c) Regulador de eventos fisiológicos in vivo ou modulador de um receptor específico (MOR et al.,
1995, AMMAR et al., 1998).
Têm se isolado também de insetos, ou mesmo do veneno destes, peptídeos que apresentam
seqüências com homologia ao de anfíbios e ação também antibiótica (FEHLBAUM et al., 1996).
Os peptídeos antimicrobianos presentes nos vertebrados podem ser considerados como
efetores ancestrais da imunidade e mais que meros remanescentes, conferem vantagens a estes
animais e complementam os sistemas de defesa de seus organismos (NICOLAS & MOR, 1995).
1.3.3.1. Propriedades e Possíveis Mecanismos de Ação
Estes peptídeos apresentam-se todos carregados positivamente e por isto chamados
catiônicos, podendo formar hélices anfifílicas de comprimento variando de um peptídeo para outro,
com a habilidade de se autopolimerizar formando longos filamentos com os grupamentos
hidrofílicos para o interior e os hidrofóbicos em contato com as partes lipofílicas da membrana.
Para formulação de um possível mecanismo de ação têm que se levar em conta uma série de
trabalhos que apresentaram evidências para tal.
Os estudos conformacionais revelaram que eram estruturas anfipáticas com potencial na forma
de α-hélice. A confirmação da estrutura α-hélice veio posteriormente com o trabalho de Marion e
colaboradores em 1988 com ressonância magnética nuclear.
20
As magaininas, peptídeos isolados de Xenopus laevis, foram usadas como modelos para a
compreensão de como elas agiam por vários pesquisadores, sendo que Urrutia e colaboradores
(1989) em estudos do comportamento da magainina 2 com abaixamento de pH em solução aquosa e
aumento na concentração de íons, ocorria uma autopolimerização do peptídeo em longos filamentos,
já a orientação em relação ao plano da bicamada lipídica depende da quantidade de peptídeo ligado a
membrana (LUDTKE et al., 1996, BIGGIN & SANSOM, 1999). Utilizando também este mesmo
peptídeo Duclohier e colaboradores (1989) demonstraram em membranas artificiais que ele forma
um canal iônico composto de três a seis monômeros por canal e que transporta cloro meta – sulfato,
reforçando estes dados temos que Cruciani
a
e colaboradores (1992), ao incorporarem a membranas
artificiais este peptídeo observavam um aumento de condutância na camada bilipídica. Trabalhos de
espectroscopia - dicroismo circular revelaram a formação de α-hélice com vesículas de
fosfatidilserina, mas não com vesículas de fosfatidilcolina atuam formando canais transmembrana
helicoidais sugerindo que os constituintes de uma membrana poderiam influenciar a formação destes
canais revelando uma especificidade (BECHINGER et al., 1998, SHAI, 1999). Fazendo-se a
mensuração do potencial de membrana, estudos revelaram que a magainina 2 e a PGLA (Peptídeo
que inicia em Glicina e termina em Leucina amida), sendo este segundo também um peptídeo
isolado de Xenopus laevis, podem despolarizar rapidamente mitocôndrias e lipossomas por atuarem
no seu citocromo oxidase decrescendo seu potencial, o que sugere que poderiam ser atacadas todas
as membranas da célula (WESTERHOFF
a
et al., 1989, JURETIC et al., 1994), tendo sido
confirmado em trabalhos com bactérias gram positivas e negativas posteriormente para as quais são
necessários de 1 a 10 μg/ml , sendo que para uma célula de mamífero já é necessário 1 mg/ml
(MATSUZAKI, 1997, MATSUZAKI, 1999).
Em síntese temos que a porção amino-terminal do peptídeo positivamente carregado interage
com os fragmentos lipídicos ácidos da membrana, induzindo a formação de α-hélice e
polimerização. O complexo supramolecular em α-hélice liga-se superficialmente e paralelo a região
hidrofóbica e começa a penetrar a membrana. a ligação deve ser transitória, e por fim a face não
polar que tem afinidade com o solvente está numa posição energeticamente desfavorável a
penetração da membrana continuará, causando simultânea dissipação do potencial de membrana
desta e assimetria lipídica, a estrutura peptídica finalmente estará mantida firmemente no lugar pela
porção folha beta a qual permanece na fase aquosa e o canal é formado. Permitindo entrada de cloro,
efluxo de hidroxilas e potássio, desacoplamento respiratório da bactéria, despolarização da
21
membrana, resultando em morte desta a propriedade não-hemolítica pode estar ligada ao colesterol
nas membranas das células nos zwitterions, haja vista que a fosfatidilcolina não induzem a formação
de alfa hélices nestes peptídeos.
Dos modelos sugeridos e mais aceitos para permeação de membrana temos primeiramente o
modelo bastão cilíndrico no qual os peptídes primeiro acumulam na superfície da membrana, fazem
a inserção no core lipídico da membrana, seguindo-se do recrutamento de monômeros adicionais
para então formar um poro; já num segundo, denominado modelo carpete, os peptídeos estão ligados
a superfície da membrana com suas superfícies hidrofóbicas voltadas para a membrana e suas
hidrofílicas para o solvente, quando atinge uma concentração de monômeros peptídicos, a
membrana é permeada e podem formar poros, sendo ainda que a carga tem influência sobre isto
(SITARAM &, NAGARAJ, 1999, SHAI & OREN, 2001).
1.3.3.2. Famílias Conhecidas de Peptídeos
Atualmente existem seis famílias de anuros nas quais já foram identificados peptídeos
antimicrobianos.
Os autores têm procurado agrupar os peptídeos antimicrobianos conforme sua homologia da
seqüência de aminoácidos, similaridades das propriedades funcionais e conformacionais em 5
grupos, contudo existem muitas divergências e uma proposta satisfatória ainda não foi encontrada,
sendo que a cada dia surgem propostas de novas famílias.
Abaixo relacionamos os dados encontrados em extenso trabalho de revisão agrupando por
famílias e gêneros.
a) Discoglossidae
Bombina variegata
Foi designado como Bombinin – Peptides (BP), isolado de um sapo europeu (CSÓRDAS &
MICHL, 1969), este peptídeo de 24 resíduos de aminoácido possuem atividade antibiótica e
hemolítica, salientando uma ação bacteriostática contra Staphylococcus aureus. Em trabalhos de
clonagem desta por Simmaco et al. (1991), obtiveram uma bombina de 27 resíduos e sem atividade
hemolítica.
22
Bombina orientalis
Os chamados Bombinins- Like Peptides, BLP 1 a 4, obtidos de um sapo asiático (GIBSON et
al., 1991), com BLP1 e 2 apresentando 27 resíduos de aminoácido e BLP3 e 4 com 25 resíduos
sendo que apesar da homologia com a bombina e ter atividade antibiótica também, não possuem
uma apreciável atividade hemolítica. Outro grupo encontrado neste gênero foi encontrado por
Mangoni e colaboradores (2000), as chamadas bombininas H (H de hidrofóbico e hemolítico), tendo
ficado caracterizado que as bombininas são compostas de 25 a 27 resíduos de aminoácido e as
bombininas H de 15 a 20, nos quais temos na posição dois da seqüência freqüentemente um D -
aminoácido. Foi determinada por Miele e colaboradores (2000) a estrutura e a partir de uma
seqüência gênica codificada um peptídeo denominado BLP-7.
Bombina maxima
Foram isolados dois grupos de peptídeos antimicrobianos das secreções deste animal. O
primeiro denominado maximinas 1, 2, 3, 4 e 5, estruturalmente relacionado aos bombinin-like
peptides (BLPs), ocorrendo no entanto, varações na seqüência nas maximinas por toda a molécula.
Foram detectadas além de uma potente atividade antimicrobiana, também citotóxica contra células
tumorais e ação espermicida das maximinas, em destaque ainda temos que a maximina 3 possui uma
significante atividade anti-HIV. Maximinas 1 e 3 foram tóxicas para camundongos com valores de
DL50 de 8,2 e 4,3 mg/kg, respectivamente. Peptídeos de um segundo grupo, denominadas
maximinas H1, H2, H3 e H4, tem homologia com peptídeos bombinina H. Estudos de seqüências de
cDNA revelaram que um peptídeo maximina mais um maximina H derivaram de uma grande
proteína comum (LAI
c
et al., 2002).
Posteriomente, um novo clone de cDNA que codifica um precursor protéico de maximina 3 e
um novo peptídeo foi isolado uma bibliotece de cDNA da pele de B. maxima, denominado
maximina H5. Com Ile-Leu-Gly-Pro-Val-Leu-Gly-Leu-Val-Ser-Asp-Thr-Leu-Asp-Asp-Val-Leu-
Gly-Ile-Leu(NH
2
) como seqüência, chamando a atenção para três resíduos básicos de aspartato que
lhe confere um caráter aniônico, diferentemente dos peptídeos maximina H catiônicos. Com relação
a ação antimicrobiana esta só foi detectada somente para cepas da bactéria Gram-positiva
Staphylococcus aureus, apresentando-se ineficaz para outras bacérias e fungos testados.
A presença
de íons metálicos, tais como Zn
+2
e Mg
+2
, não aumentaram a potência antimicrobiana. A maximina
H5 representa o primeiro exemplo de peptídeo antimicrobiano aniônico de anfíbios, também
23
fornecendo a primeira evidência que estes aliados aos conhecidos peptídeos catiônicos juntos,
possam tomar parte do sistema de defesa inatodestes animais (LAI
a
et al., 2002).
b) Pipidae
Xenopus laevis
Magaininas ou PGS 1 ou 2, Peptídeos que começam em Glicina e acabam em Serina, obtidas
da pele de uma rã africana (ZASLOFF, 1987). PGLa, Peptídeo que começam em Glicina e acaba
em Leucina amida (WILLIAMS et al., 1990). Moore e colaboradores (1991) encontraram em
extratos de estômago desta espécie nove peptídeos antimicrobianos, sendo um inédito, de caráter
básico denominado PGQ (Pro-Gly-Glu).
Westerhoff
b
e colaboradores (1995), evidenciaram um sinergismo funcional das magaininas
PGLa and magainina-2 na Escherichia coli, células tumorais e lipossomas.
As magaininas atualmente podem ser encontradas comercialmente, sendo que a primeira
tentativa de foi sob o nome de Cytolex®, um creme cicatrizante para úlceras diabéticas dos pés, bem
como antibiótico oral, porém não foi aceito pelo FDA (Food and Drug Administration's - USA) nos
seus protocolos finais. Já um novo derivado da magainina, o Locilex®, outro creme tópico com ação
microbicida é, além da indicação da formulação anterior, também é empregada nas terapias contra o
câncer, no tratamento de conjuntivites, acne, de doenças sexualmente transmissíveis, de micoses,
além de serem drogas promissoras no tratamento da gripe (MAGAININ PHARMACEUTICALS
INC., 2003).
Xenopus tropicalis
Ali e colaboradores (2001) encontraram sete peptídeos (XT-1-XT-7) com atividade
antimicrobiana da secreção da pele estimulando com a norepinefrina em X. tropicalis. Após
caracterização estrutural destes peptídeos observou-se similaridade com a seqüência de aminoácidos
de peptídeos antimicrobianos previamente isolados de Xenopus laevis foi baixa, sugerindo que estas
espécies não têm uma grande relação de proximidade filogenética. Os peptídeos XT-5 e XT-3 são
provavelmente ortólogos respectivamente do peptídeo glicina-leucina amida (PGL(a)) do X. laevis e
da região N-terminal do espaçador da prolevitide. Os peptídeos XT-1, XT-6 e XT-7 mostram
limitada similaridade estrutural à região do espaçador das proceruleínas de X. laevis e os parálogos
24
XT-2 e XT-4 são similares a regiões correspondentes da proxenopsina, já ortólogos das magaininas
não foram identificados. A região C-terminal α-amidada do peptídeo XT-7 [Gly-Leu-Leu-Gly-Pro-
Leu-Leu-Lys-Ile-Ala-Ala-Lys-Val-Gly-Ser-Asn-Leu-Leu(NH
2
)] apresentou a mais baixa
concentração mínima inibitória contra os microorganismos de referência (Staphylococcus aureus 5
μM, Escherichia coli 5 μM, e Candida albicans 40 μM), tendo se mostrado ativo contra isolados
clínicos de S. aureus methicilina-resistante, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus
saprophyticus, Streptococcus grupo C, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa e Enterobacter
cloacae. Este peptídeo foi contudo hemolítico contra eritrócitos humanos (50% de lise a 70 μM).
Estudos de dicroísmo circular mostraram que XT-7 tem uma estrutura randõnica em pH 7,0 no meio
aquoso, mas adota uma conformação de α hélice em presença de 50% de trifluoroetanol. Ao
decrescer a cationicidade de XT-7 tanto por substituição do grupo C-terminal CONH
2
por COOH ou
por deleção do resíduo de Lisina(8) produz análogos com mais de 10 vezes em decréscimo da
potência antimicrobiana.
c) Hylidae
c.1. Phyllomedusinae
Phyllomedusa sauvagii
As Dermaseptinas (DS 1 -5), obtidas de uma perereca sul americana, constituindo uma
família de peptídeos de 28 a 34 resíduos de aminoácido, ricos em Lisina. Tendo as DS1 e 5 sem
apresentar atividade hemolítica, apenas antimicrobiana apesar de 40 % de similaridade entre as
cinco, as atividades biológicas são distintas e agem em sinergismo, podendo potencializar 100 vezes
a atividade antibiótica. Encurtando a DS3 para DS3- (1-16)-NH
2
não afetaram a potência do
peptídeo e reduções mais drásticos da DS3 para 10-12 resíduos curiosamente não afetaram a
atividade para alguns microorganismos o que ocorreu para outros derivados das demais DS (MOR et
al., 1994; FLEURY et al., 1998).
Phyllomedusa bicolor
Um fato interessante é que Phylloxina (Pierre et al., 2000) não é estruturalmente homóloga a
outras dermaseptinas ou as dermofinas/deltorfinas, mas dispõe de similaridades na seqüência com os
fragmentos precursores de levitide e xenopsina, peptídeos antimicrobianos da pele de uma espécie
evolucionariamente distante de anfíbio Xenopus laevis.
25
Amiche e colaboradores (2000), posteriormente isolaram um novo ativo contra molicutes
(eubactéria sem parede), gram-positivo e pouco ativo contra gram-negativos.
Phyllomedusa distincta
As Dermadistinctinas K, L, M, Q1 e Q2 apresentaram atividade antimicrobiana contra
microorganismos gram positivos e negativos, destacando a atividade contra Pseudomonas
aeruginosa resistente a meticilina (BATISTA et al., 1999). Do mesmo animal posteriormente foi
isolado a Distinctina, um peptídeo antimicrobiano que diferia (Batista et al, 2001)
Phyllomedusa hypochondrialis
Obteve um peptídeo com seqüência obtida pelo N – terminal de NH
2
- Phe-Leu-Ser-Leu-Ile-
Pro-His-Ala-Ile-Asn-Al- Val-Ser-Ala-Ile-Ala-Lys His-Asn-COOH, denominado de JR
2
. Este
apresentou baixa atividade hemolítica e ação antimicrobian contra as bactérias gram positivas
Staphylococcus aureus ATCC 27853 e E. faecalis ATCC 25973 e ainda, contra as gram negativas
Pseudomonas aeruginosa ATCC 25923 e Escherichia coli ATCC 25922 (LEITE et al., 2001).
Phyllomedusa tarsius
Morales e colaboradores (2002) encontraram uma série de peptídeos variando de 23 a 32
resíduos de aminoácido com ação antimicrobiana contra Escherichia coli, Staphylococcus aureus
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25922, 27853 e 25923) que guardam uma homologia maior
com as distinctinas isoladas de P. distincta.
Phyllomedusa oreades
Em um recente trabalho realizado pela EMBRAPA-Recursos Genéticos e Biotecnologia
tendo colaboração direta do Laboratório SABIN, Universidade de Brasília (UnB) e a Universidade
de São Paulo (USP) foi isolada e caracterizada uma dermaseptina presente na secreção cutânea deste
anfíbio recentemente descoberto no cerrado brasileiro (BRAND et al., 2002)
26
c2. Pelodryadinae
Litoria caerulea
Salmon e colaboradores (2000) fizeram um extenso trabalho visando o isolamento,
caracterização estrutural e determinação da bioatividade da secreção defensiva da pele do hilídeo
australiano Litoria caerulea. Este novo análogo da neuromedina U de mamíferos que apresenta
grande homologia na sua seqüência de aminoácidos foi denominado de neuromedina U-23 (NmU-
23).
Litoria chloris
Segundo Steinborner e colaboradores (1998), as glândulas da pele de Litoria chloris contem
uma variedade de peptídeos incluindo quatro antibacterianos da família da caerina 1. Dois destes,
cerinas 1.6 e 1.7, estão também presentes em Litoria xanthomera, confirmando que estas duas
espécies pela composição de suas secreções são as mais próximas dentro do gênero Litoria. Os
outros dois peptídeos, cerinas 1.8 e 1.9, são novos.
Desta mesma espécie foram caracterizadas quanto a seqüência de aminoácidos, estrutura e
atividade antimicrobiana de duas novas cerinas 1 das glândulas da pele denominadas cerina 1.8
Gly- Leu- Phe- Lys -Val-Leu-Gly-Ser-Val-Ala-Lys-His-Leu-Leu-Pro-His-Val-Val-Pro-Val-Ile-Ala-
Glu-Lys-Leu(NH
2
), e cerina 1.9, Gly-Leu-Phe-Gly-Val-Leu-Gly-Ser-Ile-Ala-Lys-His-Val-Leu-Pro-
His-Val-Val-Pro-Val-Ile-Ala-Glu-Lys-Leu(NH
2
) (WABNITZ
a
et al., 1998).
Litoria citropa
Dezesseis peptídeos tipo caeruleina foram isolados da secreção da pele de Litoria citropa.
Existem quatro grupos destes peptídeos, sendo que o primeiro é baseado na estrutura do conhecido
neuropeptídeo ceruleina [pGlu-Gln-Asp-Tyr (SO
3
)Thr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe(NH
2
)], renomeado
recentemente de ceruleina 1.1. Exemplos de peptídeos pertencentes a outros grupos neste animal
isolados são os seguintes: ceruleina 2.1 [pGlu-Gln-Asp-Tyr(SO
3
)Thr-Gly-Ala-His-Met-Asp-
Phe(NH
2
)], caeruleina 3.1 [pGlu-Gln-Asp-Tyr (SO
3
)Gly-Thr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe(NH
2
)] e
ceruleina 4.1 [pGlu-Gln-Asp-Tyr (SO
3
)Thr-Gly-Ser-His-Met-Asp-Phe(NH
2
)]. Todos estes peptídeos
são acompanhados por associações aonde a fenilalanina substitui metionina, e todos os oito
peptídeos caeruleina são acompanhados pelos análogos dessulfatados (WABNITZ
a
et al. 1999).
27
Através da combinação da espectrometria de massa de spray de elétrons, espectrometria de
massa de condensação Lys-C e seqüenciador automático de Edman forneceram a possibilidade de
conhecer seqüência de aminoácidos e isolar mais dezenove peptídeos citropina das glândulas
granulosa dorsal e submental de Litoria citropa. A citropina 1.1 e citropina 1.2 são os dois maiores
peptídeos da pele e ambos mostraram uma significante atividade antibacteriana com largo espectro
(WABNITZ
b
et al.,1999). Dando continuidade ao trabalho Wegener e colaboradores (1999),
aprofundando os estudos antimicrobianos e procurando localizar a glândula de origem de tais
peptídeos, verificou que dos dezenove peptídeos encontrados na secreção de glândulas granulares
dorsais da pele deste animal, quinze destes também estão presentes na secreção da glândula
submental, destacando entre eles a citropina 1.1 e 1.2 que são majoritários em ambas, tendo ainda a
citropina 1.3, também com amplo espectro antimicrobiano.
Litoria dahlii
Onze peptídeos foram isolados deste animal e denominados dahleinas, sendo que a exceção
das dahleinas 1.1 e 1.2 que apresentaram alguma atividade antimicrobiana de largo espectro contra
bactérias gram positivas para o restante esta não foi muito expressiva e ainda, as dahleinas 4 (4.1 a
4.3) e 5 (5.1 a 5.6) que correspondem a nove dos onze peptídeos encontrados são inativas contra
microorganismos nas condições de teste. Ao serem testados num programa do National Cancer
Institute (Washington) nenhum peptídeo mostrou atividade significativa anticâncer ao contrário da
encontrada para a aureína, substãncia isolada da Litoria aurea. É importante salientar que os
peptídeos dahleina 5 inibem fortemente a formação de óxido nítrico pela NO sintetase neuronal em
concentrações μM (WEGENER et al., 2001).
Litoria genimaculata
Os peptídeos obtidos das glândulas da pele desta espécie são denominados de maculatina.
Seis peptídeos já foram isolados e caracterizados das glândulas dorsais nesta espécie, sendo que
quatro mostraram atividade antibiótica, ressaltando a maculatina 1.1 que apresentou uma
pronunciada atividade particularmente contra bactérias gram positivas. Esta substância é um
peptídeo de 21 resíduos de aminoácido com uma prolina central o que confere mobilidade a esta
molécula facilitando e incrementando sua atividade antimicrobiana. A maculatina 1.1 assemelha-se
28
com o conhecido peptídeo antibiótico caerina 1, exceto nos quatro resíduos de aminoácido centrais
do sistema cerina 1 que estão ausentes na maculatina 1.1. (ROZEK et al., 1998, CHIA et al., 2000).
Litoria infrafrenata
As glândulas granulosas dorsais desta espécie contêm cinco peptídeos incluindo a ceruleina,
um conhecido neuropeptídeo, e quatro outros, denominados frenatinas 1, 2, 3 e 4, com pesos
moleculares respectivamente de 1140, 1423, 2180 e 2493 Daltons (Da). A seqüência de aminoácidos
das frenatinas e suas estruturas não correspondem aos peptídeos isolados de outros anfíbios ou
animais. A frenatina 3, Gly-Leu-Met-Ser-Val-Leu-Gly-His-Ala-Val-Gly-Asn-Val-Leu-Gly-Gly-
Leu-Phe-Lys-Ser(OH), que possue propriedades antimicrobiana (RAFTERY et al., 1996).
Litoria aurea & L. raniformis
Dezessete peptídeos aureína da secreção das glândulas granulares dorsais de Litoria aurea, e
16 de L. raniformis. Dez destes, são comuns a ambas as espécies. Treze dos peptídeos aureína
mostraram largo espectro antibiótico. Estes peptídeos foram chamados em 3 grupos (aureínas 1 - 3)
de acordo com suas seqüências. A aureína-1, com somente 13 aminoácidos, é o menor peptídeo
ativo antibiótico e anticâncer já relatado em anuras. A aureína 2.2 foi a de melhor atividade
antibiótica.
A aureína 1-3 peptides mostraram largo espectro antibiótico e atividade anticâncer, sendo a
aureína-2.2, o maior componente da secreção da pele de L. aurea, a mais potente das aureína
antibióticas, sendo, porém de espectro menor do que a caerina-1.1 e citropina-1.1. Outro peptídeo
abundante de L. aurea e L. raniformis, aurein-3.1, apresentou atividade antibiótica moderada. As
aureínas antibióticas mostraram uma maior ação contra bactérias gram-positivas do que negativas o
que normalmente ocorre com peptídeos antibióticos de anfíbios (ROZEK et al., 2000).
Litoria. splendida
A cerina 1.1 é um dos maiores constituintes peptídicos com ação antimicrobiana isolado,da
peledeste anfíbio australiano 25 aminoácidos tendo em sua conformação duas bem definidas hélices
de Leucina 2 a Lisina 11 e de Valina 17 a Histidina 24 separadas por uma região de menor definição
da forma de hélice e grande flexibilidade. As características estruturais sugerem que este interaja
com membranas semelhante ao modelo de carpete (WONG et al., 1997)
29
Girinos desta mesma espécie produzem peptídeos de defesa muito cedo no seu
devenvolvimento, bem antes da metamorfose. Com o auxílio de CLAE espectroscopia de massa,
peptídeos foram identificados e caracterizados, não sendo encontrado nenhum nos ovos após serem
coolocados. O neuropeptídeo caeruleína foi detectado após 10 dias da deposição, e os peptídeos
antibióticos caerina 1.1, cerina 1.6 e cerina 3.1 apareceram no 14° dia. A concentração de peptídeos
aumenta com o princípio da metamorfose no 84° dia, quando a necessidade destes peptídeos é tão
necessária quanto na fase adulta (WABNITZ
b
et al., 1998).
Nos peptídeos da pele do macho e da fêmea também da Litoria splendida foram encontradas
diferenças com a descoberta do feromonio no macho esplendeiferina, juntamente com um novo
antibiótico Phe8-caeruleína, que tem seus níveis variáveis em função da época que se encontra o
animal (WABNITZ et al., 2000).
Litoria xanthomera
A secreção das glândulas da pele L. xanthomera contêm sete peptídeos. Um deles é o
conhecido peptídeo hipotensor ceruleína. Dois novos que apresentaram propriedades
antibacterianas: cerina 1.6 [Gly-Leu-Phe-Ser-Val-Leu-Gly-Ala-Val-Ala-Lys-His-Val-Leu-Pro-His-
Val-Val-Pro-Val-Ile-Ala-Glu-Lys-Leu(NH
2
)], e cerina 1.7 [Gly-Leu-Phe-Lys-Val-Leu-Gly-Ser-Val-
Ala-Lys-His-Leu-Leu-Pro-His-Val-Ala-Pro-Val-Ile-Ala-Glu-Lys-Leu(NH
2
)] e ainda, outros dois
sem propriedade antibacteriana semelhantes as cerinas 1.6 e 1.7, diferindo por não apresentar os
primeiros dois resíduos de aminoácido. A identificação de peptídeos na L. xanthomera confirma que
estas espécies é relacionada a L. caerula, L. gilleni e L. splendida mas não tanto como estas três
entre si (STEINBORNER
a
et al.; 1997, STEINBORNER
b
et al., 1997).
d) Hyperoliidae
Kassina senegalensis
Isolada de extratos de pele oriunda de um anfíbio africano a kassinatuerina–1, um peptídeo
linear antibiótico de largo espectro, tendo atividade contra Escherichia coli, Staphylococcus aureus
e Candida albicans nas respectivas concentrações inibitórias mínimas de 4, 8 e 70 μM (MATTUTE
a
et al., 2000).
30
e) Pseudidae
Pseudis paradoxa
Quatro peptídeos estruturalmente relacionados (pseudinas 1 – 4) com atividade
antimicrobiana foram isolados de extratos da pele da rã paradoxal Pseudis paradoxa, sendo que a
pseudina – 2, foi a que se mostrou mais potente, com baixa atividade hemolítica e mais abundante
na pele deste anfíbio (OLSON III et al., 2001).
f) Ranidae
Recentemente os peptídeos antimicrobianos do gênero Rana foram agrupados em oito
famílias com base nas similaridades da seqüência de aminoácidos e compreendem as brevinina–1,
brevinina–2, esculentina–1, esculentina–2, ranalexina, ranatuerina–2 e temporina (GORAYA et al.,
2000), sendo que determinados peptídeos ocorrem em espécies diferentes.
Rana brevipoda porsa
Brevininas (1 – 2). Estes peptídeos foram isolados de uma rã japonesa por Morikawa e
colaboradores (1992) e o que chama a atenção é que não possuem qualquer homologia estrutura com
magaininas e nem bombinas, segundo os autores, brev-1 apresenta um percentual de homologia com
a pipinina, um peptídeo isolado da R. pipiens de atividade liberadora de histamina e, com um
peptídeo de vespa com atividade nos aminoácidos hidrofóbicos da extremidade N-terminal, de
quimiotaxia e atividade antimicrobiana também.
Rana rugosa
As gaegurinas, um grupo de peptídeos de tamanho entre 24 e 37 resíduos de aminoácido
isolada de uma rã coreana (PARK et al., 1994) de largo espectro antimicrobiano e nocividade
pequena sobre hemácias humanas. Tendo já disponível comercialmente as gaegurinas 2 e 5.
Rana catesbeiana
Ranalexina, um peptídeo antimicrobiano obtido de extratos de girinos da Rana catesbeiana,
estruturalmente relacionado ao polimixina, um antimicrobiano (CLARK et al., 1994). De animais
adultos foram isolados nove peptídeos, denominadas Ranatuerinas 1 - 9, de extratos da pele e
exibindo atividade contra Staphylococcus aureus (GORAYA et al., 1998).
31
Rana sphenocephala
Atravé da estimulação elétrica fotam obtidas secreções da pele desta rã e dela isolados três
peptídeos com atividade inibitória do crescimento contra a bactéria gram negativa Eschericia coli. A
caracterização estrutural demonstrou que os peptídeos brevinina-1Sa com concentração inibitória
mínima (minimum inhibitory concentration - MIC) de 55 μM; brevinina-1Sb, MIC = 17 μM;
brevinin-1Sc, MIC = 14 μM representam novos membros da família brevinina-1 de peptídeos
antimicrobianos. Sua alta concentração na secreção da pele e extrema variabilidade na seqüência de
aminoácidos sugere que a família brevinina de peptídeos pode ser um valoroso marcador molecular
para a identificação e classificação taxonômica dos ranídeos (CONLON et al., 1999).
Rana clamitans
Dez peptídeos apresentando atividade diferenciada inibitória do crescimento contra as
bactérias Staphylococcus aureus (gram-positiva) e Escherichia coli (gram-negativa), e a levedura
Candida albicans foram isolados de extratos de pele da rã Rana clamitans. Destes Ranatuerina-1C,
ranalexina-1Ca, ranalexina-1Cb, ranatuerina-2Ca, e ranatuerina-2Cb, são membros de três famílias
previamente caracterizadas que foram primeiramente identificadas na Rana catesbeiana. Outros
cinco peptídeos estruturalmente relacionados (temporina-1Ca, -1Cb, -1Cc, -1Cd, e -1Ce), com 13
resíduos de aminoácido e contendo um C-terminal amidado, pertencentes a família das temporinas,
primeiramente identificados na Rana temporaria. Estes dados reforçam a hipótese de que a
distribuição e seqüências de aminoácidos de peptídeos antimicrobianos da pele podem ser uma
ferramenta valiosa na identificação e classificação de ranídeos (HALVERSON et al., 2000).
Rana esculenta
Foram isolados três peptídeos da secreção desta rã com atividade distinta contra gram
positivos negativos, sendo o primeiro e segundo peptídeos apresentam homologia com as
brevininas1 e 2 respectivamente, diferindo o terceiro, denominado esculentina que apresenta uma
acentuada atividade contra Staphylococcus aureus e baixa atividade hemolítica (SIMMACO et al.,
1993). Posteriormente foi isolado e caracterizado um peptídeo de grande potência tanto como
antimicrobiano como hemolítico, a brevinina-1E, sendo que quando houve a deleção de três
aminoácidos na porção N – terminal não afetou a atividade antimicrobiana muito, mas reduziu
sensivelmente a atividade antimicrobiana (KWON et al., 1998). Já Wang
2
e colaboradores (1998)
32
conseguiram isolar e caracterizar quatro potentes peptídeos inibidores do crescimento de
Escherichia coli da família da brevinina-2, sendo que dois deles eram idênticos as brevininas 2Ec e
2Ef anteriormente isoladas na pele deste animal.
Rana ridibunda
Ensaios realizados com a secreção da pele desta rã proveniente de Istambul, Turquia,
evidenciaram uma forte ação antimicrobiana, sendo que não foi objetivo deste trabalho o isolamento
da substância responsável pela atividade em questão, sendo que os autores suspeitam tratar de uma
proteína (ÇEVIKBAS, 1978).
Rana temporaria
A ranatuerina 1T foi isolada desta rã foram incluídas na família das ranatuerina 1, recebendo
a letra T para caracterizar a espécie de onde foi isolada, possuindo atividade antimicrobiana contra a
bacteria gram positiva Staphylococcus aureus (GORAYA et al., 1999).
Wade e colaboradores (2000) relataram ter encontrado um pequeno peptídeo amida de
caráter básico, altamente hidrofóbico co amplo espectro de atividade incluindo Staphylococcus
aureus meticilino resistente e e Enterococcus faecium vancomicina resistente.
Rana grylio
Foram isolados oito peptídeos com atividade diferenciada contra as bactérias gram positivo e
negativo respectivamente, Staphylococcus aureus e Escherichia coli, também apresentando
atividade inibitória contra a levedura Candida albicans, sendo seus peptídeos podendo ser agrupados
pela similaridade da seqüência de aminoácidos nas famílias ranatuerina-1, ranatuerina-2 e ranalexina
(KIM et al., 2000).
Rana palustris
Suas secreções são tóxicas tanto para predadores como microorganismos. Foram isolados um
total de 22 peptídeos com atividade inibitória do crescimento diferenciada sobre bactérias e
leveduras de secreções da pele obtidas por eletro-estimulação e caracterizados estruturalmente.
Destes 13, pertenciam as cinco famílias conhecidas de peptídeos antimicrobianos previamente
identificado em outras espécies de ranídeos: brevinina-1 (3 peptídeos), esculentina-1 (2 peptídeos),
33
esculentina-2 (1 peptídeo), ranatuerina-2 (6 peptídeos), e temporina (1 peptídeo). Ainda, nove
peptídeos mostraram pequena similaridade estrutural com outros peptídeos conhecidos e
classificados em uma nova família: palustrina-1 (4 peptídeo s), com 27 a 28 resíduos de
aminoácidos e uma ponte de cistina num anel heptapeptídico; palustrina-2 (3 peptídeos) com 31
resíduos de aminoácidos e uma região heptapeptídica cíclica e palustrina-3 (2 peptídeos) com 48
aminoácidos e região heptapeptídica cíclica. Os peptídeos pertencentes as famílias esculentina-1,
esculentina-2 e palustrina-3 foram os mais potentes (BASIR, 2000).
Rana sylvatica
Pela contração dos miócitos em volta das glândulas granulares nesta espécie temos a
liberação de peptídeos antimicrobianos, sendo que após a obtenção de extratos de pele conseguiu-se
isolar demonstrar a indução de um peptídeo da família da brevinina-1 ativo contra Staphylococcus
aureus e Escherichia coli na pele da rã em resposta a uma mudança ambiental (MATTUTE
b
et al.,
2000)
Rana tigerina
Quatro novos peptídeos antimicrobianos de largo espectro com11 e 12 resíduos, chamados
tigerininas, foram isolados de secreções da pele obtidas após estímulo com adrenalina. Tem como
características uma ponte bissulfídica entre duas cisteínas formando um nonapeptídico.
Análises conformacionais indicam que este peptídeo tende a formar estrutura beta exercendo
permeabilização das membranas bacterianas. As tigerininas representam os menores peptídeos
antimicrobianos catiônicos não helicoidais dos anfíbios (Sai et al. 2001).
Rana berladieri, Rana luteiventris, Rana pipiens
Um total de 24 peptídeos com atividade antimicrobiana diferenciada sobre as duas bactérias
Staphylococcus aureus e Escherichia coli e também a levedura Candida albicans. Dentre estes
havia representantes das famílias de peptídeos brevinina–1, esculentina–2, ranatuerina–2 e
temporina (Goraya et al., 2000).
34
Rana aerolata
Na pele dorsal estão associadas, numerosas proeminentes glândulas granulosas. A análise da
secreção da pele obtida por estimulação elétrica destas glândulas levaram a identificação e
caracterização de oito peptídeos com atividades antimicrobiana e hemolítica pertencente a famílias
previamente identificadas brevinina-1, temporina-1, palustrina-2, palustrina-3, esculentina-1 (dois
peptídeos), e ranatuerina-2 (dois peptídeos). A estrutura primária dos peptídeos foi consistente com
uma proximidade relação filogenética entre R. areolata e Rana palustris. Três peptídeos catiônicos
contendo cisteína estruturalmente relacionados identificados mostraram similaridade de seqüência
ao peptídeo Leucina–Arginina, um peptídeo com propriedades imunomodulatórias e liberadoras de
histamina da pele de Rana pipiens. Dados sugerem que inibidores de protease nas secreções da pele
podem desempenhar um papel complementara peptídeos α-hélice anfipáticos catiônicos na proteção
de anuros a invasões por microorganismos (Ali et al., 2002).
Rana japonica
A japonicina-1 (Phe-Phe-Pro-Ile-Gly-Val-Phe-Cys-Lys-Ile-Phe-Lys-Thr-Cys(OH) e
japonicina-2 (Phe-Gly-Leu-Pro-Met-Leu-Ser-Ile-Leu-Pro-Lys-Ala-Leu-Cys-Ile-Leu-Leu-Lys-Arg-
Ly-Cys(OH), dois peptídeos with differential growth-inhibitory activity against the Gram-negative
bacterium, Escherichia coli e a bactéria gram-positiva Staphylococcus aureus, foram isolados de um
extrato de pele da rã marrom japonesa R. japonica. Ambos apresentaram pequena similaridade de
sua seqüência de aminoácidos com outros já isolados do mesmo gênero. Estudos revelaram que a
japonicina-2 adota uma conformação helicoidal. Peptídeos semelhantes as famílias brevinina-1,
brevinina-2, e tigerinina, previamente identificados na pele ranídeosasiáticos não foram detectados,
tendo apenas um peptídeo temporina-relacionado (Ile-Leu-Pro-Leu-Val-Gly-Asn-Leu-Leu-Asn-
Asp-Leu-Leu(NH
2
) sido encontrado, a temporina-1Ja, que atipicamente não possui carga positiva.
Os valores de concentração inibitória mínima (MIC) de peptídeos contra E. coli foram japonicina-1
(30 μM); japonicina-2 (12 μM); e temporina-1Ja (100 μM). Os valores de MIC contra S. aureus
foram japonicina-1 (100 M); japonicina-2 (20 μM); e temporina-1 Ja (100 μM) (Isaacson et al.,
2002)
35
Rana tarahumarae
A população deste animal tem decrescido marcadamente nos últimos anos. A infecção pelo
fungo Batrachochytrium dendrobatidis tem implicado no declínio não só deta espécie como de
outras. Rollins-Smith e colaboradores (2002) procuraram avaliar in vitro se a peptídeos
antimicrobianos da pele providenciam proteção contra este patógeno. Verificou-se que extratos da
mistura de peptídeos de pele inibiam o crescimento de forma concentração-dependente, tendo sido
isolados três peptídeos antimicrobianos com semelhanças com a família brevinina-1 e outros três
com a ranatuerina-2. Os dois mais abundantes peptídeos, a ranatuerin-2TRa e brevinina-1Tra,
respectivamente Gly-Ile-Met-Asp-Ser-Ile-Lys-Gly-Ala-Ala-Lys-Glu-Ile-Ala-Gly-His-Leu-Leu-Asp-
Asn-Leu-Lys-Cys-Lys-Ile-Thr-Gly-Cys(OH) e (Phe-Leu-Pro-Val-Ile-Ala-Gly-Ile-Ala-Ala-Asn-Val-
Leu-Pro-Lys-Leu-Phe-Cys-Lys-Leu-Thr-Lys-Arg-Cys(OH), foram ativos contra B. dendrobatidis
(MIC de 50 μM para ranatuerina-2TRa e 12,5 μM para brevinina-1TRa contra zoosporos). Apesar
destes dados de atividade contra B. dendrobatidis in vitro isto não ocorre na infecção natural
possivelmente por fatores inerentes a mecanismos de imunidade inata.
Rana tagoi
Dois peptídeos com propriedades antimicrobianas e citolítica foram purificados de um
extrato da pele desta rã. A estrutura primária de um dos peptídeos [Phe-Leu-Pro-Ile-Leu-Gly-Lys-
Leu-Leu-Ser(10)Gly-Ile-Leu(NH
2
)] foi identificado como um membro da família das temporinas, já
o segundo, [Ala-Ile-Gly-Ser-Ile-Leu-Gly-Ala-Leu-Ala(10)Lys-Gly-Leu-Pro-Thr-Leu-Ile-Ser-Trp-
Ile(20)Lys-Asn-Arg(NH
2
)] dispõe de 78% de identidade na seqüência com a melitina do veneno da
abelha Apis florea. Comparado com a melitina, este peptídeo melitina relacionado (PRM) foi
equipotente na inibição do crescimento da bactéria Gram-positiva Staphylococcus aureus, cinco
vezes menos potente contra a Gram-negativa Escherichia coli e contra o fungo patogênico, Candida
albicans. PMR foi 13 vezes menos hemolítico do que a melitina contra eritrócitos humanos e quatro
e cinco vezes menos citolítico contra linfoma de camundongo derivado células T EL4 e fibroblastos
L929, respectivamente. Contudo, nas concentrações não tóxicas, menor ou igual 8mg por mol, PRM
não tem ação protetora em células HeLa da morte celular produzida por infecção por rhinovírus
humano tipo 2 (Conlon et al., 2003).
36
g) Myobatrachidae
g.1. Uperoleia mjobergi
Da secreção das glândulas dorsais deste animal australiano foi isolado a uperina, um
peptídeo antimicrobiano (Bradford et al., 1996)
A comparação da sequência de aminoácidos revela similaridades da uperina-3, com as
aureínas 1 - 3 e a citropina-1. As citropinas e aureínas são peptídeos de defesa relacionados do
gênero Litoria, o que não é o caso das uperinas é um exemplo de convergência evolutionária, pois
ambas famílias divergiram de um ramo comum a pelo menos 60 milhões de anos atrás mas
conservaram características de suas secreções (Rozek et al., 2000).
h) Bufonidae
Segundo alguns autores os peptídeos podem estar ausentes na secreção de sapos do gênero
Bufo (Cei et al., 1968) ou presentes em pequenas quantidades (Daly & Witkop, 1971), contudo
alguns autores questionam estas afirmações.
Bufo boreas, B. bufo, B. viridis
Em uma revisão de 1997, Clarke e colaboradores descrevem observações não publicadas de
terem encontrado em cromatografia de camada delgada, revelado com azul de Coomassie 8 bandas e
com prata que confere maior sensibilidade de coloração 21 foram detectadas. Posteriormente, estas
bandas dissolvidas apresentaram atividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus e
Micrococcus luteus e efeito fungistático contra Neurospora crassa e Aspergyllus niger. Estes dados
até agora após extensa revisão bibliográfica ainda não foram encontrados.
Bufo bufo gargarizans
Deste sapo asiático que é empregado na medicina popular da Coréia dois peptídeos
antimicrobianos: buforinas I e II foram isoladas do estômago deste anfíbio (Park et al., 1996), sendo
que em termos de atividade antimicrobiana a buforina II é aproximadamente dez vezes mais potente
contra um largo espectro de microorganismos do que a magainina-2, uma referência em peptídeos
antimicrobianos de anfíbios (Park & Kim, 1998).
37
1.3.4. Peptídeos Antineoplásicos
São relatados alguns peptídeos que além da ação antimicrobiana também possuem uma
atividade antineoplásica, abaixo podemos ver alguns exemplos.
1.3.4.1. Magainina 2 e peptídeos análogos
Este sem dúvida foram dos mais testados. Cruciani
b
e colaboradores (1991), encontraram em
seu estudo evidências que a atividade citotóxica rápida e irreversível contra tumores de células
hematopoiéticas pela magainina 2 e seus análogos sintéticos por despolarização através da formação
de canais iônicos, sendo que os análogos lisaram estas células com concentrações de 10 a 20 vezes
menores que suas contrapartidas normais, parecendo ser que apesar de tanto as células de mamíferos
malígnas quanto as normais serem suscetíveis a lise, as cancerosas o são mais. Estes análogos
também inibiram o crescimento de pequenas células tumorais de pulmão (Ohsaki et al., 1992).
Peptídeos estruturalmente similares as magaininas 2 e amida sintetizados testados. in vitro
contra células leucêmicas P388 e in vivo para quatro tumores ascíticos murinos S180 e A549
demonstrando aumento de potência in vitro em relação a seus compostos originais. O peptídeo D-
aminoácido MSI-238, provou ser tão efetivo quanto a doxorubicina nos estágios mais avançados de
tumor ovariano e sua atividade pode ser atribuída a sua resistência a degradação proteolítica (Baker
et al., 1993). Já Soballe e colaboradores (1995), utilizaram os peptídeos derivados de magaininas
MSI-511, MSI- 130 e MSI – 98 para terapia experimental local de melanomas humanos e
observaram atividade lítica tanto in vitro como em camundongos timectomizados
1.3.4.2. Litoria. aurea & L. raniformis
As aureínas apresentaram uma atividade surpreendente, especialmente os peptídeos 1.2, 3.2 e
3.3 que mostraram atividade de mais de que 90% para todos os tipos de células cancerosas humanas
testadas. O largo espectro da atividade anticâncer junto com a conhecida atividade na membrana
bacteriana sugere que esta atividade é devido a penetração e ruptura da membrana de células
cancerosas e infelizmente de células normais, mas não invalidade a sua potencialidade (Rozek et al.,
2000).
38
2. OBJETIVOS
Isolar e purificar compostos bioativos obtidos da secreção mucosa de anfíbios.
Avaliar uma possível ação antimicrobiana de substâncias puras.
Conseguir identificar possíveis moléculas que venham a ser candidatas a ponto de partida
para modificações visando aumentar a atividade antimicrobiana e reduzir a toxicidade
39
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Animais Utilizados na Obtenção das Amostras
3.1.1. Bufo schneideri Werner, 1894- Bufonidae
Popularmente conhecido como sapo ou cururú, provenientes de áreas circunvizinhas a região
metropolitana de Fortaleza, Ceará e anteriormente denominado Bufo paracnemis Lutz 1925.
Figura 2 – Foto de um espécime Bufo schneideri W.
3.1.2. Leptodactylus pentadactylus Laurenti, 1768 Leptodactylidae : Leptodactylinae
Conhecidas como gia ou rã, são provenientes de áreas circunvizinhas a região metropolitana
de Fortaleza, Ceará.
Figura 3 – Foto de um espécime Leptodactylus pentadactylus L.
40
3.2. Obtenção do Veneno de Bufo schneideri
Exsudatos foram obtidos destes anfíbios pela compressão das glândulas paratoideas e
paracnêmicas para estimular a liberação da secreção destes e coletada em quadrados plásticos de
12,5 cm lateralmente, previamente pesados. Foram coletados material tanto de espécimes fêmeas
como de machos e então homogeinizados. O material bruto coletado é separado em alíquotas e
mantido sob refrigeração até a sua utilização. Para a elaboração do extrato bruto uma alíquota de 5 g
é esmagada em gral de porcelana com o auxílio de um pistilo e acrescentados 25 ml de etanol
absoluto, posteriormente sendo transferido para um béquer e sob refrigeração (4
o
C) deixado em
contato por 24 horas, posteriormente sendo centrifugada a 3600 xg por 15 minutos e coletado o
sobrenadante para purificação (CARVALHO et al., 1992).
3.3. Obtenção de Extratos de Pele de Bufo schneideri
Estes extratos foram utilizados em testes de atividade antimicrobiana tentando avaliar se
havia alguma variação da ação estudada com a localização no animal deste tecido e do solvente
utilizado, no caso a água bidestilada e o etanol.
Para obtermos este material, seis espécimes adultos de ambos os sexos de Bufo schneideri
foram anestesiados com éter e sacrificados por ruptura de medula. Tiras de pele das regiões dorsal,
ventral e glandular foram retiradas com o auxílio de lâminas de bisturi n° 23, o material foi pesado e
submetido a extração com água bidestilada e o etanol PA para cada uma das três regiões de pele
removida(aproximadamente 0,125 g/ml),durante 24 horas à temperatura de refrigeração sob agitação
constante. Então realizaram-se filtrações em tecido de nylon e centrifugações a 15.000 x g por 20
minutos, a 4
o
C. Os resíduos foram descartados e os sobrenadantes obtidos receberam a
denominação de DA (extrato da região dorsal em água), DE (extrato da região dorsal em etanol),
VA (extrato da região ventral em água), VE (extrato da região ventral em etanol). extrato da região
em água), GA (extrato da região glandular em água), GE (extrato da região glandular em etanol), e
GE.
41
3.4. Obtenção do Veneno de Leptodactylus pentadactylus
Os exsudatos destes anfíbios foram obtidos pela administração de uma injeção subcutânea de
adrenalina 100 μg/ml na dose de 1mg/Kg de peso, sendo o exsudato coletado após 20 minutos em
água bidestilada gelada (1:4; v:v), liofilizado (Liofilizador Edwards Modulyo-4K) e então estocado
à – 25 °C.
3.5. Purificação por Cromatografia em Colunas
O material bruto coletado oriundo do veneno de Bufo schneideri foi submetido a
fracionamento em Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) utilizando coluna de absorção
hidrofóbica de fase reversa (Shim-pack PREP 2,5 cm de diâmetro por 25 cm de comprimento, sílica
com granulação de 15 μm de φ, partícula de 100 A
o
) (SHIMADZU LC-10ADVP) e eluída com
gradiente de 0 a 40 % de acetonitrila com ácido trifluoroacético 0,05 % (TFA) por 60 min., com
fluxo 5 ml/min, obtendo-se os picos 1, 2 3 e 4. Seguindo-se de uma recromatografia do pico 1
utilizando-se uma segunda coluna, analítica C-18 CLC (M) de 4,6 mm de diâmetro por 15 cm de
comprimento com partículas de sílica de 5 μm de φ , partícula de 100 A
o
) com um maior número de
placas teóricas para a separação de dois picos que saiam muito próximos. Esta segunda coluna foi
utilizada para checagem de pureza das amostras obtidas (CARVALHO et al., 1992; JOUDIOU et
al., 1993).
Para a obtenção dos peptídeos deste material, o pó liofilizado do exsudato de Leptodactylus
pentadactylus foi diluído em TFA 0,05 % (20:1; P:V) e fracionado por CLAE usando coluna C18
(20 x 25 cm) eluído num gradiente de 5 a 80 % de acetonitrila durante 103 min., num fluxo de 5
ml/min. Na purificação de proteínas se utilizou-se uma coluna preparativa filtrante Sephacryl - S
400 (0,6 cm diãmetro por 46 cm comprimento) e eluída por tampão Tris – HCl 0,05 N, separando
assim pelos diferentes pesos moleculares.
42
3.6. Cromatografia em Placa Delgada de Sílicagel
Desde muitas décadas atrás, ténicas de cromatografia em sílica ou papel tem sido utilizadas
para evidenciar componentes do veneno de animais do gênero Bufo (SHIMADA et al., 1975,
KAMANO et al., 1975).
Foi realizada em cromatofolhas AL de sílicagel 60 F254 Merck
®
de 20x20 cm e de espessura
de 0,2 mm do veneno bruto de Bufo schneideri. Numa primeira, teve como eluente o clorofórmio e
sistema revelador a base de vanilina. A seguir, para outra amostra do veneno, foi utilizado como
eluente uma mistura de clorofórmio-metanol (9:1), tendo o metanol a função de aumentar a
polaridade e facilitar a separação, já como sistema revelador foi utilizado o iodo.
3.7. Obtenção de Dados para Avaliação dos Índices de Rendimento de Extração do Veneno
Bruto de Bufo schneideri
Para fazer o extrato bruto de B. schneideri utilizou-se 5 g de veneno bruto em 25 mL de
etanol absoluto, contudo para se te um valor de rendimento mais fiel após a purificação
cromatográfica, avaliou-se o peso do resíduo Após a extração seguindo-se a purificação
cromatográfica e coletados os picos, obteve-se os valores após liofilização por diferença de peso em
frascos de eppendorff tarados previamente em balança analítica relacionando com o volume.
3.8. Estudos quanto a Variabilidade do Veneno Bruto e seus Componentes em Diversas
Localidades de Coleta
Foi coletado veneno de Bufo schneideri em diferentes localidades em Estados do Nordeste
para avaliar cromatograficamente a composição básica comparativa por cromatografia em coluna de
CLAE C4 analítica. Os locais de coleta foram diferentes localidades nas cercanias de Fortaleza
(CE); Mossoró (RN), Natal (RN); Areia (PB), Campina Grande (PB); Recife (PE). Sendo que para
cada amostra seguiu-se os mesmos procedimentos de pesagem, extração e cromatografia, sendo esta
última realizando-se inicialmente com a coluna equilibrada em 33% e após 30 minutos iniciando um
gradiente para 40% de acetonitrila com 5% de ácido trifluoroacético.
43
3.9. Determinação de Proteínas
A concentração de proteína do pico 8 de Leptodactylus pentadactylus foi feita pelo método
de Bradford (1976), usando albumina sérica bovina como padrão. A 100 μl de amostra foram
adicionados 2,5 ml do reagente de Bradford e após 10 minutos de incubação, foramrealizadas
leituras das absobâncias a 595 nm.
3.10 Eletroforese
A pureza das amostras foi avaliada por eletroforese em gel de poliacrilamida 6%, sob
condições não desnaturantes e desnaturantes com SDS 1 % e β - mercaptoetanol, comparando-se ao
lado com padrões de proteínas conhecidas para a determinação do peso molecular.
3.11. Determinação da Estrutura das Substâncias Utilizadas
3.11.1. Determinação da estrutura das novas substâncias biologicamente ativas (não protêicas)
Essa etapa foi realizada no CENAUREN - Departamento de Química Orgânica da
Universidade Federal do Ceará, por Daniel Esdras de Andrade Uchôa, sob a coordenação do Prof.
Edilberto R. Silveira utilizando técnicas de Ressonância Magnética Nuclear de prótio e de carbono
13 num espectrômetro Bruker Avance DRX 500 e então comparando os dados espectrais
encontrados com os documentados na literatura.
3.12. Ensaio de Atividade Hemolítica
Este ensaio tem sido empregado por quase que via de regra por diversos autores como
triagem para amostras com a finalidade de avaliar-se tanto a atividade antimicrobiana, assim como
também servir como uma indicação preliminar da citotoxicidade para uma possível futura utilização
e foi realizado conforme as técnicas descritas por Mor e colaboradores (1994) e Tytler e
colaboradores (1995) com modificações.
Obteve-se uma amostra de sangue fresco heparinizado, lavando-o por três vezes com PBS
(50 mM Na
3
PO
4
, 150 mM NaCl, pH 7,3 ± 0,2) e centrifugando após cada lavagem a 900 x g/15 min.
44
Este ensaio foi feito em placa de microtitulação de poliestireno (8x12x1cm) consistindo de
96 poços de fundo cônico dispostos em 8 fileiras de 12 poços na qual uma alíquota de 100 μl foram
incubados com igual volume de água destilada sob agitação para obtermos nosso controle 100 % de
hemólise, já em PBS, apenas com uma leve homogeinização, como controle negativo 100 %, e
ainda, em diluições seriadas em PBS, com o auxílio de uma micropipeta automática, das amostras-
teste ao longo de cada fileira transferindo-se 100 μl para obter um volume final de 200 μl. Então,
também com a micropipeta, foram adicionados 100μl de suspensão de hemácias a 10% em PBS em
cada poço. A liberação de hemoglobina foi monitorada após centrifugação a 900 x g / 15 min em
100 μl de sobrenadante medida a uma absorbância de 541 nanômetros (nm) até 24 horas, sendo que
os títulos foram determinados observando-se a maior diluição que ainda apresentou hemaglutinação
total.
Os bufadienolídeos foram ensaiados a partir da diluição seriada de 1 mg/ml de cada uma.
Ensaio de Atividade Antimicrobiana
Os procedimentos com a manipulação e realização dos ensaios de avaliação da atividade
antimicrobiana seguiram as normas do Code of Federal Regulations (1977)
3.13.1. Obtenção de Microorganismos.
As cepas microbianas, bactérias, utilizadas foram provenientes de coleções padronizadas
American Type Cell Culture (ATCC) adquiridas da Universidade Federal de Pernambuco em
estado de conservação por liofilização e do Hospital Universitário Walter Cantideo – UFC
(HUWC), devidamente morfológica, fisiológica e bioquímicamente caracterizada.
Bacillus subtilis ATCC 6633
Enterobacter aerogenes ATCC 1304
Escherichia coli ATCC 25922
Klebsiella pneumoniae ATCC 10031
Pseudomonas aeruginosa HUWC 1
Salmonella choleraesuis choleraesuis var typhi ATCC 6534
Staphylococcus aureus ATCC 6538 P
45
3.13.2. Preparação do Inóculo para Cultivo
As amostras de microorganismos foram obtidas por dissolução em caldo B.H.I. de uma
alíquota deste material liofilizado, esta foi repicada para meio de Müeller – Hinton por 24 horas à
temperatura de 35ºC e incubada a colônias isoladas de cultivos puros
Após sua obtenção, cada microorganismos foi repicado em triplicata para tubos contendo
meio de estocagem semi - sólido.
Antes de serem utilizados nos experimentos , cada cepa microbiana foi repicada com o
auxílio de uma alça de platina assepticamente para em diferentes tubos contendo caldo B.H.I. (Brain
Heart Infusion, Merck®) e após pelo menos 5 horas de crescimento para em meios sólidos tais
como MacConkey para verificar a pureza de tais amostras, só então, foram utilizadas nos
experimentos.
Cada uma destas cepas foram inoculadas em diferentes tubos contendo caldo B.H.I. Após
incubação dos tubos por 5 horas visando se obter uma suspensão com turvação moderada, o inóculo
foi devidamente padronizado, diluindo-se em salina (sol. NaCl 0,9%) e corrigindo a turbidez com
auxílio de uma Escala de MacFarland (0,5 ml de BaCl
2
.H
2
O 0,048 M em 99,5 ml de H
2
SO
4
0,36 N)
para grau meio (10
8
unidades formadoras de colônia por mililitro). Este foi utilizado tanto para os
enaios em meio sólido como em meio líquido.
3.13.3. Teste de Avaliação da Sensibilidade Antimicrobiana
a) Em Meio Sólido
Inoculação em Placa
Com um “swab” estéril para cada tubo com suspensão bacteriana se procedeu a semeadura
em placas com ágar Müeller-Hinton e identificadas devidamente.
Aplicação dos Discos e Amostra - Teste
Com pinça estéril foram adicionados discos de papel de filtro Whattmann n°5 estéreis de
6,25 mm de diâmetro às placas, sendo que cada um deles recebeu 10 μl da amostra teste para
realizarem-se testes de avaliação de susceptibilidade microbiana (BAUER-KIRBY modificada,
1966). Após incubação pelo tempo de 18 horas à temperatura de 35ºC serão observadas as placas
46
testes. Paralelamente serão cultivados os mesmos microorganismos para comparações morfológicas
das colônias para verificar a possibilidade de ocorrerem alterações culturais (COLLINS & LINE,
1976; CARDOSO et al., 1985).
Leitura de Resultados por Mensuração dos Halos
Os halos de inibição são áreas circulares em que não se observam o crescimento de
microorganismo que quando positivo se visualizam em torno dos discos de aplicação de amostras -
teste, sendo estes halos mensurados com o auxílio de uma régua milimetrada, conforme a figura
esquemática abaixo ilustra:
Figura 4 – Representação esquemática da área de
mensuração do halo de inibição na
placa de ensaio com meio sólido de
Müeller – Hinton.
b) Em Meio Líquido
Esta técnica terá uma tripla finalidade:
1) Podemos ter um referencial comparativo com a maioria dos trabalhos realizadas por outros
pesquisadores, 2) ter registros de pequenas variações pela sensibilidade da leitura pela
espectrofotometria, 3)economizar reativos e amostras.
Utilizou-se placas plásticas de microtitulação de 96 cavidades esterilizadas. Foi diluído 50 μl
da amostra a ser testada no primeiro poço e proceda diluição seriada num volume fixo adicionado a
partir segundo poço 50 μl de salina estéril ou PBS. Os ensaios devem ser desenvolvidos em
duplicata. A este adicionou-se 50 μl de uma suspensão de bactérias a 10
8
unidades formadoras de
47
colônia/ml (segundo os autores 10
6
u.f.c./ml), esporos ou microconídios/ml em caldo de B.H.I. a
cada poço. Diluindo-se 50 μl da suspensão de microorganismos em igual volume de formaldeído
0,4% fez-se o controle negativo e em meio de B.H.I, controle positivo.
A inibição do crescimento foi determinada pela medida da densidade óptica em
espectrofotômetro a 492 nm após uma incubação de até 24 h / 37°C.
3.14. Avaliação dos Dados por Modelos Matemáticos e Estatísticos
3.14.1. Equação de Gompertz
Utilizada para avaliar a cinética de crescimento bacteriano (LAKSHMINARAYANAN &
PITCHAIMANI, 2003; MCCANN et al., 2003; VIALETTE et al., 2003). Onde podemos observar
as fases de crescimento bacteriano denominadas de Lag e exponencial. Para compreender a
relevância destas fases temos que a Lag, também conhecida como fase de adaptação ou latência,
sendo o período em que a população bacteriana se adapta ao meio em que se encontra, iniciando a
produção de metabólitos essenciais para o seu desenvolvimento como enzimas, por exemplo; já a
fase exponencial (logarítmica ou log), é a fase na qual na qual a multiplicação ocorre com maior
velocidade, aumentando exponencialmente a população a cada período de geração.
A equação de Gompertz é definida pela expressão abaixo:
MUE
Y = NO + C
exp
{ - exp [( 2,718
C
).( LAG – X ) + 1]}
NO = log inicial do n° de células
C = diferenças entre inicial/final do n° de células
LAG = decaimento antes do crescimento (retardo ou antecipação antes da fase de crescimento
exponencial)
MUE = movimentação específica de crescimento
X = tempo
Y = log célula
48
3.14.2. Equação de Regressão Não Linear
O coeficiente angular “K” é obtido a partir de regressão curvilínea (Y = a . e
kt
) para curvas
de crescimento (GIRALDO et al., 2002).
3.14.3. Análise Estatística
Os dados ainda foram submetidos ao Teste de médias, Análise de variância, Teste Múltiplo
de Comparação de Tukey, utilizando-se o programa Prisma v4.
49
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO:
4.1. Purificações Cromatográficas das Amostras de Bufo schneideri
O extrato bruto obtido de Bufo schneideri foi submetido a purificação em CLAE em coluna
absorção hidrofóbica de fase reversa C18 de aminoetilagarose eluído em em gradiente de 0 (zero) a
40 % com acetonitrila acrescido de ácido trifluoroacético (Figura 5). O cromatograma obtido pode
ser visto abaixo, sendo que os picos abaixo discriminados pelos números 0, 1, 2, 3, e 4 foram
coletados. Esta operação foi realizada inúmeras vezes com a finalidade de acumular material em
quantidade necessária para a realização dos testes de avaliação da atividade biológica e para a
determinação das estruturas dos mesmos ou ainda, quando necessário recromatografia.
Figura 5 - Cromatograma do extrato bruto de Bufo schneideri em CLAE em coluna adsorção
hidrofóbica de fase reversa C18 de aminoetilagarose eluído em em gradiente de 0
(zero) a 40 % com acetonitrila acrescido de ácido trifluoroacético.
50
Os picos 1, 2, 3 e 4 foram submetidos a cromatografia analítica em coluna de adsorção
hidrofóbica fase reversa C4 para checar a pureza, sendo o material enviado para estudos em
Ressonância Magnética Nuclear e assim, tivemos confirmadas as estruturas dos picos 2, 3 e 4. Já o
pico 1 foi então recromatografado, conforme descrito e ilustrado (Figuras 9 e 10) mais adiante.
4.1.1. Recromatografia do Pico 1 parcialmente purificado de Bufo schneideri (F1)
A seguir pode ser visto o cromatograma obtido do pico 1 em coluna adsorção hidrofóbica de
fase reversa C18 de aminoetilagarose eluído em programa isocrático com acetonitrila acrescido de
ácido trifluoroacético (Figura 9). Os picos abaixo foram denominados como Z1, Z2, 1α, 1A, 1B e
1X e dentre estes 1A e 1B foram coletados.
Desta cromatografia começou-se a coletar para uma mais efetiva purificação os picos
denominados de 1A e 1B, resultando deste procedimento uma fração rica parcialmente purificada
1A e um 1B puro e com sua estrutura determinada, conforme pode ser observada na Figura 10.
Figura 9 - Cromatograma obtido do pico 1 em coluna adsorção hidrofóbica de fase reversa coluna,
analítica C-18 CLC (M) de aminoetilagarose (4,6 mm x 15 cm) eluído em programa
isocrático a 30 % com acetonitrila acrescida de ácido trifluoroacético
51
4.2. Determinação da Estrutura das Novas Substâncias Biologicamente Ativas (não
proteicas)
Os estudos espectrométricos de Ressonância Magnéticos Nuclear (RMN) realizados por
Uchôa (2001) das substâncias que foram isoladas do extrato etanólico da secreção das glândulas
parotóideas de B. schneideri, possibilitaram identificar do material enviado pelo nosso grupo de
pesquisa quatro compostos classificados como Bufadienolídeos, a saber: Pico 1B – Hellebrigenin
(Figura 6), Pico 2 - Telocinobufagin (Figura 7), Pico 3 – Marinobufagin (Figura 8) e Bufalin –
Bufalin (Figura 9), estando aqui ordenados em ordem crescente de hidrofobicidade.
Algumas das substâncias isoladas neste trabalho são citadas em outros trabalhos com outras
espécies do gênero Bufo, contudo são em muitas vezes produtos de síntese usados como referência
para checar análogos e não propriamente isolados do material original do animal (KAMANO et al.,
1968, SHIMADA et al., 1979). Já em 1965, Zelnick chamava a atenção para a necessidade de certos
trabalhos serem revistos haja vista os avanços da ciência a purificação pondo em evidência a
impureza de certos compostos cristalizados considerados anteriormente puros ou revelando novos
bufadienolídeos.
O levantamento bibliográfico dos dados de carbono 13 de bufadienolídeos encontrados na
natureza mostrou que , apesar desses compostos terem sido relatados anteriormente, nesta mesma
espécie no Rio Grande do Norte por Rossi e colaboradores (1997), havia equívocos nos
assinalamento de seus dados de carbono 13, principalmente para o Telocinobufagin e o
Marinobufagin, sendo que o material obtido no Laboratório de Neurofarmacologia da UECE
possibilitou a confirmação do isolamento e correta caracterização de seus compostos, sendo que no
marinobufagin divergia o ponto de fusão o que poderia sugerir a possibilidade de ser outro
composto, sendo que em Reinynolds e colaboradores (1995) num trabalho anterior ao de Rossi em
que a correlação dos dados de RMN para o Marinobufagin, isolado de Bufo marinus, é fornecida e
está completamente de acordo com a proposição apresentada no trabalho de Uchôa.
Wang
1
e colaboradores (1998) procuraram estabelecer um método de CLAE para determinar
o conteúdo dos constituintes ativos no veneno de bufonídeos utlizados na medicina tradicional
chinesa, tendo conseguido isolar e quantificar o resibufogenin e cinobufagin, usando uma fase
móvel com uma solução de acetonitrila-0.5% - KH
2
PO
4
(50:50), com o pH ajustado com ácido
52
fosfórico para 3,25 + 0,02 e conseguindo para estes componentes uma boa separação. Neste trabalho
não é descrito nenhum dos compostos isolados em nosso laboratório.
4.2.1. Hellebrigenin
O pico 1B da recromatografia de F1 após estudos foi denominado de Hellebrigenin (3β,
5β, 14β - trihidroxi – 19 – oxo – 20, 22 – bufadienolídeo, sendo também realizados testes de
avaliação da atividade biológica.
Esta substância está presente em plantas do gênero Helleborus sp (Ranunculaceae), muito
utilizada na antigüidade como contraceptiva e abortiva e citada por Riddle (1992) como um do três
principais constituintes desta planta.
A partir desta molécula tem sido sintetizado derivados acil cardiosteróides e estes são ativos
por via oral, sendo um exemplo destes cardiotônicos a D 12316 (acrihellin), a hellebrigenin-3 β-
dimetilacrilato, encontrando-se ainda em fase de avaliação clínica .
Figura 6 - Estrutura do Pico 1B: Hellebrigenin (3β, 5β, 14β - trihidroxi – 19 – oxo – 20, 22 –
bufadienolídeo)
O
O
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
HO
OH
CH
3
OH
O
53
4.2.2. Telocinobufagin
Estudos realizados no Laboratório de Neurofarmacologia da Universidade Estadual do
Ceará, com o telocinobufagin (Figura 6) também evidenciaram que este bufadienolídeo induz uma
forte atividade anestésica local mais forte e duradoura que as da lidocaína e bupivacaína, sugerindo
que esta venha ser um protótipo para uma nova classe de anestésicos locais (PATROCÍNIO et al.,
2002).
Figura 7 – Estrutura do Pico 2: Telocinobufagin (3β, 5β, 14β - trihidroxi –20, 22 – bufadienolídeo.
O
O
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
HO
OH
CH
3
CH
3
OH
4.2.3. Marinobufagin
Segundo estudos realizados por nosso grupo, o marinobufagin (Figura 7) induz atividade
epileptiforme nos registros eletrográficos, sendo bloqueados os ataques por drogas tais como
diazepan e fenitoína, podendo tendo em vista estas prerrogativas, ser utilizado para desenvolver um
modelo de estudo para o status epilepticus para avaliação farmacologia de drogas anticonvulsivantes
usadas no tratamento da epilepsia (NOGUEIRA et al., 2002).
O marinobufagin foi o primeiro bufadienolídeo a ser obtido na forma cristalizada, não
necessariamente puro, por Abel e Match em 1911, tendo só após dez anos mais tarde sido sugerido
por Faust que os bufadienolídeos eram esteróides e esta filiação foi confirmada pelo diagrama dos
54
raios-x (CROWFOOT, 1935) e pela obtenção do metilciclo pentenofenantreno a partir do marino
bufagin (JENSEN, 1937).
Figura 8 – Estrutura do Pico 3: Marinobufagin (14β, 15β - epóxi - 3β, 5β -dihidroxi–20, 22 –
bufadienolídeo)
O
O
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
HO
OH
O
CH
3
CH
3
4.2.4. Bufalin
O bufalin (3β, 14β - dihidroxi – 5β – bufa – 20, 22 – dienolídeo) (Figura 8) é descrito como
componente do veneno de outros animais do mesmo gênero que o estudado. Este foi descrito
anteriormente em diversos experimentos de purificação de componentes do Ch’an Su ou Liu-Shen-
Wan na China ou Senso no Japão como um dos três maiores constituintes juntamente com
cinobufagin e resibufogenin, sendo nos dois primeiros preparados chineses elaborados
principalmente a partir do Bufo bufo gargarizans e no terceiro, o B. japonicus (HONG et al., 1992).
A bufalin é descrita como um inibidor de bomba de sódio - potássio-ATPase e tem apresentando
efeitos analgésicos (WANG et al., 1994).
55
Figura 10 - Estrutura do Pico 4: Bufalin (3β, 14β - dihidroxi – 5β – bufa – 20, 22 – dienolídeo)
O
O
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
HO
CH
3
CH
3
OH
Algumas das substâncias evidenciada no Bufo schneideri foram encontradas em membros
deste mesmo gênero conforme será discutido a seguir. Em Bufo crucifer, espécime existente no
Brasil, foram encontrados em cromatografia com placa de sílicagel em um sistema de solventes
bufadienolídeos dentre os quais foram encontrados a hellebrigenin e bufalin (ZELNICK, 1965). No
Bufo vulgaris formosus, um sapo japonês, Shimada e colaboradores (1977) em estudos sobre seus
esteróides cardiotóxicos encontraram o bufalin. Lin e colaboradores (1984) conseguiram isolar do
Ch’an Su de Formosa, elaborado com uma mistura de Bufo bankorensis Boubour e Bufo bufo
asiaticus Steindachner, identificaram dentre outros também telocinobufagin, marinobufagin e
bufalin. Shimada e colaboradores (1987), encontraram trabalhando apenas com Bufo bankorensis
Boubour dentre outros os mesmos três bufadienolídeos que Lin e colaboradores. Já no Bufo viridis,
Shimada e colaboradores (1986) isolaram o telocinobufagin, marinobufagin e apó síntese do
hellebrigenin, usando-o como referência isolou esta substância e análogos das secreções deste
animal. Em Bufo bufo gargarizans Cantor obtido da Corea, Shimada e colaboradores (1985)
isolaram e caracterizaram o marinobufagin e bufalin.
Outros pesquisadores já haviam isolado as substâncias encontradas deste mesmo animal,
porém nenhum utilizando CLAE e aplicando direto o extrato do veneno bruto e obtendo tantas
substâncias puras em uma cromatografia com apenas uma passagem e nem apresentado uma
atividade farmacológica para estas.
56
4.3. Obtenção de Dados para Avaliação dos Índices de Rendimento Extração do Veneno
Bruto de Bufo schneideri
Para fazer o extrato bruto de B. schneideri utiliza-se 5 g de veneno bruto em 25 mL de
etanol absoluto, contudo para se te um valor de rendimento mais fiel após a purificação
cromatográfica. Este resíduo em média pesa 1,67 g o que representa aproximadamente 33,3 % do
peso do veneno bruto, sendo assim, a parte que é solúvel representa 3,33 g (66,6 %) e foi usada para
efeito de cálculo. Verificando o aspecto e a solubilidade do resíduo viu-se que este era de coloração
esbranquiçada e de aspecto quebradiço, sendo que quando misturado a água bidestilada com tempo e
agitação formava um gel, que com mais água e vigorosa agitação dissolvia-se, adquirindo a
característica de um líquido viscoso. Este, com a adição de metanol precipitou prontamente. Os
estudos além de caracterizar o veneno bruto, visaram possibilitar futuramente chegar a novos
métodos de extração e assim, purificar novas substâncias.
O rendimento médio estimado do pico 1 em relação ao bruto foi de 1,55 %. Para os picos 1A
e Hellebrigenin em relação ao pico 1 foi de 49,17 % e 24,71 % respectivamente. Já estes dois em
relação ao veneno bruto tiveram um rendimento médio estimado de 0,76 % para o pico 1A e 0,38
% para a Hellebrigenin.
4.4. Cromatografia em Placa Delgada de Sílica
Foram realizadas em cromatofolhas AL de sílicagel 60 F254 Merck
®
do veneno bruto de
Bufo schneideri obtido por compressão dos agregados glandulares parotóideos e tibial. Nas Figuras
11 e 12 a seguir, conforme podem ser observados em esquemas ilustrativos que representam os
resultados obtidos, haja vista que elas descolorem rapidamente.
57
Final da eluição
“Spots”
Início da eluição
Figura 11 - Esquema do resultado do extrato bruto de B. scneideri aplicado na Lâmina de Silicagel
AL60 F254 Merck
®
tendo como eluente o clorofórmio e sistema revelador a base de
vanilina.
Na Figura 11 podem se ver manchas que são denominadas no meio corrente de “spots” que
apresentaram coloração azul variando do azul claro e pálido (pouco intenso), passando por um azul
forte com lilás, até um azul escuro muito intenso. Tem-se que quanto mais intensa a cor, mais
concentrado está o componente.
Analisando esta placa, observa-se que ela apresenta características de triterpenos, no caso já
se tem o conhecimento que a amostra é rica em esteroidais, sendo que desta foram evidenciados o
Telocinobufagin (spot 2) e o Marinobufagin (spot 3), anteriormente já obtidos em cromatografia em
CLAE. Isto foi realizado recortando os “spots” da lâmina de silicagel e submetendo-os a coluna
analítica C18 CLC usando as amostras bem conhecidas obtidas em semipreparativa C18 como
referência e então se viu coincidência de saída e condições.
Posteriormente esta primeira placa foi repetida trocando-se o sistema revelador de vanilina
para iodo, contudo só puderam ser vistos dois “spots”, outros puderam ser evidenciados passando
esta mesma placa em vanilina. Fez-se então necessário ensaiar mais uma cromatografia nas
condições descritas abaixo.
58
Final da eluição
Apolares
Polares
Início da eluição
Figura 12 - Esquema do resultado do extrato bruto de B. scneideri aplicado na Lâmina de Silicagel
AL60 F254 Merck
®
tendo como eluente uma mistura de clorofórmio-metanol (9:1) e
sistema revelador o iodo.
Nesta placa acima (Figura 12), foi utilizado como eluente uma mistura de clorofórmio e
metanol, 90% e 10% respectivamente, tendo o metanol a função de aumentar a polaridade e facilitar
a separação, já como sistema revelador foi utilizado o iodo. Pode se observar o ponto de aplicação
se desdobrando em dois, tendo nesta região a concentração de compostos polares, já ao final temos
um “spot” que denota a região de concentração de compostos apolares
Os resultados são sugestivos que como um método de pré-purificação os ensaios em
cromatofolhas de sílicagel constituem uma boa alternativa, pois além de serem um método mais
barato, pode-se aplicar uma maior concentração de amostra bruta inicialmente e ao utilizar-se
posteriormente às colunas de purificação cromatográficas em CLAE estas seriam menos sacrificadas
e ganharia uma maior vida útil. Obviamente, isto não invalida a maior precisão de um perfil
cromatográfico em CLAE e se torna válido quando já se conhece bem o material a ser utilizado e se
quer acumular rapidamente material para ensaios biológicos.
59
4.5. Estudos da Variabilidade do Veneno Bruto e seus Componentes em Diversas
Localidades de Coleta
Uma questão que se fez presente seria a da variabilidade destes picos principais na nossa
espécie de objeto de estudo, o Bufo schneideri, era se haveria variabilidade muito grande da
composição básica do veneno com amostras provenientes de diferentes lugares.
Observou-se que há um grau de conservação dos picos primários que são os majoritários que
foram detectados inicialmente, principalmente a Fração 1 e os picos correspondentes a
Telocinobufagin, Marinobufagin e Bufalin, e vem sendo estudados no nosso Estado, contudo a
concentração dos mesmos variou bastante. Em termos de atividade isto não ocorreu.
Ilustrativamente abaixo (Figura 13), temos dois cromatogramas obtidos pelo sistema
isocrático destes estudos, sendo que apesar de preparado o extrato na mesma concentração (5 g de
veneno bruto para 25 mL de etanol absoluto), ser submetido as mesma condições de ensaio
cromatográficas de concentração, conforme vemos nos cromatogramas em anexo, tendo como
exemplo amostras oriundas de Areia (PB) e Fortaleza (CE), houve uma variação na concentração de
Telocinobufagin e Marinobufagin de maneira evidente, pois nas amostras de Fortaleza o pico
correspondente a Marinobufagin (3) é muito maior que a Telocinobufagin (2), o que ocorre ao
contrário no obtido de Areia. As amostras coletadas em Mossoró (RN) e Recife (PE) são muito
parecidas com as de Fortaleza, coincidindo as devidas proporções entre os picos principais e tempo
de saída, chama a atenção uma maior quantidade da Fração 1 no material oriundo de Mossoró. Estas
diferenças levam a questionar que fatores poderiam estar influenciando nesta variação. Um primeiro
seria a possibilidade de termos os bufadienolídeos vindo da dieta, haja vista que eles já foram
encontrados alguns em insetos, sendo que deve ser ressaltado que até então o Hellebrigenin,
Telocinobufagin, Marinobufagin e Bufalin encontrados em nossas pesquisas ou similares, não foram
descritos em insetos ou vice-versa. Um segundo fator poderia ser devido atribuído a diferentes
características climáticas do local das coletas influenciando no metabolismo de síntese dos
bufadienolídeos. Como terceiro, deve ser dito que não são conhecidas totalmente as funções dos
bufadienolídeos nos anfíbios e portanto este poderia estar variando conforme necessidades
fisiológicas ou mesmo patológicas nos animais coletados. Ainda, como quarto fator possível de ser
cogitado, poderiam ser subespécies do mesmo animal.
60
Figura 13 - Cromatogramas de amostras de veneno de Bufo schneideri oriundas de Areia (PB) e
Fortaleza (CE).
61
4.6. Purificações Cromatográficas das Amostras de Leptodactylus pentadactylus
4.6.1. Purificações Cromatográficas das Amostras de L. pentadactylus em Coluna Filtrante
Sephacryl S-400
Na Figura 14 abaixo, pode ser visto o cromatograma desta purificação onde vemos
evidenciado o Pico 8, que se destacou na avaliação da atividade biológica e foi alvo de estudo de
várias frentes de investigação no Laboratório.
Figura 14 – Cromatograma da purificação de proteínas em coluna preparativa filtrante Sephacryl -
S 400 (0,6 cm diâmetro por 46 cm comprimento) e eluída por tampão Tris– HCl 0,05 N
4.6.1. Eletroforese do pico 8 obtido na coluna Sephacryl S-400 de L. pentadactylus.
Conforme pode ser observado na Figura 10 abaixo, o pico 8 na eletroforese tanto em
condições não desnaturantes (A) e desnaturantes com SDS 1 % e β - mercaptoetanol (B) apresentou
uma única banda da proteína.
62
A = Em condições não desnaturantes
B = Em condições desnaturantes com SDS 1 % e β - mercaptoetanol
Figura 15- Avaliação eletroforética para a análise de pureza da toxina (P8) em gel de
poliacrilamida 6% sob condições não desnaturantes e desnaturantes com SDS 1 % e
β - mercaptoetanol.
O pico 8 é uma proteína que apresentou um peso moleculaear aparente de 29 kDa e pode ser
vista como uma única banda.
4.6.2. Purificação dos peptídeos de Leptodactylus. pentadactylus
Abaixo podemos observar o cromatograma de obtenção dos peptídeos deste anfíbio em
coluna semipreparativa C18 em CLAE (Figura 14).
Na Figura 15, logo após, temos o cromatigrama da checagem da pureza dos picos peptídicos
em coluna analítica C4 de fase reversa.
63
Figura 16 -
Cromatograma da obtenção dos peptídeos do exsudato liofilizado de Leptodactylus
pentadactylus fracionado por CLAE com coluna C18 eluído num gradiente de 5 a
80 % de acetonitrila durante 75 min., fluxo de 5 ml/min.
64
Figura 17 – Cromatograma de verificação da pureza cromatografia analítica em coluna de adsorção
hidrofóbica fase reversa C4 dos picos 5, 6 e 7 peptídicos de Leptodactylus
pentadactylus respectivamente.
65
4.7. Avaliação de Atividades Biológicas
Os resultados experimentais de avaliação da atividade biológica das amostras obtidas podem
ser subdivididos em duas partes: a) ação hemolítica das amostras e, b) antimicrobiana.
4.7.1. Atividade hemolítica de amostras obtidas de Bufo schneideri:
Os ensaios para a avaliação de uma possível atividade hemolítica por parte dos picos, assim
como pelo extrato bruto, tem abaixo seus resultados expressos em tabelas comentadas.
Tabela 4 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 541 nm do sobrenadante dos poços da plac
a
de microtitulação da avaliação da atividade hemolítica dos das amostras obtidas d
a
secreção da pele de Bufo schneideri.
Amostra
Poço n
o
EB
F1
Hb
Tc
Mb
Bf
1
0 833 1010 1216 0 400
2
0 217 350 0 0 220
3
0 200 0 0 0 0
4
0 0 0 0 0 0
5
0 0 0 0 0 0
6
0 0 0 0 0 0
Quantidade da
amostra (μg)
____
62,5
125
250
____
125
Concentração
(μL/mL)
____
0,125
0,25
0,5
____
0,25
Obs: 1. O valor de referência para servir como zero de calibragem do espectrofotômetro foi o sobrenadante de
hemácia 5% de camundongo + salina (sol. NaCl 0,85%).
2. O poço 1 contém a amostra na concentração – mãe da cromatografia.
EB = Extrato bruto; F1 = Fração parcialmente purificada 1; Hb = Hellebrigenin; Tc = Telocinobufagin;
Mb = Marinobufagin; Bf = Bufalin
Conforme pode-se observar na Tabela 4, quando comparado com o padrão utilizando a leitura
da absorbância dos sobrenadantes dos poços das placas de microtitulação e realiza-se a leitura em
66
um espectrofotômetro a um comprimento de onda de 541 nm, sendo este calibrado quanto ao seu
zero com o sobrenadante da incubação de uma suspensão de hemácias à 5% com igual volume de
salina, pode-se verificar que apenas os picos 1 e 2 apresentaram leituras, o que evidencia que houve
um aumento na concentração do sobrenadante detectável de hemoglobina, sendo muito mais preciso
do que a observação à vista desarmada. A fração F 1, causou hemólise comprovadamente nos poço
1, 2 e 3, resultando numa concentração hemolisante mínima (CHM) para que se detecte a atividade
nas condições experimentais de 0,125 μg/mL ou ainda, uma quantidade mínima de amostra no poço
de 62,5 μg; na amostra do Hellebrigenin observou-se hemólise nos poços 1 e 2, o que significa uma
CHM de 0, 25 μg/mL ou 125 μg; quanto ao Telocinobufagin detectamos uma intensa hemólise
apenas no poço 1, com a concentração original (0,5 ug/mL, ou 250 μg), sendo esta mais intensa do
que a obtida por incubação em condições idênticas de suspensão de hemácias à 5% e água (controle
positivo) e posteriormente submetido a vigorosa agitação repetida deste controle. O Marinobufagin
não apresentou atividade hemolítica nas condições experimentais, já o Bufalin apresentou hemólise
nos poço 1 e 2, resultando numa CHM de 0, 25 μg/mL ou ainda, 125 μg.
Importante ressaltar que o Hellebrigenin é uma amostra que foi obtida com alto grau de
pureza da recromatografia com um sistema isocrático de concentração em CLAE, conforme pode ser
observado em cromatograma da Figura 9.
O resultado encontrado para o extrato bruto poderia talvez ser justificado por ser este em
grande parte relativa constituído pelo Marinobufagin, amostra que não apresentou a atividade
hemolítica. Outra ainda, seria pelo TFA estar como composto residual e ter atividade hemolítica nas
demais amostras e não extrato bruto, contudo isto não procede, pois tivemos amostras obtidas da
cromatografia que tanto apresentaram como não a atividade testada.
Analisando os valores obtidos para a atividade hemolítica do Telocinobufagin pode se dizer
que esta é mais significativa, considerando a intensidade, do que para a fração F1 e um pouco mais
do que o Hellebrigenin baseado nos registros de absorbância do sobrenadante.
Na literatura, para peptídeos vem sendo bem discutida cada vez mais a respeito de
peculiaridades que poderiam ser possíveis causas da atividade hemolítica ser maior ou menor,
contudo para bufodienolídeos não, o que abre uma série de possibilidades a serem exploradas.
A atividade hemolítica em si pode ser referendada pelo trabalho de Das e colaboradores
(1998) que encontraram uma série de alterações hematológicas e na bioquímica do sangue in vivo
utilizando ratos destacando-se o decréscimo da hemoglobina, hematócrito, aumento de alguns
67
leucócitos e alterações enzimáticas e níveis de componente tais como glicose, uréia e creatinina
como exemplo.
Apesar de não ter utilizado hemácias conforme em nosso trabalho, mas células primárias de
carcinoma de fígado (PRC/PRF/5), Kamano e colaboradores (1998) encontraram ao mensurar o
índice de citotoxicidade (IC
50
) para o Telocinobufagin 3,5x10
-4
μg /ml, Marinobufagin 5,2x10
-1
μg /ml e Bufalin 2,8x10
-4
μg /ml. Na Figura 18 abaixo, se observa a representação de uma Bufalin
que no trabalho de Kamano e colaboradores (1998) apresentam o efeito de alterações nesta estrutura
e sua influência na atividade citolítica.
Figura 18 – Efeitos de variações parciais de da estrutura e grupos na atividade citotóxica de
bufodienolídeos, cardienolídeos de ocorrência natural e seus análogos relacionados.
68
4.7.2. Atividade hemolítica de amostras obtidas de Leptodactylus pentadactylus
Amostras de natureza protéica
Na Tabela 5, pode-se visualizar os valores obtidos em espectrofotômetro a 541 nm do
sobrenadante das cavidades das placas de microtitulação (poços) utilizada nos ensaios de amostras
obtidas da secreção de L. pentadactylus em cromatografia com coluna Sephacryl S-400
®
(P1 – P11).
Visamos neste ensaio detectar a presença ou não da atividade hemolítica, sua intensidade, bem como
estabelecer um título para estimativas quanto a relação concentração - atividade.
Tabela 5 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 541 nm do sobrenadante dos poços da placa
de microtitulação da avaliação da atividade hemolítica dos das amostras obtidas da
cromatografia em Sephacryl S-400 da secreção da pele de Leptodactylus pentadactylus
contra suspensão a 5% de sangue de ratos albinos Wistar.
Amostra
Poço n
o
P1
P2
P3
P4
P5
P6
P7
P8
P9
P10
P11
1 877 1088 864 988 845 987 1062 905 788 791 931
2 1223 1497 1158 1174 984 1179 1409 1064 885 999 940
3 1256 1403 1039 1062 968 849 1374 998 815 1148 675
4 829 823 713 849 1096 1046 1345 1006 864 1038 362
5 605 454 639 1000 1003 939 1210 946 686 652 204
6 257 138 290 718 835 914 962 913 754 497 146
7 92 170 166 407 329 350 1003 784 852 197 0
8 10 0 27 144 437 251 850 871 713 53 0
9 0 0 0 0 225 68 494 805 637 0 0
10 0 0 0 0 7 0 199 864 294 0 0
11 0 0 0 0 0 0 67 555 158 0 0
12 0 0 0 0 0 0 18 359 52 0 0
13 0 0 0 0 0 0 0 130 20 0 0
14 0 0 0 0 0 0 0 66 0 0 0
15 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0
16 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0
Título
2
7
2
6
2
7
2
7
2
8
2
7
2
11
2
15
2
12
2
7
2
5
Obs: 1. O valor de referência para servir como Zero de calibragem do espectrofotômetro foi o sobrenadante de
hemácia 5% de camundongo + salina (sol. NaCl 0,85%).
2. O poço 1 contém a amostra na concentração – mãe da cromatografia.
69
Neste ensaio pode-se, não só detectar uma atividade hemolítica como também uma atividade
aglutinante das hemácias (destacados com cor na Tabela 5), observa-se que no primeiro poço para
todos os picos (P1 – P11).do ensaio das amostras obtidas da coluna Sephacryl S-400
®
(valores
sombreados na tabela), um menor valor de leitura do sobrenadante que foi devido a uma outra
atividade também observada que foi a de aglutinação das hemácias por parte da amostras testadas.
Para os picos denominados de P8, P9 e P7 (em ordem decrescente de intensidade)
apresentaram maior atividade hemolítica in vitro e mataram mais rapidamente nos ensaios in vivo
realizados com ratos Wistar. O pico 8, o de maior intensidade hemolisante teve seu teor de proteína
determinado pelo método de Bradford e feito os devidos cálculos encontrou-se 2,09
x 10
-4
μg, que
corresponde a quantidade existente no poço que ainda causava hemólise, representando uma
concentração hemolisante mínima (CHM) para esta amostra de 2,09
x 10
-6
μg/μl.
Foram testadas in vitro com o pico 8 da cromatografia em Sephacryl S-400 hemácias de outras
duas espécies, haja vista que foi o mais ativo contra a suspensão a 5% de hemácias de rato com um
título de 2
15
como concentração hemolisante mínima. Para caprinos, encontrou-se um título de 2
8
(CHM = 1,34x10
-4
μg/μl), já em hemácias de humanos, também procurou-se avaliar uma possível
variação quanto aos tipos sangüíneos O e A, tendo como resultado uma maior susceptibilidade à
hemólise o tipo O comparando com o A, com títulos respectivamente de 2
8
(CHM= 1,34x10
-4
μg/μl)
e 2
5
(CHM = 1,07x10
-3
μg/μl).
Avaliou-se também a influência de temperatura mais baixa ( + 4 °C) nos eventos acima
descritos, e foi encontrada uma redução dos títulos de 2
8
para 2
6
(CHM = 5,35x10
-4
μg/μl) nos
caprinos, também sendo observada esta variável nos ensaios com suspensão de sangue humano a 5%
que variou de 2
8
para 2
4
(CHM = 2,14x10
-3
μg/μl) e de 2
5
para 2
1
(CHM = 17,12x10
-2
μg/μl),
respectivamente para os tipos O e A, podendo-se ver pelos resultados encontrados observou-se uma
redução sensível da atividade hemolítica para todas as hemácias testadas, possivelmente pela menor
velocidade de interação do sítio responsável pela atividade hemolítica com a superfície das
diferentes hemácias.
70
Amostras de natureza peptídica obtida em coluna hidrofóbica C18 com CLAE
Foram avaliados os picos P1, P5, P6, P7 e P14, sendo que destes, continuaram os estudo dos
P5, P6 e P7 devido a uma questão de viabilidade metodológica de separação e purificação com
rendimento aceitável.
Tabela 6 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 541 nm do sobrenadante dos poços da placa
de microtitulação da avaliação da atividade hemolítica dos das amostras peptídicas
obtidas da cromatografia em coluna absorção hidrofóbica de fase reversa C18 de
aminoetilagarose eluído em programa isocrático a 5 % com acetonitrila acrescida de
ácido trifluoroacético da secreção da pele de L. pentadactylus.
Amostra
Poço n
o
Extrato
Bruto
P1
P5
P6
P7
P14
1
0 556 547 836 480 121
2
0 505 65 63 475 24
3
0 500 10 0 160 0
4
0 246 6 0 0 0
5
0 0 0 0 0 0
Títulos
___
2
4
2
4
2
2
2
3
2
2
Obs: 1. O valor de referência para servir como zero de calibragem do espectrofotômetro foi o sobrenadante de
hemácia 5% de camundongo + salina (sol. NaCl 0,85%).
2. O poço 1 contém a amostra a 50 % da concentração – mãe da cromatografia.
Os peptídeos 1 e 5 apresentaram o valor mais expressivo de CHM ( 2
4
), contudo com
intensidades diferentes. As amostras P6 e 7 também apresentaram títulos iguais ( 2
3
)e intensidades
diferentes, sendo P6 o que apresenta os maiores valores de leitura de absorbância e de todos portanto
o que causou uma hemólise mais intensa. A amostra P14 foi a que apresentou intensidade e título
menos expressivo, sendo que o extrato do veneno bruto nas condições experimentais não apresentou
atividade hemolítica em relação aos controles.
Nascimento e colaboradores (2002) coletaram e recromatografaram duas frações hemolíticas
de Leptodactylus ocellatus, um animal de espécie diferente do que foi utilizado nos experimentos
aqui documentados, obtendo duas toxinas peptídicas com homologia que permite agrupá-los na
família das brevininas.
É vigente que a atividade hemolítica de eritrócitos humanos de um peptídeo antimicrobiano
é freqüentemente usada para mensurar a citotoxicidade do mesmo e estimar seu índice terapêutico,
pois se baseando na ausência ou presença de atividade hemolítica este peptídeo pode ser classificado
71
antibiótico ou venenoso, respectivamente. Contudo, este é um ponto que cada vez mais se torna
discordante no meio científico.
Helmerhorst e colaboradores (1999) afirmam enfaticamente que certos conceitos têm que ser
revistos, pois em estudos mostraram que as propriedades hemolíticas de peptídeos catiônicos são
fortemente dependentes de sob quais condições o ensaio de avaliação da atividade hemolítica é
realizado, tal como a força iônica do tampão de incubação, o frescor da amostra de sangue e
diferenças individuais dos diferentes antígenos dos grupos sangüíneos.
Reforçando esta idéia mais nova temos vários trabalhos que podem ser citados, tendo a
seguir apresentado alguns exemplos.
Três peptídeos isolados por Simmaco e colaboradores (1993) da secreção da pele de uma rã
européia, Rana esculenta, dois deles semelhantes a brevinina-1 e 2 isolados de uma rã japonesa,
Rana brevipoda porsa, por Morikawa e colaboradores (1992), já o terceiro peptídeo, chamado
esculentina, diferia muito dos outros dois, pois apesar dos três apresentarem atividade
antimicrobiana mesmo que distinta contra bactérias gram negativas e positivas, sendo a esculentina
que apresentou a maior atividade contra Staphylococcus aureus, tem uma mais baixa atividade
hemolítica.
Já Kwon e colaboradores (2000) em um estudo clonaram os genes de expressão e isolaram a
gaegurina 4 de uma rã coreana chamada Rana rugosa, sendo que esta manifestou atividade
antimicrobiana contra bactérias gram negativas e positivas, fungos e protozoários em detrimento de
um muito discreto efeito hemolítico sobre hemácias humanas.
Olson III e colaboradores (2000) observaram que o peptídeo pseudina-2, isolado do extrato
da pele de Pseudis paradoxa é um dos peptídeos antimicrobianos mais potentes já encontrados,
atuando contra Staphylococcus aureus e Candida albicans e com baixa atividade hemolítica. Os
autores citam que este em contraste com estudos relatados anteriormente de avaliação da atividade
hemolisante e expressos como valores de Concentração Hemolisante que lisa 50% das hemácias
(CH
50
) em μM que as temporinas da Rana grylio apresentavam 4 e 16 μM (KIM et al., 2000),
kassinatuerina-1 da Kassina senegalensis 30 μM (MATTUTE
a
et al., 2000), ranatuerina-1 pela Rana
catesbeiana 130 μM (GORAYA et al., 1998) foi encontrado para a pseudina-2 um valor de 300 μM
que é considerável.
Feder e colaboradores (2000) demonstraram que a interrelação entre estrutura-atividade da
dermaseptina S4 mostrando as conseqüências oligomerização na citotoxicidade seletiva utilizando
72
várias bactérias gram negativas, protozoários e hemácias humanas.chegaram a conclusão que
quando manipulavam os domínios hidrofóbicos para reduzir hidrofobicidade ou pelo aumento da
rede de cargas positivas afetavam dramaticamente a atividade do peptídeo e resultava em vários
análogos que dispunham de potente atividade antibacteriana mas reduzida atividade hemolítica,
contudo, segundo Mangoni e colaboradores (2000) estudando as bombininas H (H de hidrofòbicas e
hemolíticas) saumentar a hidrofobicidade e a cargas positivas não resulta em aumento da atividade
pelo menos comprovadamente a antimicrobiana o que ésugestivo ue há um conjunto de fatores
responsáveis tanto para a atividade antimicrobiana como para a hemolítica.
73
4.7.3. Avaliação da Atividade Antimicrobiana
4.7.3.1. Em Meio Sólido
a) Bufo schneideri
A Fração 1 e os picos 1B, 2 e 4 de Bufo schneideri apresentaram atividade antimicrobiana
nos ensaios em meio sólido de Mueller – Hinton de amplo espectro para as bactérias testadas com
disco de papel e também atividade hemolítica, a qual alguns autores associam esta atividade a
antimicrobiana, já o Marinobufagin não apresentou nenhuma das duas atividades, conforme pode
ser observado nos resultados abaixo apresentados na Tabela 7.
Tabela 7 -. Tamanho dos halos de inibição de .amostras obtidas da secreção da pele de Bufo
schneideri frente aos microorganismos testados
Microorganismos
Amostras
EBA
EC
KBP
PA
BCS
STA
Extrato Bruto
___ ___ ___ ___ ___
8,0**
Fração 1 14,5 12
___ ___
15,0 13,0**
Hellebrigenin 9,0 9,0
___ ___
13,0 10,0
Telocinobufagin 15,0 9,0 9,0**
___
15,0 13,5*
Marinobufagin
___ ___ ___ ___ ___ ___
Bufalin
___
8,0**
___ ___ ___
8,0
* Tamanho do halo de inibição expresso em milímetros.
** Inibição parcial
EC = Escherichia coli ATCC 25922 STA = Staphylococcus aureus ATCC 6538P
BCS = Bacillus subtilis ATCC 6631 EBA = Enterobacter aerogenes ATCC 13048
PA = Pseudomonas aeruginosa KBP = Klebsiella pneumoniae ATCC 10031
___
Resultado Negativo
A fração 1 (F1), já utilizada em ensaios anteriores com as outras amostras puras, serviu como
referência para o Hellebrigenin puro, produto de sua recromatografia, encontrando-se também para
este último atividade antimicrobiana, contudo não tão intensa quanto à fração F1.
As alíquotas de F1 e do Telocinobufagin apresentaram atividade semelhante para os
microorganismos testados, sendo que a maior atividade para Bacillus subtilis ATCC 6631,
Staphylococcus aureus ATCC 6538P e Enterobacter aerogenes ATCC 13048, sendo que o
74
Hellebrigenin apesar de ter uma atividade menos intensa é efetivo para as mesmas bactérias que
estes dois primeiros, ressaltando que os dois primeiros microorganismos são gram positivos.
A alíquota testada do Marinobufagin, nas condições experimentais, não inibiu o crescimento
de nenhuma das bactérias testadas, sendo que o Bufalin só demonstrou atividade inibitória do
crescimento da bactéria Staphylococcus aureus ATCC 6538 e uma fraca atividade de inibição
parcial para Escherichia coli ATCC.
A bactéria gram negativa de metabolismo oxidativo Pseudomonas aeruginosa não foi inibida
em seu crescimento por nenhuma das amostras utilizadas nas condições experimentais.
As amostras 1B e 2, os de menor hidrofobicidade apresentaram as maiores atividades
inibitórias contra os microorganismos testados.
Uma possibilidade de não ter sido observada para o extrato bruto uma atividade
antimicrobiana satisfatória e nenhuma hemolítica ou mais fraca, conforme foi observado para as
outras amostras de B. schneideri que foram ensaiadas, pode ter uma possível explicação nos dados
que estão no trabalho de Medina e Espinoza (1995) com Bufo marinus. Neste, ao realizar
experimento com a secreção da pele contra diversas bactérias pelos métodos de macrodiluição com
caldo nutritivo e em meio sólido com discos, só foi encontrada atividade antibacteriana contra
Escherichia coli ATCC 25922 e Staphylococcus aureus ATCC 25923, sendo que apenas para a
secreção obtida de fêmeas, tendo resultados negativos para a oriunda de machos desta espécie de
sapo ao que usamos um homogenato de secreções de ambos os sexos como prática corrente em
nosso laboratório.
É importante ressaltar que a presença de atividade antimicrobiana no gênero Bufo, não havia
sido descrita ainda para seus bufadienolídeos, mas apenas para peptídeos ou extratos da secreção da
pele, como é mostrado no trabalho de Cunha-Filho e colaboradores (2002) com Bufo rubescens,
onde se acharam atividade contra a bactéria Escherichia coli e uma fraca atividade hemolítica.
A atividade antimicrobiana de algumas substâncias de origem lipídica foi descrita por Bibel e
colaboradores (1993), contudo numa classe que não têm relação com os bufadienolídeos, as
esfingosinas que acabam constituíndo barreiras da pele contra bactérias, produzidas no extrato
córneo em humanos, destacando-se a esfinganina, ativa contra cepas resistentes de Staphylooccus
aureus e fungos, tais como Candida albicans que se mostrou susceptível não só a esfinganina, mas
também a esfingosina, dimetilesfingosina, e em menor grau a estearilamina. Em ensaios realizados
75
em meio líquido estes lipídios foram ativos contra Trichophyton mentagrophytes, T. tonsurans e
Epidermatophyton floccosum (BIBEL et al., 1995).
Kabara e colaboradores (1977) descrevem ensaios de triagem iniciais de atividade
antimicrobiana com 40 ácidos graxos, dentre naturais e compostos sintéticos, encontrando atividade
contra leveduras, bactérias gram positivas, contudo não para as negativas. Destacando-se os ácidos
graxos epimino e selena, com cadeias lineares não substituídas. A presença e posição de uma dupla
ou tripla ligação, normalmente um importante fator em cadeias longas de ácido graxo (maiores que
14 carbonos) teve pequeno ou nenhum efeito em ácidos graxos de 11 carbonos. A atividade
antimicrobiana ótima foi encontrada para ácidos graxos e seus correspondentes monoglicerídeos
quando o comprimento de cadeia era de 12 carbonos.
A squalamina (Figura 18A), um novo aminosterol isolado dos tecidos de um tubarão Squalas
acanthias e com estrutura química demonstrada como 3β-N-1- [N(3-[4-aminobutil])-1,3
diaminopropano]-7α-hydroxi- 5α-colestan-24R-il sulfato por espectroscopia de massa e NMR
bidimensional, exibindo uma potente ação bactericida contra bactérias gram positivas e negativas
(MOORE et al., 1993; RAO et al., 2000), diferenciando-se estruturalmente dos bufadienolídeos pela
ausência de duplas, mas com o esqueleto carbônico semelhante é o mais. Dentre os análogos
sintéticos deste, MSI- 1436, 3β-espermina-7α-hydroxi-5α-colestan-24R-il sulfato (Figura 18B).
A
B
Figura 19 –
(A) Estrutura da squalamina, um aminosterol, 3β-N-1- [N(3-[4-aminobutil])-1,3
diaminopropano]-7α-hydroxi- 5α-colestan-24R-il sulfato e em (B) o sintético MSI-
1436 com R1 = espermina, R2 = R-OH e R3 = OH.
76
Estes análogos, com estrutura idêntica a squalamina exceto por uma poliamina simétrica em
C3 (espermidina), além de outras substituições em C7 e C24, aumentando em muito a sua eficácia
antimicrobiana. Com a metodologia de síntese e ensaios de avaliação antimicrobianos de análogos
MSI-1436 com Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Candida
albicans, pôde-se conhecer um pouco da inter-relação entre os grupos funcionais e a atividade,
sendo descrito Alterações em C24 forneceram três variáveis: um sulfato que proporcionada carga
negativa à molécula em pH neutro; um grupo amino, carga positiva; e um grupo hidroxi sem carga,
apesar de alterar a estereoisomeria. Análogos com 7-hydroxyl. (α ou β) e sem este grupamento
foram também testados influenciaram também na atividade , estas mudanças por si só refletiram em
alterações não tão drásticas para alguns dos microorganismos testados como modificações em C3,
contudo a somatória destas altera bastante a atividade antimicrobiana (JONES et al., 1996; SHU et
al., 2002).
77
Podem ser visualizadas juntas na Figura 20 a seguir, as estruturas dos quatro bufadienolídeos
isolados e utilizados nos experimentos de B. schneideri neste trabalho de doutoramento para que se
possam tecer alguns comentários.
O
O
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
HO
OH
CH
3
OH
O
Helebrigenin
O
O
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
HO
OH
CH
3
CH
3
OH
Telocinobufagin
O
O
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
HO
OH
O
CH
3
CH
3
Marinobufagin
O
O
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
HO
CH
3
CH
3
OH
Bufalin
Figura 20 – Estrutura dos quatro bufadienolídeos isolados de B. schneideri.
Analisando-as, observa-se que todos os bufadienolídeos que apresentaram atividade, tanto
hemolítica como antimicrobiana apresentavam no carbono14 um grupamento hidroxila, o que não
acontece com o Marinobufagin que possui um grupamento epoxi e que nas condições experimentais
não apresentou nenhuma das duas atividades testadas. A maior ou menor hidrofobicidade dos
compostos pode ter um papel secundário, pois apesar dos dois mais ativos serem os menos
hidrofóbicos, Hellebrigenin e Telocinobufagin, temos que o Marinobufagin que tem uma
hidrofobicidade menor que o Bufalin, não apresenta nenhuma atividade dentre as testadas, ao
contrário do Bufalin que apresentou fracas atividades antimicrobiana e hemolítica.
78
b) Leptodactylus pentadactylus
Os resultados com os picos oriundos da Sephacryl S-400
®
(P1 – P11) foram pouco
expressivos, possivelmente devido a seu elevado peso molecular que prejudica a difusão radial do
disco de ensaio para as extremidades, tendo então a necessidade de realizar ensaios em meio líquido,
no qual não teremos influência do peso elevado. Já alguns peptídeos forneceram os resultados a
seguir.
Kennedy e Cooper (1998) observando fascinados a espuma que envolve os ovos de
Leptodactylus pentadactylus em Trinidad especularam que devido as condições pouco higiênicas das
águas esta espuma deve possuir substâncias antimicrobianas, porém estudos encontraram proteínas
incomuns envolvidas na formação desta espuma, sendo que nenhuma substância antimicrobiana de
largo espectro havia sido encontrada.
4.7.3.2. Em Meio Líquido
Os controles utilizados nos experimentos em meio líquido denominados de C1, composto de
cultura de microorganismos utilizada como inóculo sem amostra e C2, 50 μl de cultura de
microorganismos + 50 μl de meio de cultura BHI.
a) Amostras de Bufo scneider
a.1. Extratos de Pele de B. schneideri
Abaixo pode ser visto o resultado do diferentes extratos de pele denominados de DA (extrato
da região dorsal em água), DE (extrato da região dorsal em etanol), VA (extrato da região ventral
em água), VE (extrato da região ventral em etanol). GA (extrato da região glandular em água), GE
(extrato da região glandular em etanol), e GE contra quatro microorganismos: Enterobacter
aerogenes, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella choleraesuis choleraesuis var
typhi, Bacillus subtilis e Staphylococus aureus após 24 horas de incubação.
Inicialmente se fez a pergunta de qual seria em termos de proteção contra microorganismo a
área que necessitaria disto. Pelo maior contato com o solo e a forma de locomoção, a parte ventral
seria bem sugestiva, contudo não se deve esquecer que quando se pensa em predadores, tanto pela
exposição ou mesmo deglutição deste anfíbio, o dorso e a lateral são muito importantes também.
79
Figura 21 -
Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras de extratos de
diferentes regiões de pele de Bufo schneideri contra Enterobacter aerogenes em meio
líquido.
0
500
1000
1500
2000
2500
1234567891011
Diluição
Absorbância (492 nm)
GA
GE
VA
VE
DA
DE
C
Como pode ser visto acima que para este microorganismo temos que as amostras do extrato
feito com material oriundo da região dorsal do animal são menos eficientes, DA tem efeito apenas
na concentração-mãe representando 6,25 mg do material e para DE com 3, 13 mg. Para as amostras
da região ventral foram observados resultados melhores, contudo com uma redução menos intensa.
As amostras DA e DE apresentaram uma concentração mínima para o efeito de inibição do
crescimento desta bactéria de 0,78 e 0,2 mg respectivamente e uma redução mais intensa do
crescimento
conforme pode ser visto na Figura 19.
A Enterobacter aerogenes é uma bactéria gram negativa que habita o trato digestório de
animais e pode a ser importante como contaminante oportunista, encontrado em águas contaminadas
ou que recebam dejetos de animais, podendo contaminar alimentos.
80
Figura 22 -
Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras de extratos de
diferentes regiões de pele de Bufo schneideri contra Escherichia coli em meio líquido.
0
500
1000
1500
2000
2500
1234567891011
Diluição
Absorbância (492 nm)
GA
GE
VA
VE
DA
DE
C
É sugestivo que este microorganismo é sensível aos extratos, contudo de uma maneira geral,
em concentrações altas é muito pouco responsíveis ao extrato VE nas condições experimentais. A
concentração mínima para que se verifique inibição foi de 6,25 mg para GA, VA, DA, DE, sendo a
exceção GE que teve seu efeito com 1,57 mg.
A Escherichia coli é um importante indicador de contaminação por fezes, haja vista que faz
parte da microbiota de inúmeros animais, podendo caracterizar quadros de diarréia em animais,
podendo ser mortal em indivíduos jovens.
81
Figura 23 -
Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras de extratos de
diferentes regiões de pele de Bufo schneideri contra Klebsiella pneumoniae em meio
líquido.
0
500
1000
1500
2000
2500
1234567891011
Diluição
Absorbância (492 nm)
GA
GE
VA
VE
DA
DE
C
A exceção de VA que apresentou valores de absorbância semelhantes ao do controle mesmo
na concentração mais alta e portanto, negativo, detectou-se para GA, DA e DE ação inibitória do
crescimento de K. pneumoniae apenas na concentração mínima de 6,25 mg, sendo para VE 1,56 mg
e GE de pelo menos 0,59 mg.
Esta bactéria, gram negativa e uma Enterobacteriaceae, têm importância em casos de
infecção hospitalar para humanos e animais, sendo pouco importante para anfíbios.
82
Figura 24 -
Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras de extratos de
diferentes regiões de pele de Bufo schneideri contra Salmonella choleraesuis
choleraesuis var typhi em meio líquido.
0
500
1000
1500
2000
2500
1234567891011
Diluição
Absorbância (492 nm)
GA
GE
VA
VE
DA
DE
C
Semelhante ao observado e descrito para a bactéria anterior, ocorreu para VA com
Salmonella choleraesuis choleraesuis var typhi, não sendo observado mais uma vez a sua ação
inibitória nas condições experimentais. Já com VE, GA, DA e DE a ação inibitória do crescimento
ocorreu apenas no valor de concentração maior (6,25 mg) e para GE verificou-se um valor de
aproximadamente 0.39 mg.
É de importância este indicativo de atividade, haja vista que as salmonelas, bactérias gram
negativas da família das Enterobacteriaceae, são um caso de Saúde Pública podendo contaminar
alimentos e afligirem a humanos e animais (SPIKA et al., 1987). Além disto, aliado a uma série de
outras bactérias, a exemplo do Proteus sp., serem componentes da microbiota de répteis.
83
Figura 25 -
Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras de extratos de
diferentes regiões de pele de Bufo schneideri contra Bacillus subtilis em meio líquido.
0
500
1000
1500
2000
2500
1234567891011
Diluição
Absorbância (492 nm)
GA
GE
VA
VE
DA
DE
C
Esta bactéria, bem como a seguinte, Staphylococus aureus, são gram positivas e chamam a
atenção pelo comportamento quando ensaiadas com o extrato VE que foi bem mais ativo contra elas
do que para as quatro primeiras bactérias já apresentadas anteriormente que sãoclassificadas como
sendo gram negativas. Pode-se observar uma maior resistência ao crescimento mesmo com a
diluição seriada, sendo mais perceptível para GE mesmo apesar de apresentar um valor de
concentração inibitória mínima de 0, 78 mg, para GA e VE 1,56 mg, VE 2,34 mg, DA 6,25 mg e DE
considerado negativo.
84
Figura 26 -
Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras de extratos de
diferentes regiões de pele de Bufo schneideri contra Staphylococus aureus em meio
líquido.
0
500
1000
1500
2000
2500
1234567891011
Diluição
Absorbância (492 nm
)
GA
GE
VA
VE
DA
DE
C
Neste se destaca a atividade antimicrobiana de GE que teve um valor de concentração
inibitória menor do que 0,0061 mg ou ainda expressando em outra unidade 6,1 μg, podendo
observar de uma maneira geral maior atividade para todas as amostras testadas com este
microorganismo quando comparado com os valores de inibição e o comportamento encontrado para
os outros testados. As concentrações inibitórias mínimas contra o S. aureus foram de GA 1,56 mg,
VA 1,04 mg, VE 0,098 mg, DA e DE 0,78 mg.
Nestes experimentos, pôde-se observar que GE se destaca das outras amostras em termos de
atividade antimicrobiana com as bactérias testadas.
a.2 Amostras dos picos purificados obtidos de B. schneideri
Os ensaios procederam utilizando os tempos de 12 e 24 horas como limites para uma
avaliação extrema com Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Bacillus subtilis e
.Staphylococcus aureus, as bactérias de maior expressividade nos testes em meio sólido.
A seguir podem ser vistos os resultados de cada amostra com seus respectivos desvios-padrão com
12 e 24 horas entre parênteses para melhor entendimento dos gráficos de barra a exceção do extrato
85
bruto (EB) da secreção da pele de B. schneideri que apesar do ter sido testado com todas as bactérias
e não terem sido observados nas condições experimentais atividade antmicrobiana, para melhor
visualização do restante dos dados não aparecerá nas figuras abaixo.
Figura 27 -
Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras obtidas da
secreção da pele de Bufo schneideri contra Enterobacter aerogenes em meio líquido.
F1 = Fração parcialmente purificada 1; Hb = Hellebrigenin; Tc = Telocinobufagin; Mb = Marinobufagin;
Bf = Bufalin; L1 (12) = Leitura 1 com 12 horas; L2 (24) = Leitura 2 com 24 horas
A amostra Telocinobufagin (657 ± 4,242641 e 938 ± 6,363961) foi a que inibiu mais
intensamente este microorganismo, seguida pela Fração parcialmente purificada F1 (692 ± 4,949747
e 969 ± 4,949747)e a Hellebrigenin (838 ± 2,828427 e 1012 ± 4,242641), sendo mais intenso o
efeito com 12 horas do que na leitura posterior decorrida mais 12 horas de crescimento, onde as
diferenças foram menores.
Em meio líquido as amostras do Marinobufagin (1035 ± 2,828427 e 1102 ± 2,828427) e o
Bufalin (1019 ± 5,656854 e 1059 ± 3,535534) não apresentaram atividade antimicrobiana quando
comparadas com os controles C1 (1050 ± 3,535534 e 1110 ± 2,828427) e C2 (1012 ± 1,414214 e
1046 ± 2,12132), sendo que notou-se uma maior dificuldade de solubilização conforme aumentava a
hidrofobicidade, de Hellebrigenin para Bufalin.
86
Figura 28 -
Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras obtidas da
secreção da pele de Bufo schneideri contra Escherichia coli em meio líquido.
F1 = Fração parcialmente purificada 1; Hb = Hellebrigenin; Tc = Telocinobufagin; Mb = Marinobufagin;
Bf = Bufalin; L1 (12) = Leitura 1 com 12 horas; L2 (24) = Leitura 2 com 24 horas
Observou-se uma maior atividade contra Escherichia coli para F1 (700 ± 5,656854 e 968 ±
3,535534), sendo que Hellebrigenin (838 ± 4,242641 e 1012 ± 4,242641), oriundo desta amostra
anterior teve uma atividade um pouco menor que esta, mas maior que Telocinobufagin (859 ±
2,828427 e 1019 ± 2,828427). Uma discreta atividade foi encontrada para Bufalin (924 ± 4,242641 e
1026 ± 4,242641), mas nenhuma para Marinobufagin (1020 ± 5,656854 e 1054 ± 7,071068)
comparativamente aos controles C1 (1022 ± 3,535534 e 1168 ± 5,656854) e C2 (968 ± 4,949747 e
1099 ± 4,949747). Com esta bactéria as diferenças entre 12 e 24 horas foram bem menores do que
para outras ensaiadas.
87
Figura 29 -
Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras obtidas da
secreção da pele de Bufo schneideri contra Bacillus subtilis em meio líquido.
EB = Extrato bruto; F1 = Fração parcialmente purificada 1; Hb = Hellebrigenin; Tc = Telocinobufagin;
Mb = Marinobufagin; Bf = Bufalin; L1 (12) = Leitura 1 com 12 horas; L2 (24) = Leitura 2 com 24 horas
Pode-se ver que as amostras F1 (662 ± 4,949747 e 965 ± 4,242641), Hellebrigenin (738 ±
6,363961 e 1004 ± 2,12132) e Telocinobufagin (657 ± 5,656854 e 944 ± 4,242641) apresentaram
atividade antimicrobiana contra este microorganismo gram positivo, tanto com 12 como 24 horas,
sendo que Marinobufagin (1075 ± 3,535534 e 1187 ± 2,828427) e Bufalin (1079 ± 2,828427 e 1189
± 3,535534) não diferiram dos controles C1 (1175 ± 3,535534 e 1290 ± 3,535534) e C2 (1054 ±
4,242641 e 1182 ± 2,12132), podendo assim ser o Marinobufagin e Bufalin considerados sem
atividade antimicrobiana nas condições experimentais contra Bacillus subtilis.
Algumas cepas de B. subtilis e B. licheniformis foram isoladas de carneiro e frango
incriminados em episódios de intoxicação alimentar, sendo a primeira mais conhecida por seus
efeitos benéficos como produção de antibióticos e no controle biológico (FDA/CFSAN, 2003).
88
Figura 30 -
Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras obtidas da
secreção da pele de Bufo schneideri contra Staphylococcus aureus em meio líquido.
EB = Extrato bruto; F1 = Fração parcialmente purificada 1; Hb = Hellebrigenin; Tc = Telocinobufagin;
Mb = Marinobufagin; Bf = Bufalin; L1 (12) = Leitura 1 com 12 horas; L2 (24) = Leitura 2 com 24 horas
Pode-se ver que as amostras F1 (454 ± 3,535534 e 859 ± 6,363961), Hellebrigenin (461 ±
2,828427 e 896 ± 2,828427) e Telocinobufagin (354 ± 1,414214 e 726 ± 2,12132) apresentaram
atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus tanto com 12 como 24 horas, sendo que as
duas primeiras amostras não se mostraram tão efetivas. O Marinobufagin (573 ± 4,242641 e 954 ±
2,12132) e Bufalin (502 ± 3,535534 e 910 ± 2,12132) tiveram um comportamento semelhante aos
controles C1 (590 ± 4,242641 e 986 ± 4,949747) e C2 (559 ± 3,535534 e 943 ± 7,071068).
De uma maneira geral, tivemos atividade antimicrobiana de todas as amostras testadas contra
os diferentes microorganismos, destacando-se Telocinobufagin, F1, Hellebrigenin, já a amostra
Bufalin apresentou uma fraca atividade antimicrobiana contra algumas bactérias, sendo que contra
nenhuma tivemos ação do Marinobufagin.
Ao que parece em F1 temos um componente que tem atividade antimicrobiana ou ainda, o que
é mais provável, age de maneira sinérgica com o Hellebrigenin.
89
b) Amostras de Leptodactytlus pentadactylus
b.1. Peptídeos 5, 6 e 7 de Leptodactytlus pentadactylus obtidos pela CLAE em C18
b.1.1. Avaliação da atividade tempo-dependente
Iniciamente, foram realizados ensaios-piloto com um Escherichia coli, Enterobacter
aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Salmonella choleraesuis choleraesuis var typhi, Pseudomonas
aeruginosa, Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus para efetuar uma triagem, resultando na
repetição dos experimentos com alguma destas bactérias apenas.
Realizaram-se ensaios com os picos peptídicos 5, 6 e 7 obtidos de Leptodactytlus
pentadactylus contra três diferentes microorganismos em função da variável tempo com seis leituras
(2, 4, 6, 8, 12 e 24 h) em triplicata para avaliar a influência do tempo nestes dados, sendo que se
mostrou sem ação com 24 horas nas condições experimentais. Os resultados encontrados são
descritos e ilustrados abaixo, tendo sido submetidos as análises pelo modelos de Gompertz e da
Equação de regressão não linear, assim como testes estatísticos:
90
0
500
1000
1500
2000
L1(2h) L2(4h) L3(6h) L4(8h) L5(12h) L6(24h)
Tempo (h)
Absorbância (492 nm)
5
6
7
C1
C2
Figura 31 -
Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas
5, 6 e 7 obtidas de Leptodactylus pentadactylus contra Bacillus subtilis.
Todos os picos testados inibem o crescimento do Bacillus subtilis até 6 horas, sendo que em
8 horas há uma aceleração do crescimento da bactéria quando incubada com a amostra 5, o que pode
ser sugestivo do microorganismo estar utilizando-o como fonte de nutriente, sendo que os picos 6 e
7 ainda apresentam uma atividade inibitória do crescimento oque é sugestivo de uma maior
atividade em relação as outras amostras testadas nestas condições.
Com 12 horas apenas a amostra 6 apresenta alguma atividade antimicrobiana ainda. Na
leitura 6, decorrido 24 horas, aparentemente as amostra deixaram de ser utilizadas como alimento e
tem algum efeito deletério mais possivelmente devido a subprodutos metabólicos.
91
Bacillus subtillis
0 5 10 15 20 25 30
0
500
1000
1500
2000
Amostra 5
Amostra 6
Amostra 7
C1
C2
Tempo (h)
Abs (492 nm)
Figura 32 -
Análise dos dados da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas
obtidas de Leptodactylus pentadactylus pelo modelo de Gompertz contra Bacillus
subtilis.
As amostras 6, 7 e o controle C1 desviam-se deste modelo, sendo apenas a amostra 5 e o
controle C2 têm um desvio não significante, portanto não podendo-se fazer uma análise satisfatória
por este modelo.
O modelo teórico de Gompertz acima tem importância, pois através dele podemos analisar
dois parâmetros importantes que são o tempo para início do crescimento bacteriano (lag) e taxa de
crescimento máximo (Tax) que complementa as informações relacionadas com a cinética de
crescimento.
92
Bacillus subtillis
0 5 10 15 20 25 30
0
500
1000
1500
2000
2500
Amostra 5
Amostra 6
Amostra 7
C1
C2
Tempo (h)
Abs (492 nm)
Figura 33 -
Análise dos dados da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas
obtidas de Leptodactylus pentadactylus pelo modelo de Equação de Regressão Não
Linear contra
Bacillus subtilis.
Analisando os dados por este modelo teórico com um P<0,0001 de aceitabilidade deste
procedimento. Nota-se que houve uma redução do valor inicial de crescimento deste
microorganismo quando incubado com cada uma das três amostras peptídicas 5 (337,6 ± 10,89), 6
(161,1 ± 9,107) e 7 (275,2 ± 9,886) em relação aos controles C1 (518,8 ± 2,392) e C2 (482,8 ±
9,866), mostrando que seu efeito possivelmente foi só na fase inicial da bactéria, podendo ser uma
ação direta sobre a cultura bacteriana reduzindo seu número ou na sua fase inicial de multiplicação.
Porém temos uma cinética de crescimento diferente que pode ser visto acima, o que se traduz na
inclinação, na qual 5, 6 e 7 foram maiores do que os controles C1 e C2 , podendo ser uma
compensação metabólica, ou seja, acelerou a cinética para compensar o atraso inicial.
93
O início do crescimento (START) e a inclinação (K) que são parâmetros que permitem
analisar a cinética mais detalhadamente e complementa as informações obtidas pelo modelo de
Gompertz foram submetidos ao Teste de Comparação Múltipla de Tukey, resultando nas
considerações a seguir:
Coeficiente linear - start
Bacillus subtilis
A5 A6 A7 C1 C2
0
100
200
300
400
500
600
A5
A6
A7
C1
C2
Amostras
Coeficiente linear - start
Abs (492 nm)
Figura 34 -
Representação gráfica do resultado do Teste de Comparação Múltipla de Tukey da
influência das amostras peptídicas de Leptodactylus pentadactylus
no início do
crescimento (START) do Bacillus subtilis.
As amostras peptídicas se mostraram diferentes entre si com relação ao início do crescimento
microbiano e destas para os controles C1 e C2, com um P<0,001 para a amostra 6 e de P<0,015 de
significância para 5 e 7. Os controles se mostraram sem diferença significativa, com um P>0,05
quanto ao valor de START.
94
Coeficiente angular - K -
Bacillus subtilis
A5 A6 A7 C1 C2
0.000
0.025
0.050
0.075
0.100
0.125
A5
A6
A7
C1
C2
Amostras
Coeficiente angular - K
Figura 35 -
Representação gráfica do resultado do Teste de Comparação Múltipla de Tukey da
influência das amostras peptídicas de Leptodactylus pentadactylus na inclinação (K)
para análise da cinética de crescimento de Bacillus subtilis.
Quando se estuda a inclinação, temos que em termos cinéticos as amostras peptídicas 5 e 7
são sem diferença significativa (P>0,05) entre si, mas ambas diferentes de 6 (P<0,001) que
apresentou uma possível compensação metabólica bem mais intensa por parte da bactéria para
remediar a interferência inicial desta substância, sendo ainda importante salientar que as três
amostras peptídicas diferem dos dois controles. Para os valores de K temos que C1 e C2 se
mostraram diferentes com um P<0,05, o que já era esperado, pois são dois controles diferentes.
95
0
500
1000
1500
2000
2500
L1(2h) L2(4h) L3(6h) L4(8h) L5(12h) L6(24h)
Tempo (h)
Absorbância (492 nm)
5
6
7
C1
C2
Figura - 36
Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas
5, 6 e 7 obtidas de Leptodactylus pentadactylus contra Klebsiella pneumoniae.
Até as 8 horas, terceira leitura, as três amostras testadas inibem o crescimento da Klebsiella
pneumoniae, sendo que com 12 horas a atividade antimicrobiana das amostras 5 (1326 ± 2,645751)
e 6 (1371 ± 7) é muito pequena em relação ao controle C1 (1414 ± 3,605551), sendo 7 (1210 ±
6,244998) das três a que ainda apresenta uma atividade um pouco maior.
Com 24 horas chama a atenção o aumento do crescimento da bactéria quando em presença
da amostra 6 que possivelmente está sendo fonte de nutrientes.
96
Klebsiella pneumoniae
0 5 10 15 20 25 30
0
500
1000
1500
2000
2500
Amostra 5
Amostra 6
Amostra 7
C1
C2
Tempo (h)
Abs (492 nm)
Figura - 37
Análise dos dados da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas
obtidas de Leptodactylus pentadactylus pelo modelo de Gompertz contra Klebsiella
pneumoniae.
Todas as amostras e controles apresentaram um desvio do controle não significativo deste
modelo teórico e portanto, podendo-se utilizar Gompertz para estudar os dados obtidos.
Quando cultivado em presença das amostras 5 (3.468 ± 2,366), 6 (4.738 ± 0,3445) e 7 (5.174
± 0,8143), pôde-se observar que tivemos um aumento da fase lag em relação aos dois controles, C1
(2.590 ± 3,460) e C2 (2.832 ± 2,913). Isto significa dizer que retardaram o início da fase de
crescimento.
Com relação a cinética da fase exponencial, nenhuma das três amostras teve efeito
satisfatório de redução, sendo que a 7 ainda depois do tempo 12 h faz um incremento (135,2 ±
17,84) em relação aos controles C1 (113,0 ±35,22) e C2 124,6 ± 2,832).
97
Klebsiella pneumoniae
0 5 10 15 20 25 30
0
1000
2000
3000
4000
Amostra 5
Amostra 6
Amostra 7
C1
C2
Tempo (h)
Abs (492 nm)
Figura 38 -
Análise dos dados da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas
obtidas de Leptodactylus pentadactylus pelo modelo de Gompertz contra Klebsiella
pneumoniae.
Este modelo teórico se aplica para todas as amostras e controles com um P<0,0001. Pôde se
observar que os valores de início são menores para as amostras 5 (367,7 ± 11,37), 6 (310,2 ± 11,72)
e 7 (313,1 ± 7,958) em relação aos controles C1 (498,2 ± 12,30) e C2 (419,9 ± 13,33). As amostras
6 (0,08969 ± 0,002508) e 7 (0,09574 ± 0,00174) apresentaram uma maior cinética que os dois
controles C1 (0,06956 ± 0,001660) e C2 (0,07098 ± 0,001723), sendo observado para a amostra 6
aproximadamente 12 horas e com a 7, com 17 horas. Este retardo no crescimento inicial causado
pelas amostras 6 e 7 parece ter sido remediada por uma compensação metabólica por parte da
bactéria, ou seja, acelerou a cinética para compensar o atraso. Contudo, a amostra 5 (0,07887 ±
0,002065) manteve uma cinética de sua taxa metabólica com comportamento semelhante ao de C1
(0,06955 ± 0,001660) e C2 (0,07098 ± 0,001723), apesar de serem diferentes, houve interferência da
amostra (retardo) no crescimento bacteriano e também impediu a compensação metabólica por parte
98
da bactéria. Isto é sugestivo que a amostra 6 teve um melhor desempenho para esta bactéria em
relação as outras amostras.
Coeficiente linear - start
Klebsiella pneumoniae
A5 A6 A7 C1 C2
0
100
200
300
400
500
600
A5
A6
A7
C1
C2
Amostras
Coeficiente linear - start
Abs (492 nm)
Figura 39-
Representação gráfica do resultado do Teste de Comparação Múltipla de Tukey da
influência das amostras peptídicas de Leptodactylus pentadactylus no início do
crescimento (START) de Klebsiella pneumoniae.
Após a análise por Tukey pode ser visto que o efeito inicial das amostras 6 e 7 sobre a
Klebsiella pneumoniae é considerado sem diferença significativa, contudo ambos são diferentes dos
dois controles. A amostra 5 tem um comportamento diferente das duas amostras peptídicas, P<0,05
para cada uma das duas, mas ainda assim tem efeito sobre este microorganismo, sendo também
diferente dos controles C1 (P<0,001) e C2 (P<0,05). Os controles se mostraram diferentes entre si
(P<0,001).
99
Coeficiente angular - K -
Klebsiella pneumoniae
A5 A6 A7 C1 C2
0.000
0.025
0.050
0.075
0.100
A5
A6
A7
C1
C2
Amostras
Coeficiente angular - K
Figura 40 -
Representação gráfica do resultado do Teste de Comparação Múltipla de Tukey da
influência das amostras peptídicas de Leptodactylus pentadactylus na inclinação
(K) para análise da cinética de crescimento de Klebsiella pneumoniae
O coeficiente angular das amostras 6 e 7 sobre a Klebsiella pneumoniae são considerados
sem diferença significativa com um P<0,05 devido a sua proximidade de extremos considerando o
desvio-padrão, contudo ambas amostras são diferentes dos dois controles C1 e C2 com um P<0,001.
A amostra 5 é diferente de 6 e 7, P<0,05 e P<0,001 respectivamente.
Os controles não apresentaram diferença significativa entre si (P>0,05).
100
0
500
1000
1500
2000
L1(2h) L2(4h) L3(6h) L4(8h) L5(12h) L6(24h)
Tempo (h)
Absorbância (492 nm)
5
6
7
C1
C2
Figura 41-
Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas
5, 6 e 7 obtidas de Leptodactylus pentadactylus contra Staphyloccoccus aureus.
Os três peptídeos se mostraram ativos até 12 horas contra Staphyloccoccus aureus que é
uma bactéria gram negativa, tendo apresentado os seguintes valores: 5 (1710,667 ± 1,527525),
6 (1554,667 ± 1,527525) e 7 (1688 ± 1,73205), C1 (1981,667± 1,527525) e C2 (2025,687 ± 0,5773).
Pode-se observar que nas quatro primeiras horas o pico 7 se destaca dos outros dois pela sua
atividade chegando a ter um crescimento menor que o controle de valor mais próximo em valor 2,16
vezes na leitura 1 (2 h) e 1,95 na leitura posterior (4 h).
101
Staphylococcus aureus
0 5 10 15 20 25 30
0
1000
2000
3000
4000
Amostra 5
Amostra 6
Amostra 7
C1
C2
Tempo (h)
Abs (492 nm)
Figura 42-
Análise dos dados da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas
obtidas de Leptodactylus pentadactylus pelo modelo de Gompertz contra
Staphylococcus aureus.
Os dados apresentaram um desvio não significativo do modelo teórico de Gompertz.
As amostras 5 e 7 influenciaram na fase lag aumentando sua duração, 4.012 ± 0,1090 e
4.079 ± 0,2694 respectivamente, frente aos controles C1 (2.979 ± 2,647) e C2 (3.316 ± 1,931), o
que não ocorreu para a amostra 6 (2.972 ± 2,162) que apresentou um comportamento semelhante ao
dos controles. Calculando uma razão (R) utilizando a fórmula: R = lag
Ax
/lag
C1
, onde A
x
é o valor
encontrado para a fase lag da amostra x e A
C1
o da fase lag do controle C1, para uma melhor
comparação dos dados do tempo para inicio do crescimento bacteriano (fase lag) podemos dizer que
102
as amostras 5 e 7 fazem com que o S. aureus aumente em 1,209 e 1,4753 vezes o tempo para o
ínicio do crescimento desta bactéria.
Com relação a e taxa de crescimento máximo (Tax), a amostra 5 (259,9 ± 12,19) e 7
(317,8±17,25) chegaram mais rápido o seu máximo que é um valor marcadamente inferior ao dos
controles C1 (215,4±21,00) e C2 (124,6±13,89), o que não foi observado para a amostra 6
(167,1±19,47). Utilizando uma fórmula semelhante a empregada anteriormente e também
estabelecendo referência com C1 que é a cultura sem qualquer substância incubada que possa alterar
o crescimento normal da bactéria temos que a razão R = Taxa
Ax
/Taxa
C1
; onde Ax é o valor da taxa
de crescimento da amostra e Taxa
C1
a do controle 1 (C1). Temos que amostras 5 e 7 chegam a este
valor 1,2066 e 1,4753 vezes mais rápido.
Apesar da aceleração de cinética parecer algo ruim ao ser percebido, temos um esgotamento
deste microorganismo, o que poderia ser deletério para a sobrevivência deste.
103
Staphylococcus aureus
0 5 10 15 20 25 30
0
1000
2000
3000
4000
5000
Amostra 5
Amostra 6
Amostra 7
C1
C2
Tempo (h)
Abs (492 nm)
Figura 43 -
Análise dos dados da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas
obtidas de Leptodactylus pentadactylus pelo modelo de Equação de Regressão Não
Linear contra Staphylococcus aureus.
Este modelo teórico, com um P<0,0001, pode ser aplicado para todas as amostras e
controles.
Pôde se observar que os valores de início são menores para as amostras 5 (422,2 ± 15,78), 6
(470,2 ± 12,61) e 7 (310,7 ± 14,45) em relação aos controles C1 (696,8 ± 14,47) e C2 (618,5 ±
14,96) o que pode ser sugestivo de uma ação direta sobre os microorganismos quando da mistura
suspensão de bactérias e amostras, reduzindo o número de bactérias.
Em termos cinéticos traduzidos pela inclinação as amostras 5 (0,07486 ± 0,008425), 6 (0,08
± 0,001778) e 7 (0,08974 ± 0,002960) não parecem ter diferenças pelos índices em termos de
104
comportamento do controle C2 (0,08249 ± 0,001614), sendo aparentemente até maiores que C1
(0,07469 ± 0,001393).
Coeficiente linear - start
Staphylococcus aureus
A5 A6 A7 C1 C2
0
100
200
300
400
500
600
700
800
A5
A6
A7
C1
C2
Amostras
Coeficiente linear - start
Abs (492 nm)
Figura 44 -
Representação gráfica do resultado do Teste de Comparação Múltipla de Tukey da
influência das amostras peptídicas de Leptodactylus pentadactylus
no início do
crescimento (START) de Staphyloccoccus aureus.
As amostras 5 e 6 não tiveram diferença quanto ao seu comportamento sobre a bactéria com
um P>0,05 com relação a redução da quantidade inicial de Staphyloccoccus aureus.
A amostra 7, apesar de causar uma redução também tem um P diferencial significativo de
0,01 para a amostra 5 e de 0,001 quando comparada por Tukey com a amostra 6.
105
Coeficiente angular - K -
Staphylococcus aureus
A5 A6 A7 C1 C2
0.000
0.025
0.050
0.075
0.100
A5
A6
A7
C1
C2
Amostras
Coeficiente angular - K
Figura 45 -
Representação gráfica do resultado do Teste de Comparação Múltipla de Tukey da
influência das amostras peptídicas de Leptodactylus pentadactylus na inclinação (K)
para análise da cinética de crescimento de Staphyloccoccus aureus.
Pôde-se constatar que amostra 6 tem um comportamento semelhante aos dois controles na
sua inclinação K com um P>0,05. As amostras 5 e 7 diferiram na sua inclinação (P<0,01), tendo esta
última uma inclinação maior o que significa dizer que apresentou uma taxa metabólica maior do que
a amostra 5. Não foi encontrada diferença do comportamento da inclinação quando comparados 5
com 6 ou então a amostra 6 com a 7 apresentando um P>0,05.
Ao que parece temos para Staphyloccoccus aureus uma evidente alteração do crescimento
desta bactéria pelas três amostras e analisando as informações encontradas pode ser sugestivo de um
novo mecanismo pela forma de interferência.
Em Leptodactylus labyrinthicus, espécie coletada em Brasília, Zanotta e colaboradores
(2002) purificaram e caracterizaram um novo peptídeo incluído numa nova família proposta, a
Labyrinthin, devido a suas diferenciadas características com um número elevado de resíduos
106
hidrofóbico, ausência de cisteínas e região C – terminal amidada ainda não testado para verificar a
sua atividade antimicrobiana, mas com grande semelhança a outros dois peptídeos isolados por este
mesmo grupo, as labyrinthins 1 e 2 que apresentaram ação antimicrobiana e portanto sugestivo.
b.1.2. Avaliação da influência do pH na atividade antimicrobiana dos peptídeos de L.
pentadactylus
Os ensaios com as frações de Leptodactylus pentadactylus peptídicas foram realizados com
os picos 5, 6 e 7, variando-se desta vez o pH , que conforme alguns autores pode por vezes aumentar
ou diminuir a atividade, sendo os peptídeos ensaiados em pH 6,0 e 7,4 . O valor de pH inferior ao
neutro (6,0), foi escolhido conforme a literatura por em alguns casos facilitar a formação dos
complexos citolíticos de membrana. Nas nossas condições experimentais não ocorreu qualquer
diferença significativa.
b.2. Ensaio antimicrobiano com amostras do L. pentadactylus obtidas em coluna filtrante
Sephacryl S-400 em meio líquido
Foi realizado como um piloto em condições extremas temporais para leitura, com 24 horas,
utilizando todas as amostras obtidas nesta cromatografia (Tabela 7) e dela selecionado os resultados
mais expressivos para testar com mais minúncias posteriormente, conforme são apresentados aqui os
dados obtidos. Foi utilizada para as leituras no espectrofotômetro a mesma faixa de comprimento de
onda (495 nm) e os mesmos controles (C1 e C2).
107
Tabela 8 –
Ensaio antimicrobiano com amostras do Leptodactylus pentadactylus obtidas em coluna
filtrante Sephacryl S-400 em meio líquido.
Microorganismo
Amostra
EBA
SAC
KBP
STA
BCS
EC
PA
P1
1999 1674 1778 1723 1290 1574 222
P2
1742 1651 1546 1665 1420 1351 685
P3
1841 1767 1608 1539 1547 1615 433
P4
2000 2000 1214 1779 1849 1678 660
P5
1365 1217 1072 1179 1212 1198 465
P6
1123 1206 1128 1240 1370 1093 348
P7
1116 1116 1089 1217 1215 990 395
P8
1050 828 1083 1302 1270 1092 362
P9
895 870 1029 1003 877 1132 695
P10
1240 1042 1132 1035 711 1075 595
P11
1380 1114 1244 1362 1051 1080 671
C1
1397 1059 835 723 868 1224 1268
C2
1047 1003 825 513 729 1196 1247
Para a bactéria Enterobacter aerogenes (EBA) apenas P9 (895 ± 0,887017) foi menor que os
dois controles C1 (1397± 1,38453) e C2 (1047 ± 7,07168), sendo que pelo teste de comparação
múltipla de Tukey P9 difere dos controles C1 e C2 com um P < 0,001.
Contra Salmonella choleraesus choleraesus var typhi (SAC) temos uma atividade
antimicrobiana discreta para P8 (828 ± 2,828427) e P9 (870 ± 1,414214) em relação ao controle C2
(1003 ± 4,242641) e um pouco maior comparando com C1 (1059 ± 7,07106781).
Nas condições experimentais, nenhuma amostra apresenta atividade contra Klebsiella
pneumoniae (KBP) e Staphylococcus aureus (STA).
Quando incubada com Bacillus subtilis (BCS) pôde-se detectar uma atividade fraca de P10
(711 ± 1,519231) para esta bactéria com 24 horas em relação aos controles C1 (868 ± 6,36396) e C2
(729 ± 1,557692), apesar de por Tukey este é diferente dos controles (P<0,001).
Contra Escherichia coli (EC) com 24 horas, em relação aos controles C1 (1224 ± 1,169682) e
C2 (1196 ± 1,0000) temos que apresentaram atividade antimicrobiana as amostras citadas em ordem
decrescente de intensidade do seu efeito: P7 (990 ± 0,968215) > P10 (1075 ± 1,051345) > P8 (1092
± 1,067971) e P6 (1093 ± 1,068949) > P11 (1080 ± 1,056235) > P9 (1132 ± 1,10709).
Todas as amostras-teste apresentaram atividade antimicrobiana contra Pseudomonas
aeruginosa, sendo as menos intensas P9 < P2 < P11 < P4 < P10. As mais expressivas P1 > P6 > P8
> P7 > P3 > P5.
108
Os primeiros quatro picos (P1, P2, P3, P4) não apresentaram atividade contra quaisquer
microorganismo, a exceção do Pseudomonas aeruginosa, nas condições experimentais com 24
horas, possivelmente servindo apenas como fonte de nutrientes.
Nas condições experimentais, nenhuma amostra apresenta atividade contra Klebsiella
pneumoniae (KBP), Staphylococcus aureus (STA). Pelo nível de crescimento com algumas
amostras - teste em relação aos controles o microorganismo com este tempo de ensaio utiliza-se
destas como fonte de nutrientes.
Todas as amostras-teste apresentaram atividade antimicrobiana contra Pseudomonas
aeruginosa, sendo as menos intensas P9 < P2 < P11 < P4 < P10 e as mais expressivas P1 > P6 > P8
> P7 > P3 > P5, todos diferentes dos controles dos controles com P menores variando de 0,05 a
0,001.
Por ter sido observado uma tendência para alguns picos ou uma fraca atividade com 24 horas
em relação aos controles, procurou-se efetuar os experimentos seguintes com uma leitura em tempo
menor, buscando se evidenciar alguma atividade satisfatória.
Após traçarmos o perfil eletroforético, viu-se que alguns picos eram na verdade parte de
outros, conforme podemos ver no agrupamento descritos a seguir: Pool 1 (P1 e P2), Pool 2 (P3),
Pool 3 (P4, P5, P6, P7), Pool 4 (P8), Pool 5 (P9) e Pool 6 (P10 e P11). Procurando trabalhar com
amostras realmente puras, conforme pode ser visto abaixo na cromatografia e eletroforese do P8, os
ensaios se concentraram em alguns picos com atividades tóxicas mais expressivas, principalmente
no P8, P10 e P11, estudando variáveis tais como tempo e temperatura, haja vista serem de natureza
protéica.
Foi observado que pelo nível de crescimento com algumas amostras - teste em relação aos
controles alguns microorganismos após algum tempo de ensaio utilizava-se destas como fonte de
nutrientes.
109
b.2.1. Avaliação tempo/dependente da atividade antimicrobiana de substâncias extraídas de
L. pentadactylus e influência da fervura.
Em ensaios para determinação da DL50 com estudos toxicológicos foi observado que o
pico 8, objeto de apuradas pesquisas no Laboratório de Neurofarmacologia da Universidade
Estadual do Ceará (UECE), perdeu sua atividade quando aquecida a 90 ºC. Visando checar isto com
a atividade antimicrobiana, resultaram os dados expostos a seguir.
0
7
2
4,5
4,5
4
11,5
16,5
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Leitura 1 (6h)
Absorbância (492 nm)
P8
P8F
P10
P10F
P11
P11F
C1
C2
Figura 46 -
Valores de absorbância a 492 nm com 6 horas de cultivo de Pseudomonas aeruginosa
obtidas com os picos 8, 10 e 11 da cromatografia em coluna de Sephacryl S-400 de
Leptodactylus pentadactylus, com e sem desnaturação pelo calor
Para bactéria Pseudomonas aeruginosa, com 6 horas de decorrido o experimento (Figura
46), viu-se que P8 e P8F apresentaram atividade antimicrobiana, tendo valores de leitura de
absorbância menores que os dois controles, indicando assim, menor densidade de crescimento. Para
P8 o crescimento foi de zero, já para a amostra P8F (7 ± 1,41421356
) a redução é aproximadamente
66,7 % menor do que em P8. Estes dados são sugestivos de que mesmo com a desnaturação pelo
calor, esta proteína conserva parcialmente sua atividade antimicrobiana, o que nos leva a supor que
as estruturas quaternárias e terciárias contribuem para a atividade, mas não são totalmente
essenciais. A amostra P10 tem atividade antimicrobiana, assim como P10F, sendo que a fervura
reduziu a atividade aparentemente em 2,75 vezes a atividade dele natural. Observou-se que P11
tinha atividade antimicrobiana, assim como P11F e aparentemente é indiferente a fervura.
110
Com 12 horas (Figura 47), observou-se que a atividade antimicrobiana cai para todas as
amostras, sendo ainda observada uma fraca tendência à atividade de P8F (51 ± 8,48528137) em
relação aos controles C1 (103 ± 1,41421356) e C2 (63,5 ± 0,70710678). A amostra P11F
aparentemente estimula o crescimento, possivelmente como apenas fonte de alimento.
70
51
61
62
68
160,5
103
64
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Leitura 2 (12 h)
Absorbância (492 nm)
P8
P8F
P10
P10F
P11
P11F
C1
C2
Figura 47 -
Valores de absorbância a 492 nm com 12 horas de cultivo de Pseudomonas
aeruginosa obtidas com os picos 8, 10 e 11 da cromatografia em coluna de Sephacryl
S-400 de Leptodactylus pentadactylus, com e sem desnaturação pelo calor.
Na leitura de 24 horas, vemos que a situação das amostras - teste muda pouco em relação às
12 horas entre si no perfil, contudo ainda tem alguma atividade em relação aos controles.
825
558,5
1042
587,5
1114
577
900
1003
0
200
400
600
800
1000
1200
L3 (24 h)
Absorbância (492 nm)
P8
P8-F
P10
P10-F
P11
P11-F
C1
C2
Figura 48 -
Valores de absorbância a 492 nm com 24 horas de cultivo de Pseudomonas
aeruginosa obtidas com os picos 8, 10 e 11 da cromatografia em coluna de Sephacryl
S-400 de Leptodactylus pentadactylus, com e sem desnaturação pelo calor.
111
Analisando o evento pela equação de Gompertz (Figura 49), tem-se um comportamento
diferenciado para as amostras 8 e 8F dos controles C1 e C2. Nota-se que P8 não encurta ou diminui
a fase lag consideravelmente, contudo altera a cinética de crescimento diminuindo-a (172,6 ±
1,48409) em relação aos controles C1 (184,8 ± 8,07808) e C2 (233,9 ± 6,75108). Já com P8F temos
um encurtamento da fase lag, fazendo com que a bactéria entre mais cedo na fase de crescimento,
contudo o máximo desta fase cinética é menor do que a dos controles, 23,5% e 51,35 %
respectivamente para C1 e C2, significando uma redução pronunciada da taxa metabólica.
Na Figura 49 podemos observar que quando utilizado este modelo podemos ver que as
amostras 10, 10F, 11 e 11F têm um comportamento não condizente com existe modelo.
0 5 10 15 20 25 30
0
250
500
750
1000
1250
1500
PA.P8
PA.P8F
PA.P10
PA.P10F
PA.P11
PA.P11F
PA.C1
PA.C2
Tempo (h)
Abs (492 nm)
Figura 49 -
Curva de crescimento bacteriano estimada pela variação de densidade óptica a 492 nm
segundo as equações de Gompertz para Pseudomonas aeruginosa submetidas à várias
condições de tratamento com amostras obtidas na coluna Sephacryl S 400 da secreção
de Leptodactylus pentadactylus
Ainda resta salientar que as outras amostras não apresentam uma alta significância com o
modelo teórico deste na o que é sugestivo possuir outro mecanismo de ação ou ainda, serem
substâncias bem diferentes de P8 e P8F.
112
0 5 10 15 20 25 30
0
250
500
750
1000
1250
1500
PA.P8
PA.P8F
PA.P10
PA.P10F
PA.P11
PA.P11F
PA.C1
PA.C2
Tempo (h)
Abs (492 nm)
Figura 50 -
Análise dos dados da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas
obtidas de Leptodactylus pentadactylus pelo modelo de Equação de Regressão Não
Linear contra Pseudomonas aeruginosa.
Neste modelo podemos ver, conforme considerações anteriores, que as amostras 10, 10F, 11
e 11F, fogem dos modelos utilizados sendo o desvio extremamente mais drástico para o modelo de
Gompertz do que para este, ainda resta salientar que as outras amostras não apresentam uma alta
significância com este modelo teórico. Os controles C1 e C2, assim como as amostras 8 e 8F
atendem seu comportamento podendo inferir a estes algumas observações.
O número inicial (START) é evidentemente reduzido para a amostra 8F (1,522 ± 1,761) em
relação aos controles C1 (12,03 ± 0,3104) e C2 (3,759 ± 0,1737), gerando uma aceleração
metabólica que pode ser compensatória por parte da bactéria.
113
Estes modelos teóricos servem para analisar os dados como um todo, o que nem sempre
fornece informações precisas de determinadas situações de tempo, fato que em relação a
antimicrobianos às vezes são dados de interesse.
Conforme pôde ser visto representadas nas Figuras 49 e 50, as amostras P10, P10F, P11 e
P11F têm um comportamento não condizente com as equações utilizadas como modelos, com um
desvio extremamente significativo dos modelos, tanto para o de Gompertz como o da Equação de
Regressão Não Linear, sendo o desvio extremamente mais drástico para o de Gompertz do que para
este.
114
Abaixo podemos ver os dados obtidos para outro microorganismo, Salmonella choleraesus
choleraesus var typhi, para os quais serão tecidos comentários
Figura 51 -
Valores de absorbância a 492 nm com 6, 12 e 24 horas de cultivo de Salmonella
choleraesus choleraesus var typhi obtidas com os picos 8, 10 e 11 da cromatografia
em coluna de Sephacryl S-400 de Leptodactylus pentadactylus, com e sem
desnaturação pelo calor.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
L1 ( 6h)
Absorbância (492 nm)
P8
P8-F
P10
P10-F
P11
P11-F
C1
C2
Pode-se observar que de uma maneira
geral que com 6 horas todas as amostras
têm atividade antimicrobiana em relação
aos controles, tanto as nativas como as
desnaturadas e que não aparecem
diferenças significativas de atividade
entre as diferentes amostras, a exceção
de P8 (307 ± 1,41421356) e P8F (266,5
± 7,77817459).
0
100
200
300
400
500
600
L2 (12 h)
Absorbância (492 nm)
P8
P8-F
P10
P10-F
P11
P11-F
C1
C2
Na leitura 2 (12 h) a situação não tem
uma alteração muito significativa anão
ser que já não há diferença entre as
amostras nativas e desnaturadas
0
200
400
600
800
1000
1200
L3 (24 h)
Absorbância (492 nm)
P8
P8-F
P10
P10-F
P11
P11-F
C1
C2
Com 24 horas temos que as amostras
nativas não tem mais atividade
antimicrobiana, a exceção de P8 (826 ±
1,41421356) em relação aos controles
C1 (900 ± 2,82842712)e C2 (1002,5±
0,70710678). Todas as amostras
submetidas a tratamento térmico
apresentaram atividade antimicrobiana.
115
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5
0
250
500
750
1000
1250
SA.P8
SA.P8F
SA.P10
SA.P10F
SA.P11
SA.P11F
SA.C1
SA.C2
Tempo (h)
Abs (492 nm)
Figura 52 -
ondições de tratamento com, substratos extraídos de
Leptodactylus pentadactylus.
comporta
os
aos contro
Curva de crescimento bacteriano estimada pela variação de densidade óptica (492 nm)
segundo as equações de Gompertz, para Salmonella choleraesus choleraesus var
typhi, submetidas à várias c
Com relação a este modelo teórico a amostra P10 apresenta um desvio significativo de
Gompertz quando este método é utilizado para lhe inferir considerações. O controle C2 teve um
mento que o programa apenas conseguiu plotar seus pontos porém não efetuou sua curva.
Pode ser observado que a fase lag das amostras P8 e P8F foram maiores do que o controle
C1 e visualmente também maior que C2, sendo que as amostras restantes tiveram valores próxim
les. Utilizando a fórmula Razão: lag
Ax
/lag
C1
, podemos ver as relações na Tabela 8.
Detectou-se com algumas amostras um aumento da taxa metabólica de crescimento, sendo
apresentadas a seguir em ordem decrescente P11 (163,7) > P8 (106,7) em relação ao controle C1
(94,56), tendo sido observado também que as amostras apresentadas a seguir reduziram a taxa
116
metabólica P8F (69,50), P11F (60,42) e P10F (53,70) em relação ao controle o que denota que de
alguma maneira estas três amostras impedem uma compensação metabólica ou ainda, apenas atuam
nesta fase de crescimento. As razões entre as amostras e os controles podem ser observados na
abela 8 abaixo, tendo sido utilizada a fórmula Razão: lag
Ax
/lag
C1
para se estimar estas relações.
Tabela 9 -
ostras
lun phacr 00 d ção ptod pen tylus
Amostras P8 PC2
T
Tempo para inicio do crescimento bacteriano (lag) e taxa de crescimento máximo
(Tax), estimadas segundo as equações de Gompertz, para Salmonella choleraesus
choleraesus var typhi, submetidas à várias condições de tratamento com am
obtidas na co a Se yl S 4 a secre de Le actylus tadac .
P8F P10F P11 P11F PC1
lag
13,87 12,01 11,75 11,66 11,19 11,23 -
Razão
1,227 1,069 0,563 1,038 0,996 1,000 -
Taxa
106,7 69,50 53,70 163,7 60,42 94,56 -
Razão
1,128 0,735 0,617 1,731 0,639 1,000 -
OBS: *Razão: lag /lag ** razão: Taxa /Taxa ; onde Ax = amostras.
trientes, apesar de ter sido um valor acentuado que influenciou para
ter sido
metabólico da taxa de P11 (1,731) e de redução
da mes
es ou mesmo método de obtenção e beneficiamento de produtos estas substâncias tenham
utilidade.
Ax C1;; Ax C1
O aumento da fase lag de P8/ C1 (1,227) e muito mais discreto para P8F/ C1 (1,069) e
P11/C1 (1,038) é sugestivo que atue no início do crescimento na adaptação da bactéria ao meio em
que se encontra ou na produção de de metabólitos essenciais para o seu desenvolvimento. Uma
redução para P10F/ C1 (0,563) pode ser indicativo de uma promoção da aceleração do processo de
adaptação ou incremento de nu
esta segunda hipótese.
Chamam a atenção os valores de incremento
ma de P10F/ C1 (0,617) e P11F/ C1 (0,639).
Acelerar a fase lag ou a taxa metabólica pode não ter utilidade do ponto de vista de um
antimicrobiano, contudo industrialmente haja visto que bactérias são utilizados em processos como
facilitador
117
0 5 10 15 20 25 30
0
250
500
750
1000
1250
SA.P8
SA.P8F
SA.P10
SA.P10F
SA.P11
SA.P11F
SA.C1
SA.C2
Tempo (h)
Abs (492 nm)
Figura 53 -
Análise dos dados da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de
microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas
obtidas de L. pentadactylus pelo modelo de Equação de Regressão Não Linear contra
Salmonella choleraesus choleraesus var typhi.
Este modelo teórico com um P<0,0001pode ser aplicado para todas as amostras e controles.
As amostras P8 (167,7 ± 35,54), P8F (182,8 ± 23,92), P10 (138,3 ± 38,28) e P11 (159,9 ±
16,28) reduziram o valor inicial de crescimento em relação aos controles C1 (328,5 ± 12,72) e C2
(287,9 ± 40,11), sendo sugestivo de possurem uma ação direta sobre esta bactéria.
Analisando a inclinação K pôde-se observar que a amostra P10F (0,03645 ± 0,007032)
reduziu o coeficiente angular em relação aos controles C1 (0,04125 ± 0,002451) e C2 (0,049329 ±
0,008895), já as amostras P10 (0,07927 ± 0,01772) e P11 (0,07897 ± 0,006484) aumentaram,
possivelmente num efeito compensatório por parte da bactéria pelo atraso inicial que estas amostras
causaram ou estas não tinham mais efeito inibitório sobre o crescimento da bactéria e serviram como
incremento nutricional. As amostras P8 e P8F tiveram um valor de K igual aos controles, sendo
118
sugestivo que seu efeito sobre esta bactéria nas condições experimentais é mais direto sobre o
microorganismo.
b.2.2. Determinação da concentração inibitória mínima antimicrobiana do pico 8 obtido da
cromatografia em coluna filtrante Sephacryl S 400 da secreção de Leptodactylus
pentadactylus
Para complementar as informações obtidas nos experimentos que verificaram a atividade
antimicrobiana do pico 8 (P8) contra Pseudomonas aeruginosa com os parâmetros
tempo/dependência e desnaturação pelo calor, uma nova variável que é a de concentração. A
amostra utilizada de P8 nativa utilizada foi de concentração menor do que a anteriormente
empregada nos ensaios. Foi encontrado um valor 3,21x10
-2
μg de proteína ou ainda, 0,64 μg/mL
como concentração mínima capaz de inibir esta bactéria com seis horas, já a desnaturada pelo calor
foi de0,51μg ou 10,27 μg/mL.
Proteínas com ação antimicrobiana têm sido isoladas com menos freqüência do que
peptídeos. Como a exemplo, pode-se citar os obtidos de duas espécies de peixe, a Parasin, um
peptídeo derivado da região N- terminal da histona H2A de peixe-gato, Parasilurus asotus (PARK
et al., 1998) e uma proteína muito maiorrelacionada ou idêntica histona H2B, encontrada no muco
da pele de outro peixe-gato, Ictalus punctatus (ROBINETTE et al., 1998). A atividade
antimicrobiana na pele de carpa (Cyprinus carpio), e ensaios preliminares em truta arco-íris
(Oncorhynchus mykiss), e outras espécies foram sugestivos da possibilidadede outras grandes
proteínas antimicrobianas (LEMAITRE et al., 1996; EBRAN et al., 2000). Em levantamentos
bibliográficos têm sido encontrados de alguns anos para cá um considerável quantidade de trabalhos
com peixes, sendo que Smith e colaboradores (2000) detectaram quatro proteínas da truta arco-íris,
Oncorhynchus mykiss, com uma pronunciada atividade antimicrobiana contra bactérias gram
positivas, posteriormente isoladas e caracterizadas a oncorhyncin II (FERNANDES et al., 2004) e
oncorhyncin III (FERNANDES et al., 2003). Já Richards e colaboradores (2001) encontraram
atividade antimicrobiana em material oriundo de salmão do Atlântico (Salmo salar), primeiramente
em extratos ácidos, posteriormente isolando uma proteína antimicrobiana do fígado desta animal
com um peso molecular de 20.734 Da e esta identificada como uma histona H1. A proteína
apresentou uma concentração inibitória mínima de 31
μg/mL contra E. coli D31.
119
A atividade da proteína de Leptodactylus pentadactylus é extremante expressiva e específica,
o que futuramente poderá constituir numa nova opção frente o crescente aparecimento de cepas
multi-resistentes.
120
5. CONCLUSÕES
Com relação ao material obtido de Bufo schneideri, nas condições
experimentais, temos que:
Os picos 1B, 2, 3 e 4 são bufadienolídeos identificados respectivamente como
Hellebrigenin, Telocinobufagin, Marinobufagin e Bufalin.
Telocinobufagin apresenta uma atividade hemolítica mais intensa na concentração
original, contudo esta amostra tem um título de atividade menos expressivo que estes dois
outros picos, sendo que Bufalin apresenta uma atividade hemolítica bem menos intensa do
que a Hellebrigenin e Telocinobufagin.
Dentre os extratos de pele, o elaborado a partir da região glandular com etanol foi o
mais ativo contra todas as bactérias testadas, tendo apresentado uma maior atividade contra
Staphylococcus aureus.
Todos os picos testados, a exceção do Marinobufagin, foram ativos para a bactéria
gram positiva o Staphylococcus aureus ATCC 6538P e a gram negativas Escherichia coli
ATCC 25922.
Hellebrigenin apresenta também atividade antimicrobiana, contudo não tão intensa
quanto F1.
A atividade antimicrobiana de F1 e do Telocinobufagin são semelhantes para os
microorganismos testados, sendo que Hellebrigenin apesar de ter uma atividade menos
intensa é efetivo para as mesmas bactérias que estes dois primeiros.
Telocinobufagin teve ação antimicrobiana em menor ou maior grau para todas as
batérias testadas a exceção de Pseudomonas aeruginosa, a qual não foi inibida por
nenhumas das amostras testadas
Marinobufagin aparentemente não apresenta atividade hemolítica, nem
antimicrobiana nas condições experimentais utilizadas.
121
Em meio líquido a atividade antimicrobiana das amostras contra estes
micoorganismos não diferiu significativamente dos resultados em meio sólido.
Com relação ao material obtido de Leptodactylus pentadactylus, nas condições
experimentais, temos que:
Os picos obtidos da cromatografia em Sephacryl S-400 apresentam atividade
hemolítica, sendo que os picos 7, 8 e 9 os mais expressivos.
Todos eles (P1 –11) apresentam na concentração mais alta uma atividade
aglutinante e em menores hemolítica
A atividade hemolítica do P8 é variável em termos de título conforme a espécie ou
tipo sangüíneo, sofrendo influência da refrigeração.
O pico P8, extraído de L. pentadactylus apresenta uma intensa atividade
antimicrobiana contra Pseudomonas aeruginosa e mais discreta para outras bactérias
testadas (E. coli, S. aureus, K. pneumoniae, Enterobacter aerogenes, S. choleraesuis
choleraesuis var typhi, B. subtilis)
A atividade antimicroniana contra Pseudomonas aeruginosa de P8 é reduzida, mas
não abolida após tratamento térmico evidenciando a importância maior deuma estrutura
primária, sendo que para S. choleraesuis choleraesuis var typhi o tratamento térmico
possibilita uma maior durabilidade do efeito antimicrobiano.
De uma maneira geral que até 12 horas todas as amostras (P8, P8F, P10, P10F, P11
e P11F) têm atividade antimicrobiana contra S. choleraesuis choleraesuis var typhi em
relação aos controles, tanto as nativas como as desnaturadas, sem diferenças significativas
de atividade entre as diferentes amostras, a exceção de P8 e P8F com seis horas.
A ação antimicrobiana de P8 é principal parece ser por efeito direto sobre o
microorganismo no início de seu crescimento.
122
As amostras P10, P11 e suas equivalentes desnaturadas pelo calor têm um
comportamento não condizente com as outras amostras testadas, inclusive não se
enquadrando nos modelos teóricos, sendo sugestivo possuir outro mecanismo de ação ou
ainda, serem substâncias bem diferentes.
Os peptídeos 1 e 5 são os que apresentam o valor mais expressivo de CHM, contudo
o que apresenta a maior intensidade é a amostra 6, sendo que não pareceu haver relação
entre atividade antimicrobiana com hemolítica.
Os peptídeos 5, 6 e 7 de de L. pentadactylus apresentam atividade antimicrobiana
para diferentes bactérias, tanto gram positivas como negativas, sendo que a forma que eles
o fazem nem sempre é o mesmo.
Pelo modelo de Gompertz pôde ser visto que as amostras peptídicas 5 e 7 aumentam
a fase lag das bactérias S. aureus e K. pneumoniae, sendo que sua influência sobre a fase
de crescimento exponencial é bem variável.
Os peptídeos 5, 6 e 7 reduzem diretamente o numero inicial de bactérias quando
incubado com estas assemelhando-se a um efeito bactericida..
As amostras apresentaram uma atividade antimicrobiana e mais influências
metabólicas sobre Staphylococcus aureus com um mecanismo aparentemente
desconhecido.
A influência do pH na atividade antimicrobiana dos peptídeos testados não foi
significativa.
A ação antimicrobiana encontrada das amostras peptídicas não tem semelhanças
com o material que na sua maioria apresenta características protéicas obtido da
cromatogarfia em Sephacryl S-400.
As amostras testadas não só adquirem importância diretamente por seus resultados,
mas também pela sua possível utilização como modelos e pontos de partida para novos
compostos quer obtidos por síntese ou engenharia genética que venham nos fornecer novos
e eficientes antimicrobianos.
123
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