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ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
RAQUEL FERREIRA DE CARVALHO
ESTUDO DO PAPEL DA ANGIOTENSINA II NA AMPLIFICAÇÃO DO
EDEMA DE PATA INDUZIDO POR CARRAGENINA OU DEXTRAN EM
RATOS
FORTALEZA
2005
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iii
RAQUEL FERREIRA DE CARVALHO
ESTUDO DO PAPEL DA ANGIOTENSINA II NA AMPLIFICAÇÃO DO EDEMA DE
PATA INDUZIDO POR CARRAGENINA OU DEXTRAN EM RATOS
Dissertação submetida à coordenação do Curso de
Pós-graduação em Farmacologia, da Universidade
Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção
do grau de Mestre em Farmacologia.
Orientador: Profª. Drª. Gerly Anne de Castro Brito
FORTALEZA
2005
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iv
RAQUEL FERREIRA DE CARVALHO
ESTUDO DO PAPEL DA ANGIOTENSINA II NA AMPLIFICAÇÃO DO EDEMA DE
PATA INDUZIDO POR CARRAGENINA OU DEXTRAN EM RATOS
Dissertação submetida à coordenação do Curso de
Pós-graduação em Farmacologia, da Universidade
Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção
do grau de Mestre em Farmacologia.
Aprovada com Louvor em 21/03/2005
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________
Profª. Drª. Gerly Anne de Castro Brito (orientadora)
Universidade Federal do Ceará – UFC
_____________________________________________
Prof. Dr. Marcellus Henrique Loiola Ponte de Souza
Universidade Federal do Ceará – UFC
_____________________________________________
Profª. Drª. Flávia Almeida Santos
Universidade Federal do Ceará – UFC
Trabalho realizado no Laboratório da Farmacologia da Inflamação e do Câncer (LAFICA)
Departamento de Fisiologia e Farmacologia
Faculdade de Medicina – Universidade Federal do Ceará (UFC)
v
A meus pais, irmãos e ao meu
companheiro Daniel, pela eterna
compreensão e amor.
iv
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Professora Gerly Anne de Castro Brito, pelo
incentivo, competência, paciência, pela imensa presteza em orientar todos os
passos desse trabalho e, sobretudo, pela compreensão nos momentos
delicados.
Ao Professor Ronaldo de Albuquerque Ribeiro, pela acolhida no
laboratório e pelo exemplo de dedicação à pesquisa.
Ao Professor Marcellus Henrique Loiola Ponte de Souza, por ter
colaborado com este trabalho e por sua dedicação ao LAFICA.
Ao Professor Fernando Queiroz Cunha e à Giuliana Bertozi, da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da USP, pela gentileza na execução
das dosagens de citocinas.
Aos Professores Armênio Aguiar dos Santos e Flávia Almeida Santos
pelas sugestões valiosas durante o meu exame de qualificação.
Aos bolsistas de iniciação científica Rodrigo Costa Lima e Ryan Falcão,
que tiveram participação valiosa e indispensável na execução dos
experimentos.
À Maria Silvandira França Pinheiro, a Wandinha, pela imensa
disponibilidade em ajudar e pelos ensinamentos no LAFICA.
Ao José Ivan Rodrigues, pela confecção das lâminas histológicas,
sempre com dedicação e boa vontade.
Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia Silvia,
Aura e Rose e especialmente para os funcionários do biotério, Dra. Artemísia,
Phoebe e Júnior pela disposição constante em ajudar.
Aos amigos do LAFICA: Renata, Ingrid, Sílvia, Virgínia, Mariana, Vilma,
Rose, Antoniella, Hellíada, Rondinele, pelo companheirismo e convivência
prazerosa.
Ao amigo Carlos Thiago, pelo constante prazer em ajudar.
À CAPES e ao CNPq, pelo apoio financeiro.
Agradeço finalmente a Deus, que está sempre comigo nos momentos de
vitórias e também naqueles mais difíceis.
v
RESUMO
A Angiotensina II (Ang II) exerce suas ações via receptores AT1 e AT2.
Estudos recentes demonstraram que o sistema-renina-angiotensina (SRA)
participa da inflamação. O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito da Ang II
em modelos de inflamação aguda. Ratos Wistar foram separados nos grupos:
salina (Sal), Ang II (1μg), losartan (LOS, antagonista de AT1, 62,5μg) e
CGP42112A (agonista de AT2, 142,5μg). O edema de pata foi induzido pela
injeção subplantar (sp) de carragenina (Cg, 100μg) ou dextran (DXT, 100μg) e
foi medido com pletismômetro em 0, 1, 2, 3 e 4h. Nos grupos Sal e Ang II, foi
colhido tecido da pata para se determinar os níveis de mieloperoxidase (MPO),
IL-1e TNF-α. Tecidos subcutâneo e mesentérico foram removidos para
avaliação da degranulação de mastócitos através da coloração com azul de
toluidina. Os grupos Sal e Ang II do edema de pata induzido por DXT foram
tratados com mepiramina (MEP, anti-histamínico, 10mg/kg) ou metisergida
(MET, anti-serotonínico, 1,5mg/kg) 1h antes da injeção de DXT. Ang II
(0,5μg/cavidade, ip) foi injetada 1h antes da injeção ip de Cg para analisar a
migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal. Ang II, LOS e CGP
amplificaram o edema de pata induzido por Cg e DXT e essa amplificação foi
significativa já na primeira hora. A administração de Ang II não alterou a
dosagem tecidual de MPO, TNF-α e IL-1 e não induziu ou preveniu a migração
de neutrófilos para a cavidade peritoneal, mas induziu amplificação significativa
da degranulação de mastócitos. MEP e MET reduziram a potenciação do
edema do DXT pela Ang II. Nossos resultados sugerem que a Ang II potenciou
a resposta inflamatória provavelmente através de receptores AT2, já que o
antagonista de AT1, o agonista de AT2 e a Ang II amplificaram o edema de
pata. Os dados apresentados aqui sugerem que Ang II aumentou a
permeabilidade vascular através da indução da degranulação de mastócitos,
uma vez que houve amplificação precoce do edema de pata da Cg e do edema
vascular do DXT, e os antagonistas de serotonina e de histamina inibiram
significativamente o aumento do edema de pata.
vi
ABSTRACT
Angiotensin II (Ang II) exerts its actions via AT1 and AT2 receptors.
Recent studies have demonstrated that the renin-angiotensin system (RAS)
participates in inflammation. The aim of this study was to evaluate the effect of
Ang II on models of acute inflammation. Wistar rats were separated in the
groups: saline (Sal), Ang II (1μg), losartan (LOS, AT1 antagonist, 62.5μg) and
CGP42112A (AT2 agonist, 142.5μg). Paw edema was induced by subplantar
injection of carrageenan (Cg, 100μg) or dextran (DXT, 100μg) and was
measured with a plethysmometer at 0, 1, 2, 3 and 4h. In the Sal and Ang II
groups, paw tissue was taken to determine myeloperoxidase (MPO), IL-1 and
TNF-α levels. Subcutaneus and mesenterium tissue were taken to evaluate
mast cell degranulation through the toluidine blue staining. Sal and Ang II
groups of DXT-induced paw edema were treated i.p. with mepyramine (MEP,
anti-histamine, 10mg/kg) or metisergyde (MET, anti-serotonin, 1.5mg/kg) 1h
prior to the injection of DXT. Ang II (0.5μg/cavity, ip) was injected i.p. 1h before
the i.p. injection of Cg to analyse the leukocytes migration to the peritoneal
cavity. Ang II, LOS and CGP enhanced the Cg and DXT-induced paw edema
and this enhancement was already significant at 1h. The administration of Ang
II did not change the tissue content of MPO, TNF-α and IL-1 and did not
induced or prevented neutrophil migration to peritoneal cavity, but induced
significant enhancement of mast cell degranulation. MEP and MET reduced the
Ang II-facilitated DXT-induced edema. Our results suggest that Ang II enhances
the inflammatory response probably through the AT2 receptors since the AT1
antagonist, AT2 agonist and Ang II potentiated the paw edema. The data
presented here also suggest that Ang II increases the vascular permeability
through induction of mast cells degranulation, since there was early
amplification of Cg paw edema and DXT vascular edema, and antagonists of
serotonin and histamine significantly inhibited the increase in paw edema.
vii
LISTA DE ABREVIATURAS
ADP: adenosina difosfato
AIDS: síndrome da imunodeficiência adquirida
AMP
c
: adenosina monofosfato cíclico
Ang II: angiotensina II
AP-1: fator ativador de proteína 1
ASC: área sob a curva
AT1: receptor tipo 1 da angiotensina II
AT2: receptor tipo 1 da angiotensina II
BK: bradicinina
C5a: fração 5a do complemento
C3a: fração 3a do complemento
Cg: carragenina
COX: cicloxigenase
COX-1: cicloxigenase 1
COX-2: cicloxigenase 2
DAG: diacilglicerol
DXT: dextran
ECA: enzima conversora de angiotensina
fMLP: formil-metionil-leucil-fenilalanina
g: grama
GMP
c
: guanosina monofosfato cíclico
h: hora (s)
H&E: hematoxilina e eosina
5-HT: serotonina
ICAM-1: molécula de adesão intercelular 1
IFNγ: interferon γ
IgE: imunoglobulina E
IL-1: interleucina 1
IL-3: interleucina 3
IL-4: interleucina 4
IL-5: interleucina 5
viii
IL-6: interleucina 6
IL-8: interleucina 8
IL-13: interleucina 13
ip.: intraperitoneal
IP
3
: trifosfato de inositol
kg: kilograma
LOS: losartan
LPS: lipopolissacarídeo
LT: leucotrieno
LTB
4
: leucotrieno B
4
LTC
4
: leucotrieno C
4
LTD
4
: leucotrieno D
4
LTE
4
: leucotrieno E
4
MCP-1: monocyte chemoattractant protein 1
MEP: mepiramina
MET: metisergida
mg: miligrama
min: minuto (s)
mL: mililitros
mM: milimolar
MPO: mieloperoxidase
NF-κB: fator de transcrição nuclear κB
ng: nanograma
NO: óxido nítrico
PA: pressão arterial
PAF: fator de agregação plaquetária
PAI-1: plasminogen activator inhibitor 1
PAMP: padrões moleculares associados a patógenos
pg: picograma
PGD
2
: prostaglandina D
2
PGE
1
: prostaglandina E
1
PGI
2
: prostaciclina
PIP
2
: bifosfato de fosfatidilinositol
PKC: proteína quinase C
ix
PLA
2
: fosfolipase A
2
PLC: fosfolipase C
PLD: fosfolipase D
PLD
2
: fosfolipase D
2
PMN: polimorfonucleares
RANTES: regulated upon activation: normal T cell expressed (secreted)
RNA
m
: RNA mensageiro
Sal: salina
sp.: subplantar
SRA: sistema-renina-angiotensina
μg: micrograma
TNF-α: fator de necrose tumoral alfa
VCAM-1: molécula de adesão da célula endotelial 1
VEGF: fator de crescimento do endotélio vascular
VPF: fator de permeabilidade vascular
x: vezes
x
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 – Efeito da Angiotensina II sobre o volume do edema de pata
induzido por Carragenina em ratos....................................................................63
FIGURA 2 – Efeito da Angiotensina II sobre o infiltrado celular inflamatório e o
edema intersticial em ratos tratados com Carragenina sp.................................64
FIGURA 3 – Efeito do antagonista de AT1 (Losartan) sobre o volume do edema
de pata induzido por Carragenina em ratos.......................................................65
FIGURA 4 – Efeito do agonista de AT2 (CGP-42112A) sobre o volume do
edema de pata induzido por Carragenina em ratos...........................................67
FIGURA 5 – Efeito da Angiotensina II sobre o volume do edema de pata
induzido por Dextran em ratos...........................................................................69
FIGURA 6 – Efeito do antagonista de AT1 (Losartan) sobre o volume do edema
de pata induzido por Dextran em ratos..............................................................70
FIGURA 7 – Efeito do anti-histamínico Mepiramina sobre a modulação por
angiotensina II do edema de pata induzido por Dextran em ratos....................72
FIGURA 8 – Efeito do anti-serotoninérgico Metisergida sobre a modulação por
angiotensina II do edema de pata induzido por Dextran em ratos....................73
FIGURA 9 – Efeito da Angiotensina II sobre a degranulação de mastócitos
induzida por Carragenina ou por Dextran na pata de ratos...............................75
FIGURA 10 – Efeito da Angiotensina II sobre a degranulação de mastócitos na
pata de ratos tratados com Carragenina sp – histológico..................................76
FIGURA 11 – Efeito da Angiotensina II sobre a degranulação de mastócitos em
mesentério de ratos induzida pelo composto 48/80..........................................78
FIGURA 12 – Efeito da Angiotensina II (ip) sobre a degranulação de mastócitos
em mesentério de ratos incubados com o composto 48/80 –
histológico..........................................................................................................79
FIGURA 13 – Efeito da Angiotensina II sobre a dosagem de TNF-α na pata de
ratos tratados com Carragenina ou Salina sp....................................................81
FIGURA 14 – Efeito da Angiotensina II sobre a dosagem de IL-1β na pata de
ratos tratados com Carragenina ou Salina sp....................................................82
FIGURA 15 – Efeito da Angiotensina II sobre a dosagem de mieloperoidase na
pata de ratos tratados com Carragenina ou Salina sp.......................................84
FIGURA 16 – Efeito da Angiotensina II sobre a migração de polimorfonucleares
para a cavidade peritoneal induzida por Carragenina em ratos........................85
xi
ÍNDICE
I. INTRODUÇÃO........................................................................................................... 2
1. ANGIOTENSINA II: CONSIDERAÇÕES GERAIS............................................... 2
2. RECEPTORES DA ANGIOTENSINA II ................................................................ 4
3. ASPECTOS GERAIS DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA................................... 11
4. RERMEABILIDADE VASCULAR E EDEMA .................................................... 14
5. A BIOLOGIA DOS MASTÓCITOS...................................................................... 21
6. EVENTOS CELULARES DA INFLAMAÇÃO.................................................... 26
7. ANGIOTENSINA II E A RESPOSTA INFLAMATÓRIA.................................... 30
II. JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS...................................................................... 40
III. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 43
1. ANIMAIS ............................................................................................................... 43
2. APARELHOS E INSTRUMENTOS LABORATORIAIS..................................... 43
3. DROGAS, SOLUÇÕES, CORANTES E ANTISOROS........................................ 45
3.1. DROGAS.......................................................................................................... 45
3.2. CORANTES ..................................................................................................... 46
3.3. SOLUÇÕES..................................................................................................... 46
3.4 TAMPÕES E SOLUÇÕES UTILIZADOS PARA O ENSAIO
IMUNOENZIMÁTICO ........................................................................................... 47
3.5. ANTICORPOS................................................................................................. 48
3.6. TAMPÕES E SOLUÇÕES USADOS NA DOSAGEM DA ATIVIDADE DE
MIELOPROXIDASE............................................................................................... 48
4. PROTOCOLO EXPERIMENTAL......................................................................... 49
4.1. EDEMA DE PATA INDUZIDO POR CARRAGENINA EM RATOS WISTAR 49
4.2. AVALIAÇÃO DO EDEMA DE PATA INDUZIDO POR DEXTRAN EM
RATOS WISTAR ..................................................................................................... 50
4.3. INFLUÊNCIA DA MEPIRAMINA SOBRE O EDEMA DE PATA INDUZIDO
POR DEXTRAN EM RATOS WISTAR ................................................................... 51
4.4. INFLUÊNCIA DA METISERGIDA SOBRE O EDEMA DE PATA INDUZIDO
POR DEXTRAN EM RATOS WISTAR ................................................................... 52
4.5. DEGRANULAÇÃO DE MASTÓCITOS INDUZIDA POR CARRAGENINA OU
DEXTRAN NA PATA DE RATOS WISTAR............................................................ 53
4.6. DEGRANULAÇÃO DE MASTÓCITOS INDUZIDA PELO COMPOSTO 48/80
EM MESENTÉRIO DE RATOS WISTAR............................................................... 54
4.7. DOSAGEM DE TNF-
α
E IL-1
β
NA PATA DE RATOS WISTAR POR ELISA
................................................................................................................................55
4.8. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DE MIELOPEROXIDASE NA PATA DE
RATOS WISTAR ..................................................................................................... 57
4.9. AVALIAÇÃO DA MIGRAÇÃO DE POLIMORFONUCLEARES PARA A
CAVIDADE PERITONEAL DE RATOS WISTAR.................................................. 59
IV. RESULTADOS....................................................................................................... 62
1.
EFEITO DA ANGIOTENSINA II (ANG II) SOBRE O EDEMA DE PATA
INDUZIDO POR CARRAGENINA (CG) EM RATOS WISTAR .............................. 62
2. EFEITO DO ANTAGONISTA DE AT1 (LOSARTAN-LOS) SOBRE O EDEMA
DE PATA INDUZIDO POR CARRAGENINA (CG) EM RATOS WISTAR............. 62
xii
3. EFEITO DO AGONISTA DE AT2 (CGP 42112A) SOBRE O EDEMA DE PATA
INDUZIDO POR CARRAGENINA (CG) EM RATOS WISTAR .............................. 66
4. EFEITO DA ANGIOTENSINA II (ANG II) SOBRE O EDEMA DE PATA
INDUZIDO POR DEXTRAN (DXT) EM RATOS WISTAR..................................... 68
5. EFEITO DO ANTAGONISTA DE AT1 (LOSARTAN-LOS) SOBRE O EDEMA
DE PATA INDUZIDO POR DEXTRAN (DXT) EM RATOS WISTAR.................... 68
6. EFEITO DO ANTI-HISTAMÍNICO MEPIRAMINA (MEP) SOBRE A
MODULAÇÃO POR ANGIOTENSINA II (ANG II) DO EDEMA DE PATA
INDUZIDO POR DEXTRAN (DXT) EM RATOS WISTAR..................................... 71
7. EFEITO DO ANTI-SEROTONÍNÉRGICO METISERGIDA (MET) SOBRE A
MODULAÇÃO POR ANGIOTENSINA II (ANG II) DO EDEMA DE PATA
INDUZIDO POR DEXTRAN (DXT) EM RATOS WISTAR..................................... 71
8.
EFEITO DA ANGIOTENSINA II (ANG II) SOBRE A DEGRANULAÇÃO DE
MASTÓCITOS NA PATA DE RATOS WISTAR TRATADOS COM
CARRAGENINA (CG)............................................................................................... 74
9. EFEITO DA ANGIOTENSINA II (ANG II) SOBRE A DEGRANULAÇÃO DE
MASTÓCITOS NA PATA DE RATOS WISTAR TRATADOS COM DEXTRAN
(DXT) ......................................................................................................................... 74
10. EFEITO DA ANGIOTENSINA II (ANG II) SOBRE A DEGRANULAÇÃO DE
MASTÓCITOS INDUZIDA PELO COMPOSTO 48/80 EM MESENTÉRIO DE
RATOS WISTAR ........................................................................................................ 77
11. EFEITO DA ANGIOTENSINA II (ANG II) SOBRE O AUMENTO DA
DOSAGEM DE TNF-α NA PATA DE RATOS WISTAR TRATADOS COM
CARRAGENINA (CG)............................................................................................... 80
12. EFEITO DA ANGIOTENSINA II (ANG II) SOBRE O AUMENTO DA
DOSAGEM DE IL1-β NA PATA DE RATOS WISTAR TRATADOS COM
CARRAGENINA (CG)............................................................................................... 80
13. EFEITO DA ANGIOTENSINA II (ANG II) SOBRE A DOSAGEM DE
MIELOPEROXIDASE (MPO) NA PATA DE RATOS WISTAR TRATADOS COM
CARRAGENINA (CG)............................................................................................... 83
14.
EFEITO DA ANGIOTENSINA II (ANG II) SOBRE A MIGRAÇÃO DE
POLIMORFONUCLEARES (PMN) PARA A CAVIDADE PERITONEAL DE
RATOS WISTAR TRATADOS COM CARRAGENINA (CG).................................. 83
V. DISCUSSÃO ............................................................................................................ 87
VI. CONCLUSÕES.................................................................................................... 105
VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................. 107
1
I. INTRODUÇÃO
2
I. INTRODUÇÃO
1. ANGIOTENSINA II: CONSIDERAÇÕES GERAIS
A Angiotensina II (Ang II) é um polipeptídeo derivado do plasma que
tem ações importantes em várias partes do corpo, como músculo liso vascular,
córtex supra-renal, rim, cérebro, dentre outros.
O sistema-renina-angiotensina (SRA) atua de modo sinérgico com o
sistema nervoso simpático estimulando a produção de aldosterona, que exerce
atividade essencial no controle da excreção de sódio e do volume de líquido,
bem como no tônus vascular. A renina é uma enzima proteolítica secretada na
circulação por células do aparelho justaglomerular. A renina é secretada em
resposta a diversos estímulos fisiológicos, como redução na concentração de
sódio no líquido do túbulo distal e também por uma queda na pressão de
perfusão renal. A atividade nervosa simpática renal, os agonistas dos
receptores β-adrenérgicos e a prostaciclina (PGI
2
) estimulam diretamente a
secreção de renina, enquanto a Ang II produz inibição por retroalimentação
(feedback negativo). O peptídeo natriurético atrial também inibe a secreção de
renina. A renina é rapidamente depurada do plasma. Ela atua sobre o
angiotensinogênio, uma globulina plasmática produzida no fígado, separando
um decapeptídeo, a angiotensina I, da extremidade N-terminal da proteína. A
angiotensina I não tem atividade intrínseca apreciável, porém, é convertida pela
enzima conversora de angiotensina (ECA) em um octapeptídeo, a Ang II,
responsável por ações variadas em diversas partes do corpo. Ela age
diretamente sobre a zona glomerulosa do córtex supra-renal, estimulando a
3
biossíntese e a secreção de aldosterona. A Ang II pode ser degradada por
enzimas, as aminopeptidase A e N, que removem aminoácidos isolados de
modo seqüencial a partir da extremidade N-terminal, produzindo angiotensina
III e angiotensina IV respectivamente. Atualmente, sabe-se que a angiotensina
III estimula a secreção de aldosterona e está envolvida no mecanismo da sede.
A angiotensina IV também apresenta ações distintas, incluindo liberação do
inibidor do ativador de plasminogênio I (PAI-I, plasminogen activator inhibitor 1)
do endotélio. A ECA é uma enzima ligada à membrana superficial das células,
principalmente das células endoteliais. Ela está presente em vários tecidos,
como pulmão, coração, rim, cérebro e no músculo estriado.
Conseqüentemente, pode ocorrer formação local de Ang II em diferentes
tecidos, proporcionando ação local, independente da Ang II transportada pela
corrente sanguínea (RANG et al., 2003). A ECA é uma enzima do tipo cininase
II, que inativa a bradicinina e vários outros peptídeos vasodilatadores. Isso
pode contribuir para as ações farmacológicas das drogas inibidoras da ECA,
como veremos adiante (RANG et al., 2003; BOURA & SVOLMANIS, 1984).
Segundo LUFT (2001), a Ang II é considerada um hormônio
regulatório, estimulando a constricção das células do músculo liso vascular,
secreção de aldosterona da glândula adrenal e a reabsorção de sódio nos
túbulos renais. Através dessas ações, o SRA exerce um papel importante na
regulação do equilíbrio hidroeletrolítico e da pressão arterial (PA) (MIFUNE et
al., 2000; LUFT, 2001; JOHANSSON et al., 2001).
A Ang II é uma substância pressora muito potente e esta resposta
pressora se deve, em grande parte, à contração direta do músculo liso
vascular, especialmente o arteriolar. No entanto, a Ang II também pode
4
aumentar a PA por ação sobre o cérebro e o sistema nervoso autônomo. Ela
age sobre o cérebro reajustando o controle reflexo barorreceptor da freqüência
cardíaca para uma pressão mais alta; assim, a resposta pressora a Ang II
geralmente é acompanhada de pouca ou nenhuma bradicardia. A Ang II
também interage com o sistema nervoso autônomo periférico estimulando os
gânglios autonômicos, aumentando a liberação de adrenalina e noradrenalina
pela medula supra-renal e facilitando a transmissão simpática pela ação nos
terminais nervosos adrenérgicos (REID, 1992).
A Ang II é mitogênica para células musculares cardíacas e
vasculares e pode contribuir para a hipertrofia cardiovascular (SCHELLING,
1991; CAO et al., 1999). Segundo KONSTAM e cols (1992) já existem
evidências de que os inibidores da enzima conversora de angiotensina (ECA)
vão retardar, ou mesmo evitar, o desenvolvimento de alterações morfológicas
subseqüentes a infartos do miocárdio evitando, assim, o aparecimento
posterior de insuficiência cardíaca congestiva.
Portanto, a Ang II regula a PA, o volume plasmático, a atividade de
nervos simpáticos; ela também desempenha um papel importante na
patogênese das doenças cardiovasculares, como hipertrofia, infarto do
miocárdio, hipertensão e aterosclerose. A Ang II era inicialmente conhecida
apenas como um peptídeo vasoconstrictor. No entanto, vários estudos já
comprovaram que ela apresenta características de fator de crescimento e de
citocina, desempenhando um papel ativo no processo inflamatório (HORIUCHI
et al., 1999; RUIZ-ORTEGA et al., 2000; TOUYZ & BERRY, 2002).
2. RECEPTORES DA ANGIOTENSINA II
5
A Ang II exerce ações em diversos tecidos controlando o tônus
vascular, a secreção de hormônios, o crescimento tecidual e as atividades
neuronais. Todas essas ações ocorrem devido à modulação de receptores
específicos, designados como receptor do tipo 1(AT1) e receptor do tipo 2
(AT2). Eles foram seqüenciados e clonados com base na afinidade diferencial
por ligantes peptídicos (CGP 42112A) e não-peptídicos (Losartan -LOS, PD
123319) (BUMPUS et al., 1991).
A maior parte das ações conhecidas da Ang II nos tecidos adultos é
mediada pelos receptores AT1. Os receptores AT2 são abundantemente
expressos em tecidos fetais, mas presentes apenas em extensão limitada nos
tecidos adultos, como medula adrenal, regiões específicas do cérebro,
miométrio uterino e coração (GRIENDLING et al., 1996; BELONI et al., 1998).
No entanto, uma up regulation de receptores AT2 já foi relatada em algumas
condições, como no infarto do miocárdio, na hipertrofia cardíaca e nos
processos de cicatrização da pele, sugerindo um envolvimento de tal receptor
com processos de crescimento, desenvolvimento e diferenciação celular
(VISWANATHAN & SAAVEDRA, 1992; VISWANATHAN et al., 1996; ICHIKI et
al., 1996; WALSH et al., 1997).
Os receptores AT1 têm grande afinidade por LOS e pouca afinidade
por PD 123319 e CGP 42112A, enquanto os receptores AT2 têm grande
afinidade por PD 123319 e CGP 42112A e pouca afinidade por LOS. A Ang II
liga-se igualmente a ambos os subtipos. No entanto, a proporção relativa dos
dois subtipos varia de um tecido para o outro (MARTINEAU et al., 1999;
JOHANSSON et al., 2001; TOUYZ & BERRY, 2002).
6
Segundo TOUYZ & BERRY (2002) a Ang II é um hormônio
multifuncional que influencia a função de células cardiovasculares através de
uma complexa série de eventos sinalizadores intracelulares iniciados pela
ligação da Ang II aos receptores AT1 e AT2. De acordo com os autores, a
ativação dos receptores AT1 normalmente promove crescimento celular,
vasoconstricção, respostas inflamatórias e retenção de sal e água, enquanto os
receptores AT2 induzem apoptose, vasodilatação e natriurese. Os efeitos
mencionados são mediados por complexas vias sinalizadoras envolvendo
estimulação da fosfolipase C (PLC) e mobilização de cálcio; ativação de
fosfolipase D (PLD), fosfolipase A
2
(PLA
2
), proteína quinase C (PKC), MAP
quinases e NADPH oxidase e estimulação da transcrição genética. Além disso,
a Ang II pode ativar várias tirosinas quinases intracelulares, desempenhando
um papel importante no crescimento e na inflamação (MATSUSAKA &
ICHIKAWA, 1997).
Os receptores AT1 são o subtipo predominante no controle das
funções vasculares mediadas por Ang II (MATSUSAKA & ICHIKAWA, 1997).
Na vasculatura, receptores AT1 são expressos principalmente nas células
musculares lisas (MATSUSAKA & ICHIKAWA, 1997). No coração, os
receptores AT1 estão presentes nos cardiomiócitos e fibroblastos (ALLEN,
ZHUO & MENDELSOHN, 2000). O efeito vasoconstrictor da Ang II ocorre
através da ativação dos receptores AT1, o que contribui para o aumento da PA.
Esse efeito da Ang II via receptores AT1 já vem sendo utilizado no tratamento
farmacológico da hipertensão arterial, onde são utilizadas drogas bloqueadoras
seletivas desses receptores. Os antagonistas normalmente utilizados são o
LOS e o Valsartan (CAREY et al., 2001). CHENG e cols (1999) demonstraram
7
que Ang II é um potente ativador da expressão gênica de Monocyte
Chemoattractant Protein-1 (MCP-1) em cultura de células musculares lisas. Os
autores também demonstraram que a indução de MCP-1 pela Ang II ocorreu
através de um mecanismo mediado por receptores AT1. Tais ações pró-
inflamatórias da Ang II via receptores AT1 podem contribuir para a
aterogênese, uma vez que promovem a migração de monócitos para a parede
dos vasos. Além disso, Ang II induziu aumento da expressão do fator de
permeabilidade vascular em células musculares lisas da vasculatura humana e
isso foi inibido pelo Losartan, antagonista de receptores AT1 (WILLIAMS et al.,
1995). Isso sugere que os receptores AT1 medeiam o aumento de
permeabilidade vascular promovido pela Ang II.
O bloqueio de receptores AT1 em ratos reduziu a hipertrofia cardíaca
e a fibrose após infarto do miocárdio, sugerindo um papel de tais receptores em
promover o crescimento celular e o desenvolvimento de fibrose (SCHIEFFER
et al., 1994). Segundo WU e cols (2001), o bloqueio de receptores AT1
associado à estimulação de receptores AT2 atenuou a formação da neoíntima
e inibiu a inflamação em artérias de camundongos que sofreram injúria,
sugerindo que receptores AT1 estão envolvidos nos processos de crescimento
celular e de inflamação.
FUNAKOSHI e cols (1999) investigaram o efeito da Ang II sobre a
produção de interleucina 6 (IL-6) em cultura de células musculares lisas da
vasculatura de ratos in vitro. Ang II potenciou de forma significativa e dose-
dependente a expressão de IL-6, que, segundo os autores, é uma citocina pró-
inflamatória. Esse efeito foi completamente bloqueado pelo antagonista dos
8
receptores AT1, o CV11974, sugerindo um papel de receptores AT1 em induzir
a síntese de citocinas, apresentando efeito pró-inflamatório.
A ligação da Ang II ao receptor AT1 leva à ativação de proteínas G
através da troca de guanosina trifosfato (GTP) por guanosina difosfato (GDP),
resultando em liberação da subunidade α e do complexo βγ, que medeiam as
ações subseqüentes. Os receptores AT1 interagem com vários tipos de
proteína G, como Gq/11, Gi, Gα12 e Gα13. As diferentes isoformas de proteína
G estão ligadas a diferentes cascatas de sinalização. A ativação de Gq, por
exemplo, resulta em ativação da PLC, ao passo que Gα leva à formação de
guanosina monofosfato cíclico (GMP
c
) (TOUYZ & BERRY, 2002).
A segunda maior isoforma de receptores da Ang II, são os receptores
AT2, cuja expressão pode ser modulada por estados patológicos associados
com remodelamento tecidual e inflamação (MATSUBARA, 1998; AKISHITA et
al., 2000). Tais receptores são re-expressos em adultos após injúria vascular e
cardíaca (infarto do miocárdio) e também durante os processos de cicatrização
e obstrução renal, sugerindo que o receptor AT2 está intimamente envolvido
com o crescimento, desenvolvimento e diferenciação celular (VISWANATHAN
& SAAVEDRA, 1992; VISWANATHAN et al., 1996; ICHIKI et al., 1996; WALSH
et al., 1997). O papel funcional destes receptores ainda não foi bem
esclarecido, mas sabe-se que eles podem antagonizar, sob condições
fisiológicas, os efeitos mediados pelos receptores AT1 e assim inibir o
crescimento celular, promover apoptose e vasodilatação (HORIUCHI et al.,
1997; MATSUBARA, 1998; TOUYZ et al., 1999; TOUYZ & BERRY, 2002). Na
insuficiência cardíaca e na formação da neoíntima após injúria, receptores AT2
são re-expressos nas células que estão proliferando, exercendo um efeito
9
inibitório sobre os sinais mitogênicos produzidos pela Ang II, bem como sobre a
síntese de matriz extracelular, resultando em atenuação da remodelação
tecidual. Uma forma extrema de inibição do crescimento celular culmina com a
indução da morte celular programada (apoptose), que foi induzida via
receptores AT2 (MATSUBARA, 1998).
Em miócitos cardíacos e nas células da musculatura lisa vascular de
camundongos que apresentavam sobre-expressão de receptores AT2, houve
inibição da atividade pressora da Ang II. Além disso, a ativação desses
receptores nos sistemas cardiovascular e renal, resultou em cardioproteção,
vasodilatação e natriurese, efeitos contrários àqueles normalmente observados
para receptores AT1 (NAKAJIMA et al., 1995; MATSUBARA, 1998). Além
disso, dados da literatura demonstram que os receptores AT2 participam da
secreção de catecolaminas pela glândula adrenal (MARTINEAU et al., 1999),
da síntese de colágeno em células musculares lisas da vasculatura in vitro
(KATO et al., 1999; MIFUNE et al., 2000), da secreção mucosa alcalina no
duodeno (JOHANSSON et al., 2001) e também de processos pró-inflamatórios
(RAGHAVENDRA & KULKARNI, 2000; SUZUKI et al., 2000; RUIZ-ORTEGA et
al., 2001).
Os receptores AT2 podem também exercer um papel importante no
controle da PA. Dados científicos indicam que esses receptores induzem uma
vasodilatação sistêmica, contrabalançando o efeito vasoconstrictor da Ang II
sobre os receptores AT1. Essas pesquisas a respeito dos receptores AT2
tornaram-se possíveis com a descoberta de agonistas e antagonistas seletivos
para este receptor, como o CGP 42112 A e o PD 123319, respectivamente
(BARBER et al., 1999; CAREY et al., 2001).
10
As principais cascatas envolvidas com a sinalização de receptores
AT2 são: ativação de proteínas fosfatase e proteínas que promovem
desfosforilação; regulação do sistema GMP
c
- óxido nítrico (NO) e estimulação
da PLA
2
(MATSUBARA, 1998; HORIUCHI et al., 1999).
SEYEDI e cols (1995) estudaram os vasos sangüíneos de corações
de cães e pesquisaram se Ang I, II e seus fragmentos metabólicos (Ang III, IV
e Ang-1-7) seriam capazes de promover a liberação de NO e quais seriam os
mecanismos envolvidos neste processo. Ang I, II e todos os seus fragmentos
metabólicos promoveram significante aumento da liberação de nitrito. Tal efeito
foi bloqueado por Hoe 140, um antagonista dos receptores B2 de bradicinina
(BK), indicando que a liberação de nitrito está relacionada com a formação
local de cininas. O antagonista de receptores AT1, LOS e o antagonista de
receptores AT2, PD 123319 eliminaram a liberação de nitrito em resposta aos
diversos tipos de Ang. Os autores concluíram que a formação de nitrito na
microvasculatura coronária bem como nas grandes artérias de cães em
resposta aos diversos tipos de Ang ocorre devido à ativação da produção local
de cininas. Segundo o estudo de Boulanger e cols (1995), o estímulo de
receptores AT1 de carótidas de ratos causou a liberação de NO que, por sua
vez, inibiu a vasoconstricção proporcionada pela Ang II, fenômeno também
mediado pelos receptores AT1.
Segundo RUIZ-ORTEGA e cols (2000) a Ang II ativa o fator de
transcrição nuclear κ B (NF-κB) através de AT1 e de AT2 nas células da
musculatura lisa vascular. NF-κB é um fator de transcrição ambíguo de
importância particular para a resposta inflamatória. Vários estímulos relevantes
nas doenças cardiovasculares podem ativar este fator, a saber: citocinas pró-
11
inflamatórias, NO, espécies reativas de oxigênio e também as forças
mecânicas. Uma vez ativado, NF-κB leva ao aumento da expressão de vários
genes cujos produtos (citocinas, quimiocinas e moléculas de adesão) medeiam
a resposta inflamatória.
Os receptores AT1 e AT2 estão ligados à membrana plasmática das
células-alvo, o que possibilita o início rápido das ações fisiológicas da Ang II.
Além disso, grande parte das ações da Ang II que são mediadas pelos
receptores AT1 e AT2 são ações opostas, exibindo, assim, um antagonismo
fisiológico na maioria dos casos (MATSUBARA, 1998; HORIUCHI et al., 1999;
DE GASPARO et al., 2000; WU et al., 2001).
3. ASPECTOS GERAIS DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA
Embora os primeiros relatos sobre a inflamação tenham sido
encontrados em escritos egípcios de 3000 anos a.C., foi Cornelius Celsus, um
escritor romano, que, no início da era cristã, descreveu os quatro sinais
cardinais da reação inflamatória: rubor, calor, tumor e dor. O quinto sinal,
perda de função, foi mais tarde acrescentado por Vircchow no século XIX (apud
ROCHA E SILVA, 1978; SEDGWICK & WILLOUGHBY, 1985).
Em 1973, John Hunter observou que a inflamação não deve ser
classificada como uma doença, mas sim como um conjunto de reações não
específicas. No século XIX, Julius Cohnheim foi o primeiro a utilizar o
microscópio para observar os vasos sanguíneos em tecidos inflamados. Dando
continuidade às inúmeras descobertas que ajudaram a explicar o processo
inflamatório, um biólogo russo, Elie Metchnikoff descobriu o processo da
12
fagocitose em 1882; segundo Metchnikoff, o propósito da inflamação seria levar
células fagocíticas ao sítio da injúria para destruir o microorganismo invasor.
Isso, no entanto, não corroborava com a teoria humoral de Paul Ehrlich vigente
àquela época de que o objetivo da reação inflamatória seria levar os fatores
derivados do plasma ao sítio da injúria para neutralizar os agentes infecciosos.
A partir de então, reconheceu-se que tanto o fator celular (fagócitos) quanto o
fator derivado do plasma (anticorpos) são importantes para a defesa contra os
microorganismos. Outro nome importante ligado à história do estudo do
processo inflamatório foi Thomas Lewis, que estabeleceu o conceito de que
algumas substâncias químicas formadas em resposta a injuria, como a
histamina, medeiam alterações vasculares importantes no processo da
inflamação. Esse conceito de Lewis foi muito importante, uma vez que abordou
a existência dos mediadores químicos da inflamação e, conseqüentemente,
possibilitou o uso de agentes antiinflamatórios (apud COLLINS, 1999).
O evento desencadeante da reação inflamatória é o reconhecimento,
por receptores de superfície de macrófagos ou células dendríticas, de padrões
moleculares associados a patógenos (PMAP) (MEDZHITOV & JANEWAY,
2000). Essas estruturas são componentes que grandes classes de patógenos
têm em comum, como o lipopolissacarídeos (LPS) das paredes bacterianas
(RANG et al., 2003). A interação entre PMAP e receptor produz uma resposta
imediata que envolve endocitose do agente estranho, gerando sua destruição e
o processamento de seus componentes, posteriormente apresentados como
antígenos; ativação de NF-κB, que estimula a transcrição dos genes
relacionados à produção de citocinas pró-inflamatórias, dentre as quais se
13
destacam a IL-1 e o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) (PARKIN & COHEN,
2001).
Vários agentes exógenos e endógenos podem causar injúria celular.
Estes mesmos estímulos são capazes de evocar uma série complexa de
reações, em especial nos tecidos vascularizados, chamadas de reações
inflamatórias. Microscopicamente, este processo envolve alguns eventos: a)
dilatação de artérias, capilares e vênulas com aumento da permeabilidade e do
fluxo sanguíneo; b) exudação de fluidos, incluindo proteínas plasmáticas e c)
migração de leucócitos para o foco da inflamação. (ROCHA E SILVA, 1978;
SEDGWICK & WILLOUGHBY, 1985; COLLINS, 1999)
A inflamação pode ser didaticamente dividida em duas fases: aguda
e crônica. A inflamação aguda é de duração relativamente curta, podendo durar
minutos, horas ou mesmo alguns dias; sua principal característica é a presença
de exudato rico em proteínas plasmáticas (edema) e a migração de leucócitos,
principalmente os neutrófilos. A inflamação crônica, porém, é de longa duração
e está relacionada com algumas alterações histológicas, como presença de
linfócitos e macrófagos, proliferação de vasos sanguíneos, fibrose e necrose do
tecido (COLLINS, 1999; RANG et al., 2003).
A resposta inflamatória normalmente ocorre simultaneamente ao
processo de reparo. Além de destruir, diluir ou imobilizar o agente agressor, a
inflamação é responsável por eventos que, sempre que possível, promovem a
cura e a cicatrização do tecido afetado. O processo de reparo inicia-se já nas
primeiras fases da inflamação, mas atinge seu clímax após a neutralização do
agente agressor (COLLINS, 1999; RANG et al., 2003).
14
A inflamação é fundamentalmente uma resposta protetora que tem
como meta livrar o organismo tanto da causa inicial da injúria (micróbios,
toxinas) como também das conseqüências de tal injúria (células e tecidos
necróticos). No entanto, existem algumas condições em que a falta de resposta
inflamatória, ou mesmo a sua exarcebação, pode tornar-se incompatível à
saúde do organismo. Quando as defesas estão diminuídas, como ocorre na
Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS), ou mesmo quando as defesas
encontram-se suprimidas por drogas, organismos que normalmente não são
patógenos podem causar doenças. Em outras circunstâncias, a reação
inflamatória pode ocorrer frente a tipos diferentes de injúrias, como, por
exemplo, o calor, os agentes químicos e as radiações ultravioleta. Além disso,
algumas vezes os eventos inflamatórios podem ocorrer contra substâncias que
normalmente são inócuas ao organismo (como o pólem) ou mesmo contra os
tecidos do próprio corpo (condições auto-imunes). Quando isso acontece, as
respostas podem produzir destruição e podem ainda constituir-se parte do
processo da doença – tanto de forma aguda, como por exemplo na anafilaxia
como de forma crônica, como na asma, na artrite reumatóide ou na
aterosclerose. As drogas antiinflamatórias e imunossupressoras são utilizadas
exatamente nesses tipos de condições (COLLINS, 1999; RANG et al., 2003).
4. RERMEABILIDADE VASCULAR E EDEMA
As alterações no fluxo e no calibre vascular iniciam-se logo após a
injúria e se desenvolvem em níveis variados, dependendo da seriedade desta.
Esses eventos foram descritos por COLLINS (1999). Inicialmente, ocorre uma
15
vasodilatação, que primeiro envolve as arteríolas e, depois, promove a abertura
de novos leitos capilares na área. Conseqüentemente há também um aumento
do fluxo sanguíneo, que é a causa do calor e do rubor; o tempo de duração da
vasodilatação depende do tipo de estímulo. Com o tempo, a velocidade de
circulação sanguínea é diminuída devido ao aumento da permeabilidade na
microvasculatura, com extravasamento de fluido rico em proteína para o
espaço extravascular. A perda de fluido resulta em concentração de glóbulos
vermelhos nos vasos pequenos e aumento da viscosidade do sangue, uma
condição chamada de estase. Enquanto a estase se desenvolve, os leucócitos,
especialmente os neutrófilos, começam a adquirir uma orientação periférica ao
longo do endotélio vascular, num processo chamado de marginação
leucocitária. Esse fenômeno deve-se à estase sangüínea com redução da força
de cisalhamento da parede vascular (COLLINS, 1999; BRITO & RIBEIRO,
1999). Os leucócitos, então, aderem-se ao endotélio, inicialmente de forma
transitória (rolling), e depois mais avidamente, até, finalmente, migrar através
da parede vascular para o tecido intersticial.
O aumento da permeabilidade vascular leva ao escape de fluido rico
em proteína (exudato) para o interstício. Isso resulta em diminuição da pressão
oncótica intravascular e aumento da pressão oncótica do fluido intersticial. Este
fato, juntamente com o aumento da pressão hidrostática causada pela
vasodilatação, produz uma marcante saída de fluido intravascular e acúmulo
deste nos tecidos, caracterizando a formação de edema.
Como podemos observar, para que ocorram todos estes eventos
descritos é fundamental que ocorram alterações no endotélio para explicar as
modificações observadas no mesmo. Existem alguns mecanismos que foram
16
propostos por MAJNO & PALADE (1961) e modificados por COLLINS (1999).
O primeiro deles consiste na formação de fendas no endotélio das vênulas.
Este é o mecanismo pelo qual histamina, BK, leucotrienos (LT), substância P e
vários outros mediadores químicos agem. O aumento de permeabilidade ocorre
rapidamente após a exposição ao mediador e consiste em um evento de curta
duração (15 a 30 minutos); este mecanismo afeta apenas as vênulas (MAJNO
& PALADE, 1961; BOWDEN et al., 1996). Uma outra forma de modificação que
pode ocorrer no endotélio é a reorganização do citoesqueleto com retração
endotelial, que pode ser induzida in vitro por algumas citocinas – como IL-1,
TNF-α e interferon-γ (IFN-γ) – por hipoxia e por injúrias sub-letais às células
endoteliais. Em contraste ao efeito da histamina, a resposta é normalmente
retardada (4 a 6 horas) e de longa duração (24 horas ou mais); ainda
permanece incerta a hipótese de que este mecanismo contribua para o
aumento da permeabilidade in vivo (BRETT et al., 1989). O aumento da
trancitose ao longo do citoplasma endotelial também pode contribuir para a
modificação do endotélio vascular. Tal trancitose ocorre ao longo de canais que
consistem em um agrupamento de vesículas e vacúolos chamados de
organelas vesiculo-vacuolares; várias destas estão localizadas próximo às
junções intercelulares. Certos fatores, como o fator de crescimento endotelial
vascular parecem causar fendas vasculares por aumentar o número e, talvez, o
tamanho desses canais. Esse pode ser parte do mecanismo de aumento da
permeabilidade vascular induzido pela histamina e outros mediadores químicos
(FENG et al., 1996). A injúria endotelial direta pode resultar em necrose da
célula endotelial e destacamento. Esse efeito ocorre normalmente devido à
destruição direta do endotélio por estímulos, como por exemplo queimaduras
17
severas ou infecções bacterianas líticas. Todos os níveis de microcirculação
são atingidos: vênulas, capilares e arteríolas (COTRAN & BRISCOE, 1997).
Um outro mecanismo proposto para a modificação do endotélio consiste em um
aumento tardio e prolongado da permeabilidade vascular. Tal aumento inicia-se
2 a 12 horas após o estímulo, dura por várias horas ou mesmo por dias e
envolve vênulas e capilares. Injúrias térmicas de intensidade média a
moderada, radiação X ou radiação ultravioleta, além de certas toxinas
bacterianas, podem formar fendas no endotélio. O mecanismo de ação destes
agentes permanece incerto, podendo ser por efeito direto do agente, levando à
destruição celular e apoptose ou mesmo por um efeito de citocinas, causando
retração endotelial. A injúria endotelial mediada por leucócitos também pode
contribuir para a perda de integridade endotelial. Os leucócitos aderem ao
endotélio relativamente cedo durante a reação inflamatória. Eles podem ser
ativados durante esse processo, liberando espécies reativas de oxigênio e
enzimas proteolíticas, que causam injúria endotelial, bem como destacamento
das células, resultando em aumento da permeabilidade vascular. As
substâncias leucocitárias, como o LTB
4
, o 5° componente do sistema
complemento (C5a) e o fMLP (N-formyl-met-leu-phe) não foram efetivos em
produzir aumento de permeabilidade vascular em animais injetados com
mostarda nitrogenada, usada para depletar leucócitos polimorfonucleares
(PMN). Isso sugere que, ao contrário de histamina e BK, que aumentam a
permeabilidade vascular pela ação direta sobre a célula endotelial, as
substâncias LTB
4
, C5a e fMLP agem somente na presença de leucócitos PMN.
Apesar de os leucócitos PMN estarem presentes em grande quantidade no
tecido, depois de várias horas do início da resposta inflamatória, evidências
18
sugerem que essas células interagem com o endotélio vascular para regular a
permeabilidade poucos minutos após o estímulo inflamatório (WEDMORE &
WILLIAMS, 1981). Além disso, durante o reparo, muitas células endoteliais
proliferam formando novos vasos sanguíneos (angiogênese). Esses novos
vasos permanecem com fendas até que haja diferenciação das células
endoteliais, formando as junções intercelulares.
Embora estes mecanismos tenham sido descritos separadamente,
todos podem atuar em conjunto frente a um único estímulo (COLLINS, 1999).
A histamina é largamente distribuída nos tecidos, e é proveniente
principalmente dos mastócitos, que estão normalmente presentes no tecido
conjuntivo adjacente aos vasos sanguíneos. A histamina está também presente
nos basófilos e plaquetas. Os grânulos dos mastócitos contêm uma grande
quantidade de histamina pré-formada; ela é liberada durante o processo de
degranulação, que ocorre em resposta a vários estímulos: injúria física, como
trauma, frio ou calor; reações imunes envolvendo a ligação de anticorpos aos
mastócitos; fragmentos do sistema complemento (anafilatoxinas- C5a e 3°
componente do sistema complemento – C3a); proteína liberadora de histamina,
derivada dos leucócitos; neuropeptídeos (substância P) e algumas citocinas
(IL-1, IL-8). Em humanos, a histamina causa dilatação das arteríolas e aumento
da permeabilidade vascular de vênulas. A histamina é, então, considerada
como o principal mediador da fase imediata do aumento de permeabilidade
vascular, causando fendas entre as células endoteliais venulares. A histamina
age na microcirculação principalmente via receptores do tipo H
1
localizados nas
células endoteliais (COLLINS, 1999). Estudos em tecidos intactos e em células
endoteliais em cultura demonstraram que a ligação da histamina ao receptor
19
resulta em mudança de forma (contração) da célula endotelial e em formação
de espaços de 1 μm de diâmetro entre células adjacentes; esses espaços
levam ao extravasamento de macromoléculas. A estimulação de receptores H
1
em células umbilicais humanas em cultura está associada à hidrólise de
fosfatidilinositol e aumento do cálcio intracelular proveniente, inicialmente dos
estoques intracelulares, mas posteriormente do meio extracelular. O fato de a
citocalasina B (proteína que inibe a polimerização da actina) inibir o aumento
da permeabilidade vascular induzido por histamina sugere que a contração da
célula endotelial é essencial para a obtenção deste efeito. Agentes que
aumentam os níveis de adenosina monofosfato cíclico (AMP
c
) intracelular,
como os agonistas β-adrenérgicos, as metilxantinas e a prostaglandina E
1
(PGE
1
) revertem efetivamente a permeabilidade vascular induzida pela
histamina (GALLIN et al., 1992).
A histamina também é capaz de fazer com que as células endoteliais
sintetizem substâncias relaxantes para a musculatura lisa vascular, como a
prostaciclina e o NO (LUKACS et al., 1996).
A serotonina (5-hidroxitriptamina ou 5-HT) é também um mediador
vasoativo pré-formado com ações semelhantes àquelas descritas para a
histamina. A serotonina está presente nas plaquetas, nas células
enterocromafins e também nos mastócitos em roedores, mas não em
humanos.
A liberação de serotonina (e de histamina) das plaquetas é
estimulada durante a agregação plaquetária, após contato com colágeno,
trombina, adenosina difosfato (ADP) e complexo antígeno-anticorpo. A
agregação e liberação plaquetária de serotonina e de histamina é também
20
estimulada pelo fator de agregação plaquetária (PAF), derivado dos mastócitos,
durante as reações mediadas por imunoglobulina-E (Ig-E). Sendo assim, a
reação de liberação das plaquetas resulta em aumento de permeabilidade
vascular durante as reações imunológicas (COLLINS, 1999).
A BK é um cininogênio vasoativo (nonapeptídio) de alto peso
molecular que apresenta um potente efeito sobre a permeabilidade vascular.
Seus efeitos são similares aos da histamina. A BK é um importante mediador
da resposta inflamatória tecidual a estímulos irritantes, porém sua ação é de
curta duração, pois ela sofre uma rápida inativação enzimática. A degradação
enzimática pode ser feita por várias peptidases, incluindo a dipeptidil
carboxipeptidase cininase II. Esta enzima é a mesma enzima conversora que
hidrolisa a angiotensina I em angiotensina II (BOURA & SVOLMANIS, 1984).
As PGs, especialmente a PGI
2
, têm efeito sinérgico com outros
mediadores em induzir aumento de permeabilidade vascular e edema. PGs
exógenas sozinhas são indutores fracos de edema em algumas espécies como
cobaia (WILLIAMS & MORLEY, 1973) e coelho (WILLIAMS & PECK, 1977),
enquanto em rato (CRUNKHORN & WILLIS, 1971) e no homem (BASRAN et
al., 1982) elas induzem edema de forma mais acentuada. No entanto, apesar
da diferença entre as espécies, PGs da série E liberadas de células ou geradas
de precursores humorais no sítio da inflamação são sinérgicas com outros
mediadores, potenciando os efeitos pró-inflamatórios (WILLIAMS & PECK,
1977; WILLIAMS & JOSE, 1981; BASRAN et al., 1982; BUCKLEY et al., 1991).
A fonte endógena de PGs durante a inflamação aguda ainda não
está totalmente esclarecida. Todavia, as células endoteliais são prováveis
candidatas. Adicionalmente, outras células, como macrófagos e neutrófilos
21
presentes no tecido conjuntivo perivascular, podem também contribuir para a
produção dessas PGs (DAVIES & MacINTYRE, 1992).
5. A BIOLOGIA DOS MASTÓCITOS
Os mastócitos são células inflamatórias derivadas de progenitores
presentes na medula óssea, porém são amplamente distribuídos nos tecidos e
podem liberar mediadores que apresentam efeitos imediatos e crônicos
(ZHONG et al., 2001). Na espécie humana, os mastócitos são encontrados em
grande número nas adjacências dos vasos sanguíneos ou dos vasos linfáticos,
sendo também predominantes na superfície da pele e nas mucosas
geniturinária, gastrintestinal e do trato respiratório (ABBAS et al., 2000).
Estima-se que a concentração de mastócitos seja de aproximadamente 500 a
4000 por mm
3
no pulmão, 7000
a 12000 por mm
3
na pele e de 20000 por mm
3
no trato gastrintestinal (GALLI, 1993). Os mastócitos são células ricas em
fatores de crescimento que infiltram os tecidos injuriados, onde têm sido
implicados na patogênese da fibrose progressiva. A infiltração de mastócitos e
a expressão de citocinas em seus grânulos são importantes quando se trata de
injúria renal, podendo tais células contribuir para a patogênese da injúria renal
(JONES et al., 2003).
Os mastócitos expressam em sua membrana superficial receptores
para IgE – FcεRI e FcεRII/CD3 (respectivamente de alta e baixa afinidade por
IgE) e para componentes do sistema complemento, especialmente para C3a e
C5a (BUKU et al., 2001; RANG et al., 2003). Os mastócitos estão envolvidos
com as reações anafiláticas a alimentos, drogas ou venenos de animais; nestas
22
reações agudas, os anticorpos IgE ligam-se aos receptores específicos,
promovendo degranulação celular e liberando, então, uma grande quantidade
de mediadores (COLLINS, 1999).
Há bastante tempo, os mastócitos têm sido considerados células
efetoras críticas durante as doenças alérgicas mediadas por IgE e durante as
respostas imunes aos parasitas. Porém, FROSSI e cols (2004) sugerem que
essa afirmativa a respeito da função dos mastócitos é incompleta e que tal
afirmativa não considera o complexo papel desempenhado pelos mastócitos
durante a imunidade adaptativa e inata. Isso gera uma nova visão a respeito da
regulação das respostas imunes e do desenvolvimento das doenças auto-
imunes.
RIBEIRO e cols (1997) demonstraram que os mastócitos podem ser
estimulados sem, no entanto, sofrerem degranulação; nesse estudo,
mastócitos estimulados por LTB
4
produziram um fator quimiotático para
neutrófilos sem haver degranulação.
Além de promoverem amplificação da inflamação aguda, os
mastócitos são responsáveis pela secreção de um grande número de
mediadores pró-inflamatórios que contribuem para a manutenção de estados
inflamatórios crônicos, como úlcera intestinal, artrite reumatóide, cistite
intersticial, escleroderma e doença de Crohn (ABRAHAM & MALAVIYA, 1997).
Uma vez estimulados por IgE via FcεRI ou de forma não específica
por outra proteína, os mastócitos, células altamente especializadas na síntese
e secreção de substâncias farmacologicamente ativas, liberam uma grande
quantidade de mediadores químicos. Estas substâncias podem ser divididas
em duas classes: os mediadores pré-formados, tais como histamina, serotonina
23
(RANG et al., 2003) e uma pequena quantidade de TNF-α (BEIL et al., 1994;
BEIL et al., 1996; SCHMIDT-CHOUDHURY et al., 1996) e os mediadores
oriundos da chamada síntese “de novo”; os LTs (LTB
4
, LTC
4
), as PGs (PGD
2
),
as citocinas (TNF-α e ILs 3, 4, 5, 6, 8) e quimiocinas (MIP-1 e CINC-1 e 13)
fazem parte desta segunda classe (BANKS & COLEMAN, 1996; BIEDERMANN
et al., 2000; WAKAHARA et al., 2001; ZHONG et al., 2001; OLIVEIRA et al.,
2002). Além destes mediadores, os mastócitos podem também liberar
superóxidos (FUKUISH et al., 1997).
Os mastócitos são células capazes de gerar e secretar mediadores
que podem provocar mudanças vasculares e alterações celulares; estas
células podem afetar alguns fatores do plasma, bem como induzir migração de
neutrófilos nas primeiras horas e de eosinófilos após 24 horas (OLIANI et al.,
2001; OLIVEIRA et al., 2002).
Os produtos de ativação dos mastócitos podem ser liberados por
diferentes mecanismos de exocitose dependendo do tipo de agonista
(ABRAHAM & MALAVIYA, 1997).
DVORAK (1997) revelou dois mecanismos básicos de exocitose de
mastócitos: o mecanismo de liberação lenta dos mediadores e o mecanismo de
liberação rápida, também conhecido como degranulação anafilática. O
mecanismo de liberação lenta consiste em um esvaziamento lento dos
grânulos, com ausência de fusão intergranular. Já o segundo mecanismo é
descrito como explosivo, constituído de eventos de secreção rápida que se
completam minutos após a estimulação e parecem ser iniciados pela fusão
coordenada dos grânulos com concomitante secreção de mediadores através
da degranulação intracitoplasmática (DVORAK, 1997).
24
Os passos bioquímicos que envolvem a degranulação anafilática são
apenas parcialmente conhecidos; supõe-se que a ligação cruzada das IgEs ao
antígeno ative uma proteína G de ligação a GTP, que, por sua vez, provoca a
ativação de uma PLC específica para o bifosfato de fosfatidilinositol (PIP
2
).
Essa enzima catalisa a liberação de trifosfato de inositol (IP
3
) e de dialcilglicerol
(DAG) do PIP
2
de membrana. O IP
3
promove a liberação do cálcio intracelular
do retículo endoplasmático. Cálcio e DAG combinam-se com fosfolipídeos de
membrana para a ativação da proteína quinase. Com o aumento da
concentração citoplasmática de cálcio, ocorre ativação de enzimas, como a
PLA
2
; além disso, o complexo cálcio-calmodulina é capaz de ativar a quinase
de cadeia leve de miosina. Nos mastócitos, o resultado desta ativação é a
geração de mediadores lipídicos, como as PGs e LTs bem como a exocitose
dos grânulos. (ABBAS et al., 2000).
Os mastócitos são heterogêneos, ou seja, nem todas as células
liberam os mesmos mediadores ou o mesmo conjunto de mediadores. Os seus
grânulos contêm mediadores vasoativos não-lipídicos de baixo peso molecular,
sendo a histamina o protótipo desse tipo de mediador; no entanto, em certos
roedores, como no rato, a serotonina pode ter importância igual ou superior
(GALLI, 1993). Os grânulos dos mastócitos contêm também diversas enzimas,
(serino-proteases, aril-sulfatase) e também os proteoglicanos (heparina, sulfato
de condroitina) (ABBAS et al., 2000).
Além dos mediadores não-lipídicos, há, ainda, três classes de
mediadores lipídicos sintetizados pelos mastócitos quando estes são ativados.
Em geral, estas reações de síntese são iniciadas pela PLA
2
que promove a
liberação dos substratos de fosfolipídeos precursores armazenados nos corpos
25
lipídicos. O primeiro mediador lipídico descrito foi a PGD
2
, que se liga a
receptores localizados nas células da musculatura lisa, atuando como agente
vasodilatador e broncoconstrictor. Uma segunda classe de mediadores
derivados do ácido aracdônico provenientes da degranulação de mastócitos
são os LTs, sendo os principais o LTC
4
, o LTD
4
, o LTE
4
e, em menores
proporções, o LTB
4
. O terceiro mediador lipídico produzido por basófilos e,
provavelmente, pelos mastócitos, é o PAF, que tem importância particular nas
reações de fase tardia, onde atuaria ativando leucócitos (GALLI, 1993).
Os mastócitos estão também relacionados à síntese de citocinas.
GALLI e cols (1993) demonstraram que a estimulação in vitro de mastócitos de
ratos por FcεRI, ou mesmo por outros mecanismos, induz o aumento nos níveis
de RNA mensageiro (RNAm), uma maior secreção de substâncias pró-
inflamatórias e, também, o surgimento de citocinas mitogênicas, como as
interleucinas 1, 3, 4 e 6; além disso, há uma elevação nos níveis IFN-λ, de
membros da família das integrinas e de TNF-α. Relata-se também a síntese de
MIP-1e das interleucinas 5, 8/CINC-1 e 13 por mastócitos ativados (BANKS &
COLEMAN, 1996; BIEDERMANN et al., 2000; WAKAHARA et al., 2001;
OLIVEIRA et al., 2002). Em conjunto, essas citocinas regulam não só a
produção de IgE, mas também a resposta inflamatória, a hemostasia, a
hematopoiese, a angiogênese, a remodelação tecidual, dentre outros (GALLI,
1993). Além disso, os mastócitos têm sido implicados em várias doenças
correlacionadas com a neovascularização; o exato mecanismo para explicar
esse fato ainda não foi bem elucidado, porém, GRÜTZKAU (1998) estudou os
mastócitos da linhagem de pele humana HMC-1 e constatou que estas células
26
eram capazes de sintetizar, estocar e secretar o fator de crescimento endotelial
vascular (VEGF) e o fator de permeabilidade vascular (VPF).
Portanto, os mastócitos são considerados células amplificadoras da
reação inflamatória por liberarem e por estimularem a produção de muitos dos
mediadores químicos de tal processo; estes mediadores, por sua vez, podem
atuar aumentando a permeabilidade vascular ou mesmo contribuindo para a
migração e ativação de leucócitos durante a fase mais tardia da inflamação.
6. EVENTOS CELULARES DA INFLAMAÇÃO
Uma função primordial do processo inflamatório consiste em levar os
leucócitos ao sítio da injúria. Os leucócitos, por sua vez, fagocitam agentes
lesivos, matam bactérias e outros micróbios além de degradarem tecidos
necróticos e antígenos estranhos (BEVILACQUA et al., 1994; COLLINS, 1999).
No entanto, os leucócitos podem também prolongar a inflamação e induzir
dano tecidual pela liberação de enzimas, mediadores químicos e radicais
tóxicos de oxigênio (COLLINS, 1999).
A seqüência de eventos que ocorrem durante a jornada dos
leucócitos do lúmen para o tecido intersticial – extravasamento – foi
didaticamente dividida por COLLINS (1999) nos seguintes passos a saber:
marginação, rolling e adesão, que ocorrem ainda no lúmen do vaso;
transmigração através do endotélio (diapedese) e, finalmente, migração nos
tecidos intersticiais em direção a estímulos quimiotáticos.
Como resultado da vasodilatação e do aumento da permeabilidade
vascular, o fluxo sanguíneo torna-se lento e isso faz com que os leucócitos
27
assumam uma posição periférica ao longo da superfície endotelial, fenômeno
este chamado de marginação leucocitária. A partir daí, células leucocitárias
individuais ou em fileiras tombam vagarosamente ao longo do endotélio e
aderem de forma transitória (rolling). Forma-se, então, em vários pontos,
adesões mais firmes entre leucócitos e células endoteliais. Após o
estabelecimento destas adesões firmes, os leucócitos inserem pseudópodes
em direção às junções intercelulares, apertam-se entre estas junções,
assumindo uma posição entre a célula endotelial e a membrana basal.
Finalmente, os leucócitos atravessam a membrana, escapando para o espaço
extravascular. Neutrófilos, monócitos, linfócitos, eosinófilos e basófilos utilizam
essa mesma via (COLLINS, 1999).
Atualmente, sabe-se que a adesão e a transmigração leucocitária
são dependentes da ligação de moléculas de adesão à superfície dos
leucócitos e das células endoteliais. Além disso, os mediadores químicos
(agentes quimiotáticos e certas citocinas) são capazes de influenciar este
processo; isso porque estas substâncias modulam a expressão das superfícies
de adesão e a avidez das moléculas de adesão (LIPOWSKY, 1996;
SPRINGER, 1994). As moléculas de adesão envolvidas nesse processo
dividem-se em quatro famílias – as selectinas as imunoglobulinas, as integrinas
e as glicoproteínas com afinidade por mucina (COLLINS, 1999).
As selectinas são assim chamadas, pois são caracterizadas por um
domínio N-terminal extracelular – domínio lectínico. Há vários tipos de
selectinas: selectina-E, que está presente no endotélio; selectina-P, presente
no endotélio e nas plaquetas e selectina-L, presente em vários tipos de
leucócitos. As selectinas ligam-se, através de seu domínio lectínico, aos
28
oligossacarídeos que apresentam porções siálicas (por exemplo, Sialyl-Lewis
X), que estão presentes na superfície dos leucócitos. O principal papel da
selectina-P é promover o processo de rolling dos neutrófilos, monócitos e
linfócitos. Já a selectina-E , além de promoverem o rolling, promovem a adesão
ao endotélio ativado para neutrófilos, monócitos e células T (BRITO et al.,
1997; COLLINS, 1999).
A família das imunoglobulinas inclui duas moléculas de adesão
endotelial: molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) e molécula de adesão
celular vascular 1 (VCAM-1). Ambas interagem com as integrinas dos
leucócitos. A molécula ICAM-1 é responsável, principalmente, pelos processos
de adesão e de transmigração dos leucócitos; já VCAM-1 participa apenas do
processo de adesão, em especial de eosinófilos, monócitos e linfócitos
(POBER & COTRAN, 1990; COLLINS, 1999).
As integrinas são glicoproteínas heterodiméricas transmembrana; os
principais receptores para ICAM-1 são as β integrinas LFA-1 e MAC-1
(CD11a/CD18 e CD11b/CD18) e para VCAM-1 são as integrinas α
4
β
1
(VLA-4) e
α
4
β
7
(LPAM-1) (COLLINS, 1999).
O tipo de leucócito que migra para o espaço perivascular varia com a
fase em que a lesão inflamatória se encontra e com o tipo de estímulo
inflamatório. Na maior parte das formas de inflamação aguda, os neutrófilos
predominam no infiltrado durante as primeiras 6 a 24 horas, quando são, então,
substituídos por monócitos nas próximas 24 a 48 horas. Essa seqüência pode
ser explicada de forma mais clara pela ativação de diferentes pares de
moléculas de adesão, ou de fatores quimiotáticos específicos nas diversas
fases da inflamação. Além disso, os neutrófilos apresentam vida curta,
29
sofrendo apoptose e desintegrando-se após 24 a 48 horas, ao passo que os
monócitos têm uma maior sobrevida (THURESON-KLEIN et al., 1984;
MIGLIORISI et al., 1987; COLLINS, 1999; BRITO & RIBEIRO, 1999). No
entanto, existem exceções a esse padrão de infiltrado celular; em certas
infecções, como aquelas produzidas por Pseudomonas organisms, em que os
neutrófilos predominam por 2 a 4 dias. Além disso, nas infecções virais, os
linfócitos podem ser as primeiras células a chegar no sítio da inflamação
(COLLINS, 1999).
Após o extravasamento, os leucócitos migram nos tecidos em
direção ao sítio da injúria por um processo chamado de quimiotaxia. A
quimiotaxia consiste em uma locomoção orientada por um gradiente químico.
Todos os granulócitos, monócitos e, em menor extensão, os linfócitos
respondem a um estímulo químico em grau variado de velocidade (COLLINS,
1999; BRITO & RIBEIRO, 1999).
Existem agentes quimiotáticos de natureza endógena e de natureza
exógena. Os agentes exógenos mais comuns são os produtos bacterianos; a
maior parte desses produtos bacterianos contém um aminoácido terminal do
tipo N-formil-metionina, enquanto a minoria apresenta natureza lipídica. Os
mediadores químicos endógenos incluem componentes do sistema
complemento (em especial C5a), produtos da via da lipoxigenase
(principalmente o LTB
4
) e citocinas (particularmente aquelas da família das
quimiocinas, como IL-8). A ligação de agentes quimiotáticos a receptores
específicos na membrana celular dos leucócitos resulta em ativação da PLC
(mediada por proteína G), o que leva à hidrólise do PIP
2
a IP
3
e DAG, além da
liberação de cálcio das reservas intracelulares e, mais adiante, do influxo de
30
cálcio extracelular. O aumento nos níveis intracelulares de cálcio leva à
interação entre actina e miosina no pseudópode para promover a locomoção
(SNYDERMAN & UHUIG, 1992; STOSSEL, 1993; COLLINS, 1999).
7. ANGIOTENSINA II E A RESPOSTA INFLAMATÓRIA
Várias pesquisas têm sugerido que o SRA participa de respostas
imunológicas e inflamatórias. Segundo a maioria dos estudos, a Ang II está
envolvida em vários passos do processo inflamatório através da ação sobre os
receptores AT1 e AT2, como quimiotaxia e proliferação celular através da
estimulação de células mononucleares, regulação do recrutamento de células
pró-inflamatórias para o sítio da injúria (mediada pela expressão de fatores que
interferem na permeabilidade vascular, moléculas de adesão e quimiocinas
pelas células residentes) e produção de Ang II pelas células residentes
inflamatórias, contribuindo, assim, para a perpetuação da destruição tecidual
(RAGHAVENDRA & KULKARNI, 2000; SUZUKI et al., 2000; SADOSHIMA,
2000; RUIZ-ORTEGA et al., 2001; BATALLER et al., 2003).
Alterações como a hipertensão e a aterosclerose estão associadas à
presença de um processo inflamatório na parede dos vasos sanguíneos (BUSH
et al., 2000). Estudos experimentais e clínicos demonstraram que a Ang II
desempenha um papel crítico na patogênese destas condições. Os
mecanismos envolvidos incluem: vasoconstricção, ativação da transmissão
adrenérgica simpática, aumento da liberação de aldosterona, produção de
estresse oxidativo e indução da adesão entre os leucócitos e as células
endoteliais (GRAFE et al.; 1997; CHENG et al., 1999; MERVAALA et al., 1999;
31
PIQUERAS et al., 2000). Muitos estudos a respeito das alterações
cardiovasculares relatam a existência de um link entre a ativação do SRA e os
eventos isquêmicos cardiovasculares. O acúmulo de leucócitos na parede
vascular é um sinal precoce de aterosclerose. Selectina-E, VCAM-1 e ICAM-1
são moléculas de adesão que participam das interações entre leucócitos e
células endoteliais cujas expressões foram detectadas nas placas
ateroscleróticas. GRAFE e cols (1997) investigaram o papel da Ang II sobre a
expressão endotelial de selectina-E, VCAM-1 e ICAM-1 in vitro. Em células
endoteliais coronárias, a Ang II aumentou a expressão de selectina-E de forma
estatisticamente significativa. No entanto, em células endoteliais da
microvasculatura cardíaca, Ang II induziu apenas um pequeno aumento da
expressão de selectina-E. VCAM-1 e ICAM-1 não foram afetadas pela
estimulação de Ang II. Além disso, Ang II aumentou a adesão de leucócitos de
forma significativa e dependente de selectina-E. Ao final do estudo, os autores
concluíram ainda que os receptores AT1 medeiam os efeitos da Ang II sobre a
expressão de selectina-E e sobre a adesão leucocitária em células endoteliais
coronárias.
Dados científicos demonstram que Ang II induz interações in vivo
entre leucócitos e células endoteliais mediadas pela up-regulation de selectina-
P via receptores AT1 e AT2. PIQUERAS e cols (2000) observaram as vênulas
pós-capilares de mesentérios de ratos através de microscopia intravital. A
infusão de Ang II induziu um aumento significante do fluxo, do rolling, da
adesão e da transmigração de leucócitos sem, no entanto, haver qualquer
atividade de vasoconstricção. O tratamento intravenoso com o antagonista de
receptores AT1, o LOS ou com o antagonista de receptores AT2, o PD123319,
32
reduziu significativamente o efeito da Ang II. O pré-tratamento com o anticorpo
monoclonal anti selectina-P de rato aboliu o efeito da Ang II sobre os
leucócitos. Além disso, os autores provaram que tais efeitos da Ang II não são
mediados pela ativação de mastócitos, já que um grupo de animais foi pré-
tratado, antes do início da cirurgia, com cromoglicato de sódio, um agente
estabilizador de mastócitos. Concluiu-se, então, que doses sub-
vasoconstrictoras de Ang II promovem interações entre leucócitos e células
endoteliais na microcirculação mesentérica de ratos in vivo. Tal efeito é
mediado por receptores AT1 e AT2, sendo totalmente dependente da
expressão de selectina-P pelas células endoteliais. Ang II pode ter um papel
crítico sobre a adesão e a transmigração de leucócitos através do endotélio
vascular, e isso pode contribuir para a destruição vascular presente em
condições patológicas nas quais os níveis plasmáticos de Ang II estão
elevados.
KIM e cols (1996) trataram células endoteliais provenientes da aorta
humana e de coelhos com Ang II durante 18 horas e demonstraram indução
da adesão de monócitos, mas não de neutrófilos, a estas células. Tal indução
foi reduzida por inibidores dos receptores tipo 1 e 2 da Ang II. Além disso, a
indução da ligação entre monócitos e células endoteliais não foi associada à
indução de selectina-E, VCAM ou ICAM.
WILLIAMS e cols (1995) investigaram um outro mecanismo pelo qual
a Ang II poderia interferir na patogênese da aterosclerose. Estes autores
demonstraram, então, que as células da musculatura lisa vascular humana
expressam RNAm para VEGF e VPF. A Ang II induziu de forma bastante
significativa a expressão de VPF, sendo esta indução bloqueada por LOS,
33
antagonista dos receptores AT1 da Ang II. Isso sugere que os receptores AT1
medeiam a ação da Ang II em promover a indução do fator de permeabilidade
vascular nas células da vasculatura muscular lisa.
WU e cols (2001) investigaram o papel de AT1 e AT2 no
desenvolvimento da aterosclerose. Eles examinaram os efeitos de um
antagonista seletivo para receptores AT1 sobre a injúria vascular em
camundongos que apresentavam, ou não, receptores AT2. Ao final do estudo,
os autores concluíram que o bloqueio de AT1 diminui a resposta inflamatória
desenvolvida com a aterosclerose e que este efeito não diz respeito apenas ao
bloqueio dos receptores AT1, mas também ao estímulo de receptores AT2 pela
Ang II formada.
Inibidores da ECA e bloqueadores dos receptores da Ang II eram
inicialmente conhecidos pelo uso na hipertensão, na insuficiência cardíaca e
após infarto do miocárdio. Evidências novas, particularmente com os inibidores
da ECA, têm demonstrado sua capacidade em reduzir os eventos inflamatórios
agudos relacionados com a aterosclerose. Isso se deve provavelmente ao
efeito inibitório sobre o SRA, que influencia adversamente eventos-chave para
a progressão da aterosclerose, como o balanço fibrinolítico, a função das
células endoteliais vasculares e a inflamação na parede vascular (TSIKOURIS
& COX, 2003).
TAMARAT e cols (2002) estudaram os mecanismos envolvidos com
o efeito pró-angiogênico da Ang II em estudo in vivo; Ang II induziu
angiogênese através do receptor AT1 e este processo está envolvido com a
ativação de vias dependentes de VEGF e NO e também com o processo
inflamatório.
34
A Ang II também funciona como mediador pró-inflamatório na
destruição renal (RUYZ-ORTEGA et al., 2001). Em vários modelos de injúria
renal, independente da presença de hipertensão, foi descrita a ativação do
SRA. Antagonistas dos receptores AT1 da Ang II e inibidores do SRA têm sido
utilizados no tratamento da hipertensão e da proteinúria (ANDERSEN et al.,
2000).
Os mecanismos moleculares envolvidos com os processos de injúria
renal ainda não foram completamente esclarecidos, embora se saiba que as
células inflamatórias desempenham um papel chave. MEZZANO e cols (2003),
através de biópsia renal de pacientes com nefropatia diabética, investigaram a
correlação entre os parâmetros inflamatórios e a injúria renal. Para isso, foram
feitas análises através de ensaios de imunohistoquímica ou de hibridização
para detecção in situ de NFκB ativado ou da expressão de MCP-1 ou de
RANTES (do inglês regulated upon activation: normal T cell
expressed/secreted), cujos genes são regulados por NFκB. Os níveis de ECA e
de Ang II apresentaram-se elevados nas células tubulares e instersticiais.
Houve down-regulation de receptores AT1 e up-regulation de receptores AT2.
NFκB apresentou-se ativado, promovendo, up-regulation das citocinas
envolvidas com este fator. Observou-se uma correlação entre níveis elevados
de Ang II, quimiocinas e NFκB com a proteinúria e a infiltração intersticial
detectadas. De acordo com esses resultados, na nefropatia diabética humana,
componentes do SRA estão presentes nos compartimentos renais,
promovendo uma elevada produção local de Ang II, com ativação das células
tubulares e indução de parâmetros pró-inflamatórios, sugerindo a participação
da Ang II no processo inflamatório.
35
A inibição de NF-κB reduz a inflamação induzida por Ang II (MULLER
et al., 2000; SADOSHIMA, 2000; THEUER et al., 2002). MULLER e cols (2000)
testaram a hipótese de que o antioxidante pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC)
inibe NFκB, diminuindo, assim, a destruição renal e cardíaca. O ensaio de
“electrophoretic mobility shift” demonstrou aumento da atividade do DNA de
NFκB no coração e no fígado de ratos duplamente transgênicos para os genes
de renina e angiotensinogênio (dTGR). O tratamento crônico com PDTC
diminuiu a PA em ratos dTGR em relação ao grupo controle. O índice de
hipertrofia cardíaca também foi significativamente reduzido. PDTC reduziu a
albuminúria em mais de 95% e preveniu a morte. A injúria vascular foi
diminuída nos pequenos vasos renais e cardíacos. Sendo assim, os resultados
deste estudo demonstram que PDTC inibe a atividade de NFκB, atenuando a
inflamação e protegendo contra a destruição final do órgão induzida pela Ang
II.
Em células da musculatura lisa vascular, Ang II aumentou a geração
de superóxidos através de vias dependentes de fosfolipase D (PLD) e de
NADH/NADPH oxidases (TOUYZ & SCHIFFRIN, 1999). As espécies reativas
de oxigênio são capazes de ativar NF-κB e o fator ativador de proteína-1 (AP-
1), promovendo a codificação de genes de várias moléculas importantes no
processo inflamatório: moléculas de adesão, quimiocinas, citocinas, fatores de
coagulação, dentre outras (SADOSHIMA, 2000; LUFT, 2001; RUIZ-ORTEGA et
al., 2001). Segundo DIEP e cols (2002), o efeito da Ang II no desenvolvimento
da hipertensão, de anormalidades estruturais e na disfunção endotelial está
associado com a geração de estresse oxidativo e com a inflamação na parede
do vaso.
36
KLETT e cols (1993) afirmaram que o angiotensinogênio é uma
proteína de fase aguda; isso porque sua concentração plasmática aumenta
durante várias formas de inflamação aguda. Macrófagos presentes em
granulomas de ratos liberam ECA, que produz Ang II que, por sua vez, modula
a atividade de monócitos/macrófagos, amplificando a resposta inflamatória
(SIMON et al., 1991). Além disso, o LPS elevou a concentração hepática de
RNAm para angiotensinogênio, bem como, a concentração plasmática de
angiotensinogênio; este processo foi mediado por um fator derivado de
leucócito e por IL-6 (TAKANO et al., 1996). Os receptores AT1 e AT2 da Ang II
e a ECA desenvolvem-se seqüencialmente durante a angiogênese no
granuloma esponjoso em ratos (WALSH et al., 1997). Interleucina 1β (IL-1β),
uma importante citocina pró-inflamatória, está envolvida na indução do receptor
AT2 durante o processo inflamatório (VISWANATHAN & SAAVEDRA, 1992).
Todos esses achados sugerem a possibilidade de expressão de componentes
do SRA no sítio da inflamação.
Ang II atenuou a expressão de cicloxigenase-2 (COX-2) na mácula
densa do rim em ratos (CHENG et al., 1999). No entanto, OHNAKA e cols
(2000) demonstraram que Ang II promove indução da expressão de COX-2 em
cultura de células da musculatura lisa vascular de ratos.
QI e cols (2002) estudaram os efeitos opostos das cicloxigenase 1
(COX-1) e 2(COX-2) na resposta pressora a Ang II; os autores concluíram que
COX-1 e COX-2 exercem ações opostas sobre a PA sistêmica e a função
renal. Os inibidores da COX-2 reduziram o fluxo sanguíneo medular no rim,
diminuíram o fluxo da urina e potenciaram o efeito pressor da Ang II. No
entanto, este efeito pressor a Ang II foi atenuado pela inibição de COX-1.
37
Embora o papel da Ang II e seus inibidores já tenha sido reportado
em condições inflamatórias crônicas, como Colite de Crohn`s, artrite
reumatóide, inflamações granulomatosas e aterosclerose (MARTIN et al., 1984;
WEINSTOCK et al., 1981; MAVRIKAKIS et al., 1996; HIRAYAMA et al., 1990;
JASZEWSKI et al., 1990), seu papel na resposta inflamatória aguda não foi,
ainda, bem esclarecido.
RAGHAVENDRA & KULKARNI (2000) estudaram o efeito da
administração local de Ang II, Captopril ou LOS no modelo de edema de pata
induzido por carragenina (Cg) em ratos. Os autores constataram que a
administração local dessas drogas potenciou de forma dose-dependente o
edema de pata da Cg. Assim, a geração local de Ang II estaria relacionada com
processos inflamatórios, uma vez que este estudo demonstrou que
componentes do SRA, particularmente Ang II, inibidores da ECA e
bloqueadores de receptores AT1, influenciaram o processo inflamatório agudo
induzido pela Cg.
BOURA & SVOLMANIS (1984) também estudaram os mecanismos
envolvidos com o efeito do Captopril em potenciar o edema de pata da Cg. O
edema de pata da Cg foi significantemente aumentado com a inibição da ECA,
uma enzima do tipo cininase II, por Captopril. Além disso, o edema promovido
por dose submáxima de BK foi também significativamente aumentado por
Captopril, ao passo que o edema produzido em resposta a histamina ou PGE
2
foi inalterado, mostrando que o Captopril pode potenciar a inflamação em ratos
causada por vários, mas não por todos os estímulos inflamatórios. A
potenciação por Captopril do edema da Cg ou da BK foi reduzida pela
administração prévia de Indometacina, sugerindo que, ao potenciar o efeito de
38
Cg e BK, o Captopril provavelmente induz síntese e liberação de
prostaglandinas. A atividade da cininase II tissular é normalmente suficiente
para diminuir a resposta inflamatória gerada por Cg ou por BK; no entanto,
após a inibição desta enzima por Captopril, os níveis de BK aumentaram, o que
está relacionado com a liberação concomitante de PGs e com a potenciação da
inflamação. FERREIRA e cols (1974) já haviam demonstrado a liberação
sinérgica de BK e PGs durante a resposta inflamatória a Cg.
39
II. JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS
40
II. JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS
A Ang II é o principal peptídio efetor do SRA. Diversos estudos têm
abordado a influência deste peptídio sobre a regulação da PA e do equilíbrio
hidro-eletrolítico. Além disso, alguns autores sugerem que a Ang II tem papel
fundamental no curso de respostas imunológicas e inflamatórias através de
seus receptores AT1 e AT2. Muitos trabalhos abordam o papel da Ang II em
condições inflamatórias crônicas, como Colite de Crohn`s, artrite reumatóide e,
especialmente, aterosclerose. No entanto, pouco se sabe a respeito da
participação da Ang II em inflamações agudas. Sendo assim, espera-se com
este estudo contribuir para o conhecimento dos mecanismos através dos quais
a Ang II participa do processo inflamatório. Além disso, espera-se fundamentar
futuras investigações clínicas acerca dos efeitos dos ligantes de receptores
AT1 e AT2 da Ang II no tratamento de condições inflamatórias.
Para tanto, o objetivo geral deste trabalho foi investigar o papel da
Ang II em modelos experimentais de inflamação aguda.
Os objetivos específicos deste trabalho foram:
1. Investigar o efeito da Ang II em modelo de edema de pata em ratos
induzido por Cg e por dextran (DXT);
2. Avaliar a participação dos receptores AT1 e AT2 da Ang II na modulação
do edema de pata em ratos;
3. Estudar o papel da Ang II sobre migração de neutrófilos para a cavidade
peritoneal de ratos estimulada pela Cg;
4. Investigar o efeito da Ang II sobre o aumento da atividade de
mieloperoxidase (MPO) induzido por Cg na pata de ratos;
41
5. Investigar o papel da Ang II sobre o aumento da produção de citocinas
como TNF-α e IL-1β induzida pela Cg;
6. Estudar o papel da Ang II na degranulação de mastócitos induzida pelo
DXT na pata ou pelo composto 48/80 no mesentério de ratos.
42
III. MATERIAL E MÉTODOS
43
III. MATERIAL E MÉTODOS
1. ANIMAIS
Foram utilizados ratos Wistar de ambos os sexos, pesando 180-200g
provenientes do Biotério Central do Campus do Pici e do Biotério Setorial do
Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da
Universidade Federal do Ceará.
Os animais foram acondicionados em caixas de plástico, forradas
com raspa de madeira e receberam água e ração ad libitum até o início dos
experimentos. Durante os experimentos os animais ficaram em jejum com livre
acesso à água.
O protocolo utilizado foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará.
O tratamento dispensado aos animais estava de acordo com o "Guia
de Cuidados em Uso de Animais de Laboratório" do National Institues of Health
(Bethesda, MD, USA).
2. APARELHOS E INSTRUMENTOS LABORATORIAIS
• Pletismômetro Ugo-Basile 7140;
• Balança Analítica Ohaus AS2600;
• Balança Analítica Marte AL200;
• Centrífuga Eppendorf 5804R;
• Citocentrífuga Revan 2000D;
• Microscópio Óptico (MO) binocular Nikon Alphaphot 2 VS2;
44
• MO binocular acoplado à câmera fotográfica Olympus;
• Medidor de pH Hanna Instruments HI 8519N;
• Espectrofotômetro Spectronic 20 Genesys;
• Autoclave;
• Estufa Olidef cz;
• Câmara de Neubauer (0,100/0,0025mm2);
• Agulhas fenestradas 10x5 (Pentalance), 25x7 (B-D Precision Glide);
• Lâminas para microscopia;
• Lamínulas;
• Papel de filtro qualitativo;
• Alicate para deslocamento cervical;
• Seringas de 1,3,5,10 e 20mL (B-D Plastipak);
• Tubos de ensaio;
• Micropipetas Gilson de 2, 10, 20, 100, 200 e 1000 μL;
• Ponteiras para pipetas automáticas Sigma;
• Material cirúrgico (pinças, tesouras e bisturis);
• Capela de fluxo laminar Vico Biosafe Plus Classe II tipo A;
• Proveta graduada;
• Tubos de polipropileno para centrífuga (15 e 50mL);
• Espátulas de aço;
• Béqueres;
• Balões volumétricos;
• Placas de Petri;
• Homogeneizador de tecidos Ultra-turrax T8 e Dispergierstation T8.10 da
Ika Labortechnik;
45
• Micrótomo Olympus.
3. DROGAS, SOLUÇÕES, CORANTES E ANTISOROS
3.1. DROGAS
• Carragenina (FMC): sal não purificado dissolvido em salina estéril 0,9%;
• Dextran (Sigma): dissolvida em salina estéril 0,9%;
• Angiotensina II (Sigma) : dissolvida em Sal estéril 0,9%;
• CGP 42112A (Sigma) : dissolvido em Sal estéril 0,9%;
• Losartan (Merck) : dissolvido em Sal estéril 0,9%;
• Composto 48/80 (Sigma) : dissolvido em Sal estéril 0,9%;
• Mepiramina (MEP) (Sigma) : dissolvida em Sal estéril 0,9%;
• Metisergida (MET) (Sigma) : dissolvida em Sal estéril 0,9%;
• Éter etílico (Synth);
• fMLP (Sigma): dissolvido em PBS estéril a partir de uma solução de
estoque de 10
-2
M em dimetilsulfoxide (DMSO);
• Heparina (Cristália- Brasil);
• Formamida (Reagen);
• L-Metionina-sulfoximina (Sigma);
• Xilol (Reagen);
• Peróxido de hidrogênio (Smith);
• Avidina-peroxidase (DAKO);
• O-fenilenediamina diidrocloreto (OPD-Sigma) dissolvido em tampão
substrato descrito no protocolo de ELISA.
46
3.2. CORANTES
• Hematoxilina (Reagen);
• Eosina (Merck);
• Corante rápido HEMA 3;
• Corante de Turk:
Ácido acético glacial (Synth) ................................................................20,0 mL;
Violeta de genciana ................................................................................2,0 mL;
Água destilada ...........................................................................................1,0 L;
• Azul de Toluidina:
Azul de Toluidina.................................................................................100,0 mg;
Álcool Etílico P.A. .................................................................................70,0 mL;
Água Destilada......................................................................................30,0 mL;
O pH foi ajustado para 1.8 a 2.0 com HCl (5mL/L).
3.3. SOLUÇÕES
• Salina tamponada com fosfato (PBS):
Cloreto de sódio (Synth) .........................................................................8,00 g;
Cloreto de potássio (Synth) .....................................................................0,20 g;
Fosfato de sódio dibásico (Synth) ...........................................................1,15 g;
Fosfato de sódio monobásico (Synth)......................................................0,20 g;
Água destilada ........................................................................................1,00 L;
O pH foi ajustado para 7,4 com NaOH 0,1N.
• Tampão de bicarbonato pH 8,2:
47
NaHCO
3
(Synth) ........................................................................................0,1M;
NaCl (Synth) ..............................................................................................0,1M.
• Albumina bovina 1% diluída em tampão de lavagem (Sigma);
• Solução salina 0,9% estéril (Endogen);
• Solução de Ringer-Locke (RL):
Cloreto de Potássio P.A. .........................................................................9,00 g;
Cloreto de Potássio P.A. .........................................................................0,42 g;
Cloreto de Cálcio P.A. .............................................................................0,23 g;
Carbonato de Sódio P.A..........................................................................0,15 g;
Glicose.....................................................................................................0,99 g;
Água Destilada.........................................................................................1,00 L.
3.4 TAMPÕES E SOLUÇÕES UTILIZADOS PARA O ENSAIO
IMUNOENZIMÁTICO
• Tampão de bicarbonato pH 8,2:
NaHCO
3
P.A. (Merck, Sharp and Dohme – MSD, USA).....................….0,1 M;
NaCl P.A.(Merck, Sharp and Dohme – MSD, USA)..................................0,1 M.
• Tampão Substrato pH 5,0:
Ácido Cítrico..........................................................................................34,7mM;
Na
2
HPO
4
.(Merck).................................................................................66,7 Mm.
• Substrato:
OPD........................................................................................................0,4 mg;
H
2
O
2
..........................................................................................................0,4 μl;
Tampão substrato q.s.p. ...........................................................................1 mL.
48
• Tampão de lavagem PBS-tween 20, 0,1% v/v.
3.5. ANTICORPOS
• Concentrações de anticorpos e proteínas para ELISA:
citocina Ac 1
ario
Ac 2
ario
Curva (11 pontos)
TNF-α
SB230499GR SB54/450499/GR 4000pg/ml
IL-1β
SB1002/260499 SB1002/280499 4000pg/ml
Todas as citocinas e antisoros foram gentilmente cedidas pelo Prof.
Fernando de Queiróz Cunha do Departamento de Farmacologia da Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto – USP.
3.6. TAMPÕES E SOLUÇÕES USADOS NA DOSAGEM DA
ATIVIDADE DE MIELOPROXIDASE
• Tampão fosfato de potássio: 988 mL solução A + 12 mL solução B
Solução A
:
KH
2
PO
4
(Synth) ........................................................................................ 6,8 g;
Água destilada ..........................................................................................1,0 L.
Solução B:
K
2
HPO
4
(Synth) .........................................................................................8,7 g;
Água destilada ..........................................................................................1,0 L.
• Tampão de brometo de hexadeciltrimetilamônio (HTAB):
HTAB (Sigma) ............................................................................................. 5 g;
49
Tampão fosfato de potássio ........................................................................ 1 L.
• Peróxido de hidrogênio 0,1%:
Peróxido de hidrogênio 30% (Vetec) ........................................................1 mL;
Água destilada ........................................................................................29 mL.
• Solução de o-dianisidina (DDI):
O-dianisidina (Sigma) ...........................................................................16,7 mg;
Tampão fosfato de potássio .................................................................10,0 mL;
H
2
O
2
......................................................................................................50,0 μL;
Água destilada .....................................................................................90,0 mL.
4. PROTOCOLO EXPERIMENTAL
4.1. EDEMA DE PATA INDUZIDO POR CARRAGENINA EM RATOS
WISTAR
Os animais foram divididos nos seguintes grupos, de acordo com a substância
injetada na pata imediatamente antes da injeção sub-plantar (sp) de uma dose
submáxima de Cg: Sal+Cg; A+Cg (Ang II na dose de 1 μg, sp); LOS+Cg (LOS na dose
de 62,5 μg, sp) e CGP+Cg (CGP 42112A na dose de 142,5 μg, sp). Havia, ainda, os
grupos A+Sal (Ang II na dose de 1 μg, sp) e Sal+Sal, que recebeu apenas injeções sp de
Sal; ambos não receberam injeção do estímulo inflamatório (Cg). O volume da pata
traseira esquerda dos animais foi aferido por pletismômetro antes da injeção do estímulo
inflamatório (tempo zero), constituindo volume basal das patas. Imediatamente após as
50
primeiras injeções, os grupos Sal+Cg, A+Cg, CGP+Cg e LOS+Cg receberam injeção de
Cg na dose de 100 μg. Todos os animais receberam duas injeções de 50 μL cada. Uma,
2, 3 e 4 horas após as injeções, o volume da pata foi novamente aferido. Para cada
tempo, o volume do edema foi calculado como variação do volume da pata (volume no
tempo determinado – volume no tempo zero). Após avaliação do edema, os animais
foram sacrificados por deslocamento cervical e foi feita a coleta de pele e tecido celular
subcutâneo da região subplantar para análise histológica. O Esquema 1 ilustra o
delineamento experimental.
Esquema 1. Cronograma experimental do edema de pata induzido por Cg em ratos
4.2. AVALIAÇÃO DO EDEMA DE PATA INDUZIDO POR DEXTRAN
EM RATOS WISTAR
Os animais foram divididos nos seguintes grupos, de acordo com a substância
injetada na pata por via sp imediatamente antes da injeção do DXT: Sal+DXT;
A+DXT (Ang II na dose de 1 μg) e LOS+DXT (LOS na dose de 62,5 μg, sp).
0h
1h 2h
3h
4h
Aferição do volume da pata
• Sal+Sal
• Ang+Sal
• Sal+Cg
• Ang+Cg
• LOS+Cg
• CGP+Cg
Sacrifício
Histológico
sp
51
Havia, ainda, o grupo Sal+Sal, que não recebeu injeção de DXT, mas apenas
de Sal. O volume da pata traseira esquerda dos animais foi aferido por
pletismômetro antes da injeção do estímulo inflamatório (tempo zero),
constituindo volume basal das patas. Imediatamente após as primeiras
injeções, os grupos Sal+DXT, A+DXT e LOS+DXT receberam DXT na dose de
100 μg por via sp. O grupo Sal+Sal recebeu injeção de Sal. Todos os animais
receberam duas injeções de 50 μL cada. O volume do edema foi aferido 1, 2, 3
e 4 horas após as injeções e foi calculado como a variação do volume da pata
para cada espaço de tempo. O Esquema 2 mostra esse delineamento
experimental.
Esquema 2. Cronograma experimental do edema de pata induzido por DXT em ratos
4.3. INFLUÊNCIA DA MEPIRAMINA SOBRE O EDEMA DE PATA
INDUZIDO POR DEXTRAN EM RATOS WISTAR
Os animais foram divididos nos seguintes grupos: Sal/Sal+DXT;
MEP/Sal+DXT; Sal/A+DXT; MEP/A+DXT. O volume da pata traseira esquerda
dos animais foi aferido por pletismômetro (tempo zero), constituindo o volume
0h
1h 2h
3h
4h
Aferi
ç
ão do volume da
p
ata
• Sal+Sal
• Sal+DXT
• A+DXT
Sacrifício
s
p
52
basal das patas. Os grupos MEP/Sal+DXT e MEP/A+DXT receberam injeção
prévia de Mepiramina (10 mg/kg) por via ip. Os demais grupos receberam Sal
também por via ip. Após 1 hora, os grupos Sal/Sal+DXT e MEP/Sal+DXT
receberam injeções sp de Sal e de DXT (na dose de 100 μg). Os grupos
Sal/A+DXT e MEP/A+DXT receberam Ang II (na dose de 1 μg) e DXT (na dose
de 100 μg). O volume do edema foi aferido 1, 2, 3 e 4 horas após as injeções.
O volume do edema para cada espaço de tempo foi calculado como variação
do volume da pata. O Esquema 3 mostra o delineamento experimental.
Erro!
Esquema 3. Cronograma experimental da modulação por MEP ou MET do edema
de pata induzido por DXT em ratos
4.4. INFLUÊNCIA DA METISERGIDA SOBRE O EDEMA DE PATA
INDUZIDO POR DEXTRAN EM RATOS WISTAR
Os animais foram divididos nos seguintes grupos: Sal/Sal+DXT;
MET/Sal+DXT; Sal/A+DXT; MET/A+DXT. O volume da pata traseira esquerda
dos animais foi aferido por pletismômetro (tempo zero), constituindo o volume
5h
0h
1h 4h
2h
3h
Aferição do volume da pata
ip
Sal Sal+DXT
MEP/MET Sal+DXT
Sal Ang+DXT
MEP/MET Ang+DXT
sp
5h
0h
1h 4h
2h
3h
Aferição do volume da pata
ip
Sal Sal+DXT
MEP/MET Sal+DXT
Sal Ang+DXT
MEP/MET Ang+DXT
sp
53
basal das patas. Os grupos MET/Sal+DXT e MET/A+DXT receberam injeção
prévia de Metisergida (1mg/kg, ip). Os demais grupos receberam Sal também
por via ip. Passada 1 hora, os grupos Sal/Sal+DXT e MET/Sal+DXT receberam
injeções sp de Sal e de DXT (na dose de 100 μg). Os grupos Sal/A+DXT e
MET/A+DXT receberam Ang II (na dose de 1 μg) e DXT (na dose de 100 μg).
O volume do edema foi aferido 1, 2, 3 e 4 horas após as injeções. O volume do
edema para cada espaço de tempo foi calculado como variação do volume da
pata. O Esquema 3 mostra o delineamento experimental.
4.5. DEGRANULAÇÃO DE MASTÓCITOS INDUZIDA POR
CARRAGENINA OU DEXTRAN NA PATA DE RATOS WISTAR
Ratos Wistar foram divididos nos seguintes grupos: Sal+Sal, A+Sal,
Sal+Cg, Sal+DXT, A+Cg e A+DXT. Inicialmente foram aplicadas injeções sp de
Ang II (dose de 1 μg) ou solução Sal e, logo em seguida, de Cg (na dose de
100 μg), DXT (na dose de 100 μg) ou Sal. Após 1h das injeções, foi feita a
coleta de pele e tecido celular subcutâneo da região plantar para que fossem
confeccionadas as lâminas, que foram coradas com azul de toluidina. Foram
contadas 100 células em diferentes campos em MO, com aumento de 400X. A
média do percentual de mastócitos degranulados foi calculada para cada
grupo. O Esquema 4 mostra o delineamento experimental.
Erro!
54
Esquema 4. Cronograma experimental da degranulação de mastócitos induzida por Cg
ou DXT na pata de ratos
4.6. DEGRANULAÇÃO DE MASTÓCITOS INDUZIDA PELO
COMPOSTO 48/80 EM MESENTÉRIO DE RATOS WISTAR
Ratos Wistar foram divididos nos seguintes grupos: Sal+48/80;
A+48/80; Sal+RL e A+RL. Os grupos A+48/80 e A+RL receberam injeção por
via ip de 1 mL de Ang II (na concentração de 1 μg/mL); os demais grupos
receberam 1 mL de Sal ip. Os animais foram sacrificados 30 minutos após as
injeções por deslocamento cervical. Cortes do mesentério foram retirados e
incubados por 30 minutos em solução de Ringer-Locke (RL) com ou sem o
composto 48/80 (na concentração submáxima de 0,8 μg/mL), de acordo com o
grupo. Durante o período de incubação, as peças permaneceram em placas de
Petri a temperatura ambiente. Passados os 30 minutos, os tecidos foram
retirados das placas e colocados sobre as lâminas. Após a secagem, todas as
lâminas foram coradas com azul de toluidina por 2 minutos, lavadas com água
0h
1h
• Sal+Sal
• Ang+Sal
• Sal+Cg
• Sal+DXT
• Ang+Cg
• Ang+DXT
sp
Sacrifício e
Coleta de Amostras
0h
1h
• Sal+Sal
• Ang+Sal
• Sal+Cg
• Sal+DXT
• Ang+Cg
• Ang+DXT
sp
Sacrifício e
Coleta de Amostras
55
destilada e colocadas para secar. Em seguida, o excesso de gordura foi
removido com o auxílio de uma lâmina de bisturi. Foram contadas 100 células
em diferentes campos com o auxílio de MO, utilizando-se aumento de 400X.
Em seguida, calculou-se a média do percentual de mastócitos degranulados
para cada grupo. O esquema 5 ilustra o delineamento experimental utilizado.
Esquema 5. Cronograma experimental da degranulação de mastócitos em mesentério
de ratos
4.7. DOSAGEM DE TNF-α E IL-1β NA PATA DE RATOS WISTAR
POR ELISA
Ratos Wistar foram divididos nos seguintes grupos: Sal+Sal, Sal+Cg
e A+Cg. Foram aplicadas injeções sp de Ang II (na dose de 1µg) ou Sal e, logo
em seguida, de Cg (na dose de 100µg) ou Sal. Após 1h das injeções, os
animais foram sacrificados e foram colhidas amostras de pele e tecido celular
subcutâneo da região sp para posterior dosagem de TNF-α. Para a dosagem
de IL-1β, as amostras foram colhidas após 2h das injeções, de acordo com a
0h
1h
30 min
Sacrifício
Coleta do Mesentério
Sal RL+48/80
Ang RL+48/80
Sal RL
Ang RL
Incubação
Confecção das Lâminas
Leitura em MO
ip
0h
1h
30 min
Sacrifício
Coleta do Mesentério
Sal RL+48/80
Ang RL+48/80
Sal RL
Ang RL
Incubação
Confecção das Lâminas
Leitura em MO
ip
56
cinética de produção destas citocinas proposta por CUNHA e cols (2000). As
amostras colhidas foram estocadas a -70ºC e enviadas ao laboratório do Prof.
Fernando Cunha em Ribeirão Preto para que fosse feita a dosagem de TNF-α
e IL-1β pelo método de ELISA, utilizando o protocolo descrito a seguir:
• Suspensão das amostras em tampão inibidor de protease (500 μL de
tampão para cada 100 mg de tecido) e processamento com um
homogeneizador de tecidos;
• Centrifugação a 3000 rpm a 4º C por 10 min e retirada do sobrenadante;
• Incubação com 2 μg/ml de anticorpo (anticorpo de captura) diluído em
tampão de bicarbonato (pH 8.2) - 100 μl/poço (placa de 96 poços) por 16-
24h a 4° C;
• Lavagem da placa (3x) com PBS-tween 20, 0,1% v/v;
• Bloqueio com albumina bovina 1% diluída em tampão de lavagem, 100
μl/poço por 2h à temperatura ambiente;
• Lavagem da placa (3x);
• Incubação com a curva padrão das citocinas diluídas em tampão de
lavagem e das amostras a serem dosadas (100 μl/poço por 16-24h à 4°
C);
• Lavagem da placa (3x);
• Incubação com anticorpo biotinilado diluído a 1:1000 em tampão de
lavagem contendo 1% de soro normal de carneiro por 1 h à temperatura
ambiente;
• Lavagem da placa (3x);
• Incubação com avidina-peroxidase (DAKO) diluída 1:5000 em tampão de
lavagem, 100 μl/poço por 15 min à temperatura ambiente;
57
• Lavagem da placa (3x);
• Incubação com o-fenilenediamina diidrocloreto (OPD) em tampão
substrato, 100 μl/poço, cobrir a placa e deixar no escuro por 5-20 min à
temperatura ambiente;
• A reação foi parada com 150 μl/poço de H
2
SO
4
1M;
• A intensidade da coloração foi medida em espectrofotômetro a 490 nm;
• Os resultados são expressos como média ± EPM da quantidade de TNF-α
ou IL-1β, em pg/ml, para 4-6 amostras por tratamento. O esquema 6
mostra este delineamento experimental.
Esquema 6. Cronograma experimental utilizado para coleta de amostras para
dosagem de citocinas
4.8. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DE MIELOPEROXIDASE NA PATA
DE RATOS WISTAR
Ratos Wistar foram divididos nos seguintes grupos: Sal+Sal, Sal+Cg
e A+Cg. Foram aplicadas injeções sp de Ang II (na dose de 1µg) ou Sal e, logo
em seguida, de Cg (na dose de 100µg) ou Sal. Após 3h das injeções, tempo
correspondente ao pico do edema da Cg, os animais foram sacrificados e
• Sal+Sal
• Ang+Sal
• Sal+Cg
• Ang+Cg
Dosagem de TNF-α
0h
1h
2h
sp
Dosagem de IL-1β
• Sal+Sal
• Ang+Sal
• Sal+Cg
• Ang+Cg
Dosagem de TNF-α
0h
1h
2h
sp
Dosagem de IL-1β
58
foram colhidas amostras de pele e tecido celular subcutâneo da região sp, que
foram estocadas a -70ºC, para posterior dosagem da atividade de MPO no
tecido. A MPO é uma enzima encontrada predominantemente em grânulos
azurófilos de leucócitos PMN e tem sido usada como índice quantitativo para
avaliar a inflamação em vários tecidos. Para tanto, as amostras foram
suspensas em tampão de hexadeciltrimetilamônio (pH 6.0; 50 mg de tecido por
mL de tampão) e depois trituradas com um homogeneizador de tecidos. As
amostras foram congeladas, descongeladas e trituradas três vezes.
Posteriormente, foram centrifugadas a 4500 rpm, durante 12 min a uma
temperatura de 4ºC; o sobrenadante foi, então, colhido. Os níveis teciduais da
atividade de MPO foram determinados por meio da técnica descrita por
BRADLEY e cols (1982), utilizando peróxido de hidrogênio 0,0005% como
substrato para a MPO. Uma unidade de MPO foi definida como a quantidade
capaz de converter 1 μmol de peróxido de hidrogênio a água em 1 min a 22ºC.
No ensaio, à medida que o peróxido de hidrogênio era degradado ocorria a
produção de ânion superóxido, responsável pela conversão de o-dianisidina em
composto de cor marrom. A variação da densidade óptica da mistura das
amostras com a solução de o-dianisidina em função do tempo de reação foi
medida por espectrofotômetro. Os resultados foram expressos como unidades
de MPO/5mg de tecido. O delineamento experimental está mostrado no
esquema 7.
59
Esquema 7. Cronograma experimental utilizado para coleta de amostras para
dosagem da atividade de MPO tecidual
4.9. AVALIAÇÃO DA MIGRAÇÃO DE POLIMORFONUCLEARES
PARA A CAVIDADE PERITONEAL DE RATOS WISTAR
Os animais foram divididos nos grupos: Sal+Sal, Sal+Cg, A+Cg e
A+Sal. Os animais dos grupos A+Cg e A+Sal receberam injeção prévia de 0,5
mL de Ang II na dose de 0,5 μg por via intraperitoneal (ip). Os demais grupos
receberam 0,5 mL de Sal. Após 1 hora, todos os grupos receberam 0,5 mL de
uma dose submáxima de Cg (100 μg, ip), com exceção dos grupos Sal+Sal e
A+Sal, que receberam apenas Sal. Os animais foram sacrificados 4 horas após
a injeção de Cg ou Sal.
Em seguida, a cavidade peritoneal foi lavada com 7 mL da solução
de PBS heparinizado, massageada e incisada com bisturi para a coleta do
líquido com pipeta Pasteur. As contagens total e diferencial foram feitas de
acordo com método descrito por SOUZA & FERREIRA (1985).
0h
1h 2h 3h
• Sal+Sal
• Ang+Sal
• Sal+Cg
• Ang+Cg
sp
Sacrifício e
Coleta de Amostras
0h
1h 2h 3h
• Sal+Sal
• Ang+Sal
• Sal+Cg
• Ang+Cg
sp
Sacrifício e
Coleta de Amostras
60
Do líquido colhido, 20 μl foram diluídos em 380 μl de líquido de Turk
(diluição de 1:20) e utilizados para a contagem total de células em câmara de
Neubauer.
Para a contagem diferencial de células, 30 μL do exudato foram
colocados em citocentrífuga (10 min a 2800 rpm). Em seguida, as lâminas
foram coradas com corante rápido HEMA 3. A leitura foi realizada em MO, com
objetiva de imersão (aumento de 100X). Foram contadas 100 células em cada
orifício (200 células por lâmina). O número total de neutrófilos foi estimado
calculando-se as percentagens do número total de células encontradas. O
Esquema 8 traz o cronograma do experimento.
Erro!
Esquema 8. Cronograma do experimento de migração de PMN induzida por Cg para a
cavidade peritoneal em ratos.
0h
1h
4h
Sal Sal
Ang Sal
Sal Cg
Ang Cg
Sacrifício
Coleta do Lavado
Contagens Total e
Diferencial
ip
0h
1h
4h
Sal Sal
Ang Sal
Sal Cg
Ang Cg
Sacrifício
Coleta do Lavado
Contagens Total e
Diferencial
ipip
61
IV. RESULTADOS
62
IV. RESULTADOS
1. EFEITO DA ANGIOTENSINA II (Ang II) SOBRE O EDEMA DE PATA
INDUZIDO POR CARRAGENINA (Cg) EM RATOS WISTAR
A Cg (100μg, sp – grupo Sal+Cg) promoveu um aumento significativo
do volume da pata dos animais em comparação com o grupo Sal+Sal; esse
aumento foi significativo a partir da segunda hora, apresentando pico na
terceira hora. A injeção sp de Ang II (1μg) potenciou o aumento do volume da
pata induzido pela Cg. Essa potenciação foi significativa já na primeira hora
(p<0,05). No entanto, no grupo A+Sal, a Ang II não foi capaz de, por si só,
induzir alteração do volume da pata (Figuras 1 e 2).
2. EFEITO DO ANTAGONISTA DE AT1 (LOSARTAN-LOS) SOBRE O
EDEMA DE PATA INDUZIDO POR CARRAGENINA (Cg) EM RATOS
WISTAR
A injeção de LOS (62,5μg, sp) amplificou de forma significativa o
edema de pata induzido pela Cg (100μg, sp) sendo esse aumento significativo
já na primeira hora (p<0,05) e com pico na terceira hora (Figura 3).
63
A
0 1 2 3 4
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
Sal+Sal
Sal+Cg
A+Sal
A+Cg
*
*
**
**
**
Tempo (h)
Variação de Volume (mL)
B
Sal A Sal A
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
*
Cg
**
ASC
unidades arbitrárias
Sal
*
Figura 1. Efeito da angiotensina II sobre o volume do edema de pata induzido por
carragenina em ratos. Ang II (1μg, sp) ou Salina (Sal) foi injetada imediatamente
antes da indução do edema com Cg (100μg, sp) ou da injeção de Sal. O volume do
edema de pata foi aferido 1, 2, 3 e 4h após a injeção de Cg ou Sal A: Os pontos das
curvas representam a média +
EPM da variação do volume da pata de 5-6 animais por
tratamento. B: As colunas representam a área sob a curva (ASC) determinada pelo
método do trapézio. (*)p<0,05 em relação ao grupo Sal + Sal e (**)p<0,05 em relação
ao grupo Sal + Cg. ANOVA/Bonferroni.
64
Figura 2. Efeito da angiotensina II sobre infiltrado celular inflamatório e edema
intersticial em ratos tratados com carragenina subplantar. Estão representadas
fotomicrografias (aumento de 100x) de cortes histológicos corados pelo método de
H&E da região plantar das patas traseiras injetadas com sal (A), sal+Cg (B) ou Ang
II+Cg (C). Quatro horas após a injeção de Cg, observa-se que a Ang II aumenta o
edema intersticial sem, no entanto, alterar o infiltrado celular inflamatório em relação
aos animais que não receberam injeção de Ang II.
A
B
C
65
A
0 1 2 3 4
0.0
0.2
0.4
0.6
Sal+Cg
LOS+Cg
*
*
*
*
Tempo (h)
Variação de Volume (mL)
B
Sal LOS
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
*
ASC
unidades arbitrárias
Cg
Figura 3. Efeito do antagonista de AT1 (Losartan) sobre o volume do edema de
pata induzido por carragenina em ratos. LOS (62,5μg, sp) ou Salina (Sal) foi
injetado imediatamente antes da indução do edema com Cg (100μg, sp). O volume do
edema de pata foi aferido 1, 2, 3 e 4h após a injeção de Cg. A: Os pontos das curvas
representam a média +
EPM da variação do volume da pata de 5-6 animais por
tratamento. B: As colunas representam a área sob a curva (ASC) determinada pelo
método do trapézio. (*)p<0,05 em relação ao grupo Sal+Cg. Teste t.
66
3. EFEITO DO AGONISTA DE AT2 (CGP 42112A) SOBRE O EDEMA DE
PATA INDUZIDO POR CARRAGENINA (Cg) EM RATOS WISTAR
A administração de CGP (142,5μg, sp) potenciou de forma
significativa (p<0,05) o edema de pata induzido pela Cg (100μg, sp). Essa
amplificação foi significativa já nas primeiras horas (Figura 4).
67
A
0 1 2 3 4
0.00
0.15
0.30
0.45
0.60
Sal+Cg
CGP+Cg
*
*
Tempo (h)
Variação de Volume (mL)
B
Sal CGP
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
*
ASC
unidades arbitrárias
Cg
Figura 4. Efeito do agonista de AT2 (CGP-42112A) sobre o volume do edema de
pata induzido por carragenina em ratos. CGP-41212A (142,5μg, sp) ou Salina (Sal)
foi injetado imediatamente antes da indução do edema com Cg (100μg, sp). O volume
do edema de pata foi aferido 1, 2, 3 e 4h após a injeção de Cg. A: Os pontos das
curvas representam a média +
EPM da variação do volume da pata de 5-6 animais por
tratamento. B: As colunas representam a área sob a curva (ASC) determinada pelo
método do trapézio. (*)p<0,05 em relação ao grupo Sal+Cg. Teste t.
68
4. EFEITO DA ANGIOTENSINA II (Ang II) SOBRE O EDEMA DE PATA
INDUZIDO POR DEXTRAN (DXT) EM RATOS WISTAR
A administração sp de DXT (100μg) induziu aumento significativo do
volume da pata dos animais nas primeiras horas. A injeção sp de Ang II (1μg)
amplificou o edema de pata promovido pelo DXT, sendo esta amplificação
significativa (p<0,05) na primeira e segunda horas (Figura 5).
5. EFEITO DO ANTAGONISTA DE AT1 (LOSARTAN-LOS) SOBRE O
EDEMA DE PATA INDUZIDO POR DEXTRAN (DXT) EM RATOS WISTAR
A injeção de LOS (62,5μg, sp) amplificou o edema de pata induzido
pelo DXT (100μg, sp) de forma significativa desde a primeira hora, com pico já
na segunda hora (p<0,05) (Figura 6).
69
A
0 1 2 3 4
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Sal+Sal
Sal+DXT
A+DXT
*
*
Tempo (h)
Variação de Volume (mL)
B
Sal Sal A
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
*
DXT
ASC
unidades arbitrárias
**
Sal
*
Figura 5. Efeito da angiotensina II sobre o volume do edema de pata induzido por
dextran em ratos. Ang II (1μg, sp) ou Salina (Sal) foi injetada imediatamente antes da
indução do edema com DXT (100μg, sp) ou da injeção de Sal. O volume do edema de
pata foi aferido 1, 2, 3 e 4h após a injeção de DXT ou Sal. A: Os pontos das curvas
representam a média +
EPM da variação do volume da pata de 5-6 animais por
tratamento. B: As colunas representam a área sob a curva (ASC) determinada pelo
método do trapézio. (*)p<0,05 em relação ao grupo Sal + Sal. (**)p<0,05 em relação
ao grupo Sal+DXT. ANOVA/Bonferroni.
70
A
0 1 2 3 4
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
Sal+DXT
LOS+DXT
Tempo (h)
Variação de Volume (mL)
*
*
*
*
B
Sal LOS
0
1
2
*
DXT
ASC
Unidades Arbitrárias
Figura 6. Efeito do antagonista de AT1 (Losartan) sobre o volume do edema de
pata induzido por dextran em ratos. LOS (62,5μg, sp) ou Salina (Sal) foi injetado
imediatamente antes da indução do edema com DXT (100μg, sp). O volume do edema
de pata foi aferido 1, 2, 3 e 4h após a injeção de DXT. A: Os pontos das curvas
representam a média +
EPM da variação do volume da pata de 5-6 animais por
tratamento. B: As colunas representam a área sob a curva (ASC) determinada pelo
método do trapézio. (*)p<0,05 em relação ao grupo Sal+DXT. Teste t.
71
6. EFEITO DO ANTI-HISTAMÍNICO MEPIRAMINA (MEP) SOBRE A
MODULAÇÃO POR ANGIOTENSINA II (Ang II) DO EDEMA DE PATA
INDUZIDO POR DEXTRAN (DXT) EM RATOS WISTAR
A injeção de MEP (10mg/kg, ip) uma hora antes da administração sp
de DXT (100
μg) e de Ang II (1μg) reduziu de forma significativa o edema do
DXT (p<0,05), bem como a potenciação deste pela Ang II (p<0,05); isso
ocorreu entre a 2ª e a 4ª hora
(Figura 7).
7. EFEITO DO ANTI-SEROTONÍNÉRGICO METISERGIDA (MET) SOBRE A
MODULAÇÃO POR ANGIOTENSINA II (Ang II) DO EDEMA DE PATA
INDUZIDO POR DEXTRAN (DXT) EM RATOS WISTAR
A injeção de MET (1mg/kg, ip) uma hora antes da administração sp
de DXT (100
μg) e de Ang II (1μg) reduziu o edema do DXT (p<0,05), bem
como a potenciação deste pela Ang II de forma bastante significativa (p
<0,05)
durante a 1ª, 2ª, 3ª e 4ª hora
(Figura 8).
72
A
0 1 2 3 4
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
Sal / Sal+DXT
MEP / Sal+DXT
Sal / A+DXT
MEP / A+DXT
*
*
*
**
**
**
Tempo (h)
Variação de Volume (mL)
**
B
Sal+DXT A+DXT Sal+DXT A+DXT
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
MEP
*
**
Sal
**
ASC
unidades arbitrárias
*
Figura 7. Efeito do anti-histamínico mepiramina sobre a modulação por
angiotensina II do edema de pata induzido por dextran em ratos. Os animais
receberam pré-tratamento com MEP (10mg/kg, ip) ou Salina (Sal); Após 1 hora, Ang II
(1μg, sp) ou Sal foi injetada imediatamente antes da indução do edema com DXT
(100μg, sp). O volume do edema de pata foi aferido 1, 2, 3 e 4h após a injeção de
DXT. A: Os pontos das curvas representam a média +
EPM da variação do volume da
pata de 5-6 animais por tratamento. B: As colunas representam a área sob a curva
(ASC) determinada pelo método do trapézio. (*)p<0,05 em relação ao grupo Sal/Sal +
DXT. (**)p<0,05 em relação ao grupo Sal/A+DXT. ANOVA/Bonferroni.
73
A
0 1 2 3 4
0.0
0.2
0.4
0.6
Sal / Sal+DXT
MET / Sal+DXT
Sal / A+DXT
MET / A+DXT
*
*
**
**
**
**
Tempo (h)
Variação de Volume (mL)
B
Sal+DXT A+DXT Sal+DXT A+DXT
0.0
0.5
1.0
1.5
*
**
MET
Sal
** *
ASC
unidades arbitrárias
*
Figura 8. Efeito do anti-serotoninérgico metisergida sobre a modulação por
angiotensina II do edema de pata induzido por dextran em ratos. Os animais
receberam pré-tratamento com MET (1mg/kg, ip) ou Salina (Sal); Após 1 hora, Ang II
(1μg, sp) ou Sal foi injetada imediatamente antes da indução do edema com DXT
(100μg, sp). O volume do edema de pata foi aferido 1, 2, 3 e 4h após a injeção de
DXT. A: Os pontos das curvas representam a média +
EPM da variação do volume da
pata de 5-6 animais por tratamento. B: As colunas representam a área sob a curva
(ASC) determinada pelo método do trapézio. (*)p<0,05 em relação ao grupo
Sal/Sal+DXT. (**)p<0,05em relação ao grupo Sal/A+DXT. ANOVA/Bonferroni.
74
8. EFEITO DA ANGIOTENSINA II (Ang II) SOBRE A DEGRANULAÇÃO DE
MASTÓCITOS NA PATA DE RATOS WISTAR TRATADOS COM
CARRAGENINA (Cg)
A Cg (100μg, sp – grupo Sal+Cg) promoveu significativo aumento da
degranulação de mastócitos quando comparado ao grupo Sal+Sal (p<0,05). A
injeção sp de Ang II (1
μg – grupo A+Cg) potenciou significativamente (p<0,05)
o aumento na percentagem de degranulação de mastócitos produzido pela
administração sp de Cg na pata de ratos
Wistar. No grupo A+Sal, onde se
administrou apenas Ang II, na ausência de Cg, houve também significativo
(p<0,05) aumento da degranulação de mastócitos quando comparado ao grupo
Sal+Sal
(Figuras 9 e 10).
9. EFEITO DA ANGIOTENSINA II (ANG II) SOBRE A DEGRANULAÇÃO DE
MASTÓCITOS NA PATA DE RATOS WISTAR TRATADOS COM DEXTRAN
(DXT)
A administração de Ang II (1μg – grupo A+DXT) por via sp potenciou
de forma significativa (p<0,05) o aumento do índice de degranulação de
mastócitos produzido pela injeção de DXT (100
μg, sp – grupo Sal+DXT) na
pata de ratos
Wistar (Figura 9).
75
Sal A Sal A Sal A
0
25
50
75
100
*
**
*
% de mastócitos degranulados
#
Sal
Cg DXT
*
*
*
Figura 9. Efeito da angiotensina II sobre a degranulação de mastócitos induzida
por carragenina ou por dextran na pata de ratos . Ang II (1μg, sp) ou Salina (Sal) foi
injetada imediatamente antes da indução do edema com Cg (100μg, sp) ou DXT
(100μg, sp), ou da injeção de Sal. Após 1 hora, os animais foram sacrificados e foram
colhidas amostras da pele e tecido subcutâneo para a confecção de lâminas que
foram coradas com azul de toluidina. Os valores representam a média +
EPM da
percentagem de mastócitos degranulados obtidos por contagem, em microscópio
óptico, de 100 células em diferentes campos com aumento de 400X. (*)p<0,05 em
relação ao grupo Sal+Sal. (**)p<0,05 em relação ao grupo Sal+Cg. (#)p<0,05 em
relação ao grupo Sal+DXT. ANOVA/Bonferroni.
76
Figura 10. Efeito da angiotensina II sobre a degranulação de mastócitos na pata
de ratos tratados com carragenina subplantar. Estão representadas
fotomicrografias (aumento de 400x) de cortes histológicos corados com azul de
toluidina da pata de ratos que receberam Sal (A), Sal+Cg(B) ou Ang II+Cg (C) sp.
Observa-se claramente uma grande quantidade de mastócitos degranulados pela Ang
II (C) em relação aos animais que não receberam Ang II (A e B).
A
B
C
77
10. EFEITO DA ANGIOTENSINA II (Ang II) SOBRE A DEGRANULAÇÃO DE
MASTÓCITOS INDUZIDA PELO COMPOSTO 48/80 EM MESENTÉRIO DE
RATOS WISTAR
A injeção ip de Ang II (1μg) aumentou de forma significativa (p<0,05)
a degranulação de mastócitos induzida pelo composto 48/80 (0,8
μg/mL) em
mesentério de ratos
Wistar (grupo A+48/80). Além disso, no grupo A+RL, onde
Ang II foi administrada de forma ip, mas a amostra de mesentério colhida após
o sacrifício não foi incubada com o composto 48/80, também houve significativa
(p<0,05) degranulação de mastócitos, semelhante àquela do grupo A+48/80.
(Figuras 11 e 12).
78
Sal A Sal A
0
25
50
75
100
*
% de mastócitos degranulados
48/80
**
*
RL
*
Figura 11. Efeito da angiotensina II sobre a degranulação de mastócitos em
mesentério de ratos induzida pelo composto 48/80. Os animais receberam injeção
de Ang II (1μg, ip) ou de Salina (Sal). Após 30 min, os animais foram sacrificados e
foram removidas amostras do mesentério, que foram incubadas por 30 min em
solução nutritiva de Ringer-Looke (RL). Nos grupos Sal+48/80 e A+48/80,
acrescentou-se o composto 48/80 (0,8μg/ml) à solução nutritiva. Os valores
representam a média +
EPM da percentagem de mastócitos degranulados obtidas por
contagem, em microscópio óptico, de 100 células em diferentes campos com aumento
de 400X. (*)p<0,05 em relação ao grupo Sal+RL. (**)p<0,05 em relação ao grupo
Sal+48/80. ANOVA/Bonferroni.
79
A
C
E
B
D
F
Figura 12. Efeito da angiotensina II sobre a degranulação de mastócitos em
mesentério de ratos incubados com composto 48/80. Estão representadas
fotomicrografias (aumentos de 100 e 400x) de cortes histológicos corados com azul de
toluidina de mesentérios incubados em solução de RL com (C, D E e F) ou sem (A e B)
composto 48/80 em ratos que receberam Sal (A, B, C e D) ou Ang II (E e F) ip. Observa-
se claramente uma grande quantidade de mastócitos degranulados pela Ang II (E e F) em
relação aos animais que não receberam Ang II (A, B, C e D).
80
11. EFEITO DA ANGIOTENSINA II (Ang II) SOBRE O AUMENTO DA
DOSAGEM DE TNF-α NA PATA DE RATOS WISTAR TRATADOS COM
CARRAGENINA (Cg)
A injeção sp de Cg (100μg – grupo Sal+Cg) na pata de ratos Wistar
induziu aumento significativo da dosagem de TNF-
α (p<0,05). No entanto, a
injeção sp de Ang II (1
μg – grupo A+Cg) não foi capaz de alterar o aumento da
dosagem de TNF-
α promovido pela administração de Cg (Figura 13).
12. EFEITO DA ANGIOTENSINA II (Ang II) SOBRE O AUMENTO DA
DOSAGEM DE IL1-β NA PATA DE RATOS WISTAR TRATADOS COM
CARRAGENINA (Cg)
A injeção sp de Cg (100μg – grupo Sal+Cg) na pata de ratos Wistar
induziu aumento significativo da dosagem de IL-1
β (p<0,05). Porém, a injeção
sp de Ang II (1
μg – grupo A+Cg) não foi capaz de alterar o aumento da
dosagem de IL-1
β promovido pela administração de Cg (Figura 14).
81
Sal A Sal A
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
*
Cg
*
Sal
pg/mL
Figura 13. Efeito da angiotensina II sobre a dosagem de TNF-α na pata de ratos
tratados com carragenina ou salina subplantar. Ang II (1μg, sp) ou Sal foi injetada
imediatamente antes da indução do edema com Cg (100μg, sp) ou da injeção de Sal.
Após duas horas, foram retiradas amostras de pele e tecido celular subcutâneo da
região plantar. O conteúdo de TNF-α presente em cada amostra foi determinado por
ELISA. As colunas representam a média ± EPM da quantidade de TNF-α das
amostras de 5 animais por tratamento. (*)p<0,05 em relação ao grupo Sal+Sal.
ANOVA/Bonferroni.
82
Sal A Sal A
0
200
400
600
800
pg/mL
*
Cg
*
Sal
Figura 14. Efeito da angiotensina II sobre a dosagem de IL-1β na pata de ratos
tratados com carragenina ou salina subplantar. Ang II (1μg, sp) ou Sal foi injetada
imediatamente antes da indução do edema com Cg (100μg, sp) ou da injeção de Sal.
Após duas horas, foram retiradas amostras de pele e tecido celular subcutâneo da
região plantar. O conteúdo de IL-1β presente em cada amostra foi determinado por
ELISA. As colunas representam a média ± EPM da quantidade de IL-1β das amostras
de 5 animais por tratamento. (*)p<0,05 em relação ao grupo Sal+Sal.
ANOVA/Bonferroni.
83
13. EFEITO DA ANGIOTENSINA II (Ang II) SOBRE A DOSAGEM DE
MIELOPEROXIDASE (MPO) NA PATA DE RATOS WISTAR TRATADOS
COM CARRAGENINA (Cg)
A administração de Cg (100μg, sp – grupo Sal+Cg) promoveu um
aumento significativo (p<0,055) da dosagem de MPO presente no tecido
subcutâneo retirado da pata dos animais quando comparado ao grupo Sal+Sal;
esse aumento foi significativo no primeiro, no terceiro e no quinto minuto de
reação durante a leitura em espectrofotômetro. No grupo A+Cg, a
administração prévia Ang II (1
μg, sp) não promoveu alteração significativa na
dosagem de MPO em relação àquela produzida pela Cg. A Ang II (grupo
A+Sal) não foi capaz de produzir aumento da dosagem de MPO na ausência
de Cg
(Figura 15).
14. EFEITO DA ANGIOTENSINA II (Ang II) SOBRE A MIGRAÇÃO DE
POLIMORFONUCLEARES (PMN) PARA A CAVIDADE PERITONEAL DE
RATOS WISTAR TRATADOS COM CARRAGENINA (Cg)
A injeção ip de Cg (0,5μg – grupo Sal+Cg) induziu aumento
significativo (p<0,0505) da migração de PMN para a cavidade peritoneal dos
animais em relação ao grupo Sal+Sal. A administração prévia de Ang II (0,5
μg,
ip – grupo A+Cg) não promoveu potenciação da migração de PMN promovida
pela Cg. Na ausência de Cg, a Ang II (0,5
μg, ip – grupo A+Sal) não alterou o
grau de migração de PMN quando comparado ao grupo Sal+Sal
(Figura 16).
84
Sal A Sal A
0
10
20
30
40
50
*
*
CgSal
Un MPO/5m g
Figura 15. Efeito da angiotensina II sobre a dosagem de mieloperoxidase na pata
de ratos tratados com carragenina ou salina subplantar. Ang II (1μg, sp) ou Sal foi
injetada imediatamente antes da indução do edema com Cg (100μg, sp) ou da injeção
de Sal. Após duas horas, foram retiradas amostras de pele e tecido subcutâneo da
região plantar. O conteúdo de MPO presente em cada amostra foi determinado por
método enzimático colorimétrico. As colunas representam a média ± EPM de unidades
de MPO/ 5mg de tecido das amostras de 5 animais por tratamento, considerando-se o
3º min do ensaio. (*)p<0,05 em relação ao grupo Sal+Sal. ANOVA/Bonferroni.
85
A
Sal A Sal A
0
2000
4000
6000
8000
*
Cg
*
Sal
Leucócitos totais X
10
3
PMN/mL
B
Sal A Sal A
0
2000
4000
6000
8000
*
*
Sal
Cg
NeutrófilosX10
3
PMN/mL
Figura 16. Efeito da angiotensina II sobre a migração de polimorfonucleares para
a cavidade peritoneal induzida por carragenina em ratos. Inicialmente injetou-se
Ang II (0,5μg, ip) ou Salina (Sal) e, logo em seguida, injetou-se Cg (100μg, ip) ou Sal.
Contagens total (A) e diferencial (B) de leucócitos que migraram para a cavidade
peritoneal foram realizadas após 4h, quando ocorreu o sacrifício dos animais. As
barras representam a média +
EPM do número de leucócitos totais ou PMN que
migraram em 5-6 animais por tratamento. (*)p<0,05 em relação ao grupo Sal+Sal.
ANOVA/Bonferroni.
86
V. DISCUSSÃO
87
V. DISCUSSÃO
Trabalhos da literatura vêm demonstrando que a Ang II, além de
seus bem conhecidos efeitos no sistema cardiovascular, participa da
patogênese de várias doenças nas quais a resposta inflamatória está envolvida
tais como aterosclerose (WU
et al., 2001), artrite reumatóide (MARTIN et al.,
1984), doença de Chron (JASZEWSKI
et al., 1990) e reação pós-infarto do
miocádio (KLETT
et al., 1993; SCHIEFFER et al., 1994). No presente trabalho
demonstrou-se que a Ang II potenciou o edema de pata induzido por uma dose
submáxima de Cg. A Ang II, no entanto, falhou em promover inflamação na
ausência da Cg, mostrando, assim, que necessita da presença de mecanismos
desencadeadores para iniciar sua ação pró-inflamatória. A coadministração de
Ang II e Cg potenciou o efeito desta em promover inflamação. É importante
ressaltar que a dose de Cg utilizada por nós para indução do edema de pata
foi uma dose menor do que aquela responsável pelo edema clássico da Cg (DI
ROSA
et al.,1971). O fato de termos trabalhado com uma dose submáxima de
Cg foi importante, já que queríamos analisar o efeito potenciador de algumas
substâncias, como Ang II, LOS e CGP-42112A. Outros autores também já
utilizaram tal recurso (BOURA & SVOLMANIS, 1984; BLAIS
et al., 1999;
RAGHAVENDRA & KULKARNI, 2000).
O efeito pró-inflamatório da Ang II já foi relatado em outros estudos
(KLETT
et al., 1993; SCHIEFFER et al., 1994; RAGHAVENDRA & KULKARNI,
2000). A concentração plasmática do angiotensinogênio aumenta durante
várias formas de inflamação aguda. Além disso, macrófagos presentes em
granulomas de ratos liberam ECA, promovendo aumento da formação de Ang
88
II, que, por sua vez, modula a atividade de monócitos/macrófagos,
amplificando, assim, a resposta inflamatória (SIMON
et al., 1991; KLETT et al.,
1993). Segundo WALSH e cols (1997) os receptores AT1 e AT2 da Ang II, bem
como a ECA, desenvolvem-se seqüencialmente durante a angiogênese no
granuloma esponjoso em ratos, indicando a expressão de componentes do
SRA no sítio da inflamação.
SCHIEFFER e cols (1994) compararam os efeitos cardíacos da
inibição crônica da ECA e do bloqueio de receptores AT1 da Ang II em modelo
de infarto do miocárdio em ratos. Os autores demonstraram que ambas as
terapias reduziram a hipertrofia cardíaca pós-infarto, sugerindo a participação
da Ang II no processo inflamatório decorrente de um infarto de miocárdio.
O LOS, droga antagonista dos receptores AT1 da Ang II, também
potenciou o edema de pata induzido pela Cg. Estes dados estão de acordo
com RAGHAVENDRA & KULKARNI (2000), que também demonstraram que a
administração local de Captopril, LOS ou Ang II potenciou o edema de uma
dose submáxima de Cg de forma dose dependente, sugerindo que, na
inflamação induzida por Cg, Ang II é formada localmente, modulando, assim, o
processo inflamatório subseqüente. Estes autores, entretanto, limitaram-se à
demonstração do efeito destas substâncias em potenciar o edema, não se
aprofundando no estudo dos mecanismos e mediadores envolvidos na
participação da Ang II no processo inflamatório.
A Cg é um polissacarídeo sulfatado, derivado de algas marinhas. Ela
foi usada como estímulo inflamatório primeiro por Gardner, em 1960, para
induzir artrite em coelhos e cobaias. Winter e cols (1962) descreveram a
utilidade do edema de pata induzido pela injeção sp de Cg como método de
89
screening para drogas antiinflamatórias (WINTER et a., 1962; AL-HABOUBI &
ZIETLIN, 1983).
A injeção de Cg na pata traseira de animais produz um edema
bifásico constituído por uma fase inicial rápida seguida por uma fase tardia
mais sustentada. A primeira fase tem início logo após a administração de Cg,
prolongando-se por 1h. A segunda tem início após 1h, com pico entre a 3ª e
4ªhs (WINTER
et al., 1962; VINEGAR et al., 1969). Em 1969, WILLIS
estabeleceu que, durante o edema induzido por Cg, ocorre a liberação
seqüencial de histamina, cininas e prostaglandinas (PGs) (AL-HABOUBI &
ZIETLIN, 1983). A histamina e a serotonina, derivadas da degranulação de
mastócitos, são tidas como principais responsáveis pela vasodilatação e
extravasamento de plasma, que acontece até os primeiros 90 min do edema de
pata induzido por Cg em ratos, continuando a agir no decorrer de todo o
processo (DI ROSA
et al., 1971; AL-HABOUBI & ZIETLIN, 1983; DOZEN et al.,
1989).
A Cg também estimula a produção local de mediadores pró-
inflamatórios, notadamente IL-1 e TNF-
α, por células residentes. Agindo sobre
leucócitos teciduais e recrutados, IL-1 e TNF-
α ativam as cascatas da ciclo e
da lipoxigenase, gerando PGs e LTs. Esses mediadores tanto produzem
vasodilatação diretamente como atraem neutrófilos ao foco inflamatório
produzindo a fase tardia do edema. Portanto, a fase tardia é creditada
principalmente ao dano endotelial direto por leucócitos, carreamento de líquido
intravascular durante a migração de PMN e ao aumento de permeabilidade
vascular induzida por eicosanóides (VINEGAR
et al., 1982; BANKS et al., 1984;
CALHOUN
et al., 1989; WEICHMAN et al., 1989). Nessa fase o edema é maior
90
e mais prolongado, de forma que, experimentalmente, o edema da Cg é
utilizado quando se quer avaliar o efeito de uma intervenção sobre o edema
inflamatório dependente de células residentes e de migração celular.
A demonstração de que Ang II induz a potencialização da fase inicial
do edema da Cg sugere que ela está agindo via mediadores derivados de
mastócitos: histamina e serotonina. Sendo assim, resolvemos investigar o
efeito da Ang II no edema de pata induzido por DXT, substância que
desencadeia um edema do tipo vascular, onde há degranulação de mastócitos
e liberação de mediadores vasoativos. O DXT, diferente da Cg, induz um
edema que pode ser detectado já nos primeiros 30 min após sua injeção e cujo
fluido apresenta pequena quantidade de proteínas e neutrófilos (LO
et al.,
1982). A Ang II potenciou de forma significativa o edema de pata do DXT nas
primeiras horas, sugerindo que ela pode estar agindo a nível vascular, ou estar
causando degranulação de mastócitos e liberação de substâncias vasoativas.
O LOS, antagonista de receptores AT1, também potencializou o edema de pata
do DXT. Isso nos leva a crer que Ang II foi formada no local do processo
inflamatório e, agindo via receptores AT2 não bloqueados, modulou tal
processo. Corroborando com tal hipótese, alguns autores relatam que a
ativação de receptores AT2 induz, dentre outras ações, a vasodilatação
(BARBER
et al., 1999; CAREY et al., 2001; TOUYZ & BERRY, 2002). Este
efeito pode contribuir para a ação pró-inflamatória da Ang II mediada por
receptores AT2 uma vez que, com a vasodilatação, há um conseqüente
aumento da pressão hidrostática no interior dos capilares, o que pode levar à
saída de fluido para o sítio inflamatório e posterior formação de edema.
91
Já foi relatado na literatura que a Ang II promove aumento da
expressão gênica do fator de permeabilidade vascular em células da
vasculatura lisa humana
in vitro (WILLIAMS et al., 1995). O aumento da
expressão desse fator de permeabilidade vascular induzido pela Ang II foi
inibido pelo antagonista específico dos receptores AT1, o LOS, sugerindo a
participação de receptores AT1 no processo inflamatório (WILLIAMS
et al.,
1995). Nosso estudo, porém, sugere uma ação antiinflamatória para tais
receptores, pois, no modelo do edema de pata da Cg, o LOS potenciou a
inflamação causada pela injeção sp de Cg. Uma outra explicação para os
resultados obtidos no presente estudo pode ser obtida ao analisarmos o
mecanismo de ação de drogas antagonistas de receptores AT1 da Ang II.
Alguns trabalhos da literatura creditam parte das ações dessas drogas à
inibição da atividade da ECA, que é uma enzima do tipo cininase II, importante
na degradação metabólica da BK e de outras cininas (RAGHAVENDRA &
KULKARNI, 2000; SCHIEFFER
et al., 1994). Sendo assim, o efeito pró-
inflamatório do LOS pode estar relacionado à maior concentração de BK, ou
mesmo de outros mediadores endógenos que não sejam as cininas (BLAIS
et
al
., 1999), como já foi citado. O efeito pró-inflamatório do LOS pode, ainda,
estar relacionado à ação da Ang II, gerada durante o processo inflamatório,
sobre os receptores AT2 não-bloqueados, ou mesmo estimulando vias
inflamatórias através de mecanismos ainda não esclarecidos, uma vez que os
receptores AT1 encontravam-se bloqueados (RAGHAVENDRA & KULKARNI,
2000).
A princípio, poder-se-ia imaginar que as drogas que inibem a ECA
teriam efeito antiinflamatório, já que diminuem a quantidade de Ang II formada.
92
No entanto, o efeito predominante daquelas drogas parece ser o aumento dos
níveis de BK, que é uma substância pró-inflamatória. BOURA & SVOLMANIS
(1984) observaram que o Captopril, uma droga inibidora da ECA, potencializou
o edema de pata induzido tanto pela Cg como pela BK. Os níveis de BK
aumentam após a administração de Captopril. Conseqüentemente, a síntese
de PGs também é aumentada. Isso explica o efeito pró-inflamatório do
Captopril neste modelo. Além disso, WAWROCKA-PAWLAK & DABROWSKI
(1999) sugerem que os efeitos colaterais observados durante a terapia com
Captopril são conseqüentes da liberação de histamina pelos mastócitos, o que
indica mais um possível mecanismo de ação para essa droga.
Algumas linhas de pesquisa postulam que parte dos efeitos
farmacológicos das drogas antagonistas de receptores AT1 poderia ser
conseqüência da redução da atividade da ECA presente no plasma e nos
tecidos (SCHIEFFER e cols, 1994). No entanto, alguns autores encontraram
resultados conflitantes com tal afirmativa (DÉCARIE
et al., 1996; BLAIS et al.,
1999). Segundo esses autores, diferente do Captopril, a contribuição do LOS
em alterar a atividade da ECA durante a potenciação da resposta inflamatória
da Cg poderia ser desconsiderada, visto que o tratamento crônico com LOS
não alterou a quantidade de bradicinina tissular e des-Arg
9
–BK, que é gerada
pela injeção de Cg na pata, sugerindo que outros mediadores endógenos, que
não sejam as cininas, podem ser responsáveis pelo efeito do LOS em potenciar
o edema de pata da Cg. Inclusive SCHIEFFER e cols (1994) sugerem um
possível envolvimento de outros componentes do SRA na diminuição da
atividade da ECA devido ao tratamento crônico com drogas antagonistas de
receptores AT1.
93
Como o LOS, antagonista de receptores AT1, demonstrou efeito pró-
inflamatório no modelo do edema de pata da Cg e do DXT, especula-se que,
nestes modelos experimentais, os receptores AT1 exerçam um papel
antiinflamatório e que os receptores AT2 participem do processo, ou seja,
exerçam um papel pró-inflamatório. De acordo com essa hipótese, o CGP-
42112A, agonista dos receptores AT2 da Ang II, promoveu significativa
potenciação do edema de pata induzido por Cg em ratos, principalmente nas
primeiras horas, sugerindo a participação dos receptores AT2 no efeito
amplificador da Ang II na fase inicial do processo inflamatório evocado por Cg e
modulado pela Ang II localmente formada.
Embora a maioria dos autores afirme que o CGP-41112A é uma
droga agonista dos receptores AT2 (MARTINEAU
et al., 1998; MIFUNE et al.,
2000; CAO
et al., 2000; WU et al., 2001; CAREY et al., 2001; JOHANSSON et
al., 2001), há uma outra corrente de autores que descreve esta droga como
antagonista de tais receptores (RAGHAVENDRA & KULKARNI, 2000; RUIZ-
ORTEGA
et al., 2000). Sua atividade farmacológica parece variar, dependendo
do tecido da espécie estudada e das diferentes condições experimentais (
in
vivo
versos in vitro).
Tendo em vista o efeito amplificador da Ang II sobre o edema de pata
induzido pela Cg, e sendo este, pelo menos em sua fase tardia, mediado por
citocinas e por migração de neutrófilos, decidimos investigar se tais
mecanismos estariam envolvidos com o efeito pró-inflamatório da Ang II.
Inicialmente testamos a capacidade da Ang II em modular o aumento
da síntese de citocinas pró-inflamatórias induzida por Cg
in vivo. Foram
realizadas, então, a dosagem de IL-1
β e TNF-α no tecido da pata dos animais
94
envolvidos no experimento do edema de pata por Cg. Nossos resultados
mostraram que a Cg induziu a síntese de TNF-
α já na primeira hora após a
injeção e de IL-1, detectada na segunda hora como previamente descrito
(CUNHA
et al., 2000). A Ang II, por sua vez, não foi capaz de alterar a
dosagem destas citocinas induzida pela injeção de Cg na pata dos animais.
A fim de testarmos a capacidade da Ang II de promover aumento da
migração de neutrófilos induzida por uma dose submáxima de Cg, trabalhamos
com dois modelos experimentais: o de peritonite induzida pela própria Cg e o
de edema de pata, também induzido por Cg, que nos forneceu tecido para a
dosagem de MPO, enzima presente nos grânulos de neutrófilos, sendo,
portanto, uma forma de medir a infiltração neutrofílica no tecido inflamado
agudamente. Nesse sentido, detectamos que a Ang II não foi capaz de alterar o
aumento da dosagem de MPO induzido pela injeção de Cg na pata de ratos,
sugerindo que o efeito pró-inflamatório da Ang II não se deve ao aumento da
infiltração de neutrófilos no local da inflamação. Corroborando com este
achado, nosso estudo também demonstrou que a Ang II não alterou o grau de
migração de leucócitos PMN para a cavidade peritoneal de ratos induzida pela
Cg.
Uma vez estimulados, os mastócitos liberam uma série de
substâncias que podem ser divididas em duas classes: os mediadores pré-
formados, tais como histamina, serotonina (RANG
et al., 2003) e uma pequena
quantidade de TNF-
α (BEIL et al., 1994; BEIL et al., 1996; SCHMIDT-
CHOUDHURY
et al., 1996) e os mediadores oriundos da chamada síntese “de
novo”. Os LTs, as PGs, as citocinas (TNF-
α e ILs 3, 4, 5, 6, 8) e as
quimiocinas (MIP-1 e CINC-1 e 13) fazem parte desta segunda classe (BANKS
95
& COLEMAN, 1996; BIEDERMANN et al., 2000; WAKAHARA et al., 2001;
ZHONG
et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2002). Apesar de a literatura relatar que
os grânulos dos mastócitos contêm TNF-
α pré-formado, o teste de ELISA feito
por nós não detectou a presença significativamente maior desta citocina nas
patas dos animais que receberam Ang II e Cg em relação àqueles que
receberam apenas Cg. Esse resultado poderia ser explicado pelo fato de que a
quantidade de TNF-
α que se encontra pré-formada nos grânulos dos
mastócitos é pequena (GALLI, 1993) e, portanto, não detectável
experimentalmente pelo teste de ELISA. Além disso, como as amostras foram
colhidas 1 h após as injeções, não houve tempo suficiente para que houvesse
síntese “de novo” de TNF-
α. Uma outra explicação poderia ser dada pelo fato
de serem os mastócitos células heterogêneas. Conforme o sítio, ou mesmo o
tipo de agonista, os mastócitos podem liberar diferentes tipos de mediadores
(GALLI, 1993).
Outros estudos já pesquisaram a influência da Ang II sobre a
produção de citocinas pró- e antiinflamatórias, encontrando, em sua maioria,
resultados conflitantes com os nossos. De acordo com os resultados de
PEETERS e cols (1998), moduladores do SRA, como o Captopril, inibidor do
SRA, e o Valsartan, antagonista de receptores AT1, apresentaram potente
efeito inibitório sobre a síntese de citocinas pró-inflamatórias (TNF
α e IL-β)
induzida por LPS
in vitro. A citocina IL-1Ra, antiinflamatória, teve sua síntese
estimulada por Captopril, enquanto a produção de IL-6 diminuiu com o uso do
Valsartan. No entanto, esses resultados foram obtidos com concentrações
bastante altas das drogas utilizadas, concentrações estas que não poderiam
ser adotadas em uma situação
in vivo. SCHINDLER e cols (1995) também
96
encontraram resultados semelhantes. Eles reportaram que o Cartopril
apresentou ação inibitória sobre a síntese de TNF-
α e IL-1β induzida por LPS.
Porém, como no estudo de PEETERS e cols (1998), os efeitos do Captopril
sobre a produção de citocinas foram vistos apenas com concentrações acima
de 100
μM. Isso indica que os resultados encontrados também não poderiam
ser extrapolados para uma situação
in vivo.
O tratamento de pacientes hipertensos com Losartan, apesar de
reduzir a pressão arterial, também não foi capaz de reduzir os níveis de TNF-
α
(SARDO
et al., 2004). Esses diferentes efeitos de inibidores da ECA e de
antagonistas de receptores AT1 sugerem que a inibição da Ang II não é a única
via pela qual essas drogas afetam a produção de citocinas. Essa afirmativa é
suportada pela observação de que outros potentes inibidores da ECA, como
Ramipril, Perindopril e Lisinopril, não influenciam a produção de citocinas
(SCHINDLER
et al., 1995). Uma hipótese alternativa seria a de que o Captopril
agiria através de sua capacidade de induzir a síntese de prostaglandinas, as
quais são potentes inibidores da síntese de citocinas (ENDRES
et al., 1996).
A hipótese de que o Valsartan poderia atuar através de outros
mecanismos além do bloqueio de receptores AT1 ainda permanece indefinida.
FUNAKOSHI e cols (1999) investigaram o efeito da Ang II sobre a produção de
IL-6 em cultura de células musculares lisas da vasculatura de ratos
in vitro. Os
autores afirmam que IL-6 é uma citocina pró-inflamatória e multifuncional. Foi
concluído que Ang II potenciou a expressão de IL-6 de forma significativa e
dose-dependente. Além disso, este efeito da Ang II foi completamente
bloqueado pelo antagonista dos receptores AT1, o CV11974. Porém, o
antagonista dos receptores AT2, o PD123319 não mostrou efeito algum.
97
Embora esse estudo não esclareça o papel da Ang II sobre a expressão de IL-6
in vivo, sugere-se que um possível mecanismo de ação das drogas inibidoras
da ECA, bem como daquelas antagonistas dos receptores AT1 em prevenir a
aterosclerose (IKEDA
et al., 1999), seria a inibição do aumento de expressão
da IL-6 induzido pela Ang II. Os resultados desse estudo sugerem claramente o
papel da Ang II na produção de IL-6, mediando, assim, o processo inflamatório
vascular. SCHIEFFER e cols (2000) encontraram resultados semelhantes; os
autores demonstraram que Ang II, receptores AT1 e ECA são expressos em
sítios estratégicos dentro das placas ateroscleróticas humanas e que Ang II
estimula a síntese e liberação de IL-6
in vitro. Embora IL-6 seja conhecida
como uma citocina antiinflamatória, alguns estudos enfatizam o seu potencial
pró-inflamatório como regulador central da inflamação e da diferenciação de
macrófagos (BIASSUCI
et al., 1996; SCHIEFFER et al., 2000). Como podemos
observar, diferente do que ocorreu em nosso estudo, a Ang II promoveu a
síntese de citocinas nos modelos citados. Esses resultados conflitantes podem
ser, em parte, explicados pelo fato de se tratarem de sítios diferentes de
inflamação, além das diferentes condições experimentais.
A selectina-E é uma molécula de adesão intimamente relacionada
com a migração de neutrófilos para o foco inflamatório, sendo inclusive um
marcador para avaliação do grau de migração de leucócitos PMN (BRITO &
RIBEIRO, 1999). GRAFE e cols (1997) investigaram o papel da Ang II sobre a
expressão endotelial de selectina-E
in vitro. Em células endoteliais coronárias,
a Ang II aumentou a expressão de selectina-E de forma estatisticamente
significativa. No entanto, em células endoteliais da microvasculatura cardíaca,
Ang II induziu apenas um pequeno aumento da expressão de selectina-E. KIM
98
e cols (1996), ao tratarem células endoteliais provenientes da aorta humana e
de coelhos com Ang II demonstraram indução da adesão de monócitos, mas
não de neutrófilos a essas células. Esses dados estão de acordo com os
nossos resultados, que mostraram a incapacidade da Ang II em alterar o grau
de migração de neutrófilos no modelo de peritonite induzida por Cg em ratos.
Os resultados contraditórios obtidos pelos primeiros autores citados neste
parágrafo poderiam ser atribuídos a diversidade de resposta de células
endoteliais localizadas em sítios diferentes.
A Ang II, apesar de seu efeito amplificador do edema, não aumentou
a síntese de citocinas, nem tampouco a migração de neutrófilos para o sítio da
inflamação, além de potencializar o edema de pata da Cg nas primeiras horas,
bem como o edema do DXT. Estes achados levaram-nos à hipótese de que
Ang II amplificou o edema induzido por estes mediadores através da indução
de degranulação de mastócitos e liberação de mediadores vasoativos, como
histamina e serotonina, sendo esta última presente apenas em mastócitos de
roedores (MALING
et al., 1974; DE RESENDE et al., 2001). Para comprovar tal
fato, utilizando o mesmo modelo experimental, testamos o efeito da
Mepiramina, um anti-histamínico derivado da etilenodiamina e seletivo para
receptores do tipo H1 da histamina (KOROLKOVAS
et al., 1988). Utilizamos
também a Metisergida, um alcalóide semi-sintético derivado do esporão do
centeio e antagonista da serotonina (KOROLKOVAS
et al., 1988). Ambas
reduziram o edema vascular induzido pelo DXT, bem como a potencialização
do mesmo pela Ang II. Sendo que a metisergida promoveu uma redução ainda
mais acentuada do edema, chegando a reverter quase completamente a ação
da Ang II. Este achado está de acordo com dados da literatura, que
99
demonstram que o edema de pata induzido em ratos depende prioritariamente
da liberação de serotonina (MALING
et al., 1974; DE RESENDE et al., 2001).
Isso provavelmente se deve ao fato de que, em roedores, a serotonina
predomina nos grânulos dos mastócitos (MALING
et al., 1974; GALLI, 1993).
Esses dados sugerem que a amplificação do edema induzida pela Ang II se
deve, pelo menos em parte, a mediadores como histamina e serotonina,
derivados de mastócitos.
DI ROSA e cols (1971) estudaram os mediadores da inflamação
aguda induzida pela Cg em ratos. Com relação a tais mediadores, os autores
subdividiram a resposta inflamatória a Cg em três fases distintas. A primeira
envolve liberação inicial de histamina e serotonina. A segunda fase é mediada
pelas cininas, como a BK, e a terceira é mediada pelas PGs. Tanto histamina
quanto serotonina são liberados ao mesmo tempo e em tal concentração que
cada amina exerce seu efeito máximo na permeabilidade vascular. Estes
autores demonstraram, portanto, que anti-histamínicos ou antagonistas de
serotonina, administrados isoladamente, revertem apenas parcialmente o
edema de pata da Cg. No edema do DXT, também ocorre degranulação de
mastócitos e em roedores, liberação desses dois mediadores (LO
et al., 1982).
Portanto, isso explica por que em nosso estudo, mepiramina ou metisergida,
isoladamente, não foram capazes de reverter completamente o edema vascular
DXT.
Dessa forma, resolvemos avaliar o efeito da Ang II sobre a
degranulação de mastócitos em dois sítios: na própria pata inflamada pela Cg
ou pelo DXT e no mesentério de ratos, sítio com grande população de
mastócitos. Assim, colhemos tecido da pata dos animais 1h após a injeção de
100
Cg e de DXT, uma vez que a degranulação de mastócitos ocorre precocemente
nestes edemas (DI ROSA
et al., 1971; LO et al., 1982; AL-HABOUBI &
ZIETLIN, 1983; DOZEN
et al., 1989). As amostras de tecido da região
subplantar foram utilizadas para a confecção das lâminas e posterior contagem
do percentual de mastócitos degranulados após coloração com azul de
toluidina. Demonstramos, então, que a Ang II potenciou de forma significativa a
degranulação de mastócitos induzida tanto pelo DXT como pela Cg na pata de
ratos
Wistar. Além disso, Ang II promoveu, em mesentérios de ratos, aumento
significativo da degranulação de mastócitos induzida pelo composto 48/80,
conhecido por liberar histamina de mastócitos (PATON, 1951, 1957;
FELDBERG & TALESNIK, 1953; RILEY & WEST, 1956), em concentração
submáxima. Mesmo na ausência das substâncias indutoras – Cg, DXT ou
48/80 – a Ang II foi capaz de promover degranulação significativa de
mastócitos em relação aos animais que receberam apenas solução salina. Isso
sugere que o efeito da Ang II em potenciar o edema de pata da Cg e do DXT
deve ser mediado por sua ação em induzir degranulação de mastócitos de
forma direta ou indireta. É importante observarmos que, no modelo da
degranulação de mastócitos em mesentérios de ratos, a indução da
degranulação de mastócitos pela Ang II na ausência do composto 48/80 foi
bem mais acentuada quando comparada àquela induzida no modelo de
degranulação na pata dos animais. Isso provavelmente se deve à
heterogeneidade entre os mastócitos de diferentes sítios (GALLI, 1993).
A indução da degranulação de mastócitos por Ang II, mesmo na
ausência de Cg, DXT ou 48/80, abordada no parágrafo anterior, pode parecer
conflitante com os resultados obtidos por nós ao trabalharmos com o edema de
101
pata da Cg e do DXT. Nestes modelos, Ang II, por si só, não foi capaz de
induzir aumento do volume do edema. Provavelmente, o método utilizado por
nós ao medirmos o volume do edema – pletismômetro – não foi sensível o
suficiente para detectarmos o efeito da Ang II, administrada isoladamente, em
induzir degranulação de mastócitos.
De acordo com vários estudos a respeito da biologia dos mastócitos
(SHIOTA
et al., 1997; KATADA et al., 1999; MIYAZAKI & TAKAI, 2001;
DOGGRELL & WANSTALL, 2003), uma das conseqüências da degranulação
de mastócitos seria a liberação de uma protease – a quimase – que seria
responsável pela transformação da Ang I em Ang II. Dados da literatura
indicam que apenas a quimase presente em humanos, primatas e cães tem a
capacidade de formar Ang II; a quimase de ratos e camundongos teria a
capacidade de quebrar a Ang II em fragmentos inativos (FUKAMI
et al., 1998).
Porém, alguns autores, ao conduzirem pesquisas utilizando
hamsters,
concluíram que a quimase presente em tal espécie também foi capaz de gerar
Ang II após degranulação de mastócitos (SHIOTA
et al., 1997; KATADA et al.,
1999; MIYAZAKI & TAKAI, 2001; DOGGRELL & WANSTALL, 2003). Além
disso, segundo SAITO e cols (2003), um determinado tipo de enzima presente
em camundongos – a protease-1 – é capaz de clivar a Ang I para formar Ang II.
De acordo com o trabalho de JIN e cols (2001), a Ang II produzida pela
quimase participa do estado patofisiológico após infarto do miocárdio em
hamsters. Sendo assim, não se pode descartar a hipótese de que, ao promover
a degranulação de mastócitos, a Ang II induz a liberação de uma quimase,
responsável pela formação local de mais Ang II, que, por sua vez, amplifica o
processo inflamatório. Em situações de normalidade, a ECA desempenha
102
papel fundamental sobre a produção de Ang II, enquanto a quimase é estocada
nos grânulos dos mastócitos em sua forma inativa. A quimase adquire a
capacidade de formar Ang II após a degranulação de mastócitos induzida por
algum estímulo, como a injúria vascular provocada por cateter descrita no
estudo de MIYAZAKI & TAKAI (2001). É necessário que uma maior ênfase seja
dada ao mecanismo de ação que envolve degranulação de mastócitos e
liberação de mediadores inflamatórios. Segundo DOGGRELL & WANSTALL
(2003), as drogas inibidoras de quimase podem significar um importante
avanço no tratamento da injúria vascular associada à degranulação de
mastócitos.
Nossos resultados indicam que, nos modelos utilizados em nossa
pesquisa, a Ang II potencializou a inflamação através de mecanismos
independentes da migração celular. Além disso, Ang II, LOS e CGP-42112A
potenciaram o edema da Cg já nas primeiras horas, bem como aquele induzido
por DXT, o que sugere que essas drogas influenciam a fase vascular do edema
induzido por essas substâncias, isto é, a fase relacionada com a degranulação
de mastócitos e a liberação de mediadores vasoativos. Além de induzir a
degranulação de mastócitos, com a conseqüente liberação de aminas
vasoativas, a Ang II, ao potenciar a fase precoce do edema da Cg, pode
também está promovendo um aumento dos níveis de bradicinina, conhecida
por causar vasodilatação e por aumentar a permeabilidade vascular, levando
ao extravasamento de proteínas e fluídos e à formação de edema local. No
entanto, esta hipótese não foi testada em nosso trabalho. Esse aumento dos
níveis de bradicinina pode também levar à síntese de prostaglandinas
103
(DÉCARIE et al., 1996), amplificando a resposta inflamatória. Essa é uma
importante via a ser investigada em trabalhos futuros.
Esse trabalho sugere que, nos modelos utilizados, a Ang II modulou
o processo inflamatório agudo ao interferir em seu componente vascular. Isso
apresenta importância clínica relevante, uma vez que cresce o uso de drogas
relacionadas com o SRA para o tratamento da hipertensão arterial, que está
diretamente relacionada à aterosclerose, na qual a inflamação na parede dos
vasos tem papel relevante. Dessa forma, esperamos contribuir para o
esclarecimento do papel da Ang II no processo inflamatório, servindo de base
científica para testes futuros de ligantes de seus receptores como moduladores
inflamatórios em doenças nas quais a inflamação se constitui fator de
morbidade.
104
VI. CONCLUSÕES
105
VI. CONCLUSÕES
O conjunto de dados colhidos em nosso trabalho nos leva a concluir que:
• Ang II amplificou a fase vascular do edema da Cg, bem como o edema
do DXT;
• A ação da Ang II em amplificar o edema independe do aumento da
indução da síntese de citocinas ou da migração de leucócitos PMN;
• LOS, antagonista de receptores AT1, e CGP-42112A, agonista de
receptores AT2, potenciaram a fase precoce do edema da Cg e do DXT,
sugerindo a participação de receptores AT2 na amplificação do edema
por Ang II formada endogenamente;
• A ação da Ang II sobre o edema é dependente da degranulação de
mastócitos.
106
VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
107
VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Abbas, A.K.; Lichtman, A.H.; Pober, S. Effector mechanisms of
immunoglobulin E-initiated immune reactions.
In: Cellular and Molecular
Immunology. Abas, ABUL K. 4ªEd., Philadelphia: WB Saunders Company,
cap. 14, p. 279-313, 2000.
Abraham, S.N.; Malaviya, R. Mast cells in infection and immunity.
Infection
and Immunity, v. 65 (n. 9), p. 3501-08, 1997.
Akishita, M.; Horiuchi, M.; Yamada, H.
et al.. Inflammation influences
vascular remodeling through AT
2
receptor expression and sinaling. Phisiol.
Genomics.
, v. 2, p. 13-30, 2000.
Akishita, M.; Iwai, M.; Wu, L.
et al. . Inhibitory effect of AT
2
receptor on
coronary arterial remodeling after aortic.
Circulation, v. 102, p. 1684-89,
2000.
Al-Haboubi, H.A. & Zeitlin, I.J. Re-appraisal of the role of histamine in
carragenin-induced paw oedema.
Eur. J. Pharm., v. 88, p. 169-76, 1983.
Allen, A.M.; Zhuo, J.; Mendelsohn, F.A.O. Localization and function of
angiotensin AT
1
receptors. American Journal of Hypertension, v. 13, p.
31S-38S, 2000.
Andersen, S.; Tarnow, L.; Rossing, P.
et al.. Renoprotective effects of
angiotensin II receptor blockade in type 1 diabetic patients with
diabeticnephropathy.
Kidney Int., v. 57, p. 601-6, 2000.
Banks, B.E.; Vernon, C.A.; Warner, J.A. Nerve growth factor has anti-
inflammatory activity in the rat hindpaw oedema test.
Neurosci. Lett., v. 47,
p. 41-45, 1984.
Banks, E.M.S. and Coleman, J.W. A comparative study of peritoneal mast
cells from mutant IL-4 deficient and normal mice: evidence that IL-4 is not
essential for mast cell development but enhances secretion via control of
IgE binding and passive sensitization.
Citokine, v. 8 (n. 3), p. 190-6, 1996.
Barber, M.N.; Sampey, D.B.; Widdop, R.E. AT(2) receptor stimulation
enhances antihypertensive effect of AT(1) receptor antagonist in
hypertensive rats.
Hypertension, v. 34, p. 1112-16, 1999.
Basran, G.S.; Morley, P.W.; Turner, W.M. Evidence in man of synergistic
interaction between putative mediators of acute inflammation and asthma.
Lancet, v. 1, p. 935-37, 1982.
Bataller, R.; Sancho-Bru, P.; Ginès, P.; Lora, J.M.; Al-Garawi, A.; Solé, M.;
Colmenero, J.; Nicolás, J.M.; Jiménez, W.; Weich, N.; Gutiérrez-Ramos,
108
J.C.; Arroyo, V.; Rodés, J. Activated human hepatic stellate cells express
the renin-angiotensin system and synthesize angiotensin II.
Gastroenterology, v. 125 (n. 1), p. 117-25, 2003.
Beil, W.J.; Login, G.R.; Galli, S.J. and Dvorak, A.M. Ultra structural
immunogold localization of tumor necrosis factor-alpha to the cytoplasmic
granules of rat peritoneal mast cells with rapid microwave fixation.
J. Allergy
Clin. Immunol., v. 94 (n. 3), p. 531-36, 1994.
Beil, W.J.; Login, G.R.; Aoki, M.; Morgan, E.S.; Galli, S.J. and Dvorak, A.M.
Tumor necrosis factor-alpha immunoreactivity of rat peritoneal mast cells
granules decreases during early secretion induced by compound 48/80: an
ultra structural immunogold morphometric analysis.
Int. Arch. Allerg.
Immunol., v. 109 (n. 4), p. 383-89, 1996.
Beloni, A.S.; Andreis, P.G.; Macchi, V.; Gottardo, G.; Malendowicz, L.K. and
Nussdorfer, G.G. Distribution and functional significance of angiotensin II
AT1- and AT2- receptor subtypes in the rat adrenal gland.
Endocr. Res., v.
24, p. 1-15, 1998.
Bevilacqua, M.P.; Nelson, R.M.; Mannori, G.
et al.. Endhotelial-leukocyte
adhesion molecules in human disease.
Annu. Rev. Med., v. 45, p. 361-78,
1994.
Biassuci, L.; Vitelli, A.; Liuzzo, G.; Altamura, S.; Caliguri, G.; Rebuzzi, A.;
Ciliberto, G.; Maseri, A. Elevated levels of interleukin-6 in unstable angina.
Circulation, v. 94, p. 874-77, 1996.
Biedermann, T.; Kneilling, M.; Mailhammer, R.; Maier, K.; Sander, C.A.;
Kollias, G.; Kunkel, S.L.; Hültner, L. and Röcken, M. Mast cells control
neutrophil recruitment during T cell-mediated delayed-type hypersensivity
reactions through tumor necrosis factor and macrophage inflammatory
protein 2.
J. Exp. Med., v. 192 (n. 10), p. 1441-51, 2000.
Blais, C.; Leclair, P.; Molinaro, G.; Adam, A. Absence of effect of chronic
angiotensin II type 1 receptor blockade on endogenous kinin concentrations-
induced paw edema model in the rat.
Peptides, v. 20, p. 343-52, 1999.
Boulanger, C.M..; Caputo, L; Levy, B.I. Endothelial AT1 -Mediated Release
of Nitric Oxide Decreases Angiotensin II Contractions in Rat Carotid Artery.
Hypertension, v. 26, p. 752-57, 1995.
Boura, A.L.A. & Svolmanis, A.P. Converting enzyme inhibition in the rat by
captopril is accompanied by potentiation of carrageenin-induced
inflammation.
Br. J. Pharmac., v. 82, p. 003-008, 1984.
Bowden, J.J.
et al. . Substance P (NK1) receptor immunoreactivity on
endothelial cells of the rat tracheal mucosa.
Am. J. Physiol., v. 270, p. 404,
1996.
109
Bradley, P.P.; Rothstein, C.; Rothstein, G. Cellular and extracellular
myeloperoxidase in pyogenic inflammation.
Blood, v. 60 (n. 3), p. 618-22,
1982.
Brett, J.
et al. Tumor necrosis factor/cachectin increases permeability of
endothelial cell monolayers by a mechanism involving regulatory G proteins.
J. Exp. Med., v. 169, p.1977, 1989.
Brito, G.A.C.; Souza, M.H.; Melo-Filho, A.A.; Hewlett, E.L.; Lima, A.A.;
Flores, C.A.; Ribeiro, R.A. Role of pertussis toxin A subunit in neutrophil
migration and vascular permeability.
Infect. Immun., v. 65, p. 1114-18,
1997.
Brito, G.A.C. e Ribeiro, R.A. Migração de neutrófilos: mecanismos e
mediadores.
Pesqui. Med. Fortaleza, v. 2, p. 108-15, 1999.
Buckley, T.L.; Brain, S.D.; Collins, P.D.
et al. . Inflammatory edema induced
by interactions between IL-1 and the neuropeptide calcitonin gene-related
peptide.
J. immunol., v. 146, p. 3424-430, 1991.
Buku, A.; Price, J.A.; Mendlowitz, M. and Mansur, S. Mast cells
degranulating peptide binding to RBL-2H3 mast cells receptors and inhibitis
IgE binding.
Peptides, v. 22, p. 1993, 2001.
Bumpus, F.M.; Catt, K.J.; Chiu, A.T.; De Gasparo, M.; Goodfriend, T.;
Husain, A.; Peach, M.J.; Taylor, D.G.; Timmermans, P. Nomenclature for
angiotensin receptors.
Hypertension, v. 17, p. 720, 1991.
Calhoun, W.; Yu, J.; Sung, A.; Chau, T.T.; Marshall, L.A.; Weichman, B.M.;
Carlson, R.P. Pharmacologic modulation of D-49 phospholipase A2-induced
paw edema in the mouse.
Agents Actions, v. 27, p. 418-21, 1989.
Cao, Z.; Dean, R.; Wu, L.; Casley, D.; Cooper, M.E. Role of angiotensin
receptor subtypes in mesenteric vascular proliferation and hypertrophy.
Hypertension, v. 34, p. 408-14, 1999.
Cao, Z.; Kelly, D.J.; Cox, A.; Casley, D.; Forbes, J.M.; Martinello, P.; Dean,
R.; Gilbert, R.E.; Cooper, M.E. Angiotensin type 2 receptor is expressed in
the adult rat kidney and promotes cellular prolliferation and apoptosis.
Kidney Int., v. 58, p. 2437-51, 2000.
Carey, R.M.; Howell, N.L.; Jin, H.; Siragy, H.M. Angiotensin type 2 receptor-
mediated hypotension in angiotensin type 1 receptor-blocked rats.
Hypertension, v. 38, p. 1272-77, 2001.
Cheng, H.F.; Wang, J.L.; Zhang, M.Z.; Miyazaki, Y.; Ichikawa, I.; McKanna,
J.A.; Harris, R.C. Angiotensin II attenuates renal cortical cyclooxygenase-2
expression.
J. Clin. Invest., v. 103, p. 953-61, 1999.
110
Collins, T. Acute and Chronic Inflammation. In: Contran, R.S.; Kumar, V. and
Collins, T. Robbins Pathologic Basis of Disease. 6ª ed. WB Saunders
Company. Philadelphia, 1999.
Cotran, R.S.; Briscoe, D.M.: Endothelial cells in inflammation. In: Kelley, W.
et al. (eds). Textbook of Rheumatology, 5ª ed. WB Saunders Company.
Philadelphia, p. 183-98, 1997.
Crunkhorn, P.; Willis, A.L. Cutaneous reactions to intradermal
prostaglandins.
Br. J. Pharmacol., v. 41, p. 49-56, 1971.
Cunha, J.M.; Cunha, F.Q.; Poole, S.; Ferreira, S.H. Cytokine-mediated
inflammatory hyperalgesia limited by interleukin-1 receptor antagonist.
Br J
Pharmacol., v.130 (n. 6), p.1418-24, 2000.
Davies, P.; MacINTYRE, D.E. Prostaglandins and Inflammation. In: Gallin,
J.I. Inflammation: basic principles and clinical correlates. New York: Raven
Press. Cap. 7, p.123-38, 1992.
Décarie, A.; Adam, A. and Couture, R. Effects of Captopril and Icatibant on
Bradykinin (BK) and des
[Arg
9
] BK in Carrageenan-Induced Edema.
Peptides, v. 17 (n. 6), p. 1009-15, 1996.
De Gasparo, M.; Catt, K.J.; Inagami, T.
et al. International union of
pharmacology, 23: the angiotensin II receptors.
Pharmacol. Rev., v. 52, p.
415-72, 2000.
De Resende, M.A.; Pimenta Dos Rei, W.G.; Pereira, L.S.; Ferreira, W.;
Perez Garcia, M.H.; Santoro, M.M.; Nogueira de Francischi, J. Hyperalgesia
and edema responses induced by rat peripheral blood mononuclear cells
incubated with carrageenin.
Inflammation, v. 25, p. 277-85, 2001.
Diep, Q.N.; Amiri, F.; Touys, R.M.; Cohn, J.S.; Endemann, D.; Neves, M.F.;
Schiffrin, E.L. PPARalpha activator effects on AngII-induced vascular
oxidative stress and inflammation.
Hypertension, v. 40 (n. 6), p. 866-71,
2002.
Di Rosa, M.; Giroud, J.P.; Willoughby, D.A. Studies of the mediators of the
acute inflammatory response induced in rats in different sites by
carrageenan and turpentine.
J. Path., v. 104, p. 15-29, 1971.
Doggrell, S.A.; Wanstall, J.C. Will chymase inhibitors be the next major
development for the treatment of cardiovascular disorders?
Expert. Opin.
Investig. Drugs, v. 12 (n. 8), p. 1429-32, 2003.
Dozen, M.; Yamaki, K.; Oh-Ishi, S. Captopril uncovers kinin-dependent
release of arachidonic acid metabolites in carrageenin-induced rat pleurisy.
Jpn. J. Pharmacol., v. 51, p. 101-05, 1989.
111
Dvorak, A.M. New aspects of mast cell biology. Int. Arch. Allergy
Immunol., v. 114, p. 1-9, 1997.
Endres, S.; Whitaker, R.E.D.; Ghorbani, R.; Meydani, S.N. & Dinarello, C.A.
Oral aspirin and ibuprofen increase cytokine-induced synthesis of IL-1(beta)
and tumor necrosis factor-(alpha)
ex vivo. Immunology, v. 87, p. 264, 1996.
Feldberg, W., Talesnik, J. Reduction in tissue histamine by compound
48/80.
J. Physiol. (London), v. 120, p. 550-68, 1953.
Feng, D.
et al. . Vesiculo-vacuolar organelles and the regulation of venule
permeability to macromolecules by vascular permeability factor, histamine
and serotonin.
J. Exp. Med., v. 183, p. 1981, 1996.
Ferreira, S.H.; Moncada, S.; Parsons, M. & Vane, J.R. The concomitant
release of bradykinin and prostaglandin in the inflamatory response to
carrageenin.
Br. J. Pharmac., v. 52, p. 108P,1974.
Frossi, B.; De Carli, M.; Pucillo, C. The mast cell: an antenna of the
microenvironment that directs the immune response.
J. Leukoc. Biol., v. 75
(n. 4), p. 579-85, 2004.
Fukami, H.; Okunish, H.; Miyazaki, M. Chymase: its pathophysiological roles
and inhibitors.
Curr. Pharrm. Des., v. 4 (n. 6), p. 439-53, 1998.
Fukuishi, N.; Sakaguchi, M.; Matsuura, S.; Nakagawa, C.; Akagi, R. and
Akagi, M. The mechanism of compound 48/80-induced superoxide
generation mediated by A-kinase in rat peritoneal mast cells.
Biochem. Mol.
Med., v. 61, p. 107-13, 1997.
Funakoshi, Y.; Ichiki, T.; Ito, K.; Takeshita, A. Induction of interleukin-6
expression by angiotensin II in rat vascular smooth muscle cells.
Hypertension, v. 34 (n. 1), p. 118-25, 1999.
Galli, S.J. New concepts about the mast cells. In: Flier, S.J.; Underhill, L.H.
(eds). Seminars in Medicine of Beth Israel Hospital, Boston. The New
England Journal of Medicine, v. 328 (n. 4), p. 257-65, 1993.
Gallin, J.I.; Goldstein, I.M.; Snyderman, R. Inflammation: basic principles
and clinical correlates. New York. Raven Press, p. 1186p, 1992.
Grafe, M.; Auch-Schwelk, W.; Zakrzewicz, A.; Regitz-Zagrosek, V.; Bartsch,
P.; Graf, K.; Loebe, M.; Gaehtgens, P.; Fleck, E. Angiotensin II-induced
leukocyte adhesion on human coronary endothelial cells is mediated by E-
Selectin.
Circ. Res., v. 81, p. 804-11, 1997.
Griendling, K.K.; Lassegue, B.; Alexander, R.W. Angiotensin receptors and
their therapeutic implications.
Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., v. 36, p.
281-306, 1996.
112
Grützkau, A.; Krüger-Krasagakes, S.; Baumeister, H.; Schwanz, C.; Kögel,
H.; Welker, P.; Lippert, U.; Henz, B.M.; Möller, A. Syntesis, storage and
release of vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor
(VEGF/VPG) by human mast cells: implications for the biological
significance of VEGF.
Jog. Mol. Biol. Cell., v. 4, p. 875-84, 1998.
Hirayama, K.; Fukoyama, K.; Epstein, W.L. Angiotensin II producing
proteases from granulomatous tissue reaction in mice infected with
Schistosoma mansoni. Comp. Biochem. Physiol., v. 96, p. 553-57, 1990.
Horiuchi, M.; Hayashida, W.; Kambe, T.; Yamada, T. & Dzau, V.J.
Angiotensin 2 receptor dephosphorylates Bcl-2 by activating mitogen-
activated protein kinase phosphatase-1 and induces apoptosis.
Journal of
Biological Chemistry, v. 272, p. 19022-26, 1997.
Horiuchi, M.; Akishita, M.; Dzau, V.J. Recent progress in angiotensin II type
2 receptor research in the cardiovascular system.
Hypertension, v. 33, p.
613-22, 1999.
Ichiki, T.; Kambayashi, Y.; Inagami, T. Differential inducibility of angiotensin
II AT
2
receptor between SHR and WKY vascular smooth muscle cells.
Kidney Int. Suppl., v. 55, p. S14-7, 1996.
Ikeda, U.; Ikeda, M.; Seino, Y.; Takahashi, M.; Kano, S.; Shimada, K.
Interleukin 6 gene transcripts are expressed in atherosclerotic lesions of
genetically hyperlipidemic rabbits
. Atherosclerosis, v. 92, p. 213-18, 1999.
Jaszewski, R.; Tolia, V.; Ehrinpreis, M.N.
et al.. Increased colonic mucosal
angiotensin I and II concentrations in Crohn`s colitis.
Gastroenterology, v.
98, p. 1543-48, 1990.
Jin, D.; Takai, S.; Yamada, M.; Sakaguchi, M.; Yao, Y.; Miyazaki, M.
Possible roles of cardiac chymase after myocardial infarction in hamsters
hearts.
Jpn. J. Pharmacol., v. 86 (n. 2), p. 203-14, 2001.
Johansson, B.; Holm, M.; Ewert, S.; Casselbrant, A.; Pettersson, A.;
Fändriks, L. Angiotensin II type 2 receptor-mediated duodenal mucosal
alkaline secretion in the rat.
Gastrointestinal and Liver Physiology, v. 280
(n. 6), p. G1254, 2001.
Jones, S.E.; Kelly, D.J.; Cox, A.J.; Zhang, Y.; Gow, R.M.; Gilbert, R.E. Mast
cell infiltration and chemokine expression in progressive renal disease.
Kidney Int., v. 64 (n. 3), p. 906-13, 2003.
Katada, J.; Muramatsu, M.; Hayashi, M.; Hattori, M. Role of mast cell
chymase in angiotensin-induced vascular contraction of hamster cheek
pouch microvessels.
Eur. J. Pharmacol., v. 379 (n. 1), p. 63-72, 1999.
113
Kato, H.; Suzuki, H.; Tajima, S.; Ogata, Y.; Tominaga, T.; Sato, A.; Saruta,
T. Angiotensin II stimulates collagen synthesis in cultured vascular smooth
muscle cells.
J. Hypertens., v. 9, p. 17-22, 1991.
Kim, J.A.; Berliner, J.A.; Nadler, J.L. Angiotensin II increases monocyte
binding to endotelial cells.
Biochemical and Biophysical Research
Communications, v. 226, p. 862-68, 1996.
Klett, C.; Hellmann, W.; Ganten, D.; Hakenthal, E. Tissue distribution of
angiotensinogen mRNA during experimental inflammation.
Inflammation, v.
17, p. 183-97, 1993.
Konstam, M.A.
et al.. Effects of the angiotensin converting enzyme inhibitor
enalapril on the long-term progression of left ventricular dysfunction in
pacients with heart failure.
Circulation, v. 86, p. 431, 1992.
Korolkovas, A., Burckhalter, J.H. Química farmacêutica. Rio de Janeiro.
Guanabara Koogan, p. 347-492, 1988.
Lipowsky, H.H. Leukocyte margination and deformation in postcapillary
venules. In: Granger, D.N.; Schmid-Schonbein, G.W. (eds). Physiology and
Pathophysiology of leukocyte Adhesion. New York, Oxford University Press,
p. 130-47, 1996.
Lo, T.N.; Almeida, A.P. and Beaven, M.A. Dextran and carrageenan evoke
different inflammatory responses in rat with respect to composition of
infiltrates and effect of indomethacin.
J. PET., v. 221 (n. 1), p. 261-67, 1982.
Luft, F.C. Workshop: Mechanisms and cardiovascular damage in
hipertension.
Hypertension, v. 37 (2 part 2), p. 594-98, 2001.
Lukacs, N.W.; Strieter, R.M.; Chensue, S.W.; Dunkel, S.L. Activation and
regulation of chemokines in allergic airway inflammation.
J. Leukoc. Biol.,
v. 59, p. 13-17, 1996.
Maling, H.M.; Webster, M.E.; Williams, M.A.; Saul, W.; Anderson, J.R.
Inflammation induced by histamine, serotonin, bradykinin and compound
48/80 in the rat: antagonists and mechanisms of action.
J. Pharmacol. Exp.
Ther.
, v. 191 (n. 2), 1974.
Majno, G.; Palade, G.E. Studies on inflammation: I. the effect of histamine
and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study.
J.
Biophys. Biochem. Cytol., v. 11, p. 571, 1961.
Martin, M.F.; Surrall, K.E.; McKenna. F.; Dixon, J.S.; Bird, H.A.; Wright, V.
Captopril: a new tratment for rheumatoid arthritis?
Lancet, v.3, p. 1325-28,
1984.
114
Martineau, D.; Lamouche, S.; Briand, R.; Yamaguchi, N. Functional
involvement of angiotensin AT2 receptor in adrenal catecholamine secretion
in vivo.
Can. J. Physiol. Pharmacol., v. 77, p. 364-74, 1999.
Matsubara, H. Pathophysiological role of Ang II type 2 receptor in
cardiovascular and renal diseases.
Circ. Res., v. 83, p. 1182-91, 1998.
Matsusaka, T. & Ichikawa, I. Biological functions of angiotensin and its
receptors.
Annual Review of Physiology, v. 59, p. 395-412, 1997.
Mavrikakis, M.E.; Vaiopoulos, G.; Papantoniou, B.
et al.. Plasma renin
activity as a marker of renovascular injury in pacients with rheumatoid
arthritis.
Clin. Exp. Rheumatol., v. 14, p. 613-17, 1996.
Medzhitov, R. and Janeway, C. Jr. Innate immunity.
N. Engl. J. Med., v.
343, p. 338-44, 2000.
Mervaala, E.M.A.; Muller, D.N.; Park, J.K.; Schmidt, F.; Lohn, M.; Breu, V.;
Dragun, D.; Ganten, D.; Haller, H.; Luft, F.C. Monocyte Infiltration and
adhesion molecules in a rat model of high human renin hypertension.
Hypertension, v. 33 (part II), p. 389-95, 1999.
Mezzano, S.; Droguett, A.; Burgos, M.E.; Ardiles, L.G.; Flores, C.A.; Aros,
C.A.; Caorsi, I.; Vio, C.P.; Ruiz-Ortega, M.; Egido, J. Renin-angiotensin
system activation and interstitial inflammation in human diabetic
nephropathy.
Kidney Int. Suppl., v. 88, p. S64-70, 2003.
Mifune, M.; Sasamura, H.; Shimizu-Hirota, R.; Miyazaki, H.; Saruta, T.
Angiotensin II type 2 receptors stimulate collagen syntesis in cultured
vascular smooth muscle cells.
Hypertension, v. 36, p. 845-50, 2000.
Migliorisi, G.; Folkes, E.; Pawlowski, N.
et al.. In vitro studies of human
monocyte migration across endothelium in response to leucotriene B
4
and
fMet-Leu-Phe.
Am. J. Pathol., v. 127, p. 157-67, 1987.
Miyazaki, M.; Takai, S. Local angiotensin II-generating system in vascular
tissues: the roles of chymase.
Hypertens. Res., v. 24 (n. 3), p. 189-93,
2001.
Muller, D.N.; Dechend, R.; Mervaala, E.M.A.; Park, J.K.; Schmidt, F.;
Fiebeler, A.; Theuer, J.; Breu, V.; Ganten, D.; Haller, H.; Luft, F.C. NF-
[kappa]B inhibition ameliorates angiotensin II-induced inflammatory damage
in rats.
Hypertension, v. 35 (1, Part 2), p. 193, 2000.
Nakajima, M.; Hutchinson, H.; Fujinaga, M.
et al.. The angiotensin II type 2
(AT
2
) receptor antagonizes the growth effects of the AT
1
receptor: gain of
function study using in vivo gene transfer.
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., v.
92, p. 10663-67, 1995.
115
Ohnaka, K.; Numaguchi, K; Yamakawa, T.; Inagami, T. Induction of
cyclooxygenase-2 by angiotensin II in cultured rat vascular smooth muscle
cells.
Hypertension, v. 35 (1, Part 1), p. 68-75, 2000.
Oliani, S.M.; Lim, L.H.K.; Chistian, H.C.; Pell, K.; Das, A.M. and Perretti, M.
Morphological alteration of peritoneal mast cells and macrophages in the
mouse peritoneal cavity during the early phases of an allergic inflammatory
reaction.
Cell. Biol. Int., v. 25 (n. 8), p. 795-803, 2001.
Oliveira, S.H.P.; Costa, C.H.S.; Ferreira, S.H. and Cunha, F.Q. Sephadex
induces eosinophil migration to the rat and mouse peritoneal cavity:
involvement of mast cells, LTB4, TNF-
α, IL-8 and PAF. Inflamm. Res., v.
51, p. 144-53, 2002.
Parkin, J. and Cohen, B. An overview of the immune system.
Lancet, v.
357, p. 1777-89, 2001.
Paton, W.D.M. Compound 48/80, a potent histamine liberator.
Brit. J.
Pharmacol., v. 6, p. 499-508, 1951.
Paton, W.D.M. Histamine released by compounds of simple chemical
structure.
Pharmacol. Rev., v. 9, p. 269-328, 1957.
Peeters, A.C.T.M.; Netea, M.G.; Kullberg, B.J.; Thien, T.; Van Der Meer,
J.W.M. The effect of renin-angiotensin system inhibitors on pro- and anti-
inflammatory cytokine production.
Immunology, v. 94 (n. 3), p. 376-79,
1998.
Piqueras, L.; Kubes, P.; Alvarez, A.; O´Connor, E.; Issekutz, A.C.;
Esplugues, J.V.; Sanz, M.J. Angiotensin II induces leukocyte-endothelial cell
interactions in vivo via AT1 and AT2 receptor-mediated P-selectin
upregulation.
Circulation, v. 102 (n. 17), p. 2118-23, 2000.
Pober, J.S.; Cotran, R.S. The role of endothelial cells in inflammation.
Transplantation, v. 50, p. 537-44, 1990.
Qi, Z.; Hao, C-M.; Langenbach, R.I.; Breyer, R.M.; Redha, R.; Morrow, J.D.
and Breyer, M.D. Opposit effects of cyclooxygenase-1 and –2 activity on the
pressor response to angiotensin II.
J. Clin. Invest., v. 110 (n. 1), p. 61-69,
2002.
Raghavendra, V.; Kulkarni, S.K. AT1 receptor antagonism enhances
angiotensin-II- facilitated carrageenan-induced paw edema.
Methods Find
Clin. Pharmacol., v. 22, p. 633-36, 2000.
Rang, H.P.; Dale, M.M.; Ritter, J.M.; Moore, P.K. Local hormones,
inflammation and immune reactions. In: Pharmacology. 5ªed. Churchill
Livingstone. Edinburgh, 2003.
116
Reid, I.A. Interactions between ANG II, sympathetic nervous system and
baroreceptor reflexes in regulation of blood pressure.
Am. J. Physiol., v.
262, p. E763, 1992.
Ribeiro, R.A.; Souza-Filho, M.V.P.; Souza, M.H.L.P.; Oliveira, S.H.P.; Costa,
C.H.S.; Cunha, F.Q.; Ferreira, S.H.P. Role of resident mast cells and
macrophages in the neutrophil migration induced by LTB4, fMLP and C5a
des arg.
Int. Arch. Allergy Immunol., v. 112, p. 27-35, 1997.
Riley, J.F.; West, G.B. Skin histamine: its location in the tissue mast cells.
Arch. Dermatol. v. 74, p. 471-78, 1956.
Rocha e Silva, M.O. A brief history of inflammation. In: Vane, J.R.; Ferreira,
S.H. (ed). Handbook of Experimental Pharmacology. Springer-Verlag, v. 50
(1), p. 6-25, 1978.
Ruiz-Ortega, M.; Lorenzo, O.; Rupérez, M.; Konig, S.; Wittig, B.; Egido, J.
Angiotensin II activates nuclear transcription factor [Kappa] B through AT
1
e
AT
2
in vascular smooth muscle cells: molecular mechanisms. Circ. Res., v.
86, p. 1266-72, 2000.
Ruiz-Ortega, M.; Lorenzo, O.; Suzuki, Y.; Rupérez, M.; Egido, J.
Proinflamatory actions of angiotensins.
Curr. Opin. Nephrol. Hypertens., v.
10, p. 321-29, 2001.
Sadoshima, J. Cytokine actions of angiotensin II.
Circ. Res., v. 86 (n. 12), p.
1187-89, 2000.
Saito, K.; Muto, T.; Tomimori, Y.; Imajo, S.; Maruoka, H.; Tanaka, T.;
Yamashiro, K.; Fukuda, Y. Mouse mast cell protease-1 cleaves angiotensin I
to form angiotensin II.
Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 302 (n. 4),
p.773-77, 2003.
Sardo, M.A.; Castaldo, M.; Cinquegrani, M.; Bonaiuto, M.; Fontana, L.;
Campo, S.; Campo, G.M.; Altavilla, D.; Saitta, A. Effects of AT1 receptor
antagonist losartan on sICAM-1 and TNF-alpha levels in uncomplicated
hypertensive patients.
Angiology, v. 55 (n. 2), p. 195-203, 2004.
Schelling, P.; Fischer, H.; Ganten, D. Angiotensin and cell growth: A link to
cardiovascular hypertrophy?
J. Hypertens., v. 9, p. 3, 1991.
Schieffer, B.; Wirger, A.; Meybrunn, M.
et al.. Comparative effects of chronic
angiotensin converting enzyme inhibition and angiotensin II type 1 receptor
bloked on cardiac remodeling after myocardial infarction in the rat.
Circulation, v. 89, p. 2273-82, 1994.
Schieffer, B.; Schieffer, E.; Hilfiker-Kleiner, D.; Hilfiker, A.; Kovanen, P.;
Kaartinen, M.; Nussberger, J.; Harringer, W.; Drexler, H. Expression of
angiotensin II and interleukin 6 in human coronary atherosclerotic plaques:
117
potential implications for inflammation and plaque instability. Circulation, v.
101 (n. 12), p. 1372-78, 2000.
Schindler, R.; Dinarello, C.A. and Koch, K-M. Angiotensin-converting-
enzyme inhibitors suppress synthesis of tumor necrosis factor and
interleukin 1 by human peripheral blood mononuclear cells.
Cytokine, v. 7
(n. 6), p.526-33, 1995.
Schmidt-Choudhury, A.; Furuta, G.T.; Lavigne, J.A.; Galli, S.J. and Wershil,
B.K. The regulation of tumor necrosis factor-
α production in murine mast
cells: pentoxifyline or dexamethasone inhibits IgE-dependent production of
TNF-
α by distinct mechanisms. Cell. Immunol., v. 171, p. 140-46, 1996.
Sedgwick, A.D.; Willoughby, D.A. Initiation of the inflammatory response and
its prevention. In: Bonta IL, Bray MA, Parnham MJ (ed). Handbook of
Inflammation. Elsevier, v. 5, p. 27-47, 1985.
Seyedi, N.; Xu, X.B.; Najiletti, A.; Hintze, T.H. Coronary kinin generation
mediates nitric oxide release after angiotensin receptor stimulation.
Hypertension. v. 26, p.164-170, 1995.
Shiota, N.; Fukamizu, A.; Takai, S.; Okunishi, H.; Murakami, K.; Miyazaki.
Activation of angiotensin II-forming chymase in the cardiomyopathic hamster
heart.
J. Hypertens., v. 15 (n. 4), p. 431-40, 1997.
Simon, M.R.; Kamlay, M.T.; Desai, S.G.; Majumdar, A.P. Agiotensin II
augmentation of tyrosine kinase activity in human adherent mononuclear
cells.
Biochem. Med. Metab. Biol., v. 45, p. 48-55, 1991.
Snyderman, R.; Uhuig, R.J. Chemoattractant stimulus-response coupling. In:
Gallin, J.I. (ed). Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. New
York: Raven Press. p. 421-41, 1992.
Souza, G.E.P.; Ferreira, S.H. Blockade by antimacrophage serum of the
migration of PMN neutrophils into the inflammed peritoneal cavity.
Agents-
Actions
, v. 17, p. 1, 1985.
Springer, T.A. Traffic signals for lumphocyte circulation and leukocyte
migration: the multistep paradigm.
Cell, v. 76, p. 301, 1994.
Stossel, T.P. On the crawling of animal cells.
Science, v. 260, p. 1045,
1993.
Suzuki, Y.; Ruiz-Ortega, M.; Egido, J. Angiotensin II: a double-edged sword
in inflamation.
J. Nephrol., v. 13 (Suppl 3), p. S101-10, 2000.
Takano, M.; Itoh, N.; Yayama, K.; Yamano, M.; Ohtani, R.; Okamoto, H.
Interleukin-6 as a mediator responsible for inflammation induced increase in
plasma angiotensinogen.
Biochem. Pharmacol., v. 45, p. 201-06, 1996.
118
Tamarat, R.; Silvestre, J.S.; Durie, M.; Levy, B.I. Angiotensin II angiogenic
effect
in vivo involves vascular endothelial growth factor- and inflammation-
related pathways.
Lab. Invest., v. 82 (n. 6), p. 747-56, 2002.
Theuer, J.; Dechend, R.; Muller, D.N.; Park, J-K.; Fiebeler, A.; Barta, P.;
Ganten, D.; Haller, H.; Dietz, R. And Luft, F.C. Angiotensin II induced
inflammation in the kidney and inthe heart of double transgenic rats.
B.M.C.
Cardiovasc. Disord., v. 2 (n. 1), p. 3, 2002.
Thureson-Klein, A.; Hedqvist, P.; Lindborn, L. Ultrastructure of
polymorphonuclear leukocytes in postcapillary venules after exposure to
leucotriene B
4
in vivo. Acta. Physiol. Scand., v. 122, p. 221-24, 1984.
Tsikouris, J.P.; Cox, C.D. Pharmacologic blockade of the renin-angiotensin
system: vascular beyound commonly understood pharmacologic actions.
Pharmacotherapy, v. 23 (n. 9), p. 1141-52, 2003.
Touyz, R.M.; Schiffrin, E.L. Ang II-stimulated superoxide production is
mediated via phospholipase D in human vascular smooth muscle cells.
Hypertension, v. 34, p. 976-82, 1999.
Touyz, R.M.; Endermann, D.; He, G.; Li, J-S.; Schiffrin, E.L. Role of AT
2
receptors in angiotensin II-stimulared contraction of small arteries in young
SHR.
Hypertension, v. 33 (Part 2), p. 366-73, 1999.
Touyz, R.M. & Berry, C. Recent advances in angiotensin II signaling.
Braz.
J. Med. Biol. Res., v. 35 (n. 9), p. 1001-15, 2002.
Vinegar, R.; Schreiber, W.; Hugo, R. Biphasic development of carrageenan
oedema in rat.
J. Pharmacol. Exp. Ther., v. 166, p. 96-103, 1969.
Vinegar, R.; Truax, J.F.; Selph, J.L.; Voelker, F.A. Pathway of onset,
development, and decay of carrageenan pleurisy in the rat.
Fed. Proc., v.
41, p. 2588-95, 1982.
Viswanathan, M.; Saavedra, J.M. Expression of angiotensin II AT
2
receptors
in the rat skin during experimental wound healing.
Peptides, v. 13, p. 783-
86, 1992.
Viswanathan, M.; Johren, O.; de Oliveira, M.; Saavedra, J.M. Increased non-
angiotensin II
[
125
I] CGP 42112 binding in rat carotid artery after ballon
injury.
Peptides, v. 17, p. 695-99, 1996.
Wakahara, S.; Fujil, Y.; Nakao, T.; Tsuritani, K.; Hara, T.; Saito, H. and Ra.
C. Gene expression profiles for Fc
εRI, cytokines and chemokines upon
Fc
εRI activation in human cultured mast cells derived from peripheral blood.
Citokine, v. 16 (n. 4), p. 143-52, 2001.
Walsh, D.A.; Hu, D.E.; Wharton, J.; Catravas, J.D.; Blake, D.R.; Fan, T.P.
Sequential development of angiotensin receptors and angiotensin-I
119
converting enzyme during angiogenesis in the rat subcutaneous sponge
granuloma.
Br. J. Pharmacol., v. 120, p. 1302-11, 1997.
Wawrocka-Pawlak, M.; Dabrowski, R. The effect of captopril on histamine
release from purified rat mast cells.
Inflamm. Res., v. 48 (n. 5), p. 262-64,
1999.
Wedmore, C.V.; Williams, T.J. Control of vascular permeability by
polimorphonuclear leukocytes in inflammation.
Nature, v. 289, p. 646-50,
1981.
Weichman, B.M.; Berkenkopf, J.W.; Marshall, L.A. Phospholipase A2-
induced pleural inflammation in rats.
Int. J. Tissue React., v. 11, p. 129-36,
1989.
Weinstock, J.V.; Ehrinpreis, M.N.; Boros, D.L.; Gee, J.B. Effect of SQ 14225,
an inhibitor of angiotensin-I converting enzyme, on the granulomatous
response to
schistosoma mansoni eggs in mice. J. Clin. Invest., v. 67, p.
931-36, 1981.
Williams, B.; Baker, A.Q.; Gallacher, B.; Lodwick, D. Angiotensin II increases
vascular permeability factor gene expression by human vascular smooth
muscle cells.
Hypertension, v. 25 (n. 5), p. 913-17, 1995.
Williams, T.J.; Jose, P.J. Mediation of incresead vascular permeability after
complement activation.
J. Exp. Med., v. 153, p. 136-53, 1981.
Williams, T.J.; Morley, J. Prostaglandin-mediated vasodilation in
inflammation.
Nature, v. 246, p: 215-17, 1973.
Williams, T.J.; Peck, M.J. Role of prostaglandin-mediated vasodilation in
inflammation.
Nature, v. 270, p. 530-32, 1977.
Winter, C.A.; Risley, E.A.; Nuss, G.W. Carragenin-induced edema in the
hind paw of the rat as an assay for anti-inflamatory drugs.
Proc. Soc. Exp.
Biol., v. 111, p. 544-47, 1962.
Wu, L.; Iwai, M.; Nakagami, H. Li. Z.; Chen, R.; Suzuki, J.; Akishita, M., de
Gasparo, M.; Horiuchi, M. Roles of angiotensin II type 2 receptor stimulation
associated with selective angiotensin II type 1 receptor blockade with
Valsartan in the improvement of inflammation-induced vascular injury.
Circulation, v. 104 (n. 22), p. 2716-21, 2001.
Zhong, H.; Chunn, J.L.; Volmer, J.B.; Fozard, J.R.; Blackburn, M.R.
Adenosine-mediated mast cell degranulation in adenosine desaminase-
deficient mice.
J. PET., v. 298 (n. 2), p. 433-40, 2001.
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