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JOÃO LUIZ PRATTI DANIEL
AVALIAÇÃO MORFOFISIOLÓGICA DA ABSORÇÃO E
METABOLIZAÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS VOLÁTEIS PELO
PROVENTRÍCULO DE BOVINOS
Dissertação apresentada à Universidade Federal
de Lavras, como parte das exigências do Curso de
Mestrado em Ciências Veterinárias, área de
concentração em Ciências Veterinárias, para
obtenção do título de “Mestre”.
Orientador
Prof. Dr. João Chrysostomo de Resende Júnior
LAVRAS
MINAS GERAIS – BRASIL
2007
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Ficha Catalográfica Preparada pela Divisão de Processos Técnicos da
Biblioteca Central da UFLA
Daniel, João Luiz Pratti.
Avaliação morfofisiológica da absorção e metabolização de ácidos graxos
voláteis pelo proventrículo de bovinos / João Luiz Pratti Daniel. -- Lavras :
UFLA, 2007.
iv, 147 p. : il.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Lavras, 2007.
Orientador: João Chrysostomo de Resende Júnior.
Bibliografia.
1. Rúmen. 2. Omaso. 3. Proventrículo. 4. Estômago de ruminante. 5.
Superfície absortiva. 6. Índice mitótico. 7. Ácido graxo volátil. 8. Absorção. 9.
Metabolismo. 10. Valerato. 11. Câmara de difusão tecidual. 12. Bovino. I.
Universidade Federal de Lavras. II. Título.
CDD – 636.208923
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JOÃO LUIZ PRATTI DANIEL
AVALIAÇÃO MORFOFISIOLÓGICA DA ABSORÇÃO E
METABOLIZAÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS VOLÁTEIS PELO
PROVENTRÍCULO DE BOVINOS
Dissertação apresentada à Universidade Federal
de Lavras, como parte das exigências do Curso de
Mestrado em Ciências Veterinárias, área de
concentração em Ciências Veterinárias, para
obtenção do título de “Mestre”.
Aprovada em 11 de dezembro de 2007.
Prof. Dr. Mário César Guerreiro – UFLA
Prof. Dr. Raimundo Vicente de Sousa – UFLA
Prof
a
. Dra. Suely de Fátima Costa – UFLA
Prof. Dr. João Chrysostomo de Resende Júnior
UFLA
(Orientador)
LAVRAS
MINAS GERAIS – BRASIL
Dedico o presente trabalho à minha família.
“Ainda que eu falasse línguas, as dos homens e dos anjos, se eu não tivesse o
amor, seria como sino ruidoso ou como címbalo estridente. Ainda que eu
tivesse o dom da profecia, o conhecimento de todos os mistérios e de toda a
ciência; ainda que eu tivesse toda a fé, a ponto de transportar montanhas, se
não tivesse o amor, eu não seria nada. Ainda que eu distribuísse todos os meus
bens aos famintos, ainda que entregasse o meu corpo às chamas, se não tivesse
o amor, nada disso me adiantaria.”
1 Coríntios 13, 1-3
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela sabedoria.
Ao professor João Chrysostomo de Resende Júnior, pelo apoio, amizade,
incentivo e competência na realização deste trabalho.
Aos amigos Bruno Loiacono, Herta Bezerra, Juliana Costa, Leandra
Melo, Ronaldo Lima, Milton Cardoso, Fabíola Meireles, Anselmo Moreira,
Régis Ferreira, Mateus Sudano, Micaela Guidotti e Fabiano da Cruz, pela ajuda
indispensável.
Ao professor Mário César Guerreiro, pelo apoio nas análises
laboratoriais e valiosas sugestões.
Aos professores Suely de Fátima Costa e Raimundo Vicente de Sousa,
pelas valiosas sugestões.
A Universidade Federal de Lavras, em especial ao programa de pós-
graduação em Ciências Veterinárias, pela oportunidade.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES), pela concessão de bolsa.
A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais
(FAPEMIG), pelos recursos financeiros necessários à realização dos
experimentos.
Aos amigos Lucrécio e Zezinho, pela hospitalidade.
Aos meus pais, Valcyr e Sueli, e a minha companheira, Janaína, só resta
agradecer.
A todos que contribuíram, direta ou indiretamente, para a realização
deste trabalho.
SUMÁRIO
RESUMO...............................................................................................................i
ABSTRACT ........................................................................................................iii
CAPÍTULO 1........................................................................................................1
1 INTRODUÇÃO GERAL...................................................................................1
2 REFERENCIAL TEÓRICO..............................................................................3
2.1 MORFOLOGIA DO PROVENTRÍCULO.....................................................3
2.1.1 Macroscopia.................................................................................................3
2.1.2 Microscopia .................................................................................................5
2.2 DESENVOLVIMENTO DO PROVENTRÍCULO........................................7
2.2.1 Desenvolvimento pré-natal do proventrículo...............................................7
2.2.1 Desenvolvimento pós-natal do proventrículo..............................................9
2.3 ABSORÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS VOLÁTEIS PELO
PROVENTRÍCULO ...........................................................................................29
2.4 ABSORÇÃO DE ÁGUA E ELETRÓLITOS PELO PROVENTRÍCULO..45
2.5 TRANSPORTE DE ÁCIDOS GRAXOS VOLÁTEIS NO EPITÉLIO DO
PROVENTRÍCULO ...........................................................................................51
2.6 METABOLISMO DE ÁCIDOS GRAXOS VOLÁTEIS NO EPITÉLIO DO
PROVENTRÍCULO ...........................................................................................65
3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................84
CAPÍTULO 2....................................................................................................103
PARTICIPAÇÃO DO RUMINORRETÍCULO E OMASO NA SUPERFÍCIE
ABSORTIVA TOTAL DO PROVENTRÍCULO DE BOVINOS ...................103
CAPÍTULO 3....................................................................................................121
AVALIAÇÃO MORFOFISIOLÓGICA DA ABSORÇÃO E
METABOLIZAÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS VOLÁTEIS PELO RÚMEN E
OMASO DE BOVINOS...................................................................................121
RESUMO
DANIEL, João Luiz Pratti. Avaliação morfofisiológica da absorção e
metabolização de ácidos graxos voláteis pelo proventrículo de bovinos.
2007. 147 p. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) – Universidade
Federal de Lavras, Lavras, MG.
1
Cerca de 60% dos ácidos graxos voláteis (AGV), produzidos no ruminorretículo,
são absorvidos neste compartimento e outros 40% passam com a fase fluida para
o omaso e são absorvidos antes do duodeno. Dois experimentos foram realizados
para determinar as superfícies absortivas e as capacidades de absorção e
metabolização de AGV dos compartimentos do proventrículo de bovinos. No
primeiro experimento, as superfícies absortivas dos compartimentos do
proventrículo de oito bovinos adultos foram mensuradas por meio de captura e
análise de imagens. A superfície absortiva do ruminorretículo (7,7 m
2
) foi maior
do que a do omaso (2,1 m
2
). A razão superfície/digesta, entretanto, foi maior no
omaso (0,31 m
2
/kg) do que no ruminorretículo (0,13 m
2
/kg), representando uma
superfície 2,4 vezes maior no omaso por unidade de digesta. A razão superfície
absortiva/superfície de parede de um fragmento do saco ventral do rúmen
apresentou correlação positiva e alta (r = 0,84) com a superfície absortiva total
do rúmen, indicando ser possível a estimativa da superfície total do órgão por
meio de biópsia. No segundo experimento, as capacidades de absorção e
metabolismo de AGV pelo rúmen e omaso foram comparadas, in vitro. Após o
abate, foram coletados fragmentos da parede ruminal e de uma lâmina do omaso
de oito bovinos mestiços adultos. Um fragmento de mucosa isolada foi montado
em uma câmara de difusão tecidual. Ácido valérico e CrEDTA foram
adicionados ao fluido ruminal que foi utilizado no lado da câmara representativo
do lúmen. No outro lado da câmara, representativo do sangue, foi utilizada uma
solução de Krebs-Ringer bicarbonato. A superfície absortiva do fragmento do
rúmen (57,6 cm
2
) foi maior do que a do omaso (4,9 cm
2
), por causa das papilas
ruminais. O índice mitótico do omaso (0,52%) foi maior do que o do epitélio
ruminal (0,28%). A taxa fracional de absorção de AGV foi maior no omaso
(4,6%.h
-1
.cm
-2
) do que no rúmen (0,4%.h
-1
.cm
-2
). Acetato, propionato, butirato e
valerato apresentaram taxas fracionais de absorção semelhantes, em ambos os
fragmentos. A porcentagem de acetato metabolizado (10,9%) foi menor do que a
de propionato (31,1%) que foi menor do que a de butirato (39,8%) e a de
1
Comitê Orientador: Prof. Dr. João Chrysostomo de Resende Júnior – UFLA
(Orientador), Prof. Dr. Mário César Guerreiro – UFLA e Prof. Dr. Marcos Neves Pereira
– UFLA.
i
valerato (42,0%). A correlação entre o metabolismo de AGV e o índice mitótico
foi positiva, mas a absorção de AGV não foi correlacionada com as outras
variáveis no rúmen. No omaso, a correlação entre a absorção de AGV e o índice
mitótico foi positiva, entretanto, essas variáveis foram negativamente
correlacionadas com o metabolismo de AGV. Apesar da superfície absortiva do
ruminorretículo ser maior do que a do omaso, o potencial de absorção e
metabolismo de AGV do omaso é maior do que o do ruminorretículo. As
capacidades de absorção de rúmen e omaso variam na mesma direção e existem
indicações de que os fatores capazes de estimular a proliferação da parede
ruminal também são capazes de estimular a parede do omaso.
ii
ABSTRACT
DANIEL, João Luiz Pratti. Morphophysiologic evaluation of the absorption
and metabolism of volatile fatty acids by bovine forestomach. 2007. 147 p.
Dissertation (Master Program in Veterinary Science) – Universidade Federal de
Lavras, Lavras, MG.
1
About 60% of volatile fatty acids (VFA) produced in reticulorumen are absorbed
in this compartment. The other 40% pass with the fluid phase to the omasum and
are absorbed before entering the duodenum. Two experiments were carried out
to determine the absorption surfaces and the VFA absorption and metabolism
capacity of the bovine forestomach compartments. In the first experiment, the
absorption surfaces of the forestomach compartments of the eight adult bovines
were measured through image capture and analysis. The reticulorumen
absorptive surface (7.7 m
2
) was larger than the omasum absorptive surface (2.1
m
2
). The surface/digesta ratio, however, was larger in the omasum (0.31 m
2
/kg)
than in the reticulorumen (0.13 m
2
/kg), representing an omasum surface for each
digest unit 2.4 times larger. The absorption surface/wall surface ratio of one
rumen ventral sac fragment showed a positive and high correlation (r = 0.84)
with the total rumen surface, indicating that it is possible to estimate the rumen
surface by biopsy. In the second experiment, the VFA absorption and
metabolism capacities of the rumen and omasum were compared, in vitro. After
the slaughter, fragments of the rumen wall and omasum laminae were taken
from eight adult crossbred bovines. An isolated fragment of the mucosa was
fitted in a tissue diffusion chamber. Valeric acid and CrEDTA were added to the
ruminal fluid and placed on the mucosal side. Krebs-Ringer bicarbonate buffer
solution was placed on the serosal side. The absorption surface of the rumen
fragment (57.6 cm
2
) was higher than that of the omasum (4.9 cm
2
), because of
the ruminal papillae. The mitotic index of the omasum (0.52%) was higher than
that of the rumen epithelium (0.28%). The VFA fractional absorption rate was
higher in the omasum (4.6%.h
-1
.cm
-2
) than in the rumen (0.4%.h
-1
.cm
-2
). Acetate,
propionate, butyrate and valerate showed similar fractional absorption rates in
both fragments. The percentage of metabolized acetate (10.9%) was lower than
propionate (31.1%) which was lower than butyrate (39.8%) and valerate
(42.0%). The correlation between VFA metabolism and mitotic index was
positive, but the VFA absorption was not correlated with other variables in the
1
Graduate Committee: Prof. Dr. João Chrysostomo de Resende Júnior – UFLA
(Advisor), Prof. Dr. Mário César Guerreiro – UFLA and Prof. Dr. Marcos Neves Pereira
– UFLA.
iii
rumen. In the omasum, the correlation between VFA absorption and mitotic
index was positive, however, those variables were negatively correlated with the
VFA metabolism. Despite the reticulorumen absorption surface being higher
than that of the omasum, the VFA metabolism and absorption potential of the
omasum is higher than the reticulorumen. The rumen and omasum absorption
capacities vary in the same way, and there are indications that the factors
capable of stimulating the rumen wall are also capable of stimulating the
omasum wall proliferation.
iv
CAPÍTULO 1
1 INTRODUÇÃO GERAL
A digestão de polissacarídeos estruturais, como a celulose, a
hemicelulose e a pectina, não pode ser feita por enzimas oriundas de mamíferos
(Van Soest, 1994), exigindo um processo que envolve a colonização do trato
gastrintestinal (TGI) por microorganismos simbióticos (Stevens & Hume, 1998).
Os ácidos graxos voláteis
1
(AGV) produzidos no TGI como subprodutos do
metabolismo microbiano podem prover até 80% da exigência diária de energia
dos ruminantes (Bergman, 1990). A remoção (clearance) dos AGV do
ruminorretículo ocorre por dois processos: absorção pela parede do órgão e
passagem com a fase fluida para o omaso (Tamminga & Van Vuuren, 1988). Se
a taxa de produção excede a taxa de clearance, os AGV acumularão dentro do
ruminorretículo, podendo desencadear um distúrbio metabólico conhecido como
acidose ruminal (Barker et al., 1995), que tem efeitos negativos sobre o
desempenho e a saúde dos animais.
Cerca de 60% do clearance ruminal de AGV acontece por absorção pela
parede do ruminorretículo e os outros 40% passam para o omaso (Tamminga &
Van Vuuren, 1988; Peters et al., 1990a; Voelker & Allen, 2003; Resende Júnior
et al., 2006b), conferindo papel extremamente relevante no clearance de AGV a
este órgão, que parece absorver a maior parte dos AGV que a ele chega.
As superfícies internas do ruminorretículo e, provavelmente, do omaso
estão diretamente relacionadas à capacidade de absorção de AGV. A
manipulação da morfologia através da dieta e, conseqüentemente, da capacidade
de absorção da parede do ruminorretículo, é possível e tem sido preconizada
para o controle da acidose ruminal em vacas leiteiras (Dirksen et al., 1985). Há
1
Os principais AGV - acetato, propionato e butirato - são ácidos carboxílicos normais
com dois a quatro carbonos.
1
indícios de que também seja possível interferir nutricionalmente na morfologia
do omaso (Costa, 2003;
Baldwin et al., 2004). Os AGV não absorvidos no
omaso podem passar ao abomaso (Rupp et al., 1994) e o excesso de AGV na
digesta abomasal pode causar hipomotilidade do órgão (Svendsen, 1969; Bolton
et al., 1976), que consiste em um dos fatores predisponentes ao deslocamento de
abomaso em bovinos. Também já foi demonstrado que os AGV possuem efeitos
deletérios sobre o epitélio abomasal (Bödeker et al., 1994).
A atuação sobre a morfologia omasal, uma linha de pesquisa incipiente,
pode ser tão efetiva no controle de distúrbios digestivos decorrentes do acúmulo
de AGV no rúmen quanto à manipulação da capacidade de absorção da parede
ruminal. No entanto, desconhece-se a participação de cada compartimento na
superfície absortiva total do proventrículo e o potencial de absorção e
metabolização de AGV dos epitélios de cada um. Estas são informações básicas
importantes, uma vez que se têm assumido que as capacidades de absorção do
ruminorretículo e omaso são semelhantes. Outro fato importante é que a
morfologia e a fisiologia omasal são ainda grandemente desconhecidas, apesar
da fundamental importância deste órgão no processo digestório dos ruminantes.
A hipótese deste trabalho é que a superfície absortiva, bem como os
potenciais de absorção e metabolismo de AGV, dos compartimentos do
proventrículo, sejam proporcionais à magnitude de absorção atribuída a cada um
deles.
2
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 MORFOLOGIA DO PROVENTRÍCULO
2.1.1 Macroscopia
O estômago dos ruminantes é constituído por quatro compartimentos:
rúmen, retículo, omaso e abomaso. Os três primeiros constituem a parte
aglandular do estômago, denominada proventrículo. O abomaso constitui a parte
glandular do estômago, onde é produzida a secreção gástrica e ocorre a ação
desta sobre a digesta (Nickel et al., 1979). A similaridade entre a mucosa do
proventrículo e do esôfago levou muitos autores a assumirem que a parte
aglandular do estômago era uma dilatação do esôfago embrionário. Estudos
sobre a organogênese destes órgãos, entretanto, demonstraram que o
proventrículo e o abomaso se originam de um mesmo primórdio,
semelhantemente ao estômago simples (Warner, 1958; Nickel et al., 1979).
Os dois primeiros compartimentos, o rúmen e o retículo, freqüentemente
são considerados uma só câmara, denominada ruminorretículo, devido à
ausência de barreira anatômica consistente entre elas. Esse órgão é responsável
por cerca de 80% da capacidade de armazenamento do estômago, além de
ocupar a maior parte da cavidade abdominal, especialmente o antímero esquerdo
(Nickel et al., 1979). O ruminorretículo é o principal local de ação dos
microorganismos simbióticos sobre a matéria orgânica da dieta (Van Soest,
1994).
A superfície externa do ruminorretículo é marcada pela presença de
sulcos, que estão representados internamente por espessamentos da túnica
muscular, os pilares. Os sulcos, externamente, e os pilares, internamente,
delimitam os sacos cranial, dorsal, cego caudo-dorsal, cego caudo-ventral e
ventral. Entre rúmen e retículo estão a prega ruminorreticular, internamente, e o
3
sulco ruminorreticular, externamente. A extremidade cranial do saco ventral é
denominada recesso do rúmen (Nickel et al., 1979).
A superfície interna do rúmen é caracterizada pela presença de papilas,
que são projeções da mucosa que aumentam a superfície de contato deste órgão
(Banks, 1992) possibilitando, dentre outros, maior capacidade de absorção de
AGV (Dirksen et al., 1985). Assim, a superfície pode variar com a dieta em
função da necessidade de absorção de AGV (Sutton et al., 1963a) e os próprios
ácidos atuam direta (Sakata & Tamate, 1978b) e indiretamente (Sakata et al.,
1980; Shen et al., 2004) na variação do tamanho papilar.
O retículo, o mais cranial dos compartimentos do estômago, é um órgão
esférico, ligeiramente achatado cranio-caudalmente, relacionado às funções
mecânicas como a motilidade e a seleção de partículas (Van Soest, 1994). Sua
superfície interna é caracterizada pela presença de projeções da mucosa
anastomosadas denominadas cristas, que delimitam áreas poligonais, as células-
do-retículo. Por toda mucosa existem papilas cônicas de tamanho diminuto
(Nickel et al., 1979). Na parede, em sentido cranio-medial, encontra-se o sulco
do retículo (Nickel et al., 1979), responsável pelo desvio de alimentos fluidos do
esôfago para o omaso-abomaso em ruminantes jovens (Orskov et al., 1970) e
adultos (Woodford et al., 1984; Garcia et al., 2005). Apesar da sua
funcionalidade em adultos, apenas 30% da água de bebida ingerida é desviada
do ambiente ruminal (Daniel et al., 2007).
O terceiro compartimento, o omaso, é especializado em absorção
(Bueno et al., 1972; Edrise et al., 1986). Sua mucosa apresenta extensas
projeções, de diferentes tamanhos, as lâminas do omaso que são sobrepostas
umas às outras como as folhas de um livro (Nickel et al., 1979). Encontram-se
em número de 89 a 192, com média de 145 (Becker et al., 1963; McSweeney,
1988). Na superfície das lâminas encontram-se pequenas papilas
unguiculiformes (Becker et al., 1963). Os espaços entre as lâminas são
4
denominados recessos interlaminares e ficam preenchidos por digesta. Essa
organização morfológica confere a este órgão uma enorme superfície de contato,
fundamental para o desempenho de suas funções. Embora alguns autores (Nickel
et al., 1979) considerem a existência de uma organização seqüencial no tamanho
das lâminas, como exemplo, 1-4-3-4-2-4-3-4
1
, em um trabalho realizado com
omaso de 86 bezerros da raça Jersey não foi possível verificar esta organização,
já que existe uma grande variabilidade entre os animais (Becker et al., 1963).
McSweeney (1988), comparando a anatomia do omaso de bubalinos, bovinos,
ovinos e caprinos, mostrou que o omaso de grandes ruminantes é mais complexo
do que o omaso de pequenos ruminantes, devido a seu maior peso relativo ao
peso total do corpo e o maior número de lâminas.
2.1.2 Microscopia
A parede do proventrículo é composta, de uma forma geral, pelas
túnicas mucosa, submucosa, muscular e serosa, no sentido do lúmen para a
cavidade abdominal, embora existam peculiaridades entre os compartimentos. A
parede do rúmen é formada pelas túnicas mucosa, muscular (circular interna,
longitudinal externa) e serosa. A mucosa é composta pelo epitélio e pela lâmina
própria. O epitélio que reveste internamente a parede do rúmen, do tipo
estratificado pavimentoso queratinizado, é formado pelas camadas basal,
espinhosa, granulosa e córnea, dispostas nesta ordem da lâmina própria para o
lúmen (Banks, 1992; Dellmann & Brown, 1982), e tem como funções: absorção
de AGV (Barcroft et al., 1944; Danielli et al., 1945; Gray, 1948), eletrólitos e
água (Parthasarathy & Phillipson, 1953), peptídeos e aminoácidos (Matthews &
Webb, 1995), e glicose (Aschenbach et al., 2000a,b); metabolização de AGV
(Pennington, 1952; Sutton et al., 1963b); e proteção contra a digesta abrasiva e
1
Lâminas primárias = 1, lâminas grandes; Lâminas secundárias = 2, lâminas médias
grandes; Lâminas terciárias = 3, lâminas médias pequenas; Lâminas quaternárias = 4,
lâminas pequenas.
5
microorganismos (Lavker et al., 1969). Por algum tempo a paraqueratose
1
foi
considerada uma patologia do epitélio ruminal (Jensen et al., 1958). Entretanto,
esta é uma característica normal deste epitélio (Lavker et al., 1969), apesar da
maior intensidade de ocorrência em animais consumindo dietas com alto teor de
concentrados (Tamate & Kikuchi, 1978). Na camada basal do epitélio está a
população de células proliferativas (Ohwada & Tamate, 1979). O tamanho das
papilas ruminais está correlacionado à proliferação do epitélio (Sakata &
Tamate, 1974; Goodlad, 1981), bem como à intensidade do fluxo sanguíneo no
órgão (Tamate et al., 1974).
O tecido conjuntivo, situado entre o epitélio e a túnica muscular é,
muitas vezes, denominado lâmina própria-submucosa (Banks, 1992), devido à
ausência de demarcação entre esses componentes. Nessa região encontram-se
vasos sanguíneos (Schnorr & Vollmerhaus, 1968) e o plexo nervoso submucoso,
do qual fazem parte os receptores epiteliais (Leek & Harding, 1975), envolvidos
na estase ruminorreticular nos casos de acúmulo de AGV no ambiente ruminal
(Crichlow & Chaplin, 1985). Nas camadas musculares, além de vasos
sanguíneos (Schnorr & Vollmerhaus, 1968), está o plexo nervoso mioentérico,
principalmente no retículo e no saco cranial do rúmen, onde estão os receptores
de tensão (Leek & Harding, 1975), que exercem um efeito excitatório sobre a
taxa, a amplitude e a forma dos movimentos do ruminorretículo (Iggo & Leek,
1967).
A parede do retículo, semelhantemente à parede do rúmen, é composta
pelas túnicas mucosa, muscular e serosa. Porém, observa-se a presença da
muscular da mucosa, um aglomerado de musculatura lisa no ápice das cristas do
retículo (Banks, 1992). Nos locais onde as cristas do retículo se cruzam, os
feixes musculares passam de uma crista para a outra, formando uma malha
contínua de músculo liso por toda a mucosa do retículo. A delgada túnica
1
Paraqueratose: presença de núcleos na camada córnea do epitélio (Lavker et al., 1969).
6
submucosa, composta de fibras colágenas e elásticas, une-se com a lâmina
própria sem qualquer limite evidente. A túnica muscular consiste de duas
camadas de fibras musculares lisas que seguem um percurso oblíquo e se cruzam
em ângulos retos (Delmann & Brown, 1982).
A parede do omaso é constituída pelas túnicas mucosa, submucosa,
muscular e serosa. Na túnica mucosa encontra-se a muscular da mucosa, que tem
o sentido das fibras paralelo à borda livre das lâminas. No omaso, a túnica
muscular se projeta para o interior das lâminas, com fibras perpendiculares à
muscular da mucosa (Yamamoto et al., 1991; Banks, 1992). O epitélio da
mucosa do omaso é semelhante ao epitélio ruminal (Delmann & Brown, 1982), e
tem como funções:absorção de AGV (Barcroft et al., 1944; Johnston et al., 1961;
Bueno et al., 1972), água e eletrólitos (Edrise & Smith, 1977; Sklan & Hurwitz,
1985), e peptídeos e aminoácidos (Matthews & Webb, 1995; McCollum &
Webb, 1998); metabolização de AGV (Joyner et al., 1963); e proteção contra a
digesta abrasiva e microorganismos.
2.2 DESENVOLVIMENTO DO PROVENTRÍCULO
2.2.1 Desenvolvimento pré-natal do proventrículo
Desde o início da década de 1950, pesquisadores vêm tentando
demonstrar o mecanismo pelo qual o estômago dos ruminantes se desenvolve
morfofisiologicamente. Becker et al. (1951) realizaram um estudo para
acompanhar o desenvolvimento do estômago de bovinos durante a fase fetal.
Trinta e quatro conceptos com idade entre 59 e 283 dias, removidos de vacas das
raças Jersey ou Guernsey, tiveram o estômago dissecado. No início da vida fetal
o rúmen foi o maior dos compartimentos do estômago. Aos seis meses de
gestação, rúmen e abomaso apresentavam pesos semelhantes. Nos conceptos a
termo, entretanto, o abomaso representou mais da metade do peso do estômago.
7
Segundo os autores, a túnica muscular e as papilas da parede ruminal não
estavam “bem desenvolvidas” nos conceptos a termo. A diferenciação das
células do retículo e das lâminas do omaso ocorreu entre 72 e cem dias. Durante
o desenvolvimento inicial, o peso do estômago vazio representou
aproximadamente 1,8% do peso fetal até os seis meses quando reduziu
progressivamente até 1,3% nos conceptos a termo. Quando analisaram o rúmen
(55%), o retículo (13%) e o omaso (33%), pôde-se notar que estes órgãos
representavam uma proporção constante do peso total do proventrículo ao longo
da gestação, demonstrando que o desenvolvimento fetal dos compartimentos do
proventrículo provavelmente se dá pelo mesmo estímulo. Becker et al. (1963),
para verificar o desenvolvimento normal do omaso, sacrificaram 16 bezerros da
raça Jersey recebendo leite, concentrado e feno de alfafa, em grupos de quatro
animais aos dez, trinta, noventa, 120 e 150 dias. Os respectivos volumes médios
dos órgãos foram 44 mL, 102 mL, 1292 mL, 2441 mL e 2643 mL, ou seja, um
aumento de sessenta vezes num período de 140 dias
Outro experimento, visando estudar o desenvolvimento morfológico do
ruminorretículo de bovinos, foi realizado no início da década de 1990 (Stallcup
et al., 1990). Foram utilizados trinta fetos da raça Holandesa entre cem e 251
dias após a concepção. Quatro bezerros foram abatidos após o nascimento para
comparação. Aos cem dias, três a quatro camadas de células na zona basal do
epitélio ruminal já se apresentavam diferenciadas. Dos 120 aos 141 dias, foram
detectadas ondulações primárias na zona basal do epitélio, na membrana basal e
na lâmina própria. Dos 150 aos 166 dias, foram encontradas ondulações
secundárias e papilas incipientes, semelhantes às papilas ruminais com formação
completa. Nos fetos com idade entre 192 e 215 dias, puderam-se detectar ápices
isolados de papilas na massa epitelial. Nos fetos com idade acima de 244 dias, as
papilas ruminais já tinham individualidade definida. Ao parto, a porção basal das
papilas ruminais ainda permanecia fundida. O desenvolvimento das células do
8
retículo foi evidente nos fetos com cem dias e progrediu rapidamente com a
idade (Stallcup et al., 1990). Assim, fica esclarecido que o desenvolvimento
morfológico da parede do proventrículo se dá antes do nascimento.
2.2.1 Desenvolvimento pós-natal do proventrículo
Estudando o desenvolvimento do proventrículo após o nascimento,
alguns autores concluíram logo nas primeiras pesquisas, que o desenvolvimento
da musculatura era independente do desenvolvimento da mucosa (Brownlee,
1956; Sander et al., 1959; Tamate et al., 1962). Substâncias não fermentáveis
foram efetivas em estimular o desenvolvimento muscular do rúmen de novilhas
leiteiras (Harrison et al., 1960). Esponjas plásticas introduzidas no rúmen de
bezerros aumentaram a capacidade do órgão por promover desenvolvimento da
musculatura lisa (Tamate et al., 1962).
Demonstrou-se que o grau de desenvolvimento das papilas do rúmen foi
provavelmente determinado pelo teor de energia da dieta, ou pela velocidade
com que a dieta era quebrada em frações absorvíveis (Brownlee, 1956). Dieta
completamente peletizada, contendo cerca de 50% de grão e 50% de forragem,
resultou em bom crescimento papilar em carneiros (Thompson et al., 1958). A
infusão de AGV por 12 semanas, na forma de solução de sais de sódio,
estimulou o crescimento papilar em uma área limitada do rúmen de bezerros
(Flatt et al., 1958). Bezerros recebendo butirato ou propionato de sódio intra-
ruminalmente apresentaram extenso desenvolvimento papilar (Sander et al.,
1959). Tamate et al. (1962) constataram evolução no desenvolvimento papilar,
entre o nascimento e as 12 semanas de idade, em bezerros da raça holandesa
alimentados com leite, feno e concentrado. Em contrapartida, animais
alimentados apenas com leite tiveram menor tamanho de papilas do rúmen no
mesmo período.
9
Um dos primeiros trabalhos que relacionou a proliferação do epitélio
ruminal com a dieta ingerida foi realizado por Tamate et al. (1974). Neste
experimento os autores utilizaram um carneiro alimentado normalmente,
submetido a um jejum de três dias, seguido de realimentação. Durante a
condição de alimentação regular, o índice mitótico (IM) da camada basal do
epitélio ruminal (1,23%) foi maior do que após três dias de jejum (0,11%) e seis
horas após a realimentação. Vinte e quatro horas após a realimentação, o IM se
recuperou (0,80%).
No mês seguinte, o mesmo grupo de pesquisa, da Universidade de
Tohuko no Japão, publicou um trabalho onde avaliaram o efeito da freqüência
alimentar sobre o IM do epitélio ruminal de dois carneiros (Sakata & Tamate,
1974). Os dois animais consumiram a mesma quantidade de alimentos, porém
um era alimentado uma vez a cada três dias e o outro alimentado diariamente,
com um terço daquela quantidade fornecida ao primeiro. O IM da camada basal
do epitélio ruminal do carneiro alimentado intermitentemente foi maior nas
amostras coletadas 24 e 48 horas após a alimentação. Não houve diferença entre
as amostras coletadas seis horas após a alimentação.
Sabendo que os produtos da fermentação estimulavam o crescimento
papilar (Sander et al., 1959); Sakata & Tamate (1976, 1978b, 1979) estudaram o
efeito de injeções intra-ruminais de acetato, propionato ou butirato de sódio
sobre o IM do epitélio ruminal de carneiros. No primeiro estudo, dois carneiros
foram utilizados, sendo que um deles recebeu infusões diárias de 500 mL de
uma solução de butirato de sódio a 10% e o outro recebeu solução salina, como
controle (Sakata & Tamate, 1976). Este ensaio foi repetido três vezes com os
mesmos animais, trocando-se os tratamentos entre os animais a cada ensaio.
Antes de cada ensaio o IM médio foi 0,23%. Nos animais infundidos com
butirato, o índice mitótico aumentou até atingir um pico (≥1,22%) entre os dias
três e seis. Nos animais controle, o IM não ultrapassou 0,42%. No segundo
10
estudo (Sakata & Tamate, 1978b), os autores testaram a velocidade de infusão
de butirato de sódio sobre a proliferação do epitélio ruminal. Um carneiro foi
infundido durante dez segundos com uma solução de butirato de sódio 10% (2 g
de butirato/kg de peso vivo por dia), outro carneiro foi infundido com a mesma
solução, porém com o volume fracionado ao longo de vinte a 24 horas. Este
ensaio foi repetido quatro vezes, trocando-se os tratamentos entre os animais, a
cada ensaio. Em todos os carneiros o IM foi menor do que 0,48%, encontrado
antes de cada ensaio. Durante as infusões de butirato o IM foi significativamente
superior ao IM antes das infusões, até o sexto dia. Os animais infundidos
rapidamente com butirato, apresentaram maiores picos de IM do que os animais
infundidos lentamente. No terceiro estudo, os autores verificaram os efeitos de
acetato e propionato sobre a proliferação do epitélio ruminal (Sakata & Tamate,
1979). Uma solução salina foi utilizada nos animais controle. O IM aumentou
após infusão intra-ruminal de propionato e acetato até atingir um pico, dois a
quatro dias após o início da infusão e, então, declinou. O efeito mitogênico dos
ácidos ficou evidente, porém os autores especularam que o efeito do butirato
seria maior do que os efeitos de acetato e propionato, já que os valores de IM
encontrados neste experimento foram inferiores aos encontrados nos
experimentos com butirato.
Na mesma época, alguns experimentos que mensuraram o IM no epitélio
do TGI de animais de laboratório observaram variações deste índice ao longo do
dia (Pilgrim et al., 1963). Para verificar a presença de ritmo circadiano no IM do
epitélio ruminal de carneiros alimentados regularmente, Sakata & Tamate
(1978a) realizaram dois ensaios. No primeiro ensaio, foram realizadas seis
biópsias do saco ventral do rúmen de dois carneiros, a cada quatro horas, para se
ter uma representação das 24 horas do dia. Os animais foram alimentados uma
vez ao dia às 11h com feno e concentrado. No segundo ensaio, os animais foram
alimentados às 7h e as biópsias realizadas durante três dias, às 8h e 20h do
11
primeiro dia, às 12h e 24h do segundo dia e às 4h e às 16h do terceiro dia,
representando deste modo as 24 horas do dia. No primeiro ensaio o IM foi mais
baixo às 12h (0,32%), aumentou até às 20h (0,70%), quando declinou
novamente. No ensaio dois, o IM foi mais baixo às 8h (0,29%) e oscilou em
níveis mais altos nas outras coletas (0,60% à 0,93%). Apesar da oscilação
circadiana no IM, houve uma clara diferença entre os dois ensaios onde os
animais foram alimentados em horários diferentes.
Na tentativa de um maior esclarecimento sobre o ritmo circadino do IM,
um novo experimento foi realizado por pesquisadores do mesmo grupo (Ohwada
& Tamate, 1983). Três carneiros foram utilizados em três ensaios. Os animais
foram alimentados apenas com feno no primeiro ensaio, e com feno mais
concentrado no segundo ensaio, uma vez ao dia, às 18h. No terceiro ensaio os
animais foram alimentados com feno mais concentrado duas vezes ao dia, às 6h
e às 18h. As papilas foram coletadas do saco cranial do rúmen, às 3h, às 7h, às
11h, às 15h, às 19h e às 23h. Os resultados indicaram a presença de ritmo
circadiano no IM, que variou de 0,14% a 1,32% no ensaio um, 0,28% à 0,95%
no ensaio dois, e 0,25% à 1,45% no ensaio três. Quando os animais foram
alimentados uma vez ao dia apenas com feno ou feno mais concentrado, o IM
apresentou menor valor uma hora após a alimentação, e houve pequenas
diferenças entre o IM das outras coletas. Quando os animais foram alimentados
duas vezes ao dia, o menor IM apareceu uma hora após a alimentação da manhã
e o pico ocorreu cinco horas após a alimentação da tarde. O ritmo circadiano do
IM do epitélio ruminal de animais alimentados duas vezes foi menos evidente do
que em animais alimentados apenas uma vez por dia. Os autores concluíram que
o IM e seu ritmo circadiano provavelmente são relacionados à freqüência e ao
momento da alimentação.
Goodlad (1981) também estabeleceu uma relação entre a proliferação
celular do epitélio ruminal e o crescimento das papilas de carneiros sob três
12
dietas, as quais foram formuladas para resultar em diferentes proporções de
AGV no rúmen. Inicialmente os animais foram alimentados durante sete meses
com uma dieta baseada em forragem. Esta dieta foi alterada gradativamente
retirando-se forragem e incluindo-se concentrado, até que no quarto dia não
havia mais forragem na dieta. Após 62 dias, a dieta baseada em forragem foi re-
introduzida. Observou-se um aumento no IM das células basais do epitélio
ruminal, que mudou de 0,58% na dieta de forragem para 1,20% no quarto dia do
início da mudança da dieta para concentrado. Após este pico, houve um declínio
para um novo nível de atividade mitótica, levemente mais alto do que o
observado na dieta de forragem. Houve hipertrofia das papilas quando os
carneiros foram alimentados com dieta baseada em concentrados, detectada
tanto macro, quanto microscopicamente. Quando a dieta foi mudada novamente
para forragem houve uma queda acentuada no IM da camada basal do epitélio
das papilas ruminais (0,35%).
Em outro ensaio no mesmo experimento, Goodlad (1981) alimentou dois
carneiros por um período com forragem, seguindo outro período de alimentação
exclusivamente com concentrados por vários meses. A metil[
3
H]timidina foi
injetada nos animais como marcador de pares de bases do DNA, visando obter
uma determinação quantitativa da divisão celular no epitélio ruminal. O
marcador foi injetado no período onde recebiam apenas forragem, na transição
de forragem para concentrado e após vários meses com dieta exclusiva de
concentrado. O IM na transição da dieta de forragem para concentrado atingiu,
nos dias cinco e seis após o início da mudança, aproximadamente o dobro do
detectado na dieta de forragem. Isto foi seguido por um agudo declínio,
atingindo, no dia oito, valores próximos aos observados inicialmente. A técnica
utilizada permitiu ao pesquisador estimar a duração do ciclo celular da camada
basal, o qual foi de 23,1 horas na dieta de forragem, diminuindo para 17 horas na
transição de forragem para concentrado. Após vários meses ingerindo
13
concentrado, o ciclo celular da camada basal do epitélio ruminal foi 24,4 horas.
O tempo de renovação da camada basal na dieta de forragem foi 7,5 dias,
baixando para 1,9 dia durante a transição para concentrados. Após vários meses
com concentrado, o tempo estimado de renovação da camada basal foi de 4,1
dias. A estimativa de renovação do epitélio inteiro foi 16,5 dias na dieta de
forragem, 4,3 dias na transição de forragem para concentrado e 10,9 dias após
vários meses comendo concentrado. A taxa de proliferação celular da camada
basal do epitélio foi também calculada. Na dieta de forragem, a camada basal
proliferou 9,0%. Na transição de forragem para concentrados esta taxa foi de
32,7% e, após vários meses de concentrado, a proliferação foi de 17,3%. Estes
dados indicam que o efeito agudo da introdução de concentrados estimula mais a
proliferação celular do que o efeito crônico, provavelmente, porque na transição
de forragem para concentrado, uma massa celular bem maior deve ser atingida
para possibilitar a absorção e metabolização eficiente de AGV. Uma vez
atingida esta massa celular, a proliferação epitelial cai a uma taxa capaz de
possibilitar a reposição de células metabolicamente ativas.
Estava bem estabelecido que os AGV realmente estimulavam a
proliferação do epitélio ruminal, de forma aguda, in vivo, mas o mecanismo pelo
qual isto acontecia não estava claro. Experimentos evidenciaram que o ácido
butírico inibia a proliferação de células de mamíferos, in vitro (Ginsburg et al.,
1973). Em culturas primarias de epitélio ruminal, o butirato causou diminuição
na incorporação de [
3
H]timidina, um marcador de síntese, ao DNA celular (Gálfi
et al., 1981). Essa contradição entre estudos in vivo (Sakata & Tamate, 1978b) e
in vitro (Gálfi et al., 1981), sugeriam a existência de mediadores, não presentes
nas preparações in vitro.
A insulina é um dos fatores essenciais para a proliferação de células in
vitro (Bottenstein et al., 1979). Hamilton & Blackwood (1977) observaram uma
depressão da proliferação celular do epitélio oral de ratos com diabete induzida
14
experimentalmente com haloxano
1
. Para verificar o efeito da insulina na
proliferação do epitélio ruminal Sakata et al. (1980) alimentaram dois carneiros
adultos, adaptados com cânulas ruminais, com 300 g de concentrado e 700 g de
feno apenas uma vez ao dia em um período pré-experimental. O alimento, a
água e a mistura mineral foram removidos uma hora antes do início de cada
ensaio experimental. Em cinco ensaios, infundiram insulina (0,125 UI/kg de
peso corporal por hora) juntamente com glicose (300 mg/kg de peso corporal por
hora) para prevenir hipoglicemia. Em dois ensaios controles, infundiram apenas
glicose (300 mg/kg de peso corporal por hora). Em outro ensaio controle,
administraram apenas solução salina fisiológica (solução de cloreto de sódio a
0,154 M). As soluções foram infundidas na veia jugular externa direita por seis
horas, à taxa de 0,5 mL/minuto, com uma bomba peristáltica. Amostras de
sangue da veia jugular externa esquerda foram coletadas uma hora antes da
infusão, no momento da infusão e uma, duas, três, quatro, cinco, seis, nove, 12,
24 e 48 horas após o início da infusão. Biópsias de três a cinco papilas do saco
cranial foram realizadas através da cânula ruminal às zero, três, seis, 12, 24 e 48
horas após as infusões. O IM dos carneiros que receberam insulina mais glicose
aumentou significativamente entre zero e três horas após a infusão, permaneceu
alto até as 24 horas e retornou ao valor inicial às 48 horas. Nos carneiros
infundidos apenas com glicose, o IM também aumentou significativamente entre
seis a 24 horas. O IM do controle com salina não mostrou flutuações marcadas
durante o experimento. O aumento no nível do IM dos carneiros infundidos com
insulina e glicose foi significativamente mais alto do que naqueles recebendo
apenas glicose.
Outro experimento, objetivando esclarecer a contradição entre o efeito
do butirato in vitro e in vivo, foi realizado por Gálfi et al. (1986), utilizando três
ovelhas com cânula ruminal alimentadas com feno ad libitum e 400 g de
1
Haloxano: causa morte específica das células β das Ilhotas de Langerhans.
15
concentrado dividido em duas alimentações diárias. Em duas ovelhas foram
feitas infusões intra-ruminais de butirato de sódio (2 g/kg de peso corporal)
diariamente, por nove dias. Um dos animais recebeu infusão contínua através de
uma bomba peristáltica. O outro recebeu infusão rápida dentro de um a dois
minutos, uma vez ao dia. O terceiro animal foi tratado com infusão rápida de
solução salina fisiológica. Papilas ruminais foram coletadas diariamente e
cultivadas em presença de [
3
H]timidina ou preparadas histologicamente. Fluido
ruminal foi coletado para determinação da concentração de AGV. A ovelha que
recebeu infusão contínua de butirato teve uma alta concentração deste AGV no
rúmen por volta do segundo dia de infusão, enquanto a incorporação de
[
3
H]timidina pelas papilas ruminais tendeu a diminuir continuamente até o
último dia de infusão, alcançando apenas 20% em relação ao controle. O IM da
camada basal de células epiteliais foi particularmente baixo do quarto ao nono
dia. O número de células da camada córnea foi maior em relação ao controle e as
células da camada espinhosa foram menos numerosas. Nas amostras coletadas
no nono dia, houve uma marcante diminuição das cunhas epiteliais. A ovelha
que recebeu infusão aguda teve um nível médio mais baixo de butirato intra-
ruminal em relação àquela com infusão contínua e apresentou um aumento
acentuado de incorporação de [
3
H]timidina pelas papilas ruminais. No nono dia,
a incorporação de [
3
H]timidina foi duas vezes maior em comparação ao controle.
Observou-se também um alto IM da camada basal do epitélio das papilas do
rúmen. Simultaneamente, foi observado um aumento no número de células da
camada espinhosa e, aos nove dias um alongamento das cunhas epiteliais em
relação ao controle. Estes resultados mostraram que ocorre inibição de divisão
celular na presença contínua de butirato no rúmen, semelhante aos resultados
observados nos experimentos in vitro.
A partir desses trabalhos pode-se concluir que o efeito prevalente do
butirato in vivo, anti-proliferativo local ou pró-proliferativo sistêmico, é
16
determinado pela quantidade de butirato, ou seja, o efeito do butirato é dose-
dependente. Nesse contexto, o metabolismo epitelial de butirato desempenha
papel fundamental na prevenção dos efeitos indesejáveis deste ácido (Gäbel et
al., 2002). Um trabalho aplicado relacionado ao tema foi realizado por
pesquisadores húngaros na década de 1980 (Kutas et al., 1983), com o objetivo
de verificar o efeito profilático da monensina
1
na ocorrência de paraqueratose
ruminal de ovinos de engorda. Dez cordeiros foram alimentados com uma dieta
rica em concentrados. A dieta de cinco animais foi suplementada com 10 mg/kg
de monensina. Ao final do período experimental o rúmen de cada animal foi
examinado macro e microscopicamente. O escore médio de paraqueratose, onde
também se levou em conta a hiperqueratose
2
, no grupo controle foi o dobro dos
animais que consumiram monensina. Além disso, os escores de papilas aderidas
e de papilas com crescimento anormal foram maiores no grupo controle. Isso
provavelmente ocorreu pela menor produção de butirato nos animais que
consumiram monensina, indicada por menor concentração deste ácido no fluido
ruminal (11,8 mM vs 22,5 mM).
Baldwin (1999) comparou os efeitos da insulina, do IGF-1 e do fator de
crescimento epidérmico sobre a proliferação de células do epitélio ruminal de
ovinos, cultivadas in vitro. Os efeitos do butirato e do propionato também foram
avaliados. Um grupo de células foi incubado do soro fetal bovino (controle
positivo). As taxas de proliferação das células das culturas contendo insulina,
IGF-1 e fator de crescimento epidérmico foram, respectivamente, 75%, 96% e
97% da proliferação da cultura contendo soro fetal bovino. Não houve diferença
significativa entre os efeitos do fator de crescimento epidérmico e do soro fetal
bovino. A presença de butirato ou de propionato reduziu a proliferação celular.
1
Monensina: antibiótico ionóforo. Modifica a microbiota, resultando em menor
produção de metano, maior proporção de propionato e menores proporções de acetato e
butirato no total de AGV produzido.
2
Hiperqueratose: espessamento da camada córnea do epitélio (Jensen et al., 1958).
17
A adição de butirato, nas culturas contendo os fatores de crescimento, reduziu a
proliferação celular. Neste trabalho ficou demonstrada a importância de fatores
de crescimento locais, como o fator de crescimento epidérmico, na proliferação
do epitélio ruminal.
Ainda para esclarecer os mecanismos pelos quais os AGV estimulam a
proliferação do epitélio ruminal, Shen et al. (2004) testaram a hipótese de que as
alterações morfológicas nas papilas ruminais, causadas pelo nível de ingestão e o
teor de energia da dieta são acompanhadas por mudanças na concentração
plasmática do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF-1) e do
número de receptores de IGF-1 (IGF-1R) nas papilas ruminais. Vinte e quatro
cabritos com idade de três meses, consumindo feno e concentrado (1,5 vezes a
mantença de energia e duas vezes a mantença de proteína), foram aleatoriamente
alocados a um de dois grupos: alto teor de nutrientes (90 g/kg
0,75
de concentrado
e feno ad libitum) ou baixo teor de nutrientes (20 g/kg
0,75
de concentrado e feno
ad libitum). Os animais receberam concentrado uma vez ao dia. Amostras de
sangue foram coletadas um dia antes do início do período de comparação
(duração de 42 dias) e depois semanalmente por punção venosa da jugular
externa em tubos com heparina. O sangue foi centrifugado e o plasma congelado
para análise de IGF-1. Ao final do período experimental, os animais foram
sacrificados, amostras de fluido ruminal foram congeladas para determinação da
concentração de AGV e biópsias da mucosa ruminal foram realizadas. A
concentração de AGV não diferiu entre os grupos. A proporção molar de acetato
foi menor e a de butirato foi maior no grupo recebendo maior concentração de
nutrientes. O comprimento, a largura e a superfície das papilas foram maiores no
grupo que recebeu maior concentração de nutrientes. A concentração plasmática
de IGF-1 no grupo que recebeu uma dieta com alto teor de nutrientes foi
aproximadamente duas vezes mais alta do que a do grupo que consumiu dieta
com menor concentração de nutrientes. A capacidade de ligação máxima dos
18
receptores de IGF-I nas papilas ruminais foi maior no grupo que consumiu mais
nutrientes, entretanto, não houve um efeito da dieta na abundância de mRNA
para IGF-1 e para receptores de IGF-1 nas papilas ruminais. Além disso, células
do epitélio ruminal, de ambos os grupos incubadas in vitro na presença de IGF-
1, apresentaram maior síntese de DNA, indicando maior proporção de células
proliferativas. Com este experimento, ficaram indícios de que a ação
estimuladora da insulina sobre a proliferação do epitélio ruminal, in vivo (Sakata
et al., 1980), pode ser por meio de IGF-1.
Muitas pesquisas já haviam sido realizadas, utilizando a taxa de mitoses
como indicadora da proliferação celular. Mesmo conhecendo a importância da
ocorrência de mitoses para regulação da população de células do epitélio
ruminal, Tamate & Fell (1977) estudaram a influência da deleção celular
(apoptose) na regulação da população de células do epitélio ruminal. É
importante citar que a apoptose, descrita por Kerr et al. (1972), era um conceito
relativamente moderno na época. Para tal estudo, Tamate & Fell (1977)
utilizaram dois carneiros adaptados cirurgicamente com cânulas ruminais. Os
animais foram alimentados inicialmente com feno e concentrado para suprir a
mantença e passaram a ser alimentados com feno e concentrado ad libitum e,
então, tiveram a dieta alterada abruptamente para feno. A maior ingestão foi
acompanhada de hiperplasia do epitélio e de aumento no IM, além de escassez
de células em apoptose. Quando a dieta foi alterada para feno o índice mitótico
diminuiu agudamente. Durante este período, a morte de células por apoptose
contribuiu para a extensiva perda celular, principalmente nas regiões das cunhas
epiteliais. Fagossomas foram frequentemente vistos na camada basal do epitélio.
As principais mudanças nas células apoptóticas, vistas por microscopia
eletrônica, foram a agregação e a aderência da cromatina à membrana nuclear, o
acúmulo de material elétron-luzente no núcleo picnótico, a formação de pontes
de cromatina através do núcleo e a marcada endentação da membrana nuclear.
19
Apesar de o estudo ter sido qualitativo no que se refere à ocorrência de
apoptoses, os autores concluíram que a combinação de supressão das mitoses e
aumento da deleção celular é um potente mecanismo para a redução rápida da
população de células do epitélio ruminal.
Como supracitado, no início da década de 1960, Sutton et al. (1963a)
demonstraram que a capacidade de absorção de AGV pelo epitélio ruminal é
positivamente correlacionada com o desenvolvimento papilar. Assim, a
manipulação do crescimento papilar em vacas leiteiras periparturientes poderia
ser uma estratégia para minimizar a ocorrência de distúrbios metabólicos
relacionados ao acúmulo ruminal de AGV. Pensando nisso, dois trabalhos foram
realizados na década de 1980. No primeiro trabalho, os pesquisadores avaliaram
o tempo necessário para o desenvolvimento das papilas ruminais e o
correlacionaram com a capacidade de absorção de AGV (Dirksen et al., 1985).
Dois experimentos foram conduzidos. O primeiro, envolvendo o estudo
morfológico, foi conduzido utilizando nove vacas da raça holandesa adaptadas
cirurgicamente com cânulas ruminais. Biópsias da mucosa ruminal foram
realizadas em intervalos de uma ou duas semanas, a partir de oito ou nove
semanas pré-parto até oito semanas pós-parto. As amostras foram analisadas
macro e microscopicamente. Com o início do período seco a energia da dieta foi
reduzida drasticamente. Duas semanas antes do parto os animais passaram a
receber uma dieta para vacas em lactação com alto teor energético. Durante o
período seco, com a dieta pobre em energia, houve uma redução progressiva da
mucosa ruminal, observada tanto macro quanto microscopicamente. Quando os
animais passaram a receber uma dieta rica em energia iniciou-se um processo
intenso de proliferação da mucosa ruminal, que pôde ser observado até a última
semana do experimento (oitava semana pós-parto). O segundo experimento,
envolvendo os ensaios de absorção, foi realizado utilizando duas vacas da raça
holandesa não lactantes, não gestantes, adaptadas com cânula ruminal, ao final
20
de três períodos alimentares diferentes: 1) dieta pobre em energia, 2) dieta rica
em energia e 3) dieta pobre em energia; com durações de sete a 14 semanas
cada. Na ocasião dos ensaios o conteúdo ruminal foi evacuado e o rúmen foi
lavado com água. Um tubo de plástico foi inserido no esôfago para prevenir
influxo de saliva. O orifício retículo-omasal foi ocluído com um balão inflável.
Vinte litros de uma solução tamponada contendo uma mistura de AGV (acetato,
propionato e butirato) foi introduzida no ruminorretículo e amostras foram
coletadas a cada trinta minutos por quatro a cinco horas, para determinação da
concentração de AGV. A concentração de AGV diminui mais rápido nos
períodos de alta energia do que nos períodos de baixa energia. Com os dados
mostrados em um gráfico foi possível estimar a taxa fracional de absorção média
dos AGV (ka). Nos períodos de baixa energia a ka foi 21,6%/h e nos períodos de
alta energia a ka foi 82,0%/h, ou seja, um aumento de 3,8 vezes na velocidade de
absorção de AGV. Esta maior velocidade de absorção também pôde ser
observada no tempo necessário para redução da concentração de AGV em 50%
da concentração inicial. Nos períodos de baixa energia este tempo foi em média
207 minutos e nos períodos de alta energia foi 56 minutos, ou seja, uma redução
de 3,7 vezes no tempo necessário para a concentração inicial de AGV reduzir em
50%. A quantidade de AGV absorvido por minuto, durante a primeira hora do
ensaio, foi 2,7 vezes maior nos períodos de alta energia do que nos períodos de
baixa energia. Os autores concluíram que, além de contribuir para estabilizar o
ambiente ruminal, a adaptação da mucosa contribui para maior absorção de
energia. No segundo trabalho, os pesquisadores compararam o desenvolvimento
morfológico da mucosa ruminal de vacas leiteiras submetidas ou não a uma dieta
de transição, 14 dias pré-parto (Liebich et al., 1987). Biópsias de mucosa foram
realizadas no saco ventral do rúmen de 11 vacas da raça holandesa, a partir de
nove semanas antes do parto até oito semanas após o parto. Seis vacas
receberam uma dieta rica em energia 14 dias antes do parto (transição) e as
21
outras cinco vacas uma dieta pobre em energia. Todas as vacas receberam uma
dieta rica em energia após o parto. Os animais apresentaram redução das
dimensões da mucosa durante a dieta de vacas secas (pobre em energia). As
vacas que receberam a dieta de transição iniciaram um processo de proliferação
da mucosa antes do parto com a mudança de dieta, mas o outro grupo apresentou
uma redução progressiva da mucosa até o parto. Ao final de oito semanas, após
o parto, o desenvolvimento da mucosa ruminal de ambos os grupos superou o
nível que os animais apresentavam ao final da lactação.
Uma grande falha destes trabalhos, além do pequeno número de
unidades experimentais, é a falta de informações sobre a ingestão de matéria
seca. No experimento realizado por Tamate & Fell (1977), a ingestão de matéria
seca influenciou significativamente a proliferação do epitélio ruminal.
Normalmente vacas leiteiras reduzem 30% a 35% da ingestão de alimentos nas
últimas três semanas pré-parto (Grummer, 1995). Num experimento com nove
vacas secas gestantes, a diminuição na ingestão de matéria seca iniciou dois dias
antes do parto e atingiu, no dia do parto, uma redução de 60% em relação à
matéria seca ingerida três dias antes (Vazquez-Añon et al., 1994). Por outro
lado, a ingestão de matéria seca aumenta no pós-parto até atingir um pico entre
dez e 14 semanas de lactação (NRC, 1989). Nos experimentos de Dirksen et al.
(1985) e Liebich et al. (1987) a involução da mucosa ruminal durante o período
seco provavelmente se deu pela redução na ingestão de energia. A ingestão de
nutrientes é uma função da ingestão de matéria seca e do teor daqueles
nutrientes na dieta. Nestes experimentos, quando a dieta foi alterada para alto
teor de energia, a ingestão deste nutriente foi maior, levando a uma maior
proliferação da mucosa ruminal, a qual responde agudamente ao consumo
energético. No trabalho de Goodlad (1981) todo o epitélio ruminal foi renovado
em quatro dias, na transição de uma dieta rica em forragem para uma dieta rica
em concentrados. Entretanto, como a ingestão de matéria seca no pós-parto
22
aumenta gradualmente até a décima ou décima quarta semana (NRC, 1989), o
maior aporte energético recebido pelas vacas neste período possibilitou uma
rápida recuperação das dimensões da mucosa mesmo daquelas vacas que não
receberam uma dieta rica em energia no pré-parto (Liebich et al., 1987). Além
disso, o aumento papilar até a oitava semana do experimento poderia ser
explicado pelo aumento na ingestão de matéria seca (Tamate & Fell, 1977), que
proporcionou um maior aporte energético. Logo, a utilização de dietas de
transição para vacas leiteiras visando desenvolver a mucosa ruminal e aumentar
a capacidade de absorção de AGV no peri-parto deve ter sua eficácia reavaliada.
Estudos que comparem as taxas fracionais de absorção de AGV em vacas
submetidas ou não à dieta de transição devem ser realizados com um maior
número de unidades experimentais e utilizando-se técnicas que possam fornecer
essas estimativas em condições próximas das fisiológicas.
Objetivando definir melhor o crescimento visceral durante a lactação,
Baldwin et al. (2004) abateram 21 vacas multíparas holandesas em quatro
estágios de lactação: 14, noventa, 120 e 240 dias em lactação. Com o estágio de
lactação a ingestão de matéria seca aumentou até noventa dias e teve uma
redução até o dia 240 pós-parto (efeito quadrático). O peso de carcaça declinou
até o dia 120 e então aumentou até 240 dias. Como porcentagem do peso vivo,
rúmen, intestino delgado e fígado aumentaram o peso do dia 14 até o dia 120
pós-parto e a partir daí reduziram o peso até o dia 240 (efeito quadrático). Houve
uma tendência quadrática (P = 0,10) de aumento no peso do omaso como
porcentagem do peso vivo, semelhantemente ao rúmen. Mais uma vez ficou
evidente a influência da ingestão de matéria seca no desenvolvimento do
proventrículo.
Greenwood et al. (1997) trabalharam com 12 bezerros, fornecendo-lhes
dietas com os mesmos ingredientes, mas com tamanhos de partículas diferentes.
O comprimento das papilas ruminais aumentou quando o tamanho de partículas
23
de dieta diminuiu, o mesmo acontecendo com o percentual de queratina em
relação as demais camadas do epitélio ruminal, o que reduziu a proporção de
células epiteliais metabolicamente ativas. O pH ruminal foi mais baixo nas
dietas com partículas menores, mas não existiram diferenças significativas entre
as concentrações ruminais de AGV. O peso do omaso vazio foi maior nos
animais alimentados com menor tamanho de partícula. A concentração ruminal
de AGV representa o balanço entre a taxa de produção e a taxa de remoção. Se o
pH do rúmen dos animais consumindo a dieta com partículas menores
apresentou-se mais baixo, provavelmente a taxa de remoção dos AGV era maior
(Danielli et al., 1945; Dijkstra et al., 1993). Se a concentração de AGV foi
semelhante e a taxa de remoção, teoricamente, era maior, pode-se especular que
a quantidade de AGV produzida foi maior neste grupo, o que culminou em
maior desenvolvimento das papilas ruminais e do omaso.
Beharka et al. (1998) estudaram o efeito da forma física da dieta sobre o
desenvolvimento morfológico do rúmen. Visualmente não puderam observar
diferenças óbvias na forma, distribuição e comprimento das papilas ruminais
entre os diferentes tratamentos. Entretanto, o exame microscópico revelou que
papilas oriundas do saco cranial apresentaram menos alterações de forma e
comprimento como resposta à dieta do que aquelas oriundas de outras regiões do
rúmen. Este trabalho indica que o saco cranial do rúmen é menos sensível a
alterações da dieta.
McLeod & Baldwin (2000) avaliaram os efeitos da razão
forragem:concentrado da dieta e da ingestão de energia metabolizável sobre o
crescimento de órgãos viscerais de 28 ovinos. Os animais foram aleatoriamente
distribuídos em um arranjo fatorial 2x2: 75% de forragem ou 75% de
concentrado e 0,099 ou 1,81 Mcal de energia metabolizável por kg
0,75
. Após 52
dias de tratamento, os animais foram abatidos para mensuração da massa dos
órgãos viscerais. O peso do trato digestório total (rúmen, retículo, omaso,
24
abomaso e intestinos) aumentou com a ingestão de energia metabolizável e foi
maior nos animais consumindo 75% de forragem do que naqueles consumindo
75% de concentrado. O peso do rúmen não foi afetado pela dieta, mas foi maior
nos animais com maior ingestão de energia. Os pesos do retículo e do omaso
aumentaram com a maior ingestão de energia, entretanto, foram menores nos
animais que consumiram uma dieta com 75% de concentrado. As concentrações
de DNA e RNA do epitélio ruminal aumentaram com a maior ingestão de
energia, sugerindo que o crescimento ruminal ocorreu via hiperplasia celular. O
aumento no peso do omaso parece ter sido estimulado por maior teor de
forragem na dieta. Em um estudo realizado por Bueno & Ruckebusch (1974), a
motilidade do omaso de carneiros consumindo dieta peletizada foi
significativamente menor do que a motilidade daqueles consumindo forragem
grosseira. A redução na motilidade do omaso, nos animais consumindo péletes,
foi semelhante a de animais submetidos a jejum de 48 horas após consumir feno.
Como grande parte do peso do omaso, provavelmente, é representada por tecido
muscular, a ingestão de alimentos grosseiros leva ao desenvolvimento da
musculatura lisa e ao maior peso deste órgão. Experimentos que demonstrem o
desenvolvimento da mucosa e da capacidade absortiva do omaso devem ser
realizados.
Na tentativa de estabelecer um procedimento para amostragem da
mucosa ruminal e determinar as regiões do rúmen mais sensíveis a alterações
como respostas de tratamentos manipuladores da morfologia ruminal,
Lesmeister et al. (2004) utilizaram 42 bezerros holandeses em quatro
experimentos. Foram realizadas biópsias de várias regiões do rúmen, incluindo
saco cego caudo-dorsal, saco cranial, saco ventral e saco cego caudo-ventral. O
comprimento, a largura e a densidade papilar (número de papilas/cm
2
), assim
como a espessura da parede ruminal foram determinadas. Correlações entre
regiões do rúmen e entre experimentos foram realizadas. Os resultados
25
indicaram que papilas obtidas dos sacos cranial e ventral foram melhores para
representar o desenvolvimento do rúmen inteiro. Além disso, o comprimento e a
largura de papilas foram mais responsivos aos diferentes tratamentos do que a
espessura da parede ruminal. A densidade papilar não foi eficiente para refletir
as diferenças entre tratamentos.
Costa (2003), avaliando as alterações morfológicas induzidas por
butirato, propionato e lactato sobre a mucosa ruminal e epiderme de bezerros,
observou que estes AGV induziram aumento no peso do proventrículo em
relação aos animais que receberam solução salina. As infusões dos AGV
tenderam a aumentar o peso e a proporção de epitélio e conjuntivo subepitelial
no saco cranial do rúmen, mas reduziram o número de papilas por cm
2
de parede
ruminal. Embora o butirato tenha sido mais estimulador da secreção de insulina,
este AGV foi incapaz de estimular um aumento de superfície ou altura das
papilas. Todos os AGV aumentaram a proliferação das células da camada basal
do epitélio ruminal, verificada por maiores índices mitóticos. Somente o
propionato tendeu a aumentar o tamanho papilar no saco cranial do rúmen. O
butirato e o lactato foram mais indutores de alterações patológicas no epitélio
ruminal. Os efeitos dos AGV sobre a morfologia da mucosa ruminal e dos outros
tecidos queratinizados, levou a autora a sugerir que os danos morfológicos no
epitélio ruminal e nos cascos podem ter causa comum, explicando a ocorrência
simultânea de anomalias nessas estruturas, em bovinos acometidos por acidose
ruminal.
Frequentemente não são observados efeitos simultâneos da dieta sobre a
morfologia da mucosa ruminal e a capacidade absortiva do rúmen (Gäbel et al.,
1993; Gäbel & Aschenbach, 2002). Com os objetivos de induzir variações na
morfologia da parede ruminal por meio da dieta e estabelecer marcadores
morfológicos eficientes para epitélio ruminal, Resende Júnior et al. (2006a)
realizaram dois experimentos. No primeiro, sete vacas adaptadas cirurgicamente
26
com cânula ruminal foram alimentadas com feno de coastcross ad libitum e
concentrado, fornecido uma ou quatro vezes ao dia, por 19 dias, seguidos por 72
horas de jejum. Papilas ruminais foram coletadas nos dias zero, quatro, 12 e 19
do período de tratamento e 24, 48 e 72 horas após o início do jejum. Baixa
freqüência de alimentação concentrada foi associada a um aumento da
concentração de insulina plasmática ao longo do tempo após a alimentação e a
um maior IM, mas não afetou outros parâmetros morfológicos. No experimento
dois, foram realizados dois ensaios não-simultâneos com três ovinos canulados
no rúmen, consumindo silagem de alfafa e milho moído, os quais foram
submetidos abruptamente a 72 horas de jejum. Papilas ruminais foram coletadas
no final do período de alimentação e no final do jejum. O IM foi mais alto no
período de alimentação do que no período de jejum, mas outros parâmetros
morfológicos não foram capazes de responder à variação nutricional. Entres os
marcadores morfológicos estudados o IM pareceu ser a melhor variável para
avaliação da resposta morfológica do epitélio ao plano alimentar. Os autores
citaram que a freqüência de alimentação concentrada pode ser um estratégia para
regular a morfologia das papilas ruminais, porém o jejum pode ter efeitos
deletérios, de forma aguda, sobre a morfologia da mucosa ruminal.
Já se discutiu anteriormente que o tamanho das papilas ruminais não
depende apenas da proliferação epitelial, mas também do fluxo sanguíneo para o
órgão (Tamate et al., 1974). Schnorr & Vollmerhaus (1968), fazendo uma
descrição macro e microscópica minuciosa da arquitetura vascular do rúmen,
citaram a importância da micro-circulação para a mucosa ruminal, por receber os
produtos absorvidos e metabolizados pelo epitélio. Neste trabalho também se
pôde notar a grande participação dos vasos sanguíneos no volume das papilas
ruminais.
Usando micro-esferas radioativas marcadas com
141
Ce,
51
Cr e
85
Sr, Von
Engelhardt & Hales (1977) mensuraram o fluxo sanguíneo capilar para o
27
proventrículo de oito carneiros castrados com um a três anos de idade, pesando
22 a 32 kg. Os animais foram alimentados com 600 g de ração peletizada
contendo 60% de alfafa e 40% de aveia. A última alimentação foi fornecida 18
horas antes das observações experimentais. Ao final do período experimental os
animais foram abatidos e fragmentos da parede foram coletados do rúmen, do
retículo e de uma das lâminas do omaso. O fluxo sanguíneo capilar para o
proventrículo total foi em média 7,7 mL/minuto
por kilograma de peso vivo e
representou 7% do débito cardíaco. Noventa e cinco por cento do fluxo foi para
a mucosa e apenas 5% para a túnica muscular. O fluxo sanguíneo para o rúmen
foi seis vezes maior do que para o retículo e 4,4 vezes maior do que para o
omaso. Do fluxo sanguíneo para a mucosa do proventrículo, 72% se destinaram
à mucosa do rúmen, 12% à mucosa do retículo e 16% à mucosa do omaso. Do
fluxo sanguíneo para a túnica muscular do proventrículo, 60% se destinaram às
camadas musculares do rúmen, 20% às camadas musculares do retículo e 20%
às camadas musculares do omaso. O fluxo capilar na mucosa do omaso, por
unidade de superfície de parede, foi um terço daquela para o saco ventral do
rúmen, que foi aproximadamente o dobro daquele do saco dorsal. Quando os
animais foram submetidos à estresse térmico o fluxo sanguíneo para
proventrículo diminuiu, principalmente para a mucosa. Além das excelentes
informações geradas por este trabalho, pode-se sugerir que animais em estresse
térmico teriam menor capacidade de remoção dos produtos finais da
fermentação e maior chance de serem acometidos por distúrbios metabólicos.
No experimento de Von Engelhardt & Hales (1977) a distribuição de
sangue nos compartimentos do proventrículo foi estudada 18 horas após a
remoção dos alimentos. Para estudar o efeito da alimentação nas mudanças de
fluxo sanguíneo para as diferentes regiões do canal alimentar, Barnes et al.
(1983) utilizaram nove carneiros com pesos entre 27 e 39 kg, que consumiram
duzentos gramas de concentrado peletizado e feno ad libitum. O fluxo sanguíneo
28
foi estimado, por injeção de micro-esferas radioativas no ventrículo esquerdo,
vinte a trinta minutos antes, três a quatro minutos depois e duas e quatro horas
após o início da alimentação. Dentro de três minutos após o início da
alimentação, os fluxos sanguíneos para as glândulas salivares e para a
musculatura lisa do ruminorretículo aumentaram três vezes. Os fluxos
sanguíneos para as mucosas do rúmen e do retículo também aumentaram antes
que qualquer efeito da fermentação ruminal possa ter ocorrido. Duas horas após
a alimentação, os fluxos para as mucosas do rúmen e do retículo foram duas a
quatro vezes maiores do que antes da alimentação. O fluxo sanguíneo para o
omaso diminuiu durante a alimentação, mas depois se recuperou. Os fluxos
sanguíneos para abomaso, duodeno e íleo não se alteraram durante a
alimentação, mas reduziram significativamente duas e quatro horas depois. Não
houve alterações no restante do intestino delgado, no intestino grosso, no
pâncreas e no baço. Entretanto, o fluxo sanguíneo para o omento e a gordura
mesentérica diminuiu abruptamente com a alimentação e atingiu um valor
mínimo duas horas após. O fluxo sanguíneo subepitelial para ruminorretículo foi
o único a contribuir para um aumento no fluxo sanguíneo portal após a
alimentação.
2.3 ABSORÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS VOLÁTEIS PELO
PROVENTRÍCULO
O interesse em estudar a produção e a absorção de AGV no TGI dos
ruminantes vem de longa data. Um trabalho clássico foi realizado por Barcroft et
al. (1944), que demonstraram a absorção de AGV pelo TGI de um carneiro,
através de coleta de sangue dos vasos que drenam o rúmen, o retículo, o omaso,
o abomaso, o intestino delgado e o ceco. As amostras de sangue dos vasos que
drenam o rúmen e o retículo apresentaram as maiores concentrações de AGV. A
concentração de AGV no sangue venoso do omaso foi aproximadamente 45%
29
daquela encontrada do sangue venoso do rúmen e do retículo. As concentrações
de AGV no sangue dos vasos que drenam o abomaso e o intestino delgado foram
insignificantes. Entretanto, a concentração de AGV no ceco voltou a ser alta e
significativa. Os autores também demonstraram que após a infusão de acetato,
propionato ou butirato no rúmen evacuado e lavado, a quantidade recuperada foi
maior para acetato, seguido de propionato e por último butirato. Naquela data,
ainda não se pensava em metabolismo de AGV pela parede do proventrículo, o
que levou os autores a concluírem erradamente que a velocidade de absorção de
acetato era maior do que a do propionato, que era maior do que a do butirato.
Apesar desta conclusão, ficou evidente o papel do proventrículo na absorção dos
AGV produzidos no ruminorretículo.
Na mesma época, Danielli et al. (1945) pesquisaram a absorção de AGV
pelo rúmen de ovinos adultos. Para isso, o rúmen foi evacuado pela cânula e
uma solução de AGV com pH alto (7,4) ou baixo (5,8) foi introduzida no órgão.
Os animais foram anestesiados e a cavidade abdominal aberta para aplicação de
ligaduras na base do esôfago e na altura do óstio omaso-abomasal (excluindo-se
os vasos epiplóicos), para evitar o escape da solução infundida. Os AGV foram
absorvidos mais rapidamente em pH baixo do que em pH alto, indicando maior
permeabilidade do tecido à formas não dissociadas dos ácidos. Em pH 7,4 houve
pequenas diferenças na velocidade de absorção de acetato, propionato e butirato,
porém em pH 5,8 a velocidade de absorção seguiu a ordem butirato > propionato
> acetato. À medida em que os AGV eram absorvidos, a concentração de sódio
diminuía, uma evidência da participação do sódio no transporte epitelial de
AGV.
Masson & Phillipson (1951), também investigaram a absorção de AGV
pelo rúmen de ovinos. Os autores verificaram que os AGV absorvidos pelo
rúmen não apareciam totalmente no sangue que drena o órgão e geraram duas
hipóteses: 1) parte dos AGV absorvidos eram carreados pelo sistema linfático; e
30
2) os AGV eram metabolizados pela parede do rúmen. No mesmo trabalho,
verificou-se que esta diferença era maior para o butirato do que para o acetato e
o propionato, existindo uma pequena diferença entre os últimos. A concentração
sanguínea do butirato foi menos de um quarto da concentração dos outros
ácidos. Com isso os autores especularam que o metabolismo de acetato e
propionato poderia ser menor do que o de butirato. O acetato foi o único AGV
com concentrações significativas no sangue arterial, o que fez pensar que este
ácido escapou do metabolismo da parede ruminal e do fígado. Provavelmente, o
propionato foi convertido à glicose no fígado. Durante a absorção dos AGV
houve aumento na concentração intra-ruminal de cloreto e, principalmente, de
CO
2
. A relação entre a absorção de AGV e o aumento na concentração de CO
2
foi linear. Os dados deste trabalho sugeriram a possibilidade de trocas entre
substâncias do fluido ruminal e do sangue, durante a absorção de AGV.
Estudando a absorção de acetato, propionato e butirato em carneiros
alimentados ou submetidos a jejum, Pfander & Phillipson (1953) infundiram
soluções com pH próximo a 5,7 e proporções de acetato, propionato e butirato
63:21:15, no rúmen evacuado e lavado, e observaram que a quantidade de moles
absorvidos seguiu a ordem acetato > butirato > propionato. Isso provavelmente
ocorreu porque o acetato foi infundido em maiores proporções e o butirato
apresentou a maior velocidade de absorção entre os ácidos por causa do baixo
pH (Danielli et al., 1945). Num outro ensaio, em que os autores avaliaram o
efeito da remoção dos alimentos, pôde-se observar uma queda abrupta na
absorção de AGV nos animais submetidos a jejum (Pfander & Phillipson, 1953).
A absorção de compostos pelo omaso só pode ser quantificada, in vivo, a
partir do momento em que se compreenda a dinâmica da digesta neste órgão.
Porém, existem algumas dificuldades para estudar o omaso. Primeiramente pela
localização do órgão na porção intra-costal da cavidade abdominal, entre o sexto
e o décimo primeiro espaços intercostais (Nickel et al., 1979). Segundo, sua
31
cavidade é preenchida por projeções da mucosa, as lâminas do omaso (Nickel et
al., 1979), o que dificulta a inserção de dispositivos, a amostragem da digesta e o
implante de cânulas. Por último, é difícil isolar o óstio omaso-abomasal da
cavidade abdominal para estudos de absorção.
Na metade do século passado, pesquisadores já tinham dúvida sobre a
dinâmica da passagem da digesta pelo omaso. O caminho percorrido pelas fases
sólida e líquida da digesta entre o retículo e o abomaso era uma interrogação.
Desde então, três teorias passaram a existir (Gray et al., 1954): 1ª) as fases
líquida e sólida da digesta, que deixam o retículo, atravessam o omaso de forma
semelhante, ou seja, não há seleção da fase sólida no omaso; 2ª) durante a
contração reticular, parte da fase fluida da digesta atinge o abomaso sem passar
por entre as lâminas do omaso; e 3ª) quando a digesta atinge o omaso, este órgão
se contrai e expulsa parte da fase líquida ao mesmo tempo que retém a fase
sólida da digesta. Na tentativa de entender o fluxo da digesta pelo omaso, Gray
et al. (1954) dosaram as concentrações de AGV, amido, nitrogênio, sólidos e
lignina nos vários compartimentos do estômago de sete carneiros, imediatamente
após o abate. As razões nitrogênio/lignina no rúmen, no retículo e no omaso
foram semelhantes, mostrando que a separação das fases sólida e líquida não
existiu. Os autores consideraram o nitrogênio como marcador da fase líquida e a
lignina como marcador da fase sólida. Para verificar a hipótese de passagem
direta de fluido do retículo para o abomaso, os autores compararam as razões
amido/lignina entre os compartimentos. Caso esta hipótese fosse verdadeira, o
abomaso receberia uma mistura das digestas do retículo e do omaso. A razão
amido/lignina foi muito maior no retículo do que no omaso. Caso houvesse uma
mistura das digestas, a razão amido/lignina seria intermediária no abomaso.
Entretanto, a razão amido/lignina no abomaso foi semelhante à do omaso, o que
levou a exclusão das hipóteses que apoiavam uma partição da digesta no omaso.
Outro fato que apóia a conclusão dos autores é que partículas grosseiras
32
raramente foram encontradas no abomaso, o que poderia ser um indicativo da
ausência de passagem direta da digesta do retículo para o abomaso. Desde que
não houve partição da digesta, os autores estimaram a porcentagem de água e
AGV absorvidos pelo omaso, embora de forma empírica, através do aumento na
concentração de lignina e da razão AGV/lignina na digesta, respectivamente.
Trinta e três a 64% da água e 40% a 69% dos AGV presentes na digesta que
deixou o retículo foram absorvidos no omaso.
Boyne et al. (1956) determinaram as alterações da digesta ao longo do
TGI de ruminantes, durante um período de 12 horas após a alimentação. Para
isso, 24 ovelhas foram abatidas em intervalos de duas horas, após a alimentação.
Aproximadamente dois terços do conteúdo total do TGI encontraram-se no
ruminorretículo. O teor de matéria seca da digesta no omaso (21,9%) foi maior
do que no ruminorretículo (14,2%) e no abomaso (12,7%), demonstrando que a
digesta é desidratada no omaso e rehidratada no abomaso. A concentração de
AGV no omaso foi aproximadamente dois terços daquela do ruminorretículo e
dez vezes maior do que a do abomaso. As concentrações de AGV no rúmen e no
omaso aumentaram significativamente e paralelamente até quatro horas após a
alimentação e depois diminuíram. A concentração de AGV no abomaso foi
constante e baixa ao longo do tempo. Os autores concluíram que os AGV
produzidos no ruminorretículo foram absorvidos totalmente antes do abomaso.
Para obter informações sobre a absorção de AGV no TGI de bovinos em
desenvolvimento, Conrad et al. (1956) determinaram as concentrações de AGV
ao longo do TGI de cinco bezerros, com idades entre cinco e 15 semanas,
abatidos quatro a seis horas após a alimentação. A dieta consistia de péletes
contendo dois terços de feno e um terço de concentrado e foi ofertada ad libitum
desde três dias de idade. A concentração de AGV foi alta no ruminorretículo e
baixa no abomaso. Concluiu-se que os AGV foram efetivamente absorvidos
antes do abomaso e uma considerável importância foi atribuída ao omaso,
33
devido às suas numerosas lâminas, que contribuem para sua extensa superfície
absortiva.
Ainda na década de 1950, Badawy et al. (1958) realizaram um estudo
para tentar esclarecer melhor a passagem da digesta e a absorção de água e AGV
pelo omaso. Quinze ovelhas, consumindo feno e concentrado, foram abatidas. A
porcentagem de matéria seca da digesta no omaso (16,03%) foi maior do que no
retículo (7,86%) e no abomaso (6,22%). A absorção de água no omaso variou de
48 a 55%. A concentração de AGV no retículo (110,8 mEq/100g) foi maior do
que no omaso (38,2 mEq/100g) que foi maior do que no abomaso (22,1
mEq/100g). A razão AGV/cinza insolúvel reduziu 77% do retículo para o omaso
e 74% do omaso para o abomaso. A porcentagem de matéria seca da digesta
tendeu a aumentar do sulco do omaso para a curvatura maior, porém, não houve
uma mudança progressiva na direção do retículo para o abomaso. Estes
resultados apontam o omaso como importante sítio de absorção de AGV e de
desidratação da digesta. Os autores não tiveram grandes conclusões sobre a
passagem de digesta pelo omaso.
Johnston et al. (1961) estudaram a absorção de AGV pelo omaso de
bezerros com quatro ou cinco meses de idade, em dois ensaios. No primeiro
ensaio, seis bezerros foram sacrificados quatro horas após a alimentação.
Durante sete dias antes do abate os animais receberam cápsulas de óxido
crômico para ajuste das concentrações de AGV e da umidade da digesta. A
concentração de óxido crômico na matéria seca da digesta aumentou do rúmen
até o abomaso (rúmen > retículo > omaso > abomaso). Na mesma ordem a
concentração de AGV diminuiu. A razão AGV/óxido crômico indicou uma
diminuição de AGV em 51% do retículo para o omaso e 83% do omaso para o
abomaso. No segundo ensaio, dois bezerros tiveram o omaso exteriorizado e o
C
14
-1-butirato de sódio foi injetado no lúmen do órgão. Cinco a dez minutos
após a infusão houve um pico de butirato no sangue que drena o omaso. Uma
34
fração considerável do butirato foi metabolizada pelo epitélio omasal. Pôde-se
concluir que a absorção de ácidos orgânicos ocorre no omaso e em magnitude
considerável.
A absorção de AGV pelo proventrículo estava demonstrada. Para
determinar a relação entre a capacidade absortiva e o desenvolvimento estrutural
do rúmen, Sutton et al. (1963a) utilizaram cinco bezerros, que consumiram leite,
feno de alfafa e concentrado, ou apenas leite. Além do efeito da dieta, os efeitos
de idade dos animais, pH ruminal e substituição da digesta por solução salina
foram estudados. As taxas de absorção máximas (miligramas de ácido/100 mL
de solução por hora) na primeira, quarta, oitava e décima terceira semanas de
idade foram, respectivamente, trinta, 163, 179 e 402 para os bezerros
alimentados com leite, feno e concentrado e 21, 26, 22 e 22 para aqueles que
receberam apenas leite. A absorção de AGV diminuiu após a substituição do
conteúdo ruminal por solução salina durante o período de um dia. A utilização
de uma solução de AGV ao invés de salina reduziu a depressão. A absorção de
AGV foi maior em pH baixo (5,0-5,5) do que em pH alto (7,5-8,0), tanto em
animais que receberam leite, concentrado e feno, quanto naqueles alimentados
apenas leite. Em pH baixo, a taxa de absorção aumentou com o maior tamanho
da cadeia de carbono dos ácidos. Em pH alto, os resultados não foram
conclusivos quanto ao tamanho da cadeia de carbono dos AGV.
Thorlacius & Lodge (1973) estudaram os efeitos da dieta, do tampão, do
pH e da concentração sobre a absorção de AGV, em duas vacas holandesas não
lactantes, adaptadas com cânula ruminal. A absorção de AGV foi mensurada
com o rúmen lavado e temporariamente isolado. A absorção de AGV foi mais
rápida nas vacas que consumiram uma dieta rica em concentrado do que nas
vacas consumindo feno. Quando as concentrações dos tampões, bicarbonato ou
fosfato, foram baixas (50 e 40 mM, respectivamente), estes não influenciaram a
absorção de AGV, entretanto, quando as concentrações dos tampões testados
35
foram altas (90 e 75 mM, respectivamente), a absorção de AGV tendeu ser
menor na solução com bicarbonato. A dimunuição do pH aumentou a absorção
dos AGV. Em pH 7,0, as taxas fracionais de absorção de acetato, propionato e
butirato foram semelhantes. Em pH 6,5 a taxa fracional de absorção do
propionato foi 1,2 e a do butirato 1,4 vezes maiores do que a taxa fracional de
absorção do acetato. Em pH 5,5, as taxas de absorção de propionato e butirato
foram, respectivamente, 1,6 e 2,4 vezes maiores do que a taxa fracional de
absorção do acetato. As variações nas concentrações de acetato e propionato não
influenciaram o clearance de AGV.
Como discutido na seção sobre desenvolvimento do proventrículo,
dietas com alto teor de concentrados aumentam a intensidade de paraqueratose
no epitélio ruminal, além de levar a um espessamento da camada córnea
(Tamate & Kikuchi, 1978). Para observar o desenvolvimento de
hiperqueratose/paraqueratose no epitélio ruminal e a influência destas sobre a
absorção de AGV, Hinders & Owen (1965) conduziram um experimento com
quatro novilhos. Os animais foram alimentados com feno de alfafa por 33 dias e
depois com péletes de alfafa desidratada por 56 dias. Exames macroscópicos,
biópsias de papilas para exames microscópicos e mensuração da taxa de
absorção de AGV foram realizados ao final do período de alimentação com feno
e com péletes. Durante a alimentação com feno, a mucosa apresentou-se normal.
Após a mudança de dieta, a morfologia das papilas ruminais variou de simples
hipertrofia à hiperqueratose severa. Na microscopia a hiperqueratose foi
confirmada. A absorção de AGV, oito semanas após a alteração da dieta, foi
46% menor em três novilhos e 12% maior em um novilho. A quantidade de
AGV absorvida diminuiu com o aumento da severidade da
hiperqueratose/paraqueratose ruminal.
Até então, maior enfoque era recebido pelo rúmen, no que se referia à
produção e à absorção, apesar da importância do omaso no clearance de AGV.
36
Diante disso, dois experimentos foram realizados nos anos de 1970 visando
maior entendimento da absorção de AGV no omaso. Bueno et al. (1972),
utilizando quatro carneiros adultos, adaptados com cânulas no rúmen e no
abomaso, consumindo péletes de gramínea, avaliaram o efeito da remoção
cirúrgica parcial das lâminas do omaso. Cerca de 300 cm
2
de lâminas foram
removidos na cirurgia e aproximadamente 1000 cm
2
de lâminas foram
encontrados na necropsia, três meses depois. Os danos cirúrgicos sobre as
lâminas do omaso, provavelmente levou a uma redução significativa da
superfície deste órgão, já que nos animais do grupo controle a superfície
encontrada foi aproximadamente 2000 cm
2
. Amostras de fluido ruminal e
abomasal foram obtidas antes e após o procedimento cirúrgico, 3,5 horas após a
alimentação, por quatro dias consecutivos. A concentração total de AGV no
abomaso aumentou de 6 mM, uma semana antes, para 10 mM e 11 mM,
respectivamente, uma e dez semanas após a laminectomia parcial.
Edrise & Smith (1977) tentaram quantificar a porcentagem de AGV,
produzidos no ruminorretículo, absorvida no omaso de novilhos alimentados
com 60% de forragem e 40% de concentrado ou 33% de forragem e 67% de
concentrado. Amostras de digesta foram obtidas do retículo e de uma manga
flexível suturada no óstio omaso-abomasal. O polietileno glicol (PEG) foi
utilizado como marcador de fase fluida. A produção de AGV no ruminorretículo
foi estimada assumindo-se que 62% da matéria orgânica consumida foram
degradadas no rúmen e 80% desta eram convertidas em AGV. O fluxo de AGV
para os diferentes sítios do estômago foi estimado pela razão AGV/PEG. Da
produção estimada de AGV, cerca de 83% foram absorvidas no rúmen, 11% no
omaso e o restante passou para o abomaso. Dos AGV que atingiram o omaso,
cerca de 62% foram absorvidos neste órgão. Apesar do mérito pelo pioneirismo,
este experimento falhou em alguns aspectos, como a estimativa da produção de
37
AGV e a implantação de uma cânula no óstio omaso-abomasal, que podem ter
prejudicado os resultados.
Com os trabalhos discutidos acima, pôde-se concluir que parte dos AGV
produzidos no ruminorretículo são absorvidos pela parede do órgão e o restante
passa para o omaso, juntamente com a fase fluida. A diferenciação entre os dois
fatores do clearance ruminal de AGV (absorção e passagem) e a quantificação
da participação de cada fenômeno no processo, em bovinos ingerindo grandes
quantidades diárias de matéria seca foi realizada em alguns experimentos no
final da década de 1980 e no início da década de 1990.
Tamminga & Van Vuuren (1988) publicaram uma revisão sobre
formação e utilização dos produtos finais da degradação da lignino-celulose em
ruminantes. Para discutir a remoção dos produtos da fermentação do
ruminorretículo de vacas em lactação, os autores trabalharam alguns dados
publicados por Robinson et al. (1987a,b). Quando a ingestão de matéria orgânica
aumentou de 4,8 para 19,0 kg/d a produção de AGV passou de 26,6 moles/d
para 80,3 moles/d e o pH ruminal diminuiu de 6,6 para 6,0. Com o aumento da
ingestão de alimentos, a contribuição do clearance de AGV por passagem
aumentou de 30% para 40% do clearance ruminal total. Os autores concluíram
que a contribuição do clearance de AGV por passagem para o omaso é maior
em vacas leiteiras do que em carneiros e bezerros.
Peters et al. (1990b) propuseram determinar o desaparecimento ruminal
por absorção e passagem de ácido propiônico em novilhos de corte ingerindo
grandes quantidades de matéria seca, os quais tinham alta taxa de produção deste
ácido. Aproximadamente 66% do ácido propiônico desapareceram por absorção
e 34% passaram do ruminorretículo para os compartimentos subseqüentes do
TGI. A absorção e a concentração de propionato no rúmen foram relacionadas
linearmente com a sua taxa de produção. A passagem de fluido também foi
relacionada à taxa de produção de propionato. Os autores concluíram que o trato
38
digestivo distal ao ruminorretículo era um importante sítio de absorção de
propionato em bovinos, quando a taxa de produção deste ácido era alta.
Num outro estudo, os mesmos autores investigaram o desaparecimento
de ácido propiônico antes do intestino delgado e ao longo do intestino delgado
de novilhos de corte (Peters et al., 1990a). Independentemente do nível de
produção de propionato, o desaparecimento por absorção no ruminorretículo foi
40% a 57% e o restante passou para os compartimentos distais juntamente com a
fase fluida. Do propionato que deixou o ruminorretículo por passagem, 97% a
99% desapareceram antes de atingir o duodeno, independente do nível de
produção. A concentração de ácido propiônico no duodeno não diferiu do íleo e
ambos não diferiram significativamente de zero, não sendo constatada, portanto,
absorção de propionato no intestino delgado, a menos que a taxa de produção
fosse igual à taxa de absorção. Resultados semelhantes foram observados para
outros AGV, exceto para a taxa de isobutirato absorvido antes do duodeno (47 a
63%), a qual foi mais baixa do que a dos outros AGV (acima de 90%).
Concluiu-se que a absorção de AGV não parece ser um processo biológico
limitante em bovinos de corte e que o aumento da capacidade absortiva do
rúmen não necessariamente significaria aumento da performance animal,
embora essa afirmação não leve em conta os benefícios do aumento da absorção
do epitélio ruminal no controle da acidose ruminal, o que, indiretamente, poderia
aumentar a performance de produção.
Dois anos depois, os mesmos autores estudaram o clearance ruminal de
ácido acético em novilhos de corte (Peters et al., 1992). Em nível de mantença, a
absorção deste AGV representou cerca de 87% do clearance. Quando a
concentração de acetato aumentou por infusões de ácido acético não marcado, a
quantidade de ácido absorvida também aumentou, porém a participação da
absorção no clearance total, dimunui para 46,7% do total. Em média o
39
clearance por passagem contribuiu para 31,62% da remoção dos AGV do
ruminorretículo.
Dijkstra et al. (1993), trabalhando com ruminorretículo evacuado e
lavado de duas vacas em lactação, examinaram os efeitos de volume de líquido
ruminal (10 ou 30 L), pH (4,5; 5,4; 6,3 ou 7,2) e concentração de AGV (20; 50
ou 100 mM de cada AGV, totalizando 170 mM) nas taxas de absorção de
acetato, propionato e butirato. As taxas de absorção foram calculadas pelo
desaparecimento de AGV do rúmen corrigido pela taxa de passagem de líquido
para o omaso. Um aumento no pH inicial do fluido causou uma redução na taxa
fracional de absorção do propionato e do butirato. As taxas fracionais de
absorção também foram reduzidas pelo aumento do volume inicial do fluido. A
taxa fracional de absorção de acetato foi menor em uma concentração inicial de
20mM do que em uma concentração de 50 mM. A taxa fracional de absorção de
propionato tendeu a diminuir quando a concentração deste ácido aumentou. A
taxa fracional de passagem não foi afetada pelas soluções. Neste experimento,
25% a 47% do clearance ruminal ocorreram por passagem com a fase fluida
para o omaso.
Gäbel et al. (1993) mensuraram as taxas de absorção de AGV, sódio,
cloreto, magnésio e água pelo rúmen lavado e temporariamente isolado, de seis
carneiros alimentados com feno e concentrado ou submetidos a 48 horas de
jejum. Ao final de cada ensaio, três papilas de três regiões do rúmen (saco
cranial e duas porções do saco ventral) foram coletadas por biópsia e fixadas em
solução de formaldeído 4%. Quando comparada a de animais alimentados, a
concentração ruminal de AGV dos animais submetidos ao jejum diminuiu (76,2
vs 27,1 mM) e o pH aumentou (6,41 vs 7,44). Em nenhum dos três locais, onde
as papilas foram extraídas, o jejum levou a alterações significativas da superfície
absortiva. O jejum diminuiu a absorção de todas as substâncias testadas. A
diminuição relativa na absorção dos eletrólitos variou de 47% para o Na, 49%
40
para o Cl à 55% para o Mg. Para os AGV, houve uma redução de 56% na taxa
de absorção de acetato, 44% na absorção de propionato e 43% na absorção de
butirato. A diminuição na transferência de solutos foi acompanhada por uma
diminuição na absorção de água. Em outro experimento, onde o mesmo grupo de
pesquisa estudou o efeito do jejum (48 horas) sobre o transporte de 3-O-metil-α-
D-glicose (um análogo da glicose, mais resistente ao metabolismo), também não
foram observadas alterações na superfície absortiva das papilas ruminais, apesar
da redução significativa no transporte de 3-O-metil-α-D-glicose (Gäbel &
Aschenbach, 2002).
Outro experimento foi realizado na década de 1990 para verificar o
efeito da subnutrição na habilidade ruminal em absorver AGV (Perrier et al.,
1994). Quatro carneiros adultos, adaptados com cânula no saco dorsal do rúmen
e no abomaso, foram alimentados com feno por dois períodos sucessivos de
quatro semanas. Em um dos períodos, os animais receberam feno para suprir a
exigência de mantença e, no outro, a quantidade de feno foi fornecida para suprir
apenas metade da mantença. A absorção de AGV foi mensurada ao final de cada
período, pela técnica do rúmen evacuado e lavado. Três litros de uma solução
com pH 6,3 contendo AGV e CoEDTA (marcador de fluido) foram introduzidos
no rúmen e amostras de fluido coletadas regularmente durante três horas. A
ordem na velocidade de absorção foi butirato > propionato > acetato. A absorção
de água não foi significativamente diferente entre os períodos, porém as taxas de
absorção de AGV reduziram significativamente após o período de subnutrição
(61,8 vs 41,2 mmol/h).
Objetivando estudar os efeitos da pressão osmótica do fluido ruminal
sobre a cinética da água e a absorção de AGV no rúmen de ovinos sustentados
por infusão intra-gástrica de todos os nutrientes, López et al. (1994) conduziram
dois ensaios em que a pressão osmótica foi alterada por infusão de NaCl no
ambiente ruminal. A taxa de passagem de fluido mostrou uma correlação
41
positiva e linear com a pressão osmótica do fluido ruminal. Por outro lado, a
absorção de água apresentou uma correlação negativa e linear com a pressão
osmótica. Numa pressão osmótica de 341 mosmol/kg o movimento de água pela
parede ruminal foi nulo. Com aumento da pressão osmótica houve um aumento
do volume de fluido ruminal e uma diminuição da taxa de absorção de AGV, de
232 mmol/h, em pressão osmótica de 350 mosmol/kg, para 191 mmol/h, em
pressão osmótica de 490 mosmol/kg, o que levou a um acúmulo de AGV e uma
queda no pH ruminal. Apesar dos autores não descreveram as taxas fracionais de
absorção e passagem de AGV elas puderam ser calculadas a partir dos outros
dados. A contribuição do clearance por passagem no clearance total aumentou
de 12,5%, em pressão osmótica de 260 mosmol/kg, para 28,7%, em pressão
osmótica de 490 mosmol/kg, ou seja, um aumento de 2,3 vezes.
Sabia-se que a maioria dos AGV desaparecia antes do duodeno, mas
faltava estabelecer a importância quantitativa de absorção do omaso e do
abomaso. Rupp et al. (1994) procederam um experimento para mensurar o
desaparecimento de AGV através do abomaso em bovinos, utilizando uma
técnica de canulação do omaso e do abomaso. Ficou demonstrado que 37% a
38% dos AGV presentes no rúmen atingiram o abomaso e que 8% a 13%
atingiram o duodeno, caracterizando o abomaso como um importante sítio de
absorção de AGV, o que poderia ser facilitado pelo baixo pH do lúmen, que
aumentaria a proporção de AGV na forma não dissociada, favorecendo a
absorção passiva pela parede do órgão. Este experimento primou pela
dificuldade e caráter inovador da técnica de canulação do omaso e do abomaso,
mas apresentou evidências de participação do abomaso na absorção de AGV.
Voelker & Allen (2003) avaliaram os efeitos da substituição de grão
úmido de milho por polpa de beterraba peletizada sobre parâmetros da
fermentação ruminal, usando oito vacas holandesas multíparas com cânulas no
rúmen e no duodeno. As dietas experimentais com 40% de forragem (silagem de
42
milho e silagem de alfafa) e 60% de concentrado continham 0%; 6,1%; 12,1%
ou 24,3% de polpa de beterraba substituindo milho de alta umidade com base na
matéria seca. A concentração de AGV no fluido ruminal foi similar entre as
dietas, mas o tamanho do pool ruminal de AGV aumentou quadraticamente com
aumento no teor de polpa de beterraba na dieta, com maior valor para 12% de
polpa. A taxa fracional de absorção de valerato foi similar para todos os
tratamentos (~ 40%/h). A taxa fracional de passagem de fluido reduziu pela
substituição de milho por polpa, provavelmente por aumento na consistência do
fluido ruminal. Com isso, a contribuição do clearance de AGV por passagem,
que variou de 29 a 31% do clearance total, reduziu com os maiores níveis de
polpa de beterraba na dieta. A correlação entre a taxa de absorção de ácido
valérico e a concentração ruminal de AGV foi negativa (-0,69, P < 0,05),
mostrando que as vacas com maior capacidade absortiva conseguiram manter
uma ambiente ruminal menos ácido. Quanto maiores foram as taxas de absorção
e passagem de valerato, mais alto foi o pH ruminal, o que confirma a hipótese
anterior. Além disso, a maior utilização de combustíveis metabólicos para
produção de leite pode ter criado um maior gradiente de concentração de AGV
entre fluido ruminal e sangue, demonstrado por um aumento na taxa de absorção
de valerato com maior produção de leite (r = 0,49; P < 0,01).
Resende Júnior et al. (2006b), comparando técnicas para a determinação
do clearance ruminal de AGV do ruminorretículo em vacas Holandesas
alimentadas com azevém e concentrado, constataram que o desaparecimento de
AGV por passagem com a fase fluida para o omaso correspondeu a
aproximadamente 50% do clearance total. As taxas fracionais de clearance de
acetato, propionato e butirato foram semelhantes (~ 30%/h), porém o propionato
apresentou maior taxa fracional de absorção do que o butirato. O volume de
líquido ruminal foi negativamente correlacionado com as taxas fracionais de
clearance, absorção e passagem de AGV. Por outro lado, semelhantemente aos
43
dados encontrados por Voelker & Allen (2003), aumentos nas taxas de
clearance, absorção e passagem de AGV resultaram em aumento do pH ruminal.
No experimento de Resende Júnior et al. (2006b) não se pôde verificar uma
correlação entre a produção de leite e as taxas fracionais de clearance (r = -0,04;
P = 0,85) ou absorção (r = -0,01; P = 0,96) de AGV (Resende Júnior -
comunicação pessoal).
Os efeitos do volume e do pH da digesta ruminal sobre a absorção de
ácido valérico em vacas leiteiras foram avalidos por Melo (2007). Nove vacas
canuladas, em três planos alimentares (vacas produzindo em média 25,9 kg/d de
leite alimentadas com dieta completa rica em concentrado; vacas produzindo
12,3 kg/d de leite alimentadas com silagem de milho, pasto e concentrado; e
vacas secas alimentadas com pasto), foram utilizadas. Biópsias da mucosa
ruminal foram realizadas uma semana antes do início do experimento. Em cada
ensaio a digesta era evacuada e os marcadores homogeneisados (ácido valérico +
CoEDTA). No tratamento pH baixo, a digesta foi acidificada com ácido
sulfúrico, e no tratamento volume baixo, apenas parte da digesta foi retornada ao
ruminorretículo. Antes do retorno da digesta ao órgão, o óstio retículo-omasal
foi obstruído com uma esponja. Não foi possível detectar diferenças
significativas para o efeito do volume da digesta. A taxa fracional de absorção
do valerato foi mais alta em pH baixo (35,0%/h) do que em pH alto (23,9%/h).
A correlação entre a superfície absortiva e a absorção média de valerato foi
positiva e alta (r = 0,90). Apesar desta alta correlação, os animais usados neste
trabalho apresentavam uma grande disparidade de morfologia da mucosa
ruminal. Em experimentos com animais sob condições fisiológicas semelhantes
esta correlação pode ser menor.
44
2.4 ABSORÇÃO DE ÁGUA E ELETRÓLITOS PELO
PROVENTRÍCULO
Nos experimentos realizados por Danielli et al. (1945) e Masson &
Phillipson (1951), citados na seção de absorção de AGV, pudemos observar que
além de absorver AGV, surgiram evidências de que o proventrículo participa do
balanço eletrolítico do animal. Parthasarathy & Phillipson (1953) estudaram o
movimento de potássio, sódio, cloro e água através da parede ruminal de ovinos,
usando a técnica do rúmen evacuado e lavado. Sódio e potássio foram
absorvidos quando suas concentrações no fluido ruminal excederam a
concentração sanguínea. A passagem na direção reversa ocorreu quando suas
concentrações foram inferiores à do sangue. O cloro foi absorvido pelo rúmen
quando sua concentração foi 135 mg/100 mL ou mais alta. O aparecimento de
cloro ocorreu quando as concentrações foram inferiores a esta. A absorção de
água ocorreu quando as soluções inseridas no rúmen eram hipotônicas em
relação ao plasma sanguíneo. Houve influxo de água para o lúmen ruminal
quando a solução infundida era hipertônica. Foi concluído que havia relação
entre a osmolaridade do conteúdo ruminal e o movimento de água pela parede
do órgão.
Ainda nos anos de 1950, Dobson (1959) realizou um trabalho para
demonstrar o movimento do sódio, pela parede ruminal de ovinos, contra os
gradientes de concentração e eletroquímico. Foi encontrado, na parede ruminal,
um mecanismo de transporte ativo de sódio que permite direcioná-lo contra um
gradiente de concentração, semelhante ao que ocorre na pele de rã. Outro
objetivo era determinar o movimento do cloro. Foi então descoberto que o
movimento de cloro do plasma sanguíneo para o conteúdo ruminal pode ocorrer
contra um gradiente eletroquímico na presença de alta concentração de potássio
e baixa concentração de sódio no conteúdo ruminal.
45
Willes et al. (1970), utilizando três ovelhas adultas, adaptadas com
cânulas no esôfago, no rúmen e no omaso, consumindo feno de alfafa,
reportaram taxas de movimento de água marcada com
3
H pela parede ruminal,
além de estudar os efeitos do tempo após a alimentação e do pH da digesta sobre
este movimento. A taxa de absorção de água variou de 37,1 a 70,8 mL/minuto, o
influxo para o rúmen variou de 30,5 a 65,0 mL/minuto e a absorção líquida
variou de 5,1 a 13,4 mL/minuto. O movimento de água pela parede do rúmen
aumentou duas a três horas após a alimentação e então declinou. A absorção
líquida não foi consistentemente afetada pelo tempo após a alimentação, apesar
de ter havido a hipotonicidade do fluido ruminal e absorção líquida de água em
todos os momentos. Menor pH ruminal, pela adição de HCl, resultou em maior
taxa de movimento de água pela parede ruminal. Apesar de não informada pelos
autores, usando os dados do trabalho, pôde-se calcular que a taxa fracional de
absorção de água nesse experimento foi em média 7,9%/h, em um volume de
fluido ruminal médio de sete litros.
Em meados da década de 1970, o ruminorretículo foi caracterizado
como principal sítio de absorção de magnésio (Tomas & Potter, 1976). Para
estudar os efeitos de alguns fatores sobre a absorção de Mg no rúmen, Care et al.
(1984) utilizaram vinte carneiros adaptados cirurgicamente com cânula ruminal.
As soluções experimentais continham
28
Mg e CrEDTA ou PEG como
marcadores e foram introduzidas no rúmen evacuado e lavado. A absorção
líquida de Mg contra um gradiente de concentração foi observada. Um aumento
na razão K/Na na solução diminuiu a absorção líquida de Mg, por aumentar o
influxo de Mg para o rúmen. A adição de cloreto de amônio ao conteúdo
ruminal também reduziu a absorção líquida de Mg. Os efeitos da alta razão K/Na
e das altas concentrações do íon amônio foram aditivos e diminuíram a absorção
líquida de Mg e Na. Observou-se uma relação inversa entre a concentração
ruminal de cálcio e a absorção líquida de Mg. A conclusão deste estudo foi que a
46
absorção de Mg pela parede ruminal depende, ao menos em parte, de um sistema
funcional de transporte de Na.
Nos anos de 1980, dois experimentos foram realizados para entender o
movimento de minerais e água durante a passagem da digesta pelos
compartimentos do TGI de ruminantes. O primeiro deles avaliou a absorção de
água e minerais no TGI de ovinos abatidos, utilizando
141
Cério como uma
substância inabsorvível de referência (Sklan & Hurwitz, 1985). No rúmen,
houve secreção de fósforo e sódio, porém, potássio e cálcio foram absorvidos. A
água foi absorvida no omaso e secretada no abomaso. O cloro foi secretado no
omaso e mais ainda no abomaso. No duodeno, a extensiva secreção aumentou a
concentração de sódio e potássio em oito a nove vezes; de cálcio, cloro e fósforo
em três a seis vezes; de magnésio em 1,3 vezes e de água em 12 vezes. A
reabsorção dos compostos foi rápida no intestino delgado, que se mostrou o
maior sítio de absorção de todos os íons. Foi encontrado pequeno
desaparecimento líquido de cálcio, fósforo, magnésio e potássio no intestino
grosso, entretanto, água, sódio e cloreto desapareceram continuamente. O
segundo trabalho (Edrise et al., 1986), avaliou a absorção de água e minerais no
estômago de bovinos jovens (sete meses de idade), adaptados com cânulas no
rúmen e no abomaso e uma manga flexível fixada no óstio omaso-abomasal,
passível de ser exteriorizada pela cânula do abomaso. O PEG foi utilizado como
marcador. As amostras de digesta foram coletadas do rúmen, do retículo, da
saída do omaso e do abomaso. Em relação à dieta consumida, houve adição de
sódio, água, potássio e uma pequena absorção de cloreto, da cavidade da boca
até a saída do ruminorretículo. No omaso, quantidades substanciais (40-60%) de
água e sódio e uma pequena quantidade de potássio foram absorvidos, além de
uma secreção considerável de cloro. Os pH das digestas do rúmen (6,80) e do
omaso (6,78) foram muito semelhantes. No abomaso, houve adição de cloro,
sódio e água, além de uma queda abrupta do pH (3,09).
47
Estudos sobre absorção de eletrólitos e água no ruminorretículo de
animais saudáveis já haviam sido realizados. Entretanto, a influência das
alterações no fluido ruminal, em animais acometidos por acidose aguda, sobre a
absorção destes compostos ainda não era conhecida. Objetivando determinar os
efeitos agudos de hipertonicidade, baixo pH e ácido lático na absorção de sódio,
cloro, magnésio e água, pelo ruminorretículo temporariamente isolado, Gaebel et
al. (1987b) utilizaram seis carneiros com cânulas no rúmen, alimentados com
feno. A presença de lactato (0 vs 10 mM) não alterou a absorção de Na, Cl, Mg e
água. A hipertonicidade (422 mOsm/L) causou influxo de água, mas não afetou
a absorção de Na, Cl e Mg. O pH baixo (4,79 vs 6,78) diminuiu a absorção de
Na para 75% e Cl para 52% e levou a uma secreção de Mg pelo rúmen. Os
efeitos do baixo pH foram intensificados pela aplicação simultânea de lactato e
aumento da osmolaridade. Concluiu-se que a acidose ruminal aguda prejudica os
mecanismos de absorção do epitélio ruminal.
No mesmo ano do trabalho anterior, o mesmo grupo de pesquisa gerou
outra publicação sobre os efeitos da dieta, do pH intra-ruminal e da
osmolaridade sobre a absorção de Na, Cl e Mg pelo ruminorretículo evacuado e
lavado de ovinos (Gaebel et al., 1987a). Seis carneiros adultos, com cânulas no
rúmen, receberam quatro dietas diferentes, por períodos de 15 dias cada,
oferecidas na sequência: 1) feno (controle), 2) 36% feno e 64% concentrado,
3)10% feno e 90% concentrado e 4) feno. A superfície das papilas ruminais foi
determinada. As dietas com maiores proporções de concentrado resultaram em
aumento da superfície absortiva das papilas ruminais e elevaram a absorção de
Na, Cl e Mg. A hipertonicidade (422 mosmol/L) causou influxo de água para o
rúmen, mas não alterou a absorção de eletrólitos, independentemente da dieta. O
abaixamento do pH reduziu a absorção de Na, Cl e Mg e esses efeitos negativos
do pH foram menores quando os animais receberam dietas com maiores teores
de concentrado. Quando os animais receberam apenas feno, após o período de
48
alimentação com uma dieta contendo 90% de concentrado, a superfície
absortiva, a capacidade de absorção e a resistência ao abaixamento de pH
retornaram aos níveis controle. Os achados deste trabalho demonstraram que
houve resposta adaptativa reversível do epitélio ruminal às diferentes dietas.
Mais informações dos efeitos do pH sobre a absorção de eletrólitos pela
mucosa ruminal foram obtidas por Gaebel et al. (1989), que realizaram um
experimento, in vitro, para investigar a relação entre o pH e a absorção de Na e
Cl. Carneiros adultos, abatidos em um matadouro local, foram usados para
prover pedaços de mucosa que foram incubados em uma Câmara de Ussing
1
.
Fragmentos de mucosa, obtidos antes e após a incubação, foram fixados e
incluídos em resina para estudo histológico. Em pH baixo (5,5) os movimentos
de Na e Cl no sentido mucosa-serosa foram menores do que em pH alto (7,4), o
que levou a uma menor absorção líquida. À microscopia foi possível identificar
tumefação das células e especialmente de suas mitocôndrias após exposição ao
meio ácido. As alterações foram mais severas nas células das camadas
superiores do epitélio, especialmente a camada granulosa, que apresentou
grandes vacúolos (degeneração hidrópica). Estes dados indicam que o
abaixamento do pH causa alterações no transporte de Na e Cl,
predominantemente afetando os mecanismos de transporte celular.
Zhao et al. (1995), usando quatro carneiros sustentados por nutrição
intra-gástrica, estudaram a secreção de saliva e a relação entre a pressão
1
A Câmara de Ussing é um equipamento usado para mensurar a corrente de curto-
circuito e indicar o transporte iônico em um epitélio. Este aparelho é assim designado em
homenagem ao fisiologista dinamarquês Hans Ussing (1911-2000), que o inventou na
década de 1950. Sua primeira utilização foi para demonstrar o transporte ativo de sódio
na pele de rã. A Câmara de Ussing consiste de duas hemi câmaras que são fixadas após a
acomodação do tecido entre elas (epitélio ou monocamada de células cultivadas sobre
um suporte permeável). A outra parte funcional é o circuito elétrico. Atualmente,
diferentes modelos têm sido desenvolvidos e além de mensurações de resistência,
corrente e voltagem, pode-se aferir parâmetros mais complexos como impedância e
capacitância (Ussing, 1981; Hug, 2002).
49
osmótica no rúmen e o transporte líquido de água pela parede ruminal.
Diferentes soluções foram infundidas no rúmen para alterar a pressão osmótica.
A secreção de saliva foi estimada pela entrada de fósforo no fluido ruminal. O
transporte líquido de água através da parede ruminal foi calculado como a
diferença entre a entrada e a saída de água do rúmen. A correlação entre a
pressão osmótica e a absorção de água foi linear e negativa (r
2
= 0,83). Por outro
lado, a correlação entre a pressão osmótica e a taxa de passagem de fluido foi
linear e positiva (r
2
= 0,56). Concluiu-se que a pressão osmótica pode ser um
fator chave na dinâmica da água no ruminorretículo.
López et al. (2003) avaliaram a cinética da água e a absorção de AGV
pelo rúmen de três carneiros, adaptados com uma cânula no rúmen e um catéter
no abomaso, sustentados por nutrição intra-gástrica. No dia do ensaio, os
animais receberam AGV a uma taxa de infusão basal (271 mmol/h), durante as
primeiras duas horas. A partir daí, cada animal recebeu AGV a diferentes taxas
(135, 394 ou 511 mmol/h) pelas próximas 7,5 horas. Usando marcadores de fase
fluida (PEG e CrEDTA), o volume de fluido, a taxa de passagem de fluido, a
absorção aparente de água e a taxa de absorção de AGV foram estimados. Não
houve efeitos significativos da taxa de infusão de AGV no volume de fluido e na
cinética da água. Quando a taxa de infusão aumentou, a concentração de AGV e
a osmolaridade aumentaram e o pH diminuiu. A resposta da taxa de passagem de
fluido em relação à taxa de infusão de AGV foi bifásica. Ambas variáveis
aumentaram juntas até uma concentração total de AGV de 80,1 mM. Além desta
concentração, a taxa de passagem permaneceu constante. A taxa de absorção de
AGV aumentou junto com a taxa de infusão.
Niebuhr (2003) estudou, in vitro, a absorção de bicarbonato pelo epitélio
omasal de ovinos, utilizando o método da Câmara de Ussing. O transporte de
HCO
3
-
dependeu dos gradientes de concentração de HCO
3
-
e Cl
-
entre os lados
da mucosa e da serosa. A eliminação total ou parcial do Cl
-
do lado da mucosa
50
resultou em uma diminuição significativa da taxa de transporte mucosa-serosa
de HCO
3
-
. A adição do ácido 4,4’-diisotiocianatostilbeno-2,2’-disulfônico
(DIDS
1
) no lado da serosa causou uma redução da absorção de HCO
3
-
. A
absorção paracelular de HCO
3
-
, provavelmente, foi pequena, já que o aumento
da permeabilidade paracelular, por aumento da pressão osmótica no lado da
mucosa, não alterou o transporte de HCO
3
-
. A aplicação de bumetanida
2
no lado
da serosa reduziu o transporte de HCO
3
-
, o que pode indicar a presença de co-
transporte Na
+
-K
+
-2Cl
-
(NKCC) na membrana basolateral das células do epitélio
omasal. Pôde-se concluir que a absorção de HCO
3
-
e a secreção de Cl
-
no
epitélio omasal são mediadas por anti-porte iônico.
2.5 TRANSPORTE DE ÁCIDOS GRAXOS VOLÁTEIS NO EPITÉLIO
DO PROVENTRÍCULO
Nos estudos iniciais sobre absorção de AGV pelo rúmen, os
pesquisadores acreditavam que estes compostos eram absorvidos apenas sob a
forma não dissociada (HAGV) (Danielli et al., 1945; Gray, 1948). Entretanto,
logo surgiram evidências de que formas dissociadas (AGV
-
) também poderiam
ser absorvidas (Masson & Phillipson, 1951; Ash & Dobson, 1963; Stevens,
1970). Os pKa dos AGV estão em torno de 4,8 (Fukushima, 1995) e o pH do
ambiente ruminal, normalmente, apresenta-se entre 5,8 a 7,2. Pela equação de
Henderson-Hasselbalch
3
, pode-se observar que a maioria dos AGV estão sob a
forma AGV
-
no fluido ruminal (> 90%). Quando o pH do rúmen diminui, ocorre
um grande aumento na proporção de formas HAGV, porém isso é refletido em
um pequeno aumento do clearance de AGV (Stevens, 1970; Gäbel, 1995), ou
seja, a taxa de absorção não é proporcional à concentração de HAGV. Além
disso, caso os AGV fossem absorvidos apenas sob a forma HAGV, a velocidade
1
DIDS: inibidor do anti-porte Cl
-
-HCO
3
-
e de outras trocas iônicas.
2
Bumetanida: inibidor do co-transporte Na
+
-Cl
-
e Na
+
-K
+
-2Cl
-
.
3
pH = pK
a
+ log
10
([A
-
]/[AH])
51
de absorção deveria ser fortemente correlacionada com a habilidade de cada
ácido permear membranas lipídicas. De acordo com Walter & Gutknecht (1986),
a habilidade do butirato permear através de uma membrana de fosfatidilcolina é
2,7 vezes maior do que do propionato, que é 5,1 vezes maior do que do acetato.
Porém, em pH próximo da neutralidade as velocidades de absorção dos AGV
têm se mostrado muito semelhantes (Dijkstra et al., 1993; Resende Júnior et al.,
2006b). Então, esta discrepância poderia ser explicada por (Gäbel et al., 2002):
1) os mecanismos de transporte das células epiteliais podem prover prótons
adicionais, criando um micro-ambiente ácido na periferia das células epiteliais,
facilitando a transferência de HAGV; e 2) os AGV podem ser absorvidos sob a
forma AGV
-
.
O influxo de substâncias para o lúmen ruminal durante a absorção dos
AGV, como por exemplo CO
2
/HCO
3
-
(Masson & Phillipson, 1951; Ash &
Dobson, 1963), e o isolamento da anidrase carbônica no epitélio ruminal (Carter,
1971) fortaleceram a hipótese que a forma AGV
-
também poderia ser absorvida.
Por outro lado, a absorção de sódio na mesma direção dos AGV (Danielli et al.,
1945), poderia indicar uma possível fonte adicional de prótons, com a captação
apical de Na
+
através de anti-porte com H
+
(NHE) (Martens et al., 1991). Os
prótons lançados para fora da célula poderiam ser usados para converter AGV
-
à
HAGV, que por sua vez poderiam permear facilmente a membrana das células.
Holtenius (1991) estudou a absorção de AGV pelo epitélio ruminal de
quatro cabras não lactantes e não gestantes, submetidas ou não a jejum. As
concentrações plasmáticas (veia jugular externa) de acetato e de sódio
diminuíram e o pH ruminal aumentou após o jejum. A absorção de acetato foi
maior quando os autores infundiram uma solução com pH 4,9 do que quando o
pH usado foi 7,4. A concentração plasmática de sódio aumentou após a infusão
de uma solução contendo AGV, nas cabras submetidas a jejum. Os resultados
indicaram que a absorção de AGV estimulou a absorção ruminal de sódio.
52
Martens et al. (1991) estudaram os mecanismos de transporte de
22
Na e
36
Cl pelo rúmen de carneiros, in vitro, com epitélios isolados e montados em
Câmara de Ussing. A maior parte do sódio foi transportado por um mecanismo
eletricamente neutro. A ausência de cloro ou bicarbonato na solução do lado da
mucosa reduziu a absorção de sódio. Por outro lado, a ausência de sódio na
solução do lado da mucosa inibiu completamente a absorção líquida de cloro. A
substituição de potássio por colina, na solução do lado da mucosa, não alterou o
fluxo de sódio, contrariando a hipótese da presença de um co-transportador Na
+
-
K
+
-2Cl
-
. A interação entre sódio, cloreto e bicarbonato foi testada por inibidores
de transporte iônico. A adição de furosemida
1
ou bumetanida não alterou
significativamente o fluxo de sódio. A hidroclorotiazida
2
também não
influenciou o fluxo de sódio. Por outro lado, altas concentrações de amilorida
3
reduziram significativamente o transporte de sódio e cloro. Esta considerável
inibição da absorção de sódio indica que a maior parte da absorção líquida de
sódio pode ser mediada pelo anti-porte Na
+
-H
+
. Também foi determinado o
efeito do DIDS sobre o transporte de cloro. A absorção de cloro não foi alterada
pela adição de DIDS na solução do lado da mucosa. Neste trabalho pôde-se
confirmar a adição apical de prótons pelas células do epitélio ruminal, o que
poderia culminar na formação de um micro-ambiente ácido.
Gäbel et al. (1991) investigaram as influências de dieta (feno ou 81% de
concentrado), AGV, lactato e cloreto sobre o movimento de bicarbonato pela
parede do ruminorretículo evacuado e lavado, de seis carneiros, adaptados com
cânula ruminal. A substituição de AGV por gluconato e manitol, na solução
infundida no rúmen, reverteu a secreção para absorção de bicarbonato e esta
reversão não pôde ser prevenida pela presença de lactato na solução. A remoção
simultânea de cloro e AGV aumentou a absorção líquida de bicarbonato. A
1
Furosemida e bumetanida: inibidores do co-transporte Na
+
-Cl
-
e Na
+
-K
+
-2Cl
-
.
2
Hidroclorotiazida: inibidor do co-transporte Na
+
-Cl
-
.
3
Amilorida: inibidor do anti-porte Na
+
-H
+
e Na
+
-K
+
.
53
absorção de AGV e a secreção de bicarbonato foram maiores nos animais que
consumiram concentrado do que naqueles que consumiram apenas feno. Pôde-se
concluir que a secreção de bicarbonato pelo ruminorretículo depende da
presença de AGV no lúmen. Além disso, os autores citaram que a secreção de
bicarbonato pela parede ruminal pode ser um fator importante para alcalinizar a
digesta, especialmente nos animais consumindo dietas com alto teor de
concentrados.
Kramer et al. (1996) também estudaram a absorção de AGV em
carneiros, in vivo, com o rúmen evacuado e lavado, e in vitro, com epitélio
ruminal isolado e montado em Câmara de Ussing (usando
14
C-propionato e
36
Cl). In vitro, o abaixamento do pH de 7,5 para 6,5 levou a um aumento de
aproximadamente dez vezes na concentração de propionato não dissociado, mas
o fluxo mucosa-serosa de propionato aumentou apenas duas vezes. Para
examinar a influência do anti-porte Na
+
-H
+
sobre a absorção de AGV, o efeito
da amilorida foi investigado. A adição de amilorida no lado da mucosa não
alterou a absorção de propionato, sugerindo que os AGV também poderiam ser
absorvidos sob a forma AGV
-
. A adição de DIDS no lado da mucosa reduziu
significativamente a absorção de cloro. Para estudar o efeito do DIDS apenas
sobre a absorção de propionato, os autores bloquearam o transporte de cloro com
um derivado do estilbeno. Nestas condições o DIDS reduziu significativamente
o fluxo de propionato. A substituição de gluconato por nitrato
1
levou a efeitos
similares ao do DIDS. Uma elevação da concentração de cloro no lado da
mucosa resultou em uma redução significativa da absorção de propionato. Por
outro lado, o transporte de cloro foi reduzido quando a concentração de
propionato aumentou no lado da mucosa. In vivo, a teofilina foi utilizada como
agente bloqueador do anti-porte Na
+
-H
+
, já que a amilorida é tóxica. No rúmen
lavado e evacuado, a teofilina causou diminuição da absorção de sódio, porém a
1
Nitrato: inibidor de anti-porte iônico.
54
absorção de AGV (mistura de acetato, propionato e butirato) não foi afetada.
Quando o sódio foi totalmente substituído por colina, também não houve
alteração na absorção de AGV. Por outro lado, um aumento na concentração de
cloro levou à redução da absorção de AGV. Os resultados obtidos sugerem que
os AGV são absorvidos tanto sob a forma AGV
-
quanto na forma HAGV. Pôde-
se também concluir que os AGV
-
competem com Cl
-
pelos sítios de ligação de
um mecanismo de anti-porte ou que são absorvidos pelo anti-porte AGV
-
-HCO
3
-
(AE).
Ainda na década de 1990, três trabalhos envolvendo transporte ruminal
de AGV, in vitro, foram publicados por um grupo de pesquisadores
dinamarqueses. No primeiro experimento, Sehested et al. (1996) estudaram o
transporte de
22
Na, in vitro, pelo epitélio ruminal isolado de bovinos e suas
interações com AGV,
36
Cl e HCO
3
-
, usando a técnica da Câmara de Ussing. A
presença de acetato, propionato e butirato na solução estimulou o transporte
ativo de sódio. A adição de análogos de AGV de ocorrência natural (isobutirato
e 2-etil-butirato) não estimulou o transporte ativo de sódio, mas inibiu o efeito
estimulador do butirato. O efeito do butirato foi dependente da concentração e
mostrou um máximo com 20 mM. Após esta concentração, o transporte de sódio
diminuiu com aumento na concentração de butirato. Isso sugere que houve um
limite na quantidade de butirato a ser trabalhada pelo epitélio. A adição de
ouabain
1
no lado da serosa aboliu o fluxo líquido de sódio, confirmando que o
anti-porte Na
+
-K
+
ATPase na membrana basolateral é essencial para o transporte
de sódio. O anti-porte Na
+
-H
+
na membrana apical foi envolvido em
aproximadamente 60% a 70% do transporte ativo de sódio na presença de AGV.
O transporte ativo de sódio aumentou com o aumento nas concentrações de cloro
e foi significativamente reduzido com a substituição de Cl
-
por gluconato. O
transporte de cloro foi estimulado pelo butirato e reduzido pela adição de
1
Ouabain: inibidor do anti-porte Na+-K+ ATPase.
55
amilorida. Não houve efeito do DIDS sobre o transporte de sódio. A adição de
HCO
3
-
e CO
2
não alterou significativamente o fluxo de sódio, mas a adição de
acetozolamida na presença de HCO
3
-
e CO
2
reduziu significativamente o
transporte ativo de sódio. Concluiu-se que os AGV podem estimular o transporte
ativo de sódio e cloro como resultado do seu metabolismo. No segundo trabalho,
Sehested et al. (1999a) estudaram os efeitos do tamanho da cadeia de carbono,
do pH e do metabolismo sobre o transporte dos AGV. A correlação entre a
afinidade lipídica e a taxa de fluxo dos ácidos, apesar de positiva, foi baixa. A
diminuição do pH aumentou o fluxo de todos os AGV, porém não
proporcionalmente ao aumento das formas HAGV na solução. Quando o pH
baixou de 7,3 para 6,0 houve um aumento de 19 vezes nas formas HAGV, mas
um aumento de apenas duas vezes na taxa de fluxo. Não foi possível determinar
relação entre o metabolismo e o transporte de AGV. A maior parte do CO
2
produzido pelo metabolismo dos AGV apareceu no lado da mucosa, e isso foi
pronunciado com a presença dos AGV. A proporção de butirato e propionato
metabolizados foi 95% e 78%, respectivamente. Houve produção líquida de
acetato pelo epitélio ruminal. No terceiro estudo, Sehested et al. (1999b)
avaliaram a absorção de
14
C-butirato e suas interações com sódio, cloro e
bicarbonato. A absorção de butirato pela via paracelular foi insignificante, ou
seja, os AGV são absorvidos pela via transcelular, majoritariamente sem alterar
a carga elétrica celular. Houve correlação positiva e linear entre a absorção de
sódio e de butirato. Quando a concentração de sódio foi reduzida o fluxo de
butirato reduziu significativamente. A adição de amilorida, entretanto, não inibiu
o fluxo de butirato. A concentração de cloro não influenciou o transporte de
butirato, porém em condições livre de cloro, o fluxo de butirato por uma via
DIDS sensível tendeu ser maior. A remoção do bicarbonato das soluções aboliu
a absorção líquida de butirato. Não houve efeitos significativos da
56
acetazolamida
1
sobre a absorção de butirato, mas na presença de bicarbonato a
absorção líquida de butirato tendeu ser menor. Com os resultados destes estudos
pôde-se concluir que os AGV são absorvidos nas formas HAGV e AGV
-
.
Durante o transporte dos AGV há interação, ao menos, com sódio, cloro e
bicarbonato.
Desde as primeiras pesquisas demonstrou-se que a quantidade de AGV
absorvida não se refletia na quantidade de AGV que atingia o sangue portal
(Masson & Phillipson, 1951). Posteriormente várias pesquisas demonstraram o
metabolismo de AGV pelo epitélio ruminal (Sutton et al., 1963b; Weigand et al.,
1975; Baldwin & Jesse, 1992). Como supracitado, Sehested et al. (1999a) não
encontraram correlação entre a absorção e o metabolismo de AGV. Mesmo
assim, a hipótese de que o metabolismo epitelial de AGV poderia aumentar a
absorção, persistia. Na tentativa de mostrar esta relação, Gäbel et al. (2001)
compararam o transporte epitelial do n-butirato (“facilmente metabolizado”)
com aquele do iso-butirato (“resistente ao metabolismo”), em condições in vivo
(ruminorretículo evacuado e lavado) e in vitro (Câmara de Ussing). In vivo, a
absorção do n-butirato foi significativamente maior do que a do iso-butirato. Os
experimentos, in vitro, demonstraram maior fluxo na direção mucosa-serosa de
n-butirato e conseqüentemente maior absorção líquida de n-butirato. A adição do
2,4-dinitrofenol (DNP
2
) aboliu o fluxo líquido de n-butirato. Os autores
concluíram que o metabolismo e/ou a disponibilidade de ATP estimulou a
absorção líquida de n-butirato e com isso, o epitélio poderia ter uma influência
regulatória sobre a absorção de n-butirato. Nos estudos in vitro, o efeito do DNP
não foi significativo sobre o acetato e o propionato, provavelmente porque estes
ácidos são pouco metabolizados pelo epitélio ruminal (Kristensen et al., 2000a;
Kristensen & Harmon, 2004b).
1
Acetazolamida: inibidor da anidrase carbônica.
2
DNP: desacoplador da fosforilação oxidativa - inibe a produção de ATP.
57
Como visto anteriormente, a absorção de sódio, por via eletroneutra,
pode ocorrer através de anti-porte com H
+
. A ocorrência de uma via eletrogênica
(canal), através de condutância não seletiva de cátions (Na
+
, Ca
++
e Mg
++
), foi
descrita (Martens & Gäbel, 1988). Para estudar os efeitos do cloreto sobre o pH
do micro-ambiente epitelial e a absorção eletrogênica de sódio pelo epitélio
ruminal de ovinos e caprinos, Leonhard-Marek et al. (2006) usaram a técnica da
Câmara de Ussing. A absorção de Na
+
, Ca
++
e Mg
++
aumentou com o aumento
na concentração de Cl
-
. O pH da superfície epitelial também aumentou com o
Cl
-
, o que pode justificar a maior absorção de cátions. O aumento do pH pode
ser explicado por um aumento da atividade do anti-porte
1
Cl
-
-HCO
3
-
ou Cl
-
-OH
-
.
A hipótese da presença de condutância de Cl
-
na membrana apical das células
também foi testada através de implante de micro-eletrodos. Caso esta hipótese
fosse verdadeira, o aumento luminal na concentração de Cl
-
levaria a uma
hiperpolarização das células. Ao contrário da hipótese, um aumento da
concentração luminal de Cl
-
não hiperpolarizou, mas despolarizou o epitélio
ruminal. Esta observação fortalece os argumentos contra a presença de canais de
cloreto na membrana apical, sugerindo que eles estejam na membrana
basolateral das células do epitélio ruminal.
Em outro trabalho, Leonhard-Marek et al. (2007) demonstraram os
efeitos dos ânions cloreto, gluconato, sulfato e AGV
-
sobre as taxas de fluxo de
cálcio através do epitélio ruminal de ovinos, em Câmara de Ussing. O gluconato,
o sulfato e os AGV reduziram a concentração de Ca
++
nas soluções. Aumentos
nas concentrações de cloro e AGV estimularam a absorção de cálcio
significativamente, porém estes efeitos puderam ser antagonizados pelo
gluconato. As vias transcelulares de absorção de cálcio, eletroneutra (anti-porte
1
Três proteínas transportadoras caracterizadas, com base na estrutura molecular e
características funcionais, são candidatas a este conjunto de troca iônica: anion
exchanger (AE), down-regulated in adenoma (DRA) e putative anion transporter (PAT)
(Bilk et al., 2005).
58
Ca
++
-2H
+
) e eletrogênica (canal de Ca
++
), foram confirmadas. Ficou sugerida a
absorção paracelular de cálcio. Os autores especularam que o mecanismo
estimulatório dos AGV sobre a absorção de cálcio seriam pelo aumento de H
+
intracelular, o que facilitaria o anti-porte Ca
++
-2H
+
e o fornecimento de ATP
após o metabolismo.
A absorção de AGV pode se dar sob as formas HAGV ou AGV
-
.
Embora ambos os caminhos sejam benéficos para a homeostase do pH ruminal,
eles representam uma “ameaça” para o ambiente citosólico das células epiteliais
(Gäbel et al., 2002). A absorção de HAGV diminui diretamente o pH
intracelular (pH
i
), como resultado da liberação intracelular de prótons. O anti-
porte AGV
-
-HCO
3
-
leva à acidificação indireta, desde que HCO
3
-
(pK
a
= 6,1) é
substituído por AGV
-
(pK
a
= 4,8), diminuindo a capacidade tampão do citosol
(Gäbel et al., 2002). Consequentemente, mecanismos alcalinizantes eficientes
são necessários para evitar uma acidificação intracelular letal.
O anti-porte Na
+
-H
+
na membrana apical das células é, provavelmente,
um dos principais mecanismos que ajudam a manter o pH
i
(Müller et al., 2000).
Entretanto, a presença do anti-porte Na
+
-H
+
na membrana apical, apesar de
benéfico, apresenta algumas desvantagens, como a acidificação do ambiente
ruminal e a possibilidade de reciclagem de prótons para as células epiteliais.
Portanto, existem suspeitas de que mecanismos adicionais para controlar o pH
i
estejam localizados na membrana basolateral. Os mais prováveis desses
mecanismos são um anti-porte Na
+
-H
+
secundário e um mecanismo de captação
de bicarbonato (Müller et al., 2000). Gäbel et al. (2007) sugerem que a
importação de bicarbonato seja feita via isoforma 1 do co-transportador Na
+
-
HCO
3
-
(NBC1). Além disso, suspeita-se da ocorrência de exportação ativa de
íons H
+
pela membrana apical da célula (Gäbel et al., 2007).
Após a captação apical, os AGV podem ser lançados para fora da célula
no sentido da membrana baso-lateral ou então metabolizados. O catabolismo
59
intra-celular leva à produção de corpos cetônicos (acetoacetato e 3-OH-butitato)
e lactato, que são mais hidrofílicos do que os AGV (Leo et al., 1971) e não
podem atravessar a membrana por difusão passiva, necessitando de proteínas
transportadoras específicas. Müller et al. (2002) demonstraram a presença de
mRNA e da proteína isoforma 1 do transportador monocarboxilato (MCT1) em
células intactas ou cultivadas, do epitélio ruminal de ovinos. Por meio de
imunohistoquímica pôde-se mostrar que o MCT1 é expresso na camada basal do
epitélio ruminal. A adição de lactato, 3-OH-butirato ou acetoacetato no meio de
cultura levou a um abaixamento rápido do pH
i
. A presença do ácido p-
cloromercuribenzóico (pCMBA) e do floretin
1
reduziu a acidificação
intracelular. Fisiologicamente, o lactato, o 3-OH-butirato e o acetoacetato são
transportados de dentro para fora da célula. Para verificar o papel do MCT1 na
exportação destes compostos, as células cultivadas foram carregadas com estes
ácidos monocarboxílicos e o pH
i
foi registrado após a remoção extracelular dos
ácidos. A remoção dos ácidos resultou em uma rápida recuperação do pH
i
. A
presença de pCMBA e floretin inibiu a recuperação do pH
i
. Concluiu-se que o
MCT1 funciona como um mecanismo importante de remoção de corpos
cetônicos e lactato juntamente com prótons, do citossol para o sangue. Então,
além da exportação de prótons pelo anti-porte Na
+
-H
+
, o MCT1 é um
mecanismo importante de regulação do pH
i
.
Os mecanismos de transferência de AGV, do lúmen para o citoplasma
das células do epitélio ruminal, são bem conhecidos. Entretanto, os mecanismos
de transferência dos AGV, pela membrana basolateral, do citoplasma para o
sangue, não haviam sido identificados. Existe a possibilidade dos AGV
atravessarem a membrana basolateral sob a forma HAGV. Porém, no citoplasma
(pH
i
~ 7,4), 99,75% dos AGV estão sob a forma AGV
-
e precisariam de um
mecanismo de exportação para atingirem o sangue. Como normalmente o pH
1
pCMBA e floretin: inibidores de MCT.
60
ruminal é inferior ao pH
i
, se não houvesse um sistema de transporte, ocorreria
acúmulo de AGV no interior das células. Diante disso, um grupo de
pesquisadores japoneses investigaram o possível envolvimento do MCT1 no
transporte de AGV pelo epitélio ruminal in vivo (rúmen evacuado e lavado com
catéteres inseridos na artéria ruminal direita e na veia ruminal direita) e in vitro
(Câmara de Ussing), além de caracterizar a distribuição do MCT1 ao longo do
TGI de caprinos (Kirat et al., 2006). A RT-PCR revelou a presença de mRNA
para MCT1 em todas as regiões do TGI. Uma análise quantitativa, por meio de
Western blot, mostrou que o nível de proteína MCT1 seguiu a ordem rúmen >=
retículo > omaso > céco > cólon proximal > cólon distal > abomaso > intestino
delgado. A realização de imunohistoquímica no epitélio do proventrículo
indicou a expressão de MCT1 predominantemente nas camadas basal e
espinhosa. No ensaio in vivo, a injeção de pCMBA na artéria ruminal reduziu
significativamente as concentrações de acetato, propionato e 3-OH-butirato na
veia ruminal. No ensaio in vitro, a presença de pCMBA reduziu o transporte de
acetato (ácido testado) na direção mucosa-serosa. Este estudo forneceu
evidências, pela primeira vez em ruminantes, que o MCT1 tem um papel direto
no transporte de AGV.
Todos os trabalhos até aqui abordados focaram o estudo do transporte de
AGV pela parede ruminal (FIGURA 1). Porém, como foi visto na seção de
absorção de AGV pelo proventrículo, o omaso tem uma participação importante
no clearance destes ácidos, principalmente em animais que consomem grandes
quantidades de matéria seca. Apesar da sua importância, apenas um trabalho foi
encontrado na literatura sobre o transporte de AGV no omaso (Ali et al., 2006).
Para realização do estudo, carneiros de várias raças, pesos e idades, alimentados
com feno, foram abatidos. Algumas lâminas do omaso foram removidas,
dissecadas e montadas em uma Câmara de Ussing. O
14
C-acetato foi utilizado
como representante dos AGV. Para estudar o efeito do pH, a solução tampão do
61
lado da mucosa teve o pH ajustado para 7,4 ou 6,4. O pH da solução do lado da
serosa foi ajustado para 7,4 em todas as montagens, independente do tratamento.
Para estudar o efeito da concentração de AGV sobre a taxa de transporte,
soluções contendo vinte e cinco, cinqüenta ou cem mili moles de acetato por
litro foram testadas. A ocorrência de competição com outros AGV foi testada
com a presença de propionato. Em um ensaio, a amilorida foi adicionada no lado
da mucosa para determinar a existência de alguma ligação entre o anti-porte
Na
+
-H
+
e o transporte de AGV. Em outro ensaio, DIDS foi adicionado no lado
da mucosa para verificar o transporte de AGV
-
através de anti-porte com
bicarbonato ou cloreto. Ainda para verificar a presença do anti-porte AGV
-
-
HCO
3
-
o bicarbonato da solução foi removido e adicionou-se etoxizolamida
1
.
Por último, como a atividade de proteínas transportadoras é sensível à
temperatura, os transportes de AGV e cloro foram avaliados em baixa
temperatura (28 vs 38
o
C). O abaixamento do pH aumentou o transporte mucosa-
serosa e consequentemente a absorção líquida de acetato. As taxas de transporte
de acetato apresentaram correlação linear e positiva (r
2
= 0,99) com as
concentrações de acetato. Caso o acetato fosse transportado por um carreador, a
presença de um segundo AGV diminuiria o fluxo do primeiro. A presença de
propionato não alterou significativamente o transporte de acetato. A adição de
DIDS não afetou o fluxo no sentido mucosa-serosa de acetato. A eliminação de
bicarbonato e a adição de etoxizolamida não alteraram significativamente o
transporte de acetato. A redução da temperatura afetou a taxa de fluxo mucosa-
serosa de cloro, porém o efeito sobre o fluxo de acetato foi bem menor e pode
ter sido causado pela diminuição da atividade do carreador Na
+
-H
+
. A adição de
amilorida aboliu completamente o transporte de sódio e reduziu
significativamente o fluxo mucosa-serosa de acetato e, conseqüentemente, a
absorção líquida de acetato. Os dados deste único experimento apóiam a idéia de
1
Etoxizolamida: inibidor da anidrase carbônica.
62
difusão passiva de acetato pelo epitélio omasal. Este mecanismo tem a vantagem
de não precisar de carreadores e não gastar energia (FIGURA 2).
FIGURA 1 – Mecanismo proposto, fundamentado em dados da literatura, para o
transporte de ácidos graxos voláteis no epitélio ruminal. NHE: anti-porte Na
+
-
H
+
. AE: anion exchanger. DRA: down-regulated in adenoma. PAT: putative
anion transporter. NBC1: isoforma 1 do co-transportador Na
+
-HCO
3
-
. MCT1:
isoforma 1 do transportador monocarboxilato. AC: anidrase carbônica.
63
FIGURA 2 - Mecanismo proposto, fundamentado em dados da literatura, para o
transporte de ácidos graxos voláteis no epitélio omasal. NHE: anti-porte Na
+
-H
+
.
AE: anion exchanger. NKCC: co-transporte Na
+
-K
+
-2Cl
-
. MCT1: isoforma 1 do
transportador monocarboxilato.
64
2.6 METABOLISMO DE ÁCIDOS GRAXOS VOLÁTEIS NO EPITÉLIO
DO PROVENTRÍCULO
Logo nos primeiros experimentos sobre a absorção de AGV pelo
proventrículo, os pesquisadores notaram que as proporções e as quantidades de
AGV encontrados na circulação portal não era iguais àquelas que desapareciam
do rúmen (Barcroft et al., 1944; Masson & Phillipson, 1951). Masson &
Phillipson (1951) notaram que a concentração de butirato no sangue que drena o
rúmen foi muito inferior às concentrações de acetato e propionato, sugerindo a
utilização de butirato pela parede ruminal. A possibilidade de esterificação do
butirato pelo epitélio ruminal foi descartada (Pennington, 1952), já que o nível
de ácidos graxos de cadeia curta esterificados, no sangue de bovinos, mostrou-se
insignificante (McClymont, 1951). Pennington (1952) investigou o
metabolismo, in vitro, de acetato, propionato e butirato pelo epitélio ruminal e
por outros tecidos de ovinos. Fragmentos de vários tecidos, de um carneiro
abatido, foram incubados em frascos com acetato, propionato ou butirato de
sódio. Os três ácidos foram metabolizados pelo epitélio ruminal, entretanto,
houve preferência notável pelo butirato. O metabolismo de AGV pela túnica
muscular da parede do rúmen, principalmente do butirato, foi muito inferior ao
do epitélio ruminal. Uma grande parte do butirato incubado com fragmentos de
epitélio ruminal foi convertido a corpos cetônicos, principalmente acetoacetato.
Corpos cetônicos também foram formados a partir do acetato, mas não do
propionato. Houve produção de corpos cetônicos a partir do butirato incubado
com fragmentos dos epitélios do retículo e do omaso e fragmentos de fígado.
Todos estes tecidos metabolizaram mais butirato do que acetato e propionato. Os
epitélios do abomaso e do ceco e o tecido renal não mostraram preferência por
butirato e produziram pequenas quantidades de corpos cetônicos. Neste
experimento pôde-se confirmar o catabolismo de AGV pelo epitélio ruminal.
65
Sutton et al. (1963b) compararam a atividade metabólica da mucosa
ruminal de seis bezerros alimentados apenas com leite ou com leite, feno e
concentrado. Os animais foram sacrificados na décima sexta semana de idade.
Dois gramas de mucosa, obtidos do saco cranial do rúmen, foram incubados em
frascos erlenmeyer contendo acetato, propionato, butirato ou uma mistura desses
três ou ainda, glicose. As taxas de utilização (µmol/100mg matéria seca de
tecido, durante três horas) de acetato, propionato, butirato, mistura de AGV e
glicose, respectivamente, foram 5,9; 29,6; 44,1; 31,5 e 3,8 para os bezerros que
consumiram leite, feno e concentrado e 2,9; 5,8; 4,7; 5,8 e 4,2 para os bezerros
que consumiram apenas leite. Corpos cetônicos, especialmente acetoacetato,
foram produzidos nos frascos com butirato, acetato ou mistura de AGV. A razão
(acetoacetato + acetona)/3-OH-butirato variou de 1/1 a 2/1. A porcentagem de
acetato e butirato convertidos a corpos cetônicos foi 72 e 88%, respectivamente,
para animais que consumiram leite, feno e concentrado; e 17 e 29%,
respectivamente, para animais consumindo leite. O desenvolvimento da
capacidade metabólica (Sutton et al., 1963b) parece estar relacionado ao
desenvolvimento estrutural e à capacidade absortiva da mucosa ruminal (Sutton
et al., 1963a).
Joyner et al. (1963) estudaram a absorção e o metabolismo de
14
C-
butirato e
14
C-acetato pelo omaso de bezerros. Os animais foram anestesiados, a
cavidade abdominal foi incisada e o omaso foi exteriorizado. A artéria carótida
comum também foi acessada. Antes e após a infusão dos isótopos no lúmen do
omaso, amostras de sangue foram coletadas da artéria carótida comum e da veia
omasal, por quatro vezes durante 15 minutos. O butirato desapareceu
rapidamente do lúmen do omaso. A maior porção (~ 72%) do
14
C do butirato
apareceu no sangue como 3-OH-butirato. Aproximadamente um terço da
radioatividade foi encontrada no bicarbonato do sangue, sugerindo que uma
66
parte do butirato foi totalmente oxidada a CO
2
. O acetato também foi absorvido
e aparentemente não foi convertido a 3-OH-butirato.
O butirato e o propionato pareciam ser os AGV mais metabolizados pelo
epitélio ruminal. Para entender o catabolismo intra-epitelial destes ácidos,
Taylor & Ramsey (1965) incubaram fragmentos de mucosa ruminal de novilhos
com
14
C-butirato e
14
C-propionato na presença ou não de butirato e propionato
não marcados. Após três horas de incubação, 20% a 30% do butirato e 70% à
80% do propionato foram recuperados. Nos frascos com butirato, mas sem
propionato, uma fração considerável do
14
C-butirato foi convertida a acetato.
Cerca de 85% do
14
C do butirato foi encontrado no 3-OH-butirato. Dez por cento
do
14
C do butirato foi incorporado ao lactato, produzido apenas na presença de
propionato. Apoiando os resultados de outros trabalhos, que sugeriam a
formação de acetoacetato e 3-OH-butirato, não apenas pela reação reversa da
acetoacetil-CoA tiolase, mas também por uma via envolvendo 3-hidroxi-3-
metilglutaril-CoA sintetase (HMG-CoA sintetase), os dados deste experimento
concordam que parte do butirato é metabolizado pelo ciclo do ácido cítrico. Há
indícios de que o metabolismo do propionato ocorra por fixação de CO
2
para
formar succinil-CoA, um intermediário comum ao metabolismo do butirato.
Presumivelmente o lactato se origina por meio da descarboxilação do malato a
piruvato ou do oxaloacetato a fosfoenolpiruvato.
Vários estudos haviam demonstrado o metabolismo de AGV,
principalmente do butirato, pelo epitélio ruminal. Porém, a importância do
catabolismo epitelial dos AGV, in vivo, era desconhecida. Para determinar a
extensão da formação de corpos cetônicos durante a passagem do butirato pela
parede ruminal, Hodson et al. (1965) delinearam um experimento utilizando dois
bezerros holandeses, adaptados com cânula ruminal e catéteres na veia porta e
na artéria femoral, ou com a artéria carótida externa exteriorizada. Um dos
animais encontrava-se com dois meses de idade e o outro com sete. A adição de
67
uma solução com
14
C-butirato no rúmen dos bezerros resultou em um rápido
aumento na concentração de corpos cetônicos no sangue portal e no sangue
arterial, entretanto, o nível foi consistentemente maior no sangue da veia porta.
A maior parte da atividade radioativa (68 a 98%) presente nas amostras de
sangue estava na fração 3-OH-butirato, ao contrario de trabalhos in vitro (Sutton
et al., 1963b), que apresentaram uma menor proporção de 3-OH-butirato entre os
corpos cetônicos. Três a 17% do
14
C recuperado no sangue encontravam-se na
fração AGV. Os níveis de corpos cetônicos no sangue portal foram maiores no
bezerro de sete meses do que no de dois meses. Pôde-se concluir que a maior
parte do butirato absorvido é metabolizado pela parede ruminal e que este
metabolismo pode ser influenciado pela dieta.
Um dos trabalhos mais citados sobre metabolimsmo de AGV foi
realizado por Bergman & Wolff (1971). Neste trabalho, o aparecimento portal
líquido e a utilização hepática líquida de AGV foram determinados em ovinos
adultos, alimentados com alfafa peletizada e infundidos ou não com
14
C-acetato
na veia cava e submetidos a três dias de jejum. O
14
C-acetato foi infundido na
veia cava para determinar a cinética do acetato no corpo, além da produção ou
utilização esplâncnica e hepática. O ácido p-aminohipúrico foi infundido
continuamente na veia mesentérica para estimar os fluxos sanguíneos portal e
hepático. O fluxo de sangue portal representou 76 a 91% do fluxo de sangue
hepático. As taxas médias de aparecimento no sangue portal foram 68, 18 e 2
mmol/h, respectivamente, para acetato, propionato e butirato para ovinos
alimentados continuamente. Estes valores foram reduzidos para três, 0,8 e 0,6
mmol/h após três dias de jejum. Aproximadamente um terço do
14
C-acetato no
sangue arterial que entrou na região portal foi removido, independentemente da
dieta. Os autores citam que este acetato poderia ser utilizado para lipogênese na
gordura mesentérica, oxidação pela musculatura lisa, conversão a outros
compostos ou até mesmo difundir para o lúmen do TGI, apesar desta última
68
hipótese ser menos provável, pois a proporção de ácido acético no sangue sob a
forma não dissociada é muito pequena e o gradiente de concentração entre o
rúmen e o sangue é alto. As taxas de absorção portal de acetato variaram de 97
mmol/h, para animais alimentados, a 10 mmol/h, para animais em jejum.
Pequenas quantidades de acetato foram utilizadas pelo fígado. Por outro lado,
em animais alimentados, 80% a 100% do propionato e butirato foram removidos
pelo fígado e, em animais submetidos a jejum, este valor variou de 52 a 70%.
Aproximadamente 30% do acetato, 50% do propionato e 90% do butirato
produzidos no rúmen não atingiram o sangue portal. Concluiu-se que grandes
quantidades de AGV são metabolizados pelo epitélio ruminal.
Com o objetivo de relacionar o metabolismo e a absorção de butirato e
propionato pelo ruminorretículo, pesquisadores da Universidade de Iowa, nos
Estados Unidos, realizaram dois trabalhos na década de 1970. Weigand et al.
(1972a) realizaram dez ensaios, duplicatas de cinco combinações de pH e
concentração de AGV, utilizando a técnica do ruminorretículo evacuado e
lavado em bezerros, adaptados com catéteres na veia porta e na artéria aorta
torácica. Os pH testados foram 4,8, 6,0 e 7,2; e as concentrações foram 75, 150 e
225 mM. Todas as soluções (18 L) continham acetato, propionato e butirato
(65:25:15) e PEG. Todos os AGV foram absorvidos mais rápido em pH 4,8 do
que em pH 7,2. Em pH 7,4 as taxas fracionais de absorção foram iguais. Em pH
6,0 as taxas fracionais de absorção do propionato e do butirato foram 1,23 e 1,46
vezes a do acetato. Em pH 4,8 o propionato e o butirato foram absorvidos 1,45 e
1,84 vezes mais rápido do que o acetato. Como as concentrações relativas eram
65:25:15, a quantidade de moles absorvidos seguiu a ordem acetato > propionato
> butirato. Com o aumento na concentração total de AGV de 75 mM para 150
mM, a taxa de absorção praticamente dobrou, porém a taxa fracional não foi
afetada. As concentrações portais de corpos cetônicos não foram influenciadas
pela solução. A conversão de butirato a corpos cetônicos variou de 33 a 78%. O
69
abaixamento do pH e o aumento na concentração de AGV reduziram a
proporção de butirato convertido a corpos cetônicos. O 3-OH-butirato
representou aproximadamente três quartos dos corpos cetônicos na veia porta. O
aumento na concentração de AGV e o abaixamento do pH aumentaram a
concentração portal de butirato. A quantidade absoluta de butirato convertido a
corpos cetônicos foi praticamente constante. A proporção de butirato convertido
a corpos cetônicos e a taxa de absorção de butirato apresentaram correlação
negativa (r = -0,70; P < 0,05). Stevens & Stettler (1966) sugerem que o
metabolismo de butirato pode ser saturado. Os dados obtidos por Weigand et al.
(1972a) apoiam esta idéia. No segundo trabalho, Weigand et al. (1972b)
quantificaram a extensão do metabolismo de propionato durante a absorção pelo
ruminorretículo. Três novilhos holandeses com cânula ruminal, alimentados com
feno e concentrado, foram infundidos com soluções contendo de acetato,
14
C-
propionato e butirato, no ruminorretículo evacuado e lavado. As soluções com
menor pH e maiores concentrações aumentaram a absorção de AGV. As
concentrações sanguíneas portal e arterial de propionato foram positivamente
correlacionadas com as taxas de absorção de propionato. Por outro lado, as
concentrações sanguíneas de lactato não variaram significativamente. A
correlação entre as taxas de absorção de propionato e as concentrações portais e
arteriais de lactato foram baixas e não significativas. Do propionato absorvido,
2,3 a 4,9% foram convertidos a lactato. A contribuição do lactato na soma das
concentrações portais de propionato e lactato foi menor em pH 4,8 do que em
pH 7,2 e diminuiu quando as concentrações de AGV aumentaram. Isso indica
que a conversão do propionato absorvido à lactato foi limitada. A conversão de
propionato a outros produtos, que não lactato, foi muito pequena, já que
aproximadamente 100% da radioatividade do propionato absorvido foram
encontradas em propionato e lactato. Pôde-se concluir que a conversão de
propionato a lactato pelo epitélio ruminal foi pequena (< 5%) e que esta
70
conversão foi negativamente correlacionada com as taxas de absorção do
propionato.
Weekes (1972) avaliou o efeito da condição fisiológica de ovelhas
(gestação, lactação ou mantença) sobre o metabolismo de propionato e a
atividade de algumas enzimas na mucosa ruminal. Em cada condição fisiológica,
um grupo de ovelhas foi abatido e a mucosa ruminal foi coletada. Fragmentos de
papilas ruminais foram incubados com propionato para mensurar as produções
de lactato e piruvato. Outros fragmentos de mucosa foram utilizados para
determinar a atividade das enzimas propionil-CoA sintetase, propionil-CoA
carboxilase, malato desidrogenase citossólica, lactato desidrogenase, aspartato
amino-transferase, alanina amino-transferase e glutamato desidrogenase. O peso
vivo, o peso da mucosa ruminal e sua composição em termos de matéria seca,
RNA e DNA também foram determinados. As quantidades de lactato e piruvato
formadas por unidade de matéria seca de tecido, durante duas horas de
incubação, não foram afetadas pela condição fisiológica. Quando os resultados
foram expressos em termos da mucosa total, a formação de lactato foi
significativamente maior em animais lactantes. O piruvato contribuiu com dez a
25% da formação de lactato mais piruvato. A formação de piruvato por unidade
de matéria seca de tecido foi menor no início da lactação e maior no meio da
lactação. Quando os resultados são expressos em termos de mucosa total, houve
uma maior formação de piruvato durante a lactação. A proporção de propionato
convertido a lactato e piruvato foi em média 3%. Por unidade de peso de
mucosa, a condição fisiológica não afetou a atividade das enzimas propionil-
CoA sintetase, propionil-CoA carboxilase, malato desidrogenase citossólica,
lactato desidrogenase e aspartato amino-transferase. Quando os resultados são
expressos em relação ao peso total da mucosa, houve um aumento nas atividades
de todas as enzimas. Concluiu-se que a conversão de propionato a lactato e a
71
piruvato parece ser pequena e que não ocorrem adaptações desta via quando as
exigências de nutrientes são alteradas.
Ash & Baird (1973) estudaram a capacidade de ativação de AGV
(acetato, propionato e butirato), determinada pela taxa de formação dos
respectivos ésteres de CoA, pelo epitélio ruminal e pelo fígado de uma vaca
Friesian-Ayrshire não lactante. Investigou-se também o efeito de um segundo
AGV sobre a taxa de ativação de um primeiro. A atividade da propionil-CoA
sintetase foi três a quatro vezes mais alta no fígado do que no epitélio ruminal. A
presença do butirato não afetou significativamente a atividade da propionil-CoA
sintetase no fígado, mas praticamente inibiu a atividade desta no epitélio
ruminal. A atividade da butiril-CoA sintetase foi cerca de três vezes maior do
que a atividade da propionil-CoA sintetase no epitélio ruminal. Entretanto, no
fígado a atividade da butiril-CoA sintetase foi inferior a da propionil-CoA
sintetase. A presença de propionato reduziu a atividade da butiril-CoA sintetase
no fígado. Ao contrário, a presença de propionato não deprimiu a atividade da
butiril-CoA sintetase no epitélio ruminal. A presença de acetato não afetou a
ação das enzimas propionil e butiril-CoA sintetases. A atividade da acetil-CoA
sintetase foi a mais baixa das três, nos dois tecidos. A presença de propionato ou
butirato diminuiu a atividade da acetil-CoA sintetase no fígado, mas não alterou
sua atividade no epitélio ruminal. A atividade da acetil-CoA sintetase no epitélio
ruminal foi inferior à do fígado. A distribuição subcelular das enzimas
(homogeneizado total do tecido; fração citoplasmática; fração particulada e
fração membrana) também foi determinada. No fígado, a atividade de todas as
acil-CoA sintetases se localizaram na matriz e na membrana mitocondriais. No
epitélio ruminal as acil-CoA sintetases demonstraram localizações semelhantes
e, neste caso, a atividade foi dividida entre mitocôndrias e citoplasma. Os
autores citaram que o epitélio ruminal foi mais difícil de homogeneizar e que o
método utilizado para isolar as frações pode ter danificado as organelas e
72
contaminado a fração citoplasma com conteúdo mitocondrial. Ficou claro que o
butirato é mais metabolizado no epitélio ruminal e o propionato é mais
metabolizado no fígado.
Ainda na década de 1970, outro experimento foi realizado para
investigar o efeito da dieta sobre a atividade metabólica da mucosa ruminal
(Weigand et al., 1975). Dez bezerros entre quatro e seis meses de idade,
divididos em dois grupos de cinco animais, foram alimentados com feno de
alfafa ou com concentrado à base de milho e farelo de soja. Ao final de três ou
quatro meses os animais foram abatidos. Fragmentos de mucosa ruminal foram
coletados e incubados em frascos erlenmeyer por três horas com um de vários
AGV. Macroscopicamente o desenvolvimento das papilas foi muito maior nos
animais alimentados com concentrado do que naqueles alimentados com feno.
As taxas de utilização de substrato seguiu a ordem: n-butirato >> n-valerato ~
propionato > iso-valerato ~ iso-butirato. Em geral, a mucosa de animais
alimentados com feno utilizou maiores quantidades de substrato (por grama de
N de tecido) do que a mucosa de animais alimentados com concentrado. A dieta
não afetou a conversão de AGV a corpos cetônicos e lactato. O lactato
representou aproximadamente metade dos produtos do catabolismo de
propionato e n-valerato. A formação de corpos cetônicos (dois terços de
acetoacetato mais acetona) representou mais de 90% do butirato utilizado. A
formação de corpos cetônicos a partir de n-valerato, cerca de 25% do seu
catabolismo, foi restrita a 3-OH-butirato. Os autores concluíram que não houve
adaptação à metabolização de AGV por unidade de peso de mucosa. Entretanto,
a maior massa de células epiteliais nos animais alimentados com concentrado
pode refletir uma maior capacidade metabólica do rúmen.
No início da década de 1990, Harmon et al. (1991) estudaram a
influência da composição e do nível de ingestão da dieta sobre o metabolismo de
AGV pelo epitélio ruminal de bovinos. Vinte bezerros (sete meses de idade)
73
agrupados por raça, sexo e peso, receberam um de quatro tratamentos: 1) dieta
com 90% de forragem, consumo para atender uma vez a exigência de mantença;
2) dieta com 90% de forragem, consumo para atender duas vezes à exigência de
mantença; 3) dieta com 90% de concentrado, consumo para atender uma vez à
exigência de mantença; e 4) dieta com 90% de concentrado, consumo para
atender duas vezes à exigência de mantença. Após 140 dias, os animais foram
abatidos. Fragmentos da mucosa do saco cranial do rúmen foram coletados e
incubados com acetato, propionato, butirato e glicose. As atividades das enzimas
acil-CoA sintetase foram determinadas. As produções líquidas (mmol/mg de
tecido) de 3-OH-butirato e acetoacetato a partir do acetato foram maiores com o
maior consumo. A produção de CO
2
a partir do acetato foi maior nas dietas com
90% de concentrado. As produções líquidas de lactato e piruvato a partir do
propionato aumentaram com a maior ingestão, porém a produção líquida de
lactato a partir da glicose diminuiu com a maior ingestão. A captação de AGV
não foi alterada pela ingestão e foi aproximadamente dez vezes maior do que a
captação de glicose. A produção de CO
2
, a partir do propionato foi duas a cinco
vezes maior do que a partir de acetato, butirato ou glicose. O consumo de
oxigênio foi maior com a maior ingestão e não foi afetado pelo tipo de AGV.
Apenas a atividade da enzima butiril-CoA sintetase foi alterada pela dieta. Em
animais que consumiram uma dieta com 90% de forragem, a atividade desta
enzima foi maior do que naqueles consumindo uma dieta com 90% de
concentrado. A adição de butirato inibiu a atividade das enzimas acetil e
propionil-CoA sintetases em 63% e 92%, respectivamente. Os resultados
sugerem maior importância dos AGV do que da glicose para o metabolismo
energético do epitélio ruminal.
Baldwin & Jesse (1992) investigaram o padrão de desenvolvimento da
oxidação de glicose e butirato pelo rúmen de ovinos em crescimento, usando o
sistema de células isoladas. As células do epitélio ruminal foram isoladas de 21
74
ovinos lactentes, abatidos com diferentes idades (um a 56 dias). O peso do
rúmen aumentou com a idade e o peso corporal. A taxa de oxidação de glicose
(nmol/10
6
células por 120 minutos) foi baixa ao nascimento, mas aumentou
agudamente até 14 dias e permaneceu elevada até o dia 42. Após o dia 42, a
oxidação de glicose diminuiu, atingindo taxas menores do que as encontradas ao
nascimento. A oxidação de butirato a CO
2
aumentou do nascimento até o dia
quatro e declinou ao longo do período de aleitamento. A presença do butirato
inibiu a oxidação de glicose por células isoladas nos dias 14, 28 e 42. Por outro
lado, a presença de glicose inibiu o metabolismo de butirato por células isoladas
do dia quatro ao dia 28 após o nascimento. A produção de 3-OH-butirato a partir
do butirato não foi detectada ao nascimento, mas foi mensurável no dia 4 e
permaneceu constante até o dia 42. Entretanto, no dia 56, a produção deste
composto apresentou um aumento de dez vezes. Este trabalho esclareceu que as
adaptações metabólicas da mucosa ruminal estão intimamente ligadas ao
desenvolvimento morfológico do tecido e que as pricipais alterações no destino
dos carbonos oriundos de glicose ou butirato ocorrem antes do desmame.
Lane et al. (2000) também avaliaram o desenvolvimento metabólico da
mucosa ruminal de ovinos. Todos os animais receberam leite até 48 dias de
idade. Do dia 49 ao dia 84, uma parte dos animais continuou recebendo leite e
outra parte foi desmamada e passou a receber alimentos sólidos. Células do
epitélio ruminal foram isoladas de animais abatidos ao longo do período
experimental e incubadas com
14
C-glicose ou
14
C-butirato. As taxas de oxidação
de glicose e butirato e de produção de acetoacetato e lactato pelas células
isoladas dos animais recebendo apenas leite não variou com a idade. Antes do
dia 42, não foi detectada produção de 3-OH-butirato. No dia 84, os níveis de
produção de 3-OH-butirato, nos animais consumindo apenas leite, foram
semelhantes aos de animais adultos. As taxas de oxidação de glicose e butirato e
as produções de acetoacetao e lactato não foram influenciadas pela dieta, em
75
animais abatidos no dia 84. A introdução de alimentos sólidos na dieta resultou
em desenvolvimento morfológico, mas não estimulou o desenvolvimento
metabólico do rúmen, por unidade de mucosa.
Objetivando avaliar as influências da razão forragem/concentrado (75%
forragem ou 75% concentrado) e a ingestão de energia metabolizável da dieta
(0,099 ou 0,181 Mcal de energia metabolizável/kg de PV
0,75
) sobre o
metabolismo de células isoladas do epitélio ruminal, Baldwin & McLeod (2000)
abateram 28 ovinos, após um período experimental de 52 dias. Células isoladas
da mucosa ruminal foram incubadas com substratos marcados com
14
C (acetato,
propionato, butirato, glicose, glutamato e glutamina), com concentração
variando de 0,1 a 50 mM. A produção de 3-OH-butirato a partir do butirato, em
animais alimentados com 75% de forragem, não foi afetada pelo consumo de
energia, mas a produção foi maior com a maior ingestão de energia nas dietas
com 75% de concentrado. A produção de acetoacetato a partir do butirato foi
maior em animais com maior ingestão de energia. As produções de lactato e
piruvato a partir de glicose, glutamato e propionato não foram afetadas pelo
tratamento, entretanto, a taxa de metabolismo da glutamina a lactato e piruvato
aumentou com a maior ingestão de energia. Em geral, a capacidade oxidativa
das células do epitélio ruminal não foi muito influenciada pela dieta.
Na cetogênese que ocorre no fígado, a fonte de acetil-CoA é a oxidação
mitocondrial, predominantemente de ácidos graxos de cadeia longa (Mayes,
1993). No caso do epitélio ruminal, a principal fonte de acetil-CoA é a oxidação
mitocondrial de butirato, originado pela fermentação no TGI (Van Soest, 1994),
que difunde livremente para as mitocôndrias (Mayes, 1993). As enzimas
acetoacetil-CoA tiolase e HMG-CoA sintetase podem regular a formação de
corpos cetônicos. Diante disso, Lane et al. (2002) estudaram os efeitos da idade
(um a 84 dias) e da dieta (leite; leite e concentrado; leite e infusão ruminal de
AGV) sobre a expressão de mRNA para acetoacetil-CoA tiolase e HMG-CoA
76
sintetase no epitélio ruminal de ovinos. As concentrações de mRNA para
acetoacetil-CoA tiolase e HMG-CoA sintetase aumentaram com a idade,
independentemente da dieta. Os níveis de mRNA para HMG-CoA sintetase
obtidos de animais alimentados epenas com leite foram baixos antes de 42 dias
após o nascimento, quando aumentaram bruscamente. Aos 84 dias, não houve
efeito da dieta na expressão de ambas as enzimas. Pôde-se concluir que o
desenvolvimento da capacidade cetogênica do epitélio ruminal ocorre com a
idade, independentemente da dieta.
Pensando no rúmen como um ambiente heretogêneo, as diversas regiões
do epitélio ruminal poderiam estar expostas a diferentes proporções e quantidade
de produtos finais da fermentação e conseqüentemente expressar diferenças
metabólicas. Waldron et al. (2002) compararam o metabolismo de AGV por
células isoladas de diferentes regiões do rúmen de ovelhas. Após o sacrifício,
fragmentos de mucosa foram retirados do saco cranial, do saco ventral, do pilar
caudal e do saco dorsal do rúmen. As células foram isoladas por digestão seriada
com tripsina e incubadas por duas horas com propionato e butirato. As
incubações foram analizadas para 3-OH-butirato, acetoacetato, lactato e
piruvato. A origem do tecido não influenciou significativamente a produção de
metabólitos, indicando que a localização celular não é um fator crítico sobre a
taxa de metabolismo de AGV em condições in vitro.
Utilizando vacas em lactação, De Visser et al. (1998) quantificaram os
efeitos do estágio de maturidade da gramínea ensilada e das concentrações de
amido de milho floculado na dieta sobre o fluxo esplâncnico de AGV. A
liberação portal de acetato foi 14% a 31% menor do que a produção ruminal
estimada. A liberação portal de propionato foi semelhante à produção estimada.
A liberação portal de butirato mais 3-OH-butirato foi aproximadamente 70% da
produção estimada. Uma falha deste trabalho foi a estimativa da produção
ruminal de AGV, porém, ficou sugerido que o metabolismo de acetato e
77
propionato pela parede ruminal poderiam ser inferiores aos sugeridos na
literatura (Bergman, 1990).
Por mais de trinta anos aceitou-se a hipótese de que grandes proporções
de AGV eram metabolizados pelo epitélio do TGI (Bergman & Wolff, 1971).
Além do artigo publicado por Bergman & Wolff (1971), outras trabalhos
apoiaram esta hipótese (Bergman, 1990; Britton & Krehbiel, 1993; Seal &
Parker, 1994). Porém, na década atual, um grupo de pesquisadores
dinamarqueses gerou dados importantes que contrariam o que foi definido, por
Kristensen & Danfaer (2001), como: “Hipótese de Bergman”. Um raciocínio
simples, utilizado pelos pesquisadores para contrapor esta hipótese, será
desenvolvido a seguir, com dados publicados por Resende Júnior et al. (2006b).
A exigência de energia metabolizável para mantença
1
foi 14,7 Mcal/d (NRC,
2001). As produções diárias médias de AGV foram 58,7 moles de acetato, 18,4
moles de propionato e 9,6 moles de butirato. A energia metabolizável fornecida
pelos AGV foi obtida multiplicando-se o número de moles produzidos pelo calor
de combustão de cada AGV
2
. Os valores de energia metabolizável provenientes
de acetato, propionato e butirato foram, respectivamente, 12,3; 6,8; e 5,0 Mcal/d.
Pela hipótese de Bergman, 30% do acetato, 50% do propionato e 90% do
butirato seriam metabolizados pelo epitélio ruminal. Como parte da energia do
butirato é lançada sob corpos cetônicos no sangue portal, assumiu-se que 60%
da energia do butirato seriam utilizados pelo epitélio (Kristensen & Danfaer,
2001). Portanto, um total de 10,1 Mcal/d de energia metabolizável
3
seriam
consumidos pelo epitélio, ou seja, 68,7% da exigência de mantença total,
1
Peso vivo médio = 568 kg.
2
Calor de combustão: acetato = 0,209 Mcal/mol; propionato = 0,367 Mcal/mol; butirato
= 0,524 Mcal/mol.
3
Energia metabolizável dos AGV = 3,7 Mcal de acetato + 3,4 Mcal de propionato + 3,0
Mcal de butirato.
78
caracterizando o epitélio como “suprafisiológico”. Alguns trabalhos publicados
por este grupo de pesquisa serão reportados a seguir.
Kristensen et al. (2000b) investigaram o aparecimento portal líquido de
AGV em ovelhas, não lactantes, não gestantes, recebendo infusões intra-ruminal
de soluções contendo diferentes proporções de acetato, propionato, isobutirato,
butirato e valerato. Os animais foram adaptados com cânula ruminal e catéteres
nas artérias mesentéria cranial e aorta e nas veias porta, mesentérica cranial e
ruminal direita. O p-aminohipurato foi infundido continuamente na veia
mesentérica cranial ou na veia ruminal direita para determinar o fluxo
sanguíneo. O fluxo sanguíneo portal aumentou com a infusão de AGV. As
recuperações portais foram 85% para o propionato e 60% para o isobutirato. A
recuperação portal do butirato aumentou de 21% para 32% com o aumento na
taxa de infusão do butirato e com a diminuição na taxa de infusão de acetato,
assim como a recuperação portal de valerato também aumentou de 14% para
21%. A recuperação portal de acetato foi 55%, quando mensurado como
aparecimento portal líquido. Em um experimento prévio realizado pelos autores,
a captação de
14
C-acetato pelas vísceras da drenagem portal variou de 21 a 33%.
Quando a recuperação portal de acetato foi corrigida, este valor ficou entre 75%
e 78%. Os autores citaram que a utilização de AGV pelos microorganismos pode
ter afetado os resultados. Sugeriu-se que a capacidade da β-oxidação no epitélio
ruminal é limitada, o que explicaria o aumento da recuperação portal de butirato
e valerato com o aumento na taxa de infusão de butirato.
Com o objetivo de estudar a recuperação portal de AGV, sem a
interferência do metabolismo da microbiota ruminal, Kristensen et al. (2000a)
utilizaram a técnica do ruminorretículo evacuado e lavado de quatro carneiros,
infundidos com uma solução contendo AGV. Catéteres foram implantados na
artéria mesentérica cranial e nas veias porta e ruminal direita, além de uma
cânula ruminal. O
14
C-acetato e o p-aminohipurato foram infundidos
79
continuamente na veia ruminal para determinar, respectivamente, o consumo de
acetato pelas vísceras da drenagem portal e o fluxo sanguíneo portal. As
recuperações portais de acetato, propionato e isobutirato foram 109%, 95% e
102%, respectivamente. As recuperações portais de butirato (23%), isovalerato
(48%) e valerato (32%) foram inferiores as do acetato, propionato e isobutirato.
Conclui-se que o butirato, o isovalerato e o valerato, metabolizados pela β-
oxidação e por outras rotas cetogênicas no epitélio ruminal, são trabalhados
extensivamente e que a maior parte do acetato, do propionato e do isobutirato
atingem a circulação portal.
Apesar do extenso metabolismo do butirato pela parede ruminal
(Kristensen et al., 2000a,b), não mais do que 15% a 20% do butirato infundido
eram recuperados na veia porta sob a forma de 3-OH-butirato, o que sugeriu aos
pesquisadores, um metabolismo visceral significativo de 3-OH-butirato.
Kristensen et al. (2000c), estudaram o impacto do metabolismo de 3-OH-
butirato arterial pelas vísceras da drenagem portal. O aparecimento portal
líquido de butirato e de butirato mais 3-OH-butirato foram, respectivamente,
vinte e 48% do butirato absorvido. O metabolismo de 3-OH-butirato pelas
vísceras representou 32% a 44% da taxa de perda irreversível total do corpo. O
aparecimento portal líquido de butirato mais 3-OH-butirato, corrigido para o
metabolismo das vísceras, representou 62% do butirato absorvido. Os resultados
sugeriram que a oxidação epitelial do butirato normalmente é superestimada.
Experimentos já haviam sido realizados para estudar o metabolismo de
AGV pelo eptélio ruminal de ovinos. Restava saber se o comportamento dos
AGV observados nos ovinos era o mesmo nos bovinos. Kristensen & Harmon
(2004b), utilizando seis novilhos holandeses adaptados com cânula no rúmen e
catéteres na artéria mesentérica cranial e nas veias mesentérica cranial, porta,
hepática, ruminal direita e jugular externa, estudaram o metabolismo de AGV
pelo ruminorretículo evacuado e lavado. O
13
C-acetato foi infundido na veia
80
jugular externa para determinar a utilização de acetato arterial pelas vísceras
drenadas pela veia porta. O fluxo portal de acetato, corrigido pela captação
visceral do acetato arterial, representou 105% do acetato absorvido no rúmen. O
fluxo portal líquido de propionato representou 91% do propionato absorvido.
Consideravelmente, menores proporções de butirato (27%) e valerato (30%)
atingiram o sangue portal. A soma de AGV, 3-OH-butirato e lactato na veia
porta representou 99% do total de unidades acetil e 103% das unidades propionil
dos AGV absorvidos. A captação de acetato arterial pelas vísceras representou
35% a 45% do acetato total direcionado para a veia porta. Os resultados indicam
que houve um pequeno metabolismo de acetato e propionato e que butirato e
valerato são metabolizados intensivamente pelo epitélio ruminal. A maior parte
do butirato e do valerato parece não ser metabolizada a CO
2
, mas exportada
como acetato, 3-OH-butirato e outros metabólitos como o lactato. Os dados
obtidos neste estudo, associados aos resultados de estudos prévios com ovinos,
levam à conclusão de que o epitélio ruminal não tem gasto energético
“suprafisiológico”.
Sabendo que o butirato é um AGV metabolizado significativamente pelo
epitélio ruminal, Kristensen & Harmon (2004a) estudaram a capacidade do
epitélio ruminal metabolizar butirato e os efeitos do aumento do butirato ruminal
sobre o metabolismo de outros nutrientes. Quatro novilhos holandeses adaptados
com cânula no saco dorsal do rúmen e catéteres nos vasos da circulação portal,
semelhantemente aos animais utilizados por Kristensen & Harmon (2004b),
receberam infusões de soluções de AGV com níveis crescentes de butirato, no
ruminorretículo evacuado e lavado. A concentração de acetato das soluções foi
reduzida com o aumento do butirato para equilibrar a quantidade de AGV. As
taxas de absorção ruminal de butirato (mmol/h) aumentaram com o aumento nas
concentrações deste ácido. As taxas de absorção de propionato, isovalerato e
valerato não foram afetadas pela solução. As recuperações portais de butirato e
81
valerato aumentaram com as maiores concentrações de butirato e representaram
apenas 52% a 54% da quantidade absorvida destes ácidos, no tratamento com
maior concentração de butirato (36 mM). A maior absorção de butirato resultou
em menor extração hepática de propionato e butirato e aumentou as
concentrações arteriais de propionato e butirato. Os resultados indicam que a
capacidade metabólica do epitélio ruminal é limitada e que pode haver interação
entre o metabolismo de butirato e valerato. Os autores especularam que poderia
haver limitação da ativação do butirato e do valerato pela enzima butiril-CoA
sintetase.
Os experimentos anteriores mostraram interação metabólica entre o
butirato e o valerato, indicando que estes ácidos competem pela mesma rota
metabólica no epitélio ruminal. Entretanto, apenas o efeito do aumento na
concentração de butirato ruminal havia sido estudado (Kristensen & Harmon,
2004a). Para verificar os efeitos de valerato, caproato e heptanoato sobre os
fluxos portal e hepático de AGV, glicose, lactato, 3-OH-butirato, glutamato,
glutamina e insulina, Kristensen & Harmon (2005) usaram quatro novilhos com
o ruminorretículo evacuado e lavado. Adaptações cirúrgicas foram semelhantes
àquelas dos trabalhos anteriores. As concentrações arteriais de valerato e
heptanoato aumentaram com a inclusão dos respectivos ácidos na solução
infundida no rúmen, mas não houve alterações na concentração arterial de
caproato. O aumento na concentração de valerato (1,2 vs 8,0 mM) aumentou o
fluxo portal líquido de butirato e valerato, assim como o fluxo esplâncnico
líquido de propionato, butirato e valerato. Na presença de caproato (3,5 mM) e
heptanoato (3,0 mM), os fluxos portais líquidos destes ácidos representaram
54% e 45% da quantidade absorvida, indicando um extenso metabolismo pelo
epitélio ruminal. O caproato apresentou-se cetogênico no epitélio ruminal e no
fígado e aumentou a concentração arterial, a diferença entre as concentrações na
veia ruminal e arterial, o fluxo hepático líquido e o fluxo esplâncnico líquido de
82
3-OH-butirato. Mais uma vez, ficou claro o extenso metabolismo de AGV com
cadeia linear contendo quatro ou mais carbonos e a possível competição pelas
rotas metabólicas no epitélio ruminal. Os autores sugeriram que, além da β-
oxidação, outro passo limitante para o metabolismo seria a ativação do butirato e
do valerato pela enzima butiril-CoA sintetase, que tem alta afinidade por estes
ácidos, pois a redução no metabolismo epitelial do butirato foi mais intensa na
presença do valerato do que na presença do caproato e do heptanoato.
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102
CAPÍTULO 2
PARTICIPAÇÃO DO RUMINORRETÍCULO E OMASO NA
SUPERFÍCIE ABSORTIVA TOTAL DO PROVENTRÍCULO DE
BOVINOS
(DANIEL, J. L. P.; RESENDE JÚNIOR, J. C.; CRUZ, F. J. Participação do
ruminorretículo e omaso na superfície absortiva total do proventrículo de
bovinos. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, São
Paulo, v. 43, n. 5, p. 688-694, set./out. 2006.)
RESUMO
Cerca de 60% dos ácidos graxos voláteis (AGV) produzidos no ruminorretículo
são absorvidos neste compartimento e outros 40% passam com a fase fluida para
o omaso e são absorvidos antes do duodeno. O objetivo deste trabalho foi
mensurar a superfície de absorção do ruminorretículo e do omaso comparando-
as com a magnitude de absorção. Oito bovinos adultos tiveram seu estômago
removido imediatamente após o abate. Os compartimentos do estômago foram
separados, pesados e tiveram fragmentos coletados em diversas regiões
anatômicas. Procedeu-se a mensuração da superfície interna total por meio de
captura e análise de imagens digitalizadas. A superfície absortiva do
ruminorretículo (7,7 m
2
) foi maior (P < 0,01) do que a do omaso (2,1 m
2
). A
razão superfície/digesta, entretanto, foi maior (P = 0,07) no omaso (0,31 m
2
/kg)
do que no ruminorretículo (0,13 m
2
/kg), representando uma superfície 2,4 vezes
maior no omaso por unidade de digesta. A razão superfície absortiva/superfície
de parede de um fragmento do saco ventral do rúmen apresentou correlação
positiva e alta (r = 0,84; P = 0,02) com a superfície absortiva total do rúmen,
indicando ser possível a estimativa da superfície total do órgão por meio de
biópsia. As superfícies absortivas dos compartimentos parecem ser compatíveis
com a magnitude de absorção, entretanto, estudos que comparem as taxas
fracionais de absorção de AGV entre os compartimentos devem ser realizados.
Palavras - chave: Rúmen, Retículo, Estômago, Ácidos Graxos Voláteis
103
PARTICIPATION OF THE RETICULORUMEN AND OMASUM IN
THE TOTAL ABSORPTIVE SURFACE OF THE BOVINE
FORESTOMACH
ABSTRACT
About 60% of volatile fatty acids (VFA) produced in reticulorumen are absorbed
in this compartment. The other 40% pass with the fluid phase to the omasum and
are absorbed before the duodenum. The objective of this experiment was to
measure the absorption surface of the reticulorumen and omasum aiming to
compare it with the absorption magnitude. Eight adult bovines had their
stomachs removed immediately after slaughtering. The stomach compartments
were separated and weighed. Fragments were collected from several anatomical
regions. Measurements of the total internal surface were taken through image
capture and analysis. The reticulorumen absorptive surface (7.7 m
2
) was larger
(P < 0.01) than the omasum absorptive surface (2.1 m
2
). The surface/digesta
ratio, however, was larger (P = 0.07) in the omasum (0.31 m
2
/kg) than in the
reticulorumen (0.13 m
2
/kg), representing an omasum surface for each digest unit
2.4 times larger. The absorption surface/wall surface ratio of one rumen ventral
sac fragment showed a positive correlation (r = 0.84; P = 0,02) with the total
rumen surface, indicating that it is possible to estimate the rumen surface by
biopsy. The absorptive surface of the forestomach compartments seem to be
compatible with absorption magnitude. However, further studies comparing
VFA fractional absorption rate among forestomach compartments should be
carried out.
Keywords: Rumen, Reticulum, Stomach, Volatile Fatty Acid
104
INTRODUÇÃO
A remoção (clearance) de ácidos graxos voláteis (AGV), produtos finais
da ação microbiana no ruminorretículo, ocorre por dois processos. Cerca de 60%
dos AGV são removidos por absorção pela parede do órgão e o restante passa
para o omaso juntamente com a fase fluída ruminal e são absorvidos antes do
duodeno
1, 2, 3, 4
. Se a taxa de produção excede a taxa de clearance, os AGV
podem acumular no ruminorretículo e desencadear a acidose ruminal
5
, que tem
efeitos negativos sobre a ingestão de alimentos
6
, a degradação ruminal da fibra
7
,
a motilidade do rúmen
8, 9
e a morfologia da parede ruminal
10
. A superfície
interna do ruminorretículo está diretamente relacionada com a capacidade de
absorção de AGV
11
e, como as magnitudes de absorção do ruminorretículo e do
omaso parecem ser semelhantes
1, 2
, as superfícies absortivas devem ser
compatíveis com suas funções.
A manipulação nutricional da morfologia e, conseqüentemente, da
capacidade de absorção da parede do ruminorretículo é possível e tem sido
preconizada para o controle da acidose ruminal em vacas leiteiras
11
. Há indícios
de que também seja possível interferir nutricionalmente na morfologia do
omaso
12
. A atuação sobre a morfologia omasal, uma linha de pesquisa
incipiente, pode ser tão efetiva no controle de distúrbios digestivos decorrentes
da produção e acúmulo de AGV no rúmen
13
quanto a manipulação da
capacidade de absorção da parede ruminal.
O objetivo desse trabalho foi mensurar a extensão da superfície
absortiva dos compartimentos do proventrículo comparando-a à magnitude de
absorção de cada um.
MATERIAL E MÉTODOS
Oito bovinos adultos, mestiços, não submetidos a jejum, com peso
corporal de 479
+ 185 kg, alimentados a pasto, foram alocados aleatoriamente
105
em um delineamento em blocos casualizados completos, cada bloco consistindo
de um animal. Imediatamente após o abate no matadouro, o estômago foi
removido, os compartimentos (ruminorretículo, omaso e abomaso) foram
separados e pesados, reportando-se o peso de cada compartimento e das
respectivas digestas. Após as pesagens dos compartimentos, já evacuados, foram
retirados fragmentos (2,14 cm
2
) da parede de diversas regiões anatômicas. Do
saco dorsal foram retirados dois fragmentos, sendo um da parede direita e outro
da esquerda, ambos na região intermediária entre os pilares cranial e caudal do
rúmen, cinco centímetros dorsalmente ao respectivo pilar longitudinal. Do saco
cego caudo-dorsal retirou-se uma amostra, cinco centímetros dorsalmente ao
pilar caudal. No saco cranial, uma amostra foi retirada cinco centímetros
cranialmente ao pilar cranial. Do saco cego caudo-ventral, foram retiradas duas
amostras, uma cinco centímetros caudalmente ao pilar coronário ventral direito e
outra cinco centímetros caudalmente ao pilar coronário ventral esquerdo. Do
saco ventral foram retiradas três amostras, duas cinco centímetros ventralmente
aos pilares longitudinais direito e esquerdo, e uma na extremidade ventro-cranial
do saco ventral (recesso do rúmen). No caso do retículo foi retirado um
fragmento de 25 cm
2
lateralmente ao sulco do retículo. Os fragmentos foram
imersos em solução tampão fosfato (PBS: 0,79 g de NaCl; 0,223 g de Na
2
HPO
4
;
0,0524 g de NaH
2
PO
4
; H
2
O q.s.p. 100 mL) e resfriados para preservar ao
máximo as características biológicas.
Após estes procedimentos órgãos e fragmentos em PBS foram
acondicionados em caixas isotérmicas com gelo e transportados ao laboratório.
Neste local retirou-se o tecido conjuntivo excedente da superfície da serosa dos
órgãos e efetuou-se a dissecação dos compartimentos para posterior pesagem e
mensuração da superfície interna das regiões de cada um.
As regiões anatômicas do ruminorretículo foram separadas isolando-se
retículo, saco cranial, saco dorsal, saco cego caudodorsal, saco ventral e saco
106
cego caudoventral. O peso de cada segmento anatômico foi registrado e as
regiões foram fragmentadas de maneira a possibilitar digitalização de suas
imagens através de um scanner (Scan Jet 4C, Hewlett Packard
®
). Mensurações
morfológicas dos fragmentos, previamente preservados em PBS, foram
realizadas efetuando-se a contagem do número de papilas ruminais presentes em
cada fragmento. Posteriormente, a camada mucosa foi separada da muscular e
serosa anotando-se seus pesos. As papilas ruminais foram seccionadas na base
por meio de uma lâmina de bisturi e suas imagens digitalizadas através de
scanner conforme Resende Júnior
14
, sendo suas superfícies estimadas através do
programa de análise de imagens UTHSCSA Image Tool (software livre),
segundo Resende Júnior
14
.
A superfície dos fragmentos do rúmen foi calculada pela seguinte
fórmula:
Superfície absortiva = superfície de parede – (número de papilas * 0,002) +
(número de papilas * superfície média das papilas).
Assumiu-se a superfície da base de cada papila como um valor médio,
0,002 cm
2
(0,02 cm x 0,1 cm), medida com um paquímetro. Tendo-se a
superfície de cada fragmento, estimou-se a superfície de cada região do rúmen
pela proporção direta entre a superfície de parede do fragmento e a superfície de
parede da região obtida pela análise de imagem, e também de outra maneira,
pela proporção direta entre o peso do fragmento e o peso da região.
O retículo foi fragmentado de maneira que possibilitasse a digitalização
de sua imagem pelo scanner. O fragmento coletado forneceu parâmetros para
estimativa da superfície total do retículo, considerando a morfologia peculiar
deste órgão com a presença de cristas e células-do-retículo. Para estimativa da
superfície das cristas foi utilizado um modelo matemático considerando a altura
média das mesmas e o número de células-do-retículo do fragmento. A altura foi
determinada com auxílio de um paquímetro e o número de células-do-retículo
107
presentes no fragmento foi contado. Pelo número de células-do-retículo estimou-
se o número de cristas, utilizando-se o seguinte modelo: número de cristas =
3,22 + (2,24 * número de células-do-retículo). O comprimento das cristas foi
obtido dividindo-se a aresta do fragmento (5 cm) pela raiz quadrada do número
de células-do-retículo no fragmento. A superfície total das cristas do fragmento
foi estimada pela seguinte fórmula:
Superfície das cristas do fragmento = número de cristas * altura média das
cristas * comprimento médio das cristas.
A superfície do fragmento foi calculada pela seguinte fórmula:
Superfície do fragmento = superfície de parede + superfície das cristas do
retículo - superfície da base das cristas do retículo.
Para a confecção do modelo assumiu-se que as células do retículo são
quadrangulares e a espessura da base das cristas como tendo um valor médio
(0,1 cm), medido com auxílio de um paquímetro. Posteriormente, o fragmento
do retículo teve a região mucosa separada da muscular e serosa, sendo
registrados seus pesos.
Obtida a superfície e o peso do fragmento, a superfície total do retículo
foi calculada pela proporção direta entre peso do fragmento e peso total do
órgão. Outra estimativa empregou a proporção direta entre superfície do
fragmento e superfície de parede obtida pela análise de imagem. As papilas do
retículo foram desconsideradas do cálculo devido ao seu tamanho diminuto.
O omaso, previamente seccionado, teve suas lâminas contadas e
extraídas para posterior digitalização de suas imagens pelo scanner. Assumiu-se
a espessura da base das lâminas como tendo um valor médio (0,15 cm), medido
com um paquímetro. A superfície total foi calculada pela seguinte fórmula:
Superfície do omaso = superfície de parede + superfície das lâminas do omaso –
superfície da base das lâminas do omaso.
108
As papilas do omaso foram desconsideradas dos cálculos devido ao seu
tamanho diminuto.
A superfície absortiva, a superfície de parede, a superfície de projeções
(papilas, cristas ou lâminas), a razão superfície de projeções/superfície absortiva,
o peso, o peso de mucosa, a razão superfície absortiva/peso de mucosa, o peso
de não-mucosa, a razão peso de não-mucosa/superfície de parede, o número de
papilas/cm
2
de parede, a superfície média das papilas, o peso da digesta e a razão
superfície absortiva/peso da digesta dos compartimentos ou das regiões do
proventrículo foram analisados pelo procedimento GLM do pacote estatístico
SAS, de acordo com o seguinte modelo: y
ij
= μ + α
i
+ β
j
+ ε
ij
; onde μ : média
geral; α
i
: efeito de animal (i = 1 à 8); β
j
: efeito de compartimento ou região do
proventrículo (j = 1 a J
1
) ε
ij
: erro residual, assumido independente e
identicamente distribuído em uma distribuição normal com média zero e σ
2
.
Quando necessário, as médias foram comparadas pelo Teste de Scott-Knott
2
,
com auxílio do software de análises estatísticas SISVAR. Correlações foram
estabelecidas pelo procedimento CORR do SAS. Regressões lineares foram
desenvolvidas com o procedimento REG do SAS.
1
Neste caso não se definiu o número de compartimentos ou regiões em comparação, já
que o mesmo modelo é utilizado para comparar dois (ruminorretículo vs omaso), três
(rúmen vs retículo vs omaso), quatro (rúmen vs retículo vs omaso vs abomaso), seis
(saco dorsal vs saco cego caudo-dorsal vs saco cego caudo-ventral vs saco ventral vs
saco cranial vs retículo) ou até oito (saco dorsal vs saco cego caudo-dorsal vs saco cego
caudo-ventral vs saco ventral vs saco cranial vs pilares vs retículo vs omaso)
compartimentos ou regiões do proventrículo.
2
O Teste de Scott-Knott foi preferido frente ao Teste de Tukey devido à validade prática
da interpretação deste último na presente situação (muitos tratamentos). O teste proposto
por Scott e Knott em 1974 tem por objetivo agrupar as médias de tratamentos em grupos
bem distintos, através da minimização da variação dentro de grupos, utilizando o método
de análise de conglomerados no lugar da técnica de comparação múltipla. É um teste que
evita ambigüidade na interpretação de resultados, apesar da sua rigidez.
109
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O peso da digesta do ruminorretículo (Tab. 1) representou cerca de 13%
do peso corporal dos animais. Do peso da digesta total do proventrículo 14%
encontraram-se no omaso e 86% no ruminorretículo (Tab. 1). O omaso tem sido
considerado como um sítio insignificante de fermentação microbiana
15
,
entretanto, a quantidade de digesta sugere que sua importância fermentativa
pode ser maior. O peso do rúmen vazio proporcionalmente ao peso total do
estômago foi 56%, seguido pelo omaso (23%), abomaso (11%) e retículo (9%)
(Tab. 2). Apesar de ser citado na literatura
15
que a capacidade de armazenamento
do omaso é menor do que do abomaso, a grande densidade tecidual indica maior
peso específico desse compartimento vazio.
A superfície absortiva do ruminorretículo foi aproximadamente quatro
vezes maior do que a do omaso (Tab. 1). No entanto, a razão superfície/digesta,
tendeu ser maior no omaso do que no ruminorretículo, representando uma
superfície 2,4 vezes superior no omaso por unidade de digesta. Isso poderia
compensar a menor superfície absortiva, mantendo o omaso como órgão de
extrema importância no clearance de AGV. Além disso, acima de 90% da
superfície do omaso se deve às lâminas do omaso, que são estruturas
especializadas em absorção
13
(Tab. 1) e no presente trabalho apresentaram-se em
número médio de 97 (59 - 137) em cada animal, com uma superfície média de
203 cm
2
(108 a 350 cm
2
). Caso a taxa fracional de absorção no omaso não seja
eficiente, os AGV excedentes passarão para o abomaso, podendo causar
hipomotilidade desse órgão
16, 17
e, conseqüentemente, predispondo ao
deslocamento de abomaso
18
. A manipulação da capacidade absortiva do omaso
pode ser eficiente no controle de distúrbios digestivos, especialmente em vacas
leiteiras de alta produção. Outro fato a ser considerado é que nem toda superfície
absortiva do ruminorretículo está em contato com a digesta constantemente,
como ocorre no omaso. A maior parte do saco dorsal do rúmen está preenchida
110
Tabela 1 – Peso da digesta, peso do órgão, superfície absortiva, superfície de
parede, superfície de projeções, razão superfície de projeções/superfície
absortiva e razão superfície absortiva/peso da digesta do proventrículo de
bovinos mestiços com massa corporal média de 479kg
Ruminorretículo Omaso EPM
1
P
Peso da digesta (kg) 61,19 10,04 4,38 < 0,01
Peso do órgão (kg) 8,00 2,92 0,41 < 0,01
Superfície absortiva (m
2
) 7,71 2,11 0,88 < 0,01
Superfície de parede (m
2
) 1,23 0,19 0,09 < 0,01
Superfície de projeções (m
2
) 6,28 1,92 0,80 < 0,01
Superfície de projeções/
Superfície absortiva (%)
80,71 90,06 2,09 0,02
Superfície absortiva/Peso da
digesta (m
2
/kg)
0,13 0,31 0,06 0,07
1
Erro padrão da média
por gás, entrando em contato com os AGV incorporados ao fluido ruminal,
apenas por ocasião dos movimentos ruminais.
A ausência de papilas bem desenvolvidas em algumas regiões do saco
ventral e dos sacos cegos caudo-dorsal e caudo-ventral, observadas neste
trabalho, demonstram que alguns pontos destas regiões anatômicas, mesmo
localizadas mais ventralmente no rúmen, também não permanecem
constantemente em contato com o fluido ruminal, provavelmente devido ao
posicionamento dentro da cavidade abdominal permitir acúmulo de gás. O fato
de que os AGV, presentes no fluido, atuam direta
19
e indiretamente
20
na
variação do tamanho papilar confirmam esta hipótese. Nickel, Schummer e
Seiferle
12
, descrevendo um corte transversal da cavidade abdominal de um
bovino, na altura da quarta vértebra lombar, demonstram que a superfície
111
112
Tabela 2 – Peso do órgão, superfície absortiva, superfície de parede, superfície
de projeções e razão superfície de projeções/superfície absortiva do estômago
de bovinos mestiços com massa corporal média de 479kg
Rúmen Retículo Omaso Abomaso EPM
1
P
Peso do órgão (kg) 6,89a 1,11c 2,92b 1,35c 0,27
< 0,01
Superfície absortiva (m
2
) 7,40a 0,31b 2,11b - 0,72
< 0,01
Superfície de parede (m
2
) 1,10a 0,13b 0,19b - 0,07
< 0,01
Superfície de projeções (m
2
) 6,11a 0,17b 1,92b - 0,66
< 0,01
Superfície de projeções/
Superfície absortiva (%)
81,73b 57,12c 90,06a - 2,11
< 0,01
1
Erro padrão da média
a, b, c
Médias com a mesma letra na linha não diferem significativamente pelo
Teste de Scott-Knott
visceral do saco ventral se projeta em direção dorsal, sob as vísceras, no
antímero direito da cavidade abdominal. Isso possibilitaria o acúmulo
temporário de gases nas regiões mais dorsais destas projeções. Nas regiões onde
as papilas estavam presentes (sacos cegos, saco cranial e saco ventral) não
houve diferenças (P = 0,30; EPM = 2,28) no número de papilas/cm
2
de parede
(39,38 papilas/cm
2
), mas as papilas do saco cranial (0,35 cm
2
) apresentaram
maior superfície absortiva (P < 0,01; EPM = 0,03) do que aquelas do saco
ventral (0,17 cm
2
) e dos sacos cegos caudo-dorsal (0,17 cm
2
) e caudo-ventral
(0,13 cm
2
).
Dentro das diversas regiões do rúmen os sacos ventral e cranial
apresentaram as maiores superfícies absortivas (Tab. 3). Este resultado deve-se
certamente ao maior desenvolvimento epitelial estimulado por ação dos AGV
presentes no fluido ruminal em contato permanente com regiões mais ventrais
do rúmen. Os sacos cegos caudo-dorsal e caudo-ventral apresentaram as razões
113
Tabela 3 – Peso do órgão, superfície absortiva, superfície de parede, superfície de projeções, razão superfície de
projeções/superfície absortiva, peso de mucosa, peso de não-mucosa, razão superfície absortiva/peso de mucosa e razão
peso de não-mucosa/superfície de parede do proventrículo de bovinos mestiços com massa corporal média de 479kg
SD
1
SCCD
2
SCCV
3
SV
4
SC
5
Pilares Retículo Omaso EPM
6
P
Peso do órgão (g)
1818,00b 561,88d 617,38d 2074,63b 1273,00c 542,88d 1108,63c 2917,75a 119,08 < 0,01
Superfície absortiva (cm
2
)
3008,21c 6943,79c 6877,71c 31851,39a 23758,25b 792,36c 3054,05c 21073,07b 2758,23 < 0,01
Superfície de parede (cm
2
)
3008,21a 918,70c 1118,09c 3708,44a 1801,16b 396,18c 1311,34c 1896,84b 253,25 < 0,01
Superfície de projeções (cm
2
)
0,00b 6095,44b 5446,56b 26945,68a 22085,18a 0,00b 1742,71b 19190,76a 2652,11 < 0,01
Superfície de projeções/
Superfície absortiva (%)
0,00d 84,34b 76,19b 83,45b 91,73a 0,00d 57,12c 90,06a 2,75 < 0,01
Peso de mucosa (g)
602,85b 291,16c 326,61c 991,27a 674,34b - 538,08b - 55,11 < 0,01
Peso de não-mucosa (g)
1215,15a 270,72c 290,77c 1083,36a 598,65b - 570,55b - 60,18 < 0,01
Superfície absortiva/Peso
de mucosa (cm
2
/g)
6,43c 24,04b 21,98b 30,88a 39,86a - 6,01c - 4,52 < 0,01
Peso de não-mucosa/
Superfície de parede (g/cm
2
)
0,40a 0,30b 0,27b 0,33b 0,32b - 0,43a - 0,03 < 0,01
1
Saco dorsal;
2
Saco cego caudo-dorsal;
3
Saco cego caudo-ventral;
4
Saco ventral;
5
Saco cranial
6
Erro padrão da média
a, b, c, d
Médias com a mesma letra na linha não diferem significativamente pelo Teste de Scott-Knott
superfície/peso de mucosa menores do que os supracitados (Tab. 3), no entanto,
maiores do que o saco dorsal e o retículo, resultado esperado devido à escassez
de papilas no saco dorsal e à função menos relacionada à absorção e mais
relacionada à contração atribuída ao retículo e também ao saco dorsal
21
,
comprovadas aqui pela maior razão peso de não-mucosa/superfície de parede
(Tab. 3), que neste caso pode ser um indicador da espessura da túnica muscular.
A superfície dos pilares representou menos de 1% da superfície total do
proventrículo, coerente com o fato dessas estruturas representarem
espessamentos da camada muscular, com função importante na
compartimentalização e contração do rúmen
21
. A correlação entre a superfície
absortiva e o peso da camada mucosa das regiões do ruminorretículo foi
positiva e alta (0,80; P < 0,01), mostrando que o peso da camada mucosa pode
ser um bom indicativo da superfície absortiva. As superfícies absortivas das
regiões do ruminorretículo estimadas pela superfície de parede e pelo peso dos
fragmentos foram altamente correlacionadas (Fig.1).
A razão da superfície absortiva pela superfície de parede de um
fragmento do recesso do rúmen apresentou correlação positiva com a superfície
absortiva total do rúmen (0,84; P = 0,02) (Fig. 2) e com a superfície total do
ruminorretículo (0,82; P = 0,02), indicando ser possível a estimativa destas
superfícies por meio de biópsia. A correlação entre a superfície deste fragmento
e a superfície total do proventrículo, também foi positiva (0,58; P = 0,13),
possivelmente porque o epitélio do omaso e, conseqüentemente, sua superfície,
possa se proliferar sob estímulo dos AGV, como ocorre no epitélio ruminal.
Costa
12
detectou aumento de peso do omaso em bezerros mantidos em dieta
líquida que receberam AGV infundidos no rúmen, comparados aos animais do
grupo controle, sugerindo estímulo dos AGV para o desenvolvimento do omaso.
114
0
10000
20000
30000
40000
50000
0 10000 20000 30000 40000 50000
Superfície obtida pela superfície de parede (cm
2
)
Superfície obtida pelo peso da parede (cm
2
)
Figura 1 – Correlação entre as superfícies absortivas das regiões do
ruminorretículo determinadas por correlação entre a superfície de parede do
fragmento e a superfície de parede da região (SS) e entre o peso do fragmento e
o peso da região (SP). SP = 269,0687 + 1,0436 SS; r
2
= 0,90; P < 0,01; P = 0,67
para β0 = 0; P = 0,37 para β1 = 1. Linha tracejada = linha de igualdade.
115
40000
50000
60000
70000
80000
90000
6 9 12 15 18 21
Superfície absortiva/Superfície de parede do fragmento
Superfície do rúmen (cm
2
)
Figura 2 – Correlação entre a razão superfície absortiva/superfície de parede de
um fragmento do recesso do rúmen e a superfície absortiva do rúmen.
Superfície absortiva do rúmen = 29718,00 + 2604,65 * (Superfície
absortiva/Superfície de parede do fragmento); r
2
= 0,70; P = 0,02.
116
CONCLUSÕES
Apesar da superfície absortiva do ruminorretículo ser maior do que a do
omaso, a maior razão superfície/digesta no omaso pode indicar que as
superfícies absortivas são compatíveis com a magnitude de absorção de AGV.
Estudos que comparem as taxas fracionais de absorção de AGV nos
compartimentos, entretanto, devem ser realizados.
É possível a estimativa da superfície absortiva total do rúmen por meio
de biópsia de um fragmento do saco ventral.
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th
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Cornell University, 1994.
119
120
CAPÍTULO 3
AVALIAÇÃO MORFOFISIOLÓGICA DA ABSORÇÃO E
METABOLIZAÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS VOLÁTEIS PELO RÚMEN
E OMASO DE BOVINOS
(Preparado de acordo com as normas da revista “Journal of Animal Science”)
RESUMO
As capacidades de absorção e metabolismo de ácidos graxos voláteis (AGV)
pelo rúmen e omaso foram comparadas, in vitro. Após o abate, foram coletados
fragmentos da parede ruminal e de uma lâmina do omaso de oito bovinos
mestiços adultos. Um fragmento de mucosa isolada foi montado em uma câmara
de difusão tecidual. Ácido valérico e CrEDTA foram adicionados ao fluido
ruminal que foi utilizado no lado da mucosa. Uma solução de Krebs-Ringer
bicarbonato foi utilizada no lado da serosa. As taxas fracionais de absorção
foram mensuradas pela queda exponencial na razão AGV:Cr ao longo do tempo
no lado da mucosa. A taxa de metabolismo foi determinada pela diferença entre
os AGV absorvidos e os AGV que apareceram no lado da serosa ao longo do
tempo. A superfície absortiva do fragmento de rúmen (57,6 cm
2
) foi maior do
que a do omaso (4,9 cm
2
), por causa das papilas ruminais. O índice mitótico do
omaso (0,52%) foi maior do que o do epitélio ruminal (0,28%). A taxa fracional
de absorção de AGV foi maior no omaso (4,6%.h
-1
.cm
-2
) do que no rúmen
(0,4%.h
-1
.cm
-2
). Quando a superfície total foi considerada, o potencial de
absorção do omaso foi maior do que o do rúmen. Acetato, propionato, butirato e
valerato apresentaram taxas fracionais de absorção semelhantes em ambos os
fragmentos. A porcentagem de acetato metabolizado (10,9%) foi menor do que
de propionato (31,1%) que foi menor do que de butirato (39,8%) e valerato
(42,0%). Houve interação entre a taxa de metabolismo dos AGV e o
compartimento do proventrículo. No rúmen, as taxas de metabolismo dos AGV
121
foram similares (7,7 μmol.h
-1
.cm
-2
), mas no omaso, o valerato (90,0 μmol.h
-
1
.cm
-2
) foi mais metabolizado do que butirato (59,6μmol.h
-1
.cm
-2
) e propionato
(69,8 μmol.h
-1
.cm
-2
). O acetato foi o menos metabolizado (51,7 μmol.h
-1
.cm
-2
).
O metabolismo estimado considerando a superfície total foi maior no omaso do
que no rúmen. A correlação entre o metabolismo de AGV e o índice mitótico foi
positiva, mas a absorção de AGV não foi correlacionada com outras variáveis no
rúmen. No omaso, a correlação entre absorção de AGV e índice mitótico foi
positiva, entretanto, essas variáveis foram negativamente correlacionadas com o
metabolismo de AGV. A conclusão é que o potencial de absorção e metabolismo
de AGV do omaso é maior do que o do rúmen. As capacidades de absorção de
rúmen e omaso variam na mesma direção e existem indicações que os fatores
capazes de estimular a proliferação da parede ruminal também são capazes de
estimular a parede do omaso.
Palavras-chave: absorção, bovino, metabolismo, omaso, rúmen, ácido graxo
volátil
122
MORPHOPHYSIOLOGIC EVALUATION OF THE ABSORPTION AND
METABOLISM OF VOLATILE FATTY ACIDS BY BOVINE RUMEN
AND OMASUM
ABSTRACT
The volatile fatty acids (VFA) absorption and metabolism capacity of the rumen
and omasum was compared, in vitro. After the slaughter, fragments of the rumen
wall and omasum laminae were taken from eight adult crossbred bovines. An
isolated fragment of the mucosa was fitted in a tissue diffusion chamber. Valeric
acid and CrEDTA were added to the ruminal fluid and placed on the mucosal
side. Krebs-Ringer bicarbonate buffer solution was placed on the serosal side.
The fractional absorption rates were measured by the exponential VFA:Cr ratio
decay over time. The metabolism rate was determined by the difference between
the VFA absorbed and the VFA which appeared on the serosal side over time.
The absorption surface of the rumen fragment (57.6 cm
2
) was higher than that of
the omasum (4.9 cm
2
), because of the ruminal papillae. The mitotic index of the
omasum (0.52%) was higher than that of the rumen epithelium (0.28%). The
VFA fractional absorption rate was higher in the omasum (4.6%.h
-1
.cm
-2
) than in
the rumen (0.4%.h
-1
.cm
-2
). When the total surface was considered, the absorption
potential of the omasum was higher than the rumen. Acetate, propionate,
butyrate and valerate showed similar fractional absorption rate in both
fragments. The percentage of metabolized acetate (10.9%) was lower than
propionate (31.1%) which was lower than butyrate (39.8%) and valerate
(42.0%). There was interaction between the VFA metabolism rate and the
forestomach compartment. In the rumen, the VFA metabolism rate was similar
(7.7 μmol.h
-1
.cm
-2
), but in the omasum, the valerate (90.0 μmol.h
-1
.cm
-2
) was
more metabolized than butyrate (59.6 μmol.h
-1
.cm
-2
) and propionate (69.8
μmol.h
-1
.cm
-2
). Acetate was the least metabolized (51.7 μmol.h
-1
.cm
-2
). The
123
estimated metabolism considering the total surface was higher in the omasum
than in the rumen. The correlation between VFA metabolism and mitotic index
was positive, but the VFA absorption was not correlated with other variables in
the rumen. In the omasum, the correlation between VFA absorption and mitotic
index was positive, however, those variables were negatively correlated with the
VFA metabolism. The conclusion is that the VFA metabolism and absorption
potential of the omasum is higher than that of the rumen. The rumen and
omasum absorption capacities vary in the same way, and there are indications
that the capable factors to stimulate the rumen wall are also capable of
stimulating the omasum wall proliferation.
Key words: absorption, bovine, metabolism, omasum, rumen, volatile fatty acid
124
INTRODUCTION
The clearance of volatile fatty acids (VFA) occurs in the reticulorumen
by two processes: absorption through the wall and passage with the rumen fluid
to the omasum (Peters et al., 1990). If the VFA production rate exceeds the
clearance rate, VFA will accumulate and cause the metabolic disturbance known
as rumen acidosis (Barker et al., 1995), which may have negative effects on the
animal performance and health.
In cattle with high dry matter intake, about 40% of the clearance occurs
by passage (Tamminga and Van Vuuren, 1988; Voelker and Allen, 2003;
Resende Júnior et al., 2006) and more than 97% of the VFA disappear prior to
entering the duodenum (Peters et al., 1990). The absorptive surfaces of the
reticulorumen and probably of the omasum are directly related to VFA
absorption capacity. The influence of the diet on the rumen wall morphology
with consequences in absorptive surface has been known since the decade of
1950 (Browlee, 1956; Sander et al., 1959). Manipulation of the morphology, and
consequently of the absorption capacity of the rumen by variation in the diet is
possible (Dirksen et al., 1984) and it has been recommended for acidosis control.
There are indications that it is also possible to interfere in the omasal
morphology (Baldwin et al., 2004), varying the diet. The VFA not absorbed by
the omasum pass to abomasum (Rupp et al., 1994). The excess of VFA in the
abomasal digesta may cause motility dysfunction of this organ (Bolton et al.,
1976) and predispose it to abomasal displacement (Svendsen, 1969). It was also
shown that all VFA have some deleterious effects on the epithelium of the
abomasum (Bödeker et al., 1994). The understanding of the omasal physiology
seems to be as important in the control of current digestive disturbances
enhanced by the excessive VFA production and accumulation in the rumen as
the understanding of the ruminal physiology.
125
Despite the absorptive surface of the reticulorumen (7.7 m
2
) being
higher than that of the omasum (2.1 m
2
) (Daniel et al., 2006), and the absorption
and metabolism potential of the rumen being well known, the absorption and
metabolism potential of the omasum and any comparison of these parameters
among the organs are not known. The purpose of this work was to compare, in
vitro, the VFA absorption and metabolism capacity of the rumen and omasum.
MATERIALS AND METHODS
Animals, Design and Tissue Collection. Eight adult crossbred bovines,
of several weights and ages, of both sexes, coming from a commercial
slaughterhouse, were allocated to a completely randomized block design, each
block consisting of one animal, aiming to establish local control of possible
differences of breed, sex, age or weight. The animals were killed by
exsanguinations after stunning, and the forestomach was removed from the
abdominal cavity 5 to 10 minutes later. One portion (~ 80cm
2
) of ventral rumen
sac wall (Recessus ruminis) and other portion of the omasal laminae (Laminae
omasi) were cut, carefully washed with warm saline solution to remove adherent
feed particles and placed in a Krebs-Ringer bicarbonate buffer solution (Sigma-
Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA) with pH adjusted to 7.4 and immediately
transported to the laboratory at 38
o
C. The absorption assays were started 30 to
40 minutes after slaughtering. The use of isolated mucosa makes it possible to
estimate the absorption and the metabolism of VFA, simultaneously. The ventral
sac was chosen to represent the rumen because it is a region with a high
absorptive surface (Daniel et al., 2006) and morphologically more sensitive to
dietary alterations (Beharka et al., 1998). On the other hand, the origin of the
tissue does not have a significant effect on the production of metabolites by the
rumen wall (Waldron et al., 2002). In the omasum, the laminae were chosen
126
because they represent approximately 90% of the organ surface (Daniel et al.,
2006).
Solutions. About 320 mL of rumen fluid was collected from a fistulated
cow, fed tropical pasture and 2.5 kg.d
-1
of a ground corn and soybean meal based
commercial concentrate. For collections it was used a rigid tube with several
small holes in the distal portion coupled to a suction device. The filtration of the
rumen fluid was done by the own collect device. The fermentation was stopped
by addition of 6.5 mL of 50% sulfuric acid. Forty milliliter aliquots were packed
and frozen at -20
o
C. For each animal one aliquot was thawed before the
incubation. Valeric acid (Merck, Darmstadt, Germany) and CrEDTA solution
(Binnerts et al., 1968) were added to the rumen fluid until reaching
concentrations of 25 mM and 1 mM, respectively. The pH was adjusted for 6.8
with the addition of 50% NaOH solution and this solution was used on the
mucosal side of the rumen and omasum fragments. Although the pH used was
higher than pH that occurs in animals fed with TMR, this value could allow
lower differences among VFA absorption rates induced by pH (Dijkstra et al.,
1993). The Krebs-Ringer bicarbonate buffer solution with pH adjusted for 7.4,
kept at 38
o
C, was used on the serosal sides. All solutions were heated at 38
o
C
before incubation and the temperature maintained during the incubation. The
initial pH of the mucosal fluid was the same for the rumen and omasum, once in
vivo, they are similar (Edrise et al., 1986).
Preparation of the Ruminal and Omasal Epitheliums. In the
laboratory, the ruminal mucosa was isolated by removing the serosa and
muscular layers, and the omasal mucosas were cautiously separated with the aid
of two tweezers. The mucosal sheets were cut in circles (3 cm diameter) and
inserted between two half-chambers of a tissue diffusion chamber (Indústria e
Comércio Estanhof Ltda, Lavras/MG, Brazil) with an inner aperture of 4.91 cm
2
.
Edge damage was minimized by a rubber ring on the serosal side of the tissue.
127
The bathing solutions on both sides of the chamber were kept circulating by a
mini air compressor and maintained at 38
o
C in water-jacketed reservoirs.
Sampling and Analyses. Samples (300 μL) of mucosal and serosal
fluids were obtained immediately after the mounting (time zero) and at 25, 50,
75, 100 and 125 minutes. The mucosal pH was determined at each sampling
time. The serosal pH was determined at the start and end of the incubation. The
aliquots were mixed with 100 μL of 10% sulfuric acid solution and immediately
frozen at -20
o
C for subsequent analyses of VFA and chromium.
The VFA and chromium concentration was determined in the
supernatant obtained by centrifugation at 8,855 g for 15 minutes at room
temperature. Samples were analyzed for VFA by GLC (CP-3800 Gas
Chromatograph Varian, with flame ionization detector, Varian Chromatography
Systems, California, USA) using a capillary column with nitroterephthalic acid-
modified phase, chemically bonded polyethylene glycol, 25 m x 0.25 mm I.D.
and 0.2 μm of film thickness (CP-Wax 58 (FFAP) CB, Varian Analytical
Instruments, California, USA), and N
2
as carrier gas. The oven temperature was
kept at 65
o
C for 30 s. The oven temperature was increased to 125
o
C, at rate of
20
o
C.minute
-1
, then increased to 170
o
C, at rate of 50
o
C.minute
-1
. The total time
of analyze was 4.9 minutes. The VFA concentrations were corrected through the
recovery of hexanoic acid (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim,
Germany), used as internal standard. The chromium concentration was
determined by atomic absorption spectrophotometry (SpectrAA – 100 Varian,
Varian Australia Pty LTD, Victoria, Australia).
The exponential VFA:Cr decay ratio over time on the mucosal side was
used to estimate the VFA fractional absorption rate (Resende Júnior et al.,
2006). The water fractional absorption rate was assumed to be equivalent to
mucosal Cr fractional accumulation rate determined by the exponential increase
rate of the mucosal Cr concentration over time. The VFA metabolism was
128
estimated by the difference between absorbed and appeared VFA in the serosal
fluid over time.
Morphology Measurements. The rumen surface was measured with the
aid of a scanner (Scanjet 4C, Hewlett Packard). The number of papillae was
counted; twelve papillae were randomly sectioned and digitalized for surface
determination through image analysis software UTHSCSA Image Tool version
3.00 (Free Software, The University of Texas Health Science Center in San
Antonio). The total fragment surface was the sum of the papillae surface plus the
wall surface minus the surface of the base of the papillae, assumed as 0.002 cm
2
per papilla (Daniel et al., 2006). The omasum absorptive surface was constant
(4.91 cm
2
), since omasum papillae were not considered in the calculations,
because of very small size.
For microscopic measurement, a piece (~ 3 cm
2
) of the fragment was
fixed in Bouin liquid for 24 hours, dehydrated in ethanol solutions, diphanized in
xylene, and embedded in paraffin. To determine the mitotic index, 5μm sections
were stained with hematoxylin and eosin, and to measure thickness of the
epithelium layers, 5 μm sections were stained with Masson’s Tricromic. The
mitotic index of the cells of the epithelium basal layer, the epithelium thickness,
the keratin layer thickness and the non-keratin layer thickness were determined
with an optic microscope (Ernst Leitz Wetzlar Nr. 438895, Germany) at 400
magnification. The mitotic index was determined by counting all mitotic nucleus
which were expressed as percentage of the total visible nucleus. The percentage
of cells undergoing mitosis was the mean of five independent evaluators. The
mitotic index has been used since the decade of 1970 (Sakata and Tamate, 1974;
Sakata and Tamate, 1976) as a good indicator of the rumen epithelium
proliferation. As absorption capacity has relationship with epithelium
proliferation, the absorption variations might reflect variations on mitotic index.
129
Statistical Analyses
The absorption surface of the fragments, the mitotic index, the thickness
of the epithelium, the initial VFA concentration and the water fractional
absorption rate were compared using the MIXED procedure of the SAS (SAS
Institute, 1999), according to the following model: y
ij
= μ + α
i
+ β
j
+ ε
ij
; where
μ: overall mean; α
i
: random effect of animal (i = 1 to 8); β
j
: fixed compartment
effect (j = rumen or omasum); and ε
ij
: residual, assumed independently and
identically distributed in a normal distribution with mean zero and variance σ
2
.
The fractional absorption and metabolism rates of acetate, propionate,
butyrate and valerate in both compartments (rumen and omasum) were analyzed
as a split plot arrangement, using the MIXED procedure of SAS, according to
the following model: y
ijk
= μ + α
i
+ β
j
+ αβ
ij
+ γ
k
+ βγ
jk
+ ε
ijk
; where μ: overall
mean; α
i
: random animal effect (i = 1 to 8); β
j
: fixed compartment effect (j =
rumen or omasum); αβ
ij
: interaction between animal and compartment effect
(error term used for testing compartment effect); γ
k
: fixed acid effect (k =
acetate, propionate, butyrate or valerate); βγ
jk
: interaction between compartment
and acid effect; and ε
ijk
: residual.
Initial and final pH of the solutions were compared with the MIXED
procedure of SAS, according to the following model: y
ijkl
= μ + α
i
+ β
j
+ αβ
ij
+ γ
k
+ βγ
jk
+ αγ(β)
ik(j)
+ δ
l
+ βδ
jl
+ γδ
kl
+ βγδ
jkl
+ ε
ijkl
; where μ: overall mean; α
i
:
random animal effect (i = 1 to 8); β
j
: fixed compartment effect (j = rumen or
omasum); αβ
ij
: interaction between animal and compartment effect (error term
used for testing compartment effect); γ
k
: fixed solution effect (k = mucosal or
serosal fluid); βγ
jk
: interaction between compartment and solution effect;
αγ(β)
ik(j)
: interaction between animal and solution within compartment effect
(error term used for testing solution and interaction compartment*solution
effects); δ
l
: fixed time effect (l = initial or final); βδ
jl
: interaction between
130
compartment and time effect; γδ
kl
: interaction between solution and time effect;
βγδ
jkl
: interaction among compartment, solution and time effect; and ε
ijk
:
residual.
The mucosal pH was analyzed as repeated measures over time with the
MIXED procedure of SAS. The mean square of the interaction
animal*compartment was the error term used for testing compartment effect.
The covariance structures fitted were compound symmetry, unstructured, and
autoregressive of order 1. The covariance structure was chosen based on the
Akaike’s information criterion (Littell et al., 1998). Pearson correlation
coefficients among variables within compartments were performed with the
CORR procedure of SAS. Linear regressions among measurements of both
forestomach compartments were performed with the REG procedure of SAS.
RESULTS AND DISCUSSION
The largest mitotic index in the omasum epithelium basal layer (Table 1)
indicated a faster cell proliferation in that organ than in the rumen. The rumen
absorptive surface, however, was higher than that of the omasum, because of the
ruminal papillae (Table 1). Despite systemic regulation on cell proliferation
(Sakata et al., 1980; Shen et al., 2004), the local stimulation affects the epithelial
dynamics (Sakata and Tamate, 1976; Gálfi et al., 1986). The higher omasum
surface:digesta ratio (Daniel et al., 2006) could maximize the VFA local
stimulation on the cell proliferation, since large amounts of VFA pass from
reticulorumen to omasum with the ruminal fluid phase (Resende Júnior et al.,
2006). The omasum mitotic index showed positive and high correlation with the
rumen mitotic index (Figure 1), indicating that the stimulators factors for rumen
wall proliferation can be the same as the omasum wall. In the rumen, there was
131
Table 1. Absorptive surface, mitotic index, epithelium layers thickness and
mucosal fluid VFA concentration in rumen and omasum
Compartment
Rumen Omasum SEM
1
P-value
Absorptive surface (cm
2
) 57.58 4.91 5.83 < 0.01
Mitotic index (%) 0.28 0.52 0.02 < 0.01
Thickness of the epithelium (μm)
65.04 61.71 4.66 0.33
Thickness of the keratin layer (μm)
12.95 11.82 1.24 0.27
Thickness of the non-keratin layers (μm)
52.09 49.89 3.87 0.45
Total VFA (mM) 123.21 125.35 2.58 0.31
2
A +
3
P +
4
B (mM) 98.48 98.86 2.16 0.87
Acetate (mM) 56.28 56.17 1.48 0.94
Propionate (mM) 25.39 25.29 0.63 0.91
Butyrate (mM) 16.81 17.40 0.32 0.15
Valerate (mM) 24.73 25.32 0.31 0.23
1
Standard error of the means.
2
A: acetate;
3
P: propionate;
4
B: butyrate.
no significant correlation between the mitotic index and the absorptive surface
(Table 2). The explanation can be in the fact that the mitotic index responds
acutely to the alteration of the nutritional plan (Sakata and Tamate, 1976) while
the effect on the surface happens at a lower time rate (Dirksen et al., 1984;
Gäbel et al., 1993). The total thickness, the thickness of the keratin layer and the
thickness of the non-keratin layers of the rumen and omasum epithelium were
similar (Table 1) and showed positive and high correlations (Figure 2). As the
epithelium dimension is the result of the cellular synthesis and deletion (Tamate
and Fell, 1977), the higher omasum epithelium cell proliferation might have
been compensated by higher cell loss, since the larger surface:digesta ratio and
132
0.15
0.30
0.45
0.60
0.75
0.15 0.30 0.45 0.60 0.75
Rumen mitotic index (%)
Omasum mitotic index (%
)
Figure 1. Correlation between the rumen mitotic index (RMI) and the omasum
mitotic index (OMI). OMI = 0.1463 + 1.3057 RMI; r
2
= 0.53; P = 0.04; P = 0.57
for slope = 1. Dashed line shows the equality line.
the dehydration of the content in the omasum could increase the abrasive effect
on the epithelium. There was no correlation between the rumen or omasum
epithelium total thickness and the VFA fracional absorption rate nor with the
VFA metabolism rate (Tables 2 and 3). Nevertheless, the thickness of the rumen
epithelium keratin layer and the mitotic index were positively correlated with the
rumen metabolism rate (Tables 2). In the omasum, the correlation between the
VFA absorption and the mitotic index was positive, however, those variables
were negatively correlated with the VFA metabolism (Table 3).
The total and individual VFA concentrations did not differ among the
solutions used for rumen and omasum fragments (Table 1), which excludes the
possibility of that factor have influenced the VFA absorption (Dijkstra et al.,
133
Table 2. Pearson correlation coefficients and probability (P) for slope among
VFA fractional absorption rate (ka), VFA metabolism rate (Metabolism),
absorptive surface (Surface), mitotic index (MI), thickness of the epithelium
(Epithelium), thickness of the keratin layer (Keratin) and thickness of the non-
keratin layers (Non-keratin) in the rumen fragments
2 3 4 5 6 7
1- ka (%.h
-1
)
1
-0.52
(P = 0.19)
-0.29
(P = 0.48)
-0.08
(P = 0.85)
0.01
(P = 0.98)
-0.38
(P = 0.35)
0.18
(P = 0.67)
2- Metabolism
(mmol.h
-1
)
2
…
0.33
(P = 0.43)
0.68
(P = 0.06)
0.28
(P = 0.51)
0.76
(P = 0.03)
0.02
(P = 0.95)
3- Surface (cm
2
)
… ...
0.53
(P = 0.18)
0.09
(P = 0.83)
0.19
(P = 0.65)
0.03
(P = 0.94)
4- MI (%)
… … ...
-0.18
(P = 0.67)
0.28
(P = 0.50)
-0.35
(P = 0.39)
5- Epithelium (μm)
… ... ... ...
0.74
(P = 0.04)
0.96
(P < 0.01)
6- Keratin (μm)
… ... ... ... ...
0.51
(P = 0.20)
7- Non-keratin (μm)
… … … … … …
1
ka: mean of the acetate, propionate, butyrate and valerate fractional absorption
rates
2
Metabolism: means of the acetate, propionate, butyrate and valerate
metabolism rates
134
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 102030405060708090
Rumen epithelium (um)
Omasum epithelium (um)
Figure 2. Correlations between the thickness of the rumen (TRE) and omasum
(TOE) epithelium (■); the thickness of the keratin layer of the rumen (TKRE)
and omasum (TKOE) epithelium (▲); and the thickness of the non-keratin
layers of the rumen (TNKRE) and omasum (TNKOE) epithelium (●). TOE = -
2.6839 + 0.9901 TRE; r
2
= 0.62; P = 0.02; P = 0.98 for slope = 1; TKOE =
4.5998 + 0.5577 TKRE; r
2
= 0.55; P = 0.04; P = 0.08 for slope = 1; TNKOE = -
6.4885 + 1.0823 TNKRE; r
2
= 0.62; P = 0.02; P = 0.82 for slope = 1. Dashed
line shows the equality line.
135
Table 3. Pearson correlation coefficients and probability (P) for slope among
VFA fractional absorption rate (ka), VFA metabolism rate (Metabolism), mitotic
index (MI), thickness of the epithelium (Epithelium), thickness of the keratin
layer (Keratin) and thickness of the non-keratin layers (Non-keratin) in the
omasum fragments
2 3 4 5 6
1- ka (%.h
-1
)
1
-0.73
(P = 0.04)
0.80
(P = 0.02)
0.09
(P = 0.84)
-0.08
(P = 0.85)
0.12
(P = 0.78)
2- Metabolism (mmol.h
-1
)
2
...
-0.83
(P = 0.01)
0.45
(P = 0.27)
0.33
(P = 0.43)
0.44
(P = 0.27)
3- MI (%)
… …
-0.24
(P = 0.56)
-0.14
(P = 0.74)
-0.25
(P = 0.55)
4- Epithelium (μm)
… … …
0.74
(P = 0.04)
0.99
(P < 0.01)
5- Keratin (μm)
… … … …
0.62
(P = 0.10)
6- Non-Keratin (μm)
… … … … …
1
ka: mean of the acetate, propionate, butyrate and valerate fractional absorption
rates
2
Metabolism: means of the acetate, propionate, butyrate and valerate
metabolism rates
136
137
1993). Because of the valeric acid addition to the mucosal fluid, its
concentration was higher than that of butyrate and similar to that of propionate,
which does not occur in physiologic conditions. Significant differences were not
detected among the fractional absorption rates of the acetate, propionate,
butyrate and valerate in rumen and omasum (Table 4). The rates have varied
from 18,4%.h
-1
to 23,8%.h
-1
in the rumen and from 18,5%.h
-1
to 25,8%.h
-1
in the
omasum and these values were not proportional to the size of the carbon chain,
indicating the possibility of use of the valeric acid in vitro for VFA fractional
absorption ratio determination. The utilization of valeric acid as marker of
rumen VFA clearance, in vivo, was proposed by Allen et al. (2000) and
validated by Resende Júnior et al. (2006), but published data about its use in
vitro were not found. Dijkstra et al. (1993) and Resende Júnior et al. (2006)
found higher fractional absorption rates for propionato at pH close to neutral,
suggesting that the absorption rate of this acid is higher than that of the others. In
the present study, however, despite the propionate fractional absorption rate
having been numerically higher than that of the acetate and butyrate (Table 4),
there was no significant difference. The VFA fractional absorption rate by
surface unit of the omasum was 11 times higher than that of the rumen (Table
4). This finding demonstrates the higher omasum absorptive potential, even
considering the fact that the reticulorumen absorptive surface is approximately 4
times higher than the omasum (Daniel et al., 2006). The reason for such a high
magnitude of difference could be the absorption mechanisms in the organ wall.
In the rumen, the VFA are absorbed under non dissociate (lipophilic highly
permeable) and dissociate forms (through bicarbonate exchange) (Gäbel et al.,
2002). In the omasum, VFA seems to be absorbed predominantly under
protonated form (Ali et al., 2006). Furthermore, unlike the rumen, the omasum
absorbs bicarbonate, through chloride exchange (Niebuhr, 2003). The
correlation between the rumen and omasum
138
Table 4. Fractional absorption and metabolism rates of volatile fatty acids in bovine rumen and omasum fragments
incubated for 2.08 hours in a tissue diffusion chamber
Rumen Omasum P-value
1
A
2
P
3
B
4
V
5
A P B V SEM
6
Comp Acid Comp*Acid
Fractional
absorption rate
(%.h
-1
)
19.70 23.75 18.36 22.11 18.48 25.79 23.57 22.82 4.05 0.57 0.51 0.86
Fractional
absorption
Rate/surface (%.h
-
1
.cm
-2
)
0.42
b
0.49
b
0.34
b
0.45
b
3.76
a
5.25
a
4.80
a
4.67
a
0.52 <0.01 0.45 0.50
Metabolism (%) 11.10
e
33.21
cd
43.12
ab
46.46
a
10.83
e
28.94
d
36.49
bc
37.59
bc
2.21 0.01 <0.01 0.09
Metabolism rate
(μmol.h
-1
)
262.11
d
400.98
bc
348.95
bcd
544.10
a
253.57
d
342.64
bcd
292.37
cd
445.06
ab
36.33 0.06 <0.01 0.54
Metabolism
rate/surface
(μmol.h
-1
.cm
-2
)
4.96
d
7.96
d
6.90
d
10.81
d
51.66
c
69.80
b
59.56
bc
89.97
a
4.68 <0.01 <0.01 <0.01
a-e
Means within a row with the same letter are not significantly different, according the Tukey’s Test (α = 0.05).
1
Comp: compartment effect; Acid: Acid effect; Comp*Acid: Interaction between compartment and acid effect.
2
A: acetate;
3
P: propionate;
4
B: butyrate;
5
V: valerate.
6
Standard error of the means.
10
15
20
25
30
35
10 15 20 25 30 35
Rumen ka (%.h
-1
)
Omasum ka (%.h
-1
)
Figure 3. Correlation between the VFA fractional absorption rate in the rumen
(Rumen ka) and in the omasum (Omasum ka). Omasum ka = 15.2422 + 0.5117
Rumen ka; r
2
= 0.45; P = 0.07; P = 0.08 for slope = 1. Dashed line shows the
equality line.
VFA fractional absorption rates was positive (Figure 3), indicating that the
variation in the rumen and omasum absorptive capacity is unidirectional.
The increase of the mucosal fluid pH and its reduction in the serosal
fluid (Figure 4) reflected the VFA transfer in the mucosal to serosal direction.
Despite rumen and omasum mucosal pH increase during the incubation, there
was a tendency (P = 0.08) of interaction between compartment and time (Figure
5). The rumen mucosal pH rose faster than the omasum mucosal pH. This may
have happened because of the bicarbonate secretion by rumen epithelium and
the bicarbonate absorption by omasum epithelium, since the VFA absorption
rates were similar among the compartments.
The rumen VFA metabolism (33.5%), as a percentage of the absorbed,
was higher (P = 0.01) than that of the omasum (28.5%) (Table 4), probably
139
6.5
6.8
7.0
7.3
7.5
Mucosal fluid Serosal fluid
pH
Figure 4. Means of initial (black bar) and final (white bar) pH of mucosal and
serosal fluid of rumen and omasum fragments incubated for 2.08 hours in a
tissue diffusion chamber. P = 0.30 for compartment effect; P < 0.01 for solution
effect; P = 0.17 for interaction between compartment and solution effect; P <
0.01 for time effect; P = 0.27 for interaction between compartment and time
effect; P < 0.01 for interaction between solution and time effect; P = 0.16 for
interaction between compartment, solution and time effect.
because of its larger mass of active metabolic cells. Since the thicknesses of the
non-keratin layers of the rumen and omasum epithelium were similar, the
absorptive surface can be used as an indicator of the mass of active metabolic
cells. The construction of mathematical models that describe the VFA
metabolism in forestomach, should take into account the peculiarity of the
compartments. The percentage of metabolized acetate (10.9%) was lower than
that of the propionate (31.1%) which was lower than that of the butyrate (39.8%)
and valerate (42.0%) (Table 4). The present data contradicts a hypothesis
accepted for almost 40 years (Bergman and Wolff, 1971), which suggested that
140
6.80
6.85
6.90
6.95
7.00
0.00 0.42 0.83 1.25 1.67 2.08
Time (h)
Mucosal pH
Figure 5. Mucosal pH of rumen (■) and omasum (□) fragments incubated for
2.08 hours in a tissue diffusion chamber. P = 0.65 for compartment effect; P <
0.01 for time effect; P = 0.08 for interaction between compartment and time
effect.
high proportions of acetate and propionate are metabolized by gastrointestinal
tract epithelium. However, recent studies (Kristensen et al., 2000; Kristensen
and Harmon, 2004; Kristensen and Harmon, 2005) have showed that just small
proportions of these acids are used by the rumen wall. On the other hand, linear
chain VFA with four or more carbons are metabolized intensely by the rumen
epithelium (Kristensen and Harmon, 2005) and seem to compete for the same
metabolic pathway (Kristensen and Harmon, 2004; Kristensen and Harmon,
2005). The VFA activation and the β-oxidation seems to be the limited pathway
(Kristensen et al., 2000; Kristensen and Harmon, 2005). The non physiologic
concentration of valerate on the side mucosal may have affected the butyrate
metabolism significantly (Kristensen and Harmon, 2005). Kristensen and
141
Harmon (2005) observed that the portal appearance of that butyrate that
disappeared from the rumen increased from 25% to 52% when the rumen
valerate concentration increased from 1.2 to 8.0 mmol.kg
-1
. Moreover, the same
authors observed that the increase in the rumen butyrate concentration (4 to 36
mmol.kg
-1
) resulted in the increase of butyrate (18 to 52%) and valerate (16 to
54%) portal recovery, reinforcing the theory of the competition among those
VFA during the epithelial metabolism (Kristensen and Harmon, 2004). In the
hypothesis of the butyrate and valerate being metabolized in the same
proportion, if the valerate concentrations were within physiologic standards (~
1% of VFA), the butyrate metabolism in the present study, would probably be
much higher than the found.
The rumen VFA metabolism mean rate (389.03 μmol.h
-1
) was higher (P
= 0.06) than that of the omasum (333.41 μmol.h
-1
) (Table 4), reflecting the
largest percentage of metabolized VFA, since the mucosal VFA concentrations
were similar (Table 2). The rumen and omasum valerate metabolism mean rate
(494.58 μmol.h
-1
) was higher than that of the butyrate (320.66 μmol.h
-1
) and of
the propionate (371.81 μmol.h
-1
), which were higher than that of the acetate
(257.84 μmol.h
-1
) (Table 4). There was no correlation between the rumen and
omasum VFA metabolism rate (Figure 6). Even if lower proportions of absorbed
acetate and propionate are metabolized, significant amounts are used by the
forestomach wall, because usually these acids are found in elevated
concentrations in the mucosal fluid. When the metabolic rate was corrected for
the absorptive surface, there was interaction (P < 0.01) between compartment
and acid (Table 4). The average of VFA metabolism rates in the rumen (7.7
μmol.h
-1
.cm
-2
) was much lower than the average in the omasum (67.8 μmol.h
-
1
.cm
-2
) (Table 4). In the omasum, the valerate was more metabolized than the
butyrate and propionate. The acetate was the least metabolized acid, but it did
not differ significantly from the butyrate. The occurrence of that interaction was
142
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.20 0.30 0.40 0.50 0.60
Rumen metabolism rate
(mmol.h
-1
)
Omasum metabolism rat
e
(mmol.h
-1
)
Figure 6. Correlation between the volatile fatty acid metabolism rate in the
rumen (Rumen met) and in the omasum (Omasum met). Omasum met = 0.3481
+ 0.0050 Rumen met; r
2
= 0.00; P = 0.99; P = 0.03 for slope = 1. Dashed line
shows the equality line.
probably due to the magnitude of the values found in the rumen, which were
much lower than that of the omasum. However, the sequence of the rumen VFA
metabolic rates was the same of the omasum. The estimated metabolism
considering the total organ surfaces was higher in the omasum than in the
rumen.
The water fracional absorption rate, assumed as the fractional increase
rate in the chromium concentration on the mucosal side, tended to be higher (P =
0.07) in the omasum (7.40%.h
-1
) than in the rumen (4.24%.h
-1
). When the
fractional rate was adjusted by the fragment’s surface, the speed of the omasum
water absorption (1.51%.h
-1
.cm
-2
) was 19 times higher (P < 0.01) than that of the
rumen (0.08%.h
-1
.cm
-2
). The present data confirm the high capacity of the
omasum to absorb water, a well-known function, in vivo (Edrise et al., 1986).
143
The VFA metabolism and absorption potential of the omasum is higher
than that of the rumen showing that there are important physiological differences
among the organs and the necessity of more researches about the omasum
physiology. This lack of studies about omasum possibly reflects the difficulty of
accessibility because of its anatomical localization.
The rumen and omasum absorption capacities vary in the same way and
there are indications that the factors capable of stimulating the rumen wall
proliferation also are capable of stimulating the omasum wall. So, the variation
in the diet aiming to interfere in the absorption capacity of the rumen may be
effective to interfere in the omasum absorption capacity, although the fractional
rates magnitudes are different.
All these findings of the present study bring important and original
information in this area and may be very useful in the development of the
ruminant nutrition field.
LITERATURE CITED
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