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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
MORFOLÓGICAS
ANDRESSA SILVA DE FREITAS
“ACOPLAMENTO JUNCIONAL NA ZONA
SUBVENTRICULAR: A CONTRIBUIÇÃO DA CÉLULA DE
GLIA RADIAL”
TESE APRESENTADA Á UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
COMO PRÉ-REQUISITO À OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE EM
CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS
RIO DE JANEIRO
MARÇO
2008
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i
ANDRESSA SILVA DE FREITAS
ACOPLAMENTO JUNCIONAL NA ZONA
SUBVENTRICULAR: A CONTRIBUIÇÃO DA CÉLULA DE
GLIA RADIAL
TESE APRESENTADA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO COMO PRÉ-REQUISITO À
OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE EM CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS
Orientadores: Prof. João Ricardo Lacerda de Menezes
Profa. Maira Monteiro Fróes
Rio de Janeiro
Março
2008
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ii
FICHA CATALOGRÁFICA
FREITAS, Andressa
ACOPLAMENTO JUNCIONAL NA ZONA SUBVENTRICULAR: A CONTRIBUIÇÃO DA
CÉLULA DE GLIA RADIAL / ANDRESSA SILVA DE FREITAS, RIO DE JANEIRO, 2008.
xiv, 101 f
Orientador: Prof. João Ricardo Lacerda de Menezes
Orientadora: Maira Monteiro Fróes
Tese (Mestrado em Ciências Morfológicas) – UFRJ – Instituto de Ciências
Biomédicas – Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas, 2007.
1. Comunicação juncional. 2. Célula de Glia Radial 3. Zona Subventricular. I.
Menezes, João Ricardo. II. Fróes, Maira Monteiro. III.Universidade Federal do Rio de
Janeiro. Instituto de Ciências Biomédicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências
Morfológicas. IV.Título.
iii
ANDRESSA SILVA DE FREITAS
“ACOPLAMENTO JUNCIONAL NA ZONA SUBVENTRICULAR: A CONTRIBUIÇÃO DA CÉLULA DE
GLIA RADIAL”
TESE APRESENTADA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO COMO PRÉ-REQUISITO À
OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE EM CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS
Aprovada por:
Prof. Dr. _________________________________________
Prof. Vivaldo Moura Neto
Presidente da Banca
Prof. Dr. _________________________________________
Prof. João Ricardo Lacerda de Menezes
Membro
Prof. Dr. _________________________________________
Prof. José Garcia Ribeiro Abreu Jr
Revisor e membro
Prof. Dr. _________________________________________
Profa. Luis Anastacio Alves - Fiocruz
Membro
Prof. Dr. _________________________________________
Prof. Jean Christophe Houzel
Membro
iv
A percepção do desconhecido é a mais fascinante das experiências.
O homem que não tem os olhos abertos para o misterioso
passará pela vida sem ver nada.
Albert Einstein
v
A minha família,
pilar de minha existência.
vi
AGRADECIMENTOS
“A felicidade é um susto. Chega na calada da noite, na fala do dia, no improviso
das horas. Felicidade é animal arisco. Tem que ser admirada à distância porque não
aceita a jaula que preparamos para ela. Vê-la solta e livre, no campo, correndo com sua
velocidade tão elegante é uma sublime forma de possuí-la. Felicidade é chuva que cai
na madrugada, quando dormimos. O que vemos é a terra agradecida.
Felicidade é coisa que não tem nome. É silêncio que perpassa os dias tornando-os
mais belos e falantes. Felicidade é carinho de mãe em situação de desespero. É olhar
de amigo em horas de abandono.
Felicidade é palavra pouca que diz muito. É frase dita na hora certa e que vale por
livros inteiros.
Eu busco a frase de cada dia, o recado de Deus escrito na minha geladeira...
O que quero é o olhar de Jesus refletido no olhar de quem amo. Isso sim é felicidade
sem medidas. O café quente na tarde fria, a conversa tão cheia de humor, o choro de
vez em quando. Felicidades pequenas...
A felicidade é coisa sem jeito, mas com ela eu me ajeito. Não forço para que seja como
quero, apenas acolho sua chegada, quando menos espero. E então sorrio...”.
(texto de Pe. Fábio de Melo)
Como dizia Albert Eisntein, no meio da dificuldade reside a oportunidade. E fazer
uma tese é uma dificuldade porque além de toda a problemática, e como diria Leo
Morita, sofrimento que o ato em si já implica não se deve esquecer que a ciência é feita
por pessoas aparentemente normais, segundo João Ricardo. Mas apesar de tudo, foi
uma boa oportunidade para conhecer e reconhecer meus verdadeiros objetivos na vida,
meus verdadeiros amigos e companheiros, pois estes estiveram ao meu lado tanto no
“rise” quanto no “fall”.
Sendo assim, eu gostaria de agradecer primeiramente a Deus, meu pai superior
que me permitiu chegar até aqui e me deu de presente a companhia de pessoas
maravilhosas.
Gostaria também de agradecer a minha família, minha mãe Marlene, forte como
uma leoa, protegendo-me em todos os momentos e me levando comida, porque comer
definitivamente não é minha atividade predileta. Meu pai Onair, que sempre me mostrou
que devo defender minhas idéias mesmo que seja para argumentar a favor do
Flamengo. Meu irmão Leonardo, gênio na informática, ajudando-me a ter calma, dar
vii
boas risadas e mostrando-me que a vida segue seu rumo sempre. Meus lindos avós
Juracy e Alcides que sempre torceram por mim e me ajudaram a ter fé.
Meu amado chefe João. Acho que já falei, mil vezes, que te admiro muito e quero
ser assim quando crescer (a parte científica que fique bem claro...). Cientista brilhante,
dono de uma memória invejável, pessoa maravilhosa que sabe ser sensível, amigo,
pai... muito obrigado pela confiança e paciência, essa última em doses cavalares por
sinal.
Minha querida co-orientadora Maira, sua inteligência é impressionante, você me
ensinou a ser disciplinada, determinada e corajosa, meu exemplo na carreira e na vida.
Minha querida Cecília, sempre perspicaz você me ensinou a ser autocrítica, uma
tarefa difícil. Tenha certeza que sempre ouvia sua voz no meu subconsciente antes de
cometer os mesmos erros...
Meu revisor José Garcia, obrigado pela confiança.
Tem irmãos que a vida te dá de presente como uma benção e eu recebi uma,
essa é Carla Moreira. Minha amiga, irmã, colaboradora ... eu amo essa menina. Não sei
o que seria de mim sem ela. Essa tese também é sua, muito obrigada por tudo e, não
pense que acabou...
Meus queridos amigos do LNC Áurea, mesmo longe você é um exemplo para
mim. Ana Cristina, muito obrigado pelas conversas, pela orelha... menina sábia, quero
ser assim.
Léo Morita, você sempre me ensina que o silencio às vezes é sábio, mas eu sou
uma tagarela... fazer o que. Anna Lenice, minha aluninha amada você ensina que a
responsabilidade de aprender é ensinar porque o conhecimento só é válido quando se
pode passar. Dudu, rapaz inteligentíssimo que me mostrou que a vida sempre tem que
continuar. Todos os amigos do LNC, Luciana Nogarolli, José Eduardo... obrigado pela
amizade. Meus queridos ICs Leonardo, Elisa Sasse obrigado por me mostrar que a
inocência é uma maravilha.
Aos meus amigos do Departamento, Alexandra, Antonia, Adiel, Jane e muitos
outros que não caberiam nessa página. A convivência com todos foi um prazer imenso.
viii
Luciana Romão e Karla Menezes, sempre tentando diminuir meu tempo com meu
orientador. Obrigada por me ensinar a dividir (mesmo que vocês tenham feito isso
exageradamente).
Ah...
E por fim obrigada à vida, que hoje me dá a oportunidade de recomeçar.
ix
Andressa Silva de Freitas
ACOPLAMENTO JUNCIONAL NA ZONA SUBVENTRICULAR: A CONTRIBUIÇÃO
DA CÉLULA DE GLIA RADIAL
Tese de Mestrado, apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Morfológicas (Neurobiologia do
Desenvolvimento), Departamento de Anatomia, no
Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal
do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências
Morfológicas (Neurobiologia do desenvolvimento).
Esta tese foi desenvolvida, no Laboratório de Neuroanatomia Celular, sob a orientação
do Prof. João Ricardo Lacerda de Menezes e co-orientação da Prof
a
. Maira Monteiro
Fróes e contou com o apoio financeiro das seguintes entidades: CAPES, CNPq,
CNPq/PRONEX , FAPERJ, FUJB.
Rio de Janeiro
2008
x
Resumo
Nesse estudo analisamos a contribuição específica da célula de glia radial (CGR) para
o acoplamento celular mediado por junções comunicantes na zona subventricular (SVZ)
pós natal. Para tanto, desenvolvemos uma técnica para revelar o acoplamento mediado
por corantes in situ envolvendo o carregamento direto pelos prolongamentos piais da
CGR usando uma mistura de fluorocromos permeante (lucifer yellow, LY) e não
permeante juncional (rodamina-conjugada dextran 3KDa, RD). Secções de criostato e
vibratomo foram analisadas para identificar as células carregadas diretamente
(LY+RD+) ou acopladas (LY+RD-) na SVZ. Células LY+RD+ foram restritas a regiões
abaixo o carregamento pial. O acoplamento celular apresentou uma distribuição
espacial bimodal com um gupo de células próximo a luz ventricular e outro à superfície
externa da SVZ. Este padrão manteve-se durante toda a primeira semana pós-natal. A
ausência de expressão pelas células acopladas de marcadores de neuroblastos indicou
que o acoplamento das CGR é aparentemente homocelular. Tratamentos de bloqueio
de junções comunicantes diminuíram o número de células acopladas. O extenso
acoplamento celular a partir de CGR na SVZ sugere uma possível regulação em
funções neurogênicas e na regionalização na desta camada.
xi
ABSTRACT
In this study, we have analyzed the specific contribution of the cortical radial glia (RG)
for cellular junctional coupling within the postnatal subventricular zone (SVZ). To
specifically target RG as sources of dye-coupling in situ, we have developed a new
technique that involves direct cell loading through the processes that reach the pial
surface, using a mix of gap junction permeant (lucifer yellow, LY) and non-permeant
(rhodamine-conjugated dextran 3KDa, RD) fluorochromes. Cryostat or vibratome
sections were analyzed for identification of directly loaded (LY+RD+) or coupled cells
(LY+RD-) in the SVZ. LY+RD+ cells were restricted to the region underlying the pial
loading surface area. Coupled cell were distributed in a bimodal manner, with coupled
chains in the dorsal surface of the SVZ and in the region aligning the ventricle, leaving
the SVZ core relatively free of coupled cells. Coupling by RG seems to be mostly
homocellular. Blocking gap junctional communication prior to pial loading greatly
reduced or abolished dye coupling. The participation of RG in extensive cell coupling
suggests a possible role in regulation of neurogenesis and regional specialization of the
postnatal SVZ.
xii
Lista de Abreviaturas
AJ – acoplamento juncional
BLBP – Proteina cerebral ligante de lipideos (do inglês, brain lipid binding protein)
BrdU – bromodeoxiuridina
CBX – Carbenoxolone
CGR - célula de glia radial
CP – placa cortical (do inglês, cortical plate)
Ctx – córtex cerebral
Cx - conexina
DAPI - 4’,6’-diamidina-2’-fenilindol
DNA – ácido desoxirribonucleico
EGL – camada granular externa do cerebelo (do inglês, external granular layer)
GABA – ácido -aminobutírico
GFAP – proteína acídica fibrilar glial (do inglês glial fibrilary acid protein)
GFP – proteína fluorescente verde (do inglês green fluorescent protein)
GLAST - transportador de glutamato específico de astrócitos (do inglês glutamate
astrocity specific transporter)
IZ – zona intermediária (do inglês, intermediate zone)
LGE – eminência ganglionar lateral (do inglês, lateral ganglionar eminence)
LY – Lucifer Yellow
MGE – eminência ganglionar medial (do inglês, medial ganglionar eminence)
MZ – zona marginal (do inglês, marginal zone)
PBS – solução salina tamponada com fosfato
PSA-NCAM – Molécula de adesão neural polisialilada (do inglês, polysialylated neural
cell adsion molecule)
PFA - paraformaldeído
RD – Rodamina Dextrana
RMS – via migratória rostral (do inglês, rostral migratory stream)
GSS – solução salina de Gey (do inglês, Gey´s salt solution)
SVZ – zona subventricular (do inglês, subventricular zone)
xiii
TA – temperatura ambiente
vl – ventrículo lateral
VZ – zona ventricular (do inglês, ventricular zone)
WM – substância branca (do inglês, white mater)
Ca
2+
- livre de Ca
2+
xiv
SUMÁRIO
I. Introdução 01
1. Camadas Germinativas 02
1.1. Zona Subventricular pós-natal 03
2. Compartimentalização nas camadas germinativas 07
3. Neurogênese Pós-Natal 12
4. Célula de Glia Radial 14
5. Junções Comunicantes 17
5.1 Junções Comunicantes no SNC 20
6. Junções Comunicantes e Camadas Germinativas 24
II. Objetivos 32
1. Objetivos Específicos 32
III. Metodologia 33
1. Animais e Anestesia 33
2. Carregamento Pial 33
3. Injeção Intraventricular de Carbenoxolone 35
4. Excesso de Cálcio Extracelular 36
5. Marcação com Carbocianina 36
6. Imuno-histoquímica e análise 36
IV. Resultados 38
4.1. Células carregadas pelos corantes na SVZ apresentam uma
distribuição bimodal
41
4.2. Células carregadas pelos corantes na SVZ são glia radial 44
4.3. Células carregadas pelos corantes não são marcadas por captação
inespecífica
46
4.4. Células LY-positivas são Beta III tubulina negativas 48
4.5. Agentes desacoplantes diminuem a incidência de perfis celulares
monomarcados na SVZ/RMS
50
V. Discussão 53
5.1. Considerações técnicas 53
5.2. O acoplamento celular é aparentemente homocelular 56
5.3. O acoplamento celular evidenciado por corantes possivelmente é
mediado por junções comunicantes
57
5.4. A célula de glia radial na dinâmica da SVZ 60
VI. Conclusões 65
VII. Referências Bibliográficas 66
1
I. Introdução .
A capacidade de regeneração do sistema nervoso central no adulto é limitada.
Apesar disso, a capacidade de gerar novos neurônios é mantida em regiões específicas
do cérebro maduro. Entender os fatores que influenciam essa capacidade pode ser de
crucial importância para futuras terapias de reposição celular de tecidos lesionados.
Dentre os fatores que podem influenciar a proliferação celular nestas regiões
estão as interações celulares do tipo junção comunicante do tipo gap. Em trabalho
anterior, nosso grupo mostrou que a região germinativa conhecida como zona
subventricular (SVZ), presente no período pós-natal, apresentava acoplamento celular
evidenciado por corante de baixo peso molecular, sugestivo da existência de junções
comunicantes entre algumas de suas células (Menezes et al., 2000; Marins, 2006). No
entanto, não foi possível, na ocasião, identificar os tipos celulares envolvidos nesta
rede.
A SVZ pós-natal é composta primordialmente por neuroblastos migratórios,
progenitores intermediários, astrócitos, e corpos celulares de glia radial (Alves et al.,
2002; para revisão, Menezes et al., 2002). Buscando descobrir quais seriam os
parceiros celulares cuja interação é promovida por junções comunicantes na SVZ,
desenvolvemos uma técnica in situ de carregamento intracelular de fluorocromos de
baixo peso molecular que revela redes de acoplamento celular. Esta metodologia é
capaz de carregar diretamente células da glia radial (CGR), através de seus pedículos
que se ramificam logo abaixo da superfície pial, evidenciando a distribuição espacial de
células acopladas a partir deste tipo celular específico.
2
Uma vez que as células de glia radial parecem ter múltiplos papéis no
desenvolvimento, e.g., como progenitores de neurônios e glia, e, como importantes
substratos para migração neuronal, torna-se fundamental entender a relevância das
junções comunicantes para este tipo celular. É necessário entender se promovem a
interação entre células de diferentes tipos, em diferentes estágios de diferenciação e
principalmente se exercem um papel importante na regulação de proliferação, migração
e diferenciação na zona subventricular.
1. Camadas Germinativas .
Todas as células do sistema nervoso são geradas, direta ou indiretamente, a partir
de duas regiões germinativas principais chamadas de zona ventricular (ventricular zone
- VZ) e subventricular (subventricular zone - SVZ; Boulder Committee, 1970; Jacobson,
1991; Bayer e Altman, 1994; Takahashi et al., 1995). Essas camadas geram neurônios
e células gliais (Temple e Quian, 1996; Kriegstein e Noctor, 2004). Após o fechamento
do tubo neural, as células que compõem o neuroepitélio germinativo apresentam um
grande potencial proliferativo, e formam uma camada que envolve a luz dos ventrículos
cerebrais, designada de zona ventricular (Boulder Comitee, 1970; Rakic, 1974;
Caviness, 1982). Esta camada é um epitélio pseudo-estratificado, transitório, altamente
proliferativo (Jacobson, 1991; Shimada e Langman, 1970) que apresenta um padrão
específico de deslocamento dos núcleos celulares, conhecido como migração nuclear
intercinética, cuja posição baso-apical depende da fase do ciclo mitótico (Sauer, 1935).
Na fase S (de síntese de DNA) estes núcleos aproximam-se da borda mais externa da
3
VZ, no limite com a zona intermediária (Sauer, 1935; Takahashi et al., 1992, 1993).
Acredita-se que no período perinatal em roedores a VZ se reduza às células do
epêndima (Tramontin et al., 2003; Altman e Bayer, 1990). O epêndima reveste a luz dos
ventrículos (e também o canal central da medula) e é composto por células colunares
compactadas, que apresentam cílios direcionados para a luz ventricular (Spassky et al.,
2005; Boulder Comittee, 1970). No telencéfalo, tardiamente, mas ainda no período
embrionário, uma segunda camada germinativa emerge, a zona subventricular (SVZ),
que se desenvolve como camada sucessora da VZ no papel de sitio neurogênico
(Alvarez-Buylla et al., 2002.)
Algumas regiões do SNC apresentam proliferação celular persistente no período
pós-natal como, a VZ (Tramontin et al., 2003), a SVZ (Allen, 1912), o hipocampo
(Altman e Das, 1965) e a camada granular externa do cerebelo (External Granular
Layer - EGL - Miale e Sidman, 1961), dentre outras (Gould et al., 1999; Horner et al.,
2000). Entretanto, no adulto, apenas a SVZ telencefálica e a camada subgranular do
giro denteado persistem como zonas neurogênicas ativas (Emsley et al., 2005).
1.1. Zona Subventricular pós-natal
No período embrionário a SVZ está localizada imediatamente suprajacente a VZ
e se estende ao redor da mesma, desde a parede lateral posterior do ventrículo lateral
até a sua porção mais rostral (Altman e Bayer, 1990; Privat, 1972). Seu aparecimento é
concomitante à neurogênese cortical (Altman, 1969). Suas células são arredondadas ou
ovais, apresentando-se em vários níveis através da espessura da camada, e não
4
sofrem migração nuclear intercinética, como as células ventriculares (Boulder
Commitee, 1970).
No período pós-natal, é também chamada de camada subependimária, por estar
localizada imediatamente externa ao epêndima. Concomitante à regressão da VZ, a
camada subventricular muda suas características, aumentando seu potencial
proliferativo e tornando-se mais densa (Takahashi et al., 1995b). Na sua porção cortical
é revestida externamente pela substância branca (Alvarez-Buylla e Ihrie, 2007).
A composição e a organização tridimensional da SVZ adulta de mamíferos foi
descrita através de critérios ultra-estruturais e imunocitoquímicos (Doetsch et al., 1997).
Três tipos celulares principais foram identificados: (1) neuroblastos ou células tipo A; (2)
astrócitos ou células tipo B, subdivididas em B1 e B2; e (3) células indiferenciadas ou
tipo C, que podem corresponder a precursores indiferenciados, entendidos atualmente
como células precursoras amplificadoras (Doetsch et al., 2002). Formando a parede
ventricular e separando a SVZ do liquido céfalo-raquidiano encontram-se células
ependimárias.
Células tipo A com morfologia alongada e um prolongamento líder, acompanhado
de um cone de crescimento, são encontradas em agregados formando cadeias
tangencialmente orientadas, paralelas à parede do ventrículo (Lois et al., 1996;
Wichterle et al., 1997). Estas expressam marcadores neuronais precoces como classe
III beta-tubulina (Menezes et al., 1995) e PSA-NCAM, (Hu et al., 2000) e são
considerados verdadeiros neuroblastos. Estes neuroblastos formam cadeias
migratórias, estendendo-se da SVZ até o bulbo olfatório (Fig. 1), sem dispersão,
embainhadas por estruturas semelhantes a túneis, formadas por astrócitos (Peretto et
5
al., 1997; Doetsch et al., 1997). As células tipo C, com alto potencial proliferativo, são
marcadas positivamente para nestina e agrupadas em clusters próximos às cadeias de
células tipo A (Doetsch et al., 1997), são considerados como progenitores
intermediários amplificadores, com uma capacidade multipotente restrita (Doetsch et al.,
2001). Quanto aos astrócitos, as células tipo B, ainda não existe definição se estes
correspondem a dois tipos diferentes ou dois estágios de um mesmo tipo astrocitário
(Doetsch, et al., 1997, 1999; Alves et al., 2002; Menezes et al., 2002). São
considerados como as células-tronco neurais presentes na SVZ pós-natal e do adulto
(Doetsch et al., 1999; Garcia et al., 1998).
Figura 1. Neurogênese na SVZ adulta
(A) Secção coronal de um cérebro de rato adulto. O azul claro mostra o ventrículo lateral (LV, lateral
ventricle, do inglês), espaço preenchido por fluido cérebro-espinhal.
(B) Arquitetura celular da SVZ. Célula B (azul escuras) são os astrócitos que podem cumprir uma dupla
função como células-tronco da SVZ e também estrutural compondo a formação do nicho celular
neurogênico. Algumas das células B tocam o lúmen ventricular e tem um cílio único. As células tipo C
(verdes) são de divisão rápida, células de amplificação transitória derivadas das células B. Células tipo C
dão origem a células A (vermelhas), neuroblastos que migram para o bulbo olfatório onde se tornam
interneurônios locais. Vasos sanguíneos (BV, do inglês blood vessel; rosa) são mostrados com
macrófagos perivasculares (pontilhado), lamina basal (BL, do inglês basal lamina; amarela) que se
estende desde os vasos sanguíneos e se interdigita extensivamente pelas células da SVZ. As células
ependimárias ciliadas (cinzas) revestem as paredes do ventrículo
(C) Linhagem de células da SVZ. Retirado de Alvarez-Buylla e Lim (2004).
6
Durante as primeiras semanas pós-natais ocorre a migração massiva de
neurônios e neuroblastos saídos da SVZ que migram por dentro da extensão anterior
da própria SVZ (Fig. 2; também chamada de fluxo migratório rostral; RMS, do inglês
rostral migratory stream) em direção ao bulbo olfatório, para gerar os interneurônios
granulares e periglomerulares (Altman, 1969; Kishi et al., 1990; Luskin, 1993; Lois e
Alvarez-Buylla, 1994).
Figura. 2. Esquema sagital do encéfalo adulto, com o bulbo olfatório (OB) à esquerda e o cerebelo
à direita. A SVZ se entende lateralmente ao ventrículo lateral (LV). Novos neurônios são constantemente
produzidos na SVZ. Esses novos neurônios tornam-se alinhados em longas cadeias formando uma
complexa rede interconectada na SVZ. Muitas dessas cadeias na SVZ anterior conectam-se a RMS que
os leva ao OB. No OB, essas células se dispersam radialmente como células individuais e completam
sua diferenciação como interneurônios granulares e periglomerulares. Retirado de Alvarez-Buylla (2002)
A SVZ é um importante sítio germinativo que mantém o potencial proliferativo por
toda a vida (Tropepe et al.,1997). Sendo assim, há grande expectativa de que seu
potencial neurogênico tenha aplicações terapêuticas. A substituição celular é uma
demanda para a recuperação de várias doenças neurodegenerativas. Até o momento,
7
não existem terapias neuroprotetoras eficazes em prevenir a perda celular; além disso,
grande parte desta perda celular acontece antes do diagnóstico patológico.
Novos neurônios e/ou oligodendrócitos podem ser produzidos a partir de várias
células-tronco e precursores neurais, embrionários ou adultos (Zhao et al., 2008, Lathia
et al., 2007, Menn et al., 2006), porém a eficácia relativa destas matrizes para fins
terapêuticos não está ainda bem estabelecida. Além disso, o transplante celular
objetivado por muitas pesquisas pode ter inúmeras complicações naturais de qualquer
transplante alôgenico, de ordem imunológica, logística ou econômica. Uma alternativa,
e, possivelmente, uma terapêutica complementar seria manipular o destino e o
comportamento in vivo de células-tronco intrínsecas ao sistema nervoso central (SNC)
pós-natal e adulto (Sohur et al., 2006).
2. Compartimentalização nas camadas germinativas .
A importância da compartimentalização de tipos celulares é reconhecida em
estudos de desenvolvimento de invertebrados desde antes da era da biologia
molecular. Foi postulado que barreiras de compartimentalização possuem duas funções
durante o desenvolvimento: (i) não permitir a mistura de células que contribuem para
diferentes destinos durante a embriogênese e, (ii) prover informação posicional para
populações celulares vizinhas. Acredita-se assim que estas barreiras sejam essenciais
para a coordenação do crescimento e a padronização de um embrião que cresce
rapidamente em tamanho e complexidade (Kiecker et al., 2005).
8
Historicamente, diferentes mecanismos foram propostos para estabelecer a
restrição de linhagens celulares, tanto entre compartimentos como entre camadas
germinativas. Em 1960, Holtfreter Steinberg e colegas propuseram que diferentes
propriedades adesivas da superfície celular seriam responsáveis por esse fenômeno.
No encéfalo, as barreiras inter-romboméricas expressam marcadores específicos
e são caracterizadas por um maior espaço intercelular, pelo acúmulo de células de glia
radial, por componentes de matriz extracelular e pela formação precoce da zona
marginal (Puelles e Arouca, 2005). Todas essas características poderiam funcionar
como mecanismos de barreira celular. Contudo, nenhuma mistura entre tipos celulares
dos rombômeros é observada após a ablação dessas barreiras (Nittenberg et al., 1997;
Guthrie e Lumsden, 1991). Essas observações indicam que a formação das barreiras
celulares não é a causa primária da restrição celular entre os rombômeros (Kiecker et
al., 2005). Ainda assim, devido a sua prevalência, a formação de barreiras e a atividade
dos centros de sinalização local devem desempenhar um papel chave no
desenvolvimento do sistema nervoso de vertebrados.
Em se tratando da SVZ pós-natal, sua divisão foi proposta em dois
compartimentos distintos (Luskin, 1993), que não apresentam uma barreira morfológica
clara, mas que refletem dois potenciais genéticos básicos ao longo de sua extensão. De
acordo com Luskin, a porção anterior da SVZ adjacente ao terço anterior do ventrículo
lateral, (SVZa; Luskin, 1993), mais espessa, seria principalmente responsável pela
geração de neurônios destinados ao bulbo olfatório. Outra porção, menos espessa e
que ocupa o terço posterior do ventrículo lateral, chamada SVZ posterior, foi apontada
como sendo responsável pela produção exclusiva de células gliais para o córtex
cerebral (Luskin, 1993). Contudo, esta proposta inicial de compartimentos não se
9
confirmou, tendo-se demonstrado, anos mais tarde que, mesmo em idades pós-natais
jovens, a porção posterior é capaz de gerar neuroblastos (Suzuki et al., 2003). Esta
divisão funcional também não foi demonstrada na SVZ do adulto (Doetsch et al., 1997).
Apesar desta hipótese ter sido descartada, novas evidências demonstram claramente a
regionalização do trajeto SVZ/RMS; a presença de precursores restritos, que geram
apenas subtipos de interneurônios, é relatável ao longo de todo o trajeto da SVZ/RMS,
do córtex ao bulbo olfatório, tanto no eixo ântero-posterior (Hack et al., 2005), como no
médio-lateral, e envolvem domínios intra- e inter-telencefálicos (Kelsch et al., 2007,
Merkle et al. 2007; Marchis et al., 2007; Seri et al., 2006).
Pode-se ainda considerar a formação de compartimentos celulares intra-regionais,
como a formação de microdomínios (fisiológicos) e de nichos (morfológicos) para a
manutenção de células especificas. Em relação à SVZ/RMS, existem evidências de que
a distribuição celular não é homogênea como se poderia supor da observação por
técnicas histológicas comuns. Por exemplo, células em fase-S estão preferencialmente
localizadas nas bordas interna e externa da SVZ/RMS durante os 10 primeiros dias pós
natais (Menezes et al., 1998). Sabe-se também que há a formação de pequenos grupos
e de grandes cadeias de células acopladas através de junções comunicantes na borda
externa da SVZa (Menezes et al., 2000). Há ainda a concentração de corpos de células
de glia radial na interface SVZ/WM, formando possivelmente uma borda de
confinamento para a SVZ/RMS (Alves et al., 2002). A formação de ilhas de proliferação
após a ativação da sinalização de receptores tirosina kinase Eph/efrinas (Conover et al.,
2000), e um conjunto de outras evidências apontam para uma distribuição heterogênea
de tipos celulares e moleculares no interior da SVZ/RMS (Fasolo et al., 2002; Merkle
2004; Marshall e Goldman, 2002). Esses achados sugerem fortemente que, apesar da
10
aparente homogeneidade morfológica, a SVZ pode ser dividida em compartimentos
celulares discretos (Peretto et al., 2005).
Estudos de imuno-histoquímica realizados na SVZ sugerem que a população glial
pode ser heterogênea, por exemplo, quando parte dos astrócitos da SVZ continuam a
expressar vimentina e nestina, apesar da pequena diferença observada em níveis ultra-
estruturais (Doetsch et al.,1997). Combinando estudos morfológicos e funcionais
estima-se que 12% das células da SVZ são GFAP positivas mas somente 1% das
células geram neurosferas (Doetsch et al., 1999) indicando que nem todos os astrócitos
são células-tronco.
Esta sugestão de micro-domínios e de distribuição heterogênea de células na
SVZ/RMS pós-natal e adulta fica ainda mais relevante quando se considera que esta
camada é um rico sitio de células-tronco neurais.
As células-tronco são responsáveis pelo crescimento, homeostase e o reparo
dos tecidos. A manutenção e a sobrevivência destas células são reguladas por
sinalizações do seu micro-ambiente, referido como “nichos de células-tronco”. A
hipótese dos nichos foi desenvolvida por Schofield (1978) que propôs que as células-
tronco residem em compartimentos fixos ou nichos que são responsáveis pela
manutenção das propriedades definitivas das células-tronco. Postula-se então que o
nicho representa um compartimento anatômico definido que provêm sinais para as
células-tronco. Sinais estes que regulam a função destas células tanto em
invertebrados quanto em vertebrados, por exemplo: controlam o destino das células-
filhas, protegem da exaustão e da morte; provêm suporte estrutural, trófico, informação
topográfica e pistas fisiológicas apropriadas. (Jones e Wagers et al., 2008).
11
Estudos em modelos de Drosophila melanogaster e Caenorhabditis elegans
revelaram algumas características dos nichos de células-tronco que são importantes
para controlar seu comportamento. Primeiramente, sinais emanados deste nicho
regulam a auto-renovação, sobrevivência e manutenção das células-tronco (Jones e
Wagers et al., 2008, Kimbel et al., 1981; Henderson et al., 1994; Xie et al., 2000). Em
segundo lugar, a relação espacial particular entre as células-tronco e as células de
suporte pode provocar a polarização das primeiras para promover divisões assimétricas
(Deng et al., 1997; Yamashita et al., 2003). Em terceiro lugar, a adesão entre as
células-tronco e as células de suporte e/ou as moléculas de matriz extracelular ancoram
as células ao nicho promovendo a auto-renovação e os sinais para sobrevivência
celular (Song et al., 2002).
Sintetizando muitos estudos, pode se propor uma hipótese sobre os
componentes necessários para compor nichos de célula-tronco: 1. a célula-tronco
propriamente dita; 2. as células de suporte (O exemplo clássico sendo as celulas
estromais da medula óssea) que interagem diretamente com as células-tronco, através
de junções comunicantes, fatores solúveis, proteínas de matriz extracelular que podem
promover a estrutura, organização e sinais mecânicos para o nicho; 3. vasos
sanguíneos, que provêem o nicho germinativo de lâmina basal cuja composição parece
ser necessária para sua manutenção (Nikolova et al., 2007). Estes também trazem
sinais sistêmicos e promovem a condução e o recrutamento de células inflamatórias e
outras células ao nicho germinativo; 4. inervação e sinais neurais que podem comunicar
informações fisiológicas distantes ao micro-ambiente do nicho (Jones e Wagers et al.,
2008). Apesar de nem todos os nichos necessariamente apresentarem todos esses
componentes, fica claro que o nicho representa uma entidade complexa e dinâmica
12
onde a integração de múltiplos sinais são necessários para a manutenção da função e
do número das células tronco. Na SVZ, os componentes que conferem a esta região
características de nicho germinativo ainda não são completamente conhecidos. A CGR
tem o duplo potencial de ser um importante componente do nicho germinativo da SVZ e
também contribuir ela mesma como célula-tronco. A interação através de junções
comunicantes pode ser relevante na regulação das funções da CGR no nicho
germinativo da SVZ, como encontrado para outros exemplos de nichos de células-
tronco (para revisão, Jones e Wagers et al., 2008; Trosko, 2007; Worsdorfer et al.,
2008; Todorova et al., 2008)
3. Célula de Glia Radial .
As células de glia radial foram primeiramente visualizadas através do método de
Golgi e existem sugestões de que Magini (1894) tenha sido seu primeiro observador.
Logo após, Santiago Ramon y Cajal confirmou os achados em embriões de galinha (V.
Bentivoglio e Mazzarello, 1999) . Na época, porém, ainda não existia a nomenclatura
clássica de células de glia radial, sendo então chamadas de fibras radiais ou
ependimárias. (Bentivoglio e Mazzarello, 1999).
A função e o refinamento da descrição, além da denominação “célula de glia
radial” datam do inicio da década de 70, com os trabalhos de Pasko Rakic (1971, 1972).
Neste trabalho, em fetos de primatas, a CGR foi descrita como sendo uma célula
bipolar simples, núcleo ovóide localizado dentro das camadas germinativas, um curto e
fino prolongamento aderido à parede ventricular e um longo e fino prolongamento no
13
pólo oposto, com sua extremidade arborizando na camada molecular e terminando na
superfície pial onde forma a membrana limitante glial externa (Fig. 3; Rakic, 1972;
Peters e Feldman 1973; Misson et al., 1991; Kettenmann e Ransom, Neuroglia, 1995)
além do acúmulo de glicogênio no citoplasma (Choi, 1981).
Figura 3. Citoarquitetura das células de Glia Radial. (A) Reconstrução tridimensional esquemática da
porção medial do parênquima cerebral ao nível da fissura calcarina em um feto de macaco (80 dias). A
reconstrução ilustra como cada ponto na VZ é conectado pelas fibras de RG que se expandem por todo o
parênquima cerebral. (B) Reconstrução tridimensional de neurônios migratórios baseado em
eletromicrografia de lobo occipital de fetos de macacos. Retirado de Rakic (1972).
A glia radial possui características astrocitárias pois expressa moléculas como a
proteína acida fibrilar glial, a GFAP (do inglês, glial fibrillary acidic protein), a proteína
cerebral ligante de lipídeos, BLBP (do inglês, brain lipid binding protein) e o
transportador específico de glutamato, GLAST (do inglês glutamate astrocyte
transporter) todas específicas de astrócitos maduros (Hartfuss et al., 2001). Por outro
lado, a célula de glia radial também compartilha características moleculares com células
progenitoras, como o marcador de precursores neurais, nestina (Frederiksen e McKay,
1988).
14
As células de glia radial são consideradas como uma população celular transitória
e de ocorrência precoce no desenvolvimento do SNC, antes mesmo da neurogênese
cortical (Schmechel e Rakic, 1979; Campbell e Gotz, 2002; Huttner e Gotz, 2005;
Gressens et al., 1992) e são ubiquitárias no SNC (Huttner e Gotz, 2005; Anthony et al.,
2005; Edwards et al., 1990). Aumentam significativamente em número durante a
neurogênese e migração neuronal (Levitt e Rakic, 1980), e em geral desaparecem
rapidamente após o nascimento (Schmechel e Rakic, 1979; Voigt, 1989; Pixley e Vellis,
1984).
No córtex cerebral, logo após o fim do período neurogênico, as CGR abandonam
a camada germinativa cortical e migram radialmente concomitantes com sua
transformação em astrócitos que povoarão o córtex cerebral (Noctor e Kriegstein, 2004;
Rakic, 2005; Noctor et al., 2005). Por outro lado, algumas CGR subcorticais
aparentemente dão origem a interneurônios do bulbo olfatório durante a primeira
semana pós natal (Merkle et al., 2005; Tramotin et al., 2004).
Inicialmente a célula de glia radial foi estudada somente como célula suporte para
a migração, onde os neurônios recém-gerados se atrelam as CGR e migram
radialmente para a placa cortical (Rakic, 1995), e um precursor de células astrocitárias.
Mas, evidências demonstram que as células de glia radial também geram neurônios
durante o desenvolvimento embrionário (Kriegstein e Gotz, 2003; Kriegstein e Noctor,
2004; Malatesta et al., 2000; Miyata et al., 2001). Hoje já se sabe que a célula de glia
radial (CGR), apesar de sua aparente natureza glial, é um progenitor multipotente e da
origem em sua maioria a neurônios (Anthony et al., 2004; Campbell e Gotz 2002;
Weissman et al., 2003).
15
Em estudo anterior mostramos que a CGR cortical tem um curso muito mais
protraído em sua transformação astrocitária do que se pensava, mantendo-se na SVZ
(Alves et al. 2002). Isso leva a possibilidade de que a CGR cortical pode gerar não
somente astrócitos para o córtex cerebral, mas pode ser também fonte de
astrócitos/progenitores que povoam a SVZ/RMS pós natal.
4. Neurogênese Pós-Natal .
Evidências de neurogênese pós-natal foram obtidas ainda nos anos 60 (Altman,
1969), e na década de 80 (Kaplan, 1980). Esses resultados provocaram uma reação
negativa no meio científico gerando outras publicações que não confirmaram o achado
(para revisão, Kaplan, 2001). Ironicamente no mesmo período, estudos seminais sobre
neurogênese em pássaros com canto sazonal foram publicados (Alvarez-Buylla e
Nottebohm, 1988), sem no entanto causar um impacto imediato no entendimento e
avaliação da relevância da neurogênese para o cérebro maduro em outros vertebrados
(Kaplan, 2001). Hoje sabe-se que a neurogênese persiste na fase adulta (Zhao et al.,
2008; Ihrie et al., 2008; Sutter et al., 2007; Emsley et al., 2005) e que a SVZ mantém-se
ativa gerando interneurônios para o bulbo olfatório, pela rota migratória rostral (Altman,
1969; Lois e Alvarez-Buylla, 1993). No hipocampo viu-se que a neurogênese persiste
na fase adulta na camada subgranular do giro denteado estando correlacionada com a
memória (Sahay e Hen, 2007; Shors et al., 2002; Magavi et al., 2005).
Apesar do grande interesse pelo assunto há ainda muito para entender nesse
fenômeno. A identificação de marcadores que diferenciam os diferentes tipos celulares
16
e progenitores ainda é um importante problema (Svendsen et al., 2001). Muitas das
sinalizações moleculares que permitem a neurogênese e a regulação da proliferação na
SVZ ainda permanecem desconhecidas (Zhao et al., 2008).
Vários estudos apontaram evidências de neurogênese também em outras
regiões como no neocortex (Gould et al, 2001), corpo estriado (Luzzati et al., 2006),
hipotálamo (Kokoeva et al., 2005) e substancia negra (Zhao et al., 2003), no entanto,
estes ainda são controversos (Gould, 2007, Emsley et al., 2005). Algumas evidências
indicam que células precursoras endógenas podem de fato dar origem a neurônios
maduros no córtex cerebral de camundongos adultos em resposta à morte celular
induzida de neurônios de projeção (Magavi et al., 2000). Outros estudos demonstraram
que apesar da maciça proliferação que pode ser observada no córtex adulto em
resposta a lesões isquêmicas esta não é capaz de gerar novos neurônios (para revisão
ver Wiltrout et al., 2007). Desta forma apesar da controvérsia que cerca o assunto, as
únicas regiões universalmente aceitas como receptoras de novos neurônios funcionais
na fase adulta são o bulbo olfatório e o hipocampo (Emsley et al., 2005).
Outra questão que permanece sem resposta é a real função exercida pela
neurogênese pós-natal (Zhao et al., 2008; Gould, 2007; Rakic, 2002). Muitos neurônios
jovens migram para o bulbo olfatório, mas somente uma parte sobrevive para completar
sua diferenciação (Petreanu e Alvarez-Buylla, 2002). Pouco se sabe sobre a função
dos novos neurônios no bulbo olfatório em animais pós- natais. Foi sugerido que a
incorporação desses neurônios ao bulbo olfatório pode permitir mudanças na circuitaria
(Alvarez-Buylla et al., 2002; Shors et al., 2002; Sahay e Hen, 2007) estimuladas por
novos odores no meio ambiente (Magavi et al., 2005).
17
5. Junções Comunicantes .
As junções comunicantes, também conhecidas como gap junctions são
classicamente descritas como reuniões de poros ou canais intercelulares em regiões
especializadas de estreita aproximação das membranas plasmáticas de duas células
adjacentes, formando as chamadas placas juncionais. Vistos à microscopia eletrônica
de criofratura, cada canal se apresenta como uma protuberância, em forma de botão, e
guarda um distanciamento uniforme com os demais, formando arranjos hexaméricos
semi-cristalinos. Cada canal intercelular completo, em verdade, resulta do alinhamento
e estabilização, através de interações homofílicas, de dois hemicanais, de estrutura
protéica (Fig. 3 e 4). Codificando estas proteínas encontramos duas famílias gênicas
em vertebrados, não homólogas em níveis moleculares, mas guardando ambas forte
homologia estrutural. Representam estas famílias as conexinas, e, mais recentemente
reconhecidas, as panexinas (Panchin, 2005). As conexinas (Cx) compõem uma família
multigênica que soma pelo menos 20 membros nos mamíferos e são nomeadas de
acordo com a massa molecular deduzida a partir de suas seqüências primárias pós-
clonagem (Willecke et al., 2002). Apresentam-se funcionais como canais intercelulares
completos, os canais juncionais propriamente ditos, e como canais transmembranares
simples, os hemicanais ou conexons (Stout et al., 2004). As panexinas, classificadas
bem mais recentemente, são representadas por 3 isoformas, duas delas abundantes no
sistema nervoso, as panexinas 1 e 2 (Px1, Px2; Bruzzone e Dermietzel, 2006), As
panexinas neurais têm sido relacionadas à formação de canais transmembranares
simples (hemicanais) e de forma polêmica, a Px1 tem sido sugerida como capaz de
18
estabelecer corredores intercelulares completos pela aposição de dois hemicanais, à
semelhança dos canais juncionais completos de conexinas (Dahl e Locovei, 2006;
Barbe et al., 2006; Huang et al., 2007).
Os canais juncionais completos de conexinas permitem a passagem, geralmente
de forma bidirecional (Lawrence et al., 1978, Wei et al., 2004), de pequenas moléculas
– de até 1,2 kDa (Evans e Martin, 2002) - como íons inorgânicos (K
+
e Ca
2+
) água e
metabólitos (glicose), incluindo segundos mensageiros intercelulares (AMPc e GMPc) e
pequenas proteínas (como calmodulina; Curran et al., 2007) e possivelmente serotonina
(Esser et al., 2006). Estudos mostraram a transferência de pequenos RNA de
interferência (RNAsi e RNAsh; Valiunas et al., 2005). Células que estabelecem este
intercâmbio são ditas, portanto, acopladas elétrica- e/ou bioquimicamente.
Figura 4. Representação de arranjos estruturais das conexinas para a formação de canais intercelulares
juncionais . A – proteína estrutural formadora de canais intercelulares (conexina); B - estruturas
hexaméricas, chamadas de conexons ou hemicanais, formadas por 6 unidades de conexinas em torno de
um poro hidrofílico; C -interação de 2 conexons formando um canal intercelular completo; D – ilustra uma
região de placa juncional, ou junção comunicante (gap junction), que constitui-se numa coleção de canais
intercelulares concentrados em uma região da membrana (retiorado de Goodenough e Paul, 2003).
Intercellular
channel
C
B
A
D
Canal Axial
Membrana 2
Membrana 1
Canal Intracelular
Canal
Intercelular
Junção Comunicante
Conexina
19
Figura 5. Ilustração da distribuição molecular de uma única conexina na membrana plasmática. Os
cilindros representam os 4 domínios transmembranares (M1-M4). A porção extracelular é composta por 2
alças (E1 e E2) cada qual com 3 resíduos de cisteína. A porção citoplasmática é formada por uma cauda
amino- terminal (N), uma alça central ou citoplasmática (I), e um segmento carboxiterminal (C). (retirado
de Willecke e Söhl, 2004).
Entre as funções gerais atribuíveis às junções comunicantes destacam-se:
i) Crescimento e diferenciação celular. Durante a embriogênese, o acoplamento
juncional tem sido sugerido como um importante modulador do ciclo celular, porém
efeitos duais têm sido descritos em modelos diversos como a regiões proliferativas do
telencéfalo em desenvolvimento e tumores; nas primeiras, o acoplamento juncional
correlaciona-se de um modo geral, positivamente com a manutenção da atividade
proliferativa, diminuindo à medida que as células deixam a fase M e saem do ciclo
celular (Bittman et al., 1997); por outro lado, em tumores, as conexinas e seus arranjos
funcionais têm sido interpretados como fatores de supressão tumoral, enquanto pró-
metastásicos (Trosko, 2005; Mesnil et al., 2005);
ii) Cooperação metabólica. Os canais juncionais têm sido reconhecidos como vias
de fluxo intercitoplasmático de metabólitos e substâncias reguladoras da fisiologia
celular. Intercâmbio nestas bases tem sido sugerido como recurso de regulação dos
citoplasmático
extracelular
I
transmembranar
20
níveis de proliferação e de sobrevivência das células (De Mello, 1983; Lowenstein,
1985; Bennett et al., 1991; Budunova e Williams, 1994; Medina e Tabernero, 2006);
iii) Morfogênese. A comunicação juncional vem sendo classicamente atrelada ao
desenvolvimento de assimetrias, padrões e polaridades em embriões de vertebrados, e
acredita-se que substâncias reguladoras, na qualidade de morfógenos de distribuição
transjuncional, em redes de células acopladas, estejam nos bastidores da
organogênese embrionária (Guthrie e Gilula, 1989; Levin, 2007);
iv) Cascatas de sinalização. As conexinas têm sido descritas como alvos de
sinalizadores celulares, em sistemas de cascata de sinalização, envolvendo segundos
mensageiros como AMPc ou Ca2+ e proteínas quinases/fosforilases (Sáez et al., 1989;
Levin, 2007).
5.1 Junções Comunicantes no SNC
As junções comunicantes são observadas estrutural e/ou funcionalmente em todo
o encéfalo, e em todas as classes celulares (Spray e Dermietzel, 1996). Estabelecidas
entre neurônios, formam vias intercelulares de baixa resistência elétrica, denominadas
sinapses elétricas; entre representantes gliais, acoplam astrócitos fortemente, enquanto
fracamente os outros subtipos gliais entre si, e alguns destes com a astroglia (ex.
acoplamento astrócitos-oligodendrócitos); as junções comunicantes gliais, portanto, têm
sido propostas como mediadoras na formação de redes sinciciais, pangliais (Venance
et al., 1997; Fróes e Campos de Carvalho, 1998; Giaume e Venance, 1998).
Finalmente, entre estas e neurônios (Fróes et al., 1999; Nedergaard, 1994; Nadarajah
et al. 2002, Alvarez-Maubecin et al., 2000, Schipke et al., 2004; Thalakoti et al., 2007).
21
Ambos os tipos de junções parecem sofrer modulação durante o desenvolvimento, o
que pode ser demonstrado por ensaios in vitro e in situ (Venance et al., 1997; Fróes et
al., 1999; Fróes e Campos de Carvalho, 1998; Yuste et al., 1995; Kandler et al., 1995;
Peinado et al., 1993).
A presença, a atividade de canais intercelulares juncionais ou mesmo sua
associação como parceiros moleculares em outros sistemas da fisiologia celular, como
os complexos de adesão, têm sido correlacionadas à histogênese neural, regulando os
níveis de proliferação celular, a migração e a formação de domínios de co-ativação
previa- e durante o amadurecimento de circuitos de neurotransmissão (Bruzzone e
Dermietzel, 2006). Por outro lado, a expressão de conexinas no SNC parece
correlacionar-se com a expressão de genes associados ao desenvolvimento e
especificação regional, enquanto alvos de modulação por fatores de crescimento,
neuromoduladores e neurotransmissores. Sugere-se, portanto, que a funcionalidade
destas vias diretas de intercâmbio célula-célula e o crescimento/amadurecimento dos
circuitos neurais sejam eventos até certo ponto interdependentes, pois coordenados
entre si. A expressão/funcionalidade de proteínas juncionais tem sido também
associada a um grande número de patologias neurais, algumas destas relatáveis em
períodos precoces do desenvolvimento encefálico, a exemplo de processos isquêmicos
perinatais, sugerindo-se um papel como agentes de expansão dos danos neurais
(Nakase et al., 2003; Farahani et al., 2005; de Pina-Benabou et al., 2005; Bates et al.,
2007; Wiencken-Barger et al., 2007).
O envolvimento de proteínas juncionais, especialmente de conexinas, em
processos celulares e histogenéticos do desenvolvimento do SNC é atualmente
classificável em três níveis relativamente à formação dos poros: 1. como poros
22
transcelulares, 2. como poros transmembranares e 3. independentemente de poros
funcionais. Na forma de poros transcelulares, as proteínas juncionais são reconhecidas
no sistema nervoso em sua função clássica, promovendo o intercâmbio transcelular de
íons envolvidos na excitabilidade celular, metabólitos e mensageiros secundários.
Durante o desenvolvimento do sistema nervoso, a primeira forma, dependente de poros
intercelulares que instalam a condição conhecida por acoplamento juncional, tem sido
descrita no contexto de arranjos multicelulares de neuroblastos jovens, em atividade
proliferativa na zona ventricular (Lo Turco e Kriegstein 1991; Bittman et al. 1997), que
envolveriam também células de glia radial formando clusters de
progenitores/precursores neurais.
Pós-natalmente em roedor, temos evidências de formação de clusters de
neurônios jovens acoplados em período crítico da formação da circuitaria básica do
córtex telencefálico, apresentando números máximos de células recrutadas em torno de
P7 e diminuindo progressivamente para níveis baixos ao final da segunda semana pós-
natal (Peinado et al. 1993; Kandler e Katz 1995). Nestes clusters corticais, neurônios
piramidais são claramente reconhecíveis, no entanto, outras classes neuronais e
elementos astrogliais têm sido também sugeridos (Bitmann et al. 2002; Furtado 2008
manuscrito Projeto de tese de Mestrado). Na zona subventricular pós natal, o
acoplamento de neuroblastos entre si e da glia radial tem sido sugerido pela expressão
de conexinas (Miragall et al., 1997; Nadarajah et al. 1997; Cina et al., 2007) e por
ensaios funcionais de acoplamento por corante em populações celulares in situ
(Menezes et al. 2000), aguardando-se, no entanto, demonstrações mais diretas destes
possíveis pareamentos.
Poros transmembranares de conexinas têm sido descritos mais recentemente na
23
literatura, representando a atividade de conexons não alinhados. Sua atividade tem sido
relatada no sistema nervoso central em desenvolvimento, em regiões proliferativas,
como a zona ventricular (Weissman et al., 2004) e o epitélio pigmentado da retina
(Pearson et al. 2005). Os autores propõem que estes poros constituam vias
transmembranares de secreção de ATP que regulariam a propagação de ondas de
cálcio localmente e, através destas, os níveis de proliferação celular.
Por fim, um terceiro modo de atuação das proteínas de junções comunicantes
parece prescindir da formação de poros juncionais, transcelulares e transmembranares
(Stout et al., 2004; Wei et al., 2004; Xu et al., 2006; Elias et al., 2007) e têm sido
descrito na formação e estabilização de módulos de adesão celular. Evidências
recentes na literatura sugerem em comum a interação molecular das conexinas com
proteínas de citoesqueleto (filamento intermediário, microtúbulos) e de complexos
multiproteicos de adesão (como complexos de N-caderinas, por exemplo) promovendo
o contato célula-célula e consequentemente favorecendo a migração celular (Xu et al.,
2006, Elias et al., 2007).
Em conjunto, no contexto do telencéfalo, estes achados sugerem que as proteínas
juncionais carregam diferentes mensagens na coordenação, em níveis celulares e
multicelulares, da histogênese neural. Por um lado, sua atividade como hemicanais
implicaria na regulação da atividade coordenada de grupos de células jovens em, zonas
proliferativas, apresentando-se como fortes candidatos à modulação do ciclo celular
como intermediários na propagação de ondas e flutuações espontâneas de cálcio. Por
outro lado, na forma de canais intercelulares completos, comporiam domínios de co-
ativação por cálcio no córtex, envolvendo células mais maduras, já fora do ciclo
proliferativo, como os jovens neurônios piramidais, putativamente antecipando formas
24
de organização colunar propostas para o córtex. Finalmente, através de sua
participação em complexos de adesão/interação com proteínas do citoesqueleto
independentemente ou não da formação de poros transcelulares, as proteínas
juncionais atuariam na modulação da migração celular estabelecida entre estes dois
domínios neurais, as zonas proliferativas e as lâminas corticais.
6. Junções Comunicantes e Camadas Germinativas .
As junções comunicantes aparentemente exercem importante função na
proliferação celular, na migração e na diferenciação neuronal durante o
desenvolvimento cerebrocortical.
Diferentes conexinas e,mais recentemente, as panexinas, têm sido descritas no
contexto do desenvolvimento telencefálico (Bittman et al., 1997; Bittman et al.,2002;
Barbe et al., 2006; Vogt et al., 2005; Cina et al., 2007), no entanto, em sua maioria, os
estudos exploram superficialmente aspectos de regionalização e laminação da
expressão de proteínas juncionais (geralmente concentrados nas lâminas da formação
cortical) e falham numa identificação mais conspícua dos tipos celulares que
apresentariam estas moléculas. Portanto, deparamo-nos no momento, com dados
imprecisos 1. quanto ao repertório de conexinas funcionais, 2. quanto à definição dos
tipos celulares que expressam as isoformas protéicas através das camadas
telencefálicas, incluindo as regiões proliferativas, e 3. quanto ao perfil temporal de
expressão destas proteínas. Os estudos mais completos concentram-se no telencéfalo
de ratos embrionários, tendo-se descrito na zona ventricular inicialmente a expressão
25
das conexinas 26 e 43 (Nadarajah et al., 1997) e posteriormente Cx36, 37, e 45 (Cina
2007) na VZ cortical. Os perfis temporais gerados durante a exuberância da
neurogênese pré-natal no roedor apontam para o aumento dos níveis de expressão das
conexinas mais abundantes da VZ (Cx26, Cx43, Cx45) com o avanço do
desenvolvimento embrionário e o pico da neurogênese, sugerindo a participação de um
repertório específico destas conexinas. Com o aumento da espessura da parede
cortical, acompanhado de involução da VZ, a presença destas conexinas diminui nas
proximidades do ventrículo, mas aumenta nas camadas superiores (Nadarajah, 1997).
Em níveis celulares, na VZ, contamos hoje com as seguintes descrições: a glia
radial, definida dentro de critérios morfológicos gerais e/ou de imunorreatividade para
nestina e RC2: 1. apresenta-se imunorreativa para as conexinas 43 e 26 (Nadarajah et
al., 1997; Bittman et al., 1999; Elias et al., 2007); 2. apresenta à ME placas juncionais
homo- e heterocelulares (estas últimas possivelmente estabelecidas entre estas e
neuroblastos) (Nadarajah et al., 1997); 3. Mostra-se acoplada por critérios de
acoplamento por corante com possíveis coortes de neuroblastos pré-migratórios, ainda
em ciclo proliferativo (LoTurco e Kriegstein, 1991, Bittman et al., 1997, Bittman e
LoTurco, 1999), sugerindo-se os grupos glia radial/neuroblastos acoplados da VZ como
os primórdios das unidades funcionais radiais de colonização cortical (Rakic, 2007;
LoTurco e Kriegstein, 1991); 4. por fim, em estudos recentes, apresenta-se como
centros de coordenação da proliferação celular na VZ, mediante a deflagração de
ondas espontâneas de cálcio, através de ATP secretado por hemicanais de proteínas
juncionais, que passa a agir paracrinamente sobre células da VZ vizinhas, incluindo
células da glia radial (Weissman et al., 2004).
26
Os mecanismos de sinalização que determinam se as células progenitoras neurais
permanecem em estado proliferativo ou iniciam a diferenciação celular ainda não estão
completamente esclarecidos, no entanto algumas evidências sugerem um envolvimento
direto das conexinas com esta transição. A Cx43, por exemplo, descrita como o subtipo
majoritário em glia, mas também detectável em neurônios, é expressa em altos níveis
em células progenitoras neurais de rato em desenvolvimento (Bittman et al., 1999), a
exemplo da glia radial. Seus níveis decrescem com a diferenciação destas células em
neurônios in vivo (Leung et al., 2002); de forma semelhante, os níveis desta conexina
também decrescem gradualmente com a indução da diferenciação de células neuronais
imortalizadas em cultura (Rozental et al., 1998).
As unidades neuroblastos/glia radial acopladas na VZ parecem incluir os
precursores em todas as fases do ciclo celular, exceto a fase M, e não conteriam
neurônios pós-mitóticos. O acoplamento seguiria ainda um padrão dinâmico através do
ciclo celular, acentuando-se na direção de G2 e decrescendo em G1; ao longo da
neurogênese embrionária exibiria um padrão temporal quanto à exuberância de
comunicação na fase S do ciclo celular destes precursores neurais: alto no início da
neurogênese e baixo na neurogênese tardia, período em que aumenta o número de
células que saem do ciclo celular. Parece, então, que precursores desacoplados têm
menor probabilidade de entrar na fase S. Estas sugestões experimentais são
fortalecidas pela diminuição no quantitativo de células entrando na fase S conseqüente
ao uso de desacoplantes (Bittman et al., 1997). Coerentemente, guardadas as reservas
de que trata-se de estudo que defende o papel das conexinas como formadoras de
hemicanais na glia radial da VZ, o bloqueio farmacológico destes canais por agentes
desacoplantes típicos foi fortemente correlacionado à inibição do ciclo celular e das
27
ondas de cálcio associadas (Weissman et al., 2004). Estas resultados indicam que
estas proteínas e os poros por estas formados, sejam intercelulares ou transcelulares,
estão envolvidos na regulação de formas neurônio-gliais de excitabilidade celular, como
as ondas de cálcio e na regulação do ciclo proliferativo celular no telencéfalo em
desenvolvimento.
Conforme comentado acima, segundo a literatura, neuroblastos proliferativos da
VZ encontram-se acopladas à célula de glia radial, e deixariam de acoplar durante a
migração, enquanto acolados aos prolongamentos gliais (LoTurco e Kriegstein, 1991;
Bittman et al., 1997). Uma vez desligados da glia radial, re-estabeleceriam redes de
acoplamento juncional, em arranjos colunares na formação cortical, num processo de
construção e amadurecimento dos circuitos corticais (Nadarajah et al., 1997; Bittman e
Lo Turco, 1997; Bittman et al., 2002). Portanto, estas observações sugeririam um papel
dual da comunicação juncional sobre o ciclo proliferativo e sobre a diferenciação
neuronal e estabelecimentos de circuitos corticais, enquanto sem função durante a
migração radial.
Por outro lado, é possível que em algum momento durante o processo migratório
radial, ainda que intermitentemente, o acoplamento celular possa estabelecer-se entre
o par neuroblasto/glia. A presença de placas juncionais entre prolongamentos da glia
radial e neuroblastos em migração radial a partir da VZ parece sugerir esta
possibilidade (Nadarajah et al., 1997). Por outro lado, no entanto, estas placas
juncionais poderiam exercer papéis outros independentes da propriedade destas
junções quanto à formação de poros intercelulares completos ou de hemicanais. De
fato, estudos mais recentes sugerem as junções comunicantes como fortes parceiras
em complexos de adesão celular envolvidos na interação neuroblasto/prolongamento
28
glial, no caminho para as lâminas corticais durante a corticogênese pré-natal (Elias et
al., 2007). Independentemente dos mecanismos moleculares envolvidos, estudos com
transgênicos nulos para Cx43, revelam alterações de laminação cortical (Fushiki et al.
2003; pós-natos nocaute), hipocampal e cerebelar (Wiencken-Barger et al., 2007)
compatíveis com distúrbios da migração celular. De fato, camundongos embrionários
com baixa expressão fenotípica para Cx43 apresentam uma acumulação de BrDU
anormal na zona intermediária, quando o estabelecimento normal dessas células seria
na placa cortical (Fushiki et al., 2003).
Os estudos concernentes à expressão de proteínas juncionais na zona
subventricular são ainda mais escassos, e menos sistemáticos que estes realizados no
contexto da neurogênese pré-natal, dificultando conclusões acerca da significância
funcional da presença destas proteínas nesta camada proliferativa. Dentre os esparsos
relatos, temos os estudos de Miragall e colaboradores (1992, 1997), que descreveram a
presença da Cx43 por ensaios de imuno-histoquímica pós-natalmente na SVZ, em toda
a sua extensão até o bulbo olfatório e concluíram por sua expressão em células de
aspecto quiescentes da SVZ pós-natal enquanto pela ausência de Cx26 e Cx32
(Miragall et al., 1997).
Acredita-se na possibilidade de envolvimento das conexinas em processos
normais de neurogênese e plasticidade do adulto (Peretto et al., 2005; revisado em
Rouach et al., 2002; Weissman et al., 2004). A falha na regulação da neurogênese
pode estar associada a algumas doenças: na epilepsia e doença de Huntington a
neurogênese estaria aumentada e nas desordens afetivas a neurogênese estaria
diminuída (Abrous et al., 2005). Por outro lado, a neurogênese perinatal e a
neurogênese no adulto representam atualmente fortes focos investigativos, dada as
29
expectativas de recuperação de lesões do sistema nervoso central por reposição
celular. Acreditamos ao elucidar o papel do acoplamento celular na regulação e controle
da neurogênese durante o desenvolvimento normal possamos contribuir para a
definição de novas estratégias clínicas aplicadas ao tratamento de patologias
neurológicas.
Em estudos anteriores, revelamos a presença de extenso acoplamento juncional
por corante na SVZ e RMS pós-natal, em período de exuberância das atividades
proliferativa e migratória celular nesta região (Menezes et al., 2000). Posteriormente,
mostramos a transformação astrocitária sofrida pela glia radial da SVZ/RMS é um
fenômeno muito mais complexo do que se imaginava, envolvendo a permanência
destas células em nichos proliferativos desta camada e sugerindo-as na composição do
túnel astroglial que mais tarde perfaria as paredes da SVZ adulta (Alves et al. 2002). A
glia radial em transformação, portanto, foi postulada como forte candidata à reguladora
de aspectos da fisiologia da SVZ/RMS, como as atividades proliferativa e migratória dos
neuroblastos em trânsito pela SVZ/RMS. Quais fatores estariam regulando a
permanência da glia radial na SVZ? Estaria a comunicação juncional na SVZ,
envolvendo a glia radial entre si, os neuroblastos entre si, ou ambos em parcerias
heterocelulares, implicada na regulação da transformação da glia radial e na
concomitância fisiológica de processos proliferativos, migratórios e de diferenciação
celular vividos pelos neuroblastos da SVZ em seu percurso até o bulbo olfatório? Na
base destas questões de forte implicação fisiológica, no entanto, está a elucidação dos
possíveis sub-compartimentos de comunicação juncional e dos parceiros celulares
envolvidos na formação destas que poderiam ser vistas como potenciais redes
multicelulares coordenadas por comunicação juncional. Para tanto, buscamos a
30
definição destas redes em estudos in vivo/in situ, que elegem a glia radial da SVZ, de
ancoragem pial como ponto de partida para as possíveis parcerias juncionais.
Focalizamos, assim, a participação da célula de glia radial (CGR) nas redes de
acoplamento da SVZ pós-natal (Fig. 6).
Neste projeto testaremos a hipótese de que neurônios, neuroblastos, glia radial e
astrócitos possam construir circuitos de acoplamento que podem estar influindo na
atividade celular local. Para tanto utilizaremos uma adaptação da técnica de
“transection loading” (Menezes et al., 2000) “in situ”, para carregar especificamente as
CGR com corantes permeantes e não permeantes para “gap junctions” de forma a
evidenciar o acoplamento celular realizado por estas células. Em resumo, os
prolongamentos piais das CGRs neonatais residentes na SVZ serão seccionados para
permitir a entrada dos corantes diretamente para o citoplasma celular.
31
Figura 6. Possíveis parceiros da célula de glia radial na rede celular acoplada na SVZ. Células em
vermelho indicam as células carregadas inicialmente pela mistura de corantes usada para revelar o
acoplamento juncional. Células apenas verdes representam as células marcadas por acoplamento
celular. Vide materiais e métodos. Pares deletraas maisculas indicam pares de células acopladas: RR,
entre células e glia radial; RN, entre células de glia radial e neuroblastos; RA, células de glia radial e
astrocitos. WM, substancia branca (white matter em inglês); SVZ, zona subventricular.
A utilização dos prolongamentos piais das CGR como forma de carregamento
específico destas células é uma forma de responder se as células da glia radial da SVZ
contribuem para o acoplamento celular observado nesta camada (Menezes et al.,
2000). Com esta técnica exclui-se a possibilidade de carregamento direto de outras
células que não a própria CGR, tornando-a a única doadora possível neste ambiente.
RN
RR
RR
RA
32
II. Objetivos .
Avaliar a contribuição específica da célula de glia radial (CGR) para o
acoplamento celular na zona subventricular pós-natal. Com o perspectiva de que isto
possa fornecer subsídios para entender o papel das junções comunicantes na
regulação, migração e diferenciação na zona subventricular pós-natal.
1. Objetivos Específicos
1. Avaliar a distribuição do acoplamento por corante observado na SVZ/RMS
a partir da CGR.
2. Identificar os tipos celulares envolvidos no acoplamento observado com a
CGR.
3. Determinar a natureza juncional deste acoplamento.
33
III. Metodologia .
1. Animais e anestesia:
Utilizamos filhotes de ratos (Wistar), do nascimento (dia pós-natal 0, P0) a P6
nascidos em nossa própria colônia.
Os filhotes foram anestesiados por hipotermia. Todos os procedimentos
respeitaram as normas do NIH (National Institute of Health).
2. Carregamento Pial
Os filhotes (aproximadamente 30 animais) foram decapitados, seguindo então a
dissecção do crânio e a exposição da superfície encefálica submersos em solução
salina de Gey (GSS; do inglês Gey’s salt solution - 1mM Ca+2, GIBCO) gelada
suplementada com glicose (6 mg/ml). Depois da dissecção, os cérebros foram imersos
em tampão fosfato salina (0,1M, pH7.4) (PBS) livre de cálcio (PBS
ØCa+2/EGTA/glicose) à temperatura ambiente e as meninges rebatidas. Realiza-se um
leve esfregaço com tira de papel, que além de retirar a pia mater, provoca uma leve
lesão na superfície (Fig 7), e goteja-se solução com o permeante Lucifer Yellow (LY;
443 Da - 0,25%, Molecular Probes) e o fluorocromo não-permeante dextran conjugado
à Rodamina (RD; 3000 Da - 0,5%, Molecular Probes). Após lavagem com solução GSS,
o material foi fixado em paraformaldeído 4% em PBS, durante 3h. Depois os cérebros
34
foram processados para criomicrotomia ou seccionados no vibratomo (Vibratome
V1000, Pelco). No primeiro caso, os cérebros foram crioprotegidos, cortados
parassagitalmente em criostato (12 m, Leitz), as fatias montadas em lâminas e
analisadas à microscopia de epifluorescência. No segundo caso os cérebros foram
cortados em vibratomo (50 m) e as fatias montadas em lâminas e analisadas à
microscopia de epifluorescência e confocal. Algumas das secções obtidas ao vibratomo
foram processadas para imuno-histoquímica.
Figura 7. Esquema sagital de marcação no carregamento pial mostrando os dois sítios de marcação
desta técnica: o córtex cerebral e a SVZ. Pontos vermelhos representam RD e pontos amarelos
representam LY.
Como controle para captação por hemicanais ou inespecífica de LY modificamos
o ensaio de carregamento pial para uma adaptacao baseada na técnica de transection
35
loading. Neste ensaio, 2 (dois) animais, após a decapitação, foram submetidos, em
substituição ao procedimento de carregamento pial, a um único corte coronal bilateral
no lobo occipital. Este corte, realizado com bisturi cirurgico, atingiu em todos os animais
o ventrículo lateral, expondo assim a luz ventricular aos corantes. Após quatro minutos,
os cérebros foram lavados com PBS (3x de cinco minutos) e fixados como descrito
anteriormente.
3. Injeção Intraventricular de Carbenoxolone
Seis animais (P4; em três experimentos separados) receberam uma única
injeção intraventricular de carbenoxolone (100mM; CBX; ácido 3β-hidroxi-11-oxooleano-
12-eno-30-óico-3-hemissuccinato), antes do procedimento de carregamento pial. Para
tanto, os animais foram anestesiados por hipotermia e uma pequena abertura foi feita
na parte posterior do crânio expondo a superfície cortical. Uma micropipeta de vidro foi
introduzida aproximadamente 1200 mm da superfície pial ao ventrículo injetando 1-2L
de CBX (5mM) para obter uma concentração de final de 100-200M no espaço
extracelular cerebral (supondo o volume de líquor 50-60L – calculado a partir do
volume conhecido no adulto de 250l – Burns et al., 1976). A incisão foi fechada por
cola de cianoacrilato e os animais tiveram uma sobrevida de 30 minutos, sendo
submetidos na seqüência ao mesmo procedimento de carregamento pial com a
presença de 100mM de CBX na mistura de corantes. Como controle, foi injetado
somente veículo (seis animais). Muitos dos animais que receberam CBX apresentaram
convulsões após recuperarem-se da anestesia.
36
4. Excesso de cálcio Extracelular
Neste caso, os cérebros de oito (em quatro experimentos separados) animais
(P4) foram expostos durante todo o procedimento de carregamento pial a
concentrações elevadas de cálcio. Para tanto, cálcio foi adicionado em todas as
soluções em uma concentração final de 5mM. Todo o procedimento seguiu sem outras
alterações de protocolo.
5. Marcação com carbocianina
Para identificar as células de glia radial a partir da superfície pial, imediatamente
após o procedimento de carregamento pial, os cérebros foram imersos em uma solução
aquosa de Dil (1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'- tetrametilindocarbocianina perclorato; DiIC
18
(3);
5% de sucrose e 0.5% de etanol) por 30 minutos, lavados em GSS por 5 minutos e
imediatamente fixados com PFA. Após esse procedimento, pequenos cristais de Dil
foram depositados, sob inspeção visual na superfície cortical exposta.
6. Imuno-histoquímica e análise
Após curto período de fixação, algumas lâminas foram lavadas em PBS e depois
incubadas (pernoite) com o anticorpo monoclonal anti-β- tubulina de classe III (1:1000;
Covance) numa solução contendo 0,05% de Triton-X e 10% de soro normal de cabra
em PBS. Após 3 lavagens com PBS, as lâminas foram incubadas por duas horas em
anticorpo secundário anti-camundongo feito na cabra conjugado ao fluoróforo Alexa
37
Fluor 546 (1:400; Molecular Probes) diluídos em solução a 10% de soro de cabra em
PBS. Após 3 lavagens com PBS, lâminas foram cobertas com lamínula de vidro
utilizando meio de montagem N-propilgalato e seladas com esmalte.
As lâminas foram analisadas ao microscópio óptico invertido (TE200, Nikon),
fotogrados com camara digital CoolSnap-Procf monocromática (Media Cybernetics).
Para aquisição de imagens também foi utilizado microscopia confocal (LSM 510, Zeiss).
38
IV. Resultados .
A técnica de carregamento pial revelou, em todas as idades analisadas, células
com dupla marcação pelos corantes utilizados (LY+RD+ - células carregadas
diretamente pelo esfregaço pial) em duas regiões: nas camadas celulares do córtex
cerebral e na zona subventricular (SVZ; Fig. 8). Em todos os casos estas células foram
encontradas restritas as regiões subjacentes às superfícies do esfregaço. Células
marcadas apenas com Lucifer Yellow (LY+RD-), i.e., acopladas, foram encontradas
principalmente nas camadas celulares do córtex cerebral e na SVZ. Muitas vezes o
acoplamento juncional (LY+RD-) estendeu-se para além da superfície de carregamento
direto, em especial para as regiões rostrais da SVZ, ou seja, para dentro da RMS (Fig.
9).
39
40
41
4. 1. Células carregadas pelos corantes na SVZ apresentam uma distribuição bi-
modal
As células marcadas (LY+RD- e LY+RD+) na SVZ apresentam-se distribuídas em
um padrão bi-modal característico em todas as idades analisadas (Fig. 10). Nota-se
então dois grupos de células distintos: um próximo à borda externa da SVZ (Fig. 10
setas), e outro próximo à luz ventricular (Fig. 10 asteriscos). Além de apresentar uma
morfologia não-radial, o grupo próximo à borda externa da SVZ sobrepõe-se à região
onde mostramos anteriormente estarem estacionadas as células de glia radial em
transformação (Alves et al., 2002). Isto sugere que estas células são CGR em
transformação e estão acopladas. O grupo adjacente à luz ventricular apresenta
morfologia bipolar e se assemelha a CGRs bipolares e/ou células ependimárias.
Novamente, observamos células duplo-marcadas (LY-RD+) e mono-marcadas
(LY+RD-) confirmando a presença de células de ancoragem pial e sugerindo
acoplamento juncional também neste extrato. Esse padrão de distribuição manteve-se
durante todas as idades analisadas (Fig. 11; entre P0 a P6).
42
43
44
4.2. Células carregadas pelos corantes na SVZ são glia radial
Devido à morfologia específica das células de glia radial, corpos celulares no
interior da SVZ e longos prolongamentos atingindo a superfície pial, possivelmente toda
a célula diretamente carregada na SVZ é uma célula de glia radial. Isto porque, com a
técnica de carregamento pial, somente a célula de glia radial seria capaz de captar os
corantes e levá-los a SVZ. Mesmo frente a esta argumentação consistente decidimos
confirmar esta hipótese fazendo um ensaio de dupla marcação usando o transporte
post-mortem da carbocianina Dil nos cérebros previamente submetidos ao
carregamento pial.
Para tanto, mergulhamos os cérebros carregados em uma solução aquosa de Dil
(1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'- tetrametilindocarbocianina perclorato; DiIC
18
(3); 5% de
sucrose e 0.5% de etanol) por 30 minutos, lavados em GBSS por 5 minutos e
imediatamente fixados com PFA. Durante esse procedimento, pequenos cristais de Dil
são depositados na superfície cortical exposta. Após um período de 7 dias observamos
CGR marcadas com o Dil com diversas morfologias na SVZ: células com morfologia
mais complexa geralmente situadas na borda externa da SVZ e células bipolares,
próximas à luz ventricular (Fig. 12 seta e cabeça de seta). A maioria das CGR
marcadas com DiI abaixo da área de carregamento pial também se apresentou positiva
para LY (Fig 12) tanto na borda externa dorsal da SVZ (Fig. 12 C,D e E) quanto na
superfície ventricular (Fig. 12 F,G e H).
45
46
4.3. Células carregadas pelos corantes não são marcadas por captação
inespecífica
Para excluir a possibilidade de captação inespecífica de corantes pelas células da
SVZ, realizamos controles de captação de corantes onde os cérebros eram submetidos
a um corte profundo na região occipital, em substituição ao esfregaço pial, e, em
seguida, expostos aos corantes. Nestes experimentos, apesar dos corantes invadirem a
luz ventricular, não houve captação na SVZ para além da região imediatamente
adjacente ao corte (Fig. 13). Estes resultados confirmam que a técnica do carregamento
pial revela especificamente as CGR diretamente atingidas pelo esfregaço e que todo o
transporte transcelular do corante LY advém única e exclusivamente das CGRs
diretamente marcadas pelo carregamento.
47
48
4. 4. Células LY-positivas são Beta III tubulina negativas
Para inferir sobre os parceiros acoplados com as células de glia radial nos
conjuntos de células monomarcadas realizamos ensaio de imuno-histoquímica para a
isoforma classe III da beta tubulina, específica de neurônios e neuroblastos (Lee et al.,
1990; Menezes e Luskin, 1994), empregando o anticorpo TuJ1, nos cérebros
submetidos ao carregamento pial (Fig. 14). Nestes ensaios, realizamos o carregamento
pial somente com LY, de forma que o vermelho da RD não prejudicasse a análise do
TuJ1 revelado com secundário conjugado a fluorocromo RITC. Observamos que as
células LY-positivas são sempre TuJ1 negativas (Fig. 14). Note que nestes ensaios não
discriminamos entre células carregadas diretamente ou por acoplamento. No entanto, a
ausência de células TuJ1+/LY+ indica que tanto as células carregadas diretamente
quanto as marcadas por acoplamento não são neuroblastos.
49
50
4.5. Agentes desacoplantes diminuem a incidência de perfis celulares
monomarcados na SVZ/RMS
Para avaliar de forma preliminar se o acoplamento celular observado seria
mediado por junções comunicantes usamos um agente farmacológico bem estabelecido
como inibidor da comunicação juncional, o carbenoxolone (CBX - Davidson e
Baumgarten, 1988), e manobras de alto cálcio (Spray, 1996; Menezes et al., 2000).
O CBX empregado para a inibição da comunicação juncional oferece as
vantagens de ser hidrofílico e pouco tóxico (Marins, 2006; Tese de Doutorado). Até o
momento, tem se provado um bloqueador que age indistintamente para os isotipos de
conexinas (Spray et al., 2002; Salameh e Dhein, 2005). À semelhança da quase
totalidade dos agentes farmacológicos descritos como inibidores da comunicação
juncional, a presença de CBX não abole completamente o acoplamento celular
detectável por espalhamento de corantes in situ, porém o reduz significativamente, algo
entre 70 e 90% (Davidson e Baumgarten, 1988; Van Haarst et al., 1996; Menezes et al.,
2000; Pais et al., 2003).
Injetamos CBX (1-2l; 1mM) unilateralmente no ventrículo lateral esquerdo, 20-40
minutos antes do procedimento de carregamento pial. Nos animais tratados com CBX
observamos uma diminuição do acoplamento juncional, ou seja, diminuição da
proporção de células LY+RD- (Fig. 15 B). Como pode ser observado qualitativamente
na figura 8, a proporção de células LY+/RD- (acopladas) sobre LY+/RD+ (carregadas
diretamente) são consistentemente maiores no controle. A análise estatística ainda não
foi possível, dada a grande variabilidade dos níveis de carregamento entre os animais,
51
exigindo-nos experimentos adicionais que atendam à diminuição dos desvios-padrão na
coleção de ensaios.
Outra estratégia para o bloqueio do acoplamento foi efetuar o procedimento de
carregamento pial na presença de altas concentrações de cálcio extracelular (5mM).
Nestes experimentos encontramos também uma diminuição acentuada do acoplamento
celular (Fig. 15C). Não efetuamos razões para estes ensaios, mas qualitativamente
observamos uma redução acentuada, próxima a zero, dos perfis monomarcados
relativamente aos duplo-marcados, consistente com a descrição anterior, de que o
bloqueio com calcio provoca uma redução do acoplamento mais acentuada em
comparação com os ensaios com CBX (Menezes et al., 2000).
52
53
V. Discussão .
Neste trabalho investigamos a contribuição das células de glia radial (CGR) para a
rede de acoplamento presente na zona subventricular (SVZ). Para tanto,
desenvolvemos uma técnica capaz de carregar exclusivamente a CGR de forma direta
na SVZ. Demonstramos aqui que as CGRs participam de uma extensa rede acoplada,
apresentando uma distribuição espacial bimodal, e que persiste durante os seis
primeiros dias pós-natais. Nossos resultados sugerem que, a princípio, esse
acoplamento parece ser homocelular, envolvendo apenas células de origem glial. A
distribuição restrita e o caráter aparentemente homogêneo das células envolvidas
sugere a formação de compartimentos sinciciais que podem corresponder a
microdomínios funcionais da SVZ/RMS, reforçando a idéia de uma heterogenidade
espacial dentro desta camada germinativa.
5.1. Considerações técnicas
A técnica de carregamento pial de corantes empregada neste trabalho é uma
variante in vivo, da metodologia desenvolvida anteriormente em nosso laboratório,
denominada de carregamento por transecção (transection loading) (Menezes et al.,
2000) para mapeamento in situ do acoplamento juncional. Ambas derivam da técnica
de carregamento por corte (scrape loading) desenvolvida para culturas de células
dissociadas (El Fouly, 1991). Diferente do método de carregamento por transecção, a
metodologia empregada foi capaz de marcar isoladamente as CGR e permitir a análise
54
do seu acoplamento no interior da SVZ/RMS, mantendo a histoarquitetura intacta. Esta
variante técnica aproveita o fato de ser a célula de glia radial a única da SVZ que possui
prolongamentos que se estendem até a superfície pial. Desta forma, ao expor apenas
esta superfície à mistura de corantes garantimos que qualquer carregamento direto
detectado na SVZ seja atribuível, exclusivamente, aos prolongamentos gliais expostos
ao esfregaço pial.
A hipótese de que na SVZ apenas as CGR apareceriam carregadas diretamente
pelo esfregaço foi confirmada de três maneiras: 1. com a utilização do rastreador
fluorescente post-mortem, a carbocianina DiI; 2. com a imuno-histoquímica para o
marcador fenotípico de neurônios e neuroblastos, o anticorpo TuJ1; 3. indiretamente,
com a disponibilização dos fluorocromos à luz ventricular, sem esfregaço, através de
uma incisão profunda na região occipital. O primeiro método permitiu analisar a
morfologia das células carregadas com LY, confirmando sua fenotipia CGR; por ser
empregado post-mortem descarta-se a possibilidade deste corante (DiI) ser captado
inespecificamente, garantido assim a especificidade da marcação das CGR. O
segundo, por exclusão às imunorreatividades, mostrou-nos a ausência de
neuroblastos/neurônios entre as células carregadas pelo método. Isto sugere
fortemente, que as células marcadas apenas com LY seriam de linhagem glial, ou,
precursores, ainda não diferenciados. Juntos estes dois resultados corroboram a
hipótese de marcação exclusiva de CGR pelo método de carregamento pial. O terceiro
método permite excluir a hipótese de captação inespecífica (e.g., endocitose,
fragmentação de membrana durante morte celular, ou mesmo abertura de poros na
membrana plasmática), que poderia justificar perfis monomarcados (LY+RD-): mesmo
atingidas profundamente pelo corte e banhadas diretamente com a dupla
55
permeante/não-permeante, não encontramos células marcadas com distribuição na
SVZ compatível com as reveladas pelo carregamento pial, exceto pelas células
carregadas diretamente (LY+RD+) nas imediações da incisão. Em conjunto,
confirmamos o perfil fenotípico das células diretamente carregadas como CGR e
excluímos a presença detectável de neuroblastos acoplados e a possibilidade de
transporte por difusão extracelular seguido de captação inespecífica dos corantes por
células da SVZ. Em manobras como esta, através da qual tem-se, com exclusividade, a
possibilidade de avaliação do acoplamento em grandes populações celulares in situ,
tornou-se possível selecionar uma única população celular de interesse e estudar o
acoplamento desta com as demais em seus sítios histoarquitetônicos de distribuição.
Apesar de inúmeros ensaios bem sucedidos (aproximadamente 7% dos
ensaios), a técnica é de difícil reprodução. Acreditamos que parte destes insucessos
podem ser explicados pela necessidade de que o procedimento seja realizado com
rapidez. Por exemplo, em alguns experimentos a mistura de corantes não atingiu a
SVZ, talvez pela retração antecipada das membranas dos podócitos das CGR, ou, mais
remotamente, pelo fechamento dos canais juncionais por cálcio ionizado extravasado
durante o esfregaço antes da exposição aos corantes. Outro fator a ser considerado é a
grande distância que os corantes necessitam percorrer até chegar a SVZ, isto poderia
aumentar as possibilidades de insucesso no carregamento em profundidade. Uma vez
que os corantes possam não atingir concentrações significativas pelas CGR na SVZ
antes do término do procedimento (fixação com PFA). Apesar destas dificuldades nos
ensaios bem sucedidos esta técnica revela uma distribuição espacial difícil de obter
através de outras metodologias.
56
5.2. O acoplamento celular é aparentemente homocelular
Na ocasião de nossos ensaios de carregamento pial combinados à marcação
com DiI, ou processados posteriormente para imuno-histoquimica ficamos impedidos de
empregar o não-permeante, RD, dada a emissão de fluorescência em comprimento de
onda similar ao DiI e aos anticorpos secundários disponíveis para imunoquímica no
laboratório munidos de fluorocromos na mesma faixa. Esta restrição técnica, à época,
além de interferir na determinação de subtipos celulares dentro da população marcada,
impediu-nos de diferenciar as células acopladas daquelas carregadas diretamente. No
entanto, devido à sobreposição quase absoluta das células DiI+ e LY+, por um lado, e à
exclusão completa de imunorreatividade das células carregadas com LY a TuJ1,
concluímos, dentro das condições experimentais utilizadas, sobre a natureza não
neuronal das células acopladas com aquelas carregadas diretamente. Para suplantar
esta limitação, pretendemos utilizar nos experimentos futuros a capacidade de
separação espectral proporcionada pelos equipamentos de microscopia confocal
(Conchello e Lichtman, 2007) e/ou a disponibilidade de novos conjugados de alto peso
e permeantes juncionais que permitam combinações complementares diversas, em
ensaios de imuno-histoquímica.
A não participação de neuroblastos nas redes de acoplamento reveladas para a
CGR pode sugerir a restrição a arranjos de acoplamento homocelular envolvendo as
CGR da SVZ (Fig. 16). No entanto, ensaios adicionais serão necessários para excluir os
outros pareamentos possíveis, como aqueles que pudessem envolver astrócitos já
diferenciados, por exemplo, em parcerias heterólogas (Fig. 16).
57
Figura 16. Parceiros da célula de glia radial na rede de acoplamento da SVZ elucidados neste trabalho.
Vide figura 7 da introdução para legenda explicativa.
5.3. O acoplamento celular evidenciado por corantes possivelmente é mediado por
junções comunicantes
A técnica de transection loading – carregamento por transecção – foi
desenvolvida no laboratório como uma forma de detecção rápida e pouco dispendiosa
de junções comunicantes funcionais in vivo. Este método foi inicialmente empregado no
cérebro pós-natal para demonstrar pela primeira vez a existência de acoplamento
celular na zona subventricular telencefálica (Menezes et al., 2000).
RN
RR
RR
RA
?
58
A natureza juncional da difusão transcelular do permeante LY é, em geral,
confirmada por manobras conhecidas de desacoplamento total ou, mais comumente,
parcial. Nesta tese, empregamos dois agentes desacoplantes, o fármaco
carbenoxolone e a aplicação de alto cálcio em soluções de banho extracelular. Ambos
os tratamentos diminuíram drasticamente os perfis de células monomarcadas (LY+RD-)
em condições de carregamento pial, tanto na SVZ quanto no córtex, reforçando a
hipótese de carregamento transcelular por comunicação juncional. Em consonância
com nossos resultados anteriores (Menezes et al., 2000) o carbenoxolone promoveu
uma inibição parcial do acoplamento na SVZ, enquanto altas concentrações de cálcio,
resultaram em um bloqueio quase total. Esse resultado aponta positivamente para a
participação das junções comunicantes na formação de redes celulares acopladas da
SVZ. Além disso, a ausência de captação dos corantes por células fora de regiões de
esfregaço (Fig. 13) reforça a dependência com vias intercelulares de comunicação
juncional, tendo afastado a possibilidade de intermediação por hemicanais de
conexinas (Weissman et al., 2004).
A presença de conexinas na SVZ apontada em escassos estudos anteriores
(Miragall, et al.,1997) apóia a tese de intermediação por canais juncionais ativos no
espalhamento de permeantes observado na SVZ, apesar de não confirmada
posteriormente (Peretto et al., 2005). No entanto, reserva-se ao nosso grupo, até o
momento, as evidências mais conspícuas de que não só conexinas estariam presentes
na SVZ pós-natal, como também estariam implicadas na fisiologia desta camada.
Assim, detectamos a presença de conexinas 43 e 45 in situ na SVZ (dados não
mostrados) (Anna Lenice Xavier, 2008, Projeto de tese de Mestrado), presente de
maneira uniforme sugerindo sua expressão em variados tipos celulares. Demonstramos
59
ainda que o acoplamento juncional observado em culturas de explantes de SVZ
interfere amplamente na migração neuronal, e que tanto células gliais como
neuroblastos expressam a Cx 43 nestes explantes (Marins, 2006; tese de doutorado). É
possível que esta discrepância se deva a dificuldade da detecção de conexinas com os
anticorpos disponíveis atualmente, sendo a detecção por imuno-histoquímica ainda
gera controversias na literatura (ver discussão em Fillipov et al., 2003).
É possível, embora pouco provável, que parte das células que apresentaram
acoplamento revelado por corantes tenha sido marcada através da captação de LY por
poros formados por receptores purinérgicos P2X7 (Surprenant et al., 1996; Illes e
Ribeiro, 2004). Apesar de não podermos excluir a participação destes receptores na
incorporação e difusão de LY em nossos ensaios, por não termos realizados ensaios
farmacológicos específicos, algumas características de nosso modelo reduzem esta
possibilidade: 1. as altas concentrações do ligante (ATP) necessárias para abertura
destes poros (faixa mMolar) (Virginio et al., 1999a; 1999b) são pouco prováveis de
serem alcançadas na nossa preparação já que o local a nossa região de análise é
distante da região de captação do corante ou seja, de lesão; 2. apesar de alguns
autores defenderem tempos mais curtos para a abertura destes poros na presença de
elevadas concentrações de ATP (Virginio et al., 1999a; 1999b), tempos prolongados, da
ordem de 10 ou mais minutos têm sido relatados para o registro de níveis detectáveis
de captação direta de permeantes, portanto, freqüentemente maiores que o breve
tempo de exposição aos corantes (1-3 minutos) utilizado em nosso método; 3. se
houvesse a participação destes poros, esperaríamos a formação de grumos de células
LY+/RD-, uniformemente distribuídos pelo tecido; não guardaria, portanto, qualquer
60
caráter de correspondência, na profundidade da parede cortical, à área de esfregaço da
superfície pial.
Por fim, apesar de ainda não confirmadas em sistemas endógenos quanto à sua
capacidade de formação de canais intercelulares completos e funcionais, não
descartamos a possibilidade de que parte do acoplamento celular observado em
nossas preparações deva-se a uma classe recém descrita de proteínas juncionais, as
panexinas. Descritas na qualidade de homólogas funcionais das conexinas, porém, não
homólogas no seqüenciamento gênico (Bruzzone et al., 2003), estão presentes no
cérebro em desenvolvimento e adulto (Vogt et al., 2005), mas são ainda pouco
estudadas em relação ao seu papel nas camadas germinativas.
5.4. A célula de glia radial na dinâmica da SVZ
A investigação sobre o comportamento da célula de glia radial tem ganhado
grande importância nos últimos anos. Além da já conhecida função de arcabouço para
a migração neuronal, esta demonstrou ser a célula precursora multipotente. De fato, a
CGR parece ser a responsável pela produção de grande parte dos neurônios
excitatórios do cortex cerebral durante o desenvolvimento (Noctor et al., 2002,
Malatesta et al., 2003, Anthony et al., 2004) e também está presente em regiões de
adultos não mamíferos que são conhecidas por serem neurogênicas durante toda a
vida (Alvarez-Buylla et al., 2004, Zupanc and Clint, 2003, Garcia-Verdugo et al., 2002,
Weissman et al., 2003).
A centralização das funções neurogênicas e migratórias na CGR alerta para a
possibilidade de um eficiente controle regulatório, com a atividade de uma única célula
61
poder potencialmente influenciar tanto a produção neuronal como a arquitetura cortical.
Tendo em vista que algumas desordens neurológicas do desenvolvimento humano
associadas com malformações corticais envolvem defeitos na migração neuronal bem
como na produção desses neurônios (Sheen e Walsh et al., 2005; Mochida e Walsh,
2004), a modulação das funções da CGR pode ter importantes implicações clínicas.
Além disso, a morfologia única desta célula com o corpo celular na zona proliferativa e
uma fibra radial em contato com neurônios distantes do córtex em desenvolvimento
pode também permitir uma interação direta entre esta, que vem sendo interpretada
como um progenitor neural, e sua progênie, durante o desenvolvimento.
Apesar da expansão recente do conhecimento acerca das CGR, pouco ainda se
sabe sobre o repertório de agentes moleculares e os possíveis mecanismos de controle
de sua capacidade proliferativa e progenitora. Um mecanismo em potencial pode
envolver ondas de cálcio (Owens e Kriegstein, 1998) que são conhecidas por regular a
proliferação em vários tipos celulares (Berridge, 1995), também têm sido implicadas na
regulação da divisão celular na VZ (Owens e Kriegstein, 1998).
Como mostramos em trabalho anterior, na borda externa da SVZ concentram-se
os corpos celulares de glias radiais transformantes (Alves et al., 2002), sendo estes os
subtipos que julgamos reconhecer como células diretamente carregadas na SVZ neste
estudo. Também por nosso grupo, a cadeia de CGR foi demonstrada coincidindo
espacialmente com nichos de alta atividade proliferativa na borda externa da SVZ/RMS
(Menezes et al., 1998). Em adição, também demonstramos que os perfis de
acoplamento juncional, revelados pela técnica de carregamento por corte, na SVZ
ocupam estes mesmos nichos na borda externa (Menezes et al. 2000). Em conjunto,
estes achados apontam fortemente para um possível papel da comunicação juncional
62
apresentada pelas CGR na modulação da fisiologia da SVZ. Este papel via proteínas de
junções comunicantes poderia residir em: 1. compartimentalizar da SVZ – o
acoplamento entre as CGR observado nesta tese não parece envolver elementos
celulares da substancia branca ou mesmo os neuroblastos da SVZ; desta forma é
possível que o “túnel” formado por esta rede sincicial acoplada contribua na
coordenação de atividades de adesão celular, contribuindo para a estabilidade do
corredor glial (Peretto et al., 1997; Peretto et al., 2005; Xu et al., 2006; Elias et al.,
2007); 2. regular a secreção de fatores neurotróficos e substâncias neuromoduladoras
que sugere-se atuariam autocrina- e paracrinamente sobre a trama de neuroblastos em
atividades proliferativa e migratória (Mason et al., 2001; Stipursky e Gomes, 2007); 3.
controlar a transformação astrocitária da glia radial - A rede sincicial glial, ao garantir o
estabelecimento de um compartimento transcelular de CGR, poderia prover condições
à transformação do conjunto destas células em astroglia (Alves et al., 2002). Nem
mesmo sabemos ainda se esta influência é negativa, impedindo o curso desta
transformação, ou positiva, permitindo estas células a entrar no processo de
transformação em coortes. Resultados do nosso laboratório sugerem a primeira
hipótese, já que estas células parecem permanecer na borda externa da SVZ um longo
período (Alves et al., 2002). Além disto, pelo menos uma parte destas células
permanece nesta borda até a idade adulta (Menezes et al., 2008; manuscrito em
preparação). O acoplamento celular poderia por exemplo, atuar no sentido de manter
as CGR em um estado quiescente, conforme sua participação na maior parte das
linhagens tumorais estudadas (Trosko, 2007). Células totipotentes ou óvulos fertilizados
aparentemente não expressão genes de conexina ou tem a habilidade de formar
comunicação intercelular tipo gap, sendo assim acredita-se que toda célula tronco
63
mantêm-se na forma primitiva ou indiferenciada sendo seqüestrada de suas filhas
diferenciadas, sendo incapazes de acoplar com as células filhas (Trosko, 2000). Este
mesmo raciocínio poderia ser aplicado ao grupo de células acopladas próximo à luz
ventricular, aqui descrito, possuindo morfologia bipolar reminiscente as células
ependimárias. A rede de acoplamento que possivelmente envolve essas células
ependimárias poderia sustentar um sistema de sinalização para manutenção do estado
quiescente destas células (Spassky et al., 2005; Doetsch et al. 1999), embora alguns
estudos sejam contraditórios a esta suposta quiescência absoluta das células
ependimárias (Coskun et al., 2008; Johanson et al., 1999); 4. exercer uma função
tipicamente astrocitária como a manutenção da homeostase tecidual. O arranjo sincicial
das CGR poderia atuar no buffering de GABA e outras susbtâncias
neurotransmissoras/neuromoduladoras como fruto da sua atividade glial (Bolteus e
Bordey, 2004; Liu et al., 2006). Poder-se-ia imaginar que a comunicação juncional
envolvendo as CGR em redes sinciciais poderia contribuir com a formação de um
gradiente de moléculas na direção centro/periferia do corredor migratório representado
pela SVZ/RMS, determinando, junto a outros possíveis fatores, a existência e a
manutenção de domínios de fatores humorais que sustentassem os sub-
compartimentos já descritos na SVZ/RMS; exemplos seriam a acúmulo de células em
fase S na borda externa da SVZ, e os neuroblastos migratórios presentes no centro
desta camada (Menezes et al., 1998; Peretto et al., 2005).
Devido a sua posição e origem ontogenética, podemos considerar a CGR
presente na SVZ pós-natal como uma célula-tronco potencial, pelo menos uma
subpopulação destas (Merkle et al., 2007). A determinação de seu potencial progenitor
é objeto de estudo atualmente no nosso laboratório. Acreditamos que devido a sua
64
origem ontogenética cortical, as CGR estudadas nesta tese possam ter o potencial de
gerar neurônios piramidais, recapitulando seu potencial embrionário (Molyneaux et al.,
2005). Ou seja, estas CGRs, podem representar um manancial de células progenitoras
endógenas com o potencial de serem manipuladas com fins terapêuticos.
Lesões neurológicas são reconhecidamente incapacitantes e de difícil
tratamento, especialmente as que envolvem perda neuronal. A reposição neuronal
ainda é um objetivo desejável. Uma das estratégias em estudo atualmente é o
transplante de células ou precursores neuronais (Imitola, 2007; Gaillard et al., 2007;
Pfeifer et al., 2007). Deve-se levar em consideração que as atuais técnicas de
transplantes celulares têm as mesmas limitações de técnicas de transplante de órgãos
ou tecidos, como sofisticadas técnicas de cultivo/manutenção do material a ser
transplantado (Redmond et al., 2008), riscos de rejeição e mesmo a não incorporação
do transplante (Sinden et al. 1992) e outros como a produção de tumores e doenças
parasitárias dormentes (Steindler 2007; Siegel et al. 2007). Além disso, para
transplantes alogênicos, pode haver a necessidade de imunossupressão, amplamente
conhecida por diminuir o tempo de sobrevida do paciente por seus efeitos colaterais
(Sinden et al. 1992). Todos estes problemas seriam potencialmente evitados pela
ativação ou manipulação dos progenitores endógenos (Sohur et al., 2007). Sendo
assim, a manipulação das células tronco endógenas abre a possibilidade de uma
terapia mais barata, com maiores índices de sucesso e menores riscos para o paciente.
65
VI. Conclusões .
o A metodologia empregada foi capaz de marcar isoladamente as CGR e revelar uma
rede de células a estas acopladas por corante na SVZ/RMS.
o A distribuição das células acopladas mostrou-se concentrada em duas camadas: na
borda externa dorsal da SVZ e próxima à luz ventricular.
o Na SVZ, perfis de células acopladas são observados estendendo-se à região
posterior, enquanto anteriormente atingem a RMS.
o O acoplamento por corante é de natureza aparentemente homocelular.
o A comunicação juncional clássica, intermediada por conexinas, é sugerida como a
provável via de acoplamento por corante mediado pelas CGR neste modelo.
o Devido à exuberância e distribuição espacial, acreditamos que a comunicação
juncional estabelecida entre elementos gliais possa ser relevante para regulação da
neurogênese da SVZ pós natal.
66
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