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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS – UFMG
ESCOLA DE ENGENHARIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA NUCLEAR
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS E TÉCNICAS NUCLEARES
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-graduação
em Ciências e Técnicas Nucleares da Escola de
Engenharia da Universidade Federal de Minas
Gerais, como requisito parcial à obtenção do título de
Mestre em Ciências e Técnicas Nucleares.
Autora: Janine Muniz Toledo
Orientador: Dra. Patrícia de Lima Falcão Valença
Co-Orientador: Dr. Tarcísio Passos Ribeiro de Campos
Belo Horizonte – Outubro – 2006
Escola de Engenharia da UFMG
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Janine Muniz Toledo
AVALIAÇÃO POR CITOMETRIA DE FLUXO DOS PARÂMETROS
FENOTÍPICOS DE CÉLULAS MONONUCLEARES DO SANGUE
PERIFÉRICO DE CÃES SUBMETIDOS A IRRADIAÇÃO DE CABEÇA
E PESCOÇO
Belo Horizonte
Escola de Engenharia da UFMG
2006
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“O homem é sua própria estrela; e a alma que pode
Fazer um homem honesto e perfeito,
Comanda toda a luz, toda influência, todo destino;
Nada lhe advém cedo ou tarde demais.
Nossos atos são nossos anjos, bons ou maus,
Nossas sombras fatais que andam ao nosso lado, silentes.”
Epílogo a A fortuna do homem honesto,
de Beaumont e Fletcher
4
AGRADECIMENTOS
A Profa. Dra. Patrícia de Lima Falcão Valença, minha orientadora pelo
dinamismo, paciência e confiança. Orientando-me sempre de forma objetiva e
verdadeira, sem jamais permitir recuar.
Ao Prof. Dr. Tarcísio Passos Ribeiro de Campos, co-orientador por ter
proporcionado os conhecimentos necessários, incentivos, compreensão,
companheirismo, respeito e muita amizade á realização do nosso trabalho.
Ao Prof. Dr. Sávio Lana Siqueira, meu noivo e colaborador, pelo
companheirismo, paciência e amor nos momentos de dificuldade, possibilitando
em grande parte a realização deste trabalho.
Ao Dr. Miguel Torres Leite, médico Radioncologista do Instituto de Radiologia
São Francisco/BH.
A Dra. Iara Marques, física do Instituto de Radiologia São Francisco/BH, pela
colaboração com tempo e espaço cedidos para a realização dos testes com a
Teleterapia. A toda equipe técnica em especial a Marisa e a Carla e funcionários
da recepção pela cooperação.
A Karen, técnica em laboratório da Bioconsulting/Biominas e amiga, pela
dedicação, paciência, confiança e conhecimentos transmitidos para a realização
da parte experimental de análise sanguínea.
Ao Cleber Stocler, Estudante em Medicina pela Faculdade Ciências Médicas de
Minas Gerais, pelo companheirismo e atenção dispostos a me ajudar com o
transporte e anestesia dos cães. Bem como ao Geraldo, técnico do laboratório de
anatomia da Faculdade Ciências Médicas de Minas Gerais.
A Giane Xavier, amiga e colega do mestrado em Ciências e Técnicas Nucleares,
pela amizade, atenção e carinho que me acompanhou do início ao fim.
Á minha família, pela compreensão e paciência. Em especial a Samara.
Aos professores e aos colegas do Curso de Mestrado em Ciências e Técnicas
Nucleares. Em especial as colegas Larissa, Flávia e Luciene.
Aos colegas de trabalho do CEF – Centro Educacional da Floresta. Á Valéria e ao
Michel pela compreensão e flexibilidade cedidas para as alterações realizadas nos
horários dos clientes facilitando o andamento do mestrado.
Ás secretárias do Departamento de Engenharia Nuclear: Márcia, Nancy e
Bernadete pela disponibilidade em resolver questões administrativas.
5
SUMÁRIO
RESUMO..............................................................................................................
7
ABSTRACT...........................................................................................................
8
LISTA DE FIGURAS.............................................................................................
9
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS............................................................... 12
CAPÍTULO I..........................................................................................................
14
1 - Introdução e justificativa..................................................................................
14
CAPÍTULO II.........................................................................................................
18
2 - Revisão de Conceitos......................................................................................
18
2.1 - Introdução.................................................................................................... 18
2.2 - Radioterapia................................................................................................ 19
2.3 - A radiação ionizante e seus efeitos biológicos.............................................
21
2.4 - Considerações básicas sobre Imunologia................................................... 25
2.4.1 - Órgãos do sistema imune......................................................................... 25
2.4.2 - Células do sistema imune........................................................................ 25
2.4.3 - Linfócitos T e marcadores de superfície.................................................. 26
2.4.4 - Linfócitos B e marcadores de superfície.................................................. 27
2.4.5 - Células Natural Killer................................................................................ 28
2.4.6 - Respostas imunes celulares..................................................................... 29
2.4.7 - Anticorpos..................................................................................................
29
2.4.8 - Apoptose...................................................................................................
30
2.4.9 - Citocinas....................................................................................................
31
2.5 - Como ocorre a ativação do linfócito.............................................................
32
2.6 - Como ocorre a imunossupressão pelos linfócitos T.....................................
33
2.7 - Citometria de fluxo........................................................................................
34
CAPÍTULO III........................................................................................................
37
3.1 - Objetivo Geral...............................................................................................
37
3.2 - Objetivos específicos....................................................................................
37
CAPÍTULO IV...................................................................................................... 38
4 - Material e Método............................................................................................
38
6
4.1 - Animais de experimentação.........................................................................
38
4.2 - Irradiação......................................................................................................
39
4.3 - Procedimentos..............................................................................................
40
4.4 - Protocolo para separação de células mononucleadas do sangue
amostras para citometria de fluxo.........................................................................
41
4.5 - Protocolo para análise de citometria de células mononucleares ex-vivo....
42
4.6 - Materiais e equipamentos envolvidos nos procedimentos...........................
43
CAPÍTULO V........................................................................................................
44
5 - Resultados e discussão...................................................................................
44
5.1 - Avaliação de parâmetros clínicos dos cães utilizados nos experimentos....
44
5.2 - Perfis fenotípicos avaliados através do canal médio de fluorescência........
46
5.3 - Dinâmica das alterações fenotípicas em leucócitos circulantes antes e
após a irradiação..................................................................................................
46
5.3.1 - Freqüência de linfócitos T CD5+ circulantes.............................................
46
5.3.2 - Freqüência de linfócitos B IgM+ circulantes..............................................
49
5.3.3 - Freqüência de linfócitos T CD4+ circulantes............................................ 52
5.3.4 - Freqüência de linfócitos T circulantes co-expressando o receptor
CTLA-4.................................................................................................................
54
5.3.5 - Freqüência de linfócitos T circulantes co-expressando o receptor IL-2R.
59
5.3.6 - Freqüência de monócitos circulantes na população de leucócitos totais..
60
5.3.7 – Freqüência de linfócitos T circulantes co-expressando o receptor para
MHCII...................................................................................................................
63
CAPÍTULO VI.......................................................................................................
68
6 - Conclusão....................................................................................................... 68
CAPÍTULO VII......................................................................................................
69
7 - Referências Bibliográficas...............................................................................
69
7
RESUMO
O presente estudo enfoca a investigação de parâmetros fenotípicos, utilizando
marcadores de estimulação e imunosupressão celular em modelo animal, com o
objetivo de dar suporte ao planejamento e monitoramento do tratamento do
câncer. Espera-se como perspectiva futura, fornecer suporte aos médicos
radioterapeutas para o planejamento da radioterapia, com base nos aspectos
imunológicos de cada paciente. Para isso, a estratégia experimental utilizada em
nosso estudo consistiu da avaliação dos animais (cães), que apresentam
parâmetros fenotípicos, comparados pré e pós-cinética de tempo expostas a
radiação ionizante, sendo as células mononucleares avaliadas pela citometria de
fluxo. Através dessa ferramenta metodológica, observaram-se os parâmetros
fenotípicos com ou sem alterações antes e após a radiação, utilizando o cão como
modelo experimental. Foram agrupados seis cães que foram irradiados com doses
fracionadas de 2Gy semanais, totalizando 4Gy para o terceiro e quarto cão e 6 Gy
para o quinto e sexto cão. Amostras do sangue periférico foram coletadas antes e
após as irradiações, nos períodos de duas horas, 18 horas e 30 dias. As amostras
de sangue coletadas anterior à irradiação foram designadas como controle. Após
a irradiação, como descrito acima, foram realizadas novas coletas, tendo sido as
células do sangue periférico (PBMC) separadas e submetidas às marcações com
os anticorpos monoclonais anti- CD5, anti-CD4, anti_IgM, anti-CD14, anti-MHCII,
anti-CTLA-4 (CD154) e anti-IL-2R para avaliação das células T circulantes,
Células B, linhagem monocítica/macrofágica e parâmetros de estimulação,
expansão clonal e regulação da expansão clonal, respectivamente. As PBMCs
que receberam tais marcações com os anticorpos marcados com fluoresceína e
ficoeritrina foram avaliados por citometria de fluxo, e os resultados foram obtidos
pelo número absoluto de receptores para os anticorpos de interesse na superfície
celular, antes e após a irradiação de cada animal. Os resultados foram expressos
como média dos percentuais de receptores dos grupos avaliados no tempo zero
(T0), 2 horas (T2) e 18 horas (T18) após a irradiação e no trigésimo dia após a
irradiação (T30) obtidos através do canal médio de fluorescência (CMF), sendo
8
considerado um parâmetro ótimo de avaliação, uma vez que expressou as
alterações reais do número de receptores na superfície celular. Os resultados
demonstraram uma diminuição significativa das células T circulantes (CD5) e a
subpopulação CD4, após a irradiação, bem como a diminuição dos receptores de
estimulação e interação celular (MHCII) e do IL-2R que confere o “start” para a
expansão clonal. Vale ressaltar, que a diminuição da expressão desses receptores
foi acompanhada do aumento da expressão de CTLA-4, que parece ter exercido
papel autócrino, regulando, a expressão de IL-2R de linfócitos T, bem como de
outras populações adjacentes. O papel da linhagem monocítica/macrofágicas,
investigado nesse modelo, parece ser controverso, uma vez que a expressão do
receptor para CD14, não apresentou uma alteração pontual, sugerindo que o
papel como célula apresentadora de antígenos não foi bem definido no modelo
investigado, visto que os danos ocorridos na célula no nível de membrana e
núcleo parecem ser bem mais rápidos do que a própria mobilização intracelular
para que ocorra uma apresentação. Além disso, como não há indução da
fragmentação de peptídeos pelo lisossomo, por não se tratar de um evento
desencadeado por um antígeno, essa linhagem parece não ser tão eficiente nesse
sistema. Vale salientar que os dados nos permitiram inferir sobre a importância do
conhecimento da resposta imune individualizada, através da investigação do
padrão fenotípico das linhagens celulares, bem como, circulando sistemicamente,
como parâmetro para planejamento e condução de tratamentos de vários tipos de
câncer. Acreditamos, ainda que a continuidade de tal estudo, através de ensaios
clínicos, possibilitará futuramente, ampliar a qualidade de vida de pacientes
submetidos aos tratamentos por radioterapia, com o monitoramento das doses de
radiação, visando uma melhor resposta do sistema imunológico desses pacientes,
e com isso, levando à melhoria e sucesso do tratamento do câncer.
Palavras - chaves: citometria de fluxo, receptor celular, radiação Co 60
9
ABSTRACT
Of this form became essential, then, the study of new therapeutical techniques and
the deepening of those already used in the medicine with the objective to not only
lead to the clinical cure, diminishing some types of tumor, but also to brighten up
the actual damages to immunologic response of the patient for the effect of the
radiation. Inside of this context, the present study it is considered the inquiry of new
parameters, using phenotype markers of stimulation and cellular imunossupression
in animal model, for planning and monitoring of the treatment of the cancer,
expecting as perspective future, to supply has supported to the doctors for the
planning of the gamma ray, on the basis of the immunologic aspects of each
patient. For this, the used experimental strategy in our study consisted of the
evaluation of groups of animals (dogs), that they present phenotypic parameters
sufficiently similar parameters to the ones of the man, compared before and after
kinetic of dose of radiation ionizant, evaluated through flow cytometry. Through this
methodology tool, one after observed the phenotypic parameters with or without
alterations before and the irradiation, using the dog as experimental model.
Samples of peripheral blood had been gotten of a group of five dogs before and
after to have received doses in fractions of irradiation of 2Gy weekly, totalizing 4
Gy for the third and fourth dog and 6 Gy for the fifth dog corresponding these
doses to the kinetic one of 2, 18 hours and 30 days. The animals had been divided
in groups and the collected samples of blood before the radiation had been
assigned as control. After the irradiation, as described above, had been carried
through new collections, having been the cells of the peripheral blood (PBMC)
separated and submitted to the markings with the monoclonal antibodies anti-
CD5, anti-CD4, anti_IgM, anti-CD14, anti-MHCII, anti-CTLA-4 and IL-2R for
evaluation of circulating cells T, Cells B, macrophage population and parameters of
stimulation, clonal expansion and regulation of the clonal expansion, respectively.
The PBMCs that had received such markings with antibodies marked with
phluorescein and phicoeritrin had been evaluated, for flow cytometry and the
results had been gotten by the absolute number of receptors for the antibodies of
10
interest in the cellular surface, before and after the irradiation of each animal. The
results had been express as average of the percentages of receptors of the groups
evaluated in time zero (T0), 2 hours (T2) and 18 hours (T18) after the irradiation
and in the thirtieth day after the irradiation (T30) gotten through the channel
medium of fluorescence (CMF), being considered an excellent parameter of
evaluation, a time that expressed the real alterations of the number of receptors in
the cellular surface. Our results had demonstrated to a significant reduction of
circulating cells T (CD5) and subpopulation CD4, after the irradiation, as well as
the reduction of the receptors of stimulation and cellular interaction (MHCII) and of
the receptor for IL-2, that confers the start for the clonal expansion. Its worth to
mentioning that the reduction of the expression of these receptors was followed of
the increase of the CTLA-4 expression, that seems to have exerted autocrine role,
regulating, the expression of IL-2R of lymphocyte T, as well as of other adjacent
populations. The role of the macrophage population investigated in this model,
seems to be controversial, a time that the expression of the receptor for CD14, did
not present a prompt alteration, suggesting that the role as cell antigen presenter
was not clear-cut in the investigated model, since the damages occurred in the cell
in membrane level and nucleus seem to be well faster of what the proper
intracellular mobilization so that a presentation occurs. Moreover, as it does not
have induction of the spelling of peptides for lissome, for not being about an event
unchained for an antigen, this population seems not to be so efficient in this
system. Our data in had allowed them to infer on the importance of the knowledge
of the immune response with the inquiry of cellular populations gifts in the tumoral
and systemic microenvironment, as parameter for planning and conduction of
treatments of some types of cancer. We believe, despite the continuity of such
study, through clinical assays, will make possible future, to extend the quality of life
of patients submitted to the treatments for external gamma ray - teletherapy with
the monitoring of the doses of radiation, aiming at one better reply of the
immunologic system of the patient, and with this, taking to the improvement and
success of the treatment of the cancer.
Key words: flow cytometry, celular receptor, radiation Co 60
11
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1 Figura de representação esquemática do método de citometria de
fluxo........................................................................................................32
Figura 2.2Figura ilustrativa de um Citômetro de fluxo acoplado ao software cell
quest.......................................................................................................33
Figura 4.1 Punção da artéria femoral.....................................................................37
Figura 5.1 O histograma de fluorescência mostra a intensidade de fluorescência
avaliados num canal médio de fluorescência que vai de 0 a 1023, para o
número absoluto de receptores para
CD5+......................................................................................................45
Figura 5.2 Percentual médio de células CD5+ em linfócitos circulantes de cães
irradiados................................................................................................45
Figura 5.3 O histograma de fluorescência mostra a intensidade de fluorescência
avaliados num canal médio de fluorescência que vai de 0 a 1023, para o
número absoluto de receptores para IgM+.............................................48
Figura 5.4 Percentual de células B(IGM+) em linfócitos circulantes de cães
irradiados................................................................................................48
Figura 5.5 O histograma de fluorescência mostra a intensidade de fluorescência
avaliados num canal médio de fluorescência que vai de 0 a 1023, para o
número absoluto de receptores para CD4+...........................................51
Figura 5.6 Percentual médio de linfócitos CD4+ em linfócitos de cães
irradiados................................................................................................51
Figura 5.7 O histograma de fluorescência mostra a intensidade de fluorescência
avaliados num canal médio de fluorescência que vai de 0 a 1023, para o
número absoluto de receptores para CTLA-4........................................54
Figura 5.8 Percentual médio de linfócitos CTLA-4 em linfócitos CD5+ de cães
irradiados................................................................................................54
Figura 5.9 O histograma de fluorescência mostra a intensidade de fluorescência
avaliados num canal médio de fluorescência que vai de 0 a 1023, para o
número absoluto de receptores para IL-2...............................................57
12
Figura 5.10 Percentual médio de linfócitos CD5+ de cães irradiados, co-
expressando o receptor para IL-2..........................................................57
Figura 5.11 O histograma de fluorescência mostra a intensidade de fluorescência
avaliados num canal médio de fluorescência que vai de 0 a 1023, para o
número absoluto de receptores para CD14...........................................59
Figura 5.12 Percentual médio de monócitos de cães irradiados, co-expressando o
receptor CD14+......................................................................................59
Figura 5.13 O histograma de fluorescência mostra a intensidade de fluorescência
avaliados num canal médio de fluorescência que vai de 0 a 1023, para o
número absoluto de receptores para MHCII...........................................62
Figura 5.14 Expressão de MHCII a partir de células de cães irradiados, avaliados
pelo canal de fluorescência (CMF), considerando os valores negativos
para o canal médio com valores inferiores a 200...................................62
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
APCs – Antigen Presenting Cell (Célula apresentadora de antígeno)
BBL – Biological Cabinet
CD – Cluster of Differenciation
CMF – Canal Médio de Fluorescência
CTLA-4 – Cytotoxic T Lymphocyte Antigen -4
DNA – Ácido Desoxirribonucléico
DL – Dose letal
FACs – Fluorescence Activated Cell Sorter
FITC – Isotiocianato de fluoresceína
FSC – Forward Scatter (Tamanho celular)
HLA - Human Lymphocyte Antigen
Ig – Imunoglobolina
IgM – imunoglobulina M
13
IL – interleucinas
IL-2R – receptor para Interleucina IL-2
LET – transferência linear de energia
MALT - tecido linfóide associado à mucosa (linfonodos localizados ao redor do
trato respiratório superior e inferior)
GALT - tecido linfóide associado ao intestino
MEM – minimal essential medium
MHC – complexo maior de histocompatibilidade
NK – natural killer
PBMC – células sangue periférico
PBS – phosphate buffer saline (Tampão)
PVP – polivinil pirrolidona
SAR – síndrome aguda da radiação
SSC – sides Scatter (Granulosidade celular)
Th – células T helper (auxiliar)
14
CAPÍTULO 1
1 - INTRODUÇÃO
As radiações ionizantes promovem alterações biológicas funcionais do organismo
humano podendo até levar a morte celular. Estas modificações dependem,
basicamente, do nível da dose absorvida no tecido, da taxa de dose, do tipo de
exposição (crônica - aguda), bem como da área corporal da exposição (corpo
inteiro - localizada) e do tempo de exposição. Quanto maiores as taxas de dose, a
dose absorvida e o tempo de exposição maior serão as probabilidades de danos e
de mutações precursoras de câncer e de morte celular comprometendo órgãos
e/ou tecidos com suas respectivas funções prejudicando nosso metabolismo
biológico. (FENTIMAN, 1990).
A radiação exerce efeito citotóxico seletivo em células cancerosas, mas ainda não
é completamente conhecido; no entanto, as células em divisão são
radiossensíveis, e conseqüentemente células tumorais rapidamente proliferativas
são especialmente vulneráveis à radiação. Um dos efeitos colaterais do
tratamento radioterápico é a ação citotóxica, em doses terapêuticas, sobre células
em divisão de tecidos normais (FENTIMAN, 1990).
A energia de uma radiação pode ser transferida para o DNA modificando sua
estrutura, o que caracteriza o efeito direto. Efeitos indiretos ocorrem em situações
em que a energia é transferida para uma molécula intermediária (água, por
exemplo) cuja radiólise acarreta a formação de produtos altamente reativos,
capazes de lesar o DNA. (SALVAJOLI et al., 1999). Para proteínas, o dano é visto
como a perda de grupos de cadeias laterais e mudanças nas estruturas
secundárias e terciárias (conformação) da molécula protéica. O dano da radiação
para lipídios envolve a formação de peróxidos de ácidos graxos insaturados.
(SALVAJOLI et al, 1999).
15
No caso de ácidos nucléicos, as mudanças incluem a perda de bases, danos às
bases e quebra em um ou ambos os filamentos da dupla hélice do DNA.
(SALVAJOLI et al, 1999). Existem citocinas liberadas no meio de células humanas
irradiadas em cultura de tecidos que podem ser secretadas localmente dentro de
tumores, tecidos normais ou na circulação sistêmica e em pacientes que recebem
tratamento de radioterapia que trazem uma gama de efeitos como pneumonias,
fadiga, anorexia e injúria vascular. (SALVAJOLI et al, 1999).
O quadro sanguíneo altera-se já a partir de 0,25Gy de corpo inteiro. Todas as
células do sangue são alteradas, obedecendo, no entanto, a certo grau de
radiosensibilidade. Em geral os primeiros elementos a desaparecerem são os
linfócitos (em poucas horas), depois os granulócitos (alguns dias), em seguida as
plaquetas e, finalmente os eritrócitos (algumas semanas). Antes da linfocitopenia
há hiperleucocitose passageira (somente neutrófilos) com redução dos eusinófilos
e, logo a seguir, dos linfócitos. A leucopenia reinstala-se dois a três dias depois e
envolve todas as células brancas (STEWART e NICHOLSON, 2000).
Em geral, em seguida ao oitavo dia após a exposição a radiação ionizante inicia-
se a fase de regeneração da série linfática, mesmo antes que a neutrofilopenia
tenha chegado ao nível mais baixo. Usualmente a regeneração total da séria
branca se dá 4 a 6 semanas após as irradiações. Os linfonodos assim como as
formações linfáticas do organismo são altamente sensíveis. Observam-se as
primeiras alterações a partir de uma dose de 0,25 a 0,50Gy, e são totalmente
destruídos após doses de 4 a 6 Gy (STEWART e NICHOLSON, 2000).
Após uma dose de 8Gy de radiação, o baço fica reduzido acentuadamente de
volume no primeiro dia e, depois de uma semana ou mais se torna, pequeno,
vermelho escuro e de consistência firme. Atrofiam-se os corpúsculos de Malpighi.
Poucos minutos após a irradiação há paralisação da atividade miótica das células
do centro germinativo, e em poucas horas tanto os linfócitos da polpa vermelha
quanto os da branca são destruídos (STEWART e NICHOLSON, 2000).
16
O fígado é considerado altamente resistente, mas, tal conceito deve ser
modificado, pois, demonstrou-se à existência de lesões bastante profundas dos
mitocôndrios dos hepatócitos e do epitélio renal, após pequenas doses de
radiação ionizante. Lesões dos hepatócitos visíveis ao microscópio óptico foram
encontradas após a ação de 10Gy a 40Gy (esteatose, necrose). Com doses de
18,80 a 52,50Gy produziram esfacelo dos hepatócitos (STEWART e NICHOLSON,
2000).
No caso da hipófise as lesões são menores no lobo anterior do que no posterior e
ocorrem após altas doses. Grandes doses aplicadas sobre a cabeça produziram
aumento dos hormônios tireotróficos e gonodotróficos (STEWART e NICHOLSON,
2000).
Deve-se ressaltar, que as radiações ionizantes são capazes de trazer benefícios,
quanto produzir efeitos deletérios no tecido sadio, tornando-se de extremo
interesse a ampliação do conhecimento acerca dos métodos que nos permitem
visualizar e compreender mais claramente o papel dos componentes celulares
sobre os mecanismos de resposta imune, bem como daqueles que levam a
quadros imunossupressivos e/ou anérgicos em patologias graves (STEWART e
NICHOLSON, 2000).
A caracterização imunofenotípica tem sido o método preferencial para a
determinação das linhagens celulares e análise da maturação das células nas
neoplasias hematológicas. O desenvolvimento de ampla gama de anticorpos
monoclonais e das potencialidades do citômetro de fluxo, têm impulsionado esta
área nos últimos 20 anos. A citometria de fluxo é uma ferramenta metodológica
que avalia as características fenotípicas, bioquímicas ou moleculares de células. O
citômetro de fluxo avalia propriedades das células como tamanho, granulosidade,
além da complexidade interna, como componentes internos, externos e conteúdo
de DNA, avaliados através de tipos de fluorescências obtidas do sangue periférico
dos animais utilizando-se o software cell quest acoplado ao citômetro.
Sumariamente, a técnica consiste na passagem de células por um feixe de laser
que cria sinais que são colecionados por uma série de detectores acoplados ao
17
citômetro, sendo que estes são capazes de traduzir sinais claros em sinais
eletrônicos, que por sua vez, são registrados e então analisados através de
computador que fornecem gráficos (STEWART e NICHOLSON, 2000).
Dessa forma, a citometria de fluxo torna-se uma ferramenta valiosa para
determinação de linhagens celulares, permitindo, ainda, com a utilização de
marcadores de interesse para a caracterização de estadio de maturação das
células malignas no diagnóstico diferencial entre neoplasias, identificação da
clonalidade através da restrição de cadeia leve de imunoglobulina, caracterização
da heterogeneidade e dos aspectos aberrantes das populações de células
malignas; permitindo então, aplicar essas observações no monitoramento das
células sadias e doentes na radioterapia e detecção de doença residual mínima
(STEWART e NICHOLSON, 2000).
18
CAPÍTULO 2
2. Revisão de conceitos
2.1 – Introdução
A divisão celular é o processo pelo quais células se reproduzem e se dividem de
duas formas: divisão celular somática ou mitose e divisão celular reprodutiva ou
meiose. A mitose garante que cada célula filha carregue o mesmo número e tipo
de cromossomos do que a célula mãe original e, assim, o mesmo material
hereditário e potencial genético. Esta divisão permite um aumento do número de
células no corpo e é por meio dela que as células danificadas ou mortas são
substituídas e assim novas células são acrescentadas ao crescimento do corpo. O
segundo tipo de divisão é o mecanismo em que os espermatozóides e os óvulos
são produzidos (TORTORA, 2000).
A palavra oncologia deriva de onco que significa inchaço ou massa e logos de
estudo. A neoplasia origina no descontrole de crescimento celular, no processo
de mitose ou na morte por apoptose, podendo ser malignas e benignas
(TORTORA, 2000). As neoplasias benignas não se espalham para outras partes
do corpo. No caso destas interferir com a função normal do corpo ou se forem
desfigurantes, devem ser removidas. Já as malignas são capazes de se
duplicarem de forma descontrolada e rápida e infiltrarem nos tecidos adjacentes.
Esse crescimento descontrolado é chamado de hiperplasia. Células cancerosas
também têm a propriedade de metástase que é a capacidade de colonizar outras
partes do corpo se transportando pelo sistema linfático ou sanguíneo. À medida
que o câncer cresce, ele se expande e começa a competir com os tecidos normais
por espaço e nutrientes. Desse modo o tecido normal sofre alterações metabólicas
e está sujeito à atrofia e morte de suas células (TORTORA, 2000).
O câncer não é uma doença única e as células cancerosas não se comportam da
mesma maneira. Algumas células são metastáticas e outras não; algumas células
se dividem, outras não; algumas são sensíveis a drogas, outras são resistentes.
19
A quimioterapia, a radioterapia (externa e interna), a cirurgia, a criotermia
(congelamento), a hipertemia (temperatura anormalmente alta) e a imunoterapia
(reforçando as próprias defesas do organismo) podem ser utilizadas
individualmente ou combinadas (TORTORA, 2000).
2.2 - Radioterapia
Radioterapia, cirurgia e quimioterapia correspondem às principais alternativas de
tratamento do câncer, sendo cada vez mais utilizadas de forma combinada. Além
delas, hormônios e modificadores da resposta biológica têm lugar nesse arsenal
terapêutico. A radioterapia é uma ferramenta bastante eficaz no tratamento do
câncer. Quando bem indicada, os riscos envolvidos na sua utilização são
amplamente superados pelos benefícios que traz (BRASILEIRO, 2002).
Radioterapia é o uso de radiações ionizantes com o objetivo de destruir ou inibir o
crescimento de células com comportamento anormal no organismo.
A radioterapia é mais freqüentemente empregada no tratamento de neoplasias
malignas e benignas. Tem como objetivo eliminar os tumores ou impedir sua
progressão, sendo utilizada de forma isolada ou associada a outro recurso
terapêutico. Além disso, pode ser indicada para reduzir tumores que estejam
causando dor ou comprimindo outros órgãos (BRASILEIRO, 2002).
Existem duas formas de tratamento com radiação: a teleterapia e a braquiterapia,
que podem ser utilizadas isoladamente ou de forma combinada. A teleterapia, ou
radioterapia externa é a forma de radioterapia mais freqüentemente empregada.
Os raios, produzidos por um acelerador linear, são direcionados para o corpo do
paciente, atingindo o tumor e as regiões mais próximas. Na braquiterapia, a
radiação provém de materiais radioativos que são colocados no interior do
paciente, próximos às estruturas a serem tratadas, de forma temporária ou
permanente (PEREZ, 1997; BRASILEIRO, 2000).
20
A radioterapia pode ser aplicada de forma isolada. Entretanto, cada vez mais as
diferentes modalidades existentes para o tratamento do câncer são empregadas
de forma combinada. Como exemplo, aplicada antes da cirurgia, determinando
uma redução do tumor após a remoção do tumor, buscando-se eliminar eventuais
células do câncer, residuais no sítio cirúrgico. Tem seus efeitos restritos à área
sobre a qual é aplicada. Por isso, nos casos de doença avançada, é
freqüentemente associada a terapias com ação sistêmica, como quimioterapia e
tratamento hormonal. Quando aplicada simultaneamente à quimioterapia, a
radioterapia pode ter seus efeitos potencializados (BRASILEIRO, 2002).
É possível combinar cirurgia e radioterapia em uma mesma intervenção. Nesses
casos, a cirurgia é realizada no centro cirúrgico do serviço de radioterapia e, após
a exérese do tumor, a radiação é aplicada sobre o campo operatório. Está técnica
é dita radioterapia intraoperatória. Eventuais células cancerosas que não puderam
ser removidas durante a operação são eliminadas.A teleterapia é uma modalidade
de radioterapia em que a fonte de radiação é externa ao paciente, posicionada a
no mínimo 20 cm de sua superfície. A teleterapia foi introduzida na prática médica
no início do século, expandiu na década de 30 devido ao desenvolvimento dos
aparelhos de radioterapia convencional com energias superiores a 130 KV (kilo-
volts), permitindo o tratamento de tumores superficiais. Nas décadas de 40 e 50
surgiram as bombas de cobalto e os aceleradores lineares, com energias de MeVs
(mega-eletron-volts), possibilitando o tratamento de tumores profundos. Os
equipamentos utilizados em teleterapia com raios-X são os aceleradores lineares,
máquinas de raios-X e os equipamentos com fontes radioativas (NARAYAN,
2004).
A radioterapia externa é geralmente realizada em uma única sessão diária durante
cinco dias da semana. Em alguns casos, pode ser indicado o regime de
hiperfracionamento, com a aplicação de duas ou mais doses intervaladas no
mesmo dia. Durante as sessões de tratamento, o paciente é posicionado para a
aplicação, junto ao aparelho de radioterapia, de acordo com as marcas em sua
21
pele, reproduzindo as condições da simulação. Em alguns casos são utilizados
blocos protetores, colocados no aparelho, capazes de proteger das radiações
áreas do corpo especialmente sensíveis. As aplicações são realizadas com o
aparelho em diferentes posições, orientadas pelas marcas dos campos de
radiação (NARAYAN, 2004).
Cada sessão leva de 5 a 20 minutos, sendo que a radiação é aplicada de 1 a 5
minutos. A dose total de radiação depende do tipo da doença, das dimensões e
localização do tumor e das condições clínicas do paciente. Na maioria dos casos,
o tratamento dura entre 6 e 7 semanas. O fracionamento das doses (doses
diárias, distribuídas ao longo de várias semanas) e os intervalos das aplicações
(descanso nos fins de semana) foram estabelecidos para permitir a recuperação
dos tecidos normais atingidos pela radiação (NARAYAN, 2004).
2.3 - A radiação ionizante e seus efeitos biológicos
A radiação ionizante pode produzir mudanças estruturais em várias classes de
macromoléculas encontradas nas células. A radiação pode resultar na indução de
genes de respostas aguda e tardia e que o produto desses genes, especialmente
citocinas e fatores de crescimento, possa influenciar a resposta dos tecidos. Os
fatores de crescimento, por exemplo, o fator de necrose tumoral, são sintetizados
e secretados pelas células sobreviventes à radiação. Moléculas semelhantes ao
fator de crescimento secretado da parede dos vasos sanguíneos podem promover
proliferação de células musculares lisas e participar da proliferação anormal de
células endoteliais e do início da fibrose pós-irradiação. A proliferação de células
endoteliais e células de músculo liso em artérias de pequeno calibre, seguida pelo
estreitamento na luz dos vasos sanguíneos, tem sido observada após a irradiação,
produzindo um decréscimo no fluxo sanguíneo, anóxia, necrose e substituição dos
elementos constituintes do tecido normal por fibrose. (SALVAJOLI et al, 1999).
O corpo humano é constituído por cerca de 5 x 10
12
células, muitas das quais
altamente especializadas para o desempenho de determinadas funções. Quanto
22
maior o grau de especialização, isto é, quanto mais diferenciada for à célula, mais
lentamente ela se dividirá. Uma exceção significativa a essa lei geral é dada pelos
linfócitos, que, embora só se dividam em condições excepcionais, são
extremamente radiossensíveis. As células têm uma eficiente capacidade de
reparar danos. Por isto, nem todos os efeitos da radiação são irreversíveis. Em
muitos casos, as células são capazes de reparar todos os danos induzidos pela
radiação (SALVAJOLI et al, 1999).
Em alguns casos, no entanto, o dano é muito extenso levando a célula à morte.
Em outros casos, a célula é danificada, mas ainda assim consegue se reproduzir.
As células filhas terão falta de algum componente e morrerão. Finalmente, a célula
pode ser afetada de tal forma que não morre e é modificada. As células
modificadas se reproduzem e perpetuam a mutação, o que poderá significar o
começo de um tumor maligno. Um exemplo de sistema celular muito sensível é
um tumor maligno. A camada externa de células se reproduz rapidamente e
também tem um bom suprimento de sangue e oxigênio. As células são mais
sensíveis quando estão se reproduzindo e a presença de oxigênio aumenta a
sensibilidade à radiação. Células com oxigênio insuficiente tendem a ser inativas,
tais como as células localizadas no interior do tumor maligno (STEWART e
NICHOLSON, 2000).
A etapa celular e ao estágio tissular para os estágios temporais da ação das
radiações. A etapa celular se identifica por alterações ultra-estruturais da célula
que podem às vezes ser observada logo após a irradiação. Protrusões localizadas
da membrana plasmática, por exemplo, podem se observados minutos depois da
exposição celular a doses relativamente elevadas de radiação. Em poucas horas
estas alterações são seguidas por distensão da membrana e mais tarde por
invaginações da membrana nuclear. Estes efeitos são acompanhados por
variações da permeabilidade da membrana e perda de enzimas essenciais.
Contudo, os efeitos mais importantes (por exemplo, a perda ou modificação de
funções celulares que ocorrem a níveis muito mais baixos de radiação) podem ser
observados apenas após períodos mais prolongados. A perda da capacidade
23
reprodutiva é evidente apenas quando a célula não consegue se dividir; e
aberrações cromossômicas ou mutações celulares são observáveis apenas após
um número de divisões celulares suficiente para permitir a análise de células
aberrantes na população celular geral. Da mesma forma, a determinação de
alteração da capacidade de reparo das células irradiadas, processo que
normalmente se completa poucas horas depois da irradiação, geralmente requer
análise clonal de populações celulares irradiadas. Apesar disso, conhecemos
perfeitamente os estágios do ciclo celular nos quais os danos por irradiação são
mais críticos. As células de mamíferos são geralmente mais radiossensíveis
durante a mitose, e geralmente mais radiorresistentes no começo da fase S de
divisão celular, embora isto dependa muito da qualidade da radiação (STEWART
e NICHOLSON, 2000).
No estágio tissular, os tempos de resposta dos tecidos de mamíferos à exposição
à irradiação variam muito, assim como sua suscetibilidade. A observação de que
as células de mamíferos mostram suscetibilidade máxima à radiação durante a
mitose, sugere, inicialmente, que a célula-ovo fertilizada (zigoto) seria altamente
suscetível à radiação e, além disso, que em um animal os tecidos mais
radiossensíveis seriam aqueles que se renovam mais rapidamente. As células
precursoras rapidamente proliferantes do sistema hematopoiético e do epitélio
intestinal são particularmente suscetíveis e respondem muito mais rapidamente
que os tecidos moderadamente suscetíveis como o pulmão e a camada basal da
pele. O tempo necessário para danificar e destruir o tecido normal depende da
dose de radiação (STEWART e NICHOLSON, 2000).
Para o DNA os efeitos das radiações ionizantes dependem de fatores como tipo
de radiação, pH do meio, temperatura, teor de oxigênio, presença de receptores
de radicais livre, características do próprio DNA e a possibilidade de reparação
dos produtos induzidos pela radiação. Entre os efeitos estão alterações estruturais
das bases nitrogenadas e das desoxirriboses, eliminação de bases, rompimento
de pontes de hidrogênio entre duas hélices, rotura de uma ou duas cadeias,
ligações cruzadas entre moléculas de DNA e proteínas (PEREZ, 1998). Os efeitos
24
biológicos da radiação são divididos em duas categorias. A primeira categoria
consiste de exposição a altas doses de radiação em breve intervalos de tempo,
caracterizada por uma exposição única. A segunda categoria é formada pela
exposição a baixas doses de radiação num período de tempo mais extenso,
caracterizada por uma exposição crônica ou fracionada à radiação. Efeitos agudos
e crônicos podem ser observados nestas exposições, Exposições em intervalos de
tempo curto em altas doses podem produzir efeitos deletérios, descritos pelas
síndromes de radiação aguda (PEREZ, 1998).
Alguns efeitos de altas doses podem ser citados. O primeiro, a perda de cabelo
(epilação) que é similar aos efeitos na pele e ocorre depois de doses agudas de
cerca de 5Gy. Outro, a esterilidade temporária ou permanente em homens,
dependendo da dose. Em mulheres, é geralmente permanente, mas para isto
requer-se doses altíssimas, da ordem de 4 Gy nas células reprodutivas. As
cataratas (turvamento da lente do olho) surgem para um limiar de dose de 2 Gy.
Os nêutrons são especialmente relacionados com as cataratas, devido ao fato do
olho conter água e esta ser absorvedora de nêutrons. Na síndrome aguda de
radiação (SAR) vários tecidos importantes e órgãos são danificados, pode-se
produzir uma reação aguda. Os sinais iniciais e sintomas de SAR são náusea,
vômito, fadiga e perda de apetite. Abaixo de 1,5 Gy, estes sintomas que são
diferentes daqueles produzidos por uma infecção viral podem ser a única
indicação externa de exposição à radiação. Acima de 1,5 Gy, uma das três
síndromes de radiação. A síndrome hematopoiética que afeta órgãos formadores
do sangue; a síndrome gastrointestinal e a do sistema nervoso central, esta última
afetando o sistema neuromuscular (PEREZ, 1998).
Doses diferentes de radiação levam à respostas biológicas diversas. Com menos
de 0,05 Gy nenhum efeito imediato é observado.Com doses entre 0,05 e 0,50 Gy
ocorre uma ligeira variação na contagem de células do sangue. Doses de 0,50 a
1,5 Gy levam a uma ligeira variação na contagem de células do sangue e
sintomas de náusea, vômito, fadiga, etc. Em doses de 1,5 a 11 Gy, severas
25
mudanças no sangue serão notadas e os sintomas aparecem imediatamente.
Aproximadamente 2 semanas depois, algumas pessoas expostas morrem.
Aqueles expostos a doses de 3 a 5 Gy, a metade morrerão dentro de 30 dias sem
tratamento médico intensivo. A morte ocorre devido a destruição dos órgãos
formadores do sangue. Sem glóbulos brancos, as infecções aparecem. Na
margem inferior desta faixa de dose, o isolamento, antibióticos e transfusões
podem ajudar a medula a gerar novas células e o paciente poderá se recuperar
totalmente. Na margem superior desta faixa, é necessário um transplante de
medula (PEREZ, 1998).
2.4 – Considerações básicas sobre Imunologia
2.4.1 - Órgãos do sistema imune
Os órgãos linfóides primários – medula óssea e timo, são locais do
desenvolvimento e maturação das células da resposta imune; os órgãos linfóides
secundários – linfonodos, baço, tecido linfóide associado à mucosa (MALT) e
tecido linfóide associado ao intestino (GALT) organizam a resposta imune. As
células brancas tornam-se especializadas nos órgãos secundários e os linfócitos
recirculam através do sangue, órgãos linfóides secundários e vasos linfáticos, num
processo organizado de vigilância imune (PEAKMAN e VERGANI, 1999).
2.4.2 – Células do sistema imune
O sistema imune assemelha-se a outros elementos da fisiologia dos mamíferos,
sendo composto de células especializadas que funcionam dentro de estruturas
anatômicas discretas e organizadas. A medula óssea é a fonte das células
precursoras que, posteriormente, originam os constituintes celulares do sistema
imune, com exceção de um breve período – a vida fetal, quando o fígado constitui
também um local de desenvolvimento das células do sistema (PEAKMAN e
VERGANI, 1999).
A produção das células imunes é um processo pelo qual todas as células que
circulam no sangue surgem e maturam, sendo componentes da hematopoiese. A
célula precursora capaz de originar todas as linhagens de células sanguíneas,
26
variando de plaquetas até os linfócitos é chamada célula-tronco hematopoiética
pluripotente (PEAKMAN & VERGANI, 1999).
Os granulócitos – 65%, eosinófilos, neutrófilos e basófilos circulam no sangue e
estão envolvidos nas respostas inflamatórias; os monócitos – 5% a 10% – migram
rapidamente no sangue para originar a forma tissular, chamada macrófago. Os
macrófagos especiais existem em diferentes tecidos, como nas células de Kupffer
no fígado. As células dentríticas, derivadas da medula óssea, ativam e dão
estímulos iniciais aos linfócitos; os linfócitos – 25 - 35% – dividem-se em dois
subtipos principais: B e T que estão presentes na quantidade de um para cinco.
Os linfócitos B realizam o reconhecimento do antígeno e como células plasmáticas
nos tecidos, eles secretam anticorpos; e os linfócitos T são células chave na
resposta imune distinguindo entre o "próprio", os tecidos estranhos e os agentes
infecciosos (PEAKMAN e VERGANI, 1999).
2.4.3 Linfócitos T e marcadores de superfície
Estudos-chave feitos na década de 50 mostraram que os linfócitos eram células
responsáveis por duas respostas imunológicas mensuráveis: a produção de
anticorpos e a rejeição de enxertos. A remoção cirúrgica do timo aboliu
efetivamente a capacidade de um hospedeiro rejeitar um transplante de tecido, e
os linfócitos supostos de derivar do timo foram denominados linfócitos T (CALICH
et al, 1988).
Identificação dos linfócitos: a célula T é caracterizada pela presença do seu
receptor de antígeno. Juntamente com a expressão do receptor, encontra-se a
presença constitutiva de um complexo de moléculas, denominado CD3, CD4,
CD8; marcadores responsáveis por promover a resposta imunológica, tal como a
produção de anticorpos (PEAKMAN e VERGANI, 1999).
Como célula central das respostas imunológicas, poder-se ia pensar que a célula
T pudesse influenciar a maior parte dos aspectos da imunidade, mas isto não é de
todo a verdade. Muito do alcance funcional é feito por meio da secreção de
27
citocinas, fator solúvel de pequeno peso molecular, liberada pelas células para
comunicá-las entre si e influenciar a função de outras células através de
específicos receptores de superfície, embora a interação direta célula-célula com
as células B seja também importante na maturação das respostas por anticorpos.
As mais importantes funções dos linfócitos T são a sinalização para a
multiplicação da célula B, induzindo-a a produzir anticorpos e diferenciar em
plasmócitos ou células de memória; recrutamento e ativação de células da
linhagem mononuclear fagocítica; recrutamento e ativação de células T citotóxicas
especializadas em respostas antivirais; secreção de citocinas responsáveis pela
multiplicação e diferenciação de uma série de tipos celulares, incluindo outras
células T, macrófagos e eosinófilos e regulação das reações imunológicas
(PEAKMAN e VERGANI, 1999).
Uma vez que as células T sejam ativadas, elas passam a exibir um receptor
adicional, chamado CTLA-4 que se assemelha muito com a seqüência de CD28.
As moléculas B7, presentes na superfície das APCs, ligam-se com mais avidez a
CTLA-4, presente na superfície de células T, do que a CD28. A ligação de B7 a
CTLA-4 emite um sinal inibitório à célula T ativada para que a resposta
proliferativa seja efetivamente interrompida e para que seja produzida uma menor
quantidade de IL-2, fator de crescimento para a célula T. Assim, a ligação de
CTLA-4 às moléculas B7 é essencial para diminuição da resposta proliferativa das
células T ativadas ao antígeno e à molécula B7na superfície das APCs
(PEAKMAN e VERGANI, 1999).
2.4.4 Linfócitos B e marcadores de superfície
Na espécie humana, os linfócitos B desenvolvem-se inicialmente no fígado fetal e
transfere-se para a medula óssea por volta da 12ª e 16ª semana da vida fetal. A
partir daí, a medula óssea é o único local de geração dos linfócitos B, os quais
podem sofrer diferenciação final em células plasmáticas, células não-circulantes,
encontradas predominantemente na medula óssea, no linfonodo e no intestino, e
cujo papel é a produção e secreção de anticorpos (CALICH et al, 1988).
28
Os linfócitos B são indistinguíveis dos linfócitos T por microscopia eletrônica. São
melhor identificados pelas proteínas de superfície, sendo a mais óbvia a
imunoglobulina de superfície. As moléculas de superfície sobre os linfócitos B
usados na identificação destas células são: CD19, CD20, CD21, CD40, CD23.
(CALICH et al, 1988).
Os linfócitos B são um componente da resposta imune adquirida, que possui duas
características principais de especificidade e memória. Os papéis mais
importantes dos linfócitos B estão em assegurar a produção de anticorpos contra
antígenos-alvo apropriados, com a ajuda das células T e proporcionar-lhes sinais
de ativação ao apresentar o antígeno (PEAKMAN e VERGANI, 1999).
2.4.5 Células natural killer
As células natural killer (NK) são o terceiro membro, depois dos linfócitos T e B,
das populações celulares tipicamente chamadas de linfóides, com base em suas
semelhanças morfológicas, distribuição e função. O nome é derivado de duas
características, a capacidade de mediar sua função efetora ("matar" as células-
alvo) espontaneamente na ausência de sensibilização anterior para aquele alvo
específico; daí os termos "matadora e natural". Elas podem ser identificadas pela
incubação com certos tipos de células-alvo numa prova de citotoxicidade; as
células-alvo escolhidas para uso neste ensaio são, particularmente, sensíveis à
morte tipo NK e incluem certos tipos de células tumorais. São maiores que os
linfócitos T e B típicos, em termos fisiológicos as NK realizam a vigilância
imunológica contra células tumorais e infectadas por vírus; liberam citocinas no
início da infecção, para ativar células fagocíticas e recrutar linfócitos T (PEAKMAN
e VERGANI, 1999).
Os marcadores utilizados para identificar as células NK são os CD16, CD56,
CD57, e não apresentam CD3, o marcador geral da célula T. A ativação dessas
células ocorre com a efetivação de um "estado ativado" induzido por citocinas e
pela ativação da lise induzida pelo contato célula-célula. A interleucina-2 (IL-2) e a
29
IL-12 são as principais citocinas responsáveis pela ativação geral das células NK
(PEAKMAN e VERGANI, 1999).
2.4.6 - Respostas imunes celulares
Linfócitos, monócitos, granulócitos e outras células têm receptores e moléculas de
superfície que são vitais em uma gama completa de funções imunológicas:
sinalização célula-célula, ativação celular, sinalização hormônio-receptor e muitas
outras. A superfície das células imunológicas é literalmente coberta com tais
proteínas. Diferentes células com funções particulares têm proteínas de superfície
distintas, enquanto outras moléculas são comuns a vários tipos celulares
(PEAKMAN & VERGANI, 1999).
2.4.7 - Anticorpos monoclonais
O anticorpo é uma glicoproteína produzida por linfócitos após a estimulação com
uma macromolécula, o antígeno. Através da interação com a célula, o anticorpo
pode dar ao sistema imunológico inato uma especificidade que por si próprio o
sistema não possui, lembrando que o sistema inato e adquirido funcionam em
conjunto. Os anticorpos podem ser usados para atingir células específicas, sendo
que a função das células alvo é abolida ou diminuída através da lise celular,
dirigida pelos anticorpos, ou da modulação das moléculas de superfície (CALICH
et al, 1988).
A principal saída na definição de moléculas de superfície apareceu na década de
70, com a descoberta dos anticorpos monoclonais. Resumidamente, anticorpos
monoclonais e policlonais são proteínas talhadas para ligar-se a um alvo
específico. São normalmente produzidos injetando a proteína-alvo em
camundongos. Os pesquisadores, nas décadas de 70 e 80, produziram anticorpos
monoclonais injetando camundongos com extratos brutos preparados a partir de
vários tipos de células imunológicas. Alguns dos anticorpos monoclonais gerados
eram capazes de ligarem-se a estruturas sobre as superfícies das células alvo.
Puderam ser usados como instrumentos para distinguir populações de linfócitos
30
com diferentes funções, assim como identificar os neutrófilos e monócitos
(PEAKMAN & VERGANI, 1999).
Devido a vários diferentes anticorpos serem descobertos no mundo inteiro e estes
reconhecerem a mesma proteína de superfície, e as proteínas de superfície
indicarem a diferenciação da célula (por exemplo, granulócito ou linfócito), aos
anticorpos monoclonais foi dado um número de acordo com o grupo de
diferenciação ao qual eles se ligavam. Um grupo de diferenciação é, portanto, uma
molécula de superfície encontrada em células de acordo com a sua linhagem e
diferenciação, sendo identificável por um ou mais anticorpos monoclonais,
chamados CD (CD3, CD4, CD5, etc.) (PEAKMAN e VERGANI, 1999).
Os anticorpos monoclonais e policlonais podem ser produzidos e levados a reagir
com moléculas da superfície celular expressas por todos os linfócitos, pelas
células T, mas não por células B, por algumas subpopulações de células T, como,
por exemplo, CD4+ ou CD8+, ou por células T ativadas, mas não pelas células T
em repouso, como, por exemplo, aquelas que expressam o rIL-2 (CD45) (CALICH
et al, 1988).
2.4.8 - Apoptose
O termo apoptose é aplicado ao processo de morte celular que acompanha,
freqüentemente, as fases de ativação e seleção no sistema imune; isto é nos sítios
de desenvolvimento dos linfócitos (medula óssea e linfonodos para as células B e
timo para as células T). A importância da apoptose pode ser ilustrada através de
um trabalho com camundongos que não possuíam uma molécula-chave no
processo de apoptose. Tal molécula, chamada Fas (CD45), está presente na
superfície da membrana de muitas células, como os linfócitos T. Sinais positivos
recebidos através da Fas instruem as células a morrerem. Na ausência da Fas
nos camundongos, a instrução para apoptose não é dada e então os animais
desenvolveram uma síndrome caracterizada pela proliferação maciça de linfócitos
e aumento dos linfonodos, e isto é freqüentemente associado a complicações
31
adicionais, como a doença auto-imune. Tal modelo serve para sublinhar o
importante papel homeostático da apoptose no sistema imunológico (PEAKMAN e
VERGANI , 1999).
2.4.9 - Citocinas
As citocinas são fatores solúveis de pequeno peso molecular, liberadas pelas
células para comunicá-las entre si e interferir na função de outras células através
dos receptores de superfície específicos. Assim como para os números dos CD, o
rápido crescimento desta área de estudos imunológicos fez com que
pesquisadores adaptassem as nomenclaturas de forma a não criar confusão entre
as citocinas e seus efeitos nas células; portanto os fatores produzidos pelos
linfócitos são chamados de linfocinas; os fatores produzidos pelos monócitos
receberam o nome de monocinas. Mas essa nomenclatura não permaneceu, pois
logo se tornou claro que outras células além destas poderiam secretar tais fatores,
então o melhor termo e mais abrangente é denominado citocinas. E para os
fatores liberados pelas células brancas chamam de interleucinas. (CALICH et al,
1988).
O requisito para uma citocina receber a denominação de interleucina é ser
produzido por leucócitos (mesmo que não exclusivamente), ter efeito sobre a
resposta inflamatória e aguardar que o homólogo humano seja demonstrado. As
principais áreas nas quais as células T auxiliam as funções de outras células são
as que se encontram em relação aos macrófagos, as células B, as outras células
T auxiliares e as células T citotóxicas. Existem perfis de citocinas que subdividem
as células T CD4+ em dois subgrupos, as células T auxiliares 1 e T auxiliares 2,
ou T
H
1 e T
H
2 ; também as de secreção de citocinas misto T
H
0 (PEAKMAN e
VERGANI , 1999).
A IL-4 é um polipeptídio de 20kDa liberado predominantemente pelas células T
H
2,
que têm importantes efeitos em relação à função da célula T e, especialmente da
célula B. A IL-5 é de 40 kDa é liberada pelos linfócitos T
H
2 e, também, por
mastócitos ativados. A principal ação é a proliferação e diferenciação dos
32
eosinófilos, bem como para ativar eosinófilos maduros. São de importância
antiparasitária e da resposta imunológica alérgica. A IL-6 é uma citocina de 26
kDa, secretada principalmente pelas células do sistema mononuclear fagocítico,
células endoteliais e células T ativadas do tipo T
H
2. Tem papel principal na
resposta da fase aguda em episódios inflamatórios; ela induz o fígado a sintetizar
proteínas plasmáticas envolvidas nas reações de fase aguda, tais como fatores da
coagulação e do complemento e proteína C reativa. Também provoca potente
efeito sobre as células B e em tumores malignos de plasmócitos chamados
mielomas. A IL-10 tem como fonte as células T CD4+, macrófagos ativados e
células B, inibe a liberação das citocinas, tais como o TNF-α e a IL-1 pelos
macrófagos, inibindo, ainda, as funções celulares acessórias dos macrófagos na
ativação da célula T. O resultado líquido destas ações é a supressão das
respostas imunológicas da célula T. Essa citocina suprime a inflamação por vários
mecanismos imunológicos, incluindo a redução da expressão de HLA classe II,
redução da secreção de IL-2 pelas células T e diminuição de outras citocinas
como fator de necrose tumoral e IL-8 pela ativação de monócitos e macrófagos
(PEAKMAN e VERGANI , 1999).
2.5 – Como ocorre a ativação do linfócito
A ativação dos linfócitos requer, pelo menos, dois sinais: antígeno mais um co-
sinal. Para as células T, as moléculas CD4, CD8, CD45, moléculas de adesão, e
moléculas co-estimulatórias, tais como CD28, fornecem os co-sinais. Para as
células B, CD22, CD40, CD19, CD20 e CD45 têm o mesmo papel. Para ser
efetivo, o sinal deve ser transduzido e amplificado dentro do linfócito por uma série
de reações (CALICH et al, 1988).
A atividade junto à membrana deve ser traduzida por eventos intranucleares
destinados a equipar a célula para produzir uma resposta apropriada, por
exemplo, a proliferação de citocinas. O processo de ativação ocorre através da
transdução do sinal e a amplificação. Na sua forma mais simples, os
acontecimentos intracelulares de transdução envolvem geração inicial de enzimas
33
capazes de fosforilar a tirosina protéica, ativação inicial da via do fosfatidilinositol
da membrana, que leva à geração de altos níveis de cálcio intracelular, ativação
subsequente de outras proteínas celulares, ativação de proteínas de ligação e
ativação de eventos transcricionais nucleares (PEAKMAN e VERGANI, 1999).
Enquanto que a amplificação dos sinais é necessária, porque o número de
receptores de superfície dos antígenos efetivamente sinalizadas por células T e
respondedoras é sabidamente muito pequeno. Sem estes sinais adicionais de
amplificação, é improvável que o linfócito possa gerar um impulso suficiente para
se tornar ativado. Uma importante amplificação é fornecida pelas atividades
enzimáticas nas moléculas acessórias das células T e B, notoriamente CD4/CD8
nas células T, e o complexo CD19-CD21-CD81, e as moléculas CD20, CD22 e
CD40 nas células B. A molécula CD45 fornece quantidades críticas de atividade
tirosina fosfatase para os dois tipos celulares. Uma vez na periferia, as células T
são as células centrais nas respostas imunológicas. Através do contato célula-
célula e da secreção de uma série de poderosas citocinas, que ativam e
promovem a proliferação de outras células T, células B, monócitos e granulócitos.
As células T citotóxicas matam, pela lise celular induzida ou apoptose, células-alvo
que expressam um antígeno específico (CALICH et al, 1988).
2.6 - Como ocorre a imunossupressão pelos linfócitos T
Em qualquer sistema fisiológico, existe um papel-chave para a regulação negativa,
ou supressão das ações das células envolvidas, e o sistema imunológico não
constitui exceção. Um dos modos mais elegantes em que tal supressão
imunológica pode ser demonstrada é pela transferência, de um animal
experimental para outro, de uma população de células inibidoras; no referido
estudo a supressão da produção de anticorpos é induzida pela administração de
uma dose excessiva de antígeno. Através da liberação de citocinas, pela liberação
de receptores solúveis e pelo contato direto célula-célula é possível identificar o
modo como os linfócitos T agem (PEAKMAN e VERGANI, 1999).
34
2.7 – A técnica de citometria de fluxo
Citometria de fluxo é uma técnica para fazer rápidas medidas sobre partículas ou
células que estão no fluido corrente, uma por uma, até o fim, detectando a
marcação. É um método que utiliza parâmetros de dispersão de luz e
fluorescência para “classificar” e quantificar tipos ou sub-populações celulares. O
método utiliza um aparelho capaz de ler vários parâmetros (de dois a 13
dependendo do tipo de máquina e análise), simultaneamente, para cada célula ou
microorganismos, com base nas suas características físicas como tamanho
granulosidade e ligação dos anticorpos monoclonais marcados com fluocromo; ou
ainda, a citometria de fluxo é um uma ferramenta metodológica que avalia as
características fenotípicas, bioquímicas ou moleculares de células (STITES, 1994).
Como base de funcionamento da citometria de fluxo a dispersão do raio laser após
incidir sobre uma célula o que possibilitou a caracterização da morfologia celular
arquitetura molecular. Com a produção de anticorpos monoclonais aprimorou-se a
técnica possibilitando o estudo de marcadores celulares (STITES, 1994).
O princípio da citometria é a reação de imunofluorescência em meio líquido, como
mostra a figura 2.1, às linhas dentro do tubo representam o laser incidente e o
laser disperso, que tem duas variáveis: a difração que é o prolongamento do laser
num ângulo de 180º e é proporcional ao tamanho celular e a reflexão que
demonstra o desvio da luz num ângulo de 90º e apresenta correlação com a
granulosidade celular, que quanto mais complexa a célula, maior é a
reflexibilidade. Na citometria os grânulos no citoplasma podem dispersar a luz
similarmente a dispersão pelo núcleo da célula. Na figura representa-se em azul
representa a granulosidade celular, isto é, o reflexo da complexidade interna e
contribui para a dispersão do laser em várias direções, sendo que o ângulo de 90º
é o que melhor fornece essa característica celular. A linha de cor verde mostra a
fluorescência verde e a linha vermelha à fluorescência vermelha. Estas cores são
resultados de fluocromos 9AMCA, FITC - verde; CY-3 azul; PE, Rhodamina,
Texas Red - vermelhos mas que emitem cor laranja; CY-5, Allphycocianina (APC)
35
, PerCP-(FL3) (azuis mas emitem cor vermelha), substâncias fluorescentes
capazes de emitir luz (fluorescência) quando excitadas pelo laser (STITES, 1994).
Figura 2.1 – Representação esquemática do método de citometria de fluxo.
Neste método existem filtros seletivos que permitem a passagem de determinados
comprimentos de onda e impedem a passagem de outros. Os sistemas de tubos
dentro do citômetro trabalham sob pressão e esta expulsa o isoton (diluente ou
PBS) para os tubos capilares, que vai estar em contato com as células e arrastar a
população celular para cima. O isoton não deve ser armazenado no reservatório
sob pressão, devido à precipitação dos sais que podem entupir o filtro. Contudo, o
volume ideal de isoton no reservatório tem que ser igual a 2/3 do volume do
mesmo. Não é bom o reservatório estar cheio demais, pois diminui a pressão e
produz uma leitura lenta, nem muito vazio assim produzindo aumento da pressão
e leitura rápida demais. Então o controle do fluxo da amostra é dado pela pressão
no isoton, que no aparelho vai ser detectado pelo feixe de laser (STITES, 1994). O
citômetro de fluxo, como pode ser visto na figura 2.2, é acoplado ao software cell
fluorescência vermelha
90º
180º tamanho celular
LASER
dispersão
granulosidade celular
fluorescência verde
36
Figura 2.2 – Figura ilustrativa de um aparelho de citômetro de
fluxo acoplado ao software cell quest.
quest que é capaz de traduzir sinais claros em sinais eletrônicos, que por sua vez,
são registrados e então analisados através de computador.
O resultado dos pulsos de voltagens é um fluxo de números que podem ser
simplesmente impressos e usados diretamente ou (held) na memória do
computador ou sobre dispositivo de armazenagem em representações gráficas.
37
CAPÍTULO 3
OBJETIVO GERAL
Investigar os parâmetro fenotípicos antes e após a irradiação de células do
sangue periférico (PBMC) de cães, através da técnica de citometria de fluxo,
utilizando marcadores de linfócitos T e B, monócitos, estimulação e
imunossupressão celular.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
- Investigar o perfil fenotípico de células T e B circulantes de cães antes e após
a radiação com raios gama na cinética de tempo zero (T0), tempo 2 (T 2 horas)
tempo 18 (T18 horas) e tempo 30 (T30dias) após a irradiação.
- Investigar os perfis de ativação e imunossupressão de linfócitos circulantes e
correlacionar com os efeitos da radiação no modelo animal utilizado.
38
CAPÍTULO 4
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Animais de experimentação
Foram utilizados cinco animais, todos machos, de porte pequeno, sem raça
definida, de peso médio de 10kg, cedidos pelo canil do Setor de Zoonoses da
Prefeitura Municipal de Belo Horizonte.
O projeto de pesquisa foi aprovado em 03 de fevereiro de 2006 pelo CPPPA-
Centro de Preparaçoes de Peças e pesquisas Anatômicas da Faculdade de
Ciências Médicas de Minas Gerais (FCMM), com autorização de uso do Biotério
da FCMM, e utilização de câes no experimento, documentado e aprovado
seguindo o regimento interno da faculdade, assinado pelo coordenador e
professor titular Prof. Chrystiano Gonçalves Rocha.
Levou-se em conta também a literatura sobre os aspectos éticos e morais da pesquisa
em animais, preconizados por HOFF (1980), FLECKNELL (1993), FONSECA et al.
(1996), PETROIANU (1996) e (2000).
Os cães utilizados foram preparados nas 24 horas que antecederam a irradiação,
pelo Técnico responsável do Biotério do Departamento de Morfo-fisiologia da
Faculdade de Ciências Médicas de Minas Gerais. Esse preparo constou de jejum
para a anestesia e acondicionamento dos cães em baias individuais.
39
Todos os animais chegaram ao referido biotério já vacinados pelo canil da
Prefeitura Municipal de Belo Horizonte. Os cães foram também pesados em
balança de precisão.
4.2 Irradiação
A princípio havia a expectativa de analisar a variação das doses pré-estabelecida
de 2Gy, 4Gy e 6Gy, mas os primeiros resultados foram pouco expressivos com
relação à diferença estatística apresentada entre as frações de 2Gy ao total de
6Gy, então se optou por agrupar os cães e realizarmos a avaliação dos resultados
seguindo apenas a cinética de tempo; onde T0 representa tempo zero ou anterior
a irradiação, T2, representa tempo duas horas após a irradiação, T18, representa
tempo dezoito horas após a irradiação e T30, tempo trinta dias após a irradiação.
Cinco cães foram irradiados, com doses fracionadas de 2Gy semanais, sendo que
as frações totalizaram 4Gy para o terceiro e quarto cão e 6Gy para o quinto e os
dois primeiros cães ficaram apenas com a dose de 2Gy. O processo de irradiação
ocorreu no Centro de Radioterapia do Hospital São Francisco, na cidade e Belo
Horizonte, com os seguintes dados:
Aparelho: THERATRON 80 - cobalto 60
Tamanho do campo: 13 x 17 cm
2
- campo único - esquerdo
Profundidade de tratamento: 2,5 cm
Local: cabeça e pescoço com proteção para os olhos
Doses fracionadas: 2Gy semanais
4.3 Procedimentos
O procedimento básico consistiu na obtenção de amostras de sangue periférico
para obtenção de perfil de expressão dos marcadores de ativação,
imunossupressão, apoptose utilizando o citômetro de fluxo após a irradiação e
contagem do número de linfócitos antes e após cinética de tempo.
40
Figura 4.1 – Punção da artéria femural.
Os animais foram anestesiados, a cada irradiação e coleta de amostra sanguínea,
com Dopalen® (quetamina), 5mg/kg de peso e Rompum® (xylazina) na dose de
2mg/kg de peso, por via parenteral intramuscular.
O cão foi posicionado em decúbito dorsal na mesa operatória específica com
imobilização das patas, hiperextensão cervical e rotação lateral esquerda da
cabeça, procedida a depilação da região inguino-crural esquerda após palpação
abdominal de rotina.
O material de depilação utilizado foi um aparelho permanente tipo de barbear com
lâminas descartáveis. Na anti-sepsia, solução de polivinil pirrolidona-iodo a 10%
degermante (PVP-I - degermante) e polivinil pirrolidona-iodo a 10% tópico (PVP-I -
tópico), pinça hemostática reta com dente para prender a gaze molhada pelo anti-
séptico, sobre a região inguino-crural esquerda. Fez-se a punção da artéria
femoral direita, com agulha de 25 x 7mm montada em seringa descartável de
20mL, sendo aspirado em torno de 8ml a 10 ml de sangue. (Figura 4.1).
Após este procedimento cada animal foi liberado para a recuperação anestésica
em baia individual com água e ração sendo oferecidas de forma livre.
Amostras do sangue periférico foram colhidas antes (T0) e após as irradiações,
nos períodos de duas horas(T2), 18 horas (T18) e 30 dias (T30). As células do
41
sangue periférico (PBMC) foram separadas e submetidas às marcações com os
anticorpos monoclonais anti- CD5, anti-CD4, anti_IgM, anti-CD14, anti-MHCII, anti-
CTLA-4 e anti-rIL-2 para avaliação das células T circulantes, Células B, linhagem
monocítica/macrofágica e parâmetros de estimulação, expansão clonal e
regulação da expansão clonal, respectivamente.
4.4 Protocolo para separação de células mononucleadas do sangue e
amostras para citometria de fluxo
As células mononucleares do sangue periférico heparinizado dos animais foram
separadas sendo este aplicado em tubos de 50 mL (Pyrex Laboratory
Glassware®), siliconizados contendo uma mistura de Ficoll-diatrozato, obtida
comercialmente (LSM® - Lymphocyte Separation Medium, Organon Teknika
Corporation, Durhan, NC), na proporção de uma parte de Ficoll-diatrozato para
duas partes de sangue.
A preparação foi submetida à centrifugação por 40 minutos, a 400 X g à
temperatura ambiente. Ao final da centrifugação obtivemo um anel de células
mononucleares na interface entre o Ficoll e o plasma, o qual foi cuidadosamente
removido com o auxílio de uma pipeta Pasteur (Thomas Laboratory Specialities®)
e transferido para tubos de fundo cônico de 50 mL, estéreis (2070 Graduated
conical tube, Falcon). Completa-se o volume para 50 mL de meio de cultura MEM
(Minimal Essential Medium, GIBCO) e procedeu a centrifugação (10 min, 400 X g,
4°C).
As células foram lavadas por mais duas vezes utilizando-se cerca de 30 mL de
MEM. Ao final, as células foram ressuspendidas em 2 mL de meio de cultura
RPMI-1640 (GIBCO). Uma alíquota da suspensão de células foi diluída (1:20) em
solução de Turck's, e o número de células determinado através de contagem em
câmara de Newbauer, com o auxílio de um microscópio ótico. A concentração de
células foi ajustada para uma suspensão contendo 10 x 10
6
células/mL de RPMI-
42
1640. Toda manipulação das células foi realizada em condições estéreis, em
capela de fluxo laminar
(BBL®-Biological Cabinet, model 60474).
4.5 Protocolo para análise de citometria de células mononucleares ex-
vivo
Os ensaios de imunofluorescência para população de células mononucleares de
sangue periférico ex-vivo são segundo protocolo indicado pela Becton Dickinson®,
e adaptado para placas de 96 poços, como descrito abaixo.
Às placas de 96 poços foram adicionados 25 µl de solução de anticorpo
monoclonal específico para o receptor celular de interesse, marcados com
fluorocromo, diluídos 1:5 em tampão FACS (PBS 1% BSA, pH 7.4). Para cada
teste, foram utilizados 25 µl de células mononucleares, o equivalente a 250.000
células por poço. As placas foram incubadas por 20 a 30 minutos, ao abrigo da
luz, a 4°C. As amostras foram lavadas uma vez com 200 µl de PBS 0.015M pH 7.4
por centrifugação (1300 rpm, 7 min à 4°C) e o sobrenadante desprezado.
Fixaram-se as amostras com 200 µl de solução fixadora (10 g/l de
paraformaldeído, 1% de Cacodilato de Sódio, 6.67 g/l de cloreto de Sódio, pH 7.2).
Após um período de 30 min., a 4°C, as amostras foram transferidas para tubos de
1 ml e os parâmetros fenotípicos das células presentes em cada amostra foi
determinado, com o auxílio de um citômetro de fluxo (FACScan Becton
Dickinson®). A identificação das populações celulares de interesse bem como a
determinação do valor percentual de populações e subpopulações celulares e a
expressão de moléculas co-estimuladoras nessas populações foram feitas
utilizando-se o software cell quest acoplado ao citômetro.
4.6 Materiais e equipamentos envolvidos nos procedimentos
• sangue heparinizado;
• Tubos de 50 ml (Pyrex Laboratory Glassware®), siliconizados contendo
Ficoll-diatrozato, obtida comercialmente (LSM® - Lymphocyte Separation
Medium, Organon Teknika Corporation, Durhan, NC);
43
• pipeta Pasteur (Thomas Laboratory Specialities®);
• Câmara de Newbauer;
• Microscópio ótico;
• Capela de fluxo laminar (BBL®-Biological Cabinet, model 60474).
• Placas de 96 poços;
• 25 µl de solução de anticorpo monoclonal;
• Fluorocromo diluídos 1:5 em tampão FACS (PBS 1% BSA, pH 7.4);
• 200 µl de PBS 0.015M pH 7.4;
• 200 µl de solução fixadora (10 g/l de paraformaldeído, 1% de cacodilato de
sódio, 6.67 g/l de cloreto de sódio, pH 7.2);
• Tubos de 1 ml;
• Citômetro de fluxo - FACScan Becton Dickinson;
• Software cell quest acoplado ao citômetro.
• seringas 20ml
• anestésicos Dopalen® (quetamina) e Rompum® (xylazina)
44
CAPÍTULO 5
RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Avaliação de parâmetros fenotípicos dos cães utilizados nos
experimentos
Cinco cães sem raça definida foram recrutados para o experimento, tendo se
procedido à contagem de leucócitos pré e pós a irradiação, conforme protocolo
descrito. Os cães, todos machos, apresentavam peso de aproximadamente 10 kg,
tendo sido avaliados previamente por um médico veterinário. Amostras de sangue
periférico foram coletadas anteriormente à irradiação (T0) e nos tempos pré-
estabelecidos de 2 horas (T2), 18 horas (T18) e 30 dias (T30) após cada
irradiação de 2Gy fracionados semanalmente, totalizando 4Gy para o terceiro e
quarto cão e 6Gy para o quinto cão, os dois primeiros cães ficaram apenas com a
dose de 2Gy.
As irradiações, descritas detalhadamente na estratégia experimental, foram feitas
através de um aparelho Theratron 80, com uma fonte de Co-60 e DFS (distância
fonte superfície) de 80cm. O tamanho do campo utilizado foi de 13x17cm
2
. A dose
aplicada sugerida para cada experimento foi avaliada para atingir 95% até 2,5cm
de profundidade.
O lado lateral da região da cabeça e pescoço do cão, à esquerda foi escolhido
para o procedimento, por ser uma região onde existe grandes vasos, músculos e
órgãos do sistema sensorial, portanto, sendo regiões que reúnem vários tipos de
tecidos que são bem vascularizados. Com isso se atingiu um território vascular
bem representativo, ou seja, um relevante volume sanguíneo dentro do campo de
irradiação. Utilizou-se uma proteção de chumbo na região dos olhos. Ressalta-se
que não foram observados sinais clínicos tais como, palidez das mucosas,
opacidade e queda dos pêlos após as doses de irradiação.
45
A escolha da região supracitada justificou-se, também, pois órgãos linfóides como
os linfonodos são estruturas da resposta imune; sendo estes organizadores da
resposta imune e podem sofrer alterações tanto no número de células após a
irradiação, quanto no padrão fenotípico dos linfócitos que recirculam através
destes, induzindo processos de imunossupressão ou mesmo anergia após o
procedimento radioterápico.
Sabe–se que a radiação ionizante pode produzir mudanças estruturais em várias
classes de macromoléculas encontradas nas células. A radiação resulta na
indução de genes de respostas aguda e tardia, sendo que o produto desses
genes, especialmente as citocinas e fatores de crescimento, podem influenciar a
resposta histoquímica dos tecidos (ROSENTHAL et al, 1995).
Dados experimentais, (EISBRUCH et al, 1999), também sugerem que os fatores
de crescimento são sintetizados e secretados pelas células sobreviventes à
radiação. Moléculas semelhantes ao fator de crescimento secretado da parede
dos vasos sanguíneos podem promover proliferação de células musculares lisas e
participar da proliferação anormal de células endoteliais e do início da fibrose pós-
irradiação.
A proliferação de células endoteliais e células de músculo liso em artérias de
pequeno calibre, seguida pelo estreitamento na luz dos vasos sanguíneos, tem
sido observada após a irradiação, produzindo um decréscimo no fluxo sanguíneo,
anóxia, necrose e substituição dos elementos constituintes do tecido normal por
fibrose. (SALVAJOLI et al, 1999).
5.2 Perfis fenotípicos avaliados através do canal médio de
fluorescência
As populações celulares foram identificadas utilizando-se uma análise através de
histogramas de fluorescência. Foram analisadas em canal médio de fluorescência
as células ou “eventos” que passam pelo feixe de laser e são marcadas com os
anticorpos monoclonais anti- os receptores de interesse, com as fluorescências
46
distintas. Esse tipo de análise nos permitiu obter o número absoluto de células e
estimar a razão entre as populações marcadas com cada anticorpo.
Vale ressaltar que não foi observado diferenças significativas entre as doses pré-
estabelecidas 2, 4 e 6 Gy, sendo assim os resultados foram agrupados, isto é, os
resultados não foram avaliados de acordo com a cinética de dose, mas sim pelas
alterações fenotípicas ocorridas na cinética de tempo (T2 horas, T18 horas e T30
dias) após a irradiação, seguindo como referência o padrão fenotípico registrado
no tempo zero (T0), anterior a irradiação.
5.3 Dinâmica das alterações fenotípicas em leucócitos circulantes
antes e após a irradiação
5.3.1 Freqüência de linfócitos T CD5+ circulantes
A analise fenotipica dos linfócitos T foi realizada com o emprego dos anticorpos
monoclonais anti-CD5. A figura 5.1 e 5.2 mostram o resultado do percentual de
linfócitos T CD5+ na população de linfócitos totais do sangue periférico de cães
antes e após a irradiação. Na figura 5.1 o histograma de fluorescência mostra a
intensidade de fluorescência avaliados num canal médio de fluorescência que vai
de 0 a 1023, para o número absoluto de receptores para CD5, numa cinética de
tempo de 0 (zero), 2 horas e 18 horas e 30 dias após a irradiação com cobalto 60,
considerando os valores positivos, a partir do canal 200 (a partir de M1). Os picos
são representados pelas cores: lilás (2 horas-T2), azul (18 horas-T18) e preto (30
dias-T30). O pico em vermelho representa a marcação de células T totais CD5+
no tempo T0.
A figura 5.2 mostra o percentual médio de células CD5+ em linfócitos circulantes
de cães irradiados. Os momentos do experimento são representadas por tempo 0
(zero), 2 horas e 18 horas após a irradiação com cobalto 60 nas doses previstas e
após o trigésimo dia da irradiação. Diferenças estatisticamente significativas (p <
0,05) em relação ao tempo zero foram encontradas.Método estatístico utilizado -
ANOVA seguido por teste-t de Student. A análise estatística dos resultados
47
demonstrou diferença estatisticamente significativa antes e após a irradiação,
correspondentes aos tempos avaliados para 2 horas e 18 horas e aos 30 dias,
mas o mesmo não foi observado na relação entre as doses de 2, 4 e 6Gy, sendo
assim os resultados foram agrupados. O percentual de linfócitos T CD5+ foi
significativamente menor após as 18 horas após a irradiação quando comparada
aos tempos de 2 horas e também no trigésimo dia pós-irradiação.
A função de CD5 nas células T não está muito bem estabelecida, mas tem sido
reportado em humanos que atua como co-sinalizador direto para ativação ou co-
estimulação, papel também exercido por CD2, CD4, CD6 e CD28. Tem sido
reportado que este receptor pode estar envolvido na mobilização de Ca
2+
intracelular, além de estar envolvido no aumento da reposta mitogênica e
secreção e expressão de IL-2 (BURGESS et al., 1992)
48
Figura 5.1 – O histograma de fluorescência mostra a intensidade de fluorescência avaliados num
canal médio de fluorescência que vai de 0 a 1023, para o número absoluto de receptores para
CD5, numa cinética de tempo de 0 (zero), 2 horas e 18 horas e 30 dias após a irradiação com
cobalto 60, considerando os valores positivos, a partir do canal 200 (a partir de M1). Os picos são
representados pelas cores: lilás (2 horas-T2), azul (18 horas-T18) e preto (30 dias-T30). O pico em
vermelho representa a marcação de células T totais CD5+ no tempo T0.
Figura 5.2 – Percentual médio de células CD5+ em linfócitos circulantes de cães irradiados. Os
momentos do experimento são representadas por tempo 0 (zero), 2 horas e 18 horas após a
irradiação com cobalto 60 nas doses previstas e após o trigésimo dia da irradiação. Diferenças
estatisticamente significativas (p < 0,05) em relação ao tempo zero foram encontradas.Método
estatístico utilizado - ANOVA seguido por teste-t de Student.
T30
T2
T18
T0
CD5
T30
T2
T18
T0
CD5
0
50
100
% de células T CD5+ em
Linfócitos circulantes
0 2h
18h 30dias
Tempo
* P <0.05
0
50
100
% de células T CD5+ em
Linfócitos circulantes
0 2h
18h 30dias
Tempo
* P <0.05
49
5.3.2 Freqüência de linfócitos B IgM+ circulantes
A população de linfócitos B foi identificada com o emprego dos anticorpos
monoclonais anti-IgM canina. As figuras 5.3 e 5.4 mostram o resultado do
percentual médio de linfócitos B IgM+ na população de linfócitos totais do sangue
periférico de cães antes e após a irradiação. Na Figura 5.3 o histograma de
fluorescência mostra a intensidade de fluorescência avaliados num canal médio de
fluorescência que vai de 0 a 1023, para o número absoluto de receptores para
IgM+, numa cinética de tempo de 0 (zero), 2 horas e 18 horas e 30 dias após a
irradiação com raios gama (cobalto 60), considerando os valores positivos, a partir
do canal 200 (a partir de M1). Os picos são representados pelas cores: azul
(Tempo zero-T0); preto (2 horas-T2), verde (18 horas-T18). O pico para 30 dias
após irradiação não está visível, provavelmente encontra-se sobreposto. O pico
em vermelho representa a marcação de células T totais co-expressando em
sobreposição o receptor IgM+ nos tempos acima mencionados. A Figura 5.4 –
Percentual médio de células B (IgM+) em linfócitos circulantes de cães irradiados.
Os momentos do experimento são representadas por tempo 0 (zero), 2 horas e 18
horas após a irradiação e após o trigésimo dia da irradiação. Diferenças
estatisticamente significativas (p < 0,05) em relação ao tempo zero. Método
estatístico utilizado - ANOVA seguido por teste-t de Student. A analise estatística
dos resultados demonstrou diferença estatisticamente significativa antes e após a
irradiação. O percentual de linfócitos B foi significativamente menor após 2 horas e
18 horas da irradiação (27,12 ± 0,95) e (23,02 ± 0,65), respectivamente, em
relação ao tempo zero (p <0,05) (34,11. ± 1,34). Os resultados mostraram, ainda,
diminuição do percentual dessas células no trigésimo dia após a irradiação (25,21.
± 2,13), quando comparados ao tempo zero.
Sabe-se que a resposta tipo 2 gera aumento de IL4, que estimula a diferenciação
de linfócitos B, ocasionando aumento na produção de anticorpos. Este padrão
encontra-se associado comumente a uma doença severa, que pode estar
enquadrada como uma parasitose.
50
No caso de um modelo, como o utilizado no nosso estudo, que avalia aspectos da
imunussupressão induzida pela irradiação, a própria diminuição do padrão CD4 já
relatada nos resultados, poderia levar, concomitantemente, à diminuição dos
linfócitos B diferenciados (plasmócitos) e, conseqüentemente à diminuição da
resposta IgM+. Um dado da literatura (REIS, 2001), que poderia explicar a
diminuição do percentual de células B considera que no processo de
transformação dos linfócitos B em células B diferenciadas, há diferenças no
tamanho e granulosidade dessas células, o que poderia promover um
deslocamento da população para fora da região de linfócitos analisados durante a
citometria de fluxo.
Um outro fato também a ser observado, que poderia tornar a avaliação de
resposta de células B no modelo utilizado, um pouco controversa, seria a própria
possibilidade de reação cruzada oriunda de outras infecções permanentes ou
transitórias no modelo canino, que embora os cães utilizados no estudo não tendo
apresentado sintomas clínicos de patologias, poderiam apresentá-las em período
de incubação ou em estado sub-clínico, ou seja, a não detecção de diferenças
estatisticamente significativas no percentual de células B IgM+ não poderia estar
relacionada com uma possível ineficiência do modelo (UCHOA et al. 2001).
51
Figura 5.3 - O histograma de fluorescência mostra a intensidade de fluorescência avaliados num
canal médio de fluorescência que vai de 0 a 1023, para o número absoluto de receptores para
IgM+, numa cinética de tempo de 0 (zero), 2 horas e 18 horas e 30 dias após a irradiação com
raios gama (cobalto 60), considerando os valores positivos, a partir do canal 200 (a partir de M1).
Os picos são representados pelas cores: azul (Tempo zero-T0); preto (2 horas-T2), verde (18
horas-T18). O pico para 30 dias após irradiação não está visível, provavelmente encontra-se
sobreposto. O pico em vermelho representa a marcação de células T totais co-expressando em
sobreposição o receptor IgM+ nos tempos acima mencionados.
Figura 5.4 – Percentual médio de células B (IgM+) em linfócitos circulantes de cães irradiados. Os
momentos do experimento são representadas por tempo 0 (zero), 2 horas e 18 horas após a
irradiação e após o trigésimo dia da irradiação. Diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05)
em relação ao tempo zero. Método estatístico utilizado - ANOVA seguido por teste-t de Student.
T2
T18
T0
T2
T18
T0
0
40
80
% de células B em
Linfócitos circulantes
0 2h
18h 30dias
Tempo
0
40
80
% de células B em
Linfócitos circulantes
0 2h
18h 30dias
Tempo
* P <0.05
0
40
80
% de células B em
Linfócitos circulantes
0 2h
18h 30dias
Tempo
0
40
80
% de células B em
Linfócitos circulantes
0 2h
18h 30dias
Tempo
0
40
80
% de células B em
Linfócitos circulantes
0 2h
18h 30dias
Tempo
0
40
80
% de células B em
Linfócitos circulantes
0 2h
18h 30dias
Tempo
* P <0.05
52
5.3.3 Freqüência de linfócitos T CD4+ circulantes
A figura 5.5 e 5.6 demonstram o percentual de células T CD4+ na população de
linfócitos circulantes antes e após os procedimentos de irradiação. Na Figura 5.5
o histograma de fluorescência mostra a intensidade de fluorescência avaliados
num canal médio de fluorescência que vai de 0 a 1023, para o número absoluto de
receptores para CD4+, numa cinética de tempo de 0 (zero), 2 horas e 18 horas e
30 dias após a irradiação com raios gama (cobalto 60), considerando os valores
positivos, a partir do canal 200 (a partir de M1). Os picos são representados pelas
cores: verde (Tempo zero-T0); preto (2 horas-T2), azul (18 horas-T18) e lilás (30
dias-T30). O pico em vermelho representa a marcação de células T totais co-
expressando em sobreposição o receptor CD4+ nos tempos acima mencionados.
A Figura 5.6 representa o percentual médio de linfócitos CD4+ em linfócitos de
cães irradiados. As etapas do experimento são representadas por tempo 0 (zero),
2 e 18 horas após a irradiação e após o trigésimo dia da irradiação. Diferenças
estatisticamente significativas (p < 0,05) em relação ao tempo zero. O método
estatístico utilizado foi ANOVA seguido por teste-t de Student.
A analise estatística dos resultados demonstrou uma redução da população
celular antes e após a irradiação já com 2 horas após a irradiação (26, 67 ± 4,23)
em relação ao tempo zero (36,65 ± 2,56). A redução do percentual foi
drasticamente significativa (p<0,05) nas 18 horas seguinte, onde se observou um
percentual médio de células T circulantes de 12,45 ± 2, 95, que pode ser indicativo
de efeito acumulativo da quantidade de dose de irradiação gama absorvida,
percentual este que se manteve ainda bastante reduzido quando avaliado no
trigésimo dia após a irradiação. No entanto, vale ressaltar que dados da literatura
já demonstraram a expressão do marcador CD4 também por neutrófilos de cães e
essa expressão não é observada em outras espécies de mamíferos (MOORE et
al, 1992), considerando o modelo de infecção experimental por parasitas, no qual
existem estimulação e recrutamento de outras linhagens celulares. Nossos
53
resultados apontaram a redução do marcador CD4, considerada importante já nas
primeiras duas horas após a irradiação, que podem estar associados ao modelo
de imunossupressão, no qual geralmente a inversão do padrão CD4:CD8, que
normalmente é entorno de 2:1.
Nossos dados sugerem, ainda, que a redução observada no modelo canino, pode
estar associada a uma provável imunosupressão pós-radioterapia, observada na
resposta ao tratamento no câncer humano, com estadiamento avançado.
Interessante notar que num modelo de vacinação com peptídeos específicos E5,
no câncer de mama, observou-se exatamente o oposto, visto que o peptídeo
utilizado na vacinação foi capaz de induzir o recrutamento tanto de subpopulações
CD4+ e CD8+ “naive” (virgens), ressaltando-se que a resposta imune de memória
permaneceu estável. Em adição, a vacinação induziu ativação geral de célula T
total, em específico para efetor de CD4+. A vacinação com E5 levou à ativação
de células T de memória CD45RO+, CD4+, CD8+ “naive” ou “virgens”, enquanto,
paralelamente, recrutou subpopulações CD4+ e CD8+ da resposta imune geral
(HUEMAN, 2006).
Considerando que, no nosso estudo, observamos uma diminuição de células
CD4+ após a irradiação, provavelmente poderá estar havendo também uma
diminuição dessa subpopulação CD4CD45RO+, uma vez que no trigésimo dia
pós-irradiação a freqüência de células CD4 ainda permaneceu baixa em relação
ao tempo zero (controle não irradiado). Podemos inferir, ainda, que os efeitos
observados no nosso estudo podem estar associados à perda de ativação de
enzimas essenciais que conferem a co-sinalização para expansão clonal,
interferindo possivelmente na transcrição do IL-2R.
A redução da capacidade proliferativa talvez possa estar associada a uma
possível alteração da capacidade de reparo das células irradiadas, processo que
normalmente se completa poucas horas depois da irradiação e esse é um dado
que corrobora a observação de uma elevação no percentual de células CTLA-4+
verificado após a irradiação.
54
Figura 5.5- O histograma de fluorescência mostra a intensidade de fluorescência avaliados num
canal médio de fluorescência que vai de 0 a 1023, para o número absoluto de receptores para
CD4+, numa cinética de tempo de 0 (zero), 2 horas e 18 horas e 30 dias após a irradiação com
raios gama (cobalto 60), considerando os valores positivos, a partir do canal 200 (a partir de M1).
Os picos são representados pelas cores: verde (Tempo zero-T0); preto (2 horas-T2), azul (18
horas-T18) e lilás (30 dias-T30). O pico em vermelho representa a marcação de células T totais co-
expressando em sobreposição o receptor CD4+ nos tempos acima mencionados.
Figura 5.6 – Percentual médio de linfócitos CD4+ em linfócitos de cães irradiados. As etapas do
experimento são representadas por tempo 0 (zero), 2 e 18 horas após a irradiação e após o
trigésimo dia da irradiação. Diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05) em relação ao
tempo zero. O método estatístico utilizado foi ANOVA seguido por teste-t de Student.
T18
T30
T2
T0
T18
T30
T2
T0
0
25
50
% de células T CD4+ em
Linfócitos circulantes
0 2h
18h 30dias
Tempo
* P <0.05
* P <0.05
0
25
50
% de células T CD4+ em
Linfócitos circulantes
0 2h
18h 30dias
Tempo
* P <0.05
* P <0.05
55
5.3.4 Freqüência de linfócitos T CD5+ circulantes co-expressando o receptor
CTLA-4
A análise fenotípica os linfócitos T após a irradiação foi realizada com o emprego
dos anticorpos monoclonais anti-CD5, co-expressando o receptor CTLA-4. CTLA-4
é um anticorpo quimérico usado em doenças autoimunes, asma, infecções e
rejeição a enxertos. Seu alvo consiste em bloquear a co-estimulação de linfócitos
T através da inibição da ligação das moléculas B7. O bloqueio desta ligação está
associado a anergia, apoptose e indução de tolerância em modelos experimentais
de doenças autoimunes e transplante.
As figuras 5.7 e 5.8 mostram o resultado do percentual de linfócitos T CD5+CTLA-
4+ na população de linfócitos totais do sangue periférico de cães antes e após a
irradiação. Na Figura 5.7 o histograma de fluorescência mostra a intensidade de
fluorescência avaliados num canal médio de fluorescência que vai de 0 a 1023,
para o número absoluto de receptores para CTLA-4, numa cinética de tempo de 0
(zero), 2 horas e 18 horas e 30 dias após a irradiação com cobalto 60,
considerando os valores positivos, a partir do canal 200 (a partir de M1). Os picos
são representados pelas cores: verde (Tempo zero-T0); lilás (2 horas-T2), azul (18
horas-T18) e preto (30 dias-T30). O pico em vermelho representa a marcação de
células T totais co-expressando em sobreposição o receptor CTLA-4 nos tempos
acima mencionados. A Figura 5.8 evidencia o percentual médio de linfócitos
CTLA-4 em linfócitos CD5+ de cães irradiados. As etapas do experimento são
representadas por tempo 0 (zero), 2 e 18 horas após a irradiação e após o
trigésimo dia da irradiação. Diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05) em
relação ao tempo zero. O método estatístico utilizado foi ANOVA seguido por
teste-t de Student.
A análise estatística dos resultados demonstrou diferença estatisticamente
significativa antes e após a irradiação, correspondentes aos tempos avaliados
para 2 horas e 18 horas e aos 30 dias. A razão entre o percentual de linfócitos T
CD5+ que co-expressaram o receptor CTLA-4 foi significativamente maior já nas
56
duas primeiras 2 horas após a irradiação quando comparada ao tempo zero, com
um pico nas 18 horas com as doses correspondentes.
Considerando que, uma vez que as células T sejam ativadas, elas passam a exibir
um receptor adicional, designado como CTLA-4, que se assemelha muito com a
seqüência de CD28, essa elevação do numero de receptores para CTLA-4 pós-
irradiação pode ser, inicialmente justificado, pela necessidade de regulação da
expansão clonal. Sabe-se que as moléculas B7, presentes na superfície das
APCs, ligam-se com maior avidez a CTLA-4, presente na superfície de células T,
do que a CD28. A ligação de B7 a CTLA-4 é capaz de emitir um sinal inibitório à
célula T ativada para que a resposta proliferativa seja efetivamente interrompida e
para que seja produzida uma menor quantidade de IL-2, fator de crescimento para
a célula T. Assim, a ligação de CTLA-4 às moléculas B7 é essencial para
diminuição da resposta proliferativa das células T ativadas ao antígeno e à
molécula B7 na superfície das APCs. Vale ressaltar que, embora com a utilização
do nosso modelo, não possamos caracterizar uma resposta antígeno-específica,
visto que não há a presença de um antígeno, podemos inferir que o estímulo
exógeno possa conferir não somente o “start” para ativação celular, mas também
para regulação da resposta celular.
Nos resultados mostrados anteriormente, quando avaliamos o perfil de células T
totais e de suas subpopulações, sugeriram uma inversão do padrão CD4:CD8, pós
irradiação e, considerando isto, estes dados corroboram com a literatura, uma vez
que KUHN at al., (2000) mostraram que, justamente a subpopulação CD8+CTLA-
4+ foi capaz de regular a reatividade e a função das células CD4, o que justifica
essa diminuição, após a irradiação. Esses achados foram, mais tarde confirmados
por PARRY at al., (2005) que também demonstraram o papel regulador de CTLA-
4, uma vez que este receptor foi capaz de inibir a estimulação celular, e
consequentemente, o reconhecimento de peptídeos via CD3CD28 por outras
populações CD86+ (B-7) do sistema imune. Isto pôde ser observado também em
respostas anti-tumorais, quando HODI at al., (2003) mostraram que o receptor
para CTLA-4 foi capaz de bloquear a imunidade tumoral, quando pacientes com
57
carcinoma ovariano foram, previamente, vacinados, aumentando a apresentação
dos produtos derivados do tumor por células dendríticas e limitando, assim, a
potência da imunidade tumoral.
Recentemente, Quezada at al., (2006) mostraram evento semelhante, com
pacientes com encéfalomielite, visto que se observou, também uma diminuição de
células CD4+, quando células CD8CTLA-4 eram estimuladas.
58
Figura 5.7 – O histograma de fluorescência mostra a intensidade de fluorescência avaliados num
canal médio de fluorescência que vai de 0 a 1023, para o número absoluto de receptores para
CTLA-4, numa cinética de tempo de 0 (zero), 2 horas e 18 horas e 30 dias após a irradiação com
cobalto 60, considerando os valores positivos, a partir do canal 200 (a partir de M1). Os picos são
representados pelas cores: verde (Tempo zero-T0); lilás (2 horas-T2), azul (18 horas-T18) e preto
(30 dias-T30). O pico em vermelho representa a marcação de células T totais co-expressando em
sobreposição o receptor CTLA-4 nos tempos acima mencionados.
Figura 5.8 – Percentual médio de linfócitos CTLA-4 em linfócitos CD5+ de cães irradiados. As
etapas do experimento são representadas por tempo 0 (zero), 2 e 18 horas após a irradiação e
após o trigésimo dia da irradiação. Diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05) em relação
ao tempo zero. O método estatístico utilizado foi ANOVA seguido por teste-t de Student.
T30
T2
T18
T0
CD5
T30
T2
T18
T0
CD5
0
25
50
% de células CTLA-4+ em
Linfócitos T circulantes
0 2h
18h 30dias
Tempo
*
P <0.05
0
25
50
% de células CTLA-4+ em
Linfócitos T circulantes
0 2h
18h 30dias
Tempo
*
P <0.05
59
5.3.5 Freqüência de linfócitos T CD5+ circulantes co-expressando o receptor
IL-2R
A análise dos parâmetros fenotípicos dos linfócitos T após a irradiação foi
realizada com a marcação dos anticorpos monoclonais anti-CD5, co-expressando
o IL-2R. As figuras 5.9 e 5.10 mostram o resultado do percentual de linfócitos T
CD5+IL-2+ na população de linfócitos totais do sangue periférico de cães antes e
após a irradiação. A Figura 5.9 apresenta o histograma de fluorescência mostra a
intensidade de fluorescência avaliados num canal médio de fluorescência que vai
de 0 a 1023, para o número absoluto de receptores para IL-2, numa cinética de
tempo de 0 (zero), 2 horas e 18 horas e 30 dias após a irradiação com cobalto 60,
considerando os valores positivos, a partir do canal 200 (a partir de M1). Os picos
são representados pelas cores: azul (Tempo zero-T0); lilás (2 horas-T2), verde (18
horas-T18). O pico em vermelho representa a marcação de células T totais co-
expressando em sobreposição o receptor IL-2 nos tempos acima mencionados.
Na Figura 5.10 apresenta o percentual médio de linfócitos CD5+ de cães
irradiados, co-expressando o receptor para IL-2. As etapas do experimento são
representadas por tempo 0 (zero), 2 e 18 horas após a irradiação e após o
trigésimo dia da irradiação. Diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05) em
relação ao tempo zero. O método estatístico utilizado foi ANOVA seguido por
teste-t de Student.
A análise estatística dos resultados demonstrou diferença estatisticamente
significativa antes e após a irradiação, correspondentes aos tempos avaliados
para 2 horas e 18 horas (13,11 ± 1,95) e (5,83 ± 2,96), respectivamente, e aos 30
dias. A razão entre o percentual de linfócitos T CD5+ que co-expressaram o IL-2R
não foi significativamente menor nas duas primeiras 2 horas após a irradiação
quando comparada ao tempo zero (11,23 ± 3,05), porém, observou-se uma
drástica diminuição (p <0.05) nas 18 horas após a irradiação. Esse achado pode
estar associado ao papel autócrino exercido pelo receptor CTLA-4, bem como
sobre outras células que proliferaram devido à co-sinalização e que,
provavelmente, podem ter deixado de expandir-se clonalmente, devido ao papel
de CTLA-4. No entanto, aos 30 dias (12,23 ± 2,79), observou-se que os
60
percentuais não se diferenciaram em relação ao tempo zero, sugerindo que a
ação de CTLA-4 é pontual na auto-regulação, mas pode ser que não esteja tão
envolvida no processo de imunosupressão a médio ou longo prazo.
Os artigos selecionados são concordantes com os nossos achados, uma vez que
a diminuição do IL-2R pode ser pontuada após a irradiação pelo aumento de
células T CTLA-4+. Então, é correto supor que a resposta de IL-2R, observada
nas 2 horas após a irradiação, na qual não se detectou uma diminuição
importante, sugere um efeito residual da ação de IL-2R, visto que as células
parecem conseguir manter, neste momento, sua capacidade proliferativa, bem
como a sobrevivência e a ativação presentes logo após a irradiação. Esse evento
foi também observado por outros autores (PING JIN et al., 2006), que utilizaram
IL-2R recombinante em culturas de 47 doadores de perfis imunológicos diferentes
e obtiveram a mesma capacidade de ativação celular, mantendo os efeitos anti-
apoptóticos.
61
Figura 5.9 – O histograma de fluorescência mostra a intensidade de fluorescência avaliados num
canal médio de fluorescência que vai de 0 a 1023, para o número absoluto de receptores para IL-2,
numa cinética de tempo de 0 (zero), 2 horas e 18 horas e 30 dias após a irradiação com cobalto
60, considerando os valores positivos, a partir do canal 200 (a partir de M1). Os picos são
representados pelas cores: azul (Tempo zero-T0); lilás (2 horas-T2), verde (18 horas-T18). O pico
em vermelho representa a marcação de células T totais co-expressando em sobreposição o
receptor IL-2 nos tempos acima mencionados.
Figura 5.10 – Percentual médio de linfócitos CD5+ de cães irradiados, co-expressando o receptor
para IL-2. As etapas do experimento são representadas por tempo 0 (zero), 2 e 18 horas após a
irradiação e após o trigésimo dia da irradiação. Diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05)
em relação ao tempo zero. O método estatístico utilizado foi ANOVA seguido por teste-t de
Student.
T2
T18
T0
CD5
T2
T18
T0
CD5
0
25
50
% de células IL-2+ em
Linfócitos T circulantes
0 2h
18h 30dias
Tempo
* P <0.05
0
25
50
% de células IL-2+ em
Linfócitos T circulantes
0 2h
18h 30dias
Tempo
* P <0.05
62
5.3.6 Freqüência de monócitos circulantes na população de leucócitos totais
Nas figuras 5.11 e 5.12 estão representados os percentuais de monócitos
(CD14+) na população de leucócitos totais antes e após a irradiação nas mesmas
doses já descritas em materiais e métodos. Na Figura 5.11 o histograma de
fluorescência evidencia a intensidade de fluorescência avaliados num canal médio
de fluorescência que vai de 0 a 1023, para o número absoluto de receptores para
CD14, numa cinética de tempo de 0 (zero), 2 horas e 18 horas e 30 dias após a
irradiação com cobalto 60, considerando os valores positivos, a partir do canal 200
(M1). Os picos são representados pelas cores: preta (Tempo zero-T0); azul (2
horas-T2), verde (18 horas-T18) . O pico em vermelho representa a marcação de
células T totais co-expressando em sobreposição o receptor CD14 nos tempos
acima mencionados. A Figura 5.12 mostra o percentual médio de monócitos de
cães irradiados, co-expressando o receptor para CD14+. As etapas do
experimento são representadas por tempo 0 (zero), 2 e 18 horas após a irradiação
e após o trigésimo dia da irradiação. Diferenças estatisticamente significativas (p <
0,05) em relação ao tempo zero. O método estatístico utilizado foi ANOVA seguido
por teste-t de Student.
A analise estatística dos resultados demonstrou diferença estatisticamente
significativa antes e após a irradiação, correspondentes aos tempos avaliados
para 2 horas e 18 horas com percentuais médios de (1,12 ± 0,95) e (1,83 ± 0,56),
respectivamente. A análise dos resultados revelou uma diferença estatisticamente
significativa (p < 0,05) quando comparados ao dia zero (5,78 ± 0,74), mostrando
uma queda acentuada nas 2 horas e 18 horas após a irradiação que se manteve
no trigésimo dia após a irradiação (1,98 ± 0,65).
Os mecanismos pelos quais a glicoproteína CD14 é capaz de exercer sua função,
independente de um fator mitogênico (inespecífico) do tipo Lipopolissacáride
(LPS) não estão bem estabelecidos ainda, mas sabe-se que é capaz de agir como
receptor para LPS ou como uma molécula solúvel no soro, independente de estar
63
ancorada numa membrana celular mielóide (LANDMANN et al, 1998). No caso
específico do nosso estudo, no qual foram avaliadas fenotipicamente PBMCs no
modelo canino, há de se supor que a marcação com anticorpo monoclonal anti-
CD14, poderia ser, então, positiva no canal médio de fluorescência antes da
irradiação, já que tal expressão independeria de estimulação prévia. É importante
ressaltar, no entanto, que em modelos de infecção por parasitas, por exemplo, a
tendência seria de elevação dessa marcação, já nas primeiras horas pós-
estimulação, visto que a linhagem monocítica é uma das primeiras a serem
recrutadas na resposta imune (MOREIRA, 2005). Porém, considerando que o
modelo utilizado avaliou os aspectos de imunussupressão através de cinética de
irradiação, a queda dos percentuais observados já a partir das 2 horas parece ser
plausível.
64
Figura 5.11 –O histograma de fluorescência mostra a intensidade de fluorescência avaliados num
canal médio de fluorescência que vai de 0 a 1023, para o número absoluto de receptores para
CD14, numa cinética de tempo de 0 (zero), 2 horas e 18 horas e 30 dias após a irradiação com
cobalto 60, considerando os valores positivos, a partir do canal 200 (M1). Os picos são
representados pelas cores: preta (Tempo zero-T0); azul (2 horas-T2), verde (18 horas-T18) . O
pico em vermelho representa a marcação de células T totais co-expressando em sobreposição o
receptor CD14 nos tempos acima mencionados.
Figura 5.12 – Percentual médio de monócitos de cães irradiados, co-expressando o receptor para
CD14+. As etapas do experimento são representadas por tempo 0 (zero), 2 e 18 horas após a
irradiação e após o trigésimo dia da irradiação. Diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05)
em relação ao tempo zero. O método estatístico utilizado foi ANOVA seguido por teste-t de
Student.
T2
T18
T0
T2
T18
T0
0
5
10
% de cé
lulas CD14+ em
monó
citos circulantes
0 2h
18h 30dias
Tempo
0
5
10
% de cé
lulas CD14+ em
monó
citos circulantes
0 2h
18h 30dias
Tempo
* P <0.05
0
5
10
% de cé
lulas CD14+ em
monó
citos circulantes
0 2h
18h 30dias
Tempo
0
5
10
% de cé
lulas CD14+ em
monó
citos circulantes
0 2h
18h 30dias
Tempo
0
5
10
% de cé
lulas CD14+ em
monó
citos circulantes
0 2h
18h 30dias
Tempo
0
5
10
% de cé
lulas CD14+ em
monó
citos circulantes
0 2h
18h 30dias
Tempo
* P <0.05
65
5.3.7 Freqüência de linfócitos T circulantes co-expressando MHCII
MHCII são proteínas heterodímeras compostas por duas cadeias polipeptídicas
alfa e beta contribuindo com um domínio ao sítio de ligação ao peptídeo e um
domínio de suporte semelhante à Imunoglobulina. São sintetizadas no retículo
endopalsmático da célula, se transferem para o Aparelho de Golgi ligadas a uma
terceira proteína chamada cadeia invariante, que evita qualquer ligação prematura
de peptídeos endógenos ao seu sítio de ligação, até onde ela atinja o local de
degradação protéica extracelular. Uma segunda função da cadeia invariante é
enviar as moléculas MHCII para as vesículas endocíticas onde elas se ligam ao
peptídeo.
A análise fenotípica dos linfócitos T após a irradiação foi realizada com o emprego
dos anticorpos co-expressando MHCII, considerando que se trata de uma
molécula que se liga aos peptídeos antigênicos para apresentação às células T e
serve como um sinal de tradução que regula a função de macrófagos
(MATSUYAMA et al, 1993).
As figuras 5.13 e 5.14 mostram o resultado da expressão de MHCII+ no sangue
periférico de cães antes e após a irradiação. A Figura 5.13 apresenta o
histograma de fluorescência mostra a intensidade de fluorescência avaliados num
canal médio de fluorescência que vai de 0 a 1023, para o número absoluto de
receptores para MHCII, numa cinética de tempo de 0 (zero), 2 horas e 18 horas e
30 dias após a irradiação com cobalto 60, considerando os valores positivos, a
partir do canal 200 (a partir de M1). Os picos são representados pelas cores: azul
(Tempo zero-T0); preto (2 horas-T2), verde (18 horas-T18). O pico em vermelho
representa a marcação de células T totais co-expressando em sobreposição o
receptor MHCII nos tempos acima mencionados. Já a Figura 5.14 evidencia a
expressão de MHCII a partir de células de cães irradiados, avaliados pelo canal
médio de fluorescência (CMF), considerando os valores negativos para o canal
médio com valores absolutos inferiores a 200.As etapas do experimento são
representadas por tempo 0 (zero), 2 e 18 horas após a irradiação. Diferenças
66
estatisticamente significativas (p < 0,05) em relação ao tempo zero. O método
estatístico utilizado foi ANOVA seguido por teste-t de Student. NR – representa
não realizado.
A análise estatística dos resultados demonstrou diferença estatisticamente
significativa antes e após a irradiação, correspondentes aos tempos avaliados
para 2 horas e 18 horas. A expressão da molécula MHCII foi menor já nas duas
primeiras horas após a irradiação quando comparada ao tempo zero, sendo essa
diminuição não estatisticamente significativa e nem tampouco nas 18 horas com
as doses correspondentes. Considerando que em nosso estudo, a dupla
marcação não foi efetuada juntamente com macrófagos, não foi possível avaliar se
esta redução reflete efeito da irradiação sobre a ativação de proteínas, tais como a
tirosina Kinase, proteína Kinase C, já que essas vias de sinalização afetam a
apresentação de antígenos.
É importante reconhecer também, que contrariamente aos achados, quando foram
utilizados modelos de infecção por parasitas de cão (CASTRO, 2004), no nosso
estudo com modelo canino, no qual as células do sangue periférico receberam
irradiação, não houve sinalização para apresentação de antígenos e as
modificações celulares ocorridas podem ter inviabilizado a expressão dessa
molécula devido à irradiação.
De qualquer forma, como se sabe que a ligação do complexo peptído: MHC ao
receptor de célula T (TCR) e a ligação de B7 a CD28, na célula T, dirigem a
ativação e expansão de células T que encontraram o antígeno específico
apresentado por uma APC, bem como, a ativação das células T virgens é capaz
de induzir a expressão e secreção de interleucina 2 (IL-2), assim como a
expressão de receptores de alta afinidade para IL-2 na superfície das células T
antígeno-específicas. Daí torna-se coerente inferirmos sobre uma possível relação
entre a diminuição da expressão do receptor para MHC, já nas primeiras horas
67
pós-irradiação e a uma falha na ativação das vias enzimáticas responsáveis
tradução do mensageiro em proteína, pela própria irradiação.
Figura 5.13 – O histograma de fluorescência mostra a intensidade de fluorescência avaliados num
canal médio de fluorescência que vai de 0 a 1023, para o número absoluto de receptores para
MHCII, numa cinética de tempo de 0 (zero), 2 horas e 18 horas e 30 dias após a irradiação com
cobalto 60, considerando os valores positivos, a partir do canal 200 (a partir de M1). Os picos são
representados pelas cores: azul (Tempo zero-T0); preto (2 horas-T2), verde (18 horas-T18). O pico
em vermelho representa a marcação de células T totais co-expressando em sobreposição o
receptor MHCII nos tempos acima mencionados.
Figura 5.14 – Expressão de MHCII a partir de células de cães irradiados, avaliados pelo canal
médio de fluorescência (CMF), considerando os valores negativos para o canal médio com valores
absolutos inferiores a 200.As etapas do experimento são representadas por tempo 0 (zero), 2 e 18
horas após a irradiação. Diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05) em relação ao tempo
zero. O método estatístico utilizado foi ANOVA seguido por teste-t de Student. NR – representa
não realizado.
T2
T18
T0
T2
T18
T0
0
200
400
Expressão de MHCII
CMF
0 2h
18h 30dias
Tempo
NR
0
200
400
Expressão de MHCII
CMF
0 2h
18h 30dias
Tempo
NR
68
CAPÍTULO 6
CONCLUSÃO
Os nossos dados nos permitiram inferir sobre a importância do conhecimento da
resposta imune individualizada, através da investigação do padrão fenotípico das
linhagens celulares presentes no microambiente tumoral, bem como, circulando
sistemicamente, como parâmetro para planejamento e condução de tratamentos
de vários tipos de câncer.
Os primeiros resultados não demonstraram diferenças estatísticas significativas,
por este motivo optamos por não apresentar os resultados em cinética de dose,
mas sim em cinética do tempo, onde podemos registrar claramente as alterações
ocorridas com os receptores celulares avaliados.
Acreditamos, ainda que a continuidade de tal estudo, através de ensaios clínicos,
possibilitará futuramente, ampliar a qualidade de vida de pacientes submetidos
aos tratamentos por radioterapia externa – teleterapia, com o monitoramento das
doses de radiação, visando uma melhor resposta do sistema imunológico do
paciente, e com isso, levando á melhoria e sucesso do tratamento do câncer.
69
CAPÍTULO 7
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( http://www.livrosgratis.com.br )
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