( PDF ) Atividade antinociceptiva de derivados 5-trifluormetil-4,5-diidro-1H-pirazol-1-carboxiamida em modelos animais de nocicepção aguda e crônica

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA

CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E EXATAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA TOXICOLÓGICA

ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA DE DERIVADOS 5-TRIFLUORMETIL-

4,5-DIIDRO-1H-PIRAZOL-1-CARBOXIAMIDA EM MODELOS

ANIMAIS DE NOCICEPÇÃO AGUDA E CRÔNICA

TESE DE DOUTORADO

Patricia Dutra Sauzem

Santa Maria, RS, Brasil

2008

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ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA DE DERIVADOS 5-TRIFLUORMETIL-4,5-

DIIDRO-1H-PIRAZOL-1-CARBOXIAMIDA EM MODELOS ANIMAIS DE

NOCICEPÇÃO AGUDA E CRÔNICA

por

Patricia Dutra Sauzem

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas:

Bioquímica Toxicológica da Universidade Federal de Santa Maria, como requisito

parcial para a obtenção do grau de

Doutor em Bioquímica Toxicológica

Orientadora: Maribel Antonello Rubin

Co-orientador: Juliano Ferreira

Santa Maria, RS, Brasil

2008

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Universidade Federal de Santa Maria

Centro de Ciências Naturais e Exatas

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Bioquímica Toxicológica

A Comissão Examinadora, abaixo assinada, aprova a Tese de Doutorado

ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA DE DERIVADOS 5-TRIFLUORMETIL-

4,5-DIIDRO-1H-PIRAZOL-1-CARBOXIAMIDA EM MODELOS ANIMAIS

DE NOCICEPÇÃO AGUDA E CRÔNICA

elaborada por

Patricia Dutra Sauzem

como requisito parcial para a obtenção do grau de

Doutor em Bioquímica Toxicológica

COMISSÃO EXAMINADORA:

_________________________________________

Profa. Dra. Maribel Antonello Rubin

(Presidente/Orientadora)

_________________________________________

Prof. Dr. Alex Fabiani Claro Flores (UFSM)

_________________________________________

Prof. Dr. Jamil Assreuy (UFSC)

_________________________________________

Profa. Dra. Maria Ester Pereira (UFSM)

___________________________________________

Profa. Dra. Maria Rosa Chitolina Schetinger (UFSM)

Santa Maria, 6 de agosto de 2008.

iii

Dedico essa tese aos meus pais, José Antonio e Maria Neida,

que sempre souberam guiar meus passos nos caminhos da vida e

que proporcionaram-me plenas condições para atingir meus objetivos.

Agradecimentos

AGRADECIMENTOS

À minha orientadora, professora Maribel Antonello Rubin, por ter me aceito

em seu laboratório e por ter acreditado que tudo daria certo, até quando eu mesma

não acreditava.

Ao professor Juliano Ferreira pela co-orientação que, sem dúvida, foi

imprescindível para a conclusão desta tese. Agradeço, especialmente, por ter

suportado com bom humor as minhas crises de pessimismo.

Aos colegas e amigos do LABNEURO, inclusive àqueles que já concluíram

suas dissertações e teses e seguiram seus caminhos. Alguns deixaram marcas que

nunca serão apagadas, seja pelo profissionalismo, seja pela grande amizade que se

estabeleceu entre nós.

À minha fiel companheira de experimentos, Gabriela da Silva Sant’Anna, por

ter sido muito mais que uma simples colega de bancada, por ser aquela amiga de

todas as horas, por compartilhar comigo as alegrias e as tristezas e por estar sempre

disposta a colaborar.

Aos alunos de iniciação científica do LABNEURO que muitas vezes auxiliaram

na execução deste trabalho e com os quais, certamente, aprendi muitas coisas.

Aos pesquisadores do NUQUIMHE que sintetizaram os compostos estudados

nesta tese, especialmente ao doutorando Pablo Machado que esteve sempre

disposto a colaborar na execução de todo o trabalho.

Aos meus pais, José Antônio e Maria Neida, por terem apoiado minhas

decisões em todos os momentos da minha vida e pelos ensinamentos morais e

éticos que me proporcionaram desde a infância.

Aos meus irmãos, Ismael e Rafael, pela amizade, pelo carinho, pelos

momentos de descontração e por estarem sempre presentes em todos os

momentos.

À minha irmã, Danusa, e ao meu cunhado, Adriano, que mesmo estando

distantes fisicamente, estiveram sempre muito próximos.

Aos meus amados sobrinhos, João Vítor e Artur, duas criaturinhas iluminadas

que enchem meu coração de esperança de que haverá um dia em que todas as

pessoas tenham a humildade e o coração puro de uma criança.

Agradecimentos

Ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Toxicológica, à UFSM e ao

CNPq/FAPERGS/PRONEX pela disponibilização dos recursos para realização deste

trabalho.

E, finalmente, mas não menos importante, aos camundongos e ratos, cujas

vidas sacrificamos em prol do desenvolvimento da ciência.

"Todo mundo é capaz de dominar uma dor, exceto quem a sente."

(William Shakespeare)

Resumo

vii

RESUMO

Tese de Doutorado

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Bioquímica Toxicológica

Universidade Federal de Santa Maria, RS, Brasil

ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA DE DERIVADOS 5-TRIFLUORMETIL-4,5-

DIIDRO-1H-PIRAZOL-1-CARBOXIAMIDA EM MODELOS ANIMAIS DE

NOCICEPÇÃO AGUDA E CRÔNICA

Autora: Patricia Dutra Sauzem

Orientadora: Maribel Antonello Rubin

Co-orientador: Juliano Ferreira

Local e Data da Defesa: Santa Maria, 6 de agosto 2008

Identificar a causa da dor e aliviá-la é, com certeza, parte importante do tratamento de

qualquer patologia. Infelizmente, nem todas as modalidades de dor possuem um tratamento

adequado atualmente. Muitos pacientes não respondem aos fármacos disponíveis ou, então

apresentam efeitos adversos graves que impedem a continuidade do tratamento. Desta

forma, existe a necessidade de pesquisar novas drogas que sejam mais eficazes e que

produzam menos efeitos indesejados. Os derivados pirazolínicos são conhecidos pela sua

excelente eficácia como analgésicos. Por esse motivo, o NUQUIMHE e o LABNEURO têm

unido esforços na intenção de sintetizar e avaliar os efeitos biológicos de vários compostos

pirazolínicos. No presente trabalho, foi avaliado o efeito antinociceptivo e antiedematogênico

de uma série de derivados 5-trifluormetil-4,5-diidro-1H-pirazol carboxiamida (2a-j) em

modelos de nocicepção aguda e crônica em camundongos e ratos. Também foi feita uma

avaliação preliminar da toxicidade dos compostos mais ativos, após administração crônica,

além da avaliação de alguns parâmetros bioquímicos relacionados à inflamação. Oito dos 10

compostos testados apresentaram efeito antinociceptivo no teste da formalina em

camundongos. Os dois compostos de maior eficácia (2c e 2j) foram também avaliados nos

testes da placa quente, da carragenina e da artrite induzida por adjuvante completo de

Freund (CFA). Tais compostos não causaram efeito na nocicepção térmica, mas foram

eficazes na diminuição do edema induzido por carragenina em camundongos. No modelo de

artrite em ratos, os compostos 2c e 2j causaram antinocicepção, mas não diminuição do

edema. Esse efeito foi observado após administração aguda e crônica, e teve longa

duração. Os níveis séricos de haptoglobina e a atividade tecidual da mieloperoxidase não se

apresentaram alterados nos ratos tratados cronicamente com 2c e 2j, indicando que esses

compostos, provavelmente, não possuem ação antiinflamatória. Os parâmetros de

toxicidade renal e hepática (uréia, creatinina, aspartato aminotransferase e alanina

aminotrasferase) não se apresentaram alterados, bem como não foram encontrados sinais

de lesão da mucosa gástrica, nem evidências de desenvolvimento de tolerância ao efeito

antinociceptivo nos ratos tratados cronicamente com 2c e 2j. Nenhum dos compostos

testados causou alteração na atividade locomotora de camundongos e ratos. Os resultados

encontrados neste trabalho sugerem que essa nova classe de derivados pirazolínicos

parece promissora no que diz respeito ao desenvolvimento de novas drogas analgésicas.

Abstract

viii

ABSTRACT

PhD thesis

Graduating Course in Biological Sciences: Toxicological Biochemistry

Federal University of Santa Maria, RS, Brazil

ANTINOCICEPTIVE ACTIVITY OF 5-TRIFLUOROMETHYIL-4,5-DIHIDRO-1H-

PYRAZOLE-1-CARBOXIAMIDE DERIVATIVES IN ANIMAL MODELS OF ACUTE

AND CHRONIC NOCICEPTION

Author: Patricia Dutra Sauzem

Advisor: Prof. Dr. Maribel Antonello Rubin

Co-advisor: Prof. Dr. Juliano Ferreira

Place and date: Santa Maria, August 6

, 2008.

To identify the origin of pain and relieve of it is, certainly, important part of the

treatment of any pathology. Unfortunately, nor all pain modalities possess an

adequate treatment at a moment. Many patients do not obtain pain relief in response

to drugs available or, they present serious adverse effects that hinder the continuity

of treatment. So, a search for new drugs that are more efficient and that produce little

undesired effect is necessary. Pyrazole derivatives are known for their excellent

effectiveness as analgesics. In this context, the NUQUIMHE and LABNEURO have

joined efforts for synthesize and evaluate the biological effects of several pyrazole

compounds. In the present study, was evaluated the antinociceptive and

antiedematogenic effect of one series of 5-trifluoromethyl-4,5-dihidro-1H-pyrazole-1-

carboxiamide (2a-j) derivatives on acute and chronic nociception models in mice and

rats. A preliminary evaluation of the toxicity for more active compounds, after their

chronic administration, was carried out too. Some biochemistry parameters

relationships to inflammation were also evaluated. Eight of ten compounds analyzed

present antinociceptive effect on formalin test in mice. The two most efficient

derivatives (2c and 2j) were also evaluated on hot plate, carrageenan and arthritis

induced by Complete Freund Adjuvant (CFA). These compounds caused no effect

against thermal nociception, but were effective for decrease the edema carrageenan-

induced in mice. In the arthritis model in rats, 2c and 2j compounds caused

antinociception, but do not antiedematogenic action. This antinociceptive effect

occurred after acute and chronic administration and has long duration. Parameters

indicators of liver and kidney lesion (urea, creatinine, aspartate aminotransferase and

alanine aminotransferase) were not altered and were neither detected signals of

gastric mucosa lesion nor evidences of tolerance development to antinociceptive

effect in rats chronically treated with 2c or 2j. The serum level of haptoglobin and the

tissue myeloperoxidase activity of the animals that received treatment indicate that

these compounds did not present anti-inflammatory effect. None compounds

evaluated caused alteration on locomotors activity of mice and rats. The results

obtained in the present work suggest that this new class of pyrazole derivatives

seems promising for development of new analgesic drugs.

Sumário

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS...........................................................................................

RESUMO..............................................................................................................

vii

ABSTRACT..........................................................................................................

viii

LISTA DE ABREVIATURAS...............................................................................

xiii

LISTA DE FIGURAS............................................................................................

xiv

LISTA DE TABELAS...........................................................................................

xvi

I – INTRODUÇÃO................................................................................................

II. OBJETIVOS..................................................................................................... 4

II.1 – OBJETIVO GERAL.....................................................................................

II.2 – OBJETIVOS ESPECÍFICOS.......................................................................

III – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.........................................................................

III.1 – DOR E NOCICEPÇÃO ..............................................................................

III.2 – DETECÇÃO, TRANSMISSÃO E MODULAÇÃO DA DOR.........................

III.3 – MEDIADORES QUÍMICOS DA DOR E DA INFLAMAÇÃO.......................

III.4 – TRATAMENTO FARMACOLÓGICO DA DOR...........................................

III.5 – DERIVADOS PIRAZOLÍNICOS.................................................................

III.5.1 – A busca de novos derivados pirazolínicos para o tratamento da dor e

da inflamação.......................................................................................................

IV – MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................

IV.1 – ANIMAIS....................................................................................................

IV.2 – DROGAS E REAGENTES.........................................................................

IV.3 – TESTES COMPORTAMENTAIS...............................................................

IV.3.1 – Teste da formalina..................................................................................

IV.3.2 – Teste da placa quente............................................................................

IV.3.3 – Teste do edema de pata e alodínia induzidos por carragenina..............

IV.3.4 – Avaliação da atividade locomotora.........................................................

IV.3.4.1 – Teste da locomoção forçada em cilindro giratório (rotarod)................

IV.3.4.2 – Teste da locomoção espontânea.........................................................

IV.3.5 – Alodínia mecânica e edema induzidos por CFA.....................................

IV.3.5.1 – Avaliação do efeito da administração aguda dos derivados

pirazolínicos 2c e 2j: decurso temporal, relação dose-efeito sobre a

nocicepção e avaliação da atividade locomotora de ratos...................................

Sumário

IV.3.5.2 – Avaliação do efeito da administração crônica dos derivados

pirazolínicos 2c e 2j sobre a alodínia e o edema de pata induzidos por CFA.....

IV.3.6 – Avaliação do peso corporal durante a administração crônica e do

peso dos órgãos no final do tratamento com os derivados pirazolínicos 2c, 2j

ou dipirona............................................................................................................

IV.3.7 – Avaliação da atividade ulcerogênica após administração crônica dos

derivados pirazolínicos 2c, 2j ou dipirona............................................................

IV.4 – TESTES BIOQUÍMICOS........................................................................…

IV.4.1 – Avaliação de parâmetros indicativos de função renal e hepática após

administração crônica dos derivados pirazolínicos 2c, 2j ou dipirona.................

IV.4.2 – Avaliação de parâmetros hematológicos após administração crônica

dos derivados pirazolínicos 2c, 2j ou dipirona.....................................................

IV.4.3 – Determinação dos níveis séricos de haptoglobina após administração

crônica dos derivados pirazolínicos 2c, 2j ou dipirona........................................

IV.4.4 – Determinação da atividade tecidual da mieloperoxidase (MPO), N-

acetil-β-D-glucosaminidase (NAG) e eosinoperoxidase (EPO) na pata de ratos

após administração crônica dos derivados pirazolínicos 2c, 2j ou dipirona........

IV.4.5 – Determinação do nível tecidual de TNF-α na pata de ratos após

administração crônica dos derivados pirazolínicos 2c, 2j ou dipirona.................

IV.5 – ANÁLISE ESTATÍSTICA ...........................................................................

V – RESULTADOS .............................................................................................

V.1 – TESTES COMPORTAMENTAIS................................................................

V.1.1 – Avaliação do efeito dos novos pirazolínicos (2a-j) no teste da

formalina...............................................................................................................

V.1.2 – Avaliação do efeito dos novos pirazolínicos 2c e 2j no teste da placa

quente..................................................................................................................

V.1.3 – Avaliação do efeito dos novos pirazolínicos 2c e 2j no teste do edema

de pata e da alodínia induzidos por carragenina.................................................

V.1.4 – Avaliação do efeito dos novos pirazolínicos 2c e 2j sobre a atividade

locomotora de camundongos...............................................................................

V.1.4.1 – Teste da locomoção forçada em cilindro giratório (rotarod).................

V.1.4.2 – Teste da locomoção espontânea..........................................................

Sumário

V.1.5 – Avaliação do efeito agudo dos derivados pirazolínicos 2c e 2j na

alodínia mecânica e no edema de pata induzidos por CFA e na atividade

locomotora espontânea em ratos.........................................................................

V.1.6 – Avaliação do efeito da administração crônica dos derivados

pirazolínicos 2c, 2j ou dipirona na alodínia mecânica e no edema induzidos

por CFA em ratos.................................................................................................

V.1.7 – Avaliação da variação do peso corporal ao longo do tratamento

crônico com os derivados pirazolínicos 2c, 2j ou dipirona...................................

V.1.8 – Avaliação da percentagem de peso de alguns órgãos em relação ao

peso corporal dos ratos ao final do tratamento crônico com os derivados

pirazolínicos 2c, 2j e dipirona...............................................................................

V.1.9 – Avaliação da atividade ulcerogênica dos pirazolínicos 2c, 2j e da

dipirona após administração crônica....................................................................

V.2 – TESTES BIOQUÍMICOS......................................................……………….

V.2.1 – Efeito da administração crônica de 2c, 2j ou dipirona sobre alguns

parâmetros indicativos de toxicidade renal e hepática........................................ 58

V.2.2 – Efeito da administração crônica de 2c, 2j ou dipirona sobre alguns

parâmetros hematológicos ..................................................................................

V.2.3 – Determinação dos níveis plasmáticos de haptoglobina após a

administração crônica de 2c, 2j e dipirona em ratos........................................... 60

V.2.4 – Determinação da atividade tecidual das enzimas MPO, NAG e EPO na

pata de ratos após a administração crônica de 2c, 2j ou dipirona.......................

V.2.5 – Determinação dos níveis teciduais de TNF-α na pata de ratos após a

administração crônica de 2c, 2j ou dipirona........................................................ 62

VI – DISCUSSÃO.................................................................................................

VII – CONCLUSÕES............................................................................................

VIII – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..........................................................

IX – ANEXOS....................................................................................................... 94

Lista de abreviaturas

xii

LISTA DE ABREVIATURAS

AINEs – antiinflamatórios não esteroidais

B50

– 2-[5-triclorometil-5-hidróxi-3-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazol-1-il]-4-(4-bromofenil)-

5-metiltiazol

CFA – Adjuvante completo de Freund

EPO – eosinoperoxidase

FPCA

– 3-fenil-5-hidróxi-5-triclorometil-4,5-diidro-1H-1-pirazolcarboxiamida

FR140423 – 3-(difluormetil)-1-(4-metoxifenil)-5-[4-(metilsulfinil)fenil] pirazol

FR143166 – 1-(4-fluorfenil)-3-metil-5-[4-(metillsulfinil)fenil]pirazol

FR188582

– 3-cloro-5-[4-(metilsulfonil)fenil]-1-fenil-1H-pirazol

LABNEURO – Laboratório de Neurotoxicidade e Psicofarmacologia

MPCA

– 3-metil-5-hidróxi-5-triclorometil-4,5-diidro-1H-1-pirazolcarboxiamida

MPF4

– 4-metil-5-trifluormetil-5-hidróxi-4,5-diidro-1H-pirazol metil éster

MPO – mieloperoxidase

NAG – N-acetil-β-D-glucosaminidase

NUQUIMHE – Núcleo de Química de Heterociclos

PZ 2

– 3-etoximetil-5-etoxicarbonil-1H-1-metilpirazol

PZ 3

– 3-etoximetil-5-etoxicarbonil-1H-1-fenilpirazol

TNF-α – fator de necrose tumoral alfa

– 3-etil-5-trifluormetil-4,5-diidro-1H-pirazol-1-carboxiamida

– 4-metil-5-trifluormetil-4,5-diidro-1H-pirazol-1-carboxiamida

Lista de figuras

xiii

LISTA DE FIGURAS

III. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

FIGURA 1 – Estrutura química do anel pirazol......................................................

FIGURA 2 – Estrutura química da dipirona...........................................................

FIGURA 3

– Representação esquemática da estratégia de substituição

bioisostérica do anel benzênico da salicilamida para obtenção de novos 5-

trifluormetil-4,5-diidro-1H-pirazóis..........................................................................

IV. MATERIAL E MÉTODOS

FIGURA 1

– Fórmula estrutural dos derivados 5-trifluormetil-4,5-diidro-1H-

pirazol-1-carboxiamida utilizados no presente estudo...........................................

V. RESULTADOS

FIGURA 1 – Efeito dos novos derivados pirazolínicos 2a-d na nocicepção

induzida por formalina, nas fases neurogênica e inflamatória do teste, em

camundongos ........................................................................................................

FIGURA 2 – Efeito dos novos derivados pirazolínicos 2e, 2g, 2i e 2j na

nocicepção induzida por formalina, nas fases neurogênica e inflamatória do

teste, em camundongos.........................................................................................

FIGURA 3 – Comparação entre as eficácias antinociceptivas de 2c, 2j (1000

µmol/kg), salicilamida (1500 µmol/kg) e dipirona (1000 µmol/kg) no teste da

formalina em camundongos...................................................................................

FIGURA 4 – Efeito dos derivados pirazolínicos 2c e 2j (1000 µmol/kg), dipirona

(1500 µmol/kg) (DIP) ou veículo na latência para resposta ao estímulo térmico

no teste da placa quente em camundongos..........................................................

Lista de figuras

xiv

FIGURA 5 – Efeito dos derivados pirazolínicos 2c e 2j (1000 µmol/kg) ou

veículo no edema de pata induzido por carragenina 30 min e 4 h após indução

do edema em camundongons................................................................................

FIGURA 6 – Efeito dos derivados pirazolínicose 2c e 2j (1000 µmol/kg) ou

veículo na alodínia mecânica induzida por carragenina em camundongons.........

FIGURA 7 – Efeito da administração aguda dos derivados pirazolínicos 2c, 2j e

dipirona na dose de 1000 µmol/kg ou veículo na alodínia induzida por injeção

intraplantar de CFA ao longo de 24 h....................................................................

FIGURA 8 – Efeito da administração aguda dos derivados pirazolínicos 2c, 2j e

dipirona na dose de 1000 µmol/kg, sobre o edema induzido por injeção

intraplantar de CFA. ..............................................................................................

FIGURA 9 – Curva dose-efeito dos derivados pirazolínicos 2c, 2j e dipirona na

alodínia induzida por injeção intraplantar de CFA.................................................

FIGURA 10 – Efeito da administração crônica dos pirazolínicos 2c (100

µmol/kg), 2j (100 µmol/kg) e dipirona (100 µmol/kg) na alodínia induzida por

injeção intraplantar de CFA na pata ipsilateral......................................................

FIGURA 11 – Efeito da administração crônica dos pirazolínicos 2c (100

µmol/kg), 2j (100 µmol/kg) e dipirona (100 µmol/kg) na alodínia induzida por

injeção intraplantar de CFA na pata contralateral..................................................

FIGURA 12 – Efeito da administração crônica dos pirazolínicos 2c (100

µmol/kg), 2j (100 µmol/kg) e dipirona (100 µmol/kg) no edema de pata

produzido por injeção intraplantar

de CFA na pata ipsilateral. .............................

FIGURA 13 – Efeito da administração crônica dos derivados pirazolínicos 2c, 2j

e dipirona (100 µmol/kg/15 dias) nos níveis plasmáticos de haptoglobina de

ratos com inflamação crônica induzida por injeção intraplantar de CFA...............

FIGURA 14 – Efeito da administração crônica dos derivados pirazolínicos 2c, 2j

e dipirona (100 µmol/kg/15 dias) nos níveis teciduais de TNF- α de ratos com

inflamação crônica induzida por injeção intraplantar de CFA................................

Lista de tabelas

LISTA DE TABELAS

III. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

TABELA 1 –

Derivados pirazolínicos sintetizados no NUQUIMHE e testados

no LABNEURO.....................................................................................................

V. RESULTADOS

TABELA 1 – Eficácia antinociceptiva dos 4,5-diidro-1H-pirazóis 2a-j

(1000

µmol/kg) nas fases neurogênica e inflamatória do teste da formalina (20 µ

1,5%, ipl) em camundongos ................................................................................

TABELA 2 – Efeito dos 4,5-diidro-1H-pirazóis 2c e 2j

em camundongos

submetidos ao teste da locomoção forçada em cilindro giratório.........................

TABELA 3 – Efeito dos 5-trifluormetil-4,5-diidro-1H-pirazóis 2c, 2j

, salicilamida

e dipirona na atividade locomotora espontânea de camundongos.......................

TABELA 4 – Efeito dos 5-trifluormetil-4,5-diidro-1H-pirazóis 2c, 2j

, e dipirona

na atividade locomotora espontânea de ratos......................................................

TABELA 5 –

Variação percentual do volume da pata contralateral à pata

injetada com CFA ou salina..................................................................................

TABELA 6 – Efeito da administração crônica dos derivados pirazolínicos 2c,

e dipirona (100 µ

mol/kg) em ratos com inflamação crônica induzida por CFA,

sobre a percentagem de variação do peso corporal em relação

ao peso inicial

(antes da injeção de CFA)....................................................................................

TABELA 7 – Efeito da administração crônica dos derivados pirazolínicos 2c,

e dipirona, sobre a percentagem de peso de algun

s órgãos em relação ao

peso corporal........................................................................................................

TABELA 8 – Efeito da administração crônica dos novos pirazolínicos 2c e 2j

da dipirona e da administração agu

da de indometacina na mucosa gástrica de

ratos......................................................................................................................

Lista de tabelas

xvi

TABELA 9 – Efeito da administração crônica dos derivados pirazolínicos 2c,

e dipirona (100 µ

mol/kg) sobre marcadores de toxicidade hepática (AST e

ALT) e renal (uréia e creatinina) em ratos com inflamação crônica induzida por

injeção intraplantar de CFA..................................................................................

TABELA 10 – Efeito da administração crônica dos derivados pirazolínicos 2c

2j e dipirona (100 µ

mol/kg) sobre alguns parâmetros hematológicos de ratos

no modelo da inflamação crônica induzida por injeção intraplantar de CFA........

Tabela 11 – Efeito da adminstração crônica dos novos pirazóis 2c e 2j

e da

dipirona (100 µmol/kg) na atividade da MPO, NAG e EPO do tecido da pata de

ratos com inflamação crônica induzida por CFA..................................................

I. INTRODUÇÃO

Introdução

A dor é um sintoma clínico de extrema relevância para alertar os indivíduos da

ocorrência de alguma anormalidade ou doença. Por esse motivo ela é a causa

principal da procura dos consultórios médicos. Não se pode negar o papel vital da

dor, mas também não se pode negligenciar o sofrimento causado pela mesma.

Quando não adequadamente tratada, a dor pode produzir efeitos desastrosos na

vida dos pacientes e também das pessoas que convivem com eles. Uma das

principais causas de afastamento do trabalho, de depressão e de isolamento social

é, justamente, a dor não tratada adequadamente. Assim, identificar a causa e aliviar

esse sintoma é, com certeza, parte importante do tratamento de qualquer patologia.

Neste sentido, muitas pesquisas têm sido desenvolvidas para que se possa

entender melhor a gênese desse processo e, dessa forma, poder intervir

adequadamente. Uma vez que se conhece a causa de uma síndrome dolorosa,

podem-se utilizar tanto abordagens farmacológicas quanto não farmacológicas para

tratá-la. O uso de fármacos é, certamente, uma das condutas mais empregadas no

controle da dor. Infelizmente, nem todas as modalidades de dor possuem um

tratamento adequado atualmente. Muitos pacientes não respondem aos fármacos

disponíveis ou, então, apresentam juntamente com o alívio da dor, efeitos adversos

que impedem a continuidade do tratamento.

Levando em consideração a alta incidência da dor e também a falta de

analgésicos eficazes e seguros, torna-se relevante pesquisar novas moléculas com

potencial terapêutico. Neste sentido, muitos pesquisadores têm procurado

desenvolver novas drogas, cuja estrutura química seja de fácil obtenção, tanto em

nível de rendimento da síntese propriamente dita, quanto em relação aos

subprodutos gerados e à toxidade dos reagentes intermediários. Além disso, tem-se

procurado desenvolver moléculas com boa eficácia e menor incidência de efeitos

adversos em relação as já existentes.

Pirazóis e seus derivados, como a dipirona, são conhecidos pela sua

excelente eficácia como analgésicos. Por esse motivo, na última década, o

NUQUIMHE (Núcleo de Química de Heterociclos) e o LABNEURO (Laboratório de

Neurotoxicidade e Psicofarmacologia) da UFSM têm unido esforços com o intuito de

sintetizar e avaliar os efeitos biológicos de vários compostos pirazolínicos. Em

estudos anteriores, foi demonstrado o potencial antinociceptivo e antipirético de

Introdução

vários derivados dessa classe química, comprovando que, realmente, podem ser

interessantes para o desenvolvimento de novos fármacos.

Portanto, este trabalho teve por objetivo estender o conhecimento a respeito

dos efeitos dos derivados pirazolínicos sobre a nocicepção em animais de

laboratório e, assim, tentar identificar moléculas promissoras para o tratamento da

dor.

Parte dos dados que compõem esta tese foram publicados no periódico

European Journal of Medical Chemistry (Anexo 1) e os demais resultados

encontram-se sob a forma de manuscrito científico que será submetido para

publicação (Anexo 2).

II. OBJETIVOS

Objetivos

II.1 – OBJETIVO GERAL

Avaliar o possível efeito antinociceptivo, antiedematogênico e a toxicidade de

derivados 5-trifluormetil-4,5-diidro-1H-1-pirazol-1-carboxamida, utilizando modelos

de nocicepção e inflamação aguda e crônica em camundongos e ratos.

II.2 – OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1 – Avaliar a atividade antinociceptiva dos derivados pirazolínicos em modelos de

nocicepção aguda induzida por estímulo nocivo químico e térmico.

2 – Investigar o efeito dos derivados pirazolínicos sobre o edema de pata induzido

por agente químico.

3 – Avaliar o efeito antinociceptivo e antiedematogênico dos derivados pirazolínicos

em um modelo de inflamação crônica.

4 – Verificar se a administração crônica dos compostos altera os níveis séricos de

haptoglobina (marcador de inflamação), bem como analisar a atividade tecidual de

algumas enzimas marcadoras de infiltração celular e os níveis teciduais de TNF-α no

local da lesão, após a administração crônica dos compostos.

5 – Avaliar alguns parâmetros bioquímicos de função enal e hepática em animais

submetidos à administração crônica dos derivados pirazolínicos.

6 – Verificar alterações no ganho de peso e relação entre o peso de alguns órgãos e

o peso corporal, como indicadores de toxicidade, após administração crônica dos

novos derivados pirazolínicos.

7 – Avaliar a atividade ulcerogênica dos derivados pirazolínicos após administração

crônica.

8 – Verificar se os derivados pirazolínicos alteram as atividades locomotora e

exploratória dos animais, nos testes do campo aberto e cilindro giratório.

III. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Revisão Bibliográfica

III.1 – DOR E NOCICEPÇÃO

A dor é uma experiência consciente, uma interpretação dos sinais

nociceptivos que é influenciada pelas memórias individuais, aspectos emocionais,

patológicos, genéticos e fatores cognitivos. A dor, portanto, é uma experiência

altamente subjetiva, como ilustrado pela definição dada pela Associação

Internacional para o Estudo da Dor (IASP), onde ela é descrita como “uma

experiência sensorial e emocional desagradável associada à lesão tecidual real ou

potencial” (TJOLSEN & HOLE, 1997; TRACEY & MANTYH, 2007). Tendo em vista

que um dos componentes da dor é o estímulo nocivo, podemos considerá-la de

extrema importância, já que alerta os indivíduos para a ocorrência de alterações na

integridade e na funcionalidade do organismo, permitindo que sejam adotados

mecanismos de defesa (MILLAN, 1999; TRAUB, 1997). Entretanto, nem sempre a

intensidade da dor está diretamente relacionada com a presença de lesão tecidual.

Isso é particularmente verdadeiro em estados de dor crônica, onde a dor deixa de ter

uma importância adaptativa e passa a ser apenas uma fonte de sofrimento e

estresse (MILLAN, 1999; TRACEY & MANTYH, 2007).

Em relação ao tempo de duração, a dor pode ser classificada como aguda ou

crônica. A dor aguda é aquela que tem a função de alerta, caracterizando-se por ser

de curta duração (alguns segundos até poucos dias), sendo muitas vezes, mas não

necessariamente, decorrente de uma lesão tecidual e desaparecendo com a

resolução do processo que a originou (BERNARD et al., 1996; LOESER &

MELZACK, 1999). Além disso, a dor aguda tem etiologia evidente e seu diagnóstico

é facilmente definido, tornando o controle desse tipo de dor bastante eficiente

usando-se o arsenal terapêutico disponível atualmente (PORTENOY & LESAGE,

1999).

A dor crônica, por sua vez, estende-se por meses ou anos, persistindo, muitas

vezes, mesmo na ausência de qualquer lesão tecidual (ASHBURN & STAATS,

1999). Esse tipo de dor parece resultar de processos patológicos que agridem as

estruturas somáticas ou viscerais e de disfunções do sistema nervoso central ou do

sistema nervoso periférico. Muitas vezes a etiologia da dor crônica é multifatorial, o

que torna seu diagnóstico e tratamento mais complexos, envolvendo múltiplas

Revisão Bibliográfica

abordagens e nem sempre alcançando pleno êxito na sua erradicação (ASHBURN,

1999; LOESER & MELZACK, 1999).

O termo nocicepção foi introduzido por SHERRINGTON em 1906, para

diferenciar a percepção de estímulos nocivos da sensação de dor, propriamente dita.

Neste sentido, a dor representa uma experiência complexa e, muitas vezes,

subjetiva, incluindo componentes afetivos, culturais e psicológicos, enquanto

nocicepção é a sensação determinada pela estimulação das fibras aferentes

primárias que transmitem o impulso nociceptivo até o sistema nervoso central

(DUBNER & BENNET, 1983;

MEYER et al., 1994).

Em se tratando da utilização de modelos experimentais de dor em animais, é

mais adequado usar-se o termo nocicepção, uma vez que os animais não são

capazes de verbalizar os componentes subjetivos da dor. Sendo assim, tem sido

proposto que os termos dor e analgesia são mais apropriadamente utilizados para o

ser humano, enquanto nocicepção e antinocicepção são mais adequados para

animais (JONES, 1992).

III.2 – DETECÇÃO, TRANSMISSÃO E MODULAÇÃO DA DOR

O termo nociceptor é uma abreviatura de “nocirreceptor”, e denota uma

estrutura especializada na percepção de estímulos nocivos ou potencialmente

nocivos (CATERINA & JULIUS, 1999). Esse termo foi introduzido por Sherrington,

que definiu nociceptores como terminações livres de neurônios aferentes primários,

que podem ser ativados por estímulos mecânicos nocivos, térmicos ou químicos

(SHERRINGTON, 1906, MEYER et al., 1994; JULIUS & BASBAUM, 2001). A

percepção da dor inicia-se na periferia pela estimulação dos nociceptores, cujos

corpos celulares encontram-se nos gânglios das raízes dorsais e nos gânglios

trigeminias e projetam seus axônios até o corno dorsal da medula. Os nociceptores

podem ser amplamente divididos em duas classes: uma com corpos celulares de

pequeno diâmetro e axônios não mielinizados (fibras C) e outra composta por

células com corpo celular de diâmetro médio e axônios mielinizados (fibras Aδ). As

fibras C nociceptoras conduzem o estímulo lentamente, enquanto que as fibras

nociceptoras Aδ, o fazem mais rapidamente (SMITH, 1984; JULIUS & BASBAUM,

2001). É importante ressaltar que o estímulo, seja ele térmico, químico ou mecânico,

Revisão Bibliográfica

deve exceder um certo limiar para que seja interpretado pelo sistema sensorial como

nociceptivo (JULIUS & BASBAUM, 2001). De fato, estudos eletrofisiológicos

mostram que neurônios sensoriais primários podem ser estimulados por calor

nocivo, pressão intensa e agentes químicos irritantes, mas não por estímulos

inócuos como aquecimento e pressão leves (BURGESS & PERL, 1967).

Os mecanismos pelos quais os estímulos térmicos, químicos e mecânicos

desencadeiam o aparecimento do potencial de ação na fibra aferente primária

(primeiro passo na percepção da dor) ainda não estão completamente elucidados.

Contudo, existem evidências de que estímulos algogênicos induzem correntes de

cátions através de estruturas protéicas especializadas, culminando na

despolarização do aferente primário e na liberação de neurotransmissores no corno

dorsal da medula (BONICA, 1990; BEVAN & GEPPETTI, 1994; KIRCHSTEIN et al.,

1997; BESSON, 1999). Substâncias endógenas, como ácido araquidônico,

neuropeptídeos, cininas, aminoácidos excitatórios, entre outros, são produzidas e/ou

liberadas pelo tecido lesionado e estimulam receptores presentes na membrana

destes neurônios. Além disso, os mediadores inflamatórios liberados facilitam a

neurotransmissão e sensibilizam o nociceptor (BJÖRKMAN, 1995). Mais

especificamente, prostaglandinas e leucotrienos sensibilizam os terminais aferentes

primários, tornando os nociceptores periféricos mais sensíveis à bradicinina (TAIWO

& LEVINE, 1989; COHEN & PERL, 1990).

A informação nociceptiva que chega ao corno dorsal da medula espinhal,

através das fibras aferentes primárias, é transmitida via fibras ascendentes

(neurônios de projeção) aos centros supra-espinhais, onde ocorre a interpretação e

localização da dor (MILLAN, 2002). Entretanto, a avaliação dos primeiros

neurologistas, que consideravam a medula como um simples sistema de

transmissão da informação nociceptiva, está longe de ser verdadeira. Hoje se sabe

que muitos sistemas integrativos estão presentes na medula espinhal, envolvendo a

percepção e modulação de estímulos nocivos e não nocivos (SMITH, 1984; MILLAN,

2002).

Muitos trabalhos destacam o papel do sistema descendente de controle

endógeno da dor (MILLAN, 2002; VANEGAS & SCHAIBLE, 2004). As vias

descendentes podem modular a nocicepção interagindo com alguns elementos

Revisão Bibliográfica

neuronais no corno dorsal da medula: terminações das fibras aferentes primárias,

neurônios de projeção, interneurônios inibitórios e excitatórios e terminações de

outras vias descendentes (Willis, 1991; FIELDS, 1999, MILLAN, 1999; YAKSH,

1999). O sistema descendente pode exercer tanto ações facilitatórias quanto

inibitórias sobre a percepção de estímulos dolorosos e, desta forma, aumentar ou

diminuir a sensação de dor. Assim, vias descendentes inibitórias podem atenuar a

liberação de substâncias algogênicas das fibras aferentes primárias ou, ainda, direta

ou indiretamente suprimir a estimulação dos neurônios de projeção (via

interneurônios inibitórios) (MILLAN, 2002). Dentre as vias descendentes, destacam-

se as vias noradrenérgica, serotoninérgica, dopaminérgica, opioidérgica e

colinérgica. É importante ressaltar que o sistema descendente de controle da dor é

bastante complexo, sendo que um mesmo neurotransmissor pode exercer tanto

ações inibitórias quanto facilitatórias, dependendo do local onde é liberado (MILLAN,

2002).

III.3 – MEDIADORES QUÍMICOS DA DOR E DA INFLAMAÇÃO

Substâncias como íons K

, trifosfato de adenosina, glutamato, substância P e

radicais livres participam do mecanismo da nocicepção (DRAY & PERKINS, 1993;

DRAY, 1995, 1997a, 1997b). Além disso, os fragmentos celulares resultantes de

lesão tecidual são capazes de desencadear uma reação inflamatória local, atraindo

neutrófilos, eosinófilos, macrófagos e linfócitos. Essas células liberam mediadores

inflamatórios como: cininas (bradicinina e calidina); citocinas (interleucinas e fator de

necrose tumoral); aminas (serotonina, histamina) e prostanóides (prostaglandinas,

prostaciclinas e leucotrienos). Assim, a injúria celular e a reação inflamatória

decorrente de tal injúria, expõem o aferente primário a um grande número de

substâncias capazes de estimular e sensibilizar o nociceptor (TAIWO & LEVINE,

1991; GUIEU et al., 1996; MILLAN, 1997, 1999; CALIXTO et al., 2000, 2001).

III.4 – TRATAMENTO FARMACOLÓGICO DA DOR

Várias estratégias podem ser adotadas para o controle da dor, porém a

abordagem farmacológica é, sem dúvida, a mais utilizada. Entre os fármacos

Revisão Bibliográfica

analgésicos mais utilizados, os opióides e os antiinflamatórios não esteroidais

(AINEs) são os mais amplamente empregados (CAMU & VANLERSBERGUE, 2002).

Embora os opióides sejam analgésicos muito eficazes, sua utilização é

limitada pelo fato dessas drogas produzirem muitos efeitos indesejados, como

constipação, náuseas, vômitos, broncoconstrição, hipotensão, bradicardia e

depressão respiratória (MCQUEEN, 1983; HOSKIN & HANKS, 1991; CAMU &

VANLERSBERGUE, 2002). Além disso, a tolerância aos opióides instala-se

rapidamente e a dependência física é verificada após poucos dias de tratamento, o

que dificulta seu uso por longos períodos (MARTIN & SLOAN, 1977; NESTLER,

1993). Sendo assim, os AINEs têm algumas vantagens sobre os analgésicos

opióides, como não induzir tolerância e dependência com o uso crônico (NUKI,

1983). No entanto, os AINEs também podem produzir efeitos indesejáveis como

hemorragias, úlcera gástrica, falência renal e hepática, reações cutâneas, crises

asmáticas e problemas cardiovasculares (JICK et al., 1992; CARSON et al., 1993;

GARCÍA RODRÍGUEZ & JICK, 1996; BORNE, 1995; WALKER, 1997; VANE &

BOTTING, 1998; HINZ & BRUNE, 2002; FLOWER, 2003; MITCHELL & WARNER,

2006).

Os AINEs estão entre os mais largamente utilizados de todos os agentes

terapêuticos e incluem uma grande variedade de drogas, de diferentes classes

químicas (ácidos salicílicos, como o AAS; ácidos propiônicos, como o ibuprofeno;

ácidos acéticos, como a indometacina; fenamatos, como o ácido mefenâmico; ácidos

enólicos, como o piroxicam; derivados pirazolínicos, como a dipirona e o celecoxibe;

entre outras). O principal mecanismo da ação antiinflamatória, analgésica e

antipirética dos AINEs é a inibição da enzima ciclooxigenase (COX), que culmina na

diminuição da síntese de prostaglandinas (VANE, 1971; VANE & BOTTING, 1987;

VANE, 1994; CHANDRASEKHRARAN el al., 2002). Dentre os AINEs, daremos

maior ênfase aos estudos realizados com os derivados pirazolínicos, em especial a

dipirona, já que os compostos pesquisados nesse trabalho pertencem a essa classe

e que a dipirona foi utilizada em alguns experimentos como controle positivo.

Revisão Bibliográfica

III.5 – DERIVADOS PIRAZOLÍNICOS

Os derivados pirazolínicos são drogas de origem sintética que possuem em

sua estrutura um anel pirazol, que é um heterociclo de cinco membros, contendo

átomos de nitrogênio nas posições 1 e 2 do anel (Figura 1). Esses compostos aliam

atividade antiinflamatória, analgésica e antipirética (BORNE, 1995; GÜRSOY et al.,

2000) e, por isso, são eficazes no controle da dor e da febre.

FIGURA 1 – Estrutura química do anel pirazol

A descoberta dos derivados pirazolínicos como agentes antipiréticos data de

1884, quando o químico alemão Ludwig Knorr tentava sintetizar derivados

quinolínicos com atividade antipirética e, acidentalmente, obteve a antipirina. Esse

composto possui atividade analgésica, antipirética e anti-reumática, porém é muito

tóxico. Mais tarde foi sintetizado um derivado 3-metilamino da antipirina, a

aminopirina, um análogo mais potente que foi amplamente utilizado como analgésico

e antipirético nos Estados Unidos e Europa, até que fossem relatados casos de

agranulocitose fatal associados ao uso dessa droga (BORNE, 1995). Devido a esse

grave efeito colateral, houve pouco interesse pela pesquisa de novos compostos

pirazolínicos até meados de 1940, quando uma série de pirazolidinodionas mais

seguras foi sintetizada (INSEL, 1996). O representante mais importante dessa série

é a fenilbutazona, um antiinflamatório muito potente, embora seu uso em alguns

países seja restrito ao tratamento da espondilite anquilosante, devido aos seus

efeitos colaterais (INSEL, 1996). A fenilbutazona foi introduzida na terapia da artrite

em 1952, representando um marco no tratamento dessa doença. Entretanto, ela

Revisão Bibliográfica

pode causar náuseas, vômito e desconforto epigástrico em uma parcela importante

dos pacientes. Alguns casos de agranulocitose associados ao uso de fenilbutazona

também já foram descritos (INSEL, 1996).

Em 1921, o laboratório Hoechst obteve a dipirona (Figura 2), um outro

derivado pirazolínico, pela substituição de uma das metilas do grupo amino da 5-

pirazolona por metilenosulfoxilato de sódio. Estudos em animais e humanos

revelaram que a dipirona é um antipirético potente, tem boa atividade analgésica e

fraca atividade antiinflamatória (BRUNE & ALPERMANN, 1983; BRODGEN, 1986;

LAIRD & CERVERO, 1996; HINZ et al., 2007). Essa droga foi introduzida no

comércio com o nome de Novalgina

, sendo também denominada genericamente de

metamizol. A dipirona ganhou popularidade nos países em desenvolvimento e em

alguns países da Europa, especialmente devido ao seu baixo custo e alta eficácia

(ARELLANO & SACRISTAN, 1990). Porém, o uso clínico da dipirona foi proibido na

década de 70 nos Estados Unidos e em alguns países da Europa, quando seu uso

foi relacionado a casos de agranulocitose (INSEL, 1996). Entretanto, estudos

mostram que a incidência de agranulocitose em usuários de dipirona é muito baixa,

havendo uma ampla variação em relação às diferentes populações estudadas e às

doses utilizadas (The international agranulocytosis and aplastic anemia study, 1986;

LAPORTE & CARNÉ, 1987). Além disso, outros analgésicos bastante aceitos no

meio médico e acadêmico, como o paracetamol e o ácido acetilsalicílico (AAS),

também causam efeitos indesejados graves, como necrose hepática (RUMACK et

al., 1982; DICKENSON, 1997) e Síndrome de Reye (BENEDETTI & BUTLER, 1990),

em uma proporção muito maior do que a dipirona está associada à agranulocitose.

A dipirona é o analgésico e antipirético mais utilizado no Brasil. Por isso, a fim

de esclarecer aspectos relacionados à sua segurança, a Agência Nacional de

Vigilância Sanitária (ANVISA) promoveu em 2001, o “Painel Internacional de

Avaliação da Segurança da Dipirona”. Nessa oportunidade, pesquisadores de vários

países discutiram, com base em evidências científicas, os riscos do uso da dipirona.

As conclusões a que os participantes do painel chegaram foram as seguintes: a

eficácia da dipirona como analgésico e antitérmico é inquestionável; os riscos

atribuídos à sua utilização em nossa população são baixos e os dados científicos

disponíveis apontando a ocorrência destes riscos não são suficientes para indicar

uma alteração do status regulatório (venda sem presecrição); os riscos do uso de

Revisão Bibliográfica

dipirona são similares, ou menores, do que o de outros analgésicos/antitérmicos

disponíveis no mercado; a mudança de regulamentação atual da prescrição de

dipirona incorreria em aspectos negativos para a população, aumentando os riscos

de utilização de outros fármacos indicados para a mesma finalidade terapêutica

(ANVISA, 2001).

FIGURA 2 – Estrutura química da dipirona

Muitos estudos já foram realizados na tentativa de elucidar completamente o

local e o mecanismo de ação da dipirona. Nesse sentido estão descritas ações

centrais, apontando um papel da dipirona na ativação de vias descendentes

inibitórias (YAKSH & HAMMOND, 1982; TAIWO & LEVINE, 1988; BJÖRKMAN,

1995; TORTORICI et al., 1996; HERNANDEZ & VANEGAS, 2001; CARLSSON et

al., 1986; CARLSSON & JURNA, 1987; TORTORICI & VANEGAS, 1994). Além

disso, AKMAN et al. (1996) e TORTORICI et al. (1996) demonstraram que a

antinocicepção produzida por dipirona envolve mecanismos opióides. MARQUEZ &

FERREIRA (1987) demonstraram que infusões repetidas de dipirona em humanos

aliviavam a dor crônica. O efeito analgésico e antiinflamatório da dipirona na dor

crônica também foi pesquisado por TATSUO et al. (1994). Eles compararam a

atividade da dipirona, da dexametasona (corticóide) e da indometacina (AINE), e

verificaram que a dipirona tem atividade analgésica significativa e fraca atividade

antiinflamatória, enquanto que a indometacina e a dexametasona mostram equilíbrio

de atividades analgésica e antiinflamatória. Através desses resultados, os autores

concluíram que, uma vez que a dipirona não mostra atividade antiinflamatória, o

mecanismo de ação analgésico não envolve a inibição da enzima ciclooxigenase. No

entanto, esses resultados são conflitantes com os achados de CAMPOS et al.

Revisão Bibliográfica

(1998), que, injetando lipopolissacarídeo (LPS) em camundongos, demonstraram

que essa endotoxina provoca a liberação de um fator que produz contorções

abdominais. Esse fator é liberado pelos macrófagos e seu efeito é mediado pela

ação das prostaglandinas a partir do aumento de atividade da COX–2,

principalmente. A dipirona impede a liberação do fator indutor das contorções,

evitando o seu aparecimento. A seguir, CAMPOS et al., (1999) demonstraram que a

dipirona, em concentrações terapêuticas, inibe seletivamente a COX–2. Além disso,

a dipirona inibe o edema produzido pela aplicação de capsaicina na pele (inflamação

neurogênica) (SCHMELTZ et al., 2000) e inibe a nocicepção produzida por injeção

de prostaglandinas (LORENZETTI & FERREIRA, 1996). Existem, também,

evidências de que a dipirona pode inibir diretamente a atividade dos neurônios

aferentes (NEUGEBAUER et al., 1994). Estes dados são corroborados pelos

achados de BEIRITH e colaboradores (1998), que demonstraram que a dipirona

diminui a ligação de aminoácidos excitatórios a seus receptores, que são

responsáveis pela estimulação dos neurônios aferentes espinhais. Outro mecanismo

sugerido para a antinocicepção provocada pela dipirona é a via L-arginina-óxido

nítrico-GMP, já que inibidores dessa via previnem o efeito antinociceptivo da dipirona

(DUARTE et al., 1992). Apesar desses estudos citados, e de inúmeros outros, o

mecanismo de ação da dipirona ainda não está totalmente elucidado.

III.5.1 – A busca de novos derivados pirazolínicos para o tratamento da dor e

da inflamação

Desde o surgimento da dipirona, muitos outros compostos, contendo o anel

pirazol, têm sido estudados. Em 1969, OSHIMA e colaboradores estudaram a

atividade farmacológica do 1-(4-metóxi-6-metil-2-pirimidinil)-3-metil-5-metoxipirazol e

uma série de 43 análogos desse composto. Após a triagem desses compostos em

relação ao efeito analgésico, os autores verificaram que seis eram promissores e

investigaram o potencial antipirético e antiinflamatório, bem como a toxicidade

desses derivados pirazolínicos. Eles encontraram que os derivados 1-

pirimidinilpirazol são igual ou mais potentes que a aminopirina, enquanto que os

derivados 2-pirimidinilpirazol exibem atividade analgésica extremamente menor que

a aminopirina. Quanto à atividade antipirética e antiinflamatória, tais compostos são

menos potentes do que a aminopirina no combate à febre e equipotentes com a

Revisão Bibliográfica

aminopirina no teste de edema de pata induzido por carragenina e formalina. Além

disso, esses derivados pirazolínicos não se mostraram mais tóxicos do que a

aminopirina, quando comparados os valores de DL

de ambos. Eles concluíram,

ainda, que compostos contendo um grupamento metóxi na posição 5 do anel pirazol

apresentam ação analgésica, antipirética e antiinflamatória mais pronunciada do que

compostos análogos com outros substituintes nesta posição (OSHIMA et al., 1969).

MATHEUS e colaboradores (1991) demonstraram a ação antinociceptiva de

uma série de pirazol 4-acil-arilhidrazonas, quando administradas por via oral e

avaliadas no teste de contorções abdominais induzidas por acetilcolina em

camundongos. Os compostos dessa série que possuem um substituinte p-N(CH

)

ou m-OH e p-OCH

no anel aromático acil-arilhidrazona são dez vezes mais

potentes do que a dipirona, usada como droga de referência.

Vários estudos têm demonstrado a atividade antinociceptiva e antiinflamatória

do composto 3-(difluormetil)-1-(4-metoxifenil)-5-[4-(metilsulfinil)fenil] pirazol

(FR140423). O FR140423 foi sintetizado em 1997 por um grupo de pesquisadores

japoneses durante a triagem de novos compostos com potencial antiinflamatório

(TSUJI et al., 1997). Esse composto apresenta ação antinociceptica e

antiinflamatória, inibindo seletivamente a COX–2 (OCHI et al., 1999a; OCHI &

GOTO, 2001). Além disso, o FR140423 tem efeito antinociceptivo em um modelo de

dor induzida por estímulo térmico e esse efeito é antagonizado por naloxona, um

antagonista do receptor opióide (OCHI et al., 1999b). Os autores consideram que o

FR140423 é uma droga que tem ação por dois mecanismos distintos, ou seja,

inibição da COX–2 em tecidos inflamados e interação com o sistema opióide (OCHI

et al., 1999c). A administração por via oral ou intratecal, mas não

intracerebroventricular, do FR140423 também induz antinocicepção em um modelo

de dor provocada por estímulo mecânico, sendo essa ação mediada por receptores

opióides do subtipo δ, mas não pelos receptores µ e κ. O fato de a administração i.t.,

mas não i.c.v., de FR140423 causar antinocicepção indica que o sítio de ação desse

composto é espinhal e não supra-espinhal (OCHI et al., 1999b). Em estudos de

ligação, realizados com membranas preparadas a partir da medula espinhal de

camundongos, o FR140423 inibiu muito pouco a ligação de [

H] DPDPE ao receptor

opióide do subtipo δ, indicando que o FR140423 não se liga com grande

especificidade a esse receptor. Sendo assim, é provável que o efeito antinociceptivo

Revisão Bibliográfica

do FR140423 não resulte de sua interação direta com os receptores δ-opióides, mas

de mecanismos indiretos (OCHI et al., 1999b). A ação desse composto envolve,

além do sistema opióide, os sistemas inibitórios noradrenérgico e serotoninérgico

descendentes, uma vez que o efeito antinociceptivo do FR140423, injetado

intratecalmente, é antagonizado pela fentolamina (antagonista adrenérgico) e pela

metisergida (antagonista serotoninérgico) (OCHI & GOTO, 2000a, 2000b). Além de

sua comprovada ação antinociceptiva, esse composto possui ação antiinflamatória

duas vezes maior do que a indometacina no modelo de artrite induzida por colágeno

tipo II em ratos. Ao contrário da indometacina, o FR140423 não causa lesão gástrica

em ratos, mostrando-se, portanto, mais seguro do que a droga de referência (OCHI

& GOTO, 2001).

Outro composto testado pelo mesmo grupo de pesquisadores foi o FR188582

(3-cloro-5-[4-(metilsulfonil)fenil]-1-fenil-1H-pirazol), o qual mostrou-se um inibidor

altamente seletivo da COX-2, foi mais potente do que a indometacina contra o

edema de pata induzido por CFA e não causou lesão gástrica em ratos tratados com

a droga durante 10 dias (OCHI et al., 2001). Além disso, OCHI e colaboradores

(2002) também estudaram o efeito do 1-(4-fluorfenil)-3-metil-5-[4-

(metillsulfinil)fenil]pirazol (FR143166) no teste da pressão da cauda em

camundongos. O FR143166 produziu um efeito antinociceptivo mediado pela

ativação do sistema inibitório serotoninérgico descendente, da mesma forma que o

FR140423 (OCHI et al., 2002).

Tendo em vista o bom perfil analgésico, antipirético e antiinflamatório de

vários derivados pirazolínicos, muitos pesquisadores têm investido na síntese e

avaliação da atividade biológica de novos compostos dessa classe, que aliem boa

ação farmacológica e baixo índice de efeitos indesejáveis. É nesse sentido que

pesquisadores do LABNEURO vêm desenvolvendo um trabalho conjunto com

pesquisadores do NUQUIMHE da UFSM, buscando sintetizar compostos com

atividade antinociceptiva, antipirética e antiinflamatória.

Na tabela 1 estão representadas as estruturas químicas de alguns compostos

sintetizados no NUQUIMHE e já testados no LABNEURO. A administração

subcutânea de 3-metil-5-hidróxi-5-triclorometil-4,5-diidro-1H-1-pirazolcarboxiamida

(MPCA) induz antinocicepção nas fases neurogênica e inflamatória do teste da

formalina, mas não tem efeito antinociceptivo no teste de imersão da cauda. O

Revisão Bibliográfica

MPCA parece não apresentar ação antiinflamatória, já que não diminui o edema

induzido por carragenina (SOUZA et al., 2001). Ainda em relação ao MPCA, GODOY

et al. (2004) mostraram que esse composto e seu análogo 3-fenil-5-hidróxi-5-

triclorometil-4,5-diidro-1H-1-pirazolcarboxiamida (FPCA) apresentam efeito

antinociceptivo no teste das contorções abdominais. Nesse trabalho, os autores

também demonstram que a ação antinociceptiva do MPCA e do FPCA foi prevenida

pela administração intratecal de metisergida e ioimbina, ao contrário do que ocorre

para a dipirona. Esses resultados sugerem que receptores serotoninérgicos e α

adrenérgicos espinhais estão envolvidos na antinocicepção induzida por MPCA e

FPCA, mas não naquela induzida por dipirona.

Além disso, o MPCA e o FPCA revertem a febre induzida por

lipopolissacarídeo em camundongos e por Saccharomyces cerevisiae em ratos

jovens (SOUZA et al., 2002; TOMAZETTI, 2005).

O 3-etoximetil-5-etoxicarbonil-1H-1-metilpirazol (PZ 2) e seu análogo 3-

etoximetil-5-etoxicarbonil-1H-1-fenilpirazol (PZ 3), ao contrário do MPCA e do FPCA,

apresentam ação antinociceptiva num teste que emprega estímulo nocivo térmico, o

teste de imersão da cauda em água à 55ºC. O efeito antinociceptivo do PZ 3, mas

não do PZ 2, envolve a participação de mecanismos opióides (TABARELLI et al.,

2004).

Outro derivado pirazolínico recentemente estudado no LABNEURO é o 2-[5-

triclorometil-5-hidróxi-3-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazol-1-il]-4-(4-bromofenil)-5-metiltiazol

(B50), um derivado pirazolil-tiazol. O B50 apresenta ação antinociceptiva no teste

das contorções abdominais induzidas por ácido acético, mas, da mesma forma que o

MPCA, não apresenta efeito no teste de imersão da cauda. O efeito antinociceptivo

do B50 foi prevenido pela administração de naloxona, um antagonista não seletivo

dos receptores opióides, mas não por nor-binaltorfimina, antagonista do receptor κ-

opióide. Estes resultados sugerem que os receptores do subtipo κ-opióide não estão

envolvidos no mecanismo de ação do B50, embora exista uma participação do

sistema opióide (PROKOPP et al., 2004). A administração do B50, por via intratecal

também causa antinocicepção em camundongos submetidos ao teste de contorções

abdominais e este efeito é mediado pelo sistema opióide (De SOUZA et al., 2008).

Em 2006, uma série de trihalometil pirazolinas metil ester substituídas foi

sintetizada por MARTINS e colaboradores. Esses compostos foram avaliados no

Revisão Bibliográfica

teste da formalina e placa quente, onde foi demonstrada uma ação antinociceptiva

desses derivados pirazolínicos (MILANO et al., 2008). Os autores verificaram, ainda,

que compostos trifluormetil substituídos na posição 5 do anel pirazol apresentaram

maior eficácia antinociceptiva e ação mais prolongada do que aqueles triclorometil

substituídos. Os resultados desse trabalho também mostram que a mudança de um

grupamento metil da posição 3 para a posição 4 do anel pirazol, parece melhorar a

ação antinociceptiva desses compostos (MILANO et al., 2008). Além disso, MILANO

e colaboradores (2008) verificaram que a ação do MPF4 (4-metil-5-trifluormetil-5-

hidróxi-4,5-diidro-1H-pirazol metil éster), composto mais eficaz da série testada, é

mediada pelo sistema opióide.

Em 2007, MACHADO e colaboradores obtiveram derivados pirazolínicos pela

hibridização de 4,5-dihydro-1H-pyrazol com ácido salicílico. Os autores

demonstraram que esses compostos apresentam ação antinociceptiva no teste das

contorções abdominais, com uma eficácia similar àquela do ácido acetilsalicílico.

TABELA 1 – Derivados pirazolínicos sintetizados no NUQUIMHE e testados no LABNEURO

Estrutura Nomenclatura Abreviatura

O NH

3-metil-5-hidróxi-5-triclorometil-4,5-diidro-1H-

pirazol-1-carboxiamida

MPCA

O NH

3-fenil-5-hidróxi-5-triclorometil-4,5-diidro-1H-

pirazol-1-carboxiamida

FPCA

EtO

3-etoximetil-5-etoxicarbonil-1H-1-metilpirazol

PZ 2

Revisão Bibliográfica

EtO

3-etoximetil-5-etoxicarbonil-1H-1-fenilpirazol

PZ 3

2-[5-triclorometil-5-hidróxi-3-fenil-4,5-diidro-

1H-pirazol-1-il]-4-(4-bromofenil)-5-metiltiazol

B50

EtO

5-etilcarboxilato-5-hidróxi-3-metil-1-(2-

hidroxibenzoil)-4,5-diidro-1H-pirazol

5-hidróxi-3-metil-5-trifluormetil-4,5-diidro-1H-

1-(2-hidroxibenzoil)pirazol

3-metil-5-trifluormetil-5-hidróxi-4,5-diidro-1H-

pirazol metil éster

MPF3

4-metil-5-trifluormetil-5-hidróxi-4,5-diidro-1H-

pirazol metil éster

MPF4

Revisão Bibliográfica

3-metil-5- triclorometil -5-hidróxi-4,5-diidro-

1H-pirazol metil éster

MPCl3

4-metil-5- triclorometil-5-hidróxi-4,5-diidro-

1H-pirazol metil éster

MPCl4

Levando-se em consideração os estudos anteriormente citados e muitos

outros que constam na literatura sobre o assunto, pode-se sugerir que os derivados

pirazolínicos são uma classe promissora de compostos, principalmente no que diz

respeito à sua atividade antinociceptiva. Nesse sentido, o NUQUIMHE sintetizou

novos derivados pirazolínicos baseando-se na substituição bioisostérica do anel

benzênico da salicilamida pelo anel 5-trifluormetil-4,5-diidro-1H-pirazol, 3 ou 4

substituído (Figura 3). Sendo assim, o presente trabalho, foi realizado com o intuito

de avaliar os efeitos antinociceptivos e antiinflamatórios dessa série de 10 novos

derivados pirazolínicos recentemente sintetizada.

O NH

Salicylamide

Bioisosteric Replacement

O NH

FIGURA 3 – Representação esquemática da estratégia de substituição bioisostérica do anel

benzênico da salicilamida para obtenção de novos 5-trifluormetil-4,5-diidro-1H-pirazóis.

salicilamida

Substituição

bioisostérica

derivados

pirazolínicos

IV. MATERIAL E MÉTODOS

Material e Métodos

IV.1 – ANIMAIS

Foram utilizados camundongos albinos machos adultos (30-40 g) e ratos

Wistar machos adultos (180-220 g), fornecidos pelo Biotério Central da UFSM. Os

animais foram mantidos em ciclo claro-escuro de 12 horas, em temperatura de 22 ±

C e com livre acesso à água e ração.

Os experimentos foram conduzidos de acordo com orientações para os

cuidados com animais de laboratório e considerações éticas para investigação de

dor experimental em animais conscientes (ZIMMERMANN, 1983). O número de

animais empregado e os estímulos utilizados foram os mínimos necessários para

demonstrar efeitos consistentes dos procedimentos empregados e dos tratamentos

com drogas. O projeto foi encaminhado ao comitê de ética em Pesquisa e Bem Estar

Animal da UFSM e aprovado, estando registrado sob o número 23081.018371/2006-

94.

IV.2 – DROGAS E REAGENTES

Os derivados 5-trifluormetil-4,5-diidro-1H-pirazol-1-carboxiamida (2a-j) foram

sintetizados no NUQUIMHE do Departamento de Química da UFSM (Figura1).

Todos os demais reagentes empregados foram adquiridos comercialmente.

Foram preparadas soluções ou suspensões dos pirazóis utilizando-se Tween

80 (5%) e água destilada (95%) ou Tween 80 (5%), polietilenoglicol 400 (20%) e

água destilada (75%), dependendo do protocolo experimental. Os pirazóis, veículo e

drogas usadas como controle positivo foram administrados por via subcutânea. As

drogas e reagentes foram sempre preparadas no dia do ensaio, a menos que se

conhecesse a estabilidade das mesmas após o preparo. Para minimizar a geração

de resíduos, procurou-se preparar apenas a quantidade de drogas e reagentes

necessária para a execução do experimento.

Material e Métodos

2a 2b 2c 2d 2e 2f 2g 2h 2i 2j

H Me

Et Pr

i - Pr

t-Bu

Ph 4-Br-Ph H

H H H H H H H H Me

FIGURA 1 – Fórmula estrutural dos derivados 5-trifluormetil-4,5-diidro-1H-pirazol-1-carboxiamida

utilizados no presente estudo.

IV.3 – TESTES COMPORTAMENTAIS

IV.3.1 – Teste da formalina

O teste da fomalina foi utilizado a fim de verificar o efeito dos novos

compostos pirazolínicos em um modelo de dor aguda induzida por agente químico. A

injeção de formalina causa uma resposta tipicamente bifásica, que consiste em

morder e/ou lamber a pata. Durante os primeiros 5 minutos após a administração de

formalina observa-se intensa resposta nociceptiva, sendo esta primeira fase

conhecida como fase neurogênica. Logo após essa fase, ocorre uma interfase (5-15

min) onde pouca ou nenhuma resposta nociceptiva é observada. A partir de 15

minutos após a injeção de formalina ocorre uma segunda fase de intensa resposta

de lamber/morder a pata injetada que é chamada de fase inflamatória. Essa

segunda fase prolonga-se até cerca de 30 minutos depois da injeção intraplantar de

formalina (HUNSKAAR & HOLE, 1987).

Para avaliar o efeito dos derivados 5-trifluormetil-4,5-diidro-1H-pirazol-1-

carboxiamida sobre a nocicepção induzida por formalina, camundongos foram

Material e Métodos

tratados com várias doses de cada composto (25-1000 µmol/kg) ou veículo (5 % de

Tween 80 em água). Vinte minutos após esse tratamento, os animais receberam

injeção de 20 µl de formalina 1,5% (v/v) na pata. Imediatamente após a injeção de

formalina, os animais foram transferidos para uma caixa de vidro (20 x 20x 20 cm)

como o assoalho dividido em 9 áreas iguais e o comportamento nociceptivo (tempo

que os animais permaneceram lambendo ou mordendo a pata injetada) foi

observado durante 30 minutos (HUNSKAAR & HOLE (1987).

Os resultados obtidos nesse experimento foram utilizados para selecionar os

compostos que apresentaram maior efeito antinociceptivo, os quais foram utilizados

nos demais protocolos experimentais. Para isso foi considerada a eficácia da maior

dose testada nas duas fases do teste da formalina.

A eficácia dos compostos selecionados foi comparada com a eficácia da

dipirona e da salicilamida nas fases neurogênica e inflamatória do teste. As doses de

dipirona e salicilamida foram determinadas com base em experimentos piloto. A

dipirona foi administrada na dose de 1000 µmol/kg (mesma dose dos derivados

pirazolínicos em teste) e a salicilamida foi injetada na dose de 1500 µmol/kg.

IV.3.2 – Teste da placa quente

O teste da placa quente, um modelo de nocicepção aguda, foi realizado

conforme descrito por WOOLFE & MACDONALD (1944) modificado por ANKIER

(1974). O teste da placa quente consiste em expor os animais a um estímulo térmico

nocivo. Nesse experimento, a placa quente (Ugo Basile, modelo DS 37) foi mantida

na temperatura de 50 ± 1°C. O teste consistia em colocar o camundongo sobre essa

superfície metálica uniformemente aquecida e observar a latência (em segundos)

para ele lamber as patas traseiras ou saltar. Para evitar lesão tecidual, foi

estabelecido um teto de 90 s. Quando o animal não apresentava nenhum dos

comportamentos acima citados, ele era removido do aparelho pelo experimentador.

No dia anterior ao experimento, os animais foram habituados ao procedimento, a fim

de evitar a ocorrência de analgesia induzida pela novidade (SIEGFRIED, 1987), a

qual poderia mascarar os resultados. Essa habituação consistiu em expor os animais

às mesmas condições a que estariam sujeitos no dia do teste, ou seja, manipulação

pelo experimentador, injeção (salina) e exposição à placa quente. No dia do teste,

Material e Métodos

os animais receberam injeção subcutânea de veículo (salina com 5% de Tween 80)

ou dos derivados pirazolínicos selecionados anteriormente (2c e 2j; 1000 µmol/kg)

30 minutos antes da exposição ao estímulo térmico. A dipirona foi usada como

controle positivo, numa dose eficaz (1500 µmol/kg, s.c.) conforme determinado em

experimentos piloto.

IV.3.3 – Teste do edema de pata e alodínia induzidos por carragenina

Os compostos pirazolínicos 2c e 2j foram avaliados no edema de pata e na

alodínia induzidos por carragenina, um modelo experimental amplamente usado

para avaliação de inflamação aguda (WINTER, 1962, HENRIQUES et al., 1987). A

inflamação induzida por carragenina é bifásica, sendo que a primeira fase é a que

ocorre até 1h após a injeção da carragenina e a segunda fase (tardia) é a que se

segue após à primeira hora. Essas duas fases diferem quanto aos mediadores

envolvidos na formação do edema causado pela carragenina (DI ROSA et al. 1971;

SALVEMINI et al., 1996).

A carragenina foi dissolvida em solução salina numa concentração de 15

mg/ml e essa solução foi fervida por 1-2 s e resfriada em temperatura ambiente.

Camundongos receberam 20 µl dessa solução na pata traseira direita,

subcutaneamente, na superfície plantar. A formação de edema foi quantificada por

mudanças no volume da pata injetada. O volume da pata foi medido antes da

administração de carragenina, 30 minutos e 4 horas após a injeção. A avaliação do

volume da pata foi realizada pela imersão da pata injetada em uma recipiente

contendo solução aquosa de 2,5% de extran (v/v), colocado sobre uma balança

eletrônica com precisão de 0,01 g (DAHER et al., 2005). A pata foi cuidadosamente

imersa no líquido, evitando contato com as paredes do recipiente, produzindo um

deslocamento do líquido, acompanhado por um aumento do peso registrado na

balança. Visto que a densidade do líquido contido no recipiente era de 1 mg/ml, o

valor registrado pela balança foi assumido como sendo igual ao volume da pata.

Para avaliar o efeito antiedematogênico e antialodínico dos pirazolínicos,

camundongos foram administrados subcutaneamente com uma dose de 1000

µmol/kg de 2c ou 2j ou com veículo, 30 minutos antes da injeção intraplantar de

carragenina.

Material e Métodos

O edema de pata foi calculado de acordo com a equação abaixo:

% edema = [(V

inicial

– V

final

)]/V

inicial

] x 100

Onde: V

inicial

é o volume da pata antes da injeção de carragenina e V

final

é o

volume da pata 30 min ou 4 h após a injeção de carragenina.

O limiar de 50% de resposta foi determinado pelo método de up-and-down de

DIXON (1980). Para isso, a pata injetada foi estimulada com um de uma série de

sete filamentos de von Frey com incrementos logaritmos crescentes (0,016; 0,06;

0,15; 0,45; 1,3; 3,7 e 10,5 g). Foram apresentados 6 estímulos, com um intervalo

entre os estímulos de pelo menos 30 s. Foi considerada como resposta positiva, a

retirada da pata do contato com o filamento ou comportamento de sacudir ou lamber

a pata no momento ou imediatamente após a estimulação. Ambulação foi

considerada uma resposta ambígua, logo, quando ocorreu no momento da aplicação

do estímulo, este foi repetido (CHAPLAN et al., 1994). O conjunto de 6 respostas

obtido foi utilizado para o cálculo do limiar 50% de resposta (DIXON, 1980), como

mostrado a seguir:

Limiar 50% (g) = 10

[Xf+kδ]

onde X

= valor do último filamento de von Frey usado (em log); k = valor tabelado

para o padrão de respostas positivas/negativas obtidas (DIXON, 1980); δ = diferença

média (em log) entre os estímulos (0,4695).

IV.3.4 – Avaliação da atividade locomotora

IV.3.4.1 – Teste da locomoção forçada em cilindro giratório (rotarod)

Este teste foi usado para avaliar a coordenação motora dos camundongos, a

fim de verificar se as drogas testadas produziam ataxia. O aparelho do rotarod

consiste de um cilindro de 3,7 cm de diâmetro que gira em uma velocidade

constante de 8 rpm. Vinte e quatro horas antes do teste, todos os animais foram

treinados no rotarod até que conseguissem equilibrar-se no cilindro, sem cair,

durante 1 minuto. No dia seguinte, 30 min após receberem os derivados

pirazolínicos (1000 µmol/kg) ou veículo, os animais foram avaliados no cilindro

giratório. Dois parâmetros foram observados: a latência para a primeira queda e o

Material e Métodos

número de quedas durante 4 min (TSUDA et al., 1996). Neste teste foram utilizados

os mesmos animais avaliados no teste da placa quente.

IV.3.4.2 – Teste da locomoção espontânea

Da mesma forma que o teste do cilindro giratório, a avaliação da locomoção

espontânea dos camundongos foi realizada para descartar a possibilidade dos

compostos causarem algum prejuízo locomotor. A atividade locomotora espontânea

foi avaliada nos mesmos animais usados no teste da formalina, de forma que foram

quantificados concomitantemente o comportamento nociceptivo e o número de

cruzamentos realizados pelos animais. O teste foi realizado 20 min após a

administração dos pirazolínicos (1000 µmol/kg), dipirona (1000 µmol/kg), salicilamida

(1500 µmol/kg) ou veículo e os animais foram observados durante 30 min (TSUDA et

al., 1996).

IV.3.5 – Alodínia mecânica e edema induzidos por CFA

O efeito dos derivados 5-trifluormetil-4,5-diidro-1H-pirazol-1-carboxiamida

previamente selecionados no teste da formalina foi avaliado no modelo de

inflamação crônica induzida por adjuvante completo de Freund (CFA) em ratos. O

efeito dos compostos foi avaliado após administração aguda e após administração

de repetidas doses. Para induzir inflamação, os animais foram levemente

anestesiados por inalação de halotano (2-3 min) e receberam 150 µl de CFA (1

mg/ml of Mycobacterium tuberculosis inativado por calor) subcutanemente na região

plantar da pata traseira direita (WILSON et al., 2005). O desenvolvimento de alodínia

foi avaliado pelo teste com os filamentos de von Frey. Para isso, os ratos foram

colocados sobre uma plataforma elevada, cujo assoalho era formado por uma tela

metálica, permitindo o acesso à região plantar dos animais. Os animais foram

ambientados nesse aparelho por aproximadamente 15-30 min, até que a exploração

do local e comportamentos de limpeza tivessem cessado. A pata injetada e a pata

contraleral foram estimuladas com um de uma série de sete filamentos de von Frey

com incrementos logaritmos crescentes (0,8; 1,5; 3,5; 6,0; 7,5; 10,0 e 15,0 g). O

filamento foi pressionado perpendicularmente à região plantar da pata com força

Material e Métodos

suficiente para produzir um leve dobramento, permanecendo em contato por 6-8 s,

caso o animal não retirasse a pata antes. Foram apresentados 6 estímulos, com um

intervalo entre os estímulos de pelo menos 30 s ou até que houvesse uma resolução

aparente do comportamento gerado pelo estímulo anterior. Foi considerada como

resposta positiva, a retirada da pata do contato com o filamento e o comportamento

de sacudir e lamber a pata no momento ou imediatamente após a estimulação.

Ambulação foi considerada uma resposta ambígua, logo, quando ocorreu no

momento da aplicação do estímulo, este foi repetido (CHAPLAN et al., 1994). O

limiar de 50% de resposta foi determinado pelo método de up-and-down de DIXON

(1980). Resumidamente, o primeiro estímulo foi realizado com o filamento de 10 g e,

dependendo da resposta do animal, um estímulo de maior ou menor intensidade foi

aplicado, de forma que no final do teste se obtivesse um conjunto de 6 respostas.

Esse conjunto de respostas foi utilizado para o cálculo do limiar 50% de resposta

(DIXON, 1980), como mostrado a seguir:

Limiar 50% (g) = 10

[Xf+kδ]

onde X

= valor do último filamento de von Frey usado (em log); k = valor tabelado

para o padrão de respostas positivas/negativas obtidas (DIXON, 1980); δ = diferença

média (em log) entre os estímulos (0,2122).

Considerou-se que houve desenvolvimento de alodínia quando os animais

apresentaram queda significativa em seu limiar de resposta em relação ao

apresentado antes da injeção de CFA. Ou seja, um estímulo que antes era

percebido como inócuo passou a ser percebido como nocivo, fenômeno este que

corresponde à alodínia.

O edema de pata foi avaliado da mesma maneira que foi descrita para o teste

da carragenina.

IV.3.5.1 – Avaliação do efeito da administração aguda dos derivados

pirazolínicos 2c e 2j: decurso temporal, relação dose-efeito sobre a nocicepção

e avaliação da atividade locomotora de ratos

O limiar basal de resposta ao estímulo mecânico e o volume da pata foram

avaliados imediatamente antes da injeção de CFA ou salina (controle) na pata

traseira direita. Dois a três dias após a injeção intraplantar, o limiar 50% de resposta

Material e Métodos

e o volume da pata foram novamente avaliados, a fim de se verificar o aparecimento

de alodínia mecânica e edema, respectivamente. Aqueles animais que

desenvolveram alodínia e edema em resposta a injeção de CFA foram divididos em

grupos que receberam veículo ou derivados pirazolínicos ou dipirona (controle

positivo). Os animais tratados com salina foram tratados com veículo e usados como

controle do procedimento de injeção apenas.

Inicialmente, os animais receberam as drogas na dose de 1000 µmol/kg e a

alodínia e o edema foram avaliados 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 12 h e 24 h após o

tratamento, para se obter um perfil temporal de ação das mesmas. A seguir,

construiu-se uma curva dose-efeito, com as doses de 1, 10, 100 e 1000 µmol/kg dos

derivados pirazolínicos e da dipirona. Nesse caso, a alodínia foi avaliada 1 h após o

tratamento. Esses mesmos animais, após avaliação com os filamentos de von Frey,

foram transferidos para um campo aberto (arena circular com assoalho dividido em

12 áreas iguais) e foi avaliado o número de cruzamentos, como indicativo da

atividade locomotora, durante 5 min.

IV.3.5.2 – Avaliação do efeito da administração crônica dos derivados

pirazolínicos 2c e 2j sobre a alodínia e o edema de pata induzidos por CFA

Os procedimentos para indução de inflamação, avaliação da alodínia e do

edema de pata induzidos por CFA foram os mesmos adotados para a avaliação do

efeito da administração aguda dos compostos, anteriormente mencionados.

Entretanto, além das medidas na pata direita (ipsilateral), também foram realizadas

as mesmas medidas na pata esquerda (contralateral). Isso foi realizado no intuito de

verificar uma possível propagação da inflamação para a pata contralateral, bem

como avaliar o efeito dos compostos nesse fenômeno. Com base nos resultados dos

experimentos com administração aguda mencionados acima, foi escolhida a dose de

100 µmol/kg para o tratamento crônico. Com o objetivo de avaliar o efeito agudo de

cada dose do composto e comparar com o efeito cumulativo das doses repetidas,

foram feitas medidas antes e depois da administração dos compostos nos dias 1, 2,

3, 6, 9, 12 e 15 do protocolo experimental. O dia 1 corresponde ao dia do início dos

tratamentos (48-72 h após CFA). As medidas da alodínia e do edema foram feitas

imediatamente antes da injeção subcutânea e 1 h após esse tratamento. As drogas

Material e Métodos

foram administradas uma vez por dia, durante 15 dias, sempre no mesmo horário.

Vale lembrar que, como não é conhecida a farmacocinética desses compostos, a

realização das medidas 1 h após a injeção nos permitiriam identificar o

desenvolvimento de tolerância aos efeitos dos compostos. Isto por que, caso não se

fizessem essas medidas, mas apenas aquelas medidas antes da administração dos

compostos, seria difícil dizer se uma ausência de efeito seria devido a um intervalo

entre doses inadequado (24 h) ou ao desenvolvimento de tolerância. Dipirona, na

mesma dose dos derivados pirazolínicos, foi utilizada como controle positivo.

IV.3.6 – Avaliação do peso corporal durante a administração crônica e do peso

dos órgãos no final do tratamento com os derivados pirazolínicos 2c, 2j ou

dipirona

Variações no peso corporal em animais que estão recebendo algum tipo de

tratamento podem ser adotadas como um sinal de toxicidade de drogas. Por esse

motivo, os animais que receberam tratamento crônico (experimento anterior) com os

derivados pirazolínicos, dipirona ou veículo foram pesados diariamente antes do

tratamento e foi calculada a percentagem de ganho/perda de peso em relação ao

peso basal (antes de receber CFA ou salina intraplantar). Além disso, os rins, o

fígado, o baço e o estômago foram removidos no final dos experimentos e foi

calculada a percentagem do peso desses órgãos em relação ao peso corporal dos

animais.

IV.3.7 – Avaliação da atividade ulcerogênica após administração crônica dos

derivados pirazolínicos 2c, 2j ou dipirona

A atividade ulcerogênica foi avaliada após administração crônica dos pirazóis

2c, 2j ou dipirona (100 µmol/kg, uma dose diária, durante 15 dias; controles

receberam veículo). A avaliação da mucosa gástrica foi feita 24 h após a última

injeção. Seis horas antes do sacrifício, uma dose aguda de indometacina (30 mg/kg)

foi administrada a um grupo separado de ratos, que foi usado como controle positivo.

A ração, mas não a água, foi retirada 18 h antes da eutanásia. Os animais foram

eutanasiados por overdose de thiopental e o estômago foi removido, aberto e

cuidadosamente lavado com solução salina. A seguir, o estômago foi observado ao

microscópio e foram determinados o índice de lesão (IL) e o número de úlceras

Material e Métodos

(NU). O índice de lesão foi calculado pela observação dos seguintes parâmetros:

descoloração da mucosa, presença de petéquias e perda de muco. Para o cálculo

do IL, foi atribuído um valor numérico (pontos) para as alterações encontradas,

sendo 1 ponto para alteração leve, 2 pontos para alteração moderada ou 3 pontos

para alteração intensa. Essa pontuação dada para cada parâmetro foi somada para

obtenção do IL. Além disso, para úlceras maiores que 1 mm, foi atribuído 1,5 ponto

por mm de lesão. O número de úlceras foi obtido pela contagem direta do número de

lesões de até 1 mm (DJAHANGUIRI, 1969; GHEDINI et al., 2002).

IV.4 – TESTES BIOQUÍMICOS

Vinte e quatro horas após a última administração das drogas (protocolo de

administração crônica), os ratos foram eutanasiados por overdose de pentobarbital.

Amostras de sangue coletadas da aorta abdominal e de tecido da pata dos animais

foram coletadas para posterior análise.

IV.4.1 – Avaliação de parâmetros indicativos de função renal e hepática após

administração crônica dos derivados pirazolínicos 2c, 2j ou dipirona

Amostras de sangue foram coletadas em tubos contendo gel separador de

soro e foram utilizadas para dosagem da atividade da aspartato aminotransferase

(AST) e da alanina aminotransferase (ALT) como indicadores de lesão hepática, e

para dosagem de uréia e creatinina, como indicadores de toxicidade renal. Após a

coleta, as amostras foram centrifugadas e encaminhadas para um laboratório de

análises clínicas. Os níveis de AST, ALT, uréia e creatinina foram quantificados por

método enzimático usando os reagentes Ortho-Clinical Diagnostics – Johnson &

Johnson, em sistema automatizado (Vitros 950, dry chemistry; Johnson & Johnson,

Rochester, NY, USA).

IV.4.2 – Avaliação de parâmetros hematológicos após a administração crônica

dos derivados pirazolínicos 2c, 2j ou dipirona

Alguns parâmetros hematológicos foram avaliados a fim de identificar

possíveis alterações causadas pelo tratamento prolongado dos animais com os

pirazolínicos em teste ou com dipirona. Amostras de sangue foram coletas em tubos

contendo EDTA (anticoagulante) e foram encaminhadas para um laboratório de

Material e Métodos

análises clínicas para determinação automatizada de: eritrócitos, leucócitos,

linfócitos, monócitos, plaquetas, concentração de hemoglobina e hematócrito.

IV.4.3 – Determinação dos níveis séricos de haptoglobina após administração

crônica dos derivados pirazolínicos 2c, 2j ou dipirona

A haptoglobina é uma proteína de fase aguda, cujos níveis aumentam durante

a inflamação e a determinação de sua quantidade no soro pode indicar a evolução

da doença (GIFFEN et al., 2003). Amostras de sangue foram coletadas em tubos

contendo gel separador de soro e foram encaminhadas a um laboratório de análises

clínicas, onde a haptoglobina foi quantificada por nefelometria, usando o kit Dade

Behring (BN II System. Analyzer Dade Behring, Germany).

IV.4.4 – Determinação da atividade tecidual da mieloperoxidase (MPO), N-acetil-

β-D-glucosaminidase (NAG) e eosinoperoxidase (EPO) na pata de ratos, após

administração crônica dos derivados pirazolínicos 2c, 2j ou dipirona

Durante o decurso da inflamação produzida por CFA na pata dos animais,

ocorre a infiltração de células relacionadas ao sistema imunológico no local da

injeção, numa tentativa do organismo de eliminar o agente inflamatório. Essas

células, tais como neutrófilos, eosinófilos e macrófagos, produzem enzimas (MPO,

EPO e NAG) que são capazes de destruir agentes invasores. Logo, a determinação

da atividade dessas enzimas, pode fornecer uma idéia da presença ou não dessas

células no local da lesão.

Amostras de pele da pata dos animais que receberam injeção intraplantar de

CFA ou salina e que foram tratados cronicamente com veículo, dipirona ou com os

novos derivados pirazolínicos foram coletadas para análise da atividade da MPO,

NAG e EPO. As amostras de pele foram homogeneizadas com 20 volumes de

acetato de sódio 80 mM (pH 5,4) contendo 0,5 % de brometo de

hexadeciltrimetilamônio. A seguir esse homogeneizado foi centrifugado (11.200 g, 4

°C, 20 min) e coletou-se o sobrenadante para a determinação da atividade das

enzimas.

Para o ensaio da MPO, 10 µl do sobrenadante e 220 µl de acetato de sódio

80 mM (pH 5,4) contendo 15% de H

0,3 mM foram adicionados em triplicada

numa placa de 96 poços. A reação foi iniciada pela adição de 20 µl de

Material e Métodos

tetrametilbenzidina 18,4 mM e a mistura foi incubada por 3 min a 37°C. A reação foi

terminada pela imersão em banho de gelo e adição de 30 µl ácido acético ao meio

reacional. A absorbância foi verificada em 630 nm (SUZUKI et al., 1983).

O ensaio da NAG foi realizado de acordo com (LLORET et al., 1995), onde 25

µl de amostra, 150 µl de tampão citrato de sódio 50 mM (pH 4,5) e 25 ul de 4-

nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminida foram transferidos para uma placa de 96 poços,

em triplicata. Foi feita uma incubação a 37 °C, durante 60 min e a reação foi parada

pela adição de 100 µl de tampão glicina 200 mM (pH 10,4). A absorbância em 405

nm foi quantificada.

A determinação da atividade da EPO foi ensaiada conforme KANG e

colaboradores (2008). Para isso, foi preparado numa placa de 96 poços, uma

mistura reacional contendo 100 µl do sobrenadante, 100 µl de H

6,6 mM e 100 µl

de o-fenilenodiamina 0,1 mM. Essa mistura foi incubada durante 30 min a 37 °C e a

reação foi terminada pela adição de 75 µl de H

30%. A absorbância foi

quantificada em 490 nm.

A concentração de proteínas nas amostras (sobrenadante) foi determinada

pelo método de BRADFORD (1976), usando albumina sérica bovina como padrão.

Para as três enzimas, o resultado foi expresso como a razão entre a absorbância e a

quantidade de proteínas da amostra.

IV.4.5 – Determinação do nível tecidual de TNF-α na pata de ratos após

administração crônica dos derivados pirazolínicos 2c, 2j ou dipirona

Os ratos injetados com CFA intraplantar e que receberam tratamento crônico

com 2c, 2j, dipirona ou veículo foram eutanasiados 24 h após a última injeção das

drogas e a pele da pata injetada com CFA foi removida e congelada para posterior

dosagem de TNF-α. Um grupo de animais que recebeu injeção intraplantar de salina

e foi tratado durante 15 dias com veículo, foi usado como controle. O tecido da pata

foi homogeneizado em tampão fosfato 80 mM (pH 7.4) contendo: 0,5% de Tween

20, 0,1 mM de PMSF, 2 mM de EDTA, 0,01 µg/ml de inibidor de tripsina obtido de

soja, 0,1% de bacitracina e 0,1% de albumina sérica bovina. O homogeizado foi

centrifugado a 16.000 x g, por 10 min, a 4°C e o sobrenadante foi estocado a -20 °C

até o momento da análise (SOUZA et al., 2000; CAMPOS et al., 2002). A

Material e Métodos

quantificação do TNF-α tecidual foi feita usando um kit ELISA, e os procedimentos

foram aqueles descritos pelo fabricante (DuoSet ELISA Development System, rat

TNF-α/TNFSF1A, R&D Systems).

IV.5 – ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados foram analisados por análise de variância (ANOVA) de uma ou

duas vias, seguido do teste de Student-Newman-Keuls (SNK) ou Teste F, conforme

o caso. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos quando p <

0,05.

V. RESULTADOS

Resultados

V.1 – TESTES COMPORTAMENTAIS

V.1.1 – Avaliação do efeito dos novos pirazolínicos (2a-j) no teste da formalina

Todos os 10 novos derivados pirazolínicos (2a-j) foram avaliados no teste da

nocicepção induzida por formalina em camundongos. Nas Figuras 1 e 2 é mostrado

o efeito desses novos compostos nas fases neurogênica e inflamatória do teste. Os

compostos 2a, 2c-e, 2g, 2i e 2j foram capazes de diminuir o comportamento

nociceptivo dos animais, tanto na fase neurogênica quanto na fase inflamatória

(Figuras 1 e 2) . Já o derivado pirazolínico 2b, foi ineficaz na fase neurogênica,

inibindo o comportamento nociceptivo apenas na fase inflamatória (Figura 1). Por

outro lado, o composto 2f mostrou-se efetivo na primeira fase, mas não na segunda

fase do teste (Tabela 2). Além disso, o composto 2h não causou qualquer efeito

sobre a resposta nocifensiva causada por formalina, sendo inativo em ambas as

fases, neurogênica e inflamatória (Tabela 2).

Utilizando os resultados obtidos com a maior dose testada de cada derivado

pirazolínico e seus respectivos controles, foi calculada a eficácia antinociceptiva

desses compostos nas fases neurogênica e inflamatória do teste da formalina

(Tabela 1). Esses dados de eficácia serviram para indicar quais os compostos mais

promissores para dar continuidade à investigação do perfil desses derivados

pirazolínicos. Os derivados pirazolínicos 2c e 2j, na dose de 1000 µmol/kg,

mostraram maior eficácia nas duas fases do teste. Como mostrado na tabela 1,

ambos os compostos causaram inibição de quase 100% da resposta nociceptiva na

fase inflamatória. Além disso, a inibição da fase neurogênica foi também bastante

pronunciada, sendo cerca de 88% e 75% para os compostos 2c e 2j,

respectivamente. Por apresentarem maior eficácia antinociceptiva, 2c e 2j foram

escolhidos para todos os demais testes que foram realizados.

A eficácia antinociceptiva dos compostos 2c e 2j foi comparada com a

eficácia da dipirona e da salicilamida, como mostrado na Figura 3. Os derivados

pirazolínicos 2c e 2j, assim como a dipirona, foram efetivos na nocicepção

neurogênica produzida por formalina, enquanto que a salicilamida não apresentou

esse efeito. Porém, a dipirona teve uma eficácia estatisticamente menor que os

compostos 2c e 2j. Na fase inflamatória, 2c, 2j, dipirona e salicilamida foram

bastante eficazes na diminuição do comportamento nociceptivo, porém os novos

derivados pirazolínicos apresentaram efeito mais pronunciado.

Resultados

FIGURA 1 – Efeito dos novos derivados pirazolínicos 2a-d na nocicepção induzida por formalina, nas

fases neurogênica e inflamatória do teste, em camundongos. Dados expressos como média ± erro

padrão; * p < 0,05 comparado com o veículo.

Resultados

FIGURA 2 – Efeito dos novos derivados pirazolínicos 2e, 2g, 2i e 2j na nocicepção induzida por

formalina, nas fases neurogênica e inflamatória do teste, em camundongos. Dados expressos como

média ± erro padrão; * p < 0,05 comparado com o veículo.

Resultados

TABELA 1 – Eficácia antinociceptiva dos 4,5-diidro-1H-pirazóis 2a-j (1000 µmol/kg) nas fases

neurogênica e inflamatória do teste da formalina (20 µl, 1,5%, ipl) em camundongos.

Composto

Fase

neurogênica

Fase

inflamatória

Analgesia (%) Analgesia (%) Veículo Tratado

32,8 ± 6,2

70,8 ± 9,6

17 15

2b 23,3 ± 11,9 55,5 ± 10,5

9 8

2c 87,9 ± 3,6

98,2 ± 1,3

14 9

2d 48,2 ± 4,7

70,1 ± 8,4

16 12

51,9 ± 9,5

67,0 ± 8,8

10 9

2f 46,0 ± 7,2

-22,3 ± 15,1 6 8

2g 59,1 ± 7,6

72,9 ± 11,9

12 11

2h 10,0 ± 11,8 8,2 ± 17,1 8 8

33,3 ± 5,9

47,3 ± 9,8

17 18

2j 74,6 ± 3,6

97,2 ± 1,6

10 10

Valores estão expressos como média ± erro padrão; N=número de animais por grupo.

* indica diferença estatisticamente significativa em relação ao veículo quando os dados brutos foram

comparados (p < 0,05).

Resultados

FIGURA 3 – Comparação entre as eficácias antinociceptivas de 2c, 2j (1000 µmol/kg), salicilamida

(1500 µmol/kg) (SALIC) e dipirona (1000 µmol/kg) (DIP) no teste da formalina em camundongos.

Dados expressos como média ± erro padrão; n=6-9 por grupo; * p < 0,05 comparado com salicilamida

e dipirona.

V.1.2 – Avaliação do efeito dos novos pirazolínicos (2c e 2j) no teste da placa

quente

O efeito dos compostos 2c e 2j na dose de 1000 µmol/kg foi avaliado no teste

da placa quente. Na figura 4 pode-se verificar que a administração subcutânea de

2c e 2j não foi capaz de produzir elevação da latência de reposta ao estímulo

térmico. Por outro lado, a dipirona na dose de 1500 µmol/kg, incluída no teste como

um padrão interno, aumentou a latência de reposta, validando o modelo.

FIGURA 4 – Efeito dos derivados pirazolínicos 2c e 2j (1000 µmol/kg), dipirona (1500 µmol/kg) (DIP)

ou veículo na latência para resposta ao estímulo térmico no teste da placa quente em camundongos.

Dados expressos como média ± erro padrão; n=14-15 por grupo; * p < 0,05 comparado com o

veículo.

Resultados

V.1.3 – Avaliação do efeito dos novos pirazolínicos 2c e 2j no teste do edema

de pata e da alodínia induzidos por carragenina

As Figuras 5 e 6 mostram os resultados obtidos quando os compostos 2c e

2j foram avaliados no teste do edema de pata induzido por carragenina. O volume

da pata dos animais foi avaliado 30 min e 4h após a injeção de carragenina,

enquanto que o limiar de resposta mecânica foi avaliado 30 min, 1h, 2h e 4h depois

da injeção de carragenina. Foi possível observar um aumento significativo do volume

da pata dos camundongos, observando-se um edema de cerca de 30% nos

primeiros 30 min e de mais de 65% 4h após a injeção. Além disso, os animais

apresentaram queda de aproximadamente três vezes no limiar de resposta ao

estímulo tátil. Nos animais que receberam o tratamento com 2c ou 2j (1000 µmol/kg)

30 min antes da injeção de carragenina, observou-se um aumento menor do volume

da pata no tempo de 4 h e um aumento no limiar de resposta nos tempos de 1h e

2h, quando comparados aos animais que receberam veículo.

FIGURA 5 – Efeito dos derivados pirazolínicos 2c e 2j (1000 µmol/kg) ou veículo no edema de pata

induzido por carragenina 30 min e 4 h após indução do edema em camundongons. Dados expressos

como média ± erro padrão; n=14-16 por grupo; * p < 0,05 comparado com o veículo.

Resultados

FIGURA 6 – Efeito dos derivados pirazolínicos 2c e 2j (1000 µmol/kg) ou veículo na alodínia

mecânica induzida por carragenina em camundongos. Dados expressos como média ± erro padrão;

n=14-16 por grupo; * p < 0,05 comparado com o veículo.

V.1.4 – Avaliação do efeito dos novos pirazolínicos 2c e 2j sobre a atividade

locomotora de camundongos

V.1.4.1 – Teste da locomoção forçada em cilindro giratório (rotarod)

O desempenho de camundongos tratados com 1000 µmol/kg de 2c, 2j ou seu

veículo foi verificado no teste de locomoção forçada em cilindro giratório. O

tratamento não alterou nem a latência para a primeira queda nem o número de

quedas do aparelho (Tabela 2).

Resultados

TABELA 2 – Efeito dos 4,5-diidro-1H-pirazóis 2c e 2j em camundongos submetidos ao teste da

locomoção forçada em cilindro giratório.

Tratamento Latência para 1ª queda (s) Número de quedas

Veículo 76,9 ± 17,0 5,4 ± 1,3

2c 1000 µmol/kg

112,5 ± 21,3 3,7 ± 2,1

2j 1000 µmol/kg

62,6 ± 17,6 5,1 ± 1,0

Dados expressos como media ± erro padrão; n= 14-15 animais por grupo.

V.1.4.2 – Teste da locomoção espontânea

O efeito da administração subcutânea de 2c, 2j, dipirona, salicilamida sobre a

atividade locomotora espontânea foi avaliado durante 30 minutos. Os resultados,

mostrados na Tabela 3, revelaram que somente a salicilamida causou um aumento

no número de ambulações dos camundongos durante o período de observação.

TABELA 3 – Efeito dos 5-trifluormetil-4,5-diidro-1H-pirazóis 2c, 2j, salicilamida e dipirona na atividade

locomotora espontânea de camundongos.

Tratamento Número de cruzamentos N

Veículo 146,1 ± 24,7 10

2c 1000 µmol/kg

165,6 ± 30,5 8

Veículo 115,5 ± 10,0 14

2j 1000 µmol/kg

167,3 ± 31,2 9

Veículo 45,6 ± 7,2 9

Salicilamida 1500 µmol/kg

102,1 ± 26,4

Veículo 114,3 ± 22,8 6

Dipirona 1000 µmol/kg 87,7 ± 29,2 7

Dados expressos como media ± erro padrão; N = número de animais em cada grupo; * p < 0,05

comparado com o respectivo veículo.

Resultados

VI.1.5 – Avaliação do efeito agudo dos derivados pirazolínicos 2c e 2j na

alodínia mecânica e no edema de pata induzidos por CFA e na atividade

locomotora espontânea em ratos

Na Figura 7 pode-se observar que a administração intraplantar de CFA (150

µl, 1 mg/ml) produziu um decréscimo significativo no limiar de reposta dos animais

ao estímulo mecânico. Antes da injeção de CFA os animais apresentavam um limiar

50% de resposta em torno de 14 g (basal) e esse limiar caiu para cerca de 4,0 g 48-

72 h após o CFA, caracterizando o desenvolvimento de alodínia. A Figura 7 mostra

o decurso temporal do efeito da administração subcutânea de 2c, 2j, dipirona ou

veículo em ratos que desenvolveram alodínia mecânica. O pirazolínico 2c causou

um aumento do limiar de resposta, de 30 min até 12 h após sua administração,

quando comparado com os animais tratados com veículo. Uma hora depois da

injeção 2c produziu seu efeito máximo, causando um aumento de 70,8 ± 8,1 % no

limiar de resposta mecânica. O composto 2j apresentou o mesmo decurso temporal

que o composto 2c. Porém, o efeito máximo do composto 2j foi mais tardio, isto é,

apresentado um efeito máximo 4 h após a administração (85,6 ± 12,2 %). A dipirona,

incluída como controle positivo, também causou efeito anti-alodínico de 30 min até

12 h após a injeção. Entretanto, o efeito máximo do tratamento com dipirona só

ocorreu após 6 h (72,7 ± 9,5 %). Vinte e quatro horas após o tratamento dos ratos

com 2c, 2j ou dipirona, o limiar de resposta ao estímulo mecânico retornou aos

valores basais em todos os grupos, não diferindo dos animais tratados com veículo.

Os animais que receberam salina intraplantar e que foram tratados

subcutaneamente com veículo não apresentaram alterações significativas no limiar

ao longo do período de observação.

Resultados

FIGURA 7 – Efeito da administração aguda dos derivados pirazolínicos 2c (figura A), 2j (figura B) e

dipirona (figura C) na dose de 1000 µmol/kg ou veículo na alodínia induzida por injeção intraplantar

de CFA ao longo de 24 h. Um grupo injetado com salina na pata e tratado com veículo foi utilizado

com controle. Dados expressos como média ± erro padrão; n = 9-14 por grupo; * p < 0,05 comparado

com o grupo CFA/veículo.

Resultados

Nesse mesmo grupo de animais foi avaliado o volume da pata traseira direita,

a fim de verificar o desenvolvimento de edema pela injeção intraplantar de CFA. De

fato, os animais que receberam CFA, mas não aqueles que receberam salina

intraplantar, apresentaram edema da pata ipsilateral. O tratamento subcutâneo com

2c, 2j ou dipirona não foi capaz de reverter o edema induzido por CFA (Figura 8).

Em outro grupo de animais foi investigada a relação dose-efeito dos

compostos 2c, 2j e dipirona (1-1000 µmol/kg) sobre a alodínia induzida por CFA

(Figura 9). Os compostos 2c e 2j, assim como a dipirona, foram eficazes contra a

alodínia a partir de 10 µmol/kg, como pode ser verificado pelo aumento no limiar de

resposta dos animais tratados com as drogas, em relação aos animais controle que

receberam veículo. Os derivados pirazolínicos 2c, 2j e a dipirona apresentaram

potência similar, com DE

de 11,3 (1,94-65,9), 9,93 (0,86-114,2) e 10,78 (2,62-44,4)

µmol/kg, respectivamente. Entretanto, o composto 2c apresentou maior eficácia que

os demais, revertendo completamente a alodínia, na maior dose testada.

Os animais tratados com a dose de 1000 µmol/kg de 2c, 2j e dipirona e os

tratados com veículo, foram avaliados no campo aberto, imediatamente após a

avaliação da alodínia induzida por CFA. Nesse teste, foi quantificado o número de

cruzamentos realizados pelos animais. A análise estatística não demonstrou

qualquer efeito dos tratamentos sobre a locomoção espontânea (Tabela 4).

Resultados

FIGURA 8 – Efeito da administração aguda dos derivados pirazolínicos 2c (figura A), 2j (figura B) e

dipirona (figura C) na dose de 1000 µmol/kg, sobre o edema induzido por injeção intraplantar de CFA.

Dados expressos como média ± erro padrão; n=7-11por grupo.

Resultados

FIGURA 9 – Curva dose-efeito dos derivados pirazolínicos 2c (figura A), 2j (figura B) e dipirona (figura

C) na alodínia induzida por injeção intraplantar de CFA. Dados expressos como média ± erro padrão;

n =7-11por grupo; * p < 0,05 comparado com o veículo.

Resultados

TABELA 4 – Efeito dos 5-trifluormetil-4,5-diidro-1H-pirazóis 2c, 2j, e dipirona na atividade locomotora

espontânea de ratos.

Tratamento Número de cruzamentos N

CFA/Veículo 31,1 ± 3,8 16

CFA/2c 1000 µmol/kg

30,1 ± 8,6 10

CFA/2j 1000 µmol/kg

33,6 ± 6,0 11

CFA/Dipirona 1000 µmol/kg 30,0 ± 5,2 8

Dados expressos como média ± erro padrão; N = número de animais por grupo

V.1.6 – Avaliação do efeito da administração crônica dos derivados

pirazolínicos 2c, 2j ou dipirona na alodínia mecânica e no edema de pata

induzidos por CFA em ratos

A administração intraplantar de CFA produziu uma significativa e duradoura

diminuição do limiar de resposta ao estímulo mecânico no teste com filamentos de

von Frey. Na Figura 10 está mostrado o efeito cumulativo de doses diárias de 2c, 2j

e dipirona sobre a alodínia tátil, durante 15 dias de observação. Os valores do dia 1

correspondem ao limiar imediatamente antes do início do tratamento e os valores

dos dias 2, 3, 6, 9, 12 e 15 são os limiares 24 h após a injeção subcutânea das

drogas. É possível observar que no 3° dia de tratamento todas as drogas produziram

um efeito anti-alodínico estável. A partir de então, a alodínia foi avaliada a cada 3

dias apenas. Os compostos 2c e 2j causaram diminuição da alodínia desde o dia 3

até o final das observações experimentais (dia 15). Entretanto, a dipirona, na mesma

dose já apresentou efeito a partir do dia 2, permanecendo eficaz até o dia 15. É

interessante ressaltar que nenhum dos tratamentos foi capaz de elevar o limiar de

resposta aos níveis basais, ou seja, aqueles apresentados antes da administração

de CFA intraplantar. Os gráficos do lado direito da Figura 10 (D-F) representam os

limiares de resposta dos animais tratados com 2c, 2j ou dipirona 1 h após a injeção

subcutânea das drogas. Pode-se observar que todos os tratamentos produziram

efeito anti-alodínico em todos os tempos observados. É interessante verificar que até

o dia 3 o efeito parece ser mais pronunciado, sendo menor nos dias seguintes. Além

disso, praticamente não se observou um incremento no efeito antinociceptivo

Resultados

quando se compara o efeito cumulativo dos tratamentos (figuras à direita, A-C) como

o efeito adicional de cada dose diária, 1 h após receber tal dose (figuras à

esquerda).

A Figura 11 mostra os valores de limiar de resposta da pata contralateral dos

animais que receberam injeção intraplantar de CFA na pata direita e dos animais

controle que receberam salina intraplantar, bem como dos animais que receberam

tratamento com 2c, 2j, dipirona ou veículo após CFA. Como pode ser visto, os

limiares da pata esquerda não foram afetados pela injeção de CFA na pata direita.

Apenas no 15° dia de observação (17-18 dias após CFA), apareceu uma tendência

de diminuição do limiar na pata esquerda dos animais que receberam CFA

intraplantar e tratamento subcutâneo com veículo. Essa tendência não foi observada

nos animais que receberam tratamento com 2c, 2j ou dipirona. Entretanto, esses

resultados não apresentaram significância estatística.

O edema de pata decorrente da administração de CFA também foi avaliado

nesses mesmos animais em que se avaliou a presença de alodínia. Foi observado

que a injeção de CFA na pata traseira direita dos ratos produziu aumento

significativo do volume da pata em comparação com os animais que receberam

salina intraplantar (Figura 12). Esse aumento de volume representa o edema

produzido pela inflamação causada pelo CFA e foi verificado apenas na pata

injetada com CFA (Figura 12 versus Tabela 5). O efeito do tratamento com 2c, 2j ou

dipirona foi avaliado imediatamente antes da dose diária e 1 h depois da injeção. Em

nenhuma das duas situações, esse tratamento causou qualquer alteração no edema

da pata dos ratos (Figura 12).

Resultados

FIGURA 10 – Efeito da administração crônica dos pirazolínicos 2c (100 µmol/kg), 2j (100 µmol/kg) e

dipirona (100 µmol/kg) na alodínia induzida por injeção intraplantar de CFA na pata ipsilateral. Os

gráficos da esquerda (A, B e C) representam os limiares antes da administração das drogas e os da

direita (D, E e F) 1 h após o tratamento. Dados expressos como média ± erro padrão; n = 7-9 por

grupo; * p < 0,05 comparado com o grupo CFA/veículo.

Resultados

FIGURA 11 – Efeito da administração crônica dos pirazolínicos 2c (100 µmol/kg), 2j (100 µmol/kg) e

dipirona (100 µmol/kg) na alodínia induzida por injeção intraplantar de CFA na pata contralateral. Os

gráficos da esquerda (A, B e C) representam os limiares antes da administração das drogas e os da

direita (D, E e F) 1 h após o tratamento. Dados expressos como média ± erro padrão; n = 7-9 por

grupo; * p < 0,05 comparado com o grupo CFA/veículo.

Resultados

FIGURA 12 – Efeito da administração crônica dos pirazolínicos 2c (100 µmol/kg), 2j (100 µmol/kg) e

dipirona (100 µmol/kg) no edema de pata produzido por injeção intraplantar de CFA na pata

ispilateral. Os gráficos da esquerda (A, B e C) representam os limiares antes da administração das

drogas e os da direita (D, E e F) 1 h após o tratamento. Dados expressos como média ± erro padrão;

n = 5-6 por grupo.

Resultados

TABELA 5 – Variação percentual do volume da pata contralateral à pata injetada com CFA ou salina.

Tratamento

Salina/Veículo CFA/Veículo CFA/2c CFA/2j CFA/Dipirona

Dia 1

-1,36 ± 2,02 -2,82 ± 1,51 -1,33 ± 2,62 -2,89 ± 1,40 -1,44 ± 1,36

Dia 2

-2,65 ± 0,86 -2,01 ± 1,56 -4,59 ± 1,22 -1,62 ± 0,77 -0,52 ± 2,10

Dia 3

-1,11 ± 2,49 -2,12 ± 1,58 -1,17 ± 1,47 -2,66 ± 0,95 1,25 ± 1,89

Dia 6

-1,19 ± 1,72 3,43 ± 1,00 0,32 ± 2,36 0,78 ± 2,27 2,32 ± 1,92

Dia 9

4,03 ± 2,79 3,71 ± 0,87 2,40 ± 1,49 4,56 ± 2,40 5,66 ± 2,30

Dia 12

3,80 ± 1,63 4,28 ± 0,78 9,09 ± 6,38 5,04 ± 1,38 7,24 ± 1,47

Dia 15

6,40 ± 1,85 4,68 ± 1,67 3,78 ± 1,98 11,80 ± 7,77 6,76 ± 1,85

Dados expressos como média ± erro padrão; percentagens calculadas em relação ao volume basal

antes da injeção de CFA ou salina; n = 5-6 animais por grupo.

V.1.7 – Avaliação da variação do peso corporal ao longo do tratamento crônico

com os derivados pirazolínicos 2c, 2j ou dipirona

O peso corporal dos animais foi avaliado antes da injeção de CFA ou salina

intraplantar e foi monitorado ao longo do tratamento subcutâneo com 2c, 2j, dipirona

ou veículo. Na Tabela 6 nota-se que nos primeiros 2 dias de tratamento, os animais

que receberam CFA na pata, apresentaram uma menor percentagem de ganho de

peso em relação aos animais que receberam injeção de salina na pata. Entretanto,

os animais tratados com 2c, 2j ou dipirona não apresentaram diferenças entre si

nem em relação aos tratados com veículo. A partir do 3° dia de avaliação

experimental, não foram verificadas diferenças no ganho de peso nem em relação à

injeção intraplantar de salina ou CFA, nem em relação ao tratamento subcutâneo

crônico com os novos pirazolínicos, dipirona ou veículo.

Resultados

TABELA 6 – Efeito da administração crônica dos derivados pirazolínicos 2c, 2j e dipirona (100

µmol/kg) em ratos com inflamação crônica induzida por CFA, sobre a percentagem de variação do

peso corporal em relação ao peso inicial (antes da injeção de CFA).

Dados expressos como média ± erro padrão; n=5-6 por grupo; * p < 0,05 em relação ao grupo

salina/veículo.

V.1.8 – Avaliação da percentagem de peso de alguns órgãos em relação ao

peso corporal dos ratos ao final do tratamento crônico com os derivados

pirazolínicos 2c, 2j ou dipirona

Vinte e quatro horas após a última dose dos tratamentos subcutâneos, os

animais foram eutanasiados e os órgãos descritos na Tabela 7 foram removidos e

pesados. Na Tabela 7 está mostrada a percentagem de peso dos órgãos em relação

Salina/

veículo

CFA/

veículo

CFA/

dipirona

Dia 1

4,00 ± 0,88

-2,94 ± 0,85* -1,84 ± 1,21* -2,92 ± 0,93* -0,43 ± 0,94*

Dia 2

7,64 ± 1,78

0,50 ± 1,12* 1,34 ± 1,15* 1,57 ± 1,08* 2,61 ± 1,24*

Dia 3

7,00 ± 1,50 2,78 ± 1,21 1,27 ± 1,24 0,71 ± 1,73 4,09 ± 2,07

Dia 4

9,23 ± 1,54 3,86 ± 1,67 3,62 ± 1,56 3,58 ± 1,50 5,33 ± 0,88

Dia 5

11,12 ± 0,81 4,65 ± 2,91 5,94 ± 1,53 5,40 ± 1,68 6,65 ± 0,90

Dia 6

12,99 ± 1,44 6,14 ± 3,32 7,71 ± 1,80 5,90 ± 3,21 8,30 ± 1,01

Dia 7

13,79 ± 1,95 6,84 ± 3,90 8,74 ± 1,59 9,15 ± 1,82 9,62 ± 0,92

Dia 8

17,27 ± 2,12 9,48 ± 4,33 11,68 ± 1,73 12,07 ± 1,23 11,76 ± 1,13

Dia 9

17,01 ± 2,11 10,21 ± 4,11 14,16 ± 1,79 12,62 ± 1,83 12,64 ± 1,46

Dia 10

20,92 ± 2,93 13,53 ± 4,18 16,08 ± 1,82 15,88 ± 2,02 15,49 ± 2,19

Dia 11

22,86 ± 2,50 14,50 ± 3,75 18,83 ± 2,60 17,04 ± 1,69 16,54 ± 1,59

Dia 12

22,96 ± 3,12 15,25 ± 3,95 16,46 ± 2,38 17,81 ± 2,34 17,18 ± 2,25

Dia 13

25,19 ± 2,79 16,36 ± 3,76 17,28 ± 2,70 18,54 ± 2,83 18,49 ± 2,00

Dia 14

26,43 ± 2,98 18,01 ± 3,27 17,58 ± 3,03 19,02 ± 3,34 19,90 ± 1,98

Dia 15

28,72 ± 3,13 19,57 ± 3,38 17,94 ± 3,36 21,80 ± 3,58 20,21 ± 2,97

Resultados

ao peso corporal dos animais. Os tratamentos não causaram nenhuma alteração no

peso fígado, baço, rim e estômago nem no aspecto geral externo dos mesmos.

TABELA 7 – Efeito da administração crônica dos derivados pirazolínicos 2c, 2j e dipirona, sobre a

percentagem de peso de alguns órgãos em relação ao peso corporal.

Dados expressos como média ± erro padrão; n=5-6 por grupo.

V.1.9 – Avaliação da atividade ulcerogênica dos pirazolínicos 2c, 2j e da

dipirona após administração crônica

Foram avaliados o índice de lesão (IL) e o número de úlceras (NU) nos ratos

que receberam tratamento crônico com 2c, 2j e dipirona (100 µmol/kg/15 dias) ou

veículo. Como mostrado na Tabela 8, nem os novos pirazóis nem a dipirona

produziram lesão gástrica significativa. Entretanto, aqueles animais que foram

tratados com uma dose de indometacina (30 mg/kg, controle positivo), apresentaram

IL e NU significativamente aumentados (Tabela 8).

Salina/

Veículo

CFA/

veículo

CFA/

dipirona

Fígado

3,81 ± 0,11 3,94 ± 0,10 3,95 ± 0,11 4,03 ± 0,26 4,06 ± 0,23

Baço

0,31 ± 0,02 0,40 ± 0,04 0,39 ± 0,03 0,49 ± 0,06 0,46 ± 0,10

Rim

0,37 ± 0,01 0,38 ± 0,01 0,39 ± 0,03 0,39 ±0,01 0,38 ± 0,02

Estômago

0,63 ± 0,03 0,65 ± 0,03 0,68 ± 0,02 0,67 ± 0,02 0,66 ± 0,03

Resultados

TABELA 8 – Efeito da administração crônica dos novos pirazolínicos 2c e 2j e da dipirona e da

administração aguda de indometacina na mucosa gástrica de ratos

Salina/veículo 0,75 ± 0,25 0

CFA/veículo

0,71 ± 0,18

CFA/2c

1,00 ± 0,26

0,67 ± 0,67

CFA /2j

1,00 ± 0,36

CFA/ dipirona

1,40 ± 0,25

0,40 ± 0,40

Salina

0,67 ± 0,33

Indometacina

6,25 ± 0,83* 32,00 ± 7,82*

índice de lesão;

número de úlceras; N = número de animais por grupo; * p < 0.05 comparado com

o grupo salina.

V.2 – TESTES BIOQUÍMICOS

V.2.1 – Efeito da administração crônica de 2c, 2j ou dipirona sobre alguns

parâmetros indicativos de toxicidade renal e hepática

A Tabela 9 mostra o efeito da administração de 2c, 2j e dipirona, na dose de

100 µmol/kg, uma vez ao dia, durante 15 dias sobre os níveis séricos de marcadores

de lesão hepática e renal (AST e ALT, uréia e creatinina). Os resultados obtidos

indicam que os ratos que receberam os derivados pirazolínicos 2c e 2j ou dipirona

não apresentaram alterações nos níveis desses marcadores.

Resultados

TABELA 9 – Efeito da administração crônica dos derivados pirazolínicos 2c, 2j e dipirona (100

µmol/kg) sobre marcadores de toxicidade hepática (AST e ALT) e renal (uréia e creatinina) em ratos

com inflamação crônica induzida por injeção intraplantar de CFA.

aspartato aminotransferase;

alanina aminotransferade; dados expressos como média ± erro

padrão; n = 5-6 por grupo.

V.2.2 – Efeito da administração crônica de 2c, 2j ou dipirona sobre alguns

parâmetros hematológicos

A fim de identificar alguma discrasia sanguínea produzida pela administração

crônica de 2c, 2j ou dipirona, foram avaliados alguns parâmetros hematológicos ao

final de 15 dias de tratamento subcutâneo com uma dose de 100 µmol/kg. Na

Tabela 10 estão mostrados os resultados obtidos, onde se pode verificar que tanto

os novos derivados pirazolínicos 2c e 2j quanto a dipirona, causaram um aumento

estatísticamente significativo no número de leucócitos, quando comparado com os

animais que receberam veículo. O número de eritrócitos, a concentração de

hemoglobina, o hematócrito, o número de plaquetas, a percentagem de linfócitos e

monócitos permaneceram inalterados após o tratamento crônico com 2c, 2j ou

dipirona.

Salina/

veículo

CFA/

veículo

CFA/

Dipirona

AST

(U/l)

154,0 ± 9,9 153,0 ± 9,4 175,2 ± 11,4 180,7 ± 16,3 154,7 ± 7,9

ALT

(U/l)

57,2 ± 2,7 52,5 ± 4,3 57,5 ± 3,7 53,3 ± 3,7 53,2 ± 3,1

Uréia

(mg/dl)

35,7 ± 3,1 36,7 ± 2,5 39,4 ± 1,7 38,3 ± 1,9 39,8 ± 1,7

Creatinina

(mg/dl)

0,36 ± 0,02 0,35 ± 0,02 0,40 ± 0,04 0,40 ± 0,04 0,38 ± 0,03

Resultados

TABELA 10 – Efeito da administração crônica dos derivados pirazolínicos 2c, 2j e dipirona (100

µmol/kg) sobre alguns parâmetros hematológicos de ratos no modelo da inflamação crônica induzida

por injeção intraplantar de CFA.

Dados expressos como média ± erro padrão; n = 5-6 por grupo; * p < 0.05 comparado com o grupo

salina/veículo

V.2.3 – Determinação dos níveis séricos de haptoglobina após a administração

crônica de 2c, 2j ou dipirona em ratos

Ao final de 15 dias de tratamento com os compostos 2c, 2j, dipirona ou

veículo foi dosada a quantidade da proteína de fase aguda haptoglobina dos animais

que receberam injeção de CFA na pata. Um grupo de animais injetados com salina

intraplantar e que foi tratado com veículo durante os 15 dias foi introduzido como

controle. A injeção intraplantar de CFA produziu um aumento significativo nos níveis

de haptoglobina, quando comparado aos animais que receberam salina na pata

(Figura 13). Porém, nem o tratamento com 2c ou 2j nem o tratamento com dipirona

foi capaz de reduzir ou impedir esse aumento de haptolobina no soro.

Salina/

veículo

CFA/

veículo

CFA/

dipirona

Leucócitos

(x 10

/mm

)

8,18 ± 1,28 10,73 ± 0,89

16,20 ± 1,41* 15,32 ± 3,10* 14,28 ± 2,09*

Eritrócitos

(x 10

/mm

)

7,71 ± 0,21 7,40 ± 0,15 7,73 ± 0,43 7,36 ± 0,11 7,13 ± 0,35

Hemoglobina

(g/dl)

14,08 ± 0,12 13,13 ± 0,27 14,08 ± 0,76 13,60 ± 0,24 13,00 ± 0,44

Hematócrito

(%)

41,78 ± 0,70 39,32 ± 0,36 41,23 ± 2,09 40,35 ± 0,76 38,85 ± 1,6

Plaquetas

(x 10

/mm

)

863,00 ±

126,24

993,83 ±

121,14

1.050,67 ±

152,55

962,00 ±

118,84

1.051,33 ±

151,12

Linfócitos

(%)

86,90 ± 3,88 74,40 ± 7,93 67,50 ± 8,36 72,53 ± 7,98 69,48 ± 7,82

Monócitos (%)

2,22 ± 0,47 1,88 ± 0,27 2,30 ± 0,33 2,38 ± 0,32 2,03 ± 0,69

Resultados

FIGURA 13 – Efeito da administração crônica dos derivados pirazolínicos 2c, 2j e dipirona (100

µmol/kg/15 dias) nos níveis plasmáticos de haptoglobina de ratos com inflamação crônica induzida

por injeção intraplantar de CFA. Dados expressos como média ± erro padrão; n = 5-6 animais por

grupo; * p < 0,05 comparado com o grupo salina/veículo.

V.2.4 – Determinação da atividade tecidual das enzimas MPO, NAG e EPO na

pata de ratos após a administração crônica de 2c, 2j ou dipirona

Na Tabela 11 pode-se verificar que a administração de CFA intraplantar

produziu um aumento da atividade da MPO no local da injeção, quando comparado

com os animais que receberam salina intraplantar. Esse aumento foi encontrado 17-

18 dias após a injeção de CFA. Os animais que receberam 2c, 2j ou dipirona

durante 15 dias (iniciando 2-3 dias após a injeção de CFA na pata) apresentaram

níveis similares de atividade da MPO em relação àqueles animais que receberam

CFA/veículo.

Ao contrário do que se observou para a MPO, a administração de CFA na

pata dos ratos não causou aumento da atividade da NAG e da EPO (Tabela 11).

Resultados

Tabela 11 – Efeito da adminstração crônica dos novos pirazóis 2c e 2j e da dipirona (100 µmol/kg) na

atividade da MPO, NAG e EPO do tecido da pata de ratos com inflamação crônica induzida por

adjuvante completo de Freund.

MPO

(absorbância/

mg proteína)

NAG

(absorbância/

mg proteína)

EPO

(absorbância/

mg proteína)

Salina/veículo 0,02 ± 0,03 0,14 ± 0,13 0,14 ± 0,07

CFA/ veículo 0,40 ± 0,21* 0,14 ± 0,08 0,42 ± 0,14

CFA/2c 0,61 ± 0,24* 0,16 ± 0,12 0,45 ± 0,10

CFA /2j 0,43 ± 0,13* 0,15 ± 0,08 0,51 ± 0,19

CFA/dipirona 0,23 ± 0,05* 0,11 ± 0,04 0,32 ± 0,12

mieloperoxidase;

N-acetil-β-D-glucosaminidase;

peroxidase de eosinófilos; dados mostrados

como média ± SEM. * p < 0,05 comparado ao grupo salina/veículo.

V.2.5 – Determinação dos níveis teciduais de TNF-α na pata de ratos após a

administração crônica de 2c, 2j ou dipirona

A injeção de CFA na pata dos ratos induziu um aumento no nível tecidual de

TNF-α, que foi significativamente maior que os níveis presentes no tecido da pata

dos animais que receberam salina intraplantar. Esse aumento do TNF- α não foi

revertido pelo tratamento crônico dos animais com 2c, 2j ou dipirona (Figura 14).

Resultados

FIGURA 14 – Efeito da administração crônica dos derivados pirazolínicos 2c, 2j e dipirona (100

µmol/kg/15 dias) nos níveis teciduais de TNF- α de ratos com inflamação crônica induzida por injeção

intraplantar de CFA. Dados expressos como média ± erro padrão; n = 3-5 animais por grupo; * p <

0,05 comparado com o grupo salina/veículo.

VI. DISCUSSÃO

Discussão

No presente trabalho, os efeitos de uma nova série de derivados 5-

trifluormetil-4,5-diidro-1H-pirazol-1-carboxiamida (2a-j) foram demonstrados em

modelos de nocicepção e inflamação aguda e crônica, em camundongos e ratos.

Inicialmente, os efeitos dos 10 compostos que fazem parte desta série foram

avaliados nas fases neurogênica e inflamatória do teste da formalina em

camundongos. Foi, então, verificado que apenas o derivado pirazolínico 2h, o qual

possui um grupamento fenil como substituinte na posição 3 do anel pirazol, foi

ineficaz nesse teste. Os demais compostos apresentaram efeito em uma ou em

ambas as fases do teste. O composto 2a possui apenas átomos de hidrogênio nas

posições 3 e 4 do anel pirazol e causou efeito antinociceptivo tanto na fase

neurogênica quanto na fase inflamatória. Entretanto, quando um grupamento metil

foi adicionado na posição 3 do anel pirazol (composto 2b), o efeito na fase

neurogênica não foi mais encontrado. Por outro lado, quando esse grupamento

metila foi transferido da posição 3 para a posição 4 do anel pirazol (composto 2j), o

efeito antinociceptivo em ambas as fases do teste foi melhorado significativamente.

O composto 2c (etil substituído na posição 3 do anel pirazol) também foi bastante

eficaz em ambas as fases do teste. Já o derivados propil e isopropil substituídos na

posição 3 do anel pirazol (2d e 2e, respectivamente), além de apresentarem ação

nas fases neurogênica e inflamatória, também produziram curvas dose-resposta com

um perfil diferente dos demais compostos. Ou seja, no caso do composto 2d, doses

de 75 e 750 µmol/kg foram efetivas no combate à nocicepção na fase inflamatória,

mas a dose intermediária de 250 µmol/kg não produziu qualquer efeito. O composto

2e apresentou um perfil ainda mais surpreendente, visto que a menor dose (25

µmol/kg) foi a mais eficaz, tanto na fase neurogênica quanto na fase inflamatória.

Até o momento, o que se conhece a respeito dessas moléculas não permite uma

explicação clara desse perfil dose-resposta atípico. É possível que estudos

posteriores que venham a elucidar características farmacocinéticas e o(s)

mecanismo(s) de ação desses compostos, possam esclarecer esse ponto.

Outra observação interessante foi à diferença de efeito do composto 2b e seu

análogo MPCA (3-metil-5-hidróxi-5-triclorometil-4,5-diidro-1H-1-carboxiamidapirazol),

cujas ações já foram descritas na literatura (SOUZA et al., 2001). Diferente do

composto 2b, o MPCA é ativo contra a dor neurogênica, em doses semelhantes e no

mesmo teste utilizado no presente trabalho. Entretanto, o composto 2b foi mais

Discussão

eficaz na redução da nocicepção na fase inflamatória do que o MPCA. Assim, a

troca de um grupamento triclorometil da posição 5 do anel pirazol por um

grupamento trifluormetil parece melhorar o efeito antinociceptivo na fase inflamatória,

enquanto abole o efeito na fase neurogênica. O composto 2h é estruturalmente

similar ao FPCA (3-fenil-5-hidróxi-5-triclorometil-4,5-diidro-1H-1-

carboxiamidapirazol), sendo que ambos diferem apenas em relação ao substituinte

da posição 5 do anel pirazol. Trabalhos anteriores relatam a ação antinociceptiva e

antipirética do FPCA (SOUZA et al., 2002; GODOY et al, 2004). Já o pirazolínico 2h

aqui estudado, não produziu efeito antinociceptivo, sugerindo que a substituição de

triclorometil por trifluormetil de alguma maneira torna essa molécula inativa. Há que

se considerar, ainda, que FPCA e 2h foram avaliados em diferentes modelos de

nocicepção, o que torna a comparação de seus efeitos menos precisa do que se

tivessem sido avaliados em condições idênticas. Uma possível explicação para essa

diferença de efeitos dos compostos possuindo cloro ou flúor em sua estrutura pode

estar relacionada ao tamanho e eletronegatividade desses átomos. Enquanto o cloro

possui um raio de 1,81 Å (WATSON & MOKLER, 1987), o flúor tem um raio de 1,47

Å (KEVIN & KITTERINGHAN, 2001). Além disso, o cloro é menos eletronegativo do

que o flúor. Essas características podem causar efeitos estéricos e conferir às

moléculas contendo cloro ou flúor diferentes propriedades de ligação a seu sítio de

ligação. Entretanto, como até o momento não se conhece o mecanismo de ação

dessas drogas, essas conclusões são meramente especulativas. Alguns possíveis

mecanismos de ação, tais como as vias opioidérgicas, serotoninérgicas,

noradrenérgicas e glutamatérgicas, já foram investigados. Os resultados apontam

para o não envolvimento de receptores opióides, α2-adrenérgicos e do “pool”

endógeno de serotonina. Indícios sugerem uma participação da via glutamatérgica,

mas esse estudo está em andamento, não sendo conclusivo até o momento (dados

não publicados).

Após ter sido feita essa avaliação preliminar de todos os compostos da série

de derivados 5-trifluormetil-4,5-diidro-1H-pirazol-1-carboxiamida no teste da

formalina, foi calculada a eficácia dos mesmos, na maior dose administrada, a fim de

selecionar o melhor composto. Analisando os dados de eficácia nas duas fases do

teste da formalina, verificou-se que os derivados pirazolínicos 2c e 2j apresentaram

efeito extremamente similar, principalmente na fase inflamatória, onde ambos

Discussão

praticamente aboliram a resposta nociceptiva. Em resumo, para essa série de

compostos, parece que a presença de metil na posição 4 ou etil na posição 3 do

anel pirazol parecem conferir melhor eficácia antinociceptiva. Por esse motivo, 2c e

2j foram escolhidos para os demais estudos realizados.

Os efeitos dos compostos 2c e 2j foram comparados aos efeitos da dipirona e

da salicilamida no teste da formalina. A comparação com dipirona foi feita devido a

essa droga também pertencer à classe dos derivados pirazolínicos e também devido

ao seu amplo emprego na clínica médica como analgésico e antitérmico. Já a

comparação com salicilamida teve por objetivo esclarecer as propriedades

conferidas às novas moléculas pela substituição bioisostérica do benzeno da

salicilamida pelo 5-trifluormetil-4,5-diidro-1H-pirazol nos novos compostos. De fato,

essa substituição melhorou a atividade dos novos derivados pirazolínicos, uma vez

que os compostos 2c e 2j produziram maiores percentagens de antinocicepção,

sendo estatisticamente maiores que aquela induzida pela salicilamida. Outro dado

interessante foi que a dose de 2c e 2j para produzir significativa antinocicepção

menor que a de salicilamida, a qual foi ativa apenas a partir da dose de 1500

µmol/kg. Em experimentos piloto, ela foi testada na mesma dose de 2c e 2j (1000

µmol/kg), porém não apresentou nenhum efeito. É possível, sem dúvida, que doses

maiores que 1500 µmol/kg possuam eficácia similar ou até melhor que 2c e 2j.

Entretanto, isso não foi testado em virtude da baixa solubilidade da salicilamida que

não permitiu administrar doses maiores. De qualquer forma, pode-se supor que os

compostos 2c e 2j apresentam maior potência que a salicilamida. Em relação à

dipirona, parece que as substituições, presentes no anel pirazol, nos compostos 2c e

2j também tornaram esses compostos significativamente mais eficazes que a

dipirona. Isso foi verificado tanto na fase neurogênica quanto na fase inflamatória do

teste da formalina.

Uma característica interessante dessa série de derivados pirazolínicos é que,

de forma similar à dipirona, mas diferente da maioria dos AINEs, alguns compostos

apresentaram efeito na fase neurogênica do teste da formalina. Isso pode sugerir

que o mecanismo pelo qual eles exercem sua ação pode ser, pelo menos em parte,

diferente daquele dos AINEs clássicos. Esse efeito na nocicepção neurogênica é

interessante, uma vez que se sabe que a dor de origem neurogênica não é aliviada

com boa eficácia pelos analgésicos convencionais, o que pode dificultar o

Discussão

tratamento de pacientes que sofrem desse tipo de dor (DAVIS et al., 1994; NIV &

DEVOR, 2006).

Os compostos 2c e 2j foram avaliados em sua capacidade de inibir a

nocicepção induzida por estímulo térmico, no teste da placa quente. Nesse modelo,

tais compostos mostraram-se inativos, enquanto a dipirona, incluída como controle

positivo, produziu antinocicepção. Existem controvérsias na literatura a respeito da

utilidade de testes térmicos para avaliação de analgésicos fracos, como os AINEs.

Alguns autores consideram que os AINEs, assim como a dipirona, não são eficazes

em teste nocivos térmicos (AKMAN et al., 1996; TAYLOR et al., 1998). Por outro

lado, outros autores têm mostrado que a dipirona causa antinocicepção em modelos

de estimulação térmica (CARLSSON et al., 1986; CARLSSON & JURNA, 1987;

TORTORICI & VANEGAS, 1994; HERNÁNDEZ-DELGADILLO et al., 2003). Essas

discrepâncias na literatura podem ser decorrentes das diferenças na intensidade do

estímulo empregada em cada trabalho. Quando a intensidade do estímulo está ao

redor de 50°C, o efeito de analgésicos fracos pode ser detectado (NISHIYAMA &

HANAOKA, 1974; ANKIER, 1974; HUNSKAAR et al., 1986). No presente estudo, as

divergências de efeito entre dipirona e os novos compostos testado pode ter ocorrido

devido às diferentes doses empregadas para 2c e 2j (1000 µmol/kg) e para dipirona

(1500 µmol/kg). Entretanto, doses maiores de 2c e 2j não foram possíveis em

função de sua solubilidade no veículo empregado. Além disso, os derivados

pirazolínicos tricloro substituídos FPCA e MPCA, os quais têm estrutura química

bastante similar a de 2c e 2j, e que foram avaliados em doses semelhantes as aqui

empregadas, também não apresentam atividade antinociceptiva no modelo da placa

quente (SOUZA et al., 2001). Portanto, é possível que compostos 5-trialometil-4,5-

diidro-1H-pirazol-1-carboxiamida sejam, realmente, inativos contra a nocicepção

térmica.

Os novos derivados pirazolínicos 2c e 2j foram, também, testados no modelo

do edema de pata e da alodínia induzidos por carragenina, um modelo experimental

amplamente utilizado para avaliar efeito de drogas na inflamação aguda em animais

(WINTER et al.,1962). A inflamação porduzida por carragenina é caracteristicamente

bifásica (WINTER et al.,1962). Alguns trabalhos sugerem que a primeira fase (até 1

h após a injeção de carragenina) envolve a liberação de histamina, serotonina e

bradicinina (Di ROSA &WILLOUGHBY, 1971, SALVEMINI et al., 1996). Já a

Discussão

segunda fase ou fase tardia, que ocorre após 1 h da administração de carragenina,

parece ser relacionada a outros mediadores inflamatórios, como as prostaglandinas

(DI ROSA & WILLOUGHBY, 1971, SALVEMINI et al., 1996). Baseado nesses

pressupostos, uma inibição na segunda fase poderia estar relacionada à inibição da

ciclooxigenase (SALVEMINI et al., 1996). Nossos resultados demonstraram que os

compostos 2c e 2j foram ativos contra o edema de pata induzido por carragenina

apenas na fase mais tardia do teste, implicando numa possível ação antiinflamatória

para esses compostos. Além disso, não houve diferença de efeito entre os dois

compostos, sugerindo que a presença de metil na posição 4 ou etil na posição 3 do

anel pirazol não alteram a eficácia antiedematogênica dessas drogas. É interessante

ressaltar que o MPCA, composto análago ao 2c e ao 2j, foi ineficaz contra o edema

de pata produzido por carragenina em ratos (SOUZA et al., 2001). Isso pode indicar

que a substituição de cloro por flúor pode ter conferido aos compostos 2c e 2j

propriedades antiinflamatórias que não estavam presentes no MPCA. Outra hipótese

plausível para essa diferença de efeitos é que a presença de CF3 (grupamento

trifluormetil) torna os compostos metabolicamente mais estáveis em comparação

com aqueles que apresentam o isóstero CCl3 (PARK et al., 2001) e isso poderia

influenciar no efeito das drogas. Além disso, o efeito tardio de 2c e 2j (4,5 h após

sua administração) pode também estar relacionado a essa establidade metabólica

conferida pela presença de CF3 nas moléculas. De fato, a ligação flúor-carbono é

bem mais forte que a ligação cloro-carbono (PARK et al., 2001; LAUVERGNAT et

al., 1996), o que torna a primeira bem menos suscetível à oxidação que a primeira

(LAUVERGNAT et al., 1996). Essa maior resistência à oxidação pode contribuir para

uma maior estabilidade das moléculas e, assim, fazer com que sua

biodisponibilidade seja maior em relação aos compostos triclorometilados.

Entretanto, o estudo de SOUZA e colaboradores (2001) foi realizado em ratos,

diferente do presente estudo onde a inflamação induzida por carragenina foi

analisada em camundongos. Então, a diferença entre as espécies empregadas nos

dois trabalhos também pode estar relacionada aos resultados divergentes obtidos.

Além dos efeitos dos compostos 2c e 2j sobre a nocicepção e o edema de

pata em camundongos, também foram avaliados os efeitos sobre a atividade

locomotora espontânea e forçada. Nesses testes, os compostos não causaram

nenhum prejuízo da locomoção dos animais, sugerindo que os efeitos sobre a

Discussão

nocicepção não podem ser relacionados com algum prejuízo da capacidade de

resposta dos animais ao estímulo nocivo. A salicilamida, cujo efeito antinociceptivo

foi comparado com o efeito de 2c e 2j, causou um aumento na ambulação dos

camundongos, demonstrando que ela pode exercer outros efeitos além de

antinocicepção. Sabe-se que drogas psicoestimulantes, como as anfetaminas,

podem causar hiperexcitabilidade e aumentar a ambulação dos animais no campo

aberto (KELLEY, 2001; WELLMAN et al.; 2005). Entretanto, não há relatos na

literatura a esse respeito em relação à salicilamida.

Numa segunda etapa do trabalho, foram avaliados os efeitos dos derivados

pirazolínicos 2c e 2j em um modelo de artrite induzida por adjuvante completo de

Freund (CFA). As ações dos compostos sobre a alodínia e o edema induzidos por

CFA foram avaliadas após administração aguda e crônica dos mesmos. Além disso,

naqueles animais que receberam tratamento crônico, foram avaliados alguns

parâmetros indicadores de toxicidade. A avaliação da toxicidade é um aspecto

importante desse trabalho, no sentido de ampliar os dados da literatura em relação

ao perfil farmacológico dos derivados pirazolínicos. Em pesquisas anteriores

realizados no LABNEURO com outros derivados pirazolínicos, a avaliação da

toxicidade ainda não havia sido estudada.

Como previamente relatado (CHAPLAN et al., 1994; WILSON et al., 2006), a

injeção de CFA intraplantar em ratos produziu uma intensa e duradoura alodínia

mecânica, como verificado pela diminuição dos limares de resposta aos filamentos

de von Frey, a partir de 2-3 dias após a injeção. Também foi detectado edema

significativo da pata injetada com CFA, chegando a mais de 100% em relação ao

volume basal da pata antes da injeção. Tanto a alodínia quanto o edema

permaneceram evidentes até o último dia de observação experimenal (17-18 dias

após CFA), caracterizando o desenvolvimento de um processo inflamatório crônico.

Além disso, os sinais inflamatórios ficaram restritos ao local da injeção, sem

propagarem-se para a pata contralateral.

Inicialmente, os compostos 2c e 2j foram administrados de forma aguda e foi

avaliada a sua ação sobre a alodínia e o edema de pata induzido por CFA. Nesse

protocolo experimental, a dipirona foi administrada a um grupo de ratos, sendo

usada como controle positivo. Após o tratamento agudo com 2c, 2j e dipirona, o

efeito anti-alodínico instalou-se rapidamente, alterando significativamente os limiares

Discussão

de resposta dos animais 30 min após sua administração. Além disso, tanto os novos

derivados pirazolínicos quanto a dipirona causaram um efeito antinociceptivo de

longa duração (até 12 h após a injeção). Os compostos 2c, 2j e dipirona diferiram,

entretanto, no tempo necessário para atingir seu efeito antinociceptivo máximo,

enquanto 2c produziu inibição máxima da alódinia 1h após a injeção, 2j somente

atingiu seu efeito máximo 4 h após o tratamento. A dipirona causou um efeito

inibitório máximo ainda mais tardio (6 h), o que está de acordo com o fato de que ela

gera metabólitos ativos (HINZ et al., 2007). A longa duração de ação dos compostos

2c e 2j pode estar relacionada com a presença do grupamento CF3, que pode tornar

os compostos metabolicamente mais estáveis (PARK et al., 2001; KARTHIKEYAN et

al., 2007). De fato, substituições com flúor tornam a molécula bem mais resistente ao

ataque direto pelo citocromo P450 (PARK et al., 2001). Entretanto, não se pode

descartar a possibilidade de que, assim como a dipirona, esses compostos possam

também gerar metabólitos ativos, os quais poderiam ser responsáveis pela

manutenção dessa ação prolongada. Porém, estudos farmacocinéticos são

necessários para que futuramente esse ponto seja esclarecido. É importante

destacar que drogas que produzem efeitos de longa duração são interessantes na

aplicação clínica, uma vez que proporcionam maior conforto ao paciente, já que o

número de doses diárias a serem tomadas pode ser reduzido. Por esse motivo, os

compostos 2c e 2j parecem ser bons protótipos para o desenvolvimento de novas

drogas analgésicas.

Comparando o efeito anti-alodínico dos compostos 2c e 2j com o efeito da

dipirona, foi verificada uma diferença em termos de magnitude do efeito dessas

drogas. Na maior dose testada (1000 µmol/kg), o composto 2c foi capaz de reverter

completamente a alodínia induzida pelo CFA, enquanto que a dipirona, na mesma

dose, apenas proporcionou reversão parcial. Esse resultado sugere que o

pirazolínico 2c parece ser mais eficaz que a dipirona no combate à dor de origem

inflamatória.

Por outro lado, o edema induzido por CFA não foi revertido nem pela

administração aguda nem pela administração crônica de 2c, 2j ou dipirona. Relatos

prévios demonstram que a dipirona previne o edema induzido por alguns agentes,

como endotoxinas (FRACASSO et al., 1996), carragenina (BRUNE et al., 1983) e

CFA (WEITHMANN et al., 1985; TATSUO et al., 1994). Entretanto, os trabalhos

Discussão

demonstrando a ação antiedematogênica da dipirona no modelo de inflamação

induzida por CFA diferem do presente estudo, pois foram usados diferentes

protocolos de indução e avaliação da inflamação. No caso do estudo realizado por

TATSUO e colaboradores (1994), foi usado um modelo onde o CFA foi injetado na

base da cauda dos animais e o edema foi avaliado na pata 14 dias após a indução

da inflamação. Nesse modelo, ocorre uma reação sistêmica provocada pela injeção

de CFA na cauda, provocando, entre outras coisas, inflamação na pata do animal.

No presente trabalho, o CFA foi injetado na pata traseira direita dos ratos e a

inflamação ficou restrita ao local da injeção, visto que alodínia e edema não foram

detectados na pata contralateral. Tais diferenças no local da injeção do CFA podem

produzir diferentes graus de inflamação e, assim, as drogas podem agir de maneira

diferente ou mesmo serem ineficazes dependendo do modelo empregado. Outro

fator que pode explicar as divergências com relação aos dados da literatura

reportando ação antiedematogênica para a dipirona, diz respeito à cepa de

Mycobacterium utilizada na preparação do adjuvante e à linhagem dos ratos

empregados. No trabalho de WEITHMANN e colaboradores (1985), por exemplo, foi

usado CFA proveniente de Mycobacterium butyricum e os experimentos foram

realizados em ratos Lewis, diferente do presente estudo, onde foi usado CFA de

Mycobacterium tuberculosys e ratos Wistar. Nesse sentido, relatados prévios na

literatura confirmam que existe ampla variação na incidência e severidade da artrite

induzida pelo CFA, dependendo da cepa de Mycobacterium e da linhagem de ratos

usados (SWINGLE et al., 1969; VAN EDEN et al., 2001; BANIK et al., 2002; WONG

et al., 2006). Levando em consideração essas diferenças em relação aos

procedimentos adotados em trabalhos anteriores e neste, é possível que a falta de

efeito antiedematogênico da dipirona esteja relacionada ao protocolo experimental

usado.

Os compostos 2c e 2j parecem não exercer ação antiinflamatória, no modelo

de inflamação crônica induzida por CFA em ratos, como demonstrado pela sua

ineficácia em diminuir o edema de pata. Esse resultado é, de certa maneira,

conflitante com aquele encontrado quando a inflamação foi induzida por carragenina

em camundongos, onde esses compostos apresentaram ação antiedematogênica

significativa. A eficácia contra o edema induzido por carragenina parecia, realmente,

fornecer indícios de que 2c e 2j exercessem alguma atividade antiinflamatória, já

Discussão

que eles apresentaram efeito justamente na fase tardia do teste, que é considerada

ser decorrente da produção de prostaglandinas (SALVEMINI et al., 1996). Em

relação a essa discrepância nos efeitos observados nos dois modelos de inflamação,

há que se considerar as diferenças entre os dois modelos e também o protocolo

experimental empregado em cada caso. A inflamação causada pela carragenina é

considerada uma inflamação aguda, enquanto a inflamação induzida por CFA é

crônica, ou seja, com o passar dos dias os animais não apresentam resolução do

quadro inflamatório (WINTER et al.,1962; VAN EDEN et al., 2001). Além disso, no

caso do teste da carragenina, os camundongos foram tratados com 2c e 2j antes da

indução da inflamação. Já no caso do teste do CFA, os compostos foram

administrados depois de instalada a inflamação, um protocolo que permitiria ver

efeitos terapêuticos dos compostos e não efeitos preventivos, como no caso do

protocolo de administração adotado no teste da carragenina. A utilização de

protocolos de administração de drogas após a instalação de uma lesão ou doença é,

em geral, mais estreitamente relacionada com a realidade na clínica médica. São

poucos os casos em que se administram drogas antiinflamatórias antes que o

processo inflamatório tenha se instalado e produzido sinais e sintomas. Deve-se

considerar, ainda, que nesses dois modelos de inflamação aqui empregados, foram

usadas diferentes espécies de roedores, o que também pode contribuir para essa

diferença de efeito.

Após administração crônica, os derivados pirazolínicos 2c e 2j, assim como a

dipirona, reduziram a alodínia induzida pela injeção intraplantar de CFA. Além disso,

os compostos parecem não produzir tolerância, visto que eles continuaram a

apresentar efeito após administração de várias doses, sendo que até o 15° dia ainda

se observava a eficácia dos mesmos contra a alodínia. No caso deste protocolo de

administração crônica, foi dada uma injeção das drogas a cada 24 h. É interessante

notar que 24 h após receber a segunda dose (dia 3 do protocolo experimental), os

animais já apresentavam um aumento significativo em seu limiar de resposta ao

estímulo mecânico, sugerindo um alívio da dor inflamatória. Apesar disso, não foi

obtida uma reversão total da alodínia causada pelo CFA ao longo de 15 dias de

tratamento com 2c, 2j ou dipirona. É possível que doses maiores ou um maior

número de doses diárias possa produzir um bloqueio completo da alodínia, porém

isso precisa ser testado futuramente.

Discussão

Nos animais injetados intraplantarmente com CFA e que foram tratados

cronicamente com 2c, 2j ou dipirona foi avaliada a concentração de haptoglobina no

soro. Essa é uma proteína de fase aguda, cujos níveis aumentam durante a

inflamação induzida por CFA em ratos, servindo como um marcador da evolução ou

regressão da doença (GIFFEN et al., 2003). De fato, a injeção intraplantar de CFA

causou um aumento na concentração de haptoglobina, quando esse parâmetro foi

avaliado 17 a 18 dias após a indução da inflamação da pata. Entretanto, o

tratamento dos ratos com 2c, 2j ou dipirona, durante 15 dias, não foi capaz de

diminuir os níveis de haptoglobina, sugerindo que tais drogas não alteram o curso da

doença. Esse resultado está de acordo com aqueles obtidos na avaliação do edema

de pata, onde 2c, 2j e dipirona foram ineficazes em reduzir esse sinal de inflamação.

Tomados juntos, esses achados apontam para uma falta de efeito dos novos

pirazolínicos, assim como da dipirona, sobre a inflamação crônica, nas condições em

que foram testados.

Os sinais e sintomas da inflamação incluem, além de dor e edema, a

migração de células do sistema imunológico para o local inflamado (MARCHAND et

al., 2005). Os tipos de células que contribuem para a dor inflamatória dependem do

tipo de inflamação, mas, em geral, vários tipos celulares podem ser recrutados e

contribuir, ainda que em diferentes graus, para uma sensibilidade dolorosa

aumentada (MARCHAND et al., 2005). Sendo assim, a atividade das enzimas MPO,

NAG e EPO, em amostras de tecido da pata de ratos que receberam injeção

intraplantar de CFA, foram analisadas como indicadores do recrutamento de

neutrófilos, macrófagos e eosinófilos para o local da lesão, respectivamente

(SUZUKI et al., 1983; LLORET et al., 1995; KANG et al., 2008). Foi encontrado neste

estudo que a atividade da MPO, mas não da NAG ou da EPO, estava aumentada

quando avaliada 17-18 dias após a injeção do CFA, sugerindo acúmulo apenas de

neutrófilos no local da inflamação. Além disso, foi verificado que o tratamento com

2c, 2j ou dipirona não foi capaz de reduzir a atividade da MPO e, por dedução, a

infiltração de neutrófilos no sítio inflamado. No entanto, é importante ressaltar que,

até o presente momento, o decurso temporal do recrutamento de células

imunológicas após indução de inflamação por injeção intraplantar de CFA não está

completamente descrito na literatura. Em 2006, LEVY e colaboradores mostraram

que 28 dias após a indução de monoartrite na articulação do joelho de ratos pela

Discussão

injeção de CFA, o número de leucócitos totais aumentou drasticamente no líquido

sinovial local, enquanto que o número de macrófagos foi apenas modestamente

aumentado. Se a infiltração de células imunológicas na pata injetada com CFA

ocorre de maneira semelhante àquela encontrada no modelo de monoartrite

empregado por Levy e colaboradores, os resultados obtidos no presente estudo

corroboram, pelo menos em parte, com os resultados obtidos pelo estudo

anteriormente citado. Entretanto, aqui a remoção do tecido da pata para análise

indireta da infiltração celular foi feita 17-18 após a indução de inflamação com CFA,

sendo que no trabalho anteriormente citado, essa avaliação foi feita 28 dias após a

injeção do CFA. Talvez o protocolo empregado no presente trabalho não tenha sido

adequado para a detecção de um aumento de macrófagos e eosinófilos, em função

do tempo após CFA em que foram coletadas as amostras.

Existem relatos de que macrófagos e neutrófilos contribuem para a

manifestação de dor em modelos experimentais. Eles podem liberar mediadores

inflamatórios, incluindo o TNF-α, uma citocina pró-inflamatória (MARCHAND et al.,

2005). No presente trabalho, nós verificamos que os níveis teciduais de TNF-α

aumentaram na pata inflamada dos ratos, 17-18 dias após a injeção de CFA. Porém,

o tratamento crônico dos animais com 2c, 2j ou dipirona não causou redução desse

parâmetro. Esse dado aliado à falta de efeito dos compostos 2c e 2j na infiltração de

neutrófilos, reforça a idéia de que esses compostos são desprovidos de ação

antiinflamatória.

A dosagem de AST, ALT, uréia e creatinina foi realizada com o objetivo de

identificar possíveis lesões hepáticas e renais decorrentes da administração crônica

dos compostos 2c e 2j e da dipirona. Nenhum dos tratamentos produziu qualquer

alteração nesses indicadores de toxicidade, sugerindo que 2c, 2j e dipirona não são

tóxicos em ratos, ao menos na dose e duração do tratamento em que foram

avaliados.

Além dos parâmetros de toxicidade renal e hepática, também foram avaliados

outros indicadores de efeitos adversos, como mudanças no ganho de peso corporal

e alterações em parâmetros hematológicos. Estudos têm reportado que a injeção

intraplantar de CFA causa uma redução do ganho de peso corporal dos animais ao

longo do tempo, além de produzir sinais de poliartrite (WALTZ et al., 1971; FRANCH

et al., 1994; YU et al., 2006). No presente trabalho, o peso corporal foi avaliado

Discussão

diariamente ao longo dos dias de tratamento crônico. Nos dias 1 e 2 do protocolo

experimental (2 a 4 dias após a injeção de CFA) foi detectada uma diminuição no

ganho de peso dos animais que receberam CFA em relação aos que receberam

salina intraplantar. Entretanto, isso não foi afetado pelo tratamento com 2c, 2j ou

dipirona, indicando que essa diminuição no peso não tem relação com a

administração dessas drogas, mas somente com a injeção do CFA. Além disso,

sinais de poliartrite, observados por outros autores, não foram detectados no

presente estudo. É possível que essa discrepância em relação aos resultados

obtidos por outros pesquisadores esteja relacionada ao desenho experimental,

assim como à linhagem de ratos e à cepa de Mycobacterium usada na preparação

do adjuvante.

A avaliação de alguns parâmetros hematológicos nos animais que receberam

tratamento crônico com 2c, 2j ou dipirona foi feita para verificar se esse tratamento

causava alguma alteração na hematopoiese. Dentre os parâmetros avaliados,

somente foi encontrado um aumento no número de leucócitos totais dos animais que

receberam CFA intraplantar e tratamento crônico com 2c, 2j ou dipirona. Nos

animais que receberam salina intraplantar em vez de CFA e que foram submetidos

ao mesmo protocolo de tratamento com as drogas, esse aumento no número de

leucócitos não foi encontrado. Então, essa leucocitose parece ocorrer apenas na

presença de inflamação induzida por CFA, descartando a possibilidade de um efeito

per se dos derivados pirazolínicos 2c, 2j e da dipirona sobre a produção de

leucócitos. Nesse contexto, alguns trabalhos têm mostrado diminuição no

hematócrito e nos níveis de hemoglobina, produzindo anemia, e pronunciado

aumento no número de leucócitos e linfócitos em ratos injetados com CFA

(MIKOLAJEW et al., 1969; WALZ et al., 1971). Entretanto, mais uma vez, diferenças

entre os protocolos experimentais impedem uma comparação adequada como os

resultados obtidos no presente estudo.

Os efeitos adversos associados com os AINEs clássicos incluem desconforto

gastrointestinal e surgimento de lesões e úlceras da mucosa, sendo que uma

percentagem relevante dos pacientes que experimentam tais efeitos apresentam

risco de morte (VANE et al., 1998). No presente estudo, foi demonstrado que a

administração crônica dos pirazolínicos 2c, 2j ou dipirona não causou lesões da

mucosa do estômago de ratos, sugerindo uma boa tolerabilidade gástrica para essas

Discussão

drogas. Além disso, uma análise macroscópica do fígado, rins e baço não mostrou

lesões aparentes e também não houve mudança na percentagem de peso desses

órgãos em relação ao peso corporal dos animais.

Ainda em relação à toxicidade dos novos derivados pirazolínicos avaliados

neste trabalho, vale ressaltar que eles não causaram morte de nenhum animal nem

produziram sinais comportamentais de toxicidade (por exemplo, convulsões, apatia,

dificuldades locomotoras) que justificassem a eutanásia dos mesmos e a interrupção

dos experimentos.

Em resumo, os resultados obtidos nos estudos realizados com camundongos

e ratos, usando modelos de nocicepção e inflamação aguda e crônica, bem como a

análise preliminar da toxicidade dos derivados 5-trifluormetil-4,5-diidro-1H-pirazol-1-

carboxiamida, especialmente dos compostos 2c e 2j, permite concluir que estes são

bons protótipos para estudos posteriores visando o desenvolvimento de novas

drogas analgésicas.

VII. CONCLUSÕES

Conclusões

Tendo em vista os resultados obtidos no presente trabalho foi possível

concluir que:

1 – Todos os derivados 5-trifluormetil-4,5-diidro-1H-1-pirazol-1-carboxamida, exceto

o derivado 3-fenil substituído (2h), causaram antinocicepção no teste da formalina

(estímulo nocivo químico). Os compostos 3-etil e 4-metil substituídos (2c e 2j,

respectivamente) foram mais eficazes contra a nocicepção neurogênica e

inflamatória produzida pela formalina. Os derivados 2c e 2j foram ineficazes contra a

nocicepção térmica aguda (teste da placa quente).

2 – O edema de pata induzido por carragenina foi prevenido pela administração dos

novos derivados pirazolínicos 3-etil-5-trifluormetil-4,5-diidro-1H-1-pirazol-1-

carboxamida (2c) e 4-metil-5-trifluormetil-4,5-diidro-1H-1-pirazol-1-carboxamida (2j).

Além disso, esses compostos foram capazes de inibir a alodínia induzida pela

carragenina.

3 – Os derivados pirazolínicos 2c e 2j causaram efeito anti-alodínico no modelo de

inflamação crônica induzida por CFA, tanto quando administrados agudamente

quanto cronicamente. Porém, não produziram efeito antiedematogênico após

tratamento agudo ou crônico.

4 – A administração crônica dos derivados pirazolínicos 2c e 2j não foi capaz de

diminuir os níveis plasmáticos de haptoglobina (marcador de inflamação), e nem a

atividade da mieloperoxidase e a concentração de TNF-α tecidual, aumentados pela

injeção intraplantar de CFA. Esses dados indicam falta de efeito antiinflamatório

desses compostos.

5 – A administração crônica de 2c e 2j não alterou os parâmetros bioquímicos

indicadores de toxicidade renal e hepática, sugerindo que tais compostos não

causam lesão dos rins e do fígado.

Conclusões

6 – Não houve alteração no ganho de peso corporal nem do tamanho de alguns

órgãos internos de ratos que foram cronicamente tratados com 2c e 2j, indicando,

mais uma vez, que esses compostos parecem não apresentar toxicidade.

7 – Não foram encontrados sinais de lesão da mucosa gástrica após tratamento

crônico com 2c e 2j, indicando boa tolerabilidade gástrica para esses derivados

pirazolínicos.

8 – Os derivados 5-trifluormetil-4,5-diidro-1H-1-pirazol-1-carboxamida, não alteraram

a atividade locomotora de camundongos e ratos, sugerindo ausência de efeitos

inespecíficos que pudessem mascarar os resultados obtidos sobre os parâmetros

relacionados à nocicepção.

VIII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Referências Bibliográficas

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IX . ANEXOS

Anexo 1

ANEXO 1 – ARTIGO PUBLICADO NO PERIÓDICO

EUROPEAN JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY

Anexo 1

100

Anexo 1

101

Anexo 1

102

Anexo 1

103

Anexo 1

104

Anexo 1

105

Anexo 1

106

Anexo 1

107

108

ANEXO 2– MANUSCRITO

Anexo 2

109

Effect of 5-trifluoromethyl-4,5-dihydro-1H- pyrazoles on chronic inflammatory

pain model in rats

Patricia D. Sauzem

, Gabriela da S. Sant’Anna

, Pablo Machado

, Marta M. M. F.

Duarte

, Juliano Ferreira

, Carlos F. Mello

, Paulo Beck

, Helio G. Bonacorso

, Nilo

Zanatta

, Marcos A. P. Martins

and Maribel A. Rubin

Laboratório de Neurotoxicidade e Psicofarmacologia and

Núcleo de Química de

Heterociclos (NUQUIMHE), Departamento de Química, Centro de Ciências Naturais

e Exatas, Universidade Federal de Santa Maria, 97.105-900, Santa Maria, RS,

Brazil.

Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Centro de Ciências da Saúde,

Universidade Federal de Santa Maria, 97.105-900, Santa Maria, RS, Brazil.

Departamento de Ciências da Saúde, Universidade Luterana do Brasil, 97.020-001,

Santa Maria, RS, Brazil.

*Corresponding author. Tel.: +55 55 3220-8053; Fax: +55 55 3220-8978

E-mail address:

maribel.rubin@gmail.com (Maribel A. Rubin)

Anexo 2

110

Abstract

Arthritis is a joint inflammatory disease, and the primary feature which patients

present in the clinic is chronic pain. Nonsteroidal antiinflammatory drugs (NSAIDs)

are commonly used for treatment of arthritis. However, long-term use of the NSAIDs

has been associated with considerable morbidity, limiting their use. So, remains a

need to develop new drugs for effective and safe relief of chronic inflammatory pain.

In this context, the present study was designed to evaluate the antinociceptive and

antiedematogenic effect of the 5-trifluoromethyl-4,5-dihydro-1H-pyrazole derivatives

EPFCA3 and MPFCA4 after acute and chronic administration in rats submitted to

model of adjuvant-induced arthritis. Moreover, we also analyzed some biochemistry

parameters indicators of toxicity after prolonged administration of these compounds.

We find that acute and chronic administration of EPFCA3 and MPFCA4 produces

antinociceptive, but not antiedematogenic effect, on arthritis animal model induced by

CFA. In the animals that received chronic treatment with EPFCA3 and MPFCA4,

were detected no toxicity signals. Dipyrone was used as positive control and their

effect was similar to effect of the new pyrazoles. The activity of tissue

myeloperoxidase, the tissue TNF-α level and the serum haptoglobin level were

increased by CFA intraplantar injection. However, chronic administration of

EPFCA3, MPFCA4 or dipyrone was no able to alter these parameters relationship to

inflammation. Our results suggest that EPFCA3 and MPFCA4 seems to be good

candidates for development of new drugs for pain treatment.

Key words: antinociception, pyrazole carboxiamide derivatives, tactile allodynia, paw

edema, toxicity

Anexo 2

111

1. Introduction

Chronic pain affects hundreds of millions of people worldwide and alters their

physical and emotional functioning, decreases their quality of life and impairs their

ability to work (Goldenberg et al., 1987; Ashburn et al., 1999). Osteoarthritis and

rheumatoid arthritis comprise two common forms of joint inflammatory disease, and

the primary feature which patients present in the clinic is chronic pain (Wilson et al.,

2006).

Nonsteroidal antiinflammatory drugs (NSAIDs) are commonly used for

treatment of arthritis. However, long-term use of the NSAIDs has been associated

with considerable morbidity in terms to dyspepsia, gastrointestinal haemorrhage,

renal dysfunction, aggravation of hypertension, and precipitation of heart falilure

(Narsinghani et al., 2006). Since the currently available therapies used in chronic

inflammatory disorders fail to adequately alleviate pain in many patients, and side

effects of the treatments often limit their use, there remains a need to develop new

drugs for effective and safe relief of chronic inflammatory pain (Wilson et al., 2006).

Pyrazole compounds and their derivatives are widely known for their excellent

effectiveness as analgesics and antipyretics (Williams et al., 1999). Moreover, some

data have shown that the ulcerogenic activity of dipyrone, a pyrazole derivative, in

rats and humans is substantially lower than the risk associated with other NSAIDs,

such as acetylsalicylic acid and diclofenac, commonly used for pain relief (Andrade et

al., 1998; Sánchez et al., 2002). These findings suggest better tolerability of dipyrone

in relationship to other NSAIDs.

In this context, we have synthesized new pyrazole derivatives and reported

their antinociceptive and antipyretic effects in animal models of inflammation, fever

and pain (Souza et al., 2001; Souza at al. 2002; Godoy et al., 2004; Tomazetti et al.,

2005; Tabarelli et al., 2004; Prokopp et al., 2006; Sauzem et al., 2007; Milano et al.,

2008). The compounds 3-ethyl-5-hydroxy-5-trifluoromethyl-4,5-dihydro-1H-1-

carboxyamidepyrazole (EPFCA3) and 4-methyl-5-hydroxy-4-methyl-5-trifluoromethyl-

4,5-dihydro-1H-1-carboxyamidepyrazole (MPFCA4) belong to a series of ten

pyrazole derivatives recently synthesized and screened for antinociceptive and

antiedematogenic activity in mice. These compounds cause antinociception in

neurogenic and inflammatory pain induced by formalin, and antiedematogenic action

on carragenin model after acute administration (Sauzem et al., 2007). However, until

Anexo 2

112

present moment, the action in chronic models of pain and the toxicity of these

compounds have not been evaluated.

The present study was designed to determine whether the 5-trifluoromethyl-

4,5-dihydro-1H-pyrazoles derivatives EPFCA3 and MPFCA4 (Figure 1) exhibits

antinociceptive and anti-inflammatory properties after acute and chronic

administration in rats submitted to model of adjuvant-induced arthritis. Moreover, we

also analyzed some biochemistry parameters indicative of toxicity after prolonged

administration of these compounds. We also compared the action of pyrazole

compounds with that of dipyrone.

2. Materials and Methods

2.1. Animals

All experiments were performed using adult male Wistar rats weighing 180-

220 g. Animals were housed in groups of 6 per cage, at a controlled temperature (22

± 1°C), on a 12 h light/12 h dark cycle and with standard lab chow and water ad

libitum. The animals were acclimated to the experimental room for at least 2 h before

the experiments. All experiments were performed in accordance with the ethical

guidelines established for investigations of experimental pain in conscious animals

(Zimmermann, 1983) and were approved by the Committee on the Use and Care of

Laboratory Animals of our University (register number 23081.018371/2006-94).

2.2. Induction of inflammation

To induce inflammation, rats were briefly anesthetized (2–3 min) with

halothane and 150 µl of the complete Freund’s adjuvant (CFA, 1 mg/ml of heat killed

Mycobacterium tuberculosis, from SIGMA) were injected subcutaneously into the

right hind paw (Wilson et al., 2006).

2.3. Measurement of tactile allodynia

Rats were placed in cages with a wire mesh bottom which allowed full access

to the paws. Behavioral habituation was allowed for approximately 15-30 min, until

cage exploration and major grooming activities ceased. The area tested was the mid-

plantar right hind paw. The paw was touched with 1 of a series of 7 von Frey hairs

with logarithmically incremental (0.8, 1.5, 3.5, 6.0, 7.5, 10.0 and 15.0 g). The von

Anexo 2

113

Frey hairs were presented perpendicular to the plantar surface with sufficient force to

cause slight buckling against the paw, and held for approximately 6-8 s. Stimuli were

presented at intervals of several seconds, allowing for apparent resolution of any

behavioral responses to previous stimuli. Ambulation was considered an ambiguous

response, and in such cases the stimulus was repeated (Chaplan et al., 1994). The

50% withdrawal threshold was determined using up-and-down method by Dixon

(1980). In this paradigm, testing was initiated with the 10.0 g hair. Stimuli were

always presented in a consecutive fashion, whether ascending or descending. In the

absence of a paw withdrawal response to the initially selected hair, a stronger

stimulus was presented. In the event of paw withdrawal, the next weaker stimulus

was chosen. A total of 6 responses were registered and the 50% response threshold

was calculated using the equation:

50% g threshold = 10

+kδ]

where X

= value of the final von Frey hair used (in log units); k = tabular value for

the pattern of positive/negative responses (Dixon, 1980); and δ = mean difference (in

log units) between stimuli (0.2122).

2.4. Measurement of paw edema

Edema formation was quantified by changes in paw volume measured before

and after CFA injection (at time indicated in each experimental protocol). The paw

volume evaluation was made by immersing the injected paw into a cuvette filled with

a solution of 2.5% extran in water (v/v). The cuvette was fixed on the plate of an

electronic scale (precision of 0.01 g), and the careful immersion of the paw into

cuvette’s solution avoiding to touch the cuvette, was accompanied by an increase in

the weight displayed. The weight in grams is related to the increase of the liquid

column in the cuvette, but not to the mass of the paw. Since the cuvette’s solution

density was 1 mg/ml, the value displayed by the balance was promptly assumed as

the paw volume (Daher et al., 2005). The paw edema was calculated as to the

following equation:

% edema = [(V initial - V final)/V initial] x 100

were V initial is the volume of the paw before FCA or saline injection and V final is the

volume of the paw after FCA or saline injection.

Anexo 2

114

2.5. Open fied test

The effect of the drugs on spontaneous locomotor activity behavior was

assessed by the open field test, as previously reported by Guerra et al. (2006). This

test was carried out to identify motor disabilities, that could harm the paw withdrawal

response of the animals when, stimulated by von Frey filaments. The apparatus was

a box measuring 56x40x30 cm with the floor divided into 12 equal areas. The open

field session lasted 5 min and during this time the number of crossing responses was

recorded. The animal’s behaviour was evaluated one hour after drugs treatment.

2.6. Measurement of body weight

In the protocol of the chronic administration of the drugs, body weight was

followed during all time of treatment. The percentage of change in corporal weight

was calculated from basal weight (before CFA or saline paw injection) and was

considered as possible indicative of toxicity or side effects of the drugs (Yu et al.,

2006).

2.7. Gastric lesion assessment

Ulcerogenic activity was evaluated after chronic administration of EPFCA3,

MPFCA4 or dipyrone (100 µmol/kg, one dose daily for 15 days; controls received

vehicle). Six hours before sacrifice, an acute dose of indomethacin (30 mg/kg) was

administered to separated group of rats that was used as positive control from ulcer

presence. Food but not water was removed 18 h before euthanasia. The evaluation

was made 24 h after the last dose of the drugs. The animals were euthanized with

overdose of pentobarbital and the stomach was extracted, opened along the small

curvature to assess the lesion index (LI) and the number of ulcers (NU). The LI of

each animal was calculated by adding the following values obtained in the

observation of mucosa, considering the lesion degree produced: light (1 point),

moderate (2 points) or intense (3 points), evaluating the discoloration of mucosa, the

petechial presence and mucus loss. NU was determined by direct count of small

lesions (until 1 mm). When larger, the lesions were quantified considering 1.5 points

for mm. The observations were made using a microscope (Djahanguiri, 1969;

Ghedini et al., 2002).

Anexo 2

115

2.7. Biochemical analysis

2.7.1 Sample collection

Twenty four hours after the cessation of the chronic treatment, the animals

were killed by i.p. injection of sodium pentobarbital. Blood samples were collected

from the abdominal aorta into serum separator tubes (for asparte aminotransferase,

alanine aminotransferase, urea, creatinine and haptoglobin analysis) or into tubes

with EDTA (for hemogram analysis). The skin of the hind paws were removed and

immediately frozen for posterior analysis of the myeloperoxidase (MPO), N-acetyl-β-

D-glucosaminidase activity (NAG) and eosinophil peroxidase (EPO). A gross

examination was made of the abdominal organs, which were removed and weighed.

2.7.2. Hematological analysis

The number of erythrocytes, leukocytes, lymphocytes, monocytes, platelets

and the concentration of hemoglobin and the hematocritus were measured in order to

identify any possible blood dyscrasias. Quantitative determinations were measured in

whole blood collected in EDTA tubes by use of standard methods with the fully

automated PENTRA 120



(ABX Diagnostics, Montpellier, France).

2.7.3. Hepatic and renal function analysis

Alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) levels

were measured as indicators of hepatic injury, while urea and creatinine levels were

used as indicators of renal lesion. The AST and ALT levels were measured using

standard enzymatic methods with the use of Ortho-Clinical Diagnostics – Johnson &

Johnson reagents with a fully automated analyzer (Vitros 950, dry chemistry;

Johnson & Johnson, Rochester, NY, USA).

2.7.4. Haptoglobin analysis

Haptoglobin, an acute phase protein, which the level increases during

inflammation (Giffen et al., 2003), was measured by nephelometric immunoassay

using Dade Behring kits (BN II System Analyzer Dade Behring, Germany).

2.7.5. Myeloperoxidase (MPO), N-acetyl-β-D-glucosaminidase (NAG) and eosinophil

peroxidase (EPO) assay

Anexo 2

116

The MPO activity was assayed in accordance with Suzuki et al. (1983), with

some modifications. Briefly, the skin paw samples were defrosted and homogenized

with 20 volumes of 80 mM sodium acetate buffer (pH 5.4) plus 0.5%

hexadecyltrimethylammonium bromide (HTAB), centrifuged (11,200 g, 4°C, 20 min)

and the supernatants were collected. For assay, 10 µl of supernatant and 220 µl of

80 mM sodium acetate buffer (pH 5.4) containing 15% of 0.3 mM H

were added in

triplicate to a 96-well plate. The reaction was initiated by the addition of 20 µl of 18.4

mM tetramethylbenzidine. The mixture was incubated for 3 min at 37°C and then

immersed into ice bath. The reaction was stopped by the addition of 30 µl of acetic

acid and the absorbance was monitored at a wavelength 630 nm.

For NAG and EPO assay, samples had been prepared as previously

described for MPO samples. In the NAG assay, the reaction mixture was made with

10 µl of supernatant, 100 µl of 50 sodium citrate buffer (pH 4.5) and 25 µl of 4-

Nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide. The reaction mixture was incubated for 1 h

at 37°C and was stopped with 100 µl of 200 mM glycine buffer pH 10.4. The enzyme

activity was evaluated colorimetrically as absorbance at 405 nm. In the measurement

of EPO activity, 100 µl of substrate solution consisted of the 0.1 mM of o-

phenylenediamine in 0.05 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 0.1% Triton X-100

and 1 mM H

was add to 100 µl of supernatant (Lloret et al., 1995, Kang et al.,

2008). The reaction mixture was incubated for 30 min at 37°C, and then the reaction

was stopped by the addition of 50 µl of 4 M H

. The enzyme activity was

evaluated colorimetrically as absorbance at 490 nm.

2.7.6. Measurement of TNF-α levels in the rat paw

TNF-α production in the rat paw was assessed using a ELISA kit, as described

by manufacturer (DuoSet ELISA Development System, rat TNF-α/TNFSF1A, R&D

Systems). Briefly, rats that received EPFCA3, MPFCA4, dipyrone or vehicle for 15

days after CFA intraplantar injection were sacrificed 24 h after last administration of

the drugs. The subcutaneous tissue of the paws were removed and placed in a PBS

80 mM (pH 7.4) solution containing: Tween 20 0.5%, PMSF 0.1 mM, EDTA 2 mM,

antitripsin 0.01 µg/ml, bacitracin 0.1% and BSA 0.1%. Tissues were homogenized,

centrifuged at 16000 x g, for 10 min and the supernatant obtained was stored at – 20

°C until further analysis (Souza et al., 2000; Campos et al, 2002).

Anexo 2

117

2.8. Experimental design

2.8.1. Time-course study after acute administration of the new pyrazole compounds

and dipyrone

The basal threshold for mechanical stimulus and paw volume was evaluated

immediately before CFA or saline administration into right hind paw. On day 2-3 post-

CFA or saline, the 50% response threshold and the paw volume were again analyzed

to verify tactile allodynia development and paw edema, respectively. Afterwards, the

CFA-injected animals that presented allodynia received subcutaneously: vehicle

(distilled water, polyethylene glycol 400 and polysorbate 80; 75:20:5), EPFCA3 (1000

µmol/kg), MPFCA4 (1000 µmol/kg) or dipyrone (1000 µmol/kg; internal standard).

Separated groups of the animals received saline into the paw and also were treated

with vehicle and evaluated together with the others groups. The response threshold

and the paw edema were measured from 30 min to 24 h after treatment.

2.8.2. Dose-response study after acute administration of the new pyrazole

compounds and dipyrone

The procedures for allodynia induction were identical to described above. The

animals CFA-injected that developed allodynia were treated with vehicle, EPFCA3 (1-

1000 µmol/kg), MPFCA4 (1-1000 µmol/kg) or dipyrone (1-1000 µmol/kg) and the

response threshold was evaluated 1 h after.

In order to identify any impairment in locomotor activity, the animals treated at

the dose of 1000 µmol/kg or vehicle were displayed to open field test, immediately

after allodynia measurement. In this test, were registered the number of crossings

responses of the rats for 5 minutes.

2.8.3. Effect of chronic administration of the new pyrazole compounds and dipyrone

on behavioral and biochemical parameters

Before CFA or saline intraplantar injection, the baseline threshold for

mechanical stimulus, the volume and the temperature of both paws were assessed.

On 2-3 day after CFA or saline, these parameters were again evaluated and initiated

the animal’s treatment with vehicle, EPFCA3, MPFCA4 or dipyrone. All drugs were

administered subcutaneously at dose of 100 µmol/kg and dipyrone was included as

Anexo 2

118

internal standard. The animals received one injection daily for 15 days. On the days

1, 2, 3, 6, 9, 12 and 15, the 50% response threshold for von Frey hairs and the

volume of both paws were evaluated before and 1 h after treatments with EPFCA3,

MPFCA4, dipyrone or vehicle (day 1 corresponds to the first day of the treatment, 2-3

days after CFA or saline intraplantar injection). Moreover, the body weight of the

animals was measured throughout all the experiment. The measures carried through

before of the daily injection of the drugs, were made in order to verify the cumulative

effect of the treatment. On the other hand, the measures made 1 h after treatments

were used for identify to development of tolerance.

2.8.4. Statistical analyses

The results were expressed as mean ± SEM. DE

values were reported as

geometric means accompanied by their respective 95% confidence limits. Data were

analysed by one way analysis of variance (ANOVA) and post hoc tests (Student-

Newman-Keuls test-SNK) were carried out when appropriate. The level of

significance was set at p < 0.05.

3. Results

3.1. Time-course study after acute administration of EPFCA3, MPFCA4 and dipyrone

on mechanical allodynia and paw edema

Prior to induction of inflammation by CFA, the mean of threshold was about

15.0 g. By post induction day 2-3, the threshold falls about 4 times, characterizing the

allodynia development (Figure 2). For comparison, the mean value for saline

intraplantar injected rats remains around 15.0 g (Figure 1). The subcutaneous

treatment of the animals with EPFCA3, MPFCA4 or dipyrone produced increase in

the threshold response to von Frey hair’s in the CFA intraplantar injected animals

(Figure 2A-C). The response onsets 30 min after injection of drugs and has a long

duration (12 h) for all treatments. The MPFCA4 compound, 4 h after administration,

reversed allodynia in 85.6 ± 12.2 % (Figure 2A). The EPFCA3 compound presented

similar effectiveness to the MPFCA4 (70.8 ± 8.1 %, Figure 2B), but its effect occurred

earlier that the MPFCA4 effect. The effectiveness of the internal standard dipyrone

did not differ from the effectiveness of the EPFCA3 and MPFCA4, however its

Anexo 2

119

maximum effect was delayed, occurring 6 hours after the injection (72.7 ± 9.5 %, Fig.

2C).

In this same group of the animals was evaluated the paw volume in order to

verify the edema development after CFA or saline intraplantar injection. In fact, CFA,

but not saline, caused an increase of the paw volume (about 100 %), characterizing

edema development. However, the treatments of the animals with EPFCA3,

MPFCA4 or dipyrone, 48-72 h after CFA injection, had no effect on paw edema

induced by CFA (Figure 3). The animals that received saline intraplantar injection

and were treated with vehicle presented no alterations in the threshold response or

paw edema (Figures 2 and 3).

The animals were evaluated in the open field test 1 h after receive

subcutaneous treatments. The number of crossings was not modified by EPFCA3,

MPFCA4 or dipyrone treatment compared with the animals that had received vehicle

(Table 1).

3.2. Dose-response study after acute administration of EPFCA3, MPFCA4 or

dipyrone

In the Figure 4 is shown the effect of EPFCA3, MPFCA4 and dipyrone (1-1000

µmol/kg) on CFA-induced allodynia. Doses from 10 µmol/kg of EPFCA3, MPFCA4

and dipyrone caused anti-allodynic effect in the animals as demonstrate by increase

in the threshold response to von Frey hair’s after drugs treatment. All drugs had

presented similar antinociceptive potency, with ED

of 9.9 (0.9-114.2), 11.3 (1.9-

65.9) and 10.8 (2.6-44.0) µmol/kg for EPFCA3, MPFCA4 and dipyrone, respectively.

However, EPFCA3 was more efficacious than MPFCA4, reverting completely the

allodynia at dose of 1000 µmol/kg (Figure 4B).

3.3. Effect of chronic administration of the EPFCA3, MPFCA4 or dipyrone on tactile

allodynia, edema and biochemical parameters

3.4.1. Tactile allodynia

Complete Freund’s adjuvant injection produced a profound and long-lasting

decrease in the response threshold to von Frey hairs in the ipsilateral paw. In the

Figure 5A-C is shown the cumulative effect of chronic treatment with EPFCA3,

MPFCA4 and dipyrone on tactile allodynia CFA-induced. The value of the day 1

Anexo 2

120

corresponds to threshold immediately before treatments onset, and the values of the

days 2, 3, 6, 9, 12 and 15 represents the thresholds 24 h after drugs administration. It

is possible to note, in the Figure 5A-C, that from the third day of treatment, all drugs

already had stable anti-allodynic effect. EPFCA3 and MPFCA4 (100 µmol/kg) caused

antinociceptive action from day 3 until the last day of observation, while dipyrone

(100 µmol/kg) produced effect from day 2 of the treatment.

In the Figure 5D-F is shown the threshold responses of the animals 1 h after

treatment at days 1, 2, 3, 6, 9, 12 and 15. These observations were performed in

order to identify possible tolerance development. The results obtained demonstrate

no decrease in effectiveness of the drugs during observation period.

The animals injected with saline intraplantar and treated with EPFCA3,

MPFCA4 and dipyrone did not presented threshold alterations when compared to the

vehicle treated rats (data not show).

Furthermore, we did not detected allodynia in the contralateral paw during 15

days of evaluation of the response threshold to mechanical stimulus of the rats that

received CFA or saline intralpantar injection (data not show).

3.4.2. Paw edema

The injection of CFA into the right hind paw of the rats produced an increase

of the ipsilateral paw volume when compared to the animals that received saline

intraplantar injection (Figura 6). The treatment of the rats with EPFCA3, MPFCA4 or

dipyrone was not able to decrease CFA-induced edema (Figura 6). The contralateral

paw of the animals did not present increase in volume (data not show).

3.4.5. Weight of body and some internal organs

The body weight was evaluated before CFA administration and from the

beginning the treatment with EPFCA3, MPFCA4, dipyrone or vehicle (Table 2). It was

observed that the animals presented reduction in the weight profit only in the 1 and 2

days of the experimental protocol (3-4 days after CFA). This effect was not observed

in the rats that received saline intraplantar injection.

Twenty four hours after the last injection of drugs, the animals were sacrificed

and liver, spleen, right kidney and stomach were removed and weighed. The

percentage of weight of the organs in relationship to body weight was calculated and

Anexo 2

121

is shown in Table 3. The treatment with EPFCA3, MPFCA4 or dipyrone did not

caused alteration in the organs weight when compared with vehicle treated animals.

The intraplantar CFA injection also did not modify this parameter (Table 3).

3.4.6. Gastric lesion assessment

Chronic administration of EPFCA3, MPFCA4 and dipyrone (100 µmol/kg daily

for 15 days) did not induce significant gastric lesion as shown in Table 4. On the

other hand, indomethacin (30 mg/kg/single dose), used as internal standard,

produced severe damages to stomach mucosa as demonstrate by elevated lesion

index (Table 4).

3.4.7. Haemogram

The haemogram only demonstrated alteration in the leukocyte levels for the

rats injected with intraplantar CFA and treated chronicaly with EPFCA3, MPFCA4 or

dipyrone (100 µmol/kg daily for 15 days) , but not vehicle. The number of

erythrocytes and platelets, the hemoglobin concentration and the hematocrit in the

blood samples of the animal that received CFA intraplantar had not been modified

(Table 5).

3.4.8. AST, ALT, urea and creatinine levels

AST, ALT, urea and creatinine levels were assayed in blood samples of the

animals injected with CFA intraplantar and chronically treated with EPFCA3,

MPFCA4, dipyrone or vehicle, 24 h after the last injection. The serum levels of the

hepatic injury indicators (AST and ALT) and renal injury indicators (urea and

creatinine) were not modified by chronic treatment with the new pyrazoles or

dypirone when compared with vehicle treated animals (Table 6).

3.4.9. Haptoglobin levels

Seric haptoglobin level was measured in blood samples of rats that received

chronic treatment with EPFCA3, MPFCA4 or dipyrone after CFA intraplantar

injection. These treatments did not reverse the increase haptoglobin level produced

by CFA (Figure 7)

Anexo 2

122

3.4.10. MPO, NAG and EPO activity

The MPO activity increased in the rat paw tissue after CFA intraplantar

administration when compared to animals that receive intraplantar saline (Table 7).

However, chronic administration of the novel pirazole derivatives EPFCA3 and

MPFCA4 or dipyrone did not modify the increase on MPO activity CFA-induced. On

the other hand, NAG and EPO activities were not modified by CFA injection (Table

7).

3.4.11. Tissue level of TNF-α in the rat paw

The CFA injection into rats paw produced an increase of TNF-α level when

compared to animal that received intraplantar injection of saline. This increase was

not reverted nor attenuated for daily administration, during 15 days, of EPFCA3 and

MPFCA4 or dipyrone (Figure 8).

4. Discussion

In the present study, we evaluated the antinociceptive and antiedematogenic

effect of the acute and chronic administration of two novel pyrazole derivatives,

EPFCA3 and MPFCA4, against mechanical allodynia and paw edema induced by

intraplantar injection of CFA. Additionally, some toxicity indicative parameters of the

drugs were also evaluated. Moreover, we include dipyrone as an internal standard, in

order to compare its effect with the effect of the new pyrazole derivatives.

As previously related (Chaplan et al., 1994, Wilson et al., 2006), CFA

intraplantar injection produced intense and long lasting mechanical allodynia and

edema of the injected paw (Figures 2, 3, 4, 5 and 6). The contralateral paw was not

affected, suggesting that inflammation was restricted to CFA injection site.

The acute systemic treatment with EPFCA3, MPFCA4 or dipyrone produced

antinociceptive effect in the animals that presented tactile allodynia. This effect

onsets rapidly (30 min after treatment) and had a long duration (until 12 h after

treatment) for both drugs (Figure 2). EPFCA3, MPFCA4 and dipyrone had differed in

relation to time necessary to reach its maximum antinociceptive effect. While

EPFCA3 reached its maximum effect 1 h after injection, MPFCA4 only reached

its maximum effect 4 h after treatment. The long duration of the antinociceptive

Anexo 2

123

effect is in agreement with the idea that the carbon-fluorine bond is stable, probably

resulting in metabolically stable compounds (Parck et al., 2001; Karthikeyan et al.,

2007). In fact, fluorine substitution makes the molecule much more resistant to direct

chemical attack by cytochrome P450 (Parck et al., 2001). However, future studies

must be carried out to elucidate the pharmacokinetics of these new pyrazolines. The

long duration of action of EPFCA3 and MPFCA4 compounds is an interesting

characteristic, because it allows give the drug in long intervals, an advantage

for clinical use.

It is important to point out that the pirazole EPFCA3 was capable to revert

completely the mechanical allodynia at dose of 1000 µmol/kg (Figure 4A),

while MPFCA4 and dipirona reduced only partially CFA-induced tactile

hypersensitivity (Figure 4B and 4C, respectively), suggesting that EPFCA3

presents better effectiveness than MPFCA4 and dipyrone.

The paw edema induced by CFA was not reverted by acute nor chronic

treatment with EPFCA3, MPFCA4 or dipyrone (Figures 3 and 6). Previous

relates demonstrate that dipyrone prevent edema development induced by

some agents as endotoxin (Fracasso et al., 1996), carrageenan (Brune et al.,

1983) and CFA (Weithmann et al., 1985; Tatsuo et al., 1994). However,

studies published demonstrating antiedematogenic effect of dipyrone in CFA

model differs from ours because they use different protocols of induction and

evaluation of the inflammation. Tatsuo et al. (1994) induced inflammation

using a subcutaneous injection of CFA in the dorsal root of the rat tail and

measured the paw edema at day 14 after induction. In this model occurs a

systemic reaction induced by CFA, which injected in the tail, produces

inflammation into the paw of the animal. In the present work, CFA was injected

into right hind paw and the inflammation was restricted to injection site

(ipsilateral paw), since no allodynia and edema in contralateral paw were

detected. Such differences in the site of CFA injection can produces different

degrees of inflammation and, thus, the drugs action can be different.

Weithmann et al. (1985) had used CFA from Mycobacterium butyricum and

the experiment was made in Lewis rats, differing from our work, here we used

Anexo 2

124

Mycobacterium tuberculosys and Wistar rats. In fact, as previously reported,

there are wide variations in the incidence and severity of the arthritis CFA-

induced depending on the rat and Mycobacterium strains used (Wong et al.,

2006; van Eden et al., 1994; Swingle et al., 1969; Banik et al., 2002).

Therefore, the lack of antiedematogenic action of dipyrone here described can be

related to experimental procedures adopted.

As related, EPFCA3 and MPFCA4 compounds had not produced

antiinflammatory effect, as demonstrated for its inefficacy in diminishing the paw

edema CFA-induced (Figures 3 and 6). This result is conflicting with previous

findings, which pointed a possible antiinflammatory action for EPFCA3 and

MPFCA4 pyrazole derivatives (Sauzem et al., 2007). In fact, we have

demonstrated antiedematogenic effect in mice after acute administration of EPFCA3

and MPFCA4 compounds, in carrageenan-induced paw edema test (Sauzem et al.,

2007). On the other hand, we now verify that nor acute administration (1000 µmol/kg)

nor chronic administration (100 µmol/kg/15 days) of EPFCA3 or MPFCA4 was

effective to abolish or reduce the paw inflammation. However, such discrepancies

can be related to different inflammation model and animal specie used in the

previous and actual work. Other possible explanation is the different

experimental design. That is, in the previous work, the compounds were

administered before carrageenan intraplantar injection, producing a preventive

effect against inflammation development. However, in the present study, the

compounds were administered after inflammation development, a more similar

protocol to the adopted in medical treatments, and have been unable for revert

the inflammatory process already installed.

After chronic administration, the pyrazole derivatives EPFCA3 and

MPFCA4, as well as dipyrone, presents effect against allodynia CFA-induced

(Figure 5). Moreover, EPFCA3 and MPFCA4 seems produces no tolerance, since

they had continued producing antinociceptive effect, after administration of

repeated doses (one daily dose for 15 days). In this experiment was observed

that after receive two doses of the drugs, the animals presented a significant

increase into threshold response to tactile stimulus (Figure 5A, 5B and 5C),

Anexo 2

125

suggesting some relief of inflammatory pain. However, a total reversion of the

allodynia was not reached. It is possible that higher doses and/or greater

number of daily doses can produce a better effect, but this needs to be proven

future.

We also evaluated some indicative parameters of evolution of the

arthritis induced by CFA and the effect of the treatment with EPFCA3, MPFCA4

and dipyrone on these parameters. Therefore, the haptoglobin levels, an acute

phase protein, whose level increases during inflammation, and that is a good

marker to follow the evolution of the disease (Giffen et al., 2003) were

measured. In fact, the CFA intraplantar injection caused a significant increase in

haptoglobin level, when blood samples were analyzed 17-18 days after induction of

paw inflammation. Therefore, the treatment of the animals with EPFCA3, MPFCA4 or

dipyrone, during 15 days, produced no decrease in haptoglobin levels, suggesting

that these compounds did not alter the course of the inflammation. This result is in

accordance with that finding in paw edema, where the novel pyrazole

derivatives and dipyrone were ineffective.

The signs and symptoms of inflammation include, beyond pain and

edema, the cell migration (Marchand et al., 2005). The types of immune cell

that contribute to inflammatory pain depend on the inflammatory condition, but,

in general, various cell types will be recruited and will contribute to abnormal

pain sensitivity, albeit to different degrees (Marchand et al., 2005). In this line,

the activities of MPO, NAG and EPO, in samples of paw tissue, were analyzed

as indicators of recruitment of neutrophils, macrophages and eosinophils for

injection site, respectively (Suzuki et al., 1983; Lloret et al., 1995; Kang et al.,

2008). Only MPO activity was increased 17-18 days after CFA injection,

suggesting accumulation of neutrophils into inflammated paw (Table 7). The

treatment during 15 days with EPFCA3, MPFCA4 and dipyrone did not reduce

the MPO activity, possibly because did not alter the recruitment of immune

cells for lesion site. However, is important to point out that, at moment, the

time course of immune cell recruitment are no described in the literature, for

paw inflammation induced by CFA. Levy et al. (2006) had shown that 28 days

Anexo 2

126

after induction of monoarthritis in knee joint by CFA injection, the number of

total leukocytes increased drastically, while the number of macrophages was

only modestly increased into inflammation site. If the immune cell infiltration in

CFA injected paw occur similarly to demonstrate for monoarthritis in knee joint,

is possible that our experimental design did not detect increase in macrophage

number or activity. Activated macrophages have been reported to contribute to

experimental pain states. They can release many inflammatory mediators,

include TNF-α, a pro-inflammatory cytokine (Marchand et al., 2005). In this

study, we verify that TNF-α level was increased in paw inflamed tissues from

rats that received CFA intraplantar injection (Figure 8). Moreover, the chronic

treatment of the animal with EPFCA3, MPFCA4 or dipyrone was ineffective for

reduce the TNF-α level. This data and the lack of effect of EPFCA3 and MPFCA4

pyrazoles on neutrophil infiltration, strengthens the idea that these drugs did

not posses antiinflammatory action.

The concentration of AST, ALT, urea and creatinine was analyzed in

order to identify possible hepatic and renal lesions after chronic treatment with

EPFCA3, MPFCA4 and dipyrone compounds. None of the treatments produced

any alteration in these parameters, suggesting that EPFCA3, MPFCA4 and

dipyrone are not toxic in rats, in the conditions where they had been tested.

Previous studies had shown that CFA intraplantar injection produces

decrease in weight profit of the animals throughout the time and poliarthritis

signals (Waltz et al., 1971; Franch et al., 1994; Yu at al., 2006). In the present

work, the body weight was measured daily throughout treatment and was no

detected significant increase or reduction on weight profit, nor signals of

poliarthritis development. It is possible that these discrepancies in relationship

to published data for other researchers are related to different experimental

designs, rats strain and adjuvant used.

The evaluation of some hematological parameters of the animals that

received chronic treatment was made to verify any possible alteration on

hematopoiesis. Amongst the evaluated parameters, we only find an increase

Anexo 2

127

in number of leukocytes of the animals that received CFA intraplantar and

chronic treatment with EPFCA3, MPFCA4 and dipyrone, when compared to

animals that received saline intraplantar (Table 5). In the animals that received

intraplantar saline injection and were injected subcutaneously with EPFCA3,

MPFCA4 and dipyrone, this increase in leukocytes number was not observed

(data not shown). So, leukocytosis seems only occur in the CFA-induced

inflammation presence, discarding the possibility of the drugs caused per se

effect on hematopoiesis. In this context, some works shows decrease in hematocrit

values and hemoglobin levels, producing aenemia, and pronounced increase in

leukocytes and lymphocytes number in rats injected with CFA (Mikolajew et al., 1969;

Walz et al., 1971). However, one more time, differences between experimental

protocols hinder an adjusted comparison with our results.

The side effects associated with the classical NSAIDs include gastrointestinal

bleeding, ulceration, perforation of the gastrointestinal mucosa, and relevant

percentage those experiencing such effects present death risk (Vane et al., 1998).

In this work, we demonstrate that chronic administration of EPFCA3 and MPFCA4, at

effective antinociceptive dose, did not causes lesion of stomach mucosa of rats

(Table 4), suggesting that possess good gastric tolerability.

In conclusion, the antinociceptive action of EPFCA3 and MPFCA4 against

inflammatory pain induced by CFA without cause adverse effects in rats, indicate that

these compounds might be interesting for development of new drugs for pain

management.

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Figure legends

Figure 1 –Chemical structure of EPFCA3 and MPFCA4 pyrazole derivatives.

Figure 2 – Effect of acute administration (1000 µmol/kg; s.c.) of the novel pyrazole

derivatives EPFCA3 (A), MPFCA4 (B) and dipyrone (C) on mechanical allodynia

CFA-induced in rats. BL represents the threshold of mechanical response of the

animals before CFA or saline intraplantar injection. The time 0 corresponds to

threshold immediately before subcutaneous treatment with the pyrazole compounds

(48-72 h after CFA or saline intraplantar). Data are reported as mean ± SEM; n= 9-

14. *p < 0.05 compared to CFA/vehicle (SNK test).

Figure 3 – Effect of acute administration (1000 µmol/kg; s.c.) of the novel pyrazole

derivatives EPFCA3 (A) and MPFCA4 (B) or dipyrone (C) on paw edema CFA-

induced in rats. BL corresponds to paw volume of the animals before CFA or saline

intraplantar injection. The time 0 corresponds to paw volume immediately before

subcutaneous treatment with the pyrazole compounds (48-72 h after CFA or saline

intraplantar). Data are reported as mean ± SEM; n= 7-11.

Figure 4 – Dose-response effect of acute administration of the pyrazole derivatives

EPFCA3 (A) and MPFCA4 (B) or dipyrone (C) on mechanical allodynia CFA-induced

in rats. Data are reported as mean ± SEM; n= 7-11. *p < 0.05 compared to

CFA/vehicle group (SNK test).

Anexo 2

132

Figure 5 – Effect of chronic administration (100 µmol/kg; s.c.; daily for 15 days) of

the pyrazole derivatives EPFCA3 (A and D) and MPFCA4 (B and E) or dipyrone (C

and F) on ipsilateral mechanical allodynia CFA-induced in rats. The figures A, B and

C show the thresholds before daily injection of the drugs and the figures D, E and F

show the responses 1 h after administration. BL represents the threshold of

mechanical response of the animals before CFA or saline intraplantar injection. Data

are reported as mean ± SEM; n= 7-9. *p < 0.05 compared to CFA/vehicle group

(SNK test).

Figure 6 – Effect of chronic administration (100 µmol/kg; s.c.; daily for 15 days) of

the pyrazole derivatives EPFCA3 (A and D) and MPFCA4 (B and E) or dipyrone (C

and F) on ipsilateral paw edema CFA-induced in rats. The figures A, B and C show

the paw volume before daily injection of the drugs and the figures D, E and F show

the paw volume 1 h after administration. BL represents the threshold of mechanical

response of the animals before CFA or saline intraplantar injection. Data are reported

as mean ± SEM; n= 5-6.

Figure 7 – Effect of chronic administration (100 µmol/kg; s.c.; daily for 15 days) of

the pyrazole derivatives EPFCA3 and MPFCA4 or dipyrone on TNF-α level in rat paw

tissue. Data are reported as mean ± SEM; n= 3-5. *p < 0.05 compared to

saline/vehicle group (SNK test).

Figure 8 – Effect of chronic administration (100 µmol/kg; s.c.; daily for 15 days) of

the pyrazole derivatives EPFCA3 and MPFCA4 or dipyrone on serum haptoglobin

Anexo 2

133

level of rats. Data are reported as mean ± SEM; n= 3-5. *p < 0.05 compared to

saline/vehicle group (SNK test).

Figure 1

EPFCA3

MPFCA4

Anexo 2

134

Figure 2

Anexo 2

135

Figure 3

Anexo 2

136

Figure 4

Anexo 2

137

Figure 5

Anexo 2

138

Figure 6

Anexo 2

139

Figure 7

Anexo 2

140

Figure 8

Anexo 2

141

Table 1 – Effect of the 5-trifluoromethyl-4,5-dihydro-1H-pyrazoles EPFCA3, MPFCA4

and dipyrone on spontaneous locomotor activity of rats.

Treatment Crossings

Vehicle 31.1 ± 3.8

EPFCA3 1000 µmol/kg 30.1 ± 8.8

MPFCA4 1000 µmol/kg 33.6 ± 6.0

Dipyrone 1000 µmol/kg 30.0 ± 5.1

Data are reported as mean ± SEM for n=8-16 animals per group.

Anexo 2

142

Table 2 – Effect of chronic administration of the new pyrazole derivatives EPFCA3,

MPFCA4 and dipyrone (100 µmol/kg) on the variation of the corporal weight in rats

with chronic inflammation CFA-induced.

Data are reported as mean ± SEM (% in relationship to initial weight, before CFA or

saline injection) for n=5-6 animals per group; * p < 0.05 compared with saline/vehicle

group.

Saline/

vehicle

CFA/

vehicle

CFA/

EPFCA3

CFA/

MPFCA4

CFA/

Dipyrone

Day 1

4.0 ± 0.9 -2.9 ± 0.9* -1.8 ± 1.2* -2.9 ± 0.9* -0.4 ± 0.9*

Day

7.6 ± 1.8 0.5 ± 1.1* 1.3 ± 1.2* 1.6 ± 1.1* 2.6 ± 1.2*

Day

7.0 ± 1.5 2.8 ± 1.2 1.3 ± 1.2 0.7 ± 1.7 4.1 ± 2.1

Day

9.2 ± 1.5 3.9 ± 1.7 3.6 ± 1.6 3.6 ± 1.5 5.3 ± 0.9

Day

11.1 ± 0.8 4.6 ± 2.9 5.9 ± 1.5 5.4 ± 1.7 6.7 ± 0.9

Day

13.0 ± 1.4 6.1 ± 3.3 7.7 ± 1.8 5.9 ± 3.2 8.3 ± 1.0

Dia 7

13.8 ± 2.0 6.8 ± 3.9 8.7 ± 1.6 9.2 ± 1.8 9.6 ± 0.9

Day

17.3 ± 2.1 9.5 ± 4.3 11.7 ± 1.7 12.1 ± 1.2 11.7 ± 1.1

Day

17.0 ± 2.1 10.2 ± 4.1 14.2 ± 1.8 12.6 ± 1.8 12.6 ± 1.5

Day

20.9 ± 2.9 13.6 ± 4.2 16.1 ± 1.8 15.9 ± 2.0 15.5 ± 2.2

Day

22.9 ± 2.5 14.5 ± 3.8 18.8 ± 2.6 17.0 ± 1.7 16.5 ± 1.6

Day

23.0 ± 3.1 15.2 ± 4.0 16.5 ± 2.4 17.8 ± 2.3 17.18 ± 2.2

Day

25.2 ± 2.8 16.4 ± 3.8 17.3 ± 2.7 18.5 ± 2.8 18.5 ± 2.0

Day

26.4 ± 3.0 18.0 ± 3.3 17.6 ± 3.0 19.0 ± 3.3 19.9 ± 2.0

Day15

28.7 ± 3.1 19.6 ± 3.4 17.9 ± 3.4 21.8 ± 3.6 20.2 ± 3.0

Anexo 2

143

Table 3 – Effect of chronic administration of the new pyrazole derivatives EPFCA3,

MPFCA4 or dipyrone on percentage of organs weight in relationship the body weight

of the rats.

Data are reported as mean ± SEM.

Table 4 – Effect of chronic administration of the new pyrazole derivatives EPFCA3,

MPFCA4 or dipyrone on gastric mucosa of rats.

Saline/ vehicle 0.75 ± 0.25 0

CFA/vehicle

0.71 ± 0.18

CFA/EPFCA3

1.00 ± 0.26

0.67 ± 0.67

CFA /MPFCA4

1.00 ± 0.36

CFA/ dipyrone

1.40 ± 0.25

0.40 ± 0.40

Saline

0.67 ± 0.33

Indomethacin

6.25 ± 0.83*

32.00 ± 7.82*

lesion index;

number of ulcers;

c, d

single dose

N is the number of animals for group; * p < 0.05 compared with saline group.

Saline/

vehicle

CFA/

vehicle

CFA/

EPFCA3

CFA/

MPFCA4

CFA/

dipyrone

Liver

3.8 ± 0.1 3.9 ± 0.1 4.0 ± 0.1 4.0 ± 0.3 4.1 ± 0.2

Spleen

0.3 ± 0.1 0.4 ± 0.1 0.4 ± 0.1 0.5 ± 0.1 0.5 ± 0.1

Kidney

0.4 ± 0.1 0.4 ± 0.1 0.4 ± 0.1 0.4 ±0.1 0.4 ± 0.1

Stomach

0.6 ± 0.1 0.6 ± 0.1 0.7 ± 0.1 0.7 ± 0.1 0.7 ± 0.1

Anexo 2

144

Table 5 – Effect of chronic administration of the new pyrazoles derivatives EPFCA3

and MPFCA4 or dipyrone (100 µmol/kg) on hematological parameters of rats

submitted to chronic inflammation induced by CFA intraplantar injection.

Saline/

vehicle

CFA/

vehicle

CFA/

EPFCA3

CFA /

MPFCA4

CFA/

dipyrone

Leukocytes

(x 10

/mm

)

8.2 ± 1.3 10.7 ± 0.9 16.2 ± 1.4* 15.3 ± 3.1* 14.3 ± 2.1*

Erythrocytes

(x 10

/mm

)

7.7 ± 0.2 7.4 ± 0.2 7.7 ± 0.4 7.4 ± 0.1 7.1 ± 0.4

Hemoglobin

(g/dl)

14.1 ± 0.1 13.1 ± 0.3 14.1 ± 0.8 13.6 ± 0.2 13.0 ± 0.4

Hematocrit

(%)

41.8 ± 0.7 39.3 ± 0.4 41.2 ± 2.1 40.4 ± 0.8 38.8 ± 1.6

Platelet

(x 10

/mm

)

863.0 ±

126.2

993.8 ±

121.1

1,050.7 ±

152.6

962.0 ±

118.8

1,051.3 ±

151.12

Lymphocytes

(%)

86.9 ± 3.9 74.4 ± 7.9 67.5 ± 8.4 72.5 ± 8.0 69.5 ± 7.8

Monocytes

(%)

2.2 ± 0.5 1.9 ± 0.3 2.3 ± 0.3 2.4 ± 0.3 2.0 ± 0.7

Data are reported as mean ± SEM for n=5-6 animals per group. * p < 0.05 compared

with saline/vehicle group.

Anexo 2

145

Table 6 – Effect of chronic administration of the new pyrazoles derivatives EPFCA3

and MPFCA4 or dipyrone (100 µmol/kg) on indicator parameters of injury hepatic and

renal in rats submitted to chronic inflammation induced by CFA intraplantar injection.

Data are reported as mean ± SEM for n=5-6 animals per group

Saline/

Vehicle

CFA/

Vehicle

CFA/

MPFCA4

CFA/

EPFCA3

CFA/

dipyrone

AST

(U/l)

154.0 ± 9.9 153.0 ± 9.4 175.2 11.4 180.7 ± 16.3 154.7 ± 7.9

ALT

(U/l)

57.2 ± 2.7 52.5 ± 4.1 57.5 ± 3.7 53.3 ± 3.7 53.2± 3.1

Urea

(mg/dl)

35.7 ± 3.1 36.7 ± 2.5 39.4± 1.7 38.3 ± 1.9 39.83 ± 1.7

Creatinine

(mg/dl)

0.36 ± 0.02 0.35 ± 0.02 0.40 ± 0.04 0.40 ± 0.04 0.38 ± 0.03

Anexo 2

146

Table 7 – Effect of chronic administration of the new pyrazoles derivatives EPFCA3

and MPFCA4 or dipyrone (100 µmol/kg) in the TNF-α tissue level of paw rat from

animals submitted to chronic inflammation induced by CFA intraplantar injection.

MPO

(absorbance/ mg protein)

NAG

(absorbance/ mg protein)

EPO

(absorbance/ mg protein)

Saline/vehicle 0.02 ± 0.03 0.14 ± 0.13 0.14 ± 0.10

CFA/vehicle 0.40 ± 0.21* 0.14 ± 0.08 0.42 ± 0.24

CFA/EPFCA3 0.61 ± 0.24* 0.16 ± 0.12 0.45 ± 0.17

CFA/MPFCA4 0.43 ± 0.13* 0.15 ± 0.08 0.51 ± 0.34

CFA/dipyrone 0.23 ± 0.05* 0.11 ± 0.04 0.32 ± 0.20

myeloperoxidase;

N-acetyl-β-D-glucosaminidase;

eosinophil peroxidase

Data are reported as mean ± SEM. * p < 0.05 compared with saline/vehicle group.

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