( PDF ) Avaliação da expressão das proteínas p16INK4a E FHIT no papiloma e carcinoma escamocelular da cavidade oral

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Universidade Federal do Rio de Janeiro

Instituto de Ciências Biomédicas

Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas – PCM

AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS p16

INK4a

E FHIT NO

PAPILOMA E CARCINOMA ESCAMOCELULAR DA CAVIDADE ORAL

Apresentado por:

Maria Clara Diniz de Oliveira

Rio de Janeiro

2008

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Universidade Federal do Rio de Janeiro

Centro de Ciências da Saúde

Instituto de Ciências Biomédicas

Maria Clara Diniz de Oliveira

“AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS p16

INK4a

E FHIT NO

PAPILOMA E CARCINOMA ESCAMOCELULAR DA CAVIDADE ORAL”

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Ciências Morfológicas do Instituto de Ciências Biomédicas da

Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte dos

requisitos para obtenção do Título de Mestre na área de

Ciências Morfológicas – Programa MINTER.

Orientadora: Profa. Cristina Maeda Takiya

Co-orientadora: Profa. Conceição Maria Passos de Queiroz

Rio de Janeiro

2008

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III

FICHA CATALOGRÁFICA

Oliveira, Maria C. D.

“Avaliação da expressão das proteínas p16

INK4a e

FHIT no papiloma e

carcinoma escamocelular da cavidade oral”.

Rio de Janeiro, UFRJ, ICB, 2008.

82 P.

Dissertação de Mestrado em Ciências Morfológicas

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Instituto de Ciências Biomédicas

1. P16

INKa

; 2. FHIT; 3. Carcinoma Escamocelular Oral; 4. Papiloma; 5. HPV

Banca Examinadora:

__________________________________ - Orientadora

Profa. Cristina Maeda Takiya (Instituto de Ciências Biomédicas - UFRJ)

__________________________________ - Co-orientadora

Profa. Conceição Maria Passos de Queiroz (Faculdade de Medicina - UFBA)

__________________________________ - Examinador

Prof. Dr.

Radovan Borojevic (Instituto de Ciências Biomédicas - UFRJ)

____ - Examinador

Prof. Dr. Marcos Farina (Instituto de Ciências Biomédicas - UFRJ)

___________________________________ - Examinadora

Profa. Dra. Luciana Ramalho (Faculdade de Odontologia - UFBA)

_______________ - Suplente e revisor

Profa.

Dra. Maria Eugenia Duarte (Instituto de Ciências Biomédicas- UFRJ)

__________________________________ - Suplente

Profa. Dra. Fabiana Paim (Instituto de Ciências da Saúde - UFBA)

AGRADECIMENTOS

A Deus

Por ter me concedido o dom da vida, da saúde e a força necessária que me permitiram

galgar mais um degrau na minha caminhada profissional.

Ao meu filho, Matheus

Agradeço por ter me proporcionado a maior alegria da minha vida: a inexplicável e

maravilhosa experiência de ser MÃE!! Lhe agradeço também, por me ter feito descobrir a

força necessária que me fez transformar as dificuldades em aprendizado. AMO VOCÊ!!

À Prof

Cristina Takiya

Agradeço pela confiança em ter me aceito como sua orientanda e assim tornar possível a

realização deste sonho! Obrigada pela orientação e pelos conhecimentos adquiridos.

À Prof

Conceição Queiroz

Pela incansável disponibilidade, esforço, incentivo e dedicação para a realização desta

dissertação. Sem a sua ajuda, o caminho pelo qual percorri durante a elaboração desse

trabalho, com certeza teria sido muito mais difícil! Que Deus lhe abençoe.

Aos meus pais

Pelo irrestrito apoio em todos os momentos da minha vida! Esta é mais uma realização

NOSSA. Amo vocês!!

Aos meus irmãos: Graça e Toni, sobrinhos: Xande e Celo, e familiares

Por fazerem parte da minha vida. Vocês são um presente de Deus para mim!

Aos meus amigos

Pelo apoio e compreensão durante o afastamento e ausência em momentos especiais

Ao Laboratório Silvany Studart e ao Prof. Eduardo Studart

Por colaborar com o desenvolvimento desta dissertação, cedendo as amostras, além da

enorme contribuição na leitura das lâminas de imuno-histoquímica.

Aos amigos e colegas desta etapa

Karina Serravalle, Leila Queiroz, Caroline Dieder, Esther Milena por dividirem comigo

momentos nesta rica caminhada.

A colega e amiga, Patrícia Neiva Lemos de Santana

Pela grande colaboração e incentivo para a conclusão deste trabalho.

A colega e amiga, Karina Serravalle

Pelo enorme esforço e dedicação para a realização do PCR

À Tatiana Cheto

Pela paciência e disponibilidade em transmitir conhecimentos acerca da técnica de Imuno-

histoquímica. Uma contribuição sem tamanho para a realização deste trabalho!

Aos Professores do Programa Minter

Pelos conhecimentos adquiridos

“De tudo ficaram três coisas: a certeza de que estava sempre

começando, a certeza de que é preciso continuar e a certeza de que

seria interrompido antes de terminar. Fazer da interrupção um caminho

novo, fazer de cada queda um passo de dança, do medo uma escada,

do sonho uma ponte, da procura um encontro”.

Fernando Pessoa.

VII

RESUMO

O carcinoma escamocelular da cavidade oral (CCEO) tem patogênese multifatorial e

diversos fatores etiológicos têm sido apontados. As proteínas supressoras de tumor,

FHIT (fragile histidine triad) e p16

ink4a

estao envolvidas com a carcinogênese de

diversos tumores malignos, dentre os quais o CCEO. Este estudo teve como objetivo

detectar a expressão da FHIT e p16

ink4a

no CCEO e no papiloma da cavidade oral,

avaliando a relação entre a expressão destas proteínas e os aspectos

histopatológicos. Foram selecionadas 60 biópsias da cavidade oral com os

diagnósticos de CCEO (n=32), papilomas (n=19) e mucosa oral macroscopicamente

sem alterações (n=9). De acordo com a intensidade da imuno-expressão de FHIT e

p16

ink4a

foram atribuídos os seguintes escores: 0-ausência, 1-fraco, 2-moderado e 3-

forte. Em relação a p16

ink4

, 37,5% das amostras foram positivas com intensidade

variável da imuno-marcação, sendo que 50,1% mostraram expressão forte. Em

relação a FHIT, houve imunoexpressão em 65,6% dos carcinomas, 89,5% dos

papilomas e 100% das amostras de tecido normal. Nossos resultados demonstraram

que a redução da expressão da FHIT e o aumento da expressão da p16

ink4a

nos

carcinomas podem estar envolvidos no desenvolvimento de CCEO.

Palavras-chave: P16

INKa

, FHIT, Carcinoma Escamocelular Oral, Papiloma, HPV

VIII

Abstract

Oral squamous cell carcinoma (OSCC) has a multifactorial pathogenesis, and

several etiological factors have been identified. The suppressing proteins of tumor,

like FHIT (fragile histidine triad) and p16ink4a, have been involved in carcinogenesis

of various malignant tumors, including OSCC. This study aimed to detect the

expression of FHIT and p16ink4a in the OSCC and in the oral cavity papilloma,

evaluating the relationship between the expression of these proteins and the

histopathological aspects. Sixty samples from oral biopsies diagnosed as OSCC

(n=32), papilloma (n=19) and normal oral mucosa (n=9) were investigated regarding

the expression of FHIT and p16

ink4a

proteins. The following scores were given

according to the intensity of the immunoexpression of both proteins: 0-absence, 1-

weak, 2-moderate and 3-intense. The expression of p16ink4 was positive in 37.5% of

the samples and in 50.1% the immunostaining was considered intense. The

expression of FHIT was detected in 65.6% of the oral carcinomas, 89.5% in the

papillomas and 100% of the normal tissue samples. Our results demonstrated that

the reduced expression of FHIT and the increased expression of p16ink4a in

carcinomas may be involved in the development of OSCC.

Keywords: P16INKa, FHIT, Oral Squamous Cell Carcinoma, papilloma, HPV.

LISTA DE ABREVIAÇÕES

G1 - gap 1

S - Síntese

G2 - gap 2

M - Mitose

CDK - quinase dependente de ciclina

CDKI - Inibidores de quinases dependentes de ciclina

D-CDK2 - Complexo ciclina – quinase dependente de ciclina 2

D-CDK4 - Complexo ciclina – quinase dependente de ciclina 4

D-CDK6 - Complexo ciclina – quinase dependente de ciclina 6

pRb - Proteína Retinoblastoma

UV - Ultravioleta

E2F - Fator de Transcrição

PCNA - Antígeno Celular de Células Proliferativas

CCEO - Carcinoma Escamocelular Oral

HPV - Papilomavírus Humano

PCR - Reação de Cadeia em Polimerase

DAB - Diaminobenzidina

PBS - Salina Tamponada com Fosfato

µm - micrômetros

IgG – imunoglobulina G

pH – potencial hidrogênionico

DNA – ácido desoxiribonucléico

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: As fases do ciclo celular – Adaptação: DIAS Cancer Research, v. 65, p.

2260 – 2268, 2005.

Figura 2: O ciclo celular e o processo de regulação, – Adaptação: DIAS Cancer

Research, v. 65, p. 2260 – 2268, 2005.

Figura 3: Aspecto clínico do carcinoma escamocelular em língua – BORAKS, p. 304,

1996

Figura 4: Aspecto histológico do carcinoma escamocelular oral – COTRAN, KUMAR

& COLLIBORAKS, 1996.

Figura 5: Aspecto clínico do papiloma em língua – BORAKS, p. 271, 1996.

Figura 6: O genoma do HPV-16 – Adaptado GUTIÉRREZ, E.I.C.; GARZA, C.H.L.

Revista Salud Publica y Nutricion, v. 2, n 2, 2001.

Figura 7: Imuno-histoquímica para p16

INK4a

de acordo com o diagnóstico

histopatológico.

Figura 8: Imuno-histoquímica para FHIT de acordo com o diagnóstico

histopatológico.

Figura 9: Imuno-histoquímica para p16

INK4a

de acordo com o grau de diferenciação

do carcinoma.

Figura 10: Imuno-histoquímica para FHIT de acordo com o grau de diferenciação do

carcinoma.

Figura 11: Teste de Kruskal-wallis – grau de diferenciação do carcinoma x para

p16

INK4a

e FHIT.

Figura 12: Caso 26 (A. fotomicrografia do epitélio normal visto na HE; B. Imuno-

histoquímica negativa para a p16

INK4a

; C. Imuno-histoquímica positiva para FHIT).

Figura 13: Caso 12 (A. Fotomicrografia de papiloma oral na HE; B. Imunoistoquímica

negativa para p16

INK4a

; C. Imunoistoquímica positiva para FHIT).

Figura 14: Caso 36 (A. Coloração pela HE de carcinoma escamocelular bem

diferenciado; B. Ausência de reatividade para p16

INK4a

; C. Imunoistoquímica FHIT

negativa).

Figura 15: Caso 10 (A. Carcinoma escamocelular pouco diferenciado. Células

epiteliais tumorais intensamente reativas para o p16

INK4a

; B. Ausência de reatividade

para FHIT nas células tumorais).

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Perfil das amostras selecionadas

Tabela 2. Freqüência da imunoexpressão das proteínas p16

INK4a

e FHIT de acordo

com o diagnóstico histopatológico.

Tabela 3. Freqüência da imunoexpressão das proteínas p16

INK4a

e FHIT de acordo

com o grau de diferenciação do carcinoma.

XII

SUMÁRIO

Resumo.......................................................................................................

Abstract…………………………………………………………………………..

Lista de Abreviações……………………….....………………………………..

Lista de Figuras………………………………………………………………….

Lista de Tabelas…………………………………………………………………

I – Introdução…………………………………………………………………….

II – Revisão da Literatura

2.1 O ciclo celular…………………………………………………………...

2.1.1 Proteínas regulatórias do ciclo celular e supressoras de tumor...

2.2 Carcinoma escamocelular oral………………………………………..

2.2.1 Epidemiologia…………………………………………………………

2.2 Etiologia………………………………………………………………….

2.2.3 Aspectos moleculares da carcinogênese oral…………………….

2.3 Papiloma bucal e HPV ………………………………………………..

III – Objetivos

3.1 Objetivo Geral…………………………………………………………..

3.2 Objetivos Específicos………………………………………………….

IV - Materiais e Métodos

4.1 Seleção das amostras………………………………………………….

4.2 Aspectos éticos…………………………………………………………

4.3 Imuno-histoquímica

4.3.1 Detecção das proteínas p16

INK4a

e FHIT………………………

4.3.2 Quantificação da expressão das proteínas p16

INK4a

e FHIT…

4.4 Análise estatística ……………………………………………………..

V – Resultados………………………………………………………………….

VI – Discussão…………………………………………………………………..

VII – Conclusões………………………………………………………………..

VIII – Referências bibliográficas

VII

VIII

I. INTRODUÇÃO

O câncer oral é um dos dez tumores malignos mais freqüentes,

correspondendo a 6,5% dos casos de câncer no mundo (HAFKAMP et al., 2003;

PARADISO et al., 2004). Noventa e cinco por cento dos casos de câncer oral é

representado pelo carcinoma de células escamosas (CCEO), que vem apresentando

nas últimas décadas aumento significativo em sua incidência, chegando a ser

considerada uma das mais altas do mundo (DEDIVITIS, 2004; CARVALHO, 2003;

NEVlLLE et al., 2004). No Brasil, o câncer de boca representa cerca de 3% dos

casos de neoplasias malignas, sendo o quinto e o sétimo tipo de câncer mais

comum, em homens e mulheres respectivamente (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006).

Estudos epidemiológicos relatam que a incidência do câncer de boca varia de

acordo com a idade, sexo, ocupação, raça e localização anatômica. As faixas etárias

mais atingidas pela doença são aquelas acima dos 50 anos, sendo o sexo masculino

o mais atingido. A proporção de casos entre homens e mulheres é de 3:1, no

entanto, a literatura relata que essa proporção entre os sexos deverá diminuir

consideravelmente com o passar do tempo, devido ao fato das mulheres terem

modificado seus hábitos e costumes, principalmente com relação ao uso do fumo e

álcool, principais fatores de risco para o desenvolvimento desta forma de câncer. Em

relação à exposição ocupacional, atividades que envolvem oportunidades de

consumo de álcool, como garçons e empregados de cervejarias, têm sido

associados a um maior risco de desenvolver esta neoplasia (BLOT et al., 1996).

Exposições à radiação solar em atividades ocupacionais de pesca e agricultura,

principalmente em pessoas de pele clara, têm sido relacionadas particularmente ao

câncer de lábio (JITOMIRSKI, 2000). No que concerne à raça os indivíduos brancos

são os mais afetados, representando cerca de noventa e dois por cento dos casos

de câncer de boca. Quanto à localização anatômica o lábio inferior, a borda lateral

da língua e assoalho bucal são os sítios mais freqüentemente acometidos

(TAVARES & NOMA, 1997; TOMMASI, 2002; ELIAS et al, 2002; NEVILLE, 2004).

Para que ocorra neoplasia maligna é necessário que aconteça uma série de

eventos acumulados durante anos, resultantes do desequilíbrio entre a proliferação

celular (ciclo celular) e morte celular programada (apoptose). Estes eventos são

regulados por múltiplos genes, que, quando sofrem mutações podem ter seus

produtos expressos de forma alterada, iniciando a formação do tumor. Na grande

maioria dos cânceres humanos observa-se que a perda do controle do ciclo celular é

essencial para que haja transformação maligna, ocorrendo mutações, deleções e/ou

alterações na expressão em pelo menos um dos quatro reguladores chaves do ciclo

celular: p16

INK4a

, ciclina D, CDK4 e Rb. A proteína p16

INK4a

exerce sua ação no ciclo

celular como proteína inibitória ao se ligar às proteínas das famílias CDK4 e CDK6

(quinases dependentes de ciclina), impedindo a associação destas com a ciclina D1.

A inibição do complexo ciclina D1/CDK4/6 impede a fosforilação da pRb,

interrompendo desta forma o ciclo celular (HUNTER, 1997; CONTRAN et al, 2005).

As chances de desenvolver câncer aumentam com a exposição a agentes

químicos, físicos e biológicos que provocam mutações e alterações epigenéticas no

DNA. Entre os agentes químicos envolvidos no carcinoma oral, o uso do tabaco em

todas as suas formas é o fator de risco principal para o desenvolvimento desta

neoplasia, particularmente quando associado ao álcool. Entre os agentes físicos,

estão a exposição aos raios ultra-violetas e raios X. Os fatores biológicos incluem

alguns fungos e vírus. Entre estes vírus, o papiloma vírus humano (HPV) tem sido

detectado com frequência crescente no epitélio oral, displásico e carcinomatoso, em

comparação com a mucosa oral normal (FRANCESCHI, 2000; MILLER, 2001;

KANSKY, 2003; VIDAL, 2004).

Alterações na expressão da proteína do ciclo celular p16

INK4a

está descrita em

muitos cânceres, incluindo melanoma, gliomas, retinoblastoma, osteossarcoma,

câncer da mama, pulmão, próstata e carcinoma do colo uterino (KLAES, 2002). A

superexpressão da p16

INK4a

, em lesões malignas da cérvice uterina estão

associados com HPV de alto risco, que através da inativação da pRb promovem a

superexpressão da p16

INK4a

(QUEIROZ et al, 2006).

Nos últimos anos, o gene FHIT tem sido muito estudado como um importante

gene supressor tumoral, envolvido com o crescimento, proliferação celular e

apoptose. Este gene foi identificado na região frágil comum indutível FRA3B no

cromossomo 3p14.2 e parece ser inativado por deleções nas linhagens celulares

derivadas do câncer, sendo associado à progressão tumoral e ao pior prognóstico

da doença. O gene FHIT codifica uma pequena proteína citoplasmática que tem uma

atividade de adenosina trifosfato hidrolase. Diversos trabalhos na literatura têm

demonstrado que a proteína FHIT, está ausente ou reduzida nos carcinomas

cervicais, de pulmão, mama, estômago, esôfago e rim, o que é compatível com sua

função supressora de tumores (OHTA et al, 1996; HAYASHI et al, 1997; SOZZI et al,

1997; KIM et al, 2004; D'AGOSTINI et al, 2006).

Alterações na expressão deste gene também têm sido estudadas em

linhagens celulares derivadas de cânceres da cabeça e pescoço, incluindo o

carcinoma escamocelular da cavidade oral (MAO et al, 1996; VIRGÍLIO et al, 1996).

Entre as diversas alterações genéticas encontradas nas lesões de carcinomas

escamocelulares orais, observa-se a perda de heterozigose do cromossomo 3, onde

se localiza o gene FHIT (MAESTRO et al, 1993; AH-SEE et al, 1994), e ausência ou

baixa expressão dessa proteína nestas lesões (KISIELEWSKI et al, 1998; VAN

HEERDEN et al, 1999; GUERIN et al, 2006). Estudos recentes têm sugerido que a

diminuição na expressão da FHIT correlaciona-se com o uso excessivo de cigarros

e/ou álcool em tumores de esôfago (MORI et al, 2000) e de pulmão (SOZZI et al,

1997; KIM et al, 2004; D'AGOSTINI et al, 2006).

O papiloma da cavidade oral é uma neoplasia epitelial benigna. Sua etiologia

está associada ao HPV não oncogênico, particularmente tipos 6 e 11, embora

subtipos oncogênicos, tal como o HPV-16, também possam estar a ela relacionados

(BORAKS, 1996; CONTRAN et al, 2005). São tumores benignos, que ocorrem

principalmente entre os 30 e 50 anos. Usualmente, afeta o palato mole, a língua, o

freio da língua e o lábio inferior, exibindo uma doença proliferativa, parece não ter

relação com o câncer (PIGNATARI et al, 1995). Clinicamente manifesta-se como

uma lesão nodular globosa, única ou múltipla, filiforme, pediculada, de coloração

avermelhada ou esbranquiçada, superfície opaca e textura áspera, com pequena

dimensão (BORAKS, 1996).

O objetivo do presente estudo foi avaliar a expressão das proteínas p16

INK4a

FHIT em lesões neoplásicas malignas e benignas da cavidade oral. Para tanto, se

analisou através da técnica de imuno-histoquímica, biópsias de mucosa oral normal,

papiloma e CCEO, visando contribuir para melhor compreensão do papel destas

proteínas nestas lesões, para que possam vir a ser utilizadas como marcadores

moleculares que auxiliem no diagnóstico desses tipos de tumores.

II. REVISÃO DA LITERATURA

2.1 O ciclo celular

O ciclo celular compreende uma seqüência de processos nucleares e

citoplasmáticos perfeitamente coordenados, sendo a maneira fundamental pela qual

todos os seres vivos são reproduzidos. As células eucarióticas realizam o seu ciclo

de divisão duplicando seu conteúdo e dividindo-se em duas células idênticas.

Durante esse processo o material genético precisa ser fielmente replicado e

segregado em duas células. O ciclo celular é composto de 4 estágios: G1, S, G2 e

M. Para que cada fase aconteça de forma organizada, os eventos são controlados

separadamente e regulados por diversos “pontos de checagem”, não avançando no

ciclo se a fase anterior não estiver completa. Na fase G1 (gap 1) há um aumento de

tamanho celular e a célula se prepara para a replicação do material genético. Após

essa fase, há uma primeira parada do ciclo (checkpoint R), quando é verificada a

integridade genômica. Durante este evento qualquer anormalidade da informação

genética que seja detectada, interrompe a progressão do ciclo até que o reparo seja

realizado. A replicação, propriamente dita, ocorre na fase S (síntese) e permite que a

célula duplique precisamente seus cromossomos. Após a replicação cromossômica

inicia-se a fase G2 (gap2), durante a qual a célula se prepara para a fase M (mitose),

quando a célula-mãe, aumentada, finalmente divide-se, para produzir duas células-

filhas, com igual número de cromossomos (ALBERTS et al, 2002) (Figura 1).

Figura 1: Fases do ciclo celular (DIAS, 2005).

Para que o processo de divisão ocorra, alguns eventos seqüenciados

necessitam ocorrer. O primeiro passo é a ligação de um fator de crescimento a um

receptor específico na membrana plasmática que, através de seus domínios

internos, ativa proteínas transdutoras de sinais presentes no citoplasma. A

transmissão de sinais pelas proteínas transdutoras até o núcleo ativam proteínas

regulatórias nucleares, dando início à progressão do ciclo celular. São conhecidas

aproximadamente 50 proteínas que atuam como fatores de crescimento, liberadas

por vários tipos celulares, de acordo com as necessidades do organismo. As células

que possuem o receptor específico para um determinado fator de crescimento serão

iniciadas no ciclo, enquanto as que não expressam este receptor em sua superfície

permanecerão inativas (ALBERTS et al, 2002; CONTRAN et al, 2005; ZAHA et al,

2005).

2.1.1 Proteínas Regulatórias do ciclo celular e Supressoras de Tumor

A progressão através do ciclo celular constitui-se em uma seqüência de

eventos dirigidos por um “sistema de controle”, composto por uma variedade de

proteínas que permitem o correto ordenamento dos processos essenciais da

reprodução celular, tais como eventos de reparo, duplicação e separação

cromossômica (Figura 2). Esse “sistema de controle” é baseado em uma família de

proteínas ativadoras especializadas denominadas de ciclinas que se ligam a uma

família de proteínas denominadas quinases dependentes de ciclina (CDKs),

controlando sua habilidade de fosforilar proteínas alvos específicas (ALBERTS et al,

2002). O complexo CDK/ciclina coordena os eventos do ciclo celular através da

fosforilação de proteínas, processo este que pode determinar a progressão do ciclo.

A proteína pRb, por exemplo, que no estado ativo se encontra hipofosforilada, pode

ser fosforilada pelo complexo CDK/ciclina permitido a progressão do ciclo. A

quantidade das ciclinas varia periodicamente durante o ciclo celular, sendo

sintetizadas somente em fases específicas do ciclo, de acordo com as necessidades

celulares, sendo degradadas após sua utilização (NICULESCU et al, 1998;

BRUGAROLAS et al, 1999; ALBERTS et al, 2002).

A progressão da fase G1 para fase S depende da atividade das ciclinas dos

tipos D e E. A ciclina D atinge o nível máximo de expressão e forma complexos com

as CDK4 ou CDK6 durante o meio da fase G1, enquanto a ciclina E é expressa e

associada com a CDK2 próximo à passagem de G1 para a fase S (SHINTANI et al,

2002; VICENTE et al, 2002). O complexo ciclina-CDK4/6 faz a fosforilação da

proteína do retinoblastoma (pRb), com subseqüente liberação do fator de transcrição

E2F que codifica diversos promotores que iniciam a replicação do DNA e conduzem

o ciclo celular para entrada na fase S (PANDE et al, 1998; LEE, 2001; KRESTY et al,

2002; MATSUMOTO et al, 2003; PIENTONG et al, 2003).

A regulação da formação do complexo CDK/ciclina é realizada por inibidores

de ciclinas dependentes de quinases (CDKIs), que através do bloqueio da atividade

das quinases, promovem a parada do ciclo celular. Existem duas sub-famílias de

CDKIs baseadas nas semelhanças de suas seqüências e no espectro de CDKs que

eles inibem. O primeiro grupo é constituído pelas proteínas p21, p27 e p57 e o

segundo grupo pelas p15, p16, p18 e p19 (PAPADIMITRAKOPOULOU et al, 1997).

As CKI da família p21, como as p21

wap1/cip1

, p27

kip1

, p57

kip2

são inespecíficas,

atuando sobre diversos tipos de complexos CDK/ciclina. Já as CKI da família INK4,

como as p16

ink4a

, p18

ink4c

, p19

ink4d

, são específicas sobre os complexos

CDK/ciclina dos tipos D-CDK4 e D-CDK6, que atuam em G1. Outras proteínas de

controle negativo do ciclo celular são as fosfatases, que atuam na fosforilação de

CDK e desfosforilação dos complexos CDKs/ciclinas, tornando-os inativos e as

proteínas do complexo ubiquitina, que degradam as ciclinas e outras proteínas e

assim, impedem a progressão do ciclo celular. A ação dessas proteínas repercute na

atividade de proteínas inibitórias do ciclo celular ou proteínas supressoras de tumor

(De ROBERTIS, 2001; ALBERTS et al, 2002; ZAHA et al, 2003; DIAS, 2005).

Muitas proteínas supressoras de tumor têm sido estudadas com relação a sua

importância na regulação do ciclo celular. A proteína p53 desempenha um papel

fundamental na manutenção da integridade genômica (ZHANG et al, 1993; SMITH et

al, 1995). Exercendo um papel muito importante no crescimento e proliferação das

células através de ações de controle do ciclo celular (WHYTE et al, 2002; BRENNA

& SYRJÄNEN, 2003). O gene TP53 é ativado em resposta a sinais de stress celular,

especialmente induzido por danos ao DNA (radiação UV, gama ou X, carcinógenos,

depleção de ribonucleotídeos), hipóxia e rompimento de adesão celular (PLUQUET

& HAINAUT, 2001). A ação da p53 promove a parada do ciclo celular na fase G1,

permitindo, desta forma o reparo do DNA danificado. Além disso, em casos nos

quais o reparo do DNA não é possível, a p53 induz a apoptose, através da

sinalização para proteínas indutoras de apoptose, como o bax, bcl-2 e c-myc,

resultando na eliminação de células com informações genéticas inapropriadas

(JUAN et al, 2000; CADWELL & ZAMBETTI, 2001).

Figura 2: O ciclo celular e o processo de regulação (DIAS, 2005).

Outra proteína supressora de tumor bastante estudada é a fosfoproteína

nuclear, denominada Proteína pRb ou p105Rb. No estado ativo, a pRb se encontra

hipofosforilada e atua como repressor da progressão das células da fase G1 para a

fase S do ciclo celular. No início da fase G1 ocorre a síntese da ciclina D, que se liga

as CDK4 e CDK6, formando dois complexos. Mais tardiamente, ocorre a síntese da

ciclina E, que se liga a CDK2. Estes três complexos irão atuar na fosforilação da

proteína pRb. Ao entrar na fase S a forma fosforilada da proteína se torna mais

abundante, o que persiste durante as fases S, G2 e M (ALBERTS et al, 2002; ZAHA

et al, 2005).

A pRb, na fase G1, encontra-se em quantidade elevada no núcleo das células

de mamíferos na forma ativa, estando ligada a uma série de proteínas regulatórias

que favorecem a progressão do ciclo, como o fator de transcrição E2F. Quando a

célula é estimulada a se dividir, a pRb é fosforilada pelos complexos CDKs/ciclina,

torna-se inativa e libera o fator E2F. A proteína de regulação gênica E2F é

responsável pela transcrição de vários genes cujos produtos são necessários para

que a célula progrida para a fase S. (ALBERTS et al, 2002; CONTRAN et al, 2005;

DIAS, 2005; ZAHA et al, 2005).

A E2F foi a primeira proteína celular identificada ligada à pRb. Existem 6

membros da família E2F como fator de transcrição, E2F-1 a E2F-6. As proteínas

E2F regulam a atividade de promotores contendo sítios de ligação E2F e controlam

diretamente a transcrição de genes envolvidos na replicação do DNA e no controle

de crescimento celular, incluindo os genes c-myc, b-myc, cdc-2, genes codificadores

das ciclinas A e E e de proteínas, como os da DNA polimerase, PCNA e

ribonucleotideo redutase (ALBERTS et al, 2002; CONTRAN et al, 2005; DIAS, 2005;

ZAHA et al, 2005).

Inibidores de CDK como a p16

Ink4a

também é considerada uma importante

proteína supressora de tumor. No ciclo celular normal esta proteína possui

capacidade bioquímica de ligação ao complexo ciclina D-CDK4/6, inibindo a

fosforilação da proteína pRb e retornando a formação do complexo pRb/E2F. Com

isso, temos a finalização dos processos do “ponto de checagem” G1-S do ciclo

celular, impedindo que a célula saia do estágio G1 (ALBERTS et al, 2002; VON

KNEBEL DOEBERITZ, 2002; Al et al., 2003; MATSUMOTO et al., 2003; ZAHA et al,

2005).

A proteína a p16

Ink4a

, produto do gene quinase dependente de ciclina nº2

(CDKN2), também conhecido como gene supressor tumoral múltiplo n°1 (MTS1),

localizado no cromossomo 9p21, possui lócus INK4a/ARF. Nos últimos anos a

literatura vem apresentando estudos envolvendo o cromossomo 9p21 e seu lócus,

demonstrando que é freqüente a ocorrência de anormalidades nos genes, assim

como alterações na expressão da proteína p16

INK4a

nas células de diversos tumores

humanos, tais como melanomas, gliomas, retinoblastomas, osteossarcomas,

leucemias, linfomas e carcinomas de mama, pulmão, próstata, cérvice uterina e da

cabeça e pescoço (CAIRNS et al, 1995; CHEN et al, 1999; SAITO et al, 1999;

KEATING et al, 2001; KLAES et al, 2002; MORTIER et al, 2002).

Visto que a p16

INK4a

inibe a proliferação celular somente nas células com pRb

funcional, alterações na pRb, cíclica D ou de CDKs devem predispor a célula a

apresentar uma progressão anormal do ciclo celular. Uma relação recíproca tem sido

vista entre expressão da p16

INK4a

com a pRb, sugerindo a presença de uma alça de

controle de retroalimentação (“feedback”) negativa que permite a pRb limitar a

concentração da p16

INK4a

(MURPHY et al, 2003).

A inativação desses genes deve interferir com a diferenciação terminal e levar

a uma proliferação irrestrita e processo tumoral. Desta forma, é esperado que a

ausência ou inativação da p16

INK4a

, na expressão gênica, estrutura ou função da

proteína, resulte em rompimento do controle do ciclo celular, com conseqüente

desenvolvimento do tumor, o que está associado com carcinogênese de tumores

que mostram deficiência da p16

INK4a

(PAPADIMITRAKOPOULOU et al, 1997;

MORTIER et al, 2002; WING YUEN et al, 2002; Al et al, 2003).

Nos últimos anos, o gene humano da tríade frágil da histidina (FHIT) tem sido

estudado como um importante gene supressor tumoral, envolvido com o

crescimento, proliferação celular e apoptose. Este gene foi identificado no

cromossomo 3 humano, particularmente na região 3p14.2, e contém um dos sítios

frágeis mais importantes do genoma humano, o FRA3B. A região 3p14.2 é, de fato,

considerada o local mais ativo e frágil do genoma humano, sendo muito suscetível à

deleções homozigóticas e perda de heterozigotia (SMEETS et al, 1986; OHTA et al,

1996; DRUCK et al, 1997). Os sítios frágeis subdividem-se em dois tipos: sítios

frágeis raros - encontrados em uma pequena proporção de indivíduos, menos de 5%

da população, herdados de forma mendeliana codominante, e sítios frágeis comuns

- importantes por constituírem “hotspots” para quebras cromossômicas e talvez sítios

de integração de DNA estranho, e que são encontrados em todos os indivíduos.

O sítio FRA3B, considerado um sítio frágil comum, é uma região alvo de

deleções homozigóticas em muitas linhagens de células humanas cancerosas.

Esses dados somam-se aos achados de experimentos nos quais o gene FHIT

parece ser inativado por deleções nas linhagens celulares derivadas do câncer,

sendo associado à progressão tumoral e ao prognóstico ruim da doença, pois a

perda deste gene parece estimular a síntese e proliferação de DNA (OHTA et al,

1996; HAYASHI et al, 1997; SOZZI et al, 1997). A prova da função supressora de

tumor do FHIT vem de observações realçadas pela suscetibilidade espontânea ao

desenvolvimento de tumores malignos em ratos knockout. Outros estudos

identificam o gene FHIT como supressor tumoral, devido ao fato do aumento de

expressão deste gene do tipo selvagem inibir o crescimento de células tumorais,

somado ao fato destes autores terem consiguido suprimir significantemente o

crescimento tumoral através da transfecção do gene FHIT para linhagens de células

tumorais que apresentavam deleção deste gene. Neste estudo constatou-se que a

re-expressão do gene FHIT nestas células levou à indução da apoptose, parada no

ciclo celular e supressão da atividade tumoral (JI et al, 1999). Todos esses achados,

compatíveis com função supressora de tumores, evidenciam o gene FHIT como um

importante gene supressor tumoral alvo de diversos estudos (NAWROZ et al, 1994;

KISIELEWSKI et al, 1998; VAN HEERDEN et al, 1999).

Diversos relatos da literatura têm demonstrado que a proteína FHIT se

expressa em baixos níveis na maioria dos tecidos adultos, porém está ausente ou

reduzida à níveis indetectáveis em alguns tumores sólidos tais como carcinomas

cervicais, de pulmão, mama, estômago, rim e de cabeça e pescoço (ISHWAD et al,

1996; DRUCK et al, 1997; GONZALEZ et al, 1998; KISIELEWSKI et al, 1998;

PARTRIDGE et al, 1999; GOTTE et al, 2000; PATEROMICHELAKIS et al, 2000;

SUNG et al, 2000; TANIMOTO et al, 2000; ISHII et al, 2001; LEE et al, 2001).

Estudos evidenciam que a proteína FHIT exerce atividade hidrolítica sobre a

diadenosina trifosfato (Ap3A) liberando moléculas de adenosina difosfato (ADP) e

adenosina monofosfato (AMP). No entanto esta atividade hidrolítica não é atribuída à

função supressora de tumores desta proteína (BARNES et al, 1996).

Estudos de cristalografia têm demostrado que ligar substratos nucleotídeos

com a proteína FHIT altera a superfície molecular desta proteína, e que talvez, seja

o complexo FHIT-substrato a forma ativa envolvida nas vias de sinalização e

progressão do ciclo celular (LIMA et al, 1997; BRENER et al, 1999). Além disso, tem

sido relatado que o estado normal do FHIT é um complexo FHIT-PPi, e que o nível

de diadenosina 5’,5’’’- P

polifosfato desloca o PPi, e que a formação deste novo

complexo sinaliza a morte celular (VARTANIAN, 1996). Conhecidos substratos do

FHIT são a Ap3A e Ap4A, e alterações nos níveis de Ap3A e Ap4A tem sido

associados à indução de apoptose em cultura de células humanas (VARTANIAN,

1997). Estudos recentes sugerem que o Ap4A seja o substrato mais estável

requerido pelo complexo FHIT para que este exerça a função de supressão tumoral,

enquanto o Ap3A seja o reflexo da atividade enzimática do FHIT (MURPHY et al,

2000).

Até o presente momento a literatura mostra que a perda da proteína FHIT é

muito importante na transformação maligna, pois leva à instabilidade genética,

através da perda do controle do ciclo celular, apoptose ou à falha nas vias de

sinalização (SIPRASHVILI et al, 1997; KISSELEV et al, 1999). Contudo, os

mecanismos através dos quais a proteína FHIT exerce suas atividades anti-tumorais

ainda permanece em grande parte desconhecida (OHTA et al, 1996; SIPRASHVILI

et al, 1997; PACE et al, 1998; SARD et al, 1999; CHANG et al, 2002).

Diferentemente de outras enfermidades, o câncer é resultante de um

processo de proliferação descontrolada de uma única linhagem celular, que escapou

do complexo sistema de controle regulatório do ciclo celular. As proteínas envolvidas

no controle do ciclo celular e as proteínas supressoras de tumor, tais como a p16

Ink4a

e FHIT, respectivamente, são extremamente importantes nos processos

carcinogênicos de diversos tumores malignos, icluindo o carcinoma escamocelular

da cavidade oral. Qualquer mutação em seus respectivos genes ou alterações

nessas proteínas pode resultar em um descontrole do processo de proliferação

celular, culminando no desenvolvimento de uma neoplasia maligna (LOEB & LOEB,

2000).

2.2 Carcinoma Escamocelular Oral

Entre as neoplasias malignas que afetam a cavidade bucal, o carcinoma

escamocelular é responsável por noventa e cinco por cento do total de casos. Os

outros cinco por cento são representados por melanomas, sarcomas e neoplasias

das glândulas salivares (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2002).

O carcinoma escamocelular oral, também denominado carcinoma

epidermóide ou carcinoma espinocelular, é uma neoplasia maligna epitelial que tem

a sua origem em células próximas a camada basal que, devido a agentes etiológicos

diversos, passaram a ter uma capacidade de expansão anormal e acabam por

substituir o epitélio normal (NAPGAL & DAS, 2003).

Clinicamente, o Carcinoma escamocelular apresenta nas fases iniciais

aspecto variado assemelhando-se a leucoplasia, eritroplasia ou eritroleucoplasia

(SOUSA et al, 2004). Com a evolução da doença, o carcinoma escamocelular pode

tornar-se uma lesão endofítica ou exofítica, dependendo do seu padrão de

crescimento, ambas possuindo um caráter infiltrativo, que resulta em uma lesão mal

delimitada, endurecida e de superfície granulosa (Figura 3) (TOMMASI, 2002). Os

sítios mais afetados são lábio, língua e assoalho da boca, podendo também afetar

trígono retro-molar, mucosa jugal, rebordo alveolar e palato duro. Essa patologia

pode levar à destruição do osso subjacente levando a uma radiotransparência com

margens indefinidas. Apesar dessas lesões se localizarem em áreas de fácil acesso

ao exame, a maioria delas possui diagnóstico tardio devido à ausência de dor

(NEVILLE et al, 2004).

Figura 3: Aspecto clínico do Carcinoma escamocelular em língua. (BORAKS, 1996).

Histopatologicamente, o carcinoma escamocelular é caracterizado por ilhas e

cordões invasivos de células epiteliais malignas que assemelham-se às células da

camada espinhosa. As células neoplásicas apresentam, em geral, citoplasma

abundante com núcleos grandes e um aumento da relação núcleo/citoplasma. Graus

variados de pleomorfismo celular e nuclear são também frequentemente observados

(Figura 4) (NEVILE et al, 2004).

Figura 4: Aspecto histológico do Carcinoma escamocelular oral. CONTRAN et al, 2005.

Inúmeros fatores influenciam o prognóstico da doença, no entanto, o

estadiamento clínico da lesão é o melhor indicador de prognóstico, sendo realizado

pelo sistema TNM, onde o T significa extensão da lesão primária, N linfonodos

envolvidos e M metástases a distância. Os vários aspectos de TNM são reunidos,

para que se determine o estágio apropriado (I, II, III e IV). Quanto maior a

classificação do estágio, pior o prognóstico, pois significa o envolvimento de

linfonodos e a constatação de metástases (NEVILLE et al, 2004; UICC, 2004).

O carcinoma escamocelular oral é muito heterogêneo nos sítios acometidos,

no comportamento biológico e na resposta ao tratamento. Na prática clínica o

planejamento do tratamento e o prognóstico desta forma de câncer são baseados

principalmente na classificação TNM, embora existam evidências crescentes que

esta forma de classificação, apesar de sua grande importância no que tange ao

planejamento terapêutico, é insuficiente para predizer o prognóstico dos pacientes

(JAYASURYA et al, 2005).

O tratamento do câncer de boca é preferencialmente cirúrgico, podendo ou

não ser complementado pela radioterapia, dependendo do local e extensão do tumor

primário e do status dos linfonodos cervicais. Desde que as lesões sejam

diagnosticadas o mais precocemente possível, o tratamento pode ser efetuado com

maior possibilidade de sucesso, alcançando-se, assim, um prognóstico favorável

(PARISE JR, 2000; NEVILLE et al, 2004).

No entanto, ainda se observa um número crescente de pacientes que chegam

aos serviços com a doença já em fase avançada; aproximadamente, 60% chegam

aos hospitais especializados com o câncer de boca nos estágios III e IV, cujo

tratamento torna-se mais difícil, causando nos casos de sobrevivência desfiguração,

disfunção e trauma psicológico, interferindo, dessa forma, na qualidade de vida do

indivíduo (KERDPON & SRIPLUNG, 2001).

2.2.1 Epidemiologia

De acordo com dados da OMS, as neoplasias malignas da boca ocupam a 8ª

posição entre as mais freqüentes no mundo, no entanto a sua incidência é

extremamente variável. Em alguns países da Ásia hábitos locais, como mascar

folhas de bétele e tabaco, fazem com que a taxa de incidência de câncer de boca

seja muito superior em relação a outras áreas do mundo. Na Índia, por exemplo, a

taxa de incidência de câncer de boca para cada cem mil habitantes é de 12,6 -

número superior à média mundial que varia entre 1 à 10 (WORLD HEALTH

REPORT, 2003).

No Brasil, o Instituto Nacional do Câncer (INCA) estimou que no ano de 2006

surgiriam 13.470 novos casos de neoplasias malignas de boca, sendo 10.060 no

sexo masculino e 3.410 no sexo feminino. Esses números colocam o câncer de boca

como o quinto tipo de câncer mais freqüente entre os homens e o sétimo entre as

mulheres (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006). Nos Estados Unidos, foram esperados

para o ano de 2005, 29.370 novos casos de câncer de boca, com 19.100 casos

entre os homens e 10.270 entre as mulheres (JEMAL et al, 2005).

A taxa de mortalidade para neoplasias malignas de boca, no período de 1979

a 1998 no Brasil, variou de 2,16 para 2,96 a cada 100.000 homens e de 0,48 para

0,70 a cada 100.000 mulheres, representando aumento dessas taxas em 37% e

46,8%, respectivamente para homens e mulheres. No ano de 2003 o INCA estimou

3245 óbitos por câncer de boca no país (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2002). Nos

Estados Unidos, foram estimados para o ano de 2005, 5190 mortes devido a

neoplasias malignas da boca, sendo 3420 entre os homens e 1770 entre as

mulheres (JEMAL et al, 2005).

Com relação à sobrevida, os pacientes em geral apresentam uma taxa de

cinco anos isentos de recidiva da doença em apenas 20 a 30% dos casos,

principalmente para os tumores de língua e assoalho de boca. Nas lesões labiais, a

taxa de cinco anos isentos de recidiva é em torno de 90% (CONTRAN et al, 2005).

Estudos epidemiológicos relatam que a incidência do câncer de boca varia de

acordo com a idade, sexo, raça e localização anatômica. As faixas etárias mais

atingidas pela doença são aquelas acima dos 50 anos, sendo o sexo masculino o

mais atingido. A proporção de casos entre homens e mulheres é de 3:1, no entanto,

a literatura relata que essa proporção entre os sexos deverá diminuir

consideravelmente com o passar do tempo, devido ao fato das mulheres terem

modificado seus hábitos e costumes, principalmente com relação ao uso do fumo e

álcool, principais fatores de risco para o desenvolvimento desta forma de câncer

(JITOMIRSKI, 2000). No que concerne à raça os indivíduos brancos são os mais

afetados, representando cerca de noventa e dois por cento dos casos de câncer de

boca. Quanto à localização anatômica o lábio inferior, a borda lateral da língua e

assoalho bucal são os sítios mais freqüentemente acometidos (TAVARES & NOMA,

1997; ELIAS et al, 2002; TOMMASI, 2002; NEVILLE, 2004).

2.2.2 Etiologia

A etiologia do Carcinoma escamocelular oral ainda não está completamente

estabelecida. Acredita-se que, assim como nas outras formas de câncer, exista uma

interação de diversos fatores etiológicos, genéticos e ambientais. Os fatores

etiológicos ambientais subdividem-se em agentes químicos, físicos e biológicos

(NEVILLE, 2004; SOUSA et al, 2004).

De acordo com TODD et al, (1997), as alterações cromossômicas mais

frequentemente relacionadas ao carcinoma oral de células escamosas são

encontradas nos cromossomos 1, 3, 9, 11, 13, 14, 15 e 18. CALIFANO, et al (1996)

propuseram a perda do braço curto do cromossomo 9, no epitélio caracterizado

morfologicamente como hiperplásico, como um evento inicial da carcinogênese. Os

mesmos autores relacionaram a perda do braço curto dos cromossomos 3 e 17 com

a transição do epitélio hiperplásico para displásico. Perdas adicionais dos braços

longos dos cromossomos 11, 13 e 14 foram detectadas no carcinoma in situ,

enquanto a perda do braço curto do cromossomo 6, de todo o cromossomo 8 e do

braço longo do cromossomo 4 promoveria a invasão da lesão maligna nos tecidos.

Ainda não se conhece o exato significado dessas alterações na carcinogênese

bucal, entretanto acredita-se que levariam à mutações de genes responsáveis pela

proliferação, crescimento e morte das células.

Em relação aos fatores ambientais, entre os agentes químicos, o tabaco

destaca-se como um dos principais fatores etiológicos, devido ao fato de possuir

entre as 2500 diferentes substâncias presentes em sua composição, 300

substâncias consideradas carcinógenos. Entre as quais se destacam as

nitrosaminas específicas do tabaco e os hidrocarbonetos policíclicos. Essas

substâncias quando metabolizadas dão origem a compostos hidrofílicos reativos

capazes de produzirem danos ao DNA das células (JOHNSON, 2001; DAS &

NAGPAL, 2002; KUPER et al, 2002).

A freqüente ingestão de bebidas alcoólicas também é um fator etiológico

importante, no entanto não existe um consenso sobre sua ação. Acredita-se que o

álcool leve a deficiências nutricionais e imunológicas que permitam que o organismo

seja mais suscetível à ação de carcinógenos, assim como aumente a

permeabilidade das células aos carcinógenos presentes, principalmente, no tabaco

(DAS & NAGPAL, 2002). Alguns estudos mostraram que o etanol é transformado em

acetaldeído por bactérias da flora bucal e essa substância é capaz de produzir

danos ao DNA das células (HOMANN et al, 1997).

O sinergismo entre tabaco e álcool aumenta em muito o risco de desenvolver

uma neoplasia maligna da boca. Alguns estudos mostram que a associação entre

essas duas substâncias aumenta em 50 vezes a chance de desenvolver câncer de

boca, enquanto o tabaco isolado é responsável por um aumento de 20 vezes, e o

álcool 5 vezes (HUNTER et al, 2005).

Em relação aos fatores biológicos, alguns fungos e vírus têm sido detectados

em associação com o câncer oral. Entre esses vírus, o papiloma vírus humano

(HPV) tem sido detectado com frequência crescente no epitélio oral carcinomatoso,

em comparação com a mucosa oral normal (MILLER, 1994; MILLER & WHITE,

1996; FRANCESCHI, 2000; ZUR HAUSEN, 2000; MILLER, 2001; KANSKY, 2003;

HERMANN et al, 2004; VIDAL, 2004). Entretanto, o papel deste vírus na

carcinogênese oral ainda é controverso, com alguns estudos demonstrando a

presença viral e sua correlação com a carcinogênese (MILLER & WHITE, 1996;

MCGLENNEN, 2000; SCULLY et al, 2000; MILLER & JOHNSTONE, 2001; TINOCO

et al, 2004; BOY et al, 2006), enquanto outros estudos não consideram sua

participação no câncer oral (MIGUEL et al, 1998; CHANG et al, 2002; PATRICK et

al, 2002). No entanto, a presença na mucosa oral dos subtipos anogenitais, HPV

6/11 e 16/18, podem significar transmissão oro genital, o que torna este vírus um

importante co-fator no desenvolvimento do câncer oral assim como é considerado no

carcinoma de cérvice uterino (SYRJANEN et al, 1987; PALEFSK et al, 1995;

WALBOOMERS, 1999; MILLER & JOHNSTONE, 2001).

2.2.3 Aspectos Moleculares da Carcinogênese Oral.

O câncer é considerado uma doença genética que resulta do acúmulo de

alterações sucessivas no DNA levando a formação de uma célula com capacidade

de proliferação e crescimento autônomos. O desenvolvimento do CCEO é um

evento de múltiplas etapas tanto em nível fenotípico quanto genotípico. Durante este

processo, há um rompimento dos padrões regulatórios normais que regem as

funções celulares básicas, como divisão, diferenciação e morte celular, resultando

em aumento do tempo de vida celular, imortalização e transformação tumoral

(JEFFRIES et al, 1999; DE ROBERTS, 2001; CONTRAN et al, 2005).

As alterações genéticas que levam a formação de neoplasias malignas

alteram ao menos quatro categorias de genes. A primeira delas é a dos proto-

oncogenes, cujos produtos são importantes para o crescimento celular fisiológico e a

sua expressão aumentada ou mutação podem levar ao crescimento celular

desordenado e oncogênese, sendo nesse caso chamados de oncogenes. Os genes

supressores de tumor estão relacionados ao controle da divisão celular e caso

detectem alguma alteração durante o processo, promovem a parada da divisão

celular. Uma outra categoria de genes que pode estar alterada é a dos reguladores

de apoptose. Eles são necessários para levar à morte celular quando algum erro

genético não foi reparado. A quarta categoria de genes que pode estar alterada é a

dos genes de reparo do DNA. A alteração nessa família de genes predispõe à novas

mutações afetando a proliferação e sobrevivência celular de forma indireta, pois

influencia a habilidade do organismo em reparar danos não letais ocorridos em

proto-oncogenes, genes supressores de tumor e genes reguladores de apoptose

(DAS & NAPGAL, 2002; CONTRAN et al, 2005).

No entanto, duas classes de genes estão diretamente associadas ao processo

de carcinogênese: os genes supressores de tumor e os oncogenes (DE ROBERTS,

2001). A inativação de genes supressores de tumor, através de mutações pontuais,

amplificações, rearranjos e deleções e a ativação de oncogenes por amplificação

estrutural, amplificação gênica, rearranjo cromossômico ou infecção viral, são

fenômenos biológicos fundamentais na transformação de uma célula normal em uma

célula neoplásica. Os oncogenes estão inativos ou são expressos em baixas

quantidades nas células normais, sendo denominados proto-oncogenes.

Entre os oncogenes associados ao desenvolvimento do carcinoma

escamocelular da cavidade oral os mais estudados são os bcl-2, CCND, ERBB2,

FGF3, HRAS e myc. (ZHANG et al, 1993; SMITH et al, 1995; SOUSA et al, 2004;

CONTRAN et al, 2005). Destacam-se, também, a atuação do EGFR que apresenta

seu RNAm aumentado em 69 vezes em 92% das neoplasias malignas e do TGF-a

que tem um aumento de 5 vezes em 87,5% em comparação com tecido normal de

pacientes que não possuem a neoplasia. Foi observado, que taxas elevadas desses

dois oncogenes estão relacionadas a uma redução do tempo livre de doença

(GRANDIS & TWEARDY, 1993; RUBIN GRANDIS et al, 1998). A amplificação dos

genes da família ras (K-ras, H-ras e N-ras) está associada a pacientes com CCEO

relacionados ao hábito de mascar folhas de tabaco. Os genes C-myc e N-myc

apresentam superexpressão em 20 a 40% dos casos (DAS & NAPGAL, 2002).

Em relação aos genes supressores de tumor que destacam-se nos estudos

das bases moleculares da carcinogênese da cavidade oral, o gene p16

(CDKN2a/INK4a), sobressai como um importante gene supressor de tumor, que

codifica a proteína a p16

INK4a

envolvida com a via de controle do ciclo celular

p16

INK4a

/ciclina-CDK4-6/pRb; sendo considerada um regulador negativo desta via.

Desde que foi descoberta em 1993, os estudos vêm demonstrando que a expressão

da proteína p16

INK4a

está frequentemente alterada em diversas neoplasias humanas,

incluindo os carcinomas epidermóides da cabeça e pescoço (HEICHMAN &

ROBERTS, 1994; DE PAULA et al, 2006).

Os trabalhos na literatura demonstram que anormalidades no gene p16

ocorrem por deleção (33%), metilação (20%) ou mutação (10%) (PANDE et al, 1998;

SHAHNAVAZ et al, 2001; TSAI et al, 2001). Nos carcinomas escamocelulares da

cabeça e pescoço, REED et al, (1996) demonstraram que a inativação do gene da

p16 está presente em quase 80% dos casos, sendo a deleção responsável por

quase 50% dos casos.

Tem-se estabelecido a idéia de que a perda de função da p16

INK4a

ocorre nas

etapas iniciais da carcinogênese (REZENIKOFF et al, 1996; GUAN et al, 1999), com

alguns estudos indicando que a perda da p16

INK4a

é a primeira anormalidade

genética detectável no carcinoma escamocelular oral (VAN DER RIET et al, 1994;

CALIFANO et al, 1996). Além dos tumores malignos, a inativação do gene p16

também tem sido freqüentemente reportada em lesões bucais pré-malignas,

reforçando o papel precoce desse gene no desenvolvimento do carcinoma

escamocelular da cabeça e pescoço (PANDE et al, 1998; KRESTY et al, 2002).

Estes resultados demonstram que essas lesões pré-malignas já possuem

aberrações genéticas comumente encontradas nos estágios finais do carcinoma

escamocelular oral, indicando a proteína p16

INK4a

como marcador de

acompanhamento preditivo do risco para desenvolvimento do câncer desses

pacientes (PAPADIMITRAKOPOULOU et al, 1997).

Em acordo com os resultados das análises genéticas nos carcinomas

escamocelulares da cabeça e pescoço, a expressão da proteína p16

INK4a

também se

mostrou anormal. A ausência da expressão da proteína pelo método da imuno-

histoquímica nesses tumores variou de 55% a 90%, com média de 74% nos estudos

avaliados (Al et al, 2003). Outros estudos na literatura também relatam ausência

e/ou acentuada perda de expressão desta proteína no carcinoma escamocelular oral

(REED et al, 1996; BOVA et al, 1999; GRUTTGEN et al, 2001; MORTIER et al,

2002; WING YUEN et al, 2002; LINGBAO et al, 2003). Uma análise imuno-

histoquímica, confirmado por Western Blot, da expressão de ciclinas, CDKs e CDKIs

da fase G1-S em mucosa normal, displasia epitelial e carcinoma escamocelular oral

foi realizado por SHINTANI et al, (2002). Neste estudo, a p16

INK4a

foi detectada em

todas as mucosas normais e nas displasias de grau leve. Nas displasias com grau

moderado a severo, a p16

INK4a

não foi detectada em 7% e 30% dos casos,

respectivamente, aumentando para quase 70% nos casos de carcinoma

escamocelular oral.

PANDE et al, (1998) analisaram por imuno-histoquímica as proteínas p16

INK4a

e pRb em amostras de carcinoma escamocelular da cabeça e pescoço, em lesões

pré-malignas e em amostras de tecidos bucais normais, procurando correlação com

o processo de tumoração bucal. Para a p16

INK4a

, a ausência foi observada em 63%

dos carcinomas epidermóides e 59% das lesões pré-malignas. Além disso, a

ausência na expressão da p16

INK4a

foi significativa quanto à correlação com

estadiamento tumoral mais avançado. Estes achados reforçam a idéia de que

anormalidades no gene da p16

INK4a

são eventos comuns no carcinoma

escamocelular oral, sendo que os índices dessas anormalidades aumentam de

forma progressiva do grau histológico bem diferenciado para o pouco diferenciado

(TSAI et al, 2001).

KRESTY et al, (2002) avaliaram alterações no lócus INK4/ARF pela técnica

da reação em cadeia da polimerase (PCR) em 28 amostras bucais com diagnóstico

de displasia epitelial bucal severa, para verificar a existência de correlação entre a

presença de anormalidades cromossômicas com o risco de transformação maligna.

Segundo os autores, perda de heterozigosidade no braço curto do cromossomo 9p é

o defeito mais comum relatado nos carcinomas escamocelulares de cabeça e

pescoço, e também em lesões pré-malignas, encontrando correlação positiva dessa

perda de heterozigosidade com a progressão histológica, desenvolvimento e

recorrência do câncer bucal. Neste estudo, perda de heterozigosidade foi a alteração

molecular mais freqüente (42,1%), significativa nas lesões do assoalho bucal.

Metilação no gene da p16 esteve presente em 57,7% dos casos, sendo que os

maiores índices ocorreram nos casos de língua e assoalho bucal. Deleção ou

mutação ocorreram em 15% e 7,7%, respectivamente. Estes resultados

demonstraram que essas lesões pré-malignas já possuem aberrações genéticas

comumente encontradas nos estágios finais de carcinoma escamocelular oral,

indicando a p16

INK4a

como marcador de acompanhamento preditivo do risco desses

pacientes.

CHEN et al, (1999) analisaram por imuno-histoquímica a expressão da

p16

INK4a

na cavidade bucal em 10 casos de hiperceratose, 30 lesões pré-malignas

(displasia leve, moderada e severa) e 15 carcinomas escamocelulares sendo a

marcação para p16

INK4a

positiva em 82% dos pacientes. De uma forma geral, houve

marcação positiva da p16

INK4a

com superexpressão progressiva, a partir dos casos

de tecidos normais, hiperceratóticos, displásicos até os carcinomas epidermóides

sem metástases. Os autores também identificaram maior expressão da p16

INK4a

nos

casos com estádio e grau avançado do tumor.

Com o objetivo de elucidar os padrões de expressão de diversas proteínas

associadas com o ciclo celular, SAITO et al, (1999) analisaram a p16

INK4a

em lesões

da cavidade bucal (10 mucosas normais, 23 displasias leves, 23 moderadas, 11

severas, 44 carcinomas escamocelulares) por imuno-histoquímica. O resultado para

p16

INK4a

foi progressivo a partir da mucosa normal (2,0%), displasia leve (2,65%),

displasia moderada (5,35%), displasia severa (5,09%) até carcinoma escamocelular

(11,3%). Os autores fizeram uma importante análise a respeito da superexpressão

da p16

INK4a

nos casos de carcinomas. Com base na revisão da literatura feita

afirmam que, etiologicamente, o HPV consiste em um importante fator de risco para

o carcinoma da cavidade oral, e associam os resultados encontrados com estudos

que demonstram a superexpressão da p16

INK4a

em lesões malignas da cérvice

uterina associadas com HPV de alto risco.

FREGONESI et al, (2003) pesquisaram a p16

INK4a

e suas correlações com o

HPV em lesões bucais abrangendo hiperplasias, papilomas, lesões pré-malignas e

carcinomas escamocelulares. Para os autores a presença focal da p16

INK4a

(>10 a

30% das células marcadas) ou difusas (>30%) era preferencialmente encontrada em

lesões pré-malignas e malignas, enquanto o padrão esporádico (5 a 10%) era

associado com lesões benignas. Observaram forte associação entre a

superexpressão da proteína p16

INK4a

com as lesões bucais que eram malignas ou

com alto potencial de malignização. Um dado interessante foi que a lesão de

hiperplasia bucal infectada com HPV 16/18 produziu um padrão difuso de marcação

da p16

INK4a

. Por outro lado, algumas lesões pré-malignas e malignas, negativas para

o HPV de alto risco, foram p16

INK4a

negativas ou tiveram marcações esporádicas.

Estes resultados indicariam uma íntima associação entre a infecção de HPV de alto

risco e os padrões imuno-histoquímicos da p16

INK4a

Outra proteína supressora de tumor também muito estudada na

carcinogênese do carcinoma escamocelular da cavidade oral é a FHIT. Estudos

recentes têm revelado que a perda de expressão do gene FHIT tem sido observado

em vários tipos de tumores malignos, inclusive no carcinoma escamocelular oral.

Estes achados sugerem que anormalidades no FHIT desempenham um importante

papel na carcinogênese (OTHA et al, 1996).

O método da imunohistoquímica parece ser o mais sensível na detecção das

alterações de expressão da proteína FHIT, quando comparado a outros métodos

(SOZZI et al, 1997; VAN HEERDEN et al, 2001). Análises por imunohistoquímica

demonstram que existe uma significante perda de expressão desta proteína em

pacientes com carcinoma escamocelular da cabeça e pescoço, nestes trabalhos a

perda de expressão do FHIT variou entre 17% a 68% (GOTTE et al, 2000; LEE et al,

2001).

Segundo MINETA et al, (2002), embora a baixa expressão da proteína FHIT

seja frequentemente encontrada no carcinoma escamocelular oral, indicando que

esta proteína exerce um papel importante no desenvolvimento desta neoplasia;

ainda permanece incerto se a expressão da FHIT está relacionada ou não com

características clínico-patológicas e prognóstico deste tipo de tumor. Em seus

experimentos foi encontrado alterações na expressão da proteína FHIT em 53% dos

casos de carcinoma escamocelular oral, confirmando a idéia de que esta proteína

exerce ação na carcinogênese do CCEO. Os autores identificaram que as células

tumorais que exibiam baixa expressão da FHIT apresentavam alta proliferação,

contribuindo desta forma para o comportamento tumoral agressivo. Os resultados

encontrados pelos autores mostraram que a expressão da proteína FHIT não está

relacionada com as características clínico-patológicas e prognóstico desse tipo de

tumor. Contudo, outros trabalhos na literatura associam a baixa expressão do FHIT

a um mau prognóstico (BURKE et al, 1998; TOMIZAWA et al, 1998; SEGAWA et al,

2000).

Em seus estudos KISIELEWSKI et al, (1998), relatam ter identificado em suas

amostras de carcinoma escamocelular oral 66% de ausência de expressão da

proteína FHIT, e concluem afirmando que as alterações na expressão da proteína

FHIT nas amostras de CCEO, em comparação com a expressão desta mesma

proteína em amostras de tecidos bucais normais, sugerem que as alterações do

gene FHIT desempenham atividade na carcinogênese oral.

VAN HEERDEN et al, (1999) encontraram ausência ou redução dos níveis de

expressão desta proteína em 41% das amostras de carcinoma escamocelular oral e

nas áreas de displasia adjacentes às lesões malignas, os autores com base em seus

achados sugerem que a inativação do FHIT deve ocorrer nas fases iniciais da

carcinogênese oral e concluem afirmando que anormalidades na expressão deste

gene exercem um importante papel na carcinogênese oral. Achados semelhantes

foram relatados por CHANG et al, (2002). Em consonância com as conclusões dos

trabalhos de VAN HEERDEN (1999) & CHANG (2002), TANIMOTO et al, (2000)

recomendam a análise da expressão do gene FHIT em biópsias da cavidade oral de

lesões pré-malignas, para que possamos identificar entre essas lesões, aquelas que

realmente possuem potencial para transformação maligna.

O estudo das proteínas p16

INK4a

e FHIT, seja na expressão das proteínas ou

nas anormalidades cromossômicas, vêm sendo indicados como mais uma

ferramenta a ser aplicada na pesquisa do processo carcinogênico em diversas

neoplasias humanas, especialmente nas lesões da cérvice uterina, nas quais têm

sido amplamente difundidas. Nas lesões da cavidade bucal, malignas e pré-

malignas, os estudos relatam diminuição progressiva nas expressões destas

proteínas do tecido normal, passando pelas displasias e para o carcinoma.

Atualmente, o diagnóstico das neoplasias malignas, que guiará as decisões

terapêuticas, é realizado com base na morfologia da lesão, no entanto, sabe-se que

tumores com características morfológicas semelhantes não apresentam,

necessariamente, o mesmo curso clínico e resposta terapêutica. Essas diferenças

encontradas levam a necessidade de uma nova classificação das neoplasias, com

base nas características moleculares da lesão, na tentativa de realizarmos um

diagnóstico mais preciso, melhorando o tratamento e prognóstico do paciente (KIM &

CALIFANO, 2004; CUPERLOVIC-CULF et al, 2005).

Para o câncer escamoso da cavidade oral ainda não existe um perfil

molecular definido, devido a sua complexa patogênese e às inúmeras alterações nos

diversos sistemas de controle celular necessários para que esta neoplasia maligna

se estabeleça (SCHLIEPHAKE, 2003).

2. 3 Papiloma bucal e HPV

O papiloma escamoso da cavidade oral é uma neoplasia epitelial benigna que

pode ocorrer em qualquer idade. Clinicamente manifesta-se como uma lesão

nodular globosa, única ou múltipla, filiforme, pediculada, de coloração avermelhada

ou esbranquiçada, quando queratinizada, superfície opaca e textura áspera, com

pequena dimensão (Figura 5). Os sítios mais comumente acometidos são o dorso da

língua, mucosa labial e palato duro. Histopatologicamente, o papiloma apresenta-se

como uma papilomatose, podendo ser definida como projeções epiteliais finas e

digitiformes sustentadas por eixos fibrovasculares centrais e recobertas por epitélio

escamoso estratificado ordenado e típico (SHAFER et al, 1987; REGEZI, 1993;

BORAKS, 1996; TOMMASI, 2002; CONTRAN et al, 2005).

Figura 5 - Aspecto clínico do papiloma em língua (BORAKS, 1996).

Sua etiologia pode estar associada a traumatismo crônico de baixa

intensidade, com alguns casos de origem virótica associada ao HPV, sendo os

subtipos 6 e 11 os mais frequentemente associados a essa forma benigna de

neoplasia, embora subtipos oncogênicos, tal como o HPV-16, também possam estar

a ela relacionados. Demonstrando, nesses casos, um risco potencialmente maligno

desta lesão. Principalmente quando a esse fator etiológico viral somam-se outros

fatores de risco para o câncer oral, já citados anteriormente (SYRJANEN et al, 1987;

BORAKS, 1996; TOMMASI, 2002; CONTRAN et al, 2005).

Devido à sua importância médica, o HPV tem sido extensivamente estudado,

estando associado a uma variedade de patologias, sendo capaz de causar lesões

em mucosas urogenitais e bucorespiratórias produzindo proliferações epiteliais

características no sítio de infecção. São espécies, e quase sempre tecido e sítio

específicos, sendo cada tipo associado a processos histopatológicos distintos

(DESAINTES et al, 1997; FONSECA & CARMO, 2000).

A associação entre lesões malignas e infecção pelo HPV no epitélio genital

masculino e feminino já é conhecida, sendo considerado como agente causal

inequívoco do câncer de colo uterino (SYRJANEN et al, 1987; XAVIER et al, 2005).

Na cavidade oral, esses vírus estão associados ao desenvolvimento de lesões como

a verruga vulgar, papiloma, condiloma acuminado e a hiperplasia epitelial focal e seu

interesse cresceu enormemente a partir do momento em que foram associados a

lesões malignas orais, especialmente ao carcinoma oral de células escamosas

(CHANG et al, 1991; REGEZI & SCIUBBA, 1991; MILLER & WHITE, 1996;

SNIJDERS et al, 1997; SHIMA et al, 2000; ZUR HAUSEN, 2000; SCULLY, 2001;

OLIVEIRA et al, 2003; CASTRO et al, 2004).

Os papilomas vírus (PV) são membros da família Papovaridae, que também

inclui o vírus polioma. São vírus pequenos não envelopados medindo 45-55 nm de

diâmetro e com genoma de aproximadamente 7200-8000 pares de base (pb).

Possuem capsídeo icosaédrico composto de 72 capsômeros, envolvendo DNA

genômico circular de fita dupla (PFISTER & FUCHS, 1994; BOUDA et al, 2000;

SCULLY, 2001; TERAI & TAKAGI, 2001; ROSENBLATT, 2005).

O genoma do Papilomavírus é constituído por dois segmentos principais,

sendo cada um constituído por uma série de regiões ou openning reading frame

(ORFs), que codificam as proteínas virais. Este genoma pode ser dividido em três

regiões; as regiões precoces “early” (E: E1 - E7), e tardias “later” (L: L1 e L2),

responsáveis pelos processos iniciais e finais de replicação, respectivamente, e a

região LCR (região longa de controle), que compreende 10% do seu genoma

(KIRNBAUER et al, 1993; ZUR HAUSEN, 1996; TERAI & TAKAGI, 2001).

As regiões E são expressas logo no início da infecção, sendo responsáveis

pelos mecanismos de regulação da síntese de DNA. Essas regiões E são

expressas em células infectadas, além de células transformadas. Já as regiões L

expressas nos estágios posteriores da infecção codificam as proteínas do capsídeo

viral. As proteínas L1 e L2 são utilizadas na adesão celular entre o vírus e as

diversas células teciduais (ZUR HAUSEN, 1996). A LCR, ou região não codante,

varia de tamanho entre os papilomavírus, sendo esta região responsável pelo

controle da expressão genética e processos como transcrição e replicação viral

(ZUR HAUSEN, 1996; ROSENBLATT, 2005) (Figura 6).

O HPV é um vírus que se multiplica exclusivamente no núcleo das células

infectadas (SARRUF & DIAS, 1997; TERAI et al, 2001). Os receptores pelos quais

os papilomavirus se ligam e penetram nas células ainda não foram completamente

identificados. Estudos recentes indicam que a expressão de integrinas, presentes na

superfície de células basais seriam candidatos a receptores do vírus do papiloma. O

genoma do HPV, nas células basais e parabasais se estabelece como epissoma,

replicando-se, como acontece nas lesões benignas e pré-invasivas em baixo padrão

(DOORBAR, 2005; ROSENBLATT et al, 2005) e apenas genes envolvidos nos

processos iniciais da infecção são transcritos, como o E5, E6 e E7. Multiplicação

extensiva do DNA viral e transcrição de todos os genes, bem como a formação do

capsídeo viral (L1 e L2) ocorre apenas nas camadas suprabasais. Partículas virais

maduras estão, portanto, ausentes nas células basais, e a replicação produtiva do

DNA está restrita às células do estrato espinhoso e granuloso (CHANG et al, 1991).

Figura 6: Genoma do HPV-16 (GUTIERREZ & GARZA, 2001).

As lesões causadas pelo HPV dependem do tipo do vírus, além da região da

camada epitelial em que ele permanece. Os HPV de baixo risco, geralmente

replicam-se apenas nas camadas inferiores do epitélio estratificado, enquanto os

ceratinócitos estão passando por divisão celular. Em contraste, os HPVs de alto

risco tem o seu genoma integrado ao DNA e se replicam nas camadas mais altas do

epitélio, quando os ceratinócitos entram completamente no processo de

diferenciação terminal. Desta forma, os tipos virais de alto risco podem estimular as

células a replicar o DNA em meios não-habituais em maiores proporções do que os

tipos de baixo risco (TOMAS et al, 1999; ROSENBLATT et al, 2005).

As proteínas E6 e E7 são as principais responsáveis pela transformação

celular mediada pelos HPVs de alto risco que atuam na modulação de atividades de

proteínas celulares que regulam o ciclo celular (SYRJÄNEN & SYRJÄNEN, 1999;

SOUTHERN & HERRINGTON, 2000; ROSENBLATT et al, 2005). O gene L1 regula

os níveis de expressão das proteínas virais E6 e E7, importantes na tumorigênese,

devido a interação e inativação das funções supressoras das proteínas p53 e pRb

(ZUR HAUSEN, 1996).

A propriedade de imortalização não se verifica nas infecções causadas pelo

HPV de baixo risco. Os genes E6 e E7 dos HPVs de alto risco são juntos

necessários e suficientes para imortalização de células epiteliais escamosas

primárias, enquanto que as E6 e E7 codificadas pelos HPVs de baixo risco estão ou

inativas ou fracamente ativadas na mesma amostra . Os genes E6 e E7 estão

invariavelmente expressos em lesões malignas cervicais HPV positivas (FRANCIS et

al, 2000).

Mais de 100 tipos de HPV já foram identificados, sendo na cavidade oral, 24

tipos (HPVs-1, 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 13, 16, 18, 30, 31, 32, 33, 35, 45, 52, 55, 57, 59,

69, 72 e 73) associados com lesões benignas e 12 tipos (HPVs-2, 3, 6, 11, 13, 16,

18, 31, 33, 35, 52 e 57) com lesões malignas. Entre esses subtipos os HPV-6 e

HPV-11 têm um baixo risco de associação com malignidade e são chamados de

benignos ou de baixo risco, enquanto outros tais como HPV-16 e HPV-18 são

fortemente associados com malignidade e são chamados de malignos ou

oncogênicos ou de alto risco, sendo comprovadamente carcinogênicos estando

associados à produção das oncoproteínas E6 e E7 produzidas pelos mesmos

(TERAI & BURK, 2001; TERAI & TAKAGI, 2001).

O E6 é um dos principais genes expressos na infecção pelo HPV e este

possui um papel importante na imortalização celular. A atividade transformadora da

oncoproteina E6 é dependente da sua ligação com a proteína supressora de tumor

p53. A E6 liga-se, seqüestra e degrada fisiologicamente a p53 por uma via

ubiquitina-dependente (CROOK & VOUSDEN, 1994; SUGERMAN & SHILLITOE,

1997). Esse fenômeno interfere de maneira relevante nos mecanismos de apoptose

e reparo de DNA (RAPP & CHEM, 1998). A formação do complexo E6-p53 é

fundamental para a inativação das funções supressoras da p53. Essa parece ser

uma atividade específica dos HPVs de alto risco, pois os HPVs de baixo risco

codificam E6 que não inativam a p53 pelo mesmo mecanismo (WERNESS et al,

1990).

Por outro lado a E7 se liga e seqüestra a pRb, induzindo a sua degradação,

fato observado devido à redução da meia-vida desta proteína em células

expressando HPVs de alto risco. A E7 ligada a pRb, preferencialmente na forma

ativa, facilita a liberação de E2F, promovendo, desta forma, a progressão do ciclo

celular, atuando nas fases G1 e S, o que pode eventualmente propiciar o

desenvolvimento do câncer (BOYER et al, 1996). A E7 dos HPVs de baixo risco

ligam-se a pRb com baixa afinidade, enquanto a E7 dos HPVs de alto risco ligam-se

com alta afinidade a pRb (LEE et al, 1998).

Os subtipos HPV oncogênicos 16, 18, 31 e 33 são os mais fortemente

associados ao carcinoma oral de células escamosas (KUI et al, 2003; SUGIYAMA et

al, 2003; SMITH et al, 2004; ZHANG et al, 2004). No papiloma, os subtipos não

oncogênicos 6 e 11 são os mais frequentemente envolvidos. Embora subtipos

oncogênicos, tais como HPV-16 HPV-18, também estejam associados a essa lesão,

porém em menor frequência (SYRJANEN et al, 1987; SARRUF & DIAS, 1997;

OLIVEIRA et al, 2003; CHEN et al, 2006).

Alguns tumores benignos induzidos pelo HPV apresentam regressão

espontânea, enquanto outros persistem ou sofrem transformação maligna. O mesmo

tipo de HPV pode determinar lesões benignas ou malignas, dependendo das

condições imunológicas (outras) do hospedeiro (JACYNTHO et al, 1994). Os

papilomas, apesar de serem considerados tumores benignos, e ter na maioria dos

casos um prognóstico bom, fazem parte das lesões com potencial de malignização,

principalmente nos casos de etiologia viral pelo HPV, sobretudo quando recidivados

ou quando ulcerados, independente do tamanho, volume, localização ou idade

(ZEGARELLI, 1982; LITTLE, 1988). PAZ (1997), identificou a presença do HPV-6,

considerado um subtipo de baixo risco para o desenvolvimento do câncer, em 50%

dos carcinomas de tonsilas e em 15% por cento dos carcinomas de língua. Portanto,

o potencial maligno de lesões benignas, nas quais é identificado a presença de

subtipos de HPV de baixo risco, deve ser considerado.

III. OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

- Avaliar a expressão das proteínas p16

INK4a

e FHIT no papiloma e no

carcinoma escamocelular da cavidade oral.

3.2 Objetivo Específico

- Avaliar a expressão das proteínas p16

INK4a

e FHIT no carcinoma oral de

células escamosas e a sua relação com o grau de diferenciação histológica.

IV. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Seleção das amostras

Foram selecionadas 60 biópsias em blocos parafinados dos arquivos do

laboratório de Anatomia Patológica e Citopatologia Silvany Studart do Hospital

Português (Salvador, Bahia, Brasil), obtidas entre janeiro de 2002 e dezembro de

2005. Trinta e dois casos com diagnóstico de carcinoma escamocelular, 19

papilomas e 9 amostras de tecido normal, foram utilizados para a realização da

técnica de imunoistoquímica. O diagnóstico histológico foi feito pela coloração

hematoxilina e eosina.

Dos casos de carcinoma escamocelular, 7 (21,9%) eram pouco diferenciados,

10 (31,3%) moderadamente diferenciados e 15 (46,8%) bem diferenciados (tabela

1).

Tabela 1. Características das amostras

Variáveis n = 60

Diagnóstico histopatológico

Epitélio normal 9 15

Papiloma 19 31,7

Carcinoma 32 53,3

Grau de diferenciação do Carcinoma

Pouco diferenciado 7 21,9

Moderadamente diferenciado 10 31,3

Bem diferenciado 15 46,8

n = número da população do estudo.

Refere-se apenas aos 32 pacientes diagnosticados com carcinoma.

4.2 Aspectos Éticos

Este estudo foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital

Português (registro n

19/07) tendo sido analisado e aprovado.

4.3 – Imuno-histoquímica

4.3.1 - Detecção das proteínas p16

INK4a

e FHIT

Cortes histológicos de tecido incluídos em parafina, com 5µm de espessura

foram desparafinizados em xilol e rehidratados em álcool (100 a 70%). Em seguida,

as amostras foram aquecidas em tampão citrato (90 – 95

C), pH 6.0 por 20 minutos.

A seguir foram incubadas em metanol contendo H

a 0.3% para inibir a atividade

da peroxidase endógena e incubadas overnight com anticorpo anti-FHIT (Dako,

S3022) diluído 1:250 e anticorpo anti-p16

INK4a

(MTM Laboratories, Clone E6H)

diluído 1:100 em diluente da DAKO (53022). Após lavagem em PBS, as lâminas

foram incubadas por 30 minutos em IgG mouse DP (DAKO Envision) e reveladas

com Diaminobenzidina (DAB). Foram utilizados como controle positivo da p16

INK4a

amostras de carcinoma escamocelular invasivo do colo uterino e da FHIT, epitélio

de amígdala normal.

4.3.2. Quantificação da expressão das proteínas p16

INK4a

e FHIT

O exame das lâminas de imunoistoquímica para as proteínas p16

INK4a

e FHIT

foi realizado separadamente por dois patologistas e quando havia discordância era

consultado um terceiro especialista. A reação foi considerada positiva para p16

INK4a

quando era observada coloração castanha no núcleo e do citoplasma e para FHIT a

coloração castanha no citoplasma. De acordo com a intensidade da imuno-

expressão foi atribuído os seguintes escores: 0 (ausência), 1 (reação fraca), 2

(reação moderada) e 3 (reação forte).

4.4 Análise Estatística

O teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis foi aplicado para verificar se os

diferentes diagnósticos histopatológicos diferem com relação à imunoexpressão das

proteínas p16

INK4a

e FHIT considerando-se como significativos valores de p<0.05.

Como o teste de Kruskal-Wallis apenas verifica se pelo menos um dos grupos

histológicos difere de algum outro e não aponta qual ou quais seriam estes grupos,

nas comparações com p<0.05 foi aplicado o procedimento de Holms para identificar

qual(is) par(es) de grupo(s) é(são) diferente(s).

V. RESULTADOS

Das 32 amostras de carcinoma escamocelular analisadas, 20 (62,5%) foram

negativas (escore=0) e 12 (37,5%) foram consideradas positivas; sendo que apenas

1 amostra (3,1%) apresentou reação fraca (escore=1), 5 (15,6%) apresentaram

reação moderada (escore=2), e 6 (18,8%) apresentaram reação forte (escore=3).

Nos papilomas escamosos, de um total de 19 amostras, 100% foram consideradas

negativas (escore=0). Entre as 9 amostras de tecido normal, em 8 (88,9%) não

houve imunoexpressão da p16

INK4a

(escore=0), com apenas 1 amostra (11,1%)

apresentando reação moderada (escore=2).

Em relação ao FHIT, das 32 amostras de carcinoma, 11 (34,4%) não

apresentaram imunoexpressão (escore=0), enquanto 21 amostras (65,6%)

apresentaram resultado positivo, sendo que 13 (40,6%) apresentaram reação fraca

(escore=1), 4 (12,5%) apresentaram reação moderada (escore=2) e outras 4

amostras (12,5%) apresentaram reação forte (escore=3). Nos papilomas, 2

amostras (10,5%) não apresentaram imunoexpressão (escore=0), enquanto 6

(31,6%) apresentaram reação fraca (escore=1), 10 (52,6%) reação moderada

(escore=2) e 1 amostra (5,3%) apresentou reação forte (escore=3). Entre as

amostras de tecido normal, 2 (22,2%) apresentaram reação fraca (escore=0), 1

(11,1%) apresentou reação moderada (escore=2) e 6 (66,7%) apresentaram reação

forte (escore=3) (Tabela 2 e figuras 7 e 8).

Tabela 2 – Imunoexpressão das proteínas p16INK4a e FHIT.

Diagnóstico histopatológico

Epitélio normal Papiloma Carcinoma

Total

Imunohistoquímica

n = 9 % n = 19 % n = 32 % n = 60 %

p16INK4a

Ausência 8 88,9 19 100,0 20 62,5 47 78,3

Fraco 0 --- 0 --- 1 3,1 1 1,7

Moderado 1 11,1 0 --- 5 15,6 6 10,0

Forte 0 --- 0 --- 6 18,8 6 10,0

FHIT

Ausência 0 --- 2 10,5 11 34,4 13 21,7

Fraco 2 22,2 6 31,6 13 40,6 21 35,0

Moderado 1 11,1 10 52,6 4 12,5 15 25,0

Forte 6 66,7 1 5,3 4 12,5 11 18,3

O grupo com carcinoma apresentou escores mais elevados para a expressão

de p16

INK4a

, seguido do epitélio normal e de papiloma. No que se refere à expressão

de FHIT, a mucosa normal apresentou escores mais elevados, seguida pelo

papiloma e carcinoma respectivamente.

88,9

10 0 , 0

62,5

0,0 0,0

3,1

11, 1

0,0

15 , 6

0,0 0,0

18 , 8

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

Epitélio normal Papiloma Carcinoma

Diagnóstico histopatológico

Percentagem (%)

Ausência

Fraco

Moderado

Forte

Figura 7. Imunohistoquímica para p16

INK4a

de acordo com o diagnóstico histopatológico.

0,0

10 , 5

34,4

22,1

31,6

40,6

11, 1

52,6

12 , 5

66,7

5,3

12 , 5

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

Epitélio normal Papiloma Carcinoma

Diagnóstico histopatológico

Percentagem (%)

Ausência

Fraco

Moderado

Forte

Figura 8. Imunohistoquímica para FHIT de acordo com o diagnóstico histopatológico.

De acordo com o teste de Kruskal-Wallis os resultados proporcionam

evidência, ao nível de 5% de significância, de que existe diferença entre os

pacientes no que refere ao diagnóstico histológico, quanto à imunohistoquímica para

p16

INK4a

(p = 0,0053) e FHIT (p = 0,0013).

Teste Kruskal-Wallis - Diagnóstico histopatológico x p16

INK4a

e FHIT

Ranks

9 27,06

19 24,00

32 35,33

9 46,67

19 33,32

32 24,28

Diagnóstico

Epitélio normal

Papiloma

Carcinoma

Total

Epitélio normal

Papiloma

Carcinoma

Total

p16INK4a

FHIT

N Mean Rank

Test Statistics

a,b

10,489 13,252

2 2

p16INK4a FHIT

Chi-Square

Asymp. Sig.

,0053 ,0013

Kruskal Wallis Test

Grouping Variable: Diagnóstico histopatológico

De acordo com o procedimento de Holms, no que se refere à

imunohistoquímica para o p16INK4a somente os grupos histológicos Papiloma e

Carcinoma apresentaram diferença. Quanto à imunohistoquímica para o FHIT, todos

os pares de grupos histológicos (normal e papiloma, normal e carcinoma, papiloma e

carcinoma) diferiram entre si.

De acordo com o grau de diferenciação do carcinoma e a imunoexpressão da

p16

INK4a

, das 32 amostras 7 eram pouco diferenciadas, sendo duas (28,6%)

negativas e 5 (71,4%) fortemente positivas para p16

INK4a

. Nenhum dos carcinomas

pouco diferenciados apresentou reação fraca ou moderada.

Das 10 amostras de lesões moderadamente diferenciadas, sete (70%) eram

negativas e 3 (30%) apresentaram reação moderadamente positiva para p16

INK4a

Nenhuma das lesões moderadamente diferenciadas apresentou reação fraca ou

forte.

Em relação aos carcinomas bem diferenciados, a expressão da proteína

p16

INK4a

foi negativa em onze amostras (73,3%), fracamente positiva em uma

amostra (6,7%), moderadamente positiva em duas amostras (13,3%) e fortemente

positiva em uma amostra (6,7%) (Tabela 3 e figura 5).

A relação entre a intensidade da imunoexpressão do FHIT e o grau de

diferenciação do tumor mostrou que as sete amostras de carcinoma pouco

diferenciado (28,6%) não expressaram a proteína, em uma amostra (14,2%) a

expressão foi fraca, em duas (28,6%) foi moderada e em duas amostras (28,6%) foi

forte.

Nos carcinomas moderadamente diferenciados, duas amostras (20%) não

expressaram FHIT, sete (70%) apresentaram reação moderada e em uma amostra

(10%) a reação foi forte. Nenhum dos carcinomas moderadamente diferenciados

apresentou reação moderada.

Entre os carcinomas bem diferenciados, sete (46,7%) não apresentaram

imunoexpressão de FHIT, cinco (33,3%) apresentaram reação fraca, em dois

(13,3%) a reação foi moderada e em um (6,7%) a reação foi forte (Tabela 3 e figuras

9 e 10).

Tabela 3- Imunoexpressão de p16

INK4a

e FHIT em relação ao grau de diferenciação do

carcinoma.

Grau de diferenciação do carcinoma

Pouco Moderadamente Bem

Total

Imunohistoquímica

n = 7 % n = 10 % n = 15 % n = 32 %

p16

INK4a

Ausência 2 28,6 7 70,0 11 73,3 20 62,5

Fraco 0 --- 0 --- 1 6,7 1 3,1

Moderado 0 --- 3 30,0 2 13,3 5 15,6

Forte 5 71,4 0 --- 1 6,7 6 18,8

FHIT

Ausência 2 28,6 2 20,0 7 46,7 11 34,4

Fraco 1 14,2 7 70,0 5 33,3 13 40,6

Moderado 2 28,6 0 --- 2 13,3 4 12,5

Forte 2 28,6 1 10,0 1 6,7 4 12,5

28,6

70,0

73,3

0,0 0,0

6,7

0,0

30,0

13 , 3

71,4

0,0

6,7

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

Pouco Moderadamente Bem

Grau de diferenciação do carcinoma

Percentagem (%)

Ausência

Fraco

Moderado

Forte

Figura 9. Imunohistoquímica para p16

INK4a

de acordo com o grau de diferenciação do carcinoma.

28,6

20,0

46,7

14 , 2

70,0

33,3

28,6

0,0

13 , 3

28,6

10 , 0

6,7

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

Pouco Moderadamente Bem

Grau de diferenciação do carcinoma

Percentagem (%)

Ausência

Fraco

Moderado

Forte

Figura 10. Imunohistoquímica para FHIT de acordo com o grau de diferenciação do carcinoma.

O teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis foi aplicado para verificar se os

pacientes que apresentaram diferenças no que se refere ao grau de diferenciação

do carcinoma diferiam com relação à imunohistoquímica para p16

INK4a

e FHIT.

De acordo com o teste de Kruskal-Wallis os resultados evidenciaram diferença

(p= 0,0199) entre os pacientes, no que refere ao grau de diferenciação do

carcinoma, quanto à imunohistoquímica para p16

INK4a

. As lesões pouco

diferenciadas apresentaram os maiores escores para a p16

INK4a

, seguido das lesões

moderadamente diferenciadas e bem diferenciadas (Figura 11).

O teste de Kruskal-Wallis não detectou diferença entre os três graus de

diferenciação do carcinoma no que se refere à imunohistoquímica para FHIT

(p=0,3056).

Figura 11. Teste de Kruskal-Wallis - Grau de diferenciação do Carcinoma x p16

INK4a

e FHIT

Ranks

7 24,07

10 14,55

15 14,27

7 20,57

10 16,85

15 14,37

Grau de diferenciação

Pouco diferenciado

Moderadamente

diferenciado

Bem diferenciado

Total

Pouco diferenciado

Moderadamente

diferenciado

Bem diferenciado

Total

p16INK4a

FHIT

N Mean Rank

Test Statistics

a,b

7,830 2,371

2 2

p16INK4a FHIT

Chi-Square

Asymp. Sig.

,0199 ,3056

Kruskal Wallis Test

Grouping Variable: Grau de

diferenciação do carcinoma

Visando identificar os pares de grau de diferenciação do carcinoma que

diferem entre si no que diz respeito à expressão do p16INK4a, utilizou-se o

procedimento não-paramétrico de Holms. Verificou-se através deste procedimento,

que os pares pouco e moderadamente diferenciados e também os pares pouco e

bem diferenciados diferiram quanto à expressão da p16INK4a.

Figura 12. Caso 26. A: Fotomicrografia do epitélio normal visto na HE. Aumento original: 10 X; B.

Imunoistoquímica para p16

INK4a

. Ausência de reatividade no epitélio normal. Aumento original: 20X; C.

Imunoistoquímica para FHIT – imunoreatividade epitelial. Aumento original: 20X.

Figura 13. Caso 12. A. Fotomicrografia de papiloma oral. HE. Aumento original: 4X; B.

Imunoistoquímica p16

INK4a

. Ausência de reatividiade no epitélio do papiloma. Aumento original: 20X;

C. Imunoistoquímica para FHIT. Leve reatividade das células epiteliais basais e suprabasais.

Aumento original: 4X.

Figura 14. Caso 36. A. Coloração pela HE de carcinoma escamocelular bem diferenciado. Ninhos

epitleiais contendo pérolas córneas. Aumento original: 40X; B. Ausência de reatividade para p16

INK4a

em ninhos de invasão. Imunoistoquímica. Aumento original: 40X; C. Imunoistoquímica FHIT negativa.

Aumento original: 40X.

Figura 15. Caso 10. A. Carcinoma escamocelular pouco diferenciado. Células epiteliais tumorais

intensamente reativas para o p16

INK4a

- imunoistoquímica. Aumento original: 40X; B. Ausência de

reatividade para FHIT nas células tumorais e córion, reatividade vista em glândulas (controle interno).

Aumento original: 4X.

VI. DISCUSSÃO

Avanços recentes na área da biologia celular e molecular têm elucidado

mecanismos do sistema de controle do ciclo celular, demonstrando que a

desregulação em algumas de suas vias são eventos comuns encontrados em

tumores de várias partes do organismo. Nos últimos anos, diversos marcadores

moleculares vêm sendo identificados e empregados na tentativa de avaliar melhor o

diagnóstico e prognóstico desses pacientes.

Neste estudo foi avaliada a expressão das proteínas p16

INK4a

e FHIT através

da técnica de imunoistoquímica em sessenta amostras de biópsias da cavidade oral,

visando avaliar a expressão destas proteínas em papilomas e carcinoma escamoso.

Sessenta e dois e meio por cento dos casos de carcinoma escamocelular oral

não apresentaram expressão da p16

INK4a

, o que está de acordo com outros estudos.

AI e colaboradores (2003) encontraram ausência da expressão da p16

INK4a

entre

55% a 90%. Nos casos de carcinoma em que houve expressão variada da p16

INK4a

(18,8% forte, 15,6% moderada e 3,1% fraca), possivelmente podem indicar que

nestas amostras a p16

INK4a

está livre (detectável), consequentemente não exercendo

sua função de supressão tumoral. Estes casos poderiam estar relacionados à

infecção pelo HPV, assim como ocorre nos casos de carcinoma escamocelular de

colo uterino de acordo com o estudo de CHEN e colaboradores (1999).

O HPV tem sido implicado na patogênese de vários tipos de tumores

malignos. FREGONESI e colaboradores (2003) pesquisaram a expressão da

p16

INK4a

e sua correlação com o HPV em lesões bucais, tais como hiperplasias,

papilomas, lesões pré-malignas e carcinomas escamocelulares. Para estes autores,

a presença focal da p16

INK4a

(>10 a 30% das células marcadas) ou difusa (>30%)

era preferencialmente encontrada em lesões pré-malignas e malignas, enquanto o

padrão esporádico (5 a 10%) era associado com lesões benignas. Um dado

interessante foi que a lesão de hiperplasia bucal infectada com HPV 16/18 produziu

um padrão difuso de marcação da p16

INK4a

. Estes resultados indicam associação

estreita entre a infecção por HPV de alto risco e expressão da p16

INK4a

. Estudos a

respeito da presença do DNA-HPV, em especial os de alto risco, no carcinoma

escamocelular oral fazem-se necessários para melhor estabelecimento se os

resultados da expressão da p16

INK4a

nestas lesões possam ser devido à inativação

da pRb pela oncoproteína E7 do HPV de alto risco.

Os resultados de diversos estudos na área de cabeça e pescoço são

discrepantes, revelando um complexo panorama para p16

INK4a

(PANDE et al, 1998;

CHEN et al, 1999; SAITO et al, 1999; KRESTY et al, 2002; MORTIER et al, 2002;

SHINTANI et al, 2002). PAPADIMITRAKOPOULOU e colaboradores (1997)

demonstraram expressão negativa da p16

INK4a

em maior quantidade em grupos de

lesões bucais com displasias epiteliais, comparadas com o grupo sem alteração

celular, o que indica que a proteína diminui a sua expressão conforme aumenta o

grau da displasia. MORTIER e colaboradores (2002) em seus estudos mostram

dados que indicam que a progressão maligna de lesões pré-neoplásicas requer

inativação da p16

INK4a

. Sendo assim, sugerem o estudo da expressão da p16

INK4a

para verificar o grau de inativação desta proteína nos protocolos de tratamento de

lesões com potencial de transformação maligna.

Em relação ao grau de diferenciação do carcinoma e a expressão da p16

INK4a

observou-se que os casos moderadamente e bem diferenciados foram negativos em

70% e 73,3% dos casos, respectivamente. Setenta e um vírgula quatro por cento

dos casos de carcinoma pouco diferenciados apresentaram forte expressão desta

proteína. CHEN e colaboradores (1999) identificaram maior expressão da p16

INK4a

nos casos em grau avançado do tumor.

Quanto aos papilomas, 100% apresentaram ausência de marcação para a

p16

INK4a

, significando que nesta patologia não há interferência no ciclo celular.

Este estudo mostra ausência de expressão da proteína FHIT em 34,4% dos

casos de carcinoma e expressão fraca em 40,6%, o que está de acordo com os

achados de VAN HEERDEN e colaboradores (1999), que em 32 casos de CCEO

demonstraram perda ou redução na expressão da FHIT em 66% dos casos. Em

relação à expressão da proteína FHIT nos casos de carcinoma, este estudo

encontrou resultados semelhantes aos relatados na literatura. Análises por

imunoistoquímica demonstram que existe uma significante perda de expressão

desta proteína em pacientes com carcinoma escamocelular da cabeça e pescoço,

variando entre 17% a 68% (KISIELEWSKI et al, 1998; VAN HEERDEN et al, 1999;

GOTTE et al, 2000; LEE et al, 2001; CHANG et al, 2002). Dentre os casos de

papiloma 89,5% expressaram FHIT e todas as amostras de tecido normal foram

positivas para este marcador.

Diversos trabalhos na literatura têm demonstrado que a proteína FHIT está

expressa em baixos níveis na maioria dos tecidos normais, porém está ausente ou

reduzida em níveis indetectáveis em alguns tumores sólidos, tais como os

carcinomas de cabeça e pescoço (GOTTE et al, 2000; LEE et al, 2001). Os autores

revelam que a perda desta proteína é importante na transformação maligna, pois

leva à instabilidade genética, através da perda do controle do ciclo celular, apoptose

ou à falha nas vias de sinalização (SIPRASHVILI et al, 1997; KISSELEV et al, 1999).

Contudo, os mecanismos através dos quais a proteína FHIT exerce seu papel ainda

permanece em grande parte desconhecida (OHTA et al, 1996; CHANG et al, 2002).

Um estudo recente em tumores de esôfago sugere que a diminuição na expressão

da FHIT correlaciona-se com o uso excessivo de cigarros e/ou álcool (MORI et al,

2000). No entanto, PARADISO e colaboradores (2004) não encontraram correlação

da FHIT com o uso de tabaco ou álcool. Esta divergência entre os dois estudos,

pode ser devido ao número limitado de casos no segundo trabalho.

MINETA e colaboradores (2002), relatam a perda da expressão da proteína

FHIT em 53% dos casos de carcinoma escamocelular oral, confirmando a hipótese

de que esta proteína exerce atividade carcinogênica no CCEO. Os resultados

encontrados pelos autores mostraram que a expressão da proteína FHIT não está

relacionada com as características clínico-patológicas e prognóstico desse tipo de

tumor. Contudo, outros trabalhos na literatura associam a baixa expressão da FHIT

a um prognóstico mais reservado (BURKE et al, 1998; TOMIZAWA et al, 1998;

SEGAWA et al, 2000).

Os resultados do estudo de KISIELEWSKI e colaboradores (1998) mostram

que 66% dos carcinomas de cabeça e pescoço não expressam a proteína FHIT.

Este estudo também investigou a expressão da proteína FHIT pela análise de

western blot e mostrou que todos os tumores expressam baixos níveis da FHIT.

Estes autores discutem o fato de que níveis baixos da proteína FHIT e sua detecção

por PCR podem indicar que a expressão desta proteína está realmente ausente,

sendo que a detecção da expressão corresponderia a células estromais infiltradas.

Em relação ao grau de diferenciação do carcinoma e a expressão da FHIT os

grupos pouco, moderadamente e bem diferenciados dos casos de carcinoma não

apresentaram diferenças estatisticamente significativas em relação à expressão da

proteína, o que está de acordo com os achados de VAN HEERDEN e colaboradores

(1999). Estes autores observaram coloração heterogênea com expressão fortemente

positiva em áreas de tumor bem diferenciado e fraca intensidade foi notada em

áreas pouco diferenciadas. Entretanto, não houve correlação estatisticamente

significativa entre a expressão da FHIT e diferenciação tumoral.

Em relação aos papilomas, apenas 10,5% apresentaram ausência de

imunoexpressão para a FHIT, e 31,6% apresentaram expressão fraca. TANIMOTO e

colaboradores (2000) recomendam a análise da expressão do gene FHIT em

biópsias da cavidade oral de lesões pré-malignas, para identificar entre essas

lesões, aquelas que realmente possuem potencial para transformação maligna.

Da mesma forma, em relação à FHIT, observa-se que alguns casos de

carcinoma foram negativos para este marcador, o que poderia estar relacionado com

o uso do tabaco. Entretanto, não se dispõe de dados epidemiológicos sobre o hábito

de fumar e/ou uso de álcool nestes casos.

Apesar de se observar alteração na expressão das proteínas p16

INK4a

e FHIT,

diferente do que acontece no carcinoma cervical, a via p16

INK4a

não parece ser

importante na carcinogênese oral. Em estudo futuro pretendemos avaliar, por meio

da técnica do PCR, a presença do DNA-HPV, em especial nas amostras com alta

positividade para p16

INK4a

VII. CONCLUSÕES

Os resultados deste estudo permitiram concluir que:

• A p16

INK4a

está expressa no carcinoma escamoso oral (CCEO), enquanto

que no papiloma esta proteína está ausente.

• A imunoexpressão de p16

INK4a

está correlacionada com o grau de

diferenciação do carcinoma escamoso.

• A proteína FHIT é expressa nas lesões orais benignas (papilomas) e

mucosa oral normal.

• A imunoexpressão da proteína FHIT não está correlacionada ao grau de

diferenciação do carcinoma.

VIII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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