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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
FABIANA LOPES DE PAULA
AVALIAÇÃO IN VIVO DE UM COMPÓSITO DE
HIDROXIAPATITA E ALGINATO NO REPARO ÓSSEO
Salvador
2008
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II
de Paula, Fabiana Lopes
Avaliação in vivo de um compósito de hidroxiapatita e alginato no reparo
ósseo. /Fabiana Lopes de Paula.
Salvador, 2008.
138 f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Marcos Farina de Souza.
Co-Orientador: Profa. Dra. Fabiana Paim Rosa.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Rio de
Janeiro / Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Odontologia,
2008.
1. Materiais biocompatíveis. 2. Calvária. 3. Biocompósitos
4. Hidroxiapatita. 5. Alginato. 6. Microesferas. I. Universidade Federal do
Rio de Janeiro. II.Universidade Federal da Bahia. Faculdade de
Odontologia III.Souza,
Marcos Farina. IV. Rosa, Fabiana Paim. V. Título.
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III
FABIANA LOPES DE PAULA
AVALIAÇÃO IN VIVO DE UM COMPÓSITO DE
HIDROXIAPATITA E ALGINATO NO REPARO ÓSSEO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Morfológicas, Área de
Concentração em Bioengenharia Tecidual, nível
Mestrado, Turma Fora de Sede, da Universidade
Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos
para a obtenção do Título de Mestre.
Orientador: Prof. Dr. Marcos Farina de Souza
Co-orientadora: Prof
a
. Dr
a
. Fabiana Paim Rosa
Salvador
2008
IV
TERMO DE APROVAÇÃO
V
Dedico este trabalho aos meus pais, Sérgio
Sérgio Sérgio
Sérgio
Augusto de Paula
Augusto de PaulaAugusto de Paula
Augusto de Paula e Sandra Maria Lopes de
Sandra Maria Lopes de Sandra Maria Lopes de
Sandra Maria Lopes de
Paula
PaulaPaula
Paula que sempre se dedicaram, com entusiasmo,
à minha formação moral e intelectual. Tantas
vezes abdicaram seus próprios sonhos para que os
meus se tornassem reais. Obrigada pelo incentivo
nesta nova trajetória. Esta conquista é nossa.
Amo vocês!
Amo vocês!Amo vocês!
Amo vocês!
VI
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais Sérgio Augusto de Paula e Sandra Maria Lopes de
Paula pelo amor, carinho e eterno incentivo na busca de meus ideais;
À minha irmã Cláudia e ao meu cunhado René pelo apoio e estímulo
proporcionado ao longo de minha vida e desta caminhada;
Ao meu noivo, Carlos Henrique, por estar sempre do meu lado com,
muito carinho, amor, dedicação, perseverança, paciência e compreensão em todos
os momentos de nossa caminhada. Obrigada pelo amor a mim dedicado;
Às minhas avós, Ruth e Ema por sempre incentivar e contribuir para
minha educação;
Ao Orientador Prof. Marcos Farina e Co-orientadora Prof
a.
Fabiana
Paim, pela acolhida, tornando possível a realização deste sonho e pelos
ensinamentos transmitidos durante esta trajetória;
Ao Prof. Vivaldo Moura Neto e Prof. Radovan Borojevic, pelo empenho
e dedicação na implementação do Mestrado em Ciências Morfológicas na cidade de
Salvador.
VII
Ao Dr. Aryon de Almeida Barbosa Júnior, pelo apoio e contribuição
científica no desenvolvimento deste estudo;
Ao amigo Fúlvio Borges Miguel, pela amizade, pelo incentivo à minha
formação profissional, pela agradável convivência e pela valiosa ajuda,
especialmente na elaboração deste trabalho, o que tornaram as dificuldades e os
obstáculos menos árduos. Valeu os momentos de alegria;
À amiga Isabela Barreto por ter sido uma grande amiga e irmã durante
todos os momentos desta caminhada. Nossa aprendizagem será eterna. Obrigada;
Ao amigo Victor Nunes pelo carinho e amizade, desenvolvidos ao longo
destes anos e pela valiosa acolhida em sua residência, nos momentos alegres e
delicados durante a realização deste estudo;
As amigas Edmália, Rhyna e Caty pela amizade, contribuição e troca de
experiências, especialmente na fase experimental e laboratorial deste estudo;
À Ritinha da Faculdade de Odontologia da UFBA, por não ter medido
esforços em nos ajudar no cuidado de nossos materiais;
Aos pesquisadores do Centro de Pesquisas Físicas (CBPF), em especial,
à Alexandre Rossi e Sílvia Rachel, pela atenção e por terem cedido as amostras
do biomaterial;
Aos membros do Laboratório de Biomoineralização (UFRJ) pela
experiência compartilhada durante minha estadia no Rio de Janeiro;
Aos funcionários da UFRJ, em especial, à Edna Aleixo dos Santos e à
Rosângela dos Santos Ramos, pelo amparo e prestatividade durante minha
estadia no Rio de Janeiro.
VIII
Ao Dr. Marcos Vannier, Adriana Rangel e Cláudio Figueira do
Laboratório de Microscopia Eletrônica, do Instituto Gonçalo Moniz (FIOCRUZ), pelo
apoio na realização da parte laboratorial deste estudo;
À Prof
a
.
Maria de Fátima Dias Costa, Pró-reitora de Pesquisa e Pós-
Graduação da UFBA (2003-2006), pelo carinhoso auxílio na execução deste estudo;
Ao Centro de Criação de Animais de Laboratório, da Faculdade de
Medicina Veterinária da UFBA, na pessoa de Profª. Maria das Graças Farias Pinto,
por ter cedido o espaço físico e à Maria do Socorro, pelos cuidados com os
animais;
Às técnicas, Cristina Mota e Cátia Magalhães, que auxiliaram na fase
laboratorial deste estudo;
A todos meus familiares por sempre terem acreditado em mim;
A todos os professores do PCM, pelo empenho em propagar valiosos
conhecimentos;
À FAPESB e CAPES, pela bolsa de estudos concedida;
Aos animais, para que os estudos pudessem ser realizados.
IX
“Não se pode ensinar coisa alguma a alguém,
“Não se pode ensinar coisa alguma a alguém,“Não se pode ensinar coisa alguma a alguém,
“Não se pode ensinar coisa alguma a alguém,
pode
podepode
pode-
--
-se apenas auxiliá
se apenas auxiliáse apenas auxiliá
se apenas auxiliá-
--
-lo a descobrir por si
lo a descobrir por si lo a descobrir por si
lo a descobrir por si
mesmo”
mesmo”mesmo”
mesmo”
Galileu Galilei
Galileu GalileiGalileu Galilei
Galileu Galilei
RESUMO
Este estudou objetivou analisar morfologicamente o potencial osteogênico de um
compósito de hidroxiapatita e alginato em defeitos ósseos com dimensões críticas
(diâmetro de aproximadamente 8,0 mm), confeccionados cirurgicamente em calvária
de rato. Os ratos (48 adultos machos), Rattus norvegicus Wistar, foram divididos
aleatoriamente em dois grupos: GI – controle (sem implantação do compósito) e GII
– grupo experimental (com implantação do compósito) e, analisados por microscopia
óptica nos pontos biológicos de 15, 45, 90 e 120 dias e por microscopia eletrônica de
transmissão analítica aos 120 dias após a implantação do biomaterial. Observou-se
que o biomaterial apresentou alta fragmentação desde os primeiros tempos
estudados, e que diversos fragmentos com dimensões variadas apresentaram-se
envoltos por osso neoformado. Através da microscopia eletrônica de transmissão,
verificou-se que nas áreas onde houve neoformação óssea em torno de fragmentos
do material, três regiões puderam ser identificadas: o biomaterial rico em
hidroxiapatita; uma região contígua contendo fósforo, mas não contendo cálcio;
região de ossificação inicial contendo fibrilas de colágeno e fosfato de cálcio com
razão cálcio/fósforo menor do que a região do biocompósito. A região rica em fósforo
e pobre em cálcio em torno do compósito é original na literatura sobre o assunto e
deve estar associada especificamente ao biomaterial utilizado, necessitando estudos
adicionais para o entendimento de sua natureza. Regiões de fibrose também foram
observadas nos tempos estudados. Em conclusão, o biomaterial estudado apresenta
alto potencial para aplicação clínica.
Palavras-chave: Engenharia tecidual; biomateriais; regeneração óssea, compósito
de hidroxiapatita/alginato.
XI
ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate morphologically the osteogenic capacity of a
composite of hydroxyapatite and alginate in bone defects with critical sizes (diameter
of circa 8,0 mm), surgically made in the calvaria region of rats. The rats (48 adult
males), Rattus norvegicus Wistar, were divided randomly into two groups: GI –
control (without composite implantation) and GII – experimental group (with
composite implantation) and analyzed by optical microscopy at the biological time
points 15, 45, 90 and 120 days, and by transmission electron microscopy 120 days
after the implantation of biomaterial. It was observed that the biomaterial presented a
high degree of fragmentation since the first experimental points studied, and that the
fragments were surrounded by new bone. These aeas were studied by analytical
transmission electron microscopy, using energy dispersive x-ray spectrometry. Three
regions could be distinguished: the biomaterial rich in hydroxyapatite; a contiguous
region containing phosphorus but without calcium; a region of initial ossification
containing mineralizing collagen fibrils with a calcium/phosphorus ratio smaller than
the region rich in the composite particles. The intermediate region (without calcium),
that just surrounds the composite has not been described in the literature yet, and
probably is associated specifically to the biocomposite used. More studies are
needed to understand its nature. Regions of fibrotic tissue were also observed in the
experimental points analyzed. In conclusion, the biomaterial presents a great
potential for application as bone grafts in the clinical area.
Key-words: Tissue engineering; biomaterials, bone regeneration, hydroxyapatite/
alginate composite.
XII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Diagrama esquemático da fibrila e molécula de colágeno 8
Figura 2. Diagrama esquemático da classificação dos biomateriais 11
Figura 3. Esquema das possíveis associações de fosfatos de cálcio com os
polímeros
16
Figura 4. Estrutura química do alginato 17
Figura 5. Adesão do íon cálcio à unidade G da cadeia polimérica 18
Figura 6. Vista macroscópica do compósito 23
Figura 7. Anti-sepsia do campo operatório com álcool iodado 24
Figura 8. Incisão bicoronal na área posterior da calvária 26
Figura 9. Elevação do periósteo 26
Figura 10. Exposição do tecido ósseo posterior à remoção da calvária 27
Figura 11. Confecção do defeito ósseo com fresa trefina 27
Figura 12. Demarcação do defeito ósseo 28
Figura 13. Defeito ósseo confeccionado na calvária 28
Figura 14. Implantação do compósito no interior do defeito ósseo 29
Figura 15. Sutura do retalho reposicionado 30
Figura 16A.
Esquema da redução das calvárias para microscopia óptica 32
Figura 16B.
Esquema de secção transversal anterior na calvária 32
Figura 17A.
Esquema do desbaste dos blocos 33
Figura 17B.
Esquema dos cortes histológicos por vista transversal 33
XIII
Figura 18A. Esquema da redução das calvárias para microscopia eletrônica 34
Figura 18B. Esquema da redução das calvárias para microscopia eletrônica 34
Figura 19. GI 15 dias: Na área central do defeito nota-se presença de vasos
sangüíneos (VS) e fibras colágenas (FC) – coloração: HE
38
Figura 20. GI 15 dias: Região próxima ao tecido ósseo remanescente (TOR) com
presença de vasos sangüíneos (VS) e fibras colágenas (FC) –
coloração: HE
38
Figura 21. GI 15 dias: Vasos sangüíneos (VS) e fibras colágenas (FC) em
proximidade ao tecido ósseo remanescente (TOR) – coloração:
picrossírus vermelho
39
Figura 22. GI 15 dias: Região próxima à borda óssea com presença de fibras
colágenas (FC) e vasos sangüíneos (VS) – coloração: tricômico de
Masson Goldner
39
Figura 23. GI 15 dias: Região de interface entre tecido ósseo remanescente (TOR)
e tecido mineralizado (TM) com presença de vasos sangüíneos (VS) –
coloração: azul de toluidina com fucsina básica
40
Figura 24A.
GI 15 dias: Região próxima ao tecido ósseo remanescente (TOR), onde
se observa a formação de tecido mineralizado (TM) – coloração: azul de
toulidina com fucsina básica
40
Figura 24B. GI 15 dias: Imagem obtida por microscopia de polarização, da mesma
região observada na figura 24A. Notar que a região de neoformação
óssea (área iluminada difusa) não apresenta organização das fibrilas de
colágeno como no tecido ósseo remanescente (área iluminada com
fibrilas em paralelo)
40
Figura 25. GII 15 dias: Imagem de bloco de resina epóxi na região de borda óssea,
onde se observa fragmentação irregular e deslocamento do biomaterial
(BM) próximo ao tecido ósseo remanescente (TOR) – coloração: azul de
Richardson
41
Figura 26. GII 15 dias: Região de borda óssea com presença de fragmentação
irregular do biomaterial (BM), próximo ao tecido ósseo remanescente
(TOR) – coloração: HE
42
Figura 27. GII 15 dias: Fragmentação irregular do biomaterial (BM) na região
central do defeito – coloração: HE
42
Figura 28. GII 15 dias: Imagem obtida próximo à borda óssea. Notam-se presença
de vasos sangüíneos (VS), macrófagos (M) e células gigantes
multinucleadas (CG) próximos as partículas fragmentadas do
biomaterial (BM) – coloração: tricômico de Masson Goldner
43
Figura 29. GII 15 dias: Área central do defeito onde se observa fragmentação
irregular do biomaterial (BM), vasos sangüíneos (VS) e células
inflamatórias, como células gigantes multinucleadas (CG) e macrófagos
(M) – coloração: tricômico de Masson Goldner
43
Figura 30. GII 15 dias: Proliferação das fibras colágenas (FC) a partir do tecido
ósseo remanescente (TOR), encontrado nas bordas ósseas, de permeio
às partículas do biomaterial (BM) – coloração: picrossírus vermelho
44
Figura 31. GII 15 dias: Área central do defeito com presença de septos de fibras
colágenas (FC) ao redor de partículas fragmentadas do biomaterial
(BM) –coloração: picrossírus vermelho
44
XIV
Figura 32. GII 15 dias: Neoformação de tecido mineralizado (TM) próximo ao
tecido ósseo remanescente (TOR), encontrado nas bordas do defeito –
coloração: tricômico de Masson Goldner
45
Figura 33. GII 15 dias: Região central do defeito ósseo onde se observa
neoformação de tecido mineralizado (TM) próximo à dura-máter –
coloração: tricômico de Masson Goldner
45
Figura 34. GI 45 dias: Presença de fibras colágenas (FC) e vasos sanguineos (VS)
em proximidade ao tecido ósseo remanescente (TOR) – coloração:
picrossírus vermelho
46
Figura 35. GI 45 dias: Área central do defeito com redução em espessura da área
cicatricial e presença de fibras colágenas (FC) – coloração: HE
47
Figura 36. GI 45 dias: Região de borda óssea com presença de vasos sangüíneos
(VS) e tecido mineralizado – coloração: tricômico de Masson Goldner
47
Figura 37A.
GI 45 dias: Formação de tecido ósseo reparativo (TO) em íntimo contato
com o tecido ósseo remanescente (TOR) – coloração: azul de toluidina
com fucsina básica
48
Figura 37B. GI 45 dias: Imagem obtida por microscopia de polarização, da mesma
região observada na figura 37A. Observar a formação de tecido ósseo
(área iluminada de forma irregular) em íntimo contato com o tecido
ósseo remanescente (área iluminada em feixes paralelos)
48
Figura 38. GII 45 dias: Região central do defeito, onde se pode observar a
fragmentação irregular do biomaterial (BM) – coloração: HE
49
Figura 39. GII 45 dias: Imagem onde se observa o biomaterial (BM) fragmentado,
próximo ao tecido ósseo remanescente (TOR) das bordas do defeito.
De permeio as partículas, pode-se notar a presença de tecido
mineralizado (TM) – coloração : HE
49
Figura 40. GII 45 dias: Área central do defeito com presença de células
inflamatórias, como macrófagos (M) e células gigantes multinucleadas
(CG) e partículas do biomaterial (BM) – coloração: tricômico de Masson
Goldner
50
Figura 41. GII 45 dias: Região próxima à borda óssea onde se pode encontrar
tecido mineralizado (TM) ao redor das partículas do biomaterial (BM),
com presença de macrófago (M) – coloração: tricômico de Masson
Goldner
50
Figura 42. GII 45 dias: Área central do defeito com formação de septos de fibras
colágenas (FC) de permeio ao biomaterial (BM) – coloração: picrossírus
vermelho
51
Figura 43. GII 45 dias: Proliferação de fibras colágenas (FC) nas proximidades do
tecido ósseo remanescente (TOR), encontrado nas bordas do defeito.
As mesmas aparecem circundando partículas do biomaterial (BM) –
coloração: picrossírus vermelho
51
Figura 44A.
GII 45 dias: Imagem de bloco de resina epóxi na região de borda óssea,
onde se observa tecido ósseo remanescente (TOR) e formação de
tecido mineralizado (TM) de permeio as partículas do biomaterial (BM) –
coloração: azul de Richardson
52
Figura 44B.
GII 45 dias: Imagem obtida por microscopia de polarização, da mesma
região observada na figura 44A. Notar que na região central da imagem
aparece neoformação óssea em torno de cada partícula (áreas
iluminadas na figura), o que mostra grande potencial osteogênico do
biomaterial, especialmente quando fragmentado
52
XV
Figura 45. GI 90 dias: Região próxima ao tecido ósseo remanescente (TOR) com
presença de vasos sangüíneos (VS) e fibras colágenas (FC) –
coloração: picrossírus vermelho
53
Figura 46. GI 90 dias: Presença de vasos sangüíneos (VS) e fibras colágenas (FC)
na região central do defeito – coloração: picrossírus vermelho
53
Figura 47. GI 90 dias: Presença de fibras colágenas (FC) em proximidade ao
tecido ósseo remanescente (TOR) – coloração: HE
54
Figura 48. GI 90 dias: Região de proximidade ao tecido ósseo remanescente
(TOR) com presença de vasos sangüíneos (VS) e fibras colágenas (FC)
– coloração: tricômico de Masson Goldner
54
Figura 49A.
GI 90 dias: Formação de tecido ósseo reparativo (TO) na borda óssea
do defeito (TOR - tecido ósseo remanescente) – coloração: azul de
toluidina com fucsina básica
55
Figura 49B.
GI 90 dias: Imagem obtida por microscopia por microscopia de
polarização, da mesma região observada na figura 49A. Observar
formação óssea em contato com o tecido ósseo remanescente (áreas
iluminadas na figura).
55
Figura 50. GII 90 dias: Área central do defeito, onde se observa tecido
mineralizado (TM) ao redor das partículas fragmentadas do biomaterial
(BM) – coloração: HE
56
Figura 51. GII 90 dias: Região próxima à borda óssea onde se observa tecido
ósseo remanescente (TOR) e tecido mineralizado (TM) de permeio as
partículas do biomaterial (BM) – coloração: HE
56
Figura 52. GII 90 dias: Área central do defeito. De permeio ao biomaterial (BM)
fragmentado, nota-se células gigantes multinucleadas (CG) e tecido
mineralizado (TM) – coloração: tricômico de Masson Goldner
57
Figura 53. GII 90 dias: Região próxima ao tecido ósseo remanescente (TOR) nas
bordas do defeito, onde se observa ao redor do biomaterial (BM)
fragmentado, células gigantes multinucleadas (CG), macrófagos (M) e
tecido mineralizado (TM) – coloração: tricômico de Masson Goldner
57
Figura 54. GII 90 dias: Imagem de bloco de resina epóxi onde está incluída a
região do defeito crítico produzido na calvária, observado em lupa com
baixo aumento. Observam-se duas esferas (BM - biomaterial),
parcialmente fragmentadas, com presença de ramificações de vasos
sangüíneos (VS) nas suas direções
58
Figura 55. GII 90 dias: Imagem de bloco de resina epóxi onde se observa
neoformação de tecido ósseo (TO) e vasos sangüíneos (VS) ao redor
do biomaterial (BM) fragmentado – Material pós fixado com tetróxido de
ósmio, sem coloração adicional
58
Figura 56. GII 90 dias: Pode-se observar na área central do defeito septos de
fibras colágenas (FC) e tecido mineralizado (TM) circundando partículas
do biomaterial (BM) fragmentado – coloração: picrossírus vermelho
59
Figura 57. GII 90 dias: Na região próximo as bordas do defeito, observa-se septos
de fibras colágenas (FC) envolvendo partículas do biomaterial (BM) –
coloração: picrossírus vermelho
59
Figura 58. GI 120 dias: Área central do defeito com presença de tecido fibroso
denso (FC - fibras colágenas) – coloração: HE
60
Figura 59. GI 120 dias: Região em proximidade à borda óssea do defeito com
presença de vasos sangüíneos (VS) e fibras colágenas (FC) –
coloração: HE
61
XVI
Figura 60. GI 120 dias: Área central do defeito com presença de núcleos de
mineralização (TM - tecido mineralizado) – coloração: tricômico de
Masson Goldner
61
Figura 61. GI 120 dias: Região em proximidade ao tecido ósseo remanescente
(TOR) onde se observa vasos sangüíneos (VS), osteoblastos (OB) e
formação de tecido mineralizado (TM) – coloração: tricômico de Masson
62
Figura 62. GI 120 dias: Formação de tecido ósseo (TO) próximo às bordas ósseas
– coloração: azul de toluidina com fucsina básica
62
Figura 63. GII 120 dias: Área central do defeito com presença de tecido ósseo
neoformado (TO) ao redor das partículas do biomaterial (BM)
fragmentado e vasos sangüíneos (VS) – coloração: HE
64
Figura 64. GII 120 dias: Região próxima à borda óssea do defeito onde se observa
partículas do biomaterial (BM) fragmentado irregularmente, que estão
envoltas por tecido ósseo (TO) e, presença de vasos sangüíneos (VS) –
coloração: HE
64
Figura 65. GII 120 dias: Área central do defeito com formação de tecido ósseo
(TO) pelos osteoblastos (OB) ao redor das partículas do biomaterial
(BM). Nota-se presença de macrófagos (M) e células gigantes
multinucleadas (CG) – coloração: tricômico de Masson Goldner
65
Figura 66. GII 120 dias: Região próxima as bordas do defeito. Notam-se
macrófagos (M), células gigantes multinucleadas (CG) e tecido
mineralizado (TM) em proximidade ao biomaterial (BM) – coloração:
tricômico de Masson Goldner
65
Figura 67. GII 120 dias: Nesta região em proximidade ao tecido ósseo
remanescente (TOR) das bordas do defeito, pode-se identificar
partículas do biomaterial (BM) envoltas por septos de fibras colágenas
(FC) e tecido mineralizado (TM) – coloração: picrossírus vermelho
66
Figura 68. GII 120 dias: Área central do defeito onde se observa fragmentos do
biomaterial (BM) reunidos em grupos e delineados por septos de fibras
colágenas (FC) – coloração: picrossírus vermelho
66
Figura 69. GII 120 dias: Imagem em maior aumento da região apresentada
anteriormente. Nota-se a formação de tecido mineralizado (TM) e
delineamento por fibras colágenas (FC) das partículas do biomaterial –
coloração: picrossírus vermelho
67
Figura 70. GII 120 dias: Imagem obtida de bloco de resina epóxi onde se identifica
tecido ósseo (TO) com presença de osteócitos (OC) ao redor do
biomaterial (BM)
67
Figura 71. GII 120 dias: Imagem de bloco de resina epóxi (corte longitudinal) onde
se observam esferas fragmentadas desde o tecido ósseo remanescente
(TOR) até a área central do defeito (AC). Nota-se a formação de tecido
ósseo ao redor do biomaterial (BM) – coloração: azul de Richardson
68
Figura 72. GII 120 dias: Imagem obtida por microscopia de polarização, da mesma
região observada na figura anterior. Notar a presença de tecido ósseo
ao redor das esferas (áreas iluminadas na figura)
68
Figura 73. GII 120 dias: Imagem de uma região de interface entre biomaterial (BM)
e tecido ósseo (TO) dispostos em lamelas, com presença de osteócitos
(OC) – coloração: azul de toluidina com fucsina básica
69
Figura 74. GII 120 dias: Nesta região pode-se observar produção de matriz
extracelular diferente do tecido osteóide, ao redor do biomaterial (BM) –
coloração: azul de toluidina com fucsina básica
69
XVII
Figura 75. GII 120 dias: Região contendo o biomaterial (BM), osso neoformado
(TO) e matriz osteóide (MO). Nota-se presença de osteoblasto (OB)
adjacente à matriz osteóide – coloração: tricômico de Masson Goldner
70
Figura 76. GII 120 dias: Imagem obtida por microscopia de contraste interferencial
Nomarski. Notar a formação de matriz osteóide (MO) e de tecido ósseo
(TO) pelos osteoblastos (OB) de permeio ao biomaterial (BM) –
coloração: trocômico de Masson Goldner
70
Figura 77. Região de implantação do compósito no defeito ósseo confeccionado
em calvária de rato. Ausência de mineralização em torno do biomaterial
(região eletrondensa acima, à esquerda). Presença de célula
envolvendo o biomaterial (estrela). Detalhe das nanopartículas de
hidroxiapatita (inserto)
72
Figura 78. Presença de fibrilas de colágeno com bandeamento típico (setas), e
depósitos minerais entre as fibrilas (regiões eletrondensas). Barra = 0,5
µm
73
Figura 79. Área correspondente ao início da mineralização de tecido ósseo
próximo ao biomaterial (não visível na imagem), com presença de
fibrilas de colágeno com bandeamento típico (setas). Barra = 0,5 µm
73
Figura 80. Detalhe em grande aumento, de uma região semelhante à da imagem
anterior, mostrando o início da mineralização óssea, próximo ao enxerto
(não visível na imagem). A mineralização (regiões eletrodensas)
localiza-se na região entre as fibrilas de colágeno. Bandeamento típico
das fibrilas (setas)
74
Figura 81. Região em estágio avançado de mineralização em torno do biomaterial
(BM). O contraste intenso na região dos “gaps” (setas) das fibrilas indica
presença de tecido mineralizado
74
Figura 82. Três regiões de natureza distinta relacionadas ao biomaterial (BM) em
áreas onde houve mineralização envolvendo o material; “linha
cimentante” (LC); matriz mineralizada rica em colágeno do tipo I (COL)
75
Figura 83. Região mineralizada em torno do biomaterial (BM), com área não
mineralizada intercalada entre o biomaterial e a matriz mineralizada rica
em fibrilas de colágeno (COL)
75
Figura 84. As figuras acima representam espectros EDS das regiões: A)
Nanopartículas do biomaterial; B) região circundante próxima ao
biomaterial; C) região com tecido ósseo em formação. Notar que a
região que circunda o material, não contém cálcio, e que a região de
tecido ósseo em formação apresenta relação Cálcio/Fósforo inferior à
das partículas de hidroxiapatita
77/78
XVIII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Distribuição dos animais de acordo com os grupos e pontos
biológicos
XIX
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
β-TCP β-tricálcio fosfato
α-TCP α-tricálcio fosfato
BM Biomaterial
BSP Sialoproteína óssea
Ca/PO
4
Relação cálcio/fosfato
CBPF Centro Brasileiro de Pesquisas Físicas
CEUA Comitê de Ética no Uso de Animais
CG Célula gigante
COL Fibrilas de colágeno
FC Fibras colágenas
FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz
HA Hidroxiapatita
LBTB Laboratório de Bioengenharia Tecidual e Biomateriais
LC Linha cimentante
M Macrófago
MEC Matriz extracelular
MET Microscopia eletrônica de transmissão
MO Matriz osteóide
Nº Número
XX
OB Osteoblasto
OC Osteócito
OCN Osteocalcina
ON Osteonectina
OPN Osteopontina
PGs Proteoglicanas
RGD Seqüência tripeptídica Arginina-Glicina-Asparagina
ROG Regeneração óssea guiada
SPARC Proteína ácida secretada rica em cisteína
TM Tecido mineralizado
TO Tecido ósseo
TOR Tecido ósseo remanescente
UEFS Universidade Estadual de Feira de Santana
UFBA Universidade Federal da Bahia
UFRJ Universidade Federal do Rio de Janeiro
Unidade G
Ácido α-L-Gulurônico
Unidade M
Ácido (1,4) β-D-Manurônico
VS Vaso sangüíneo
XXI
SUMÁRIO
TERMO DE APROVAÇÃO III
DEDICATÓRIA IV
AGRADECIMENTOS V
RESUMO IX
ABSTRACT X
LISTA DE FIGURAS XI
LISTA DE TABELAS XVIII
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS IX
SUMÁRIO XXI
1 INTRODUÇÃO 1
2 REVISÃO DE LITERATURA 4
2.1 TECIDO ÓSSEO 4
2.2 BIOENGENHARIA TECIDUAL ÓSSEA E BIOMATERIAIS 11
2.2.1 Biocerâmicas e Alginatos 14
3 OBJETIVOS 19
3.1 OBJETIVO GERAL 19
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 20
4 METODOLOGIA 21
4.1 AMOSTRA 21
4.2 BIOMATERIAL 22
XXII
4.3 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO 24
4.4 IMPLANTAÇÃO DO BIOMATERIAL 29
4.5 OBTENÇÃO DAS CALVÁRIAS 30
4.6 PROCESSAMENTO LABORATORIAL 31
4.6.1 Microscopia óptica 31
4.6.2 Microscopia eletrônica de transmissão 33
4.6.3 Microanálise de raios-X 34
5 RESULTADOS 37
5.1 MICROSCOPIA ÓPTICA 37
5.1.1 Ponto biológico: 15 dias 37
5.1.2 Ponto biológico: 45 dias 46
5.1.3 Ponto biológico: 90 dias 52
5.1.4 Ponto biológico: 120 dias 60
5.2 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO 71
5.3 MICROANÁLISE DE RAIOS-X 76
6 DISCUSSÃO 79
7 CONCLUSÃO 86
REFERÊNCIAS 88
ANEXO
1
1 INTRODUÇÃO
O tecido ósseo é composto por células e matriz extracelular, orgânica e
inorgânica (HILL e ORTH, 1998). Este tecido apresenta-se metabolicamente ativo
devido ao seu excelente potencial remodelação e regeneração. Entretanto, a
remodelação óssea é limitada pela morfologia e dimensão do defeito (MARINS e
outros, 2004). Defeitos ósseos podem ser causados por diversos fatores como
traumas, anomalias de desenvolvimento, neoplasias, doenças degenerativas, entre
outros (HERCULIANI e outros, 2000; PINHEIRO e outros, 2003a), e são
denominados “críticos” quando não regeneram espontaneamente (SCHMITZ e
HÖLLINGER, 1986) tornando o reparo dificultado, levando à deposição de tecido
conjuntivo fibroso (FRAME, 1980; RUPPRECHT e outros, 2003).
Com a finalidade de solucionar tais dificuldades, a bioengenharia tecidual
óssea tem possibilitado, nos últimos anos, o aperfeiçoamento e/ou desenvolvimento
de técnicas regenerativas e biomateriais (HERCULIANI e outros, 2000), que podem
ser preparados com materiais naturais ou sintéticos, como metais, cerâmicas e
polímeros (MARCANTONIO JUNIOR, 1997; CALLISTER JUNIOR, 2002).
2
Cerâmicas são materiais formados por elementos metálicos e não
metálicos, apresentando-se freqüentemente como óxidos, nitretos e carbetos. Aqui
se incluem cerâmicas que contêm minerais argilosos, cimentos e vidros. Dentre as
características destes materiais destacamos: são isolantes, para a passagem de
eletricidade e calor, e são mais resistentes do que metais e polímeros, a altas
temperaturas e ambientes abrasivos. Relativamente ao comportamento mecânico,
as cerâmicas são duras, porém quebradiças (SUH, 1998; KAWACHI e outros, 2000;
CALLISTER JUNIOR, 2002). De acordo com sua composição química, as cerâmicas
derivadas de fosfato de cálcio podem ser compostas de: hidroxiapatita (HA), β-
tricálcio fosfato (β-TCP), α-tricálcio fosfato (α-TCP), dentre outros (LeGEROS, 2002).
A HA, Ca
10
(PO
4
)
6
(OH)
2
,
é amplamente utilizada nas técnicas regenerativas ósseas
por sua semelhança com os fosfatos de cálcio presentes na fase mineral do tecido
ósseo; não apresenta risco de transmissão de doenças, apresenta boa
biocompatibilidade, união direta com o tecido ósseo e excelente osteocondutividade
(ROSA e outros, 1998; KURASHINA e outros, 1998; ONO e outros, 1999; GURGEL,
2000; YUASA e outros, 2004). Entretanto, como qualquer outro material cerâmico, a
HA apresenta baixa elasticidade e alta fragilidade, o que reduz suas propriedades
mecânicas (NEUMANN e EPPLE, 2006) e aumenta a dificuldade de manutenção no
sítio implantado.
Com o objetivo de suprimir estas limitações, tem-se utilizado da
associação de diferentes materiais com distintas composições, estruturas e
propriedades para produzir um biomaterial com características superiores àquelas
da HA, denominados compósitos (SALEM, 2006). Dentre os materiais empregados
na produção destes, destacam-se o colágeno (ALPASLAN, ALPASLAN, OYGUR,
1994), quitosana, alginato e outros (NEUMANN e EPPLE, 2006).
3
Sempre que estes biomateriais são produzidos faz-se necessário avaliar
suas interações, quando em contato com células e/ou tecidos. Assim, estudos in
vivo utilizando defeitos ósseos críticos possibilitam estudar a biocompatibilidade,
bem como o potencial osteogênico destes biomateriais.
Neste contexto, este estudo visa analisar, histologicamente, a capacidade
regenerativa de um compósito formado pela associação de fosfato de cálcio (HA) e
polímero de alginato, no formato de esferas, implantado em defeitos ósseos críticos,
criados em calvária de rato.
4
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 TECIDO ÓSSEO
O osso é um tecido conjuntivo altamente especializado, constituído por
diferentes tipos celulares e matriz extracelular mineralizada (MEGHJI, 1992; HILL e
ORTH, 1998). Macroestruturalmente, este tecido é diferenciado em osso cortical ou
compacto, encontrado na região mais periférica dos ossos; e trabecular ou
esponjoso, localizado subjacente ao cortical, com espaços intertrabeculares, onde
se localiza a medula óssea (RHO, SPEARING, ZIOUPOS, 1998). Estes tipos ósseos
são revestidos externa e internamente por membranas conjuntivas, denominadas
periósteo e endósteo, respectivamente (ALLEN, HOCK, BURR, 2004).
O componente celular deste tecido é constituído por osteoblastos, células
de recobrimento ósseo, osteócitos e osteoclastos (SODEK e McKEE, 2000). Os três
primeiros tipos originam-se a partir de células-tronco mesenquimais, enquanto os
osteoclastos surgem da fusão de células do sistema monocítico-fagocitário (MARKS
JUNIOR e HERMEY, 1996).
5
Os osteoblastos, após a sua maturação, tornam-se completamente ativos
e sintetizam matriz osteóide, a qual posteriormente é mineralizada, denominada
matriz óssea (MACKIE, 2003). Quando mantidos no interior desta, estas células são
conhecidas como osteócitos, que são fundamentais para a manutenção da matriz.
Ainda, estas células podem permanecer quiescentes, na superfície óssea, como
células de revestimento (SODEK e McKEE, 2000), entretanto, quando estimuladas,
retomam sua atividade metabólica.
O tecido ósseo é um compósito que contém quantidades decrescentes
de: minerais, colágeno, proteínas não colagênicas, água e lipídeos (BOSKEY e
PASCHALIS, 2000; BOSKEY, 2005). A fase inorgânica deste tecido é constituída,
principalmente, pelos íons fosfato e cálcio, organizados como cristais de HA
(YOUNG, 2003). Associados a estes, podem ser encontrados outros íons, em menor
quantidade, como: bicarbonato, sódio, potássio, citrato, magnésio, carbonato,
lactato, fluoreto, zinco, bário e estrôncio (VIANNA, 1988).
A parte orgânica do osso é formada, aproximadamente, por 95% de
colágeno tipo I associado a proteínas não-colagênicas, como a osteocalcina (OCN),
osteopontina (OPN), sialoproteína óssea (BSP), osteonectina (ON), além de
glicoproteínas e proteoglicanas. Estas proteínas estão presentes especificamente
nos tecidos mineralizados. Contudo, a BSP e a ON, também são encontradas em
outros tecidos (SODEK e McKEE, 2000).
A OCN, proteína gla do osso, é uma das proteínas não-colagênicas mais
abundantes do tecido ósseo (HING, 2004). Embora seu papel na formação e
remodelação óssea ainda não esteja bem elucidado (SODEK e McKEE, 2000),
sabe-se que esta proteína apresenta alta afinidade pelos cristais de hidroxiapatita
6
(HA) (MURSHED e outros, 2004; YOUNG, 2003), desempenhando possivelmente
um papel na regulação da maturação destes cristais (SODEK e CHEIFETZ, 2000).
A OPN e a BSP, juntas, formam a maioria das proteínas não-colagênicas
ósseas (SODEK e McKEE, 2000; SODEK e CHEIFETZ, 2005) e também
apresentam forte ligação com os cristais de HA (GIACHELLI e STEITZ, 2000). Estas
proteínas pertencem a uma família que contêm, em sua estrutura, a seqüência
tripeptídica Arginina-Glicina-Asparagina (RGD), que contribui para a sinalização,
ativação e adesão celular, uma vez que é reconhecida pelas integrinas presentes na
superfície celular dos osteoblastos (YOUNG, 2003; SODEK e CHEIFETZ, 2005).
Em estudos in vitro, a OPN demonstrou ser uma potente inibidora da
formação e crescimento dos cristais de HA (BOSKEY e outros, 1993; HUNTER e
outros, 1996). Esta proteína também auxilia na adesão (SODEK e McKEE, 2000) e
motilidade dos osteoclastos durante o mecanismo de absorção óssea (GIACHELLI e
STEITZ, 2000). Em contrapartida, a BSP promove a diferenciação osteoblástica
(WUTTKE e outros, 2001) e facilita a nucleação dos cristais de HA in vitro (HUNTER
e GOLDBERG, 1993; HUNTER e outros, 1996) e in vivo (SODEK e McKEE, 2000).
Ademais, estimula a absorção óssea (WUTTKE e outros, 2001).
A ON é uma proteína ácida rica em cisteína (SPARC – secreted protein
acidic and rich in cysteine), expressa na superfície celular dos osteoblastos (SODEK
e CHEIFETZ, 2000). Esta proteína tem forte afinidade tanto pelo colágeno, quanto
pelo mineral (YOUNG, 2003). Sua função ainda não está totalmente identificada,
contudo, é expressa ubiquamente em tecidos com alta capacidade remodeladora
(YOUNG, 2003).
Vale ressaltar que, dentre as glicoproteínas presentes neste tecido, a
fibronectina é a primeira a ser expressa durante a formação óssea e uma das mais
7
abundantes na matriz extracelular (MEC), sendo responsável pela organização
desta; além disto, promove a adesão celular por meio da seqüência RGD e participa
no mecanismo de mineralização (SODEK e McKEE, 2000; YOUNG, 2003; BOSKEY,
2005).
As proteoglicanas (PGs) encontradas na matriz óssea são classificadas
em: proteoglicanas grandes que formam agregados, proteoglicanas pequenas ricas
em leucina e proteoglicanas de heparan sulfato. A principal proteoglicana grande
formadora de agregados encontrada no osso é a versican, um condroitin sulfato que
parece ser importante para a organização da matriz e promoção da motilidade e
crescimento celular. In vitro, esta proteoglicana é encontrada associada aos núcleos
de mineralização (BOSKEY, 2005).
As principais proteoglicanas de baixo peso molecular ricas em leucina
encontradas no tecido ósseo, biglicana e decorina, assim como a versican, são
condroitin sulfato. Estas PGs ligam-se a fatores de crescimento e a moléculas
presentes na matriz, como por exemplo, as de colágeno. Nestas moléculas, ambas
PGs, são localizadas nas regiões de “gap”, onde ocorre a mineralização. No entanto,
elas se degradam com o início e maturação do osso (SODEK e McKEE, 2000;
MACKIE, 2003; YOUNG, 2003; BOSKEY, 2005).
Os lipídeos presentes na matriz óssea são importantes no metabolismo e
mineralização do tecido. A maioria destes é derivada da membrana celular que
contém plataformas lipídicas, conhecidas como “rafts”, moduladoras da sinalização e
função da membrana. Ademais, há lipídeos dentro da MEC que parecem estar
associadas ao colágeno e à membrana das vesículas da matriz extracelular, sítio
inicial da mineralização, tanto nas cartilagens quanto em alguns ossos (BOSKEY,
2005).
8
O colágeno tipo I, principal componente da fase orgânica da matriz óssea,
tem papel fundamental na estrutura e função do tecido (RHO, SPEARING,
ZIOUPOS, 1998; SODEK e McKEE, 2000; YOUNG, 2003), visto que favorece a
deposição mineral na forma de cristais de HA entre suas moléculas proporcionando,
deste modo, dureza e resistência. Esta última característica deriva da sua estrutura
fibrilar altamente organizada em tripla hélice (ROSSERT e CROMBRUGGHE, 1996).
Ultraestruturalmente, as moléculas dos colágenos fibrilares medem 300
nm de comprimento e, em três dimensões, mantêm-se alinhadas e sobrepostas
umas às outras. Entre o final de uma molécula e o início da outra, há um intervalo de
40 nm, denominado de “gap”. As regiões onde as moléculas de colágeno se
sobrepõem são conhecidas como “overlap”, e medem 27 nm (ROSSERT e
CROMBRUGGHE, 1996; RHO, SPEARING, ZIOUPOS, 1998; LANDIS e SILVER,
2002). A soma destas, 67 nm, é conhecida como distância D e se repete
periodicamente em cada molécula (Figura 1) (RHO, SPEARING, ZIOUPOS, 1998).
Figura
1. Diagrama esquemático da fibrila e molécula de colágeno.
(Fonte: http://www.ccmbel.org/Chap5.html).
O mecanismo de mineralização do tecido ósseo é complexo e envolve
células, MEC orgânica e eventos físico-químicos. Neste mecanismo, as proteínas da
9
matriz atuam como fatores reguladores e/ou nucleadores da deposição de cristais
(BOSKEY, 2005) de HA, que se iniciam nos “gaps” das moléculas de colágeno
(ROSSERT e CROMBRUGGHE, 1996). Os íons cálcio e fosfato, necessários para
iniciar e favorecer o crescimento destes cristais, estão presentes no plasma e fluidos
extracelulares. Quando esta formação cristalina resulta do aumento da relação
cálcio/fosfato (Ca/PO
4
), ocorre a nucleação homogênea. Por outro lado, se esta
precipitação ocorrer em uma superfície já formada ou em função de algum agente
quelante, como proteínas e lipídeos, a nucleação é denominada heterogênea. Nesta
última, uma vez formados, estes cristais crescem pela adição de íons, envolvem a
molécula de colágeno e ocupam os espaços intermoleculares (BOSKEY, 2005).
Concomitantemente à mineralização descrita acima, existe também outro
tipo de formação de cristais de HA. Neste, os osteoblastos desenvolvem, na sua
superfície, evaginações que posteriormente se destacam e originam as vesículas da
matriz. Estas criam microambientes protegidos e apropriados à formação e
crescimento dos cristais. Contudo, vale ressaltar que o mecanismo pelo qual estas
vesículas favorecem a mineralização ainda não está completamente elucidado
(BOSKEY, 2005).
O tecido ósseo, após sua mineralização e maturação, apresenta
constante capacidade remodeladora e atividade regenerativa (GREEN e outros,
2002; DE LONG JUNIOR e outros, 2007), exceto quando alguns fatores interferem
neste mecanismo, tais como: ausência de vascularização, presença de um tecido
com elevado potencial proliferativo na área circunvizinha e dimensões e morfologias
do defeito (SCHMITZ e HÖLLINGER, 1986). Nestas situações, são utilizados vários
materiais como enxertos ou implantes ósseos, classificados em autógenos,
10
homógenos ou alógenos, heterógenos ou xenógenos e aloplásticos (BERNARD,
1991; MOON e outros, 2006).
Os enxertos autógenos, obtidos do mesmo indivíduo, são considerados
padrão de excelência na regeneração óssea devido às suas propriedades
biológicas. (MARINS e outros, 2004). Dentre estas, sobressaem um elevado número
de células da linhagem osteogênica que favorecem os mecanismos de
osteoindução, osteoestimulação e osteocondução. Estes enxertos proporcionam
ainda a manutenção do suprimento sangüíneo e da vitalidade destas células,
principalmente nos primeiros dias após a implantação, e ausência de infecção
cruzada. Porém, esta técnica necessita de uma intervenção cirúrgica adicional, o
que aumenta o tempo cirúrgico, o risco de infecções, a possibilidade de dor e
desconforto ao paciente e limitada quantidade de enxerto, fatores estes
considerados como inconvenientes para a sua utilização clínica (YAKAMOTO, LUZ,
ARAÚJO, 1994; BEGLEY e outros, 1995; ONG e outros, 1998; LEE e outros, 2000;
LEONETTI, RAMBO, THRONDSON, 2000; CHAN e outros, 2002; LUTOLF e outros,
2003; MARINS e outros, 2004; MASTROGIACOMO e outros, 2005).
Os enxertos homógenos são obtidos de um indivíduo da mesma espécie,
contudo geneticamente diferente, assim, seu uso pode estar comprometido, visto
que há a possibilidade de transmissão viral e rejeição, em função da carga
antigênica (MOORE e outros, 2001).
Os enxertos obtidos de doadores de espécies diferentes, enxertos
heterógenos, assim como aqueles fabricados em laboratórios, enxertos aloplásticos
(BERNARD, 1991), têm sido amplamente aperfeiçoados para mimetizar o
mecanismo de neoformação óssea e serem utilizados na bioengenharia tecidual
óssea como substitutos ósseos.
11
2.2 BIOENGENHARIA TECIDUAL ÓSSEA E BIOMATERIAIS
A Bioengenharia Tecidual é uma área interdisciplinar das Ciências da
Saúde, que aborda princípios de biologia celular e molecular, física, engenharias
química e de materiais e medicina, com o objetivo de desenvolver novas técnicas,
tecidos e/ou biomateriais, bem como aperfeiçoar os já existentes (SACHLOS e
CZERNUSZKA, 2003; LAVIK e LANGER, 2004).
Neste contexto, os biomateriais preparados com matérias-primas naturais
como alginato, colágeno e quitosana, ou sintéticos como cerâmicas, metais e
polímeros (Figura 2) são definidos como materiais a serem implantados no corpo
com a finalidade de substituir tecidos lesados e/ou perdidos (MUNTING, MIRTCHI,
LEMAITRE, 1993; MARCANTONIO JUNIOR, 1997, KURASHINA e outros, 1998;
ONO e outros, 1999; CALLISTER JUNIOR, 2002; SUH, 2000; LAVIK e LANGER,
2004; NEUMMAN e EPPLE, 2006).
Figura 2. Diagrama esquemático da classificação dos biomateriais.
(NEUMMAN e EPPLE, 2006).
12
Para a implantação in vitro e in vivo destes, faz-se necessário conhecer
suas propriedades físico-químicas, bem como as características peculiares a cada
sítio de implantação, tecido e/ou órgão, visto que estes fatores determinam distintas
respostas biológicas e, portanto, resultam em diferentes resultados experimentais e
clínicos (ROSA, 1997; LAVIK e LANGER, 2004).
Assim, é válido ressaltar que os biomateriais devem ser biocompatíveis,
isto é, induzir resposta inflamatória mínima, ser porosos e ter biodegradação
controlada para permanecer no local implantado por um período necessário e,
assim, estimular reações químicas e biológicas favoráveis à sua função. Ainda, não
devem apresentar potencial carcinogênico, genotóxico e toxicidade local e/ou
sistêmica (REGI, 1997; EISELT e outros, 2000; GURGEL, 2000; GUASTALDI, 2004)
Estas propriedades, somadas à sua topografia e química de superfície (ANSELME,
2000), assim como a suas diferentes morfologias e formas de apresentação
(cilindros, discos, esferas, esponjas, matrizes, membranas, géis e pós) favorecem os
mecanismos celulares necessários ao reparo tecidual (VASCONCELOS e outros,
2003). Contudo, independente da sua geometria, tanto a interconexão dos poros
quanto o diâmetro destes, são fatores críticos à osteogênese (CHANG e outros,
2000; KARAGEORGIOU e KAPLAN, 2005; MASTROGIACOMO e outros, 2006),
uma vez que, em consonância com sua área de superfície, favorecem a formação
de novos vasos sangüíneos em paralelo à migração, adesão, inserção e proliferação
das células mesenquimais diferenciadas e da linhagem osteoblástica (EISELT e
outros, 2000; KARAGEORGIOU e KAPLAN, 2005; MASTROGIACOMO e outros,
2006).
Destarte, com o intuito de desenvolver biomateriais com porosidade e
interconexão apropriados à regeneração óssea, vários estudos têm sido
13
desenvolvidos (CAROTENUTO e outros, 1999; LU e outros, 1999; CHANG e outros,
2000; JOSCHEK e outros, 2000; FLAUTRE e outros, 2001; RODRIGUES e outros,
2003; KARAGEORGIOU e KAPLAN, 2005; LeGUEHENNEC e outros, 2005;
MASTROGIACOMO e outros, 2006), porém, ainda não há um consenso em relação
ao diâmetro e área de superfícies ideais.
Neste contexto, na tentativa de suprimir tais limitações, nas últimas
décadas, as pesquisas científicas, na área de Bioengenharia Tecidual Óssea têm
almejado aperfeiçoar a composição, características físico-químicas,
biocompatibilidade, forma e geometria dos biomateriais (BURG, PORTER, KELAM,
2000; KON e outros, 2000; LAVIK e LANGER, 2004).
Estudos experimentais necessários à avaliação destes novos
biomateriais, prévios à sua aplicação clínica, possibilitam identificar e compreender
os diferentes mecanismos da osteogênese fundamentais na regeneração óssea:
osteocondução, osteoestimulação e osteoindução, os quais nem sempre ocorrem
simultaneamente.
Segundo Misch e Dietsh (1993), a osteocondução corresponde à
migração de células sobre o biomaterial implantado, porém não induz a formação de
tecido mineralizado. Entende-se por osteoindução a diferenciação de células-tronco
mesenquimais indiferenciadas e perivasculares em células osteogênicas. Por
osteoestimulação, compreende-se a formação de matriz óssea por meio da
estimulação de osteoblastos presentes.
Ao escolher o modelo experimental, deve-se considerar custo, facilidade
de manuseio, armazenamento e sua obtenção (MARDEN e outros, 1994; VERNA e
outros, 2002; LIEBSCHNER, 2004). De acordo com estes critérios, segundo
14
Liebschner (2004), o rato é o modelo animal mais utilizado nos estudos
experimentais.
Em relação à Bioengenharia Tecidual Óssea, faz-se necessário atentar
para a anatomia e tipo de tecido ósseo (compacto ou esponjoso), morfologia e
tamanho do defeito, vascularização, bem como, para o nível de desenvolvimento e
maturação óssea (LIEBSCHNER, 2004; LOGEART-AVRAMOGLOU e outros, 2005).
Neste contexto, a calvária de rato adulto é um sítio anatômico apropriado no estudo
da regeneração óssea (MARDEN e outros, 1994; VERNA e outros, 2002). No
entanto, quando da confecção de defeitos críticos, a presença da sutura sagital
nesta região pode limitar a avaliação da capacidade osteogênica dos biomateriais
e/ou técnicas regenerativas, visto que há, nesta região, células do tecido conjuntivo
que podem se proliferar e resultar em fibrose (BOSCH, MELSEN, VARGERVIK,
1998).
2.2.1 Biocerâmicas e Alginatos
A maioria das cerâmicas consiste em compostos que são formados entre
elementos metálicos e não metálicos, para os quais as ligações interatômicas ou são
totalmente iônicas ou predominantemente iônicas, com alguma natureza covalente
(SUH, 1998; CALLISTER JUNIOR, 2002). Estes materiais têm sido utilizados desde
1894, por Dreesman, com o uso do gesso (CaSO
4
.½ H
2
O) como possível substituto
15
ósseo, entretanto, devido a sua baixa resistência mecânica, fragmentação e total
degradação, esta cerâmica deixou de ser implantada (KAWACHI e outros, 2000).
Posteriormente, na década de 60, a primeira biocerâmica utilizada como
substituto ósseo foi a alumina densa (α-Al
2
O
3
), a qual tem sido empregada até os
dias atuais em próteses ortopédicas (SUH, 1998; KAWACHI e outros, 2000).
Todavia, outras biocerâmicas também são utilizadas, como a zircônia (ZrO
2
), dióxido
de titânio (TiO
2
) e fosfatos de cálcio (KAWACHI e outros, 2000), dentre os quais
destacam-se os de relevância biológica: fosfato de cálcio amorfo, brushita, monetita,
fosfato de cálcio octacálcico, pirofosfato de cálcio e apatita (LeGEROS, 2002).
A apatita é subdividida com base nos seus ânions prevalecentes, como:
cloro (cloroapatita), flúor (fluorapatita), hidroxil (hidroxiapatita), dentre outros. A
hidroxiapatita pura tem proporção Ca/P de 1,67 e estequiometria Ca
10
(PO
4
)
6
(OH)
2
,
(LeGEROS, 2002). Esta biocerâmica destaca-se por estar disponível em
quantidades ilimitadas, não transmitir doenças, ser biocompatível, osteofílica,
osteocondutora e semelhante à HA presente na fase inorgânica do tecido ósseo
(ROSA, 1997; ROSA e outros, 1998; KURASHINA e outros, 1998; ONO e outros,
1999; GURGEL, 2000; ROHANIZADEH, TRÉCANT-VIANA, DACULSI, 1999;
YUASA e outros, 2004; MASTROGIACOMO e outros, 2005; WOODARD e outros,
2007). No entanto, devido à falta de propriedades mecânicas, como baixa
resistência e módulo elástico, e alta fragilidade (SACHLOS e CZERNUSZKA, 2003;
BENAQQA e outros, 2005; REZWAN e outros, 2006), sua utilização clínica, como
substitutos ósseos em áreas extensas, tem sido restrita (MASTROGIACOMO e
outros, 2005).
Desta forma, com o objetivo de satisfazer os requisitos inerentes ao
conceito de biomimese, os avanços tecnológicos têm possibilitado a associação de
16
diferentes tipos de materiais orgânicos e/ou inorgânicos, para o desenvolvimento de
compósitos com características físico-químicas aprimoradas em relação aos
materiais, quando aplicados individualmente (RIBEIRO, BARRIAS, BARBOSA,
2004). Logo, suas propriedades são variáveis, pois dependem do tipo da
combinação, da geometria e microestrutura do biomaterial, as quais devem ser
adaptadas de acordo com os requisitos clínicos e biomecânicos da situação clínica
(THIAN e outros, 2002; NEUMMAN e EPPLE, 2006).
Dentre os possíveis materiais atualmente associados às biocerâmicas,
podem-se destacar os polímeros sintéticos (poliglicólico e poliláctico) e os polímeros
naturais (colágeno, alginato, condroitin sulfato, quitosano) (Figura 3) (ALPASLAN,
ALPASLAN, OYGUR, 1994; NEUMANN e EPPLE, 2006; SALEM, 2006).
Figura 3. Esquema das possíveis associações de fosfatos de cálcio com os polímeros.
(NEUMMAN e EPPLE, 2006).
Os alginatos são polissacarídeos naturais, extraídos de algas pardas, os
quais podem ser utilizados na Bioengenharia Tecidual (GOMBOTZ e WEE, 1998).
Estes polissacarídeos são polímeros lineares do ácido (1,4) β-D-Manurônico
(unidades M) e de ácido α-L-Gulurônico (unidades G) (Figura 4) que apresentam
variação na proporção e distribuição seqüencial ao longo da cadeia polimérica
(GOMBOTZ e WEE, 1998; EISELT e outros, 2000; BOONTHEEKUL, KONG,
MOONEY, 2005). As propriedades físicas destes polímeros são determinadas por
17
sua composição, extensão das seqüências lineares e por seu peso molecular
(KLÖCK e outros, 1997; GOMBOTZ e WEE, 1998).
Figura 4. Estrutura química do alginato.
(Fonte: http://www.monografias.com/trabajos12/alginato/alginato.shtml).
A adição de cátions divalentes ao alginato, em soluções aquosas, pode
estabelecer ligações cruzadas e formar hidrogéis, uma rede tridimensional com o
objetivo de estabilizar, permanentemente, os polímeros (GOMBOTZ e WEE, 1998;
KUO e MA, 2001). Estes cátions interagem, preferencialmente, com o ácido α-L-
Gulurônico (unidades G) para formar pontes entre as cadeias poliméricas adjacentes
(Figura 5A) (REES, 1981; BOONTHEEKUL, KONG, MOONEY, 2005). Embora o
cálcio seja o cátion mais utilizado na formação dos hidrogéis (BOONTHEEKUL,
KONG, MOONEY, 2005), outros cátions também podem ser utilizados, como o zinco
(ASLANI e KENNEDY, 1996) e o bário (KLÖCK e outros, 1997). Este modelo de
rede tridimensional, denominado de “egg-box”, é baseado nas propriedades físico-
químicas dos hidrogéis de alginato e nas propriedades de adesão dos cátions
(Figura 5B) (REES, 1981). Esta rede é, comumente, formada a partir do gotejamento
da solução de alginato de sódio ou potássio, em solução aquosa de íons de cálcio,
normalmente, composta por cloreto de cálcio (KUO e MA, 2001).
18
Figura 5. Adesão do íon cálcio à unidade G da cadeia polimérica.
(Fonte: A- http://www.fmcbiopolymer.com/PopularProducts/FMCAlginates/Gelation/tabid/799)
(Fonte: B- http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/paroi/images/eggbox.gif).
19
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar, in vivo, a capacidade regenerativa de um compósito à base de
hidroxiapatita e alginato no formato de microesferas, implantado em defeitos ósseos
produzidos na calvária de rato.
20
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
A) Avaliar, por microscopia óptica, o comportamento e o padrão de
organização tecidual resultante da implantação de microesferas de
hidroxiapatita/alginato em defeitos ósseos críticos, criados cirurgicamente, em
calvária de rato.
B) Analisar, por microscopia óptica, o processo de formação óssea
após a implantação das microesferas de hidroxiapatita/alginato.
C) Analisar, por microscopia eletrônica, o padrão de deposição dos
minerais no ponto biológico de 120 dias, após a implantação de microesferas
de hidroxiapatita/alginato.
D) Analisar, a ultraestrutura do tecido neoformado em torno do
biomaterial implantado, nas regiões onde ocorreu mineralização, por
microscopia eletrônica de transmissão e microanálise de raios X,
21
4 METODOLOGIA
4.1 AMOSTRA
Após a aprovação no Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da
Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS) (Anexo), todos os
procedimentos adotados para criação, tratamento, manutenção e/ou morte dos
animais foram realizados de acordo com as normas éticas de conduta para
experimentação animal.
Neste estudo utilizamos 48 ratos machos, Rattus norvegicus Wistar,
com massa corporal aproximada de 350 a 420 gramas, os quais receberam
água ad libitum e ração sólida
1
e foram mantidos em condições ideais de
luminosidade e temperatura durante todo o período experimental.
Os animais foram divididos, aleatoriamente, em dois grupos (GI-
grupo controle e GII- grupo experimental) e avaliados, após os procedimentos
cirúrgicos, em quatro pontos biológicos, de acordo com a tabela 1.
1
Nuvital do Brasil
22
Tabela 1. Distribuição dos animais de acordo com os grupos e
pontos biológicos.
Grupo I (GI) – Grupo controle – sem implantação de biomaterial.
Grupo II (GII) – Grupo experimental – Implantação das microesferas
de hidroxiapatita/alginato.
4.2 BIOMATERIAL
Os biomateriais utilizados neste estudo, compósito de
hidroxiapatita/alginato, no formato de microesferas, foram produzidos no Centro
Brasileiro de Pesquisas Físicas (CBPF), a partir da mistura HA com alginato de
sódio, na proporção de 15:1. Esta mistura foi colocada em uma seringa e
gotejada em uma solução de cloreto de cálcio (CaCl
2
0,15M), em temperatura
ambiente. Instantaneamente, observou-se a formação de esferas de diferentes
tamanhos, em função das trocas iônicas entre o alginato de sódio e o cloreto
de cálcio (modelo egg-box). Em seguida, as esferas foram retiradas da
Período
(dias)
Grupos
15 45 90 120 Total
GI 6 6 6 6 24
GII 6 6 6 6 24
Total 12 12 12 12 48
23
solução, peneiradas, lavadas em água destilada e secadas na estufa a 37
0
C
por 24 horas.
As esferas utilizadas neste estudo não foram calcinadas, desta
forma não houve a etapa de aquecimento, não havendo, portanto, a eliminação
do alginato de sua composição, o que as caracteriza como compósitos à base
de hidroxiapatita e alginato (Figura 6), com diâmetro aproximado de 400 µm.
Figura 6. Vista macroscópica do compósito.
24
4.3 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO
Para a realização dos procedimentos cirúrgicos, os animais foram
submetidos à anestesia geral com injeção intramuscular de cloridrato de
quetamina
2
, na proporção de 0,1 mL/100 g de peso corporal e à sedação e
analgesia com dose única de injeção intramuscular de cloridrato de xilazina
3
,
na proporção de 0,04 mL/100 g de massa corpórea. Em seguida, os animais
foram tricotomizados na região de calvária e, posteriormente, realizou-se a anti-
sepsia do campo operatório com álcool iodado (Figura 7). Os mesmos foram
posicionados em decúbito ventral para a realização da cirurgia na calvária.
Figura 7. Anti-sepsia do campo operatório com álcool iodado.
2
Vetaset
®
, Fort Dodge
3
Coopazine
®
, Fort Dodge
25
A cirurgia iniciou-se com uma incisão bicoronal, com aproximadamente 5
cm de extensão, realizada com lâmina de bisturi nº15
4
(Figura 8), seguida de
divulsão com tesoura de extremidade reta e romba e elevação do retalho
cutâneo para o acesso ao periósteo. Em seguida, foi realizada uma incisão
linear no periósteo com lâmina de bisturi nº15, com aproximadamente 5 mm de
extensão e com uma espátula nº7
5
. Posteriormente, o periósteo foi elevado
(Figura 9) e removido com uma tesoura de ponta reta
6
, para a exposição do
tecido ósseo (Figura 10) e, em seguida, com o auxílio de uma fresa trefina
7
com 8,0 mm de diâmetro, montada em contra-ângulo
8
com redução de 1:16,
acoplado em motor cirúrgico
9
(Figura 11), com 1500 rpm, sob constante
irrigação com solução fisiológica, produziu-se o defeito ósseo (Figura 12 e 13)
circular transfixado, entre os vértices das suturas cranianas anterior e posterior.
Vale ressaltar que, a dura-máter não permanece no seu local, pois ela é
removida em conjunto com o tecido ósseo.
4
Becton-Dickinson
5
Duflex
6
Duflex
7
Dentoflex
8
Dentoflex
9
Driller
26
Figura 8. Incisão bicoronal na área posterior da calvária.
Figura 9. Elevação do periósteo.
27
Figura 10. Exposição do tecido ósseo posterior à remoção do periósteo.
Figura 11. Confecção do defeito ósseo com a fresa trefina.
28
Figura 12. Demarcação do defeito ósseo.
Figura 13. Defeito ósseo confeccionado na calvária.
29
4.4 IMPLANTAÇÃO DO BIOMATERIAL
Previamente à implantação dos biomateriais nos defeitos ósseos, as
microesferas foram acondicionadas em tubos tipo “eppendorf”
10
e esterilizadas
em autoclave
11
, à temperatura de 120
0
C por 30 minutos. Em seguida, as
mesmas foram implantadas com o auxílio de uma espátula nº 7 (Figura 14).
Após a implantação do compósito, o retalho foi reposicionado e
suturado com pontos interrompidos de fio de seda 4.0
12
, com o auxílio de um
porta-agulha
13
(Figura 15).
Figura 14. Implantação do compósito no interior do defeito ósseo.
10
Eppendorf
11
Dabi Atlante
12
Ethicon - Johnson & Johnson
®
13
Duflex
30
Figura 15. Sutura do retalho reposicionado.
4.5 OBTENÇÃO DAS CALVÁRIAS
Após os pontos biológicos correspondentes aos 15, 45, 90 e 120
dias de pós-operatórios, os animais foram sacrificados com injeção intra-
peritoneal de dose letal de anestésico de cloridrato de quetamina.
Posteriormente, com o auxílio de uma lâmina de bisturi nº 10
14
, realizou-se uma
incisão na região do pescoço para a remoção do tecido epitelial e muscular e,
em seguida, removeu-se toda a porção superior da calvária, utilizando-se
alicate de corte, tesoura e espátula nº 7. Assim, os espécimes foram obtidos e
14
Bencton Dickinson
31
colocados em recipientes plásticos identificados, contendo álcool a 70% como
fixador para a análise por microscopia óptica e, solução fixadora de Karnovisky
modificado (glutaraldeído 2,5%, paraformaldeído 4%, em tampão cacodilato de
sódio 0,2M pH 7.2-7.4) para a análise por microscopia óptica e eletrônica.
4.6 PROCESSAMENTO LABORATORIAL
4.6.1 Microscopia óptica
Os procedimentos laboratoriais foram realizados, em parte, de
acordo com o protocolo cedido pela Prof
a
. Dr
a
. Maria Eugênia Leite Duarte, do
Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal do Rio de Janeiro
(UFRJ) e pelos procedimentos do Laboratório de Bioengenharia Tecidual e
Biomateriais (LBTB), do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade
Federal da Bahia (UFBA). Previamente ao processamento histológico, os
espécimes foram reduzidos com o auxílio de discos de carburundum nº 409
15
acoplados em motor elétrico rotativo
16
, nas partes inferior, posterior e anterior
da calvária (Figura 16A). Nesta última, realizou-se um corte transversal na
região inicial do defeito (Figura 16B).
15
Dremel
16
Dremel
32
Posteriormente, os espécimes foram desidratados por uma série
crescente de soluções alcoólicas (70, 95 e 100%), clarificados em xilol e, por
fim, infiltrados, inicialmente, em solução contendo metil-metacrilato e di-butil-
ftalato, solução I, e, logo após, em soluções de metil-metacrilato, di-butil-ftalato
e peróxido de benzoíla em concentrações diferentes, soluções II e III. Após
estes procedimentos, realizou-se a inclusão das calvárias em vidros, contendo
bases semi-fluidas (solução III em estufa a 39
0
C, por 72 horas). Logo em
seguida, os espécimes foram recobertos com solução III fluida e os vidros
foram fechados com tampas rosqueáveis permanecendo na estufa a 39
0
C por,
aproximadamente, dois dias.
Figura 16A. Esquema de redução das calvárias para microscopia óptica.
Figura 16B. Esquema de secção transversal anterior na calvária.
Após a total polimerização da solução III, os vidros foram quebrados
e os blocos desbastados com o auxílio da fresa reta
17
, acoplada ao motor
elétrico rotativo (Figura 17A). Em seguida, estes foram desbastados no
micrótomo de alto impacto
18
para cortes de tecidos não descalcificados, até o
17
Dremel
18
Leica RM 2255
®
, Microsystems
33
diâmetro aproximado de 8,5 mm do defeito, o qual foi mensurado com um
compasso de ponta seca e uma régua milimetrada. Foram então realizados
doze cortes histológicos seriados de 6 µm (Figura 17B), os quais foram corados
por hematoxilina-eosina, picrossírius vermelho para fibras colágenas e
tricômico de Masson Goldner para tecido ósseo neo-mineralizado.
Figura 17A. Esquema do desbaste dos blocos.
Figura 17B. Esquema dos cortes histológicos por vista transversal.
4.6.2 Microscopia eletrônica de transmissão
Os espécimes foram inicialmente preparados no Laboratório de
Microscopia Eletrônica do Instituto Gonçalo Moniz da Fundação Oswaldo Cruz
(FIOCRUZ). O término da preparação, bem como as análises histológicas
foram realizadas no Laboratório de Biomineralização do Instituto de Ciências
Biomédicas da UFRJ.
Anteriormente à fixação, os espécimes foram reduzidos, com o
mesmo instrumento utilizado para a microscopia óptica, nas partes laterais,
34
anterior e posterior do defeito ósseo confeccionado na calvária, com
permanência de pequena quantidade de tecido ósseo circunjacente ao defeito
(Figuras 18A e 18B).
Figuras 18A e 18B. Esquema de redução das calvárias para microscopia eletrônica.
Desta forma, procedeu-se com a fixação em solução de Karnovisky
modificado em um período de 48 horas e, posteriormente, a amostra foi
dividida em quatro partes iguais, em forma de cruz, com o auxílio de navalha
para microtomia
19
. Estas amostras foram lavadas com tampão de cacodilato de
sódio 0,1M. Duas partes desta amostra foram pós-fixadas em tetróxido de
ósmio a 1% no tampão por 45 minutos, no escuro e a temperatura ambiente e,
as duas partes restantes da calvária foram excluídas da passagem pelo
tetróxido de ósmio.
Uma vez pós-fixado, o material foi novamente lavado em tampão
cacodilato de sódio 0,1M. Este material, bem como aqueles excluídos da pós-
fixação foram desidratados em concentrações crescentes de acetona: 15%,
30%, 50 %, 70%, 90 %, 100 % (duas vezes) e acetona super seco, por 10
19
Easy Path
®
, Dura Edge
35
minutos em cada etapa. Em seguida, as amostras foram incluídas em resina
Epóxi Polybed
20
, na proporção de 1:3 (resina:acetona), 1:1 e resina pura, com
o intervalo de 12 horas para cada troca. Após este período, foi realizado o
emblocamento das amostras em molde especial de silicone contendo a mesma
resina e, posteriormente, as mesmas foram mantidas a 60 ºC em estufa, por 72
horas, para a polimerização.
Posteriormente a polimerização, as amostras que foram excluídas
da pós-fixação foram seccionadas em duas partes e colocadas, longitudinal e
transversalmente, em lâminas para microscopia com cola
21
. Desta forma, as
amostras foram observadas, com lupa, e fotografadas.
Seções polidas do material incluído em resina Epoxi
Após este procedimento, estas amostras foram lixadas, com o
auxílio de lixas d’água nº 220 para a redução da espessura até
aproximadamente 70 µm, e polidos com lixas d’água nº 2000 com irrigação
constante em água corrente. A observação dos cortes foi realizada por campo
claro e microscopia de polarização
22
.
Cortes semi-finos do material incluído em resina Epoxi
As outras amostras foram cortadas no micrótomo
23
com espessura
aproximada de 2 a 3µm, secas em placa quente e coradas com azul de
toluidina e fucsina básica (células coram em tonalidade azul, osso cora em
tonalidades de rosa); azul de Richardson (1% de azul de metileno em Borax-
NaB
4
O
7
12H
2
O e 1% azur II em água destilada; células coram em tonalidades
de azul) e corante Masson Goldner (osso cora em verde, tecido osteóide cora
20
Polyscience
®
21
Superbonder
®
22
Zeiss – Modelo Axioplan
23
Bausch & Lomb
36
em abóbora). Após a evaporação, as lâminas foram lavadas em água corrente
e, quando secas, as lamínulas foram colocadas com a com a utilização de
resina
24
. Em seguida, os cortes foram analisados no microscópio óptico
25
e
fotografados com câmera
26
acoplada a este.
Cortes ultra-finos do material incluído em resina Epoxi
Para a análise por microscopia eletrônica, os blocos contendo o
material foram trimados manualmente. Este foram cortados com faca de
diamante, para a obtenção de cortes ultrafinos, com espessura entre 40 a 100
nm em ultramicrótomo
27
. Os mesmos foram coletados em grades de níquel,
previamente limpas em ácido fosfórico a 10%, contrastados em acetato de
uranila (20 min) e citrato de chumbo (3 min) e analisados no microscópio
eletrônico de transmissão
28
.
4.6.3 Microanálise de raios X
Os elementos presentes na região neoformada em torno do
biomaterial no ponto biológico de 120 dias, foram determinados utilizando o
sistema de microanálise de raios X (Noran-voyager) acoplado ao microscópio
de transmissão (JEOL 1200 EX com sistema de varredura do feixe ASID 4D).
O procedimento experimental baseia-se em concentrar o feixe de elátrons na
região de interesse, e analisar os raios X emitidos. Um espectro típico de raios
X obtido nestas condições, apresenta duas componentes: (1) “raio-X contínuo”,
24
Entellan
®
, Merck
25
Zeiss Axioplan
26
Evolution MP 5.0, Media Cybernetics
27
Bausch & Lombs
28
JEOL 1200EX
37
causado pela desaceleração dos elétrons incidentes ao interagirem com o
núcleo e a nuvem eletrônica, sem a ionização dos átomos,da amostra e (2)
“raios-X característicos”, resentes na forma de picos no espectro, devidos aos
decaimentos de elétrons de camadas mais externas dos átomos para
preencher vacâncias em camadas mais internas geradas pelo feixe incidente.
5 RESULTADOS
5.1 MICROSCOPIA ÓPTICA
5.1.1 Ponto biológico: 15 dias
Aos 15 dias, no grupo I, notou-se proliferação de capilares
sangüíneos e de fibras colágenas tanto na região central do defeito (Figura 19)
quanto nas bordas ósseas (Figura 20, 21 e 22), porém nesta última localização,
estas características foram mais proeminentes. Na região de interface do tecido
ósseo remanescente e o tecido mineralizado neoformado observou-se vasos
sangüíneos e células inflamatórias (Figura 23). Em análise por microscopia de
polarização pode-se observar que o tecido ósseo neoformado não apresenta
organização das fibrilas de colágeno semelhante ao osso pré-existente na
proximidades das bordas ósseas (Figuras 24A e 24B). (Nas figuras 24, 24A e
24B, o corte histológico tem direção sagital).
38
Figura 19. GI 15 dias: Na área central do defeito nota-se presença de vasos sangüíneos (VS) e fibras
colágenas (FC) – coloração: HE.
Figura 20. GI 15 dias: Região próxima ao tecido ósseo remanescente (TOR) com presença de vasos
sangüíneos (VS) e fibras colágenas (FC) – coloração: HE.
25 µm
VS
FC
TOR
25 µm
VS
FC
39
Figura 22. Borda óssea com presença de tecido fibroso. SETAS..... (PIFG) 40x
Figura 21. GI 15 dias: Vasos sangüíneos (VS) e fibras colágenas (FC) em proximidade ao tecido
ósseo remanescente (TOR) – coloração: picrossírus vermelho.
Figura 22. GI 15 dias: Região próxima à borda óssea com presença de fibras colágenas (FC) e vasos
sangüíneos (VS) – coloração: tricômico de Masson Goldner.
25 µm
VS
FC
TOR
25 µm
VS
FC
40
Figura 23. GI 15 dias: Região de interface entre tecido ósseo remanescente (TOR) e tecido
mineralizado (TM) com presença de vasos sangüíneos (VS) – coloração: azul de toluidina com fucsina
básica.
Figura 24A. GI 15 dias: Região próxima ao tecido ósseo remanescente (TOR), onde se observa a
formação de tecido mineralizado (TM) – coloração: azul de toulidina com fucsina básica.
Figura 24B. GI 15 dias: Imagem obtida por microscopia de polarização, da mesma região observada
na figura 24A. Notar que a região de neoformação óssea (área iluminada difusa) não apresenta
organização das fibrilas de colágeno como no tecido ósseo remanescente (área iluminada com fibrilas em
paralelo).
25 µm
TOR
TM
VS
TOR
TM
A
B
41
Neste período, no grupo II, observou-se deslocamento (Figura 25) e
fragmentação irregular das microesferas nas bordas ósseas (Figura 26) e na
área central do defeito (Figura 27). Foram observados vasos sangüíneos em
toda a extensão do defeito e reação inflamatória crônica granulomatosa com
presença de macrófagos e células gigantes multinucleadas (Figuras 28 e 29).
Neste ponto biológico notou-se, ainda, proliferação de tecido fibroso em direção
centrípeta, ou seja, das bordas ósseas para a região central do defeito (Figura
30). Nesta última região, as fibras colágenas são vistas em torno a grupos de
partículas ou emitindo pequenos septos que envolvem individualmente cada
fragmento de partícula (Figura 31). A formação de tecido neomineralizado foi
observada em duas regiões do defeito: associado às bordas ósseas e na área
central, próximo à dura-máter (Figuras 32 e 33).
Figura 25. GII 15 dias: Imagem de bloco de resina epóxi na região de borda óssea, onde se observa
fragmentação irregular e deslocamento do biomaterial (BM) próximo ao tecido ósseo remanescente (TOR)
– coloração: azul de Richardson.
TOR
BM
42
Figura 26. GII 15 dias: Região de borda óssea com presença de fragmentação irregular do biomaterial
(BM), próximo ao tecido ósseo remanescente (TOR) – coloração: HE.
Figura 27. GII 15 dias: Fragmentação irregular do biomaterial (BM) na região central do defeito –
coloração: HE.
100 µm
TOR
100 µm
BM
BM
BM
43
Figura 28. GII 15 dias: Imagem obtida próximo à borda óssea. Notam-se presença de vasos
sangüíneos (VS), macrófagos (M) e células gigantes multinucleadas (CG) próximos as partículas
fragmentadas do biomaterial (BM) – coloração: tricômico de Masson Goldner.
Figura 29. GII 15 dias: Área central do defeito onde se observa fragmentação irregular do biomaterial
(BM), vasos sangüíneos (VS) e células inflamatórias, como células gigantes multinucleadas (CG) e
macrófagos (M) – coloração: tricômico de Masson Goldner.
25 µm
VS
CG
M
BM
25 µm
BM
M
VS
BM
CG
44
Figura 30. GII 15 dias: Proliferação das fibras colágenas (FC) a partir do tecido ósseo remanescente
(TOR), encontrado nas bordas ósseas, de permeio às partículas do biomaterial (BM) – coloração:
picrossírus vermelho.
Figura 31. GII 15 dias: Área central do defeito com presença de septos de fibras colágenas (FC) ao
redor de partículas fragmentadas do biomaterial (BM) –coloração: picrossírus vermelho.
50 µm
BM
FC
TOR
50 µm
BM
BM
FC
45
Figura 32. GII 15 dias: Neoformação de tecido mineralizado (TM) próximo ao tecido ósseo
remanescente (TOR), encontrado nas bordas do defeito – coloração: tricômico de Masson Goldner.
Figura 33. GII 15 dias: Região central do defeito ósseo onde se observa neoformação de tecido
mineralizado (TM) próximo à dura-máter – coloração: tricômico de Masson Goldner.
50 µm
TM
TM
TOR
100 µm
TM
46
5.1.2 Ponto biológico: 45 dias
Aos 45 dias, no grupo I, notou-se tecido fibroso mais denso
comparado ao período anterior nas bordas ósseas (Figura 34), com redução,
em espessura, da área cicatricial, em toda extensão linear do defeito (Figura
35). Ademais, nestas duas localizações foram observados vasos sangüíneos
(Figuras 34 a 36). Na região em proximidade ao tecido ósseo remanescente
notou-se formação de tecido ósseo reparativo (Figuras 37A e 37B).
Figura 34. GI 45 dias: Presença de fibras colágenas (FC) e vasos sanguineos (VS) em proximidade
ao tecido ósseo remanescente (TOR) – coloração: picrossírus vermelho.
25 µm
TOR
VS
FC
47
Figura 35. GI 45 dias: Área central do defeito com redução em espessura da área cicatricial e
presença de fibras colágenas (FC) – coloração: HE.
Figura 36. GI 45 dias: Região de borda óssea com presença de vasos sangüíneos (VS) e tecido
mineralizado – coloração: tricômico de Masson Goldner.
25 µm
FC
25 µm
VS
TM
48
Figura 37A. GI 45 dias: Formação de tecido ósseo reparativo (TO) em íntimo contato com o tecido
ósseo remanescente (TOR) – coloração: azul de toluidina com fucsina básica.
Figura 37B. GI 45 dias: Imagem obtida por microscopia de polarização, da mesma região observada
na figura 37A. Observar a formação de tecido ósseo (área iluminada de forma irregular) em íntimo contato
com o tecido ósseo remanescente (área iluminada em feixes paralelos).
Neste ponto biológico, no grupo II, a fragmentação das esferas
aconteceu de forma irregular em toda a extensão do defeito, de similaridade ao
período anterior (Figuras 38 e 39), porém nas bordas ósseas notou-se tecido
mineralizado em contato com as partículas do compósito (Figura 39). Notou-se
resposta inflamatória crônica granulomatosa como presença de células
gigantes multinucleadas ao redor das esferas fragmentadas (Figuras 40 e 41).
Pode-se observar, em relação ao período anterior, na área central do defeito,
tecido fibroso mais denso formando septos ao redor das esferas fragmentadas
(Figura 42) e, nas proximidades das bordas ósseas, proliferação de fibras
colágenas em direção centrípeta (Figura 43). A formação de tecido ósseo
ocorreu, especialmente, ao redor dos fragmentos das microesferas (Figuras
44A e 44B).
A
B
B
TOR
TO
49
Figura 38. GII 45 dias: Região central do defeito, onde se pode observar a fragmentação irregular do
biomaterial (BM) – coloração: HE.
Figura 39. GII 45 dias: Imagem onde se observa o biomaterial (BM) fragmentado, próximo ao tecido
ósseo remanescente (TOR) das bordas do defeito. De permeio as partículas, pode-se notar a presença
de tecido mineralizado (TM) – coloração : HE.
50 µm
BM
BM
TOR
BM
TM
50 µm
50
Figura 40. GII 45 dias: Área central do defeito com presença de células inflamatórias, como
macrófagos (M) e células gigantes multinucleadas (CG) e partículas do biomaterial (BM) – coloração:
tricômico de Masson Goldner.
Figura 41. GII 45 dias: Região próxima à borda óssea onde se pode encontrar tecido mineralizado
(TM) ao redor das partículas do biomaterial (BM), com presença de macrófago (M) – coloração: tricômico
de Masson Goldner.
50 µm
50 µm
BM
CG
M
BM
M
TM
25 µm
51
Figura 42. GII 45 dias: Área central do defeito com formação de septos de fibras colágenas (FC) de
permeio ao biomaterial (BM) – coloração: picrossírus vermelho.
Figura 43. GII 45 dias: Proliferação de fibras colágenas (FC) nas proximidades do tecido ósseo
remanescente (TOR), encontrado nas bordas do defeito. As mesmas aparecem circundando partículas do
biomaterial (BM) – coloração: picrossírus vermelho.
50 µm
FC
BM
50 µm
FC
TOR
BM
52
Figura 44A. GII 45 dias: Imagem de bloco de resina epóxi na região de borda óssea, onde se observa
tecido ósseo remanescente (TOR) e formação de tecido mineralizado (TM) de permeio as partículas do
biomaterial (BM) – coloração: azul de Richardson.
Figura 44B. GII 45 dias: Imagem obtida por microscopia de polarização, da mesma região observada
na figura 44A. Notar que na região central da imagem aparece neoformação óssea em torno de cada
partícula (áreas iluminadas na figura), o que mostra grande potencial osteogênico do biomaterial,
especialmente quando fragmentado.
5.1.3 Ponto biológico: 90 dias
Aos 90 dias, no grupo I, em toda a extensão do defeito foi observada
proliferação de vasos sangüíneos e fibras colágenas (Figuras 45 a 48). Nas
bordas ósseas observou formação de tecido ósseo reparativo como nos pontos
biológicos anteriores (Figura 49A e 49B).
BM
TOR
TM
53
Figura 45. GI 90 dias: Região próxima ao tecido ósseo remanescente (TOR) com presença de vasos
sangüíneos (VS) e fibras colágenas (FC) – coloração: picrossírus vermelho.
Figura 46. GI 90 dias: Presença de vasos sangüíneos (VS) e fibras colágenas (FC) na região central
do defeito – coloração: picrossírus vermelho.
25 µm
25 µm
TOR
FC
VS
VS
FC
54
Figura 47. GI 90 dias: Presença de fibras colágenas (FC) em proximidade ao tecido ósseo
remanescente (TOR) – coloração: HE.
Figura 48. GI 90 dias: Região de proximidade ao tecido ósseo remanescente (TOR) com presença de
vasos sangüíneos (VS) e fibras colágenas (FC) – coloração: tricômico de Masson Goldner.
25 µm
25 µm
TOR
FC
FC
VS
55
Figura 49A. GI 90 dias: Formação de tecido ósseo reparativo (TO) na borda óssea do defeito (TOR -
tecido ósseo remanescente) – coloração: azul de toluidina com fucsina básica.
Figura 49B. GI 90 dias: Imagem obtida por microscopia por microscopia de polarização, da mesma
região observada na figura 49A. Observar formação óssea em contato com o tecido ósseo remanescente
(áreas iluminadas na figura).
Neste período, no grupo II, de forma semelhante aos outros
períodos, as esferas mantiveram-se fragmentadas com presença de tecido
mineralizado circundando-as (Figuras 50 e 51). Pode-se identificar resposta
inflamatória crônica granulomatosa com presença de células gigantes
multinucleadas e macrófagos. Estas células, juntamente com vasos
sangüíneos e conseqüente formação de tecido neomineralizado, foram
observadas circundando as partículas do biomaterial fragmentado (Figuras 52
a 55). Vale ressaltar que, visualizando o bloco de resina epóxi, pode-se
observar que os vasos sangüíneos se ramificam na direção do biomaterial
(Figura 54). Ainda neste período, notaram-se fibras colágenas em toda a
extensão do defeito, como observado nos períodos biológicos anteriores,
delineando as esferas fragmentadas, em grupos ou individualmente (Figuras 56
e 57).
TOR
TO
56
Figura 50. GII 90 dias: Área central do defeito, onde se observa tecido mineralizado (TM) ao redor das
partículas fragmentadas do biomaterial (BM) – coloração: HE.
Figura 51. GII 90 dias: Região próxima à borda óssea onde se observa tecido ósseo remanescente
(TOR) e tecido mineralizado (TM) de permeio as partículas do biomaterial (BM) – coloração: HE.
50 µm
BM
TM
TOR
50 µm
BM
BM
TM
57
Figura 52. GII 90 dias: Área central do defeito. De permeio ao biomaterial (BM) fragmentado, nota-se
células gigantes multinucleadas (CG) e tecido mineralizado (TM) – coloração: tricômico de Masson
Goldner.
Figura 53. GII 90 dias: Região próxima ao tecido ósseo remanescente (TOR) nas bordas do defeito,
onde se observa ao redor do biomaterial (BM) fragmentado, células gigantes multinucleadas (CG),
macrófagos (M) e tecido mineralizado (TM) – coloração: tricômico de Masson Goldner.
25 µm
CG
BM
TM
25 µm
BM
CG
M
TOR
TM
58
Figura 54. GII 90 dias: Imagem de bloco de resina epóxi onde está incluída a região do defeito crítico
produzido na calvária, observado em lupa com baixo aumento. Observam-se duas esferas (BM -
biomaterial), parcialmente fragmentadas, com presença de ramificações de vasos sangüíneos (VS) nas
suas direções.
Figura 55. GII 90 dias: Imagem de bloco de resina epóxi onde se observa neoformação de tecido
ósseo (TO) e vasos sangüíneos (VS) ao redor do biomaterial (BM) fragmentado – Material pós fixado com
tetróxido de ósmio, sem coloração adicional.
BM
BM
VS
VS
BM
TO
VS
59
Figura 56. GII 90 dias: Pode-se observar na área central do defeito septos de fibras colágenas (FC) e
tecido mineralizado (TM) circundando partículas do biomaterial (BM) fragmentado – coloração: picrossírus
vermelho.
Figura 57. GII 90 dias: Na região próximo as bordas do defeito, observa-se septos de fibras colágenas
(FC) envolvendo partículas do biomaterial (BM) – coloração: picrossírus vermelho.
50 µm
BM
FC
TM
50 µm
FC
BM
60
5.1.4 Ponto biológico: 120 dias
Após 120 dias, no grupo I, notou-se na maioria dos cortes
histológicos, em toda a extensão do defeito, fibrose mais densa comparada aos
pontos biológicos anteriores (Figuras 58 e 59). Observou-se discreta
proliferação vascular em toda a extensão do defeito, porém esta foi mais
evidente próximo às bordas ósseas (Figura 59). Em toda a extensão do defeito,
notou-se ausência de células inflamatórias e, na região central do defeito pode-
se observar núcleos de mineralização focal. Ademais, em proximidade às
bordas ósseas notou-se formação de tecido ósseo reparativo (Figura 60 e 61).
Figura 58. GI 120 dias: Área central do defeito com presença de tecido fibroso denso (FC - fibras
colágenas) – coloração: HE.
25 µm
FC
61
Figura 59. GI 120 dias: Região em proximidade à borda óssea do defeito com presença de vasos
sangüíneos (VS) e fibras colágenas (FC) – coloração: HE.
Figura 60. GI 120 dias: Área central do defeito com presença de núcleos de mineralização (TM -
tecido mineralizado) – coloração: tricômico de Masson Goldner.
FC
VS
25 µm
25 µm
TM
62
Figura 61. GI 120 dias: Região em proximidade ao tecido ósseo remanescente (TOR) onde se
observa vasos sangüíneos (VS), osteoblastos (OB) e formação de tecido mineralizado (TM) –
coloração: tricômico de Masson.
Figura 62. GI 120 dias: Formação de tecido ósseo (TO) próximo às bordas ósseas – coloração: azul
de toluidina com fucsina básica.
25 µm
VS
TM
TOR
OB
50 µm
TO
63
Neste período, no grupo II, a fragmentação das esferas mostrou-se
semelhante ao ponto biológico anterior. Em toda a extensão do defeito,
observaram-se vasos sangüíneos no interstício, interpondo os agrupamentos
de partículas fragmentadas (Figuras 63 e 64). Foi observada reação
inflamatória crônica granulomatosa, de semelhança aos períodos anteriores
(Figuras 65 e 66). Ainda, em toda a extensão do defeito, o tecido fibroso
mostrou-se mais denso, com a mesma disposição espacial, comparado com os
pontos biológicos anteriores (Figuras 67 e 68). Estas fibras colágenas
encontraram-se envolvendo as partículas do biomaterial fragmentado,
juntamente com tecido mineralizado (Figura 69). Houve formação de tecido
ósseo, ao redor das partículas (Figura 70), desde as bordas ósseas até a área
central do defeito (Figuras 71 e 72). Em algumas situações, as partículas
mostraram-se reunidas em diversos grupos circundados por tecido ósseo
disposto em lamelas, com presença de osteócitos (Figura 73). Em algumas
regiões em torno das partículas do biomaterial, não se observou claramente
tecido osteóide (Figura 74), enquanto em outras, observou-se tecido osteóide
em contato com osso neoformado, contendo células ósseas no seu interior
(Figura 75).
64
Figura 63. GII 120 dias: Área central do defeito com presença de tecido ósseo neoformado (TO) ao
redor das partículas do biomaterial (BM) fragmentado e vasos sangüíneos (VS) – coloração: HE.
Figura 64. GII 120 dias: Região próxima à borda óssea do defeito onde se observa partículas do
biomaterial (BM) fragmentado irregularmente, que estão envoltas por tecido ósseo (TO) e, presença de
vasos sangüíneos (VS) – coloração: HE.
50 µm
BM
TO
VS
50 µm
BM
VS
BM
TO
65
Figura 65. GII 120 dias: Área central do defeito com formação de tecido ósseo (TO) pelos
osteoblastos (OB) ao redor das partículas do biomaterial (BM). Nota-se presença de macrófagos (M) e
células gigantes multinucleadas (CG) – coloração: tricômico de Masson Goldner.
Figura 66. GII 120 dias: Região próxima as bordas do defeito. Notam-se macrófagos (M), células
gigantes multinucleadas (CG) e tecido mineralizado (TM) em proximidade ao biomaterial (BM) –
coloração: tricômico de Masson Goldner.
BM
TO
OB
25 µm
M
C
G
50 µm
CG
M
BM
TM
66
Figura 67. GII 120 dias: Nesta região em proximidade ao tecido ósseo remanescente (TOR) das
bordas do defeito, pode-se identificar partículas do biomaterial (BM) envoltas por septos de fibras
colágenas (FC) e tecido mineralizado (TM) – coloração: picrossírus vermelho.
Figura 68. GII 120 dias: Área central do defeito onde se observa fragmentos do biomaterial (BM)
reunidos em grupos e delineados por septos de fibras colágenas (FC) – coloração: picrossírus vermelho.
100 µm
BM
TOR
FC
TM
100 µm
FC
BM
67
Figura 69. GII 120 dias: Imagem em maior aumento da região apresentada anteriormente. Nota-se a
formação de tecido mineralizado (TM) e delineamento por fibras colágenas (FC) das partículas do
biomaterial – coloração: picrossírus vermelho.
Figura 70. GII 120 dias: Imagem obtida de bloco de resina epóxi onde se identifica tecido ósseo (TO)
com presença de osteócitos (OC) ao redor do biomaterial (BM).
50 µm
FC
BM
TM
BM
TO
OC
10 µm
68
Figura 71. GII 120 dias: Imagem de bloco de resina epóxi (corte longitudinal) onde se observam
esferas fragmentadas desde o tecido ósseo remanescente (TOR) até a área central do defeito (AC). Nota-
se a formação de tecido ósseo ao redor do biomaterial (BM) – coloração: azul de Richardson.
Figura 72. GII 120 dias: Imagem obtida por microscopia de polarização, da mesma região observada
na figura anterior. Notar a presença de tecido ósseo ao redor das esferas (áreas iluminadas na figura).
AC
TOR
TO
BM
69
Figura 73. GII 120 dias: Imagem de uma região de interface entre biomaterial (BM) e tecido ósseo
(TO) dispostos em lamelas, com presença de osteócitos (OC) – coloração: azul de toluidina com fucsina
básica.
Figura 74. GII 120 dias: Nesta região pode-se observar produção de matriz extracelular diferente do
tecido osteóide, ao redor do biomaterial (BM) – coloração: azul de toluidina com fucsina básica.
10 µm
TO
OC
BM
10 µm
BM
70
Figura 75. GII 120 dias: Região contendo o biomaterial (BM), osso neoformado (TO) e matriz osteóide
(MO). Nota-se presença de osteoblasto (OB) adjacente à matriz osteóide – coloração: tricômico de
Masson Goldner.
Figura 76. GII 120 dias: Imagem obtida por microscopia de contraste interferencial Nomarski. Notar a
formação de matriz osteóide (MO) e de tecido ósseo (TO) pelos osteoblastos (OB) de permeio ao
biomaterial (BM) – coloração: tricrômico de Masson Goldner.
10 µm
10 µm
BM
OB
MO
TO
10 µm
TO
BM
MO
OB
71
5.2 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO
Aos 120 dias, por meio da análise de Microscopia Eletrônica de
Transmissão (MET), analisou-se a região do compósito bem como o tecido
circunvizinho, na área central do defeito. Da mesma forma que nas imagens
histológicas, verificou-se que em algumas áreas não houve mineralização em
torno do biomaterial, sendo este envolvido por tecido conjuntivo e por células
(Figura 77). Em outras situações, notou-se tecido mineralizado neoformado
muito próximo aos fragmentos do biomaterial (Figuras 78 e 79). A deposição de
minerais ocorreu nas regiões ricas em fibrilas de colágeno, sendo que
aparentemente o início da mineralização se deu entre estas fibrilas (Figuras 79
e 80), possivelmente como resultado da presença dos produtos mineralizados
das vesículas da matriz. Em regiões de mineralização mais intensa, observou-
se maior definição das regiões dos “gaps” das fibrilas, o que caracteriza
tipicamente mineralização nesta região (Figura 81). Nas situações onde houve
formação de tecido ósseo em torno dos fragmentos do biomaterial, foi possível
distinguir uma terceira região, estreita e diretamente em contato com o
biomaterial, que não se encontra mineralizada. Denominamos esta região, por
comparação com processo conhecido de formação óssea, de “linha
cimentante”, embora este ponto ainda deva ser esclarecido (Figuras 81, 82 e
83). (Observar comentário mais adiante sobre os espectros de microanálise de
raios X).
72
Figura 77. Região de implantação do compósito no defeito ósseo confeccionado em calvária de rato.
Ausência de mineralização em torno do biomaterial (região eletrondensa acima, à esquerda). Presença de
célula envolvendo o biomaterial (estrela). Detalhe das nanopartículas de hidroxiapatita (inserto). Barra =
120nm.
73
Figura 78. Presença de fibrilas de colágeno com bandeamento típico (setas), e depósitos minerais
entre as fibrilas (regiões eletrondensas). Barra = 0,5 µm.
Figura 79. Área correspondendo ao início da mineralização de tecido ósseo próximo ao biomaterial
(não visível na imagem), com presença de fibrilas de colágeno com bandeamento típico (setas). Barra =
0,5 µm.
74
Figura 80. Detalhe em grande aumento de uma região semelhante à da imagem anterior, mostrando o
início da mineralização óssea, próximo ao enxerto (não visível na imagem). A mineralização (regiões
eletrodensas) localiza-se na região entre as fibrilas de colágeno. Bandeamento típico das fibrilas (setas).
Barra = 250nm.
Figura 81. Região em estágio avançado de mineralização em torno do biomaterial (BM). O contraste
intenso na região dos “gaps” (setas) das fibrilas indica presença de tecido mineralizado. Barra= 400nm
75
Figura 82. Três regiões de natureza distinta relacionadas ao biomaterial (BM) em áreas onde houve
mineralização envolvendo o material; “linha cimentante” (LC); matriz mineralizada rica em colágeno do
tipo I (COL). Barra = 400 nm.
Figura 83. Região mineralizada em torno do biomaterial (BM), com área não mineralizada intercalada
entre o biomaterial e a matriz mineralizada rica em fibrilas de colágeno (COL). Barra = 450nm.
76
5.3 MICROANÁLISE DE RAIOS-X
Espectros de microanálise de raios X das três regiões descritas
acima foram obtidos. Verifica-se qualitativamente que a relação Cálcio/Fósforo
nos espectros diferiu sensivelmente. Na região correspondente ao fragmento
do biomaterial (Figura 84A) esta razão pode ser considerada como a
estequiométrica para hidroxiapatita. A região imediatamente adjacente ao
biomaterial (Figura 84B) apresentou pico representativo de fósforo, entretanto
ausência de cálcio. Já a região onde se observou tecido ósseo em formação
(Figura 84C), apresentou ambos os elementos, mas com relação
Cálcio/Fósforo inferior à do biomaterial, o que é compatível com tecido ósseo
em formação, onde há presença de material orgânico e de minerais amorfos
(Figura 84C).
O fato de não se ter observado cálcio na região contígua ao material
levanta a questão sobre a sua natureza: está por ser esclarecido se nesta
região há presença de vesículas da matriz e osteopontina, o que caracterizaria
início de calcificação (e portanto se justificaria a denominação de “linha
cimentante”), ou se ali se encontram vestígios do alginato, o qual não teria sido
absorvido pelo tecido mesmo após os 120 dias do ensaio.
77
A
B
78
Figura 84. As figuras acima representam espectros EDS das regiões: A. Nanopartículas do
biomaterial; B. região circundante próxima ao biomaterial; C. região com tecido ósseo em formação. Notar
que a região que circunda o material, não contém cálcio, e que a região de tecido ósseo em formação
apresenta relação Cálcio/Fósforo inferior à das partículas de hidroxiapatita.
C
79
6 DISCUSSÃO
Os avanços científicos e tecnológicos na área da Bioengenharia
Tecidual Óssea, nas últimas décadas, têm possibilitado o aperfeiçoamento das
técnicas regenerativas já descritas, desenvolvimento de novas técnicas, bem
como elaboração de novos biomateriais (MIGUEL e outros, 2006).
A utilização clínica das biocerâmicas, especificamente àquelas
derivadas do fosfato de cálcio, é favorecida em função de suas propriedades
biológicas de biocompatibilidade, bioatividade e osteocondução (STOCUM,
1998; ANSELME e outros, 1999; YUAN e outros 2002; PELISSIER e outros,
2003; MASTROGIACOMO e outros, 2005; LEVENTOURI, 2006; DE LONG
JUNIOR e outros, 2007). Contudo, seu uso clínico pode ser limitado devido sua
alta fragilidade (SACHLOS e CZERNUSZKA, 2003; BENAQQA e outros, 2005;
REZWAN e outros, 2006) e ausência de propriedades osteoindutoras
(STOCUM, 1998; PELISSIER e outros, 2003; DE LONG JUNIOR e outros,
2007). Desse modo, estes biomateriais têm sido utilizados com êxito na
regeneração óssea apenas em defeitos relativamente pequenos (ANSELME e
outros, 1999; MASTROGIACOMO e outros, 2005).
Diante destas limitações, alguns autores têm utilizado estas
biocerâmicas em associação com células da linhagem osteogênica (ANSELME
e outros, 1999; MASTROGIACOMO e outros, 2005), fatores de crescimento
80
(PELISSIER e outros, 2003; DE LONG JUNIOR e outros, 2007) ou proteínas
ósseas morfogenéticas (BMPs) (DE LONG JUNIOR e outros, 2007), bem como
a outros tipos de biomateriais, como por exemplo, polímeros naturais
(NEUMANN e EPPLE, 2006) ou sintéticos (WANG, 2003; NEUMANN e EPPLE,
2006), caracterizando os compósitos.
O desenvolvimento destes compósitos requer ensaios experimentais
in vitro, para avaliar a citocompatibilidade e in vivo para estudar suas
interações teciduais, biocompatibilidade, velocidade de degradação e potencial
osteogênico, previamente à sua aplicação clínica, o que garante segurança e
eficácia. Durante a realização destes experimentos, diversos modelos animais
têm sido utilizados, tais como: camundongos, coelhos, ovelhas, cães e ratos.
Em consonância com o exposto, este trabalho utilizou o rato como modelo
animal, especialmente pela disponibilidade de aquisição, fácil manutenção e
manipulação (MOREIRA e outros, 2003), com o objetivo de estudar a resposta
tecidual da implantação de um compósito de HA e alginato, no formato de
microesferas, em defeitos ósseos críticos, cirurgicamente confeccionados na
calvária destes animais.
Segundo Schimitz e Hollinger (1986) este modelo experimental,
defeitos ósseos críticos, não se regeneram ao longo da vida do animal e,
portanto, são adequados para avaliar o potencial osteogênico de biomateriais
destinados à regeneração óssea. Contudo, a dimensão exata do diâmetro
destes defeitos (no estudo de regeneração óssea) é bastante controversa, haja
vista que alguns estudos utilizam defeitos com 4 mm (ROCHA e outros, 2004),
5 mm (BOSCH, MELSEN, VARGERVIK, 1998; CACCIAFESTA e outros, 2001),
6 mm (BRUNEL e outros, 1996; GÓMEZ e outros, 2006) e 8 mm (TAKAGI e
81
URIST, 1982; HOLLINGER 1986; SCHMITZ e outros, 1990; MARDEN e outros,
1994; FERREIRA e outros, 2004; CARDOSO e outros, 2006; MIGUEL e outros,
2006; INTINI e outros, 2007).
Todos os trabalhos supracitados que utilizaram defeitos com 8 mm
de diâmetro, apresentaram resultados histológicos com neoformação óssea
restrita às bordas, em aproximadamente 3 mm de extensão, com
preenchimento da área remanescente com tecido conjuntivo fibroso, o que
também foi encontrado nos animais do grupo controle de nosso estudo, sem
implantação do biomaterial, em todos os pontos biológicos, ratificando que
diâmetro de 8 mm é o mais apropriado, visto que nesta dimensão os
mecanismos de osteocondução e osteoindução apresentam-se limitados
(MIGUEL e outros, 2006).
A maioria dos compósitos é fabricada no formato de blocos, no
entanto a utilização de microesferas neste trabalho, possibilitou a migração e
proliferação celular devido à presença de espaços entre estas, resultantes da
disposição espacial das mesmas no sítio de implantação (MARINS e outros,
2004), o que favorece a angiogênese e a regeneração óssea (WU e outros,
2004). Entretanto, verificou-se que manter as esferas no volume do defeito
ósseo sem a utilização de membranas biológicas é uma tarefa difícil
(MUNTING e outros, 1993; KURASHINA e outros, 1998; MARINS e outros,
2004), haja vista seu deslocamento pós-cirúrgico observado durante toda a
fase experimental deste estudo, provavelmente em função da ausência de
substrato de união entre as partículas, posição da cabeça do animal durante a
fase do sono, bem como ao prurido característico da fase cicatricial da derme.
82
No intuito de suprimir tais limitações técnicas, tem-se associado o
uso de membranas aos biomateriais, baseado nos conceitos de regeneração
óssea guiada (ROG) (DAHLIN e outros, 1988; AUTOUN e outros, 2001;
GERBI, 2001; PINHEIRO e outros, 2003b), com a manutenção do periósteo ou
o uso de membranas biológicas. Todavia, neste estudo não foi utilizado esta
técnica, pois o periósteo, como membrana conjuntiva, é abundante em vasos
sangüíneos, células osteogênicas e fibroblásticas, em sua constituição (ALLEN,
HOCK, BURR, 2004), o que poderia interferir em nossos resultados, se
mantido sobre as microesferas implantadas.
Sabendo-se que os biomateriais desenvolvidos para a bioengenharia
tecidual óssea, devem atuar como arcabouços tridimensionais com poros
interconectados e área de superfície que favoreçam as atividades celulares de
migração, proliferação e diferenciação (FARAJ, Van KUPPEVELT, DAAMEN,
2007), bem como a angiogênese no interior de sua estrutura (EISELT e outros,
2000; YUAN e outros 2002; KARAGEORGIOU e outros, 2005;
MASTROGIACOMO e outros, 2005; REZWAN e outros, 2006), e quando
necessário, devem ter biodegradação controlada (MASTROGIACOMO e
outros, 2005), é válido ressaltar que, quando estes arcabouços são produzidos
por materiais cerâmicos e/ou compósitos, o grau de solubilidade destes,
resultante da temperatura de confecção, pode interferir no crescimento celular
(TAMPIERI e outros, 2005). Assim, compósitos de HA e alginato preparados
com temperatura de 20
0
C tem uma solubilidade menor quando comparado
aqueles confeccionados com 35
0
C. Esta menor solubilidade possibilita o
crescimento celular na superfície do compósito, bem como no interior do
arranjo tipo “egg-box” (TAMPIERI e outros, 2005). Em nosso estudo, foi
83
possível observar em todos os pontos biológicos no grupo experimental,
neoformação óssea de permeio às partículas fragmentadas do compósito,
apesar da temperatura de preparação do compósito utilizado no nosso estudo
diferir a do biomaterial estudado no trabalho supracitado.
Durante os procedimentos cirúrgicos realizados para a confecção
dos defeitos críticos, há ruptura vascular que incita uma resposta tecidual com
migração de células inflamatórias (THOMSEN e outros, 2000; ROSA, 2001).
No nosso estudo aos 15 dias observou-se inflamação crônica nos dois grupos,
porém no grupo experimental esta se caracterizou como granulomatosa,
possivelmente em função da biodegradação das microesferas. No grupo
controle, nos pontos biológicos restantes, não foram identificado células
inflamatórias. No entanto, no grupo experimental a inflamação crônica
manteve-se presente, de permeio às partículas, durante todo o período
experimental, devido pelo menos, em parte, à presença constante de
microfragmentos de HA que estimulam células fagocíticas.
Vale ressaltar que, cerâmicas de fosfato de cálcio quando interagem
com os fluidos teciduais após sua implantação, apresentam degradação. Este
mecanismo resulta em dissolução dos seus cristais, com o aumento da
concentração local de íons cálcio (Ca
+2
) e fosfato (PO
4
-3
), favorecendo a
precipitação do fosfato de cálcio nos microporos do biomaterial
(ROHANIZADEH e outros, 1999), a qual deve ocorrer simultânea à
neoformação óssea (STOCUM, 1998; ROHANIZADEH E OUTROS, 1999;
MASTROGIACOMO E OUTROS, 2005).
Concomitante à reação inflamatória, há liberação de citocinas e
fatores de crescimento que recrutam células mesenquimais indiferenciadas e
84
fibroblastos (REDDI, WIENTROUB, MUTHUKUMARAN, 1987). A proliferação
destes foi observada, de maneira progressiva, em todos os grupos e pontos
biológicos deste estudo. Porém, no grupo experimental, os septos fibrosos
encontraram-se ao redor do tecido neomineralizado adjacente às partículas
fragmentadas. Este resultado foi semelhante ao de Kuboki e outros (1998),
onde a formação tecidual óssea ocorreu dentro dos poros do biomaterial e o
tecido fibroso ao redor das partículas. Ademais, é válido ressaltar que, a
neoformação óssea acontece a partir das paredes circundantes do defeito em
direção centrípeta (CACCIAFESTA e outros, 2001), dado este observado em
todos os pontos biológicos do grupo experimental. Em algumas áreas do grupo
experimental, observou-se tecido ósseo neoformado tanto em torno de
partículas individualizadas como em torno de grupos de partículas do
biomaterial, em regiões diversas do defeito, dando a impressão de que ali o
material se mostrou osteoindutor. Isto pode estar relacionado com a presença
do alginato no compósito, o qual forma polímeros altamente aniônicos (ricos
em grupamentos carboxila), com potencial para adsorver moléculas
importantes da matriz extracelular no contexto da biologia do tecido ósseo,
induzindo localmente a diferenciação de osteoblastos. Neste caso, o material
não seria osteoindutor por si, mas ao longo do tempo, teria potencial para
adsorver moléculas relevantes no processo de indução da formação do tecido.
Os mecanismos envolvidos na mineralização e, conseqüentemente,
na neoformação óssea, são complexos e envolvem a interação de vários
fatores biológicos e físico-químicos. De acordo com Landis e Silver (2002), a
deposição inicial de minerais nas fibrilas de colágeno acontece em locais
distintos e de forma independente, como na região entre as fibrilas, e na região
85
dos “gaps”. Estes dados foram observados em nosso estudo, por MET, aos
120 dias após a implantação do biomaterial, onde a mineralização iniciou-se
entre as fibrilas de colágeno, provavelmente por vesículas da matriz, e
posteriormente nas regiões de “gaps” das moléculas de colágeno, o que
mimetiza a mineralização do tecido ósseo fisiológico.
Fato a destacar foi a presença de uma camada fina não
mineralizada entre o biomaterial e o tecido ósseo neoformado, nas regiões
onde houve mineralização em torno do implante. Denominamos, neste
trabalho, esta região de “linha cimentante”; entretanto, se faz necessário
estudar detalhadamente sua natureza, pois visando a utilização potencial do
biomaterial estudado nesta dissertação, devemos nos direcionar para sua
otimização. Se a área não mineralizada contiver alginato, será importante rever
a proporção hidroxiapatita/alginato no compósito, bem como a idéia tomada a
priori, de que esta substância é adsorvida pelo organismo em período de tempo
curto.
Diante do exposto, defeitos ósseos críticos consistem em um grande
desafio na área biomédica, pois os mecanismos naturais de reparo são
limitados. Desta forma, o desenvolvimento e a utilização de novos biomateriais
para a regeneração óssea nestas situações tornam-se promissores, como os
compósitos de hidroxiapatita e alginato analisados neste estudo, os quais
demonstraram ser biocompatíveis e osteocondutores. Entretanto, para a
regeneração óssea em situações clínicas com defeitos de dimensões críticas é
necessário a utilização de biomateriais com propriedades osteoindutoras.
Assim, sugere-se a realização de novos estudos com este biomaterial em
outros sítios de implantação.
86
7 CONCLUSÃO
De acordo com os resultados experimentais obtidos neste estudo,
pode-se concluir que:
• O compósito avaliado, formado por microesferas de
hidroxiapatita/alginato, mostrou-se biocompatível;
• O biomaterial implantado mostrou-se osteocondutor com
deposição de minerais, entre as fibrilas de colágeno e nas
regiões de “gaps”, mimetizando a osteogênese fisiológica;
• O modelo experimental empregado, defeito crítico em calvária
de rato, foi apropriado para avaliar a capacidade regenerativa
deste novo biomaterial;
87
• Encontrou-se nas áreas onde houve mineralização, em torno
do biomaterial, três regiões distintas: o biomaterial rico em
hidroxiapatita, uma região contígua contendo fósforo, mas
não cálcio e região de ossificação inicial contendo fibrilas de
colágeno e fosfato de cálcio com razão cálcio/ fósforo menor
do que a região do biocompósito;
• Estudos adicionais são necessários para avaliar o potencial
osteoindutor deste compósito.
88
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