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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS – UFAL
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE - ICBS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
DA SAÚDE
ESTUDO DA ATEROSCLEROSE INDUZIDA POR DIFERENTES
TIPOS DE DIETA HIPERLIPÍDICA EM COELHOS ALBINOS
(Oryctolagus cuniculus)
Dissertação de Mestrado
José André Bernardino dos Santos
Maceió-Al
agosto de 2008
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS – UFAL
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE - ICBS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
DA SAÚDE
ESTUDO DA ATEROSCLEROSE INDUZIDA POR DIFERENTES
TIPOS DE DIETA HIPERLIPÍDICA EM COELHOS ALBINOS
(Oryctolagus cuniculus)
José André Bernardino dos Santos
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências da
Saúde da Universidade Federal de Alagoas,
como pré-requisito para a obtenção do título de
Mestre em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Célio Fernando de Sousa Rodrigues
Maceió-Al
agosto de 2008
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B523
BERNARDINO, José André dos Santos
Estudo da aterosclerose induzida por diferentes tipos de dieta hiperlipídica em coelhos albinos
(Oryctolagus cuniculus). [manuscrito] / José André dos Santos Bernardino. - 2008.
Xi, 80f.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Alagoas. Inst.
De Ciências Biológicas e de Saúde. Programa de Pós-Graduação em
Ciências da Saúde.
Orientação: Dr. Célio Fernando de Sousa Rodrigues
1. Aterosclerose. 2. Dieta I. Título II. Autor
CDU 616.13-
004.6
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS – UFAL
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE - ICBS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
DA SAÚDE
Membros da Comissão Julgadora da Dissertação de Mestrado de José André
Bernardino dos Santos, apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências
da Saúde da Universidade Federal de Alagoas, em 14/ 08/ 2008.
Comissão julgadora:
-----------------------------------------------------------------------------
Prof. Dr. Célio Fernando de Sousa Rodrigues (Orientador - ICBS UFAL)
-----------------------------------------------------------------------------
Prof. Dr. Mário Jorge Jucá (FAMED-UFAL)
-----------------------------------------------------------------------------
Prof. Dr. Márcio Antônio Babinski (Universidade Federal Fluminense)
-----------------------------------------------------------------------------
Prof. Dr. Euclides Maurício Trindade Filho (Uncisal)
-----------------------------------------------------------------------------
Prof. Dr. Francisco Carlos Pereira (suplente – ICBS/UFAL)
iv
"O justo olha pela vida dos seus animais."
Provérbios 12:10
v
DEDICATÓRIA
A Deus.
A minha família que sempre ajudou de todas as formas.
Um agradecimento especial à minha esposa, Yarandi Macedo dos Santos a quem
devo todo o apoio e entusiasmo que me foram decisivos no mestrado e aos meus
filhos, Luiz André e Álvaro Levi que suas ternuras inspiraram tranqüilidade e desejo
de alcançar o objetivo pretendido. Agradeço de coração aberto ao meu amigo pela
sua grande força, estímulo e seus ensinamentos e que a todo instante foi meu ponto
de apoio: Célio Fernando de Sousa Rodrigues não deixaria também de agradecer.
vi
AGRADECIMENTO
À Universidade Federal de Alagoas, que através de seus professores valorosos
conseguiram abrir as portas para o mestrado e assim termos o privilégio de realizar
nossos sonhos de realizar mestrado.
Ao orientador no mestrado, Célio Fernando de Sousa Rodrigues, com extrema
competência, sabedoria e atenção com que me orientou para o meu engajamento no
meio experimental.
Todos os membros do grupo de pesquisa em aterosclerose que de uma forma ou de
outra acrescentaram muito neste trabalho.
Aos professores Antonio José Casado Ramalho, Katharina Jucá, Rodrigo Freitas,
Walter Toledo de Lima, Fernando Wagner que contribuirão deveras para consolidar
minha pesquisa experimental e que muitas vezes me substituíram na minha
ausência no meu trabalho.
Ao prof. Mauro Guilherme de Barros Quirino Martins, diretor da Faculdade de
Ciências Biológicas e da Saúde –FCBS –CESMAC, que através de seus estímulos e
permissão para realização dos experimentos da Faculdade de medicina Veterinária.
A Professora Flaviana Santos Wanderley, pela atenção e toda preocupação com o
manejo dos coelhos na cunicultura.
A todos os meus colegas do laboratório de Anatomia Humana e Animal: Carlos,
Júnior, Girleide, Nazaré, Anacleto e Petrúcio por terem me ajudado, tanto no reforço
positivo como no material para dissecação dos animais.
Ao senhor, Elinaldo, o obrigado por ter me ajudado tanto durante os experimentos. A
professora Teresinha do curso de nutrição da Universidade Federal de Alagoas que
me deu toda atenção durante a formatação do projeto. A Delma do laboratório de
histologia da ICBS e o Maciel do Hospital Universitário pela atenção e ajuda nos
preparos das lâminas histológicas e a minha amiga Claudjane que me ajudou
ativamente nos experimentos. A todos aos meus professores de Pós-graduação,
muito obrigado pela dedicação, interesse, seus conhecimentos e experiências
compartilhadas nas aulas.
vii
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS...............................................................................ix
RESUMO..............................................................................................................x
ABSTRACT.........................................................................................................xi
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................1
2. REVISÃO DA LITERATURA...........................................................................3
2.1 ATEROSCLEROSE........................................................................................4
2.2 FORMAÇÃO DA PLACA ATEROSCLERÓTICA ..........................................5
2.3 CLASSIFICAÇÃO DAS LESÕES ATEROSCLERÓTICAS............................7
2.3.1 LESÃO DO TIPO I......................................................................................7
2.3.2 LESÃO DO TIPO II.....................................................................................8
2.3.3 LESÃO DO TIPO III....................................................................................9
2.3.4 LESÃO DO TIPO IV ...................................................................................9
2.3.5 LESÃO DO TIPO V .................................................................................. 9
2.3.6 LESÃO DO TIPO VI .............................................................................. 10
2.4 MODELO EXPERIMENTAL DE ATEROGÊNESE EM COELHOS ............ 10
2.5 HEMOANÁLISE EM COELHOS COM DIETA ATEROGÊNICA ................. 14
3. MATERIAL E MÉTODO ............................................................................... 20
3.1 AMOSTRA .................................................................................................. 21
3.2 RANDOMIZAÇÃO DA AMOSTRA ............................................................. 22
3.3 DIETA ........................................................................................................ 23
3.4 PREPARO E ADMINISTRAÇÃO DA DIETA ATEROGÊNICA .................. 24
3.5 DOSAGEM BIOQUÍMICA .......................................................................... 25
viii
3.6 EUTANÁSIA E HISTOPATOLOGIA .......................................................... 26
3.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................................... 27
4. RESULTADOS ............................................................................................. 28
4.1 ADAPTAÇÃO À DIETA ............................................................................. 29
4.2 TAXAS DE COLESTEROL ........................................................................ 33
4.2.1 COLESTEROL TOTAL POR GRUPOS ................................................. 33
4.2.2 COLESTEROL HDL .............................................................................. 34
4.2.3 COLESTEROL LDL ................................................................................ 35
4.3 DOSAGENS DE TRIGLICERÍDEOS ......................................................... 36
4.4 PESO DO ANIMAL ..................................................................................... 37
4.5 ALTERAÇÕES CUTÂNEAS E FECAIS ..................................................... 38
4.6 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA ................................................................. 41
5. DISCUSSÃO ................................................................................................ 49
5.1 ADAPTAÇÃO À DIETA .............................................................................. 50
5.2 COLESTEROLEMIA .................................................................................. 51
5.3 DOSAGENS DE TRIGLICERÍDEOS .......................................................... 53
5.4 PESO DO ANIMAL .................................................................................... 54
5.5 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA ................................................................ 56
6. CONCLUSÕES ............................................................................................ 59
REFERÊNCIAS ............................................................................................... 61
REFERÊNCIAS CONSULTADAS .................................................................. 69
APÊNDICES .................................................................................................... 71
ANEXOS .......................................................................................................... 77
ix
LISTA DE ABREVIATURAS
AHA AMERICAN HEART ASSOCIATION
COLEST COLESTEROL
G1 GRUPO 1 - CONTROLE
G2 GRUPO 2 - COLESTEROL 1 g
G3 GRUPO 3 - GEMA 20 ml
G4 GRUPO 4 - BANHA 20 ml
G5 GRUPO 5 - GEMA 40 ml
G6 GRUPO 6 - BANHA 40 ml
HDL-c LIPOPROTEÍNA DE ALTA DENSIDADE
IM INTRA-MUSCULAR
IV INTRA-VENOSA
LDL-C LIPOPROTEÍNA DE BAIXA DENSIDADE
NS NÃO SIGNIFICANTE
vs VERSUS
x
RESUMO
A gema de ovo de galinha e a banha do porco, em relação aos outros alimentos, têm
alto índice de colesterol total. 20 ml de gema apresenta em média 200 mg de
colesterol total e 20 ml de banha valor médio de 14 mg de colesterol total. São bons
alimentos para experiências referentes à colesterolemia, são de baixo custo
comparando-os com colesterol puro. Métodos: Foram utilizados coelhos da Nova
Zelândia (n=42) adultos entre 7 a 8 meses de idade divididos em grupos de 4: grupo
controle com ração 200 g e água ad libitum (G1); o grupo tratado com 1 g de
colesterol (G2); grupo tratado com 20 ml gema de ovo (G3); grupo tratado com 20 ml
de banha (G4); grupo (G5) tratado com 40 ml de gema e o grupo (G6) tratado com
40 ml de banha. Todos os grupos foram alimentados durante o período de 100 dias
tendo como objetivo verificar qual das dietas é melhor para indução da
aterosclerose. A coleta de sangue para as dosagens do perfil lipídico dos animais
aconteceram nos momentos 0, 30, 60 e 100 dias. Ao término do período
experimental, os animais foram submetidos à eutanásia. Segmentos do arco aórtico,
da artéria carótida direita e artéria femoral direita foram coletados para análise
histológica. Resultados: Como esperado o grupo G1 não observou alteração, o
grupo G2 formação leve de aterosclerose, o grupo G3 obteve aumento significante
(p<0,05) nos níveis de colesterol total, o grupo G4 não foram identificada alterações
histológicas e o G5 e G6 não se adaptaram a dieta administrada. Ao exame
microscópico, foram observadas células espumosas no arco aórtico, femoral e
carótida e espessamento de endotélio no grupo G3 de forma significante
comparando-os ao G2. Conclusão: A dieta enriquecida com gema de ovo de
galinha é a melhor opção para formação de células espumosas e espessamento de
endotélio, é prática e de baixo custo para pesquisas com colesterolemia e
aterosclerose.
Palavras-chave: Aterosclerose, gema de ovo, banha de porco, células espumosas,
colesterol.
xi
ABSTRACT
The egg yolk chicken and pork lard as compared with other foods, have high
cholesterol. 20 ml of gem shows on average 200 mg cholesterol and 20 ml of lard
average value of 14 mg of cholesterol. Good food for experiences concerning
cholesterol, are low cost compared them with cholesterol powder. Method: We used
rabbits of New Zealand (n = 42) adults from 7 to 8 months of age divided into groups
of 4: control group diet with 200 g and water ad libitum (G1), the group treated with 1
g of cholesterol (G2); group treated with 20 ml egg yolk (G3); group treated with 20
ml of lard (G4); group (G5) treated with 40 ml of yolk and the group (G6) treated with
40 ml of lard. All groups were fed during the period of 100 days with the aim of
verifying which of the diet is best for induction of atherosclerosis. The blood collection
for the dosages of the lipid profile of animals occurred at times 0, 30, 60 and 100
days. At the end of the trial period, the animals were subjected to euthanasia.
Segments of the aortic arch, the right carotid artery and right femoral artery were
collected for analysis histological. Results: As expected the group G1 not noticed
amendment, the group G2 training light of atherosclerosis, the group returned G3
significant increase (p <0,05) in total cholesterol levels, the group G4 were not
identified histological changes and G5 and G6 is not adapted the diet administered.
By microscopic examination, were observed foam cells in the aortic arch, and femoral
and carotid thickening of endothelium in the group G3 so significant comparing them
with the G2. Conclusion: The diet enriched with egg yolk, chicken is the best option
for formation of foam cells and thickening of endothelium, is practical and low cost for
research on cholesterol and atherosclerosis.
Key words: Atherosclerosis, egg yolk, pork lard, foam cells, cholesterol.
1
1. INTRODUÇÃO
2
A aterosclerose é responsável pelo maior índice de morbidade e
mortalidade que ocorre no mundo. Esta doença é encontrada nas artérias e ocorre
inicialmente através do acúmulo de colesterol e proliferação de células musculares
lisas no endotélio, que leva a sua inflamação. Este fenômeno originará uma placa
fibrosa que se projeta para dentro do lúmen do vaso, levando a uma série de
complicações circulatórias (CORRÊA-CAMACHO et al., 2007). Para realização de
experimentos que envolva a formação da aterosclerose, os coelhos são os melhores
modelos, devido à excreção lenta do colesterol exógeno e desenvolvimento da
doença de forma rápida, ocasionando lesões em regiões da aorta proximal, mais do
que na distal. A aorta em coelhos pode apresentar superfície afetada com formação
de células espumosas na região subendotelial, sem ulceração, necrose, fibrose ou
trombose. (STEHBENS, 1986).
Não foi encontrada literatura comparando o efeito das diferentes dietas
no que diz respeito a colesterolemia, nem sobre as alterações morfológicas
produzidas na luz do vaso, em animais submetidos às mesmas condições de
laboratórios e nem a determinação da vantagem de uma dieta sobre outra, do ponto
de vista operacional. Vários autores descrevem diferentes modelos de aterosclerose
experimental, muitos deles, sem descrições claras dos métodos e na maioria das
vezes utilizando colesterol puro misturado a ração, o que torna o experimento mais
caro e complexo.
Desta forma, objetivamos padronizar um modelo de dieta experimental
simples, facilmente reprodutível e de baixo custo. Com este objetivo, testamos três
diferentes modelos de dieta experimental para verificar qual destas é mais eficaz,
com a hipótese que é possível a administração de dieta mais simples e de menor
custo em relação as mais utilizadas pelos pesquisadores para a indução de
aterosclerose em coelhos.
A determinação da vantagem de uma dieta sobre outra, contribuirá para
a construção de um modelo experimental para indução de aterosclerose, em
coelhos, que possa servir como referência para o desenvolvimento de outras
pesquisas, que visem à prevenção, o tratamento ou a redução da aterosclerose.
3
2. REVISÃO DA LITERATURA
4
2.1 – ATEROSCLEROSE
Segundo HACKAM et al. (2003), a palavra aterosclerose vem do grego
atero que significa caldo ou pasta, e esclerose , endurecimento.
Conforme FUSTER (1999), a aterosclerose é uma das doenças que
acomete mais pessoas no mundo e é uma das causas de morte mais comuns no
hemisfério ocidental. Na mesma abordagem LUZ et al. (2003), afirma que a dieta
gordurosa promove o aumento de colesterol no sangue e é um fator preponderante
as várias doenças ateroscleróticas na América e na Europa. FONSECA et al. (2002)
descreveram que as doenças oriundas de dieta gordurosa são as mais variadas e se
relacionam à obesidade, hipertensão arterial, problemas cardiovasculares, câncer,
enfermidades articulares, colelitíase, cálculos renais, esteatose hepática,
enfermidades endocrinometabólicas, resistência à insulina, diabetes mellitus,
intolerância à glicose, hiperisulinemia, hiperlipidemia, diminuição de HDL-c,
hiperuricemia, transtornos menstruais, problemas respiratórios e refluxo
gastresofágico.
Aterosclerose é um processo crônico, progressivo e sistêmico que tem
como mecanismo uma resposta inflamatória e fibroproliferativa no endotélio de um
vaso sanguíneo. Nesta patologia é comum encontrar vasos arteriais comprometidos
como da aorta, carótidas, renais, ilíacas e femorais. Entre os principais fatores de
risco para lesão arterial encontra-se a hipercolesterolemia, hipertensão arterial,
diabetes, tabagismo, obesidade, envelhecimento e fatores genéticos (LUZ et al.,
2003).
De todas as formas de esclerose arterial, a aterosclerose é bastante
significativa, em virtude das placas ateromatosas promoverem a obstrução do vaso
e várias síndromes isquêmicas graves desde infarto do miocárdio, acidente vascular
encefálico, gangrena dos membros, entre outras. Em experimentos com animais,
tratados por meio de uma dieta gordurosa, foram evidenciada a aterosclerose,
hipertensão arterial e diabetes mellitus. Com esta mesma dieta em macacos, porcos
e coelhos, foram percebidas alterações celulares durante a formação do ateroma
(DUQUE, 1998).
5
2.2 - FORMAÇÃO DA PLACA ATEROSCLERÓTICA
Experimentalmente, o processo de aterogênese pode ser percebido em
apenas uma semana de exposição a uma dieta hipercolesterolêmica. De forma
rápida, a atividade inflamatória se torna nítida, com aumento das moléculas de
adesão e migração celular, gerando a diferenciação de monócitos em macrófagos
que se tornam captadores para LDL-c oxidado, que determina na formação das
células espumosas, uma etapa inicial da aterogênese (LUZ et al., 1999).
Morfologicamente, as lesões ateroscleróticas são de dois tipos: filetes
gordurosos e placas fibrosas. Os filetes gordurosos são amarelos e lisos projetando-
se levemente para o interior da luz arterial e são compostos de lipídios e células
musculares lisas alongadas. Essas lesões têm sido encontradas em artérias de
pessoas de todas as faixas etárias, inclusive em lactentes e geralmente não causam
sintomas clínicos. A placa fibrosa, por sua vez, é composta por células musculares
lisas, fibras de colágeno, componentes plasmáticos e lipídios e de coloração
esbranquiçada à amarelada e projeta-se em variados graus para dentro da luz
arterial, podendo até obstruí-la. Essas placas são encontradas predominantemente
nas artérias aorta abdominal, coronárias, poplíteas e carótida interna (BRUNNER et
al., 2000).
A primeira alteração desencadeada pela aterosclerose é a aderência de
leucócitos, principalmente monócitos, na superfície do endotélio. Nas
hipercolesterolemias observadas clinicamente, esses aglomerados de leucócitos
surgem ao fim de 7 a 12 dias. Os monócitos rolam pela superfície do endotélio,
passam entre as células endoteliais e rapidamente alcançam a subíntima do vaso
sanguíneo, transformam-se em células espumosas. Nessa situação aparecem
lesões nas artérias dos membros inferiores, em seguida nas artérias ilíacas, aorta e
por fim, nas artérias coronárias. A lesão é uma aparente separação das células
endoteliais e retração do endotélio sobre a estria gordurosa, expondo a subíntima ao
sangue, especialmente nas bifurcações e regiões de maior turbilhonamento
sanguíneo (DUQUE, 1998).
6
Nas fases iniciais do ateroma tem-se verificado um alargamento da
artéria como para compensar a progressiva redução da luz arterial. Quando o grau
da estenose no vaso ultrapassa 30-40%, para de ocorrer o alargamento
compensatório e o estreitamento do lúmen torna-se evidente. Este fenômeno nem
sempre acontece, ou só acontece em segmentos da artéria. A aterosclerose pode ao
inverso ser acompanhada de enrugamento de toda a artéria lesada, o que
determinaria o efeito oclusivo das placas ateromatosas (PASTERKAMP, 1995).
De acordo com BARGER e BEEUWKES (1990), numa artéria normal os
pequenos vasos nutridores da parede se distribuem pela camada adventícia e
penetram externamente na camada média. Na artéria ateromatosa, os pequenos
vasos nutridores se proliferam e se alongam e formam um plexo microvascular na
íntima vascular alterada. O desenvolvimento inadequado desses microvasos
contribui para uma isquemia intraparietal e distúrbios na produção das secreções
endoteliais, podendo ocasionar hemorragia, ruptura e trombose da placa, com
eventual oclusão arterial e infarto do miocárdio.
Sabe-se que 80% do colesterol é sintetizado pelo próprio organismo e
apenas 20% é obtido na dieta (PEREIRA, 2006). Há uma importância das
lipoproteínas e da associação das lipoproteínas de baixa densidade (LDL) com o
ateroma. Assim, há relação da dieta gordurosa com a prevalência da aterosclerose.
As pessoas com pouca ingestão de gorduras, com ingestão protéica adequada e
com predomínio de glicídios na alimentação tinham menores valores de lipídios
sanguíneos e assim, menores incidências de aterosclerose (GOFMAN, 1950).
Segundo LIBBY (2002), o acumulo de lipídios, células inflamatórias e
elementos fibrosos que se depositam nas paredes arteriais são os responsáveis pela
formação de placas ou estrias gordurosas e que geralmente ocasionam obstrução.
Contudo as lipoproteínas, principalmente a de baixa densidade (LDL) tem ocupado
papel de destaque na etiologia da doença aterosclerótica ainda que muitos
indivíduos desenvolvam doenças cardiovasculares na ausência de anormalidade no
perfil das lipoproteínas.
Embora qualquer artéria possa ser afetada, as principais artérias
acometidas na doença são aorta e as artérias coronárias e cerebrais tendo como
principais conseqüências o infarto do miocárdio, a isquemia cerebral e o aneurisma
da aorta (GOTTLIEB, 2005). Estudos sugerem duas fases interdependentes na
7
evolução da aterosclerose: a primeira fase predomina uma formação anatômica de
lesão aterosclerótica sob influência dos fatores de risco aterogênico e que leva
décadas para evoluir. Devido a sua historia insidiosa, sua evolução, comumente,
não traz manifestação clinica severa. A segunda fase, conhecida como
trombogênica, determina a formação aguda de trombo sobre a placa aterosclerótica
e está envolvida nos eventos agudos coronários como infarto do miocárdio, angina
instável e morte súbita, que é geralmente desencadeada por desestabilização da
placa aterosclerótica com redução significativa e abrupta da luz do vaso devida à
formação local do trombo (FUSTER, 1994).
2.3- CLASSIFICAÇÃO DAS LESÕES ATEROSCLERÓTICAS
As lesões ateroscleróticas são classificadas pela sua fisiopatologia em tipo
I até VI, segundo a American Heart Association (AHA). As leves são denominadas
do tipo I e II; as lesões intermediárias do tipo III e lesões avançadas IV, V e VI
(STARY et al., 1995).
A seguir, descrevem-se as lesões do tipo I a VI:
2.3.1- LESÃO DO TIPO I
Corresponde a formação de células espumosas. Estas células são
características das lesões iniciais e são formadas por macrófagos ricos em lipídeos.
A lesão inicial depende do acúmulo de LDL-c no espaço subendotelial. O transporte
8
do LDL-c para esta região é um fenômeno passivo e diretamente proporcional a sua
concentração sanguínea. O próprio stress hemodinâmico aumenta o aprisionamento
da LDL que oxidado por ação de produtos oxidativos de células da parede arterial
como endotélio, células musculares lisas e macrófagos (WU, et al., 1992). A LDL
oxidada é reconhecida pelo macrófago, englobando as moléculas de lipoproteínas
tornando-se ricos em conteúdo lipídico, formando a célula espumosa (ZAGO et al.,
2007). Esta lesão do tipo I é microscópica e há um aumento no número de
macrófagos e pelo surgimento das células espumosas, que são macrófagos cheios
de gordura, disposto na intima do vaso comprometido e que tem sido evidenciada
em crianças e adolescentes. Também pode ocorrer em adultos, principalmente em
pessoas que tem pouca aterosclerose ou em áreas de artérias que tem resistência
às lesões ateroscleróticas. Em coelhos com hipercolesterolemia, observou-se que a
primeira alteração que ocorre nas artérias é a aderência aumentada de monócitos
ao endotélio e acúmulo de macrófagos e células espumosas na túnica íntima
(ROSENFELD, 1987).
2.3.2- LESÃO DO TIPO II
Conhecida como estria gordurosa, é a forma visível da lesão do vaso.
São compostas por macrófagos, células musculares lisas e pequenos flocos de
gordura extracelular. Há dois tipos diferentes desta lesão: a primeira são as menos
usuais, no entanto com maior potencial destrutivo e são oriundas das lesões tipo I
com um maior número de macrófagos, possuem maior número de células e maior
quantidade de matriz extracelular. Comumente encontradas em áreas
hemodinâmicas específicas e tendem a progredir mais rápido e para formas mais
complicadas de lesão aterosclerótica. Lesões tipo II são encontradas antes da 3º
década de vida (STARY et al., 1996).
9
2.3.3- LESÃO DO TIPO III
Histologicamente é observada gotículas lipídicas extracelulares
espalhadas entre as camadas de células musculares lisas e localizadas logo abaixo
da camada de macrófagos e células espumosas. Estes pequenos depósitos de
gotículas lipídicas extracelulares substituem a matriz intercelular de proteoglicanos e
fibras e afastam as células musculares lisas. Posteriormente, estes pequenos
depósitos lipídicos unir-se-ão para formar um núcleo lipídico extracelular o que
caracteriza a lesão do tipo IV ou ateroma (STARY et al., 1995).
2.3.4- LESÃO DO TIPO IV
É conhecida como Ateroma. Possui um núcleo lipídico individualizado,
formado pela fusão das gotículas de gordura das lesões tipo III. Esta apresenta
macrófagos e gordura livre em abundância e fragmentos de células, devido a
necrose. Diante deste fenômeno este núcleo é conhecido com centro necrótico
(STARY, 1989).
2.3.5- LESÃO DO TIPO V
Este tipo corresponde a fase V e tem como característica a presença de
tecido fibroso envolvendo o núcleo lipídico. Divide-se em fibroateroma que tem como
10
característica a formação de uma camada de tecido fibroso envolvendo o núcleo
lipídico, em placa calcificada correspondendo à presença de cálcio na camada
fibrosa ou no núcleo lipídico e a placa fibrótica onde se evidencia o tecido fibrosado
com ausência de núcleo lipídico (STARY et al., 1995).
2.3.6- LESÃO DO TIPO VI
È preponderante a formação de trombo, fissura, rotura, hemorragia ou
erosão. São as causas dos eventos coronarianos isquêmicos agudos e geralmente
são oriundos de placas do tipo IV ou V. A complicação da placa tem maior chance
de ocorrer quando existe remodelamento do vaso, presença de um núcleo lipídico
superior a 40% da área total da placa, capa fibrótica fina e presença de grande
quantidade de células inflamatórias (STARY, 1992).
2.4- MODELO EXPERIMENTAL DE ATEROGÊNESE EM COELHOS
ANITSCHKOW (1913) induziu, pela primeira vez, aterosclerose em
coelhos alimentando-os com gema de ovo e colesterol puro tendo resposta em
algumas semanas de dieta: a aorta de 90% dos coelhos apresentou placas
acinzentadas semelhantes às das coronárias de homens vítimas de infarto do
miocárdio. Posteriormente, o autor concluiu que o colesterol não era o único
responsável pelos aparecimentos das placas ateroscleróticas, uma vez que repetiu
os experimentos em ratos e cachorros e não obteve o mesmo resultado.
11
Para SARAIVA et al. (1978), o esvaziamento gástrico do coelho é muito
lento, podendo encontrar resíduo alimentar com 5 dias de jejum, e portanto devem
ser utilizados para estudos de investigação da absorção de medicamentos
administrados oralmente ou para estudo de dietas. Estes animais não conseguem
vomitar, e seu estômago deve estar sempre cheio com alguma coisa, pois podem
morrer se tiverem o estomago vazio (MIRASOL, 2008).
Segundo, KARNABATIDIS et al. (2006) tanto a artéria como a veia
auricular são excelentes vias medicamentosas, anestésicas e de punção em relação
a outros vasos. Estes autores utilizaram 30 coelhos Nova Zelândia e o sucesso foi
demonstrado em relação aos outros acessos de vasos.
Do gênero oryctolagus (cuniculos), pertencente à família lagomorpha, a
variedade albina é de fácil criação, especialmente a raça Nova Zelândia que chega
ate 4 a 5 kg de peso. É um bom modelo experimental para estudo da aterosclerose.
Drogas podem ser administradas por via oral, por meio de sonda
orogástrica ou na água de beber, injeções intravenosas podem ser feitas com muita
facilidade na veia marginal da orelha, pela qual também se pode colher amostras de
sangue para diferentes análises (STAHLKE Jr et al., 2004). A veia auricular lateral é
a via de mais fácil acesso no coelho, e por isto animais com longas orelhas são os
preferidos para os experimentos laboratoriais. A venopunção na orelha, é facilitada
com uso de cateter de calibre 20 (MURDOCK, 1969).
SMITH (2008), afirma que os coelhos Nova Zelândia adultos, tem seu
peso oscilando entre 4,5 kg para fêmeas e 5 kg para machos, são animais precoces
chegando a pesar 1,8 a 2 kg em 8 a 10 semanas. As fêmeas são mansas e
proliferas. O metabolismo do coelho é lento, dieta gordurosa em excesso não é
queimada, é armazenada como gordura do corpo.
Conforme HERRERA et al. (2001), a fibra estimula e facilita a digestão no
coelho, sua redução determina diarréia, devido ao crescimento de bactérias
indesejáveis.
Quanto as dietas administradas, cada autor utilizou um modelo diferente:
o TELOKEN et al. (2000), fizeram uso de 27 coelhos Nova Zelândia, sendo um
grupo com 7 coelhos que recebeu ração padrão e mais dois grupos com 10
animais que receberam ração acrescida com 0,5% de colesterol mais 4 % de banha
animal em 5 semanas e 10 semanas. A ração era fornecida em 150 g diárias
12
juntamente com o complemento descrito. Como resultado o grupo controle
apresentou ganho de peso ( 620 g) no final do experimento. A taxa de colesterol
total no sangue, foi de 100 mg/dL e triglicerídeo 98 mg/dL. O grupo que recebeu
dieta rica em colesterol em 5 semanas aumentou o peso em 1070 g, teve taxa de
colesterol total de 103,4 mg/dL e triglicerídeo de 114 mg/dL. O grupo tratado em 10
semanas obteve aumento de peso em 920 g, colesterol total em 314,1 mg/dL e
triglicerídeo em 122 mg/dL.
Já KUYMJIAN et al. (2004), realizaram experimentos em 38 coelhos Nova
Zelândia, com dieta enriquecida de colesterol a 0,5 % durante 12 semanas. Um
grupo com dieta regular, e os outros grupos respectivamente com antagonistas de
canais de cálcio ( amlodipina, diltiazem e nifedipina) durante o mesmo período para
formação de placas na aorta e carótida. Os antagonistas de canais de cálcio não
modificaram a aterogênese induzida experimentalmente pela dieta rica em colesterol
tanto na aorta como na artéria carótida.
Administrando dieta aterogênica, com valor de 1200 mg de colesterol
diário, em 6 coelhos por um período de 4 meses de tratamento AMARAL et al.
(1989), observaram lesões ateroscleróticas nas artérias intercostais, ocasionando
isquemia sobre os ossos vertebrais, tendo relações semelhantes às percebidas no
ser humano.
ALARCÓN (2004), administrou 118 dias, em 4 grupos com 5 coelhos,
uma dieta aterogênica com 60 mg/dia de colesterol, obtendo taxas de colesterol total
baixas.
MANRESA e RECEDILLA (1986) demonstraram que as lesões
ateromatosas são mais observadas na aorta abdominal e em bifurcações. A lesão
inicia-se com estria fibrosa, que tem aspecto esbranquiçado, elevando
discretamente o endotélio e em seguida a formação da placa fibrosa, o ateroma.
Para encontrar estes resultados foram utilizadas 10 ratas Sprague-kawly, que
ingeriram 2% de colesterol mais 5% de óleo de coco durante 60 dias.
GONZÁLES-GONZÁLES et al. (2005) fizeram uso de ração aterogênica
em coelhos divididos em um grupo jovem (750 g) e um adulto (3500 g), baseando-se
o protocolo de MANRESA e RECEDILLA (1986). Esta dieta modificada era
composta por 25,5 g colesterol mais 1,5 g de tiouracil, 10 g de ácido cólico e 200 g
de manteiga. Estes foram padronizados com 200 g de mistura para um quilo de
13
ração. Neste experimento a taxa de mortalidade foi em maior número nos coelhos
adultos (5 coelhos) alimentados com dieta aterogênica.
JALDIN et al.(2006), em seus experimentos, evidenciaram que a dieta
com gema de ovo determina aterosclerose leve em coelhos e alterações
semelhantes às provocadas pelo colesterol purificado comercial; que pode ser
utilizada como fonte de colesterol alimentar de baixo custo em modelos de
aterosclerose experimental, contudo esses autores não formaram grupo com
colesterol puro para comparar com seu controle e com o grupo alimentado com
gema.
AMARAL et al. (1989) utilizaram 12 coelhos para serem alimentados com
dieta rica com 350 mg de colesterol durante 60 dias misturado com banha de porco.
Estes autores não referem quanto de banha deram aos animais. Foram observadas
lesões ateroscleróticas e obstruções vasculares em diversos ramos da artéria aorta
em especial coronária e intercostal.
RENOUD e LECOMPTE (1970) em experimento com 16 coelhos de 2
semanas durante 9 meses pesando 1 a 1,5 kg, formou 3 grupos: grupo 1, foi
alimentado com 100 g de ração comercial (6 animais); o grupo 2, com dieta
preparada com 89,9% de ração, 5% manteiga, 5% óleo de milho e 0,1% de
colesterol (4 animais) ; e grupo 3, com 89,9% de ração, 10% de manteiga e 0,1% de
colesterol (6 animais). Foi realizada coleta de sangue para hemoanálise. Nos 9
meses de experimento, alcançou os seguintes resultados: grupo 3, 100% do coelhos
desenvolveram aterosclerose.
MARTIN et al. (1985) usaram coelhos pensando 2,34 ± 1 kg durante 12
semanas. Um grupo com 5 coelhos recebeu 2 g de colesterol mais 10 ml de óleo de
oliva. Foram retirados segmentos da aorta torácica e abdominal. No final do
experimento os animais obtiveram aumento de peso. Foram encontrados focos
pequenos de calcificação e células espumosas em quatro segmentos arteriais
analisados: arco da aorta, primeiro e décimo segundo segmentos torácicos da aorta
e artéria mesentérica superior.
AMARAL et al. (1989) avaliaram, em estudo experimental, lesões
ateroscleróticas produzidas com dieta aterogênica. Foram utilizados 12 coelhos com
6 meses de idade pesando entre 2500g a 3000g durante 4 meses. Um grupo com 6
14
coelhos recebeu dieta com volume de 160g diários. Esta dieta, foi composta com
ração comercial, colesterol e banha de porco perfazendo ingesta de 1200 mg de
colesterol. Outro grupo recebeu apenas ração comercial. Os resultados
demonstraram lesões ateroscleróticas e obstruções vasculares em muitas artérias
principalmente nas artérias coronárias e intercostais.
2.5- HEMOANÁLISE EM COELHOS ALIMENTADO COM DIETA
ATEROGÊNICA.
SANTOS (2001) utilizou valor padrão de referência dos lipídios para
indivíduos acima dos 20 anos de idade em seu experimento: colesterol total menor
que 200 mg/dL, ótimo; LDL-c menor que 100 mg/dL, ótimo; HDL-c menor que 40
mg/dL baixo e maior que 60, alto; e taxas de triglicerídeos menor que 150 mg/dL,
ótimo.
No experimento de PERCÁRIO (1993), a ração rica em colesterol, foi
preparada pela vaporização de uma solução de colesterol em clorofórmio sobre a
ração na proporção de 1,5 g de colesterol para 100 g de ração e o valor de LDL-c foi
calculado matematicamente pela equação de Friedwald: LDL = Col total -
(HDL+Tg/5) de acordo com LESSA et al. (1997).
Com 24 coelhos ( 4 grupos com 6 animais) , FERNANDES et al. (2006),
avaliaram o colesterol plasmático com uso de extrato etanólico de própolis. Para
hipercolesterolemia dos animais a dieta foi enriquecida com gema de ovo. Estes
grupos tratados tiveram um aumento significante no nível de colesterol total e LDL-c
(p<0,05).
MERRIL et al. (1957), realizaram experimentos com 27 coelhos com
aproximadamente 10 meses formando 3 grupos: o grupo 1 com 6 animais que
recebeu apenas a ração comercial, o grupo 2 que recebeu ração suplementada com
15
2% de colesterol e grupo 3 com ração, colesterol 2% mais 0,4% de ácido nicotínico
durante 8 semanas. No resultado deste experimento o grupo 2 obteve valor do
colesterol total de 1300 mg/dL. No grupo com dieta acrescida com colesterol 2%
mais 0,4 % de acido nicotínico obteve taxas de 500 mg/dL.
CONNOR et al. (1967), usaram 36 coelhos formando 5 grupos. A dieta
foi ração comercial (6 animais de controle, duração 12 meses), manteiga de cacau
(duração 11 meses, 12 animais) , óleo de coco (6 meses, 10 animais) , manteiga (4
animais, 8 meses) e manteiga com 0,25% de colesterol (4 animais, durante 4 meses
e meio). O nível de colesterol total foi crescente no grupo com manteiga a 0,25% de
colesterol, chegando à taxa de 596 mg/dL no final do experimento.
No experimento de HENRY et al. (1981), foram utilizados 56 coelhos
pesando entre 2,3 kg a 2,6 kg. O grupo que recebeu 2 % de colesterol, obteve taxa
de colesterol total de 1903 mg/dL. Estes coelhos antes do experimento tinham taxas
de colesterol total em 45 mg/dL. Os valores de triglicerídeos chegaram a 129 mg/dL,
diferentemente da taxa anterior ao experimento (90 mg/dL). Este experimento foi
realizado em oito semanas.
KAGAN et al. (1981), em seu modelo experimental, utilizaram coelhos
pesando entre 2,5 e 3,5 kg, formando 2 grupos para tratamento dietético. O grupo 1
(controle), recebeu ração comercial em 100 g e o grupo 2 recebeu a ração mais 2 g
de colesterol mais 8 g de óleo de amendoim por dia durante um período de 105 dias.
O nível de colesterol total na ultima coleta foi bastante significante, chegando aos
valores de 3450 mg/dL.
WAKASUGI (1984), usou 2 grupos com 8 coelhos, pesando de 2,8 a 3,4
kg, para realizar uma dieta com estes. Um grupo com ração normal (100 g) e o
segundo grupo com ração comercial modificada (100 g mais 1% de colesterol). Foi
analisado o total de colesterol e triglicerídeo durante uma semana de dieta. O
resultado do grupo com ração comercial obteve taxa de colesterol total de 58 mg/dL,
sendo LDL-c 17 mg/dL e HDL-c 24 mg/dL e de triglicerídeo em 63 mg/dL. O grupo
tratado com colesterol obteve taxas de colesterol total em 517 mg/dL, LDL-c em 228
mg/dL e HDL-c em 22 mg/dL, e triglicérides em 33 mg/dL.
BOCAN et al. (1993), com tempo de 9 semanas, realizaram um
experimento em coelhos pesando entre 1,2 kg e 1,5 kg, formando 7 grupos com 8
animais. Um grupo com ração comercial, segundo grupo com 0,1% de colesterol, o
16
terceiro grupo com 0,25% de colesterol, grupo 4 com 0,5% de colesterol, grupo 5
com 1% de colesterol, grupo 6 com 1,5% de colesterol e grupo 7 com 2% de
colesterol . Na nona semana foram retiradas segmentos da aorta torácica e da
femoral para observar desenvolvimento da aterosclerose. Nos grupos alimentados
com 1%, 1,5% e 2% de colesterol obtiveram valores próximos de colesterol total no
dia 30 e no dia 63, que foram entre a 800 de 1000 mg/dL. Nos valores 0,25% de
colesterol foi percebida a presença de lesões fibromusculares e na artéria femoral foi
notada a presença de lesão com extensão de células espumosa (50%). Nos grupos
de 0,5%, 1% e 2% de colesterol foram encontrados presença de macrófagos, lesões
fibrosas. Concluiu que 1% de colesterol na dieta é ideal para aterogênese em
coelhos.
Em experimentos com coelhos alimentados com 100 gramas de ração ao
dia acrescentada, apenas, de 0,5% de colesterol e 2% de gordura de coco, foi
possível promover disfunções do endotélio (RIBEIRO JORGE et al., 1997). Neste
experimento testaram dois grupos com 7 coelhos da raça Nova Zelândia com peso
de 2,14±0,16 kg : um grupo com ração normal e o segundo grupo com 100 g de
ração, acrescida com 0,5% colesterol e 2% de gordura de coco durante 30 dias. No
final do mês a taxa de colesterol total ultrapassou 1600 mg/dL e LDL-c chegou ao
valor de 1000 mg/dl.
Retomando a pesquisa em coelhos RIBEIRO JORGE et al. (1998),
separaram três grupos com 10 coelhos machos pesando em media 2,5 kg com
idade média de oito semanas para um tratamento dietético com duração de 30 dias:
o grupo controle, um segundo grupo com óleo de babaçu a 10% mais 0,5 % de
colesterol e o terceiro grupo com suco de berinjela. A administração com 0,5% de
colesterol juntamente com a gordura de babaçu a 10% mostrou acentuada elevação
do colesterol total (2183%), da LDL-c (4875%) e das triglicérides (174%) quando
comparadas com grupo controle. Aterosclerose foi identificada na parede da aorta.
Na pesquisa de ASAI et al. (1998), dois grupos de coelhos da Nova
Zelândia, pesando entre 2,3 -2,7 kg, receberam dieta aterogênica. O grupo I, com 19
animais (grupo da esplenectomia); e o grupo II, com 14 animais (grupo controle). O
grupo com 19 coelhos foi dividido em dois subgrupos: 12 coelhos com dieta com 1%
de colesterol e 7 coelhos com ração comercial. O segundo grupo também foi dividido
em dois subgrupos: 9 coelhos com dieta 1% de colesterol e 5 coelhos com ração
17
normal. Foram retiradas aorta para rotina histológica e foram realizadas analises do
sangue. O valor do colesterol total no dia 0 passou de 42 mg/dL para 1689 mg/dL
em seis meses. No grupo II passou de 56 mg/dl para 2227 mg/dL. A taxa de HDL-c
no grupo I mudou de 20,8 mg/dL para 31,5 mg/dL e no grupo II de 28,3 mg/dL para
29,6 mg/dL. A taxa de triglicerídeo no grupo I passou de 84,8 mg/dL para 454,6
mg/dl e no grupo II de 104 mg/dL para 718,3 mg/dL. Em exame microscópico foram
notadas células espumosas na aorta. No grupo I, foram observadas 26% de
formação de placas aterosclerótica e no grupo II 13,7%.
IHARA et al. (1998), experimentaram dois protocolos de indução de
aterosclerose em coelhos adultos, um modelo para fase aguda com 18 animais,
adicionando a ração 1,5 % de colesterol durante dois meses e o outro modelo para
fase crônica com 40 animais incluindo a dieta 0,5 % de colesterol durante três
meses. O nível inicial de colesterol plasmático passou de 41 mg/dL para 986 mg/dL
após um mês e aumentou para 1416 mg/dL após os três meses. Exame histológico
revelou lesão hepática. No experimento para fase crônica o nível de colesterol total
foi superior a 1000 mg/dL e lesões na aorta foi maior. Concluíram que os 2 modelos
são úteis no estudo de evolução ateroscleróticas. Quanto ao peso dos animais não
houve diferença significante durante os experimentos e o consumo de ração foi
menor, após um mês de dieta com colesterol, em relação àqueles grupos
alimentados com ração comercial.
TELOKEN et al. (2000), estudando 27 coelhos machos Nova Zelândia,
formaram 3 grupos: o primeiro grupo com 7 coelhos recebeu ração comercial, o
segundo grupo com 10 animais foram alimentados com dieta rica 0,5% de colesterol
mais 4% de gordura de porco e terceiro grupo com 10 animais com dieta acrescida
a 0,5% de colesterol. A ração diária foi de 150 g e água livremente durante 10
semanas de experimento. No grupo controle o colesterol total alcançado foi de 100
mg/dL e de LDL-c valor de 84 mg/dL e a taxa de triglicerídeo obtido foi de 98,2
mg/dL no final de experimento. O grupo que recebeu colesterol a 0,5%, obteve
colesterol total de 103,4mg/dl, LDL-c de 144,9 mg/dL e o valor do triglicerídeo
alcançou 114,6 mg/dL. Com a dieta com colesterol mais banha as taxas de
colesterol total foram de 314,1 mg/dL, LD-c de 268,9 e triglicerídeos de 122 mg/dL.
Concluíram que 10 semanas são suficientes para aumentar os níveis séricos de
colesterol total.
18
VALIENTE et al. (2001), utilizaram 18 coelhos machos Nova Zelândia
com média de 2,4 kg que receberam 100 g diárias de ração e foram divididos em 3
grupos: grupo I dieta suplementada com 0,5% de colesterol, durante 12 semanas,
grupo II alimentado com ração suplementada com 1% de colesterol e grupo III
alimentado com ração normal. No grupo I, o peso inicial alterou de 2,33 kg para 2,77
kg, no grupo II de 2,4 kg para 3,23 kg e no grupo III de 2,4 kg passou para 2,7 kg.
No grupo II, todos os coelhos apresentaram manifestações de lesões
ateroscleróticas na artéria carótidas (estrias gordurosas) e taxas de colesterol total
em 723,9 mg/dL; enquanto que no grupo I, com taxas de colesterol de 486,5 mg/ dL,
apenas 2 coelhos apresentaram estas lesões. Experimento com 1% de colesterol é
um bom modelo experimental para formações ateroscleróticas em coelhos.
LIMA et al. (2003), utilizaram coelhos Nova Zelândia, com peso médio de
2200±100 g, com 12 semanas de idade receberam ração comercial com 100 g
diárias e água a vontade. Os coelhos foram separados em 6 grupos com 6 animais.
O grupo 1, com ração normal; grupo 2, com ração acrescida 0,5% de colesterol e
ácido cólico; grupo 3, com ração mais colesterol mais acido cólico e bixina; grupo 4
com ração mais 0,5% colesterol mais ácido cólico e quercetina, grupo 5 com ração
mais 0,5% colesterol e acido cólico mais bixina e quercetina; e grupo 6 com ração
mais 0,5% colesterol mais ácido cólico e norbixina. Em 28 dias de tratamento as
amostras do sangue foram coletadas para obtenção dos soros. Todos os grupos
tratados com colesterol a 0,5% tiveram aumento no nível de colesterol total em
media 10 vezes maior que o grupo 1 (ração normal).
STAHLKE Jr et al. (2004), realizaram experimentos em 2 grupos com 10
coelhos pesando 2000±456 g durante 60 dias. Usando metionina no grupo I e no
grupo II como controle. Foram colhidas amostras de sangue para dosagem de
colesterol, triglicerídeos, HDL-c, LDL-c e homocisteína nos dias 0, 30 e 60.
Segmentos proximal, intermédio e distal da aorta foram coletados para exame
microscópico. Nesta análise, identificaram-se depósitos subendoteliais de
macrófagos espumosos, fazendo protrusão na luz do vaso, sem sinal da presença
de cálcio nos segmentos citados.
RIBEIRO JORGE et al. (2005), utilizaram grupos com 10 coelhos
hipercolesterolêmicos como controle e os outros grupos com atorvastatina,
fluvastatina, pravastatina e normal. Com exceção do grupo normal, aos animais foi
19
administrada ração comercial acrescida de 0,5 % de colesterol e 2% de óleo de coco
durante 35 dias. No final do tratamento todos os animais tiveram ganho de peso
com média de 200 g. Em média o grupo alimentado com colesterol e óleo de coco
obtiveram o valor de colesterol total em 760 mg/ dL. Do LDL-c em 600 mg/dL,
diferentemente dos demais grupos que apresentaram média de 200 mg/dL de LDL-
c, alem deste resultado, o grupo tratado com colesterol , também apresentou
evolução da aterosclerose, onde foi observado maior concentração de lipossomos
extracelulares na região endotelial.
JALDIN et al. (2006), Experimentaram 14 coelhos machos, pesando em
média 1200 kg. Constituindo dois grupos: grupo I de controle 150 g de ração e o
grupo II que recebeu dieta contendo uma gema de ovo misturada a 13, 5 ml de óleo
de milho para cada 150 g de ração comercial. A ração mais a dieta foram
processadas para peletização. A duração experimental foi de 3 meses. Considerou a
cada gema de ovo tendo como referência 225 mg de colesterol (TABELA DE
COMPOSIÇÃO QUÍMICA DOS ALIMENTOS, 2007). Foram retirados segmentos da
aorta torácica e abdominal, artérias renais e bifurcações da ilíaca, femoral e
carótidas. No grupo controle não foram encontrados diferenças significantes, mas no
grupo com gema de ovo foram encontradas células espumosas e estavam presentes
na aorta abdominal, renal, carótidas e femoral. Em apenas um animal foi observado
o espessamento da íntima em grau moderado na transição da aorta torácica para
abdominal. Os níveis de colesterol obtidos com dieta a 0,15% de colesterol vindo da
gema são bem inferiores aos atingidos com dieta contendo 1% de colesterol
purificado, entretanto no final do experimento foram muitos próximos os níveis
plasmáticos denotando certa equivalência. A gema foi ineficaz na elevação de
triglicerídeos plasmático em relação ao colesterol purificado 1%. A gema pode ser
utilizada como fonte de colesterol alimentar de baixo custo em modelos de
aterosclerose experimental. O grupo que recebeu dieta suplementada teve peso
corporal maior que o grupo controle estatisticamente significante.
20
3. MATERIAL E MÉTODO
21
3.1 - AMOSTRA
Foram utilizados 42 coelhos raça Nova Zelândia adultos machos
nascidos com uma diferença de no máximo três semanas, os animais foram
desmamados após 40 dias, sendo nessa época admitidos ao experimento com peso
que variou entre 700 e 800 g, alimentados com ração Socil® e água ad libitum.
Quando os animais atingiram entre 7 a 8 meses iniciou-se o experimento, apesar de
serem criados nas mesmas condições e local, em gaiolas individuais, pesavam entre
2000 e 3000 g . Estes coelhos ficaram em uma cunicultura a temperatura e luz
natural, localizado em Marechal Deodoro no Hospital Escola de Veterinários do
Centro de Estudos Superiores de Maceió – CESMAC, onde foram acompanhados
por médicos veterinários antes e durante a pesquisa.
O tamanho da amostra foi definido baseado na maioria dos protocolos
internacionais que utilizam esse modelo experimental, sendo estes realizados
freqüentemente com cinco ou sete animais.
Se aplicarmos o cálculo do tamanho da amostra, quanto maior o valor de
p (1 – p) maior será o tamanho da amostra. Não dispondo de qualquer informação
sobre o valor de p, usa-se p = 0,5 e assim trabalhando-se com uma amostra de
tamanho grande, há maior segurança nos resultados encontrados. Dessa forma foi
utilizado p = 0,5 e confiança de 95% para população Infinita seguindo a fórmula: n =
z
2
[ p ( 1 – p ) / e
2
] (SCHMIDT, 2007).
O valor de p (1 – p) = 0,25 quando p vale 0,5 e para o valor de z Foi
consultada a tabela para área de 47,5% = 0,475, obtendo valor de Z = 1,96 desvios
padrões. Admitindo o erro padronizado a 0,37 foi achado o número de animais para
nível de significância de resultado: n=1, 96
2
[0,5(0,5) / 0, 37
2
] n 7.
22
3.2 - RANDOMIZAÇÃO DA AMOSTRA
Os coelhos foram randomizados em 6 grupos com 7 animais: grupo 1, 2,
3, 4, 5 e 6. Os animais foram enumerados de 1 a 42 e num saquitel foram colocados
papéis enumerados de 1 a 42. Foi solicitado a uma pessoa não participante do
experimento a puxar do saquitel cada número. Conforme os números eram
sorteados, os animais eram alocados um em cada grupo, até que os grupos
estivessem completos. Assim, foi determinado um coelho por gaiola. Os coelhos
foram pesados com uma balança digital de precisão Marte®, modelo AS 5000 C
com carga máxima de 5 kg e mínima 5 g. Para evitar a mistura de animais durante
as manipulações, cada animal recebeu um número na face interna da orelha direita,
com pincel atômico de cor preta (Fig. 1). A descrição dos grupos randomizados é
descrita a seguir (item 3.3).
Figura 1. Número localizado na face interna auricular do
coelho 38 (grupo G2 – Colesterol).
23
3.3 - DIETA
Para todos os grupos, foi oferecida diariamente, 200 gramas de ração e
água ad libitum, havendo sobra, a dieta era novamente complementada até 200 g.
Como os coelhos têm o hábito de roer a ração, quando a ração não tinha
mais a forma de grãos, era desprezada e substituída por nova.
A ração utilizada foi a Socil® tem a composição básica necessária ao
animal: proteína bruta (15%), extrato etéreo (2,5%), matéria fibrosa (16%), matéria
mineral (10%), cálcio (2,5%), fósforo (0,42%), umidade (13%), carboidrato (31,58%).
A dieta complementar foi preparada diariamente, durante 100 dias, segundo o
protocolo padronizado neste experimento com:
a) Gema de ovo de galinha Carnaúba® tipo grande que em 100 ml
apresenta a seguinte composição: colesterol (997,5 mg); lipídios totais (28,7 g) e
ácidos graxos saturados (8,53 g).
b) Banha de porco industrializada Sadia® em 100 g apresenta colesterol
(72 mg), lipídios totais (60 g) e ácido graxo saturado (39 g).
c) Colesterol puro.
Estes complementos dietéticos, foram escolhidos por serem de menor
custo e para se verificar qual a eficácia destes na formação de aterosclerose em
comparação com a administração de colesterol puro Imtrextraco®. Os grupos foram
assim distribuídos:
Grupo 1 (G1) - Grupo de controle, que recebeu apenas a ração Socil®
em 200 g diária.
Grupo 2 (G2) – Ração acrescida com 1 g de colesterol.
Grupo 3 (G3) – Ração e 20 ml de gema ao dia.
Grupo 4 (G4) – Ração e 20 ml de banha ao dia.
Grupo 5 (G5) – Ração e 40 ml de gema ao dia.
Grupo 6 (G6) – Ração e 40 ml de banha ao dia.
24
Com exceção do grupo colesterol, onde foi administrada 1g diária em
duas tomadas seguidas de 0,5 g, os demais grupos receberam o complemento
alimentar dividido em duas tomadas diárias via sondagem oral (Sonda de Nelaton n°
18), com intervalo de 4 a 5 horas por um período de 100 dias.
A ração foi pesada e oferecida pela manhã e deixada à disposição do
animal. Ao trocar a dieta no dia seguinte, foi pesada a eventual sobra do dia anterior
para cálculo da dieta efetivamente consumida.
3.4 - PREPARO E ADMINISTRAÇÃO DA DIETA ATEROGÊNICA
O preparo da dieta foi diário para se evitar contaminação dos animais ou
do próprio alimento. Antes da sondagem oral, a banha foi aquecida no forno de
microondas para liquefação. Os valores de referência seguiram a tabela de
composição na Indústria Sadia® e na Unifesp correspondendo às taxas de colesterol
em 7 mg em porção de 10 ml do produto. A gema foi ofertada crua aos coelhos, a
opção por se administrar à gema na forma líquida, foi para facilitar a maior absorção
possível de colesterol que é melhor do que a administração na forma sólida. Cada
gema tem como referência 225 mg de colesterol (TABELA DE COMPOSIÇÃO DE
ALIMENTO, 2007). Para a ingestão da gema, os ovos foram limpos, lavados com
hipoclorito de sódio e deixados de molho por 5 minutos e abertos no momento da
sondagem, evitando assim deterioração e contaminação da dieta. O colesterol foi
administrado através de uma seringa de 5 ml especialmente preparada para injeção
do pó (cortada sua extremidade para introdução do pó) , sem nenhum meio
solvente, assim havia a certeza que o animal ingeriu exatamente 1g de colesterol.
Nesta administração a seringa foi introduzida até o istmo das fauces (orofaringe)
para ocorrer o reflexo de deglutição. O colesterol administrado, não foi perdido, pois
a própria saliva do animal tornou o colesterol homogêneo e o animal foi mantido em
25
posição inclinada por tempo de 3 minutos para evitarmos qualquer perda da ingesta.
Este colesterol (Imtrextraco ®) foi adquirido exclusivamente para o experimento.
A pequena quantidade de colesterol puro (1 g) era injetada, em duas
tomadas de 0,5 g lentamente, para evitar falso trajeto e conseqüente engasgo e
pneumonia aspirativa do animal. A opção por este modelo, deveu-se ao
entendimento, que dissolver 1% de colesterol na ração, como ocorre em vários
protocolos experimentais, não garantiria que o grupo faria ingesta homogeneamente,
já que cada animal deglute quantidade diferente de ração, independentemente a
idade que tenha. Portanto, o colesterol dissolvido em peletas, não garantiria que o
animal deglutisse toda a ração oferecida o que não nos conferiria a certeza que cada
animal ingeriu exatamente 1g de colesterol.
3.5- DOSAGEM BIOQUÍMICA
Foi realizada análise bioquímica do sangue após jejum de 12 a 14 horas
(PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO, 2007) em todos os coelhos, para
verificação de suas taxas de colesterol Total, HDL-c e LDL-c bem como de
triglicerídeos. O procedimento foi realizado 4 vezes (dias 0, 30, 60 e 100) de
tratamento dietético. O sangue foi coletado na artéria auricular central (Fig.2), com
seringa de 5 ml e condicionado em tubetes de 6 ml sem anticoagulante para análise.
Ao fim da coleta amostras eram encaminhadas à clínica de hemoanálise onde foram
centrifugadas e seguiram o procedimento operacional padrão para análise do
colesterol total, HDL-c e triglicerídeos. As frações do LDL-c foram obtidas através da
fórmula Friedewald: LDL-c = [(CT-c - HDL-c) – (TG/5)].
Todos os dados colhidos foram anotados em protocolos específicos e
individuais para cada animal, a quantidade de ração consumida e quaisquer outras
alterações observadas foram igualmente registradas.
26
Figura 2. Artéria auricular central (Seta).
3.7- EUTANÁSIA E HISTOPATOLOGIA
No final do experimento, cada animal foi submetido a procedimento
cirúrgico para a retirada de fragmento da artéria carótida comum direita próxima de
sua bifurcação, do arco aórtico para descendente e a artéria femoral direita em nível
de sua emergência; para isto foi realizada a incisão mediana
cervicotoracoabdominal e na face medial da coxa. Esses segmentos foram
dissecados por planos até expor os vasos para a retirada dos fragmentos nos quais
foram tratados e colocados em solução de formaldeído a 10%.
Para a eutanásia, os animais foram previamente anestesiados com
cloridrato de cetamina (Ketamina®) 9 mg (IM), associado ao cloridrato de Xilazina
(Rompun®) na dose de 30 mg (IM) (SANFORD e COLBY, 1980). A eutanásia
ocorreu com a administração destes anestésicos. A dose foi ultrapassada, até ser
observada parada cárdio-respiratória do animal.
27
Após a realização da dieta para a indução de placas ateroscleróticas, os
vasos retirados foram submetidos à rotina histológica e coradas com Tricrômico de
Masson para microscopia de luz.
3.8 - ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram analisados através da estatística descritiva usando
como ferramenta software GraphPad Prism (versão 5.0). Os dados desta análise
foram expressos em média e desvio padrão. Para comparações entre os grupos
tratados com a dieta complementar foi usado o ANOVA one-way e uso do teste de
Tukey para saber se existiam ou não diferenças significantes entre as médias dos
tratamentos aplicados. Foi adotado o nível significante de 95% para evitar o risco de
falsa rejeição da hipótese nula (p<0,05). Para caracterizar os resultados significantes
utilizamos um asterisco (*) e não significante (NS).
28
4. RESULTADOS
29
Nesse experimento, observou-se que 100% dos animais desenvolveram
doença aterosclerótica quando alimentado com 1g de colesterol, o que também
ocorreu com todos os alimentados com 20ml de gema, demonstrando que os dois
modelos são eficazes na indução desta patologia. Contudo, a média do
espessamento endotelial após 100 dias, foi sempre maior no grupo com gema, em
relação ao grupo com colesterol. O modelo com a gema foi tão melhor que o modelo
com colesterol, que a média do espessamento conseguido chegou a ser 399,4%
maior quando se analisou a aorta, 398,2% na femoral e 66,2% na carótida comum.
Os resultados detalhados são apresentados a seguir:
4.1- ADAPTAÇÃO À DIETA
O comportamento dos grupos em relação à dieta desenvolveu-se da
seguinte forma:
G1 (controle) - Seguiu-se o padrão habitual do animal ofertando
diariamente 200 g de ração.
G2 (colesterol 1g), G3 (gema 20 ml) e G4 (banha 20 ml) – Adaptaram-se
bem à dieta administrada, dividida em duas tomadas (gema e banha), sem óbito
nestes grupos. Apesar de 2 coelhos do grupo do colesterol apresentarem sinais de
acidente vascular encefálico no final do experimento no 95º dia (Fig. 5). Na análise
necroscópica foi observada esteatose hepática em 7 animais (100%) do G2 e 5
(71,4%) do G3 (Fig. 6). Nestes grupos, as fezes apresentaram tonalidade escura
(Fig. 11).
G5 (40 ml de gema) e G6 (40 ml de banha) - não se adaptaram à dieta.
Estes grupos foram suspensos no 30º dia de experimento em decorrência de
evolução para óbito (6 animais do grupo G5 e 4 animais do grupo G6). No grupo G5
e no G6, o resultado da necropsia identificou enterite mucóide com congestão
gastrointestinal (Fig. 3 e 4). Esta dieta acarretou imediato efeito colateral nos
30
animais como afagia, astenia, disenteria e melena. Mesmo com a suspensão
imediata da dieta, os cuidados tomados para manter a vida dos animais doentes não
tiveram êxito. Ficou evidente que este volume de dieta não é suportada pelos
animais, mesmo sendo administrada em duas tomadas.
Figura 3. Enterite mucóide no intestino grosso (G5 - gema 40 ml).
Observar-se distensão de alças Intestinais (seta).
Figura 4. Enterite mucóide no intestino grosso.
(grupo 6 - banha 40 ml). Observar-se distensão de alças
31
Intestinais (seta).
Figura 5. Acidente vascular encefálico: hemiplegia esquerda
(grupo 2 - colesterol 1 g).
Figura 6. Esteatose hepática no coelho do grupo 2
(colesterol 1 g).
32
No último trimestre do experimento, o grupo controle reduziu em média
13,6% o volume diário de ração ingerida, este resultado em relação aos demais
grupos foi significante (P<0.0001).
O apetite dos animais por ração evoluiu de forma semelhante nos grupos
G2 (gema) ao G4 (banha), aumentando sua ingesta gradativamente; nestes grupos,
apenas o G2 foi significante em ralação ao G6. No grupo G5 apetite diminuiu (12,5%)
no 30º dia. No grupo G6, os animais se adaptaram e passaram a se alimentar melhor
com aumento de 305,5% (Tab. 1).
Tabela 1. Média, desvio padrão e porcentagem da ingesta diária de ração (g)
conforme o dia e o grupo experimental. (G1) controle, (G2) 1 g de colesterol,
(G3) 20 ml de gema, (G4) 20 ml de banha, (G5) 40 ml de gema, (G6) 40 ml de
banha.
P< 0,05. G1* vs G2, G1* vs G3, G1* vs G4 ,G1* vs G5, G1* vs G6, G2* vs G6 .
Analisando a tabela 1, observa-se que apenas o grupo controle (G1) e o
grupo com 40 ml de gema diminuíram o volume de ração ingerido em relação ao
início do experimento.
Conforme esperado pelos pesquisadores, os animais em que foi
administrado colesterol, gema, ou banha diminuíram o volume de ração ingerida.
33
4.2- TAXAS DE COLESTEROL
A seguir, apresentam-se separadamente os dados referentes às taxas de
colesterolemia Total, HDL e LDL segundo os grupos:
4.2.1- COLESTEROL TOTAL POR GRUPOS
G2 (1 g de colesterol) – No dia 30 passou de 105,2 mg/dL para 243,3
mg/dL (aumento de 131,3%). O valor de colesterol total médio foi subindo durante o
experimento, sendo que, no dia 100, foi de 105,2 mg/dL para 1005,2 mg/dL (tendo
aumentado 855,5% em relação ao dia 0).
G3 (20 ml de gema) - Observa-se que houve o maior aumento da taxa
média de colesterol e que foram bastante expressivas, estas aumentaram de 52,2
mg/dL para 1466,6 mg/dL no dia 30 (aumento de 2708,4%) e se mantiveram com
taxas próximas a esta no dia 100 , passando de 52,2 mg/dL para 1820,6 mg/dL
(aumento de 3387,7%).
G4 (20 ml de banha) - No dia 30 passou o valor do colesterol de 69,5
mg/dL para 215,3 mg/dL (aumento de 211,6%), e chegando no dia 100 valor de 69,5
mg/dL para 183,4 mg/dL ( aumento de 163,9%).
G5 (40 ml de gema) - Quanto às taxas de colesterol total este grupo no
30° dia passou de 73,2 mg/dL para 653,8 mg/dL (aumento de 793,2%).
G6 (40 ml de banha) - O colesterol total mudou de 65,7 mg/dL para 145,2
mg/dL (aumento de 121%), do dia zero para o dia 30.
Comparando-se o grupo com dieta de gema 20 ml (G3), a variação do
colesterol total foi significante (P<0,0180) em relação ao grupo controle (G1)
34
chegando a aumentar 3387,7% no dia 100 em relação ao dia 0, que passaram
respectivamente de 52,2 mg/dL para 1820,6 mg/dL. A descrição das médias e
desvio padrão de cada grupo está melhor detalhada por trimestre na tabela a seguir:
Tabela 2. Média, desvio padrão e porcentagem da colesterolemia total
conforme o dia e grupo experimental. (G1) controle, (G2) 1 g de colesterol, (G3)
20 ml de gema, (G4) 20 ml de banha, (G5) 40 ml de gema, (G6) 40 ml de banha.
* P< 0,05. G2 vs G1 e G3 vs G1.
4.2.2- COLESTEROL HDL
Na tabela 3, as frações de colesterol HDL-c demonstram com 95% de
confiança, que existiram diferenças significantes entre os grupos, com valor de p <
0, 018. O grupo em que foi administrado 20 ml de gema (G3), obteve destaque com
aumento do HDL-c de 91,5% em relação ao dia 0. O resultado deste grupo foi
significante em relação ao grupo G1 ( que teve decréscimo 18,1%) e G4 (onde
ocorreu aumento de 50,9%). Os grupos G5 e G6 tiveram decréscimo de 8% e
46,8% respectivamente, resultados estes que não se revelaram significantes.
35
Tabela 3. Média, porcentagem e desvio padrão do colesterol HDL plasmático
(mg/dL) conforme o dia e o grupo experimental. (G1) controle, (G2) 1 g de
colesterol, (G3) 20 ml de gema, (G4) 20 ml de banha, (G5) 40 ml de gema, (G6)
40 ml de banha.
p < 0,05 . G3* vs G1 e G3 vs G4. (NS) comparado outros grupos.
4.2.3- COLESTEROL LDL
Valores do LDL-c (mg/dL) plasmático não revelaram diferenças reais e
significantes entre os grupos experimentais (p> 0,12). O grupo G2 obteve nível de
LDL-c de 1781,1% no dia 100, em referência à primeira análise sanguínea. Mesmo
com estes valores elevados, este, não obteve dados tão expressivos como no grupo
G3 (20 ml diárias de gema), que apresentou taxa de 14,2 mg/dL (dia 0) para 1742,1
mg/dL no final do experimento (aumento de 12.168,3%), estes resultados, são
apresentados na tabela a seguir.
36
Tabela 4. Média, porcentagem e desvio padrão do colesterol LDL (mg/dL)
plasmático conforme o dia e o grupo experimental. (G1) controle, (G2) 1 g de
colesterol, (G3) 20 ml de gema, (G4) 20 ml de banha, (G5) 40 ml de gema, (G6)
40 ml de banha.
Dados expressos NS para os grupos experimentais, p > 0,05.
4.3- DOSAGENS DE TRIGLICERÍDEOS
A taxa de triglicerídeo no grupo controle obteve aumento de 7%, o grupo
G2 (1 g de colesterol) apresentou redução de 7,4%. O grupo G3 (gema 20 ml)
aumentou 136,5%. Já o grupo o G4 (banha 20 ml), que obteve um aumento 278%
(quase o dobro do grupo anterior). Grupo G5 (40 ml gema) aumentou 609,5% em
relação a sua primeira análise, sendo significante através do teste de Tukey
comparando-o com outros grupos, tendo o valor de p<0,04 (Tab. 5). O grupo G6
(banha 40 ml), em sua segunda análise (dia 30) obteve aumento de 283,5% de
triglicerídeo (Tabela 5).
37
Tabela 5. Média, porcentagem e desvio padrão do triglicerídeo plasmático
(mg/dL) conforme o dia e o grupo experimental. (G1) controle, (G2) 1 g de
colesterol, (G3) 20 ml de gema, (G4) 20 ml de banha, (G5) 40 ml de gema, (G6)
40 ml de banha.
p <0,05. Relação entre os grupos G3* vs G1, G5* vs G1.
4.4 - PESO DO ANIMAL
Os dados da tabela 6, demonstram o peso (g) dos coelhos por grupo
durante 100 dias (exceto o grupo G5 e G6, com duração de 30 dias), revelando que
os grupos em tratamento até o dia 100 obtiveram ganhos de peso aproximados,
mais com diferença significante para o grupo alimentando com 20 g de gema
(aumento de 16,8%) para os 100 dias em relação ao grupo controle (aumento de
15,9%) e ao grupo 1 g de colesterol (aumento de 5,3%) com valor de p<0,0002. O
grupo 40 g de gema foi significante (aumento de 1,6%) no dia 30 em relação apena
ao grupo controle. Apesar do grupo controle (ração comercial) ter consumido maior
volume de ração, em comparação com os grupos que receberam outras dietas, não
se observou resultados significantes em relação ao ganho de peso, conforme pode
ser observado na Tabela 6.
38
Tabela 6. Média, porcentagem e desvio padrão do peso (g) do animal conforme
o dia e o grupo experimental. (G1) controle, (G2) 1 g de colesterol, (G3) 20 ml
de gema, (G4) 20 ml de banha, (G5) 40 ml de gema, (G6) 40 ml de banha.
p <0,05. Relação entre os grupos G3* vs G1, G3* vs G2, e G5* vs G1.
4.5 - ALTERAÇÕES CUTÂNEAS E FECAIS
O grupo G4 (20 ml de banha), apresentou várias complicações clínicas: 2
tiveram alopécia (Fig. 7), 2 xantomas labiais (Fig. 8) e 1 xantoma auricular (Fig. 9),
contudo nenhum destes animais evoluiu para óbito. 3 animais desenvolveram
disenteria aguda nos primeiros dias (Fig. 10).
O grupo G3 (20 ml de gema), apresentou fezes escurecidas (Fig. 11).
39
Figura 7. Alopécia no coelho do grupo G4 (20 ml banha).
Figura 8. Xantoma na região mentual do coelho do grupo
G4 (20 ml de banha) (seta).
40
Figura 9. Xantoma na face auricular interna do coelho
do grupo G4 (20 ml de banha) (seta).
Figura 10. Aspecto das fezes (diarréia) no grupo G6
(banha 40 ml) (seta).
41
Figura 11. Aspecto das fezes escurecidas no grupo G3
(gema 20 ml) (seta).
4.6- ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA
Para esta análise, foram retiradas as artérias carótida comum direita em
nível de sua bifurcação, o arco da aorta e o segmento proximal da artéria femoral
direita. Os resultados dos grupos seguem descritos nas tabelas 7, 8, 9 e 10.
G1 (controle) - Não foram observadas alterações histológicas nos vasos
analisados.
G2 (colesterol 1g) - Foi evidenciada formações de células espumosas
em todos os animais (100%) e espessamento endotelial em 6 animais (71,4%), (Fig.
13 e 14).
42
G3 (gema 20 ml) - Foram observadas bem delineadas, células
espumosas e espessamento em 6 coelhos (85,7%) , (Fig. 15 e 16). De acordo com
a mensuração do espessamento a aorta e femoral foram significantes comparados
com os demais (Tabela 9).
G4 (banha 20 ml) não foram observadas alterações do endotélio.
G5 (gema 40 ml) - Mesmo com apenas 30 dias de dieta, observou-se a
formação de células espumosas em 2 animais (28,5%) e em 1 animal (14,3%)
espessamento do endotélio (Fig. 17).
G6 (banha 40 ml) - Não foram observadas alterações histológicas com o
mesmo tempo de tratamento do G1.
Figura 12. Ausência de espessamento endotelial da aorta
G1 ( controle). Aumento 4X.
43
Figura 13. Presença de células espumosas (seta). Carótida comum no
grupo G2 ( 1 g de colesterol). Aumento 4X.
Figura 14. Espessamento do endotélio, 630 µm. Artéria femoral
G2 (1 g de colesterol). Aumento 4X.
44
Figura 15. Espessamento do endotélio, 540 µm. Artéria carótida
G3 (20 ml de gema). Aumento 4X.
Figura 16. Espessamento do endotélio, 810 µm. Aorta
G3 (20 ml de gema ). Aumento 4X.
45
Figura 17. Espessamento do endotélio, 350 µm. Aorta G5
(40 ml de gema ). Aumento 4X.
Para facilitar a análise dos dados histológicos optou-se por apresentá-los
em tabelas.
Tabela 7. Número de vasos sanguíneos analisados por grupos que
apresentaram células espumosas sem espessamento de endotélio. (G1)
Controle, (G2) 1 g de colesterol, (G3) 20 ml de gema, (G4) 20 ml de banha, (G5)
40 ml de gema, (G6) 40 ml de banha.
GRUPOS G1 G2 G3 G4 G5 G6
Carótida 0 3 4 0 0 1
Aorta 0 4 1 0 0 1
Femoral 0 3 1 0 0 1
* p <0,05. G2* vs G1, G2* vs G4, G2* vs G5, G3* vs,G4, G3* vs G5 e G3* vs G6.
46
Analisando a tabela 7, observa-se que os grupos com utilização de
banha, apenas apresentaram alterações com altas doses.
Tabela 8. Número de vasos sanguíneos identificados com espessamento de
endotélio. (G1) Controle, (G2) 1 g de colesterol, (G3) 20 ml de gema, (G4) 20 ml
de banha, (G5) 40 ml de gema, (G6) 40 ml de banha.
GRUPOS G1 G2 G3 G4 G5 G6
Carótida 0 2 1 0 0 0
Aorta 0 7 5 0 2 0
Femoral 0 1 4 0 0 0
* p <0,05. G2* vs G1, G2* vs G4*, G2* vs G5, G2* vs G6, G3* vs G1 , G3* vs G4, G3* vs G5 e G3
vs G6.
Nessa tabela, verifica-se que todos os animais com ingestão de 1 g de
colesterol (G2) e todos com 20 ml de gema (G3), apresentaram espessamento
endotelial em algum dos vasos analisados.
Tabela 9. Média e desvio padrão do espessamento do endotélio em
micrômetros (µm) nos grupos (G2) 1 g de colesterol e (G3) 20 ml de gema.
VASOS (µm) AORTA FEMORAL CARÓTIDA
GRUPO DE COLESTEROL (1 g) 144,2±15,2* 72,3±12,2 108,5±37,8
GRUPO DE GEMA (20 ml) 720,1±153,4*
360,2±75,3*
180,3±65,4
* p <0,05. G2: aorta* vs femoral e carótida, G3: aorta* vs carótida.
47
O espessamento endotelial de 144,2 µm no (G2) e 720,1µm (G3), foi
399,4% a mais na aorta dos animais alimentados com gema. Na femoral, o grupo
colesterol (G2) apresentou espessamento de 72,3 µm e no grupo Gema (G3)
espessou 360,2 µm (aumento de 398,2%). Na carótida, a relação da média de
espessamento nestes grupos foi de 108,5 µm para 180,3 µm respectivamente
(66,2% a mais de espessamento), conforme foi apresentado na tabela 9.
Comparando-se com o grupo do colesterol, esse resultado comprovou um efeito
bem mais agressivo da gema sobre o endotélio.
Na tabela a seguir, apresentam-se o número e a porcentagem de animais
que desenvolveram aterosclerose.
Tabela 10. Número de animais que desenvolveram aterosclerose. (G1)
Controle, (G2) 1 g de colesterol, (G3) 20 ml de gema, (G4) 20 ml de banha, (G5)
40 ml de gema, (G6) 40 ml de banha.
* p <0,05. G2 vs G5 , G3 vs G5. NS . G2 vs G3.
Um dado importante nestes resultados é o fato de todos os coelhos do
grupo de colesterol (1g), bem como todos os do grupo com 20 ml de gema
apresentaram aterosclerose, o que comprovou a eficácia dos dois modelos na
indução da doença.
Concluindo os resultados, apresenta-se a seguir uma tabela, onde se tem
um estudo comparativo do colesterol total no atual experimento (BERNARDINO e
SOUSA-RODRIGUES, 2008) com os diferentes modelos propostos.
48
Tabela 11. Comparação entre os experimentos realizados sobre os tipos de
dieta hipercolesterolêmica e o valor do colesterol plasmático total em relação
aos resultados de Bernardino & Sousa-Rodrigues
AUTORES DIAS
DIETA
COLESTEROL
(mg/dL)
ASAI et al. (1998)
COLEST 1,0% 1689
BERNARDINO e SOUSA-RODRIGUES (2008)
20 ml BANHA PORCO 183
1 GEMA (20 ml) 1820,6
COLEST 1 g
1005,2
BOCAN et al. (1993)
COLEST 0,25% 287,5
COLEST 0,5% 505,8
COLEST 1,0% 843
COLEST 1,5% 816
COLEST 2,0% 855
CONNOR et al. (1967)
COLEST 0,25% + MANTEIGA 596
HENRY et al. (1981)
COLEST 2,0% + PLACEBO 1903
IHARA et al. (1998)
COLEST 0,5% 1000
COLEST 1,5% 1416
VALIENTE et al. (2001)
COLEST 0,5%
486,5
WAKASUGI et al. (1984)
COLEST 1,0% 517
RIBEIRO JORGE et al. (1997)
COLEST 0,5%+GORDURA BABAÇU 10% 1693
RIBEIRO JORGE et al. (1998)
COLEST 0,5%+GORDURA BABAÇU 10% 1360,5
RIBEIRO JORGE et al. (2005)
COLEST 0,5%+ÓLEO DE COCO 2,0% 760
KAGAN et al. (1981)
COLEST 2,0% +ÓLEO DE AMENDOIM 8g 3450
MERRIL et al. (1957)
COLEST 2,0% + PLACEBO 1300
COLEST 2,0% + ÁCIDO NICOTIM 0,4% 500
LIMA et al. (2003)
COLEST 0,5% 138,3
49
5. DISCUSSÃO
50
5.1- ADAPTAÇÃO À DIETA
Analisando o trabalho Gonzáles-Gonzáles et al. (2005), que alimentaram
36 coelhos com dieta aterogênica, 05 animais morreram no espaço de 30 dias. O
Protocolo da prática consistia em colesterol 25,5 g mais 1,5 g de tiouracil, 10 g de
ácido cólico e 200 g de manteiga que foi padronizado com 200 g de mistura para 1
kg de ração. Diferentemente destes autores, que dissolveram a dieta gordurosa na
ração peletizada dos animais, (e sabendo que cada animal se alimenta com volume
diferente), para ter certeza que cada animal alimentava-se exatamente com a
dosagem desejada, nós preferimos administrar diretamente a dieta via oral, através
de seringa ou sonda nasogástrica. Isto se deve ao fato de desejarmos nesta
dissertação, estabelecer com precisão qual das dietas é mais deletéria à parede
arterial, bem como pretendeu-se aqui, determinar qual dieta tem menor custo e se
as dietas de fácil aquisição e administração produzem com eficácia os modelos
experimentais de arteriosclerose. Baseados nisto, verificamos em nosso trabalho
que é viável provocar arteriosclerose sem a necessidade de manipular dietas
elaboradas em laboratórios, bem como não é necessário adquirir colesterol puro,
produto este, que pode ser de alto custo, poderá limitar alguns experimentos, ao
passo em que tanto a gema como a banha são mais facilmente encontradas.
Nossos resultados comprovaram que a dieta simplesmente com gema de ovo é mais
eficaz que o colesterol puro que vinha até então sendo constantemente utilizado nas
pesquisas nacionais e internacionais.
ANITSCHKOW (1913) em seu experimento com coelho mostrou que 90%
desenvolveram aterosclerose com gema de ovo e colesterol puro. Também Jaldin et
al., 2006, evidenciaram que a dieta com gema de ovo desenvolvem aterosclerose
leve em coelhos e alterações semelhantes às provocadas pelo colesterol puro.
Apesar destes autores descreverem a formação de placas, não deixam claro como
deve reproduzido esse modelo, ou seja, por quanto tempo foi administrado a gema,
bem como com qual a quantidade de gema (em volume) deve ser administrada.
Também nenhum autor descreveu qual o volume máximo de gema suportado pelos
51
animais sem causar óbito. Talvez, seja este o motivo das dietas descritas por
ANITSCHKOW (1913) e JALDIN et al. (2006) não estarem sendo utilizadas com
freqüência. Dessa forma, a comunidade científica não conseguindo reproduzir
fidedignamente estes modelos, optaram por modelos mais caros e elaborados e
agora, baseados em nossos resultados, comprovadamente menos eficazes. Em
nosso experimento a simplicidade de manuseio e a administração da gema crua de
galinha, nos deram resultados significativamente maiores de colesterol total, de sua
fração LDL, bem como no espessamento do endotélio arterial, espessamento este,
que não foi descrito por estes autores.
Levando-se em consideração a ingestão de ração peletizada nos animais
com dieta suplementada com gema, com banha ou com colesterol observou-se
ingesta bem menor em relação ao grupo controle. Para este, era ofertada apenas
ração peletizada. Este comportamento alimentar dos animais já era obviamente
esperado, uma vez que estávamos forçando os animais a alimentarem-se com
gema, ou banha, ou ainda, com colesterol. Tal observação, não é novidade e já foi
descrita por IHARA et al. (1998). Estes autores observaram que consumo de ração,
também, foi menor após um mês de dieta com colesterol em relação aqueles grupos
alimentados apenas com ração comercial.
5.2 – COLESTEROLEMIA
CONNOR et al. (1967), usando 0,25% de colesterol acrescido de
manteiga durante 135 dias, obteve valor de colesterol plasmático total obtendo taxa
média de 596 mg/dL. Com a mesma dosagem de colesterol e acrescentando 2% de
óleo de coco, durante 35 dias, RIBEIRO JORGE et al. (2005) obteve taxa de
colesterol de 760 mg/dL, nós em 100 dias obtivemos taxa de colesterol total de
52
1821mg/dL com 20 ml de gema, portanto bem mas eficiente do que o modelo
retratado por estes autores.
Por outro lado, analisando os trabalhos experimentais sobre
aterosclerose em coelhos observou-se que a administração com 2 % de colesterol
mais 10 % de óleo de amendoim do trabalho de KAGAN et al. (1981), determinou
em um índice bem mais elevado (3450 mg/dL) no valor de colesterol total
plasmático. Apesar dos bons resultados descritos, estes autores descrevem que o
colesterol foi dissolvido nas peletas, contudo estes não deixam claro como foi a
administração do óleo de amendoim, como na maioria dos trabalhos, os autores
dificultam a reprodução do modelo.
Oportunamente MERRIL et al. (1957) e HENRY et al. (1981) com
administração de 2,0 % de colesterol mais placebo obtiveram valores de colesterol
em 60 dias de 1300 e 1900 mg/dL respectivamente, resultados semelhantes aos
1819 e 1821mg/dL encontrados por nós em 60 e 120 dias com a administração de
20 ml de gema.
Com administração de colesterol em 1% na dieta do trabalho de
WAKASUGI et al. (1984); BOCAN et al. (1993); ASAI (1998); VALIENTE et al. (2001)
e BERNARDINO E SOUSA-RODRIGUES (2008) obtiveram dosagens de colesterol
plasmático crescentes, demonstrando que o valor do colesterol plasmático foi
diretamente proporcional ao tempo de experimento, apesar de termos encontrado
um valor de colesterol plasmático em média, bem maior no da 30 do que no dia 0 e
maior ainda no dia 60, mais praticamente estes valores foram estáveis entre o dia 60
e o dia 100. Este resultado também se confirma para os experimentos realizados
com dosagens de 0,5% de colesterol segundo BOCAN et al. (1993), IHARA et al
(1998), VALIENTE et al. (2001). Trabalhos de RIBEIRO JORGE et al.(1997 e 1998),
acrescentando ao colesterol de 0,5% mais 10% de gordura de babaçu tiveram com
resultado valores de colesterol plasmático no tempo de 30 dias ultrapassando 100
mg/dL de colesterol plasmático . TELOKEN et al. (2000) usando 0,5% de colesterol
mais 4% de gordura de porco obteve em 70 dias valor de colesterol de 314 mg/dL e
oportunamente, nosso trabalho, BERNARDINO E SOUSA–RODRIGUES (2008) com
uso de 20 g de banha de porco, sem uso de colesterol puro obteve taxas inferiores
com média de 183 mg/dL em 100 dias.
53
JALDIN et al. (2006), usaram uma gema para 150 gramas de ração
obtiveram valores de colesterol total plasmático abaixo aos resultados de
BERNARDINO E SOUSA-RODRIGUES (2008). Nesta observação destacamos que
o aumento das taxas de colesterol total no grupo G3 (20 ml de gema) foi bem maior
que no grupo G2 (1000 mg de colesterol). Apesar de uma gema apresentar o
volume de 20 ml, possui em média de 225 mg de colesterol, os autores acreditam
que a hipercolesterolemia foi mais acentuada devido ao fato do colesterol está
melhor dissolvido e distribuído na gema em sua forma líquida, isto possivelmente
explicaria a absorção facilitada do colesterol exógeno.
5.3- DOSAGENS DE TRIGLICERÍDEOS
HENRY et al. (1981) com colesterol 2% em 60 dias, obteve taxas de
triglicerídeos de 129±30 mg/dL em relação ao dia zero que foi de 90±23 mg/dL.
Oportunamente WAKASUGI et al. (1984) com 1% de colesterol durante uma
semana, obteve taxa de triglicerídeo baixa de 33±20 mg/dL. O trabalho de
TELOKEN et al (2000), usando ração acrescida com 0,5% de colesterol mais 4 % de
banha animal durante 70 dias, obtiveram taxas de triglicerídeos 122 mg/dL em seu
experimento. Para RIBEIRO JORGE et al. (1998) os valores de triglicerídeo
chegaram a ter um aumento em 174% em relação ao grupo controle. Sua dieta
estava baseada em 0,5% de colesterol juntamente com a gordura de babaçu a 10%,
administrada durante 35 dias. Através do trabalho de ASAI et al. (1998) foi
evidenciado aumento do triglicerídeo com dieta 1% de colesterol passando de
104±18,1 mg/dL para 718,3± 356,3 mg/dL durante 180 dias. No outro grupo de seu
experimento, colesterol 0,5%, o valor médio de triglicerídeo foi de 122 mg/dL em 70
dias.
Os resultados das taxas de triglicerídeos destes autores foi bastante
discrepante, estranhamente, observe-se ainda, o aumento dos triglicerídeos para
54
autores que acrescentaram apenas colesterol à dieta (HENRY et al.,1981), os quais
obtiveram valores próximos ao experimento que administrou colesterol e banha
animal (TELOKEN et al., 2000).
Estranhamos os resultados descritos por HENRY et al. (1981), por que
em nosso resultado foi evidenciado que quando se acrescenta uma dieta rica em
gordura (banha), a taxa de triglicerídeo, presente fortemente na banha, aumenta de
forma significante em relação àqueles tratados com colesterol ou gema de ovo,
conforme descrito abaixo.
Evidenciamos que após 100 dias, no grupo G3 (20 ml de gema), as taxas
de triglicerídeos foram de 150,2 mg/dL enquanto que o grupo G4 (20 ml de banha)
foi de 386,3 mg/dL, já o grupo G2 (1g de colesterol) teve taxas de triglicerídeos de
70,2 mg/dL e no dia 0, a taxa foi de 75,8 mg/dL. Já o grupo G1 (grupo apenas com
ração) obteve nível médio de triglicerídeo em 74,4 mg/dL.
Os resultados são reforçados pelos demais autores citados, identificando
que a dieta com banha de porco aumenta de forma significante o nível de
triglicerídeo ou outro tipo de gordura acrescida na dieta. O trabalho de ASAI et al.
(1998), foi outra exceção, com resultados ainda mais gritantes, quando através da
administração de colesterol a 1% obteve no final de seu experimento taxas elevadas
de triglicerídeos de 718,3± 356,3 mg/dL. O que explicaria estes resultados?
Imaginamos que, além do tempo de administração da dieta superior a qualquer outro
trabalho citado (180 dias), a ração comercial oferecida aos animais, talvez já
contivesse algum tipo de gordura suficiente para influenciar no aumento dessas
taxas.
5.4- PESO DO ANIMAL
Levando em consideração o peso do coelho após experimento, Martin et
al, 1985, perceberam aumento em média de 900 g. Em concordância, o trabalho de
TELOKEN et al. (2000), obtiveram em seus animais experimentais ganho de peso
55
em 620g e com ração acrescida com 0,5% de colesterol mais 4 % de banha animal
um ganho de 920 g em 70 dias experimentais.
Diferente dos resultados IHARA et al. (1998) em seu experimento não
obtiveram diferença significante do peso animal e o consumo de ração foi menor
após um mês de dieta com colesterol em relação àqueles grupos alimentados com
ração comercial. Oportunamente o trabalho de VALIENTE et al. (2001) demonstrou
aumentou em 400 g para os animais tratados com dieta rica em colesterol 0,5%,
aumento de 200 g para os tratados com colesterol 1% e para grupo controle teve
aumento de 300 g, sem mostrar diferença significante nestes pesos, da mesma
forma RIBEIRO JORGE et al. (2005), em seu trabalho destacaram aumento de peso,
em média 200 g, sem ocorrer diferença significante. Em nosso trabalho observou-se
(Tabela 6) que o G3 (20 ml de gema) no final de 100 dias apresentou diferença
significante do seu pesos médio. Os outros animais neste mesmo período não
tiveram valores significantes, reforçando-nos os trabalhos citados anteriormente, que
há um aumento de peso dos animais nos dias determinados de experimentos,
entretanto nenhum grupo se destacou de forma significante. Exceção o trabalho de
JALDIN et al. (2006) que obteve no grupo com dieta suplementada com gema de
ovo peso corporal final maior e significante em relação ao grupo controle,
correspondendo aos mesmos resultados do nosso experimento com gema de ovo .
Vale ressaltar que nos diversos trabalhos experimentais, não há uma
padronização do peso dos animais, tornando difícil à comparação entre as
descrições. Autores como RENOUD e LECOMPTE (1970) chegaram a utilizar
animais com peso entre 1000 a 1500 g; MARTIN et al. (1985) usaram coelhos
com peso de 2340 ± 1000 g; AMARAL et al. (1989) entre 2500 g a 3000 g e
KAGAN et al. (1981), em seu modelo experimental, utilizaram coelhos pesando entre
2500 e 3500 g; quando já é provado que os coelhos mais pesados desenvolvem
aterosclerose com mais facilidade.
56
5.5- ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA
DUQUE (1998), já havia observado a formação de células espumosas
que surgiram principalmente nas artérias dos membros inferiores, em seqüência nas
artérias ilíacas, aorta e por último nas artérias coronárias. Conforme o experimento
de MARTIN et al. (1985), foram encontrados principalmente no arco da aorta,
intercostal e artéria mesentérica superior pequenas áreas de calcificação e células
espumosas. Análise de MANRESA e RECEDILLA (1986) mostra que as lesões
ateromatosas são mais observadas na aorta abdominal e em bifurcações.
ASAI et al. (1998) chama atenção ao exame microscópico quando foram
observadas células espumosas na aorta, da mesma forma Ihara et al, 1998
confirmam que lesões na aorta foram maiores em relação a outros vasos estudados.
Confrontando estes trabalhos, e evidenciando a rota da aterosclerose na aorta os
dois trabalhos de Amaral et al. (1989) demonstram lesões ateroscleróticas e
obstruções vasculares em diversos ramos da aorta em especial coronária e
intercostais. Ilustrando a importância da aorta como foco da patogenia da
aterosclerose BRUNNER et al. (2000), afirmaram que as placas fibrosas que se
desenvolvem, são compostas por células musculares lisas, fibras de colágeno,
componentes plasmáticos e lipídios nas quais são encontradas mais na aorta
abdominal, coronárias, poplíteas e carótida interna.
No experimento VALIENTE et al. (2001), todos os coelhos apresentaram
manifestações de lesões ateroscleróticas na artéria carótida, bem como também nos
experimentos de KUYMJIAN et al. (2004) foram notadas aterogênese induzida pela
dieta rica em colesterol na aorta e na artéria carótida. Em confirmação STAHLKE Jr
et al. (2004) realizaram cortes histológicos em três partes da aorta, onde foram
percebidos depósitos subendoteliais de macrófagos espumosos, fazendo protrusão
na luz do vaso, sem sinal da presença de cálcio .
GOTTLIEB (2005), em seus estudos afirmaram que qualquer artéria pode
ser afetada, mas as principais artérias acometidas na doença são aorta, artérias
coronárias e cerebrais. RIBEIRO JORGE et al. (2005), também apresentaram em
57
seu trabalho evolução da aterosclerose na aorta, onde foi observado maior
concentração de lipossomos extracelulares na região endotelial.
Levando em consideração a importância da gema, JALDIN et al. (2006)
encontraram acúmulos de lipídicos discretos no interior de células espumosas e que
estavam presentes na aorta abdominal, renal, carótidas e femoral. Em nosso
trabalho o foco do estudo histopatológico concentrou-se no arco da aorta, artéria
carótida comum direita e artéria femoral direita, e são estes os vasos que mais se
destacam nos fenômenos da aterosclerose segundo os autores citados revelando-
os, em investigação, que estes três vasos desenvolvem formação de células
espumosas. O resultado nosso, no grupo G3 (gema 20 ml) revelou o espessamento
de endotélio que se destaca mais na aorta e femoral conforme o gráfico 9.
Nesta análise e em concordância a American Heart Association (AHA)
sobre as lesões ateroscleróticas que são classificadas pela sua fisiopatologia em
tipo I até VI, em nossos estudos, evidenciaram-se lesões intermediárias, que de
acordo com AHA representa a fase III ou pré-ateroma.
Cada autor dos descritos acima, utiliza um tipo diferente de modelo e um
tipo diferente de dieta. Não há uma padronização, os trabalhos analisados, não
descrevem com precisão o modelo utilizado. Cada grupo desenvolve suas
adaptações e adequações.
Por este motivo, decidimos comparar três modelos de dieta, utilizando os
produtos mais descritos pelos autores que encontramos. A grande maioria dos
autores compulsados administra colesterol puro dissolvido na dieta peletizada. O
primeiro modelo descrito foi com gema de ovo, ANITSCHKOW (1913), mas este não
se propagou. Alguns outros administraram banha, que no imaginário popular é bem
pior para a saúde quando utilizada para dieta, o que em nossos resultados, não se
comprovou.
Apesar da maioria dos autores optarem por um modelo mais caro, e bem
prático (colesterol dissolvido em peletas), este não é o mais eficaz na produção de
placas, sendo a gema mais prejudicial ao endotélio arterial do que a própria banha.
Não apenas ao endotélio, senão vejamos os nossos resultados:
No caso da esteatose hepática, no grupo da gema (20 ml) foi constatada
em 5 animais (71,4%). No grupo colesterol, ocorreu em 7 animais (100%).
58
Em todos os animais do grupo gema (G3) e do grupo colesterol (G2)
observaram-se alterações no endotélio arterial (espessamento) em algum dos vasos
analisados. No grupo que recebeu o dobro de gema (G5) com apenas 30 dias de
experimento, já se puderam evidenciar espessamento de endotélio na aorta de dois
animais, apesar deste grupo ter sido suspenso após os 30 dias, demonstrou a
eficácia da dieta com gema no modelo de aterosclerose experimental. Foi
interessante constatar que o grupo alimentado com 20 ml diários de banha animal
(G4), não apresentou qualquer espessamento de endotélio (repetimos 3 vezes as
lâminas deste grupo obtendo o mesmo resultado). Apesar de terem sido observados
espessamento no mesmo número de vasos no grupo gema (G3) e no grupo
colesterol (G2); na tabela 9, demonstra uma diferença discrepante na espessura
endotelial do grupo gema (G3), que foi 399,4% a mais na aorta; na femoral, aumento
de 398,2% e na carótida, espessamento a mais de 66,2%.
59
6. CONCLUSÕES
60
1- A produção de aterosclerose experimental é possível e viável utilizando-se
colesterol puro 1%, 20 ml gema de galinha crua ou 20 ml de banha de porco.
2- A administração de 20 ml de gema crua de ovo de galinha é funcional, mais
barata e mais eficaz para modelos experimentais que envolvam estudos do perfil
lipídico e produção de aterosclerose experimental.
3- A pior dieta para estudos de indução de aterosclerose experimental é a que utiliza
banha de porco.
4- Coelhos Albinos Nova Zelândia não suportam dietas que administrem mais de 20
ml de gema ou de banha.
61
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ROSENFELD, M.E.; SCHAFFER, A.S.; SCHWARTZ, C.J.; WAGNER, W.D.;
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68
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69
REFERÊNCIAS CONSULTADAS
70
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documentação – Trabalhos acadêmicos – apresentação. Rio de Janeiro, 2005.
_____________ .NBR 6029: Informação e documentação: livros e folhetos:
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Janeiro: Positivo, 2006.
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1988. 564 p.
HOEL, P.G. Estatística elementar. Rio de Janeiro: Editora Atlas, 1989.
SOBOTTA, J.B. Atlas de Anatomia humana. Rio de Janeiro, Guanabara-Koogan,
1996.
71
APÊNDICES
1
ESTUDO DA ATEROSCLEROSE INDUZIDA POR DIFERENTES TIPOS DE
DIETA HIPERLIPÍDICA EM COELHOS ALBINOS (NOVA ZELÂNDIA)
FICHA DE CONTROLE DO GRUPO
Grupo ____ Dieta de ____g de ______________
Data:__ / __ / _______ ______________ Hora: ____ : ____
Relato sobre o Grupo / Aspecto Geral:
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
Descrição do Procedimento de Coleta de Sangue para Análise Laboratorial:
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
RESULTADO DOS EXAMES
Animais Colesterol Total Colesterol LDL Colesterol HDL Triglicerídeos
V. de Referêcia
Coelho 1
Coelho 2
Coelho 3
Coelho 4
Coelho 5
Coelho 6
Coelho 7
Observações / Dificuldades:
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
Responsável pelo preenchimento.: _______________________________________
2
ESTUDO DA ATEROSCLEROSE INDUZIDA POR DIFERENTES TIPOS DE
DIETA HIPERLIPÍDICA EM COELHOS ALBINOS (NOVA ZELÂNDIA)
FICHA DE CONTROLE INDIVIDUAL
Grupo _________ Animais Dieta de ____g de ________________
Avaliação dos Animais para Submissão na Pesquisa:
Coelho ___, Gaiola ____, Data de admissão ___/____/____, ___________Hora ___:___,
Peso do Coelho(g) :_____ Programação da ração – ad libidum
Aspecto Geral:
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
__________________________________________________________________
1ª. Tomada: Peso do Coelho (g) :_______
Hora: Início ____:_____ Término ____:____ Duração ____:_____
Troca de água sim ( ) não ( ) Limpeza da gaiola sim ( ) não ( )
Nível de aceitação da dieta:
ótimo ( ), bom ( ), regular ( ), aceita c/ dificuldade ( ), aceita c/ muita dificuldade ( )
não aceitou ( ) _____________________________________________________________
observações gerais :
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
2ª. Tomada:
Hora: Início ____:_____ Término ____:____ Duração ____:_____
Nível de aceitação da dieta:
ótimo ( ), bom ( ), regular ( ), aceita c/ dificuldade ( ), aceita c/ muita dificuldade ( )
não aceitou ( ) _____________________________________________________________
observações gerais :
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
Responsável pelo preenchimento.: _______________________________________
3
ESTUDO DA ATEROSCLEROSE INDUZIDA POR DIFERENTES TIPOS DE
DIETA HIPERLIPÍDICA EM COELHOS ALBINOS (NOVA ZELÂNDIA)
FICHA DE CONTROLE INDIVIDUAL
Grupo ______ Animais Dieta de ____g de ________________
1ª. Tomada:
Peso do Coelho (g) :_______ Peso de Ração Ingerida (g): _____
Coelho ___, Gaiola ____, _____ Dia: Data ___/____/____, _____________
Hora: Início ____:_____ Término ____:____ Duração ____:_____
Troca de água sim ( ) não ( ) Limpeza da gaiola sim ( ) não ( )
Nível de aceitação da dieta:
ótimo( ), bom( ), regular( ), aceita c/ dificuldade( ), aceita c/ muita dificuldade( )
não aceitou ( ) __________________________________________________________
Aspecto Geral / Observações:
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
__________________________________________________________________
2ª. Tomada:
Hora: Início ____:_____ Término ____:____ Duração ____:_____
Nível de aceitação da dieta:
ótimo( ), bom( ), regular( ), aceita c/ dificuldade( ), aceita c/ muita dificuldade( )
não aceitou ( ) __________________________________________________________
Aspecto Geral / Observações:
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
__________________________________________________________________
Responsável pelo preenchimento: _______________________________________
4
ESTUDO DA ATEROSCLEROSE INDUZIDA POR DIFERENTES TIPOS DE
DIETA HIPERLIPÍDICA EM COELHOS ALBINOS (NOVA ZELÂNDIA)
FICHA DE CONTROLE INDIVIDUAL
Grupo ______ Animais Dieta de ____g de ________________
Relatório de Suspensão Temporária da Pesquisa:
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
_____________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
____________________________________________________________
Relatório de Suspensão Definitiva da Pesquisa:
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
_____________________________________________
Data: ___ / ___ / ______, _______________________ Hora: ___ : ___
Responsável pelo preenchimento.: _______________________________________
5
ESTUDO DA ATEROSCLEROSE INDUZIDA POR DIFERENTES TIPOS DE
DIETA HIPERLIPÍDICA EM COELHOS ALBINOS (NOVA ZELÂNDIA)
FICHA DE CONTROLE INDIVIDUAL
Grupo ___ Coelho _____ Gaiola: ____ Data:___ / ___ / ______ Hora: ___ : ___
Necropsia
Descrição do Procedimento:
Achados:
Conclusão:
Observações:
Responsável pelo preenchimento.: _______________________________________
6
ANEXOS
1
2
3
4
Livros Grátis
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