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UNIVERSIDADE LUTERANA DO BRASIL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM DIAGNÓSTICO
GENÉTICO E MOLECULAR
Estudo do Polimorfismo G54C no gene SREBF-1c em Pacientes
Dislipidêmicos
Dissertação para obtenção do Título de
Mestre em Diagnóstico Genético e
Molecular.
Eliane Hüller
Orientadora: Drª. Cláudia Dornelles da Silva
CANOAS
2007
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AGRADECIMENTOS
À Jeová Deus, por todas as coisas boas que tem feito por mim, pela proteção nos
diversos momentos da minha vida, pela sabedoria, discernimento e fundamentalmente
por ter me conduzido até aqui.
Aos meus pais, razão da minha existência, pelo amor, incentivo e compreensão
nos momentos de ausência, pelo desenvolvimento da conduta e caráter que tenho, pelo
suporte psicológico na minha formação. Por seu exemplo de determinação, coragem e
perseverança frente à vida.
Ao meu irmão e cunhada, Elemar e Magda, pelo apoio emocional e material, sem
o qual seria inviável o término deste curso.
À minha grande amiga e colega de mestrado Cinara Regina Volkmer, por sempre
ter estado ao meu lado nas diversas etapas deste curso, me incentivando e orientando na
concretização desta pesquisa. Pelas boas risadas, bate papos, desabafos e
fundamentalmente pelo companheirismo.
Às queridas colegas de Mestrado Janice Karpinski e Maristela Flores por dividir as
suas experiências e contribuir com sugestões.
Aos colegas bolsistas do laboratório de Genética Molecular da ULBRA, pelo
auxílio e bom humor durante o trabalho.
À Dra. Cláudia Dornelles da Silva por ter aceito ser minha orientadora e ter me
encaminhado para o tema tratado.
Ao Coordenador do Programa de Pós-graduação em Diagnóstico Genético e
Molecular, Dr. Daniel Simon, por seu empenho e atenção.
À Coordenadora dos Mestrados, Dra. Maria Cleidia Oliveira, pela competência,
excepcional atendimento e desprendimento.
Ao Doutorando Andry Fiterman Costa, por ter disponibilizado o acesso aos
pacientes, aos dados clínicos, bioquímicos e o auxílio nas análises estatísticas.
À Dra. Nadine Clausell por ter viabilizado a realização dessa pesquisa.
Em fim, a todas aquelas pessoas que embora não tenham sido mencionadas e
que contribuíram para a realização deste trabalho, o meu mais sincero e profundo
agradecimento.
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“O degrau de uma escada não serve simplesmente para que alguém permaneça
em cima dele, destina-se a sustentar o pé de um homem pelo tempo suficiente
para que ele coloque o outro um pouco mais alto”.
(Thomas Henry Huxley – Biólogo Inglês)
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO................................................................................................................. 10
1.1 COLESTEROL E METABOLISMO DOS LIPÍDIOS ....................................................... 10
1.2 DOENÇAS ASSOCIADAS AO METABOLISMO DOS LIPÍDIOS................................... 14
1.3 FATORES GENÉTICOS E FÁRMACOS....................................................................... 18
1.4 MECANISMO E ESTRUTURA DAS SREBPs ............................................................... 20
1.5 INFLUÊNCIA DOS SREBPS NOS NÍVEIS LIPIDICOS E DA GLICOSE ....................... 24
1.6 POLIMORFISMO G54C NO GENE SREBF-1c ............................................................ 26
2 JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS....................................................................................... 28
3 MATERIAL E MÉTODOS................................................................................................. 29
3.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO.................................................................................... 29
3.2 POPULAÇÃO DO ESTUDO.......................................................................................... 29
3.2.1 SELEÇÃO DA AMOSTRA..........................................................................................
29
3.2.2 COLETA DE DADOS ................................................................................................. 30
3.3 SELEÇÃO DAS VARIÁVEIS CLÍNICAS, BIOQUÍMICAS E ANTROPOMÉTRICAS DA
AMOSTRA .......................................................................................................................... 30
3.4 EXTRAÇÃO DE DNA .................................................................................................... 34
3.5 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR).......................................................... 34
3.6 GENOTIPAGEM POR RFLP.........................................................................................
35
3.7 ANÁLISES GENOTÍPICAS ........................................................................................... 36
3.8 ANÁLISES ESTATÍSTICAS .......................................................................................... 36
3.9 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS ......................................................................................... 38
4 RESULTADOS ................................................................................................................ 39
4.1 ANÁLISES MOLECULARES DO GENE SREBP-1c...................................................... 39
4.2 ANÁLISE DESCRITIVA DA AMOSTRA ........................................................................ 39
4.3 FREQÜÊNCIAS GENOTÍPICAS E GÊNICAS NA AMOSTRA TOTAL ......................... 42
4.4 INFLUÊNCIA DOS GENÓTIPOS DO POLIMORFISMO G54C SOBRE OS NÍVEIS
LIPÍDICOS 43
4.5 ANÁLISES DE FREQÜÊNCIAS DO POLIMORFISMO G54C EM RELAÇÃO AOS
NÍVEIS LIPÍDICOS.............................................................................................................. 46
4.5.1 Freqüências Genotípicas de Acordo com Níveis de CT e TG..................................... 46
4.5.2 Freqüências Genotípicas de Acordo com Níveis de LDL-C e HDL-C ......................... 47
4.6 ANÁLISES DAS FREQUÊNCIAS GENÓTÍPICAS DE ACORDO COM AS VARIÁVEIS
ANTROPOMÉTRICAS........................................................................................................ 48
4.7 INFLUÊNCIA DAS ESTATINAS SOBRE OS NÍVEIS LIPÍDICOS.................................. 51
4.8 FREQÜÊNCIAS GENOTÍPICAS ENTRE PORTADORES E NÃO PORTADORES DE
DMT2.................................................................................................................................. 54
5 DISCUSSÃO E CONCLUSÃO ......................................................................................... 55
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................... 61
ANEXOS............................................................................................................................. 69
5
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Etapas da formação de um ateroma ....................................................... 15
Figura 2. Estrutura dos genes SREBFs.................................................................. 21
Figura 3. Sistema regulador proteolítico das SREBPs ........................................... 23
Figura 4. Tamanho dos fragmentos do gene SREBF-1c após o processo de
clivagem com a enzima XmnI no sítio G54C ............................................................ 36
Figura 5.
Perfil eletroforético do polimorfismo G54C do gene SREBF-1c .............. 39
Figura 6. Porcentagens de homens e mulheres por categoria de IMC na amostra
de 121 indivíduos dislipidêmicos .............................................................................. 42
Figura 7. Comparação de médias de IMC entre os genótipos do gene SREBF 1c
por sexo.................................................................................................................... 50
Figura 8. Comparação de médias da relação de cintura/quadril entre os genótipos
do gene SREBF-1c por sexo .................................................................................... 51
Figura 9. Níveis lipídicos entre não usuários e usuários de estatinas .................... 52
6
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Características importantes das lipoproteínas.......................................... 11
Tabela 2: Classificação dos níveis lipídicos para indivíduos maiores de 20 anos .... 13
Tabela 3: Descrição dos primers e condições de amplificação por PCR do gene
SREBF-1c......................................................... ........................................................ 35
Tabela 4: Análise descritiva da amostra total ........................................................... 41
Tabela 5: Freqüências genotípicas e gênicas para o polimorfismo G54C no gene
SREBF-1c................................................................................................................. 43
Tabela 6: Influência do polimorfismo G54C sobre o perfil lipídico na amostra total . 43
Tabela 7: Influência do sexo em relação ao polimorfismo G54C sobre os níveis
lipídicos na amostra total.......................................................................................... 45
Tabela 8: Freqüências genotípicas de acordo com os níveis de CT e de TG .......... 46
Tabela 9: Comparação de freqüências genotípicas de acordo com as categorias
de CT e TG para os dois sexos em separado .......................................................... 47
Tabela 10: Freqüências genotípicas de acordo com os níveis de LDL-C e de HDL-
C............................................................................................................................... 48
Tabela 11: Análise das freqüências genotípicas conforme as categorias de IMC e
as relações de cintura/quadril na população estudada............................................. 49
Tabela 12: Análise comparativa dos níveis lipídicos entre usuários e não usuários
de estatinas .............................................................................................................. 52
Tabela 13: Níveis lipídicos e de glicose dos indivíduos não usuários de estatinas
em relação aos genótipos......................................................................................... 53
Tabela 14: Níveis lipídicos e de glicose dos indivíduos usuários de estatinas em
relação aos genótipos............................................................................................... 53
Tabela 15: Comparação das freqüências genotípicas entre portadores e não
portadores de DMT2 por sexo .................................................................................. 54
7
LISTA DE ABREVIATURAS
Apo: Apolipoproteínas
BHLHLZ: Basic helix loop helix leucine zipper
Col não HDL: Colesterol não HDL
CT: Colesterol total
DAC: Doença arterial coronariana
DCV: Doenças cardiovasculares
DMT2: Diabete melito tipo 2
DPV: Doença vascular periférica
HDL: Lipoproteínas de densidade alta
HDL-C: HDL Colesterol
HMG-CoA: 3 hidroxi-3metilglutaril Coenzima A
IDL: Lipoproteínas de densidade intermidiária
IMC: Índice de massa corporal
LDL: Lipoproteínas de densidade baixa
LDL-C: LDL Colesterol
LDL-R: LDL receptor
LPL: Lipoproteína lípase
PCR: Reação em cadeia da polimerase
Qm: Quilomícron, Lipoproteínas de maior tamanho
RCQ: Relação cintura quadril
RE: Retículo endoplasmático
RFLP: Restiction Fragment length polymorphism
S1P: Protease sítio 1
S2P: Protease sítio 2
SCAP: SREBP – Cleavage activating protein
SNP: Single nucleotide polymorphisms
SR-BI: Scavenger receptor class B type I
SRES: Elemento regulatório de Esteróis
SREBF: Sterol Regulatory Element Binding Factor
SREBP: Sterol Regulatory Element Binding Protein
TG: Triacilgliceróis
VLDL: Lipoproteínas de densidade muito baixa
8
RESUMO
As proteínas de ligação ao elemento regulatório de esteróis (SREBPs) são
membros de uma família de fatores de transcrição denominada basic-helix-loop-
helix-leucine-zipper (bHLHZ). As SREBPs favorecem a expressão de mais de 30
genes envolvidos na síntese do metabolismo dos lipídios e da glicose. Existem
três diferentes isoformas das SREBPs, 1a, 1c e 2. Neste estudo investigamos as
freqüências do polimorfismo G54C no gene SREBF-1c localizado no éxon 18c, o
qual está relacionado com diabete melito tipo 2 e obesidade. A amostra estudada
foi composta por 121 dislipidêmicos, sendo 53 homens e 68 mulheres, com idade
média de 61,6 anos. As variáveis genéticas foram comparadas com dados
clínicos, bioquímicos, antropométricos e o uso de estatinas. Os resultados
mostraram que as freqüências dos genótipos GG, GC e CC foram 0,13, 0,50 e
0,37 respectivamente, e estão em equilíbrio de Hardy- Weinberg. A freqüência do
alelo variante C foi elevada na população (0,62) em comparação ao alelo G.
Neste estudo não foram observadas associações entre os genótipos do gene
SREBF-1c e os níveis lipídicos. Nas análises feitas do polimorfismo G54C de
acordo com as variáveis antropométricas, uma associação estatisticamente
significante entre a freqüência de portadores do genótipo CC em homens e a
relação cintura/quadril (RCQ) ≥ 0,95cm foi detectada (p=0,019). Foi encontrada
uma diferença significativa entre as médias da RCQ no sexo masculino (p =
0,001). Constatou-se que a presença do alelo C predispõe à obesidade. Não
foram verificadas associações significativas entre os genótipos do gene SREBF-
1c, níveis lipídicos e o uso de estatinas. Na amostra estudada foi encontrada uma
associação de significância limítrofe entre genótipos do SREBP-1c com o alelo C
e os níveis de glicose (p=0,066). Quando as freqüências genotípicas foram
comparadas entre portadores e não portadores de DMT2 em relação ao sexo, foi
verificada a influência do alelo variante C em mulheres, tendo uma significância
limítrofe (p=0,056) para a presença de DMT2. Em conclusão, este estudo
demonstrou que o alelo variante C do polimorfismo G54C no gene SREBF-1c tem
uma influência diferente nas interações gene-gênero e que predispõe para o risco
de DMT2 e obesidade, não contribuindo para variações nos níveis lipídicos.
9
ABSTRACT
The sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) are transcription
factors of the basic helix-loop-helix-leucine zipper (bHLH-Zip) family. The SREBPs
play a key role in the expression of at least 30 genes by promoting regulation of
glucose and lipids metabolism. Three isoforms have been identified: SREBP-1a,
1c and 2. In the present study, was investigated frequency of polymorphisms
G54C in SREBP-1c located in the 18c exon, which was related to type 2 diabetes
and obesity. The sample studied was composed by 121 dyslipidemic individuals,
being 53 men and 68 women, with mean age 61,6 years old. The genetic variables
were compared with clinical, biochemical, anthropometrics data and statin therapy.
The results showed that the frequencies of genotypes GG, GC and CC were 0,13,
0,50 and 0,37 respectively, and are in Hardy-Weinberg equilibrium. The frequency
of C variant allele was higher in population (0,62) in comparison with G allele.
Than in this study associations were not observed between genotypes of gene
SREBP-1c of the polymorphism and lipid levels. In the analyses performed of the
polymorphism G54C in agreement with anthropometrics variables, statistically
significant linkage between in the frequency of carriers of CC genotype in men
(p = 0,019) and waist/hip ratio (≥ 0,95 cm) was detected. It was found statistically
significant associations between the mean of waist/hip ratio and gender men
(p= 0,001). It was supposed that the C allele could be related with obesity.
Significant associations between SREBP-1c genotypes, lipid levels and statin use
was not verified. In the sample studies it was found a borderline associations
between SREBP-1c genotypes with C allele and glucose levels (p = 0,066). When
the genotypes frequency was compared between carriers and no carriers of DMT2
in relation to the gender, it was verified the influence of the C allele in women,
tends a bordering significant associations for the presence DMT2 (p=0,056). In
conclusion, this study demonstrated that the variant C allele of the gene SREBF-
1c of the polymorphism G54C in the has a different influence in the interactions
gene-gender and that it predisposes for the risk of DMT2 and obesity, no
contributes to variation in the lipid levels.
10
1 INTRODUÇÃO
1.1 COLESTEROL E METABOLISMO DOS LIPÍDIOS
Os lipídios são de grande importância para nosso organismo, cujas
concentrações devem manter-se dentro dos limites adequados. Alterações nos
níveis lipídicos podem resultar em conseqüências indesejáveis na fisiologia
celular provocando vários processos patológicos. (MIERAS, 2004). Para que a
síntese dos lipídios ocorra, a célula conta com uma família de proteínas
denominadas do inglês Sterol Regulatory Element Binding Proteins (SREBPs),
que funcionam como fatores de transcrição, favorecendo a expressão de vários
genes envolvidos na síntese dos lipídios e da glicose (LEÓN et al., 2002).
O colesterol como membro da família dos lipídios esteróides, juntamente
com os fosfolipídios, possui função estrutural, formando a dupla camada que
constitui as membranas celulares e a camada única que reveste as lipoproteínas.
Além disso, serve como precursor de sais biliares, vitamina D e hormônios
esteróides. As células têm diferentes vias para obtenção de colesterol, entre
esses mecanismos estão a síntese endógena e a exógena. O aporte lipídico
endógeno e exógeno pode ser transportado pelas lipoproteínas para os seus
sítios de estocagem (fígado e tecido adiposo) ou ser usado como fonte imediata
de energia (GUYTON, 2002; MIERAS, 2004). Na tabela 1 encontram-se descritas
as principais características das lipoproteínas.
A solubilidade do colesterol no sangue deve-se as lipoproteínas
plasmáticas, principalmente as lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e as
lipoproteínas de densidade muito baixa (VLDL), que tem a capacidade de ligar e
solubilizar grandes quantidades de colesterol. A rota de captação de colesterol
pode ser interrompida em indivíduos que herdam mutações no gene que codifica
a proteína receptora de LDL. Os receptores podem não existir, ou estarem
presentes, e não funcionarem. Em quaisquer desses casos, as células são
deficientes na captação de LDL e o colesterol acumula-se no sangue,
11
predispondo os indivíduos a desenvolverem aterosclerose (DEVLIN, 1998;
ALBERTS et al., 1999).
Tabela 1: Características importantes das lipoproteínas
Lipoproteína Função Origem
Quilomícron (Qm)
(lipoproteínas de maior
tamanho)
Transporte de triacilgliceróis
(TG) exógenos e colesterol
Intestinal (epitélio do
intestino delgado)
Remanescentes Qm Transporte de colesterol
exógeno
Intravascular (fígado)
VLDL (lipoproteínas de
densidade muito baixa)
Transporte de TG endógeno e
moderadas concentrações de
colesterol e fosfolipídios
Hepático (fígado)
IDL (lipoproteínas de
densidade
intermediária)
Transporte de colesterol
endógeno e fosfolipídios
Intravascular
LDL (lipoproteínas de
densidade baixa)
Transporte de colesterol aos
tecidos
Intravascular
HDL (lipoproteína de
densidade alta)
Transporte de colesterol dos
tecidos ao fígado (transporte
reverso)
Intestinal, hepático e
intravascular
FONTE: Adaptado da Revista Argentina de Cardiologia. COMISIÓN DE DISLIPEMIAS, 2001
.
A estrutura e a composição das lipoproteínas plasmáticas são
enzimaticamente reguladas e formadas por uma parte central de lipídios
hidrofóbicos (éster de colesterol e triacilgliceróis), circundadas por uma capa de
lipídios polares e proteínas, denominadas apolipoproteínas (MARTINEZ, 2004).
Os triacilgliceróis (TG) constituem aproximadamente 95% do tecido
adiposo e são as principais formas de armazenamento de lipídios no corpo. Os
TG podem ser definidos como gordura neutra, cujo núcleo é constituído por uma
molécula de glicerol unida a três moléculas de ácidos graxos. Concentrações
séricas elevadas de TG também têm sido relacionadas com uma maior incidência
de aterosclerose (SPOSITO, 2004).
12
Após a ingestão de gordura (via exógena), os TG e o colesterol livre são
absorvidos nas células intestinais como ácidos graxos e colesterol livre. Dentro
das células da mucosa intestinal, os ácidos graxos são reesterificados e,
juntamente com o colesterol, incorporados no cerne de uma partícula nascente
de Qm. As Qm entram no plasma, onde são incorporados também as
apolipoproteínas que capacitam a lípase lipoprotéica (LPL) a hidrolisar os TG em
partículas menores, liberando os ácidos graxos para absorção nos tecidos
periféricos. A LPL se liga a células endoteliais, enquanto que as apolipoproteínas
se desprendem neste processo, resultando nas partículas Qm remanescentes
que são absorvidas pelo receptor de LDL (LDL-R) e a proteína relacionada ao
LDL-R nos hepatócitos (MONTGOMERY et al., 1996; MARTÍNEZ et al., 2001).
Os TG sintetizados endogenamente são transportados pelas VLDL,
produzidas primariamente no fígado. Quando as VLDL circulam, seu conteúdo de
TG é hidrolisado pela enzima LPL. Os ácidos graxos liberados podem entrar nos
adipócitos, onde são reestereficados e armazenados como TG, ou nos músculos,
onde são oxidados para produção de energia. A partícula residual de VLDL, rica
em ésteres de colesterol, agora é considerada uma IDL e possui dois destinos,
um deles onde metade delas é captada pelo fígado, e removida pelo LDL-R,
enquanto que a outra é convertida em LDL, a principal carreadora de colesterol no
sangue. As partículas de LDL estão envolvidas no transporte de colesterol para as
células periféricas, as quais podem utilizá-lo para necessidades fisiológicas ou
estocá-lo. Quando estes tecidos necessitam de mais colesterol eles aumentam o
número de LDL-R na sua superfície e removem mais LDL do plasma via LDL-R,
sendo que o inverso também ocorre quando a necessidade de colesterol diminui
(CONSENSO BRASILEIRO SOBRE DISLIPIDEMIAS, 1996; CORELLA e
ORDOVAS, 2005).
É interessante destacar, que os aumentos nas concentrações de LDL e
colesterol total (CT) estão relacionados ao risco aumentado de doenças
cardiovasculares (DCV), ao contrário das concentrações de HDL que atuam como
um fator de proteção para estas doenças. Quanto maior a concentração de LDL,
13
mais facilmente ocorre sua entrada no endotélio vascular, passando pela parede
do vaso, até a sua oxidação na camada íntima, formando as placas de ateroma.
Em geral, 1% de diminuição nos níveis de LDL está associado a uma redução de
2-3% no risco de desenvolvimento de DCV. Até alguns anos, um perfil lipídico
inadequado era definido quase que exclusivamente pelos níveis de LDL, mas hoje
se sabe que baixos níveis de HDL, níveis elevados de TG e lipoproteínas
remanescentes, também são fatores importantes para o cálculo de risco para
doenças cardiovasculares (BREWER, 1999; LIBBY, 2001; NCEP,2001).
O National Cholesterol Education Program (NCEP), um dos principais
órgãos que define diretrizes para o perfil lipídico, apresenta a classificação para
os níveis lipídicos na tabela 2:
Tabela 2: Classificação dos níveis lipídicos para indivíduos maiores de 20 anos.
Lipídios Níveis (mg/dl) Classificação
LDL-C
< 100
100 – 129
130 – 159
160 – 189
≥ 190
ótimo
próximo ao ótimo
levemente elevado
elevado
muito elevado
HDL-C
< 40
> 60
baixo
elevado
Colesterol total
< 200
200 – 239
≥ 240
desejável
levemente elevado
elevado
Triacilgliceróis
< 150
150 – 199
200 – 499
≥ 500
normal
levemente elevado
elevado
muito elevado
O transporte reverso do colesterol consiste basicamente na remoção do
excesso de colesterol e TG circulante via tecido hepático, para reutilização ou
excreção pela bile. Este excesso é transferido às HDL, que são sintetizadas por
macrófagos, pelos tecidos hepático e intestinal. A remoção da HDL pelo fígado é
mediada por um receptor denominado SR-BI (scavenger receptor class B type I)
14
que internaliza somente ésteres de colesterol e libera a lipoproteína para
captação de mais lipídeos ( KRIEGER, 1999; TABAS, 2002).
A via biológica do metabolismo dos lipídios e das lipoproteínas é
extremamente complexa e inclui muitas etapas importantes, e cada uma delas
envolve uma ação coordenada de várias proteínas.
1.2 DOENÇAS ASSOCIADAS AO METABOLISMO DOS LIPÍDIOS
Doenças como dislipidemia, síndrome de resistência à insulina, diabete
melito tipo 2 (DMT2) e doença arterial coronariana (DAC) estão
comprovadamente associadas ao metabolismo dos lipídios.
As dislipidemias são modificações no metabolismo dos lipídios que
desencadeiam alterações nas concentrações das lipoproteínas plasmáticas,
favorecendo o desenvolvimento de doenças crônico-degenerativas como DMT2 e
DCV (SANTOS, 2001).
As doenças cardiovasculares incluem a doença arterial coronariana (DAC)
e a doença vascular periférica (DVP). Todas são resultado de alterações no
funcionamento do sistema circulatório formado pelo coração, vasos sangüíneos e
vasos linfáticos. Essas doenças apresentam padrão de herança multifatorial,
devido à complexa interação entre diferentes genes e o ambiente (BRESLOW,
2000; IZAR et al., 2003).
Segundo os dados do Sistema de Informações de Mortalidade do Ministério
da Saúde (SIM), no ano de 2000, as DCV foram responsáveis pelo maior número
de óbitos no Brasil, correspondendo a mais de 27% do total de óbitos. Essas
doenças foram responsáveis também por 15,2% das internações realizadas no
SUS, na faixa etária entre 30 e 69 anos, sendo que, do total de casos, 17,7%
foram relacionadas ao acidente vascular encefálico e ao infarto agudo do
15
miocárdio. A hipertensão arterial e o DMT2 constituem os principais fatores de
risco para as DCV.
A DAC é um distúrbio no qual depósitos de gordura acumulam-se nas
células que revestem a parede de uma artéria coronária, e conseqüentemente,
obstruem o fluxo sangüíneo. O depósito de gordura (Figura 1) denominado
ateroma, forma-se gradualmente e desenvolve-se nos grandes ramos das duas
artérias coronárias principais, as quais circundam o coração e provêem sangue ao
mesmo (MARTINEZ, 2004).
Figura 1 Etapas da formação de um ateroma.
(A) Na presença de fatores de risco, o processo
aterogênico evolui ocorrendo penetração e oxidação de lipoproteínas para o espaço subendotelial, além de
penetração de leucócitos, principalmente mononucleares, que irão se transformar em células espumosas. (B)
Os leucócitos, bem como as células da parede vascular passam a secretar citocinas e fatores de crescimento
que levam à proliferação celular de células musculares lisas, as quais secretam enzimas que podem
degradar a matriz extracelular. (C) Os mediadores da resposta inflamatória podem inibir a síntese de
colágeno e causar degeneração da matriz, provocando ruptura da placa e ativação do sistema trombogênico,
causando os trombos, os quais causam as mais agudas complicações da aterosclerose (LIBBY et al., 2002).
16
A ocorrência de aterosclerose depende do nível de colesterol presente nas
LDL (LDL-C). As lipoproteínas plasmáticas LDL e HDL exercem funções
diferentes e relevantes. A LDL fornece colesterol aos tecidos e a HDL remove o
excesso de colesterol das células que depois de transportado para o fígado, pode
ser excretado. (MARZZOCO e TORRES, 1999).
Os dados que permitiram estabelecer com segurança a associação entre
dislipidemias e aterosclerose foram obtidos de estudos anatomopatológicos,
experimentais, epidemiológicos e clínicos, a maioria deles utilizando para análise,
valores bioquímicos das dosagens de CT, TG e HDL-C ou da determinação
indireta de LDL-C (CONSENSO BRASILEIRO SOBRE DISLIPIDEMIA,1996).
Uma vez diagnosticada a dislipidemia, é necessário distinguir a etiologia da
mesma, se primária (origem genética, algumas só se manifestando com influência
ambiental) ou secundária. A importância dessa classificação é que muitas das
dislipidemias secundárias são curáveis com o controle da doença de base,
enquanto as primárias são apenas controláveis (MANO, 2003;MARTINEZ, 2004).
O DMT2 é outra doença sistêmica que envolve alterações no metabolismo
de carboidratos, lipídios, proteínas e eletrólitos, de caráter crônico e evolutivo. A
prevalência desta doença vem aumentando no mundo em paralelo ao aumento da
prevalência da obesidade, com previsão de chegar a 366 milhões de indivíduos
com diabetes em 2030, sendo a DCV, a causa de morte em até 80% dos
indivíduos com DMT2. A “modernização” da dieta, com aumento dos teores de
gordura e açúcar refinado, é responsável pelo aumento da prevalência desta
doença a cada ano. Ela caracteriza-se por deficiência de secreção ou de ação da
insulina com conseqüente hiperglicemia (AQUINO et al., 2003; WILD et al., 2004;
LAAKSONEN et al., 2005).
O DMT2 especificamente, associa-se a vários fatores de risco
cardiovasculares, incluindo hipertensão arterial sistêmica, obesidade, resistência
17
à insulina, anormalidades nos lipídios e lipoproteínas plasmáticas, elevação de
TG e redução de colesterol contido na HDL-C. A associação desses fatores de
risco tem sido denominada síndrome metabólica (JIANG et al., 2004; KRAUSS,
2004).
Grande parte das características patológicas da DMT2 podem ser
atribuídas a um dos três principais efeitos da deficiência de insulina: (1) utilização
diminuída de glicose pelas células, com a conseqüente elevação do nível de
glicemia no sangue, que pode atingir de 300 à 1.200 mg/dl; (2) mobilização
acentuada das gorduras das áreas de armazenamento, com conseqüente
anormalidade do metabolismo da gordura, bem como da deposição de colesterol
nas paredes arteriais, causando aterosclerose; e (3) depleção das proteínas dos
tecidos (ADA, 2000).
A insulina é um hormônio que regula os níveis de glicose no sangue e
promove sua deposição no corpo sob forma de gordura. A ação clássica da
insulina é estimular a síntese de ácidos graxos no fígado em períodos de excesso
de carboidratos. Quando não há disponibilidade de insulina, a síntese de gordura
torna-se pequena ou ausente, porque a glicose não penetra satisfatoriamente nas
células adiposas e hepáticas. E a ausência de glicose nas células adiposas
dificulta a síntese de TG pelos tecidos (CARVALHEIRA et al., 2002)
Mais de 80% dos pacientes com DMT2 são obesos, isto é relevante, pois a
resistência à insulina é em parte devida ao efeito da obesidade. A resistência à
insulina é uma doença de origem provavelmente genética, e pode ser devida a
defeitos na transdução de sinais, variando de insulina ou receptores de insulina
anormais, a defeitos nos transportadores da glicose. Para a mesma quantidade
de insulina produzida, a catalisação da glicose é menor, gerando a produção de
mais insulina (CHAMPE e HARVEY, 2000).
18
1.3 FATORES GENÉTICOS E FÁRMACOS
A variação dos níveis lipídicos é uma característica de etiologia
multifatorial, determinada por uma ampla gama de fatores, tanto ambientais
quanto genéticos. Variações em um grande número de genes envolvidos na
síntese de proteínas estruturais e enzimas relacionadas no metabolismo de
lipídios poderiam, a princípio, responder por variações do perfil lipídico de cada
indivíduo. Desta maneira, qualquer gene que seja responsável pela produção de
uma proteína envolvida nesta rota metabólica poderia ser um “gene candidato” na
investigação de determinantes genéticos dos níveis lipídicos (ANDRADE e HUTZ,
2002).
A identificação de fatores genéticos e ambientais que influenciam os níveis
de lipídios no plasma representa um grande passo voltado ao desenvolvimento de
estratégias para prevenção e tratamento de doenças cardiovasculares. Neste
sentido, as proteínas SREBPs ocupam um papel chave na área da saúde. Elas
entre outras funções, regulam a expressão do receptor de LDL, uma molécula que
habilita os hepatócitos removerem o colesterol contido nas partículas de LDL na
corrente sanguínea. Uma dieta elevada em colesterol costuma impedir que as
SREBPs dirijam-se até o núcleo da célula e se tornem maturas, resultando na
diminuição das sínteses do colesterol e dos receptores de LDL, promovendo um
aumento de colesterol no sangue e o risco iminente da formação da placa
aterosclerótica (LAI et al., 2003).
As pesquisas decorrentes da compreensão dos principais fatores de risco
modificáveis, que são, o aumento dos níveis de colesterol sérico encontrados nas
LDL-C, diminuição dos HDL-C, hipertensão, DMT2, dislipidemias e tabagismo; e
entre fatores de risco não modificáveis, a idade e a herança genética, contribuem
significativamente para a redução da mortalidade por doenças cardiovasculares.
(STEINER, 2001; THIRD JOINT TASK FORCE, 2003).
19
É fundamental nesses casos a utilização de fármacos hipolipemiantes que
tem por objetivo reduzir as LDL-C, TG, CT e o Col. não HDL ou aumentar as
concentrações plasmáticas de HDL-C. Em indivíduos com aterosclerose, o
tratamento da dislipidemia é relevante, sendo que, as principais classes de
fármacos utilizados são as estatinas, também conhecida como, inibidores de
HMG-CoA redutase (enzima chave na rota da síntese do colesterol). A estatina é
utilizada para reduzir a incidência de morte por infarto agudo do miocárdio e
acidente vascular cerebral (TOPOL, 2004). Como resultado da depleção do
colesterol intracelular, há um aumento do número e atividade funcional dos
receptores LDL e um aumento proporcional da depuração das lipoproteínas.
Muitos estudos randomizados envolvendo estes fármacos, mostraram que as
estatinas são eficientes em baixar os níveis de CT (18-25%) e LDL-C (25-55%),
assim como, costumam reduzir moderadamente os níveis de TG (10-15%) e
aumentar os níveis de HDL-C (5-10%) (KREISBERG et al., 2001).
Outros fármacos importantes são os fibratos, que tem maior influência na
redução dos TG em 20 à 40%, e aumenta as HDL-C em 10 à 25%. Eles são
capazes, entre outras coisas, de induzir a lipólise das lipoproteínas ricas em TG,
modular favoravelmente a captação de ácidos graxos pelo fígado, com diminuição
hepática de TG, e aumentar a síntese de HDL-C favorecendo o transporte reverso
do colesterol (BHATNAGAR,1998; STEINER, 2001).
Investigações farmacogenéticas com polimorfismos de genes na rota
SREBP-SCAP e a terapia com hipolipemiantes tem sido relatados em estudos
como o de Fiegenbaum et al. (2005) que descreveram o polimorfismo A2386G
analisado no gene SCAP (SREBP- Cleavage Activating Protein) como tendo um
significante impacto na baixa dos níveis do colesterol total e TG na resposta da
terapia com estatinas (Simvastatin). Outro estudo relatado por Salek, et al. (2002),
onde analisaram o polimorfismo -36del/G no gene SREBF-1a e o polimorfismo
A2386G no gene SCAP, também encontraram uma redução significativa dos
níveis de CT e LDL-C em resposta a terapia com estatinas (Fluvastatin). Fan et al.
(2001) em seus estudos sobre a resposta dos níveis lipídicos à estatina
20
(Pravastatin), relataram não ter achado nenhuma associação com os genótipos
do SCAP. Isso sugere que a variabilidade interindividual na resposta é um dos
fatores que pode limitar o benefício alcançado, uma vez que muitos indivíduos
apresentam efeitos adversos à medicação, a qual pode não apresentar a eficácia
esperada.
Espera-se que futuramente ocorra a identificação de grande parte da
variabilidade genética responsável pelas diferenças interindividuais na ação de
fármacos, e que inúmeras associações genoma-resposta a fármacos sejam
compiladas, contribuindo de maneira mais eficaz no controle da mortalidade por
doenças cardiovasculares (FIEGENBAUM e HUTZ, 2006).
1.4 MECANISMO E ESTRUTURA DAS SREBPs
Fatores de ligação ao elemento regulatório de esterol (SREBFs) são
fatores de transcrição que regulam a homeostase lipídica por ativação da
expressão de aproximadamente 30 genes envolvidos no metabolismo do
colesterol, ácidos graxos, TG e glicose. As proteínas SREBPs foram purificadas
em 1993. Elas tem estruturas similares e dois genes, SREBF-1 localizado no
cromossomo 17p11.2 e o SREBF-2 no 22q13 que codificam três isoformas de
proteínas (SREBP-1a, SREBP-1c e SREBP-2) (SHIMANO, 2002; DUAN et al.,
2005).
As SREBPs 1a e 1c são produzidas pelo mesmo gene SREBF-1, esse
gene possui dois promotores que produzem transcritos de diferentes tamanhos,
por splicing alternativo, e se diferem no primeiro éxon (éxon 1a e éxon 1c). Os
outros éxons são comuns a ambas isoformas. Em humanos, o splicing alternativo
no final da região 3’ do gene, também tem sido descrito (éxon 18a e 19a ou 18c e
19c). A SREBP-2 é produzida pelo gene SREBF-2, não apresentando outra
isoforma (Figura 2). O gene SREBF-1 tem a extensão de 26 kb, com 22 éxons e
20 íntrons e o gene SREBF-2 tem a extensão de 72kb, com 19 éxons e 18 íntrons
(FERRÉ e FOUFELLE, 2007).
21
A SREBP-1a é altamente expressado em linhagens de células e tecidos
com alta capacidade de proliferação celular, tais como: o baço e o intestino. A
SREBP-1c, principal regulador do ambiente nutricional, é expressado em altos
níveis no fígado, tecido adiposo, músculo esquelético, glândula adrenal e cérebro
(HUA et al., 1995; OSBORNE, 2001; EBERLÉ et al., 2004(b); THOT et al., 2004;
HARDING et al., 2006).
Vários estudos têm mostrado que os ativadores do gene SREBF-1c são o
receptor X do fígado (LXR) e o receptor X retinóide (RXR). Eles codificam um
fator de transcrição que é crítico para o aumento da expressão de inúmeros
genes envolvidos na biosíntese e esterificação de ácidos graxos. Essa ativação
da SREBP-1c pelos LXR/RXR são acompanhados por um aumento substancial
de SREBP-1c nuclear, levando a ativação de genes alvo lipogênicos (REPA et
al., 2000; SHULTZ et al., 2000; YOSHIKAWA et al., 2001; EDWARDS et al., 2002;
SHIMANO, 2002).
Figura 2 - Estrutura dos genes SREBFs. EBERLÉ et al., 2004(b).
22
As SREBPs são proteínas de aproximadamente 1150 aminoácidos que se
subdividem em três domínios: 1) Um extremo NH
2
-terminal de aproximadamente
480 aminoácidos contendo o motivo basic-helix-loop-helix-leucine-zipper
(bHLHLZ), uma família de fatores de transcrição, que permite as SREBPs se
ligarem ao DNA e ativarem a transcrição; 2) Uma região hidrofóbica de
aproximadamente 80 aminoácidos que consiste em duas hélices transmembrana
separadas por uma alça curta hidrofóbica que se projeta para dentro do lúmem do
retículo endoplasmático (RE); 3) Um domínio que executa a função regulatória do
COOH terminal de 590 aminoácidos.
Em outras palavras, as SREBPs são orientadas na membrana em forma de
grampo, com os domínios NH
2
-terminal e o COOH terminal, projetados para
dentro do citoplasma do retículo endoplasmático (RE). Quando a célula necessita
sintetizar algum dos lipídios, as SREBPs sofrem o processo proteolítico dirigindo-
se até o núcleo. Este sistema é o responsável pelo controle dos níveis de
colesterol nas membranas, células e sangue (NOHTURFFT et al., 1998; YANG et
al., 2000, WEBER et al., 2004).
O sistema regulador proteolítico (Figura 3) ocorre quando a primeira
clivagem proteolítica é realizada por uma enzima denominada protease sítio-1
(S1P), uma serina-protease que rompe o anel hidrofílico da SREBP projetando-se
no lúmen do RE. O aumento do conteúdo de esterol bloqueia a atividade da S1P.
A segunda clivagem requer a ação da protease sítio-2 (S2P), uma metaloprotease
dependente de zinco. Para que a S2P atue sobre a SREBP, o S1P precisa já ter
sido clivado. Neste processo regulador intervem uma proteína denominada SCAP,
que é um regulador que ativa a S1P e que atua como sensor de esteróis,
diminuindo sua atividade quando ocorre o aumento no nível de esteróis na célula.
O SCAP é a chave para a ativação das SREBPs (NOHTURFFT et al., 1999; KING
2003; FIEGENBAUM et al., 2005).
Uma recente descoberta sugere que a proteína SCAP interage com uma
segunda proteína do RE denominada Insig, a qual se liga ao SCAP e auxilia na
23
retenção do complexo SREBP-SCAP no compartimento do RE. Sob condições
apropriadas (baixa concentração de esterol ou possível elevação da insulina) a
interação entre Insig e SCAP diminui, permitindo então, que o SCAP acompanhe
a SREBP até o complexo de Golgi para que a proteólise ocorra, e imediatamente
após a segunda clivagem os SREBPs maturos entram no núcleo ligando-se a
uma seqüência especial do DNA, as SRES (Elemento regulatório de esteróis) ou
E-box, na região promotora dos genes alvo, ativando a transcrição (YANG et al.,
2002; YABE et al., 2003; EBERLÉ et al., 2004(b)).
Figura 3 - Sistema regulador proteolítico das SREBPs. EBERLÉ et al., 2004(b). Detalhes no texto,
páginas 22 e 23.
24
1.5 INFLUÊNCIA DOS SREBPS NOS NÍVEIS LIPIDICOS E DA GLICOSE
Segundo Matsuda et al. (2001), a síntese de colesterol e de ácidos graxos
no fígado aumentam em resposta a privação de colesterol e a elevação da
insulina, sendo que ambas às sínteses são controladas pelas SREBPs. Quando
os níveis de colesterol são baixos, por causa do tratamento com estatinas por
exemplo, o nível nuclear das SREBPs sobe, correlacionando-se com o aumento
no nível de mRNA dos genes alvos, incluindo a 3hidroxi-3metilglutaril Coenzima A
(HMG CoA) redutase e sintetase, e o receptor de LDL. Em concordância com
isso, Radhakrishnan et al. (2004), relatam que na presença de altos níveis de
esterol o complexo SREBP-SCAP é retido na membrana do RE e quando os
níveis de esterol diminuem, o complexo SREBP-SCAP se movem até o complexo
de Golgi, onde o sistema regulador proteolítico entra em ação.
No fígado ocorre o metabolismo dos lipídios e da glicose hepática, e estes
metabolismos são principalmente regulados pela insulina, que atua aumentando a
glicólise, glicogênese e a lipogênese (síntese de ácidos graxos) em períodos de
excesso de carboidratos (KIM et al., 2004). Quando a dieta é rica em carboidratos
a insulina é secretada e estimula a expressão de genes envolvidos na utilização
da glicose e inibe genes envolvidos na produção da glicose. O mecanismo pelos
quais a insulina controla a expressão desses genes era pobremente entendido.
Recentemente porém, tem sido proposto que a SREBP-1c seja o mediador chave
do efeito transcricional da insulina. A insulina aumenta a síntese e a quantidade
nuclear deste fator, o qual quando superexpresso no fígado simula os efeitos da
insulina sobre os genes sensíveis a ela (FOUFELLE e FERRÉ, 2001; FERRÉ et
al., 2001)
A presença de mutações no gene SREBF-1c podem induzir um aumento
da função da proteína SREBP-1c provocando a resistência à insulina, com
alterações nos níveis lipídicos. Quando a insulina aumenta no plasma, a síntese
de ácidos graxos é elevada, agravando a propensão ao DMT2 e à obesidade, que
são estados freqüentes da resistência à insulina, e são caracterizados pela
25
diminuição dos níveis de mRNA da SREBP-1c em tecidos adiposos (FOUFELLE
E FERRÉ, 2002; SEWTER et al., 2002; VERNIA et al.; 2006).
Várias evidências sugerem que esses efeitos da insulina são mediados
pelo aumento da SREBP-1c. In vivo, a quantidade total de SREBP-1c no fígado é
reduzida pelo jejum que suprime a secreção de insulina e aumenta com a
realimentação. De forma semelhante, os níveis de mRNA da SREBP-1c
diminuem em animais com diabete induzida por estreptozotocina e aumentam
após tratamento com insulina. A superexpressão da SREBP-1c no fígado de
animais transgênicos, previne a redução do mRNA das enzimas lipogênicas
(SHIMOMURA et al., 1999(c)).
Muitos indivíduos com obesidade e resistência à insulina apresentam
esteatose hepática (doença metabólica). As evidências indicam que a esteatose
hepática devida a resistência à insulina é causada pelo acúmulo de SREBP-1c,
que está elevado em resposta aos altos níveis circulantes de insulina. De maneira
semelhante, ocorre a superexpressão da SREBP-1c nuclear no fígado de
camundongos ob/ob, o que leva a uma acentuada diminuição de glicose no
sangue, devido a um aumento da expressão da glicoquinase hepática (enzima
que fosforila a glicose), que por sua vez acentua a glicólise e a lipogenese
hepática. Em contraste a perda da função da SREBP-1c levaria a resistência à
insulina. Apesar da presença de resistência à insulina nos tecidos periféricos, a
insulina continua a ativar a transcrição da SREBP-1c no fígado desses
camundongos. Portanto, os níveis elevados de SREBP-1c nuclear aumentam a
expressão de genes lipogênicos, a síntese de ácidos graxos e o acúmulo de TG
(SHIMOMURA et al., 1999(a,b) e 2000; TOBE et al., 2001; CARVALHEIRA et al.,
2002; KIM et al., 2004).
Vernia et al. (2006) descreveram uma mutação do tipo “missense”,
polimorfismo 605C>T no SREBF-1c em pacientes com DMT2, que altera a função
da proteína, diminuindo sua eficiência de ligação ao DNA e sua habilidade de
ativar a transcrição de genes alvo. Em um estudo de Éberle et al. (2004)(a)
26
realizado na França, em pessoas obesas e com DMT2, foram identificados 19
polimorfismos no gene SREBF-1(do SNP1 até o SNP19), todos variações do tipo
SNPs (do inglês Single Nucleotide Polymorphisms). Desses, o SNP1, SNP3,
SNP5, SNP6 e o SNP17 foram associados a obesidade. Laudes et al. (2004),
analisaram o SNP intrônico 18c e 19c, e encontraram significativa associação
com elevados níveis de colesterol no plasma e DMT2, caracterizando assim, que
as variações no gene SREBF-1 tem um relevante papel nas alterações
metabólicas.
1.6 POLIMORFISMO G54C NO GENE SREBF-1c
O SREBF-1c está localizado como citado anteriormente, no cromossomo
17p11.2, e alguns polimorfismos têm sido detectados nesse gene. No presente
estudo destaca-se o polimorfismo que gera um sítio de restrição para a enzima
XmnI. Esse polimorfismo envolve a substituição G54C, descrita também como
SNP17, e que está localizada no éxon 18c (HUA et al., 1995; EBERLÉ et al.,
2004). Para este polimorfismo especificamente, até a presente data, existem
apenas três trabalhos (ÉBERLE et al., 2004(a); LAAKSONEN et al., 2005(a);
FELDER et al., 2007)
De acordo com Felder et al. (2007), num estudo realizado com uma
amostra da população austríaca, a SREBP-1c é descrito como um fator de
transcrição envolvido na regulação do metabolismo dos lipídios, glicose e na
regulação da expressão do gene da adiponectina (hormônio produzido pelo tecido
adiposo). Em seus estudos com o polimorfismo G54C, observaram que o alelo
variante C está associado significativamente com o aumento da prevalência de
DMT2.
Em outro estudo realizado na Finlândia, Laaksonen et al. (2005)(a)
pesquisaram a variante genética da SREBP-1c e descreveram que o genótipo
GG, está significativamente relacionada com a síntese de colesterol em homens.
Na concentração dos marcadores da síntese do colesterol endógeno (latosterol, e
27
a proporção de latosterol para colesterol), cerca de 30% da amostra que
apresentava o genótipo GG foram significativamente mais altas, em relação aos
portadores do alelo C. Quando a análise foi limitada ao sexo, os homens com os
genótipos GG tinham as concentrações de 50% mais elevadas, do que os
portadores do alelo C. Portanto, o resultado deste estudo demonstrou que o gene
SREBF-1c com o polimorfismo G54C, afeta o metabolismo dos esteróis em
homens, baseando-se em que os genótipos GG tem taxas de colesterol mais
altas que os portadores dos genótipos CC e GC.
No estudo de Éberle et al. (2004)(a), realizado com pessoas obesas e com
DMT2, o polimorfismo G54C foi analisado. Dentro deste trabalho foram realizados
dois estudos, um de caso-controle com um grupo de pessoas obesas e não
obesas, e um de coorte com um grupo pessoas com DMT2.
No estudo de caso-controle, os autores observaram uma freqüência de
mais de 50% do alelo C no grupo de não obesos, sendo que o alelo G foi
associado ao grupo de obesos e que o polimorfismo G54C estaria associado à
obesidade mórbida. No estudo de coorte observaram uma diminuição da
freqüência do alelo C em ambos os grupos de DMT2, comparados com o grupo
controle. Embora a freqüência do alelo C tenha diminuído, a mesma continuou
significativamente mais alta que a do alelo G.
Os autores sugerem ainda, que o alelo G, que estaria associado com a
obesidade, poderia proteger da dislipidemia pelo aumento da adipogênese e que
os portadores do alelo C parecem desenvolver dislipidemia, em particular no
contexto patofisiológico, sugerindo que as interações gene-gene e/ou gene-
ambiente seriam necessárias para a expressão do fenótipo (ÉBERLE et al.,
2004(a)).
28
2 JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS
Uma área promissora da genética é a investigação de polimorfismos no
DNA entre indivíduos. A base genética para variações pode ser uma troca de
bases no DNA, uma duplicação ou deleção de um ou vários pares de bases.
(INTERNATIONAL HUMAN GENOME SEQUENCING CONSORTIUM, 2001).
Neste sentido, vários polimorfismos genéticos têm sido estudados e
associados à aterosclerose, com implicações intrínsecas sobre as vias
bioquímicas de processos que propiciam o desenvolvimento desta patologia. Por
isso, a possibilidade de prever o risco de progressão de lesões ateroscleróticas,
através da análise genética pode ser de grande importância no controle de
pacientes com DAC (MAGALHÃES et al., 2004; OLIVIERI, 2002).
Estudos têm mostrado que alterações no gene SREBF-1c podem predispor
ao aparecimento de doenças metabólicas, tais como a DMT2, resistência à
insulina, obesidade e dislipidemias. A célula reconhece a variação dos níveis
lipídicos pela ação das SREBPs. Estas proteínas regulam a expressão de vários
genes envolvidos na biosíntese e captura do colesterol (EBERLÉ et al., 2004(b)).
Isso torna o gene SREBF-1c um importante instrumento para pesquisa na análise
da influência do polimorfismo G54C sob os níveis lipídicos e de glicose.
É importante ressaltar que pouco se sabe sobre a variabilidade do gene
SREBF-1c em populações brasileiras, bem como, qual a influência dessa
variabilidade sobre os parâmetros lipídicos. Desta forma, o presente estudo tem
como objetivos:
I. Determinar as freqüências gênicas e genotípicas do polimorfismo G54C
no gene SREBF-1c, na população dislipidêmica selecionada;
II. Realizar um estudo de associação entre os alelos do SREBF-1c com os
dados clínicos, bioquímicos e antropométricos, visando estabelecer uma relação
entre genótipo e fenótipo dislipidêmico.
29
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO
Este é um estudo observacional, de delineamento transversal, analítico,
sem grupo controle.
3.2 POPULAÇÃO DO ESTUDO
Participaram da amostra de conveniência desta pesquisa 121 indivíduos
que buscaram atendimento no Ambulatório de Dislipidemia, Serviço de
Cardiologia, do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), selecionados no
período de janeiro de 2005 à dezembro de 2006.
3.2.1 SELEÇÃO DA AMOSTRA
Critérios de Inclusão: Homens e mulheres dislipidêmicos, provenientes do
Serviço de Cardiologia do HCPA.
Os pacientes que preecheram os critérios de inclusão foram informados do
presente estudo e, ao concordarem em participar, assinaram um termo de
consentimento livre e esclarecido, conforme anexo 1. Os participantes receberam
informações detalhadas sobre o propósito e objetivos do estudo, bem como dos
procedimentos realizados. Os pacientes que não conseguiram ler o termo foram
informados através de leitura em voz alta.
Critérios de Exclusão: pacientes portadores do vírus HIV*, gestantes e
pacientes com idade inferior a 18 anos.
*
Estudos indicam que a infecção pelo vírus HIV-1 induz um conjunto
complexo de genes a alterar o perfil lipídico destes pacientes (CONSTANTS et al.,
1994;
GUYADER et al., 2002; WOUT et al., 2005). As modificações nas
30
concentrações de lipídios plasmáticos são bem mais acentuadas naqueles
pacientes que recebem terapia antiviral com inibidores de protease, uma vez que
estes medicamentos apresentam o sítio ativo de ligação à proteína viral com
estrutura molecular similar a algumas proteínas envolvidas no metabolismo
lipídico, promovendo assim uma inibição total ou parcial do metabolismo lipídico
(JAIN et al., 2001; YU et al., 2005).
3.2.2 COLETA DE DADOS
Durante a consulta do paciente com a equipe médica do Ambulatório de
Dislipidemia do HCPA foi preenchido um questionário (anexo 2) a partir do qual
foram obtidos os dados clínicos, epidemiológicos e antropométricos. Subseqüente
a consulta, o paciente foi encaminhado ao setor de coleta do HCPA para a
retirada de 10 ml de sangue, em condições estéreis, para as análises moleculares
e bioquímicas. As análises bioquímicas foram realizadas como parte da rotina de
diagnóstico laboratorial oferecida aos pacientes que buscam atendimento no
Serviço de Cardiologia do HCPA. As amostras para análise molecular foram
encaminhadas ao laboratório de Biologia Molecular da ULBRA.
3.3 SELEÇÃO DAS VARIÁVEIS CLÍNICAS, BIOQUÍMICAS E
ANTROPOMÉTRICAS DA AMOSTRA
As variáveis de interesse foram selecionadas por apresentarem relação
direta com o tema do estudo, uma vez que são consideradas fatores de risco para
o desenvolvimento de DCV e dislipidemia.
As variáveis sedentarismo, tabagismo, consumo de álcool e uso de
estatinas foram obtidas a partir da referência do paciente ao mesmo, durante a
consulta com a equipe médica do Ambulatório de Dislipidemia do HCPA.
SEDENTARISMO: O paciente informou se pratica alguma atividade física
regularmente, tipo, duração e periodicidade da atividade física. Foi considerado
sedentário o indivíduo que referiu não praticar nenhum tipo de atividade física.
31
CONSUMO DE ÁLCOOL: O paciente informou se costuma tomar bebidas
alcoólicas, idade de início da ingestão, o tipo de bebida ingerida, quantas
unidades ingere periodicamente (por semana). Foram consideradas três
possibilidades para a análise dos dados referidos: Sim, nunca e passado.
TABAGISMO: O paciente informou se é fumante, idade de início, há quanto
tempo fuma, quantos cigarros fuma por dia. Foram consideradas três
possibilidades para a análise dos dados referidos: Sim, nunca e passado.
USO DE ESTATINAS: O paciente informou se já fez ou faz uso de
medicamentos para dislipidemia e há quanto tempo o faz. Foram consideradas
duas possibilidades para a análise dos dados referidos: Sim (faz uso de estatinas)
ou não (não faz uso de estatinas).
No presente estudo foi considerado apenas o uso de estatinas, uma vez
que 93% da amostra faz uso deste tipo de fármaco. O n da amostra foi
considerado muito reduzido para a realização de análises estatísticas em relação
ao uso de outros fármacos hipolipemiantes (fibratos e ácido nicotínico), sendo que
em alguns casos o uso destes fármacos estava associado ao uso de estatinas.
PERFIL CLÍNICO: As variáveis clínicas selecionadas para análise
estatística foram obtidas a partir da anamnese (referência à presença da doença
já diagnosticada e uso de medicação específica para a mesma), exame físico,
dados laboratoriais e demais exames complementares, anteriores e realizados
subseqüentes à consulta inicial, apresentando alterações significativas. São elas:
diabete melito, hipertensão e cardiopatia isquêmica.
DIABETE MELITO: Os indivíduos participantes da amostra foram
considerados como portadores de diabete melito por referirem a doença na
anamnese, fazerem uso de medicação específica, além de apresentarem
32
hiperglicemia recorrente ou persistente, confirmada ao se demonstrar qualquer
um dos itens seguintes:
•
Nível plasmático de glicose em jejum em ou acima de 126 mg/dL (7,0
mmol/l) Exame bioquímico realizado subseqüente à consulta, como
parte da rotina de diagnóstico laboratorial oferecida aos pacientes que
buscam atendimento no Serviço de Cardiologia do HCPA.
•
Nível plasmático de glicose em ou acima de 200 mg/dL (11,1 mmol/l) duas
horas após uma dose de 75g de glicose oral como em um teste de
tolerância à glicose Exame bioquímico realizado anterior a consulta.
•
Nível plasmático de glicose aleatória em ou acima de 200 mg/dL (11,1
mmol/l) Exame bioquímico realizado anterior a consulta.
HIPERTENSÃO: Os indivíduos participantes da amostra foram
considerados como portadores de hipertensão por apresentarem níveis de
pressão arterial sistêmica acima de 140/90 mmHg no dia da primeira consulta,
além de referirem a doença na anamnese e fazerem uso de medicação
específica. O critério utilizado na pesquisa obedeceu as IV Diretrizes Brasileiras
de Hipertensão Arterial, definidas em 2004 pelas Sociedades Brasileiras de
Cardiologia, de Nefrologia e de Hipertensão (MION JR.et al, 2004), elas orientam
que após cinco minutos de repouso do paciente em ambiente calmo, deverão ser
realizadas pelo menos três medidas, com intervalo de um minuto entre elas. A
média das duas últimas deve ser considerada como a pressão arterial do paciente
hipertenso.
Preparo do paciente para aferição da pressão arterial
1. O procedimento deve ser explicado ao paciente;
2. Repouso de pelo menos cinco minutos em ambiente calmo;
3. Evitar bexiga cheia;
4. Não praticar exercícios físicos 60 a 90 minutos antes;
5. Não ingerir bebidas alcoólicas, café ou alimentos e não fumar 30 minutos
antes;
33
6. Manter pernas descruzadas, pés apoiados no chão, dorso recostado na
cadeira e relaxado;
7. Remover roupas do braço no qual será colocado o manguito;
8. Posicionar o braço na altura do coração (nível do ponto médio do esterno
ou 4º espaço intercostal), apoiado, com a palma da mão voltada para cima
e o cotovelo ligeiramente fletido;
9. O paciente não deve falar durante o procedimento.
CARDIOPATIA ISQUÊMICA: Os indivíduos participantes da amostra foram
considerados como portadores de cardiopatia isquêmica por relatarem na
anamnese a presença da mesma, além de apresentarem exame físico e exames
complementares alterados (ECG), bem como fazerem uso de medicação
específica.
PERFIL LIPÍDICO: A coleta de sangue para determinação do perfil lipídico
foi realizada em pacientes em jejum de 12 horas. Os níveis de colesterol total,
HDL-C, LDL, VLDL e triacilgliceróis foram dosados por métodos enzimáticos
(anexo 2). A fração LDL-C foi calculada segundo a fórmula descrita por
Friedewald et al. (1972), que é válida somente para casos onde os níveis de TG
são inferiores a 400 mg/dL.
MEDIDAS ANTROPOMÉTRICAS: Foram obtidas a partir de medição
realizada durante a consulta e foram aferidas por meio de técnicas padronizadas
e incluíram: 1) medida da massa corporal, aferida por meio de balança
antropométrica e 2) medida da estatura realizada por meio de estadiômetro fixo,
em ambos os casos os indivíduos utilizaram avental e estavam descalços. O IMC
foi então calculado como massa (kg)/estatura (m
2
) e classificado segundo as
normas descritas pela OMS (2004).
A aferição da circunferência da cintura e quadril foi realizada segundo
Machado e Sichieri (2002), estando o indivíduo em pé, em posição ereta,
utilizando-se uma fita métrica flexível e inextensível de 200 cm de comprimento,
34
com precisão de uma casa decimal. Para garantir a validade e fidedignidade das
medidas, observou-se rigorosamente a posição da fita no momento da medição,
mantendo-a no plano horizontal. Para obtenção dos valores das circunferências,
circundava-se com a fita o local do corpo que se desejava medir, sendo a mesma
colocada com firmeza, sem esticar excessivamente, evitando-se assim a
compressão do tecido subcutâneo. A leitura foi feita no centímetro mais próximo, no
ponto de cruzamento da fita.
Foi solicitado que o paciente ficasse em posição ortostática, abdômen
relaxado, braço ao lado do corpo e os pés juntos. Sinteticamente, a aferição da
medida da cintura será realizada a uma distância entre a borda inferior da última
costela e a crista ilíaca e em um plano horizontal. O perímetro dos quadris foi
aferido considerando a extensão máxima ao redor das nádegas (MACHADO e
SICHIERI, 2002).
A relação cintura-quadril foi obtida pela divisão dos perímetros da cintura
(cm) e do quadril (cm). Dentre os pontos de cortes estabelecidos o mais utilizado
tem sido 0,80 cm para o sexo feminino e 0,95 cm para o masculino (MACHADO e
SICHIERI, 2002).
3.4 EXTRAÇÃO DE DNA
O DNA de cada amostra foi extraído do sangue total através da técnica
descrita por Lahiri e Nurnberger (1991).
3.5 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
A identificação do polimorfismo foi realizada pela técnica molecular de
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), seguida de (RFLP) com a
endonuclease de restrição apropriada.
35
A reação de amplificação foi preparada em um volume final de 50µl,
contendo 10mM Tris (pH 8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl
2
, 200µM de dNTPs, 20
pmol de cada primer, 0,5µL de enzima Taq DNA polimerase e 2µL de DNA (a
quantidade de DNA presente em cada amostra não foi avaliada no presente
estudo).
Os produtos de PCR da região polimórfica do gene SREBF-1c foram
amplificados conforme o protocolo descrito na tabela 3. Em seguida corados com
brometo de etídio e, após eletroforese em gel de agarose 1,5%, foram
visualizados em luz ultravioleta. O tamanho das bandas foi avaliado com um
marcador de peso molecular (100 pb).
Tabela 3: Descrição dos primers e condições de amplificação por PCR do gene SREBF-1C.
3.6 GENOTIPAGEM POR RFLP
Após a digestão com endonuclease de restrição Xmn I, os produtos de
clivagem foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 3% e visualizados
sob luz UV após terem sido corados com brometo de etídio. As condições de
clivagem são: Tempo de incubação: 4 horas; Temperatura: 37°C; Quantidade de
enzima: 1µL. Os dados moleculares obtidos a partir da genotipagem foram
registrados no anexo 3. As análises moleculares, tanto de amplificação quanto de
clivagem, foram realizadas em duplicata para confirmação dos resultados obtidos.
Primers ( 5’ - 3’)
Condições de
amplificação
Referência
5’-TCCTGTGTGCTACTTTGCCTTTT-3’
5’- GGACAGAGCTGGGAGGTG-3’
94°C - 4’
94°C - 30’’
59°C - 30’’ 30 X
72°C - 30’’
72°C - 5’
EBERLÉ, et
al., 2004
36
3.7 ANÁLISES GENOTÍPICAS
A presença do alelo 54C no éxon 18c do gene SREBF-1c, abole o sítio de
restrição para a enzima Xmn I, gerando um fragmento de 370 pb. A presença do
alelo 54G cria o sítio de restrição resultando em dois fragmentos, de 207 pb e
163 pb. Os genótipos para o polimorfismo foram observados a partir dos
fragmentos gerados e representados abaixo:
5’ 3’
Figura 4 - Tamanho dos fragmentos do gene SREBF-1c após o processo de clivagem com a
enzima XmnI no sítio G54C.
3.8 ANÁLISES ESTATÍSTICAS
A freqüência alélica foi calculada por contagem gênica. O teste de χ
2
de
Pearson foi usado para verificar se a freqüência observada dos genótipos estava
de acordo com a esperada e se foram consistentes com o equilíbrio de Hardy-
Weinberg. O objetivo dos testes foi também verificar a existência de associações
5` .... GAANN /
NNTTC ..... 3
`
G54C
PCR
3`.....CTTNN / NNAAG ......5`
Restrição Enzimática Xmn I
Genótipo Genótipo
Genótipo
GG
GC CC
163pb
207pb
370pb
370pb
163pb
207pb
37
significativas entre os genótipos GG, GC e CC e as variáveis categorizadas CT,
TG, LDL-C e HDL-C. Esta análise foi refeita estratificada por sexo a fim de
verificar se há alguma influência do gênero na associação.
O Teste Exato de Fisher, foi utilizado para comparar as variáveis
categóricas com a presença ou não da associação dos alelos analisados em
pacientes dislipidêmicos.
Análises de Variância (ANOVA) foram realizadas a fim de se verificar a
existência de diferenças na média das variáveis contínuas - CT, TG, LDL-C, HDL-
C, Glicose e col. não-HDL – comparando com os genótipos, com o objetivo de
verificar se há algum alelo que seja “dominante” ou “determinante”. As análises
foram também feitas estratificadas por sexo e pela variável uso de estatinas,
codificada como SIM ou NÃO, bem como para portadores e não portadores de
DMT2. Para saber quais os genótipos que diferem fez-se o teste de Tukey.
O Teste t de Student ou não paramétrico correspondente foi utilizado para
comparar as variáveis contínuas com a presença ou não do desfecho. Os dados
coletados foram lançados e analisados no programa de análise estatística SPSS
(Statistical Package for Social Sciences) versão 12.0 para Windows. Todas as
análises foram realizadas com base em um intervalo de confiança de 95% e nível
de significância de 5%.
As variáveis controladas foram: idade, sexo, IMC, relação cintura/quadril,
cardiopatia isquêmica, diabete melito, hipertensão, uso de medicamentos
(estatinas), níveis lipídicos e de glicose.
O número total de observações para as variáveis difere de 121 (n total) em
alguns casos, pois os níveis de LDL colesterol não foram calculados para
indivíduos com TG acima de 400 mg/dL. Para 20 indivíduos os dados de cintura e
38
quadril não estavam descritos no prontuário de coleta de dados e não foi possível
preenchê-los posteriormente.
3.9 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
O presente estudo foi projetado de acordo com as Diretrizes e Normas
Regulamentadoras de Pesquisa envolvendo Seres Humanos (resolução 196/1996
do Conselho Nacional de Saúde), aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital de
Clínicas de Porto Alegre no dia 09 de dezembro de 2004, com N° de Protocolo
04300, sendo aprovado também pelo Comitê de Ética da ULBRA.
39
4 RESULTADOS
4.1 ANÁLISES MOLECULARES DO GENE SREBF-1c
A figura 5 mostra no gel de agarose, a eletroforese com os resultados
obtidos a partir das análises por PCR-RFLP para o polimorfismo G54C no gene
SREBF-1c . A coluna 1 apresenta o marcador de peso molecular (100 pb), as
colunas 2 e 3 apresentam sucessivamente, o controle negativo e o produto de
PCR amplificado (370 pb). A coluna 4 mostra o perfil de restrição para o genótipo
GG com fragmentos de 207 pb e 163 pb. A coluna 5 mostra o perfil de restrição
para o genótipo GC com fragmentos de 370 pb, 207 pb e 163 pb. A coluna 6
mostra o perfil de restrição para o genótipo CC com fragmentos de 370 pb. Os
tamanhos esperados para os fragmentos de restrição estão identificados à direita
do gel.
Figura 5 -
Perfil eletroforético do polimorfismo G54C do gene SREBF-1c.
4.2 ANÁLISE DESCRITIVA DA AMOSTRA
A tabela 4 mostra as características gerais da amostra coletada. Pode-se
observar que a freqüência de tabagismo e consumo de álcool são
370 pb
207 pb
163 pb
1 2
3 4 5 6
40
significativamente superiores no sexo masculino (p = 0,046 e p < 0,0001,
respectivamente), enquanto que o sedentarismo é mais freqüente nas mulheres,
porém sem diferença estatisticamente significativa entre os sexos (p = 0,070). A
idade média da amostra é de 61,68 (faixa de variação 22-89 anos), sendo que
homens e mulheres não diferem quanto a este parâmetro (p = 0,098). Em relação
ao uso de estatinas e doenças concomitantes, não houveram diferenças
significativas entre homens e mulheres.
Nos níveis lipídicos de forma geral, o perfil lipídico da população
investigada não está dentro dos valores considerados “ótimos” pela NCEP (2001),
discutidos na revisão bibliográfica deste trabalho. A média dos valores de
colesterol está acima do valor considerado desejável (< 200 mg/dl) e os níveis de
LDL-C estão na faixa limítrofe deste (130-159 mg/dl), com a média de 146,44
mg/dl. Além disso, podemos observar que os homens têm níveis
significativamente menores de HDL-C, quando comparados com as mulheres (p =
0,002). Os níveis de triacilgliceróis não diferem entre homens e mulheres, embora
a média (250,69 mg/dl) encontra-se bastante elevada em relação aos valores
considerados ótimos (<150 mg/dl). Quanto aos níveis de glicose, estes também
se encontram elevados em relação aos valores considerados normais (70 a 99
mg/dl) em ambos os sexos, porém sem diferença significativa entre eles
(p=0,509). O valor médio do colesterol não HDL na amostra é de 187,15 mg/dl,
sendo elevado em relação ao nível considerado ótimo (130 mg/dl), porém homens
e mulheres não diferem quanto a este parâmetro (p = 0,418).
Nas variáveis antropométricas, observou-se a alta média do índice de
massa corporal (IMC) 29,01 kg/m
2
, ficando na categoria de sobrepeso. De acordo
com a Organização Mundial da Saúde (OMS, 2007), as medidas do IMC são
classificadas como: IMC < 18,5 kg/m
2
como abaixo do peso, IMC < 25 kg/m
2
como normal, IMC ≥ 25 kg/m
2
como sobrepeso, IMC ≥ 30 kg/m
2
como obesidade
e IMC ≥ 40 kg/m
2
como obesidade mórbida. Nesta amostra, cerca de 29,75% das
pessoas enquadram-se dentro da categoria de obesos e 4,95% na categoria de
obesidade mórbida.
41
Tabela 4: Análise descritiva da amostra total.
Características Total Mulheres Homens p
n (%) 121 68 53
Idade ª, anos 61,68 ± 11,33 62,79 ± 11,67 60,24 ± 10,80 0,217
Sedentarismo (%) 55,0 63,2 44,2 0,070
Tabagismo (%)
0,046*
Sim 13,6 8,8 20,0
Nunca 48,3 57,4 36
Passado 38,1 33,8 44,0
Consumo de álcool (%)
<0,0001*
Sim 18,8 10,4 30,0
Nunca 19,7 10,5 32,0
Passado 61,5 79,1 38,1
Uso de Estatinas (%) 0,145
Sim 45,5 51,5 37,7
Não 54,5 48,5 62,3
Perfil clínico (%)
Diabete melito 39,7 42,6 35,8 0,461
Cardiopatia isquêmica 33,1 30,9 35,8 0,697
Hipertensão arterial 76,9 82,4 69,8 0,130
Níveis Lipídicos
a
, mg/dl
CT 234,94 ± 51,71 240,53 ± 54,13 227,77 ± 47,99 0,173
HDL-C 47,65 ± 10,11 50,12 ± 10,43 44,49 ± 8,80
0,002*
LDL-C 146,44 ± 46,29 148,95 ± 47,08 143,16 ± 45,54 0,528
TG 250,69 ± 201,13 252,00 ± 203,73 249,00 ± 199,67 0,906
COL não-HDL 187,15 ± 50,10 190,41 ± 50,85 182,96 ± 49,28 0,418
Glicose 125,52 ± 51,10 124,66 ± 53,33 126,62 ± 48,56 0,509
Medidas antropométricasª
IMC (kg/m
2
) 29,01 ± 5,10 29,66 ± 5,77 28,17 ± 3,99 0,098
Cintura (cm) 101,23 ± 10,97 100,18 ± 11,63 102,53 ± 10,08 0,279
ª valores apresentados como média (±) Desvio Padrão (DP); p para a comparação entre
homens e mulheres; *p estatisticamente significativo, Teste t e teste de Levene; χ
2
de Pearson;
Teste Exato de Fisher; Teste t e teste Mann Whitney.
42
Na análise da distribuição das categorias de IMC não existe diferença
significativa quando se comparam homens e mulheres (p = 0,098) figura 6.
Figura 6 - Porcentagens de homens e mulheres por categoria de IMC na amostra de 121
indivíduos dislipidêmicos.
4.3 FREQÜÊNCIAS GENOTÍPICAS E GÊNICAS NA AMOSTRA TOTAL
As freqüências genotípicas e gênicas do polimorfismo investigado estão
apresentadas na tabela 5.
Não houve diferença significativa na freqüência dos alelos entre homens e
mulheres e a distribuição dos mesmos encontra-se em equilíbrio de Hardy-
Weinberg.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Peso normal Sobrepeso Obesidade Obesidade
mórbida
% da amostra
Amostra Total Mulheres Homens
43
Tabela 5: Freqüências genotípicas e gênicas para o polimorfismo G54C no gene SREBF-1c .
Genótipos Alelos
GG GC CC G C p
n total
Freqüências %
16
0,132
60
0,496
45
0,372
46
0,38
75
0,62
0,848
(n)
Homens %
10
0,189
23
0,434
20
0,377
0,406
0,594
(n)
Mulheres %
6
0,088
37
0,544
25
0,368
0,361
0,639
0,222
χ
2
de Pearson. p para a comparação entre as freqüências gênicas.
4.4 INFLUÊNCIA DOS GENÓTIPOS DO POLIMORFISMO G54C SOBRE OS
NÍVEIS LIPÍDICOS
Na tabela 6 podemos observar que a presença do alelo variante C, não
está associada significativamente aos níveis lipídicos quando se analisa a
amostra como um todo, porém, nos níveis de glicose especificamente, o alelo C
tem uma significância limítrofe (p= 0,066).
Tabela 6: Influência do polimorfismo G54C sobre o perfil lipídico na amostra total.
Genótipos
GG GC CC p
n 16 60 45
CT 240,38 ± 44,98 236,17 ± 49,65 231,38 ± 57,19 0,812
HDL-C 47,31 ± 11,44 47,55 ± 9,81 47,91 ± 10,24 0,974
LDL-C 152,04 ± 46,07 149,28 ± 44,75 140,19 ± 49,01 0,584
TG 217,31 ± 106,96 246,03 ± 204,97 268,76 ± 222,08 0,662
C não HDL 193,06 ± 44,91 188,33 ± 47,95 183,47 ± 55,19 0,782
Glicose 114,31 ± 26,99 118,05 ± 34,39 139,47 ± 70,46
0,066
Valores apresentados como média (±) DP em mg/dl; p para a comparação entre os
genótipos; *p estatisticamente significativo; ANOVA; Kruskal-Wallis (TG e glicose).
44
Quando a amostra total é analisada não são observadas interações
significantes entre os sexos e os níveis lipídicos (Tabela 7).
Os níveis de LDL-C apresentam-se mais altos em homens portadores do
genótipo GG do que entre as mulheres, o que também pode ser visto nos níveis
de CT, porém não há nenhuma diferença estaticamente significativa. Os níveis de
TG apresentam-se mais altos em mulheres portadoras do genótipo CC do que as
portadoras do genótipo GG, apesar desta diferença não ser estatisticamente
significativa entre os genótipos.
Já os níveis de glicose são bem mais elevados em homens portadores do
genótipo CC. Em relação aos níveis lipídicos de HDL-C e de col. não HDL, não
foram observadas diferenças entre os genótipos.
45
Tabela 7: Influência do sexo em relação ao polimorfismo G54C sobre os níveis lipídicos
na amostra total.
GG GC CC P
LDL-C
n 06 34 19 0,459
Feminino 134,30 ± 52,41 155,31 ± 45,10 142,00 ± 49,54
n 09 18 18 0,320
Masculino 163,84 ± 40,07 137,89 ± 43,01 138,08 ± 49,80
HDL-C
n 06 37 25 0,300
Feminino 56,00 ± 11,87 50,19 ± 9,83 48,60 ± 10,89
n 10 23 20 0,245
Masculino 42,10 ± 7,72 43,30 ± 8,33 47,05 ± 9,58
CT
n 06 37 25 0,746
Feminino 229,50 ± 51,46 244,84 ± 49,26 236,80 ± 62,56
n 10 23 20 0,378
Masculino 246,90 ± 42,13 222,22 ± 48,08 224,60 ± 50,44
TG
n 06 37 25 0,350
Feminino 195,83 ± 67,68 230,27 ± 192,26 297,64 ± 236,20
n 10 23 20
Masculino 230,20 ± 126,61 271,39 ± 226,06 232,65 ± 203,15 0,781
Glicose
n 06 37 25 0,107
Feminino 123,17 ± 18,32 113,05 ± 27,66 142,20 ± 78,70
n 10 23 20 0,362
Masculino 109,00 ± 30,74 126,09 ± 42,55 136,05 ± 60,45
Col Não HDL
n 06 37 25 0,623
Feminino 173,50 ± 45,79 194,65 ± 46,06 188,20 ± 59,11
n 10 23 20 0,303
Masculino 204,80 ± 42,30 178,17 ± 50,18 177,55 ± 50,72
Níveis lipídicos apresentados como média (±) DP em mg/dl; p para a comparação entre
genótipos; *p estatisticamente significativo; ANOVA; Kruskal-Wallis (TG e glicose).
46
4.5 ANÁLISES DE FREQÜÊNCIAS DOS GENÓTIPOS DO POLIMORFISMO
G54C EM RELAÇÃO AOS NÍVEIS LIPÍDICOS
4.5.1 Freqüências Genotípicas de Acordo com Níveis de CT e TG
As freqüências genotípicas foram comparadas agrupando-se os indivíduos
para os níveis de CT e de TG, conforme a NCEP. Assim, fez-se a comparação
entre as freqüências das categorias de CT < 200 mg/dl, CT ≥ 200 e < 240 mg/dl e
os de CT ≥ 240 mg/dl. Isto foi repetido para os níveis TG < 150 mg/dl , TG ≥ 150
e < 200 mg/dl e TG ≥ 200 mg/dl. A tabela 8 resume os resultados encontrados
para as freqüências genotípicas.
Pode-se observar que nenhuma diferença estatisticamente significativa foi
encontrada para os níveis de CT e TG na amostra total.
Tabela 8: Freqüências genotípicas de acordo com os níveis de CT e TG.
CT < 200
+
CT ≥ 200 e
< 240
+
CT ≥ 240
+
TG < 150
+
TG
≥ 150 e
< 200
+
TG ≥ 200
+
n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%)
GG 3 (10,7) 5 (13,2) 8 (14,5) 5 (11,6) 3 (11,5) 8 (15,4)
GC 12 (42,9) 21 (55,3) 27 (49,1) 20 (46,5) 13 (50,0) 27 (51,9)
CC 13 (46,4) 12 (31,6) 20 (36,4) 18 (41,9) 10 (38,5) 17 (32,7)
p 0,793 0,908
+
Valores dados em mg/dl; p para comparação das freqüências genotípicas entre
categorias lipídicas; *p estatisticamente significativo; χ
2
de Pearson.
A comparação de freqüências também foi realizada para os dois sexos em
separado (Tabela 9), usando-se os mesmos critérios descritos anteriormente. As
freqüências genotípicas não diferiram para os diferentes níveis lipídicos em
nenhum dos sexos.
47
Tabela 9: Comparação de freqüências genotípicas de acordo com as categorias de CT e
TG para os dois sexos em separado.
CT < 200
+
Entre 200 e
240
+
CT ≥ 240
+
TG < 150
+
Entre 150 e
200
+
TG ≥ 200
+
n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%)
Masculino
GG 1 (7,7) 4 (21,1) 5 (23,8) 2 (11,1) 3 (27,3) 5 (20,8)
GC 6 (46,2) 9 (47,4) 8 (38,1) 8 (44,4) 2 (18,2) 13 (54,2)
CC 6 (46,2) 6 (31,6) 8 (38,1) 8 (44,4) 6 (54,5) 6 (25,0)
p 0,764 0,252
Feminino
GG 2 (13,3) 1 (5,30) 3 (8,8) 3 (12,0) 0 (0,0) 3 (10,7)
GC 6 (40,0) 12 (63,2) 19 (55,9) 12 (48,0) 11 (73,3) 14 (50,0)
CC 7 (46,7) 6 (31,6) 12 (35,3) 10 (40,0) 4 (26,7) 11 (39,3)
p 0,730 0,473
+
Valores dados em mg/dl; p para comparação das freqüências genotípicas entre
categorias lipídicas; χ
2
de Pearson.
4.5.2 Freqüências Genotípicas de Acordo com Níveis de LDL-C e HDL-C
As freqüências genotípicas foram comparadas agrupando-se os indivíduos
em relação aos níveis de LDL-C e HDL-C, conforme a NCEP. Os níveis de LDL-C
foram agrupados em LDL-C ≤ 100 mg/dl, com a de LDL-C > 100 mg/dl. Isto foi
repetido para os níveis de HDL-C, onde foram comparados os níveis de HDL-C ≤
40 e HDL-C > 40 mg/dl. A tabela 10 resume os resultados encontrados em
relação às freqüências genotípicas.
Pode-se observar que nenhuma diferença estatisticamente significativa foi
encontrada entre genótipos e os níveis de HDL-C e LDL-C. A comparação de
freqüências também foi realizada para os dois sexos em separado, usando-se os
mesmos critérios descritos anteriormente. As freqüências genotípicas não
diferiram em relação aos níveis lipídicos em nenhum dos sexos.
48
Tabela 10: Freqüências genotípicas de acordo com os níveis de LDL-C e de HDL-C.
LDL-C HDL-C
LDL-C
≤ 100
+
LDL-C
> 100
+
p HDL-C
≤ 40
+
HDL-C
>40
+
p
n (%) n (%) 0,418
n (%) n (%) 0,772
GG 15
3 (15,8)
12 (14,1) 16 5 (16,7) 11 (12,1)
GC 52
7 (36,8)
45 (52,9) 60 15 (50,0) 45 (49,5)
CC 37 9 (47,4) 28 (32,9) 45 10 (33,3) 35 (38,5)
Masculino 0,535
0,243
GG 9 1 (11,1) 8 (22,2) 10 4 (22,2) 6 (17,1)
GC 18 3 (33,3) 15 (41,7) 23 10 (55,6) 13 (37,1)
CC 18 5 (55,6) 13 (36,1) 20 4 (22,2) 16 (45,7)
Feminino 0,364
0,567
GG 6 2 (20,0) 4 (8,2) 6 1 (8,3) 5 (8,9)
GC 34 4 (40,0) 30 (61,2) 37 5 (41,7) 32 (57,1)
CC 19 4 (40,0) 15 (30,6) 25 6 (50,0) 19 (33,9)
+
Valores dados em mg/dl; p para comparação das freqüências genotípicas entre
categorias lipídicas; *p estatisticamente significativo; χ
2
de Pearson.
4.6 ANÁLISES DAS FREQUÊNCIAS GENÓTÍPICAS DE ACORDO COM AS
VARIÁVEIS ANTROPOMÉTRICAS
A tabela 11 apresenta os resultados de freqüências genotípicas de acordo
com as categorias de IMC e os pontos de corte para a relação cintura/quadril
(OMS, 2004).
A freqüência de portadores do genótipo CC é maior em homens que
apresentam a relação cintura/quadril ≥ 0,95, (p=0,019) .
49
Tabela 11: Análise das freqüências genotípicas conforme as categorias de IMC e as
relações de cintura/quadril na população estudada.
IMC (kg/m
2
) RELAÇÃO CINTURA/QUADRIL (cm)
MULHERES HOMENS
IMC < 25 25 ≤ IMC < 30
IMC ≥ 30 < 0.80 ≥ 0.80 < 0.95 ≥ 0.95
n (%) n (%) n (%)
GG
4 (17,39) 4 (7,14) 8 (19,04) 0 5 (8,93) 3 (21,43) 7 (22,58)
GC
11 (47,83) 32 (57,14) 17 (40,48) 0 31 (55,36) 9 (64,29) 8 (25,80)
CC
8 (34,78) 20 (35,72) 17 (40,48) 0 20 (35,71) 2 (14,28) 16 (51,61)
p 0,343 *0,019
*p estatisticamente significativo, χ
2
de Pearson.
Analisando-se a média de IMC para os sexos e os genótipos, verifica-se
que a média de IMC em mulheres portadoras do genótipo GG é de 30,89 Kg/m
2
,
enquanto que para o genótipo CC é de 28,94 Kg/m
2
, e para homens portadores
do genótipo GG é de 29,92 Kg/m², enquanto que para o genótipo CC é de 28,61
Kg/m².
Observa-se que não existe uma diferença estatisticamente significante
entre os genótipos em relação aos sexos. A figura 7 representa estes resultados
graficamente.
50
Figura 7 - Comparação de médias de IMC entre os genótipos do gene SREBF 1c por
sexo.
ANOVA.
Os resultados da análise das médias para a relação cintura/quadril estão
apresentados na figura 8, onde se pode observar que os genótipos do polimorfismo
G54C não influenciam este parâmetro na amostra total analisada, porém quando se faz
a análise de variância separando a amostra por sexo. Verifica-se que há diferença
significativa entre as médias da relação cintura/quadril no sexo masculino e os
genótipos do gene SREBF-1c (p = 0,001).
Para saber onde ocorreu a diferença, ou seja, quais os genótipos que
diferem, fez-se o teste de Tukey. Constatou-se que o genótipo CC difere dos demais.
Para a diferença entre as médias da relação cintura/quadril dos genótipos CC e GG o
valor encontrado foi de 0,062 (p = 0,040) e para a diferença entre as medias da relação
cintura quadril dos genótipos CC e GC, o valor encontrado foi de 0,080 (p = 0,001).
25
25,5
26
26,5
27
27,5
28
28,5
29
29,5
30
30,5
31
31,5
GG
GC
C
C
IMC (Kg/m
2
)
Médias de IMC - Mulheres p = 0,690
Médias de IMC - Homens p = 0,137
51
Desta maneira, verificou-se que presença do alelo variante C é um fator de
influência para o desenvolvimento da obesidade.
0,86
0,88
0,9
0,92
0,94
0,96
0,98
1
1,02
1,04
1,06
GG GC CC
Relação cintura/quadril(cm)
Mulheres
p = 0,625
Homens
p = 0,001
Figura 8 - Comparação de médias da relação de cintura/quadril entre os genótipos do
gene SREBF-1c por sexo.
Kruskall-Wallis.
4.7 INFLUÊNCIA DAS ESTATINAS SOBRE OS NÍVEIS LIPÍDICOS
Com a finalidade de se verificar a influência das estatinas sobre o perfil
lipídico da amostra, realizou-se uma análise comparativa entre não usuários e
usuários de estatinas. Quando a amostra total é analisada observamos interações
significantes com os níveis lipídicos de colesterol total, LDL-C e col. não HDL
entre não usuários e usuários de estatinas (Tabela 12).
A figura 9 mostra os resultados graficamente.
52
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
CT HDL-C LDL-C TG COL
não-HDL
Glicose
Média (mg/dl)
Não Usuários
Usuários
p
=
0,005
p = 0,873
p
<
0,0001
p
=
0,012
p
=
0,004
p = 0,814
Tabela 12: Análise comparativa dos níveis lipídicos entre usuários e não usuários de
estatinas.
Não Usuários Usuários p
n 66 55
CT 247,14 ± 46,11 220,31 ± 54,62 *0,005
HDL-C 47,79 ± 9,17 47,49 ±11,23 0,875
LDL-C 161,63 ± 42,19 124,02 ± 43,25
*< 0,0001
TG 209,06 ± 120,98 300,64 ± 260,04 *0,012
COL não-HDL 199,09 ± 44,70 172,82 ± 52,81 *0,004
Glicose 124,52 ± 57,29 126,73 ± 43,00 0,814
+
Valores apresentados como média (±) DP em mg/dl; *p estatisticamente significativo.
Figura 9 - Níveis lipídicos entre não usuários e usuários de estatinas. *p estatisticamente
significativo; ANOVA; Kruskal-Wallis (TG e glicose).
53
As tabelas 13 e 14 mostram a comparação das variáveis lipídicas dos
indivíduos não usuários e usuários de estatinas, respectivamente, entre os
genótipos estudados.
Não foi observada nenhuma significância estatística para as variáveis
lipídicas e os genótipos entre os indivíduos não usuários e usuários de estatinas.
Tabela 13: Níveis lipídicos e de glicose dos indivíduos não usuários de estatinas em
relação aos genótipos.
Valores apresentados como média (±) DP em mg/dl; ANOVA; Kruskal-Wallis (TG e glicose).
Tabela 14: Níveis lipídicos e de glicose dos indivíduos usuários de estatinas em relação
aos genótipos.
Genótipos
GG GC CC p
n 5 25 25
CT 239,20 ± 50,86 217,00 ± 47,12 219,84 ± 63,06 0,715
HDL-C 49,20 ± 10,03 46,84 ± 10,99 47,80 ± 12,04 0,900
LDL-C 150,40 ± 59,92 129,30 ± 40,85 111,29 ± 40,64 0,197
TG 235,40 ± 155,00 262,56 ± 270,35 354,76 ± 264,45 0,411
COL não-HDL 190,00 ± 44,83 170,16 ± 46,26 172,04 ± 61,08 0,749
Glicose 124,60 ± 21,96 116,16 ± 26,12 137,72 ± 56,16 0,209
Valores apresentados como média (±) DP em mg/dl; ANOVA; Kruskal-Wallis (TG e glicose).
Genótipos
GG GC CC p
n 11 35 20
CT 240,91 ± 44,72 249,86 ± 47,42 245,80 ± 46,47 0,848
HDL-C 46,45 ± 12,40 48,06 ± 9,01 48,05 ± 7,76 0,873
LDL-C 152,64 ± 43,51 162,81 ± 42,71 164,75 ± 42,19 0,735
TG 209,09 ± 85,51 234,23 ± 144,83 165,00 ± 74,02 0,124
COL não-HDL 194,45 ± 47,07 201,31 ± 45,42 197,75 ± 44,22 0,897
Glicose 109,64 ± 28,70 119,40 ± 39,58 141,65 ± 86,64 0,249
54
4.8 FREQÜÊNCIAS GENOTÍPICAS ENTRE PORTADORES E NÃO
PORTADORES DE DMT2
Tabela 15: Comparação das freqüências genotípicas entre portadores e não portadores
de DMT2 por sexo.
Portadores Não
Portadores
p
n total n(%) n(%) 0,129
GG 6 (12,5) 10 (13,7)
GC 19 (39,58) 41 (56,16)
CC 23 (47,92) 22 (30,14)
Homens
0,400
GG 2 (10,53) 8 (23,53)
GC 8 (42,10) 15 (44,12)
CC 9 (47,37) 11 (32,35)
Mulheres
0,056
GG 4 (13,79) 2 (5,0)
GC 11 (37,93) 26 (65,00)
CC 14 (48,28) 11 (27,5)
χ
2
de Pearson.
Na amostra total estudada não foram observadas interações significativas
entre os genótipos dos portadores e não portadores de DMT2 (p = 0,129). Porém,
quando a mesma é estratificada por sexo, torna-se clara a influência do alelo C
para a presença de DMT2 em mulheres portadoras dos genótipos GC e CC com
significância estatística limítrofe (p = 0,056). Já em homens, nenhuma diferença
estatisticamente significante foi encontrada entre os genótipos e a presença ou
não da doença. Calculou-se a freqüência alélica dos genótipos do grupo de
portadores e não portadores de DMT2. No grupo de portadores a freqüência do
alelo C foi de 67% e no grupo de não portadores a mesma foi de 62%.
55
5 DISCUSSÃO E CONCLUSÃO
Nos últimos anos, avanços sem precedentes têm sido alcançados no
campo da genética das doenças multifatoriais, tais como dislipidemias, DMT2,
obesidade, DCV, e a resistência à insulina. Muitos genes codificantes para
proteínas envolvidas no metabolismo de lipídios foram identificados, localizados
cromossomicamente, e tiveram suas seqüências de DNA caracterizadas
(ANDRADE e HUTZ, 2002). Em contribuição a esses avanços científicos,
conduzimos o primeiro estudo brasileiro do polimorfismo G54C no gene SREBF-
1c como um possível “gene candidato” a alterações nos níveis lipídicos e de
glicose em humanos.
A amostra estudada foi composta de 121 indivíduos dislipidêmicos, sendo
alguns portadores de comorbidades, tais como: DMT2, cardiopatia isquêmica e
hipertensão arterial sistêmica, comprovados através de exames laboratoriais e
clínicos. A presença da idade média que foi acima dos 60 anos, sedentarismo,
alto índice de tabagismo, presença de doenças como DMT2, hipertensão e alto
índice de IMC que coloca a amostra na categoria de sobrepeso (muito próxima à
obesidade), são fatores de risco para o desenvolvimento da DCV, dados estes
que conferem com a literatura (STEINER, 2001; FIEGENBAUM E HUTZ, 2006;
SANTOS, 2001).
Compuseram a amostra 53 homens (43,8 %) e 68 mulheres (56,2 %). A
freqüência pouco mais elevada de mulheres na amostra estudada pode estar
relacionada com um maior cuidado das mulheres em relação à saúde e a
disponibilidade de tempo para consultar.
A freqüência alélica do polimorfismo G54C foi similar à encontrada em
outros estudos (EBERLÉ et al., 2004(a); FELDER et al., 2007), e está em
equilíbrio de Hardy-Weinberg. A freqüência do alelo variante C foi elevada na
população (62%) em comparação com o alelo G, e está de acordo com a
literatura citada acima.
56
As freqüências mais elevadas encontradas de tabagismo (p = 0,046),
consumo de álcool (p < 0,0001) em indivíduos do sexo masculino refletem um
comportamento da sociedade ocidental que faz com que os homens apresentem
perfis de risco diferenciados para o desenvolvimento de DCV em relação aos
indivíduos do sexo feminino (FILARDO e NETO, 2001; SIMÃO et al. 2002;
BARRETO et al. 2003; MELO et al., 2007).
Neste estudo não foram observadas associações significativas entre níveis
bioquímicos e sexo (p > 0,05). No entanto, é possível observar que o perfil lipídico
da amostra não está dentro dos valores de referência para pessoas acima de 20
anos segundo o NCEP (2001), condição essa, pré-requisito para a seleção da
população estudada. Observou-se porém, associação significativa entre o nível de
HDL-C e o sexo masculino (p= 0,002). Da mesma maneira, é possível observar
que os níveis de glicose também estão acima do normal. Embora sem associação
estatisticamente significativa, esse último dado confere aos indivíduos
predisposição ao desenvolvimento de DMT2, um fator de risco de grande
importância no desenvolvimento de DCV (BLONDE et al., 2006).
Referente aos níveis lipídicos CT, HDL-C, LDL-C, TG e Col. não HDL, não
foram observadas associações significativas entre os genótipos do gene SREBF-
1c. Outros autores entretanto, encontraram associações significativas em
portadores do alelo variante C (p = 0,024) em relação aos níveis de TG (EBERLÉ
et al., 2004)(a) e no alelo variante T do mesmo gene SREBF-1c, porém no
polimorfismo intrônico C/T no éxon 18c, a significância estatística foi em relação
aos níveis de CT e LDL-C (p < 0,05)(LAUDES et al., 2004). Eberlé et al. (2004)(a),
similarmente com o presente estudo, não encontraram uma associação
significativa entre os genótipos e os níveis lipídicos de CT e HDL-C. Observa-se
neste estudo que a presença do alelo variante C tem uma forte tendência de
associação nos níveis de glicose (p=0,066). Entretanto, para os níveis de Col. não
HDL e para os níveis de glicose, não foram observados resultados similares na
literatura.
57
Os autores Laaksonen et al. (2005)(a) demonstraram em seus estudos com
o gene SREBF-1c que portadores do genótipo GG têm níveis de CT mais altos do
que portadores dos genótipos GC e CC, afetando o metabolismo dos esteróis em
homens. Neste estudo não observou-se associações significativas entre os níveis
lipídicos, sexo e genótipos. Verificou-se porém, que os homens portadores do
genótipo GG apresentam de forma similar à literatura citada, níveis mais altos de
LDL-C e de CT em relação às mulheres portadoras do genótipo GG. Isto sugere
que o alelo normal G pode estar associado com a dislipidemia em homens e o
polimorfismo G54C do SREBF-1c ser funcionalmente diferente em resposta aos
níveis lipídicos com relação ao gênero.
Nas análises feitas entre os genótipos do polimorfismo G54C e as variáveis
antropométricas, observou-se significância estatística em homens portadores do
genótipo CC (p = 0,019) apresentando a relação cintura /quadril (RCQ) de ≥ 0,95.
Nas mulheres porém, apesar de não apresentarem uma diferença estatística,
observou-se que a maior freqüência é a de portadoras do alelo C. Esta análise
indica que a presença do alelo C predispõe à obesidade. Isto encontra-se em
concordância com o estudo de Eberlé et al. (2004)(a), que encontraram uma
significativa associação do polimorfismo G54C com a obesidade mórbida, onde a
freqüência do alelo variante C foi maior que 50%.
A literatura também tem relatado que os riscos associados à obesidade são
mais eficientemente previstos levando-se em conta o padrão de acúmulo de
gordura intra-abdominal, através de medidas da circunferência da cintura e da
RCQ (OMS, 2004). Dobbelsteyn et al. (2001) demonstraram em um estudo
realizado no Canadá que pode ser relevante a relação entre RCQ e obesidade, o
que encontra-se em concordância com nossos achados.
Para corroborar esses resultados, realizou-se uma análise onde
comparamos as médias da RCQ entre os genótipos do gene SREBF-1c por sexo.
Verificou-se novamente uma diferença significativa entre as médias da RCQ no
58
sexo masculino (p = 0,001), com portadores do genótipo CC apresentando maior
média.
Na amostra total realizou-se uma análise comparativa dos níveis lipídicos
entre usuários e não usuários de estatinas, obtendo-se uma redução significativa
nos níveis de CT, LDL-C e Colesterol não HDL em usuários de estatinas. Porém
quando se correlacionou os genótipos do polimorfismo G54C com os níveis
lipídicos e a resposta as estatinas, não verificaram-se associações significativas.
Isto talvez se deva ao pequeno número amostral, quando se fez a separação por
genótipos, bem como, pode ser devida à diferença existente no perfil lipídico da
nossa população em relação às demais, demonstrando a importância das
variações interindividuais na resposta ao tratamento com o uso de estatinas.
Felder et al.(2007) confirmaram que o gene SREBF-1c codifica o fator de
transcrição envolvido na regulação do metabolismo da glicose e que tem
implicações na patofisiologia da DMT2. Foi realizado em função disto, uma
análise comparativa entre as freqüências genotípicas do gene SREBF-1c em
portadores e não portadores de DMT2 categorizada por sexo, uma vez que na
amostra total não obteve-se interações significativas.
Nessa análise entretanto, verificou-se a influência do alelo variante C em
mulheres portadoras dos genótipos GC e CC, tendo uma significância limítrofe
para a presença de DMT2. Outros estudos também confirmam a influência do
alelo variante do gene SREBF-1c no desenvolvimento da DMT2. Entre estes,
Laudes et al (2004) em seus estudos no mesmo gene SREBF-1c, porém com
outro polimorfismo, o intrônico C/T no éxon 18c, relataram a influência do alelo
variante T associado com a presença de DMT2 em homens (p<0,05). Já o estudo
de Eberlé et al (2004)(a) apesar de não ter usado como parâmetro de
comparação as freqüências do genótipo do gene SREBF-1c separando
portadores e não portadores de DMT2, observaram de forma similar ao nosso
estudo, uma freqüência bem maior do alelo variante C no grupo de DMT2
(p=0,06). Sugere-se desta maneira que o gene SREBF-1c está associado a
59
presença de DMT2 independente do polimorfismo ser o G54C, e esta influência
parece estar relacionada à presença do alelo variante. Porém mais estudos são
necessários para analisar-se a relação entre os polimorfismos no gene SREBF-1c
e a presença de DMT2.
Concluindo, neste estudo não foram observadas diferenças significativas
entre os níveis lipídicos e os genótipos do gene SREBF-1c do polimorfismo G54C
na população de indivíduos dislipidêmicos. Percebeu-se sim, uma forte
associação entre níveis de glicose, DMT2 e obesidade para indivíduos portadores
do alelo variável C.
Na amostra total observou-se a importância do uso de fármacos
hipolipemiantes na redução dos níveis de CT, LDL-C, TG e Col. não HDL, porém,
quando a correlação foi feita entre usuários de fármacos e os genótipos do gene
SREBF-1c, polimorfismo G54C, não foram encontradas associações
significativas, o que talvez se deva ao fato do polimorfismo não interferir na
resposta aos fármacos. Por outro lado, cabe ressaltar que o número amostral do
presente estudo é considerado pequeno, especialmente quando separa-se
usuários e não usuários de estatinas, dificultando a obtenção de algumas
conclusões.
Este estudo demonstrou também que o alelo variante C do polimorfismo
G54C do gene SREBF-1c tem uma influência diferente nas interações gene-
gênero, o que requer outros estudos para uma consideração mais direcionada e
complexa, a fim de elucidarmos o porquê destas diferenças.
Sugerimos que para futuros estudos sejam realizadas análises utilizando
um grupo controle e um número amostral mais elevado. Também, a comparação
e o cruzamento dos resultados obtidos com os de outros genes que estão sendo
estudados na mesma população, utilizando para isso métodos estatísticos mais
avançados. Além disso, uma pesquisa voltada para a influência que talvez os
hormônios sexuais possam exercer na rota do SREBP-1c, uma vez que até a
60
presente data, nenhum estudo se voltou a esse assunto no Brasil. Realizando-se
isso, talvez seja possível elucidar algumas questões relativas aos mecanismos
que causam as mudanças no metabolismo dos lipídios e da glicose.
É sabido que somente um polimorfismo não costuma ser o único fator
determinante na variação individual dos níveis de lipídios e glicose, mas sim,
muitos polimorfismos de diferentes genes e que, juntamente com fatores
ambientais, estejam envolvidos nesta resposta. Portanto, o presente estudo vem
agregar mais um gene candidato para o risco de DMT2 e obesidade.
61
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ADA – AMERICAN DIABETES ASSOCIATION. Type 2 Diabetes in Children
and Adolescents. Diabetes Care, 23: 381-89, 2000.
ALBERTS, B. et al. Fundamentos da Biologia Celular. Edit. Artmed, 486-
487, Porto Alegre-RS,1999.
ALTMAN, L.K. et al. Distúrbios do Coração e dos Vasos Sangüíneos.
Doença Arterial Coronariana, Edit. Literatura Médica, Merck & Co., Inc., Cap.
27, 2006
ANDRADE, F.; HUTZ, M. The Genetic Component of Serum Lipid
Determination. Ciência & Saúde Coletiva, 7 (1):175-182, 2002.
AQUINO, M. et al. Revendo Diabetes e Gravidez. Revista Ciências Médicas.
Campinas-SP, 2003.
BARRETO, S. et al. Quantificando o Risco de Doença Coronariana na
Comu-nidade. Projeto Bambuí. Arq. Bras. Cardiol. 81: 549-55,2003.
BHATNAGAR, D. Lipid Lowering Drugs in the Management of
Hyperlipidaemia. Pharmacol. Ther., 79: 205-30, 1998.
BREWER, H.B. Hypertriglyceridemia: Changes in the Plasma Lipoproteins
Associated with Increased Risk of Cardiovascular Disease. Am.J.Cardiol.,
83: 3f-12f, 1999.
BRESLOW, J.L. Genetics of Lipoprotein Abnormalities Associated with
Coronary Heart Disease Susceptibility. Annual Review of Genetics, 34: 233-
254, 2000.
BLONDE, L. et al Reducing Cardiovascular Disease Risk in Patients with
Diabetes: A Message from the National Diabetes Education Program. J.
American Acad. Nurse Practice, 18: 524-33, 2006.
CARVALHEIRA, J. et al. Vias de Sinalização da Insulina. Arq. Bras.
Endocrinologia Metabologia, 46 (4), 2002.
CHAMPE, P.; HARVEY, R. Bioquímica Ilustrada. Artes Médicas, 446, Porto
Alegre-RS, 2000.
COMISSIÓN DE DISLIPEMIAS. Rev. Argentina Cardiol., 69(1): 1-9, 2001.
CONSTANS A. et al. Plasma Lipids In HIV Infected Patients: A Prospective
Study in 95 Patients. Eur J Clin Invest. 2: 416-20, 1994.
62
CONSENSO BRASILEIRO SOBRE DISLIPIDEMIAS. Arq. Bras. Cardiol., 67:
113- 128 , 1996.
CORELLA, D.; ORDOVAS, J.M. Single Nucleotide Polymorphisms that
Influence Lipid Metabolism: Interaction with Dietary Factors. Annual
Review Nutrition, 25: 341- 90, 2005.
DEVLIN, T. Metabolismo de lipídios II: Vias do Metabolismo de Lipídios
Especiais. Manual Bioquímica Correlações Clínicas. Edgar Blücher, 339-47,
São Paulo,1998.
DOBBELSTEYN, C. et al. A Comparative Evaluation of Waist
Circumference, Waist-to-hip Ratio and Body Mass Index as Indicators of
Cardiovascular Risk Factors. International J. Obesity -The Canadian Heart
Health Surveys Research Group, 25: 652-661, 2001
DUAN, X. et al. The Effect of Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2
Polymorphism on the Serum Lipid in Northerm Chinese Subjects. J. Lipid
Research, 46: 252-57, 2005.
EBERLÉ, D. et al. SREBF-1 Gene Polymorphisms are Associated with
Obesity and Type 2 Diabetes in French Obese and Diabetic Cohorts.
Diabetes Association, 53: 2153-57, 2004(a).
EBERLÉ, D. et al. SREBP Transcription Factors: Master Regulators of
Lipid Homeostasis. Biochimic, 86: 839-48, 2004(b).
EDWARDS, P.; KAST, H. ; ANISFELD, A. BAREING it al: The Adoption of
LXR and FXR and their Roles in Lipid Homeotasis. J. Lipid Research, 43: 2-
12, 2002
FAN, Y. et al. Effects of Pravastatin Therapy on Serum Lipids and
Coronary Reactivity are not Associated with SREBP Cleavage Activating
Protein Polymorphism in Healthy Young Men. Clinical Genetics, 60(4): 319-
21, 2001.
FELDER, T. et al. The SREBF-1 Locus is Associated with Type 2 Diabetes
and Plasma Adiponectin Levels in a Middle-Aged Austrian Population.
International J. Obesity, 31: 1099- 103, 2007.
FERRÉ, P. et al. Sterol Regulatory Element Binding Protein 1c Mediates
Insulin Action on Hepatic Gene Expression. Biochemical Society
Transactions, 4 (29): 547-51, 2001.
FERRÉ, P.; FOUFELLE, F. SREBP-1c Transcription Factor and Lipid
Homeostasis: Clinical Perspective. Hormone Research, 68: 72-82, 2007.
63
FIEGENBAUM, M. et al. Determinants os Variable Response to
Simvastatim Treatment: The Role of Common Variants of SCAP, SREBF-
1a and SREBP-2 Genes. The Pharmacogenomics Journal, 5: 359-64, 2005.
FIEGENBAUM, M.; HUTZ, M. H. Farmacogenetica de Fármacos
Hipolipemiantes. Medicina , Ribeirão Preto, 39 (4): 543-53, 2006.
FILARDO, R.; NETO, C. Indicadores Antropométricos e da Composição
Corporal de Homens e Mulheres entre 20 e 39,9 Anos de Idade. Rev. Bras.
Cineantrop. Desemp. Humano, 3: 55-62, 2001.
FOUFELLE, R.; FERRÉ, P. Regulation of Carbohydrate Metabolism by
Insulin: Role of Transcription Factor SREBP-1c in the Hepatic
Transcriptional Effects of the Hormone. J. Soc. Biol., 195(3): 243-48, 2001.
FOUFELLE, F.; FERRÉ, P. New Perspectives in the Regulation of Hepatic
Glycolytic and Lipogenic Genes by Insulin and Glucose: A Role for the
Transcription Factor Sterol Regulatory Element Binding Protein-1c.
Biochem. J., 366: 377-91, 2002.
FRIEDEWALD, W., LEVY, R., FREDRICKSON, D. Estimation of the
concentration of low density lipoprotein cholesterol in plasma without
use of the preparative ultracentrifuge. Clinical Chemistry, v.18, p. 499-502,
1972.
GUYADER E. et al. Role for Human Immunodeficiency Vírus Type 1
Membrane Cholestrol in Viral Internalization. J Virol.76: 10356-64, 2002.
GUYTON, A. Tratado de Fisiologia Médica. Guanabara Koogan, 973: 730-
38, Rio de Janeiro, 2002.
HARDING, A. et al. Polymorphisms in the Gene Encoding Sterol
Regulatory Element Binding Factor 1c are Associated with Type 2
Diabetes. Diabetologia, 49: 2642-48, 2006.
HUA, X. et al. Structure of the Human Gene Encoding Sterol Regulatory
Element Binding Protein-1 (SREBF-1) and Localization of SREBF1 and
SREBF2 to Chromosomes 17p11.2 and 22q13. Genomics, 25 (3): 667-73,
1995.
INTERNATIONAL HUMAN GENOME SEQUENCING CONSORTIUM. Initial
Sequencing and Analysis of the Human Genome. Nature, 409: 860-921,
2001.
IZAR, M. et al. Fatores de Risco, Marcadores Bioquímicos e
Polimorfismos Genéticos na Doença Arterial Coronariana Prematura. Arq.
Bras. Cardiol., 80: 379-87, 2003.
64
JAIN, R. et al. Metabolic Complications Associated With Antiretroviral
Therapy. Antiviral Research, 51: 151-77, 2001.
JIANG, R. et al. Non–HDL Cholesterol and Apolipoprotein B Predict
Cardiovascular Disease Events Among Men with Type 2 Diabetes.
Diabetes Care, 27: 1991-97, 2004.
KIM, S. et al. SREBP –1c Mediates the Insulin Dependent Hepatic
Glucokinase Expression. J. Biol. Chem., 279 (29): 30823-29, 2004.
KING, M. Cholesterol and Bile Metabolism. 2003. Disponível em:
<
www.dentistry.leeds.com.uk/thcme/home.htmal> Acesso em: 17/03/06.
KRAUSS, R. Lipid and Lipoproteins in Patients with Type 2 Diabetes.
Diabetes Care, 27: 6, 2004.
KREISBERG, R. et al. Lipids and Atherosclerosis: Lessons Learned from
Randomized Controled Trials of Lipid Lowering and Other Relevant
Studies. J. Clin. Endocrinol. Metab., 87: 423-37, 2002.
KRIEGER, M. Charting the Fate of the “Good Cholesterol”: Identification
and Characterization of the High Density Lipoprotein Receptor SR-BI.
Annual Rev. Biochem, 68: 528-58, 1999.
LAAKSONEN, R. et al. Genetic Variant SREBF-1 Genes is Significantly
Related to Cholesterol Synthesis in Man. Atherosclerosis, 1-4, 2005(a).
LAAKSONEN, R. et al. Dietary Cargohidrate Modification Enhances Insulin
Secretion in Persons with the Metabolic Syndrome. Am. J. Clin. Nutr.,
82(6): 1218-27, 2005(b).
LAHIRI, D.; NURNBERGER, J. A Rapid Non–Enzimatic Method for the
Preparation of HMW DNA from Blood for RFLP Studies. Nucleic Acids
Research, 311: 158-61, 1991.
LAI, C. et al. The ApoA5 Locus is a Strong Determinant of Plasma
Triglyceride Concentrations Across Ethnic Groups in Singapore. Journal
of Lipid Research, 44: 2365-73, 2003
LAUDES, M. et al. Genetic Variants in Human Sterol Regulatory Element
Binding Protein-1c in Syndromes of Severe Insulin Resistance and Type
2 Diabetes. Diabetes, 53(3): 842-46, 2004.
LEÓN, N. et al. Mecanismo de Acción de las Proteínas que se Unen a los
Elementos Regulatorios de Esteroles (SREBPs) en la Biosíntese del
Colesterol y Ácidos Grasos. Revista de Investigação Clinica, 54(2): 145-53,
2002.
65
LIBBY, P. Current Concepts of the Acute Coronary Syndromes.
Circulation, 104 (3): 365-72, 2001.
LIBBY, P.; RIDKER, A.; MASERI, A. Inflammation and Atherosclerosis
Circulation; 105:1135-43, 2002
MACHADO, P.A.N.; SICHIERI, R. Relação Cintura-Quadril e Fatores de
Dieta em Adultos. Revista de Saúde Pública, 36: 198- 200, 2002.
MAGALHÃES, M. et al. Novas Perspectivas no Tratamento das
Dislipidemias. Revista da SOCERJ , 17 (2): 105-11, 2004.
MANO, R. Conceito de Dislipidemias. Disponível em:
<
www.manuaisdecardiologia.med.br > Acesso em: 17/05/07.
MARTÍNEZ, F. et al. El Colesterol es Esencial en el Desarrollo Embrionario
y en el Crecimiento Celular. Revista Faculdade Medicina - UNAM, 44 (4):
168-76, 2001.
MARTINEZ, T. Dislipidemias: da Teoria à Prática. Atheneu, São Paulo,
2004.
MARZZOCO, A.; TORRES, B. Bioquímica Básica. Guanabara Koogan, Rio
de Janeiro ,1999.
MATSUDA, M. et al. SREBP Cleavage-Activiting Protein (SCAP) is
Required for Increased Lipid Synthesis in Induced by Cholesterol
Deprivation and Insulin Elevation. Genes Dev., 15: 1206-16, 2001.
MELO, N. et al. Terapêutica de Reposição Hormonal e Doença
Cardiovascular. Disponível em:
<
http://www.vicnet.com.br/starfire/sobrac/6.htm> Acessado em 24/07/07.
MIERAS, M. El Colesterol: Una Molécula Entre la Vida y la Muerte. Real
Acad. Ciencias Zaragoza, 9: 50, 2004.
MINISTERIO DA SAÚDE – SIM (Sistema de Informações sobre Mortalidade).
Indicadores e Dados básicos de 2005. Disponível em:
<
http://portal.saude.com.br > Acessado em 18/05/2007.
MION, JR, D. et al. IV Diretrizes Brasileiras de Hipertensão Arterial.
Arquivos Brasileiros de Cardiologia, 82: 1-14, 2004
MONTGOMERY, R. et al. Biochemistry – A Case Oriented Approach. Stª.
Louis, Mosby, 1996.
NCEP – NACIONAL CHOLESTEROL EDUCATION PROGRAM. Executive
Summary of the Nacinal Cholesterol Education Program. Expert Panel
66
Treatment of High Blood on Detection, Evaluation and Cholesterol in
Adults. (Adult Treatment Panel III) Jama,285: 2486-96, 2001.
NOHTURFFT, A. et al. Topology of SREBP Cleavage-Activating Protein, a
Polytopic Membrane Protein with a Sterol Sensing Domain. J. Biol. Chem.,
273: 17243-50, 1998.
NOHTURFFT, A. et al. Sterol Regulate Cycling of SREBP Cleavage
Activating Protein (SCAP) Between Endoplasmic Reticulum and Golgi.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 11235-40, 1999.
ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE – OMS. Disponível em:
<
http://www.who.int/bmi/index.jsp?introPage=intro_3.html>. Acesso em
23/03/07.
OLIVIERI, O. Apo C-III Gene Polymorphisms and Risk of Coronary Artery
Disease. Journal of Lipids Research, 43: 1450- 57, 2002.
OSBORNE, T. CREating a SCAP-Less Liver Keeps SREBPs Pinned in the
ER Membrane and Prevents Increased Lipid Synthesis in Response to
Low Cholesterol and High Insulin. Genes & Development, 15: 1873-78,
2001.
RADHAKRISHNAN, A. et al. Direct Binding of Cholesterol to the Purified
Membrane Region of SCAP: Mechanism for a Sterol Sensing Domain.
Mol. Cell., 15: 259-68, 2004.
ROFF, D. ; BENTZEN, P. The Statistical Analysis of Mitochondrial DNA
Polymorphisms: x² and the Problem of Small Samples. Molec. Biol. Evol.,
6: 539-45, 1989.
REPA, J. et al. Regulation of Mouse Sterol Regulatory Element Binding
Protein – 1c gene (SREBF-1c) by Oxysterol Receptor, LXRα and LXRβ.
Genes Dev., 14: 2819-30, 2000.
SALEK, L. et al. Effects of SREBF-1a and SCAP Polymorphisms on
Plasma Levels of Lipids, Severity, Progression and Regression of
Coronary Atherosclerosis and Response to Therapy with Fluvastatin. J.
Mol. Med., 80(11): 737044, 2002.
SANTOS, R.D. III Diretrizes Brasileiras sobre Dislipidemias e Diretrizes de
Prevenção da Aterosclerose do Departamento de Aterosclerose da
Sociedade Brasileira de Cardiologia. Arq. Bras. Cardiol., 77: 4-44, 2001.
SEWTER, C. et al. Human Obesity and Type 2 Diabetes are Associated
with Alterations in SREBP1 Isoform Expression that are Reproduced ex
Vivo by Tumor Necrosis Factor-Alpha. Diabetes, 51: 1035-41, 2002.
67
SIMÃO, M. et al. Doenças Cardiovasculares: Perfil de Trabalhadores do
Sexo Masculino de uma Destilaria do Interior Paulista. Revista Eletrônica
de Enfermagem, 4:27 – 35, 2002. Disponível em <
http://www.fen.ufg.br>
Acessado em: 07/06/07.
SHIMANO, H. Sterol Regulatory Element Binding Protein Family as Global
Regulators of Lipid Synthetic Genes in Energy Metabolism. Elsevier
Science USA, 65: 167-94, 2002.
SHIMOMURA, I. et al. Decreased IRS-2 and Increased SREBP-1c Lead to
Mixed Insulin Resistence and Senditivity in Livers of Lipodystrophic and
ob/ob Mice. Mol. Cell., 6(1): 77-86, 2000.
SHIMOMURA, I. et al. Leptin Reverses Insulin Resistence and Diabetes
Mellitus in Mice with Congenital Lipodystrophy. Nature, 401: 73-6, 1999(a).
SHIMOMURA, I. et al. Increased Levels of Nuclear SREBP-1c Associated
with Fatty Livers in Two Mouse Models of Diabetes Mellitus. J. Biol.
Chem., 274: 30028-32, 1999(b).
SHIMOMURA, I. et al. Insulin Selectively Increases SREBP-1c mRNA in the
Livers of Rats with Streptozotocin-Induced Diabetes. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 96: 13656-61, 1999(c).
SCHULTZ, J. et al. Role of LXR in Control of Lipogenesis. Genes Dev., 14:
2831- 38, 2000.
STEINER, G. The use of Fibrates and Statins in Preventing
Atherosclerosis in Diabetes. Curr Opin Lipidol., 12: 611-17, 2001.
TABAS, I. Consequences of Cellular Cholesterol Accumutation: Basic
Concepts and Physiological Implications. J. Clin. Invest., 110(7): 905-11,
2002.
THIRD JOINT TASK FORCE OF EUROPEAN AND OTHER SOCIETIES ON
CARDIOVASCULAR DISEASE PREVENTION IN CLINICAL PRACTICE.
Executive Summary of European Guidelines on Cardiovascular Disease
Prevention in Clinical Practice. Eur. Heart J., 24: 1601-10, 2003.
TOBE, K. et al. Increased Expression of the Sterol Regulatory Element
Binding Protein-1 Gene in Insulin Receptor Substrate-2 (-/-) Mouse Liver.
J. Biol. Chem., 276(42): 38337040, 2001.
TOPOL, E. Intensive Statin Therapy – A Sea Change in Cardiovascular
Prevention. N. Engl. J. Med., 350: 1562-63, 2004.
68
THOT, J. et al. Selective Coactivator Interactions in Gene Activation by
SREBP-1a and SREBP-1c. Molecular and Cellular Biology, 24(18): 8288-300,
2004.
VERNIA, S. et al. A Rare Missense Mutation in a Type 2 Diabetes Patient
Decreases the Transcriptional Activity of Human Sterol Regulatory
Element Binding Protein-1. Human Mutation, 868, 2006.
WEBER, L. et al. Maintaining Cholesterol Homeostasis: Sterol Regulatory
Element Binding Proteins. World J. Gastroenterol., 10(21): 3081-87, 2004.
WILD, S. et al. Global Prevalence of Diabetes: Estimates for the Year 2000
and Projections for 2030. Diabetes Care, 27 (5): 1047-53, 2004.
WOUT, A. et al. Nef Induces Multiple Genes Involvided in Cholesterol
Sinthesis and Uptake in Human Immunodeficiency Virus Type I Infected T
cells. J. Virology, 79: 10053-8, 2005
YABE, D. et al. Liver Specific mRNA for Insig-2 Down-Regulated by
Insulin: Implications for Fatty Acid Synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
100: 3155-60, 2003.
YANG, T. et al. Crucial Step in Cholesterol Homeostasis: Sterol Promote
Binding of SCAP to Insig-1, a Membrane Protein that Facilitates Retention
of SREBPs in ER. Cell, 110: 489-500, 2002.
YOSHIKAWA, T. et al. Identification of Liver X Receptor/ Retinoid X
Receptor as an Activator of the Regulatory Element Binding Protein – 1c
Gene Promoter. Mol. Cell. Biol., 21: 2991 – 3000, 2001.
YU, P. et al. Hypolipidemic Therapy Under Special Conditions: Acquired
Imunedeficiency Syndrome. Arq. Bras. Cardiol., 85: 5, 2005.
69
ANEXO 1
CONSENTIMENTO PARA PARTICIPAÇAO DO PROJETO DE PESQUISA:
“Estudo de Freqüência do Polimorfismo G54C no Gene SREBF-1c (Sterol
Regulatory Element Binding Factor-1c) em Pacientes Dislipidêmicos”.
Objetivos do Estudo
As doenças do coração representam um problema de saúde pública no mundo.
Existem diversos fatores de risco responsáveis pelo aparecimento dessas doenças, os
quais podem ser divididos em imutáveis e mutáveis. Fatores imutáveis são aqueles que
não podemos mudar e, por isso, não podemos tratá-los, são eles: hereditariedade
(herança genética herdada de nossos pais), idade e sexo (homens têm maiores chances
de ter um ataque cardíaco). Os fatores mutáveis são aqueles sobre os quais podemos
influir, mudando, prevenindo ou tratando, são eles: fumo, colesterol elevado (HDL é o
bom colesterol e o LDL é o mau colesterol), pressão arterial elevada, dieta (ingestão de
alimentos gordurosos), vida sedentária (falta de exercícios físicos), obesidade (excesso
de peso) e estresse (tensão emocional). O colesterol elevado é um dos fatores de risco
mais importantes para o surgimento das doenças do coração e sua diminuição está
comprovadamente ligada a uma diminuição desse risco. O presente estudo tem como
objetivo conhecer uma região do seu material genético (DNA) que pode estar
influenciando o aparecimento de colesterol alto e, conseqüentemente, as doenças do
coração.
Procedimentos
Durante a visita ao consultório, algumas perguntas como idade, sexo,
escolaridade e dieta serão realizadas. Serão obtidas também medidas como peso, altura
e comprimento do quadril.
Após, será realizada uma coleta de sangue para dosar os níveis de colesterol e
realizar as análises genéticas. Outras duas coletas serão necessárias após 3 e 6 meses,
a partir dessa consulta. As consultas deverão ser devidamente marcadas.
Essas coletas serão feitas apenas para este estudo e em nada influenciarão o
tratamento. A coleta não vai causar nenhum problema, exceto o pequeno incômodo de
dor no momento da introdução da agulha para a retirada do sangue.
Riscos e Desconfortos:
Os riscos e desconfortos aos pacientes deste estudo são aqueles associados aos
procedimentos da coleta de sangue. Essa quantidade é pequena (10 mL) e, por isso,
dificilmente causará algum mal-estar geral (1 em cada 1000 pessoas), no entanto, poderá
haver dor no local da coleta e, eventualmente, um pequeno hematoma.
Benefícios:
Os benefícios da participação nesse estudo estão relacionados aos exames
oferecidos e ao acompanhado recebido para verificar as condições do coração paciente.
70
O paciente também estará contribuindo com informações fundamentais que ampliarão o
conhecimento da relação entre a hereditariedade e o medicamento usado no tratamento
da doença arterial coronariana.
Alternativa:
Se o paciente escolher não participar, não haverá nenhuma diferença, quanto ao
acompanhamento médico
.
Custos:
Não será cobrado algum pagamento pela participação no estudo.
Dúvidas:
Alguma dúvida referente ao estudo poderá ser esclarecida pela Dra.Nadine
Clausell, telefone: (51) 2101.8657 (Serviço de Cardiologia).
Confidencialidade:
Todas as informações e os resultados advindos dos procedimentos realizados
serão considerados confidenciais e serão conhecidos somente da equipe envolvida.
Todos os questionários e materiais coletados serão identificados através de um código
criado na entrada do estudo. Este código será a única identificação no banco de dados,
sendo utilizado para análise dos dados e divulgação dos mesmos no meio científico.
Participação voluntária:
Uma cópia desse documento será fornecida, caso desejar. Se houver desistência
em algum momento do estudo, nenhuma diferença quanto ao acompanhamento e
tratamento será observado.
Significado de sua assinatura:
A sua assinatura abaixo significa que você entendeu a informação que lhe foi
fornecida sobre o estudo e sobre o termo de consentimento. Se você assinar este
documento significa que você concorda em participar do mesmo.
_____________, _____ de ____________ de ______.
Nome completo:____________________________________________________
Endereço completo:_________________________________________________
Número do telefone:_________________________________________________
Assinatura do Paciente:______________________________________________
Data:_____________________________________________________________
Nome da Pessoa que obteve o consentimento:____________________________
Assinatura:________________________________________________________
ANEXO 2
“Estudo de Freqüência do Polimorfismo G54C no Gene SREBF-1c (Sterol
Regulatory Element Binding Factor-1c) em Pacientes Dislipidêmicos”.
PROTOCOLO DE COLETA DE DADOS
NOTA: Toda informação foi mantida sob estrita confidencialidade. Este
questionário foi armazenado em arquivos fechados. Seu número de identificação
foi à única conexão à informação coletada.
Secretaria da Saúde do Estado do Rio Grande do Sul
Hospital de Clínicas de Porto Alegre
Serviço de Cardiologia
Ambulatório de Dislipidemia
Ficha de Avaliação de Pacientes
Identificação do paciente
Caso
nº: Registro do HCPA: Data da primeira avaliação:
/ /
Nome:
Cartão SUS:
Processo SES:
Data de nascimento: / / Sexo: [1] Mas [2] Fem Cor:
[1] branco [2] negro [3] amarelo [4] pardo [5] outro
Estado Civil:
[1] solteiro [2] casado [3] separado/divorciado [4] viúvo [5] outro Profissão:
Endereço Residencial:
Bairro:
Cidade: CEP: -
Telefone Residencial: Telefone Celular: Telefone recados:
Origem do paciente: [1] SMS [2] SES [3] encaminhamento interno: [4] outro:
História Clínica
1. O paciente sabe ter dislipidemia? [1] sim [2] não (pule para pergunta 10)
2. Em caso afirmativo, como soube?
[1] médico
[2] enfermeiro
[3] banco de sangue
[4] rastreamento
[5] acha ter
[6] outro ____________
[7] não lembra
[8] não se aplica
3. Sabe qual tipo de dislipidemia tem? [1] sim [2] não (pule para pergunta 5)
4. Qual o tipo?
[1] hipercolesterolemia
[2] hipertrigliceridemia
[3] mista
[4] outra
[8] não se aplica
5. Desde quando sabe ter dislipidemia?
[1] menos de 1 ano [2] entre 1 e 3 anos [3] entre 3 e 5 anos [4] entre 5 e 10 anos
[5] entre 10 e 20 anos [6] mais de 20 anos [7] não lembra [8] não se aplica
6. Está usando medicamentos para dislipidemia? [1] sim [2] não Em caso afirmativo, quais?
nome comercial nome farmacológico Forma farmacêutica Concentração dose intervalo de dose Data início
1
2
3
7. Já fez uso de medicamentos para dislipidemia no passado? [1] sim [2] não Em caso afirmativo, quais?
nome comercial nome farmacológico dose diária data início data fim motivo interrupção
1
2
3
Motivos para interrupção [1] falha [2] efeito adverso (descrever) [3] médico mandou parar [4] achou que estava curado [5] custo [6] outro (descrever) [7] não lembra
8. Houve recomendação de tratamento não-farmacológico? [1] sim [2] não Em caso afirmativo, preencha o quadro abaixo
Recomendação Segue? Recomendação Segue? Recomendação Segue? Recomendação Segue?
[1] sim [2] não [1] sim [2] não [1] sim [2] não [1] sim [2] não
[1] sim [2] não [1] sim [2] não [1] sim [2] não [1] sim [2] não
[1] suspender tabagismo
[2] perda de peso
[3] reduzir ingesta de gorduras
saturadas
[4] aumentar ingesta de frutas e
verduras
[5] realizar exercícios físicos
[6] diminuir ovo
[7] diminuir leite integral
[8] reduzir ingesta de bebidas
alcoólicas
[9] reduzir ingesta de sal
[10] parar anticoncepcional
[11] orientações por nutricionista
[12] outras__________________
9. Usa ou usou tratamentos alternativos para dislipidemia? [1] sim [2] não Em caso afirmativo, quais?
[1] homeopatia [2] berinjela (forma____________) [3] chás ___________________ [8] não se aplica
10. Fuma? [1] sim [2] não fuma mas fumou ____ cigarros por dia por ____ anos e parou há ____ anos [3] nunca fumou (pule para pergunta 12)
11. Preencha a tabela:
tipo idade de início continua / idade de término nº de cigarros (unidades) por dia Grau de confiabilidade*
[1] cigarro com filtro;
[2] cigarro sem filtro
[3] palheiro
[4] charuto
[5] cachimbo
[6] outro _____________________
*Grau de confiabilidade: [1] excelente [2] bom [3] regular [4] ruim
12. Costuma tomar bebidas alcoólicas? [1] sim [2] não bebe mas bebeu [3] nunca bebeu (pule para pergunta 14)
13. Preencha a tabela:
14. Apresenta outras doenças diagnosticadas? [1] sim [2] não Em caso afirmativo, quais?
[1] diabete melito
[2] hipotireoidismo
[3] hipertireoidismo
[4] HAS
[5] cardiopatia isquêmica
[6] insuficiência cardíaca
[7] arritmia ____________________
[8] valvulopatia ________________
[9] depressão
[10] miopatia
[11] hepatopatia
[12] insuficiência renal
[13] imunodeficiência ____________
[14] outra ____________________
[88] não se aplica
15. Apresenta dispnéia? [1] sim [2] não (pule para pergunta 18)
tipo idade de início continua / idade de término unidade nº de unidades por semana
Grau de confiabilidade
Tipos: [1] cerveja; [2] cachaça; [3] vinho; [4] conhaque; [5] uísque; [6]0 outra
Unidades: [1] martelo (100 ml); [2] copo comum (250 ml); [3] cálice (100 ml); [4] dose (60 ml); [5] garrafa (600 ml); [6] lata (350 ml)
Grau de confiabilidade: [1] excelente [2] bom [3] regular [4] ruim
16. Qual é a relação da dispnéia com os esforços?
[1] ocorre aos grandes esforços
[2] ocorre aos médios esforços
[3] ocorre aos pequenos esforços
[4] ocorre ao deitar
[5] melhora com esforço
[6] não tem relação com esforços
[7] ocorre em crises paroxísticas
[8] não se aplica
17. Se a dispnéia tem relação com esforços:
[1] tem piorado progressivamente [2] tem melhorado progressivamente [3] não tem se alterado [8] não se aplica
18. Apresenta dor ou desconforto no peito? [1] sim [2] não (pule para pergunta 23)
19. Qual é a relação da dor/desconforto com os esforços?
[1] ocorre aos grandes esforços
[2] ocorre aos médios esforços
[3] ocorre aos pequenos esforços
[4] ocorre ao deitar
[5] melhora com esforço
[6] não tem relação com esforços
[7] ocorre em crises paroxísticas
[8] não se aplica
20. Se a dor tem relação com esforços, ao suspender o esforço ela:
[1] alivia em menos de 5 minutos
[2] alivia entre 5 e 10 minutos
[3] alivia após 10 minutos
[4] não alivia
[8] não se aplica
21. A dor é desencadeada por algum das seguintes situações?
[1] emoções
[2] nervosismo
[3] refeição
[4] deitar
[5] tossir
[6] respirar
[7] frio
[8] repouso
[9] outro _______________
[88] não se aplica
22. Qual é a localização da dor?
[1] esterno médio e
superior
[2] esterno inferior
[3] ace anterior do tórax
[4] MSE
[5] sobre o coração
[6] mal localizada
[7] outro _______________
[8] não se aplica
23. Apresenta dor nos membros inferiores? [1] sim [2] não (pule para pergunta 28)
24. Qual a localização da dor?
[1] panturrilha [2] pré-tibial [3] outra ___________________ [8] não se aplica
25. Qual é a relação da dor com caminhar rápido ou subir uma escada?
[1] é desencadeada por
[2] alivia
[3] não tem relação
[4] outro
[8] não se aplica
26. O que ocorre com a dor se continuar caminhando?
[1] piora [2] alivia [3] não modifica [8] não se aplica
27. O que ocorre com a dor se parar de caminhar?
[1] alivia em menos de 5 minutos
[2] alivia entre 5 e 10 minutos
[3] alivia após 10 minutos
[4] não alivia
[8] não se aplica
28. Tem palpitações? [1] sim [2] não (pule para pergunta 30)
29. As palpitações ocorrem:
[1] aos esforços
[2] em repouso
[3] em crises paroxísticas
[4] outro ______________
[5] sem correlação evidenciada
[8] não se aplica
30. Há queixas potencialmente atribuíveis a problema neurológico?
[1] não
[2] diminuição de força
[3] alterações da sensibilidade
[4] alterações da marcha
[5] tremor de extremidades
[6] alterações da memória recente
[7] alterações da memória remota
[8] outros__________________
31. Doenças na família biológica: (caso afirmativo, registrar a idade de início da doença)
Doença Parentesco Idade Doença Parentesco Idade
32. Pratica alguma atividade física regularmente?
[1] não
[2] sim, aeróbia
[3] sim, anaeróbia
[4] sim, aeróbia e anaeróbia
[5] tem atividade física associada ao trabalho
[6] outra ______________________________
33. Duração e periodicidade da atividade física: _____ minutos, ______ vezes por semana
34. Que outras queixas o paciente refere ter?
[1] nenhuma
[2] cefaléia
[3] ansiedade
[4] insônia
[5] constipação
[6] diarréia
[7] dispepsia
[8] deficiência visual
[9] deficiência auditiva
[10] problemas sexuais
[11] dor osteoarticular
[12] anorexia
[13] cansaço
[14] obstrução nasal
[15] tosse
[16] alergia ____________________________
[17] problemas dermatológicos ____________
[18] problemas ginecológicos______________
[19] outro______________________________
35. Que medicamentos usa além dos descritos para dislipidemia?
nome comercial nome farmacológico Forma farmacêutica
Concentração dose intervalo de dose Data início prescrito?
1
[1] sim [2] não
2
[1] sim [2] não
3
[1] sim [2] não
4
[1] sim [2] não
5
[1] sim [2] não
6
[1] sim [2] não
7
[1] sim [2] não
36. Faz uso de outros tratamentos alternativos como homeopatia, chás ou espiritismo? [1] sim [2] não Em caso afirmativo, citar:
[1] __________________________________________________________________
[2] __________________________________________________________________
[3] __________________________________________________________________
[4] __________________________________________________________________
[5] __________________________________________________________________
[6] __________________________________________________________________
Se o paciente for do sexo masculino, pule para questão 43
37. Já esteve grávida? [1] sim [2] não
38. Gestações: ______ Partos normais: ________ Partos Cesáreos: ________ Abortos espontâneos: _______ Abortos provocados: _______
39. Faz uso de métodos anticoncepcionais? [1] sim [2] não
40. Qual(s) método(s) está usando?
[1] preservativo masculino
[2] preservativo feminino
[3] DIU
[4] diafragma
[5] ligadura tubária
[6] vasectomia
[7] método hormonal ____________
[8] não se aplica
41. Já usou outro método? [1] sim [2] não Qual (is)? _____,_____,_____,_____
42. Se usa ou usou método hormonal (Anticoncepcional ou Terapia de Reposição Hormonal), preencha o quadro:
nome comercial nome farmacológico Forma farmacêutica data de início data de término
1
2
3
43. Paciente estudou? [1] sim [2] não
44. Qual a maior titulação / graduação?
[1] sabe assinar
[2] primeiro grau incompleto ( até ___________)
[3] primeiro grau completo
[4] segundo grau incompleto (até__________)
[5] segundo grau completo
[6] terceiro grau incompleto (faculdade __________ )
[7] terceiro grau completo (faculdade ___________)
[8] pós-graduação (nível __________)
45. A principal fonte de renda é:
[1] empregador
[2] assalariado empresa particular
[3] empregado público
[4] autônomo
[5] empresário ________________
[6] aposentado
[7] outro ____________________
46. A renda familiar média estimada em salários mínimos é:
[1] menos de 1
[2] entre 1 e 3
[3] entre 3 e 5
[4] entre 5 e 10
[5] entre 10 e 20
[6] entre 20 e 50
[7] mais de 50
47. Tem algum plano de saúde complementar?
[1] Não [2] sim _______________________
Exame Físico
48. Pressão arterial
[1] PA1: ________/________
[2] PA2: ________/________
[3] média das aferições: ________/________
49. Freqüência cardíaca: __________
50. Peso: ___________ kg 51. Altura: ___________ m
52. Circunferência braquial:
__________ cm
53. Quadril: __________ cm
54. Cintura: __________cm
55. Palpação do íctus cordis:
[1] impalpável
[2] palpável normal
[3] impulsão pré-sistólica
[4] impulsivo
[5] palpável em decúbito
lateral E
56. Extensão do íctus cordis: ________ cm
57. Posição do ictus cordis:
[1] LHC
[2] entre LHC e LAA
[3] LAA
[4] outro ________
[5] 4º espaço intercostal
[6] 5º espaço intercostal
[7] 6º espaço intercostal
[8] outro ________
58. Há impulsão para-esternal esquerda? [1] sim [2] não
59. Os pulsos carotídeos são:
[1] normais
[2] com ascenção lenta
[3] com ascenção e queda rápidas
[4] diminuído a direita
[5] diminuído a esquerda
[6] diminuídos bilateralmente
60. Há sopros carotídeos?
[1] não [2] sim à direita [3] sim à esquerda [4] sim bilateral
61. Há sopros no precórdio?
[1] não
[2] em área de VE
[3] em área aórtica
[4] em área de VD
[5] em área pulmonar
62. Graduação do sopro precordial:
[1] grau I
[2] grau II
[3] grau III
[4] grau IV
[5] grau V
[6] grau VI
[8] não se aplica
63. Bulhas acessórias:
[1] nenhuma [2] B4 [3] B3 [4] B4 e B3
64. A segunda bulha é:
[1] normal [2] hipofonética [3] hiperfonética
65. O ritmo cardíaco é:
[1] regular [2] irregular, sugere extrassístole [3] irregular, sugere fibrilação [4] irregular inespecífico
66. Há turgência jugular a 45º? [1] sim [2] não
67. Há edema de membros inferiores?
[1] não [2] em tornozelo [3] pré-tibial [4] até joelho [5] até coxa
68. A tireóide é: [1] impalpável [2] palpável normal [3] palpável aumentada
69. Há xantelasma? [1] sim [2] não
70. Há xantomas?
[1] não [2] em artic. metacarpofalangiana [3] no tendão de aquiles [4] no cotovelo
[5] outra localização ___________________________________
71. Há arco córneo [1] sim [2] não
72. Anormalidades na semiologia respiratória:
[1] não há anormalidades
[2] aumento do diâmetro AP
[3] diminuição difusa do MV
[4] diminuição do MV a direita
[5] diminuição do MV a esquerda
[6] sibilos
[7] roncos
[8] estertores
[9] outra_________________
73. Há massas palpáveis no abdômen?
[1] não
[2] sim, rins
[3] sim, fígado
[4] sim, baço
[5] sim,
outro____________
74. A aorta é palpável no abdômen?
[1] não [2] sim, aparentemente
normal
[3] sim, parece dilatada
75. Há sopros no abdômen?
[1] não
[2] sim, em art. renal D
[3] sim, em art. renal E
[4] sim, sobre aorta
[5] sim, sobre ilíacas
[6] sim, outra_____________
76. Pulsos periféricos:
[1] radial _______
[2] braquial _______
[3] femoral _______
[4] poplíteo _______
[5] tibial posterior _______
[6] pedioso _______
[1] normais; [2] ausente a D; [3] ausente a E; [4] ausente bilateral; [5] diminuído a D; [6] diminuído a E; [7] diminuído bilateral; [8] com sopro (femural)
77. Anormalidades no exame neurológico:
[1] não há alteração
[2] hemiplegia E
[3] hemiplegia D
[4] hemiparesia E
[5] hemiparesia D
[6] alterações sensibilidade
[7] distúrbio do equilíbrio
[8] afasia / disfasia
[9] outro_______________
Exames Complementares – Data:____/____/____
78. Colesterol total ________ 79. HDL ________ 80. triglicerídeos ________ 81. LDL (calculado) ________
LDL = Ct – HDL – tg/5
82. Glicemia ________
83. Creatinina ________
84. Sódio: ____________
85. Potássio ________
86. TGO: _______
87. TGP: _______
88. GGT: _______
89. ácido úrico: _________
90. TSH: _________
91. CK total: __________
92. Anormalidades ao ECG
[1] sem alterações
[2] sinais de sobrecarga ventricular esquerda
[3] ondas Q patológicas em parede septal
[4] ondas Q patológicas em parede anterior
[5] ondas Q patológicas em parede lateral
[6] ondas Q patológicas em parede inferior
[7] bloqueio de ramo direito
[8] bloqueio de ramo esquerdo
[9] hemibloqueio esquerdo
[10] bloqueio AV I grau
[11] bloqueio AV II grau tipo 1
[12] bloqueio AV II grau tipo 2
[13] bloqueio AV total
[14] ritmo de marcapasso
[15] outra _________________
93. Anormalidades ao Ecocardiograma
[1] Aorta: ___
[2] AE: ___
[3] VEd: ___
[4] VÊS: ___
[5] PP: ___
[6] Septo: __-
[7] VD: ___
[8] Sem alterações
[9] Disfunção ventricular diastólica tipo 1
[10] Disfunção ventricular diastólica tipo 2
[11] Disfunção ventricular diastólica tipo 3
[12] Disfunção ventricular sistólica difusa
[13] Disfunção ventricular sistólica septal
[14] Disfunção ventricular sistólica anterior
[15] Disfunção ventricular sistólica lateral
[16] Disfunção ventricular sistólica inferior
[17] Acinesia septal
[18] Acinesia anterior
[19] Acinesia lateral
[20] Acinesia inferior
[21] Discinesia
[22] Outra: _________________________________
94. Outros exames realizados:
[1] __________________________________________________________________
[2] __________________________________________________________________
[3] __________________________________________________________________
[4] __________________________________________________________________
[5] __________________________________________________________________
[6] __________________________________________________________________
Diagnósticos Estabelecidos na Avaliação Inicial
Data do diagnóstico Data do diagnóstico
95. Diagnósticos:
[1] __________________________________Compensado [sim] [não] ___/___/___
[2] __________________________________Compensado [sim] [não] ___/___/___
[3] __________________________________Compensado [sim] [não] ___/___/___
[4] __________________________________Compensado [sim] [não] ___/___/___
[5] __________________________________Compensado [sim] [não] ___/___/___
[6] __________________________________Compensado [sim] [não] ___/___/___
Conduta Após Avaliação Inicial
96. Plano inicial:
[1] alta ambulatorial
[2] solicitados exames e retorno em ___________________
[3] orientação de medidas não-farmacológicas e retorno em ____ meses
[4] manter tratamento em uso e retorno em ___ meses
[5] iniciar tratamento farmacológico e retorno em ___ meses
[6] encaminhamento a outro ambulatório
[7] encaminhamento a nutricionista
[8] encaminhamento a farmacêutica
[9] randomização para:
a) atendimento multiprofissional
b) atendimento médico exclusivo
97. Orientação não-farmacológica realizada: suspender tabagismo
[1] perda de peso
[2] reduzir ingesta de gorduras saturadas
[3] aumentar ingesta de frutas e verduras
[4] realizar exercícios físicos
[5] diminuir ovo
[6] diminuir leite integral
[7] reduzir ingesta de bebidas alcoólicas
[8] reduzir ingesta de sal
[9] parar anticoncepcional
[10] orientação por nutricionista
[11] outras___________________
[12] não se aplica
98. Tratamento farmacológico iniciado:
nome comercial nome farmacológico
Forma
farmacêutica concentração dose intervalo de dose
SUS?
1
[1] não [2] SMS [3]
SES
2
[1] não [2] SMS [3]
SES
3
[1] não [2] SMS [3]
SES
4
[1] não [2] SMS [3]
SES
5
[1] não [2] SMS [3]
SES
99. Tratamento farmacológico finalizado:
nome comercial nome farmacológico
Forma
farmacêutica
concentração dose intervalo de dose
motivo
1
2
3
4
5
100. Observações
101. Data prevista para retorno: _______/_______/_______
102. Responsável pela coleta dos dados básicos: ________________________________________________
ANEXO 3
“Estudo de Freqüência do Polimorfismo G54C no Gene SREBF-1c (Sterol
Regulatory Element Binding Factor-1c) em Pacientes Dislipidêmicos”.
Número de controle:______________________________________________
Número do paciente no HCPA:______________________________________
NOTA: Toda informação será mantida sob estrita confidencialidade. Este
questionário será armazenado em arquivos fechados. Seu número de
identificação será a única conexão à informação coletada.
FICHA DE BIOLOGIA MOLECULAR
Gene
Genótipo Sim Não
GG
SREBF-1c GC
CC
Observação:_______________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
Livros Grátis
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