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Universidade Federal da Bahia
Escola de Medicina Veterinária
Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos
AVALIAÇÃO DO SÊMEN DE CAPRINOS DA
RAÇA BÖER POR MEIO DO TESTE
HIPOSMÓTICO
SIDNEY GONÇALVES GONZALEZ ALVES
Salvador – Bahia
2006
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ii
SIDNEY GONÇALVES GONZALEZ ALVES
AVALIAÇÃO DO SÊMEN DE CAPRINOS DA RAÇA BÖER POR MEIO DO TESTE
HIPOSMÓTICO
Dissertação apresentada à Escola de Medicina
Veterinária da Universidade Federal da Bahia,
como requisito para obtenção do título de
Mestre em Ciência Animal nos Trópicos, na
área de Reprodução Animal.
Orientador: Prof. Dr. Marcos Chalhoub Coelho Lima
Salvador – Bahia
2006
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iii
AVALIAÇÃO DO SÊMEN DE CAPRINOS DA RAÇA BÖER POR MEIO DO TESTE
HIPOSMÓTICO
SIDNEY GONÇALVES GONZALEZ ALVES
Dissertação defendida e aprovada para obtenção do grau de Mestre em Ciência Animal nos
Trópicos.
Salvador, 24 de outubro de 2006.
Comissão Examinadora:
Prof. Dr. Marcos Chalhoub Coelho Lima - UFBA
Orientador
Dr. Jeferson Ferreira da Fonseca – EMBRAPA CAPRINOS
Prof. Dr. Antonio de Lisboa Ribeiro Filho - UFBA
iv
Dedico esta dissertação a memória de meus
avós Manoel Reinaldo Alves, Albino
Gonzalez Martinez, Hildete Conceição
Gonçalves Gonzalez e a minha avó Maria de
Lourdes Assis Alves;
Aos meus pais José Carlos Assis Alves e
Jacira G. G. Alves;
A minha irmã Bianca G. G. Alves;
E todas as pessoas que se fizeram especiais
nos mais diversos momentos de minha vida.
v
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus e a seu filho Jesus Cristo.
Agradeço a José Carlos Assis Alves, meu Pai, a minha Mãe, Jacira Gonçalves Gonzalez Alves
e a minha irmã Bianca, por fazerem parte de minha vida.
Ao meu orientador Dr. Marcos Chalhoub Coelho Lima, pela paciência, ensinamentos e
disponibilidade. Pelo privilégio de ter sido seu aluno e por admirar seu trabalho em prol da
Medicina Veterinária.
Ao sempre presente professor e amigo Dr. Antonio de Lisboa Ribeiro Filho por todos os
momentos e ensinamentos.
Agradeço a amizade e o companheirismo de meus colegas de curso que se fizeram e se farão
presentes por toda a minha vida. Em especial aos mais próximos como Alexandre Augusto,
Ana Karine, Ana Paula Portela, Carmo Biscarde, Daniela Freitas, Marta Vasconcelos e Raul
Santana.
A meu amigo e irmão Rodrigo Freitas Bittencourt (Rodrigão), pela confiança, pela presença
constante nesses anos de universidade e principalmente pelos inúmeros momentos de
descontração compartilhados.
Aos professores da Escola de Medicina Veterinária da UFBA, especialmente professor José
Resende, por seus ensinamentos que ajudaram a compor muito do pouco que sei.
Agradeço aos meus amigos e irmãos da “Gbraz” que a muito fazem parte de minha vida e
com os quais já dividi vários momentos, sejam de alegria ou de tristeza, mas com certeza os
momentos de alegria foram e serão os mais freqüentes.
Agradeço a todos que de maneira direta ou indireta ajudaram-me a transpor mais esse degrau
de minha vida e que vocês se mostrem presentes e continuem a auxiliar-me na minha carreira
profissional.
E por fim, agradeço aos Animais por tudo o que são e representam.
vi
"Só quando se vêem os próprios erros
através de uma lente de aumento e se faz
exatamente o contrário com os erros dos
outros, é que se pode chegar à justa
avaliação de uns e de outros.”
(Mohandas Karamchand Gandhi)
vii
ÍNDICE
LISTA DE TABELAS ix
LISTA DE FIGURAS x
LISTA DE ABREVIATURAS xi
RESUMO xii
SUMMARY
xiii
1. INTRODUÇÃO GERAL 1
2. REVISÃO DE LITERATURA 3
2.1 O espermatozóide e seu metabolismo 3
2.2 A membrana espermática 6
2.3 O teste hiposmótico (HOST) 8
2.3.1 Soluções hiposmóticas e osmolaridade 11
2.3.2 Tempo de incubação e fixação com formol-salina tamponada 14
3. EXPERIMENTO I: O teste hiposmótico na avaliação do sêmen in natura
de caprinos da raça Böer: Efeito da solução,
osmolaridade e tempo de incubação
Resumo 16
Abstract
16
3.1
Introdução 17
3.2 Material e métodos 18
3.2.1 Os locais e animais experimentais 18
3.2.2 Colheita e avaliação seminal 18
3.2.3 O teste hiposmótico 19
3.2.4 Delineamento experimental 22
3.3 Resultados e discussão 23
3.3.1 Características do sêmen in natura 23
3.3.2 Determinação da osmolaridade 24
3.3.3 Avaliação da solução e tempo de incubação 27
3.3.4 Repetibilidade intra-ensaio 28
3.4 Conclusões 29
3.5 Referências bibliográficas 29
4. EXPERIMENTO II: Influência da solução e da osmolaridade sobre os
resultados do teste hiposmótico na avaliação do sêmen
congelado de caprinos da raça Böer
Resumo 33
Abstract
33
4.1
Introdução 34
4.2
Material e métodos 35
viii
4.2.1 Local e animais experimentais 35
4.2.2 Congelação do sêmen 35
4.2.3 Descongelação e avaliação seminal 36
4.2.4 O teste hiposmótico 37
4.2.5 Delineamento experimental 38
4.3
Resultados e discussão 38
4.3.1 Características do sêmen descongelado 38
4.3.2 Avaliação da solução e osmolaridade 40
4.4
Conclusões 43
4.5
Referências bibliográficas 43
5.
CONSIDERAÇÕES FINAIS 47
6.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS GERAIS
49
APÊNCIDE
57
ix
LISTA DE TABELAS
Experimento I: O teste hiposmótico na avaliação do sêmen in natura de caprinos da
raça Böer: Efeito da solução, osmolaridade e tempo de incubação.
Tabela 3.1
Características físicas do sêmen in natura (
X
± s).
23
Tabela 3.2
Alterações morfológicas no sêmen in natura (
X
± s).
24
Classificação dos espermatozóides quanto à morfologia no sêmen Tabela 3.3
in natura.
24
Percentual de reação dos espermatozóides caprinos ao teste Tabela 3.4
hiposmótico em diferentes soluções (
X
± s).
25
Percentual de reação dos espermatozóides caprinos ao teste hiposmótico Tabela 3.5
em diferentes soluções e tempos de incubação (
X
± s).
27
Tabela 3.6 Variabilidade intra-ensaio do teste hiposmótico de cada ejaculado. 28
Experimento II: Influência da solução e da osmolaridade sobre os resultados do teste
hiposmótico na avaliação do sêmen congelado de caprinos da raça Böer.
Tabela 4.1
Características físicas do sêmen descongelado (
X
± s)
39
Tabela 4.2
Alterações morfológicas no sêmen descongelado (
X
± s)
39
Classificação dos espermatozóides quanto à morfologia no sêmen Tabela 4.3
descongelado
40
Percentual de reação dos espermatozóides caprinos ao teste
Tabela 4.4
hiposmótico em diferentes soluções e osmolaridades (
X
± s)
41
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1 O espermatozóide e suas estruturas internas. 3
Representação diagramática da membrana plasmática e sua estrutura de Figura 2.2
“mosaico fluido”.
7
Representação gráfica dos possíveis dobramentos observados na cauda Figura 2.3
de espermatozóides submetidos ao teste hiposmótico.
9
Porcentagem de alterações observadas no teste hiposmótico conforme Figura 3.1
região da cauda do espermatozóide caprino.
26
Algumas variações de reações hiposmóticas, classificadas como cauda
fortemente enrolada, apresentadas pelos espermatozóides caprinos
Figura 4.1
descongelados. 42
xi
LISTA DE ABREVIATURAS
AD - Água destilada
CAB - Cabeça do espermatozóide
CBRA - Colégio Brasileiro de Reprodução Animal
CDFA - Diacetato de carboxifluoresceína
CG - Cauda geral
CIT - Solução de Citrato de sódio
CLO - Solução de Cloreto de sódio
COBEA - Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
CONC - Concentração espermática
FCIT - Solução de Frutose + Citrato de sódio
FRU - Solução de Frutose
FST - Formol-salina tamponada
GCD - Gota citoplasmática distal
GCP - Gota citoplasmática proximal
HO - Hiposmótico(a)
HOST - Teste hiposmótico (Hypoosmotic swelling test)
IA - Inseminação artificial
IP - Iodeto de propídio
MP - Motilidade progressiva
MT - Motilidade total
PI - Peça intermediária da cauda do espermatozóide
PP - Peça principal da cauda do espermatozóide
PT - Peça terminal da cauda do espermatozóide
SAC - Solução de Sacarose
SPSS - Statistical Package for the Social Sciences (Pacote Estatistico para Ciências
Sociais)
TURB - turbilhão ou movimento de massa
VIG - vigor espermático
VOL - volume
xii
ALVES, S.G.G. Avaliação do sêmen de caprinos da raça Böer por meio do teste
hiposmótico. Salvador, Bahia, 2006. 79f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal dos
Trópicos) - Escola de Medicina Veterinária, Universidade Federal da Bahia, 2006.
RESUMO
O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de diferentes fatores sobre os resultados do teste
hiposmótico (HOST) para o sêmen in natura e congelado de caprinos da raça Böer. O
primeiro experimento testou o efeito do tipo de solução, da osmolaridade e do tempo de
incubação a 37°C sobre o percentual de reação hiposmótica do espermatozóide caprino in
natura, especificamente de machos da raça Böer, e a repetibilidade na leitura desta reação.
Para tal, utilizaram-se 24 ejaculados, divididos em três etapas, provenientes de cinco
reprodutores. Para o HOST, foram utilizadas uma solução de água destilada (0mOsmol/Kg),
duas soluções de açúcar, duas de eletrólitos e uma associação de açúcar-eletrólito, estas cinco
últimas, em quatro diferentes osmolaridades: 50, 100, 150 e 200mOsmol/Kg H
2
O.
Observaram-se neste primeiro experimento, resultados mais expressivos (82,30±4,49%)
utilizando eletrólitos, sendo sugerida a solução de citrato de sódio a 50mOsmol/Kg H
2
O,
incubada por 15 minutos a 37ºC, com uma repetibilidade na leitura de 4,26±1,68%, para a
realização do HOST no sêmen in natura de caprinos da raça Böer. O segundo experimento
testou o efeito da solução e da osmolaridade nos resultados do HOST para o sêmen caprino
congelado. Utilizaram-se, para tal, 12 doses de sêmen, provenientes de dois reprodutores da
raça Bôer, incubadas em seis soluções, sendo uma de água destilada (0mOsmol/Kg), duas
soluções de açúcar, duas de eletrólitos e uma associação de açúcar-eletrólito, estas cinco
últimas, em três diferentes osmolaridades: 50, 100, 150mOsmol/Kg H
2
O. A acentuada
diferença osmótica entre o espermatozóide e a água destilada proporcionou à osmolaridade de
0mOsmol/Kg uma média de reação hiposmótica (56,42%) superior (P<0,05) às osmolaridades
de 100 e 150mOsmol/Kg H
2
O, as quais apresentaram médias de 52,00% e 50,18%
respectivamente. Os resultados observados, neste segundo experimento, e a facilidade de
obtenção, apontam a água destilada como uma possibilidade de solução para realização o
HOST (15 minutos de incubação a 37°C) no sêmen congelado de caprinos da raça Böer.
PALAVRAS-CHAVE: Caprino; sêmen; teste hiposmótico; osmolaridade; Böer.
xiii
ALVES, S.G.G. The hypoosmotic swelling test in goat semen of the Boer breed. Salvador,
Bahia, 2006. 79f. Dissertation (Master’s Degree in Animal Science of the Tropics) - School of
Veterinary Medicine, Federal University of Bahia, 2006.
SUMMARY
The aim this study was to evaluate the effect of different factors on the results of hypoosmotic
swelling test (HOST) in fresh and frozen goat semen of the Boer breed. In the first
experiment, twenty-four ejaculated were used, of five male goats, for tested of evaluate the
influence of solution, osmolarity and incubation time at 37°C on the percentile of
hypoosmotic reaction of goat spermatozoid, specifically of the Boer breed, and to verify the
intra-assay variability of the HOST. Were used solutions of distilled water, two solutions of
sugar, two electrolytes and an association of sugar-electrolyte. The omolarity of the solutions
varied from 50 to 200, at 50mOsmol/Kg H
2
O increments. The distilled water (0mOsmol/Kg)
was used also as solution. It was observed, in this first experiment, better results using
electrolytes. In this first experiment, the sodium citrate solution 50mOsmol/Kg H
2
O,
incubated by 15 minutes, with low intra-assay variability of 4.26%±1.68, was the suggested
solution for Boer goat HOST. The second experiment tested the membrane integrity frozen
goat sperm using the HOST and compare different solutions in frozen semen. The parameters
of total and progressive motility and mass movement of twelve semen samples were evaluated
post-thaw and incubated, for 15min/37ºC, in six different solutions: distilled water
(0mOsmol/Kg), two sugars, two electrolytes and sugar-electrolyte association, these five last
in three different osmolarities (50, 100 and 150mOsmol/Kg H
2
O). The elevated osmotic
difference between the spermatozoa and distilled water provided to 0mOsmol/Kg osmolarity
an average superior reaction (56.42%) to 100 and 150mOsmol/Kg H
2
O osmolarities (P<0.05),
which presented averages of 52.00% and 50.18% respectively. The distilled water, based on
the observed results, in this second experiment, and in the acquisition easiness, was the
suggested solution to HOST (15min/37°C) in the frozen goat semen of Boer breed, with 56%
of sperm exhibiting HOST percentage.
KEY-WORDS: Goat; semen; hypoosmotic swelling test; osmolarity; Boer breed.
1
1. INTRODUÇÃO GERAL
A caprinocultura é uma atividade econômica explorada em todos os continentes, estando
presente em áreas sob as mais diversas características edafoclimáticas. Entretanto, somente
em alguns países esta atividade apresenta expressão econômica, sendo, na maioria dos casos,
desenvolvida de forma empírica e extensiva, com baixos níveis de tecnologia (LEITE, 2000).
Segundo dados de MACHADO e SIMPLÍCIO (1995) a baixa oferta e o uso irregular de
machos caprinos elege a inseminação artificial (IA) como um importante instrumento na
difusão de características genéticas e fenotípicas consideradas essenciais no melhoramento do
rebanho caprino nacional. Isto se torna possível porque poucos machos, altamente
selecionados, podem, por meio da IA, inseminar milhares de fêmeas por ano (NUNES, 2001 e
FOOTE, 2002). Entretanto, os processos de colheita e manipulação do sêmen, também podem
acarretar alterações deletérias à membrana plasmática do espermatozóide, comprometendo a
capacidade fertilizante do ejaculado. Afinal, o espermatozóide é uma célula complexa que se
torna infértil quando um dos vários aspectos bioquímicos ou morfológicos é afetado (MELO,
1999).
O método tradicional para estimar essa capacidade de fertilização é a avaliação subjetiva da
motilidade espermática. Segundo GARNER e HAFEZ (2003), a motilidade espermática por si
só, não é um método totalmente seguro para predizer a real capacidade fertilizante do
reprodutor, pois espermatozóides móveis podem apresentar alterações na membrana
plasmática de difícil visualização durante a avaliação da motilidade. Por isso que, a
combinação de vários fatores numa análise multifatorial seria segundo MELO (1999), o mais
apropriado para o diagnóstico da funcionalidade do espermatozóide.
A integridade osmótica da membrana plasmática deve ser considerada como requisito mínimo
essencial à viabilidade celular, pois, a membrana plasmática é responsável, através das trocas
com o meio externo, pelo equilíbrio osmótico celular. Com base nesta integridade osmótica,
JEYENDRAN et al. (1984) propuseram o teste hiposmótico ou HOST (Hypoosmotic Swelling
Test), como um novo ensaio na avaliação da funcionalidade da membrana plasmática do
espermatozóide.
2
Devido a sua morfologia singular, o espermatozóide, ao ser submetido a uma condição
hiposmótica, não consegue manter o equilíbrio osmótico intracelular, em decorrência do
grande influxo de água para o interior da célula, sofrendo com isso, alterações na sua
morfologia espermática. A metodologia empregada atualmente para o HOST é de simples
confecção e tem desempenhado papel importante no diagnóstico da qualidade seminal.
Contudo, na tentativa da padronização e desenvolvimento do HOST para as diversas espécies
de animais domésticos, alguns pesquisadores vêm testando variações no protocolo descrito
inicialmente por JEYENDRAN et al. (1984).
Assim, objetivou-se neste estudo observar os efeitos de alguns fatores sobre o percentual de
reação hiposmótica do espermatozóide caprino in natura e congelado, de machos da raça
Böer, através da: (1) da observação da solução que promove maior percentual de reação
hiposmótica (HO), (2) da osmolaridade que permite maior reação HO e (3) do tempo de
incubação necessário para ocorrência desta reação.
3
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 O espermatozóide e seu metabolismo
Os gametas masculinos ou espermatozóides são únicos entre as células quanto à forma e à
função, pois, quando maduros, são células terminais, produtos finais de processos complexos
de desenvolvimento, não passando por outras divisões ou diferenciações (AX et al., 2003). Os
espermatozóides são células alongadas (Fig. 2.1), compostas por uma cabeça de perfil fino,
que comporta o núcleo com sua cromatina altamente condensada compreendida por um
número haplóide de cromossomos, e uma cauda, responsável pela motilidade celular. O
espermatozóide é completamente envolto pela membrana plasmática (GARNER e HAFEZ,
2003).
Figura 2.1 O espermatozóide e suas estruturas internas. (Fonte: adaptado de
SENGER, 2003).
4
Sobre a cabeça do espermatozóide encontra-se o acrossoma ou capa acrossomal, uma fina
cobertura com dupla camada de membranas que envolvem intimamente o núcleo espermático.
O acrossoma contém as enzimas hidrolíticas necessárias à penetração no oócito (BRINSKO,
1999). Segundo GARNER e HAFEZ (2003), esta penetração inicia-se com a fusão do
segmento equatorial do acrossoma, juntamente com a porção anterior da região pós-
acrossomal, à membrana oócitária durante a fertilização. Este fenômeno é denominado de
reação acrossomal que, conforme observado por GONÇALVES et al. (2002), só ocorre com a
capacitação do espermatozóide pelo trato genital feminino na migração espermática.
A cauda do espermatozóide encontra-se dividida em quatro discretas divisões anatômicas: o
colo (conexão da cauda com a cabeça), a peça intermediária, a peça principal e a peça
terminal. A articulação do colo, com o núcleo espermático, ocorre em uma concavidade do
núcleo identificada como fossa de implantação (BARTH e OKO, 1989).
A peça intermediária apresenta-se como uma estrutura flagelar do tipo 9+(9+2), isto é: nove
fibras densas que circundam nove pares de microtúbulos, e estes envolvem dois filamentos
simples de microtúbulos. O axonema é composto pela estrutura 9+2 de microtúbulos sendo
recoberto, junto com as fibras que o circundam, por uma bainha em forma de hélice composta
por numerosas mitocôndrias (JASKO, 1992).
A bainha da peça principal é composta por fibras, como se fossem costelas, e é esta
característica que a distingui da peça intermediária. O annulus é a região que separa essas
duas bainhas; a peça terminal está na região mais distal e começa onde termina a bainha
fibrosa. Inicialmente, o arranjo 9+2 do axonema permanece intacto na peça terminal, e mais
distalmente, os pares de microtúbulos dissociam-se e terminam, restando no final somente os
microtúbulos centrais (BARTH e OKO, 1989).
Segundo DE ROBERTIS e DE ROBERTIS JR. (1993) e STRYER (1996c), os pares de
microtúbulos periféricos do axonema deslizam uns sobre os outros, para produzir o
encurvamento, resultando no movimento da cauda do espermatozóide. Em uma cauda de
espermatozóide intacta, os raios resistem a esse movimento de deslizamento, que é então
convertido em um encurvamento local; a nexina, que é uma proteína muito distensível,
mantém juntos os pares de microtúbulos durante este processo de deslizamento para que o
movimento da cauda do espermatozóide possa ocorrer.
5
Antigamente, acreditava-se que depois de formado, os espermatozóides traziam consigo a
energia necessária à sua meta fisiológica; sabe-se hoje, que estas células são capazes de
efetuar trocas metabólicas com o meio onde se encontram e essas trocas são facilitadas pelo
caráter filiforme do espermatozóide, o qual lhe confere grande permeabilidade (MIES FILHO,
1987).
O espermatozóide maduro não possui um sistema de reparação celular, nem é capaz de
sintetizar novas enzimas. Conseqüentemente, a maioria dos constituintes necessários para a
função ou metabolismo espermático é sintetizada durante a espermatogênese, restando ao
espermatozóide somente as funções de manutenção e produção de energia (AMANN e
GRAHAM, 1992).
Os espermatozóides retiram a energia necessária à sua fisiologia do substrato extracelular,
sendo esta derivada principalmente dos carboidratos (AMANN e GRAHAM, 1992). Embora
faltem muitas das organelas associadas aos processos metabólicos, os espermatozóides
possuem as enzimas envolvidas nas reações da glicólise, no ciclo de Krebs, na oxidação de
ácidos graxos e no transporte eletrônico (GARNER e HAFEZ, 2003).
Os glicídios são considerados a reserva energética e o intermediário metabólico, podendo ser
rapidamente mobilizados para gerar glicose, que é a principal fonte para a produção de
energia (STRYER, 1996b), mas conforme observado por AMANN e GRAHAM (1992), nem
todos os açúcares ou carboidratos, podem ser metabolizados pelos espermatozóides.
A glicose é transportada através da membrana plasmática por proteínas específicas,
proporcionando a principal fonte de adenosina trifosfato (ATP) para os espermatozóides
durante o metabolismo aeróbico (SCHMITT et al., 2003). Esta atividade aeróbica fornece a
maioria da energia que será convertida em ATP, e embora este ATP seja utilizado em grande
parte para manter a motilidade espermática, alguma parte também é usada na manutenção dos
processos ativos de transporte da membrana plasmática, impedindo a perda de componentes
iônicos vitais ao espermatozóide (GARNER e HAFEZ, 2003).
6
2.2 A membrana espermática
As propriedades biológicas e biofísicas das membranas celulares, incluindo a membrana
espermática, são determinadas pela sua composição molecular. Essa composição é
especialmente interessante na tecnologia da reprodução animal, pois exerce influência na
fusão da membrana espermática durante a fertilização e nas mudanças físicas que ocorrem na
mesma durante a capacitação espermática, a congelação e a descongelação (PARKS e
GRAHAM, 1992).
Segundo ZÚCCARI (1998), as membranas biológicas constituem uma barreira de
permeabilidade altamente seletiva sendo a composição molecular e iônica do meio
intracelular regulada por sistemas de transportes especializados, na forma de bombas e
passagens moleculares.
O espermatozóide de mamíferos é um exemplo de célula altamente especializada, que possui
uma membrana plasmática compartimentada, que pode ser subdividida em cinco regiões
conhecidas como acrossoma, segmento equatorial, lâmina pós-acrossomal, peça intermediária
e peça principal/terminal (CHRISTOVAN et al., 2004).
A membrana plasmática do espermatozóide é composta por uma dupla camada lipídica
estruturada em um modelo chamado de “mosaico fluído” (Fig. 2.2), assim denominado por
causa do mosaico de proteínas entre os lipídios e por que a camada lipídica é fluida, isto é: as
moléculas lipídicas difundem-se rapidamente no plano da dupla camada, assim como as
proteínas, a menos que sejam ancoradas por interações específicas. Esta dupla camada possui
os fosfolipídios (moléculas compostas por uma cadeia de ácidos graxos hidrofóbicos e por
uma cabeça polar contendo um grupo de fosfato hidrofílico) como seu componente
predominante (STRYER, 1996a; HEIDEMANN, 1999).
Embora, muitos componentes da membrana plasmática estejam distribuídos uniformemente
ao longo da superfície do espermatozóide, cada região também contém uma população
específica de antígenos, responsáveis pela sua função especializada, por exemplo, o
reconhecimento da zona pelúcida (CHRISTOVAN et al., 2004).
7
Figura 2.2 Representação diagramática da membrana plasmática e sua
estrutura de “mosaico fluido”. (Fonte: ZAFIAN, 1984)
A membrana plasmática do espermatozóide sofre extensa remodelação devido a mudanças
nas quantidades relativas de fosfolipídios, a processamento e reposicionamento de antígenos,
durante a maturação epididimária e capacitação espermática, além da troca de proteínas com o
líquido seminal (CHRISTOVAN et al., 2004). Por isso, a membrana plasmática é
extremamente importante para a manutenção do balanço iônico celular. Lesões nessa estrutura
podem resultar em morte espermática (SQUIRES et al., 1999).
As técnicas de preservação de sêmen podem promover graves alterações na membrana
plasmática do espermatozóide. Condições adversas como o resfriamento, por exemplo, que
alteram a orientação dos lipídios, podem afetar a estabilidade da membrana ou induzir a um
rearranjo das moléculas denominado de fase hexagonal II, formando pontos de fragilidade que
promoverão uma permeabilidade excessiva ou mesmo, a ruptura da membrana. Esta fase
hexagonal II pode ser transitória ou persistir irreversivelmente mesmo após o aquecimento
(PARKS e GRAHAM, 1992). Esse resfriamento leva também a uma produção ineficiente de
ATP pela célula, promovendo diversas alterações na fisiologia espermática, principalmente a
abertura dos canais de cálcio promovendo posteriormente a hidrólise dos fosfolipídios
danificando e aumentando a permeabilidade da membrana plasmática do espermatozóide
(AMANN e PICKETT, 1987).
Contrastando com outras células, o espermatozóide não tem capacidade de restaurar a
membrana plasmática quando lesionada, pois a fluidez da membrana é baixa e o
8
espermatozóide tem uma quantidade mínima de citoplasma, tornando falha esta capacidade de
síntese regenerativa (CARDULLO e WOLF, 1990).
Antes do estudo de JEYENDRAN et al. (1984) ser publicado, nenhum teste, relativamente
simples, com o propósito de verificar a integridade funcional da membrana plasmática do
espermatozóide estava disponível. Afinal, estudos histológicos só demonstravam a
integridade física da membrana plasmática, assim como a técnica de coloração “supravital”,
que só demonstra a habilidade que o corante tem em atravessar membranas, sinalizando
injúria ou morte celular.
Baseando-se nesse fato, JEYENDRAN et al. (1984) conseguiram desenvolver uma técnica de
fácil aplicação (teste hiposmótico), que avalia a integridade funcional da membrana
espermática, podendo ser utilizada rotineiramente na clínica andrológica humana.
2.3 Teste hiposmótico (HOST)
Segundo LAGARES et al. (1998), a membrana plasmática está envolvida com trocas
metabólicas com o meio extracelular e, por isso a grande importância do estudo da
funcionalidade da mesma, somado aos parâmetros tradicionais de avaliação da qualidade do
sêmen, com a finalidade de aumentar os índices de fertilidade.
Durante décadas, a integridade da membrana plasmática celular tem sido avaliada por meio da
utilização de corantes. Colorações tais como a eosina/nigrosina ou o trypan-blue, também
chamadas de colorações “vitais”, comumente são usadas para verificar a integridade física da
membrana plasmática do espermatozóide (BRITO et al., 2003).
Mas recentemente, colorações fluorescentes foram desenvolvidas com a mesma finalidade,
principalmente para o espermatozóide criopreservado. O Iodeto de propídio (IP) que é um
corante DNA-específico, cora de vermelho fluorescente somente os espermatozóides com
lesões na membrana plasmática. Já o diacetato de carboxifluoresceína (CDFA), que pode ser
combinado ao IP na avaliação da integridade da membrana espermática, irradia uma
coloração verde fluorescente ao sofrer hidrólise quando penetra em um espermatozóide com
membrana plasmática intacta (HARRISON e VICKERS, 1990). Entretanto, a necessidade de
9
um microscópio de fluorescência inviabiliza a utilização dessas colorações em
espermiogramas feito a campo.
Contudo, a avaliação da integridade física da membrana plasmática do espermatozóide, por si
só, não é suficiente para predizer a possível capacidade fertilizante da célula espermática
(JAGER et al., 1991), pois, a funcionalidade bioquímica da membrana plasmática, é um dos
fatores que possibilita ao espermatozóide reconhecer o oócito e desencadear assim, todo o
processo de penetração/fertilização.
Trabalhando com sêmen humano, JEYENDRAN et al. (1984), propuseram a utilização do
teste hiposmótico ou HOST (Hypoosmotic Swelling Test) na avaliação da integridade
funcional da membrana plasmática do espermatozóide, baseando-se em um fenômeno
denominado “swelling”, observado inicialmente por DREVIUS e ERIKSSON no ano de
1966.
Uma das características da membrana plasmática da célula espermática é a sua capacidade de
transporte seletivo de moléculas. Quando exposta a uma condição de baixa osmolaridade, a
água penetra no interior dos espermatozóides para atingir o equilíbrio osmótico (INAMASSU
et al., 1999). Este influxo de água aumenta o volume das células e a membrana plasmática se
expande (swelling); o espermatozóide então, por apresentar morfologia singular, ao ser
submetido ao choque hiposmótico tende a promover um dobramento de cauda (Fig. 2.3),
dando um indicativo que estava com a membrana plasmática integralmente funcional
(DELL’AQUA JÚNIOR et al. 2002).
Figura 2.3 Representação gráfica dos possíveis dobramentos observados na
cauda de espermatozóides submetidos ao teste hiposmótico. (DELL’AQUA
JÚNIOR et al., 2002).
10
Entretanto, devido à existência de alterações morfológicas na região da cauda do
espermatozóide, decorrentes de processos pré-ejaculatórios e/ou inabilidade técnica que
causa, por exemplo, o choque térmico, fez-se necessário o emprego de fórmulas nas quais se
diferenciassem essas alterações das ocasionadas pelo HOST. Para tal, JEYENDREN et al.
(1984) propuseram uma fórmula matemática direta, na qual se multiplica o número de
espermatozóides alterados após o HOST por cem e divide-se pelo total de espermatozóides
contados na mesma área. CORREA e ZAVOS (1994) e VAZQUEZ et al. (1997) utilizaram
uma fórmula semelhante, mas subtraíram do valor final a proporção de espermatozóides com
cauda semelhante à reativa em uma amostra controle.
Visando melhorar essa metodologia de cálculo, MELO (1999), após observar que a incubação
espermática em soluções isosmóticas, reproduzindo o ensaio de VAZQUEZ et al. (1997), não
induzia mudanças significativas na morfologia da cauda, concluiu que a própria avaliação do
sêmen para a morfologia espermática, poderia ser utilizada como grupo controle. Sendo
assim, propôs uma fórmula matemática, na qual a porcentagem de reação hiposmótica é
expressa por: HO(%) = (% de alterações na região da cauda após o HOST) – (% de alterações
na região da cauda antes do HOST), sendo que possíveis resultados negativos são
considerados iguais a zero.
Com esta fórmula, MELO (1999) acredita ter diminuído o erro de leitura e interpretação dos
resultados, simplificando ainda mais o HOST, aproximando-se do valor real de formas
reativas, principalmente em ejaculados com elevada porcentagem de alterações na região da
cauda antes do HOST.
Embora a cabeça do espermatozóide também seja recoberta pela membrana plasmática, o
volume desta não aumenta tanto em condições hiposmótica como o volume da cauda, que no
espermatozóide bovino, pode aumentar de 3,5 a 4 vezes (DREVIUS e ERIKSSON, 1966).
Este fato, segundo MELO (1999), indica a não necessidade da inclusão das anormalidades de
acrossoma e cabeça na fórmula de cálculo de formas reativas ao HOST.
A microscopia por contraste de fase é a mais indicada para a avaliação da reação espermática
ao HOST. O aumento tem variado de 200 a 1.000 vezes (JEYENDRAN et al., 1984;
DELL’AQUA JÚNIOR et al., 2002; FONSECA et al., 2001; FERREIRA et al., 2001),
entretanto MELO (1999) aconselha o uso de aumentos maiores, quando possível, como 1.250
11
vezes, pois com isso, minimizam-se possíveis erros na leitura, principalmente nas alterações
da morfologia da peça terminal, mais difíceis de serem avaliadas em pequenos aumentos.
O número de células espermáticas a serem contadas visando determinar percentualmente a
reação hiposmótica da amostra de sêmen, varia conforme os pesquisadores. JEYENDRAN et
al. (1984), não observou diferença significativa entre as avaliações que contaram 100 ou 200
espermatozóides por amostra. NIE e WENZEL (2001), também não observaram essa
diferença entre as contagens de 100 e 200 e entre 100 e 500 espermatozóides, com
porcentagens de 87,0±1,4 x 87,1±1,4 (P=0,61) e 84,3±1,0 x 83,8±0,9 (P=0,24),
respectivamente.
Com base no protocolo proposto por JEYENDRAN et al. (1984) para o sêmen humano,
vários pesquisadores vêm utilizando o HOST no sêmen de diversas espécies domésticas, tais
como nos bovinos (CORREA e ZAVOS, 1994), suínos (VAZQUEZ et al., 1997), eqüinos
(MELO e HENRY, 1999), cães (INAMASSU et al., 1999) e ovinos (OBERST et al., 2003). A
capacidade de reação do espermatozóide caprino frente a condições hiposmóticas foi
demonstrada por FERREIRA et al. (2001) e por FONSECA et al. (2001). Sendo que, esses
pesquisadores utilizam diferentes soluções hiposmóticas, em diversas osmolaridades na
aplicação do HOST.
2.3.1 Soluções hiposmóticas e osmolaridade
O teste hiposmótico foi primeiramente aplicado utilizando-se soluções de açúcares (frutose,
melitose e sacarose) e eletrólitos (citrato de sódio e cloreto de sódio), onde a solução
composta por 50% de frutose e 50% de citrato de sódio, ambos a 150mOsmol/Kg H
2
O,
mostrou-se superior às demais em espermatozóides humanos (JEYENDRAN et al., 1984).
Ainda de acordo com JEYENDRAN et al. (1984), o citrato de sódio e o cloreto de sódio são
eletrólitos que atuam na manutenção da integridade funcional dos espermatozóides, sendo o
citrato de sódio empregado em estudos de padronização do HOST. A frutose e a sacarose são
açúcares comumente utilizados em meios diluidores de sêmen, embora a membrana
plasmática não permita o transporte da sacarose, devido ao seu peso molecular, o que pode
gerar reações diferentes das obtidas com a frutose, açúcar que tem fluxo através da membrana
12
plasmática do espermatozóide. NEILD et al. (1999) realizaram estudos nos quais, além desses
dois açúcares, foi utilizada também a lactose como componente da solução hiposmótica.
PINTO e LOBO (1997) utilizaram como solução hiposmótica o meio proposto por Kenney et
al. (1975), regulando sua osmolaridade para 150mOsmol/Kg H
2
O. Nesta solução foi incubado
sêmen eqüino in natura e o resfriado, tendo estes demonstrado uma reação positiva ao HOST.
A água destilada (AD) foi usada por DELL’AQUA JÚNIOR et al. (2002) e MELO et al.
(2003), como solução HO na incubação de sêmen eqüino congelado, sendo observado, pelos
últimos, uma superioridade (P<0,05) desta solução em comparação à solução de sacarose a
100mOsmol/Kg H
2
O.
A associação de frutose com citrato de sódio, na preparação de soluções hiposmóticas para o
sêmen caprino, é mais freqüente que a utilização de soluções compostas exclusivamente por
citrato de sódio (FONSECA et al., 2001; SANTOS et al., 2001; BITTENCOURT et al., 2005;
FONSECA et al., 2005); possivelmente, o uso dessa associação para o sêmen caprino baseie-
se na conclusão de JEYENDRAN et al. (1984).
Os meios/diluentes utilizados na conservação da célula espermática, possuem uma
osmolaridade em torno de 300mOsmol/Kg H
2
O (MIYAMOTO e CHANG, 1973; citado por
JEYENDRAN et al., 1984); essa mesma osmolaridade, foi classificada por RODRÍGUEZ-
GIL et al. (1994), VAZQUEZ et al. (1997) e MELO (1999) como isosmótica em relação ao
espermatozóide, canino, suíno e eqüino, respectivamente.
LAGARES et al. (1988) mensuraram a osmolaridade do plasma seminal eqüino e obtiveram
média de 284,8mOsmol/Kg H
2
O. Essa média pode ser estendida ao sêmen dos demais
mamíferos domésticos, pois segundo GARNER e HAFEZ (2003), a composição química,
inorgânica e bioquímica dos espermatozóides é basicamente a mesma, diferindo
quantitativamente em relação aos constituintes do plasma seminal de cada espécie.
Soluções com osmolaridade acima de 250mOsmol/ Kg H
2
O, tendem a promover menores
percentuais de reação hiposmótica nos espermatozóide, pois aproximam-se da osmolaridade
do plasma seminal. Esse comportamento foi observado por MELO e HENRY (1999), onde os
espermatozóides submetidos ao HOST em soluções de 250 e 300mOsmol/Kg H
2
O,
13
apresentaram média de reação abaixo de 7% e 5%, respectivamente. Comportamento este,
também observado, embora com médias um pouco mais altas, por NIE e WENZEL (2001) e
por FONSECA et al. (2005), no sêmen eqüino e caprino, respectivamente. Assim sendo,
espera-se um maior percentual de reação hiposmótica dos espermatozóides, quando incubados
em soluções cuja osmolaridade varie de 0 a 200mOsmol/Kg H
2
O.
Experimentos conduzidos por diversos pesquisadores, vem demonstrando que o intervalo de
100 a 150mOsmol/Kg H
2
O tem permitido, aos espermatozóide, um percentual maior de
reatividade hiposmótica. CORREA e ZAVOS (1994) relataram que os espermatozóides
bovinos apresentaram 48% de reação hiposmótica (P<0,05) quando submetidos à
osmolaridade de 100mOsmol/Kg H
2
O. FONSECA et al. (2005) não observaram diferença
significativa entre as osmolaridade de 100, 125 e 150mOsmol/Kg H
2
O, sendo que a segunda,
demonstrou um leve aumento numérico na porcentagem de reação. OBERST et al. (2003),
também não encontraram diferença significativa entre 100 e 150mOsmol/Kg H
2
O trabalhando
com o sêmen ovino.
LIN et al. (1998) relacionaram a fertilidade e sub-fertilidade de homens com a integridade
funcional da membrana plasmática do espermatozóide, através do HOST, obtendo correlação
positiva (P<0,05), tanto do sêmen in natura como congelado, usando como meio hiposmótico
a água destilada (0mOsmol/Kg).
A água destilada tem demonstrado uma variação na resposta hiposmótica dos
espermatozóides, quando nela incubados. MELO et al. (2003) observaram a semelhança entre
os percentuais de reação hiposmótica do espermatozóide eqüino, quando incubados em AD ou
em solução de cloreto de sódio a 100mOsmol/Kg H
2
O, e a superioridade da AD quando
comparada à solução de sacarose na mesma osmolaridade. Comparando soluções de citrato de
sódio e de frutose, ambas a 100mOsmol/Kg H
2
O, com a AD, et al. (2005b) não obsevaram
diferenças entre a AD e as duas soluções, quando fixadas com formol-salina tamponada,
entretanto, no ensaio que não ocorreu essa fixação a AD mostrou-se superior (P<0,05),
demonstrando que o HOST utilizando AD, sofre uma possível interferência quando fixado.
Contudo, a confirmação desta interferência necessita de mais estudos.
14
2.3.2 Tempo de incubação e fixação com formol-salina tamponada
Embora CORTÉS et al. (1993) indiquem que a maior proporção de reação hiposmótica ocorre
nos primeiros vinte minutos do HOST, ainda não está definido qual o tempo de incubação
mínimo que o espermatozóide necessita para reagir adequadamente ao HOST. Em seu
experimento, CORREA e ZAVOS (1994) incubaram o sêmen bovino por 60 minutos em
banho-maria a 37°C; PINTO e LOBO (1997) reduziram este tempo para 10 minutos;
LAGARES et al. (1998) utilizaram cinco minutos à temperatura ambiente; MELO e HENRY
(1999) e BITTENCOURT et al. (2005) retornaram para os 30 minutos a 37°C, FERREIRA et
al. (2001) compararam os percentuais de reação hiposmóticas encontrados, com o sêmen
caprino, após os cinco e 25 minutos de incubação e DELL’AQUA JÚNIOR et al. (2002)
fizeram a leitura imediatamente após o sêmen eqüino ser misturado à solução hiposmótica.
Ressaltando que diversas soluções foram utilizadas nessas experimentações.
NIE e WENZEL (2001) utilizando sêmen eqüino in natura, não observaram diferença
significativa entre tempos de incubação variando de 15 a 180 minutos, embora houvesse uma
tendência numérica a favor dos 60 minutos. Corroborando com esse resultado, trabalhos
semelhantes, com sêmen congelado eqüino, indicaram que 15 minutos de incubação a 37°C,
são suficientes, pois ao final deste tempo, a maior parte dos espermatozóides com membrana
funcionalmente íntegra já reagiu à condição hiposmótica (MELO et al., 2003; ALVES et al.,
2005b).
Através da revisão de literatura, pôde-se observar que alguns autores, após o término do
tempo de incubação, não realizam a fixação da amostra, seja com formol-salina tamponada
(FST) ou com glutaraldeído, para a posterior leitura da mistura sêmen/solução hiposmótica.
Entretanto, essa fixação, com FST, foi utilizada por MELO e HENRY (1999) para o sêmen
eqüino resfriado e por COTTORELLO (2002) e SNOECK (2003) para o sêmen eqüino
congelado, não sendo relatado por esses autores qualquer interferência desse protocolo sobre
os resultados de espermatozóides reativos ao teste.
Embora o mecanismo de ação do formaldeido frente à unidade celular não esteja totalmente
esclarecido, MASON e O’LEARY (1991) observaram que, o formaldeido, presente na
solução de FST, atua junto aos microtubúlos ligando-se a α e β tubulina, despolimerizando a
estrutura tubular, e desnaturando as proteínas presentes na membrana plasmática. Essa
15
desnaturação protéica, segundo análises de ZHU et al. (2002), promove alterações na
permeabilidade da membrana dificultando ou impedindo o transporte de água para dentro da
célula.
Talvez, seja essa alteração na permeabilidade da membrana plasmática do espermatozóide,
que justifique a não ocorrência de diferença (P>0,05) nas médias entre as soluções,
observadas por ALVES et al. (2005b), dos espermatozóides reativos ao teste HO com ou sem
fixação em FST pós-incubação. Pois, com base nesta hipótese, a reação hiposmótica seria
cessada quando fixada em formol salina.
Assim, após avaliar sua metodologia e sua interação com a membrana plasmática celular, o
HOST pode ser considerado mais do que uma prova do estado metabólico do espermatozóide,
representando também uma prova da habilidade do espermatozóide em se capacitar durante
seu percurso dentro do trato reprodutivo feminino (JEYENDRAN et al., 1992).
16
3. EXPERIMENTO I
O teste hiposmótico na avaliação do sêmen in natura de caprinos da raça Böer: Efeito da
solução, osmolaridade e tempo de incubação
(The hypoosmotic swelling test in fresh goat semen of the Boer breed: Effect of solution,
osmolarity and incubation time)
ALVES, S.G.G.; CHALHOUB, M.
Escola de Medicina Veterinária – UFBA, Salvador-BA, 40170-110, Brasil.
Resumo
O objetivo deste experimento foi avaliar a influência da solução, da osmolaridade e do tempo
de incubação sobre o percentual de reação hiposmótica do espermatozóide caprino,
especificamente de machos da raça Böer, e sua repetibilidade intra-ensaio. Para tal
utilizaram-se 24 ejaculados, divididos em três etapas, provenientes de cinco reprodutores.
Para o teste hiposmótico (HOST) foram utilizadas uma solução de água destilada
(0mOsmol/Kg), duas soluções de açúcar (frutose e sacarose), duas de eletrólitos (citrato de
sódio e cloreto de sódio) e uma associação de açúcar-eletrólito (frutose-citrato de sódio), estas
cinco últimas, em quatro diferentes osmolaridades: 50, 100, 150 e 200mOsmol/Kg H
2
O. A
incubação do sêmen in natura nas soluções com 50mOsmol/Kg H
2
O, permitiu maiores
médias (P>0,05) de resposta positiva ao HOST. Nessas soluções, o percentual de
espermatozóides reativos ao HOST aos 15 minutos de incubação, variou entre 74,90 a
82,30%, independente do soluto utilizado. Observaram-se melhores resultados ao HOST com
o uso de eletrólitos, sendo sugerida a solução de citrato de sódio a 50mOsmol/Kg H
2
O,
incubada por 15 minutos, com uma repetibilidade de leitura média de 4,26%±1,68, para a
realização do HOST no sêmen de caprinos da raça Böer.
Palavras-chave: Teste hiposmótico; sêmen; caprino; Böer.
Abstract
Twenty-four ejaculated were used, of five male goats, with the objective of evaluate the
influence of solution, osmolarity and incubation time on the percentile of hypoosmotic
reaction of goat spermatozoid, specifically of the Boer breed, and to verify the intra-assay
variability of the hypoosmotic swelling test (HOST). Were used solutions of distilled water,
two solutions of sugar (fructose and sucrose), two electrolytes (sodium citrate and sodium
chloride) and an association of sugar-electrolyte (sodium citrate-fructose). The omolarity of
the solutions varied from 50 to 200, at 50mOsmol/Kg H
2
O increments. The distilled water
(0mOsmol/Kg) was used also as solution. The fresh semen incubation in solutions of
100mOsmol/Kg H
2
O, independently of the solute, increased (P>0.05) sperm HOST response,
varying from 74.90 to 82.30%, incubated by 15 minutes. It was observed of better results
using electrolytes. The sodium citrate solution 100mOsmol/Kg H
2
O, incubated by 15 minutes,
17
with low intra-assay variability of 4.26%±1.68, was the suggested solution for Boer goat
HOST.
Key-words: Hypoosmotic swelling test; semen; goat; Boer.
3.1 Introdução
Dentre os aspectos morfológicos estruturais dos espermatozóides, a integridade da membrana
plasmática é crucial para o funcionamento da célula espermática, por isso, a grande
importância do estudo da funcionalidade da mesma, que, segundo LAGARES et al. (1998), se
somado aos parâmetros tradicionais de avaliação da qualidade do sêmen, podem ajudar a
aumentar os índices de fertilidade ou no diagnóstico de possíveis causas de infertilidade.
O teste hiposmótico ou “hypoosmotic swelling test” (HOST), desenvolvido por JEYENDREN
et al. (1984), com a finalidade avaliar a integridade funcional da membrana plasmática do
espermatozóide, vem sendo adaptado por diversos pesquisadores (CORREA e ZAVOS, 1994;
LIN et al., 1998; MELO e HENRY, 1999; FERREIRA et al., 2001; DELL’AQUA JÚNIOR.
et al., 2002; ALVES et al., 2005b) no que se refere ao uso de diferentes soluções
hiposmóticas, na osmolaridade dessas soluções, no tempo de incubação no qual o sêmen é
submetido, dentre outras variações, visando determinar o melhor protocolo de HOST para as
diversas espécies de animais domésticos.
Segundo JEYENDRAN et al. (1984), os açúcares e os eletrólitos são conhecidos por
manterem a integridade funcional os espermatozóides. Por isso, esses solutos são
freqüentemente utilizados, sozinhos ou combinados, em ensaios de padronização do HOST.
Os experimentos de HOST com o sêmen caprino disponíveis na literatura, são na maioria,
realizados com soluções de citrato de sódio (FERREIRA et al., 2001) ou associação de frutose
com citrato de sódio (FONSECA et al., 2001; BITTENCOURT, et al., 2005; FONSECA et
al., 2005), baseados em ensaios que observaram melhores percentuais de reação hiposmótica,
em outras espécies, utilizando essas soluções.
As soluções hiposmóticas com osmolaridades variando de 100 a 150mOsmol/Kg H
2
O são as
que permitem, nas diversas espécies de mamíferos, um maior percentual de espermatozóides
reagindo positivamente ao HOST (JEYENDRAN et al., 1984; MELO e HENRY, 1999; NIE e
WENZEL, 2001; FONSECA et al., 2005). Segundo Rota et al. (2000), a osmolaridade ideal é
aquela que permite o maior percentual de espermatozóides reativos ao HOST sem, no entanto,
18
provocar a lise celular; esta osmolaridade, bem como o tempo no qual se atinge o percentual
máximo de reatividade espermática, varia com as espécies a serem estudadas, por isso a
necessidade de estudos para determinação destes valores.
Assim, o objetivo do presente experimento foi observar os efeitos de alguns fatores sobre o
percentual de reação espermática, frente ao HOST, do sêmen caprino in natura, através da:
(1) osmolaridade que permite maior percentual de reação hiposmótica, (2) solução e tempo de
incubação que permitem maior percentual de reação hiposmótica e (3) determinação da
repetibilidade intra-ensaio do HOST.
3.2 Material e Métodos
3.2.1 Os locais e animais experimentais
Foram selecionados cinco machos adultos da raça Böer, em idade reprodutiva (
X
= 3,6 anos),
submetidos a exames andrológicos prévios e considerados aptos à reprodução, baseando-se
nos valores sugeridos pelo Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (CBRA; HENRY e
NEVES, 1998).
Os animais, de propriedade da Fazenda Santa Fé, localizada no município de Iaçu-Ba
(12°46’01”S e 40°12’43”W), foram manejados de forma intensiva, com fornecimento diário
de concentrado balanceado, forragem verde, sal mineral e água ad libitum. O controle
sanitário era realizado periodicamente, seguindo um esquema pré-estabelecido pela
propriedade.
Todos os procedimentos adotados neste estudo estiveram de acordo com os princípios éticos
na experimentação animal recomendados pelo COBEA (2005).
3.2.2 Colheita e avaliação seminal
Foi colhido um total de 24 ejaculados de cinco reprodutores, por vagina artificial, utilizando
como manequins fêmeas em estro induzido.
19
Após a colheita, o volume do ejaculado foi verificado e registrado em mililitros (mL). Cada
ejaculado foi avaliado quanto à motilidade total e progressiva, vigor espermático e turbilhão.
A avaliação subjetiva da motilidade e do vigor espermático foi realizada, examinando-se
alíquotas do ejaculado diluídas em solução comercial de ringer com lactato, em microscopia
óptica (40x) e os resultados expressos em percentual para a motilidade e numa escala de zero
a cinco para o vigor e turbilhão, este último avaliado sem diluição sobre um aumento de 10
vezes. Todas as avaliações seguiram as recomendações do CBRA (HENRY e NEVES, 1998).
Após essas avaliações, outra alíquota de sêmen foi retirada do ejaculado e adicionada a uma
solução de formol-salina tamponada (HANCOCK, 1957), numa diluição de 1:400, para
posterior cálculo da concentração espermática, pela contagem dos espermatozóides em
câmara de Neubauer (HENRY e NEVES, 1998).
A avaliação da morfologia espermática foi realizada por esfregaços preparados com o sêmen
in natura, corados com panótico rápido (Instant Prov®; NewProv; Pinhais-PR). Cada
esfregaço foi avaliado, posteriormente, sob microscopia ótica de imersão (1.000x), estimando-
se os percentuais de espermatozóides morfologicamente normais e com anormalidades
conforme HENRY e NEVES (1998).
3.2.3 O teste hiposmótico
O teste hiposmótico foi empregado para avaliar a integridade funcional da membrana
plasmática dos espermatozóides caprino. Com base na metodologia aplicada por NIE e
WENZEL (2001), este experimento foi dividido em três etapas.
Cada etapa foi subdividida em dois tempos. O primeiro (avaliação andrológica, colheita de
sêmen e teste hiposmótico) foi realizado na própria Fazenda Santa Fé; o segundo tempo
(avaliação morfológica e reação hiposmótica) foi realizado no Laboratório de Embriologia do
Hospital de Medicina Veterinária, da Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal
da Bahia (EMEV-UFBA). O sêmen utilizado em todas as etapas foi colhido e processado
como descrito anteriormente.
20
A leitura do percentual de reação dos espermatozóides ao HOST foi feita, através de
microscopia de contraste de fase com um aumento de 1.000 vezes, colocando-se uma gota da
fração sêmen/solução entre lâmina e lamínula.
Visando diminuir o erro de leitura e interpretação do percentual de reação ao HOST, foi
utilizada a fórmula proposta por MELO e HENRY (1999), na qual, contando-se 100 células,
se subtrai as anormalidades espermáticas das alterações resultantes da incubação espermática
em meio hiposmótico.
Etapa I: Comparação das osmolaridades
Com o intuito de determinar a osmolaridade que proporciona o maior percentual de
espermatozóides reativos ao HOST, foram colhidos, por vagina artificial, dois ejaculados
provenientes de cinco reprodutores, totalizando dez ejaculados, utilizando como manequins
fêmeas em estro induzido.
Foram avaliadas quatro osmolaridades (50, 100, 150 e 200mOsmol/Kg H
2
O) em cinco
diferentes soluções, sendo duas de açúcares (frutose e sacarose), duas de eletrólitos (citrato de
sódio e cloreto de sódio) e uma associação de açúcar-eletrólito (frutose-citrato de sódio),
totalizando 20 soluções. A osmolaridade dessas soluções foi medida, com base no seu ponto
de congelação, em aparelho de precisão (μ OSMETTE TM, Model 5004 Automatic
Osmometer – Natick MA – USA). As soluções, imediatamente após o preparo, foram
armazenadas em tubos para centrífuga estéreis e estocadas em freezer a -18°C.
Trinta minutos antes da colheita as soluções foram descongeladas e acondicionadas em tubos
de micro-centrífuga, inseridos numa placa flutuante, mantidos em banho-maria a 37°C. Após
a colheita e avaliação dos parâmetros espermáticos, alíquotas de sêmen foram submetidas ao
HOST, sendo acrescidas, na proporção de 1:10 (10μL de sêmen em 100μL de solução), às
soluções contidas nos tubos de micro-centrífuga, e submetidas à incubação em banho-maria a
37°C por 30 minutos.
Após o término da incubação, cada amostra, foi fixada com 50 μL de formol-salina
tamponada a 37°C e armazenada em geladeira (5°C) até o momento da leitura do percentual
21
de reação hiposmótica, por meio de preparação úmida entre lâmina e lamínula sob objetiva de
imersão, por microscopia de contraste de fase com aumento de 1.000 vezes.
Etapa II: Comparação das soluções e tempos de incubação
Foram utilizadas seis soluções hiposmóticas, sendo uma de água destilada, duas soluções de
açúcares (frutose e sacarose), duas de eletrólitos (citrato de sódio e cloreto de sódio) e uma
associação de açúcar-eletrólito (frutose-citrato de sódio). Excluindo-se a água destilada
(0mOsmol/Kg), as cinco soluções restantes possuíam a osmolaridade de 100mOsmol/Kg
H
2
O, baseado nos resultados encontrados na Etapa I deste experimento.
A água destilada foi utilizada na proporção de 1:8 (10μL de sêmen em 80μL de água
destilada) e as demais soluções na proporção de 1:10 (10μL de sêmen em 100μL de solução),
reproduzindo as proporções utilizadas por ALVES et al. (2005b).
Nesta etapa, foi avaliada a influência do tempo de incubação sobre o percentual de
espermatozóides reativos ao HOST. Para isso, foram colhidos, por vagina artificial, dez
ejaculados provenientes de cinco reprodutores, utilizando como manequins fêmeas em estro
induzido.
Compararam-se os tempos de 15 minutos e 30 minutos de incubação, para as seis soluções,
sendo realizada ainda uma fixação imediata para a água destilada (0 minuto), reproduzindo o
protocolo proposto por MELO et al. (2003). O HOST, adicionando-se os tempos de incubação
de zero e 15 minutos, seguiu a metodologia aplicada na etapa anterior.
Ao término dos respectivos tempos de incubação, cada amostra, foi fixada em formol-salina
tamponada a 37°C. As amostras utilizando água destilada foram fixadas com 25 μL de
formol-salina tamponada e as demais amostras foram fixadas com 50 μL. Após a fixação, a
conservação e a leitura das amostras seguiu o protocolo descrito na Etapa I.
22
Etapa III: Repetibilidade intra-ensaio
Com o objetivo de determinar a repetibilidade intra-ensaio do HOST (MELO, 1999), um
ejaculado de quatro reprodutores, foi fracionado em cinco alíquotas e submetidas ao HOST de
escolha (citrato de sódio a 100mOsmol/Kg H
2
O e 15 minutos de incubação), conforme
resultados da etapa anterior. O HOST, a fixação, a conservação e a leitura das amostras desta
etapa, ocorreram como descritos na etapa I.
3.2.4 Delineamento experimental
As análises descritivas: média, desvio-padrão, mediana, valores máximo e mínimo foram
realizadas conforme SAMPAIO (2002).
O delineamento experimental foi de blocos ao acaso, considerando o bode como bloco, com
20 tratamentos (5 soluções x 4 osmolaridades x 10 ejaculados) na Etapa I; a Etapa II seguiu o
esquema fatorial 6x3x10 (solução x tempo de incubação x ejaculado), totalizando 13
tratamentos e não 18, pois o tempo de incubação de 0 minuto foi imposto somente a uma
solução.
Os dados foram submetidos, em ambas as etapas, a análise de variância e comparados pelos
testes de Tukey e Duncan, utilizando uma probabilidade de 5%. Para essas análises foi
empregado o pacote estatístico para ciências sociais SPSS (Statistical Package for the Social
Sciences – version 11.0) (SPSS, 2001).
Algumas variáveis, quando necessário, foram transformadas em ângulo, visando normalizar a
resposta e homogeneizar as variâncias dos tratamentos analisados.
Na etapa III a repetibilidade foi obtida por meio do cálculo da proporção do desvio padrão em
relação à média.
23
3.3 Resultados e discussão
3.3.1 Características do sêmen in natura
As médias e seus respectivos desvios-padrão, referentes ao volume (VOL), motilidade total
(MT), motilidade progressiva (MP), vigor (VIG), turbilhão (TURB) e concentração
espermática (CONC), dos ejaculados utilizados nas três etapas deste experimento (Tab. 3.1),
mostraram-se dentro dos padrões sugeridos pelo CBRA (HENRY e NEVES, 1998).
Tabela 3.1 Características físicas do sêmen in natura (
X
± s)
Etapa VOL (mL) MT (%) MP (%)
VIG
(0-5)
TURB
(0-5)
CONC
(x10
6
sptz/mL)
I*
0,90±0,17 82,50±4,24 75,50±4,97 3,10±0,31 3,30±0,67 2.010,00±731,89
II*
0,89±0,15 84,50±3,68 77,00±4,83 3,20±0,42 3,50±0,85 2.062,00±642,83
III**
0,70±0,08 86,25±4,78 80,00±4,08 3,25±0,50 3,50±1,00 2.200,00±919,61
X
0,86±0,16 83,96±4,16 76,88±4,84 3,17±0,38 3,42±0,77 2.063,33±697,21
X
= média; s = desvio-padrão; VOL = volume; MT = motilidade total; MP = motilidade progressiva;
VIG = vigor; TURB = turbilhão; CONC = concentração
* n = 10 ejaculados; ** n = 4 ejaculados
As características espermáticas não apresentaram diferença (P>0,05) entre as etapas (I, II e
III), entretanto, foi observada uma diminuição progressiva do VOL colhido e um leve
incremento nas outras características. Essa diminuição do VOL colhido também foi observada
por MORAES et al. (2003), com diferença estatística, onde concluíram que ejaculações
freqüentes tendem a diminuir o VOL médio do ejaculado.
Contrariando o observado por MORAES et al. (2003) para o sêmen de animais das raças
Saanen, Anglo-nubiana e Moxotó, o leve aumento observado na CONC pode ser justificado
pela diminuição do número de ejaculados utilizados, de dez para quatro, e pelo intervalo
maior entre as etapas 2 e 3. Ainda assim, a CONC mostrou-se inferior aos 2,53x10
9
sptz/mL e
aos 3x10
9
sptz/mL, descritos pelo próprio MORAES e colaboradores e por NUNES e
SALGUEIRO (2002), respectivamente.
Na Tab. 3.2 estão expressos os valores médios das alterações morfológicas visualizadas nas
amostras de sêmen, dos ejaculados utilizados nas três etapas deste experimento. Visando
facilitar posteriormente a classificação das reações hiposmóticas, as alterações na morfologia
espermática foram classificadas em alterações de cabeça (CAB), gota citoplasmática proximal
24
(GCP), gota citoplasmática distal (GCD), peça intermediária (PI) e cauda geral (CG), esta
última englobando todas as alterações localizadas nas peças principal/terminal da cauda do
espermatozóide.
Tabela 3.2 Alterações morfológicas no sêmen in natura (
X
± s)
Etapa CAB (%) GCP (%) GCD (%) PI (%) CG (%)
I*
1,90±1,28 0,00±0,00 0,10±0,31 2,90±1,66 8,80±4,23
II*
1,50±1,26 0,20±0,42 0,40±0,51 3,20±2,48 9,50±3,44
III**
1,75±1,70 0,00±0,00 0,25±0,50 3,00±1,82 11,50±4,04
X
1,71±1,30 0,08±0,28 0,25±0,44 3,04±1,98 9,54±3,83
X
= média; s = desvio-padrão; CAB = cabeça; GCP = gota citoplasmática proximal; GCD = gota
citoplasmática distal; PI = peça intermediária; CG = cauda geral
* n = 10 ejaculados; ** n = 4 ejaculados
As alterações de acrossoma observadas nos 24 ejaculados foram computadas juntamente com
as alterações de CAB, em decorrência da não observação das mesmas durante a leitura dos
percentuais de reação hiposmótica nas Etapas e I, II e III.
A média total de espermatozóides anormais (14,63±4,26) observada ficou abaixo do limite
máximo (20%) estabelecido pelo CBRA (HENRY e NEVES, 1998), para a seleção de bodes
para a monta natural (Tab. 3.3). Sendo que, em média, 88% desses espermatozóides anormais
apresentavam alterações de cauda.
Tabela 3.3 Classificação dos espermatozóides quanto à morfologia no sêmen in natura
Etapa
Espermatozóides normais
(
X
± s)
Espermatozóides anormais
(
X
± s)
Defeitos de cauda
(
X
± s)
I*
86,30±5,14 13,70±5,14 11,80±4,80
II*
85,20±3,93 14,80±3,93 13,30±4,02
III**
83,50±2,38 16,50±2,38 14,75±2,50
X
85,38±4,26 14,63±4,26 12,92±4,16
X
= média; s = desvio-padrão
* n = 10 ejaculados; ** n = 4 ejaculados
3.3.2 Determinação da osmolaridade
Estão descritos na Tab. 3.4, os resultados das reações hiposmóticas observados na Etapa I.
Comparando os valores médios, observou-se que a osmolaridade de 100mOsmol/Kg H
2
O,
apresentou, em três das cinco soluções (frutose, citrato de sódio, frutose-citrato de sódio), as
maiores médias (P>0,05) dentre as cinco soluções utilizadas. As outras duas maiores médias
foram observadas nas soluções de sacarose a 50mOsmol/Kg H
2
O e de cloreto de sódio a
150mOsmol/Kg H
2
O.
25
Tabela 3.4 Percentual de reação positiva dos espermatozóides caprinos ao teste
hiposmótico em diferentes soluções (
X
± s)
SOLUÇÕES
OSM
FRU SAC CIT CLO FCIT
X
± s
50
74,40±13,01
79,70±15,35
A
79,80±9,99 78,30±14,25 78,40±11,07 78,12±12,51
A
100
77,70±10,84
73,50±16,56
A
81,70±7,11 78,10±15,17 79,40±6,00 78,08±11,73
A
150
72,30±13,77 77,70±11,32
A
79,40±8,56 80,10±12,98 78,00±11,99 77,50±11,70
A
200
73,60±15,17
a
52,60±18,22
bB
74,10±6,4
a
75,30±8,94
a
75,70±11,06
a
70,26±15,10
B
X
± s
74,50±12,93 70,88±18,52 78,75±8,32 77,95±12,66 77,87±9,99 75,99±13,16
X
= média; s = desvio-padrão; OSM = osmolaridade em mOsmol/Kg H
2
O; FRU = frutose; SAC = sacarose;
CIT = citrato de sódio; CLO = cloreto de sódio; FCIT = frutose-citrato de sódio
ab
Letras diferentes na mesma linha (P<0,05)
AB
Letras diferentes na mesma coluna (P<0,05)
Assim, como neste experimento, MELO e HENRY (1999), no sêmen eqüino, e FONSECA et
al. (2001), no sêmen caprino congelado, observaram a maior facilidade (P>0,05), com que a
osmolaridade de 100mOsmol/Kg H
2
O promove a reação hiposmótica. Entretanto, essa
facilidade, diverge das observações de VAZQUEZ et al. (1997), no sêmen suíno, e de
FONSECA et al. (2005), no sêmen caprino, onde a osmolaridade de 150mOsmol/Kg H
2
O e
125mOsmol/Kg H
2
O, respectivamente, proporcionaram maiores médias de reação (P>0,05),
quando comparada à de 100mOsmol/Kg H
2
O. O espermatozóide canino (RODRÍGUEZ-GIL
et al., 1994) também apresentou maiores médias de reação ao HOST, conforme esses autores,
quando incubado em soluções com osmolaridade variando entre 100 e 150mOsmol/Kg H
2
O.
Aplicando o HOST no sêmen ovino, OBERST et al. (2003), também não observaram
diferença estatística entre soluções a 100 e 150mOsmol/Kg H
2
O.
Com a ausência de diferença estatística entre as soluções, excluindo sacarose a
200mOsmol/Kg H
2
O, comparou-se os tipos de alterações hiposmóticas e sua localização na
cauda do espermatozóide. Para isso as soluções foram blocadas e tentando um maior
detalhamento, as alterações de peça principal (PP) e peça terminal (PT) foram separadas das
de CG. Com isso, as alterações denominadas de cauda fortemente dobrada e de cauda
fortemente enrolada foram agrupadas em CG (Fig. 3.1), ressaltando que, para esta análise,
foram utilizados os valores totais observados durante a leitura das alterações hiposmóticas,
isto é, sem a aplicação da fórmula proposta por MELO e HENRY (1999).
26
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
50 100 150 200
%
PI
PP
PT
CG
Figura 3.1 Porcentagem de alterações observadas no teste hiposmótico conforme
região da cauda do espermatozóide caprino nas diferentes osmolaridades.
PI = peça intermediária; PP = peça principal; PT = peça terminal; CG = cauda geral;
MELO e HENRY (1999) observaram que as alterações hiposmóticas no espermatozóide
eqüino, se concentraram nas classificadas como CG, que neste caso específico incluía as
alterações de PP e PT. Embora no presente experimento essas alterações tenham sido
separadas, pode-se concluir que há uma incidência maior de ocorrência das alterações
hiposmóticas fora do sítio da peça intermediária. Em outro experimento, MELO et al. (2005)
observaram que as alterações, aqui classificadas como CG, representam entre 24 e 77% do
total de reações hiposmóticas apresentadas pelo espermatozóide eqüino. Já FONSECA et al.
(2005) observaram que essas alterações variaram de 19 a 52% no espermatozóide caprino. No
presente experimento, essas alterações variaram de 14,1 a 83,3%, considerando todos os
tratamentos.
Embora as média gerais das reações hiposmóticas, tenham se mostrado semelhantes
(P>0,05), entre as osmolaridade de 50mOsmol/Kg H
2
O (78,12%), quando comparada às
médias das osmolaridades de 100 e 150mOsmol/Kg H
2
O, que foram de 78,08% e 77,5%,
respectivamente, escolheu-se a osmolaridade de 50mOsmol/Kg H
2
O, para a Etapa II, pela
maior facilidade em observar as alterações de CG na microscopia óptica de contraste de fase,
mesmo em aumentos menores (400x), e pela menor incidência de alterações de PT, estas de
difícil observação em aumentos menores que 1.000 vezes (MELO, 1999).
27
3.3.3 Avaliação da solução e tempo de incubação
Os percentuais de reação hiposmótica do espermatozóide caprino, nas soluções de frutose,
sacarose, citrato de sódio, cloreto de sódio e frutose-citrato de sódio, todas a 50mOsmol/Kg
H
2
O e na água destilada (0mOsmol/Kg), em seus respectivos tempos de incubação, estão
expressos na Tab. 3.5.
Tabela 3.5 Percentual de reação dos espermatozóides caprinos ao teste hiposmótico em
diferentes soluções e tempos de incubação (
X
±s)
SOLUÇÕES
50mOsmol/Kg H
2
O
INC
(min)
AD* FRU SAC CIT CLO FCIT
0
70,20±14,88
- - - - -
15
72,50±10,32
77,50±6,45 74,90±10,98 82,30±4,29 76,10±12,23 75,10±5,76
30
67,80±15,13
76,00±8,90 72,20±14,76 79,90±6,26 77,20±12,99 78,80±5,55
X
70,17±13,29
a
76,75±7,60
ab
73,55±12,74
ab
81,10±5,37
b
76,65±12,29
ab
76,95±5,82
ab
X
= média; s = desvio-padrão; INC = tempo de incubação; AD = água destilada 0mOsmol/Kg;
FRU = frutose; SAC = sacarose; CIT = citrato de sódio; CLO = cloreto de sódio; FCIT = frutose-citrato
de sódio
ab
Letras diferentes na mesma linha (P<0,05)
* 0mOsmol/Kg
Trabalhos de MELO et al. (2003) e ALVES et al. (2005b) demonstraram a possibilidade do
uso da água destilada (AD) para o HOST no sêmen eqüino. Entretanto, a média geral da AD,
para o sêmen caprino in natura, neste experimento, mostrou-se inferior (P<0,05) à média da
solução de CIT a 50mOsmol/Kg H
2
O, com valores percentuais de 70,17±13,29
e 81,10±5,37,
respectivamente. E embora, tenha se mostrado semelhante (P>0,05) às outras soluções, a AD
apresentou o menor percentual médio de reação hiposmótica no espermatozóide caprino in
natura. Essa menor capacidade da AD foi observada por ALVES et al. (2005b) quando
analisaram o efeito da fixação com formol-salina tamponada, utilizada no presente
experimento, sobre os percentuais de reação hiposmótica no espermatozóide eqüino. Esses
autores observaram que a AD, quando não fixada, foi superior (P<0,05) às soluções de FRU e
CIT, ambas a 100mOsmol/Kg H
2
O. Essa fixação, talvez explique porque, neste experimento,
a AD demonstrou o menor percentual médio de reação hiposmótica. Entretanto, a proporção
de AD utilizada, também pode ter influenciado este resultado, afinal ALVES et al. (2005a),
utilizando uma proporção de 1:10, observaram a superioridade da AD (P<0,05), além da não
interferência da fixação (P>0,05); proporções de AD também foram comparadas por
BORGES et al. (2005), onde a proporção de 1:15 mostrou-se superior às demais. Contudo,
essas hipóteses, para o sêmen caprino in natura, devem ser testadas por meio de outros
28
experimentos, utilizando um maior número de repetições, ou delineadas para responder a essa
questão.
NIE e WENZEL (2001) não observaram diferença estatística entre vários tempos de
incubação, partindo de 15 minutos até os 180 minutos, assim como VAZQUEZ et al. (1997),
também não a observaram em incubações variando de 30 a 120 minutos. Corroborando com
os resultados encontrados por MELO et al. (2003) e por ALVES et al. (2005b), a ausência de
diferença (P>0,05), no presente experimento, entre os tempos de incubação, dentro da
solução, indicou a incubação por 15 minutos como satisfatória à reação hiposmótica do sêmen
caprino in natura. Tendo, a solução de CIT o maior percentual numérico de reação
hiposmótica (82,30%) dentre as soluções estudas nesta etapa.
3.3.4 Repetibilidade intra-ensaio
Os valores médios das características físicas e morfológicas do sêmen in natura dos quatros
ejaculados utilizados na avaliação da repetibilidade intra-ensaio foram expressos nas Tab. 2.
A proporção do desvio padrão em relação à média, em cada ejaculado, de cada um dos quatro
reprodutores, representou a repetibilidade intra-ensaio por animal; a média dessas variações
por animal representou a repetibilidade média intra-ensaio, que foi de 4,26%±1,68, variando
de 2,58% a 6,02% nos bodes estudados (Tab. 3.6).
Tabela 3.6 Repetibilidade intra-ensaio do teste hiposmótico de cada ejaculado
HOST
Repetição
Ejaculado MT (%) MP (%) NOR (%)
1 2 3 4 5
X
± s (%)
RIE
1
90 85 86 82 83 78 80 79
80,40±2,07
2,58
2
85 80 82 78 83 75 82 86
80,80±4,32
5,35
3
90 80 85 83 76 80 71 75
77,00±4,63
6,02
4
80 75 81 82 81 75 82 80
80,20±2,49
3,10
X
= média; s = desvio-padrão; MT = motilidade total; MP = motilidade progressiva;
NOR = espermatozóides sem alterações morfológicas; HOST = reação hiposmótica; RIE = repetibilidade
intra-ensaio
A repetibilidade média intra-ensaio observada neste experimento foi superior à encontrada por
NIE e WENZEL (2001) e inferior à observada por MELO e HENRY (1999), ressaltando que
esses autores trabalharam com sêmen eqüino. Sendo também inferior à média observada por
JEYENDRAN et al. (1984), para o sêmen humano. Esses resultados demonstram a alta
29
repetibilidade do HOST, que nesta etapa utilizou a solução de CIT a 50mOsmol/Kg H
2
O com
tempo de incubação de 15 minutos.
3.4 Conclusões
Baseado nos resultados observados na Etapa I a osmolaridade de 50mOsmol/Kg H
2
O foi
selecionada para a Etapa II, pois apresentou, quando comparada à osmolaridade de 100 e
150mOsmol/Kg H
2
O, maiores médias (P>0,05) para as alterações hiposmóticas, classificadas
como cauda geral (CG) e menores para as localizadas na peça terminal (PT). Essa escolha
decorreu da maior facilidade em observar as alterações de CG na microscopia óptica, mesmo
em aumentos menores (400x), e pela menor incidência de alterações de PT, pois estas são de
difícil observação em aumentos menores que 1.000 vezes, facilitando com isso a leitura do
teste hiposmótico.
A facilidade de obtenção por parte do profissional de campo e o baixo custo frente às demais
soluções, justificaram a adição da água destilada (AD) estéril como um possível meio
hiposmótico, na realização do teste hiposmótico para o sêmen caprino in natura. Entretanto,
neste experimento, a AD apresentou um menor capacidade média, de reação hiposmótica, às
demais soluções, sendo inclusive diferente (P<0,05) à solução de citrato de sódio a
50mOsmol/Kg H
2
O. Assim, baseado nesses resultados, a incubação do sêmen caprino in
natura, durante 15 minutos, em uma solução de citrato de sódio a 50mOsmol/Kg H
2
O, na
proporção de 1:10, foi capaz de proporcionar ao espermatozóide, um melhor percentual de
reação hiposmótica (82,30%; P>0,05) frente às demais soluções.
A variação média de 4,26%±1,68 observada entre as leituras dos espermatozóides com reação
positiva ao teste hiposmótico, utilizando a solução de CIT a50mOsmol/Kg H
2
O com tempo de
incubação de 15 minutos, demonstrou alta repetibilidade, possibilitando assim, uma margem
de segurança, na comparação entre os resultados observados por diferentes pesquisadores.
3.5 Referências bibliográficas
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33
4. EXPERIMENTO II
Influência da solução e da osmolaridade sobre os resultados do teste hiposmótico na
avaliação do sêmen congelado de caprinos da raça Böer
(Solution and osmolarity influence on the results of hypoosmotic swelling test in frozen goat
semen of the Boer breed)
ALVES, S.G.G.; CHALHOUB, M.
Escola de Medicina Veterinária – UFBA, Salvador-BA, 40170-110, Brasil.
Resumo
O objetivo deste experimento foi observar a influência da solução e da osmolaridade sobre os
resultados do teste hiposmótico (HOST) para o sêmen caprino congelado. Utilizaram-se, para
tal, 12 doses de sêmen, provenientes de dois reprodutores. Foram empregadas para o HOST
uma solução de água destilada (0mOsmol/Kg), duas soluções de açúcar (frutose e sacarose),
duas de eletrólitos (citrato de sódio e cloreto de sódio) e uma associação de açúcar-eletrólito
(frutose-citrato de sódio), estas cinco últimas, em três diferentes osmolaridades: 50, 100,
150mOsmol/Kg H
2
O. Após a descongelação, foram retiradas alíquotas do sêmen e
submetidas ao HOST em 16 tratamentos. Decorrido o tempo de incubação de 15 minutos a
37°C, fixaram-se as amostras com formol-salina para a posterior leitura do percentual de
reação hiposmótica. A osmolaridade de 0mOsmol/Kg proporcionou uma média de reação
hiposmótica (56,42%) superior (P<0,05) às osmolaridades de 100 e 150mOsmol/Kg H
2
O, as
quais apresentaram médias de 52,00% e 50,18% respectivamente. A água destilada, a frutose
e o cloreto de sódio foram às soluções que apresentaram as maiores médias de reação
hiposmótica, 56%, 53% e 53% respectivamente, sendo superiores à solução de sacarose
(P<0,05). Somente a solução de frutose apresentou diferença (P<0,05) entre as osmolaridades
dentro da mesma solução. Essa mesma diferença não foi observada quando se comparou as
soluções a 100mosmol/Kg H
2
O. Com base nos resultados observados e na facilidade de sua
obtenção, a água destilada pode ser utilizada para se realizar o HOST (15 minutos de
incubação a 37°C) no sêmen congelado de caprinos da raça Böer com um percentual médio
de reação hiposmótica de 56%.
Palavras-chave: Teste hiposmótico; osmolaridade; sêmen congelado; caprino; Böer.
Abstract
The aim of this study was to evaluate goat sperm membrane integrity using the hypoosmotic
swelling test (HOST) and compare different solutions in frozen semen. The parameters of
total and progressive motility and mass movement of twelve semen samples were evaluated
post-thaw and incubated, for 15min/37ºC, in six different solutions: distilled water
(0mOsmol/Kg), two sugars (fructose and sucrose), two electrolytes (sodium citrate and
sodium chloride) and sugar-electrolyte association (fructose-sodium citrate), these five last in
three different osmolarities (50, 100 and 150mOsmol/Kg H
2
O). The samples semen post-thaw
34
were removed and submitted to HOST in 16 treatments and, elapsed the time of incubation
(15min/37°C), fixed in formaldehyde for subsequent reading of sperm exhibiting HOST
percentage. The 0mOsmol/Kg osmolarity was superior (56.42%) to 100 and 150mOsmol/Kg
H
2
O osmolarities (P<0.05), which presented averages of 52.00% and 50.18% respectively.
The distilled water, the fructose and the sodium chloride went the solutions that presented
largest averages of sperm exhibiting HOST, 56%, 53% and 53% respectively, being superior
the sucrose solution (P<0.05). Only the fructose solution presented difference (P <0.05)
among the osmolarities inside of same solution. That same difference was not observed when
was compared the solutions to 100mosmol/Kg H
2
O. The distilled water, based on the
observed results and in the acquisition easiness, was the suggested solution to HOST
(15min/37°C) in the frozen goat semen of Boer breed, with 56% of sperm exhibiting HOST
percentage.
Key-words: Hypoosmotic swelling test; osmolarity; frozen semen; goat; Boer.
4.1 Introdução
Os eventos físico-químicos deletérios da criopreservação são irreversíveis, pois alteram as
estruturas da membrana plasmática do espermatozóide e reduzem a motilidade espermática
(WOLF et al., 1999). Por isso, os espermatozóides necessitam preencher os requisitos
mínimos para obterem uma taxa de fertilização adequada, após serem submetidas a qualquer
método de preservação. Indubitavelmente, o melhor método para se testar a eficiência de uma
determinada tecnologia de preservação de sêmen baseia-se nas taxas de fertilidade, obtidas
após sua utilização. Apesar disso, testes laboratoriais existentes para verificar a capacidade
fertilizante dos espermatozóides têm valor significativo, porém nem sempre refletem a
capacidade fertilizante da amostra estudada. Dentre os testes laboratoriais de rotina podemos
destacar a avaliação da motilidade total, motilidade progressiva, vigor e morfologia do sêmen
(RIBEIRO FILHO, 1996).
Na tentativa de melhorar a precisão na análise da viabilidade do sêmen criopreservado foram
criados métodos laboratoriais alternativos que medem com eficácia, a integridade física e
funcional do espermatozóide, tais como as colorações fluorescentes (HARRISON e
VICKERS, 1990) e o teste hiposmótico (JEYANDRAN et al., 1984). Este último com base no
transporte de fluidos, que ocorre através da membrana plasmática intacta, estrutura crucial aos
eventos relacionados ao processo de fertilização, que incluem desde a capacitação
espermática até a fusão com o oócito (PAPA et al., 2000).
Sob condições de baixa osmolaridade, a célula espermática tenta equilibrar osmoticamente os
meios intra e extracelular, resultando na expansão (swelling) de sua membrana plasmática
35
com conseguinte dobramento de cauda (DELL’AQUA JÚNIOR et al., 2002). Entretanto,
segundo ROTA et al. (2000), a osmolaridade ideal é aquela que permite o maior percentual de
espermatozóides reativos ao HOST sem, no entanto, provocar a lise celular; esta
osmolaridade, bem como o tempo no qual se atinge o percentual máximo de reatividade
espermática, varia com as espécies a serem estudadas, por isso a necessidade de estudos para
determinação destes valores, principalmente porque, segundo AISEN e VENTURINO (2004),
o percentual de reação hiposmótica está estreitamente relacionado com a capacidade
fertilizante in vitro do espermatozóide.
Assim, o objetivo do presente experimento foi observar os efeitos da (1) osmolaridade e do
(2) tipo de solução sobre o percentual de reação hiposmótica do sêmen congelado de caprinos
da raça Böer.
4.2 Material e Métodos
4.2.1 Local e animais experimentais
Foram utilizadas doze doses de sêmen congelado, provenientes de dois reprodutores da raça
Böer, em idade reprodutiva, submetidos a exames andrológicos prévios e considerados aptos à
reprodução, baseando-se nos valores sugeridos pelo Colégio Brasileiro de Reprodução
Animal (CBRA; HENRY & NEVES, 1998).
4.2.2 Congelação do sêmen
Foram utilizados somente os ejaculados que apresentaram acima de 80% de motilidade total.
As doses foram congeladas utilizando-se um diluidor de congelação à base de Tris-Gema
(SALAMON e RITAR, 1982; ROBERTS, 1986) e envasadas em palhetas francesas de
0,5mL, contendo aproximadamente 200x10
6
sptz/mL. Após o envase, as palhetas foram
encaminhadas para o resfriamento (BARBOSA, 1999), no qual foram colocadas
horizontalmente sobre plataformas de isopor, dentro de uma geladeira de 280L, com
temperatura interna estabilizada entre 4 e 5
o
C. Dessa forma, as palhetas foram submetidas a
uma curva de resfriamento de -1,07°C/min, na qual chegavam a uma temperatura de 5
o
C
após, aproximadamente, 30 minutos. As palhetas permaneceram a esta temperatura por 2
36
horas antes de serem colocadas horizontalmente dentro de uma caixa de isopor
(40x32x20cm), ficando a uma altura de 5cm da lâmina líquida de nitrogênio líquido. Após 20
minutos no vapor, as palhetas foram mergulhadas no nitrogênio líquido e colocadas em raques
devidamente identificadas e armazenadas em botijão criogênico até o momento da
descongelação.
Todo o processo de colheita e congelação do sêmen ocorreram no Laboratório de Reprodução
Animal da Escola de Medicina Veterinária - Universidade Federal da Bahia (UFBA) –
Salvador/BA.
Todos os procedimentos adotados neste estudo estiveram de acordo com os princípios éticos
na experimentação animal recomendados pelo COBEA (2005).
4.2.3 Descongelação e avaliação seminal
As doses de sêmen foram descongeladas em banho-maria a 37°C por 30 segundos. Todo o
material utilizado para as avaliações, manipulação e armazenamento do sêmen descongelado
foram previamente aquecidos e mantidos a uma temperatura de 37°C por intermédio de placa
aquecedora ou banho-maria.
Imediatamente após a descongelação foi retirada uma ou mais alíquotas de sêmen para
avaliação da motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP) e vigor espermático (VIG).
A avaliação da morfologia espermática foi realizada por meio de esfregaços preparados com o
sêmen descongelado, corados com o corante rápido para hematologia (Instant Prov®;
NewProv; Pinhais-PR). Cada esfregaço foi avaliado, posteriormente, sob microscopia ótica de
imersão (1.000x), estimando-se os percentuais de espermatozóides morfologicamente normais
e com anormalidades; todas essas avaliações seguiram as recomendações do CBRA para o
sêmen caprino congelado (HENRY e NEVES, 1998). Entretanto, as alterações morfológicas
classificadas como cauda fortemente enrolada, cauda fortemente dobrada e enrolada e cauda
enrolada sobre cabeça foram agrupadas como alterações de cauda geral (CG) visando uma
possível comparação entre os tipos de reação hiposmótica observados.
37
4.2.4 O teste hiposmótico
Visando determinar, o protocolo que permitisse um maior percentual de reação hiposmótica
positiva, ao espermatozóide caprino criopreservado, foram utilizadas seis diferentes soluções.
Uma de água destilada (0mOsmol/Kg), duas de açúcares (frutose e sacarose), duas de
eletrólitos (citrato de sódio e cloreto de sódio) e uma associação de açúcar-eletrólito (frutose-
citrato de sódio), sendo estas cinco últimas, preparadas em três osmolaridades (50, 100,
150mOsmol/Kg H
2
O), totalizando 16 soluções. A osmolaridade dessas soluções foi medida,
com base no seu ponto de congelação, em aparelho de precisão (μ OSMETTE TM, Model
5004 Automatic Osmometer – Natick MA – USA). As soluções, imediatamente após o
preparo, foram armazenadas em tubos para centrífuga estéreis e estocadas em freezer a -18°C.
Minutos antes da descongelação das doses de sêmen, as soluções hiposmóticas foram
descongeladas e acondicionadas em tubos de micro-centrífuga, inseridos numa placa
flutuante, mantidos em banho-maria a 37°C. Após a descongelação e avaliação dos
parâmetros espermáticos, alíquotas do sêmen foram submetidas ao teste hiposmótico (HOST),
sendo acrescidas, na proporção de 1:8 (10μL de sêmen em 80μL de água destilada), para a
água destilada, e 1:10 (10μL de sêmen em 100μL de solução), para as demais soluções,
reproduzindo as proporções utilizadas por ALVES et al. (2005b), e submetidas à incubação
em banho-maria a 37°C por 15 minutos.
Após o término da incubação, as amostras, utilizando água destilada, foram fixadas com 25μL
de formol-salina tamponada (HANCOCH, 1957) e as demais amostras fixadas com 50μL,
sendo armazenadas em geladeira (5°C) até o momento da leitura do percentual de reação
hiposmótica, por meio de preparação úmida entre lâmina e lamínula sob objetiva de imersão,
por microscopia de contraste de fase com aumento de 1.000 vezes. Optou-se por contar 100
células, pois, segundo JEYENDRAN et al. (1984), não houve diferença estatística entre
contar 100 ou 200 espermatozóides. Visando diminuir o erro de leitura e interpretação do
percentual de reação ao HOST, foi utilizada a fórmula proposta por MELO e HENRY (1999),
na qual, contando-se 100 células, se subtrai as anormalidades espermáticas das alterações
resultantes da incubação espermática em meio hiposmótico.
38
4.2.5 Delineamento experimental
O delineamento experimental foi de blocos ao acaso, considerando o bode como bloco,
seguindo o esquema fatorial 6x4x12 (soluções x osmolaridades x doses de sêmen),
totalizando 16 tratamentos e não 24, pois uma solução possuía osmolaridade única, sendo a
mesma não utilizada nas outras soluções. As análises descritivas: média, desvio-padrão,
mediana, valores máximo e mínimo foram realizadas conforme SAMPAIO (1998).
Algumas variáveis, quando necessário, foram transformadas em ângulo, visando normalizar a
resposta e homogeneizar as variâncias dos tratamentos analisados
Os dados foram submetidos à análise de variância e comparados pelos testes de Tukey e
Duncan, utilizando uma probabilidade de 5%. Para essas análises foi empregado o pacote
estatístico para ciências sociais SPSS (Statistical Package for the Social Sciences – version
11.0) (SPSS, 2001).
4.3 Resultados e discussão
4.3.1 Características do sêmen descongelado
Na Tab. 4.1 encontram-se os valores obtidos nas avaliações das características seminais das
amostras de sêmen descongeladas utilizadas neste experimento. As características
espermáticas não apresentaram diferença (P>0,05) entre os bodes, sendo a motilidade
progressiva a característica seminal que apresentou maior variação (50 a 70%) com média de
65,83%. A motilidade total apresentou média de 68,75% e o vigor espermático mostrou-se
praticamente semelhante (3,13 ± 0,37) em todas as doses de sêmen descongeladas.
39
Tabela 4.1 Características físicas das doses de sêmen descongeladas
Bode Dose MT (%) MP (%) VIG (0-5)
1 70 65 3
2 65 60 3
3 65 60 3
4 70 65 3,5
5 60 65 2,5
I
6 70 60 3
66,67±4,08 62,50±2,73 3,00±0,31
7 75 65 3
8 75 65 4
9 70 60 3
10 75 60 3,5
11 70 65 3
II
12 60 50 3
70,83±5,84 61,67±6,83 3,25±0,41
X
± s
12 doses
68,75±5,27 62,08±4,98 3,13±0,37
X
= média; s = desvio-padrão; MT = motilidade total; MP = motilidade progressiva; VIG = vigor
Os valores médios das características seminais após a descongelação, encontrados no presente
estudo, mostraram-se superiores aos observados por SALGUEIRO et al. (2003),
BITTENCOURT et al. (2005) e MARCO-JIMÉNEZ et al. (2006) e próximos aos valores
observados por SIVASELVAM et al. (2000) e citados por PURDY (2005) em sua revisão
sobre criopreservação de sêmen caprino. AISEN et al. (2000) observaram uma média superior
para motilidade total, entretanto, esses autores além de trabalharem com sêmen ovino,
adicionaram trealose e EDTA ao meio de congelação, conferindo assim um fator de proteção
extra quando comparado ao meio base, que foi o mesmo utilizado neste experimento.
Comparando as médias de alterações morfológicas observadas nas doses de sêmen
descongeladas (Tab. 4.2), observamos a existência de diferença (P<0,05) entre os bodes.
Entretanto, a média geral dessas alterações manteve-se abaixo dos valores máximos
recomendados pelo CBRA (HENRY e NEVES, 1998), para o sêmen descongelado da espécie
caprina.
Tabela 4.2 Alterações morfológicas no sêmen descongelado (
X
± s)
Bode ACR CAB PI (%) PP (%) PT (%) CG (%)
1*
6,33±2,06
a
1,83±1,16
a
3,50±2,58
a
3,67±2,16
a
3,33±2,06
a
4,00±2,28
a
2*
2,83±1,47
b
5,00±2,09
b
9,33±3,01
b
1,83±1,94
a
0,83±0,98
b
7,67±1,63
b
X
4,58±2,50 3,42±2,31 6,42±4,05 2,75±2,17 2,08±2,02 5,83±2,69
X
= média; s = desvio-padrão; ACR = acrossoma; CAB = cabeça; PI = peça intermediária; PP = peça
principal; PT = peça terminal; CG = cauda geral
ab
Letras diferentes na mesma coluna (P<0,05); * n = seis
40
Pôde-se observar que a média das alterações acrossomais encontradas mantiveram-se abaixo
das médias observadas por MARCO-JIMÉNEZ et al. (2006) e acima das observadas por
VIANA et al. (2006), sendo que esses autores trabalharam com sêmen caprino congelado e
resfriado respectivamente. Entretanto a média aqui observada de 4,58% manteve-se próxima à
reportada por MEMON et al. (1986) para o sêmen caprino in natura também coletado por
vagina artificial.
A média dos espermatozóides considerados normais pós-descongelação foi de 74,92% (Tab.
4.3), estando esta em média 10-20% abaixo à reportada por AISEN e VENTURINO (2004)
para o sêmen caprino/ovino, entretanto os valores preconizados por esses autores referem-se
ao sêmen in natura. Já quando comparamos essa média à reportada por MARCO-JIMÉNEZ
et al. (2005) para o sêmen ovino congelado, observamos sua superioridade. Entretanto, vale
ressaltar que esses autores utilizaram nas suas análises a citometria de fluxo, conseguindo
assim valores mais precisos e reais que os obtidos por microscopia óptica.
Tabela 4.3 Classificação dos espermatozóides quanto à morfologia no sêmen
descongelado
Bode
Espermatozóides normais
(
X
± s)
Espermatozóides anormais
(
X
± s)
Defeitos de cauda
(
X
± s)
1*
77,33±5,12 22,67±5,12 14,50±3,83
2*
72,50±3,14 27,50±3,14 19,67±3,50
X
**
74,92±4,77 25,08±4,77 17,08±4,42
X
= média; s = desvio-padrão
* n = seis; ** n = 12
O processo de criopreservação está associado com a diminuição da função espermática,
incluindo dobramentos de cauda, ruptura de membrana plasmática, redução da motilidade,
dentre outros diversos efeitos deletérios. Contudo, embora não tenha sido objetivo deste
estudo, os percentuais de motilidade total, motilidade progressiva, vigor espermático e
alterações morfológicas dos espermatozóides nas doses de sêmen descongeladas,
demonstraram que o meio de congelação utilizado manteve as características seminais acima
dos percentuais recomendados pelo CBRA (HENRY e NEVES, 1998).
4.3.2 Avaliação da solução e osmolaridade
Os valores percentuais médios dos espermatozóides reativos ao HOST nas seis diferentes
soluções e osmolaridades, com seus respectivos desvios-padrão, estão representados na Tab.
41
4.4. Foi observada diferença (P<0,05) entre as médias de reação hiposmótica na solução de
água destilada (AD) e na solução de sacarose (SAC), sendo esta última semelhante (P>0,05)
às soluções que continham citrato de sódio (CIT) em sua composição.
Tabela 4.4 Percentual de reação dos espermatozóides caprinos ao teste hiposmótico em
diferentes soluções e osmolaridades (
X
± s)
SOLUÇÕES
OSM
FRU SAC CIT CLO FCIT
AD
(0mOsmol/Kg)
50
57,17±3,81
A
50,92±6,44 51,75±6,28 53,08±5,80 50,50±6,44 56,42±7,06
100
55,25±3,19
A
48,33±5,83 50,58±5,12 54,50±11,58 51,33±9,47 56,42±7,06
150
49,50±5,26
aB
48,58±4,18
a
49,42±3,70
a
53,33±5,77
ab
50,08±6,47
ab
56,42±7,06
b
X
53,97±5,23
a
49,28±5,53
b
50,58±5,09
ab
53,64±7,97
a
50,64±7,39
ab
56,42±7,06
a
X
= média; s = desvio-padrão; OSM = osmolaridade em mOsmol/Kg H
2
O; FRU = frutose; SAC =
sacarose; CIT = citrato de sódio; CLO = cloreto de sódio; FCIT = frutose-citrato de sódio; AD = água
destilada
ab
Letras diferentes na mesma linha (P<0,05)
AB
Letras diferentes na mesma coluna (P<0,05)
A solução hiposmótica composta pela associação de frutose e citrato de sódio (FCIT) é
rotineiramente utilizada na aplicação do HOST no sêmen caprino (FONSECA et al., 2001;
SANTOS et al., 2001; BITTENCOURT et al., 2005; FONSECA et al. 2005). Observações de
JEYENDRAN et al. (1984) concluíram que essa associação permitiu um maior percentual de
reação hiposmótica ao espermatozóide humano, entretanto, no presente experimento, essa
solução permitiu percentuais semelhantes (P>0,05) aos das demais soluções utilizadas. A
ocorrência dessa variação entre experimentos, talvez, deva-se à diferença existente entre os
espermatozóides caprino e humano, afinal CURRY e WATSON (1994) sugeriram a
existência de diferenças, entre espécies, na sensibilidade da membrana plasmática em permitir
o transporte de água para o interior da célula.
O soluto utilizado no preparo da solução hiposmótica também parece influir na
permeabilidade da membrana espermática, afinal observamos que açúcares e eletrólitos
proporcionam variações da resposta hiposmótica, corroborando assim com as observações de
JEYENDRAN et al. (1984). Soluções formuladas com frutose (FRU) tendem a proporcionar
maiores percentuais de reação hiposmótica que soluções formuladas com SAC,
principalmente em osmolaridades superiores a 50mOsmol/Kg H
2
O (JEYENDRAN et al.,
1984; NEILD et al., 1999; NIE & WENZEL 2001). Assim como neste experimento,
JEYENDRAN et al. (1984) observaram que o cloreto de sódio (CLO) proporcionou médias
de reação hiposmótica mais elevadas que o CIT, entretanto o CIT e a AD proporcionaram
reações hiposmóticas de visualização mais facilitada, classificadas como cauda fortemente
42
enrolada (Fig. 4.1), detalhadas em algumas de suas diversas apresentações por FONSECA et
al. (2005).
Figura 4.1 Algumas variações de reações hiposmóticas, classificadas como cauda
fortemente enrolada, apresentadas pelos espermatozóides caprinos descongelados.
Neste experimento, excluindo a FRU, não foram observadas diferenças (P>0,05) entre os
percentuais de reação hiposmótica quando se compararam as osmolaridades dentro da
solução, contudo na osmolaridade de 150mOsmol/Kg H
2
O ocorreu diferença (P<0,05) quando
comparadas as soluções. Mesmo assim, foi observado leves incrementos nos percentuais de
reação hiposmótica nas osmolaridades abaixo de 150mOsmol/Kg H
2
O. Neste protocolo, a AD
proporcionou percentuais de reações semelhantes às soluções de FCIT e de CLO e superiores
(P<0,05) às soluções de FRU, SAC e CIT.
JEYENDRAN et al. (1984) observaram no sêmen humano que a osmolaridade de
150mOsmol/Kg H
2
O permitiu médias de reação superiores quando comparadas com
osmolaridades variando de 50 a 300mOsmol/Kg H
2
O. Entretanto, diferentes faixas osmóticas
são observadas conforme a espécie animal estudada. NEILD et al. (1999) selecionaram a faixa
de 25 a 100mOsmol/Kg H
2
O e MELO e HENRY (1999) a de 100mOsmol/Kg H
2
O, ambos
para o sêmen eqüino; Já para o sêmen caprino in natura, FONSECA et al. (2005)
selecionaram a de 125mOsmol/Kg H
2
O, pois a mesma além de permitir um número maior de
reações hiposmóticas, promoveu mais reações do tipo fortemente enrolada.
Devido às variações na eleição da osmolaridade mais adequada para o HOST nas diversas
espécies estudadas e na constante ausência de diferença (P>0,05) entre as osmolaridades
situadas na faixa osmótica de 50 a 150mOsmol/Kg H
2
O (JEYENDRAN et al., 1984; MELO
& HENRY, 1999; NIE & WENZEL, 2001; FONSECA et al.. 2005), a facilidade em observar
determinados tipos de reações hiposmóticas e o percentual de incidência dessas reações, têm
sido determinantes na seleção da solução/osmolaridade.
43
Embora NEILD et al. (1999) tenham relatado maior percentual de células reativas ao HOST
utilizando soluções de açúcares abaixo de 100mOsmol/Kg H
2
O, estes autores não testaram o
uso da AD como solução hiposmótica. No presente ensaio, a osmolaridade de 0mOsmol/Kg
(AD) não influiu no resultado (P>0,05) quando co-relacionados às soluções nas
osmolaridades abaixo de 150mOsmol/Kg H
2
O, apresentando também média de reação
levemente superior às demais osmolaridades (56,42%). Embora não estimada, a AD
promoveu maior facilidade e rapidez na leitura do HOST no sêmen caprino descongelado,
pois apresentou maior incidência de espermatozóides com reações do tipo cauda fortemente
enrolada e enrolada sobre cabeça. Essa incidência foi confirmada por MELO et al. (2005)
quando observaram que a solução de AD promoveu maiores índices de cauda fortemente
enrolada (P<0,05) quando comparada às outras soluções e osmolaridades.
4.4 Conclusões
Com base nos resultados encontrados, as osmolaridades abaixo de 150mOsmol/Kg H
2
O
permitiram (P>0,05) percentuais mais expressivos de reação hiposmótica dos
espermatozóides descongelados de caprinos da raça Böer.
Soluções formuladas com açúcares, eletrólitos ou associação de ambos, permitem níveis de
reação hiposmótica semelhantes, diferindo na incidência do tipo de reação proporcionada por
cada soluto.
A água destilada pode ser utilizada como solução hiposmótica, na avaliação da integridade da
membrana plasmática do espermatozóide caprino congelado, em decorrência da sua
acessibilidade, baixo custo e facilidade de leitura baseada no tipo de reação hiposmótica
observada.
4.5 Referências bibliográficas
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47
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Dentro dos objetivos propostos e com base nos resultados observados neste experimento,
pode-se considerar que:
A osmolaridade de 50mOsmol/Kg H
2
O, entre as osmolaridades testadas no sêmen caprino in
natura, apresentou as maiores médias (P>0,05) para as reações hiposmóticas, classificadas
como cauda geral, sendo essas reações de visualização mais rápida e precisa na microscopia
óptica de contraste de fase, facilitando com isso a leitura do teste hiposmótico;
Não houve diferença entre os tempos de incubação a 37°C, demonstrando assim, a não
necessidade de incubações por mais de 15 minutos, pois neste intervalo a quase totalidade dos
espermatozóides com membrana plasmática integra já reagiu ao teste hiposmótico;
A água destilada apresentou, para o sêmen caprino in natura, média percentual de reação
hiposmótica inferior (P>0,05) às demais soluções, sendo inclusive diferente (P<0,05) à
solução de citrato de sódio a 100mOsmol/Kg H
2
O;
A incubação do sêmen caprino in natura, durante 15 minutos, em uma solução de citrato de
sódio a 50mOsmol/Kg H
2
O, na proporção de 1:10, foi capaz de proporcionar ao
espermatozóide, uma melhor média percentual de reação hiposmótica (82,30%; P>0,05)
frente às demais soluções.
A repetibilidade do teste hiposmótico (variação média de 4,26%) possibilita uma margem de
segurança na sua utilização e na comparação entre os resultados observados por diferentes
pesquisadores;
Soluções formuladas com açúcares, eletrólitos ou associação de ambos, permitem níveis de
reação hiposmótica semelhantes no sêmen caprino congelado/descongelado, principalmente
em osmolaridades abaixo de 150mOsmol/Kg H
2
O.
48
O tipo de reação hiposmótica mostrou ser um facilitador na leitura do teste hiposmótico, pois
alguns tipos de reações são mais facilmente e rapidamente observados, na microscopia ótica
de contraste de fase.
A água destilada pode ser utilizada, como solução hiposmótica, na avaliação da integridade da
membrana plasmática do espermatozóide caprino congelado, em decorrência da sua
acessibilidade, baixo custo e facilidade de leitura, baseada no tipo de reação hiposmótica
observada.
49
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS GERAIS
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57
APÊNDICE
Tabela 3.7 Quantidade em gramas dos solutos para o preparo das soluções hiposmóticas *
Soluto (g)
Osmolaridade da solução
(mOsmol/Kg H
2
O)
Frutose Sacarose Citrato de sódio Cloreto de sódio
50 0,9006 1,7116 0,4640 0,1460
100 1,8013 3,4233 0,9280 0,2920
150 2,7020 5,1348 1,3920 0,4380
200 3,6024 6,8464 1,8560 0,5840
* Cada solução foi preparada dissolvendo a quantidade em gramas de cada soluto em 100mL de água destilada
q.s.p.; a associação frutose-citrato de sódio foi elaborada com 50% de solução de frutose + 50% de solução de
citrato de sódio.
Tabela 3.8 Média da osmolaridade das soluções de açúcares e eletrólitos
Osmolaridade (mOsmol/Kg H
2
O)*
Soluto/Solução
50 100 150 200
Frutose 49,5 100,0 153,0 206,5
Sacarose 51,5 95,5 148,0 200,0
Citrato de sódio 53,0 102,0 157,0 198,0
Cloreto de sódio 50,0 98,0 151,5 204,5
Frutose-Citrato de sódio 51,0 99,5 153,0 210,5
Aparelho de medição: μ OSMETTE TM, Model 5004 Automatic Osmometer – Natick MA – USA
* médias obtidas de duas leituras
Tabela 3.9 Formulação para o preparo da solução de formol-salina
Reagente Quantidade
Solução tampão
Fosfato de sódio (Na
2
HPO
4
) 21,68 g
A
Água destilada e deionizada (q.s.p.) 500 mL
Fosfato de potássio monobásico 22,25 g
B
Água destilada e deionizada (q.s.p.) 500 mL
Solução de NaCl
NaCl 9,01 g
Água destilada e deionizada (q.s.p.) 500 mL
Solução estoque
Solução A 200 mL
Solução B 80 mL
Solução de formol-salina
Solução estoque 100 mL
Solução de NaCl 150 mL
Formalina Comercial 62,5 mL
Água destilada e deionizada (q.s.p.) 500 mL
Fonte: Hancock. (1957).
58
Experimento I
Etapa 1
Tabela 3.10 Comparação entre as leituras das amostras incubadas nas diferentes soluções com osmolaridade de
50mOsmol/Kg H
2
O (análise de variância)
Variável dependente: Reação
Fonte
Soma dos quadrados
Tipo III
Graus de
liberdade
Quadrado
médio
F P
Modelo corrigido 192,680
a
4 48,170 0,290 0,883
Intercepto 305136,720 1 305136,720 1836,059 0,000
Soluções 192,680 4 48,170 0,290 0,883
Erro 7478,600 45
Total 312808,000 50
Total corrigido 7671,280 49
a
Quadrado R = 0,025 (quadrado R ajustado = -0,062)
Tabela 3.11 Comparação, pelos testes de Tukey e Duncan, das médias obtidas nas leituras das amostras
incubadas nas diferentes soluções com osmolaridade de 50mOsmol/Kg H
2
O (análise de variância)
Subconjunto
Teste Solução n
1
Tukey HSD
a,b
Frutose 10 74,40
Cloreto de sódio 10 78,30
Frutose-Citrato de sódio 10 78,40
Sacarose 10 79,70
Citrato de sódio 10 79,80
P
0,881
Duncan
Frutose 10 74,40
Cloreto de sódio 10 78,30
Frutose-Citrato de sódio 10 78,40
Sacarose 10 79,70
Citrato de sódio 10 79,80
P
0,413
Médias para grupos em subconjuntos homogêneos
Baseado na soma dos quadrados Tipo III
O termo erro é a média do quadrado (erro) = 166,191
a
média harmônica do tamanho da amostra = 10,000
b
alfa = 0,05
59
FRU SAC CIT CLO FCIT
Solução
40
50
60
70
80
90
100
Reação (%)
29
33
Figura 3.2 Amplitudes de resposta (reação hiposmótica) das amostras incubadas nas diferentes soluções com
osmolaridade de 50mOsmol/Kg H
2
O
Tabela 3.12 Comparação entre as leituras das amostras incubadas nas diferentes soluções com osmolaridade de
100mOsmol/Kg H
2
O (análise de variância)
Variável dependente: Reação
Fonte
Soma dos quadrados
Tipo III
Graus de
liberdade
Quadrado
médio
F P
Modelo corrigido 359,680
a
4 89,920 0,634 0,641
Intercepto 304824,320 1 304824,320 2149,341 0,000
Soluções 359,680 4 89,920 0,634 0,641
Erro 6382,000 45 141,822
Total 311566,000 50
Total corrigido 6741,680 49
a
Quadrado R = 0,053 (quadrado R ajustado = -0,031)
Tabela 3.13 Comparação, pelos testes de Tukey e Duncan, das médias obtidas nas leituras das amostras
incubadas nas diferentes soluções com osmolaridade de 100mOsmol/Kg H
2
O (análise de variância)
Subconjunto
Teste Solução n
1
Tukey HSD
a,b
Sacarose 10 73,50
Frutose 10 77,70
Cloreto de sódio 10 78,10
Frutose-Citrato de sódio 10 79,40
Citrato de sódio 10 81,70
P
0,543
Duncan
Sacarose 10 73,50
Frutose 10 77,70
Cloreto de sódio 10 78,10
Frutose-Citrato de sódio 10 79,40
Citrato de sódio 10 81,70
P
0,178
Médias para grupos em subconjuntos homogêneos
Baseado na soma dos quadrados Tipo III
O termo erro é a média do quadrado (erro) = 141,822
a
média harmônica do tamanho da amostra = 10,000
b
alfa = 0,05
60
FRU SAC CIT CLO FCIT
Solução
40
50
60
70
80
90
100
Reação (%)
34
Figura 3.3 Amplitudes de resposta (reação hiposmótica) das amostras incubadas nas diferentes soluções com
osmolaridade de 100mOsmol/Kg H
2
O
Tabela 3.14 Comparação entre as leituras das amostras incubadas nas diferentes soluções com osmolaridade de
150mOsmol/Kg H
2
O (análise de variância)
Variável dependente: Reação
Fonte
Soma dos quadrados
Tipo III
Graus de
liberdade
Quadrado
médio
F P
Modelo corrigido 377,000
a
4 94,250 0,670 0,616
Intercepto 300312,500 1 300312,500 2133,743 0,000
Soluções 377,000 4 94,250 0,670 0,616
Erro 6333,500 45 140,744
Total 307023,000 50
Total corrigido 6710,500 49
a
Quadrado R = 0,056 (quadrado R ajustado = -0,028)
Tabela 3.15 Comparação, pelos testes de Tukey e Duncan, das médias obtidas nas leituras das amostras
incubadas nas diferentes soluções com osmolaridade de 150mOsmol/Kg H
2
O (análise de variância)
Subconjunto
Teste Solução n
1
Tukey HSD
a,b
Frutose 10 72,30
Sacarose 10 77,70
Frutose-Citrato de sódio 10 78,00
Citrato de sódio 10 79,40
Cloreto de sódio 10 80,10
P
0,587
Duncan
Frutose 10 72,30
Sacarose 10 77,70
Frutose-Citrato de sódio 10 78,00
Citrato de sódio 10 79,40
Cloreto de sódio 10 80,10
P
0,198
Médias para grupos em subconjuntos homogêneos
Baseado na soma dos quadrados Tipo III
O termo erro é a média do quadrado (erro) = 140,744
a
média harmônica do tamanho da amostra = 10,000
b
alfa = 0,05
61
FRU SAC CIT CLO FCIT
Solução
40
50
60
70
80
90
100
Reação (%)
3927
35
Figura 3.4 Amplitudes de resposta (reação hiposmótica) das amostras incubadas nas diferentes soluções com
osmolaridade de 150mOsmol/Kg H
2
O
Tabela 3.16 Comparação entre as leituras das amostras incubadas nas diferentes soluções com osmolaridade de
200mOsmol/Kg H
2
O (análise de variância)
Variável dependente: Reação
Fonte
Soma dos quadrados
Tipo III
Graus de
liberdade
Quadrado
médio
F P
Modelo corrigido 3927,720
a
4 981,930 6,091 0,001
Intercepto 246823,380 1 246823,380 1531,184 0,000
Soluções 3927,720 4 981,930 6,091 0,001
Erro 7253,900 45 161,198
Total 258005,000 50
Total corrigido 11181,620 49
a
Quadrado R = 0,351 (quadrado R ajustado = 0,294)
Tabela 3.17 Comparação, pelos testes de Tukey e Duncan, das médias obtidas nas leituras das amostras
incubadas nas diferentes soluções com osmolaridade de 200mOsmol/Kg H
2
O (análise de variância)
Subconjunto
Teste Solução n
1 2
Tukey HSD
a,b
Sacarose 10 52,60
Frutose 10 73,60
Citrato de sódio 10 74,10
Cloreto de sódio 10 75,30
Frutose-Citrato de sódio 10 75,70
P
1,000 0,996
Duncan
Sacarose 10 52,60
Frutose 10 73,60
Citrato de sódio 10 74,10
Cloreto de sódio 10 75,30
Frutose-Citrato de sódio 10 75,70
P
1,000 0,740
Médias para grupos em subconjuntos homogêneos
Baseado na soma dos quadrados Tipo III
O termo erro é a média do quadrado (erro) = 161,198
a
média harmônica do tamanho da amostra = 10,000
b
alfa = 0,05
62
FRU SAC CIT CLO FCIT
Solução
20
40
60
80
100
Reação (%)
36
24
32
132
Figura 3.5 Amplitudes de resposta (reação hiposmótica) das amostras incubadas nas diferentes soluções com
osmolaridade de 200mOsmol/Kg H
2
O
Tabela 3.18 Comparação entre as leituras das amostras incubadas em diferentes osmolaridades (análise de
variância)
Variável dependente: Reação
Fonte
Soma dos quadrados
Tipo III
Graus de
liberdade
Quadrado
médio
F P
Modelo corrigido 2200,900
a
3 733,633 4,451 0,005
Intercepto 1154896,020 1 1154896,020 7006,936 0,000
Osmolaridades 2200,900 3 733,633 4,451 0,005
Erro 32305,080 196 164,822
Total 1189402,000 200
Total corrigido 34505,980 199
a
Quadrado R = 0,064 (quadrado R ajustado = 0,049)
Tabela 3.19 Comparação, pelos testes de Tukey e Duncan, das médias obtidas nas leituras das amostras
incubadas em diferentes osmolaridades (análise de variância)
Subconjunto
Teste Osmolaridade n
1 2
Tukey HSD
a,b
200mOsmol/Kg H
2
O 50 70,26
150mOsmol/Kg H
2
O 50 77,50
100mOsmol/Kg H
2
O 50 78,08
50mOsmol/Kg H
2
O 50 78,12
P
1,000 0,995
Duncan
200mOsmol/Kg H
2
O 50 70,26
150mOsmol/Kg H
2
O 50 77,50
100mOsmol/Kg H
2
O 50 78,08
50mOsmol/Kg H
2
O 50 78,12
P
1,000 0,822
Médias para grupos em subconjuntos homogêneos
Baseado na soma dos quadrados Tipo III
O termo erro é a média do quadrado (erro) = 164,822
a
média harmônica do tamanho da amostra = 50,000
b
alfa = 0,05
63
50mOsmol 100mOsmol 150mOsmol 5200mOsmol
mOsmol
20
40
60
80
100
Reação (%)
34
28
24
148
33
21
25
23
35
39
27
Figura 3.6 Amplitudes de resposta (reação hiposmótica) das amostras incubadas em diferentes osmolaridades
Tabela 3.20 Comparação das médias de reação hiposmótica na peça intermediária do espermatozóide das
amostras incubadas em diferentes osmolaridades (análise de variância)
Variável dependente: Peça intermediária (PI)
Fonte
Soma dos quadrados
Tipo III
Graus de
liberdade
Quadrado
médio
F P
Modelo corrigido 4242,295
a
3 1414,098 19,750 0,000
Intercepto 5335,445 1 5335,445 74,519 0,000
Osmolaridades 4242,295 3 1414,098 19,750 0,000
Erro 14033,260 196 71,598
Total 23611,000 200
Total corrigido 18275,555 199
a
Quadrado R = 0,232 (quadrado R ajustado = 0,220)
Tabela 3.21 Comparação, pelos testes de Tukey e Duncan, das médias de reação hiposmótica na peça
intermediária do espermatozóide das amostras incubadas em diferentes osmolaridades (análise de
variância)
Subconjunto
Teste Osmolaridade n
1 2 3
Tukey HSD
a,b
50mOsmol/Kg H
2
O 50 0,98
100mOsmol/Kg H
2
O 50 1,70 1,70
150mOsmol/Kg H
2
O 50 5,38
200mOsmol/Kg H
2
O 50 12,60
P
0,974 0,134 1,000
Duncan
50mOsmol/Kg H
2
O 50 0,98
100mOsmol/Kg H
2
O 50 1,70
150mOsmol/Kg H
2
O 50 5,38
200mOsmol/Kg H
2
O 50 12,60
P
0,671 1,000 1,000
Médias para grupos em subconjuntos homogêneos
Baseado na soma dos quadrados Tipo III
O termo erro é a média do quadrado (erro) = 71,598
a
média harmônica do tamanho da amostra = 50,000
b
alfa = 0,05
64
50mOsmol 100mOsmol 150mOsmol 200mOsmol
Osmolaridade
0
10
20
30
40
50
60
PI (%)
136
51
98
58
152
192
112
102
62
12
92
82
42
122
48
2
68
Figura 3.7 Amplitudes das médias de reação hiposmótica na peça intermediária do espermatozóide das
amostras incubadas em diferentes osmolaridades
Tabela 3.22 Comparação das médias de reação hiposmótica na peça principal do espermatozóide das amostras
incubadas em diferentes osmolaridades (análise de variância)
Variável dependente: Peça principal (PP)
Fonte
Soma dos quadrados
Tipo III
Graus de
liberdade
Quadrado
médio
F P
Modelo corrigido 626,855
a
3 208,952 0,588 0,624
Intercepto 36531,045 1 36531,045 102,773 0,000
Osmolaridade 626,855 3 208,952 0,588 0,624
Erro 69669,100 196 355,455
Total 105827,000 200
Total corrigido 70295,955 199
a
Quadrado R = 0,009 (quadrado R ajustado = -0,006)
Tabela 3.23 Comparação, pelos testes de Tukey e Duncan, das médias de reação hiposmótica na peça principal
do espermatozóide das amostras incubadas em diferentes osmolaridades (análise de variância)
Subconjunto
Teste Osmolaridade n
1
Tukey HSD
a,b
150mOsmol/Kg H
2
O 50 10,60
200mOsmol/Kg H
2
O 50 13,82
50mOsmol/Kg H
2
O 50 14,30
100mOsmol/Kg H
2
O 50 15,34
P
0,591
Duncan
150mOsmol/Kg H
2
O 50 10,60
200mOsmol/Kg H
2
O 50 13,82
50mOsmol/Kg H
2
O 50 14,30
100mOsmol/Kg H
2
O 50 15,34
P
0,258
Médias para grupos em subconjuntos homogêneos
Baseado na soma dos quadrados Tipo III
O termo erro é a média do quadrado (erro) = 355,455
a
média harmônica do tamanho da amostra = 50,000
b
alfa = 0,05
65
50mOsmol 100mOsmol 150mOsmol 200mOsmol
Osmolaridade
0
20
40
60
80
100
PP (%)
174
179 56
53
16
132
52
172
73
71
34
84
164
6
4
14
191
62
26
182
63
102
24
Figura 3.8 Amplitudes das médias de reação hiposmótica na peça principal do espermatozóide das amostras
incubadas em diferentes osmolaridades
Tabela 3.24 Comparação das médias de reação hiposmótica na peça terminal do espermatozóide das amostras
incubadas em diferentes osmolaridades (análise de variância)
Variável dependente: Peça terminal (PT)
Fonte
Soma dos quadrados
Tipo III
Graus de
liberdade
Quadrado
médio
F P
Modelo corrigido 6165,895
a
3 2055,298 17,711 0,000
Intercepto 7975,845 1 7975,845 68,729 0,000
Osmolaridade 6165,895 3 2055,298 17,711 0,000
Erro 22745,260 196 116,047
Total 36887,000 200
Total corrigido 28911,155 199
a
Quadrado R = 0,213 (quadrado R ajustado = 0,201)
Tabela 3.25 Comparação, pelos testes de Tukey e Duncan, das médias de reação hiposmótica na peça terminal do
espermatozóide das amostras incubadas em diferentes osmolaridades (análise de variância)
Subconjunto
Teste Osmolaridade n
1 2 3
Tukey HSD
a,b
50mOsmol/Kg H
2
O 50 0,94
100mOsmol/Kg H
2
O 50 2,06 2,06
150mOsmol/Kg H
2
O 50 7,26
200mOsmol/Kg H
2
O 50 15,00
P
0,954 0,078 1,000
Duncan
50mOsmol/Kg H
2
O 50 0,94
100mOsmol/Kg H
2
O 50 2,06
150mOsmol/Kg H
2
O 50 7,26
200mOsmol/Kg H
2
O 50 15,00
P
0,604 1,000 1,000
Médias para grupos em subconjuntos homogêneos
Baseado na soma dos quadrados Tipo III
O termo erro é a média do quadrado (erro) = 116,047
a
média harmônica do tamanho da amostra = 50,000
b
alfa = 0,05
66
50mOsmol 100mOsmol 150mosmol 200mOsmol
Osmolaridade
0
10
20
30
40
50
60
PT (%)
5955
135
162
91
82
106
104
95
161
67
65
68
145
66
Figura 3.9 Amplitudes das médias de reação hiposmótica na peça terminal do espermatozóide das amostras
incubadas em diferentes osmolaridades
Tabela 3.26 Comparação das médias de reação hiposmótica, classificadas como cauda geral do espermatozóide,
das amostras incubadas em diferentes osmolaridades (análise de variância)
Variável dependente: Cauda geral (CG)
Fonte
Soma dos quadrados
Tipo III
Graus de
liberdade
Quadrado
médio
F P
Modelo corrigido 33510,440
a
3 11170,147 13,218 0,000
Intercepto 790778,880 1 790778,880 935,761 0,000
Osmolaridade 33510,440 3 11170,147 13,218 0,000
Erro 165632,680 196 845,065
Total 989922,000 200
Total corrigido 199143,120 199
a
Quadrado R = 0,168 (quadrado R ajustado = 0,156)
Tabela 3.27 Comparação, pelos testes de Tukey e Duncan, das médias de reação hiposmótica, classificadas como
cauda geral do espermatozóide, das amostras incubadas em diferentes osmolaridades (análise de
variância)
Subconjunto
Teste Osmolaridade n
1 2
Tukey HSD
a,b
200mOsmol/Kg H
2
O 50 40,96
150mOsmol/Kg H
2
O 50 66,08
100mOsmol/Kg H
2
O 50 70,78
50mOsmol/Kg H
2
O 50 73,70
P
1,000 0,557
Duncan
200mOsmol/Kg H
2
O 50 40,96
150mOsmol/Kg H
2
O 50 66,08
100mOsmol/Kg H
2
O 50 70,78
50mOsmol/Kg H
2
O 50 73,70
P
1,000 0,220
Médias para grupos em subconjuntos homogêneos
Baseado na soma dos quadrados Tipo III
O termo erro é a média do quadrado (erro) = 845,065
a
média harmônica do tamanho da amostra = 50,000
b
alfa = 0,05
67
50mOsmol 100mOsmol 150mOsmol 200mOsmol
Osmolaridade
0
20
40
60
80
100
CG (%)
132
9252
14
53
62
102 63
182
24
68
Figura 3.10 Amplitudes das médias de reação hiposmótica, classificadas como cauda geral do espermatozóide,
das amostras incubadas em diferentes osmolaridades
Etapa 2
Tabela 3.28 Comparação entre as leituras das amostras incubadas em água destilada (0mOsmol/Kg) nos três
tempo de incubação (análise de variância)
Variável dependente: Reação
Fonte
Soma dos quadrados
Tipo III
Graus de
liberdade
Quadrado
médio
F P
Modelo corrigido 110,467
a
2 55,233 0,297 0,745
Intercepto 147700,833 1 147700,833 795,405 0,000
Incubação 110,467 2 55,233 0,297 0,745
Erro 5013,700 27 185,693
Total 152825,000 30
Total corrigido 5124,167 29
a
Quadrado R = 0,022 (quadrado R ajustado = -0,051)
Tabela 3.29 Comparação, pelos testes de Tukey e Duncan, das médias obtidas nas leituras das amostras
incubadas em água destilada (0mOsmol/Kg) nos três tempo de incubação (análise de variância)
Subconjunto
Teste Incubação n
1
Tukey HSD
a,b
30 minutos 10 67,80
0 minuto (leitura imediata) 10 70,20
15 minutos 10 72,50
P
0,724
Duncan
30 minutos 10 67,80
0 minuto (leitura imediata) 10 70,20
15 minutos 10 72,50
P
0,474
Médias para grupos em subconjuntos homogêneos
Baseado na soma dos quadrados Tipo III
O termo erro é a média do quadrado (erro) = 185,693
a
média harmônica do tamanho da amostra = 10,000
b
alfa = 0,05
68
0 min (leitura imediata) 15 min 30 min
Tempo de incubação
30
40
50
60
70
80
90
Reação (%)
29
16
Figura 3.11 Amplitudes de resposta (reação hiposmótica) das amostras incubadas em água destilada
(0mOsmol/Kg) nos três tempo de incubação
Tabela 3.30 Comparação entre as leituras das amostras incubadas por 15 minutos nas diferentes soluções a
50mOsmol/Kg H
2
O (análise de variância)
Variável dependente: Reação
Fonte
Soma dos quadrados
Tipo III
Graus de
liberdade
Quadrado
médio
F P
Modelo corrigido 552,600
a
5 110,520 1,410 0,235
Intercepto 350217,600 1 350217,600 4468,961 0,000
Solução 552,600 5 110,520 1,410 0,235
Erro 4231,800 54 78,367
Total 355002,000 60
Total corrigido 4784,400 59
a
Quadrado R = 0,116 (quadrado R ajustado = 0,034)
Tabela 3.31 Comparação, pelos testes de Tukey e Duncan, das médias obtidas nas leituras das amostras
incubadas por 15 minutos nas diferentes soluções a 50mOsmol/Kg H
2
O (análise de variância)
Subconjunto
Teste Solução n
1 2
Tukey HSD
a,b
Água destilada (0mOsmol/Kg) 10 72,50
Sacarose 10 74,90
Frutose-Citrato de sódio 10 75,10
Cloreto de sódio 10 76,10
Frutose 10 77,50
Citrato de sódio 10 82,30
P
0,150
Duncan
Água destilada (0mOsmol/Kg) 10 72,50
Sacarose 10 74,90 74,90
Frutose-Citrato de sódio 10 75,10 75,10
Cloreto de sódio 10 76,10 76,10
Frutose 10 77,50 77,50
Citrato de sódio 10 82,30
P
0,269 0,101
Médias para grupos em subconjuntos homogêneos
Baseado na soma dos quadrados Tipo III
O termo erro é a média do quadrado (erro) = 78,367
a
média harmônica do tamanho da amostra = 10,000
b
alfa = 0,05
69
AD FRU SAC CIT CLO FCIT
Solução
50
60
70
80
90
Reação (%)
101
23
30
Figura 3.12 Amplitudes de resposta (reação hiposmótica) das amostras incubadas por 15 minutos nas diferentes
soluções a 50mOsmol/Kg H
2
O
Tabela 3.32 Comparação entre as leituras das amostras incubadas por 30 minutos nas diferentes soluções a
50mOsmol/Kg H
2
O (análise de variância)
Variável dependente: Reação
Fonte
Soma dos quadrados
Tipo III
Graus de
liberdade
Quadrado
médio
F P
Modelo corrigido 1033,683
a
5 206,737 1,621 0,170
Intercepto 340356,017 1 340356,017 2668,567 0,000
Solução 1033,683 5 206,737 1,621 0,170
Erro 6887,300 54 127,543
Total 348277,000 60
Total corrigido 7920,983 59
a
Quadrado R = 0,130 (quadrado R ajustado = 0,050)
Tabela 3.33 Comparação, pelos testes de Tukey e Duncan, das médias obtidas nas leituras das amostras
incubadas por 30 minutos nas diferentes soluções a 50mOsmol/Kg H
2
O (análise de variância)
Subconjunto
Teste Solução n
1 2
Tukey HSD
a,b
Água destilada (0mOsmol/Kg) 10 67,80
Sacarose 10 72,20
Frutose 10 76,00
Cloreto de sódio 10 77,20
Frutose-Citrato de sódio 10 78,80
Citrato de sódio 10 79,90
P
0,176
Duncan
Água destilada (0mOsmol/Kg) 10 67,80
Sacarose 10 72,20 72,20
Frutose 10 76,00 76,00
Cloreto de sódio 10 77,20 77,20
Frutose-Citrato de sódio 10 78,80 78,80
Citrato de sódio 10 79,90
P
0,055 0,182
Médias para grupos em subconjuntos homogêneos
Baseado na soma dos quadrados Tipo III
O termo erro é a média do quadrado (erro) = 127,543
a
média harmônica do tamanho da amostra = 10,000
b
alfa = 0,05
70
AD FRU SAC CIT CLO FCIT
Solução
30
40
50
60
70
80
90
Reação (%)
24
29
16
Figura 3.13 Amplitudes de resposta (reação hiposmótica) das amostras incubadas por 30 minutos nas diferentes
soluções a 50mOsmol/Kg H
2
O
Etapa 3
Tabela 3.34 Comparação entre as leituras das cinco alíquotas de cada ejaculado incubadas na solução de citrato
de sódio a 50mOsmol/Kg H
2
O (análise de variância)
Variável dependente: Reação
Fonte
Soma dos quadrados
Tipo III
Graus de
liberdade
Quadrado
médio
F P
Modelo corrigido 46,000
a
3 15,333 1,210 0,338
Intercepto 126723,200 1 126723,200 9997,886 0,000
Ejaculado 46,000 3 15,333 1,210 0,338
Erro 202,800 16 12,675
Total 126972,000 20
Total corrigido 248,800 19
a
Quadrado R = 0,185 (quadrado R ajustado = 0,032)
Tabela 3.35 Comparação, pelos testes de Tukey e Duncan, das médias obtidas nas leituras das cinco alíquotas de
cada ejaculado incubadas na solução de citrato de sódio a 50mOsmol/Kg H
2
O (análise de variância)
Subconjunto
Teste Ejaculado n
1
Tukey HSD
a,b
3 5 77,00
4 5 80,20
1 5 80,40
2 5 80,80
P
0,362
Duncan
3 5 77,00
4 5 80,20
1 5 80,40
2 5 80,80
P
0,139
Médias para grupos em subconjuntos homogêneos
Baseado na soma dos quadrados Tipo III
O termo erro é a média do quadrado (erro) = 12,675
a
média harmônica do tamanho da amostra = 5,000
b
alfa = 0,05
71
1234
Ejaculado
70
75
80
85
Reação (%)
18
Figura 3.14 Amplitudes de resposta (reação hiposmótica) das cinco alíquotas de cada ejaculado incubadas na
solução de citrato de sódio a 50mOsmol/Kg H
2
O
Experimento II
Tabela 4.5 Comparação entre as leituras das amostras incubadas em água destilada x soluções a 50mOsmol/Kg
H
2
O (análise de variância)
Variável dependente: Reação
Fonte
Soma dos quadrados
Tipo III
Graus de
liberdade
Quadrado
médio
F P
Modelo corrigido 487,611
a
5 97,522 2,651 0,030
Intercepto 204586,722 1 204586,722 5562,017 0,000
Solução 487,611 5 97,522 2,651 0,030
Erro 2427,667 66 36,783
Total 207502,000 72
Total corrigido 2915,278 71
a
Quadrado R = 0,167 (quadrado R ajustado = 0,104)
72
Tabela 4.6 Comparação, pelos testes de Tukey e Duncan, das médias obtidas nas leituras das amostras
incubadas em água destilada x soluções a 50mOsmol/Kg H
2
O (análise de variância)
Subconjunto
Teste Solução n
1 2 3
Tukey HSD
a,b
Frutose-Citrato de sódio 12 50,50
Sacarose 12 50,92
Citrato de sódio 12 51,75
Cloreto de sódio 12 53,08
Água destilada 12 56,42
Frutose 12 57,17
P
0,090
Duncan
Frutose-Citrato de sódio 12 50,50
Sacarose 12 50,92
Citrato de sódio 12 51,75 51,75
Cloreto de sódio 12 53,08 53,08 53,08
Água destilada 12 56,42 56,42
Frutose 12 57,17
P
0,349 0,079 0,124
Médias para grupos em subconjuntos homogêneos
Baseado na soma dos quadrados Tipo III
O termo erro é a média do quadrado (erro) = 36,783
a
média harmônica do tamanho da amostra = 12,000
b
alfa = 0,05
AD FRU SAC CIT CLO FCIT
Solução
40
50
60
70
Reação hiposmótica (%)
75
24
Figura 4.2 Amplitudes de resposta (reação hiposmótica) das amostras incubadas na água destilada x soluções
a 50mOsmol/Kg H
2
O
Tabela 4.7 Comparação entre as leituras das amostras incubadas em água destilada x soluções a
100mOsmol/Kg H
2
O (análise de variância)
Variável dependente: Reação
Fonte
Soma dos quadrados
Tipo III
Graus de
liberdade
Quadrado
médio
F P
Modelo corrigido 587,569
a
5 117,514 2,047 0,083
Intercepto 200239,014 1 200239,014 3488,469 0,000
Solução 587,569 5 117,514 2,047 0,083
Erro 3788,417 66 57,400
Total 204615,000 72
Total corrigido 4375,986 71
a
Quadrado R = 0,134 (quadrado R ajustado = 0,069)
73
Tabela 4.8 Comparação, pelos testes de Tukey e Duncan, das médias obtidas nas leituras das amostras
incubadas em água destilada x soluções a 100mOsmol/Kg H
2
O (análise de variância)
Subconjunto
Teste Solução n
1 2
Tukey HSD
a,b
Sacarose 12 48,33
Citrato de sódio 12 50,58
Frutose-Citrato de sódio 12 51,33
Cloreto de sódio 12 54,50
Frutose 12 55,25
Água destilada 12 56,42
P
0,108
Duncan
Sacarose 12 48,33
Citrato de sódio 12 50,58 50,58
Frutose-Citrato de sódio 12 51,33 51,33
Cloreto de sódio 12 54,50 54,50
Frutose 12 55,25
Água destilada 12 56,42
P
0,072 0,097
Médias para grupos em subconjuntos homogêneos
Baseado na soma dos quadrados Tipo III
O termo erro é a média do quadrado (erro) = 57,400
a
média harmônica do tamanho da amostra = 12,000
b
alfa = 0,05
AD FRU SAC CIT CLO FCIT
Solução
20
30
40
50
60
70
80
Reação hiposmótica (%)
76
79
Figura 4.3 Amplitudes de resposta (reação hiposmótica) das amostras incubadas na água destilada x soluções
a 100mOsmol/Kg H
2
O
Tabela 4.9 Comparação entre as leituras das amostras incubadas em água destilada x soluções a
150mOsmol/Kg H
2
O (análise de variância)
Variável dependente: Reação
Fonte
Soma dos quadrados
Tipo III
Graus de
liberdade
Quadrado
médio
F P
Modelo corrigido 551,111
a
5 110,222 3,592 0,006
Intercepto 188907,556 1 188907,556 6155,974 0,000
Solução 551,111 5 110,222 3,592 0,006
Erro 2025,333 66 30,687
Total 191484,000 72
Total corrigido 2576,444 71
a
Quadrado R = 0,214 (quadrado R ajustado = 0,154)
74
Tabela 4.10 Comparação, pelos testes de Tukey e Duncan, das médias obtidas nas leituras das amostras
incubadas em água destilada x soluções a 150mOsmol/Kg H
2
O (análise de variância)
Subconjunto
Teste Solução n
1 2
Tukey HSD
a,b
Sacarose 12 48,58
Citrato de sódio 12 49,42
Frutose 12 49,50
Frutose-Citrato de sódio 12 50,08 50,08
Cloreto de sódio 12 53,33 53,33
Água destilada 12 56,42
P
0,300 0,070
Duncan
Sacarose 12 48,58
Citrato de sódio 12 49,42
Frutose 12 49,50
Frutose-Citrato de sódio 12 50,08
Cloreto de sódio 12 53,33 53,33
Água destilada 12 56,42
P
0,064 0,177
Médias para grupos em subconjuntos homogêneos
Baseado na soma dos quadrados Tipo III
O termo erro é a média do quadrado (erro) = 30,687
a
média harmônica do tamanho da amostra = 12,000
b
alfa = 0,05
AD FRU SAC CIT CLO FCIT
Solução
35
40
45
50
55
60
65
Reação hiposmótica (%)
55
16
Figura 4.4 Amplitudes de resposta (reação hiposmótica) das amostras incubadas na água destilada x soluções
a 150mOsmol/Kg H
2
O
Tabela 4.11 Comparação entre as leituras das amostras incubadas na solução de frutose (análise de variância)
Variável dependente: Reação
Fonte
Soma dos quadrados
Tipo III
Graus de
liberdade
Quadrado
médio
F P
Modelo corrigido 382,056
a
2 191,028 10,927 0,000
Intercepto 104868,028 1 104868,028 5998,518 0,000
Osmolaridade 382,056 2 191,028 10,927 0,000
Erro 576,917 33 17,482
Total 105827,000 36
Total corrigido 958,972 35
a
Quadrado R = 0,398 (quadrado R ajustado = 0,362)
75
Tabela 4.12 Comparação, pelos testes de Tukey e Duncan, das médias obtidas nas leituras das amostras
incubadas na solução de frutose (análise de variância)
Subconjunto
Teste Osmolaridade n
1 2
Tukey HSD
a,b
150 mOsmol/Kg H
2
O 12 49,50
100 mOsmol/Kg H
2
O 12 55,25
50 mOsmol/Kg H
2
O 12 57,17
P
1,000 0,507
Duncan
150 mOsmol/Kg H
2
O 12 49,50
100 mOsmol/Kg H
2
O 12 55,25
50 mOsmol/Kg H
2
O 12 57,17
P
1,000 0,270
Médias para grupos em subconjuntos homogêneos
Baseado na soma dos quadrados Tipo III
O termo erro é a média do quadrado (erro) = 17,482
a
média harmônica do tamanho da amostra = 12,000
b
alfa = 0,05
50mOsmol 100mOsmol 150mOsmol
Osmolaridade
40
45
50
55
60
65
70
Reação hiposmótica (%)
Figura 4.5 Amplitudes de resposta (reação hiposmótica) das amostras incubadas na solução de frutose
Tabela 4.13 Comparação entre as leituras das amostras incubadas na solução de sacarose (análise de variância)
Variável dependente: Reação
Fonte
Soma dos quadrados
Tipo III
Graus de
liberdade
Quadrado
médio
F P
Modelo corrigido 48,722
a
2 24,361 0,785 0,465
Intercepto 87418,778 1 87418,778 2815,832 0,000
Osmolaridade 48,722 2 24,361 0,785 0,465
Erro 1024,500 33 31,045
Total 88492,000 36
Total corrigido 1073,222 35
a
Quadrado R = 0,045 (quadrado R ajustado = -0,012)
76
Tabela 4.14 Comparação, pelos testes de Tukey e Duncan, das médias obtidas nas leituras das amostras
incubadas na solução de sacarose (análise de variância)
Subconjunto
Teste Osmolaridade n
1
Tukey HSD
a,b
100 mOsmol/Kg H
2
O 12 48,33
150 mOsmol/Kg H
2
O 12 48,58
50 mOsmol/Kg H
2
O 12 50,92
P
0,499
Duncan
100 mOsmol/Kg H
2
O 12 48,33
150 mOsmol/Kg H
2
O 12 48,58
50 mOsmol/Kg H
2
O 12 50,92
P
0,292
Médias para grupos em subconjuntos homogêneos
Baseado na soma dos quadrados Tipo III
O termo erro é a média do quadrado (erro) = 31,045
a
média harmônica do tamanho da amostra = 12,000
b
alfa = 0,05
50mOsmol 100mOsmol 150mOsmol
Osmolaridade
35
40
45
50
55
60
Reação hiposmótica (%)
55
Figura 4.6 Amplitudes de resposta (reação hiposmótica) das amostras incubadas na solução de sacarose
Tabela 4.15 Comparação entre as leituras das amostras incubadas na solução de citrato de sódio (análise de
variância)
Variável dependente: Reação
Fonte
Soma dos quadrados
Tipo III
Graus de
liberdade
Quadrado
médio
F P
Modelo corrigido 32,667
a
2 16,333 0,617 0,546
Intercepto 92112,250 1 92112,250 3477,591 0,000
Osmolaridade 32,667 2 16,333 0,617 0,546
Erro 874,083 33 26,487
Total 93019,000 36
Total corrigido 906,750 35
a
Quadrado R = 0,036 (quadrado R ajustado = -0,022)
77
Tabela 4.16 Comparação, pelos testes de Tukey e Duncan, das médias obtidas nas leituras das amostras
incubadas na solução de citrato de sódio (análise de variância)
Subconjunto
Teste Osmolaridade n
1
Tukey HSD
a,b
150 mOsmol/Kg H
2
O 12 49,42
100 mOsmol/Kg H
2
O 12 50,58
50 mOsmol/Kg H
2
O 12 51,75
P
0,514
Duncan
150 mOsmol/Kg H
2
O 12 49,42
100 mOsmol/Kg H
2
O 12 50,58
50 mOsmol/Kg H
2
O 12 51,75
P
0,303
Médias para grupos em subconjuntos homogêneos
Baseado na soma dos quadrados Tipo III
O termo erro é a média do quadrado (erro) = 26,487
a
média harmônica do tamanho da amostra = 12,000
b
alfa = 0,05
50mOsmol 100mOsmol 150mOsmol
Osmolaridade
40
45
50
55
60
65
70
Reação hiposmótica (%)
24
Figura 4.8 Amplitudes de resposta (reação hiposmótica) das amostras incubadas na solução de citrato de sódio
Tabela 4.17 Comparação entre as leituras das amostras incubadas na solução de cloreto de sódio (análise de
variância)
Variável dependente: Reação
Fonte
Soma dos quadrados
Tipo III
Graus de
liberdade
Quadrado
médio
F P
Modelo corrigido 13,722
a
2 6,861 0,102 0,903
Intercepto 103576,694 1 103576,694 1543,419 0,000
Osmolaridade 13,722 2 6,861 0,102 0,903
Erro 2214,583 33 67,109
Total 105805,000 36
Total corrigido 2228,306 35
a
Quadrado R = 0,006 (quadrado R ajustado = -0,054)
78
Tabela 4.18 Comparação, pelos testes de Tukey e Duncan, das médias obtidas nas leituras das amostras
incubadas na solução de cloreto de sódio (análise de variância)
Subconjunto
Teste Osmolaridade n
1
Tukey HSD
a,b
50 mOsmol/Kg H
2
O 12 53,08
150 mOsmol/Kg H
2
O 12 53,33
100 mOsmol/Kg H
2
O 12 54,50
P
0,906
Duncan
50 mOsmol/Kg H
2
O 12 53,08
150 mOsmol/Kg H
2
O 12 53,33
100 mOsmol/Kg H
2
O 12 54,50
P
0,694
Médias para grupos em subconjuntos homogêneos
Baseado na soma dos quadrados Tipo III
O termo erro é a média do quadrado (erro) = 67,109
a
média harmônica do tamanho da amostra = 12,000
b
alfa = 0,05
50mOsmol 100mOsmol 150mOsmol
Osmolaridade
20
30
40
50
60
70
80
Reação hiposmótica (%)
76
75
Figura 4.9 Amplitudes de resposta (reação hiposmótica) das amostras incubadas na solução de cloreto de
sódio
Tabela 4.19 Comparação entre as leituras das amostras incubadas na solução de frutose-citrato de sódio (análise
de variância)
Variável dependente: Reação
Fonte
Soma dos quadrados
Tipo III
Graus de
liberdade
Quadrado
médio
F P
Modelo corrigido 9,722
a
2 4,861 0,084 0,919
Intercepto 92314,694 1 92314,694 1599,502 0,000
Osmolaridade 9,722 2 4,861 0,084 0,919
Erro 1904,583 33 57,715
Total 94229,000 36
Total corrigido 1914,306 35
a
Quadrado R = 0,005 (quadrado R ajustado = -0,055)
79
Tabela 4.20 Comparação, pelos testes de Tukey e Duncan, das médias obtidas nas leituras das amostras
incubadas na solução de frutose-citrato de sódio (análise de variância)
Subconjunto
Teste Osmolaridade n
1
Tukey HSD
a,b
150 mOsmol/Kg H
2
O 12 50,08
50 mOsmol/Kg H
2
O 12 50,50
100 mOsmol/Kg H
2
O 12 51,33
P
0,915
Duncan
150 mOsmol/Kg H
2
O 12 50,08
50 mOsmol/Kg H
2
O 12 50,50
100 mOsmol/Kg H
2
O 12 51,33
P
0,708
Médias para grupos em subconjuntos homogêneos
Baseado na soma dos quadrados Tipo III
O termo erro é a média do quadrado (erro) = 57,715
a
média harmônica do tamanho da amostra = 12,000
b
alfa = 0,05
50mOsmol 100mOsmol 150mOsmol
Osmolaridade
30
40
50
60
70
Reação hiposmótica (%)
79
16
Figura 4.10. Amplitudes de resposta (reação hiposmótica) das amostras incubadas na solução de Frutose-Citrato
de sódio
Tabela 4.21 Correlação de Pearson entre o percentual de reação hiposmótica total e os parâmetros espermáticos
(n=192)
Característica Reação Motilidade total Motilidade progressiva Vigor
Reação -
Motilidade total
0,188
P=0,009
-
Motilidade progressiva
-0,084
P=0,245
0,540
P=0,000
-
Vigor
0,105
P=0,148
0,657
P=0,000
0,333
P=0,000
-
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