ads:
i
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Ciências Biomédicas
Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas
Avaliação do efeito do peptídeo Ac2-26 no desenvolvimento
da resposta inflamatória alérgica em ratos
André Gustavo Calvano Bonavita
Rio de Janeiro
2007
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
ii
Avaliação do efeito do peptídeo Ac2-26 no desenvolvimento da
resposta inflamatória alérgica em ratos
André Gustavo Calvano Bonavita
Tese de Doutorado apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas da
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como
parte dos requisitos necessários à obtenção do
título de Doutor em Ciências Morfológicas
(Morfologia).
Orientadores: Patrícia Machado Rodrigues Silva
Marco Aurélio Martins
Rio de Janeiro
Dezembro de 2007
ads:
iii
Avaliação do efeito do peptídeo Ac2-26 no desenvolvimento da resposta
inflamatória alérgica em ratos
André Gustavo Calvano Bonavita
Orientadores: Patrícia Machado Rodrigues Silva e Marco Aurélio Martins
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências
Morfológicas da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências Morfológicas (Morfologia).
Aprovado por:
______________________________________
______________________________________
______________________________________
______________________________________
______________________________________
Rio de Janeiro
Dezembro de 2007
iv
FICHA CATALOGRÁFICA
BONAVITA, ANDRÉ GUSTAVO CALVANO
Avaliação do efeito do peptídeo Ac2-26 no desenvolvimento da resposta
inflamatória alérgica em ratos.
Rio de Janeiro: UFRJ, CCS, 2007
xv, p il.116
Tese: Mestre em Ciências Morfológicas
1. Alergia 2. Inflamação 3. Hiperalgesia 4. Anexina-1 5. Ac2-26
I. Universidade Federal do Rio de Janeiro
II. Título
v
"Nossa loucura é a mais sensata das
emoções; tudo o que fazemos deixamos
como exemplos para os que sonham um
dia serem assim como nós: Loucos...
mas Felizes!!!"
Mário Quintana
Mário QuintanaMário Quintana
Mário Quintana
"Não acredite numa coisa sem ter
uma boa razão para fazê-lo."
Bertrand Russel
Bertrand RusselBertrand Russel
Bertrand Russel
“Eu não atiro com a mão; aquele
que atira com a mão esqueceu o rosto de
seu pai. Eu atiro com a mente.“
Stephen King
Stephen KingStephen King
Stephen King
vi
Dedico esse trabalho a mulher
Dedico esse trabalho a mulher Dedico esse trabalho a mulher
Dedico esse trabalho a mulher
que eu amo, Ana Carolina Araújo
que eu amo, Ana Carolina Araújo que eu amo, Ana Carolina Araújo
que eu amo, Ana Carolina Araújo
Peçanha, por sua importância em
Peçanha, por sua importância em Peçanha, por sua importância em
Peçanha, por sua importância em
minha vida.
minha vida. minha vida.
minha vida.
vii
AGRADECIMENTOS
A minha querida noiva e futura esposa Ana Carolina Araujo Peçanha, pelo
carinho, amor, amizade e compreensão comigo, e que certamente teve papel
importante para conclusão desse trabalho;
Aos meus pais Francisco Arnaldo Bonavita e Marilza Angelina Calvano Bonavita
que sempre me apoiaram em todos os momentos de minha e sem os quais não
estaria aqui hoje;
Aos meus orientadores Dra. Patrícia Machado Rodrigues Silva e Dr. Marco Aurélio
Martins pela confiança depositada em mim, pela orientação e pela oportunidade
de desenvolver este trabalho;
Aos Drs. Mauro Perretti, Christiane Bandeira de Melo, Bruno Lourenço Diaz e
Iolanda Fierro que muito contribuíram para a evolução desse trabalho;
Aos grandes amigos Emiliano de Oliveira Barreto, Juliane Pereira da Silva,
Vinicius Frias Carvalho, Tatiana Lavich, Renato Jabour Pennaforte, Sabrina
Lucena, Francisco (Chico) Farias-Filho e Magda Fraguas Serra pelo exemplo de
profissionalismo, e pela grande amizade dentro e fora do laboratório, sem os quais
não chegaria aonde cheguei;
A toda equipe do Laboratório de Inflamação e do Departamento de Fisiologia e
Farmacodinâmica da Fundação Oswaldo Cruz, com os quais trabalhei e convivi ao
longo desses quatro anos;
Ao Curso de Pós-graduação em Ciências Morfológicas e do Centro de Ciências da
Saúde da Universidade Federal do Rio de Janeiro;
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e a
Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) pelo apoio financeiro.
A Deus...
viii
RESUMO
Estudos evidenciaram que o peptídeo Ac2-26 derivado da anexina-1 tem capacidade
de reproduzir os efeitos antiinflamatórios desta proteína. Neste estudo, objetivamos
avaliar o efeito do tratamento com o peptídeo Ac2-26 sobre o desenvolvimento da
inflamação e hiperalgesia alérgicas, e buscar a elucidação dos principais mecanismos
envolvidos. Ratos Wistar sensibilizados e desafiados com ovoalbumina, por via
intrapleural, desenvolveram intensa resposta inflamatória e o tratamento com o
peptídeo inibiu desgranulação de mastócitos e exsudato rico em neutrófilos e
eosinófilos. O peptídeo inibiu também a geração de eotaxina na pleura. In vitro, o
peptídeo Ac2-26 inibiu a liberação de histamina de tecido subcutâneo de animais
sensibilizados após desafio antigênico e a produção de eotaxina em culturas de
células mesoteliais de rato e epiteliais de cobaia estimuladas por IL-13. A
administração intraplantar do peptídeo Ac2-26 inibiu a resposta hiperalgésica
alérgica, fenômeno este que foi revertido pelo tratamento local com o antagonista do
receptor da lipoxina A
4
(BOC-2). A hiperalgesia causada pela associação de
histamina e 5-HT foi igualmente sensível ao tratamento com o peptídeo e BOC-2.
Análise de PCR em tempo real mostrou o aumento na expressão do receptor de
lipoxina A
4
na pata dos ratos. A avaliação histológica revelou, ainda, que o peptídeo
Ac2-26 inibiu o infiltrado neutrofílico plantar após o desafio com o antígeno, fenômeno
revertido pelo tratamento com BOC-2. Além disso, o efeito anti-hiperalgésico do
peptídeo foi sensível ao inibidor da enzima óxido nítrico sintase (L-NAME) e da
guanilato ciclase (ODQ). Macrófagos em cultura foram capazes de gerar óxido nítrico
frente à estimulação com Ac2-26. Concluímos, que o peptídeo Ac2-26 foi capaz de
inibir a resposta alérgica por atuar em diversos pontos do processo inflamatório,
incluindo desgranulação de mastócitos, extravasamento plasmático, migração de
leucócitos e liberação de mediadores inflamatórios e que seus efeitos mostraram-se
decorrentes da ação sobre o receptor de lipoxina A
4
e da produção de óxido nítrico.
ix
ABSTRACT
Previous investigations have provided evidence that annexin-1 derived peptide (Ac2-
26) has the capacity to reproduce the anti-inflammatory effect of the full-legth protein.
In the current study, we evaluated the effect of Ac2-26 peptide on the allergic
inflammation and hyperalgesia as well as to investigate the mechanism involved in
such activity. We showed that sensitized Wistar rats challenged intrapleurally with
antigen presented an intense inflammatory response, which was sensitive to treatment
with Ac2-26. Mast cell degranulation and neutrophil and eosinophil rich exudates were
suppressed. The peptide also inhibited eotaxin generation in the pleural cavity. In
vitro, Ac2-26 peptide blocked antigen-induced histamine release from subcutaneous
tissue fragments obtained from sensitized animals and production of eotaxin of rat
mesothelial cells and guinea pig trachea cells following stimulation with IL-13. Ac2-26
administration into rat hindpaw inhibited the allergic hyperalgesia, a phenomenon
reversed after treatment with the lipoxin A
4
antagonist BOC-2. Hyperalgesic response
caused by histamine and 5-HT was also sensitive to the Ac2-26 peptide and ALX
antagonist. Real-time PCR indicated the up-regulation of lipoxin A
4
receptor in the rat
paw. Histological anlaysis revealed that neutrophil migration was reduced by the
peptide and sensitive to BOC-2 treatment. In addition, the anti-hyperalgesic effect of
Ac2-26 peptide was suppressed by treatment with the nitric oxide synthase inhibitor
(L-NAME) or the guanilate cyclase inhibitor (ODQ). Cultured macrophages generated
nitric oxide after incubation with Ac2-26 peptide. We conclude that Ac2-26 was able to
inhibit the allergic inflammatory response acting in different points including mast cell
degranulation, plasma leakage, leukocyte migration and inflammatory mediator
release by a mechanism dependent on its activity lipoxin A
4
receptor and nitric oxide
generation.
x
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS.................................................................................................xii
LISTA DE ABREVIATURAS....................................................................................xiv
1. INTRODUÇÃO........................................................................................................1
1.1. Alergia .................................................................................................................1
1.1.1. Fase Sensibilizadora.......................................................................................2
1.1.2. Fase Efetora.....................................................................................................2
1.2. Resposta Inflamatória Alérgica.........................................................................3
1.2.1. Alterações Vasculares ....................................................................................3
1.2.2. Alterações Celulares.......................................................................................4
1.2.3. Dor ....................................................................................................................5
1.3. Mediadores envolvidos da inflamação alérgica ..............................................6
1.3.1. Aminas Vasoativas..........................................................................................7
1.3.2. Cininas .............................................................................................................8
1.3.3. Mediadores Lipídicos .................................................................................8
1.3.4. Óxido Nítrico (NO).....................................................................................11
1.3.5. Citocinas ........................................................................................................12
1.3.6. Quimiocinas...................................................................................................14
1.4. Glicocorticóides ...............................................................................................15
1.4.1. Anexina-1 .......................................................................................................17
2. OBJETIVOS..........................................................................................................22
3. MATERIAL E MÉTODOS .....................................................................................23
3.1. Animais .............................................................................................................23
3.2. Sensibilização...................................................................................................23
3.2.1. Modelo de pleurisia.......................................................................................23
3.2.1.1. Avaliação de leucócitos e níveis protéicos na pleura.............................23
3.2.1.2. Quantificação de Eotaxina.........................................................................24
3.2.2. Modelo de hiperalgesia.................................................................................24
3.2.2.1. Modelo de sinergismo................................................................................25
3.2.2.2. Análise histopatológica do tecido plantar ...............................................25
xi
3.2.3. Tratamentos...................................................................................................26
3.3. Liberação de histamina anafilática de fragmentos tecidos hipodérmicos in
vitro ..........................................................................................................................26
3.3.1 Quantificação de histamina...........................................................................27
3.4. Quimiotaxia de eosinófilos..............................................................................27
3.5. Isolamento e cultura de células mesoteliais de ratos...................................28
3.6. RT-PCR..............................................................................................................29
3.7. Real Time PCR..................................................................................................29
3.8. Isolamento e cultura de células de traquéia de cobaias...............................30
3.7. Cultura de células RAW 264,7 e quantificação de óxido nítrico ..................31
3.9. Análise estatística ............................................................................................31
3.10. Fonte de obtenção de drogas e reagentes...................................................31
4. RESULTADOS......................................................................................................34
4.1. Efeito do peptídeo Ac2-26 sobre a pleurisia alérgica ...................................34
4.2. Efeito do peptídeo Ac2-26 na desgranulação de mastócitos e liberação de
histamina induzida por alergeno ...........................................................................34
4.3. Peptídeo Ac2-26 inibe a formação de eotaxina in vivo e in vitro .................35
4.4. Ausência de efeito do Ac2-26 sobre a quimiotaxia de eosinófilos in vitro .35
4.5. Efeito do peptídeo Ac2-26 sobre a hiperalgesia induzida por mediadores
inflamatórios............................................................................................................36
4.6. Ação do peptídeo na resposta hiperalgésica é mediada pelo receptor de
lipoxina A
4
................................................................................................................36
4.7. Efeito do peptídeo sobre a migração de neutrófilos na pata de ratos.........37
4.8. Ação direta do peptídeo derivado da anexina-1 sobre a ação de mediadores
inflamatórios............................................................................................................37
4.9. Peptídeo Ac2-26 inibe hiperalgesia alérgica por um mecanismo dependente
da produção e ação do óxido nítrico.....................................................................38
5. DISCUSSÃO.........................................................................................................59
6. CONCLUSÃO .......................................................................................................66
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................................67
ANEXOS ...................................................................................................................86
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Efeito inibitório do peptídeo Ac2-26 no extravasamento protéico pleural, no
acúmulo de neutrófilos 4 h após desafio e no acúmulo de eosinófilos 12 h após
desafio..........................................................................................................................35
Figura 2 - Efeito do peptídeo Ac2-26 (16-66 µM) sobre a liberação de histamina por
fragmentos de tecidos subcutâneos estimulados com ovoalbumina...........................39
Figura 3 - Análise da expressão de ALX de células mesoteliais de rato obtidos por
RT-PCR........................................................................................................................40
Figura 4 - Efeito do tratamento com dexametasona ou peptídeo Ac2-26 na geração
de eotaxina no efluente pleural observada 6 h após o desafio pleural em animais
ativamente sensibilizados............................................................................................41
Figura 5 - Efeito do tratamento com dexametasona ou peptídeo Ac2-26 na geração
de eotaxina de células mesoteliais de rato e células epiteliais de traquéia de cobaia
estimuladas com IL-13.................................................................................................42
Figura 6 - Cinética de efeito do tratamento com o peptídeo Ac2-26 sobre a
hiperalgesia térmica induzida por ovoalbumina na pata de ratos ativamente
sensibilizados...............................................................................................................43
Figura 7 - Efeito do co-tratamento com o peptídeo Ac2-26 e do antagonista do ALX
sobre a hiperalgesia térmica induzida por ovoalbumina na pata de ratos ativamente
sensibilizados...............................................................................................................44
Figura 8 - Expressão de mRNA dos receptores FRP e da anexina-1 na pata de
ratos.............................................................................................................................46
Figura 9 - Analise histológica de secções plantares de ratos sensibilidados e
desafiados com ovoalbumina ou salina.......................................................................47
Figura 10 - Efeito do tratamento com o peptídeo Ac2-26 na presença ou ausência do
antagonista de ALX sobre o número de neutrófilos.................................................48
Figura 11 - Cinética de hiperalgesia induzida pela injeção intraplantar da associação
de histamina e 5-HT e a sensibilidade ao peptídeo Ac2-26 injetado 1 h antes da
estimulação com ovoalbumina.....................................................................................49
xiii
Figura 12 - Efeito do BOC-2 sobre a inibição da hiperalgesia por Ac2-26 na pata de
ratos.............................................................................................................................50
Figura 13 - Efeito do L-NAME sobre a atividade anti-hiperalgésica do Ac2-26 na pata
de ratos........................................................................................................................51
Figura 14 - Efeito do ODQ sobre a atividade anti-hiperalgésica do Ac2-26 na pata de
ratos.............................................................................................................................52
Figura 15 - Efeito do nitroprussiato de sódio (NPS) sobre a hiperalgesia induzida por
alergeno.......................................................................................................................53
Figura 16 - Liberação de óxido nítrico por uma linhagem de macrófagos de
camundongos (RAW 264,7) após estimulação com Ac2-26 in vitro............................54
xiv
LISTA DE ABREVIATURAS
5-HT 5-hidroxitriptamina (serotonina)
5-LO 5-lipoxigenase
ALX Lipoxina A
4
AINES Antiinflamatórios não esteroidais
ATL Análogo sintético de 15-epi-lipoxina A
4
cDNA DNA complementar
cGMP Guanosina trifosfato cíclico
COX Ciclooxigenase
cPLA
2
Fosfolipase A
2
citosólica
DMEM Meio Dubelco Modificado
Dexa Dexametasona
EDTA-Na
2
Ácido etilenodiamino tetra-acético disódico
ELISA Ensaio de imunoabsorção enzimática
eNOS NOS endotelial
EPM Erro padrão da média
FPR Receptor de peptídeos formilados
GM-CSF Fator estimulador de colônia de macrófagos e granulócitos
GR Receptor de glicocorticóide
GRE Elementos de resposta a glicocorticóides
HBSS Solução Salina Balanceada de Hank
ICAM-1 Molécula de adesão intercelular -1
IFNγ
Interferon gama
IgE Imunoglobulina E
IL Interleucina
iNOS NOS induzida
I-R Isquemia reperfusão
i.p. Intraperitoneal
i.pl. Intrapleural
xv
Kg Kilograma
LDL Lipoproteína de baixa densidade
LPS Lipopolissacarídeo
L-NAME Nitro-L-arginina metil éster
LT Leucotrieno
MCP Proteína quimiotática para monócitos
MHC Complexo principal de histocompatibilidade
MIP Proteína inflamatória de macrófagos
nNOS NOS neuronal
NO Óxido nítrico
NOS Óxido nitrico sintase
NPS Nitroprussiato de sódio
OPT o-ftaldeído
OVA Ovoalbumina
PAF Fator de ativação plaquetária
PBS Salina tamponada com fosfato
PCR Reação em cadeia pela polimerase
PG Prostaglandina
PK Proteína quinase
RANTES Regulador da expressão e secreção de célula T normal
RNA Ácido ribonucléico
RT-PCR Transcriptase reversa em PCR
SCF Fator de células tronco
VCAM-1 Molécula de adesão vascular-1
TNF-α
Fator de necrose tumoral-alfa
TX Tromboxano
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Alergia
As manifestações alérgicas são de grande importância em países
desenvolvidos e tendem a atingir proporções epidêmicas no mundo atual (Warner el
at, 2006). Uma razão para isso seria o aumento da exposição a alergenos em
conseqüência da poluição, ou ainda, uma redução da resposta do sistema
imunológico durante períodos críticos do desenvolvimento humano. Essas doenças
representam desordens inflamatórias complexas e crônicas que envolvem o
recrutamento e ativação de muitas células inflamatórias e estruturais, as quais
liberam mediadores que levam a mudanças fisiopatológicas típicas observadas nas
vias aéreas, na pele e em vários outros tecidos (Miescher & Vogel, 2002).
O conceito alergia foi introduzido em 1906, por von Pirquet, que reconheceu
que os antígenos possuem a capacidade de induzir mudanças na reatividade e
hipersensibilidade do organismo frente ao contato com agentes estranhos (Bukantz
SC, 2002). Atualmente o termo é freqüentemente usado como sinônimo de um grupo
de patologias associadas e mediadas por imunoglobulina E (IgE). As doenças
alérgicas podem ser classificadas conforme a dependência do envolvimento de
anticorpos do tipo IgE, onde as dependentes são denominadas de atópicas e as
independentes de não-atópicas (Kay, 2001).
O aumento da produção de imunoglobulina E em resposta a antígenos é um
marcador de doenças atópicas como asma, rinite, sinusite, conjuntivite, dermatites,
alergia alimentar, reações a drogas dentre outras (Holgate & Mavroleon, 1998). A IgE
possui um papel fundamental na patogenia das alergias, em virtude da sua
capacidade de se ligar especificamente a receptores, que podem ser de alta afinidade
(FcεRI) situados na superfície, preferencialmente, de mastócitos e basófilos, e de
baixa afinidade (FcεRII) que estão presentes na superfície de monócitos/macrófagos
(Matz e col., 1994; Vecchiarelli e col., 1994; Wishah e col, 2002), linfócitos (Park e
col., 1996) e eosinófilos (Nutten e col., 1997; Lantero e col. 2000). Esses receptores
quando ativados regulam um processo de transdução de sinal que culmina na
2
liberação de diversos mediadores e citocinas importantes para o disparo e a
manutenção das respostas alérgicas (Metcalfe e col., 1997; Leung, 1998; Galli, 2000).
1.1.1. Fase Sensibilizadora
No curso da resposta alérgica pode-se identificar pelo menos duas fases
distintas, uma fase sensibilizadora e uma fase efetora. Na primeira fase, o alergeno
ao entrar em contato com o organismo interage com células especializadas
denominadas células apresentadoras de antígenos que expressam o complexo
principal de histocompatibilidade (MHC) classe II. Uma vez ligado a essas células, o
antígeno é internalizado e processado, gerando peptídeos que formam complexos
com as moléculas do MHC classe II. Esses complexos migram para a superfície
dessas células onde interagem com células T virgens (Th
0
-CD4
+
), um fenômeno que
normalmente ocorre em tecidos linfóides. Há ainda a ligação entre as moléculas co-
estimulatórias B7 e CD28 na superfície da célula apresentadora de antígeno e a
célula T, respectivamente. Como resultado dessa comunicação há a ativação das
células T o que gera uma transdução de sinal com ativação da cascata das
fosfoquinases. Conseqüentemente, as células T diferenciam-se em células Th
2
secretoras de citocinas pró-alérgicas, como IL-4, IL-5, IL-9 e IL-13, importantes na
resposta mediada por IgE (para revisão Delves e Roitt, 2000 a,b; Corry, 2002)
As interleucinas, IL-4 e IL-13 atuam sobre linfócito B diferenciando essas
células em plasmócitos e induzindo a troca de isotipo para síntese e secreção de IgE.
Outro sinal importante nessa resposta é a secreção de IgE e a interação entre o
ligante CD40 da célula T com seu receptor no linfócito B (Broide, 2001). As
imunoglobulinas E irão se fixar aos seus receptores presentes nas células alvos e
com a reexposição ao antígeno inicia-se a fase efetora da resposta alérgica.
1.1.2. Fase Efetora
O reconhecimento de antígenos multivalente por moléculas de IgE ligadas a
superfície de mastócitos acarreta uma ligação cruzada (“cross-liking”) de seus
3
receptores de alta afinidade (FcεRI) e a indução de uma via de sinalização
intracelular. A ativação dessas vias leva à desgranulação dos mastócitos com
liberação de histamina e o início da síntese de moléculas inflamatórias lipídicas como
leucotrienos e prostaglandinas (Galli e col., 2005; Gilfillan e Tkaczyk, 2006). O “cross-
linking” do receptor ainda leva à produção de citocinas incluindo TNF-α, IL-6, IL-4, IL-
13 e de várias quimiocinas que promovem a migração de eosinófilos e linfócitos ao
local da reação (Pease e Williams, 2006). A ação dos produtos secretados pelos
mastócitos pode ser percebida através das alterações fisiológicas que caracterizam a
reação de hipersensibilidade imediata tipo I.
1.2. Resposta Inflamatória Alérgica
A resposta alérgica ocorre quando substâncias presentes no ambiente entram
em contado com o organismo de indivíduos sensibilizados, o que gera uma resposta
inflamatória. No decorrer dessa resposta, duas fases são observadas: a reação
imediata ou inflamação aguda decorrente da liberação dos mediadores produzidos
pelos mastócitos e a reação inflamatória tardia, onde células inflamatórias se
acumulam no tecido devido à ação de fatores quimiotáticos (Holgate e Mavroleon,
1998).
A resposta inflamatória é caracterizada pelos cinco sinais cardinais que
incluem rubor, calor, edema, dor e a perda de função (Gallin e col., 1992). Estes
sinais são resultados de alterações vasculares e celulares em resposta à ação dos
mediadores inflamatórios. Nas alergias respiratórias, a ocorrência de inflamação
resulta ainda num comprometimento funcional de vias aéreas devido à obstrução
destas pela produção excessiva de muco e hiperresponsividade brônquica, devido à
ativação de terminações nervosas do tecido (Conti e DiGioacchino, 2001; Spina e
Page, 2002).
1.2.1. Alterações Vasculares
4
As primeiras alterações vasculares são devido à intensa desgranulação de
mastócitos e a liberação de aminas vasoativas, sendo estes os primeiros mediadores
a serem secretados no sítio inflamatório (Holgate, 1998). As aminas vasoativas atuam
sobre a musculatura lisa vascular causando uma vasoconstrição transitória seguida
de vasodilatação das arteríolas, gerando um aumento significativo do fluxo sanguíneo
no tecido inflamado o que determina a ocorrência de vermelhidão e conseqüente
aumento de temperatura local (Aschheim e Zweifach; 1962). O aumento do número
de hemácias nesses vasos resulta num aumento da viscosidade do sangue
ocasionando uma redução do fluxo sangüíneo, isso permite então a marginação dos
leucócitos no leito vascular (Florey e Sheppard, 1970). Ainda sobre ação das aminas
vasoativas, há um aumento da permeabilidade vascular que permite a saída de um
exsudato rico em proteínas para o interstício caracterizando o edema inflamatório
tecidual (Ninkovic e Hunt, 1995; Saria e col., 1988)
1.2.2. Alterações Celulares
Após a ativação dos mastócitos além das aminas vasoativas, diversos outros
mediadores são secretados, dentre estes, estão principalmente citocinas como
interleucinas (IL-3, IL-4, IL-5 e IL-6), interferon (IFNγ), TNFα e os derivados lipídicos
que são sintetizados após a ativação da célula (Dugas e col., 1990; Bradding e col.,
1995). Estes medidores são responsáveis pela cronificação da rresposta inflamatória,
pois recrutam células circulantes, leucócitos, para o tecido inflamado através da
geração de um gradiente de concentração, formando um infiltrado celular tipicamente
observado em tecidos inflamados. A migração dos leucócitos ocorre a partir da sua
marginação no interior dos vasos devido às alterações vasculares (Ley e col., 1993).
As células migram para o tecido através de um processo que inclui quatro etapas, o
rolamento, a ativação, adesão e diapedese (Wardlaw e col., 1994). A migração celular
depende de fatores quimiotáticos e da expressão de moléculas de adesão na
membrana celular tanto dos leucócitos quanto no endotélio (Tedder e col., 1995).
Quando os leucócitos atingem o tecido alvo, são ativados por citocinas e outros
mediadores e passam a secretar diversos mediadores e enzimas que podem
5
prolongar a inflamação. Dentre as alterações provocadas por essas células estão
ativação de terminações nervosas, alterações vasculares, dano tecidual e o
recrutamento de mais leucócitos para o local (Wardlaw e col., 1994). O infiltrado
celular se apresenta de forma estereotipada onde se evidencia um acúmulo inicial de
neutrófilos, seguido por uma chegada tardia de eosinófilos (Lima e col, 1990). A
presença dessas células incluindo, também, os linfócitos e monócitos e células
estruturais como fibroblastos, células epiteliais, célula mesoteliais está relacionada
com o desenvolvimento e cronificação da resposta inflamatória alérgica (Pearlman,
1999; Piliponsky e col., 2002; Mutsaers, 2004; Purwar e col., 2006).
1.2.3. Dor
A Associação Internacional para Estudo da Dor define o fenômeno de dor
como: “Uma experiência sensorial e emocional desagradável, relacionada com lesão
tecidual real ou potencial”. Isto pressupõe a existência de pelo menos dois
componentes cruciais: a sensação dolorosa propriamente dita ou nocicepção, e a
reatividade emocional à dor. Fisiologicamente a dor funciona como um sinal de alerta
colocando em ação reações de preservação que visam poupar o organismo da
agressão, tendo um papel importante de defesa do corpo (Treede, 1995). A dor
aguda gerada por agressão ao corpo produz reação de alarme e ativa mecanismos
de defesa, podendo ser considerada fisiológica. Já a dor crônica é patológica, pois
não tem função de alarme, podendo persistir na ausência de uma lesão real (Kelly e
Payne, 1991).
A dor está associada à atividade elétrica nas fibras nervosas aferentes
primárias de pequeno diâmetro presentes nos tecidos periféricos, profundos ou
viscerais, podendo ser mielinizados (fibras Aδ) ou não (fibras C), sendo denominados
nociceptores. Estas terminações nervosas são ativadas por estímulos exógenos de
diversas naturezas, incluindo estímulos mecânicos, elétricos, químicos, térmicos,
além de estímulos endógenos como inflamação, aumento do peristaltismo e isquemia
tecidual (Hardy e col., 1950). Os nociceptores se diferenciam dos outros receptores
sensoriais específicos por possuírem um limiar mais alto de ativação, e só são
6
ativados por estímulos de intensidade nociva (Treed, 1995). A informação nociceptiva
é levada através das fibras nervosas até neurônios presentes no gânglio da raiz
dorsal da medula espinhal e a partir daí para o córtex sensorial e motor do cérebro. O
estímulo agudo pode resultar em rápida transmissão para as fibras sensoriais e uma
resposta motora imediata com o objetivo de reconhecer e evitar a fonte de lesão
(Clarke e Harris , 2004).
A sensação dolorosa latente que se estabelece durante a reação inflamatória,
na qual mediadores químicos promovem a sensibilização ou ativação de nociceptores
é conhecida como hiperalgesia (Meyer, 1995). Esse fenômeno decorre da ligação dos
mediadores inflamatórios a receptores presentes nas membranas das terminações
nervosas livres e dessa forma atuam diminuindo o limiar de ativação desses
nociceptores que passam a ser ativados com estímulos de baixa intensidade os quais
em condições normais não causariam dor (Graven-Nielsen e Mense, 2001). A ação
dos mediadores inflamatórios na sensibilização ou ativação dos nociceptores tem sido
demonstrada experimentalmente em pessoas e animais através de ensaios
comportamentais e técnicas de eletrofisiologia (Duarte e col, 1988; Ferreria, 1993;
Nakamura e Ferreira, 1987).
Nas respostas alérgicas inflamatórias, como a sinusite, a dor é constante nos
tecidos inflamados, sendo o sintoma de maior queixa dos indivíduos sintomáticos.
Porém, em algumas manifestações alérgicas podem causar uma informação
nociceptiva que não é conhecida como dor. Nas urticárias, por exemplo, ocorre
irritação do tecido acompanhado de coceira. Na rinite, a ativação dos nociceptores faz
com que o indivíduo espirre e tenha sensação de queimação. Em pacientes
asmáticos, a ativação e sensibilização das fibras C causam o aumento da reatividade
brônquica (Spina e Page, 2002). Spina (2003) realizou um estudo comparativo
sustentando a ocorrência de hiperalgesia em alergias, uma vez que os mecanismos
farmacológicos de ação analgésica também possuem efeito supressor da
hiperresponsividade brônquica.
1.3. Mediadores envolvidos da inflamação alérgica
7
1.3.1. Aminas Vasoativas
A histamina é uma amina vasoativa amplamente distribuída sendo encontrada
nos grânulos citoplasmáticos presente nos mastócitos e também nos basófilos
(Marone e col, 1997). Estas células por meio de estimulação imunológica (IgE e
citocinas) ou não imunológica (48/80; ionóforo de cálcio; substância P; opióides)
liberam histamina para o meio extracelular, onde irá atuar em seus receptores
celulares (Barnes, 2001).
Há diversas evidências que mostram que a histamina tem papel chave na
fisiopatologia da inflamação alérgica. Entre os efeitos relevantes estão vasodilatação,
aumento da permeabilidade vascular, ativação de neurônios sensoriais, aumento da
produção de muco, contração de células musculares lisas brônquica (causando
broncoespasmo no caso da asma) e gastrointestinal. A histamina pode ainda ter ação
imunomodulatória sobre células T, eosinófilos, macrófagos e monócitos (Barnes,
2001; Marone, 2003).
Atualmente são identificados quatro subtipos de receptores para histamina: H
1
,
H
2
, H
3
e H
4
, sendo que os efeitos pró-inflamatórios parecem ser mediados
principalmente via receptor H
1
(Macglashan, 2003). Antagonistas de receptores H
1
têm reconhecido efeito terapêutico na rinite alérgica, urticária crônica e eczema
atópico, entretanto parecem não ser eficazes na terapêutica da asma muito
possivelmente devido à complexidade desta patologia (Zitt, 2003).
A serotonina, também denominada 5-hidroxitriptamina (5-HT), aparece
estocada somente em mastócitos e basófilos de roedores, enquanto que no homem é
encontrada principalmente em plaquetas e terminações nervosas serotoninérgicas
(Hourani e Cusack, 1991). Esse mediador possui ação hiperalgésica através de
mecanismo diretos sobre nociceptores e ainda atividade edematogênica atuando
sobre seus receptores presentes no endotélio vascular e nas plaquetas (Doak e
Sawynok, 1997; Nishiyama, 2005; Nitanda e col, 2005). A 5-HT pode induzir
hiperalgesia de uma forma indireta por ação quimiotática de neutrófilos e na liberação
de prostaglandina e noradrenalina (Tambeli e col, 2006).
8
1.3.2. Cininas
A bradicinina foi descrita primeiramente por Rocha e Silva e colaboradores
(1949), quando demonstraram que a incubação de plasma com veneno de Bothrops
jararaca originava uma substância com forte atividade hipotensora e indutora de
contração da musculatura lisa intestinal. Desde então, as cininas têm sido implicadas
em diversos processos fisiológicos e fisiopatológicos. Esses mediadores parecem
modular muitos dos eventos observados durante o processo inflamatório incluindo
vasodilatação, aumento da permeabilidade vascular, extravasamento plasmático,
migração celular, dor e hiperalgesia (Dray, 1997, Hall, 1997, Marceau e col., 1998).
Alguns desses efeitos são mediados diretamente por seus receptores nas células
alvos ou indiretamente via liberação de outros mediadores e neurotransmissores
(Marceau e col., 1998).
As cininas, uma vez produzidas, são capazes de ativar os receptores
classificados como B
1
e B
2
(Hall, 1997, Marceau e col., 1998, Pesquero e Bader,
1998). Os receptores B
2
são constitutivamente expressos no sistema nervoso central
e periférico e têm alta afinidade pela bradicinina, sendo a maioria das ações das
cininas mediadas por ele (Hall, 1997). Mais recentemente Tuner e colaboradores
(2001) sugeriram o envolvimento de cininas e do receptor B
2
no desenvolvimento de
hiperreatividade induzida por antígeno e eosinofilia nas vias aéreas de humanos. Os
receptores B
1
parecem estar ausentes em condições fisiológicas normais, porém são
expressos rapidamente em certas patologias pela ação de agentes pró-inflamatórios
como LPS ou citocinas (Marceau e col., 1998). A participação de receptores B
1
durante o processo inflamatório e na hiperalgesia vem sendo evidenciada e tem
ficado cada vez mais consistente com o desenvolvimento de antagonistas B
1
mais
seletivos (Campos e Calixto, 1995; Ahluwalia e Perretti, 1996; Hall, 1997; Vianna e
Calixto, 1998).
1.3.3. Mediadores Lipídicos
9
No decorrer da resposta inflamatória células são ativadas e uma classe de
mediadores lipídicos é sintetizada a partir do metabolismo de fosfolipídeos de
membrana. Esses mediadores denominados eicosanóides, são biologicamente ativos
e estão envolvidos em diversos processos inflamatórios severos, tais como asma,
artrite reumatóide, psoríase e colites ulcerativas (O’Sullivan, 1999).
Quando a cascata inflamatória é ativada, as enzimas fosfolipase A
2
e
fosfolipase C clivam fosfolipídeos de membrana (fosfatidilcolina e fosfatidilinositol)
liberando o ácido araquidônico (Campbell e Halushka, 1996) que é então
metabolizado principalmente por duas vias enzimáticas distintas, a via da
ciclooxigenase (COX) ou a via das lipoxigenases (LO). A COX é a enzima chave na
biossíntese das prostaglandinas (PGG
2
, PGH
2
, PGD
2
, PGE
2
, PGF
2
α), prostaciclina
(PGI
2
) e tromboxana A
2
(TXA
2
). Já a lipoxigenase metaboliza o ácido araquidônico
levando à formação de leucotrienos (LTA
4
, LTB
4
, LTC
4
, LTD
4
e LTE
4
) ou lipoxinas
(Bulger e Maier, 2000).
Existem três isoformas de ciclooxigenases identificadas, a COX-1, a COX-2 e a
COX-3. A COX-1 é constitutiva, sendo normalmente expressa em diversos tecidos,
onde é responsável pela síntese das prostaglandinas que participam da manutenção
da homeostase fisiológica (Funk e FitzGerald, 1991; Harris, 1992). A COX-2 é
encontrada constitutivamente no endotélio vascular, sendo amplamente induzida por
citocinas, cininas e fatores de crescimento, após o início da inflamação em diversos
tipos celulares, acarretando a produção de prostaglandinas que desempenham
importante atividade pró-inflamatória (Vane e col., 1998). Acredita-se que a COX-3
seja o principal alvo dos fármacos analgésicos e antipiréticos como o paracetamol e
dipirona (Senior, 2002). Os antiinflamatórios não esteroidais (AINES), como a
aspirina, são amplamente utilizados clinicamente e possuem capacidade de inibir
ambas COX-1 e -2. A inibição da COX-1 é responsável por muitos dos efeitos
colaterais dos AINES que incluem lesão da mucosa gastrointestinal e toxicidade renal
(Bulger e Maier, 2000).
O ácido araquidônico também é substrato para a 5-lipoxigenase (5-LO),
enzima responsável pela síntese de outros mediadores que desempenham
importante papel em respostas inflamatórias de origem alérgica, incluindo os
10
leucotrienos e lipoxinas (Samuelsson e col., 1983). A ação da 5-LO sobre o ácido
araquidônico gera o leucotrieno A
4
(LTA
4
) que sofre ação de hidrolases e é convertido
em leucotrieno B
4
(LTB
4
), potente agente quimiotático para neutrófilos e eosinófilos,
contribuindo para a formação do infiltrado celular em tecidos inflamados (Evans e col.,
1991; Ford-Hutchinson, 1991). O LTA
4
também pode ser metabolizado em LTC
4
que,
por sua vez, pode sofrer clivagens e gerar LTD
4
e LTE
4
. Os leucotrienos C
4
, D
4
e E
4
são conhecidos como leucotrienos cisteínicos e mimetizam muitos dos aspectos da
fisiopatologia das doenças alérgicas principalmente da asma, apresentando potentes
efeitos sobre musculatura lisa, glândulas submucosas, células epiteliais e induzindo
hiperresponsividade brônquica e formação de edema (Samuelson e col., 1987; Krell e
col., 1990; Henderson, 1994).
Endogenamente o ácido araquidônico pode ser metabolizado pela 15-
lipoxigenase, enzima presente no epitélio pulmonar, eosinófilos e neutrófilos, dando
origem a compostos intermediários que sofrem ação da 5-LO gerando a lipoxinas A
4
(para revisão Louis e col.,2005). A aspirina é capaz de acetilar de forma irreversível a
COX-2 que começa a produzir metabólitos como a 15-epi-lipoxina A
4
(ATL-1). A 15-
epi-lipoxina A
4
similar a lipoxina A
4
endógena é um mediador lipidico com atividade
antiinflamatória (para revisão Fierro e Serhan, 2001). A atividade antiinflamatória da
lipoxina A
4
e seus análogos são decorrentes de sua ação sobre o receptor ALX
(ilustração 1). O receptor ALX, também conhecido como receptor FRPL1, pertence à
subfamília dos receptores de peptídeos formilados (FPR) que possuem 7 domínios
transmembrana e são acoplados à proteína G e a essa família incluem-se ainda os
receptores FPR e FPRL2. Essa classe de receptores mostra-se promíscua a diversas
substâncias como peptídeo de proteínas do envelope de HIV-1, pequenos peptídeos
sintéticos como o fMLP e peptídeos e lipídeos agonistas (para revisão Le e col.,
2001).
Outro mediador lipídico bioativo é o fator de ativação plaquetária (PAF).
Inúmeros tipos celulares incluindo plaquetas, neutrófilos, monócitos/macrófagos,
basófilos, mastócitos e células endoteliais podem produzir PAF (para revisão
Stafforini e col., 2003). O PAF é capaz de induzir broncoconstrição e hiperreatividade
brônquica, exsudação plasmática, hipersecreção de muco e recrutamento e ativação
11
de eosinófilos, além de provocar broncoconstrição aguda quando inalado por
pacientes asmáticos (Barnes e Chung, 1989). Esse mediador também se mostrou
importante no desenvolvimento da rinite alérgica induzindo extravasamento
plasmático que contribui no surgimento da rinoréia e congestão nasal (Alfaro, 2004).
Ilustração 1: ALX é um receptor possuindo 7 domínios transmembrana que na presença de
seus ligantes ativa proteína G. Tem como ligantes a lipoxina A
4
, 15-epi-lipoxina A
4
e
análogos estáveis da lipoxina A
4
(adaptado de Levy, 2005).
1.3.4. Óxido Nítrico (NO)
O óxido nítrico é um gás solúvel produzido nos tecidos por ação da óxido
nítrico sintase (NOS do inglês nitric oxide syntase), durante a metabolização de L-
arginina em L-citrulina. Existem três isoformas da NOS: duas constitutivas – endotelial
(eNOS) e neuronal (nNOS), localizadas no endotélio e terminações nervosas
respectivamente – e uma induzida (iNOS), presente em vários tipos celulares na
presença de estímulos inflamatórios como endotoxina (LPS), IL-1β, TNF-α e
interferon γ (Hamid e col., 1993; Saleh e col., 1998).
12
Sua participação durante o processo inflamatório ainda é discutível. Dados
apontam o aumento dos níveis de óxido nítrico em diversas patologias como atrite
reumatóide, lupus eritematoso, psoriase, choque séptico, urticária e dermatite atópica
(Sirsjo e col., 1996; Becherel e col, 1997; Abramson e col., 2001; Clancy e col., 2001;
Taniuchi e col., 2001). Além disso, evidências mostram um aumento da expressão de
iNOS no pulmão e aumento dos níveis de NO no ar exalado de pacientes asmáticos.
Nas vias aéreas o óxido nítrico promoveria o aumento da permeabilidade vascular,
hipersecreção de muco, acúmulo de células inflamatórias e citotoxicidade devido a
formação de peroxinitrito (Ricciardolo, 2003; Sadeghi-Hashjin e col., 1998; Schuiling e
col., 1998). O peroxinitrito formado pela reação entre óxido nítrico e superóxido está
relacionado com diversos efeitos citotóxicos como lesão no DNA, oxidação de LDL e
inibição da respiração mitrocondrial (Ischiropoulos e al-Mehdi, 1995). NO ainda é
capaz de inibir a secreção de corticosterona hormônio que atua na modulação da
resposta inflamatória (Givalois e col., 2002).
Todavia outros estudos mostram que o óxido nitríco pode ter um efeito protetor
sobre a resposta inflamatória. Animais deficientes, que não expressam a iNOS,
mostraram-se mais susceptíveis as lesões inflamatórias (Mashimoto e Goyal, 1999).
Gilroy (2005) sugere que a aspirina induziria a formação de 15-epi-lipoxina elevaria os
níveis de eNOS e iNOS e conseqüentemente de NO que atuaria modulando
negativamente a interação de leucócitos ao endotélio e assim controlando a migração
dessas células para o foco inflamatório. Foi identificado ainda que o óxido nítrico é
capaz de inibir a produção de citocinas por monócitos de pacientes asmáticos
(Wishah e col., 2002). O estudo sobre o benefício do uso de substâncias
moduladoras da produção de NO ainda é controverso e deve ser melhor esclarecido.
1.3.5. Citocinas
As citocinas são proteínas que medeiam muitas das respostas imunes e
inflamatórias. São geradas frente a estímulos antigênicos ou inflamatórios e atuam de
forma autócrina ou parácrina, local ou sistemicamente, pela ligação a seus receptores
13
em células alvos (Barnes e col., 1998). O quadro 1 destaca alguns dos efeitos já
descritos para diferentes citocina.
As interleucinas IL-4, IL-13 e IL-5 são as citocinas que se destacam no
decorrer da inflamação alérgica. A IL-4 mostra-se importante para o desenvolvimento
e crescimento de linfócitos Th
2
atuando de forma autócrina sobre essas células e sua
ausência acarreta o não desenvolvimento destas, assim como sua manutenção
(Brusselle e col., 1995; Corry e col., 1998). Essa citocina também atua diretamente
sobre linfócitos B induzindo proliferação, diferenciação e indução da secreção de IgE
(Blaser, 1996). Juntamente com o stem cell factor, IL-3 e IL-9, a IL-4 participa no
crescimento dos mastócitos teciduais (Madden e col., 1991; Renauld e col., 1995;
Temann e col., 1998) e é um potente modulador de sua ativação (Nilsson & Nilsson,
1995).
A IL-13 é uma citocina imunoregulatória produzida predominantemente por
células Th
2
ativadas e, assim como a IL-4, tem a capacidade de induzir células B
humanas a sintetizar IgE e promover diferenciação de linfócitos Th
2
(Kaplan e col.,
1996). Possui papel na hiperresponsavidade brônquica, visto que anticorpos anti-IL13
inibem essa resposta após desafio antigênico em camundongos imunizados (Grunig e
col., 1998; Wills-Karp e col., 1998). A superexpressão de IL-13 resulta na produção
de eotaxina, recrutamento de eosinófilos e nas vias aéreas a hipersecreção de muco
(Zhu e col., 1999). Durante muito tempo foi sugerido, e amplamente aceito, que IL-4 e
IL-13 possuiriam ações redundantes e compensatórias durante a inflamação alérgica,
devido ao fato de que ambas compartilham uma mesma subunidade de receptor, a
subunidade α do receptor de IL-4. Entretanto estudos mais recentes descreveram
funções particulares para a IL-13 (para revisão ver Hershey, 2003).
A IL-5 parece ser um elemento essencial na indução da inflamação alérgica
mediada por eosinófilos possuindo importante papel na diferenciação, recrutamento,
sobrevivência e função dos eosinófilos (Coffman e col., 1989; Sanderson, 1992; Kopf
e col., 1996; Lee e col., 1997). A importância da IL-5 na resposta alérgica foi bem
estudada utilizando camundongos deficientes para essa citocina, nestes animais o
estímulo alérgico nas vias respiratórias não gerava eosinofilia em nenhum dos tecidos
analisados (medula óssea, sangue e pulmão) (Foster e col., 1996; Hogan e col.,
14
1998). A eotaxina é uma importante quimiocina no recrutamento de eosinófilos.
Investigações utilizando camundongos e cobaias sugerem que a IL-5 e eotaxina
agem cooperativamente em promover o recrutamento dos eosinófilos para os tecidos
(Mould e col., 1997).
Quadro 1: Citocinas e seus principais efeitos.
Atividade Citocinas Efeito
Regulação da IgE IL-4; IL-13, IL-2, IL-5 e IL-6
IFN-γ e IL-12
IL-12
Troc
a de classe de Ig,
sinergismo com IL-4
↓Ação da IL-4
↓ Diferenciação Th
2
↑Produção de IFN-γ
↑ Diferenciação Th
1
Indução de Eosinofilia IL-3, IL-5 e GM-CSF
Diferenciação, funções e
sobrevivência; pré-
ativação de
eosinófilos
Desenvolvimento e
ativação de Mastócitos
IL-3, IL-9, IL-10 e SCF Crescimento de mastócitos
Adaptado de Jirapongsananuruk e Leung (1997).
1.3.6. Quimiocinas
No homem, as quimiocinas constituem uma família composta de mais de 50
proteínas de baixo peso molecular que coordenam de forma precisa o tráfego de
leucócitos no microambiente linfóide e, também, regulam o recrutamento dessas
células para o foco inflamatório (Rot e Von Andrian, 2004). Essas proteínas são
classificadas de acordo com a posição de resíduos de cisteínas na região carboxi-
terminal onde formam pontes dissulfeto (Luster, 1998). A maior subfamília é
constituída pelas CC quimiocinas, onde dois resíduos de cisteína aparecem
adjacentes, têm como alguns de seus integrantes as eotaxinas 1 e 2, RANTES, MIP-
1α, MIP-1β e MCP-1 a 5. No quadro 2 encontram-se seus efeitos quimiotáticos sobre
15
diversas células. Essas quimiocinas CC estão envolvidas na quimiotaxia para
eosinófilos, monócitos e linfócitos T e aparecem apresentando grande relevância no
processo alérgico (Borish e Steinke, 2003). Há também o grupo das CXC
quimiocinas, no qual os resíduos cisteínicos aparecem separados por um aminoácido
não conservado. O destaque no grupo é a IL-8 que é um potente indutor de
quimiotaxia para neutrófilos (Baggiolini e Dahinden, 1994; Luster, 1998). Uma terceira
subfamília possui um único par de cisteínas sendo a linfotactina a principal
representante, e uma quarta seriam as CX
3
C quimiocinas, com três aminoácidos
separando os dois resíduos de cisteína sendo a fractalina a principal componente
(para revisão ver Borish and Steinke, 2003).
Quadro 2: Quimiocinas e seus efeitos quimiotáticos sobre os diversos tipos celulares
QUIMIOCINA EOSINÓFILO CÉLULA T MONÓCITO NEUTRÓFILO
IL-8
- - - +++
RANTES ++
Células T de
memória
+ -
MCP-1 + + ++ -
MCP-3 + + + -
MCP-4 ++ + + -
MIP-1α
- Células CD8- ++ -
Eotaxina +++ - - -
Adaptado de Barnes e colaboradores, 1998.
1.4. Glicocorticóides
Os glicocorticóides são hormônios esteróides que exercem papel crucial na
manutenção da homeostase sendo necessários para a sobrevivência (Sapolsky, e
col, 2000). Desde o bem sucedido uso da hidrocortisona (cortisol), o principal
16
glicocorticóide sintetizado pelo córtex da adrenal, em 1948, na supressão dos
sintomas clínicos da artrite reumatóide, diversos compostos com atividade de
glicocorticóide foram sintetizados. Atualmente os glicocorticóides são amplamente
usados no tratamento de uma variedade de doenças inflamatórias e alérgicas, como
a asma e doenças autoimunes (Asadullah e col. 2002). O uso terapêutico sistêmico
ou tópico dos glicocorticóides continua crescendo, sendo empregado em quase todas
as especialidades médicas. Dados mostram que 10 milhões de prescrições médicas
com glicocorticóides são realizadas por ano nos Estados Unidos e 6,6 milhões na
Alemanha, contabilizando um gasto de 10 bilhões de dólares por ano (Schwabe,
1996).
Suas ações são exercidas em conseqüência da interação com seu receptor
intracelular específico denominado receptor de glicocorticóide (GR), que pertence a
superfamília de receptores de esteróides a qual inclui os receptores de
mineralocorticóides, hormônios sexuais e da tireóide, ácido retinóico e vitamina D
(Kumar e Thompson, 1999). No citoplasma o GR está normalmente associado a
proteínas reguladoras (hsp90, hsp70, p59 e p23) que impedem a translocação do
receptor para o núcleo. Após ligação do glicocorticóide ao receptor ocorrem
mudanças estruturais, levando à dissociação das proteínas reguladoras e assim
expondo sinais de localização nuclear. Como resultado há uma rápida translocação e
dimerização do complexo (glicocorticóide-receptor) para o núcleo, onde há ligação ao
DNA em uma seqüência específica da região promotora conhecida como elementos
de resposta a glicocorticóides (GRE), havendo como conseqüência alterações na
transcrição de genes (para revisão Barnes & Adcock, 2003 e Pelaia e col., 2003).
Os glicocorticóides ao ativarem seu receptor nas células responsivas vão
produzir seus efeitos regulando diretamente ou indiretamente a transcrição de genes
alvo (Reichardt e Schutz, 1998). No controle do processo inflamatório alérgico, o
principal efeito dos glicocorticóides está associado a sua capacidade de inibir a
síntese de muitas proteínas pró-inflamatórias pela supressão da etapa de transcrição
dessas moléculas. Entre os genes suprimidos estão os das citocinas (IL-1, IL-2, IL-3,
IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, TNF-α, GM-CSF, SCF), quimiocinas (IL-8,
RANTES, MIP-1α, MCP-1, MCP-3, MCP-4, eotaxina), moléculas de adesão (ICAM-1,
17
VCAM-1, E-selectina), enzimas da síntese de mediadores inflamatórios (iNOS, COX-
2, cPLA
2
), e receptores inflamatórios (receptor NK
1
e NK
2
de taquicininas e B
2
da
bradicinina) (Umland e col., 2002; Barnes e Adcock, 2003). Os glicocorticóides podem
ainda suprimir a inflamação pelo aumento da síntese de proteínas anti-inflamatórias
como a anexina-1 (anteriormente denominada de lipocortina-1), a citocina
interleucina-10 (IL-10), o antagonista do receptor de IL-1 (IL-1ra) e IκB-α um inibidor
do fator de transcrição pró-inflamatório NF-κB (Barnes, 2006) e mais recentemente
aumentar a expressão do receptor da lipoxina A
4
um eicosanóide com atividades anti-
inflamatórias (Hashimoto e col., 2007).
Frente à ampla ação dos glicocorticóides, muitas células inflamatórias e
estruturais que estão ativadas de forma anormal nas doenças alérgicas são inibidas.
Os efeitos gerais observados sobre a função e número dessas células são
observados na ilustração 2.
Ilustração 2: Efeitos celulares dos glicocorticóides sobre células inflamatórias e estruturais.
(adaptado de Barnes e Adcock, 2003).
1.4.1. Anexina-1
18
Durante os anos 70 estava claro que grande parte dos efeitos dos
glicocorticóides era decorrente da inibição da liberação de eicosanóides e que essa
inibição ocorria ao nível de liberação de substrato. Em outras palavras, os
glicocorticóides eram capazes de bloquear a ativação da fosfolipase A
2
enzima que
fornece ácido araquidônico de fosfolipídios de membrana para ação da
ciclooxigenase e lipoxigenase. Já na década seguinte, diversos grupos de pesquisa
mostraram que a inibição da liberação de ácido araquidônico pelos glicocorticóides
era dependente da síntese e liberação de proteínas inibitórias. O tratamento com
glicocorticóide resultava na produção de um fator que mimetizava os efeitos do
esteróide. Esse fator foi identificado como uma proteína de 37 kDa chamada
lipocortina e, posteriormente, denominada anexina-1 que detém atividade inibidora da
fosfolipase A
2
e conseqüentemente da geração de prostaglandinas (Parente e Solito,
2004; Kamal e col., 2005).
A anexina-1 é o primeiro membro de uma superfamília de proteínas
estruturalmente relacionadas que apresenta uma porção central conservada,
possuindo uma seqüência de 70 aminoácidos repetidos quatro vezes e agrupados
numa estrutura globular. Esse domínio é precedido por uma região N-terminal que
varia em sua seqüência e tamanho, sendo única em cada anexina e acredita-se ser
responsável pelas específicas e diferentes funções de cada membro (foram
caracterizadas até o momento 13 tipos de anexinas em mamíferos). (Gerke e Moss,
1997; Perretti e Gavins, 2003).
Desde sua descoberta, tem sido mostrado o papel da anexina-1 no controle do
crescimento e diferenciação celular, na transdução de sinal, na liberação do ácido
araquidônico e no tráfego de vesículas intracelulares (Viollete e col., 1990; Pepinsky e
col. 1991; Croxtall e Flower, 1992; Diakonova e col., 1997; Croxtall e col., 2000). A
aplicação da anexina-1 recombinante humana em modelos experimentais de
inflamação aguda e crônica reproduziu alguns dos efeitos antiinflamatórios dos
glicocorticóides (Perretti, 1998). Além disso, animais deficientes de anexina-1 ou
ainda animais tratados com anticorpos anti-anexina-1 apresentaram uma resposta
inflamatória prolongada demonstrando um papel da anexina endógena na modulação
19
da resposta inflamatória (Yang, e col., 2003; Hannon e col., 2003). De fato, diversos
tipos celulares como mastócitos, macrófagos, monócitos, neutrófilos e células
epiteliais são capazes de produzir e/ou responder a doses farmacológicas de
anexina-1 (Goulding e col., 1990; Croxtall e Flower, 1992; Francis e col., 1992; De
Catarina e col., 1993; Solito ecol., 1998; Oliani e col., 2000). O quadro 3 apresenta
alguns efeitos da anexina-1 em sistemas in vivo e in vitro.
Quadro 3: Efeitos da anexina 1 ou do peptídeo derivado Ac 2-26 em modelos experimentais
in vivo e in vitro.
Modelo Espécie Sistema Efeito Referência
Peritonite Camundongo
In vivo
Inibe extravasamento
celular
Perreti e col., 2001
I-R coração Rato
In vivo
Inibe lesão tecidual La e col., 2001
I-R mesentério Camundongo
In vivo
Inibe adesão celular
Induz descolamento celular
Inibe extravasamento
proteíco
Gavins e col.,
2003
Neutrófilo Humano
In vitro
Inibe influxo de cálcio
Inibe transmigração
Perreti e col., 2001
Solito e col., 2003
(I-R: Isquemia reperfusão)
Em mamíferos, os glicocorticóides regulam a síntese, fosforilação e posição da
anexina na célula assim como o envolvimento dessa molécula em suas ações sobre a
regulação da migração de leucócitos, da inflamação aguda e crônica, sobre lesão
isquêmica, dor e febre (para revisão Roviezzo e col., 2002). Pequenos peptídeos
obtidos da região N-terminal retêm sua atividade biológica. Dentre os fragmentos se
destaca o Ac2-26, um peptídeo de 24 aminoácidos (N-acetil-
AMVSEFLKQAWFIENEEQEYTVQT), que possui 3 kDa e que mimetiza muitos dos
efeitos antiinflamatórios da anexina-1 em modelos experimentais in vivo e in vitro (La
e col., 2001; Gavins e col., 2005).
20
O extravasamento de leucócitos é uma etapa importante na resposta
inflamatória (Panes e col., 1999). Análises de microscopia intravital, mostraram que a
administração da anexina-1 ou de seu peptídeo Ac2-26 reduziu o número de
leucócitos aderidos ao endotélio e também das células que transmigraram, fenômeno
esse decorrente de um aumento da desadesão dos leucócitos à parede do vaso
(Mancuso e col., 1995, Lim e col., 1998; Gavins e col., 2003) (ilustração 3).
Ilustração 3: Hipótese da desadesão. Em condições basais a anexina-1 (ANX-1)
encontra-se no citosol. A interação leucócito (neutrófilo foi ilustrado) endotélio, anexina-1
é externalizada. Uma vez na superfície anexina-1 ou seu peptídeo mimético (Ac2-26),
obtido por degradação enzimática (E), interage em seu receptor aumentando as
concentrações intracelulares de cálcio e shedding de L-selectina assim promovendo a
desadesão dos leucócitos ao endotélio. (adaptado de Perretti, 2003)
Utilizando anticorpos específicos observou-se a anexina-1 produzida pelos
neutrófilos era precipitada quando ligada ao receptor de lipoxina A
4
(ALX)
seletivamente quando os leucócitos estavam aderidos ao endotélio (Perretti e col.,
2002). A estimulação do ALX pela lipoxina A
4
ou lipoxinas produzidas pela acetilação
da COX-2 pela aspirina resulta numa inibição do tráfego de neutrófilos e da resposta
inflamatória indicando que a anexina-1 possa atuar de forma similar a lipoxina A
4
21
(Chiang e col., 2000). Dados de Perretti e colaboradores (2002) mostraram que
ambos, anexina-1 e lipoxina A
4
interagem de forma sinérgica sobre o receptor
humano ALX (FPRL1) inibindo a atividade dos neutrófilos na inflamação.
22
2. OBJETIVOS
Considerando-se as evidências que indicam a capacidade do peptídeo Ac2-26,
derivado de anexina-1, em reproduzir os efeitos farmacológicos dos glicocorticóides,
e sabendo-se que estes últimos são os mais potentes agentes supressores da
resposta inflamatória, tivemos como objetivo nesse trabalho avaliar o efeito do
tratamento com o peptídeo Ac2-26 sobre o desenvolvimento da inflamação e
hiperalgesia alérgicas, bem como buscar a elucidação dos principais mecanismos
envolvidos. Como objetivos específicos constaram avaliar:
- o efeito do peptídeo Ac2-26 sobre a desgranulação de mastócitos e
extravasamento protéico;
- o efeito do peptídeo Ac2-26 sobre a geração de eotaxina a partir de células
mesoteliais de ratos, de traquéia de cobaia e macrófagos em cultura;
- o efeito do peptídeo Ac2-26 sobre a quimiotaxia de eosinófilos in vitro;
- a expressão do receptor de lipoxina A
4
tanto em cultura de células mesoteliais
como no tecido plantar de ratos;
- o efeito do peptídeo Ac2-26 sobre a resposta hiperalgésica induzida pela pela
estimulação combinada das aminas vasoativas histamina e serotonina;
- o envolvimento de neutrófilos na ação anti-inflamatória do peptídeo Ac2-26
sobre a hiperalgesia alérgica;
- a participação do óxido nítrico no efeito anti-hiperalgésico do peptídeo Ac2-
26.
23
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Animais
Ratos Wistar (250-300 g) e cobaias Hartley (250-400g), de ambos sexos,
provenientes do Centro de Criação de Animais de Laboratório (CECAL) da FIOCRUZ
foram utilizados de acordo com normas estabelecidas pela Comissão de Ética no Uso
de Animais (CEUA da FIOCRUZ, licença nº 0085-02). Os animais foram mantidos em
um ciclo controlado claro e escuro de 12 horas, temperatura ambiente de 25ºC, com
água e alimento ad libitum.
3.2. Sensibilização
Ratos Wistar foram ativamente sensibilizados através da injeção subcutânea
de uma mistura contendo 50 µg de ovoalbumina (OVA) e 5 mg de hidróxido de
alumínio como adjuvante. Para avaliação da resposta alérgica, após 14 dias da
sensibilização, os animais foram desafiados antigenicamente por via intrapleural
(pleurisia) e intraplantar (hiperalgesia).
3.2.1. Modelo de pleurisia
Os ratos foram injetados por via intrapleural (i.pl.) com OVA (12 µg/cavidade).
Animais não sensibilizados injetados com igual dose de OVA ou, ainda, sensibilizados
injetados com solução de NaCl 0.9% (salina) estéril foram utilizados como controles.
O lavado pleural foi coletado e o volume medido com seringa graduada e então
utilizado para analises celulares e de mediadores.
3.2.1.1. Avaliação de leucócitos e níveis protéicos na pleura
A contagem de leucócitos totais no efluente pleural, coletado 4 e 12 horas após
o desafio antigênico, foi realizada em câmara de Neubauer e microscópio ótico
24
(objetiva 10x), após diluição das alíquotas em líquido de Türk (1:40). As contagens
diferenciais foram efetivadas em citoesfregaços, centrifugados a uma rotação de 47 x
g, por 5 min e posteriormente corados pelo método de May-Grunwald-Giemsa. A
avaliação foi feita em microscópio ótico com objetiva de imersão em óleo (objetiva
100x). Para a contagem de mastócitos, amostras do efluente pleural foram coletadas
4 horas após desafio antigênico e diluídas em azul de toluidina e avaliados em
câmara de Neubauer e microscópio de luz (objetiva 10x).
O efluente pleural foi ainda centrifugado a 1300 x g por 10 min e conteúdo
protéico foi quantificado por espectrofotometria (540 nm) pela técnica do biureto
(Gornall e col, 1949).
3.2.1.2. Quantificação de Eotaxina
Do efluente pleural foram recolhidas amostras para dosagem de eotaxina pelo
método de ELISA. O anticorpo anti-eotaxina murina (0,2 µg/mL, 100 µL por poço) foi
adsorvido à superfície de uma placa de 96 poços por 18 h a 25°C que foi, em
seguida, lavada com tampão fosfato de potássio 1 M (ph 7,5) adicionado de
Timerosal (2 mg/mL) e Tween 20 (0,05%). Os sítios não específicos foram
bloqueados com BSA (1%) em PBS por 1 h a 25°C. Após lavagem das placas com
tampão, as amostras (livres de células) ou o padrão de eotaxina foram adicionados e
feita incubação por a 25°C por 1 h. As placas foram lavadas com solução contendo
NaCl (0,14 M), NaPO
4
(1 M), KCl (2,7 M), Timerosal (2 mg/mL) e Tween 20 (0,05%),
seguida da adição de 100 µL do anticorpo biotinilado anti-eotaxina por mais 1 h a
25ºC. Na seqüência, a placa foi novamente lavada, adicionou-se neutravidina-
peroxidade seguida de uma nova incubação por 1 h a 25ºC. Após a última lavagem
da placa, foi adicionado o subtrato para a peroxidade (k-blue, Neogen) por 30 min e a
reação interrompida com H
2
SO
4
(0,19 M). A placa foi lida em leitor de ELISA
(Molecular Devices) utilizando o comprimento de onda de 450 nm.
3.2.2. Modelo de hiperalgesia
25
O estado de hiperalgesia foi detectado utilizando-se o modelo da placa quente
modificado (Lavich, 2005). O animal foi posto sobre uma plataforma aquecida a 52,5
± 0.5ºC e dois cronômetros foram disparados para registrar a latência de resposta da
retirada das patas traseiras. Como descrito acima, os animais foram ativamente
sensibilizados e 14 dias após foram desafiados com injeção intraplantar de
ovoalbumina (12 µg/pata) num volume máximo de 100 µL na pata esquerda,
enquanto que a direita sempre foi injetada com igual volume (100 µl) de salina. Os
resultados foram expressos em termos de variação de latência de retirada das patas
esquerda e direita, medida em segundos. Vale ressaltar que animais tinham inteira
liberdade de movimentos, limitados apenas por uma redoma de acrílico de
aproximadamente 18 cm de diâmetro por 40 cm de altura. Desta forma, elimina-se o
componente de estresse provocado pela imobilização.
3.2.2.1. Modelo de sinergismo
Além do grupo estímulado com antígeno, um outro grupo de animais normais
recebeu na pata uma mistura de histamina (5 µg/pata) e 5-HT (1 µg/pata). Nessas
concentrações, esses mediadores atuam de forma sinérgica induzindo uma resposta
hiperalgésia a estímulo térmico (Lavich, 2003).
3.2.2.2. Análise histopatológica do tecido plantar
Os animais foram sacrificados em câmara de CO
2
e em seguida retirou-se o
coxim plantar de ambas as patas posteriores. Os tecidos foram fixados em solução
Carson-Milloning com 4% de formaldeído (Herrera, 1992). Posteriormente o material
foi incluído em parafina e cortado em micrótomo na espessura de 5 µm para
confecção das lâminas. Estas foram coradas com hematoxilina eosina (H&E) e
analisadas em microscópio ótico (Olympus B201, Japão) para verificar a presença de
infiltrado leucocitário. As análises foram realizadas em tecido plantar retirado no
tempo de 180 min (Lavich, 2006) após o desafio antigênico. A contagem dos
26
neutrófilos foi realizada em 50 campos diferentes utilizando o aumento de 1000 vezes
do microscópio ótico e óleo de imersão. Os resultados foram expressos como a
média de células nos campos observados.
3.2.3. Tratamentos
Para estudar os efeitos do fragmento N-Terminal da anexina-1 sobre a
pleurisia alérgica, o peptídeo Ac2-26 (Advance Biotechnology Center) (50 e 200
µg/cavidade) foi injetado intrapleuramente 5 min antes do desafio alergênico. Nos
grupos controles, o peptídeo foi substituído por veículo (salina estéril) ou por um
pepídeo não relacionado (seqüência 204-212 da anexina 5 humana; Perretti e col.,
1991). Alternativamente, dexametasona (0,5 mg/Kg) injetada intraperitonealmente 1 h
antes do desafio. Além disso, grupos de animais tratados com Ac2-26 e estimulados
com ovoalbumina receberam tratamento com um antagonista de ALX (BOC-2, diluido
em DMSO 0,1 %) injetado intraplantarmente concomitante com o peptídeo ou apenas
veículo (DMSO 0,1 %).
Para estudar os efeitos do fragmento N-Terminal da anexina-1 sobre a
resposta hiperalgésica (alérgica e inflamatória), o peptídeo Ac2-26 (50-200 µg/pata)
foi injetado intraplantarmente 1 h antes do estímulo. Nos grupos controle, o peptídeo
foi substituído por veículo (salina estéril). Alternativamente, foram realizados
experimentos pré-tratando os animais com inibidor da síntese de óxido nítrico (L-
NAME - 50 e 100 mg/Kg i.p.) ou com um inibidor da guanilato ciclase (ODQ - 100
µg/pata) 1 h antes da tratamento com o peptídeo. Outro grupo experimental, animais
foram tratados com nitroprussiato de sódio (250-700 µg/pata) antes do desafio
alérgico. Além disso, outro grupo foi tratado com um análogo estável da 15-epi-
lipoxina A
4
(ATL-1, gentilmente cedido pela Dra. Iolanda Fierro) antes do desafio com
ovoalbumina, sendo o grupo controle tratado com veículo (etanol - 0,1 %).
3.3. Liberação de histamina anafilática de fragmentos tecidos hipodérmicos in
vitro
27
Ratos ativamente sensibilizados foram sacrificados em câmara de CO
2
e
fragmentos da hipoderme dorsal de aproximadamente 1 mg foram removidos e
colocados em placas de 48 poços contendo meio HBSS com Ca
++
e Mg
++
. Os
fragmentos foram expostos a ovoalbumina (300 µg/ml) por 1 h em estufa a 37°C, 5%
de CO
2
, a placa foi então centrifugada por 10 min a 150 x g, sendo ao final o
sobrenadante da reação recolhido e diluído em ácido perclórico (0,8 N) para posterior
quantificação de histamina liberada conforme mencionado (de Oliveira Barreto e col.,
2003). Para testar o potencial efeito do peptídeo Ac2-26 (16-66 µM) sobre a liberação
de histamina decorrente do desafio antigênico, os tecidos foram pré-tratados com o
peptídeo ou com veículo durante 1 hora a 37°C antes da estimulação com
ovoalbumina.
3.3.1 Quantificação de histamina
A quantificação foi feita pela técnica de fluorimetria (Shore e col., 1959). As
alíquotas do sobrenadante da reação foram diluídas em ácido clorídrico (0,1 N) e
hidróxido de sódio (0,8 N), de modo que garanta a ligação com o-ftaldeído (OPT),
reagente este que emite fluorescência a 450 nm quando exitado a 360 nm. Após
coletado o sobrenadante os tecidos foram secados em estufa à 40°C por 15 min e os
resultados foram expressos como quantidade de histamina liberada (ng) por peso
seco de tecido (mg).
3.4. Quimiotaxia de eosinófilos
Eosinófilos foram isolados da cavidade peritoneal de ratos normais usando
gradiente de Percoll como descrito anteriormente (Martins e col., 1989). A suspensão
de eosinófilos apresentava 85-95% de pureza e a viabilidade avaliada através do
corante de azul de trypan foi de 96%. Experimentos de migração foram realizados
utilizando câmara de quimiotaxia de 48 poços (Neuro Probe, Inc.USA) e filtros de
nitro celulose (poros de 3 µm) de acordo com a descrição da técnica (Richards e
McCullough, 1984).
28
Para avaliar o efeito do peptídeo Ac2-26 sobre os eosinófilos, células foram
pré-incubadas com o peptídeo ou veículo por 1 h à 37°C; então a suspensão celular
(2 x 10
5
celulas; 50 µl) foram colocadas no compartimento superior da câmara
enquanto que no compartimento inferior foi preenchido com eotaxina murina (0.1
µM), fator de ativação plaquetária (PAF, 1 µM) e veículo (RPMI medium, pH 7.2,
0.1% BSA). A câmera de quimiotaxia foi então incubada por 2 h à 37°C e 5% CO
2
. O
filtro foi fixado e corado como já descrito (Richards e McCullough, 1984). Eosinófilos
migrados até 40 µm da superfície superior do filtro (HPF – “high power field”) foram
contados em 15 campos consecutivos utilizando objetiva de imersão (Martins e col.,
1989).
3.5. Isolamento e cultura de células mesoteliais de ratos
Células mesoteliais foram obtidas de ratos Wistar conforme descrito por Yang
e col. (2004). Ratos foram sacrificados em câmara de CO
2
e a cavidade peritoneal
lavada com 25 ml de solução contendo 0.25 % de tripsina e 0.02 % EDTA-Na
2
. Após
2 horas, a cavidade foi aberta através de um corte longitudinal, o lavado coletado e
centrifugado a 200 x g, por 10 min a 10°C. As células foram ressuspensas em DMEM
Ham’s/F12 contendo 2-mercaptoetanol (50 µM), penicilina (100 µg/ml), estreptomicina
(100 µg/ml) e de soro fetal bovino (20%), sendo cultivadas em frascos de cultura a
37°C e 5% CO
2
. Após 24 h, as células não aderidas foram removidas e aquelas
aderentes foram cultivadas até confluência. A monocamada de células mesoteliais foi
dissociada com 0.25% tripsina–0.02% EDTA-Na
2
e repassadas para placas de 48
poços (5x10
4
céls/poço). Após confluência, as células foram incubadas com
DMEM/F12 livre de soro e estimuladas na presença ou ausência de tratamentos .
Para avaliar o efeito da anexina sobre as células em estudo, o peptídeo Ac2-26
(13-66 µM) foi adicionado a cultura 1 hora antes da estimulação das células por IL-13.
Após diferentes tempos de incubação (24-72 h), o sobrenadante recolhido,
centrifugado a 2000 x g for 10 min a 4°C e estocado para posterior quantificação dos
mediadores secretados.
29
3.6. RT-PCR
RNA foi extraído a partir 10
7
células mesoteliais em 1 mL de Trizol de acordo
com o protocolo do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). 1 µg do total de RNA
purificado foi utilizado como molde para a sintese da primeira fita de cDNA usando
transcriptase reversa SuperScript II (Invitrogen). PCR foi realizado usando 2 µL da
reação de transcriptase reversa (equivalente a 100 ng de RNA inicial) como molde,
200 µM dNTPs, 20 nM de cada primer e 2 U de Taq polimerase (Amersham), num
volume reacional de 50 µl, de acordo com as instruções do fabricante da enzima. As
seqüências de primers (Alpha DNA, Montreal, Canada) e o tamanho dos produtos
amplificados foram: β-actina de rato, 5’-TGACCCAGATCATGTTTGAGAC-3’ e 5’-
GGATTCCATACCCAGGAAGGA-3’ (458 bp); ALX de rato, 5’-
CCGTCCATTAAGAGTCCTTAC-3’ e 5’- TCATATTGCTTTTATATCAATGTT (343 bp).
As condições do PCR foram: um passo de desnaturação a 94°C por 2 min; seguido
por 45 ciclos a 94°C por 30 s, 52°C por 30 s e 72°C por 60 s; seguidos pela passo de
extensão final a 72°C por 7 min. Um total de 20 µl de cada produto de PCR foi corrido
num gel de agarose (2%) e visualizado com brometo de etídeo. As seqüências
primers para β-actina de rato foram baseadas nas seqüências do GenBank, número
de acesso BC063166. As seqüências primers para ALX de rato foram as mesmas
publicadas anteriormente (Chiang e col., 2003)
3.7. Real Time PCR
Fragmentos de até 1 mg do coxim plantar de ratos foram coletados e
adicionados a trizol (%) e congelados. O RNA total foi extraído utilizando protocolo
RNAeasy de acordo com o fabricante (Qiagen, West Sussex, UK). O RNA total serviu
para a síntese de cDNA a partir de primers aleatórios e transcriptase reversa AMV
(Invitrogen, Paisley, UK). Alíquotas do cDNA foram analisados por PCR quantitativo
de tempo real usando o kit TaqMan Universal PCR master mix e primers
fluorescentes obtidos da Applied Biosystems (California, USA). As condições dos
ciclos foram preparadas de acordo com as instruções do fabricante. Sinais de
30
fluorescência da seqüência específica foram detectadas pelo sistema de Detecção
ABI Prism 7700. A expressão do mRNA FPRL-1, FPRL-2 e anexina-1 foram
normalizados para cada amostra de acordo com a expressão de mRNA de
gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH) para compensar qualquer variação
da quantidade de mRNA. Níveis de expressão foram calculados de acordo com o
método ∆∆C
T
(Pfaffl, 2001). Todos os resultados foram expressos em relação à
amostra com a menor expressão obtida.
3.8. Isolamento e cultura de células de traquéia de cobaias
Após sacrifício dos animais em câmara de CO
2
, faz-se dissecção e exposição
da traquéia em condições estéreis. Após fechamento de ambas as extremidades, a
traquéia foi removida e foi injetada em seu interior meio DMEN F12 contendo 0.1%
protease tipo I4 por 90 min a 37ºC. Os segmentos de traquéia serão transferidos para
placas de cultura contendo meio DMEM Ham’s/F12 com 10% soro fetal bovino e
abertas longitudinalmente. As células epiteliais forão retiradas mediante gentil
raspagem, dissociadas para romper possíveis grumos e centrifugadas 200 x g por 10
min. O precipitado celular foi ressuspendido em meio DMEM Ham’s/F12 contendo 50
µM 2-mercaptoetanol, 100 µg/ml penicilina, 100 µg/ml estreptomicina e 5% de soro
fetal bovino. Após contagem das células em câmara de Neubauer, foi feita avaliação
morfológica das células em microscópio de contraste de fase e avaliação da
viabilidade (> 95%) através do corante azul de tripan. As células forão, então,
adicionadas a placas de 48 poços (4 x10
5
células/poço) num volume final de 1 ml,
sendo mantidas por 4-5 dias até obtenção de confluência. Na seqüência, as células
serão estimuladas com IL-13 (1 ng/mL) por 24 h a 37°C em estufa de CO
2
umidificada. Em alguns grupos de experimentos, foi feita adição de dexametasona ou
peptídeo Ac2-26, em diferentes concentrações, 1 h antes da estimulação com IL-13.
O sobrenadante recolhido, centrifugado a 2000 x g for 10 min a 4°C e estocado para
posterior quantificação dos mediadores secretados.
31
3.7. Cultura de células RAW 264,7 e quantificação de óxido nítrico
A linhagem de macrófagos de camundongos (RAW 264) foi cultivada em
frascos de cultura contendo DMEM Ham’s/F12 contendo 2-mercaptoetanol (50 µM),
penicilina (100 µg/ml), estreptomicina (100 µg/ml) e de soro fetal bovino (20%), sendo
mantidas a 37°C e 5% CO
2
.
Para avaliar o efeito do peptídeo Ac2-26 em induzir óxido nítrico, as células
foram tripsinizadas e plaqueadas x células/mL em placas de 48 poços na presença de
concentrações crescentes do peptídeo Ac2-26 (16-66 µM) por 24 h a 37°C e 5% CO
2
.
Após esse tempo o sobrenandante foi recolhido e mantido a -20ºC para posterior
quantificação de óxido nítrico.
A dosagem de óxido nítrico foi realizada de forma indireta a partir da
quantificação de nitrito (NO
2-
). Das amostras obtidas, 100 µL foram adicionados a
placas de 96 poços, ao que se seguiu a adição de 100 µL do reagente de Griess (N-
(1-naftil) etilenodiamina 0,1% em H
2
O e sulfanilamida 1% em ácido fosfórico 5%) que
reage com o nitrito presente nas amostras. O produto da reação foi lido em
espectrofotômetro a 540 nm.
3.9. Análise estatística
Os resultados obtidos foram analisados através do teste de análise de variância
(ANOVA), seguido do teste estatístico “one-way“ de Newman-Keuls-Student. Os
dados foram expressos como a média ± erro padrão da média (EPM) de no mínimo 6
animais, onde os valores de P<0.05 foram considerados estatisticamente
significativos.
3.10. Fonte de obtenção de drogas e reagentes
2-mercaptoetanol SIGMA
5-HT SIGMA
32
Ácido clorídrico MERCK
Ácido perclórico MERCK
Ácido Sulfurico MERCK
Azul de toluidina MERCK
BOC-2 (Boc-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe) Phoenix Pharmaceuticals
BSA SIGMA
Cloreto de Potássio MERCK
Dexametasona SIGMA
DMEM Ham’s/F12 SIGMA
EDTA-Na
2
SIGMA
Estreptomicina SIGMA
Formaldeído MERCK
HBSS com Ca
++
e Mg
++
SIGMA
Hematoxilina eosina MERCK
Hidróxido de alumínio Sanofi-Synthelabo
Hidróxido de sódio REAGEN
Histamina SIGMA
IL-13 SIGMA
K-blue SIGMA
L-NAME SIGMA
May-Grunwald-Giemsa SIGMA
Nitroprussiato de sódio HypoFarma
ODQ SIGMA
O-ftaldeído (OPT) SIGMA
Ovoalbumina SIGMA
PAF BACHEM
PBS SIGMA
Penicilina SIGMA
Protease tipo I4 SIGMA
Reagente de Griess SIGMA
33
RPMI-1640 SIGMA
Soro fetal bovino SIGMA
Timerosal SIGMA
Tripsina SIGMA
Tween 20 SIGMA
34
4. RESULTADOS
4.1. Efeito do peptídeo Ac2-26 sobre a pleurisia alérgica
O desafio pleural com ovoalbumina (12 µg/cavidade) em ratos sensibilizados
provocou uma reação inflamatória caracterizada por um intenso extravasamento de
plasma e infiltrado leucocitário (Figura 1). Em analogia com estudos prévios de nosso
grupo (Lima e col., 1991; Silva e col., 2001), o infiltrado mostrou-se basicamente
neutrofílico (Figura 1b), na fase inicial (4 h após desafio), e eosinofílico (Figura 1c) na
fase tardia do processo (12 h após desafio). O tratamento local com o peptídeo Ac2-
26 (50 e 200 µg/cavidade) inibiu de forma dose resposta o extravasamento proteíco
(Figura 1a), assim como o infiltrado de neutrófilos e eosinófilos (Figuras 1b e 1c
respectivamente). Como mostrado na Tabela 1, o número de células mononucleares
pleurais, que geralmente aparece aumentado após desafio intrapleural com
ovoalbumina, manteve-se inalterado após tratamento com peptídeo Ac2-26 quando
comparados com o grupo sensibilizado e desafiado. Complementarmente, um
peptídeo irrelevante utilizado como controle não afetou nenhum dos parâmetros
inflamatórios observados após desafio com ovoalbumina. Valores (média ± EPM)
para os grupos não tratados e tratados com o peptídeo controle variaram de 38,4 ±
4,8 (n=7) à 31,5 ± 4,3 mg/cavidade (n=5) em relação conteúdo total de proteína e de
42,7 ± 5,3 (n=7) à 42,0 ± 2,6 x10
6
células/cavidade para o influxo de leucócitos.
4.2. Efeito do peptídeo Ac2-26 na desgranulação de mastócitos e liberação de
histamina induzida por alergeno
De acordo com dados anteriores (Lima e col., 1991), o desafio intrapleural com
ovoalbumina em ratos sensibilizados leva a uma significativa redução do número de
mastócitos intactos recuperados da cavidade pleural, 4 h após o desafio. Como
ilustrado na Tabela 2, o pré-tratamento com o peptídeo Ac2-26 significativamente
aumentou o número de mastócitos intactos recuperados no lavado pleural após
35
injeção do alergeno. Além disso, a liberação de histamina (Figura 2) a partir de
fragmentos da hipoderme desafiados in vitro com ovoalbumina foi atenuada pela
exposição ao peptídeo Ac2-26 (13-66 µM) confirmando seu efeito em proteger a
ativação de mastócitos.
4.3. Peptídeo Ac2-26 inibe a formação de eotaxina in vivo e in vitro
Silva e colaboradores (2001) mostraram que o acúmulo de eosinófilos em ratos
sensibilizados e desafiados é precedido pela geração de eotaxina e este fenômeno é
inibido com o tratamento dos animais com anticorpo anti-eotaxina. Nossos dados
mostram que o tratamento com o dexametasona ou o peptídeo Ac2-26 aboliu a
formação de eotaxina observada no lavado pleural 6 h após o desafio com
ovoalbumina em ratos ativamente sensibilizados (Figura 3). Células mesoteliais de
pleura produzem eotaxina quando estimuladas por citocinas (Katayama e col., 2002).
Com base nesses achados, células mesoteliais de peritônio de ratos foram isoladas e
o receptor de anexina-1 ou FPRL-1 foi detectado por RT-PCR (Figura 4). Em seguida
testamos o efeito do peptídeo Ac2-26 sobre a produção de eotaxina por essas células
estimuladas por IL-13. Vimos que os tratamentos com dexametasona (1 e 10 µM) ou
com o peptídeo Ac2-26 (16-33 µM) foram capazes de inibir de forma significativa a
produção de eotaxina pelas células mesoteliais (Figura 5a). De forma similar, células
epiteliais da traqueía de cobaias estimuladas com IL-13 produzem eotaxina e o
tratamento com dexametasona (1 e 10 µM)) ou peptídeo Ac2-26 (16-33 µM) foi capaz
de inibir essa resposta (Figura 5b) confirmando a atividade do peptídeo derivado da
anexina-1 em inibir a geração dessa quimiocina.
4.4. Ausência de efeito do Ac2-26 sobre a quimiotaxia de eosinófilos in vitro
Para determinar se o peptídeo Ac2-26 teria capacidade de inibir diretamente o
recrutamento de eosinófilos, nós investigamos seu efeito sobre a quimiotaxia dessas
células usando como estímulo eotaxina e PAF utilizando o sistema da câmara de
36
Boyden. Como mostrado na Tabela 3, o peptídeo Ac2-26 (3.3-66 µM) falhou em
alterar a migração de eosinófilos in vitro.
4.5. Efeito do peptídeo Ac2-26 sobre a hiperalgesia induzida por aminas
vasoativas
Lavich e colaboradores (2003) mostraram que ratos passivamente
sensibilizados e desafiados com antígeno injetado na pata apresentam uma reação
inflamatória onde se pode observar presença de edema e hiperalgesia local, processo
decorrente da ação sinérgica de histamina e 5-HT. A injeção de ovoalbumina (12
µg/pata) em ratos sensibilizados gerou uma intensa resposta hiperalgésica com
resposta máxima entre 15 e 60 min e que se manteve por até 6 h após o estímulo
(Figura 6a). O pré-tratamento com peptídeo Ac2-26 (25 - 100 µg/pata) inibiu de forma
dose resposta a hiperalgesia plantar induzida pela associação histamina e 5-HT
(Figura 6a). Injetando-se o peptídeo em diferentes períodos de tempo antes do
estímulo antigênico, notou-se que sua ação perdurou por até 3 h antes da
estimulação conforme visto na Figura 6b.
4.6. Ação do peptídeo na resposta hiperalgésica é mediada pelo receptor de
lipoxina A
4
Vários autores vêm mostrando que os efeitos da anexina-1 são mediados via
receptor FPRL-1 ou receptor de lipoxina A
4
(ALX) (Para revisão ver Gavins e col.
2005). Tratando os animais com um inibidor do receptor (BOC-2; 1,2 - 5 nmol/ pata),
injetado concomitantemente ao composto Ac2-26, foi observada a reversão do efeito
anti-hiperalgésico do peptídeo sobre a resposta alérgica (Figura 7). O tratamento com
BOC-2 ou seu veículo não causaram qualquer alteração nas respostas (dados não
mostrados). Amostras da pata de ratos foram processadas e analisadas por PCR de
tempo real onde foi confirmada a expressão dos genes dos receptores FPR, FPRL-1
e FPRL-2, respectivamente apresentados como FPR, Fpr-rs1 e Fpr-rs2 (Figura 8) e
também a expressão da anexina-1 (Anx-1). Além disso, na Tabela 4 mostramos que o
37
tratamento dos animais com um análogo estável da lipoxina A
4
(ATL-1; 250 ng/pata)
foi capaz de inibir de forma similar a resposta hiperalgésica cujo efeito foi revertido
pelo uso do antagonista.
4.7. Efeito do peptídeo sobre a migração de neutrófilos na pata de ratos
Recentemente nosso laboratório demonstrou o papel crucial de neutrófilos na
hiperalgesia alérgica (Lavich, 2006). Complementarmente, dados na literatura
mostram que o peptídeo Ac2-26 tem grande capacidade de inibir a migração de
neutrófilos para o sítio inflamatório num processo dependente do receptor FPRL-1
(para revisão Parente e Solito, 2004). Através de cortes histológicos das patas de
animais sensibilizados e desafiados com ovoalbumina (12 µg/mL) nas situações não
tratado, tratado com o peptídeo e tratado com peptídeo mais o antagonista do
receptor (Figura 9 B, C e D respectivamente), pode-se perceber uma redução do
número de células inflamatórias nas patas de animais tratados com peptídeos em
relação aos não tratados. Contando o número de neutrófilos nos tecidos, notamos
uma redução significativa dessas células nos animais tratados com peptídeo efeito
esse revertido pela adição do antagonista do receptor (Figura 10).
4.8. Ação direta do peptídeo derivado da anexina-1 sobre a ação de mediadores
inflamatórios
Ferreira (1997) observou que anexina-1 e seu peptídeo derivado eram capazes
de inibir a hiperalgesia mecânica induzida por estímulos pró-inflamatórios como
carragenina, bradicinina, e citocinas TNF-α e IL-6. Conforme mostrado anteriormente,
o tratamento com o peptídeo foi capaz de inibir a desgranulação de mastócitos in vivo
e in vitro. Mostramos que a injeção concomitante das aminas vasoativas histamina e
5-HT na pata de ratos induziu uma resposta hiperalgésica (Figura 11). O pré-
tratamento com o peptídeo Ac2-26 (50 µg/pata), 1 h antes do estímulo, foi capaz de
inibir a hiperalgesia térmica na pata de ratos (Figura 11), sugerindo a ação direta do
38
peptídeo sobre as terminações nervosas. Essa resposta também foi sensível ao
tratamento com o receptor de lipoxina A
4
(Figura 11).
4.9. Peptídeo Ac2-26 inibe hiperalgesia alérgica por um mecanismo dependente
da produção e ação do óxido nítrico
Recentemente vêm se mostrando o papel do óxido nítrico (NO) como possível
molécula antiinflamatória (Wallace, 2005) e ainda que esta participasse nas respostas
da lipoxina A
4
assim como de seus análogos estáveis sobre a resposta inflamatória
(Paul-Clark e col., 2004). Como a lipoxina e a anexina-1 compartilham o mesmo
receptor, avaliamos o papel do NO na ação do peptídeo. Primeiramente utilizamos
um inibidor inespecífico da síntese de óxido nítrico o L-NAME (30 - 100 µg/Kg i.p.). O
tratamento realizado 30 min antes da injeção do peptídeo foi capaz de atenuar de
forma dose-dependente a inibição da hiperalgesia pelo Ac2-26 (Figura 13).
Complementarmente, tratamos os animais com um inibidor da guanilato ciclase
(ODQ; 100 µg/para), enzima importante no mecanismo de ação do óxido nítrico.
Como observado na Figura 14, o ODQ foi capaz de evitar o efeito do peptídeo sobre
a hiperalgesia alérgica. Em paralelo um doador de óxido nítrico, nitroprussiato de
sódio (250 - 750 µg/pata), foi capaz de inibir a hiperalgesia alérgica de forma similar
ao peptídeo (Figura 15), indicando o papel do óxido nítrico nessa resposta inibitória.
Macrófagos são conhecidos pela sua capacidade de secretar óxido nítrico. Tendo
isso em vista, testamos a capacidade do peptídeo Ac2-26 em induzir esse mediador
num modelo in vitro. A estimulação de uma linhagem de macrófagos (RAW 264,7)
pelo peptídeo foi capaz de induzir a produção de óxido nítrico de forma dose resposta
(Figura 16) e, além disso, o tratamento prévio dessas células com o BOC-2 inibiu a
produção de óxido nítrico por essas células (dados não mostrados).
39
Figura 1: Efeito inibitório do peptídeo Ac2-26 (50 e 200 µg/cavidade, i.pl.) no
extravasamento protéico pleural (a), no acúmulo de neutrófilos (b) 4 h após desafio e
no acúmulo de eosinófilos (c) 12 h após desafio. Todos os ratos foram desafiados
com ovoalbumina (12 µg/cavidade, i.pl.). Os valores estão expressos com média ±
EPM de no mínimo 6 animais. * P < 0,001 quando comparados com grupo não
sensibilizado. +P < 0,01 quando comparados com grupo sensibilizado e desafiado.
0
4
8
12
Neutrófilos x 10
6
/cavidade
*
+
+
0
10
20
30
40
Proteina (mg/cavidade)
*
+
+
0
2
4
6
8
10
12
Eosinófilos x 10
6
/cavidade
*
+
Sensibilização
Ac 2-26 (µg/cavidade)
Ovoalbumina
-
-
+
+
-
+
+
200
+
+
50
+
a
b
c
40
Tabela 1. Efeito peptídeo Ac2-26 derivado da anexina 1 sobre o infiltrado
mononuclear induzido por antígeno na cavidade pleural de ratos sensibilizados.
Células mononucleares x 10
6
cavidade
-1
Condição Tratamento
4 h após desafio 12 h após desafio
Não sensibilizado - 7,38 ± 0,41 7,97 ± 0,54
Sensibilizado - 12,87 ± 1,42* 22,08 ± 2,63*
Sensibilizado Ac2-26 9,72 ± 1,18 18,27 ± 2,70
Pré-tratamento local com Ac2-26 (200 µg/cavidade) foi realizado 5 min antes do desafio
alergênico. Todos os ratos foram desafiados com ovoalbumina (12 µg/cavidade, i.pl.). A
análise celular foi realizada 4 e 12 h após o desafio. Cada valor representa a média ±
EPM de no mínimo 8 animais. *P < 0,01 em relação ao grupo controle.
41
Tabela 2. Efeito peptídeo Ac2-26 derivado da anexina sobre a desgranulação de
mastócitos induzido por antígeno na cavidade pleural de ratos sensibilizados.
Condição Tratamento
Mastócitos intactos
x 10
3
cavidade
-1
Não sensibilizado - 679,7 ± 55,1
Sensibilizado
- 4,2 ± 4,7*
Sensibilizado
Ac2-26 247,5 ± 77,8
+
Pré-tratamento local com Ac2-26 (200 µg/cavidade) foi realizado 5 min antes do desafio
alergênico. Todos os ratos foram desafiados com ovoalbumina (12 µg/ cavidade, i.pl.).
A análise dos mastócitos foi realizada 4 h após o desafio. Cada valor representa a
média ± EPM de no mínimo 8 animais *P < 0,01 em relação ao grupo não sensibilizado.
+
P < 0,01 em relação ao grupo sensibilizado.
42
Figura 2: Efeito do peptídeo Ac2-26 (16-66 µM) sobre a liberação de histamina
por fragmentos de tecidos subcutâneos estimulados com ovoalbumina (300
µg/ml). Os valores estão expressos como média ± EPM de no mínimo 4
fragmentos. *P < 0,001 comparado ao grupo não desafiado.
+
P < 0,001
comparado ao grupo desafiado com ovoalbumina não tratado com o peptídeo
Ac2-26.
0
10
20
30
40
50
Ovoalbumina: - +
+
+ +
*
Ac2-26 (µM):
- -
16
33 66
+
+
Histamina liberada
(ng por mg tecido)
43
Figura 3: Efeito do tratamento com dexametasona (Dexa) (1 mg/Kg, i.p.) ou peptídeo
Ac2-26 (200 µg/cavidade, i.pl.) na geração de eotaxina no efluente pleural observada
6 h após o desafio pleural (ovoalbumina, 12 mg/cavidade, i.pl.) em animais
ativamente sensibilizados. Os valores estão expressos como média ± EPM de no
mínimo 6 animais. *P < 0,001 comparado ao grupo não sensibilizado.
+
P < 0,001
comparado ao grupo desafiado com ovoalbumina.
0
250
500
750
*
+
+
Sensibilização:
Tratamento:
Ovoalbumina:
-
-
-
+
-
+
+
Ac2-26
+
+
Dexa
+
Eotaxina (fmol)/cavidade
44
Figura 4: Análise da expressão de ALX de células mesoteliais de rato obtidos por
RT-PCR. RNA isolado de cultura de células mesoteliais isoladas de rato foi
transcrito reversamente (+RT) e usado como molde para PCR usando primers de
ALX e β-actina-especifica de rato. Reações de PCR utilizando reação RT onde a
transcriptase reversa foi omitida (-RT) foi utilizado como controle. Um padrão de
250-bp (Invitrogen) foi utilizado para medir os produtos do PCR, as bandas de
250- e 500-bp estão indicadas.
rALXR
β
ββ
β-Actina
500 bp
250 bp
RT
rALXR
β
ββ
β-Actina
500 bp
250 bp
RT
45
Figura 5: Efeito do tratamento com dexametasona (Dexa) (1 e 10 µM) ou
peptídeo Ac2-26 (16-66 µM) na geração de eotaxina de células mesoteliais de
rato (a) e células epiteliais de traquéia de cobaia (b) estimuladas com IL-13 (2
ng/ml). Os valores estão expressos como média ± EPM de no mínimo 4 pontos
distintos.
*
P < 0,001 comparado com o grupo não estimulado.
+
P < 0,001
comparado ao grupo não tratado e estimulado com IL-13.
IL-13 (2 ng/ml)
Meio
0
25
50
75
Eotaxina (
ρ
M)
0
250
500
750
1000
Eotaxina (
ρ
M)
Tretamento
(µM)
*
+
+
+
+
+
Dexa
Ac2-26
*
+
+ +
+
+
- - 1 10 16 6633
a
b
46
Tabela 3. Ausência de efeito do peptídeo derivado da anexina-1 sobre a
quimiotaxia de eosinófilos induzida por PAF in vitro.
Eosinófilos por 15 HPF
Ac2-26 (µM) Veículo Eotaxina PAF
0
4.2 ± 1.3 15.7 ± 3.6* 91.6 ± 6.9*
33
5.0 ± 1.2 11.0 ± 3.5* 86.1 ± 12.0*
66
4.5 ± 0.7 14.3 ± 4.5* 138.0 ± 9.2*
Eosinófilos foram pré-incubados com Ac2-26 (33 e 66 µM) por 1 h a 37ºC antes da
estimulação com eotaxina (0,1 µM) ou PAF (1 µM) por 2 h. Resultados representam
média ± EPM de 4 a 6 experimentos.
*P < 0,01 comparado com eosinófilos não
tratados estimulados com veículo.
47
Salina
OVA [12 µg/pata]
+ Ac2-26 [25 µg/pata]
+ Ac2-26 [50 µg/pata]
+ Ac2-26 [100 µg/pata]
0 180 36015 60
0.0
2.5
5.0
7.5
∆
Latência (s)
(a)
*
*
*
*
+
+
+
+
+
+
Salina
OVA [12 µg/pata]
+ Ac2-26 (1 h antes)
+ Ac2-26 (3 h antes)
+ Ac2-26 (6 h antes)
0 180 36015 60
0.0
2.5
5.0
7.5
∆
Latência (s)
(b)
Tempo (min)
*
*
*
*
+
+
+
+
Figura 6: Cinética de efeito do tratamento com o peptídeo Ac2-26 (25-100 µg/pata)
sobre a hiperalgesia térmica induzida por ovoalbumina (12 µg/pata) na pata de ratos
ativamente sensibilizados. (a) Dose-resposta (25-100 µg/pata) de ação peptídeo e (b)
análise temporal de inibição numa dose única (50 µg/pata). Os valores estão
expressos como média ± EPM de no mínimo 5 animais. * P < 0,001 quando
comparado ao grupo controle. + P < 0,001 quando comparado ao grupo desafiado
com ovoalbumina.
48
0.0
2.5
5.0
7.5
∆
Latência (s)
Ac2-26 [50µg/pata]:
BOC [nmol/pata]:
-
-
-
-
+
-
+
1,2
+
2,5
+
5
*
+
#
#
Figura 7: Efeito do co-tratamento com o peptídeo Ac2-26 (50 µg/pata) e do
antagonista do ALX (BOC-2; 1,2 - 5 nmol) sobre a hiperalgesia térmica induzida por
ovoalbumina (12 µg/pata) na pata de ratos ativamente sensibilizados. Os valores
estão expressos como média ± EPM de no mínimo 5 animais. * P < 0,001 quando
comparado ao grupo controle.
+
P < 0,001 quando comparado ao grupo desafiado
com ovoalbumina.
#
P < 0,01 quando comparado ao grupo desafiado com
ovoalbumina e tratado com peptídeo Ac2-26.
49
Figura 8: Expressão de mRNA dos receptores FRP e da anexina-1 na pata de ratos.
A expressão do mRNA para os receptores formilados FPR, FPRL-1 e FPRL-2
respectivamente apresentados como FPR, Fpr-rs1 e Fpr-rs2 e para anexina-1 (Anx-1)
foi avaliada em tecido plantar obtido de animais controle não sensibilizados e
desafiados com ovalbumina (Sal+Ova/Sal) e de animais sensibilizados e desafiados
com ovoalbumina (IO/I+Sal). Os dados foram obtidos de um experimento realizado
em triplicata.
Sal+Ova/Sal IO/I+Sal
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
FPR
Fpr-rs1
Fpr-rs2
AnxA1
Sal+Ova/Sal IO/I+Sal
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
FPR
Fpr-rs1
Fpr-rs2
AnxA1
Anx-1
Mudan
ç
as relativas de
mRNA
Sal+Ova/Sal IO/I+Sal
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
FPR
Fpr-rs1
Fpr-rs2
AnxA1
Sal+Ova/Sal IO/I+Sal
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
FPR
Fpr-rs1
Fpr-rs2
AnxA1
Anx-1
Mudan
ç
as relativas de
mRNA
Mudanças relativas de mRNA
50
Tabela 4: Efeito do análogo estável da 15-epi-lipoxina A
4
(ATL-1) e tratamento com
BOC-2 na hiperalgesia induzida por antígeno na pata de ratos sensibilizados.
Condição Desafiado Tratamento
∆Latência (s)
Não-sensibilizado
-
Salina
0,06 ± 0,03
Sensibilizado
+
Salina
5,78 ± 0,89
*
+
ATL-1
2,28 ± 0,85
+
+
+ BOC-2
5,48 ± 0,34
#
Pré-tratamento local com ATL-1 (250 ng/pata) foi realizado 1 h antes do desafio
alergênico. Todos os grupos desafiados receberam ovoalbumina (12 µg/pata). Grupo
controle foi injetado com veículo. O antagonista do receptor ALX (BOC-2; 5
nmol/pata) foi administrado concomitantemente com o ATL-1. ∆ de latência foi
avaliado 1 h após o desafio com ovoalbumina. Cada valor representa a média ± EPM
de pelo menos 5 animais. * P < 0,001 quando comparado com grupo controle. + P <
0,01 quando comprado com grupo sensibilizado desafiado
#
P < 0,001 quando
comparado com grupo tratado com ATL-1.
51
Figura 9: Analise histológica de secções plantares de ratos sensibilizados e
desafiados com ovoalbumina ou salina. Após 180 min do desafio antigênico, a pele
plantar foi removida e fixada com formaldeído 12 h. Secções representativas de 5 µm
da pata foram coradas com hematoxilina e eosina e observados em microcópio de luz
(200x). Os cortes histológicos representam secções da pele plantar de animais de
animais sensibilizados e desafiados com ovoalbumina (12 µg/pata) (B) nas situações:
tratados com Ac2-26 (50 µg/pata) (C) ou tratado com Ac2-26 e BOC-2 (5 nmol/pata)
(D) ou desafiados com salina no controle (A).
A
B
C D
A
B
C D
52
Figura 10: Efeito do tratamento com o peptídeo Ac2-26 na presença ou ausência do
antagonista do receptor ALX (BOC-2; 5 nmol/pata) sobre o número de neutrófilos. O
número de neutrófilos foi obtido após contagem de 50 campos aleatórios das secções
histológicas da planta de ratos de animais sensibilizados e desafiados na presença ou
ausência dos tratamentos. Grupo controle recebeu injeção de veículo. * P < 0,001
quando comparado com grupo controle. + P < 0,001 quando comprado com grupo
sensibilizado e desafiado
#
P < 0,001 quando comparado com grupo sensibilizado e
desafiado tratado com Ac2-26.
0.0
1.5
3.0
4.5
6.0
*
#
+
OVA [12 µg/pata]:
-
+
+
+
Ac2-26 [50 µg/pata]:
-
- +
+
BOC-2 [5 nmol/pata]:
-
-
-
+
Número de Neutrófilos/campo
53
0 180 36015 60
0.0
2.5
5.0
7.5
∆
Latência (s)
Tempo (min)
+Ac2-26 [50 µg/pata]
+Ac2-26 [100 µg/pata]
Salina
Histamina + 5-HT
*
*
*
*
+
+
+
+
+
+
+
Figura 11: Cinética de hiperalgesia induzida pela injeção intraplantar da associação
de histamina (5 µg/pata) e 5-HT (1 µg/pata) e a sensibilidade ao peptídeo Ac2-26 (50
e 100 µg/pata) injetado 1 h antes da estimulação com ovoalbumina (12 µg/pata).
Injeção de salina foi utilizada como controle. Resultados são expressos como média ±
EPM de pelo menos 5 animais. * P < 0.001 quando comparado com grupo não
estimulado.
+
P < 0.01 quando comparado com grupo estimulado.
54
0.0
2.5
5.0
7.5
∆
Latência (s)
Ac2-26 [50 µg/pata]:
BOC-2 [nmol/pata]:
-
-
-
-
+
-
+
1,2
+
2,5
+
5
*
+
#
#
Figura 12: Efeito do BOC-2 sobre a inibição da hiperalgesia por Ac2-26 na pata de
ratos. Animais foram tratados concomitantemente com BOC-2 (1,2 - 5 nmol/pata) e
Ac2-26 (50 µg/pata) 1 h antes da estimulação com a associação histamina e 5-HT (5
µg/pata e 1 µg/pata respectivamente). Injeção de salina foi usado como controle.
Resultados são expressos como média ± EPM de pelo menos 5 animais. * P < 0.001
quando comparado com grupo não estimulado. + P < 0.01 quando comparado com
grupo estimulado.
#
P < 0.01 quando comparado com grupo tratado com Ac 2-26.
55
0.0
2.5
5.0
7.5
+
*
#
∆
Latência (s)
#
Ac 2-26 [50 µg/pata]:
L-NAME [mg/Kg]:
-
-
-
-
+
-
+
50
+
100
-
+
OVA [12 µg/ pata]:
-
+ +
+
+
+
Figura 13: Efeito do L-NAME sobre a atividade anti-hiperalgésica do Ac2-26 na pata
de ratos. Os animais foram pré-tratados com L-NAME (50 mg/Kg; i.p.) 1 h antes da
administração do peptídeo (50 µg/pata). Estimulação com ovoalbumina (12 µg/pata)
foi realizada 1 h após a injeção do Ac2-26. Grupo controle recebeu injeção de salina.
Resultados expressos como média ± EPM de pelo menos 5 animais. *P < 0.001
quando comprados com grupo não estimulado.
+
P < 0.01 quando comparado com
grupo estimulado.
#
P < 0.001 quando comparado com grupo tratado com Ac2-26.
56
0.0
2.5
5.0
7.5
+
#
∆
Latência (s)
Ac 2-26 [100 µg/pata]:
-
-
-
-
+
-
+
+
-
+
OVA [12 µg/ pata]:
-
+
+
+
+
ODQ [100 µg/pata]:
*
Figura 14: Efeito do ODQ sobre a atividade anti-hiperalgésica do Ac2-26 na pata de
ratos. Animais foram tratados com ODQ (100 µg/pata) concomitantemente com Ac2-
26 (50 µg/pata). Estimulação com ovoalbumina (12 µg/pata) foi feita 1 h após o
tratamento. Grupo controle recebeu salina. Resultados expressos como média ±
EPM de pelo menos 5 animais. *P < 0.001 quando comparados com grupo não
estimulado.
+
P < 0.01 quando comparado com grupo estimulado.
#
P < 0.001 quando
comparado com grupo tratado com Ac2-26.
57
0 60 12015
0.0
2.5
5.0
7.5
Salina
OVA [12 µg/pata]
+ NPS [250 µg/pata]
+ NPS [500 µg/pata]
+ NPS [750 µg/pata]
Tempo (min)
∆
Latência (s)
*
*
*
+
+
+
+
+
+
Figura 15: Efeito do nitroprussiato de sódio (NPS) sobre a hiperalgesia induzida por
alergeno. Animais foram pré-tratados com NPS (250-750 µg/pata) 1 h antes do
desafio com ovoalbumina (12 µg/pata). Salina foi injetada no grupo controle.
Resultados expressos como média ± EPM de pelo menos 5 animais. * P < 0.001
quando comprados com grupo não estimulado.
+
P < 0.01 quando comparado com
grupo estimulado.
58
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
*
**
**
Ac 2-26 (µg/mL):
- 50 100 200
NO
2
-
(µM)
Figura 16: Liberação de óxido nítrico por uma linhagem de macrófagos de
camundongos (RAW 264,7) após estimulação com Ac2-26 (50-200 µg/mL) in vitro.
Análise foi realizada 24 h após a estimulação. Valores estão expressos como média ±
EPM de pelo menos 3 experimentos.
*
P< 0.05 e **P< 0.01 quando comparados com
ponto controle.
59
5. DISCUSSÃO
Nesse trabalho foi realizado um estudo sobre a atividade do peptídeo Ac2-26
derivado da anexina-1 sobre a resposta inflamatória alérgica. A anexina-1 é uma
proteína expressa pela ação de glicocorticóides sendo considerada a molécula que
garante, em parte, seus efeitos antiinflamatórios (Roviezzo e col., 2002; Hannon e
col., 2003). De fato, diversos estudos fornecem evidências do papel dessa proteína
na ação regulatória dos glicocorticóides sobre a migração de neutrófilos (Perretti e
Flower, 1993), edema inflamatório (Cirino e col., 1989), lesão isquêmica (Relton e
col., 1991; Cuzzocrea e col., 1997), dor (Ferreira e col., 1997) e febre (Davidson e
col., 1991). É claro que os glicocorticóides possuem outros mecanismos de ação
independentes da anexina-1 (Buttgereit e Scheffold, 2002; Hannon e col., 2003;
Bartholome e col., 2004).
Foi mostrado que o peptídeo Ac2-26 (e a anexina-1) ativa o receptor de
lipoxina A
4
, sugerindo que ambos possam atuar de forma similar sobre esse receptor
e assim inibir a formação de mediadores inflamatórios e o recrutamento de leucócitos
(Perretti, 2003). Esse receptor, denominado ALX, é expresso em ratos (Chiang e col.,
2003), e diversos parâmetros estudados no modelo de pleurisia alérgica em ratos
como edema, geração de eotaxina e acúmulo de eosinófilos foram sensíveis ao
tratamento com os análogos estáveis da lipoxina A
4
(Bandeira-Melo e col., 2000a;
Bandeira-Melo e col.,2000b). Notadamente, estudos colocaram as lipoxinas como
fortes candidatos a novas terapias antialérgicas (Levy e Serhan, 2003). Por essas
razões avaliamos a suposta ação do peptídeo mimético da anexina-1 na inflamação
alérgica. Para tal usamos dois modelos de inflamação alérgica.
Primeiramente exploramos o modelo onde ratos sensibilizados com
ovoalbumina reagem ao desafio antigênico pleural apresentando rápido
extravasamento protéico e edema, que atingem valores máximos entre 1 a 4 h após o
desafio. Essas alterações são seguidas por um influxo de neutrófilos, entre 4 e 8 h, e
um influxo de células mononucleares e eosinófilos percebidos primeiramente após 1
h e chegando a valores máximos entre 12 e 24 h após o desafio (Lima e col., 1991;
Lima e col., 1997). Todos esses eventos são sensíveis ao tratamento sistêmico com
60
dexametasona, enquanto que antagonistas de histamina e 5-HT inibem o
extravasamento plasmático sem alterar o infiltrado leucocitário (Lima e col., 1991;
Martins e col., 1993). No primeiro grupo experimental, demonstramos que a
administração local do peptídeo Ac2-26 reduz o extravasamento plasmático e a
migração de neutrófilos e eosinófilos para a cavidade pleural deixando intacto o
acúmulo de mononucleares causados pelo desafio alergênico. Esse último resultado
contrasta com os amplos efeitos causados pelo tratamento com glicocorticóides e
pode indicar certo grau de seletividade nas ações do peptídeo Ac2-26. Em seguida
investigamos os mecanismos inibitórios do peptídeo sobre o extravasamento de
plasma e mudanças celulares causadas pelo desafio alergênico tendo em vista que
Getting e colaboradores (1997) observaram que ações do peptídeo Ac2-26 em inibir o
extravasamento plasmático assim como o recrutamento de leucócitos em um modelo
de inflamação induzido por zimozan.
Um mecanismo hipotético que pode contribuir para a ação inibitória do
peptídeo derivado da anexina-1 sobre inflamação alérgica é a regulação da atividade
dos mastócitos residentes. Mastócitos possuem importante função na inflamação
alérgica por liberarem mediadores pré-formados e neo-sintetizados induzidos após
sua ativação (Galli, 1997; Lemanske e Busse, 2003). No caso particular da pleurisia
desencadeada por alergeno na pleura de ratos, a ativação de mastócitos mostra-se
ser o evento primário acarretando o extravasamento plasmático e a infiltração de
leucócitos (Diaz e col., 1996; Lima e col., 1996). É conhecido que a anexina-1 pode
ter sua síntese aumentada em mastócitos por estímulos distintos (Tasaka e col.,
1994; Oliani e col., 2000) e esse aumento pode estar correlacionado com a redução
da liberação de histamina induzida por composto 48/80 (Tasaka e col., 1994). Em
nosso estudo, o tratamento local com o peptídeo Ac2-26 atenua a desgranulação de
mastócitos no espaço pleural de ratos após o desafio com ovoalbumina, achado esse
corroborado pelos dados in vitro, onde concentrações ativas do peptídeo Ac2-26
abole a liberação de histamina decorrente da estimulação com ovoalbumina sobre
fragmentos de tecido subcutâneo de ratos sensibilizados. De forma geral, esses
dados dão suporte à interpretação de que mastócitos sejam alvos relevantes nos
efeitos antialérgicos do peptídeo Ac2-26 e ainda estão de acordo com os achados de
61
Cirino e colaboradores (1989) onde anexina-1 recombinante humana inibe o edema
induzido pelo composto 48/80 na parta de ratos. A sensibilidade de mastócitos de
ratos à anexina-1 pode ser o motivo dos diferentes resultados encontrados em
modelos murinos onde os efeitos inibitórios da dexametasona não foram modificados
pela neutralização da anexina-1 por anticorpos (Das e col.,1997; Teixeira e col., 1998)
nem mimetizados pelo peptídeo Ac2-26 (Teixeira e col., 1998). Provavelmente
mastócitos de camundongos são menos seletivos à anexina-1 ou pode haver uma
diferença da expressão do receptor de anexina-1/lipoxina A
4
entre as espécies.
Complementarmente o bloqueio da liberação de histamina, um mediador crítico para
a inflamação alérgica pode representar um mecanismo complementar dos efeitos do
peptídeo.
Semelhante ao observado após o tratamento com análogos estáveis da
lipoxina A
4
(Bandeira-Melo e col., 2000b) a administração tanto do peptídeo quanto da
dexametasona aboliram a geração de eotaxina induzida por alergeno com paralela
proteção do recrutamento de eosinófilos. Essa quimiocina tem papel crucial no
mecanismo de recrutamento de eosinófilos para a pleura após desafio com
ovoalbumina (Silva e col., 2001), embasando a interpretação de que o efeito anti-
eotaxina do peptídeo Ac2-26 pode ter importância no seu papel antialérgico. Ao tentar
identificar a fonte de eotaxina e possível alvo de ação para o peptídeo Ac2-26 nesse
modelo, encontramos que células mesoteliais são produtoras de eotaxina (Katayama
e col., 2002). A estimulação com hIL-13 é capaz de induzir a produção dessa
quimiocina em cultura primária de células mesoteliais de ratos, sendo esse sistema
sensível ao peptídeo Ac2-26 e à dexametasona, sugerindo que esses agentes
estejam atuando sobre essas células na pleura prevenindo a geração de eotaxina no
modelo de pleurisia alérgica. O efeito do peptídeo Ac2-26 provavelmente ocorre após
a ativação do receptor de anexina-1/lipoxina A
4
visto que essas células expressam o
mesmo. Além disso, células epiteliais da traquéia de cobaias também se mostraram
sensíveis ao tratamento com o peptídeo sobre a secreção de eotaxina in vitro
embasando a ação do peptídeo mimético da aneixna-1 em regular a geração de
eotaxina.
62
Outro mecanismo pelo qual o peptídeo derivado da anexina-1 poderia ter uma
ação anti-eosinofílica seria uma ação sobre a função locomotora dessas células.
Entretanto, experimentos in vitro revelaram que o peptídeo Ac2-26 falhou em inibir a
quimiotaxia de eosinófilos induzida por PAF. Esse resultado está de acordo com
incapacidade do fragmento de anexina-1 em afetar a migração de eosinófilos de
camundongo em resposta a aplicação intradérmica de MCP-1α (Teixeira e col.,
1998). Essa refratariedade dos eosinófilos ao peptídeo Ac2-26 também foi observada
aos análogos estáveis de lipoxina A
4
(Bandeira-Melo e col., 2000b). Entretanto, Liu e
colaboradores (2005) demonstraram que glicocorticóides aumentam a expressão de
anexina-1 em eosinófilos humanos onde atua bloqueando parcialmente a interação
entre as moléculas de adesão β
2
-integrina com a proteína de adesão intercelular
ICAM-1. Essa diferença de resultados pode ser decorrente aos mecanismos
envolvidos nas diferentes etapas do processo de migração dos leucócitos (para
revisão Broide e Sriramarao, 2001; Bochner e Schleimer, 2001).
Durante as reações inflamatórias, inclusive as desencadeadas por componentes
imunológicos, ocorre a sensibilização dos nociceptores gerando um estado de
hiperalgesia. Alterações nociceptivas em condições alérgicas foram demonstradas
em estudos experimentais nos quais indivíduos atópicos submetidos a estímulos
dolorosos apresentaram alterações emocionais se comparados com indivíduos não
atópicos (Stosh e col., 1991). Diversos mediadores pró-inflamatórios incluindo aminas
vasoativas, bradicinina (Lavich e col., 2003), TNF-α (Nordahl e col., 2000), IL-1β
(Alstergren e col., 1998; Kopp, 1998), prostaglandinas (Portanova e col., 1996; Omote
e col., 2002), leucotrieno B
4
(Cunha e col., 2003) liberados na resposta alérgica se
mostraram importantes na modulação da dor. Ferreira e colaboradores (1997)
utilizando um modelo de hipersensibilidade mecânica mostrou que a anexina-1 tem
papel importante no efeito anti-hiperalgésico da dexametasona contra diversos
estímulos inflamatórios como carragenina, bradicinina, e as citocinas TNF-α, IL-1β e
IL-6. Além disso foi documentado que o peptídeo mimético da anexina-1 é capaz de
bloquear a resposta nociceptiva induzida por formalina em camundongos (Perretti e
63
col., 2004). Em nossos estudos avaliamos a ação do peptídeo Ac2-26 sobre a
hiperalgesia térmica induzida por alérgeno.
A estimulação intraplantar de ovoalbumina em animais sensibilizados acarreta
uma intensa resposta hiperalgésica frente à estimulação térmica, resposta que se
mantém por até 6 horas após estimulação (Lavich e col., 2006). Em nossos estudos
foi observado que o tratamento prévio com o peptídeo Ac2-26 foi capaz de inibir a
hiperalgesia térmica provocada por alergeno. Apesar do efeito direto do peptídeo
sobre nociceptores ainda não ter sido avaliado, um estudo mostrou que danos
causados em nervos periféricos levam a um aumento da expressão de anexina-1 em
microglia indicando sua ação como uma molécula regulatória neuroprotetora (Metzer
e col., 2001).
Conforme dito anteriormente, acredita-se que a anexina-1 compartilhe o mesmo
receptor da lipoxina A
4
(Gavins e col. 2005). O trabalho de Levy e colaboradores
(2002) foi identificado um aumento da expressão da lipoxina A
4
, assim como de seu
próprio receptor, em pulmões de camundongos após desafio antigênico, e ainda que
a administração de um análogo estável da lipoxina teria a habilidade de bloquear a
hiperatividade brônquica e o processo inflamatório. Interessantemente, a
hiperatividade brônquica e a resposta hiperalgésica apresentam similaridades quando
a seus mecanismos e modulação farmacológica (Spina, 2003). Vimos que o receptor
de lipoxina A
4
é expresso na pata dos ratos sensibilizados e desafiados com
antígeno, e ainda, que o tratamento com um análogo estável da lipoxina (ATL) foi
capaz de inibir a hiperalgesia alérgica na pata de ratos de forma similar ao peptídeo
mimético da anexina. De forma complementar a perda da atividade anti-hiperalgésica
do peptídeo Ac2-26 foi observada quando fez-se administração de um antagonista do
receptor ALX, sugerindo que as ações antihiperalgésicas do peptídeo ocorram
através desse receptor de fato.
Notamos que, assim como na pleura, o peptídeo Ac2-26 foi capaz de inibir a
migração de neutrófilos para a pata de ratos desafiados com ovoalbumina, resposta
essa sensível ao tratamento com antagonista do receptor de lipoxina A
4
. É bem
descrita a ação da anexina-1 e do seu peptídeo derivado no bloqueio da migração de
neutrófilos para o foco inflamatório por um mecanismo dependente da ativação dos
64
receptores de lipoxina A
4
(para revisão Perretti, 2003). De uma forma geral, a
anexina-1 é externalizada pelos neutrófilos e liga-se à ALX (ou FPRL-1 receptor de
peptídeos formilados) provocando um aumento intracelular de cálcio que interfere
com a adesão dessa célula com o endotélio. Recentemente nosso laboratório
identificou a importância dos neutrófilos na manutenção da hiperalgesia térmica
provocada por alérgeno em ratos (Lavich e col., 2006), sugerindo um outro
mecanismo pelo qual provavelmente o peptídeo pode estar modulando a resposta
hiperalgésica.
Como observado o peptídeo Ac2-26 foi capaz de inibir a liberação de histamina
por mastócitos in vivo e in vitro. Aminas vasoativas são importantes mediadores que
participam na indução da resposta hiperalgésica inflamatória. Após a interação
desses mediadores secretados por mastócitos com seus receptores, ocorre ativação
de cascatas de sinalização intracelular envolvendo PKA e/ou PKC e conseqüente
abertura de canais de sódio levando a uma diminuição do limiar de ativação dos
nociceptores facilitando a despolarização e que desta maneira passam a ser ativados
por estímulos de baixa intensidade, os quais em condições normais não promoveriam
dor (Graven-Nielsen e Mense, 2001; Coutaux, 2005). Dados de nosso laboratório
mostram que a interação sinérgica desses mediadores está envolvida na indução da
hiperalgesia alérgica (Lavich e col., 2003). Mostramos que o tratamento com o
peptídeo Ac2-26 foi capaz de abolir os efeitos hiperalgésicos induzidos pelo
sinergismo histamina/5-HT sugerindo que o peptídeo tenha uma ação não somente
sobre a desgranulação de mastócitos, mas também sobre os nociceptores, e que
esse fenômeno é decorrente também de uma ação via receptores de lipoxina A
4
, pois
é igualmente sensível ao tratamento com o antagonista de ALX. O mecanismo exato
pelo qual esse efeito ocorre ainda não é claro. Na busca de um mecanismo pela qual
o peptídeo mimético da anexina-1 esteja atuando na modulação da hiperalgesia,
apontamos o óxido nítrico como possível molécula alvo.
Óxido nítrico sempre foi reconhecido com sendo uma molécula pró-
inflamatória, porém recentemente tem sido apontado um papel do óxido nítrico como
modulador da resposta inflamatória (Wallace, 2006). Estudos mostraram que além
dos efeitos clássicos já descritos para a aspirina sobre a produção de prostaglandinas
65
ela também atua na produção de 15-epi-lipoxina A
4
que atua ativando a óxido nítrico
sintase endotelial e gerando óxido nítrico o qual interfere com interação entre
leucócitos, principalmente neutrófilos, e as células endoteliais (para revisão Gilroy,
2005). Como neutrófilos possuem papel crucial na resposta hiperalgésica alérgica
(Lavich e col., 2006), pode haver uma ligação entre esses dois dados. Duarte e
colaboradores (1990) mostraram que ratos tratados com um doador de óxido nítrico
exibiram uma redução da resposta hiperalgésica induzida por prostaglandina E
2
. Além
disso, sildenafil um inibidor da fosfodiesterase do tipo 5 inibe a hiperalgesia em ratos
estimulados com carragenina e ainda aumenta a atividade anti-hiperalgésica do
nitroprussiato de sódio sugerindo a participação da via NO-cGMP (Jain e col., 2001).
Conforme demonstramos o tratamento com L-NAME e com ODQ inibiram a ação do
peptídeo Ac2-26 sobre a hiperalgesia alérgica. Uma hipótese é de que a interação do
Ac2-26 com o ALX induza a produção de óxido nítrico no local da inflamação e que
esse por sua vez atuaria modulando a hiperalgesia alérgica, uma resposta via NO-
cGMP. Utilizando cultura de macrógafos vimos que o peptídeo Ac2-26 foi capaz de
induzir a secreção de óxido nitrico in vitro indicando que esse mediador possa estar
realmente envolvido nas ações anti-hiperalgésicas no peptídeo. Corroborando essa
idéia, Scanell e colaboradores (2007) recentemente mostraram que anexina-1 atua
sobre macrófagos levando a secreção de óxido nitrico que terial um papel na
modulação da fagocitose de neutrófilos apoptóticos e assim um papel na resolução
da inflamação.
66
6. CONCLUSÃO
Nesse trabalho evidenciamos que o peptídeo Ac2-26, derivado da anexina-1,
mostrou-se capaz de inibir a resposta inflamatória pleural alérgica de forma associada
à inibição do extravasamento protéico, infiltrado eosinofílico e da geração do agente
eosinofilotático eotaxina, e independente de uma ação direta sobre a atividade
locomotora de eosinófilos. O peptídeo Ac2-26 suprimiu igualmente o componente
hiperalgésica da resposta alérgica, de forma dependente de sua ligação ao ALX e em
clara associação com a ativação da via NO-cGMP. Em conjunto, estes dados
respaldam que o tratamento com o peptídeo Ac2-26 coloca-se como um proposta
terapêutica promissora para doenças inflamatórias de natureza alérgica.
67
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABRAMSON, S.B., ATTUR, M., AMIN, A.R., CLANCY, R. Nitric oxide and
inflammatory mediators in the perpetuation of osteoarthritis. Curr Rheumatol Rep 3:
535-41. 2001.
AHLUWALIA, A., PERRETTI, M. Involvement of Bradykinin B1 Receptors in the
Polymorphonuclear Leukocyte Accumulation Induced by Il-1 Beta in Vivo in the
Mouse. J Immunol 156: 269-274. 1996.
ALFARO, V. Role of histamine and platelet-activating factor in allergic rhinitis. J
Physiol Biochem 60:101-11. 2004.
ALSTERGREN, P., ERNBERG, M., KVARNSTROM, M., KOPP, S. Interleukin-1beta
in synovial fluid from the arthritic temporomandibular joint and its relation to pain,
mobility, and anterior open bite. J Oral Maxillofac Surg 56: 1059-65. 1998.
ASADULLAH, K., SCHACKE, H., CATO, A.C. Dichotomy of glucocorticoid action in
the immune system. Trends Immunol 23: 120-2. 2002.
ASCHHEIM, E., ZWEIFACH, B.W. Quantitative studies of protein and water shifts
during inflammation. Am J Physiol 202: 554-8. 1962.
BAGGIOLINI, M., DAHINDEN, C.A. Cc Chemokines in Allergic Inflammation. Immunol
Today 15: 127-133. 1994.
BANDEIRA-MELO, C., BOZZA, P.T., DIAZ, B.L., CORDEIRO, R.S., JOSE, P.J.,
MARTINS, M.A., SERHAN, C.N. Cutting edge: lipoxin (LX) A4 and aspirin-triggered
15-epi-LXA4 block allergen-induced eosinophil trafficking. J Immunol 164: 2267-71.
2000.
BANDEIRA-MELO, C., SERRA, M.F., DIAZ, B.L., CORDEIRO, R.S., SILVA, P.M.,
LENZI, H.L., BAKHLE, Y.S., SERHAN, C.N., MARTINS, M.A. Cyclooxygenase-2-
derived prostaglandin E2 and lipoxin A4 accelerate resolution of allergic edema in
Angiostrongylus costaricensis-infected rats: relationship with concurrent eosinophilia.
J Immunol 164: 1029-36. 2000.
BARNES, P.J., CHUNG, K.F. Paf Antagonists in Asthma. Lancet 1: 1071-1072. 1989.
BARNES, P.J. Efficacy of Inhaled Corticosteroids in Asthma. J Allergy Clin Immunol
102: 531-538. 1998.
BARNES, P.J. Histamine and serotonin. Pulm Pharmacol Ther 14: 329-39. 2001.
68
BARNES, P.J. How corticosteroids control inflammation: Quintiles Prize Lecture 2005.
Br J Pharmacol 148: 245-54. 2006.
BARNES, P.J., ADCOCK, I.M. How do corticosteroids work in asthma? Ann Intern
Med 139: 359-70. 2003.
BARTHOLOME, B., SPIES, C.M., GABER, T., SCHUCHMANN, S., BERKI, T.,
KUNKEL, D., BIENERT, M., RADBRUCH, A., BURMESTER, G.R., LAUSTER, R.,
SCHEFFOLD, A., BUTTGEREIT, F. Membrane glucocorticoid receptors (mGCR) are
expressed in normal human peripheral blood mononuclear cells and up-regulated after
in vitro stimulation and in patients with rheumatoid arthritis. FASEB J 18: 70-80. 2004.
BECHEREL, P.A., CHOSIDOW, O., LE GOFF, L., FRANCES, C., DEBRE, P.,
MOSSALAYI, M.D., AROCK, M. Inducible nitric oxide synthase and proinflammatory
cytokine expression by human keratinocytes during acute urticaria. Mol Med 3: 686-
94. 1997.
BLASER, K. Allergen dose dependent cytokine production regulates specific IgE and
IgG antibody production. Adv Exp Med Biol 409: 295-303. 1996.
BOCHNER, B.S., SCHLEIMER, R.P. Mast cells, basophils, and eosinophils: distinct
but overlapping pathways for recruitment. Immunol Rev 179: 5-15. 2001.
BORISH, L.C., STEINKE, J.W. 2. Cytokines and chemokines. J Allergy Clin Immunol
111: S460-75. 2003.
BRADDING, P., MEDIWAKE, R., FEATHER, I.H., MADDEN, J., CHURCH, M.K.,
HOLGATE, S.T., HOWARTH, P.H. TNF alpha is localized to nasal mucosal mast cells
and is released in acute allergic rhinitis. Clin Exp Allergy 25: 406-15. 1995.
BROIDE, D.H. Molecular and cellular mechanisms of allergic disease. J Allergy Clin
Immunol 108: S65-71. 2001.
BROIDE, D., SRIRAMARAO, P. Eosinophil trafficking to sites of allergic inflammation.
Immunol Rev 179: 163-72. 2001.
BRUSSELLE, G., KIPS, J., JOOS, G., BLUETHMANN, H., PAUWELS, R. Allergen-
Induced Airway Inflammation and Bronchial Responsiveness in Wild-Type and
Interleukin-4-Deficient Mice. Am J Respir Cell Mol Biol 12: 254-259. 1995.
BUKANTZ, S.C. Clemens von Pirquet and the concept of allergie. J Allergy Clin
Immunol 109: 724-6. 2002.
BULGER, E.M., MAIER, R.V. Lipid Mediators in the Pathophysiology of Critical Illness.
Crit Care Med 28: N27-36. 2000.
69
BUTTGEREIT, F., SCHEFFOLD, A. Rapid glucocorticoid effects on immune cells.
Steroids 67: 529-34. 2002.
CAMPBELL, W.B., HALUSHKA, P.V. Lipid-derived autacoids, eicosanoids and
platelet-activating factor. Hardman J. G., Limbird, L.E., Molinoff, P.B., Ruddon, R.W.,
Gilman, A.G. Goodman and Gilman´s The Pharmacological Basis of Therapeutics.
McGraw-Hill, N ew York. 601-616. 1996.
CAMPOS, M.M., CALIXTO, J.B. Involvement of B1 and B2 Receptors in Bradykinin-
Induced Rat Paw Oedema. Br J Pharmacol 114: 1005-1013. 1995.
CHIANG, N., FIERRO, I.M., GRONERT, K., SERHAN, C.N. Activation of lipoxin A(4)
receptors by aspirin-triggered lipoxins and select peptides evokes ligand-specific
responses in inflammation. J Exp Med 191: 1197-208. 2000.
CHIANG, N., TAKANO, T., ARITA, M., WATANABE, S., SERHAN, C.N. A novel rat
lipoxin A4 receptor that is conserved in structure and function. Br J Pharmacol 139:
89-98. 2003.
CIRINO, G., PEERS, S.H., FLOWER, R.J., BROWNING, J.L., PEPINSKY, R.B.
Human recombinant lipocortin 1 has acute local anti-inflammatory properties in the rat
paw edema test. Proc Natl Acad Sci USA 86: 3428-32. 1989.
CLANCY, R., MARDER, G., MARTIN, V., BELMONT, H.M., ABRAMSON, S.B.,
BUYON, J. Circulating activated endothelial cells in systemic lupus erythematosus:
further evidence for diffuse vasculopathy. Arthritis Rheum 44:1203-8. 2001.
CLARKE, R.W., HARRIS, J. The organization of motor responses to noxious stimuli.
Brain Res Brain Res Rev 46:163-72. 2004.
COFFMAN, R.L., SEYMOUR, B.W., HUDAK, S., JACKSON, J., RENNICK, D.
Antibody to interleukin-5 inhibits helminth-induced eosinophilia in mice. Science 245:
308-10. 1989.
CONTI, P., DIGIOACCHINO, M. MCP-1 and RANTES are mediators of acute and
chronic inflammation. Allergy Asthma Proc 22: 133-7. 2001.
CORRY, D.B. Emerging immune targets for the therapy of allergic asthma. Nat Rev
Drug Discov 1: 55-64. 2002.
CORRY, D.B., GRUNIG, G., HADEIBA, H., KURUP, V.P., WARNOCK, M.L.,
SHEPPARD, D., RENNICK, D.M., LOCKSLEY, R.M. Requirements for allergen-
induced airway hyperreactivity in T and B cell-deficient mice. Mol Med 4: 344-55.
1998.
70
COUTAUX, A., ADAM, F., WILLER, J.C., LE BARS, D. Hyperalgesia and allodynia:
peripheral mechanisms. Joint Bone Spine 72: 359-71. 2005.
CROXTALL, J.D., CHOUDHURY, Q., FLOWER, R.J. Glucocorticoids act within
minutes to inhibit recruitment of signalling factors to activated EGF receptors through
a receptor-dependent, transcription-independent mechanism. Br J Pharmacol 130:
289-98. 2000.
CROXTALL, J.D., FLOWER, R.J. Lipocortin 1 mediates dexamethasone-induced
growth arrest of the A549 lung adenocarcinoma cell line. Proc Natl Acad Sci USA 89:
3571-5. 1992.
CUNHA, J.M., SACHS, D., CANETTI, C.A., POOLE, S., FERREIRA, S.H., CUNHA,
F.Q. The critical role of leukotriene B4 in antigen-induced mechanical hyperalgesia in
immunised rats. Br J Pharmacol 139: 1135-45. 2003.
CUZZOCREA, S., TAILOR, A., ZINGARELLI, B., SALZMAN, A.L., FLOWER, R.J.,
SZABÓ, C., PERRETTI, M. Lipocortin 1 protects against splanchnic artery occlusion
and reperfusion injury by affecting neutrophil migration. J Immunol 159: 5089-97.
1997.
DAS, A.M., FLOWER, R.J., HELLEWELL, P.G., TEIXEIRA, M.M., PERRETTI, M. A
novel murine model of allergic inflammation to study the effect of dexamethasone on
eosinophil recruitment. Br J Pharmacol 121: 97-104. 1997.
DAVIDSON, J., FLOWER, R.J., MILTON, A.S., PEERS, S.H., ROTONDO, D.
Antipyretic actions of human recombinant lipocortin-1. Br J Pharmacol 102: 7-9. 1991.
DE CATERINA, R., SICARI, R., GIANNESSI, D., PAGGIARO, P.L., PAOLETTI, P.,
LAZZERINI, G., BERNINI, W., SOLITO, E., PARENTE, L. Macrophage-specific
eicosanoid synthesis inhibition and lipocortin-1 induction by glucocorticoids. J Appl
Physiol 75: 2368-75. 1993.
DELVES, P.J., ROITT, I.M. The immune system. Second of two parts. N Engl J Med
343: 108-17. 2000.
DELVES, P.J., ROITT, I.M. The immune system. First of two parts. N Engl J Med 343:
37-49. 2000.
DE OLIVEIRA BARRETO, E., DE FRIAS CARVALHO, V., DIAZ, B.L., BALDUINO, A.,
CORDEIRO, R.S., MARTINS, M.A., RODRIGUES E SILVA, P.M. Adoptive transfer of
mast cells abolishes the inflammatory refractoriness to allergen in diabetic rats. Int
Arch Allergy Immunol 131: 212-20. 2003.
71
DIAKONOVA, M., GERKE, V., ERNST, J., LIAUTARD, J.P., VAN DER VUSSE, G.,
GRIFFITHS, G. Localization of five annexins in J774 macrophages and on isolated
phagosomes. J Cell Sci 110: 1199-213. 1997.
DIAZ, B.L., SERRA, M.F., ALVES, A.C., CORDEIRO, S.B., MARTINS, M.A., E SILVA,
P.M. Local exposure to salbutamol or Bt2 cyclic AMP inhibits pleural exudation and
leukocyte influx caused by antigen in rats. Eur J Pharmacol 296: 173-80. 1996.
DOAK, G.J., SAWYNOK, J. Formalin-induced nociceptive behavior and edema:
involvement of multiple peripheral 5-hydroxytryptamine receptor subtypes.
Neuroscience 80: 939-49. 1997.
DRAY, A. Kinins and their receptors in hyperalgesia. Can J Physiol Pharmacol 75:
704-12. 1997.
DUARTE, I.D., FERREIRA, S.H. L-NAME causes antinociception by stimulation of the
arginine-NO-cGMP pathway. Mediators Inflamm 9: 25-30. 2000.
DUARTE, I.D., LORENZETTI, B.B., FERREIRA, S.H. Peripheral analgesia and
activation of the nitric oxide-cyclic GMP pathway. Eur J Pharmacol 186: 289-93. 1990.
DUARTE, I.D., NAKAMURA, M., FERREIRA, S.H. Participation of the sympathetic
system in acetic acid-induced writhing in mice. Braz J Med Biol Res 21: 341-3. 1988.
DUGAS, B., PAUL-EUGENE, N., CAIRNS, J., GORDON, J., CALENDA, A., MENCIA-
HUERTA, J.M., BRAQUET, P. Leukotriene B4 potentiates the expression and release
of Fc epsilon RII/CD23, and proliferation and differentiation of human B lymphocytes
induced by IL-4. J Immunol 145: 3406-11. 1990.
EVANS, J.M., PIPER, P.J., COSTELLO, J.F. The pharmacological profile of SK&F
104353-Z2, a potent, selective inhaled antagonist of cysteinyl leukotrienes, in normal
man. Adv Prostaglandin Thromboxane Leukot Res 21A: 469-72. 1991.
FERREIRA, S.H. Inflammatory pain: the role of cytokines and its control by drugs
which release nitric oxide. Ann Ist Super Sanita 29: 367-73. 1993.
FERREIRA, S.H., CUNHA, F.Q., LORENZETTI, B.B., MICHELIN, M.A., PERRETTI,
M., FLOWER, R.J., POOLE, S. Role of lipocortin-1 in the anti-hyperalgesic actions of
dexamethasone. Br J Pharmacol 121: 883-8. 1997.
FIERRO, I.M., SERHAN, C.N. Mechanisms in anti-inflammation and resolution: the
role of lipoxins and aspirin-triggered lipoxins. Braz J Med Biol Res 34: 555-66. 2001.
FLOREY, L., SHEPPARD, B.L. The permeability of arterial endothelium to horseradish
peroxidase. Proc R Soc Lond B Biol Sci 174: 435-43. 1970.
72
FORD-HUTCHINSON, A.W. Inhibition of leukotriene biosynthesis. Ann N Y Acad.
1991.
FOSTER P. S., HOGAN S. P., RAMSAY A. J., MATTHAEI K. I., YOUNG I. G.
Interleukin 5 Deficiency Abolishes Eosinophilia, Airways Hyperreactivity, and Lung
Damage in a Mouse Asthma Model. J Exp Med 183: 195-201. 1996.
FRANCIS, J.W., BALAZOVICH, K.J., SMOLEN, J.E., MARGOLIS, D.I., BOXER, L.A.
Human neutrophil annexin I promotes granule aggregation and modulates Ca(2+)-
dependent membrane fusion. J Clin Invest 90: 537-44. 1992.
FUNK, C.D., FITZGERALD, G.A. Eicosanoid forming enzyme mRNA in human
tissues. Analysis by quantitative polymerase chain reaction. J Biol Chem 266: 12508-
13. 1991.
GALLI, S.J. The Paul Kallos Memorial Lecture. The mast cell: a versatile effector cell
for a challenging world. Int Arch Allergy Immunol 113: 14-22. 1997.
GALLI, S.J. Allergy. Curr Biol 10: R93-5. 2000.
GALLI, S.J., NAKAE, S., TSAI, M. Mast cells in the development of adaptive immune
responses. Nat Immunol 6: 135-42. 2005.
GALLIN, J.I., GODSTEIN, I.M., SNYDERMAN, R. Inflammation: basic principles and
clinical correlates. New York. 1992.
GAVINS, F.N., SAWMYNADEN, P., CHATTERJEE, B.E., PERRETTI, M. A twist in
anti-inflammation: annexin 1 acts via the lipoxin A4 receptor. Prostaglandins Leukot
Essent Fatty Acids 73: 211-9. 2005.
GAVINS, F.N., YONA, S., KAMAL, A.M., FLOWER, R.J., PERRETTI, M. Leukocyte
antiadhesive actions of annexin 1: ALXR- and FPR-related anti-inflammatory
mechanisms. Blood 101: 4140-7. 2003.
GERKE, V., MOSS, S.E. Annexins and membrane dynamics. Biochim Biophys Acta
1357: 129-54. 1997.
GETTING, S.J., FLOWER, R.J., PERRETTI, M. Inhibition of neutrophil and monocyte
recruitment by endogenous and exogenous lipocortin 1. Br J Pharmacol 120: 1075-82.
1997.
GILFILLAN, A.M., TKACZYK, C. Integrated signalling pathways for mast-cell
activation. Nat Rev Immunol 6: 218-30. 2006.
73
GILROY, D.W. New insights into the anti-inflammatory actions of aspirin-induction of
nitric oxide through the generation of epi-lipoxins. Mem Inst Oswaldo Cruz 100: 49-54.
2005.
GIVALOIS, L., LI, S., PELLETIER, G. Central nitric oxide regulation of the
hypothalamic-pituitary-adrenocortical axis in adult male rats. Brain Res Mol Brain Res
102: 1-8. 2002.
GORNALL, A.G., BARDAWILL, C.J., DAVID, M.M. Determination of serum protein by
means of the biuret reaction. J Biol Chem 177: 751-766. 1949.
GRAVEN-NIELSEN, T., MENSE, S. The peripheral apparatus of muscle pain:
evidence from animal and human studies. Clin J Pain 17:2-10. 2001.
GOULDING, N.J., LUYING, P., GUYRE, P.M. Characteristics of lipocortin 1 binding to
the surface of human peripheral blood leucocytes. Biochem Soc Trans 18: 1237-8.
1990.
GRAVEN-NIELSEN, T., MENSE, S. The peripheral apparatus of muscle pain:
evidence from animal and human studies. Clin J Pain 17: 2-10. 2001.
GRUNIG, G., WARNOCK, M., WAKIL, A.E., VENKAYYA, R., BROMBACHER, F.,
RENNICK, D.M., SHEPPARD, D., MOHRS, M., DONALDSON, D.D., LOCKSLEY
R.M., CORRY, D.B. Requirement for Il-13 Independently of Il-4 in Experimental
Asthma. Science 282: 2261-2263. 1998.
HALL, J.M. Bradykinin receptors. Gen Pharmacol 28: 1-6. 1997.
HAMID, Q., SPRINGALL, D.R., RIVEROS-MORENO, V., CHANEZ, P., HOWARTH,
P., REDINGTON, A., BOUSQUET, J., GODARD, P., HOLGATE, S., POLAK, J.M.
Induction of Nitric Oxide Synthase in Asthma. Lancet 342: 1510-1513. 1993.
HANNON, R., CROXTALL, J.D., GETTING, S.J., ROVIEZZO, F., YONA, S., PAUL-
CLARK, M.J., GAVINS, F.N., PERRETTI, M., MORRIS, J.F., BUCKINGHAM, J.C.,
FLOWER, R.J. Aberrant inflammation and resistance to glucocorticoids in annexin 1-/-
mouse. FASEB J 17: 253-5. 2003.
HARDY, J.D., WOLFF, H.G., GOODELL, H. Experimental evidence on the nature of
cutaneous hyperalgesia. J Clin Invest 29: 115-40. 1950.
HARRIS, K. The role of prostaglandins in the control of renal function. Br J Anaesth
69: 233-5. 1992.
HASHIMOTO, A., MURAKAMI, Y., KITASATO, H., HAYASHI, I., ENDO, H.
Glucocorticoids co-interact with lipoxin A4 via lipoxin A4 receptor (ALX) up-regulation.
Biomed Pharmacother 61: 81-5. 2007.
74
HENDERSON, W.R.JR. Role of leukotrienes in asthma. Ann Allergy 72: 272-8. 1994.
HERRERA, G.A. Ultrastructural immunolabeling in diagnostic surgical pathology:
illustrative cases. Ultrastruct Pathol 16: 71-85. 1992.
HERSHEY, G.K. Il-13 Receptors and Signaling Pathways: An Evolving Web. J Allergy
Clin Immunol 111: 677-690; quiz 691. 2003.
HOGAN, S.P., MATTHAEI, K.I., YOUNG, J.M., KOSKINEN, A., YOUNG, I.G.,
FOSTER, P.S. A novel T cell-regulated mechanism modulating allergen-induced
airways hyperreactivity in BALB/c mice independently of IL-4 and IL-5. J Immunol 161:
1501-9. 1998.
HOLGATE, S.T. Asthma and allergy--disorders of civilization? QJM 91: 171-84. 1998.
HOLGATE, S.T., MAVROLEON, G. The molecular and cell biology of allergy. J
Laryngol Otol 112: 1126-37. 1998.
HOURANI, S.M., CUSACK, N.J. Pharmacological receptors on blood platelets.
Pharmacol Rev 43: 243-98. 1991.
ISCHIROPOULOS, H., AL-MEHDI, A.B. Peroxynitrite-mediated oxidative protein
modifications. FEBS Lett 364: 279-82. 1995.
JAIN, N.K., PATIL, C.S., SINGH, A., KULKARNI, S.K. Sildenafil-induced peripheral
analgesia and activation of the nitric oxide-cyclic GMP pathway. Brain Res 909: 170-8.
2001.
JIRAPONGSANANURUK, O., LEUNG, D.Y. Clinical applications of cytokines: new
directions in the therapy of atopic diseases. Ann Allergy Asthma Immunol 79: 5-16.
1997.
KAMAL, A.M., FLOWER, R.J., PERRETTI, M. An overview of the effects of annexin 1
on cells involved in the inflammatory process. Mem Inst Oswaldo Cruz 100: 39-47.
2005.
KAPLAN, M.H., SCHINDLER, U., SMILEY, S.T., GRUSBY, M.J. Stat6 is required for
mediating responses to IL-4 and for development of Th2 cells. Immunity 4: 313-9.
1996.
KATAYAMA, H., YOKOYAMA, A., KOHNO, N., SAKAI, K., HIWADA, K., YAMADA, H.,
HIRAI, K. Production of eosinophilic chemokines by normal pleural mesothelial cells.
Am J Respir Cell Mol Biol 26: 398-403. 2002.
75
KAY, A.B. Allergy and allergic diseases. First of two parts. N Engl J Med 344: 30-7.
2002.
KELLY, J.B., PAYNE, R. Pain syndromes in the cancer patient. Neurol Clin 9: 937-53.
1991.
KOPF, M., BROMBACHER, F., HODGKIN, P.D., RAMSAY, A.J., MILBOURNE, E.A.,
DAI, W.J., OVINGTON, K.S., BEHM, C.A., KOHLER, G., YOUNG, I.G., MATTHAEI,
K.I. IL-5-deficient mice have a developmental defect in CD5+ B-1 cells and lack
eosinophilia but have normal antibody and cytotoxic T cell responses. Immunity 4:15-
24. 1996.
KOPP, S. The influence of neuropeptides, serotonin, and interleukin 1beta on
temporomandibular joint pain and inflammation. J Oral Maxillofac Surg 56: 189-91.
1998.
KRELL, R.D., AHARONY, D., BUCKNER, C.K., KUSNER, E.J. Peptide leukotriene
receptors and antagonists. Adv Prostaglandin Thromboxane Leukot Res 20: 119-26.
1990.
KUMAR, R., THOMPSON, E.B. The structure of the nuclear hormone receptors.
Steroids 64: 310-9. 1999.
LA, M., D'AMICO, M., BANDIERA, S., DI FILIPPO, C., OLIANI, S.M., GAVINS, F.N.,
FLOWER, R.J., PERRETTI, M. Annexin 1 peptides protect against experimental
myocardial ischemia-reperfusion: analysis of their mechanism of action. FASEB J 15:
2247-56. 2001.
LANTERO, S., ALESSANDRI, G., SPALLAROSSA, D., SCARSO, L., ROSSI, G.A.
Stimulation of eosinophil IgE low-affinity receptor leads to increased adhesion
molecule expression and cell migration. Eur Respir J 16: 940-6. 2000.
LAVICH, T.R., CORDEIRO, R.S., SILVA, P.M., MARTINS, M.A. A novel hot-plate test
sensitive to hyperalgesic stimuli and non-opioid analgesics. Braz J Med Biol Res 38:
445-51. 2005.
LAVICH, T.R., CORDEIRO, R.S., CALIXTO, J.B., E SILVA, P.M., MARTINS, M.A.
Combined action of vasoactive amines and bradykinin mediates allergen-evoked
thermal hyperalgesia in rats. Eur J Pharmacol 462: 185-92. 2003.
LAVICH, T.R., SIQUEIRA, R.A., FARIAS-FILHO, F.A., CORDEIRO, R.S.,
RODRIGUES E SILVA, P.M., MARTINS, M.A. Neutrophil infiltration is implicated in the
sustained thermal hyperalgesic response evoked by allergen provocation in actively
sensitized rats. Pain 125: 180-7. 2005.
76
LE, Y., OPPENHEIM, J.J., WANG, J.M. Pleiotropic roles of formyl peptide receptors.
Cytokine Growth Factor Rev 12: 91-105. 2001.
LEE, N.A., MCGARRY, M.P., LARSON, K.A., HORTON, M.A., KRISTENSEN, A.B.,
LEE, J.J. Expression of IL-5 in thymocytes/T cells leads to the development of a
massive eosinophilia, extramedullary eosinophilopoiesis, and unique histopathologies.
J Immunol 158:1332-44. 1997.
LEMANSKE, R.F.JR., BUSSE, W.W. 6. Asthma. J Allergy Clin Immunol 111: S502-19.
2003.
LEUNG, D.Y. Molecular basis of allergic diseases. Mol Genet Metab 63: 157-67.
1998.
LEVY, B.D. Lipoxins and lipoxin analogs in asthma. Prostaglandins, Leukotrienes and
Essential Fatty Acids 73: 231-237. 2005.
LEVY, B.D., DE SANCTIS, G.T., DEVCHAND, P.R., KIM, E., ACKERMAN, K.,
SCHMIDT, B.A., SZCZEKLIK, W., DRAZEN, J.M., SERHAN, C.N. Multi-pronged
inhibition of airway hyper-responsiveness and inflammation by lipoxin A(4). Nat Med 8:
1018-23. 2002.
LEVY, B.D., SERHAN, C.N. Exploring new approaches to the treatment of asthma:
potential roles for lipoxins and aspirin-triggered lipid mediators. Drugs Today (Barc)
39: 373-84. 2003.
LEY, K., TEDDER, T.F., KANSAS, G.S. L-selectin can mediate leukocyte rolling in
untreated mesenteric venules in vivo independent of E- or P-selectin. Blood 82: 1632-
8. 1993.
LIM, L.H., SOLITO, E., RUSSO-MARIE, F., FLOWER, R.J., PERRETTI, M. Promoting
detachment of neutrophils adherent to murine postcapillary venules to control
inflammation: effect of lipocortin 1. Proc Natl Acad Sci USA 95: 14535-9. 1998.
LIMA, M.C., CHAGAS, M.S., SILVA, P.M., CALHEIROS, A.S., PROUVOST-DANON,
A., FARI-NETO, H.C., CORDEIRO, R.S., MARTINS, M.A.Histamine-potentiating
activity in rat anaphylactic pleural fluid: role of serotonin. Braz J Med Biol Res 29:
1049-56. 1996.
LIMA, M.C., MARTINS, M.A., PEREZ, S.A., PEIXOTO, J.M., SILVA, P.M.,
CORDEIRO, R.S. Kinetics of pleural exudation and cellular alterations induced by
antigen in actively sensitized rats. Braz J Med Biol Res 23: 857-60. 1990.
LIMA, M.C., MARTINS, M.A., PEREZ, S.A., SILVA, P.M., CORDEIRO, R.S.,
VARGAFTIG, B.B. Effect of azelastine on platelet-activating factor and antigen-
induced pleurisy in rats. Eur J Pharmacol 197: 201-7. 1991.
77
LIMA, M.C., PROUVOST-DANON, A., E SILVA, P.M., CHAGAS, M.S., CALHEIROS,
A.S., CORDEIRO, R.S., LATINE, D., BAZIN, H., RYAN, U.S., MARTINS, M.A. Studies
on the mechanisms involved in antigen-evoked pleural inflammation in rats:
contribution of IgE and complement. J Leukoc Biol 61: 286-92. 1997.
LIU, J., ZHU, X., MYO, S., LAMBERTINO, A.T., XU, C., BOETTICHER, E., MUNOZ,
N.M., SANO, M., CORDOBA, M., LEAROYD, J., MELITON, A., JOHNSON, M., LEFF,
A.R. Glucocorticoid-induced surface expression of annexin 1 blocks beta2-integrin
adhesion of human eosinophils to intercellular adhesion molecule 1 surrogate protein.
J Allergy Clin Immunol 115: 493-500. 2005.
LUIS, N.A., HAMILTON, K.E., COLGAN, S.P. Prostaglandins, Leukotrienes and
Essential Fatty Acids 73: 197-202. 2005.
LUSTER, A.D. Chemokines--Chemotactic Cytokines That Mediate Inflammation. N
Engl J Med 338: 436-445. 1998.
MACGLASHAN, D.W.Jr. Histamine: A Mediator of Inflammation. J Allergy Clin
Immunol 112: S53-59. 2003.
MADDEN, K.B., URBAN, J.F.JR., ZILTENER, H.J., SCHRADER, J.W., FINKELMAN,
F.D., KATONA, I.M. Antibodies to IL-3 and IL-4 suppress helminth-induced intestinal
mastocytosis. J Immunol 147:1387-91. 1991.
MANCUSO, F., FLOWER, R.J., PERRETTI, M. Leukocyte transmigration, but not
rolling or adhesion, is selectively inhibited by dexamethasone in the hamster post-
capillary venule. Involvement of endogenous lipocortin 1. J Immunol 155: 377-86.
1995.
MARCEAU, F., HESS, J.F., BACHVAROV, D.R. The B1 receptors for kinins.
Pharmacol Rev 50: 357-86. 1998.
MARONE, G., CASOLARO, V., PATELLA, V., FLORIO, G., TRIGGIANI, M. Molecular
and cellular biology of mast cells and basophils. Int Arch Allergy Immunol 114: 207-17.
1997.
MARONE, G., GRANATA, F., SPADARO, G., GENOVESE, A., TRIGGIANI, M. The
histamine-cytokine network in allergic inflammation. J Allergy Clin Immunol. 112: S83-
8. 2003.
MARTINS, M.A., CASTRO FARIA NETO, H.C., BOZZA, P.T., E SILVA, P.M., LIMA,
M.C., CORDEIRO, R.S., VARGAFTIG, B.B. Role of PAF in the allergic pleurisy
caused by ovalbumin in actively sensitized rats. J Leukoc Biol 53:104-11. 1993.
78
MARTINS, M.A., SILVA, P.M., FARIA NETO, H.C., BOZZA, P.T., DIAS, P.M., LIMA,
M.C., CORDEIRO, R.S., VARGAFTIG, B.B. Pharmacological modulation of Paf-
induced rat pleurisy and its role in inflammation by zymosan. Br J Pharmacol 96: 363-
71. 1989.
MASHIMO, H., GOYAL, R.K. Lessons from genetically engineered animal models. IV.
Nitric oxide synthase gene knockout mice. Am J Physiol 277: G745-50. 1999.
MATZ, J., WILLIAMS, J., ROSENWASSER, L.J., BORISH, L.C. Granulocyte-
macrophage colony-stimulating factor stimulates macrophages to respond to IgE via
the low affinity IgE receptor (CD23). J Allergy Clin Immunol 93: 650-7. 1994.
MELZER, P., SAVCHENKO, V., MCKANNA, J.A. Microglia, astrocytes, and
macrophages react differentially to central and peripheral lesions in the developing
and mature rat whisker-to-barrel pathway: a study using immunohistochemistry for
lipocortin1, phosphotyrosine, s100 beta, and mannose receptors. Exp Neurol 168: 63-
77. 2001.
METCALFE, D.D., BARAM, D., MEKORI, Y.A. Mast cells. Physiol Rev 77: 1033-79.
1997.
MEYER, R.A. Cutaneous hyperalgesia and primary afferent sensitization. Pulm
Pharmacol 8:187-93. 1995.
MIESCHER, S.M., VOGEL, M. Molecular aspects of allergy. Mol Aspects Med 23:
413-62. 2002.
MOULD, A.W., MATTHAEI, K.I., YOUNG, I.G., FOSTER, P.S. Relationship between
interleukin-5 and eotaxin in regulating blood and tissue eosinophilia in mice. J Clin
Invest 99: 1064-71. 1997.
MUTSAERS, S.E. The mesothelial cell. Int J Biochem Cell Biol 36: 9-16. 2004.
NAKAMURA, M., FERREIRA, S.H. A peripheral sympathetic component in
inflammatory hyperalgesia. Eur J Pharmacol 135: 145-53. 1987.
NILSSON, G., NILSSON, K. Effects of interleukin (IL)-13 on immediate-early response
gene expression, phenotype and differentiation of human mast cells. Comparison with
IL-4. Eur J Immunol 25: 870-3. 1995.
NINKOVIC, M., HUNT, S.P. Opiate and histamine H1 receptors are present on some
substance P-containing dorsal root ganglion cells. Neurosci Lett 53: 133-7. 1985.
NISHIYAMA, T. Effects of a 5-HT2A receptor antagonist, sarpogrelate on thermal or
inflammatory pain. Eur J Pharmacol 516: 18-22. 2005.
79
NITANDA, A., YASUNAMI, N., TOKUMO, K., FUJII, H., HIRAI, T., NISHIO, H.
Contribution of the peripheral 5-HT 2A receptor to mechanical hyperalgesia in a rat
model of neuropathic pain. Neurochem Int 47: 394-400. 2005.
NORDAHL, S., ALSTERGREN, P., KOPP, S. Tumor necrosis factor-alpha in synovial
fluid and plasma from patients with chronic connective tissue disease and its relation
to temporomandibular joint pain. J Oral Maxillofac Surg 58: 525-30. 2000.
NUTTEN, S., TROTTEIN, F., GOUNNI, A.S., PAPIN, J.P., CAPRON, A., CAPRON, M.
From allergy to schistosomes: role of Fc receptors and adhesion molecules in
eosinophil effector function. Mem Inst Oswaldo Cruz 92: 9-14. 1997.
OLIANI, S.M., CHRISTIAN, H.C., MANSTON, J., FLOWER, R.J., PERRETTI, M. An
immunocytochemical and in situ hybridization analysis of annexin 1 expression in rat
mast cells: modulation by inflammation and dexamethasone. Lab Invest 80: 1429-38.
2000.
OMOTE, K., YAMAMOTO, H., KAWAMATA, T., NAKAYAMA, Y., NAMIKI, A. The
effects of intrathecal administration of an antagonist for prostaglandin E receptor
subtype EP(1) on mechanical and thermal hyperalgesia in a rat model of
postoperative pain. Anesth Analg 95: 1708-12. 2002
O'SULLIVAN, S. On the role of PGD2 metabolites as markers of mast cell activation in
asthma. Acta Physiol Scand Suppl 644: 1-74. 1999.
PANES, J., PERRY, M., GRANGER, D.N. Leukocyte-endothelial cell adhesion:
avenues for therapeutic intervention. Br J Pharmacol 126: 537-50. 1999.
PARENTE, L., SOLITO, E. Annexin 1: more than an anti-phospholipase protein.
Inflamm Res 53: 125-32. 2004
PARK, C.S., RA, D.J., LEE, S.M., JEONG, S.W., UH, S., KIM, H.T., KIM, Y.H.
Interleukin-4 and low-affinity receptor for IgE on B cells in peripheral blood of patients
with atopic bronchial asthma. J Allergy Clin Immunol 97: 1121-8. 1996.
PAUL-CLARK, M.J., VAN CAO, T., MORADI-BIDHENDI, N., COOPER, D., GILROY,
D.W. 15-epi-lipoxin A4-mediated induction of nitric oxide explains how aspirin inhibits
acute inflammation. J Exp Med 200: 69-78. 2004.
PEARLMAN, D.S. Pathophysiology of the inflammatory response. J Allergy Clin
Immunol 104: S132-7. 1999.
PEASE, J.E., WILLIAMS, T.J. Chemokines and their receptors in allergic disease. J
Allergy Clin Immunol 118: 305-18. 2006.
80
PELAIA, G., VATRELLA, A., CUDA, G., MASELLI, R., MARSICO, S.A. Molecular
mechanisms of corticosteroid actions in chronic inflammatory airway diseases. Life Sci
72:1549-61. 2003.
PEPINSKY, R.B. Phosphorylation of lipocortin-1 by the epidermal growth factor
receptor. Methods Enzymol 198: 260-72. 1991.
PERRETTI, M. Lipocortin 1 and chemokine modulation of granulocyte and monocyte
accumulation in experimental inflammation. Gen Pharmacol 31: 545-52. 1998.
PERRETTI, M. The annexin 1 receptor(s): is the plot unravelling? Trends Pharmacol
Sci 24: 574-9. 2003.
PERRETTI, M., CHIANG, N., LA, M., FIERRO, I.M., MARULLO, S., GETTING, S.J.,
SOLITO, E., SERHAN, C.N. Endogenous lipid- and peptide-derived anti-inflammatory
pathways generated with glucocorticoid and aspirin treatment activate the lipoxin A4
receptor. Nat Med. 8: 1296-302. 2002.
PERRETTI, M., FLOWER, R.J. Modulation of IL-1-induced neutrophil migration by
dexamethasone and lipocortin 1. J Immunol 150: 992-9. 2003.
PERRETTI, M., GAVINS, F.N. Annexin 1: an endogenous anti-inflammatory protein.
News Physiol Sci 18: 60-4. 2003.
PERRETTI, M., GETTING, S.J., SOLITO, E., MURPHY, P.M., GAO, J.L. Involvement
of the receptor for formylated peptides in the in vivo anti-migratory actions of annexin
1 and its mimetics. Am J Pathol 158: 1969-73. 2001.
PESQUERO, J.B., BADER, M. Molecular Biology of the Kallikrein-Kinin System: From
Structure to Function. Braz J Med Biol Res 31: 1197-1203. 1998.
PFAFFL, M.M. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-
PCR. Nucleic Acids Res 29: e45. 2001.
PIERETTI, S., DI GIANNUARIO, A., DE FELICE, M., PERRETTI, M., CIRINO, G.
Stimulus-dependent specificity for annexin 1 inhibition of the inflammatory nociceptive
response: the involvement of the receptor for formylated peptides. Pain 109: 52-63.
2004.
PILIPONSKY, A.M., GLEICH, G.J., BAR, I., LEVI-SCHAFFER, F. Effects of
eosinophils on mast cells: a new pathway for the perpetuation of allergic inflammation.
Mol Immunol 38: 16-18. 2002.
PORTANOVA, J.P., ZHANG, Y., ANDERSON, G.D., HAUSER, S.D., MASFERRER,
J.L., SEIBERT, K., GREGORY, S.A., ISAKSON, P.C. Selective neutralization of
81
prostaglandin E2 blocks inflammation, hyperalgesia, and interleukin 6 production in
vivo. J Exp Med 184: 883-91. 1996.
PURWAR, R., WERFEL, T., WITTMANN, M. IL-13-stimulated human keratinocytes
preferentially attract CD4+CCR4+ T cells: possible role in atopic dermatitis. J Invest
Dermatol 126:1043-51. 2006.
REICHARDT, H.M., SCHUTZ, G. Glucocorticoid signalling--multiple variations of a
common theme. Mol Cell Endocrinol 146: 1-6. 1998.
RELTON, J.K., STRIJBOS, P.J., O'SHAUGHNESSY, C.T., CAREY, F., FORDER,
R.A., TILDERS, F.J., ROTHWELL, N.J.. Lipocortin-1 is an endogenous inhibitor of
ischemic damage in the rat brain. J Exp Méd 174: 305-10. 1991.
RENAULD, J.C., KERMOUNI, A., VINK, A., LOUAHED, J., VAN SNICK, J. Interleukin-
9 and its receptor: involvement in mast cell differentiation and T cell oncogenesis. J
Leukoc Biol 57: 353-60. 1995.
RICCIARDOLO, F.L. Multiple Roles of Nitric Oxide in the Airways. Thorax 58: 175-
182. 2003.
RICHARDS, K.L., MCCULLOUGH, J. A modified microchamber method for
chemotaxis and chemokinesis. Immunol Commun 13: 49-62. 1984.
ROCHA E SILVA, M., BERALDO, W.T., ROSENFELD, G. Bradykinin, a hypotensive
and smooth muscle stimulation factor release from plasma by snake venoms and by
trypsin. Am. J. Physiol 156: 261-273. 1949.
ROT, A., VON ANDRIAN, U.H. Chemokines in innate and adaptive host defense:
basic chemokinese grammar for immune cells. Annu Rev Immunol 22: 891-928. 2004.
ROVIEZZO, F., GETTING, S.J., PAUL-CLARK, M.J., YONA, S., GAVINS, F.N.,
PERRETTI, M., HANNON, R., CROXTALL, J.D., BUCKINGHAM, J.C., FLOWER R.J.
The annexin-1 knockout mouse: what it tells us about the inflammatory response. J
Physiol Pharmacol 53: 541-53. 2002.
SADEGHI-HASHJIN, G., FOLKERTS, G., HENRICKS, P.A., MUIJSERS, R.B.,
NIJKAMP, F.P. Peroxynitrite in Airway Diseases. Clin Exp Allergy 28: 1464-1473.
1998.
SALEH, D., ERNST, P., LIM, S., BARNES, P.J., GIAID, A. Increased Formation of the
Potent Oxidant Peroxynitrite in the Airways of Asthmatic Patients Is Associated with
Induction of Nitric Oxide Synthase: Effect of Inhaled Glucocorticoid. Faseb J 12: 929-
937. 1998.
82
SAMUELSSON, B., DAHLEN, S.E., LINDGREN, J.A., ROUZER, C.A., SERHAN, C.N.
Leukotrienes and lipoxins: structures, biosynthesis, and biological effects. Science
237: 1171-6. 1987.
SANDERSON, C.J. Interleukin-5, eosinophils, and disease. Blood 79: 3101-9. 1992.
SAPOLSKY, R.M., ROMERO, L.M., MUNCK, A.U. How do glucocorticoids influence
stress responses? Integrating permissive, suppressive, stimulatory, and preparative
actions. Endocr Rev 21: 55-89. 2001.
SARIA, A., MARTLING, C.R., YAN, Z., THEODORSSON-NORHEIM, E., GAMSE, R.,
LUNDBERG, J.M. Release of multiple tachykinins from capsaicin-sensitive sensory
nerves in the lung by bradykinin, histamine, dimethylphenyl piperazinium, and vagal
nerve stimulation. Am Rev Respir Dis 137: 1330-5. 1988.
SCANNELL, M., FLANAGAN, M.B., DESTEFANI, A., WYNNE, K.J., CAGNEY, G.,
GODSON, C., MADERNA, P. Annexin-1 and peptide derivatives are released by
apoptotic cells and stimulate phagocytosis of apoptotic neutrophils by macrophages. J
Immunol 178: 4595-605. 2007.
SCHUILING, M., MEURS, H., ZUIDHOF, A.B., VENEMA, N., ZAAGSMA, J. Dual
Action of Inos-Derived Nitric Oxide in Allergen-Induced Airway Hyperreactivity in
Conscious, Unrestrained Guinea Pigs. Am J Respir Crit Care Med 158: 1442-1449.
1998.
SCHWABE, U. Corticosteroide. P. Schwabe (Ed.), Arzneiverordnungs- Report 1996
(pp. 184– 188). Stuttgart: Fischer. 1996.
SENIOR, K. Homing in on COX 3-the elusive target of paracetamol. The Lancet
Neurology 1: 399. 2002.
SHORE, P.A., BURKHALTER, A., COHN, V.H.JR. A method for the fluorometric
assay of histamine in tissues. J Pharmacol Exp Ther 127: 182-6. 1959.
SILVA, P.M., ALVES, A.C., SERRA, M.F., PIRES, A.L., SILVA, J.P., BARRETO, E.O.,
CORDEIRO, R.S., JOSE, P.J., TEIXEIRA, M.M., LAGENTE, V., MARTINS, M.A.
Modulation of eotaxin formation and eosinophil migration by selective inhibitors of
phosphodiesterase type 4 isoenzyme. Br J Pharmacol 134: 283-94. 2001.
SIRSJO, A., KARLSSON, M., GIDLOF, A., ROLLMAN, O., TORMA, H. Increased
expression of inducible nitric oxide synthase in psoriatic skin and cytokine-stimulated
cultured keratinocytes. Br J Dermatol 134: 643-8. 1996.
SOLITO, E., DE COUPADE, C., PARENTE, L., FLOWER, R.J., RUSSO-MARIE, F.
Human annexin 1 is highly expressed during the differentiation of the epithelial cell line
83
A 549: involvement of nuclear factor interleukin 6 in phorbol ester induction of annexin
1. Cell Growth Differ 9: 327-36. 1998.
SOLITO, E., KAMAL, A., RUSSO-MARIE, F., BUCKINGHAM, J.C., MARULLO, S.,
PERRETTI, M. A novel calcium-dependent proapoptotic effect of annexin 1 on human
neutrophils. FASEB J 17: 1544-6. 2003.
SPINA, D. A comparison of the pharmacological modulation of hyperalgesia and
bronchial hyperresponsiveness. Pulm Pharmacol Ther 16: 31-44. 2003.
SPINA, D., PAGE, C.P. Asthma -- a need for a rethink? Trends Pharmacol Sci 23:
311-5. 2002.
STAFFORINI, D.M., MCINTYRE, T.M., ZIMMERMAN, G.A., PRESCOTT, S.M.
Platelet-activating factor, a pleiotrophic mediator of physiological and pathological
processes. Crit Rev Clin Lab Sci.40: 643-72. 2003.
STOSH, V.I., SHUGAĬLOV, I.A., MOSKOVETS, O.N., SHUL'GIN, E.G., MYL'NIKOV,
A.V. Characteristics of the pain sensitivity in patients with accompanying allergic
diseases prior to stomatologic surgery. Anesteziol Reanimatol 6: 31-4. 1991.
TAMBELI, C.H., OLIVEIRA, M.C., CLEMENTE, J.T., PELEGRINI-DA-SILVA, A.,
PARADA, C.A. A novel mechanism involved in 5-hydroxytryptamine-induced
nociception: the indirect activation of primary afferents. Neuroscience 141: 1517-24.
2006.
TANIUCHI, S., KOJIMA, T., HARA, MT.K., YAMAMOTO, A., SASAI, M., TAKAHASHI,
H., KOBAYASHI, Y. Increased serum nitrate levels in infants with atopic dermatitis.
Allergy 56: 693-5. 2001.
TASAKA, K., HAMADA, M., MIO, M. Inhibitory effect of interleukin-2 on histamine
release from rat mast cells. Agents Actions 41: C26-7. 1994.
TEDDER, T.F., STEEBER, D.A., CHEN, A., ENGEL, P. The selectins: vascular
adhesion molecules. Faseb J 9: 866-73. 1995.
TEIXEIRA, M.M., DAS, A.M., MIOTLA, J.M., PERRETTI, M., HELLEWELL, P.G. The
role of lipocortin-1 in the inhibitory action of dexamethasone on eosinophil trafficking in
cutaneous inflammatory reactions in the mouse. Br J Pharmacol 123: 538-44. 1998.
TEMANN, U.A., GEBA, G.P., RANKIN, J.A., FLAVELL, R.A. Expression of interleukin
9 in the lungs of transgenic mice causes airway inflammation, mast cell hyperplasia,
and bronchial hyperresponsiveness. J Exp Med 188: 1307-20. 1998.
TREEDE, R.D. Peripheral acute pain mechanisms. Ann Med 27:213-6. 1995.
84
TURNER, P., DEAR, J., SCADDING, G., FOREMAN, J.C. Role of Kinins in Seasonal
Allergic Rhinitis: Icatibant, a Bradykinin B2 Receptor Antagonist, Abolishes the
Hyperresponsiveness and Nasal Eosinophilia Induced by Antigen. J Allergy Clin
Immunol 107: 105-113. 2001.
UMLAND, S.P., SCHLEIMER, R.P., JOHNSTON, S.L. Review of the molecular and
cellular mechanisms of action of glucocorticoids for use in asthma. Pulm Pharmacol
Ther 15: 35-50. 2002.
VANE, J.R., BAKHLE, Y.S., BOTTING, R.M. Cyclooxygenases 1 and 2. Annu Rev
Pharmacol Toxicol 38: 97-120. 1998.
VECCHIARELLI, A., SIRACUSA, A., MONARI, C., PIETRELLA, D., RETINI, C.,
SEVERINI, C. Cytokine regulation of low-affinity IgE receptor (CD23) on monocytes
from asthmatic subjects. Clin Exp Immunol 97: 248-53. 1994.
VIANNA, R.M., CALIXTO, J.B. Characterization of the Receptor and the Mechanisms
Underlying the Inflammatory Response Induced by Des-Arg9-Bk in Mouse Pleurisy. Br
J Pharmacol 123: 281-291. 1998.
VIOLETTE, S.M., KING, I., BROWNING, J.L., PEPINSKY, R.B., WALLNER, B.P.,
SARTORELLI, A.C. Role of lipocortin I in the glucocorticoid induction of the terminal
differentiation of a human squamous carcinoma. J Cell Physiol 142:70-7. 1990.
WALLACE, J.L. Nitric oxide as a regulator of inflammatory processes. Mem Inst
Oswaldo Cruz 100: 5-9. 2005.
WALLACE, J.L. Nitric oxide, aspirin-triggered lipoxins and NO-aspirin in gastric
protection. Inflamm Allergy Drug Targets 5: 133-7. 2006.
WARDLAW, A.J., SYMON, F.S., WALSH, G.M. Eosinophil adhesion in allergic
inflammation. J Allergy Clin Immunol 94: 1163-71. 1994.
WARNER, J.O., KALINER, M.A., CRISCI, C.D., DEL GIACCO, S., FREW, A.J., LIU,
G.H., MASPERO, J., MOON, H.B., NAKAGAWA, T., POTTER, P.C.,
ROSENWASSER, L.J., SINGH, A.B., VALOVIRTA, E., VAN CAUWENBERGE, P.
Allergy practice worldwide: a report by the World Allergy Organization Specialty and
Training Council. Int Arch Allergy Immunol 139: 166-74. 2006.
WILLS-KARP, M., LUYIMBAZI, J., XU, X., SCHOFIELD, B., NEBEN, T.Y., KARP,
C.L., DONALDSON, D.D. Interleukin-13: Central Mediator of Allergic Asthma. Science
282: 2258-2261. 1998.
WISHAH, K., MALUR, A., RAYCHAUDHURI, B., MELTON, A.L., KAVURU, M.S.,
THOMASSEN, M.J. Nitric oxide blocks inflammatory cytokine secretion triggered by
85
CD23 in monocytes from allergic, asthmatic patients and healthy controls. Ann Allergy
Asthma Immunol 89: 78-82. 2002.
YANG, Y.H., MORAND, E.F., GETTING, S.J., PAUL-CLARK, M., LIU, D.L., YONA, S.,
HANNON, R., BUCKINGHAM, J.C., PERRETTI, M., FLOWER, R.J. Modulation of
inflammation and response to dexamethasone by Annexin 1 in antigen-induced
arthritis. Arthritis Rheum 50: 976-84. 2004.
YANG, X., YE, R., KONG, Q., YANG, Q., DONG, X., YU, X. CD40 is expressed on rat
peritoneal mesothelial cells and upregulates ICAM-1 production. Nephrol Dial
Transplant 19: 1378-84. 2004.
ZHU, Z., HOMER, R.J., WANG, Z., CHEN, Q., GEBA, G.P., WANG, J., ZHANG, Y.,
ELIAS, J.A. Pulmonary Expression of Interleukin-13 Causes Inflammation, Mucus
Hypersecretion, Subepithelial Fibrosis, Physiologic Abnormalities, and Eotaxin
Production. J Clin Invest 103: 779-788. 1999.
ZITT, M.J. The Role of Nonsedating Antihistamines in Asthma Therapy. Allergy
Asthma Proc 24: 239-252. 2003.
86
ANEXOS
87
ANEXO I
88
89
90
91
92
93
94
95
ANEXO II
Ac2-26 inhibit the allergic hyperalgesia through the lipoxin A
4
receptor and NO-
cGMP pathway
André Gustavo Bonavita; Francisco Alves Farias-Filho; Ana Carolina Reigada;
Vinicius Frias Carvalho; Renato Balão Cordeiro; Patrícia Machado Rodrigues e
Silva; Iolanda Fierro
†
; Mauro Perretti*; Marco Aurélio Martins
Departamento de Fisiologia e Farmacodinâmica, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ,
Av. Brasil, no 4365, Maguinhos, CEP 21045-900, Rio de Janeiro, Brazil.
†
Departamento de Farmacologia e Psicobiologia, Instituto de Biologia Roberto
Alcantara Gomes, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Maracanã, CEP 20551-
030, Rio de Janeiro, Brasil.
* Department of Biochemical Pharmacology, The William Harvey Research Institute,
Queen Mary University of London, Charterhouse Square, London, UK.
Address correspondence and reprint requests to Dr. Marco A. Martins, Departamento
de Fisiologia e Farmacodinamica, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Av. Brasil, no
4365, Manguinhos, CEP 21045-900, Rio de Janeiro, Brazil. Fax number +55-21-
25587382, [email protected]
Key words: Allergy, Annexin-1, Inflammation, Hyperalgesia, ALX receptor, Neutrophil,
NO-cGMP pathway.
96
ABSTRACT
In current study we evaluated the activity of annexin 1-derived peptide Ac2-26 on a
model of allergic hyperalgesia. Rat paws hyperalgesia produced by injection of
ovalbumin 14 days post-sensitization were inhibited by administration of Ac2-26 (50-
200 µg/paw). The ALX antagonist, BOC-2 (1.25-5 µmol/paw) was able to revert the
Ac2-26 effect. Histological analysis of challenged rat paw treated with th peptide
shows a signifcative inhibition of the neutrophil accumulation that was sensitive to
BOC-2. The lipoxin stable analog has the same responses on allergen hyperalgesia.
The hyperalgesia produced by the synergic action of histamine (5µg/paw) and 5-HT
(1µg/paw) were equaly inhibited by the peptide and the effect blocked by the
antagonist. To atest the nitric oxide (NO) and NO-cGMP pathway on the
antihyperalgesia effect of the Ac2-26, challenged animals were pre-treated with the
NO synthase inhibitor L-NAME (50-100 mg/Kg) or with the guanylyl cyclase inhibitor
ODQ (100 µg/paw). In both cases the peptide effects were abolished. The NO-donor
nitroprussiate sodium (NPS) mimetize effect of the Ac2-26 on the allergic
hyperalgesia. In vitro mice macrophages stimulated with the peptide were able to
produce NO in a dose-response fashion. Our data suggest that Ac2-26 inhibit the
allergic hyperalgesia evoked by allergic stimulus, probably by reducing the neutrophils
accumulation and blocking the histamine and 5-HT action on nociceptor through the
lipoxin A
4
receptor in a mechanism depended of NO-cGMP pathway.
97
INTRODUCTION
Acute allergic inflammatory
response results from the activation of mast cells through
allergen-specific IgE stimulation, resulting in the release
of preformed and inducible
proinflammatory mediators (Busse, 1998; Lemanske & Busse, 2003; Kay, 2001).
Therefore, in atopic patients, exposure of the skin, nose, airways or intestinal tract to
allergen challenge causes inflammation within minutes, a phenomenon frequently
associated with both tissue damage and nerve injury (Williams, 2000).
Sensitization of primary nociceptors often depends on the production and release of
inflammatory mediators at the site of injury. The vasoactive amines, histamine and 5-
hydroxytryptamine (5-HT) have classically been implicated in the processing of
nociception in several inflammatory conditions (Besson, 1997). The involvement of
these mediators in itching and oedema formation following allergen challenge is also
well established (Kay, 2001). Lavich et al (2003, 2006) shows that a state of thermal
hyperalgesia is present in the area of tissue damage created by allergen challenge.
The phenomenon is shown to be independent of the concomitant oedematogenic
response and is critically mediated by the synergistic interaction of at least three
autacoids—histamine, 5-HT and bradykinin as well as neutrophil accumulation in
tissue.
Anti-inflammatory therapy with glucocorticoid agents is currently the most effective
pharmacological approach for allergy, but its applicability is limited by the wide range
of undesirable side effects associated with steroid therapy (Barnes, 1995).
Glucocorticoid are able to induce the production of annexin 1, an anti-inflammatory
protein of the superfamily of annexins, which has been implicated as an endogenous
mediator of the glucocorticoid effect in many circumstances (Roviezzo et al., 2002).
Studies have emphasized that the N-terminal peptide of annexin 1 (peptide Ac2-26)
has the capacity of reproducing the anti-inflammatory actions of the full-length protein.
This peptide of 24 amino acids inhibits tissue recruitment of neutrophils caused by
different stimuli in vivo (Cirino et al., 1993; Perretti et al., 1993), and can also
reproduce the anti-inflammatory effect of annexin-1 in inflammatory models like the
carrageenan-induced mechanical hyperalgesia (Ferreira et al., 1997) or tissue injury
98
caused by artery occlusion and reperfusion shock (Cuzzocrea et al., 1997). Our
previous work shows that the peptide has ability to reduce the allergic inflammatory
response resulting from the inhibiting of mast cell degranulation and eotaxin
generation (Bandeira-de Melo et al, 2005).
Researches has shown a direct interaction of annexin 1 and its peptides with the
specific seven trans-membrane G protein-coupled lipoxin A
4
receptor (ALX) (Perretti et
al., 2002). Further, stable analogues of lipoxin A
4
are able to block allergic airway
inflammation, as shown by decreased eosinophil influx and release of mediators such
as IL-4, IL-5, IL-13 and eotaxin, both in the mouse (Levy et al., 2002) and rat
(Bandeira-Melo et al., 2000a,b). Complementary some data shows that lipoxin A
4
and
analogs induces the generation of nitric oxide which act as an antiinflamatory
molecule (Wallace, 2005; Gilroy, 2005) since nitric oxide is a potent inhibitor of
neutrophil-endothelial adhesive interactions (Wallace & Miller, 2000). The current
study was undertaken to evaluate the mechanims of the annexin 1
peptide derivative
Ac2-26 on the allergic inflammation hyperalgesia in rat paws triggered by antigen with
focous on the ALX and the nitric oxide generation.
99
2. Methods
2.1. Animals
All experiments were performed in male Wistar rats, weighing between 180 and
220 g, obtained from the breeding colony of the Oswaldo Cruz Foundation, Rio de
Janeiro, Brazil. The animals were housed in groups of five and maintained on a 12-h
light/dark cycle, with water and food ad libitum until use. The Ethics Committee for
Care and Use of Laboratory Animals of The Oswaldo Cruz Foundation approved the
experimental protocols employed in this study (License no. 0085-02).
2.2. Actively sensitization and hind paw challenge and stimuli
Active
sensitization was achieved by s.c. injection (0.2 ml) of a mixture
containing 50 µg of ovalbumin and 5 mg of aluminum hydroxide
in 0.9% NaCl solution
(saline). Ovalbumin dissolved in sterile
saline was administered intraplantarly (i.pl.) (12
µg/paw)
14 days postsensitization. In another set of experiments animals received an
i.pl. injection of the association histamine (5 µg/paw) and 5-HT (1 µg/paw) dissolved in
sterile saline. All i.pl. injections were in a final volume of 100 µl or 50µl when animals
received 2 injections.
All solutions were always made fresh immediately before use.
2.3. Algesimetric assay
Thermal hyperalgesic response was evaluated as previously described (Lavich
et al., 2005). Briefly, animals were individually placed on a hot plate (Eddy's Hot Plate)
with the temperature adjusted to 51°C and the withdrawal response latency of each
hind paw determined at 15, 60, 180 and 360 min after allergen challenge. The heat
source was maintained at constant intensity, which caused a stable withdrawal latency
of approximately 8-10 s in sham-challenged paws. The animals were only tested in one
series of measurements, and the typical responses were hind paw shaking and/or
lifting. The latency to the response was manually recorded with a chronometer. The
experiments were performed in a sound-attenuated and air-conditioned (20-22 °C)
room. Hyperalgesia to heat was defined as a decrease in withdrawal latency and
100
calculated as follows: ∆ paw withdrawal latency (s) = right paw withdrawal latency – left
paw withdrawal latency and representend as ∆ Latency.
2.4. Histopathology and neutrophil enumeration
After killing the animals in a CO
2
atmosphere, the subcutaneous tissue of the
paws was removed and fixed in Carson-Millonig phosphate-buffered 4% formaldehyde
fixative (Herrera, 1992). Routine histological techniques were used to paraffin-embed
the entire tissue, which was sectioned at 5 µm and stained with H&E. The tissues
sections were examined under an Olympus B201 microscope to check the presence
of inflammatory infiltrates at 180 h after allergen challenge. To assess the number of
neutrophil in tissue, each section was evaluated at 1000 magnification on optical
microscopy and these cells were counted in fifty fields. The mean value of the fifty
areas was taken as representative of the whole section.
2.5. Real Time PCR
Quantitative real-time PCR. Total RNA was extracted from treated cells with the
RNeasy mini spin columns (Qiagen, West Sussex, UK) according to manufacturer’s
protocol. Total RNA from 5 to 10 × 106 cells was used for first-strand cDNA synthesis
with random primers and AMV reverse Transcriptase (Invitrogen, Paisley, UK).
Aliquots of the cDNA were assayed in triplicate by real-time quantitative PCR using
the TaqMan Universal PCR master mix and fluorescent primers obtained from Applied
Biosystems (California, USA; Assay-on-demand Gene Expression™ products).
Cycling conditions were set according to manufacturer’s instructions. Sequence
specific fluorescent signal was detected by an ABI Prism 7700 sequence Detector
System. FPRL-1/ALX mRNA expression was normalised for each sample with respect
to the corresponding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) mRNA
expression to compensate for potential variation in mRNA loading. Expression levels
were calculated according to ∆∆C
T
method (Pfaffl, 2001). All subsequent data were
expressed relative to the sample with the lowest expression set as one.
101
2.6. Raw 264,7 cell culture and NO
2
-
quantification
The mouse macrophage cell line RAW 264.7 were grown in DMEM Ham’s/F12
supplemented with 20% (v/v), mercaptoethanol (50 µM) fetal bovine serum,
streptomycin (100 µg/ml) and penicillin (100 µg/ml) at 37°C in a 5% CO
2
humidified
incubator. The cells used for all experiments were cultured in triplicate at a density of
5×10
5
cells/ml in 24-well tissue culture plates with various concentrations of peptide
Ac2-26 (50-200 µg/ml). The levels of nitric oxide from the culture supernatants were
determined using the Griess reaction. One hundred microliters of culture supernatant
was mixed with 2 ml of distilled water, 200 µl of 1% sulfanilamide in HCl and 200 µl of
0.12% N-(1-naphthyl)-ethylenediamine dihydrochloride at room temperature for 10
min, and the absorbance at 540 nm was measured.
2.7. Drug Treatments
To study the effect of human annexin 1 N terminus
on allergic hyperalgesia, the
peptide Ac2-26 (50–200 µg/paw) was injected intraplantarally 60 min before allergen
challenge. The participation of the formyl peptide receptor was evaluated by
concomitant administration of the BOC-2 antagonist (1.2-5 nmol) with Ac2-26 or ATL
60 min before allergen challenge. We used the lipoxin A
4
stable analog (ATL) (125-
500 ng/paw) for comparison. In control groups, we use sterile saline, ethanol (3%) as
ATL vehicle control or DMSO (3%) as control vehicle for BOC-2. L-NAME (50 mg/Kg)
was diluted in sterile saline was injected i.p. 1 hour before Ac2-26 treatment. ODQ
(100 µg/paw) was diluted in sterile saline was injected concomitantly with Ac2-26 in
the hind-paw. NPS (250-750 µg/paw) was diluted in sterile saline was injected in the
paw 1 hour before Ac2-26 treatment.
2.8. Materials
Peptide Ac2–26 (acetyl-AMVSEFLKQAWIENEEQEYV-VQTVK, MW 3,050)
was prepared by the Advance Biotechnology Center (The Charing Cross and
Westminster Medical School, London) by using solid-phase stepwise synthesis. Purity
was more than 90% as assessed by HPLC and capillary electrophoresis (data
supplied by manufacturer). Histamine, 5-HT, ovalbumin and L-NAME were obtained
102
from Sigma Chemical Co (Poole, Dorset UK). BOC-2 (Boc-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe)
was obtained from Phoenix Pharmaceuticals. ATL-1, the stable 15-epi-lipoxin A
4
analog, was a generous gift from Brigham and Women’s Hospital (Harvard Medical
School, Boston, MA).
2.9. Statistical Analysis
All data are presented as means ± SEM. Statistical analysis involving two groups was
done with Student’s t-test, whereas analysis of variance (ANOVA) and Newman-
Keuls-Student’s test were used to compare more than two groups. P values of 0.05 or
less (two-tail test) were considered significant.
103
3. Results
3.1. Effect of peptide Ac2-26 on inflammatory hyperalgesia in the rat paw is
mediated by ALRX receptor.
Ovalbumin paw challenge (12 µg/paw) in sensitized rats results in a high
thermal hyperalgesia response with maximun response at 1 hour after antigen
stimulation (Fig. 1). Local treatment with peptide Ac2-26 (25-100 µg/paw) dose-
dependently inhibits this response (Fig 1A). This effect was still observed with injection
of the peptide 3 hours before stimulation (Fig 1B). For the others experiments the
timepoint of 1 hour after stimulation and the peptide dose of 50 µg/paw were used.
Works suggest that Ac2-26 acts by a mechanism dependent on the activation of the
lipoxin A
4
receptor (ALX) (Perretti et al., 2002). To confirm the hypothesis that Ac2-26
acts through this receptor, animals were treated with Ac2-26 in presence or absence
of the LXA
4
receptor antagonist (BOC-2; 1.2-5 nmol/paw). The antagonist was able to
reverse the inhibitory effect of the peptide on allergen-induced-hyperalgesia in a dose-
dependent manner (Fig 1C). The real time PCR analysis indicated that the ALX is
present in the rat paw (Fig 2). In fact a stable lipoxin A
4
analog (ATL-1) was able to
mimetize the Ac2-26 effect over the paw hyperalgesia and was sensible to the
antagonist too (Table 1).
3.2. BOC-2 prevents the protective effect of Ac2-26 on the allergen-evoked
neutrophil accumulation
Neutrophils accumulation was show to participate on the later hyperalgesia
response after allergic stimulation (Lavich, 2006). The histological analysis indicate
that the peptide reduce the inflammatory cells influx on the rat paw after ovalbumin
challenge (data not shown). The number of neutrophil was counted at 1000
magnification and Ac2-26 was able to reduce the neutrophil accumulation at the
inflammatory site (Fig. 3). Furthermore the co-treatment with the LXA
4
receptor
antagonist prevents the effect of the peptide on neutrophil numbers confirming the
mechanism dependet of the ALX (Fig 3).
104
3.3. Ac2-26 peptide inhibit the hyperalsegia induced by histamine and 5-HT
Our previous dada have shown that mast cells degranulation and histamine
release was inhibited by the Ac2-26 on an allergen-evoked inflammation in the rat
pleura and in a model of hypodermic tissues culture (Bandeira-Melo et al, 2005).
Lavich el al (2003) shows that the allergic hyperalgesia is dependent in part of a
synergic action of the mast cells mediators histamine and 5-. As illustrated on Figure 4
histamine (5µg/paw) and 5-Ht (1µg/paw) acts together to induce thermal hyperalgesia
in the hind paw. The administration of Ac2-26 was able to inhibit directly the
hyperalgesia induced by these vasoactive amines confirming the protective action of
the peptide against mast cell preformed mediator.
3.4. The NO-cGMP pathway is invoilved on the Ac2-26 effects
Nitric oxide have been shown as possible molecule in the action of aspirin
triggered lipoxin A
4
(Gilroy, 2005; Wallace et al, 2005). As both the lipoxin analog
(ATL) and annexin-1 peptide share the same receptor, in this stage we analized the
participation of the NO-cGMP pathway on the Ac2-26 responses. First animals were
pre-treated with a nonspecific nitric oxide synthase inhibitor L-NAME (50 and 100
mg/Kg; i.p.). L-NAME was able to revert the peptide effects over allergic hyperalgesia
in the rat paw (Fig 5A). Treatment with L-NAME only it was not able to interfere with
the ovoalbumin response (dada not shown). Similary the guanylyl cyclase inhibitor
ODQ (100 µg/paw) 1 hour before the injection of the peptide blocks the effect of Ac2-
26 (Fig 5B) inidicating the participation of this rote on the antihyperalgesic effect of the
annexin-1 derived peptide. Nitroprussiate sodium (250-750 µg/paw) a NO-donor was
able to mimic the inhibitory effect on the allergen-evoked hyperalgesia (Fig 5C)
suggesting the involviment of nitric oxide on the antihyperalgesic action of Ac2-26.
3.5. Effect of Ac2-26 peptide on nitric oxide release by RAW 264.7 cells in vitro
105
Stimulation of the mice macropage line cell (RAW 264) with diferent
concentration of Ac2-26 (50 – 200 µg/mL) were able to induce nitric oxide release in
vitro 24 hours before stimulation as show in figure 6. Methanol (0,2 %) negative
control did not interfere with the result (data not show). This data corroborate the
hypotesis that peptide Ac2-26 effects on the hyperalgesia may act via production of
nitric oxide.
4. Discussion
Sensibilization of nociceptors during inflamation reaction generate a state of
hyperalgesia. Experimental studies have shown that nociceptions alterations occur
during the alergic condictions where atopic individuals demonstrate emotional
responses when compared with non-atopic after a painfull stimulation (Stoch et al.,
1991). A vary of pro-inflammatory mediators including vasoactive amines, bradykinin
(Lavich et al., 2003), TNF-α (Nordahl et al., 2000), IL-1β (Alstergren et al., 1998;
Kopp, 1998), prostaglandins (Portanova et al., 1996; Omote et al., 2002) and
leukotriene B
4
(Cunha et al., 2003) that are released in the alergic response shown to
be important to pain modulation. Ferreira et al (1997) using a mechanic stimulation
hiperssensibility model demonstrate that anexin-1 has a important role in the
antihyperalgesic effects of dexamethasone. Besides that Pieretti et al (2004) have
shown that the annexin-1 mimetic peptide was able to block the nociception induced
by formalin in mice. Inour studies we evaluated the effects of Ac2-26 peptide on the
thermal hyperalgesia evoked by allergen.
The intraplantar stimulation with ovoalbumin on sensitized rats induce a intense
hyperalgesic response to thermal stimulation, that be mntained for 6 hoours after
stimulation (Lavich et al., 2006). Our data demonstrate that the pre-treatment with
Ac2-26 peptide was able to inhibit the thermal hiperalgesia evoked by allergen.
Besides the direct effect of the peptide over the nociceptor was not evaluated, a study
shows that peripherial nerve damage lead to a increase of the annexin-1 expression
oon microglia cells indicating the neuroprotecting action of this molecule (Metzer et al.,
2001).
106
Works suggests that annexin-1, as well as his mimetic peptide, share the same
receptor of the lipoxin A
4
(for review Gavins et al., 2005). A work from Levy et al
(2002) identify a increase of lipoxin A4 expression and it receptor on mice lungs after
antigen challenge and that the animals treatment with a stable lipoxin A
4
analog result
in a inhibition of the airway hyper-responsiveness and inflammation. Interestingly
airway hyper-responsiveness and the hyperalgesic response have similarities on thier
mechanims and pharmacological modulation (Spina, 2003). Our data showed
expression of the FPR receptors including the lipoxin A
4
receptor on the sensitized
and challenged rats paw and besides that the treatment with the lipoxin A
4
stable
analog was capable to inhibit the allergen evoked hyperalgesia as the same way of
the annexin peptide. Complementary administration of the ALX antagonist abolish the
anti-hyperalgesia effect of the Ac2-26 suggesting the actions of the peptide is
madiated by this receptor.
Recentely our group show that neuthophils are important cell in the maintenance
of the allergic hyperalgesia (Lavich, 2006). Extensively works show that annexin-1 and
it peptide modulate the migration of these cells to the inflammatory site through ALX
where it modulate the adhesion to the endothelial and transmigration (for review see
Perretti and Flower, 2004). As noted ovalbumin challenge result in a increase of those
cells on the rat paw, which was significantly reduced by the Ac2-26 treatment effect
abolished by ALRX antagonist. This suggest that neutrophil migration inhibition by the
annexin mimetic peptide could be important to it effects on hyperalgesia.
Vasoactive amines are important mediator in the inflammatory hyperalgesia
acting directly on nociceptors leading to a reduction of the activation threshold.
(Graven-Nielsen & Mense, 2001; Coutaux, 2005). Our laboratory data reported a
synergic action of these mediators on the allergic hyperalgesia (Lavich e col., 2003).
In this present study the rat treatment with Ac2-26 abolish the hyperalgesia effects of
the histamine/5-HT synergy suggesting that the peptide has a direct action on the
nociceptor besides the effects on mast cells histamine release (Bandeira-Melo, 2005)
and this phenomenon was equaly sensible to lipoxin A
4
antagonist treatment. The
mechanims which the anti-hyperalgesic actions of the peptide occurs is not clear.
107
While searching the mechanisms envolved on the effects of Ac2-26 we point up to
nitric oxide.
Nitric oxide is recognized as a imflammatory mediator however recently is being
pointed as a modulator of the inflamatory response (Wallace, 2005). Studies shows
that the antiinflammatory effects of aspirin are dependet of the 15-epi-lipoxin A
4
generation which acts on endothelial cells promoting the production of nitric oxide that
will inhibit the interaction of leukocytes, mainly neutrophils, with the endothelium (for
review Gilroy, 2004). Duarte et al (1990) demonstrate that rat treated with a nitric
oxide donor show a reduction of the hyperalgesia response induced by prostaglandin
E
2
. The treatment with sidenafil a phosphodiesterase 5 inhibitor avoy the hyperalgesia
induced by carragenin and potentiate the anti-hyperalgesic effects of sodium
nitroprussiate on rats suggesting the participation of the NO-cGMP pathway (Jain e
col., 2005). As we demonstrate the L-NAME or ODQ treatment reversed the actions of
the Ac2-26 peptide on allergen evoked hyperalgesia. We hypothesy that Ac2-26
interact with ALX leading to a nitric oxide generation on the inflammatory site resulting
on a modulation of the hyperalgesia by the NO-cGMP pathway. Culture of murine cells
with Ac2-26 result in a dose-dependent production of nitric oxide in vitro corroborating
or hypothesis. In fact. Scanell et al (2007) reported that annexin-1 induces the nitric
oxide formation by macrophages where it has an important role on phagocitosis
modulation and on inflammation resolution.
By data exposed here we conclude that Ac2-26 is able to inhibit the allergen
evoked hyperalgesia by modulating neutrophill migration and nociceptors activation.
Finaly, we conclude that action is dependent on ALX and by the NO-cGMP pathway.
108
References
Alstergren, P., Ernberg, M., Kvarnstrom, M., Kopp, S. Interleukin-1beta in synovial
fluid from the arthritic temporomandibular joint and its relation to pain, mobility, and
anterior open bite. J Oral Maxillofac Surg 56: 1059-65. 1998.
Bandeira-Melo, C., Bonavita, A.G., Diaz, B.L., E Silva, P.M., Carvalho, V.F., Jose,
P.J., Flower, R.J., Perretti, M., Martins, M.A. A novel effect for annexin 1-derived
peptide ac2-26: reduction of allergic inflammation in the rat.J Pharmacol Exp Ther
313(3): 1416-22. 2005.
Bandeira-Melo, C., Bozza, P.T., Diaz, B.L., Cordeiro, R.S., Jose, P.J., Martins, M.A.,
Serhan, C.N. Cutting edge: lipoxin (LX) A4 and aspirin-triggered 15-epi-LXA4 block
allergen-induced eosinophil trafficking. J Immunol 164: 2267-71. 2000.
Bandeira-Melo, C., Serra, M.F., Diaz, B.L., Cordeiro, R.S., Silva, P.M., Lenzi, H.L.,
Bakhle, Y.S., Serhan, C.N., Martins, M.A. Cyclooxygenase-2-derived prostaglandin E2
and lipoxin A4 accelerate resolution of allergic edema in Angiostrongylus
costaricensis-infected rats: relationship with concurrent eosinophilia. J Immunol 164:
1029-36. 2000.
Barnes P.J. Anti-inflammatory mechanisms of glucocorticoids. Biochem Soc Trans.
23(4): 940-5. 1995.
Besson, J.M.The complexity of physiopharmacologic aspects of pain. Drugs. 53 Suppl
2: 1-9. 1997.
Busse, W.W. Inflammation in asthma: the cornerstone of the disease and target of
therapy.J Allergy Clin Immunol. 102:S17-22. 1998.
Cirino, G., Cicala, C., Sorrentino, L., Ciliberto, G., Arpaia, G., Perretti, M., Flower, R.J.
Anti-inflammatory actions of an N-terminal peptide from human lipocortin 1. Br J
Pharmacol. 108: 573-4. 1993.
Coutaux, A., Adam, F., Willer, J.C., Le Bars, D. Hyperalgesia and allodynia: peripheral
mechanisms. Joint Bone Spine 72: 359-71. 2005.
Cunha, J.M., Sachs, D., Canetti, C.A., Poole, S., Ferreira, S.H., Cunha, F.Q. The
critical role of leukotriene B4 in antigen-induced mechanical hyperalgesia in
immunised rats. Br J Pharmacol 139: 1135-45. 2003.
Cuzzocrea, S., Tailor, A., Zingarelli, B., Salzman, A.L., Flower, R.J., Szabó, C.,
Perretti, M. Lipocortin 1 protects against splanchnic artery occlusion and reperfusion
injury by affecting neutrophil migration. J Immunol 159: 5089-97. 1997.
109
Duarte, I.D., Lorenzetti, B.B., Ferreira, S.H. Peripheral analgesia and activation of the
nitric oxide-cyclic GMP pathway. Eur J Pharmacol 186: 289-93. 1990.
Ferreira, S.H., Cunha, F.Q., Lorenzetti, B.B., Michelin, M.A., Perretti, M., Flower, R.J.,
Poole, S. Role of lipocortin-1 in the anti-hyperalgesic actions of dexamethasone. Br J
Pharmacol 121: 883-8. 1997.
Gavins, F.N., Sawmynaden, P., Chatterjee, B.E., Perretti, M. A twist in anti-
inflammation: annexin 1 acts via the lipoxin A4 receptor. Prostaglandins Leukot Essent
Fatty Acids 73: 211-9. 2005.
Gilroy, D.W. New insights into the anti-inflammatory actions of aspirin-induction of
nitric oxide through the generation of epi-lipoxins. Mem Inst Oswaldo Cruz 100: 49-54.
2005.
Graven-Nielsen, T., Mense, S. The peripheral apparatus of muscle pain: evidence
from animal and human studies. Clin J Pain 17: 2-10. 2001.
Herrera, G.A. Ultrastructural immunolabeling in diagnostic surgical pathology:
illustrative cases. Ultrastruct Pathol 16: 71-85. 1992.
Jain, N.K., PatiL, C.S., Singh, A., Kulkarni, S.K. Sildenafil-induced peripheral
analgesia and activation of the nitric oxide-cyclic GMP pathway. Brain Res 909: 170-8.
2001.
Kay, A.B. Allergy and allergic diseases. First of two parts. N Engl J Med 344: 30-7.
2002.
Kopp, S. The influence of neuropeptides, serotonin, and interleukin 1beta on
temporomandibular joint pain and inflammation. J Oral Maxillofac Surg 56: 189-91.
1998.
Lavich, T.R., Cordeiro, R.S., Calixto, J.B., e Silva, P.M., Martins, M.A. Combined
action of vasoactive amines and bradykinin mediates allergen-evoked thermal
hyperalgesia in rats. Eur J Pharmacol 462: 185-92. 2003.
Lavich, T.R., Cordeiro, R.S., Silva, P.M., Martins, M.A. A novel hot-plate test sensitive
to hyperalgesic stimuli and non-opioid analgesics. Braz J Med Biol Res 38: 445-51.
2005.
Lavich, T.R., Siqueira, R.A., Farias-Filho, F.A., Cordeiro, R.S., Rodrigues E Silva,
P.M., Martins, M.A. Neutrophil infiltration is implicated in the sustained thermal
hyperalgesic response evoked by allergen provocation in actively sensitized rats. Pain
125: 180-7. 2006.
110
Lemanske, R.F. Jr., Busse, W.W. 6. Asthma. J Allergy Clin Immunol 111: S502-19.
2003.
Levy, B.D., De Sanctis, G.T., Devchand, P.R., Kim, E., Ackerman, K., Schmidt, B.A.,
Szczeklik, W., Drazen, J.M., Serhan, C.N. Multi-pronged inhibition of airway hyper-
responsiveness and inflammation by lipoxin A(4). Nat Med 8: 1018-23. 2002.
Melzer, P., Savchenko, V., McKanna, J.A. Microglia, astrocytes, and macrophages
react differentially to central and peripheral lesions in the developing and mature rat
whisker-to-barrel pathway: a study using immunohistochemistry for lipocortin1,
phosphotyrosine, s100 beta, and mannose receptors. Exp Neurol 168: 63-77. 2001.
Nordahl, S., Alstergren, P., Kopp, S. Tumor necrosis factor-alpha in synovial fluid and
plasma from patients with chronic connective tissue disease and its relation to
temporomandibular joint pain. J Oral Maxillofac Surg 58: 525-30. 2000.
Omote, K., Yamamoto, H., Kawamata, T., Nakayama, Y., Namiki, A. The effects of
intrathecal administration of an antagonist for prostaglandin E receptor subtype EP(1)
on mechanical and thermal hyperalgesia in a rat model of postoperative pain. Anesth
Analg 95: 1708-12. 2002.
Perretti, M., Ahluwalia, A., Harris, J.G., Goulding, N.J., Flower, R.J. Lipocortin-1
fragments inhibit neutrophil accumulation and neutrophil-dependent edema in the
mouse. A qualitative comparison with an anti-CD11b monoclonal antibody.J
Immunol151: 4306-14. 1993.
Perretti, M., Chiang, N., La, M., Fierro, I.M., Marullo, S., Getting, S.J., Solito, E.,
Serhan, C.N. Endogenous lipid- and peptide-derived anti-inflammatory pathways
generated with glucocorticoid and aspirin treatment activate the lipoxin A4 receptor.
Nat Med. 8: 1296-302. 2002.
Perretti M, Flower RJ.Annexin 1 and the biology of the neutrophil.J Leukoc Biol. 2004
Jul;76(1):25-9. Epub 2004 Feb 13.
Pieretti, S., Di Giannuario, A., De Felice, M., Perretti, M., Cirino, G. Stimulus-
dependent specificity for annexin 1 inhibition of the inflammatory nociceptive
response: the involvement of the receptor for formylated peptides. Pain 109: 52-63.
2004.
Pfaffl, M.M. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.
Nucleic Acids Res 29: e45. 2001.
Portanova, J.P., Zhang, Y., Anderson, G.D., Hauser, S.D., Masferrer, J.L., Seibert, K.,
Gregory, S.A., ISakson, P.C. Selective neutralization of prostaglandin E2 blocks
inflammation, hyperalgesia, and interleukin 6 production in vivo. J Exp Med 184: 883-
91. 1996.
111
Roviezzo, F., Getting, S.J., Paul-Clark, M.J., Yona, S., Gavins, F.N., Perretti, M.,
Hannon, R., Croxtall, J.D., Buckingham, J.C., Flower, R.J. The annexin-1 knockout
mouse: what it tells us about the inflammatory response. J Physiol Pharmacol. 53(4 Pt
1): 541-53. 2002.
Scannell, M., Flanagan, M.B., DeStefani, A., Wynne, K.J., Cagney, G., Godson, C.,
Maderna, P. Annexin-1 and peptide derivatives are released by apoptotic cells and
stimulate phagocytosis of apoptotic neutrophils by macrophages. J Immunol 178:
4595-605. 2007.
Spina, D. A comparison of the pharmacological modulation of hyperalgesia and
bronchial hyperresponsiveness. Pulm Pharmacol Ther 16: 31-44. 2003.
Stosh, V.I., Shugaĭlov, I.A., Moskovets, O.N., Shul'gin, E.G., Myl'nikov, A.V.
Characteristics of the pain sensitivity in patients with accompanying allergic diseases
prior to stomatologic surgery. Anesteziol Reanimatol 6: 31-4. 1991.
Wallace, J.L. Nitric oxide as a regulator of inflammatory processes. Mem Inst Oswaldo
Cruz 100: 5-9. 2005.
Wallace JL, Miller MJ.Nitric oxide in mucosal defense: a little goes a long
way.Gastroenterology. 2000 Aug;119(2):512-20.
112
Legends
Figure 1: Intraplantar injection of ovalbumin (12 µg/paw; filled squares) into the left
hind paw of sensitized rats induces hyperalgesia (∆ Lantency). Treatment with Ac2-26
peptide (25-100 µg/paw) inhibit the allergen evoked hyperalgesia (A). The injection of
the peptide 1 or 3 h before stimulation was able to inhibit the hyperalgesia, effect not
observed when injected 6 h before stimulation (B). Ovalbumin stimulation was
replaced with saline in the control (open circles). The administration of the ALX
antagonist, BOC-2 (1.2-5 nmol/paw) prevents the effect of Ac2-26 at time point of 1 h
(C). Results were expressed as means ± SEM from at least 5 animals. * P < 0.001
compared with saline control group.
+
P < 0.001 compared to allergen-challenged
sensitised group.
#
P < 0.01 compared to allergen-challenged sensitised treated with
Ac2-26 group.
Figure 2: Expression of FPR, Fpr-rs1 e Fpr-rs2 and anexin-1 mRNA by real-time PCR
from rat paw of animals sensitized and challenged with ovalbumin (Sal+Ova/Sal)
compared with animals saline sensitized animals challenged with ovalbumin
(IO/I+Sal). Data are means ± SEM of 2-3 independent experiments run in triplicate.
Figure 3: Neutrophil counts from skin section stained with hematoxylin and eosin and
examined by means of light microscopy (200x) of ovoalbumin-challenged sensitized
rats paw treated or not with Ac2-26 (50 µg/paw) in presence or absence of BOC-2 (5
nmol/paw). Data represents means of number of neutrophils per 50 fields ± SEM. * P
< 0.001 compared with saline control group.
+
P < 0.001 compared to allergen-
challenged sensitised group.
#
P < 0.01 compared to allergen-challenged sensitised
treated with Ac2-26 group.
Figure 4: Hyperalgesic effect of intraplantar injection of the association histamine and
5-HT (5 µg/paw and 1 µg/paw respectively; filled squares) into the left hind paw of
113
rats, as measured by the modified hot-plate test, and its sensitivity to Ac2-26 (50-100
µg/paw). Histamine plus 5-HT stimulation was replaced with saline in the control (open
circles) (A). BOC-2 (1.2-5 nmol/paw) co-administrated with Ac2-26 abolish the peptide
effect at time point of 1 h (B). Results were expressed as means ± SEM from at least
5 animals. * P < 0.001 compared with non-stimulated group.
+
P < 0.001 compared to
stimulated group.
#
P < 0.01 compared to allergen-challenged sensitised treated with
Ac2-26 group.
Figure 5: Effect of L-NAME (A), ODQ (B) and Nitruprissiate sodium (NPS) (C) on
allergen evoked hyperalgesia. Animals that were pre-treated with L-NAME (50 mg/Kg;
s.c.) 1 h before Ac2-26 (50 µg/paw) administration were stimulated with ovalbumin (12
µg/paw) 1 h after Ac2-26 injection. Challenged groups were replaced by saline in the
control groups. Animals that were treated with ODQ (100 µg/paw) recevied
concomitantly Ac2-26 (50 µg/paw) and stimulation with ovalbumin (12 µg/paw) was
made 1 h after treatment injection. NPS (250-750 µg/paw) was injected 1 h before
ovoalbumin (12 µg/paw) challenge. Results were expressed as means ± SEM from at
least 5 animals. * P < 0.001 compared with non-stimulated group.
+
P < 0.01
compared to stimulated group. # P < 0.001 compared to Ac2-26 treated group.
Figure 6: Release of nitric oxide from mice-macrophage line cells (RAW 264) after
stimulation with Ac 2-26 (50-200 µg/mL) in vitro. The analysis was made at 24 h post
stimulation. Data are expressed as mean ± S.E.M. from at least 3 experiments.
+
P<
0.05 and ++ P< 0.01 compared with medium-stimulated cells.
114
Table 1. Effect of lipoxin stable analog (ATL-1) and BOC-2 treatment on on antigen-
induced hyperalgesia on sensitized rats paw.
Condition Challenged Treatment
∆ of Latency (s)
Non-sensitized
-
0.06 ± 0.03
Sensitized
+
5.78 ± 0.89
*
Sensitized
+
ATL-1
2.28 ± 0.85
+
Sensitized
+
+ BOC-2
5.48 ± 0.34
#
Local pre-treatment with ATL-1 (250 ng/paw) was performed 1 h before allergen
challenge. All groups were challenged with ovalbumin (12 µg/cavity). Control groups
was injected with sterile saline. Lipoxin A
4
receptor analog (BOC-2; 5nmols) was
given concomitantly with ATL-1. The ∆ of Latency was performed at 1 h post-allergen
challenge. ). Each value represents the mean ± SEM from at least 5 animals. * P <
0.001 compared to control group. + P < 0.01 to allergen-challenged sensitised group.
#
P < 0.001 compared to Ac2-26 treated group.
115
Saline
OVA [12 µg/paw]
+ Ac2-26 [25 µg/paw]
+ Ac2-26 [50 µg/paw]
+ Ac2-26 [100 µg/paw]
0 180 36015 60
0.0
2.5
5.0
7.5
∆
Latency (s)
(A)
*
*
*
*
+
+
+
+
+
0.0
2.5
5.0
7.5
∆
Latency (s)
Ac2-26 [50 µg/paw]:
BOC [nmol/pata]:
-
-
-
-
+
-
+
1.2
+
2.5
+
5
*
+
#
#
(C)
Saline
OVA [12 µg/paw]
+ Ac2-26 (1 h before)
+ Ac2-26 (3 h before)
+ Ac2-26 (6 h before)
0 180 36015 60
0.0
2.5
5.0
7.5
∆
Latency (s)
(B)
Time (s)
*
*
*
*
+
+
+
+
Fig. 1
Saline
OVA [12 µg/paw]
+ Ac2-26 [25 µg/paw]
+ Ac2-26 [50 µg/paw]
+ Ac2-26 [100 µg/paw]
0 180 36015 60
0.0
2.5
5.0
7.5
∆
Latency (s)
(A)
*
*
*
*
+
+
+
+
+
0.0
2.5
5.0
7.5
∆
Latency (s)
Ac2-26 [50 µg/paw]:
BOC [nmol/pata]:
-
-
-
-
+
-
+
1.2
+
2.5
+
5
*
+
#
#
(C)
Saline
OVA [12 µg/paw]
+ Ac2-26 (1 h before)
+ Ac2-26 (3 h before)
+ Ac2-26 (6 h before)
0 180 36015 60
0.0
2.5
5.0
7.5
∆
Latency (s)
(B)
Time (s)
*
*
*
*
+
+
+
+
Fig. 1
116
Fig. 2
Sal+Ova/Sal IO/I+Sal
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
FPR
Fpr-rs1
Fpr-rs2
AnxA1
Relative mRna Change
Sal+Ova/Sal IO/I+Sal
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
FPR
Fpr-rs1
Fpr-rs2
AnxA1
Relative mRna Change
117
0.0
1.5
3.0
4.5
6.0
*
#
+
OVA [12 µg/paw]:
-
+
+
+
Ac2-26 [50 µg/paw]:
-
- +
+
BOC [5 nmol/paw]:
-
-
-
+
Number of neutrophils/field
Fig. 3
0.0
1.5
3.0
4.5
6.0
*
#
+
OVA [12 µg/paw]:
-
+
+
+
Ac2-26 [50 µg/paw]:
-
- +
+
BOC [5 nmol/paw]:
-
-
-
+
Number of neutrophils/field
Fig. 3
118
0 180 36015 60
0.0
2.5
5.0
7.5
∆
Latency (s)
Time (min)
+Ac2-26 [50 µg/paw]
+Ac2-26 [100 µg/paw]
Saline
Histamine + 5-HT
*
*
*
*
+
+
+
+
+
+
+
(A)
0.0
2.5
5.0
7.5
∆ Latency (s)
Ac2-26 [50 µg/paw]:
BOC [nmol/pata]:
-
-
-
-
+
-
+
1.2
+
2.5
+
5
(B)
*
+
#
#
Fig. 4
0 180 36015 60
0.0
2.5
5.0
7.5
∆
Latency (s)
Time (min)
+Ac2-26 [50 µg/paw]
+Ac2-26 [100 µg/paw]
Saline
Histamine + 5-HT
*
*
*
*
+
+
+
+
+
+
+
(A)
0.0
2.5
5.0
7.5
∆ Latency (s)
Ac2-26 [50 µg/paw]:
BOC [nmol/pata]:
-
-
-
-
+
-
+
1.2
+
2.5
+
5
(B)
*
+
#
#
Fig. 4
119
0 60 12015
0.0
2.5
5.0
7.5
Saline
OVA [12 µg/paw]
+ NPS [250 µg/paw]
+ NPS [500 µg/paw]
+ NPS [750 µg/paw]
Time (min)
∆
Latency (s)
0.0
2.5
5.0
7.5
+
*
∆ Latency (s)
Ac 2-26 [100 µg/paw]:
-
-
-
-
+
-
+
+
-
+
OVA [12 µg/ paw]:
-
+
+
+
+
ODQ [100 µg/paw]:
**
0.0
2.5
5.0
7.5
+
+
+
*
*
*
∆
Latency (s)
Ac 2-26 [100 µg/paw]:
L-NAME [µg/Kg]:
-
-
-
-
+
-
+
50
+
100
-
+
OVA [12 µg/ paw]:
-
+ + +
+
+
(a)
(b)
(c)
Fig. 5
0 60 12015
0.0
2.5
5.0
7.5
Saline
OVA [12 µg/paw]
+ NPS [250 µg/paw]
+ NPS [500 µg/paw]
+ NPS [750 µg/paw]
Time (min)
∆
Latency (s)
0.0
2.5
5.0
7.5
+
*
∆ Latency (s)
Ac 2-26 [100 µg/paw]:
-
-
-
-
+
-
+
+
-
+
OVA [12 µg/ paw]:
-
+
+
+
+
ODQ [100 µg/paw]:
**
0.0
2.5
5.0
7.5
+
+
+
*
*
*
∆
Latency (s)
Ac 2-26 [100 µg/paw]:
L-NAME [µg/Kg]:
-
-
-
-
+
-
+
50
+
100
-
+
OVA [12 µg/ paw]:
-
+ + +
+
+
(a)
(b)
(c)
Fig. 5
120
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
+
++
++
Ac 2-26 (µg/mL): - 50 100 200
NO
2
-
(µM)
Fig. 6
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
+
++
++
Ac 2-26 (µg/mL): - 50 100 200
NO
2
-
(µM)
Fig. 6
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
