( PDF ) Avaliação in vitro do sêmen caprino resfriado a 4ºC em dois métodos e dois tipos de diluidores

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Universidade Federal da Bahia

Escola de Medicina Veterinária

Mestrado em Medicina Veterinária Tropical

AVALIAÇÃO IN VITRO DO SÊMEN CAPRINO RESFRIADO A 4ºC EM DOIS MÉTODOS

E DOIS TIPOS DE DILUIDORES

ANA KARINA DIAS SARAIVA VIANA

Salvador - Bahia

2003

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ANA KARINA DIAS SARAIVA VIANA

AVALIAÇÃO IN VITRO DO SÊMEN CAPRINO RESFRIADO A 4ºC EM DOIS MÉTODOS

E DOIS TIPOS DE DILUIDORES

Dissertação apresentada à Escola de

Medicina Veterinária da Universidade

Federal da Bahia, como requisito para a

obtenção do título de Mestre em Medicina

Veterinária Tropical, na área de Saúde

Animal.

Orientador: Prof. Dr. Marcos Chalhoub Coelho Lima

Salvador - Bahia

2003

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FICHA CATALOGRÁFICA

ELABORADO PELA BIBLIOTECA DA EMV – UFBA

VIANA, Ana Karina Dias Saraiva

Avaliação in vitro do sêmen caprino resfriado a 4ºC em dois métodos e dois tipos de

diluidores/ Ana Karina Dias Saraiva Viana. - Salvador, Bahia, 2003. 34p. Dissertação

(Mestrado em Medicina Veterinária Tropical) - Escola de Medicina Veterinária da

Universidade Federal da Bahia, 2003.

Professor orientador – Prof . Dr. Marcos Chalhoub Coelho Lima

Palavras-chave – Sêmen; caprino; resfriamento; diluidor; centrifugação.

iii

AVALIAÇÃO IN VITRO DO SÊMEN CAPRINO RESFRIADO A 4ºC EM DOIS MÉTODOS

E DOIS TIPOS DE DILUIDORES

ANA KARINA DIAS SARAIVA VIANA

Dissertação defendida e aprovada para obtenção do grau de Mestre em Medicina Veterinária

Tropical.

Salvador, 30 de setembro de 2003.

Comissão Examinadora:

______________________________________________

Prof. Dr. Marcos Chalhoub Coelho Lima - UFBA

Orientador

______________________________________________

Prof. Dr. Antônio de Lisboa Ribeiro Filho - UFBA

______________________________________________

Prof. Dr. Antônio Jorge Del Rei - UESB

Dedico este trabalho aos meus pais e às

minhas irmãs, pelo imenso incentivo e

apoio, e ao meu marido, Ícaro, pela

extraordinária compreensão e dedicação.

AGRADECIMENTOS

A Deus pela inspiração e força.

A minha família, especialmente a meus pais e irmãs, pelo carinho e apoio em todos os momentos,

principalmente naqueles mais difíceis.

Ao meu marido, Ícaro, pelo amor incondicional, compreensão e apoio constante durante a

realização desse trabalho.

Ao Professor Marcos Chalhoub, pela orientação.

Ao Setor de Pós-Graduação da Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia

pela oportunidade e apoio na realização deste trabalho.

Aos professores Antônio de Lisboa e José Resende e à Médica Veterinária Mônica, pela ajuda

dispensada.

Em especial, aos alunos da graduação e da pós-graduação da EMV – UFBA, Ana Karine Almeida,

Ana Paula Portela, Rodrigo Bittencourt, Sidney Alves, Aline Quintela, Jaciara Campos e Daniela

Freitas, pela grande colaboração e dedicação durante a realização desse trabalho.

A Professora Ângela Ornelas, em especial, pela solicitude e apoio, e a todos do Laboratório de

Diagnóstico de Doenças Parasitárias, principalmente Sue Fernandez, Érika Viana, Rosângela Uzêda

e Ademilton.

A Professora Thereza Cristina Calmon Bittencourt pela grande ajuda na análise estatística.

À minha querida irmã, Shirleide, pelas traduções e correções realizadas.

Aos colegas de trabalho Liliane Dantas, Gabriela Bicca, Rodrigo Fagundes e Alexandre Luna, e aos

meus alunos, pelo apoio e pela compreensão nos momentos em que precisei estar ausente.

Ao funcionário Biri, que tratou dos animais durante todo o período do experimento.

À amiga Sara Franco, e ao amigo Anselmo Santos, pela ajuda em todos os momentos em que

precisei.

E a todos aqueles que colaboraram para a realização desse trabalho.

vii

“A mente que se abre a uma nova idéia

jamais voltará ao seu tamanho original...”

(Albert Einstein)

viii

ÍNDICE

página

LISTA DE TABELAS....................................................................................................... ix

LISTA DE FIGURAS........................................................................................................ x

LISTA DE ABREVIATURAS.......................................................................................... xii

RESUMO........................................................................................................................... xiii

SUMMARY......................................................................................................................... xiv

1 INTRODUÇÃO GERAL................................................................................................ 1

2 REVISÃO DE LITERATURA....................................................................................... 3

2.1 Características seminais............................................................................................... 3

2.2 Uso de diluidores ricos em lecitinas e fosfolipídeos na preservação seminal............. 4

2.3 Plasma seminal e sua remoção no resfriamento do sêmen.......................................... 6

2.4 Mecanismos envolvidos no processo de resfriamento do sêmen................................ 7

2.5 Resfriamento do sêmen caprino.................................................................................. 8

3 ARTIGO CIENTÍFICO................................................................................................. 10

4 CONSIDERAÇÕES GERAIS........................................................................................ 25

5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................... 26

ANEXOS........................................................................................................................... 31

LISTA DE TABELAS

página

TABELA 1 –

Avaliação do sêmen a fresco dos quatro reprodutores caprinos

utilizados durante o experimento........................................................

TABELA 2 –

Média (x) e Desvio Padrão (s) da Motilidade total (%) dos

espermatozóides diluídos no meio leite desnatado-glicose sem (LS)

e com (LC) centrifugação e do sêmen no meio tris-gema sem (GS)

e com (GC) centrifugação, 0h (T0), 3h (T1), 6h (T2), 12h (T3), 24h

(T4) e 48h (T5) após o início do resfriamento....................................

TABELA 3 –

Média (x) e Desvio Padrão (s) do Vigor (0-5) dos espermatozóides

diluídos no meio leite desnatado-glicose sem (LS) e com (LC)

centrifugação e do sêmen no meio tris-gema sem (GS) e com (GC)

centrifugação, 0h (T0), 3h (T1), 6h (T2), 12h (T3), 24h (T4) e 48h

(T5) após o início do resfriamento.....................................................

TABELA 4 –

Média (x) e Desvio Padrão (s) das Patologias do acrossoma (%)

dos espermatozóides diluídos no meio leite desnatado-glicose sem

(LS) e com (LC) centrifugação e do sêmen no meio tris-gema sem

(GS) e com (GC) centrifugação, 0h (T0), 3h (T1), 6h (T2), 12h

(T3), 24h (T4) e 48h (T5) após o início do resfriamento...................

TABELA 5 –

Média (x) e Desvio Padrão (s) das Patologias de cauda (%) dos

espermatozóides diluídos no meio leite desnatado-glicose sem (LS)

e com (LC) centrifugação e do sêmen no meio tris-gema sem (GS)

e com (GC) centrifugação, 0h (T0), 3h (T1), 6h (T2), 12h (T3), 24h

(T4) e 48h (T5) após o início do resfriamento....................................

TABELA 6 –

Média (x) e Desvio Padrão (s) do pH (0-14) do sêmen diluído no

meio leite desnatado-glicose sem (LS) e com (LC) centrifugação, e

do sêmen no meio tris-gema sem (GS) e com (GC) centrifugação,

0h (T0), 24h (T4) e 48h (T5) após o início do resfriamento..............

TABELA 7 –

Composição do diluidor leite desnatado-glicose................................ 32

TABELA 8 –

Composição do diluidor tris-gema.....................................................

TABELA 9 –

Ficha de colheita e diluição do sêmen................................................

TABELA 10 –

Ficha para análise do sêmen nos diferentes tempos........................... 34

LISTA DE FIGURAS

Página

FIGURA 1 – Curvas de resfriamento da água à temperatura inicial de 34ºC,

contendo as amostras leite desnatado-glicose (LS) e tris-gema (GS)

sem centrifugação, e da água à temperatura inicial de 21º C,

contendo as amostras leite desnatado-glicose (LC) e tris-gema (GC)

com centrifugação, conservada em refrigerador...................................

FIGURA 2 – Comparação entre as médias de motilidade total dos

espermatozóides, em função dos métodos de diluição, leite

desnatado-glicose sem (LS) e com (LC) centrifugação e tris-gema

sem (GS) e com (GC) centrifugação, nos diferentes tempos de

avaliação, 0h (T0), 3h (T1), 6h (T2), 12h (T3), 24h (T4) e 48h (T5)

de resfriamento......................................................................................

FIGURA 3 – Comparação entre as médias de motilidade total dos

espermatozóides, em função dos diferentes tempos de avaliação, 0h

(T0), 3h (T1), 6h (T2), 12h (T3), 24h (T4) e 48h (T5) de

resfriamento, nos meios leite desnatado-glicose sem (LS) e com

(LC) centrifugação e tris-gema sem (GS) e com (GC)

centrifugação.........................................................................................

FIGURA 4 – Comparação entre as médias do vigor dos espermatozóides, em

função dos métodos de diluição, leite desnatado-glicose sem (LS) e

com (LC) centrifugação e tris-gema sem (GS) e com (GC)

centrifugação, nos diferentes tempos de avaliação, 0h (T0), 3h (T1),

6h (T2), 12h (T3), 24h (T4) e 48h (T5) de

resfriamento..........................................................................................

FIGURA 5 – Comparação entre as médias do vigor dos espermatozóides, em

função dos diferentes tempos de avaliação, 0h (T0), 3h (T1), 6h (T2),

12h (T3), 24h (T4) e 48h (T5) de resfriamento, nos meios leite

desnatado-glicose sem (LS) e com (LC) centrifugação e tris-gema

sem (GS) e com (GC) centrifugação.....................................................

FIGURA 6 – Comparação entre as médias de patologias de acrossoma dos

espermatozóides, em função dos métodos de diluição, leite

desnatado-glicose sem (LS) e com (LC) centrifugação e tris-gema

sem (GS) e com (GC) centrifugação, nos diferentes tempos de

avaliação, 0h (T0), 3h (T1), 6h (T2), 12h (T3), 24h (T4) e 48h (T5)

de resfriamento......................................................................................

FIGURA 7 – Comparação entre as médias de patologias de acrossoma dos

espermatozóides, em função dos diferentes tempos de avaliação, 0h

(T0), 3h (T1), 6h (T2), 12h (T3), 24h (T4) e 48h (T5) de

resfriamento, nos meios leite desnatado-glicose sem (LS) e com

(LC) centrifugação e tris-gema sem (GS) e com (GC)

centrifugação.........................................................................................

FIGURA 8 – Comparação entre as médias de patologias de cauda dos

espermatozóides, em função dos métodos de diluição, leite

desnatado-glicose sem (LS) e com (LC) centrifugação e tris-gema

sem (GS) e com (GC) centrifugação, nos diferentes tempos de

avaliação, 0h (T0), 3h (T1), 6h (T2), 12h (T3), 24h (T4) e 48h (T5)

de resfriamento......................................................................................

FIGURA 9 – Comparação entre as médias de patologias de cauda dos

espermatozóides, em função dos diferentes tempos de avaliação, 0h

(T0), 3h (T1), 6h (T2), 12h (T3), 24h (T4) e 48h (T5) de

resfriamento, nos meios leite desnatado-glicose sem (LS) e com

(LC) centrifugação e tris-gema sem (GS) e com (GC)

centrifugação.........................................................................................

FIGURA 10 – Comparação entre as médias de pH do sêmen, em função dos

métodos de diluição, leite desnatado-glicose sem (LS) e com (LC)

centrifugação e tris-gema sem (GS) e com (GC) centrifugação, nos

diferentes tempos de avaliação, 0h (T0), 24h (T4) e 48h (T5) de

resfriamento..........................................................................................

FIGURA 11 – Comparação entre as médias de pH do sêmen, em função dos

diferentes tempos de avaliação, 0h (T0), 24h (T4) e 48h (T5) de

resfriamento, nos meios leite desnatado-glicose sem (LS) e com

(LC) centrifugação e tris-gema sem (GS) e com (GC)

centrifugação.........................................................................................

FIGURA 12 –

Fluxograma de execução experimental.................................................

xii

LISTA DE ABREVIATURAS

UFBA – Universidade Federal da Bahia

HOSPMEV – Hospital de Medicina Veterinária

EMV – Escola de Medicina Veterinária

IA – Inseminação artificial

MT – Motilidade total

V – Vigor

PA – Patologia de acrossoma

PC – Patologia de cauda

SPTZ – espermatozóide

CBRA – Colégio Brasileiro de Reprodução Animal

x – média

s – desvio padrão

G – tris-gema

L – leite desnatado-glicose

S – sem centrifugação

C – com centrifugação

LS – sêmen diluído em leite desnatado-glicose, sem centrifugação

LC – sêmen diluído em leite desnatado-glicose, com centrifugação

GS – sêmen diluído em tris-gema, sem centrifugação

GC – sêmen diluído em tris-gema, com centrifugação

T0 – início do resfriamento

T1 – 3 horas após início do resfriamento

T2 – 6 horas após início do resfriamento

T3 – 12 horas após início do resfriamento

T4 – 24 horas após início do resfriamento

T5 – 48 horas após início do resfriamento

xiii

VIANA, A.K.D.S. Avaliação in vitro do sêmen caprino resfriado a 4ºC em dois métodos e dois

tipos de diluidores. Salvador, Bahia, 2003. 34p. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária

Tropical) - Escola de Medicina Veterinária, Universidade Federal da Bahia, 2003.

RESUMO

O presente trabalho objetivou comparar in vitro dois métodos e dois diluidores no resfriamento de

sêmen caprino. Para tanto, avaliou-se os seguintes parâmetros, motilidade total, vigor, patologia de

acrossoma, patologia de cauda e pH. O experimento foi realizado no Laboratório de Embriologia do

Setor de Reprodução - HOSPMEV-UFBA, onde o sêmen de 4 bodes das raças Saanen e Pardo

Alpina foi colhido por meio de vagina artificial, 4 vezes por semana durante duas semanas, em

presença de fêmea em estro induzido. Após a colheita o sêmen foi analisado quanti-

qualitativamente e dividido em quatro alíquotas iguais, que foram submetidas a dois diluidores,

tris-gema (G) e leite desnatado-glicose (L), e dois métodos, com (C) e sem (S) centrifugação,

formando os seguintes grupos: (LS) diluída em leite desnatado-glicose e (GS) diluída em tris -gema

de ovo, sem centrifugação, e (LC) diluída em leite desnatado-glicose e (GC) tris-gema, com

centrifugação. O sêmen diluído foi resfriado e conservado a 4º C, e avaliado quanto à motilidade

total, vigor e patologia de acrossoma e patologia de cauda em cada um dos seguintes tempos: (T0)

0, (T1) 3, (T2) 6, (T3) 12, (T4) 24 e ( T5) 48 horas após o início do resfriamento, enquanto que o

pH foi avaliado apenas em T0, T4 e T5. Em relação aos parâmetros motilidade total e vigor, em

todos os tempos avaliados, o diluidor tris-gema foi superior (p<0,05) ao diluidor leite desnatado-

glicose, contudo os métodos com e sem centrifugação não demonstraram diferenças (p>0,05). O

diluidor tris-gema sem centrifugação apresentou menor porcentagem de patologia de acrossoma (p

< 0,05), até 24 horas de resfriamento, a partir daí não houve diferenças, exceto para o diluidor leite

desnatado-glicose com centrifugação, que apresentou a maior (p<0,05) porcentagem de patologias.

A porcentagem de patologias de cauda não diferiu (p<0,05) em ambos os diluidores em todos os

tempos , contudo foi positivamente influenciada pela centrifugação após 24 horas de resfriamento

no tris-gema, e a partir de 6 horas no leite desnatado-glicose. Os diluidores e métodos não alteraram

o pH (p>0,05). Conclui-se que o diluidor tris-gema, quando comparado ao diluidor leite desnatado-

glicose, preservou melhor a motilidade, vigor e patologia de acrossoma. Entretanto, a remoção do

plasma seminal não influenciou as características seminais, em todos os tempos de resfriamento

avaliados, exceto em relação à patologia de cauda.

Palavras-chave – Sêmen; caprino; resfriamento; diluidor; centrifugação.

xiv

VIANA AKDS. Evaluation in vitro of cooled goat semen at 4ºC in different methods and

extenders. Salvador, Bahia, 2003. 34p. Dissertation (Master of Science in Tropical Veterinary

Medicine) – School of Veterinary Medicine, Federal University of Bahia, 2003.

SUMMARY

The objective of this experiment was compare in vitro two methods and two extenders to cool goat

semen, through the following evaluated parameters, motility, vigor, acrosome pathology, tail

pathology and pH. This experiment was performed at the Embryology Laboratory of the

Reproduction Department – HOSPMEV – UFBA. The semen of four Saanen and Pardo Alpina

goats was collected by means of artificial vagina, four times a week during two weeks, in the

presence of female in estrus induced. After the collecting the semen was analysed quant-

qualitatively and divided into 4 equal aliquots, which were submitted to two extenders, skim milk-

glucose (L) and tris-egg yolk (G), and two methods with (C) and without (S) centrifugation,

forming the following groups: (LS) diluted in skim milk-glucose and (GS) diluted in tris-egg yolk,

without centrifugation, and (LC) diluted in skim milk-glucose and (GC) tris-egg yolk, with

centrifugation. The semen diluted was cooled and stored to 4º C, and evaluated according to total

motility, vigor, acrosome pathology and tail pathology in each of the following periods: (T0) 0, (T1)

3, (T2) 6, (T3) 12, (T4) 24 and (T5) 48 hours after the beginning of the cooling, while pH was

evaluated just at T0, T4 and T5. According to the parameters of motility and vigor, in all the periods

of cooling evaluated, the extender tris-yolk was higher (p<0.05) to the extender milk-glucose,

however the methods, with and without centrifugation did not present differences (p>0.05). The

extender tris-yolk without centrifugation showed lower percentage of acrosome pathology (p<0.05),

until 24 hours after the beginning of the cooling. After that moment, there were no differences,

except to the extender milk-glucose with centrifugation, which one presented the higher (p < 0.05)

percentage of acrosome pathology. The percentage of tail pathology did not change (p<0,05) for

both of the extenders, in all the periods, nevertheless it was improved by centrifugation after 24

hours of cooling in the tris-yolk, and after 6 hours in the milk-glucose. The extenders and the

methods didn't modify the pH (p>0.05). It concludes the extender tris-egg yolk, when compared

with the extender milk-glucose, was more efficient in preserving the motility, vigor and acrosome

pathology. Nevertheless, the remotion of the seminal plasma did not influence on the seminal

characteristics, in all the periods of cooling evaluated, except to tail pathology.

Key-words – Semen; goat; cooling; extenders; centrifugation.

1 INTRODUÇÃO GERAL

A caprinocultura brasileira, principalmente na região Nordeste, é predominantemente uma

exploração extensiva e pode até, em algumas regiões, ser classificada como atividade extrativista

(MACHADO e SIMPLÍCIO, 1995). Diante da crescente demanda de proteína de origem animal

pelas populações humanas, principalmente por aquelas localizadas nas regiões, onde uma grande

parte dos habitantes vive em estado de pobreza absoluta, - como, por exemplo no Nordeste

brasileiro,- sobrevém a necessidade do aumento da produção e da produtividade dos animais

economicamente exploráveis (SOUZA e FILHO, 1992). Neste contexto, os caprinos podem

desempenhar papel importante, haja visto sua marcante concentração nessas áreas, devido à sua

capacidade de adaptação às condições ambientais adversas de onde são criados. Para isso, é

necessário reverter os atuais níveis produtivos no tocante à produtividade de carne e leite dos

caprinos que ainda são insatisfatórios devido, principalmente, ao mérito genético médio dos

rebanhos (SANTOS et al., 2001).

A inseminação artificial (IA) caprina é um método bastante prático, global e de suma importância,

que aliada a um programa de melhoramento genético, é capaz de viabilizar o aumento da

produtividade em um curto espaço de tempo (NUNES e FELICIANO SILVA, 1984). Desta forma,

a IA pode representar um poderoso instrumento para que se atinjam os objetivos da exploração

racional de caprinos, tais como melhoramento genético, preservação de germoplasma, controle de

doenças sexualmente transmissíveis e controle do ciclo de produção, entretanto, é pouco aplicada à

espécie caprina no Nordeste do Brasil (MACHADO e SIMPLÍCIO, 1995).

O desenvolvimento de programas de IA gerou a necessidade de preservar o sêmen em condições

artificiais com o intuito de possibilitar o seu transporte do local da colheita ao local de inseminação

e também a inseminação de grande número de fêmeas durante extensos períodos ou diferentes

épocas do ano (MAXWELL e SALAMON, 1993). A finalidade de conservar o sêmen é prolongar a

capacidade de fertilização dos espermatozóides ao reduzir ou parar o seu metabolismo, como é feito

na conservação do sêmen líquido, usando a redução da temperatura (resfriamento) ou outro método

que deprima o metabolismo espermático, e no estado congelado, submetendo-o a temperaturas

abaixo de zero (EVANS e MAXWELL, 1987; MAXWELL e SALAMON, 1993). O resfriamento

do sêmen pode causar danos ultra-estruturais, bioquímicos e funcionais à membrana plasmática do

espermatozóide, resultando em uma redução da motilidade, viabilidade e fertilidade (ROY, 1957;

IRITANI e NISHIKAWA, 1961).

Várias pesquisas têm sido conduzidas, visando avaliar a viabilidade do sêmen caprino diluído

criopreservado ou não, com o objetivo de determinar qual substância proporciona melhores

condições para sobrevivência espermática e conseqüentemente melhores índices de fertilidade,

tendo em vista que um dos pré-requisitos para o sucesso da IA é o uso de um diluente capaz de

manter a integridade da membrana plasmática (OLLERO et al., 1998 apud MORENO et al., 2001).

Segundo MIES FILHO (1987), independente da espécie animal um bom diluidor deve apresentar as

seguintes características: ausência de toxicidade, osmolaridade igual ou próxima do sêmen, pH

favorável segundo a espécie, preparação simples e ser de baixo custo. Além disso, deve conter

substâncias nutritivas e crioprotetoras para assegurar a sobrevivência dos espermatozóides (EVANS

e MAXWELL, 1987). Os meios biológicos como leite, água de coco e gema de ovo são os mais

utilizados para a conservação do sêmen animal (NUNES, 1998). Porém, o leite e a gema de ovo são

ricos em fosfolipídios, o que servem de substrato para a ação da fosfolipase A (LEBOEUF et al.,

2000), enzima presente no plasma seminal caprino secretada pelas glândulas bulbouretrais, que ao

interagir com os fosfolipídios dos diluidores geralmente utilizados para conservação do sêmen

caprino, causa a liberação de substâncias tóxicas aos espermatozóides (ROY, 1957). MEMON et al.

(1985) reportaram que a remoção do plasma do sêmen caprino é benéfica para a preservação da

integridade do espermatozóide após congelação, independente do diluente utilizado.

Por razões econômicas e práticas, busca-se desenvolver um método mais eficiente para a

conservação do sêmen no estado líquido, isto é, resfriado, superando assim, parte das dificuldades

deste processo. O uso do sêmen líquido como uma alternativa ao sêmen congelado traria vantagens

em sistemas de produção extensivos (LEBOEUF et al., 2000).

Objetivou-se nesse trabalho comparar os diluidores tris-gema e leite desnatado com e sem

centrifugação utilizados no processo de resfriamento e conservação, a 4ºC, do sêmen caprino, por

meio da avaliação dos seguintes parâmetros seminais: motilidade total (MT), vigor (V), patologia

de acrossoma (PA), patologia de cauda (PC) e pH, e desta forma, determinar o método e o diluente

mais eficientes em preservar as características seminais, por até 48 horas.

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Características seminais

Segundo EVANS e MAXWELL (1987) o volume do ejaculado da espécie caprina varia de 0,5 a 1,5

mL e a concentração varia de 1,5 a 5,0 milhões de espermatozóides/mL. SOUZA e MIES FILHO

(1986) coletaram sêmen de 2 bodes da raça Saanen, encontrando média do volume do ejaculado

igual a 0,63 ± 0,28 mL, média da motilidade igual a 90,91 ± 2,02% e média de concentração igual a

3,68 ± 0,39 x 10

espermatozóides/mL. Entretanto, BORDOLOI e SHARMAN (1983) estudando

as características seminais em diferentes raças de caprinos, obtiveram para a raça Saanen, média de

motilidade de 77,45 ± 2,47% e de patologia total de 8,55 ± 1,06%, e para a raça Beetal média de

83,43 ± 1,60% e 9,22 ± 0,81% para as referidas características respectivamente.

MENDONZA et al. (1989) avaliando os componentes químicos do plasma seminal colheram

sêmen se 11 bodes da raça Angorá em dois anos consecutivos e observaram média de volume do

ejaculado de 0,80 ± 0,30 e 0,98 ± 0,52 mL, as concentrações espermáticas foram 3,33 ± 0,49 e 2,94

± 0,45 x 10

/mL, os valores de pH foram 7,01± 0,34 e 7,20 ± 0,17, e nos dois anos o escore de

motilidade foi 4 (escala 0-5). Neste mesmo estudo, estes autores encontraram concentrações (mg/

100mL) de frutose de 875,00 ± 97,00 e ácido cítrico 73,00 ± 17,00 na composição do plasma

seminal, suficientes para manter a motilidade espermática, e obtiveram também concentrações (µL/

mL) de riboflavina de 5,38 ± 2,98; 3,09 ± 0,85 e 1,73 ± 0,88 respectivamente para os ejaculados

amarelo, amarelo claro e branco, concluindo que esta substância é responsável pela cor amarelada

do sêmen caprino.

AZERÊDO et al. (2001) compararam as médias de motilidade e vigor do sêmen fresco com e sem

plasma e encontraram respectivamente, 85,41 ± 4,64 % e 67,50 ± 2,47% de motilidade e 4,55 ±

0,20 e 4,36 ± 0,13 de vigor (0-5).

O plasma seminal dos caprinos pode ser as vezes de cor amarela devido à presença de riboflavina,

proveniente das glândulas vesiculares. A pressão osmótica do sêmen se mantém mais pelos

componentes orgânicos do que pelos inorgânicos, apesar de existirem quantidades consideráveis de

sódio, potássio e cloro. As principais substâncias orgânicas presentes no sêmen caprino são frutose,

sorbitol, inositol, ácido cítrico, fosfolipídios, glicerilfosforilcolina, prostaglandinas e proteínas. O

pH se mantém muito próximo a 7,0 por um complexo sistema tampão. Uma característica do

plasma seminal caprino é a presença de uma enzima (fosfolipase A) que se origina das glândulas

bulbouretrais. A energia necessária para manter a motilidade e viabilidade dos espermatozóides

procede dos açúcares especialmente da frutose, presente no plasma seminal. (EVANS e

MAXWELL, 1987)

2.2 Uso de diluidores ricos em lecitinas e fosfolipídeos na preservação seminal

Os diluentes sintéticos mais utilizados para diluir o sêmen de carneiro contêm como tampão o tris e

ou citrato sódico, glicose ou frutose como fonte de energia e gema de ovo para proteger a

membrana espermática contra o choque térmico. Esses diluentes também são utilizados para o

sêmen caprino, mas com menor quantidade de gema de ovo, para evitar a ação da enzima do plasma

seminal caprino sobre a gema de ovo. Este problema pode ser resolvido utilizando menor

concentração de gema de ovo no diluente, utilizando um meio que não contenha gema de ovo ou

retirando o plasma do sêmen por centrifugação, com o que se eliminará a enzima. Quando se

conserva o sêmen caprino deve-se utilizar diluente à base de leite desnatado-glicose a fim de evitar

qualquer possibilidade de reação e coagulação de gema de ovo durante a estocagem (EVANS e

MAXWELL, 1987).

A maioria dos diluidores usa gema de ovo ou leite como componente básico, uma vez que a

proteção do espermatozóide contra o choque térmico é provida por fosfatidil-colinas (lecitinas) e

lipoproteínas da gema e pela caseína do leite (DEN DAAS, 1992).

Em condições de campo, o diluente de sêmen mais facilmente disponível é o leite de vaca, que pode

se utilizar tanto integral, desnatado ou em pó reconstituído. Também se utiliza leite UHT, que tem a

propriedade de conservar melhor. Ao utilizar o leite completo, desnatado ou em pó, deve-se aquecer

entre 92 a 95º C, em banho maria, durante 8 a 10 minutos, para inativar os efeitos tóxicos de sua

fração protéica e não ferver (EVANS e MAXWELL, 1987).

A técnica tradicional para diluição do sêmen caprino deriva da técnica clássica usada para bovinos,

contudo nesse processo os espermatozóides sofrem influência negativa de catalisação e hidrolisação

da lecitina da gema de ovo, pois o plasma seminal de caprinos é rico em fosfolipase A, proveniente

das glândulas bulbo uretrais, que interagindo com os fosfolipídeos dos diluidores liberam ácidos

graxos, os quais são espermicidas (ROY, 1957; AAMDAL et al., 1965; CORTEEL, 1974).

O diluidor à base de leite é rico em fosfolipídeos e o acúmulo de ácido lático leva à uma queda do

pH (acidez) que causa a morte dos espermatozóides (TIWARI et al., 1968). Muitos diluidores têm

sido utilizados na conservação do sêmen caprino, porém o leite desnatado continua sendo o

preferido, devido à sua disponibilidade (NUNES e SALLES, 1993).

CHAUHAN e ANAND (1990) diluíram sêmen de caprinos da raça Jaminapari em diluidores à base

de citrato glicose gema, tris gema e leite desnatado gema, e observaram melhores resultados de

motilidade, quantidade de espermatozóides vivos e defeito de acrossoma, durante as etapas do

processo de congelação no meio tris gema. Neste mesmo estudo, por meio de ensaios sobre a

atividade das enzimas fosfolipase e lisofosfolipase sobre as lecitinas contidas na gema de ovo

utilizada no diluente à base de tris, concluíram que não há hidrólise destes fosfolipídeos. Portanto, a

congelação do sêmen em diluente de tris gema sem a remoção do plasma seminal produz altas

taxas de fertilidade.

PELLICER et al. (1997) purificaram a glicoproteína 60 kDa com triglicéride lipase ativa e

identificaram-na como o único componente da glândula bulbouretral, responsável pela deterioração

dos espermatozóides em diluentes à base de leite. Essas glicoproteínas promovem o decréscimo da

percentagem e motilidade espermática, degradação da qualidade do movimento, quebra do

acrossoma e morte celular. Entretanto, desde que o plasma seminal também contém fatores

favoráveis à sobrevivência espermática, acredita-se que, para uma melhor preservação do sêmen

caprino, inibidores específicos de lipases poderiam ser adicionados aos diluidores à base de leite,

sem a eliminação do plasma seminal.

DEKA e RAO (1985) compararam a eficácia de quatro extensores, gema citrato frutose glicerol, tris

gema ácido cítrico frutose glicerol, leite desnatado gema frutose glicerol e rafinose gema glicerol, e

observaram que a motilidade espermática de sêmen congelado foi maior quando utilizou-se o

extensor tris gema ácido cítrico frutose glicerol e leite desnatado gema (68,43 % e 65,86 %), do que

no extensor gema citrato frutose glicerol e rafinose gema glicerol (48,86 % e 47,71 %). A

percentagem de defeito de acrossoma foi menor nos extensores tris gema ácido cítrico frutose

glicerol e leite desnatado gema (13,83 % e 14,09 %) do que no extensor gema citrato frutose

glicerol (18.85 %), mas não houve diferença entre gema citrato frutose glicerol e rafinose gema

glicerol.

2.3 Plasma seminal e sua remoção no resfriamento do sêmen

Segundo (CORTEEL, 1977) na espécie caprina a remoção do plasma seminal por centrifugação

imediatamente após a colheita aumenta a percentagem de células vivas e sua motilidade durante a

armazenagem em diluentes de gema de ovo ou leite, mas não demonstra influência sobre a

qualidade de sêmen colhido do epidídimo. Isto significa que os componentes deletérios ao sêmen

armazenado “in vitro” estão presentes no plasma seminal. Entretanto, RITAR e SALAMON (1982),

recomendaram o uso de 1,5% de gema de ovo em um diluente à base de gema de ovo, sem remoção

do plasma seminal, como uma alternativa prática.

A centrifugação é um processo complexo, que consome tempo e pode também causar perda de

espermatozóides no sobrenadante, além da possibilidade de causar estresse físico à célula

espermática devido à força a que é submetida (CORTEEL, 1981; GIL et al., 2002).

Enquanto a maioria dos resultados reportados sobre a viabilidade e fertilidade do sêmen não

centrifugado, resfriado por 5-8h foram satisfatórios, períodos de estocagem maior (12-24h)

reduziram a fertilidade (LEBOEUF et al., 2000).

NUNES (1982) observou que durante o processamento do sêmen as células espermáticas sofrem

efeitos deletérios do plasma seminal não só em temperaturas abaixo de 0ºC como a 37ºC.

Entretanto, a eliminação do plasma seminal a fim de minimizar os efeitos negativos sobre a

conservação do sêmen, pode afetar a capacitação “in vivo” dos espermatozóides, visto que o plasma

seminal possui enzimas e outras substâncias importantes para a fertilidade do sêmen (NUNES,

1986; MAXWELL e JOHNSON, 1999).

ROY (1957), IRITANI e NISHIKAWA (1961) observaram melhor sobrevivência espermática

quando ejaculados de sêmen caprino foram centrifugados uma vez antes da diluição, do que quando

não centrifugado. MEMON et al. (1985) estudaram o efeito da remoção do plasma seminal, por

duas lavagens, sobre a motilidade espermática e encontraram significância positiva. A remoção do

plasma seminal foi benéfica em preservar a integridade espermática após a congelação.

ROCA et al. (1997) avaliaram a viabilidade e fertilidade do sêmen centrifugado e não centrifugado,

da raça caprina Murciano-Granadina, diluído em tris gema de ovo, resfriado e conservado a 5ºC, e

constataram que a viabilidade espermática diminui com o tempo de conservação, mas não houve

diferença entre sêmen centrifugado e não centrifugado para os parâmetros de qualidade avaliados.

2.4 Mecanismos envolvidos no processo de resfriamento do sêmen

A primeira descoberta sobre a preservação de espermatozóide mamífero foi feita por

SPALLAZONI em 1776 apud MAXWELL e SALAMON (1993), que resfriou sêmen de sapo,

garanhão e homem em neve e observou que não houve morte de todas as células espermáticas, mas

uma imotilidade temporária e indução de um estado de letargia reversível quando submetidos a

temperaturas mais elevadas.

A conservação do sêmen por períodos curtos é dependente da redução reversível da motilidade e da

atividade metabólica dos espermatozóides a baixas temperaturas. O sêmen caprino é diluído e a

curva de refrigeração deve estar compreendida entre 0,25 e 0,35º C/ min até que seja atingida a

temperatura de 5º C. Neste caso, a motilidade do espermatozóide é mantida, em baixos níveis, por

alguns dias. No entanto, a estocagem do sêmen refrigerado em diluidores à base de citrato-gema e

leite de vaca não deve exceder oito horas, pois a partir deste momento mais de 50% da motilidade é

perdida (SAHNI, 1987). Contudo, NIMBULKAR et al. (1982), relataram vitalidade plena dos

espermatozóides, até quatro dias de estocagem, em meio à base de citrato de sódio gema de ovo,

enriquecidos com ácido acético e ácido capróico.

A conservação do sêmen no estado líquido, por períodos curtos, consiste em resfriar o sêmen

diluído desde 30ºC a 15ºC ou mais freqüentemente, a 5ºC, mantendo-o nesta temperatura até o

momento de utilizá-lo. O resfriamento do sêmen em refrigerador é feito colocando-se os tubos

contendo sêmen em recipiente com água. O ritmo do resfriamento deve ser regulado pelo tamanho

do recipiente e a quantidade de água dentro deste (EVANS e MAXWELL, 1987).

Durante o processo de resfriamento ocorrem mudanças na conformação da membrana plasmática

espermática, que resultam em arranjos anormais dos fosfolipídeos e proteínas, permitindo a rápida

passagem de moléculas que normalmente passariam através da membrana vagarosamente

(AMANN e PICKETT, 1987).

O termo choque térmico descreve as mudanças que ocorrem nos espermatozóides quando esses são

resfriados da temperatura corporal até 4ºC (JASKO, 1994). Desta forma, o choque térmico causa

danos irreversíveis ao espermatozóide caracterizados por movimento anormal (circular ou

retrógrado), rápida degradação da motilidade, quebra do acrossoma e da membrana plasmática

(aumento da permeabilidade), diminuição do metabolismo e perda de componentes intracelulares

(GRAHAM, 1996). Estas mudanças ocorrem durante a fase de transição, que se caracteriza pela

passagem da membrana plasmática do estágio líquido para o estágio cristalino, fase de gel, devido a

alterações na forma das moléculas de fosfolipídeos (AMANN e PICKETT, 1987).

A estocagem do sêmen causa danos ultra-estruturais, bioquímicos e funcionais ao espermatozóide

resultando em uma redução da motilidade, viabilidade e fertilidade. Muitas pesquisas têm sido

desenvolvidas no intuito de minimizar estes problemas, mas a fertilidade do sêmen armazenado é

geralmente menor do que a do sêmen fresco (ROY, 1957; IRITANI e NISHIKAWA, 1961).

O choque térmico pode ser minimizado pelo resfriamento lento do sêmen diluído à 4ºC, em uma

proporção de 0,05ºC/ min de 20ºC até 4ºC (PICKETT e AMANN, 1993) e pela adição de proteínas

do leite ou da gema de ovo nos diluidores de sêmen (AMANN e PICKETT, 1987).

A motilidade dos espermatozóides pode ser mantida por vários dias à 5ºC, porém o sêmen declina

em um ritmo de 10-35% por dia de armazenamento. O período máximo de conservação para obter

um nível aceitável de fertilidade para inseminação artificial é de 24h para os ovinos e 48 para

caprinos, considerando que para essa espécie se pode fazer uma inseminação mais profunda

(EVANS e MAXWELL, 1987).

2.5 Resfriamento do sêmen caprino

ROCA et al. (1997) avaliaram as médias de motilidade e de acrossomas normais no sêmen de bodes

da raça Murciano-Granadina, centrifugado e não centrifugado, resfriado a 5ºC em diluidor à base de

tris gema, obtendo valores de motilidade (escala 0-5) de 3,5 e 3,25 respectivamente, e porcentagem

de acrossomas normais de 75% e 68% respectivamente, após 96 horas de conservação e concluíram

que não há diferença significativa entre os valores observados.

AZEVÊDO e TONIOLLI (2000) colheram, resfriaram e conservaram a 4ºC, durante 48 horas, o

sêmen de seis caprinos da raça Marota diluídos em meios à base de água de coco, leite desnatado e

leite desnatado adicionado de ácido 3-indol-acético (IAA), e após 48 horas de resfriamento

obtiveram maior porcentagem de espermatozóides vivos normais, 74,2 ± 1,21 %, além de menor

porcentagem de espermatozóides vivos danificados e de mortos, respectivamente 6.9 ± 0.37 % e

18.9 ± 0.98 %, no terceiro diluidor.

Estudando o resfriamento do sêmen caprino a 4º C, FIGUEIRÊDO et al. (2002) compararam

diluidores à base de água de coco, com e sem glicerol, e observaram que a porcentagem de

espermatozóides móveis, após 48 horas de resfriamento e 5 minutos de incubação a 37º C, foi 32,27

± 4,89 e 59,33 ± 6,56 respectivamente, concluindo que não há vantagem no uso do glicerol durante

o processo de resfriamento.

NUNES e FELICIANO (1984) concluíram que o sêmen caprino resfriado a 4º C no diluidor leite

desnatado glicose é viável até 12 horas de resfriamento, apresentando até este momento excelentes

características “in vitro”. Os resultados de porcentagem de espermatozóides vivos e anomalias

espermáticas após 48 horas de incubação a 4º C obtidos neste estudo foram, 35% e 17%

respectivamente.

3 ARTIGO CIENTÍFICO

Avaliação in vitro do sêmen caprino resfriado a 4ºC com e sem centrifugação nos diluidores

leite desnatado-glicose e tris-gema.

Evaluation in vitro of washed and unwashed goat semen diluted in Skim milk-glucose and tris-egg

yolk extenders and stored at 4ºC

VIANA, A.K.D.S.

; CHALHOUB, M.

; RIBEIRO FILHO, A. de L.

; ALMEIDA, A.K.

; PORTELA, A.P.M.

;

BITTENCOURT, R.F.

; ALVES, S.G.G

; BITTENCOURT, T.C.C.

; QUINTELA, A.T.

1 Mestranda em Medicina Veterinária Tropical (UFBA) - E-mail: karinasar[email protected]

2 Departamento de Patologia e Clínicas da Escola de Medicina Veterinária (UFBA)

3 Alunos de graduação e pós-graduação da Escola de Medicina Veterinária (UFBA)

4 Departamento de Produção Animal (UFBA)

RESUMO

O objetivo deste experimento foi comparar in vitro dois métodos e dois diluidores para o

resfriamento de sêmen caprino. O sêmen de 4 bodes das raças Saanen e Pardo Alpina foi colhido,

quatro vezes por semana durante duas semanas, analisado quanti-qualitativamente e dividido em

quatro alíquotas, que foram submetidas a dois diluidores, tris-gema e leite desnatado-glicose, e dois

métodos, com e sem centrifugação. Em seguida, o sêmen foi resfriado e conservado a 4º C durante

48 horas, e avaliado quanto a motilidade total, vigor, patologia de acrossoma, patologia de cauda e

pH. Em relação a motilidade total e vigor, em todos os tempos avaliados, o diluidor tris-gema foi

superior (p<0,05) ao diluidor leite desnatado-glicose, contudo os métodos com e sem centrifugação

não demonstraram diferenças (p>0,05). O diluidor tris-gema sem centrifugação apresentou menor

porcentagem de patologia de acrossoma (p < 0,05), até 24 horas de resfriamento; a partir daí não

houve diferenças, exceto para o diluidor leite desnatado-glicose com centrifugação, que apresentou

a maior (p<0,05) porcentagem de patologias. A porcentagem de patologias de cauda não diferiu

(p<0,05) em ambos os diluidores em todos os tempos , contudo foi positivamente influenciada pela

centrifugação após 24 horas de resfriamento no tris-gema, e a partir de 6 horas no leite desnatado-

glicose. Os diluidores e métodos não alteraram o pH (p>0,05). Conclui-se que o diluidor tris-gema,

quando comparado ao diluidor leite desnatado-glicose, preservou melhor a motilidade, vigor e

patologia de acrossoma. A remoção do plasma seminal não influenciou as características seminais,

em todos os tempos de resfriamento avaliados, exceto em relação à patologia de cauda.

Palavras-chave: sêmen; caprino; diluidor; resfriamento.

SUMMARY

The objective of this experiment was compare in vitro two methods and two extenders to cool goat

semen. The semen of four Saanen and Pardo Alpina goats was collected, four times a week during

two weeks, analysed quant-qualitatively and divided into 4 equal aliquots, which were submitted to

two extenders, skim milk-glucose and tris-egg yolk, and two methods with and without

centrifugation. Afterwards, the semen diluted was cooled and stored to 4º C during 48 hours, and

evaluated according to total motility, vigor, acrosome pathology, tail pathology and pH. According

to the parameters of motility and vigor, in all the periods of cooling evaluated, the extender tris-yolk

was higher (p<0.05) to the extender milk-glucose, however the methods, with and without

centrifugation did not present differences (p>0.05). The extender tris-yolk without centrifugation

showed lower percentage of acrosome pathology (p<0.05), until 24 hours after the beginning of the

cooling. After that moment, there were no differences, except to the extender milk-glucose with

centrifugation, which one presented the higher (p < 0.05) percentage of acrosome pathology. The

percentage of tail pathology did not change (p<0,05) for both of the extenders, in all the periods,

nevertheless it was improved by centrifugation after 24 hours of cooling in the tris-yolk, and after 6

hours in the milk-glucose. The extenders and the methods didn't modify the pH (p>0.05). It

concludes the extender tris-egg yolk, when compared with the extender milk-glucose, was more

efficient in preserving the motility, vigor and acrosome pathology. Nevertheless, the remotion of the

seminal plasma did not influence on the seminal characteristics, in all the periods of cooling

evaluated, except to tail pathology.

Key-words: semen; goat; extenders; cooling.

INTRODUÇÃO

Várias pesquisas têm sido conduzidas, visando a avaliar a viabilidade do sêmen caprino diluído

criopreservado ou não, com o objetivo de determinar qual substância proporciona melhores

condições para sobrevivência espermática e conseqüentemente melhores índices de fertilidade,

tendo em vista que um dos pré-requisitos para o sucesso da IA é o uso de um diluente capaz de

manter a integridade da membrana plasmática (OLLERO et al., 1998 apud MORENO et al., 2001).

Por razões econômicas e práticas, busca-se desenvolver um método mais eficiente para a

conservação do sêmen no estado líquido, isto é, resfriado, superando assim parte das dificuldades

deste processo. O uso do sêmen líquido como uma alternativa ao sêmen congelado traria vantagens

em sistemas de produção extensivos (LEBOEUF et al., 2000). Contudo, o processo de resfriamento

causa danos irreversíveis ao espermatozóide levando à infertilidade, mas, esse choque térmico pode

ser minimizado pelo resfriamento lento do sêmen diluído, em uma proporção de 0,05ºC/ min até

4ºC (PICKETT e AMANN, 1993) e pela adição de fosfolipídios do leite ou da gema de ovo nos

diluidores de sêmen (AMANN e PICKETT, 1987).

Por outro lado, o plasma seminal de caprinos é rico em fosfolipase A, que interagindo com os

fosfolipídeos dos diluidores liberam ácidos graxos, os quais são espermicidas. Na espécie caprina a

remoção do plasma seminal por centrifugação imediatamente após a colheita aumenta a

‘percentagem de células vivas e sua motilidade durante a armazenagem em diluentes de gema de

ovo ou leite (ROY, 1957; AAMDAL, 1965; CORTEEL, 1974).

O objetivo deste experimento foi comparar dois métodos, com e sem centrifugação, e dois tipos de

diluidores, o primeiro à base de leite desnatado-glicose, e o segundo a base de tris-gema, utilizados

no processo de resfriamento do sêmen caprino, através da avaliação dos seguintes parâmetros

seminais: motilidade total (MT), vigor (V), patologia de acrossoma (PA), patologia de cauda (PC) e

pH, e desta forma determinar o método e o diluente mais eficiente em preservar as referidas

características seminais, durante o resfriamento e conservação a 4ºC por até 48 horas.

ANIMAIS

Neste estudo, foram selecionados 4 reprodutores caprinos, sendo dois da raça Pardo Alpina e dois

Saanen, com base no aspecto zootécnico e sanitário e submetidos previamente a exames clínicos e

andrológicos, e considerados aptos para reprodução, com idade variando entre 3 e 5 anos. Os

animais foram mantidos, durante o período experimental, nas baias do setor de grandes animais do

Hospital de Medicina Veterinária, localizado no Campus de Ondina da Universidade Federal da

Bahia (HOSPMEV-UFBA). A alimentação desses animais foi feita em sistema de confinamento,

recebendo capim no cocho, feno, ração balanceada, contendo 24% de Proteína bruta, 2 vezes ao dia,

e água e sal mineral ad libitum.

MATERIAIS E MÉTODOS

O processamento do sêmen e a avaliação das características analisadas foi realizada no Laboratório

de Embriologia do Setor de Reprodução do HOSPMEV-UFBA, nos meses de janeiro a junho de

2003, sendo de janeiro a março os parâmetros analisados imediatamente após a colheita do sêmen, e

de abril a junho os parâmetros analisados posteriormente.

A colheita de sêmen foi por meio de vagina artificial (modelo francês), acoplada a um tubo de vidro

graduado, aquecida com água a 45º C. Para efetuar a colheita por este método foi necessário utilizar

uma cabra, como manequim, com estro induzido pela aplicação de 2mL de estradiol (ECP



Cipionato de estradiol, Laboratório TUCCO), por via intramuscular. Foram colhidos oito ejaculados

de cada reprodutor perfazendo um total de 32 amostras. Foram realizadas 4 colheitas por semana,

no período de 15 dias, de cada reprodutor.

Após cada colheita o sêmen foi levado ao laboratório, colocado em banho-maria a 37ºC e avaliado

quanto às características físicas, químicas e microscópicas. O volume do ejaculado foi determinado

imediatamente após a colheita, através da graduação do tubo coletor. A cor e o aspecto foram

analisados pela observação direta (MIES FILHO, 1987) e o pH foi determinado utilizando-se uma

fita colorimétrica apropriada (Neutralit - Laboratório Merk). O turbilhonamento foi avaliado por

meio de uma alíquota de 20 µl de sêmen sobre lâmina em placa aquecida, observada em

microscópio óptico com aumento de 100 vezes, e classificada com base numa escala de zero

(ausência) a cinco (turbilhão máximo), conforme CBRA (1998). A atividade de movimento dos

espermatozóides foi determinada em motilidade total (MT), expressa em percentagem (0 a 100%),

por avaliação microscópica de uma alíquota de 10 µL de sêmen entre lâmina e lamínula, aquecidos

à temperatura de 37º C. O vigor do movimento dos espermatozóides foi classificado utilizando-se

uma escala subjetiva de zero (vigor nulo) a cinco (vigor máximo). As avaliações da motilidade e do

vigor foram realizadas em microscópio óptico com aumento de 100 vezes, conforme CBRA (1998).

Uma alíquota de 0,02 mL de sêmen foi retirada com uma micropipeta de 20 µL, e diluída em 4 mL

de solução formol-salina tamponada (proporção de 1:200), para posterior determinação da

concentração espermática em câmara de Neubauer, em microscópio óptico com aumento de 400

vezes, sendo o número de espermatozóides expresso em mL, conforme CBRA (1998). A

morfologia espermática do sêmen fresco foi avaliada em lâminas contendo esfregaços corados,

segundo KARRAS (1950) apud PAPA et al. (1988), por meio de microscopia comum. Em cada

lâmina foram avaliadas 100 células de diferentes campos e determinada a percentagem de

anomalias totais (EVANS e MAXWELL, 1987). No tempo T0 e nos demais tempos avaliou-se

apenas o acrossoma quanto as seguintes patologias: edema, destacado, deformado e oblíquo; e a

cauda quanto as patologias a seguir: enrolada, dobrada, fraturada e edema de peça intermediária.

Nesse experimento foram testados dois diluidores, sendo um à base de leite desnatado-glicose,

descrito por CORTEEL (1974), e outro à base de tris-gema descrito por EVANS e MAXWELL

(1987). Após a colheita, foram retiradas duas alíquotas de 200µL (0,2 mL) de sêmen. A primeira

alíquota foi dividida em duas partes de 100µL, colocadas em diferentes tubos plásticos de 15 mL

com tampa e pré-diluída com 1,0 mL dos meios diluidores em teste, sem a remoção do plasma

seminal: LS (sem centrifugação diluída em leite desnatado - glicose) e GS (sem centrifugação

diluída em tris - gema de ovo). A segunda alíquota de 200µL foi colocada em tubos idênticos aos

utilizados para LS e GS, diluída em meio de centrifugação, solução Ringer com Lactato, na

proporção de 1:9, e centrifugada a 600 G por 10 min (DELL’AQUA JUNIOR e PAPA, 2001), em

seguida foi retirado o sobrenadante, a fim de remover o plasma seminal, e então o “pellet”

ressuspenso em meio de centrifugação foi dividido em duas partes, colocados em tubos plásticos

com tampa e pré-diluído com 1,0 mL dos meios diluidores em teste: LC (com centrifugação diluída

em leite desnatado - glicose) e GC (com centrifugação diluída em tris - gema de ovo), totalizando 4

amostras, LS, GS, LC, GC pré-diluídas numa proporção de 1:10.

Os diluidores foram preparados a 37ºC, e à temperatura ambiente, 21ºC, a fim de diluir

respectivamente as amostras de sêmen sem plasma seminal (LS e GS) e com plasma seminal (LC e

GC), obtendo uma concentração final de 240x10

espermatozóides por amostra em um volume final

de 2 mL. A concentração e o volume final da amostra foram determinados com base na dose

inseminante de 60 x 10

espermatozóides, segundo EVANS e MAXWELL (1987), CORTEEL e

LEBOEUF (1990), e cada amostra de ejaculado (LS, GS, LC, GC) possuía o equivalente a quatro

doses de 0,5 mL. A taxa de diluição utilizada foi de 1:20, segundo RITAR et al. (1990), que foi

calculada com base na concentração e volume final desejados, a partir da concentração total e

volume total da alíquota utilizada. As amostras LS, GS, LC, GC, foram diluídas com a quantidade

de diluente calculada, a fim de atingir a concentração de 120x10

espermatozóides/mL e logo após

o volume excedente foi desprezado até obter 2mL.

As amostras LS, GS, LC e GC, contidas em tubos plásticos fechados e identificados, foram

colocadas, as duas primeiras, dentro de um becker contendo 500 mL de água a 37ºC, as duas

últimas em outro becker contendo 500 mL de água à temperatura ambiente, 21ºC, e levadas a um

refrigerador, o qual submeteu o sêmen a uma curva lenta de resfriamento (0,1ºC/ min) até uma

temperatura constante de 4ºC. Para se determinar a taxa de resfriamento das amostras e a

manutenção da temperatura a 4ºC, foi utilizado um sensor de imersão acoplado a um termômetro

eletrônico digital de leitura instantânea. A temperatura das amostras no interior do refrigerador foi

monitorada a cada dez minutos na primeira hora de resfriamento. Após esse período o

acompanhamento foi feito de 20 em 20 minutos até chegar à terceira hora de resfriamento.

Nos momentos T0 (0h), T1 (3h), T2 (6h), T3 (12h), T4 (24h), T5 (48h) após o início do

resfriamento, foram retiradas alíquotas das quatro amostras de sêmen: LS, GS, LC e GC , aquecidas

a 37ºC e avaliadas quanto à MT, V, PA e PC, enquanto que o pH foi avaliado apenas em T0, T4 e

T5, da mesma forma que se procedeu com o sêmen fresco. As amostras foram retiradas do

refrigerador e colocadas em caixa isotérmica, para que as alíquotas fossem obtidas, já que o

pequeno volume do sêmen caprino impossibilitou a retirada por um sistema fechado, tal qual

através de sondas, onde não houvesse necessidade da abertura do refrigerador para retirada das

amostras deste, pois acarretaria uma grande perda da amostra dentro do sistema de sonda.

Os resultados de todas as características seminais avaliadas, MT, V, PA, PC e pH, nos diferentes

tempos de resfriamento, métodos e diluidores, foram expressos em média e desvio padrão e

submetidos a ANOVA (P<0,05) para a análise estatística, que foi efetuada utilizando-se o Statistical

Package for Social Sciences (SPSS - versão 11.0). As médias foram comparadas pelo Teste de

Tukey (HSD).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados referentes às características do sêmen fresco, média e o desvio padrão do volume,

concentração, motilidade total, vigor, turbilhonamento, pH e patologia total dos quatro reprodutores

caprinos utilizados neste experimento, estão representados na tabela 1.

Os ejaculados apresentaram-se dentro dos padrões normais para a espécie caprina e foram

considerados satisfatórios para serem submetidos ao processo de resfriamento. As características

seminais dos animais foram melhores, baseando-se no limite imposto para a congelação, visto que

até então não existem parâmetros definidos para o processo de resfriamento. Os valores mínimos de

motilidade progressiva, vigor, turbilhonamento e o valor máximo de patologia espermática total

foram estipulados em 70%, 3, 3 e 20%, respectivamente, segundo CBRA (1998).

TABELA 1- Avaliação do sêmen a fresco dos quatro reprodutores caprinos utilizados durante o

experimento.

BODE A

x ± s

BODE B

x ± s

BODE C

x ± s

BODE D

x ± s TOTAL

Freqüência (n) 8 8 8 8 32

Volume (mL) 0,71 ± 0,17 0,99 ± 0,31 1,08 ± 0,30 1,05 ± 0,35 0,96 ± 0,31

Cor/ aspecto

Amarelado /

cremoso

Amarelado /

cremoso

Amarelado /

cremoso

Amarelado /

cremoso

Amarelado /

cremoso

Concentração (x 10

sptz/mL) 3,44 ± 1,83 7,42 ± 2,70 4,95 ± 1,60 5,56 ± 1,29 5,34 ± 2,34

Turbilhonamento (0 - 5) 4,88 ± 0,23 4,50 ± 0,00 4,31 ± 0,26 4,31 ± 0,46 4,50 ± 0,36

Motilidade progressiva (%) 84,38 ± 11,16 88,75 ± 3,54 86,88 ± 7,99 83,75 ± 7,44 85,94 ± 7,87

Vigor (0 – 5) 4,50 ± 0,27 4,50 ± 0,00 4,38 ± 0,23 4,63 ± 0,35 4,50 ± 0,25

pH (0 - 14) 7,50 ± 0,00 7,19 ± 0,37 7,25 ± 0,27 7,56 ± 0,18 7,38 ± 0,28

Patologia total (%) 7,75 ± 1,28 12,25 ± 2,12 14,37 ± 1,30 10,62 ± 2,33 11,25 ± 3,01

As curvas de resfriamento foram demonstradas na figura 1 e nota-se que a água do recipiente

contendo as amostras LS e GS, à temperatura inicial de 34ºC e a água do recipiente contendo as

amostras LC e GC, à temperatura inicial de 21ºC se igualaram em torno de 190 minutos após o

início do resfriamento e a partir daí se mantiveram equivalentes até a temperatura de 4ºC, o que

ocorreu a aproximadamente 360 minutos após o início do resfriamento. Após atingirem 4ºC, ambas

as curvas se mantiveram constantes durante todo o tempo em que o sêmen foi armazenado.

Neste experimento, utilizou-se uma curva de resfriamento lenta, onde a temperatura decresceu em

média 0,08ºC/ min., a fim de minimizar os efeitos do choque térmico sobre as células espermáticas,

estando essa velocidade de acordo com a reportada por PICKETT e AMANN (1993), que

sugeriram uma curva de 0,05ºC/ min de 20ºC até 4º C para o sêmen eqüino. Entretanto, SAHNI

(1987) sugeriu para o sêmen caprino, uma curva de refrigeração compreendida entre 0,25 e 0,35º

C/ min até que seja atingida a temperatura de 5º C.

0 20 40 60 120 180 240 300 360 420

Tempo (minutos)

Temperatura (ºC)

Água a 21ºC

Água a 34ºC

FIGURA 1- Curvas de resfriamento da água à temperatura inicial de 34ºC, contendo as amostras

leite desnatado-glicose (LS) e tris-gema (GS) sem centrifugação, e da água à temperatura inicial de

21º C, contendo as amostras leite desnatado-glicose (LC) e tris-gema (GC) com centrifugação,

conservada em refrigerador.

Na tabela 2 estão apresentados os resultados obtidos quanto a motilidade total dos espermatozóides

de acordo com o diluidor e método utilizado.

TABELA 2- Média (x) e Desvio Padrão (s) da Motilidade total (%) dos espermatozóides diluídos

no meio leite desnatado-glicose sem (LS) e com (LC) centrifugação e do sêmen no meio tris-gema

sem (GS) e com (GC) centrifugação, 0h (T0), 3h (T1), 6h (T2), 12h (T3), 24h (T4) e 48h (T5) após

o início do resfriamento.

Diluidor e

Método

x ± s

83,59 ±

9,69 Aa

56,41 ±

27,36 Ab

50,72 ±

31,51 Ab

48,37 ±

33,23 Ab

42,43 ±

34,55 Abc

33,00 ±

31,04 Ac

70,62 ±

15,24 Ba

54,88 ±

20,49 Ab

52,50 ±

19,55 Abc

45,78 ±

20,91 Abc

44,93 ±

22,07 Ac

30,68 ±

18,20 Ad

84,06 ±

8,46 Aa

80,63 ±

11,55 Ba

77,66 ±

13,96 Bab

69,75 ±

23,63 Bb

56,28 ±

29,62 ABc

40,62 ±

29,61 ABd

70,00 ±

17,08 Ba

71,09 ±

17,49 Ba

72,34 ±

19,04 Ba

65,31 ±

18,31 Bab

60,65 ±

25,47 Bbc

46,78 ±

24,75 Bd

Médias dentro de colunas seguidas por diferentes letras maiúsculas, diferem estatisticamente (p<0,05).

Médias dentro de linhas seguidas por diferentes letras minúsculas, diferem estatisticamente (p<0,05).

No que se refere à motilidade total dos espermatozóides, verificou-se que a centrifugação,

independente do meio utilizado, reduziu significativamente a MT, no início do resfriamento (T0).

Após o início do resfriamento, em T1, T2 e T3 as amostras diluídas em tris-gema apresentaram MT

superior (p<0,05) àquelas diluídas em leite desnatado-glicose, independente da centrifugação. Já

nos tempos T4 e T5 a MT espermática no GC foi semelhante (p>0,05) ao GS e maior (p< 0,05) do

que as apresentadas por LS e LC que por sua vez também foram semelhantes ao GS.

Ao comparar os seis tempos avaliados em função dos diluidores e métodos utilizados, observou-se

que a motilidade total no GC se manteve inalterada até o tempo T3, e que em GS não houve

alteração (p>0,05) até o tempo T2. A partir daí, tanto para GC como para GS, houve diminuição da

MT a cada momento avaliado. Por outro lado, quando se utilizou o leite desnatado-glicose,

independente da centrifugação, houve uma queda brusca da MT de T0 para T1. De T1 a T4 a MT

se manteve inalterada, para LS, e o mesmo ocorreu para LC de T1 a T3. A menor MT no LC foi

observada em T5, enquanto que em LS não houve diferença da MT entre T4 e T5.

A maior média de motilidade total após 24 horas de resfriamento foi 60,65% no meio tris-gema

centrifugado, que foi similar ao resultado encontrado por AZEVÊDO e TONIOLLI (2000), onde a

motilidade espermática no diluidor leite desnatado, adicionado de ácido 3-indol-acético (IAA), após

24 horas de resfriamento a 4º C, foi de 61,5%. Após 48 horas de estocagem, o melhor resultado de

motilidade obtido neste estudo foi 46,78%, corroborando com os resultados de AZEVÊDO e

TONIOLLI (2000) e FIGUEIRÊDO et al. (2002). Contudo, os resultados obtidos neste experimento

foram inferiores aos encontrados por ROCA et al. (1997) que avaliaram as médias de motilidade no

sêmen resfriado a 5ºC em diluidor à base de tris gema, centrifugado e não centrifugado, obtendo

valores de motilidade (escala 0-5) de 3,5 e 3,25 respectivamente, após 96 horas de conservação.

De T4 para T5 houve uma redução da MT em todos os diluidores e métodos devido aos danos ultra-

estruturais, bioquímicos e funcionais causados aos espermatozóides, resultando em uma redução da

viabilidade e fertilidade, como descrito por ROY (1957), IRITANI e NISHIKAWA (1961). A

diminuição da motilidade dos espermatozóides declinou em um ritmo de 25% por dia de

armazenamento, concordando com EVANS e MAXWELL (1987) que referem uma taxa de 10 a

35% de redução da motilidade por dia de resfriamento. Desta forma, o período máximo de

conservação para obter um nível aceitável de fertilidade para inseminação artificial é de 48h para

caprinos, considerando que para essa espécie se pode fazer uma inseminação mais profunda.

Na tabela 3 são demonstrados os resultados obtidos quanto ao vigor dos espermatozóides de acordo

com o diluidor e método utilizado.

Observou-se que houve uma redução no vigor dos espermatozóides após a centrifugação para o

sêmen diluído no tris-gema, no T0. Assim como a MT, durante T1, T2 e T3, as amostras diluídas no

tris-gema demonstraram médias de vigor superiores (p<0,05) àquelas diluídas no leite desnatado-

glicose, independente do processo de centrifugação. Entretanto nos tempos T4 e T5 o vigor no GC

LS LC GS GC

Diluidor e Método

Motilidade total (%)

FIGURA 2- Comparação entre as médias de

motilidade total dos espermatozóides, em

função dos métodos de diluição, leite

desnatado-glicose sem (LS) e com (LC)

centrifugação e tris-gema sem (GS) e com

(GC) centrifugação, nos diferentes tempos de

avaliação, 0h (T0), 3h (T1), 6h (T2), 12h

(T3), 24h (T4) e 48h (T5) de resfriamento.

T0 T1 T2 T3 T4 T5

Tempos

Motilidade total (%)

FIGURA 3- Comparação entre as médias de

motilidade total dos espermatozóides, em

função dos diferentes tempos de avaliação, 0h

(T0), 3h (T1), 6h (T2), 12h (T3), 24h (T4) e

48h (T5) de resfriamento, nos meios leite

desnatado-glicose sem (LS) e com (LC)

centrifugação e tris-gema sem (GS) e com

(GC) centrifugação.

foi semelhante (p>0,05) ao GS e maior (p< 0,05) do que as apresentadas por LS e LC, que por outro

lado foram iguais ao GS.

TABELA 3- Média (x) e Desvio Padrão (s) do Vigor (0-5) dos espermatozóides diluídos no meio

leite desnatado-glicose sem (LS) e com (LC) centrifugação e do sêmen no meio tris-gema sem (GS)

e com (GC) centrifugação, 0h (T0), 3h (T1), 6h (T2), 12h (T3), 24h (T4) e 48h (T5) após o início do

resfriamento.

Diluidor e T0 T1 T2 T3 T4 T5

Método

x ± s x ± s x ± s x ± s x ± s x ± s

4,45 ±

3,28 ±

3,00 ± 2,97 ± 2,50 ± 2,23 ±

0,26 ABa 1,22 Ab 1,36 Abc 1,39 Abc 1,63 Acd 1,53 Ad

4,23 ± 3,37 ± 3,42 ± 3,00 ± 2,95 ± 2,34 ±

0,33 Aa 0,79 Abc 0,74 Ab 0,95 Abc 0,91 ABc 1,17 Ad

4,69 ± 4,34 ± 4,27 ± 4,09 ± 3,50 ± 2,65 ±

0,27 Ba 0,36 Bab 0,56 Bab 0,90 Bb 1,32 BCc 1,67 ABd

4,28 ± 4,31 ± 4,16 ± 4,03 ± 3,84 ± 3,25 ±

0,60 Aa 0,65 Ba 0,68 Bab 0,89 Bab 1,00 Cb 1,29 Bc

Médias dentro de colunas seguidas por diferentes letras maiúsculas, diferem estatisticamente (p<0,05).

Médias dentro de linhas seguidas por diferentes letras minúsculas, diferem estatisticamente (p<0,05).

O vigor no GC se manteve inalterado até o tempo T3, enquanto que em GS não houve alteração

(p>0,05) até o tempo T2. A partir daí, tanto para GC como para GS, houve diminuição do V a cada

momento avaliado. Por outro lado, quando se utilizou o leite desnatado-glicose, independente da

centrifugação, houve uma queda do V de T0 para T1. De T1 a T4 a MT se manteve inalterada, para

LS, e o mesmo ocorreu para LC de T1 a T3. O menor V no LC foi observado em T5, enquanto que

em LS não houve diferença do V entre T4 e T5.

Constatou-se neste estudo que o vigor espermático apresentou o mesmo comportamento da

motilidade frente ao resfriamento a 4ºC e possivelmente uma correlação positiva. Segundo

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

LS LC GS GC

Diluidor e Método

Vigor (0-5)

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

T0 T1 T2 T3 T4 T5

Tempos

Vigor (0-5)

FIGURA 4- Comparação entre as médias do

vigor dos espermatozóides, em função dos

métodos de diluição, leite desnatado-glicose

sem (LS) e com (LC) centrifugação e tris-

gema sem (GS) e com (GC) centrifugação,

nos diferentes tempos de avaliação, 0h (T0),

3h (T1), 6h (T2), 12h (T3), 24h (T4) e 48h

(T5) de resfriamento.

FIGURA 5- Comparação entre as médias do

vigor dos espermatozóides, em função dos

diferentes tempos de avaliação, 0h (T0), 3h

(T1), 6h (T2), 12h (T3), 24h (T4) e 48h

(T5) de resfriamento, nos meios leite

desnatado-glicose sem (LS) e com (LC)

centrifugação e tris-gema sem (GS) e com

(GC) centrifugação.

MORENO et al. (2001), a motilidade e o vigor espermático não devem ser os únicos critérios de

avaliação após a diluição do sêmen caprino.

Na tabela 4 estão apresentados os resultados obtidos quanto à patologia de acrossoma dos

espermatozóides de acordo com o diluidor e método utilizado.

TABELA 4- Média (x) e Desvio Padrão (s) das Patologias do acrossoma (%) dos espermatozóides

diluídos no meio leite desnatado-glicose sem (LS) e com (LC) centrifugação e do sêmen no meio

tris-gema sem (GS) e com (GC) centrifugação, 0h (T0), 3h (T1), 6h (T2), 12h (T3), 24h (T4) e 48h

(T5) após o início do resfriamento.

Diluidor e

Método

x ± s

2,41 ±

1,01 Aa

3,78 ±

1,52 ABb

4,63 ±

1,68 ABbc

4,94 ±

2,48 ABc

4,50 ±

2,14 ABbc

5,16 ±

2,24 ABc

3,16 ±

1,22 Ba

4,41 ±

1,72 Ab

5,16 ±

1,55 Bbc

5,81 ±

2,26 Bc

5,38 ±

1,96 Ac

5,94 ±

2,00 Bc

1,78 ±

0,87 Ca

3,28 ±

1,30 Bb

3,56 ±

1,37 Cbc

3,37 ±

1,86 Cb

4,25 ±

2,09 Bc

3,81 ±

1,84 Abc

2,84 ±

1,08 ABa

3,81 ±

1,20 ABb

4,31 ±

1,49 ACbc

4,03 ±

1,66 ACbc

5,06 ±

1,72 ABc

4,47 ±

1,81 Abc

Médias dentro de colunas seguidas por diferentes letras maiúsculas, diferem estatisticamente (p<0,05).

Médias dentro de linhas seguidas por diferentes letras minúsculas, diferem estatisticamente (p<0,05).

A porcentagem de patologias de acrossoma aumentou logo após a centrifugação (T0) nos dois

diluidores utilizados. Em T2 e T3 o GS apresentou menos PA (p<0,05) que o leite desnatado-

glicose e foi igual ao GC. Enquanto que no último tempo avaliado (T5), o LC apresentou a maior

média (p<0,05) de PA entre os diluidores e métodos avaliados. As amostras centrifugadas não

demonstraram diferenças (p>0,05) em relação às não centrifugadas, independente do diluente

utilizado neste experimento.

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

LS LC GS GC

Diluidor e Método

Patologia de acrossoma (%

)

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

T0 T1 T2 T3 T4 T5

Tempos

Patologia de acrossoma (%

)

FIGURA 6- Comparação entre as médias de

patologias de acrossoma dos espermatozóides,

em função dos métodos de diluição, leite

desnatado-glicose sem (LS) e com (LC)

centrifugação e tris-gema sem (GS) e com

(GC) centrifugação, nos diferentes tempos de

avaliação, 0h (T0), 3h (T1), 6h (T2), 12h (T3),

24h (T4) e 48h (T5) de resfriamento.

FIGURA 7- Comparação entre as médias de

patologias de acrossoma dos espermatozóides,

em função dos diferentes tempos de avaliação,

0h (T0), 3h (T1), 6h (T2), 12h (T3), 24h (T4) e

48h (T5) de resfriamento, nos meios leite

desnatado-glicose sem (LS) e com (LC)

centrifugação e tris-gema sem (GS) e com

(GC) centrifugação.

Em relação ao tempos avaliados, observou-se que houve um aumento das patologias de acrossoma

(p < 0,05) no tempo T1. Contudo, a partir do tempo T2 não houve diferença na porcentagem de

patologias de acrossoma (p > 0,05) em todos os diluidores e métodos testados.

Os resultados de PA obtidos neste estudo são similares aos de DEKA e RAO (1985), que

encontraram valores de PA de 4,42% e 4,48% no sêmen diluído em meios à base de tris-gema

glicerol e leite desnatado gema glicerol, respectivamente, após resfriamento a 5º C. Resultados

semelhantes foram obtidos por DEKA e RAO (1987), que observaram média de 5,30% de PA após

resfriamento do sêmen a 5º C, utilizando uma curva rápida (1º C/ minuto), e quando foi submetido a

uma curva lenta (0,2º C/ minuto), encontraram média de 2,97% de PA. Contudo, AZEVÊDO e

TONIOLLI (2000) encontraram valores superiores aos obtidos neste estudo ao resfriar sêmen

caprino em leite desnatado, de 6,90% e 10,50% após 24 e 48 horas de resfriamento,

respectivamente.

ROCA et al. (1997) avaliaram as médias de acrossomas normais no sêmen de bodes da raça

Murciano-Granadina, centrifugado e não centrifugado, resfriado a 5ºC em diluidor à base de tris

gema, obtendo porcentagens de acrossomas normais de 75% e 68% respectivamente, após 96 horas

de conservação e concluíram que não há diferença significativa entre os valores observados. Em

contrapartida MEMON et al. (1985) concluíram que a remoção do plasma seminal do sêmen

caprino foi benéfica em preservar a integridade de acrossoma após congelamento, independente do

diluidor utilizado.

Na tabela 5 estão apresentados os resultados obtidos quanto à patologia de cauda dos

espermatozóides de acordo com o diluidor e método utilizado.

Após a centrifugação (T0) as amostras diluídas em leite-glicose apresentaram aumento da

percentagem de patologias de cauda, que em T1 se manteve inalterada em ambos diluidores e

métodos. Em T3, LC apresentou maior média (p<0,05) de PC, enquanto que no tempo T4, LS

demonstrou PC superior (p<0,05) às demais amostras. As amostras centrifugadas apresentaram

menor média (p<0,05) de PC do que as não centrifugadas em ambos diluidores em T5.

Em ambos diluidores e métodos as médias de PC não aumentaram (p>0,05) de T0 até T2. De T3

para T4, as amostras diluídas em tris-gema e leite-glicose sem centrifugação demonstraram

aumento da percentagem de PC, enquanto em T5 apenas GS apresentou acréscimo da média.

TABELA 5- Média (x) e Desvio Padrão (s) das Patologias de cauda (%) dos espermatozóides

diluídos no meio leite desnatado-glicose sem (LS) e com (LC) centrifugação e do sêmen no meio

tris-gema sem (GS) e com (GC) centrifugação, 0h (T0), 3h (T1), 6h (T2), 12h (T3), 24h (T4) e 48h

(T5) após o início do resfriamento.

Diluidor e

Método

x ± s

6,69±

3,16 Aa

6,84±

2,24 Aa

6,19±

2,56 ABa

7,91±

4,41 Aa

14,19±

5,17 Ab

16,25±

6,55 Ab

8,13±

3,41 Ba

7,72±

2,63 Aa

7,91±

3,54 ACa

11,59±

5,89 Bc

10,31±

4,97 Bbc

12,38±

6,50 Bc

5,94±

2,40 Aa

6,59±

3,29 Aa

8,22±

5,14 Aa

7,34±

3,40 Aa

12,13±

6,77 BCb

15,34±

5,12 Ac

7,03±

3,20 ABa

7,16±

3,99 Aa

7,22±

2,07 Aa

7,59±

4,32 Aa

9,13±

4,94 BDab

11,47±

7,15 Bb

Médias dentro de colunas seguidas por diferentes letras maiúsculas, diferem estatisticamente (p<0,05).

Médias dentro de linhas seguidas por diferentes letras minúsculas, diferem estatisticamente (p<0,05).

NUNES e FELICIANO SILVA (1984) ao avaliarem o sêmen caprino, diluído em leite desnatado

glicose e resfriado a 4ºC, encontraram porcentagem de patologia de cauda de 8,6%, 11% e 13,6%

respectivamente após 0, 12 e 24 horas de resfriamento, sendo esses valores similares aos obtidos no

presente estudo. Esses resultados confirmam o efeito do resfriamento, causando choque térmico nas

células espermáticas, como foi reportado por GRAHAM (1996). Entretanto, FIGUEIRÊDO et al.

(2002) resfriaram sêmen caprino a 4ºC, diluído em água de côco, e observaram menor porcentagem

de PC após 0, 24 e 48 horas de resfriamento, respectivamente 5,37%, 3,11% e 5,33%.

Os resultados do pH do sêmen, de acordo com o diluidor e método utilizados, são demonstrados na

tabela 6.

TABELA 6- Média (x) e Desvio Padrão (s) do pH (0-14) do sêmen diluído no meio leite desnatado-

glicose sem (LS) e com (LC) centrifugação, e do sêmen no meio tris-gema sem (GS) e com (GC)

centrifugação, 0h (T0), 24h (T4) e 48h (T5) após o início do resfriamento.

Diluidor e

Método

x ± s

6,51 ± 0,08 Aa 6,48 ± 0,08 Aa 6,46 ± 0,12 Aa

6,54 ± 0,14 Aa 6,5 ± 0,00 Ab 6,5 ± 0,00 Ab

6,48 ± 0,20 Aa

6,46 ± 0,17 Aa 6,46 ± 0,17 Aa

6,53 ± 0,25 Aa 6,46 ± 0,17 Aa 6,45 ± 0,19 Aa

Médias dentro de colunas seguidas por diferentes letras maiúsculas, diferem estatisticamente (p<0,05).

Médias dentro de linhas seguidas por diferentes letras minúsculas, diferem estatisticamente (p<0,05).

LS LC GS GC

Diluidor e Método

Patologias de cauda (%)

T0 T1 T2 T3 T4 T5

Temp os

Patologias de cauda (%)

FIGURA 8- Comparação entre as médias de

patologias de cauda dos espermatozóides, em

função dos métodos de diluição, leite

desnatado-glicose sem (LS) e com (LC)

centrifugação e tris-gema sem (GS) e com

(GC) centrifugação, nos diferentes tempos de

avaliação, 0h (T0), 3h (T1), 6h (T2), 12h (T3),

24h (T4) e 48h (T5) de resfriamento.

FIGURA 9- Comparação entre as médias de

patologias de cauda dos espermatozóides, em

função dos diferentes tempos de avaliação, 0h

(T0), 3h (T1), 6h (T2), 12h (T3), 24h (T4) e

48h (T5) de resfriamento, nos meios leite

desnatado-glicose sem (LS) e com (LC)

centrifugação e tris-gema sem (GS) e com

(GC) centrifugação.

Observou-se que o pH diferiu (p < 0,05) apenas para LC, nos tempos T4 e T5. Em relação à

comparação entre LS, LC, GS e GC, não foram observadas diferenças (p > 0,05) em todos os

tempos avaliados. Esses resultados demonstram, que ambos os diluidores foram capazes de manter

o sistema tampão que mantém o PH seminal próximo a 7,0 , mesmo nas amostras em que o plasma

foi removido. Segundo MIES FILHO (1987) e EVANS e MAXWELL (1987), a capacidade em

manter o pH é uma das características de um bom diluidor.

Neste experimento foi utilizado o diluidor à base de tris, adicionado de 2,5% de gema de ovo. Esta

quantidade é muito inferior aos 14% utilizados para o sêmen ovino (EVANS e MAXWELL,1987),

entretanto corrobora com RITAR e SALAMON (1982) que afirmaram que a concentração de 1,5%

de gema de ovo em um diluente à base de tris está na margem de segurança para a criopreservação

do sêmen caprino, pois como foi reportado por ROY (1957), AAMDAL (1965) e CORTEEL

(1974), as fosfolipases A, presentes no plasma seminal desta espécie, degradam os fosfolipídeos da

gema de ovo contida nos diluidores causando uma ação deletéria sobre os espermatozóides.

MEMON et al. (1985) reportaram uma drástica deterioração das células espermáticas pós-

descongelamento quando o sêmen não centrifugado foi diluído em um meio com 11% de gema de

ovo. Discordando destes achados, CHAUHAN e ANAND (1990) mostraram que o sêmen não

centrifugado pode ser eficientemente preservado em baixa temperatura após diluição em meio a

base de tris, com alta concentração de gema de ovo.

Os melhores resultados de motilidade total, vigor e patologias de acrossoma foram demonstrados

quando o sêmen foi diluído no meio tris-gema em comparação ao meio leite desnatado-glicose, o

que demonstra uma boa proteção da gema de ovo, mesmo em pequena quantidade. Os resultados

encontrados vão de encontro aos observados por CHAUHAN e ANAND (1990) que obtiveram

melhores resultados de motilidade, quantidade de espermatozóides vivos e defeito de acrossoma,

durante e após o processo de congelamento no meio tris-gema.

6,0

6,1

6,2

6,3

6,4

6,5

6,6

LS LC GS GC

Diluidor e Método

pH (0-14)

6,1

6,2

6,3

6,4

6,5

6,6

T0 T4 T5

Tempos

(

0-14

)

FIGURA 10- Comparação entre as médias de

pH do sêmen, em função dos métodos de

diluição, leite desnatado-glicose sem (LS) e

com (LC) centrifugação e tris-gema sem (GS)

e com (GC) centrifugação, nos diferentes

tempos de avaliação, 0h (T0), 24h (T4) e 48h

(T5) de resfriamento.

FIGURA 11- Comparação entre as médias de

pH do sêmen, em função dos diferentes tempos

de avaliação, 0h (T0), 24h (T4) e 48h (T5) de

resfriamento, nos meios leite desnatado-glicose

sem (LS) e com (LC) centrifugação e tris-gema

sem (GS) e com (GC) centrifugação.

As amostras de sêmen resfriadas apresentaram maior (p<0,05) porcentagem de patologias de

acrossoma e patologia de cauda, independente do diluidor utilizado, quando comparadas com as

amostras de sêmen antes do resfriamento, estando esses resultados de acordo com os encontrados

por RIBEIRO FILHO (1996) ao resfriar sêmen equino.

Observou-se que após a centrifugação houve uma brusca redução da motilidade e do vigor, e um

aumento das patologias de acrossoma dos espermatozóides nos dois diluidores utilizados, o que não

ocorreu com as amostras que não foram centrifugadas. Esses resultados corroboram com

CORTEEL (1981) e GIL et al. (2002) que relataram que o processo de centrifugação pode causar

estresse físico aos espermatozóides, além do que neste trabalho a curva de resfriamento do sêmen

centrifugado foi mais rápida do que a do sêmen não centrifugado nos 190 minutos iniciais de

resfriamento, o que pode ter influenciado negativamente sobre a motilidade e vigor espermáticos.

Entretanto após o início do resfriamento, durante as 48 horas de conservação, não foram

encontradas diferenças significativas entre as amostras, com e sem plasma seminal, o que está de

acordo com aos resultados observados por ROCA et al. (1997) que avaliaram as médias de

motilidade e de acrossomas normais no sêmen resfriado a 5ºC em diluidor à base de tris-gema,

centrifugado e não centrifugado. Estes resultados são discordantes dos obtidos por CORTEEL

(1974) e MEMON et al. (1985), que observaram efeito benéfico da retirada do plasma sobre a

motilidade dos espermatozóides.

O presente estudo demonstrou que até 48 horas de conservação a 4º C, todas as amostras,

independente do diluidor e método utilizado, apresentaram viabilidade, uma vez que o mínimo

aceitável de motilidade e vigor após congelamento é de 30% e 2, respectivamente, como

preconizado pelo CBRA (1998). Foram utilizados parâmetros para o sêmen congelado, visto que até

então não existem limites mínimos definidos para o processo de resfriamento.

CONCLUSÕES

O diluidor tris-gema mostrou-se melhor que o leite desnatado-glicose, em relação à motilidade total,

vigor e patologias de acrossoma espermáticos de 3 até 12 horas de resfriamento, contudo não houve

diferença entre os diluidores quanto à patologia de cauda.

A remoção do plasma, nos diluidores à base de tris-gema e à base de leite desnatado-glicose, não

alterou a motilidade, o vigor, as patologias de acrossoma e o pH espermáticos, entretanto em

relação à patologia de cauda a centrifugação foi benéfica após 24 horas de resfriamento no tris-

gema, e a partir de 6 horas no leite desnatados-glicose.

A centrifugação do diluidor a base de gema , de 24 até 48 horas resultou em maior motilidade total

e vigor em relação ao diluidor a base de leite desnatado centrifugado e não centrifugado;

O resfriamento do sêmen caprino a 4º C, em ambos diluidores e métodos estudados mostrou

viabilidade até 48 horas de conservação. Entretanto, até 24 horas, o sêmen apresentou porcentagem

de motilidade, de vigor, de patologias de acrossoma e de patologias de cauda capazes de garantir

uma maior fertilidade dentro de um período suficiente para transportá-lo a longas distâncias.

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4 CONSIDERAÇÕES GERAIS

Nas condições da realização deste trabalho, e dentro das finalidades a que foi proposto, os

resultados obtidos permitem as seguintes considerações:

- O diluidor tris-gema mostrou-se melhor que o leite desnatado-glicose, em relação à motilidade

total, vigor e patologias de acrossoma de 3 até 12 horas de resfriamento, contudo não houve

diferença entre os diluidores quanto à patologia de cauda;

- A centrifugação do diluidor a base de gema , de 24 até 48 horas resultou em maior motilidade

total e vigor em relação ao diluidor a base de leite desnatado centrifugado e não centrifugado;

- A remoção do plasma, nos diluidores à base de tris-gema e à base de leite desnatado-glicose,

não alterou a motilidade, o vigor, as patologias de acrossoma e o pH espermáticos, entretanto

em relação à patologia de cauda a centrifugação foi benéfica após 24 horas de resfriamento no

tris-gema, e a partir de 6 horas no leite desnatados-glicose.

- Testes complementares são necessários para avaliar o potencial fertilizante dos

espermatozóides, e principalmente trabalhos in vivo que comprovem a fertilidade espermática.

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ANEXOS

FIGURA 12- Fluxograma de execução experimental

Colheita do sêmen

fracionamento do ejaculado

alíquota 1 alíquota 2

LS GS

refracionamento

centrifugação

LC GC

refracionamento

diluição

Resfriamento a 4ºC

T0=0h

T1=3h

T2=6h

T5=48h

T4=24h

T3=12h

T0=0h

Avaliação:

Avaliações:

•

Volume

•

Cor/ aspecto

•

Motilidade total

•

Vigor

•

Turbilhonamento

•

Concentração

•

Patologia total

Avaliações:

•

Motilidade total

•

Vigor

•

Patologia de acrossoma

yPatologia

de cauda

TABELA 7- Composição do diluidor leite desnatado-glicose (CORTEEL,1974)

COMPONENTES QUANTIDADES

Leite desnatado em pó*

10,000 g

Glicose 0,194 g

Água bidestilada 100,000 mL

Penicilina 100.000 U.I.

Estreptomicina 0,100 g

* O leite deve ser mantido num banho-maria em água fervente durante 10 minutos, e os antibióticos

devem ser adicionados ao leite resfriado a 32º C.

TABELA 8- Composição do diluidor tris-gema (EVANS e MAXWELL,1987)

COMPONENTES QUANTIDADES

Tris (hidroximetilaminometano)

3,634 g

Frutose 0,500 g

Ácido Cítrico 1,990 g

Gema de ovo 2,500 mL

Água bidestilada 100,000 mL

Penicilina 100.000 U.I.

Estreptomicina 0,100 g

TABELA 9- Ficha de colheita e diluição do sêmen (ADAPTADO DE RIBEIRO FILHO, 1996)

1.IDENTIFICAÇÃO

NOME:________________________________ Nº DO EJACULADO:_______________________

DATA:________________________________ HORA:___________________________________

2. AVALIAÇÃO DO SÊMEN

VOLUME:____________________________COR / ASPECTO:____________________________

MOTILIDADE (%):____________ VIGOR (0-5):______________ pH (0-14):_______________

CONCENTRAÇÃO:_________ + _________ = __________ x 10 = _________x 10

SPTZ / ML

3. DILUIÇÃO DO SÊMEN

DOSE INSEMINANTE = 60 x 10

SPTZ

VOLUME FINAL = 2 ML

CONCENTRAÇÃO FINAL = 120 x 10

SPTZ / ML

CONCENTRAÇÃO TOTAL = ________ x 10

SPTZ / ML

VOLUME TOTAL = CONCENTRAÇÃO TOTAL

CONCENTRAÇÃO FINAL

4. QUANTIDADE DE DILUENTE

VOLUME TOTAL - (PRÉ-DILUIÇÃO + SÊMEN) = __________ - _________ = _____________

VOLUME FINAL = VOLUME TOTAL - VOLUME DESPREZADO (2 = ________ - _______)

5. INÍCIO DO RESFRIAMENTO (HORA) ______________________

TABELA 10- Ficha para análise do sêmen nos diferentes tempos (ADAPTADO DE RIBEIRO FILHO, 1996)

BODE:___________________COLHEITA (DATA, HORA, Nº):__________________________

T0 (H)________ T1 (H)________ T2 (H)________T3 (H)______T4 (H)_______ T5 (H)_______

VARIÁVEIS LS LC GS GC

T0 T1 T2 T3 T4 T5 T0 T1 T2 T3 T4 T5 T0 T1 T2 T3 T4 T5 T0 T1 T2 T3 T4 T5

MT (%)

V (0-5)

pH (0-14)

PA (%)

PC (%)

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