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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
CENTRO BIOMÉDICO
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOPATOLOGIA CLÍNICA E EXPERIMENTAL
MARCO AURÉLIO RODRIGUES DA FONSECA PASSOS
AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO RENAL EM MODELOS DE
PROGRAMAÇÃO NA LACTAÇÃO: INIBIÇÃO DA PROLACTINA
E EXPOSIÇÃO À NICOTINA
RIO DE JANEIRO
2007
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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
CENTRO BIOMÉDICO
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOPATOLOGIA CLÍNICA E
EXPERIMENTAL - CLINEX
AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO RENAL EM MODELOS DE PROGRAMAÇÃO
NA LACTAÇÃO: INIBIÇÃO DA PROLACTINA E EXPOSIÇÃO À
NICOTINA
Tese de doutorado apresentada ao
Programa de Pós-graduação em
Fisiopatologia Clínica e Experimental da
Faculdade de Ciências Médicas da
Universidade do Estado do Rio de Janeiro
para obtenção do grau de Doutor em
Ciências.
RIO DE JANEIRO
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3
2007
UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
CENTRO BIOMÉDICO
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOPATOLOGIA CLÍNICA E EXPERIMENTAL -
CLINEX
AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO RENAL EM MODELOS DE PROGRAMAÇÃO NA
LACTAÇÃO: INIBIÇÃO DA PROLACTINA E EXPOSIÇÃO À NICOTINA
ORIENTADORES:
Dr. EGBERTO GASPAR DE MOURA
Prof
o
Titular do Departamento de Cências Fisiológicas do Instituto de Biologia
Roberto Alcântara Gomes da Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Dr
a
. MAGNA COTTINI DA FONSECA PASSOS
Prof
a
. Adjunta do Departamento de Nutrição Aplicada do Instituto de Nutrição da
Universidade do Estado do Rio de Janeiro
BANCA EXAMINADORA:
Efetivos:
Prof
a
. Nádia Maria Frizzo Trugo
Prof
a
. Karen de Jesus Oliveira e Sanches
Prof
a
. Patrícia Cristina Lisboa
Prof
o
. Jorge Reis Almeida
Prof
o
. Egberto Gaspar de Moura
Suplentes:
Prof
a
.Carmem Cabanela Pazos de Moura
Prof
a
.Celi Saba Nascimento
4
Rio de Janeiro
2007
FICHA CATALOGRÁFICA
Passos, Marco Aurélio Rodrigues
Avaliação da função renal em modelos de programação na lactação:
inibição da prolactina e exposição à nicotina. Marco Aurélio Rodrigues
da Fonseca Passos – 2007.
xiii, 65p.
Orientadores: Egberto Gaspar de Moura e Magna Cottini da Fonseca
Passos.
Tese (Doutorado) – Universidade do Estado do Rio de Janeiro,
Faculdade de Ciências Médicas, Curso de Pós–graduação em
Fisiopatologia Clínica e Experimental.
1. Programação. 2. Rim 3. Lactação 4. Prolactina . 5.Nicotina 6.Teses. I.
Moura, Egberto Gaspar. II. Passos, Magna Cottini Fonseca. III.
Universidade do Estado do Rio de Janeiro.
Faculdade de Ciências
Médicas
. IIII. Título.
5
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Fisiologia Endócrina do
Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes da Universidade do
Estado do Rio de Janeiro, sob orientação dos Professores Dr. EGBERTO
GASPAR DE MOURA e Dra. MAGNA COTTINI DA FONSECA
PASSOS e, contou com o apoio financeiro do Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), da Coordenação do
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e da Fundação
de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ).
6
Dedicatória
A minha família, por todo amor, segurança e amizade que ela me dedica:
Meus pais, Antonio Carlos e Liege, meus irmãos.
Minha esposa Magna e, especialmente, nosso filho Lucas.
7
AGRADECIMENTOS
A professora Magna Cottini da Fonseca Passos pela sua presença generosa,
inteligente e infatigável em todos os momentos dessa tese.
Ao meu orientador professor Egberto Gaspar de Moura por ser tão desprendido
com o seu brilhantismo, se dispondo a me orientar, apesar de seus inúmeros e
crescentes compromissos.
A professora Patrícia Lisboa pela sua ajuda na revisão (sempre rápida e exata), e
pelo estímulo ao longo do trabalho.
As professoras mestrandas e doutorandas, Isabela, Elaine, Isis, Aline, Fernanda,
Ananda e Ana Paula, pela sua imensa ajuda na obtenção do material e pela
acolhida carinhosa. Aos alunos de iniciação científica, sempre dedicados, apesar
da sua pesada jornada curricular diária.
Ao professor José Firmino Nogueira Neto pela competente condução da análise
laboratorial das amostras. Ao farmacêutico Antônio Carlos Macedo de Sá,
também responsável pelo dedicado trabalho de análise laboratorial das amostras.
Ao professor Jorge Reis Almeida, pela amizade e pelas discussões que tivemos
sobre as implicações morfológicas do trabalho.
A Amélia Gomes, dedicada, competente e gentil secretária do CLINEX, por todo
o cuidado e atenção com os alunos da pós-graduação.
A todos os meus amigos.
8
ÍNDICE
Página
Lista de figuras x
Lista de abreviaturas xi
Resumo xii
Abstract xiii
Introdução 2
Revisão de literatura 5
Programação Metabólica
Desenvolvimento Renal
Programação Neonatal e Função Renal
Inibição da PRL no Período Neonatal
Exposição Materna à Nicotina no Período Neonatal
5
7
9
11
15
Objetivos 17
Materiais e Métodos 19
Programação por inibição da prl materna: modelo experimental
de restrição calórica moderada neonatal
20
Esquema Experimental 21
Programação por exposição materna à nicotina no período neonatal 22
Peso renal
24
Medidas da função renal
24
Clearance de creatinina (CCr)
Análise estatística
25
26
Resultados 27
Estado nutricional dos animais programados por inibição da PRL materna na
lactação
28
Peso absoluto e relativo dos rins dos animais programados por inibição da
PRL materna na lactação.
30
Proteinúria dos animais programados por inibição da PRL materna na
32
9
lactação.
Clearance e concentração sérica de creatinina em animais programados por
inibição da PRL materna na lactação.
33
Concentração sérica de sódio e potássio em animais programados por
inibição da PRL materna na lactação.
34
Estado nutricional de animais programados por exposição materna à nicotina
na lactação.
36
Peso absoluto e relativo dos rins dos animais programados por exposição
materna à nicotina na lactação.
39
Proteinúria dos animais programados por exposição materna à nicotina na
lactação.
40
Clearance e concentração sérica de creatinina em animais programados por
exposição materna à nicotina na lactação.
41
Concentração sérica de sódio e potássio em animais programados por
exposição materna à nicotina na lactação.
42
Discussão
43
Conclusão
50
Referências
52
10
LISTA DE FIGURAS
Página
FIGURA 1
Evolução da ingestão de ração por animais
programados por
inibição da PRL materna na lactação.
28
FIGURA 2
Evolução do peso corporal dos animais
programados por inibição
da PRL materna na lactação.
29
FIGURA 3
Tecido adiposo retroperitoneal (TARP) de animais
programados
por inibição da PRL materna na lactação.
29
FIGURA 4
Peso absoluto e relativo dos rins dos animais programados
por inibição da PRL materna na lactação.
31
FIGURA 5
Proteinúria dos animais programados por inibição da PRL
materna na lactação.
32
FIGURA 6
Clearance e concentração sérica de creatinina em animais
programados por inibição da PRL materna na lactação.
33
FIGURA 7
Concentração sérica de sódio e potássio em animais
programados por inibição da PRL materna na lactação.
35
FIGURA 8
Evolução do peso corporal durante a lactação e ingestão
alimentar de animais programados por exposição materna à
nicotina na lactação.
37
FIGURA 9
Tecido adiposo retroperitoneal (TARP) de animais
programados por exposição materna à nicotina na lactação.
38
FIGURA 10
Peso absoluto e relativo dos rins dos animais programados
por exposição materna à nicotina na lactação.
39
FIGURA 11
Proteinúria dos animais programados por exposição materna
à nicotina na lactação.
40
FIGURA 12
Clearance e concentração sérica de creatinina em animais
programados por exposição materna à nicotina na lactação.
41
FIGURA 13
Concentração sérica de sódio e potássio em animais
programados por exposição materna à nicotina na lactação.
42
11
LISTA DE ABREVIATURAS
ADH Hormônio antidiurético (vasopressina)
BRO bromocriptina (2-bromo-α-ergocriptina)
C controle
ClCr clearance da creatinina
D
2
receptor de dopamina tipo 2
EPM erro padrão da média
GH hormônio do crescimento
hPL lactogênio placentário
Hts hormônios tireódeos
IGF-1 fator de crescimento semelhante à insulina do tipo 1
IGF-2 fator de crescimento semelhante à insulina do tipo 2
i.p intraperitoneal
NaCl cloreto de sódio
NIC grupo exposto à nicotina
NPY neuropeptídio Y
PC peso corporal
PIF fator inibidor de prolactina
PRF fator liberador de prolactina
PRL prolactina
RAS sistema renina angiotensina
Rpm rotações por minuto
TARP tecido adiposo retroperitoneal
T
3
3, 5, 3’ - triiodotironina
TRH hormônio liberador de tireotrofina
12
Introdução
13
Estudos epidemiológicos e experimentais evidenciaram que alterações
nutricionais ou hormonais em períodos críticos do desenvolvimento, como a
gestação e/ou a lactação, podem resultar em modificações estruturais,
metabólicas e funcionais de tecidos e sistemas do organismo, que podem se
tornar permanentes na idade adulta, resultando no desenvolvimento de doenças.
Esta relação tem sido chamada de “programação” (Barker, 1994; Lucas, 1994,
Moura & Passos, 2005).
Estudos com animais experimentais para testar a hipótese da
“programação” têm imposto perturbações tais como desnutrição materna
moderada ou severa, exposição hormonal ou à nicotina durante a gestação e/ou
lactação. A grande maioria destes estudos confirma que estas perturbações
levam ao desenvolvimento de excesso de peso (Passos et al, 2000), diminuição da
sensibilidade a insulina (Burns et al., 1997; Bertin et al., 1999), aumento da
pressão arterial (Almeida & Mandarim-de-Lacerda, 2005; Tonkiss et al., 1998;
Woodall et al., 1996), disfunção renal (Almeida & Mandarim-de-Lacerda, 2005),
disfunções no eixo hipotálamo-hipófise tireóide e resistência à ação da leptina
(Passos et al 2002, Passos et al, 2004, Vicente et al, 2004).
Observou-se, que o peso corporal dos animais adultos varia de acordo com
o estado nutricional materno na lactação. A desnutrição materna na lactação
programa o peso corporal, a função tireóidea e a resistência à ação anorexigênica
da leptina da prole na idade adulta (Passos et al, 2000, Passos et al 2002, Passos
et al, 2004). As mães desnutridas apresentam alterações importantes na
produção e composição do leite (Passos et al., 2000), com maior secreção de T3
pelo leite (Passos et al., 2001), aumento na concentração sérica de leptina e
diminuição na concentração sérica de prolactina (Lisboa et al., 2006).
14
A restrição protéica em ratas na gestação está associada à diminuição do
peso renal, do número de néfrons e da taxa de filtração glomerular da prole ao
nascimento (Langley-Evans, 1999a).
Lucas e colaboradores (1989, 1991, 1997 e 2001) demonstraram que
filhotes de ratas submetidas à restrição calórica de 50% na primeira metade,
segunda metade ou durante toda a gravidez, apresentaram diminuição da taxa de
filtração glomerular, do número e da morfologia glomerular aos 3 meses de idade,
com importante nefroesclerose. Em estudo recente, Almeida & Mandarim-de-
Lacerda (2005), em modelo de restrição calórica (50%) na gestação ou lactação,
evidenciaram hipertensão, disfunção renal e glomeruloesclerose na prole com 120
dias.
A inibição da prolactina (PRL) materna leva a um quadro de desnutrição
da prole lactente e, quando realizado ao final da lactação, serve como um modelo
de desmame precoce. Os resultados do estudo utilizando o modelo de
programação por inibição da PRL na lactação sugerem que este hormônio
desempenha um papel importante na regulação do peso corporal e da função
tireoideana durante o desenvolvimento, inclusive com resistência ao efeito
anorexigênico da leptina na prole programada quando adulta (Bonomo et al.,
2007). Entre as alterações na composição do leite, decorrentes do bloqueio da
PRL, há a maior passagem de leptina pelo leite das mães tratadas com
bromocriptina (Bonomo et al., 2005). Curiosamente, animais cujas mães foram
tratadas com leptina na lactação e, portanto tiveram maior passagem de leptina
através do leite (Lins et al., 2005), desenvolveram uma forma de programação da
ação da leptina, do peso e composição corporal, que guardam alguma semelhança
com o modelo de bloqueio da PRL.
Muitos modelos animais têm demonstrado uma associação entre baixo
peso ao nascer (induzido por exposição materna à restrição protéica,
15
dexametasona, gentamicina, deficiência de vitamina A ou isquemia uterina) com
hipertensão arterial na idade adulta (Gilbert et al, 1991; Celsi et al, 1998;
Vehaskari et al, 2001). Como a inibição da PRL também leva a um baixo peso, ela
pode ser incluída como um destes modelos animais citados. Não encontramos na
literatura estudos relacionados especificamente ao bloqueio da PRL na lactação e
efeitos sobre a função renal da prole na vida adulta. Estes efeitos serão
demonstrados pela primeira vez no presente estudo.
Por outro lado, a exposição materna a fatores exógenos, tais como
poluentes e drogas como álcool e cigarro, pode programar a prole. A
administração de nicotina (um dos principais componentes do cigarro) às ratas
lactantes pode imprimir alterações na prole, através da passagem desta
substância pelo leite.
16
REVISÃO DE LITERATURA
PROGRAMAÇÃO METABÓLICA
Diversos estudos têm mostrado que a gestação e/ou a lactação podem ser
períodos críticos para o futuro desenvolvimento nutricional e hormonal da prole,
uma relação que tem sido denominada programação (Barker et al 1989; Lucas,
1991). Esta seria uma modificação permanente de uma determinada função,
conseqüente a uma alteração nutricional ou hormonal ocorrida em um período
crítico nos primeiros dias de vida.
Hormônios e seus receptores exercem importantes efeitos tecido-
específico e idade específica sobre o desenvolvimento (Dauncey
et al.,
2001).
Durante o desenvolvimento fetal, as ações coordenadas de IGF-1, IGF-2, insulina,
glicocorticóides e hormônios tireódeos (HTs) desempenham papel central no
controle e diferenciação, crescimento e maturação (Fowden, 1999).
A teoria da programação metabólica destaca a importância da
plasticidade dos fenômenos biológicos em resposta à ação externa, como por
exemplo, carência ou excesso de alimento. Entretanto, os mecanismos envolvidos
nesse processo não estão totalmente esclarecidos, mas o período e o tempo de
exposição a estímulos ou insultos metabólicos parecem ser particularmente
importantes, visto que, em mamíferos, a maior parte do desenvolvimento relativo
ao processo de divisão celular ocorre na vida intra-uterina, sendo que em alguns
órgãos este desenvolvimento continua após o nascimento (Nyirenda
et al.,
2001).
Portanto, para a aplicação da teoria da programação metabólica, dois
critérios têm sido considerados fundamentais. O primeiro corresponde ao
período em que ocorre o processo de interação com os fatores ambientais, ou
17
seja, a potencialidade do fenômeno a ser observado depende do momento ou
período de ocorrência no transcorrer do desenvolvimento biológico, chamado de
período crítico ou vulnerável (critical ontogenic window). E o segundo critério diz
respeito à irreversibilidade das modificações observadas (Moura & Passos,
2005).
18
DESENVOLVIMENTO RENAL
Em embriões de mamíferos, o metanéfron ou rim permanente é derivado
de interações recíprocas de dois derivados mesodérmicos primordiais: o broto
ureteral e o mesênquima metanéfrico. Por volta do 28º dia de gestação no
homem, (dia embrionário E11 em ratos), o broto ureteral evagina-se a partir das
porções caudais do ducto de Wolff e invade o blastema do mesênquima
metanéfrico (Pohl et al. 2002). A seguir, uma série de modificações teciduais dá
lugar a organogênese renal.
Sumariamente, os condensados mesenquimais durante o processo de
epitelialização e diferenciação celular adquirem uma luz em seu interior
culminando com a formação de vesículas renais. As células no pólo distal destas
vesículas alteram sua forma ao mesmo tempo em que a vesícula dobra-se sobre si
mesma originando uma fenda para formar um corpo que lembra a forma de uma
vírgula, conhecida como comma-shaped body. Em seguida uma outra dobra em
sentido antagônico a primeira se forma no pólo proximal do comma-shaped body,
fazendo assim que a vesícula original assuma então a forma de uma letra S, sendo
agora dita um S-shaped body. O S-shaped body inicia um processo de
alongamento e finalmente acaba por fundir-se distalmente com a sua respectiva
ponta de broto ureteral ocorrendo então a comunicação de suas luzes de modo a
formarem um ducto contínuo. No interior da fenda do pólo distal do S-shaped
body começa surgir material de matriz extracelular no meio do qual vai ocorrer o
processo de vasculogênese, que desenvolverá neste sítio a futura região
mesangial. Todas estas estruturas se organizam no sentido da evolução para o
que conhecemos como glomérulo adulto.
Este processo iniciando-se nas regiões mais superficiais do córtex renal é
seguido por divisões subseqüentes de novos ramos do broto ureteral com
expansão e crescimento de novo tecido de uma maneira centrífuga, de modo a
encontrarmos estruturas mais distintamente evoluídas em posições mais
19
profundas do córtex renal que foi se formando. Enquanto isto, nas regiões mais
superficiais, novas gerações de ramos do broto ureteral vão sendo induzidos pelo
próprio mesênquima a se ramificar mais e com eles novos concentrados, vesículas
e novos glomérulos imaturos que sofrerão o mesmo processo. (Almeida e
Mandarim-de-Lacerda 2002, Almeida et al. 2003).
Todos os componentes do sistema renina–angiotensina (RAS) estão
presentes no desenvolvimento do rim e são importantes na nefrogenesis (Guron
& Friberg, 2000). Vários estudos de programação fetal têm mostrado que a
menor expressão dos componentes do RAS durante o período ativo de
nefrogenesis está associada com menor número de néfrons e hipertensão arterial
(HA) na idade adulta (Vehaskari et al., 2004; Woods et al 2001). Além disso,
outros estudos sugerem uma interação entre glicorticoides e RAS intrarenal, tal
como o excesso de glicocorticoides como um regulador negativo dos componentes
do RAS no feto (Celsi et al., 1998; Segar et al., 1995).
20
PROGRAMAÇÃO NEONATAL E FUNÇÃO RENAL
Vários autores (Langley-Evans et al.,1999a; Woods et al.,2001; Vehaskari
et al., 2001), desenvolveram modelos de restrição protéica materna em ratos.
Todos observaram redução no número de nefrons na prole de mães submetidas à
restrição protéica. Isto sugere que eventos perinatais podem influenciar o
desenvolviment renal.
Em modelos de desnutrição fetal foi demonstrado que proles com baixo
peso ao nascimento desenvolvem hipertensão na idade adulta. Em ratos, a
restrição protéica e calórica (30%) na gestação resultou em prole com peso até
33% mais baixo e com pressão sistólica 5 a 8 mmHg mais elevada quando adultos
(Woodall et al., 1996). Um modelo mais moderado de restrição protéica na
gestação (9% de proteína), resultou em pequena diminuição do peso ao nascer e
retardo no crescimento dos órgãos do tronco, sem, entretanto, afetar o cérebro.
Estes animais apresentaram aumento da pressão arterial a partir de 4 semanas
de idade (Langley-Evans, 1994a) que persistiu até a idade adulta (Langley-Evans,
1994b).
Vários mecanismos têm sido propostos para explicar os efeitos da
desnutrição materna sobre a pressão arterial da prole, incluindo diminuição da
sensibilidade do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, diminuição da atividade 11-β
hidroxiesteróide desidrogenase placentária (11-β HSD) e alteração do
desenvolvimento renal (Langley-Evans, 1999b).
Apesar do rim ter um papel importante na regulação da pressão arterial
em longo prazo e novas evidências apontarem para a programação
in utero
deste
mecanismo, o rim fetal tem sido pouco estudado. A glomerulogênese tem sido
avaliada quantitativa em ratos (Bertram et al. 2000) e em humanos (Almeida e
Mandarim-de-Lacerda, 2002). O rim fetal pode ser afetado pelo estado
21
nutricional materno durante a gestação. A restrição protéica em ratas na
gestação está associada à diminuição do peso renal, do número de néfrons e da
taxa de filtração glomerular da prole ao nascimento (Langley-Evans, 1999a).
Lucas e colaboradores (1989,1991 e 1997) demonstraram que filhotes de
ratas submetidas à restrição calórica de 50% na primeira metade, segunda
metade ou durante toda a gravidez apresentaram diminuição da taxa de filtração
glomerular, do número e alteração morfológica glomerular aos 3 meses de idade.
Mais recentemente Lucas e colaboradores (2001) mostraram significativa
diminuição da taxa de filtração glomerular além de importante nefroesclerose
nesses animais desnutridos na gestação.
22
INIBIÇÃO DA PRL NO PERÍODO NEONATAL
A PRL é um hormônio polipeptídico de cadeia simples, com peso molecular
23 kDa, pertencente à família de hormônios somatomamotróficos,
estruturalmente relacionada ao GH e ao lactogênio placentário (hPL) (Tyrrell et
al, 1994). Sua homologia entre primatas pode variar em 97%; e entre primatas e
roedores 56% (Sinha, 1995). O bloqueio deste hormônio na lactação reduz a
produção de leite e conseqüentemente causa desnutrição da prole neste período,
caracterizando um modelo de programação hormonal (Bonomo et al., 2005;
Bonomo et al., 2007).
A PRL é sintetizada e secretada pelos lactotrofos adenohipofisários, sob
influência de vários fatores, tais como: sono, estresse, hipoglicemia, exercício,
estrogênio, TRH e dopamina (Ascoli & Segaloff, 1996). Sabe-se que a PRL pode
ser produzida no cérebro, placenta e glândula mamária; sendo suas variantes
encontradas em vários tecidos de mamíferos, podendo ser resultado de junção
alternativa do transcrito primário, clivagem proteolítica e modificações pós-
traducionais da cadeia de aminoácidos (Freeman et al, 2000).
Em mamíferos, o controle hipotalâmico sobre a secreção de PRL é
amplamente inibitório, sendo exercido pelo fator inibidor da liberação de PRL
(PIF) (Melmed & Kleinberg, 2002). Observou-se que drogas que afetam o
metabolismo das catecolaminas são capazes de alterar a secreção de PRL; o fato
da dopamina estar presente em alta concentração na eminência média e
pedúnculo hipofisário sugere que a dopamina seja o principal PIF hipotalâmico
(Freeman et al, 2000). A existência de receptores dopaminérgicos na
adenohipófise, bem como a evidência morfológica da íntima relação entre os
terminais neurosecretores de dopamina e os pequenos vasos sangüíneos do
23
sistema porta hipofisário, sustentam a hipótese de que a dopamina é um
neurotransmissor inibidor fisiológico da liberação de PRL (Ascoli & Segaloff,
1996). Sabe-se que a dopamina inibe a secreção de PRL, ¨
in vivo”
e “
in vitro¨
,
por se ligar a receptores dopaminérgicos na membrana dos lactotrofos (Melmed
& Kleinberg, 2002), pertencentes à subclasse D2 (Dal Toso et al, 1989).
Sabe-se que o TRH é capaz de promover a liberação de PRL dos
lactotrofos de maneira dose-dependente; sendo conhecido como o fator
estimulador da secreção de PRL (PRF). O TRH estimula uma secreção bifásica de
PRL, caracterizada por uma primeira fase de elevação rápida, seguida por
concentração menor na fase secundária (Melmed & Kleinberg, 2002).
O principal sítio de ação da PRL é a glândula mamária, contribuindo para o
crescimento e desenvolvimento do tecido (mamogênese), estimulando a síntese
de leite (lactogênese) (Tyrrell et al, 1994), sendo responsável pelo início e
manutenção da lactação. No processo de lactogênese, a PRL estimula a captação
de aminoácidos, síntese de caseína e α-lactoalbumina, captação de glicose e
síntese da lactose e gordura láctea (Tucker, 1994).
A hipófise murina neonatal produz pouca PRL, sendo cerca de 20% da PRL
circulante do filhote proveniente da transferência através do leite materno
(Chen, 1987). Vários estudos estabeleceram que a PRL transferida pelo leite nos
5 primeiros dias pós-parto é necessária para o desenvolvimento apropriado da
função neuroendócrina (Shah et al, 1988) e sistema imune da prole (Gunes &
Mastro, 1996).
Os receptores para PRL foram identificados no túbulo proximal, na
porção ascendente da alça de Henle, túbulo contornado distal e ducto coletor
(Evan et al., 1977; Mountjoy et al., 1980).
Sakai et al. (1999) demonstraram que as células parietais da cápsula de
Bowman no rim sintetizam PRL de uma maneira autócrina/paracrina. A PRL é
24
capaz de inibir a atividade Na
+
K
+
-ATPase no túbulo proximal (Ibarra et al.,
2005), o que pode explicar porque ratos tratados com PRL apresentam maior
excreção urinária de sódio, potássio e água. Apesar de estimular a secrecão de
aldosterona (Kau et al., 1999), a PRL não apresenta efeito importante sobre a
filtração glomerular ou pressão arterial média (Ibarra et al., 2005).
A bromocriptina (BRO), um agonista dopaminérgico, ativa diretamente os
receptores de dopamina nos lactotrofos (D2), inibindo a liberação de PRL
espontânea e induzida pelo TRH (Ascoli & Segaloff, 1996).
Bonomo (2003) demonstrou em ratas lactantes tratadas com BRO nos
três últimos dias da lactação (19, 20 e 21), que a inibição da PRL programou para
hipometabolismo e hipotireoidismo na prole dulta. Detectou-se redução da
lactogênese e baixo peso dos filhotes ao desmame em decorrência de uma
desnutrição calórica moderada. Ratas lactantes BRO apresentaram menor peso
corporal e o seu leite apresentou maior conteúdo de leptina (Bonomo et al.,
2005), contudo sem exibir alteração da composição bioquímica.
A prole BRO quando adulta apresentou maior adiposidade central e total,
sem hiperfagia, hiperleptinemia e resistência central à leptina (Bonomo et al.,
2007). Além disto, verificou-se um hipotireoidismo secundário. O maior peso
corporal, sem alteração de ingestão alimentar e a redução dos HTs sugerem o
desenvolvimento de um quadro de hipometabolismo na vida adulta. A avaliação da
composição corporal destes animais mostrou ainda maior proteína corporal e
glicogênio muscular, e menor quantidade de água e minerais totais. Também se
observou hiperglicemia, hipercorticosteronemia e hipoadiponectinemia, que
sugerem o desenvolvimento de resistência à insulina neste modelo. Quanto ao
perfil lipídico, detectou-se hipertrigliceridemia e hipercolesterolemia na idade
adulta.
25
Não existe, até o momento, na literatura nenhum estudo sobre inibição da
PRL em ratas no período neonatal e programação da função renal. Assim
objetivamos estudar a função renal neste modelo de programação hormonal.
26
EXPOSIÇÃO MATERNA À NICOTINA NO PERÍODO NEONATAL
Sabe-se que o cigarro é um fator de risco importante na progressão da
doença renal crônica (Orth, 2000). Sugere-se que a nicotina, por ser um potente
mitogênico, induza a produção de matriz extracelular nas células mesangiais
humanas (Mercado & Jaimes, 2007). O risco relativo de microalbuminúria é bem
maior (1,92) em fumantes (>20 cigarros/dia) (Pinto-Sietsma et al., 2000; Halimi
et al., 2000).
O tabagismo na gestação é considerado um fator de risco de morbi-
mortalidade perinatal, baixo peso ao nascer e anormalidades neurológicas (Butler
& Goldstein, 1973; Navarro et al., 1989; DiFranza & Lew, 1995). Sabe-se que,
após poucos cigarros, ocorrem alterações como: elevação de ADH, GH,
glicocorticóides, adrenalina e leptina (Ramos & Ramos, 2002). A nicotina está
presente no leite materno, e a prole lactente apresenta taquicardia, sugerindo
um aumento na ação adrenérgica (Silva, 2002). O fumo na gestação relaciona-se a
menor concentração de leptina no cordão umbilical do recém nato, prematuros ou
não (Mantzoros et al., 1997).
Estudos demonstram uma associação inversa entre tabagismo e peso
corporal, sugerindo que a interrupção da exposição à nicotina ocasione ganho de
peso (Levin et al.,1987). Ratos expostos à nicotina apresentam perda de peso,
diminuição na ingestão alimentar, aumento de gasto energético e de NPY (Li et
al., 2000).
Foi relatado que a exposição à nicotina no período pré e perinatal leva a
um aumento de peso corporal da prole aos 3 meses de idade (Chen & Kelly, 2005).
Recentemente, nosso grupo evidenciou que a administração materna de nicotina,
apenas na lactação, programou maior peso corporal, maior adiposidade (central e
total) e disfunção tireoideana na prole adulta.
27
Embora existam poucos estudos sobre as alterações renais provocadas
pela nicotina, Czekaj et al (2002) demonstraram, em ratas gestantes expostas à
nicotina, modificação do formato dos túbulos contorcidos, proximal e distal, com
diminuição da altura do epitélio cúbico. Não encontramos referências a estudos
relacionando exposição à nicotina na lactação e efeitos sobre os rins da prole.
Isso nos motivou a incluir este modelo no estudo proposto.
28
Objetivos
29
OBJETIVO GERAL
Avaliar a função renal nos seguintes modelos de programação metabólica
durante a lactação: inibição da síntese materna de PRL com bromocriptina (BRO)
e exposição materna à nicotina.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS;
Modelo de inibição da PRL com BRO
Acompanhar peso corporal e ingestão alimentar do desmame até a idade
adulta;
Determinar as concentrações séricas de creatinina, sódio e potássio aos
30, 90 e 180 dias de idade;
Determinar o clearance de creatinina na urina de 24h aos 90 e 180 dias;
Determinar a proteinúria aos 30, 90 e 180 dias de idade;
Modelo de exposição materna a nicotina
Acompanhar peso corporal e ingestão alimentar durante a lactação até a
idade adulta;
Determinar as concentrações séricas de creatinina, sódio e potássio aos
180 dias de idade;
Determinar o clearance de creatinina na urina de 24h aos 180 dias;
Determinar a proteinúria aos 180 dias de idade;
30
Materiais e Métodos
31
MODELOS EXPERIMENTAIS
PROGRAMAÇÃO POR INIBIÇÃO DA PRL MATERNA: MODELO
EXPERIMENTAL DE RESTRIÇÃO CALÓRICA MODERADA NEONATAL
Ratas Wistar fêmeas, nulíparas, com 3 meses de idade, foram
mantidas em biotério em temperatura (25±1°C) e ciclo claro-escuro (7:00-19:00)
controlados. As ratas foram acasalados na proporção de 2 fêmeas para 1 macho,
recebendo ração comercial e água sem restrição. Ao nascimento, cada ninhada foi
limitada a 6 filhotes machos, para maximizar o potencial lactotrófico (Fishbeck &
Rasmussen, 1987).
Durante a lactação, as lactantes foram divididas em 2 grupos
experimentais:
BRO: que recebeu 1 mg de 2-bromo-alfa-ergocriptina (BRO - Novartis, SP, BR),
em 200 µl de solução metanol-salina (1:1), 2x/dia, nos 3 últimos dias da lactação;
(Bonomo et al., 2005; Bonomo et al., 2007)
C: que recebeu 200 µl de solução metanol-salina 1:1, 2x/dia, nos 3 últimos dias da
lactação.
32
Figura 1: esquema experimental, onde: C = grupo controle; BRO = grupo
tratado com bromocriptina.
C
BRO
18, 19,
20 dias
RATAS
LACTANTES
21 dias
21 dias
DESMAME
T
RATAMENTO
18, 19,
20 dias
IDADE ADULTA
90 e
180
dias
90 e
180
dias
SACRIFÍCIO
(
PROLE
)
33
PROGRAMAÇÃO POR EXPOSIÇÃO MATERNA À NICOTINA NO PERÍODO
NEONATAL:
Ratas Wistar adultas nulíparas, mantidas em biotério sob condições
controladas, foram acasaladas (2 fêmeas/1 macho), recebendo água e ração sem
restrição. Após 24 h do parto, para maximizar o potencial lactotrófico,
ajustamos a ninhada para 6 filhotes machos (Fishbeck & Rasmussen, 1987).
Ao nascimento da prole, as ratas lactantes foram divididas em 2 grupos:
NIC (bomba infusora de nicotina): minibombas osmóticas (Alzet, 2ML2)
implantadas s.c., liberando nicotina free-base (6mg/Kg/dia) diluída em NaCl 0,9%
durante 14 dias de lactação;
C (bomba controle): minibombas implantadas s.c. liberando solução salina,
diariamente, por 14 dias da lactação.
Figura 2: esquema experimental, onde: C = grupo controle; NIC = grupo
exposto à nicotina.
C
NIC
14 dias
RATAS
LACTANTES
21 dias
21 dias
DESMAME
T
RATAMENTO
14 dias
VIDA ADULTA
180 dias 180 dias
SACRIFÍCIO
(
PROLE
)
34
Em ambos os modelos, o peso corporal e a ingestão de ração das proles
foram avaliados a cada 4 dias até a idade adulta.
Dois dias antes do sacrifício, as proles de ambos os modelos experimentais
de programação foram colocadas em gaiola metabólica para a coleta da urina de
24 horas, que foi centrifugada e analisada.
As proles BRO (30, 90 e 180 dias de vida) e NIC (180 dias de vida) foram
sacrificadas após anestesia com pentobarbital (0,15 mL/ 100 g PC, ip). O sangue
foi coletado, por punção cardíaca, centrifugado (3.000 rpm/4ºC/15 minutos) e o
soro obtido, armazenado em freezer a -20ºC.
Foi realizada a ressecção e pesagem da gordura retroperitoneal para
avaliar a adiposidade central (Toste et al, 2006; Fagundes et al, 2007).
35
PARÂMETROS AVALIADOS NOS MODELOS DE PROGRAMAÇÃO:
Peso renal
A razão entre o peso dos rins (Rim) e o peso corporal (PC) foi determinada
para calcular o peso renal relativo = Rim(g)/PC(g).
Medidas da função renal
A avaliação da proteinúria foi realizada por um analisador automático A15
da marca BioSystemes, após a centrifugação da urina, pelo método do Vermelho
de Pirogalol. A proteína presente na amostra reage com o vermelho de pirogalol e
o molibdato em meio ácido, originando um complexo colorido quantificado por
espectrofotometria.
O sódio e potássio séricos foram avaliados pelo método do íon seletivo em
um aparelho AVL 9180 Electrolyte Analyser, utilizando um kit SnapPack Roche.
As concentrações séricas e urinárias de creatinina foram medidas pelo
método do picrato alcalino, onde a creatinina presente na amostra reage com o
picrato em meio alcalino originando um complexo colorido. A velocidade de
formação do complexo é medida no período inicial da reação, evitando-se a
interferência de outros compostos. O aparelho utilizado foi um analisador
automático A15 marca BioSystems.
O clearance de creatinina foi então calculado como: ClCr = creatinina
urinária (mg/dL) x fluxo urinário (mL/min) / creatinina sérica (mg/dL); e
posteriormente corrigido para a massa corporal dos animais (em kg), conforme
detalhado abaixo.
O fluxo urinário coletado (volume) no período de 24 horas (1440 minutos)
foi dividido pelo tempo de coleta. Os resultados foram expressos em ml/min. Em
nosso protocolo, o volume urinário foi corrigido pelo peso do rato sendo expresso
por 100 g de peso corporal. Os resultados foram expressos em µl/min/100g p.c.
36
EXEMPLO:
Amostra NIC 0969 Registro C9F1 30
Volume urinário = 7,5 ml (7500 µl)
Tempo = 1440 min.
Peso corporal = 65,5 g
Fluxo urinário por minuto = 7,5 / 1440 = 0,0052 ml/min = 5,2 µl/min
V’=Fluxo urinário por 100 g de peso corporal= (5,2 X 100) / 65,5 = 7,95
µl/min/100g p.c.
Clearance de creatinina (CCr):
Representa a depuração plasmática da creatinina por unidade de tempo
pela totalidade dos glomérulos renais funcionantes, calculada pela fórmula (U x
V'/P), sendo U a concentração urinaria de creatinina, V' o fluxo urinário minuto e
P a concentração plasmática de creatinina. Os resultados foram expressos em
µl/min/100g p.c.
EXEMPLO:
Amostra NIC 0969 Registro C9F1 30
U = Creatinina urina = 20,65 mg/dL
P = Creatinina soro = 0,59 mg/dL
V’= 7,95 µl/min/100g p.c.
CCr = Clearance de creatinina = (20,65 X 7,95) / 0,59 = 278 µl/min/100g
p.c.
37
Análise estatística:
Os dados foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM). Para
comparação entre os grupos foi utilizado o teste t de Student não pareado. A
análise de variância bivariada (Two-way ANOVA) foi aplicada nos parâmetros de
evolução temporal de peso corporal e consumo alimentar. As diferenças foram
consideradas significativas quando p < 0,05.
38
Resultados
39
Estado nutricional dos animais programados por inibição da PRL materna na
lactação:
Os animais mantidos até a idade adulta (180 dias), cujas mães foram
tratadas com BRO ao final da lactação não apresentaram alteração na ingestão
de ração (figura 1), porém apresentaram maior peso corporal a partir do 133º dia
(figura 2).
Aos 180 dias, estes animais exibiram aumento de 2 vezes do tecido adiposo
retroperitoneal (TARP). (figura 3).
Figura 1. Evolução da ingestão de ração por animais cujas mães foram tratadas com
bromocriptina (BRO) ou não (CON) na lactação. Os dados são expressos em média ± EPM,
n = 8 animais/grupo.
0 25 50 75 100 125 150 175 200
0
10
20
30
CON
BRO
dias
Ingestão de ração
(g/dia)
40
0 25 50 75 100 125 150 175 200
0
100
200
300
400
500
CON
BRO
*
dias
Peso corporal (g)
Figura 2: Evolução do peso corporal de animais cujas mães foram tratadas com
bromocriptina (BRO) ou não (CON) na lactação. Os dados são expressos em média ± EPM,
onde: * p < 0,05. n = 8 animais/grupo.
Figura 3. Tecido adiposo retroperitoneal (TARP) de animais adultos (180 dias) cujas
mães foram tratadas com bromocriptina (BRO) ou não (C) na lactação. Os dados são
expressos em média ± EPM, onde: * p < 0,05. n = 8 animais/grupo.
C
BRO
0
10
20
30
40
*
TARP g
41
Peso absoluto e relativo dos rins dos animais programados por inibição da
PRL materna na lactação:
A figura 4 mostra os pesos absoluto e relativo (relação peso
renal/corporal) renais da prole BRO aos 30, 90 e 180 dias de idade. Aos 30 dias,
os animais BRO apresentaram maior (15,4%; p< 0,05) peso renal absoluto e menor
peso relativo, embora não estatisticamente significativo. Aos 90 e 180 dias,
embora não haja diferença significativa no peso absoluto do rim, ocorre uma
diminuição significativa do peso renal relativo (9,2%, 15,7%, respectivamente,
p<0,05 - figuras 4D e 4F).
42
C BRO
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
*
A
g
C BRO
0.00
0.25
0.50
0.75
B
Peso rim/
Peso corporal g
C BRO
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
C
g
C BRO
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
*
D
Peso rim/
Peso corporal g
C BRO
0
1
2
E
g
C BRO
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
*
F
Peso rim/
Peso corporal g
Figura 4 - Peso absoluto e relativo do rim de ratos com 30 (A, B), 90 (C, D) e 180 (E, F)
dias de idade cujas mães foram tratadas com bromocriptina (BRO) ou não (C) na
lactação. Os dados são expressos em média ± EPM, onde: * p < 0,05. n = 7 animais/grupo.
43
Proteinúria dos animais com 30, 90 e 180 dias de idade programados por
inibição da PRL materna na lactação:
Aos 30 e 180 dias de idade o grupo BRO apresentou maior proteinúria
(93% e 36%, p< 0,05, respectivamente) comparado aos controles (figuras 5A e
5C). Aos 90 dias, a proteinúria também foi maior (28%), porém não foi
estatisticamente significativa (figura 5B).
C bromo
0
10
20
B
mg/ 24h
C Bromo
0
10
20
*
C
mg/ 24h
Figura 5 - Proteinúria dos animais 30 (A), 90 (B) e 180 (C) dias de idade cujas mães
foram tratadas com bromocriptina (BRO) ou não (C) na lactação. Os dados são expressos
em média ± EPM, onde: * p < 0,05. n = 7 animais/grupo.
C Bromo
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
*
A
mg/24h
44
Clearance e concentração sérica de creatinina em animais com 90 e 180 dias
programados por inibição da PRL materna na lactação:
Os animais BRO apresentaram menor clearance de creatinina tanto aos 90
(figura 6 A) quanto aos 180 (figura 6 B) dias de idade (32%; p<0,03 e 30%;
p<0,05; respectivamente). Com relação a creatinina sérica, estes animais
apresentaram maiores concentrações aos 180 dias (20%; p<0,05), conforme
mostra a figura 6 D.
C BRO
0
100
200
300
400
500
*
A
clearence creatinina
µ
l/min/100g p.c.
C BRO
0
100
200
300
400
500
600
*
B
clearence creatinina
µ
l/min/100g p.c.
C BRO
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
C
mg/dl
C BRO
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
*
D
mg/dl
Figura 6 – Clearance de creatinina dos animais com 90 (A) e 180 (B) dias de idade.
Creatinina sérica dos animais com 90 (C) e 180 (D) dias de idade cujas mães foram
tratadas com bromocriptina (BRO) ou não (C) na lactação. Os dados são expressos em
média ± EPM, onde: * p < 0,05. n = 7 animais/grupo.
45
Concentração sérica de sódio e potássio em animais com 30, 90 e
180 dias programados por inibição da PRL materna na lactação:
Os animais BRO não apresentaram alteração na concentração sérica de
sódio em nenhuma das idades estudadas (figura 7 A, B e C, respectivamente). No
entanto, as concentrações séricas de potássio foram maiores aos 90 (19%,
p<0,05) e 180 dias (29%; p<0,02) comparados aos respectivos controles.
46
C BRO
0
100
200
A
Sódio mEq/L
C BRO
0
100
200
B
Sódio mEq/L
C BRO
0
100
200
C
Sódio mEq/L
C BRO
0
1
2
3
4
5
6
7
D
Potássio mEq/L
C BRO
0
1
2
3
4
5
6
7
*
E
Potássio mEq/L
C BRO
0
1
2
3
4
5
6
*
F
Potássio mEq/L
Figura 7 – Concentração sérica de sódio dos animais com 30 (A), 90 (B) e 180 (C) dias de
idade. Concentração sérica de potássio dos animais com 30 (D), 90 (E) e 180 (F) dias de
idade, cujas mães foram tratadas com bromocriptina (BRO) ou não (C) na lactação. Os
dados são expressos em média ± EPM, onde: * p < 0,05. n = 7 animais/grupo.
47
Estado nutricional dos animais programados por exposição materna à
nicotina na lactação:
Não detectamos alteração de peso corporal da prole lactente (figura 8A)
cujas mães foram expostas à nicotina na lactação. Porém, o peso corporal do
grupo NIC aumentou significativamente dos 73 aos 93 dias de idade (p<0,01) e
dos 163 aos 180 dias (p<0,05) como mostra a figura 8B. Apesar desse aumento do
peso corporal esses animais não apresentaram alterações no consumo alimentar
(figura 8C).
48
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
0
10
20
30
40
C
NIC
idade (dias)
Peso Corporal (g)
A
0 25 50 75 100 125 150 175 200
0
100
200
300
400
500
C
NIC
*
*
*
*
*
*
*
Idade (dias)
Peso corporal (g)
B
0 30 60 90 120 150 180
0
10
20
30
40
50
NIC
C
C
dias
ingestão ração g
Figura 8: Evolução do peso corporal durante a lactação (A), do desmame a idade adulta
(B) e ingestão alimentar de animais cujas mães foram expostas a nicotina (NIC) ou não
(C) na lactação. Os dados são expressos em média ± EPM, onde: * p < 0,05. n = 8
animais/grupo.
49
O grupo NIC apresentou maior TARP (20%) em relação ao grupo controle
(figura 9).
Figura 9: Quantidade de TARP de animais cujas mães foram expostas a nicotina (NIC)
ou não (C) na lactação. Os dados são expressos em média ± EPM, onde: * p < 0,05. n = 8
animais/grupo
C
NIC
0
2
4
6
*
TARP g
50
Peso absoluto e relativo dos rins dos animais programados por exposição
materna à nicotina na lactação:
O grupo NIC não exibiu alteração do peso renal absoluto e relativo (figura
10).
C
NIC
0.0
0.5
1.0
1.5
A
Peso rim g
C
NIC
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
B
Peso rim/
Peso corporal g
Figura 10 - Peso absoluto e relativo dos rins de ratos com 180 dias de idade cujas mães
foram expostas à nicotina (NIC) ou não (C) na lactação. Os dados são expressos em
média ± EPM, n = 8 animais/grupo.
51
Proteinúria dos animais com 180 dias programados por exposição materna à
nicotina na lactação:
Os animais NIC aos 180 dias de idade apresentaram menor proteinúria
(57%; p<0,01) comparado ao grupo controle (figura 11).
C NIC
0
5
10
15
*
Proteinúria mg/24h
Figura 11 – Proteinúria de ratos com 180 dias de idade cujas mães foram expostas à
nicotina (NIC) ou não (C) na lactação. Os dados são expressos em média ± EPM, onde: * p
< 0,01. n = 7 animais/grupo.
52
Clearance e concentração sérica de creatinina dos animais com 180 dias
programados por exposição materna à nicotina na lactação:
Conforme observamos na figura 11 A, o clearance de creatinina do grupo
NIC não se alterou significativamente aos 180 dias de idade. Entretanto, esses
animais apresentaram menor creatinina sérica (18%; p<0,01 - figura 12B).
C NIC
0
100
200
300
A
clearence creatinina
µ
l/min/100g p.c.
C NIC
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
*
B
mg/ dl
Figura 12 – Clearance (A) e concentração sérica (B) de creatinina em ratos com 180 dias
de idade cujas mães foram expostas à nicotina (NIC) ou não (C) na lactação. Os dados
são expressos em média ± EPM, onde: * p < 0,01. n = 7 animais/grupo.
53
Concentração sérica de sódio e potássio dos animais com 180 dias
programados por exposição materna à nicotina na lactação:
A figura 13A mostra que o grupo NIC não apresentou alteração na
concentração sérica de sódio, enquanto a concentração sérica de potássio foi
menor (22%, p<0,05) comparado ao controle (figura 13B).
C NIC
0
100
200
A
Sódio mEq/L
C NIC
0
5
10
*
B
Potássio mEq/L
Figura 13 – Concentração sérica de sódio (A) e potássio (B) em ratos com 180 dias de
idade cujas mães foram expostas à nicotina (NIC) ou não (C) na lactação. Os dados são
expressos em média ± EPM, onde: * p < 0,05. n = 7 animais/grupo.
54
DISCUSSÃO
55
Alguns modelos de programação baseados na desnutrição materna ou da
prole demonstraram um potencial importante de danos à função renal (Langley-
Evans, 1999ª, Lucas 2001). Neste estudo estamos demonstrando, pela primeira
vez, os efeitos da hipoprolactinemia e da exposição materna à nicotina na
lactação sobre a função renal da prole na idade adulta.
Bonomo et al (2007) demonstraram a participação da PRL na lactação
sobre a programação do peso corporal. Foi detectado, ao desmame, um menor
ganho do peso corporal (8%) nos filhotes cujas mães foram tratadas com BRO
nos 3 últimos dias de lactação, como conseqüência da menor oferta de leite à
prole, o que caracteriza uma desnutrição neonatal ou desmame precoce. Esta
desnutrição precoce, apesar de pequena e transitória, pode ter sido o fator de
imprinting do sobrepeso apresentado na idade adulta corroborando os dados de
estudos anteriores, em que a desnutrição foi mais severa e por toda a gestação
(Vickers et al., 2000) ou lactação (Passos et al., 2000, 2002, 2004, Vicente et
al., 2004).
No presente estudo, apesar da prole adulta não apresentar aumento do
consumo alimentar, observamos maior peso corporal a partir do 130º dia de vida,
provavelmente, devido à maior quantidade de gordura retroperitoneal, que está
aumentada em torno de 2 vezes aos 180 dias de idade.
É interessante observar o aumento do peso renal absoluto já aos 30 dias,
que se normaliza aos 90 e 180 dias. Porém, quando analisamos o peso renal em
relação ao peso corporal observamos, pelo contrário, menor peso relativo já aos
30 dias, intensificando a diferença até os 180 dias. Considerando que esses
animais apresentam uma desnutrição moderada na lactação, corroboramos os
estudos de programação da função renal em modelos de restrição protéica ou
56
calórica em ratas na gestação ou lactação, que mostram diminuição do peso renal,
associado, em alguns casos, a diminuição glomerular e de volume renal (Brenner
et al., 1988; Fassi et al., 1998; Langley-Evans, 1999a; Woods et al., 2001; Ots et
al. 2004; Zandi-Nejad et al., 2006)
A perda de massa renal funcional torna-se clinicamente evidente com o
desenvolvimento de hipertensão sistêmica e proteinúria tanto em indivíduos com
baixo peso ao nascer como em modelos experimentais de restrição protéica ou
calórica (Zandi-Nejad et al, 2006; Woods, 2007). Declínio da função renal
semelhante, com o desenvolvimento espontâneo de hipertensão arterial e
proteinúria, têm sido descritos em animais nascidos com número de néfrons
reduzidos (Brenner et al., 1988; Fassi et al., 1998,). O trabalho de Woods et al.,
(2001), mostrou que a restrição protéica foi capaz de reduzir o número de
néfrons em cerca de 35% e causar hipertensão, avaliada por catéter intra-
arterial de longa permanência, (cerca de 2 meses) sensível à sobrecarga de sal.
Brennner et al., (1988), após realizarem o clássico modelo de ablação de 5/6 da
massa renal e observarem hipertensão arterial, hipertrofia e esclerose
glomerular, submeteram os ratos a transplante renal isogênico. Chamaram esta
operação de “suplementação de rim” e observaram que o 1/6 de rim contra-
lateral curava-se da hipertrofia e esclerose glomerular enquanto o animal deixava
de ser hipertenso (Ots et al. 2004).
A programação pela BRO interrompe precocemente o aleitamento materno,
determinando uma restrição calórica menos severa que aquelas provocadas nos
modelos experimentais descritos usualmente na literatura. A expressão dessa
restrição na forma de programação se revela menos intensa, embora com
alterações significativas na função renal do rato adulto. Em nosso trabalho,
observamos aos 30 dias, maior proteinúria em um animal que ainda apresenta um
clearance normal, mas que vai se alterar em seguida. Acreditamos que, da mesma
57
forma que se verifica em seres humanos (Mimran et al., 1994), essa proteinúria
seja um prenúncio da lesão que evoluirá para um processo de insuficiência renal.
Os animais de 90 dias apresentam um aumento não significativo da proteinúria,
que evolui para se tornar significativo aos 180 dias. Finalmente, a insuficiência
renal nos animais BRO é evidenciada laboratorialmente, pela diminuição do
clearance da creatinina já a partir dos 90 dias, se mantendo aos 180 dias, e
também pelo aumento do potássio sérico aos 90 e 180 dias de idade e, pelo
aumento da creatinina sérica aos 180 dias, mostrando uma evolução gradual para
a insuficiência renal, com o envelhecimento. Estes dados corroboram o estudo de
Almeida & Lacerda (2005) que analisaram a função renal em ratos adultos, cujas
mães foram submetidas à restrição calórica na lactação, e também detectaram
diminuição do clearance da creatinina e aumento da proteinúria. Estas alterações
da função renal também foram encontradas em ratos adultos programados pela
restrição protéica na gestação (Nwagwu et al 2000). Estes achados são
sugestivos de uma deterioração progressiva da função renal em animais expostos
a desnutrição materna no período neonatal. Em ratos, a nefrogênese continua na
lactação, daí a importância dos estudos realizados durante a lactação.
A proteinúria é um marcador de doença renal que tem um valor
prognóstico; indivíduos com maior proteinúria têm maior morbidade, a qual está
relacionada à patologia renal e cardiovascular em geral (Marso et al., 2000).
Contrariamente aos resultados do presente estudo, realizado em machos,
Woods et al (2005) relataram que ratas fêmeas são relativamente resistentes à
programação da função renal pela restrição protéica moderada no período
perinatal. A restrição protéica materna não altera o clearance de creatinina
como ocorre nos machos e parece que o sistema renina-angiotensina intrarenal
tem um papel importante neste efeito protetor nas fêmeas. Porém, os estudos
sobre programação da função renal e gênero são controversos e parece que estão
relacionados com a severidade da restrição protéica e o tempo de administração
58
da dieta (Gurnani et al, 2000 and Vehaskari et al, 2001). Também, o
procedimento metodológico, pode influenciar no resultado, visto que se
mantivermos machos e fêmeas na mesma ninhada em restrição, a tendência é dos
machos consumirem mais que as fêmeas.
Um dos mecanismos que pode explicar as alterações da função renal em
animais programados por desnutrição materna pode ser a supressão do sistema
renina-angiotensina na fase fetal e/ou neonatal. Woods et al. (2001)
demonstraram, em modelo de restrição protéica materna na gestação, redução
dos níveis de angiotensina II, de RNAm de renina e da concentração de renina no
rim dos filhotes recém nascidos.
Algumas hipóteses podem ser levantadas com relação ao aumento de
potássio sérico nos animais adultos do grupo BRO do presente estudo. A primeira
seria uma diminuição nos níveis de aldosterona, já que ela aumenta a captação
celular e a excreção renal de potássio. Outra hipótese, considerando o fato de
que estes animais são resistentes à insulina (dados não publicados), seria a
diminuição da ação da insulina indutora da captação celular de potássio.
Os efeitos da leptina sobre o rim têm sido recentemente demonstrados.
Animais hiperleptinêmicos apresentam glomeruloesclerose focal e proteinúria
(Wolf et al., 2006 e Papafragkaki & Tolis , 2005). Em modelo de programação
semelhante ao do presente estudo, porém com administração materna de BRO no
início da lactação, foi demonstrado aumento de leptina sérica nos filhotes já a
partir do 4º dia de lactação (Bonomo et al., 2005). Em experimento posterior
(Bonomo et al., 2007), com administração de BRO ao final da lactação, foi
verificado hiperleptinemia na prole em idade adulta. Assim, a hiperleptinemia,
quer agindo como fator de impressão metabólica quer na idade adulta,
decorrente da obesidade, pode contribuir para a insuficiência renal.
A observação da associação entre obesidade e doença renal crônica (Hall
et al., 1999) chama a atenção para a importância clínica dos estudos sobre
59
programação e alterações da função renal. A ocorrência de hiperleptinemia
associada à obesidade e o conhecimento do potencial lesivo renal desse hormônio
(Wolf et al., 2006), justificam a atenção que deve ser dada à programação da
obesidade. Outra evidência que não deve ser negligenciada é a associação da
resistência à insulina comumente observada em obesos e os seus efeitos renais,
como, o aumento da invasão do tecido adiposo intrarenal por macrófagos, levando
a um remodelamento vascular com alteração da função renal. Além disso, a
hiperinsulinemia provoca diretamente um relaxamento da arteríola aferente,
hiperfiltração glomerular e danos renais (Knight et al., 2007).
Embora a constatação da ação lesiva da nicotina sobre os rins remonte aos
séculos 19 e 20 (Lickint, 1939), mais recentemente esses estudos foram
retomados e os fatores responsáveis pelas lesões renais foram identificados
(Orth, 2002c). O principal fator responsável pela lesão renal é a hiperativação da
divisão simpática do sistema nervoso autônomo (Ross, 2006). Odoni et al. (2002),
realizaram um experimento com ratos, onde, em um dos grupos submetido a ação
da nicotina, foi feita uma microcirurgia para denervação simpática. O grupo
exposto a nicotina sem cirurgia apresentou glomeruloesclerose, lesão tubular e
vascular, enquanto o grupo exposto a nicotina e submetido a denervação não
apresentou lesão renal.
Apesar da susceptibilidade renal a diversos tipos de fatores de
programação, como por exemplo, exposição ao excesso de glicocorticóides,
insuficiência de vitamina A ou desnutrição protéica-calórica, não observamos um
conjunto de evidências laboratoriais na prole adulta de mães expostas à nicotina
na lactação, que aponte para as alterações típicas de insuficiência renal na idade
adulta, apesar de apresentarem alterações que indicam uma programação, como o
aumento do peso corporal e da adiposidade central.
Outras alterações laboratoriais como a diminuição da proteinúria e das
concentrações séricas de potássio e creatinina merecem uma maior atenção.
60
O aumento do peso corporal, com aumento da gordura retroperitoneal pode
indicar uma condição de resistência à insulina. Em estudo recente, Bruin et al.
(2007) demonstraram que animais programados por exposição materna a nicotina
na gestação e lactação, apresentam redução da massa de células pancreáticas do
nascimento aos seis meses de idade, com conseqüente intolerância a glicose.
Porém, esse dano não ocorre se a exposição materna se restringe ao período de
lactação. Assim, existe a possibilidade de no nosso modelo de exposição à
nicotina somente no período de lactação, a prole adulta não apresente resistência
à insulina. É possível até, que ao contrário, nossos animais, quando adultos,
apresentem maior sensibilidade à insulina. Isso explicaria a diminuição do
potássio sérico pela ação indutora da insulina na captação de potássio celular e
um estímulo ao anabolismo protéico, que poderia estar associado à menor
concentração sérica de creatinina e menor proteinúria.
A proteinúria, presente em fumantes, mesmo moderados (Halimi et al.,
2000), encontra-se diminuída em nosso experimento. Embora isso possa indicar
uma possível proteção da integridade renal causada pela programação com a
nicotina, não conseguimos evidenciar de que forma ela ocorreria. Uma hipótese
plausível seria a desses animais apresentarem menor resposta à adrenalina e
conseqüentemente menor ativação simpática, contribuindo para uma relativa
proteção contra os efeitos
associados à doença renal (proteinúria, aumento da creatinina sérica e altos
níveis de potássio sérico). Além disso, a menor resposta à adrenalina,
contribuiria para a maior sensibilidade e secreção de
insulina, uma vez que a adrenalina aumenta a resistência à ação da insulina e inibe
sua secreção.
61
CONCLUSÕES
62
A inibição da PRL na lactação programa uma disfunção renal na prole
adulta, que pode ser evidenciada através de estudos laboratoriais da função
renal.
A lesão renal pode estar associada à obesidade programada no modelo de
inibição da PRL na lactação.
Não evidenciamos programação de lesão renal no modelo utilizando a
exposição materna à nicotina. Pelo contrário, os dados podem sugerir uma ação
protetora ao risco de disfunções renais.
63
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